УНИВЕРЗИТЕТ У НИШУ МЕДИЦИНСКИ ФАКУЛТЕТ Гордана (Д) Петровић, спец. др мед. КЛИНИЧКО-БИОХЕМИЈСКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ НЕАЛКОХОЛНЕ МАСНЕ БОЛЕСТИ ЈЕТРЕ КАО МАНИФЕСТАЦИЈЕ МЕТАБОЛИЧКОГ СИНДРОМА ДОКТОРСКА ДИСЕРТАЦИЈА Ниш, 2016. година UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF MEDICINE Gordana (D) Petrović, spec. dr med. CLINICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE AS MANIFEASTATIONS OF METABOLIC SYNDROME DOCTORAL DISSERTATION Niš, 2016. godina Посебну захвалност изражавам ментору проф. др Горану Бјелаковићу на уложеном труду, времену и сугестијама које су имале пресудан утицај на квалитет и садржај докторске дисертације. Захваљујем председнику комисије проф. др Александру Нагорном на корисним сугестијама и добронамерним саветима. Проф. др Татјани Јевтовић Стоименов и проф. др Драгану Михаиловићу дугујем изузетну захвалност на практичној помоћи у екcперименталном делу ове дисертације. Захваљујем проф. др Петру Сворцану на смерницама датим у току писања докторске дисертације. Захваљујем колективу Хрватског ветеринарског института на указаном гостопримству и подршци у току експерименталног дела рада на докторској дисертацији. Захваљујем се колегама са Клинике за гастроентерологију и хепатологију, КЦ Ниш на практичној помоћи у клиничком и екcперименталном делу рада. Захваљујем својој породици и родитељима, који су увек веровали у мене и мој рад. Гордана Петровић Подаци о докторској дисертацији Ментор: Проф. др Горан Бјелаковић, субспецијалиста гастроентерологије и хепатологије, Универзитет у Нишу, Медицински факултет Наслов: Клиничко-биохемијске карактеристике неалкохолне масне болести јетре као манифестације метаболичког синдрома Резиме: Увод. Неалкохолна масна болест јетре (NAFLD) је хронично обољење јетре, које карактерише акумулација триглицерида у више од 5 % хепатоцита у одсуству конзумирања алкохола у количинама штетним за јетру. Циљеви. Утврдити клиничке и биохемијске карактеристике пацијената са NAFLD; утврдити удруженост полиморфизма I148M PNPLA3 гена са развојем NAFLD. Пацијенти и методе. Истраживањем је обухваћено 55 пацијената, код којих је на основу анамнестичких података, антропометријских мерења, биохемијских анализа крви и ултразвучног (UZ) прегледа абдомена постављена дијагноза NAFLD и метаболичког синдрома (MS). Контролну групу је чинио 31 здрав испитаник. Биопсија јетре је извршена код 16 пацијената. Мерење концентрације цитокератина-18 (CK-18) у крвној плазми извршено је имуноензимским тестом. За детекцију полиморфизма PNPLA3 rs738409 користили смо молекуларну PCR-RFLP методу. Резултати. Пацијенти са NAFLD статистички су имали сигнификантно више средње вредности AST, ALT, GGT, CRP, феритина, фибриногена, гликемије наште, инсулина и HOMA- IR (p<0,001), LDL холестерола (p<0,05), док је вредност HDL холестерола била виша у контролној групи (p<0,05). У NAFLD групи је статистички сигнификантно била заступљенија хипертензија, DM тип 2, MS и гојазност у односу на контролну групу (p<0,001). Метаболички синдром је статистички био заступљенији код пацијената са UZ налазом масне јетре II и III степена (p<0,01) у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена, као и гојазност, хипертензија и DM тип 2 (p<0,05). Униваријантна логистичка регресиона анализа је утврдила да MS статистички значајно (p<0,001) повећава вероватноћу појаве NAFLD. Највиша средња вредност CK-18 у плазми утврђена је код пацијената са NASH и она је статистички била виша у односу на групу пацијента са обичном стеатозом (p<0,05). Пацијенти са NAFLD, хомозиготи за полиморфни G алел PNPLA3 гена, имали су статистички сигнификантно више средње вредности нивоа AST и ALT у односу на носиоце нормалног алела (p<0,05). Закључак. Неалкохолна масна болест јетре је хепатична манифестација метаболичког синдрома. PNPLA3 I148M полиморфизам је предиспонирајући фактор за развој NAFLD. Научна област: Медицина, интерна медицина Научна дисциплина: Гастроентерологија са хепатологијом Кључне речи: неалкохолна масна болест јетре, метаболички синдром, цитокератин-18, полиморфизам PNPLA3 гена УДК: 616.36-008.6-071 ЦЕРИФ класификација: B 550, Гастроентерологија Тип лиценце Креативне заједнице: CC BY-NC-ND Data on Doctoral Dissertation Doctoral Supervisor: Proffesor Goran Bjelaković, gastroenterologist, University of Niš, Faculty of medicine Title: Clinical and biochemical characteristics of non-alcoholic fatty liver disease as manifeastations of metabolic syndrome Abstract: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a chronic liver disease, characterized by the accumulation of triglycerides in more than 5% of hepatocytes in the absence of alcohol intake harmful to the liver. The aims of the study were to determine the clinical and biochemical characteristics of patients with NAFLD, to establish the association between polymorphism of the I148M variant in the PNPLA3 gene and NAFLD. The study encompassed 55 patients, who were diagnosed with NAFLD and metabolic syndrome (MS), based on anamnestic data, anthropometric measurements, blood test results, and abdominal ultrasound. The control group included 31 healthy participants. Liver biopsy was performed in 16 patients. Measuring of CK-18 concentration in blood plasma was done by ELISA. For the detection of the PNPLA3 rs738409 polymorphism, we used a PCR-RFLP method. The patients with NAFLD had statistically significantly higher mean values of AST, ALT, GGT, triglycerides, urates, CRP, ferritin, FBG, insulin, HOMA-IR (p<0.001), LDL (p<0.05), whereas the levels of HDL were higher in the control group (p<0.05). MS as well as obesity, hypertension, and type 2 DM were statistically more present in patients with NAFLD comared to the control group (p<0.001) and in patients with grade 2 and 3 ultrasound findings fatty liver in relation to grade 1 (p<0.05). A univariate logistic regression analysis showed that MS statistically significantly (p<0.001) increases the probability of the occurrence of NAFLD. The highest mean value of plasma CK-18 was found in patients with NASH, and it was statistically higher with regard to patients with common steatosis (p<0.05) Patients with NAFLD, homozygotes for the G allele PNPLA3 gene polymorphism, had statistically significantly higher activities of AST and ALT compared to the carriers of a normal allele (p<0.05). NAFLD is the hepatic manifestation of MS. PNPLA3 I148M polymorphism is a predisposing factor for the development of NAFLD. Scientific Field: Medical science, internal medicine Scientific Discipline: Gastroenterology and hepatology Key Words: non-alcoholic fatty liver disease, metabolic syndrome, cytokeratin 18, PNPLA3 gene polymorphism UDC: 616.36-008.6-071 CERIF Classification: B 550, Gastroenterology Creative Commons License Type: CC BY-NC-ND Садржај 1. Увод .......................................................................................................... 1 2. Преглед литературе ................................................................................. 4 2.1. Дефиниција и подела неалкохолне масне болести јетре ..................... 4 2.2. Епидемиологија NAFLD ......................................................................... 5 2.3 Етиологија NAFLD ................................................................................. 8 2.3.1 Ризични фактори ..................................................................................... 8 2.3.1.1. NAFLD и гојазност .................................................................................. 8 2.3.1.2. NAFLD и дијабетес ................................................................................. 10 2.3.1.3. NAFLD и метаболички синдром ............................................................ 12 2.4. Патогенеза NAFLD ................................................................................. 18 2.4.1. Теорија „два ударца“ ............................................................................... 19 2.4.2. Инсулинска резистенција ....................................................................... 19 2.4.3. Липидна акумулација, стеатоза јетре .................................................... 20 2.4.4. Инфламација, стеатохепатитис .............................................................. 20 2.4.4.1. Цитокини .................................................................................................. 20 2.4.4.2. Адипокини ............................................................................................... 22 2.4.4.3. Оксидативни стрес и митохондријална дисфункција .......................... 23 2.4.4.4. Апоптоза хепатоцита .............................................................................. 24 2.4.4.5. Ендоплазматски ретикулум стрес и раст бактерија ............................. 24 2.4.5. Генетска предиспозиција ........................................................................ 25 2.4.5.1. Patatin like phospolipase domain conteining -3 ген (PNPLA3) .............. 25 2.5. Клиничке манифестације и лабораторијски налази ............................. 27 2.6. Дијагноза NAFLD .................................................................................... 29 2.7. Патохистолошке карактеристике NAFL и NASH ................................ 36 2.8. Природни ток болести и прогноза ......................................................... 41 2.9. Терапија NAFLD ..................................................................................... 44 2.9.1. Промена животних навика ..................................................................... 44 2.9.2. Фармакотерапија NAFLD ....................................................................... 45 2.9.2.1. Метформин и тиазолидини .................................................................... 46 2.9.2.2. Витамин Е ................................................................................................ 48 2.9.2.3. Хиполипемици ......................................................................................... 49 2.9.2.4. Омега-3 масне киселине и урсодезоксихолна киселина ..................... 50 3. Научна хипотеза ...................................................................................... 51 4. Циљеви истраживања ............................................................................. 53 5. Пацијенти и методе рада ........................................................................ 54 5.1. Опрема коришћена у истраживању ....................................................... 55 5.2. Методе рада ............................................................................................. 56 5.2.1. Антропометријска мерења ..................................................................... 57 5.2.1.1. Индекс телесне масе, body mass index-BMI .......................................... 57 5.2.2. Мерење крвног притиска ........................................................................ 57 5.2.3. Биохемијске анализе крви ...................................................................... 58 5.2.4. Присуство метаболичког синдрома ....................................................... 58 5.2.5. Допунске анализе .................................................................................... 59 5.2.6. Ултразвук ................................................................................................. 59 5.2.7. Биопсија јетре .......................................................................................... 60 5.2.8. Патохистолошка анализа ........................................................................ 60 5.2.9. Квантитативно мерење цитокератина 18 у крвној плазми .................. 61 5.2.10. Молекуларна дијагностика ..................................................................... 63 5.2.10.1. Екстракција DNK .................................................................................... 64 5.2.10.2. PCR-RFLP метода за дијагностику полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) ................................................................................. 65 5.2.10.3. Визуелизација продукта умножавања DNK ......................................... 66 5.2.10.4. Детекција полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) .................... 67 5.2.11. Статистичка обрада резултата ............................................................... 68 6. Резултати .................................................................................................. 69 6.1. Демографски параметри пацијената студијске (NAFLD) и контролне групе ....................................................................................... 69 6.2. Антропометријски параметри пацијената NAFLD и контролне групе ......................................................................................................... 69 6.3. Клинички и биохемијски параметри пацијената NAFLD и контролне групе ....................................................................................... 71 6.3.1. Клинички параметри пацијената NAFLD и контролне групе ............ 71 6.3.2. Биохемијски параметри пацијената NAFLD и контролне групе ........ 72 6.4. Заступљеност метаболичког синдрома код пацијената NAFLD и контролне групе ....................................................................................... 74 6.5. Предиктори појаве NAFLD..................................................................... 76 6.6. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на присуство метаболичког синдрома .................................................................................................. 78 6.7. Демографкси, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на BMI .......................................... 80 6.8. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на присуство дијабетес мелитус тип 2 .......................................................................................................... 82 6.9. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на вредност NAFLD фиброзниог скора ......................................................................................................... 85 6.10. Резултати ултразвучног прегледа јетре ................................................ 90 6.10.1. Предиктори ултразвучног налаза масне јетре ......................................... 96 6.10.1.1 Резултати униваријантне логистичке регресионе анализе ....................... 96 6.11. Патохистолошка анализа биопсијских узорака пацијената NAFLD групе ......................................................................................................... 99 6.12. Квантитативно мерење цитокератина 18 у крвној плазми .................. 104 6.12.1. ROC анализа предиктивних вредности CK-18 у процени присуства NASH у NAFLD групи биопсираних пацијената ................................. 111 6.13. Резултати молекуларног испитивања, доказ полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) ................................................................. 114 7. Дискусија ................................................................................................. 121 8. Закључак .................................................................................................. 144 9. Литература ............................................................................................... 150 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 1 1. УВОД Неалкохолна масна болест јетре (NAFLD, енгл. Non-alcoholic Fatty Liver Disease) је хронично обољење јетре, широког хистолошког спектра, почев од обичне стеатозе јетре, до прогресивних форми болести као што су неалкохолни стеатохепатитис (NASH, енгл. Non-alcoholic Steatohepatitis), цироза јетре и хепатоцелуларни карцином (HCC, engl. hepatocellular carcinoma). Стеатоза јетре је бенигно, непрогресивно обољење које карактерише акумулација триглицерида (TG) у више од 5% хепатоцита, у одсуству конзумирања алкохола у количинама штетним за јетру. Са друге стране, неалкохолни стеатохепатитис се карактерише стеатозом и некроинфламаторном активношћу, са или без придружене перивенуларне фиброзе. Неалкохолна масна болест јетре је најчешћа хронична болест јетре у западним земљама и најчешћи разлог повишења нивоа аминотрансфераза. Код највећег броја пацијената NAFLD је удружена са метаболичким ризичним факторима, као што су: дијабетес, дислипидемија, гојазност и хипертензија, због чега се NAFLD данас сматра хепатичном манифестацијом метаболичког синдрома (MS), а инсулинска резистенција (IR) главним патофизиолошким механизмом. Пацијенти са метаболичким синдромом имају четири до једанаест пута већи ризик да развију NAFLD. С обзиром на ову чињеницу, пацијенти са NAFLD имају повећану стопу морбидитета и морталитета у поређењу са општом популацијом. Малигнитети, исхемијски срчани удар и компликације везане за болест јетре, водећи су узрок смрти пацијената са NAFLD. Неалкохолни стеатохепатитис је прогресивно обољење и етиолошки је фактор у 30% до 75% случајева криптогене цирозе. Код једне четвртине пацијената са NASH развије се цироза јетре у дужем временском периоду и у мањем проценту болесника HCC. Сматра се да ће следећих десет или двадесет година NASH бити Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 2 најчешћи разлог трансплантације јетре. Најзначајнији фактори ризика прогресије NASH су: старост, гојазност (централна гојазност), дислипидемија и дијабетес. Патогенеза NAFLD је мултифакторијална. Инсулинска резистенција је најзначајнији патогенетски фактор акумулације хепатоцелуларне масти, а интрацелуларне слободне масне киселине, оксидативни стрес, деплеција аденозин трифосфата (ATP) и митохондријална дисфункција, узрок су хепатоцелуларног оштећења у стеатотичној јетри. Епидемиолошке, породичне и близаначке студије пружају доказе о наследној предиспозицији за развој NAFLD. Највише пажње студије су поклониле I148M варијанти patatin like phospholipase domain conteining-3 (PNPLA3) гена. Овај полиморфизам PNPLA3 гена подразумева замену нуклеотида цитозина гуанином, при чему долази до замене изолеуцина метионином у положају 148. Више студија потврдило је јаку корелацију између ове генске варијане и склоности ка акумулацији масти у јетри у свим етничким групама. У циљу постављања дијагнозе NAFLD неопходно је искључити друге етиолошке факторе акумулације триглицерида и оштећења јетре, као што су: конзумирање алкохола, употреба лекова, метаболичке, аутоимуне, наследне болести јетре и вирусне хепатитисе. Клиничка слика код пацијената са NAFLD је обично асимптоматска или са неспецифичним симптомима и физичким знацима. Неалкохолна масна болест јетре се случајно открива у току рутинских лабораторијских анализа када се нађу повишене аминотрансферазе или ултразвучним прегледом, када се дијагностикује „светла“ јетра. Код 78% пацијената са NAFLD вредности јетриних ензима су нормалне и могу остати у референтним вредностима током прогресије болести и развоја NASH и фиброзе, због чега јетрини ензими нису специфични за дијагнозу болести. Ултразвук (UZ) јетре је тренутно imaging техника избора за дијагнозу NAFLD због своје широке доступности и прихватљивих дијагностичких могућности. Сензитивније imaging методе од ултразвука су магнетна резонанца (MR), магнетно резонантна спектроскопија (MRS) и транзијентна еластографија (TE) (FibroScan). Међутим, њихова употреба у дијагностици NAFLD лимитирана је високом ценом и Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 3 доступношћу у здравственим установама, недовољном сензитивношћу и специфичношћу у степеновању NAFLD, односно дијагностици NASH и фиброзе. Због дугог, индолентног тока пацијенти са NASH се обично откривају у одмаклој фази болести, када се развије декомпензована цироза или HCC и када је прогноза лоша, што указује да посебан аспект болести представља правовремена, брза и тачна дијагноза. Данас постоји ургентна потреба за налажењем неинвазивних биохемијских параметара, који би имали довољну сензитивност и специфичност у диферентовању обичне стеатозе од стеатохепатитиса, што би знатно олакшало скрининг пацијената са NAFLD. С обзиром да апоптоза хепатоцита представља критичан процес на путу прогресије неалкохолне масне јетре (NAFL, енгл. Non- alcoholic Fatty Liver) у NASH, мерење плазматских нивоа цитокератина-18 (CK-18) може имати предиктивну вредност у дијагностици NASH, што је потврђено у више студија. Биопсија јетре се и даље сматра „златним стандардом“ за постављање дијагнозе NAFLD, диферентовање обичне стеатозе од стеатохепатитиса, процене степена стеатозе, лобуларне инфламације, балонирања хепатоцита и стадијума фиброзе. Додатно забрињава чињеница да нема ефикасног, специфичног третмана неалкохолне масне јетре и NASH, осим промене животних навика и физичке активности, што додатно компликује одложену дијагнозу болести и неповољно утиче на прогнозу ових болесника. Истраживања су вршена са статинима, тиазолидинима, витамином Е, урсодеоксихолном киселином у терапији NAFLD, али за сада нема ефикасне, циљане терапије. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 4 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ 2.1. Дефиниција и подела неалкохолне масне болести јетре Неалкохолна масна болест јетре је у последње две деценије најчешћа хронична болест јетре у западним земљама, са преваленцом од 20% до 30% код одраслих особа [1]. Преваленца NAFLD расте паралелно са епидемијом гојазности и дијабетес мелитуса (DM) тип 2, који су фактори ризика за настанак NAFLD [2, 3]. Први пут као ентитет, болест су описали 1980. године Ludwig и сар. код мале групе пацијената са хистолошким налазом јетрине „неименоване“ болести, коју карактерише акумулација масти у јетри, некроинфламаторна активност и у највећем броју случајева фиброза, у одсуству историје конзумирања алкохола у значајним количинама. Болест је названа неалкохолни стеатохепатитис [4]. Неалкохолна масна болест јетре се данас не посматра као примарна болест јетре, већ као део метаболичког синдрома, инсулинске резистенције, дијабетеса, дислипидемије и хипертензије [5, 6]. Сматра се да примарна NAFLD представља хепатичну манифестацију метаболичког синдрома, а инсулинска резистенција је кључни патофизиолошки механизам [7, 8]. Примарна NAFLD је клиничко патолошки ентитет који подразумева: § акумулацију триглицерида у јетри (стеатозу у више од 5% хепатоцита) која се дијагностикује imaging методама или хистолошким налазом макровезикуларне стеатозе и § одуство конзумирања алкохола у количинама штетним за јетру (>21 алкохолног пића недељно код мушкарца и >14 алкохолних пића недељно код жена кроз период од две године пре биопсије јетре) и других секундарних узрока јетрине стеатозе [9]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 5 Неалкохолна масна болест јетре се хистолошки категоризује у неалкохолну масну јетру и неалкохолни стеатохепатитис [9]. Неалкохолна масна јетра је бенигно, непрогресивно обољење јетре, које хистолошки карактерише присуство макровезикуларне стетатозе у више од 5% хепатоцита, без знакова хепатоцелуларног оштећења, док NASH подразумева присуство хепатичне стеатозе, лобуларне инфламације (акутна и/или хронична) са оштећењем хепатоцита (балонирајућа дегенерација), са или без придружене фиброзе [1, 8, 9]. Унутар NAFLD спектра, само пацијенти са NASH развијају прогресивно оштећење јетре. Неалкохолни стеатохепатитис прогредира до цирозе у 23% случајева за 10-15 година и ређе до HCC. Данас је NASH трећи најчешћи разлог трансплатације јетре са трендом пораста инциденце. Висока преваленца NASH код трансплантираних пацијената са налазом криптогене цирозе сугерише јаку повезаност oва два ентитета [10, 11, 12]. Секундарно се NAFLD може јавити код хепатитиса C, Wilsonove болести, ретких урођених поремећаја метаболизма липида и инсулинске резистенције (абеталипопротеинемија, хипобеталипопротеинемија, Mauriac и Weber Christian синдром, и липодистрофија), изгладњивања, код пацијената на тоталној парентералној исхрани, удружено са појединим поремећајима трудноће, као последица коришћења појединих лекова (амиодарон, тамоксифен, синтетски естрогени, глукокортикоиди, метотрексат и др.), дејства појединих хемикалија (органси растварачи) и код пацијената подвргнутих абдоминалним хируршким интервенцијама (опсежне ресекције танког црева, јејуноилеални by-pass и билиопанкреасне операције), али много ређе. Инциденца, механизам и природни ток болести NAFLD у овим обољењима нису познати [9, 13]. 2.2. Епидемиологија NAFLD Зависно од методологије која је коришћена и испитиваним популацијама, извештаји о преваленци NAFLD се разликују у свету. На основу ових извештаја преваленца NAFLD креће се у распону од 6,3% до 33%, средња вредност је 20% у Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 6 општој популацији, док се преваленца NASH креће од 3% до 5%. С обзиром на пандемију гојазности у свету и јаку удруженост NAFLD са MS преваленца NAFLD је у сталном порасту [14]. Измењени социоекономски услови живота, начин исхране (висок унос засићених масти и угљених хидрата) и физичка неактивност имају значајну улогу у високој преваленци NAFLD [15]. Висока преваленца NAFLD утврђена је у Јужној и Северној Америци, Азији, Аустралији, Средњем Истоку и Европи. Данас је NAFLD најчешћи разлог повишених нивоа аминотрансфераза и испитивања у хепатолошким одељењима. Процену преваленце стеатозе јетре у популационим студијама није могуће вршити на основу биопсије јетре код пацијената са NAFLD због инвазивности процедуре и могућих компликација. У ову сврху су коришћени подаци добијени биопсијом јетре донора и неинвазивним радиолошким методама, као што су ултразвук, компјутеризована томографија (CT), MR и MRS [14]. Користећи патохиостологију, Williams и сар. су у Сједињеним Америчким Државама (SAD) утврдили преваленцу стеатозе јетре од 46%, NASH је откривен код 12,2% испитиване популације, односно код 29,9% пацијената са UZ налазом стеатозе јетре и каснијом биопсијом јетре. Разлике у преваленци биле су условљене етничком припадношћу (већа код Хиспаноамериканаца 58,3% у поређењу са Афроамериканцима 35,1%), присуством дијабетеса (74% NAFLD и 22% NASH), полом (мушки пол 58,9%), годинама (старији пацијенти), већим индексом телесне масе (BMI, енгл. body mass index) и хипертензијом [16]. У студији Lee и сар., преваленца NAFLD у Азији, процењена након биопсије јетре код 589 потенцијалних донора јетре, износила је 51%. Стеатоза већа од 30% била је присутна код 10,4% испитиване популације и NASH код 2,2% испитаника [17]. Zois и сар. су у студији на постмортем биопсијама јетре особа настрадалих у несрећама или услед изненадне смрти утврдили високу преваленцу стеатозе и стеатохепатитиса у Грчкој популацији, 31% и 39% [18]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 7 У циљу утврђивања преваленце NAFLD у Италији је спроведена Dionysos студија. Ултразвучним прегледом испитаника утврђена је преваленца NAFLD од 20% до 25% [5]. У групи пацијената са трећим степеном гојазности подвргнутих баријатријском хируршком лечењу, у анализи 12 студија преваленца хистолошки потврђене стеатозе износила је 91% (85% до 98%), NASH-а 37% (24% до 98%) и цирозе 1,7% (1% до 7%) [2]. Dvorak и сар. су ултразвучном студијом код пацијената са DM тип 2 утврдили преваленцу NAFLD од 79%. Метаболички синдром је утврђен код 93% пацијената, са уском повезаношћу NAFLD и компонената метаболичког синдрома (BMI, обима струка (OS) и серумских триглицерида) [19]. Сличном студијом, Leite и сар. утврдили су преваленцу NAFLD од 69% код пацијената са DM тип 2 [20]. У мултицентричној студији Caballeria и сар. код 766 испитаника, преваленца NAFLD процењена ултразвуком износила је 33% код мушкараца и 20% код жена [21]. Етничка припадност, године старости и пол имају утицаја на преваленцу NAFLD. Хиспаноамериканци имају највећу преваленцу NAFLD, што се може објаснити I148M алелом у PNPLA3 гену, који је најчешћи код ове етничке групе [22]. Преваленца NAFLD у Америци утврђена протонском MRS, у Тексасу износила је 30%. Највећа преваленца од 45% забележена је код Хиспаноамериканаца. Преваленца NAFLD била је нижа код белаца 33% и црнаца 24% [23]. У ретроспективној студији, Friht и сар. поделили су пацијенте са хистолошки доказаном NAFLD у три групе, зависно од година старости, на старије пацијенте (више од 60 година), пацијенте средњих година (од 50 до 60 година) и млађе пацијенте (мање од 50 година), и утврдили да постоји асоцијација између година старости и NAFLD, и година старости и степена фиброзе. Старији пацијенти су имали значајно виши степен фиброзе на биопсији и цироза је била чешћа код ове групе пацијената [24]. Преваленца NAFLD у Азији процењена ултразвуком након здравствене контроле 26.527 особа била је знатно виша код мушког пола 31% у односу на Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 8 женски пол 16% [25]. Мушки пол је ризични фактор за развој NAFLD, NASH, хепатичну фиброзу и целокупан морталитет код пацијената са NAFLD [14]. 2.3. Етиологија NAFLD 2.3.1. Ризични фактори Најзначајнији примарни фактори ризика за развој NAFLD су гојазност, DM тип 2, дислипидемија и MS [2, 3, 5, 6, 8, 9, 26, 27]. 2.3.1.1. NAFLD и гојазност Гојазност у свету данас има епидемијске размере. Према проценама Светске здравствене организације (SZO) из 2014. године, у свету 1,9 милијарди особа старијих од 18 година је прекомерно ухрањено и 0,6 милијарди од овог броја је гојазно. Гојазност дефинисана BMI изнад 30 kg/m2 фактор је ризика за мултипле кардиоваскуларне поремећаје, дислипидемију, дијабетес и MS [28]. Гојазност је узрок пораста укупног морталитета и смањења животног века до 20 година, нарочито код млађих особа [29]. Као стање стално присутне инфламације ниског степена, гојазност је повезана са компликацијама, као што су: DM тип 2, хипертензија, болести жучне кесе, остеоартритис и психосоцијални проблеми. Гојазност има своје импликације на развој малигнитета (дебелог црева, ендометријума, бубрега, једњака, желуца, панкреаса и жучне кесе) и са IR представља фактор ризика за развој HCC. Особе са BMI већим од 40 kg/m2 имају 50% до 60% већи ризик за развој малигнитета у односу на нормално ухрањене особе [30, 31]. Гојазност је један од најзначајнијих фактора ризика за развој NAFLD. Процене су да се стеатоза јетре развија код 57% до 74% гојазних особа, код 90% особа са трећим степеном гојазности и да више од једне трећине асимпроматских озбиљно гојазних особа има хистолошке карактеристике NASH [2, 27]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 9 Пацијенти са HCC на терену криптогене цирозе имају високу преваленцу гојазности и дијабетеса, у поређењу са пацијентима са HCC на терену цирозе алкохолне или вирусне етиологије, што указује да је NAFLD основни узрок криптогене цирозе компликоване развојем HCC код ове групе пацијената [14, 32]. У циљу процене прогресије болести Fassio и сар. пратили су 22 пацијента са NASH, код којих је друга биопсија јетре рађена три године након прве биопсије. Прогресија фиброзе утврђена је код једне трећине пацијената, а гојазност и BMI су били једини параметри удружени са степеном прогресије [33]. Гојазност проузрокује инсулинску резистенцију у масном ткиву, појачану липолизу, инфилтрацију инфламаторним ћелијама и промене у секрецији адипоцитокина. Специфични адипоцитокини повезују MS, DM тип 2 и NAFLD, а дисбаланс у њиховој експресији има главну улогу у прогресији болести до NASH и цирозе [34]. Све је више доказа да дистрибуција масног ткива има пресудну важност за развој метаболичких компликација. Сматра се да висцерално масно ткиво, као ендокрини орган, има предоминантни значај у овим процесима у односу на поткожно масно ткиво [28]. Висцерална гојазност зависи од пола (чешћа је код мушкараца), година старости, хормонског статуса (менопауза код жена), дијететских навика (високо калорична исхрана), пушења и физичке активности (седатарни начин живота). Постоје квантитативне и квалитативне разлике у медијаторима који се ослобађају из периферног и висцераног масног ткива. Повећање висцералне гојазности има за последицу смањену продукцију заштитних адипокина (адипонектин) и повећану продукцију проинфламаторних цитокина и адипокина, што за последицу има развој NASH [34]. Највећи број епидемиолошких и клиничких студија користи BMI за процену гојазности. Индекс телесне масе је математичка формула која представља однос телесне тежине изражене у килограмима и квадрата телесне висине изражене у метрима. У односу на BMI одређује се категорија гојазности. Нормалан BMI је до 25 kg/m2. Просечне вредности ухрањености у односу на BMI су: BMI ≤ 18,5 kg/m2 потхрањеност, BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 је нормална ухрањеност, BMI од 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 прекомерна ухрањеност и BMI ≥ 30,0 kg/m2 гојазност. Гојазност Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 10 је подељена у три степена у односу на BMI. BMI у распону од 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 први је степен или блага гојазност, BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 други степен или средње изражена гојазност и BMI већи од 40 kg/m2 трећи степен или озбиљна гојазност [28, 35]. Многе епидемолошке студије су показале да BMI већи од 30 kg/m2 носи значајан пораст морбидитета и морталитета [28, 29]. Подаци Prospective Studies Collaboration указују да је пораст BMI за сваких 5 kg/m2 изнад 25 kg/m2, узрок повећаног морталитета за 30% [35]. У односу на BMI, процена абдоминалне гојазности мерењем обима струка је значајнија, јер су метаболички фактори чешћи и озбиљнији са порастом овог типа гојазности. Обим струка је један од критеријума MS и предиктор је повећаног морбидитета и морталитета као последице гојазности, DM типа 2, кардиоваскуларних болести (KVB) и NAFLD [28, 36, 37]. Абдоминална гојазност корелира са преваленцом NAFLD/NASH и уско је повезана са инсулинском резистенцијом, главним патогенетским фактором развоја NASH [15]. Особе са нормалним BMI, али повећаним обимом струка имају већи ризик за развој кардиометаболичких компликација, смрти [28] и оболевања од NAFLD [27]. 2.3.1.2. NAFLD и дијабетес У свету 347 милиона људи болује од дијабетеса и процене су Светске здравствене организације да ће 2030. године дијабетес бити седми водећи узрок смрти. Пацијенти са дијабетесом имају повећан ризик од развоја хроничних микровезикуларних и макровезикуларних дегенеративних промена. Преваленца NAFLD и прогресивних форми обољења (неалкохолни стеатохепатитис и фиброза) код пацијената са DM тип 2, расту са порастом епидемије гојазности, IR, дислипидемије и MS [19, 20, 27, 38]. Генетски фактори и фактори околине у интереакцији са метаболичким поремећајима убрзавају прогресију NAFLD код дијабетичара. Са друге стране, пацијенти са стеатозом јетре имају већу стопу предијабетеса и присуство NAFLD предиспонира развој DM тип 2. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 11 Неалкохолна масна болест јетре и DM тип 2 често коегзистирају и деле заједничке факторе ризика, посебно висцералну гојазност, као и патогенетске механизме. Инсулинска резистенција и хиперинсулинемија, дислипидемија, оксидативни стрес и инфламација, доприносе развоју оба ентитета [39]. Преваленца NAFLD код пацијената са дијабетесом креће се од 69% до 79% [16, 19, 20]. Преваленца NAFLD расте са порастом јутарње гликемије наште, од 27% код пацијената са нормалним вредностима јутарње гликемије, 43% код пацијената са повишеном гликемијом наште, до 62% код пацијената са DM тип 2 [40]. Високу преваленца NAFLD и NASH код пацијената са дијабетесом, потврдили су резултати проспективне студије Williams и сар. 2011. године. Преваленца NAFLD и NASH код дијабетичара, у односу на целокупну испитивану популацију износила је 74% vs. 46% и 22% vs. 12%. Утврђено је да је инсулинска резистенција независан фактор ризика развоја NASH у целој групи, а пацијенти са израженом фиброзом су имали већи степен инсулинске резистенције у односу на пацијенте са умереном фиброзом [16]. У проспективним студијама DM тип 2 је независан фактор ризика прогресије NAFLD, развоја фиброзе, HCC и морталитета [39]. Ризични фактори за напредовање болести и развој NASH код пацијената са NAFLD и дијабетесом су: старост, метаболички синдром, висцерална гојазност, дуже трајање дијабетеса, фамилијарна историја дијабетеса, високи серумски нивои гама глутамил транспептидазе (GGT) и виши однос аспартат аминотрансфераза (AST)/аланин аминотрансфераза (ALT) [41]. Студија Leite и сар. из 2011. године процењивала је степен прогресије NAFLD код пацијената са DM тип 2. Код 78% пацијената утврђено је присуство NASH, док је фиброза била присутна код 36% до 60% пацијената. Прогресија болести није била удружена са клиничким карактеристикама везаним за дијабетес. Повишен серумски ниво триглицерида, ниски серумски нивои липопротеина високе густине (HDL холестерола) и пораст нивоа ALT су независно били удружени са повећаним ризиком развоја NASH. Аутори су овом студијом дошли до закључка да је биопсију јетре потребно размотрити код свих пацијената са DM тип 2 код којих се UZ нађе стеатоза јетре [42]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 12 Younosi и сар. су у проспективној студији пацијената са хистолошки доказаном NAFLD утврдили да пацијенти са дијабетесом имају већу стопу цирозе (25% vs. 10%, p=0,04) и већи укупни морталитет у поређењу са пацијентима без дијабетеса (56,8% vs. 27,3%, p=0,001), као и морталитет везан за јетру (18,2% vs. 2,3%, p =0,02) [43]. У две независне студије Targher и сар. су пратећи популацију пацијената са NAFLD и DM тип 2 утврдили високу преваленцу кардиоваскуларних и цереброваскуларних догађаја, и болести периферне циркулације (p<0,001) код наведене групе пацијената у односу на пацијенте без NAFLD. Веза између NAFLD и кардиоваскуларних обољења је независна од класичних фактора ризика, ензима јетре, гликорегулације, терапије и присуства MS. Резултати ових студија потврђују хипотезу да је селекција пацијената са NAFLD у популацији оболелих од DM тип 2 од значаја у предикцији ризика развоја кардиоваскуларних болести [44, 45]. 2.3.1.3. NAFLD и метаболички синдром Концепт метаболичког синдрома постоји 80 година. У последње две деценије забележен је тренд пораста броја пацијената са MS. Reaven је 1988. године описао синдром X, под којим је подразумевао присуство DM типа 2, дислипидемије, повишеног крвног притисака и IR [46]. De Fronzo и Ferrannini су предложили назив синдром инсулинске резистенције, имајући у виду да је у основи поремећаја IR [47]. Метаболички синдром, синдром X или синдром инсулинске резистенције је назив за констелацију метаболичких, биохемијских, клиничких и физиолошких фактора који директно повећавају ризик атеросклеротских кардиоваскуларних болести, DM типа 2 и морталитета. Метаболички синдром подразумева поремећај регулације глукозе, централну гојазност, атерогену дислипидемију, артеријску хипертензију, проинфламаторно и протромботичко стање [48, 49]. У обележја MS убрајају се и NAFLD, синдром опструктивне sleep апнеје, синдром полицистичних јајника и хиперурикемија. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 13 Особе са MS обољевају 4,7 пута чешће од NAFLD у односу на особе без метаболичког синдрома. Метаболички синдром носи пет пута већи ризик за настанак дијабетеса и два до три пута већи ризик за настанак атеросклеротског кардиоваскуларног обољења [50]. Treeprasertsuk и сар. су користећи Фрамингамски ризични скор (године, крвни притисак, тотални холестерол, HDL холестерол, пушење и историју дијабетеса) утврдили да су пацијенти са NAFLD на знатно већем десетогодишњем ризику обољевања од кардиоваскуларних болести у односу на општу популацију истог пола и година. Метаболички синдром је био присутан код две трећине пацијената (63,7%), а гојазност код 73,8% [51]. Већи број обележја метаболичког синдрома код једне особе удружен је са вишеструко већим ризиком обољевања од NAFLD, а присуство само једног обележја носи 3,6 пута већи ризик [52]. Chituri и сар. су утврдили да 87% пацијената са NAFLD имају карактеристике метаболичког синдрома (94% централну гојазност, 82% дислипидемију и 50% глукозну интолеранцију) и практично 98% пацијената има IR, која је чешћа и озбиљнија код пацијената са NASH у односу на пацијенте са хроничним хепатитисом C [53]. Светска здравствена организација је 1998. године предложила критеријуме за постављање дијагнозе MS, што је био први покушај дефинисања синдрома. Критеријуми SZO дају највећи знаћај инсулинској резистенцији као основном етиолошком фактору MS. Касније су се критеријуми и њихова предиктивна вредност мењали, а нове консензус конференције су дале нове дефиниције. Данас постоји више дефиниција које су дале свој допринос у идентификовању и груписању клиничких и лабораторијских параметара овог синдрома. Сада су најчешће у употреби две дефиниције, које не укључују инсулинску резистенцију као један од дијагностичких критеријума, већ се фокусирају на друге клиничке параметре, које је лакше мерити: 1. Дефиниција The National Cholesterol Educational Programm (NCEP) Adult Treatment Panel III (ATP III), објављена 2001. године и допуњена од стране Aмеричког удружења за срце (AHA, engl. American Heart Association) 2005. године, заснива се на присуству три од следећих пет критеријума: Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 14 абдоминална гојазност, хипертриглицеридемија, низак ниво HDL холестерола, повишен крвни притисак и хипергликемија [49,50]. Критеријуми NCEP/ATP III су усмерени на проналажење болесника са MS у смислу превенције кардиоваскуларних болести (Табела 1). Табела 1. Критеријуми за дијагнозу метаболичког синдрома према NCEP/ATP III. Присуство најмање три од следећих пет компоненти Централна абдоминална гојазност Обим струка ≥ 102 cm за мушкарце, односно ≥ 88 cm за жене Повишен ниво триглицерида ≥1,7 mmol/l, или већ третирана абнормалност Снижен ниво HDL холестерол < 1,03 mmol/l код мушкараца, < 1,29 mmol/l код жена, или већ третирана абнормалност Повишен крвни притисак систолни ≥ 130 mmHg и/или дијастолни ≥ 85 mmHg, или већ лечена хипертензија Повишен ниво глукозе наште ≥ 5,6 mmol/l, или већ постојећи dijabetes melitus тип 2 2. Дефиниција Интернационалне федерације за дијабетес (IDF, енгл. International Diabetes Federation) је најновија дефиниција која датира из 2005. Заснива се на присуству абдоминалне гојазности и два од преостала четири критеријума. У складу са овом дефиницијом, посебан значај даје се централној (абдоминалној) гојазности, која се изражава преко обима струка, који је етнички дефинисан. Посебно су наведене вредности обима струка за све етничке групе, у циљу универзалне примене [54] (Табела 2). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 15 Табела 2. Критеријуми за дијагнозу метаболичког синдрома према IDF. Централна абдоминална гојазност Обим струка ≥ 94 cm за мушкарце, односно ≥ 80 cm за жене у Европи Плус било које две од следеће четири компоненте Повишен ниво триглицерида ≥1,7 mmol/l, или већ третирана абнормалност Снижен ниво HDL холестерол < 1,03 mmol/l код мушкараца, < 1,29 mmol/l код жена, или већ третирана абнормалност Повишен крвни притисак Систолни ≥ 130 mmHg и/или дијастолни ≥ 85 mmHg, или већ лечена хипертензија Повишен ниво глукозе наште ≥ 5,6 mmol/l, или већ постојећи dijabetes melitus тип 2 Метаболички синдром је глобални, растући здравствени проблем због високе преваленце гојазности и дијабетеса. Интернационална федерација за дијабетес процењује да једна четвртина светске популације има MS. Виши социоекономски статус, седантарни начин живота и висок BMI су удружени са MS. Процењена преваленца MS у NHANES студији (енгл. National Helth and Nutrition Examination Survey) износила је 5% код особа нормалне тежине, 22% код особа са прекомерном тежином и 60% код гојазних особа [55]. Weiss и сар. су утврдили метаболички синдром код 50% млађих особа са трећим степеном гојазности [56]. Преваленца MS зависи од старости популације. У САД, преваленца се креће од 7% у популацији старости 20 до 29 година до 42% у популацији од 60 до 69 година старости [57]. Сматра се да једна четвтина Европљана има метаболички синдром, а преваленца је слична и у земљама Средње и Јужне Америке. У развијеним Азијским земљама преваленца се креће од 13% код мушкараца до 18% код жена [58]. Као фактори ризика за развој MS наводе се: § године старости (око 44% Американаца старијих од 50 година има MS), § женски пол (жене чешће имају MS у односу на мушкарце, нарочито у периоду менопаузе), Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 16 § стрес (физиолошки, емоционални или психолошки стрес повезан са хипоталамо-хипофизно-адреналном дисфункцијом), § физичка неактивност предиспонира централну гојазност, смањење нивоа HDL холестерола, развој хипертензије и кардиоваскуларних обољења, § гојазност (пораст централне гојазности, односно обима струка за 1 cm повећава ризик развоја MS за 7,4%) и § хормонски дизбаланс (полицистична болест јајника, инсуфицијенција лучења тестостерона, хормона раста и повећан ниво гликокортикоида). Остали добро документовани фактори су пушење, генетска предиспозиција и неуроендокрини профил маладаптивне реакције на стрес. Метаболичке консеквенце “дефекта” биланса енергије су висцерална гојазност, IR, атерогена дислипидемија и инфламација, што носи висок ризик развоја NASH и фиброзе међу NAFLD пацијентима [58, 59]. Инсулинска резистенциија је патолошко стање које карактерише одсуство физиолошког одговора периферних ткива на инсулин, што доводи до метаболичких и хемодинамских поремећаја познатих као MS. Настаје као резултат дисфункције масног ткива, са ослобађањем адипоцитокина и поремећаја метаболизма слободних масних киселина. Прекомерно ослобађање масних киселина у плазми из депоа триглицерида, пре свега интрабдоминалног масног ткива дејстом хормонски сензитивне липазе и из липопротеина богатих триглицеридима деловањем липопротеинске липазе, доприноси развоју IR [60]. Инсулин има двоструко дејство, са једне стране стимулише липопротеинску липазу, а са друге има антилиполитичко дејство. Најважнији механизам дејства инсулина је инхибиција липолизе у масном ткиву [61]. Инсулинска резистенција се манифестује када ћелије јетре, скелетних мишића и масног ткива постају мање осетљиве на инсулин или резистентне. Пораст IR интензивира процес липолизе триглицерида у масном ткиву, а повећана продукција слободних масних киселина инхибира антилиполитичко дејство инсулина. У јетри слободне масне киселине стимулишу глуконеогенезу, синтезу триглицерида и липопротеина врло ниске густине (VLDL, енгл. Very Low Density Lipoproteins) [62], што доводи до снижења нивоа липопротеина високе густине (HDL, енгл. High Density Lipoprotein) и повећање Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 17 нивоа липопротеина ниске густине (LDL, енгл. Low Density Lipoprotein). У мишићима слободне масне киселине инхибирају инсулин посредовано преузимање глукозе, смањују стварање гликогена и повећавају ниво интрамиоцитних триглицерида. Акумулација слободних масних киселина у панкреасним острвцима доводи до поремећаја инсулинске секреције и последичне глукозне интолеранције [63]. Слободне масне киселине имају липотоксично дејство, које се манифестује путем дејства токсичних метаболита акумулираних триглицерида у ектопичним органима (јетра, мишићи и панкреатичне бета ћелије), активирања инфламаторних путева, ћелијске дисфункције и липоапоптозе. Крајњи резултат ових промена је липотоксична јетрина болест, односно NASH [64]. Хронична инфламација удружена са висцералном гојазношћу индукује појачану секрецију проинфламаторних цитокина и редукује секрецију антилипогених хормона (адипонектин), који код пацијената са NAFLD имају важну улогу у развоју хепатичне инсулинске резистенције. Последица ових збивања су оксидативни стрес, апоптоза хепатоцита и прогресија NAFL у NASH. Адипокини својим системским метаболичким дејствима доприносе развоју гојазности, инсулинској резистенцији, самим тим и MS [65]. Снижени нивои адипонектина, којег луче искључиво адипоцити масног ткива, сматрају се предиктором присуства MS и KVB [66]. Смањена секреција или резистенција на лептин код гојазних особа води таложењу триглицерида у неадипозним органима, панкреасу, јетри и мишићима, до инфламације, апоптозе и коначно до фиброгенезе у јетри. Липотоксичност у овим органима узрок је настанка IR, која је промотор развоја дијабетеса. Лептин резистенција је алтернативни концепт развоја MS [34]. Адипоцити и моноцити у масном ткиву производе проинфтламаторне цитокине као што су: фактор некрозе тумора алфа (TNF-α), резистин, интерлеукин (IL)-6, IL-8 и C-реактивни протеин (CRP). Ridker и сар. су у проспективној студији, Women Helth Study, пратећи 14.719 жена у осмогодишњем периоду, дошли до закључка да је високо сензитивни C-реактивни протеин (hs-CRP engl. high sensitive- C reactive protein) >3mg/l код особа са метаболичким синдромом, предиктор будућег ризика KVB [67]. Zimerrman и сар. налазе изражену корелацију BMI и hs- Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 18 CRP код пацијената са NAFLD. Пораст BMI за 10% праћен је порастом hs-CRP за 20% [68]. Први корак у лечењу MS је препознавање болесника у најранијем стадијуму и едукација болесника о ризику настанка кардиоваскуларних болести и DM типа 2. Најбитнија терапијска мера је промена животних навика у смислу повећања физичке активности, промена навика у исхрани и смањењење телесне тежине. Редукција телесне тежине повољно утиче на друге компоненте MS и смањује ризик настанка DM типа 2. Најбољи резултати се постижу смањењем калоријског уноса и редовном физичком активношћу. Калоријски унос треба смањити на 500-1000 калорија недељно, са редукцијом телесне тежине 0,5 до 1 kg на недељном нивоу. Циљ је редукција телесне тежине 7% до 10%, за 6 до 12 месеци. Препоручује се умерена физичка активност (30 минута дневно) у виду брзог ходања, трчања, пливања и вожње бицикла. Редовно вежбање у комбинацији са дијетом повољно утиче на све компоненте метаболичког синдрома и смањује инциденцу DM типа 2 код пацијената са поремећајем толеранције глукозe [69]. Пацијентима са високим ризиком за развој компликација MS, поред промене животних навика уводи се и медикаментна терапија. Болести које произилазе из дефиниције метаболичког синдрома лече се фармаколошки (антихипертензивима, атидијабетицима, хиполипемицима, лековима за лечење гојазности), а терапијски циљ и препоруке за лечење произилазе из смерница за сваку поједину болест. У клиничким и експерименталним истраживањима све више даје се на значају интестиналној микрофлори као могућем етиопатогенетском фактору у настанку MS. Иако је неколико студија објавило охрабрујуће резултате о повољном дејству пробиотика и пребиотика у терапији MS, и даље недостаје добар клинички доказ ефикасности њихове дуготрајне употребе у третману MS [70]. 2.4. Патогенеза NAFLD Патогенеза NAFLD није до краја разјашњена. Фактори који доводе до прогресивног хепатоцелуларног оштећења јетре, након акумулације триглицерида у хепатоцитима, комплексни су и нису до краја разјашњени. Промена на нивоу Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 19 локалних и системских фактора који контролишу равнотежу метаболизма липида у јетри, пре свега инсулинске резистенције, воде ка акумулацији триглицерида у паренхиму јетре. Стеатотична јетра постаје осетљивија на секундарна оштећења, што доводи до хепатоцелуларне инфламације и фиброзе [71]. 2.4.1. Теорија „два ударца“ У разјашњењу патогенезе NAFLD и NASH водећа је теорија „два ударца” [72, 73]. „Први ударац” је акумулација триглицерида у јетри или стеатоза јетре, а „други ударац” прогресија оштећења јетре посредована инфламаторним цитокинима, митохондријалном дисфункцијом и оксидативним стресом, што за последицу има развој стеатохепатитиса и фиброзе јетре [73, 74]. Чињеница да оксидативни стрес узрокује прогресивну ћелијску смрт, са експанзијом прогениторних ћелија и смањењем репликативне способности хепатоцита, што је основа прогресије болести до цирозе јетре и HCC, теорија „трећег ударца“ све више добија на значају [75]. Почетак болести и прогресија су резултат садејства молекуларних механизама и фактора околине. 2.4.2. Инсулинска резистенција Инсулинска резистенција, односно поремећај у сигнализацијском путу инсулина на нивоу инсулинског рецептора, доводи до периферне липолизе, појачаног допремања и преузимања слободних масних киселина у јетри [76]. Хронична хиперинсулинемија покреће липогенезу регулишући липогенске трансцрипционе факторе као што су: параксизомални пролиферативни активирани рецептор гама (PPAR γ, енгл. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) [77] и стерол регулаторни елемент везујући протеин-1c (SREBP-1c, енгл. Sterol regulatory element binding protein-1c) у jetri [78]. PPAR γ је једарни фактор транскрипције који у масном ткиву регулише диференцијацију адипоцита, метаболизам липида, хомеостазу глукозе и осетљивост на инсулин. Студије су показале повољно дејство Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 20 синтетичког PPAR γ агонисте (пиоглитазон) на стеатозу јетре, инфламацију, балонирање хепатоцита, IR и ниво аминотрансфераза [79]. SREBP-1c је главни транскрипциони регулатор гена који контролише de novo липогенезу [78]. 2.4.3. Липидна акумулација, стеатоза јетре Акумулирани триглицериди у јетри потичу од естерификованих слободних масних киселина и глицерола унутар хепатоцита. Слободне масне киселине у јетри, допремају се путем портне вене липолизом из масног ткива, дијететских извора или настају de novo липогенезом. Акумулација триглицерида у јетри последица је повећане синтезе de novo, повећаног допремања масти из масног ткива, смањеног отпремања масти из јетре и/или смањене оксидације масних киселина. Инсулинска резистенција инхибицијом бета оксидације масних киселина даље продубљује стеатозу јетре [80]. Највећи проценат триглицерида у јетри, више од 60% потиче од слободних масних киселина пореклом из масног ткива. У овом процесу већи значај има висцерално масно ткиво, јер је метаболички активније [73]. Слободне масне киселине се у хепатоциту везују за коензим А (CoA). Комплекс слободних масних киселина и CoA, индукује интрацелуларну инфламацију стимулисањем нуклеарног фактора kappa B (NF-kB) [81]. Инкорпорацијом триглицерида у аполипопротеин B (аpo B) посредством микрозомалног трансфер протеина (MTP) настају VLDL честице. Потенцијални патогенетски фактор NAFLD може бити алтерација MTP/apoB синтезе и секреције, што води ка смањеном капацитету отпремања липида из јетре [82]. 2.4.4. Инфламација, стеатохепатитис 2.4.4.1. Цитокини Фактори који покрећу другу фазу хепатоцелуларног оштећења су: оксидативни стрес, пероксидација липида, цитокини и хормони пореклом из висцералног масног ткива [73]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 21 Инсулинска резистенција доводи до дисфункције адипоцита, са повећаном продукцијом адипоцитокина, пептида пореклом из висцералног масног ткива као што су: TNF-α, IL-6 и лептин. Дисбаланс у секрецији ових цитокина представља даљу везу између гојазности и NAFLD. Проинфламаторни цитокини доводе до миграције инфламаторних ћелија у јетру и активације стелатних ћелија са следственом продукцијом протеина екстрацелуларног матрикса [83]. Продукција цитокина и хемокина је повећана у NASH и има улогу у патогенези оштећења и прогресији болести. Цитокини учествују у свим хистолошким стадијумима развоја NASH, укључујући неутрофилну хемотаксу, хепатичну апоптозу/некрозу, формирање Малоријевих телашаца и активацију стелатних ћелија. Кључни цитокин у развоју NAFLD и NASH је TNF-α [84]. Ометањем инсулинске сигнализације фактор некрозе тумора-α у јетри доприноси инсулинској резистенцији, и оксидативном стресу инхибирајући kappa киназу бета (IKK-β) [85] и активирањем SREBP-1c, што доводи до стеатозе јетре. Активацијом цитозолних сфингомијелиназа, TNF-α продукује церамид, који активира више киназа, чиме продубљује инсулинску резистенцију, али доводи и до повећаног ослобађања слободних радикала кисеоника. Слободни радикали кисеоника повећавају производњу TNF-α, што доводи до повећане митохондријалне пермеабилности, ослобађања митохондријалног цитохрома c са последичном апоптозом хепатоцита. Иако постоје два TNF-α рецептора, TNF-α1 и TNF-α2, само TNF-α1 је медијатор смрти хепатоцита [75]. Hotamisligil и сар. су први указали на везу експресије TNF-α у масном ткиву и инсулинске резистенције у NASH [86]. Пацијенти са NASH имају већи серумски ниво TNF-α у поређењу са контролом. Нивои циркулишућег TNF-α код пацијената са NASH су у позитивној корелацији са степеном фиброзе [87, 88, 89]. Третман пацијената са NASH pentoxifyllinom (инхибира TNF-α) смањује ниво аминотрансфераза и има повољно дејство на стеатозу јетре [90]. Трансформишући фактор раста бета (TGF-β) посредује у фиброгенези активирајући стелатне и Купферове ћелије на продукцију протеина екстрацелуларног матрикса и трансформацију преосталих стелатних ћелија у миофибробласте. Студија Hasegawa и сар. показала је да су нивои TGF-β већи код пацијената са NASH у поређењу са обичном стеатозом [91], а слични су резултати Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 22 студије Dass и сар. [92]. Резултати недавне студије Mahmoud и сар. потвђују позитивну корелацију између серумских нивоа TGF-β и степена фиброзе код пацијената са NASH [93]. Нивои IL-6, такође су повишени код пацијената са NAFLD и значајно су већи код пацијената са NASH у односу на пацијенте са обичном стеатозом [84, 94]. 2.4.4.2. Адипокини Адипонектин је антинфламаторни адипокин, производ масног ткива, који побољшава инсулинску осетљивост и сматра се протективним фактором развоја NAFLD. Адипонектин повећава липидну оксидацију у јетри и скелетним мишићима активацијом AMP-активиране протеинске киназе, индукује PPAR-α и смањује активност ензима укључених у синтезу слободних масних киселина, као што су ацетил-CoA карбоксилаза и синтетаза [78]. Системске концентрације адипонектина су 20% до 60% ниже код пацијената са NAFLD у односу на контролу [95]. Пацијенти са NASH и хипоадипонектинемијом имају тежи степен упалних промена, што указује да је недостатак адипонектина важан фактор ризика за развој масне јетре, односно стеатохепатитиса [75, 87]. Бројне епидемиолошке студије су индентификовале снижен ниво адипонектина као независан фактор ризика за развој NAFLD. Постоји директна веза између хипоадипонектинемије и NASH, независно од IR [95, 96]. Снижен ниво адипонектина и смањена експресија његових рецептора на хепатоцитима доводи до смањења његовог антагонизујућег дејства у односу на TNF-α, и смањења повољног дејства на бета-оксидацију масних киселина и инсулинску осетљивист, што води липидној акумулацији у јетри и инфламацији [73]. Лептин својим утицајем на инсулинску резистенцију повећава оксидативни стрес и продукцију цитокина са једне стране, а са друге стране доприноси фибрози директно путем активације стелатних ћелија или индиректно путем TGF-β. Повишени нивои лептина, односно лептин резистенција код пацијената са NAFLD, корелира са степеном стеатозе, инфламације, али не и са степеном фиброзе [97]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 23 2.4.4.3. Оксидативни стрес и митохондријална дисфункција Улога оксидативног стреса и митохондријалне дисфункције код пацијената са NASH добро је позната. Оксидативни стрес корелира са степеном инфламаторних промена у NASH. Нормално се бета оксидација масних киселина одвија у митохондријама хепатоцита. Преоптерећење бета оксидационог система митохондрија хепатоцита доводи до оксидативног стреса, ослобађања хепатотоксичних слободних радикала кисеоника и водоник пероксида, који директно оштећују структуру и функцију митохондрија [98]. Оксидативни стрес активира NF-kB што доводи до повећене производње проифламаторних цитокина, који даље доводе до неутрофилне хемотаксе, апоптозе хепатоцита и активације стелатних ћелија [81]. Хронична инфламација, удружена са хепатичном стеатозом и активација NF-kB, има кључну улогу у карциногенези и развоју HCC. Неравнотежа између концентрација слободних радикала кисеоника и антиоксиданаса, доводи до липидне пероксидације полинезасићених слободних масних киселина, ћелијске мембране, мембране митохондрија и дезоксирибонуклеинске киселине (DNK). Продукти липидне пероксидације су цитотоксични алдехиди, као што су: малондиалдехид (MDA) и 4-хидроксиноненал (HNE). MDA и HNE покрећу потенцијално штетан имуни одговор, активирају стелатне ћелије на продукцију колагена или стимулишу неутрофилну хемотаксу [99]. Слободни радикали кисеоника са цитотоксичним алдехидима покрећу синтезу проинфламаторних цитокина (TNF α, IL-6, IL-8, TGF β), продубљују окидативни стрес и утичу на смањење продукције ATP. Резултат ових процеса је оштећење хепатоцита, инфламација и апоптоза хепатоцита. Бета оксидација масних киселина код пацијената са NAFLD одвија се и алтернативним путевима као што су citohrom P-450E1 (CYP2E1) оксидативни систем, што такође доводи до ослобађања слободних радикала кисеоника. Алтернативни пут CYP ензимима (CYP2E1 и CYP4A) обавља се у ендоплазматском Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 24 ретикулуму. Појачана активност и експресија CYP2E1 утврђена је код пацијената са NASH и може представљати извор слободних радикала кисеоника [100]. 2.4.4.4. Апоптоза хепатоцита Слободне масне киселине имају директно и индиректно липотоксично дејство. Оне проузрокују транслокацију митохондријалног протеина Bax у лизозоме, што доводи до дестабилизације лизозома и ослобађања катепсина B из лизозома у цитоплазму. Катепсин B активира транскрипцијски фактор NF-kB и TNF-α. Фактор некрозе тумора-α додатно оштећује лизозоме и доводи до катепсин B индуковане апоптозе хепатоцита. Из оштећених митохондрија ослобађа се цитохром c, а недостатак ATP активира протеолитичку активност каспаза и доводи до фрагментације DNK и кондензације хроматина [99]. У NASH индукованој смрти хепатоцита учествују и спољашњи, и унутрашњи пут апоптозе. Активиране каспаза-3 и каспаза-7 у току прогресије болести ослобађају цитокератин-18, главни цитоскелетни протеин апоптозе [101]. Вредности CK-18 су значајно више код пацијената са NASH у односу на пацијенте са NAFL, такође и код пацијената са узнапредовалом фиброзом у односу на пацијенте без фиброзе или са фиброзом првог или другог степена [102]. 2.4.4.5. Ендоплазматски ретикулум стрес и раст бактерија Остали механизми укључени у патогенезу NASH су ендоплазматски ретикулум стрес и ендотоксемија. Хиперлипидемија и хиперинсулинемија узрокују ендоплазматски ретикулум стрес, што доводи до инфламације, апоптозе и митохондријалне дисфункције у хепатоциту [103]. Раст бактерија у танком цреву праћен је појачаним ослобађањем бактеријских липополисахарида, производњом етанола, ацеталдехида и фенола што доводи до ендотоксемије. Бактеријски токсини путем портне вене преносе се до јетре, где активирају стелатне и Купферове ћелије које ослобађају азотне оксиде и Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 25 цитокине. Бактеријски токсини, липополисахариди имају улогу у патогенези NAFLD [104]. Повећана пермеабилност зида црева и раст бактерија у танком цреву налазе се чешће код пацијената са NAFLD и корелирају са степеном стеатозе [105]. Претходно описане промене могу објаснити обољевање пацијената са јејуноилеалним by-passom од NASH и фиброзе. Ову хипотезу поткрепљује чињеница да промена цревне флоре дејством антибиотика и пробиотика, повољно делује на смањење инфламације у паренхиму јетре код ових пацијената. 2.4.5. Генетска предиспозиција Познато је да постоје етничке и интериндивидулане разлике у обољевању од NAFLD. Генетске и епигенетске промене у NAFLD све више добијају на значају у патогенези болести. Студије чији је предмет истраживања генски полиморфизам код пацијената са NAFLD највише значаја придају генима који утичу на основне патогенетске промене у NAFLD, као што су IR, оксидативни стрес, метаболизам масних киселина, имунитет и регулаторни процеси на путу развоја фиброзе [106]. С обзиром на патогенетску повезаност MS и NAFLD, варијације гена повезаних са IR, као што је полиморфизам једног нуклеотида у PPAR γ гену, адипонектину, инсулинском рецептору, резистину и TNF-α, биле су део истраживања многих студија [106, 107]. 2.4.5.1. Patatin like phospolipase domain conteining-3 ген (PNPLA3) Највише пажње студије (GWS, енгл. Genome wide assotiation study) су поклониле PNPLA3 гену (SNP rs 738409, код I148M), познатом још и као адипонутрин, у патогенези NAFLD. Romeo и сар. су 2008. године, први установили након DNK секвенционирања, да је један алел на PNPLA3 гену, на дугом краку хромозома 22, јако удружен са хепатичном стеатозом и инфламацијом. Овај полиморфизам PNPLA3 гена подразумева замену нуклеотида цитозина гуанином и промену у положају 148, што има за последицу синтезу метионина уместо Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 26 изолеуцина. PNPLA3 ген кодира протеин који има 481 амино киселину, молекулске масе 53 kD и припада фамилији 14 пататину сличних фосфолипаза. Прогенитор ове фамилије је пататин који има неспецифичну активност ацил хидролазе липида. Претпоставља се да I148M варијанта PNPLA3 гена редукује његову ензимску активност према глицерол липидима, услед чега долази до акумулације масти у јетри. Одговори на питање фунционалних последица овог генског полиморфизма су контрадикторни и још увек се интензивно расправља о могућим другим физиолошким улогама PNPLA3 гена [22, 108, 109]. Студија Romeo и сар. показала је да је овај алел најчешћи код Хиспаноамериканаца и G хомозиготи имали су два пута већи степен стеатозе јетре у односу на носиоце нормалног алела. Веза између PNPLA3 полиморфизма и стеатозе јетре остала је непромењена и висока, и након корелације са BMI, дијабетесом, употребом етанола, што је потвдило да се ова повезаност не може приписати познатим факторима ризика NAFLD [22]. Овај алел је најзначајнија детерминанта етничких и интериндивидуланих разлика у развоју хепатичне стеатозе [109]. Одговор на питање зашто поједини пацијенти са стеатозом развијају стеатохепатитис са фиброзом, а код других болест нема тенденцију прогресије, није до краја разјашњен. Постоји више доказа да на развој NAFLD, односно стеатохепатитиса, утичу генетски фактори. Speliotes и сар. су утвдили повезаност G алела rs738409 са степеном хистолошких промена у јетри, стеатозом, лобуларном инфламацијом и фиброзом, али не и са метаболичким синдромом, обимом струка, инсулинском резистенцијом [110]. Valenti и сар. су први утврдили у две независне групе пацијената, са хистолошки потврђеном NAFLD, да хомозиготи за I148M алел имају 3,3 пута већи ризик да развију NASH и фиброзу [111]. Асоцијација PNPLA3 I148M полиморфизма са степеном фиброзе је доказана и у недавно објављеној мета анализи. Наиме, резултати мета анализе указују да GG хомозиготи имају 3,24 пута већи некроинфламаторни скор и 3,2 пута већи ризик развоја фиброзе у поређењу са CC хомозиготима [112]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 27 Недавна студија Liu и сар. потврђује јаку удруженост PNPLA3 rs738409 C>G полиморфизма код пацијената са HCC на терену NAFLD (p<0,0001). Степен удружености пропорционалан је броју присутних G алела, независно од фактора ризика, као што су године, пол, гојазност, дијабетес и присуство цирозе. Носиоци GG алела имају до пет пута већи ризик развоја HCC и млађи су до 4 године од носиоца CC алела [113]. Ови подаци сугеришу да I148M варијанта постаје критичан фактор обољевања од NAFLD у присуству предиспонирајућих фактора, као што су инсулинска резистенција у висцералној гојазности, повећани флукс слободних масних киселина, повећана липогенеза у условима хиперинсулинемије или измењен метаболизам масти [108]. 2.5. Клиничке манифестације и лабораторијски налази Неалкохолна масна болест јетре је обично асимптоматска, клинички нема болест. Болест се углавном открива случајно током рутинских лабораторијских анализа крви, затим у току антилипемичне терапије, када се открију повишене вредности аминотрансфераза или се ултразвучним прегледом открије масна јетра. Симптоми болести су неспецифични и минимални у виду дискомфора у горњем десном квадранту абдомена, слабости, умора и мучнине. Физикалним прегледом код највећег броја болесника утврђује се централна гојазност и хепатомегалија [3, 8]. У каснијим стадијумима болести може се јавити жутица, дистензија абдомена, гастроинтестинално крварење и конфузија што указује на развој NASH повезане цирозе јетре [114]. Случајно откривена стеатоза јетре imaging методама, код пацијента који има симптоме или знакове болести јетре или повишене вредности јетриних ензима, захтева евалуацију пацијента у смислу суспектне NAFLD [9]. Лабораторисјки тестови који се рутински раде у циљу евалуације пацијената сумњивих на NAFLD обухватају одређивање: ALT, AST, алкалне фосфатазе (ALP), GGT, билирубина, албумина, протромбинског времена (PT) и комплетну крвну слику (KKS) [115]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 28 Аминотрансферазе су повишене обично 3 до 4 пута изнад горње границе, флуктуирају и обично је ниво ALT виши од AST, мада AST може имати веће вредности нарочито код пацијената са NASH повезаном цирозом. Однос AST/ALT већи од 1 предиктор је развоја узнапредовале фиброзе (bridging/cirozа) [38]. Више од 80% пацијената са NAFLD имају нормалне вредности аминотрансфераза, које могу остати непромењене и у току прогресије болести [17, 116]. У Dallas Heart Study више од 79% пацијената са NAFLD имало је нормалне вредности ALT [23]. Студија Mofrad и сар. показала је да се код пацијената са нормалним вредностима ALT може наћи читав хистолошки спектар NAFLD [117]. Сходно томе на NAFLD треба посумњати код пацијената са утврђеним факторима ризика. Историја болести нарочито треба да се усресреди на стања често удружена са „примарном“ NAFLD, као што су метаболички синдром, дијабетес, гојазност и кардиоваскуларне болести, али је потребно искључити и друге узроке стеатозе јетре и то: конзумирање алкохола, претходне операције на цревима, полицистичну болест оваријума или употребу лекова као што су амиодарон и тамоксифен [118]. Године старости, гојазност, дијабетес и однос AST/ALT>1 предиктори су развоја прогресивних форми болести, односно могу помоћи у селекцији пацијената са NASH и узнапредовалом фиброзом, што такође треба узети у обзир [38]. Скрининг за NAFLD код пацијената са метаболичким синдромом или дијабетесом и уредним налазима јетриних биохемијских тестова засад није препоручен у смерницама Америчког удружења за проучавање болести јетре (AASLD, енгл. American Association for The Study of Liver Diseases), с обзиром на недостатке везано за сазнања о оптималној дијагностици, лечењу и дугорочној користи [9]. Вредности ALP могу бити средње повишене код пацијената са NAFLD, али је њихов значај у дијагностици NASH мали [13]. У студијама су забележене изоловано повишене вредности ALP код пацијената са NAFLD и нормалним вредностима аминотрансфераза [119]. Повишене вредности AST и GGT корелирају са степеном стеатозе јетре, али су мање осетљиви у односу на ALT [58]. Студија Tahan и сар. налази да изоловано повишене вредности GGT код пацијената са NAFLD корелирају са степеном фиброзе. Користећи граничну вредност GGT од Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 29 96,5 U/L, GGT предвиђа узнапредовалу фиброзу са специфичношћу 83% и сензитивношћу од 69% [120]. Снижене вредности албумина, протромбинског времена и повишене вредности билирубина јављају се у одмаклим фазама болести, односно са развојем NASH повезане цирозе [13]. 2.6. Дијагноза NAFLD Прва и најчешће коришћена дијагностичка метода за скрининг асимптоматских пацијената са повишеним аминотранферазама и суспектом NAFLD је ултразвук. Ултразвук је неинвазивна, јефтина, доступна метода, чија је сензитивност од 60% до 94%, а специфичност 66% до 97% [121]. Ултразвучне промене код пацијената са NAFLD карактерише хепатомегалија, хиперехогеност паренхима јетре („светла“ јетра), хепаторенални контраст, атенуација ултразвучних таласа у субкапсуларним регијама, отежана визуализација портне вене, зида жучне кесе, капсуле јетре и крвних судова [122, 123]. Ултразвук има одређене недостатке. Сензитивност и специфичност UZ у дијагностици NAFLD значајно опада код гојазних пацијената и мања је од 40% [124]. Сензитивност UZ значајно опада уколико је стеатоза мања од 30% [125]. Ултразвуком није могуће разликовати стеатозу од стеатохепатитиса и фиброзе [115,126]. Lijima и сар. су у студији пацијената са NAFLD користили контрастни UZ и контраст Левовист, и утврдили да акумулација контраста 20 минута након апликације значајно опада код пацијената са NASH и фиброзом у односу на пацијенте са стеатозом [127]. Компјутеризована томографија има ограничену употребу у евалуацији стеатозе јетре, са једне стране због зрачења, доступности и цене прегледа, а са друге због интер и интра индивидуланих варијација које се јављају у раду. Неалкохолна масна јетра се на CT карактерише атенуацијом у нивоу паренхима јетре у поређењу са интрахепатичним крвним судовима, слезином и бубрезима, што се изражава у Хоунсфиелдовим јединицама (HU). Разлика у атенуацији између Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 30 јетре и слезине од -10 HU или јетра - слезина однос мањи од 1 су предиктивни за стеатозу јетре. Јетра-слезина однос мањи од 1 има сензитивност од 73% до 100% и специфичност 95% до 100% у дијагностици стеатозе, која захвата више од трећине паренхима јетре [128]. Компјутеризована томографија без контраста је сензитивнија у процени стеатозе јетре у односу на CT са контрастом и од значаја је у дијагностици код пацијената са фокалном стеатозом [123]. Магнетна резонанца је осетљивија од UZ и CT у детекцији стеатозе јетре и у стању је да детектује стеатозу мању од 3%. Варијанта MR, протонска MRS такође детерминише степен стеатозе са добром хистолошком корелацијом. Међутим, MR и MRS су скупе методе, чија је употреба лимитирана доступношћу. Ниједна од ових метода нема довољну сензитивност и специфичност у стадирању NAFLD, односно дијагностици NASH и фиброзе [126]. Транзијентна еластографија или FibroScan, спада у групу неинвазивних метода која се темељи на принципу пропорционалности брзине ширења механичког или ултразвучног таласа са тврдоћом ткива јетре, које је утолико тврђе уколико има више везивног ткива. Ради се о уређају који има механички вибратор коаксијално спрегнут са UZ трансдусером и који прислоњен у интеркостални простор одашиље механички импулс у јетру, чију брзину ширења детектује ултразвучна сонда на темељу доплерског учинка и израчунава вредност изражену у kPa према једначини за Young-ов модул еластичности [129]. Метода је поузданија у дијагностици цирозе у односу на утврђивање значајне фиброзе. Према мета анализи 50 студија (8.433 болесника) са различитим болестима јетре AUROC (енгл. area under the receiver operated curve) за цирозу износи 0,87 до 0,98, просечно 0,94 (оптимална средња вредност 13,01 kPa), а за значајну фиброзу 0,75 до 0,93, просечно 0,84 (оптимална средња вредност 7,65 kPa) [130]. FibroScan је јефтина, безболна метода која се може изводити крај постеље пацијента или у амбуланти, има задовољавајућу прецизност и репродуцибилност у дијагнози фиброзе јетре. Ограничавајући чиниоци ове методе су хабитус болесника, односно гојазност, узани међуребарни простори и присуство асцита. Yoneda и сар. су процењивали тврдоћу јетре користећи FibroScan код 67 пацијената са хистолошки доказаном NAFLD и налазе корелирали са хистолошким. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 31 FibroScan је имао AUROC за фиброзу другог степена 0,87, фиброзу трећег степена 0,90 и цирозу 0,99 [131]. Комбинација транзијентне еластографије са серумским маркерима је потенцијални неинвазивни метод процене фиброзе код пацијената са NAFLD. Евалуација пацијената са суспектном NAFLD, захтева искључење секундарних узрока стеатозе јетре и других етиолошких фактора хроничног обољења јетре. Код пацијента са суспектном NAFLD могу се наћи повишене вредности феритина. Уколико је повишена и сатурација трансферина неопходно је генско тестирање на хемохроматозу, а код хомозигота или хетерозигота C282Y мутације у HFE гену, потребна је биопсија јетре са одређивањем концентрације гвожђа у сувој материји јетре. Код пацијената са NAFLD као епифеномен често се налазе повишене вредности аутоантитела. Висок титар аутоантитела, уз лабораторијске налазе високих вредности аминотрансфераза и високих вредности глобулина, захтевају даље детаљно испитивање у смислу аутоимуне болести јетре. Неалкохолна масна болест јетре по дефиницији подразумева искључење конзумирања значајних количина алкохола. Препоруке AASLD су да значајно конзумирање алкохола подразумева више од 21 пића недељно за мушкарце и 14 пића за жене у периоду од две године пре биопсије јетре [9]. Тренутно доступни неинвазивни маркери за постављање дијагнозе NAFLD укључују клиничке симптоме и знаке болести, лабораторијске тестове, imаging методе и комбинацију лабораторијских и клиничких тестова. Већина ових испитивања је довољна за дијагнозу NAFLD, али не и за прогнозу болести, односно имају малу специфичност и сензитивност у диферентовању NAFL и NASH и одређивању степена фиброзе. Због тога је биопсија јетре и даље „златни стандард“ у постављању дијагнозе NASH [126]. Патохистолошком анализом ткива добијеног у току биопсије могуће је поставити дијагнозу NAFLD, разликовати обичну стеатозу од стеатохепатитиса, проценити степен некроинфламаторних промена и стадијум фиброзе. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 32 Биопсија јетре има своје недостатке: инвазивна је, захтева често хоспитализацију пацијента и седацију, одређени трошак, праћена је боловима у горњем десном квадранту абдомена или десном рамену и ређе компликацијама. Најозбиљнија, али ретка компликација биопсије јетре је интраперитонеална хеморагија. Остале ретке компликације су билијарни асцитес, билијарни перитонитис, билијарни плеуритис, пнеумоторакс, пнеумоперитонеум, субфренични апсцес и хематом [132]. Горе наведене могуће компликације представљају лимитирајући фактор у понављању биопсија у циљу праћења прогресије болести и ефекта терапије. Са друге стране, биопсијски узорак представља педесетохиљадити део ткива јетриног паренхима, који у току прогресије саме болести није подједнако захваћен патолошким променама, што утиче на варијабилност самог узорка, а самим тим и на валидност патохистолошког налаза [133]. Последњих година посебна пажња се поклања истраживању и налажењу неинвазивних биомаркера NAFLD који би се користили у скринингу популације, стадирању болести, праћењу прогресије болести и ефекта терапије, односно заменили биопсију јетре. Брза, неинвазивна процена фиброзе код пацијената са NASH је од великог клиничког интереса, јер су такви пацијенти на високом ризику да развију компликације као што је портна хипертензија или HCC и зато захтевају континуирано праћење. Нови биомаркери морају бити довољно сензитивни да идентификују оболеле особе од NAFLD, специфични да искључе особе без болести, јефтини, једноставни за употребу и лако поновљиви. Идеални биомаркер треба да помогне у праћењу прогресије болести кроз време, праћењу терапијског одговора и да омогући процену прогнозе болести. Бројне студије су усресређене на истраживање биомаркера, мерљивих серумских параметара инфламације, апоптозе хепатоцита, фиброзе и оксидативног стреса. У ту сврху анализиране су дијагностичке могућности TNF-α, hs-CRP, адипонектина, лептина, хијалуронске киселине, интерлеукина-6, пентраксина 3 и феритина као маркера инфламације који се ослобађају у току развоја NASH [115, 126, 134, 135]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 33 Најзначајнији биомаркер, који највише обећава у дијагнози NASH је цитокератин-18. Цитокератин-18 је најважнији интермедијарни цитоскелетални протеин у јетри који се ослобађа у току апоптозе хепатоцита, дејством активираних специфичних интраћелијских протеаза, каспаза 3 и 7 које разлажу више интраћелијских структура, између осталог и CK-18. Разлагањем CK-18 ослобађа се неоепитоп, CK18Asp396 (М30) који се може детектовати моноклоналним антителом М30, што омогућава процену ћелиске апоптозе коришћењем имуноензимских тестова (ELISA). Коришћењем других врста ELISA, М65 и M65ED, мери се ниво фрагментисаног, али и интактног CK-18, односно укупна ћелијска смрт, укључујући апоптозу и некрозу. Прве студије које су забележиле повишене нивое фрагмената CK-18 у крви користећи ELISA технику рађене су код пацијената са хроничним хепатитисом C. Wieckowska и сар. су код 44 пацијента са хистолошки доказаном NAFLD мерили концентрацију CK-18 у плазми. Ниво CK-18 у плазми био је значајно виши код пацијената са хистолошки потврђеним NASH у односу на обичну стеатозу јетре и нормалну биопсију (средња вредност: 766 U/L [480-991] vs. 202 U/L [160-258] vs. 215 U/L [150-296], p<0,01). У студији је одређена гранична вредност CK-18 од 395 U/L са одличном сензитивношћу и специфичношћу у дијагнози NASH (AUROC 0,93, сензитивност 85,7%, специфичност 99,9%) [136]. Слични су резултати мултицентричне студије Feldstein и сар. Резултати студије су показали да пораст нивоа CK-18 у плазми повећава вероватноћу потврде NASH на биопсији јетре. Ниво CK-18 је био значајно виши код пацијената са фиброзом у поређењу са пацијентима без фиброзе (средња вредност: 305 (192, 493) vs. 193 (151, 261); p<0.001), као и у стадијуму 2 и 3 фиброзе у односу на стадијум фиброзе 0-1 (средња вредност: 304 (211, 575) vs. 211 (154, 363); p<0.002). Специфичност CK-18 теста у дијагнози NASH у овој студији била је већа од 90%, а сензитивност је износила 80% [102]. Shen и сар. су у групи пацијената са NAFLD одређивали CK-18 М30, М65 и М65ED одговарајућим ELISA тестовима. Серумски нивои апоптотичког биомаркера М30 и биомаркера укупне ћелијске смрти М65 и М65ED, били су значајно виши у NAFLD групи у односу на контролу, а предиктивна вредност за Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 34 NASH била је слична у сва три теста (AUROC 0,8). Серумски нивои М30 имали су сензитивност и специфичност од 80% у дијагностици прогресије болести и развоја NASH, а серумски нивои М65ED сензитивност 81% и специфичност 74% у дијагностици фиброзе [137]. Резултати студија Joka и сар. сугеришу да су ELISA тестови који мере нивое укупног CK-18 у крви, попут М65/М65ED супериорнији у односу на М30 у детекцији средње изражене фиброзе и стеатозе [138]. Налази ових и других студија указују да је плазма/серум CK-18 обећавајући биомаркер NASH, који би могао да се користи у праћењу активности болести и одговора на терапију. Резултати мета анализа десет студија на више од 1000 пацијената са NAFLD су потврдили да је CK-18 специфичан биомаркер за NASH (AUROC 0,82) [139]. Међутим, резултати недавних студија, укључујући секундарну мета анализу, показали су мању тачност CK-18 и сензитивност око 60% [140]. Поред охрабрујућих резултата CK-18 се не користи рутински у клиничкој пракси, јер још увек не постоји јасно дефинисана гранична вредност CK-18 за дијагнозу стеатохепатитиса [9]. У настојању да побољшају прецизност неинвазивних параметара у дијагнози NASH и процени присуства и стадијума фиброзе, неколико група истраживача је креирало панеле користећи различите комбинације клиничких и биохемијских параметара обједињених у одређену формулу. Дијагностички панели за NAFLD могу бити подељени у две категорије, једни за дијагнозу NASH и други за дијагнозу фиброзе. Различите студијске групе су се бавиле развојем неинвазивних дијагностичких панела за NASH, најзначајнији су: HAIR скор (хипертензија, ALT и инсулинска резистенција), NAFIC скор (феритин, инсулин и тип IV колагена), NAFLD дијагностички панел (дијабетес, пол, BMI, триглицериди и CK-18), NASH test (године, пол, висина, тежина, триглицериди, GGT, холестерол, α 2 макроглобулин, AST, ALT, аполипопротеин А1, хаптоглобин и тотални билирубин), NASH Diagnostic (CK-18, адипонектин, резистин), Palekar скор (године, пол, AST, BMI, AST/ALT однос и хијалуронска киселина) и други. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 35 У групи дијагностичких панела за процену фиброзе најзначајнији су: AST/ALT однос, FIB-4 тест (године, тромбоцити (ТR), AST, ALT), APRI index (AST, ТR), BARD скор (BMI, AST/ALT однос, дијабетес), FibroMeter (године, тежина, гликемија, AST, ALT, феритин, ТR), NAFLD фиброзни скор и други [115, 126, 134, 135]. Једини панел који је препоручен у најновијим смерницама Америчке асоцијације за проучавање болести јетре и Америчке гастроентеролошке асоцијације је NAFLD фиброзни скор [9]. Angulo и сар. су 2006. године на великој групи испитаника са NAFLD креирали NAFLD фиброзни скор комбинујући 6 варијабле у математичку формулу, у циљу издвајања пацијената са узнапредовалом фиброзом (F3-F4) и без узнапредовале фиброзе (F1-F2). Скоринг систем користи следеће варијабле: године, BMI, гликемију наште, односно присуство дијабетеса, AST/ALT однос, број тромбоцита и албумине. Користећи две граничне вредности, могуће је селектовати пацијенте са узнапредовалом фиброзом, код којих је резултат NAFLD фиброзног скора већи од 0,676, док одсуство узнапредовале фиброзе детерминише NAFLD фиброзни скор мањи од -1,455. Користећи нижу граничну вредност -1,455, узнапредовала фиброза је могла бити искључена са високом тачношћу (негативна предиктивна вредност 93%). Користећи вишу граничну вредност 0,676, присуство узнапредовале фиброзе је могло бити такође утврђено са високом прецизношћу (позитивна предиктивна вредност 90%). Вредности између граничних, припадају групи недетерминисаних вредности. Користећи NAFLD фиброзни скор Angulo и сар., известили су да је у њиховој студији код 75% пацијената биопсија јетре могла бити избегнута, са тачношћу од 90% [141]. Иако се неинвазивни тестови за дијагнозу NAFLD/NASH стално развијају, тачност ових тестова је неадекватна. Највећи недостатак ових панела неинвазивних биомаркера је што су били предмет истраживања студија пресека, а не лонгитудиналних студија, тако да је њихов значај у праћењу болести и предвиђању одговора на ординирану терапију Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 36 непознат. Посебан проблем представља категоризација пацијената са NAFLD у почетним и средњим стадијумима NASH неинвазивним тестовима. Тренутно је само биопсијом јетре могуће прецизно проценити обим и тип стеатозе, некроинфламаторну активност и фиброзу, и потвдити дијагнозу NAFLD/NASH. Хистопатолошка анализа биопсијских узорака пацијената са NAFLD је и даље златни стандард у постављању дијагнозе NAFLD/NASH. На крају треба дати одговор на питање којим пацијентима са NAFLD треба препоручити биопсију јетре, узимајући у обзир да прогноза болесника са обичном стеатозом и стеатохепатитисом није иста. Према тренутно важећим смерницама AASLD из 2012. године, биопсију јетре треба размотрити код пацијената са NAFLD који су на повећаном ризику од стеатохепатитиса и фиброзе, а у ову групу треба уврстити пре свега пацијенте са метаболичким синдромом и пацијенте код којих резултат NAFLD фиброзног скора упућује на могуће присуство узнапредовале фиброзе. Биопсију јетре треба размотрити и код пацијената са NAFLD код којих остали секундарни узроци стеатозе и хроничне болести јетре не могу бити искључени другим дијагностичким методама. Код асимптоматских пацијената, са случајно откривеном стеатозом ултразвучним прегледом и нормалним вредностима биохемијских налаза јетриних проба, биопсија јетре не може бити препоручена [9]. 2.7. Патохистолошке карактеристике NAFLD и NASH Као што је раније речено, патохистолошка анализа ткива јетре код пацијената са NAFLD је златни стандард у постављању дијагнозе NAFLD/NASH. Патохистолошком анализом потврђујемо дијагнозу болести, односно искључујемо друге могуће узроке стеатозе и хроничног обољења јетре. Истовремено врши се евалуација и семиквантификација некроинфламаторне активности, фиброзе и архитектонског ремоделовања [142]. Хистолошки спектар NAFLD укључује: § различите облике малих и великих капљица макровезикуларне стеатозе, са или без лобуларне и порталне инфламације и Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 37 § стеатохепатитис, који се карактерише стеатозом, инфламацијом и знацима оштећења хепатоцита. У завршном извештају AASLD конференције о NASH из 2002. године обједињене су хистопатолошке карактеристике NASH. Највећи број патолога користи ове критеријуме при постављању патохистолошке дијагнозе NASH. Најважнија хистопатолошка карактеристика NAFLD је стеатоза, односно акумулација масти у форми триглицерида унутар хепатоцита. Минимум критеријума за дијагнозу NAFLD је присуство више од 5% масно измењених хепатоцита у узорку ткива [1]. Хепатоцелуларна стеатоза је подељена у макровезикулану и микровезикуларну стеатозу. У макровезикуларној стеатози једна велика капљица масти или више малих јасно ограничених капљица, окупирају цитоплазму хепатоцита и дислоцирају нуклеус на периферију ћелије. У микровезикуларној стеатози нуклеус остаје центално смештен, а цитоплазма је испуњена бројним ситним капљицама масти. Стеатоза у NAFLD је обично макровезикуларна, мада и микровезикуларна стеатоза може бити присутна. Стеатоза у NAFLD обично почиње у зони 3 јетриног ацинуса, перивенуларно, мада се у тежим степенима стеатозе може видети и панацинусна стеатоза. У обичној стеатози могу се уочити фокуси лобуларне инфламације, благе порталне упале и липогрануломи. Знаци хепатоцелуларног оштећења и фиброзе се не налазе у обичној стеатози [143]. Тежина стеатозе обично се процењује семиквантитативно. Најрепродуцибилнији модел користи ацинарну архитектуру за дељење паренхима јетре на трећине и изражава у процентима степен захваћености паренхима јетре стеатозом: од 5% до 33% блага стеатоза, 33% до 66% умерена стеатоза и >66% изражена стеатоза [144]. У току прогресије NAFLD, са развојем фиброзе и цирозе, стеатоза може постепено да се губи, тако да не мора бити присутна у циротичној јетри. Минимални критеријуми за постављање хистолошке дијагнозе NASH укључују: присуство стеатозе, хепатоцелуларног оштећења (обично у виду Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 38 балонирања хепатоцита) и лобуларне инфламације (типично локализоване у зони 3 ацинуса). Присуство фиброзе није дијагностички критеријум NASH [11]. Хепатоцелуларно оштећење у NASH може бити у виду балонирања хепатоцита, апоптозе или литичке некрозе. Балонирање хепатоцита је најважнија хистолошка карактеристика NASH, у прогностичким студијама је удружено са прогресијом болести и високом инциденцом цирозе јетре [145]. Балонирани хепатоцити су увећани, са обилнијом, бледом цитоплазмом и имају велико хиперхоматско једро са израженим нуклеолусом. Капљице масти и/или Малоријева телашца могу се наћи у цитоплазми балонираних хепатоцита. Кератин 8 и 18 су у балонираном хепатоциту распоређени на периферији. Иако се балонирање хепатоцита може доказати уобичајним бојењем хематоксилин еозином, губитак кератина 8 и 18 у хепатоциту доказан имунолошким бојењем, може помоћи у препознавању балонирања хепатоцита. Апоптотичка (ацидофила) телашца су чест налаз у NASH и последица су хепатоцелуларног оштећења, и програмиране смрти ћелија. Ацидофилна телашца се чешће налазе у синусоидима [146]. Идентификују се уобичајеним бојењем, али се додатно препознају имунохистохемијским бојењем на фрагменте кератина 18. Број ацидофилних телашаца на mm2 ткива јетре (acidophil body index) се користи као комплементарна хистолошка карактеристика када је дијагноза NASH несигурна [142]. Лобуларна инфламација је обично блага и састављена је од мешовитог запаљенског инфилтрата (лимфоцити, неутрофили, еозинофили и Купферове ћелије). Полиморфонуклеари понекад окружују балониране хепатоците (обично садрже Малоријева телашца) и ова лезија се назива satellitosis. Лобуларни микрогрануломи (агрегати синусоидалних Купферових ћелија) и липогрануломи (састављени од масних капљица, инфламатормих ћелија и колагена) су чест налаз у NASH [146, 147]. Портална инфламација у NAFLD/NASH је обично одсутна или средње изражена. У случајевима када је портална инфламација диспропорционално изражена, треба искључити друге хроничне болести јетре (хепатитис C или аутоимуни хепатитис). Изражена портална инфламација код нелечених пацијената Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 39 са NAFLD може бити одраз прогресије болести, односно дефинитивног развоја NASH. Фиброза код пацијената са NASH обично почиње у зони 3 ацинуса и карактерише се одлагањем колагена и протеина екстрацелуларног матрикса дуж синусоида у зони 3 и око хепатоцита. Напредовањем болести може се јавити портална/перипортална фиброза, briдging фиброза и цироза јетре (NASH повезана цироза је микронодуларна или мешовита). У стадијуму цирозе, стеатоза и некроинфламаторна реакција могу нестати, па је ово стање познато као „прегорео“ NASH, а цироза је хистолошки квалификована као криптогена [142,146]. У мета анализи десет лонгитудиналних хистолошких студија, године и паренхимална или портална инфламација на иницијалној биопсији, били су независни предиктори прогресије у цирозу јетре [148]. Остале хистолошке промене које се могу наћи на патохистолошком узорку пацијенaта са NASH укључују: Малоријева телашца, мегаминтохондрије, гликогенизирана једра и депозицију гвожђа. Малоријева течашца су еозинофилне, интрацитоплазматске инклузије локализоване близу нуклеуса у балонираним хепатоцитима у зони 3 ацинуса, обично у подручју перисинусоидалне фиброзе и састоје се од кератина 8 и 18, убиквитина и p62 [149]. Присуство Малоријевих телашаса није неопходно за постављање хистолошке дијагнозе NASH, али је додатно потврђује. Малоријева телашца нису сpецифична за NASH, могу се јавити и у другим хроничним болестима јетре. Магамитохондрије су округле или облика игле, еозинофилне, интрацитоплазматске инклузије, које се чешће јављају у хеpатоцитима код микровезикуларне стеатозе. Последица су липидне пероксидације или представљају адаптивну реакцију. Гликогенизирана једра су вакуолизована једра локализована у перипорталним хепатоцитима. Њихово присуство у патохистолошкој анализи потврђује неалкохолну етиологију NASH, јер се врло ретко јављају код алкохолног стеатохепатитиса. Хепатична сидероза у NASH је обично блага и јавља се у перипорталним хепатоцитима и/или панацинарно у ретикулоендотелним ћелијама [142]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 40 Тренутно су у употреби два система стадирања патохистолошких промена у NAFLD. Brunt и сар. су 1999. године развили први систем стадирања патохистолошких промена у NAFLD, као одговор на потребу за прецизном класификацијом патохистолошких промена у NASH, а његова једноставна уpотреба и репродуцибилност је доказана протеклих година. Процењујући стеpен хепатоцелуларне стеатозе, балонирања хепатоцита и инфламације (интралобуларне и порталне), Brunt и сар. су некроинфламаторну активност у NASH класификовали у три градуса: градус 1 (блага), градус 2 (умерена) и градус 3 (изражена) (Табела 3.). Истовремено су предложили стадирање фиброзе у четири стадијума, зависно од локализације и раширености фиброзе: стадијум 1, зона 3 перисинусоидалне фиброзе; стадијум 2, исто као 1 уз жаришну или екстензивну порталну/перипорталну фиброзу; стадијум 3, премошћавајућа фиброза и стадијум 4, цироза [144]. Табела број 3. Градирање некроинфламаторне активности према Brunt и сар. Градус Стеатоза* Балонирање Инфламација 1 (блага) 1-2 Благо 0-1 лобуларна 0-1 портална 2 (умерена) 2-3 Присутно-зона 3 2 лобуларна 1-2 портална 3 (изражена) 3 Изражено-зона 3 3 лобуларна 1-2 портална Легенда: *Стеатоза (градус 1.мање од 33% хепатоцита, градус 2. 33% до 66% хепатоцита, градус 3. више од 66 % хепатоцита) NASH Clinical Research Network (CRN) је 2005. године субкласификовао стадијум 1 фиброзе у 3 категорије: стадијум 1А блага перисинусоидна фиброза у зони 3, стадијум 1B умерена перисинусоидална фиброза у зони 3 и стадијум 1C портална/перипортална фиброза. NASH CRN је развио NAFLD activity score (NAS), који обухвата читав хистолошки сpектар NAFLD и омогућава евалуирање хистолошких промена у NAFLD кроз време, као и прецизно упоређивање налаза биоpсија у клиничким студијама на основу броја бодова добијених семиквантитативним оцењивањем pојединих хистолошких карактеристика. Резултат скора се израчунава сабирањем Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 41 скорова стеатозе (0-3), лобуларне инфламације (0-3) и балонирања (0-2), а вредности NAS се крећу од 0-8 (Табела 4.) [150]. Поједине студије користиле су вредности NAS≥5 као сурогат за pостављање хистолошке дијагнозе NASH, а биоpсије са NAS≤2 су означаване као „not NASH“. Вредности између ових означавају се као граничне (borderline). Недавно су Brunt и сар. након ревизија биопсија 976 pацијаната укључених у NASH CRN, нашли да је само 75% биопсија са дефинитивним NASH имало NAS 5, 28% је припадало граничној групи, 7% „not NASH“ биопсија имало је NAS 5 и 29% са NAS 4 су имали NASH. Аутори су закључили да патохистолошки налаз NASH није увек у корелацији са резултатима NAS [151]. Табела број 4. Комpоненте NAFLD activity score. Комpоненте Дефиниција Score Стеатоза мање од 5% 5%-33% >33% до 66% >66% 0 1 2 3 Лобуларна инфламација Одсутна Мање од 2 жаришта 2-4 жаришта Више од 4 жаришта 0 1 2 3 Комpоненте Дефиниција Score Балонирање Одсутно Благо Много балонираних ћелија 0 1 2 2.8. Природни ток болести и прогноза Дугорочно праћење пацијената са NAFLD у циљу процене природног тока и прогнозе болести било је предмет више студија. У завршном извештају AASLD из 2012. године, резултати ових студија су обједињени и на основу њих је закључено: а) пацијенти са NAFLD имају већу стопу укупног морталитета у односу на општу популацију, Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 42 б) најчешћи узрок смрти пацијената са NAFLD и NASH су кардиоваскуларна обољења и ц) пацијенти са NASH (али не и са NAFL) имају повећану стопу морталитета везаног за јетру [9]. Најчешћи разлог смрти пацијената са NAFLD су кардиоваскуларна обољења, затим малигнитети и на трећем месту су болести јетре [10, 152, 153]. Пацијенти са NAFLD, два пута чешће умиру од кардиоваскуларних болести у односу на општу популацију [154, 155] и у односу на пацијенте са другим болестима јетре [156]. Обољења јетре као узрок морталитета код пацијената са NAFLD су на трећем месту, а у општој популацији су на тринаестом месту. Пацијенти са NAFLD умиру девет пута чешће од обољења јетре у односу на општу популацију [153]. Упркос чињеници да NASH представља прогресивно обољење у односу на NAFL, нема разлике у укупном кардиоваскуларном морталитету између пацијената са обичном стеатозом и NASH, док је код пацијената са NASH десет пута већи морталитет услед обољења јетре у односу на пацијенте са обичном стеатозом [154]. Неалкохолна масна јетра је бенигно, непрогресивно обољење, док NASH прогредира у 26% до 37% случајева до фиброзе и доводи до развоја цирозе јетре у 20-30% [33, 145, 157, 158]. Развој NASH повезане цирозе има лошу дугорочну прогнозу. Десетогодишња стопа морталитета износи 20% код Child-Pugh А пацијената и 45 % развијају декомпензацију болести унутар 10 година од дијагнозе. Пацијенти са NASH повезаном цирозом имају значајан ризик развоја HCC (2,6% годишње) [158]. Присуство мултиплих метаболичких поремећаја код пацијената са NAFLD значајно повећава ризик за развој NASH и фиброзе [7, 38, 59]. Године (више од 45 година), гојазност, дијабетес и однос AST/ALT већи од 1 су предиктори узнапредовале фиброзе (bridging фиброзе/цирозе) [38]. Пацијенти са криптогеном цирозом имају диспропорционално висок степен метаболичких ризичних фактора (DM тип 2, гојазност и метаболички синдром), што је карактеристика пацијената са NAFLD [155,159]. Дијабетес мелитус тип 2 и гојазност се виђају код више од 70% пацијената са криптогеном цирозом, што је много чешће у односу на пацијенте са вирусном или алкохолном цирозом. Са друге стране на патохистолошким узорцима ткива пацијената са криптогеном цирозом Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 43 нађе се једна или више хистолошких карактеристика NASH, што су индиректи показатељи прогресивног тока болести пацијената са NASH и везе са криптогеном цирозом [9, 14, 32, 155]. Препоруке AASLD конференције о NASH из 2012. године су да пацијенти са NASH цирозом треба да буду подвргнути скринингу за гастроезофагеалне варикозитете и HCC скринингу [9]. У 40% до 62% случајева пацијенти са NASH повезаном цирозом развијају компликације цирозе, укључујући HCC после 5 до 7 година праћења [152, 159]. Хистолошке карактеристике NASH често нису присутне у стадијуму цирозе, што отежава дијагнозу болести. Најважнији фактори ризика развоја криптогене цирозе, самим тим и HCC су узнапредовала фиброза, старост, дијабетес, гојазност и депозиција гвожђа [160]. Bugianesi и сар. су 2002. године пратили 641 пацијента са HCC. Од 641 пацијента, 6,9% су развили HCC на терену криптогене цирозе. Ови пацијенти су упоређивани са пацијентима који су имали HCC на терену HCV цирозе, HBV цирозе и алкохолне цирозе. Након компарације, анализирани подаци су показали да су гојазност, дијабетес, дислипидемија и инсулинска резистенција, односно поремећаји који су удружени са NASH, били сигнификантно урдужени и са налазом криптогене цирозе [32]. У следећих десет или двадесет година очекује се да NASH буде најчешћи разлог узнапредовалих болести јетре, а самим тим и најчешћи разлог трансплантације јетре [14]. Према научном регистру реципијената трансплантанта (SRTR) у Америци, NASH-повезано end-stage обољење јетре је тренутно трећи најчешћи разлог трансплантације јетре, после хепатитиса C и алкохолне цирозе. Последњих година забележен је тренд пораста трансплантација јетре због NASH, од 1,2% 2001. године на 9,7 % 2009. године [12]. Због дугог, индолентног клиничког тока, NASH се често превиди код пацијената, тако да се пацијенти јављају у одмаклој фази болести, са више коморбидитета, већим промером самог тумора, када је и прогноза лошија. Очекује се да временом компликације NASH расту, с обзиром на епидемију гојазности, дијабетеса и метаболичког синдрома [160]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 44 2.9. Терапија NAFLD Упрокос бројним истраживањима, данас не постоји ефикасна терапија за NAFLD. Највећи број терапијских модалитета код пацијената са NAFLD показују ефикасност у смањењу степена стеатозе, инфламације, балонирања, али не и степена фиброзе. Сматра се да је разлог недовољне ефикасности терапије NAFLD или не постојање довољно ефикасног антифибротичког лека или недовољно дуго праћење пацијената у студијама, што условљава недовољно времена за адекватне процене. Терапијски приступ пацијентима са NAFLD подразумева „лечење пацијената“ и „лечење јетре“, односно следеће приступе: a) промену животних навика (дијета и/или физичка активност), b) терапију лековима и c) хируршку терапију [161]. 2.9.1. Промена животних навика Резултати лонгитудиналних, рандомизованих студија подржавају употребу дијете и физичке активности, као прве терапије у лечењу пацијената са NAFLD и коморбидитета [161, 162]. Мета анализа рандомизованих студија Musso и сар. из 2012. године показала је да редукција телесне тежине 5% и више, значајно смањује стеатозу и повољно утиче на кардиометаболичке факторе ризика код пацијената са NAFLD, док редукција телесне тежине више од 7% смањује стеатозу, лобуларну инфламацију, балонирање, али не и фиброзу [163]. У рандомизованој, контролисаној студији Promrat и сар. испитивали су ефикасност комбинације дијете, физичке активности и промена у понашању код 31 гојазног пацијента са хистолошки доказаним NASH у односу на контролну групу. Пацијенти који су редуковали тежину за 7% или више, имали су значајно смањење хистолошке активности болести, NAS, али не и фиброзе [164]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 45 Према препорукама AASLD из 2012. године, потребна је редукција телесне тежине 3% до 5% у циљу смањења стеатозе, а у циљу смањења некроинфламаторне активности потребна је редукција телесне тежине 10% [9]. Квалитет дијете пацијената са NAFLD има велики значај у патогенези болести, јер је доказано да пацијенти са NAFLD конзумирају велике количине засићених масних киселина и холестерола, пића која садрже фруктозу и мале количине витамина А и Е [165, 166]. Брзи губитак телесне тежине може довести до погоршања болести, односно фиброзе, тако да је много битније „квалитативно“ смањење телесне тежине у односу на „квантитативно“. Пацијентима се препоручује квалитетна, балансирана дијета. Сатурисане масти и храна која садржи високе концентрације шећера, укључујући просте шећере, рафинисана зрна, пиринач и кромпир, морају бити ограничени у исхрани и замењени целим зрном, махунаркама, воћем и поврћем са малим садржајем шећера. Конзумирање полинезасићених масних киселина из ланеног семена и рибе имају повољно дејство на инсулинску осетљивост, као и антинфламаторно дејство [161]. Неколико студија је потврдило повољан ефекат редовног вежбања на NAFLD и IR. Редовно вежбање подразумева вежбање у току кога се губи 400 kcal, два до три пута недељно, у трајању 30 до 60 минута. Комбинација вежбања и дијете има синергистичко дејство [9, 156, 161]. Вежбање код одраслих пацијената са NAFLD, без других терапијских модалитета може да смањи степен стеатозе, али је његов утицај на друге хистолошке одлике у NAFLD непознат [9]. 2.9.2. Фармакотерапија NAFLD Терапија пацијената са NAFLD треба најпре да буде усмерена на терапију коморбидитета, као што су DM тип 2, IR, дислипидемија и хипертензија, који неповољно утичу не само на обољења јетре, већ и на кардиоваскуларне болести и укупан морталитет. Присуство NAFLD без коморбидитета није индикација за ординирање антидијабетика, хиполипемика или антихипертензивне терапије [156]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 46 Фармакотерапија пацијената са NAFLD још увек није универзално прихваћена. 2.9.2.1. Метформин и тиазолидини Узимајући у обзир блиску повезаност инсулинске резистенције и патогенезе NAFLD, лекови који побољшавају инсулинску осетљивост могли би представљати терапију избора за пацијенте са NAFLD. Највише тестирани лекови у терапији NAFLD/NASH су бигванидини (метформин) и тиазолидини (пиоглитазон и росиглитазон) [167]. Метформин је лек који побољшава инсулинску осетљивост својим повољним дејством на оксидацију масних киселина у масном ткиву, смањење глуконеогенезе и повећање преузимања глукозе у мишићима. Неколико клиничких студија је потврдило повољан терапијски ефекат метформина код пацијената са NAFLD, процењујући утицај различитих доза лека на ниво аминотрансфераза, MS и хистолошку активност. Razavizade и сар. су упоређивали ефикасност метформина и пиоглитазона код одраслих пацијената са NAFLD. Употреба метформина (1g/дневно) и пиоглитазона (30mg/дневно) након четири месеца довела је до сигнификантног смањења нивоа аминотрансфераза, холестерола, IR процењене хомеостатским моделом инсулинске резистенције (HOMA-IR, Homeostasis model insulin resistance assessment index) и стеатозе јетре у обе групе [168]. Резултати мета анализе Li и сар. доказују повољно дејство метформина на смањење нивоа аминотрансфераза, HOMA-IR, али не и на хистолошку активност болести [169]. Насупрот овим обећавајућим резутатима, резултати појединих студија су обесхрабрујући у погледу дејства метформина на ниво аминотрансфераза, степен хистолошких промена и инсулинску резистенцију. Рандомизована, двоструко слепа TONIC студија је упоређивала ефикасност метформина (500mg два пута дневно) и витамина Е (400IU дневно) са плацебом у терапији деце са NAFLD. Упоређујући ефикасност метформина и витамина Е са Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 47 плацебом, нису утврђене значајније промене у нивоу аминотрансфераза, степену стеатозе, лобуларне инфламације или фиброзе, изузев повољног дејства на балонирање хепатоцита у обе групе [170]. Рандомизована, двоструко слепа студија Haukeland и сар. је процењивала терапијски ефекат метформина код одраслих пацијената са NAFLD у односу на плацебо. Закључак студије је да није било сигнификантно значајне разлике у дејству метформина и плацеба на хистолошку активност болести, CT налаз, нивое аминотрансфераза и маркера инсулинске резистенције [171]. С обзиром да метформин није имао значајније повољно дејство на хистолошке промене код пацијената са NASH, према препорукама AASLD из 2012. године метформин није уврштен у специфичну терапију пацијената са NAFLD [9]. Тиазолидини су лекови који побољшавају инсулинску осетљивост активацијом PPAR γ рецептора, који су присутни у јетри, скелетним мишићима и масном ткиву. Агонисти PPAR γ (тиазолидини) побољшавају оксидацију масних киселина и смањују процес липогенезе у јетри. Тиазолидини побољшавају инсулинску осетљивост директно делујући на адипоците (повећањем броја и диференцијације адипоцита, стимулисањем преузимања глукозе) и индиректно путем смањења липолизе, смањеног ослобађања анти-инсулинских адипокина (TNF-α и резистин) и повећања инсулину сличних адипокина (адипонектин). Пиоглитазон је тиазолидин, чији је терапијски ефекат код пацијената са NAFLD испитиван у више студија. Рандомизована студија Belforta и сар. на 55 болесника са дијабетесом типа 2 или интолерацијом глукозе и хистолошки потврђеном дијагнозом NASH показала је да пиоглитазон (45mg/дневно) значајно смањује степен стеатозе, балонирања и инфламације у односу на плацебо. Забележено је значајно смањење нивоа аминотрансфераза, побољшање HOMA-IR и смањење некроинфламаторне активности у односу на плацебо, али не и степена фиброзе [172]. Резултати студије Aithal и сар. указују да пиоглитазон има задовољавајуће дејство на смањење фиброзе [173]. Рандомизовна, мултицентрична PIVENS студија је упоређивала ефикасност пиоглитазона, витамина Е и плацеба код 247 пацијената без дијабетеса, са Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 48 хистолошки доказаним NASH (пиоглитазон 30 mg/дан, n= 80 vs. Витамин Е 800 IU/дан, n=84 и vs. плацебо, n=83; за 96 недеља). Примарни циљ студије био је процена ефикасности пиоглитазона и витамина Е у редукцији NAFLD Activity Score. Примарни циљ није постигнут у групи пацијената на пиоглитазону, међутим пиоглитазон и витамин Е су довели до сигнификантног пада нивоа аминотрансфераза, IR, редукције степена стеатозе, лобуларне инфламације и хепатоцелуларног балонирања, док није било утицаја на степен фиброзе. На биопсији рађеној по завршетку терапије, комплетна резолуција стеатохепатитиса је утврђена код 47% пацијената на пиоглитазону у односу на 21% на плацебу [79]. Мета анализа која је обухватила четири рандомизоване, контролисане студије, које су процењивале ефикасност тиазолидина (росиглитазона и пиоглитазона) у односу на плацебо код пацијената са NASH, потврдила је повољан ефекат ова два лека на смањење стеатозе, лобуларне инфламације и некроинфламаторне активности. Пиоглитазон је показао повољно дејство и на смањење фиброзе [174]. Пиоглитазон има повољно терапијско дејство код пацијената са NASH, због чега је уврштен у специфичну терапију пацијената са доказаним NASH на биопсији јетре у препорукама AASLD из 2012. године. Међутим, ефикасност и безбедност дуготрајне примене пиоглитазона код пацијената са NASH још увек није установљена. 2.9.2.2. Витамин Е Оксидацијом слободних масних киселина код пацијената са NASH ослобађају се слободни радикали кисеоника, који делују директно цитотоксично и индиректно активирањем проинфламаторних цитокина. Обзиром на овај патогенетски механизам, разумна је употреба антиоксиданаса, пре свега витамина Е код пацијената са NAFLD и NASH. Ефикасност витамина Е у терапији пацијената са NAFLD је била предмет истраживања многих студија. Повољно фармакотерапијско дејство витамина Е се огледа у смањењу нивоа аминотрансфераза, смањењу стеатозе, балонирања, Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 49 инфламације и резолуције стеатохепатитиса, што је доказано у највећој клиничкој PIVENS студији [79]. Није утврђен повољан утицај витамина Е на фиброзу. Витамин Е је препоручен као прва линија терапије пацијената без дијабетеса са хистолошки потврђеним NASH у дози од 800 IU/дневно. Витамин Е се за сада не препоручује у терапији NASH код дијабетичара, NAFLD пацијената без биопсије, NASH цирозе као и криптогене цирозе, док будућа испитивања не буду доказала његову ефикасност [9]. Упркос одличним резултатима терапије витамином Е код пацијената са NASH, битна чињеница коју треба имати у виду код дуготрајне терапије витамином Е је могућност повећања свеукупног морталитета, што је било запажено у мета анализи Бјелаковића и сар [175]. 2.9.2.3. Хиполипемици Дислипидемија је увек присутна код пацијената са NAFLD, тако да је ефекат терапије хиполипемицима, односно статинима код NAFLD процењиван у више студија. Како су пацијенти са NAFLD на повећаном кардиоваскуларном ризику, неопходна је агресивна фармакотерапија кардиоваскуларних фактора ризика. Терапија хиполипемицима односно статинима је стуб ове терапије. Статини снижавају ниво LDL холестерола и на тај начин утичу на смањење кардиоваскуларног морбидитета и морталитета. Најчешћи нежељени ефекат терапије статинима је пораст нивоа аминотрасфераза. Доступни подаци указују да су статини безбедни у терапији пацијената са NAFLD. У опсервационој студији пацијената са хиперлипидемијом и повишеним аминотрансферазама, учесталост даљег повишења нивоа аминотрансфераза током терапије статинима је била слична као и код пацијената који нису користили статине у терапији, а имали су повишене аминотрансферазе [176]. Анализирани резултати студија у пероду од 1980. до 2012. године су показали да су хиполипемици, као што су фибрати и статини коришћени самостално или у комбинацији са цитопротективним лековима безбедни и поједини имају повољно фармакотерапијско дејство на смањење стеатозе код пацијената са Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 50 NAFLD/NASH. Тренутно важеће препоруке су при ставу да повишење аминотрансфераза мање од три пута изнад нормале није контраиндикација за ординирање статина уз редовне лабораторијске контроле [177, 178]. Према препорукама AASLD из 2012. године статини се могу користити за терапију дислипидемија код пацијената са NAFL и NASH. Не препоручује се њихова употреба у специфичној терапији NASH, док рандомизоване, контролисане студије не утврде њихово дејство на хистолошке промене [9]. 2.9.2.4. Омега-3 масне киселине и урсодеоксихолна киселина У контролисаној студији Zhu и сар. употреба омега-3 масних киселина у комбинацији са дијетом код пацијената са NAFLD имала је повољнији ефекат на смањење нивоа аминотрансфераза и степен стеатозе јетре процењен ултразвуком у односу на дијету самостално [179]. Према препорукама AASLD омега три масне киселине треба ординирати пацијентима са NAFLD и хипертриглицеридемијом, али не као специфичну терапију NAFL или NASH. Урсодеоксихолна киселина се не препоручује у терапији NAFL или NASH [9]. Бројни други лекови (пробиотици, пентоксифилин, анти TNF-α моноклонална антитета, glukagon-like-peptide-1 рецептор агонист, дипептидил пептидазе-4инхибитори и др.) се испитују у студијама као потенцијална терапија NAFL и NASH, али за сада нема задовољавајућих резултата и нових препорука. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 51 3. НАУЧНА ХИПОТЕЗА Основна претпоставка овог истраживања темељи се на сазнањима из великог броја студија, чији је императив истраживања био налажење неиназивних биомаркера, односно серумских параметара инфламације, апоптозе, оксидативног стреса и фиброзе, чијим мерењем је могуће поставити дијагнозу NASH и проценити степен прогресије болести. Тренутно једини критеријум на основу кога је могуће дијагностиковати NASH је патохистологија, односно биопсија јетре. С обзиром на инвазивност процедуре, могуће компликације, варијације узорка, интерпрентације од стране патолога намеће се потреба за откривањем нових једноставних, неинвазивних биомаркера, који би имали довољну сензитивност и специфичност да разликују обичну стеатозу од стеатохепатитиса и омогуће стадирање болести, што би знатно олакшало скриниг популације са NAFLD. Развој неинвазивних биомаркера омогућио би праћење прогресије болести и евалуацију одговора на терапију, и у клиничкој пракси и у клиничким студијама, што је данас једино могуће понављањем биопсије јетре. Брза, неинвазивна процена фиброзе код пацијената са NASH, од великог је клиничког интереса, јер су такви пацијенти на високом ризику да развију компликације као што је портна хипертензија или HCC и зато захтевају континуирано праћење. Ефикасан биомаркер или панел биомаркера би могао прецизно да мери степен инфламаторних и фиброзних промена у целом паренхиму јетре, који није хомогено захваћен болешћу, што би допринело дијагностичкој прецизности. Нови биомаркери морају бити довољно сензитивни да идентификују оболеле особе од NAFLD/NASH, специфични да искључе особе без болести, јефтини, једноставни за употребу и лако поновљиви. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 52 Најзначајнији биомаркер, који највише обећава у дијагнози NASH је цитокератин-18. Цитокератин-18 је најважнији интермедијарни цитоскелетални протеин у јетри који се ослобађа у току апоптозе хепатоцита. Пошто апоптоза хепатоцита представља критичан процес на путу прогресије NAFLD у NASH, мерење плазматских нивоа CK-18 може диферентовати NAFL од NASH, што је потврђено у више студија. Наследни фактори имају значајну улогу у предиспозицији ка неалкохолној масној болести јетре и I148M варијанта PNPLA3 гена је најважнији генски полиморфизам повезан са акумулацијом масти у јетри у свим етничким групама. На основу ових запажања, постављене су следеће хипотезе у току овог истраживања: § Цитокератин-18 је биомаркер апоптозе хепатоцита задовољавајуће сензитивности и специфичности у диферентовању стеатозе и стеатохепатитиса. § Плазматски ниво цитокератина-18 корелира са степеном некроинфламаторне активности и степеном фиброзе. § Адипонутрин или I148M варијанта PNPLA3 гена је удружена са повећањем нивоа аминотрансфераза (AST и ALT), као најосетљивијим маркерима оштећења хепатоцита и накупином триглицерида у јетри, што су показали резултати више студија. § PNPLA3 I148M варијанта гена је удружена са накупином триглицерида у јетри, независно од познатих метаболичких ризичних фактора. § PNPLA3 I148M варијанта је повезана са хистолошким степеном оштећења јетре код пацијената са NAFLD. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 53 4. ЦИЉЕВИ ИСТРАЖИВАЊА 1. Утврдити клиничко-биохемијске карактеристике неалкохолног масног обољења јетре, као и његових поткатегорија укључујући масну јетру и неалкохолни стеатохепатитис. 2. Утврдити главне ризичне факторе за настанак NAFLD. 3. Утврдити повезаност метаболичког синдрома и NAFLD. 