U N I V E R Z I T E T U N I Š U PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET Departman za hemiju Marko Z. Mladenović Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara DOKTORSKA DISERTACIJA Niš, 2017. U N I V E R S I T Y OF N I Š FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS Department of Chemistry Marko Z. Mladenović Combinatorial libraries of selected natural and synthetic biologically active esters DOCTORAL DISSERTATION Niš, 2017. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara MENTOR: dr Niko S. Radulović, redovni profesor Prirodno-matematičkog fakulteta, Departman za hemiju, Univerzitet u Nišu ČLANOVI KOMISIJE: 1. dr Polina Blagojević, vanredni profesor Prirodno-matematičkog fakulteta, Departman za hemiju, Univerzitet u Nišu, predsednik 2. dr Irena Novaković, naučni saradnik, Institut za hemiju, tehnologiju i metalurgiju, Univerzitet u Beogradu 3. dr Tamara Todorović, docent Hemijskog fakulteta, Univerzitet u Beogradu 4. dr Zorica Stojanović-Radić, docent Prirodno-matematičkog fakulteta, Departman za biologiju i ekologiju, Univerzitet u Nišu Прилог 4/1 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: докторска дисертација Аутор, АУ: Марко З. Младеновић Ментор, МН: Нико C. Радуловић Наслов рада, НР: Комбинаторне библиотеке одабраних природних и синтетских биолошки активних естара Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: српски/енглески Земља публиковања, ЗП: Србија Уже географско подручје, УГП: Србија Година, ГО: 2017. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 11 поглавља; 574 стране; 269 цитата; 20 табелa; 103 сликe; 506 прилога Научна област, НО: хемија Научна дисциплина, НД: органска хемија и биохемија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Органска синтеза, kомбинаторне библиотеке естара, етарска уља, (1R*,3S*,5R*)-сабинол, дуголанчани алкохоли, региоизомерни алилметоксифеноли, метил-2-(фероценилметил)ацетоацетати, метил-2- бензилацетоацетати, биолошка/фармаколошка активност, QSPR УДК 543.632.514.3 + 547.1-3 Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Део истраживања на пројекту ев. бр. 172061 надлежног Министарства. Експериментални део је рађен у Лабораторији за органску анализу и синтезу, Департман за хемију, Природно-математички факултет, Универзитет у Нишу Извод, ИЗ: У овој докторској дисертацији је применом комбинаторног приступа (креиране су три библиотеке са укупно 171 једињењем, од којих је 121 ново једињење) приказана успешна идентификација и добивање (мили)грамских количина одабраних природних естара. Као резултат тога, идентификовани су нови секундарни метаболити из етарских уља биљних врста: Achillea falcata L. ((1R*,3S*,5R*)-сабинил-формијат и тиглат), Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl ((1R*,3S*,5R*)-сабинил-формијат, тиглат, нонаноат и деканоат), Scandix balansae Reut. ex Boiss. (октадецил-валерат), Scandix pecten-veneris L. (естри изобутанске киселине и n-C15, C17, C21 и C23 алкохола, као и естара изовалеријанске киселине и n-C13, C15 и C17 алкохола) и Anthemis segetalis Ten. (еугенил-ангелат, 2-метилбутаноат и 3-метилбутаноат). Такође, комбинаторни приступ је успешно искоришћен за упоређење хемијских/биолошких особина естара који садрже фероценско језгро и њихових фенил аналога (библиотека 18 (13 нових) метил-ацетоацетата (ди)супституисаног у положају 2). Синтетисани естри су спектрално окарактерисани коришћењем MS, NMR (1D- и 2D- NMR, као и NMR експеримената са додатком лантанидног реагенса хемијског померања), FTIR и UV-Vis анализа, а у случају естара који садрже фероценско језгро и електрохемијском (циклична волтаметрија) и ренгенском структурном анализом. За неколико естара је показано да поседују акутну токсичност према A. salina, цитотоксичност на две ћелијске линије, инхибиторну активност на AChE, антиноцицептивну и антимикробну активност. (1R*,3S*,5R*)-Сабинол је показао два пута већу активност у односу на морфин, а антифунгална активност 2-ацетил-2-(фероценилметил)-4- метил-4-пентеноата је била упоредива са активношћу нистатина према Candida albicans. Датум прихватања теме, ДП: 27.12.2013. Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Полина Благојевић Члан: Ирена Новаковић Члан: Тамара Тодоровић Члан: Зорица Стојановић-Радић Члан, ментор: Нико Радуловић Образац Q4.09.13 - Издање 1 Прилог 4/2 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: doctoral dissertation Author, AU: Marko Z. Mladenović Mentor, MN: Niko S. Radulović Title, TI: Combinatorial libraries of selected natural and synthetic biologically active esters Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: Serbian/English Country of publication, CP: Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2017 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 11 chapters/ 574 pages/ 269 ref./ 20 tables/ 103 figures/ 506 appendices Scientific field, SF: Chemistry Scientific discipline, SD: Organic chemistry and biochemistry Subject/Key words, S/KW: Organic synthesis, combinatorial libraries of esters, (1R*,3S*,5R*)-sabinol, long- chain alkanols, regioisomeric allylmethoxyphenols, methyl-2-benzylacetoacetates, methyl-2-(ferrocenylmethyl)acetoacetates, essential oils, biological/pharmacological activity, QSPR UC 543.632.514.3 + 547.1-3 Holding data, HD: library Note, N: This work is a part of the research performed within the Project No. 172061. Synthesis of compounds and their spectral analyses were performed in the Laboratory of organic analysis and synthesis, Department of chemistry, Faculty of Science and Mathematics, University of Niš Abstract, AB: Herein, a successful identification and a means of arriving at (milli)gram quantities of the selected natural esters was achieved through the application of a synthetic combinatorial approach (three libraries with 171 constituents in total, among them 121 new compounds). As a result, new secondary metabolites from Achillea falcata L. ((1R*,3S*,5R*)-sabinyl formate and tiglate), Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl ((1R*,3S*,5R*)-sabinyl formate, tiglate, nonanoate and decanoate), Scandix balansae Reut. ex Boiss. (octadecyl valerate), Scandix pecten-veneris L. (esters of isobutanoic acid and n-C15, C17, C21 and C23 alkanols, as well as esters of isovaleric acid and n-C13, C15 and C17 alkanols) and Anthemis segetalis Ten. (eugenyl angelate, 2-methylbutanoate and 3- methylbutanoate) essential-oil samples wеre identified. Also, the combinatorial approach was successful used for a systematical comparison of chemical/biological properties of ferrocene-containing esters and their corresponding phenyl analogs (a library of eighteen (13 new) 2-substituted methyl acetoacetates). The structures of the synthesized esters were spectrally characterized by MS, NMR (1D- and 2D-NMR, as well as, an NMR methodology that employ lanthanide-induced shifts), FTIR and UV-Vis analyses, and in the case of ferrocene-containing compounds by electrochemical (cyclic voltammetry) and X-ray analyse(s). Several esters were shown to be toxic to A. salina, possessed cytotoxic (to two cell lines), AChE inhibitory, antinociceptive and antimicrobial activities. Antinociceptive activity of (1R*,3S*,5R*)-sabinol was two times higher than that of morphine, and the antifungal activity of 2- acetyl-2-(ferrocenylmethyl)-4-methyl-4-pentenoate was comparable to that of nystatin against Candida albicans. Accepted by the Scientific Board on, ASB: 27.12.2013. Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Polina Blagojević Member: Irena Novaković Member: Tamara Todorović Member: Zorica Stojanović-Radić Member, Mentor: Niko Radulović Образац Q4.09.13 - Издање 1 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara Подаци о докторској дисертацији Ментор: др Нико С. Радуловић, редовни професор Природно-математичког факултета, Департман за хемију, Универзитет у Нишу Наслов: Комбинаторне библиотеке одабраних природних и синтетских биолошки активних естара Резиме: У овој докторској дисертацији је применом комбинаторног приступа (креиране су три библиотеке са укупно 171 једињењем, од којих је 121 ново једињење) приказана успешна идентификација и добивање (мили)грамских количина одабраних природних естара. Као резултат тога, идентификовани су нови секундарни метаболити из етарских уља биљних врста: Achillea falcata L. ((1R*,3S*,5R*)-сабинил-формијат и тиглат), Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl ((1R*,3S*,5R*)-сабинил-формијат, тиглат, нонаноат и деканоат), Scandix balansae Reut. ex Boiss. (октадецил-валерат), Scandix pecten-veneris L. (естри изобутанске киселине и n-C15, C17, C21 и C23 алкохола, као и естара изовалеријанске киселине и n-C13, C15 и C17 алкохола) и Anthemis segetalis Ten. (еугенил-ангелат, 2-метилбутаноат и 3-метилбутаноат). Такође, комбинаторни приступ је успешно искоришћен за упоређење хемијских/биолошких особина естара који садрже фероценско језгро и њихових фенил аналога (библиотека 18 (13 нових) метил-ацетоацетата (ди)супституисаног у положају 2). Синтетисани естри су спектрално окарактерисани коришћењем MS, NMR (1D- и 2D-NMR, као и NMR експеримената са додатком лантанидног реагенса хемијског померања), FTIR и UV-Vis анализа, а у случају естара који садрже фероценско језгро и електрохемијском (циклична волтаметрија) и ренгенском структурном анализом. За неколико естара је показано да поседују акутну токсичност према A. salina, цитотоксичност на две ћелијске линије, инхибиторну активност на AChE, антиноцицептивну и антимикробну активност. (1R*,3S*,5R*)-Сабинол је показао два пута већу активност у односу на морфин, а антифунгална активност 2-ацетил-2-(фероценилметил)-4-метил-4-пентеноата је била упоредива са активношћу нистатина према Candida albicans. Научна област: хемија Научна дисциплина: органска хемија и биохемија Кључне речи: Органска синтеза, kомбинаторне библиотеке естара, етарска уља, метил-2- (фероценилметил)ацетоацетати, метил-2-бензилацетоацетати, региоизомерни алилметоксифеноли, (1R*,3S*,5R*)-сабинол, дуголанчани алкохоли, биолошка/фармаколошка активност, QSPR УДК: 543.632.514.3 + 547.1-3 CERIF класификација: P 390, Органска хемија; P 395, Хемија органометалних једињења; P 004, Биохемија, метаболизам Тип лиценце Креативне заједнице: CC BY-NC-ND Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara Data on Doctoral Dissertation Doctoral Supervisor: Academic title, First and Last Name, Title of the University and Faculty Title: Title of Doctoral Dissertation Abstract: Herein, a successful identification and a means of arriving at (milli)gram quantities of the selected natural esters was achieved through the application of a synthetic combinatorial approach (three libraries with 171 constituents in total, among them 121 new compounds). As a result, new secondary metabolites from Achillea falcata L. ((1R*,3S*,5R*)-sabinyl formate and tiglate), Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl ((1R*,3S*,5R*)-sabinyl formate, tiglate, nonanoate and decanoate), Scandix balansae Reut. ex Boiss. (octadecyl valerate), Scandix pecten-veneris L. (esters of isobutanoic acid and n-C15, C17, C21 and C23 alkanols, as well as esters of isovaleric acid and n-C13, C15 and C17 alkanols) and Anthemis segetalis Ten. (eugenyl angelate, 2-methylbutanoate and 3-methylbutanoate) essential-oil samples wеre identified. Also, the combinatorial approach was successful used for a systematical comparison of chemical/biological properties of ferrocene-containing esters and their corresponding phenyl analogs (a library of eighteen (13 new) 2-substituted methyl acetoacetates). The structures of the synthesized esters were spectrally characterized by MS, NMR (1D- and 2D-NMR, as well as, an NMR methodology that employ lanthanide-induced shifts), FTIR and UV-Vis analyses, and in the case of ferrocene-containing compounds by electrochemical (cyclic voltammetry) and X-ray analyse(s). Several esters were shown to be toxic to A. salina, possessed cytotoxic (to two cell lines), AChE inhibitory, antinociceptive and antimicrobial activities. Antinociceptive activity of (1R*,3S*,5R*)-sabinol was two times higher than that of morphine, and the antifungal activity of 2-acetyl-2-(ferrocenylmethyl)-4-methyl-4-pentenoate was comparable to that of nystatin against Candida albicans. Scientific Field: Chemistry Scientific Discipline: Organic chemistry and biochemistry Key Words: Organic synthesis, combinatorial libraries of esters, (1R*,3S*,5R*)-sabinol, long- chain alkanols, regioisomeric allylmethoxyphenols, methyl-2-benzylacetoacetates, methyl-2-(ferrocenylmethyl)acetoacetates, essential oils, biological/pharmacological activity, QSPR UDC: 543.632.514.3 + 547.1-3 CERIF Classification: P 390, Organic chemistry; P 395, Organometallic chemistry; P 004, Biochemistry, Metabolism Creative Commons License Type: CC BY-NC-ND Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara Eksperimentalni deo ove doktorske disertacije rađen je u Laboratoriji za organsku analizu i sintezu, Departmana za Hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u Nišu, u okviru istraživanja na projektu ON 172061 „Kombinatorne biblioteke heterogenih katalizatora, prirodnih proizvoda, modifikovanih prirodnih proizvoda i njihovih analoga: put ka novim biološkim agensima” Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije. Ovom prilikom najiskrenije se zahvaljujem svom mentoru profesoru Niku Raduloviću na ukazanom poverenju, vremenu, strpljenju, podršci i nesebičnoj pomoći tokom izrade ove disertacije, kao i na prijateljskom odnosu tokom ovih godina. Najsrdačnije se zahvaljujem i članovima komisije, prof. dr Polini Blagojević, dr Ireni Novaković, doc. dr Tamari Todorović i doc. dr Zorici Stojanović-Radić, na korisnim sugestijama i savetima koji su značajno doprineli kvalitetu disertacije. Veliku zahvalnost dugujem i doc. dr Zorici Stojanović-Radić, doc. dr Pavlu Ranđeloviću i Nikoli Stojanović na pomoći pri ispitivanju antimikrobne aktivnosti i farmakoloških aktivnosti, prof. dr Polini Blagojević na pomoći pri izvođenju in silico eksperimenata i dr Tatjani Ilić-Tomić, dr Lidiji Senerović i dr Jasmini Nikodinović-Runić na pomoći pri ispitivanju citotoksične aktivnosti. Zahvalnost dugujem i kolegama iz grupe, koji su mi mnogo puta nesebično pomagali a najviše jer su doprineli da rad u laboratoriji protekne u dobroj atmosferi. Naposletku, zahvaljujem se i svojoj porodici na bezgraničnoj podršci i razumevanju. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara Oznake i skraćenice -Nomenklatura- n - normalni niz p - para E - Entgegen (stereodeskriptor) Z - Zuzammen (stereodeskriptor) -Reagensi i rastvarači- CDCl3 - deuterohloroform C6D6 - deuterobenzen DCC - N,N'-dicikloheksilkarbodiimid DMAP - 4-(dimetilamino)piridin DMF - dimetilformamid DMSO - dimetilsulfoksid Et2O - dietil-etar EtOH - etanol Eu(fod)3 - tris(6,6,7,7,8,8,8-heptafluor-2,2-dimetil-3,5-oktandionat)europijum(III) MeOH - metanol PrOH - propanol t-BuOH - terc-butanol TMS - tetrametilsilan TTC - 2,3,5-trifeniltetrazolijum-hlorid -Hromatografija i masena spektrometrija- AMDIS - automatizovani sistem za identifikaciju i dekonvoluciju masenih spektara EI - elektronska jonizacija FID - plameno-jonizacioni detektor (Flame Ionization Detector) GC - gasna hromatografija GC-MS - gasna hromatografija-masena spektrometrija HP - Hewlett-Packard Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara [M] +. - molekulski jon m/z - odnos mase i naelektrisanja MPLC - tečna hromatografija pri srednjim pritiscima (Medium Preasure Liquid Chromatography) PIC - parcijalna jonska struja (partial ion current) rel. int. - relativni intenzitet RI - retencioni indeks u odnosu na n-alkane (Den Dool i Kratz, 1963) Rt - retenciono vreme (Retention Time) TLC - tankoslojna hromatografija (Thin-Layer Chromatography) TIC - ukupni jonski hromatogram (Total Ion Chromatogram) -Infracrvena spektroskopija i ultraljubičasta i vidljiva spektroskopija- ATR - Attenuated Total Reflectance FT - Fourier-ova transformacija FTIR - Furije-transformisana infracrvena spektroskopija (Fourier Transformed Infrared Spectroscopy) IR - infracrvena (InfraRed) UV - ultraljubičasta (UltraViolet) UV-Vis - spektroskopija u UV i Vis oblasti (UltraViolet–Visible spectroscopy) -Nuklearna-magnetna rezonantna spektroskopija- 1D jednodimenzionalni 2D dvodimenzionalni 13 C NMR – nuklearno-magnetna rezonantna spektroskopija ugljenika-13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) d - dublet dd - dublet dubleta ddd - dublet dubleta dubleta dddd - dublet dubleta dubleta dubleta ddq - dublet dubleta kvarteta Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara dt - dublet tripleta, DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 1 H - 1 H COSY - 1 H - 1 H Correlation Spectroscopy 1 H NMR - protonska nuklearno-magnetna rezonantna spektroskopija (Hydrogen-1 Nuclear Magnetic Resonance) HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC - Heteronuclear Single Quantum Coherence J - konstanta kuplovanja m - multiplet NMR - nuklearno-magnetna rezonantna spektroskopija (Nuclear Magnetic Resonance) NOESY - Nuclear Overhauser Effect Spectroscoy ppm - parts per million s - singlet sept - septuplet sext - sekstuplet (sextuplet) t - triplet tst - triplet septupleta tquint - triplet kvinteta q - kvartet (quartet) quint - kvintet (quintet) qquint - kvartet kvinteta δ - hemijsko pomeranje u NMR spektru δH - hemijsko pomeranje u 1H NMR spektru δC - hemijsko pomeranje u 13C NMR spektru Δδ - razlika u hemijskim pomeranjima ΔEu - gradijent pomeranja Δcal - izračunate vrednosti hemijskih pomeranja indukovanih lantanidom na osnovu Mekonel- Robertsonove (McConnell-Robertson) jednačine Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara -Biološka aktivnost- AChE - acetilholinesteraza ACTI - acetiltioholin-jodid ATCC - American Type Culture Collection BSA - albumin iz goveđeg seruma (Bovine Serum Albumin) CFU - Colony-Forming Unit DTNB - 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina) MBC - minimalna baktericidna koncentracija (Minimum Bactericidal Concentration) MFC - minimalna fungicidna koncentracija (Minimum Fungicidal Concentration) MHA - Mueller Hinton Agar MIC - minimalna inhibitorna koncentracija (Minimum Inhibitory Concentration) MTT - 3-(4,5-dimetiltijazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid NCCLS - američki nacionalni komitet za kliničke laboratorijske standarde (National Committee for Clinical Laboratory Standards) DA - Saburo dekstrozni agar (Sabouraud Dextrose Agar) -Statistička analiza- MVA - multivarijantna analiza AHC - aglomerativna hijerarhijska klaster analiza (Agglomerative Hierarchical Clustering) PCA - analiza glavne komponente (Principal Component Analysis) -Merne jedinice- Å - angstrem °C - Celzijusov stepen cm - centimetar eV - electron Volt g - gram h - sat Hz - herc (Hertz) kg - kilogram Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara l - litar m - metar MHz - megaherc mg - miligram min - minut ml - mililitar mm - milimetar mmol - milimol ng - nanogram nm - nanometar s - sekunda μl - mikrolitar μm - mikrometar -Ostalo- BAMT - benzoeva kiselina-metiltransferaza (Benzylic Acid Methyl Transferase) BI - Balaban-ov indeks BL - baseline (vrednost osnovne linije) DFT - density functional theory et al. - i drugi/ostali (Et alia) HCMV - Human Cytomegalovirus HIV - Human Immunodeficiency Virus HSV - Herpes Simplex Virus MMFF94 - Merck molecular force field 94 MTI - molekulski topološki indeks npr. - na primer p.n.e. - pre nove ere rel. int. - relativni intenzitet SAR - veza strukture i aktivnosti molekula (Structure Activity Relationships) SAMT - salicilna kiselina-metiltransferaza (Salicylic acid methyl transferase) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara SD - standardna devijacija sl. - slično syn. - sinonim i td. - i tako dalje tj. - to jest tr - trag WI - Wiener-ov indeks Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara SADRŢAJ Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 1. UVOD I CILJEVI 1 2. OPŠTI DEO 7 2.1. Estri 8 2.1.1. Sinteza estara 8 2.1.1.1. Šteglihova (Steglich) esterifikacija 8 2.1.2. Biosinteza estara u biljkama 10 2.1.3. Biološke/farmakološke aktivnosti estara 12 2.2. Etarska ulja 14 2.2.1. Etarska ulja – dobivanje, analiza, značaj 14 2.2.2. Biološki/farmakološki značaj etarskih ulja i njihovih sastojaka 16 2.2.3. Etarska ulja kao izvor estara 19 2.3. Feroceni 22 2.3.1. Struktura, osobine i sinteza derivata ferocena 22 2.3.2. Biološka aktivnost jedinjenja sa ferocenil grupom 22 2.4. Kombinatorne biblioteke 24 2.4.1. Kombinatorne biblioteke – princip kreiranja, podela i primena 24 2.4.2. Biološki i farmakološki značaj kombinatornih biblioteka 30 2.4.3. Primena u identifikaciji prirodnih proizvoda 38 3. EKSPERIMENTALNI DEO 41 3.1. Hemikalije i rastvarači 42 3.2. Biljni materijal i priprema uzoraka za analizu 43 3.2.1. Biljni materijal 43 3.2.2. Izolovanje etarskih ulja 44 3.3. Metode razdvajanja i analize 44 3.3.1. Gasna hromatografija – masena spektrometrija (GC-MS) i gasna hromatografija (GC) 44 3.3.1.1. Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) 44 3.3.1.2. Gasna hromatografija sa plameno-jonizacionim detektorom (GC- FID) 45 3.3.1.3. Identifikacija sastojaka 45 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 3.3.1.4. Kvantifikacija odabranih sastojaka 45 3.3.2. Hromatografija na tankom sloju (TLC) 46 3.3.3. Tečna hromatografija pri srednjim pritiscima (MPLC) 46 3.3.4. „Dry flash” hromatografija 46 3.3.5. Infracrvena spektroskopija (IR) 46 3.3.6. Nuklearno-magnetna rezonantna (NMR) spektroskopija 47 3.3.7. Rendgenska strukturna analiza 47 3.3.8. Ciklična voltametrija 47 3.3.9. Ultraljubičasta (UV) spektroskopija 48 3.3.10. Elementalna mikroanaliza 48 3.4. Izolovanje i sinteza jedinjenja 48 3.4.1. Sinteza biblioteke estara trans-sabinola 48 3.4.1.1. Izolovanje (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata 48 3.4.1.2. Hidroliza (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata 48 3.4.1.3. Sinteza estara trans-sabinola 48 3.4.2. Sinteza biblioteke izobutanoata, 2-metilbutanoata i (izo)valerata dugolančanih alkohola 54 3.4.3. Sinteza biblioteke estara alilmetoksifenola 62 3.4.3.1. Sinteza regioizomernih alilmetoksifenola 62 3.4.3.1.1. Opšte uputstvo za O-metilovanje fenola 62 3.4.3.1.2. Opšte uputstvo za O-alilovanje fenola 62 3.4.3.1.3. Dobivanje o-alilfenola (Klajzenovo (Claisen) premeštanje) 63 3.4.3.2. Sinteza alilmetoksifenil estara 63 3.4.4. Sinteza biblioteke metil-(ferocenilmetil)acetoacetata 85 3.4.5. Sinteza biblioteke metil-benzilacetoacetata 89 3.4.6. Sinteza 2,2-dipropil- i 2,2-dialil-supstituisanih metil-acetoacetata 93 3.5. Testiranje biološke aktivnosti estara 94 3.5.1. Testiranje in vitro aktivnosti 94 3.5.1.1. Korišćeni mikroorganizmi 94 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 3.5.1.2. Antimikrobna aktivnost 95 3.5.1.3. Inhibicija acetilholinesteraze 96 3.5.1.4. Određivanje citotoksičnosti na fibroblaste pluća (MRC5) i ćelije melanoma (A375) 97 3.5.2. Testiranje in vivo aktivnosti 98 3.5.2.1. Eksperimentalne životinje 98 3.5.2.2. Test abdominalnih grčeva izazvanih acetilholinom (writhing test) 98 3.5.2.3. Osetljivost na termalni nadražaj - metode vruće ploče (hot-plate test) i imerzije repa (tail immersion test) 99 3.5.2.4. Određivanje akutne toksičnosti 99 3.6. Statistička obrada podataka 100 3.7. In silico eksperimenti 100 3.7.1. Optimizacija geometrije molekula i izračunavanje NMR hemijskih pomeranja i konstanti spin–spin kuplovanja 100 3.7.2. Eksperimenti molekulskog dokovanja (ukotljavanja) 100 4. REZULTATI I DISKUSIJA 102 4.1. Kombinatorna biblioteka sabinil estara 103 4.1.1. Kreiranje kombinatorne biblioteke, sinteza i spektralna karakterizacija estara trans-sabinola 103 4.1.1.1. Kreiranje biblioteke i sinteza estara 103 4.1.1.2. Nomenklaturni problemi koji se tiču stereohemije derivata sabinola 103 4.1.1.3. NMR spektralna karakterizacija odabranih jedinjenja biblioteke 105 4.1.2. Hemijski sastav etarskih ulja biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia ssp. serbica 124 4.1.2.1. Achillea falcata L. 124 4.1.2.2. Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl 128 4.1.3. Biološka aktivnost odabranih sintetisanih sabinil estara 132 4.1.3.1. Određivanje akutne toksičnosti 132 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 4.1.3.2. Inhibicija acetilholinesteraze (AChE) 133 4.1.3.3. Antinociceptivna aktivnost 138 4.2. Kombinatorna biblioteka izobutanoata, 2-metilbutanoata i (izo)pentanoata dugolančanih alkohola 144 4.2.1. Određivanje sastava etarskih ulja biljnih vrsta Scandix balansae i S. pecten-veneris 144 4.2.1.1. Scandix balansae Reut. ex Boiss. 144 4.2.1.2. Scandix pecten-veneris L. 148 4.2.2. Kreiranje kombinatorne biblioteke, sinteza estara dugolančanih alkohola i njihova spektralna karakterizacija 151 4.2.3. Veza strukture molekula i njihovih gasno-hromatografskih osobina (retencionih indeksa) 154 4.2.4. Prirodna rasprostranjenost estara dugolančanih alkohola iz kombinatorne biblioteke 158 4.2.5. Kvantifikacija identifikovanih estara dugolančanih alkohola u biljnom materijalu 160 4.2.6. Hemotaksonomski značaj identifikovanih estara dugolančanih alkohola 161 4.2.7. Mikrobiološka aktivnost odabranih jedinjenja iz kombinatorne biblioteke 167 4.3. Kombinatorna biblioteka alilmetoksifenil estara 170 4.3.1. Identifikacija nepoznatih sastojaka etarskog ulja biljne vrste Anthemis segetalis 170 4.3.2. Dizajn i kreiranje biblioteke alilmetoksifenil estara 172 4.3.3. Spektralna karakterizacija 176 4.3.4. Veza strukture molekula i njihovih gasno-hromatografskih osobina (retencionih indeksa) 181 4.3.5. Biološka/farmakološka aktivnost odabranih derivata iz biblioteke alilmetoksifenil estara 185 4.3.5.1. Određivanje akutne toksičnosti 186 4.3.5.2. In vitro citotoksičnost (antiproliferativna aktivnost) 187 4.3.5.3. Inhibitorna aktivnost na acetilholinesterazu (AChE) 189 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 4.3.5.4. Antibakterijska aktivnost 189 4.3.6. Veza strukture odabranih jedinjenja biblioteke i njihovih bioloških osobina (SAR) 190 4.4. Kombinatorna biblioteka metil-(ferocenilmetil)acetoacetata i odgovarajućih benzil analoga 194 4.4.1. Dizajn i kreiranje biblioteke 194 4.4.2. Spektralna karakterizacija derivata metil-2-oksobutanoata 196 4.4.3. Rendgenska strukturna analiza metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil- 4-heksenoata [12f] 207 4.4.4. Elektrohemijsko ispitivanje odabranih metil-acetoacetata koji sadrže ferocensko jezgro 213 4.4.5. Antimikrobna aktivnost sintetisanih jedinjenja iz biblioteke metil- acetoacetata 215 5. ZAKLjUČAK 221 6.1. IZVOD 224 6.2. SUMMARY 228 7. LITERATURA 232 8. PRILOZI 245 9. BIOGRAFIJA AUTORA 543 10. BIBLIOGRAFIJA 545 11. IZJAVE AUTORA 550 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 1 1. UVOD I CILJEVI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 2 Kombinatorna biblioteka predstavlja skup jedinjenja sintetisanih korišćenjem istih hemijskih reakcija na meĊusobno razliĉitim, ali funkcionalno srodnim supstratima. Pojava kombinatorne hemije je znaĉajno promenila proces otkrivanja novih, aktivnih molekula u farmaceutskoj industriji, omogućavajući sintezu i testiranje velikog broja homologih serija jedinjenja (Beavers i Chen, 2002). Kombinatorne biblioteke se generalno mogu smatrati jedno- ili višedimenzionalnim (u zavisnosti da li se u reakciji varira identitet jednog ili više uĉesnika). Dodatnim dimenzijama biblioteke se mogu smatrati sve pridodate osobine tih jedinjenja, poput biološke aktivnosti i spektralnih podataka. Biblioteke mogu sadrţati sintetisane smeše jedinjenja, ĉista jedinjenja, ili mogu predstavljati hemijske strukture generisane u kompjuterskom programu. Postoje dva osnovna pristupa u kreiranju kombinatornih biblioteka. Prvi predstavlja kreiranje „skrining” biblioteka kod kojih se sintezom nasumiĉnih homologih serija traga za novim, biološki aktivnim jedinjenjima. Mnogo efikasniji pristup je kreiranje biblioteka koje sadrţe jedinjenja nastala modifikacijom biološki aktivnih jedinjenja u cilju povećanja njihove aktivnosti i/ili smanjenja toksiĉnosti (Nilakantan et al., 2002). Ovo se najĉešće postiţe formiranjem kombinatornih biblioteka kod kojih se polazi od biološki aktivnih prirodnih proizvoda (prirodna jedinjenja predstavljaju osnovu za analoge koji su dizajnirani na „neprirodan” naĉin), njihovih derivata (hemijski transformisan prirodni proizvod) i analoga (de novo sintetisano jedinjenje sa odabranim strukturnim sliĉnostima sa prirodnim proizvodom). Kombinatorne biblioteke prirodnih proizvoda, koje kao reagense koriste smešu jedinjenja ili konkretno jedinjenje iz biljnog materijala, pruţaju ekonomski isplativ pristup paleti teško dostupnih hiralnih substrata sa već „ugraĊenom” farmakoforom. Jedinjenja koja sadrţe estarsku funkciju, bilo prirodni proizvodi ili sintetska jedinjenja, zauzimaju znaĉajno mesto u farmakologiji i medicinskoj hemiji. Estri su veoma privlaĉni u kombinatornom smislu usled konceptualno lako ostvarivog dobijanja velikog broja razliĉitih ĉlanova sintetskih biblioteka koje ukljuĉuju variranje dva strukturna fragmenta (alkoholnog i kiselinskog dela molekula). TakoĊe, strukturna varijacija u okviru nekog estra se moţe ostvariti i uvoĊenjem novih grupa na već postojeće, pogodno funkcionalizovane, estre. Kako su estri ĉesti prirodni proizvodi, i veoma ĉesto nosioci neke biološke aktivnosti, u ovoj disertaciji se (detalji se nalaze niţe obrazloţeni) razmatraju dve nove primene kombinatornih biblioteka u: 1. Identifikaciji potencijalno biološki aktivnih sekundarnih metabolita biljnih vrsta koje sadrţe estarsku funkciju. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 3 2. UtvrĊivanju strukturnih/farmakofornih zahteva za postojanje biološke aktivnosti estara sa ferocenil ili fenil grupama tj. promene u biološkoj aktivnosti estara kao posledice uvoĊenja ferocenil grupe ili formalne zamene aromatiĉnog jezgra ferocenom kod estara sa već dokazanom biološkom aktivnošću. Prvi cilj: Iako su našle znaĉajnu primenu u farmakologiji i hemiji materijala, kombinatorne biblioteke do sada nisu korišćene za identifikaciju sekundarnih metabolita. S obzirom da je veliki broj jedinjenja koja se koriste u medicinske svrhe biljnog porekla (Newman i Cragg, 2007) jedna od osnovnih metoda za pronalaţenje novih, biološki aktivnih jedinjenja je analiza hemijskog sastava nedovoljno istraţenih biljnih vrsta. Iz tog razloga, primena kombinatornih biblioteka za identifikaciju sekundarnih metabolita moţe, logiĉno, dovesti do pronalaţenja velikog broja novih, potencijalno biološki aktivnih biljnih sastojaka. Estri, kao veoma rasprostranjeni sekundarni metaboliti, na osnovu novijih istraţivanja (Radulović et al., 2013a), pokazuju znaĉajnu biološku/farmakološku aktivnost, i predstavljaju odliĉne kandidate za ĉiju se identifikaciju moţe primeniti pristup kombinatorne hemije. Pre svega zbog velikog broja kombinacija razliĉitih prirodnih alkohola i kiselina, kao i zbog jednostavne sinteze (npr. Steglich-ovom metodom esterifikacije). Pored toga, lako dostupna etarska ulja, kao sloţene smeše isparljivih sekundarnih metabolita biljaka, mogu biti izvor novih estara velike strukturne raznolikosti. Slika 1.1. Retrosintetska shema sinteze estara Kao izvor prirodnih biološki aktivnih estara mogu posluţiti etarska ulja nedovoljno ispitanih biljnih vrsta iz „aromatiĉnih” familija Apiaceae i Asteraceae (familija koje su poznate po biljnim vrstama bogatim etarskim uljima sa velikim brojem sastojaka (meĊu kojima su i estri)). Kao izvor mogu posluţiti i etarska ulja dobro prouĉenih biljnih vrsta jer se pokazalo da su prilikom njihove ponovne analize, mnogi prirodni proizvodi meĊu kojima i estri sa potencijalnom biološkom aktivnošću, zanemareni od strane autora zbog ĉinjenice da u literaturi ne postoje njihovi maseni spektri i odgovarajući retencioni indeksi, kao i zbog nemogućnosti njihovog izolovanja (npr. zbog male zastupljenosti metabolita u biljci). Ukoliko je pomoću dostupnih Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 4 podataka iz masenih spektara moguće naslutiti samo fragment strukture estra, ili ukoliko je moguć veliki broj izomera sa istom masenom fragmentacijom i molekulskom masom (npr. ukoliko nam je poznat kiselinski deo, a ne moţemo samo na osnovu masenog spektra da odredimo da li je alkohol nerazgranat ili raĉvast) najlogiĉniji i jedini sveobuhvatni pristup je sinteza kombinatornih biblioteka svih izomernih estara, slika 1.1. Poznavanje biosintetskog puta, za koji se veruje da je po njemu nastalo ciljno jedinjenje, u mnogome olakšava kreiranje biblioteke i smanjuje broj jedinjenja koja je potrebno sintetisati. Iako je ovaj pristup vremenski zahtevniji, jer kombinatorne biblioteke ne sadrţe samo ciljna jedinjenja iz etarskog ulja, njegova velika prednost je to što je sintezom biljnih sastojaka i njihovih homologa moguća njihova spektralna karakterizacija i dobijanje jedinjenja sa potencijalno većom biološkom/farmakološkom aktivnošću u odnosu na prirodni metabolit. Analizom rezultata dobivenih za sve ĉlanove kombinatorne biblioteke moguće je utvrditi vezu izmeĊu strukture molekula i njegove aktivnosti (identifikaciju njihove farmakofore) što olakšava potragu za novim biološki aktivnim prirodnim proizvodima biljnog porekla i njihovu dalju derivatizaciju tj. kreiranje novih kombinatornih biblioteka. Drugi cilj: Derivati ferocena su, još od otkrivanja njegove strukture 1951. godine, u ţiţi interesovanja velikog broja hemiĉara (Damljanović et al., 2009a), bilo da se oni bave organskom sintezom, koordinacionom hemijom, hemijom materijala ili medicinskom hemijom i farmakologijom (Damljanović et al., 2011). Razlog tome je nekoliko jedinstvenih karakteristika ovih jedinjenja, kao što su: lakoća derivatizacije i izuzetna stabilnost u vodenom i u nevodenom medijumu (Damljanović et al., 2011). Intenzivirana su istraţivanja bioloških aktivnosti derivata ferocena u poslednjih nekoliko godina, posebno posle otkrića ferocenil derivata hidroksitamoksifena koji poseduje znaĉajnu citostatiĉku aktivnost (Ratković et al., 2010). Osnovni pristup u kreiranju potencijalno biološki aktivnih derivata ferocena je zasnovan na ĉinjenici da je poznato da dolazi do potenciranja već poznatih ili pojave novih bioloških osobina kada se aromatiĉno jezgro formalno zameni jezgrom ferocena. Iako postoji veliki broj istraţivanja u kojima je uvoĊenje jezgra ferocena ili supstitucija aromatiĉnog jezgra ferocenom rezultirala znaĉajnim povećanjem biološke aktivnosti nikada nije izvršena uporedna analiza analognih homologih serija jedinjenja sa aromatiĉnim i ferocenil jezgrom. Najlogiĉniji pristup za uporednu analizu je kreiranje kombinatorne biblioteke homologih serija ferocenil derivata i njihovih benzil analoga, slika 1.2. Kombinatorna biblioteka koja sadrţi homologe serije organometalnih jedinjenja sa ferocenil jezgrom i njihove aromatiĉne analoge bi omogućila da se utvrdi da li je Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 5 ferocenil jezgro deo farmakofore tj. uticaj ferocenil grupe na biološku aktivnost sintetisanih jedinjenja. Jedinjenja koja mogu da posluţe kao osnova za kreiranje kombinatorne biblioteke derivata ferocena i njihovih aromatiĉnih analoga su derivati 3-oksobutanske kiseline, slika 1.2. Razlog za to je njihova poznata biološka aktivnost (Torosyan et al., 1987) i mogućnost kreiranja velike homologe serije 2-mono- ili 2,2-disupstituisanih derivata. Slika 1.2. Retrosintetska shema sinteze homologih serija ferocenil derivata i njihovih benzil analoga Imajući sve prethodno u vidu, za ciljeve ove doktorske disertacije je postavljeno kreiranje kombinatornih biblioteka u cilju identifikacije i odreĊivanja biološke aktivnosti odabranih estara iz etarskih ulja biljnih vrsta familija Apiaceae (Scandix balansae Reut. ex Boiss. i Scandix pecten- veneris L.) i Asteraceae (Anthemis segetalis Ten., Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl i Achillea falcata L.). TakoĊe, za jedan od ciljeva je postavljeno i kreiranje kombinatorne biblioteke alkil supstituisanih metil-2-(ferocenilmetil)acetoacetata i njihovih benzil supstituisanih analoga u cilju utvrĊivanja uticaja supstitucije aromatiĉnog jezgra ferocenom na biološku aktivnost estara. Istraţivanja vezana za izradu ove doktorske disertacije obuhvatila su sledeće: 1. Izolovanje i detaljnu analizu hemijskog sastava etarskih ulja biljnih vrsta Scandix balansae, Scandix pecten-veneris, Anthemis segetalis, Achillea ageratifolia subsp. serbica i Achillea falcata; 2. Identifikaciju (kreiranjem kombinatorne biblioteke) nepoznatih estara iz etarskog ulja plodova biljne vrste Scandix balansae; 3. Identifikaciju (kreiranjem kombinatorne biblioteke) nepoznatih estara iz etarskog ulja korena, nadzemnog dela i plodova biljne vrste Scandix pecten-veneris; 4. Identifikaciju (kreiranjem kombinatorne biblioteke) nepoznatih estara iz etarskog ulja nadzemnog dela biljne vrste Anthemis segetalis; Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 6 5. Identifikaciju (kreiranjem kombinatorne biblioteke) nepoznatih estara iz etarskog ulja nadzemnog dela i korena biljne vrste Achillea falcata; 6. Identifikaciju (kreiranjem kombinatorne biblioteke) nepoznatih estara iz etarskog ulja nadzemnog dela i korena biljne vrste Achillea ageratifolia subsp. serbica; 7. Kreiranje kombinatorne biblioteke 2-alkil supstituisanih metil-2- (ferocenilmetil)acetoacetata i njihovih benzil analoga; 8. Spektroskopsku i strukturnu karakterizaciju sintetisanih jedinjenja; 9. Ispitivanje mikrobiološke i farmakološke aktivnosti kombinatornih biblioteka estara. PredviĊena ispitivanja bila su sprovedena korišćenjem sledećih metoda: 1. Dobijanje etarskih ulja – hidrodestilacija po Clevenger-u; 2. Analiza – gasna hromatografija (GC), gasna hromatografija sa masenom detekcijom (GC-MS) i nuklearna magnetna rezonantna spektroskopija ugljenika ( 13 C NMR); 3. Izolovanje, razdvajanje i prečišćavanje – kolonska hromatografija, „dry-flash“ hromatografija i teĉna hromatografija pod srednjim pritiscima (MPLC); 4. Spektroskopska i strukturna karakterizacija – nuklearna magnetna rezonantna spektroskopija ugljenika i vodonika ( l H i 13 C NMR, jedno- i dvodimenzionalna), infracrvena spektroskopija (IR), ultraljubiĉasta-vidljiva spektroskopija (UV-Vis), masena spektrometrija (MS) i rendgenska strukturna analiza (X-ray kristalografija); 5. Mikrobiološka aktivnost – mikrodiluciona metoda po preporukama CLSI-a; 6. OdreĊivanje citotoksiĉnosti na fibroblaste pluća (MRC5) i ćelije melanoma ( 375); 7. OdreĊivanje acetilholinesteraza inhibitorne aktivnosti; 8. OdreĊivanje akutne toksiĉnosti na raĉiće (Artemia salina); 9. OdreĊivanje in vivo antinociceptivne aktivnosti (test abdominalnih grĉeva izazvanih acetilholinom (writhing test) i test osetljivosti na termalni nadraţaj - metode vruće ploĉe (hot- plate test) i imerzije repa (tail immersion test)); 10. Optimizacija geometrije molekula i izraĉunavanje NMR hemijskih pomeranja i konstanti spin–spin kuplovanja; 11. Molekulsko dokovanje (ukotljavanje). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 7 2. OPŠTI DEO Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 8 2.1. Estri 2.1.1. Sinteza estara Većina hemiĉara se slaţe sa ĉinjenicom da estri predstavljaju najrasprostranjeniju i najznaĉajniju klasu organskih jedinjenja (Otera, 2003). Razlog tome su: njihove hemijske osobine (pa su ĉesto korišćeni u sintezi sloţenih molekula kao zaštitne grupe karboksilne i/ili hidroksilne funkcije, npr. u sintezi makrolida, šećera i peptida), velika strukturna raznolikost (širok dijapazon kombinacija razliĉitih prirodnih i sintetskih alkohola i kiselina koji mogu nagraditi estre), jednostavnost sinteze i preĉišćavanja (postoji veliki broj ustaljenih sintetskih metoda), kao i zbog njihove svevaţnosti u industriji, pre svega u proizvodnji hrane i lekova (Otera, 2003). TakoĊe, njihovom znaĉaju je doprinela i široka rasprostranjenost u prirodi (do sada je identifikovan veliki broj prirodnih estara kao sekundarnih metabolita viših biljaka i ţivotinja). Estri predstavljaju najveću grupu mirisnih jedinjenja (Baser i Demirci, 2007) od kojih veoma ĉesto zavisi karakteristiĉan miris i ukus plodova razliĉitog voća i povrća (npr. fenetil- acetat (ruţe, med), etil-heksanoat (jabuke, banane), etil-oktanoat (ananas, kruške), γ-dekalakton i γ-dodekalakton (breskve)). Pored toga, njihova koliĉina i meĊusobni koliĉinski odnos su od velikog znaĉaja za ukus alkoholnih pića (npr. etil-2-metilbutanoat, etil-heksanoat, etil-oktanoat, izoamil-acetat, izobutil-acetat, heksil-acetat i fenetil-acetat (Baser i Demirci, 2007)). Do sada je usavršeno više razliĉitih metoda za sintezu estara, pre svega u katalizovanim reakcijama kiselina i odgovarajućih alkohola kao i reakcijama transesterifikacije jednog estra u drugi (Otera, 2003). Najveći nedostatak reakcija (trans)esterifikacije potiĉe od uspostavljanja (nepovoljne) ravnoteţe izmeĊu reaktanata i proizvoda reakcije (Otera, 2003). Iz tog razloga se za pomeranje ravnoteţe na stranu graĊenja proizvoda (estra) koristi višak jednog od reaktanata uz konstantno odvoĊenje proizvoda (estra i/ili vode/alkohola) iz reakcione smeše. U nekim sluĉajevima se ovaj problem rešava korišćenjem anhidrida, alkoksida ili sliĉno (Otera, 2003). 2.1.1.1. Šteglihova (Steglich) esterifikacija Šteglihova metoda podrazumeva esterifikaciju karboksilnih kiselina alkoholima ili tiolima pod „blagim” eksperimentalnim uslovima korišćenjem N,N'-dicikloheksilkarbodiimida (DCC) i katalitiĉkih koliĉina 4-aminopiridina (najĉešće 4-(dimetilamino)piridina, DMAP) (Neises i Steglich, 1978; Steglich i Höfle, 1969) i predstavlja jednu od najkorišćenijih metoda za esterifikaciju (Otera, 2003). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 9 Slika 2.1.1. Mehanizam Šteglihove (Steglich) esterifikacije i nastajanja sporednih proizvoda Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 10 Ova metoda esterifikacije je po prvi put primenjena sedamdesetih godina prošlog veka (Buzas et al., 1962) i u poĉetku je korišćen samo DCC. Naţalost, primena samo diimida je imala nekoliko ozbiljnih nedostataka, pre svega u nekim sluĉajevima prinos reakcije nije bio zadovoljavajući, reakcija je bila spora i ĉesto je nastajala i N-acilurea kao glavni proizvod. Ovi nedostaci su eliminisani upotrebom DMAP-a (Steglich i Höfle, 1969). Nedostatak koji potiĉe od nastajanja N,N'-dicikloheksil uree (DCU) se moţe prevazići uklanjanjem diimida koji je vezan za ĉvrstu podlogu. U prvom koraku reakcije (slika 2.1.1) kiselina sa DCC-om daje elektrofilni intermedijer (I) koji dalje reaguje sa DMAP-om pri ĉemu nastaje novi još elektrofilniji intermedijer (II). Nukleofilnom karbonilnom supstitucijom intermedijera (II) u reakciji sa alkoholom dolazi do graĊenja estra i regeneracije DM P-a (Otera, 2003). Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi što omogućava korišćenje supstrata sa osetljivim funkcionalnim grupama. Ovo pre svega omogućava laku i brzu sintezu (prirodnih) proizvoda sa estarskom grupom i upravo iz tog razloga Šteglihova esterifikacija se moţe primeniti na širok spektar kiselina i alkohola, ukljuĉujući poliole (Steglich i H fle, 1969), α-hidroksikiseline (Gilon et al., 1979) i veoma nestabilne alkohole kao što je vitamin (Neises i Steglich, 1990). Ove reakcija takoĊe omogućava sintezu estara sa tercijarnim alkoholima jer reakcija nije jako osetljiva na sternu zaklonjenost alkoholne ili karboksilne grupe (Otera, 2003). Iako sa povećanjem sternih smetnji oĉekivano dolazi do smanjenja prinosa reakcije i do nastajanja N-aciluree u većem prinosu, prinos esterifikacije je i dalje zadovoljavajući. Kao dobar primer moţe se uzeti esterifikacija 2,5- cikloheksadienkarboksilne kiseline sa razliĉitim alkoholima (Neises i Steglich, 1990): MeOH (95%), EtOH (84%), i-PrOH (75%), t-BuOH (65%). 2.1.2. Biosinteza estara u biljkama Biosintetski put kojim nastaju terpeni predstavlja osnovni put sinteze ugljovodoniĉnih skeleta ĉijom kasnijom modifikacijom nastaje većina isparljivih sekundarnih metabolita biljaka (Dudareva et al., 2004). Modifikacija najĉešće obuhvata redukciju, dekarboksilaciju, uvoĊenje hidroksilne grupe i nastajanje estara i etara (Dudareva et al., 2004). Dve najĉešće grupe isparljivih estara (onih koji ulaze u sastav etarskih ulja) su metil estri (nastali metilovanjem prirodnih kiselina) i acetil estri (nastali acetilovanjem sekundarnih metabolita sa slobodnom alkoholnom i/ili fenolnom grupom). Biosinteza isparljivih estara je prikazana na slici 2.1.2. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 11 Biosinteza estara se zasniva na enzimski katalizovanoj reakciji transfera acil grupe iz acetilkoenzima A na alkohol. Slika 2.1.2. Shema biosinteze estara Neki od prirodnih metil estara su veoma rasprostranjeni u biljnom svetu. Na primer, metil-salicilat je identifikovan kao sekundarni metabolit u brojnim biljnim vrstama (Knudsen i Tollsten, 1993), i potvrĊeno je da se koncentracija ovog estra u biljnom tkivu znaĉajno povećava, verovatno kao deo odbrambenog mehanizma, pri napadu insekata ili parazita (Van Poecke et al., 2001; Chen et al., 2003). Sinteza metil-salicilata se odvija pod dejstvom enzima salicilna kiselina-metiltransferaze (SAMT) koji je po prvi put prouĉavan iz cveta biljne vrste Clarkia breweri (Ros et al., 1999). Zanimljivo je da se SAMT enzim pokazao dovoljno aktivnim da izvrši i metilovanje benzoeve kiseline dovodeći do graĊenja još jednog ĉesto identifikovanog, isparljivog estra – metil-benzoata (Pott et al., 2004), dok enzim benzoeva kiselina- metiltransferaza (B MT) ne moţe da izvrši metilovanje salicilne kiseline (Dudareva et al., 2000). Nakon toga je identifikovana serija od 24 enzima koji metiluju prirodne kiseline (Chen et al., 2003). Veoma su ĉesti proizvodi acilovanja isparljivih alkohola sirćetnom, (izo)pentanskom, benzoevom kiselinom itd. U svim do sada poznatim sluĉajevima, takvi biljni isparljivi estri su biosintetisani pomoću, nedavno otkrivene, grupe aciltransferaza oznaĉene kao BAHD (zajedniĉka skraćenica je nastala od prvih slova imena ĉetiri enzima koji su prvi identifikovani (St-Pierre et al., 1998)). Mnogi B HD enzimi su ukljuĉeni u sintezu neisparljivih biljnih sastojaka (npr. acetilovani alkaloidi ili derivati taksola (St-Pierre et al., 1998; Walker i Croteau, 2000)) ili su ukljuĉeni u poĉetne korake sinteze sastojaka etarskih ulja (npr. eugenola (Gang et al., 2002)). Do sada je u nekoliko sluĉajeva potvĊeno da neki od BAHD enzima nisu selektivni i mogu katalizovati esterifikaciju nekoliko razliĉitih alkohola i/ili kiselina (npr. BAHD enzim iz zrelih plodova razliĉitih vrsta jagoda (Fragaria spp.) katalizuje acilovanje heptanola, oktanola i geraniola sirćetnom, butanskom i heksanskom kiselinom (Aharoni et al., 2000; Beekwilder et al., Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 12 2004) ili BADH enzim iz cveta ruţe istovremeno moţe da aciluje geraniol i citronelol (Shalit et al., 2003)). 2.1.3. Biološke/farmakološke aktivnosti estara Prema SCIfinder Scholar pretrazi CAS baze podataka, u trenutku pisanja ove disertacije, objavljeno je više od 860.000 radova koji sadrţe pojam estar. Veliki deo ovih radova ima kao cilj istraţivanja identifikaciju, sintezu, spektralnu karakterizaciju i primenu prirodnih ili sintetskih estara. Pretraga koja pored pojma estar ima i sintagmu biološka aktivnost je rezultovala u pronalaţenju oko 22.000 publikacija. One se odnose na biološku aktivnost ĉistih estara ili smeša jedinjenja meĊu kojima su i estri (najĉešće je to bilo ispitivanje biološke aktivnosti etarskih ulja i biljnih ekstrakata). Pošto je nemoguće obuhvatiti sve rezultate bioloških testiranja estara, u ovom delu će biti reĉi o odabranim estrima i odabranim aspektima njihove biološke aktivnosti. Najpoznatiji estar koji se koristi u medicinske svrhe je acetilsalicilna kiselina poznatija kao aspirin. spirin je jedan od najĉešće korišćenih lekova u svetu, sa procenjenom godišnjom proizvodnjom 40.000 tona (Warner et al., 2002) i spada u grupu osnovnih lekova medicinskih ustanova po regulativama Svetske zdravstvene organizacije. Postoje podaci da je još u 5. veku pre nove ere Hipokrat leĉio ljude korom bele vrbe (Salix alba L.). To je bio i povod da se u 18. veku izvrši izolovanje sastojaka iz kore ĉime se došlo do otkrića salicilne kiseline (Edmund, 1763). Iako je salicilna kiselina imala pozitivne biološke/farmakološke karakteristike njena primena je imala i ozbiljnih nedostataka, pre svega je uzrokovala digestivne probleme poput dijareje, a ĉak su poznati i smrtni sluĉajevi kao posledica primene ove kiseline u velikim dozama. Krajem 19. veka istraţivaĉi nemaĉke farmaceutske kompanije Bajer (Bayer) su izvršili derivatizaciju salicilne kiseline esterifikacijom slobodne fenolne grupe sirćetnom kiselinom, a što je u velikoj meri smanjilo negativne efekte (Sneader, 2000). Pored toga, vaţno je napomenuti da reakcija esterifikacije salicilne kiseline predstavlja jednu od prvih derivatizacija prirodnih proizvoda što je izazvalo ekspanziju farmaceutske industrije. U leĉenju malignih oboljenja, koja predstavljaju najveću zdravstvenu pretnju današnjice, estri takoĊe imaju vaţnu ulogu. Pre svega treba pomenuti Paclitaxel (taksol), prirodni proizvod izolovan iz kore pacifiĉke tise (Taxus brevifolia Nutt.), koji predstavlja najprodavaniji antikancer lek današnjice (Radulović, 2012). Iako taksol predstavlja sekundarni metabolit veoma sloţene strukture sa nekoliko razliĉitih funkcionalnih grupa, neosporno je da su prisutne estarske grupe Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 13 deo farmakofore. TakoĊe, nedavno objavljeni rezultati o selektivnoj aktivnosti estara progesterona prema tumorskim ćelijskim linijama (Chavez-Riveros et al, 2014) još jednom su potvrdili antikancer potencijal estara. Pored toga, mnogi estri su pokazali i dejstvo protiv virusa (Gorin et al., 1997; José et al., 2014): HIV (Human Immunodeficiency Virus), HSV (Herpes Simplex Virus) i HCMV (Human Cytomegalovirus). Pored estarskih grupa koje su deo sloţenih molekula i estri „jednostavne” strukture, koji se u prirodi najĉešće nalaze u etarskim uljima aromatiĉnih biljaka, takoĊe pokazuju znaĉajnu biološku aktivnost. Mnogi estri izolovani iz etarski ulja pokazuju sedativno, analgetsko i antiinflamatorno dejstvo. Kao vaţan primer biološki aktivnih estara iz etarskih ulja mogu se navesti estri izovalerijanske (3-metilbutanske) kiseline (Suerbaev et al., 2013). Neki izovalerati predstavljaju znaĉajne intermedijere u sintezi lekova, dok se neki već dugo primenjuju u medicini kao aktivni sastojci lekova (Validolum, Corvalolum). Najpoznatiji biološki aktivni izovalerati su: mentil-izovalerat (Validolum; kao glavni aktivni sastojak ovog sedativa koji se koristi za leĉenje neuroza, histerije, stenokardije), etil estar α-bromoizovalerijanske kiseline (sedativ i spazmolitik), cikloheksil-izovalerat (antimikrobna aktivnost protiv bakterija Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa i kvasca Candida albicans) i benzil-izovalerat sa antimikrobnom aktivnošću protiv bakterija E. coli i S. aureus (Suerbaev et al., 2013). TakoĊe i estri jednostavnih aromatiĉnih kiselina su pokazali izuzetne biološke karakteristike. Zanimljiv primer su estri antranilne kiseline koji su u nedavnim istraţivanjima pokazali širok dijapazon korisnih farmakoloških karakteristika. Metil- i izopropil-N- metilantranilati, izolovani iz etarskog ulja meksiĉke narandţe (Choisya ternata Kunth), u brojnim biološkim testiranjima su se pokazali kao dobri analgetici, anksiolitici i antidepresivi (Pinheiro et al., 2014). Prethodna ispitivanja biološke aktivnosti metil-N-metilantranilata (Heindel et al., 1968) su pokazala i njihovu antibakterijsku i antifungalnu aktivnost. Pored toga, dokazana je i znaĉajna biološka aktivnost estara fenilpropanoida, kao i terpenskih alkohola i kiselina, npr. analgetska aktivnost bornil-4-metoksibenzoata (Radulović et al., 2013a) i td. U najvećem broju sluĉajeva, ukoliko je prisutna, estarska funkcionalna grupa ĉini osnovu farmakofore i nosilac je biološke aktivnosti, meĊutim, postoje i primeri jedinjenja u kojima je estarska grupa druga, pomoćna farmakofora. Kod takvih jedinjenja promene u strukturi estarskog delu uslovljavaju promene fiziĉkih i hemijskih osobina celog molekula, npr. omogućavajući brţi Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 14 prolaz kroz ćelijsku membranu, brţu interakciju sa enzimima (Kim et al., 2010), i na taj naĉin omogućavaju dejstvo glavne farmakofore. 2.2. Etarska ulja 2.2.1. Etarska ulja – dobivanje, analiza, značaj Najpoznatiji i do sada najprouĉavaniji sekundarni metaboliti aromatiĉnih biljaka su oni metaboliti koji ulaze u sastav etarskih ulja. Razlog tome je, najĉešće, njihovo lako dobivanje iz biljnog materijala kao i njihove organoleptiĉke i biološke karakteristike. Po definiciji, etarska ulja predstavljaju teĉne ili poluteĉne kompleksne smeše isparljivih sekundarnih metabolita biljaka dobivenih procesom destilacije vodenom parom ili mehaniĉkim ceĊenjem (Kovaĉević, 2004). Iako većina biljnih vrsta u većoj ili manjoj meri biosintetiše sastojke etarskih ulja, najpoznatije „aromatiĉne” biljne vrste pripadaju familijama Apiaceae, Asteraceae, Cupressaceae, Hypericaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Pinaceae, Piperaceae, Rutaceae, Santalaceae, Zingiberaceae i Zygophyllaceae (Baser i Demirci, 2007). Najveća koliĉina etarskih ulja je smeštena, u zavisnosti od biljne vrste/roda/familije, u konkretnom delu biljke (Kovaĉević, 2004), pa su neke biljne vrste karakteristiĉne po velikom sadrţaju ulja u cvetovima (Matricaria chamomilla (nemaĉka kamilica), Syzygium aromaticum (karanfilić)), listu (Mentha spicata (nana), Melissa officinalis (matiĉnjak), Petroselinum crispum (persun)), kori (Cinnamomum verum (cimet), Santalum album (sandalovina)), korenu/rizomu (Zingiber officinale (Ċumbir), Iris spp. (perunika)), plodu/semenu (Pimpinella anisum (anis), Foeniculum vulgare (moraĉ), Myristica fragans (morski orašćić)). U većini sluĉajeva etarsko ulje iz razliĉitih organa iste biljne jedinke je veoma sliĉno po hemijskom sastavu (Kovaĉević, 2004), meĊutim, dešava se da se ova ulja znaĉajno kvalitativno/kvantitativno razlikuju (npr. postoje znaĉajne razlike u sastavu etarskog ulje plodova, listova i korena peršuna). Nekada se smatralo da sastojci etarskih ulja nemaju znaĉajnu fiziološku ulogu i da predstavljaju sporedne proizvode biljnog metabolizma, ali je u današnje vreme potvrĊen znaĉaj i uloga etarskih ulja. Neke od poznatih bioloških uloga sekundarnih metabolita iz ulja su: privlaĉno/odbojno deluju na insekte, zaštita od biljojeda, stvaranje povoljne mikroklime itd. (Kovaĉević, 2004). Iako prvi zapisi o korišćenju i dobivanju etarskih ulja, pre svega iz biljnih vrsta roda Cedrus i biljnih vrsta Cupressus sempervirens i Glycyrrhiza glabra datiraju još oko 2600. godine pre nove ere (Gurib-Fakim, 2006), prva sistematska istraţivanja sastojaka etarskih Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 15 ulja biljnih vrsta mogu se pripisati francuskim hemiĉarima Dimi (Dumas) i Bertoleu (Berthollet) (Başer i Buchbauer, 2009). Duma je izvršio prvu analizu ugljovodonika, oksigenovanih ugljovodonika i prirodnih proizvoda koji sadrţe azot i/ili sumpor, dok je Bertole izmerio ugao optiĉke rotacije nekoliko prirodnih proizvoda i njihovih derivata (Başer i Buchbauer, 2009). Najvaţnija istraţivanja na kraju 19. i poĉetku 20. veka, a koja se mogu smatrati istorijskom prekretnicom u analizi i identifikaciji prirodnih proizvoda, sproveo je Valah (Wallach). On je vršio izolovanje pojedinaĉnih sastojaka ulja i prouĉavao njihove osnovne fiziĉke i hemijske osobine (Başer i Buchbauer, 2009). Pored toga, utvrdio je da neki terpeni koji su do tada nosili razliĉita imena, najĉešće prema nazivu biljne vrste iz koje su izolovani, predstavljaju isto hemijsko jedinjenje. U to vreme ugljovodonici sa molekulskom formulom C10H16 su bili poznati pod imenom terpeni zbog njihovog prisustva u terpentinovom ulju, dok su svi do tada identifikovani metaboliti sa molekulskom formulom C10H16O i C10H18O bili poznati kao kamfori (Başer i Buchbauer, 2009). Valahova istraţivanja su bila povod da se do 1891. godine izoluje i okarakteriše veliki broj terpena – pineni, kamfen, limonen, felandreni, terpinolen itd. Nekoliko godina kasnije Valah je napisao prvu sveobuhvatnu knjigu o terpenima kao sekundarnim metabolitima biljaka i predloţio njihovu biosintezu iz izoprenskih jedinica zbog ĉega je i dobio Nobelovu nagradu u znak priznanja za izvanredan uspeh u analizi prirodnih proizvoda (Başer i Buchbauer, 2009). Hipoteza o biosintezi terpena je detaljno razrešena i potvrĊena tek 1953. godine od strane hemiĉara Ruţiĉke (Lavoslav Ruţiĉka). MeĊutim, tek je razvoj novih analitiĉkih metoda za izolovanje i identifikaciju sekundarnih metabolita, kao i novih instrumenata, izazvalo ekspanziju u pronalaţenju novih, potencijalno biološki aktivnih, sekundarnih metabolita (Başer i Buchbauer, 2009). Prvo je na osnovu prikupljenih empirijskih podataka, Vudvard (Woodward) predloţio niz pravila koja se mogu primeniti za identifikaciju novih prirodnih proizvoda na osnovu korelacije izmeĊu λmax poloţaja u UV spektrima i strukture molekula (Woodward, 1941). UvoĊenje hromatografskih metoda razdvajanja, gasne hromatografije sa masenom detekcijom (GC-MS) i nuklearno-magnetno-rezonantne (NMR) spektroskopije je omogućilo je identifikaciju najvećeg broja prirodnih proizvoda, ukljuĉujući i sastojke etarskih ulja (Radulović, 2012). Skoro eksponencijalni rast u identifikaciji sastojaka etarskih ulja i drugih sekundarnih metabolita je u suštini posledica znaĉajnog napretka ovih analitiĉkih metoda od 1950-tih. Naroĉito u poslednjih nekoliko decenija, za popularizaciju i ekspanziju izolovanja i analize etarskih ulja bilo je od Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 16 vaţnosti i potvrĊivanje znaĉajnih bioloških/farmakološki primenljivih osobina sekundarnih metabolita koji ulaze u sastva ulja (Radulović, 2012). Ustanovljeno je da su etarska ulja sloţene smeše od nekoliko desetina do nekoliko stotina alifatiĉnih i aromatiĉnih jedinjenja (Baser i Demirci, 2007). Etarska ulja najĉešće sadrţe monoterpenske i seskviterpenske ugljovodonike, oksigenovane mono- i seskviterpene (alkohole, aldehide, ketone, kiseline, estre), kao i fenilpropanoide (Baser i Demirci, 2007). U najvećem broju sluĉajeva etarska ulja sadrţe i druge klase jedinjenja, koja su ĉesto nosioci organoleptiĉkih i bioloških osobina celog etarskog ulja, npr: lako isparljive zasićene i nezasićene ugljovodonike, alkohole, tiole, aldehide, ketone, masne kiseline i estre (Saad et al., 2013). Do sada su identifikovana i detaljno prouĉena ĉetiri biosintetska puta nastajanja najĉešćih sastojaka etarskih ulja biljaka (Başer i Buchbauer, 2009): mevalonatni i deoksiksiluloza-5-fosfatni put (sinteza terpenoida), biosintetski put aromatiĉnih jedinjenja preko šikiminske kiseline (fenilpropanski put) i acetatni biosintetski put (sinteza masnih kiselina i poliketida). O znaĉaju i popularnosti etarskih ulja kao izvoru jedinjenja širokog spektra ugljovodoniĉnih skeleta sa izuzetnim biološkim/farmakološkim potencijalom govori i broj dostupnih publikacija u literaturi. Naime, u vreme pisanja ove disertacije, na osnovu SCI Finder Scholar pretrage CAS baze podataka, pojam etarsko ulje je sadrţavalo 114.571 publikacija u kojima su predstavljeni rezultati analize sastava etarskih ulja, sinteze (novih) sastojaka, ispitivanja njihove biosinteze, bioloških osobina, etnofarmakološke primene, kao i primene etarskih ulja ili njegovih odreĊenih sastojaka u hemotaksonomske svrhe. 2.2.2. Biološki/farmakološki značaj etarskih ulja i njihovih sastojaka Opšte je poznato da biljni sekundarni metaboliti poseduju veliku hemijsku raznovrsnost i biohemijsku specifiĉnost koja ih jasno razlikuje od sintetskih jedinjenja i ĉini da biljke predstavljaju i dalje najveći izvor biološki i farmakološki aktivnih jedinjenja (Radulović, 2012). Biološkа aktivnost prirodnih proizvoda (аntimikrobna, citotoksiĉna, analgetska i dr.) je najĉešće posledica njihovе znaĉajnе ulogе u zaštiti biljnih vrsta od napada mikroorganizama, herbivora, kao i interakcije (kompeticije) sa drugim biljnim vrstama, omogućavajući njihov opstanak u teškim prirodnim uslovima (Radulović, 2012). Ĉinjenica da je izmeĊu 1990. i 2000. godine stavljeno u promet preko 40 lekova koji predstavljaju izolovane prirodne proizvode ili hemijski transformisane prirodne proizvode (npr. azitromicin, orlistat, paklitaksel, sirolimus (rapamicin), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 17 sinercid, takrolimus i topotekan) govori u prilog velike farmakološke vaţnosti prirodnih proizvoda (Radulović, 2012). Hemijske osobine koje uslovljavaju veću biološku aktivnost prirodnih proizvoda u odnosu na sintetske proizvode kombinatornih biblioteka je njihova hiralnost i veća (prostorna) sloţenost, broj vodoniĉnih veza, veća rigidnost skeleta molekula prirodnih proizvoda, kao i raznovrsnost policikliĉnih sistema (Newman et al., 2003; Radulović, 2012). Kroz vekove, ljudi su koristili veliki broj biljnih vrsta kao izvor hrane, za proizvodnju odeće, skloništa, prevoznih sredstava, zaĉina, i pre svega kao preparate za leĉenje mnogih bolesti. Biljni metaboliti ĉine osnovu tradicionalne medicine koja egzistira hiljadama godina i koja i danas pruţa ĉoveĉanstvu veliki spektar lekovitih proizvoda. Sa pojavom savremenih analitiĉkih metoda za identifikaciju i izolovanje sastojaka etarskih ulja, ovi biljni sekundarni metaboliti su postali stalna meta istraţivaĉa sa ciljem pronalaţenja i razvoja novih biološki i farmakološki aktivnih jedinjenja. Iskorišćavanje farmakološkog potencijala etarskih ulja ili njegovih sastojaka zahteva pre svega potpunu identifikaciju svih sastojaka ulja kao i dobijanje dovoljnih koliĉina, izolovanjem ili sintezom, za testiranje njihove biološke aktivnosti. Samo u našoj laboratoriji, u poslednjih desetak godina, izvršena je potpuna analiza sastava etarskih ulja preko sto biljnih vrsta, identifikovano je preko hiljadu sastojaka i izvršeno je biološko testiranje velikog broja etarskih ulja i ĉistih, izolovanih ili sintetisanih, sastojaka ulja (Radulović, 2012). Do sada su najveći biološki/farmakološki potencijal pokazale biljne vrste iz familija piaceae, Asteraceae, Lamiaceae, Rutaceae, i Brassicaceae. Iako velika kompleksnost sastava etarskih ulja povećava mogućnost pozitivnih bioloških osobina usled sinergizma sastojaka, većina istraţivaĉa favorizuje izolovanje i testiranje biološke aktivnosti pojedinaĉnih sastojaka ulja (Saad et al., 2013). Glavni sastojci etarskih ulja su u većini sluĉajeva nosioci biološke aktivnosti ulja, meĊutim, postoje studije gde etarska ulja imaju veću biološku aktivnost nego kombinacija glavnih izolovanih sastojaka, što ukazuje da su sastojci prisutni u malom procentu kritiĉni za aktivnost ulja, a ponekad i glavni nosioci aktivnosti (Baser i Demirci, 2007). Kao primer sinergizma i uticaja sastojaka prisutnih u malom procentu u uljima moţe se navesti poreĊenje antifungalne aktivnosti etarskih ulja i njihovih glavnih sastojaka. PotvrĊeno je da je u većini sluĉajeva antifungalna aktivnost etarskog ulja znaĉajno veća u odnosu na aktivnost pojedinaĉnih glavnih sastojaka (Saad et al., 2013). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 18 Najverovatnije zbog povećanja rezistentnosti na postojeće antibiotike, kao i zbog jednostavnosti metoda za ispitivanje, najviše je izuĉavana antibakterijska aktivnost etarskih ulja (Baser i Demirci, 2007; Dorman i Deans, 2000; Hammer et al., 1999). Znaĉajnu, i farmakološki primenljivu, antibakterijsku aktivnost su pokazala etarska ulja sa visokim sadrţajem eugenola, timola, karvakrola i/ili drugih fenolnih jedinjenja (Baser i Demirci, 2007; Dorman i Deans, 2000). PotvrĊeno je, uporeĊivanjem aktivnosti karvakrola i njegovog metil etra, kao i uporeĊivanjem aktivnosti timola i p-cimena, da osnovu farmakofore ĉini slobodna fenolna grupa, (Saad et al., 2013). TakoĊe, uporeĊivanjem aktivnosti timola i karvakrola, pokazano je da relativni poloţaj fenolne grupe, u odnosu na druge supstituente na benzenovom jezgru utiĉe na promenu sposobnosti inhibiranja rasta razliĉitih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija (Saad et al., 2013). Znaĉajnu antimikrobnu aktivnost, protiv većine poznatih sojeva bakterija, pokazali su i estri iz etarskih ulja (Baser i Demirci, 2007; Dorman i Deans, 2000). Prisustvo estarske grupe u geranil- i bornil-acetatu uslovljava veću aktivnost ovih jedinjenja u poreĊenju sa odgovarajućim alkoholima (Saad et al., 2013). Pored estarske i fenolne grupe kao farmakofora, prisustvo karbonilne grupe u hemijskoj strukturi (kod terpenskih aldehida i ketona), dvogube veze (na primeru razliĉite (veće) aktivnosti limonena u odnosu na p-cimen) i razgranatost alkil niza u sastojcima etarskih ulja, pozitivno utuĉu na antibakterijsku aktivnosti ovih sastojaka (Saad et al., 2013). Kao i u sluĉaju antibakterijske, najveću antifungalnu aktivnost su pokazali fenilpropanoidi (eugenol, ĉavikol, 4-alil-2,6-dimetoksifenol), praćeni kiselinama, alkoholima, aldehidima, ketonima, estrima iz etarskih ulja (Baser i Demirci, 2007; Kalemba i Kunicka, 2003). Zanimljivo je da u sluĉaju fenilpropanoida postojanje voluminoznih supstituenata u blizini fenolne grupe (povećanje sterne zaklonjenosti –OH ili –OCH3), kao i povećanje broja alkil supstituenata na benzenovom jezgru, povećava antifungalnu aktivnost datih derivata (Saad et al., 2013). Pored antimikrobne (antibakterijske i antifungalne) aktivnosti, etarska ulja kao i pojedini izolovani/sintetisani sastojci ulja su do sada pokazali širok spektar bioloških aktivnosti (Baser i Demirci, 2007; Saad et al., 2013): najĉešće analgetsku, antiinflamatornu, antitumorsku, antialergijsku aktivnost, itd. TakoĊe, postoje sluĉajevi gde etarska ulja, iako sama po sebi ne pokazuju nikakvu aktivnost, se koriste za spreĉavanje neţeljenih efekata upotrebe farmaceutskih Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 19 preparata ili za jaĉanje imunog sistema, a što znaĉajno doprinosi boljem i brţem izleĉenju (Carrasco et al., 2009; Ramage et al., 2012). 2.2.3. Etarska ulja kao izvor estara Najveći broj do sada analiziranih etarskih ulja sadrţi estre. Najĉešće su to estri mravlje, sirćetne, propanske, 2-metilpropanske (izobutanske), butanske, 2-metilbutanske, 3-metilbutanske (izovalerijanske), pentanske (valerijanske), cimetne, benzoeve, salicilne, (E)-2-metil-2-butenske (tiglinske), (Z)-2-metil-2-butenske (angelika) kiseline, slika 2.2.1. Ĉesto su prisutni i estri viših masnih kiselina (Cn, n > 10). U sastav estara su pre svega terpenski (monoterpenski (karvakrol, timol, geraniol, nerol, citronelol, linalol, α-terpineol, mentol, izopulegol, trans-sabinol, borneol, mirtenol) i seskviterpenski (α- i β-bisabolol, cis-lanceol, α-, β- i γ-eudezmol)), fenilpropanoidni (eugenol, kavibetol, koniferil-alkohol, fenetil-alkohol), „green leaf” (cis-3-heksen-1-ol, trans-3- heksen-1-ol), kao i dugolanĉani (Cn, n > 10) alkoholi i fenoli (slika 2.2.2). Slika 2.2.1. Kiseline koje najĉešće ulaze u sastav estara iz etarskih ulja Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 20 Neretko su estri glavni sastojci ulja ili predstavljaju glavne nosioce biološke aktivnosti etarskog ulja (Blagojević et al., 2006; Simić et al., 2000). Kao primer estara koji su glavni sastojci etarskih ulja mogu se navesti izomeri sabinil-acetata (Achillea serbica (Simić et al., 2000)), fragranil-acetat (Achillea umbelata (Radulović et al., 2012a)), linalil-acetat (Lavandula angustifolia (Koto et al., 2006)), metil-salicilat (Gaultheria spp. (Baser i Demirci, 2007)) itd. Slika 2.2.2. Alkoholi koji najĉešće ulaze u sastav estara iz etarskih ulja Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 21 Laktoni (npr. ftalidi), ciliĉni estri hidroksi-kiselina, su ĉesti sastojci etarskih ulja mnogih biljnih vrsta (Baser i Demirci, 2007). Laktoni sadrţe heterocikliĉni kiseonik u susedstvu karbonila najĉešće u petoĉlanom (γ-laktoni: npr. γ-angelikalakton, γ-valerolakton, γ-dekalakton, sotolon) ili šestoĉlanom (δ-laktoni: npr. δ-valerolakton) (ne)zasićenom prstenu (Baser i Demirci, 2007), slika 2.2.3. Kao sastojci etarskih ulja, npr. ulja korena biljnih vrsta Abelmoschus moschatus i Angelica archangelica, identifikovani su i makrocikliĉni laktoni ambretolid, 15- pentadekanolid i 16-heksadekanolid (Baser i Demirci, 2007). Kumarin i njegovi derivati (dihidrokumarin, umbeliferon, skopoletin, bergapten) takoĊe predstavljaju prirodne laktone koji su ĉesto identifikovani kao sastojci etarskih ulja biljnih vrsta iz familija Rutaceae, Apiaceae, Lamiaceae i Asteraceae (Baser i Demirci, 2007). Slika 2.2.3. lifatiĉni laktoni, kumarini i ftalidi identifikovani kao sastojci etarskih ulja Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 22 Ftalidi (sadrţe supstituisano izobenzofuransko jezgro) predstavljaju 3-alkil/aril supstituisane laktone 2-(hidroksimetil)benzoeve kiseline (Baser i Demirci, 2007). Ftalidi (3- butilftalid, sedanenolid i (E)-ligustilid) su karakteristiĉni za vrste porodice Apiaceae (Baser i Demirci, 2007) i zasluţni su za aromu i miris lišća, korena i semena celera (Apium graveolens) i angelike (Angelica archangelica). 2.3. Feroceni 2.3.1. Struktura, osobine i sinteza derivata ferocena Dva tima istraţivaĉa su 1951. godine, u dva potpuno razliĉita eksperimenta (Kealy i Pauson, 1951; Miller et al., 1952), sasvim sluĉajno dobili neoĉekivani proizvod – ferocen (narandţasti prah). Identifikacija i potvrda strukture ferocena (Wilkinson et al., 1952) je uslovila ekspanziju analize njegovih fiziĉkih i hemijski osobina kao i njegovu derivatizaciju što je imalo kljuĉnu ulogu u razvoju moderne organometalne hemije. Ono što ferocen ĉini jedinstvenim jeste neoĉekivano velika stabilnost za jedno organometalno jedinjenje što omogućava dobivanje velikog broja derivata ferocena, a da je pri tome oĉuvano osnovno jezgro metalocena. Postoje dva osnovna naĉina sinteze derivata ferocena. Prvi ĉine reakcije kojima se razliĉiti supstituenti prvo uvode u ciklopentadien, a zatim uspostavlja jezgro ferocena polazeći od dobivenog supstituisanog ciklopentadiena i drugi, danas mnogo ĉešći, direktna supstitucija lako dostupnog ferocena ili njegovih derivata. Lakoća derivatizacije i velika stabilnost je uslovila da derivati ferocena dobiju industrijski znaĉaj, pre svega do jedinjenja koja se koriste kao netoksiĉni antidetonatori (Emelyanov et al., 2001) i za sintezu nanocevi (Conroy et al., 2010). 2.3.2. Biološka aktivnost jedinjenja sa ferocenil grupom Još od otkrića strukture, ferocen i njegovi derivati su privlaĉili veliku paţnju medicinskih hemiĉara. Skoro eksponencijalni godišnji rast broja sintetisanih serija ferocenil analoga prirodnih ili sintetskih biološki aktivnih jedinjenja je posledica pre svega njegovih hemijskih osobina koje mogu usloviti veću biološku aktivnost ferocenil derivata u odnosu na analogna jedinjenja sa fenil grupom. Ono što ĉini ferocen atraktivnim strukturnim fragmentom je: 1) ferocen je lipofilniji od benzena što mu olakšava prolaz kroz ćelijsku membranu i na taj naĉin se moţe povećati biološka aktivnost u odnosu na fenil analoge, 2) derivati ferocena su veoma stabilni (u vodenim i u Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 23 nevodenim sredinama) i 3) najĉešće nisu toksiĉni (nesupstituisani ferocen je bio netoksiĉan za pse ĉak i u dozi od 1 g po kilogramu telesne mase (Yeary, 1969)). Sinteza potencijalno biološki aktivnih derivata ferocena se najĉešće bazira na ĉinjenici da supstitucija aromatiĉnog jezgra ili alifatiĉnog niza u molekulu, koji već poseduje biološku/farmakološku aktivnost, ferocenom moţe povećati aktivnost farmakofore i celog molekula uopšte. MeĊutim, nemoguće je sa sigurnošću predvideti uticaj ugraĊivanja ferocenskog jezgra u molekul na njegovu biološku aktivnost. Ponekad supstitucija fenil jezgra ili alifatiĉnog dela molekula ferocenom moţe znaĉajno smanjiti biološku aktivnost tih molekula. Na primer, u jednom od prvih pokušaja ispitivanja farmakološke aktivnosti derivata ferocena od strane Loeva i Floresa (Loev i Flores, 1961) nije se došlo do ţeljenih rezultata (testirani ferocenil analozi amfetamina i fenitoina nisu pokazali biološku aktivnost). Na sreću, nije se odustalo od ove ideje što je rezultiralo istraţivanjima u kojima je potvrĊena in vitro i in vivo biološka aktivnost derivata ferocena ukljuĉujući i dejstvo protiv razliĉitih sojeva gljivica, bakterija (Damljanović et al., 2009a), parazita izazivaĉa malarije (Fouda, 2007), HIV-a (human immunodeficiency virus (Kondapi, 2006)), ćelijskih linija kancera (Staveren, 2004), itd. Prva testiranja citotoksiĉnog potencijala derivata ferocena na transformisane ćelije, sedamdesetih godina prošlog veka (Fiorina, 1978), nisu pokazala znaĉajnu aktivnost, meĊutim, uoĉena aktivnost je bila dovoljna da se demonstrira znaĉaj uvoĊenja ferocenil grupe u molekul jer je povećana aktivnost u odnosu na jedinjenja koja ne sadrţe ferocen. U poslednjih nekoliko decenija, mnoga sintetisana organometalna jedinjenja su pokazala aktivnost kao antikancer agensi, od kojih su neki već ušli u fazu kliniĉkih ispitivanja (Top, 2001). Najznaĉajniji primer je ferocenski analog poznatog citotoksiĉnog agensa (4-hidroksitamoksifen u kome je izvršena zamena fenil grupe ferocenil grupom) koji je u testiranju pokazao znaĉajno veću aktivnost na ćelije tumora dojke u odnosu na 4-hidroksitamoksifen. Pored toga, do znaĉajnih rezultata se došlo i testiranjem kombinatornih biblioteka derivata ferocena kreiranih modifikacijom poznatog antimalarika hlorohina (chloroquine). Ferohin (ferroquine) je pokazao 35 puta veću aktivnost od primarnog hlorohina (Pradines, 2001) protiv rezistentne vrste parazita Plasmodium falciparium i nalazi se u drugoj fazi kliniĉkog ispitivanja (Henry, 2008). U nedavnim studijama je potvrĊeno da je upravo ferocen kao deo farmakofore uslovio povećanje biološke aktivnosti u odnosu na hlorohin (Dubar et al., 2012; Dubar et al., 2013). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 24 TakoĊe, sve je veći broj istraţivanja, uslovljenih sve uĉestalijom pojavom rezistentnosti patogenih mikroorganizama na postojeće lekove, zasnovanih na sintezi ferocenskih analoga prirodnih proizvoda ili sintetskih derivata sa antimikrobnom aktivnošću u cilju pronalaţenja novih, efikasnijih antimikrobnih agenasa (Ilić et al., 2010). Iako je veliki broj sintetisanih derivata ferocena pokazao znaĉajnu antimikrobnu aktivnost, do sada nijedan od derivata nije prošao u neku od faza kliniĉkog ispitivanja. MeĊutim, uoĉena aktivnost, koja je ĉesto u rangu već primenjivanih antibiotika, pokazuje da je samo pitanje vremena kada će neki od derivata ferocena dobiti širi znaĉaj u borbi protiv patogenih bakterija i gljiva. 