UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Marija S. Kostadinović SELEKCIJA LINIJA KUKURUZA SA POBOLJŠANIM KVALITETOM PROTEINA I ADAPTIRANIH NA UMERENO KLIMATSKO PODRUČJE UPOTREBOM MOLEKULARNIH MARKERA Doktorska disertacija Beograd, 2015. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Marija S. Kostadinović MARKER ASSISTED SELECTION FOR QUALITY PROTEIN MAIZE INBRED LINES ADAPTED TO TEMPERATE REGIONS Doctoral Dissertation Belgrade, 2015 Mentori: dr Marina Stamenković-Radak, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet dr Dragana Ignjatović-Micić, naučni savetnik, Institut za kukuruz „Zemun Polje“, Beograd Član komisije za ocenu doktorske disertacije: dr Jelena Vančetović, naučni savetnik, Institut za kukuruz „Zemun Polje“, Beograd Datum odbrane:________________ ZAHVALNICA Zahvaljujem se Institutu za kukuruz „Zemun Polje“ što mi je omogućio izradu ove doktorske disertacije. Želim od srca da se zahvalim svom mentoru u Institutu za kukuruz „Zemun Polje“ dr Dragani Ignjatović-Micić na velikoj podršci, pomoći, usmeravanju, stručnim savetima i svemu što me je oblikovalo u mom istraživačkom radu i omogućilo izradu doktorske disertacije. Zahvaljujem se svom mentoru sa Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu prof dr Marini Stamenković Radak na izuzetnoj profesionalnosti i pristupačnosti, kao i na veoma korisnim sugestijama tokom doktorskih studija i izrade ove disertacije. Ogromnu zahvalnost dugujem dr Jeleni Vančetović na dragocenim stručnim savetima, idejama i predlozima, kao i na podršci i zalaganju pri izradi disertacije. Veliko hvala kolegama iz Laboratorije za molekularnu genetiku i fiziologiju, a naročito dr Danijeli Ristić na nesebičnoj pomoći pri izradi eksperimentalnog dela disertacije kako u laboratoriji, tako i u polju, kao i Snežani Mladenović Drinić, rukovodiocu projekta „Poboljšanje svojstava kukuruza i soje molekularnim i konvencionalnim oplemenjivanjem“ finansiranog od strane Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja u okviru koga je izrađena ova disertacija. Zahvaljujem se dr Sofiji Božinović na organizacionoj pomoći pri realizaciji eksperimentalnog dela disertacije u poljskim ogledima, kao i pri statističkoj obradi rezultata. Hvala članovima istraživačke grupe dr Jelene Vančetović i mr Gorana Stankovića na tehničkoj pomoći pri realizaciji eksperimentalnog dela disertacije u poljskim ogledima. Posebnu zahvalnost dugujem svojoj porodici i prijateljima na ogromnoj podršci i ljubavi. Ovu disertaciju posvećujem mami koja je najzaslužnija za sve ono što jesam danas. SELEKCIJA LINIJA KUKURUZA SA POBOLJŠANIM KVALITETOM PROTEINA I ADAPTIRANIH NA UMERENO KLIMATSKO PODRUČJE UPOTREBOM MOLEKULARNIH MARKERA REZIME Hranljiva vrednost kukuruza je niska zbog niskog sadržaja dve esencijalne aminokiseline - lizina i triptofana. Poboljšanje hranljive vrednosti kukuruza predstavlja jedan od glavnih ciljeva savremenih programa oplemenjivanja zbog sve značajnijih klimatskih promena i rasta ljudske populacije, odnosno sve veće potrebe za hranom. Najveći uspeh postignut je 60-ih godina prošlog veka otkrićem opaque2 (o2) mutanta sa superiornim hranljivim svojstvima. Međutim, plejotropni efekti o2 mutacije čine endosperm zrna kukuruza mekim, a samo zrno osetljivim na pucanje, trulež i štetočine. Istraživači Međunarodnog centra za poboljšanje pšenice i kukuruza u Meksiku (eng. International Maize and Wheat Improvement Center - CIMMYT) su metodama konvencionalnog oplemenjivanja stvorili kukuruz visokog kvaliteta proteina (eng. Quality Protein Maize – QPM), koji istovremeno ima visoku hranljivu vrednost proteina endosperma i dobre agronomske performanse. Iako je QPM razvijen klasičnim metodama selekcije, poslednjih godina se sve više primenjuje selekcija upotrebom molekularnih markera (eng. Marker Assisted Selection - MAS) sa ciljem poboljšanja elitnih linija za kvalitet proteina. Unutar sekvence o2 gena identifikovana su tri različita SSR markera – phi057, phi112 i umc1066, koji se koriste za utvrđivanje polimorfizma inbred linija i kao selekcioni markeri za o2 gen (eng. foreground selection). Molekularni markeri se koriste i radi utvrđivanja procenta genoma rekurentnog roditelja u potomstvima povratnih ukrštanja (eng. background selection). Primena foreground i background selekcije smanjuje broj generacija potrebnih za stvaranje željenog genotipa klasičnim metodama selekcije koje se zasnivaju na fenotipskom odabiru biljaka. Osnovni cilj ovog rada bio je dobijanje linija kukuruza poboljšanog kvaliteta proteina adaptiranih na umereno klimatsko područje, korišćenjem specifičnih molekularnih markera za opaque2 gen, kao i da se održe dobre agronomske osobine i kombinaciona sposobnost poboljšanih linija. Za poboljšanje kvaliteta proteina korišćene su, kao rekurentni roditelji (recipijenti o2 recesivne mutacije), elitne linije standardnog kvaliteta zrna ZPL 3 i ZPL 5. Kao izvor povećanog sadržaja triptofana i lizina (donor o2 recesivne mutacije) korišćena je tropska QPM linija CML 144. Identifikacija i potvrda rezultata QPM selekcije podrazumevala je biohemijske analize (određivanje sadržaja proteina, triptofana i izračunavanje indeksa kvaliteta - procenta triptofana u proteinu), kao i evaluaciju agronomski važnih osobina u poljskim ogledima. Kao rezultat ovog rada dobijeno je trinaest linija povećanog sadržaja triptofana (od 37-50% u odnosu na početnu vrednost roditeljske standardne linije), povećanog indeksa kvaliteta (42-56% u odnosu na početnu vrednost roditeljske linije), očuvane genetičke sličnosti sa rekurentnom linijom (93% genoma rekurentnog roditelja), visokog stepena modifikacije endosperma zrna (100% zrna tvrdog endosperma), povećanog prinosa zrna (11-31% u odnosu na roditeljsku liniju) i očuvanih odličnih kombinacionih sposobnosti. Biohemijski parametri su pokazali pozitivne korelacije sa prinosom zrna, što ukazuje na mogućnost paralelne selekcije na povećani prinos i poboljšanje kvaliteta zrna u ispitivanom materijalu. Na osnovu dobijenih korelacija između ispitivanih biohemijskih i fenotipskih osobina, za dobijanje genotipova sa većim sadržajem triptofana i indeksa kvaliteta mogla bi se preporučiti selekcija na visinu biljke, dužinu klipa i broj redova zrna. Između hibrida sa roditeljskom linijom ZPL 5 i hibrida sa odabranim BC2F3 potomstvima, za većinu ispitivanih fenotipskih osobina nisu utvrđene statistički značajne razlike, što je ukazalo da su kod sub-linija poboljšanog kvaliteta očuvane dobre kombinacione sposobnosti roditeljske linije ZPL 5. Mali procenat zrna sa mekim endospermom kod ispitivanih hibrida potvrdio je prisustvo gena modifikatora za tvrdoću endosperma. Kombinacijom konvencionalnog i molekularnog oplemenjivanja dobijene su linije poboljšanog kvaliteta proteina, koje su adaptirane na uslove umerenog klimatskog područja i mogu se preporučiti za programe stvaranja QPM hibrida. Ključne reči: hranljiva vrednost kukuruza, selekcija upotrebom molekularnih markera - MAS, opaque2, QPM (Quality Protein Maize) Naučna oblast: BIOLOGIJA Uža naučna oblast: MOLEKULARNA GENETIKA BILJAKA UDK broj: [[631.527:633.15]:577.112.387]:551.581.22(043.3) MARKER ASSISTED SELECTION FOR QUALITY PROTEIN MAIZE INBRED LINES ADAPTED TO TEMPERATE REGIONS SUMMARY Maize nutritional quality is poor due to the low levels of two essential aminoacids - lysine and tryptophan. Because of the climatic changes and increased food demands due to the human population growth, improvement of the maize nutritional quality is one of the main goals of many breeding programs. A major breakthrough has been the isolation of the opaque2 (o2) mutant with superior nutritional properties in the 1960s. However, pleiotropic effect of the o2 mutation makes the maize endosperm soft and susceptible to cracking, ear rots, and storage pests. Using conventional breeding methodologies, interdisciplinary research team in the International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT), Mexico, created the new, agronomically acceptable and nutritionally improved opaque2 types by the name of Quality Protein Maize (QPM). Although QPM was created through conventional breeding, marker assisted selection (MAS) is becoming increasingly used approach for improvement of protein quality in maize. Three simple sequence repeats (phi057, phi112 and umc1066), located as internal repetitive sequences within the o2 gene, are being utilized as foreground selection markers for the o2 gene. Molecular markers are also effectively employed for identification of the genotypes with the highest proportion of recurrent parent genome (background selection). Both foreground and background selection decrease the number of the generations required to create desirable genotype through conventional breeding based on the fenotypic selection. The main objective of this research was to create high quality protein maize lines adapted to temperate regions using opaque2 specific molecular markers, while maintaining their good agronomic performances and combining abilities. Two elite inbred lines - ZPL 3 and ZPL 5 were selected as the recurrent parents, to be the recipients of the o2 allele and to improve the tryptophan content. CML 144, a QPM tropical inbred line, was selected as the donor line of o2. Identification and confirmation of the QPM selection results involved biochemical analysis (determination of protein content, tryptophan content and quality index - tryptophan to protein ratio) and evaluation of the agronomicaly important traits in the field trials. As the result of this research, 13 lines were created that have 37-50% increased tryptophan content compared to their normal version, 42-56% increased quality index, 93% recovery of the recurrent parent genome, 100% kernels with hard endosperm, 11- 31% increase in grain yield and preserved combining abilities. Positive correlations were found between grain yield and biochemical parameters, indicating potential simultaneous selection and improvement for these traits. Based on the correlations found between biochemical and phenotypic parameters, selection for the plant height, ear length and kernel row number could be recomended for development of high quality maize genotypes. Significant differences were not found for the majority of the agronomic traits between hybrids created with ZPL 5 and hybrids with selected BC2F3 progenies, what has confirmed that combining abilities of the parental line ZPL 5 are preserved. Also, small percentage of the soft endosperm kernels of the analyzed hybrids confirmed the presence of the modifier genes that cause the formation of a hard, vitreous endosperm. Using the integrated conventional and molecular breeding approach, we created high protein quality maize lines adapted to temperate regions, that can be considered as candidate parents for developing QPM hybrids. Key words: maize nutritional value, marker assisted selection (MAS), opaque2, quality protein maize (QPM) Scientific field: BIOLOGY Special topic: MOLECULAR GENETICS OF PLANTS UDK number: [[631.527:633.15]:577.112.387]:551.581.22(043.3) SADRŽAJ 1.UVOD ............................................................................................................................1 1.1. Značaj i poreklo kukuruza ..................................................................................... 1 1.2. Kvalitet zrna kukuruza ........................................................................................... 2 1.3. Kvalitet proteina kukuruza .................................................................................... 4 1.3.1 Značaj kukuruza visokog kvaliteta proteina.................................................... 6 1.4. Molekularno genetički pristup u oplemenjivanju biljaka ...................................... 8 1.4.1. Genetički markeri ............................................................................................ 8 1.4.1.1. Molekularni markeri ............................................................................... 10 1.4.2. Selekcija pomoću molekularnih markera - MAS .......................................... 12 1.4.3. Primena molekularnih markera u procesu stvaranja kukuruza visokog kvaliteta proteina ..................................................................................................... 15 1.4.3.1. Opaque2 gen ........................................................................................... 15 1.4.3.2. Geni modifikatori sadržaja aminokiselina .............................................. 15 1.4.3.3. Geni modifikatori tvrdoće endosperma .................................................. 16 1.4.3.4. Stvaranje genotipova visokog kvaliteta proteina .................................... 17 2. CILJ RADA ...............................................................................................................21 3. MATERIJAL I METODE ........................................................................................22 3.1. Biljni materijal ..................................................................................................... 22 3.2. Molekularne analize ............................................................................................. 24 3.2.1. Izolacija DNK ............................................................................................... 24 3.2.1.1. Izolacija DNK iz lista ............................................................................. 24 3.2.1.2. Izolacija DNK iz zrna ............................................................................. 25 3.2.2. Određivanje koncentracije i provera kvaliteta DNK ..................................... 26 3.2.2.1. Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije i provera kvaliteta DNK ............................................................................................................................. 26 3.2.2.2. Elektroforetsko određivanje koncentracije i provera kvaliteta DNK na agaroznom gelu ................................................................................................... 27 3.2.3. SSR analiza ................................................................................................... 27 3.2.3.1. Analiza opaque2 specifičnim SSR markerima ....................................... 27 3.2.3.2. Genetička karakterizacija SSR markerima ............................................. 28 3.2.4. Elektroforetsko razdvajanje PCR produkata ................................................. 34 3.2.4.1. Agarozna elektroforeza .......................................................................... 34 3.2.4.2. Poliakrilamidna elektroforeza ................................................................ 34 3.2.5. Statistička analiza podataka dobijenih molekularnim markerima................. 35 3.2.5.1. Genetička sličnost ................................................................................... 35 3.2.5.2. Klaster analiza ........................................................................................ 35 3.3. Biohemijske analize ............................................................................................. 36 3.3.1. Priprema uzoraka........................................................................................... 36 3.3.2. Sadržaj triptofana .......................................................................................... 36 3.3.3. Sadržaj proteina ............................................................................................. 38 3.3.4. Indeks kvaliteta ............................................................................................. 39 3.3.5. Statistička analiza biohemijskih osobina....................................................... 39 3.4. Stepen modifikacije endosperma zrna kukuruza ................................................. 40 3.5. Analiza morfoloških i agronomskih osobina ....................................................... 40 3.5.1. Statistička analiza fenotipskih osobina ......................................................... 44 4. REZULTATI..............................................................................................................45 4.1. Genetička i biohemijska karakterizacija roditeljskih linija .................................. 45 4.1.1. Analiza roditeljskih linija opaque2 specifičnim markerima ......................... 45 4.1.2. Određivanje genetičke sličnosti između roditeljskih linija ........................... 46 4.1.3. Biohemijska analiza roditeljskih linija .......................................................... 46 4.2. Genetička karakterizacija potomstava povratnih ukrštanja (BC1 i BC2) ............. 47 4.2.1. Analiza biljaka BC1 i BC2 generacija opaque2 specifičnim markerima ....... 47 4.2.2. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i potomstava BC2 generacije ......................................................................................................... 49 4.3. Genetička, fenotipska i biohemijska karakterizacija potomstava dobijenih samooplodnjom povratnih ukrštanja (BC2F2, BC2F3 i BC2F4) .................................... 54 4.3.1. Analiza biljaka BC2F2 generacije opaque2 specifičnim markerima ............. 54 4.3.2. Genetička i fenotipska karakterizacija BC2F3 generacije .............................. 54 4.3.2.1. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i potomstava BC2F3 generacije .............................................................................. 54 4.3.2.2. Analiza fenotipskih osobina BC2F3 generacije ....................................... 57 4.3.3. Genetička, fenotipska i biohemijska karakterizacija BC2F4 generacije ........ 61 4.3.3.1. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i potomstava BC2F4 generacije .............................................................................. 61 4.3.3.2. Određivanje stepena modifikacije endosperma zrna BC2F4 generacije .. 63 4.3.3.3. Biohemijska evaluacija BC2F4 generacije .............................................. 64 4.3.3.4. Izbor sub-liniija za fenotipsku i biohemijsku evaluaciju ........................ 65 4.4. Fenotipska i biohemijska evaluacija odabranih sub-linija ................................... 67 4.4.1. Analiza fenotipskih osobina odabranih sub-linija ......................................... 67 4.4.2. Određivanje stepena modifikacije endosperma zrna odabranih sub-linija.... 71 4.4.3. Biohemijska analiza odabranih sub-linija ..................................................... 71 4.4.4. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i sub-linija povećanog sadržaja triptofana ................................................................................. 76 4.5. Fenotipska evaluacija hibrida .............................................................................. 78 4.5.1. Analiza fenotipskih osobina hibrida .............................................................. 78 4.5.2. Određivanje stepena modifikacije endosperma zrna hibrida ........................ 82 5. DISKUSIJA ................................................................................................................83 6. ZAKLJUČCI..............................................................................................................99 7. LITERATURA ........................................................................................................101 1 1.UVOD 1.1. Značaj i poreklo kukuruza Kukuruz (Zea mays L.) je jedna od najvažnijih gajenih žitarica na svetu, a u Srbiji se po proizvodnji nalazi na prvom mestu. Veći deo (oko 78%) svetske proizvodnje, sa preko 800 miliona tona godišnje, usmeren je na proizvodnju stočne hrane. Međutim, potreba za korišćenjem kukuruza u ljudskoj ishrani se stalno povećava, naročito u sub-saharskom delu Afrike i Latinskoj Americi, sa procenjenom godišnjom stopom rasta od 1,3% do 2020. godine (Ortiz i sar., 2010). Globalna predviđanja ukazuju da će do 2025. godine kukuruz postati usev sa najvećom proizvodnjom, kao i da će se u zemljama u razvoju do 2050. potreba za ovom kulturom udvostručiti (Rosegrant i sar., 2008). Prema podacima Organizacije za hranu i poljoprivredu (eng. Food and Agriculture Organisation - FAO) iz 2013. godine, kukuruz je u Srbiji zauzimao površinu od 1,31 milion ha, sa prosečnim prinosom od 4,94 t/ha i ukupnom proizvodnjom od 6,48 miliona tona. Kukuruz je takođe i glavni izvozni proizvod srpske poljoprivrede i, prema FAO, 2011. godine izvezeno je više od 1,6 miliona tona. Kukuruz može da se koristi u ljudskoj ishrani, kao hrana za stoku i kao sirovina u industriji. U našoj zemlji kukuruz se najviše koristi u ishrani životinja, gde se za potrebe silaže koristi cela biljka, kao i u ljudskoj ishrani i proizvodnji skroba. Od kukuruza se dobija brašno, griz, skrob, ulje i sirup, čest je sastavni deo mnogih namirnica (hleb, kolači, keks, supe, sosovi, kaše, kokice). U industrijskoj proizvodnji, procesima fermentacije i destilacije dobija se alkohol (čak i neki tipovi viskija), a kukuruz se sve više koristi i za proizvodnju bioetanola i biorazgradive plastike (Torney i sar., 2007; Schgiwietzke i sar., 2008). Pored agronomskog značaja, kukuruz služi i kao model organizam za osnovna istraživanja. Najdetaljnije je istražen genetički sistem među žitaricama i genom je sekvenciran i mapiran 2009. godine (Schnable i sar., 2009). Kukuruz je domestifikovan od divlje trave teozinte (Zea mays spp. parviglumis) u Centralnoj Americi pre oko 9000 godina (Matsuoka i sar., 2002). U vreme otkrića Novog Sveta posebno je bio rasprostranjen kod Asteka i Inka, odakle se širio do Severne Amerike i Kanade, kao i prema Južnoj Americi, do Čilea. Kukuruz je prvi put u 2 Evropu, odnosno na jug Španije, sa Karipskih ostrva doneo Kolumbo 1493. godine. Od tada je nastao veliki broj lokalnih populacija kukuruza u Evropi, putem prirodne selekcije i oplemenjivanja, što je dovelo do adaptacije na različite ekološke uslove i lokalnu upotrebu (Camus-Kulandaivelu i sar., 2006). Različiti tipovi kukuruza na prostoru bivše Jugoslavije vode poreklo od kukuruza iz Severne Amerike, Južne Amerike i Meksika, a njihova introdukcija je trajala od XVI do XX veka. Pojavljivanje kukuruza na prostoru bivše Jugoslavije zabeleženo je 1572. godine u Dalmaciji, gde je stigao iz Italije, dok je u Srbiji njegovo gajenje počelo 1576. (Radić, 1872). Prve introdukovane sorte kukuruza bile su pretežno tvrdunci nedovoljno adaptirani na tipove zemljišta i klimatske uslove, dok je druga introdukcija donela tvrdunce iz Meksika i sa Anda, što je povećalo varijabilnost postojeće germplazme. Treća introdukcija se dogodila u XVIII veku i obuhvatala je tvrdunce poreklom iz Kanade i Nove Engleske (SAD) koji su u naše krajeve stigli preko Slovenije i Hrvatske. Ovo je doprinelo formiranju sorti jedinstvene genetičke osnove koje su bolje adaptirane na hladnije klimatske uslove. Poslednja introdukcija se desila krajem XIX i početkom XX veka. Introdukovani su zubani iz Severne Amerike, a najznačajni za proizvodnju su bili zubani kukuruznog pojasa SAD-a. Spontanim ukrštanjem ovih zubana sa prethodno introdukovanim tvrduncima nastao je tip evropskog kukuruznog pojasa, što je bila poslednja veća prirodna hibridizacija značajna za evoluciju kukuruza u Evropi (Trifunović, 1978). 1.2. Kvalitet zrna kukuruza U zrnu kukuruza su prisutni i makro- i mikronutrijenti. U makronutrijente spadaju ugljeni hidrati (skrob), lipidi i proteini, a u mikronutrijente minerali, vitamini i fitohemikalije. U zavisnosti od hemijskog sastava pojedinih genotipova kukuruz se koristi kao hrana za ljude, za ishranu životinja, ili kao sirovina za proizvodnju namirnica, farmaceutskih i kozmetičkih proizvoda. Sastav makro- i mikronutritijenata zrna je bio predmet mnogih istraživanja sa ciljem poboljšanja hranljive vrednosti kukuruza (Kurlich i Juvik, 1999; Shewry, 2007; Žilić i sar., 2011; Ignjatović-Micić i sar., 2015). 3 Kukuruz je bogat izvor energije. Zrno kukuruza prosečno sadrži 71,7% skroba, 9,5% proteina, 4,3% ulja, 1,4% pepela i 2,6% šećera (Watson, 2003). Skrob se sastoji od dva glukozna polimera - amilaze (21%) i amilopektina (79%). Ova dva polimera imaju različite fizičke karakteristike i oplemenjivanje za određena svojstva skroba uključuju promenu njihovih relativnih proporcija. Skrob je glavni izvor energije i glavna komponenta prinosa, a u industriji se koristi za dobijanje pasta i zaslađivača, proizvoda za apsorpciju vlage, zgušnjavanje (povećanje viskoziteta) različitih proizvoda, kao i za proizvodnju bioetanola. Proteini kukuruza imaju nisku hranljivu vrednost zbog niskog sadržaja esencijalnih aminokiselina lizina, triptofana i metionina (Gernah i sar., 2011). Ljudi i monogastrične životinje ne mogu da sintetišu lizin i triptofan, već moraju da ih unose hranom. Prosečna vrednost sadržaja lizina od 2% u zrnu kukuruza je manja od polovine vrednosti preporučene od strane FAO za ljudsku ishranu. Dok je u razvijenim zemljama, u kojima je hrana raznovrsna, ovo zanemarljivo, u zemljama u kojima je kukuruz glavni izvor hranjivih materija ova činjenica predstavlja veliki problem. Prema procenama svetske zdravstvene organizacije (eng. World Health Organisation - WHO) iz 2005. godine, u zemljama u razvoju oko 32% predškolske dece je zakržljalo i nerazvijeno zbog nedovoljnog unosa proteina (Black i sar., 2008). Zato je kukuruz sa poboljšanim kvalitetom proteina neophodan za ishranu ljudi čiji je glavni izvor proteina upravo kukuruz. Takođe, nedostatak esencijalnih aminokiselina u ishrani životinja nadoknađuje se dodavanjem aditiva i proteinskih suplemenata, što znatno poskupljuje hranu za životinje. Kukuruz sa povećanim sadržajem ovih aminokiselina značajno bi doprineo smanjenju troškova za proizvodnju stočne hrane veće nutritivne vrednosti. Kukuruzno ulje predstavlja koncentrovani izvor energije za životinje, a povećanje saržaja ulja u zrnu dovodi do povećanja kalorijske vrednosti kukuruznog zrna. Pored sadržaja ulja, veoma velika pažnja se obraća i na sastav masnih kiselina ulja. Upotreba kukuruznog ulja u ishrani ljudi se smatra poželjnom, zbog visokih sadržaja mononezasićenih ili polinezasićenih masnih kiselina. Stvaranje genotipova sa određenim sastavom masnih kiselina ima za cilj poboljšanje zdravlja ljudi (Lands, 2005). Kukuruzno ulje se koristi i u proizvodnji sapuna, melema, mastila, tekstila, nitroglicerina i insekticida. Takođe je i sirovina za proizvodnju biodizela. 4 Kukuruz se takođe može upotrebiti i za proizvodnju funkcionalne hrane. To je hrana koja, pored uobičajenih nutritivnih efekata, utiče blagotvorno na jednu ili više zdravstvenih funkcija tela, poboljšavajući stanje zdravlja ili/i smanjujući rizik od bolesti (Diplock i sar., 1999). Tako, na primer, fitohemikalije kao što su karotenoidi, antocijanini i fenolna jedinjenja imaju visoku antioksidativnu aktivnost (Lopez- Martinez i sar., 2009). U većem broju eksperimenata je ukazano da umereno i dugotrajno unošenje nekih sekundarnih metabolita ima značajan efekat na smanjenje incidence kancera i mnogih hroničnih bolesti (Kutchen i Dixon, 2005). Funkcionalna hrana sadrži jednu ili više bioaktivnih komponenti. Stvorene su linije i hibridi kukuruza od kojih se dobijaju proizvodi koji imaju potencijalno značajne blagotvorne efekte, kao što su kukuruz s visokim sadržajem esencijalne aminokiseline lizina, i kukuruz sa visokim sadržajem β-karotena i antocijanina koji imaju antioksidativno dejstvo. Primer funkcionalne hrane je i hladno ceđeno ulje kukuruza koje smanjuje holesterol u krvi smanjujući njegovu apsorpciju (Ostlund i sar., 2002). 1.3. Kvalitet proteina kukuruza Endosperm zrna kukuruza čine oko 90% skroba i 10% proteina. Proteini endosperma se prema rastvorljivosti mogu klasifikovati u albumine (rastvorljivi u vodi), globuline (rastvorljivi u solima), zeine ili prolamine (rastvorljivi u alkoholu) i gluteline (rastvorljivi u bazama). U endospermu zrna kukuruza standardnog kvaliteta, proporcije proteinskih frakcija iznose 3% albumina, 3% globulina, 60% zeina (prolamina) i 34% glutelina (Xu i sar., 2009). Zeini, dominantna frakcija proteina, su na osnovu strukture podeljeni u četiri familije: α-, β-, γ- i δ-zeini (Esen, 1986; Kirihara i sar., 1988; Thompson i Larkins, 1989). α-zeini su polipeptidi molekularne težine 19 kDa i 22 kDa i čine oko 60% ukupnih zeina (Larkins i sar., 1989). β-zeini, polipeptidi od 15kDa, predstavljaju 5 - 10% zeina i sadrže manje prolina, ali više cisteina i metionina nego α- zeini. γ-zeini su druga najzastupljenija grupa zeina sa oko 25%, mada mogu biti prisutni i do 50% ukupnih zeina (Ortega i Bates, 1983). To su polipeptidi od 16 kDa, 27 kDa i 50 kDa i veoma su bogati prolinom i cisteinom. δ-zeini su najmanje zastupljena frakcija zeina (5%), molekularne težine od 10 kDa i 18kDa, koji su jako bogati aminokiselinama koje sadrže sumpor. 