4. Утврдити значај неинвазивних биомаркера и процедура (биохемијских анализа крви, ултразвука) у постављању дијагнозе неалкохолног масног обољења јетре, као и у класификацији NAFLD на подтипове. 5. Утврдити значај одређивања плазматског цитокератина-18 у постављању дијагнозе NAFLD. 6. Утврдити удруженост полиморфизма I148M PNPLA3 гена са биохемијским параметрима NAFLD, као и са хистолошким параметрима активности болести. 7. Испитати удруженост полиморфизма I148M PNPLA3 гена са метаболичким синдромом и корелирати са вредностима цитокератина-18 у плазми. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 54 5. ПАЦИЈЕНТИ И МЕТОДЕ РАДА Проспективно истраживање спроведено је у периоду од јануара 2012. до октобра 2014. године у Клиници за гастроентерологију и хепатологију Клиничког центра Ниш, у Нишу. Студија је обухватила 55 пацијената, 32 жене и 23 мушкарца, старости од 24 до 71. године, код којих је на основу анамнестичких података, физикалног прегледа, биохемијских анализа крви, антропометријских мерења и ултразвучног прегледа абдомена постављена дијагноза неалкохолне масне болести јетре и метаболичког синдрома. Критеријуми за укључивање пацијената у студију били су: § пацијенти мушког и женског пола старији од 18 година, § са метаболичким синдромом, § са повишеним вредностима аминотрансфераза, § са ултразвучним налазом масне јетре и/или § патохистолошким налазом стеатозе или стеатохепатитиса. Пацијентима код којих је на основу анамнестичких података, биохемијских анализа крви (повишене аминотрансферазе у временском периоду дужем од 6 месеци) и ултразвучног прегледа постављена сумња на неалкохолни стеатохепатитис, или узрок лезије јетре није био јасан, индикована је биопсија јетре. Пацијенти који су прихватили биопсију јетре укључени су у истраживање и касније анализе. Код пацијената, код којих је постављена сумња на друге могуће етиолошке факторе оштећења јетре (позитивна антитела која би упућивала на аутоимуне болести јетре, позитивна серологија на вирусне хепатитисе, позитивна анамнеза о употреби лекова и хемикалија, и могућем токсичном оштећењу јетре и др.) нису укључени у истраживање. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 55 Критеријуми за искључивање пацијената из студије: § конзумирање алкохола (више од 21 пиће недељно за мушкарце и више од 14 пића недељно за жене уназад две године). § употреба хепатотоксичних лекова (кортикостероиди, имуносупресиви, амиодарон). § метаболичке и генетске болести јетре (Wilson-ова болест, хемохроматоза, α 1 антитрипсин дефицијенција). § акутни и хронични вирусни хепатитиси (хепатитис B и хепатитис C) и § аутоимуне болести јетре (примарна билијарна цироза, примарни склерозирајући холангитис и аутоимуни хепатитиси). У контролну групу укључен је 31 испитаник, код којих је на основу анамнестичких података, антропометријских мерења, биохемијских анализа крви и ултразвучног прегледа, искључена дијагноза неалкохолне масне болести јетре, других болести јетре и метаболичког синдрома. Испитаници су потписали информисани пристанак и сагласност, чиме су потврдили своју сагласност о употреби анамнестичких, лабораторијских и патохистолошких налаза у сврху предложеног истраживања. Студија је одобрена од стране Етичког комитета Медицинског факултета Универзитета у Нишу, одлука број 01-10204-15. Истраживање је спроведено у складу са Етичким принципима Хелсиншке декларације и са принципима добре клиничке праксе. 5.1. Опрема коришћена у истраживању § Вага за мерење телесне тежине, § Висинометар за мерење телесне висине, § Апарат за биохемијска испитивања, Beckman Coulter, AU680, § Апарат за одређивање вредности инсулина, Cobas e411, § Aпарат аутотехникон, § Kлизни микротом, § Ултразвучни апарат, Siemens ACUSON X300 § Vortex mixer Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 56 § Centrifuga § DNK QIAcube, Qiagen, SAD § Капиларна електрофореза QIAxcel, Qiagen, SAD § Компјутер Intel CORE i5 § Микроскоп Olympus BX50 § PCR апарат, Thermal Cycler, Veriti 96-well, Applied Biosystems, SAD § PCR кабинет, Ehret Mini 2 § Пипете Rainin, LTS pipeta 0,5 – 10 µl, 10 – 100 µl i 20 – 200 µl § Спектрофотометар "Immunoscan plus-Labsystem", Finland 5.2. Методе рада Приликом хоспитализације у Клиници за гастроентерологију и хепатологију Клиничког центра Ниш, пацијентима су узимани демографски подаци и детаљна анамнеза. Обављен је физикални преглед, извршена су антропометријска мерења, биохемијске анализе крви и ултразвучни преглед абдомена. Истовремено је узимана крв за имуноензимска и молекуларна испитивања. Детаљно су проучени ранији лабораторијски налази и остала медицинска документација пацијената и на основу доступних налаза урађене су допунске биохемијске анализе које су недостајале, а неопходне су за постављање дијагнозе хроничног стеатозног обољења јетре и предвиђене су истраживањем. Увидом у медицинску документацију болесника, код којих су утврђене повишене вредности јетриних ензима у временском периоду дужем од 6 месеци, извршена је биопсија јетре. У студији је узимана анамнеза о ранијем и садашњем конзумирању алкохола, о коришћењу хепатотоксичних лекова (кортикостероида, имуносупресива, амиодарона ...), о присустним коморбидитетима: (предгојазност, гојазност, DM тип 2, дислипидемија и артеријска хипертензија) и aнамнеза о ранијим болестима јетре (прележаним вирусним хепатитисима, евентуалним метаболичким, аутоимуним и наследним болестима јетре). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 57 5.2.1. Антропометријска мерења Антропометријска мерења су обухватила мерење телесне тежине (ТТ), телесне висине (TV) и обима струка. Телесна тежина је мерена код пацијената у лакшој одећи, без ципела, изражена у килограмима (kg), коришћењем ваге са аутоматским укључивањем и искључивањем. Телесна висина изражена у центриметрима (cm) мерена је коришћењем стандардизоване мерне опреме и скале. Обим струка је мерен флексибилним метром, у стојећем ставу, на средини између доње ивице ребарног лука и карличног гребена у хоризоталној равни. 5.2.1.1. Индекс телесне масе, body mass index-BMI На основу добијених вредности телесне висине и телесне тежине израчунали смо вредност BMI, као однос телесне тежине у kg и телесне висине у м2 (kg/m2). На основу вредности BMI пацијенти су подељени у више група: § BMI до 18,5 kg/m2 потхрањеност, § BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 је нормална ухрањеност, § BMI од 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 прекомерна ухрањеност, предгојазност, § BMI од 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 први је степен или блага гојазност, § BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 други степен или средње изражена гојазност и § BMI већи од 40 kg/m2 трећи степен или озбиљна гојазност. 5.2.2. Мерење крвног притиска Мерење артеријског притиска је вршено сфигмоманометром у седећем положају, након одмора пацијента од 10 минута. Бележене су вредност систолног (SKP) и дијастолног крвног притиска (DKP), и изражене су у јединицама живиног стуба (mmHg). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 58 5.2.3. Биохемијске анализе крви Лабораторијска обрада, биохемијске и хематолошке анализе крви, у току проспективног истраживања, извршене су у Централној биохемијској лабораторији Клиничког центра Ниш. У лабораторијским анализама крви рађена је комплетна крвна слика, CRP, активност аминотрансфераза, ALP, GGT, вредности укупног (UBIL) и директног билирубина (DBIL), урата, феритина, церулоплазмина, гвожђа, гликемије наште, инсулина наште, вредности укупног холестерола (HOL), HDL холестерола, LDL холестерола, TG, укупних протеина и албумина, фактора коагулације (PT, интернационални нормализован однос (INR, енгл. international normalized ratio), парцијално тромбопластинско време и фибриноген). Утврђен је однос AST/ALT. Инсулинска резистенција процењена је HOMA моделом [180]. HOMA IR = гликемија (mmol/L) x инсулин (mU/L) 22.5 Утврђена је вредност NAFLD фиброзног скора (предиктивног панела фиброзе), коришћем 6 варијабли (године, BMI, тромбоцити (TR), гликемија наште/дијабетес, AST/ALT однос) повезаних у математичку формулу: NAFLD фиброзни скор = -1,675 + 0,037 x године + 0,094 x BMI (kg/m2) + 1,13 x гликемија наште/дијабетес (да=1, не=0) + 0,99 x AST/ALT однос - 0,013 x TR (x109/L) -0,66 x албумини (g/dl) Вредност NAFLD фиброзног скора мања од -1,45 искључује узнапредовалу фиброзу, вредност већа од 0,675 потврђује узнапредовалу фиброзу, док вредности између две граничне припадају групи недетерминисаних вредности. 5.2.4. Присуство метаболичког синдрома Присуство метаболичког синдрома и његових компоненти анализирано је код сваког болесника користећи NCEP/ATPIII критеријуме [49,50]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 59 Метаболички синдром je присутан уколико пацијент има најмање три од следећих пет компоненти: § централна-абдоминална гојазност (обим струка ≥ 102 cm за мушкарце, односно ≥ 88 cm за жене), § повишен ниво триглицерида: ≥ 1.7 mmol/l, или већ третирана абнормалност, § снижен HDL холестерол: < 1,03 mmol/l код мушкараца, односно < 1.29 mmol/l код жена, или већ третирана абнормалност, § повишен крвни притисак: систолни ≥ 130 mmHg и/или дијастолни ≥ 85 mmHg, или већ лечена хипертензија, § повишен ниво глукозе наште: ≥ 5.6 mmol/l, или већ постојећи DM тип 2. 5.2.5. Допунске анализе Након детаљног прегледа доступне медицинске документације болесника у појединим случајевима (непотпуна медицинска документација или дијагностичка дилема) извршене су допунске серолошке анализе, које су подразумевале: · серолошка испитивања на вирусне хепатитисе B и C (HBs Ag, анти HCV At) и · имуне комплексе, имуноглобулине (IgG, IgA, IgM) и патолошка антитела (антимитохондријална, антиглаткомишићна, антинуклеарна At), и одређивање вредности α 1 антитрипсина. 5.2.6. Ултразвук Ултразвучни преглед јетре извођен је у току преподневних часова уз претходни режим гладовања ноћ пре прегледа. Коришћен је апарат ACUSION Simens модел X 300 и ултразвучна сонда од 3,5 MHz. Процењивана је величина и структура паренхима јетре, ехоконтраст између јетре и десног бубрега, степен ехогености паренхима, степен визуализације крвних судова, дијафрагме, постериорног сегмента десног режња, односно степен атенуације UZ таласа. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 60 Стеатоза јетре оцењена ултразвуком подељена је у три степена, зависно од тежине UZ промена: § као степен I, блага стеатоза која се UZ приказује као умерено хиперехоген паренхим, уз видљиву портну вену и дијафрагму; § степен II, умерена стеатоза када је паренхим изразитије хиперехоген, тако да се интрахепатични крвни судови и дијафрагма слабије приказују; § степен III, јетра је изразито хиперехогена, без могућности добре визуализације портне вене, дијафрагме, постериорног сегмента десног режња, односно присутна је атенуација UZ таласа [181, 182]. 5.2.7. Биопсија јетре Биопсија јетре је рађена стандардним интеркосталним, средњим аксиларним приступом, након осмочасовног гладовања. Пре интервенције апликован је субкутано локални анестетик лидокаин хлорид у подручје биопсије и извршен је ултразвучни приказ истог подручја. Биопсија је рађена иглом Менгхини. 5.2.8. Патохистолошка анализа Патохистолошка обрада узорка ткива јетре добијеног у току биопсије, анализа и опис препарата, рађена је у Институту за патологију Клиничког центра Ниш. Исечци ткива фиксирани су у 10% пуферисаном неутралном формалину 24 сата. Раствор формалина припреман је непосредно пре употребе. На дно посуде стављан је филтер папир, а узорковани ткивни исечци били су окружени формалином са свих страна. Однос формалина и узоркованог ткива износио је најмање 10:1. Дехидратација исечака у етил-алкохолу прогресивне концентрације, просветљење у ксилолу и прожимање парафином обављено је у аутоматизованом апарату аутотехникону, а након тога исечци су укалупљивани у парафинске блокове. Парафински блокови ткива сечени су на клизном микротому, на ткивне Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 61 резове дебљине 4-5 микрона, који су одлагани у водено купатило са деминерализованом водом на температури 37°C и монтирани на предметна стакла. Ткивни пресеци су депарафинисани, доведени до воде, бојени стандардном хематоксилин-еозин (HE) методом и микроскопски анализирани на микроскопу Leica DM1000, са дигиталном камером Leica EC3. Коришћени су готови раствори хематоксилина (Mayer's hematoxylin, Bio Optica, Италија) и еозина (1% водени раствор, BioGnost, Република Хрватска). Патохистолошка анализа је користећи систем стадирања патохистолошких промена према Brunt и сар. [144] подразумевала: § постављање дијагнозе неалкохолне масне јетре, § одређивање степена стеатозе, § постављање дијагнозе NASH према минималним критеријумима (стеатоза, лобуларна упала, балонирање хепатоцита), § стадирање некроинфламаторне активности и § одређивање стадијума фиброзе. 5.2.9. Квантитативно мерење цитокератина-18 у крвној плазми Мерење концентрације цитокератина-18 у крвној плазми пацијената извршено је имуноензимским тестом – ELISA на Институту за биохемију Медицинског факултета Универзитета у Нишу. Имуноензимски тест sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay kit for cytokeratin 18, је брза, једноставна, осетљива и специфична техника за квантитативно мерење вредности цитокератина-18 у крвној плазми, а изводи се по упутству произвођача Cloud-Clone Corp (SAD). У одговарајуће бунарчиће који су обложени познатим антителом специфичним за CK-18, додато је 100 µl плазме и 100µl стандарда (одговарајућих концентрација). Након инкубације од 2 сата у сваки бунарчић микротитарске плоче додат је авидин коњугован са horseradish peroxidase-ом (HRP). Након додавања TMB субстрата, долази до промене у боји (ензим је укључен у реакцију и обавиће деструкцију супстрата, појавиће се жута боја) само у бунарима који садрже CK-18, Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 62 биотин коњуговано антитело и авидин коњугован са ензимом. Реакција ензим - супстрат престаје додавањем раствора сумпорне киселине. Интезитет боје је директно пропорционалан концентрацији CK-18 у испитујућем узорку. Резултат реакције очитали смо на ELISA читачу, на таласној дужини од 450 nm. Концентрација CK-18 у узорцима је затим одређена упоређивањем оптичке густине (OD) узорака и концентрације на стандардној криви. Пре почетка радне процедуре теста, коју смо извели по упутству произвођача, узорке крвне плазме и све коришћене реагенсе у тесту држали смо на собној температури 60 минута (од 18°C до 25°C). Стандард је реконституисан са растварачем стандарда у количини од 1 ml и чуван је 10 минута на собној температури уз лагано мешање. Концентрација стандарда у раствору је 125 ng/ml. Најпре смо разредили стандард, тј. смањили смо концентрацију у раствору са 125 ng/ml на 12,5 ng/ml. Овако разређени стандард служи као највиши радни стандард (12,5 ng/ml) у тесту. Серијска разблажења стандарда извршили смо на следећи начин (Слика 1). Слика 1. Серијска разблажења стандарда. У осам епендорф туба унели смо по 500 µl растварача стандарда. Из прве епендорф тубе, у којој концентрација стандарда износи 12,5 ng/ml, пренели смо 500 µl у другу епендорф тубу, не подижући наставак микропипете, иститрирали смо суспензију најмање три пута и благо промешали. На тај начин концентрација у Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 63 другој туби износила је 6,25 ng/ml. Поступак смо поновили у свим наредним епендорф тубама све до седме из које садржај није пребачен у осму епендорф тубу, већ у њој остаје растварач стандарда као „blank“. Понављањем поступка добили смо следећа разређења стандарда: 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,12 ng/ml, 1,56 ng/ml, 0,78 ng/ml, 0,39 ng/ml, 0,20 ng/ml и 0 ng/ml. Након припреме реагенаса, узорака и стандарда у микротитар плочу пресвучену антителом специфичним за CK-18, унели смо по 100 µl стандарда, „blank“-а и узорке у одговарајућим бунарчићима. Садржај микротитар плоче лагано смо протресли, прекрили заштитном фолијом, а затим инкубирали 120 минута на 37°C. Након инкубације испразнили смо садржај базенчића, а затим исте напунили са 100 µl etection Reagent А и инкубирали 30 минута на 37°C. Након инкубације испрали смо микротитар плочу, тако што смо испразнили садржај базенчића, а затим исте напунили са 350 µl пуфера за испирање плоча и поступак поновили још два пута. Након испирања испразнили смо садржај базенчића, а затим исте напунили са 100 µl detection reagent B и инкубирали 30 минута на 37°C. После инкубације испрали смо микротитар плочу, тако што смо испразнили садржај базенчића, а затим исте напунили са 350 µl пуфера за испирање плоча. Овај поступак смо поновили још четири пута. Након испирања додали смо по 90 µl раствора субстрата (substrate solution) у сваки базенчић микротитар плоче, прекрили је заштитном фолијом и инкубирали 20 минута на 37°C. После 20 минута инкубације са субстратом у сваки базенчић додали смо по 50 µl стоп раствора (stop solution), за заустављање реакције. 5.2.10. Молекуларна дијагностика Молекуларна дијагностика полиморфизма PNPLA3 rs738409 код пацијената са NAFLD и у контролној групи извршена је у Лабораторији за бактеријске зоонозе Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 64 и молекуларну дијагностику бактеријских болести, Хрватског ветеринарског института Загреб, у Загребу. За молекуларну дијагностику у циљу генотипизације односно утврђивања генског полиморфизма PNPLA3 I148M гена ланчаном реакцијом полимеразе (PCR енгл. Polymerase chain reaction) извршено је узораковање крви од 5ml у вакуум епрувети са додатком EDTA. Узорак је замрзнут на -20°C. 5.2.10.1. Екстракција DNK Геномска DNK изолована је из крви пацијената помоћу уређаја за аутоматску изолацију DNK QIAcube (Qiagen, SAD) према упутству произвођача. Слика 2. QIAcube (Qiagen, SAD) уређај за аутоматску изолацију DNK. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 65 5.2.10.2. PCR-RFLP метода за дијагностику полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) Како би се утврдио полиморфизам PNPLA3 rs 738409 (C10109G) рађена је PCR реакција, а затим је продукт PCR реакције сечен рестрикционим ензимом BtsCI (New England Biolabs), молекуларна метода PCR-RFLP описана у референци Dutta, 2012[183]. За извођење методе у микротубама припремана је реакциона смеша за сваки узорак појединачно. PCR реакциона смеша укупне запремине 20 µl се састојала од 10 μl мешавине HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Немачка), 7 μl воде (RNase-free Water, Qiagen, Немачка), 0,5 μл усходног прајмера PLA3_F (TGG GCC TGA AGT CCG AGG GT), 0,5 μl нисходног прајмера PLA3_R (CCG ACA CCA GTG CCC TGC AG) и 2 μl DNK. Коначна концентрација сваког прајмера (Bio Basic Canada Inc., Канада) у реакционој смеши била је 0,25 μM. У PCR реакцији коришћена је негативна контрола (NK) у којој је уместо DNK у реакциону смешу додато 2 μl воде (RNase-free Water, Qiagen, Њемачка), (Табела 5.). Табела 5. Састав PCR реакционе смеше Hot StarTaq Master Mix (Qiagen) 10 μl RNAse-Free Water (Qiagen) 7 μl Прајмер Секвенца (5′-3′): PLA3_R TGG GCC TGA AGT CCG AGG GT 0,5 μl PLA3_R CCG ACA CCA GTG CCC TGC AG 0,5 μl DNK 2 μl Укупно 20 μl Овако припремљене микротубе, са укупном запремином реакционе смеше од 20 μl, смештене су у PCR апарат „Thermal Cycler“, Veriti 96-well, Applied Biosystems. Умножавање PCR продукта је извршено са почетном денатурацијом при 95°C током 15 минута, након које је уследило 35 циклуса денатурације при 94°C током 30 секунди, везивање прајмера при 66°C током 30 секунди и продужавање Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 66 ланаца при 72°C током 30 секунди, и завршни корак продужавања ланаца, крајња екстензија при 72°C у трајању од 7 минута (Табела 6.). Табела 6. Протокол умножавања PCR продукта. 1 почетна денатурација 95°C/15 min. 2 35 циклуса денатурација 94°C/30 sec. везивање прајмера 66ºC/30 sec. продужавање ланаца 72°C/30 sec. 4 крајња екстензија 72°C/7 min. За разлагање продукта умножавања ензимом BtsCI у микротубама припремана је реакциона смеша за сваки узорак појединачно. Реакциона смеша укупне запремине 15 µl се састојала од 10 µl PCR продукта, 3,3 µl воде (RNase-free Water, Qiagen, Немачка), 1,5 µl Cut Smart pufera (New England Biolabs) и 0.2 µl BtsCI (New England Biolabs) рестрикционог ензима. Смеша је инкубирана 4 сата на 50°C у апарату „Thermal Cycler“, Veriti 96-well, Applied Biosystems. Продукти рестриктивне дигестије анализирани су помоћу уређаја за капиларну електрофорезу QIAxcel (Qiagen, Немачка). 5.2.10.3. Визуелизација продукта умножавања DNK Продукти умножавања DNK анализирани су помоћу уређаја за капиларну електрофорезу QIAxcel (Qiagen, САД). QIAxcel систем користи капиларну гел-електрофорезу како би се омогућило брзо одвајање нуклеинских киселина на основу величине. За разлику од традиционалних агарозних гел-електрофореза раздвајање се изводи у капиларима који су део предприпремљеног гел улошка. Сваки узорак се аутоматски наноси у појединачни капилар (зависно од напона и времена трајања) након чега се примењује струја. Негативно наелектрисани молекули нуклеинских киселина мигрирају кроз капилару до позитивно наелектрисаног краја. Као и код агарозне гел-електрофорезе молекули ниске молекулске тежине мигрирају брже него они високе молекулске тежине. Како молекули мигрирају кроз Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 67 капилар, пролазе детектор који открива и мери флуоресцентни сигнал. Фотомултиплицирајући детектор претвара емисијски сигнал у податак у електронском облику, који се затим преноси на рачунар за даљу обраду користећи компјутерски програм QIAxcel ScreenGel software. Након обраде подаци су приказани као електроферограм или слике гела (Слика 2.). Слика 2. – Одвајање узорка помоћу QIAxcel система 5.2.10.4. Детекција полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) За детекцију полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) користили смо молекуларну PCR-RFLP методу која је базирана на умножавању дела генома који кодира синтезу протеина BCSP-31. Очекивана величина продукта умножавања износи 333 bp (базних парова). Величина продукта PCR реакције од 333 bp доказана је помоћу уређаја за капиларну електрофорезу QIAxcel (Qiagen, Немачка) са компјутерским програмом QIAxcel BioCalculator. Након извршене PCR реакције продукти умножавања разлагани су рестрикционим ензимом BtsCI (New England Biolabs) како би се разликовали нормални хомозигот (C10109C), хетерозигот (C10109G) и мутантни хомозигот (G10109G). Разлагањем умноженог DNK фрагмента од 333 bp код нормалног Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 68 хомозигота добијени су фрагменти величина 200 bp и 133 bp, код хетерозигота фрагменти 333 bp, 200 bp и 133 bp, а код мутантног хомозигота добијен је фрагмент величине 333 bp (Табела 7.). Табела 7. Очекивана величина продукта умножавања. хомозигот (C10109C) хетерозигот (C10109G) мутантни хомозигот (G10109G) Очекиване величине PCR-RFLP продуката (bp) 333 333 200 200 133 133 5.2.11. Статистичка обрада резултата Континуални параметри представљени су средњим вредностима, стандардним девијацијама и медијанама. Атрибутивни параметри представљени су учесталостима и процентима. Нормалност расподеле континуалних варијабли испитивана је Shapiro-Wilk или Kolmogorov-Smirnov тестом у зависности од величине испитиваних група испитаника. Упоређивање вредности континуалних параметара између два независна узорака вршено је Mann-Whitney и Студентовим т-тестом, а поређење 3 независна узорка Kruskal-Wallis тестом или ANOVOM (у зависности од нормалности расподеле поређених варијабли). У зависности од нормалности расподеле утврђивање повезаности континуалних варијабли утврђивано је Pearson-овим (r) или Spearman-овим (r) коефицијентом линеарне корелације. Pearson-овим c2 тестом, а по потреби, у случају табела контигенције 2´2, коришћен је Mantel-Haenzel-ов или Fisher-ов тест тачне вероватноће за поређење учесталости и расподеле модалитета атрибутивних параметара. Утврђивање предиктабилности независних параметара на зависне дихотомне параметре утврђивано је униваријантном логистичком регресионом анализом. Статистичка обрада података обављена је програмом SPSS 15.0, а као минимална статистички значајна вредност коришћена је p<0,05. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 69 6. РЕЗУЛТАТИ 6.1. Демографски параметри пацијената студијске (NAFLD) и контролне групе NAFLD (студијску) групу чинило је 55 (63,95%) пацијената, а контролну 31 (36,05%) здрав испитаник. Просечна старост пацијената NAFLD групе износила је 49,29±12,95, са медијаном од 52 године, док је старост испитаника контролне групе 47,84±10,08 уз медијану од 49 година. На основу Mann-Whitney теста није утврђена статистички значајна разлика старости пацијента NAFLD и испитаника контролне групе. У NAFLD групи било је 23 мушкарца (41,82%) и 32 жене (58,18%), док је у контролној групи било 10 мукараца (32,26%) и 21 жена (67,74%). Није нађена статистички значајна разлика у полној структури пацијената NAFLD и испитаника контролне групе (Табела 8.) Табела 8. Демографски параметри пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група, n=55 Контролна група, n=31 Старост (год) 49,29 ± 12,95 52 47,84 ± 10,08 49 Пол (м/ж) 23 (41,82%) 32 (58,18%) 10 (32,26%) 21 67,74%) 6.2. Антропометријски параметри пацијената NAFLD и контролне групе Није нађена статистички значајна разлика између група у погледу средњих вредности телесне висине. Код пацијената NAFLD групе средње вредности осталих антропометријских параметара, обима струка, телесне тежине и индекса телесне масе статистички су биле значајно више у односу на контролну групу (p<0,001) (Табела 9.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 70 Табела 9. Антропометријски параметри пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 OS (cm) 106,36 ± 8,44*** 105 78,87 ± 7,18 79,00 TT (kg) 92,22 ± 14,83*** 92 65,00 ± 8,90 62,00 TV (m) 1,68 ± 0,12 1,65 1,70 ± 0,09 1,68 BMI (kg/m2) 32,83 ± 4,20*** 32,87 22,52 ± 2,08 22,77 *** - p<0,001 У NAFLD групи 16 мушкараца је имало OS ≥ 102 cm (Табела 10.). Обим струка ≥ 88 cm имале су све жене NAFLD групе (Табела 11.). Табела 10. Дистрибуција пацијената мушког пола NAFLD групе у односу на обим струка OS, мушкарци NAFLD група n=23 n % средња вредност OS (cm) ≥ 102 16 69,57 110,00 OS (cm) < 102 7 30,43 101,29 Табела 11. Дистрибуција пацијената женског пола NAFLD групе у односу на обим струка OS, жене NAFLD група n=32 n % средна вредност OS (cm) ≥ 88 32 100,00 106,00 OS (cm) < 88 0 0,00 0,00 У NAFLD групи било је 17 (30,91%) пацијената са прекомерном ухрањеношћу и 38 (69,09%) са гојазношћу (Табела 12.). У групи гојазних пацијената 22 (40,00%) је било са првим степеном гојазности, 13 (23,64%) са другим степеном и 3 (5,45%) са трећим степеном односно озбиљно гојазних. У контролној групи највећи број испитаника, њих 29 је било нормално ухрањено. Гојазност као категорија ухрањености, као и први, други и Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 71 трећи степен гојазности посматране као јединствена категорија гојазности, статистички су били заступљенији код испитаника NAFLD групе (p<0,001) у односу на контролну групу (Табела 12.). Табела 12. Дистрибуција пацијената NAFLD и контролне групе у односу на BMI Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 BMI (kg/m2) n % n % BMI < 18,5 kg/m2 0 0,00% 1 3,23% BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 0 0,00% 29 93,55% BMI до 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 17 30,91% 1 3,23% BMI (kg/m2) ≥ 30,0 kg/m2 38 69,09%*** 0 0,00% BMI од 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 22 40,00%x*** 0 0,00% BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 13 23,64% 0 0,00% BMI већи од 40 kg/m2 3 5,45% 0 0,00% *** - p<0,001, x - поређење првог, другог и трећег степена гојазности као јединствене категорије 6.3. Клинички и биохемијски параметри пацијената NAFLD и контролне групе 6.3.1. Клинички параметри пацијената NAFLD и контролне групе У NAFLD групи је било 40 (72,73%) пацијената са хипертензијом и 26 са DM тип 2 (47,27%). У контролној групи није било дијабетичара, а 4 испитаника су (12,90%) имали хипертензију. Хипертензија и DM тип 2 статистички су били заступљенији у NAFLD групи у односу на контролну групу (p<0,001) (Табела 13.). Табела 13. Заступљеност DM тип 2 и хипертензије код пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 Хипертензија 40 72,73%*** 4 12,90% DM тип 2 26 47,27%*** 0 0,00% *** - p<0,001 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 72 Код пацијената NAFLD групе просечне вредности систолног крвног притиска износиле су 137,18±18,60 mmHg и биле су статистички значајно више у односу на контролну групу, у којој су износиле 116,45±13,86 mmHg (p<0,001). Просечне вредности дијастолног крвног притиска у NAFLD групи износиле су 84,73±10,69 mmHg и такође су статистички биле значајно више у односу на контролну групу у којој су износиле 72,90±9,98 mmHg (p<0,001) (Табела 14.). Табела 14. Вредности систолног и дијастолног крвног притиска код пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 SKP (mmHg) 137,18 ± 18,60*** 140 116,45 ± 13,86 120 DKP (mmHg) 84,73 ± 10,69*** 90 72,9 ± 9,98 70 *** - p<0,001 6.3.2. Биохемијски параметри пацијената NAFLD и контролне групе Код пацијената NAFLD групе утврђене су статистички значајно више средње вредности серумских нивоа LDL холестерола, укупног билирубина (p<0,05), укупног холестерола (p<0,01), TG, урата, CRP, феритина и фибриногена (p<0,001), док је средња вредност HDL холестерола (p<0,05) била виша у контролној групи. Средње вредности серумских нивоа директног билирубина су биле више код испитаника NAFLD групе, али без статистички значајне разлике у односу на контролну групу. Није нађена статистички значајна разлика између група у погледу средњих вредности INR и тромбоцита (Табела 15.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 73 Табела 15. Биохемијски параметри пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 Урати (µmol/l) 373,01 ± 94,55*** 375,1 239,98 ± 56,57 237,4 UBIL (µmol/l) 12,78 ± 5,66* 12,2 10,17 ± 2,91 9,9 DBIL (µmol/l) 2,23 ± 1,08 2 1,81 ± 0,54 1,6 Албумини (g/l) 45,1 ± 3,09 45,2 44,05 ± 3,84 44,9 HOL (mmol/l) 5,86 ± 1,06** 5,82 5,16 ± 1,08 5,12 HDL (mmol/l) 1,15 ± 0,25 1,13 1,28 ± 0,28* 1,34 LDL (mmol/l) 3,76 ± 0,92* 3,8 3,26 ± 0,87 3,3 TG (mmol/l) 2,28 ± 1,12*** 1,91 1,2 ± 0,37 1,08 CRP (mg/l) 6,2 ± 10,38*** 3,4 1,69 ± 1,63 1,1 Феритин (µg/l) 145,38 ± 113,45*** 113,9 45,65 ± 28,17 39,3 INR 1,07 ± 0,11 1,06 1,08 ± 0,08 1,06 FIB (g/l) 4,47 ± 1,02*** 4,27 3,48 ± 0,86 3,55 TR x109/l 242,69 ± 66,6 235 253,9 ± 50,48 261 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 У NAFLD групи средње вредности серумских нивоа јетриних ензима износиле су: AST 40,17±21,82 U/L, ALT 59,56±43,94 U/L, GGT 61,62±67,10 U/L i ALP 71,85±28,67 U/L. Код испитаника контролне групе средње вредности AST су износиле: 20,8±4,25 U/L, ALT 16,85±6,23 U/L, GGT 19,45±14,97 U/L и ALP 55,50±16,56 U/L. Пацијенти NAFLD групе су имали статистички значајно више средње вредности серумских нивоа AST, ALT, GGT (p<0,001) и ALP (p<0,01) у односу на испитанике контролне групе (Табела 16). Табела 16. Активност серумских ензима пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 AST (U/l) 40,17 ± 21,82*** 34,8 20,84 ± 4,25 20,1 ALT (U/l) 59,56 ± 43,94*** 52,5 16,85 ± 6,23 16,1 ALP (U/l) 71,85 ± 28,67** 63,1 55,50 ± 16,56 49,8 GGT (U/l) 61,62 ± 67,10*** 38,4 19,45 ± 14,97 14,7 ** - p<0,01, *** - p<0,001 Вредност AST/ALT одређивана је код испитаника NAFLD групе и износила је 0,79±0,34, уз медијану 0,68. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 74 Средње вредности јутарње гликемије наште, инсулина наште и HOMA-IR биле су статистички значајно више код пацијената NAFLD групе у односу на контролну групу (p<0,001) (Табела 17.). Табела 17. Вредности гликемије, инсулина и HOMA-IR пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 Гликемија (mmol/l) 6,56 ± 2,38*** 6,00 5,00 ± 0,74 5,00 Инсулин (mu/l) 39,16 ± 28,88*** 4,27 12,41 ± 4,37 13,00 HOMA-IR 13,67 ± 18,88*** 7,47 2,77 ± 1,07 2,88 *** - p<0,001 6.4. Заступљеност метаболичког синдрома код пацијената NAFLD и контролне групе У NAFLD групи је било 48 (87,27%) пацијената са метаболичким синдромом, што је статистички значајно више у односу на контролну групу где их је било 3 (9,68%) (p<0,001) (Табела 18.). Табела 18. Присуство метаболичког синдрома код пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група n=55 Контролна група n=31 MS 48 87,27%*** 3 9,68% Број компоненти MS 0 0 0,00% 14 45,16% 1 1 1,82% 9 29,03% 2 6 10,91% 5 16,13% 3 16 29,09% 3 9,68% 4 16 29,09% 0 0,00% 5 16 29,09% 0 0,00% *** - p<0,001 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 75 Подједнак број пацијената NAFLD групе, 16 (29,09%) је имало 3, 4 и 5 компоненте MS (Табела 18). У контролној групи највећи број испитаника, њих 14 (45,16%) није имало MS, 9 испитаника (29,03%) је имало једну компоненту MS, 5 испитаника (16,13%) је било са две компоненте, 3 испитаника (9,68%) са три, док није било испитаника са 4 и 5 компоненти MS (Табела 18). Све компоненте MS статистички су биле заступљеније у NAFLD групи у односу на контролну групу на нивоу статистичке значајности од p<0,001, изузев компоненте снижених нивоа HDL холестерола, где је ниво статистичке значајности p<0,01(Табела 19.). Табела 19. Заступљеност компоненти метаболичког синдрома код пацијената NAFLD и контролне групе Параметар NAFLD група Контролна група Компонента MS n % n % OS (cm) 48 87,27%*** 0 0,00% HDL (mmol/l) 33 60,00%** 9 29,03% TG (mmol/l) 36 65,45%*** 5 16,13% Хипертензија/ SKP и/или DKP 50 90,91%*** 9 29,03% Гликемија≥5,6 mmol/l/DM 38 69,09%*** 5 16,13% ** - p<0,01, *** - p<0,001 Најизраженија компонента MS у NAFLD групи била је лечена хипертензија или повишен SKP и/или DKP која је утврђена код 50 (90,91%) пацијената. Заступљеност осталих компонети метаболичког синдрома износила је: централна гојазност 87,27%, повишена гликемија наште или већ постојећи DM тип 2 69,09%, повишен ниво TG 65,45% и снижен ниво HDL холестерол 60,00%. Присуство хипертензије или повишен SKP и/или DKP mmHg, као компоненте MS у NAFLD групи статистички је било значајно чешће од присуства метаболичких компоненти, повишен серумски ниво TG, присуство DM или повишена гликемија наште (p<0,01), као и снижен ниво HDL холестерола (p<0,001) (Табела 20.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 76 Табела 20. Заступљеност компоненти MS код пацијената NAFLD групе Компонента MS n=55 % p OS (cm) 48 87,27% HDL (mmol/l) 33 60,00% TG (mmol/l) 36 65,45% Хипертензија/ SKP и/или DKP 50 90,91% ** vs TG и гликемија≥5,6mmol/l/DM, *** vs HDL Гликемија≥5,6 mmol/l/DM 38 69,09% ** - p<0,01, *** - p<0,001 6.5. Предиктори појаве NAFLD На основу резултата униваријантне логистичке регресионе анализе (Табела 21.) статистички значајни параметри за појаву NAFLD су гликемија наште, инсулин наште, HOMA-IR, урати, TG, AST, ALT, GGT, CRP, феритин, фибриноген, телесна тежина, MS, број компонената MS, SKP, DKP, хипертензија (p<0,001), холестерол, ALP, OS (p<0,01), као и билирубин, HDL холестерол и LDL холестерол (p<0,05) (Табела 21.). Присуство MS статистички значајно (p<0,001) повећава вероватноћу за појаву NAFLD 64 пута (IP 15,31-267,59), лечена хипертензија или повишен SKP ≥ 135 mmHg и/или DKP ≥ 85 mmHg као метаболичка компонента 24,44 пута (IP 7,34-81,38), присутан DM или повишена гликемија наште ≥ 5,6 mmol/l 11,62 пута (IP 3,81-35,45), повишени серумски ниво триглицерида ≥ 1,7 mmol/l 9,85 пута (IP 3,26-29,88), хипертензија 9,14 пута (IP 3,26-25,61). Присуство снижених нивоа HDL холестерола (< 1,03 mmol/l код мушкараца и < 1,29 mmol/l код жена) статистички значајно повећава вероватноћу за настанак NAFLD за 3,78 пута (IP 1,43-9,43) (p<0,01) (Табела 21.). Ако број компонената MS посматрамо као мерљиву варијаблу онда пораст MS за 1, статистички значајно (p<0,001) повећава вероватноћу да дође до појаве NAFLD за 8,58 пута (IP 3,26-25,61) (Табела 21.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 77 Табела 21. Вредности OR за процену утицаја фактора од интереса на појаву NAFLD, резултати униваријантне логистичке регресионе анализе Параметар OR 95,0% IP p Доња Горња Старост (год) 1,01 0,97 1,05 0,5869 Пол мушки 0,66 0,26 1,67 0,3826 Гликемија (mmol/l) 4,09 1,94 8,64 ***0,0002 Инсулин (mu/l) 1,36 1,18 1,56 ***0,0000 HOMA-IR 3,55 1,96 6,44 ***0,0000 Урати (µmol/l) 1,03 1,01 1,04 ***0,0000 UBIL (µmol /l) 1,14 1,02 1,28 *0,0254 DBIL (µmol /l) 1,86 0,99 3,47 0,0527 Албумини (g/l) 1,1 0,96 1,25 0,1726 HOL (mmol/l) 1,87 1,18 2,97 **0,0076 HDL (mmol/l) 0,13 0,02 0,78 *0,0260 LDL (mmol/l) 1,85 1,1 3,12 *0,0209 TG (mmol/l) 16,02 4,17 61,58 ***0,0001 AST (U/l) 1,29 1,15 1,44 ***0,0000 ALT (U/l) 1,23 1,1 1,37 ***0,0002 ALP (U/l) 1,03 1,01 1,06 **0,0090 GGT (U/l) 1,09 1,04 1,14 ***0,0005 CRP (mg/l) 2,23 1,46 3,41 ***0,0002 Феритин (µg/l) 1,03 1,01 1,04 ***0,0001 INR 0,36 0 30,07 0,6519 FIB (g/l) 3,74 1,92 7,31 ***0,0001 TR x109/l 1 0,99 1 0,4155 OS (cm) 1,87 1,18 2,98 **0,0079 TT (kg) 1,22 1,12 1,33 ***0,0000 BMI (kg/m2) 837,13 0,01 1,01E±08 0,2594 MS 64 15,31 267,586 ***0,0000 MS HDL (mmol/l) 3,78 1,43 9,43 **0,0070 MS TG (mmol/l) 9,85 3,26 29,8 ***0,0000 MS хипертензија/SKP и/или DKP 24,44 7,34 81,38 ***0,0000 MS гликемија>5,6mmol/l/DM 11,62 3,81 35,45 ***0,0000 Број елемената MS 8,58 3,36 21,93 ***0,0000 SKP (mmHg) 1,09 1,05 1,14 ***0,0000 DKP (mmHg) 1,11 1,06 1,17 ***0,0000 Хипертензија 9,14 3,26 25,61 ***0,0000 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 Повећање следећих предикторских варијабли за јединичну меру доводи до статистички значајног пораста вероватноће за појаву NAFLD (p<0,001) на следећи начин: TG 16,02 пута (IP 4,17-61,58), гликемија наште 4,09 пута (IP 1,94-8,64), HOMA-IR 3,55 пута (IP 1,96-6,44), инсулин наште 36% (IP 1,18-1,56), AST 29% (IP Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 78 1,15-1,44), ALT 23% (IP 1,10-1,37), TT 22% (IP 1,12-1,33), DKP 11% (IP 1,06-1,17), GGT и SKP 9% (IP 1,04-1,14/1,17), урати и феритин 3% (IP 1,01-1,04). Пораст за јединичну вредност холестерола и OS доводи до пораста вероватноће за појаву NAFLD 87% (IP 1,18-2,97/2,98), а ALP 3% (IP 1,01-1,06) (p<0,01). Пораст за јединичну вредност LDL холестерола доводи до пораста вероватноће за појаву NAFLD 85% (IP 1,10-3,12), док повећање HDL холестерола за јединичну вредност доводи до смањења вероватноће за NAFLD 87% (IP 0,02-0,78) (p<0,05) (Табела 21.). 6.6. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на присуство метаболичког синдрома У NAFLD групи је било 48 (87,27%) пацијената са МS 30 (62,50%) жена и 18 (37,50%) мушкараца, док је у NAFLD групи без MS било 5 мушкараца (71,43%) и 2 жене (28,57%). Просечна старост пацијената са MS износила је 50,71±12,26 година, а пацијената без MS 39,57±14,35. Није утврђена статистички значајна разлика у полу и старости пацијената ове две групе. У NAFLD групи пацијената са MS утврђене су статистички значајно више средње вредности гликемије наште, BMI (p<0,01), инсулина наште и HOMA-IR (p<0,05), док је у групи NAFLD пацијената без MS статистички значајно била виша средња вредност серумских нивоа HDL холестерола (p<0,05). Утврђене су више средње вредности OS (107,02 ± 8,6) у NAFLD групи са MS у односу на испитанике без MS (101,86±5,9), али без статистичке значајности (Табела 22.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 79 Табела 22. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на присуство метаболичког синдрома Параметар NAFLD без MS, n=7 NAFLD са MS, n=48 Старост (год) 39,57 ± 14,35 34 50,71 ± 12,26 54 Пол (м/ж) 5 (71,43%) / 2 (28,57%) 18 (37,50%) / 30 (62,50%) Гликемија (mmol/l) 4,99 ± 0,54 4,9 6,79 ± 2,46 6,1 ** Инсулин (mu/l) 23,14 ± 10,95 23 41,49 ± 29,99 29* HOMA-IR 5,18 ± 2,65 4,78 14,9 ± 19,9 7,61* Urati (µmol/l) 363,41 ± 76,48 349,8 374,41 ± 97,52 377,65 UBIL (µmol/l) 11,8 ± 3,56 12,9 12,93 ± 5,92 11,65 DBIL (µmol/l) 2,03 ± 0,81 2,1 2,26 ± 1,12 2 Албумини (g/l) 46,33 ± 2,72 47,9 44,93 ± 3,12 45,05 HOL (mmol/l) 6,25 ± 1,13 5,83 5,81 ± 1,05 5,82 HDL (mmol/l) 1,32 ± 0,25 1,2* 1,12 ± 0,24 1,12 LDL (mmol/l) 4,03 ± 0,85 4 3,72 ± 0,93 3,8 TG (mmol/l) 2,44 ± 1,67 2,08 2,26 ± 1,04 1,9 AST (U/l) 47,91 ± 26,33 42,1 39,04 ± 21,17 34,8 ALT (U/l) 60,26 ± 20,47 56,9 59,46 ± 46,52 51,2 ALP (U/l) 57,81 ± 19,43 58,1 73,9 ± 29,37 64,1 GGT (U/l) 68,26 ± 45,85 47,8 60,65 ± 69,98 35,6 CRP (mg/l) 6,24 ± 6,25 3,3 6,2 ± 10,9 3,45 Феритин (µg/l) 198,37 ± 195,16 142,7 137,65 ± 97,19 111,3 INR 1,04 ± 0,03 1,03 1,08 ± 0,11 1,06 FIB (g/l) 4,25 ± 0,64 4,07 4,5 ± 1,07 4,3 TR x109/l 237,14 ± 48,43 226 243,5 ± 69,22 235,5 OS (cm) 101,86 ± 5,9 102 107,02 ± 8,6 106 TT (kg) 84,71 ± 10,03 86 93,31 ± 15,17 93,5 BMI (kg/m2) 28,65 ± 3,19 28,41 33,44 ± 4 33,46** SKP (mmHg) 134,29 ± 19,88 140 137,6 ± 18,59 137,5 DKP (mmHg) 81,43 ± 12,15 80 85,21 ± 10,52 90 AST/ALT 0,8 ± 0,32 0,64 0,78 ± 0,35 0,69 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 У NAFLD групи пацијената са MS 11 (22,92%) пацијената је било са предгојазношћу, 37 (77,08%) пацијената је било гојазно, 22 пацијента (45,83%) је било са првим степеном гојазности, 12 (25,00%) са другим степеном и 3 (6,25%) је било са трећим степеном гојазности (Табела 23.). У NAFLD групи без MS највећи број пацијената је био са предгојазношћу, 6 (85,71%). Гојазност као категорија ухрањености, затим први, други и трећи степен гојазности као јединствена категорија гојазности статистички значајно су били заступљенији код пацијената са NAFLD и MS у односу на пацијенте NAFLD групе без MS (p<0,01) (Табела 23.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 80 Табела 23. Дистрибуција пацијената NAFLD групе без и са метаболичким синдромом у односу на BMI Параметар NAFLD без MS, n=7 NAFLD са MS, n=48 BMI n % n % BMI < 18,5kg/m2 0 0,00% 0 0,00% BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 0 0,00% 0 0,00% BMI од 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 6 85,71% 11 22,92%** BMI ≥ 30,0 kg/m2 1 14,29% 37 77,08%** BMI одd 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 0 0,00% 22 45,83% x** BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 1 14,29% 12 25,00% BMI већи од 40 kg/m2 0 0,00% 3 6,25% ** - p<0,01 x - поређење благе, средње изражене и озбиљне гојазности као јединствене категорије У NAFLD групи са МS 39 (81,25%) пацијената је имало хипертензију и 26 (54,17%) DM тип 2. У NAFLD групи пацијената са MS статистички су били заступљенији хипертензија (p<0,01) и DM (p<0,05) у односу на NAFLD групу без MS (Tабела 24), у којој је један пацијент имао хипертензију (14,29%), док није било пацијената са DM (Табела 24.). Табела 24. Заступљеност DM тип 2 и хипертензије пацијената NAFLD групе са и без метаболичког синдрома Параметар NAFLD без MS, n=7 NAFLD са MS, n=48 Хипертензија 1 14,29% 39 81,25%** DM тип 2 0 0,00% 26 54,17%* ** - p<0,01, * - p<0,05 6.7. Демографкси, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на BMI У NAFLD групи је било 38 (69,09%) пацијената са гојазношћу, 24 (63,16%) жене и 14 (36,84%) мушкараца, просечне старости 50,32±13,07 година. Седамнаест пацијената је било прекомерно ухрањено, 8 (47,06%) жена и 9 (52,94%) мушкараца, Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 81 просечне старости 47,00±12,76. Нису утврђене статистички значајне разлике у полу и старости пацијената у односу на BMI (Табела 25. и 26.). У групи пацијената са гојазношћу у односу на пацијенте са прекомерном ухрањеношћу статистички су значајно биле више средње вредности OS и ТТ, на нивоу максималне значајности од p<0,001 (Табела 25.). Табела 25. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на BMI Параметар NAFLD, BMI<30 kg/m2, n=17 NAFLD, BMI ³30 kg/m2, n=38 Старост (год) 47,00 ± 12,76 47 50,32 ± 13,07 54 Гликемија (mmol/l) 6,19 ± 1,56 6 6,72 ± 2,67 5,95 Инсулин (mu/l) 33,76 ± 30,9 27 41,57 ± 28,02 29,5 HOMAIR 10,93 ± 15,55 7,44 14,89 ± 20,26 7,74 Урати (µmol/l) 361,45 ± 74,9 348,2 378,18 ± 102,63 380,35 UBIL (µmol/l) 13,63 ± 4,71 13 12,41 ± 6,06 10,9 DBIL (µmol/l) 2,22 ± 0,77 2,1 2,24 ± 1,2 2 Албумини (g/l) 44,61 ± 3,49 45,6 45,32 ± 2,91 45,05 HOL (mmol/l) 6,18 ± 0,98 5,83 5,72 ± 1,08 5,82 HDL (mmol/l) 1,20 ± 0,26 1,16 1,12 ± 0,24 1,13 LDL (mmol/l) 3,96 ± 0,85 3,8 3,66 ± 0,95 3,8 TG (mmol/l) 2,42 ± 1,46 1,87 2,22 ± 0,94 1,93 AST (U/l) 38,72 ± 19,03 34,7 40,82 ± 23,17 34,9 ALT (U/l) 51,91 ± 17,91 49,9 62,98 ± 51,38 55,3 ALP (U/l) 65,08 ± 24,21 59,7 74,88 ± 30,25 65,35 GGT (U/l) 66,29 ± 52,67 56,5 59,53 ± 73,19 35,6 CRP (mg/l) 5,44 ± 8,16 2,7 6,54 ± 11,32 3,55 Феритин (µg/l) 176,18 ± 139,11 154 131,60 ± 98,91 106,6 INR 1,06 ± 0,09 1,04 1,08 ± 0,12 1,06 FIB (g/l) 4,20 ± 0,6 4,09 4,59 ± 1,15 4,48 TR x109/l 243,29 ± 48,44 240 242,42 ± 73,88 233 OS (cm) 100,18 ± 5,07 102 109,13 ± 8,22 107,50*** TT (kg) 80,76 ± 10,67 76 97,34 ± 13,58 98,75*** SKP (mmHg) 138,24 ± 17,04 140 136,71 ± 19,46 130 DKP (mmHg) 86,47 ± 11,83 90 83,95 ± 10,21 87,5 AST/ALT 0,78 ± 0,33 0,64 0,79 ± 0,35 0,69 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 У NAFLD групи са BMI≥30 kg/m2 више пацијената је било са хипертензијом, 30 (78,95%), са DM тип 2 21 (55,26%) и са MS 37 (97,37%), али статистички значајно више само са MS, у односу на групу пацијената са NAFLD и прекомерном Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 82 ухрањеношћу (p<0,01). У групи пацијената са NAFLD и гојазношћу статистички је било више пацијената са централном гојазношћу и сниженим серумским нивоом HDL холестерола као метаболичким компонентама (p<0,05) у односу на пацијенте са NAFLD и прекомерном ухрањеношћу, а такође је статистички било значајно више пацијената који као јединствену посматрану категорију имају 3, 4 или 5 компоненте MS (p<0,01) (Табела 26.). Табела 26. Поређење испитиваних параметара између пацијената NAFLD групе са BMI<30 kg/m2 и BMI³30 kg/m2 Параметар NAFLD, BMI<30 kg/m 2, n=17 NAFLD, BMI³30 kg/m2, n=38 Женски пол 8 47,06% 24 63,16% Мушки пол 9 52,94% 14 36,84% Хипертензија 10 58,82% 30 78,95% DM 5 29,41% 21 55,26% MS 11 64,71% 37 97,37% ** Компоненте MS MS обим струка 12 70,59% 36 94,74% * MS HDL (mmol/l) 6 35,29% 27 71,05% * MS TG (mmol/l) 11 64,71% 25 65,79% MS хипертензија/SKP и/или DKP 16 94,12% 34 89,47% MS гликемија≥5,6mmol/l/DM 11 64,71% 27 71,05% Број MS компонената 0 0 0,00% 0 0,00% 1 0 0,00% 1 2,63% 2 6 35,29% 0 0,00% 3 4 23,53% 12 31,58% x** 4 3 17,65% 13 34,22% 5 4 23,53% 12 31,58% * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 x - поређење заступљености 3, 4 ili 5 МS компоненти као јединствене категорије 6.8. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на присуство дијабетес мелитус тип 2 У NAFLD групи је било 26 (47,27%) пацијената са DM тип 2. Просечна старост пацијената са NAFLD и DM тип 2 (56,62±8,26 vs. 42,72±12,96) је Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 83 статистички била значајно виша у односу на пацијенте NAFLD групе без DM (p<0,01) (Табела 27.). Табела 27. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на присуство DM тип 2 Параметар NAFLD без DM n=29 NAFLD са DM n=26 Старост (год) 42,72 ± 12,96 41 56,62 ± 8,26 58,00** Гликемија (mmol/l) 5,52 ± 0,81 5,4 7,72 ± 2,98 6,55** * Инсулин (mu/l) 33,28 ± 17,25 28 45,72 ± 37,2 29 HOMAIR 8,36 ± 4,97 7,35 19,58 ± 25,94 7,88 Урати (µmol/l) 368,19 ± 79,21 354,2 378,39 ± 110,58 377,65 UBIL (µmol/l) 13,44 ± 6,12 12,9 12,05 ± 5,12 10,8 DBIL (µmol/l) 2,23 ± 0,95 2,1 2,23 ± 1,23 1,8 Албумини (g/l) 45,68 ± 2,9 45,8 44,46 ± 3,22 44,85 HOL (mmol/l) 6,02 ± 1,07 5,83 5,69 ± 1,05 5,76 HDL (mmol/l) 1,15 ± 0,27 1,12 1,14 ± 0,23 1,15 LDL (mmol/l) 3,98 ± 0,86 3,9 3,50 ± 0,94 3,6 TG (mmol/l) 2,19 ± 1,16 1,87 2,39 ± 1,08 2,02 AST (U/l) 41,03 ± 24,86 33,9 39,21 ± 18,28 35 ALT (U/l) 67,13 ± 50,41 55,3 51,12 ± 34,39 44,15 ALP (U/l) 70,37 ± 24,71 63,1 73,51 ± 32,95 63,25 GGT (U/l) 68,79 ± 81,5 38,4 53,63 ± 46,48 36,5 CRP (mg/l) 4,71 ± 4,5 3,2 7,87 ± 14,31 3,8 Феритин (µg/l) 159,30 ± 118,9 154,1 129,85 ± 107,15 103 INR 1,06 ± 0,08 1,04 1,09 ± 0,13 1,06 FIB (g/l) 4,29 ± 0,82 4,25 4,67 ± 1,2 4,42 TR x109/l 246,38 ± 69,65 231 238,58 ± 64,14 237,5 OS (cm) 105,31 ± 8,44 103 107,54 ± 8,46 106,5 TT (kg) 93,90 ± 15,81 92 90,35 ± 13,72 90,5 TV (m) 1,72 ± 0,12 1,72** 1,63 ± 0,1 1,61 BMI (kg/m2) 31,83 ± 4,13 32,43 33,93 ± 4,07 34,01 SKP (mmHg) 134,48 ± 15,6 135 140,19 ± 21,38 140 DKP (mmHg) 86,55 ± 9,92 90 82,69 ± 11,33 82,5 AST/ALT 0,67 ± 0,22 0,61 0,91 ± 0,4 0,78** * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 У групи пацијената са DM тип 2 било је 5 (19,23%) мушкараца и 21 (80,77%) жена, док је у групи пацијената без DM било 11 (37,93%) жена и 18 (62,07%) мушкараца. У NAFLD групи са DM тип 2 статистички је било више жена (p<0,01).У овој групи пацијената у односу на пацијенте са NAFLD без DM статистички Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 84 значајно су биле више средње вредности јутарње гликемије наште (p<0,001) и односа AST/ALT (p<0,01) (Табела 27.). Табела 28. Поређење испитиваних параметара пацијената NAFLD групе у односу на присуство DM тип 2 Параметар NAFLD без DM, n=29 NAFLD са DM, n=26 Женски пол 11 37,93% 21 80,77%** Мушки пол 18 62,07% 5 19,23% Ухрањеност BMI < 18,5kg/m2 0 0,00% 0 0,00% BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 0 0,00% 0 0,00% BMI од 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 12 41,38% 5 19,23% BMI ≥ 30,0 kg/m2 17 58,62% 21 80,77% Гојазност Без 12 41,38% 5 19,23% BMI од 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 11 37,93% 11 42,31% x** BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 5 17,24% 8 30,77% BMI већи од 40 kg/m2 1 3,45% 2 7,69% Хипертензија 15 51,72% 25 96,15%*** MS 22 75,86% 26 100,00%* Компоненте MS Обим струка (cm) 23 79,31% 25 96,15% MS HDL (mmol/l) 15 51,72% 18 69,23% MS TG (mmol/l) 20 68,97% 16 61,54% MS Хипертензија/ SKP i/ ili DKP 24 82,76% 26 100,00% MS Гликемија ≥5,6 mmol/l/DM 12 41,38% 26 100,00%*** MS елемената 0 0 0,00% 0 0,00% 1 1 3,45% 0 0,00% 2 6 20,69% 0 0,00% 3 10 34,48% 6 23,08% y* 4 9 31,03% 7 26,92% 5 3 10,35% 13 50,00%** BMI ³30 17 58,62% 21 80,77% * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 x - поређење благе, средње изражене и озбиљне гојазности као јединствене категорије y - поређење заступљености 3, 4 или 5 компоненти MS као јединствене категорије Код пацијената NAFLD групе са DM тип 2, 5 (19,23%) пацијената је било прекомерно ухрањено и 21 (80,77%) гојазно, док је у групи пацијената без DM тип 2 12 (41,38%) било прекомерно ухрањено и 17 (58,62%) гојазно (Табела 28.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 85 Груписањем пацијената са првим, другим и трећим степеном гојазности као јединствене категорије гојазности утврђено је да их има статистички значајно више у групи са DM тип 2 (p<0,01). У NAFLD групи пацијената са DM тип 2 статистички су били заступљенији хипертензија (p<0,001) и MS (p<0,05). Утврђено је да су све компоненте метаболичког синдрома заступљеније у пацијената са DM тип 2, сем снижених нивоа триглицерида, али без статистичке значајности. У NAFLD групи пацијената са DM тип 2 је било статистички значајно више пацијената са 3 и више компоненти MS и посебно са 5, у односу на пацијенте без DM (p<0,05) (Табела 28.). 6.9. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на вредност NAFLD фиброзног скора Користећи вредност NAFLD фиброзног скора пацијенти NAFLD групе су подељени у три групе: без узнапредовале фиброзе (вредност NAFLD фиброзног скора мања од -1,45), са узнапредовалом фиброзом (вредност NAFLD фиброзног скора већа од 0,675) и интермедијарну групу (пацијенти са вредностима NAFLD фиброзног скора између ове две граничне). На основу вредности NAFLD фиброзног скора, највећи број пацијената je био у групи без узнапредовале фиброзе, њих 28 (50,91%), 21 (38,18%) је било у интермедијарној групи, а само 6 (10,91%) је било са налазом узнапредовале фиброзе (Графикон 1). Графикон 1. Расподела пацијената са NAFLD у односу на вредност NAFLD фиброзног скора Интермедијарна група 21; 38,18% Одсуство фиброзе 28; 50,91% Узнапредовала фиброза 6; 10,91% Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 86 Kruskal-Wallis тест и ANOVA потврдили су да постоје статистички значајне разлике између група подељених на основу вредности NAFLD фиброзног скора у односу на године старости (p<0,001), гликемију наште, број TR, OS, BMI, SKP, односа AST/ALT (p<0,01), као и ниво директог билирубина и албумина (p<0,05). Утврђене су статистички значајне разлике у полној структури пацијената ове три групе. Мушки пол био је статистички значајно заступљенији у групи са одсуством фиброзе у односу на интермедијарну групу (p<0,01) и у односу на групу са узнапредовалом фиброзом (p<0,05) (Табела 29.). Просечна старост пацијената са узнапредовалом фиброзом (64,50±5,24) и у групи са интермедијарном фиброзом (57,19±5,13) статистички је била значајно виша у односу на групу са одсуством фиброзе (40,11±11,11) (p<0,001), а старост групе са узнапредовалом фиброзом статистички је значајно била виша и у односу на старост интермедијарне групе (p<0,01) (Табела 29.). У односу на групу пацијената са одсуством фиброзе статистички значајно виша средња вредност јутарње гликемије наште је утврђена код групе са узнапредовалом фиброзом (p<0,05), али и у интермедијарној групи (p<0,01). Средње вредности албумина су биле највише у групи пацијената са одуством фиброзе, статистички значајно више у односу на обе преостале групе понаособ (p<0,05). Средње вредности серумских нивоа ALT су биле највише у групи пацијената са одсуством фиброзе, али без статистичке значајности у односу на остале две групе понаособ. Вредност ALT у интермедијарној групи статистички је била значајно виша у односу на групу са узнапредовалом фиброзом (p<0,05). Средње вредности фибриногена су биле највише код испитаника са узнапредовалом фиброзом, статистички значајно више у односу на групу са одсуством фиброзе (p<0,05). Средње вредности тромбоцита су биле највише у групи са одсуством фиброзе, статистички значајно више у односу на интермедијарну групу (p<0,001) и групу са узнапредовалом фиброзом (p<0,05). Утврђене су највише средње вредности обима OS и BMI у групи са узнапредовалом фиброзом, статистички значајно више у односу на групу са одсуством фиброзе (p<0,001) и у односу на интермедијарну групу (p<0,05) (Табела 29.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 87 Табела 29. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената NAFLD групе у односу на вредност NAFLD фиброзног скора Параметар Одуство фиброзе n=28 Интермедијарна група n=21 Узнапредовала фиброза n=6 Старост (год)*** 40,11±11,11 38,50 57,19±5,13 a***58,00 64,50±5,24 a***b*65,00 Пол *** (a vs b±c) (мушки/женски) 18 (64,29%) 10 (35,71%) b**c* 4 (19,05%) 17 (80,95%) 1 (16,67%) 5 (83,33%) Гликемија(mmol/l)** 5,76±1,19 5,45 7,10±2,38 a**6,20 8,37±4,72 a*6,40 Инсулин (mu/l) 36,05±20,03 29,95 44,64±36,14 29,00 34,43±37,54 20,80 HOMAIR 9,71±7,21 7,47 17,40±23,85 7,63 19,07±33,33 6,07 Urati (µmol/l) 375,62±87,11 388,40 352,96±67,87 354,20 431,03±177,15 398,30 UBIL (µmol) 13,31±6,08 12,40 11,55±4,91 11,20 14,62±6,20 13,50 DBIL (µmol)* 2,13±1,02 1,85 2,07±0,60 2,00 3,30±1,99 2,85 Албумини (g/l)* 46,27±2,85 bc*46,60 44,15±2,71 43,70 43,02±3,62 43,30 HOL (mmol/l) 6,02±1,09 5,83 5,86±1,03 6,25 5,1±0,91 5,14 HDL (mmol/l) 1,12±0,26 1,10 1,21±0,22 1,22 1,07±0,29 1,07 LDL (mmol/l) 3,91±0,86 3,85 3,65±0,95 3,80 3,38±1,20 3,30 TG (mmol/l) 2,37±1,32 1,9 2,28±0,89 2,04 1,87±0,85 1,55 AST (U/l) 39,05±25,67 30,30 42,35±19,10 38,60 37,80±9,31 39,80 ALT (U/l) 65,10±52,36 51,20 59,22±34,64 c*55,30 34,87±18,50 30,35 ALP (U/l) 66,84±24,73 59,75 73,63±28,17 65,90 89,00±43,48 87,00 GGT (U/l) 67,34±82,97 37,90 49,70±32,54 41,40 76,70±78,55 55,95 CRP (mg/l) 4,45±3,47 3,50 5,89± 8,06 3,10 15,45±26,83 4,30 Феритин (µg/l) 154,27±125,48 148,40 127,29± 94,96 101,00 167,20±124,54 129,55 INR 1,06±0,08 1,03 1,06±0,10 1,06 1,18±0,20 1,10 FIB (g/l) 4,23±0,88 4,16 4,53±0,80 4,27 5,41±1,77 a*4,93 TR x109/l ** 275,39±72,41 ***bc*263,00 207,81±39,00 212,00 212,17±35,89 230,50 OS (cm) ** 104,14±5,55 102,50 106,24±9,56 107,00 117,17±8,40 a***b*117,50 TT (kg) 94,63±14,68 92,50 87,35±15,84 83,00 98,00±6,00 b*99,00 TV (m)*** 1,73± 0,10 bc**1,74 1,62±0,11 1,60 1,61±0,04 1,60 BMI (kg/m2)** 31,47±3,50 31,84 33,18±4,35 32,04 37,91±2,51 a***b*37,84 SKP (mmHg)** 130,54±15,95 130,00 141,43±13,24 a*140,00 153,33±32,04 15,50 DKP (mmHg) 83,21±11,32 80,00 87,38±6,25 90,00 82,50±18,37 80,00 AST/ALT** 0,67±0,21 0,62 0,80±0,31 0,70 1,27±0,51 a**b*1,17 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 a - vs одсуство фиброзе, b - vs интермедијарна, c - vs узнапредовала фиброза Пацијенти са узнапредовалом фиброзом су имали највише средње вредности TT, статистички значајно више у односу на испитанике интермедијарне групе Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 88 (p<0,05). Средње вредности SKP су биле највише у групи са узнапредовалом фиброзом, али због високе стандардне девијације, а малог узорка, не и статистички значајне у односу на остале две групе понаособ. Статистички значајно више средње вредности SKP утврђене су у интермедијарној групи у односу на групу са одсуством фиброзе (p<0,05). Највиша средња вредност односа AST/ALT утврђена је у групи са узнапредовалом фиброзом, статистички значајно виша у односу на групу са одсуством фиброзе (p<0,01) и у односу на интермедијарну групу (p<0,05) (Табела 29.). У NAFLD групи пацијената са одсуством фиброзе 11 (39,29%) је било прекомерно ухрањено и 17 (60,71%) пацијената је било гојазно. У интермедијарној групи 6 (28,57%) пацијената је било прекомерно ухрањено и 15 (71,43%) је било гојазно, док су у групи са узнапредовалом фиброзом сви пацијенати имали неки степен гојазности, највише 4 (66,67%) пацијента са другим степеном гојазности. Није утврђена статистички значајна разлика у степену ухрањеност између група формираних на основу NAFLD фиброзног скора (Табела 30.). Табела 30. Ухрањеност и гојазност пацијената NAFLD групе у односу на вредност NAFLD фиброзног скора. Параметар Одуство фиброзе n=28 Интермедијарна група n=21 Узнапредовала фиброза n=6 Ухрањеност BMI < 18,5kg/m2 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% BMI од 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 11 39,29% 6 28,57% 0 0,00% BMI ≥ 30,0 kg/m2 17 60,71% 15 71,43% 6 100,00% Гојазност Без 11 39,29% 6 28,57% 0 0,00% BMI од 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 12 42,86% 9 42,86% 1 16,67%xa* BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 5 17,86% 4 19,05% 4 66,67% BMI већи од 40 kg/m2 0 0,00% 2 9,52% 1 16,67% **- p<0,01 a - vs одуство фиброзе x - поређење благе, средње изражене и озбиљне гојазности као јединствене категорије Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 89 Утврђено је да је гојазност првог, другог и трећег степена као јединствена категорија гојазности статистички значајно заступљенија код пацијената са узнапредовалом фиброзом у односу на пацијенте без узнапредовале фиброзе. (p<0,05) (табела 30.). У NAFLD групи пацијената са узнапредовалом фиброзом сви пацијенти су имали већ дијагностиковану и лечену хипертензију и DM тип 2. Код пацијената са NAFLD са вредностима NAFLD фиброзног скора који се карактерише као одсуство фиброзе статистички је било мање пацијената са хипертензијом у односу на интермедијарну групу (p<0,01), као и групу са узнапредовалом фиброзом (p<0,05). Заступљеност пацијената са DM тип 2 статистички је био значајно виша у интермедијарној групи и групи са узнапредовалом фиброзом у односу на пацијенте са одсуством фиброзе (p<0,001) (Табела 31.). Табела 31. Заступљеност DM тип 2 и хипертензије пацијената NAFLD групе у односу на вредност NAFLD фиброзног скора. * - p<0,05, ** - p<0,01, ** - p<0,001 a - vs одсуство фиброзе Утврђено је да заступљеност пацијената са MS расте са порастом NAFLD фиброзног скора као категоријском варијаблом, односно највећа је (100,00%) код пацијената са узнапредовалом фиброзом, а најмања код пацијената са одсуством фиброзе (78,57%), међутим с обзиром на релативно мале групе, а високе проценте пацијената са MS, нису нађене статистички значајне разлике. На овај начин може се објаснити и пораст заступљености следећих компоненти MS: повећаног обима струка, присуства дијагностиковане и лечене хипертензије или повишених вредности SKP и/или DKP и повишених серумских нивоа гликемије наште односно присутног DM тип 2. Присуство дијабетеса или повишених нивоа гликемије наште као метаболичка компонента статистички је била заступљенија у интермедијарној Параметар Одуство фиброзе n=28 Интермедијарна група n=21 Узнапредовала фиброза n=6 Хипертензија 15 53,57% 19 90,48%a** 6 100%a* DM 5 17,86% 15 71,43%a*** 6 100%a*** Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 90 групи и групи са узнапредовалом фиброзом понаособ у поређењу са групом пацијената са одсутном фиброзом (p<0,05). Повишен ниво TG као метаболичка компонента била је заступљенија у групи са одсутном фиброзом и интермедијарној групи у односу на групу са узнапредовалом фиброзом, а разлика између групе са одсутном фиброзом и групе где је фиброза узнапредовала је статистички значајна (p<0,05) (Табела 32.). Табела 32. Заступљеност метаболичког синдрома пацијената NAFLD групе у односу на вредност NAFLD фиброзног скора. Параметар Одуство фиброзе n=28 Интермедијарна група n=21 Узнапредовала фиброза n=6 MS 22 78,57% 20 95,24% 6 100,00% Компоненте MS MS обим струка (cm) 22 78,57% 20 95,24% 6 100,00% MS HDL (mmol/l) 16 57,14% 14 66,67% 4 66,67% MS TG (mmol/l) 20 71,43%c* 15 71,43% 1 16,67% MS хипертензија/SKP и/или DKP 23 82,14% 21 100,00% 6 100,00% MS гликемија≥5,6 mmol/l/DM 14 50,00% 18 85,71%a* 6 100,00%a* Број MS компоненти 0 1 1 3,57% 0 0,00% 0 0,00% 2 5 17,86% 1 4,76% 0 0,00% 3 9 32,14% 5 23,81% 2 33,33% 4 8 28,57% 5 23,81% 3 50,00% 5 5 17,86% 10 47,62% 1 16,67% * - p<0.05 a - vs група са одсутном фиброзом, c - vs група са узнапредовалом фиброзом Нису утврђене статистички значајне разлике расподеле пацијената по броју компонената MS између група формираних на основу NAFLD фиброзног скора. 6.10. Резултати ултразвучног прегледа јетре Ултразвучним прегледом јетре извршили смо процену величине и структуре паренхима јетре, ехоконтраст између јетре и десног бубрега, степен ехогености паренхима, степен визуализације крвних судова, дијафрагме, постериорног Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 91 сегмента десног режња, односно степен атенуације UZ таласа. Ултрасонографијом утврдили смо сва три степена неалкохолне масне јетре. Степен I или блага стеатоза се UZ приказује као умерено хиперехоген паренхим, уз видљиву порталну вену и дијафрагму. Степен II или умерена стеатоза подразумева изразитије хиперехоген паренхим јетре, тако да се интрахепатични крвни судови и дијафрагма слабије приказују (Cлика 4.), и степен III, јетра је изразито хиперехогена, без могућности добре визуализације портне вене, дијафрагме, постериорног сегмента десног режња, односно присутна је атенуација UZ таласа (Cлика 5.). Слика 3. Ултразвучни налаз стеатозе јетре, степен I. Слика 4. Ултразвучни налаз стеатозе јетре, степен II. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 92 Слика 5. Ултразвучни налаз стеатозе јетре, степен III. Највећи број пацијената NAFLD групе, 23 (41,82%), имало је ултразвучни налаз масне јетре III степена, 20 (36,36%) пацијената је имало UZ налаз масне јетре II степена и 12 (21,82%) пацијената било је са I степеном. Kruskal-Wallis тест и ANOVA анализа показали су да постоје статистички значајне разлике између група са различитим ултразвучним степеном за инсулин, гликемију наште, LDL холестерол, OS, BMI (p<0,05), HOMA-IR и TT (p<0,01) (Табела 33.). На основу Студентовог т-теста и Mann-Whitney теста, поређењем група са различитим ултразвучним степеном понаособ, код пацијената NAFLD групе ултразвучног налаза масне јетре II степена средње вредности BMI статистички су биле значајно више у односу на групу са ултазвучним налазом масне јетре I степена, 33,26±4,16 (33,29) vs. 29,85±3,11 (33,26) kg/m2 (p<0,05). Такође, пацијенти са UZ налазом масне јетре III степена, у поређењу са са пацијентима са UZ налазом I степена, имали су статистички значајно више средње вредности OS (109,26±7,76 vs.100,75±6,15 cm) и BMI (34,01±4,12 vs. 29,85±3,11 kg/m2) (p<0,01). Средња вредност телесне тежине била је највиша код пацијената са UZ налазом масне јетре III степена, статистички значајно виша у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре II степена (p<0,05) и UZ налазом масне јетре I степена (p<0,001). У односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена статистички су значајно биле више средње вредности инсулина наште и HOMA-IR код пацијената Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 93 са UZ налазом масне јетре II (p<0,01) и III степена (p<0,05). Средње вредности гликемије наште статистички су биле значајно више код пацијената са UZ налазом масне јетре II и III степена у односу на пацијенте ултразвучног налаза I степена (p<0,05). Није нађена статистички значајна разлика средњих вредности аминотрансфераза, ALP, GGT, холестерола, триглицерида, CRP, фибриногена и феритина код пацијената са различитим ултразвучним степеном (Табела 33.). Табела 33. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената са NAFLD у односу на UZ степен масне јетре Параметар NAFLD UZ I n=12 NAFLD UZ II n=20 NAFLD UZ III n=23 Старост (год) 48,00 ± 15,18 53 50,80 ± 12,74 54 48,65 ± 12,36 52 Гликемија (mmol/l) 5,49 ± 0,93 5,35 7,10 ± 2,97 a*6,00 6,64 ± 2,24 a*6,10 Инсулин (mu/l)a* 22,92 ± 8,16 22 48,03 ± 33,13 a**35,40 39,92 ± 29,15 a*30,00 HOMA-IR** 5,61 ± 2,12 5,16 18,11 ± 21,99 a**8,50 14,01 ± 20,03 a*7,92 Урати (µmol/l) 350,86 ± 95,67 336,65 382,27 ± 106,38 375,25 376,52 ± 85,07 381,3 UBIL (µmol/l) 11,15 ± 2,7 11,6 14,23 ± 7,15 12,1 12,38 ± 5,23 12,2 DBIL (µmol/l) 1,78 ± 0,47 1,8 2,45 ± 1,44 2,1 2,28 ± 0,89 2,1 Албумини (g/l) 45,06 ± 2,57 44,85 44,87 ± 3,29 44,85 45,33 ± 3,26 46 HOL (mmol/l) 6,27 ± 0,94 5,83 5,99 ± 0,98 6,17 5,54 ± 1,13 5,28 HDL (mmol/l) 1,25 ± 0,24 1,18 1,12 ± 0,22 1,08 1,12 ± 0,27 1,12 LDL (mmol/l) 4,15 ± 0,83 c*4,05 3,92 ± 0,9 3,95 3,41 ± 0,9 3,5 TG (mmol/l) 2,24 ± 1,25 1,83 2,32 ± 0,94 1,87 2,27 ± 1,23 1,96 AST (U/l) 38,51 ± 23,19 33,2 43,32 ± 26,89 35 38,30 ± 16,14 34,8 ALT (U/l) 50,04 ± 21,91 46,45 67,36 ± 61,87 54,55 57,74 ± 32,93 55,3 ALP (U/l) 72,26 ± 26,44 65,55 71,88 ± 28,34 61,8 71,61 ± 31,21 65,9 GGT (U/l) 84,10 ± 113,11 39,7 50,68 ± 50,56 35,1 59,41 ± 45,37 41,7 CRP (mg/l) 5,69 ± 4,9 4,15 7,11 ± 14,95 3,65 5,68 ± 7,65 3,2 Феритин (µg/l) 151,88 ± 161,38 111,05 137,57 ± 100,73 129,95 148,78 ± 98,56 142,7 INR 1,02 ± 0,05 1,03 1,09 ± 0,08 a*1,08 1,08 ± 0,14 1,03 FIB (g/l) 4,46 ± 0,7 4,29 4,60 ± 1,31 4,28 4,36 ± 0,91 4,2 TR x109/l 245,17 ± 58,12 245,5 256,45 ± 79,25 237,5 229,43 ± 58,44 226 OS (cm) * 100,75 ± 6,15 101 106,40 ± 9 103,5 109,26 ± 7,76 a**107,00 TT(kg)** 82,10 ± 9,22 79,1 89,77 ± 13,59 91,5 99,63 ± 14,8 a***b*100,00 TV (m) 1,66 ± 0,12 1,66 1,64 ± 0,1 1,61 1,71 ± 0,12 b*1,72 BMI (kg/m2)* 29,85 ± 3,11 29,27 33,26 ± 4,16 a*33,29 34,01 ± 4,12 a**34,22 SKP (mmHg) 132,92 ± 13,22 140 132,50 ± 15,6 130 143,48 ± 21,92 140 DKP (mmHg) 82,08 ± 10,33 80 83,00 ± 9,51 80 87,61 ± 11,57 90 AST/ALT 0,78 ± 0,26 0,69 0,80 ± 0,34 0,74 0,78 ± 0,39 0,63 a - vs UZ I, b - vs UZ II, c - vs UZ III, * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 94 Гојазност као категорија ухрањености статистички је била заступљенија код пацијената са UZ налазом масне јетре II и III степена понаособ у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена (p<0,05), а иста значајност се добија и на основу табеле контигенције 3x2. Блага, средње изражена и озбиљна гојазност као јединствена категорија гојазности статистички значајно су биле заступљеније код пацијената са UZ налазом масне јетре II степена у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена (p<0,05), (Табела 34.). Табела 34. Корелација BMI у односу на UZ степен масне јетре Параметар NAFLD UZ I, n=12 NAFLD UZ II, n=20 NAFLD UZ III, n=23 BMI (kg/m2) Broj % Broj % Broj % BMI < 18,5 kg/m2 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% BMI oд 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% BMI oд 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 8 66,67% 4 20,00% 5 21,74% BMI ≥ 30,0 kg/m2* 4 33,33% 16 80% a* 18 78,26% a* BMI (kg/m2) Број % Број % Број % BMI oд 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 3 25,00% 10 50,00%ax* 9 39,13%ax* BMI oд 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 1 8,33% 5 25,00% 7 30,43% BMI већи од 40 kg/m2 0 0,00% 1 5,00% 2 8,70% * - p<0,05 a – vs. ултразвучни степен I, x– поређени као јединствена категорија испитаници са BMI ³ 30 kg/m2 На основу табела контигенције 3´2 присуство хипертензије и DM тип 2 у NAFLD групи статистички се значајно разликовало у односу на UZ степен масне јетре (p<0,05) (Табела 35.). Табела 35. Заступљеност хипертензије и DM тип 2 код пацијената са NAFLD у односу на UZ степен масне јетре Параметар NAFLD UZ I, n=12 NAFLD UZ II, n=20 NAFLD UZ III, n=23 Хипертензија* 5 41,56% 16 80,00%a* 19 82,61%a* DM* 2 16,67% 10 50,00% 14 60,87%*a * - p<0,05, a – vs. UZ степен I Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 95 Поређењем понаособ, хипертензија је била заступљенија код пацијената са UZ налазом масне јетре II и III степена у односу на пацијенте са UZ налазом I степена (p<0,05). Такође, DM тип 2 је био најзаступљенији код пацијената са UZ налазом масне јетре III степена, статистички значајно више у односу на групу пацијената са UZ налазом I степена (p<0,05) (Табела 35.). Утврђена је статистички значајна разлика у заступљености полова између пацијената NAFLD са UZ налазом масне јетре II и III степена p<0,05. Мушки пол је статистички био заступљенији код пацијената NAFLD групе са UZ налазом III степена у односу на групу пацијената са UZ налазом масне јетре II степена (Табела 36.). Табела 36. Заступљеност полова пацијената са NAFLD у односу на UZ степен масне јетре Пол NAFLD UZ I, n=12 NAFLD UZ II, n=20 NAFLD UZ III, n=23 Женски 7 58,33% 15 75,00% 10 43,48% Мушки 5 41,67% 5 25,00% 13 56,52%b* * - p<0,05, b – vs. ултразвучни степен II Метаболички синдром је статистички био заступљенији код пацијената са UZ налазом масне јетре II и III степена (p<0.01) у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена (Табела 37.). Заступљеност снижених нивоа HDL-холестерола као метаболичке компоненте у односу на пацијенате са UZ налазом масне јетре I степена статистички је значајно виша код пацијената II (p<0,01) и III UZ степена масне јетре (p<0,05). Већ постојећи DM тип 2 или повишена гликемија наште најзаступљенија је код пацијената са III UZ степеном масне јетре, статистички значајно више у односу на пацијенте UZ I степена (p<0,05) (Tабела 37.) У NAFLD групи са UZ налазом масне јетре II и III степена статистички је било значајно више пацијената са 4 и 5 компоненти метаболичког синдрома у односу на групу пацијената са UZ I степеном масне јетре (p<0.05) (Табела 37.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 96 Табела 37. Заступљеност метаболичког синдрома код пацијената са NAFLD у односу на UZ степен масне јетре Параметар NAFLD UZ I, n=12 NAFLD UZ II, n=20 NAFLD UZ III, n=23 MS 6 50,00% 20 100,00% a** 22 95,65% a** Компоненте MS MS обим струка (cm) 9 75,00% 18 90,00% 21 91,30% MS HDL (mmol/l) 3 25,00% 15 75,00% a** 15 65,22% a* MS TG (mmol/l) 7 58,33% 13 65,00% 16 69,57% MS хипертензија/SKP и/или DKP 10 83,33% 18 90,00% 22 95,65% MS гликемија≥5,6 mmol/l/DM 5 41,67% 15 75,00% 18 78,26% a* Број MS компоненти 0 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 1 8,33% 0 0,00% 0 0,00% 2 5 41,67% 0 0,00% 1 4,35% 3 3 25,00% 6 30,00% 7 30,43% 4 1 8,33% 9 45,00% ax* 6 26,09% ax* 5 2 16,67% 5 25,00% 9 39,13% * - p<0,05, ** - p<0,01, a - vs UZ степен I, x – поређени као јединствена категорија пацијенти са 4 i 5 компоненте MS 6.10.1. Предиктори ултразвучног налаза масне јетре 6.10.1.1. Резултати униваријантне логистичке регресионе анализе На основу резултата униваријантне логистичке регресионе анализе статистички значајни параметри од интереса за појаву вишег ултразвучног степена масне јетре код пацијената са NAFLD (UZ степен II и III масне јетре) су: BMI, MS, број компоненти MS, компонента MS снижен серумски ниво HDL холестерола и гојазност (p<0,01), као и инсулин, HOMA-IR, OS, TT, гојазност првог и другог степена, хипертензија, DM тип 2 и компонента MS повишена гликемија наште или већ присутан DM тип 2 (p<0,05). Присуство MS повећава вероватноћу за виши UZ степен масне јетре 42 пута (IP 4,28-411,97), компонента MS снижен ниво HDL холестерол 6,92 пута (IP 1,61-29,80), гојазност 7,56 пута (IP 1,85-30,86), гојазност првог степена 5,63 пута (IP 1,20-26,41), гојазност другог степена 10,67 пута (IP 1,12-101,34), DM тип 2 6,32 пута (1,23-32,34), хипертензија 6,12 пута (IP Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 97 1,54-24,37), Компонента MS повишена гликемија наште или присутан DM тип 2 4,62 пута (IP 1,20-17,79) (Табела 38.). Табела 38. Вредности OR за процену утицаја фактора од интереса на појаву вишег ултразвучног степена масне јетре- резултати униваријантне логистичке регресионе анализе Параметар OR 95% IP p Доња Горња Старост (год) 1,01 0,96 1,06 0,6939 Пол мушки 1,01 0,28 3,69 0,9904 Гликемија (mmol/l) 2,23 0,98 5,07 0,0558 Инсулин (mu/l) 1,08 1,01 1,16 *0,0248 HOMAIR 1,39 1,04 1,86 *0,0250 Урати (µmol/l) 1,00 1,00 1,01 0,3567 UBIL (µmol/l) 1,08 0,95 1,23 0,2612 DBIL (µmol/l) 2,12 0,86 5,19 0,1021 Албумини (g/l) 1,01 0,82 1,24 0,9537 HOL (mmol/l) 0,61 0,32 1,17 0,1386 HDL (mmol/l) 0,12 0,01 1,80 0,1233 LDL (mmol/l) 0,52 0,24 1,13 0,1002 TG (mmol/l) 1,04 0,58 1,88 0,8868 AST (U/l) 1,00 0,97 1,04 0,7637 ALT (U/l) 1,01 0,99 1,03 0,4031 ALP (U/l) 1,00 0,98 1,02 0,9552 GGT (U/l) 0,99 0,99 1,00 0,2247 CRP (mg/l) 1,01 0,94 1,08 0,8467 Феритин (µg/l) 1,00 0,99 1,00 0,8208 FIB (g/l) 1,02 0,54 1,92 0,9569 TR x109/l 1,00 0,99 1,01 0,8832 OS (cm) 1,16 1,03 1,31 *0,0150 TT (kg) 1,08 1,02 1,14 *0,0115 BMI (kg/m2) 1,34 1,07 1,67 **0,0094 Блага гојазност 5,63 1,20 26,41 *0,0285 Средње изражена гојазност 10,67 1,12 101,34 *0,0393 Присутна гојазност 7,56 1,85 30,86 0,0049 SKP (mmHg) 1,02 0,98 1,06 0,3675 DKP (mmHg) 1,03 0,97 1,09 0,3326 Хипертензија 6,12 1,54 24,37 *0,0101 DM 6,32 1,23 32,34 *0,0270 MS OS (cm) 3,25 0,62 17,15 0,1648 MS HDL (mmol/l) 6,92 1,61 29,80 **0,0094 MS TG (mmol/l) 1,48 0,40 5,50 0,5587 MS хипертензија/SKP и/или DKP 2,67 0,39 18,17 0,3164 MS гликемија ≥5,6 mmol/l/DM 4,62 1,20 17,79 *0,0261 Број елемената MS 3,27 1,47 7,29 **0,0037 MS 42,00 4,28 411,97 **0,0013 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 98 Пораст броја елемената MS за један повећава вероватноћу налаза вишег UZ степена масне јетре 3,27 пута (IP 1,47-7,29), пораст HOMA-IR 39% (IP 1,04-1,86), BMI 34% (IP 1,07-1,67), ОS 16% (IP 1,03-1,31), инсулин 8% (IP 1,01-1,16), а пораст TT за 1kg повећава вероватноћу за озбиљан UZ налаз у студијској групи 8% (IP 1,02-1,14) (Табела 38.). Значајне предикторске варијабле из униваријантне анализе уврштене су у модел мултиваријантне логистичке регресије, с тим да је изостављено присуство умерене и озбиљне гојазности и третирано је само присуство гојазности. (Табела 39.). Мултиваријантна логистичка регресиона анализа је као најважније предикторе вишег UZ степена масне јетре издвојила: ТТ, хипертензију, снижен ниво HDL холестерола као компоненте MS и припадајућу константу. Табела 39. Вредности OR за процену утицаја фактора од интереса на појаву вишег ултразвучног степена масне јетре, резултати мултиваријантне логистичке регресионе анализе Параметар OR 95% IP p Доња Горња TT (kg) 1,12 1,02 1,22 *0,0180 Лечена хипертензија 15,25 1,97 118,25 **0,0091 MS HDL (mmol/l) 7,25 1,21 43,30 *0,0298 Constant 0,00 0,0126 * - p<0,05, ** - p<0,01, R2 = 0,5319 Регресиони модел који као независно променљиве укључује ова три фактора и константу регресије објашњава 53,19% промену вероватноће за појаву вишег UZ степена масне јетре (R2 = 0,5319). На основу вредности ОR најзначајнији је утицај хипертензије, следи утицај снижених вредности HDL холестерола као компоненте MS, а потом и ТТ. Појава великих вредности IP за ове компоненте модела последица је већ наведеног (Табела 39.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 99 6.11. Патохистолошка анализа биопсијских узорака пацијената NAFLD групе Биопсија јетре је урађена код 16 (29,09%) пацијената са неалкохолном масном болешћу јетре. У патохистолошкој анализи биопсијских узорака за семиквантитативно означавање изражености поједине патохистолошке карактеристике употребљавана је подела коришћена у радовима Brunt и сар. [144]. У нашој групи пацијената са NAFLD, код 4 (25%) пацијента утврђено је постојање стеатозе (Слика 6.), без критеријума за стеатохепатитис. Неалкохолни стеатохепатитис (NASH) дефинисан на основу минималних критеријума (присутност стеатозе, лобуларне упале и знакова оштећења хепатоцита у виду балонирања или апоптозе) био је присутан у 75 % случајева (Слика 7. и 8.). Слика 6. Steatosis hepatis. HE, објектив x 40 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 100 Слика 7. Steatohepatitis. Накупина лимфоцита и Купферових ћелија. HE, објектив x 40 Слика 8. Балонизација хепатoцита i Mallory hijalin. HE, objektiv x 10 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 101 Највећи број биопсираних пацијената, 56,25% је имао благу некроинфламаторну активност (градус 1), 12,5% пацијената је имао средње изражену некроинфламаторну активност (градус 2) и код једног пацијента (6,25%) утврђена је изражена некроинфламаторна активност (градус 3). Код једног пацијента је утврђена премошћавајућа („bridging“) фиброза (Tабела 40.). Табела 40. Учесталост и израженост појединих патохистолошких карактеристика NAFLD и расподела пацијената према стадијуму некроинфламаторне активности и фиброзе према Brunt и сар. Параметар n=16 n % Стеатоза Градус 1, 5% - 33% 7 43,75% Градус 2, 33% - 66% 7 43,75% Градус 3, >66% 2 12,5% Балонизација хепатоцита Нема 3 18,75% Мало балонираних ћелија 6 37,5% Умерено балонирање 7 43,75% Интралобуларна упала (број жаришта на повећању 200x) без жаришта 3 18,75% 1=1 жариште 9 56,25% 2=2-4 жаришта 3 18,75% 3=>4 жаришта 1 6,25% Портална инфламација нема 6 37,5% блага 7 43,75% умерена 3 18,75% изражена 0 0 Некроинфламаторни стадијум према Брунту 0 4 25% Градус 1, благи 9 56,25% Градус 2, умерени 2 12,5% Градус 3, изражени 1 6,25% Стадијум фиброзе према Брунту 0 13 81,25% Перисинусоидална/ перицелуларна фиброза 0 0% Перисинусоидална са порталном фиброзом 2 12,5% Премоштавајућа фиброза 1 6,25% Цироза 0 0% Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 102 Код групе пацијената са NASH статистички су биле значајно више средње вредности гликемије наште, инсулина, HOMA-IR, урата, триглицерида, AST, ALT, ALP, GGT, CRP, феритина, OS, TT, BMI, SKP, DKP (p<0,001), укупног билирубина, LDL холестерола (p<0,01), директног билирубина, холестерола и фибриногена (p<0,05) у односу на испитанике контролне групе. Пацијенти са NASH су имали статистички значајно више средње вредности HOMA-IR и укупног билирубина у односу на пацијенте са обичном стеатозом (p<0,05) (Tабела 41). Табела 41. Демографски, антропометријски и биохемијски параметри пацијената са стеатозом јетре, са NASH и испитаника контролне групе Параметар Контрола, n=31 Стеатоза (м.