2.4. Kombinatorne biblioteke 2.4.1. Kombinatorne biblioteke – princip kreiranja, podela i primena Još od prve sintetske transformacije prirodnog, biološki aktivnog jedinjenja (derivatizacija salicilne kiseline esterifikacijom slobodne hidroksilne grupe sirćetnom kiselinom (Sneader, 2000)) medicinski hemiĉari su uvideli znaĉaj modifikacije delova strukture (kreiranja serija) i/ili sinteze analoga biološki aktivnih prirodnih proizvoda sa ciljem povećanja njihove biološke aktivnosti i/ili smanjenja toksiĉnosti. Ovakav hemijski pristup, kao i pojava novih i efikasnijih analitiĉkih metoda i instrumenata, uslovili su, sredinom 80-tih godina prošlog veka, pojavu potpuno nove grane hemije – kombinatornu hemiju (Jung, 2008). Osnovna ideja kombinatorne hemije predstavlja brzu i ekonomiĉnu sintezu (slika 2.4.1) velikog broja razliĉitih jedinjenja – kombinatornih biblioteka sa ciljem prouĉavanja njihovih fiziĉkih, hemijskih, bioloških i farmakoloških osobina. Treba pomenuti da su metode kombinatorne hemije našle primenu i u pronalaţenju novih poluprovodnika, superprovodnika, katalizatora i polimera ali je njihova osnovna praktiĉna primena, od njihovog nastajanja, pa do danas, u medicinskoj hemiji za pronalaţenje novih farmaceutski primenljivih, biološki aktivnih jedinjenja (Jung, 2008). Iako se za prvu primenu kombinatorne hemije moţe smatrati Merifildova (Bruce Merrifield) sinteza peptida na ĉvrstoj fazi (Merrifield, 1963), znaĉajan napredak u ovoj oblasti se uoĉava tek sredinom 80-tih i poĉetkom 90-tih godina, pre svega sa pojavom kombinatornih metoda sinteze peptida na površini smola (Geysen et al., 1984), „tea bags” (Houghten, 1985) i „pool and split” metode (Furka et al., 1991). Sve do 1992. godine, fokus kombinatorne hemije je bio na sintezi Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 25 peptida i oligonukleotida (Thompson i Ellman, 1996), naţalost, bez znaĉajnijih bioloških/farmakoloških rezultata. Slika 2.4.1. Uporedni prikaz tradicionalnog i kombinatornog sintetskog pristupa Dobiveni rezultati su demonstrirali sve pozitivne karakteristike kombinatornog pristupa, u smislu što brţe i ekonomiĉnije sinteze velikog broja derivata, meĊutim, sintetisana jedinjenja nisu pokazivala znaĉajnu biološku aktivnost (Thompson i Ellman, 1996). Iz tog razloga paţnja je preusmerena na sintezu kombinatornih biblioteka drugih klasa jedinjenja. Prvi takav primer (Bunin i Ellman, 1992) je sinteza kombinatorne biblioteke derivata benzodiazepina (slika 2.4.2). Zbog zapaţenih dobrih farmakokinetiĉkih osobina mnogih malih organskih molekula (molekulska masa < 600-700), kreiranje, sinteza i testiranje biološke aktivnosti biblioteka takvih jedinjenja je brzo postala glavna preokupacija medicinskih hemiĉara (Thompson i Ellman, 1996). Slika 2.4.2. Skelet kombinatorne biblioteke benzodiazepina (R1, R2, R3 i R4 odabrana grupa supstituenata) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 26 Osnovni „proizvodi” kombinatorne hemije predstavljaju kombinatorne biblioteke. Kombinatornu biblioteku ĉini skup jedinjenja sintetisanih korišćenjem istih hemijskih reakcija na meĊusobno razliĉitim, ali funkcionalno srodnim supstratima. Broj jedinjenja u kombinatornim bibliotekama (najĉešće od 10 do 105 jedinjenja) zavisi od raznolikosti raspoloţivih supstrata, broja sintetskih koraka, kao i cilja njenog kreiranja. Na primer, kreiranjem biblioteke polazeći od 10 supstrata (takozvanih skeleta biblioteka) i njihovom reakcijom sa 100 razliĉitih reagenasa dobija se biblioteka prve generacije sa 1.000 novih jedinjenja. Ukoliko se izvrši dalja transformacija proizvoda iz biblioteke prve generacije sa dodatnom zbirkom reagenasa (npr. 50) rezultat je biblioteka druge generacije sa 50.000 proizvoda (slika 2.4.3). Biblioteke bilo koje generacije najĉešće sadrţe serije ĉistih jedinjenja, meĊutim, mogu sadrţati i smeše sintetskih, izolovanih prirodnih proizvoda ili kompjuterski generisane serije hemijskih jedinjenja. Slika 2.4.3. Piramidalni prikaz kreiranja kombinatornih biblioteka Kombinatorna hemija je relativno nova oblast, pa zbog toga istraţivaĉi nastavljaju da eksperimentišu sa razliĉitim pristupima dizajniranja biblioteka. Dva osnovna tipa biblioteka su, na osnovu principa kreiranja, nasumiĉne „screening” i ciljane „focus” biblioteke. Kod skrining biblioteka se sintezom nasumiĉnih serija traga za novim, biološki aktivnim jedinjenjima, provodnicima, polimerima, katalizatorima, itd. Najĉešće se za kreiranje skrining biblioteke biraju jedinjenja sa novim skeletom (novel skeleton) ili ona koja nisu dovoljno hemijski i biološki ispitana. Drugi tip predstavljaju fokus biblioteke koje sadrţe jedinjenja nastala modifikacijom strukture već poznatih katalizatora, provodnika ili biološki aktivnih jedinjenja kreiranih sa ciljem Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 27 poboljšanja fiziĉkih/hemijskih ili bioloških karakteristika polaznih molekula (Nilakantan et al., 2002). Do sada je najveći broj biblioteka kreiran korišćenjem neke od metoda sinteze na ĉvrstoj fazi (Thompson i Ellman, 1996), pre svega „pool and split” i metode „paralelne sinteze”. Ovaj tip sinteze zapoĉinje vezivanjem polaznog jedinjenja za ĉvrstu fazu (najĉešća ĉvrsta faza je neka nerastvorna smola). Osnovna prednost ove metode je jednostavnost i brzo preĉišćavanje i izolovanje jedinjenja filtriranjem i ispiranjem viška reagensa, a zatim odvajanje (raskidanjem veze) proizvoda od ĉvrste faze. TakoĊe, moguće je dodavati veliki višak reagensa što ĉesto omogućava visoki prinos reakcija (Thompson i Ellman, 1996). Proces kreiranja biblioteka je još više ubrzan nedavnim otkrićem naĉina identifikacije proizvoda bez predhodnog razdvajanja od ĉvrste faze (Thompson i Ellman, 1996). Na primer, ukoliko je cilj kreiranje kombinatorne biblioteke koja se sastoji od jedinjenja X-Y1, X-Y2, X-Y3, X-Y4, X-Y5, to se moţe izvesti dodavanjem reagenasa Y1-Y5 u rastvor koji sadrţi ĉvstu fazu za koju je predhodno vezan supstrat X, sa oĉekivanjem da će nastati svih pet proizvoda. MeĊutim, ĉest problem je to što kinetika reakcija izmeĊu supstrata X i reaktanata Y1- Y5 nije ista, pa rezultujuće smeše nisu ekvimolarne već sadrţe neke dominantne proizvode što onemogućava nastavak kreiranja biblioteke. Istraţivaĉi su ovaj problem rešili „pool and split” metodom (slika 2.4.4). Nakon vezivanja razliĉitih polaznih supstrata za ĉvrstu fazu, dobivene heterogene smeše supstrata vezanih za ĉvrstu fazu se dele npr. na 50 grupa (najĉešće u bunarićima reakcionih ploĉa ili u vijalama) i dodaje se niz reagenasa (Aneesh et al., 2010). Nakon završetka reakcije, dobivena smeša se ponovo deli na 50 novih grupa. Ukoliko je dobijena potpuno homogena smeša, onda svaka nova grupa sadrţi podjednak broj perlica ĉvrste smole koji sadrţe proizvode prve generacije ( neesh et al., 2010). Nakon toga, dodaje se novi niz reagenasa i postupak se ponavlja sve dok se ne dobije ţeljeni broj derivata (slika 2.4.4), a zatim se vrši ciljno biološko testiranje aktivnosti pojedinaĉnih bunarića. Ukoliko se pokaţe da je odreĊena grupa jedinjenja biološki aktivna vrši se takozvana dekonvolucija smeše gde je osnovni zadatak sinteza pojedinaĉnih derivata biološki aktivne smeše u cilju otkrivanja jedinjenja koje je nosilac te aktivnosti (Thompson i Ellman, 1996). Nedostatak ovog pristupa se zasniva na ĉinjenici da zbog velikog broja sastojaka smeše (bunarići mogu da sadrţe i desetine hiljada derivata) ĉesto dolazi do maskiranja biološki aktivnih proizvoda od strane neaktivnih sastojaka. Sa druge strane, moţe da se desi da smeša pokazuje znaĉajnu aktivnost koja je posledica Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 28 sinergizma ili zbira aktivnosti molekula koji pojedinaĉno ne pokazuju dovoljnu biološku aktivnost da bi bili razmatrani kao potencijalni farmakološki agensi. Iz tog razloga je najefikasniji i najpouzdaniji naĉin kreiranje manjih biblioteka (smanjuje se verovatnoća za laţne pozitivne ili negativne rezultate) od nekoliko desetina do nekoliko stotina jedinjenja. Slika 2.4.4. „Pool and split” metoda kreiranja kombinatornih biblioteka Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 29 Druga najĉešća metoda na ĉvrstoj fazi je metoda „paralelne sinteze” (Thompson i Ellman, 1996). Kod ove metode sva jedinjenja iz kombinatorne biblioteke se sintetišu pojedinaĉno u odvojenim posudama i, za razliku od „pool and split” metode, kao konaĉni proizvodi nastaju pojedinaĉni ĉisti supstrati. Ova metoda nije pogodna za stvaranje velikih biblioteka (zbog vremenske i finansijske neefikasnosti), ali je veoma korisna za kreiranje manjih i specijalizovanijih biblioteka pre svega za optimizaciju biološke aktivnosti potencijalnih farmakoloških agenasa (Thompson i Ellman, 1996). Proces paralelne sinteze je u poslednje vreme u potpunosti automatizovan korišćenjem aparata sintezatora (synthesizer; slika 2.4.5) koji omogućavaju potpuno automatizovano odvijanje reakcije i razdvajanje proizvoda. Slika 2.4.5. Sintezatori za paralelnu sintezu biblioteka (preuzeto sa: (a) http://en.wikipedia.org/wiki/User:Chem4067sp13/sandbox; b) http://hili.uga.edu/equipment.html) Sinteza na ĉvrstoj fazi je tradicionalno popularnija metoda kreiranja kombinatornih biblioteka, ali mnogi istraţivaĉi ĉesto koriste i pristup sinteze u teĉnoj fazi (Thompson i Ellman, 1996). Osnovna prednost metode sinteze u teĉnoj fazi je to što nije potrebno vezivanje poĉetnog supstrata za ĉvrstu fazu kao i raskidanje veze sa ĉvrstom fazom nakon završetka reakcije, što znaĉajno ubrzava proces sinteze (Thompson i Ellman, 1996). Stoga su „kratke” reakcione sekvence od jednog ili nekoliko koraka sa visokim prinosom i stehiometrijskim odnosom supstrata i reaktanata pogodne za metodologiju u teĉnoj fazi, pošto nije potrebno preĉišćavanje (Thompson i Ellman, 1996). Lako je uoĉljivo, na osnovu pomenutih kriterijuma, da je glavni nedostatak ove metode izolovanje proizvoda, koje ĉesto traje veoma dugo, kao i nemogućnost Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 30 automatizacije procesa izolovanja (Thompson i Ellman, 1996). MeĊutim, u poslednje vreme evidentan je znaĉajan napredak u automatizaciji i razvijanju novih metoda teĉno-teĉne ekstrakcije što je omogućilo sve ĉešće kreiranje velikih biblioteka metodom paralelne sinteze u teĉnoj fazi. Vaţno je naglasiti da ova metoda ima najveći znaĉaj u istraţivaĉkim laboratorijama, gde predstavlja osnovni pristup sinteze malih kombinatornih biblioteka organskih molekula. Na kraju, potrebno je reći da, iako obe metode imaju i svojih prednosti i nedostataka (slika 2.4.6), oba pristupa i dalje predstavljaju osnovu kombinatorne hemije, i medicinske hemije generalno, sa ciljem pronalaţenja novih katalizatora, provodnika, polimera i pre svega za identifikaciju novih farmakoloških agenasa. Slika 2.4.6. UporeĊivanje metodologija metode na ĉvrstoj i teĉnoj fazi 2.4.2. Biološki i farmakološki značaj kombinatornih biblioteka Svakodnevno povećanje rezistentnosti mikroorganizama na postojeće lekove kao i sve uĉestalija pojava bolesti savremenog ĉoveka su uslovile da je osnovni cilj medicinskih hemiĉara i farmaceutskih kompanija što brţa identifikacija i stavljanje u promet novih biološki aktivnih jedinjenja. Jedan od poĉetnih koraka u razvoju terapeutskih agenasa je identifikacija jedinjenja ili (dela) skeleta strukture jedinjenja koje moţe da interaguje sa „metom” (receptorom, enzimom, itd.). Nakon toga se vrši sinteza derivata/analoga tog poĉetnog jedinjenja sa ciljem maksimalnog povećanja farmakološke aktivnosti i/ili smanjenja neţeljene toksiĉnosti. Otkriće polaznog Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 31 potencijalno biološki aktivnog jedinjenja i optimizacija njegove aktivnosti zahteva sintezu velikog broja njegovih derivata/analoga. Zbog toga, tradicionalni sintetski pristup (sinteza i dobijanje u ĉistom stanju pojedinaĉnih derivata, što je veoma ĉesto vremenski zahtevno i ekonomski neisplativo) se ne moţe primeniti u farmaceutskoj industriji. Kombinatorna hemija je uvela revoluciju u proizvodnju i pronalaţenje novih lekova omogućavajući brzu sintezu i testiranje velikog broja serija jedinjenja (Beavers i Chen, 2002). TakoĊe, kombinatorna hemija je promenila paradigme otkrivanja lekova, jer se automatizacijom i „minijaturnim” sintezama veoma brzo dolazilo do velikih biblioteka derivata/analoga/stereoizomera koji su veoma ĉesto pokazivali razliĉite biološke/farmakološke karakteristike povećavajući verovatnoću pronalaţenja novog farmaceutski primeljivog derivata. Danas većina farmaceutskih kompanija koristi metode kombinatorne hemije za kreiranje biblioteka kod kojih se najĉešće polazi od biološki aktivnih prirodnih proizvoda, njihovih derivata i analoga sa nadom da će izvršene izmene delova strukture uticati da sintetisani derivati pokazuju veću biološku aktivnost u odnosu na polazna jedinjenja. Do sada je najzastupljenija vrsta biblioteka bila ona koja sadrţi serije izolovanih prirodnih proizvoda (peptida, šećera, steroida, derivata masnih kiselina, poliketida, terpena, flavonoida, alkaloida i ostalih primarnih i sekundarnih metabolita) ili ona kod koje se polazi od (biološki aktivnih) prirodnih proizvoda i vrši se kreiranje biblioteke njihovih derivata i/ili sintetskih analoga. Razlog tome je ekonomski isplativ pristup paleti teško dostupnih hiralnih supstrata sa već „ugraĊenom” farmakoforom, kao i veliki broj rezultata koji svedoĉe o pozitivnoj biološkoj aktivnosti i farmakološkoj primenljivosti prirodnih proizvoda. Istorijski gledano, prirodni proizvodi i njihovi derivati predstavljaju najveći broj farmaceutskih preparata (npr. 60% citostatika, kao i 75% lekova za leĉenje raznih infekcija ĉine prirodni proizvodi ili sintetski derivati prirodnih proizvoda (Newman et al., 2003)). Uporedo sa razvojem kombinatorne hemije, analiza prirodnih proizvoda je poĉetkom 90-tih godina prošlog veka doţivela renesansu (Rouhi, 2003a) uslovljavajući ekspanziju u kreiranju kombinatornih biblioteka derivata prirodnih proizvoda (Ganesan, 2001; Gordon et al., 1997; Ortholand i Ganesan, 2004; Rouhi, 2003b; Watson, 1999). Iako su izolovani prirodni proizvodi znaĉajno doprineli razvoju farmaceutske industrije, kasnije je potvrĊeno da veći farmakološki znaĉaj imaju sintetski derivati dobiveni modifikacijom prirodnih proizvoda, jer je uoĉeno da pored korisnih bioloških karakteristika izolovani prirodni proizvodi ĉesto ispoljavaju i negativne farmakološke osobine. U takvim sluĉajevima se teţi da se modifikacijom strukture smanji toksiĉnost prirodnog proizvoda i/ili Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 32 poveća pozitivna biološka aktivnost. Glavne strukturne izmene, koje uslovljavaju i razliĉitu biološku aktivnost, izmeĊu prirodnih proizvoda i modifikovanih prirodnih proizvoda najĉešće potiĉu od supstitucije/adicije dela strukture što ĉesto podrazumeva povećanje broja hiralnih centara, promenu stepena zasićenosti molekula (uvoĊenje dvogubih veza ili prstenova), uvoĊenje heteroatoma ili heterociklusa, aromatiĉnih jezgara, itd. Slika 2.4.7. Prirodni proizvodi koji su posluţili kao osnovne strukture kombinatornih biblioteka (Bz = benzil, Ac = acetil) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 33 Najkorišćeniji i najlogiĉniji pristup za ovakve transformacije je kreiranje kombinatornih biblioteka derivata/analoga prirodnih proizvoda. Nekoliko grupa istraţivaĉa (Feher i Schmidt, 2003; Henkel et al., 1999; Lee i Schneider, 2001) je potvrdilo benefite ovakvog pristupa. Oni su izvršili detaljnu analizu razlika izmeĊu prirodnih proizvoda, ĉlanova kombinatornih biblioteka i jedinjenja koja već imaju farmaceutsku primenu i uoĉili da najveći biološki potencijal imaju biblioteke sintetskih jedinjenja koji u osnovi skeleta imaju integrisane prirodne proizvode. Jedan od prvih kreatora biblioteka gde je prirodni proizvod u osnovi biblioteke je profesor Nikolau i njegov tim istraţivaĉa (Nicolaou i Pfefferkorn, 2001) koji su uspeli da izvrše „elegantnu” sintezu biblioteka polazeći od taksola (Xiao et al., 1997), sarkodiktina (sarcodictyins) (Nicolaou et al., 1999), epotiolona (epothiolones) (Nicolaou et al., 1997), vankomicina (vancomycin) (Nicolaou et al., 2001a), muskona (muscone) (Nicolaou et al., 1998) i psamaplina A (psammaplin A) (Nicolaou et al., 2001b). Rezultati do kojih su došli u poslednjih dvadesetak godina su motivisali istraţivaĉe i doprineli kreiranju velikog broja biblioteka polazeći od prirodnih proizvoda takozvanih semisintetskih derivata koji su dobili medicinsku primenu, pre svega u onkologiji i u borbi protiv mikroorganizama (slika 2.4.7). Treba pomenuti nedavno odobrene farmaceutske proizvode (slika 2.4.8) nastale kao rezultat ovakvog kombinatornog pristupa: simvastatin, topotekan, irinotekan i miglitol. U skorije vreme je razvijeno još nekoliko znaĉajnih pristupa kreiranja kombinatornih biblioteka transformisanih prirodnih proizvoda meĊu kojima se izdvaja pristup kreiranja hibrida prirodnih proizvoda (Tietze et al., 2003) sa idejom kombinovanja dva ili više razliĉitih prirodnih proizvoda. Nedavni primer Ĉena i saradnika (Chen et al., 2005) ilustruje primenu kombinovanja tri serije prirodnih proizvoda i njihovih derivata (slika 2.4.9) u kreiranju dve velike biblioteke hibrida (reakcijom 20 jedinjenja sa osnovnom strukturom A, 24 jedinjenja strukture B i 16 jedinjenja strukture C, dobijaju se dve serije hibrida sa ukupno 864 derivata). Abel i saradnici su objavili DYMONS (diversity modified natural scaffolds) metod kreiranja biblioteka gde se razliĉiti supstituenti uvode u strukturu prirodnog proizvoda poznate biološke aktivnosti (Abel et al., 2002). Bajorah je uveo novu kombinatornu metodu kreiranja prirodnih/sintetskih hibridnih biblioteka poznatih kao „MetaFocus” (Metabolite Focused) biblioteke, kod kojih se vrši sinteza i analiza bioloških karakteristika ĉlanova biblioteka koji imaju sliĉnu strukturu kao i identifikovani prirodni proizvodi sa potvrĊenom biološkom aktivnošću (Bajorath, 2002). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 34 Slika 2.4.8. Lekovi dobiveni modifikacijom prirodnih proizvoda Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 35 Osim njihove korisnosti u otkriću lekova, biblioteke derivata na bazi prirodnih proizvoda sluţe i u hemogenomici za otkrivanje ekspresije gena kao i bolje razumevanje interakcije malih molekula i proteina koje regulišu ćelijske procese (Piggott i Karuso, 2004). Biblioteke malih prirodnih ili sintetskih molekula kao i malih molekula koji vrše modulaciju funkcije proteina su od krucijalnog znaĉaja za razumevanje S R-a (veze izmeĊu strukture i biološke aktivnosti molekula „Structure ctivity Relationships”) i pronalaţenja novih lekova (Schreiber, 2005). Sve ovo ukazuje da uvoĊenje prirodnih proizvoda kao osnove za kreiranje kombinatornih biblioteka otvara veliki broj novih i uzbudljivih mogućnosti za buduća farmaceutska istraţivanja sa obećavajućim rezultatima. Slika 2.4.9. Šrajberova metoda kreiranja biblioteka hibrida prirodnih proizvoda Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 36 Pretraţivanjem literature je uoĉeno da, za pronalaţenje novih farmakoloških agenasa, veliki znaĉaj imaju i tzv. de novo biblioteke konstruisane zamenom aromatiĉnog jezgra prirodnog ili sintetskog biološki aktivnog derivata ferocenskom grupom. Veliki broj istraţivanja (Pejović et al., 2014 i reference citirane u ovom radu) je pokazao da uvoĊenje ferocenske grupe ili zamena aromatiĉnog jezgra ferocenskim moţe znaĉajno poboljšati (poţeljna) bioaktivna svojstva molekula. Najznaĉajniji primer (Gielen i Tiekink, 2005; Pradines et al., 2001) je sinteza kombinatornih biblioteka ferocenskih analoga hlorohina što je rezultovalo pomenutim otkrićem ferohina, najnaprednijeg organometalnog kandidata za farmaceutsku primenu u leĉenju malarije (trenutno je pri kraju faze II kliniĉkog ispitivanja; slika 2.4.10). Ferohin je posluţio i kao polazni molekul za sintezu kombinatornih biblioteka ferocenil derivata drugog reda (Pradines et al., 2001) koji su takoĊe pokazali znaĉajnu biološku aktivnost (slika 2.4.11). Slika 2.4.10. Struktura ferohina (ferroquine) MeĊutim, iako su metode kombinatorne hemije, skraćivanjem vremena i smanjivanjem troškova potrebnih za sintezu i biološka testiranja velikog broja jedinjenja, opravdale njen znaĉaj u farmaciji, ova oblast hemije je i dalje na velikom udaru kritiĉara koji smatraju da ona predstavlja nedovoljno efikasno oruĊe za otkrivanje novih lekova (Borman, 2004). Razlog tome je nepovoljan odnos broja sintetisanih jedinjenja i broja biološki aktivnih ĉlanova biblioteka koji dobiju farmakološki znaĉaj. Naime, iako se skrining biblioteke sastoje od velikog broja (novih/„novel”) jedinjenja ĉesto se dešava da nijedan ĉlan biblioteke ne pokaţe ţeljene hemijske/biološke karakteristike. TakoĊe, i kod kreiranja fokus biblioteka, dolazilo se do negativnih rezultata, jer je promena delova strukture biološki aktivnog jedinjenja uticala na gubljenje farmakofore ili onemogućavanje interakcije farmakofore sa ciljnim molekulom. Veliki deo krivice za ovakav negativni stav prema ovoj grani medicinske hemije pripada i istraţivaĉima koji se bave kreiranjem biblioteka i prouĉavanjem metoda kombinatorne hemije, jer su glavni fokus stavili na usavršavanje tehnika i metoda za brzu sintezu velikih kombinatornih biblioteka ne vodeći raĉuna o njihovom kvalitetu i biološkom potencijalu ĉlanova biblioteka (Boldi, 2006). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 37 Slika 2.4.11. Osnovne strukturne jedinice kombinatornih biblioteka drugog reda koje sadrţe ferohinsko jezgro TakoĊe, zbog vremenskog ograniĉenja odustajalo se od komplikovanijih sinteza biblioteka (sinteze iz većeg broja sintetskih koraka). Iz ovih razloga, većina farmaceutskih kompanija ima arhivu neiskorišćenih, nasumiĉno kreiranih, a pritom skupocenih, velikih kombinatornih biblioteka bez ikakvog biološkog potencijala. U skorije vreme, ovi nedostaci “prve generacije” biblioteka su otklonjeni, pa je kombinatorni pristup i dalje najvaţnije oruĊe farmaceutskih kompanija koje godišnje ulaţu velike koliĉine novca za razvoj ove grane hemije (Boldi, 2006). Kombinacija kombinatorne hemije i kompjuterskog predviĊanja osobina je znaĉajno olakšala identifikaciju promena u strukturi farmakofora biološki aktivnih jedinjenja koje uslovljavaju bolju interakciju molekula sa ciljnim molekulom tj. povećanje njegove aktivnosti. Na ovaj naĉin je povećana verovatnoća dobijanja pozitivnih rezultata i znatno je smanjen broj ĉlanova koje je potrebno sintetisati. Ovo se takoĊe postiţe i korišćenjem algoritma za optimizaciju fiziĉkih/hemijskih/bioloških osobina ĉlanova biblioteke (Brown i Martin, 1997). Na kraju treba istaći u praksi ustaljeno tvrĊenje Golebiovskog i njegovih saradnika (Golebiowski et al., 2001) koji smatraju da kombinatorna biblioteka u potpunosti opravdava svoje postojanje Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 38 ukoliko sadrţi makar jedno jedinjenje sa dovoljnim potencijalom (izraţena preko selektivnosti, farmakokinetike, fiziĉko-hemijskih osobina i odsustva toksiĉnosti) za napredak u programu razvoja lekova. Poslednjih deset godina došlo je do ekspanzije u istraţivanju i usvajanju kombinatornih tehnika (Aneesh et al., 2010). Svakodnevni porast potrebe za farmaceutskim preparatima kao i sve veća ograniĉenja troškova za istraţivanja su uslovili porast interesovanja za metode koje nude veću produktivnost sa niţim troškovima (Aneesh et al., 2010). Verovanje da će kombinatorna hemija proizvesti efikasnu i ekonomiĉnu generaciju lekova izazvalo je ogromno ulaganje farmaceutskih kompanija u ovu oblast. MeĊutim, ostaje još mnogo da se radi u ovoj oblasti, pre svega na smanjenju odnosa broja sintetisanih jedinjenja i krajnjih derivata koji dobiju praktiĉnu primenu što je danas i u budućnosti osnovni zadatak istraţivaĉa kombinatorne hemije. 2.4.3. Primena u identifikaciji prirodnih proizvoda Naţalost, u velikom broju radova o GC i GC-MS analizi sekundarnih metabolita dolazilo je do zanemarivanja mnogih detektovanih sastojaka, naroĉito onih prisutnih u tragovima, zbog ĉinjenice da nisu postojali maseni spektri u literaturi koji odgovaraju masenom spektru identifikovanog sastojka. Ovi sastojci mogu biti glavni nosioci organoleptiĉkih osobina i/ili biološke/farmakološke aktivnosti analiziranog uzorka etarskog ulja, ekstrakta, itd. Analiza fragmentacija uoĉenih u masenim spektrima moţe dati ideju o identitetu detektovanog sastojka. TakoĊe, predviĊanje vrednosti njihovih retencionih indeksa moţe dati dodatnu potvrdu o pretpostavljenoj strukturi. ko je nemoguće na osnovu MS/RI podataka izvršiti identifikaciju, vrši se hromatografsko izolovanje pomenutih sastojaka ili, u sluĉaju sloţenih smeša i kada su ciljni sastojci prisutni samo u tragovima, neophodan je sintetski pristup sa ciljem dobijanja uzorka ĉistog jedinjenja sa pretpostavljenom strukturom. Sintetski pristup, iako je vremenski zahtevniji, ima nekoliko prednosti u odnosu na ĉešće korišćeni izolaciono-identifikacioni pristup, jer se dobija ţeljeno jedinjenje u koliĉinama koje omogućavaju potpunu spektralnu karakterizaciju i analizu biološke/farmakološke aktivnosti u brojnim testovima (Vermeulen i Collin 2003; Vermeulen et al., 2003). Ukoliko za pretpostavljenu strukturu nepoznatog sastojka postoji veći broj mogućih izomera, najlogiĉniji i najsveobuhvatniji pristup identifikaciji je kreiranje male biblioteke takvih jedinjenja (izomera). Prilikom dizajniranja biblioteke uzima se u obzir i biosintetski put za koji Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 39 se veruje da vodi nastanku ciljnog sastojka i na taj naĉin se znaĉajno smanjuje broj jedinjenja koja treba sintetisati. Takve biblioteke ne sadrţe samo ciljne molekule već i njihove izomere/derivate/analoge što daje mogućnost prouĉavanja fiziĉkih/hemijskih osobina u okviru grupe srodnih jedinjenja ukljuĉujući i odnos strukture i njihovih bioloških/farmakoloških karakteristika. Ĉak i u sluĉaju da se utvrdi da jedinjenja iz biblioteke nisu sastojci analizirane biljne vrste (organizma), ĉini se da će ona ubrzo biti identifikovana u nekom drugom organizmu, s obzirom na to da je posledica kreiranja biblioteke postojanje literaturno dostupnih podataka (biblioteke masenih spektara, retencionih indeksa itd.) koji će omogućiti njihovu jednostavnu identifikaciju bez ponovne sinteze/izolovanja (dereplikaciju). U literaturi postoji veliki broj revijalnih radova (Chaiken i Janda, 1996; Gordon i Kerwin, 1998; Obrecht i Villalgordo, 1998; Terrett et al., 1995; Wilson i Czarnik, 1997) u kojima je sumirano kreiranje funkcionalno razliĉitih kombinatornih biblioteka, sintetskih metoda, i tehnika korišćenih za ispitivanje biološke aktivnosti derivata iz biblioteka (Khan et al., 1999), što jasno pokazuje da je kombinatorna hemija veoma snaţno oruĊe za pronalaţenje novih lekova i biomolekula sa specifiĉnom funkcijom. MeĊutim, pretragom literature je utvrĊeno da je kombinatorni pristup samo u nekoliko sluĉajeva do sada iskorišćen za identifikaciju sekundarnih metabolita. Prvi takvi primeri su tek iz 1999. godine kada su Kan i Berger sa saradnicima (Berger et al., 1999; Khan et al., 1999) izvršili kreiranje kombinatorne biblioteke S-metil tioestara sa ciljem identifikacije nosioca organoleptiĉkih osobina (karakteristiĉne arome) sireva. Pored identifikacije metabolita nastalih u procesu sazrevanja sireva, glavni cilj kreiranja biblioteke S-metil tioestara je bio da se razvije metodologija i da se proceni mogućnost primene kombinatornog pristupa u identifikaciji sekundarnih metabolita (Khan et al., 1999). Pozitivni rezultati ovih istraţivanja, pre svega malo zastupljenih sastojaka, su bili povod da se nastavi korišćenje ove metode za identifikaciju i drugih prirodnih proizvoda. Nekoliko godina kasnije, Vermeulen i saradnici (Vermeulen et al., 2001) su još jednom pokazali da je kombinatorna hemija obećavajući pristup za karakterizaciju i identifikaciju novih polifunkcionalnih tiola. Zahvaljujući kreiranju biblioteka merkaptoketona i merkaptoalkohola, uspeli su da identifikuju nosioce organoleptiĉkih osobina mnogih prehrambenih proizvoda koje, zbog njihovog prisustva u malim koncentracijama (ng/kg), nije bilo moguće sa sigurnošću identifikovati drugim metodama (Vermeulen et al., 2001). Narednih godina su Vermeulen i saradnici (Vermeulen et al., 2003; Vermeulen i Collin, 2002; Vermeulen i Collin, 2003) kreirali biblioteke Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 40 merkaptoaldehida, alkohola i estara na osnovu kojih su identifikovali isparljiva jedinjenja iz vina, marakuje, itd. Sintezom male kombinatorne biblioteke prirodnih proizvoda Radulović i saradnici (Radulović et al., 2013b) su nedavno izvršili identifikaciju novih dugolanĉanih 3-metil-2- alkanona iz etarskog ulja korena biljne vrste Inula helenium L. ( steraceae) i još jednom potvrdili sve benefite korišćenja kombinatornog pristupa u identifikaciji sekundarnih metabolita (pored identifikacije novih prirodnih proizvoda, kreirana biblioteka je pruţila i mogućnost ispitivanja odnosa strukture i biološke/farmakološke aktivnosti sintetisanih homologa). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 41 3. EKSPERIMENTALNI DEO Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 42 3.1. Hemikalije i rastvarači Neposredno pre korišćenja svi rastvaraĉi (dietil-etar, dihlormetan, n-heksan, n-pentan, dimetil-sulfoksid, aceton, N,N-dimetilformamid, acetonitril) su predestilovani, dok su ostale hemikalije upotrebljene bez prethodnog preĉišćavanja. Kiseline koje su korišćene za sintezu estara su bile: metanska (mravlja), etanska (sirćetna), propanska, izobutanska, butanska, 2- metilbutanska, 3-metilbutanska (izovalerijanska), pentanska (valerijanska), 3-metil-2-butenska (senecio), (E)-2-metil-2-butenska (tiglinska), (Z)-2-metil-2-butenska (angelika), heksanska, heptanska, oktanska, nonanska, dekanska, dodekanska (laurinska), tetradekanska (miristinska), heksadekanska (palmitinska), (Z)-9-oktadecenska (oleinska), oktadekanska (stearinska), benzoeva i 2-hidroksibenzoeva (salicilna) kiselina. Alkoholi/fenoli koji su korišćeni za sintezu estara su bili: 2-metoksi-4-alilfenol (eugenol), 2-hidroksifenol (katehol), 3-hidroksifenol (rezorcinol), 4-hidroksifenol (hidrohinon), 2-metoksifenol (gvajakol), n-alkoholi (tridekanol, tetradekanol, pentadekanol, heksadekanol, heptadekanol, oktadekanol, heneikozanol, trikozanol). Za sintezu derivata ferocena i regioizomera eugenola korišćeni su: kalijum-karbonat, metil-jodid, etil-jodid, alil-bromid, metalil-hlorid, prenil-bromid, heksil-bromid, benzil-hlorid, ferocen, fosforna kiselina, natrijum-hidroksid, metil-acetoacetat, N,N-dimetilaminometan, anhidrovani magnezijum-sulfat. Za Šteglihovu (Steglich) reakciju su pored pobrojanih kiselina i alkohola/fenola korišćeni i: N,N'-dicikloheksilkarbodiimid, 4-(dimetilamino)piridin. Za odreĊivanje retencionih indeksa i koeficijenata osetljivosti (response factor) korišćeni su: smeše alkana od heptana do eikozana i od heneikozana do tetrakontana, sabinen, β-felandren, (Z)-3- heksen-1-ol, nonanon, kariofilen-oksid, dekanal i metil-heksadekanoat. Za biološka testiranja korišćeni su: tvin 80 (Tween 80), tetraciklin, nistatin, streptomicin, hloramfenikol, 2,3,5- trifeniltetrazolijum-hlorid, natrijum-dodecilsulfat (SDS), acetiltioholin-jodid (ATCI), 5,5'- ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB), acetilholin esteraza iz elektriĉne jegulje (AChE), bovin serum albumin iz seruma goveĉeta (BSA), 2-amino-2-hidroksimetilpropan-1,3-diol- hidrohlorid, fizostigmin, morfin, acetilholin-jodid, RPMI-1640 medijum. Navedeni materijal je bio komercijalan, a proizvode ga: Alfa Aesar (Haverhill, Masaĉusec, SAD), Acros Organics (Geel, Belgija), Carl Roth (Karlsruhe, Nemaĉka), Centrohem (Stara Pazova, Srbija), Fluka (St. Gallen, Švajcarska), Galenika (Beograd, Srbija), Hoffmann La Roche (Bazel, Švajcarska), J. T. Baker (Deventer, Holandija), Merck (Darmštat, Nemaĉka), Sigma–Aldrich (Sentluis, SAD), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 43 Supelco (Bellefonte, SAD), Zdravlje (Leskovac, Srbija), Zorka (Šabac, Srbija). Kavibetol (5-alil- 2-metoksifenol) je izolovan iz etarskog ulja biljne vrste Piper betle L. koje je dobijeno kao poklon od profesora dr Karl-Heinz Kubeczke (Hamburg, Nemaĉka). 3.2. Biljni materijal i priprema uzoraka za analizu 3.2.1. Biljni materijal Biljni materijal korišćen za analizu je sakupljen na teritoriji Srbije, Crne Gore i Sirije sa prirodnih staništa kao i iz botaniĉke bašte u Drezdenu (Nemaĉka). Botaniĉka identifikacija je izvršena prema dihotomnim kljuĉevima odgovarajućih flora. Herbarski primerci deponovani su u herbarijumu Prirodno-matematiĉkog fakulteta u Nišu, Laboratorija za organsku analizu i sintezu i herbarijumu biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. U tabeli 3.2.1 su navedeni datumi i lokaliteti sa kojih je sakupljan biljni materijal, delovi biljaka koji su korišćeni za analizu i prinos etarskog ulja dobivenog hidrodestilacijom. Tabela 3.2.1. Podaci o uzorcima ispitivanih biljnih vrsta Takson Lokalitet Vreme sakupljanja Biljni delovi Prinos (w/w, %) Anthemis segetalis Ten. Bioĉe Crna Gora jun, 2008. nadzemni delovi 0,13 Scandix balansae Reut. Ex Boiss. Botaniĉka bašta Drezden Nemaĉka jul, 2012. plodovi 0,18 Scandix pecten-veneris L. Gabrovaĉka reka Srbija maj, 2010. nadzemni delovi 0,12 koren 0,18 plodovi 0,15 Knez selo nadzemni delovi 0,11 koren 0,18 Palilula, Niš nadzemni delovi 0,08 koren 0,16 Achillea falcata L. Ma‟loula Sirija jul, 2010. nadzemni delovi 0,05 koren 0,004 Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl Jelašniĉka klisura Srbija jun, 2013. nadzemni delovi 0,30 jun, 2014. 0,30 Suva planina jun, 2013. 0,31 jun, 2014. 0,31 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 44 3.2.2. Izolovanje etarskih ulja Etarska ulja su izolovana hidrodestilacijom u aparatu po Klevendţeru (Clevenger). Nakon usitnjavanja i odmeravanja, biljni materijal je hidrodestilovan tokom 2,5 h. Dobivena etarska ulja su ekstrahovana dietil-etrom, a zatim su ekstrakti sušeni preko anhidrovanog magnezijum-sulfata. Prinos ulja je odreĊen odmah nakon odvajanja sredstva za sušenje filtriranjem, odnosno uparavanja dietil-etra na rotacionom vakuum uparivaĉu. Dobivena etarska ulja su, odmah nakon obrade, analizirana korišćenjem metoda GC i GC-MS. 3.3. Metode razdvajanja i analize 3.3.1. Gasna hromatografija – masena spektrometrija (GC-MS) i gasna hromatografija (GC) 3.3.1.1. Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) Gasno-hromatografska analiza (GC-MS) etarskih ulja i sintetisanih jedinjenja je izvršena na gasnom hromatografu tipa HP 6890N, sa DB-5MS kapilarnom kolonom (5% fenilmetilsiloksan, dimenzije 30 m  0,25 mm, debljina filma 0,25 μm, gilent Technologies, SAD). Gasni hromatograf je bio direktno povezan sa masenim detektorom MSD 5975B iste kompanije. Uslovi analize: radna temperatura injektora 250 °C, odnosno detektora 320 °C; linearni temperaturni program zagrevanja kolone u opsegu od 70 ° do315 °C, odnosno u opsegu od 150 ° do 315 °C u sluĉaju estara derivata ferocena [12a – 12h] sa brzinom povećanja temperature od 5 °C/min, nakon ĉega je postojao izotermalni period na 315 °C u trajanju od 10 minuta. Injektiran je rastvor uzorka u etru (1 μl rastvora koncentracije 1 mg u 1 ml dietil-etra), u pulsnom „split” modu (40:1), pri protoku od 1,5 ml/min helijuma za prvih 30 sekundi, a zatim je protok odrţavan na 1,0 ml/min do kraja analize. Jonizacija je vršena elektronima energije 70 eV, sa akvizicijom m/z vrednosti opsegu od 35 do 650 i brzinom skeniranja na 0,32 s po skenu. Procentualni sastav pojedinih sastojaka je odreĊen na osnovu odnosa površina pikova, bez korišćenja korekcionih faktora. Obrada ukupnih jonskih hromatograma (TIC) je vršena u programu MestreNova (ver.6.0.2-5475, Mestrelab Research, Španija). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 45 3.3.1.2. Gasna hromatografija sa plameno-jonizacionim detektorom (GC-FID) Gasno-hromatografska analiza sa plameno-jonizacionim detektorom (GC-FID) je izvršena korišćenjem Agilent 7890A GC sistema sa HP-5MS kapilarnom kolonom (5% fenilmetilsiloksan, dimenzije 30 m  0,32 mm, debljina filma 0,25 μm, gilent Technologies, SAD). Linearni temperaturni program zagrevanja kolone je bio u opsegu 150 °300 °C, sa brzinom promene temperature od 5 °C/min, posle ĉega je temperatura odrţavana na 300 °C u trajanju od 5 min. Radna temperatura injektora je odrţavana na 250 °C. Uzorci, 1 μl rastvora, su injektirani u „splitlessˮ modu. Parametri FID detektora: temperatura grejaĉa 300 °C; H2 protok, 30 ml/min; protok vazduha, 400 ml/min; frekvencija beleţenja signala, 20Hz. 3.3.1.3. Identifikacija sastojaka Obrada rezultata je vršena pomoću MSD ChemStation softvera (ver. D.03.00.611, Agilent Technologies, SAD) u kombinaciji sa AMDIS (ver. 2.68) i NIST MS Search programskim paketima (ver. 2.0d, Nacionalni institut za standarde i tehnologiju (NIST), SAD). MDIS je korišćen za dekonvoluciju masenog skena, tj. ekstrakciju masenih spektara iz skenova preklopljenih pikova, dok je NIST MS Search obezbedio algoritam za pretragu biblioteka masenih spektara. Linearni retencioni indeksi svih sastojaka analiziranih uzoraka su odreĊeni koinjekcijom uzorka sa homologom serijom n-alkana od C7-C38 (Den Dool i Kratz, 1963). Hemijski sastav uzoraka etarskih ulja je odreĊen uporeĊivanjem linearnih retencionih indeksa sastojaka sa literaturnim vrednostima ( dams, 2007), kao i na osnovu poreĊenja masenih spektara jedinjenja sa spektrima jedinjenja iz biblioteka Wiley Registry of Mass Spectral Data 11 th Edition, NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 07, MassFinder 2.3, Adams (Adams, 2007) i biblioteke masenih spektara laboratorije za organsku analizu i sintezu, PMF-a u Nišu. Gde god je bilo moguće, vršena je i analiza uzorka sa koinjektiranim odgovarajućim standardom. Rezultati GC i GC-MS analiza etarskih ulja sumirani su u prilozima 8.1.1 i 8.2.1. 3.3.1.4. Kvantifikacija GC-FID kvantifikacija sintetisanih estara, koji su sastavni deo etarskog ulja biljnih vrsta Scandix pecten-veneris, S. balansae, Anthemis segetalis, Achillea ageratifolia subsp. serbica i Achillea falcata, je izvršena kreiranjem kalibracionih krivih, odnos koncentracije estara i Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 46 površine pikova (C = f ( )), nekoliko razliĉitih rastvora (3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, 0,00625 mg/ml) estara u hloroformu ili etil-acetatu. 3.3.2. Hromatografija na tankom sloju (TLC) nalitiĉka TLC je vršena na aluminijumskim ploĉama sa slojem silika-gela 60 F254 (Merck, Nemaĉka). Kao eluent korišćene su razliĉite smeše heksana i dietil-etra. Vizualizacija mrlja je vršena pomoću UV svetlosti (254 nm), odnosno 30%-tnim (v/v) rastvorom sumporne kiseline ili 10%-tnim etanolnim (w/w) rastvorom fosfomolibdenske kiseline, a zatim zagrevanjem. 3.3.3. Tečna hromatografija pri srednjim pritiscima (MPLC) Preparativno razdvajanje pomoću MPLC-a (Medium Preassure Liquid Chromatography) je ostvareno pomoću Büchi instrumenta (tip C 610, Büchi Labortechnik, Švajcarska) sa radnom pumpom istog proizvoĊaĉa (Module C-601, pump controler C-610) pri protoku od 2,5 ml/min na prethodno napakovanoj koloni silika-gela 60 (>230 mesh-a, proizvoĊaĉ Büchi, Flawil, Švajcarska) pod gradijentnim uslovima smešom heksana i dietil-etra. 3.3.4. „Dry flash” hromatografija Aparatura za „dry flash” hromatografiju, koja je bila korišćena za preparativno razdvajanje sastojaka etarskog ulja A. ageratifolia subsp. serbica kao i za preĉišćavanje sintetisanih jedinjenja, sastojala se od kolone silika gela 60 (>230 mesh-a, proizvoĊaĉ Merck, Darmštat, Nemaĉka), napakovane na sinterovanom staklenom levku srednje poroznosti i veliĉine, i standardne boce za vakuum filtraciju. Kao eluent je korišćena smeša heksana i dietil- etra pod gradijentnim ili izokratskim uslovima. 3.3.5. Infracrvena spektroskopija (IR) FTIR spektri (FT = Fourier-ova transformacija, ATR-attenuated total reflectance) sintetisanih jedinjenja snimani su na spektrofotometrima Thermo Nicolet, model 6700 (Waltham, SAD) i Perkin-Elmer FTIR 31725-X. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 47 3.3.6. Nuklearno-magnetna rezonantna (NMR) spektroskopija Jednodimenzionalni i dvodimenzionalni NMR spektri su snimani na tri instrumenata: Varian Unity 200 NMR (200 MHz za 1 H, a 50 MHz za 13 C), Bruker Avance III 400 MHz ( 1 H na 400 MHz, 13 C na 101 MHz) i Bruker Avance II+ 600 ( 1 H na 600 MHz, 13 C na 150 MHz) NMR spektrometrima na 25 °C u deuterisanom hloforormu (CDCl3) ili benzenu (C6D6) kao rastvaraĉima. Vrednosti hemijskih pomeranja su date u δ (ppm) jedinicama, a konstante sprezanja u Hz. Unutrašnji standard za 1H NMR je bio tetrametilsilan (TMS) (δ 0,00) a za 13C NMR deuterohloroform CDCl3 (δ 77,16). 2D NMR spektri ( 1 H – 1H COSY, NOESY, HSQC i HMBC) kao i višepulsni spektri (DEPT90 i DEPT135) su snimani uz primenu uobiĉajenih pulsnih sekvenci. Spektri su obraĊivani u programu MestreNova (ver.6.0.2-5475, Mestrelab Research, Španija). 3.3.7. Rendgenska strukturna analiza Rendgenska strukturna analiza je izvedena na Oxford Diffraction Xcalibur Sapphire3 Gemini difraktometru koristeći Cu Kα zraĉenje (λ = 1,5418 Å) na sobnoj temperaturi. Podaci su obraĊeni u CrysAlis softveru korišćenjem SCALE3 ABSPACK (Oxford Diffraction, 2008). naliza kristalne strukture je izvršena korišćenjem programa SHELXS i SHELXL (Sheldrick, 2008). Svi H atomi su postavljeni na geometrijski definisane poloţaje sa konstantnim C-H rastojanjima od 0,93 Å kada je H atom vezan za sp 2 hibridizovan ugljenik, 0,96 Å kada je vezan za sp 3 hibridizovan ugljenik i 0,97 Å kada je H atom vezan za sp 3 hibridizovan ugljenik koji je vezan za sp 2 hibridizovan ugljenik. CIF-datoteka je deponovana u bazi kristalografskih podataka u Kembridţu (Cambridge Crystallographic Data Centre) pod rednim brojem CCDC No. 909288 i besplatno je dostupna na sajtu www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif. 3.3.8. Ciklična voltametrija Eksperimenti cikliĉne voltametrije su izvedeni na sobnoj temperaturi u standardnoj ćeliji sa tri elektrode Autolab potenciostata (PGSTAT302 N). Radna elektroda je disk platine preĉnika 2 mm (Metrohm). Pomoćna elektroda je bila ţica od platine, dok je Ag/AgCl elektroda korišćena kao referentna elektroda. Pre svakog eksperimenta, radna elektroda je polirana korišćenjem Metrohm 6.2802.000 (aluminijum-oksid na tkanini), a zatim ispirana destilovanom vodom. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 48 3.3.9. Ultraljubičasta (UV) spektroskopija Ultraljubiĉasti spektri su snimani na aparatu UV-1650 PC Shimadzu koristeći acetonitril kao rastvaraĉ. 3.3.10. Elementalna mikroanaliza Elementalna mikroanaliza je izvršena na Carlo Erba 1106 mikroanalizatoru i dobivene vrednosti za analizirane estre su se dobro slagale sa izraĉunatim vrednostima. 3.4. Izolovanje i sinteza jedinjenja 3.4.1. Sinteza biblioteke estara trans-sabinola 3.4.1.1. Izolovanje (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata Etarsko ulje biljne vrste A. ageratifolia subsp. serbica je hromatografisano smešom n- heksana i dietil-etra pod srednjim pritiscima. Dobiveno je 5 frakcija od kojih je treća frakcija (n- heksan/dietil-etar, 97:3 (v/v)) sadrţala, na osnovu GC-MS analize, ĉist (1R*,3S*,5R*)-sabinil- acetat (1,02 g; prinos 34%). 3.4.1.2. Hidroliza (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata Rastvor natrijum-metoksida je pripremljen rastvaranjem 140 mg natrijuma (6,09 mmol) u anhidrovanom metanolu (10 ml), a zatim je dodato 1,02 g (5,26 mmol) (1R*,3S*,5R*)-sabinil- acetata. Reakciona smeša je dovedena do refluksa, pa je dodat višak smeše leda i vode, nakon ĉega je smeša zakišeljena hlorovodoniĉnom kiselinom (HCl:H2O, 1:1, v/v). Nakon toga reakciona smeša je ekstrahovana dietil-etrom (3 × 50 ml), a organski slojevi su spojeni, osušeni preko anhidrovanog magnezijum-sulfata, a rastvaraĉ uparen na rotacionom vakuum-uparivaĉu. Dobiveno je 792 mg (5,21 mmol) trans-sabinola. Prinos reakcije je bio 99,1%. 3.4.1.3. Sinteza estara trans-sabinola Estri trans-sabinola sa mravljom, propanskom, izobutanskom, butanskom, 2- metilbutanskom, 3-metilbutanskom, nonanskom, dekanskom, tiglinskom, senecio, angelika i benzoevom kiselinom su pripremljeni na osnovu opšte procedure Šteglihove sinteze estara korišćenjem N,N'-dicikloheksilkarbodiimida (DCC) i 4-(dimetilamino)piridina (DMAP). Rastvor Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 49 trans-sabinola (60 mg, 0,39 mmol), odgovarajuće pomenute kiseline (0,42 mmol), DMAP-a (15 mg, 0,12 mmol) i DCC-a (90 mg, 0,45 mmol) u 30 ml suvog dihlormetana je mešan preko noći na sobnoj temperaturi uz zaštitu od vlage iz atmosfere korišćenjem kalcijum-hloridne cevĉice. Nakon toga, istaloţena N,N'-dicikloheksilurea je profiltrirana, a filtrat je ukoncentrovan na rotacionom vakuum uparivaĉu. Dodatna koliĉina uree je izdvojena na isti naĉin nakon dodavanja n-pentana i hlaĊenja na 0 °C. Dobiveni pentanski ekstrakt, nakon uparavanja rastvaraĉa, je preĉišćen hromatografijom pri srednjem pritisku na silika gelu koristeći n-heksan/dietil-etar kao eluent (n-heksan/dietil-etar, 97:3 (v/v)). Ĉistoća estarskih frakcija je proveravana pomoću TLC i GC-MS analiza. Pored trans-sabinola [1], i sintetisani estri ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijat [1a], (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetat [1b], (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglat [1h], (1R*,3S*,5R*)-sabinil- senecioat [1i], (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoat [1k], (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoat [1l], (1R*,3S*,5R*)-sabinil-benzoat [1m]) su potpuno spektralno okarakterisani (GC-MS, IR, UV- Vis, 1D- i 2D-NMR) dok su preostali estri okarakterisani samo GC-MS analizom (maseni spektri i retencioni indeksi). Spektralni podaci i prinosi trans-sabinola i sabinil estara: (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-ol (trans-sabinol) [1]: bezbojna teĉnost; RI 1142, DB-5MS; FTIR (ATR) cm-1: 3361, 2956, 2929, 2871, 1656, 1464, 1364, 1313, 1200, 1090, 1068, 1049, 1013, 958, 881, 832, 785; EIMS m/z(rel. int.): 152(0,2) [M + ], 134(19), 120(3), 119(23), 117(5), 110(4), 109(24), 108(3), 107(6), 105(10), 95(21), 93(14), 92(100), 91(99), 83(12), 82(5), 81(52), 80(5), 79(38), 78(5), 77(19), 70(11), 69(9), 67(13), 66(4), 65(11), 63(4), 55(20), 53(16), 51(7), 43(13), 41(23), 39(17); izraĉunato za C10H16O: C 78,90, H 10,59, O 10,51%; naĊeno C 78,85, H 10,62, O 10,53%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,01 (singlet, 1H, CHa-10), 4,95 (singlet, 1H, Hb-10), 4,45 (široki dublet, J = 7,4 Hz, 1H, CH-3), 2,07 (dublet dubleta dubleta, J = 13,9, 7,4, 2,1 Hz, 1H, CHa-2), 1,73 (dublet, J = 13,9 Hz, 1H, CHb-2), 1,66 (dublet dubleta, J = 8,7, 3,4 Hz, 1H, CH-5), 1,63 (široki singlet, 1H, OH), 1,45 (septuplet, J = 6,8 Hz, 1H, CH-7), 1,06 (dublet dubleta, J = 4,3, 3,4, 1H, CHb-6), 0,93 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH- 9), 0,88 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH-8), 0,82 (dublet dubleta dubleta, J = 8,7, 4,3, 2,1 Hz, 1H, Ha-6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 157,3 (C-4), 105,8 (C-10), 75,2 (C-3), 37,7 (C-1), 37,3 (C- 2), 32,6 (C-7), 29,0 (C-5), 20,1 (C-6), 19,8 (C-9), 19,6 (C-8). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 50 (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-formijat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-formijat) [1a]: bezbojna teĉnost; prinos: 78%; RI 1227, DB-5MS; FTIR (ATR) cm-1: 2912, 2852, 1743, 1652, 1601, 1523, 1460, 1376, 1236, 1159, 1118, 1054, 1019, 950, 893, 830, 721; EIMS m/z(rel. int.): 134(3), 119(8), 117(2), 108(5), 105(4), 93(6), 92(48), 91(100), 79(8), 78(3), 77(7), 69(5), 65(4), 53(4), 43(7), 41(9), 39(5); izraĉunato za C11H16O2: C 73,30, H 8,95, O 17,75%; naĊeno C 73,35, H 8,94, O 17,71%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,00 (dublet, J = 0,8 Hz, 1H, CH-11), 5,59 (dublet dubleta, J = 7,8, 0,8 Hz, 1H, CH-3), 5,14 (singlet, 1H, CHa-10), 5,09 (singlet, 1H, CHb-10), 2,22 (dublet dubleta dubleta, J = 14,6, 7,8, 2,0 Hz, 1H, CHa-2), 1,80 (dublet, J = 14,6 Hz, 1H, CHb-2), 1,71 (dublet dubleta, J = 8,7, 3,4 Hz, 1H, CH-5), 1,48 (septuplet, J = 6,8 Hz, 1H, CH-7), 0,95 (dublet dubleta, J = 4,7, 3,4 Hz, 1H, CHb-6), 0,94 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH-9), 0,88 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH-8), 0,82 (dublet dubleta dubleta, J = 8,7, 4,7, 2,0 Hz, 1H, CHa-6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 160,5 (C-11), 151,8 (C- 4), 110,4 (C-10), 75,9 (C-3), 37,2 (C-1), 35,8 (C-2), 32,3 (C-7), 29,3 (C-5), 19,7 (C-9), 19,6 (C- 8), 18,6 (C-6). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-acetat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-acetat) [1b]: bezbojna teĉnost; RI 1291, DB-5MS; FTIR (ATR) cm-1: 2958, 2873, 1735, 1653, 1605, 1523, 1450, 1368, 1233, 1188, 1115, 1054, 1018, 966, 889, 826, 746; EIMS m/z(rel. int.): 134(5), 119(11), 117(3), 109(3), 108(10), 105(5), 93(6), 92(46), 91(100), 82(5), 79(7), 78(3), 77(8), 65(5), 53(4), 43(23), 41(7), 39(5); izraĉunato za C12H18O2: C 74,19, H 9,34, O 16,47%; naĊeno C 74,15, H 9,36, O 16,49%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,45 (široki dublet, J = 7,7 Hz, 1H, CH-3), 5,10 (singlet, 1H, CHa-10), 5,06 (singlet, 1H, CHb-10), 2,18 (dublet dubleta dubleta, J = 14,5, 7,7, 2,2 Hz, 1H, CHa-2), 2,01 (singlet, 3H, CH-12), 1,76 (dublet, J = 14,5 Hz, 1H, CHb-2), 1,69 (dublet dubleta, J = 8,6, 3,4 Hz, 1H, CH-5), 1,47 (septuplet, J = 6,8 Hz, 1H, CH-7), 0,94 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH-9), 0,92 (dublet dubleta, J = 4,5, 3,4 Hz, 1H, CHb-6), 0,87 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH-8), 0,80 (dublet dubleta dubleta, J = 8,6, 4,5, 2,2 Hz, 1H, CHa- 6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170,4 (C-11), 152,3 (C-4), 109,7 (C-10), 76,2 (C-3), 37,1 (C- 1), 35,8 (C-2), 32,4 (C-7), 29,4 (C-5), 21,5 (C-12), 19,7 (C-9), 19,6 (C-8), 18,7 (C-6). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-propanoat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-propanoat) [1c]: bezbojna teĉnost; prinos: 75%; RI 1379, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 51 134(6), 119(12), 117(6), 109(4), 108(11), 105(3), 93(6), 92(50), 91(100), 82(4), 79(3), 78(5), 77(6), 65(4), 57(3), 53(5), 43(12), 41(6), 39(3). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-izobutanoat ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-izobutanoat) [1d]: bezbojna teĉnost; prinos: 72%; RI 1414, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 134(4), 119(9), 117(4), 109(3), 108(9), 105(4), 93(7), 92(49), 91(100), 82(7), 79(5), 78(3), 77(7), 65(5), 53(4), 43(18), 41(5), 39(4). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-butanoat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-butanoat) [1e]: bezbojna teĉnost; prinos: 70%; RI 1465, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 134(6), 119(11), 117(2), 109(2), 108(8), 105(4), 93(6), 92(48), 91(100), 82(5), 79(4), 78(2), 77(5), 65(3), 53(3), 43(16), 41(8), 39(3). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-2-metilbutanoat ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-2-metilbutanoat) [1f]: bezbojna teĉnost; prinos: 63%; RI 1500, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 134(8), 119(12), 117(2), 109(2), 108(3), 105(3), 93(6), 92(50), 91(100), 85(6), 79(4), 78(2), 77(5), 65(2), 57(18), 53(3), 43(5), 41(8), 39(3). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-3-metilbutanoat ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-izovalerat) [1g]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1513, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 134(7), 119(12), 117(2), 109(3), 108(7), 107(2), 105(3), 93(6), 92(51), 91(100), 85(10), 79(4), 78(2), 77(5), 65(2), 57(11), 53(2), 43(6), 41(8), 39(4). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-(E)-2-metilbut-2-enoat ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglat) [1h]: bezbojna teĉnost; prinos: 59%; RI 1610, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2957, 2872, 1705, 1652, 1612, 1435, 1383, 1345, 1255, 1189, 1132, 1065, 1006, 957, 890, 836, 787, 733; EIMS m/z(rel. int.): 134(11), 119(19), 117(3), 108(10), 105(4), 101(5), 93(6), 92(49), 91(100), 83(26), 79(5), 77(6), 65(4), 55(20), 53(5), 43(5), 41(6), 39(5); izraĉunato za C15H22O2: C 76,88, H 9,46, O 13,66%; naĊeno C 76,91, H 9,41, O 13,68%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,79 (kvartet kvarteta, J = 7,0, 1,2 Hz, 1H, CH-13), 5,52 (široki dublet, J = 7,7 Hz, 1H, CH-3), 5,09 (singlet, 1H, CHa-10), 5,07 (singlet, 1H, CHb-10), 2,21 (dublet dubleta dubleta, J = 14,5, 7,7, 2,2 Hz, 1H, CHa-2), 1,81 (pseudo kvintet, J = 1,2 Hz, 3H, CH3-15), 1,81 (dublet, J = 14,5 Hz, 1H, CHb-2), 1,78 (dublet kvarteta, J = 7,0, 1,2 Hz, 3H, CH3-14), 1,70 (dublet dubleta, J = 8,5, 3,4 Hz, 1H, CH-5), 1,48 (septuplet, J = 6,8 Hz, 1H, CH-7), 0,98 (dublet Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 52 dubleta, J = 4,4, 3,4 Hz, 1H, CHb-6), 0,94 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-9), 0,88 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-8), 0,81 (dublet dubleta dubleta, J = 8,5, 4,4, 2,2 Hz, 1H, CHa-6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167,5 (C-11), 152,4 (C-4), 137,0 (C-13), 128,9 (C-12), 109,6 (C-10), 76,0 (C-3), 37,1 (C-1), 35,9 (C-2), 32,4 (C-7), 29,4 (C-5), 19,8 (C-9), 19,6 (C-8), 18,7 (C-6), 14,3 (C-14), 12,1 (C-15). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-3-metilbut-2-enoat ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioat) [1i]: bezbojna teĉnost; prinos: 63%; RI 1612, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2957, 2870, 1705, 1651, 1610, 1521, 1440, 1380, 1230, 1184, 1130, 1008, 960, 891, 830, 781, 732; EIMS m/z(rel. int.): 134(10), 119(19), 117(4), 108(10), 105(4), 101(7), 93(5), 92(47), 91(100), 83(56), 79(5), 77(7), 65(5), 55(17), 53(7), 43(8), 41(9), 39(8); izraĉunato za C15H22O2: C 76,88, H 9,46, O 13,66%; naĊeno C 76,86, H 9,48, O 13,66%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,62 (pseudo septuplet, J = 1,2 Hz, 1H, CH-12), 5,48 (široki dublet, J = 7,8 Hz, 1H, CH-3), 5,09 (singlet, 1H, CHa-10), 5,06 (singlet, 1H, CHb-10), 2,20 (dublet dubleta dubleta, J = 14,4, 7,8, 2,2 Hz, 1H, CHa-2), 2,15 (dublet, J = 1,2 Hz, 3H, CH3-15), 1,87 (dublet, J = 1,2 Hz, 3H, CH3-14), 1,77 (dublet, J = 14,4 Hz, 1H, CHb-2), 1,69 (dublet dubleta, J = 8,6, 3,4 Hz, 1H, CH-5), 1,47 (septuplet, J = 6,9 Hz, 1H, CH-7), 0,96 (dublet dubleta, J = 4,5, 3,4 Hz, 1H, CHb-6), 0,94 (dublet, J = 6,9 Hz, 3H, CH3-9), 0,89 (dublet, J = 6,9 Hz, 3H, CH3-8), 0,79 (dublet dubleta dubleta, J = 8,6, 4,5, 2,2 Hz, 1H, CHa-6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166,1 (C-11), 156,5 (C- 13), 152,7 (C-4), 116,4 (C-12), 109,4 (C-10), 75,2 (C-3), 37,1 (C-1), 36,0 (C-2), 32,4 (C-7), 29,4 (C-5), 27,4 (C-14), 20,2 (C-15), 19,8 (C-9), 19,6 (C-8), 18,7 (C-6). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-(Z)-2-metilbut-2-enoat ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-angelat) [1j]: bezbojna teĉnost; prinos: 49%; RI 1557, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 134(9), 119(14), 105(3), 101(3), 93(6), 92(50), 91(100), 83(22), 79(4), 77(5), 65(3), 55(19), 53(4), 43(5), 41(5), 39(4). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-nonanoat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-nonanoat) [1k]: bezbojna teĉnost; prinos: 61%; RI 1940, DB-5MS; FTIR (ATR) cm-1: 2956, 2926, 2855, 1732, 1653, 1609, 1558, 1506, 1457, 1434, 1365, 1330, 1242, 1163, 1107, 1064, 1053, 1009, 967, 889, 834, 795, 744, 722, 669, 622; EIMS m/z(rel. int.): 159(1), 141(3), 135(3), 134(11), 119(15), 105(4), 93(8), 92(62), 91(100), 79(4), 77(4), 71(4), 57(6), 55(5), 53(3), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 53 43(10), 41(8), 39(2); izraĉunato za C19H32O2: C 78,03, H 11,03, O 10,94%; naĊeno C 77,99, H 11,08, O 10,93%; NMR podaci su prikazani u tabeli 4.1.1. (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-dekanoat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-dekanoat) [1l]: bezbojna teĉnost; prinos: 56%; RI 2046, DB-5MS; FTIR (ATR) cm-1: 2956, 2925, 2854, 1732, 1652, 1609, 1558, 1505, 1434, 1365, 1327, 1242, 1163, 1108, 1064, 1053, 1008, 967, 894, 834, 795, 743, 721, 676, 622; EIMS m/z(rel. int.): 173(2), 155(4), 135(6), 134(20), 120(3), 119(25), 108(8), 107(3), 105(5), 93(13), 92(90), 91(100), 85(3), 79(6), 77(6), 71(5), 69(4), 57(6), 55(8), 53(3), 43(15), 41(11), 39(2); izraĉunato za C20H34O2: C 78,38, H 11,18, O 10,44%; naĊeno C 78,41, H 11,16, O 10,43%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 5,46 (široki dublet, J = 7,7 Hz, CH-3), 5,09 (singlet, CHa-10), 5,05 (singlet, CHb-10), 2,24 (triplet, J = 7,5 Hz, CH2-12), 2,18 (dublet dubleta dubleta, J = 14,5, 7,7, 2,1 Hz, CHa-2), 1,74 (dublet, J = 14,5 Hz, CHb-2), 1,68 (dublet dubleta, J = 8,6, 3,4 Hz, CH-5), 1,59 (kvintet, J = 7,5 Hz, CH2-13), 1,47 (septuplet, J = 6,8 Hz, 1H, CH-7), 1,32-1,23 (preklopljeni signali, CH2-14–19), 0,94 (dublet, J = 6,8 Hz, CH3-9), 0,92 (dublet dubleta, J = 4,5, 3,4 Hz, 1H, CHb-6), 0,89 (triplet, J = 6,7 Hz, 3H, CH3-20), 0,88 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-8), 0,79 (dublet dubleta dubleta, J = 8,6, 4,5, 2,1 Hz, 1H, CHa-6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3): 173,2 (C-11), 152,4 (C-4), 109,7 (C-10), 75,9 (C-3), 37,1 (C-1), 35,9 (C-2), 34,8 (C-12), 32,4 (C-7), 29,4 (C-5), 31,8, 29,4, 29,2, 29,1 (C- 14C-18), 25,0 (C-13), 22,7 (C-19), 19,8 (C-9), 19,6 (C-8), 18,6 (C-6), 14,1 (C-20); 1H NMR (400 MHz, C6D6): 5,72 (široki dublet, J = 7,7 Hz, 1H, CH-3), 5,31 (singlet, 1H, CHa-10), 5,12 (singlet, 1H, CHb-10), 2,08 (triplet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-12), 2,00 (dublet dubleta dubleta, J = 14,4, 7,7, 2,1 Hz, 1H, CHa-2), 1,76 (dublet, J = 14,4 Hz, 1H, CHb-2), 1,54 (kvintet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-13), 1,52 (dublet dubleta, J = 8,6, 3,5 Hz, 1H, CH-5), 1,27 (sekstet, J = 7,0 Hz, 2H, CH2-19), 1,24-1,13 (preklopljeni signali, 12H, CHb-6, CH-7, CH2-14–18), 0,91 (triplet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3-20), 0,80 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-9), 0,75 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-8), 0,68 (dublet dubleta dubleta, J = 8,6, 4,3, 2,1 Hz, 1H, CHa-6); 13 C NMR (101 MHz, C6D6): 172,4 (C-11), 152,8 (C-4), 110,0 (C-10), 75,8 (C-3), 37,2 (C-1), 36,0 (C-2), 34,8 (C-12), 32,6 (C-7), 32,2 (C-18), 29,9 (C-5), 29,8, 29,7, 29,6, 29,4, (C-14C-17), 25,3 (C-13), 23,1 (C-19), 19,8 (C- 9), 19,7 (C-8), 18,9 (C-6), 14,4 (C-20). (1R*,3S*,5R*)-4-Metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-benzoat ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-benzoat) [1m]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 52%; RI 1890, DB-5MS; EIMS m/z(rel. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 54 int.): 194(2), 135(2), 134(13), 123(4), 119(19), 117(3), 106(5), 105(56), 93(4), 92(52), 91(100), 79(6), 78(4), 77(34), 65(5), 53(3), 51(7), 43(4), 41(5); izraĉunato za C17H20O2: C 79,66, H 7,86, O 12,48%; naĊeno C 79,69, H 7,82, O 12,49%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,00 (dublet dubleta, J = 7,8, 1,3 Hz, CH-13, CH-17)), 7,54 (triplet tripleta, J = 7,8, 1,3 Hz, CH-15), 7,42 (triplet, J = 7,8 Hz, CH-14, CH-16)), 5,71 (široki dublet, J = 7,7 Hz, CH-3), 5,16 (singlet, CHa- 10), 5,15 (singlet, CHb-10), 2,29 (dublet dubleta dubleta, J = 14,6, 7,7, 2,2 Hz, CHa-2), 1,91 (dublet, J = 14,6 Hz, CHb-2), 1,75 (dublet dubleta, J = 8,6, 3,4 Hz, CH-5), 1,51 (septuplet, J = 6,8 Hz, 1H, CH-7), 0,97 (preklopljeni signali, 4H, CHb-6, CH3-9), 0,90 (dublet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-8), 0,87 (dublet dubleta dubleta, J = 8,6, 4,5, 2,2 Hz, 1H, CHa-6); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3): 165,9 (C-11), 152,1 (C-4), 132,8 (C-15), 130.6 (C-12), 129,6 (C-13, C17), 128,3 (C-14, C16), 110,1 (C-10), 76,8 (C-3), 37,1 (C-1), 36,0 (C-2), 32,4 (C-7), 29,4 (C-5), 19,8 (C-9), 19,6 (C-8), 18,9 (C-6). 3.4.2. Sinteza biblioteke izobutanoata, 2-metilbutanoata i (izo)valerata dugolančanih alkohola Rastvor izobutanske, butanske, 2-metilbutanske, 3-metilbutanske ili pentanske kiseline (1 mmol) i odgovarajućeg dugolanĉanog alkohola (C13-C18, C21 i C23), DMAP-a (0,3 mmol) i DCC- a (1,1 mmol) u 50 ml suvog dihlormetana je mešan preko noći na sobnoj temperaturi uz zaštitu od vlage iz atmosfere korišćenjem kalcijum-hloridne cevĉice. Istaloţena urea je odvojena filtriranjem (dodatna koliĉina uree je istaloţena dodavanjem n-pentana i stajanjem preko noći u friţideru), a filtrat je uparen na rotacionom vakuum uparivaĉu. Dobiveni ostatak je preĉišćen gradijentnom hromatografijom (MPLC) na silika gelu pomoću smeše heksan/dietil-etar kao eluenta. Estri su isprani sa kolone smešom heksan/dietil-etar, 4:1 (v/v), a njihova ĉistoća je proveravana TLC i GC-MS analizama. Spektralni podaci estara dugolanĉanih alkohola: Tridecil-izobutanoat [2a]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 74%; RI 1827, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2922, 2852, 1735 (C=O), 1467, 1386, 1343, 1257, 1190 (C-O), 1154 (C-O), 1076; EIMS m/z(rel. int.): 270(1) [M + ], 227(3), 199(2), 183(1), 182(4), 157(1), 155(1), 129(3), 127(2), 115(3), 113(5), 101(0.9), 99(6), 89(67) [C3H7COOH2 + ], 88(9), 85(8), 71(59), 57(30), 43(100); izraĉunato za C17H34O2: C 75,50, H 12,67, O 11,83%; naĊeno C 75,55, H 12,64, O 11,81%; 1 H Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 55 NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,43-1,20 (preklopljeni signali, 20H, - (CH2)10-), 1,16 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,3 Hz, 3H, CH3-13‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C- 11‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2, (C-4‟–C-10‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-12‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-13‟). Tridecil-2-metilbutanoat [2b]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 78%; RI 1915, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1734 (C=O), 1462, 1380, 1355, 1262, 1239, 1181 (C-O), 1151 (C-O), 1083, 1012; EIMS m/z(rel. int.): 284(1) [M + ], 255(5), 227(1), 183(2), 169(1), 155(3), 143(1), 129(2), 115(3), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(11), 101(3), 99(4), 85(29), 71(10), 57(85), 43(45); izraĉunato za C18H36O2: C 76,00, H 12,75, O 11,25%; naĊeno C 76,01, H 12,73, O 11,26%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,36 (sekstet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,79-1,36 (preklopljeni signali, 4H, CH2-3, CH2-2‟), 1,36-1,26 (preklopljeni signali, 20H, -(CH2)10-), 1,14 (dublet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3-5), 0,91 (triplet, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-13‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 176,8 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 41,1 (C-2), 31,9 (C-11‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-10‟), 28,7 (C-2‟), 26,8 (C-3), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-12‟), 16,6 (C-5), 14,1 (C-13‟), 11,6 (C-4). Tridecil-3-metilbutanoat [2c]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 70%; RI 1917, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2853, 1735 (C=O), 1466, 1386, 1294, 1252, 1185 (C-O), 1168 (C-O), 1120, 1096, 1003; EIMS m/z(rel. int.): 284(2) [M + ], 269(3), 227(5), 199(2), 183(2), 182(11), 157(1), 155(3), 143(2), 141(1), 127(2), 115(4), 113(4), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(9), 101(1), 99(2), 85(58), 71(15), 57(70), 43(56); izraĉunato za C18H36O2: C 76,00, H 12,75, O 11,25%; naĊeno C 76,02, H 12,73, O 11,25%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,19 (dublet, J = 6,4 Hz, 2H, CH2-2), 2,13 (triplet septupleta, J = 6,4, 6,4 Hz, 1H, CH-3), 1,62 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-3‟), 1,38-1,22 (preklopljeni signali, 20H, -(CH2)10-), 0,96 (dublet, J = 6,4 Hz, 6H, CH3-4, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-13‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 173,3 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 43,5 (C-2), 31,9 (C-11‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-10‟), 28,6 (C-2‟), 25,9, 25,7 (C-3, C-3‟), 22,7 (C-12‟), 22,4 (C-4, C-5), 14,1 (C-13‟). Tetradecil-izobutanoat [2d]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 78%; RI 1927, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2923, 2853, 1736 (C=O), 1467, 1389, 1343, 1257, 1190 (C-O), 1154 (C-O), 1075; Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 56 EIMS m/z(rel. int.): 284(2) [M + ], 241(2), 213(1), 197(1), 169(2), 141(1), 129(2), 127(4), 115(2), 113(2), 101(1), 99(5), 89(78) [C3H7COOH2 + ], 88(13), 85(9), 71(63), 57(34), 43(100); izraĉunato za C18H36O2: C 76,00, H 12,75, O 11,25%; naĊeno C 76,02, H 12,73, O 11,25%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,40-1,20 (preklopljeni signali, 22H, -(CH2)11-), 1,17 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,3 Hz, 3H, CH3-14‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C-12‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-11‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-13‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-14‟). Tetradecil-3-metilbutanoat [2e]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 80%; RI 2021, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2853, 1736 (C=O), 1466, 1391, 1373, 1251, 1185 (C-O), 1168 (C-O), 1120, 1096, 1003; EIMS m/z(rel. int.): 298(0,5) [M + ], 241(4), 197(3), 196(10), 169(2), 113(2), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(10), 85(44), 71(12), 57(58), 43(42); izraĉunato za C19H38O2: C 76,45, H 12,83, O 10,72%; naĊeno C 76,40, H 12,87, O 10,73%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,18 (dublet, J = 6,5 Hz, 2H, CH2-2), 2,13 (nonuplet, J = 6,5 Hz, 1H, CH-3), 1,62 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-3‟), 1,40-1,20 (preklopljeni signali, 22H, - (CH2)11-), 0,96 (dublet, J = 6,5 Hz, 6H, CH3-4, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-14‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 173,3 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 43,5 (C-2), 31,9 (C- 12‟), 29,6, 29,5 (C-5‟-C-10‟), 29,3, 29,2 (C-4‟, C-11‟), 28,6 (C-2‟), 25,9, 25,7 (C-3, C-3‟), 22,7 (C-13‟), 22,4 (C-4, C-5), 14,1 (C-14‟). Pentadecil-izobutanoat [2f]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 75%; RI 2031, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2853, 1736 (C=O), 1468, 1391, 1346, 1260, 1190 (C-O), 1155 (C-O), 1068; EIMS m/z(rel. int.): 298(3) [M + ], 255(4), 227(1), 211(2), 210(6), 183(1), 155(1), 129(1), 127(2), 113(1), 101(1), 99(3), 89(68) [C3H7COOH2 + ], 88(17), 85(11), 71(49), 57(31), 43(100); izraĉunato za C19H38O2: C 76,45, H 12,83, O 10,72%; naĊeno C 76,44, H 12,84, O 10,72%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,40-1,20 (preklopljeni signali, 24H, - (CH2)12-), 1,16 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,4 Hz, 3H, CH3-15‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C- 13‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-12‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-14‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-15‟). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 57 Pentadecil-2-metilbutanoat [2g]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 78%; RI 2131, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1734 (C=O), 1462, 1379, 1355, 1262, 1239, 1181 (C-O), 1150 (C-O), 1083, 1013; EIMS m/z(rel. int.): 312(1) [M + ], 255(3), 227(1), 211(2), 210(5), 183(1), 143(1), 127(1), 113(2), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(13), 101(1), 99(2), 85(36), 71(15), 57(82), 43(39); izraĉunato za C20H40O2: C 76,86, H 12,90, O 10,24%; naĊeno C 76,81, H 12,96, O 10,23%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3)) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,36 (sekstet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,79-1,37 (preklopljeni signali, 4H, CH2-3, CH2-2‟), 1,34-1,20 (preklopljeni signali, 24H, -(CH2)12-), 1,14 (dublet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3-5), 0,91 (triplet, J = 6,1 Hz, 3H, CH3- 4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-15‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 176,8 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 41,1 (C-2), 31,9 (C-13‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-12‟), 28,7 (C-2‟), 26,8 (C-3), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-14‟), 16,6 (C-5), 14,1 (C-15‟), 11,6 (C-4). Pentadecil-3-metilbutanoat [2h]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 72%; RI 2134, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1736 (C=O), 1466, 1368, 1293, 1253, 1185 (C-O), 1168 (C-O), 1120, 1096; EIMS m/z(rel. int.): 312(1) [M + ], 255(3), 227(1), 211(2), 210(7), 183(1), 169(1), 155(1), 143(2), 141(2), 115(2), 113(2), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(8), 101(2), 99(2), 85(51), 71(15), 57(64), 43(48); izraĉunato za C20H40O2: C 76,86, H 12,90, O 10,24%; naĊeno C 76,83, H 12,93, O 10,24%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,19 (dublet, J = 6,5 Hz, 2H, CH2-2), 2,13 (triplet septupleta, J = 6,5, 6,5 Hz, 1H, CH-3), 1,62 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-3‟), 1,40-1,18 (preklopljeni signali, 24H, -(CH2)12-), 0,96 (dublet, J = 6,5 Hz, 6H, CH3-4, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-15‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 173,3 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 43,5 (C-2), 31,9 (C-13‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-12‟), 28,6 (C-2‟), 25,9, 25,7 (C-3, C-3‟), 22,7 (C-14‟), 22,4 (C-4, C-5), 14,1 (C-15‟). Heksadecil-izobutanoat [2i]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 81%; RI 2143, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2853, 1736 (C=O), 1467, 1391, 1343, 1256, 1190 (C-O), 1155 (C-O), 1076; EIMS m/z(rel. int.): 312(2) [M + ], 269(7), 241(2), 227(1), 225(4), 197(1), 127(1), 99(2), 89(56) [C3H7COOH2 + ], 85(28), 71(81), 57(24), 43(100); izraĉunato za C20H40O2: C 76,86, H 12,90, O 10,24%; naĊeno C 76,87, H 12,91, O 10,22%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2- 2‟), 1,38-1,22 (preklopljeni signali, 26H, -(CH2)13-), 1,16 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3- 4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,5 Hz, 3H, CH3-16‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C-1, Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 58 C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C-14‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-13‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-15‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-16‟). Heksadecil-3-metilbutanoat [2j]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 83%; RI 2235, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2920, 2853, 1736 (C=O), 1466, 1369, 1294, 1250, 1185 (C-O), 1168 (C-O), 1120, 1097, 1002; EIMS m/z(rel. int.): 326(1) [M + ], 311(1), 269(7), 197(2), 183(1), 169(1), 155(2), 143(2), 141(2), 129(1), 127(2), 115(2), 113(3), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(21), 101(3), 99(4), 85(69), 71(15), 57(88), 43(67); izraĉunato za C21H42O2: C 77,24, H 12,96, O 9,80%; naĊeno C 77,20, H 12,98, O 9,82%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,19 (dublet, J = 6,5 Hz, 2H, CH2-2), 2,13 (triplet septupleta, J = 6,5, 6,5 Hz, 1H, CH-3), 1,62 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-3‟), 1,45-1,15 (preklopljeni signali, 26H, - (CH2)13-), 0,96 (dublet, J = 6,5 Hz, 6H, CH3-4, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-16‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 173,2 (C-1, C=O), 64.3 (C-1‟), 43,5 (C-2), 31,9 (C- 14‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-13‟), 28,6 (C-2‟), 25,9, 25,7 (C-3, C-3‟), 22,7 (C-15‟), 22,4 (C-4, C-5), 14,1 (C-16‟). Heptadecil-izobutanoat [2k]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 74%; RI 2243, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1736 (C=O), 1467, 1386, 1344, 1257, 1190 (C-O), 1155 (C-O), 1121, 1076; EIMS m/z(rel. int.): 326(2) [M + ], 283(4), 255(1), 239(1), 238(4), 211(1), 141(1), 129(1), 127(2), 115(1), 113(2), 101(1), 99(3), 89(79) [C3H7COOH2 + ], 88(30), 85(11), 71(59), 57(38), 43(100); izraĉunato za C21H42O2: C 77,24, H 12,96, O 9,80%; naĊeno C 77,24, H 12,95, O 9,81%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,38-1,20 (preklopljeni signali, 28H, - (CH2)14-), 1,16 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,3 Hz, 3H, CH3-17‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C- 15‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-14‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-16‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-17‟). Heptadecil-2-metilbutanoat [2l]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 72%; RI 2330, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2923, 2853, 1735 (C=O), 1463, 1379, 1349, 1300, 1258, 1238, 1182 (C-O), 1151 (C-O), 1122, 1080, 1031, 1013; EIMS m/z(rel. int.): 340(9) [M + ], 283(13), 255(1), 239(4), 238(13), 227(1), 211(2), 155(1), 143(1), 141(1), 113(3), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(12), 101(1), 99(4), 85(60), 71(31), 57(43), 43(64); izraĉunato za C22H44O2: C 77,58, H 13,02, O Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 59 9,40%; naĊeno C 77,61, H 13,00, O 9,39%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,36 (sekstet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,79-1,37 (preklopljeni signali, 4H, CH2- 3, CH2-2‟), 1,33-1,20 (preklopljeni signali, 28H, -(CH2)14-), 1,14 (dublet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3- 5), 0,91 (triplet, J = 6,1 Hz, 3H, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-17‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 176,8 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 41,1 (C-2), 31,9 (C-15‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-14‟), 28,7 (C-2‟), 26,8 (C-3), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-16‟), 16,6 (C-5), 14,1 (C- 17‟), 11,6 (C-4). Heptadecil-3-metilbutanoat [2m]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 77%; RI 2336, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1736 (C=O), 1466, 1369, 1294, 1253, 1185 (C-O), 1167 (C-O), 1120, 1097, 1001; EIMS m/z(rel. int.): 340(2) [M + ], 325(1), 283(10), 269(1), 255(2), 239(2), 238(6), 211(2), 155(2), 141(1), 113(3), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(32), 101(2), 99(2), 85(56), 71(21), 57(92), 43(48); izraĉunato za C22H44O2: C 77,58, H 13,02, O 9,40%; naĊeno C 77,57, H 13,01, O 9,42%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,19 (dublet, J = 6,5 Hz, 2H, CH2-2), 2,13 (triplet septupleta, J = 6,5, 6,5 Hz, 1H, CH-3), 1,62 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-3‟), 1,40-1,18 (preklopljeni signali, 28H, -(CH2)14-), 0,96 (dublet, J = 6,5 Hz, 6H, CH3-4, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,4 Hz, 3H, CH3-17‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 173,3 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 43,5 (C-2), 31,9 (C-15‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-14‟), 28,6 (C-2‟), 25,9, 25,7 (C-3, C-3‟), 22,7 (C-16‟), 22,4 (C-4, C-5), 14,1 (C-17‟). Oktadecil-izobutanoat [2n]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 87%; RI 2340, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1736 (C=O), 1467, 1391, 1341, 1255, 1190 (C-O), 1155 (C-O), 1077; EIMS m/z(rel. int.): 340(3) [M + ], 252(4), 169(1), 129(1), 115(1), 101(2), 99(6), 89(85) [C3H7COOH2 + ], 88(59), 85(19), 71(71), 57(59), 43(100); izraĉunato za C22H44O2: C 77,58, H 13,02, O 9,40%; naĊeno C 77,58, H 12,99, O 9,43%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,40-1,20 (preklopljeni signali, 30H, -(CH2)15-), 1,17 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-18‟); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C- 1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C-16‟), 29,6, 29,5 (C-5‟-C-14‟), 29,3, 29,2 (C-4‟, C-15‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-17‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-18‟). Oktadecil-butanoat [2o]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 72%; RI 2371, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2851, 1736 (C=O), 1467, 1391, 1341, 1255, 1190 (C-O), 1155 (C-O), 1077; Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 60 EIMS m/z(rel. int.): 340(2) [M + ], 129(1), 115(1), 101(1), 99(5), 89(80) [C3H7COOH2 + ], 88(57), 85(18), 71(60), 57(56), 43(100); izraĉunato za C22H44O2: C 77,58, H 13,02, O 9,40%; naĊeno C 77,62, H 13,00, O 9,38%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,30 (triplet, J = 7,0 Hz, 2H, CH2-2), 1,72-1,54 (preklopljeni signali, 4H, CH2-3, CH2-2‟), 1,38- 1,22 (preklopljeni signali, 30H, -(CH2)15-), 0,96 (triplet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-18‟); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173,8 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 36,3 (C-2), 31,9 (C-16‟), 29,6, 29,5 (C-5‟-C-14‟), 29,4, 29,3 (C-4‟, C-15‟), 28,7 (C-2‟), 25,7 (C- 3‟), 22,7 (C-17‟), 18,5 (C-3), 14,1 (C-18‟), 13,7 (C-4). Oktadecil-2-metilbutanoat [2p]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 72%; RI 2430, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2923, 2853, 1735 (C=O), 1463, 1379, 1349, 1299, 1258, 1238, 1182 (C-O), 1151 (C-O), 1122, 1080, 1031, 1013; EIMS m/z(rel. int.): 354(0,4) [M + ], 339(1), 297(5), 269(1), 253(1), 252(6), 169(1), 127(2), 115(3), 113(2), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(12), 101(2), 99(2), 85(23), 71(9), 57(29), 43(20); izraĉunato za C23H46O2: C 77,90, H 13,07, O 9,03%; naĊeno C 77,86, H 13,10, O 9,04%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,36 (sekstet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,79-1,37 (preklopljeni signali, 4H, CH2-3, CH2-2‟), 1,33- 1,20 (preklopljeni signali, 30H, -(CH2)15-), 1,14 (dublet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3-5), 0,91 (triplet, J = 6,1 Hz, 3H, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-18‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 176,8 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 41,1 (C-2), 31,9 (C-16‟), 29,6, 29,5 (C-5‟-C-14‟), 29,3, 29,2 (C-4‟, C-15‟), 28,7 (C-2‟), 26,8 (C-3), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-17‟), 16,6 (C-5), 14,1 (C-18‟), 11,6 (C-4). Oktadecil-3-metilbutanoat [2q]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 85%; RI 2436, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2920, 2852, 1736 (C=O), 1466, 1369, 1294, 1253, 1185 (C-O), 1168 (C-O), 1120, 1097, 1003; EIMS m/z(rel. int.): 354(1) [M + ], 339(1), 297(4), 253(2), 252(7), 225(1), 143(1), 129(1), 127(2), 115(1), 113(2), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(10), 101(2), 99(2), 85(28), 71(9), 57(33), 43(22); izraĉunato za C23H46O2: C 77,90, H 13,07, O 9,03%; naĊeno C 77,91, H 13,08, O 9,01%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,19 (dublet, J = 6,5 Hz, 2H, CH2-2), 2,13 (nonuplet, J = 6,5 Hz, 1H, CH-3), 1,62 (kvintet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-3‟), 1,40-1,18 (preklopljeni signali, 30H, -(CH2)15-), 0,96 (dublet, J = 6,5 Hz, 6H, CH3- 4, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,3 Hz, 3H, CH3-18‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 173,2 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 61 (C-1, C=O), 64,3 (C-1‟), 43,5 (C-2), 31,9 (C-16‟), 29,6, 29,5 (C-5‟-C-14‟), 29,3, 29,2 (C-4‟, C- 15‟), 28,6 (C-2‟), 25,9, 25,7 (C-3, C-3‟), 22,7 (C-17‟), 22,4 (C-4, C-5), 14,1 (C-18‟). Oktadecil-pentanoat [2r]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 74%; RI 2484, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2921, 2852, 1736 (C=O), 1466, 1368, 1293, 1252, 1185 (C-O), 1168 (C-O), 1120, 1096, 1003; EIMS m/z(rel. int.): 354(1) [M + ], 297(2), 269(2), 253(2), 239(1), 155(1), 127(2), 115(2), 113(2), 103(100) [C4H9COOH2 + ], 102(9), 101(3), 99(1), 85(38), 71(19), 57(22), 43(22); izraĉunato za C23H46O2: C 77,90, H 13,07, O 9,03%; naĊeno C 77,93, H 13,10, O 8,97%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-2‟), 2,32 (triplet, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-2), 1,67-1,54 (preklopljeni signali, 4H, CH2-3, CH2-2‟), 1,40-1,22 (preklopljeni signali, 32H, -(CH2)16-), 0,94 (triplet, J = 7,0 Hz, 3H, CH3-5), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3- 18‟); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 174,0 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,1 (C-2), 31,9 (C-16‟), 29,6, 29,5 (C-5‟-C-14‟), 29,4, 29,3 (C-4‟, C-15‟), 28,7 (C-2‟), 27,1 (C-3), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C- 17‟), 22,3 (C-4), 14,1 (C-18‟), 13,7 (C-5). Heneikozil-izobutanoat [2s]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 70%; RI 2746, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2920, 2852, 1736 (C=O), 1467, 1390, 1342, 1255, 1189 (C-O), 1154.7 (C-O), 1076; EIMS m/z(rel. int.): 294(1), 211(7), 169(1), 129(5), 115(10), 113(6), 101(5), 99(8), 89(87) [C3H7COOH2 + ], 88(47), 85(23), 71(45), 57(31), 43(100); izraĉunato za C25H50O2: C 78,47, H 13,17, O 8,36%; naĊeno C 78,50, H 13,14, O 8,36%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,40-1,20 (preklopljeni signali, 36H, -(CH2)18-), 1,17 (dublet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,4 Hz, 3H, CH3-21‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C- 1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C-19‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-18‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-20‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-21‟). Trikozil-izobutanoat [2t]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 76%; RI 2947, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2920, 2852, 1735 (C=O), 1467, 1390, 1342, 1255, 1189 (C-O), 1154 (C-O), 1076; EIMS m/z(rel. int.): 323(1), 295(1), 211(2), 183(1), 129(3), 115(16), 113(2), 101(23), 99(26), 89(92) [C3H7COOH2 + ], 88(42), 85(13), 71(64), 57(67), 43(100); izraĉunato za C27H54O2: C 78,96, H 13,25, O 7,79%; naĊeno C 78,95, H 13,26, O 7,79%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,06 (triplet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-1‟), 2,54 (septuplet, J = 7,0 Hz, 1H, CH-2), 1,62 (kvintet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-2‟), 1,40-1,20 (preklopljeni signali, 40H, -(CH2)20-), 1,17 (dublet, J = 7,0 Hz, Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 62 6H, CH3-3, CH3-4), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,4 Hz, 3H, CH3-23‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 177,2 (C-1, C=O), 64,4 (C-1‟), 34,0 (C-2), 31,9 (C-21‟), 29,6, 29,5, 29,3, 29,2 (C-4‟–C-20‟), 28,6 (C-2‟), 25,9 (C-3‟), 22,7 (C-22‟), 19,0 (C-3, C-4), 14,1 (C-23‟). 3.4.3. Sinteza biblioteke estara alilmetoksifenola 3.4.3.1. Sinteza regioizomernih alilmetoksifenola 3.4.3.1.1. Opšte uputstvo za O-metilovanje fenola Odgovarajući fenol, metil-jodid (1,1 molskih ekvivalenata) i anhidrovani kalijum- karbonat (1,5 molskih ekvivalenata) su rastvoreni/suspendovani u 50 ml suvog acetona. Dobivena suspenzija je refluktovana 4 h, a zatim mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Nakon toga, aceton je uparen na rotacionom vakuum uparivaĉu, dodato je 50 ml destilovane vode i vodeni sloj je ekstrahovan dietil-etrom (3 × 50 ml). Organski slojevi su spojeni, osušeni preko anhidrovanog magnezijum-sulfata, a rastvaraĉ je uparen na rotacionom vakuum-uparivaĉu. Kada su kao poĉetni materijal korišćeni benzendioli (rezorcinol, katehol i hidrohinon) dobivena sirova smeša mono- i di-orto metilovanih fenola je razdvojena kiselo-baznom ekstrakcijom. U drugim sluĉajevima, sirovi proizvodi su preĉišćeni hromatografijom (MPLC; heksana/dietil-etar, 6:1, v/v). Prinos ove reakcije je od 58% do 75%. 3.4.3.1.2. Opšte uputstvo za O-alilovanje fenola Odgovarajući metoksi- ili hidroksifenol, alil-bromid (1 molski ekvivalent) i anhidrovani kalijum-karbonat (1,1 molskih ekvivalenata) su rastvoreni/suspendovani u 50 ml N,N- dimetilformamida (DMF). Suspenzija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Kada su kao poĉeni materijal korišćeni benzendioli (rezorcinol, katehol i hidrohinon), u dobivenu sirovu smešu mono- i di-orto alilovanih fenola, dodato je 50 ml destilovane vode, a smeša proizvoda je razdvojena kiselo-baznom ekstrakcijom. Ukoliko su kao poĉetni reagensi korišćeni metoksifenoli, sirovi proizvodi su preĉišćeni hromatografijom (MPLC) na silika gelu korišćenjem smeše heksana i dietil-etra (6:1, v/v) kao eluenta. Prinos ove reakcije je od 71% do 82%. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 63 3.4.3.1.3. Dobivanje o-alilfenola (Klajzenovo (Claisen) premeštanje) Alilfenil-etri su zagrevani na 220 °C, u toku 4 h u atmosferi azota. Dobiveni proizvod je preĉišćen hromatografijom (MLPC) korišćenjem smeše heksana i dietil-etra u odnosu 6:1 (v/v). Prinos ove reakcije je od 68% do 86%. 3.4.3.2. Sinteza alilmetoksifenil estara Smeša odgovarajućeg fenola i kiseline, u molskom odnosu 1:1, DCC-a (1,1 molski ekvivalent) i DMAP-a (0,3 molskih ekvivalenata) u dihlormetanu mešana je preko noći, na sobnoj temperaturi. Istaloţena urea je uklonjena filtriranjem (dodatna koliĉina uree je istaloţena dodavanjem n-pentana i stajanjem preko noći u friţideru). Nakon uparavanja rastvaraĉa ostatak je preĉišćen gradijentnom hromatografijom (MPLC) korišćenjem smeše heksan/dietil-etar. Ĉistoća dobivenih estara nakon hromatografije je proveravana TLC i GC-MS analizama. Sintetisani estri (eugenil-2-metilbutanoat [3f], eugenil-3-metilbutanoat [3g], eugenil-angelat [3i], eugenil-senecioat [3j], eugenil-tiglat [3k], eugenil-oktanoat [3n], eugenil-benzoat [3v], 2-alil-3- metoksifenil-pentanoat [5h], 2-alil-3-metoksifenil-tiglat [5k], 2-alil-5-metoksifenil-pentanoat [6h], 2-alil-5-metoksifenil-tiglat [6k]) su potpuno spektralno okarakterisani (GC-MS, IR, UV- Vis, 1D i 2D-NMR) dok su preostali estri okarakterisani samo GC-MS analizom (maseni spektri i retencioni indeksi). Spektralni podaci i prinosi sintetisanih estara: 4-Alil-2-metoksifenil-formijat (eugenil-formijat) [3a]: bezbojna teĉnost; prinos: 84%; RI 1457, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 193(2), 192(16) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 150(6), 149(58), 147(8), 137(23), 133(31), 132(17), 131(44), 122(12), 121(27), 115(8), 107(6), 104(36), 103(57), 102(6), 94(12), 93(10), 91(63), 89(7), 79(17), 78(19), 77(61), 66(12), 63(17), 55(30), 53(12), 52(11), 51(32), 50(12), 41(13), 39(32). 4-Alil-2-metoksifenil-acetat (eugenil-acetat) [3b]: bezbojna teĉnost; prinos: 80%; RI 1519, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 206(6) [M + ], 164(100) [C10H12O2 + ], 149(23), 137(9), 133(13), 132(11), 131(20), 121(21), 115(6), 107(5), 104(13), 103(19), 91(23), 89(5), 79(6), 77(12), 66(4), 65(10), 55(12), 53(8), 52(6), 51(11), 43(38), 41(8), 39(13). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 64 4-Alil-2-metoksifenil-propanoat (eugenil-propanoat) [3c]: bezbojna teĉnost; prinos: 75%; RI 1613, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 220(4) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(25), 133(10), 132(8), 131(20), 105(7), 104(11), 103(14), 91(21), 77(12), 66(6), 65(6), 57(23), 55(10), 51(8), 39(10). 4-Alil-2-metoksifenil-izobutanoat (eugenil-izobutanoat) [3d]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1761, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 234(4) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 133(10), 132(5), 121(5), 104(9), 103(14), 71(11), 55(6), 43(35), 41(9). 4-Alil-2-metoksifenil-butanoat (eugenil-butanoat) [3e]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1705, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 234(2) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(19), 133(10), 132(7), 131(12), 121(5), 104(10), 103(11), 91(16), 79(5), 77(11), 71(10), 65(7), 55(6), 43(28), 41(16), 39(9). 