5 Zeini imaju nizak sadržaj nekoliko esencijalnih aminokiselina – treonina, histidina, cisteina, metionina i lizina, dok su u potpunosti lišeni triptofana (Sofi i sar., 2009). Lizin i triptofan su najdeficitarnije esencijalne aminokiseline. S druge strane, ne- zeinski proteini imaju izbalansiran i visok sadržaj lizina i triptofana (Vasal, 2000). Poboljšanje kvaliteta proteina kukuruza podrazumeva povećanje ne-zeinske frakcije i represiju sinteze zeina. Značajna istraživanja na poboljšanju kvaliteta proteina kukuruza su započeta 60- ih godina prošlog veka, nakon otkrića prirodnih mutanata koji imaju veći sadržaj lizina i triptofana - opaque2 (o2), floury2 (fl2), opaque7 (o7), opaque6 (o6) i floury3 (fl3) (Mertz i sar., 1964; Nelson i sar., 1965; McWhirter, 1971; Ma i Nelson, 1975). Recesivna mutacija o2 se pokazala kao najpogodnija za genetičke manipulacije u programima oplemenjivanja radi stvaranja visoko lizinskog kukuruza. Genotipovi kukuruza koji su recesivno homozigotni (o2o2) imaju značajno veći sadržaj lizina i triptofana nego genotipovi koji su heterozigotni (O2o2) ili dominantno homozigotni (O2O2) za opaque2 lokus (Crow i Kermicle, 2002). Slika 1. Šematski prikaz strukture opaque2 gena (modifikovano iz Hartings i sar., 1989). Na slici su označeni TATA blok, start kodon (ATG), stop kodon (TGA) i poli- (A)-rep. Otvoreni okvir čitanja je podeljen na egzone (pravougaonik) i introne (linija), čije su veličine u baznim parovima (bp) označene ispod svakog od njih. 6 Opaque2 gen je kloniran (Schmidt i sar., 1987; Motto i sar., 1988) i identifikovane njegove glavne strukturne karakteristike (Hartings i sar., 1989). Region sa najvećom homologijom TATA bloku (5'-CTATTTG-3') počinje 339 bp „uzvodno“ od početka gena. Otvoreni okvir čitanja (eng. Open Reading Frame - ORF) obuhvata 1362 bp i sastoji se od šest egzona veličine od 465 do 61 bp, kao i pet introna, smeštenih u centralnom delu gena, veličine od 678 bp do 83 bp. Stop kodon TGA nalazi se na poziciji 2490, a poli-(A)-rep počinje 34 baza nakon poliadenilacijskog signala (Slika 1). Opaque2 gen se nalazi na kraćem kraku hromozomu 7 (bin 7.01) i njegova ekspresija se odvija specifično u endospermu zrna deset dana nakon polinacije (Gallusci i sar., 1994). Izolacija i karakterizacija opaque2 gena pokazala je da on kodira transkripcioni faktor koji reguliše sintezu zeina, a koji pripada grupi „basic leucine zipper (bZIP)“ aktivatora (Schmidt i sar., 1990). O2 protein aktivira transkripciju gena koji pripadaju različitim metaboličkim putevima - 22 kDa α-zeina (Schmidt i sar., 1992) i 15 kDa β-zeina (Cord Neto i sar., 1995), b-32 (Lohmer i sar., 1991) i cyPpdk1 (jedan od dva citosolna izoforma piruvat-ortofosfat-kinaze) (Maddaloni i sar., 1996). Ovaj gen redukuje produkciju zeina, čime se povećava količina lizina i triptofana (Damerval i Devienne, 1993), a utiče i na sintezu enzima koji je u vezi sa razgradnjom lizina (Brochettobraga i sar., 1992). Nekoliko studija je pokazalo da je dejstvo ključnih enzima u metabolizmu aminokiselina izmenjeno kod o2 kukuruza, povećavajući sadržaj lizina i triptofana. Aktivnost aspartat-kinaze, važnog enzima u sintezi lizina, je kod o2 povećana (Brennecke i sar., 1996), dok je aktivost lizin- ketogluterat-reduktazo-dehidrogenaze smanjena (Kemper i sar., 1999), što dovodi do visokog sadržaja lizina u endospermu. 1.3.1 Značaj kukuruza visokog kvaliteta proteina Plejotropni efekat opaque2 gena je uzrokovao da njegova inkorporacija u visoko prinosne komercijalne hibride bude neuspešna zbog brojnih agronomskih nedostataka i problema u preradi – smanjenog prinosa, mekog endosperma, brašnjavog i nepopunjenog izgleda zrna, kao i osetljivosti na trulež klipa i skladištne štetočine (Bjarnason i Vasal, 1992; Vasal, 2001). Ovi problemi su izazvali obustavljanje većine 7 istraživanja, a među institutima koji su nastavili rad najviše uspeha postigli su istraživači Međunarodnog centra za poboljšanje pšenice i kukuruza u Meksiku (eng. International Maize and Wheat Improvement Center - CIMMYT). Metodama konvencionalnog oplemenjivanja uspeli su da meki endosperm zrna konvertuju u tvrdi, povećaju prinos zrna do nivoa najprinosnijeg kukuruza standardnog kvaliteta zrna i učine ga otpornijim na bolesti i štetočine (Vivek i sar., 2008). Dobijeni kukuruz visokog kvaliteta proteina (eng. Quality Protein Maize – QPM) istovremeno ima visoku nutritivnu vrednost proteina endosperma i dobre agronomske performanse. Iako je QPM stvoren prvenstveno za korišćenje u regionima u kojima je, zbog siromaštva, kukuruz glavna ljudska hrana, postoje mnogi razlozi za njegovu proizvodnju i korišćenje i u ostalim regionima sveta. Nekoliko studija (Bressani, 1991; Akuamoa-Boateng, 2002; Krivanek i sar., 2007; Mbuya i sar., 2011) je pokazalo pozitivne efekte prilikom ishrane ljudi i životinja ovim kukuruzom. Zbog visokog kvaliteta proteina (80 - 90 % vrednosti proteina mleka) i visoke biološke vrednosti, QPM može zameniti proteine animalnog porekla u ishrani ljudi i monogastričnih životinja. Pored kvalitetnijih proteina, QPM ima i povećan sadžaj niacina (vitamin B3) i poboljšano iskorišćavanje kalcijuma i karotena (Prassana i sar., 2001). Takođe je bogatiji u sadržaju gvožđa i cinka (Agrawal i sar., 2010). Značaj gajenja QPM hibrida postaje sve veći kada se ima u vidu uticaj klimatskih promena (povećanje temperature vazduha i smanjenje količine padavina) na smanjenje prinosa kukuruza. Zbog dvostruko bržeg prirasta telesne težine životinja i boljeg iskorišćavanja pripremljenog obroka od QPM kukuruza (Burgoon i sar., 1992), deo proizvedenog standardnog kukuruza bi se mogao preusmeriti za druge potrebe, kao što je proizvodnja etanola. Značaj QPM kukuruza potvrđuje i činjenica da se 1977. godine ovaj kukuruz gajio samo na teritoriji četiri države, a u 2003. godini u 23 države na površini od 3,5 miliona hektara (Sofi i sar., 2009). CIMMYT je proizveo širok spektar QPM germplazme adaptirane na uslove tropskih i subtropskih predela. Među zemljama u razvoju izdvajaju se nacionalni istraživački programi stvaranja QPM genotipova u Južnoj Africi, Brazilu, Kini, Gani i Indiji. Prema Gill (2008), očekuje se da 2020. godine u Kini 30 % područja na kome se gaji kukuruz bude pod QPM kukuruzom. U 17 država sub-saharske Afrike QPM se gaji na otprilike 200,000 ha, od čega 70,000 pripada Gani. Međutim, nešto veći izazov je stvaranje QPM genotipova adaptiranih na 8 uslove umerenih klimatskih područja. Prvi pokušaj adaptacije QPM genotipova na uslove severnoameričkog kontinenta učinjen je na Univerzitetu Severne Dakote (eng. The North Dakota State University - NDSU), gde je stvoreno 50 QPM genotipova (Carena, 2013). U Institutu za kukuruz "Zemun Polje" istraživanja na opaque2 mutaciji i poboljšanju kvaliteta kukuruza započeta su 70 - ih godina prošlog veka (Denić i sar., 1979). Poslednjih nekoliko godina razvijen je program stvaranja genotipova kukuruza visokog kvaliteta proteina adaptiranih na umereno klimatsko područje (Ignjatović-Micić i sar., 2009; Ignjatović-Micić i sar., 2010; Ignjatović-Micić i sar., 2013). Pored konvencionalnih metoda oplemenjivanja, deo programa se odnosi na upotrebu specifičnih molekularnih markera u procesu stvaranja QPM linija (Kostadinović i sar., 2014). 1.4. Molekularno genetički pristup u oplemenjivanju biljaka 1.4.1. Genetički markeri Genetički markeri predstavljaju delove genoma koji odražavaju genetičke razlike između različitih vrsta ili jedinki iste vrste, a na osnovu kojih se indirektno dobija informacija o genima (ili delovima genoma) uključenih u ekspresiju ispitivane osobine. Oni predstavljaju polimorfizam u strukturi DNK ili produkata ekspresije, koji je moguće detektovati (Sunnucks, 2000). Idealan marker mora da ispunjava sledeće kriterijume: 1) visok stepen polimorfizma (da postoji u različitim oblicima tako da se mogu razlikovati različite varijante alela), 2) ravnomerna raspoređenost po genomu, 3) kodominantno nasleđivanje, 4) mogućnost da se lokus lako i brzo uoči u ranim fazama razvića, 5) odsustvo uticaja faktora spoljašnje sredine na njihovu detekciju (Smith, 1987). Markeri igraju važnu ulogu u proučavanju varijabilnosti, konstrukciji mapa i detektovanju povezanih gena kod različitih genotipova i mogu se svrstati u grupe: morfološki, biohemijski i molekularni. 9 Morfološki markeri su vezani za morfološke i agronomske osobine čije se nasleđivanje prati posmatranjem pojave određenog fenotipa (Tanksley, 1983). Oni su pod uticajem spoljašnje sredine, varijabilnost koja se kod njih procenjuje ne odgovara uvek varijabilnosti na nivou genoma usled interakcije genotipa i sredine na fenotipsko ispoljavanje osobine i njihovom upotrebom nije moguće razlikovati heterozigote od homozigota. Zbog toga je ova vrsta markera nepouzdana i subjektivna. Biohemijski markeri se zasnivaju na polimorfizmu proteina i obuhvataju strukturne proteine, rezervne proteine semena i izoenzime. Izoenzimi predstavljaju različite molekulske forme jednog enzima sa istom katalitičkom funkcijom, a razlikuju se u pH vrednosti i koncentraciji supstrata pri kojoj pokazuju enzimski efekat. Izoenzimi su alelne varijante enzima kodirane od strane istih strukturnih gena. Osnovni nedostatak izoenzima je njihov relativno mali broj i nizak nivo polimorfizma. Molekularni markeri su fragmenti DNK molekula, koji mogu biti deo gena ili nekodirajućih delova genoma. Upotreba molekularnih markera je zasnovana na DNK polimorfizmu, koji čini osnovu u dizajniranju strategija za njihovo korišćenje u određene svrhe. DNK markeri nisu pod uticajem spoljašnje sredine, lako se izoluju iz biljnog materijala, a analize su relativno jednostavne i efikasne. Različite vrste molekularnih markera mogu se podeliti u dve grupe: 1) markeri zasnovani na hibridizaciji:  RFLP (eng. Restriction Fragment Lenght Polymorphism - polimorfizam dužine restrikcionih fragmenata) 2) markeri zasnovani na lančanoj reakciji polimeraze:  AFLP (eng. Amplified Fragment Lenght Polymorphism - polimorfizam dužine amplifikovanih fragmenata)  RAPD (eng. Random Amlified Polymorphic DNA - nasumično umnožena polimorfna DNK)  SSR (eng. Simple Sequence Repeat - ponovci jednostavnih sekvenci)  STS (eng. Sequence Tagged Site - markeri poznate sekvence i lokacije u genomu)  SNP (eng. Single Nucleotide Polymorphism - polimorfizam pojedinačnih nukleotida). 10 1.4.1.1. Molekularni markeri Molekularni markeri imaju značajnu primenu u istraživanjima genoma biljaka. Koriste se za utvrđivanje filogenetskih i evolutivnih odnosa vrsta i populacija, određivanje stepena genetičkog diverziteta između udaljenih i srodnih vrsta, unutar populacija, kao i za efikasno upravljanje genetičkim resursima (Andersen i Lübberstedt, 2003). Dobijeni podaci se mogu koristiti za "otisak" genotipova (eng. fingerprinting) radi njihove identifikacije i zaštite, razumevanja veza između jedinki koje se ispituju, olakšavanja unošenja hromozomskih segmenata iz drugih vrsta, kao i za mapiranje gena koji kontrolišu ekspresiju različitih agronomski značajnih osobina (Larson, 2002). Među različitim tipovima molekularnih markera, SSR markeri se smatraju najboljim izborom u oplemenjivanju biljaka zbog mogućnosti efikasne karakterizacije velikih populacija i visokog stepena ponovljivosti. Sastoje se od tandemski ponovljenih kratkih sekvenci molekula DNK, dužine 2 - 6 bp (Chambers i MacAvoy, 2000). Varijacije u broju ponavljanja ovih sekvenci daju amplifikovane produkte različitih dužina. Regioni koji ograničavaju ove sekvence se koriste za dizajniranje parova specifičnih prajmera. Prednosti SSR markera su visok nivo polimorfizma, kodominantnost alela i ravnomerna distribucija duž genoma (Morgante i sar., 2002; Barcaccia i sar., 2006). Iako su ovo kodominantni markeri, mutacije na mestima vezivanja prajmera mogu dovesti do pojave „null“ alela (nema umnožavanja fragmenta), što može da dovede do grešaka u oceni genotipa. SSR markeri predstavljaju dobar izbor za mapiranje genoma, genotipizaciju i evaluaciju germplazme (Smith i sar., 1997; Senior i sar., 1998). Sekvence ovih markera su, zbog visokog stepena varijabilnosti, posebno pogodne za razlikovanje srodnih genotipova i zato se često koriste u analizama varijabilnosti populacija (Smith i Devey, 1994), kao i za identifikaciju srodnih sorti (Vosman i sar., 1992). SSR markeri vezani za gene poznate funkcije mogu biti testirani za povezanost sa fenotipskim varijacijama i nekim drugim biološkim funkcijama (Ayers i sar., 1997). Činjenica da je u mnogim organizmima polimorfizam uglavnom rezultat promene u jednom nukleotidu (tačkaste mutacije) dovela je do razvoja SNP tehnika za proučavanje ove vrste varijabilnosti. Najčešće je jedan SNP prisutan na 200 - 500 bp, a njihova gustina je veća u intergenskim i intronskim regionima nego u egzonima 11 (Weising i sar., 2005). Analitičke procedure zahtevaju informacije o sekvenci za dizajniranje specifičnih PCR prajmera ili oligonukleotidnih proba. Detekcija ovih markera se ne zasniva na gel elektroforezi, što predstavlja značajnu prednost kod obimnih genotipizacija u selekciji, pošto tehnologije zasnovane na gel elektroforezi mogu biti suviše zahtevne i dugotrajne. Velika gustina SNP markera povećava verovatnoću pronalaženja polimorfizma u ciljnom genu, što obezbeđuje veliku prednost u odnosu na ostale markere, koji su najčešće blisko povezani sa lokusom od interesa. Iako je upotreba SNP markera kod biljaka još uvek u razvoju, očekuje se da će u bliskoj budućnosti postati najčešće korišćeni markeri, posebno kada cele sekvence genoma biljaka postanu dostupne (Ganal i sar., 2011). Pošto predstavljaju najčešći tip genetičkih varijacija u biljkama, SNP markeri mogu imati značajnu ulogu u proučavanju otpornosti na bolesti, abiotičke i biotičke stresove i ekonomski važnih osobina. Kukuruz poseduje visoku učestalost SNP markera, od 1/31bp u nekodirajućim do 1/124bp u kodirajućim regionima (Tenaillon i sar., 2001; Ching i sar., 2002; Vroh Bi i sar., 2006). Razvoj SNP markera kod kukuruza nudi primenu u savremenim istraživanjima populaciono genetičkim, identifikaciji gena, oplemenjivanju i karakterizaciji germplazme. Razvoj novih tehnologija molekularne genetike omogućio je precizniju identifikaciju gena odgovornih za poželjne osobine. Primena molekularnih markera danas predstavlja nezamenljivi deo različitih programa selekcije i oplemenjivanja. Kada su vrlo blisko vezani za gen od interesa ili se nalaze unutar gena, mogu se korisiti za indirektnu selekciju željenog svojstva, i ovaj postupak predstavlja najjednostavniji vid selekcije pomoću molekularnih markera (eng. Marker Assisted Selection - MAS). Zahvaljujući molekularnim markerima, poligena svojstva mogu biti razložena na pojedinačne komponente, tzv. lokuse za kvantitativna svojstva (eng. Quantitative Trait Loci - QTL), što doprinosi boljem razumevanju nasleđivanja ovih svojstava i omogućava korišćenje MAS-a zajedno sa metodama klasične selekcije. 12 1.4.2. Selekcija pomoću molekularnih markera - MAS Za uspešan program stvaranja hibrida kukuruza najvažnije je stvoriti elitne inbred linije i rekombinacijama povećati broj novih alela i njihovih kombinacija (Lee and Tracy, 2009). Za inkorporaciju poželjnih svojstava (alela) u elitne inbred linije osnovni metod kod konvencionalnog oplemenjivanja je kombinacija povratnih ukrštanja i samooplodnje uz fenotipsku selekciju. Sa svakom generacijom povratnog ukrštanja elitne linije u koju se ugrađuje željena osobina (rekurentni roditelj) iz linije koja poseduje željeni gen (donor) dobija se veći procenat genoma rekurentnog roditelja. Proces povratnog ukrštanja se odvija onoliko dugo koliko je potrebno da se stvori linija koja je genetički identična rekurentnom roditelju uz dodato željeno svojstvo. Taj proces može da traje i do deset generacija. Stoga je neophodna efikasnija selekcija kako bi se ovaj proces skratio. Konvencionalno oplemenjivanje se oslanja na fenotipsku selekciju i u manjoj meri razlikuje uticaj spoljašnje sredine od uticaja gena. Kod selekcije upotrebom molekularnih markera selekcija željene osobine se vrši markerima koji mogu biti direktno vezani za gen ili deo genoma koji utiče na ekspresiju te osobine. Markerima se direktno prati prisustvo poželjnih alela, nezavisno od uticaja faktora spoljašnje sredine. MAS ima za cilj da poveća genetičku dobit u odnosu na klasične metode selekcije i oplemenjivanja, i ta razlika bi trebalo da bude utoliko veća ukoliko je veći stepen fenotipske varijabilnosti, a niža heritabilnost ciljne osobine. MAS se pokazao kao odličan pristup koji upotpunjuje i znatno povećava efikasnost konvencionalnog oplemenjivanja (Balding i sar., 2003; Ribaut i Hoisington, 1998). DNK se može izolovati iz listova mladih biljaka, što omogućava selekcionerima da pre polinacije odbace biljke koje nemaju gen od interesa (Vivek i sar., 2008). Pomoću molekularnih markera se mogu odrediti biljke sa najvećim procentom genoma rekurentnog roditelja nakon povratnog ukrštanja i smanjiti broj biljaka koje treba testirati, kao i broj generacija potrebnih za stvaranje željenog genotipa. Postoji velika razlika u postignutim rezultatima primene MAS za kvalitativne (regulisane dejstvom jednog ili nekoliko gena) i kvantitativne (regulisane dejstvom velikog broja gena/QTL) osobine. Mnogo manje je postignuto kod kvantitativnih osobina, kao što su prinos i tolerantnost na sušu, pošto je manipulacija QTL otežana 13 zbog malog fenotipskog doprinosa svakog od pojedinačnih gena, epistatičkih interakcija između njih i uticaja faktora spoljašnje sredine. Mnogi markeri pokazali su se kao nepouzdani u predviđanju željenog fenotipa. U velikom broju slučajeva, razlog za ovo je nedovoljna preciznost u mapiranju QTL-ova (Young, 1999; Sharp i sar., 2001), a još jedan ograničavajući faktor u primeni MAS-a je cena metoda i marker sistema koji se koriste u ovim istraživanjima. Različite roditeljske kombinacije i/ili različiti eksperimentalni uslovi dovode do identifikacije delimično ili potpuno nepreklapajućih setova QTL (Rong i sar., 2007). U cilju prevazilaženja ovog problema, poslednjih nekoliko godina se koristi pristup meta analize koji kombinuje rezultate iz različitih, nezavisnih eksperimenata (Glass, 1976; Chardon i sar., 2004; Wang i sar., 2006). Koristeći princip meta analize, Hao i sar. (2010) su identifikovali neke važne konstitutivne i adaptivne QTL-ove za tolerantnost na sušu kod kukuruza, kao i specifične gene i njihove familije koji učestvuju u odgovoru biljke na ovaj stres. Uporedili su rezultate QTL mapiranja iz 12 populacija testiranih u 22 eksperimenta koji su obuhvatali 160 QTL-ova detektovanih u optimalnim uslovima i 239 QTL-ova u uslovima suše. Na osnovu ovih podataka, identifikovano je 39 QTL-ova u uslovima suše i 36 QTL-ova u optimalnim uslovima, od kojih su 32 bila adaptivna a ostali konstitutivni. Takođe su uradili i in silico mapiranje i identifikovali 48 potencijalnih gena kandidata uključenih u odgovor kukuruza na stres suše. Predviđa se da će se na ovaj način identifikovati specifični geni i metabolički putevi uključeni u tolerantnost na stres suše, što će dovesti do efikasnijeg stvaranja komercijalnih genotipova tolerantnih na ovaj stres. Najveći napredak u oplemenjivanju primenom molekularnih markera je postignut kod osobina koje su regulisane dejstvom jednog gena i jasno su fenotipski definisane. Monogene osobine kod kukuruza, kao što su citoplazmatična muška sterilnost i otpornost na neke štetočine i bolesti, su mnogo ređe od poligenih. Kvalitativne osobine su posebno značajne kod tipova kukuruza za specifične namene (šećerac, kokičar, kukuruz sa visokim sadržajem proteina). Tamilkumar i sar. (2014) objavili su rezultate uspešne upotrebe molekularnih markera za poboljšanje nutritivne vrednosti kukuruza. Fitinska kiselina (eng. Phytic Acid - PA) sadrži fosfor čvrsto vezan u svom molekulu. Takav fosfor nije biodostupan i nije iskoristiv za ljude, kao ni za monogastrične životinje. Molekul fitinske kiseline vrlo 14 lako gradi soli fitate, vezujući minerale koji su veoma važni: kalcijum, kalijum, magnezijum, cink i gvožđe, čineći ih na taj način nedostupnim i neiskoristivim. Mutacija (lpa2-2) (eng. low phitic acid) smanjuje sadržaj fitinske kiseline za 30% i trostruko povećava prisustvo neorganskog fosfora (Shi i sar., 2003). Selekcijom na lpa2-2 mutaciju pomoću SSR markera umc2230 stvorene su linije sa sniženim sadržajem fitinske kiseline i očuvanim dobrim agronomskim osobinama, koje će se koristiti za dobijanje visoko prinosnih hibrida poboljšane nutritivne vrednosti. Dugo vremena su sekundarni metaboliti biljaka smatrani sporednim produktima bez nutritivne vrednosti, ali su poslednjih godina studije pokazale da jedinjenja kao što su karotenoidi i antocijanini utiču na prevenciju pojave kancera i mnogih hroničnih oboljenja (Kutchan i Dixon, 2005). Njihovo antioksidativno dejstvo je važno jer neutralizuju slobodne radikale koji izazivaju oštećenja biomolekula (DNK, lipidi i proteini) i na taj način smanjuju rizik od degenerativnih bolesti (Ames, 1979; Temple, 2000). Najzastupljeniji karotenoidi u biljnom svetu β - karoteni, su prekursori vitamina A i doprinose smanjenju rizika pojave katarakte i bolesti koronarnih arterija. Nedostatak vitamina A u ishrani ljudi u zemljama u razvoju doveo je do brojnih pokušaja povećanja sadržaja β - karotena u najvažnijim gajenim biljkama, uključujući i kukuruz (Welch i Graham, 2004). Muthusamy i sar. (2015) su stvorili linije kukuruza koje su imale do 12 puta povećani sadržaj β - karotena selekcijom pomoću markera specifičnog za gen koji kodira β - karoten hidroksilazu 1 (crtRB1). Hibridi dobijeni ukrštanjem ovih linija su imali do 10 puta veći sadržaj β - karotena i mogu se koristiti širom sveta u programima biofortifikacije, važne strategije za rešavanje nedostatka mikronutritijenata u ishrani ljudi u siromašnim zemljama u razvoju. Antocijanini su pigmenti koji biljnom tkivu daju crvenu, plavu i ljubičastu boju i imaju anti-inflamatorno, anti-kancerogeno i hipoglikemičko dejstvo (Hagiwara i sar., 2001). Selekcijom pomoću molekularnih markera sadržaj antocijanina povećan je kod kukuruza kokičara (Lago i sar., 2013), kao i kod kukuruza šećerca (Lago i sar., 2014). Za selekciju korišćena su dva SSR markera - nc009 (deo purple plant1 - pl1 gena) i umc1776, odnosno bnlg1064 (deo colored plant1 - b1 gena). Zbog antioksidativnog potencijala antocijanina kojim su bogate, ovako stvorene linije kokičara i šećerca mogu se smatrati novom funkcionalnom hranom. 15 1.4.3. Primena molekularnih markera u procesu stvaranja kukuruza visokog kvaliteta proteina Stvaranje kukuruza visokog sadržaja lizina i triptofana obuhvata manipulacije sa tri posebna genetička sistema: 1. opaque2 recesivni alel (o2o2) 2. geni modifikatori ("enhanseri" o2 gena; eng. to enhance - pojačati; nakon vezivanja regulatornih proteina dovode do naglog porasta aktivnosti gena) koji "pojačavaju" sadržaj lizina i triptofana u endospermu 3. geni modifikatori koji transformišu mekani u tvrdi endosperm. 1.4.3.1. Opaque2 gen Osnovni preduslov za proces stvaranja kukuruza sa povećanim sadržajem lizina i triptofana je prisustvo opaque2 gena u homozigotnom recesivnom stanju. Unutar sekvence opaque2 gena identifikovana su tri različita interna repetitivna elementa (SSR markera) – phi057, phi112 i umc1066, koji se koriste za utvrđivanje polimorfizma inbred linija i kao selekcioni markeri za opaque2 gen. Markeri phi057 i umc1066 se nasleđuju kodominantno, što omogućava identifikaciju kako homozigotnih tako i heterozigotnih opaque2 genotipova u dobijenom potomstvu. Marker phi112 pokazuje dominantni polimorfizam, pa se ne može koristiti za razlikovanje recesivnih homozigota, ali se može koristiti za kontrolu čistoće semena tokom rutinskog održavanja opaque2 i QPM linija. Kod svakog ukrštanja, neophodno je markere primeniti na roditeljskim linijama da bi se potvrdila njihova polimorfnost (Vivek i sar., 2008). 1.4.3.2. Geni modifikatori sadržaja aminokiselina Modifikatori/enhanseri se sastoje od lokusa koji utiču na nivo sadržaja lizina i triptofana u endospermu. Diskriminacija genotipova nosioca gena modifikatora od genotipova kukuruza standardnog kvaliteta koji se fenotipski ne razlikuju vrši se biohemijskim analizama. Sadržaj lizina i triptofana u zrnu kukuruza su visoko 16 korelisani (Nurit et al., 2009). Prosečan sadržaj lizina i triptofana kod standardnog kukuruza je oko 2% i 0,4%, redom, a kod QPM oko 4% i 0,8%, redom. Vrednosti kod standardnog kukuruza variraju od 1,6 - 2,6% za lizin i od 0,2 - 0,6% za triptofan, kao i od 2,7 – 4,5% za lizin i 0,5 - 1,1% za triptofan kod njihovih prevedenih o2 verzija (Vivek i sar., 2008). Ukoliko se sadržaj lizina i triptofana ne prati tokom stvaranja linija i hibrida može se desiti da se dobiju o2o2 genotipovi sa istim sadržajem kao kod standardnog kukuruza. Identifikovana su tri gena modifikatora, na hromozomima 2, 4 i 7, koji kontrolišu nivo faktora sinteze proteina i tako utiču na sadržaj aminokiselina (Wang i sar., 2001; Wu i sar., 2002). SSR markeri za sadržaj aminokiselina se uvode u programe oplemenjivanja kukuruza na visok kvalitet proteina, ali se njihova efikasnost u ovim programima još uvek ispituje. Babu i sar. (2012) su identifikovali 24 SSR markera za gene kandidate za metabolizam lizina i triptofana, kao i o2 modifikatore. Ovi markeri imaju potencijal za primenu kod finog mapiranja gena modifikatora, kao i za selekciju linija kukuruza visokog sadržaja lizina i triptofana upotrebom molekularnih markera. 