јетра), n=4 NASH, n=12 Старост (год) 47,84 ± 10,08 49 48 ± 15,3 48,5 48,75 ± 11,76 49 Гликемија (mmol/l) 5 ± 0,74 5 5,5 ± 1,07 5,6 6,12 ± 0,84 a***5,90 Инсулин (mu/l) 12,41 ± 4,37 13 20 ± 5,29 a**21,00 33,45 ± 17,28 a***28,50 HOMAIR 2,77 ± 1,07 2,88 4,72 ± 0,68 a**4,89 9,31 ± 5,58 a*** b*7,52 Урати (µmol/l) 239,98 ± 56,57 237,4 373,1 ± 89,55 a**373,05 353,21 ± 73,07 a***338,90 UBIL (µmol/l) 10,17 ± 2,91 9,9 9,3 ± 3,24 9,6 15,68 ± 5,38 a** b*13,90 DBIL (µmol/l) 1,81 ± 0,54 1,6 1,55 ± 0,54 1,65 2,59 ± 0,92 a* 2,35 Албумини (g/l) 44,05 ± 3,84 44,9 43,2 ± 2,72 43,45 44,69 ± 2,45 44,75 HOL (mmol/l) 5,16 ± 1,08 5,12 5,98 ± 0,8 5,76 5,91 ± 0,78 a*6,23 HDL (mmol/l) 1,28 ± 0,28 1,34 1,29 ± 0,21 1,21 1,13 ± 0,25 1,22 LDL (mmol/l) 3,26 ± 0,87 3,3 4,08 ± 0,82 4,05 4,05 ± 0,55 a**4,00 TG (mmol/l) 1,2 ± 0,37 1,08 2,24 ± 1,39 1,91 1,75 ± 0,33 a***1,79 AST (U/l) 20,84 ± 4,25 20,1 45,1 ± 39,33 a*28,15 49,48 ± 31,92 a*** 39,20 ALT (U/l) 16,85 ± 6,23 16,1 45,23 ± 24,37 a**36,75 81,59 ± 74,38 a***51,40 ALP (U/l) 55,5 ± 16,56 49,8 72,2 ± 40,28 58,65 85,54 ± 30,69 a***74,10 GGT (U/l) 19,45 ± 14,97 14,7 173 ± 173,2 a**116,25 71,58 ± 55,02 a***62,15 CRP (mg/l) 1,69 ± 1,63 1,1 8,53 ± 7,89 a*6,95 8,12 ± 10,06 a***3,75 Феритин (µg/l) 45,65 ± 28,17 39,3 181,8 ± 291,6 46,45 126,46 ± 77,84 a***108,90 INR 1,08 ± 0,08 1,06 1,09 ± 0,1 1,05 1,11 ± 0,14 1,1 FIB (g/l) 3,48 ± 0,86 3,55 4,77 ± 0,92 a**4,58 4,27 ± 0,99 a*4,17 TR x109/l c*253,90 ± 50,48 261 215 ± 39,87 219 219,33 ± 32,54 220,5 OS (cm) 78,87 ± 7,18 79 102,5 ± 7,05 a***101,50 104,33 ± 9,07 a***103,50 TT (kg) 65 ± 8,9 62 84,75 ± 12,53 a**85,00 85,95 ± 13,99 a***85,70 TV (m) 1,7 ± 0,09 1,68 1,67 ± 0,13 1,64 1,64 ± 0,11 1,6 BMI (kg/m2) 22,52 ± 2,08 22,77 30,4 ± 4,25 a**30,11 31,85 ± 4,7 a***30,17 SKP (mmHg) 116,45 ± 13,86 120 137,5 ± 17,08 a*135,00 145,83 ± 23,53 a***140,00 DKP (mmHg) 72,9 ± 9,98 70 87,5 ± 5 a**90,00 85,83 ± 8,75 a***90,00 AST/ALT / ± / / 0,92 ± 0,33 0,89 0,75 ± 0,37 0,62 * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 a - vs контрола, b - vs стеатоза, c - vs NASH Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 103 Код пацијената са обичном стеатозом статистички су значајно биле више средње вредности OS (p<0,001), инсулина, HOMA-IR, урата, АLТ, GGT, фибриногена, ТТ, BMI, DKP (p<0,01), SKP, AST и CRP (p<0,05) у односу на испитанике контролне групе. Број тромбоцита је био статистички значајно виших вредности код испитаника контролне у односу на пацијенте NASH групе (p<0,05) (Табела 41.). Није утврђена статистички значајна разлика у полној структури испитаника контролне групе, групе са стеатозом јетре и NASH групе. Груписањем прекомерне ухрањености и гојазности као јединствене категорије ухрањености утврђено је да је статистички значајно више оваквих пацијената у NASH групи и у групи са стеатозом јетре у односу на контролну групу (p<0,001). Гојазност првог, другог и трећег степена као јединствена категорија гојазности статистички је била заступљенија код пацијената са стеатозом јетре (p<0,05) и у NASH групи (p<0,001) у односу на контролну групу (Табела 42.). Статистички значајно више пацијената са NASH у односу на испитанике контролне групе је имало MS (91,67% vs. 9,68%) (p<0,001). Заступљеност централне гојазности, већ постојеће хипертензије или повишен SKP и/или DKP и повишен ниво јутарње гликемије наште или већ постојећи DM као метаболичких компоненти било је статистички значајно више у пацијената са NASH у односу на испитанике контролне групе (p<0,001). У NASH групи је било статистички значајно више пацијената са DM тип 2 и хипертензијом, са компонентом MS повишен ниво триглицерида (p<0,01) и са компонентном MS снижен ниво HDL холестерола у односу на контролну групу (p<0,05). У NASH групи статистички је било значајно више пацијената са 3 и више компоненти MS, као и са 4 и 5 компоненти MS ако се посматрају као јединствена категорија у односу на контролну групу (p<0,001) (Табела 42.). У групи са обичном стеатозом јетре 50% пацијената је имало метаболички синдром. У овој групи статистички су биле заступљеније централна гојазност (p<0,001) и повишен ниво триглицерида (p<0,05) као метаболичке компоненте у односу на контролну групу (Табела 42.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 104 Табела 42. Поређење испитиваних параметара између пацијената са стеатозом јетре, NASH и контролне групе * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 a - vs контрола x - поређење прекомерне ухрањености и гојазности као јединствене категорије y - поређење благе, средње изражене и озбиљне гојазности као јединствене категорије z - поређење заступљености 3, 4 и 5 компоненти МS као јединствене категорије w - поређење заступљености 4 и 5 компоненти МS као јединствене категорије 6.12. Квантитативно мерење цитокератина-18 у крвној плазми. Вредности резултата квантитативног мерења цитокератина 18 у крвној плазми пацијената NAFLD групе и испитаника контролне групе приказани су у табели 43. и дијаграму 1. Параметар Контрола, n=31 Стеатоза (м. јетра), n=4 NASH, n=12 Женски пол 21 67,74% 3 75,00% 8 66,67% Мушки пол 10 32,36% 1 25,00% 4 33,33% Ухрањеност BMI < 18,5kg/m2 1 3,23% 0 0,00% 0 0,00% BMI од 18,5 kg/m2 до 24,9 kg/m2 29 93,55% 0 0,00% 0 0,00% BMI од 25 kg/m2 до 29,9 kg/m2 1 3,23% 2 50,00% ax*** 6 50,00%ax*** BMI ≥ 30,0 kg/m2 0 0,00% 2 50,00% 6 50,00% Гојазност Без 31 100,00% 2 50,00% 6 50,00% BMI од 30 kg/m2 до 34,99 kg/m2 0 0,00% 1 25,00% ay* 4 33,33% ay*** BMI од 35 kg/m2 до 39,99 kg/m2 0 0,00% 1 25,00% 1 8,33% BMI већи од 40 до kg/m2 0 0,00% 0 0,00% 1 8,33% Хипертензија 4 12,90% 2 50,0% 7 58,33%a** DM 0 0,00% 1 25,00% 4 33,33%a** MS 3 9,68% 2 50,00% 11 91,67%a*** Компоненте MS MS обим струка (cm) 0 0,00% 3 75,00%a*** 10 83,33% a *** MS HDL (mmol/l) 9 29,03% 2 50,00% 8 66,67%a* МS TG (mmol/l) 5 16,13% 3 75,00%a* 7 58,33%a** MS хипертензија/SKP и/или DKP 9 29,03% 3 75,00% 11 91,67%a*** MS гликемија ≥5,6 mmol/l/DM 5 16,13% 2 50,00% 9 75,00%a*** MS елемената 0 14 45,16% 0 0,00% 0 0,00% 1 9 32,26% 1 25,00% 0 0,00% 2 5 12,90% 1 25,00% 1 8,33% 3 3 9,68% 0 0,00% 3 25,00%az*** 4 0 0,00% 0 50,00% 6 50,00%aw*** 5 0 0,00% 2 16,67% 2 16,67% Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 105 Табела 43. Концентрација CK-18 у плазми испитаника контролне и групе пацијената са NAFLD Контрола, n=31 NAFLD, n=55 CK-18 (U/L) 258,58 ± 79,39 270 879,81 ± 248,50 ***964,50 *** - p<0,001 Средње вредности цитокератина-18 у плазми код пацијената NAFLD групе биле су статистички значајно више у односу на контролну групу (879,81±248,50 vs. 258,58±79,39) (p<0,001) (Табела 43. и Дијаграм 1.). Дијаграм 1. Box-plot дијаграм вредности CK-18 NAFLD и контролне групе Табела 44. Концентрација CK-18 у плазми код појединих подгрупа пацијената са NAFLD CK-18 (U/L) NAFLD без биопсије, n=39 859,10 ± 351,70 741,50 Стеатоза, n=4 716,38 ± 213,62 651,00 NASH, n=12 998,29 ± 223,80 *1007,50 * - p<0,05 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 106 Највиша средња вредност цитокератина-18 у плазми утврђена је код пацијената са NASH и она је статистички била значајно виша у односу на групу пацијената са стеатозом (998,29±223,80 vs. 716,38±213,62) (p<0,05) код којих је ова вредност најнижа у NAFLD групи. Средња вредност цитокератина-18 у NAFLD групи пацијената без биопсије износила је 859,10±351,70. Kruskal-Wallis тестом није потврђено да постоји статистички значајна разлика вредности CK-18 између испитиваних подгрупа студијске групе (Табела 44. и Дијаграм 2.). Дијаграм 2. Box-plot дијаграм вредности CK-18 подгрупа NAFLD групе Табела 45. Концентрација CK-18 у плазми пацијената са NASH у односу на остале пацијенате са NAFLD NAFLD без NASH, n=43 NASH, n=12 CK-18 (U/L) 845,83 ± 341,95 715,5 998,29 ± 223,80 *1007,50 Пацијенти са NASH имали су већу средњу вредност цитокератина-18 у односу на остале пацијенте NAFLD групе, релативно близу границе статистичке значајности од 0,05 (p=0,0622) (Табела 45. и Дијаграм 3.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 107 Дијаграм 3. Box-plot дијаграм вредности ELISA код NASH и non-NASH испитаника NAFLD групе Табела 46. Концентрација CK-18 у плазми пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на степен стеатозе Стеатоза гр. 1, n=7 Стеатоза гр. 2, n=7 Стеатоза гр.3, n=2 CK-18 (U/L) 840,50 ± 250,54 779,5 960,36 ± 259,29 930,40 1119,50 ± 109,6 1119,5 У нашем истраживању утврђено је да вредности цитокератина-18 расту са степеном стеатозе. Kruskal Wallis тестом утврђена је статистичка зависност CK-18 у односу на степен стеатозе (p<0,05), мада Mann-Whitney тестом нису утврђене статистички значајне разлике између група понаособ (Табела 46. и Дијаграм 4.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 108 Дијаграм 4. Box-plot дијаграм вредности CK-18 код пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на степен стеатозе Табела 47. Концентрација CK-18 код пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на израженост интралобуларне инфламације Интрало. инфлам. 0, n=3 Интрало. инфлам. 1, n=9 Интрало. инфлам. 2, n=3 CK-18 (U/L) 615,17 ± 83,6 595 900,94 ± 143,3 a*930,50 1143,17 ± 110,11 b*a**1197,00 * - p<0,05, ** - p<0,01 а - vs. инфламација 0, б - vs. инфламација 1 У нашем истраживању утврђено је да средња вредност CK-18 у плазми расте са степеном интралобуларне инфламације, а Kruskal Wallis тестом утврђена је статистички значајна повезаност степена ове инфламације и вредности CK-18 у плазми (p<0,05). Студентовим т-тестом утвђено је да пацијенти са интралобуларном инфламацијом првог степена имају статистички значајно више средње вредности CK-18 у односу на пацијенте без инфламације (p<0,05), као и пацијенти са инфламацијом другог степена (p<0,01). Утврђена је статистички значајно виша средња вредност CK-18 у плазми код пацијената са Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 109 интралобуларном инфламацијом другог степана у односу на први степен (p<0,05) (Табела 47. и Дијаграм 5.). Дијаграм 5. Box-plot дијаграм вредности CK-18 код пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на ниво интралобуларне инфламације Табела 48. Концентрација CK-18 у плазми код пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на степен балонизације хепатоцита Балонизација 0, n=3 Блага балонизација , n=6 Умерена балонизација, n=7 CK-18 (U/L) 615,17 ± 83,6 595 884,7 ± 157,1 a*911,00 1098,8 ± 215,9 a** 1023,00 * - p<0,05, ** - p<0,01 a - vs. балонизација 0 Утврђено је да средња вредност CK-18 расте са са степеном балонизације хепатоцита. ANOVOM је утврђена статистички значајна повезаност степена балонизације хепатоцита и плазматских нивоа CK-18 (p<0,01). Студентовим т-тестом утврђено је да пацијенти са благом балонизацијом хепатоцита имају статистички значајно више вредности CK-18 у односу на пацијенте без балонизације (p<0,05), као и пацијенти са умереном балонизацијом хепатоцита (p<0,01) (Табела 48. и Дијаграм 6.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 110 Дијаграм 6. Box-plot дијаграм вредности CK-18 код пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на степен балонизације хепатоцита Табела 49. Концентрација CK-18 у плазми код пацијената NAFLD групе са биопсијом јетре у односу на степен фиброзе Фиброза 0, n=13 Фиброза стадијум 2, n=2 CK-18 (U/L) 855,81 ± 199,57 891,5 1129,00 ± 123,04 *1129,00 * - p<0,05, Mann-Whitney тестом утврђено је да су средње вредности CK-18 у плазми статистички значајно више код пацијената са фиброзом другог стадијума у односу на пацијенте без фиброзе (1129,00±123,00 vs. 855,81±199,57) (p<0,05) (Табела 49. и Дијаграм 7.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 111 Дијаграм 7. Box-plot дијаграм вредности CK-18 код пацијената са биопсијом јетре у односу на степен фиброзе 6.12.1. ROC анализа предиктивних вредности CK-18 у процени присуства NASH у NAFLD групи биопсираних пацијената На слици 9. је ROC (енгл. receiver operating characteristic) крива предиктивних вредности CK-18 у процени присуства NASH у групи биопсираних пацијената са NAFLD. Површина испод криве износи 0,83 са стандардном грешком процене од 0,13 и близу прага статистичке значајности (p=0,0523) уз 95% интервал поверења који је веома широк (0.57 до 1.10) што указује на недовољну поузданост у закључивању. У прилог овоме говоре и нагли падови специфичности на 75%, као и 50% када сензитивност пређе 66,67%, односно 91,67% респективно. Мали број биопсираних пацијената је свакако један од узрока оваквих наглих промена. ROC анализа дефинише сензитивност и специфичност за сваку вредност CK-18. Када се као пресек изабере вредност CK-18 од 743 збир сензитивности и специфичности је највећи, односно сензитивност методе тада износи 92%, а специфичност је 75% (Табела 50.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 112 Слика број 9. ROC крива за предикцију присуства NASH код биопсираних пацијената NAFLD групе на основу вредности CK-18 Табела 50. Вредности специфичности и сензитивности за предикцију присуства NASH на основу вредности CK-18 ELISA Сензитивност Специфичност Сензитивност ± специфичност 542,50 1,0000 0,0000 1,000 569,25 1,0000 0,2500 1,250 605,25 1,0000 0,5000 1,500 661,25 0,9167 0,5000 1,417 743,00 0,9167 0,7500 1,667 793,75 0,8333 0,7500 1,583 850,00 0,7500 0,7500 1,500 911,00 0,6667 1,0000 1,417 964,50 0,5833 1,0000 1,333 1007,50 0,5000 1,0000 1,250 1018,25 0,4167 1,0000 1,167 1021,50 0,4167 1,0000 1,417 1032,50 0,3333 1,0000 1,333 1119,50 0,2500 1,0000 1,250 1206,50 0,1667 1,0000 1,167 1338,75 0,0833 1,0000 1,083 1462,50 0,0000 1,0000 1,000 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 113 Као статистички значајне, издвајају се позитивне корелације вредности CK- 18 са старошћу и гликемијом (p<0,01), као и нивоом фибриногена и SKP (p<0,05) (Табела 51.). Табела 51. Корелација вредности CK-18 са наведеним парематрима у NAFLD групи Параметар r Старост (год) 0,37** Гликемија (mmol/l) 0,36** Инсулин (mu/l) 0,23 HOMAIR 0,24 Урати (µmol/l) 0,15 UBIL (µmol/l) -0,04 DBIL (µmol/l) 0,05 Албумини (g/l) -0,11 HOL (mmol/l) -0,13 HDL (mmol/l) -0,15 LDL (mmol/l) -0,11 TG (mmol/l) -0,05 AST (U/l) 0,11 ALT (U/l) -0,01 ALP (U/l) 0,18 GGT (U/l) -0,12 CRP (mg/l) 0,09 Феритин (µg/l) -0,03 FIB (g/l) 0,28* TR x109/l -0,16 OS (cm) 0,23 TT (kg) 0,15 TV (m) -0,14 BMI (kg/m2) 0,25 SKP (mmHg) 0,29* DKP (mmHg) 0,23 AST/ALT 0,08 * - p<0,05, ** - p<0,01 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 114 6.13. Резултати молекуларног испитивања, доказ полиморфизма PNPLA3 rs738409 (C10109G) Након екстракције DNK из крви 86 испитаника и извршене PCR реакције, величину продукта PCR реакције од 333 bp, доказали смо помоћу уређаја за капиларну електрофорезу (Слика 10.). Легенда: Маркер – маркер са продуктима умножања величина 15, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 i 1000 парова база NK – негативна контрола Узорци 1 – 10 након PCR реакције. У PCR реакцији умножен је фрагмент DNK величине 333 bp. Слика 10. Умножени фрагмент DNK у испитујућим узорцима (од 1. до 10.), величине 333 bp Након извршене PCR реакције продукти умножавања третирани су рестрикционим ензимом BtsCI (New England Biolabs) како би се извршила детекција нормалног хомозигота (C10109C), хетерозигота (C10109G) и полиморфног хомозигота (G10109G). Дигестијом умноженог DNK фрагмента од 333 bp код нормалног хомозигота добијени су фрагменти величина 200 bp и 133 bp, код хетерозигота фрагменти 333 bp, 200 bp и 133 bp, а код полиморфног хомозигота добијен је фрагмент величине 333 bp. Полиморфизам PNPLA3 rs738409 доказали смо на основу очекиване величине продукта умножавања (Слика 11.). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 115 Легенда: Маркер – маркер са продуктима умножања величина 15, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 i 1000 парова база NK – негативна контрола Узорци: 1 i 3, нормални хомозиготи (C10109C), Узорци: 2, 5 i 7, хетерозиготи (C10109G) i Узорци: 4, 6, 8, 9 i 10, мутантни хомозиготи (G10109G). Слика 11. Доказ полиморфизма PNPLA3 rs738409, у испитујућим узорцима (од 1. до 10.), након цепања ензимом BtsCI, PCR-RFLP У целом испитиваном узорку било је 23 (26,74%) испитаника са нормалним хомозиготом (CC), 25 (29,07%) са хетерозиготом (CG) и 38 (44,19%) са полиморфним хомозиготом (GG) (Табела 52.). Табела 52. Заступљеност генотипова у контролној и NAFLD групи Генотипови Контрола, n=31 NAFLD, n=55 Укупно, n=86 C/C 10 32,26% 13 23,64% 23 26,74% C/G 9 29,03% 16 29,09% 25 29,07% G/G 12 38,71% 26 47,27% 38 44,19% Утврђено је да 13 (23,64%) пацијента NAFLD групе имају CC хомозигот, 16 (29,09%) пацијената су били хетерозиготи, CG и 26 (47,27%) полиморфни хомозиготи, GG. У контролној групи 10 (32,26%) испитаника су били CC хомозиготи, 9 (29,03%) испитаника су били CG хетерозиготи и 12 GG полиморфни хомозиготи (38,71%). Заступљеност полиморфног хомозигота (GG) је била већа код Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 116 NAFLD групе (c2=0,58, p=0,4453), али без статистички значајне разлике у расподели генотипова између контролне и NAFLD групе (Табела 52.). У NAFLD групи 42 (76,36%) пацијента је имало G алел, а у контролној 21(67,74%) испитаник. Заступљеност G алела код NAFLD групе била је већа, али нису утврђене статистички значајне разлике у расподели G алела између контролне и NAFLD групе (c2=1,20, p=0,2732, OR=1,42; 0,725,6 mmo/l/DM 9 69,23% 10 62,50% 19 73,08% MS елемената 0 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% 1 0 0,00% 0 0,00% 1 3,85% 2 1 7,69% 1 6,25% 4 15,38% 3 5 38,46% 4 25,00% 7 26,92% 4 3 23,08% 6 37,50% 7 26,92% 5 4 30,77% 5 31,25% 7 26,92% * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 Само један пацијент коме је рађена биопсија јетре имао је нормалан C/C генотип, 10 пацијената су били полиморфни GG хомозиготи и 5 пацијената су били CG хетерозиготи. Сви пацијенти са патохистолошким налазом обичне стеатозе су имали G алел, један је имао CG генотип и 3 пацијента су имали GG генотип. У NASH групи 11(91,67%) пацијента су имали G алел, 4 (33,33%) су били CG хетерозиготи, 7 (58,33%) GG полиморфни хомозиготи, док је један пацијент с благом некроинфламаторном активношћу имао нормалан хомозигот CC. Троје Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 120 пацијената са NASH и фиброзом су такође имали мутантни G алел, један пацијенат са перисинусоидалном и порталном фиброзом је био хетерозигот CG, други је био мутантни хомозигот GG и један пацијент са премошћавајућом (bridging) фиброзом је био хетерозигот CG. Није нађена статистички значајна разлика у степену патохистолошких промена између појединих генотипова због малог броја пацијената код којих је рађена биопсија јетре, међу којима је само један пацијент био носиоц нормалног алела (Табела 58). Табела 58. Поређење параметара патохистолошког налаза биопсије јетре у односу на генотип Параметар C/C, n=1 C/G, n=5 G/G, n=10 Стеатоза Градус I, 5% - 33% 0 0,00% 3 60,00% 4 40,00% Градус II, 33% - 66% 1 100,00% 2 40,00% 4 40,00% Градус III, >66% 0 0,00% 0 0,00% 2 20,00% Балонизација хепатоцита Нема 0 0,00% 1 20,00% 2 20,00% Мало балонираних ћелија 1 100,00% 0 0,00% 5 50,00% Умерено балонирање 0 0,00% 4 80,00% 3 30,00% Интрало. инфламација Без жаришта 0 0,00% 1 20,00% 2 20,00% 1 жариште 1 100,00% 1 20,00% 7 70,00% 2-4 жаришта 0 0,00% 2 40,00% 1 10,00% >4 жаришта 0 0,00% 1 20,00% 0 0,00% Фиброза 0 1 100,00% 3 60,00% 9 90,00% Перисинусоидална/ перицелуларна фиброза 0 0,00% 0 0,00% 0 0,00% Перисинусоидална са порталном фиброзом 0 0,00% 1 20,00% 1 10,00% Премоштавајућа фиброза 0 0,00% 1 20,00% 0 0,00% * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 121 7. ДИСКУСИЈА Неалкохолна масна болест јетре је најчешћа хронична болест јетре одраслих особа и значајан је глобални здравствени проблем, због високе преваленце, незадовољавајуће неинвазивне дијагностике, прогресивног тока и непостојања ефикасне фармакотерапије. Данас се NAFLD посматра као мултисистемско обољење које повећава ризик настанка DM типа 2 два пута, инциденцу и преваленцу хроничних болести бубрега и кардиоваскуларних болести, независно од утврђених кардиоваскуларних ризичних фактора [184]. Преваленца NAFLD расте са тежином ризичних фактора и код пацијената са нормалном телесном тежином износи 10-20%, код пацијената са предгојазношћу око 50% и више од 90% код пацијената са BMI већим од 35 kg/m2. Преваленца NAFLD код пацијената са типом 2 DM износи око 50%. Високи нивои холестерола и триглицерида, и снижен ниво HDL холестерола су такође фактори ризика за развој NAFLD и развој метаболичког синдрома, што објашњава уску повезаност ова два ентитета, тако да се данас NAFLD посматра као његова јетрина компонента [2,7,8, 27, 185]. Фамилијарна предиспозиција и етничке разлике у склоности развоја NAFLD указују да су генетски фактори, пре свега полиморфизам PNPLA3 гена, значајна детерминанта развоја и прогресије NAFLD/NASH [22,108,109,186, 187]. Неалкохолна масна болест јетре има широки хистолошки спектар, почев од обичне стеатозе, која је непрогресивно, бенигно обољење, до стеатохепатитиса, који представља потенцијално прогресиван облик болести, који може довести до цирозе јетре и у мањем проценту до HCC [33,152,156,157,158,159]. Не развијају сви пацијенти са NAFLD прогресивне форме болести. Присуство мултиплих метаболичких поремећаја као што су дијабетес, гојазност, дислипидемија и хипертензија, носи висок ризик прогресије болести [7, 38, 58, 59]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 122 Неалкохолна масна болест јетре је обично асимтоматска болест, случајно се открива када се у току лабораторијских анализа нађу повишене вредности аминотрансфераза, пре свега ALT или се ултразвучним прегледом случајно открије „масна јетра“ [8, 188]. Имајући у виду чињеницу да више од 80% пацијента са NAFLD има нормалне вредности аминотрансфераза, које могу остати непромењене у току прогресије болести и развоја NASH [17, 116, 117] и да не постоји оптимални ниво ALT, који би имао предиктивну вредност за NASH и узнапредовалу фиброзу, на NAFLD треба посумњати код пацијената са утврђеним метаболичким ризичним факторима, који се морају узети у обзир при селекцији пацијената за биопсију јетре, у циљу потврде NASH и узнапредовале фиброзе [189]. Значај препознавања пацијената са NAFLD је велики из разлога правовременог деловања на удружене факторе ризика и превенирања прогресије болести и развоја NASH, цирозе јетре, инсуфицијенције јетре, HCC и екстрахепатичних повезаних болести [184]. Најчешће коришћена дијагностичка метода за скрининг асимптоматских пацијената са повишеним вредностима аминотрансфераза, нарочито у присуству ризичних фактора за NAFLD је ултразвук. Употреба других дијагностичких метода, веће сензитивности и специфичности у утврђивању степена стеатозе и фиброзе, као што су МR, протонcкa МRS и ТЕ, често је лимитирана ценом и доступношћу. Скрининг пацијената са NAFLD би био знатно олакшан налажењем неинвазивног биомаркера довољне сензитивности и специфичности у процени степена прогресије болести. Цитокератин-18 је обећавајући биомаркер будуће неинвазивне дијагнозе NASH и фиброзе [102, 136, 137, 138, 139], али је потребна даља валидација имуноензимског теста и утврђивање граничне вредности, што је био један од циљева нашег истраживања. Нашим истраживањем, обухваћено је 55 пацијената са NAFLD, просечне старости 52 године, који су имали повишене серумске нивое аминотрансфераза и ултразвучни налаз „масне јетре“. У контролној групи био је 31 здрав испитаник, просечне старости 49 година. Код 16 пацијената, који су имали повишене серумске нивое аминотрансфераза у временском трајању дужем од 6 месеци и ултразвучни Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 123 налаз масне јетре извршена је биопсија јетре. NAFLD групу чинило је 23 пацијента мушког (41,82%) и 32 женског пола (58,18%). У контролној групи било је 10 мушкараца (32,26%) и 21 жена (67,74%). Није утврђена статистички значајна разлика у полу и старости пацијената NAFLD и контролне групе. У NAFLD групи 17 (30,91%) пацијената је било прекомерно ухрањено и 38 (69,09%) гојазно. У групи гојазних, највећи број, 22 (40,00%) пацијента било је са првим степеном гојазности, 13 (23,64%) са другим степеном и 3 (5,45%) пацијента са трећим степеном гојазности. У контролној групи највећи број испитаника, њих 29 је било нормално ухрањено. Гојазност, као и први, други и трећи степен гојазности били су статистички значајно заступљенији у NAFLD групи (p<0,001). Средње вредности BMI (32,83±4,20 vs. 22,87±7,18 kg/m2) и OS (106,36±8,44 vs. 78,87±7,18 cm) статистички су биле значајно више у NAFLD групи у односу на контролну групу (p<0,001). Резултати нашег истраживања су у сагласаности са резултатима студије Leite и сар. у којој су испитаници са NAFLD имали статистички значајно више средње вредности BMI, OS и статистички је била заступљенија гојазност (p<0,001) [20] и студије Williams и сар. у којој је 45,4% испитаника било гојазно са средњим вредностима BMI (32,40±5,30 vs. 27,6±4,94 kg/m2) статистички значајно вишим у односу на контролну групу [16]. У студији Rocha и сар. 53% испитаника са NAFLD било је прекомерно ухрањено, 40% је било гојазно, 30% је било са првим и 10 % са другим степеном гојазности [190]. Студија Kirovski и сар. је утврдила статистички значајно више средње вредности BMI (28,7±5,9 vs. 24,8±3,6 kg/m2) и OS (102,2±13,4 vs. 86,9±13,1 cm) код испитаника NAFLD групе у односу на контролу (p<0,001) [191], што је сагласно са нашим резултатима. У нашем истраживању 26 (47,27%) пацијената NAFLD групе имало је DM тип 2. Резултати нашег истраживања су у сагласности са резултатима ранијих студија у којима се преваленца дијабетеса код испитаника са NAFLD креће од 18% до 45%. Неколико студија је показало да је NAFLD предиктор појаве дијабетеса независно од конвенционалних фактора ризика, као што су гојазност, инсулинска резистенција, метаболички синдром, што указује да између ова два ентитета постоји узрочо-последична веза. Присуство DM тип 2 значајно повећава ризик Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 124 прогресије болести у неалкохолни стеатохепатитис и различите степене фиброзе [42, 157, 192, 193] и независан је фактор ризика за морталитет пацијената са NAFLD [39,154]. Пацијенти са NAFLD и DM тип 2 у нашем истраживању су били старији, статистички сигнификантно је био виши AST/ALT однос и заступљеност MS, гојазности првог, другог и трећег степена као јединствене категорије и хипертензије у односу на пацијенте са NAFLD без DM тип 2, дакле имали су све предиктивне факторе развоја NASH и фиброзе [38, 41,43]. У NAFLD групи је било статистички значајно више пацијената са хипертензијом (72,73% vs. 12,90%), са средњим вредностима систолног (137,18±18,60 vs. 116,45±13,86 mmHg) и дијастолног крвног притиска (84,73±10,69 vs. 72,90±9,98 mmHg) статистички значајно вишим у односу на контролну групу (p<0,001). Резултати нашег истраживања су сагласни са резултатима студије Hamaguchi и сар. у којој су средње вредности систолног (123,7±15,9 mmHg) и дијастолног (77,8±9,7 mmHg) крвног притиска испитаника NAFLD групе статистички биле значајно више у односу на контролну групу (p<0,001) [194] и студији Williams и сар. у којој је 68,2 % испитаника са NAFLD имало хипертензију [16]. Раније студије су утврдиле да систолни и дијастолни крвни притисак корелирају са степеном стеатозе јетре и да пацијенти са систолном хипертензијом имају два пута већи ризик развоја NAFLD [195]. Пацијенати са NAFLD у нашем истраживању имали су статистички значајно више средње вредности LDL холестерола, билирубина (p<0,05), ALP, укупног холестерола (p<0,01), AST, ALT, GGT, инсулина, гликемије наште, триглицерида, урата, CRP, феритина, фибриногена и HOMA-IR (p<0,001), док је вредност HDL холестерола била виша у контролној групи (p<0,05). Није нађена статистички значајна разлика између група у погледу средњих вредности INR, броја тромбоцита и директног билирубина. Резултати униваријантне регресионе анализе у нашем истраживању показали су да су статистички значајни биохемијски, анатропометријски и клинички параметри од интереса за развој NAFLD: гликемија наште, инсулин наште, инсулинска резистенција изражена као HOMA-IR, урати, TG, АSТ, ALT, Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 125 GGT, CRP, феритин, FIB, HOL, HDL холестерол, LDL холестерол, TT, MS, број компонената MS, SKP, DKP, хипертензија и OS. Дислипидемија је ризични фактор за настанак NAFLD и прогресију болести [20, 42, 196, 197, 198]. Преваленца дислипидемије код пацијената са NAFLD креће се од 42%-72% [199, 200]. Ово доказују и резултати нашег истраживања, у којем су пацијенти са NAFLD имали статистички значајно више средње вредности холестерола, LDL холестерола и триглицерида у односу на контролну групу. Вредности HDL холестерола су биле статистички значајно ниже у студијској групи што је сагласно са резултатима Lee и сар. [201] и Kirovski и сар [191]. У нашем истраживању, утврдили смо да пораст нивоа триглицерида за једну јединицу мере повећава вероватноћу појаве NAFLD 16,02 пута, HOL за 87%, LDL холестерол за 85%, док повећање HDL холестерола за једну мерну јединицу смањује вероватноћу појаве NAFLD за 87%. Инсулинска резистенција је уско повезана са NAFLD, како са развојем стеатозе, тако и са прогресијом болести до стеатохепатитиса, цирозе и карцинома јетре [202].Средње вредности инсулинске резистенције NAFLD групе изражене као HOMA-IR у нашем истраживању биле су статистички значајно више у односу на контролну групу, што је сагласно са резултатима студије Salgado и сар. [203] и Önnerhag и сар. [204]. Утврдили смо да пораст HOMA-IR за једну мерну јединицу повећава 3,55 пута вероватноћу појаве NAFLD. Као и код других болести јетре, јетрини биохемијски тестови су најчешће коришћени маркери присутног оштећења јетре. Од четири основна јетрина ензима на основу којих се поставља сумња на болест јетре (AST, ALT, GGT и ALP), најчешће коришћен је ALT као маркер акумулације масти у хепатоцитима, и следственог оштећења и развоја NASH, на основу кога се поставља потреба за биопсијом јетре. Међутим поставља се питање оправданости оваквих ставова, имајући у виду да читав хистолошки спектар NAFLD може бити присутан, а да серумске вредности ALT остану у границама нормалних [117, 205]. Однос AST/ALT већи од 1 је предиктор развоја узнапредовале фиброзе [38]. У нашем истраживању активност ензима ALT је била статистички значајно виша у односу на контролну групу (p<0,001), као и GGT, АSТ и ALP (p<0,01). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 126 Однос АSТ/ALT одређиван је код пацијената са NAFLD и износио је 0,79±0,34, уз медијану 0,68. Резултати студије Hu и сар. утврдили су да BMI, ОS, крвни притисак, ТG, HDL холестерол, укупни HOL, LDL холестерол, гликемија наште и мокраћна киселина имају дијагностичку вредност за NAFLD, а да су метаболички фактори (гојазност, абдоминална гојазност, дислипидемија, хипертензија и тип 2 DM) ризични фактори за NAFLD, што је сагласно са нашим резултатима [206]. Независни фактори ризика појаве NAFLD у студији Leite и сар. били су повишени серумски нивои ALT, повишен ниво TG и већи OS односно гојазност, која повећава вероватноћу појаве NAFLD 5 пута [20]. Снижен ниво HDL холестерола и BMI су окаректерисани као независни фактори ризика развоја NAFLD у студији Kirovski и сар. [191]. У студији Miyake и сар. резултати униваријантне регресине анализе утврдили су да су старост, BMI, SKP и DKP, АSТ, ALT, GGT, ALP, HOL, TG, HDL холестерол, LDL холестерол, мокраћна киселина и гликемија наште удружени са ризиком појаве NAFLD [207], што је сагласно са нашим резултатима. Резултати нашег истраживања сагласни су са резултатима велике популационе струдије Bedogni и сар. који су утврдили са су повишен BMI, OS, виши серумски ниво TG, гликемије наште, ALT и снижен ниво HDL холестерола значајно удружени са развојем NAFLD [5]. У нашем истраживању у NAFLD групи било је 48 (87,27%) пацијената са MS. Метаболички синдром је статистички био заступљенији у NAFLD групи у односу на контролу, као и све компоненте MS (p<0,001). Подједнак број пацијената NAFLD групе, 16 (29,09%) имао је 3, 4 и 5 компоненте MS. Заступљеност компонети метаболичког синдрома износила је: лечена хипертензија или повишен SKP и/или DKP 90,91%, централна гојазност 87,27%, повишена гликемија наште или већ постојећи DM 69,9%, повишен ниво TG 65,45% и снижен ниво HDL холестерол 60,00%. Присуство хипертензије, као метаболичке компоненте статистички је било значајно чешће од присуства осталих метаболичких компоненти: повишеног нивоа триглицерида, већ дијагностикованог DM тип 2 или повишене гликемије наште (p<0,01) и сниженог нивоа HDL-холестерола (p<0,001). Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 127 Резултати униваријантне регресионе анализе указују да присуство MS статистички значајно повећава ризик појаве NAFLD чак 64 пута, као и поједине компоненте MS, као што су: лечена хипертензија или повишен SKP и/или DKP за 24,44 пута, присутан DM или повишена гликемија наште 11,62 пута и повишен ниво TG 9,85 пута (p<0,001). Утврђено је да присуство снижених серумских нивоа HDL холестерола статистички значајно повећава ризик за настанак NAFLD за 3,78 пута (p<0,01). Пораст за јединичну вредност OS повећава вероватноћу настанка NAFLD за 87% (p<0,01). Такође, пораст броја метаболичких компоненти за 1, статистички значајно повећава вероватноћу да дође до појаве NAFLD за 8,58 пута (p<0,001). У студији Pinidiyapathirage и сар. биваријантна анализа је утврдила да су BMI≥25 kg/m2, OS≥90 cm код мушкараца или OS≥80 cm код жена, SKP≥130 mmHg, DKP≥85mmHg, гликемија наште≥5,6 mmo/l, инсулинска резистенција процењена HOMA моделом и TG≥1,7 mmo/l значајно удружени са појавом NAFLD. Утврђено је да гојазност, дефинисана BMI или OS повећава вероватноћу појаве NAFLD 5 пута [208]. Резултати нашег истраживања су сагласни са резултатима Chituri и сар. који су утврдили да 87% пацијената са NAFLD имају карактеристике MS, 94% је имало централну гојазност, 82% дислипидемију, 50% глукозну интолеранцију [53] и практично 98% пацијената имало је инсулинску резистенцију и студији Dvorak и сар. у којој је 98% испитаника са NAFLD имало метаболички синдром [19]. У студији Radu и сар. заступљеност метаболичких компоненти је износила у опадајућем редоследу: централна гојазност 88,41%, дијабетес мелитус или повишена гликемија наште 68,87%, хипертензија 62,58%, хипертриглицеридемија 55,79 % и снижен ниво HDL холестерола 39,90 % [209]. У студији Kotronen и сар. више од 90% испитаника са NAFLD је имало бар један метаболички ризични фактор, а 33% је имало све карактеристике MS [210]. Hu и сар. су логистичком регресионом анализом утврдили да је свака компонента метабличког синдрома независно удружена са појавом NAFLD. Ризик појаве NAFLD повећава се 1,5 до 3,8 пута у присуству понаособ централне гојазности, лечене хипертензије или повишеног SKP и/или DKP, дислипидемије, Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 128 присутног дијабетеса или повишене гликемије наште ≥ 5,6 mmol/l и повишених серумских концентрација мокраћне киселине [206]. Преваленца централне гојазности, DM, хипертензије, повишене гликемије наште и TG била је статистички значајно виша код испитаника NAFLD групе у студији Cheah и сар. Студија је утврдила да пацијенти са већим обимом струка 1,2 пута чешће оболевају од NAFLD [196]. Wang и сар. су утврдили да присуство само једног метаболичког ризичног фактора носи 3,6 пута већи ризик развоја NAFLD, што указује на сигнификантно велики ризик развоја болести у раним стадијумима MS. Број метаболичких ризичних фактора је од већег прогностичког значаја за појаву NAFLD у односу на само присуство метаболичког синдрома. Рани скрининг и третман сваке метаболичке компоненте има велики значај у превенцији развоја NAFLD [52]. У проспективној студији Hamaguchi и сар. у периоду од годину дана праћења 3147 одраслих особа без NAFLD у тренутку укључивања у студију, утрврђено је да су испитаници са MS имали 4-11 пута већи ризик развоја NAFLD [211]. С обзиром да је MS предиктор развоја NASH, према препорукама AASLD, код пацијената са NAFLD присуство MS је критеријум селекције пацијената за биопсију јетре [9]. У нашем истраживању сви пацијенти су имали један или више метаболичких ризичних фактора, а 29,09 % је имало свих 5 ризичних фактора. У ранијим студијама утврђено је да више од 90% пацијената са NAFLD има једну или више компоненти метаболичког синдрома, а њих 33% има комплетну дијагнозу [210, 212, 213]. Утицај MS и појединих његових компоненти на развој NAFLD, у нашем истраживању је значајно већи у односу на претходне студије, што је и разумљиво с обзиром да је највећи број пацијената укључених у истраживање имао MS, као и 4 и 5 компоненте метаболичког синдрома, статистички значајно више у односу на контролу групу (p<0,001). Имајући у виду да је MS предиспонирајући фактор прогресије болести [59, 214], висока преваленца MS код пацијената са NAFLD у нашем истраживању, представља “позив на буђење“ у креирању мера превенције и Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 129 лечења метаболичких ризичних фактора у циљу превенирања прогресије болести, развоја NASH и цирозе јетре. У нашем истаживању посебно су анализиране биохемијске, антропометријске и клиничке карактеристике пацијента NAFLD групе у односу на BMI, присуство DM типа 2 и MS. Утврђено је да пацијенти NAFLD групе са MS имају статистички значајно више средње вредности BMI, гликемије наште (p<0,01), инсулина наште и инсулинске резистенције процењене HOMA-IR (p<0,05) у односу на пацијенте исте групе без MS. Код пацијената NAFLD групе без MS статистички је значајно био виши ниво HDL холестерола (p<0,05). У NAFLD групи са MS статистички је било значајно више пацијената са хипертензијом (p<0,01) и DM типа 2 (p<0,05) у односу на NAFLD групу без MS. Код пацијената NAFLD групе са MS 11 (22,92%) пацијента је било предгојазно, 37 (77,08%) пацијената је било гојазно, 22 (45,83%) је било са првим степеном гојазности, 12 (45,83%) са другим степеном и 3 (6,25%) пацијента са трећим степеном гојазности, док је у NAFLD групи без MS највећи број пацијената био са предгојазношћу. Гојазност као категорија ухрањености, затим гојазност првог, другог и трећег степена, као јединствена категорија гојазности статистички значајно су били заступљенији код пацијената са NAFLD и MS у односу на пацијенте NAFLD групе без MS (p<0,01). Истовремено пацијенти са гојазношћу су имали статистички значајно чешће MS (97,37% vs. 64,71%), као и заступљеност 3, 4 и 5 компоненте MS (p<0,01) у односу на пацијенте са предгојазношћу. Резултати нашег истраживања сагласни су са резултатима студије Kang и сар. у којој су испитаници NAFLD групе са MS имали сигнификантно више средње вредности OS, нижи ниво HDL холестерола и виши ниво инсулинске резистенције процењене HOMA моделом [214]. У студији Marchesini и сар. утврђен је пораст преваленце MS код пацијената са NAFLD са порастом BMI, од 18% код нормално ухрањених до 67% код гојазних. Такође, утврђен је пораст преваленце свих метаболичких компоненти и пацијената са 3 и више компоненати MS са порастом BMI, што је сагласно са нашим резултатима [59]. Rocha и сар. су такође утврдили раст преваленце метаболичког Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 130 синдрома са порастом BMI и OS. Метаболички синдром је био присутан код 12% испитаника са предгојазношћу и 56% испитаника са гојазношћу [190]. Биопсија јетре је златни стандард у дијагнози болести, али из етичких разлога није у широкој употреби, јер се ради о пацијентима углавном без клиничких симптома, са често нормалним вредностима аминотрансфераза. С обзиром да постоји добра корелација ултразвучног налаза масне јетре са