4-Alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoat (eugenil-2-metilbutanoat) [3f]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1761, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2929, 2854, 1757, 1639, 1601, 1509, 1450, 1266, 1201, 1122, 1036, 996, 892, 747; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 199 (2,67), 217 (0,73), 258 (0,23), 273 (0,20); EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(13), 133(7), 132(5), 131(8), 104(6), 103(8), 91(11), 77(8), 57(43), 55(5), 41(13), 39(5); izraĉunato za C15H20O3: C 72,55, H 8,12, O 19,33%; naĊeno C 72,50, H 8,15, O 19,35%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 6,94 (dublet, J = 7,9 Hz, 1H, CH-6), 6,80 (dublet, J = 1,8 Hz, 1H, CH-3), 6,77 (dublet dubleta, J = 7,9, 1,8 Hz, 1H, CH-5), 5,98 (dublet dubleta tripleta, J = 17,0, 10,1, 6,7 Hz, 1H, CH-9), 5,12 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), 5,10 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,81 (singlet, 3H, CH3-7), 3,39 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8,), 2,67 (sekstet, J = 7,1 Hz, 1H, CH-12), 1,85 (kvintet, J = 7,1 Hz, 2H, CH2-13), 1,32 (dublet, J = 7,1 Hz, 3H, CH3-15), 1,06 (triplet, J = 7,1 Hz, 3H, CH3-14); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 174,7 (C=O), 151,0 (C-2), 138,7 (C-4), 138,3 (C-1), 137,1 (C-9), 122,5 (C-6), 120,7 (C-5), 116,0 (C-10), 112,9 (C-3), 55,8 (C-7), 41,0 (C-12), 40,0 (C-8), 25,4 (C- 13), 16,7 (C-15), 11,4 (C-14). 4-Alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoat (eugenil-3-metilbutanoat) [3g]: bezbojna teĉnost; prinos: 55%; RI 1769, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2960, 2873, 1758, 1638, 1603, 1506, 1464, 1418, 1266, 1183, 1146, 1120, 1033, 994, 912, 816, 747, 674; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 65 200 (3,44), 216 (1,31), 274 (0,37), 280 (0,35); EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(30) [C10H12O2 + ], 149(16), 133(9), 132(6), 131(9), 103(9), 91(15), 85(7), 77(9), 65(6), 57(23), 55(6), 43(7), 41(20), 39(9); izraĉunato za C15H20O3: C 72,55, H 8,12, O 19,33%; naĊeno C 72,52, H 8,13, O 19,35%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 6,95 (dublet, J = 8,0 Hz, 1H, CH-6), 6,81 (dublet, J = 1,8 Hz, 1H, CH-3), 6,79 (dublet dubleta, J = 8,0, 1,8 Hz, 1H, CH-5), 6,00 (dublet dubleta tripleta, J = 17,0, 10,1, 6,7 Hz, 1H, CH-9), 5,13 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), 5,11 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,83 (singlet, 3H, CH3-7), 3,40 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8), 2,47 (dublet, J = 7,1 Hz, 2H, CH2-12), 2,29 (nonuplet, J = 7,1 Hz, 1H, CH-13), 1,10 (dublet, J = 7,1 Hz, 6H, CH3-14 and CH3-15); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 171,1 (C=O), 151,0 (C-2), 138,8 (C-4), 138,2 (C-1), 137,1 (C-9), 122,6 (C-6), 120,7 (C-5), 116,0 (C-10), 112,9 (C-3), 55,8 (C-7), 43,1 (C-12), 40,1 (C-8), 25,9 (C- 13), 22,3 (C-14, C-15). 4-Alil-2-metoksifenil-pentanoat (eugenil-pentanoat) [3h]: bezbojna teĉnost; prinos: 52%; RI 1816, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(17), 133(9), 132(6), 131(10), 104(7), 103(8), 91(10), 77(7), 57(13), 55(6), 41(10). 4-Alil-2-metoksifenil-angelat (eugenil-angelat) [3i]: bezbojna teĉnost; prinos: 59%; RI 1800, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2929, 1730, 1647, 1602, 1507, 1455, 1419, 1265, 1223, 1200, 1119, 1033, 913, 847, 797, 747; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 200 (3,44), 217 (2,22), 274 (0,33); EIMS m/z(rel. int.): 246(5) [M + ], 164(28) [C10H12O2 + ], 103(5), 91(10), 84(5), 83(100), 77(6), 55(72), 53(5), 39(8); izraĉunato za C15H18O3: C 73,14, H 7,37, O 19,49%; naĊeno C 73,19, H 7,35, O 19,46%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 6,97 (dublet, J = 7,9 Hz, 1H, CH-6), 6,80 (dublet, J = 1,8 Hz, 1H, CH-3), 6,77 (dublet dubleta, J = 7,9, 1,8 Hz, 1H, CH-5), 6,19 (kvartet kvarteta, J = 6,0, 1,6 Hz, 1H, CH-13), 5,96 (dublet dubleta tripleta, J = 17,0, 10,1, 6,7 Hz, 1H, CH-9), 5,10 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), 5,08 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,80 (singlet, 3H, CH3-7), 3,37 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8), 2,08–2,03 (preklopljeni signali, 6H, CH3-14 and CH3-15); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 166,1 (C=O), 151,1 (C-2), 139,2 (C-13), 138,7 (C-4), 138,2 (C-1), 137,2 (C-9), 127,5 (C-12), 122,7 (C-6), 120,7 (C-5), 116,0 (C-10), 112,9 (C-3), 55,9 (C-7), 40,1 (C-8), 20,1 (C-14), 15,8 (C-15). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 66 4-Alil-2-metoksifenil-senecioat (eugenil-senecioat) [3j]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1857, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2937, 2837, 1731, 1649, 1602, 1507, 1464, 1420, 1264, 1201, 1119, 1061, 1036, 952, 847, 817, 751; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 203 (3,61), 216 (3,18), 275 (0,44); EIMS m/z(rel. int.): 246(3) [M + ], 165(5), 164(40) [C10H12O2 + ], 103(5), 91(8), 84(5), 83(100), 77(5), 55(21), 39(7); izraĉunato za C15H18O3: C 73,14, H 7,37, O 19,49%; naĊeno C 73,15, H 7,36, O 19,49%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 6,98 (dublet, J = 8,0 Hz, 1H, CH-6), 6,82 (dublet, J = 1,8 Hz, 1H, CH-3), 6,79 (dublet dubleta, J = 8,0, 1,8 Hz, 1H, CH-5), 6,05-5,94 (preklopljeni signali, 2H, CH-9 i CH-12), 5,13 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), 5,11 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,84 (singlet, 3H, CH3-7), 3,41 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8), 2,25 (dublet, J = 1,3 Hz, 3H, CH3-15), 2,00 (dublet, J = 1,3 Hz, 3H, CH3-14); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 164,5 (C=O), 159,2 (C- 13), 151,2 (C-2), 138,6 (C-4), 138,0 (C-1), 137,2 (C-9), 122,9 (C-6), 120,7 (C-5), 116,0 (C-10), 115,2 (C-12), 112,9 (C-3), 55,9 (C-7), 40,1 (C-8), 27,5 (C-14), 20,4 (C-15). 4-Alil-2-metoksifenil-tiglat (eugenil-tiglat) [3k]: bezbojna teĉnost; prinos: 63%; RI 1861, DB- 5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2973, 2937, 2916, 2833, 1718, 1651, 1601, 1509, 1467, 1440, 1421, 1286, 1203, 1189, 1152, 1112, 1081, 1034, 1001, 911, 855, 795, 756, 717, 674; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 199 (2,87), 216 (1,65), 274 (0,21); EIMS m/z(rel. int.): 246(6) [M + ], 164(100) [C10H12O2 + ], 103(5), 91(9), 84(5), 83(100), 77(6), 55(61), 53(5), 39(8); izraĉunato za C15H18O3: C 73,14, H 7,37, O 19,49%; naĊeno C 73,18, H 7,34, O 19,48%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 7,13 (kvartet kvarteta, J = 7,0, 1,3 Hz, 1H, CH-13), 6,98 (dublet, J = 7,9 Hz, 1H, CH- 6), 6,82 (dublet, J = 1,8 Hz, 1H, CH-3), 6,79 (dublet dubleta, J = 7,9, 1,8 Hz, 1H, CH-5), 6,00 (dublet dubleta tripleta, J = 17,0, 10,1, 6,7 Hz, 1H, CH-9), 5,13 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), 5,11 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,83 (singlet, 3H, CH3-7), 3,41 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8), 1,98 (pseudo kvintet, J = 1,3 Hz, 3H, CH3-15), 1,90 (dublet kvarteta, J = 7,0, 1,3 Hz, 3H, CH3-14); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 166,2 (C=O), 151,2 (C-2), 138,9 (C-13), 138,6 (C-4), 138,5 (C-1), 137,2 (C-9), 128,1 (C-12), 122,7 (C-6), 120,7 (C-5), 116,0 (C-10), 112,9 (C-3), 55,9 (C-7), 40,1 (C-8), 14,5 (C-14), 12,2 (C-15). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 67 4-Alil-2-metoksifenil-heksanoat (eugenil-heksanoat) [3l]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1910, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 262(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(14), 133(7), 132(5), 131(8), 104(6), 103(7), 91(11), 77(7), 65(4), 55(7), 43(18), 41(10). 4-Alil-2-metoksifenil-heptanoat (eugenil-heptanoat) [3m]: bezbojna teĉnost; prinos: 63%; RI 2011, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 276(1) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(12), 133(6), 132(5), 131(7), 104(5), 103(7), 91(10), 77(6), 55(8), 43(18), 41(12). 4-Alil-2-metoksifenil-oktanoat (eugenil-oktanoat) [3n]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 2113, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2961, 2872, 1756, 1638, 1604, 1464, 1420, 1267, 1182, 1148, 1120, 1031, 990, 911, 818, 747; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 200 (3,22), 215 (1,82), 273 (0,57); EIMS m/z(rel. int.): 290(0,8) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(10), 133(5), 131(6), 104(5), 103(6), 91(8), 77(5), 57(11), 55(9), 43(8), 41(12); izraĉunato za C18H26O3: C 74,45, H 9,02, O 16,53%; naĊeno C 74,44, H 9,03, O 16,53%; 1 H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 6,93 (dublet, J = 7,9 Hz, 1H, CH-6), 6,78 (dublet, J = 1,7 Hz, 1H, CH-3), 6,76 (dublet dubleta, J = 7,9, 1,7 Hz, 1H, CH-5), 5,95 (dublet dubleta tripleta, J = 17,0, 10,1, 6,7 Hz, 1H, CH- 9), 5,09 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), 5,07 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,80 (singlet, 3H, CH3-7), 3,37 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8), 2,56 (triplet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-12), 1,73 (kvintet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-13), 1,48-1,42 (multiplet, 2H, CH2-14), 1,39-1,25 (preklopljeni signali, 6H, CH2-17, CH2-16, CH2-15), 0,90 (triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-18); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 172,1 (C-11), 150,9 (C-2), 138,8 (C-4), 138,1 (C-1), 137,1 (C-9), 122,5 (C-6), 120,7 (C-5), 116,1 (C-10), 112,7 (C-3), 55,8 (C-7), 40,1 (C-8), 34,1 (C-12), 31,7 (C-16), 29,0 (C-14, C-15), 25,1 (C-13), 22,6 (C-17), 14,1 (C- 18). 4-Alil-2-metoksifenil-nonanoat (eugenil-nonanoat) [3o]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 2215, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 304(0,5) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(9), 133(5), 131(5), 104(5), 103(5), 91(7), 77(4), 57(7), 55(10), 43(11), 41(13). 4-Alil-2-metoksifenil-dekanoat (eugenil-dekanoat) [3p]: bezbojna teĉnost; prinos: 59%; RI 2317, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 318(0,6) [M + ], 165(9), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(11), 133(3), 131(4), 104(8), 103(6), 91(7), 77(5), 57(5), 55(9), 43(12), 41(15). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 68 4-Alil-2-metoksifenil-dodekanoat (eugenil-dodekanoat) [3q]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 57%; RI 2518, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 346(0,4) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 133(4), 131(4), 104(3), 103(3), 91(4), 77(3), 57(5), 55(9), 43(9), 41(9). 4-Alil-2-metoksifenil-tetradekanoat (eugenil-tetradekanoat) [3r]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 61%; RI 2721, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 374(0,3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(6), 133(3), 131(3), 104(3), 103(3), 91(3), 77(2), 69(3), 57(5), 55(8), 43(9), 41(8). 4-Alil-2-metoksifenil-heksadekanoat (eugenil-heksadekanoat) [3s]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 59%; RI 2923, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 402(0,1) [M + ], 165(5), 164(100) [C10H12O2 + ], 133(3), 132(3), 131(4), 104(3), 103(2), 91(4), 77(2), 69(3), 57(5), 55(9), 43(14), 41(11). 4-Alil-2-metoksifenil-oktadekanoat (eugenil-oktadekanoat) [3t]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 63%; RI 3121, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 430(0,2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(5), 133(3), 132(2), 131(3), 104(2), 103(2), 91(3), 77(2), 69(4), 57(6), 55(9), 43(10), 41(7). 4-Alil-2-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoat (eugenil-(Z)-9-oktadecenoat) [3u]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 61%; RI 3099, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 428(0,2) [M+], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(5), 133(3), 132(2), 131(3), 104(3), 103(2), 91(3), 77(2), 69(4), 67(4), 57(3), 55(10), 43(5), 41(7). 4-Alil-2-metoksifenil-benzoat (eugenil-benzoat) [3v]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 65%; RI 2124, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2963, 2911, 1735, 1639, 1603, 1509, 1450, 1419, 1260, 1201, 1174, 1060, 1037, 999, 908, 802, 703; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 199 (3,14), 220 (0,86), 274 (0,14), 280 (0,22); EIMS m/z(rel. int.): 269(3), 268(18) [M + ], 106(8), 105(100) [C7H5O + ], 91(6), 78(3), 77(29), 65(2), 51(5); izraĉunato za C17H16O3: C 76,10, H 6,01, O 17,89%; naĊeno C 76,14, H 6,02, O 17,84%; 1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ 8,27-8,23 (multiplet, 2H, CH-17, CH-13), 7,65 (triplet tripleta, J = 7,9, 1,6 Hz, 1H, CH-15), 7,53 (široki triplet, J = 7,9 Hz, 2H, CH-14, CH-16), 7,10 (dublet, J = 7,9 Hz, 1H, CH-6), 6,87 (dublet, J = 1,7 Hz, 1H, CH-3), 6,85 (dublet dubleta, J = 7,9, 1,7 Hz, 1H, CH-5), 6,02 (dublet dubleta tripleta, J = 17,0, 10,1, 6,7 Hz, 1H, CH-9), 5,16 (pseudo dublet kvarteta, J = 17,0, 1,7 Hz, 1H, CH-10trans), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 69 5,14 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H, CH-10cis), 3,83 (singlet, 3H, CH3-7), 3,44 (široki dublet, J = 6,7 Hz, 2H, CH2-8); 13 C NMR (101 MHz, CDCl3), δ 164,9 (C-11), 151,0 (C- 2), 139,1 (C-4), 138,2 (C-1), 137,1 (C-9), 133,4 (C-15), 130,3 (C-17, C-13), 129,6 (C-12), 128,5 (C-16, C-14), 122,7 (C-6), 120,8 (C-5), 116,2 (C-10), 112,9 (C-3), 55,9 (C-7), 40,1 (C-8). 4-Alil-2-metoksifenil-salicilat (eugenil-salicilat) [3w]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 70%; RI 2203, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 285(3), 284(14) [M + ], 165(7), 164(77), 149(11), 137(3), 133(5), 132(5), 131(9), 122(10), 121(100) [C7H5O2 + ], 115(3), 105(3), 104(6), 103(10), 93(15), 92(8), 91(15), 79(4), 77(10), 65(32), 64(5), 63(7), 55(4), 53(4), 51(6), 39(14). 2-Alil-4-metoksifenil-formijat [4a]: bezbojna teĉnost; prinos: 79%; RI 1454, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 193(2), 192(9) [M + ], 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 150(5), 149(39), 148(4), 147(11), 137(7), 135(6), 134(7), 133(16), 132(21), 131(45), 122(7), 121(39), 119(4), 115(8), 107(5), 106(4), 105(15), 104(24), 103(57), 102(7), 94(7), 93(11), 92(7), 91(58), 90(4), 89(7), 79(12), 78(17), 77(54), 76(4), 66(9), 65(28), 64(7), 63(17), 62(7), 55(12), 53(10), 52(8), 51(24), 50(11), 43(4), 41(6), 39(25), 38(5). 2-Alil-4-metoksifenil-acetat [4b]: bezbojna teĉnost; prinos: 75%; RI 1517, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 206(5) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(22), 147(5), 133(8), 132(11), 131(21), 121(17), 105(7), 104(11), 103(19), 91(24), 89(3), 79(5), 78(5), 77(15), 65(11), 55(4), 51(8), 43(28), 39(9). 2-Alil-4-metoksifenil-propanoat [4c]: bezbojna teĉnost; prinos: 72%; RI 1610, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 220(4) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(18), 147(4), 133(7), 132(10), 131(15), 105(5), 104(8), 103(14), 91(19), 79(4), 77(11), 65(9), 57(23), 55(4), 51(4), 39(7). 2-Alil-4-metoksifenil-izobutanoat [4d]: bezbojna teĉnost; prinos: 72%; 61%; RI 1652, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 234(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(14), 133(5), 132(8), 131(12), 121(8), 105(5), 104(6), 103(13), 91(17), 77(10), 71(13), 65(8), 55(3), 51(4), 43(33), 41(13), 39(9). 2-Alil-4-metoksifenil-butanoat [4e]: bezbojna teĉnost; prinos: 56%; RI 1703, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 234(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(16), 137(5), 133(11), 132(7), 131(13), 121(6), 105(5), 104(8), 91(19), 79(6), 78(4), 77(10), 65(9), 55(4), 43(31), 41(21), 39(8). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 70 2-Alil-4-metoksifenil-2-metilbutanoat [4f]: bezbojna teĉnost; prinos: 54%; RI 1760, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(26), 103(6), 91(9), 77(7), 65(5), 57(40), 41(10), 39(5). 2-Alil-4-metoksifenil-3-metilbutanoat [4g]: bezbojna teĉnost; prinos: 55%; RI 1766, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(11), 147(5), 133(5), 132(6), 131(10), 121(5), 104(6), 103(11), 91(16), 85(9), 77(9), 65(7), 57(33), 55(5), 43(7), 41(18), 39(10). 2-Alil-4-metoksifenil-pentanoat [4h]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1815, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(5), 164(42) [C10H12O2 + ], 149(9), 91(6), 84(6), 83(100), 55(21), 53(5), 39(7). 2-Alil-4-metoksifenil-angelat [4i]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1796, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(6) [M + ], 164(30) [C10H12O2 + ], 149(6), 103(5), 91(8), 84(6), 83(100), 77(6), 65(5), 55(74), 53(6), 39(8). 2-Alil-4-metoksifenil-senecioat [4j]: bezbojna teĉnost; prinos: 69%; RI 1851, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(3) [M + ], 165(5), 164(42) [C10H12O2 + ], 149(9), 91(6), 84(6), 83(100), 77(5), 55(21), 53(5), 39(7). 2-Alil-4-metoksifenil-tiglat [4k]: bezbojna teĉnost; prinos: 70%; RI 1853, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(7) [M + ], 165(5), 164(29) [C10H12O2 + ], 149(5), 103(5), 91(7), 84(5), 83(100), 77(5), 65(5), 55(63), 53(5), 39(8). 2-Alil-4-metoksifenil-heksanoat [4l]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1908, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 262(2) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(14), 133(7), 132(5), 131(8), 121(4), 104(7), 103(8), 99(4), 91(11), 77(7), 71(5), 65(4), 55(8), 43(20), 41(11), 39(7). 2-Alil-4-metoksifenil-heptanoat [4m]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 2010, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 276(0,8) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(12), 133(6), 132(5), 131(7), 121(3), 104(5), 103(7), 91(10), 77(6), 65(4), 57(3), 55(9), 43(19), 41(13), 39(5). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 71 2-Alil-4-metoksifenil-oktanoat [4n]: bezbojna teĉnost; prinos: 55%; RI 2112, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 290(0,6) [M + ], 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(10), 133(5), 132(4), 131(6), 104(5), 103(6), 91(8), 77(5), 65(3), 57(12), 55(10), 43(9), 41(15). 2-Alil-4-metoksifenil-nonanoat [4o]: bezbojna teĉnost; prinos: 53%; RI 2213, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 304(0,6) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(10), 133(6), 131(5), 104(4), 103(5), 91(8), 77(6), 55(10), 43(12), 41(9). 2-Alil-4-metoksifenil-dekanoat [4p]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 2316, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 318(0,5) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(8), 133(5), 131(3), 104(9), 103(5), 91(8), 77(3), 57(8), 55(6), 43(11), 41(9). 2-Alil-4-metoksifenil-dodekanoat [4q]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 62%; RI 2517, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 346(0,4) [M + ], 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 133(4), 132(3), 131(4), 104(3), 103(4), 91(5), 77(3), 57(6), 55(11), 43(12), 41(11). 2-Alil-4-metoksifenil-tetradekanoat [4r]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 56%; RI 2719, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 374(0,3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(6), 133(3), 131(4), 104(3), 103(3), 91(4), 77(3), 69(3), 68(3), 57(5), 55(10), 43(11), 41(10). 2-Alil-4-metoksifenil-heksadekanoat [4s]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 54%; RI 2921, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 402(0,2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(5), 133(3), 104(3), 103(3), 91(3), 77(2), 69(4), 57(6), 55(10), 43(12), 41(9). 2-Alil-4-metoksifenil-oktadekanoat [4t]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 57%; RI 3118, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 430(0,2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(4), 132(2), 131(3), 103(3), 91(3), 77(2), 71(3), 69(4), 57(8), 55(9), 43(12), 41(7). 2-Alil-4-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoat [4u]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 53%; RI 3098, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 428(0,2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(4), 132(3), 131(3), 103(3), 91(3), 77(3), 69(5), 67(5), 57(3), 55(12), 43(5), 41(8). 2-Alil-4-metoksifenil-benzoat [4v]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 61%; RI 2120, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 269(2), 268(7) [M + ], 148(4), 106(8), 105(100) [C7H5O + ], 103(4), 91(8), 78(4), 77(38), 65(4), 51(11), 50(3), 39(3). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 72 2-Alil-4-metoksifenil-salicilat [4w]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 65%; RI 2199, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 285(3), 284(12) [M + ], 165(3), 164(29), 149(4), 133(2), 132(3), 131(4), 122(7), 121(100) [C7H5O2 + ], 115(2), 105(2), 104(3), 103(7), 93(12), 92(5), 91(10), 79(2), 77(6), 66(3), 65(25), 64(4), 63(5), 55(3), 53(3), 51(4), 39(11). 2-Alil-3-metoksifenil-formijat [5a]: bezbojna teĉnost; prinos: 74%; RI 1432, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 193(3), 192(12) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(8), 150(3), 149(41), 148(6), 147(11), 137(8), 135(6), 134(7), 133(15), 132(15), 131(49), 122(5), 121(52), 115(5), 107(6), 106(8), 105(16), 104(28), 103(52), 102(3), 94(5), 93(15), 92(8), 91(65), 89(5), 79(13), 78(18), 77(56), 66(11), 65(29), 64(7), 63(15), 55(11), 53(9), 52(8), 51(25), 50(5), 43(6), 41(4), 39(31), 38(8). 2-Alil-3-metoksifenil-acetat [5b]: bezbojna teĉnost; prinos: 77%; RI 1489, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 207(2), 206(12) [M + ], 205(3), 192(7), 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(38), 162(4), 161(5), 150(4), 149(28), 148(8), 147(18), 138(4), 137(36), 135(26), 134(4), 133(19), 132(4), 131(10), 122(19), 121(40), 120(6), 119(4), 107(21), 106(4), 105(5), 104(6), 103(30), 102(8), 94(9), 93(10), 92(5), 91(30), 90(4), 89(7), 81(6), 79(16), 78(14), 77(38), 76(5), 74(6), 69(13), 67(6), 66(9), 65(21), 63(13), 56(11), 55(13), 54(6), 53(14), 43(33), 42(8), 39(26). 2-Alil-3-metoksifenil-propanoat [5c]: bezbojna teĉnost; prinos: 76%; RI 1581, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 220(14) [M + ], 166(6), 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(43), 161(7), 149(14), 147(15), 141(5), 137(18), 133(13), 131(5), 122(19), 121(33), 119(4), 105(11), 103(14), 100(5), 97(8), 94(8), 91(21), 83(11), 82(12), 80(6), 79(11), 78(9), 77(25), 74(11), 70(6), 69(13), 67(13), 66(10), 65(11), 63(9), 60(6), 57(39), 56(40), 55(16), 53(7), 51(20), 44(14), 43(16), 42(13), 41(22), 39(21). 2-Alil-3-metoksifenil-izobutanoat [5d]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1625, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 235(4), 234(22) [M + ], 165(94), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(13), 149(19), 148(12), 147(12), 135(23), 133(10), 131(7), 121(10), 105(9), 104(3), 103(14), 91(19), 79(7), 78(8), 77(18), 71(31), 65(11), 63(5), 55(4), 53(5), 51(9), 43(98), 41(24), 39(16). 2-Alil-3-metoksifenil-butanoat [5e]: bezbojna teĉnost; prinos: 61%; RI 1670, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 235(3), 234(17) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(7), 149(21), 148(8), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 73 147(10), 137(5), 135(29), 133(11), 131(7), 121(10), 105(7), 103(11), 91(15), 79(6), 78(6), 77(15), 71(21), 65(9), 55(5), 51(7), 43(50), 41(18), 39(12). 2-Alil-3-metoksifenil-2-metilbutanoat [5f]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1726, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(9) [M + ], 165(7), 164(86) [C10H12O2 + ], 149(6), 133(7), 131(6), 115(2), 107(10), 105(7), 79(6), 77(13), 65(6), 57(100), 55(8), 41(9). 2-Alil-3-metoksifenil-3-metilbutanoat [5g]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1730, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(10) [M + ], 177(8), 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(27), 151(5), 149(19), 148(5), 147(8), 137(5), 135(20), 133(8), 131(5), 125(11), 124(13), 123(5), 121(6), 107(9), 105(5), 103(8), 96(7), 95(7), 91(13), 85(13), 83(35), 82(17), 81(29), 79(9), 78(5), 77(14), 69(6), 68(6), 67(13), 65(8), 57(44), 56(7), 55(71), 54(10), 53(13), 51(7), 43(34), 42(8), 41(67), 39(27). 2-Alil-3-metoksifenil-pentanoat [5h]: bezbojna teĉnost; prinos: 61%; RI 1779, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2958, 2933, 2873, 1756, 1638, 1605, 1588, 1468, 1439, 1267, 1231, 1208, 1139, 1111, 1065, 993, 906, 851, 783, 736; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 199 (2,78), 216 (2,44), 272 (0,20); EIMS m/z(rel. int.): 248(14) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(7), 149(19), 147(8), 137(5), 135(23), 133(9), 131(5), 121(7), 107(10), 105(5), 103(9), 91(14), 85(13), 79(5), 78(5), 77(13), 57(37), 55(8), 51(6), 41(22); izraĉunato za C15H20O3: C 72,55, H 8,12, O 19,33%; naĊeno C 72,52, H 8,15, O 19,33%; 1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ 7,19 (triplet, J = 8,2 Hz, 1H, CH-5), 6,75 (dublet, J = 8,2 Hz, 1H, CH-6), 6,67 (dublet, J = 8,2 Hz, 1H, CH-4), 5,86 (dublet dubleta tripleta, J = 16,4, 10,2, 6,2 Hz, 1H, CH-9), 4,97 (pseudo dublet kvarteta, J = 16,4, 1,5 Hz, 1H, CH-10trans), 4,95 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,2, 1,5 Hz, 1H, CH-10cis), 3,82 (singlet, 3H, CH3-7), 3,32 (široki dublet, J = 6,2 Hz, 2H, CH2-8), 2,56 (triplet, J = 7,6 Hz, 2H, CH2-12), 1,74 (kvintet, J = 7,6 Hz, 2H, CH2-13), 1,44 (sekstet, J = 7,6 Hz, 2H, CH2-14), 0,97 (triplet, J = 7,6 Hz, 3H, CH3-15); 13 C NMR (150 MHz, CDCl3), δ 172,2 (C=O), 158,4 (C-3), 149,9 (C-1), 135,7 (C-9), 127,2 (C-5), 120,8 (C-2), 114,9 (C-4), 114,8 (C-10), 108,1 (C-6), 56,0 (C-7), 34,1 (C-12), 28,2 (C-8), 27,0 (C-13), 22,3 (C-14), 13,7 (C-15). 2-Alil-3-metoksifenil-angelat [5i]: bezbojna teĉnost; prinos: 59%; RI 1765, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(10) [M + ], 148(5), 103(5), 91(6), 84(7), 83(100) [C5H7O + ], 77(5), 65(6), 56(5), 55(78), 53(8), 51(7), 39(8). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 74 2-Alil-3-metoksifenil-senecioat [5j]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1812, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(3) [M + ], 164(20), 163(5), 149(6), 91(6), 84(5), 83(100) [C5H7O + ], 77(5), 55(19), 53(5), 39(6). 2-Alil-3-metoksifenil-tiglat [5k]: bezbojna teĉnost; prinos: 59%; RI 1815, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2933, 2837, 1723, 1650, 1637, 1604, 1589, 1468, 1439, 1264, 1234, 1208, 1111, 1065, 1012, 993, 909, 868, 843, 770, 741, 723; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 200 (3,44), 217 (2,66), 270 (0,22); EIMS m/z(rel. int.): 246(11) [M + ], 164(5), 163(8), 91(6), 84(6), 83(100) [C5H7O + ], 77(6), 55(55), 39(7); izraĉunato za C15H18O3: C 73,15, H 7,36, O 19,49%; naĊeno C 73,15, H 7,38, O 19,47%; 1 H NMR (600 MHz, CDCl3), δ 7,19 (triplet, J = 8,2 Hz, 1H, CH-5), 7,11 (kvartet kvarteta, J = 7,0, 1,3 Hz, 1H, CH-13), 6,75 (dublet, J = 8,2 Hz, 1H, CH-6), 6,70 (dublet, J = 8,2 Hz, 1H, CH-4), 5,86 (dublet dubleta tripleta, J = 16,5, 10,2, 6,2 Hz, 1H, CH-9), 4,94 (pseudo dublet kvarteta, J = 16,5, 1,6 Hz, 1H, CH-10trans), 4,93 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,2, 1,6 Hz, 1H, H-10cis), 3,82 (singlet, 3H, CH3-7), 3,31 (široki dublet, J = 6,2 Hz, 2H, CH2-8), 1,95 (široki signal, 3H, CH3-15), 1,88 (dublet kvarteta, J = 7,0, 1,3 Hz, 3H, CH3-14); 13 C NMR (150 MHz, CDCl3), δ 166,4 (C=O), 158,4 (C-3), 150,1 (C-1), 139,2 (C-13), 135,8 (C-9), 128,2 (C-12), 127,1 (C-5), 120,9 (C-2), 115,0 (C-4), 114,8 (C-10), 107,9 (C-6), 55,8 (C-7), 28,2 (C-8), 14,6 (C-14), 12,2 (C-15). 2-Alil-3-metoksifenil-heksanoat [5l]: bezbojna teĉnost; prinos: 63%; RI 1869, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 263(2), 262(11) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(17), 148(6), 147(8), 135(20), 133(7), 131(5), 121(6), 107(8), 105(5), 103(8), 99(9), 91(12), 78(4), 77(11), 71(13), 65(6), 55(9), 51(4), 43(40), 42(5), 41(15), 39(9). 2-Alil-3-metoksifenil-heptanoat [5m]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1971, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 277(2), 276(11) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(14), 148(5), 147(5), 135(17), 133(6), 131(4), 121(5), 113(6), 107(6), 105(4), 103(6), 91(9), 85(5), 77(8), 65(5), 57(5), 55(9), 43(33), 41(15), 39(6). 2-Alil-3-metoksifenil-oktanoat [5n]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 2073, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 291(2), 290(9) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(11), 148(5), 147(5), 135(15), 133(5), 131(3), 115(3), 103(6), 91(8), 77(7), 65(4), 57(29), 55(9), 43(14), 41(16), 39(5). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 75 2-Alil-3-metoksifenil-nonanoat [5o]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 2175, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 305(2), 304(8) [M + ], 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(11), 148(5), 147(5), 137(5), 135(14), 133(5), 131(3), 103(5), 91(7), 77(6), 71(9), 65(3), 57(13), 55(11), 43(18), 41(17), 39(5). 2-Alil-3-metoksifenil-dekanoat [5p]: bezbojna teĉnost; prinos: 55%; RI 2279, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 319(1), 318(5) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 148(3), 147(4), 137(3), 135(9), 133(5), 131(4), 103(9), 91(7), 77(7), 71(8), 57(6), 55(11), 43(13), 41(15). 2-Alil-3-metoksifenil-dodekanoat [5q]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 58%; RI 2480, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 347(2), 346(6) [M + ], 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(8), 148(4), 147(3), 137(4), 135(10), 133(3), 131(2), 107(4), 103(4), 91(4), 77(4), 71(4), 57(11), 55(11), 43(17), 41(14), 39(3). 2-Alil-3-metoksifenil-tetradekanoat [5r]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 60%; RI 2685, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 375(1), 374(5) [M + ], 165(15), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 148(4), 137(5), 135(9), 133(3), 131(4), 103(3), 91(4), 77(3), 69(4), 57(10), 55(11), 43(17), 41(12), 39(2). 2-Alil-3-metoksifenil-heksadekanoat [5s]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 56%; RI 2891, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 402(0.1) [M + ], 166(3), 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 135(7), 131(3), 107(5), 81(6), 69(11), 57(4), 55(28), 54(4). 2-Alil-3-metoksifenil-oktadekanoat [5t]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 59%; RI 3092, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 430(1) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(11), 131(5), 103(4), 91(3), 77(5), 71(4), 57(11), 55(5), 43(13), 41(7). 2-Alil-3-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoat [5u]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 58%; RI 3070, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 428(2) [M + ], 165(16), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 148(4), 135(8), 133(3), 107(4), 103(3), 95(3), 91(4), 81(4), 77(3), 69(8), 67(6), 57(5), 55(16), 43(9), 41(11). 2-Alil-3-metoksifenil-benzoat [5v]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 55%; RI 2089, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 269(3), 268(12) [M + ], 148(5), 106(12), 105(100) [C7H5O + ], 103(5), 91(9), 78(4), 77(39), 65(3), 51(9), 50(3). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 76 2-Alil-3-metoksifenil-salicilat [5w]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 60%; RI 2166, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 285(2), 284(9) [M + ], 165(5), 164(25), 149(9), 133(4), 131(3), 122(8), 121(100) [C7H5O2 + ], 115(3), 104(5), 103(8), 93(12), 92(3), 91(11), 77(5), 65(18), 64(3), 63(6), 55(3), 39(10). 2-Alil-5-metoksifenil-formijat [6a]: bezbojna teĉnost; prinos: 72%; RI 1451, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 193(4), 192(24) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(3), 150(5), 149(35), 148(5), 147(9), 137(5), 135(5), 134(11), 133(18), 132(16), 131(55), 122(6), 121(45), 115(6), 107(8), 106(9), 105(16), 104(26), 103(50), 102(4), 94(4), 93(8), 92(7), 91(57), 89(8), 79(11), 78(6), 77(62), 66(5), 65(19), 64(8), 63(12), 55(10), 53(5), 51(28), 43(11), 41(8), 39(30). 2-Alil-5-metoksifenil-acetat [6b]: bezbojna teĉnost; prinos: 70%; RI 1514, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 206(20) [M + ], 192(4), 166(3), 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(55), 147(18), 138(5), 137(29), 133(19), 103(18), 102(4), 91(17), 89(5), 78(11), 77(26), 65(11), 62(4), 51(14), 43(47), 39(14). 2-Alil-5-metoksifenil-propanoat [6c]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1606, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 221(1), 220(10) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(28), 149(10), 147(10), 137(11), 133(7), 131(3), 121(5), 103(12), 91(21), 78(3), 77(10), 71(10), 69(3), 55(3), 53(4), 51(6), 44(3), 43(65), 41(18), 39(10). 2-Alil-5-metoksifenil-izobutanoat [6d]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1647, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 235(2), 234(11) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(30), 149(8), 148(3), 147(10), 137(11), 135(3), 133(9), 131(4), 121(5), 105(5), 104(3), 103(12), 91(12), 79(5), 78(6), 77(12), 71(13), 65(6), 63(3), 55(3), 53(3), 51(6), 43(65), 41(18), 39(10). 2-Alil-5-metoksifenil-butanoat [6e]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1692, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 235(2), 234(10) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(32), 149(10), 148(3), 147(10), 137(11), 135(4), 133(10), 131(3), 121(5), 105(4), 103(11), 91(11), 79(5), 78(5), 77(12), 71(12), 65(6), 55(3), 51(6), 43(36), 41(14), 39(9). 2-Alil-5-metoksifenil-2-metilbutanoat [6f]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1746, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(9) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(23), 149(6), 147(8), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 77 137(8), 133(7), 105(5), 103(10), 91(11), 85(7), 79(5), 78(5), 77(11), 69(5), 65(5), 57(67), 55(6), 41(20), 39(8). 2-Alil-5-metoksifenil-3-metilbutanoat [6g]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1751, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(6) [M + ], 191(5), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(20), 149(6), 147(9), 137(8), 133(7), 103(9), 91(10), 85(8), 79(5), 78(6), 77(8), 57(29), 43(8), 39(7). 2-Alil-5-metoksifenil-pentanoat [6h]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1801, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2950, 2912, 2836, 1755, 1618, 1582, 1466, 1437, 1380, 1236, 1186, 1152, 1110, 1055, 1034, 995, 960, 913, 868, 828, 720; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 200 (2,98), 217 (2,98), 272 (0,32); EIMS m/z(rel. int.): 248(7) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(27), 149(8), 147(9), 137(8), 133(8), 103(9), 91(9), 85(7), 78(5), 77(9), 65(5), 57(21), 55(5), 41(15), 39(6); izraĉunato za C15H20O3: C 72,55, H 8,12, O 19,33%; naĊeno C 72,53, H 8,15, O 19,32%; 1 H NMR (600 MHz, CDCl3), δ 7,13 (dublet, J = 8,5 Hz, 1H, CH-3), 6,74 (dublet dubleta, J = 8,5, 2,6 Hz, 1H, CH-4), 6,63 (dublet, J = 2,6 Hz, 1H, CH-6), 5,86 (dublet dubleta tripleta, J = 16,5, 10,2, 6,6 Hz, 1H, CH-9), 5,01 (pseudo dublet kvarteta, J = 16,5, 1,3 Hz, 1H, CH-10trans), 5,00 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,2, 1,3 Hz, 1H, CH-10cis), 3,77 (singlet, 3H, CH3-7), 3,21 (široki dublet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-8), 2,55 (triplet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-12), 1,75 (kvintet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-13), 1,45 (sekstet, J = 7,5 Hz, 2H, CH2-14), 0,97 (triplet, J = 7,5 Hz, 3H, CH3- 15); 13 C NMR (150 MHz, CDCl3), δ 172,1 (C=O), 158,8 (C-5), 149,8 (C-1), 135,6 (C-9), 130,5 (C-3), 124,0 (C-2), 115,8 (C-10), 111,9 (C-4), 107,9 (C-6), 55,2 (C-7), 34,5 (C-12), 28,1 (C-8), 27,2 (C-13), 22,3 (C-14), 13,7 (C-15). 2-Alil-5-metoksifenil-angelat [6i]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1787, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(7,8) [M + ], 164(9) [C10H12O2 + ], 163(11), 103(5), 91(6), 84(6), 83(100) [C5H7O + ], 77(7), 55(71), 53(5), 39(8). 2-Alil-5-metoksifenil-senecioat [6j]: bezbojna teĉnost; prinos: 67%; RI 1842, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(4) [M + ], 164(18) [C10H12O2 + ], 163(5), 84(6), 83(100) [C5H7O + ], 55(18), 53(5), 39(6). 2-Alil-5-metoksifenil-tiglat [6k]: bezbojna teĉnost; prinos: 70%; RI 1845, DB-5MS; FTIR (ATR) cm -1 : 2912, 2836, 1724, 1650, 1618, 1583, 1504, 1465, 1437, 1380, 1238, 1188, 1152, 1110, 1055, 1034, 994, 960, 913, 868, 829, 722; UV (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ɛ): 199 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 78 (3,68), 217 (2,78), 274 (0,32); EIMS m/z(rel. int.): 246(5) [M + ], 164(8) [C10H12O2 + ], 163(10), 91(5), 84(7), 83(100) [C5H7O + ], 55(54), 39(5); izraĉunato za C15H18O3: C 73,15, H 7,36, O 19,49%; naĊeno C 73,09, H 7,38, O 19,53%; 1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ 7,13 (dublet, J = 8,5 Hz, 1H, CH-3), 7,11 (kvartet kvarteta, J = 7,0, 1,3 Hz, 1H, CH-13), 6,74 (dublet dubleta, J = 8,5, 2,6 Hz, 1H, CH-4), 6,63 (dublet, J = 2,6 Hz, 1H, CH-6), 5,86 (dublet dubleta tripleta, J = 16,5, 10,2, 6,6 Hz, 1H, CH-9), 5,02 (pseudo dublet kvarteta, J = 16,5, 1,3 Hz, 1H, CH-10trans), 5,01 (pseudo dublet kvarteta, J = 10,2, 1,3 Hz, 1H, CH-10cis), 3,77 (singlet, 3H, CH3-7), 3,21 (široki dublet, J = 6,6 Hz, 2H, CH2-8), 1,95 (široki signal, 3H, CH3-15), 1,88 (dublet kvarteta, J = 7,0, 1,1 Hz, 3H, CH3-14); 13 C NMR (150 MHz, CDCl3), δ 166,2 (C=O), 158,8 (C-5), 149,8 (C- 1), 139,4 (C-13), 136,6 (C-9), 130,6 (C-3), 128,1 (C-12), 123,9 (C-2), 115,8 (C-10), 111,9 (C-4), 107,8 (C-6), 55,4 (C-7), 33,9 (C-8), 14,6 (C-14), 12,2 (C-15). 2-Alil-5-metoksifenil-heksanoat [6l]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1890, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 263(1), 262(5) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(23), 149(7), 148(3), 147(7), 137(8), 135(3), 133(7), 131(3), 121(3), 107(2), 105(3), 103(8), 99(5), 91(8), 78(4), 77(8), 71(7), 65(4), 55(6), 51(3), 43(24), 42(4), 41(11), 39(5). 2-Alil-5-metoksifenil-heptanoat [6m]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1990 DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 277(1), 276(5) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(20), 149(5), 147(6), 137(7), 135(3), 133(6), 131(4), 121(3), 113(3), 105(3), 103(6), 91(6), 85(3), 77(6), 65(3), 57(4), 55(6), 43(20), 41(11), 39(4). 2-Alil-5-metoksifenil-oktanoat [6n]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 2091, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 291(1), 290(4) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(18), 149(5), 148(3), 147(6), 135(6), 133(5), 131(2), 103(6), 91(5), 77(5), 65(3), 57(15), 55(8), 43(11), 41(13), 39(4). 2-Alil-5-metoksifenil-nonanoat [6o]: bezbojna teĉnost; prinos: 55%; RI 2192, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 305(1), 304(4) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(17), 149(11), 147(5), 137(6), 133(4), 103(5), 91(4), 77(4), 71(5), 65(3), 57(7), 55(8), 43(12), 41(12), 39(3). 2-Alil-5-metoksifenil-dekanoat [6p]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 2293, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 319(1), 318(4) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(11), 149(8), 147(5), 137(4), 133(6), 131(5), 103(10), 91(6), 77(5), 71(10), 57(7), 55(13), 43(11), 41(18). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 79 2-Alil-5-metoksifenil-dodekanoat [6q]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 61%; RI 2494, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 347(0,5), 346(2) [M + ], 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(13), 149(3), 147(4), 137(5), 133(3), 103(3), 91(4), 77(4), 71(2), 57(7), 55(8), 43(12), 41(11). 2-Alil-5-metoksifenil-tetradekanoat [6r]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 65%; RI 2699, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 375(0,5), 374(2) [M + ], 165(15), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(11), 149(3), 137(5), 133(3), 103(3), 91(4), 77(3), 69(3), 57(6), 55(8), 43(13), 41(9). 2-Alil-5-metoksifenil-heksadekanoat [6s]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 52%; RI 2901, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 402(0,1) [M + ], 165(15), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(4), 147(3), 137(4), 103(3), 71(3), 69(3), 55(6), 43(8), 41(7). 2-Alil-5-metoksifenil-oktadekanoat [6t]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 65%; RI 3103, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 430(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(7), 149(5), 133(3), 103(4), 91(3), 77(5), 69(4), 57(4), 55(12), 43(13), 41(7). 2-Alil-5-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoat [6u]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 59%; RI 3080, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 429(1), 428(3) [M + ], 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 163(11), 149(3), 137(5), 133(3), 103(3), 95(3), 77(3), 69(6), 67(4), 57(3), 55(11), 43(6), 41(9). 2-Alil-5-metoksifenil-benzoat [6v]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 62%; RI 2102, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 269(1), 268(9) [M + ], 148(4), 106(13), 105(100) [C7H5O + ], 103(6), 91(9), 78(5), 77(41), 65(5), 51(11), 50(4). 2-Alil-5-metoksifenil-salicilat [6w]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 60%; RI 2181, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 285(1), 284(7) [M + ], 165(4), 164(32), 149(11), 133(5), 131(4), 122(9), 121(100) [C7H5O2 + ], 115(5), 104(6), 103(9), 93(12), 92(4), 91(12), 77(6), 65(18), 63(6), 55(4), 39(10). 2-Alil-6-metoksifenil-formijat [7a]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1413, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 193(2), 192(11) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 150(4), 149(43), 148(4), 147(10), 137(7), 135(7), 134(7), 133(15), 132(21), 131(48), 122(7), 121(42), 120(4), 119(4), 115(9), 107(6), 106(4), 105(15), 104(27), 103(59), 102(6), 94(6), 93(11), 92(8), 91(58), 89(7), 79(13), 78(17), 77(56), 66(10), 65(29), 64(6), 63(17), 62(6), 55(14), 53(10), 51(24), 50(10), 43(3), 41(6), 39(27), 38(5). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 80 2-Alil-6-metoksifenil-acetat [7b]: bezbojna teĉnost; prinos: 70%; RI 1470, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 206(4) [M + ], 164(100) [C10H12O2 + ], 147(7), 145(3), 138(3), 136(3), 135(6), 134(4), 133(14), 131(17), 121(24), 120(4), 118(3), 104(15), 103(40), 91(18), 90(4), 77(20), 62(5), 43(27), 39(16). 2-Alil-6-metoksifenil-propanoat [7c]: bezbojna teĉnost; prinos: 67%; RI 1554, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 220(4) [M + ], 192(3), 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(20), 147(7), 137(4), 135(5), 133(13), 132(10), 131(23), 122(30), 121(45), 104(10), 103(26), 102(6), 97(5), 91(31), 89(5), 79(13), 78(12), 77(20), 74(11), 70(10), 69(9), 68(6), 67(10), 66(6), 65(13), 63(8), 57(30), 56(32), 55(12), 53(12), 51(20), 50(10), 44(9), 43(17), 42(12), 41(14), 39(20). 2-Alil-6-metoksifenil-izobutanoat [7d]: bezbojna teĉnost; prinos: 57%; RI 1595, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 235(1), 234(4) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(12), 148(3), 147(4), 135(5), 133(5), 131(11), 121(8), 105(5), 104(6), 103(13), 91(19), 79(4), 78(4), 77(11), 71(15), 65(9), 63(4), 55(3), 51(5), 43(62), 41(15), 39(10). 2-Alil-6-metoksifenil-butanoat [7e]: bezbojna teĉnost; prinos: 52%; RI 1653, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 234(3) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(13), 147(5), 133(5), 132(6), 131(9), 121(7), 105(5), 104(5), 103(11), 91(14), 79(3), 78(3), 77(9), 71(10), 65(7), 55(3), 51(3), 43(33), 41(11), 39(7). 2-Alil-6-metoksifenil-2-metilbutanoat [7f]: bezbojna teĉnost; prinos: 66%; RI 1700, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(10), 132(6), 131(9), 121(5), 104(5), 103(11), 91(14), 85(8), 77(8), 65(6), 57(70), 41(14), 39(6). 2-Alil-6-metoksifenil-3-metilbutanoat [7g]: bezbojna teĉnost; prinos: 67%; RI 1703, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(11), 132(7), 131(9), 121(5), 103(11), 91(15), 85(8), 77(8), 65(6), 57(32), 43(6), 41(17), 39(8). 2-Alil-6-metoksifenil-pentanoat [7h]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1749, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(12), 132(7), 131(10), 121(6), 104(5), 103(9), 91(12), 85(7), 77(7), 65(5), 57(21), 55(5), 41(11), 39(5). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 81 2-Alil-6-metoksifenil-angelat [7i]: bezbojna teĉnost; prinos: 69%; RI 1725, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(6) [M + ], 164(21) [C10H12O2 + ], 103(8), 91(16), 83(100), 79(5), 77(7), 65(5), 55(76), 53(11), 52(5), 51(7), 41(5), 39(14). 2-Alil-6-metoksifenil-senecioat [7j]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1773, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(2) [M + ], 164(19) [C10H12O2 + ], 103(5), 91(7), 84(6), 83(100), 55(18), 39(6). 2-Alil-6-metoksifenil-tiglat [7k]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1775, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(9) [M + ], 164(19) [C10H12O2 + ], 103(5), 91(8), 84(5), 83(100), 55(49), 39(5). 2-Alil-6-metoksifenil-heksanoat [7l]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1838, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 262(1) [M + ], 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(10), 148(3), 147(3), 133(5), 131(8), 121(5), 105(4), 103(9), 99(5), 91(13), 78(3), 77(7), 71(9), 65(6), 55(7), 43(28), 42(4), 41(10), 39(7). 2-Alil-6-metoksifenil-heptanoat [7m]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1938, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 276(2) [M + ], 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(3), 147(4), 131(6), 121(5), 113(4), 103(7), 91(9), 85(3), 77(7), 65(5), 57(4), 55(8), 43(30), 41(12). 2-Alil-6-metoksifenil-oktanoat [7n]: bezbojna teĉnost; prinos: 53%; RI 2038, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 290(1) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(7), 147(3), 133(3), 131(6), 103(8), 91(9), 77(5), 65(4), 57(20), 55(11), 43(12), 41(14), 39(4). 2-Alil-6-metoksifenil-nonanoat [7o]: bezbojna teĉnost; prinos: 50%; RI 2139, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 304(1) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(6), 133(4), 103(7), 91(7), 77(4), 71(6), 65(3), 57(10), 55(10), 43(12), 41(12), 39(3). 2-Alil-6-metoksifenil-dekanoat [7p]: bezbojna teĉnost; prinos: 59%; RI 2240, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 318(2) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(5), 133(5), 131(3), 103(12), 91(6), 77(5), 71(6), 57(11), 55(13), 43(11), 41(9). 2-Alil-6-metoksifenil-dodekanoat [7q]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 60%; RI 2441, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 347(0,1), 346(0.4) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(5), 103(4), 91(5), 77(3), 71(3), 57(7), 55(10), 43(12), 41(9). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 82 2-Alil-6-metoksifenil-tetradekanoat [7r]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 58%; RI 2645, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 374(0,3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(4), 103(3), 91(4), 77(3), 69(4), 57(7), 55(10), 43(12), 41(9). 2-Alil-6-metoksifenil-heksadekanoat [7s]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 55%; RI 2844, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 402(0,2) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(4), 103(3), 77(5), 69(3), 55(7), 43(9), 41(5). 2-Alil-6-metoksifenil-oktadekanoat [7t]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 51%; RI 3054, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 430(0,2) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(5), 132(3), 103(4), 91(3), 77(7), 69(5), 57(4), 55(14), 43(13), 41(7). 2-Alil-6-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoat [7u]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 50%; RI 3027, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 428(0,3) [M + ], 165(14), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(4), 132(3), 104(3), 95(2), 77(3), 69(7), 67(6), 57(3), 55(13), 43(4), 41(8). 2-Alil-6-metoksifenil-benzoat [7v]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 58%; RI 2058, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 268(5) [M + ], 148(5), 106(13), 105(100) [C7H5O + ], 103(5), 91(9), 78(3), 77(48), 65(12), 51(18), 50(5). 2-Alil-6-metoksifenil-salicilat [7w]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 61%; RI 2129, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 285(2), 284(8) [M + ], 165(12), 164(34), 149(8), 133(8), 131(6), 122(5), 121(100) [C7H5O2 + ], 115(12), 104(5), 103(9), 93(12), 91(12), 77(8), 65(18), 63(8), 55(11), 39(9). 5-Alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoat [8a]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1753, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(18), 132(6), 131(8), 104(7), 103(9), 91(18), 85(6), 77(11), 65(6), 57(54), 55(8), 51(5), 41(21), 39(9). 5-Alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoat [8b]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1759, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(10), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(20), 133(5), 132(7), 131(7), 104(8), 103(9), 91(18), 85(6), 77(10), 65(6), 57(24), 55(6), 43(7), 41(20), 39(10). 5-Alil-2-metoksifenil-pentanoat [8c]: bezbojna teĉnost; prinos: 65%; RI 1808, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(23), 133(5), 132(8), 131(8), 104(9), 103(10), 91(17), 85(7), 77(10), 65(6), 57(19), 55(9), 41(19), 39(8). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 83 5-Alil-2-metoksifenil-angelat [8d]: bezbojna teĉnost; prinos: 60%; RI 1791, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(7) [M + ], 164(24) [C10H12O2 + ], 103(8), 91(18), 84(5), 83(100), 77(8), 65(8), 64(1.5), 55(80), 53(9), 51(6), 39(12). 5-Alil-2-metoksifenil-senecioat [8e]: bezbojna teĉnost; prinos: 54%; RI 1853, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(3) [M + ], 164(32) [C10H12O2 + ], 149(5), 103(5), 91(12), 84(6), 83(100), 77(6), 55(25), 53(6), 39(10). 5-Alil-2-metoksifenil-tiglat [8f]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1856, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(8) [M + ], 164(26) [C10H12O2 + ], 103(6), 91(15), 84(6), 83(100), 79(5), 77(8), 65(6), 55(73), 53(8), 51(5), 39(13). 3-Alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoat [9a]: bezbojna teĉnost; prinos: 66%; RI 1705, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(4) [M + ], 165(9), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(13), 132(7), 131(11), 121(5), 103(12), 91(14), 85(10), 77(11), 65(5), 57(65), 41(14), 39(8). 3-Alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoat [9b]: bezbojna teĉnost; prinos: 67%; RI 1708, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(9), 132(8), 131(10), 121(6), 103(15), 91(16), 85(9), 77(7), 65(7), 57(28), 43(10), 41(15), 39(10). 3-Alil-2-metoksifenil-pentanoat [9c]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1754, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(1) [M + ], 165(12), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(8), 132(12), 131(13), 121(5), 104(5), 103(8), 91(15), 85(12), 77(8), 65(5), 57(18), 55(8), 41(12), 39(6). 3-Alil-2-metoksifenil-angelat [9d]: bezbojna teĉnost; prinos: 69%; RI 1737, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(5) [M + ], 164(19) [C10H12O2 + ], 103(6), 91(12), 83(100), 79(7), 77(8), 65(6), 55(75), 53(10), 51(7), 39(12). 3-Alil-2-metoksifenil-senecioat [9e]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1787, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(3) [M + ], 164(25) [C10H12O2 + ], 103(8), 91(12), 84(11), 83(100), 79(7), 77(10), 55(19), 39(8). 3-Alil-2-metoksifenil-tiglat [9f]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1798, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(5) [M + ], 164(20) [C10H12O2 + ], 103(6), 91(8), 84(8), 83(100), 55(55), 39(8). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 84 4-Alil-3-metoksifenil-2-metilbutanoat [10a]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1768, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(2) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(12), 121(9), 103(5), 91(8), 77(6), 57(32), 55(6), 41(14), 39(7). 4-Alil-3-metoksifenil-3-metilbutanoat [10b]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1775, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(1) [M + ], 165(8), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(8), 121(15), 103(8), 91(10), 85(6), 77(7), 57(10), 41(12), 39(7). 4-Alil-3-metoksifenil-pentanoat [10c]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1830, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(15), 147(6), 121(11), 103(8), 85(9), 77(11), 65(9), 57(15), 55(6), 39(8). 4-Alil-3-metoksifenil-angelat [10d]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1820, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(8) [M + ], 164(25) [C10H12O2 + ], 149(8), 103(5), 91(12), 84(5), 83(100), 77(11), 65(8), 55(62), 54(8), 53(9), 39(11). 4-Alil-3-metoksifenil-senecioat [10e]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1885, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(3) [M + ], 165(10), 164(8) [C10H12O2 + ], 149(10), 121(8), 103(10), 91(6), 84(7), 83(100), 77(8), 65(7), 55(22), 53(10), 39(10). 4-Alil-3-metoksifenil-tiglat [10f]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1888, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(8) [M + ], 165(12), 164(23) [C10H12O2 + ], 149(6), 103(12), 91(8), 83(100), 79(8), 77(12), 65(9), 55(66), 54(8), 53(12), 39(16). 3-Alil-4-metoksifenil-2-metilbutanoat [11a]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1781, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(11), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(14), 121(11), 103(9), 91(12), 77(8), 65(6), 57(32), 55(6), 41(14), 39(7). 3-Alil-4-metoksifenil-3-metilbutanoat [11b]: bezbojna teĉnost; prinos: 62%; RI 1785, DB- 5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(3) [M + ], 165(13), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(15), 121(11), 103(7), 91(10), 85(5), 77(7), 57(10), 41(13), 39(6). 3-Alil-4-metoksifenil-pentanoat [11c]: bezbojna teĉnost; prinos: 68%; RI 1841, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 248(1) [M + ], 165(15), 164(100) [C10H12O2 + ], 149(23), 147(5), 121(17), 103(6), 85(7), 77(12), 65(8), 57(16), 55(6), 39(5). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 85 3-Alil-4-metoksifenil-angelat [11d]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1830, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(10) [M + ], 164(37) [C10H12O2 + ], 149(7), 103(5), 91(11), 84(6), 83(100), 77(9), 65(7), 55(74), 54(6), 53(9), 39(12). 3-Alil-4-metoksifenil-senecioat [11e]: bezbojna teĉnost; prinos: 58%; RI 1897, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(5) [M + ], 165(7), 164(7) [C10H12O2 + ], 149(8), 121(7), 103(9), 91(12), 84(6), 83(100), 77(8), 65(7), 55(30), 53(8), 39(13). 3-Alil-4-metoksifenil-tiglat [11f]: bezbojna teĉnost; prinos: 64%; RI 1898, DB-5MS; EIMS m/z(rel. int.): 246(12) [M + ], 165(8), 164(57) [C10H12O2 + ], 149(5), 121(5), 103(10), 91(14), 84(6), 83(100), 79(5), 77(9), 65(8), 55(80), 54(6), 53(10), 39(14). 3.4.4. Sinteza biblioteke metil-(ferocenilmetil)acetoacetata Ferocen (6,21 g, 0,033 mola) je dodat u rastvor N,N,N’,N’-tetrametilmetandiamina (10 g, 0,098 mola), 85% (w/w) H3PO4 (9,2 g) i 86 ml sirćetne kiseline i smeša je pod inertnom atmosferom (N2) zagrevana na 170 °C, uz mešanje, 5 h. Nakon toga, rastvor je mešan preko noći na sobnoj temperaturi, dodato je 100 ml vode i izvršena je ekstrakcija dietil-etrom (3 × 50 ml). Vodeni sloj je ohlaĊen na ledenom kupatilu i neutralisan vodenim rastvorom natrijum- hidroksida. Dobivena crna uljasta teĉnost je bila ekstrahovana etrom (4 × 80 ml), a nakon uparavanja rastvaraĉa sirovi (N,N-dimetilaminometil)ferocen (prinos: 72%) je sušen preko noći u eksikatoru nad CaCl2 (Lednicer i Hauser, 1960). Mešanjem rastvora (N,N- dimetilaminometil)ferocena (5,88 g, 24,18 mmol) i metil-jodida (5,15 g, 36,3 mmol) u acetonu (100 ml) tokom 2 h na sobnoj temperaturi, dobiveni su narandţasti kristali koji su nakon filtriranja i ispiranja sa malom koliĉinom dietil-etra (2 × 10 mL) sušeni preko noći u eksikatoru nad CaCl2. Dobiveno je 8,85 g (23 mmol) (ferocenilmetil)trimetilamonijum-jodida (prinos: 95%). Rastvor sirovog jodida (8,85 g) i natrijumove soli metil-acetoacetata (46 mmol, dobivene dodavanjem stehiometrijske koliĉine elementarnog natrijuma u dioksanski rastvor metil- acetoacetata) u suvom 1,4-dioksanu (ukupno 50 ml) refluktovan je 7 h, a zatim mešan preko noći na sobnoj temperaturi. U rastvor je dodato 50 ml vode, pa je on ekstrahovan dihlormetanom (4 × 100 ml), spojeni organski slojevi su isprani vodom (2 × 50 ml) i sušeni preko noći anhidrovanim MgSO4. Nakon uparavanja rastvaraĉa, ostatak je preĉišćen „dry flash” hromatografijom (SiO2/heksan-dietil-etar, 4:1, v/v) i dobiven je ĉist metil-2-(ferocenilmetil)acetoacetat (6,14 g, Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 86 19,54 mmol; prinos 85%). Smeša metil-2-(ferocenilmetil)-acetoacetata (750 mg, 2,39 mmol), odgovarajućeg alkil halogenida (4,78 mmol), anhidrovanog K2CO3 (826 mg, 5,98 mmol) i suvog acetona (50 ml) je refluktovana uz mešanje 4 h, a zatim i preko noći na sobnoj temperaturi. ceton je uparen na rotacionom vakuum uparivaĉu, dodato je 50 ml vode i dobivena suspenzija je ekstrahovana dietil-etrom (4 × 50 mL). Nakon sušenja preko noći (mešanjem sa anhidrovanim MgSO4), rastvaraĉ je uparen, a sirovi proizvod je preĉišćen „dry flash” hromatografijom (SiO2/heksan-dietil-etar 4:1, v/v). Spektralni podaci i prinosi sintetisanih estara: Metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoat [12a]: narandţasti kristali; prinos: 85%; FTIR (ATR) cm -1 : 3092, 2952, 1742 (COOMe), 1715 (C=O), 1645, 1435, 1357, 1244, 1204, 1145, 1105, 1024, 1000, 922, 819, 733, 699; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 205 (3,52), 437 (0,49); EIMS m/z(rel. int.): 315(47), 314(100) [M + ], 282(12), 255(4), 236(48), 212(10), 204(22), 199(17), 171(31), 141(16), 121(44), 95(5), 78(5), 56(7), 43(3); izraĉunato za C17H22FeO2: C 64,98, H 7,06, Fe 17,77, O 10,18%; naĊeno C 64,99, H 7,05%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,11 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,06–4,01 (preklopljeni signali, 4H, CH-2‟–5‟), 3,71 (singlet, 3H, CH3-5), 3,58 (triplet, J = 7,3 Hz, 1H, CH-3), 2,92 (dublet, J = 7,3 Hz, 2H, CH2-6), 2,17 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 202,5 (C-2), 169,6 (C-4), 84,6 (C-1‟), 68,7 (C-1‟‟–5‟‟), 68,6, 68,5, 67,8, 67,7, (C-2‟–5‟), 61,7 (C-3), 52,4 (C-5), 29,6 (C-6), 28,7 (C-1). Metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoat [12b]: narandţasti kristali; prinos: 70%; FTIR (ATR) cm -1 : 3092, 2947, 1739 (COOMe), 1705 (C=O), 1644, 1440, 1363, 1280, 1236, 1179, 1170, 1104, 1025, 998, 922, 863, 827, 804, 667; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 204 (3,60), 438 (0,52); EIMS m/z(rel. int.): 329(21), 328(100) [M + ], 297(5), 250(76), 226(13), 220(24), 199(50), 185(19), 164(4), 155(23), 152(33), 134(8), 122(18), 121(37), 77(4), 56(14), 43(9); izraĉunato za C18H24FeO2: C 65,87, H 7,37, Fe 17,01, O 9,75%; naĊeno C 65,91, H 7,36%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,11 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,07–4,02 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟, CH-4‟ i CH-2‟ ili CH-5‟), 4,00–3,96 (multiplet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,70 (singlet, 3H, CH3-5), 3,02 (dublet, J = 14,1 Hz, 1H, CH2-6), 2,83 (dublet, J = 14,1 Hz, 1H, CH2-6), 2,10 (singlet, 3H, CH3-1), 1,24 (singlet, 3H, CH3-1‟‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,5 (C-2), 173,0 (C-4), 82,3 (C-1‟), 70,0, 69,6 (C-2‟, C-5‟), 68,7 (C-1‟‟–5‟‟), 67,9, 67,8 (C-3‟, C-4‟), 61,1 (C-3), 52,3 (C-5), 35,8 (C-6), 26,5 (C-1), 19,1 (C-1‟‟‟). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 87 Metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3-oksobutanoat [12c]: narandţasti kristali; prinos: 63%; FTIR (ATR) cm -1 : 3090, 2949, 1738 (COOMe), 1714 (C=O), 1641, 1439, 1360, 1275, 1171, 1106, 1025, 997, 926, 829, 806; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 205 (3,58), 437 (0,50); EIMS m/z(rel. int.): 343(23), 342(100) [M + ], 340(7), 311(4), 264(14), 236(21), 234(9), 199(41), 152(12), 122(8), 121(20), 56(5), 43(2); izraĉunato za C19H26FeO2: C 66,68, H 7,66, Fe 16,32, O 9,35%; naĊeno C 66,67, H 7,66%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,13 (široki singlet, 5H, CH- 1‟‟–5‟‟), 4,07–4,00 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟, CH-4‟ i CH-2‟ ili CH-5‟), 3,98–3,92 (multiplet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,70 (singlet, 3H, CH3-5), 3,01–2,85 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,05 (singlet, 3H, CH3-1), 1,81 (kvartet, J = 7,6 Hz, 2H, CH2-1‟‟‟), 0,79 (triplet, J = 7,6 Hz, 3H, CH3-2‟‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,0 (C-2), 172,1 (C-4), 82,2 (C-1‟), 69,7, 69,4 (C-2‟, C-5‟), 68,8 (C-1‟‟–5‟‟), 67,8, 67,7 (C-3‟, C-4‟), 65,1 (C-3), 52,0 (C-5), 36,8 (C-6), 27,2 (C-1), 24,3 (C-1‟‟‟), 8,2 (C-2‟‟‟). Metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoat [12d]: narandţasti kristali; prinos: 84%; FTIR (ATR) cm -1 : 3080, 2949, 1751 (COOMe), 1715 (C=O), 1641, 1439, 1402, 1355, 1278, 1167, 1106, 1025, 994, 934, 832, 801, 749, 696; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 206 (3,62), 438 (0,54); EIMS m/z(rel. int.): 355(23), 354(100) [M + ], 276(10), 274(12), 270(8), 248(22), 218(8), 211(10), 200(8), 199(50), 181(24), 152(20), 139(6), 121(33), 56(10), 43(8); izraĉunato za C20H26FeO2: C 67,81, H 7,40, Fe 15,76, O 9,03%; naĊeno C 67,82, H 7,42%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 5,60 (multiplet, 1H, CH-2‟‟‟), 5,13 (multiplet, 1H, CH2-3‟‟‟), 5,07 (multiplet, 1H, CH2-3‟‟‟), 4,13 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,09–4,02 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟, CH-4‟ i CH-2‟ ili CH-5‟), 3,99 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,70 (singlet, 3H, CH3-5), 3,03–2,86 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,53 (dublet tripleta, J = 7,3, 1,0 Hz, 2H, CH2-1‟‟‟), 2,07 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 204,5 (C-2), 172,1 (C-4), 132,2 (C-2‟‟‟), 119,1 (C-3‟‟‟), 82,2 (C-1‟), 69,7, 69,5 (C-2‟, C-5‟), 68,7 (C-1‟‟–5‟‟), 67,9, 67,8 (C-3‟, C-4‟), 64,9 (C-3), 52,3 (C-5), 36,1 (C-1‟‟‟), 32,9 (C-6), 27,5 (C-1). Metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metilpent-4-enoat [12e]: narandţasti kristali; prinos: 62%; FTIR (ATR) cm -1 : 3092, 2952, 1742 (COOMe), 1715 (C=O), 1644, 1436, 1355, 1221, 1179, 1156, 1105, 1025, 1000, 897, 819; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 206 (3,62), 436 (0,52); EIMS m/z(rel. int.): 369(25), 368(100) [M + ], 312(2), 290(14), 281(4), 270(9), 258(10), 248(15), 225(39), 199(61), 195(38), 152(11), 135(7), 121(44), 56(14), 43(12); izraĉunato za Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 88 C21H28FeO2: C 68,49, H 7,66, Fe 15,16, O 8,69%; naĊeno C 68,52, H 7,65%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,88 (pseudo triplet, J = 1,4 Hz, 1H, CH-3‟‟‟), 4,71 (široki singlet, 1H, CH-3‟‟‟), 4,10 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,05–4,03 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟, CH-4‟ i CH-2‟ ili CH-5‟), 3,99 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,68 (singlet, 3H, CH3-5), 3,12–2,93 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,68–2,47 (multiplet, 2H, CH2-3‟‟‟), 2,05 (singlet, 3H, CH3-1), 1,67 (široki singlet, 3H, CH3-4‟‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,3 (C-2), 172,4 (C-4), 140,9 (C-2‟‟‟), 114,8 (C-3‟‟‟), 82,2 (C-1‟), 69,7, 69,6 (C-2‟, C-5‟), 68,7 (C-1‟‟–5‟‟), 67,9, 67,8 (C-3‟, C-4‟), 64,8 (C-3), 52,0 (C-5), 40,2 (C-1‟‟‟), 34,0 (C-6), 28,1 (C-1), 23,8 (C-4‟‟‟). Metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoat [12f]: narandţasti kristali; prinos: 66%; FTIR (ATR) cm -1 : 3096, 2949, 1740 (COOMe), 1709 (C=O), 1670, 1436, 1352, 1284, 1233, 1177, 1151, 1103, 1042, 1000, 881, 803, 777; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 205 (3,61), 439 (0,56); EIMS m/z(rel. int.): 383(19), 382(100) [M + ], 380(9), 281(12), 270(17), 248(10), 238(11), 236(45), 210(19), 209(25), 207(13), 205(10), 200(10), 199(85), 139(8), 135(6), 121(47), 56(10), 43(13); izraĉunato za C22H30FeO2: C 69,11, H 7,91, Fe 14,61, O 8,37%; naĊeno C 69,12, H 7,89%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,91 (triplet septupleta, J = 7,0, 1,4 Hz, 1H, CH-2‟‟‟), 4,12 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,04 (široki singlet, 2H, CH-3‟, CH-4‟), 3,99 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,94 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,68 (singlet, 3H, CH3-5), 3,03–2,84 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,47 (široki dublet, J = 7,0 Hz, 2H, CH2-1‟‟‟), 2,04 (singlet, 3H, CH3-1), 1,72 (pseudo kvartet, J = 1,2 Hz, 3H, CH3-5‟‟‟), 1,59 (široki dublet, J = 1,2 Hz, 3H, CH3-4‟‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,1 (C-2), 172,4 (C-4), 135,3 (C-2‟‟‟), 117,6 (C-3‟‟‟), 82,3 (C-1‟), 69,7, 69,5 (C-2‟, C-5‟), 68,7 (C-1‟‟–5‟‟), 67,9, 67,8 (C-3‟, C-4‟), 65,0 (C-3), 52,1 (C-5), 32,8 (C-1‟‟‟), 30,4 (C-6), 27,3 (C-1), 26,0 (C-5‟‟‟), 18,1 (C- 4‟‟‟). Metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoat [12g]: narandţasti kristali; prinos: 39%; FTIR (ATR) cm -1 : 3060, 2953, 1740 (COOMe), 1712 (C=O), 1639, 1493, 1435, 1352, 1270, 1231, 1196, 1177, 1140, 1080, 997, 841, 809; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 204 (3,60), 436 (0,54); EIMS m/z(rel. int.): 399(27), 398(100) [M + ], 396(7), 320(16), 290(6), 255(11), 254(19), 249(26), 236(5), 226(8), 225(8), 200(11), 199(79), 197(6), 152(11), 122(9), 121(30), 56(8), 43(8); izraĉunato za C23H34FeO2: C 69,35, H 8,60, Fe 14,02, O 8,03%; naĊeno C 69,30, H 8,62%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 4,12 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,06–4,03 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 89 (multiplet, 2H, CH-3‟, CH-4‟), 3,98 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,94 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,69 (singlet, 3H, CH3-5), 2,94 (dublet, J = 2,3 Hz, 2H, CH2-6), 2,05 (singlet, 3H, CH3-1), 1,73 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 2H, CH2-1‟‟‟), 1,33–1,21 (preklopljeni signali, 8H, CH2-2‟‟‟–5‟‟‟), 0,87 (pseudo triplet, J = 6,8 Hz, 3H, CH3-6‟‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,1 (C-2), 172,2 (C-4), 82,3 (C-1‟), 69,7, 69,4 (C-2‟, C-5‟), 68,8 (C-1‟‟–5‟‟), 67,9, 67,8 (C-3‟, C-4‟), 64,6 (C-3), 52,0 (C-5), 37,5 (C-6), 31,6, 31,2, 23,8, 22,4 (C-2‟‟‟–5‟‟‟), 29,4(C- 1‟‟‟), 27,2 (C-1), 13,8 (C-6‟‟‟). Metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoat [12h]: narandţasti kristali; prinos: 68%; FTIR (ATR) cm -1 : 3064, 2952, 1744 (COOMe), 1714 (C=O), 1603, 1495, 1434, 1354, 1274, 1246, 1175, 1155, 1105, 1083, 1000, 958, 818, 741, 701; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 204 (3,60), 438 (0,52); EIMS m/z(rel. int.): 405(27), 404(100) [M+], 402(6), 326(10), 295(7), 283(28), 270(9), 266(9), 262(5), 261(34), 260(14), 231(21), 230(10), 229(6), 200(8), 199(51), 122(11), 121(34), 56(10), 43(9); izraĉunato za C24H28FeO2: C 71,29, H 6,98, Fe 13,81, O 7,92%; naĊeno C 71,30, H 6,99%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,33–7,20 (multiplet, 3H, CH-4‟‟‟– 6‟‟‟), 7,14–7,07 (multiplet, 2H, CH-3‟‟‟, 7‟‟‟), 4,17 (široki singlet, 5H, CH-1‟‟–5‟‟), 4,04–4,01 (multiplet, 2H, CH-3‟, CH-4‟), 3,94 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,90 (široki singlet, 1H, CH-2‟ ili CH-5‟), 3,65 (singlet, 3H, CH3-5), 3,11 (široki singlet, 2H, CH-6), 2,96 (široki singlet, 2H, CH-1‟‟‟), 1,93 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,6 (C-2), 172,2 (C-4), 136,5 (C-2‟‟‟), 130,0 (C-4‟‟‟, 6‟‟‟), 128,3 (C-3‟‟‟, 7‟‟‟), 126,8 (C-5‟‟‟), 82,1 (C-1‟), 70,0, 69,8 (C-2‟, C-5‟), 68,8 (C-1‟‟–5‟‟), 68,0, 67,9 (C-3‟, C-4‟), 66,4 (C-3), 51,9 (C-5), 39,4 (C- 1‟‟‟), 34,8 (C-6), 28,9 (C-1). 3.4.5. Sinteza biblioteke metil-benzilacetoacetata Suspenzija anhidrovanog K2CO3 (23,46 g, 169,74 mmol) u suvom acetonu (150 ml), metil-acetoacetata (8,00 g, 68,89 mmol) i benzil-hlorida (10,42 g, 82,31 mmol) refluktovana je, uz mešanje 4 h, a zatim i preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon uparavanja rastvaraĉa, dodato je 100 ml vode i dobivena smeša je ekstrahovana dietil-etrom (4 × 100 ml). Organski slojevi su isprani vodom (2 × 50 ml) i sušeni preko noći (anh. MgSO4), rastvaraĉ je uparen i dobivena smeša metil-2-benzilacetoacetata i metil-2,2-dibenzilacetoacetata je frakcionisana izokratskom kolonskom hromatografijom (SiO2/heksan–dietil-etar 9:1, v/v). Prva frakcija je sadrţala ĉist metil-2,2-dibenzilacetoacetat 4,08 g (13,77 mmol; prinos 20%) dok je druga sadrţala metil-2- Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 90 benzilacetoacetat (10,30 g, 49,94 mmol; prinos 72%). Smeša metil-2-benzilacetoacetata (1,00 g, 4,85 mmol), odgovarajućeg alkil-halogenida (9,70 mmol), anhidrovanog K2CO3 (1,67 g, 12,08 mmol) i suvog acetona (50 ml) refluktovana je uz mešanje 4 h a zatim i preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon uparavanja rastvaraĉa, dodato je 50 ml vode i dobivena smeša je ekstrahovana dietil-etrom (4 × 50 ml). Organski slojevi su spojeni i sušeni preko noći anhidrovanim MgSO4, uparen je rastvaraĉ i sirova smeša je frakcionisana „dry flash” hromatografijom (SiO2/heksan–dietil-etar 4:1, v/v). Ĉisti metil-2-alkil-2-benzilacetoacetati su dobiveni u prinosu od 55% do 90%. Spektralni podaci sintetisanih estara: Metil-2-benzil-3-oksobutanoat [13a]: bezbojni kristali; prinos: 65%; FTIR (ATR) cm -1 : 3070, 2944, 1736 (COOMe), 1713 (C=O), 1644, 1436, 1358, 1262, 1215, 1145, 1050, 1001, 851, 809, 749, 700; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 194 (2,52); EIMS m/z(rel. int.): 206(4) [M + ], 188(5), 164(11), 163(94), 147(19), 145(11), 133(9), 132(13), 131(100), 129(5), 105(6), 104(26), 103(24), 91(37), 78(17), 77(15), 65(7), 51(7), 43(9); izraĉunato za C12H14O3: C 69,88, H 6,85, O 23,27%; naĊeno C 69,89, H 6,84, O 23,27%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,30–7,14 (preklopljeni signali, 5H, CH-2‟–6‟), 3,80 (triplet, J = 7,6 Hz, 1H, CH-3), 3,69 (singlet, 3H, CH3- 5), 3,16 (dublet, J = 7,6 Hz, 2H, CH2-6), 2,18 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 202,3 (C-2), 169,6 (C-4), 138,0 (C-1‟), 128,7 (C-2‟, 6‟), 128,6 (C-3‟, 5‟), 126,7 (C-4‟), 61,1 (C-3), 52,4 (C-5), 34,0 (C-6), 29,6 (C-1). Spektralni podaci su u saglasnosti sa literaturnim (Rafiee et al., 2011). Metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoat [13b]: bezbojni kristali; prinos: 88%; FTIR (ATR) cm -1 : 3062, 2958, 1742 (COOMe), 1709 (C=O), 1642, 1494, 1454, 1435, 1355, 1273, 1194, 1176, 1095, 989, 811, 747, 701; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 196 (2,50); EIMS m/z(rel. int.): 220(6) [M + ], 189(8), 188(20), 178(29), 177(89), 161(7), 159(8), 147(18), 146(37), 145(68), 121(12), 118(35), 117(42), 116(10), 115(28), 105(10), 91(100), 79(7), 78(85), 77(10), 65(16), 59(6), 51(7), 43(64); izraĉunato za C13H16O3: C 70,89, H 7,32, O 21,79%; naĊeno C 70,92, H 7,30, O 21,78%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,28–7,19 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟–5‟), 7,07 (dublet dubleta, J = 7,1, 2,1 Hz, 2H, CH-2‟, 6‟), 3,2 (singlet, 3H, CH3-5), 3,28 (dublet, J = 13,7 Hz, 1H, CH-6), 3,04 (dublet, J = 13,7 Hz, 1H, CH-6), 2,16 (singlet, 3H, CH3-1), 1,29 (singlet, 3H, CH3-1‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,2 (C-2), 172,8 (C-4), 136,3 (C- Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 91 1‟), 130,0 (C-2‟, 6‟), 128,2 (C-3‟, 5‟), 126,8 (C-4‟), 64,3 (C-3), 52,2 (C-5), 34,0 (C-6), 25,6 (C- 1), 18,4 (C-1‟‟). Spektralni podaci su u saglasnosti sa literaturnim (Lee i Kim, 2002). Metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoat [13c]: bezbojni kristali; prinos: 82%; FTIR (ATR) cm -1 : 3064, 2945, 1742 (COOMe), 1709 (C=O), 1640, 1433, 1357, 1231, 1195, 1144, 1083, 993, 862, 744, 699; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 194 (2,52); EIMS m/z(rel. int.): 234(15) [M + ], 203(9), 202(25), 192(22), 191(55), 177(5), 174(6), 173(13), 161(12), 160(33), 159(69), 145(40), 132(10), 131(30), 117(29), 115(19), 92(8), 91(100), 78(46), 77(9), 65(15), 51(5), 43(53); izraĉunato za C14H18O3: C 71,77, H 7,74, O 20,49%; naĊeno C 71,81, H 7,72, O 20,47%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,32–7,15 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟–5‟), 7,04 (dublet dubleta, J = 7,3, 2,2 Hz, 2H, CH-2‟, 6‟), 3,70 (singlet, 3H, CH3-5), 3,22 (dublet, J = 14,2 Hz, 1H, CH-6), 3,11 (dublet, J = 14,1 Hz, 1H, CH-6), 2,10 (singlet, 3H, CH3-1), 1,86 (kvartet, J = 7,6 Hz, 2H, CH2-1‟‟), 0,87 (triplet, J = 7,6 Hz, 3H, CH3-2‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 204,9 (C-2), 172,3 (C-4), 136,4 (C-1‟), 129,9 (C-2‟, 6‟), 128,2 (C-3‟, 5‟), 126,8 (C-4‟), 65,2 (C-3), 52,1 (C-5), 36,8 (C-6), 27,2 (C-1), 24,3 (C-1‟‟), 8,3 (C-2‟‟). Metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoat [13d]: bezbojni kristali; prinos: 90%; FTIR (ATR) cm -1 : 3064, 2953, 1744 (COOMe), 1713 (C=O), 1641, 1496, 1435, 1357, 1238, 1171, 1145, 1083, 993, 924, 751, 701; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 195 (2,49); EIMS m/z(rel. int.): 246(1) [M + ], 206(6), 205(50), 204(16), 203(56), 174(7), 173(63), 172(11), 171(28), 162(6), 144(18), 143(34), 141(10), 131(26), 129(36), 128(29), 127(7), 123(17), 117(7), 115(22), 105(15), 91(100), 78(12), 77(10), 65(19), 51(6), 43(64); izraĉunato za C15H18O3: C 73,15, H 7,38, O 19,47%; naĊeno C 73,15, H 7,39, O 19,46%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,31–7,19 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟–5‟), 7,06 (dublet dubleta, J = 7,3, 2,2 Hz, 2H, CH-2‟, 6‟), 5.70 (multiplet, 1H, CH-2‟‟), 5,18 (multiplet, 1H, CH-3‟‟), 5,11 (multiplet, 1H, CH-3‟‟), 3,71 (singlet, 3H, CH3-5), 3,31–3,08 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,57 (široki dublet, J = 7,2 Hz, 2H, CH2-1‟‟), 2,11 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 204,2 (C-2), 171,8 (C-4), 136,1 (C-1‟), 132,2 (C-2‟‟), 129,8 (C-2‟, 6‟), 128,3 (C-3‟, 5‟), 126,9 (C-4‟), 119,2 (C-3‟‟), 64,8 (C-3), 52,1 (C- 5), 37,7 (C-6), 36,1 (C-1‟‟), 27,5 (C-1). Metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4-enoat [13e]: bezbojni kristali; prinos: 79%; FTIR (ATR) cm -1 : 3086, 2953, 1747 (COOMe), 1711 (C=O), 1642, 1433, 1354, 1195, 1171, 1083, 900, 743, 701; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 194 (2,52); EIMS m/z(rel. int.): 260(1) [M + ], Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 92 205(10), 203(15), 201(28), 186(15), 185(26), 173(32), 171(9), 169(13), 157(25), 156(6), 155(61), 144(6), 143(21), 142(9), 141(9), 137(30), 131(20), 129(20), 128(11), 125(8), 117(9), 115(22), 109(14), 91(100), 77(10), 65(16), 43(57); izraĉunato za C16H20O3: C 73,82, H 7,74, O 18,44%; naĊeno C 73,79, H 7,75, O 18,46%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,28–7,18 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟–5‟), 7,07 (dublet dubleta, J = 7,2, 2,3 Hz, 2H, CH-2‟, 6‟), 4,91 (široki singlet, 1H, CH-3‟‟), 4,74 (široki singlet, 1H, CH-3‟‟), 3,69 (singlet, 3H, CH3-5), 3,30– 3,25 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,63 (široki singlet, 2H, CH2-1‟‟), 2,09 (singlet, 3H, CH3-1), 1,69 (široki singlet, 3H, CH3-4‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,1 (C-2), 172,3 (C-4), 140,9 (C- 2‟‟), 136,4 (C-1‟), 129,9 (C-2‟, 6‟), 128,2 (C-3‟, 5‟), 126,8 (C-4‟), 114,7 (C-3‟‟), 64,6 (C-3), 52,1 (C-5), 40,2 (C-6), 38,8 (C-1‟‟), 28,1 (C-1), 24,0 (C-4‟‟). Metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4-enoat [13f]: bezbojni kristali; prinos: 84%; FTIR (ATR) cm -1 : 3069, 2949, 1740 (COOMe), 1711 (C=O), 1644, 1496, 1436, 1354, 1274, 1177, 1153, 1081, 996, 747, 701; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 193 (2,50); EIMS m/z(rel. int.): 274(1) [M + ], 199(14), 184(10), 183(100), 173(9), 171(10), 152(6), 151(64), 145(7), 131(22), 129(8), 116(15), 115(13), 91(54), 69(18), 43(78); izraĉunato za C17H22O3: C 74,42, H 8,09, O 17,49%; naĊeno C 74,45, H 8,09, O 17,46%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,25–7,17 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟–5‟), 7,07 (dublet dubleta, J = 7,3, 2,3 Hz, 2H, CH-2‟, 6‟), 4,99 (triplet septupleta, J = 7,0, 1,4 Hz, 1H, CH-2‟‟), 3,69 (singlet, 3H, CH3-5), 3,03–2,84 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,51 (dublet dubleta, J = 7,0, 1,0 Hz, 2H, CH2-1‟‟), 2,09 (singlet, 3H, CH3- 1), 1,72 (pseudo kvartet, J = 1,4 Hz, 3H, CH3-5‟‟), 1,59 (široki dublet, J = 1,0 Hz, 3H, CH3-4‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 204,6 (C-2), 172,2 (C-4), 136,3 (C-1‟), 135,5 (C-2‟‟), 129,8 (C-2‟, 6‟), 128,1 (C-3‟, 5‟), 126,7 (C-4‟), 117,4 (C-3‟‟), 64,6 (C-3), 52,0 (C-5), 37,5 (C-6), 30,1 (C-1‟‟), 27,1 (C-1), 25,9 (C-5‟‟), 18,0 (C-4‟‟). Metil-2-acetil-2-benziloktanoat [13g]: bezbojni kristali; prinos: 62%; FTIR (ATR) cm -1 : 3072, 2945, 1745 (COOMe), 1712 (C=O), 1642, 1496, 1454, 1440, 1355, 1251, 1177, 1121, 1080, 1031, 815, 743, 700; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 196 (2,56); EIMS m/z(rel. int.): 290(10) [M + ], 248(10), 247(43), 216(18), 215(62), 177(17), 174(14), 173(10), 146(10), 145(79), 131(19), 129(8), 117(41), 116(18), 115(22), 102(12), 92(10), 91(100), 78(9), 43(56); izraĉunato za C18H26O3: C 74,45, H 9,02, O 16,53%; naĊeno C 74,39, H 9,05, O 16,56%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,26–7,18 (preklopljeni signali, 3H, CH-3‟–5‟), 7,02 (dublet dubleta, J = 7,3, 2,1 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 93 Hz, 2H, CH-2‟, 6‟), 3,68 (singlet, 3H, CH3-5), 3,03–2,84 (AB kvartet, 2H, CH2-6), 2,09 (singlet, 3H, CH3-1), 1,78 (pseudo triplet, J = 6,9 Hz, 2H, CH2-1‟‟), 1,33–1,24 (preklopljeni signali, 8H, CH2-2‟‟–5‟‟), 0,88 (pseudo triplet, J = 6,9 Hz, 3H, CH3-6‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,0 (C-2), 172,5 (C-4), 136,5 (C-1‟), 129,7 (C-2‟, 6‟), 128,2 (C-3‟, 5‟), 126,8 (C-4‟), 64,8 (C-3), 52,1 (C-5), 37,4 (C-6), 31,5, 31,4, 23,8, 22,5 (C-2‟‟–5‟‟), 29,5(C-1‟‟), 27,2 (C-1), 13,9 (C-6‟‟). Metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoat [13h]: bezbojni kristali; prinos: 55%; FTIR (ATR) cm -1 : 3067, 2945, 1741 (COOMe), 1707 (C=O), 1644, 1495, 1454, 1432, 1354, 1231, 1179, 1154, 1086, 2019, 991, 744, 699; UV-Vis (MeCN, 0,05 M) λmax nm (log ε): 195 (2,50); EIMS m/z(rel. int.): 296(1) [M + ], 254(7), 253(15), 222(11), 221(30), 206(11), 205(91), 178(6), 174(11), 173(97), 144(10), 117(9), 116(25), 115(27), 103(10), 92(9), 91(100), 65(15), 43(33); izraĉunato za C19H20O3: C 77,00, H 6,80, O 16,20%; naĊeno C 77,02, H 6,81, O 16,17%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,27–7,19 (preklopljeni signali, 6H, CH-3‟–5‟, 4‟‟–6‟‟), 7,10 (dublet dubleta, J = 7,3, 2,3 Hz, 4H, CH-2‟, 6‟, 3‟‟, 7‟‟), 3,66 (singlet, 3H, CH3-5), 3,21 (široki singlet, 4H, CH2-6, 1‟‟), 1,93 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,4 (C-2), 172,0 (C-4), 136,3 (C-1‟, 2‟‟), 130,0 (C-2‟, 6‟, 3‟‟, 7‟‟), 128,3 (C-3‟, 5‟, 4‟‟, 6‟‟), 126,9 (C-4‟, 5‟‟), 66,1 (C-3), 51,9 (C-5), 39,8 (C-6, 1‟‟), 29,1 (C-1). Spektralni podaci su u saglasnosti sa literaturnim (Sankar et al., 2012). 3.4.6. Sinteza 2,2-dipropil- i 2,2-dialil-supstituisanih metil-acetoacetata Suspenzija anhidrovanog K2CO3 (9,52 g, 68,96 mmol) u suvom acetonu (100 ml), metil- acetoacetata (2,00 g, 17,24 mmol) i alil-bromida (8,21 g, 68,96 mmol) refluktovana je 4 h pa mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon uparavanja rastvaraĉa, ostatku je dodata voda (100 ml) i izvršena je ekstrakcija dietil-etrom (4 × 50 ml). Organski slojevi su spojeni i isprani vodom (2 × 50 ml) i sušeni preko noći nad anhidrovanim MgSO4. Rastvaraĉ je uparen a sirova smeša je frakcionisana „dry flash” hromatografijom (SiO2/heksan–dietil-etar 4:1, v/v). Dobiveno je 2,64 g (13,45 mmol) metil-2,2-dialilacetoacetata (prinos 78%). Metil-2,2-dialilacetoacetat (1,00 g, 8,4 mmol) rastvoren je u metanolu i mešan na sobnoj temperaturi sa 10% Pd/C (100 mg) pod atmosferom vodonika (atmosferski pritisak) sve do trenutka kada više nije bilo potrošnje vodonika. Katalizator je uklonjen filtriranjem a rastvaraĉ je uparen na rotacionom vakuum uparivaĉu. Ostatak je na osnovu TLC i GC-MS analiza predstavljao ĉist metil-2,2-dipropilacetoacetat (1,00 g, 5 mmol; prinos 98%). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 94 Spektralni podaci sintetisanih estara: Metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoat [14]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 78%; FTIR (ATR) cm-1: 3045, 2940, 1742 (COOMe), 1710 (C=O), 1640, 1436, 1356, 1279, 1210, 1141, 1054, 992, 918; EIMS m/z(rel. int.): 196(1) [M + ], 155(19), 154(40), 153(18), 141(5), 139(10), 138(5), 137(10), 125(7), 123(49), 122(16), 121(9), 113(12), 112(9), 111(8), 96(6), 95(38), 94(19), 93(33), 91(15), 81(31), 80(18), 79(41), 77(20), 67(16), 65(9), 59(19), 53(15), 43(100); izraĉunato za C11H16O3: C 67,32, H 8,22, O 24,46%; naĊeno C 67,29, H 8,19, O 24,52%; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 5,67–5,48 (multiplet, 2H, CH-2‟, 2‟‟), 5,15–5,11 (multiplet, 2H, CH-3‟, 3‟‟), 5,08–5,04 (multiplet, 2H, CH-3‟, 3‟‟), 3,73 (singlet, 3H, CH3-5), 2,65–2,57 (multiplet, 4H, CH2-1‟, 1‟‟), 2,13 (singlet, 3H, CH3-1); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 203,7 (C-2), 171,8 (C-4), 132,1 (C-2‟, 2‟‟), 119,0 (C-3‟, 3‟‟), 63,3 (C-3), 52,2 (C-5), 36,0 (C-1‟, 1‟‟), 26,9 (C-1). Spektralni podaci su u saglasnosti sa literaturnim (Sankar et al., 2012). Metil-2-acetil-2-propilpentanoat [15]: bezbojna uljasta teĉnost; prinos: 76%; FTIR (ATR) cm -1 : 2962, 1741 (COOMe), 1716 (C=O), 1651, 1434, 1356, 1149, 1030; EIMS m/z(rel. int.): 200(1) [M + ], 158(34), 130(6), 129(100), 97(13), 73(7), 69(10), 59(6), 55(8), 43(23); izraĉunato za C11H20O3: C 65,97, H 10,06, O 23,97%; naĊeno C 65,98, H 10,07, O 23,95%; 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 3,72 (singlet, 3H, CH3-5), 2,11 (singlet, 3H, CH3-1), 1,92–1,72 (preklopljeni signali, 4H, CH2-1‟, 1‟‟), 1,22–1,00 (preklopljeni signali, 4H, CH2-2‟, 2‟‟), 0,92 (pseudo triplet, J = 7,0 Hz, 6H, CH3-3‟, 3‟‟); 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 205,3 (C-2), 173,2 (C-4), 63,6 (C-3), 52,1 (C-5), 33,7 (C-1‟, 1‟‟), 26,7 (C-1), 17,3 (C-2‟, 2‟‟), 14,4 (C-3‟, 3‟‟). Spektralni podaci su u saglasnosti sa literaturnim (Wang i Tian, 1999). 3.5. Testiranje biološke aktivnosti estara 3.5.1. Testiranje in vitro aktivnosti 3.5.1.1. Korišćeni mikroorganizmi Antibakterijska aktivnost odabranih sintetisanih jedinjenja ([2a – 2n], [2q], [3], [5], [6], [3f], [3g], [3i – 3k], [5h], [5k], [6h], [6k], [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15]) testirana je na sojevima bakterija koji pripadaju American Type Culture Collection (Maryland, USA (ATCC)) ili predstavljaju kliniĉke izolate ili izolate iz hrane: Gram-pozitivne: Sarcina lutea (ATCC 9431), Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 95 S. lutea (izolat iz hrane), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), S. aureus (ATCC 6538), S. aureus (izolat iz rane), Bacillus cereus (ATCC 9139), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Gram- negativne: Proteus mirabilis (ATCC 12453), P. mirabilis (izolat iz urina), Proteus vulgaris (ATCC 8427), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), E. aerogenes (izolat iz rane), Enterobacter cloacae (izolat iz rane), Escherichia coli (ATCC 8739), E. coli (izolat iz fecesa), E. coli (izolat iz rane), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031), K. pneumoniae (izolat iz urina), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), P. aeruginosa (izolat iz urina) i Salmonella enterica (ATCC 13076). Antifungalna aktivnost ([2a – 2n], [2q], [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15]) testirana je na dve vrste gljivica: kvasac Candida albicans (ATCC 10231) i plesni Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404). Bakterijski sojevi su odrţavani na hranljivom agaru na temperaturi od 37 °C, dok su gljivice kultivisane na Saburo (Sabouraud) dekstroznom agaru (SDA) na 30 °C u mikrobiološkoj laboratoriji (Departman za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematiĉki fakultet, Univerzitet u Nišu). 3.5.1.2. Antimikrobna aktivnost Ispitivanje antimikrobne aktivnosti je vršeno mikrodilucionom metodom (po preporukama Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI, 2007). Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) je odreĊena na osnovu testiranja niza razblaţenja ispitivanih supstanci u mikrotitarskim ploĉama sa 96 bunarića. Bakterije korišćene za testiranje su kultivisane na 37 °C u Mueller Hinton agaru (MHA), a gljivice u SDA agaru na 30 °C. Nakon 18 h kultivisanja, suspenzija bakterija je napravljena u Mueller Hinton bujonu. Turbidimetrijskom metodom, korišćenjem denzitometra (DEN-1 McFarland Densitometer, Biosan), broj mikroorganizama je podešen na 0,5 jedinica na McFarland-ovoj skali. Krajnja koncentracija inokuluma bakterija i kvasca je iznosila 5 × 10 5 CFU/ml (CFU – colony-forming unit). Suspenzija plesni (A. brasiliensis) je napravljena u SD bujonu, i konaĉna veliĉina fungalnog inokuluma (1 × 104 CFU) je potvrĊena brojanjem u Thoma komori. Uzorci za testiranje su pripremljeni rastvaranjem u dimetil-sulfoksidu (DMSO; u opsegu koncentracija 0,0025 – 6 mg/ml za jedinjenja [3] (0,015 – 36,59 mmol/l), [5] (0,015 – 36,59 mmol/l), [6] (0,015 – 36,59 mmol/l), [3f] (0,01 – 24,19 mmol/l), [3g] (0,01 – 24,19 mmol/l), [3i – 3k] (0,01 – 24,39 mmol/l), odnosno u opsegu 0,001 – 4 mg/ml za [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15] ([12a] (0,003 – 12,74 mmol/l), [12b] (0,003 – 12,20 mmol/l), [12c] (0,0029 – 11,70 mmol/l), [12d] (0,0028 – 11,30 mmol/l), [12e] (0,0027 – Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 96 10,87 mmol/l), [12f] (0,0026 – 10,47 mmol/l), [12g] (0,0025 – 10,05 mmol/l), [12h] (0,0025 – 9,90 mmol/l), [13a] (0,0049 – 19,42 mmol/l), [13b] (0,0045 – 18,18 mmol/l), [13c] (0,0043 – 17,09 mmol/l), [13d] (0,0041 – 16,26 mmol/l), [13e] (0,0038 – 15,38 mmol/l), [13f] (0,0036 – 14,60 mmol/l), [13g] (0,0034 – 13,79 mmol/l), [13h] (0,0034 – 13,51 mmol/l), [14] (0,0051 – 20,41 mmol/l), [15] (0,005 – 20,0 mmol/l)). Finalna koncentracija DMSO-a u svakom bunariću je najviše iznosila 10% (v/v), za koju je ranije potvrĊeno da ne utiĉe na rast testiranih sojeva. Rastvori etarskog ulja Scandix pecten-veneris (8 mg/ml) i ĉistih estara dugolanĉanih alkohola su pripremljeni u 0,05% (maseni procenat) vodenom rastvoru surfaktanta tvina 80 (Tween 80) u opsegu koncentracija 0,001 – 8,00 mg/ml ([2a] (0,0037 – 29,63 mmol/l), [2b – 2d] (0,0035 – 28,17 mmol/l), [2e] i [2f] (0,0034 – 26,85 mmol/l), [2g – 2i] (0,0032 – 25,64 mmol/l), [2j] i [2k] (0,0031 – 24,54 mmol/l), [2l – 2o] (0,0029 – 23,53 mmol/l), [2p – 2r] (0,0028 – 22,60 mmol/l)). U sluĉaju estara dugolanĉanih alkohola rastvaraĉ (0,05% vodni ratsvor tvina 80) je korišćen kao negativna kontrola. Bakterijski inokulumi su dodati u sve bunariće koji sadrţe jedinjenja u odgovarajućim koncentracijama i ploĉe su inkubirane na 37 °C u toku 24 h (u sluĉaju gljiva inkubacija je bila na 30 °C u toku 48 h). Streptomicin, hloramfenikol, tetraciklin i nistatin su korišćeni kao pozitivne kontrole dok je rastvaraĉ (10%-tni vodeni rastvor DMSO-a ili acetona) korišćen kao negativna kontrola. Bakterijski rast je vizualizovan dodavanjem 20 μl 0,5%-tnog vodenog rastvora 2,3,5-trifeniltetrazolijum-hlorida (TTC) (Sartoratto et al., 2004). MIC je definisan kao najniţa koncentracija jedinjenja koja je spreĉavala vidljiv rast mikroorganizma, dok minimalna baktericidna/fungicidna koncentracija (MBC/MFC) oznaĉava najniţu koncentraciju koja je ubila 99,9% mikroorganizama. Testovi su ponavljani tri puta u triplikatu. 3.5.1.3. Inhibicija acetilholinesteraze Dejstvo odabranih jedinjenja ([1], [1a], [1b], [1h], [1i], [3f – 3k], [5h], [5k], [6h], [6k]) na aktivnost acetilholinesteraze (AchE) je mereno kolorimetrijski, na osnovu Elmanove (Ellman) metode (Adhami et al., 2012). U mikrotitarskim ploĉama sa 96 bunarića dodato je 25 µl 15 mM ACTI, 125 µl 3 mM DTNB u puferu A (50 mM Tris–HCl, pH 7,9 koji sadrţi 0,1 M NaCl i 0,02 M MgCl2), 50 µl pufera B (50 mM Tris–HCl, pH 7,9 koji sadrţi 0,1% BSA) i 25 µl rastvora testiranih jedinjenja (0,156 – 40,000 µg jedinjenja u 1 ml 10% (v/v) DMSO). Apsorbancija rastvora (405 nm) je merena svakih 15 sekundi u toku 1 minuta (pet merenja). Nakon toga, 25 µl rastvora AChE (0,22 U/ml u puferu B) je dodato u svaki bunar, pa je ploĉa inkubirana 10 minuta Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 97 na 25 °C. Nakon ovog perioda, apsorbancija je ponovo merena na 15 sekundi (ukupno osam merenja). Kao negativna kontrola je korišćen 10%-tni vodeni rastvor DMSO-a. Apsorbancija koja je rezultat spontane hidrolize supstrata (apsorbancija merena pre dodavanja enzima (slepa proba)) oduzeta je od vrednosti apsorbancije nakon dodavanja AChE. Razliĉite koncentracije fizostigmina (u opsegu 0,12 – 15 µmol/ml) korišćene su kao pozitivna kontrola. Svaki test, u triplikatu, ponovljen je tri puta. 3.5.1.4. OdreĎivanje citotoksičnosti na fibroblaste pluća (MRC5) i ćelije melanoma (A375) Humani fibroblast pluća (MRC5 linija ćelija (ATCC)) i ćelijska linija melanoma A375 ( TCC) su uzgajane u vlaţnoj atmosferi 95% vazduha i 5% CO2 (v/v, zasićen vlagom) na 37 °C, i odrţavane kao monoslojne kulture u RPMI-1640 medijumu koji je sadrţavao 100 µg/ml streptomicina, 100 U/ml penicilina i 10% (v/v) fetal bovine seruma (FBS). MRC5 i 375 ćelije su tretirane sa dve koncentracije (50 µg/ml i 5 mg/ml) svakog testiranog jedinjenja u toku 24 h, a citotoksiĉni efekat je kvantifikovan na osnovu smanjenja koliĉine 3-(4,5-dimetiltijazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijum-bromida (MTT) (Hansen et al., 1989). Apsorbancija je merena na 490 nm na ĉitaĉu mikrotitarskih ploĉa (MTX Labsystems Inc., Vienna, WY, USA). Test je izveden dva puta u ĉetiri ponavljanja, a rezultati su predstavljeni kao procenat u odnosu na vrednost kontrole (netretiranih ćelija; izraţena kao 100%). Poĉetno testiranje je izvršeno za 12 jedinjenja (eugenol [3], 2-alil-3-metoksifenol [5], 2-alil-5-metoksifenol [6], eugenil-2-metilbutanoat [3f], eugenil-3- metilbutanoat [3g], eugenil-senecioat [3j], eugenil-tiglat [3k], eugenil-angelat [3i], 2-alil-3- metoksifenil-valerat [5h], 2-alil-3-metoksifenil-tiglat [5k], 2-alil-5-metoksifenil-valerat [6h] i 2- alil-5-metoksifenil-tiglat [6k]). Pored toga, IC50 vrednosti (koncentracija jedinjenja koja dovodi do 50% smanjenja vijabilnosti ćelija) odreĊene su za 2-alil-5-metoksifenol [6], eugenil-2- metilbutanoat [3f] i eugenil-angelat [3i] za koje su testovi izvedeni u koncentracijama od 1 µg/ml do 1 mg/ml ([6] (6,1 µmol/l – 6,1 mmol/l), [3f] (4,03 µmol/l – 4,03 mmol/l), [3i] (4,1 µmol/l – 4,1 mmol/l)) nakon 48 ĉasovne ćelijske inkubacije. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 98 3.5.2. Testiranje in vivo aktivnosti 3.5.2.1. Eksperimentalne ţivotinje Miševi muškog pola soja BALB/c (20 ± 5 g) stari 5 nedelja dobijeni su iz Vivarijum Instituta za biomedicinska istraţivanja, Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu. Ţivotinje su ĉuvane u grupama od po šest miševa pod standardnim laboratorijskim uslovima: 12 h ciklusi svetla i mraka na 22±2 °C sa stalno dostupnom hranom i vodom. Ţivotinje su aklimatizovane na laboratorijske uslove najmanje 12 h pre testiranja (bez hrane, ali sa dostupnom vodom). Petnaest eksperimentalnih grupa i dve kontrolne (pozitivna i negativna kontrola), sa šest ţivotinja po grupi, korišćeno je u testovima abdominalnih grĉeva izazvanih acetilholinom (AChW) i testiranju osetljivosti na termalni nadraţaj (Matheus et al., 2005). Osetljivost na termalni nadraţaj odreĊena je kod ţivotinja (petnaest grupa) koje su intraperitonealno primile odabrana sintetisana jedinjenja ([1], [1a], [1b], [1h], [1i]; rastvor u maslinovom ulju) neposredno pre eksperimenata u dozama od 12,5, 25 i 50 mg/kg ([1] (0,082 mmol/kg – 0,33 mmol/kg), [1a] (0,069 mmol/kg – 0,28 mmol/kg), [1b] (0,064 mmol/kg – 0,26 mmol/kg), [1h] i [1i] (0,053 mmol/kg – 0,21 mmol/kg)), dok su dve grupe dobile morfijum 5 mg/kg (0,018 mmol/kg) ili maslinovo ulje. Za potrebe testiranja uticaja na nastanak abdominalnih grĉeva izazvanih acetilholinom, ţivotinje su primile odabrana jedinjenja ([1], [1a], [1b], [1h], [1i]) 1 h pre eksperimenata. Svi eksperimenti su sprovedeni u skladu sa principima zaštite i korišćenja laboratorijskih ţivotinja u nauĉnim istraţivanjima (Direktiva EEZ od 1986; 86/609/EEC) i odobrene su od strane lokalnog etiĉkog odbora. 3.5.2.2. Test abdominalnih grčeva izazvanih acetilholinom (writhing test) Ţivotinje su tretirane kao što je opisano u odeljku 3.5.2.1. Jedan sat nakon injektiranja jedinjenja data je i injekcija ACh (5 mg/kg), a broj abdominalnih grĉeva (ekstenzija zadnjih ekstremiteta i abdomena) meren je tokom 5 min nakon injekcije (Bittencourt et al., 1995). Procenat inhibicije = [broj grĉeva (kontrola) - broj grĉeva (test)]/broj grĉeva (kontrola) × 100 (Radulović et al., 2013a). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 99 3.5.2.3. Osetljivost na termalni nadraţaj - metode vruće ploče (hot-plate test) i imerzije repa (tail immersion test) Ţivotinje tretirane kao u odeljku 3.5.2.1. su stavljene na vruću ploĉu (15, 30, 45, 60, 90 i 120 minuta nakon injektiranja testiranih jedinjenja) zagrejanu na 55 ± 1 °C ili je donji deo repova ţivotinja potopljen u vodu zagrejanu na 50 ± 0,5 °C. Osnovna linija (BL) je definisana kao vreme potrebno da ţivotinja reaguje na toplotni nadraţaj 60 i 30 minuta pre injektiranja testiranih jedinjenja i morfina i predstavlja normalnu reakciju ţivotinja na temperaturu. Povećanje vremena (%) potrebnog za reakciju (IB) je raĉunato na osnovu formule: ((vreme za reakciju × 100)/BL) – 100 gde je BL vrednost osnovne linije. Antinociceptivnost je kvantifikovana kao površina ispod grafika zavisnosti (area under the curve; UC) i raĉunata kao zbir UC1 (AUC1 = 15 × IB[(min15)/2 + (min30) + (min45) + (min60)/2]) i AUC2 (AUC2 = 30 × IB[(min60)/2 + (min90) + (min120)/2]). Procenat produţenja reakcije ţivotinje pod dejstvom morfina, odnosno svake koncentracije testiranih jedinjenja je raĉunat na osnovu formule: % = AUC/max; gde je max = [(20 × 100)/BL−100] × 105 (Matheus et al., 2005). ko ţivotinja nije reagovala 20 s u testu vruće ploĉe (cut off, vreme 20 s), odnosno 15 s u testu imerzije repa (cut off, vreme 15 s), smatralo se da je ona neosetljiva na tu draţ (Matheus et al., 2005). 3.5.2.4. OdreĎivanje akutne toksičnosti Jedna kašika (oko 10 g) liofiliziranih cista raĉica (Artemia salina) je dodata u 1 l pripremljene veštaĉke morske vode (sastav: NaCl (23,926 g/l), Na2SO4 (4,008 g/l), KCl (0,677 g/l), NaHCO3 (0,196 g/l), KBr (0,098 g/l), H3BO3 (0,026 g/l), NaF (0,003 g/l), MgCl2 (5,077 g/l), CaCl2 (1,147 g/l), SrCl2 (0,014 g/l)). Većina cisti se, uz zagrevanje na 25 °C, aerisanje i osvetljavanje, transformisalo nakon 48 h. Nakon toga, po 20 nauplija je prebaĉeno u Petrijeve šolje koje sadrţe testirana jedinjenja ([1], [1a], [1b], [1h], [1i], [3], [5], [3f], [3g], [3i – 3k], [5h], [5k], [6h]) rastvorena u DMSO-u i razblaţena morskom vodom. Krajnje koncentracije testiranih jedinjenja u Petrijevim šoljama su bile u opsegu 0,2 – 0,0025 mg/ml za jedinjenja [1], [1a], [1b], [1h], [1i] i u opsegu 0,05 – 0,005 mg/ml za [3], [5], [3f], [3g], [3i – 3k], [5h], [5k], [6h], dok je konaĉna koncentracija DMSO-a bila manja od 1% (v/v). Pod tim uslovima, DMSO nije uticao na raĉiće i predstavljao je negativnu kontrolu. Raĉići nisu hranjeni u toku testiranja. Petrijeve šolje su drţane na sobnoj temperaturi pod konstantnim izvorom svetlosti, ali nisu aerisane. Brojanje mrtvih raĉića je vršeno nakon 24, 48 i 72 h. LC40 ili LC50 (koncentracija koja je letalna za 40 ili Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 100 50% raĉića) je odreĊena nakon statistiĉke analize. Svi testovi su raĊeni u triplikatu, a ponavljani su dva puta. Kao pozitivna kontrola su korišćene razliĉite koncentracije natrijum-dodecilsulfata. 3.6. Statistička obrada podataka Za statistiĉku obradu dobijenih numeriĉkih podataka i utvrĊivanja statistiĉke znaĉajnosti vrednosti korišćena je (ANOVA) analiza varijanse. Interval poverenja je u svim statistiĉkim analizama bio 95%. Metoda analize glavne komponente (PCA) i aglomerativna hijerarhijska klaster analiza (AHC) vršene su pomoću Excel plug-in programa XLSTAT, verzija 2011.4.02 i 2012.6.02. Obe metode su primenjene na sledećim grupama varijabli: originalne varijable (procentualni sadrţaj sastojaka koji je veći od 1% u uzorcima etarskih ulja ili MIC vrednosti antimikrobne aktivnosti) kao i zbir procenata klasa jedinjenja (monoterpeni, seskviterpeni, diterpeni, fenilpropanoidi, „green leaf“-derivati, benzaldehidi, alifatiĉni estri, masne kiseline, derivati metabolizma masnih kiselina i ostalo). U sluĉaju HC analize primenjeni su: Pirsonova (Pearson) razlika i Euklidova (Euclidean) udaljenost. Vršena PC analiza je Pirsonovog (n) tipa. 3.7. In silico eksperimenti 3.7.1. Optimizacija geometrije molekula i izračunavanje NMR hemijskih pomeranja i konstanti spin–spin kuplovanja Kvantno-mehaniĉka izraĉunavanja za trans-sabinol [1] i nekoliko odabranih njegovih estara [1a – 1j] su vršena na DF nivou teorije (density functional theory), konkretno Beckeov triparametarnom hibridnom funkcijom zajedno sa Lee–Yang–Parro-vom korelacionom funkcijom, B3LYP. Za sve atome je korišćen osnovni set 6-311G** (d, p). Vrednosti hemijskih pomeranja protona i njihovih konstanti kuplovanja su bili izraĉunati korišćenjem GI O-DFT metode (B3LYP, 6-311G** (d, p) osnovni set). Proraĉuni su izvedeni korišćenjem programskog paketa Gaussian 03 (Frisch et al., 2004). 3.7.2. Eksperimenti molekulskog dokovanja (ukotljavanja) trans-Sabinol [1], njegovi estri [1a – 1j], kao i poznati AChE inhibitori (rivastigmin i fizostigmin) su dokovani u kristalnu strukturu acetilholin esterase (AChE) iz vrste jegulje Torpedo californica (Protein Data Bank (PDB) kod: 1EA5). Svi eksperimenti dokovanja su Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 101 izvršeni korišćenjem AutoDock Vina 1.1.2 softvera (Trott i Olson, 2010), kao blind docking (dokovanje nije ograniĉavano na odreĊeni deo proteina) (Rnjan et al., 2010). Zapremina proteina u koju se molekul dokuje (centar x, y, z = 4,91, 64,80, 56,36) obuhvata ceo enzim; veliĉina prostora za pretraţivanje je bila 60 × 66 × 60 Å. Ligandima je bila dozvoljena fleksibilnost u toku dokovanja dok su osnovni skelet receptora i boĉni lanci bili potpuno fiksirani. Za svako dokovano jedinjenje je korišćena konformacija dobivena geometrijskom optimizacijom na DFT nivou (6–311**(d,p) B3LYP). utodock Tools, verzija 1.5.6 je korišćena za konvertovanje liganda i molekula receptora u odgovarajući (pdbqt) format za utoDock Vina dokovanje. Isti program je bio korišćen za prikazivanje rezultata dokovanja (Sanner, 1999). Svi in silico eksperimenti su raĊeni korišćenjem Intel® Core™ i7-3930K 3,20 GHz šestojezgarnog CPU procesora. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 102 4. REZULTATI I DISKUSIJA Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 103 4.1. Kombinatorna biblioteka sabinil estara 4.1.1. Kreiranje kombinatorne biblioteke, sinteza i spektralna karakterizacija estara trans-sabinola 4.1.1.1. Kreiranje biblioteke i sinteza estara GC-MS analizom uzoraka etarskih ulja nadzemnih delova biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia subsp. serbica, kao i uzorka ulja korena A. falcata bilo je uoĉeno da su glavni sastojci ovih ulja trans-sabinol [1] i jedan od dijastereoizomernih sabinil-acetata [1b]. Poĉetna identifikacija glavnih sastojaka je bila bazirana na uporeĊivanju vrednosti retencionih indeksa i masenih spektara detektovanih sastojaka sa literaturnim vrednostima, odnosno spektrima (Adams, 2007; Cégiéla-Carlioz et al., 2005; Mack et al., 2013). Parcijalne jonske struje (PIC; partial ion current) uzoraka ulja Af1/Af2/As1/As2 (sastav je dat u prilogu 8.1.1), koje odgovaraju promeni intenziteta jona na m/z 91 sa vremenom, ukazivali su na prisustvo i drugih sastojaka sa veoma sliĉnom fragmentacijom kao što je ona kod glavnih sastojaka ulja - trans-sabinola i sabinil-acetata. S obzirom na njihovu malu relativnu zastupljenost u uljima (do nekoliko procenata) hromatografsko izolovanje iz ulja (veoma sloţene smeše od nekoliko stotina sastojaka) je bilo praktiĉno nemoguće. Stoga je jedini logiĉan pristup bio sinteza male biblioteke estara trans-sabinola, a zatim i njihova ko-hromatografija sa uzorcima etarskog ulja. Broj jedinjenja koja su ĉinila biblioteku je znatno smanjen uzimajući u obzir hromatografske osobine (retencioni indeksi) i fragmentaciju detektovanih sastojaka (o MS i RI analizi će biti detaljnije diskutovano u poglavlju 4.1.2.1). Standardi sabinil estara mravlje, propanske, izobutanske, butanske, 2-metilbutanske, 3-metilbutanske, (E)-2-metil-2-butenske (tiglinske), (Z)-2-metil-2- butenske (angelika), 3-metil-2-butenske, nonanske, dekanske i benzoeve kiseline su dobiveni polazeći od trans-sabinola korišćenjem Šteglihove procedure za esterifikaciju (slika 4.1.1). 4.1.1.2. Nomenklaturni problemi koji se tiču stereohemije derivata sabinola Pretragom literature je uoĉeno da je prethodno korišćeno nekoliko naĉina za imenovanje stereoizomera sabinola i njihovih derivata. Na primer, u prethodnom ispitivanju biljne vrste Achillea ageratifolia subsp. serbica, koja je i deo istraţivanja obuhvaćenih ovom doktorskom disertacijom, Simić i saradnici (Simić et al., 2000) su utvrdili da njeno etarsko ulje sadrţi oko Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 104 40% „β-sabinil-acetata”. Na osnovu odliĉnog slaganja neasigniranih 1H NMR podataka „β- sabinil-acetata” (C S registarski broj 304898-00-8) sa našim podacima (videti Eksperimentalni deo) zakljuĉili smo da se radi o identiĉnom estru sirćetne kiseline sa istim dijastereoizomerom sabinola. Slika 4.1.1. Shema sinteze estara trans-sabinola MeĊutim, znaĉenje stereodeskriptora „β” iskorišćenog u pomenutom radu je nejasno, a pored toga ne postoji povezana struktura sa pomenutim CAS brojem. Nakon detaljne pretrage literature, nismo našli nijedan drugi navod deskriptora „β” za razlikovanje dva dijastereoizomera (obiĉno oznaĉenih kao cis i trans) sabinil-acetata, ili bilo kod drugog derivata sabinola. Dodatno, u C S bazi podataka sledeća imena su navedena kao sinonimi: trans-sabinol i (1R*,3S*,5R*)-4- metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-ol, i trans-sabinil-acetat i (1R*,3R*,5R*)-4- metilen-1-(1-metiletil)biciklo[3.1.0]heksan-3-il-acetat. Odmah je uoĉljivo suprotno znaĉenje stereodeskriptora trans (relativna konfiguracija C-3 stereogenog centra) u alkoholu i njegovom acetatu. Generalno, znaĉenje deskriptora „β” je nedvosmisleno u tri sluĉaja (IUPAC, 1997): ako je poznat referentni stereocentar (kao u šećerima); ako je relativna stereohemija na ovaj naĉin iskazana svim stereogenim centrima (kao u CAS nomenklaturi); ili ako postoji definisana Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 105 apsolutna konfiguracija i dogovorena orijentacija strukture, tj. naĉin prikazivanja strukture (kao kod steroida). U samom radu Simić i saradnici (Simić et al., 2000) nisu naveli dodatne informacije o stereohemiji identifikovanog estra, odnosno nije navedena literatura na osnovu koje je iskorišćen deskriptor „β”, pored toga nije data struktura sa iskazanom stereohemijom niti postoji deo diskusije koji se tiĉe stereohemije. MeĊutim, na osnovu poreĊenja NMR podataka, moţe se zakljuĉiti da je „β-izomer”, iz rada Simića i saradnika (Simić et al., 2000), izomer sa 1R*,3S*,5R*-relativnom stereohemijom. Na osnovu izloţenog, moţe se zakljuĉiti da cis/trans, odnosno β nisu pogodni kao stereodeskriptori za razlikovanje dijastereoizomernih derivata sabinola; cis/trans zbog oĉigledne konfuzije (estri trans-sabinola su nazivani cis-sabinil-karboksilatima i obrnuto) i zato što korišćenje deskriptora β ne daje ikakvu stereohemijsku informaciju o ovom bicikliĉnom sistemu. Verujemo da je jedini naĉin za razrešavanje ovog Gordijevog ĉvora korišćenje CIP (Cahn- Ingold-Prelog) sistema (IUPAC, 1997). Pošto su po IUPAC-u nazivi, ĉak i za takve relativno male molekule, veoma komplikovani, predlaţemo korišćenje stereohemijske notacije (1R*,3S*,5R*) ispred tradicionalnog imena, odnosno da se estri imenuju kao (1R*,3S*,5R*)- sabinil-karboksilati kada potiĉu iz trans-sabinola ((1R*,3S*,5R*)-sabinola), i (1R*,3R*,5R*)- sabinil-karboksilati kada estri potiĉu od cis-sabinola ((1R*,3R*,5R*)-sabinola). Predlaţemo ovaj naĉin imenovanja derivata sabinola, a ne korekciju dosadašnje cis/trans nomenklature, jer mislimo da bi takva korekcija (prebacivanje cis-sabinil estara u trans i obrnuto) izazvalo još veću nomenklaturnu konfuziju. 4.1.1.3. NMR spektralna karakterizacija odabranih jedinjenja biblioteke trans-Sabinol [1] i cis-sabinol, oba poznata prirodna proizvoda (ĉesto prisutni kao isparljivi biljni metaboliti), su dijastereoizomeri koji se razlikuju samo u stereohemiji na stereogenom centru C-3 (slika 4.1.1): (1R*,3S*,5R*)- odnosno (1R*,3R*,5R*)-4-metilen-1-(1- metiletil)-biciklo[3.1.0]heksan-3-ol. U cilju nedvosmislenog odreĊivanja identiteta (a naroĉito relativne stereohemije) alkohola i estara iz kreirane male biblioteke sabinil estara, izvršili smo detaljnu 1D- i 2D-NMR analizu alkohola [1] i nekih od njegovih sintetisanih estara (koji su deo biblioteke, a koji su identifikovani kao glavni sastojci etarskog ulja biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia subsp. serbica, i odabranih novih jedinjenja iz biblioteke). Vaţno je napomenuti da je detaljnom pretragom literature ustanovljeno da ne postoje 2D-NMR spektralni podaci za Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 106 trans-sabinol [1] i (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetat [1b], dok su sintetisani estri [1a], [1h – 1m] nova jedinjenja (bez spektralnih podataka u literaturi). Da bi olakšali potpunu asignaciju 1H/13C NMR signala, izvršena je optimizacija geometrije analiziranih jedinjenja na B3LYP-DFT nivou teorije (6–311**(d,p) osnovni set) i izraĉunate su odgovarajuće spin-spin konstante kuplovanja, kao i 1H/13C hemijska pomeranja. Konformer jedinjenja [1a] sa najmanjom energijom je prikazan na slici 4.1.2; konformeri sa najmanjom energijom ostalih pomenutih jedinjenja su analogni ovoj konformaciji. Optimizovana geometrija (konformacija laĊe: C-3 je orijentisan ka ciklopropil delu, dok je ugao izmeĊu C-2–C- 3–C-4 i C-1–C-5–C-6 ravni oko 21°) se u potpunosti slaţe sa predhodno objavljenom konformacionom analizom tujana i srodnih jedinjenja (Norin et al., 1973). Slika 4.1.2. Optimizovana geometrija (DFT nivo teorije) i vaţne, eksperimentalno opaţene (oznaĉene strelicama), NOESY interakcije (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 107 Za sva sintetisana jedinjenja iz biblioteke, potpuna asignacija 1 H i 13 C NMR signala je bila bazirana na detaljnoj analizi 1D (ukljuĉujući 1H spektre sa homonuklearnim i 13C spektre bez heteronuklearnog dekuplovanja, DEPT90 i DEPT135) i 2D spektara ( 1 H–1H COSY, NOESY, HMBC i HSQC). Asignacija signala je diskutovana samo za formijat [1a] i nonanoat [1k]; u sluĉaju svih ostalih estara, asignacija je bila u potpunosti analogna (videti eksperimentalni deo, poglavlje 3.4.1.3 i tabelu 4.1.1). 1 H i 13 C NMR spektri formijata [1a] su sadrţali oĉekivani broj signala na osnovu pretpostavljene strukture estra (slike 4.1.3 i 4.1.4). Dva dubleta na 0,88 i 0,94 ppm (svaki odgovara integralu od 3 protona) su asignirani kao dijastereotopne metil grupe iz izopropil grupe (C-8 i C-9 protoni). Ovi protoni su se kuplovali sa jednim protonom (septuplet) na 1,48 ppm ( 3 J = 6,8 Hz). Povezivanje (HSQC NMR eksperiment) pomenutih 1H sa odgovarajućim 13C signalima omogućilo je asignaciju 13C NMR signala ugljenikovih atoma iz izopropil grupe (C-7 – 32,3 ppm, C-8 i C-9 – 19,6 ppm i 19,7 ppm). Slika 4.1.3. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] (signal na 2.27 potiĉe od zaprljanja iz rastvaraĉa) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 108 Slika 4.1.4. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Pored toga, u HMBC spektru je uoĉena korelacija izmeĊu svih protona iz izopropil grupe i ugljenika na 37,7 ppm. Na osnovu ovoga ovaj signal (neprotonovani ugljenik; informacija iz DEPT90 i DEPT135 spektara) pripisan je C-1 ugljeniku. Dodatno, C-7 proton se daljinski kuplovao (HMBC spektar) sa ugljenicima ĉiji su signali na 35,8 i 18,6 ppm (slika 4.1.5). Na osnovu HSQC spektra, signal ugljenika na 35,8 ppm je bio direktno povezan sa protonima ĉiji se signali u 1 H NMR spektru nalaze na 2,22 i 1,80 ppm. Ovi protoni se kupluju sa protonom ĉiji je signal 5,59 ppm (direktno vezan za ugljenik na 75,9 ppm) koji je pritom pokazivao HMBC korelaciju sa sp 2 -hibridizovanim ugljenikom (110,4 ppm) i onim iz formil grupe (160,5 ppm; direktno vezanog za proton ĉiji je signal na 8,00 ppm). Sliĉno tome, signal ugljenikovog atoma metilenske grupe na 18,6 ppm je pokazivao HSQC korelaciju sa protonima na hemijskim pomeranjima od 0,82 i 0,95 ppm i HMBC korelaciju sa vodonikom ĉiji se signal nalazio na 1,71 ppm. Signal protona na 1,71 ppm (vezan za ugljenik ĉiji se signal nalazio na 29,3 ppm) je pokazivao HMBC korelacije sa neprotonovanim sp 2 -hibridizovanih ugljenikom (C-4; 151,8 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 109 ppm) i ugljenikom ĉiji je signal na pomeranju od 110,4 ppm (za ovaj ugljenikov atom su direktno vezani protoni koji se javljaju na 5,09 i 5,14 ppm). Na osnovu ovih korelacija, 1 H NMR rezonance na 2,22 i 1,80 ppm su asignirane C-2 protonima; rezonanca na 5,59 ppm C-3 protonu, a rezonance na 1,71 i 0,82 ppm C-6 protonima. 1 H NMR signal na najjaĉem polju (8,00 ppm) je, na osnovu vrednosti hemijskog pomeranja u 1 H NMR spektru i pokazanim korelacijama u HSQC i HMBC spektrima, dodeljen formil (C-11) protonu. Slika 4.1.5. Odabrane HMBC interakcije (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] korišćene u rasvetljavanju strukture Pored geminalnog kuplovanja ( 2 J = 14,6 Hz), C-2 proton na višem hemijskom pomeranju (2,22 ppm; široki dublet dubleta dubleta) se takoĊe kupluje i sa C-3 protonom (3J = 7,8 Hz) i jednim od C-6 protona (vodonikom ĉiji se signal nalazi na 0,82 ppm; daljinsko kuplovanje 4J = 2,0 Hz). Sa druge strane, drugi C-2 proton se jedino vidljivo geminalno kuplovao ( 2 J = 14,6 Hz) sa jednim (C-2) protonom. Na osnovu ovoga i konformacije najmanje energije, koja je predstavljena na slici 4.1.2, signal na pomeranju 2,22 ppm potiĉe od C-2Ha (pro-R) protona, a signal na 1,80 ppm od C-2Hb (pro-S) protona. Torzioni ugao izmeĊu C-2Ha i C-3H u predloţenom modelu je bio 26° (sinperiplanarna orijentacija; na osnovu ĉega se oĉekuje velika vrednost konstante kuplovanja), dok je torzioni ugao izmeĊu C-2Ha i C-3H u predloţenom modelu bio 92° (slika 4.1.6; nije se oĉekivalo jako kuplovanje ovih protona). W-geometrija C- 2Ha–C-2–C-1–C-6–C-6Ha fragmenta (slika 4.1.7) objašnjava uoĉeno daljinsko kuplovanje Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 110 izmeĊu C-2Ha i C-6Ha (0,82 ppm); izraĉunata (DFT) vrednost spin-spin kuplovanja je bila +1,4 Hz. Na osnovu pretpostavljene geometrije formijata, ne oĉekuje se takvo kuplovanje u sluĉaju C- 2Hb ili C-6Hb (0,95 ppm) protona; u prilog tome govore i male vrednosti izraĉunatih J za odgovarajuće parove protona. TakoĊe, C-2Ha–C-2–C-1–C-5–C-5H fragment (slika 4.1.8) je imao pribliţno W-geometriju (izraĉunata vrednost spin-spin kuplovanja je iznosila -0,5 Hz). Ovo sprezanje je potvrĊeno eksperimentom selektivnog homonuklearnog dekuplovanja; kada je ozraĉen signal C-5H protona tada je signal C-2Ha protona postao znaĉajno oštriji. Slika 4.1.6. Torzioni uglovi izmeĊu C-2Ha (pro-R) i C-3H (26; sinperiplanarna orijentacija) i C- 2Hb (pro-S) i C-3H protona (92) u optimizovanoj geometriji (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata Multipletnost i vrednosti konstanti kuplovanja signala C-2 i C-3 protona se mogu iskoristiti za odreĊivanje relativne stereohemije trans-sabinola i njegovih estara. Kao što je opisao Norin sa saradnicima (Norin et al., 1973), i kao što se oĉekivalo na osnovu vrednosti odgovarajućih diedralnih uglova, u sluĉaju cis-sabinola, konstante kuplovanja C-2Hb i C-3 protona su uporedive sa vrednostima konstanti kuplovanja C-2Ha i C-3 protona; to znaĉi da je u cis-sabinolu i njegovim estrima signal C-2Hb protona, najverovatnije, dublet dubleta sa konstantama kuplovanja 2 J oko 14 Hz i 3 J oko 7 Hz. Vrednosti hemijskih pomeranja i oblici signala u 1 H NMR spektrima analiziranih jedinjenja su se u potpunosti slagali sa predhodno objavljenim vrednostima za trans-sabinol (Norin et al., 1973). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 111 Slika 4.1.7. W-geometrija C-2Ha–C-2–C-1–C-6–C-6Ha fragmenta (1R*,3S*,5R*)-sabinil- formijata (odgovarajuće veze su prikazane crnom bojom; numeracija atoma ugljenika i vodonika je prikazana na slici 4.1.2) Slika 4.1.8. W-geometrija C-2Ha–C-2–C-1–C-5–C-5H fragmenta (1R*,3S*,5R*)-sabinil- formijata (odgovarajuće veze su prikazane crnom bojom; numeracija atoma ugljenika i vodonika je prikazana na slici 4.1.2) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 112 Interesantno, signal formil protona je pseudokvartet (slika 4.1.9). Eksperimentima selektivnog homonuklearnog dekuplovanja je utvrĊeno da se formil proton kupluje sa protonom C-3H ( 4 J = 0,8 Hz) i sa oba C-2 protona (vrednosti odgovarajućih konstanti 5J su bile manje od 1 Hz). Izraĉunate vrednosti spin-spin konstanti kuplovanja 4J i 5J za formil proton su -0,9 (C-3H), +0,6 (C-2Hb), i +0,1 Hz (C-2Ha) i slaţu se (apsolutne vrednosti) sa eksperimentalno dobivenim vrednostima, kao i sa rezultatima predhodnih analiza konstanti daljinskog kuplovanja u estrima mravlje kiseline (Hayamizu and Yamamoto, 1967). Predloţena relativna stereohemija, odnosno optimizovana konformacija (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata, bile su u skladu sa uoĉenim nOe korelacijama protona (slika 4.1.2). Na primer, bile su uoĉene nOe korelacije izmeĊu protona C- 2Ha i C-3H, C-6Ha i C-5H, C-9H i C-7H. Zbog male razlike u hemijskom pomeranju signala C- 6Hb (0,95 ppm) i C-9H (0,94 ppm), postojanje nOe korelacije izmeĊu C-6Hb i C-2Hb protona nije bilo moguće sa sigurnošću ni potvrditi niti odbaciti. Slika 4.1.9. Oblik 1 H NMR signala formil protona (pseudo kvartet; signal prvi odozgo) (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata i promene oblika ovog signala nakon ozraĉivanja C-3H, C-2Ha i C-2Hb protona (eksperimenti selektivnog homonuklearnog dekuplovanja; redom odozgo na dole; numeracija atoma ugljenika i vodonika je prikazana na slici 4.1.2) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 113 Signali protona iz sabinil dela ostalih analiziranih estara iz kombinatorne biblioteke su imali veoma sliĉna hemijska pomeranja (u istom deuterisanom rastvaraĉu – CDCl3)/multipletnost kao i protoni iz (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata. Na primer, signali C-5H su bili u opsegu 1,66 – 1,77 ppm; signali C-7H su bili u opsegu 1,45 – 1,48 ppm, itd. Kao što je bilo oĉekivano, najveće razlike u spektrima trans-sabinola i njegovih estara su bile prisutne u hemijskim pomeranjima protona koji su blizu OH/estarske grupe. U poreĊenju sa hemijskim pomeranjem protona C-3 u estrima (ovaj proton je vezan za isti ugljenik kao i estarska (-OCOR) grupa), C-3 proton u spektru jedinjenja [1] je pomeren ka višem polju za do 1,14 ppm; C-2 protoni su bili pomereni ka višem polju za maksimalno 0,15 ppm; C-10Ha/Hb su bili pomereni ka višem polju za 0,13 ppm. Potpuna asignacija signala NMR spektara ostalih estara iz biblioteke je navedena u eksperimentalnom delu (poglavlje 3.4.1.3) i tabeli 4.1.1. Pretragom literature, ustanovljeno je da postoji samo jedna prethodna studija sa kompletnom NMR asignacijom estra sirćetne kiseline i jednog od dijastereoizomernih sabinola (Cégiéla-Carlioz et al., 2005). Naţalost, autori ovog rada nisu definisali da li je analizirano jedinjenje bilo estar cis- ili trans-sabinola. Uoĉena razlika u hemijskim pomeranjima u ovoj disertaciji i 1 H i 13 C NMR spektara sabinil-acetata iz rada Cégiéla-Carlioza i saradnika (snimljenih u istom rastvaraĉu) moţe biti posledica razlike u stereohemiji C-3 ugljenika. Pored formijata, u ovom delu će biti i detaljno opisana NMR asignacija estara trans-sabinola sa dugolanĉanim kiselinama (nonanskom i dekanskom kiselinom). Za nonanoat i dekanoat su 1D- ( 1 H (slika 4.1.10) i 13C, ukljuĉujući 1H spektre sa homonuklearnim i 13C spektre bez heteronuklearnog dekuplovanja, DEPT90 i DEPT135) i 2D- ( 1 H – 1H COSY, NOESY, HSQC, HMBC) NMR spektri snimljeni u dva rastvaraĉa (CDCl3 i C6D6). Podaci iz dobivenih spektara su omogućili asignaciju 1H i 13C NMR signala na analogan naĉin kao i u sluĉaju (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata. 1H i 13C NMR podaci nonanoata [1k] su predstavljeni u tabeli 4.1.1 (za dekanoat [1l] asignacija je navedena u eksperimentalnom delu (poglavlje 3.4.1.3)). Pored stereohemijskih informacija iz NOESY spektara i vrednosti konstanti kuplovanja u 1 H NMR i 13 C NMR spektru bez heteronuklearnog dekuplovanja, odreĊivanje stereohemije jedinjenja [1k] i [1l], olakšano je eksperimentima homonuklearnog dekuplovanja i eksperimentima sa dodatkom lantanidnog reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3). Spektralni podaci oba jedinjenja su bili veoma sliĉni i zbog toga će u ovom delu biti razmatrana samo spektralna karakterizacija jednog od njih – nonanoata. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 114 Tabela 4.1.1. NMR spektralni podaci (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata i eksperimentalne ΔEu vrednosti pomeranja protona (1H) i ugljenika ( 13 C) Poloţaj δH (ppm) a δH (ppm) b ΔEuH c δc (ppm) a δc (ppm) b ΔEuC c 1 37,1 (široki s) 37,2 2,54 2a 2,18 (1H, ddd, J = 14,5, 7,7, 2,2 Hz) 2,00 (1H, ddd, J = 14,4, 7,7, 2,1 Hz) e 2,40 35,9 (široki t, J = 131,1 Hz) 36,1 4,38 2b d 1,74 (1H, d, J = 14,5 Hz) 1,76 (1H, d, J = 14,4 Hz) e 5,33 3 d 5,46 (1H, široki d, J = 7,7 Hz) 5,72 (1H, široki d, J = 7,7 Hz) 11,40 75,9 (pseudo ddq, J = 155,4, 12,1, 6,1 Hz) 75,8 4,89 4 152,4 (široki s) 152,8 2,35 5 d 1,68 (1H, dd, J = 8,5, 3,4 Hz) 1,52 (1H, dd, J = 8,5, 3,4 Hz) 1,67 29,4 (široki d, J = 160,1 Hz) 29,8 2,68 6a 0,79 (1H, ddd, J = 8,5, 4,4, 2,2 Hz) 0,68 (1H, ddd, J = 8,5, 4,3, 2,1 Hz) e 1,87 18,7 (široki pseudo t, J = 161,4 Hz) 18,9 2,87 6b 0,92 (1H, dd, J = 4,4, 3,4) 1,14 (1H, dd, J = 4,3, 3,4) e 3,86 7 1,47 (1H, sept, J = 6,8 Hz) 1,16-1,22 (9H, preklopljeni signali) / 32,4 (široki d, J = 123,5 Hz) 32,6 0,95 8 0,88 (3H, d, J = 6,8 Hz); 0,94 (3H, d, J = 6,8 Hz) 0,75 (3H, d, J = 6,8 Hz) e 0,59 19,6 (pseudo qquint, J = 124,9, 4,8 Hz) 19,7 0,54 9 0,80 (3H, d, J = 6,8 Hz) e 0,40 19,8 (pseudo qquint, J = 124,8, 4,8 Hz) 19,8 0,27 10a d 5,09 (1H, s); 5,06 (1H, s) 5,30 (1H, s) e 4,13 109,7 (dddd, 159,2, 156,3, 2,8, 2,5 Hz) 110,0 3,54 10b d 5,11 (1H, s) e 1,73 173,2 (dtdt, J = 7,1, 4,3, 3,9, 2,9 Hz) 172,4 2,35 11 34,8 (pseudo tquint, J = 127,9, 3,5 Hz) 34,8 16,11 12 2,24 (2H, t, J = 7,5 Hz) 2,08 (2H, t, J = 7,4 Hz) 9,00 25,0 (br tquint, J = 127,2, 3,8 Hz) 25,3 8,31 13 1,59 (2H, quint, J = 7,5 Hz) 1,56 (2H, quint, J = 7,5 Hz) 5,20 29,0 e preklopljeni signali 29,4 d 3,18 14 1,23-1,31 (10H, preklopljeni signali) ≈ 1,17f 2,75 29,2e preklopljeni signali 29,6 d 1,45 15-16 1,16-1,22 (9H, preklopljeni signali) / 29,1 e preklopljeni signali 29,5 d 0,76 17 31,8 preklopljeni signali 32,2 0,41 18 1,24 (2H, sext, J = 7,0 Hz) 0,00 22,7 (široki t, J = 124,3 Hz) 23,0 0,14 19 0,88 (3H, t, J = 6,9 Hz) 0,89 (3H, t, J = 7,0 Hz) 0,00 14,1 (široki qquint, J = 124,3, 3,7 Hz) 14,3 0,00 a NMR spektri snimani na 25 °C u CDCl3. b NMR spektri snimani na 25 °C u C6D6. c Eksperimentalne ΔEu vrednosti za protone (ΔEuH) i ugljenike 13 C (ΔEuC). d Dodatna 1H˗1H kuplovanja (J2b-3 = 0,9 Hz, J3-5 = 0,7 Hz, J3-10a ≈ 1,0 Hz, J3-10b ≈ 1,0 Hz, J5-10a = 0,9 Hz, J5-10b = 0,9 Hz) su odreĊena eksperimentima 1H homonuklearnog dekuplovanja. eAsignacija je potvrĊena NMR eksperimentom sa dodatkom reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3). fHemijska pomeranja su odreĊena ekstrapolacijom grafiĉke zavisnosti [Eu(fod)3]/[trans-sabinil- nonanoat] za vrednost [Eu(fod)3] = 0. / Izraĉunavanje ∆Eu nije moguće zbog preklapanja signala u 1 H NMR spektru snimljenom bez Eu(fod)3, kao i u spektrima nakon dodatka Eu(fod)3 u molskom odnosu 0,07 – 0,21. Skraćenice: d – dublet, dd – dublet dubleta, ddd – dublet dubleta dubleta, dddd – dublet dubleta dubleta dubleta, sept – septuplet, s – singlet, sext – sekstuplet, t – triplet, quint – kvintet, ddq – dublet dubleta kvarteta, tquint – triplet kvinteta, qquint – kvartet kvinteta. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 115 Slika 4.1.10. Preklopljeni 1 H NMR spektri (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata snimljeni u CDCl3 (prikazan crvenom bojom) i C6D6 (prikazan plavom bojom) Relativna stereohemija tri stereogena centra (cis kondenzacija troĉlanog i petoĉlanog prstena i cis orijentacija RCOO- grupe i ciklopropana) je inicijalno pretpostavljena na osnovu analize NOESY spektra snimljenog u C6D6 (slika 4.1.11) i vrednosti konstanti 1 H- 1 H kuplovanja. Diedralni uglovi nonanoata [1k] su procenjeni iz MM2 optimizovanog modela (ChemBio 3D Ultra 12.0, CambridgeSoft) estra u kome je prsten ciklopentana u konformaciji „otvorene koverte” (ugao izmeĊu ravni C-1-C-2-C-4-C-5 i C-2-C-3-C-4 od 10 do 15), koja je bila oĉekivana (Norin et al., 1973). U ovom modelu torzioni ugao izmeĊu C-2Ha i C-3H je iznosio 17,9° (skoro sinperiplanarna orijentacija), a izmeĊu C-2Hb i C-3H 91,4°. Vrednost ugla od 91,4° govori o veoma maloj vrednosti konstante kuplovanja izmeĊu C-2Hb i C-3H protona, što je u skladu sa eksperimentalno odreĊenim vrednostima (0,9 Hz) za nonanoat [1k]. Pored ovog kuplovanja C-3H protona, selektivnim homonuklearnim dekuplovanjem su uoĉena i kuplovanja ovog protona sa C-5H, C-10Ha i C-10Hb protonima (J3-5 = 0,7 Hz, J3-10a ≈ 1 Hz, i J3-10b ≈ 1 Hz). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 116 Takve vrednosti konstanti kuplovanja su bile oĉekivane za ovako rigidnu strukturu u kojoj je C- 3H skoro koplanaran sa C-5H, C-10Ha i C-10Hb, a što je moguće samo u sluĉaju 1R*,3S*,5R*- dijastereoizomera. Slika 4.1.11. Optimizovana geometrija (MM2), numeracija C-2, C-6 i C-10 protona, i odabrane NOESY (C6D6) interakcije (obeleţene strelicama) za (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoat [1k] Na kraju, nedvosmislena potvrda navedene relativne stereohemije je dobivena iz eksperimenata titracije nonanoata sa lantanidnim reagensom hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) koja je praćena NMR-om (Norin et al. 1973). Estarska grupa je jedino znaĉajno (Luisovo) bazno mesto u molekulu nonanoata [1k] i zbog toga se oĉekuje koordinacija Eu(fod)3 i karbonilnog kiseonikovog atoma. Dodavanje Eu(fod)3 je uslovljavalo, više ili manje izraţeno, pomeranje svih signala protona ka slabijem polju. Zavisnost promene hemijskog pomeranja (slika 4.1.12) u zavisnosti od odnosa [Eu(fod)3]/[nonanoat] je, generalno, bila linearna (kvadrat koeficijenta korelacije svih analiziranih protona (R 2 ) je bio veći od 0,99) u opsegu molskih odnosa [Eu(fod)3]/[nonanoat] 0,0 – 0,21. Najveće vrednosti gradijenta pomeranja (nagib krive na grafiku; ∆Eu) su dobivene za protone koji su blizu oĉekivanog mesta koordinacije kompleksa europijuma (elektronski par na kiseoniku; C-3 i C-12 protoni (∆Eu = 11,40 odnosno 9,00), praćeni C-2Hb, C-13H, C-10Ha i C- 6Hb protonima (tabela 4.1.1)). Naţalost, izraĉunavanje ∆Eu vrednosti nije bilo moguće za C-7 i C-15 – C-17 protone zbog preklapanja njihovih signala u protonskom NMR spektru snimljenom bez Eu(fod)3, kao i u spektrima nakon dodavanja reagensa hemijskog pomeranja u opsegu Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 117 molskih odnosa 0,07 – 0,21. Protoni C-18 metilenske i C-19 metil grupe se nisu pomerali ni ka jaĉem ni ka slabijem polju. Za neke od protona uoĉena je pojava „signal crossover” (npr. C-2Hb – C-2Ha, C-6Hb – C-14H, C-6Hb – C-5H i C-9H – C-19H; slika 4.1.12), na osnovu koje je zakljuĉeno o udaljenosti tih protona i koordinacionog mesta paramagnetnog katjona (Genĉić i Radulović, 2015). Slika 4.1.12. Grafik zavisnosti promene hemijskog pomeranja protona i molskog odnosa [Eu(fod)3]/[nonanoat] dobiven titracijom (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata reagensom hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) (numeracija atoma je prikazana na slici 4.1.11) Na osnovu rezultata iz prethodnih istraţivanja, kompleks europijuma je indukovao veliko paramagnetno pomeranje signala C-6Hb protona samo u sluĉaju trans-sabinola (u sluĉaju cis- sabinola, dodavanje reagensa hemijskog pomeranja nije izazvalo pomeranje odgovarajućih signala (Norin et al., 1973)). Uoĉeni uticaj (izraţen preko ∆Eu) dodavanja Eu(fod)3 na hemijsko pomeranje C-6 protona (razlikovanje C-6Ha i C-6Hb se bazira na osnovu postojanja „W”- kuplovanja C-6Ha i C-2Ha protona), ∆Eu = 1,87 i 3,86 za Ha-6, odnosno Hb-6, još jednom je nedvosmisleno potvrdio 1R*,3S*,5R*- relativnu stereohemiju sabinil estara iz kombinatorne biblioteke. Eksperimenti sa dodatkom Eu(fod)3 su nam omogućili da izvršimo asignaciju onih ugljenikovih atoma koje nismo mogli asignirati analizom 1D ( 13C, ukljuĉujući 13C spektar bez heteronuklearnog dekuplovanja) i 2D (HMBC, HSQC) NMR spektara (tabela 4.1.1). Naime, asignacija signala C-14 – C-16 ugljenika iz nonanoil dela estra je bila praktiĉno nemoguća zbog veoma bliskih 13 C hemijskih pomeranja i preklapanja odgovarajućih protona u 1H NMR spektru. Postepeni dodatak Eu(fod)3, molski odnosi 0,07, 0,14 i 0,21, uslovljavao je pseudokontaktno pomeranje svih signala atoma ugljenika-13 ka slabijem polju. Paramagnetno pomeranje signala Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 118 je bilo najveće (izraţeno preko gradijenta pomeranja ∆Eu; tabela 4.1.1) za ugljenike koji su blizu mesta koordinacije europijuma (npr. C-12, C-13, C-3; slika 4.1.13). Kao što je oĉekivano, uoĉene su male razlike u vrednostima ∆Eu izmeĊu signala za 13C i 1H koji su meĊusobno vezani, a one potiĉu od malih razlika u njihovom relativnom poloţaju u odnosu na katjon europijuma. Ova pojava je priliĉno univerzalna za sve multinuklearne NMR eksperimente (Gansow et al., 1971). Slika 4.1.13. Grafik zavisnosti hemijskog pomeranja ugljenika-13 i molskog odnosa [Eu(fod)3]/[nonanoat] dobivenog titracijom (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata reagensom hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) (numeracija atoma je prikazana na slici 4.1.11) Bez obzira na konformaciju Eu(fod)3-estar kompleksa, moglo se oĉekivati da je Eu vezan za kiseonik C=O grupe uvek trans u odnosu na alkil niz kiselinskog dela zbog sternih odbijanja. TakoĊe, oĉekivano je bilo da alkil niz zauzme cik-cak (sve anti), linearnu konformaciju. Bazirano na ovom modelu, sa minimalizovanom energijom pomoću MM2, rastojanje ugljenika Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 119 iz alkil niza i karbonilnog kiseonika iskorišćeno je za odreĊivanje poloţaja C-14 – C-16 ugljenika u odnosu na europijum. Kako ∆Eu vrednost u dugolanĉanim alkoholima i estrima opada sa povećanjem rastojanja ugljenika u odnosu na koordinaciono mesto, kreirali smo grafik log ∆Eu u odnosu na log r, gde je r rastojanje izmeĊu kiseonika iz karbonilne grupe i odgovarajućeg ugljenika (Norin et al., 1973). Ugljenikovi atomi C-11 i C-12 su bili iskljuĉeni iz proraĉuna zbog oĉekivanog znaĉajnog udela kontaktnog efekta (ovakva interakcija je posebno znaĉajna u sluĉaju atoma koji je direktno koordinovan za lantanidni jon, a ograniĉena je na atome ugljenika i vodonika samo u najbliţoj okolini koordinacionog mesta, s obzirom na to da interakcije „kroz veze” znaĉajno opadaju i potpuno nestaju nakon tri do ĉetiri veze (Genĉić i Radulović, 2015). Najveći korelacioni koeficijent (R2 = 0,9882; slika 4.1.14) je dobiven kada je rastojanje ugljenikovih atoma C-14, C-15 i C-16 (r = 4,315, 5,681, odnosno 7,994 Å) korelisano sa vrednostima ∆Eu (3,18, 1,45, odnosno 0,76) signala ugljenikovih atoma ĉija su hemijska pomeranja 29,4, 29,6 i 29,5 ppm. Ovo je omogućilo nedvosmislenu potvrdu asignacije signala C- 14 – C-16 ugljenika. Iz spektara (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoat–Eu(fod)3 kompleksa bilo je moguće još odrediti i relativnu orijentaciju oko C-11–O veze. Iz tog razloga, izvršili smo konformacionu analizu korišćenjem tzv. lanthanide probe metode (Genĉić i Radulović, 2015). Interni pravougli koordinatni sistem je postavljen tako da se karbonilni kiseonikov atom nalazi u koordinatnom poĉetku (x, y, z [0, 0, 0]), dok je C=O veza postavljena kao z-osa. Pozicija europijuma je bila okarakterisana duţinom veze Eu–O (r), uglom Eu–O–C-11 (α) i diedarskim uglom Eu–O–C-11– O (θ). Vrednost diedarskog ugla je varirana u opsegu od 0° do 180°, a ugao α je bio u opsegu 110° – 130° i duţina veza od 2,20 – 2,40 Å sa ciljem utvrĊivanja poloţaja europijuma koji daje najbolje slaganje izraĉunatih (Δcal) sa eksperimentalnim vrednostima (ΔEu). Vrednosti konstanti kuplovanja u 1 H NMR spektru protona iz sabinil dela su praktiĉno ostale nepromenjene dodavanjem lantanida, što je sugerisalo da formiranje europijum-sabinil estar kompleksa nema znaĉajnog uticaja na konformaciju sabinil dela. Iz tog razloga su koordinate sabinil dela i njegova geometrija drţane konstantnim. Optimalni poloţaj europijuma je utvrĊen korišćenjem ChemBio 3D Ultra 12.0 softverskog paketa. Geometrijski faktor ((3cos 2 θ - 1)/r3) u Mekonel- Robertsonovoj (McConnell–Robertson) jednaĉini je raĉunat za 2a, 2b, 3, 5, 6a, 6b, 10a i 10b protone, kao i za sve ugljenike (C-1 – C-19) i to za svaki poloţaj lantanidnog jona (slika 4.1.15). Dobivene ∆cal vrednosti za protone iz sabinil dela su korelisane sa eksperimentalnim ∆Eu Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 120 vrednostima istih protona i najveći koeficijent korelacije (R2 = 0,9695) je dobiven za sluĉaj kada je europijum bio u poloţaju: r = 2,330 Å, α = 120,8° i θ = 180° (slika 4.1.16). Slika 4.1.14. Grafik zavisnosti log ΔEu od log r za (1R*,3S*,5R*)-sabinil nonanoat-Eu(fod)3 kompleks (C-11 i C-12 ugljenici su iskljuĉeni zbog velikog udela kontaktne interakcije sa europijumom) Slika 4.1.15. Konformacija Eu(fod)3-sabinil-nonanoat kompleksa sa najniţom energijom dobivena pomoću lanthanide probe metode. Parametri za izraĉunavanje Δcal vrednosti u Mekonel-Robertsonovoj jednaĉini su prikazani za C-6Hb proton Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 121 Prikazana konformacija estra u kompleksu (slika 4.1.16) je veoma sliĉna sa konformerom (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata sa najmanjom energijom. Iako je korelacioni koeficijent (R 2 ) imao visoke vrednosti za konformer 1, vrednost standardne devijacije (SD; 0,00182) sugeriše da (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoat–Eu(fod)3 kompleks moţe, dodatno, postojati i u konformaciji koja je manje stabilna od konformera 1. Shodno tome, analizirali smo dodatne poloţaje europijuma polazeći od konformera 2 (slika 4.1.17) koji ima, bazirano na MM2 proraĉunu, 2 kcal/mol veću energiju od konformera 1. Najveći korelacioni koeficijent (R2 = 0,6790) je dobiven kada je europijum lociran na r = 2,330 Å, α = 120,8° i θ = 180° (slika 4.1.17) ponovo sa velikim vrednostima standardne devijacije (SD; 0,00183). Slika 4.1.16. Konformacija Eu(fod)3-sabinil-nonanoat kompleksa sa najniţom energijom (konformer 1) dobivena pomoću lanthanide probe metode (parametri poloţaj europijuma: r = 2,330 Å, α = 120,8° i θ = 180°) i korelacija Δcal sa ΔEu za 2a, 2b, 3, 5, 6a, 6b, 10a i 10b protone Nakon toga, odluĉili smo da izvršimo analizu korelacija izmeĊu eksperimentalnih ∆Eu i izraĉunatih ∆cal za razliĉite smeše konformera 1 i 2. Ĉak i mali udeo 2 u konformacionoj smeši uslovljavao je bolju korelaciju izmeĊu ∆cal i ∆Eu (na primer, smeša koja je sadrţala 5% konformera 2 i 95% konformera 1 je imala R 2 = 0,9741 i SD = 0,00154). Sistematiĉnom analizom smeša konformera 1 i 2 sa gradijentom od 1% (od 100% konformera 1 do 100% konformera 2), utvrĊeno je da najveći korelacioni koeficijent (R2 = 0,9881) i najmanju vrednost standardne devijacije (SD = 0,00073) ima smeša koja sadrţi 55% konformera 1 i 45% Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 122 konformera 2 (slika 4.1.18). Odavde sledi da postoji razlika u zastupljenosti konformera slobodnog sabinil estra i konformacija estra u kompleksu sa lantanidnim reagensom. Slika 4.1.17. Konformacija Eu(fod)3-sabinil-nonanoat kompleksa sa najniţom energijom (konformer 2) dobivena pomoću lanthanide probe metode (poloţaj europijuma: r = 2,330 Å, α = 120,8° i θ = 180°) i korelacija Δcal sa ΔEu za 2a, 2b, 3, 5, 6a, 6b, 10a i 10b protone Uoĉeno je da signali C-11 i C-12 atoma pored dipolarne interakcije su pod uticajem kontaktnog efekta sa katjonom europijuma (neoĉekivano male ∆Eu vrednosti za C-11 (2,35) i ekstremno velike vrednosti za C-12 (16,11)). Druga ĉinjenica koja je potvrdila prisustvo kontaktne interakcije kod C-11 i C-12 ugljenika je vrednost korelacionog koeficijenta i standardne devijacije za nonanoil deo molekula (C-11 – C-19). Dobiveni grafik zavisnosti izraĉunatih ∆cal i eksperimentalnih ∆Eu vrednosti je imao mnogo veće vrednosti korelacionog koeficijenta i manje vrednosti standardne devijacije (R 2 = 0,9938 i SD = 0,00015) kada ugljenici C-11 i C-12, zbog pretpostavljenog udela kontaktne interakcije, nisu uzeti u obzir u odnosu na sluĉaj kada je grafik sadrţao i ugljenike C-11 i C-12 (R2 = 0,8083 i SD = 0,00309; slika 4.1.19). Uoĉena promena vrednosti ∆Eu usled kontaktne interakcije uslovljena graĊenjem kompleksa sa lantanidnim reagensom hemijskog pomeranja moţe izazvati ozbiljne probleme u analizi NMR spektara, npr. ĉest je sluĉaj da kontaktna interakcija izaziva pogrešnu asignaciju ugljenika prirodnih proizvoda (Genĉić i Radulović, 2015). TakoĊe, problem predstavlja i ĉinjenica da ne postoji konkretan naĉin za predviĊanje ili izraĉunavanje vrednosti udela kontaktne interakcije. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 123 Slika 4.1.18. Korelacija Δcal i ΔEu vrednosti protona iz Eu(fod)3-sabinil-nonanoat kompleksa smeše konformera 1 i 2 u molskom odnosu 0,55:0,45 Slika 4.1.19. Korelacija Δcal i ΔEu vrednosti za protone iz Eu(fod)3-sabinil-nonanoat kompleksa za a) C-11-C19 i b) C13-C19 ugljenike Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 124 4.1.2. Hemijski sastav etarskih ulja biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia subsp. serbica 4.1.2.1. Achillea falcata L. Achillea falcata L. (syn. A. damascena DC.) je endemiĉna, mediteranska biljna vrsta iz porodice glavoĉika ( steraceae, Compositae; slika 4.1.20), koja je veoma cenjena zbog svojih farmakoloških osobina. Detaljnom pretragom literature je ustanovljeno da je A. falcata nedovoljno hemijski ispitana (postoji samo nekoliko istraţivanja u kojima su identifikovani i analizirani sekundarni metaboliti iz taksona A. falcata). Etarsko ulje ove biljne vrste je do sada ispitivano u tri prethodne studije (Aburjai i Hudaib, 2006; Kürkçüoglu et al., 2003; Senatore et al., 2005) u kojima su ustanovljena tri hemotipa ove biljne vrste. Slika 4.1.20. Izgled biljne vrste Achillea falcata L. Ovakva hemotipska raznolikost, kao i mali broj fitohemijskih ispitivanja ovog taksona, bili su povod da se izvrši detaljna analiza hemijskog sastava etarskog ulja dobivenog hidrodestilacijom nadzemnog dela i korena biljnog materijala sakupljenog u Siriji (tabela 3.2.1). Uzorci ulja nadzemnih delova i korena su detaljno analizirani (GC-FID i GC-MS) što je omogućilo identifikaciju 180 sastojaka koji su ĉinili 97,4 – 98,4% ukupnih površina pikova u GC hromatogramima (prilog 8.1.1). Tipiĉan ukupni jonski hromatogram (TIC) uzorka ulja nadzemnih delova (Af1; prilog 8.1.1) je predstavljen na slici 4.1.21. Glavni sastojci ulja su bili (1R*,3S*,5R*)-sabinol ([1]; 19,1%) i (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetat ([1b]; 11,4%). U poĉetku identitet glavnih sastojaka je pretpostavljen na osnovu uporeĊivanja vrednosti retencionih indeksa i masenih spektara sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007; Cégiéla-Carlioz et al., 2005; Mack et al., 2013), a kasnije je potvrĊen GC ko-hromatografijom standarda ovih jedinjenja Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 125 sa uzorcima etarskih ulja korena i nadzemnih delova. Standard (1R*,3S*,5R*)-sabinola je dobiven hidrolizom (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata koji potiĉe iz biblioteke sekundarnih metabolita istraţivaĉke grupe „OSAˮ (engl. Organic Synthesis and Analysis) Departmana za hemiju, PMF-a u Nišu (struktura oba standarda je potvrĊena NMR analizom; eksperimentalni deo). (1R*,3S*,5R*)-Sabinol i njegov acetat su, takoĊe, bili meĊu glavnim sastojcima i etarskog ulja korena (Af1; 6,5%, odnosno 4,2%). Slika 4.1.21. Ukupni jonski hromatogram (TIC) i hromatogram parcijalne jonske struje (PIC; m/z 91) uzorka etarskog ulja Af1 koji ilustruju prisustvo (1R*,3S*,5R*)-sabinola i njegovih estara Maseni spektri jedinjenja [1] i [1b] su predstavljeni na slici 4.1.22. Generalno, MS fragmentacija oba jedinjenja je veoma sliĉna. Na primer, najintenzivniji joni u masenim spektrima su bili na m/z 91 i 92. Pored toga, nekoliko fragmenata sa malim (u odnosu na osnovni jon) relativnim intenzitetom (npr. m/z 134, 119, 55) su, takoĊe, bili prisutni u masenim spektrima oba jedinjenja. Fragmentni jon m/z 81 (relativni intenzitet 52%) u masenom spektru sabinola nije bio prisutan u masenom spektru acetata. Kao što se i oĉekivalo, fragmentni jon acetil grupe m/z 43 (CH3CO + , nastao raskidanjem C–O veze; obeleţen strelicom na slici 4.1.22), iz masenog Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 126 spektra (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata, bio je zanemarljivog intenziteta u masenom spektru sabinola. Slika 4.1.22. Maseni spektri (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1], (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] i 7 drugih sabinil estara iz etarskog ulja biljne vrste A. falcata (joni nastali fragmentacijom a i b su oznaĉeni strelicom; Rt (min)) Fragmentacija jedinjenja [1c], [1d], [1f] i [1g] (GC-MS hromatogram uzorka etarskog ulja Af1; slika 4.1.21) je bila skoro identiĉna sa fragmentacijom (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata (slika 4.1.22). U cilju detektovanja dodatnih, prisutnih u tragovima, sastojaka ulja sa MS fragmentacijom sliĉnom kao kod glavnog sastojka [1b], generisali smo hromatogram parcijalne jonske struje (PIC) uzoraka ulja Af1/Af2 koji je pokazivao promenu jonske struje m/z 91 sa vremenom (slika 4.1.21). To nam je omogućilo da detektujemo dodatne homologe Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 127 (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata (ukupno sedam; pikovi [1a], [1c – 1h], slika 4.1.21), za koje smo pretpostavili da su, takoĊe, estri sabinola. Za sve detektovane sastojke u PIC hromatogramu, osnovni jon je bio m/z 91, drugi po intenzitetu je bio m/z 92, dok su ostali fragmentni joni (m/z 108, 119, 134) imali znaĉajno manji relativni intenzitet (slika 4.1.21). U masenim spektrima ovih jedinjenja su uoĉeni i fragmentni joni koji su omogućili identifikaciju kiselinskog dela. Na primer, maseni spektri jedinjenja [1d] i [1e] su sadrţali fragmentne jone na m/z 43 i 71, na osnovu kojih smo pretpostavili da su to najverovatnije estri izobutanske i/ili butanske kiseline (fragmentacioni put a (C3H7CO + ) i b (C3H7 + ), slika 4.1.22). U odnosu na RI vrednosti acetata (RI = 1291), RI vrednosti (DB-5-MS kolona) za jedinjenja [1d] i [1e] su za 123 (RI[1d] = 1414), odnosno 174 RI jedinica (RI[1e] = 1465) veće. Ovo je takoĊe ukazivalo da su jedinjenja [1d] i [1e] homolozi (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata sa raĉvastim/linearnim alkil nizom ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-izobutanoat i butanoat). Na osnovu ovoga pretpostavili smo da je sastojak ulja [1a] verovatno (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijat (RI[1a] = 1291), [1c] (1R*,3S*,5R*)-sabinil-propanoat (fragmentni jon m/z 57 (C2H5CO + ), RI[1c] = 1379 (RI = RIacetat + 88)), dok su sastojci [1f] i [1g] najverovatnije (1R*,3S*,5R*)-sabinil-2-metilbutanoat i 3-metilbutanoat (fragmentni joni m/z 57 (C4H9 + ) i 85 (C4H9CO + ), RI[1f] = 1500 (RI = RIbutanoat + 35) i RI[1g] = 1513 (RI = RIbutanoat + 48)). Prisustvo fragmentnih jona m/z 55 (C4H7 + ) i 83 (C4H7CO + ) u masenom spektru jedinjenja [1h] je sugerisalo da je ovaj sastojak ulja sabinil estar jedne od izomernih C5H8O2 nezasićenih karboksilnih kiselina ((E)-2-metil-2-butenske (tiglinske), (Z)-2-metil-2-butenske (angelika) ili 3- metil-2-butenske (senecio) kiseline). TakoĊe, RI vrednosti (RI[1h] = 1610) su ukazivale na to da je [1h] verovatnije estar nezasićene kiseline sa raĉvastim, a ne sa linearnim nizom. Ko-injekcija (GC-MS) standarda estara (1R*,3S*,5R*)-sabinola iz kombinatorne biblioteke sa uzorcima ulja je potvrdila pretpostavljeni identitet sastojaka ulja [1a], [1c – 1g] i otkrila da je sastojak ulja [1h] estar (1R*,3S*,5R*)-sabinola i (E)-2-metil-2-butenske (tiglinske) kiseline. Detaljnom pretragom literature (SciFinder pretraga CAS baze podataka) je ustanovljeno da su ĉetiri estra (1R*,3S*,5R*)-sabinola (formijat, tiglat, angelat, senecioat) potpuno nova jedinjenja i da formijat [1a] i tiglat [1h] predstavljaju novootkrivene prirodne proizvode. Koliĉina (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] u etarskom ulju nadzemnih delova biljne vrste A. falcata, odreĊena je konstruisanjem (GC-FID) kalibracione prave (y = 4671,38x + 9,937; R2 = 0,999). Ovom analizom je utvrĊeno da 100 g suvih nadzemnih delova sadrţi 0,625 mg (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 128 4.1.2.2. Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl Jedna od vizuelno i olifaktorno najatraktivnijih biljnih vrsta roda Achillea je srpska hajduĉka trava (slika 4.1.23; Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Hayek (sin. A. serbica Nym.)) – endemiĉna biljna vrsta centralnog dela Balkanskog poluostrva (Richardson, 1976). Slika 4.1.23. Izgled biljne vrste Achillea ageratifolia subsp. serbica Do sada su isparljivi i neisparljivi metaboliti ove biljne vrste bili predmet istraţivanja nekoliko studija (Trifunović et al., 2006; Bohlmann i Jastrow, 1962; Chalchat et al., 1999; Simić et al., 2000). Etarsko ulje je do sada analizirano samo dva puta i to uzorci ulja koji su dobiveni hidrodestilacijom biljnog materijala (nadzemnih delova) sakupljenog iz geografski veoma bliskih populacija (Jelašniĉka klisura i Suva planina) i najverovatnije sakupljenog tokom dve uzastopne godine (1998-1999; vreme sakupljanja biljnog materijala nije navedeno od strane Šalša i saradnika (Chalchat et al., 1999)). MeĊutim, ove grupe istraţivaĉa su objavile potpuno razliĉite rezultate analize sastava etarskog ulja ovog taksona. MeĊu 15 identifikovanih sastojaka, Simić i saradnici (Simić et al., 2000) su identifikovali “β-sabinil-acetat” (39,9%), kamfor (33,9%) i 1,8- sineol (8,6%), kao glavne sastojke ulja. Sa druge strane, Šalša i saradnici (Chalchat et al., 1999) su identifikovali 47 sastojaka ulja meĊu kojima su dominantni sastojci bili: cis-hrizantenol Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 129 (15,9%), kamfor (11,0%), 1,8-sineol (14,2%), trans-hrizantenil-acetat (4,4%), α-pinen (5,0%), jomogi-alkohol (5,1%) i 2-pirolidinon (6,3%). Ovako razliĉiti sastavi ulja su predstavljali povod da izvršimo ponovnu analizu sastava etarskog ulja izolovanog iz biljnog materijala (nadzemni delovi) sakupljenog iz dve populacije (Jelašniĉka klisura i Suva planina) i tokom dve uzastopne godine (2013. i 2014). Analiza je imala za cilj pokušaj da se odgovori na sledeće pitanje: „Da li postoje dva razliĉita hemotipa ove vrste, odnosno da li sastav ulja zavisi od geografskih i/ili klimatskih faktora?”. Dodatno, nadali smo se da ćemo se susresti sa „β-sabinil-acetat” hemotipom, kako bi potvrdili stereohemijsko znaĉenje „β” (Simić et al., 2000). Kombinacija detaljnih GC-MS i GC-FID analiza, preparativnog hromatografskog razdvajanja sastojaka ulja i dostupnost standarda iz kreirane biblioteke sabinil derivata, omogućila je identifikaciju ukupno 301 sastojka etarskog ulja biljne vrste A. ageratifolia subsp. serbica dobivenog iz biljnog materijala sa dve razliĉite lokacije i sakupljenog tokom dve uzastopne godine (2013. i 2014). Identifikovani isparljivi metaboliti iz biljnog materijala sakupljenog 2013. godine sa dve lokacije (Suva planina i Jelašniĉka klisura u blizini Niša), zajedno sa sastavom MPLC frakcija pool-ovanog etarskog ulja, predstavljeni su u prilogu 8.1.1. Na slici 4.1.24 je prikazan jonski hromatogram (TIC) uzorka etarskog ulja biljne vrste A. ageratifolia subsp. serbica dobivenog hidrodestilacijom suvog biljnog materijala sakupljenog juna 2013. godine na Suvoj planini. Slika 4.1.24. Ukupni jonski hromatogram (TIC) uzorka etarskog ulja biljne vrste A. ageratifolia subsp. serbica Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 130 Na osnovu ovih analiza identifikovano je 95,7 – 98,9% ukupnih površina pikova u hromatogramu etarskog ulja ili MPLC frakcija ulja. Terpenoidi su ĉinili 94,0 i 95,5% etarskog ulja uzorka As1, odnosno As2, sa monoterpenima kao najzastupljenijom klasom (87,8 – 90,5%). Etarsko ulje se uglavnom sastojalo od monoterpena tujanskog, bornanskog i p-mentanskog tipa sa sabinil-acetatom (30,8 – 37,9%), kamforom (12,3 – 16,1%), 1,8-sineolom (8,3 – 12,6%) i trans-sabinolom (5,0 – 6,3%) kao glavnim sastojcima. Za glavni sastojak ulja (sabinil-acetat) detaljnom NMR analizom, ĉistog acetata izolovanog kolonskom hromatografijom iz ulja, potvrĊeno je da ima istu stereohemiju kao trans-sabinol (relativna stereohemija hiralnih centara je 1R*, 3S* i 5R*). UporeĊivanjem sastava etarskih ulja (prilog 8.1.1) uoĉene su samo kvantitativne razlike izmeĊu As1 i As2 (biljni materijal sakupljen iz dve razliĉite populacije iste godine). Najuoĉljivija je kvantitativna razlika u sadrţaju glavnih sastojaka ulja, na primer, sadrţaj sabinil-acetata je varirao ≈ 7% u zavisnosti od lokacije populacije odakle je ubran biljni materijal. MeĊutim, relativni odnos sadrţaja glavnih sastojaka ulja je ostao isti. Nasuprot kvantitativnim razlikama izmeĊu uzoraka iz relativno bliskih mesta sakupljanja biljnog materijala (ali sa znaĉajnom razlikom u nadmorskoj visini), sastav ulja se nije znaĉajno promenio od jedne sezone do druge (2013. i 2014. godina). Uzorci ulja iz 2014. godine se praktiĉno nisu razlikovali (najveće uoĉene razlike su u prisustvu/odsustvu sastojaka zastupljenih u tragovima, a ukupna razlika ne prelazi 0,1%) od ulja iz 2013. godine. Iz ovog razloga vrednosti relativnog sadrţaja sastojaka u uzorcima ulja iz 2014. godine nisu prikazane u tabeli (prilog 8.1.1). Iako je našom analizom 281 jedinjenje po prvi put identifikovano kao sastojak A. ageratifolia subsp. serbica etarskog ulja, ukljuĉujući i dva potpuno nova prirodna proizvoda o ĉemu će biti reĉi kasnije, sastav ulja sa obe lokacije je, generalno, sliĉan sastavu ulja (makar na osnovu identifikovanih glavnih sastojaka) koji su objavili Simić i saradnici (Simić et al., 2000). Sa druge strane, naši uzorci etarskih ulja, sa visokim sadrţajem monoterpena tujanskog tipa (41,1 – 49,4%) su veoma razliĉiti od onih koje su analizirali Šalša i saradnici (Chalchat et al., 1999). Oni su identifikovali 47 jedinjenja iz ulja ovog taksona, sa visokim sadrţajem monoterpena pinanskog skeleta (28,7%; npr. cis-hrizantenol (15,9%) i trans-hrizantenil-acetat (4,4%)), pri ĉemu monoterpeni tujanskog tipa nisu identifikovani. trans-Hrizantenil-acetat je u našim uzorcima ulja identifikovan samo u tragovima dok je sadrţaj cis-hrizantenola u uzorcima As1 i As2 bio 0,8 – 1,0%. S obzirom na to da nisu uoĉene znaĉajne sezonske promene u sastavu Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 131 etarskog ulja, kao i da razlike u uslovima ţivotne sredine dve populacije (razlika u nadmorskoj visini od 1215 m) uslovljavaju samo kvantitativne promene u sastavu ulja, zakljuĉili smo da populacije A. ageratifolia subsp. serbica iz Jelašniĉke klisure i sa Suve planine pripadaju istom sabinil-acetat-kamfor-1,8-sineol-trans-sabinol hemotipu. Ovo je isti hemotip sa koji su se susreli Simić i saradnici (Simić et al., 2000), ali je potpuno razliĉit od onog iz studije Šalše i saradnika (Chalchat et al., 1999). Postoje dva moguća objašnjenja za ovakve razlike u sastavu ulja. Prvo, manje verovatno, da na tako malom prostoru (A. ageratifolia subsp. serbica raste na površini manjoj od 1 km 2 u blizini vrha Suve planine, gde je Šalša naveo da su sakupili biljni materijal) rastu dva potpuno razliĉita hemotipa ove biljne vrste, i drugo ili da je izvršena pogrešna taksonomska identifikacija biljnog materijala ili da je nešto pogrešeno prilikom izolovanja i/ili obrade etarskog ulja. Sve dok cis-hrizantenol-trans-hrizantenil-acetat hemotip ne bude ponovo otkriven, postojanje ovog hemotipa biljne vrste A. ageratifolia subsp. serbica treba uzimati sa rezervom. Hromatogram koji prikazuje parcijalne jonske struje (PIC; m/z 91, 92, 119 i 134 joni) etarskog ulja i nekih od frakcija (prilog 8.1.1) indicirao je prisustvo dodatnih sastojaka sliĉnih sabinolu, a najverovatnije homologe serije estara ovog alkohola. Nakon detaljnog razmatranja njihovih masenih spektara i vrednosti retencionih indeksa, postupak je bio identiĉan analizi PIC hromatograma i masenih spektara sastojaka ulja biljne vrste A. falcata, ovi sastojci ulja su identifikovani kao estri sabinola i mravlje, propanske, izobutanske, butanske, 2-metilbutanske, 3- metilbutanske, (E)-2-metil-2-butenske, nonanske i dekanske kiseline. Ko-hromatografijom uzorka etarkog ulja sa standardima estara iz biblioteke, o njihovoj sintezi i spektralnoj analizi je bilo reĉi u poglavlju 4.1.1, nedvosmisleno je potvrĊeno da etarsko ulje biljne vrste A. ageratifolia subsp. serbica sadrţi (1R*,3S*,5R*)-sabinil estre i to formijat, propanoat, izobutanoat, butanoat, 2-metilbutanoat, 3-metilbutanoat, (E)-2-metil-2-butenoat (tiglat), nonanoat i dekanoat. Poslednja dva estra, (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoat i dekanoat, na osnovu detaljne pretrage literature, predstavljaju potpuno nova jedinjenja, pored formijata i tiglata koji su prvi put identifikovani u ovoj disertaciji kao sastojci ulja biljne vrste A. falcata, koja nisu do sada nikad opisana ili pomenuta u literaturi. Pretragom literature smo, takoĊe, uoĉili da su sabinil estri, izuzev sabinil- acetata, veoma retki sekundarni metaboliti biljnog carstva. Njihovo prisustvo u prirodi je karakteristiĉno za familiju Asteraceae sa samo jednom studijom o identifikaciji ovih estara kao sekundarnih metabolita biljne vrste van ove familije (Kitagawia baicalensis (Redow. ex Willd.) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 132 Pimenov; familija Apiaceae (Letchamo et al., 2005). Dodatno, ovi estri nisu podjednako rasprostranjeni u okviru familije glavoĉika i ĉini se da su karakteristiĉni za rodove Achillea i Anthemis. Novi estri iz ulja A. ageratifolia subsp. serbica su dodatno kvantifikovani (mg/100 g suvih nadzemnih delova) konstruisanjem kalibracionih pravih (površina ispod GC-FID pikova u odnosu na koncentraciju estara). Konstruisane kalibracione prave (površina = 4498,6856 × koliĉina estra – 49,3379 za nonanoat i površina = 6409,7444 × koliĉina estra – 176,4735 za dekanoat) su imale dobar korelacioni koeficijent R 2 = 0,9997, odnosno 0,9998. Ovom analizom je utvrĊeno da 100 g suvih nadzemnih delova sadrţi 12,2 μg (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata i 9,8 μg (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata. 4.1.3. Biološka aktivnost odabranih sintetisanih sabinil estara 4.1.3.1. OdreĎivanje akutne toksičnosti U koncentracionom opsegu 0,0025 – 0,2 mg/ml (krajnja koncentracija estara u medijumu; [1] (0,016 – 1,32 mmol/l), [1a] (0,014 – 1,11 mmol/l), [1b] (0,013 – 1,03 mmol/l), [1h] i [1i] (0,011 – 0,85 mmol/l)), trans-sabinol i neki njegovi estri (formijat, acetat, tiglat i senecioat) su bili umereno toksiĉni prema vrsti raĉića Artemia salina (tabela 4.1.2). Tabela 4.1.2. kutna toksiĉnost sastojaka etarkog ulja biljne vrste A. falcata [1], [1a], [1b], [1h] i strukturno srodnog jedinjenja ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i]) na morske raĉiće Artemia salina Jedinjenje LD50 (mmol/l, nakon 24 h) LD50 (mmol/l, nakon 48 h) trans-Sabinol [1] 0,35 0,26 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-formijat [1a] 0,29 0,20 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-acetat [1b] 0,24 0,17 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-tiglat [1h] 0,15 0,06 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-senecioat [1i] 0,04 0,03 Najtoksiĉniji su bili estri tiglinske i senecio kiseline. Dobiveni rezultati se slaţu sa prethodnim istraţivanjima toksiĉnosti biljnih ekstrakata/etarskih ulja koja su sadrţala sabinil- acetat. Na primer, LC50 vrednosti etarskih ulja vrsta Lantana camara i Artemisia absinthium ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetat je bio glavni sastojak oba ulja) je bila 0,23, odnosno 15,7 – 31,9 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 133 μg/ml (Judzentiene et al., 2012; Medeiros et al., 2012). TakoĊe u nekoliko prethodnih studija je uoĉeno da su pored raĉića i neki sisari osetljivi na dejstvo ovog acetata i njegovih homologa. Poznato je da upotreba biljne vrste Juniperus sabina izaziva abortus i spreĉava razvoj fetusa upravo zbog velikog sadrţaja estra jednog od dijastereoizomernih sabinola i sirćetne kiseline (Casares, 1964; Pages et al., 1996). Pored toga, upotreba velikih koliĉina Juniperus vrsta moţe izazvati preuranjeni poroĊaj i roĊenje malih, slabih, ili mrtvih teladi i jagnjadi što je, takoĊe, pripisano prisustvu sabinil-acetata (Burrows i Tyrl, 2012). 4.1.3.2. Inhibicija acetilholinesteraze (AChE) Acetilholinesteraza (AChE) pripada serin-hidrolaza superfamiliji enzima i zaduţena je za katalizu hidrolize neurotransmitera acetilholina. Struktura i mehanizam dejstva AChE u procesu neurotransmisije do sada su veoma iscrpno prouĉeni. Poznato je da se aktivno mesto AChE nalazi u „dubokoj i uskoj klisuri” enzima (slika 4.1.25). Slika 4.1.25. (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-senecioat dokovan u katalitiĉko mesto „duboke i uske klisure” ChE enzima iz vrste Torpedo californica (PDB kod: 1E 5); katalitiĉke aminokiseline Ser200, His440 i Glu327 (predstavljene crvenom bojom), se nalaze „duboko u klisuri” Tri aminokiselinska ostatka (Ser200, His440 i Glu327) koji se nalaze na dnu „klisure”, (slike 4.1.25 i 4.1.26) formiraju tzv. katalitiĉku trijadu i direktno su ukljuĉeni u proces hidrolize Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 134 acetilholina (Millard et al., 1999; Sussman et al., 1991). Mnogi AChE inhibitori (neki od ovih inhibitora se koriste u leĉenju lchajmerove bolesti, B) takoĊe interaguju sa ovim aminokiselinskim ostacima. Na primer, karbamatna grupa rivastigmina (RS; slika 4.1.27) kovalentno interaguje sa Ser200 i reverzibilno inhibira enzim (Bar-On et al., 2002; Sussman et al., 1991). Isto vaţi i za drugi B lek, fizostigmin (FS). Milard i saradnici (Millard et al., 1999) su potvrdili i da su Trp84 i Phe330 takoĊe vaţni za interakciju enzima sa ligandom. Slika 4.1.26. Energetski najpovoljniji poloţaj (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata dokovanog u kristalnu strukturu AChE iz vrste Torpedo californica (PDB kod: 1E 5); katalitiĉke aminokiseline Ser200, His440 i Glu327 su predstavljene crvenom bojom Kao što se uoĉava na slici 4.1.27, testirani sabinil estri imaju odreĊenu strukturnu sliĉnost sa RS i FS. Na primer, analogno karbamatnoj grupi u RS/FS, sabinil estri sadrţe elektrofilnu estarsku grupu (slika 4.1.27). Primetna je sliĉna supstitucija na biciklo[3.1.0]heksanskom jezgru Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 135 estara [1a – 1j] i benzenovom prstenu RS i FS; prostorni odnos kljuĉnih strukturnih fragmenata (npr. raspored elektrofilnih grupa i ostalih delova molekula) i ukupan oblik jedinjenja [1a – 1j] je uporediv sa onim kod molekula RS ili FS (slika 4.1.27). Slika 4.1.27. Strukturna sliĉnost (1R*,3S*,5R*)-sabinil estara [1a – 1j] i inhibitora acetilholinesteraze (rivastigmina i fizostigmina; komercijalnih lekova za leĉenje lchajmerove bolesti) Na osnovu ovakvih poklapanja delova strukture, sa razlogom se oĉekivalo da estri [1a – 1j] mogu da se uklope u acetilholinesteraznu „klisuru” koja sadrţi katalitiĉku trijadu i na taj naĉin inhibiraju dejstvo AChE, tj. pokaţu ChE inhibitornu aktivnost. Sabinil estri (ligandi, L) su mogli jednostavno da „blokiraju” pristup Ch aktivnom mestu enzima (oni mogu formirati kompleks sa enzimom, AChE-L) ili ĉak kovalentnu vezu sa Ser200 (esterifikacija Ser200 OH- grupe; tj. moguća reverzibilna inhibicija, slika 4.1.28, put a). Sa druge strane, u sluĉaju (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata, angelata i senecioata, alkoholna grupa iz Ser200 je mogla reagovati sa nezasićenim kiselinskim delom gradeći proizvod konjugovane Majklove adicije (potencijalna reverzibilna inhibicija, slika 4.1.28, put b). U oba pretpostavljena sluĉaja, bilo bi potrebno da se ligand „uklopi” u navedenu usku „klisuru”, dok za kovalentnu interakciju sa Ser200, molekul bi morao da priĊe (u odgovarajućoj povoljnoj orijentaciji) odreĊenom aminokiselinskom ostatku. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 136 Slika 4.1.28. Mogući mehanizam eksperimentalno uoĉene AChE inhibitorne aktivnosti (1R*,3S*,5R*)-sabinil estara: (1) interakcija liganda (na slici je L = (1R*,3S*,5R*)-sabinil- senecioat) sa ostacima aminokiselina prostorno bliskih katalitiĉkoj trijadi (formiranje ChE-L kompleksa) moţe blokirati pristup Ch katalitiĉkom mestu u enzimu; (2) kovalentna modifikacija Ser200 (put a: transesterifikacija ili put b: Majklova adicija) inhibira enzim (reverzibilno ili ireverzibilno) Slika 4.1.29. Energetski najpovoljniji poloţaj (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata dokovanog u kristalnu strukturu AChE iz vrste Torpedo californica (PDB kod: 1EA5) i AChE ostaci aminokiselina koje su na 7 Å oko senecioata; katalitiĉke aminokiseline Ser200, His440 i Glu327 su predstavljene crvenom bojom Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 137 U cilju potvrde pretpostavljenih mehanizama, izvršili smo nekoliko eksperimenata dokovanja liganada [1a – 1j], RS i FS na AChE enzim kao receptor. Interesantno je da su se svi naĊeni, energetski povoljni, poloţaji jedinjenja [1a – 1j] nalazili unutar katalitiĉke „klisure”, što je ukazivalo na to da sabinil estri mogu reagovati sa ostacima aminokiselina iz katalitiĉke trijade. Najpovoljniji doking poloţaji (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata su predstavljeni na slikama 4.1.26 i 4.1.29. Jedinjenje [1i] se nalazi u blizini ostataka aminokiselina koje su vaţne za aktivnost AChE (Ser200, Glu327, His440, Phe330 i Trp84 (Millard et al., 1999; Sussman et al., 1991)) sa elektrofilnom estarskom grupom/dvostrukom vezom orijentisanom prema Ser200. Ovakvo prostorno ureĊenje sugeriše da se ligand moţe vezati za enzim na naĉin koji omogućava njihovu kovalentnu modifikaciju. TakoĊe, sliĉan rezultat je dobiven i u sluĉaju drugih testiranih estara trans-sabinola. Kao što se moţe videti na slici 4.1.27, sintetisani sabinil estri [1a – 1j] ĉine biblioteku jedinjenja u kojoj je struktura jednog dela molekula sistematski varirana. Na primer, polazeći od (1R*,3S*,5R*)-sabinil-2-metilbutanoata ([1f] je imao najveće sliĉnosti sa RS), skraćivanjem alkil niza su formalno dobiveni estri [1a – 1e], dok su promenom poloţaja metil grupe i/ili uvoĊenjem dvostruke veze dobiveni estri [1g – 1j]. Rezultati eksperimenta dokovanja su ukazivali da ove promene u strukturi mogu biti vaţne za ChE inhibitornu aktivnost. Izraĉunate vrednosti energije vezivanja (tabela 4.1.3) su sugerisale da se (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglat i (1R*,3S*,5R*)-sabinil- senecioat veoma jako vezuju za enzim (energija vezivanja oko 8,5 kcal/mol) dok je (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijat posedovao najmanji afinitet prema AChE. Vrednosti energija vezivanja za estre zasićenih kiselina (oko 7,5 kcal/mol) su manje u odnosu na estre nezasićenih kiselina. Tabela 4.1.3. Inhibicija acetilholinesteraze i izraĉunate vrednosti energije vezivanja (molekulsko dokovanje) trans-sabinola [1] i njegovih estara [1a], [1b], [1h] i [1i] Jedinjenje % AChE inhibicije a) Energija vezivanja (kcal/mol) trans-Sabinol [1] 25,3 -6,5 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-formijat [1a] 18,9 -6,9 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-acetat [1b] 22,7 -7,4 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-tiglat [1h] 23,2 -8,4 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-senecioat [1i] 40,0 -8,3 a) U koncentraciji od 20 μg/ml ([1] (0,13 mmol/l), [1a] (0,11 mmol/l), [1b] (0,10 mmol/l), [1h] (0,09 mmol/l), [1i] (0,09 mmol/l)) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 138 Odabir jedinjenja koja su bila ukljuĉena u in vitro AChE test je bio baziran na rezultatima eksperimenta dokovanja i na osnovu njihove zastupljenosti u etarskom ulju biljne vrste A. falcata. Iz tog razloga, izvršili smo testiranje (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tigata (novog prirodnog proizvoda), senecioata (sa najvećom izraĉunatom energijom vezivanja) i formijata (sa najmanjom izraĉunatom energijom vezivanja; novi prirodni proizvod). TakoĊe, izvršeno je testiranje i trans- sabinola i acetata kao glavnih sastojaka ulja biljnih vrsta A. falcata i A. ageratifolia subsp. serbica. Nadali smo se da će ovakav izbor jedinjenja obezbediti osnovu za SAR (odnos strukture i aktivnosti) analizu. Rezultati testiranja inhibicije AChE su predstavljeni u tabeli 4.1.3 i, uopšeno govoreći, su u skladu sa onima iz eksperimenta dokovanja. Kao što je predviĊeno, meĊu testiranim estrima, najmanju inhibitornu aktivnost je imao (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijat. Rezultati i in silico i in vitro testiranja su pokazali da je prisustvo dvogube veze u kiselinskom delu vaţno za ChE inhibitornu aktivnost, a da je razlika u delovanju [1h] i [1i] posledica razlike u supstituciji oko dvostruke veze. Inhibitori acetilholinesteraze se veoma ĉesto koriste za leĉenje digestivnih problema. Dokazano je da ubrzavaju peristaltiku creva i na taj naĉin ubrzavaju proces varenja hrane (Law et al., 2001). Vaţno je napomenuti da se ĉaj dobiven od delova biljne vrste A. falcata u narodnoj medicini koristi iz ovog razloga (Aburjai et al., 2007; Alzweiri et al., 2011). 