1.4.3.3. Geni modifikatori tvrdoće endosperma Prisustvo gena modifikatora koji transformišu mekani u tvrdi endosperm se lako može utvrditi projektovanjem svetla vidljivog dela spektra kroz zrno, korišćenjem prosvetljivača (Vivek i sar., 2008). Zrna koja su neprozirna ukazuju na prisustvo opaque2 gena, a stepen modifikacije se određuje vizuelno, na osnovu stepena transparentnosti, skalom od 1 (potpuno prozirna) do 5 (potpuno neprozirna). Wallace i sar. (1990) su utvrdili da povećani nivo γ-zeina doprinosi nastanku fenotipa tvrdog endosperma pošto QPM zrna u endospermu imaju otprilike duplo veći sadržaj ovih proteina u odnosu na o2 mutante. Visoka korelacija između stepena modifikacije endosperma zrna i povećanog nivoa γ-zeina jasno ukazuje da ovi proteini učestvuju u nastanku prozirnog endosperma kod o2 i da geni modifikatori utiču na njihov sadržaj (Lopes i Larkins, 1991; 1995; Holding i Larkins, 2006). Dva gena odgovorna za tvrdoću endosperma su mapirana na hromozomu 7. Jedan od njih je lociran pored gena (gzr1) (eng. gamma zein modifier1) (Lopes i sar., 1995). Takođe, mapirano je i nekoliko QTL - ova za γ-zeine na hromozomima 1, 7 i 9 17 (Holding i sar., 2008). Efikasnost primene SSR markera za tvrdoću endosperma u programima oplemenjivanja kukuruza na visok kvalitet proteina se još uvek ispituje. Institut za kukuruz “Zemun Polje“ poseduje kolekciju opaque2 inbred linija razvijenih tokom sedamdesetih godina prošlog veka. Sa ciljem detaljnijeg opisa ovih linija urađena je analiza sadržaja triptofana i SSR analiza sa opaque2 specifičnim markerima (phi057, umc1066 i phi112), markerom za gen modifikator tvrdoće endosperma (umc1216) i šest markera za gene modifikatore sadržaja aminokiselina (bnlg2248, phi072, bnlg1633, bnlg1382, phi075 i mmc0241) (Ignjatović i sar., 2009). Utvrđene su značajne razlike u sadržaju triptofana izmedu standardnih i opaque2 linija. Svi SSR prajmeri korišćeni za razlikovanje normalnih i opaque2 linija su dali pozitivne rezultate. Prajmeri za modifikatore aminokiselina i tvrdoću endosperma nisu razlikovali standardne i opaque2 linije, kao ni opaque2 linije sa različitim sadržajem triptofana. Ovakvi rezultati se mogu objasniti mehanizmom regulacije gena na koje utiče o2 alel i/ili nedovoljno bliskom vezanošću SSR markera i ciljnih gena za rutinski skrining genotipova sa različitim sadržajem triptofana. U svakom slučaju, ovi markeri nisu pogodni za MAS. 1.4.3.4. Stvaranje genotipova visokog kvaliteta proteina Osnovni zadatak u selekciji QPM hibrida je istovremeno ostvarivanje visokog sadržaja esencijalnih aminokiselina i visokog prinosa zrna. Identifikacija i potvrda rezultata QPM selekcije podrazumeva biohemijske analize (određivanje sadržaja proteina, triptofana i izračunavanje indeksa kvaliteta - procenta triptofana u proteinu), kao i poljske oglede (praćenje agronomski važnih osobina). Prilikom stvaranja QPM germplazme prati se samo sadržaj triptofana, pošto je metoda brža i jednostavnija od metode za utvrđivanje sadržaja lizina. Procenat triptofana bi trebalo da bude veći od 0,075 u celom zrnu, odnosno od 0,070 u endospermu. Indeks kvaliteta proteina (% triptofana u proteinu) bi trebalo da bude veći od 0,80 u celom zrnu, odnosno 0,70 u endospermu. Selekcija upotrebom molekularnih markera povećava pouzdanost, efikasnost, uštedu novca i vremena u procesu stvaranja linija i hibrida kukuruza poboljšanog kvaliteta (Babu i sar., 2004). Babu i sar. (2005) objavili su rezultate konverzije 18 standardne inbred linije V25 u QPM verziju koristeći QPM donor liniju CML176. Gupta i sar. (2013) su pomoću MAS stvorili QPM roditeljske linije Vivek-9 hibrida i dobili QPM hibrid za duplo kraće vreme u odnosu na konvencionalno oplemenjivanje. Kombinujući konvencionalno oplemenjivanje i MAS, Zhang i sar. (2010) su dobili linije sa povećanim sadržajem lizina koristeći kao roditeljske komponente o2 i o16 kukuruz. Korišćenje treće generacije molekularnih markera kao što su SNP-ovi i razvoj savršenijih metoda za njihovu detekciju dovešće do njihove sve značajnije uloge u istraživanjima vezanim za MAS (Babu i sar., 2005). Sekvenciranje i bioinformatika daju novu dimenziju dešifrovanju i manipulisanju genetičkom osnovom poželjnih osobina. Metode funkcionalne genomike koja omogućava proučavanje ekspresije gena ukuljučuju korišćenje EST-ova (engl. Expressed Sequence Tag) i microarray tehnika. Korišćenje genskih sekvenci dobijenih iz EST-ova ili analognih gena, tzv. „kandidat gena“, obećava dalji napredak u identifikaciji gena koji kontrolišu željena svojstva. Jedan od načina za dobijanje QPM genotipova je pomoću genetičkih modifikacija (GM). Pošto je visok nivo lizina i triptofana kod opaque2 i QPM kukuruza povezan sa velikom redukcijom zeina učinjeni su pokušaji da se genetičkim inženjeringom smanji sadržaj ovih rezervnih proteina koristeći konstrukte tako dizajnirane da se redukuje proizvodnja zeina u zrnu (Segal i sar., 2003; Huang i sar., 2005, 2006). Ovaj pristup je takođe doveo do stvaranja opaque fenotipa (Segal i sar., 2003), što ukazuje da je taj fenotip direktno povezan sa redukcijom zeina. Druga strategija podrazumeva modifikaciju strukture proteina insercijom kodona za deficitarne esencijalne aminokiseline u određene regione genske sekvence ili menjajući postojeće kodone kako bi kodirali ove aminokiseline. Tako su radi poboljšanja kvaliteta proteina kukuruza kodoni za lizin i triptofan insertovani na specifičnu poziciju cDNK za 19 kDa α-zein (Wallace i sar., 1988). Slično tome, kodoni za lizin dodati su genu za γ-zein (Torrent i sar., 1997) i u proteinskim telima transgenih biljaka kukuruza došlo je do velike akumulacije γ-zeina bogatih lizinom, međutim kasnije studije su pokazale nestabilnost tih proteina i njihovo otežano skladištenje u semenu. Genetičke modifikacije vezane za ekspresiju gena za heterologne proteine su dale obećavajuće rezultate u poboljšanju hranljive vrednosti kukuruza. Metodom 19 mikrobombardovanja gen za 22 kDa kafirin, rezervni protein iz sirka (Sorghum bicolor), prenet je u genom kukuruza gde je došlo do ekspresije i značajne sinteze ovog proteina (Song i sar., 2004). Ekspresija gena za amarantin, rezervni protein iz semena amarantusa (Amaranthus hypochondriacus) u kukuruzu dovela je do povećanja sadržaja proteina i esencijalnih aminokiselina (Rascon-Cruz i sar., 2004). Takođe, gen koji kodira protein bogat lizinom iz polena paradajza (Solanum berthaultii) - SB401 je uspešno integrisan u genom kukuruza i njegova ekspresija je dovela do značajnog povećanja sadržaja lizina od 16,1% do 54,8% i ukupnih proteina od 11,6% do 39% u zrnu kukuruza (Yu i sar., 2004). Analize semena transgenog kukuruza su pokazale da je nivo lizina i ukupnih proteina ostao visok u šest narednih generacija, što ukazuje na stabilnost transformacije. Iako molekularna biotehnologija ima isti cilj kao i klasično oplemenjivanje, odnosno dobijanje biljaka sa poboljšanim svojstvima, ključna razlika je što se klasičnim metodama oplemenjivanja ne prenosi samo jedan ili dva željena gena već dolazi do rekombinacije genoma roditelja. Takođe, tradicionalne metode oplemenjivanja zasnivaju se na prenosu genetičkog materijala polnim putem između jedinki iste ili veoma bliskih vrsta, za razliku od molekularne biotehnologije kojom se vrši transfer jednog ili više poželjnih gena iz bilo koje evolucione kategorije u istu ili drugu kategoriju organizama. Na taj način se vrši kreiranje genetički modifikovanih organizama sa željenim osobinama. Molekularna biotehnologija je relativno nova nauka i ne postoji dovoljno naučnih podataka o bezbednosti korišćenja njenih rezultata u praksi. Kompleksnost ekosistema i višećelijskih organizama otežava predviđanje potencijalnog negativnog efekta genetički modifikovanih organizama na zdravlje ljudi i životinja, biodiverzitet i ekološke procese u celini. U odnosu na GM useve čija je upotreba ograničena velikim otporom javnosti i zakonskim regulativama, MAS je daleko perspektivniji pristup. Primenom molekularnih markera direktno se prati prisustvo željenih alela koji se tradicionalnim metodama prenose u ciljane genotipove radi poboljšanja određene osobine. Takođe, pomoću molekularnih markera se mogu odrediti biljke sa najvećim procentom genoma rekurentnog roditelja nakon povratnog ukrštanja i smanjiti broj biljaka koje treba testirati. Za kraće vreme moguće je stvoriti linije i hibride poboljšanog kvaliteta proteina, pri čemu je važno da promene kvaliteta ne utiču na prinos zrna i 20 ostale agronomske performanse. Njihovim gajenjem obezbedila bi se proizvodnja potrebnih količina biljnih proteina visokog kvaliteta, veće hranljive i biološke vrednosti za ishranu ljudi i domaćih životinja. 21 2. CILJ RADA Poboljšanje hranljive vrednosti kukuruza predstavlja jedan od glavnih ciljeva savremenih programa oplemenjivanja zbog sve značajnijih klimatskih promena i rasta ljudske populacije, odnosno sve veće potrebe za hranom. Razvoj metoda molekularne genetike doveo je do upotrebe molekularnih markera u procesima selekcije. Selekcija pomoću molekularnih markera upotpunjuje i znatno povećava efikasnost konvencionalnog oplemenjivanja. Upotrebom molekularnih markera može se smanjiti broj povratnih ukrštanja potrebnih za unošenje određenog alela u liniju recipijenta. Osnovni cilj ovog rada je dobijanje linija kukuruza poboljšanog kvaliteta proteina adaptiranih na umereno klimatsko područje, korišćenjem specifičnih molekularnih markera za opaque2 (o2) gen. Osim toga, cilj je da se održe dobre agronomske osobine, kao i kombinaciona sposobnost poboljšanih linija u odnosu na njihove izogene linije. Za poboljšanje kvaliteta proteina koristiće se, kao rekurentni roditelji (recipijenti o2 recesivne mutacije), linije standardnog kvaliteta zrna ZPL 3 i ZPL 5. Kao izvor povećanog sadržaja triptofana i lizina (donor o2 recesivne mutacije) koristiće se linija visokog kvaliteta proteina CML 144. Osnovna pretpostavka rada je da se korišćenjem specifičnih molekularnih markera za opaque2 gen mogu direktno birati heterozigotne i recesivno homozigotne biljke tokom procesa selekcije. Istovremeno, analizom odabranih O2o2 i o2o2 biljaka SSR markerima vršiće se izbor biljaka sa najvećim procentom genoma rekurentne linije. Na ovaj način bi trebalo povećati efikasnost selekcije, odnosno stvoriti poželjni genotip za manji broj generacija. Takođe, ocena fenotipskih osobina poboljšanih genotipova je neophodna kako bi se očuvale dobre agronomske performanse. Rezultati ovog rada mogu proširiti dosadašnja znanja o genetičkom poboljšanju elitnih linija i hibrida kukuruza na kvalitativna svojstva i tako dati doprinos savremenim genetičkim i molekularnim istraživanjima. Očekuje se da će dobijeni rezultati dati potpuniju sliku o prednostima selekcije upotrebom molekularnih markera kod kukuruza, čime bi se mogla povećati efikasnost selekcije. Gajenjem linija i hibrida visokog kvaliteta proteina obezbedila bi se proizvodnja biljnih proteina veće hranljive i biološke vrednosti u ishrani ljudi i domaćih životinja. 22 3. MATERIJAL I METODE 3.1. Biljni materijal Za poboljšanje kvaliteta proteina korišćene su, kao rekurentni roditelji, dve linije standardnog kvaliteta zrna (standardne linije) – ZPL 3 i ZPL 5. Ove linije su tipa zubana, imaju narandžasto zrno i adaptirane su na lokalne agroekološke uslove. Zbog odličnih kombinacionih sposobnosti one su komponente vodećih hibrida Instituta za kukuruz „Zemun Polje“. Kao izvor poboljšanog kvaliteta proteina (povećanog sadržaja triptofana i lizina) korišćena je linija visokog kvaliteta proteina CML 144, poreklom iz CIMMYT-a, Meksiko (eng. International Maize and Wheat Improvement Center). CML 144 je QPM (eng. Quality Protein Maize) tropska linija tipa tvrdunca, belog zrna i odličnih kombinacionih sposobnosti. U ovom istraživanju proces konverzije standardne linije u liniju poboljšanog kvaliteta proteina pomoću molekularnih markera se sastojao iz dva ciklusa povratnog ukrštanja i tri ciklusa samooplodnje. Ukrštanjem ZPL 3 x CML 144 i ZPL 5 x CML 144 dobijene su F1 generacije koje su povratno ukrštene sa rekurentnim roditeljima (standardnim linijama). U dobijenim BC1 potomstvima odabrane su heterozigotne biljke za opaque2 gen (O2o2) pomoću specifičnih SSR markera, koje su zatim povratno ukrštene sa rekurentnim roditeljima (formiranje BC2 generacija). Na biljkama BC2 generacija je ponovo izvršena selekcija na osnovu heterozigotnosti opaque2 gena, kao i na osnovu najveće genetičke sličnosti sa rekurentnim roditeljima (utvrđene pomoću SSR markera ravnomerno raspoređenih po genomu) i izvršena je njihova samooplodnja (formiranje BC2F2 generacija). Među biljkama BC2F2 generacija je izvršena selekcija recesivnih homozigota za opaque2 gen (o2o2) koje su zatim samooplođene kako bi se formirala BC2F3 generacija. Kod dobijenih biljaka je analizirana genetička sličnost sa rekurentnim roditeljima SSR markerima, a urađene su i odgovarajuće biohemijske i agronomske analize potomstava pojedinačnih klipova iz ove generacije. Iste analize ponovljene su sledeće godine na potomstvima pojedinačnih klipova iz BC2F4 generacije dobijene samooplodnjom biljaka BC2F3 generacije. Šematski prikaz konverzije standardne inbred linije u QPM verziju koristeći QPM donora dat je na Slici 2. 23    Slika 2. Šematski prikaz konverzije standardne inbred linije (RP - rekurentni roditelj) u QPM verziju. 24 3.2. Molekularne analize Molekularne analize su rađene u BC1, BC2 i BC2F2 generacijama za utvrđivanje heterozigotnosti/homozigotnosti opaque2 gena, a u BC2, BC2F3 i BC2F4 generacijama, kao i kod poboljšanih linija, za određivanje sličnosti potomstava sa rekurentnim roditeljem. 3.2.1. Izolacija DNK Za analizu opaque2 specifičnim SSR markerima, DNK je izolovana iz listova pojedinačnih biljaka. Za određivanje genetičke sličnosti između roditeljskih linija, kao i između rekurentnog roditelja i potomstava, korišćeni su grupni uzorci od listova 10 biljaka (BC2F3), odnosno 10 zrna (BC2F4) po genotipu. 3.2.1.1. Izolacija DNK iz lista DNK je izolovana prema metodi datoj u Doyle i Doyle (1987), iz uzoraka biljaka uzetih četiri nedelje nakon nicanja. Tkivo mladih i zdravih listova je samleveno u tečnom azotu do finog praha koristeći tučak i avan. Izmereno je po 100 mg od svakog uzorka i dodato po 900 µL pufera za ekstrakciju (2% CTAB; 100 mM Tris - HCl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 1,4 M NaCl; 0,2% β-mercaptoethanol) prethodno zagrejanog na 65 °C u vodenom kupatilu. Svaki uzorak sa puferom je homogenizovan laganim okretanjem ependorf tube i inkubiran u vodenom kupatilu na 65 °C 60 minuta. Nakon inkubiranja dodato je 900 µL Sevag-ovog reagensa (hloroform i izoamil alkohol u odnosu 24:1), i uzorci su mućkani do dobijanja emulzije. Uzorci su zatim centrifugirani 5 minuta na 12000 rpm na sobnoj temperaturi, nakon čega je gornja faza prebačena u novu ependorf tubu, a donja faza je odbačena. Dodato je 0,7 zapremine izopropil alkohola i uzorci su ostavljeni preko noći na - 20 ºC radi precipitacije DNK. Sledećeg dana su uzorci centrifugirani 5 minuta na 12000 rpm na sobnoj temperaturi. Nakon centrifugiranja supernatant je odbačen, a u uzorke je dodato po 1 mL 75% etanola. Inkubacija na sobnoj temperaturi je trajala 1 sat. Uzorci su zatim centrifugirani 10 minuta na 12000 rpm na sobnoj temperaturi, nakon čega je supernatant odbačen. 25 Ponovo je dodato po 1 mL 75% etanola u uzorke koji su zatim centrifugirani 3 minuta na 12000 rpm, na sobnoj temperaturi. Talog DNK je sušen na sobnoj temperaturi oko sat vremena, a zatim resuspendovan u 30 μL 0,1 x TE puferu (1 mM TRIS, pH 8,0; 0,1 mM EDTA, pH 8,0) i ostavljen da se rastvori preko noći na 4 ºC. 3.2.1.2. Izolacija DNK iz zrna Izolacija DNK je urađena prema metodi datoj u Rogers i Bendich (1988). Po deset zrna sa svake analizirane biljke je samleveno u mlinu za simultano mlevenje pojedinačnog zrna (Kataskapt). Vreme mlevenja je iznosilo dva puta po tri minuta. Od svakog zrna izmereno je po 100 mg i napravljen je grupni uzorak, od koga je izmereno po 250 mg brašna za izolaciju. U svaki uzorak dodato je 2 x CTAB (2% CTAB; 1,4 M NaCl; 1% PVP; 20 mM EDTA; 100 mM Tris-HCl, ph 8,0) pufera za izolaciju, u odnosu tkivo:pufer 1:1 i 1 x CTAB pufer (dva puta razblažen 2 x CTAB pufer) u odnosu tkivo:pufer 1:2. Oba pufera su prethodno zagrejana u vodenom kupatilu na 65 °C. Svaki uzorak sa puferom je homogenizovan laganim okretanjem ependorf tube i inkubiran u vodenom kupatilu na 65 °C 30 minuta. Nakon inkubiranja dodata je jedna zapremina Sevag-ovog reagensa (hloroform i izoamil alkohol u odnosu 24:1) radi denaturacije proteina, i uzorci su mućkani do dobijanja emulzije. Zatim su centrifugirani 2 minuta na 12000 rpm na 4 °C. Nakon centrifugiranja gornja faza je prebačena u novu ependorf tubu, a donja je odbačena. U uzorke je zatim dodata 1/10 zapremine 10% CTAB pufera (10% CTAB; 0,7 M NaCl), prethodno zagrejanog u vodenom kupatilu na 65 °C, i jedna zapremina Sevag-ovog reagensa, i uzorci su mućkani do dobijanja emulzije. Nakon toga su centrifugirani 2 minuta na 12000 rpm na 4 °C. Posle centrifugiranja, gornja faza je prebačena u novu ependorf tubu, a donja je odbačena. U uzorke je zatim dodata jedna zapremina pufera za precipitaciju (1% CTAB, 50 mM Tris, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0). Uzorci su lagano promućkani i inkubirani na sobnoj temperaturi 20 minuta, do taloženja DNK. Nakon precipitacije izvršeno je centrifugiranje 2 minuta na 12000 rpm na 4 °C. Supernatant je odbačen, a talog resuspendovan u „high-salt“ TE puferu (10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0; 1 M NaCl) i inkubiran u vodenom kupatilu na 65 °C 10 minuta. Nakon inkubacije dodate su dve zapremine hladnog 96% etanola. Sadržaj ependorf epruvete je promućkan i ostavljen 30 minuta na - 20 °C. Uzorci su 26 centrifugirani 15 minuta na 12000 rpm na 4 °C. Nakon centrifugiranja supernatant je odbačen, a talog ispran dva puta u 1 ml hladnog 75% etanola. Talog DNK je sušen na sobnoj temperaturi oko sat vremena, a zatim resuspendovan u 30 μL 0,1 x TE puferu (1 mM TRIS, pH 8,0; 0,1 mM EDTA, pH 8,0) i ostavljen da se rastvori preko noći na 4 ºC. 3.2.2. Određivanje koncentracije i provera kvaliteta DNK Koncentracija i kvalitet DNK su određeni spektrofotometrijski i elektroforezom na agaroznom gelu. 3.2.2.1. Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije i provera kvaliteta DNK Uzorci su razblaženi u 0,1 x TE puferu 1000 puta. Apsorbancija je merena na talasnim dužinama λ=230 nm, λ=260 nm i λ=280 nm (spektrofotometar Shimadzu UV- 1601). Koncentracija DNK je izračunata po formuli: C (μg/μL) = (OD260 x R x 50)/1000 gde je: OD260 – apsorbancija na talasnoj dužini λ=260 nm R – razblaženje uzorka 50 – koncentracija 50 μg/μL koja ima apsorbancu OD = 1 (jedna jedinica optičke gustine odgovara koncentraciji DNK od 50 μg/mL) Odnosi apsorbanci na λ = 260 nm i λ = 280 nm, kao i λ = 260 nm i λ = 230 nm se koriste da bi se procenila čistoća DNK. λ = 260 nm pokazuje koncentraciju nukleinskih kiselina u uzorku, dok proteini apsorbuju svetlost na λ = 280 nm, a fenoli na λ = 230 nm. DNK se smatra dovoljno čistom za marker analizu ako je odnos OD260 / OD280 u opsegu 1,8 - 2,0, a odnos OD260 / OD230 u opsegu 1,8 - 2,2. 27 3.2.2.2. Elektroforetsko određivanje koncentracije i provera kvaliteta DNK na agaroznom gelu Genomska DNK je analizirana na 0,8% agaroznom gelu. Na gel je nanošeno po 8 μl DNK uzoraka pomešanih sa 1/3 zapremine pufera (0,25% brom fenol plavo, 30% glicerol u dd H2O). Kao standardi za određivanje koncentracija korišćena su različita razblaženja λ DNK (5, 10, 50, 100 i 250 ng/μL). Korišćen je aparat za horizontalnu elektroforezu (DNA Sub-Cell™, BioRad). Elektroforeza u 0,5 x TBE (deset puta razblažen 5 x TBE pufer - 445 mM Tris; 445 mM borna kiselina; 0,5 M EDTA, pH 8,0) je trajala 1 h na konstatnoj struji jačine 40 mA. Nakon elektroforeze gelovi su bojeni 20 minuta u rastvoru etidijum bromida koncentracije 0,5 μg/μL, a zatim pod UV svetlom transiluminatora fotografisani pomoću sistema za dokumentaciju (gel documentation system, BioDocAnalyze, Biometra). Koncentracija DNK uzoraka je određena vizuelnim poređenjem sa koncentracijama standarda. Kvalitet DNK, odnosno stepen razgradnje pri ekstrakciji, procenjen je poređenjem traka uzoraka sa λ DNK. Razmaz ispod traka ukazuje na mehaničku ili hemijsku degradaciju. Po utvrđivanju koncentracije i kvaliteta izolovane DNK, uzorci su do upotrebe čuvani na - 20 °C. 3.2.3. SSR analiza 3.2.3.1. Analiza opaque2 specifičnim SSR markerima SSR analiza je urađena sa tri prajmera (LKB Vertriebs GmbH) specifična za opaque2 gen (Tabela 1). Reakcija amplifikacije se odvijala u 20 µL reakcione smeše koja je sadržala DreamTaq™ Green PCR Master Mix (2X) (Fermentas), 0,25 μM prajmera (forward i reverse) i 20 ng DNK. 28 Tabela 1. Naziv, pozicija na hromozomu (bin), ponovak i sekvenca SSR prajmera specifičnih za opaque2 gen Naziv prajmera Bin Ponovak Sekvenca prajmera (forward i reverse) phi 057 7.01 GCC 5’-CTCATCAGTGCCGTCGTCCAT-3’ 5’-CAGTCGCAAGAAACCGTTGCC-3’ phi 112 7.01 AG 5’-TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGT-3’ 5’-AGGAGTACGCTTGGATGCTCTTC-3’ umc 1066 7.01 (GCCAGA)5 5’-ATGGAGCACGTCATCTCAATGG-3’ 5’-AGCAGCAGCAACGTCTATGACACT-3’ Lančana reakcija polimeraze (eng. Polymerase Chain Reaction - PCR) je rađena na TProfessional Standard Thermocycler-u (Biometra) po sledećem programu: 1) inicijalna denaturacija na 94 ºC/2 min, 2) 40 ciklusa denaturacije na 94 ºC/1 min, vezivanja prajmera na 60 ºC/2 min i elongacije na 72 ºC/2 min, 3) finalna elongacija na 72 ºC/10 min. PCR produkti su razdvojeni na 2,5% agaroznom gelu, kao i na 8% poliakrilamidnom gelu radi boljeg razdvajanja fragmenata. Približne veličine amplifikovanih produkata za svaki SSR lokus su određene prema poziciji trake na gelu u odnosu na DNK marker od 100 bp. 3.2.3.2. Genetička karakterizacija SSR markerima SSR analiza je urađena metodom Edwards-a i sar. (1991), sa ukupno 52 prajmera (Tabela 2). Zbog nedostupnosti određenih markera, broj markera se razlikovao po generacijama (roditeljske linije - 40, BC2 - 34, BC2F3 - 32, BC2F4 - 32, sub-linije - 32). U svim slučajevima, markeri su bili ravnomerno raspoređeni po genomu. Reakcija amplifikacije se odvijala u 25 µL reakcione smeše koja je sadržala DreamTaq™ Green PCR Master Mix (2X), 0,5 μM prajmera (forward i reverse) i 20 ng DNK. Lančana reakcija polimeraze je rađena na TProfessional Standard Thermocycler- u (Biometra) po programu Touchdown, koji se sastoji od sledećih koraka: 1) inicijalna denaturacija na 95 °C/5 min, 2) 15 ciklusa denaturacije na 95° C/30 sek, vezivanja prajmera na 63,5 °C/1 min (uz smanjivanje temperature za 0,5 °C po ciklusu) i elongacije na 72 °C/1 min, 3) 22 ciklusa denaturacije na 95 °C/30 sek, vezivanja 29 prajmera na 56 °C/1 min i elongacije na 72 °C/1 min, 4) finalna elongacija na 72 °C/7 min. PCR produkti su razdvojeni na 8% poliakrilamidnom gelu. 30 Tabela 2. Naziv, pozicija na hromozomu (bin), ponovak, sekvenca SSR prajmera i generacija u kojoj su korišćeni za analizu Naziv prajmera Bin Ponovak Sekvenca (forward i reverse) Generacija u kojoj je korišćen za analizu Roditeljske linije BC2 BC2F3, BC2F4 Sub- linije 1 umc 1282 1.01 (AT)6 5’-TACACTACACGACTCCCAACAGGA-3’ 5’-GCGAGGGTTCTTTCCATAGAGAAT-3’ + + + 2 umc 1070 1.02 (TC)7 5’-TTCCAGTAAGGGAGGTGCTG-3’ 5’-TAAGCAACATATAGCCGGGC-3’ + + 3 umc 1076 1.05 CA 5’-TTGGAAATCACCAATTGATATAGTTTG-3’ 5’-TCTATTGCAAACGCCAAAAGTAGC-3’ + 4 umc 1335 1.06 (AG)24 5’-ATGGCATGCATGTGTTTGTTTTAC-3’ 5’-ACAGACGTCGCTAATTCCTGAAAG-3’ + + 5 umc 1013 1.08 (GA)9 5’-TAATGTGTCCATACGGTGGTGG-3’ 5’-AGCTGGCTAGTCTCAGGCACTC-3’ + + + + + 6 bnlg 1643 1.08 (AG)24 5’-ACCACCGTCCACCTCCAC-3’ 5’-ATTGACCCCGTGACCCTC-3’ + + + + + 7 umc 2047 1.09 (GACT)4 5’-GACAGACATTCCTCGCTACCTGAT-3’ 5’-CTGCTAGCTACCAAACATTCCGAT-3’ + + + + + 8 umc 1605 1.12 (GGC)4 5’-GGAGAAGCACGCCTTCGTATAG-3’ 5’-CCAGGAGAGAAATCAACAAAGCAT-3’ + + 9 umc 1265 2.02 (TCAC)4 5’-GCCTAGTCGCCTACCCTACCAAT-3’ 5’-TGTGTTCTTGATTGGGTGAGACAT-3’ + + + + 10 bnlg 2248 2.03 (AG)30 5’-CCACCACATCCGTTACATCA-3’ 5’-ACTTTGACACCGGCGAATAC-3’ + + + 11 bnlg 1633 2.07 (AG)16 5’-GTACCTCCAGGTTTACGCCA-3’ 5’-TCAACTTCTCATGCACCCAT-3’ + + + 12 bnlg198 2.08 - 5’-GTTTGGTCTTGCTGAAAAATAAAA-3’ 5’-GCTGGAGGCCTACATTATTATCTC-3’ + + 13 bnlg 1520 2.09 (AG)22 5’-TCCTCTTGCTCTCCATGTCC-3’ 5’-ACAGCTGCGTAGCTTCTTCC-3’ + + 31 Tabela 2. Nastavak Naziv prajmera Bin Ponovak Sekvenca (forward i reverse) Generacija u kojoj je korišćen za analizu Roditeljske linije BC2 BC2F3, BC2F4 Sub- linije 14 phi 036 3.04 AG 5’-CCGTGGAGAGACGTTTGACGT-3’ 5’-TCCATCACCACTCAGAATGTCAGTGA-3’ + + + + + 15 bnlg 197 3.06 - 5’-GCGAGAAGAAAGCGAGCAGA-3’ 5’-CGCCAAGAAGAAACACATCACA-3’ + + 16 bnlg 1350 3.08 (AG)13 5’-TGCTTCAGCGCATTAAACTG-3’ 5’-TGCTCGTGTGAGTTCCTACG-3’ + + + + + 17 umc 1594 3.09 (TA)10 5’-CACTGCAGGCCACACATACATA-3’ 5’-GCCAGGGGAGAAATAAAATAAAGC-3’ + + + + + 18 phi 072 4.00 AAAC 5’-ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT-3’ 5’-GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT-3’ + 19 umc 2039 4.03 (CAG)5 5’-CATCTCCTACCAGCTCACCCC-3’ 5’-GCTCGGGGTAGTAGTGTTCTCCTT-3’ + + + 20 umc 1418 4.08 (GGAAG)4 5’-TCACACACACACTACACTCGCAAT-3’ 5’-GAGCCAAGAGCCAGAGCAAAG-3’ + + 21 bnlg 589 4.10 - 5’-GGGTCGTTTAGGGAGGCACCTTTGGT-3’ 5’-GCGACAGACAGACAGACAAGCGCATTGT-3’ + + 22 umc 1109 4.10 (ACG)4 5’-TCACACACACACTACACTCGCAAT-3’ 5’-GAGCCAAGAGCCAGAGCAAAG-3’ + + + + + 23 bnlg 557 5.03 - 5’-TCACGGGCGTAGAGAGAGA-3’ 5’-CGAAGAAACAGCAGGAGATGAC-3’ + + + + + 24 umc 1274 5.03 (TGC)5 5’-TTGAGTCTGGTACTGCGTATGAGG-3’ 5’-TAGCACTCCAACAGCAAGAGTTTG-3’ + + + 25 phi 085 5.06 AACGC 5’-AGCAGAACGGCAAGGGCTACT-3’ 5’-TTTGGCACACCACGACGA-3’ + + 26 phi 087 5.06 ACC 5’-GAGAGGAGGTGTTGTTTGACACAC-3’ 5’-ACAACCGGACAAGTCAGCAGATTG-3’ + + + + + 32 Tabela 2. Nastavak Naziv prajmera Bin Ponovak Sekvenca (forward i reverse) Generacija u kojoj je korišćen za analizu Roditeljske linije BC2 BC2F3 BC2F4 Sub- linije 27 phi 075 6.00 CT 5’-GGAGGAGCTCACCGGCGCATAA-3’ 5’-AAAGGTTACTGGACAAATATGCGTAACTCA-3’ + + 28 umc 1006 6.02 (GA)19 5’-AATCGCTTACTTGTAACCCACTTG-3’ 5’-AGTTTCCGAGCTGCTTTCTCT-3’ + + + + + 29 mmc 0241 6.05 (TA)4N13 (TG)15 5’-TATATCCGTGCATTTACGTTT-3’ 5’-CATCGCTTGTCTGTCGA-3’ + + + 30 bnlg 1443 6.05 (AG)25 5’- TACCGGAATCCTCTTTGGTG-3’ 5’- TTTGACAACCTCTTCCAGGG-3’ + + + + + 31 umc 1695 7.00 (CA)8 5’-CAGGTAATAACGACGCAGCAGAA-3’ 5’-GTCCTAGGTTACATGCGTTGCTCT-3’ + + + + + 32 umc 1036 7.02 GA 5’-CTGCTGCTCAAGGAGATGGAGA-3’ 5’-GACACACATGCACGAGCAGACT-3’ + + 33 umc 1393 7.02 (GTC)4 5’-CCTTCTTCTTATTGTCACCGAACG-3’ 5’-GCCGATGAGATCTTTAACAACCTG-3’ + + 34 27-kDa γ-zein 7.02 - 5’-CGGTTTCTCCTAAATACTCCCCC-3’ 5’-CTATACCTACGTCCCCACCCTT-3’ + 35 umc 1015 7.03 (GA)45 5’-CAGACACAAGCAGCAAAGCAAG-3’ 5’-TCCGACTCCAAGAAGAGGAGAA-3’ + + 36 umc 1324 7.03 (AGC)5 5’-ATCCATCATCATCATCATTGCTTG-3’ 5’-ATGTCATCATGTACCAGGTGTTGG-3’ + + + 37 umc 1782 7.04 (GAC)4 5’-CGTCAACTACCTGGCGAAGAA-3’ 5’-TCGCATACCATGATCACTAGCTTC-3’ + + + 38 umc 1799 7.04 (TG)12 5’-GTGATGAATAATGTCCCCAATTCC-3’ 5’-GGACAGATGTCTGGAGATTGCTTT-3’ + + + + + 39 umc 1944 7.04 - 5’-GAAGAAGGATCGCACACATGG-3’- 5’-AGACTGTCGCGCTGTACTATACCC-3’ + + 33 Tabela 2. Nastavak Naziv prajmera Bin Ponovak Sekvenca (forward i reverse) Generacija u kojoj je korišćen za analizu Roditeljske linije BC2 BC2F3, BC2F4 sub- linije 40 phi 116 7.06 ACTG/ACG 5’-GCATACGGCCATGGATGGGA-3’ 5’-TCCCTGCCGGGACTCCTG-3’ + + + + 41 bnlg 2235 8.02 (AG)23 5’-ATCCGGAGACACATTCTTGG-3’ 5’-CTGCAAGCAACTCTCATCGA-3’ + + + + + 42 umc 1858 8.04 (TA)8 5’-GTTGTTCTCCTTGCTGACCAGTTT-3’ 5’-ATCAGCAAATTAAAGCAAAGGCAG-3’ + + + + 43 phi 080 8.08 AGGAG 5’-CACCCGATGCAACTTGCGTAGA-3’ 5’-TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3’ + + + 44 phi 033 9.01 AAG 5’-ATCGAAATGCAGGCGATGGTTCTC-3’ 5’-ATCGAGATGTTCTACGCCCTGAAGT-3’ + + + 45 umc 1040 9.01 (CT)11 5’-CATTCACTCTCTTGCCAACTTGA-3’ 5’-AGTAAGAGTGGGATATTCTGGGAGTT-3’ + + + + 46 bnlg 127 9.03 - 5’-CATGTATACGAGAAGCACCCTAT-3’ 5’-ATCGTAACTCAGCGGTTTGTG-3’ + 47 umc 1492 9.04 (GCT)4 5’-GAGACCCAACCAAAACTAATAATCTCTT-3’ 5’-CTGCTGCAGACCATTTGAAATAAC-3’ + + + + + 48 umc 1771 9.04 (CGTC)4 5’-GTGAAATGTTGTTTCCAATGCAAG-3’ 5’-CATCAGGAAGGAAGACGACTAGGA-3’ + 49 umc 1507 10.04 (CACAA)4 5’-GATTCAAACCAAACACTTTTCCCA-3’ 5’-CGAACCTTGCTGTGTGTTTATCAG-3’ + + 50 bnlg 1526 10.04 (AG)15 5’-ACGAGCGAGTGGAGAATAGG-3’ 5’-AGCCCAGTACGTGGGGTC-3’ + + + + 51 umc 1506 10.05 (AACA)4 5’-AAAAGAAACATGTTCAGTCGAGCG-3’ 5'-ATAAAGGTTGGCAAAACGTAGCCT-3’ + + + + + 52 umc 1827 10.05 (GAC)6 5’-GCAAGTCAGGGAGTCCAAGAGAG-3’ 5’-CCACCTCACAGGTGTTCTACGAC-3’ + + + + - podaci nisu dostupni 34 3.2.4. Elektroforetsko razdvajanje PCR produkata 3.2.4.1. Agarozna elektroforeza Produkti PCR reakcije sa opaque2 specifičnim markerima su razdvojeni na 2,5% agaroznom gelu. Na gel je nanošeno po 8 μL PCR smeše. Kao standardi korišćeni su 20 bp i 100 bp DNK markeri (Fermentas). Korišćen je aparat za horizontalnu elektroforezu (DNA Sub-Cell™, BioRad). Elektroforeza u 0,5 x TBE puferu (deset puta razblažen 5 x TBE pufer - 445 mM Tris; 445 mM borna kiselina; 0,5 M EDTA, pH 8,0) je trajala 1,5 h na konstantnoj struji jačine 40 mA. Nakon elektroforeze gelovi su bojeni 20 minuta u rastvoru etidijum bromida koncentracije 0,5 μg/μL, a zatim pod UV svetlom transiluminatora fotografisani pomoću sistema za dokumentaciju (gel documentation system, BioDocAnalyze, Biometra). 3.2.4.2. Poliakrilamidna elektroforeza Amplifikovani produkti dobijeni opaque2 specifičnim markerima koji se nisu jasno razdvojili na agaroznom gelu, kao i produkti SSR analize za utvrđivanje genetičke sličnosti sa roditeljskim linijama, razdvojeni su na 8% poliakrilamidnom gelu (akrilamid/bis-akrilamid 19:1, 5 x TBE, 10% amonijum-persulfat i TEMED). Na gel je nanošeno po 8 μL PCR smeše. Kao standardi korišćeni su 20 bp i 100 bp DNK markeri (Fermentas). Za izvođenje elektroforeze je korišćen Mini Protean Tetra-cell (BioRad), četvoro-komorni aparat za vertikalnu poliakrilamidnu elektroforezu. Elektroforeza u 1 x TBE (pet puta razblažen 5 x TBE pufer - 445 mM Tris; 445 mM borna kiselina; 0,5 M EDTA, pH 8,0) je trajala 1,5 h pri konstantnom naponu od 80 V. Nakon elektroforeze gelovi su bojeni 20 minuta u rastvoru 0,5 μg/μL etidijum bromida, a zatim pod UV svetlom transiluminatora fotografisani pomoću sistema za dokumentaciju (gel documentation system, BioDocAnalyze, Biometra). 