патохистолошким налазом, ултразвук је препоручен као прва дијагностичка метода. Резултати недавне мета анализе показују да је UZ прецизна и поуздана техника за откривање више од 20%-30% стеатозно измењеног паренхима јетре, у поређењу са хистологијом, са осетљивошћу од 84,8% и специфичношћу од 93,6% [215]. У нашем истраживању придржавали смо се критеријума Nedleman и сар. који су компарирајући патохистолошки и ултразвучни налаз масне јетре утврдили тачност UZ налаза од 88% у дијагнози и степеновању масне јетре [181]. Највећи број пацијената NAFLD групе у нашем истраживању, 23 (41,82%) имало је ултразвучни налаз масне јетре III степена, 20 (36,36%) пацијената је имало UZ налаз масне јетре II степена и 12 (21,82%) је било са UZ налазом масне јетре I степена. Пацијенти са UZ налазом II и III степена масне јетре имали су статистички значајно више вредности BMI, гликемије наште, инсулина наште и инсулинске резистенције изражене као HOMA-IR у односу на групу пацијената са UZ налазом масне јетре I степена. Такође, пацијенти са UZ налазом масне јетре III степена, имали су статистички значајно више средње вредности и OS. Није утврђена статистички значајна разлика средњих вредности аминотрансфераза, ALP, GGT, холестерола, триглицерида, CRP, фибриногена и феритина код пацијената са различитим ултразвучним степеном. Хипертензија, гојазност (p<0,05) и метаболички синдром (p<0,01) статистички су значајно били заступљенији код пацијената са UZ налазом масне јетре II и III степена у односу на пацијенте са UZ налазом I степена. Такође, DM тип 2 је био најзаступљенији код пацијената са UZ налазом масне јетре III степена, статистички значајно чешће у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена (p<0,05). Заступљеност снижених вредности HDL холестерола као метаболичке компоненте статистички је значајно била већа Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 131 код пацијента са UZ налазом масне јетре II и III степена и они су имали статистички значајно чешће 4 или 5 компоненте MS у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена (p<0,05). Већ постојећи DM или повишена гликемија наште као метаболичка компонента била је најзаступљенија код пацијената са UZ налазом масне јетре III степена, статистички заступљенија у односу на пацијенте са UZ налазом масне јетре I степена (p<0,05). У нашем истраживању униваријантном логистичком регресионом анализом установили смо као значајне предикторе појаве вишег ултразвучог степена масне јетре: BMI, MS, број компоненти MS, компоненту MS снижен ниво HDL холестерола и гојазност (p<0,01), као и инсулин, HOMA-IR, OS, ТТ, гојазност првог и другог степена, хипертензију, DM и компоненту MS повишена гликемија наште или већ постојећи DM (p<0,05). Утврђено је да присуство MS повећава вероватноћу за виши степен стеатозе процењене UZ за 42 пута, компонента MS снижен ниво HDL холестерол 6,92 пута, гојазност 7,56 пута, гојазност првог степена 5,63 пута, гојазност другог степена 10,67 пута, DM 6,32 пута, хипертензија 6,12 пута и компонента MS повишена гликемија наште или присутан DM за 4,62 пута. Мултиваријантна логистичка регресиона анализа је као најважније предикторе вишег UZ степена масне јетре издвојила: телесну тежину, хипертензију и снижен ниво HDL холестерола као компоненту MS. Овај добијени модел условљава 53,19% промену вероватноће за виши UZ степен стеатозе јетре. Резултати нашег истраживања сагласни су са резултатима студије Eguchi и сар. у којој је утврђено да пацијенти са озбиљнијим ултразвучним налазом масне јетре имају статистички значајно више средње вредности OS, BMI, ТТ и више нивое аминотрансфераза, гликемије наште, инсулина и инсулинске резистенције процењене HOMA-IR [216] и студији Abanhag и сар. у којој је највећи број испитаника NAFLD групе био са ултразвучним налазом масне јетре градуса II, а средње вредности BMI су статистички значајно корелирале са степеном стеатозе [197]. У студији Ghamar-Chehreh и сар. униваријантна логистичка регресиона анализа је потврдила статистички значајну удруженост инсулина, HOMA-IR, повишене гликемије наште, аминотрансфераза, TG и TT са степеном ултразвучног Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 132 налаза масне јетре што је слично нашим резултатима [217]. У студији Razavizade и сар. утврђено је да су HDL-холестерол, TG и ALT независни фактори ризика вишег степена масне јетре процењене ултразвуком [218]. У нашем истраживању активност аминотрансфераза, као најосетљивијих биомаркера оштећења хепатоцита, у NAFLD групи била је статистички значајно виша у односу на контролну групу, али није нађена статистичка значајност у односу на степен стеатозе процењене ултразвуком, што пружа индиректне доказе да на основу нивоа аминотрансфераза не можемо проценити степен прогресије болести. Нашим истраживањем установили смо удруженост компоненти MS са UZ степеном масне јетре. NAFLD група са UZ налазом масне јетре II и III степена имала је статисички значајно више пацијената са четири и пет компоненти MS, што је слично студијама чији резултати указују да присуство већег броја метаболичких поремећаја носи већи ризик развоја прогресивних форми болести [58, 219]. Ултразвук има одређене недостатке. Сензитивност и специфичност UZ у дијагностици NAFLD значајно опада код гојазних пацијената [124], а у нашој студији је највећи број пацијената имао BMI≥30 kg/m2. Такође треба узети у обзир ниску сензитивност ултразвука за стеатозу мању од 30% [125]. Ултразвуком није могуће диферентовати стеатозу од стеатохепатиса и фиброзе [115, 126], а највећи број пацијената наше студије имао је мултипле ризичне факторе предикторе прогресије болести. Све ово представља изазов, не само за клиничара у процени којим пацијентима са UZ налазом масне јетре треба индиковати биопсију јетре, већ и за пацијенте који су најчешће без значајнијих симптома болести, често са нормалним вредностима аминотрансфераза, да прихвате интервенцију. У оквиру спектра NAFLD, обична стеатоза јетре је стабилно стање, које не прогредира код највећег броја пацијената кроз много година. Међутим, пацијенти са NASH и фиброзом су под већим ризиком прогресије болести до декомпензоване цирозе јетре, развоја портне хипертензије, развоја HCC или смрти уколико трансплантација јетре није урађена. За разлику од пацијената са обичном стеатозом, пацијенти са придруженом фиброзом јетре захтевају праћење у смислу Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 133 развоја варикозитета једњака и HCC, због чега је идентификовање присуства и тежине фиброзе јетре код пацијената са NAFLD од велике важности у вођењу протокола лечења и праћења пацијената са овим обољењем јетре. Имајући претходно у обзир, учињени су напори да се идентификују неинвазивни показатељи фиброзе код пацијената са NAFLD. Аngulo и сар. су у својој студији утврдили да користећи две граничне вредности NAFLD фиброзног скора, сачињеног од рутинских клиничких и лабораторијских параметара повезаних у математичку формулу, можемо прецизно предвидети присуство или одсуство узнапредовале фиброзе (bridging фиброзе и цирозе) код пацијената са NAFLD [141]. NAFLD фиброзни скор представља једноставан скоринг систем, који је јефтин, лак за израчунавање и може да се користи за праћење пацијената и откривање оних који захтевају даљу евалуацију у смислу прогресије болести. Резултати других студија су такође потврдили значај NAFLD фиброзног скора у откривању пацијената са NAFLD и узнапредовалом фиброзом [220, 221]. Ретроспективна, мултицентрична студија Angulo и сар. утврдила је да је NAFLD фиброзни скор најбољи индикатор за откривање пацијената са NAFLD, који имају повећани ризик развоја компликација повезаних са болешћу јетре и повећани укупни морталитет [222]. Према препорукама AASLD NAFLD фиброзни скор је код пацијената са NAFLD, препоручен као клинички користан метод идентификације пацијената са узнапредовалом фиброзом и цирозом [9]. Користећи NAFLD фиброзни скор као неинвазивни метод процене присутне фиброзе у нашем истраживању утврђено је да је 6 (10,91%) пацијената имало вредност NAFLD фиброзног скора већу од 0,675 односно узнапредовалу фиброзу, 28 (50,91%) је имало вредност NAFLD фиброзног скора мању од -1,45 односно нису имали узнапредовалу фиброзу и 28 (50,91%) је припадало интермедијарној групи. Просечна старост пацијента са узнапредовалом фиброзом и пацијената интермедијарне групе статистички је била значајно већа у односу на групу са одсуством фиброзе (p<0,001), а старост групе са узнапредовалом фиброзом Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 134 статистички је значајно била већа и у односу на старост пацијената интермедијарне групе (p<0,01). У односу на групу са одсуством фиброзе статистички значајно више средње вредности серумског нивоа гликемије наште и фибриногена, телесне тежине су утврђене код групе пацијента са узнапредовалом фиброзом (p<0,05), као и односа АSТ/ALT (p<0,01), BMI и OS (p<0,001). Утврђено је да је гојазност првог, другог и трећег степена као јединствена категорија гојазности статистички значајно заступљенија код пацијената са узнапредовалом фиброзом у односу на пацијенте без узнапредовале фиброзе (p<0,05). У групи пацијената са узнапредовалом фиброзом сви пацијенти су имали већ дијагностиковану и лечену хипертензију и DM тип 2. У односу на пацијенте са вредностима NAFLD фиброзног скора који се карактерише као одсуство фиброзе, хипертензија је статистички значајно била заступљенија код пацијената интермедијарне групе (p<0,01) и групе са узнапредовалом фиброзом (p<0,05). Такође заступљеност пацијената са DM тип 2 статистички је била значајно већа у интермедијарној групи и групи са узнапредовалом фиброзом, у односу на групу са одсуством фиброзе (p<0,001). Утврђено је да заступљеност пацијента са MS расте са порастом NAFLD фиброзног скора као категоријском варијаблом, односно највећа је (100,00%) код пацијената са узнапредовалом фиброзом, а најмања код пацијента са одсуством фиброзе (78,57%), међутим с обзиром на релативно мале групе, а високе проценте пацијената са MS, нису нађене статистички значајне разлике. Средње вредности ALT су биле највише у групи пацијената са одсуством фиброзе, али без статистичке значајности у односу на остале две групе понаособ, што је последица изузетно велике стандардне девијације у овој групи. Вредност ALT у интермедијарној групи статистички је била значајно виша у односу на групу са узнапредовалом фиброзом (p<0,05). Нашим истраживањем је утврђено да су пацијенти са вредностима NAFLD фиброзног скора већим од 0,675, који карактерише узнапредовалу фиброзу, били старији, статистички чешће имали дијабетес, гојазност и средње вредности односа Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 135 АSТ/ALT веће од 1 (1,27±0,51), односно све ризичне факторе за узнапредовалу фиброзу [38]. Код 16 пацијената са NAFLD извршена је патохистолошка анализа биопсијских узорака јетре. Биопсија јетре индикована је на основу повишених нивоа аминотрансфераза у временском периоду дужем од 6 месеци, упркос ординираној терапији. Патохистолошком анализом утврђена је узнапредовала фиброза (bridging фиброза) само код једног пацијента, чије су вредности NAFLD фиброзног скора биле више од 0,675. С обиром да биоспија јетре код осталих пацијената са вредностима NAFLD фиброзног скора које би указивале на узнапредовалу фиброзу није рађена, јер нису били испуњени напред наведени критеријуми и да су средње вредности ALT биле највише у групи са NAFLD фиброзним скором који карактерише одсуство фиброзе, поставља се питање оправданости оваквих ставова. У патохистолошкој анализи биопсијских узорака за семиквантитативно означавање изражености поједине патохистолошке карактеристике употребљавана је подела коришћена у радовима Brunt и сар [144]. У нашој групи пацијената са неалкохолном масном болести јетре, неалкохолни стеатохепатитис дефинисан на основу минималних критеријума (присутност стеатозе, лобуларне упале и знакова оштећења хепатоцита у виду балонирања или апоптозе) био је присутан код 12 пацијента односно у 75 % случајева. Код 4 (25%) пацијента утврђено је постојање обичне стеатозе, без критеријума за стеатохепатитис. Највећи број биопсираних пацијената, 56,25% имао је благу некроинфламаторну активност, 12,5% средње изражену и један пацијент (6,25%) изражену некроинфламаторну активност. Код једног пацијента утврђена је премошћавајућа (bridging) фиброза. У односу на котролну групу, код пацијената са NASH статистички су биле значајно више средње вредности гликемије наште, инсулина, HOMA-IR, урата, TG, АSТ, ALT, ALP, GGT, CRP, феритина, OS, ТТ, BMI, SKP, DKP (p<0,001), укупног билирубина, LDL холестерола (p<0,01), директног билирубина, холестерола и фибриногена (p<0,05). Пацијенти са NASH су имали статистички значајно више средње вредности HOMA-IR и укупног билирубина у односу на пацијенте са Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 136 обичном стеатозом (p<0,05). Пацијенати са обичном стеатозом јетре статистички су имали значајно више средње вредности OS (p<0,001), инсулина, HOMA-IR, урата, ALT, GGT, фибриногена, ТТ, BMI, DKP (p<0,01), SKP, АSТ и CRP (p<0,05), у односу на контролу. Гојазност је статистички значајно била заступљенија код пацијената са стеатозом јетре и NASH у односу на контролну групу (50% vs. 0,00%), а у NASH групи и MS (91,67% vs. 9,68%) и поједине компоненте MS: централна гојазност (83,33% vs. 0,00%), већ дијагностикована хипертензија или повишене вредности SKP и/или DKP (91,67% vs. 29,03%), гликемија наште ≥ 5,6 mmol/l или већ дијагностикован DM (75% vs. 16,13%) (p<0,001), повишен ниво ТG (58,33% vs. 16,13%) (p<0,01) и снижен ниво HDL холестерола (66,67% vs. 29,03%). У односу на контролну групу, у NASH групи статистички је било значајно више пацијената са 4 и 5 компоненти MS (p<0,001), хипертензијом (58,33% vs.12,90%) и дијабетесом (33,33%). У групи са обичном стеатозом јетре 50% пацијената имало је метаболички синдром, а централна гојазност и повишен ниво ТG као метаболичке компоненте биле су статистички заступљеније у односу на контролну групу. Резултати нашег истраживања сагласни су са резултатима истраживања Sobhonslidsuk и сар. у којем су пацијенти са NASH имали већи BMI (27,7 vs. 23,9) и OS (89,1 vs. 76,4) у односу на контролу. Статистички је било више пацијената са гојазношћу (86,7% vs. 33,3%), хипертензијом (50% vs. 13,3%), метаболичким синдромом (63,3% vs. 6,7%) и дијабетесом (p<0,001) у односу на контролну групу. Пацијенти са NASH су имали више средње вредности АSТ, ALT, гликемије наште, инуслина, HOMA-IR, TG (p<0,001) и урата (p<0,01) у односу на контролну групу. Инсулинска резистенцијан процењена HOMA моделом и висцерална гојазност утврђени су као ризични фактори развоја NASH, а инсулинска резистенција и као ризични фактор прогресије болести [223]. У студији Wasfy и сар. пацијенти са стеатозом јетре, NASH и цирозом, имали су статистички значајно више средње вредности BMI, гликемије наште, инсулина и HOMA-IR у односу на контролу, а пацијенти са NASH су имали и више вредности TG и ALT, што је сагласно са нашим резултатима. Средње вредности АSТ и однос АSТ/ALT су такође биле статистички значајно више код пацијената са Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 137 NASH у односу на контролу, али и у односу на пацијенте са стеатозом, што није утврђено у нашем истраживању. Инсулинска резистенција процењена HOMA-IR је била највиша у NASH групи, статистички значајно виша у односу на пацијенте са обичном стеатозом, што је сагласно са нашим резултатима [224]. Ниво инсулинске резистенције у студији Bookman и сар. код пацијената са NASH био је статистички значајно виши у односу на пацијенте са обичном стеатозом јетром. Истовремено обе групе пацијената су имале статистички значајно више нивое серумског инсулина, гликемије наште и инсулинске резистенције у односу на контролну групу. Ниво серумског инсулина је био највиши у групи са NASH, али без статистичке значајности у односу на групу пацијената са стеатозом јетре [254]. Наведени резултати су сагласни са нашим резултатима. На основу резултата нашег истраживања није утврђена статистички значајна разлика у серумским нивоима аминотрансфераза између пацијената са обичном стеатозом и NASH, што је потврђено у студијама других аутора [135]. У студији Marchesini и сар. 88 % пацијената са NASH је имало метаболички синдром, док је код пацијената са масном јетром MS утврђен код 67% пацијената. Пацијенти са NASH су имали озбиљније метаболичке поремећаје и већу преваленцу метаболичких компоненти у поређењу са пацијентима са масном јетром [59]. Резултати ове студије су сагласни са нашим резултатима. Неалкохолна масна болест јетре је велики изазов за клиничаре, због недостататка дијагностичких метода, које су поуздане, тачне, лако поновљиве и изводљиве, у циљу пружања одговарајућих информација о некроинфламаторним променама и степену фиброзе јетре. Селекција пацијената са ризиком прогресије болести је јако битна. Најтачнија дијагностичка метода је хистолошко бодовање фиброзе јетре и некроинфламације, “златни стандард степеновања хепатичне инфламације и фиброзе”. Ткиво јетре се добија перкутаном биопсијом јетре, која је инвазивна процедура, са могућим компликацијама. Неинвазивни и тачни скрининг тестови, који могу да замене биопсију јетре су потребни, ради селекције пацијената за посебан медицински приступ у циљу контроле болести и превенирања развоја завршног стадијума слабости јетре [226]. Неинвазивни биомаркер NASH који Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 138 највише обећава је мерење серумских нивоа цитокератина-18, биомаркера некрозе и апоптозе хепатоцита [227]. Апоптоза и некроза су важни процеси ћелијске смрти код болести јетре. Док је некроза типично последица акутног оштећења, као што је исхемија/реперфузија или акутне лековима индуковане хепатотоксичности, апоптоза представља високо организовану и генетски контролисану, програмирану смрт ћелија. Недавно је утврђено да фрагменти цитокератина-18, као и солубилни CK-18, који се ослобађају у крви у току апоптозе и некрозе хепатоцита, имају предиктивну вредност и корелирају са хистолошким карактеристикама NASH, односно лобуларном инфламацијом, балонирањем ћелија и степеном фиброзе, што потврђује њихову корист у клиничкој пракси [102, 136, 137, 138, 228, 229, 230]. Закључци две одвојене мета анализе Chen и сар. на више од 800 пацијената у 10 студија, и Yang и сар. је да фрагменти цитокератина-18, као и укупни цитокератин-18, имају клинички значајну корист у неинвазивној дијагностици NASH [231, 232]. Препоруке AASLD за дијагнозу и лечење NAFLD из 2012. године нису уврстиле употребу цитокератина-18 у рутинску клиничку праксу, јер још увек не постоји јасно дефинисана гранична вредност CK-18 за дијагнозу стеатохепатитиса [9]. Нашим истраживањем проценили смо значај квантитативног мерења нивоа CK-18 у крвној плазми у дијагностици NAFLD и NASH код пацијената код којих је биопсијом јетре потврђена дијагноза NASH и корелирали их са хистолошким степеном активности болести и биохемисјким параметрима. У нашем истраживању утврдили смо да су средње вредности цитокератина- 18 у плазми код пацијената NAFLD групе биле статистички значајно више у односу на контролну групу (p<0,001). Највиша средња вредност CK-18 у плазми утврђена је код пацијената са NASH и она је статистички била виша у односу на групу пацијента са обичном стеатозом (p<0,05). Утврђено је да средња вредност CK-18 расте са степеном интралобуларне инфламације, а Kruskal Wallis тестом утврђена је статистички значајна повезаност степена интралобуларне инфламације и балонизације хепатоцита са плазматским Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 139 нивоом CK-18 (p<0,05). Студентовим т-тестом утврђене су статистички сигнификантно више средње вредности CK-18 у групама са инфламацијом првог и другог степена понаособ у односу када интралобуларна инфламација није присутна, као и код инфламације другог степена у односу на први степен (p<0,05). Утврђено је да средња вредност CK-18 расте са са степеном балонизације хепатоцита. Студентовим т-тестом утврђено је да пацијенти са благом и умереном балонизацијом хепатоцита имају статистички сигнификантно више средње вредности CK-18 у односу када је балонизација хепатоцита одсутна (p<0,01). Средње вредности CK-18 крвној плазми статистички су биле више код пацијената са NASH и фиброзом другог стадијума у односу на пацијенте код којих није утврђено присуство фиброзе (p<0,05). У нашем истраживању утврђена је позитивна статистички значајна корелација између плазматских нивоа CK-18 са старошћу, гликемијом наште (p<0,01), фибриногеном и SKP (p<0,05). У студији Shen и сар. такође је утврђена позитивна корелација CK-18 са гликемијом наште [137]. Иако су резултати ранијих студија указивали на статистички значајну позитивну корелацију нивоа аминотрансфераза и CK-18 [227, 233], у нашем истраживању она није доказана. Изглед ROC криве у нашем истраживању указује на недовољну предиктивну вредност CK-18 у процени присуства NАSH код пацијената са NAFLD. На недовољну поузданост у закључивању указује површина испод криве која износи 0,83 са стандардном грешком процене од 0,13, статистичка значајност у раздвајању близу прага значајности (p=0,0523), као и веома широк 95% интервал поверења (0,57 до 1,10). Када се као пресек (cut-off) узме вредност CK-18 од 743 U/L збир сензитивноси и специфичности је највећа, односно сензитивност методе тада износи 92%, а специфичност 75%. Наши резултати потврђују потенцијалну клиничку корист одређивања CK-18 као биохемијске анализе код пацијената са NAFLD и мултиплим ризичним факторима (метаболички синдром, гојазност и дијабетес) у циљу дијагностике прогресије болести и развоја NASH и фиброзе, али је потребна даља валидација имуноензимског теста на већем броју биопсираних пацијената. Ограничење нашег истраживања је мали број пацијената код којих је Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 140 извршена биопсија јетре и постављена дијагноза NASH, што утиче на процену статистичке значајности анализе, а самим тим и на доношење дефинитивних закључака. Познато је да поред метаболичких ризичних фактора, генске мутације имају предиспонирајућу улогу у равоју и прогресији NAFLD, што објашњава етничке и интериндивидуалне разлике у склоности ка болести [22, 109, 234]. Romeo и сар. су у мултиетничкој, епидемиолошкој, популационој студији, Dallas Heart студији, први открили повезаност полиморфизма rs738409 (I148M) PNPLA3 гена и садржаја масти у јетри, мерене и квантификоване протонском MRS. Највећа фреквенца G алела утврђена је код Хиспаноамериканаца (0,49), нижа код Американаца европског порекла (0,23) и Афро-американаца (0,17) [22]. Резултати великог броја студија и недавне мета анализе потврдили су повезаност I148M варијанте PNPLA3 гена (познатог као адипонутрин) лоцираном на дугом краку 22 хромозома, са развојем и прогресијом NAFLD, укључујући и развој HCC [110, 111, 112, 113]. Овај полиморфизам гена подразумева замену нуклеотида цитозина гуанином, што је праћено заменом изолеуцина метионином на кодону 148. Претпоставља се да ова аминокиселинска субституција смањује ензимску липолитичку активност PNPLA3 према триглицеридима, чиме ензим изгледа стиче нову функцију и повећава синтезу фосфолипида, што за последицу има развој макровезикуларне стеатозе јетре [235, 236, 237]. Овај генски полиморфизам је удружен са развојем NAFLD и код деце и код одраслих. Удруженост је условљена женским полом, етничком припадношћу, али не и присуством метаболичког синдрома и инсулинске резистенције [238], што је отворило нова питања о патогенези NAFLD. Тренутна сазнања говоре да је PNPLA3 I148M полиморфизам генска детерминанта прогресивног оштећења јетре и развоја NASH, и предиспонирајући је фактор у присуству других ризичних фактора, као што су гојазност, IR, унос алкохола и хепатитис C вирусна инфекција [239]. У већем броју независних студија доказана је уска повезаност PNPLA3 I148M полиморфизма са стеатозом јетре и повишеним серумским нивоима Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 141 аминотрансфераза, што говори у прилог да ова генска варијанта предиспонира пацијенте са NAFLD за оштећење јетре [187, 240, 241, 242, 243]. Студије у којима је утврђена повезаност PNPLA3 I148M полиморфизма сa степеном патохистолошких промена код пацијената са NAFLD, са друге стране нису доказале повезаност овог полиморфизма са степеном гојазности процењене BMI, висцералном гојазношчу, дијабетесом, серумским нивоима TG, HDL- холестерола и LDL-холестерола [110, 111, 243, 244]. У већем броју студија које су процењивале повезаност PNPLA3 I148M и инсулинске резистенције процењене HOMA моделом, није утврђена разлика у HOMA-IR између хомозигота PNPLA3 I148M полиморфизма и носиоца нормалног алела, што доводи до закључка да I148M варијанта PNPLA3 гена има утицај на развој стеатозе јетре и прогресију болести независно од IR [110, 242, 243, 245]. Нема података о удружености овог генског полиморфизма и његовом утицају на развој NAFLD у српској популацији. У нашем истраживању ми смо утврдили да је заступљеност PNPLA3 rs738409 генотипова, CC, CG и GG у контролној групи износила 32,26%, 29,03% и 38,71%, док је код пацијената са NAFLD заступљеност генотипова била 23,64%, 29,09% и 47,27%. Поређењем биохемијских параметара, између различитих генотипова пацијената са NAFLD, утврђено је да пацијенти са полиморфним геном (GG) имају статистички значајно више средње вредности нивоа АSТ и ALT у односу на носиоце нормалног алела, односно CC хомозиготе (p<0,05), што би указивало да је PNPLA3 I148M полиморфизам повезан са развојем NAFLD. Није утврђена удруженост I148M варијанте PNPLA3 гена са BMI, дијабетесом, хипертензијом, MS, повишеним серумским нивоом TG, укупног HOL, HDL холестерола, LDL холестерола, гликемије наште и HOMA-IR. У студији Romea и сар. утврђена је статистички значајна удруженост овог генског полиморфизма са серумским нивоом аминотрансфераза, али не и са BMI, HOMA-IR, серумским нивоом инсулина, гликемијом наште, TG, укупног HOL, LDL холестерола и HDL холестерола [22]. Kotronen и сар. такође утврђују да је rs738409 полиморфизам удружен са порастом серумског нивоа АSТ и ALT, али нису утврдили корелација са серумским нивом инсулина, TG и холестерола [242]. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 142 Студија Speliotes и сар. није утврдила удруженост PNPLA3 I148M варијанте са BMI, OS, нивоима TG, HDL холестерола, LDL холестерола, дијабетесом, MS и HOMA-IR [110]. Резултати нашег истраживања сагласни су са резултатима наведених аутора. У студији Sookoian и сар. утврђено је да PNPLA3 I148M полиморфизам повећава два пута ризик за развој NAFLD , независно од пола, година, BMI и IR процењене HOMA. Такође је утврђена удруженост rs738409 G алела са серумским нивоима АSТ и ALT, независно од година, BMI, HOMA-IR и серумских нивоа триглицерида [243]. Резултати недавне мета анализе су недвосмислено показали да је rs738409 полиморфизам јак модификатор природног тока NAFLD у различитим популацијама широм света. Утврђено је да је GG генотип у односу на CC генотип удружен са повећањем серумских нивоа ALT за 28%. Са друге стране утврђена је негативна корелација између мушког пола и утицаја rs738409 генотипа на садржај масти у јетри. Резултати ове мета анализе су дали одговор и на питање утицаја овог полиморфизма и NAFLD удружених коморбидитета као што су гојазност и инсулинска резистенција. Наиме, све укључене студије у мета анализи показале су несигнификантну разлику између генотипова за HOMA-IR, серумске нивое глукозе, инсулина и BMI [112]. У већем броју студија, анализирајући степен удружености rs738409 и прогресије NAFLD од обичне стеатозе до стеатохепатитиса и различитих степена фиброзе, уочена је статистички значајна удруженост rs738409 генотипа и хистолошког степена болести, како код одраслих, тако и код деце, независно од гојазности, дијабетеса или стеатозе [110, 111, 241, 243, 246]. Резултати недавне мета анализе 16 студија су потврдили ова запажања. Утврђено је да носиоци G алела, односно GG хомозиготи имају не само већи степен стеатозе јетре, већ развијају агресивније облике болести (GG хомозиготи имају 3,24 пута већи ризик за озбиљније некроинфламаторне промене и 3,2 пута већи ризик развоја фиброзе у односу на CC хомозоготе односно носиоце нормалног алела I148M PNPLA3 гена). У овој студији није забележен повећан ризик развоја фиброзе Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 143 између хомозигота носиоца мутантног G алела и хетерозигота, али је забележен адитивни утицај броја G алела на развој стеатозе јетре [112]. У нашем истраживању највећи број пацијената код којих је рађена биопсија јетре, њих 15 су били носиоци G алела, односно 10 пацијената су били GG хомозиготи, 5 пацијената су били CG хетерозиготи и 1 пацијент нормалан хомозигот CC. Сви пацијенти са патохистолошким налазом обичне стеатозе (100%) имали су G алел, 1 је имао CG генотип и 3 GG генотип. У NASH групи 11 (91,67%) пацијената имало је G алел, 4 (33,33%) су били CG хетерозиготи, 7 (58,33%) GG мутантни хомозиготи, док је један пацијент са благом некроинфламаторном активношћу имао нормалан хомозигот CC. Троје пацијената са NASH и фиброзом су такође имали мутантни G алел, један пацијенат са премошћавајућом и порталном фиброзом је био хетерозигот CG, други је био мутантни хомозигот GG и један пацијент са премошћавајућом (bridging) фиброзом је био хетерозигот CG. Наши резултати говоре у прилог удружености G алела са степеном хистолошких промена, мада због малог броја пацијента код којих је извршена биопсија јетре, међу којима је само један пацијент носиоц нормалног алела, није било могуће утврдити статистичку значајност утицаја мутантног G алела на степен хистолошких промена, због чега су потребна даља истраживања. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 144 8. ЗАКЉУЧАК На основу добијених резултата у нашем истраживању закључујемо: 1. Неалкохолна масна болест јетре је хепатична манифестација метаболичког синдрома. Метаболички синдром има 87,27 % пацијената са NAFLD, 50% са NAFL и 91,67% са NASH. Сви пацијенти имају један или више метаболичких ризичних фактора, а 29,09% има свих 5 ризичних фактора. Метаболички синдром и све компоненте МS су статистички сигнификантно заступљеније код пацијената са NAFLD и NASH као поткатегоријом болести у односу на контролну групу. 2. Метаболички синдром и свака компонента MS појединачно, статистички сигнификантно повећавају вероватноћу појаве NAFLD: лечена хипертензија и/или повишен систолни крвни притисак ≥ 130 mmHg и/или дијастолни притисак ≥ 85 mmHg за 24,44 пута, присутан DM тип 2 или повишена гликемија наште ≥ 5,6 mmol/l 11,62 пута, повишен ниво триглицерида ≥ 1,7 mmol/l или већ третирана абнормалност 9,85 пута, снижен ниво HDL холестерола или већ третирана абнормалност за 3,78 пута. Пораст броја метаболичких компоненти за 1, статистички значајно повећава вероватноћу да дође до појаве NAFLD за 8,58 пута. 3. Пацијенти са NAFLD и метаболичким синдромом имају статистички сигнификатно виши ниво гликемије наште, инсулина, инсулинске резистенције, заступљенију хипертензију, гојазност и DM тип 2 у односу на пацијенте са NAFLD без метаболичког синдрома, односно све факторе ризика прогресије болести. Преваленца метаболичког синдрома код пацијената са NAFLD расте са порастом индекса телесне масе. Биопсију Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 145 јетре треба размотрити код пацијената са MS и ултразвучним налазом масне јетре. 4. Патогенеза NAFLD није до краја разјашњена и инсулинска резистенција се сматра основним патогенетским механизмом развоја и прогресије болести. Пацијенти са NAFLD (NAFL и NASH) имају статистички сигнификантно виши ниво инсулина и инсулинске резистенције изражене као HOMA-IR у односу на контролну групу, као и пацијенти са NASH у односу на пацијенте са обичном стеатозом јетре, због чега можемо закључити да је инсулинска резистенција значајан предиктор појаве и прогресије NAFLD. Пораст HOMA-IR за једну мерну јединицу повећава 3,55 пута вероватноћу појаве NAFLD. 5. Дислипидемија је значајан фактор ризика појаве NAFLD. Пацијенти са NAFLD/NASH имају статистички сигнификантно виши ниво холестерола, LDL холестерола, триглицерида, док је ниво HDL холестерола статистички значајно виши у контролној групи. Пораст нивоа триглицерида за једну јединицу мере повећава вероватноћу појаве NAFLD 16,02 пута, HOL за 87% и LDL холестерол за 85%, док повећање HDL холестерола за једну мерну јединицу смањује вероватноћу појаве NAFLD за 87%. 6. Пацијенти са NAFLD (NAFL и NASH) имају статистички сигнификантно већи индекс телесне масе и обим струка, као мере централне гојазности, у односу на контролну групу. Индекс телесне масе и OS су параметри које можемо лако измерити и представљају важан антропометријски индикатор за скрининг популације са високим ризиком развоја NAFLD и прогресијe болести. 7. Пацијенти са NAFLD и NASH имају статистички сигнификантно заступљенију гојазност, DM тип 2, хипертензију и сигнификантно виши ниво систолног и дијастолног крвног притиска у односу на контролну групу. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 146 8. Пацијенти са DM тип 2 и NAFLD су старији, имају статистички сигнификантно виши ниво гликемије наште, односа АSТ/ALT, заступљеност хипертензије, метаболичког синдрома и гојазности првог, другог и трећег степена као јединствене категорије гојазности у односу на пацијенте са NAFLD без дијабетеса, односно све факторе ризика развоја узнапредовале фиброзе. Биопсију јетре треба размотрити код пацијената са већ дијагностикованим DM тип 2 и ултразвучним налазом масне јетре. 9. Као и код других болести јетре, јетрини биохемијски тестови су најчешће коришћени маркери присутног оштећења јетре. У нашем истраживању активност ензима ALT је била статистички значајно виша у односу на контролну групу, као и GGT, АSТ и ALP. Није утврђена статистички значајна разлика у активности аминотрансфераза између пацијената са обичном стеатозом јетре и NASH, због чега се поставља питање оправданости употребе амнитрансфераза као критеријума селекције пацијената за биопсију јетре. Пацијенти са NAFLD имали су статистички значајно више вредности CRP, феритина, урата, фибриногена и билирубина у односу на контролну групу. 10. Употреба неинвазивних скорова, као што је NAFLD фиброзни скор, у клиничкој пракси и свакодневном раду је корисна у селекцији пацијената са супектном узнапредовалом фиброзом и потребом за биопсијом јетре. 11. Пацијенти са вредностима NAFLD фиброзног скора већим од 0,675, који карактерише узнапредовалу фиброзу су старији, статистички сигнификантно чешће имају DM тип 2, хипертензију, гојазност и однос АSТ/ALT већи од 1. 12. Ултразвук је јефтина и доступна дијагностичка метода, због чега је техника избора за скрининг пацијената на развој NAFLD нарочито код пацијента са мултиплим ризичним факторима. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 147 13. Пацијенти са ултразвучним налазом II и III степена масне јетре статистички сигнификантно имају већи BMI, OS, ниво инсулина, гликемије наште, инсулинске резистенције, заступљеност гојазности, хипертензије, DM тип 2, метаболичког синдрома, 4 и 5 компоненти метаболичког синдрома у односу на пацијенте ултразвучног степена I масне јетре. 14. Степен хепатичне стеатозе процењен UZ, у присуству метаболичког синдрома је бољи неинвазивни метод праћења болести у односу на ензиме јетре. 15. Метаболички синдром статистички сигнификантно повећава вероватноћу за појаву вишег ултразвучног степена масне јетре, као и поједине његове компоненте: снижен ниво HDL холестерола за 6,92 пута, повишена гликемија наште ≥ 5,6 mmo/l или већ присутан DM тип 2 4,62 пута, хипертензија 6,12 пута, гојазност 7,66 пута, гојазност првог степена 5,63 пута и гојазност другог степена 10,67 пута. Пораст броја елемената MS за један статистички значајно повећава вероватноћу развоја вишег UZ степена масне јетре за 3,27 пута. 16. Независни фактори ризика за равој масне јетре вишег ултразвучног степена су телесна тежина, хипертензија и снижен ниво HDL холестерола као метаболичка компонента. Овај модел повећава за 53,19% вероватноћу прогресије NAFLD процењену ултразвуком. 17. Пацијенти са NAFLD имају статистички сигнификантно више средње вредности CK-18 у плазми у односу на контролну групу. Унутар NAFLD спектра, највишу средњу вредност CK-18 у плазми имају пацијенти са NASH и она је статистички сигнификантно виша у односу на групу пацијента са обичном стеатозом. 18. Утврђена је статистички значајна повезаност степена интралобуларне инфламације и балонизације хепатоцита, и нивоа CK-18 у плазми, али не и степена стеатозе. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 148 19. Пацијенти са NASH и са перисинусоидалном и порталном фиброзом имају статистички сигнификантно више средње вредности CK-18 у плазми у односу на пацијенте са NASH без присутне фиброзе. 20. Имуноензимски тест за квантитативно мерење нивоа CK-18 у плазми може имати потенцијалну клиничку корист за пацијенте са NAFLD и мултиплим ризичним факторима у неинвазивној дијагностици NASH и фиброзе, али је потребна даља валидација имуноензимског тест на већем броју биопсираних пацијената. 21. Биопсија јетре и патохистолошка анализа су „златни стандард“ дијагнозе NASH и фиброзе код пацијената са NAFLD. 22. Полиморфизам I148M PNPLA3 гена чешћи је код пацијента са NAFLD у односу на контролну групу. Пацијенти са NAFLD, хомозиготи за полиморфни G алел имају статистички сигнификантно вишу активност АSТ и ALT, као најосетљивијих маркера оштећења хепатоцита, у односу на носиоце нормалног алела, односно CC хомозиготе, што указује да је PNPLA3 I148M полиморфизам предиспонирајући фактор развоја NAFLD код пацијената са ризичним факторима. 23. Није утврђена удруженост I148M варијанте PNPLA3 гена са BMI, дијабетес мелитусом, хипертензијом, метаболичким синдромом, повишеним серумским нивоом триглицерида, укупним холестеролом, HDL холестеролом, LDL холестеролом, гликемијом наште и инсулинском резистенцијом, израженом као HOMA-IR, односно ризичним факторима за развој NAFLD, што објашњава интериндивидулане разлике у склоности ка болести. 24. Евидентна је удружености G алела са степеном хистолошких промена код пацијената са NAFLD, међутим због малог броја пацијената код којих је рађена биопсија јетре, није утврђен статистички сигнификантни утицај Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 149 полиморфног G алела на степен хистолошких промена, због чега су потребна даља истраживања на већем броју пацијената подвргнутих биопсији и патохистолошкој анализи. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 150 9. ЛИТЕРАТУРА 1. Neuschwander-Tetri BA, Caldwell SH. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology 2003; 37:1202-19. 2. Machado M, Marques-Vidal P, Cortez-Pinto H. Hepatic histology in obese patients undergoing bariatric surgery. J Hepatol. 2006;45:600–6. 3. Westphal SA. Non-alcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes. European Endocrinology. 2008;4(2):70-3. 4. Ludwig J, Viggiano TR, McGill DB, Oh BJ. Nonalcoholic steatohepatitis: Mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease. Mayo Clin Proc 1980;55(7):434–8. 5. Bedogni G, Miglioli L, Masutti F, Tiribelli C, Marchesini G, Bellentani S. Prevalence of and risk factors for nonalcoholic fatty liver disease. The Dionysos nutrition and liver study. Hepatology. 2005; 42: 44–52. 6. Siddiqui MS, Sterling RK, Luketic VA, Puri P, Stravitz RT, Bounera I, Boyett S, Fuchs M, Sargeant C, Warnick GR, Grami S, Sanyal AJ. Association between high-normal levels of alanine aminotransferase and risk factors for atherogenesis. Gastroenterology 2013;145(6): 1271–9. 