4.1.3.3. Antinociceptivna aktivnost U nekim sluĉajevima, antinocicepcija i analgezija se mogu smatrati znacima akutne intoksikacije ( khila et al., 2007). Iz tog razloga smo ispitali mogućnost uticaja trans-sabinola i sabinil estara ([1a], [1b], [1h] i [1i]) na reakciju miševa na razliĉite nociceptivne stimuluse (termalne i hemijske) u nekoliko antinociceptivnih modela: metoda vruće ploĉe (VP), metoda imerzije repa (IR) i test abdominalnih grĉeva izazvanih acetilholinom ( ChW). Ovi modeli su izabrani zato što oni pruţaju uvid u razliĉite aspekte (mehanizme) antinocicepcije. Na primer, VP i IR testovima se meri vreme reakcije ţivotinja na termiĉki stimulus. MeĊutim, rezultati VP testa preteţno govore o supraspinalnoj reakciji na stimulus, dok rezultati IR testa govore o spinalnoj kontroli reakcije na stimulus. Reakcije ţivotinja u IR testu su posredovane spinobulbo- spinalnim spojem ili su posledica procesa uĉenja (Le Bars et al., 2001). U toku VP testa praćeno je koliko puta je ţivotinja poskakivala i koliko puta je lizala šape (ovo je najĉešća reakcija na termalni nadraţaj na vrućoj ploĉi). Lizanje šapa predstavlja reakciju na štetni stimulus, dok je Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 139 poskakivanje indikacija afektivnih ĉinilaca bola, pa prema tome u ove reakcije mogu biti ukljuĉeni razliĉiti sistemi (Zetler, 1983). Pojava abdominalnih grĉeva izazvanih acetilholinom (AChW) nije jedino posledica direktne stimulacije nikotinskih receptora već indirektno moţe biti povezana i sa oslobaĊanjem prostaglandina (Hackett and Buckett, 1975; Whittle, 1964). Štaviše, ACh-indukovana grĉenja nisu inhibirana samo korišćenjem analgetika i narkotika, već i simpatomimetiĉkim, antiholinergiĉkim i antihistaminskim lekovima (Collier et al., 1968). Prema tome, istovremena analiza rezultata sva tri testa (VP i IR i ChW) moţe omogućiti razjašnjenje mogućeg mehanizma, na primer daje mogućnost odreĊivanja razliĉitih ciljnih sistema ukljuĉenih u nocicepciju (Radulović et al., 2013c). Kao što se moţe videti iz rezultata prikazanih u tabeli 4.1.4 i na slikama 4.1.30 – 4.1.32, u svim uraĊenim testovima su svi ispitani sabinil-estri pokazali neki stepen antinociceptivne aktivnosti. Dobiveni rezultati su sugerisali da testirana jedinjenja imaju uticaj i na periferni i na centralni nervni sistem. MeĊutim, ĉini se da je mehanizam antinocicepcije, kao i dozna zavisnost trans-sabinola i njegovih estara drugaĉija. Na primer, trans-sabinol [1] izaziva odlaganje reakcije ţivotinja na termalni stimulus u oba testa (VP i IR; slike 4.1.30 i 4.1.31). U testu vruće ploĉe, kada je primenjen u najvećoj dozi od 50 mg/kg telesne mase (0,33 mmol/kg), maksimalni efekat trans-sabinola je uoĉen 15 minuta nakon davanja ovog jedinjenja; nakon toga, antinociceptivni efekat se je polako smanjivao tokom 90 minuta. Reakcija ţivotinja tretiranih trans-sabinolom u VP testu je bila dozno zavisna (slike 4.1.30 i 4.1.31), dok je nasuprot tome u IR testu najmanja doza trans-sabinola (12,5 mg/kg) izazvala najveće produţenje vremena reakcije ţivotinja. Pik aktivnosti (maksimalna aktivnost) je zabeleţena nakon 15 minuta od injektiranja testiranih jedinjenja (efekat trans-sabinola u tom vremenu je dva puta veći od efekta morfina (5 mg/kg (0,018 mmol/kg); slika 4.1.30)). Generalno govoreći, trans-sabinol je bio najaktivnije jedinjenje u IR testu (tabela 4.1.4 i slika 4.1.31), dok je u AChW testu [1] pokazao umerenu aktivnost (slika 4.1.32). Nasuprot IR testu, najveću aktivnost u VP testu je pokazao (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglat: doza od 50 mg/kg je izazvala povećanje od 140% osnovne linije 15 minuta nakon tretiranja ţivotinje, dok je morfin (5 mg/kg) izazivao veoma malo povećanje osnovne linije (≈ 1%) u tom trenutku eksperimenta (slika 4.1.31). TakoĊe je bilo uoĉljivo da sabinil estri (naroĉito acetat, slika 4.1.32) imaju mnogo veći uticaj na grĉenje miševa u odnosu na trans-sabinol. Dakle, ĉinilo se da je, za razliku od VP i ChW testova, slobodna alkoholna grupa od znaĉaja za aktivnost trans-sabinola u IR testu. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 140 Tabela 4.1.4. Antinociceptivno dejstvo trans-sabinola [1] i njegovih estara [1a], [1b], [1h] i [1i] kao i pozitivne kontrole (morfin) u VP i IR testovima izraţeno kao procenat povećanja površine ispod krive promene vremena reakcije ţivotinje u toku eksperimenta Jedinjenje (1R*,3S*,5R*)- Sabinol [1] (1R*,3S*,5R*)- Sabinil-formijat [1a] (1R*,3S*,5R*)- Sabinil-acetat [1b] (1R*,3S*,5R*)- Sabinil-tiglat [1h] (1R*,3S*,5R*)- Sabinil-senecioat [1i] Morfin Test/doza (mg/kg) 12,5 25 50 12,5 25 50 12,5 25 50 12,5 25 50 12,5 25 50 5 VP 3,1 9,7 14,2 5,4 5,8 14,6 0,1 2,5 5,1 2,3 7,6 8,5 3,2 3,8 39,7 81,8 IR 22,4 21,0 21,3 2,9 3,8 13,6 1,9 5,0 6,1 3,5 10,2 28,2 3,3 20,9 27,0 76,1 AChW / 17,9 62,7 44,8 40,3 55,2 / 50,7 80,6 31,4 44,8 44,8 14,9 40,3 50,7 / / - jedinjenje u datoj koncentraciji nije testirano. Kompletno razjašnjenje dobivenih razlika u aktivnostima ispitanih jedinjenja, kao i odgovarajuće dozne zavisnosti, nije moguće. MeĊutim, moţe se reći da: niske doze moţda utiĉu na odreĊene specifiĉne populacije/subpopulacije receptora koji su ukljuĉeni u percepciju stimulusa (što uslovljava da se veća antinociceptivna aktivnost moţe videti u niţim primenjenim dozama, kao na slici 4.1.31); testirana jedinjenja deluju na opioidne podtipove receptora lociranih na supraspinalom i spinalom nivou (Radulović et al., 2013c) ili da aktiviraju serotonin i adrenergijske bulbospinalne puteve, da dolazi do stimulacije vagusa koja uzrokuje opštu depresiju centralnog nervnog sistema (Le Bars et al., 2001). Uopšteno govoreći, iako ChW test nije specifiĉan (Whittle, 1964), dobiveni rezultati su pokazali da testirani (1R*,3S*,5R*)-sabinil estri najverovatnije interaguju sa nikotinskim receptorima. Treba imati u vidu da dobivena antinociceptivna aktivnost moţe biti sekundarna aktivnost sedativnog dejstva primenjenih supstanci (Herrick-Davis et al., 1989). Kratko vreme potrebno za maksimalno delovanje primenjenih supstanci (u VP testu, uoĉen je maksimalni efekat posle 15 minuta (slika 4.1.30), dok je u IR testu, u većini sluĉajeva maksimum aktivnosti bio u 30-tom minutu (slika 4.1.31), što ukazuje na to da se primenjeni (1R*,3S*,5R*)-sabinil estri veoma brzo metabolišu. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 141 Slika 4.1.30. Efekat trans-sabinola (A), (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata (B), (1R*,3S*,5R*)- sabinil-formijata (C), (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata (D) i (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata (E), u dozama od 12,5 (-▲-), 25 (-▼-) i 50 (-◆-) mg/kg, na reakciju miševa na nociceptivni stimulus u testu vruće ploĉe u odnosu na morfin (5 mg/kg, -█-) i slepu probu (10 ml/kg, -●-). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost povećanja osnovne linije S.D. (n = 6) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 142 Slika 4.1.31. Efekat trans-sabinola (A), (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata (B), (1R*,3S*,5R*)- sabinil-formijata (C), (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata (D) i (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata (E), u dozama od 12,5 (-▲-), 25 (-▼-) i 50 (-◆-) mg/kg, na reakciju miševa na nociceptivni stimulus u testu imerzije repa u odnosu na morfin (5 mg/kg, -█-) i slepu probu (10 ml/kg, -●-). Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost povećanja osnovne linije S.D. (n = 6) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 143 Slika 4.1.32. Efekat trans-sabinola [1] i estara ([1a], [1b], [1h] i [1i]), u dozama od 12,5, 25 i 50 mg/kg, na broj grĉeva uoĉenih kod miševa nakon injekcije ACh (V – vehikulum (maslinovo ulje)) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 144 4.2. Kombinatorna biblioteka izobutanoata, 2-metilbutanoata i (izo)pentanoata dugolančanih alkohola 4.2.1. OdreĎivanje sastava etarskih ulja biljnih vrsta Scandix balansae i S. pecten- veneris 4.2.1.1. Scandix balansae Reut. ex Boiss. Scandix balansae Reut. ex Boiss. (familija piaceae (štitašice)) je endemiĉna biljna vrsta karakteristiĉna za obronke planine Kavkaz (slika 4.2.1). Pretraţivanjem dostupne literature utvrĊeno je da ne postoje podaci o isparljivim i neisparljivim sekundarnim metabolitima ove biljne vrste što nas je navelo da izvršimo detaljnu analizu etarskog ulja šizokarpa metodom kapilarne gasne hromatografije kuplovane sa masenospektrometrijskom detekcijom. Opredelili smo se za analizu plodova, jer biljne vrste iz familije Apiaceae ĉesto upravo tu akumuliraju etarsko ulje (Corsi i Biasci, 1998). Slika 4.2.1. Izgled biljne vrste Scandix balansae U uzorku etarskog ulja dobivenog hidrodestilacijom suvih plodova je identifikovan 81 sastojak (91,4% ukupnih površina ispod pikova u TIC hromatogramu; slika 4.2.2; prilog 8.2.1; uzorak S8). Najzastupljenije klase su bili alkani (51,2%) i jedinjenja nastala iz metabolizma masnih kiselina (29,6%). UtvrĊeno je da su glavni sastojci ulja alkani sa 13-17 ugljenikovih atoma (tridekan (6,7%), pentadekan (13,4%) i heptadekan (19,3%)) i dugolanĉani alkan (nonakozan (7,6%)). U ulju su, pored alkana i jedinjenja nastalih iz metabolizma masnih Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 145 kiselina, identifikovani i green leaf derivati (2,0%) i terpeni (monoterpeni u tragovima (< 0,05%), seskviterpeni (0,4%) i diterpeni (4,3%)). Slika 4.2.2. TIC hromatogram etarskog ulja plodova biljne vrste Scandix balansae Većina identifikovanih sastojaka predstavljala je uobiĉajene sekundarne metabolite prisutne u etarskim uljima (npr. (E)-kariofilen, pulegon itd.). MeĊutim, neki od sastojaka nisu mogli biti identifikovani zbog nepostojanja masenih spektara kao i vrednosti retencionih indeksa u dostupnim bazama (Wiley, MassFinder i Adams). Na primer, u ulju su detektovana tri sastojka sa relativno velikim vrednostima retencionih indeksa (RI = 2021, 2436 i 2484) i veoma sliĉnom MS fragmentacijom što je impliciralo da su identifikovana jedinjenja ĉlanovi homologe serije prirodnih proizvoda. Na osnovu analize fragmentacija u masenim spektrima, tj. prisustva osnovnog jona na m/z 103 i intenzivnih jona na m/z 85 i 57 (slika 4.2.3), zakljuĉeno je da detektovani sastojci sadrţe fragment koji potiĉe od neke od izomernih pentanskih kiselina (2- metilbutanske, 3-metilbutanske i/ili pentanske kiseline (m/z 103 [C4H9COOH2 + ], 57 [C4H9 + ] i 85 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 146 [C4H9CO + ])). Velike vrednosti retencionih indeksa, kao i molekulski joni [M] + na m/z 298 i 354, ukazivali su na ĉinjenicu da je reĉ o estrima (izo)pentanske kiseline i linearnih i/ili raĉvastih dugolanĉanih alkohola (tetradekanola i oktadekanola). Ova pretpostavka je bila podrţana i razlikama u vrednostima retencionih indeksa (povećanje RI vrednosti za ≈ 100 jedinica po dodatoj metilenskoj grupi) identifikovanih sastojaka i literaturnih vrednosti za heksil-pentanoat, heptil-2-metilbutanoat i heptil-3-metilbutanoat (Forero et al., 2008). Slika 4.2.3. Maseni spektar sastojka (RI = 2484) etarskog ulja plodova biljne vrste Scandix balansae koji je identifikovan kao oktadecil-izovalerat Pored ova tri sastojka, detektovano je još jedno jedinjenje za koje su vrednosti m/z 340 molekulskog jona, m/z 43 osnovnog jona i intenzivnih jona na m/z 89 i 71 u masenom spektru (slika 4.2.4), kao i vrednost retencionog indeksa (2340), ukazivale na to da je reĉ o oktadecil- izobutanoatu (njegov retencioni indeks je za ≈ 100 jedinica manji od detektovanih (izo)pentanoata zajedno sa razlikom od 14 Da izmeĊu m/z vrednosti dominantnih pikova u Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 147 masenom spektru). S obzirom na kompleksnost etarskog ulja (sadrţi 81 sastojak) kao i ĉinjenicu da su identifikovani estri prisutni u malom procentu (do 0,3%), njihovo izolovanje u ĉistom stanju radi dodatne potvrde strukture nije bilo moguće. U cilju potvrde identifikacije detektovanih sastojaka, izvršena je sinteza biblioteke estara dugolanĉanih alkohola i (izo)- butanskih i (izo)-pentanskih kiselina (detaljnije o kreiranju biblioteke estara, njihovoj sintezi i spektralnoj analizi će biti reĉi u poglavlju 4.2.2). Slika 4.2.4. Maseni spektar sastojka (RI = 2340) etarskog ulja plodova biljne vrste Scandix balansae koji je identifikovan kao oktadecil-izobutanoat Gasno-hromatografska analiza smeše uzorka etarskog ulja sa dobijenim standardima estara iz biblioteke (koinjekcija) je nedvosmisleno potvrdila prvobitnu pretpostavku da su tetradecil-3-metilbutanoat [2e], oktadecil-izobutanoat [2n], oktadecil-3-metilbutanoat [2q] i oktadecil-pentanoat [2r] sastojci etarskog ulja plodova biljne vrste S. balansae od kojih je oktadecil-pentanoat [2r] potpuno novo jedinjenje - detaljnom pretragom literature nisu pronaĊeni nikakvi podaci o ovom jedinjenju. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 148 4.2.1.2. Scandix pecten-veneris L. Scandix pecten-veneris L. (Apiaceae; slika 4.2.5) je široko rasprostranjena biljna vrsta u oblasti Sredozemlja i jedini je predstavnik roda Scandix u flori Srbije (Josifović, 1974). Pretraţivanjem literature je ustanovljeno da je ova štitašica, iako se u Iranu i Turskoj već dugo koristi u tradicionalnoj medicini, nedovoljno fitohemijski ispitana, pri ĉemu je poslednja analiza sekundarnih metabolita vršena još sredinom osamdesetih godina dvadesetog veka (Kubeczka, 1982). Slika 4.2.5. Izgled biljne vrste Scandix pecten-veneris Sastav etarskog ulja korena, nadzemnih delova i plodova, na osnovu prinosa ulja nearomatiĉne (0,08 – 0,18% (w/w)) biljne vrste Scandix pecten-veneris L. (Apiaceae), izolovanih iz biljnog materijala sakupljenog u Nišu i sa dve lokacije u blizini Niša (tabela 3.2.1) dat je u prilogu 8.2.1. Identifikovana su ukupno 123 sastojaka ulja koji predstavljaju 92,7% – 99,2% ukupnih površina ispod pikova u TIC hromatogramima (slika 4.2.6). Dominantnu klasu jedinjenja, u uzorcima ulja nadzemnih delova i korena, ĉinili su alkani (47,8% – 78,1%). Njihova zastupljenost u etarskom ulju plodova je bila znatno niţa (11,1%). Preostali deo uzorka etarskog Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 149 ulja plodova su uglavnom ĉinili green leaf metaboliti (61,7%) i seskviterpeni (13,4%). Identifikovani monoterpeni su ĉinili samo mali deo ulja nadzemnih delova (0,1% – 0,4%) i plodova (< 0,05%), dok u etarskom ulju korena nisu detektovani ĉak ni u tragovima. Slika 4.2.6. TIC hromatogram etarskog ulja a) korena, b) nadzemnih delova i c) plodova biljne vrste Scandix pecten-veneris Pretragom literature ustanovljeno je da je ovako visok sadrţaj alkana, sa tridekanom (13,9% – 52,8%), pentadekanom (8,5% – 23,5%) i/ili heptadekanom (1,2% – 5,2%) kao glavnim sastojcima ulja, karakteristiĉan jedino za etarska ulja biljnih vrsta iz roda Scandix. Ovaj podatak moţe imati hemotaksonomski znaĉaj zato što su, za razliku od dugolanĉanih n-alkana koji su generalno ĉesti biljni metaboliti, n-alkani srednje duţine lanca (konkretno tridekan, pentadekan i heptadekan) retki metaboliti za koje se ĉini da ne potiĉu iz mitohondrijalnog biosintetskog puta (Radulović et al., 2012b). Identifikacija 109 od 123 sastojaka ulja je izvršena na osnovu poreĊenja masenih spektara i odgovarajućih retencionih indeksa sa literaturnim vrednostima kao i GC-koinjekcijom ulja sa dostupnim standardima. Preostalih 14 pikova u GC hromatogramu je poticalo od dve serije jedinjenja za koje je pretpostavljeno da su to estri dugolanĉanih alkohola i (izo)butanske kao i (izo)pentanske kiseline. Njihova struktura je, kao i u sluĉaju sastojaka ulja vrste Scandix balansae, pretpostavljena na osnovu karakteristiĉne MS fragmentacije, kao i na osnovu vrednosti njihovih retencionih indeksa. Fragmenti na m/z 103, 101, 85, 57 i 43, koji se Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 150 slaţu sa fragmentacijom pentanoata (Adams, 2007) i molekulskih jona na m/z 270, 284, 298, 312, 326, 340 i 354 (relativni intenzitet 1% – 9%) su ukazivali da su to estri (izo)pentanske kiseline i dugolanĉanih alkohola. Za masene spektre jedinjenja iz druge serije sastojaka etarskih ulja je bilo karakteristiĉno prisustvo osnovnog jona na m/z 43 [C3H7 + ] i intenzivnih jona na m/z 89 [C3H7COOH2 + ] i 71 [C3H7CO + ], što je ukazivalo da su to estri izobutanske kiseline ili butanske kiseline. GC- koinjekcija sintetisanih standarda estara sa uzorcima etarskog ulja je potvrdila prisustvo tridecil- [2a], tetradecil- [2d], pentadecil- [2f], heksadecil- [2i], heptadecil- [2k], oktadecil- [2n], heneikozil- [2s] i trikozil-izobutanoata [2t], kao i tridecil- [2c], tetradecil- [2e], pentadecil- [2h], heksadecil- [2j], heptadecil- [2m] i oktadecil-3-metilbutanoata (izopentanoata) [2q] u etarskom ulju biljne vrste S. pecten-veneris (prilog 8.2.1; uzorci S1 – S7) od kojih su tridecil- [2a], pentadecil- [2f], heptadecil- [2k], heneikozil- [2s] i trikozil-izobutanoati [2t], kao i tridecil- [2c], pentadecil- [2h] i heptadecil-3-metilbutanoati [2m] potpuno nova jedinjenja koja su po prvi put bila identifikovana kao biljni sekundarni metaboliti. UporeĊivanjem sastava ovog etarskog ulja sa prethodnim istraţivanjima ( shraf et al., 1979; Kubeczka, 1982) uoĉene su znaĉajne razlike kako u broju, tako i u identitetu detektovanih metabolita. U prethodna dva ispitivanja hemijskog sastava etarskog ulja identifikovano je 10 (Ashraf et al., 1979), odnosno 12 sastojaka (Kubeczka, 1982). U etarskom ulju korena, šraf i saradnici (Ashraf et al., 1979) su identifikovali samo 10 sastojaka ulja meĊu kojima su dominirale dodekanska kiselina (laurinska kiselina; 38,0%) i 2-undekanon (11,0%). Rezultati druge po redu analize sastava ulja vrste S. pecten-veneris (Kubeczka, 1982) se mnogo više slaţu sa rezultatima naše analize zato što je i tada naĊeno da su glavni sastojci ulju alkani. Od svega 12 sastojaka detektovanih u istraţivanju Kubeĉke i saradnika (Kubeczka, 1982), glavni sastojci su bili tridekan (19,4%), pentadekan (18,5%), heptadekan (23,0%), tetradekanal (8,0%) i (E)-4- (prop-1-enil)fenil-butanoat (u tom radu imenovan kao anil-butirat, 9,9%) u etarskom ulju nadzemnih delova, odnosno tridekan (13,7%), pentadekan (12,7%), heptadekan (3,5%), tetradekanal (0,3%) i (E)-4-(prop-1-enil)fenil-butanoat (53,0%) u etarskom ulju korena. Ovako znaĉajne razlike, naroĉito sa prvim istraţivanjem ( shraf et al., 1979), bi se mogle objasniti postojanjem razliĉitih hemotipova ovog taksona, klimatskih faktora, postojanja infekcije biljaka, vremena branja i drugih faktora koji mogu dovesti do promene u profilu isparljivih sastojaka. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 151 4.2.2. Kreiranje kombinatorne biblioteke, sinteza estara dugolančanih alkohola i njihova spektralna karakterizacija Motivisani krajnje ograniĉenom i specifiĉnom rasprostranjenošću detektovanih sekundarnih metabolita odluĉili smo da potvrdimo njihov pretpostavljeni identitet kreiranjem biblioteke gore navedenih estara. Odluĉili smo se za sintetski pristup usled kompleksnosti etarskih ulja biljnih vrsta S. balansae i S. pecten-veneris, kao i ĉinjenice da su identifikovani estri prisutni u malom procentu (do 3,3%), pa je njihovo hromatografsko izolovanje u ĉistom stanju radi dodatne potvrde strukture bilo potpuno nemoguće. Pored toga, ako se na osnovu dostupnih podataka ne moţemo odluĉiti za neki od izomera sa veoma sliĉnim spektralnim i hromatografskim osobinama, najlogiĉniji i jedini sveobuhvatni pristup je kreiranje biblioteke jedinjenja svih izomera, a zatim njihova koinjekcija sa uzorcima etarskog ulja što bi nedvosmisleno potvrdilo identitet detektovanih sekundarnih metabolita. Prilikom kreiranja biblioteke, uzet je u obzir biosintetski put po kojem ova jedinjenja nastaju da bi smanjili ukupan broj jedinjenja koja treba sintetisati. Tako je kreirana biblioteka estara izobutanske, butanske, 2-metilbutanske, 3-metilbutanske i pentanske kiseline sa dugolanĉanim n-alkoholima (C13 – C18, C21 i C23) korišćenjem Šteglihove metode (slika 4.2.7). Slika 4.2.7. Sinteza estara dugolanĉanih n-alkohola [2a – 2t] Ukupni prinos estara [2a – 2t], vrlo slabog mirisa voskaste note, bio je u intervalu od 72% do 87%. Svi sintetisani estri [2a – 2t] su detaljno spektralno okarakterisani (1H- i 13C-NMR, IR, MS; prilozi 8.2.2 – 8.2.81), a njihova struktura je u potpunosti potvrĊena analizom 1D- i 2D- NMR spektara (slike 4.2.8 – 4.2.12). Iako smo utvrdili da sintetisani estri iz serije 2- metilbutanoata nisu prisutni u ulju, ova serija nam je pruţila mogućnost uporeĊenja njihovih spektralnih/hromatografskih/bioloških karakteristika sa ostalim sintetisanim (izo)pentanoatima iz etarskog ulja. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 152 Slika 4.2.8. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Slika 4.2.9. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 153 Slika 4.2.10. 1 H – 1H COSY spektar (CDCl3; 1 H: 400 MHz) oktadecil-izobutanoata [2n] Slika 4.2.11. HSQC spektar (CDCl3; 1 H: 400 MHz, 13 C: 101 MHz) oktadecil-izobutanoata [2n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 154 Slika 4.2.12. HMBC spektar (CDCl3; 1 H: 400 MHz, 13 C: 101 MHz) oktadecil-izobutanoata [2n] 4.2.3. Veza strukture molekula i njihovih gasno-hromatografskih osobina (retencionih indeksa) Sintetisana biblioteka homologih serija izobutanoata i izopentanoata identifikovanih u etarskom ulju biljnih vrsta S. pecten-veneris i S. balansae, kao i serija 2-metilbutanoata, sa pravilnom promenom vrednosti njihovih retencionih indeksa, omogućila nam je da ispitamo vezu strukture ovih estara sa njihovim gasno-hromatografskim osobinama (retencioni indeksi). UporeĊivanjem vrednosti retencionih indeksa ovih estara uoĉene su pravilne razlike (∆RI) izmeĊu izomernih butanoata kao i izomernih pentanoata. Vrednosti retencionih indeksa butanoata su za oko 30 RI jedinica bile veće u odnosu na izobutanoate sa istim brojem ugljenikovih atoma. Kod izomernih pentanoata postojanje raĉve kod 3-metilbutanoata (izovalerata) uslovljavalo je da su njihove vrednosti retencionih indeksa bile za oko 50 RI jedinica manje u odnosu na odgovarajuće pentanoate (valerate), dok su 2-metilbutanoati eluirali najbrţe sa GC (DB-5MS) kolone, sa oko 5 jedinica manjim RI vrednostima u odnosu na izomerne 3-metilbutanoate (tabela 4.2.1). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 155 Prvo je razmatrana zavisnost vrednosti retencionih indeksa (DB-5MS kolona) od broja ugljenikovih atoma u molekulima estara. Kao što se moţe uoĉiti na slici 4.2.13, uoĉena je linearna zavisnost RI vrednosti od broja C atoma estara iste kiseline i razliĉitih dugolanĉanih n- alkohola. Dobivene jednaĉine (RI = 41,8 + 106,14 x C za izobutanoate; slika 4.2.13a, RI = 50,3 + 103,75 x C za 2-metilbutanoate; slika 4.2.13b i RI = 102,8 + 101,39 x C za 3-metilbutanoate; slika 4.2.13c, gde je C ukupan broj ugljenikovih atoma u molekulu) su imale odliĉne vrednosti koeficijenta korelacije (r 2 ≥ 0,99). Daljom analizom, uoĉeno je da niţi ĉlanovi kombinatorne biblioteke pokazuju mnogo nepravilniju promenu retencionih indeksa (ΔRI izmeĊu susednih ĉlanova kombinatorne biblioteke u opsegu 95 – 112) u odnosu na ĉlanove sa alkoholnim delom koji sadrţi 15 ili više ugljenikovih atoma (ΔRI = 100 – 101). Ovakva ΔRI je bila uoĉena za sve serije jedinjenja biblioteke (tabela 4.2.1) i moţe se objasniti razliĉitim udelom promena molekulskih osobina izazvanih uvoĊenjem dodatnih metilenskih grupa kod niţih i viših ĉlanova homologih serija biblioteke. Ĉini se da je, ukoliko je niz duţi od petnaest ugljenikovih atoma, promena RI vrednosti izomernih butanoata i pentanoata skoro ista kao i za seriju n-alkana (tj. prisustvo estarske grupe ima znatno manji uticaj na vrednosti retencionih indeksa kod estara dugolanĉanih alkohola u odnosu na rastući alkil niz). Nakon toga su vrednosti nekoliko topoloških indeksa (Vinerov (Wiener, 1947), Balabanov (Balaban, 1983) i molekularni topološki indeks (molecular topological index (Schultz, 1989)); izraĉunatih pomoću ChemBio3D Ultra 12.0 softvera), koji uzimaju u obzir postojanje metil raĉvi kao i mesta raĉvanja u kiselinskom delu, kao jedine razlike meĊu sintetisanim estrima, iskorišćene za dobijanje univerzalne jednaĉine koja moţe predvideti vrednosti retencionih indeksa svih sintetisanih estara. Jednaĉine dobivene pojedinaĉnom upotrebom ovih topoloških indeksa nisu mogle uspešno da se koriste za predviĊanje vrednosti retencionih indeksa. Tek je uvoĊenje sva tri pomenuta indeksa u jednu jednaĉinu, ukljuĉujući i broj ugljenikovih atoma u molekulu estra, rezultovalo jednaĉinom (RI = 240,5 + 91,2 x C + 2,94 x WI + 4,6 x 10 -5 x BI - 0,381 x MTI, gde je C ukupan broj ugljenikovih atoma u molekulu, WI vrednost Vinerovog indeksa, BI vrednost Balabanovog indeksa i MTI vrednost molekulskog topološkog indeksa) koja predviĊa vrednosti retencionih indeksa sa prihvatljivom greškom, od ±18 RI jedinica (izuzev heneikozil-izobutanoata [2s] kod koga je razlika u eksperimentalnoj i predvidjenoj vrednosti retencionih indeksa iznosila 38,5 jedinica; tabela 4.2.1 i slika 4.2.14). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 156 a) b) c) Slika 4.2.13 Zavisnost RI vrednosti (DB-5MS kolona) od broja ugljenikovih atoma u molekulu estra iste kiseline ((a) - izobutanske, (b) - 2-metilbutanske i (c) - 3-metilbutanske kiseline) i razliĉitih dugolanĉanih n-alkohola Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 157 Slika 4.2.14. Razlika izmeĊu eksperimentalnih i predviĊenih vrednosti retencionih indeksa za seriju estara iz kreirane kombinatorne biblioteke Dobivenu jednaĉinu treba obazrivo koristiti u sluĉaju identifikacije 2-metilbutanoata i 3- metilbutanoata zato što ova jedinjenja imaju veoma sliĉne vrednosti retencionih indeksa (ΔRI izmeĊu 2-metilbutanoata i 3-metilbutanoata je oko 5 jedinica). MeĊutim, i eksperimentalne i predviĊene vrednosti retencionih indeksa pokazuju da 2-metilbutanoati uvek brţe eluiraju, što olakšava njihovu identifikaciju naroĉito u sluĉaju kada se oba izomera naĊu u istom GC hromatogramu. Dobivena jednaĉina, takoĊe, moţe uspešno da se iskoristi za razlikovanje izomernih butanoata i pentanoata, odnosno onih estara koji imaju istu molekulsku formula, ali se razlikuju u duţini i alkoholne i kiselinske grupe. To znaĉi da ukoliko MS fragmentacija indicira da je analizirano jedinjenje estar butanske ili pentanske kiseline sa n-alkoholima, korišćenjem ove jednaĉine, ĉak i u sluĉajevima nepostojanja molekulskog jona, moţe se odrediti broj ugljenikovih atoma u molekulu estra, odnosno broj ugljenikovih atoma u kiselinskom delu. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 158 Tabela 4.2.1. Estri dugolanĉanih n-alkohola i izobutanske, 2-metilbutanske i 3-metilbutanske kiseline: eksperimentalni i predviĊeni retencioni indeksi (RI) Jedinjenje RI 1 ) RI 2 ) Tridecil-izobutanoat [2a] 1827 1832 Tridecil-2-metilbutanoat [2b] 1915 1918 Tridecil-3-metilbutanoat [2c] 1917 1919 Tetradecil-izobutanoat [2d] 1927 1933 Tetradecil-3-metilbutanoat [2e] 2021 2020 Pentadecil-izobutanoat [2f] 2031 2036 Pentadecil-2-metilbutanoat [2g] 2131 2123 Pentadecil-3-metilbutanoat [2h] 2134 2124 Heksadecil-izobutanoat [2i] 2143 2141 Heksadecil-3-metilbutanoat [2j] 2235 2229 Heptadecil-izobutanoat [2k] 2243 2248 Heptadecil-2-metilbutanoat [2l] 2330 2337 Heptadecil-3-metilbutanoat [2m] 2336 2338 Oktadecil-izobutanoat [2n] 2340 2358 Oktadecil-2-metilbutanoat [2p] 2430 2447 Oktadecil-3-metilbutanoat [2q] 2436 2449 Heneikozil-izobutanoat [2s] 2746 2708 Trikozil-izobutanoat [2t] 2947 2962 1) Retencioni indeksi (RI) estara dugolanĉanih alkohola sa izobutanskom, 2- metilbutanskom i 3-metilbutanskom kiselinom na DB-5MS koloni. 2 ) PredviĊene RI vrednosti po jednaĉini datoj u tekstu. 4.2.4. Prirodna rasprostranjenost estara dugolančanih alkohola iz kombinatorne biblioteke Iako estri dugolanĉanih alkohola predstavljaju strukturno relativno jednostavne molekule, detaljna pretraga literature je pokazala da su ova jedinjenja veoma retka ili u nekim sluĉajevima potpuno nova. Pregled njihove rasprostranjenosti u prirodi je dat u tabeli 4.2.2. Pentadecil- [2f], heptadecil- [2k], heneikozil- [2s] i trikozil-izobutanoat [2t], tridecil- [2b], pentadecil- [2g] i heptadecil-2-metilbutanoat [2l], tridecil- [2c], pentadecil- [2h] i heptadecil-3-metilbutanoat [2m], kao i oktadecil-pentanoat [2r] nikada do sada nisu identifikovani, opisani ili pomenuti u literaturi. Izuzev tridecil- [2a] i oktadecil-izobutanoata [2n], tetradecil- [2e], heksadecil- [2j] i oktadecil-3-metilbutanoata [2q] i svih 2-metilbutanoata [2b, 2g, 2l] iz tabele 4.2.2, svi ostali estri su po prvi put identifikovani kao sekundarni metaboliti nekog organizma. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 159 Tabela 4.2.2. Prirodna rasprostranjenost estara dugolanĉanih alkohola sa izobutanskom i 3- metilbutanskom kiselinom Jedinjenje Ţivotinjska 1 )/biljna 2 ) vrsta Referenca Tridecil-izobutanoat [2a] Cataglyphis bicolor 1 ) Gokcen et al., 2002 Adenophora tetraphylla 2 ) Wang et al., 2008 Tridecil-3-metilbutanoat * [2c] / Tetradecil-izobutanoat [2d] Riptortus clavatus 1 ) Yasuda et al., 2007 Melipona bicolor 1 ) Abdalla et al., 2004 Riptortus pedestris 1 ) Mizutani et al., 2008 Capra aegagrus 1 ) He et al., 2009 Tetradecil-3-metilbutanoat [2e] Alligator mississippiensis 1 ) Ibrahim et al., 1998 Castor fiber 1 ) Groenneberg, 1979 Pentadecil-izobutanoat * [2f] / Pentadecil-3-metilbutanoat * [2h] / Heksadecil-izobutanoat [2i] Lasiopodomys brandtii 1 ) Zhang et al., 2007 Heksadecil-3-metilbutanoat [2j] Macrotomia densiflora 2 ) Papageorgiou et al., 1997 Valeriana officinalis var. latifolia 2 ) Huang et al., 2009 Elaeagnus moorcroftii 2 ) Yan et al., 1988 Angelica dahurica 2 ) Ling et al., 2011 Heptadecil-izobutanoat * [2k] / Heptadecil-3-metilbutanoat * [2m] / Oktadecil-izobutanoat [2n] Riptortus clavatus 1 ) Yasuda et al., 2007 Riptortus pedestris 1 ) Mizutani et al., 2008 Polyergus rufescens 1 ) D'Ettorre et al., 2000 Oktadecil-3-metilbutanoat [2q] Macrotomia densiflora 2 ) Papageorgiou et al., 1997 Alligator mississippiensis 1 ) Ibrahim et al., 1998 Oktadecil-pentanoat * [2r] / Heneikozil-izobutanoat * [2s] / Trikozil-izobutanoat * [2t] / * ) Nova jedinjenja. 1) Ţivotinjska vrsta koja sadrţi pomenuti dugolanĉani estar. 2) Biljna vrsta koja sadrţi pomenuti dugolanĉani estar. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 160 4.2.5. Kvantifikacija identifikovanih estara dugolančanih alkohola u biljnom materijalu U cilju odreĊivanja koliĉine estara u suvom biljnom materijalu vrsta S. pecten-veneris i S. balansae, konstruisane su odgovarajuće kalibracione prave korišćenjem gasno-hromatografske analize sa plameno-jonizacionim detektorom (GC-FID). Dobivene kalibracione prave u koncentracionom opsegu 0,0688 – 1,1 mg/ml su imale izuzetno visoke vrednosti korelacionog koeficijenta (R 2 ) u intervalu 0,9965 – 0,9999 (tabela 4.2.3). UtvrĊeno je da 100 g suvog korena biljne vrste S. pecten-veneris sadrţi 0 – 0,31 mg estara dugolanĉanih alkohola, 0 – 3,27 mg u 100 g suvih nadzemnih delova i 0 – 0,03 mg u 100 g suvih plodova. TakoĊe je utvrĊeno da 100 g suvih plodova biljne vrste S. balansae sadrţi 0,54 mg tetradecil-3-metilbutanoata [2e], 0,61 mg oktadecil-izobutanoata [2n], 0,65 mg oktadecil-3-metilbutanoata [2q] i 0,83 mg oktadecil- pentanoata [2r] (tabela 4.2.3). Tabela 4.2.3. Kvantifikacija estara dugolanĉanih alkohola u biljnom materijalu vrsta Scandix Jedinjenje Jednačina kalibracione prave Korelacioni koeficijent (R 2 ) Sadrţaj estara1) S1 2 ) S2 2 ) S3 2 ) S4 2 ) Tridecil-izobutanoat [2a] C = 1,3639 × 10 −4 A + 0,0111 0,9982 - - 0,21 - Tridecil-2-metilbutanoat [2b] C = 1,5724 × 10 −4 A + 0,0072 0,9994 - - - - Tridecil-3-metilbutanoat [2c] C = 2,4488 × 10 −4 A + 0,0125 0,9986 0,14 - 0,02 - Tetradecil-izobutanoat [2d] C = 1,3582 × 10 −4 A + 0,0092 0,9978 0,31 0,02 0,91 - Tetradecil-3-metilbutanoat [2e] C = 2,4435 × 10 −4 A + 0,0115 0,9974 0,15 - 0,72 0,54 Pentadecil-izobutanoat [2f] C = 1,3513 × 10 −4 A + 0,0088 0,9992 0,14 - 3,27 - Pentadecil-2-metilbutanoat [2g] C = 1,5664 × 10 −4 A + 0,0064 0,9994 - - - - Pentadecil-3-metilbutanoat [2h] C = 2,4377 × 10 −4 A + 0,0108 0,9989 0,15 - 2,18 - Heksadecil-izobutanoat [2i] C = 1,3413 × 10 −4 A + 0,0075 0,9995 0,16 - 0,57 - Heksadecil-3-metilbutanoat [2j] C = 2,4394 × 10 −4 A + 0,0102 0,9965 0,03 - 0,05 - Heptadecil-izobutanoat [2k] C = 1,3364 × 10 −4 A + 0,0062 0,9988 0,05 - 0,04 - Heptadecil-2-metilbutanoat [2l] C = 1,5598 × 10 −4 A + 0,0058 0,9981 - - - - Heptadecil-3-metilbutanoat [2m] C = 2,4302 × 10 −4 A + 0,0075 0,9994 0,05 - 0,02 - Oktadecil-izobutanoat [2n] C = 1,3256 × 10 −4 A + 0,0045 0,9998 0,04 - 0,42 0,61 Oktadecil-3-metilbutanoat [2q] C = 2,4211 × 10 −4 A + 0,0015 0,9999 0,06 - 0,04 0,56 Oktadecil-pentanoat [2r] C = 1,7892 × 10 −4 A + 0,0021 0,9986 - - - 0,83 Heneikozil-izobutanoat [2s] C = 1,3208 × 10 −4 A + 0,0036 0,9974 - 0,03 0,04 - Trikozil-izobutanoat [2t] C = 1,3158 × 10 −4 A + 0,0025 0,9989 - - 0,03 - 1) Sadrţaj estara u uzorku biljnog materijala je izraţen kao miligrami estara u 100 grama suvog biljnog materijala. 2 ) S1 = S. pecten-veneris suvi koren, S2 = S. pecten-veneris suvi plodovi, S3 = S. pecten-veneris suvi nadzemni delovi bez plodova, S4 = S. balansae suvi plodovi. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 161 4.2.6. Hemotaksonomski značaj identifikovanih estara dugolančanih alkohola S obzirom da identifikovane serije estara predstavljaju veoma retka/nova jedinjenja, kao i da do sada pomenuti estri nisu identifikovani kao sekundarni metaboliti biljnih vrsta iz porodice piaceae, odluĉili smo da ispitamo hemotaksonomski potencijal sastava etarskih ulja za odreĊivanje taksonomskih odnosa u okviru familije Apiaceae, roda Scandix i/ili plemena Scandiceae generalno ili na nivou taksona (npr. kao markeri za S. balansae, S. pecten-veneris itd.) korišćenjem multivarijantne statistiĉke analize (MV ). Izvršene su dve odvojene analize u cilju otkrivanja potencijalnih evolutivnih trendova i veza u okviru plemena Scandiceae meĊusobnim uporeĊivanjem dostupnih podataka o sastojcima etarskih ulja taksona iz ovog plemena (prilog 8.2.82), a nakon toga i statistiĉka analiza proširene baze podataka sa uzorcima etarskih ulja nasumiĉno odabranih plemena iz porodice Apiaceae. Obe statistiĉke metode (aglomerativno hijerarhijsko klasterovanje (AHC) i analiza glavne komponente (PC )) su primenjene korišćenjem originalnih (sastojci ulja koji su makar u jednom uzorku bili prisutni sa više od 1%) i modifikovanih podataka, gde su kao varijable korišćene klase identifikovanih sastojaka etarskih ulja (monoterpeni, seskviterpeni, diterpeni, fenilpropanoidi, green leaf metaboliti, benzaldehidi, alifatiĉni estri, masne kiseline i derivati dobiveni iz masnih kiselina). Analiza glavne komponente (PCA) u kojoj su korišćene originalne varijable je pokazala da izmeĊu velikog broja sastojaka etarskih ulja postoji znaĉajna korelacija (izraţena kao korelacioni koeficijent; r 2 ). Visoke vrednosti korelacionog koeficijenta (≥ +0,9) su meĊu alkanima, monoterpenima, seskviterpenima, masnim kiselinama i derivatima masnih kiselina. Na primer, svi korelacioni koeficijenti izmeĊu derivata masnih kiselina (palmitinske kiseline, linoleinske kiseline, metil-oktadekanoata, tetradekanala, heksadekanala i oktadekanala) imaju vrednosti veće od +0,98. Koeficijent koji opisuje korelaciju izmeĊu cis- i/ili trans-sabinen- hidrata sa terpinen-4-olom takoĊe ima visoku vrednost (≥ +0,982). Kao što je predloţeno u nedavnom istraţivanju (Radulović et al., 2012c) rezultati PCA analize (dobivene vrednosti koeficijenta korelacije) mogu biti iskorišćene za istraţivanje (makar hipotetiĉki) biosintetskih puteva sugerišući da je sinteza konkretnih sastojaka etarskih ulja blisko povezana, tj. ĉesto ukljuĉuje i isti sistem enzima i/ili isti biosintetski intermedijer. Iz tog razloga, dobivena pozitivna korelacija izmeĊu pomenutih monoterpena nije iznenaĊujuća znajući da se biosinteza dva izomerna sabinen-hidrata vrši preko terpinen-4-il katjona (T4C). Ovaj katjon se formira [1,2]-H Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 162 premeštanjem iz α-terpinil katjona (univerzalnog intermedijera monocikliĉnih monoterpena). Ukoliko T4C odmah interaguje sa vodom dobija se terpinen-4-ol dok sekundarnom ciklizacijom nastaje tujanski katjon koji dovodi do graĊenja cis- ili trans-sabinen-hidrata (Hyatt et al., 2007; Mahmoud et al., 2004). Korelacioni koeficijent izmeĊu nekih acikliĉnih monoterpena (linalool, geranil-acetat, geranil-izovalerat, neril-acetat i neril-propanoat) ima vrednost veću od +0,923 dok je u sluĉaju kamfena i bornil-acetata, biosintetski blisko povezanih, vrednost korelacionog koeficijenta je još veća (+0,951). Pored monoterpena i neki seskviterpeni su meĊusobno jako korelisali, npr: γ-amorfen, τ-kadinol, γ-kadinol i murola-4(14),15-dien (≥ +0,998;); β-bisabolen, β-kubeben, 4-hidroksigermakren D, ar-kurkumen i γ-kurkumen (≥ +0,955); (Z,E)-farnezen i (E,E)-α-farnezen (≥ +0,974). Drugi parovi biosintetski povezanih sekundarnih metabolita sa visokim vrednostima korelacionog koeficijenta su bili: fenhol-fenhil-acetat (+0,974), apiol- elemicin (+0,997), 1-heksanol-(E)-2-heksenal (+0,974), tridekan-pentadekan (+0,942) i oktakozan-pentakozan (+0,959). Ovakva povezanost tridekana i pentadekana, kao i oktakozana i pentakozana se moţe objasniti radom istih enzima zaduţenih za njihovu biosintezu, a koji vrše transformaciju masnih kiselina do pomenutih alkana elongacijom ili dekarboksilacijom/dekarbonilacijom (Radulović et al., 2012c). Neoĉekivano visoke vrednosti koeficijenta korelacije su dobivene u sluĉaju nekoliko seskviterpena i nekih derivata masnih kiselina (npr. γ-amorfena, τ-kadinola, γ-kadinola i murola-4(14),15-diena sa nonanom i dekanom, ≥ +0,998; ar-kurkumena, γ-kurkumena, β-bisabolena i β-kubebena sa 1-oktanolom i 1- okten-3-il-acetatom, ≥ +0,928). Dendrogram dobiven kao rezultat HC analize korišćenjem originalnih varijabli je dat na slici 4.2.15, a zbog bolje vizualizacije rezultata skraćenice uzoraka (prilog 8.2.82) iz razliĉitih rodova su predstavljene razliĉitom bojom ( HC1). Na dendrogramu su uoĉene tri statistiĉki razliĉite grupe, C1 – C3. Grupa C1 sadrţi biljne vrste (uzorke ulja biljnih vrsta Scandix iberica i Anthriscus cerefolium) koje preteţno sadrţe fenilpropanoide (1-alil-2,4-dimetoksibenzen i estragol) dok grupa C2 sadrţi samo uzorke biljne vrste Anthriscus caucalis (An Ca1 – An Ca6). Ostali uzorci koji pripadaju rodu Anthriscus su prepoznati kao statistiĉki razliĉiti i bili su rasporeĊeni u klasama C1 (Anthriscus caucalis) i C3 (Anthriscus nemorosa i Anthriscus sylvestris). Grupa C3 sadrţavala je najveći broj uzoraka (44 od ukupno 59 uzoraka) meĊu kojima i uzorak etarskog ulja biljne vrste Scandix balansae. Ova grupa je takoĊe najraznovrsnija u pogledu glavnih sastojaka ili klasa sastojaka u uzorcima etarskih ulja. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 163 Slika 4.2.15. Dendrogram ( HC analiza; kao varijable su korišćeni procenti sastojaka ulja (samo oni sastojci ulja koji su makar u jednom uzorku prisutni sa više od 1%)) predstavlja razlike u hemijskom sastavu 59 uzoraka etarskih ulja razliĉitih vrsta plemena Scandiceae (skraćenice su date u prilogu 8.2.82) dobivene na osnovu razlike u Euklidovoj (Euclidean) udaljenosti (razlike (dissimilarity) u intervalu [0-22000] Na osnovu dendrograma (slika 4.2.15), oĉigledno je da analizirane vrste iz rodova plemena Scandiceae ne ĉine monofiletsku grupu. Iako razliĉite vrste koje pripadaju istom rodu pokazuju tendenciju grupisanja (primeri za to se mogu naći meĊu razliĉitim taksonima rodova Athamanta, Geocaryum, Chaerophyllum, Scandix, Myrrhis, Anthriscus i Molopospermum) u nekoliko sluĉajeva uzorci etarskih ulja biljnih vrsta koje pripadaju istom rodu su bili klasifikovani u statistiĉki razliĉitim grupama (npr. uzorak ulja (Sc u4) biljne vrste Scandix australis je smešten u C1, dok su preostali uzorci (Sc Au1 – Sc Au3) grupisani u C3, kao i u sluĉaju ranije pomenutih vrsta roda Anthriscus (koje su se javljale u sve tri klade C1 – C3). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 164 Nedostatak primene pojedinaĉnih sastojaka kao MV varijabli je taj što statistiĉki aparat ne prepoznaje sliĉnosti izmeĊu uzoraka ulja sa razliĉitim, ali biosintetski povezanim sastojcima (npr. kamfor/borneol, trans-/cis-sabinen-hidrat, α/δ-kadinen itd; (Hyatt et al., 2007; Mahmoud et al., 2004; Radulović et al., 2009a). Jedan od pristupa rešavanju ovog problema je korišćenje modifikovanih podataka gde se kao varijable koriste klase identifikovanih sastojaka etarskih ulja (Radulović et al., 2007). Iz tog razloga smo odluĉili da ponovimo multivarijantnu analizu korišćenjem osam transformisanih varijabli (monoterpeni, seskviterpeni, diterpeni, fenilpropanoidi, green leaf metaboliti, benzaldehidi, alifatiĉni estri, masne kiseline i derivati dobiveni iz masnih kiselina). Korišćenjem ovog tipa varijabli je dobiven dendrogram dat na slici 4.2.16. Slika 4.2.16. Uvećanje (u intervalu [0-30000]) dendrograma (AHC analiza) dobivenog korišćenjem relativnih koliĉina klasa sastojaka (monoterpena, seskviterpena, diterpena, fenilpropanoida, green leaf metabolita, benzaldehida, alifatiĉnih estara, masnih kiselina i derivata masnih kiselina) 59 uzoraka etarskih ulja razliĉitih vrsta plemena Scandiceae (skraćenice su date u prilogu 8.2.82) dobivene na osnovu razlike u Euklidovoj (Euclidean) udaljenosti (razlike (dissimilarity) u intervalu [0-26000]) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 165 Grupisanje uzoraka u dendrogramu AHC2 se evidentno razlikovalo od grupisanja zapaţenog u dendrogramu AHC1, ali su na kraju obe AHC analize (AHC1 i AHC2) dovele do istog zakljuĉka, tj. da ne postoje znaĉajne razlike u profilu isparljivih metabolita biljnih vrsta iz razliĉitih rodova plemena Scandiceae. Iako su sliĉnosti izmeĊu isparljivih profila taksona plemena Scandiceae dovoljne da ukaţu na bliske odnose izmeĊu svih vrsta plemena Scandiceae i moţda ĉak dovoljne da opravdaju plemensku pripadnost svih rodova, analize izvršene korišćenjem drugih varijabli (morfoloških karakteristika, neisparljivih metabolita itd.) ukazuju na problematiĉne odnose unutar plemena Scandiceae. Prema Hejvudu (Heywood, 1971), koji je izvršio klasifikaciju na osnovu morfoloških karakteristika, rodovi Geocaryum i Molopospermum su bili ukljuĉeni u pleme Scandiceae. Nasuprot tome, Pimenov i Leonov (Pimenov i Leonov, 1993) preporuĉuju da ove rodove treba iskljuĉiti iz plemena Scandiceae. TakoĊe, Kalestani (Calestani, 1905) i Serso-Larival (Cerceau-Larrival, 1962) se slaţu da je rod Athamanta deo ovog plemena, dok Hejvud (Heywood, 1971), kao i Pimenov i Leonov (Pimenov i Leonov, 1993) imaju suprotno mišljenje. Rezultati nedavnog istraţivanja, ITS DN (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence) filogenetska analiza plemena Scandiceae, ukazuju da su rodovi Athamantha i Geocaryum ĉlanovi plemena, dok bi rod Molopospermum trebao biti iskljuĉen iz ovog plemena (Downie et al., 2000). Na prvi pogled, rezultati multivarijantne analize (dendrogrami AHC1 i AHC2) nisu podrţavali izdvajanje pomenutih rodova iz plemena Scandiceae. Umesto toga, velika sliĉnost izmeĊu uzoraka isparljivih metabolita biljnih vrsta rodova Athamanta, Geocaryum i Molopospermum sa uzorcima drugih taksona iz plemena Scandiceae je dodatno potvrdila da pomenuti rodovi pripadaju ovom plemenu. U cilju daljeg ispitivanja odnosa taksona u okviru plemena Scandiceae, ponovili smo statistiĉke analize korišćenjem većeg broja podataka koji ukljuĉuje i uzorke etarskih ulja predstavnika rodova van plemena Scandiceae. Za proširenje baze korišćeni su podaci o sastavu etarskih ulja 56 uzoraka taksona iz razliĉitih rodova familije piaceae koji je u nedavnom istraţivanju iskorišćen za odreĊivanje hemotaksonomskih odnosa podfamilije Saniculoideae (Radulović et al., 2012c). MeĊusobni odnosi uzoraka, dendrogram AHC1, bili su generalno uoĉljivi i na novom dobivenom dendrogramu (rezultati prvobitne AHC1 analize nisu promenjeni dodavanjem novih varijabli; slika 4.2.17). MeĊutim, uzorci biljnih vrsta predstavnika rodova van plemena Scandiceae su bili smešteni u iste klade kao i uzorci predstavnika taksona iz Scandiceae na osnovu ĉega se moţe zakljuĉiti da isparljivi metaboliti, ukljuĉujući i estre dugolanĉanih Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 166 alkohola, nisu pogodni za razgraniĉavanje razliĉitih rodova/plemena. Drugim reĉima, ĉini se da evolucija isparljivih metabolita taksona Scandiceae nije rod-specifiĉna i ne prati morfološku evoluciju. Umesto toga, individualni taksoni (pripadnici razliĉitih rodova/vrsta ili samo razliĉite populacije jedne vrste) su moţda evoluirali tako da su sposobni da ispune specifiĉne zahteve okoline (Croteau et al., 2000). Slika 4.2.17. Dendrogram ( HC analiza; procenti sastojaka ulja korišćeni kao varijable) predstavlja razlike u hemijskom sastavu 115 uzoraka etarskih ulja razliĉitih vrsta porodice Apiaceae (uzorci vrsta plemena Scandiceae su obojeni crveno, skraćenice uzoraka su date u prilogu 8.2.82) dobivene na osnovu razlike u Euklidovoj (Euclidean) udaljenosti (razlike (dissimilarity) u intervalu [0-25200]) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 167 4.2.7. Mikrobiološka aktivnost odabranih jedinjenja iz kombinatorne biblioteke Neki od estara dugolanĉanih alkohola identifikovanih u etarskim uljima biljnih vrsta S. pecten-veneris i S. balansae su ranije bili detektovani u sekretima insekata (tabela 4.2.2), što je ukazivalo na mogućnost da ovi estri imaju vaţnu biološku ulogu i u biljnom organizmu kao, na primer, u uspostavljanju odnosa izmeĊu jedinki odreĊene biljne populacije i/ili u odnosima biljaka sa drugim ĉiniocima njihove okoline. S obzirom na to da se isparljivi metaboliti koji imaju pomenutu ulogu najĉešće nalaze na površini biljnog materijala (na površini nadzemnih delova) odluĉili smo da izvršimo analizu dihlormetanskog ispirka nadzemnih delova biljne vrste S. pecten-veneris. naliza je pokazala da ispirak ne sadrţi, ĉak ni u tragovima, identifikovane estre kao ni glavne sastojke ulja što je ukazivalo na to da oni, verovatno, imaju neku drugu ulogu u biljnom organizmu. U cilju pronalaţenja njihove potencijalne uloge, imajući u vidu da su brojna istraţivanja potvrdila znaĉajnu mikrobiološku aktivnost sastojaka etarskih ulja (Radulović et al., 2012b), izvršili smo testiranje antimikrobne aktivnosti sintetisanih estara mikrodilucionom metodom prema preporukama instituta za kliniĉke laboratorijske standarde (Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI, 2007). Pored odabranih estara iz biblioteke (identifikovanih kao sastojci ulja analiziranih Scandix vrsta) testirani su i sintetisani estri 2- metilbutanske kiseline, etarsko ulje biljne vrste Scandix pecten-veneris i tridekan kao jedan od glavnih sastojaka etarskih ulja S. pecten-veneris i S. balansae. Uzorci su testirani na šest sojeva bakterija (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella enterica, Bacillus cereus, B. subtilis i Staphylococcus aureus) i dve vrste gljiva (Candida albicans i Aspergillus brasiliensis). Većina testiranih uzoraka je pokazala antimikrobnu aktivnost prema pomenutim mikroorganizmima, osim u sluĉaju bakterije Escherichia coli, pri ĉemu su vrednosti minimalne inhibitorne (MIC) i minimalne baktericidne/fungicidne koncentracije (MBC/MFC) bile u rasponu od 1,00 do 8,00 mg/ml (tabela 4.2.4). MeĊu testiranim uzorcima, najaktivniji je bio tridecil-3-metilbutanoat ([2c] MIC = 1,00 – 4,00 mg/ml (3,5 – 14,0 mmol/l) i MBC/MFC = 1,00 – 4,00 mg/ml (3,5 – 14,0 mmol/l)) dok je najmanju aktivnost pokazao heksadecil-3-metilbutanoat [2j]. 3-Metilbutanoati tetradekanola [2e], heptadekanola [2m] i oktadekanola [2q] su inhibirali rast samo po jednog mikroorganizma. Estri su pokazali veoma slabu aktivnost protiv testiranih gljivica sa relativno visokim MIC vrednostima (4,00 – 8,00 mg/ml (8,0 – 24,6 mmol/l)). MeĊutim, testiranje je pokazalo znaĉajnu inhibitornu aktivnost etarskog ulja S. pecten-veneris i sintetisanih estara prema bakteriji Bacillus cereus. Tri mikroorganizma (Escherichia coli, Salmonella enterica i Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 168 Aspergillus brasiliensis) su u potpunosti bili rezistentni na dejstvo etarskog ulja i estara ĉak i u najvećoj testiranoj koncentraciji. Moţe se zakljuĉiti da dobivena selektivna, slaba do umerena antimikrobna aktivnost ispitivanog ulja i estara dugolanĉanih alkohola pokazuje da identifikovani estri kao i ostali sastojci etarskih ulja S. pecten-veneris i S. balansae ne igraju znaĉajnu ulogu u odbrani biljnog organizma od mikroorganizama. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 169 Tabela 4.2.4. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Scandix pecten-veneris, tridekana i odabranih estara iz kombinatorne biblioteke – minimalna inhibitorna (MIC) i minimalna baktericidna/fungicidna koncentracija (MBC/MFC) Testirani uzorak Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Bacillus cereus Escherichia coli Proteus vulgaris Salmonella enterica Candida albicans Aspergillus brasiliensis ATCC 6538 ATCC 6633 ATCC 9139 ATCC 8739 ATCC 8427 ATCC 13076 ATCC 10231 ATCC 16404 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MFC MIC MFC mmol/l Tridekan NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT 21,7 21,7 NA NT Etarsko ulje a) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 NA NT NA NT NA NT 8,0 8,0 NA NT Tridecil-izobutanoat [2a] NA NT 29,6 NA 14,8 14,8 NA NT 29,6 29,6 NA NT NA NT NA NT Tridecil-2-metilbutanoat [2b] NA NT NA NT 14,1 14,1 NA NT 14,1 14,1 NA NT NA NT NA NT Tridecil-3-metilbutanoat [2c] NA NT 14,0 NA 7,0 7,0 NA NT 3,5 3,5 14,0 14,0 14,0 14,0 NA NT Tetradecil-izobutanoat [2d] NA NT NA NT 14,0 14,0 NA NT 14,0 14,0 NA NT NA NT NA NT Tetradecil-3-metilbutanoat [2e] NA NT NA NT 6,7 6,7 NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT Pentadecil-izobutanoat [2f] 26,8 26,8 NA NT 13,4 13,4 NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT Pentadecil-2-metilbutanoat [2g] NA NT NA NT 6,4 6,4 NA NT 12,8 12,8 NA NT NA NT NA NT Pentadecil-3-metilbutanoat [2h] NA NT NA NT 3,2 3,2 NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT Heksadecil-izobutanoat [2i] NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT 12,8 NA Heksadecil-3-metilbutanoat [2j] NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT Heptadecil-izobutanoat [2k] NA NT NA NT 12,3 12,3 NA NT NA NT NA NT 24,6 24,6 NA NT Heptadecil-2-metilbutanoat [2l] 23,6 NA NA NT 11,8 NA NA NT 23,6 NA NA NT NA NT NA NT Heptadecil-3-metilbutanoat [2m] NA NT NA NT 11,8 NA NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT Oktadecil-izobutanoat [2n] NA NT NA NT 23,6 NA NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT Oktadecil-3-metilbutanoat [2q] NA NT NA NT 22,6 22,6 NA NT NA NT NA NT NA NT NA NT AB * ) (MIC) mol/l 0,2 a 0,88 a 0,88 a 3,6 a 0,43 a 0,43 a 0,84 b 6,7 b a ) mg/ml; * ) AB–antibiotik/antimikotik (a-tetraciklin i b-nistatin) su korišćeni kao pozitivne kontrole. NA = uzorak nije aktivan. NT = uzorak nije testiran. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 170 4.3. Kombinatorna biblioteka alilmetoksifenil estara 4.3.1. Identifikacija nepoznatih sastojaka etarskog ulja biljne vrste Anthemis segetalis Matricaria chamomilla L. (nemaĉka kamilica) i Anthemis nobilis L. (syn. Chamaemelum nobile (L.) All; rimska kamilica), poznate pod zajedniĉkim narodnim imenom „kamiliceˮ, spadaju u grupu najstarijih, a pritom i dalje intenzivno korišćenih, medicinskih biljnih vrsta (Srivastava et al., 2010). Kamilice se preporuĉuju za leĉenje širokog spektra zdravstvenih problema i nalaze se na FDA (US Food and Drug Administration) i GRAS (Generally Recognized As Safe) listama (Srivastava et al., 2010). MeĊutim, mnoge druge vrste iz porodice steraceae (Compositae), od kojih su neke veoma toksiĉne npr. izazivaju alergije (Benner and Lee, 1973; Radulović et al., 2010), rastu na istim podruĉjima i mogu biti lako pogrešno botaniĉki identifikovane kao M. chamomilla ili A. nobilis od strane (neiskusnih) sakupljaĉa biljaka. TakoĊe je veoma vaţno istaći pogrešno mišljenje da svi taksoni koji su morfološki sliĉni rimskoj ili nemaĉkoj kamilici poseduju iste (i samo) pozitivne farmakološke karakteristike kao ove dve biljne vrste. Jedan od takvih primera je i Anthemis segetalis Ten. (syn. A. brachycentros J. Gay ex W.D.J. Koch, Cota brachycentros J. Gay, C. segetalis (Ten.) Holub). Anthemis segetalis (slika 4.3.1) je rasprostranjena biljna vrsta u jugoistoĉnoj Evropi (Italija i Balkansko poluostrvo (Vuĉković et al., 2010)) i pripada istom rodu kao i rimska kamilica (Anthemis nobilis). Slika 4.3.1. Izgled biljne vrste Anthemis segetalis Ten. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 171 U literaturi postoji veoma mali broj fitohemijskih studija ove biljne vrste (Radulović et al., 2009b; Vuĉković et al., 2010). Nedavno su ĉlanovi naše istraţivaĉke grupe izvršili detaljnu (GC i GC-MS) analizu sastava etarskog ulja nadzemnih delova A. segetalis (Radulović et al., 2009b), prilikom koje je detektovano 150 sastojaka, ukljuĉujući i tri jedinjenja identifikovana analizom masenih spektara, ali za koja nisu postojali dostupni literaturni podaci. U tom trenutku dostupni podaci su omogućili samo da se pretpostavi da su oni prirodno veoma retko zastupljeni estri nekog regioizomera alilmetoksifenola sa izomernim pentanskim i izomernim 2-pentenskim kiselinama (za detalje videti Radulović et al. (2009b)). Ĉak i u sluĉaju najpoznatijeg alilmetoksifenola - eugenola (4-alil-2-metoksifenola) nije bilo literaturnih MS i RI podataka, a dodatni problem sa identifikacijom takvih regioizomernih jedinjenja je taj što oni imaju veoma sliĉne masene spektre, a takoĊe bi se oĉekivalo da imaju i veoma bliske RI vrednosti. Iz tog razloga, konaĉna potvrda njihove strukture (identifikacije) nije mogla da se izvrši samo na osnovu MS/RI podataka (to se u sluĉaju nekih alilmetoksifenola, do sada, pokazalo pogrešnim ( li et al., 2000; Šmelcerović et al., 2007)). Za nedvosmislenu identifikaciju je bila potrebna i NMR analiza, kao i IR analiza, a što zahteva uzorke potpuno ĉistih jedinjenja. Naţalost, ova jedinjenja nisu mogla biti izolovana iz dobivenog uzorka etarskog ulja usled njihove male zastupljenosti u ulju (0,1 – 0,2%) i sloţenosti smeše (etarsko ulje sadrţi više od 150 sastojaka). Iz tog razloga, jedini logiĉni pristup je bio kreiranje sintetske kombinatorne biblioteke (o kreiranju biblioteke i sintezi estara više u poglavlju 4.3.2) estara regioizomera alilmetoksifenola, a zatim njihova GC-koinjekcija sa uzorcima etarskog ulja. Kombinacijom NMR, IR, MS, GC i GC-MS analiza, ukljuĉujući i kohromatografiju etarskog ulja i sintetisanih jedinjenja, utvrĊeno je da su prirodno zastupljeni estri (tj. sastojci etarskog ulja biljne vrste A. segetalis) eugenil-angelat [3i], eugenil-2-metilbutanoat [3f] i eugenil-3- metilbutanoat [3g] (slika 4.3.2). Pretragom literature je utvrĊeno da je eugenil-angelat [3i] potpuno novo jedinjenje koje je u ovoj analizi po prvi put detektovano kao biljni i/ili ţivotinjski metabolit. Pored toga, pretragom je utvrĊeno da je samo nekoliko estara regioizomera alilmetoksifenola do sada identifikovano u prirodi (Baranauskiene, 2007; Hendriks et al., 1977; Kollmannsberger et al., 2000; Lin et al., 1977; Tomczykowa et al., 2005). Kreiranjem GC-FID kalibracionih pravih, odreĊena je koliĉina ovih estara u sveţem biljnom materijalu: 0,22 mg (eugenil-2-metilbutanoat [3f]), 0,13 mg Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 172 (eugenil-3-metilbutanoat [3g]) i 0,21 mg (eugenil-angelat [3i]) na 100 g nadzemnih delova ove biljne vrste (tabela 4.3.1). Slika 4.3.2. Identifikovani eugenil estri iz etarskog ulja biljne vrste A. segetalis Tabela 4.3.1. GC-FID kvantifikacija eugenil estara iz etarskog ulja biljne vrste A. segetalis Jedinjenje C a Jednačina Korelacioni koeficijent (R 2 ) Sadrţajb Eugenil-angelat [3i] 1 – 0,0625 C = 2,2852 × 10 −4 A + 3,4047 × 10 −4 0,99979 0,21 Eugenil-3-metilbutanoat [3g] C = 1,5235 × 10 −4 A + 1,0342 × 10 −4 1,00000 0,13 Eugenil-2-metilbutanoat [3f] C = 1,3285 × 10 −4 A + 1,2342 × 10 −4 0,99986 0,22 a ) Opseg koncentracija (mg/ml), b ) Sadrţaj je izraţen kao mg estra u 100 g sveţih nadzemnih delova. 4.3.2. Dizajn i kreiranje biblioteke alilmetoksifenil estara Jedini naĉin za odreĊivanje strukture prethodno detektovanih metabolita iz ulja, za koje je GC-MS analizom pretpostavljeno da su to estri regioizomera alilmetoksifenola i izomernih pentanskih, odnosno pentenskih kiselina, bio je sinteza estara izomera alilmetoksifenola i pentanskih, odnosno pentenskih kiselina, a nakon toga njihova GC-koinjekcija sa uzorcima etarskog ulja. Iz tog razloga smo kreirali kombinatornu biblioteku od 54 estra (od kojih je 49 potpuno novih jedinjenja) devet (od mogućih 10) regioizomera alilmetoksifenola (slika 4.3.3) i izomernih pentanskih, odnosno 2-pentenskih kiselina (slika 4.3.4). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 173 Semimikro koliĉine estara [3f – 3k] i [8a – 8f] su dobivene direktno u procesu esterifikacije prirodno zastupljenih fenola – eugenola (4-alil-2-metoksifenola [3]), odnosno kavibetola (5-alil-2-metoksifenola [8]). Kao poĉetni materijal za sintezu ostalih derivata iz biblioteke [4-7f – 4-7k] i [9-11a – 9-11f] korišćeni su rezorcinol, katehol ili hidrohinon. Sintetska strategija (slika 4.3.4) je bila bazirana na ĉetiri razliĉite reakcije: bazno katalizovano metilovanje (i) i o-alilovanje poĉetnih fenola (ii), Klajzenovo premeštanje (iii) i Šteglihovu esterifikaciju (iv). Za dobivanje razliĉitih regioizomera korišćen je samo razliĉiti redosled ovih sintetskih koraka. Slika 4.3.3. Regioizomerni alilmetoksifenoli (3-alil-5-metoksifenol [Ph]* nije bilo moguće sintetisati korišćenim sintetskim pristupom) U sluĉaju serija derivata [4-7f – 4-7k] prvo smo pripremili sve izomerne O-alil-O- metilbenzendiole (reakcije (i) i (ii) na slici 4.3.4). Klajzenovim premeštanjem (premeštanje alil grupe u orto poloţaj; reakcija (iii) na slici 4.3.4), a zatim esterifikacijom (iv) su dobiveni ţeljeni Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 174 derivati. U sluĉaju drugih serija derivata [9-11a – 9-11f] odgovarajući benzendioli su podvrgnuti Klajzenovom premeštanju odmah nakon O-alilovanja. Na taj naĉin pripremljeni C- alilbenzendioli su prvo metilovani, a onda esterifikovani u sluĉaju derivata katehola [9a – 9f] i rezorcinola [10a – 10f] ili prvo esterifikovani, a onda metilovani u sluĉaju hidrohinona [11a – 11f]. Od dve slobodne fenolne grupe, onu koja je orto u odnosu na alil grupu (zbog sterne zaklonjenosti) je bilo mnogo teţe metilovati ili esterifikovati. Stoga, kada je dobiveni 2-alil-1,4- benzendiol prvo esterifikovan, a onda metilovan, glavni proizvodi su bili 3-alil-4-metoksifenil estri [11a – 11f]. Obrnutim redosledom sintetskih koraka (prvo metilovanje, a onda esterifikacija) su dobiveni 2-alil-4-metoksifenil estri [4f – 4k]. Naţalost, ovim sintetskim pristupom nije bilo moguće dobiti 5-alil-3-metoksifenol, odnosno njegove estre. Slika 4.3.4. Sinteza izomernih alilmetoksifenil-pentanoata, odnosno 2-pentenoata. (i) MeI, K2CO3, DMF, 24 h, sobna temperatura; (ii) alil-bromid, K2CO3, DMF, 24 h, sobna temperatura; (iii) 220 °C, 4 h, N2; (iv) RCOOH, DCC/DMAP, CH2Cl2, 24 h, sobna temperatura Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 175 Dobivena biblioteka estara (54 jedinjenja) omogućila je identifikaciju svih alilmetoksifenil estara iz etarskog ulja biljne vrste A. segetalis. MeĊutim, da bi prouĉili odnos strukture estara regioizomernih alilmetoksifenola i njihovih hromatografskih osobina, tj. omogućili njihovu identifikaciju i kada standardi jedinjenja nisu dostupni, proširili smo poĉetnu biblioteku derivata eugenola [3] i 4 njegovih regioizomera [4 – 7] sintezom njihovih estara sa homologom serijom od 13 n-kiselina (C1-C4 i C6-C10, C12, C14, C16, C18; slika 4.3.5). Slika 4.3.5. Sinteza alilmetoksifenil estara Pored eugenola, od 10 mogućih regioizomera alilmetoksifenola, odabrali smo seriju 2-alil izomera uz variranje poloţaja metoksi grupe na jezgru. Promena duţine n-alkil niza u kiselinskom delu je omogućila uporeĊivanje vrednosti retencionih indeksa (RI) susednih estara Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 176 iz serija (efekat uvoĊenja metilenske grupe na gasno-hromatografske osobine). TakoĊe, dopunjene poĉetne serije estara alilmetoksifenola su bile pogodne za ispitivanje veze retencionih indeksa estara izomernih alilmetoksifenola sa istim kiselinama s obzirom da ih je veoma teško razlikovati samo na osnovu masenih spektara. Pored estara n-kiselina izvršili smo i sintezu odgovarajućih izobutanoata [3-7d], oleata [3-7u], benzoata [3-7v] i salicilata [3-7w] sa ciljem utvrĊivanja uticaja uvoĊenja odreĊenih strukturnih fragmenata na RI vrednosti (raĉvanje alkil niza, nezasićenje ili uvoĊenje aromatiĉnog prstena u strukturu estara). Prinos estara (raĉunajući samo korak esterifikacije) je bio u opsegu 50 – 84%. Pretraţivanjem literature je utvrĊeno da 55 jedinjenja od 85 dodatnih estara predstavlja potpuno nova jedinjenja bez dostupnih spektralnih ili hromatografskih podataka. Iz toga sledi da kreirana biblioteka estara regioizomernih alilmetoksifenola od 139 estara sadrţi ukupno 104 potpuno nova jedinjenja ukljuĉujući i po prvi put detektovani sekundarni metabolit – eugenil-angelat [3i]. 4.3.3. Spektralna karakterizacija U masenim spektrima sintetisanih jedinjenja su uoĉene fragmentacije karakteristiĉne za alilmetoksifenole i odgovarajuću kiselinu i generalno su veoma sliĉne za sve korišćene fenole. Na primer, serije izomernih pentanoata su sadrţale molekulski jon ([M]+) na m/z 248 i osnovni jon na 164 [C10H12O2] + , dok je kod serija izomernih 2-pentenoata osnovni jon bio na m/z 83 [C5H7O] + (slika 4.3.6). Pored toga, odnos relativnih intenziteta fragmentnih jona u masenim spektrima izomernih estara su bili veoma sliĉni. Osnovni jon u masenim spektrima homologe serije estara alifatiĉnih n-kiselina (C1-C10, C12, C14, C16, C18), izobutanske i oleinske kiseline je bio na m/z 164 [C10H12O2] + . U masenim spektrima serije estara benzoeve i salicilne kiseline osnovni jon je bio na m/z 105 [C7H5O + ], odnosno 121 [C7H5O2 + ], redom. Pored MS, 1 H- i 13 C-NMR (sa potpunom asignacijom svih 1 H i 13 C signala) spektara, u eksperimentalnom delu (poglavlje 3.4.3.2) i prilozima (deo 8.3) prikazani su i IR i UV spektralni podaci za neke sintetisane alilmetoksifenil estre ([3f], [3g], [3i], [3j], [3k], [3n], [3v], [5h], [5k], [6h], [6k]). Potpuna asignacija 1 H i 13 C NMR signala (slike 4.3.7 i 4.3.8) je izvršena analizom 1D i 2D ( 1 H – 1H COSY (slika 4.3.9), HSQC (slika 4.3.10), HMBC (slike 4.3.11) i NOESY) spektara, a dobiveni rezultati su bili u saglasnosti sa predloţenim strukturama kao i sa literaturnim podacima za eugenil-2-metilbutanoat [3f], eugenil-3-metilbutanoat [3g] i eugenil- benzoat [3v] (Hendriks et al., 1977; Lin et al., 2007; Sadeghian et al., 2008). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 177 Slika 4.3.6. Maseni spektri eugenil-angelata (A) i eugenil-izovalerata (B) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 178 Slika 4.3.7. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar eugenil-angelata [3i] Slika 4.3.8. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar eugenil-angelata [3i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 179 Slika 4.3.9. 1 H – 1H COSY spektar eugenil-angelata [3i] Slika 4.3.10. HSQC spektar eugenil-angelata [3i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 180 Slika 4.3.11. HMBC spektar eugenil-angelata [3i] Spektri estara iz iste homologe serije (npr. serije [3], [5] ili [6]) su se razlikovali samo u singalima koji potiĉu iz kiselinskog dela dok su se uporeĊivanjem spektara estara razliĉitih alilmetoksifenola i istih kiselina (npr. uporeĊivanjem spektara jedinjenja [3k], [5k] i [6k]) uoĉavale samo razlike koje potiĉu od signala razliĉitih regioizomera alilmetoksifenola. Kao što se i oĉekivalo, signali protona iz alilnog spinskog sistema su imali ista hemijska pomeranja i oblik u spektrima svih estara eugenola ( = 5,10 – 5,13, 5,08 – 5,11 (protoni iz alkenskog dela alil grupe) i 3,37 – 3,41 ppm za protone iz metilenske grupe). Isti trend je bio prisutan i kod estara iz homologe serije [5] ( = 4,94 – 4,97, 4,93 – 4,95, 3,31 – 3,32 ppm) i [6] ( = 5,01 – 5,02, 5,00 – 5,01, 3,21 ppm), mada su signali bili malo pomereni ka višem polju. U sluĉaju svih estara, hemijsko pomeranje signala protona iz -OCH3 grupe je bilo 3,77 – 3,84 ppm dok su hemijska pomeranja signala protona aromatiĉnog jezgra fenola bila u opsegu 6,63 – 7,19 ppm. Ovakvo pomeranje protona ka jaĉem polju je bilo oĉekivano s obzirom da je benzenov prsten u korišćenim fenolima sadrţao dve elektron-donorske grupe (signali protona iz nesupstituisanog benzena se nalaze na 7,26 ppm u 1 H-NMR spektru). Upravo su razlike u obliku signala Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 181 (multipletnosti) i hemijskom pomeranju protona sa aromatiĉnog jezgra estara razliĉitih alilmetoksifenola omogućile njihovu potpunu asignaciju. Sa druge strane, razlike u kiselinskom delu estara istih alilmetoksifenola su nam omogućile razlikovanje estara 2-metilbutanske/3- metilbutanske/pentanske kiseline, odnosno senecio/tiglinske/angelika kiseline. Vaţno je napomenuti da jedino u sluĉaju eugenil-oktanoata upotrebom 1D i 2D (1H – 1H COSY, HSQC, HMBC i NOESY) NMR spektara nije bila moguća asignacija C15-C17 ugljenika i protona iz n- alkil (heptil) niza usled njihove velike sliĉnosti. 4.3.4. Veza strukture molekula i njihovih gasno-hromatografskih osobina (retencionih indeksa) Retencioni indeksi (DB-5MS kolona) svih sintetisanih izomernih pentanoata, odnosno 2- pentenoata su navedeni u tabeli 4.3.2. Iako su dobivene vrednosti retencionih indeksa obuhvatale veliki deo hromatograma (1700 – 1841 za izomerne pentanoate i 1725 – 1898 za izomerne 2- pentenoate), nekoliko grupa izomera je praktiĉno koeluiralo (npr. [7f], [7g] i [9a]; [8a], [6f] i [6g] ili [9c], [6i] i [9e]). Na osnovu dobivenih vrednosti RI, moţe se generalizovati da, bez obzira na korišćeni fenol, estri eluiraju sledećim redosledom sa DB-5MS kolone: 2- metilbutanoati ≈ 3-metilbutanoati < angelati < valerati < senecioati  tiglati (tabela 4.3.2) sa proseĉnim razlikama izmeĊu izomernih estara: ΔRI(isovalerati/2-metilbutanoati) = 5, ΔRI(valerati/izovalerati) = 50, ΔRI(senecioati/angelati) = 56 i ΔRI(tiglati/senecioati) = 4. Tabela 4.3.2. Vrednosti retencionih indeksa sintetisanih izomernih pentanoata, odnosno 2- pentenoata (DB 5-MS) 2-metilbutanoat (f) 3-metilbutanoat (g) pentanoat (h) angelat (i) senecioat (j) tiglat (k) 2-Alil-4-metoksifenil [4] 1760 1766 1815 1796 1851 1853 2-Alil-3-metoksifenil [5] 1726 1730 1779 1765 1812 1815 2-Alil-5-metoksifenil [6] 1746 1751 1801 1787 1842 1845 2-Alil-6-metoksifenil [7] 1700 1703 1749 1725 1773 1775 3-Alil-2-metoksifenil [9] 1705 1708 1754 1737 1787 1798 3-Alil-4-metoksifenil [11] 1781 1785 1841 1830 1897 1898 4-Alil-2-metoksifenil [3] 1761 1769 1816 1800 1857 1861 4-Alil-3-metoksifenil [10] 1768 1775 1830 1820 1885 1888 5-Alil-2-metoksifenil [8] 1753 1759 1808 1791 1853 1856 Oĉigledno je bilo da potpuna identifikacija i razlikovanje izomernih estara alilmetoksifenola nije moguća korišćenjem samo masenih spektara i vrednosti retencionih Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 182 indeksa usled njihove velike sliĉnosti. Iz tog razloga, rezultati nekih od prethodnih istraţivanja, gde su identifikovani estri eugenola kao sastojci etarskih ulja (samo na osnovu GC-MS analize), treba uzeti sa rezervom. Na primer, nedavno je eugenil-valerat identifikovan kao sastojak etarskog ulja biljne vrste H. perforatum (Šmelcerović et al., 2007), ali bez ikakve potvrde da se radi upravo o eugenolu kao jednom od 10 mogućih regioizomera alilmetoksifenola. Na osnovu vrednosti iz tabele 4.3.2, vrednosti retencionih indeksa koje su autori (Šmelcerović et al., 2007) naveli za eugenil-valerat (1832; DB-5MS kolona) se mnogo bolje slaţe sa vrednostima za 4-alil- 3-metoksifenil-valerat (1830, tabela 4.3.2). U jednom drugom sluĉaju ( li et al., 2000), odreĊena RI vrednost (GC kolona iste polarnosti kao i ona koja je bila korišćena u našoj GC analizi) za pretpostavljeni eugenil-valerat je 50 (!) jedinica niţa u odnosu na RI vrednosti većine analiziranih estara pentanske (valerijanske) kiseline iz tabele 4.3.2. Zato je od izuzetne vaţnosti, u cilju potvrde strukture ovih izomera, izvršiti dodatne strukturne analize (npr. NMR analiza izolovanog jedinjenja) ili ko-hromatografija uzorka etarskog ulja sa standardima jedinjenja. Nadamo se da će dobiveni MS i RI podaci pomoći da se olakša buduća identifikacija ovakvih derivata, minimizuje broj grešaka u identifikaciji i da će ovde otkrivene greške u prethodnim studijama usloviti povećanje opreznosti istraţivaĉa prilikom identifikacije sekundarnih metabolita koji bi mogli realno (biosintetski) da postoje kao veliki broj izomera. Pretragom literature je uoĉeno da su izomerni alilmetoksifenil pentanoati, odnosno 2- pentenoati generalno veoma retka jedinjenja. Isto se pokazalo i prilikom pretrage prisustva ostalih estara alilmetoksifenola (npr. formijata, acetata, propanoata itd.). Verujemo da je to posledica nepostojanja MS i RI podataka u literaturi, a što je uslovljavalo „zanemarivanjeˮ potencijalno detektovanih takvih sastojaka pri analizi etarskih ulja drugim fitohemijskim analizama. To nas je motivisalo, kao što je već navedeno, da proširimo poĉetnu biblioteku estara alilmetoksifenola. Uporednom analizom hromatogafskih osobina unutar homologih serija, kao i uporeĊivanjem homologih serija razliĉitih regioizomera alilmetoksifenola pokušano je da se uvede jednaĉina koja bi omogućila teorijsko predviĊanje retencionih indeksa ovih jedinjenja. Analizom dobivenih RI vrednosti u okviru svih homologih serija estara (tabela 4.3.3) je uoĉeno da jedinjenja sa manjim molekulskim masama (formijati, acetati, propanoati i butanoati) imaju manje pravilnu promenu retencionih indeksa izmeĊu susednih ĉlanova (57 – 63 jedinica za formijate/acetate i u opsegu 93 – 97 za acetate/propanoate/butanoate) u odnosu na heksanoate i više ĉlanove serija (ΔRI = 101 – 102). Ovo je verovatno posledica manje drastiĉne promene Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 183 strukture uvoĊenjem metilenskih grupa u jedinjenja C6 – C18 u odnosu na C1 – C4 (tj. prisustvo estarske grupe je imalo manji „doprinosˮ RI vrednosti u odnosu na alifatiĉni niz kod ĉlanova biblioteke sa većim molekulskim masama). TakoĊe, uporeĊenjem odnosa vrednosti retencionih indeksa i broja ugljenikovih atoma u n-alkil nizu kiselinskog dela estara homologih serija alilmetoksifenola [3 – 7] došlo se do jednaĉina (RI = 1304,84 + 101,05 x C za eugenil, RI = 1257,24 + 101,99 x C za 2-alil-3-metoksifenil, RI = 1304,12 + 100,96 x C za 2-alil-4- metoksifenil, RI = 1281,80 + 101,17 x C za 2-alil-5-metoksifenil i RI = 1229,24 + 101,14 x C za 2-alil-6-metoksifenil estre, gde je C bio ukupan broj atoma ugljenika u kiselinskom delu, a koeficijenti korelacije za sve jednaĉine su bili veći od 0,99), koje se mogu iskoristiti za predviĊanje RI vrednosti nepoznatih estara n-kiselina i alilmetoksifenola. Ove jednaĉine su se pokazale veoma korisnim za izraĉunavanje vrednosti retencionih indeksa u sluĉaju nepoznatih estara (npr. [3 – 7] undekanoata, tridekanoata, pentadekanoata itd.). Pored osnovnih jednaĉina koje ukljuĉuju samo broj ugljenikovih atoma u kiselinskom delu, odluĉili smo da kreiramo i jednaĉine koje ukljuĉuju i druge strukturne karakteristike molekula estara izraţene preko razliĉitih topoloških indeksa (u našem sluĉaju Vinerov (Wiener, 1947), Balabanov (Balaban, 1983) i molekulski topološki indeks (Schultz, 1989)). Korelacija pojedinih topoloških indeksa sa retencionim indeksima ili istovremeno dva indeksa sa RI vrednostima dobivane su jednaĉine sa nezadovoljavajućim predviĊanjima retencionih indeksa. MeĊutim, kombinacija sva tri topološka indeksa je dovela do jednaĉina (prilog 8.3.210) koje predviĊaju teorijske RI vrednosti sa veoma malom greškom od 0 – 11 jedinica (tabela 4.3.3). Nedostatak ovih jednaĉina je to što mogu da se koriste samo u okviru serija estara alilmetoksifenola. Iz tog razloga smo uvoĊenjem i ĉetvrtog parametra (broja ugljenikovih atoma u kiselinskom delu) pokušali da dobijemo univerzalnu jednaĉinu za izraĉunavanje vrednosti retencionih vrednosti estara svih mogućih regioizomera alilmetoksifenola. Rezultujuća jednaĉina (RI = 1217,3141 – 1,6284 x 10-4 x B – 0,6404 x MTI + 5,2455 x W + 68,4139 x C, gde je B, Balabanov indeks, MTI, molekulski topološki indeks, W, Vinerov indeks i C, ukupan broj ugljikovih atoma u kiselinskom delu), predviĊala je vrednosti retencionih indeksa sa malom greškom od 0 – 10 jedinica izuzev nekoliko estara kod kojih je greška bila 20 – 35 jedinica u poreĊenju sa eksperimentalnim RI vrednostima (slika 4.3.12). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 184 Tabela 4.3.3. Eksperimentalne i teorijske vrednosti retencionih indeksa alilmetoksifenil estara Eugenil 2-Alil-4- metoksifenil 2-Alil-3- metoksifenil 2-Alil-5- metoksifenil 2-Alil-6- metoksifenil [3] [4] [5] [6] [7] RI a RI b RI a RI b RI a RI b RI a RI b RI a RI b Formijat a 1457 1457 1454 1458 1432 1428 1451 1447 1413 1417 Acetat b 1519 1520 1517 1519 1489 1489 1514 1509 1470 1471 Propanoat c 1613 1614 1610 1613 1581 1582 1606 1600 1554 1555 Izobutanoat d 1654 1655 1652 1656 1625 1625 1647 1639 1595 1597 Butanoat e 1705 1705 1703 1704 1670 1671 1692 1689 1653 1653 2-Metilbutanoat f 1761 1761 1760 1762 1726 1726 1746 1743 1700 1701 3-Metilbutanoat g 1769 1769 1766 1768 1730 1731 1751 1748 1703 1704 Pentanoat h 1816 1816 1815 1817 1779 1780 1801 1798 1749 1749 Angelat i 1800 1801 1796 1801 1765 1766 1787 1778 1725 1727 Senecioat j 1857 1858 1851 1856 1812 1814 1842 1832 1773 1775 Tiglat k 1861 1862 1853 1859 1815 1816 1845 1834 1775 1778 Heksanoat l 1910 1910 1908 1909 1869 1870 1890 1887 1838 1838 Heptanoat m 2011 2011 2010 2011 1971 1972 1990 1988 1938 1938 Oktanoat n 2113 2113 2112 2113 2073 2074 2091 2088 2038 2038 Nonanoat o 2215 2215 2213 2214 2175 2176 2192 2189 2139 2139 Dekanoat p 2317 2317 2316 2316 2279 2280 2293 2290 2240 2241 Dodekanoat q 2518 2518 2517 2518 2480 2481 2494 2490 2441 2442 Tetradekanoat r 2721 2721 2719 2722 2685 2686 2699 2693 2645 2647 Heksadekanoat s 2923 2923 2921 2924 2891 2893 2901 2894 2844 2846 Oktadekanoat t 3121 3121 3118 3122 3092 3094 3103 3096 3054 3056 (Z)-9-Oktadecenoat u 3099 3099 3098 3101 3070 3071 3080 3073 3027 3029 Benzoat v 2124 2124 2120 2121 2089 2089 2102 2099 2058 2059 Salicilat w 2203 2203 2199 2202 2166 2166 2181 2175 2129 2131 RI a – Eksperimentalne vrednosti retencionih indeksa alilmetoksifenil estara (DB-5MS kolona). RI b – PredviĊene vrednosti retencionih indeksa. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 185 Pored navedenog, generalno, redosled eluiranja estara istih kiselina i razliĉitih alilmetoksifenola je bio: RI2-alil-6-metoksifenil estri < RI2-alil-3-metoksifenil estri < RI2-alil-5-metoksifenil estri < RI2- alil-4-metoksifenil estri < RI4-alil-2-metoksifenil estri. Slika 4.3.12. Korelacija vrednosti eksperimentalno dobivenih retencionih indeksa (RIE; DB-5- MS kolona) i izraĉunatih RI vrednosti (RIT) 4.3.5. Biološka/farmakološka aktivnost odabranih derivata iz biblioteke alilmetoksifenil estara Da bi utvrdili da li su alilmetoksifenil estri toksiĉni i/ili poseduju korisne farmakološke osobine, za odabrana jedinjenja iz biblioteke (eugenil-angelat [3i], eugenil-2-metilbutanoat [3f], eugenil-3-metilbutanoat [3g], eugenil-tiglat [3k], eugenil-senecioat [3j], 2-alil-3-metoksifenil- valerat [5h], 2-alil-3-metoksifenil-tiglat [5k], 2-alil-5-metoksifenil-valerat [6h] i 2-alil-5- metoksifenil-tiglat [6k]), testirana je njihova akutna toksiĉnost prema raĉićima (Artemia salina), citotoksiĉnost na netransformisanu (fibroblast, MRC5) i transformisanu (melanoma, A375) ćelijsku liniju. TakoĊe smo ispitivali njihovu inhibitornu aktivnost na acetilholinesterazu. Pored toga, motivisani prethodnim rezultatima o aktivnosti derivata eugenola (Pauli i Kubeczka, 2010), odluĉili smo da ispitamo i njihovu antibakterijsku aktivnost protiv odabranih bakterija (ukupno 17 Gram-pozitivnih i Gram-negativnih sojeva bakterija). Izbor jedinjenja za testiranje nije bio Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 186 sluĉajan. Jedinjenja [3k] i [3j] su testirana da bi se utvrdio uticaj razliĉite stereohemije dvostruke veze i poloţaj metil grupe (α ili ) u kiselinskom delu na biološku aktivnost alilmetoksifenil estara. Uporedo sa estrima iz biblioteke, testirali smo i poĉetne fenole (eugenol [3], 2-alil-3- metoksifenol [5] i 2-alil-5-metoksifenol [6]) da bi utvrdili kakav uticaj ima slobodna fenolna grupa na biološku aktivnost. 4.3.5.1. OdreĎivanje akutne toksičnosti Rezultati testiranja akutne toksiĉnosti su dati u tabeli 4.3.4. Više od polovine testiranih jedinjenja ([3k], [5h], [6h], [5k] i [6k]), ukljuĉujući i novi sekundarni metabolit iz etarskog ulja biljne vrste A. segetalis – eugenil-angelat [3i], nisu pokazali aktivnost u testiranim koncentracijama 0,005 – 0,05 mg/ml (veće koncentracije nisu mogle biti testirane zbog slabe rastvorljivosti jedinjenja u veštaĉkoj morskoj vodi). Ostala testirana jedinjenja (tabela 4.3.4) su pokazala slabu akutnu toksiĉnost. Tabela 4.3.4. kutna toksiĉnost metabolita iz etarskog ulja biljne vrste A. segetalis i strukturno srodnih jedinjenja Jedinjenje a Mortalitet b Mortalitet c LC40 d LC40 e Eugenol [3] 55,0 82,5 0,15 0,05 2-Alil-3-metoksifenol [5] 72,5 82,5 0,12 0,06 [3f] 62,5 92,5 0,12 <0,02 [3g] 55,0 80,0 0,16 0,04 [3j] 42,5 70,0 0,18 0,07 a ) U tabeli su prikazana samo jedinjenja aktivna u testiranim koncentracijama. b ) Mortalitet za koncentracije 0,05 mg/ml (0,30 mmol/l za fenole, odnosno 0,20 mmol/l za estre) u % nakon 24 h. c ) Mortalitet za koncentracije 0,05 mg/ml (0,30 mmol/l za fenole, odnosno 0,20 mmol/l za estre) u % nakon 48 h. d ) µmol/ml, nakon 24 h. e ) µmol/ml, nakon 48 h. Nekoliko jedinjenja, ĉak i u najvećoj testiranoj koncentraciji, uzrokovala su smrt oko 50% jedinki (npr. [3], [3f], [3g]) i iz tog razloga nismo mogli sa sigurnošću da izraĉunamo LC50. Umesto toga, izraĉunali smo LC40 vrednosti kako bi omogućili lakše meĊusobno uporeĊivanje toksiĉnosti testiranih jedinjenja, naroĉito uporeĊivanje toksiĉnosti estara i odgovarajućih fenola. Kao što se moţe uoĉiti iz tabele 4.3.4. sva jedinjenja su pokazala sliĉan stepen toksiĉnosti (LC40) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 187 prema raĉićima Artemia salina u intervalu 0,12 do 0,18 µmol/ml (nakon perioda inkubacije od 24 h), odnosno od 0,02 do 0,07 µmol/ml (nakon inkubacije od 48 h). 4.3.5.2. In vitro citotoksičnost (antiproliferativna aktivnost) Testirano je dejstvo odabranih jedinjenja iz kombinatorne biblioteke alilmetoksifenola ([3], [5] i [6]) i njihovih derivata ([3f], [3g], [3i], [3j], [3k], [5h], [5k], [6k] i [6h]) na proliferaciju netransformisane (MRC5) i transformisane (A375) ćelijske linije (slika 4.3.13). Sva testirana jedinjenja su pokazala citotoksiĉni efekat na obe ćelijske linije kada su bila primenjena u visokim koncentracijama (5 mg/ml). U ovoj koncentraciji, 4-alil-2-metoksifenil-3- metilbutanoat [3g] i 4-alil-2-metoksifenil-tiglat [3k] su pokazivali najslabiji antiproliferativni efekat. Ovi derivati su bili sposobni da inhibiraju 60% i 70% ćelijske proliferacije obe ćelijske linije. Kada su testirane 100 puta niţe koncentracije (50 μg/ml) citotoksiĉni efekat se smanjio što je potvrdilo koncentracijsku zavisnost citotoksiĉnosti. U koncentraciji od 50 μg/ml, jedinjenja [6], [3f], [3i] pokazivala su najveći citotoksiĉni efekat i inhibirala proliferaciju fibroblasta 50 – 60% i 20 – 40% u sluĉaju ćelija melanoma. Generalno, nije uoĉena selektivnost prema nekoj ćelijskoj liniji. S druge strane, primetan je bio znaĉajan stimulatorni efekat na in vitro proliferaciju ćelija melanoma kada su jedinjenja [6], [3g] ili [3j] dodata u medijum. Ova jedinjenja nisu pokazala citotoksiĉni efekat na ćelije fibroblasta. Ovako razliĉito dejstvo na in vitro proliferaciju ćelija je takoĊe zabeleţeno kada su kao test jedinjenja korišćene polinezasićene masne kiseline (Mollerup i Haugen, 1996). Na osnovu poĉetnih rezultata odabrana su tri jedinjenja sa najvećim citotoksiĉnim potencijalom (2-alil-5-metoksifenol [6], eugenil-2-metilbutanoat [3f] i eugenil-angelat [3i]) i odreĊena je njihova IC50 vrednost nakon 48 h inkubacije. U sluĉaju ćelija fibroblasta, za derivate [3f] i [3i] odreĊena je IC50 vrednosti od 50 μg/ml (200 μM), dok je IC50 za fenol [6] iznosila 200 μg/ml (1,2 mM). IC50 vrednost za eugenil- 2-metilbutanoat [3f] je iznosila 50 μg/ml (200 μM), za eugenil-angelat [3i] 60 μg/ml (244 μM), a za 2-alil-5-metoksifenol [6] 300 μg/ml (1,8 mM) u sluĉaju ćelija melanoma. Dobivene IC50 vrednosti su relativno visoke u odnosu na IC50 vrednosti poznatih citotoksika i ukazuju na slabu citotoksiĉnost testiranih derivata. Za eugenol [3], kao jedan od najpoznatijih alilmetoksifenola, ranije je potvrĊeno da izaziva apoptozu u masnim ćelijama (Park et al., 2005) i ćelijама HL-60 (Human promyelocytic leukemia cells) (Okada et al., 2005). Ranije odreĊene IC50 vrednosti za eugenol su bile u opsegu Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 188 od 20 do 130 μM za razliĉite ćelijske linije, a naĊeno je da on nema efekat na ćelije melanoma pri koncentraciji od 100 μM, ĉak i posle šest dana tretmana (Pisano et al., 2007). Naši rezultati ukazuju na to da je prisustvo eugenola u medijumu (u koncentraciji 300 μM) imalo veći uticaj na ćelije fibroblasta u odnosu na ćelije melanoma 375, što je u saglasnosti sa prethodno dobivenim rezultatima. Slika 4.3.13. Efekat eugenola, njegovih regioizomera i nekoliko odabranih estara na proliferaciju (a) fibroblasta MRC5 i (b) ćelija melanoma 375. Ćelije su tretirane sa 50 g/ml (■) i 5 mg/ml (□) supstance tokom 24 h Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 189 4.3.5.3. Inhibitorna aktivnost na acetilholinesterazu (AChE) Kao i u sluĉaju testiranja akutne toksiĉnosti (Artemia salina), pokazalo se da većina testiranih derivata iz biblioteke ne inhibira acetilholinesterazu. Ĉak i u najvećoj testiranoj koncentraciji, 0,16 mol/ml (40 g/ml), samo su eugenil estri angelika [3i], senecio [3j] i 2- metilbutanske kiseline [3f] pokazali izvestan efekat inhibirajući aktivnost acetilholinesteraze 35,4% [3i], 17,4% [3j] i 26,1% [3f]. 