35 3.2.5. Statistička analiza podataka dobijenih molekularnim markerima 3.2.5.1. Genetička sličnost Prisustvo/odsustvo traka u SSR analizi je pretvoreno u binarne podatke (1 i 0) koji su korišćeni kao osnovna matrica za izračunavanje genetičke sličnosti (GS) između ispitivanih genotipova kukuruza, po metodi Dice-a (1945): gde je: a - prisustvo trake u oba genotipa (ij) b - prisustvo trake kod genotipa i, a odsustvo kod genotipa j c - prisustvo trake kod genotipa j, a odsustvo kod genotipa i 3.2.5.2. Klaster analiza Na osnovu matrica genetičkih sličnosti ispitivanih genotipova kukuruza urađena je klaster analiza primenom UPGMA metode (eng. Unweight Pair Group Method with Arithmetic Mean) u SAHN programu (eng. Sequential, Agglomerative, Hierarchical, and Nested Clustering Method; Sneath i Sokal, 1973), pomoću NTSYS-pc2.1 softvera (Rohlf, 2000). Rezultati su prikazani grafički u formi dendrograma. Za svaki dendrogram je izračunat ko-fenetički koeficijent korelacije između matrica genetičkih sličnosti po Dice-u, a njegova značajnost je testirana Mantel-ovim testom (Mantel, 1967). 36 3.3. Biohemijske analize Utvrđivanje kvaliteta zrna kukuruza podrazumeva određivanje sadržaja triptofana i ukupnih proteina, kao i izračunavanje indeksa kvaliteta (procenat triptofana u proteinu). 3.3.1. Priprema uzoraka Od svakog genotipa odabrana su dva reprezentativna uzorka od po 30 zrna. Zrno je sušeno 16-18 sati na 65 °C u termostatu, zatim samleveno u ciklonskom mlinu (Cyclotec 1093 lab mill, Foss Tecator) do čestica veličine 500 μm. Brašno je odmašćeno heksanom u Sokslet ekstraktoru (Inkolab) u trajanju od 4 h. 3.3.2. Sadržaj triptofana Sadržaj triptofana određen je po metodi datoj u Nurit i sar. (2009). Ova kolorimetrijska metoda se zasniva na Hopkins-Cole reakciji, u kojoj jedan molekul glioksilne kiseline i dva molekula triptofana formiraju obojeno jedinjenje sa maksimumom apsorbancije na 560 nm. Izmereno je po 80 mg brašna od svakog uzorka i od dve kontrole (kukuruz standardnog kvaliteta zrna i QPM) i dodato po 3 mL sveže napravljenog rastvora papaina (1 mg papaina/1 mL 0,165 M CH3COONa, pH 7,0). Rastvor papaina, bez uzorka, je korišćen kao slepa kontrola. Papain je protein koji sadrži veliku količinu triptofana (jedan molekul papaina sadrži 7 jedinica triptofana). Pri finalnom računanju sadržaja triptofana, vrednosti dobijene za slepu probu se oduzimaju od vrednosti dobijene za uzorke. Uzorci su kratko promešani na vorteksu i inkubirani u termostatu na 65 °C 16 sati (preko noći). Jedan sat nakon početka i jedan sat pre završetka hidrolize uzorci su ponovo na kratko promešani na vorteksu. Nakon inkubacije uzorci su ohlađeni na sobnoj temperaturi, promešani na vorteksu i centrifugirani 10 minuta na 3600 rpm. Po 1 mL supernatanta je prebačeno u nove tube i dodato po 3 mL kolorimetrijskog reagensa (0,46% glioksilna kiselina, jednake zapremine 30 N H2SO4 i 1,25% FeCl3- 6H2O u 7 N H2SO4), a zatim su uzorci inkubirani 30 minuta na 65 °C. Nakon hlađenja 37 uzoraka na sobnoj temperaturi apsorbancija je očitana na spektrofotometru na 560 nm. Procenat triptofana je izračunat pomoću standardne (kalibracione) krive dobijene na osnovu apsorpcija poznatih količina triptofana, opsega od 0 do 30 μg/mL (Tabela 3) prema formuli: % trp = OD560 korigovano x Faktor gde je: OD560 korigovano = OD560 uzorak - OD560 papain blank Tabela 3. Priprema razblaženja triptofana poznatih koncentracija za izradu standardne krive Koncentracija triptofana (µg/mL) Triptofan 100 µg/ml (mL) NaH3CCOOH, 0,165 M, pH 7,0 (mL) Ukupna zapremina (mL) 1 0,0 0,0 10,0 10,0 2 10 1,0 9,0 10,0 3 15 1,5 8,5 10,0 4 20 2,0 8,0 10,0 5 25 2,5 7,5 10,0 6 30 3,0 7,0 10,0 38 3.3.3. Sadržaj proteina Ukupan sadržaj proteina u celom zrnu određen je po Kjedal (Kjeldahl) metodi (Vivek i sar., 2008). Po ovoj metodi sadržaj proteina se određuje indirektno, na osnovu koncentracije azota (N) u uzorku dobijene odgovarajućom titracionom tehnikom. Od svakog uzorka odmereno je približno 0,2 g brašna i preneto u staklene tubuse za razaranje. Zatim je dodat katalizator (Kjeltalos Cu / 3,5, koji sadrži 3,5g K2SO4 i 0,4g CuSO4 x 5H2O, na vrh špatule), 5 mL smeše koncentrovane H2SO4 i H3PO4 (50:1) i 2,5 mL 30% H2O2. Uzorci su sagorevani u tekatoru (Digestion System 20, 1005 Heating Unit) na 420 °C u trajanju od 60 minuta (dok se uzorak ne obezboji). Nakon sagorevanja uzorci su ostavljeni u digestoru dok se ne ohlade (oko 30 minuta). U odgovarajuće rezervoare aparata za destilaciju (FOSS, 2200 Kjeltec Auto Destillation) su sipani 40% NaOH i destilovana voda, a u erlenmajere po 25 mL 4% H3BO3, koja sadrži indikatore (brom krezol zeleno i metil rot). Tubusi i erlenmajeri su postavljeni u odgovarajuća ležišta u aparatu. Uključivanjem aparata automatski je dodato po 70 mL destilovane vode i 50 mL NaOH, nakon čega je otpočeo proces destilacije u trajanju od tri minuta. Tokom destilacije, crvena boja borne kiseline postaje zelena. Pomoću aparata za titraciju (METROHM) u erlenmajere je dodavana 0,1 N HCl, a titracija je vršena do pojave početne crvene boje. Ukupni proteini (P) su izračunati po formuli: gde je: VHCl (mL) - zapremina HCl utrošene za titraciju uzoraka Vblank (mL) - zapremina HCl utrošene za titraciju slepe probe CHCl (mol/L) - koncentracija HCl muzorka (g) - težina uzorka F - faktor za izračunavanje sadržaja proteina za kukuruz = 6,25 39 3.3.4. Indeks kvaliteta Indeks kvaliteta (QI – quality index) proteina (% triptofana u proteinu) izračunat je prema formuli: 3.3.5. Statistička analiza biohemijskih osobina Sve analize su obavljene u dva ponavljanja i za sve parametre je urađena jednofaktorijalna analiza varijanse (eng. Analysis of Variance - ANOVA) po kompletno slučajnom blok sistemu u MSTAT-C statističkom programu. Značajnosti razlika između srednjih vrednosti genotipova za različite osobine su utvrđene na osnovu Fisher-ovog LSD (eng. Least Significant Difference) testa, na nivou značajnosti od 0,05. Fenotipske korelacije između posmatranih parametara su izračunate primenom Pearson-ovog koeficijenta korelacije (r): gde je: - suma odstupanja vrednosti parametra X od njegove srednje vrednosti - suma odstupanja vrednosti parametra Y od njegove srednje vrednosti - kvadratni koren iz sume kvadrata odstupanja vrednosti parametra X od njegove srednje vrednosti - kvadratni koren iz sume kvadrata odstupanja vrednosti parametra Y od njegove srednje vrednosti 40 3.4. Stepen modifikacije endosperma zrna kukuruza Prema Vivek i sar. (2008) zrna kukuruza su prema stepenu modifikacije endosperma definisana od zrna tipa 1 (potpuno prozirna) do tipa 5 (potpuno neprozirna). Zrna sa ≤ 25% neprozirnosti su tip 2, sa ≤ 50% tip 3, a sa ≤ 75% tip 4 (Slika 3). Određivanje stepena modifikacije endosperma rađeno je na prosvetljivaču, projektovanjem svetla vidljivog dela spektra, vizuelnom ocenom transparentnosti zrna. Birana su zrna tipa 1, 2 i 3, nakon što je marker analizom bilo utvrđeno prisustvo o2 alela. Slika 3. Zrna kukuruza na prosvetljivaču grupisana prema stepenu modifikacije endosperma (Vivek i sar., 2008) 3.5. Analiza morfoloških i agronomskih osobina Pošto u BC2F2 generaciji ukrštanja ZPL 3 x CML 144 nije detektovana ni jedna recesivno homozigotna biljka, sva dalja ispitivanja su rađena samo na potomstvu ukrštanja ZPL 5 x CML 144. 41 Recesivno homozigotna (o2o2) potomstva BC2F3 generacije iz ukrštanja ZPL 5 x CML 144 dobijene 2012. godine, zajedno sa linijom ZPL 5, posejana su 2013. godine u polju po slučajnom blok sistemu (eng. RCBD - Randomized Complete Block Design) u dva ponavljanja na dve lokacije. Sejan je po jedan red od svakog genotipa, u 10 kućica. Razmak između redova iznosio je 0,7 m, a između kućica u redu 0,4 m. Posejano je po tri zrna u svakoj kućici, a nakon nicanja biljaka, u fazi od pet do sedam listova, izvršeno je raščupavanje na po dve biljke u kućici. Četiri nedelje nakon nicanja uzeti su uzorci za SSR analizu, identifikovano je pet potomstva sa najvećim procentom genoma rekurentnog roditelja i na njima su dalje merene fenotipske osobine. Spisak svih fenotipskih osobina, jedinice u kojima su izražene vrednosti merenja, kao i opis merenja su prikazani u Tabeli 4. Istovremeno, odabrana potomstva su ukrštena sa komercijalnim test F1 hibridom radi provere kombinacione sposobnosti u odnosu na standardnu liniju. Kombinacija odabranog testera i standardne linije predstavlja jedan od vodećih hibrida Instituta za kukuruz „Zemun Polje“. Uporedo sa ovim ogledom posejano je po pet kućica istih potomstava BC2F3 generacije. Biljke iz ovih redova su samooplođene i dobijena je BC2F4 generacija. Nakon berbe je određen stepen modifikacije endosperma zrna na prosvetljivaču, sadržaj triptofana, ukupnih proteina i indeks kvaliteta zasebno za svaki samooplođeni klip. Ponovo je pomoću SSR markera određena genetička sličnost sa standardnom linijom. Na osnovu svih dobijenih fenotipskih, biohemijskih i SSR rezultata, odabrane su sub- linije koje su genetički najsličnije roditeljskoj liniji i koje od nje najmanje odstupaju po svojim agronomskim osobinama, a istovremeno imaju povećani sadržaj triptofana. Sledeće, 2014. godine, postavljen je ogled po istom eksperimentalnom dizajnu kao i prethodne godine sa odabranim sub-linijama, kao i ogled sa F1 generacijom test- ukrštanja (hibridi) odabranih genotipova. U ogledu sa test-ukrštanjima kao standard je korišćen izogeni komercijalni hibrid. Takođe, odabrane sub-linije su samooplođene radi biohemijskih i genetičkih analiza. 42 Tabela 4. Analizirane morfološke i agronomske osobine Tip osobine Osobina Skraćenica Jedinica Opis načina merenja Morfološke osobine Visina biljke VB cm Visina biljke od površine zemlje do vrha metlice Visina biljke do klipa VBK cm Visina biljke od površine zemlje do nodusa koji nosi primarni klip Broj listova BL Ukupan broj listova na biljci Broj listova iznad klipa BLK Broj listova na biljci iznad primarnog klipa Broj klipova po biljci BKB Ukupan broj klipova po parceli podeljen sa ukupnim brojem biljaka Procenat slomljenih biljaka SB % Broj slomljenih biljaka podeljen sa ukupnim brojem biljaka po parceli i pomnožen sa 100 Period između metličenja i svilanja ASI dani Razlika između pojave polena i svile kod više od 50% analiziranih biljaka Agronomske osobine Dužina klipa DK cm Dužina klipa od drške do vrha klipa Prečnik klipa PK cm Prečnik izmeren na sredini klipa Broj redova zrna BRZ Ukupan broj redova zrna na klipu Broj zrna u redu BZR Ukupan broj zrna u redu Dubina zrna DZ cm Razlika između prečnika klipa i prečnika oklaska podeljena sa dva Masa 100 zrna MZ g Prosečna masa 100 zrna sa sredine klipa Procenat oklaska OK % Težina oklaska od uzorka od 5 klipova podeljena sa ukupnom težinom 5 klipova pomnoženo sa 100 Procenat vlage VL % Procenat vlage u zrnu u trenutku berbe Prinos zrna PR t/ha Prinos zrna sa parcele preračunat na prinos u t/ha sa 14% vlage 43 Morfološke osobine merene su u polju na biljkama u fazi cvetanja i izražene kao srednja vrednost. Zabeleženi su datumi metličenja i svilanja svih genotipova na osnovu kojih je izračunat broj dana između metličenja i svilanja - ASI (eng. Anthesis Silking Interval) za svaki genotip. U berbi su obrane sve biljke po elementarnoj parcelici i izmerena težina klipova po genotipu. Odabrano je pet klipova za određivanje sadržaja vlage (vlagomer Dickey John GAC 2100) i težine oklaska. Preračun prinosa zrna sa parcele na prinos u t/ha sa 14% vlage rađen je prema sledećoj formuli: gde je: P - površina elementarne parcele Mep - prinos zrna (masa) sa elementarne parcele Muz - masa uzorka od pet klipova Mok - masa oklasaka uzorka od pet klipova %Vl - procenat vlage u zrnu u trenutku berbe. Nakon berbe uzeto je deset klipova po genotipu za merenje komponenti prinosa. Prečnik klipa i oklaska su izmereni pomoću šublera. Masa 100 zrna je određena tako što je odbrojano dva puta po sto zrna sa sredine klipova, izmereno je na analitičkoj vagi i izračunata srednja vrednost. 44 3.5.1. Statistička analiza fenotipskih osobina Za svaku osobinu je izračunata srednja vrednost ( ), minimalna vrednost (Xmin), maksimalna vrednost (Xmax), standardna devijacija (σ), koeficijent varijacije (CV) i varijansa (σ2) po sledećim formulama (Hadživuković, 1991): gde je: n - broj podataka Xi - vrednost pojedinačnog podatka Za sve parametre i obe lokacije je urađena dvofaktorijalna analiza varijanse (eng. Analysis of Variance - ANOVA) po kompletno slučajnom blok sistemu u MSTAT-C statističkom programu. Značajnost razlika između srednjih vrednosti genotipova za različite osobine određena je na osnovu Fisher-ovog LSD (eng. Least Significant Difference) testa, na nivou značajnosti od 0,05. Korelacije između posmatranih parametara su izračunate primenom Pearson- ovog koeficijenta korelacije (r). Na osnovu srednjih vrednosti morfoloških osobina urađena je klaster analiza, pri čemu je kao mera distance korišćen kvadrat euklidskog rastojanja, a kao metod grupisanja UPGMA (eng. Unweight Pair Group Method with Arithmetic Mean). Klaster analiza je urađena u NTSYSpc 2.1 programu (Rohlf, 2000).   45    4. REZULTATI 4.1. Genetička i biohemijska karakterizacija roditeljskih linija 4.1.1. Analiza roditeljskih linija opaque2 specifičnim markerima Markeri phi057 i umc1066 pokazali su ko-dominantni polimorfizam između linija standardnog kvaliteta zrna i QPM linije. Phi057 je dao fragment veličine oko 170 bp kod CML 144 i oko 160 bp kod ZPL 3 i ZPL 5. Umc1066 je dao fragment veličine oko 150 bp kod CML 144 i oko 165 bp kod ZPL 3 i ZPL 5. Phi112 je pokazao dominantni polimorfizam između linija. Null alel (izostanak trake) je bio prisutan kod CML 144, a fragment veličine oko 170 bp kod ZPL 3 i ZPL 5. Zbog nemogućnosti razlikovanja dominantnih homozigota (O2O2) i heterozigota (O2null), marker phi112 je izbačen iz daljih analiza, a za selekciju su korišćeni phi057 i umc1066. Ilustracija amplifikacije roditeljskih linija CML 144 i ZPL 5 sa tri opaque2 specifična SSR markera je data na Slici 4. Slika 4. SSR profil opaque2 specifičnih markera phi057, umc1066 i phi112. M: 100 bp DNK marker, P1: CML 144, P2: ZPL 5. 46 4.1.2. Određivanje genetičke sličnosti između roditeljskih linija Od 40 SSR markera korišćenih u analizi (Tabela 2), 24 markera je pokazalo polimorfizam između ZPL 3 i ZPL 5 sa jedne, i CML 144 sa druge strane. Ukupni broj amplifikovanih alela je bio 72. Broj alela dobijen sa pojedinačnim markerima se kretao od 2 do 4, a prosečan broj alela po markeru je bio 3. Genetička sličnost između ZPL 3 i CML 144, kao i između ZPL 5 i CML 144, izračunata prema Dice-ovom koeficijentu, je bila 0,05. 4.1.3. Biohemijska analiza roditeljskih linija Linija visokog kvaliteta proteina CML 144 je imala skoro duplo veći sadržaj triptofana i indeks kvaliteta (QI) u odnosu na linije standardnog kvaliteta zrna ZPL 3 i ZPL 5. Sadržaj proteina je bio sličan kod sve tri ispitivane linije. Sadržaj proteina (%), sadržaj triptofana (%) i indeks kvaliteta (QI) roditeljskih linija su prikazani u Tabeli 5. Tabela 5. Sadržaj proteina (%), sadržaj triptofana (%) i indeks kvaliteta (QI) roditeljskih linija Protein (%) Triptofan (%) QI ZPL 3 10,98 0,052 0,47 ZPL 5 11,07 0,054 0,48 CML144 10,95 0,093 0,85 QPM prag 1 >0,075 >0,8 1granične vrednosti sadržaja triptofana i indeksa kvaliteta (QI), koje određuju QPM genotip U odnosu na vrednosti za QPM prag, obe linije standardnog kvaliteta zrna su imale manji sadržaj triptofana - ZPL 3 linija za 31%, a ZPL 5 za 28%. QI je bio manji za 41% (ZPL 3), odnosno 40% (ZPL 5). Kod linije visokog kvaliteta proteina vrednosti za triptofan i QI su bile iznad QPM praga. Sadržaj triptofana je bio veći za 24%, a QI za 47 0,63%. Razlike u sadržaju triptofana i indeksu kvaliteta između standardnih linija i QPM linije su prikazane na Slici 5. Vrednosti za QPM prag su date kao 1 (100%). Slika 5. Sadržaj triptofana i indeks kvaliteta (QI) roditeljskih linija ZPL 3, ZPL 5 i CML 144, predstavljeni kao % u odnosu na vrednosti za QPM prag. Vrednosti za QPM prag su date kao 1 (100%). 4.2. Genetička karakterizacija potomstava povratnih ukrštanja (BC1 i BC2) 4.2.1. Analiza biljaka BC1 i BC2 generacija opaque2 specifičnim markerima Nakon prvog i drugog povratnog ukrštanja formirane su BC1 i BC2 generacije. Ukrštanjem biljaka F1 (O2o2) generacije i RP (O2O2), odnosno BC1 (O2o2) i RP (O2O2), dobijena su BC1 i BC2 potomstva koja su činile heterozigotne (O2o2) i dominatno homozigotne biljke (O2O2). Odabrani opaque2 specifični SSR markeri korišćeni su za identifikaciju heterozigotnih biljaka. Ilustracija amplifikacije roditeljskih linija (CML 144 i ZPL 5) i BC1 potomstva sa markerom phi057 je data na Slici 6.   48    Slika 6. SSR profil opaque2 specifičnog markera phi057. M: 100 bp DNK marker, P1: CML 144, P2: ZPL 5, 1-17: BC1 potomstva. Strelicama su obeležene heterozigotne biljke. Od 100 biljaka dobijenih iz ukrštanja (ZPL 3)2 x CML 144 identifikovane su 52 heterozigotne i 48 dominantno homozigotnih biljaka. Slični rezultati su dobijeni i za BC1 potomstvo iz ukrštanja (ZPL 5)2 x CML 144 - od 100 biljaka identifikovano je 47 heterozigotnih (47%) i 53 dominantno homozigotne biljke (53%). Identifikovane heterozigotne biljke su povratno ukrštene sa rekurentnim roditeljem ZPL 3, odnosno ZPL 5, radi formiranja BC2 generacije. Od 227 biljaka dobijenih iz ukrštanja (ZPL 3)3 x CML 144 identifikovano je 109 heterozigotnih (48%) i 118 dominantno homozigotnih biljaka (52%). Slični rezultati su dobijeni i za potomstvo ukrštanja (ZPL 5)3 x CML 144 - od 67 biljaka identifikovano je 29 heterozigotnih (43,3%) i 38 dominantno homozigotnih biljkaka (56,7%). Identifikovane heterozigotne biljke su samooplođene radi formiranja BC2F2 generacije. Biljke koje su nakon berbe imale dovoljnu količinu semena odabrane su za analizu genetičke sličnosti sa rekurentnim roditeljem (ukupno 43). 49 4.2.2. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i potomstava BC2 generacije Za određivanje genetičke sličnosti između rekurentnih roditeljskih linija i potomstava BC2 generacije korišćeno je 34 SSR markera (Tabela 2). Četrnaest markera je bilo monomorfno, tako da su genetičke sličnosti izračunate na osnovu rezultata dobijenih sa 20 polimorfnih SSR markera. ZPL 3 Ukupni broj dobijenih alela sa 20 SSR prajmera je iznosio 79. Broj alela dobijen sa pojedinačnim markerima se kretao od dva do 6, a prosečan broj alela je iznosio 3,95. Vrednosti koeficijenata genetičke sličnosti (GS) između rekurentnog roditelja ZPL 3 i potomstava (P-1 do P-43) su iznosile od 0,51 do 0,89 (Tabela 6), sa srednjom vrednošću od 0,74. Za dalju selekciju izabrana su tri potomstva koja su imala najveću vrednost koeficijenta genetičke sličnosti: P-30 je sa koeficijentom genetičke sličnosti 0,89, P-36 sa 0,87 i P-33 sa 0,86. Vrednosti GS preostalih 40 potomstava su iznosile od 0,51 - 0,85 i ona nisu korišćena u daljem radu. 50 Tabela 6. Koeficijenti genetičke sličnosti (GS) BC2 potomstava sa rekurentnim roditeljem ZPL 3 Potomstvo Koeficijent GS Potomstvo Koeficijent GS Potomstvo Koeficijent GS P-1 0,81 P-15 0,79 P-29 0,78 P-2 0,80 P-16 0,67 P-30 0,89 P-3 0,72 P-17 0,71 P-31 0,84 P-4 0,68 P-18 0,74 P-32 0,71 P-5 0,75 P-19 0,77 P-33 0,86 P-6 0,77 P-20 0,59 P-34 0,85 P-7 0,74 P-21 0,57 P-35 0,74 P-8 0,81 P-22 0,61 P-36 0,87 P-9 0,62 P-23 0,51 P-37 0,81 P-10 0,65 P-24 0,70 P-38 0,72 P-11 0,74 P-25 0,64 P-39 0,78 P-12 0,67 P-26 0,77 P-40 0,72 P-13 0,81 P-27 0,81 P-41 0,71 P-14 0,67 P-28 0,83 P-42 0,83 P-43 0,75 51 Na osnovu matrica genetičkih sličnosti urađena je klaster analiza, kako bi se potvrdila sličnost između rekurentnog roditelja i potomstava. Rezultati klaster analize prikazani su grafički u formi dendrograma (Slika 7). Potomstva sa najvećim koeficijenton GS grupisala su se u klaster I sa roditeljskom linijom ZPL 3, P-30 i P-36 u sub-klaster Ia, a P-33 u sub-klaster Ib. Klaster analiza pokazala je dobro poklapanje sa matricom genetičkih sličnosti po Dice-u, što je potvrdila visoka vrednost ko-fenetičkog koeficijenta korelacije (r = 0,88). Slika 7. Dendrogram rekurentnog roditelja ZPL 3 i BC2 potomstava analiziranih pomoću SSR markera dobijen UPGMA klaster metodom na osnovu genetičkih sličnosti izračunatih po Dice-u.   52    ZPL 5 Ukupni broj dobijenih alela sa 20 SSR prajmera je iznosio 76. Broj alela dobijen sa pojedinačnim markerima se kretao od dva do 6, a prosečan broj alela je iznosio 3,8. Elektroforegram za SSR prajmer umc2047 je prikazan na Slici 8. Slika 8. Elektroforegram SSR alela za prajmer umc2047 roditeljskih linija i BC2 potomstava. M: 100 bp DNK marker, P1: CML 144, P2: ZPL 5, 1-8: BC2 potomstva Vrednosti keoficijenata genetičke sličnosti (GS) između rekurentnog roditelja ZPL 5 i potomstava (P-1 do P-8) su iznosile od 0,67 do 0,85 (Tabela 7), sa srednjom vrednošću od 0,75. Tabela 7. Koeficijenti genetičke sličnosti (GS) BC2 potomstava sa rekurentnim roditeljem ZPL 5 Potomstvo Koeficijent GS Potomstvo Koeficijent GS P-1 0,75 P-5  0,67 P-2  0,85 P-6  0,71 P-3  0,72 P-7  0,80 P-4  0,78 P-8  0,74 53 Za dalju selekciju izabrana su dva potomstva koja su imala najveću vrednost koeficijenta genetičke sličnosti: P-2 sa 0,85, a P-7 sa 0,80. Vrednosti GS preostalih šest potomstava su iznosile od 0,67 - 0,78 i ona nisu korišćena u daljem radu. Na osnovu matrica genetičkih sličnosti urađena je klaster analiza, da bi se potvrdila sličnost između rekurentnog roditelja i potomstava. Rezultati klaster analize prikazani su grafički u formi dendrograma (Slika 9). Potomstva od P-1 do P-6 izdvojila su se u klaster I, P-7 i P-8 u klaster II, a za njih je vezana roditeljska linija ZPL 5. Klaster analiza pokazala je dobro poklapanje sa matricom genetičkih sličnosti po Dice-u što je potvrdila visoka vrednost ko-fenetičkog koeficijenta korelacije (r = 0,98). Slika 9. Dendrogram rekurentnog roditelja ZPL 5 i BC2 potomstava analiziranih pomoću SSR markera dobijen UPGMA klaster metodom na osnovu genetičkih sličnosti izračunatih po Dice-u. 54 4.3. Genetička, fenotipska i biohemijska karakterizacija potomstava dobijenih samooplodnjom povratnih ukrštanja (BC2F2, BC2F3 i BC2F4) 4.3.1. Analiza biljaka BC2F2 generacije opaque2 specifičnim markerima Nakon samooplodnje odabranih heterozigotnih biljaka BC2 generacije, formirana je BC2F2 generacija. Dobijeno je potomstvo koje je sadržalo heterozigotne (O2o2), dominatno homozigotne (O2O2) i recesivno homozigotne biljke (o2o2). U ovom koraku selekcije, odabrani opaque2 specifični SSR markeri su korišćeni za identifikaciju recesivno homozigotnih biljaka. Od 329 biljaka BC2F2 potomstva iz ukrštanja ZPL 3 x CML 144 detektovano je 15 recesivno homozigotnih biljaka (4,5%). Nijedna od ovih biljaka nije dala dovoljan broj zrna, što je onemogućilo dalji rad sa potomstvom koje potiče od linije standardnog kvaliteta zrna ZPL 3. Takođe je i kod potomstva iz ukrštanja ZPL 5 x CML 144 identifikovan znatno manji procenat recesivno homozigotnih biljaka od očekivanih 25% - samo 7,6%, odnosno 19 od ukupno 250 biljaka. Ove biljke su samooplođene radi formiranja BC2F3 generacije. Zrno sa deset biljaka kod kojih je dovoljno uspela samooplodnja posejano je u polju za dalja ispitivanja. 4.3.2. Genetička i fenotipska karakterizacija BC2F3 generacije 4.3.2.1. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i potomstava BC2F3 generacije Analiza genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja (ZPL 5) i BC2F3 potomstava urađena je pomoću 32 SSR markera (Tabela 2). Tri markera nisu iskorišćena u analizi zbog loše amplifikacije (phi072 i phi087) ili odsustva amplifikacije (bnlg2235). Ukupni broj dobijenih alela sa 29 SSR parajmera je iznosio 163, od čega je 53 bilo monomorfno (32,5%), a 110 polimorfno (67,5%). Broj alela dobijen sa pojedinačnim markerima se kretao od dva do 6, a prosečan broj alela je iznosio 5,6. Elektroforegram za SSR prajmer umc1594 je prikazan na Slici 10.   55    Slika 10. Elektroforegram SSR alela za prajmer umc1594 rekurentnog roditelja (RP) i BC2F3 potomstava. M: 20 bp DNK marker, RP: ZPL 5, 1-10: BC2F3 potomstva. Koeficijenti genetičke sličnosti (GS) između rekurentnog roditelja (RP) i potomstava (P-1 do P-10) su iznosili od 0,71 do 0,94, sa srednjom vrednošću od 0,81. Potomstva koja su imala koeficijent GS ispod 0,81 su odbačena iz daljih analiza. Pet preostalih potomstava je imalo koeficijent GS veći od prosečnog (Tabela 8) i korišćena su za dalji proces dobijanja linija visokog kvaliteta proteina. Tabela 8. Koeficijenti genetičke sličnosti (GS) BC2F3 potomstava sa rekurentnim roditeljem ZPL 5 Potomstvo Koeficijent GS Potomstvo Koeficijent GS P-1 0,82 P-6  0,91 P-2  0,78 P-7  0,83 P-3  0,75 P-8  0,71 P-4  0,84 P-9  0,71 P-5  0,94 P-10  0,76 56 Na osnovu matrica genetičkih sličnosti urađena je klaster analiza, da bi se potvrdila sličnost između rekurentnog roditelja i BC2F3 potomstava. Rezultati klaster analize prikazani su grafički u formi dendrograma (Slika 11). Grupisanje potomstava P- 5 i P-6 u isti klaster (I) sa rekurentnim roditeljem ZPL 5 je potvrdilo rezultate dobijene analizom genetičke sličnosti prema kojima upravo ova dva potomstva imaju najveći koeficijent GS. Visoka vrednost ko-fenetičkog koeficijenta korelacije (r = 0,94) potvrdila je dobro poklapanje dobijenog klastera sa matricom genetičkih sličnosti po Dice-u. Slika 11. Dendrogram rekurentnog roditelja (RP) i BC2F3 potomstava analiziranih pomoću SSR markera dobijen UPGMA klaster metodom na osnovu genetičkih sličnosti izračunatih po Dice-u. Na odabranim potomstvima urađene su fenotipske analize i ona su ukrštena sa komercijalnim testerom radi provere kombinacionih sposobnosti u poređenju sa rekurentnim roditeljem. Ova potomstva su takođe samooplođena (formiranje BC2F4 generacije) i nakon berbe određena je genetička sličnost sa rekurentnim roditeljem, stepen modifikacije endosperma zrna i izvršena je biohemijska evaluacija. 57 4.3.2.2. Analiza fenotipskih osobina BC2F3 generacije Analizirane fenotipske osobine roditeljske linije ZPL 5 i odabranih BC2F3 generacije u poljskim ogledima predstavljene su njihovim prosečnim vrednostima i intervalom variranja ( , Xmin i Xmax). Srednje vrednosti i parametri varijabilnosti 15 analiziranih fenotipskih osobina su dati u Tabeli 9. Koeficijent varijacije (CV) je izračunat na osnovu srednjih vrednosti i standardne devijacije (σ) da bi se uporedila variranja osobina. Najmanji koeficijenti varijacije su izračunati za procenat vlage u zrnu - %VL (2,37%) i ukupan broj listova - BL (2,45%), dok je najveće variranje utvrđeno kod procenta slomljenih biljaka - %SB (72,07%). Koeficijent varijacije veći od 30% je utvrđen za period između metličenja i svilanja - ASI (34,64%) i prinos zrna - PR (30,65%). Analiza varijanse je pokazala statistički značajne razlike između analiziranih genotipova za određene osobine. U Tabeli 9. su prikazani nivoi značajnosti za sredine kvadrata genotipa iz analize varijanse. Visoko značajno variranje (P<0,001) između genotipova je uočeno kod sledećih osobina: visine biljke - VB, broja listova - BL, broja listova iznad klipa - BLK i broja redova zrna - BRZ. Osobina visina biljke iznad klipa - VBK pokazala je srednje značajno variranje (P<0,01), dok je kod broja klipova po biljci - BKB, dužine klipa - DK, mase 100 zrna - MZ i prinosa zrna - PR uočeno slabo značajno variranje (P<0,05). Genotip nije bio značajan izvor variranja (ns) za period između metličenja i svilanja - ASI, procenat slomljenih biljaka - %SB, procenat oklaska - %OK, procenat vlage u zrnu - %VL, broj zrna u redu -BZR i dubinu zrna - DZ. LSD test je pokazao da ne postoje statistički značajne razlike između roditeljske linije ZPL 5 i ispitivanih potomstava za sledeće osobine: period između metličenja i svilanja - ASI, broj listova iznad klipa - BLK, broj klipova po biljci - BKB, procenat slomljenih biljaka - %SB, procenat oklaska - %OK, broj zrna u redu - BZR i masu 100 zrna - MZ. Kod svih genotipova uočena je značajna razlika u odnosu na ZPL 5 za visinu biljke - VB, ukupan broj listova - BL i broj redova zrna - BRZ. U odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5, najmanja statistički značajna razlika za visinu biljke iznad klipa - VBK, procenat vlage - %VL, dužinu klipa - DK, dubinu zrna - DZ i prinos zrna - PR je bila kod potomstava P-5 i P-6. 58 Tabela 9. Fenotipske osobine BC2F3 generacije ASI VB (cm) VBK (cm) BL BLK BKB SB (%) OK (%) VL (%) DK (cm) BRZ BZR DZ (cm) MZ (g) PR (t/ha) ZPL 5 5,00a 159,60b 59,47b 14,60b 4,20a 0,65a 6,83a 30,82ab 24,08b 15,27c 13,77c 30,79ab 0,74b 20,34a 2,03c P-1 3,50a 196,90a 81,72ab 17,02a 5,48a 0,92a 13,68a 31,01ab 25,25a 17,39ab 15,70b 32,30ab 0,86ab 23,81a 3,98ab P-4 4,75a 212,40a 82,00ab 16,60a 5,10a 0,98a 10,46a 31,12ab 25,47a 18,73a 15,95b 36,67a 0,86ab 24,25a 4,44a P-5 3,75a 192,70a 68,63ab 16,25a 4,88a 0,70a 15,66a 29,49ab 24,81ab 15,79bc 16,80b 30,10ab 0,82ab 17,65a 2,70bc P-6 4,50a 197,00a 72,63ab 16,28a 4,72a 0,78a 8,10a 31,98a 24,89ab 16,53bc 16,17b 29,15b 0,80ab 20,03a 2,71bc P-7 3,25a 206,90a 95,20a 17,20a 4,85a 1,00a 15,95a 27,93b 25,42a 17,53ab 18,50a 31,85ab 0,91a 26,51a 4,25a 4,12 194,23 76,61 16,32 4,87 0,84 11,78 30,39 24,99 16,88 16,15 31,81 0,83 22,10 3,35 Xmin 3,25 159,60 59,47 14,60 4,20 0,65 6,83 3,98 24,08 15,27 13,77 29,15 0,74 17,65 2,03 Xmax 5,00 212,40 95,20 17,20 5,48 1,00 15,95 31,12 25,47 18,73 18,50 36,67 0,91 26,51 4,44 SD 1,74 19,30 13,23 0,94 0,48 0,34 8,55 3,10 1,77 1,97 1,61 4,92 0,11 4,09 1,66 CV (%) 34,64 5,35 11,09 2,45 4,92 15,76 72,07 6,95 2,37 8,12 5,72 11,58 15,10 12,99 30,65 LSD0.05 2,62 28,19 28,83 2,07 1,32 0,57 24,90 3,56 1,13 2,11 1,53 7,44 0,1626 9,38 1,39 MS 2,08ns 1364,91*** 619,24** 3,45*** 0,71*** 0,09* 60,71ns 8,40ns 1,08ns 6,40* 9,46*** 27,87ns 0,013ns 43,28* 3,98* ASI - razlika između datuma polinacije i svilanja u danima, VB - visina biljke (cm), VK - visina klipa (cm), BL - ukupan broj listova, BLK - broj listova iznad klipa, BKB - broj klipova po biljci, SB - slomljene biljke (%), OK - % oklaska, VL - % vlage u zrnu u momentu berbe, DK - dužina klipa (cm), BRZ - broj redova zrna na klipu, BZR - broj zrna u redu, DZ - debljina zrna (cm), MZ - masa 100 zrna (g), PR - prinos zrna u t/ha sa 14% vlage u zrnu, - srednja vrednost, Xmin - minimalna vrednost, Xmax - maksimalna vrednost, SD - standardna devijacija, MS - sredina kvadrata genotipova iz analize varijanse (ANOVA), *, ** i *** - statistički značajno na nivou od 0,05; 0,01 i 0,001, redom, ns - statistički nesignifikantno, CV - koeficijent varijacije, LSD0.05 - LSD vrednost na nivou značajnosti od 0,05. Prosečne vrednosti parametara označene istim slovom unutar svake kolone se statistički ne razlikuju na nivou značajnosti od 0,05. 59 Na osnovu srednjih vrednosti fenotipskih osobina urađena je klaster analiza, pri čemu je kao mera distance korišćen kvadrat euklidskog rastojanja (Tabela 11). Na osnovu UPGMA klaster metode dobijen je dendrogram prikazan na slici 12. Potomstva P-1, P-7 i P-4 izdvojila su se u klaster I, P-5 i P-6 u klaster II, a za njih je vezana roditeljska linija. Najmanja distanca u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5 uočena je kod potomstava P-6 (24,89) i P-5 (26,37), što je potvrdilo dobijene rezultate analize genetičke sličnosti BC2F3 potomstava. Tabela 11. Kvadrati euklidskog rastojanja između ZPL 5 i BC2F3 potomstava Potomstvo Distanca (kvadrat euklidskog rastojanja) P-1 48,96 P-4 53,65 P-5 26,37 P-6 24,89 P-7 73,28 60 Slika 12. Dendrogram rekurentnog roditelja ZPL5 i BC2F3 potomstava dobijen UPGMA klaster metodom iz kvadrata euklidskog rastojanja na osnovu fenotipskih osobina.   61    4.3.3. Genetička, fenotipska i biohemijska karakterizacija BC2F4 generacije Samooplodnja odabranih BC2F3 potomstava bila je uspešna samo na jednoj lokaciji, dok na drugoj nije bilo dovoljno zrna za dalji rad. Nakon berbe odabrano je 14 BC2F4 potomstava (Tabela 8) čiji su klipovi dali dovoljno zrna za SSR i biohemijsku analizu, kao i za setvu naredne godine. 4.3.3.1 Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i potomstava BC2F4 generacije Analiza genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja ZPL 5 i potomstava BC2F4 generacije urađena je pomoću 32 SSR markera (Tabela 2). Tri markera nisu iskorišćena u analizi zbog loše amplifikacije (phi087, umc1015 i bnlg1350). Ukupni broj dobijenih alela sa 29 SSR prajmera je iznosio 132, od čega je 54 bilo monomorfno (40,9%), a 78 polimorfno (59,1%). Broj alela dobijen sa pojedinačnim markerima se kretao od jedan do 6, a prosečan broj alela je iznosio 4,55. Elektroforegram za SSR prajmer umc1594 je prikazan na Slici 13. Slika 13. Elektroforegram SSR alela za prajmer umc1594 rekurentnog roditelja (RP) i BC2F4 potomstava. M: 20 bp DNK marker, RP: ZPL 5, 1-14: BC2F4 potomstva.         62 Koeficijenti genetičke sličnosti (GS) između rekurentnog roditelja (RP) i BC2F4 potomstava su iznosili od 0,81 do 0,93, sa srednjom vrednošću od 0,88. Devet potomstava je imalo vrednost koeficijenta GS veću od prosečne (0,91 - 0,93) (Tabela 8). P-6/4 je imalo najveći koeficijent GS - 0,93, zatim P-5/1, P-5/4 i P-6/2 po 0,92, a P-4/1, P-5/2, P-5/3, P-6/1 i P-6/3 po 0,91. Ova potomstva su korišćena za agronomske i biohemijske analize. Vrednosti koeficijenta GS preostalih pet potomstava (P-1/1, P-1/2, P-7/1, P-7/2, i P-7/3) su iznosile od 0,80 - 0,84 i osim P-1/2 (zbog visokog sadržaja triptofana), nisu korišćena u daljim analizama. Na osnovu matrica genetičkih sličnosti urađena je klaster analiza, da bi se potvrdila sličnost između rekurentnog roditelja i BC2F4 potomstava. Rezultati klaster analize prikazani su grafički u formi dendrograma (Slika 14). Grupisanje potomstava P- 4/1, P-5/1, P-5/2, P-5/3, P-5/4, P-6/1, P-6/2, P-6/3 i P-6/4 u isti klaster (I) sa rekurentnim roditeljem ZPL 5 je potvrdilo rezultate dobijene analizom genetičke sličnosti prema kojima upravo ovih devet potomstava imaju najveći koeficijent GS. Klaster analiza pokazala je dobro poklapanje sa matricom genetičkih sličnosti po Dice-u što je potvrđeno visokom vrednošću ko-fenetičkog koeficijenta korelacije (r = 0,94). 63 Slika 14. Dendrogram rekurentnog roditelja ZPL 5 i BC2F4 potomstava analiziranih pomoću SSR markera dobijen UPGMA klaster metodom na osnovu genetičkih sličnosti izračunatih po Dice-u. 4.3.3.2. Određivanje stepena modifikacije endosperma zrna BC2F4 generacije Od 14 potomstava BC2F4 generacije kod šest (P-1/1, P-4/1, P-5/1, P-5/2, P-5/3 i P-5/4) su identifikovana samo zrna sa tvrdim endospermom (≤ 25% opaque). Potomstva P-6/1 i P-6/2 su imala i zrna koja su ≤ 50% opaque (6,3% i 8,3%, redom) i ≤ 75% opaque (2,7% i 3,4%, redom). Ostala potomstva (P-1/2, P-6/3, P-6/4, P-7/1, P-7/2 i P-7/3) su imala i zrna sa mekim endospermom (100% opaque). Najmanji procenat zrna sa mekim endospermom nađen je kod potomstva P-6/4 (2,2%), a najveći kod P-7/2 (4,9%). Učestalosti različitih klasa (≤ 25% opaque, ≤ 50% opaque, ≤ 75% opaque i 100% opaque) stepena modifikacija endosperma zrna BC2F4 generacije data je u Tabeli 12. 64 4.3.3.3. Biohemijska evaluacija BC2F4 generacije Rezultati analize biohemijskih parametara pokazali su značajno povećanje sadržaja triptofana i indeksa kvaliteta (QI) kod svih ispitivanih potomstava u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5, dok sadržaj proteina nije bio značajno promenjen u odnosu na roditeljsku liniju (Tabela 12). Analiza varijanse je pokazala statistički značajne razlike između analiziranih genotipova za ispitivane biohemijske osobine. U Tabeli 12. su prikazani nivoi značajnosti za sredine kvadrata za genotip. Visoko značajno variranje (P<0,001) između genotipova uočeno je kod sadržaja triptofana i proteina, dok je indeks kvaliteta pokazao umereno značajno variranje (P<0,01). Najveće povećanje sadržaja triptofana (43%) i QI (46%) u odnosu na roditeljsku liniju uočeno je kod potomstva P-1/2. Nešto manje povećanje sadržaja triptofana (33%) i QI (37%) u odnosu na ZPL 5 utvrđeno je kod potomstva P-6/4. Kod devet ispitivanih potomstava povećanje sadržaja triptofana iznosilo je preko 20% (20 - 28%). Najmanje povećanje sadržaja triptofana uočeno je kod potomstava P-7/1, P-7/2 i P-7/3 (13 - 18%). Odnos prosečnih vrednosti sadržaja triptofana i QI BC2F4 generacije i roditeljske linije ZPL 5 (izražen u %) je prikazan na Slici 15. Vrednosti roditeljske linije date su kao 100% (1). 65 Slika 15. Sadržaj triptofana i indeks kvaliteta (QI) BC2F4 generacije, predstavljeni kao % vrednosti roditeljske linije ZPL 5. Vrednosti za ZPL 5 su date kao 1 (100%). 4.3.3.4. Izbor sub-liniija za fenotipsku i biohemijsku evaluaciju Na osnovu svih dobijenih fenotipskih, biohemijskih i SSR rezultata, izabrano je deset sub-linija za fenotipsku i biohemijsku evaluaciju (Tabela 12). Linije P-1/1, P-7/1, P-7/2 i P-7/3 su odbačene zbog niske genetičke sličnosti sa ZPL 5 (0,80 do 0,84). Pored nezadovoljavajućeg stepena genetičke sličnosti sa rekurentnim roditeljem, P-7/1 i P-7/2 linije su imale nizak stepen modifikacije endosperma zrna (manje od 90% zrna u kategorijama ≤ 25% opaque i ≤ 50% opaque), a P-7/3 i nizak sadržaj triptofana (0,068%). 66 Tabela 12. Rezultati genetičke, fenotipske i biohemijske karakterizacije BC2F4 potomstava na osnovu kojih su odabrane sub-linije za dalja ispitivanja BC2F3 BC2F4 Koeficijent GS Stepen modifikacija endosperma zrna (%) Triptofan (%) Proteini (%) QI Sub- linije ≤ 25% opaque ≤ 50% opaque ≤ 75% opaque 100% opaque ZPL 5 0,060f 11,56ab 0,52h P-1 P-1/1 0,81 100,0 - - - 0,073cde 11,49ab 0,64cdefg P-1/2 0,81 91,2 4,4 2,0 2,4 0,086a 11,26abc 0,76a S-1 P-4 P-4/1 0,91 100,0 - - - 0,072cde 11,74a 0,61fg S-2 P-5 P-5/1 0,92 100,0 - - - 0,073bcde 10,62cd 0,69bcde S-3 P-5/2 0,91 100,0 - - - 0,075bcd 11,31ab 0,66bcdef S-4 P-5/3 0,91 100,0 - - - 0,072cde 11,02bcd 0,66bcdef S-5 P-5/4 0,92 100,0 - - - 0,073bcde 10,51d 0,70abc S-6 P-6 P-6/1 0,91 91,0 6,3 2,7 - 0,073cde 11,61ab 0,63efg S-7 P-6/2 0,92 88,3 8,3 3,4 - 0,073bcde 10,51d 0,69abcd S-8 P-6/3 0,91 91,3 1,3 3,6 3,8 0,077bc 11,82a 0,66bcdef S-9 P-6/4 0,93 83,5 11,9 2,4 2,2 0,080ab 11,20abc 0,71ab S-10 P-7 P-7/1 0,84 75,5 9,3 11,7 3,5 0,070de 11,84a 0,59g P-7/2 0,84 85,2 4,7 5,2 4,9 0,071cde 11,30ab 0,63defg P-7/3 0,80 97,4 - - 2,6 0,068e 10,98bcd 0,62fg 0,073 11,25 0,65 Xmin 0,060 10,51 0,52 Xmax 0,086 11,84 0,76 SD 0,01 0,49 0,06 MS 0,00*** 0,40** 0,01*** CV (%) 4,60 2,63 4,50 LSD0.05 0,01 0,64 0,07 - srednja vrednost, Xmin - minimalna vrednost, Xmax - maksimalna vrednost, SD - standardna devijacija, MS - sredina kvadrata genotipova iz analize varijanse, ** i *** - statistički značajno na nivou od 0,01 i 0,001, redom, CV - koeficijent varijacije, LSD0.05 - LSD vrednost na nivou značajnosti od 0,05. Prosečne vrednosti parametara označene istim slovom unutar svake kolone se statistički ne razlikuju na nivou značajnosti od 0,05. 67 4.4. Fenotipska i biohemijska evaluacija odabranih sub-linija 4.4.1. Analiza fenotipskih osobina odabranih sub-linija Analizirane fenotipske osobine roditeljske linije ZPL 5 i odabranih sub-linija u poljskim ogledima predstavljene su njihovim prosečnim vrednostima i intervalom variranja ( , Xmin i Xmax). Srednje vrednosti i parametri varijabilnosti 15 analiziranih fenotipskih osobina su dati u Tabeli 13. Koeficijent varijacije (CV) je izračunat da bi se uporedila variranja osobina. Najmanji CV su izračunati za ukupan broj listova - BL (3,22%), procenat vlage u zrnu - %VL (3,79%) i visinu biljke - VB (3,86%), dok je najveće variranje nađeno kod procenta slomljenih biljaka - %SB (89,71%). Koeficijent varijacije veći od 30% je utvrđen za period između metličenja i svilanja - ASI (35,72%). Analiza varijanse je pokazala statistički značajne razlike između analiziranih genotipova za većinu osobina. U Tabeli 13. su prikazani nivoi značajnosti za sredine kvadrata genotipova iz analize varijanse. Visoko značajno variranje (P<0,001) između genotipova je uočeno kod sledećih osobina: visine biljke - VB, visine biljke iznad klipa - VBK, broja listova - BL, broja listova iznad klipa - BLK, broja klipova po biljci - BKB, procenta vlage u zrnu - %VL, dužine klipa - DK, dubine zrna - DZ, mase 100 zrna - MZ i prinosa zrna - PR. Osobine broj redova zrna - BRZ i broj zrna u redu - BZR pokazale su umereno značajno variranje (P<0,01). Genotip nije bio značajan izvor variranja (ns) za period između metličenja i svilanja - ASI, procenat slomljenih biljaka - %SB i procenat oklaska - %OK. LSD test je pokazao da ne postoje statistički značajne razlike između roditeljske linije ZPL 5 i ispitivanih sub-linija za sledeće osobine: period između metličenja i svilanja - ASI, broj klipova po biljci - BKB, procenat slomljenih biljaka - %SB i procenat oklaska - %OK. Kod svih genotipova uočena je statistički značajna razlika u odnosu na ZPL 5 za visinu biljke - VB i broj redova zrna - BRZ. U odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5, najmanja statistički značajna razlika za visinu biljke iznad klipa - VBK, ukupan broj listova - BL, broj listova iznad klipa - BLK, procenat vlage u zrnu - %VL, dužinu klipa - DK, broj zrna u redu - BZR, dubinu zrna - DZ, masu 100 zrna - MZ i prinos zrna - PR je bila kod sub-linija S-3 do S-10. 68 Tabela 13. Fenotipske osobine odabranih sub-linija Genotip ASI VB (cm) VBK (cm) BL BLK BKB SB (%) OK (%) VL (%) DK (cm) BRZ BZR DZ (cm) MZ (g) PR (t/ha) ZPL 5 3,00ab 168,90e 47,25b 13,43de 4,10f 0,81a 6,72ab 18,62ab 17,25b 14,94de 12,75c 30,59cd 0,77bc 18,05c 3,16de S-1 4,75a 193,73bcd 69,63a 16,15a 5,18ab 0,88a 15,73a 21,30a 19,49a 16,71c 15,05b 29,60d 0,99a 29,48a 5,56b S-2 3,25ab 217,30a 73,03a 16,10a 5,50a 1,02a 3,12b 19,40ab 19,94a 18,69a 15,85ab 39,01a 1,00a 25,54a 8,59a S-3 4,25ab 185,40d 50,03b 13,65cde 4,38def 0,80a 12,67ab 21,38a 17,10b 14,60e 15,58ab 27,95d 0,73c 18,05c 2,46e S-4 2,50b 187,38cd 45,60b 13,23de 4,55cde 0,80a 3,49b 16,38b 17,44b 16,86bc 15,50ab 34,90abc 0,77bc 15,67c 3,77cde S-5 4,25ab 195,63bcd 51,88b 13,93bcd 4,75bcd 0,78a 10,10ab 18,30ab 17,19b 16,36cd 15,60ab 32,79bcd 0,80bc 16,92c 3,50cde S-6 3,50ab 186,08d 47,00b 13,23de 4,58cde 0,88a 3,12b 17,42b 17,49b 17,08abc 15,45ab 35,61abc 0,77bc 15,37c 4,14bcd S-7 4,75a 196,83bcd 54,50b 13,88bcd 4,60cde 0,78a 4,79ab 18,35ab 17,25b 18,44ab 15,30b 36,94ab 0,82bc 18,02c 4,74bc S-8 3,75ab 202,68b 54,93b 14,45b 4,88bc 0,90a 9,81ab 18,45ab 17,06b 16,19cde 16,85a 32,85bcd 0,85b 16,58c 4,26bcd S-9 4,00ab 197,95bc 54,25b 14,25bc 4,65cde 0,90a 3,35b 19,25ab 16,81b 16,90bc 15,10b 32,88bcd 0,76bc 17,55c 3,50cde S-10 3,00ab 189,48cd 46,18b 13,10e 4,28ef 0,94a 13,39ab 16,65b 16,84b 17,19abc 15,45ab 32,89bcd 0,78bc 17,66c 3,88cde 3,73 192,80 54,02 14,13 4,68 0,86 7,85 18,68 17,62 16,72 15,32 33,27 0,82 18,99 4,32 Xmin 2,50 168,90 45,60 13,10 4,10 0,78 3,12 16,65 16,81 14,60 12,75 27,95 0,73 15,37 2,46 Xmax 4,75 217,30 73,03 16,15 5,50 1,02 12,67 21,38 19,94 18,69 16,85 39,01 1,00 29,48 8,59 SD 1,63 14,62 11,68 1,20 0,49 0,16 7,37 2,52 1,20 1,62 1,25 4,15 0,10 4,58 1,93 MS 2,22ns 584,39*** 341,57*** 4,64*** 0,64*** 0,02*** 87,84ns 10,52ns 4,49*** 6,13*** 3,82** 41,72** 0,04*** 77,53*** 10,67*** CV (%) 35,72 3,86 12,27 3,22 5,97 18,50 89,71 11,81 3,79 6,14 6,07 9,70 7,41 11,71 23,21 LSD0.05 2,10 11,72 10,44 0,72 0,44 0,25 11,09 3,48 1,05 1,62 1,46 5,08 0,1 3,50 1,58 ASI - razlika između datuma polinacije i svilanja u danima, VB - visina biljke (cm), VK - visina klipa (cm), BL - ukupan broj listova, BLK - broj listova iznad klipa, BKB - broj klipova po biljci, SB - slomljene biljke (%), OK - % oklaska, VL - % vlage u zrnu u momentu berbe, DK - dužina klipa (cm), BRZ - broj redova zrna na klipu, BZR - broj zrna u redu, DZ - debljina zrna (cm), MZ - masa 100 zrna (g), PR - prinos zrna u t/ha sa 14% vlage u zrnu, - srednja vrednost, Xmin - minimalna vrednost, Xmax - maksimalna vrednost, SD - standardna devijacija, MS - sredina kvadrata genotipova iz analize varijanse (ANOVA), ** i *** - statistički značajno na nivou od 0,01 i 0,001, redom, ns - statistički nesignifikantno, CV - koeficijent varijacije, LSD0.05 - LSD vrednost na nivou značajnosti od 0,05. Prosečne vrednosti parametara označene istim slovom unutar svake kolone se statistički ne razlikuju na nivou značajnosti od 0,05. 69 Na osnovu srednjih vrednosti fenotipskih osobina je urađena klaster analiza, pri čemu je kao mera distance korišćen kvadrat euklidskog rastojanja (Tabela 14). Na osnovu UPGMA klaster metode dobijen je dendrogram prikazan na slici 16. Najveća distanca u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5 uočena je kod sub-linija S-2 (103,87) i S-1 (58,32), što je potvrdilo njihovo grupisanje u poseban klaster (II). Sub-linije S-3 do S- 10, čije su vrednosti distanci iznosile od 16,45 (S-3) do 35,71 (S-8), formirale su poseban klaster (I) sa roditeljskom linijom, pri čemu se S-3 izdvojila sa ZPL 5 u sub- klaster Ia. Dobijeni rezultati klaster analize fenotipskih osobina potvrdili su rezultate LSD testa gde su najmanje značajne razlike između srednjih vrednosti ispitivanih osobina odabranih sub-linija u odnosu na ZPL 5 uočene upravo kod sub-linija od S-3 do S-10. Tabela 14. Kvadrati euklidskog rastojanja između ZPL 5 i odabranih sub-linija Sub-linija Distanca (kvadrat euklidskog rastojanja) S-1 58,32 S-2 103,87 S-3 16,45 S-4 18,65 S-5 19,30 S-6 19,31 S-7 28,09 S-8 35,71 S-9 19,92 S-10 21,44 70 Slika 16. Dendrogram rekurentnog roditelja ZPL5 i odabranih sub-linija dobijen UPGMA klaster metodom iz kvadrata euklidskog rastojanja na osnovu fenotipskih osobina. 71 4.4.2. Određivanje stepena modifikacije endosperma zrna odabranih sub-linija Od deset ispitivanih sub-linija kod četiri (S-2, S-4, S-5 i S-6) su identifikovana samo zrna sa tvrdim endospermom (≤ 25% opaque). Pored ≤ 25% opaque zrna, sub- linija S-1 je imala još samo potpuno nemodifikovana zrna (100% opaque) u najvećem procentu (12,22%) u odnosu na ostale sub-linije (1,36% - 2,89%) i izbačena je iz daljeg rada. Prosečne učestalosti različitih klasa (≤ 25% opaque, ≤ 50% opaque, ≤ 75% opaque i 100% opaque) stepena modifikacija endosperma zrna odabranih sub-linija date su u Tabeli 15. 4.4.3. Biohemijska analiza odabranih sub-linija Sub-linije S-1 i S-7 nisu dale dovoljnu količinu zrna, pa biohemijske analize nisu rađene. Sve ostale sub-linije su imale veći sadržaj triptofana i indeks kvaliteta u odnosu na roditeljsku standardnu liniju. Prosečne vrednosti sadržaja proteina (%), sadržaja triptofana (%) i indeksa kvaliteta (QI) odabranih sub-linija su prikazane u Tabeli 15. Tabela 15. Prosečne vrednosti stepena modifikacija endosperma zrna (%), sadržaja triptofana (%), sadržaja proteina (%), indeksa kvaliteta (QI) i prinosa zrna (t/ha) odabranih sub-linija BC2F3 BC2F4 Sub- linije Stepen modifikacije endosperma zrna (%) Triptofan (%) Proteini (%) QI Prinos (t/ha) ≤ 25% opaque ≤ 50% opaque ≤ 75% opaque 100% opaque ZPl 5 0,060 11,56 0,52 3,16 P-1 P-1/2 S-1 87,78 0,00 0,00 12,22 - - - 5,56 P-4 P-4/1 S-2 100,00 0,00 0,00 0,00 0,075 11,59 0,65 8,59 P-5 P-5/1 S-3 97,84 1,81 0,00 0,35 0,072 11,19 0,64 2,46 P-5/2 S-4 100,00 0,00 0,00 0,00 0,074 10,60 0,70 3,77 P-5/3 S-5 100,00 0,00 0,00 0,00 0,075 10,46 0,72 3,50 P-5/4 S-6 100,00 0,00 0,00 0,00 0,075 10,62 0,71 4,14 P-6 P-6/1 S-7 80,76 11,92 5,96 1,36 - - - 4,74 P-6/2 S-8 90,77 3,23 3,37 2,64 0,070 10,18 0,69 4,26 P-6/3 S-9 77,34 16,55 3,23 2,89 0,076 10,84 0,70 3,50 P-6/4 S-10 85,25 5,72 6,13 2,89 0,070 10,24 0,68 3,88 72 Povećanje sadržaja triptofana odabranih sub-linija u odnosu na roditeljsku liniju kretalo se u rangu od 27% kod S-9 do 17% kod S-8 i S-10. Najveće povećanje QI (38%) u odnosu na ZPL 5 utvrđeno je kod S-5, a najmanje (23%) kod S-3. Odnos prosečnih vrednosti sadržaja triptofana i QI odabranih sub-linija i roditeljske linije ZPL 5 (izražen u %) je prikazan na Slici 17. Vrednosti roditeljske linije date su kao 100% (1). Slika 17. Sadržaj triptofana i indeks kvaliteta (QI) odabranih sub-linija, predstavljeni kao % vrednosti roditeljske linije ZPL 5. Vrednosti za ZPL 5 su date kao 1 (100%). Nakon samooplodnje analiziranih sub-linija, na dve lokacije je dobijen različiti broj klipova sa dovoljnim brojem zrna za biohemijske analize i dalji rad. Sadržaj triptofana (%), sadržaj proteina (%) i indeks kvaliteta (QI) pojedinačnih klipova odabranih sub-linija sa obe lokacije posebno u poređenju sa roditeljskom linijom ZPL 5 prikazani su u Tabeli 16. Rezultati analize biohemijskih komponenti pokazali su statistički značajne razlike u sadržaju triptofana i indeksu kvaliteta (QI) kod svih ispitivanih sub-linija u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5. U Tabeli 16. su prikazani nivoi značajnosti za sredine kvadrata za genotip. Visoko značajno variranje (P<0,001) između genotipova uočeno je kod svih ispitivanih biohemijskih osobina. 73 Tabela 16. Sadržaj triptofana (%), sadržaj proteina (%) i indeks kvaliteta (QI) odabranih sub-linija po lokacijama Genotip Triptofan (%) Protein (%) QI I lokacija II lokacija I lokacija II lokacija I lokacija II lokacija ZPL 5 0,060d 0,060k 11,54b 11,58bc 0,52f 0,52p S-2 0,076ab 0,078bc 11,75a 11,48de 0,65d 0,68i - 0,067j - 11,49cd - 0,58o - 0,078bcd - 11,39e - 0,68i - 0,072defghij - 11,48de - 0,63m - 0,075bcdefgh - 11,59b - 0,65l - 0,072defghij - 11,97a - 0,60n S-3 0,071bc 0,071efghij 11,35b 10,75h 0,63e 0,66k - 0,074cdefghi - 11,20f - 0,66k - 0,071fghij - 11,46de - 0,62m S-4 0,080a 0,074cdefghi 11,09c 10,96g 0,72b 0,68j 0,071bc 0,071efghij 10,39d 10,43k 0,68c 0,68i - 0,071efghij - 10,21l - 0,70gh - 0,075bcdefgh - 10,44k - 0,72de - 0,077bcde - 10,65i - 0,72cd S-5 - 0,081ab - 10,98g - 0,74b - 0,073cdefghij - 10,41k - 0,70f - 0,069hij - 10,11mn - 0,68hi - 0,068ij - 10,03n - 0,68i - 0,075bcdefgh - 10,48jk - 0,72cd - 0,081ab - 10,73hi - 0,75a - 0,076bcdefg - 10,47jk - 0,73c S-6 0,076ab 0,071efghij 10,97c 10,21l 0,69c 0,70g 0,076ab 0,077bcde 10,97c 10,73hi 0,69c 0,72cd 0,074ab 0,076bcdefg 10,02e 11,00g 0,74a 0,69hi - 0,074cdefghi - 10,39k - 0,71ef S-8 - 0,070ghij - 10,18lm - 0,69hi S-9 - 0,068ij - 10,54j - 0,65l - 0,085a - 11,14g - 0,76a S-10 0,066cd - 10,11e - 0,65d - 0,075ab - 10,37d - 0,72b - 0,072 0,073 10,86 10,84 0,67 0,68 Xmin 0,060 0,060 10,02 10,03 0,74 0,52 Xmax 0,080 0,085 11,75 11,97 0,52 0,76 SD 0,006 0,005 0,59 0,54 0,06 0,05 MS 0,00*** 0,00*** 0,73*** 0,58*** 0,01*** 0,01*** CV (%) 3,17 2,93 0,80 0,38 3,31 2,59 LSD0.05 0,01 0,01 0,20 0,09 0,01 0,01 - srednja vrednost, Xmin - minimalna vrednost, Xmax - maksimalna vrednost, SD - standardna devijacija, MS - sredina kvadrata genotipova iz ANOVA, *** - statistički značajno na nivou od 0,001, CV - koeficijent varijacije, LSD0.05 - LSD vrednost na nivou značajnosti od 0,05. Prosečne vrednosti parametara označene istim slovom unutar svake kolone se statistički ne razlikuju na nivou značajnosti od 0,05. 74 Statistička značajnost koeficijenata korelacija između biohemijskih komponenti i ispitivanih fenotipskih osobina odabranih sub-linija prikazana je u Tabeli 17. Ispitivane biohemijske osobine nisu pokazale značajne fenotipske korelacije sa većinom fenotipskih osobina. Visoko značajne korelacije (P<0,01) uočene su između sadržaja triptofana - TRP i visine biljke - VB, broja redova zrna - BRZ i indeksa kvaliteta - QI, a značajne korelacije (P<0,05) između sadržaja triptofana - TRP i broja listova iznad klipa - BLK, dužine klipa - DK i broja zrna u redu - BZR. Sadržaj proteina pokazao je visoko značajne korelacije (P<0,01) sa procentom vlage - %VL, masom 100 zrna - MZ i indeksom kvaliteta - QI, a značajnu korelaciju (P<0,05) sa brojem redova zrna - BRZ. Između indeksa kvaliteta - QI i broja redova zrna - BRZ, sadržaja triptofana - TRP i proteina - PROT uočene su visoko značajne korelacije (P<0,01), a značajne korelacije (P<0,05) između indeksa kvaliteta - QI i visine biljke - VB, kao i dužine klipa - DK. Između prinosa zrna - PR i većine ispitivanih osobina uočene su značajne fenotipske korelacije. Jedino procenat slomljenih biljaka - %SB i biohemijski parametri nisu pokazali značajne korelacije sa prinosom zrna - PR. Značajna korelacija (P<0,05) ustanovljena je između prinosa zrna - PR i procenta oklaska - %OK, a visoko značajne fenotipske korelacije (P<0,01) između prinosa zrna - PR i ostalih ispitivanih osobina. 75 Tabela 17. Statistička značajnost koeficijenata korelacija između biohemijskih komponenti i fenotipskih osobina odabranih sub-linija ASI VB VBK BL BLK BKB %SB %OK %VL DK BRZ BZR DZ MZ PR TRP PROT QI PR ** ** ** ** ** ** ns * ** ** ** ** ** ** 1 TRP ns ** ns ns * ns ns ns ns * ** * ns ns ns 1 PROT ns ns ns ns ns ns ns ns ** ns * ns ns ** ns ns 1 QI ns * ns ns ns ns ns ns ns * ** ns ns ns ns ** ** 1 ns - statistički nesignifikantno, * i ** - statistički značajno na nivou od 0,05 i 0,01, redom 76 4.4.4. Određivanje genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja i sub-linija povećanog sadržaja triptofana Genetička sličnost izračunata je između roditeljske linije ZPL 5 i pojedinačnih klipova odabranih sub-linija čiji je sadržaj triptofana bio iznad praga za QPM. Za analizu je korišćeno 32 SSR markera (Tabela 2). Ukupni broj amplifikovanih alela je bio 63. Broj alela dobijen sa pojedinačnim markerima se kretao od 1 do 4, a prosečan broj alela po markeru je bio 1,97. Genetička sličnost između ZPL 5 i svih analiziranih sub-linija, izračunata prema Dice-ovom koeficijentu, je bila 0,93. Na osnovu matrica genetičkih sličnosti urađena je klaster analiza, da bi se potvrdila sličnost između rekurentnog roditelja i poboljšanih linija. Rezultati klaster analize prikazani su grafički u formi dendrograma (Slika 18). Sve analizirane linije formirale su jedinstveni klaster sa rekurentnim roditeljem ZPL 5 što je potvrdilo rezultate dobijene analizom genetičke sličnosti. Visoka vrednost ko-fenetičkog koeficijenta korelacije (r = 1) potvrdila je dobro poklapanje dobijenog klastera sa matricom genetičkih sličnosti po Dice-u. Slika 18. Dendrogram roditeljske linije ZPL 5 i poboljšanih sub-linija analiziranih pomoću SSR markera dobijen UPGMA klaster metodom na osnovu genetičkih sličnosti izračunatih po Dice-u. 77 Na osnovu svih rezultata, dobijene su linije povećanog sadržaja triptofana (od 37-50% u odnosu na početnu vrednost roditeljske linije), povećanog indeksa kvaliteta (42-56% u odnosu na početnu vrednost roditeljske linije), održane genetičke sličnosti sa roditeljskom linijom (93% genoma rekurentnog roditelja), visokog stepena modifikacije endosperma zrna (100% zrna tvrdog endosperma), povećanog prinosa zrna (11-31% u odnosu na roditeljsku liniju) i očuvanih odličnih kombinacionih sposobnosti (Tabela 18). Linije poboljšanog kvaliteta, dobijene kombinacijom konvencionalnog i molekularnog oplemenjivanja, adaptirane su na uslove umerenog klimatskog područja. Tabela 18. Koeficijent genetičke sličnosti, stepen modifikacija endosperma zrna, sadržaj triptofana i prinos zrna poboljšanih linija BC2F3 BC2F4 Sub- linija Genotip Koef. GS Stepen modifikacije endosperma zrna (%) Triptofan (%) Prinos (t/ha) ≤ 25% opaque ≤ 50% opaque ≤ 75% opaque 100 % opaque P-5 P-5/2 S-4 S-4/1 0,93 100 - - - 0,080 3,77 S-4/3 0,93 100 - - - 0,074 S-4/6 0,93 100 - - - 0,075 S-4/7 0,93 100 - - - 0,077 P-5/3 S-5 S-5/1 0,93 100 - - - 0,081 3,50 S-5/6 0,93 100 - - - 0,081 S-5/7 0,93 100 - - - 0,076 P-5/4 S-6 S-6/1 0,93 100 - - - 0,076 4,14 S-6/3 0,93 100 - - - 0,074 S-6/5 0,93 100 - - - 0,077 S-6/6 0,93 100 - - - 0,076 S-6/7 0,93 100 - - - 0,074 P-6 P-6/4 S-10 S-10/2 0,93 100 - - - 0,075 3,88 78 4.5. Fenotipska evaluacija hibrida 4.5.1. Analiza fenotipskih osobina hibrida Analizirane fenotipske osobine hibrida sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) i odabranim potomstvima BC2F3 generacije (H-2 do H-5) u poljskim ogledima predstavljene su njihovim prosečnim vrednostima i intervalom variranja ( , Xmin i Xmax). Srednje vrednosti i parametri varijabilnosti 15 analiziranih fenotipskih osobina su dati u Tabeli 19. Koeficijent varijacije (CV) je izračunat da bi se uporedila variranja osobina. Najmanji koeficijenti varijacije su dobijeni za visinu biljke - VB (1,81%), broj zrna u redu - BRZ (2,07%) i procenat vlage u zrnu - %VL (2,52%), dok je najveće variranje nađeno kod procenta slomljenih biljaka - %SB (142,98%). Koeficijent varijacije veći od 30% je utvrđen za period između metličenja i svilanja - ASI (30,12%). Analiza varijanse je pokazala statistički značajne razlike između analiziranih genotipova za mali broj osobina. U Tabeli 19 su prikazani nivoi značajnosti za sredine kvadrata genotipova iz analize varijanse. Visoko značajno variranje (P<0,001) između genotipova je uočeno kod visine biljke - VB. Osobina broj redova zrna - BRZ pokazala je srednje značajno variranje (P<0,01), dok je kod procenta vlage u zrnu - %VL i prinosa zrna - PR uočeno slabo značajno variranje (P<0,05). Genotip nije bio značajan izvor variranja (ns) za period između metličenja i svilanja - ASI, visinu biljke iznad klipa - VBK, broj listova - BL, broj listova iznad klipa - BLK, broj klipova po biljci - BKB, procenat slomljenih biljaka - %SB, procenat oklaska - %OK, dužinu klipa - DK, broj zrna u redu - BZR, dubinu zrna - DZ i masu 100 zrna - MZ. Statistički značajne razlike ne postoje između H-1 i ostalih hibrida za sledeće osobine: period između metličenja i svilanja - ASI, visinu biljke iznad klipa - VBK, ukupan broj listova - BL, broj klipova po biljci - BKB, procenat slomljenih biljaka - %SB, procenat oklaska - OK, broj zrna u redu - BZR, dubinu zrna - DZ, masu 100 zrna - MZ i prinos zrna - PR. Kod svih hibrida uočena je statistički značajna razlika u odnosu na H-1 za broj redova zrna - BRZ. U odnosu na H-1, najmanja statistički značajna razlika za visinu biljke - VB, broj listova iznad klipa - BLK, procenat vlage u zrnu - %VL i dužinu klipa - DK je bila kod hibrida H-2. 