4.3.5.4. Antibakterijska aktivnost Za odabrane alilmetoksifenole i njihove estre je takoĊe bila testirana antibakterijska aktivnost prema 17 sojeva bakterija (ATCC sojeva, kao i kliniĉkih izolata ili izolata iz hrane). Generalno, sva jedinjenja su pokazivala znaĉajan antibakterijski potencijal sa MIC vrednostima u opsegu 0,0025 – 6,00 mg/ml (tabela 4.3.5). I Gram-pozitivni i Gram-negativni sojevi su pokazivali veoma sliĉnu osetljivost na testirana jedinjenja, gde su generalno TCC sojevi pokazivali nešto veću osetljivost u odnosu na odgovarajuće izolate. Rast sojeva Proteus mirabilis i Enterobacter cloacae je bio inhibiran prisustvom svih testiranih jedinjenja u medijumu. S druge strane najotporniji soj je bio Sarcina lutea. Ovo je bio veoma iznenaĊujući rezultat, jer su Gram- pozitivni sojevi generalno poznati po većoj osetljivosti u odnosu na Gram-negativne (Radulović et al., 2011). Najjaĉu antimikrobnu aktivnost su pokazali 2-alil-3-metoksifenol ([5]; MIC = 0,32 – 3,00 mg/ml (1,95 – 18,29 mmol/l); srednja vrednost svih MIC vrednosti = 0,87 mg/ml (5,30 mmol/l)), 2-alil-5-metoksifenil-tiglat ([6k]; MIC = 0,32 – 6,00 mg/ml (1,30 – 24,39 mmol/l); srednja vrednost svih MIC vrednosti = 1,08 mg/ml (4,39 mmol/l)) i eugenol ([3]; MIC 0,32 – 1,50 mg/ml (1,95 – 9,15 mmol/l); srednja vrednost svih MIC vrednosti = 1,16 mg/ml (7,07 mmol/l)). Eugenol je inhibirao rast svih testiranih sojeva bakterija (tabela 4.3.5) što je bilo i oĉekivano na osnovu prethodnih studija u kojima je pokazano jako antimikrobno dejstvo ovog alilmetoksifenola protiv širokog spektra mikroorganizama (Didry et al., 1994; Shapiro et al., 1994; Ali et al., 2005; Tippayatum & Chonhenchob, 2007; Qiu et al., 2010; Rico-Molina et al., 2012; El- bed et al., 2011). Što se tiĉe sekundarnih metabolita iz etarskog ulja nadzemnih delova biljne vrste A. segetalis, eugenil-angelat [3i], 2-metilbutanoat [3f] i 3-metilbutanoat [3g], su pokazali aktivnost samo na odreĊen broj bakterija (tabela 4.3.5). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 190 4.3.6. Veza strukture odabranih jedinjenja biblioteke i njihovih bioloških osobina (SAR) Razmatrajući strukturu derivata alilmetoksifenola i njihove biološke karakteristike (SAR) se moglo zakljuĉiti da su metoksi grupa, –OC(O)– (–OH u sluĉaju fenola) grupa i dvostruka veza iz alil grupe delovi farmakofore testiranih jedinjenja. Potencijalni farmakoforni trougao (zelene linije) najstabilnijeg (otimizovan na MMFF94 nivou teorije) konformera eugenil-2- metilbutanoata [3f] je prikazan na slici 4.3.14. Kao što se oĉekivalo, konformacije najniţih energija ostalih eugenil estara su bile uporedive sa onom [3f] izuzimajući kiselinski deo (ovo je bilo potvrĊeno preliminarnom pretragom konformacionog prostora testiranih jedinjenja). To nas je navelo na zakljuĉak da su duţine i uglovi farmakofornih trouglova takoĊe meĊusobno sliĉni. Drugim reĉima, u okviru podfamilije estara istog regioizomera alilmetoksifenola, razlike u biološkoj aktivnosti izmeĊu konkretnih estara su najverovatnije prouzrokovane 3D razlikama u kiselinskom delu molekula. Slika 4.3.14. Konformer eugenil-2-metilbutanoata [3f] sa najniţom energijom (MMFF94 nivo teorije; MarvinSketch 5.9.1; H-atomi nisu prikazani; O-atomi su prikazani crvenom bojom; C- atomi su prikazani sivom bojom; mogući farmakoforni trougao je prikazan zelenom bojom) . Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 191 Tabela 4.3.5. ntibakterijska aktivnost testiranih jedinjenja izraţena kao minimalna inhibitorna koncentracija (MIC; mmol/l) Bakterijski sojevi [3] [5] [6] [3f] [3g] [3i] [3j] [3k] [5h] [5k] [6h] [6k] S * C * Sarcina lutea ATCC 9431 9,15 > 36,60 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 0,67 < 0,07 Sarcina lutea izolat (hrana) 9,15 > 36,60 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 0,17 0,30 Staphylococcus aureus ATCC 6538 4,58 2,29 > 36,60 1,51 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 1,51 0,34 < 0,07 Staphylococcus aureus ATCC 25923 4,58 2,29 > 36,60 12,10 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 > 24,19 3,02 0,67 0,60 Staphylococcus aureus izolat (rana) 9,15 4,58 > 36,60 3,02 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 3,02 1,34 0,30 Proteus mirabilis ATCC 12453 4,58 2,29 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 12,10 > 24,19 > 24,19 > 24,19 3,02 1,34 0,30 Proteus mirabilis izolat (urin) 4,58 2,29 4,58 > 24,19 6,05 1,51 12,10 12,10 12,10 6,05 24,19 12,10 0,34 < 0,07 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 9,15 2,29 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 12,10 24,19 3,02 0,34 0,15 Enterobacter aerogenes izolat (rana) 9,15 2,29 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 1,51 0,17 0,30 Enterobacter cloacae izolat (rana) 4,58 2,29 9,15 0,76 24,19 6,05 24,19 6,05 24,19 6,05 24,19 24,19 0,17 0,30 Escherichia coli ATCC 8739 9,15 9,15 > 36,60 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 3,02 1,34 1,21 Escherichia coli izolat (feces) 9,15 9,15 > 36,60 12,10 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 > 24,19 3,02 1,34 2,41 Escherichia coli izolat (rana) 2,29 2,29 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 > 24,19 1,51 0,67 0,30 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 4,58 4,58 > 36,60 3,02 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 3,02 0,17 1,21 Klebsiella pneumoniae izolat (urin) 9,15 9,15 > 36,60 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 > 24,19 24,19 > 24,19 > 24,19 1,51 0,17 2,41 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9,15 9,15 18,30 1,51 1,51 > 24,19 > 24,19 > 24,19 3,02 24,19 24,19 1,51 1,34 2,41 Pseudomonas aeruginosa izolat (urin) 9,15 18,30 18,30 1,51 1,51 > 24,19 > 24,19 24,19 6,05 > 24,19 24,19 1,51 0,67 2,41 * ) S – Streptomicin, C – hloramfenikol; koncentracije antibiotika su izraţene u µmol/l. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 192 Nasuprot tome, pomenuti trougao se znaĉajno razlikuje kada se uporede oĉekivane farmakofore estara razliĉitih regioizomernih fenola (npr. [3] i [5]). U takvim sluĉajevima pokazana razliĉita biološka aktivnost je verovatno bila posledica razliĉitog rastojanja izmeĊu farmakofornih taĉaka. Pored toga, esterifikacija fenolne OH grupe znaĉajno povećava lipofilnost molekula što moţe biti jedan od znaĉajnijih uzroka razliĉite aktivnosti estara i odgovarajućih fenola (npr. eugenola i njegovih estara). U sluĉaju analize akutne toksiĉnosti (Artemia salina), ĉini se da kiselinski deo (zasićeni, raĉvasti alkil niz kod 2-metilbutanske i 3- metilbutanske kiseline) ima vaţan uticaj na aktivnost. TakoĊe, manja je toksiĉnost kada je metil grupa kiselinskog dela u -poloţaju u poreĊenju sa α poloţajem (tabela 4.3.4). Valerati, angelati i tiglati nisu bili toksiĉni. Eugenil-senecioat [3j] je bio najmanje toksiĉan od svih testiranih derivata dok je najveću toksiĉnost pokazao eugenil-2-metilbutanoat [3f]. Aktivnost eugenola [3] je bila neznatno manja u odnosu njegov estar (eugenil-2-metilbutanoat [3f]) kao i u odnosu na njegov regioizomer 2-alil-3-metoksifenol [5]. Kako je ranije pomenuto, ovo moţe biti posledica razliĉite orijentacije –OH, –OMe i alil grupa kod dva izomerna fenola. Rezultati testiranja in vitro citotoksiĉnosti su potpuno saglasni sa rezultatima testiranja akutne toksiĉnosti: [3f] je bio najaktivniji meĊu testiranim derivatima. UvoĊenje dvostruke veze u kiselinski deo i translokacija metil grupe sa α- na - ili -C atom su uslovljavale smanjenje citotoksiĉnosti na obe testirane ćelijske linije (fibroblasti i ćelije melanoma). TakoĊe je na osnovu rezultata bilo oĉigledno da je aktivnost fenola ([3], [5] i [6]) zavisila od meĊusobnog rastojanja i orijentacije –OH, –OMe i alil grupa i generalno je isti odnos postojao i kod estara istih kiselina i razliĉitih regioizomera alilmetoksifenola. Iako većina jedinjenja nije pokazala inhibirajuću aktivnost, rezultati testiranja uticaja na AChE su i dalje bili veoma interesantni iz SAR perspektive. Za razliku od eugenil- angelata koji je pokazao najveću aktivnost, preostala dva eugenil estra sa izomernim nezasićenim kiselinama (senecio i tiglinskom kiselinom) su pokazivali znatno slabiju ili ĉak zanemarljivu aktivnost. Pored toga, aktivnost eugenil-2-metilbutanoata je bila manja nego u sluĉaju angelata, dok njegov izomer (3-metilbutanoat) nije bio aktivan. Ovakvo ponašanje derivata je ukazivalo da prisustvo, poloţaj supstitucije i stereohemija dvostruke veze imaju vaţnu ulogu za pojavu i/ili izraţenost aktivnosti. Što se tiĉe antibakterijske aktivnosti serije derivata [3] i [5], fenoli su pokazivali veću i manje selektivnu aktivnost u odnosu na njihove estre, dok je suprotno vaţilo za seriju derivata [6] u kojoj su testirani estri (npr. [6f]) imali veću aktivnost u odnosu na fenol [6] koji je takoĊe imao veće MIC vrednosti u odnosu na regioizomerne alilmetoksifenole [3] i [5]. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 193 MeĊutim, ovako nepovoljan odnos (u sluĉaju antibakterijske aktivnosti) –OH, –OMe i alil grupa kod fenola [6] u tiglatu [6f] bio je kompenzovan uvoĊenjem novog strukturnog fragmenta - α,-nezasićenog karbonila tiglinske kiseline. Na osnovu ovih testiranja moţe se generalno zakljuĉiti da su eugenil estri prisutni u etarskom ulju biljne vrste A. segetalis slabo do umereno toksiĉni. Ukupna koliĉina pomenutih estara u 100 g sveţih nadzemnih delova je bila oko 0,55 mg. S obzirom da se biljne infuzije pripremaju ekstrakcijom nekoliko grama suvog biljnog materijala u oko 200 ml vode, to bi znaĉilo da jedna šolja ĉaja biljnog materijala vrste A. segetalis sadrţi najviše ukupno 1 g/ml eugenil estara. Uopšteno govoreći, u ovoj koncentraciji ovi estri nisu bili aktivni ni u jednom biološkom testiranju, pa je stoga razumno oĉekivati da njihovo prisustvo u etarskom ulju ne bi uticalo negativno na konzumenta. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 194 4.4. Kombinatorna biblioteka metil-(ferocenilmetil)acetoacetata i odgovarajućih benzil analoga 4.4.1. Dizajn i kreiranje biblioteke Znaĉajan broj biološki aktivnih derivata ferocena je, od otkrića ferocena do danas, sintetisan sa ciljem da se poboljšaju postojeće biološke osobine odgovarajućih fenil analoga i/ili umanje njihove neţeljene karakteristike (npr. smanji toksiĉnost, poveća metaboliĉka stabilnost). Postoji veliki broj sluĉajeva kada je došlo do povećanja biološke aktivnosti derivata koji su nastali kao rezultat formalne izmene fenil jezgra ferocenskim (Allardyce et al., 2005; Biot et al., 1997; Damljanović et al., 2009a; Damljanović et al., 2009b; Damljanović et al., 2012; Fouda et al., 2007; Ilić et al., 2010; Ilić et al., 2012; Jaouen et al., 2000; Neuse, 2005; Pejović et al., 2012a; Pejović et al., 2012b; Staveren i Metzler-Nolte, 2004), ali postoji mali broj studija u kojima se istovremeno ispituju i uporeĊuju derivati ferocena i njihovi fenil analozi. Naroĉito je oskudan broj radova o posledicama ovakve formalne izmene na antimikrobnu aktivnost (Arbi et al., 2011). Poslednjih nekoliko godina ĉlanovi naše istraţivaĉke grupe („OSA”) su izvršili sintezu znaĉajnog broja novih jedinjenja koja sadrţe ferocen od kojih su neka pokazala znaĉajnu aktivnost protiv patogenih mikroorganizama (Damljanović et al., 2009a; Damljanović et al., 2009b; Damljanović et al., 2012; Ilić et al., 2010; Ilić et al., 2012; Pejović et al., 2012a; Pejović et al., 2012b). Motivisani rezultatima Torozijana i njegovih saradnika (Torosyan et al., 1987), koji su utvrdili antibakterijsku aktivnost derivata 3-oksobutanske kiseline, odluĉeno je da se osmisli mala biblioteka derivata ove kiseline, polazeći od metil-3- oksobutanoata, koji u poloţaju 2 sadrţe ferocenil jezgro, kao i njihovih fenil analoga, a nakon toga da se testira njihova aktivnost protiv većeg broja razliĉitih sojeva patogenih (prema ĉoveku) mikroorganizama. Pored toga, dizajnirana biblioteka jedinjenja bi predstavljala odliĉnu polaznu taĉku za uporednu analizu spektralnih i hromatografskih osobina ovih analoga, kao i za sintezu mnogih drugih derivata korisnih, ne samo u farmaciji, već i u drugim granama nauke (katalize, organske sinteze, hemije materijala, itd.). Naš cilj je, takoĊe, bio i da utvrdimo kakav uticaj na pomenutu aktivnost ima i deo molekula bez ferocenil ili fenil jezgra zbog ĉega je odluĉeno da se sintetišu dva derivata metil-3- oksobutanoata koji ne sadrţe ferocenil ili fenil jezgro. Sintetski pristup koji je bio iskorišćen za sintezu ove biblioteke, a koja sadrţi dve serije derivata metil-3-oksobutanoata [12a – 12h] i [13a – 13h], predstavljen je na slici 4.4.1. Polazeći od ferocena i bis-(N,N-dimetilamino)metana dobiven je (N,N- Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 195 dimetilamino)metilferocen korišćenjem pristupa koji je prethodno detaljno opisan u istraţivanju Lednicera i Hauzera (Lednicer i Hauser, 1960). Nakon toga je u reakciji dobivenog (N,N-dimetilamino)metilferocena sa viškom metil-jodida dobivena kvaternerna amonijum so, (ferocenilmetil)trimetilamonijum-jodid ([(C5H5)Fe(C5H4CH2NMe3)] + I - ), u visokom prinosu (95%). Slika 4.4.1. Sinteza metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a – 12h] i metil-2-benzil-3- oksobutanoata [13a – 13h] (Reagensi: i) CH2(NMe2)2, H3PO4, CH3COOH; ii) višak CH3I; iii) CH3COCH2COOMe/NaOMe; iv) RX, K2CO3; v) CH3COCH2COOMe/ K2CO3) Natrijumova so metil-acetoacetata, dobivena dodavanjem stehiometrijske koliĉine elementarnog natrijuma u dioksanski rastvor metil-acetoacetata, podvrgnuta je reakciji (nukleofilna supstitucija) sa sintetisanim (ferocenilmetil)trimetilamonijum-jodidom i dobiven je metil-2-(ferocenilmetil)acetoacetat [12a] u prinosu od 85%. Drugi korak u sintezi ferocenil derivata biblioteke, alkilovanje, izvršen je reakcijom dobivenog metil-2- (ferocenilmetil)acetoacetata [12a] sa viškom odgovarajućeg alkil-halogenida u prisustvu anhidrovanog kalijum-karbonata. Odgovarajući 2,2-disupstituisani metil-acetoacetati [12a – 12h] su dobiveni u razliĉitom prinosu (39% – 84%), a prinos se oĉekivano smanjivao sa povećanjem duţine alkil niza. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 196 Na analogan naĉin, polazeći od benzil-hlorida i metil-acetoacetata, izvršena je i sinteza fenil analoga (metil-2-alkil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a – 13h]. Pored zamene fenil jezgra ferocenskim, odluĉeno je da se variraju i ostali delovi molekula. Promenom duţine lanca [12 i 13a, b i g], kao i uvoĊenjem supstituisane dvostruke veze (mono-, di- i trisupstituisane dvostruke veze [12 i 13d, e i f]) ţeleli smo da ispitamo kako ove promene u strukturi utiĉu na njegove biološke karakteristike. Pored toga, izvršena je i sinteza dva dodatna jedinjenja (metil-2-acetil-2-alil-4-pentenoata [14] i metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15]), koja ne zadrţe ni fenil niti ferocenil jezgro, u cilju utvrĊivanja bioloških karakteristika acetoacetatnog skeleta. Detaljnom pretragom literature je utvrĊeno da su sva sintetisana jedinjenja iz biblioteke metil-acetoacetata, izuzev [13a], [13b], [13h], [14] i [15] (Lee i Kim, 2002; Rafiee et al., 2011; Sankar et al., 2012; Wang i Tian, 1999), potpuno nova jedinjenja (ukupno 13). 4.4.2. Spektralna karakterizacija derivata metil-2-oksobutanoata Sintetisana jedinjenja [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15] su potpuno spektralno okarakterisana standardnim tehnikama (MS, IR, UV–Vis, 1H i 13C NMR (1D i 2D), ukljuĉujući i NMR spektre snimljene uz dodatak lantanidnog reagensa hemijskog pomeranja; prilozi 8.4.1 – 8.4.120). Svi dobiveni spektralni podaci su u potpunosti bili u skladu sa predloţenim strukturama kao i sa literaturnim podacima za poznata jedinjenja: [13a] (Rafiee et al., 2011), [13b] (Lee i Kim, 2002), [13h] (Sankar et al., 2012), [14] (Sankar et al., 2012) i [15] (Wang i Tian, 1999). U masenim spektrima su uoĉene fragmentacije karakteristiĉne za alkil supstituisani metil-acetoacetat, kao i za ferocenilmetil strukturni fragment (slika 4.4.2). Slika 4.4.2. MS fragmentacija benzil ili ferocenilmetil supstituisanih metil-acetoacetata (1) i fragmentacija karakteristiĉna samo za jedinjenja sa benzil grupom (2, 3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 197 Pored molekulskih jona [M +. ], koji su u isto vreme bili i osnovni joni (slika 4.4.3), maseni spektri jedinjenja [12a – 12h] su sadrţavali i jone visokog intenziteta na m/z 43 [CH3CO] + , 56 [Fe] + , 121 [C5H5Fe] + i 199 [C5H5FeC5H4CH2] + . Zanimljivo je da joni formirani gubitkom fragmenta [M - C5H5] + , koji su karakteristiĉni za jedinjenja koja poseduju ferocenil jezgro, nisu bili uoĉeni u masenim spektrima jedinjenja [12a – 12h], već su bili prisutni joni koji su rezultat istovremenog gubitka ciklopentadienil i CH3COC(R)COOCH3 fragmenata (slika 4.4.3), što je rezultiralo pojavom naoĉigled benzen-gvoţĊe kompleksa [FeC6H6] + . Na postojanje ovog kompleksa, takoĊe, ukazuje i pojava intenzivnog jona na m/z 199 za koji je pretpostavljeno da potiĉe od sendviĉ kompleksa gvoţĊa sa ciklopentadienilidnim anjonom i benzenom kao ligandima [C5H5FeC6H6] + . Slika 4.4.3. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Sa druge strane kod serije metil-acetoacetata koji sadrţe benzil grupu [13a – 13h], tropilijum jon (m/z 91) je predstavljao, izuzev kod jedinjenja [13a] i [13f], najintenzivniji jon u masenom spektru (slika 4.4.4). Zanimljivo je da neki od najdominantnijih jona, detektovanih u masenim spektrima svih jedinjenja iz serije benzil supstituisanih metil- Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 198 acetoacetata [13a – 13h], formiranih gubitkom acetil ili COOMe grupe, nisu detektovani kod jedinjenja iz serije metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a – 12h]. Slika 4.4.4. Maseni spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Glavna zajedniĉka odlika IR spektara svih metil-acetoacetata iz biblioteke (slika 4.4.5) su intenzivne trake na 1705 – 1715 cm-1 za [12a – 12h], odnosno 1710 – 1715 cm-1 za [13a – 13h], [14] i [15], koje se mogu pripisati vibracijama ketonske karbonilne grupe (C=O), i 1738 – 1751 cm-1 apsorpcija druge karbonilne grupe (COOMe). UV spektri svih ferocenil supstituisanih metil-acetoacetata [12a – 12h] su sadrţali dva apsorpciona maksimuma na pribliţno istim talasnim duţinama, 205 i 438 nm, dok su UV spektri fenil analoga [13a – 13h] sadrţali samo jedan apsorpcioni maksimum na oko 195 nm. Uz nekoliko izuzetaka, 1 H i 13 C rezonancije iz NMR spektara (snimljenih na 200 ( 1 H) i 50 ( 13 C) MHz) svih sintetisanih metil-acetoacetata su bile asignirane na osnovu integrala i multipletnosti signala, oĉekivanim efektima supstituenata i poreĊenjem dobivenih rezultata sa literaturnim podacima: [13a] (Rafiee et al., 2011), [13b] (Lee i Kim, 2002), [13h] (Sankar et al., 2012) i [14] (Sankar et al., 2012). U 1 H NMR spektrima jedinjenja [12a – 12h], široki singlet koji potiĉe od protona iz nesupstituisanog ciklopentadienil prstena ferocena se pojavljivao na gotovo istom hemijskom pomeranju, u intervalu 4,17 – 4,11 ppm. Zanimljivo je da se u spektrima sintetisanih jedinjenja [12a – 12h] pojavljivao razliĉit broj i oblik signala protona iz monosupstituisanog prstena ferocenil grupe, a ovakva pojava je verovatno bila Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 199 uslovljena razliĉitim anizotropnim efektom karbonilnih grupa. Ovim protonima je u 1H NMR spektru jedinjenja [12a] odgovarao samo široki signal na 4,06 – 4,01 ppm (integral od ĉetiri protona), dok su se u spektrima jedinjenja [12f] i [12g] javila tri multipleta (4,07 – 4,02 (2H), 4,01 – 3,96 (1H) i 3,96 – 3,91 (1H)), a spektri preostalih metil-acetoacetata ([12b – 12e] i [12h]) sadrţe dva multipleta (4,09 – 4,00 (3H) i 4,01 – 3,92 (1H)). Slika 4.4.5. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Sa druge strane, protoni sa fenil jezgra kod serije metil-acetoacetata [13a – 13h] su imali skoro ista hemijska pomeranja, u opsegu 7,32 – 6,90 ppm. Preostali signali u protonskom spektru koje su sadrţavala sva jedinjenja iz biblioteke su: singleti u intervalu 3,73 – 3,65 ppm (3H, COOCH3) i 2,18 – 1,93 ppm (3H, CH3CO), kao i AB multiplet signal drugog reda u intervalu 3,12 – 2,78 ppm (-CH2Fc) za [12c – 12f] i u intervalu 3,32 – 2,99 ppm (-CH2Ph) za [13d – 13g]. Pojava oĉekivanih signala u alifatiĉnom, karbonilnom, fenil i/ili ferocenil regionu 13 C NMR spektara svih sintetisanih jedinjenja je potvrdila strukturu sintetisanih ferocenil, fenil i dialkil supstituisanih metil-acetoacetata. U cilju rezolucije preklopljenih signala u protonskom NMR spektru jedinjenja [12b], [12d], [12f] i [13b], odluĉeno je da se ponovo snime 1H i 13C NMR spektri ovih jedinjenja na 400 (1H) i 101 (13C) MHz (tabela 4.4.1, slike 4.4.6 – 4.4.10). Pored 1D (1H i 13C), u cilju dodatne potvrde prethodne asignacije spektara metil-acetoacetata, snimljeni su i 2D NMR spektri (DEPT, 1 H– 1 H COSY (slika 4.4.8), HSQC (slika 4.4.9), HMBC (slika 4.4.10) i NOESY (tabela 4.4.2)). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 200 Slika 4.4.6. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] Slika 4.4.7. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 201 Tabela 4.4.1. 1 H i 13 C NMR spektroskopski podaci (400 ( 1 H) i 101 ( 13 C) MHz) za jedinjenja [12b], [12f], [12d] i [13d] [12b] [12f] [12d] [13d] 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1 2,12 (s, 3H) 26,5 2,06 (s, 3H) 27,3 2,08 (s, 3H) 27,5 2,13 (s, 3H) 27,5 2 / 205,4 / 205,1 / 204,5 / 204,2 3 / 61,1 / 65,0 / 65,1 / 64,9 4 / 173,0 / 172,4 / 172,1 / 171,1 5 3,72 (s, 3H) 52,2 3,70 (s, 3H) 52,0 3,72 (s, 3H) 52,1 3,72 (s, 3H) 52,1 6 3,04 (d, J = 14,1 Hz, 1H), 2,87 (d, J = 14,1 Hz, 1H) 36,0 3,02 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,96 (d, J = 14,5 Hz, 1H) 33,0 3,02 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,96 (d, J = 14,5 Hz, 1H) 33,0 3,26 (d, J = 14,1 Hz, 1H), 3,17 (d, J = 14,1 Hz, 1H) 37,8 2‟ i 6‟ / / / / / / 7,10 (d, J = 6,5 Hz, 2H) 129,9 1‟ / 82,4 / 82,3 / 82,0 / 136,2 3‟, 5‟, 4‟ / / / / / / 7,32–7,17 (preklopljeni signali, 3H) 126,9, 128,3 2‟ ili 5‟ 4,02 (dt, J = 2,5, 1,4 Hz, 1H) 69,6 3.97 (pseudo q, J = 1,8 Hz, 1H) 69,5 4,00 (dd, J = 3,1, 1,7 Hz, 1H) 69,5 / / 2‟ ili 5‟ / / 4,01 (pseudo q, J = 1,8 Hz, 1H) 69,7 4,05 (dd, J = 3,1, 1,7 Hz, 1H) 69,7 / / 3‟, 4‟ (i 2‟ ili 5‟ za [12b]) 4,07–4,02 (preklopljeni signali, 3H) 67,8, 67,9, 70,0 4,05 (pseudo t, J = 1,8 Hz, 2H) 67,8, 67,9 4,08 (dd, J = 3,1, 1,7 Hz, 2H) 67,9, 68,0 / / 1‟‟-5‟‟ 4,11 (široki s, 5H) 68,7 4,13 (široki s, 5H) 68,7 4,13 (široki s, 5H) 68,7 / / 1‟‟‟ 1,27 (s, 3H) 19,2 2,49 (široki d, J = 7,0 Hz, 2H) 30,5 2,55 (dt, J = 7,3, 1,2 Hz, 2H) 36,3 2,61 (široki d, J = 7,2 Hz, 2H) 36,2 2‟‟‟ / / 4,94 (t st, J = 7,0, 1,4 Hz, 1H) 117,7 5,64 (m, 1H) 132,5 5,78 (m, 1H) 132,3 3‟‟‟ / / / 135,3 cis-H 5,12 (m, 1H), trans-H 5,15 (m, 1H) 119,0 cis-H 5,14 (m, 1H), trans- H 5,18 (široki singlet, 1H) 119,2 4‟‟‟(cis sa CH2) / / 1,61 (široki d, J = 1,4 Hz 3H) 18,1 / / / / 5‟‟‟(trans sa CH2) / / 1,74 (pseudo q, J = 1,4 Hz, 3H) 26,0 / / / / Korišćene skraćenice: s-singlet, d-dublet, dd-dublet dubleta, dt-dublet tripleta, t st-triplet septupleta, m-multiplet, q-kvartet. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 202 Tabela 4.4.2. Uoĉene NOESY interakcije (400 MHz) za jedinjenja [12b], [12f], [12d] i [13d] 3b 3f 3d 4d H-1 H-1‟‟‟, H-5, H-6, H-2‟, H-5‟ H-5, H-6, H-2‟ or H-5‟ (δ = 4.01), H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-5‟‟‟ H-5, H-6, H-2‟ ili H-5‟ (δ = 4,05), H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟ H-5, H-6, H-2‟ ili H-6‟, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟ H-5 H-1, H-6, H-1‟‟‟ H-1, H-6, H-1‟‟‟, H-4‟‟‟, H-5‟‟‟ H-1, H-6, H-2‟ ili H-5‟ (δ = 4,05), H-1‟‟‟, H-2‟‟‟ H-1, H-6, H-2‟ ili H-6‟, H-3‟ i/ili H-4‟, H-5‟, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟(-cis) H-6 H-1, H-5, H-1‟‟‟, H-2‟, H-5‟ H-1, H-5, H-2‟, H-5‟, H-1‟‟‟, H- 2‟‟‟, H-4‟‟‟, H-5‟‟‟ H-1, H-5, H-2‟, H-5‟, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟(-trans) H-1, H-5, H-2‟ ili H-6‟, H-3‟ i/ili H-4‟, H-5‟, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟(-cis) H-2‟ ili H-5‟ (na niţem hemijskom pomeranju) H-1, H-6, H-1‟‟‟ H-6, H-1‟‟‟ H-6, H-1‟‟‟ / H-2‟ ili H-5‟ (na višem hemijskom pomeranju) / H-1, H-6, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-4‟‟‟, H-5‟‟‟ H-1, H-6, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟ / H-2‟ ili H-6‟ / / / H-1, H-5, H-6, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟ (-cis) H-3‟ i/ili H-4‟, H-5‟ / / / H-5, H-6, H-1‟‟‟ H-3‟, H-4‟ (i za 3b H-2‟ ili H-5‟) H-1, H-6, H-1‟‟‟ / / / H-1‟‟-H-5‟‟ / / / / H-1‟‟‟ H-1, H-5, H-6, H-2‟, H-5‟ H-1, H-5, H-6, H-2‟, H-5‟, H-2‟‟‟, H-4‟‟‟, H-5‟‟‟ H-1, H-5, H-6, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟, H-2‟, H-5‟ H-1, H-5, H-6, H-2‟ ili H-6‟, H- 3‟ i/ili H-4‟, H-5‟, H-2‟‟‟, H-3‟‟‟ H-2‟‟‟ / H-1, H-6, H-2‟ ili H-5‟ (δ = 4,01), H-1‟‟‟, H-5‟‟‟ H-1, H-5, H-6, H-2‟ ili H-5‟ (δ = 4,05), H-1‟‟‟, H-3‟‟‟(-cis) H-1, H-5, H-6, H-2‟ ili H-6‟, H- 1‟‟‟, H-3‟‟‟(-cis) H-3‟‟‟ / / H-3‟‟‟ (-cis): H-1, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟. H- 3‟‟‟ (-trans): H-1, H-1‟‟‟, H-6 H-3‟‟‟ (-cis): H-1, H-5, H-6, H- 2‟ ili H-6‟, H-1‟‟‟, H-2‟‟‟. H- 3‟‟‟ (-trans): H-1, H-1‟‟‟ H-4‟‟‟ / H-5, H-6, H-2‟ ili H-5‟ (δ = 4,01), H-1‟‟‟ / / H-5‟‟‟ / H-1, H-5, H-6, H-2‟ ili H-5‟ (δ = 4,01), H-1‟‟‟, H-2‟‟‟ / / Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 203 Slika 4.4.8. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Slika 4.4.9. HSQC spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 204 Slika 4.4.10. HMBC spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] U pokušaju da potvrdimo asignaciju signala supstituisanog ciklopentadienil prstena ferocena u jedinjenju [12b] kao i signala C2‟‟‟ i C3‟‟‟ protona u [12d] snimljeni su njihovi 1H NMR spektri na 400 MHz uz dodatak lantanidnog reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3 (tris(6,6,7,7,8,8,8-heptafluor-2,2-dimetil-3,5-oktandionat)europijum(III))). Kao što se moţe uoĉiti na slikama 4.4.11 i 4.4.12, hemijsko pomeranje protona se menjalo u zavisnosti od koliĉine dodatog reagensa (Eu(fod)3), što se objašnjava graĊenjem kompleksa derivata metil- acetoacetata [12b] sa katjonom europijuma (Eu 3+ ) iz (Eu(fod)3), gde usled njihove dipolarne (pseudokontaktne) interakcije (lokalne promene magnetnog polja) dolazi do promena hemijskih pomeranja protona (Akhmedov et al., 2010). Jedinjenja analizirana u eksperimentima sa dodatkom lantanidnog reagensa hemijskog pomeranja [12b] i [12d] su sadrţala dva potencijalna atoma za koje je moguća koordinacija europijuma (slobodni elektronski parovi na oba karbonilna kiseonika prisutna u acetoacetatnom delu molekula (slika 4.4.13)). Kompleksiranje predloţeno na slici 4.4.13 je potkrepljeno znaĉajnim promenama hemijskih pomeranja protona koji su bili u neposrednoj blizini karbonilne grupe i skoro zanemarljivim promenama u hemijskom pomeranju protona koji su bili udaljeni od karbonilnih grupa (npr. protoni iz nesupstituisanog prstena ciklopentadiena ferocenil grupe). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 205 Slika 4.4.11. a) 1 H NMR spektar jedinjenja [12b] snimljen u CDCl3 bez reagensa hemijskog pomeranja (1), a spektar (2) sa 4,2%, (3) sa 8,4% i (4) sa 12,6% Eu(fod)3 (izraţeno kao molski odnos reagensa hemijskog pomeranja i jedinjenja [12b]); b) Odgovarajuća uvećanja spektara jedinjenja [12b] u intervalu 3,70 – 4,30 ppm Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 206 Slika 4.4.12. a) 1 H NMR spektar jedinjenja [12d] snimljen u CDCl3 bez reagensa hemijskog pomeranja (1), a spektar (2) sa 4,2%, (3) sa 8,4% i (4) sa 16,8% Eu(fod)3 (izraţeno kao molski odnos reagensa hemijskog pomeranja i jedinjenja [12d]); b) Odgovarajuća uvećanja spektra pod a) jedinjenja [12d] u intervalima 3,6 – 4,7, 5,1 – 5,4 i 5,6 – 6,3 ppm Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 207 Slika 4.4.13. Predloţena struktura kompleksa Eu(fod)3 i metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata ([12b]; R = metil) ili metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-pentenoata ([12d]; R = alil) Povećanje koliĉine Eu(fod)3 je uslovilo pomak signala protona iz supstituisanog ciklopentadienil prstena ferocena (H-3‟, 4‟ i 2‟ ili 5‟) ka slabijem polju. Signali multipleta, iz NMR spektra jedinjenja [12b], na 4,02 i 4,05 ppm, dodatkom ovog reagensa su se pomerali ka slabijem polju i nakon dodatka 12 mg Eu(fod)3 su se transformisali u jedan multiplet na 4,28 ppm, što je bilo u skladu sa njihovom prethodnom asignacijom (H-2‟ i H-5‟ proton). Sa druge strane, multiplet koji potiĉe od H-3‟ i H-4‟ protona, sa poĉetnih 4,07 ppm, shodno oĉekivanju, se znatno sporije pomerao sa dodatkom Eu(fod)3 i, sa dodatih 12 mg Eu(fod)3, došlo je do preklapanja ovog multipleta sa singletom protona iz nesupstituisanog ciklopentadienilnog prstena ferocena. Kao u sluĉaju [12b], postepeno dodavanje Eu(fod)3 u uzorak [12d] je rezultiralo pojednostavljanjem njegovog protonskog spektra. Spinski sistemi višeg reda (multipleti na 5,12 i 5,15 ppm) jedinjenja [12d] koji su odgovarali protonima iz alil grupe (C-2‟‟‟ i C-3‟‟‟ protoni), dodatkom lantanidnog reagensa hemijskog pomeranja su transformisani u spinske sisteme prvog reda, tj. u dublet dubleta tripleta (H-2‟‟‟), dublet dubleta (trans-H-3‟‟‟ (u odnosu na H-2‟‟‟)) i dublet dubleta (cis-H-3‟‟‟ (u odnosu na H-2‟‟‟)) protone sa dodatkom 12 mg Eu(fod)3 reagensa. 4.4.3. Rendgenska strukturna analiza metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4- heksenoata [12f] Monokristal metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] je bio podesan za rendgensku strukturnu analizu (tabela 4.4.3). Analiza je pokazala da su ciklopentadienilni (Cp) prsteni jedinjenja [12f] u eklipsnoj konformaciji (slike 4.4.14 i 4.4.15). Torzioni ugao dela molekula C-12−Cg1−Cg2−C-17 iznosi −2,0° (Cg1 i Cg2 su centroidi odgovarajućih ciklopentadienidnih prstenova). Diedralni ugao izmeĊu Cp prstenova Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 208 u ferocenil grupi je iznosio 1,7(2)°. Rastojanje Fe−Cg za supstituisani prsten je 1,645 Å, dok je za nesupstituisani prsten to rastojanje bilo 1,651 Å. Tabela 4.4.3. Kristalografski podaci metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] [12f] Empirijska formula C21H26O3Fe Molekulska masa 382,27 Boja i oblik kristala Narandţast, prizma Veliĉina kristala (mm3) 0,20 x 0,16 x 0,13 Temperatura (K) 293(2) Talasna duţina (Å) 1,5418 Kristalni sistem Monokliniĉni Prostorna grupa P21/a Dimenzije jediniĉne ćelije a (Å) 9,6899(4) b (Å) 19,8839(7) c (Å) 10,6516(4) α (°) 90 β (°) 110,053(4) γ (°) 90 V (Å 3 ); zapremina jediniĉne ćelije 1927,86(13) Z (broj molekula po jediniĉnoj ćeliji) 4 Dcalc (Mg/m 3 ); izraĉunata gustina kristala 1,317 μ (mm-1) 6,394 θ opseg za prikupljanje podataka (°) 4,42 do 72,10 Sakupljene refleksije 6819 Nezavisne refleksije, Rint 3711; 0,0293 Iscrpnost (%) do θ = 67° 99,9 Metoda utaĉnjavanja full-matrix least-squares on F2 Podaci/ograniĉenja/parametri 3711/0/230 Faktor slaganja (goodness-of-fit) F 2 1,056 Konaĉni R1/wR2 faktori [I >2σ(I)] 0,0451/0,1116 Najveća razlika difrakcionog pika i rupe (largest diff. peak and hole; (eÅ -3 )) 0,347/−0,577 C-2 atom, koji zauzima centralno mesto u molekulu formira ĉetiri najduţe C−C veze u molekulu metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] (tabela 4.4.4). Duţine veza C-2−C-3 i C-3−C-11 su iznosile 1,55 Å, a što se moglo oĉekivati jer su i C-11 i C-3 sp 3 hibridizovani atomi. MeĊutim, C-3−C-2−C-11 ugao [112,8(2)°] je znaĉajno odstupao Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 209 od oĉekivanog ugla za tetraedarsku geometriju oko C-2 atoma (tabela 4.4.4). Najkraća C−C veza u molekulu je bila C-4−C-5 [1,319(4) Å] što se i oĉekuje od lokalizovane dvostruke veze. Tabela 4.4.4. Duţine (Å) i uglovi (°) odabranih veza u metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metil-4-heksenoatu [12f] [12f] duţine veza (Å) uglovi veza (°) O1−C1 1,186(3) C1−O2−C8 115,6(2) O2−C1 1,333(3) O1−C1−O2 124,1(2) O2−C8 1,443(3) O1−C1−C2 125,8(2) O3−C9 1,200(3) O2−C1−C2 110,04(19) C1−C2 1,529(3) C1−C2−C9 109,24(19) C2−C9 1,539(3) C1−C2−C11 108,75(19) C2−C11 1,548(3) C9−C2−C11 109,32(18) C2−C3 1,550(3) C1−C2−C3 107,78(19) C3−C4 1,501(3) C9−C2−C3 108,9(2) C4−C5 1,319(4) C11−C2−C3 112,82(19) C5−C6 1,494(4) C4−C3−C2 113,9(2) C5−C7 1,510(4) C5−C4−C3 126,6(3) C9−C10 1,503(4) C4−C5−C6 125,1(3) C11−C12 1,501(3) C4−C5−C7 120,4(3) C6−C5−C7 114,5(3) O3−C9−C10 121,0(2) O3−C9−C2 121,6(2) C10−C9−C2 117,3(2) C12−C11−C2 114,57(19) Svi atomi (bez atoma vodonika) koji su ĉinili fragmente, C-1−O-1−O-2−C-8 i C-3−C- 4−C-5−C-6−C-7, bili su skoro koplanarni (srednja vrednost kvadratne devijacije za ove dve ravni je bila 0,001 Å, odnosno 0,027 Å, a vrednost diedralnog ugla izmeĊu tih ravni: 60,4(1)°). Fragment, C-11−C-2−C-9−O-3−C-10, je takoĊe bio planaran (srednja vrednost kvadratne devijacije je bila 0,047 Å, a vrednosti diedralnog ugla sa C-1−O-1−O-2−C-8, odnosno sa C-3−C-4−C-5−C-6−C-7: 80,7(2)°, odnosno 66,7(1)°). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 210 Slika 4.4.14. Molekulska struktura (ORTEP prikaz, u elipsoidama sa 40% verovatnoće) metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] sa numeracijom atoma korišćenom pri strukturnoj analizi Slika 4.4.15. Projekcija metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] koja pokazuje eklipsnu konformaciju ciklopentadiena (software MERCURY je korišćen za pripremu slika) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 211 U kristalnoj strukturi metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] ne postoje klasiĉne vodoniĉne veze. Jedino veza (short contact) C-6−H-6b…O1i [simetrijski kod: (i) −x−1,−y, −z; C6…O1i, 3,609(4); H-6b…O1i, 2,67Å; C-6−H-6b…O1i, 167°] se moţe uzeti u obzir kao prisutna slaba vodoniĉna veza dok su ostale C−H…O interakcije imale veće H…O rastojanje i manji C−H…O ugao. Prisutna slaba vodoniĉna veza, C6−H6b…O1i, povezivala je molekule u centrosimetriĉni dimer kao što je prikazano na slici 4.4.16. Slika 4.4.16. Prikaz slabe vodoniĉne veze, C-6−H-6b…O-1i [simetrijski kod: (i) −x−1,−y, −z], koja povezuje molekule metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] u centrosimetriĉni dimer U nedavnom istraţivanju Bogdanović i Novaković (Bogdanović i Novaković, 2011) su utvrdili da skoro 60% kristalnih struktura koje sadrţe monosupstituisani ferocen (Fc) formiraju Fc-Fc dimer kao zajedniĉki gradivni blok. Formiranje ovog dimera se zasniva na odliĉnoj elektrostatiĉkoj komplementarnosti izmeĊu dve Fc jedinice koje su paralelno postavljene i u direktnom su kontaktu. Takva interakcija je bila prisutna i u kristalnoj strukturi metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metil-4-heksenoata [12f] i zajedno sa C6−H6b…O1i formira dvostruki lanac u kristalnoj rešetki (slike 4.4.17 i 4.4.18). Ovi lanci su bili meĊusobno povezani slabim C−H…π interakcijama sa ciklopentadienilnim prstenovima kao π-akceptorima C−H veza (slika 4.4.19). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 212 Slika 4.4.17. Interakcija dva jezgra ferocena (Fc-Fc) bazirana na elektrostatiĉkoj komplementarnosti izmeĊu dve ferocenil grupe (Bogdanović i Novaković, 2011). Fc-Fc dimeri su prikazani u dve ortogonalne projekcije Slika 4.4.18. Uĉešće nesupstituisanog Cp prstena u C−H…π interakcijama kao π-akceptor C- 10 metil grupe (isprekidanom plavom linijom su obeleţeni C…H kontakti sa rastojanjem manjim od 2,9 Å Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 213 Slika 4.4.19. Lanac (u dve projekcije) formiran postojanjem C-6−H-6b…O-1 slabih vodoniĉnih veza (slika 4.4.16) i Fc-Fc interakcija (slika 4.4.17) 4.4.4. Elektrohemijsko ispitivanje odabranih metil-acetoacetata koji sadrţe ferocensko jezgro Poznato je da je vrednost redoks potencijala ferocen/fericenijum katjon veoma vaţna za postojanje antimikrobnog potencijala derivata ferocena, naroĉito protiv gljivice Candida albicans (Ilić et al., 2012; Damljanović et al., 2009a). Iz tog razloga je odluĉeno da se izvrši elektrohemijska karakterizacija odabranih jedinjenja iz biblioteke koji sadrţe ferocen kako bi se stekao uvid u kojoj meri će vrednost/promena vrednosti redoks potencijala imati veze sa antimikrobnom aktivnošću jedinjenja iz biblioteke. Elektrohemijske osobine odabranih derivata ([12a], [12b], [12d], [12e], [12f] i [12h]) ispitivane su cikliĉnom voltametrijom u Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 214 acetonitrilu koji sadrţi 0,1 mol/l litijum-perhlorata kao elektrolita. Sva jedinjenja su podlegla redoks procesu na sliĉnom potencijalu (E1/2 = +364,5 do +392,0 mV, tabela 4.4.5). Tabela 4.4.5. Rezultati cikliĉne voltametrije Jedinjenje a Ep,a (mV) b Ep,c (mV) b Ep (mV) c E1/2 (mV) d Ip,a (A)e Ip,a (A)e Ip,a/Ip,c Ferocen 391 320 71 355,5 34,5 -32,16 1,073 [12a] 421 333 88 377 29,80 -32,19 0,926 [12b] 406 323 83 364,5 41,10 -37,02 1,110 [12d] 430 354 76 392 28,89 -27,43 1,053 [12e] 421 336 85 378,5 30,47 -28,62 1,065 [12f] 412 327 85 369,5 35,43 -34,11 1,039 [12h] 436 348 88 392 28,20 -26,70 1,056 a -Koncentracija jedinjenja: 5 mM; korišćeni elektrolit: LiClO4 (0,1 M) u acetonitrilu; frekvencija skeniranja:  = 100 mVs-1. b -Ep,a i Ep,c: pik anodnog, odnosno katodnog potencijala u odnosu na referentnu elektrodu (Ag/AgCl). c -Ep = Ep,a - Ep,c. d -E1/2 = ½(Ep,a + Ep,c). e -Ip,a i Ip,c: pik anodne, odnosno katodne struje. S obzirom na to da grupe koje su vezane za jezgro ferocena u derivatima [12a], [12b], [12d], [12e], [12f] i [12h] ne utiĉu na njegov -elektronski sistem, dobivene su oĉekivane vrednosti redoks potencijala koje su bile veoma sliĉne vrednosti redoks potencijala nesupstituisanog ferocena (tabela 4.4.5). Na slici 4.4.20 je predstavljen reprezentativni primer ciklovoltamograma jedinjenja iz biblioteke (konkretno za metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4- pentenoat [12d]). Slika 4.4.20. Ciklovoltamogrami jedinjenja [12d] (5 mM), ferocena (5 mM) i elektrolita (0,1 M rastvor LiClO4 u acetonitrilu) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 215 Razlike izmeĊu anodnog i katodnog potencijala su bile veoma blizu teorijskih vrednosti (tabela 4.4.5), pikovi anodne i katodne struje su bili proporcionalni kvadratnom korenu frekvencije skeniranja, a njihov odnos je bio nezavisan od brzine skeniranja što je ukazivalo na difuziono kontrolisan proces (slika 4.4.21). Slika 4.4.21. Katodna i anodna struja metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-pentenoata [12d] dobivena na razliĉitim frekvencijama skeniranja u acetonitrilu 4.4.5. Antimikrobna aktivnost sintetisanih jedinjenja iz biblioteke metil- acetoacetata In vitro antimikrobna aktivnost sintetisanih derivata metil-acetoacetata je ispitana na šest sojeva bakterija (tri Gram-pozitivna i tri Gram-negativna) i dve gljive korišćenjem mikrodilucione metode. Rezultati odreĊivanja MIC, MBC ili MFC vrednosti su prikazani u tabeli 4.4.6 kao proseĉne vrednosti tri ponavljanja. Samo su jedan soj bakterija (Bacillus cereus) i oba soja gljiva bili osetljivi na dejstvo svih ispitivanih jedinjenja. Jedinjenja iz biblioteke su imala inhibitorno dejstvo na rast mikroorganizama, pri ĉemu su MIC vrednosti bile u opsegu 0,0050 – 20,6 μmol/ml. U većini sluĉajeva MBC vrednosti su bile jednake MIC vrednostima ili dva puta veće. Gram-pozitivni bakterijski sojevi su bili najosetljiviji (naroĉito soj B. cereus) na dejstvo derivata metil-acetoacetata. Minimalna inhibitorna koncentracija za Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 216 metil-acetoacetate koji sadrţe ferocen [12a – 12h] je bila u opsegu 0,2 – 10,5 μmol/ml u sluĉaju Gram-pozitivnih sojeva bakterija, 1,4 – 9,9 μmol/ml za Gram-negativne sojeve, a 0,0050 – 11,7 μmol/ml u sluĉaju gljivica. Pored B. cereus, rast sojeva Staphylococcus aureus i Salmonella enterica je bio znaĉajno inhibiran prisustvom testiranih jedinjenja u medijumu, dok je najotporniji soj bio bakterija Escherichia coli. Od svih testiranih jedinjenja najveću antimikrobnu aktivnost su pokazali [12e] i [12a] inhibirajući rast svih testiranih sojeva (opseg aktivne koncentracije za [12e] je bio 0,0050 – 5,4 μmol/ml, a 3,2 – 6,4 μmol/ml za [12a]). Serija metil-acetoacetata [13a – 13h] koja sadrţi fenil umesto ferocenil grupe je generalno pokazala slabiju antimikrobnu aktivnost sa vrednostima minimalne inhibitorne koncentracije u opsegu od 0,30 do 16,3 μmol/ml. Korišćeni sojevi Gram-pozitivnih i Gram- negativnih bakterija su pokazali veoma sliĉnu osetljivost (Gram-pozitivne MIC = 1,7 – 9,7 μmol/ml i za Gram-negativne MIC = 6,9 – 16,3 μmol/ml) na testiranu seriju metil- acetoacetata [13a – 13h]. Kao i u sluĉaju metil-acetoacetata koji sadrţe ferocen [12a – 12h] i u sluĉaju fenil analoga, najosetljiviji su bili sojevi gljivica (MIC = 0,30 – 9,1 μmol/ml). Najmanje selektivnu aktivnost je pokazao derivat [13d] koji je inhibirao rast svih sojeva, ali u relativno visokim koncentracijama u opsegu 4,1 – 16,3 μmol/ml. Iako su MIC vrednosti veće u odnosu na seriju [12a – 12h], ova jedinjenja inhibiraju rast i onih mikroba na koje derivati koji sadrţe ferocen nisu bili aktivni, na primer inhibitorno dejstvo jedinjenja [12d] i [13d] na soj S. aureus. Najveću osetljivost na fenil derivate je pokazao soj C. albicans, dok su najveću otpornost pokazali sojevi bakterija E. coli i S. aureus. Sintetisani derivati metil-acetoacetata koji nisu posedovali fenil i/ili ferocenil jezgro [14] i [15] su pokazali relativno malu aktivnost sa višim vrednostima aktivnih inhibitornih koncentracija (u opsegu 5,0 – 20,6 μmol/ml). TakoĊe treba pomenuti da je metil-2-acetil-2- alil-4-pentenoat [14] bio najslabiji antimikrobni agens jer je inhibitorno delovao samo u najvećoj testiranoj koncentraciji od 4 mg/ml (20,6 μmol/ml), dok je metil-2-acetil-2- propilpentanoat [15] bio aktivniji i manje selektivan sa MIC = 5,0 – 10,0 μmol/ml (tabela 4.4.6). S obzirom da jedinjenja [14] i [15] nisu sadrţala ferocenil i/ili fenil jezgro, slaba aktivnost ovih derivata je pokazala da sam skelet metil-acetoacetata nema znaĉajan antimikrobni potencijal. Sa druge strane, ovi rezultati su nedvosmisleno potvrdili da prisustvo fenil i/ili ferocenil grupe višestruko povećava antimikrobnu aktivnost sintetisanih jedinjenja iz biblioteke u odnosu na nesupstituisani metil-acetoacetat. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 217 Tabela 4.4.6. Minimalna inhibitorna (MIC) i minimalna baktericidna (MBC)/fungicidna (MFC) koncentracija (μmol/ml) jedinjenja [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15] Bakterije Gljive Gram-pozitivne Gram-negativne Bacillus cereus Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Proteus vulgaris Salmonella enterica Aspergillus brasiliensis Candida albicans MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MFC MIC MFC [12a] 3,2 3,2 3,2 3,2 6,4 6,4 6,4 6,4 3,2 3,2 6,4 6,4 3,2 6,4 3,2 3,2 [13a] 9,7 9,7 9,7 9,7 / / / / 9,7 9,7 9,7 19,4 0,3 2,4 4,9 4,9 [12b] 0,8 1,5 / / 1,5 3,1 / / / / / / 1,5 6,1 1,5 3,1 [13b] 4,5 4,5 4,5 9,1 / / / / 9,1 9,1 9,1 18,2 1,1 9,1 9,1 9,1 [12c] 0,7 0,7 1,5 2,9 0,2 0,4 / / / / 1,5 2,9 2,9 11,7 0,2 0,7 [13c] 4,3 4,3 8,6 17,1 / / / / 8,6 17,1 8,6 8,6 4,3 17,1 4,3 4,3 [12d] 2,8 2,8 / / / / / / / / 2,8 5,7 5,7 / 0,2 0,7 [13d] 8,1 16,3 8,1 16,3 16,3 16,3 16,3 16,3 16,3 16,3 16,3 16,3 16,3 / 4,1 4,1 [12e] 1,4 2,7 1,4 2,7 0,2 0,3 5,4 5,4 2,7 5,4 1,4 5,4 1,4 5,4 0,005 0,1 [13e] 3,9 7,7 7,7 15,4 / / / / 7,7 15,4 7,7 7,7 1,9 7,7 1,9 3,9 [12f] 5,2 5,2 / / 10,5 10,5 / / / / / / 10,5 / 0,3 1,3 [13f] 14,6 14,6 14,6 14,6 / / / / 14,6 14,6 14,6 14,6 14,6 / 7,3 14,6 [12g] 1,3 2,5 / / / / / / / / / / 2,5 10,1 0,6 1,3 [13g] 6,9 6,9 6,9 6,9 / / 6,9 13,8 / / 6,9 6,9 6,9 13,8 3,4 6,9 [12h] 1,2 2,5 / / 2,5 4,9 / / / / 2,5 9,9 2,5 9,9 1,2 2,5 [13h] 1,7 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 / / 3,4 6,8 3,4 6,8 3,4 13,6 1,7 6,8 [14] 20,6 / 20,6 / / / 20,6 / 20,6 / 20,6 / 20,6 / 20,6 20,6 [15] 10,0 20,0 / / / / / / 10,0 20,0 10,0 20,0 10,0 / 5,0 10,0 AB * 0,9 a 0,9 a 0,2 a 3,5 a 0,4 a 0,4 a 6,7 b 0,8 b * AB – antibiotici (a-tetraciklin i b-nistatin; nmol/ml) korišćeni kao pozitivne kontrole. / – jedinjenje nije aktivno. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 218 Najznaĉajniji rezultat koji je otkriven ovim testiranjem je velika osetljivost sojeva gljivica na metil-acetoacetate koji sadrţe ferocen [12a – 12h] (npr. MIC [12e] = 5 nmol/ml u sluĉaju C. albicans). Ovi rezultati su jasno pokazali da se sintetisani derivati metil- acetoacetata (naroĉito [12e]) mogu potencijalno iskoristiti u leĉenju kandidijaze (Biot et al., 2002) (antifungalna aktivnost metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metil-4-pentenoata [12e] je uporediva sa aktivnošću komercijalno dostupnog antifungalnog leka – nistatina, tabela 4.4.6). PoreĊenje većeg broja podataka koji se odnose na veći broj opservacija i varijabli (u ovom sluĉaju serija derivata metil-acetoacetata je predstavljala opservacije dok je njihova antimikrobna aktivnost predstavljala varijable) se najĉešće vrši korišćenjem multivarijantne statistiĉke analize (npr. aglomerativno hijerarhijsko klasterovanje – AHC (Berrazeg et al., 2013; Damljanović et al., 2009a; Pejović et al., 2012b)). U cilju klasifikacije testiranih jedinjenja na osnovu njihove pokazane antimikrobne aktivnosti izvršili smo HC analizu korišćenjem dobijenih MIC vrednosti derivata [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15] protiv šest sojeva bakterija i dva soja gljiva (tabela 4.4.6) kao varijabli. Dobiveni dendrogram AHC analize je predstavljen na slici 4.4.22. Aglomerativno hijerarhijsko klasterovanje (AHC) je pokazalo prisustvo tri grupe jedinjenja (C1 – C3; skraćenice korišćenih derivata su date u tabeli 4.4.6). Grupa C1 je sadrţala dve odvojene podgrupe od kojih jedna sadrţi samo derivate sa fenil grupom ([13a], [13b], [13c] i [13e]) i veoma je bliska drugoj podgrupi koja sadrţi samo dva derivata metil- acetoacetata [14] i [15]. Zajedniĉka osobina ovih derivata ([13a], [13b], [13c] i [13e]) je nepostojanje aktivnosti u sluĉaju sojeva S. aureus i E. coli. Jedinjenja iz druge podgrupe iz C1, pored rezistentnosti dva pomenuta soja bakterija na njihovo dejstvo, ne inhibiraju rast i soja B. subtilis. U poreĊenju sa [14] i [15], jedinjenja [13a], [13b], [13c] i [13e] imaju niţe MIC vrednosti (5,0 – 20,6 μmol/ml) za sve sojeve prema kojima su pokazali aktivnost što je potvrdilo da prisutno aromatiĉno jezgro (fenil grupa) igra vaţnu ulogu u pokazanoj antimikrobnoj aktivnosti sintetisanih metil-acetoacetata. Klasa C2 je sadrţavala 5 jedinjenja (od kojih ĉetiri sadrţe ferocensku ([12a], [12c], [12e] i [12h]) i jedan derivat sa fenil grupom [13h]) koja su bila najaktivnija protiv svih testiranih sojeva bakterija i gljivica (npr. MIC vrednosti u sluĉaju gljivice C. albicans su bili 5 nmol/ml). Ova klasa je bila dodatno podeljena na dve podklase, od kojih je prva sadrţavala jedinjenja sa najvećom aktivnošću ([12a] i [12e]) dok je druga sadrţavala metil-2- (ferocenilmetil)-2-etil-3-oksobutanoat [12c], metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoat [13h] i metil- 2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoat [12h]. Preostala jedinjenja su bila rasporeĊena u dve podklase grupe C3 od kojih je jedna sadrţavala samo derivate sa ferocenil grupom, a Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 219 druga derivate sa fenil grupom ukljuĉujući i jedan ferocenil derivat (metil-2-acetil-2- (ferocenilmetil)-4-pentenoat [12d]). Bilo je razumno oĉekivati da veliĉina molekula koji imaju istu farmakoforu utiĉe na stepen interakcije sa ciljnim biomolekulima testiranih (mikro)organizama što je i uslovilo grupisanje derivata koji sadrţe ferocensko jezgro i njihovih fenil analoga izmeĊu, i unutar, klasa dobijenih AHC analizom. Slika 4.4.22. Dendrogram (AHC analiza) razlika antimikrobne aktivnosti (MIC vrednosti jedinjenja [12a – 12h], [13a – 13h], [14] i [15] protiv šest bakterijskih sojeva i dva soja gljiva) 18 jedinjenja iz biblioteke metil-acetoacetata dobivene na osnovu razlike u Euklidovoj (Euclidean) udaljenosti korišćenjem agregacionog kriterijuma - Vardova (Ward) metoda Na osnovu dobivenog dendrograma (slika 4.4.22) bilo je evidentno, manje ili više homogeno, grupisanje jedinjenja koja sadrţe ferocenil ili fenil grupu i koja pokazuju razliĉitu biološku aktivnost. Generalno, dobiveni rezultati (tabela 4.4.6, slika 4.4.22) su jasno pokazali uticaj formalne zamene fenil grupe ferocenskom na biološku (u ovom sluĉaju antimikrobnu) aktivnost aromatiĉnih jedinjenja. Pored toga, u našem sluĉaju je uvoĊenje ferocenske umesto Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 220 fenil grupe uĉinilo jedinjenja aktivnijim antimikrobnim agensima. TakoĊe je, makar u sluĉaju testiranih mikroorganizama, pokazano da su derivati koji sadrţe fenil grupu [13a – 13h] aktivniji od dialkil supstituisanih derivata ([14] i [15]). Drugi i mnogo vaţniji (svakako mnogo primenjiviji) rezultat ovog testiranja antimikrobne aktivnosti je bio taj što su se derivati metil-acetoacetata pokazali kao veoma efektni inhibitori rasta soja C. albicans. Opšte je poznata ĉinjenica da hemohromatoza predstavlja ozbiljan faktor rizika za pojavu kandidijaze, kao i da je rast vrsta Candida inhibiran nedostatkom gvoţĊa u organizmu (Biot et al., 2000). U sluĉaju jedinjenja iz biblioteke, ĉini se da gvoţĊe iz ferocenskog jezgra nije dostupno za gljivice, meĊutim, neki autori predlaţu da je antifungalna aktivnost jedinjenja koja sadrţe ferocen posledica povećanja koncentracije Fe3+ jona (Swarts et al., 2001). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 221 5. ZAKLjUČAK Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 222 Pretragom literature je uoĉeno da je kombinatorni (sintetski) pristup do sada iskorišćen samo u nekoliko sluĉajeva za identifikaciju sekundarnih metabolita biljaka (Berger et al., 1999; Khan et al., 1999; Radulović et al., 2013b; Vermeulen et al., 2001; Vermeulen et al., 2003; Vermeulen i Collin, 2002; Vermeulen i Collin, 2003). U pomenutim istraţivanjima prikazane su pozitivne strane korišćenja ovog pristupa; pored identifikacije novih jedinjenja, kreirane biblioteke su pruţile i mogućnost ispitivanja odnosa strukture i biološke/farmakološke aktivnosti sintetisanih derivata. Rezultati ove doktorske disertacije, tj. kreirane sintetske kombinatorne biblioteke u toku njene izrade, nedvosmisleno su potvrdile sve prednosti ovog pristupa, naroĉito kod identifikacije sastojaka prisutnih u malim koliĉinama u etarskim uljima. Uspešnost primene ovog pristupa se ovde pokazala stoprocentnom: uspešno su identifikovani svi prirodni proizvodi koje nije bilo moguće identifikovati uobiĉajenim izolaciono-identifikacionim pristupom. Identifikovani su novi sekundarni metaboliti biljnih vrsta Achillea falcata L. ((1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijat i tiglat), Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl ((1R*,3S*,5R*)- sabinil-formijat, tiglat, nonanoat i dekanoat), Scandix balansae Reut. ex Boiss. (oktadecil- valerat), Scandix pecten-veneris L. (estri izobutanske kiseline i n-C15, C17, C21 i C23 alkohola, kao i estri izovalerijanske kiseline i n-C13, C15 i C17 alkohola) i Anthemis segetalis Ten (eugenil-angelat, 2-metilbutanoat i 3-metilbutanoat). TakoĊe je dokazano da je kombinatorni sintetski pristup, iako je bio vremenski zahtevniji, u znaĉajnoj prednosti u odnosu na ĉešće korišćeni izolaciono-identifikacioni pristup, jer su prirodni proizvodi i srodna jedinjenja dobivani (sintetisani) u koliĉinama koje su omogućile potpunu spektralnu karakterizaciju jedinjenja i ispitivanje odabranih bioloških/farmakoloških aktivnosti. Kao dokaz toga predstavlja ĉinjenica da je utvrĊena biološka aktivnost predstavnika svake od kreiranih sintetskih biblioteka: antinociceptivna aktivnost i inhibicija aktivnosti acetilholinesteraze jedinjenja iz biblioteke estara (1R*,3S*,5R*)-sabinola, antimikrobna aktivnost jedinjenja iz biblioteke estara dugolanĉanih alkohola i (izo)butanske i (izo)pentanskih kiselina, kao i akutna toksiĉnost, citotoksiĉnost, inhibicija aktivnosti acetilholinesteraze i antimikrobna aktivnost prirodnih eugenil estara i odabranih regioizomera biblioteke estara alilmetoksifenola. Primena ovog pristupa je omogućila uporeĊivanje biološke aktivnosti serija analoga, u našem sluĉaju uporeĊivanje biološke aktivnosti alkil supstituisanih metil-2-(ferocenilmetil)acetoacetata i njihovih benzil supstituisanih analoga. Uoĉeno je da jedinjenja iz biblioteke poseduju širok opseg aktivnosti, od neaktivnih jedinjenja do onih koja su veoma aktivna sa MIC vrednostima u opsegu 0,0050 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 223 – 20,6 μmol/ml, kao i da znaĉajno veću aktivnost pokazuju metil-acetoacetati koji sadrţe ferocensko jezgro. Na kraju, interesantno je napomenuti da je za sva testirana jedinjenja (testirano je 50 od ukupno 189 sintetisanih jedinjenja), pokazano da poseduju neku vrstu aktivnosti od kojih najveći farmakološki potencijal i, u budućnosti moguću farmakološku primenu, imaju estri (1R*,3S*,5R*)-sabinola (formijat, acetat, tiglat i senecioat). Maksimalna antinociceptivna aktivnost je zabeleţena nakon 15 minuta od davanja ovih jedinjenja ţivotinjama, npr. efekat (1R*,3S*,5R*)-sabinola u tom vremenu je dva puta veći od efekta morfina. Metil-2-acetil-2- (ferocenilmetil)-4-metil-4-pentenoat poseduje antifungalnu aktivnost prema soju Candida albicans, a koja je bila uporediva sa aktivnošću nistatina. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 224 6.1. IZVOD Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 225 U doktorskoj disertaciji pod nazivom „Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara“ prikazana je identifikacija i sinteza odabranih (prirodnih) estara koja je sprovedena korišćenjem kombinatornog sintetskog pristupa. U ovu svrhu su kreirane tri kombinatorne biblioteke sa ukupno 171 jedinjenjem od kojih je 121 bilo potpuno novo jedinjenje. TakoĊe, u ovoj disertaciji je prikazana i uspešna primena kombinatorne metodologije za meĊusobno poreĊenje hemijskih/bioloških osobina serije ferocenskih derivata i odgovarajućih fenil analoga: kreirana je biblioteka sa ukupno 18 (13 novih jedinjenja) derivata metil-acetoacetata. Svi sintetisani estri su detaljno spektralno okarakterisani: MS, NMR (1D- i 2D-NMR), FTIR i UV-Vis podacima, a u sluĉaju biblioteke ferocenskih derivata dodatno i elektrohemijski (cikliĉna voltametrija), kao i rendgenskom strukturnom analizom. Stereohemijske nedoumice u sluĉaju estara (1R*,3S*,5R*)-sabinola kao i problem preklapanja signala protona u 1 H NMR spektru iz ferocenskih derivata su razrešeni korišćenjem reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3). Svi estri iz kombinatornih biblioteka koji su bili identifikovani kao sastojci etarskih ulja analiziranih biljnih vrsta su kvantifikovani kreiranjem GC-FID kalibracionih prava. Na osnovu prethodno pokazanih pozitivnih farmakoloških osobina estara sa sliĉnom strukturom kao kod estara iz biblioteka, odabrani sintetisani estri su podvrgnuti biološkim i/ili farmakološkim testiranjima da bi se ispitala njihova in vitro antimikrobna, in vivo antinociceptivna i in vitro inhibitorna aktivnost na acetilholinesterazu, kao i njihova akutna toksiĉnost na soj raĉića Artemia salina i in vitro citotoksiĉnost na dve linije ćelija (fibroblasti i ćelije melanoma). Dobiveni su sledeći rezultati:  Detaljnom analizom hemijskog sastava etarskog ulja korena i/ili nadzemnih delova biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia subsp. serbica potvrĊeno je da etarska ulja obe biljne vrste sadrţe nova jedinjenja, kao i sastojke koji su veoma retko detektovani u biljnom svetu. Podaci iz biblioteke estara (1R*,3S*,5R*)-sabinola su omogućili nedvosmislenu potvrdu da etarsko ulje biljnih vrsta A. falcata i A. ageratifolia sadrţi (1R*,3S*,5R*)-sabinol i seriju njegovih estara (od kojih su ĉetiri (formijat, tiglat, nonanoat i dekanoat) potpuno nova jedinjenja). Pored toga, uoĉene su i predloţen je naĉin kako da se koriguju nelogiĉnosti u nomenklaturi koja se tiĉe relativne stereohemije sabinil estara, a koje potiĉu od kontradiktorne upotrebe cis- i trans- stereodeskriptora za imenovanje dijastereoizomera sabinola i njegovih estara (estri cis-sabinola su imenovani kao trans-sabinil estri i obrnuto). Predloţili smo upotrebu CIP sistema kako bi se izbegle dalje nedoumice. Dobiveni rezultati testiranja akutne toksiĉnosti, inhibitorne aktivnosti na AChE i antinociceptivne aktivnosti (1R*,3S*,5R*)-sabinola i odabranih (1R*,3S*,5R*)-sabinil estara pokazali su da ova Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 226 jedinjenja imaju znaĉajan biološki/farmakološki potencijal. U koncentracionom opsegu 0,0025 – 0,2 mg/ml (1R*,3S*,5R*)-sabinol, (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijat, acetat, tiglat i senecioat su pokazali umerenu toksiĉnost na slanovodne raĉiće. Sabinol i pomenuti estri su, takoĊe, pokazali i antinociceptivnu aktivnost u tri razliĉita in vivo modela. (1R*,3S*,5R*)- Sabinol je izazivao produţetak vremena potrebnog za reakciju ţivotinje na termalni nadraţaj u dva testa (metode vruće ploĉe (hot-plate) i imerzije repa (tail immersion)). U testiranju zasnovanom na metodi vruće ploĉe, kada je primenjen u najvećoj dozi (50 mg/kg), maksimalni efekat (1R*,3S*,5R*)-sabinola je uoĉen nakon 15 minuta od trenutka davanja testiranog jedinjenja ţivotinji. TakoĊe, (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglat, u dozi od 50 mg/kg, izazvao je povećanje osnovne linije za 140% nakon 15 minuta od davanja jedinjenja laboratorijskoj ţivotinji. Pored toga, pomenuta jedinjenja su umereno inhibirala aktivnost acetilholinesteraze (u testiranoj koncentraciji od 20 µg/ml ova jedinjenja su izazvala smanjenje aktivnosti acetilholinesteraze do 40%).  Detaljne GC i GC-MS analize uzoraka etarskih ulja biljnih vrsta Scandix pecten- veneris i S. balansae omogućile su identifikaciju 123, odnosno 81 sastojka ulja, redom. Pretragom literature je ustanovljeno da (ne)isparljivi metaboliti biljne vrste S. balansae do sada nisu nikada izuĉavani, dok je u poslednjem istraţivanju sekundarnih metabolita biljne vrste S. pecten-veneris identifikovano samo 12 sastojaka etarskog ulja. Na osnovu masenih spektara, kao i na osnovu vrednosti retencionih indeksa, pretpostavljeno je da etarsko ulje obe biljne vrste sadrţi dve serije estara (izomerne butanoate i pentanoate) dugolanĉanih, nerazgranatih alkohola. Poĉetna pretpostavka o strukturi nepoznatih sastojaka ulja je povrĊena kreiranjem sintetske biblioteke takvih estara, a zatim i uporeĊivanjem njihovih masenih spektara, RI vrednosti kao i GC-MS koinjekcijom uzoraka ĉistih estara sa uzorcima etarskog ulja. Ukupno osam estara iz biblioteke (sedam iz etarskog ulja biljne vrste S. pecten- veneris (estri izobutanske kiseline i n-C15, C17, C21 i C23 alkohola, kao i estri izovalerijanske kiseline i n-C13, C15 i C17 alkohola) i jedan iz etarskog ulja biljne vrste S. balansae (oktadecil- valerat)) predstavlja potpuno nove prirodne proizvode. Pretragom literature je ustanovljeno da su do sada estri izomernih butanskih i pentanskih kiselina dugolanĉanih alkohola veoma retko detektovani u biljnom svetu i da su ĉešće prisutni kao metaboliti insekata ili drugih ţivotinja. Rezultati in vitro testiranja antimikrobne aktivnosti su pokazali da su svi testirani mikroorganizmi bili podloţni dejstvu testiranih estara kao i etarskog ulja biljne vrste S. pecten-veneris, izuzev bakterije Escherichia coli, sa MIC i MBC/MFC vrednostima u opsegu od 1,00 do 8,00 mg/ml. Multivarijantna statistiĉka analiza ( HC i PC ) je pokazala da su pomenuti estri potencijalni hemotaksonomski markeri na nivou roda i/ili vrste, kao i da Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 227 metabolizam isparljivih sekundarnih metabolita taksona iz plemena Scandiceae nije rod- specifiĉan niti prati njihovu morfološku evoluciju.  U cilju potvrde identifikacije strukture sastojaka etarskog ulja biljne vrste Antemis segetalis Ten. ( steraceae) izvršena je sinteza kombinatorne biblioteke od 54 izomernih pentanoata i izomernih 2-pentenoata regioizomernih alilmetoksifenola (ukupno 49 potpuno novih jedinjenja). GC-MS analiza u kombinaciji sa analizom 1D- i 2D-NMR spektara jedinjenja iz biblioteke nedvosmisleno je potvrdila da su eugenil-angelat, 2-metilbutanoat i 3- metilbutanoat (0,21, 0,22 i 0,13 mg u 100 g sveţeg biljnog materijala) sekundarni metaboliti prisutni u etarskom ulju biljne vrste A. segetalis. U cilju istraţivanja hromatografskih osobina (retencionih indeksa) u okviru ove serije, kao i izmeĊu serija estara izomernih alilmetoksifenola, poĉetna biblioteka je dopunjena sa još 85 dodatnih estara eugenola, 2-alil- 3-metoksifenola, 2-alil-4-metoksifenola, 2-alil-5-metoksifenola i 2-alil-6-metoksifenola sa 17 kiselina. Dobivena QSPR jednaĉina omogućava predviĊanje vrednosti retencionih indeksa ovakvih i srodnih jedinjenja, tj. poĉetnu identifikaciju ovakvih jedinjenja bez njihove sinteze. Pri testiranju akutne toksiĉnosti i citotoksiĉnosti prirodnih eugenil estara i odabranih strukturnih izomera iz biblioteke uoĉeno je da su pomenuti estri slabo do umereno toksiĉni prema testiranim organizmima/linijama ćelija. TakoĊe, testirani estri su bili slabi inhibitori acetilholinesteraze i ne pokazuju znaĉajnu antimikrobnu aktivnost.  U cilju odreĊivanja odnosa hemijskih i bioloških osobina ferocenskih derivata i njihovih fenil analoga, izvršeno je kreiranje biblioteke od 18 metil-acetoacetata (di)supstituisanih u poloţaju 2 (od kojih su 13 nova jedinjenja). Testirana je in vitro antimikrobna aktivnost sintetisanih jedinjenja na šest razliĉitih sojeva bakterija i dve gljive. Uoĉeno je da jedinjenja iz biblioteke imaju širok opseg aktivnosti, od neaktivnih jedinjenja do onih koja su veoma aktivna (MIC vrednosti u opsegu 0,0050 – 20,6 μmol/ml). Metil-2- acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metil-4-pentenoat je pokazao najveću antimikrobnu aktivnost protiv svih testiranih mikroorganizama, naroĉito u sluĉaju soja C. albicans sa MIC vrednostima koje su bile uporedive sa MIC vrednostima nistatina. Statistiĉka analiza (multivarijantna) dobivenih MIC vrednosti je pokazala da ferocenski derivati imaju razliĉitu (i u ovom sluĉaju znaĉajno veću) antimikrobnu aktivnost u odnosu na fenil analoge. Dobiveni rezultati su obećavajući u smislu mogućeg razvoja novih antimikotika, baziranih na metil- acetoacetatima koji sadrţe ferocensko jezgro, za leĉenje kandidijaze. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 228 6.2. SUMMARY Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 229 This PhD thesis, entitled: "Combinatorial libraries of selected natural and synthetic biologically active esters", presents the results of successful identification and a means of arriving at (milli)gram quantities of selected natural esters achieved through the application of a synthetic combinatorial approach. Three libraries with 171 compounds in total, among them 121 new compounds, were prepared for this purpose. Also the combinatorial library approach was successfully applied for a systematic comparison of chemical/biological properties of ferrocene-containing compounds and their corresponding phenyl analogs: a library of eighteen (13 new) 2-substituted methyl acetoacetates was synthesized. The structures of the synthesized esters were characterized through extensive spectral MS, NMR (1D- and 2D-NMR), FTIR and UV-Vis analyses, and in the case of ferrocene-containing compounds by electrochemical (cyclic voltammetry) and X-ray analysis. Stereochemistry of the compounds and overlapping resonances occurring in the corresponding 1 H NMR spectra, in the case of (1R*,3S*,5R*)-sabinyl esters and esters that contained ferrocene unit, respectively, were inferred/resolved by the application of an NMR methodology that employed a lanthanide-induced shift reagent (Eu(fod)3). All esters from combinatorial libraries that were identified as plant metabolites were quantified by GC analyzes with a flame ionization detector (FID) and appropriate calibration curves were set up. Based on the (ethno)pharmacological properties of esters with similar molecular structure, the obtained samples of the pure esters were assayed for different biological and/or pharmacological activities (in vitro antimicrobial, in vivo antinociceptive, in vitro acetylcholinesterase inhibitory activities and their toxicity (in vitro cytotoxicity against two cell lines (fibroblast and melanoma) and acute toxicity against Artemia salina)). The following results were obtained:  Detailed analyses of the essential-oil profile of the under- and/or aboveground parts of Achillea falcata and A. ageratifolia subsp. serbica, revealed that both species produce new or components with a restricted occurrence in the Plant Kingdom. The synthesized library of (1R*,3S*,5R*)-sabinyl esters provided unequivocal proof that both species produce (1R*,3S*,5R*)-sabinol and several of its esters (four of which (the formate, tiglate, nonanoate and decanoate) were newly discovered natural products). Additionally, a nomenclature confusion regarding the relative stereochemistry of sabinyl esters, that came from the opposing use of cis- and trans- for the parent alcohols and the derived esters, was addressed. We propose the use of CIP notation in connection with the trivial names to avoid further ambiguities. The herein presented results regarding the acute toxicity, AChE inhibitory activity and antinociceptive activity of (1R*,3S*,5R*)-sabinol and selected (1R*,3S*,5R*)- Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 230 sabinyl esters further corroborate that these compounds might be able to interact with different targets in crustacean/mammalian organisms and that they have an influence on both the peripheral and central nervous systems. When applied in the concentration range 0.0025 – 0.2 mg/ml, (1R*,3S*,5R*)-sabinol and (1R*,3S*,5R*)-sabinyl formate, acetate, tiglate and senecioate showed moderate toxicity in Artemia salina acute toxicity assay. (1R*,3S*,5R*)- Sabinol and the mentioned esters displayed antinociceptive action in three in vivo models: (1R*,3S*,5R*)-sabinol caused an increase in animal response to thermal stimuli in both hot plate and tail immersion tests. In the hot plate test, when applied in the highest dose (50 mg/kg), the maximal effect of the alcohol was observed 15 min after the administration. (1R*,3S*,5R*)-Sabinyl tiglate, at 50 mg/kg, produced a 140% baseline increase 15 min after the treatment in the hot plate test. Additionally, (1R*,3S*,5R*)-sabinol and its esters moderately inhibited acetylcholinesterase (at the concentration of 20 µg/ml, these compounds caused a reduction of acetylcholinesterase activity up to 40%).  Detailed GC and GC-MS analyses of the essential-oil samples of Scandix pecten- veneris and S. balansae enabled the identification of 123 and 81 constituents, respectively. In contrast, in the latest phytochemical report on S. pecten-veneris only 12 essential-oil constituents were identified. On the other hand, to the best of our knowledge, there are no previous studies on either the volatile or nonvolatile secondary metabolites of S. balansae. In the course of the identification procedure, gas chromatography (GC) and GC combined with mass spectrometry (MS) analyses revealed that the essential-oil samples from both umbellifers contained isomeric butanoates and pentanoates of long-chain 1-alkanols. A synthetic library of the tentatively identified esters allowed the accumulation of their spectral data and final identity corroboration. Eight esters from the library (seven from S. pecten- veneris essential-oil samples (n-C15, C17, C21 and C23 isobutyrates, as well as n-C13, C15 and C17 isovalerates) and one from S. balansae oil sample (octadecyl pentanoate)) turned out to be new natural metabolites. Up to now the isomeric esters of butanoic and pentanoic acids of straight-chain alcohols with 6–23 carbon atoms (identity hinted by the MS fragmentation patterns in the preliminary analyses of the mentioned oils) were either new or very rare in the Plant Kingdom and were more characteristic of insect or other animal species. The in vitro antimicrobial activity assay revealed that all screened microorganisms were susceptible to the action of the tested compounds and the essential oil, except for the bacterium Escherichia coli, with MIC and MBC/MFC values ranging from 1.00 to 8.00 mg/ml. Multivariate statistical analyses (AHC and PCA) demonstrated that the mentioned esters were excellent candidates for chemotaxonomic markers at species and even genus levels, as well as, that the Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 231 evolution of the volatiles‟ metabolism of Scandiceae taxa was neither genera-specific nor follows their morphological evolution.  To determine the exact structure of the previously tentatively identified minor essential-oil constituents of a Chamomile species (Antemis segetalis Ten. (Asteraceae)), we synthesized a combinatorial library of 54 regioisomeric allylmethoxyphenyl pentanoates and 2-pentenoates (49 completely new compounds). GC-MS in combination with 1D- and 2D- NMR analyses of the synthesized compounds provided unambiguous data that led to a straightforward identification of the mentioned A. segetalis constituents as eugenyl angelate, 2-methylbutanoate and 3-methylbutanoate (0.21, 0.22, and 0.13 mg/100 g of fresh plant material, respectively). In the aim to explore the gas chromatographic behavior (retention index trends) among and between series of isomeric allylmethoxyphenyl esters, the starting combinatorial library of 54 regioisomeric allylmethoxyphenyl pentanoates and 2-pentenoates was enlarged with 85 additional esters of 4-allyl-2-methoxyphenol (eugenol), 2-allyl-3- methoxyphenol, 2-allyl-4-methoxyphenol, 2-allyl-5-methoxyphenol and 2-allyl-6- methoxyphenol (o-eugenol) with 17 different acids. The results of biological activity tests showed that the naturally occurring eugenyl esters and selected structurally related compounds from the library demonstrated a low to moderate toxicity. They were also relatively weak inhibitors of AChE and of microbial growth.  A series of eighteen (13 new) 2-substituted methyl acetoacetates containing ferrocenyl and/or phenyl units were synthesized in low-to-good yields. Within this small library, along with the ferrocenyl group being formally replaced with a phenyl group, other moieties were varied as well. The compounds were screened for their in vitro antimicrobial activity against six bacteria and two fungal/yeast strains. They demonstrated a wide range of activities, from low to highly active compounds, with MIC values in the range 0.0050 – 20.6 μmol/ml. Methyl 2-acetyl-2-(ferrocenylmethyl)-4-methyl-4-pentenoate showed the highest antimicrobial activity against the tested strains, especially in the case of C. albicans with a MIC value similar to that of nystatin. AHC statistical analysis of the antimicrobial assay results confirmed that the compounds having a ferrocene unit instead of a phenyl unit have a different (and in the present study, greater) activity. The obtained results are also promising in terms of the possible development of new anticandidal agents based of ferrocene- containing acetoacetates. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 232 7. LITERATURA Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 233 Abdalla FC, Graeme JR, Morgan D, Cruz-Landim C (2004) J. Brazil Chem. Soc. 15: 621. Abel U, Koch C, Speitling M, Hansske FG (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 453. Aburjai T, Hudaib M (2006) Pharmacogn. Mag. 2: 188. Aburjai T, Hudaib M, Tayyema R, Yousef M, Qishawi M (2007) J. Ethnopharmacol. 110: 294. Adams RP (2007) Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography-Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, IL, USA. Adhami HR, Linder T, Kaehlig H, Schuster D, Zehl M, Krenn L (2012) J. Ethnopharmacol. 139: 142. Aharoni A, Keizer LCP, Bouwmeester HJ, Sun ZK, Alvarez-Huerta M, Verhoeven HA, Blaas J, van Houwelingen A, De Vos RCH, van der Voet H, Jansen RC, Guis M, Mol J, Davis RW, Schena M, van Tunen AJ, O'Connella AP (2000) Plant Cell, 12: 647. Akhmedov NG, Dacko CA, Güven A, Söderberg BCG (2010) Magn. Reson. Chem. 48: 134. Ali M, Chaudhari A, Velasco-Negueruela A, Pérez-Alonso, MJ (2000) J. Essent. Oil Res. 12: 64. Ali SM, Khan AA, Ahmed I, Musaddiq M, Ahmed KS, Polasa H, Rao LV, Habibullah CM, Sechi LA, Ahmed N (2005) Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 4: 1. Allardyce CS, Dorcier A, Scolaro C, Dyson PJ (2005) Appl. Organomet. Chem. 19: 1. Alzweiri M, Al Sarhan A, Mansi K, Hudaib M, Aburjai T (2011) J. Ethnopharmacol. 137: 27. Aneesh TP, Belzik N, Nisha AR, Resiya S, Silvipriya KS, Asokan MA, Sonu J (2010) Inventi Rapid: Med. Chem. 1: 1. Arbi M, Pigeon P, Top S, Rhouma A, Aifa S, Rebai A, Vessières A, Plamont MA, Jaouen G J (2011) Organomet. Chem. 696: 1038. Ashraf M, Ahmad R, Bhatty MK (1979) Pakistan J. Sci. Ind. Res. 22: 320. Bajorath J (2002) J. Comput. Aided. Mol. Des. 16: 431. Balaban AT (1983) Pure Appl. Chem. 55: 199. Bamoniri A, Ebrahimabadi AH, Mazoochi A, Behpour M, Kashi FJ, Batooli H (2010) Food Chem. 122: 553. Bar-On P, Millard CB, Harel M, Dvir H, Enz A, Sussman JL, Silman I (2002) Biochemistry 41: 3555. Baranauskiene R (2007) Chem. Nat. Compd. 43: 331. Başer KHC, Buchbauer G (2009) Handbook of Essential Oils Science, Technology, and Applications, CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 234 Başer KHC, Demirci F (2007) In Berger RG (Ed.). Flavours and Fragrances: Chemistry, Bioprocessing and Sustainability, Springer. Başer KHC, Ermin N, Demirçakmak B (1998) J. Essent. Oil Res. 10: 463. Başer KHC, Tabanca N, Özek T, Demirci B, Duran A, Duman H (2000) Flavour Frag. J. 15: 43. Beavers MP, Chen X (2002) J. Mol. Graph. Model. 20: 463. Beekwilder J, Alvarez-Huerta M, Neef E, Verstappen FWA, Bouwmeester HJ, Aharoni A (2004) Plant Physiol. 135: 1865. Benner MH, Lee HJ (1973) J. Allergy Clin. Immunol. 52: 307. Berger C, Martin N, Collin S, Gijs L, Khan JA, Piraprez G, Spinnler HE, Vulfson EN (1999) J. Agric. Food Chem. 47: 3274. Berrazeg M, Drissi M, Medjahed L, Rolain JM (2013) J. Med. Microbiol. 62: 864. Biot C, François N, Maciejewski L, Brocard J, Poulain D (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 839. Biot C, Glorian G, Maciejewski LA, Brocard JS, Domarle O, Blampain G, Millet P, Georges AJ, Abessolo H, Dive D, Lebibi J (1997) J. Med. Chem. 40: 3715. Bittencourt SC, De Lima TCM, Morato GS (1995) Gen. Pharmacol. 26: 1083. Blagojević PD, Radulović NS, Palić RM, Stojanović GS (2006) J. Agr. Food Chem. 54: 4780. Bogdanović G , Novaković SB (2011) Cryst. Eng. Comm. 13: 6930. Bohlmann F, Jastrow H (1962) Chem. Ber. 95: 1742. Boldi AM (2006) Combinatorial Synthesis of Natural Product-Based Libraries, CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton, USA. Borman S (2004) Chem. Eng. News, 82: 32. Bos R, Koulman A, Woerdenbag HJ, Quax WJ, Pras N (2002) J. Chromatogr. A 966: 233. Brown RD, Martin YC (1997) J. Med. Chem. 40: 2304. Bunin BA, Ellman JA (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 10997. Burrows GE, Tyrl RJ (2012) Toxic plants of North America (2nd Edn.), John Wiley & Sons, Oxford, UK. Buzas A, Egnell C, Freon P (1962) C. R. Acad. Sci. 255: 945. Carrasco FR, Schmidt G, Romero AL, Sartoretto JL, Caparroz-Assef SM, Bersani-Amado CA, Cuman RK (2009) J. Pharm. Pharmacol. 61: 961. Casares R (1964) Food Cosmet. Toxicol. 2: 680. Calestani V (1905) Webbia, 1: 89. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 235 Camarda L, Stefano VD, Pitonzo R (2008) Chem. Nat. Compd. 44: 532. Cégiéla-Carlioz P, Bessière J-M, David B, Mariotte A-M, Gibbons S, Dijoux-Franca M-G (2005) Flavour Fragr. J. 20: 671. Cerceau-Larrival MTH (1962) Mem. Mus. Natl. Hist. Nat., Ser. B, Bot. 14: 1. Chaiken IM, Janda KD (1996) Molecular diversity and combinatorial chemistry, American Chemical Society, Washington, DC, USA. Chalchat J-C, Gorunovic MS, Petrovic SD (1999) J. Essent. Oil Res. 11: 306. Chavez-Riveros A, Garrido M, Apan MTR, Zambrano A, Díaz M, Bratoeff E (2014) Eur. J. Med. Chem. 82: 498. Chen F, D‟ uria JC, Tholl D, Ross JR, Gershenzon J, Noel JP, Pichersky E (2003) Plant J. 36: 577. Chen C, Li X, Neumann CS, Lo MM-C, Schreiber SL (2005) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44: 2249. Chizzola R (2009) Nat. Prod. Commun. 4: 1235. Chizzola R (2011) Nat. Prod. Commun. 6: 1147. Clinical and Laboratory Standards Institute (2007) Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Seventeenth informational supplement. Document M 100-S17, NCCLS, Wayne, PA, USA. Collier HOJ, Dinneen LC, Johnson CA, Schneider C (1968) Br. J. Pharmacol. Chemother. 32: 295. Conroy D, Moisala A, Cardoso S, Windle A, Davidson J (2010) Chem. Eng. Sci. 65: 2965. Corsi G, Biasci D (1998) Ann. Bot. 81: 157. Croteau R, Kutchan TM, Lewis NG (2000) In: Buchanan B, Gruissem W, Jones R (Ed) Biochemistry & Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists, p. 1250. Damljanović I, Vukićević M, Radulović N, Palić R, Ellmerer E, Ratković Z, Joksović MD, Vukićević RD (2009a) Bioorg. Med. Chem. Lett. 19: 1093. Damljanović I, Ĉolović M, Vukićević M, Manojlović D, Radulović N, Wurst K, Laus G, Ratković Z, Joksović M, Vukićević RD (2009b) J. Organomet. Chem. 694: 1575. Damljanović I, Stevanović D, Pejović , Vukićević M, Novaković SB, Bogdanović G , Mihajlov-Krstev T, Radulović N, Vukićević RD (2011) J. Organomet. Chem. 696: 3703. Demirci B, Koşar M, Demirci F, Dinç M, Başer KHC (2007) Food Chem. 105: 1512. Den Dool H, Kratz PD (1963) J. Chromatogr. 11: 436. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 236 D'Ettorre P, Errard C, Ibarra F, Francke W (2000) Chemoecology 10: 135. Didry N, Dubreuil L, Pinkas M (1994) Pharm. Acta Helv. 69: 25. Dorman HJ, Deans SG (2000) J. Appl. Microbiol. 88: 308. Downie SR, Katz-Downie DS, Spalik K (2000) Am. J. Bot. 87: 76. Dubar F, Bohic S, Slomianny C, Morin JC, Thomas P, Kalamou H, Guérardel Y, Cloetens P, Khalife J, Biot C (2012) Chem. Commun. 48: 910. Dubar F, Slomianny C, Khalife J, Dive D, Kalamou H, Guérardel Y, Grellier P, Biot C (2013) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52: 7690. Dudareva N, Murfitt LM, Mann CJ, Gorenstein N, Kolosova N, Kish CM, Bonham C, Wood K (2000) Plant Cell, 12: 949. Dudareva N, Pichersky E, Gershenzon J (2004) Plant Physiol. 135: 1893. Ebrahimabadi AH, Djafari-Bidgoli Z, Mazoochi A, Kashi FJ, Batooli H (2010) Food Control 21: 1173. Edmund S (1763) Philos. Tr. Soc. Lond. 53: 195. El-Abed S, Houari A, Latrache H, Remmal A, Koraichi SI (2011) Res. J. Microbiol. 6: 394. Emelyanov VE, Simonenko LS, Skvortsov VN (2001) Chem. Technol. Fuel Oil 37: 224. Feher M, Schmidt JM (2003) J. Chem. Inf. Comput. Sci. 43: 218. Fiorina VJ, Dubois RJ, Brynes S (1978) J. Med. Chem. 21: 393. Forero MD, Quijano CE, Pino JA (2008) Flavour Frag. J. 24: 25. Fouda MFR, Abd-Elzaher MM, Abdelsamaia RA, Labib AA (2007) Appl. Organomet. Chem. 21: 613. Frisch MJ, Trucks GW, Schlegel HB, Scuseria GE, Robb MA, Cheeseman JR, et al. (2004) Gaussian 03, Gaussian, Inc.,Wallingford CT. Furka A, Sebestyén F, Asgedom M, Dibó G (1991) Int. J. Pept. Protein Res. 37: 487. Gang DR, Beuerle T, Ullmann P, Werck-Reichhart D, Pichersky E (2002) Plant Physiol. 130: 1536. Gao C, Tian C, Lu Y, Xu J, Luo J, Guo X (2011) Food Control 22: 517. Ganesan A (2001) Pure Appl. Chem. 73: 1033. Gansow OA, Willcott MR, Lenkinski RE (1971) J. Am. Chem. Soc. 93: 4295. Genĉić MS, Radulović NS (2015) RSC Adv. 5: 72670. Geysen HM, Meloen RH, Barteling SJ (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998. Gielen M, Tiekink E (2005) Metallotherapeutic Drugs and Metal-Based Diagnostic Agents: The Use of Metals in Medicine, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England. Gilon C, Klausner Y, Hassner A (1979) Tetrahedron Lett. 20: 3811. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 237 Gokcen OA, Morgan ED, Dani FR, Agosti D, Wehner R (2002) J. Chem. Ecol. 28: 71. Golebiowski A, Klopfenstein SR, Portlock DE (2001) Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 273. Gordon EM, Kerwin JF (1998) Combinatorial chemistry and molecular diversity in drug discovery, Wiley, New York, USA. Gordon EM, Patel DV, Jacobs JW, Gordeev MF, Zhou J (1997) Chimia, 51: 821. Gorin BI, Ferguson CG, Thatcher GRJ (1997) Tetrahedron Lett. 38: 2791. Groenneberg TO (1979) Chem. Scripta 13: 56. Gurib-Fakim A (2006) Mol. Aspects Med. 27: 1. Hackett D, Buckett WR (1975) Eur. J. Pharmac. 