79 Tabela 19. Fenotipske osobine hibrida Genotip ASI VB (cm) VBK (cm) BL BLK BKB SB (%) OK (%) VL (%) DK (cm) BRZ BZR DZ (cm) MZ (g) PR (t/ha) H-1 2,00a 220,18b 84,18a 14,52a 4,02b 1,00a 7,81a 14,15a 18,42b 17,99ab 13,10b 36,24a 1,12a 37,20a 10,07ab H-2 1,70a 220,20b 84,70a 14,98a 4,45ab 0,90a 6,25a 15,22a 18,42b 17,00b 13,75a 33,06a 1,09a 36,74a 9,67b H-3 2,50a 228,22b 84,92a 15,18a 4,58a 0,95a 3,12a 15,33a 19,56a 18,32ab 14,25a 36,50a 1,11a 36,88a 11,64ab H-4 2,00a 236,42a 85,78a 15,25a 4,60a 0,90a 1,56a 14,08a 19,24ab 18,42ab 13,80a 37,28a 1,15a 36,82a 10,15ab H-5 2,25a 238,85a 90,98a 15,30a 4,48ab 1,00a 4,69a 14,28a 18,62b 19,02a 14,15a 36,22a 1,16a 36,51a 11,93a 2,1 228,78 86,11 15,04 4,42 0,95 4,69 14,62 18,86 18,15 13,81 35,86 1,13 36,83 10,69 Xmin 1,75 220,18 84,18 14,52 4,02 0,90 1,56 14,08 18,42 17,00 13,10 33,06 1,09 36,51 9,67 Xmax 2,5 238,85 90,98 15,30 4,60 1,00 7,81 15,33 19,56 19,02 14,25 37,28 1,16 37,20 11,93 SD 0,64 14,51 6,89 0,50 0,36 0,07 6,37 1,40 0,74 1,37 0,68 4,47 0,07 1,19 2,41 MS 0,33 ns 307,82*** 30,92 ns 0,40 ns 0,22 ns 0,01 ns 24,41 ns 1,50 ns 1,07* 2,22 ns 0,82** 10,51 ns 0,01 ns 0,25 ns 4,16* CV (%) 30,12 1,81 4,12 3,62 5,87 8,15 142,98 9,00 2,52 4,86 2,07 6,35 6,86 4,15 10,30 LSD0.05 1,24 8,13 9,84 1,51 0,51 0,15 13,16 2,58 0,94 1,73 0,56 4,47 0,15 3,00 2,16 ASI - razlika između datuma polinacije i svilanja u danima, VB - visina biljke (cm), VK - visina klipa (cm), BL - ukupan broj listova, BLK - broj listova iznad klipa, BKB - broj klipova po biljci, SB - slomljene biljke (%), OK - % oklaska, VL - % vlage u zrnu u momentu berbe, DK - dužina klipa (cm), BRZ - broj redova zrna na klipu, BZR - broj zrna u redu, DZ - debljina zrna (cm), MZ - masa 100 zrna (g), PR - prinos zrna u t/ha sa 14% vlage u zrnu, - srednja vrednost, Xmin - minimalna vrednost, Xmax - maksimalna vrednost, SD - standardna devijacija, MS - sredina kvadrata genotipova iz analize varijanse (ANOVA), *, ** i *** - statistički značajno na nivou od 0,05; 0,01 i 0,001, redom, ns - statistički nesignifikantno, CV - koeficijent varijacije, LSD0.05 - LSD vrednost na nivou značajnosti od 0,05. Prosečne vrednosti parametara označene istim slovom unutar svake kolone se statistički ne razlikuju na nivou značajnosti od 0,05. 80 Na osnovu srednjih vrednosti fenotipskih osobina je urađena klaster analiza sa kvadratom euklidskog rastojanja (Tabela 20) kao merom distance i rezultati su prikazani u obliku dendrograma (Slika 19). Najveća distanca u odnosu na hibrid sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) uočena je kod hibrida H-5 (42,30), a nešto manja kod H-3 (34,84) i H-4 (34,52), što je i potvrdilo njihovo grupisanje u poseban klaster (II). Hibrid H-2 kod koga je dobijena najmanja vrednost distance (25,22), izdvojen je u poseban klaster (I) sa hibridom H-1 što je potvrdilo rezultate LSD testa gde su najmanje značajne razlike između srednjih vrednosti ispitivanih osobina hibrida u odnosu na hibrid sa ZPL 5 uočene upravo kod hibrida H-2. Tabela 20. Kvadrati euklidskog rastojanja između hibrida sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) i odabranim potomstvima (H-2 do H-5) Hibrid Distanca (kvadrat euklidskog rastojanja) H-2 25,22 H-3 34,84 H-4 34,52 H-5 42,30 81 Slika 19. Dendrogram hibrida dobijen UPGMA klaster metodom iz kvadrata euklidskog rastojanja na osnovu fenotipskih osobina. 82 4.5.2. Određivanje stepena modifikacije endosperma zrna hibrida Kod ispitivanih hibrida uočen je sličan procenat zrna sa ≤ 25% opaque endospermom (93,87% - 98,75%). Jedino hibrid sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) nije imao nijedno zrno sa mekim endospermom (100% opaque), dok se procenat ovih zrna kod ostalih hibrida kretao od 0,36% - 4,06%. Prosečne učestalosti različitih klasa (≤ 25% opaque, ≤ 50% opaque, ≤ 75% opaque i 100% opaque) stepena modifikacije endosperma zrna hibrida sa odabranim potomstvima BC2F3 generacije date su u Tabeli 21. Tabela 21. Procenat učestalosti različitih klasa stepena modifikacije endosperma zrna hibrida ≤ 25% opaque (%) ≤ 50% opaque (%) ≤ 75% opaque (%) 100% opaque (%) H-1 98,47 1,00 0,53 0,00 H-2 93,87 3,27 1,44 1,41 H-3 98,30 1,35 0,00 0,36 H-4 98,75 0,68 0,16 0,41 H-5 95,12 0,35 0,47 4,06 83 5. DISKUSIJA Hranljiva vrednost žitarica je glavno ograničenje za njihovu upotrebu u ishrani ljudi i životinja. Proteini žitarica, uključujući i proteine endosperma kukuruza, imaju nizak sadržaj esencijalnih aminokiselina, naročito lizina, triptofana i metionina (Segal i sar., 2003). Biološka vrednost standardnog kukuruza iznosi 40% od vrednosti mleka (Bressani, 1991) i zato je potrebno dopuniti ishranu dodatnim izvorima proteina, kao što su mahunarke ili proizvodi životinjskog porekla. Kombinacija žitarica i mahunarki je česta u praksi, pošto se sastav njihovih esencijalnih aminokiselina dopunjuje - žitarice imaju visok sadržaj aminokiselina bogatih sumporom i nizak sadržaj lizina, dok je kod mahunarki taj odnos suprotan (Shewry i Halford, 2002). Hranljiva vrednost žitarica je od posebnog značaja u siromašnim i nerazvijenim područjima subsaharske Afrike, Azije i Južne Amerike, u kojima su one osnovna ljudska hrana i glavni izvor proteina. S druge strane, u razvijenim zemljama se najviše pažnje obraća na uticaj proteina žitarica na funkcionalna svojstva pri industrijskoj preradi hrane. Korišćeni su različiti pristupi kako bi se povećala hranljiva vrednost kukuruza, ali je najveći uspeh postignut otkrićem opaque2 mutanta (o2) sa superiornim hranljivim svojstvima (Mertz i sar., 1964). Direktna upotreba o2 mutacije u programima oplemenjivanja nije bila uspešna zbog njenih negativnih plejotropnih efekata. Paez i sar. (1969) su prvi objavili značaj modifikacije endosperma zrna za smanjenje negativnih plejotropnih efekata o2 mutacije. Selekcija na tvrdi endosperm je integrisana u programe stvaranja QPM, kukuruza poboljšane nutritivne vrednosti proteina bez negativnih plejotropnih efekata o2 mutacije. Promena u sastavu proteina endosperma zrna QPM, izazvana o2 mutacijom, podrazumeva povećanje od 60-100% sadržaja deficitarnih esencijalnih aminokiselina lizina i triptofana, kao i smanjenje od 50% lizinom siromašne prolaminske frakcije, što povećava svarljivost proteina i unos azota u odnosu na kukuruz standardnog kvaliteta zrna (Vasal, 2000). Pored toga, QPM ima povećan sadržaj niacina, gvožđa i cinka i utiče na poboljšano iskorišćavanje kalcijuma i karotena. Nastanak QPM je rezultat dvodecenijskog procesa oplemenjivanja. Istraživači u CIMMYT-u su, koristeći tehnike povratne (back-cross) i rekurentne selekcije, konvertovali nekoliko populacija kukuruza u opaque2 i zatim popravili nepoželjne 84 osobine (Bjarnason i Vasal, 1992; Villegas i sar., 1992). Iako je QPM razvijen klasičnim metodama selekcije, poslednjih godina se sve više primenjuje selekcija upotrebom molekularnih markera sa ciljem poboljšanja elitnih linija za kvalitet proteina. Kod klasične selekcije, pri popravci elitne linije za neku recesivnu osobinu koja nema vidljiv fenotipski marker (kao što je sadržaj lizina/triptofana) neophodno je posle svakog povratnog ukrštanja uraditi samooplodnju. Kod samooplođenih biljaka je moguće fenotipski identifikovati recesivne biljke za sledeću generaciju povratnog ukrštanja. Upotrebom specifičnih markera izbegava se generacija samooplodnje, već se direktno biraju recesivne i heterozigotne BC biljke (eng. foreground selection). Na ovaj način se dvostruko smanjuje broj potrebnih generacija tokom procesa povratnih ukrštanja. Selekcija upotrebom molekularnih markera za poboljšanje kvaliteta proteina je već korišćena kod tropskog i suptropskog kukuruza (Babu i sar., 2005; Zhang i sar., 2010; Zhang i sar., 2012; Gupta i sar., 2013). Prevođenje standardnog kukuruza na kukuruz visokog kvaliteta proteina adaptiranog na umereno klimatsko područje predstavlja veći izazov, pošto zahteva introgresiju opaque2 i gena modifikatora iz egzotične, neadaptirane germplazme. U Institutu za kukuruz „Zemun Polje“ već nekoliko godina se realizuje program poboljšanja komercijalnih, elitnih inbred linija na visok kvalitet proteina, čiji su deo i istraživanja prikazana u ovoj disertaciji. Dve elitne linije, ZPL 3 i ZPL 5, su selekcijom pomoću molekularnih markera prevođene na QPM varijante, korišćenjem tropske linije CML 144 kao donora poželjnih svojstava. Ovaj proces se sastojao iz dva ciklusa povratnog ukrštanja i tri ciklusa samooplodnje, kao što je opisano u radu Babu i sar (2004). Babu i sar. (2005) objavili su rezultate konverzije standardne inbred linije V25 u QPM verziju koristeći liniju CML176 kao donora visokog kvaliteta proteina. Njihov rad obuhvatio je selekciju za opaque2 gen u dve generacije povratnog ukršanja, selekciju biljaka genetički najsrodnijim rekurentnom roditelju u BC2F2 generaciji, kao i fenotipsku selekciju za poželjne agronomske osobine u dve uzastopne generacije samooplodnje. Prvi korak MAS je utvrđivanje polimorfnosti opaque2 specifičnih SSR markera za dati par roditeljskih linija pošto isti marker može biti polimorfan za jedan, a monomorfan za drugi par linija. Za kombinaciju linija ZPL 3 i CML 144, kao i ZPL 5 i CML 144, ko-dominantnu polimorfnost su pokazali markeri umc1066 i phi057, dok je 85 marker phi112 pokazao dominantni polimorfizam, što je u skladu sa rezultatima dobijenim u radovima Babu i sar. (2005) i Jompuk i sar. (2011). Nasuprot tome, u radu Danson i sar. (2006) prajmer umc1066 nije detektovao polimorfizam između QPM linija i linija standardnog kvaliteta zrna, dajući jedan isti fragment veličine 134 bp kod oba genotipa, što potvrđuje neophodnost testiranja roditeljskih komponenti na polimorfnost specifičnih opaque2 SSR markera. Zbog dominantne prirode polimorfizma, marker phi112 se u ovom radu nije koristio za razlikovanje recesivnih homozigota. Određivanje genetičke sličnosti između roditeljskih linija, kao i između roditelja i potomstava BC2, BC2F3 i BC2F4 generacija tokom procesa MAS je neophodno kako bi se identifikovala potomstva sa najvećim koeficijentom GS sa rekurentnim roditeljem. Upotreba molekularnih markera radi utvrđivanja procenta genoma rekurentnog roditelja u potomstvima povratnih ukrštanja (eng. background selection; Charcosset, 1997) smanjuje broj generacija potrebnih za stvaranje željenog genotipa. Na osnovu rezultata GS roditelja i potomstava smanjuje se broj biljaka koje je potrebno testirati i povećava efikasnost oplemenjivanja (Mladenović Drinić i sar., 2012). Pouzdanost rezultata zavisi od broja korišćenih markera, njihove ravnomerne raspodele po genomu, generacije ukrštanja i broja pojedinačnih biljaka u populaciji (Tamilkumar i sar., 2014). Simulacione studije su pokazale da povećanje broja markera na više od tri po hromozomu nije efikasno u ranim generacijama povratnih ukrštanja (Hospital i sar., 1992). U ovom radu korišćeno je najmanje tri markera po hromozomu. Za određivanje genetičke sličnosti (GS) između roditeljskih linija korišćeno je 40 SSR markera, sa prosečno 3 alela po markeru, što je slično rezultatima dobijenim na linijama kukuruza i u drugim radovima. Maphosa i sar. (2011) dobili su prosečan broj od 4,15 alela sa 24 SSR markera, Bante i Prasanna (2003) 3,25 alela sa 36 SSR markera, a Legesse i sar. (2007) 3,85 alela sa 27 SSR markera. S druge strane, nešto veći broj alela dobijen je u radu Warburton i sar. (2002) - 4,9 alela sa 88 SSR markera. Razlike u broju alela mogu biti posledica različitih faktora, kao što su broj SSR markera i tip ponovaka korišćenih u analizi, kao i različite metode korišćene za detekciju polimorfizma (Liu i sar., 2003; Legesse i sar., 2007). U ovom radu su korišćeni prajmeri sa ponovcima od dva do pet nukleotida. Prajmeri koji imaju ponovke sa većim brojem nukleotida su manje polimorfni u odnosu na one sa dinukleotidnim ponovcima, ali se 86 koriste kako bi se izbegla pojava “stutter “ traka koje se češće javljaju kod prajmera sa dinukleotidnim ponovcima (Warburton i sar., 2002). Genetička sličnost između ZPL 3 i CML 144, kao i između ZPL 5 i CML 144, izračunata prema Dice-ovom koeficijentu, je bila veoma niska (0,05), što je najverovatnije posledica vrste germplazme (adaptirana i egzotična). Ovako niska GS između donora i rekurentnog roditelja obično zahteva veći broj povratnih ukrštanja radi povraćaja genoma rekurentnog roditelja. Pored selekcije primenom molekularnih markera, MAS za poboljšanje kvaliteta proteina podrazumeva i određivanje sadržaja triptofana/lizina u odgovarajućim generacijama selekcije. Sadržaj lizina i triptofana u zrnu kukuruza su visoko korelisani (r = 0,85) (Hernandes i Bates, 1969), a ovakav njihov odnos uočen je i kod standardnog i kod QPM kukuruza (Bjarnson i Vasal, 1992; Vivek i sar., 2008). Zato je dovoljno pratiti samo jednu aminokiselinu tokom procesa stvaranja QPM germplazme. Pošto je metoda za određivanje sadržaja triptofana brža i jednostavnija, ona se i češće primenjuje u odnosu na određivanje sadržaja lizina. Sadržaj triptofana kod kukuruza standardnog kvaliteta zrna je obično ispod 0,060%. U radu Ignjatovic-Micic i sar. (2009) sadržaj triptofana kod linija B73 i Oh43 je bio 0,059% i 0,054%, redom. Slične vrednosti od 0,059% kod hibrida ZP74b i 0,052% kod ZP636, kao i malo veća vrednost od 0,065% kod hibrida ZP434, dobijene su analizom biohemijskih komponenti hibrida kukuruza (Žilić i sar., 2011). Kao što se i očekivalo, kod ispitivanih roditeljskih linija u ovom radu sadržaj triptofana i indeks kvaliteta bili su skoro duplo veći kod linije CML 144 u odnosu na linije ZPL 3 i ZPL 5. Takođe, obe vrednosti su bile iznad praga za QPM. Ovi rezultati su u saglasnosti sa rezultatima koje su dobili Jompuk i sar. (2006) i Prasanna i sar. (2001), kod kojih su vrednosti za sadržaj triptofana bile duplo veće kod QPM genotipova u odnosu na kukuruz standardnog kvaliteta zrna, dok su vrednosti za sadržaj proteina bile slične kod svih ispitivanih genotipova. Sadržaj proteina se takođe nije razlikovao između CML 144 i ZPL 3, odnosno ZPL 5. Nakon što su rezultati genetičke i biohemijske karakterizacije potvrdili dobar odabir roditeljskih linija, njihovim ukrštanjem formirana je F1 generacija u kojoj su sve biljke bile heterozigotne za opaque2 gen (O2o2). Nakon povratnih ukrštanja formirane su BC1 i BC2 generacije, odnosno potomstva koje su činile dominatno homozigotne (O2O2) i heterozigotne (O2o2) biljke. Procenat identifikovanih heterozigotnih biljaka u BC1 i BC2 generacijama bio je približno 50%, što je u skladu sa očekivanim odnosom 1 87 O2O2 : 1 O2o2 prema pravilima Mendelovog nasleđivanja. Slični rezultati su dobijeni i u radu Babu i sar. (2005), koji su identifikovali 71 heterozigot od ukupno 148 biljaka BC1 generacije (47,6%), kao i 74 od 159 biljaka BC2 generacije (46,5%). U radu Gupta i sar. (2013) nađeno je 87 heterozigota od ukupno 158 biljaka BC1 generacije (55,1%), kao i 98 od 212 biljaka BC2 generacije (46,2%). Identifikacija heterozigotnih biljaka omogućava odbacivanje potomstava koja nemaju željeni alel (O2O2) pre polinacije, što znatno doprinosi efikasnosti selekcije. Kada su u pitanju markeri kao što su phi057 i umc1066, koji su locirani unutar samog opaque2 gena, selekcija željenih genotipova je vrlo jednostavna. Ovakav odnos markera i ciljnog gena jeste najpoželjniji u procesima MAS, ali takvi markeri nisu uvek dostupni, osim ako nisu već klonirani i sekvencirani (Babu i sar., 2005). Utvrđivanjem procenta genoma rekurentnog roditelja i BC2 generacije, ustanovljeno je da je kod 65% BC2 potomstava koeficijent GS bio oko proseka, a njihov broj je opadao ka višim i nižim vrednostima. Skoro simetrična distribucija biljaka sa niskim, srednjim i visokim koeficijentom genetičke sličnosti sa rekurentnim roditeljem u BC2 generaciji ukazuje na dovoljan broj podataka dobijen molekularnim markerima. Vrednosti koeficijenata genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja ZPL 3 i BC2 potomstava (P-1 do P-43) su iznosile od 0,51 do 0,89, sa srednjom vrednošću od 0,74. Vrednosti koeficijenata GS između rekurentnog roditelja ZPL 5 i BC2 potomstava (P-1 do P-8) su iznosile od 0,67 do 0,85, sa srednjom vrednošću od 0,75. Zbog nepredvidivih okolnosti u poljskim uslovima, posebno kod QPM germplazme koja je sklona slabom klijanju, odabrano je više od jedne biljke za dalji proces selekcije - tri iz ukrštanja ZPL 3 x CML 144 i dve iz ukrštanja ZPL 5 x CML 144. Takođe, odabir više od jednog genotipa doprinosi većoj genetičkoj varijabilnosti, što povećava kvalitet fenotipske selekcije poželjnih agronomskih svojstava u kasnijim generacijama. Dobijeni rezultati genetičke sličnosti su u skladu sa rezultatima Babu i sar. (2005), gde je srednja vrednost procenta genoma rekurentnog roditelja bila 78,4%, a za dalju selekciju odabrane su tri biljke sa najvećim procentom - 95,75%, 93,25% i 92,75%, redom. Slične rezultate dobili su i Gupta i sar. (2013), koji su za formiranje BC2F2 generacije izabrali biljke čiji je procenat genoma rekurentnog roditelja iznosio od 83,7% do 94,4% kod jednog i od 80% do 93,7% kod drugog ukrštanja. Za razliku od navedenih radova, u ovom radu nisu identifikovana BC2 potomstva sa preko 90% genoma rekurentnih 88 roditelja. Najverovatnije je manja genetička sličnost posledica većih razlika između roditeljskih linija (tropska prema adaptiranoj germplazmi). Heterozigotne jedinke sa najvećim procentom genoma rekurentnog roditelja su nakon povratnih ukrštanja samooplođene radi formiranja BC2F2 generacije. Dobijeno potomstvo je sadržalo dominatno homozigotne (O2O2), heterozigotne (O2o2) i recesivno homozigotne biljke (o2o2) čiji je očekivani odnos 1:2:1 (25:50:25%). Recesivno homozigotne biljke su identifikovane pomoću specifičnih opaque2 markera u oba ukrštanja. Od potomstva iz ukrštanja ZPL 3 x CML 144 detektovano je 4,5% recesivno homozigotnih biljaka. Nijedna od ovih biljaka samooplodnjom nije dala dovoljan broj zrna (250) za biohemijske i genetičke analize, kao i za formiranje sledeće generacije, što je onemogućilo dalji rad sa potomstvima koja potiču od linije standardnog kvaliteta zrna ZPL 3. Takođe je i kod potomstva iz ukrštanja ZPL 5 x CML 144 identifikovan znatno manji procenat (7,6%) recesivno homozigotnih biljaka od očekivanih 25%. Manji procenat recesivno homozigotnih biljaka od očekivanog dobili su i Jompuk i sar. (2011). Kod potomstva iz ukrštanja Agron20 x Pop65C6-46 nađeno je osam recesivnih homozigota od ukupno 70 biljaka (8,57%), a kod potomstva iz ukrštanja Agron29 x Pop65C6-55 samo jedna recesivno homozigotna biljka od ukupno 70 (1,43%). Autori su kao mogući uzrok ovakvih rezultata naveli malu veličinu uzorka i slučajno odabrane biljke iz polja. Najverovatnije je na mali broj o2o2 biljaka uticala veća kompetitivnost polena sa dominantnim alelom (O2). Kompeticija polena je naročito dobro opisana kod kukuruza zbog specifične građe cveta koja omogućava detaljno izučavanje ovog fenomena (Jones, 1928; Mulcahy, 1971; Ottaviano i Sari-Gorla, 1979; Ottaviano i sar., 1988). Najvažnije komponente vitalnosti polena su klijavost polenovog zrna i stopa rasta polenove cevčice. Sari-Gorla i Rovida (1980) su pokazali da polenova zrna koja nose recesivni o2 alel imaju slabiju klijavost u odnosu na polenova zrna sa dominantnim alelom, dok razlike u brzini rasta polenove cevčice nisu uočene. Klijavost polena mogu izmeniti mnogi faktori, kao što su odnosi između gameta (Sari-Gorla i Rovida, 1980), uticaji spoljne sredine (Young, 1992) i interakcija sa tkivom stubića tučka (Pfahler, 1967; Heslop-Harrison, 1975; Sari-Gorla i sar., 1976; Herrero i Arbeloa, 1989). Takođe, kompleksni fiziološki odnosi između polena i stubića tučka podrazumevaju aktivaciju stubića od strane polenove cevčice, kao i uticaj proteina stubića na genom polena. 89 Razlike u kompetitivnosti polena mogu zato da se objasne razlikama u sposobnosti indukcije metaboličkih odgovora u stubiću tučka ili upotrebi njegovih metaboličkih produkata. Interakcija polena i tučka je od suštinske važnosti za uspešnu oplodnju (Cheung, 1995) i podrazumeva strogo regulisane procese koji obezbeđuju uspešno spajanje muških i ženskih gameta (Edlund i sar., 2004). Inkompatibilna polenova zrna su zaustavljena na svom putu ka plodniku tučka (Takayama i Isogai, 2005). Genetička osnova odnosa između polena i stubića tučka utvrđena je kod kukuruza (Pfahler, 1967; Sari-Gorla i sar., 1976; Ottaviano i sar., 1980, 1983), ali je identifikovano samo nekoliko specifičnih gena koji ga direktno kontrolišu (Sari-Gorla i sar., 1995). Opisano je više različitih Gametophytic factor gena (Ga) koji pripadaju grupi gena specifičnih za razvoj polena, klijavost i rast polenove cevčice (Bianchi i Lorenzoni, 1975), od kojih je prvi i najbolje opisan gen Ga1-s. Polenova zrna koja nose recesivni alel (ga) su manje kompetitivna za tkivo stubića od onih sa dominantnim alelom (Ga) (Nelson, 1952, 1994). Ako je muški roditelj heterozigotan (Ga/ga), na oplodnju može da utiče preferencijalni prenos alela što rezultira manjim brojem zrna na klipu. Ovo bi takođe moglo biti objašnjenje zašto je tokom izrade ove disertacije često bio prisutan problem sa količinom zrna po samooplođenom klipu, pa je između ostalog i dovoljan broj zrna po biljci bio jedan od faktora za odabir genotipova. Novije studije iz oblasti tehnologije transkriptoma i proteoma proširile su dosadašnje znanje o ekspresiji gena i proteina uključenih u interakciju polena i tučka (Qin i sar.., 2009; Sang i sar., 2012; Xu i sar., 2012), kao i o post-transkripcionoj regulaciji ove interakcije (Kang i sar., 2012; Li i sar., 2013; Peng i sar., 2013; Yang i sar., 2013). Ga1-s gen je mapiran i selekcijom pomoću molekularnih markera ugrađen u roditeljske linije belog hibrida voskovca putem šest generacija povratnih ukrštanja i jedne samooplodnje (Liu i sar., 2014). Između dominantno i recesivno homozigotnih hibrida za ovaj gen uočena je potpuna inkompatibilnost. Ovo je dominantan gen koji se zbog svoje specifičnosti najlakše inkorporira u elitne linije putem MAS. Ga geni su veoma bitni za hibride specifičnih svojstava koji se baziraju na recesivnim genima, kao što je i QPM, pa bi bilo vrlo korisno ugraditi Ga1-s gen putem MAS u novodobijene QPM linije. 90 Identifikovane recesivno homozigotne biljke BC2F2 generacije su samooplođene radi formiranja BC2F3 generacije. Koeficijenti genetičke sličnosti između rekurentnog roditelja ZPL 5 i potomstava (P-1 do P-10) su iznosili od 0,71 do 0,94. Pet potomstava koja su imala koeficijent GS veći od prosečnog (82% - 94%) su korišćena za dalji proces dobijanja linija visokog kvaliteta proteina. Na odabranim BC2F3 potomstvima urađena je analiza fenotipskih osobina. Prema rezultatima LSD testa, kod svih genotipova uočena je statistički značajna razlika u odnosu na ZPL 5 za visinu biljke, ukupan broj listova i broj redova zrna, dok za ostale ispitivane osobine ove razlike ili nisu bile značajne ili su bile najmanje statistički značajne. Za period između metličenja i svilanja nisu utvrđene statistički značajne razlike između roditeljske linije ZPL 5 i ispitivanih potomstava, što je od posebnog značaja kada se uzme u obzir da su roditeljske linije adaptirane na različite klimatske uslove. Kod potomstava P-5 i P-6 uočen je najveći broj osobina (12 od ispitivanih 15) čije se srednje vrednosti statistički značajno ne razlikuju u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5. Ovi rezultati su potvrđeni i dobijenim vrednostima GS, kao i klaster analizom. Pet odabranih BC2F3 potomstava su samooplođena radi formiranja BC2F4 generacije. Od dve lokacije na kojima su postavljeni ogledi, samooplodnja je bila uspešna samo na jednoj. Izdvojeno je ukupno 14 potomstava koja su imala dovoljan broj zrna. Prvi korak u odabiru genotipova za sledeću generaciju je bio utvrđivanje genetičke sličnosti BC2F4 potomstava sa rekurentnim roditeljem ZPL 5. Koeficijenti genetičke sličnosti su iznosili od 0,81 do 0,93, sa srednjom vrednošću od 0,88. Od 14 analiziranih potomstava, devet je imalo vrednost koeficijenta GS veću od prosečne (0,91 - 0,93) i ona su dalje korišćena za agronomske i biohemijske analize. Modifikacija mekog u tvrd endosperm je jedan od ključnih koraka u stvaranju QPM genotipova. Plejotropni efekti o2 mutacije čine endosperm zrna kukuruza mekim, a samo zrno osetljivim na pucanje, trulež i štetočine. Mehanizam kojim geni modifikatori menjaju strukturu endosperma zrna kukuruza od mekog i brašnjavog u tvrdi nije u potpunosti razjašnjena, niti se zna njihov broj, pozicija na hromozomu, kao ni razlike u nivou ekspresije u genotipovima različitog porekla (Prassana i sar., 2001; Sofi i sar., 2009). Poznato je prisustvo dva gena odgovorna za tvrdoću endosperma na hromozomu 7. Jedan od njih je lociran pored gena gzr1 (eng. gamma zein modifier1) 91 (Lopes i sar., 1995). Uticaj γ-zeina na nastanak tvrdog endosperma, kao i uticaj gena modifikatora na sadržaj ovih proteina posledica su visoke korelacije između stepena modifikacije endosperma zrna i povećanog nivoa γ-zeina (Lopes i Larkins, 1991; 1995). Tokom procesa stvaranja QPM genotipova, preporučuje se odabir zrna tipa 3 (≤ 50% netransarentnosti) u F2 generaciji, tipa 2 (≤ 25% netransparentnosti) i tipa 3 u sledeće dve generacije, a tipa 2 u preostalim generacijama. Zrna tipa 3 su najbolji izbor u ranim generacijama pošto predstavljaju kompromis između garantovanog prisustva o2o2, što je glavni prioritet, i zadovoljavajućeg stepena modifikacije endosperma, koji može da se popravi u sledećim generacijama. U ovom periodu selekcije, zrna tipa 1 su najverovatnije O2O2 ili O2o2, zrna tipa 5 su o2o2, a zrna tipa 4 imaju malu verovatnoću da u sledećim generacijama postignu dovoljan stepen modifikacije endosperma. Ovakav princip odabiranja zrna za formiranje sledeće generacije je primenjen i u ovom radu. Stepen modifikacije endosperma zrna u BC2F4 generaciji je generalno bio visok. Od devet BC2F4 potomstava koja su na osnovu vrednosti GS odabrane za dalji rad, kod pet su identifikovana samo zrna sa tvrdim endospermom (≤ 25% opaque). Kod preostala četiri potomstva identifikovana su i zrna koja su ≤ 50% opaque (od 1,3% do 11,9%) i ≤ 75% opaque (2,4% do 3,6%), dok se procenat zrna sa mekim endospermom (100% opaque) kretao od 2,2% do 3,8%. Mali procenat zrna mekog endosperma ukazuje na to da je postignut zadovoljavajući stepen modifikacije endosperma zrna. Biohemijska evaluacija potomstava BC2F4 generacije pokazala je značajno povećanje sadržaja triptofana i indeksa kvaliteta kod svih ispitivanih potomstava u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5, dok sadržaj proteina nije bio značajno promenjen u odnosu na roditeljsku liniju. Kod devet potomstava koja su imala najveći koeficijent GS sa roditeljskom linijom povećanje sadržaja triptofana u odnosu na ZPL 5 iznosilo je od 20% do 33%, a povećanje QI od 17% do 37%. Među potomstvima čiji je koeficijent GS bio ispod prosečne vrednosti izdvaja se P-1/2 sa najvećim povećanjem sadržaja triptofana (43%) i QI (46%) u odnosu na roditeljsku liniju. Iako je ovo potomstvo imalo vrednost GS ispod prosečne, zbog izuzetno visokog sadržaja triptofana odabrano je za dalji rad. Na osnovu dobijenih rezultata stepena modifikacije zrna, biohemijske i SSR analize, izabrano je deset sub-linija za fenotipsku i biohemijsku evaluaciju u poljskim 92 ogledima. Analiza varijanse je pokazala statistički značajne razlike između analiziranih genotipova za većinu osobina. Genotip nije bio značajan izvor variranja za period između metličenja i svilanja, kao ni za procenat slomljenih biljaka i procenat oklaska. Rezultati LSD testa identifikovali su kod svih genotipova statistički značajne razlike u odnosu na ZPL 5 za visinu biljke i broj redova zrna. Pošto je isti rezultat dobijen i za potomstva prethodne generacije, u prethodnoj godini, može se pretpostaviti da su vrednosti za ove dve osobine rezultat tropskog porekla roditeljske linije CML 144. Takođe, dobijen je isti rezultat kao u prethodnoj generaciji i za period između metličenja i svilanja, gde ne postoje statistički značajne razlike između roditeljske linije ZPL 5 i ispitivanih sub-linija. Ovo je potvrdilo dobru adaptiranost potomstava na uslove umerenog klimatskog područja. U odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5, najmanja statistički značajna razlika za većinu osobina je bila kod sub-linija od S-3 do S-10. Kod sub-linije S-3 uočen je najveći broj osobina (13 od ispitivanih 15) čije se srednje vrednosti statistički značajno ne razlikuju u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5. Ovi rezultati su u skladu sa rezultatima klaster analize na osnovu srednjih vrednosti fenotipskih osobina. Sub-linije od S-3 do S-10 formirale su poseban klaster sa roditeljskom linijom. U okviru njega, posebno se sa roditeljskom linijom izdvojila sub- linija S-3, kod koje su utvrđene najmanje značajne razlike između srednjih vrednosti ispitivanih osobina u odnosu na ZPL 5. Odabrane sub-linije su samooplođene i nakon berbe određen je stepen modifikacije endosperma i izvršena je biohemijska evaluacija svakog pojedinačnog klipa. Na osnovu dobijenih rezultata odabrane su sub-linije sa najvećim sadržajem triptofana i urađena je analiza genetičke sličnosti sa roditeljskom linijom ZPL 5, kako bi se potvrdilo da li su linije zadržale visok procenat sličnosti sa genomom rekurentnog roditelja. Analizom stepena modifikacije endosperma zrna deset sub-linija, kod četiri su identifikovani samo klipovi sa zrnom tvrdog endosperma (≤ 25% opaque). Zrno mekog endosperma (100% opaque) bilo je prisutno kod ostalih šest sub-linija u malom procentu, što je potvrdilo da je održan zadovoljavajući stepen modifikacije endosperma zrna. Sve analizirane sub-linije su imale veći sadržaj triptofana i indeks kvaliteta u odnosu na roditeljsku standardnu liniju. Prosečno povećanje sadržaja triptofana odabranih sub-linija u odnosu na roditeljsku liniju kretalo se od 17% do 27%. Najveće 93 prosečno povećanje QI u odnosu na ZPL 5 iznosilo je 38%, a najmanje 23%. Kada su u pitanju pojedinačni klipovi, 46% je imalo sadržaj triptofana iznad praga za QPM, a za još 40% može se reći da imaju povećani sadržaj ove aminokiseline (0,070-0,075%). Dobijeni rezultati su u skladu sa rezultatima dobijenih u radu Gupta i sar. (2013), kod kojih je povećanje sadržaja triptofana iznosilo od 6 do 24% u odnosu na roditeljsku liniju standardnog kvaliteta zrna. Rezultati analize biohemijskih komponenti pokazali su statistički značajne razlike u sadržaju triptofana i indeksu kvaliteta kod svih ispitivanih sub-linija u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5. Takođe, visoko značajno variranje (P<0,001) između genotipova uočeno je kod svih ispitivanih biohemijskih osobina. Koeficijent varijacije je bio niži kod biohemijskih osobina u odnosu na fenotipske osobine i prinos zrna. Moguće objašnjenje je relativno mala genotipska varijabilnost za ove osobine. Poznavanje korelacija između različitih osobina, uključujući i kvalitet zrna, može da objasni u kom stepenu te osobine utiču na ekonomsku isplativost gajenja određenog genotipa (Bello i sar., 2012). Između prinosa zrna i većine ispitivanih osobina u ovom radu uočene su značajne korelacije. Značajna korelacija (P<0,05) ustanovljena je između prinosa zrna i procenta oklaska, a visoko značajne fenotipske korelacije (P<0,01) između prinosa zrna i ostalih ispitivanih osobina. Visoko značajne korelacije između prinosa i komponenti prinosa se uobičajeno detektuju zbog njihove međuzavisnosti (Blum, 1988). Komponente prinosa kao što su dužina klipa, prečnik klipa, broj redova zrna, broj zrna u redu i masa 100 zrna imaju veću heritabilnost od prinosa zrna (Austin i Lee, 1996; Messmer i sar., 2009), tako da se njihovim poboljšanjem može postići povećanje prinosa (Gupta i sar., 2006). Ispitivane biohemijske osobine nisu pokazale značajne korelacije sa većinom fenotipskih osobina. Visoko značajne korelacije (P<0,01) uočene su između sadržaja triptofana i visine biljke, broja redova zrna i indeksa kvaliteta, a značajne korelacije (P<0,05) između sadržaja triptofana i broja listova iznad klipa, dužine klipa i broja zrna u redu. Sadržaj proteina pokazao je visoko značajne korelacije (P<0,01) sa procentom vlage, masom 100 zrna i indeksom kvaliteta, a značajnu korelaciju (P<0,05) sa brojem redova zrna. Između indeksa kvaliteta i broja redova zrna, kao i sadržaja triptofana i proteina uočene su visoko značajne korelacije (P<0,01), a značajne korelacije (P<0,05) između indeksa kvaliteta i visine biljke, kao i dužine klipa. Na osnovu dobijenih 94 rezultata, za dobijanje genotipova sa većim sadržajem triptofana i indeksa kvaliteta mogla bi se preporučiti selekcija na visinu biljke, dužinu klipa i broj redova zrna. Biohemijski parametri su pokazali pozitivne statistički nesignifikantne korelacije sa prinosom zrna, što je delimično u saglasnosti sa rezultatima dobijenim u radu Zaidi i sar. (2008). Ovi autori dobili su značajne korelacije (P<0,05) između prinosa zrna i sadržaja proteina, kao i sadržaja triptofana u zrnu, a između prinosa zrna i sadržaja triptofana u proteinu nije uočena statistički značajna korelacija. Reddy i sar. (2013) su takođe dobili pozitivne korelacije između prinosa zrna i sadržaja triptofana, kao i indeksa kvaliteta, dok je između prinosa zrna i sadržaja proteina uočena negativna korelacija. Negativna korelacija između prinosa i sadržaja proteina dobijena je u nekoliko istraživanja (Mosisa i sar., 2008; Idikut i sar., 2009; Selvaraj i Nagarajan, 2011), dok je u radu Prakash i sar. (2006) uočena pozitivna korelacija kao i u ovom radu. Pošto su dobijene korelacije pozitivne, može se očekivati da se povećanjem prinosa povećaju i biohemijski parametri. Međutim, to povećanje neće biti veliko, pošto korelacije nisu bile statistički značajne. Ova činjenica, međutim, ukazuje na mogućnost paralelne selekcije na povećani prinos i poboljšani kvalitet zrna u ispitivanom materijalu. Agroekološki uslovi imaju važno mesto u proizvodnom procesu kukuruza jer u velikoj meri utiču na dobijanje proizvoda visokog prinosa i kvaliteta. Klimatski faktori i zemljište, najznačajniji agroekološki faktori, utiču na stabilnost sadržaja proteina, kao i sadržaja lizina i triptofana. Različita istraživanja su pokazala da je sadržaj triptofana kod QPM u stresnim i optimalnim uslovima bio veći nego sadržaj triptofana kod kukuruza standardnog kvaliteta zrna u optimalnim uslovima (Prasanna i sar., 2001; CIMMYT, 2003; Mosisa, 2005; Gupta i sar., 2009), što se može objasniti drastičnim smanjenjem zeina, kao i povećanjem drugih rezervnih proteina bogatih lizinom i triptofanom (Tengan, 2010). Superiornost kvaliteta proteina QPM u odnosu na genotipove standardnog kvaliteta je dokazana u optimalnim uslovima zemljišta u Srbiji (Ignjatović- Micić i sar., 2013), Zimbabveu i Keniji (Mosisa i sar, 2007), kao i u različitim klimatskim uslovima (Ignjatović-Micić i sar., 2015). U radu Bello i sar. (2012) sadržaj lizina i triptofana, kao i indeks kvaliteta su bili značajno veći kod QPM, a vrednosti su održane iznad praga za QPM i u uslovima različitog sadržaja azota u zemljištu. Slično tome, objavljeno je i da je kvalitet proteina stabilniji nego sadržaj proteina i 95 modifikacije endosperma zrna kod QPM u različitim uslovima sredine (Pixley and Bjarnason, 2002; Zaidi et al, 2008). U ovom radu kod svih ispitivanih sub-linija uočen je povećani sadržaj triptofana u odnosu na liniju standardnog kvaliteta zrna. Kod većeg broja analiziranih pojedinačnih klipova (87%) vrednosti su bile iznad ili malo ispod granice za QPM. Kod malog broja ispitivanih genotipova uočena su odstupanja ovih vrednosti u okviru istog genotipa na različitim lokacijama, što se može objasniti specifičnim agroekološkim uslovima. Za razliku od 2013. godine kada su klimatski uslovi bili optimalni, u predvegetacionom periodu 2014. godine, bilo je neoubičajeno toplo i suvo vreme sa malo snega. Nedostatak vlage u zemljištu nadoknađen je u vegetacionom periodu, kada su u maju, julu i septembru zabeležene veoma obilne i intezivne padavine. Dok je temperatura vazduha bila u granicama višegodišnjeg proseka, ukupna količina padavina u toku vegetacionog perioda iznosila je 873,2 mm, što je duplo više u odnosu na uslovno optimalnu količine vode od 425 mm (Vučić, 1976). Kod ispitivanih sub-linija je održan povećani nivo triptofana iz prethodne generacije, što govori o visokoj heritabilnosti ove osobine. Takođe, moglo bi se zaključiti da su sub-linije homozigotne za gene modifikatore sadržaja aminokiselina. Na osnovu rezultata biohemijske analize samooplođenih pojedinačnih klipova BC2F4 generacije sub-linija odabrano je ukupno 13, čiji je sadržaj triptofana bio iznad praga za QPM i izračunata je genetička sličnost između roditeljske linije ZPL 5 i ovih sub-linija poboljšanog kvaliteta. Genetička sličnost između ZPL 5 i svih analiziranih sub-linija, izračunata prema Dice-ovom koeficijentu, je bila 0,93. Rezultate GS potvrdila je i klaster analiza na osnovu matrica genetičkih sličnosti, prema kojoj su analizirane linije formirale jedinstveni klaster sa rekurentnim roditeljem ZPL 5. Ovakvi rezultati potvrdili su da su linije sa povećanim sadržajem triptofana zadržale visok procenat sličnosti sa genomom rekurentnog roditelja. Svih 13 linija poboljšanog kvaliteta zrna potiču od P-5 i P-6 potomstva BC2F3 generacije, koja su imala najveći koeficijent GS sa rekurentnim roditeljem, najmanju distancu na osnovu srednjih vrednosti fenotipskih osobina, kao i najveći broj fenotipskih osobina čije se srednje vrednosti statistički značajno ne razlikuju u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5. Rezultati dobijeni u ovom radu su u skladu sa rezultatima Gupta i sar. (2013) koji su povratili genom rekurentnog roditelja u proseku za 94%, kao i Zhang i sar. (2010) kod kojih je taj procenat iznosio od 92 do 95%. 96 Odabrana BC2F3 potomstva su ukrštena sa komercijalnim test F1 hibridom radi provere kombinacionih sposobnosti dobijenih sub-linija u poređenju sa rekurentnim roditeljem. Analiza varijanse dobijenih hibrida je pokazala statistički značajne razlike između analiziranih genotipova za mali broj osobina. Za većinu ispitivanih osobina genotip nije bio značajan izvor variranja. Rezultati LSD testa pokazali su da ne postoje statistički značajne razlike između hibrida sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) i ostalih hibrida za većinu ispitivanih osobina. Kod svih hibrida uočena je značajna razlika u odnosu na H-1 za broj redova zrna. U odnosu na H-1, najmanje statistički značajne razlike za visinu biljke, broj listova iznad klipa, procenat vlage u zrnu i dužinu klipa su uočene kod hibrida H-2. Veliki broj osobina ispitivanih hibrida čije se srednje vrednosti statistički ne razlikuju u odnosu na H-1 ukazuje da su kod linija poboljšanog kvaliteta zrna očuvane dobre kombinacione sposobnosti roditeljske linije ZPL 5. Na osnovu srednjih vrednosti fenotipskih osobina hibrida urađena je klaster analiza. Najveća distanca u odnosu na hibrid sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) uočena je kod hibrida H-5, a nešto manja kod H-3 i H-4, što je i potvrdilo njihovo grupisanje u poseban klaster. Hibrid H-2, kod koga je dobijena najmanja vrednost distance, izdvojen je u poseban klaster sa hibridom H-1, što je potvrdilo rezultate LSD testa gde su najmanje značajne razlike između srednjih vrednosti ispitivanih osobina hibrida u odnosu na hibrid sa ZPL 5 uočene upravo kod hibrida H-2. Analiza stepena modifikacije endosperma zrna pokazala je kod svih ispitivanih hibrida sličan procenat zrna sa ≤ 25% opaque endospermom (93,87% - 98,75%). Jedino hibrid sa roditeljskom linijom ZPL 5 (H-1) nije imao nijedno zrno sa mekim endospermom (100% opaque), dok se procenat ovih zrna kod ostalih hibrida kretao od 0,36% - 4,06%. Mali procenat zrna sa mekim endospermom potvrđuje prisustvo gena modifikatora za tvrdoću endosperma, odnosno dobar odabir genotipova u procesu dobijanja linija poboljšanog kvaliteta zrna. Prednosti MAS u poboljšanju kvaliteta kukuruza su već objavljene (Babu i sar., 2005; Zhang i sar., 2010; Zhang i sar., 2012; Gupta i sar., 2013). Ona povećava pouzdanost i efikasnost procesa stvaranja linija i hibrida kukuruza poboljšanog kvaliteta (Babu i sar., 2004). Babu i sar. (2005) objavili su rezultate konverzije standardne inbred linije V 25 u QPM verziju koristeći QPM donor liniju CML 176. Njihov rad obuhvatio je selekciju za opaque2 gen u dve generacije povratnog ukršanja, selekciju biljaka 97 genetički najsličnijih rekurentnom roditelju u BC2F2 generaciji, kao i fenotipsku selekciju za poželjne agronomske osobine u dve uzastopne generacije samooplodnje. Gupta i sar. (2013) su pomoću MAS stvorili QPM roditeljske linije Vivek-9 hibrida i dobili QPM hibrid za duplo kraće vreme u odnosu na konvencionalno oplemenjivanje. SSR markeri su uspešno iskorišćeni kako za odabir genotipova recesivno homozigotnih za o2 gen, tako i onih sa najvećim procentom genoma rekurentnog roditelja. Kombinujući konvencionalno oplemenjivanje i MAS, Zhang i sar. (2010) su dobili linije sa povećanim sadržajem lizina koristeći kao roditeljske komponente o2 i o16 kukuruz. Selekcijom na o2 i o16 pomoću SSR markera umc1066 i umc1141, nakon dva ciklusa povratnog ukrštanja i tri ciklusa samooplodnje, stvorene su linije koje su imale veći sadržaj lizina od oba roditelja (23% i 64%). Jompuk i sar. (2011) su ukrštanjem inbred linija standardnog kvaliteta zrna (Agron20 i Agron29) i QPM linija (Pop65C6-46 i Pop65C6-55) i upotrebom SSR markera specifičnih za opaque2 gen dobili sedam linija koje su imale duplo veći sadržaj triptofana u odnosu na kukuruz standardnog kvaliteta zrna. Dve linije iz njihovog istraživanja koje su pokazale najbolje kombinacione sposobnosti preporučene su za programe stvaranja QPM hibrida. Rezultati ovog rada su dobijanje linija povećanog sadržaja triptofana (37-50% u odnosu na početnu vrednost roditeljske standardne linije), povećanog indeksa kvaliteta (42-56% u odnosu na početnu vrednost roditeljske linije), očuvane genetičke sličnosti sa rekurentnom linijom (93% genoma rekurentnog roditelja), visokog stepena modifikacije endosperma zrna (100% zrna tvrdog endosperma), povećanog prinosa zrna (11-31% u odnosu na roditeljsku liniju) i očuvanih odličnih kombinacionih sposobnosti. Ove linije poboljšanog kvaliteta, dobijene kombinacijom konvencionalnog i molekularnog oplemenjivanja, adaptirane su na uslove umerenog klimatskog područja. Molekularna genetika je danas u svetu sastavni deo različitih programa selekcije i oplemenjivanja žitarica. Povećanje hranljive vrednosti zrna kukuruza je samo jedan od primera njene primene. U odnosu na druge žitarice, najveći napredak je ostvaren kod kukuruza, zato što se njegova proizvodnja nalazi u vlasništvu velikih privatnih kompanija (Pioneer Hi-Bred, Syngenta, Monsanto, KWS, Limagrain) koje ulažu velika sredstva u razvoj novih tehnologija. Savremena selekcija i oplemenjivanje kroz različite segmente kao što su sekvenciranje genoma, razvoj molekularnih markera zajedno sa fenotipskom evaluacijom, funkcionalna genomika, asocijativno mapiranje, 98 transformacije, poziciono kloniranje, molekularno oplemenjivanje i evaluacija u poljskim ogledima, dovode do stvaranja novih varijeteta. Gajenje linija i hibrida visokog kvaliteta proteina obezbedilo bi proizvodnju biljnih proteina veće hranljive i biološke vrednosti za ishranu ljudi i domaćih životinja. 99 6. ZAKLJUČCI Na osnovu dobijenih rezultata proučavanja upotrebe molekularnih markera u stvaranju linija kukuruza sa poboljšanim kvalitetom proteina adaptiranih na umereno klimatsko područje, došlo se do sledećih zaključaka:  Molekularni markeri phi057 i umc1066, specifični za opaque2 gen, pokazali su ko-dominantni polimorfizam između linija standardnog kvaliteta zrna i QPM linije.  Procenat identifikovanih heterozigotnih biljaka u BC1 i BC2 generacijama bio je približno 50%, što je u skladu sa očekivanim odnosom 1 O2O2 : 1 O2o2 prema pravilima Mendelovskog nasleđivanja.  U BC2F2 generaciji identifikovan je manji procenat recesivno homozigotnih biljaka od očekivanih 25% - 4,5% kod ukrštanja ZPL 3 x CML 144 i 7,6% kod ukrštanja ZPL 5 x CML 144. Najverovatnije je na mali broj o2o2 biljaka uticala veća kompetitivnost polena sa dominantnim alelom (O2).  Pomoću opaque2 specifičnih markera, tokom selekcije su direktno birane heterozigotne i recesivno homozigotne biljke. Takođe, upotrebom SSR markera ravnomerno raspoređenih po genomu, za dalju selekciju birana su potomstva sa najvećim koeficijentom genetičke sličnosti sa rekurentnim roditeljima. Na taj način je povećana efikasnost selekcije, odnosno smanjen broj generacija potrebnih za dobijanje željenog genotipa.  Kod ispitivanih sub-linija održan je povećani nivo triptofana iz prethodne BC2F4 generacije, što ukazuje na visoku heritabilnost ove osobine, kao i na to da su sub-linije homozigotne za gene modifikatore sadržaja aminokiselina.  Mali procenat zrna mekog endosperma kod ispitivanih sub-linija ukazuje na to da je postignut zadovoljavajući stepen modifikacije endosperma.  Kod analiziranih sub-linija biohemijski parametri su pokazali pozitivne statistički nesignifikantne korelacije sa prinosom zrna, što ukazuje na mogućnost paralelne selekcije na povećani prinos i poboljšani kvalitet zrna u ispitivanom materijalu. 100  Na osnovu dobijenih korelacija između ispitivanih biohemijskih i fenotipskih osobina, za dobijanje genotipova sa većim sadržajem triptofana i indeksa kvaliteta mogla bi se preporučiti selekcija na visinu biljke, dužinu klipa i broj redova zrna.  Kombinacijom konvencionalnog i molekularnog oplemenjivanja dobijeno je trinaest linija adaptiranih na uslove umerenog klimatskog područja koje imaju povećani sadržaj triptofana (37-50% u odnosu na početnu vrednost roditeljske linije), povećani indeks kvaliteta (42-56% u odnosu na početnu vrednost roditeljske linije), očuvanu genetičku sličnost sa roditeljskom linijom (93% genoma rekurentnog roditelja), visok stepen modifikacije endosperma zrna (100% zrna tvrdog endosperma), povećani prinos zrna (11-31% u odnosu na roditeljsku liniju), kao i očuvane odlične kombinacione sposobnosti. Svih 13 linija poboljšanog kvaliteta potiču od P-5 i P-6 potomstva BC2F3 generacije koja su imala najveći koeficijent genetičke sličnosti sa rekurentnim roditeljem, kao i najveći broj fenotipskih osobina čije se srednje vrednosti statistički značajno ne razlikuju u odnosu na roditeljsku liniju ZPL 5.  Između hibrida sa roditeljskom linijom ZPL 5 i hibrida sa odabranim BC2F3 potomstvima, za većinu ispitivanih fenotipskih osobina nisu utvrđene statistički značajne razlike, što je ukazalo da su kod sub-linija poboljšanog kvaliteta očuvane dobre kombinacione sposobnosti roditeljske linije ZPL 5.  Mali procenat zrna sa mekim endospermom kod ispitivanih hibrida potvrdio je prisustvo gena modifikatora za tvrdoću endosperma.  Rezultati ove disertacije potvrdili su prednosti selekcije upotrebom molekularnih markera u poboljšanju kvaliteta kukuruza. Pošto su roditeljske linije korišćene u ovom radu bile različitog porekla (tropska i adaptirana germplazma), što je potvrdio veoma nizak koeficijent genetičke sličnosti između njih (0,05), povraćaj genoma rekurentnog roditelja kod poboljšanih linija je iznosio 93%. Radi većeg povraćaja genoma rekurentnog roditelja, za prevođenje standardnog kukuruza na kukuruz visokog kvaliteta proteina adaptiranog na umereno klimatsko područje, preporučuje se još jedno povratno ukrštanje. 101 7. LITERATURA Agrawal, P. K., H. S. Gupta (2010): Enhancement of protein quality of maize using biotechnological options. Anim. Nutr. Feed Technol. 10: 79−91. Akuamoa-Boateng, A. (2002): Quality protein maize infant feeding trials in Ghana. Ghana Health Service. Ashanti, Ghana. Ames, B.N. (1979): Identifying enviromental chemicals causing mutations and cancer. Science 204: 587-593. Andersen, J.R., T. Lübberstedt (2003): Functional markers in plants. Trends in Plant Science 8: 554-560. Austin, D.F., M. Lee (1996): Comparative mapping in F2:3 and F6:7 generations of quantitative trait loci for grain yield and yield components in maize. Theor. Appl. Genet. 92: 817-826. Ayers, N.M., A.M. McClung, P.D. Larkin, H.F.J. Bligh, C.A. Jones, W.D. Park (1997): Microsatellites and a single nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm. Theor. Appl. Genet. 94: 773– 781. Babu, R., S.K. Nair, M. Prassana, H.S. Gupta (2004): Integrating marker assisted selection in crop breeding – prospects and challenges. Curr Sci, 87 (5): 607-619. Babu, R., Nair S.K., A. Kumar, S. Venkatesh, J.C. Sekhar, N.N. Singh, G. Srinivasan, H.S. Gupta (2005): Two-generation marker-aided backcrossing for rapid conversion of normal maize lines to quality protein maize (QPM). Theor Appl Genet 111: 888-897. 102 Babu, B.K., P.K. Agrawal, H.S. Gupta, A. Kumar, J.C. Bhatt (2012): Identification of candidate gene–based SSR markers for lysine and tryptophan metabolic pathways in maize (Zea mays). Plant Breeding 131: 20-27. Bantte, K., B.M. Prasanna (2003): Simple sequence repeat polymorphism in quality protein maize (QPM) lines. Euphytica, 129: 337-344. Barcaccia, G., L. Pallottini, P. Parrini, M. Lucchin (2006): A genetic linkage map of a flint maize (Zea mays var. Indurata L.) Italian landraces using one way pseudo-test cross strategy and multilocus PCR based markers. Maydica 51: 469-480 Bello, O.B., O.J. Olawuyi, M.A. Azeez, M. Lawal, S.Y. Abdulmaliq, M.S. Afolabi, S.A. Ige, J. Mahamood (2011-12): Genotypic variation in endosperm protein, lysine and tryptophan contents of normal extra-early maize cultivars and their quality protein hybrids under nitrogen stress and non-stress enviroments. Journal of Research (Science), 22-23: 27-48. Bianchi, A., C. Lorenzoni (1975): Gametophytic factors in Zea mays. In: Mulcahy, D.L. (ed.) Gamete Competition in Plants and Animals. North Holland, Amsterdam: 257-263. Bjarnason, M., S.K. Vasal (1992): Breeding of quality protein maize (QPM). Plant Breeding Review 9: 181-216. Black, R.E., L.H., Allen, Z.A., Bhutta, L.E. Caulfield, M. de Onis, M. Ezzati, C. Mathers, J. Rivera (2008): Maternal and child undernutrition: global and regional exposures and health consequences. The Lancet 371(9608):243-260. Blum, A. (1988): Plant breeding for stress environments. CRC Press, Boca Raton, R.L. Brennecke, K., A.J. Souza Neto, J. Lugli, P.J. Lea, R.A. Azevedo (1996): Aspartate kinase in the maize mutants ask1-lt19 and opaque-2. Phytochemistry 41: 707-712. 103 Bressani, R. (1991): Protein quality of high-lysine maize for humans. Cereal Foods World 36: 806-811. Bressani, R. (1992): Nutritional value of high-lysine maize in humans. In: E.T. Mertz (Ed.), Quality protein maize. Am. Ass. Cereal Chem., St. Paul, MN: 205-224. Brochetto-Braga, M.R., A. Leite, P. Arruda (1992): Partial purification and characterization of lysine-ketoglutarate reductase in normal and opaque-2 maize endosperms. Plant Physiology 98: 1139-1147. Burgoon, K.G., J.A. Hansen, D.A. Knabe, A.J. Bockholt (1992): Nutritional value of quality protein maize for starter and finisher swine. Journal of Animal Science 70: 811- 817. Camus-Kulandaivelu, L., J-B. Veyrieras, D. Madur, V. Combes, M. Fourmann, S. Barraud, P. Dubreuil, B. Gouesnard, D. Manicacci, A. Charcosset (2006): Maize adaptation to temperate climate: relationship between population structure and polymorphism in the Dwarf gene. Genetics 172: 2449–2463. Carena, M.J. (2013): Development of cold and drought tolerant short-season maize germplasm for fuel and feed utilization. Crop Breeding and Applied Biotechnology 13: 1-8. Chambers, K.G., E.S. MacAvoy (2000): Microsatellites: consensus and controversy. Comp. Biochem. Physiol. (Part B). 126: 455-476. Charcosset, A. (1997): Marker-assisted introgression of quantitative trait loci. Genetics. 147: 1469-1485. 104 Chardon, F., B. Virlon, L. Moreau, M. Falque, J. Joets, L. Decousset, A. Murigneux, A. Charcosset (2004): Genetic architecture of flowering time in maize as inferred from quantitative trait loci meta-analysis and synteny conservation with the rice genome. Genetics 168: 2169–2185. Cheung, A.Y. (1995): Pollen-pistil interaction in compatible pollination. Proc Natl Acad Sci USA 92: 3077-3080. Ching, A., K.S. Caldwell, M. Jung, M. Dolan, O.S. Smith, S. Tingey et al. (2002): SNP frequency: haplotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines. BMC Genet. 3: 19-32 . CIMMYT (2003): The development and promotion of quality protein maize in sub- Saharan Africa. Progress Report Submitted to Nippon Foundation, Harare, Zimbabwe. Cord Neto, G., J.A. Yunes, M.J. Dasilva, A.L. Vettore, P. Arruda, A. Leite (1995): The involvement of Opaque 2 on beta-prolamin gene regulation in maize and Coix suggests a more general role for this transcriptional activator. Plant Molecular Biology 27: 1015- 1029. Crow, J.F., J. Kermicle (2002): Oliver Nelson and quality protein maize. Genetics 160:819. Damerval, C., D. de Vienne (1993): Quantification of dominance for proteins pleiotropically affected by opaque-2 in maize. Heredity 70: 38-51. Danson, J., M. Mbogori, M. Kimani, M. Lagat, A. Kuria, A. Diallo (2006): Marker assisted introgression of opaque2 gene into herbicide resistant elite maize inbred lines. African journal of biotechnology, 5 (24): 2417-2422. 105 Denić, M., V. Hadži-Tašković Šukalović, D. Jelenić, J. Dumanović, I. Božović (1979): Comparison of some chemical methods for screening maize genotypes with improved protein quality. Genetika 11(1): 75-83. Dice, L.R. (1945): Measures of the amount of ecologic association between species, Ecology, 26: 297-302. Diplock, A. T., P. J. Agget, M. Ashwell, F. Bornet, E. B. Fern, M. B. Roberfroid (1999): Scientific concepts of functional foods in Europe: consensus document. British Journal of Nutrition, 81(1): S1–S27. Doyle, J.J., J.L. Doyle (1987): A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull, 19: 11-15. Edlund, A.F., R. Swanson, D. Preuss (2004): Pollen and stigma structure and function: the role of diversity in pollination. Plant Cell 16 Suppl: S84-97. Edwards, A., A. Civitello, H.A. Hammond, C.T. Caskey (1991): DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American Journal of Human Genetics 49: 746-756. Esen, A. (1987): A proposed nomenclature for the alcohol-soluble proteins (zeins) of maize (Zea mays L.). J. Cereal Sci. 5: 117. Gallusci, P., F. Salamini, R.D. Thompson (1994): Differences in cell typespecific expression of the gene Opaque 2 in maize and transgenic tobacco. Molecular and General Genetics 244: 391-400. 106 Ganal, M.W., G. Durstewitz, A. Polley, A. Berard, E.S. Buckler, A. Charcosset, J.D. Clarke, E. Graner, M. Hansen, J. Joets, M. le Paslier, M.D. McMullen, P. Montalent, M. Rose, C. Schon, Q. Sun, H. Walter, O.C. Martin, M. Falque (2011): A large maize (Zea mays L.) SNP genotyping array: Development and germplasm genotyping, and genetic mapping to compare with the B73 reference genome. PloS ONE 6(12): e28334. Gernach, D.I., C.C. Ariahu, E.K. Ingbian (2011): Effects of malting and lacting on some chemical and functional properties of maize (Zea mays). American Journal of Food Technology 6: 404-412. Gill, G. (2008): Quality protein maize and special purpose maize improvement. In Recent Advances in crop improvement CAS training at PAU from 05-25 Feb, 377-385. Glass, G.V. (1976): Primary, secondary, and meta-analysis of research. Educ Res 5:3–8. Gupta, P.K., S. Rustgi, N. Kumar (2006): Genetic and molecular basis of grain size and grain number and its relevance to grain productivity in higher plants. Genome 49: 565– 571. Gupta, H.S., P.K. Agrawal, V. Mahajan, G.S. Bisht, A. Kumar (2009): Quality protein maize for nutritional security: Rapid development of short duration hybrids through molecular marker assisted breeding. Curricul. Sci. 96: 230-237. Gupta, H.S., R. Babu, P.K. Agrawal, V. Mahajan, F. Hossain, N. Thirunavukkarasu (2013): Accelerated development of quality protein maize hybrid through marker- assisted introgression of opaque-2 allele. Plant Breed 118: 77-82. Hadživuković, S. (1991): Statistički metodi. Poljoprivredni fakultet, Novi Sad. 107 Hagiwara, A., K. Miyashita, T. Nakanishi, M. Sano, S. Tamano, T. Kadota, T. Koda, M. Nakamura, K. Iamaida, N. Ito, T. Shirai (2001): Pronounced inhibition by a natural anthocyanin, purple corn color, of 2-amino-16- phenylimidazol (4-5-b) pyridine (PhIP) associated colorectal carcinogenisis. Cancer Letters. 