30: 280. Hammer KA, Carson CF, Riley TV (1999) J. Appl. Microbiol. 86: 985. Hansen MB, Nielsen SE, Berg K (1989) J. Immunol. Meth. 119: 203. Hayamizu K, Yamamoto O (1967) J. Mol. Spectrosc. 23: 121. He S, Yang X, Li H, Ma Y (2009) Shipin Gongye Keji 30: 133. Heindel ND, Lemke TF, Lenke SM, Fish VB (1968) J. Med. Chem. 11: 369. Hendriks H, Smith D, Hazelhoff B (1977) Phytochemistry 16: 1853. Henkel T, Brunne RM, Müller H, Reichel F (1999) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38: 643. Henry M, Briolant S, Fontaine A, Mosnier J, Baret E, Amalvict R, Fusai T, Fraisse L, Rogier C, Pradines B (2008) Antimicrob. Agents Ch. 52: 2755. Herrick-Davis S, Chippari S, Luttinger D, Ward SJ (1989) Eur. J. Pharmacol. 162: 365. Heywood VH (1971) The biology and chemistry of the Umbelliferae, Academic Press, London, UK. Houghten RA (1985) P. Natl. Acad. Sci. 82: 5131. Huang B, Qin L, Chu Q, Zhang Q, Gao L, Zheng H (2009) Chromatographia 69: 489. Hyatt DC, Youn B, Zhao Y, Santhamma B, Coates RM, Croteau RB, Kang C (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 5360. Ibrahim SA, Avery JW, Weldon PJ, Wheeler JW (1998) Biosciences 53: 201. Ilić D, Damljanović I, Stevanović D, Vukićević M, Blagojević P, Radulović N, Vukićević RD (2012) Chem. Biodivers. 9: 2236. Ilić D, Damljanović I, Stevanović D, Vukićević M, Radulović N, Kahlenberg V, Laus G, Vukićević RD (2010) Polyhedron 29: 1863. Jaouen G, Top S, Vessieres A, Alberto R (2000) J. Organomet. Chem. 600: 23. José DP, Bartholomeeusen K, da Cunha RD, Abreu CM, Glinski J, da Costa TBF, Rabay AFMB, Filho LFP, Dudycz LW, Ranga U, Peterlin BM, Pianowski LF, Tanuri A, Aguiar RS (2014) Virology, 462-463: 328. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 238 Josifović M (1974) Flora SR Srbije, Tom V, S NU, Nauĉno delo, Beograd, Srbija. Judzentiene A, Budiene J, Gircyte R, Masotti V, Laffont-Schwob I (2012) Rec. Nat. Prod. 6: 180. Jung G (2008) Combinatorial Chemistry: Synthesis, Analysis, Screening, WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany. IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). XML on-line corrected version: http://goldbook.iupac.org (2006-) created by M. Nic, J. Jirat, B. Kosata; updates compiled by A. Jenkins. ISBN 0-9678550-9-8. doi:10.1351/goldbook.A00003. Kalemba D, Kunicka A (2003) Curr. Med. Chem. 10: 813. Kapetanos C, Karioti A, Bojović S, Marin P, Veljić M, Skaltsa H (2008) Chem. Biodivers. 5: 101. Kaya A, Demirci B, Başer KHC (2007) J. Essent. Oil Res. 19: 155. Kealy TJ, Pauson PL (1951) Nature, 168: 1039. Khan JA, Gijs L, Berger C, Martin N, Piraprez G, Spinnler HE, Vulfson EN, Collin S (1999) J. Agric. Food Chem. 47: 3269. Kim I-H, Nishi K, Kasagami T, Morisseau C, Liu J-Y, Tsai H-J, Hammock BD (2012) Bioorg. Med. Chem. Lett. 22: 5889. Knudsen JT, Tollsten L (1993) Bot. J. Linn. Soc. 113: 263. Kollmannsberger H, Fricke G, Paulus H, Nitz S (2000) Adv. Food Sci. 22: 47. Kondapi AK, Satyanarayana N, Saikrishna AD (2006) Arch. Biochem. Biophys. 450, 123. Koto R, Imamura M, Watanabe C, Obayashi S, Shiraishi M, Sasaki Y, Azuma H (2006) J Cardiovasc Pharmacol. 48: 850. Kovaĉević N (2004) Etarska ulja. Osnovi farmakognozije. Srpska školska knjiga, Beograd, Srbija. Kubeczka KH (1982) Aromat. Plants 7: 165. Kürkçüoğlu M, Başer KHC, Işcan G, Malyer H, Kaynak G (2006) Flavour Frag. J. 21: 115. Kürkçüoglu M, Demirci B, Tabanca N, Özek T, Başer KHC (2003) Flavour Fragr. J. 18: 192. Law NM, Bharucha AE, Undale AS, Zinsmeister AR (2001) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 281: G1228. Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW (2001) Pharmacol. Rev. 53: 597. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 239 Lednicer D, Hauser CR (1960) In: Newmann MS (Ed) Organic Syntheses, Vol. 40. Wiley, New York, p 31. Lee M, Kim DH (2002) Bioorgan. Med. Chem. 10: 913. Lee M-L, Schneider G (2001) J. Comb. Chem. 3: 284. Letchamo W, Korolyuk EA, Tkachev AV (2005) J. Essent. Oil Res. 17: 577. Lin CF, Shen CC, Chen CC, Sheu SJ, Huang YL (2007) Phytochemistry 68: 2450. Ling L, Lei L, Wei Z, Jingxia Z, Diya L, Ziyang L (2011) Yaowu Fenxi Zazhi 31: 112. Loev B, Flores M (1961) J. Org. Chem. 26: 3595. Mack L, Gros P, Burkhardt J, Seifert K (2013) Phytochemistry 96: 158. Mahmoud SS, Williams M, Croteau R (2004) Phytochemistry 65: 547. Matheus ME, Berrondo LF, Vieitas EC, Menezes FS, Fernandes PD (2005) J. Ethnopharmacol. 102: 377. Medeiros LBP, Rocha MS, de Lima SG, de Sousa Júnior GR, Citó AMGL, da Silva D, Lopes JAD, Moura DJ, Saffi J, Mobin M, da Costa JGM (2012) Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 22: 1259. Merrifield RB (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149. Millard CB, Kryger G, Ordentlich A, Greenblatt HM, Harel M, Raves ML, Segall Y, Barak D, Shafferman A, Silman I, Sussman JL (1999) Biochemistry 38: 7032. Miller SA, Tebboth JA, Tremaine JF (1952) J. Chem. Soc. 632. Mizutani N, Wada T, Yasuda T, Endo N, Yamaguchi T, Moriya S (2008) Appl. Entomol. Zool. 43: 585. Mollerup S, Haugen A (1996) Br. J. Cancer. 74: 613. Neises B, Steglich W (1978) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 17: 522. Neises B, Steglich W (1990) Coll. 7: 93. Neuse EW (2005) J. Inorg. Organomet. Polym. Mater. 15: 3. Newman DJ, Cragg GM (2007) J. Nat. Prod. 70: 461. Newman DJ, Cragg GM, Snader KM (2003) J. Nat. Prod. 66: 1022. Nickavar B, Mojab F, Mojahedi A (2009) Chem. Nat. Compd. 45: 443. Nicolaou KC, Cho SY, Hughes R, Winssinger N, Smethurst C, Labischinski H, Endermann R (2001a) Chem. Eur. J. 7: 3798. Nicolaou KC, Hughes R, Pfefferkorn JA, Barluenga S, Roecker AJ (2001b) Chem. Eur. J. 7: 4280. Nicolaou KC, Pastor J, Winssinger NC, Murphy F (1998) J. Am. Chem. Soc. 120: 5132. Nicolaou KC, Pfefferkorn JA (2001) Biopolymers, 60: 171. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 240 Nicolaou KC, Pfefferkorn J, Xu J, Winssinger N, Ohshima T, Kim S, Hosokawa S, Vourloumis D, van Delft F, Li T (1999) Chem. Pharm. Bull. 47: 1199. Nicolaou KC, Winssinger N, Pastor J, Ninkovic S, Sarabia F, He Y, Vourloumis D, Yang Z, Li T, Giannakakou P, Hamel E (1997) Nature, 387: 268. Nilakantan R, Immermann F, Haraki K (2002) Comb. Chem. High T. Scr. 5: 105. Nori-Shargh D, Raftari S, Deyhimi F (2007) Flavour Frag. J. 22: 350. Norin T, Strömberg S, Weber M (1973) Acta Chem. Scand. 27: 1579. Obrecht D, Villalgordo JM (1998) Solid-supported combinatorial and parallel synthesis of small-molecular-weight compound libraries, Pergamon, Oxford, England. Okada N, Hirata A, Murakami Y, Shoji M, Sakagami H, Fujisawa S (2005) Anticancer. Res. 25: 3263. Ortholand Y-Y, Ganesan A (2004) Curr. Opin. Chem. Biol. 8: 271. Otera J (2003) Esterification – Methods, Reactions, and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim. Oxford Diffraction (2008) CrysAlis CCD and CrysAlis RED Versions 1.171.32.24, Oxford Diffraction Ltd., Abington, England. Pages N, Fournier G, Baduel C, Turt N, Rusnac M (1996) Phytother. Res. 10: 438. Papageorgiou VP, Mellidis AS, Yannovits-Argiriadis N (1997) Agro. Food. Ind. Hi-Tec, 8: 24. Park BS, Song YS, Yee SB, Lee BG, Seo SY, Park YC, Kim JM, Kim HM, Yoo YH (2005) Apoptosis 10: 193. Pauli A, Kubeczka KH (2010) Nat. Prod. Commun. 9: 1387. Pavlović M, Petrović S, Milenković M, Couladis M, Tzakou O, Niketić M (2011) Nat. Prod. Commun. 6: 271. Pejović , Damljanović I, Stevanović D, Vukićević M, Novaković SB, Bogdanović G , Radulović N, Vukićević RD (2012a) Polyhedron 31: 789. Pejović , Denić MS, Stevanović D, Damljanović I, Vukićević M, Kostova K, Tavlinova- Kirilova M, RanĊelović P, Stojanović NM, Bogdanović G , Blagojević P, D'hooghe M, Radulović NS, Vukićević RD (2014) Eur. J. Med. Chem. 83: 57. Pejović , Stevanović D, Damljanović I, Vukićević M, Novaković SB, Bogdanović G , Mihajilov-Krstev T, Radulović N, Vukićević RD (2012b) Helv. Chim. Acta. 95: 1425. Piggott AM, Karuso P (2004) Comb. Chem. High Throughput Screen. 7: 607. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 241 Pimenov MG, Leonov MV (1993) The genera of the Umbelliferae, Royal Botanic Gardens, Kew, UK. Pinheiro MMG, Radulović NS, Miltojević AB, Boylan F, Fernandes PD (2014) Eur. J. Pharmacol. 727: 106. Pisano M, Pagnan G, Loi M, Mura ME, Tilocca MG, Palmieri G, Fabbri D, Dettori MA, Delogu G, Ponzoni M, Rozzo C (2007) Mol. Cancer. 6: 8. Pott MB, Hippauf F, Saschenbrecker S, Chen F, Ross J, Kiefer I, Slusarenko A, Noel JP, Pichersky E, Effmert U, Piechulla B (2004) Plant Physiol. 135: 1946. Pradines B, Fusai T, Daries W, Laloge V, Rogier C, Millet P, Panconi E, Kombila M, Parzy D (2001) J. Antimicrob. Chemother. 48: 179. Qiu J, Feng H, Lu J, Xiang H, Wang D, Dong J, Wang J, Wang X, Liu J, Deng X (2010) Appl. Environ. Microb. 76: 5846. Radulović NS (2012) Serbian Biochemical Society Second Conference University of Belgrade, Belgrade, Serbia. Radulović NS, Blagojević PD, Palić RM (2009a) Nat. Prod. Commun. 4: 405. Radulović NS, Blagojević PD, RanĊelović PJ, Stojanović NM (2013c) Curr. Top. Med. Chem. 13: 2134. Radulović N, Blagojević P, Skropeta D, Zarubica , Zlatković B, Palić R (2010) Nat. Prod. Commun. 5: 121. Radulović NS, Blagojević PD, Zlatković BK, Palić RM (2009) J. Chin. Chem. Soc. 56: 642. Radulović N, Denić M, Stojanović-Radić Z, Skropeta D (2012b) J. Am. Oil. Chem. Soc. 89: 2165. Radulović NS, Dekić MS, RanĊelović PJ, Stojanović NM, Zarubica , Stojanović-Radić Z (2012a) Food Chem. Toxicol. 50: 2016. Radulović N, Dekić M, Stojanović-Radić Z, Palić R, (2011) Turk. J. Chem. 35: 1. Radulović NS, Mladenović MZ, ĐorĊević ND (2012c) Chem. Biodiversity 9: 1320. Radulović N, ĐorĊević N, Zlatković B, Palić R (2008) Chem. Pap. 62: 603. Radulović N, Zlatković B, Palić R, Stojanović G (2007) Nat. Prod. Commun. 2: 453. Radulović NS, Denić MS, Stojanović-Radić ZZ (2013b) Phytochem. Anal. 25:75. Radulović NS, Zlatković DB, RanĊelović PJ, Stojanović NM, Novaković SB, Akhlaghi H (2013a) Food Funct. 4: 1751. Rafiee E, Khodayari M, Joshaghani M (2011) Can. J. Chem. 89: 1533. Ramage G, Milligan S, Lappin DF, Sherry L, Sweeney P, Williams C, Bagg J, Culshaw S (2012) Front. Microbiol. 3: 220. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 242 Ratković Z, Juranić ZD, Stanojković T, Manojlović D, Vukićević RD, Radulović N, Joksović MD (2010) Bioorg. Chem. 38: 26. Richardson IBK (1976) Flora Europaea vol. 4, Cambridge University Press, Cambridge, UK. Rico-Molina D, Aparicio-Ozores G, Dorantes-Alvarez L, Hernández-Sánchez H (2012) Am. J. Food Technol. 7: 289. Rnjan N, Andreasen KF, Kumar S, Hyde-Volpe D, Arya DP (2010) Biochemistry 49: 9891. Ross JR, Nam KH, D‟ uria JC, Pichersky E (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367: 9. Rouhi AM (2003a) Chem. Eng. News, 81: 77. Rouhi AM (2003b) Chem. Eng. News, 81: 104. Saad NY, Muller CD, Lobstein A (2013) Flavour Fragr. J. 28: 269. Sadeghian H, Seyedi SM, Saberi MR, Arghiania Z, Riazi M (2008) Bioorgan. Med. Chem. 16: 890. Sanner MF (1999) J. Mol. Graph. Model. 17: 57. Sankar U, Raju C, Uma R (2012) Curr. Chem. Lett. 1: 123. Sartoratto A, Machado ALM, Delarmelina C, Figueira GM, Duarte MCT, Rehder VLG (2004) Braz. J. Microbiol. 35: 275. Schreiber SL (2005) Nat. Chem. Biol. 1: 64. Schultz HP (1989) J. Chem. Inf. Comp. Sci. 29: 227. Senatore F, Napolitano F, Apostolides Arnold N, Bruno M, Herz W (2005) Flavour Fragr. J. 20: 291. Shalit M, Guterman I, Volpin H, Bar E, Tamari T, Menda N, Adam Z, Zamir D, Vainstein A, Weiss D, Pichersky E, Lewinsohn E (2003) Plant Physiol. 131: 1868. Shapiro S, Meier A, Guggenheim B (1994) Oral Microbiol. Immunol. 9: 202. Sheldrick GM (2008) Acta Crystallogr. A 64:112. Simić N, nĊelković S, Palić R, Vajs V, Milosavljević S (2000) Flavour Fragr. J. 15: 141. Šmelcerović A, Spiteller M, Ligon AP, Šmelcerović Ţ, Raabe N (2007) Biochem. Syst. Ecol. 35: 99. Sneader W (2000) BMJ 321: 1591. Srivastava JK, Shankar E, Gupta S (2010) Mol. Med. Rep. 3: 895. Staveren DR, Metzler-Nolte N (2004) Chem. Rev. 104: 5931. Steglich W, Höfle G (1969) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 8: 981. Stepnicka P (2008) Ferocenes: Ligands, materials and biomolecules. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, UK. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 243 St-Pierre B, Laflamme P, Alarco AM, De Luca V (1998) Plant J. 14: 703. Suerbaev KA, Zhaksylykova GZ, Appazov NO (2013) J. Pet. Environ. Biotechnol. 4: 1. Sussman JL, Harel M, Frolow F, Oefner C, Goldman A, Toker L, Silman I (1991) Science 253: 872. Swarts JC, Swarts DM, Maree MD, Neuse EW, Madeleine C, Lier JE (2001) Anticancer Res. 21: 2033. Terrett NK, Gardner M, Gordon DW, Kobylecki RJ, Steele J (1995) Tetrahedron, 30: 8135. Thompson LA, Ellman JA (1996) Chem. Rev. 96: 555. Tietze LF, Bell HP, Chandrasekhar S (2003) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 42: 3996. Tippayatum P, Chonhenchob V (2007) Kasetsart J. (Nat. Sci.) 41: 319. Tomczykowa M, Gudej J, Majda T, Gora J (2005) J. Essent. Oil Res. 17: 632. Tomić A, Petrović S, Pavlović M, Couladis M, Tzakou O, Milenković M, Vuĉićević D (2008) Chem. Nat. Compd. 44: 789. Top S, Vessieres A, Cabestaing C, Laios I, Leclercq G, Provot C, Jaouen G (2001) J. Organometal. Chem. 637: 500. Torosyan GO, Gekchyan GG, Akopyan GS, Babayan ZR, Mkrtchyan AA, Babayan AT (1987) Fiziologicheski Aktivnye Veshchestva 19: 9. Trifunović S, Milosavljević S, Vajs V, Macura S, Todorović N (2008) Magn. Reson. Chem. 46: 427. Trott O, Olson AJ (2010) J. Comput. Chem. 31: 455. Tümen G, Başer KHC (1997) J. Essent. Oil Res. 9: 335. Vajs V, Milosavljević S, Tešević V, Ţivanović P, Janĉić R, Todorović B, Slavkovska V (1995) J. Essent. Oil Res. 7: 529. Van Poecke RMP, Posthumus MA, Dicke M (2001) J. Chem. Ecol. 27: 1911. Van Staveren DR, Metzler-Nolte N (2004) Chem. Rev. 104: 5931. Velasco-Negueruela A, Pérez-Alonso MJ, Burzaco A (1991) J. Essent. Oil Res. 3: 469. Vermeulen C, Collin S (2002) J. Agric. Food Chem. 50: 5654. Vermeulen C, Collin S (2003) J. Agric. Food Chem. 51: 3618. Vermeulen C, Guyot-Declerck C, Collin S (2003) J. Agric. Food Chem. 51: 3623. Vermeulen C, Pellaud J, Gijs L, Collin S (2001) J. Agric. Food Chem. 49: 5445. Vuĉković I, Vujisić Lj, Stešević D, Radulović S, Lazić M, Milosavljević S (2010) Phytother. Res. 24: 225. Walker K, Croteau R (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 583. Wang XQ, Tian YG (1999) Zhongguo Yiyao Gongye Zazhi 30: 389. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 244 Wang SP, Xu FY, Zhang GZ, Zhang XW (2008) Hebei Daxue Xuebao, Ziran Kexueban 28: 373. Warner TD, Mitchell JA (2002) P. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 13371. Watson C (1999) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38: 1903. Whittle BA (1964) Br. J. Pharmacol. Chemother. 22: 246. Wiener H (1947) J. Am. Chem. Soc. 69: 17. Wilkinson G, Rosenblum M, Whiting MC, Woodward RB (1952) J. Am. Chem. Soc. 74: 2125. Wilson SR, Czarnik AW (1997) Combinatorial chemistry synthesis and applications, Wiley, New York, USA. Woodward RB (1941) J. Am. Chem. Soc. 63: 1123. Xiao X-Y, Parandoosh Z, Nova MP (1997) J. Org. Chem. 62: 6029. Yan H, Wang Q, Wei F (1988) Youji Huaxue 8: 346. Yasuda T, Mizutani N, Honda Y, Endo N, Yamaguchi T, Moriya S, Fukuda T, Sasaki R (2007) Appl. Entomol. Zool. 42: 161. Yeary RA (1969) Toxicol. Appl. Pharm. 15: 666. Zetler G (1983) Eur. J. Pharmac. 92: 151. Zhang J, Zhao C, Rao X, Wang D, Liu X, Qin X, Zhang Z (2007) Dongwu Xuebao 53: 616. Ţivanović P, Đoković D, Vajs V, Slavkovska V, Todorović B, Milosavljević S (1994) Pharmazie 49: 463. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 245 8. PRILOZI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 246 – Spisak priloga – Prilog 8.1.1. Hemijski sastav etarskih ulja izolovanih iz biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia subsp. serbica Prilog 8.1.2. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.3. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.4. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.5. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.6. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.7. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.8. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.9. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.10. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.11. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.12. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.13. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.14. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.15. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.16. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.17. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.18. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.19. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.20. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.21. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.22. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.23. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.24. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.25. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.26. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.27. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.28. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.29. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.30. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-propanoata [1c] Prilog 8.1.31. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-izobutanoata [1d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 247 Prilog 8.1.32. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-butanoata [1e] Prilog 8.1.33. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-2-metilbutanoata [1f] Prilog 8.1.34. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-3-metilbutanoata [1g] Prilog 8.1.35. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.36. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.37. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.38. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.39. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.40. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.41. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.42. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.43. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.44. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.45. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.46. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.47. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.48. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.49. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.50. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.51. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.52. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.53. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.54. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.55. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-angelata [1j] Prilog 8.1.56. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.57. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.58. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.59. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.60. 1 H – 1H COSY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.61. DEPT90 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.62. DEPT135 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.63. HSQC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.64. HMBC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.65. NOESY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 248 Prilog 8.1.66. 1 H NMR (400 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.67. 13 C NMR (101 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.68. 1 H – 1H COSY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.69. DEPT90 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.70. DEPT135 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.71. HSQC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.72. HMBC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.73. NOESY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.74. 13 C NMR (101 MHz, C6D6) spektar bez heteronuklearnog dekuplovanja (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.75. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.76. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.77. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.78. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.79. 1 H – 1H COSY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.80. DEPT90 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.81. DEPT135 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.82. HSQC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.83. HMBC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.84. NOESY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.85. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar bez heteronuklearnog dekuplovanja (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.86. 1 H NMR (400 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.87. 13 C NMR (101 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.88. 1 H – 1H COSY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.89. DEPT90 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.90. DEPT135 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.91. HSQC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.92. HMBC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.93. NOESY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.94. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-benzoata [1m] Prilog 8.2.1. Hemijski sastav etarskih ulja izolovanih iz vrsta Scandix balansae i Scandix pecten-veneris Prilog 8.2.2. Maseni spektar tridecil-izobutanoata [2a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 249 Prilog 8.2.3. IR spektar tridecil-izobutanoata [2a] Prilog 8.2.4. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tridecil-izobutanoata [2a] Prilog 8.2.5. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tridecil-izobutanoata [2a] Prilog 8.2.6. Maseni spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Prilog 8.2.7. IR spektar tridecil-2- metilbutanoata [2b] Prilog 8.2.8. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Prilog 8.2.9. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Prilog 8.2.10. Maseni spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Prilog 8.2.11. IR spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Prilog 8.2.12. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Prilog 8.2.13. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Prilog 8.2.14. Maseni spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Prilog 8.2.15. IR spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Prilog 8.2.16. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Prilog 8.2.17. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Prilog 8.2.18. Maseni spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Prilog 8.2.19. IR spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Prilog 8.2.20. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Prilog 8.2.21. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Prilog 8.2.22. Maseni spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Prilog 8.2.23. IR spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Prilog 8.2.24. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Prilog 8.2.25. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Prilog 8.2.26. Maseni spektar pentadecil-izobutanoata [2g] Prilog 8.2.27. IR spektar pentadecil-izobutanoata [2g] Prilog 8.2.28. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-2-metilbutanoata [2g] Prilog 8.2.29. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-2-metilbutanoata [2g] Prilog 8.2.30. Maseni spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Prilog 8.2.31. IR spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Prilog 8.2.32. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Prilog 8.2.33. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Prilog 8.2.34. Maseni spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Prilog 8.2.35. IR spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Prilog 8.2.36. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 250 Prilog 8.2.37. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Prilog 8.2.38. Maseni spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Prilog 8.2.39. IR spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Prilog 8.2.40. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Prilog 8.2.41. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Prilog 8.2.42. Maseni spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Prilog 8.2.43. IR spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Prilog 8.2.44. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Prilog 8.2.45. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Prilog 8.2.46. Maseni spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Prilog 8.2.47. IR spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Prilog 8.2.48. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Prilog 8.2.49. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Prilog 8.2.50. Maseni spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Prilog 8.2.51. IR spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Prilog 8.2.52. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Prilog 8.2.53. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Prilog 8.2.54. Maseni spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Prilog 8.2.55. IR spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Prilog 8.2.56. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Prilog 8.2.57. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Prilog 8.2.58. Maseni spektar oktadecil-butanoata [2o] Prilog 8.2.59. IR spektar oktadecil-butanoata [2o] Prilog 8.2.60. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-butanoata [2o] Prilog 8.2.61. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-butanoata [2o] Prilog 8.2.62. Maseni spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Prilog 8.2.63. IR spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Prilog 8.2.64. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Prilog 8.2.65. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Prilog 8.2.66. Maseni spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Prilog 8.2.67. IR spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Prilog 8.2.68. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Prilog 8.2.69. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Prilog 8.2.70. Maseni spektar oktadecil-pentanoata [2r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 251 Prilog 8.2.71. IR spektar oktadecil-pentanoata [2r] Prilog 8.2.72. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-pentanoata [2r] Prilog 8.2.73. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-pentanoata [2r] Prilog 8.2.74. Maseni spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Prilog 8.2.75. IR spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Prilog 8.2.76. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Prilog 8.2.77. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Prilog 8.2.78. Maseni spektar trikozil-izobutanoata [2t] Prilog 8.2.79. IR spektar trikozil-izobutanoata [2t] Prilog 8.2.80. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar trikozil-izobutanoata [2t] Prilog 8.2.81. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar trikozil-izobutanoata [2t] Prilog 8.2.82. Skraćenice uzoraka predhodno analiziranih etarskih ulja biljnih vrsta iz plemena Scandiceae iskorišćenih za multivarijantnu statistiĉku analizu Prilog 8.3.1. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-formijata (eugenil-formijata) [3a] Prilog 8.3.2. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-acetata (eugenil-acetata) [3b] Prilog 8.3.3. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-propanoata (eugenil-propanoata) [3c] Prilog 8.3.4. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-izobutanoata (eugenil-izobutanoata) [3d] Prilog 8.3.5. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-butanoata (eugenil-butanoata) [3e] Prilog 8.3.6. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.7. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2-metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.8. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2-metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.9. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2-metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.10. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.11. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.12. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.13. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 252 Prilog 8.3.14. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.15. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.16. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3-metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.17. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3-metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.18. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3-metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.19. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.20. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.21. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.22. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.23. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.24. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-pentanoata (eugenil-pentanoata) [3h] Prilog 8.3.25. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Prilog 8.3.26. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Prilog 8.3.27. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Prilog 8.3.28. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Prilog 8.3.29. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.30. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.31. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil- senecioata) [3j] Prilog 8.3.32. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.33. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.34. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 253 Prilog 8.3.35. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.36. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.37. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.38. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.39. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.40. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil- tiglata) [3k] Prilog 8.3.41. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil- tiglata) [3k] Prilog 8.3.42. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.43. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.44. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.45. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.46. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.47. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-heksanoata (eugenil-heksanoata) [3l] Prilog 8.3.48. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-heptanoata (eugenil-heptanoata) [3m] Prilog 8.3.49. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.50. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.51. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil- oktanoata) [3n] Prilog 8.3.52. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil- oktanoata) [3n] Prilog 8.3.53. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.54. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.55. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.56. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.57. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.58. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-nonanoata (eugenil-nonanoata) [3o] Prilog 8.3.59. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-dekanoata (eugenil-dekanoata) [3p] Prilog 8.3.60. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-dodekanoata (eugenil-dodekanoata) [3q] Prilog 8.3.61. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-tetradekanoata (eugenil-tetradekanoata) [3r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 254 Prilog 8.3.62. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-heksadekanoata (eugenil- heksadekanoata) [3s] Prilog 8.3.63. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktadekanoata (eugenil-oktadekanoata) [3t] Prilog 8.3.64. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoata (eugenil-(Z)-9- oktadecenoata) [3u] Prilog 8.3.65. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.66. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.67. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil- benzoata) [3v] Prilog 8.3.68. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil- benzoata) [3v] Prilog 8.3.69. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.70. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.71. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.72. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.73. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.74. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-salicilata (eugenil-salicilata) [3w] Prilog 8.3.75. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-formijata [4a] Prilog 8.3.76. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-acetata [4b] Prilog 8.3.77. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-propanoata [4c] Prilog 8.3.78. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-izobutanoata [4d] Prilog 8.3.79. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-butanoata [4e] Prilog 8.3.80. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-2-metilbutanoata [4f] Prilog 8.3.81. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-3-metilbutanoata [4g] Prilog 8.3.82. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-pentanoata [4h] Prilog 8.3.83. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-angelata [4i] Prilog 8.3.84. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-senecioata [4j] Prilog 8.3.85. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-tiglata [4k] Prilog 8.3.86. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-heksanoata [4l] Prilog 8.3.87. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-heptanoata [4m] Prilog 8.3.88. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-oktanoata [4n] Prilog 8.3.89. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-nonanoata [4o] Prilog 8.3.90. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-dekanoata [4p] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 255 Prilog 8.3.91. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-dodekanoata [4q] Prilog 8.3.92. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-tetradekanoata [4r] Prilog 8.3.93. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-heksadekanoata [4s] Prilog 8.3.94. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-oktadekanoata [4t] Prilog 8.3.95. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoata [4u] Prilog 8.3.96. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-benzoata [4v] Prilog 8.3.97. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-salicilata [4w] Prilog 8.3.98. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-formijata [5a] Prilog 8.3.99. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-acetata [5b] Prilog 8.3.100. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-propanoata [5c] Prilog 8.3.101. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-izobutanoata [5d] Prilog 8.3. 102. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-butanoata [5e] Prilog 8.3.103. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-2-metilbutanoata [5f] Prilog 8.3.104. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-3-metilbutanoata [5g] Prilog 8.3.105. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.106. IR spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.107. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.108. 13 C NMR (150 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.109. 1 H – 1H COSY spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.110. DEPT spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.111. HSQC spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.112. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-angelata [5i] Prilog 8.3.113. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-senecioata [5j] Prilog 8.3.114. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.115. IR spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.116. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.117. 13 C NMR (150 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.118. 1 H – 1H COSY spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.119. DEPT spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.120. HSQC spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.121. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-heksanoata [5l] Prilog 8.3.122. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-heptanoata [5m] Prilog 8.3.123. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-oktanoata [5n] Prilog 8.3.124. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-nonanoata [5o] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 256 Prilog 8.3.125. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-dekanoata [5p] Prilog 8.3.126. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-dodekanoata [5q] Prilog 8.3.127. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-tetradekanoata [5r] Prilog 8.3.128. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-heksadekanoata [5s] Prilog 8.3.129. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-oktadekanoata [5t] Prilog 8.3.130. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoata [5u] Prilog 8.3.131. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-benzoata [5v] Prilog 8.3.132. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-salicilata [5w] Prilog 8.3.133. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-formijata [6a] Prilog 8.3.134. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-acetata [6b] Prilog 8.3.135. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-propanoata [6c] Prilog 8.3.136. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-izobutanoata [6d] Prilog 8.3.137. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-butanoata [6e] Prilog 8.3.138. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-2-metilbutanoata [6f] Prilog 8.3.139. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-3-metilbutanoata [6g] Prilog 8.3.140. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-pentanoata [6h] Prilog 8.3.141. IR spektar 2-alil-5-metoksifenil-pentanoata [6h] Prilog 8.3.142. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-angelata [6i] Prilog 8.3.143. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-senecioata [6j] Prilog 8.3.144. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.145. IR spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.146. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.147. 13 C NMR (150 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.148. 1 H – 1H COSY spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.149. DEPT spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.150. HSQC spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.151. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-heksanoata [6l] Prilog 8.3.152. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-heptanoata [6m] Prilog 8.3.153. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-oktanoata [6n] Prilog 8.3.154. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-nonanoata [6o] Prilog 8.3.155. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-dekanoata [6p] Prilog 8.3.156. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-dodekanoata [6q] Prilog 8.3.157. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-tetradekanoata [6r] Prilog 8.3.158. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-heksadekanoata [6s] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 257 Prilog 8.3.159. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-oktadekanoata [6t] Prilog 8.3.160. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoata [6u] Prilog 8.3.161. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-benzoata [6v] Prilog 8.3.162. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-salicilata [6w] Prilog 8.3.163. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-formijata [7a] Prilog 8.3.164. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-acetata [7b] Prilog 8.3.165. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-propanoata [7c] Prilog 8.3.166. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-izobutanoata [7d] Prilog 8.3.167. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-butanoata [7e] Prilog 8.3.168. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-2-metilbutanoata [7f] Prilog 8.3.169. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-3-metilbutanoata [7g] Prilog 8.3.170. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-pentanoata [7h] Prilog 8.3.171. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-angelata [7i] Prilog 8.3.172. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-senecioata [7j] Prilog 8.3.173. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-tiglata [7k] Prilog 8.3.174. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-heksanoata [7l] Prilog 8.3.175. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-heptanoata [7m] Prilog 8.3.176. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-oktanoata [7n] Prilog 8.3.177. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-nonanoata [7o] Prilog 8.3.178. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-dekanoata [7p] Prilog 8.3.179. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-dodekanoata [7q] Prilog 8.3.180. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-tetradekanoata [7r] Prilog 8.3.181. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-heksadekanoata [7s] Prilog 8.3.182. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-oktadekanoata [7t] Prilog 8.3.183. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoata [7u] Prilog 8.3.184. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-benzoata [7v] Prilog 8.3.185. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-salicilata [7w] Prilog 8.3.186. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata [8a] Prilog 8.3.187. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata [8b] Prilog 8.3.188. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-pentanoata [8c] Prilog 8.3.189. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-angelata [8d] Prilog 8.3.190. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-senecioata [8e] Prilog 8.3.191. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-tiglata [8f] Prilog 8.3.192. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata [9a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 258 Prilog 8.3.193. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata [9b] Prilog 8.3.194. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-pentanoata [9c] Prilog 8.3.195. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-angelata [9d] Prilog 8.3.196. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-senecioata [9e] Prilog 8.3.197. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-tiglata [9f] Prilog 8.3.198. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-2-metilbutanoata [10a] Prilog 8.3.199. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-3-metilbutanoata [10b] Prilog 8.3.200. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-pentanoata [10c] Prilog 8.3.201. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-angelata [10d] Prilog 8.3.202. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-senecioata [10e] Prilog 8.3.203. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-tiglata [10f] Prilog 8.3.204. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-2-metilbutanoata [11a] Prilog 8.3.205. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-3-metilbutanoata [11b] Prilog 8.3.206. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-pentanoata [11c] Prilog 8.3.207. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-angelata [11d] Prilog 8.3.208. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-senecioata [11e] Prilog 8.3.209. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-tiglata [11f] Prilog 8.3.210. QS R jednaĉine za izraĉunavanje teorijskih vrednosti retencionih indeksa estara regioizomera alilmetoksifenola (Molekulski Topološki Indeks (MTI), Balabanov (B) i Vinerov (Wiener; W) indeks) Prilog 8.4.1. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Prilog 8.4.2. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Prilog 8.4.3. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Prilog 8.4.4. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Prilog 8.4.5. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.6. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.7. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.8. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.9. DEPT spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.10. NOESY spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 259 Prilog 8.4.11. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.12. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.13. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.14. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.15. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.16. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.17. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.18. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.19. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3-oksobutanoata [12c] Prilog 8.4.20. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3-oksobutanoata [12c] Prilog 8.4.21. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3- oksobutanoata [12c] Prilog 8.4.22. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3- oksobutanoata [12c] Prilog 8.4.23. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.24. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.25. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Prilog 8.4.26. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Prilog 8.4.27. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Prilog 8.4.28. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Prilog 8.4.29. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.30. DEPT spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 260 Prilog 8.4.31. HSQC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.32. HMBC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.33. NOESY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.34. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.35. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.36. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.37. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.38. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.39. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.40. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.41. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.42. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.43. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.44. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.45. DEPT spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.46. HSQC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.47. HMBC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.48. NOESY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 261 Prilog 8.4.49. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 18 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.50. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 18 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.51. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metilpent-4-enoata [12e] Prilog 8.4.52. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metilpent-4-enoata [12e] Prilog 8.4.53. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4- metilpent-4-enoata [12e] Prilog 8.4.54. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4- metilpent-4-enoata [12e] Prilog 8.4.55. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.56. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.57. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.58. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.59. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.60. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.61. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.62. DEPT spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.63. HSQC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.64. HMBC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.65. NOESY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.66. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Prilog 8.4.67. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Prilog 8.4.68. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Prilog 8.4.69. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Prilog 8.4.70. Maseni spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12h] Prilog 8.4.71. IR spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 262 Prilog 8.4.72. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3- oksobutanoata [12h] Prilog 8.4.73. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3- oksobutanoata [12h] Prilog 8.4.74. Maseni spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Prilog 8.4.75. IR spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Prilog 8.4.76. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Prilog 8.4.77. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Prilog 8.4.78. Maseni spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Prilog 8.4.79. IR spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Prilog 8.4.80. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Prilog 8.4.81. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Prilog 8.4.82. Maseni spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Prilog 8.4.83. IR spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Prilog 8.4.84. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Prilog 8.4.85. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Prilog 8.4.86. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.87. IR spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.88. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.89. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.90. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.91. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.92. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.93. DEPT spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.94. HSQC spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.95. HMBC spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.96. NOESY spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 263 Prilog 8.4.97. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4-enoata [13e] Prilog 8.4.98. IR spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4-enoata [13e] Prilog 8.4.99. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4- enoata [13e] Prilog 8.4.100. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4- enoata [13e] Prilog 8.4.101. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4-enoata [13f] Prilog 8.4.102. IR spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4-enoata [13f] Prilog 8.4.103. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4- enoata [13f] Prilog 8.4.104. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4- enoata [13f] Prilog 8.4.105. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Prilog 8.4.106. IR spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Prilog 8.4.107. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Prilog 8.4.108. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Prilog 8.4.109. Maseni spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Prilog 8.4.110. IR spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Prilog 8.4.111. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Prilog 8.4.112. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Prilog 8.4.113. Maseni spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Prilog 8.4.114. IR spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Prilog 8.4.115. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Prilog 8.4.116. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Prilog 8.4.117. Maseni spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Prilog 8.4.118. IR spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Prilog 8.4.119. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Prilog 8.4.120. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 264 Prilog 8.1.1. Hemijski sastav etarskih ulja izolovanih iz biljnih vrsta Achillea falcata i A. ageratifolia subsp. serbica RI 2 Sastojci Klasa Af1 Af2 As1 As2 As (MPLC frakcije) ID 3 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 731 3-Metil-1-butanol FAD 0,1 tr - tr - - - - - - - - - - - tr MS, RI 762 1-Pentanol FAD tr - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 765 3-Metil-2-buten-1-ol FAD tr tr tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI 778 3-Metil-2-butenal FAD tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 785 Butan-2,3-diol FAD - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 802 Heksanal FAD tr tr - tr - - 0,1 - - - - - - - - - MS, RI, CoI 828 3-Metilbutanska kiselina FAD 1,4 tr tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 830 2-Metilbutanska kiselina FAD - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 831 Furfural FAD tr tr tr tr - - tr - - - - - - - - - MS, RI 844 Furfuril-alkohol FAD 1,2 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 845 (E)-2-Heksenal FAD - - - 0,1 - - 0,1 - - - - - - - - - MS, RI 846 (E)-3-Heksen-1-ol FAD tr - 0,1 tr - - - - - - - - - - - 0,3 MS, RI 855 (Z)-2-Heksen-1-ol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - - 0,1 MS, RI 865 1-Heksanol FAD tr 0,4 0,1 0,1 - - - - - - - - - - - 0,7 MS, RI 873 (Z)-4-Heksen-1-ol FAD tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 892 2-Heptanon FAD - - tr tr - - - tr - - - - - - - - MS, RI, CoI 902 Nonan FAD - - - tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 904 Heptanal FAD tr - - tr - - tr - - - - - - - - - MS, RI, CoI 908 Santolinatrien MH tr - 0,8 1,7 2,9 - - - - - - - - - - - MS, RI 926 Artemizijatrien MH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 927 Triciklen MH - - - 0,1 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 928 α-Tujen MH tr - 0,1 0,1 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 934 α-Pinen MH 2,8 - 0,3 0,6 1,7 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 944 Tujan MH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 944 6-Metil-2-heptanon FAD tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 948 Kamfen MH tr - 0,5 0,7 2,7 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 954 Tuja-2,4(10)-dien MH - - - tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 955 Benzaldehid SM 0,2 1,6 tr tr - - - tr - - - - - - - - MS, RI, CoI 958 1-Heptanol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - tr 0,2 MS, RI, CoI 968 Heksanska kiselina FAD - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 970 Artemizeol MO - - tr tr - - tr 0,1 - - - - - - - - MS, RI 971 Sabinen MH 0,4 - 0,2 1,0 3,7 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 975 1-Okten-3-ol FAD tr tr tr tr - - - - - - - - - - - - MS, RI 978 6-Metil-5-hepten-2-on K tr - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 265 Nastavak priloga 8.1.1. 978 β-Pinen MH tr - 0,2 0,3 1,3 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 988 3-Oktanon FAD - - - tr - - - - - - - 0,1 0,2 - - - MS, RI 990 β-Mircen MH - - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 991 2-Pentilfuran FAD tr - tr 0,1 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 992 Dehidro-1,8-sineol MO tr - tr 0,2 - - tr 0,3 - - - - - - - - MS, RI 1000 Jomogi-alkohol MO 0,5 - 1,2 1,1 - - - - - - - tr 9,1 6,5 1,3 0,5 MS, RI, CoI, NMR 1001 Oktanal FAD tr - tr tr - - tr - - - - - - - - - MS, RI 1002 2-Metilpropil-3-metilbutanoat FAD - 0,8 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1004 (E)-3-Heksenil-acetat FAD - - - tr - - - tr - - - - - - - - MS, RI 1006 α-Felandren MH - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1007 Heksil-acetat FAD - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1008 (E,E)-2,4-Heptadienal FAD tr - tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1011 δ-3-Karen MH - - - tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1017 α-Terpinen MH 0,3 - 0,2 0,3 2,8 - - - - - - - - - - - MS, RI 1023 p-Cimen MH 0,4 - 1,2 0,5 4,2 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1027 Limonen MH - - 0,1 0,1 1,5 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1030 Santolina-alkohol MO 3,0 0,9 tr tr - - - - - - - tr - - - - MS, RI 1030 (Z)-β-Ocimen MH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1032 Benzil-alkohol SM - 1,5 tr tr - - - - - - - - - - - tr MS, RI, CoI 1033 1,8-Sineol MO 4,9 tr 12,6 8,3 - - 1,3 10,2 0,7 0,1 - - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1034 (E)-3-Okten-2-on FAD - - tr tr - - - - - - tr - - - - - MS, RI 1036 Lavanda-lakton FAD - - tr tr - - - - - - - - - - - 0,1 MS, RI 1038 Fenilacetaldehid SM tr 1,8 tr tr - - - - 0,3 - - - - - - - MS, RI, CoI 1039 cis-p-Menta-2,8-dien-1-ol MO - - tr tr - - - - - - 0,1 0,1 - - - - MS, RI, CoI 1052 (E)-β-Ocimen MH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1057 (5Z)-2,6-Dimetil-1,5,7-oktatrien-3-ol MO - - 0,2 tr - - - - - - 2,1 - - - - - MS, RI, CoI 1059 Artemizija-keton MO 1,9 - 1,9 3,2 - 6,5 2,8 tr - - - - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1061 γ-Terpinen MH 0,2 - 0,3 tr 7,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1065 (5E)-2,6-Dimetil-1,5,7-oktatrien-3-ol MO - - 0,5 0,3 - - - - - - 5,6 0,2 - - - - MS, RI 1066 Heptanska kiselina FAD - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1067 2-Metilbenzaldehid SM - - - tr - - - 0,1 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1067 (Z)-3-Heksenil-propanoat FAD 0,4 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1068 Acetofenon SM tr 0,5 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1069 cis-Linalool-oksid (furanoidni) MO - - - 0,1 - - - - - - - - 0,1 0,5 0,5 0,2 MS, RI, CoI 1071 p-Krezol SM - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1073 cis-Sabinen-hidrat MO 0,9 tr 0,6 0,5 - - - - - - - - 0,9 2,9 2,7 1,9 MS, RI, CoI 1082 Artemizija-alkohol MO 0,5 tr 1,5 1,7 - - - - - 0,2 27,2 8,5 0,3 - - - MS, RI, CoI, NMR 1087 Gvajakol SM tr 0,4 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 266 Nastavak priloga 8.1.1. 1088 Terpinolen MH 0,1 - tr 0,1 2,3 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1091 p-Cimenen SM - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1095 3-Metilbutil-2-metilbutanoat FAD - - tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1096 Linalool MO tr - 0,1 0,1 - - - - - - 0,9 2,6 0,8 - - - MS, RI, CoI 1100 Undekan FAD - tr tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1101 trans-Sabinen-hidrat MO - - 0,8 0,4 - - - - - - - - - - - 8,4 MS, RI, CoI 1102 2-Metilbutil-3-metilbutanoat FAD - - tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1104 Nonanal FAD - 0,7 - 0,2 - 0,2 0,3 0,1 - - - - - - - - MS, RI 1104 Hotrienol MO - - tr tr - - - - - - - 0,1 0,3 - - - MS, RI, CoI 1105 Filifolon MO - - tr 0,1 - tr 0,2 0,1 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1106 (E)-6-Metil-3,5-heptadien-2-on K - - tr tr - - - - - - - tr 0,2 - - - MS, RI 1107 cis-Tujon MO 0,2 - 0,2 0,6 - - tr 0,7 0,7 0,7 0,9 - - - - - MS, RI, CoI 1111 Izohrizantenon MO - - - tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1112 2-Fenil-1-etanol SM 0,1 1,3 tr tr - - - - - - - - - - - tr MS, RI, CoI 1114 p-Menta-1,3,8-trien MH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1115 endo-Fenhol MO - - tr tr - - - - - - tr tr - - - - MS, RI, CoI 1118 trans-Tujon MO 1,5 tr 0,5 0,9 - tr 0,7 3,5 1,0 - - - - - - - MS, RI, CoI 1120 Dehidrosabina-keton MO tr - tr tr - - - - - - - - tr - - - MS, RI, CoI 1120 trans-p-Menta-2,8-dien-1-ol MO - - - tr - - - - - - - - tr 0,8 0,5 0,2 MS, RI, CoI 1122 Izoforon O tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1122 cis-p-Ment-2-en-1-ol MO - - 0,3 0,2 - - - - - - - - 3,3 1,5 0,5 0,1 MS, RI, CoI 1126 Hrizantenon MO 0,3 tr 0,7 0,4 - - - 0,6 3,9 0,2 - - - - - - MS, RI, CoI 1126 α-Kamfolenal MO - - 0,1 tr - - tr 0,1 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1129 trans-Hrizantenon MO - - tr tr - - - - - - - - - 0,5 0,6 - MS, RI, CoI 1131 trans-Kar-3-en-2-ol MO - - - tr - - - - - - - - - tr - - MS, RI, CoI 1133 Izotujol MO - - - 0,1 - - - - - - - - - 0,8 2,3 4,4 MS, RI, CoI 1135 cis-p-Menta-2,8-dien-1-ol MO 0,2 tr - tr - - - - - - - - 0,1 - - - MS, RI, CoI 1137 3-Nonen-2-on FAD - - - tr - - - - - - tr tr - - - - MS, RI, CoI 1139 trans-p-Ment-2-en-1-ol MO - - 0,3 tr - - - - - - - - - - 0,5 3,4 MS, RI, CoI 1140 p-Menta-3-en-8-ol MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1142 (1R*,3S*,5R*)-Sabinol MO 19,1 6,5 5,0 6,3 - - - - tr tr 6,4 49,3 52,1 3,5 0,5 - MS, RI, CoI, NMR 1143 Ipsdienol MO - - - tr - - - - - - - - - tr tr - MS, RI 1144 cis-Verbenol MO 0,5 0,1 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1146 trans-Verbenol MO 0,9 tr - tr - - - - - - - - - - 0,5 3,4 MS, RI, CoI 1148 Kamfor MO 2,9 tr 16,1 12,3 - - - tr 19,6 74,5 0,3 - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1148 Neoizotujan-3-ol MO - - - tr - - - - - - - - 0,3 - - - MS, RI, CoI 1149 Jorgovan-aldehid B MO - - tr tr - - - - - - 0,2 - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 267 Nastavak priloga 8.1.1. 1151 Kamfen-hidrat MO - - tr tr - - - - - - - 0,1 0,2 - - - MS, RI, CoI 1152 (Z)-3-Nonen-1-ol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - tr - MS, RI 1153 Nerol-oksid MO - - - tr - - - 0,1 tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1154 Eukarvon MO 0,3 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1155 cis-Hrizantemol MO - - - tr - - - - - - - - - - - 1,3 MS, RI, CoI 1156 Pentilbenzen SM - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1157 Izoborneol MO - - tr tr - - - - - - 0,1 0,2 - - - - MS, RI, CoI 1157 β-Pinen-oksid MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1158 Sabina-keton MO 0,3 - tr 0,3 - - - - - - - - 1,5 1,5 1,4 - MS, RI, CoI 1162 trans-Pinokamfon MO - - - tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1163 cis-Hrizantenol MO - - 1,0 0,8 - - - - - - 9,5 16,5 3,4 - - - MS, RI, CoI, NMR 1164 Pinokarvon MO 0,2 - 0,3 0,1 - - - 0,3 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1165 1-Nonanol FAD - 0,3 tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1166 Lavandulol MO - - - 0,1 - - - - - - - 0,1 tr - - - MS, RI, CoI 1168 Umbelunon MO 0,4 - - tr - - - - - - - 0,1 - - - - MS, RI 1168 Artemizil-acetat MO - - 0,3 tr - 0,1 0,3 0,3 - - - - - - - - MS, RI 1169 Oktanska kiselina FAD - - tr tr - - - - - - - - - - tr - MS, RI, CoI 1170 δ-Terpineol MO 0,2 tr tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1170 trans-Kar-2-en-4-ol MO - - tr tr - - - - - - - 0,4 - - - - MS, RI, CoI 1171 p-Menta-1,5-dien-8-ol MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1172 Borneol MO 2,0 0,8 0,8 1,8 - - - - - - - 0,1 14,3 24,9 14,5 9,4 MS, RI, CoI, NMR 1172 cis-Linalool-oksid (piranoidni) MO - - - tr - - - - - - - - - - - 0,9 MS, RI, CoI 1174 Mentol MO tr tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1175 cis-Pinokamfon MO tr - tr tr - - - - 0,3 tr - - - - - - MS, RI, CoI 1179 Terpinen-4-ol MO 1,2 0,8 1,8 1,5 - - - - 0,1 0,4 36,9 12,7 0,6 - - - MS, RI, CoI, NMR 1181 Thuj-3-en-10-al MO 0,2 - 0,4 0,7 - - - - 13,2 1,6 - - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1187 trans-p-Menta-1(7),8-dien-2-ol MO - - tr tr - - - - - - - tr 0,8 0,2 - - MS, RI, CoI 1189 2-Dekanon FAD - - tr tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI 1189 p-Cimen-8-ol MO tr - 0,2 tr - - - - - - - - 0,1 0,3 0,8 0,2 MS, RI, CoI 1194 Mirtenol MO 0,2 - 0,2 tr - - - - - - - - 0,8 2,4 0,8 tr MS, RI, CoI 1195 (Z)-4-Decenal FAD tr tr tr tr - tr 0,1 0,1 - - - - - - - - MS, RI 1197 cis-Piperitol MO - - tr tr - - - - - - 0,3 0,8 tr - - - MS, RI, CoI 1198 α-Terpineol MO 0,6 0,6 1,5 1,3 - - - - - - - - 0,4 3,9 18,4 24,3 MS, RI, CoI, NMR 1198 Mirtenal MO 0,3 tr tr 0,2 - - - 0,1 2,3 tr - - - - - - MS, RI, CoI 1199 1-Dodecen FAD tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1199 Metilĉavikol SM - - tr tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1200 Dodekan FAD - 0,7 tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1202 Šafranal MO - - - tr - - - tr tr - - - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 268 Nastavak priloga 8.1.1. 1203 α-Kamfolenol MO - - tr tr - - - - - - - - - - - 0,4 MS, RI 1207 γ-Terpineol MO - - - tr - - - - - - - - - - 0,6 2,8 MS, RI, CoI 1208 trans-Piperitol MO 0,4 tr 0,2 0,1 - - - - - - - - 1,1 0,5 0,2 - MS, RI, CoI 1210 Dekanal FAD 0,2 0,6 0,1 0,2 - 0,5 0,3 0,1 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1214 Fragranol MO 3,3 1,8 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1218 2,6,6-Trimetil-2,4-cikloheptadien-1-on MO - - tr tr - - - - - - 0,1 - - - - - MS, RI 1219 trans-Karveol MO 0,2 - 0,4 0,4 - - - - - - - tr 2,5 6,8 6,1 1,3 MS, RI, CoI 1221 β-Ciklocitral MO - - tr tr - - - 0,1 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1224 Nerol MO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,4 0,3 MS, RI, CoI 1225 m-Kumenol MO - - tr tr - - - - - - 0,1 0,4 0,1 - - - MS, RI, CoI 1226 p-Kumenol MO - - - tr - - - - - - - 0,1 0,4 - - - MS, RI, CoI 1227 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-formijat MO 0,3 tr tr tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1228 cis-p-Menta-1(7),8-dien-2-ol MO 0,1 tr - - - - - - - - - - - 0,4 tr - MS, RI, CoI 1231 cis-Karveol MO tr - 0,1 0,2 - - - - - - - - 0,6 0,4 1,0 0,2 MS, RI, CoI 1233 (Z)-3-Heksenil-3-metilbutanoat FAD 0,1 tr - tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI 1234 Metiltimol MO - - tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1235 trans-Hrizantenil-acetat MO - - tr tr - - - tr - - - - - - - - MS, RI 1239 Neral MO - - tr tr - - - - - - tr - - - - - MS, RI, CoI 1241 Kumin-aldehid MO 0,5 tr 0,3 0,3 - - 0,2 2,2 1,2 - - - - - - - MS, RI, CoI 1244 Karvon MO tr - 0,3 0,1 - - - - - 0,5 - - - - - - MS, RI, CoI 1244 p-Menta-1(7),8(10)-dien-9-ol MO - - - tr - - - 0,2 - - - - - - - - MS, RI, CoI 1250 cis-Mirtanol MO - 1,2 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1252 Geraniol MO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,1 0,8 MS, RI, CoI 1252 Ĉavikol SM - - 0,1 tr - - - - - - 0,1 0,4 0,2 - - - MS, RI, CoI 1253 (Z)-4-Decen-1-ol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI 1254 Piperiton MO 0,3 0,4 tr tr - - - - - - 0,1 0,4 - - - - MS, RI, CoI 1256 2-Feniletil-acetat SM - - tr 0,1 - - - - 1,1 0,1 - - - - - - MS, RI 1257 trans-p-Menta-2-en-7-ol MO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,2 0,2 MS, RI, CoI 1258 Karvenon MO - - tr tr - - - - - - tr 0,1 - - - - MS, RI 1259 trans-Mirtanol MO - - tr tr - - - - - - - - - - tr 0,1 MS, RI, CoI 1259 Fragranil-formijat MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1260 (E)-2-Decenal FAD - - 0,1 tr - - - - 2,6 - - - - - - - MS, RI 1261 cis-Hrizantenil-acetat MO - - 0,2 0,3 - 0,2 0,7 0,9 - - - - - - - - MS, RI 1262 3-Izotujanol-acetat MO - - - tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1262 Nonanska kiselina FAD - tr tr tr - - - - - - - - - - 0,2 - MS, RI, CoI 1269 1-Dekanol FAD tr 0,3 - tr - - - - - - - - - - tr tr MS, RI, CoI 1270 Geranial MO - - tr tr - - - - - - 0,2 - - - - - MS, RI 1274 Izopiperitenon MO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 269 Nastavak priloga 8.1.1. 1275 Perila-aldehid MO - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1275 cis-Verbenil-acetat MO - - - tr - - - tr 0,9 - - - - - - - MS, RI 1283 trans-α-Nekrodol-acetat MO - - - tr - - - - 1,3 - - - - - - - MS, RI 1285 trans-Linalool-oksid-acetat (piranoidni) MO - - tr tr - - - - - - 0,2 - - - - - MS, RI 1286 α-Terpinen-7-al MO - - tr tr - - - - - tr - - - - - - MS, RI, CoI 1287 Bornil-acetat MO 0,2 - 0,1 0,4 - 0,2 1,2 7,7 2,7 - - - - - - - MS, RI 1288 Lavandulil-acetat MO - - tr tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI 1291 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-acetat MO 11,4 4,2 30,8 37,9 0,2 45,7 88,8 68,3 19,6 - - - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1299 Timol MO 0,4 tr tr tr - - - - - - - - tr tr 1,0 16,1 MS, RI, CoI 1298 Perila-alkohol MO - - tr tr - - - - - - - - - - tr 0,5 MS, RI 1300 Tridekan FAD tr 1,0 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1302 Terpinen-4-il-acetat MO - - 0,1 0,1 - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI 1304 trans-Pinokarvil-acetat MO - - tr tr - - - 0,2 - - - - - - - - MS, RI 1305 Undekanal FAD tr tr tr tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1308 Karvakrol MO 0,1 1,5 0,6 tr - - - - - tr 0,3 - - - - - MS, RI, CoI 1316 (E,E)-2,4-Dekadienal FAD tr tr 0,1 tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1322 (Z)-3-Heksenil-tiglat FAD - - tr tr - 0,2 - - - - - - - - - - MS, RI 1326 cis-Pinokarvil-acetat MO - - - tr - - tr tr - - - - - - - - MS, RI 1328 Heksil-tiglat FAD - - - tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1330 p-Menta-1,4-dien-7-ol MO 0,1 - 0,1 tr - - - - - - - - - - 0,8 3,4 MS, RI 1332 Mirtenil-acetat MO - - - 0,1 - tr tr 0,2 tr - - - - - - - MS, RI 1336 trans-Karvil-acetat MO - - 0,2 0,1 - 0,1 0,1 0,7 0,3 - - - - - - - MS, RI 1337 δ-Elemen SH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1341 Fragranil-acetat MO - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1349 α-Kubeben SH tr - tr tr 0,3 - - - - - - - - - - - MS, RI 1351 α-Terpinil-acetat MO - - - tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI 1354 α-Longipinen SH - - - 0,1 3,6 - - - - - - - - - - - MS, RI 1357 Eugenol SM 0,3 5,9 0,3 0,2 - - - - - 1,3 0,9 0,1 tr tr tr - MS, RI, CoI 1360 (E)-2-Undecenal FAD - - - tr - - - - 1,7 - - - - - - - MS, RI 1362 cis-Karvil-acetat MO - - 0,1 0,1 - - 0,1 0,3 - - - - - - - - MS, RI 1365 Dekanska kiselina FAD - tr tr tr - - - - - - - - - 0,1 0,5 tr MS, RI, CoI 1369 Ciklosativen SH - - - tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1373 α-Jangen SH - - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1379 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-propanoat MO 2,0 0,4 0,1 0,2 - 2,4 0,2 - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1380 Geranil-aceton MO - - - tr - - - 0,2 1,3 - - - - - - - MS, RI, CoI 1384 α-Kopaen SH tr 0,6 0,1 tr 2,4 - - - - - - - - - - - MS, RI 1385 (E)-β-Damascenon O - - tr tr - - - - 0,3 - - - - - - - MS, RI 1387 β-Burbonen SH 0,1 - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 270 Nastavak priloga 8.1.1. 1390 β-Kubeben SH tr - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1391 1-Tetradecen FAD - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1392 (E)-Jasmon MO tr - tr tr - - - - - - - - - - 0,2 0,2 MS, RI 1393 β-Elemen SH - - tr tr 0,3 - - - - - - - - - - - MS, RI 1396 Vanilin SM - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1399 (Z)-Jasmon MO - - tr tr - - - - - - - - - 0,3 1,5 0,7 MS, RI 1400 Tetradekan FAD - - tr tr 0,3 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1401 2-Dodekanon FAD - - - tr - - - - 0,8 - - - - - - - MS, RI 1406 Metileugenol SM 0,3 tr 0,4 0,2 - - - - - 1,9 1,4 - - - - - MS, RI, CoI 1408 Longifolen SH - - - tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1411 α-Gurjunen SH - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1414 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-izobutanoat MO 2,7 0,8 0,1 0,3 tr 6,8 0,1 - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1421 p-Cimen-7-ol-acetat MO - - 0,1 0,1 - - - 0,2 9,5 - - - - - - - MS, RI, CoI 1423 α-Cedren SH 0,4 0,4 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1426 (E)-Kariofilen SH - tr 0,2 0,2 9,0 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1429 β-Cedren SH 0,1 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1433 β-Kopaen SH tr - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1434 Perilil-acetat MO tr tr - - - tr 0,3 - - - - - - - - - MS, RI 1438 Fragranil-propanoat MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1438 Mirtenil-propanoat MO - - - tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1441 Aromadendren SH - - 0,5 - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1445 (Z,E)-2,6-Dodekadienal FAD - - tr tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI 1453 Geranilaceton K tr tr tr tr - - - - 0,3 tr - - - - - - MS, RI, CoI 1454 (E)-β-Farnezen SH 0,3 2,5 0,1 0,1 2,8 tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1456 α-Humulen SH - - tr tr 0,4 0,2 - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1462 (E)-2-Dodecenal FAD - - - tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI 1462 Aloaromadendren SH - - tr tr 0,3 - - - - - - - - - - - MS, RI 1465 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-butanoat MO tr - - tr - 0,2 tr tr - - - - - - - - MS, RI, CoI 1466 γ-Dekalakton FAD - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1467 10-epi-β-Akoradien SH 0,2 0,6 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1470 1-Dodekanol FAD - tr tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI 1478 γ-Murolen SH - - tr tr 0,6 - - - - - - - - - - - MS, RI 1479 Fragranil-izobutanoat MO 0,1 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1482 ar-Kurkumen SH 0,2 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1484 Germakren D SH 1,8 3,2 0,6 0,6 23,9 tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1485 Fenetil-2-metilbutanoat SM - - tr tr - - - tr - - - - - - - - MS, RI 1485 (E)-β-Jonon O - - - tr - - - - - tr 0,1 - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 271 Nastavak priloga 8.1.1. 1489 Fenetil-3-metilbutanoat SM - - - 0,1 - - - 0,2 1,2 - - - - - - - MS, RI 1491 β-Selinen SH tr - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1499 Biciklogermakren SH - - 0,2 0,4 12,5 3,9 - - - - - - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1500 Pentadekan FAD - - tr tr 0,3 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1500 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-2-metilbutanoat MO 3,1 1,7 0,3 0,4 - 10,8 0,1 - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1508 δ-Amorfen SH - - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1511 β-Kurkumen SH - - tr tr 0,4 - - - - - - - - - - - MS, RI 1512 Tridekanal FAD - tr tr tr - 0,3 - - - - - - - - - - MS, RI 1513 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-3-metilbutanoat MO 2,6 1,7 0,1 0,4 tr 15,4 0,1 - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1513 (E,E)-α-Farnezen SH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1515 γ-Kadinen SH - - - tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1516 Seskvisineol SO 0,2 0,6 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1517 Izobornil-3-metilbutanoat MO - - tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1518 Kubebol SO 0,3 tr tr tr - - - - - - - - - 0,1 - - MS, RI 1520 7-epi-α-Selinen SH - - - tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1520 δ-Kadinen SH tr tr 0,1 tr 1,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1525 β-Seskvifelandren SH 1,5 4,2 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1527 cis-Kalamenen SH - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1527 Mirtenil-butanoat MO - - - tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1534 trans-Kadina-1,4-dien SH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1540 α-Kadinen SH - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI 1542 (E)-α-Bisabolen SH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1544 α-Kalakoren SH tr - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1553 Elemicin SM - - tr tr - - - - - - - 0,1 0,1 - - - MS, RI 1563 (E)-Nerolidol SO tr 4,5 - tr - - - - - - 0,6 0,4 0,6 - - - MS, RI 1565 β-Kalakoren SH - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1570 (Z)-3-Heksenil-benzoat FAD - - tr tr - 0,2 - - - - - - - - - - MS, RI 1577 Neril-2-metilbutanoat MO - - - tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1580 Neril-3-metilbutanoat MO - - tr tr - 0,6 - - - - - - - - - - MS, RI 1582 Mint-oksid SO 0,4 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1583 epi-Junen-10-ol SO - - tr tr - - - 0,2 - - - - - - - - MS, RI 1584 Fragranil-3-metilbutanoat MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1586 Spatulenol SO 2,2 6,4 1,2 0,3 - - - - - - - 0,3 0,4 2,1 0,5 - MS, RI 1586 Globulol SO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,2 0,2 MS, RI 1587 Kariofilen-oksid SO 0,4 2,0 1,7 1,7 - - - - - 16,2 0,8 - - - - - MS, RI, CoI, NMR 1588 Klovenol SO - - - tr - - - - - - - tr tr - - - MS, RI 1593 β-Kopaen-4α-ol SO tr - 0,1 tr - - - - - - 0,8 0,3 0,4 - - - MS, RI 1597 4(14)-Salvialen-1-on SO 0,5 1,7 - tr - - - - 0,9 - - - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 272 Nastavak priloga 8.1.1. 1600 Heksadekan FAD - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1606 Kopaborneol SO - - 0,2 tr - - - - - - - - - - - - MS, RI 1609 Tetradekanal FAD - - - tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI 1610 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-tiglat MO 1,8 2,1 tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1615 Humulen-epoksid II SO - - tr tr - - - - - tr - - - - - - MS, RI 1616 Junenol SO 0,2 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1616 β-Panasinsen-5α-ol SO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,3 0,4 MS, RI 1617 Neidentifikovano jedinjenje 4 ) N 1,6 2,7 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1620 Torilenol SO 0,3 0,8 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1630 Murola-4,10(14)-dien-1β-ol SO - - 0,1 tr - - - - - - 0,9 - - - - - MS, RI 1631 epi-1-Kubenol SO - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1636 Kariofila-4(12),8(13)-dien-5α-ol SO - - 0,2 0,2 - - - - - - - - - 6,2 6,6 0,4 MS, RI 1637 β-Cedren-9-on SO - - tr tr - - - tr 0,7 - - - - - - - MS, RI 1638 epi-α-Murolol SO 0,3 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1639 Kariofila-4(12),8(13)-dien-5β-ol SO - - 0,7 0,8 - - - - - - - - - 15,5 13,7 3,6 MS, RI, CoI 1642 epi-α-Kadinol SO - - tr tr - - - - - - tr 0,2 0,3 - - - MS, RI 1647 α-Murolol SO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,2 0,7 MS, RI 1658 Akorenol B SO 0,7 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1658 β-Eudezmol SO 0,4 2,7 0,4 0,3 - - - - - - - - - 5,5 6,4 1,9 MS, RI 1659 neo-Intermedeol SO - - tr tr - - - - - - - - - 2,3 4,1 1,5 MS, RI 1660 Selin-11-en-4α-ol SO - - 0,2 0,2 - - - - - - - - - 1,7 tr - MS, RI 1673 14-Hidroksi-(Z)-kariofilen SO - - 0,2 0,1 - - - - - - - - - 4,5 4,5 0,6 MS, RI 1676 γ-Dodekalakton FAD - - 0,1 tr - - - - - - - - - - - 0,7 MS, RI 1679 1-Tetradekanol FAD - 1,0 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1679 Mustakon SO 0,2 0,6 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1679 Valeranon SO 0,1 - tr tr - - - 0,1 2,3 - - - - - - - MS, RI 1680 Helifolenol B SO - - - tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI 1683 α-Bisabolol SO - - - 0,1 - - - - - - 0,1 0,3 0,4 - - - MS, RI 1688 Eudezma-4(15),7-dien-1β-ol SO - - tr tr - - - - - - - - - - 0,4 - MS, RI 1688 1-Heptadecen FAD - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1690 Germakra-4(15),5,10(14)-trien-1α-ol SO 0,5 - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1699 2-Pentadekanon FAD - - tr tr - - - - 0,3 - - - - - - - MS, RI 1700 Amorfa-4,9-dien-2-ol SO 0,1 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1700 Heptadekan FAD - - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI 1704 10-nor-Kalamenen-10-on SO - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1719 ar-Kurkumen-15-al SO 0,2 1,3 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1720 Pentadekanal FAD 0,2 0,8 0,1 tr - 0,4 - - - - - - - - - - MS, RI 1729 Fragranil-heksanoat MO 0,2 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 273 Nastavak priloga 8.1.1. 1730 (Z)-Nuciferol SO - - tr - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1733 Hamazulen O - - - tr - 0,2 - - - - - - - - - - MS, RI 1736 (E)-Seskvilavandulil-acetat SO - - tr tr - - - 0,1 tr - - - - - - - MS, RI 1740 Mint-sulfid SO - - - tr - 0,6 - - - - - - - - - - MS, RI 1745 Izobiciklogermakrenal SO 0,2 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1751 γ-Kostol SO - 8,1 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1760 β-Akoradienol SO 0,3 1,3 - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1763 Tetradekanska kiselina FAD - tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1773 1-Pentadekanol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI, CoI 1781 14-Hidroksi-α-muurolen SO tr - tr tr - - - - - - - - - - tr - MS, RI 1800 Oktadekan FAD - - tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1801 14-Hidroksi-δ-kadinen SO 0,3 0,4 tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI 1818 Heksadekanal FAD - - tr tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI 1826 Izopropil-tetradekanoat FAD 1,0 tr - - - - - - - - - - - - - - MS, RI 1828 Fragranil-heptanoat MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1840 Heksahidrofarnezil-aceton K 1,2 0,1 0,1 0,1 - - - 0,3 6,4 - - - - - - - MS, RI 1888 1-Heksadekanol FAD tr 0,8 - tr - - - - - - - - - - - - MS, RI 1896 1-Nonadecen FAD - - tr tr tr - - - - - - - - - - - MS, RI 1900 Nonadekan FAD tr tr tr tr 0,2 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1902 2-Heptadekanon FAD - - - tr - - - - tr - - - - - - - MS, RI 1911 Heptadekanal FAD - - tr tr - 0,1 - - - - - - - - - - MS, RI 1932 Metil-heksadekanoat FAD tr - tr tr - tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1933 Fragranil-oktanoat MO tr - - - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1940 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-nonanoat MO - - tr tr - tr tr - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1966 Heksadekanska kiselina FAD tr 5,9 0,1 - - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 1976 1-Heptadekanol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI, CoI 2000 Eikozan FAD - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2046 (1R*,3S*,5R*)-Sabinil-dekanoat MO - - - tr - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2082 1-Oktadekanol FAD - - tr tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI, CoI 2100 Heneikozan FAD tr tr 0,2 tr - - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2200 Dokozan FAD - - - tr 0,1 tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2280 1-Eikozanol FAD - - - tr - - - - - - - - - - 0,1 - MS, RI 2300 Trikozan FAD tr tr - 0,2 0,8 tr - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2400 Tetrakozan FAD - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2500 Pentakozan FAD - - - tr 0,7 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2600 Heksakozan FAD - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2700 Heptakozan FAD - - - tr 1,3 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI 2800 Oktakozan FAD - - tr tr 0,1 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 274 Nastavak priloga 8.1.1. 2900 Nonakozan FAD - - - tr 2,5 - - - - - - - - - - - MS, RI, CoI Ukupno (%) 98,4 97,4 95,8 97,1 98,4 96,3 97,8 98,9 96,7 97,6 97,1 96,0 98,4 96,3 97,0 97,8 Monoterpenoidi (ugljovodonici) MH 4,2 - 4,5 6,0 30,9 - - - - - - - - - - - Monoterpenoidi (oksigenovani) MO 72,6 28,2 83,2 84,4 0,2 89,4 96,9 97,6 79,2 78,2 91,4 92,8 94,1 58,7 58,9 86,4 Seskviterpenoidi (ugljovodonici) SH 5,6 11,5 1,3 1,4 59,9 4,1 - - - - - - - - - - Seskviterpenoidi (oksigenovani) SO 7,8 30,4 5,0 3,7 - 0,6 - 0,4 5,0 16,2 3,2 2,6 3,6 37,9 37,0 9,3 Masne kiseline i jedinjenja izvedena iz metabolizma masnih kiselina FAD 4,5 11,5 0,8 0,8 7,4 2,1 0,9 0,3 5,4 - tr 0,1 0,2 0,2 1,7 2,1 Jedinjenja šikimatnog puta SM 0,9 13,0 0,8 0,6 tr 0,3 - 0,3 2,6 3,3 2,4 0,6 0,3 tr tr tr Jedinjenja nastala iz karotenoida K 1,2 0,1 0,1 0,1 - - - 0,3 6,7 tr - tr 0,2 - - - Ostali O tr - tr tr - 0,2 - - - - - - - - - - Neidentifikovana jedinjenja N 1,6 2,7 - - - - - - - - - - - - - - 1 ) Uzorci etarskih ulja biljne vrste Achillea falcata (Af1-nadzemni deo, Af2-koren) i nadzemnih delova vrste A. ageratifolia subsp. serbica (As1 i As2) kao i MPLC frakcija ukupnog ulja As (F1-F12); tr = trag (< 0.05%); - = komponenta nije detektovana. 2) RI = eksperimentalno odreĊeni retencioni indeksi na DB-5MS koloni koinjekcijom homologe serije n-alkana C7-C30. 3 ) ID = Identifikacija; Identitet jedinjenja je potvrĊen poreĊenjem njihovih masenih spektara sa spektrima iz Wiley 6, Nist 02, MassFinder 2.3, izraĉunatih retencionih indeksa sa literaturnim vrednostima ( dams, 2007), koinjekcijom sa odgovarajućim standardom i 13C-NMR analizom. 4) Maseni spektar (EI, 70 eV; m/z, rel. int) neidentifikovane komponente: 221(1), 220(1), 140(10), 139(100), 121(4), 109(5), 96(3), 95(21), 93(4), 81(5), 71(7), 67(4), 55(3), 43(34), 41(3). Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 275 Prilog 8.1.2. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.3. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 276 Prilog 8.1.4. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.5. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 277 Prilog 8.1.6. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.7. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 278 Prilog 8.1.8. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.9. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 279 Prilog 8.1.10. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Prilog 8.1.11. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinola [1] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 280 Prilog 8.1.12. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.13. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 281 Prilog 8.1.14. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.15. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 282 Prilog 8.1.16. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.17. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 283 Prilog 8.1.18. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Prilog 8.1.19. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-formijata [1a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 284 Prilog 8.1.20. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.21. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 285 Prilog 8.1.22. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.23. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 286 Prilog 8.1.24. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.25. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 287 Prilog 8.1.26. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.27. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 288 Prilog 8.1.28. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Prilog 8.1.29. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-acetata [1b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 289 Prilog 8.1.30. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-propanoata [1c] Prilog 8.1.31. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-izobutanoata [1d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 290 Prilog 8.1.32. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-butanoata [1e] Prilog 8.1.33. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-2-metilbutanoata [1f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 291 Prilog 8.1.34. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-3-metilbutanoata [1g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 292 Prilog 8.1.35. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.36. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 293 Prilog 8.1.37. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.38. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 294 Prilog 8.1.39. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.40. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 295 Prilog 8.1.41. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.42. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 296 Prilog 8.1.43. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Prilog 8.1.44. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-tiglata [1h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 297 Prilog 8.1.45. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.46. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 298 Prilog 8.1.47. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.48. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 299 Prilog 8.1.49. 1 H – 1H COSY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.50. DEPT90 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 300 Prilog 8.1.51. DEPT135 spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.52. HSQC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 301 Prilog 8.1.53. HMBC spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Prilog 8.1.54. NOESY spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-senecioata [1i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 302 Prilog 8.1.55. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-angelata [1j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 303 Prilog 8.1.56. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.57. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 304 Prilog 8.1.58. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.59. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 305 Prilog 8.1.60. 1 H – 1H COSY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.61. DEPT90 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 306 Prilog 8.1.62. DEPT135 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.63. HSQC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 307 Prilog 8.1.64. HMBC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.65. NOESY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 308 Prilog 8.1.66. 1 H NMR (400 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.67. 13 C NMR (101 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 309 Prilog 8.1.68. 1 H – 1H COSY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.69. DEPT90 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 310 Prilog 8.1.70. DEPT135 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.71. HSQC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 311 Prilog 8.1.72. HMBC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Prilog 8.1.73. NOESY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 312 Prilog 8.1.74. 13 C NMR (101 MHz, C6D6) spektar bez heteronuklearnog dekuplovanja (1R*,3S*,5R*)-sabinil-nonanoata [1k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 313 Prilog 8.1.75. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.76. IR spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 314 Prilog 8.1.77. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.78. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 315 Prilog 8.1.79. 1 H – 1H COSY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.80. DEPT90 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 316 Prilog 8.1.81. DEPT135 (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.82. HSQC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 317 Prilog 8.1.83. HMBC (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.84. NOESY (CDCl3) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 318 Prilog 8.1.85. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar bez heteronuklearnog dekuplovanja (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 319 Prilog 8.1.86. 1 H NMR (400 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.87. 13 C NMR (101 MHz, C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 320 Prilog 8.1.88. 1 H – 1H COSY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.89. DEPT90 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 321 Prilog 8.1.90. DEPT135 (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.91. HSQC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 322 Prilog 8.1.92. HMBC (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Prilog 8.1.93. NOESY (C6D6) spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-dekanoata [1l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 323 Prilog 8.1.94. Maseni spektar (1R*,3S*,5R*)-sabinil-benzoata [1m] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 324 Prilog 8.2.1. Hemijski sastav etarskih ulja izolovanih iz vrsta Scandix balansae i Scandix pecten-veneris RI 1 Sastojci Klasa 2 S1 3 S2 3 S3 3 S4 3 S5 3 S6 3 S7 3 S8 3 ID 4 763 Butanska kiselina G - - - - - - - 1,6 MS, RI, CoI 784 Butan-2,3-diol G - - - - - - - 0,2 MS, RI 799 Etil-butanoat G - - - - - - - 0,2 MS, RI, CoI 800 Oktan A - - - - - - - tr MS, RI, CoI 827 2-Metilbutanska kiselina G - - - - - - - tr MS, RI, CoI 832 3-Metilbutanska kiselina G - - - - - - - tr MS, RI, CoI 851 (Z)-3-Heksen-1-ol G 4,4 0,2 1,3 54,0 - - - tr MS, RI 871 1-Heksanol G tr - - 7,7 - - - - MS, RI, CoI 934 α-Pinen M - - tr - - - - - MS, RI, CoI 967 Heksanska kiselina G - - - - - - - tr MS, RI, CoI 976 Sabinen M - - 0,4 - - - - - MS, RI, CoI 1020 β-Felandren M 0,1 0,1 - - - - - tr MS, RI 1052 (E)-β-Ocimen M tr 0,1 - - - - - - MS, RI, CoI 1100 Undekan A 0,2 0,7 0,6 - - - - tr MS, RI, CoI 1118 Nonanal FA tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1142 (Z)-3-Heksenil-butanoat G 0,2 0,4 - - - - - tr MS, RI, CoI 1150 Heksil-izobutanoat G tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1200 Dodekan A 0,1 0,2 tr - - - - tr MS, RI, CoI 1210 Dekanal FA - tr - - - - - - MS, RI, CoI 1235 (Z)-3-Heksenil-3-metilbutanoat G tr tr - - - - - - MS, RI 1241 Pulegon M - - - - - - - tr MS, RI 1265 2-Metildodekan A tr tr - - - - tr - MS, RI 1293 1-Tridecen FA tr tr tr - - tr tr tr MS, RI 1300 Tridekan A 24,1 50,7 52,8 8,5 13,9 39,2 22,9 6,7 MS, RI, CoI 1354 4-Hidroksibenzaldehid O - - - - - - - tr MS, RI 1373 Ciklosativen S tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1380 α-Kopaen S tr tr tr tr - - - - MS, RI 1388 β-Burbonen S tr - tr - - - - - MS, RI 1393 β-Elemen S 0,1 - - - - - - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 325 Nastavak priloga 8.2.1. 1397 1-Tetradecen FA tr 0,1 - - - - - tr MS, RI 1400 Tetradekan A 0,5 0,5 tr - - 1,1 - 0,2 MS, RI, CoI 1408 (Z)-Kariofilen S tr tr - - - - - - MS, RI, CoI 1409 Dodekanal FA - - - - - - - tr MS, RI 1416 Metileugenol PP - - - tr - - - - MS, RI, CoI 1424 (E)-Kariofilen S 18,5 13,5 10,0 8,2 tr 0,5 tr tr MS, RI, CoI 1436 β-Kopaen S tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1443 Metil-(4-hidroksifenil)acetat O - - - - - - - 0,7 MS, RI 1450 Metil-4-hidroksibenzoat O - - - - - - - 0,5 MS, RI 1456 (E)-β-Farnezen S tr tr - - - - - - MS, RI, CoI 1461 Humulen S 1,3 0,8 0,5 tr - - - - MS, RI, CoI 1478 Germakren D S tr - 7,2 tr - - - - MS, RI, CoI 1485 trans-Muurola-4(14),5-dien S 0,2 tr - 1,1 - - - - MS, RI 1494 1-Pentadecen FA 0,5 0,3 - - tr 0,5 0,6 0,5 MS, RI 1500 Biciklogermakren S 1,4 - tr - - - - - MS, RI, CoI 1500 Pentadekan A 16,5 19,4 8,5 1,3 10,7 23,5 21,9 13,4 MS, RI, CoI 1511 Tridekanal FA tr - - - - - - tr MS, RI 1513 (E,E)-α-Farnezen S tr - 2,5 - - - - - MS, RI, CoI 1515 (Z)-2-Pentadecen FA 0,4 0,5 - - - - - tr MS, RI 1520 (E)-Metilizoeugenol PP tr - - tr - - - - MS, RI, CoI 1525 δ-Amorfen S 0,4 tr - tr - - - - MS, RI, CoI 1537 6-Decenil-izobutanoat* FA tr 0,1 tr - - - - - MS, RI 1545 Decil-izobutanoat FA tr tr tr tr - - - - MS, RI 1555 Izokariofilen-oksid S tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1559 1-(4-Hidroksi-3-metoksifenil)-2-propanon O - - - - - - - 0,2 MS, RI 1566 Germakren B S 3,4 0,1 tr 4,1 - - - - MS, RI, CoI 1576 Izoĉavikol-butanoat PP 0,7 0,5 - - - 0,5 tr - MS, RI, CoI 1576 1-Tridekanol FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 1580 Spatulenol S - - - - - - - tr MS, RI 1582 Germakren D-4-ol S 0,5 - - - - - - - MS, RI 1586 Kariofilen-oksid S 0,7 0,3 tr tr - - - 0,4 MS, RI, CoI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 326 Nastavak priloga 8.2.1. 1600 Heksadekan A 0,2 0,1 tr - - - tr 0,2 MS, RI, CoI 1603 Humulen-epoksid I S tr - - - - - - - MS, RI, CoI 1612 Tetradekanal FA 3,0 2,7 5,8 8,4 tr - tr 2,7 MS, RI 1630 Metil-4-hidroksimandelat O - - - - - - - 1,1 MS, RI 1632 Decil-3-metilbutanoat FA 0,1 tr - - - - - - MS, RI 1646 Kariofila-4(12),8(13)-dien-5α-ol S 0,3 - - - - - - - MS, RI 1651 epi-α-Muurolol S 0,1 - - - - - - - MS, RI 1657 Eugenil-izobutanoat PP 0,1 tr - - - - - - MS, RI, CoI 1664 α-Kadinol S 0,3 - - tr - - - - MS, RI 1669 Epoksiizoĉavikol-butanoat* PP - - - - - 5,1 0,7 - MS, RI 1669 (E)-2-Tetradecen-1-ol FA - - - - - - - tr MS, RI 1677 1-Tetradekanol FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 1694 1-Heptadecen FA 0,2 0,1 - - - - - 0,5 MS, RI 1700 Heptadekan A 5,2 2,6 1,2 tr 1,7 3,7 5,2 19,3 MS, RI, CoI 1717 (Z)-2-Heptadecen FA 0,1 tr - - - - - tr MS, RI 1720 Pentadekanal FA 0,2 tr - - - - - - MS, RI 1722 (2E,6Z)-Farnezol S tr - - - - - - - MS, RI 1739 (E)-Pseudoizoeugenil-izobutanoat PP 1,0 1,1 tr - 0,7 - - - MS, RI 1756 Tetradekanska kiselina FA - - - - - - - 0,2 MS, RI, CoI 1778 1-Pentadekanol FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 1778 Epoksipseudoizoeugenil-izobutanoat* O 0,3 0,2 - - 10,5 2,4 3,0 tr MS, RI 1802 (Z)-11-Heksadecenal FA tr 0,1 tr 0,7 - - - - MS, RI 1810 (E)-9-Heksadecenal FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 1817 Heksadekanal FA 0,7 0,1 0,8 - 1,5 - 0,7 3,1 MS, RI 1826 (E)-Pseudoizoeugenil-2-metilbutanoat O 0,3 - - - tr - - 0,7 MS, RI 1827 Tridecil-izobutanoat FA 0,2 tr - - - - - - MS, RI, CoI 1836 Neofitadien izomer I D 0,4 - tr - - - 0,7 0,4 MS, RI 1840 Heksahidrofarnezil-aceton O tr - - - - - - 0,2 MS, RI 1841 (E)-Pseudoizoeugenil-3-metilbutanoat PP tr - - - - - - - MS, RI 1861 Neofitadien izomer II D tr tr - - - - - 0,2 MS, RI 1879 Neofitadien izomer III D - - - - - - - 0,4 MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 327 Nastavak priloga 8.2.1. 1885 (E)-Epoksipseudoizoeugenil-2-metilbutanoat PP 0,1 0,3 - - tr - - - MS, RI 1896 1-Nonadecen FA - - - - - - - 0,7 MS, RI 1900 Nonadekan A - tr - - - - - - MS, RI, CoI 1905 (E)-2-Nonadecen FA - - - - - - - 1,3 MS, RI 1913 Metil-heksadekanoat FA tr - - - - - - tr MS, RI 1917 Tridecil-3-metilbutanoat FA 0,1 tr tr - - - tr - MS, RI, CoI 1918 Heptadekanal FA - - - - - - - 0,2 MS, RI, CoI 1927 Tetradecil-izobutanoat FA 0,2 0,1 tr tr 0,9 - tr - MS, RI, CoI 1932 Metil-heksadekanoat FA - - - - - - - 0,2 MS, RI, CoI 1961 Heksadekanska kiselina FA 0,4 tr - - 3,5 0,9 6,1 4,3 MS, RI, CoI 1982 1-Heptadekanol FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 1991 (Z)-13-Oktadecenal FA 0,2 tr tr - tr - - - MS, RI 1992 Etil-heksadekanoat FA 0,2 tr - - - - - 0,2 MS, RI, CoI 2018 Oktadekanal FA 0,2 tr 0,3 tr 0,9 - - 5,1 MS, RI 2021 Tetradecil-3-metilbutanoat FA 0,1 tr tr - 0,7 - 0,4 0,2 MS, RI, CoI 2031 Pentadecil-izobutanoat FA 0,1 tr tr - 0,3 3,3 0,9 - MS, RI, CoI 2049 cis-Falkarinol O tr - - - - - - - MS, RI, CoI 2057 Heptadekanska kiselina FA - - - - - - - tr MS, RI, CoI 2082 1-Heptadekanol FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 2100 Heneikozan A 0,1 0,3 - - - - - - MS, RI, CoI 2102 Metil-(Z,Z,Z)-9,12,15-oktadekatrienoat FA tr - - tr - - tr - MS, RI, CoI 2107 (E)-Fitol D 0,8 - 0,6 - - tr 1,5 3,3 MS, RI 2134 Pentadecil-3-metilbutanoat FA 0,1 tr tr - 2,1 - 0,3 - MS, RI, CoI 2143 Heksadecil-izobutanoat FA 0,1 0,1 tr - 0,5 - 0,6 - MS, RI, CoI 2130 (E,E)-9,12-Oktadekadienska kiselina FA - - - - - - - 2,2 MS, RI 2135 Metil-oktadekanoat FA - - - - - - - 3,8 MS, RI, CoI 2159 Oktadekanska kiselina FA - - - - - - - 0,9 MS, RI, CoI 2163 Etil-(E,E)-9,12-oktadekadienoat FA 0,1 tr - - - - - - MS, RI, CoI 2180 (Z)-3-Heksenil-tetradekanoat FA tr - - - 6,2 - - - MS, RI 2196 Etil-oktadekanoat FA tr tr - - 7,8 - 2,1 - MS, RI, CoI 2200 Dokozan A - - - - - - tr - MS, RI, CoI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 328 Nastavak priloga 8.2.1. 2206 (E)-2-Dokozen FA - - - - - - - tr MS, RI 2216 (E)-Fitil-acetat D - - - - - - tr - MS, RI, CoI 2235 Heksadecil-3-metilbutanoat FA tr tr tr - - - tr - MS, RI, CoI 2243 Heptadecil-izobutanoat FA tr tr tr - - - tr - MS, RI, CoI 2291 1-Eikozanol FA tr - - - - - - 0,2 MS, RI 2300 Trikozan A 0,1 tr 0,2 tr 0,1 - tr 0,2 MS, RI, CoI 2336 Heptadecil-3-metilbutanoat FA tr tr tr - tr - - - MS, RI, CoI 2340 Oktadecil-izobutanoat FA tr tr tr - tr - 0,4 0,2 MS, RI, CoI 2382 (Z)-3-Heksenil-heksadekanoat FA tr - - - - - - - MS, RI, CoI 2383 1-Heneikozanol FA - - - - - - - 0,2 MS, RI 2391 Butil-oktadekanoat FA - - - - - - 1,0 - MS, RI, CoI 2400 Tetrakozan A tr tr tr tr - - tr - MS, RI, CoI 2436 Oktadecil-3-metilbutanoat FA tr tr tr - tr - tr 0,2 MS, RI, CoI 2484 Oktadecil-pentanoat FA - - - - - - - 0,3 MS, RI, CoI 2489 1-Dokozanol FA tr - tr - - - - 0,2 MS, RI 2500 Pentakozan A 0,2 tr 0,3 tr tr - 0,6 0,2 MS, RI, CoI 2562 2-Metilpentakozan A tr - - - - - tr - MS, RI 2600 Heksakozan A 0,1 0,1 tr tr tr - 0,9 tr MS, RI, CoI 2693 1-Heptakozen FA - - - - - - - 0,4 MS, RI 2700 Heptakozan A 1,1 tr 2,0 0,4 2,1 0,8 3,0 1,3 MS, RI, CoI 2736 Metil-tetrakozanoat FA tr - - - tr - - - MS, RI, CoI 2746 Heneikozil-izobutanoat FA tr - - - - - - tr MS, RI, CoI 2765 2-Metilheptakozan A tr - - - - 0,8 tr - MS, RI 2800 Oktakozan A 0,2 tr tr tr tr tr 1,0 0,5 MS, RI, CoI 2808 (E)-Skvalen O 0,1 - tr 1,3 1,8 0,5 1,8 0,5 MS, RI, CoI 2847 Heksakozanal FA tr - - - tr 0,3 - - MS, RI 2900 Nonakozan A 2,8 0,3 3,8 0,9 13,9 6,9 8,4 7,6 MS, RI, CoI 2929 Heptakozanon FA - - - - - - 0,9 - MS, RI, CoI 2947 Trikozil-izobutanoat FA tr - - - - - - - MS, RI, CoI 3000 Triakontan A tr tr tr - tr tr 0,7 0,5 MS, RI, CoI 3049 Oktakozanal FA tr - - - 0,8 0,5 - - MS, RI Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 329 Nastavak priloga 8.2.1. 3100 Hentriakontan A 0,2 0,5 0,3 tr 4,3 2,2 3,3 1,1 MS, RI, CoI 3101 (E)-2-Hentriakonten FA - - - - - - - 0,9 MS, RI 3116 2-Nonakozanon FA tr - - - 0,8 - 1,2 - MS, RI 3180 Triakontanal FA tr - - - 2,3 - - - MS, RI 3200 Dotriakontan A - - - - 1,1 - 0,4 - MS, RI, CoI 3230 2-Triakontanon FA - - - - 2,5 - 3,0 - MS, RI Ukupno (%) 96,0 97,9 99,2 96,6 92,7 93,0 95,3 91,4 Alkani A 51,6 75,4 69,7 11,1 47,8 78,1 68,4 51,2 Diterpeni D 1,2 tr 0,6 - tr tr 2,2 4,3 Jedinjenja šikimatnog puta PP 4,0 2,8 0,1 tr 12,4 8,2 4,3 - “Green leaf” jedinjenja G 4,6 0,6 1.3 61,7 - - - 2,0 Masne kiseline i srodna jedinjenja FA 7,2 4,2 6,9 9,1 30,7 5,5 18,4 29,6 Monoterpeni M 0,1 0,2 0,4 - - - - tr Ostali O 0,1 - - 1,3 1,8 0,5 1,8 3,9 Seskviterpeni S 27,2 14,7 20,2 13,4 tr 0,5 tr 0,4 1 ) Redosled eluiranja sa DB-5MS kolone (RI = vrednosti eksperimentalno odreĊenih retencionih indeksa koinjekcijom homologe serije n- alkana C7-C33); 2 ) Klase jedinjenja: Alkani ( ), diterpeni (D), fenil propanoidi (PP), “green leaf” jedinjenja (G), masne kiseline i srodna jedinjenja (FA), monoterpeni (M), ostali (O), seskviterpeni (S). 3 ) tr = trag (<0,05%), - = komponenta nije detektovana, (S1, S2, S3)- nadzemni delovi, (S4)-plodovi, (S5, S6, S7)-koren biljne vrste S. pecten-veneris, (S8)-plodovi biljne vrste S. balansae. 4 ) ID = identifikacija, MS = identitet komponenti je utvrĊen poreĊenjem njihovih masenih spektara sa spektrima iz Wiley 6, Nist 02, MassFinder 2.3 i interne MS biblioteke, RI = poreĊenjem retencionih indeksa literaturnim vrednostima (Adams, 2007), CoI = koinjekcijom odgovarajućeg standard. *) Nije utvrĊen taĉan izomer. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 330 Prilog 8.2.2. Maseni spektar tridecil-izobutanoata [2a] Prilog 8.2.3. IR spektar tridecil-izobutanoata [2a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 331 Prilog 8.2.4. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tridecil-izobutanoata [2a] Prilog 8.2.5. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tridecil-izobutanoata [2a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 332 Prilog 8.2.6. Maseni spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Prilog 8.2.7. IR spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 333 Prilog 8.2.8. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Prilog 8.2.9. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tridecil-2-metilbutanoata [2b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 334 Prilog 8.2.10. Maseni spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Prilog 8.2.11. IR spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 335 Prilog 8.2.12. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Prilog 8.2.13. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tridecil-3-metilbutanoata [2c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 336 Prilog 8.2.14. Maseni spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Prilog 8.2.15. IR spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 337 Prilog 8.2.16. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Prilog 8.2.17. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-izobutanoata [2d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 338 Prilog 8.2.18. Maseni spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Prilog 8.2.19. IR spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 339 Prilog 8.2.20. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Prilog 8.2.21. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar tetradecil-3-metilbutanoata [2e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 340 Prilog 8.2.22. Maseni spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Prilog 8.2.23. IR spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 341 Prilog 8.2.24. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Prilog 8.2.25. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-izobutanoata [2f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 342 Prilog 8.2.26. Maseni spektar pentadecil-2-metilbutanoata [2g] Prilog 8.2.27. IR spektar pentadecil-2-metilbutanoata [2g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 343 Prilog 8.2.28. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-2-metilbutanoata [2g] Prilog 8.2.29. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-2-metilbutanoata [2g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 344 Prilog 8.2.30. Maseni spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Prilog 8.2.31. IR spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 345 Prilog 8.2.32. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Prilog 8.2.33. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar pentadecil-3-metilbutanoata [2h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 346 Prilog 8.2.34. Maseni spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Prilog 8.2.35. IR spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 347 Prilog 8.2.36. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Prilog 8.2.37. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-izobutanoata [2i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 348 Prilog 8.2.38. Maseni spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Prilog 8.2.39. IR spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 349 Prilog 8.2.40. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Prilog 8.2.41. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heksadecil-3-metilbutanoata [2j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 350 Prilog 8.2.42. Maseni spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Prilog 8.2.43. IR spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 351 Prilog 8.2.44. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Prilog 8.2.45. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-izobutanoata [2k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 352 Prilog 8.2.46. Maseni spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Prilog 8.2.47. IR spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 353 Prilog 8.2.48. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Prilog 8.2.49. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-2-metilbutanoata [2l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 354 Prilog 8.2.50. Maseni spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Prilog 8.2.51. IR spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 355 Prilog 8.2.52. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Prilog 8.2.53. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heptadecil-3-metilbutanoata [2m] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 356 Prilog 8.2.54. Maseni spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Prilog 8.2.55. IR spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 357 Prilog 8.2.56. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Prilog 8.2.57. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-izobutanoata [2n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 358 Prilog 8.2.58. Maseni spektar oktadecil-butanoata [2o] Prilog 8.2.59. IR spektar oktadecil-butanoata [2o] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 359 Prilog 8.2.60. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-butanoata [2o] Prilog 8.2.61. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-butanoata [2o] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 360 Prilog 8.2.62. Maseni spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Prilog 8.2.63. IR spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 361 Prilog 8.2.64. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Prilog 8.2.65. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-2-metilbutanoata [2p] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 362 Prilog 8.2.66. Maseni spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Prilog 8.2.67. IR spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 363 Prilog 8.2.68. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Prilog 8.2.69. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-3-metilbutanoata [2q] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 364 Prilog 8.2.70. Maseni spektar oktadecil-pentanoata [2r] Prilog 8.2.71. IR spektar oktadecil-pentanoata [2r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 365 Prilog 8.2.72. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-pentanoata [2r] Prilog 8.2.73. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar oktadecil-pentanoata [2r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 366 Prilog 8.2.74. Maseni spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Prilog 8.2.75. IR spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 367 Prilog 8.2.76. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Prilog 8.2.77. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar heneikozil-izobutanoata [2s] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 368 Prilog 8.2.78. Maseni spektar trikozil-izobutanoata [2t] Prilog 8.2.79. IR spektar trikozil-izobutanoata [2t] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 369 Prilog 8.2.80. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar trikozil-izobutanoata [2t] Prilog 8.2.81. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar trikozil-izobutanoata [2t] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 370 Prilog 8.2.82. Skraćenice uzoraka predhodno analiziranih etarskih ulja biljnih vrsta iz plemena Scandiceae iskorišćenih za multivarijantnu statistiĉku analizu Skraćenice Biljna vrsta Referenca Anthriscus caucalis M. Bieb. An Ca1-2 Stablo (Chizzola, 2011) An Ca3-4 List (Chizzola, 2011) An Ca5-6 Plod (Chizzola, 2011) Anthriscus cerefolium (L.) Hoffm. var. trichocarpa Neil. An Ce1 Stablo (Chizzola, 2011) An Ce2 List (Chizzola, 2011) An Ce3 Nadzemni deo (Chizzola, 2011) An Ce4-5 Plod (Chizzola, 2011) An Ce6 Nadzemni deo (Başer et al., 1998) Anthriscus nemorosa (M. B.) Speng. An Ne1 Nadzemni deo (Nickavar et al., 2009) An Ne2 Koren (Pavlović et al., 2011) Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm. An Sy1 List (Bos et al., 2002) An Sy2 Koren (Bos et al., 2002) Athamanta haynaldii Borb. & Uechtr. At Ha1 Cvet (Ţivanović et al., 1994) At Ha2 Nezreli plod (Ţivanović et al., 1994) At Ha3 Zreli plod (Ţivanović et al., 1994) At Ha4 Plod (Tomić et al., 2008) Athamanta sicula L. At Si1 Cvet (Camarda et al., 2008) At Si2 Seme (Camarda et al., 2008) At Si3 List (Camarda et al., 2008) Athamanta turbith subsp. hungarica (Borbas) Tutin At Tu1 Plod (Tomić et al., 2008) Chaerophyllum aksekiense A. Duran et Duman Ch Ak Plod (Başer et al., 2000) Chaerophyllum aromaticum L. Ch Ar1-2 List (Chizzola, 2009) Ch Ar3-4 Plod (Chizzola, 2009) Ch Au Chaerophyllum aureum L. (Kapetanos et al., 2008) Chaerophyllum bulbosum L. Ch Bu1 Plod (Kubeczka, 1982) Ch Bu2 Koren (Kubeczka, 1982) Chaerophyllum byzantinum Boiss. Ch By Nadzemni deo (Kürkçüoğlu et al., 2006) Chaerophyllum coloratum L. Ch Co1 Plod (Vajs et al., 1995) Ch Co2 Šizokarp (Vajs et al., 1995) Ch Hi Chaerophyllum hirsutum L. (Kapetanos et al., 2008) Ch Li Chaerophyllum libanoticum Boiss. et Kotschy (Demirci et al., 2007) Chaerophyllum macropodum Boiss. Ch Ma1 List (Ebrahimabadi et al., 2010) Ch Ma2 Cvet (Ebrahimabadi et al., 2010) Ch Te Chaerophyllum temulum L. (Kapetanos et al., 2008) Geocaryum cynapioides (Guss.) L. Engstrand Ge Cy1-2 Nadzemni deo (Radulović et al., 2008) Grammosciadium scabridum Boiss. Gr Sc Nadzemni deo (Nori-Shargh et al., 2007) Molopospermum peloponnesiacum (L.) W. D. J. Koch Mo Pe1 Terpenoidni aldehidi-estarski tip (Kubeczka, 1982) Mo Pe2 Dil apiol tip (Kubeczka, 1982) Myrrhis odorata (L.) Scop. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 371 Nastavak priloga 8.2.82. My Od1 Plod (Kubeczka, 1982) My Od2 Koren (Kubeczka, 1982) Scandix australis L. Sc Au1 Nadzemni deo (Velasco-Negueruela et al., 1991) Sc Au2 Plod (Kubeczka, 1982) Sc Au3 Koren (Kubeczka, 1982) Scandix australis L. subsp. grandiflora (L.) Thell. Sc Au4 Nadzemni deo (Tümen i Başer, 1997) Scandix balansae Reut. ex Boiss. Naši rezultati analize Sc Ba Plod Scandix iberica Bieb. Sc Ib1 Cvet (Kaya et al., 2007) Sc Ib2 Plod (Kaya et al., 2007) Scandix pecten-veneris L. subsp. brachycharpa (Guss.) Tell Sc PVB1 Nadzemni deo (Kubeczka, 1982) Sc PVB2 Koren (Kubeczka, 1982) Scandix pecten-veneris L. subsp. pecten-veneris L. Sc PVP Nadzemni deo (Kubeczka, 1982) Semenovia tragioides Boiss. Se Tr Nadzemni deo (Bamoniri et al., 2010) Sphallerocarpus gracilis (Besser ex Trevir.) Koso-Pol. Sp Gr Seme (Gao et al., 2011) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 372 Prilog 8.3.1. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-formijata (eugenil-formijata) [3a] Prilog 8.3.2. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-acetata (eugenil-acetata) [3b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 373 Prilog 8.3.3. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-propanoata (eugenil-propanoata) [3c] Prilog 8.3.4. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-izobutanoata (eugenil-izobutanoata) [3d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 374 Prilog 8.3.5. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-butanoata (eugenil-butanoata) [3e] Prilog 8.3.6. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 375 Prilog 8.3.7. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2-metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.8. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2-metilbutanoata) [3f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 376 Prilog 8.3.9. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2-metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.10. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 377 Prilog 8.3.11. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.12. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 378 Prilog 8.3.13. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Prilog 8.3.14. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata (eugenil-2- metilbutanoata) [3f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 379 Prilog 8.3.15. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.16. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3-metilbutanoata) [3g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 380 Prilog 8.3.17. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3-metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.18. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3-metilbutanoata) [3g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 381 Prilog 8.3.19. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.20. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 382 Prilog 8.3.21. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.22. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 383 Prilog 8.3.23. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata (eugenil-3- metilbutanoata) [3g] Prilog 8.3.24. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-pentanoata (eugenil-pentanoata) [3h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 384 Prilog 8.3.25. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Prilog 8.3.26. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 385 Prilog 8.3.27. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Prilog 8.3.28. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-angelata (eugenil-angelata) [3i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 386 Prilog 8.3.29. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.30. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 387 Prilog 8.3.31. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil- senecioata) [3j] Prilog 8.3.32. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 388 Prilog 8.3.33. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.34. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 389 Prilog 8.3.35. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Prilog 8.3.36. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 390 Prilog 8.3.37. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-senecioata (eugenil-senecioata) [3j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 391 Prilog 8.3.38. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.39. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 392 Prilog 8.3.40. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil- tiglata) [3k] Prilog 8.3.41. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil- tiglata) [3k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 393 Prilog 8.3.42. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.43. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 394 Prilog 8.3.44. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Prilog 8.3.45. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 395 Prilog 8.3.46. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-tiglata (eugenil-tiglata) [3k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 396 Prilog 8.3.47. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-heksanoata (eugenil-heksanoata) [3l] Prilog 8.3.48. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-heptanoata (eugenil-heptanoata) [3m] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 397 Prilog 8.3.49. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.50. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 398 Prilog 8.3.51. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil- oktanoata) [3n] Prilog 8.3.52. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil- oktanoata) [3n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 399 Prilog 8.3.53. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.54. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 400 Prilog 8.3.55. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Prilog 8.3.56. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 401 Prilog 8.3.57. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktanoata (eugenil-oktanoata) [3n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 402 Prilog 8.3.58. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-nonanoata (eugenil-nonanoata) [3o] Prilog 8.3.59. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-dekanoata (eugenil-dekanoata) [3p] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 403 Prilog 8.3.60. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-dodekanoata (eugenil-dodekanoata) [3q] Prilog 8.3.61. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-tetradekanoata (eugenil-tetradekanoata) [3r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 404 Prilog 8.3.62. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-heksadekanoata (eugenil- heksadekanoata) [3s] Prilog 8.3.63. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-oktadekanoata (eugenil-oktadekanoata) [3t] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 405 Prilog 8.3.64. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoata (eugenil-(Z)-9- oktadecenoata) [3u] Prilog 8.3.65. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 406 Prilog 8.3.66. IR spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.67. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil- benzoata) [3v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 407 Prilog 8.3.68. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil- benzoata) [3v] Prilog 8.3.69. 1 H – 1H COSY spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 408 Prilog 8.3.70. DEPT spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.71. HSQC spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 409 Prilog 8.3.72. HMBC spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Prilog 8.3.73. NOESY spektar 4-alil-2-metoksifenil-benzoata (eugenil-benzoata) [3v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 410 Prilog 8.3.74. Maseni spektar 4-alil-2-metoksifenil-salicilata (eugenil-salicilata) [3w] Prilog 8.3.75. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-formijata [4a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 411 Prilog 8.3.76. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-acetata [4b] Prilog 8.3.77. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-propanoata [4c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 412 Prilog 8.3.78. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-izobutanoata [4d] Prilog 8.3.79. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-butanoata [4e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 413 Prilog 8.3.80. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-2-metilbutanoata [4f] Prilog 8.3.81. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-3-metilbutanoata [4g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 414 Prilog 8.3.82. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-pentanoata [4h] Prilog 8.3.83. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-angelata [4i] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 415 Prilog 8.3.84. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-senecioata [4j] Prilog 8.3.85. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-tiglata [4k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 416 Prilog 8.3.86. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-heksanoata [4l] Prilog 8.3.87. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-heptanoata [4m] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 417 Prilog 8.3.88. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-oktanoata [4n] Prilog 8.3.89. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-nonanoata [4o] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 418 Prilog 8.3.90. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-dekanoata [4p] Prilog 8.3.91. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-dodekanoata [4q] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 419 Prilog 8.3.92. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-tetradekanoata [4r] Prilog 8.3.93. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-heksadekanoata [4s] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 420 Prilog 8.3.94. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-oktadekanoata [4t] Prilog 8.3.95. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoata [4u] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 421 Prilog 8.3.96. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-benzoata [4v] Prilog 8.3.97. Maseni spektar 2-alil-4-metoksifenil-salicilata [4w] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 422 Prilog 8.3.98. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-formijata [5a] Prilog 8.3.99. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-acetata [5b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 423 Prilog 8.3.101. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-propanoata [5c] Prilog 8.3.101. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-izobutanoata [5d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 424 Prilog 8.3. 102. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-butanoata [5e] Prilog 8.3.103. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-2-metilbutanoata [5f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 425 Prilog 8.3.104. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-3-metilbutanoata [5g] Prilog 8.3.105. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 426 Prilog 8.3.106. IR spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.107. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 427 Prilog 8.3.108. 13 C NMR (150 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.109. 1 H – 1H COSY spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 428 Prilog 8.3.110. DEPT spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Prilog 8.3.111. HSQC spektar 2-alil-3-metoksifenil-pentanoata [5h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 429 Prilog 8.3.112. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-angelata [5i] Prilog 8.3.113. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-senecioata [5j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 430 Prilog 8.3.114. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.115. IR spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 431 Prilog 8.3.116. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.117. 13 C NMR (150 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 432 Prilog 8.3.118. 1 H – 1H COSY spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.119. DEPT spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 433 Prilog 8.3.120. HSQC spektar 2-alil-3-metoksifenil-tiglata [5k] Prilog 8.3.121. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-heksanoata [5l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 434 Prilog 8.3.122. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-heptanoata [5m] Prilog 8.3.123. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-oktanoata [5n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 435 Prilog 8.3.124. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-nonanoata [5o] Prilog 8.3.125. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-dekanoata [5p] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 436 Prilog 8.3.126. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-dodekanoata [5q] Prilog 8.3.127. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-tetradekanoata [5r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 437 Prilog 8.3.128. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-heksadekanoata [5s] Prilog 8.3.129. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-oktadekanoata [5t] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 438 Prilog 8.3.130. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-(Z)-9-oktadecenoata [5u] Prilog 8.3.131. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-benzoata [5v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 439 Prilog 8.3.132. Maseni spektar 2-alil-3-metoksifenil-salicilata [5w] Prilog 8.3.133. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-formijata [6a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 440 Prilog 8.3.134. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-acetata [6b] Prilog 8.3.135. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-propanoata [6c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 441 Prilog 8.3.136. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-izobutanoata [6d] Prilog 8.3.137. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-butanoata [6e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 442 Prilog 8.3.138. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-2-metilbutanoata [6f] Prilog 8.3.139. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-3-metilbutanoata [6g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 443 Prilog 8.3.140. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-pentanoata [6h] Prilog 8.3.141. IR spektar 2-alil-5-metoksifenil-pentanoata [6h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 444 Prilog 8.3.142. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-angelata [6i] Prilog 8.3.143. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-senecioata [6j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 445 Prilog 8.3.144. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.145. IR spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 446 Prilog 8.3.146. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 447 Prilog 8.3.147. 13 C NMR (150 MHz, CDCl3) spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.148. 1 H – 1H COSY spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 448 Prilog 8.3.149. DEPT spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Prilog 8.3.150. HSQC spektar 2-alil-5-metoksifenil-tiglata [6k] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 449 Prilog 8.3.151. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-heksanoata [6l] Prilog 8.3.152. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-heptanoata [6m] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 450 Prilog 8.3.153. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-oktanoata [6n] Prilog 8.3.154. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-nonanoata [6o] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 451 Prilog 8.3.155. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-dekanoata [6p] Prilog 8.3.156. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-dodekanoata [6q] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 452 Prilog 8.3.157. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-tetradekanoata [6r] Prilog 8.3.158. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-heksadekanoata [6s] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 453 Prilog 8.3.159. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-oktadekanoata [6t] Prilog 8.3.160. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoata [6u] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 454 Prilog 8.3.161. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-benzoata [6v] Prilog 8.3.162. Maseni spektar 2-alil-5-metoksifenil-salicilata [6w] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 455 Prilog 8.3.163. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-formijata [7a] Prilog 8.3.164. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-acetata [7b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 456 Prilog 8.3.165. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-propanoata [7c] Prilog 8.3.166. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-izobutanoata [7d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 457 Prilog 8.3.167. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-butanoata [7e] Prilog 8.3.168. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-2-metilbutanoata [7f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 458 Prilog 8.3.169. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-3-metilbutanoata [7g] Prilog 8.3.170. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-pentanoata [7h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 459 Prilog 8.3.171. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-angelata [7i] Prilog 8.3.172. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-senecioata [7j] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 460 Prilog 8.3.173. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-tiglata [7k] Prilog 8.3.174. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-heksanoata [7l] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 461 Prilog 8.3.175. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-heptanoata [7m] Prilog 8.3.176. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-oktanoata [7n] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 462 Prilog 8.3.177. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-nonanoata [7o] Prilog 8.3.178. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-dekanoata [7p] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 463 Prilog 8.3.179. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-dodekanoata [7q] Prilog 8.3.180. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-tetradekanoata [7r] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 464 Prilog 8.3.181. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-heksadekanoata [7s] Prilog 8.3.182. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-oktadekanoata [7t] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 465 Prilog 8.3.183. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-(Z)-9-octadecenoata [7u] Prilog 8.3.184. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-benzoata [7v] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 466 Prilog 8.3.185. Maseni spektar 2-alil-6-metoksifenil-salicilata [7w] Prilog 8.3.186. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata [8a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 467 Prilog 8.3.187. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata [8b] Prilog 8.3.188. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-pentanoata [8c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 468 Prilog 8.3.189. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-angelata [8d] Prilog 8.3.190. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-senecioata [8e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 469 Prilog 8.3.191. Maseni spektar 5-alil-2-metoksifenil-tiglata [8f] Prilog 8.3.192. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-2-metilbutanoata [9a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 470 Prilog 8.3.193. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-3-metilbutanoata [9b] Prilog 8.3.194. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-pentanoata [9c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 471 Prilog 8.3.195. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-angelata [9d] Prilog 8.3.196. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-senecioata [9e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 472 Prilog 8.3.197. Maseni spektar 3-alil-2-metoksifenil-tiglata [9f] Prilog 8.3.198. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-2-metilbutanoata [10a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 473 Prilog 8.3.199. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-3-metilbutanoata [10b] Prilog 8.3.200. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-pentanoata [10c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 474 Prilog 8.3.201. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-angelata [10d] Prilog 8.3.202. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-senecioata [10e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 475 Prilog 8.3.203. Maseni spektar 4-alil-3-metoksifenil-tiglata [10f] Prilog 8.3.204. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-2-metilbutanoata [11a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 476 Prilog 8.3.205. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-3-metilbutanoata [11b] Prilog 8.3.206. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-pentanoata [11c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 477 Prilog 8.3.207. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-angelata [11d] Prilog 8.3.208. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-senecioata [11e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 478 Prilog 8.3.209. Maseni spektar 3-alil-4-metoksifenil-tiglata [11f] Prilog 8.3.210. QS R jednaĉine za izraĉunavanje teorijskih vrednosti retencionih indeksa estara regioizomera alilmetoksifenola (Molekulski Topološki Indeks (MTI), Balaban (B) i Viner (Wiener; W) indeks) Formijati: RI = 3,989755493164E+003 - 2,166670680046E+000*(B) - 1,375000663102E+000*(MTI) + 4,212507476807E+002*(W) Acetati: RI = 6,691173934937E+001 + 4,540009573102E-001*(B) - 8,146362397820E-001*(MTI) - 9,102171158791E+001*(W) Propanoati: RI = -1,345571050644E+002 + 4,017797328997E-001*(B) - 6,848248681054E-001*(MTI) - 9,266377073526E+001*(W) Izobutanoati: RI = 2,614200830460E+002 + 1,990455309860E-001*(B) - 6,834448345471E-001*(MTI) - 4,914413464069E+001*(W) Butanoati: Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 479 RI = 8,363445425034E+002 + 4,557566903532E-002*(B) - 6,340967561118E-001*(MTI) - 6,672153234482E+000*(W) Pentanoati: RI = 2,937264127731E+002 + 1,462281949352E-001*(B) - 6,300567130093E-001*(MTI) - 3,972449481487E+001*(W) Heksanoati: RI = 3,880983176231E+002 + 9,138613881078E-002*(B) - 5,992980105802E-001*(MTI) - 2,610789650679E+001*(W) Heptanoati: RI = 3,882352986336E+002 + 7,527960161678E-002*(B) - 5,337888817303E-001*(MTI) - 2,394290554523E+001*(W) Oktanoati: RI = 3,650090432167E+002 + 6,400980986655E-002*(B) - 4,879703922197E-001*(MTI) - 2,257200330496E+001*(W) Nonanoati: RI = 3,455220279694E+002 + 5,488949717255E-002*(B) - 4,222155392636E-001*(MTI) - 2,156522563100E+001*(W) Dekanoati: RI = 2,320351114273E+002 + 5,732058582362E-002*(B) - 3,576766909100E-001*(MTI) - 2,582212340832E+001*(W) Dodekanoati: RI = 2,461459026337E+002 + 3,532712726155E-002*(B) - 3,466657700483E-001*(MTI) - 1,801709163189E+001*(W) Tetradekanoati: RI = 1,339600601196E+002 + 2,926124306396E-002*(B) - 2,837756783701E-001*(MTI) - 1,790177613497E+001*(W) Heksadekanoati: RI = -4,535357074738E+002 + 3,576147375861E-002*(B) - 2,112057888880E-001*(MTI) - 2,707711011171E+001*(W) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 480 Oktadekanoati: RI = 1,205457687378E+001 + 1,966713496950E-002*(B) - 1,769717424177E-001*(MTI) - 1,656938421726E+001*(W) Oleati: RI = -3,717486724854E+002 + 2,404806966661E-002*(B) - 1,995798796415E-001*(MTI) - 2,046914321184E+001*(W) Benzoati: RI = 7,414566371441E+002 + 8,079306007130E-002*(B) - 4,274292086484E-001*(MTI) - 1,752589645982E+001*(W) Salicilati: RI = 6,643770780563E+002 + 6,299481657334E-002*(B) - 4,776749685407E-001*(MTI) - 1,408468650281E+001*(W) 2-Metilbutanoati: RI = 6,137265276909E+002 + 7,388932147296E-002*(B) - 6,519615489524E-001*(MTI) - 1,694684320688E+001*(W) Izovalerati: RI = 4,493946166039E+002 + 9,209619613830E-002*(B) - 6,099579471629E-001*(MTI) - 2,286093458533E+001*(W) Tiglati: RI = 2,272391700745E+001 + 1,611401839182E-001*(B) - 7,031325402204E-001*(MTI) - 4,343090942502E+001*(W) Angelati: RI = -1,606432580948E+001 + 1,972664503846E-001*(B) - 6,384534031386E-001*(MTI) - 5,552042612433E+001*(W) Senecioati: RI = -7,203476715088E+001 + 1,848236022051E-001*(B) - 7,007778463885E-001*(MTI) - 5,092970725894E+001*(W) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 481 Prilog 8.4.1. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Prilog 8.4.2. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 482 Prilog 8.4.3. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Prilog 8.4.4. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 483 Prilog 8.4.5. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.6. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 484 Prilog 8.4.7. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.8. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 485 Prilog 8.4.9. DEPT spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Prilog 8.4.10. NOESY spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3-oksobutanoata [12b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 486 Prilog 8.4.11. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.12. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 487 Prilog 8.4.13. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.14. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 488 Prilog 8.4.15. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.16. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 489 Prilog 8.4.17. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.18. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-metil-3- oksobutanoata [12b] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 490 Prilog 8.4.19. Maseni spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3-oksobutanoata [12c] Prilog 8.4.20. IR spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3-oksobutanoata [12c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 491 Prilog 8.4.21. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3- oksobutanoata [12c] Prilog 8.4.22. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-(ferocenilmetil)-2-etil-3- oksobutanoata [12c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 492 Prilog 8.4.23. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.24. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 493 Prilog 8.4.25. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Prilog 8.4.26. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 494 Prilog 8.4.27. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Prilog 8.4.28. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 495 Prilog 8.4.29. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.30. DEPT spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 496 Prilog 8.4.31. HSQC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Prilog 8.4.32. HMBC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 497 Prilog 8.4.33. NOESY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 498 Prilog 8.4.34. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.35. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 3 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 499 Prilog 8.4.36. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.37. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 6 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 500 Prilog 8.4.38. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.39. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 9 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 501 Prilog 8.4.40. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.41. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 12 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 502 Prilog 8.4.42. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.43. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 503 Prilog 8.4.44. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.45. DEPT spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 504 Prilog 8.4.46. HSQC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.47. HMBC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 505 Prilog 8.4.48. NOESY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4-enoata [12d] nakon dodavanja 15 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 506 Prilog 8.4.49. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 18 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Prilog 8.4.50. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)pent-4- enoata [12d] nakon dodavanja 18 mg reagensa hemijskog pomeranja (Eu(fod)3) Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 507 Prilog 8.4.51. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metilpent-4-enoata [12e] Prilog 8.4.52. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4-metilpent-4-enoata [12e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 508 Prilog 8.4.53. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4- metilpent-4-enoata [12e] Prilog 8.4.54. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-4- metilpent-4-enoata [12e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 509 Prilog 8.4.55. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.56. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 510 Prilog 8.4.57. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.58. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 511 Prilog 8.4.59. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.60. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5- metilheks-4-enoata [12f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 512 Prilog 8.4.61. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.62. DEPT spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 513 Prilog 8.4.63. HSQC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Prilog 8.4.64. HMBC spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 514 Prilog 8.4.65. NOESY spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)-5-metilheks-4-enoata [12f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 515 Prilog 8.4.66. Maseni spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Prilog 8.4.67. IR spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 516 Prilog 8.4.68. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Prilog 8.4.69. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-(ferocenilmetil)oktanoata [12g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 517 Prilog 8.4.70. Maseni spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12h] Prilog 8.4.71. IR spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3-oksobutanoata [12h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 518 Prilog 8.4.72. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3- oksobutanoata [12h] Prilog 8.4.73. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-(ferocenilmetil)-3- oksobutanoata [12h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 519 Prilog 8.4.74. Maseni spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Prilog 8.4.75. IR spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 520 Prilog 8.4.76. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Prilog 8.4.77. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-3-oksobutanoata [13a] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 521 Prilog 8.4.78. Maseni spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Prilog 8.4.79. IR spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 522 Prilog 8.4.80. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Prilog 8.4.81. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-metil-3-oksobutanoata [13b] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 523 Prilog 8.4.82. Maseni spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Prilog 8.4.83. IR spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 524 Prilog 8.4.84. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Prilog 8.4.85. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-benzil-2-etil-3-oksobutanoata [13c] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 525 Prilog 8.4.86. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.87. IR spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 526 Prilog 8.4.88. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.89. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 527 Prilog 8.4.90. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.91. 13 C NMR (101 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 528 Prilog 8.4.92. 1 H – 1H COSY spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.93. DEPT spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 529 Prilog 8.4.94. HSQC spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Prilog 8.4.95. HMBC spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 530 Prilog 8.4.96. NOESY spektar metil-2-acetil-2-benzilpent-4-enoata [13d] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 531 Prilog 8.4.97. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4-enoata [13e] Prilog 8.4.98. IR spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4-enoata [13e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 532 Prilog 8.4.99. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4- enoata [13e] Prilog 8.4.100. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-4-metilpent-4- enoata [13e] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 533 Prilog 8.4.101. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4-enoata [13f] Prilog 8.4.102. IR spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4-enoata [13f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 534 Prilog 8.4.103. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4- enoata [13f] Prilog 8.4.104. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benzil-5-metilheks-4- enoata [13f] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 535 Prilog 8.4.105. Maseni spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Prilog 8.4.106. IR spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 536 Prilog 8.4.107. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Prilog 8.4.108. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-benziloktanoata [13g] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 537 Prilog 8.4.109. Maseni spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Prilog 8.4.110. IR spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 538 Prilog 8.4.111. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Prilog 8.4.112. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2,2-dibenzil-3-oksobutanoata [13h] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 539 Prilog 8.4.113. Maseni spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Prilog 8.4.114. IR spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 540 Prilog 8.4.115. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Prilog 8.4.116. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-alilpent-4-enoata [14] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 541 Prilog 8.4.117. Maseni spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Prilog 8.4.118. IR spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 542 Prilog 8.4.119. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Prilog 8.4.120. 13 C NMR (50 MHz, CDCl3) spektar metil-2-acetil-2-propilpentanoata [15] Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 543 9. BIOGRAFIJA AUTORA Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 544 Marko Mladenović je roĊen 31.03.1987. godine u Leskovcu. Osnovnu školu „Braća Milenković” i prirodno-matematiĉki smer Gimnazije „Stevan Jakovljević” završio je kao uĉenik generacije i nosilac diplome „Vuk Karadţić”. Dobitnik je specijalnog priznanja princa leksandra KaraĊorĊevića za izuzetan uspeh u srednjoj školi, 2006. godine. Prirodno-matematiĉki fakultet u Nišu, Odsek za hemiju, upisao je školske 2006/07. godine. Studije je završio 2010. godine, sa proseĉnom ocenom 9,40 i ocenom 10 na diplomskom radu. Dobitnik je godišnje nagrade Srpskog hemijskog društva za 2011. godinu za izuzetan uspeh u toku studija. Doktorske akademske studije na Departmanu za hemiju istog fakulteta upisao je školske 2010/11. Poloţio je sve ispite predviĊene studijskim programom sa ocenom 10. Završio je školu masene spektrometrije - The Mass Spectrometry in Environmental Pollutants Detection - koju su organizovali Prirodno-matematiĉki fakultet u Nišu i Université Pierre et Marie Curie (Pariz) 2013 i 2014. godine. Školske 2013/2014 godine je bio angaţovan za izvoĊenje studentskih veţbi iz predmeta Principi organske sinteze, a školske 2016/2017 za izvoĊenje studentskih veţbi iz predmeta Preparativna organska hemija na Departmanu za hemiju Prirodno-matematiĉkog fakulteta u Nišu. Od 01.02.2011. godine kao istraţivaĉ-pripravnik a od 24. 04. 2013. godine kao istraţivaĉ-saradnik uĉestvuje na projektu „Kombinatorne biblioteke heterogenih katalizatora, prirodnih proizvoda, modifikovanih prirodnih proizvoda i njihovih analoga: put ka novim biološkim agensima”. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 545 10. BIBLIOGRAFIJA Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 546 М21 – Radovi objavljeni u vrhunskim meĎunarodnim časopisima  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Polina D. Blagojević, Zorica Z. Stojanović- Radić, Tatjana Ilic-Tomic, Lidija Senerovic, Jasmina Nikodinovic-Runic “Toxic essential oils. Part III: Identification and biological activity of new allylmethoxyphenyl esters from a Chamomile species (Anthemis segetalis Ten.)”, Food and Chemical Toxicology 2013, 62, 554-565.  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Zorica Stojanović-Radić, Goran . Bogdanović, Dragana Stevanović, Rastko D. Vukićević “Synthesis, characterization and antimicrobial evaluation of a small library of ferrocene-containing acetoacetates and phenyl analogs - the discovery of a potent anticandidal agent”, Molecular Diversity 2014, 18, 497- 510.  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Zorica Stojanović-Radić, “Synthesis of small libraries of natural products: New esters of long-chain alcohols from the essential oil of Scandix pecten-veneris L. (Apiaceae)”, Flavour and Fragrance Journal 2014, 29, 255-266.  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Pavle J. Randjelovic, Nikola M. Stojanović, Milan S. Dekić, Polina D. Blagojević “Toxic essential oils. Part IV: The essential oil of Achillea falcata L. as a source of biologically/pharmacologically active trans-sabinyl esters”, Food and Chemical Toxicology 2015, 80, 114-129.  Marko Z. Mladenović, Niko S. Radulović, “The essential oil of Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl (Asteraceae) revisited: the stereochemical nomenclature issues, structural elucidation and synthesis of (new) sabinyl esters”, Flavour and Fragrance Journal 2017, 32, 5-23. М22 – Radovi objavljeni u istaknutim meĎunarodnim časopisima  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Nevenka D. ĐorĊević, “Chemotypification of Astrantia major L. (Apiaceae): Essential oil and Lignan Profiles of fruits”, Chemistry and biodiversity 2012, 9, 1320-1337.  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Polina D. Blagojević, “ „Low-Level‟ Chemotaxonomic Analysis of the Plant Family Apiaceae: The Case of Scandix balansae Reut. ex Boiss. (Tribe Scandiceae)”, Chemistry and biodiversity 2013, 10, 1202-1219. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 547  Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Polina D. Blagojević, “(Un)Targeted Metabolomics in Asteraceae: Probing the Applicability of Essential-Oil Profiles of Senecio L. (Senecioneae) Taxa in Chemotaxonomy”, Chemistry and biodiversity 2014, 11, 1330-1353.  Tatjana Mitrović, Slaviša Stamenković, Vladimir Cvetković, Niko Radulović, Marko Mladenović, Milan Stanković, Marina Topuzović, Ivana Radojević, Olgica Stefanović, Sava Vasić, Ljiljana Ĉomić, “Platismatia glauca and Pseudoevernia furfuracea lichens as sources of antioxidant, antimicrobial and antibiofilm agents”, EXCLI Journal 2014, 13, 938-953. М23 – radovi objavljeni u meĎunarodnim časopisima • Tatjana Lj. Mitrović, Slaviša M. Stamenković, Vladimir J. Cvetković, Niko S. Radulović, Marko Z. Mladenović, Milan S. Stanković, Marina D. Topuzović, Ivana D. Radojević, Olgica D. Stefanović, Sava M. Vasić, Ljiljana R. Ĉomić, Dragana S. Šeklić, na D. Obradović, Sneţana D. Marković, “Contribution to the knowledge of the chemical composition and biological activity of the lichens Cladonia foliacea Huds. (Wild.) and Hypogymnia physodes (L.)”, Oxidation communications 2016, 38, 2016-2032.  Niko S. Radulović, Vojkan M. Miljković, Marko Z. Mladenović, Goran S. Nikolić “Essential oils of Morus alba and M. nigra leaves: Effect of drying on the chemical composition”, Natural Product Communications 2017, 12, 115-118. М52 – radovi objavljeni u časopisu nacionalnog značaja  Marko Z. Mladenović, Niko S. Radulović, “Quantitative structure-retention relationship of gas chromatographic retention indices of long-chain esters: The case of Scandix-pecten veneris L. essential-oil constituents”, Facta Universitatis, Series Physics, Chemistry and Technology 2016, 14, 97-104. М34 – Radovi saopšteni na meĎunarodnim skupovima objavljeni u izvodu  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović; New esters of long chain alcohols and isobutanoic and isovaleric acids from the essential oil of Scandix pecten-veneris L. (Apiaceae); P-19, Book of Abstract 2012, 43 th International Symposium on Essential Oils, Lisbon, Portugal.  N. S. Radulović, P. D. Blagojević, M. Z. Mladenović; Volatile secondary metabolites of Senecio vernalis Waldst. & Kit.; P-20, Book of Abstract 2012, 43 th International Symposium on Essential Oils, Lisbon, Portugal. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 548  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović, N. D. ĐorĊević; Chemotypification of Astrantia major L. (Apiaceae) inferred from its fruit essential oil profile; P-29, Book of Abstract 2012, 43 th International Symposium on Essential Oils, Lisbon, Portugal.  P. J. RanĊelović, N. S. Radulović, M. Z. Mladenović, N. M. Stojanović, M. S. Dekić; Biologically active trans-sabinol esters from the essential oil of Achillea falcata L. (Asteraceae); PP-160, Book of Abstract 2014, 45 th International Symposium on Essential Oils, Istanbul, Turkey.  P. D. Blagojević, N. S. Radulović, M. Z. Mladenović, Z. Z. Stojanović-Radić, T. Ilić- Tomić, L. Senerović, J. Nikodinović-Runić; Identification and biological activity of allylmethoxyphenyl esters from Anthemis segetalis Ten. (Asteraceae) essential oil; PP-163, Book of Abstract 2014, 45 th International Symposium on Essential Oils, Istanbul, Turkey.  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović, M. D. Vukićević, R. D. Vukićević; Volatile secondary metabolites of Conocephalum conicum (L.) Dum. from Serbia; PP-150, Book of Abstract 2014, 45 th International Symposium on Essential Oils, Istanbul, Turkey.  P. D. Blagojević, N. S. Radulović, M. Z. Mladenović; Chemical analysis of Scandix balansae Reut. ex Boiss. (tribe Scandiceae) fruit essential oil and a “low-level” chemotaxonomic analysis of the plant family Apiaceae; PP-164, Book of Abstract 2014, 45 th International Symposium on Essential Oils, Istanbul, Turkey.  N. M. Stojanović, P. J. Randjelović, I. R. Ilić, M. Z. Mladenović, N. S. Radulović; The first report on the acute toxicity of the highly valued essential oil of lemon balm (Melissa officinalis L., Lamiaceae) in female BALB/c mice; OP-1, Book of Abstract 2016, 47 th International Symposium on Essential Oils, Nice, France.  V. M. Miljković, M. Z. Mladenović, G. Nikolić, N. S. Radulović; Effect of drying on the volatile profile of Morus alba L. and M. nigra L. leaves; PP-59, Book of Abstract 2016, 47 th International Symposium on Essential Oils, Nice, France. М64 - Radovi saopšteni na skupovima nacionalnog značaja objavljeni u izvodu  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović; Synthesis of methoxy-(propenyl)phenyl esters from the essential oil of Anthemis segetalis Ten. (Asteraceae); BH15-P, Book of Abstracts 2011, 49 th Meeting of the Serbian Chemical Society, Kragujevac, Serbia.  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović; New octadecyl esters from the essential oil of Scandix balansae Reut. ex Boiss (Apiaceae) fruits; BH-P4, Book of Abstracts 2012, 50 th Meeting of the Serbian Chemical Society, Belgrade, Serbia. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 549  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović; New esters of long chain alcohols and isobutanoic and isovaleric acids from the essential oil of Scandix pecten-veneris L. (Apiaceae); HA P16, Book of Abstract 2012, First international conference of young chemists of Serbia, Belgrade, Serbia.  N. S. Radulović, P. D. Blagojević, M. Z. Mladenović; Volatile secondary metabolites of Senecio vernalis Waldst. & Kit.; HA P17, Book of Abstract 2012, First international conference of young chemists of Serbia, Belgrade, Serbia.  M. Z. Mladenović, N. S. Radulović; New esters of trans-sabinol from the essential oil of Achillea serbica Nym. (Asteraceae): synthesis and structural elucidation; HA P09, Book of Abstract 2015, Third international conference of young chemists of Serbia, Belgrade, Serbia.  N. S. Radulović, M. Z. Mladenović, P. D. Blagojević; A low-level chemotaxonomic analysis of the plant family Apiaceae: the case of Scandix balansae Reut. ex Boiss. (tribe Scandiceae); Book of Abstract 2013, 11 th Symposium on the Flora of Southeastern Serbia and Neighbouring Regions, Vlasina, Serbia.  M. Z. Mladenović, N. S. Radulović, Z. Z. Stojanović-Radić, D. Stevanović, R. D. Vukićević; Synthesis, characterization and antimicrobial evaluation of a small library of ferrocene-containing acetoacetates and phenyl analogs-the discovery of a potent anticandidal agent; OH-P01, Book of Abstracts 2014, 51 th Meeting of the Serbian Chemical Society, Nis, Serbia.  N. S. Radulović, M. G. Nikolić, M. Z. Mladenović, R. D. Vukićević; Synthesis and spectral characterization of a library of 1-phenylpyrazoles containing a ferrocene unit and their phenyl analogues; OH-P03, Book of Abstracts 2014, 51 th Meeting of the Serbian Chemical Society, Nis, Serbia.  M. Z. Mladenović, N. S. Radulović, S. Filipović; The essential oil of Achillea ageratifolia (Sm.) Boiss. subsp. serbica (Nyman) Heimerl (Asteraceae) revisited: structural elucidation and synthesis of (new) sabinyl esters; Book of Abstract 2016, 12 th Symposium on the Flora of Southeastern Serbia and Neighbouring Regions, Kopaonik, Serbia. Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 550 11. IZJAVE AUTORA Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 551 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 552 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 553 Kombinatorne biblioteke odabranih prirodnih i sintetskih biološki aktivnih estara 554 ТИПОВИ ЛИЦЕНЦИ 1. Ауторство. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора, на начин одређен од аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци (CC BY 3.0). 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора, на начин одређен од аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела (CC BY-NC 3.0). 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе вашег дела у делима других аутора, ако се наведе име аутора, на начин одређен од аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела (CC BY-NC-ND 3.0). 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора, на начин одређен од аутора или даваоца лиценце, и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прераде (CC BY-NC-SA 3.0). 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе вашег дела у делима других аутора, ако се наведе име аутора, на начин одређен од аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела (CC BY-ND 3.0). 6. Ауторство – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора, на начин одређен од аутора или даваоца лиценце, и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода (CC BY-SA 3.0).