171: 17-25. Hao, Z., X. Li, X. Liu, C. Xie, M. Li, D. Zhang, S. Zhang (2010): Meta-analysis of constitutive and adaptive QTL for drought tolerance in maize. Euphytica 174: 165–177. Hartings, H., M. Maddaloni, N. Lazzaroni, N.D. Fonzo, M. Motto, F. Salamini, R. Thompson (1989): The O2 gene which regulates zein deposition in maize endosperm encodes a protein with structural homologies to transcriptional activators. EMBO Journal 8: 2795-2801. Hernandez, H.H., L.S. Bates (1969): A modified method for rapid tryptophan analysis in maize. CIMMYT Research Bulletin no. 13. Mexico, D.F.: CIMMYT. Herrero, M., A. Arbeloa (1989): Influence of the pistil on pollen tube kinetics in peach (Prunus persica). Am. J. Bot. 76: 1441-1447. Heslop-Harrison, J. (1975): Male gametophyte selection and the pollen stigma- interaction. In: Mulcahy, D. L. (ed.) Gamete Competition in Plants and Animals, North- Holland, Amsterdam, 177-190. Holding, D.R., B.A. Larkins (2006): The development and importance of zein protein bodies in maize endosperm. Maydica 51: 243-254. Holding, D.R., B.G. Hunter, T. Chung, B.C. Gibbon, C.F. Ford, A.K. Bharti, J. Messing, B.R. Hamaker, B.A. Larkins (2008): Genetic analysis of opaque2 modifier loci in quality protein maize. Theor. Appl. Genet. 117: 157-170. Hospital, F., C. Chevalet, P. Mulsant (1992): Using markers in gene introgression programs. Genetics 132: 1199-1210. 108 Huang, S.S., D.E. Kruger, A. Frizzi, R.L. D’Ordine, C.A. Florida, W.R. Adams, W.E. Brown, M.H. Luethy (2005): High-lysine corn produced by thecombination of enhanced lysine biosynthesis and reduced zein accumulation. Plant Biotechnol J 3: 555–569. Huang, S, A. Frizzi, C.A. Florida, D.E. Kruger, M.H. Luethy (2006): High lysine and high tryptophan transgenic maize resulting from the reduction of both 19- and 22-kD alpha-zeins. Plant Mol Biol 61: 525–535. Idikut, L., A.I. Atalay, S.N. Kara, A. Kamalak (2009): Effect of hybrid on starch, protein and yields of maize grain. J. Anim. Vet. Adv. 8:1945-1947. Ignjatović-Micić, D., K. Marković, D. Ristić, S. Mladenovic Drinić, S. Stanković, V. Lazić-Jančić, M. Denić (2009): Variability analysis of normal and opaque2 maize inbred lines. Genetika 41(1): 81-93. Ignjatović-Micić, D., G. Stanković, K. Marković, S. Mladenović Drinić, V. Lazić- Jančić, M. Denić (2010): Kernel modifications and tryptophan content in QPM segregating generations. Genetika, 42(2): 267-278. Ignjatović-Micić, D., M. Kostadinović, G. Stanković, K. Marković, J. Vančetović, S. Božinović, V. Anđelković (2013): Biochemical and agronomic performance of quality protein maize hybrids adapted to temperate regions. Maydica 58: 311-317. Ignjatović-Micić, D., J. Vančetović, D. Trbović, Z. Dumanović, M. Kostadinović, S. Božinović (2015): Grain nutrient composition of maize (Zea mays L.) drought-tolerant populations. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63: 1251-1260. Jompuk, P., W. Wongyai, C. Jampatong, S. Apisitvanich (2006): Detection of quality protein maize (QPM) using simple sequence repeat (SSR) markers and analysis of tryptophan content. Kasetsart J. (Nat.Sci.), 40: 768-774. 109 Jompuk, C., P. Cheuchart, P. Jompuk, S. Apisitwanich (2011): Improved tryptophan content in maize with opaque-2 gene using marker assisted selection (MAS) in backcross and selfing generations. Kasetsart J. (Nat.Sci.), 45: 666-674. Jones, D. F. (1928): Selective Fertilization. University of Chicago Press, Chicago. Kang, M., Q. Zhao, D. Zhu, J. Yu (2012): Characterization of microRNAs expression during maize seed development. BMC Genomics 13: 360. Kemper, E.L., G. Cord Neto, F. Papes, K.C. Martinez Moraes, A. Leite, P. Arruda (1999): The role of Opaque2 in the control of lysine-degrading activities in developing maize endosperm. Plant Cell 11: 1981-1993. Kirihara, J.A., J.B. Petri, J. Messing (1988): Isolation and sequence of a gene encoding a methionine-rich lO-kDa zein protein from maize. Gene 71:359. Kostadinović, M., D. Ignjatović-Micić, G. Stanković, J. Vancetović, D. Ristić, S. Mladenović Drinić (2014): Genetic and biochemical characterisation of parental inbred lines in marker assisted selection for quality protein maize. Genetika 46(2): 579-590. Krivanek, A.F., H.D. Groote, N.S. Gunaratna, A.O. Diallo, D. Friesen (2007): Breeding and Disseminating Quality Protein Maize (QPM) for Africa. African Journal of Biotechnology 6: 312-324. Kurilich, A.C., J.A. Juvik (1999): Quantification of carotenoid and tocopherol antioxidants in Zea mays. J. Food and Agric. Chem. 47: 1948-1955. Kutchan, T., R.A. Dixon (2005): Physiology and metabolism: Secondary metabolism: Natures chemical reservoir under deconvolution. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 227-229. Lago, C., M. Landoni, E. Cassani, E. Doria, E. Nielsen, R. Pilu, (2013): Study and characterization of a novel functional food: purple popcorn. Mol Breeding 31: 575-585. 110 Lago, C., M. Landoni, E. Cassani, S. Atanassiu, E. Cantaluppi, R. Pilu (2014): Development and characterization of a coloured sweet corn line as a new functional food. Maydica 59: 191-200. Lands, W.E.M. (2005): Dietary fat and health: the evidence and the politics of prevention: careful use of dietary fats can improve life and prevent disease. Annals of the New York Academy of Sciences 1055: 179-192. Larkins, B.A., C.R. Lending, J.C. Wallace, G. Galili, E.E. Kawata, K.B. Geetha, A.L. Kriz, D.N. Martin, C.E. Bracker (1989): Zein gene expression during maize endosperm development. In: The Molecular Basis of Plant Development. R. Goldberg, ed. Alan R. Liss: New York. 109-120. Larson, S. (2002): Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants. R.J. Henry (ed.), CABI Publishing, Oxford. Book review. Heredity 88: 220. Lee, E.A., W.F. Tracy (2009): Modern maize breeding. In: Bennetzen JL, Hake S (eds) Maize handbook - Volume II: Genetics and genomics, Springer Science and Business, New York: 142-160. Legesse, B.W., A.A. Myburg, K.V. Pixley, A.M. Botha (2007): Genetic diversity of African inbred lines revealed by SSR markers. Hereditas, 144: 10-17. Li, X.M., Y.L. Sang, X.Y. Zhao, X.S. Zhang (2013): High-throughput sequencing of small RNAs from pollen and silk and characterization of miRNAs as candidate factors involved in pollen-silk interactions in maize. PLoS One 8(8): e72852. Liu, K., M. Goodman, S. Muse (2003): Genetic structure and diversity among maize inbred lines as inferred from DNA microsatellites. Genetics, 165: 2117-2128. 111 Liu, X., H. Sun, P. Wu, Y. Tian, D. Cui, C. Xu, S. Li, P. Li, H. Zhang, T. Chen, D. Li, X. Zhao, Y. Zhang, Y. Xue, H. Chen (2014): Fine mapping of the maize cross- incompability locus Gametophytic factor 1 (ga1) using a homogeneous population. Crop Science 54(3): 873-881. Lohmer, S., M. Maddaloni, M. Motto, N. Difonzo, H. Hartings, F. Salamini, R.D. Thompson (1991): The maize regulatory locus Opaque-2 is inhibited by upstream open reading frames present in the leader sequence. Embo Journal 10: 617-624. Lopes, M. A., B.A. Larkins (1991): Gamma-zein content is related to endosperm modification in quality protein maize (QPM). Crop Science 31: 1655-1662. Lopes, M. A., B.A. Larkins (1995): Genetic analysis of opaque2 modifier gene activity in maize endosperm. Theoretical and Applied Genetics 119(5): 274-281. Lopes, M.A., K. Takasaki, D.E. Bostwick, T. Helentjaris, B.A. Larkins (1995): Identification of two opaque2 modifier loci in quality protein maize. Molecular and General Genetics 247(5): 603-13. Lopez-Martinez, L.X., R.M. Oliart-Ros, G. Valerio-Alfaro, C.H. Lee, K.L. Parkin, H.S. Garcia (2009): Antioxidant activity, phenolic compounds and anthocyanins content of eighteen strains of Mexican maize. Food Science and Technology, 42: 1187–1192. Ma, Y., O.E. Nelson (1975): Amino acid composition and storage proteins in two new high-lysine mutants in maize. Cereal Chemistry 52: 412-419. Maddaloni, M., G. Donini, C. Balconi, E. Rizzi, P. Gallusci, F. Forlani, S. Lohmer, R. Thompson, F. Salamini, M. Motto (1996): The transcriptional activator Opaque-2 controls the expression of a cytosolic form of pyruvate orthophosphate dikinase-1 in maize endosperms. Molecular and General Genetics 250: 647-654. 112 Mantel, N. (1967): The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research 27: 209-220. Maphosa, M., G. Oballim, A. Nalukenge, R. Edema, P. Okori (2011): Feasibilty of zein proteins, simple sequence repeats and phenotypic traits for background selection in quality protein maize breeding. African Crop Science Journal, 19 (2): 65-78. Matsuoka, Y, Y. Vigouroux, M.M. Goodman, G.J. Sanchez, E. Buckler, J. Doeblry (2002): A single domestication for maize shown by multilocus microsatellite genotyping. Proc Natl Acad Sci USA 99: 6080-6084. Mbuya, K., K.K. Nkogolo, A. Kalonji-Mbuyi (2011): Nutritional analysis of quality protein maize varieties selected for agronomic characteristics in a breeding program. Int J Plant Breed Genet, 5: 317-327. McWhirter, K. S., (1971): A floury endosperm, high lysine locus on chromosome 10. Maize Genet. Coop. Newsletter 45: 184. Mertz, E.T., L.S. Bates, O.E. Nelson (1964): Science, 145: 279-280. Messmer, R., Y. Fracheboud, M. Banziger, M. Vargas, P. Stamp, J.M. Ribaut (2009): Drought stress and tropical maize: QTL-by-environment interactions and stability of QTLs across environments for yield components and secondary traits. Theor. Appl. Genet. 119: 913-930. Mladenović Drinić, S., M. Kostadinović, D. Ristić, M. Stevanović, Z. Čamdžija, M. Filipović, D. Kovačević (2012): Correlation of yield and heterosis of maize hybrids and their parental lines with genetic distance based on SSR markers. Genetika, 44(2): 399- 408. 113 Morgante, M., M. Hanafey, W. Powell (2002): Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nature Genet 3: 194-200. Mosisa, W. (2005): Genetic and crop-physiological basis of nitrogen efficiency in tropical maize: Field Studies, PhD Dissertation, University of Hannover, Hannover, Germany. Mosisa, W., M. Bänziger, D. Friesen, G.S.A. Erley, O.D. Alpha, B. Vivek, W.J. Horst (2007): Protein quantity and quality, and grain yield perfor-mance of quality protein maize and normal endosperm maize under diffe-rent levels of nitrogen. Afr. Crop Sci. Conf. Proceed. 8: 1905-1909. Mosisa, W., M. Banziger, D. Friesen, G. Schulte auf’ m Erley, W.J. Horst, B.S. Vivek (2008): Relative importance of general combining ability and specific combining ability among tropical maize (Zea mays L.) inbreds under contrasting nitrogen environments. Maydica 53: 279-288. Motto, M., M. Maddaloni, G. Ponziani, M. Brembilla, R. Marotta, N. di Fonzo, C. Soave, R. Thompson, F. Salamini (1988): Molecular cloning of the o2-m5 allele of Zea Mays using transposon marking. Mol Gen Genet 212: 488-494. Mulcahy, D.L., (1971): A correlation between gametophytic and sporophytic characteristics in Zea mays L. Science, 171: 1155—1156. Muthusamy, V., F. Hossain, N. Thirunavukkarasu, M. Choudhary, S. Saha, J.S. Bhat, M.B. Prassana, H.S. Gupta (2014): Development of β-carotene rich maize hybrids through marker-assisted introgression of β-carotene hydroxylase allele. PLoS ONE 9(12): e113583. doi:10.1371/journal.pone.0113583. Nelson, O. (1952): Non reciprocal cross sterility in maize. Genetics 37:101-124. 114 Nelson, O. E., E. T. Mertz, L. S. Bates (1965): Second mutant gene affecting the amino acid pattern of maize endosperm proteins. Science 150: 1469–1470. Nelson, O.E. (1994): The Gametophyte Factors of Maize. In: Freeling, M. Walbot, V. (eds) The Maize Handbook, 496-502. Springer, New York. Nurit, E., A. Tiessen, K. Pixley, N. Palacios-Rojas (2009): Reliable and inexpensive colorimetric method for determining protein-bound tryptophan in maize kernels. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57: 7233-7238. Ortega, E.I., L.S., Bates (1983): Biochemical and agronomic studies of 2 modified hard- endosperm opaque-2 maize (Zea mays L) populations. Cereal Chem. 60: 107–111. Ortiz, R., S. Taba, V.H. Chávez Tovar, M. Mezzalama, Y. Xu, J. Yan, J.H. Crouch (2010): Conserving and enhancing maize genetic resources as global public goods – a perspective from CIMMYT. Crop Sci. 50: 13–28. Ostlund Jr, R. E., S.B. Racette, A. Okeke, W.F. Stenson (2002): Phytosterols that are naturally present in commercial corn oil significantly reduce cholesterol absorption in humans. The American Journal of Clinical Nutrition 75: 1000-1004. Ottaviano, E., M. Sari-Gorla (1979): Genetic variability of male gametophyte in maize. Pollen genotype and pollen-style interaction. In: Israeli-Italian Joint Meeting. Genetics and Breeding in Crop Plants. Monographs in Genetic Agraria IV Rome: 89-106. Ottaviano, E., M. Sari-Gorla, D.L. Mulcahy (1980): Pollen tube growth rates in Zea mays: implications for genetic improvement of crops. Science 210: 437-438. Ottaviano, E., M. Sari-Gorla, I. Arenari (1983): Male gametophyte competitive ability in maize. Selection and implications with regard to the breeding system. In: Mulcahy, D.L. and Ottaviano, E. (eds) Pollen: Biology and Implications for Plant Breeding, Elsevier, New York: 367-373. 115 Ottaviano, E., M. Sari-Gorla, M. Villa (1988): Pollen competitive ability in maize: within population variability and response to selection. Theor. Appl. Genet. 76: 601- 608. Paez, A.V., J.L. Helm, M.S. Zuber (1969): Lysine content of opaque2 maize kernels having different phenotyps. Crop Sci. 29: 251-252. Peng, T., H. Sun, Y. Du, J. Zhang, J. Li, et al. (2013): Characterization and expression patterns of microRNAs involved in rice grain filling. PLoS One 8: e54148. Pfahler, P.L., (1967): Fertilization ability of maize pollen grains. II Pollen genotype, female sporophyte and pollen storage interaction. Genetics, 57: 513-521. Pixley, K.V., M.S. Bjarnason (2002): Stability of grain yield, endosperm modification, and protein quality of hybrid and open-pollinated quality protein maize (QPM) cultivars. Crop Sci. 42: 1882-1890. Prakash, O., P. Shanti, E. Satyanarayana, R.S. Kumar (2006): Studies on inter relationship and path analysis for yield improvement in sweet corn (Zea mays L.). New Bot. 33: 91-98. Prassana, B.M., S.K. Vasal, B. Kassahun, N.N. Singh, (2001): Quality protein maize. Curr. Sci. 81(10): 1308-1319. Qin, Y., A.R. Leydon, A. Manziello, R. Pandey, D. Mount et al. (2009): Penetration of the stigma and style elicits a novel transcriptome in pollen tubes, pointing to genes critical for growth in a pistil. PLoS Genet 5: e1000621. Radić, D. (1872): Sve o kukuruzu. Društvo za poljsku privredu, Beograd 116 Rasco´n-Cruz, Q., S. Sinagawa-Garcı´a, J.A. Osuna-Castro, N. Bohorova, O. Paredes- Lo´pez (2004): Accumulation, assembly, and digestibility of amarantin expressed in transgenic tropical maize. Theor. Appl.Genet. 108: 335-342. Reddy, Y.R., D. Ravi, C.R. Reddy, K.V.S.V. Prasad, P.H. Zaidi, M.T. Vinayan, M. Blummel (2013): A note on the correlations between maize grain and maize stover quantitative and qualitative traits and the implications for whole maize plant optimisation. Field Crops Research 153: 63-69. Ribaut, J.M., D.A. Hoisington (1998): Marker assisted selection: new tools and strategies. Trends Plant Sci. 3: 236-239. Rohlf, F.J. (2000): NTSYS-pc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System version 2.1. Owner’s manual. Rogers, S.O., A.J. Bendich (1988): Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual A6: l-10. Rong, J., F.A. Feltus, V.N. Waghmare, G.J. Pierce, P.W. Chee, X. Draye, Y. Saranga, R.J. Wright, T.A. Wilkins, O.L. May, C.W. Smith, J.R. Gannaway, J.F. Wendel, A.H. Paterson (2007): Meta-analysis of polyploidy cotton QTL shows unequal contributions of subgenomes to a complex network of genes and gene clusters implicated in lint fiber development. Genetics 176: 2577–2588. Rosengrant, M., C. Ringler, S. Msangi, T. Sulser, T. Zhu, S. Cline (2008): International Model for Policy Analysis of Agricultural Commodities and Trade (IMPACT): Model Description, International Food Research Institute: Washington, D.C. Sang, Y.L., M. Xu, F.F. Ma, H. Chen, X.H. Xu et al. (2012): Comparative proteomic analysis reveals similar and distinct features of proteins in dry and wet stigmas. Proteomics 12: 1983–1998. 117 Sari-Gorla, M., R. Bellintani, E. Ottaviano (1976): Competitive ability of maize pollen. Interaction between genotypes of pollen and stylar tissues. Maydica, 21: 77-88. Sari-Gorla, M., E. Rovida (1980): Competitive ability of maize pollen. Intergametophytic effects. Theor. Appl. Genet. 57: 37-41. Sari-Gorla, M., G. Binelli, M.E. Pe, M. Villa (1995): Detection of genetic factors controlling pollen-style interaction in maize. Heredity 74: 62-69. Schgiwietzke, S., Y. Kim, E. Ximenez, N. Mosier, M. Ladisch (2008): Ethanol production from maize. Molecular Genetic Approaches to Maize Improvement (book), part VI: 347-364. Schmidt, R.J., F.A. Burr, B. Burr (1987): Transposon tagging and molecular analysis of the maize regulatory locus opaque-2. Science 238(4829): 960–963. Schmidt, R.J., F.A. Burr, M.J. Aukerman, B. Burr (1990): Maize regulatory gene opaque-2 encodes a protein with a “leucine-zipper” motif that binds to zein DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87: 46-50. Schmidt, R.J., M. Ketudat, M.J. Aukerman, G. Hoschek (1992): Opaque-2 is a transcriptional activator that recognizes a specific target site in 22-kD zein genes. Plant Cell 4: 689-700. Schnable, P.S., D. Ware, R.S. Fulton i sar. (2009): The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science 326 (5956): 1112-1115. Segal, G., R.T. Song, J. Messing (2003): A new opaque variant of maize by a single dominant RNA-interference-inducing transgene. Genetics 165: 387–397. 118 Selvaraj, C.I., P. Nagarajan (2011): Interrelationship and path-coefficient studies for qualitative traits, grain yield and other yield attributes among maize (Zea mays L.). International Journal of Plant Breeding and Genetics 5 (3): 209-223. Senior, M.L., J.P. Murphy, M.M. Goodman, C.W. Stuber (1998): Utility of SSRs for determining genetic similarities and relationships in maize using an agarose gel system. Crop Sci 38: 1088-1098. Sharp, P.J., S. Johnston, G. Brown, R.A. McIntosh, M. Pallotta, M. Carter, H.S. Bariana, S. Khartkar, E.S. Lagudah, R.P. Singh, M. Khairallah, R. Potter, M.G.K. Jones (2001): Validation of molecular markers for wheat breeding. Aust. J. Agric. Res. 52: 1357–1366. Shewry, P.R. (2007): Improving the protein content and composition of cereal grain. Journal of Cereal Science 46: 239-250 Shewry., P.R., N.G. Halford (2002): Cereal seed storage proteins: stuctures, properties and role in grain utilization. Journal of Experimental Botany 53 (370): 947-958. Shi, J., H. Wang, Y. Wu, J. Hazebroek, R.B. Meeley, D.S. Ertl (2003): The maize low- phytic acid mutant lpa2 is caused by mutation in an inositol phosphate kinase gene. Plant Physiol. 131: 507-515. Smith, J.S.C. (1987): Gene Markers and Their Uses in the Conservation, Evaluation and Utilization of Genetic Resources of Maize (Zea mays L.). International Training Session on Scientific Management of Gene Banks, Raleigh, N.C. Smith, D.N., M.E. Devey (1994): Occurrence and inheritance of microsatellites in Pinus radia. Genome 37: 977–983. 119 Smith, J.S.C., E.C.L Chin., H. Shu, O.S. Smith, S.J. Wall, M.L. Senior, S.E Mitchell., S. Kresovich, J. Ziegle (1997): An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea mays L.) comparisons with data from RFLPs and pedigree. Theor Appl Genet 95: 163–173. Sneath, P.H.A., R.R. Sokal (1973): Numerical taxonomy. W.H. Freeman and Company, San Francisco. Sofi, P.A., S.A. Wani, A.G. Rather, S.H. Wani (2009): Review article: Quality protein maize (QPM): genetic manipulation for the nutritional fortification of maize. J. Plant Breed. Crop Sci. 1(6): 244-253. Song, R., G. Segal, J. Messing (2004): Expression of the sorghum 10-kDamember kafirin gene cluster in maize endosperm. Nuc. Acid. Res.32(22): e189 doi:10.1093/nar/gnh183 Sunnucks, P. (2000): Efficient genetic markers for population biology. Trends Ecol. Evol. 15: 199-203. Takayama, S., A. Isogai (2005): Self-incompatibility in plants. Annu Rev Plant Biol 56: 467-489. Tamilkumar, P., N. Senthil, S. Suseshkumar, A.U. Thangavelu, P. Nagarajan, S. Vellaikumar, K.N. Ganesan, N. Natarajan, R. Balagopal, T. Nepolean, M. Raveendran (2014): Introgression of low phytic acid locus (lpa2-2) into an elite Maize (Zea mays L.) inbred through marker assisted backcross breeding. Australian Journal of Crop Science 8(8): 1224-1231. Tanksley, S.D. (1983): Molecular markers in plant breeding. Plant Mol Biol Rep 1: 3-8. Temple, N.J. (2000): Antioxidants and disease: More questions than answers. Nutrition Research 20: 449-459. 120 Tenaillon, M.I., M.C. Sawkins, A.D. Long, R.L. Gaut, J.F. Doebley, B.S. Gaut (2001): Patterns of DNA sequence polymorphism along chromosome 1 of maize (Zea mays ssp. mays L.). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9161–9166. Tengan, K.M.L. (2010): Conversion of Okomasa-a normal open pollinated maize variety to quality protein maize using the backcross breeding approach, MSc Thesis, Kwame Nkrumah University of Science and Technology, Kumasi. Thompson, G.A., B.A. Larkins (1989): Structural elements regulating zein gene expression. BioEssays 10: 108. Torrent, M., I. Alvarez, M.I. Geli, I. Dalcol, D. Ludevid (1997): Lysine-rich mediated zeins accumulate in protein bodies of transiently transformed maize endosperms. Plant Mol. Biol. 34: 139-149. Torney, F., L. Moeller, A. Scarpa, K. Wang (2007): Genetic engineering approaches to improve bioethanol production from maize. Curr. Opin. Biotechnol. 18: 193-199. Trifunović, V. (1978): Maize production and maize breeding in Europe. in: Walden D.B. (ur.) Maize Breeding and Genetics, New York: Wiley: 41-57. Vasal, S.K. (2000): The quality protein maize story. Food Nutr. Bull. 21: 445–450. Vasal, S.K. (2001): High quality protein corn. In: Hallauer AR (ed) specialty corns. CRC Press, New York, 85-129. Villegas, E., S.K. Vasal, M. Bjarnason (1992): Quality protein maize - what is it and how was it developed. In: E.T. Mertz (Ed.), Quality protein maize. Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul, MN: 27-48. 121 Vivek, B.S., A.F. Krivanek, N. Palacios-Rojas, S. Twumasi-Afriyie, A.O. Diallo (2008): Breeding Quality Protein Maize (QPM): Protocols for Developing QPM Cultivars. Mexico, D.F.: CIMMYT. Vosman, B., P. Arens, W. Rus-Kortekaas, M.J.M. Smulders (1992): Identification of highly polymorphic DNA regions in tomato. Theor. Appl. Genet. 85: 239-244. Vroh Bi, I., M.D. McMullen, H.S. Villeda, S. Schroeder, J. Gardiner, M. Polacco, C. Soderlund, R. Wing, Z. Fang, E.H. Coe (2006): Singlenucleotide polymorphisms and insertion-deletions for genetic markers and anchoring the maize fingerprint contig physical map. Crop Sci 46: 12–21. Vučić, N. (1976): Navodnjavanja poljoprivrednih kultura. Poljoprivredni fakultet, Novi Sad. Wallace, J.C., G. Galili, E.E. Kawata, R.E. Cuellar, B.A. Shotwell, B.A. Larkins (1988): Aggregation of lysine-containing zeins into protein bodies in Xenopus oocytes. Science 240: 662–664. Wallace, J.C., M.A. Lopes, E. Paiva, B.A. Larkins (1990): New methods for extraction and quantitation of zeins reveal a high content of gamma-Zein in modified opaque-2 maize. Plant Physiology 92(1): 191-196. Wang, X., B.A. Larkins (2001): Genetic analysis of amino acid accumulation in opaque-2 maize endosperm. Plant Physiol. 125: 1766—1777. Wang, Y., Y. Ji, Z. Zhang, Y. Zheng (2006): The comparative analysis based on maize integrated QTL map and metaanalysis of plant height QTLs. Chin Sci Bull 51: 2219– 2230. 122 Warburton, M.L., X. Zianchun, J. Crossa, J. Franco, A.E. Melchinger, M. Frisch, M. Bohn, D. Hoisington (2002): Genetic characterization of CIMMYT inbred maize lines and open pollinated populations using large scale fingerprinting methods. Crop Sci, 42: 1832-1840. Watson, S. A. (2003): Description, development, structure and composition of the corn kernel. In Corn: Chemistry and Technology, 2nd ed.; White, J., Johnson, L., Eds.; American Association of Cereal Chemists: St. Paul, MN: 69−101. Weising, K., H. Nybom, K. Wolff, G. Kahl (2005): DNA fingerprinting in plants: principles, methods and applications, 2nd edn. Boca Raton. CRC Press. Welch, R.M., R.D. Graham (2004): Breeding for micronutrients in staple food crops from a human nutrition perspective. Journal of Experimental Botany 55: 353-364. Wu, R.L., X.Y. Lou, C.X. Ma, X.L. Wang, B.A. Larkins, G. Casella (2002): An improved genetic model generates high-resolution mapping of QTL for protein quality in maize endosperm. Proc Natl Acad Sci USA 99: 11281-11286. Xu, Y., D.J. Skinner, H. Wu, N. Palacios-Rojas, J.L. Araus, J. Yan, S. Gao, M.L.Warburton, J.H. Crouch (2009): Advances in maize genomics and their value for enhancing genetic gains from breeding. International Journal of Plant Genomics 2009: Article ID 957602 (doi:10.1155/2009/957602). Xu, X.H., H. Chen, Y.L. Sang, F. Wang, J.P. Ma et al. (2012): Identification of genes specifically or preferentially expressed in maize silk reveals similarity and diversity in transcript abundance of different dry stigmas. BMC Genomics 13: 294. Yang, J., X. Liu, B. Xu, N. Zhao, X. Yang et al. (2013): Identification of miRNAs and their targets using high-throughput sequencing and degradome analysis in cytoplasmic male-sterile and its maintainer fertile lines of brassica juncea. BMC Genomics 14: 9. 123 Young, H. (1992): Environmental effects on pollen characters and paternity. In: Ottaviano, E., Mulcahy, D. L. and Sari- Gorla, M. (eds) Angiosperm Pollen and Ovules. Basic and Applied Aspects. Springer-Verlag, Berlin. Young, N.D. (1999): A Cautiously Optimistic Vision for Marker Assisted Breeding. Mol. Breed. 5: 505-510. Yu, J., P. Peng, X. Zhang, Q. Zhao, D. Zhy, X. Sun, J. Liu, G. Ao (2004): Seed-specific expression of a lysine rich protein sb401 genesignificantly increases both lysine and total protein content in maizeseeds. Mol. Breed. 14: 1-7. Zaidi, P.H., S.K. Vasal, P. Maniselvan, G.C. Jha, K. Mehrajjudin, R.P. Singh, (2008): Stability in performance of quality protein maize under abiotic stress. Maydica 53: 249- 260. Zhang, W.L., W.P.Yang, Z.W. Chen, M.C. Wang, L.Q. Yang, Y.L. Cai (2010): Molecular marker-assisted selection for o2 introgression lines with o16 gene in corn. Acta Agronomica Sinica 36(8): 1302-1309. Zhang, X, W.H. Pfeiffer, N. Palacios-Rojas, R. Babu, H. Bouis, J. Wang (2012): Probability of success of breeding strategies for improving pro-vitamin A content in maize. Theor Appl Genet. 125: 235-246. Žilić, S., D. Dodig, M. Milašinović Šeremešić, V. Kandić, M. Kostadinović, S. Prodanović, Đ. Savić (2011): Small grain cereals compared for dietary fibre and protein content. Genetika 43(2): 381-395. BIOGRAFIJA Marija Kostadinović je rođena 25.05.1980. godine u Beogradu, gde je završila osnovnu školu i gimnaziju. Diplomirala je 2008. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, sa prosečnom ocenom 8,74. Doktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, studijski program Biologija, modul Genetika, upisala je 2010. godine, a ispite predviđene programom za doktorske studije je položila sa prosečnom ocenom 9,8. U Institutu za kukuruz „Zemun Polje“ (Laboratorija za biotehnologiju) počinje volonterski rad 2009. godine. Od 2011. godine angažovana je na projektu „Poboljšanje svojstava kukuruza i soje molekularnim i konvencionalnim metodama“ finansiranim od strane Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja RS kao mlađi istraživač, a od 2012. godine kao istraživač saradnik u Laboratoriji za biotehnologiju. Osnovnu istraživačku aktivnost razvija u oblasti molekularne genetike biljaka koja se odnosi na proučavanje strukture i funkcije genoma kukuruza. Primarno se bavi selekcijom kukuruza na poboljšanje kvaliteta proteina upotrebom molekularnih markera, kao i genetičkom karakterizacijom linija, hibrida i populacija kukuruza banke gena Instituta za kukuruz „Zemun Polje“ i biohemijskim ispitivanjem kvaliteta zrna. Uključena je i u utvrđivanje divergentnosti različitih vrsta šumskog drveća pomoću molekularnih markera, kao i u karakterizaciju korovskih biljnih vrsta. Član je Društva genetičara Srbije i Društva selekcionara i semenara Srbije. Rezultate svojih istraživanja objavila je u 12 naučnih radova publikovanih u domaćim i međunarodnim časopisima, kao i u 24 naučnih saopštenja.