7. Sanyal AJ. NASH: A global helth problem. Hepatol Res. 2011; 41(7): 670-4. 8. Paschos P, Paletas K.Non alcoholic fatty liver disease and metabolic syndrome. Hippokratia 2009;13(1): 9–19. 9. Chalasani N, Younossi Z, Lavine JE, Diehl AM, Brunt EM, Cusi K, Charlton M, Sanyal AJ. The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease: practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases, American College of Gastroenterology, and the American Gastroenterological Association. Hepatology 2012;55:2005–2023. 10. Sugimoto K, Takei Y. Clinicopathological features of non-alcoholic fatty liver disease. Hepatol Res.2011; 41: 911–920. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 151 11. Hubscher SG. Histological assessment of non-alcoholic fatty liver disease. Histopathology 2006;49:450–465. 12. Zezos P, Renner EL. Liver transplantation and non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2014; 20(42): 15532–15538. 13. Collantes R, Ong JP, Younossi MZ, Nonalcoholic fatty liver disease and the epidemic of obesity, Cleveland Clin J Med, 2004;71: 657–664. 14. Vernon G, Baranova A, Younossi ZM. Systematic review: the epidemiology and natural history of non-alcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis in adults. Aliment Pharmacol Ther 2011;34:274-285. 15. Farrell GC, Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease: From steatosis to cirrhosis. Hepatology 2006; 43: S99–S112. doi: 10.1002/hep.20973 16. Williams CD, Stengel J, Asike MI, Torres DM, Shaw J, Contreras M, Landt CL, Harrison SA. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis among a largely middle-aged population utilizing ultrasound and liver biopsy: a prospective study. Gastroenterology 2011; 140:124-131 17. Lee JY, Kim KM, Lee SG, Yu E, Lim YS, Lee HC, Chung YH, Lee YS, Suh DJ. Prevalence and risk factors of non-alcoholic fatty liver disease in potential living liver donors in Korea: a review of 589 consecutive liver biopsies in a single center. J Hepatol 2007; 47(2): 239–44. 18. Zois CD, Baltayiannis GH, Bekiari A, Goussia A, Karayiannis P, Doukas M, Demopoulos D, Mitsellou A, Vougiouklakis T, Mitsi V, Tsianos EV. Steatosis and steatohepatitis in postmortem material from Northwestern Greece. World J Gastroenterol 2010;16(31): 3944–9. 19. Dvorak K, Hainer R, Petrtyl J, Zeman M, Vareka T, Zak A, Sroubkova R, Svestka T, Vitek L, Bruha R. The prevalence of nonalcoholic liver steatosis in patients with type 2 diabetes mellitus in the Czech Republic. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2014. 20. Leite NC, Salles GF, Araujo AL, Villela-Nogueira CA, Cardoso CR.Prevalence and associated factors of non-alcoholic fatty liver disease in patients with type-2 diabetes mellitus. Liver Int. 2009;29:113-9. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 152 21. Caballerıa L, Pera G, Auladell MA, Torau P, Munoz L, Miranda D, Aluma A, Casas JD, Sauchez C, Gill D, Auba J, Tiban A, Canut S, Bernad J, Aizpurua MM. Prevalence and factors associated with the presence of nonalcoholic fatty liver disease in an adult population in Spain. Eur J Gastroenterol Hepatol 2010;22(1): 24–32 22. Romeo S, Kozlitina J, Xing C, Pertsemlidis A, Cox D, Pennacchio AL, Boerwinkle E, Cohen CJ & Hobbs HH. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease. Nat Genet. 2008; 40(12): 1461-5. 23. Browning JD, Szczepaniak LS, Dobbins R, Nuremberg P, Horton JD, Cohen JC,et al. Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States: impact of ethnicity. Hepatology 2004;40:1387–1395. 24. Frith J, Day CP, Henderson E, Burt AD, Newton JL. Non-alcoholic fatty liver disease in older people. Gerontology 2009; 55: 607–13. 25. Chen ZW, Chen LY, Dai HL, Chen JH,Fang LZ. Relationship between alanine aminotransferase levels and metabolic syndrome in nonalcoholic fatty liver disease. J Zhejiang Univ Sci B 2008; 9: 616–22 26. Campos GM, Bambha K, Vittinghoff E, Rabl C, Posselt AM, Ciovica R, et al. A clinical scoring system for predicting nonalcoholic steatohepatitis in morbidly obese patients. Hepatology 2008;47:1916–1923. 27. Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002;16:1221-1231. 28. Cornier MA, Després JP, Davis N, Grossniklaus DA, Klein S et al. Assessing adiposity: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation 2011;124: 1996-2019. 29. Fontaine KR, Redden DT, Wang C, Westfall AO, Allison DB. Years of life lost due to obesity. JAMA 2003; 289: 187-193 30. Lu K, Song XL, Han SL, Wang CH, Zhong N, Qi LF. Potential study perspectives on mechanisms and correlations between adiposity and malignancy. Asian Pac J Cancer Prev. 2014; 152:1057-60. 31. Bechmann LP, Hannivoort RA, Gerken G, Hotamisligil GS, Trauner M, Canbay A. The interaction of hepatic lipid and glucose metabolism in liver diseases. J Hepatol 2012; 56: 952-964 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 153 32. Bugianesi E, Leone N, Vanni E, Marchesini G, Brunello F, Carucci P, MussoA, De Paolis P,Capussotti L, Salizzoni M, Rizzetto M. Expanding the natural history of nonalcoholic steatohepatitis: from cryptogenic cirrhosis to hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2002; 123:134 –140 33. Fassio E, Alvarez E, Dominguez N, Landeira G, Longo C. Natural history of nonalcoholic steatohepatitis: a longitudinal study of repeat liver biopsies. Hepatology 2004; 40:820 -826 34. Mirza MS. Obesity, Visceral Fat, and NAFLD: Querying the Role of Adipokines in the Progression of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. ISRN Gastroenterology 2011;2011:592404. 35. Whitlock G, Lewington S, Sherliker P, Clarke R, Emberson J, Halsey J,Qizilbash N, Collins R, Peto R. Body-mass index and cause-specific mortality in 900 000 adults: collaborative analyses of 57 prospective studies. Lancet. 2009;373:1083– 1096. 36. Rexrode KM, Carey VJ, Hennekens CH, Walters EE, Colditz GA, Stampfer MJ, Willett WC, Manson JE. Abdominal adiposity and coronary heart disease in women. JAMA1998;280(21):1843-8. 37. Snijder MB, Dekker JM, Visser M, Bouter LM, Stehouwer CD, Kostense PJ, Yudkin JS, Heine RJ, Nijpels G, Seidell JC. Am J Clin Nutr. Associations of hip and thigh circumferences independent of waist circumference with the incidence of type 2diabetes: the Hoorn Study. Am J Clin Nutr 2003;77(5):1192-7. 38. Angulo P, Keach JC, Batts KP, Lindor KP. Independent predictors of liver fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 1999; 30:1356– 1362 39. Leite NC, Villela-Nogueira CA, Cardoso CRL, Salles GF. Non-alcoholic fatty liver disease and diabetes: From physiopathological interplay to diagnosis and treatment. World J Gastroenterol. 2014;20(26):8377-8392. 40. Jimba S, Nakagami T, Takahashi M, Wakamatsu T, Hirota Y, Iwamoto Y, Wasada T. Prevalence of non-alcoholic fatty liver disease and its association with impaired glucose metabolism in Japanese adults. Diabet Med 2005; 22(9):1141-5. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 154 41. Doycheva I, Patel N, Peterson M, Loomba R. Prognostic implication of liver histology in patients with nonalcoholic fatty liver disease in diabetes. J Diabetes Complications. 2013;27(3):293-300. 42. Leite NC, Villela-Nogueira CA, Pannain VL, Bottino AC, Rezende GF, Cardoso CR, Salles GF. Histopathological stages of nonalcoholic fatty liver disease in type 2 diabetes: prevalences and correlated factors. Liver Int 2011; 31: 700-706 43. Younossi ZM, Gramlich T, Matteoni CA, Boparai N, McCullough AJ. Nonalcoholic fatty liver disease in patients with type 2 diabetes. Clin Gastroenterol Hepatol 2004; 2: 262-265 44. Targher G, Bertolini L, Padovani R, Rodellas S, Tessari R, Zenari L, Day C, Arcaro G. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and its association with cardiovascular disease among type 2 diabetic patients. Diabetes Care 2007;30(5):1212–18. 45. Targher G, Bertolini L, Poli F, Rodella S, Scala L, Tessari R, Zenari L, Falezza G. Nonalcoholic fatty liver disease and risk of future cardiovascular events among type 2 diabetic patients. Diabetes 2005;54(12):3541–6. 46. Reaven GM. Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes 1988; 37: 1595-1607. 47. DeFronzo RA, Ferrannini E. Insulin resistance. A multifaceted syndrome responsible for NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidemia, and atherosclerotic cardiovascular disease. Diabetes Care 1991; 14: 173–94. 48. Kaur J. A Comprehensive Review on Metabolic Syndrome. Cardiology Research and Practice 2014;2014:943162. 49. Carr DB, Utzschneider KM, Hull RL, Kodama K, Retzlaff BM, Bruzell JD, Shofer JB, Fish BE, Knopp RH, Kahn SE. Intra-abdominal fat is a major determinant of the National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III criteria for the metabolic syndrome. Diabetes 2004; 53(8): 2087-94. 50. Alberti KG, Eckel RH, Grundy SM, Zimmet PZ, Cleeman Ji, Donato KA, Fruchart JC, James WP, Lorla CM, Smith SC Jr. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the international diabetes federation task force on epidemiology and prevention; National heart, lung, and blood institute; Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 155 American heart association; World heart federation; International atherosclerosis society; And international association for the study of obesity. Circulation. 2009;120(16):1640–5. 51. Treeprasertsuk S, Leverage S, Adams LA, Lindor KD, Sauver J, Angulo P. The Framingham risk score and heart disease in nonalcoholic fatty liver disease. Liver International 2012;32(6): 945–950. 52. Wang Y, Li Yy, Nie Yq, Zhou Yj, Cao Cy, Xu L. Association between metabolic syndrome and the development of non-alcoholic fatty liver disease.Experimental and Therapeutic Medicine 2013;6(1):77-84. 53. Chitturi S, Abeygunasekera S, Farrell GC et al. NASH and insulin resistance: insulin hypersecretion and specific association with the insulin resistance syndrome. Hepatology 2002; 35: 373–9. 54. The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome. International Diabetes Federation, 2005. Availablefrom:www.idf.org/webdata/docs/IDF Metasyndrome definition.pdf 55. Park Y-W, Zhu S, Palaniappan L, Heshka S, Carnethon MR, Heymsfield SB. The metabolic syndrome: prevalence and associated risk factor findings in the US population from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988–1994. Archives of Internal Medicine. 2003;163(4):427–436. 56. Weiss R, Dziura J, Burgert TS, et al. Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents. N Engl J Med 2004; 350:2362–74. 57. Ford ES, Giles WH, Dietz WH. Prevalence of the metabolic syndrome among US adults: findings from the third National Health and Nutrition Examination Survey. JAMA 2002; 287: 356–59. 58. Tarantino G, Finelli C. What about non-alcoholic fatty liver disease as a new criterion to define metabolic syndrome? World J Gastroenterol. 2013; 19(22):3375-84. 59. Marchesini G, Bugianesi E, Forlani G, Cerrelli F, Lenzi M, Manini R, Natale S, Vanni E, Villanova N, Melchionda N.,Rizzetto M. Nonalcoholic fatty liver, steatohepatitis, and the metabolic syndrome. Hepatology 2003; 37: 917–923. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 156 60. Eckel RH. Lipoprotein lipase. A multifunctional enzyme relevant to common metabolic diseases. N Engl J Med 1989; 320:1060–68. 61. Jensen MD, Caruso M, Heiling V, Miles JM. Insulin regulation of lipolysis in nondiabetic and IDDM subjects. Diabetes 1989; 38:1595–601. 62. Lewis GF, Uffelman KD, Szeto LW, Weller B, Steiner G. Interaction between free fatty acids and insulin in the acute control of very low density lipoprotein production in humans. J Clin Invest 1995; 95: 158–66. 63. Hotamisligil GS, Peraldi P, Budavari A, Ellis R, White MF, Spiegelman BM. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-α- and obesity-induced insulin resistance. Science.1996;271(5249):665–668. 64. Kenneth C. Role of Obesity and Lipotoxicity in the Development of Nonalcoholic Steatohepatitis: Pathophysiology and Clinical Implications. Gastroenterology 2012;142: 711-725. 65. Dodson MV, Mir PS, Hausman GJ, Guan LL, Du M, Jiang Z, Fernyhough ME, Bergen WG. Obesity, metabolic syndrome, and adipocytes. J Lipids. 2011;2011:721-686. 66. Garg MK, Dutta MK, Mahalle N. Adipokines (adiponectin and plasminogen activator inhhibitor-1) in metabolic syndrome. Indian J Endocrinol Metab 2012;16: 116-123 67. Ridker PM, Buring JE, Cook NR, Rifai N. C-reactive protein, the metabolic syndrome, and risk of incident cardiovascular events: an 8-year follow-up of 14 719 initially healthy American women. Circulation. 2003; 107(3): 391-7. 68. Zimmermann E, Anty R, Tordjman J, Verrijken A, Gual P, Tran A, Iannelli A, Gugenheim J, Bedossa P, Francque S, Le Marchand-Brustel Y, Clement K, Van Gaal L, Sørensen TI, Jess T. C-reactive protein levels in relation to various features of non-alcoholic fatty liver disease among obese patients. J Hepatol. 2011; 55(3): 660-5. 69. Tuomilehto J, Lindstrom J, Eriksson JG, et al. Prevention of type 2diabetes mellitus by changes in lifestyle among subjects with impaired glucose tolerance. N Engl J Med 2001; 344: 1343–50. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 157 70. Festi D, Schiumerini R, Eusebi LH, Marasco G, Taddia M, Colecchia A. Gut microbiota and metabolic syndrome. World J Gastroenterol. 2014;20(43):16079- 16094. 71. Adams LA, Angulo P, Lindor KD.Nonalcoholic fatty liver disease. CMAJ. 2005; 172(7): 899-905. 72. Day CP, James OF. Steatohepatitis: a tale of two “hits”? Gastroenterology1998; 114: 842-845. 73. Dowman JK, Tomlinson JW, Newsome PN. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. QJM.2010;103:71–83. 74. Perlemuter G, Bigorgne A, Cassard-Doulcier AM, Naveau S. Nonalcoholic fatty liver disease: from pathogenesis to patient care. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2007; 3(6): 458-69. 75. Stojsavljević S, Gomerčić Palčić M, Virović Jukić L, Smirčić Duvnjak L, Duvnjak M. Adipokines and proinflammatory cytokines, the key mediators in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2014; 20(48): 18070-18091. 76. Sydney A Westphal. Non-alcoholic Fatty Liver Disease and Type 2 Diabetes. European Endocrinology, 2008;4(2):70-3 77. Anty R, Lemoine M. Liver fibrogenesis and metabolic factors. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2011 Jun;35 (1): 10-20. 78. Stefan N, Kantartzis K, Haring HU. Causes and metabolic consequences of fatty liver. Endocr Rev.2008;29:939–60. 79. Sanyal AJ, Chalasani N, Kowdley KV, McCullough A, Diehl AM, Bass NM, Neuschwander-Tetri BA, Lavine JE, Tonascia J, Unalp A,Van Natta M, Clark J, Brunt EM, Kleiner DE, Hoofnagle JH, Robuck PR; NASH CRN. Pioglitazone, vitamin E, or placebo for nonalcoholic steatohepatitis. N Engl J Med. 2010 May 6;362(18):1675-85. 80. Postic C, Girard J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J Clin Invest. 2008;118:829–38. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 158 81. Cai D, Yuan M, Frantz DF, et al. Local and systemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKK-beta and NF-kappaB. Nat Med 2005; 11: 183-190 82. Namikawa C, Shu-Ping Z, Vyselaar JR, Nozaki Y, Nemoto Y, Ono M, et al. Polymorphisms of microsomal triglyceride transfer protein gene and manganese superoxide dismutase gene in non-alcoholic steatohepatitis. J Hepatol. 2004;40:781–6. 83. McCullough AJ. Update on nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Gastroenterol 2002;34:255–62 84. Braunersreuther V, Viviani GL, Mach F, Montecucco F. Role of cytokines and chemokines in non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2012;18(8):727-735 85. Yuan M, Konstantopoulos N, Lee J, et al. Reversal of obesityanddiet-induced insulin resistance with salicylates or targeted disruption of Ikk beta. Science 2001; 293:1673–1677 86. Hotamisligil GS, Shargill NS, Spiegelman BM. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science 1993; 259: 87-91. 87. Hui JM, Hodge A, Farrell GC, Kench JG, Kriketos A, George J. Beyond insulin resistance in NASH: TNF-alpha or adiponectin? Hepatology 2004; 40: 46-54 88. Dandona P, Weinstock R, Thusu K, Abdel-Rahman E, Aljada A, Wadden T. Tumor necrosis factor-alpha in sera of obese patients: fall with weight loss. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 2907-2910 89. Lesmana CR, Hasan I, Budihusodo U, Gani RA, Krisnuhoni E, Akbar N, Lesmana LA. Diagnostic value of a group of biochemical markers of liver fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis. J Dig Dis 2009; 10: 201-206. 90. Lee YM, Sutedja DS, Wai CT, Dan YY, Aung MO, Zhou L, Cheng CL, Wee A, Lim SG. A randomized controlled pilot study of Pentoxifylline in patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Hepatol Int 2008; 2: 196-201. 91. Hasegawa T, Yoneda M, Nakamura K, Makino I, Terano A. Plasma transforming growth factor-beta1 level and efficacy of alpha-tocopherol in patients with non- Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 159 alcoholic steatohepatitis: a pilot study. Aliment Pharmacol Ther 2001; 15: 1667- 1672 92. Das SK, Balakrishnan V. Role of cytokines in the pathogenesis of non-alcoholic Fatty liver disease. Indian J Clin Biochem. 2011;26(2):202-9. 93. Mahmoud AA, Bakir AS, Shabana SS. Serum TGF-β, Serum MMP-1, and HOMA-IR as non-invasive predictors of fibrosis in Egyptian patients with NAFLD. Saudi J Gastroenterol. 2012; 18 (5):327-33. 94. Wieckowska A, Papouchado BG, Li Z, Lopez R, Zein NN, Feldstein AE. Increased hepatic and circulating interleukin-6 levels in human nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol. 2008;103(6):1372-9. 95. Lemoine M, Ratziu V, Kim M, Maachi M, Wendum D, Paye F, et al. Serum adipokine levels predictive of liver injury in non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int. 2009;29:1431–8 96. Finelli C, Tarantino G. What is the role of adiponectin in obesity related non- alcoholic fatty liver disease? World J Gastroenterol. 2013;19(6):802-812. 97. Chitturi S, Farrell G, Frost L, et al. Serum leptin in NASH correlateswith hepatic steatosis but not fibrosis: a manifestation oflipotoxicity? Hepatology 2002; 36:403–409 98. Sanyal AJ, Campbell-Sargent C, Mirshahi F, Rizzo WB, Contos MJ, Sterling RK, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: association of insulin resistance and mitochondrial abnormalities. Gastroenterology. 2001; 120:1183–92. 99. Basaranoglu M, Basaranoglu G, Sentürk H.From fatty liver to fibrosis: a tale of "second hit". World J Gastroenterol. 2013;19(8):1158-65. 100. Weltman MD, Farrell GC, Hall P, Ingelman-Sundberg M, Liddle C. Hepatic cytochrome P450 2E1 is increased in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 1998;27:128–33. 101. Chakraborty JB1, Oakley F, Walsh MJ. Mechanisms and biomarkers of apoptosis in liver disease and fibrosis. Int J Hepatol. 2012;2012:648915. 102. Feldstein AE, Wieckowska A, Lopez AR, Liu Y-C, Zein NN, McCullough AJ. Cytokeratin-18 fragment levels as noninvasive biomarker for nonalcoholic Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 160 steatohepatitis: A multicenter validation study. Hepatology 2009;50(4):1072- 1078. 103. Day CP. From fat to inflammation. Gastroenterology. 2006;130:207–10. 104. Gangarapu V, Yıldız K, Ince AT, Baysal B. Role of gut microbiota: obesity and NAFLD. Turk J Gastroenterol. 2014;25(2):133-40. 105. Miele L, Valenza V, La Torre G, Montalto M, Cammarota G,Ricci R, et al. Increased intestinal permeability and tight junction alterations in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2009;49(6):1877-87. 106. Duvnjak M, Barsić N, Tomasić V, Lerotić I. Genetic polymorphisms in non-alcoholic fatty liver disease: clues to pathogenesis and disease progression. World J Gastroenterol. 2009;15(48):6023-7. 107. Li YY. Genetic and epigenetic variants influencing the development of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2012;18(45):6546-51. 108. Dongiovanni P, Donati B, Fares R, Lombardi R, Mancina RM, Romeo S, Valenti L. PNPLA3 I148M polymorphism and progressive liver disease. World J Gastroenterol. 2013;19(41):6969-78. 109. Romeo S, Huang-Doran I, Baroni MG, Kotronen A. Unravelling the pathogenesis of fatty liver disease: patatin-like phospholipase domain-containing 3 protein. Curr Opin Lipidol 21: 247–252. 110. Speliotes EK, Butler JL, Palmer CD, Voight BF; GIANT Consortium; MIGen Consortium; NASH CRN,Hirschhorn. PNPLA3 variants specifically confer increased risk for histologic nonalcoholic fatty liver disease but not metabolic disease. Hepatology. 2010;52(3):904-12. 111. Valenti L, Al-Serri A, Daly AK, et al. Homozygosity for the PNPLA3 / adiponutrin I148M polymorphism influences liver fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2010; 51: 1209-17. 112. Sookoian S, Pirola CJ. Meta-analysis of the influence of I148M variant of patatin-like phospholipase domain containing 3 gene (PNPLA3) on the susceptibility and histological severity of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2011; 53: 1883-1894. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 161 113. Liu YL, Patman GL, Leathart JB, Piguet AC, Burt AD, Dufour JF, Day CP, Daly AK, Reeves HL, Anstee QM. Carriage of the PNPLA3 rs738409 C >G polymorphism confers an increased risk of non-alcoholic fatty liver disease associated hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2014;61(1):75-81. 114. Sass DA, Chang P, Chopra KB. Nonalcoholic fatty liver disease: a clinical review. Dig Dis Sci. 2005;50(1):171-80. 115. Wieckowska A, Feldstein AE. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 2008;28(4):386-95. 116. Khosravi S, Alavian SM, Zare A, Daryani NE, Fereshtehnejad SM, Daryani NE, Keramati MR, Abdollahzade S, Taba Taba Vakili S. Non alcoholic fatty liver disease and correlation of serum alanin aminotransferase level with hystopathologic findings. Hepat Mon. 2011;11(6):452-8. 117. Mofrad P, Contos MJ, Haque M, et al. Clinical and histologic spectrum of nonalcoholic fatty liver disease associated with normal ALT values. Hepatology 2003;37:1286–1292. 118. de Alwis NM, Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease: the mist gradually clears. J Hepatol. 2008; 48 (1): 104-12. 119. Pantsari MW, Harrison SA. Nonalcoholic fatty liver disease presenting with an isolated elevated alkaline phosphatase. J Clin Gastroenterol 2006; 40: 633-635. 120. Tahan V, Canbakan B, Balci H, Dane F, Akin H, Can G, Hatemi I, Olgac V, Sonsuz A, Ozbay G, Yurdakul I, Senturk H. Serum gammaglutamyltranspeptidase distinguishes non-alcoholic fatty liver disease at high risk. Hepato-Gastroenterology 2008;, 55 (85): 1433–1438. 121. Machado MV, Cortez-Pinto H. Non-invasive diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease. A critical appraisal. J Hepatol 2013; 58: 1007-1019 122. Sanyal AJ. AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2002; 123 (5): 1705–1725. 123. Lupsor M, Badea R. Imaging diagnosis and quantification of hepatic steatosis: is it an accepted alternative to needle biopsy? Rom J Gastroenterol. 2005 Dec;14(4):419-25. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 162 124. Mottin CC, Moretto M, Padoin AV, Swarowsky AM, Toneto MG, Glock L, et al. The role of ultrasound in the diagnosis of hepatic steatosis in morbidly obese patients. Obes Surg 2004;14:635–637. 125. Ryan CK, Johnson LA, Germin BI, Marcos A. One hundred consecutive hepatic biopsies in the workup of living donors for right lobe liver transplantation. Liver Transpl 2002; 8:1114-1122. 126. Obika M, Noguchi H. Diagnosis and evaluation of nonalcoholic fatty liver disease. Exp Diabetes Res. 2012;2012:145754. 127. Iijima H., Moriyasu F, Tsuchiya K, Suzuki S, Yoshida M, Shimizu M, Sasaki S, Nishiguchi S, Maeyama S. Decrease in accumulation of ultrasound contrast microbubbles in non-alcoholic steatohepatitis. Hepatology Research 2007; 37: 722–730. 128. Park SH, Kim PN, Kim KW, Kim Lee SW, Yoon SE, Park Sw, Ha HK, Lee MG, Hwang S, Lee SG, Yu ES, Cho EY. Macrovesicularhepatic steatosis in living liver donors: use of CT for quantitative and qualitative assessment. Radiology. 2006; 239 (1): 105–12. 129. Wong GL. Update of liver fibrosis and steatosis with transient elastography (Fibroscan). Gastroenterol Rep (Oxf). 2013;1(1):19-26. 130. Friedrich-Rust M1, Ong MF, Martens S, Sarrazin C, Bojunga J, Zeuzem S, Herrmann E. Performance of transient elastography for the staging of liver fibrosis: a meta-analysis. Gastroenterology. 2008;134(4):960-74. 131. Yoneda M, Yoneda M, Fujita K, Inamori M, Tamano M, Hiriishi H, Nakajima A. Transient elastography in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Gut. 2007;56(9):1330-1. 132. Bravo AA, Sheth SG, Chopra S. Liver biopsy. N Engl J Med 2001; 344: 495-50. 133. Ratziu V, Charlotte F, Heurtier A i sur. Sampling variability of liver biopsy in nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2005;128:1898-906. 134. Fitzpatrick E, Dhawan A. Noninvasive biomarkers in non-alcoholic fatty liver disease: current status and a glimpse of the future. World J Gastroenterol. 2014;20(31):10851-63. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 163 135. Pearce SG, Thosani NC, Pan JJ. Noninvasive biomarkers for the diagnosis of steatohepatitis and advanced fibrosis in NAFLD. Biomark Res. 2013;1(1):7. 136. Wieckowska A, Zein NN, Yerian LM, Lopez AR, McCullough AJ, Feldstein AE: In vivo assessment of liver cell apoptosis as a novel biomarker of disease severity in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2006, 44:27–33. 137. Shen J, Chan HL, Wong GL, Choi PC, Chan AW, Chan HY, Chim AM, YeungDK, Chan FK, Woo J, Yu J, Chu WC, Wong VW: Non-invasive diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis by combined serum biomarkers. J Hepatol 2012, 56:1363–1370. 138. Joka D, Wahl K, Moeller S, Schlue J, Vaske B, Bahr MJ, Manns MP, SchulzeOsthoff K, Bantel H: Prospective biopsy-controlled evaluation of cell death biomarkers for prediction of liver fibrosis and nonalcoholicsteatohepatitis. Hepatology 2012, 55:455–464. 139. Musso G, Gambino R, Cassader M, Pagano G. Meta-analysis: natural history of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and diagnostic accuracy of non-invasive tests for liver disease severity. Ann Med 2011; 43: 617-649. 140. Kwok R, Tse YK, Wong GL, Ha Y, Lee AU, Ngu MC, Chan HL, Wong VW. Systematic review with meta-analysis: noninvasive assessment of non- alcoholic fatty liver disease-- the role of transient elastography and plasma cytokeratin-18 fragments. Aliment Pharmacol Ther 2014; 39(3): 254-69 141. Angulo P, Hui JM, Marchesini G, Bugianesi E, George J, Farrell GC, Enders F, Saksena S, Burt AD, Bida JP, Lindor K, Sanderson SO, Lenzi M, Adams LA, Kench J, Therneau TM, Day CP: The NAFLD фиброзни скор: a noninvasive system that identifies liver fibrosis in patients with NAFLD. Hepatology 2007, 45:846–854. 142. Brunt EM, Tiniakos DG. Histopathology of nonalcoholic fatty liver disease.World Journal of Gastroenterology: WJG 2010;16(42):5286-5296. 143. Brunt EM, Tiniakos DG. Alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease. In: Odze RD, Goldblum JR, eds. Surgical Pathology of the GI Tract, Liver, Biliary Tract and Pancreas. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier, 2009: 1007-1014. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 164 144. Brunt EM, Janney CG, Di Bisceglie AM, NeuschwanderTetri BA, Bacon BR. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol 1999; 94: 2467-2474. 145. Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, McCullough AJ. Nonalcoholic fatty liver disease: a spectru of clinical and pathological severity. Gastroenterology 1999;116: 1413-1419. 146. Takahashi Y, Fukusato T. Histopathology of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World J Gastroenterol. 2014;20(42):15539- 15548. 147. Brunt EM. Nonalcoholic steatohepatitis: pathologic features and differential diagnosis. Semin Diagn Pathol 2005; 22:330-338. 148. Argo CK, Northup PG, Al-Osaimi AM, Caldwell SH. Systematic review of risk factors for fibrosis progression in nonalcoholic steatohepatitis. J Hepatol 2009; 51: 371-379. 149. Zatloukal K, Stumptner C, Fuchsbichler A, Fickert P, Lackner C, Trauner M, Denk H. The keratin cytoskeleton in liver diseases. J Pathol 2004; 204: 367- 376. 150. Kleiner DE, Brunt EM, Van Natta M, Behling C, Contos MJ, Cummings OW, Ferrell LD, Liu YC, Torbenson MS, UnalpArida A, Yeh M, McCullough AJ, Sanyal AJ. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology 2005;41: 1313-1321. 151. Brunt EM, Kleiner DE, Wilson LA, Belt P, NeuschwanderTetri BA. Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology 2011; 53: 810-820. 152. Adams LA, Lymp JF, St Sauver J, Sanderson SO, Lindor KD, Feldstein A, Angulo P. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population- based cohort study. Gastroenterology. 2005; 29: 13 –121. 153. Ong JP, Pitts A, Younossi ZM. Increased overall mortality and liver- related mortality in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2008;49:608–612 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 165 154. Rafiq N, Bai C, Fang Y, Srishord M, McCullough A, Gramlich T, Younossi ZM. Long-term follow-up of patients with nonalcoholic fatty liver. Clin Gastroenterol Hepatol 2009; 7: 234-238. 155. Caldwell SH, Oelsner DH, Iezzoni JC, Hespenheide EE, Battle EH, Driscoll CJ. Cryptogenic cirrhosis: clinical characterization and risk factors for underlying disease. Hepatology. 1999 Mar;29(3):664-9. 156. Machado MV, Cortez-Pinto H. Non-alcoholic fatty liver disease: what the clinician needs to know. World J Gastroenterol. 2014;20(36):12956-80. 157. Adams LA, Sanderson S, Lindor KD, Angulo P. The histological course of nonalcoholic fatty liver disease: a longitudinal study of 103 patients with sequential liver biopsies. J Hepatol 2005;42:132-138. 158. Jessica K Dyson, Quentin M Anstee, Stuart McPherson. Non-alcoholic fatty liver disease: a practical approach to diagnosis and staging. Frontline Gastroenterology 2013;0:1–8. 159. Ratziu VD, Bonyhay L, Di Martino V, Charlotte F, Cavallaro L, Sayegh- Tainturier MH, et al. Survival, liver failure, and hepatocellular carcinoma in obesity-related cryptogenic cirrhosis. Hepatology 2002;35(6):1485-93. 160. Starley BQ, Calcagno CJ, Harrison SA. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 2010 ;51(5):1820-32. 161. Federico A, Zulli C, de Sio I, Del Prete A, Dallio M, Masarone M, Loguercio C.Focus on emerging drugs for the treatment of patients with non- alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2014;20(45):16841-16857. 162. Bhat G, Baba CS, Pandey A, Kumari N,Choudhury G. Life style modification improves insulin resistance and liver histology in patients with non- alcoholic fatty liver disease. World J Hepatol. 2012;4(7):209-17. 163. Musso G, Gambino R, Cassader M, Pagano G. A metaanalysis of randomized trials for the treatment of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2010; 52: 79-104. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 166 164. Promrat, K., D.E. Kleiner, H.M. Niemeier, et al. Randomized controlled trial testing the effects of weight loss on nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2010; 51: 121–129. 165. Musso G, Gambino R, De Michieli F, Cassader M, Rizzetto M, Durazzo M, Fagà E, Silli B, Pagano G. Dietary habits and their relations to insulin resistance and postprandial lipemia in nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2003; 37: 909-916. 166. Yilmaz Y. Review article: fructose in non-alcoholic fatty liver disease. Aliment Pharmacol Ther 2012; 35: 1135-1144. 167. Mazza A, Fruci B, Garinis GA, Giuliano S, Malaguarnera R, Belfiore A. The role of metformin in the management of NAFLD. Exp Diabetes Res. 2012;2012:716404 168. Razavizade M, Jamali R, Arj A, Matini SM, Moraveji A, Taherkhani E. The effect of pioglitazone and metformin on liver function tests, insulin resistance, and liver fatcontent in nonalcoholic Fatty liver disease: a randomized double blinded clinical trial. Hepat Mon. 2013 May 21;13(5):e9270. 169. Li Y, Liu L, Wang B, Wang J, Chen D. Metformin in non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. Biomed Rep. 2013;1(1):57- 64. 170. Lavine JE, Schwimmer JB, Van Natta ML, Molleston JP, Murray KF, Rosenthal P, Abrams SH, Scheimann AO, Sanyal AJ, Chalasani N, Tonascia J, Ünalp A, Clark JM, Brunt EM, Kleiner DE, Hoofnagle JH, Robuck PR. Effect of vitamin E or metformin for treatment of nonalcoholic fatty liver disease in children and adolescents: the TONIC randomized controlled trial. JAMA 2011; 305: 1659-1668 171. Haukeland JW, Konopski Z, Eggesb HB i sur. Metformin in patients with non-alcoholic fatty liver disease: a randomized, controlled trial. Scand J Gastroenterol 2009;44:853–60 172. Belfort R, Harrison SA, Brown K i sur. A placebo-controlled trial of pioglitazone in subjects with nonalcoholic steatohepatitis. N Engl J Med 2006;355:2297–307. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 167 173. Aithal GP, Thomas JA, Kaye PV, Lawson A, Ryder SD, Spendlove I, Austin AS, Freeman JG, Morgan L, Webber J. Randomized, placebo-controlled trial of pioglitazone in nondiabetic subjects with nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 2008;135(4):1176-84 174. Boettcher E, Csako G, Pucino F, Wesley R, Loomba R.Meta-analysis: pioglitazone improves liver histology and fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis. Aliment Pharmacol Ther. 2012;35(1):66-75. 175. Bjelakovic G, Nikolova D, Gluud LL, Simonetti RG, Gluud C. Mortality in randomized trials of antioxidant supplements for primary and secondary prevention: systematic review and meta-analysis. JAMA 2007; 297: 842-857 176. Chalasani N, Aljadhey H, Kesterson J, Murray MD, Hall SD. Patients with elevated liver enzymes are not at higher risk for statin hepatotoxicity. Gastroenterology 2004; 126: 1287-1292 177. Nseir W, Mograbi J, Ghali M. Lipid-lowering agents in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: human studies. Dig Dis Sci 2012; 57: 1773-1781 178. Tziomalos K. Lipid-lowering agents in the management of nonalcoholic fatty liver disease. World J Hepatol. 2014;6(10):738-44. 179. Zhu FS, Liu S, Chen XM, Huang ZG, Zhang DW. Effects of n- 3 polyunsaturated fatty acids from seal oils on nonalcoholic fatty liver disease associated with hyperlipidemia World J Gastroenterol. 2008;14(41):6395- 400. 180. Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia. 1985;28:412-19. 181. Needleman L, Kurtz AB, Rifkin MD, Cooper HS, Pasto ME, Goldberg BB. Sonography of diffuse benign liver disease: accuracy of pattern recognition and grading. AJR Am J Roentgenol 1986;146:1011-5. 182. Saadeh S, Younossi ZM, Remer EM, Gramlich T, Ong JP, Hurley M, et al. The utility of radiological imaging in fatty liver disease. Gastroenterology 2002;123:745–50. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 168 183. Dutta AK. A New PCR-RFLP Method for Diagnosing PNPLA3 rs738409 Polymorphism . WebmedCentral GENETICS 2011;2(11):WMC002401 184. Byrne CD, Targher G. NAFLD: A multisystem disease. J Hepatol. 2015 ;62(1S):S47-S64. 185. Watanabe S, Hashimoto E, Ikejima K, Uto H, Ono M, Sumida Y, Seike M, Takei Y, Takehara T, Tokushige K, Nakajima A, Yoneda M, Saibara T, Shiota G,Sakaida I, Nakamuta M, Mizuta T, Tsubouchi H, Sugano K, Shimosegawa T. Evidence-based clinical practice guidelines for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. Hepatol Res. 2015;45(4):363-77. 186. Kawaguchi T, Sumida Y, Umemura A et al. Genetic polymorphisms of the human PNPLA3 gene are strongly associated with severity of non-alcoholic fatty liver disease in Japanese. PLoS One. 2012; 7: e38322. 187. Hotta K, Yoneda M, Hyogo H et al. Association of the rs738409 polymorphism in PNPLA3 with liver damage and the development of nonalcoholic fatty liver disease. BMC Med Genet. 2010; 11: 172. 188. Souza MR, Diniz Mde F, Medeiros-Filho JE, Araujo MS. Metabolic syndrome and risk factors for non-alcoholic fatty liver disease. Arq. Gastroenterol. 2012; 49: 89–96. 189. Verma S, Jensen D, Hart J, Mohanty SR. Predictive value of ALT levels for non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and advanced fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Liver Int. 2013;33(9):1398-405. 190. Rocha R, Cotrim HP, Carvalho FM, Siqueira AC, Braga H, Freitas LA. Body mass index and waist circumference in non-alcoholic fatty liver disease. J Hum Nutr Diet. 2005;18(5):365-70 191. Kirovski G, Schacherer D, Wobser H, Huber H, Niessen C, Beer C, Schölmerich J, HellerbrandC.Prevalence of ultrasound-diagnosed non alcoholic fatty liver disease in a hospital cohort and its association with anthropometric, biochemical and sonographic characteristics. Int J Clin Exp Med. 2010;3(3):202-10. 192. Nakahara T, Hyogo H, Yoneda M, Sumida Y, Eguchi Y, Fujii H, Ono M, Kawaguchi T, Imajo K, Aikata H, Tanaka S, Kanemasa K, Fujimoto K, Anzai Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 169 K, Saibara T, Sata M, Nakajima A, Itoh Y, Chayama K, Okanoue T; Japan Study Group of Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Type 2 diabetes mellitus is associated with the fibrosis severity in patients with nonalcoholic fatty liver diseasein a large retrospective cohort of Japanese patients. J Gastroenterol. 2014;49(11):1477-84. 193. McPherson S, Hardy T, Henderson E, Burt AD, Day CP, Anstee QM. Evidence of NAFLD progression from steatosis to fibrosing steatohepatitis using paired biopsies: implications for prognosis and clinical management. J Hepatol. 2015;62(5):1148-55. 194. Hamaguchi M, Kojima T, Takeda N, Nagata C, Takeda J, Sarui H, Kawahito Y, Yoshida N, Suetsugu A, Kato T, Okuda J, Ida K, Yoshikawa T. Nonalcoholic fatty liver disease is a novel predictor of cardiovascular disease. World J Gastroenterol. 2007;13(10):1579-84. 195. Donati G, Stagni B, Piscaglia F, Venturoli N, Morselli-Labate AM, Rasciti L, et al. Increased prevalence of fatty liver in arterial hypertensive patients with normal liver enzymes: role of insulin resistance. Gut. 2004;53:1020–3. 196. Cheah WL, Lee PY, Chang CT, Mohamed HJ, Wong SL. Prevalence of ultrasound diagnosed nonalcoholic fatty liver disease among rural indigenous community of Sarawak and its association with biochemical and anthropometric measures. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2013;44(2):309-17. 197. Abangah G, Yousefi A, Asadollahi R, Veisani Y, Rahimifar P, Alizadeh S. Correlation of Body Mass Index and Serum Parameters With Ultrasonographic Grade of Fatty Change in Non-alcoholic Fatty Liver Disease. Iran Red Crescent Med J. 2014;16(1):e12669. 198. Lizardi-Cervera J, Laparra DI, Chávez-Tapia NC, et al. Prevalence of NAFLD and metabolic syndrome in asym-tomatics subjects. Rev Gastroenterol Mex. 2006; 71(4):453-459. 199. Eguchi Y, Hyogo H, Ono M, Mizuta T, Ono N, Fujimoto K, et al. Prevalence and associated metabolic factors of nonalcoholic fatty liver disease in the general population from 2009 to 2010 in Japan: a multicenter large retrospective study. J Gastroenterol. 2012;47:586–95. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 170 200. Harrison SA, Oliver D, Arnold HL, Gogia S, Neuschwander-Tetri BA. Development and validation of a simple NAFLD clinical scoring system for identifying patients without advanced disease. Gut. 2008;57:1441–7. 201. Lee S, Jin Kim Y, Yong Jeon T, Hoi Kim H, Woo Oh S, Park Y, Soo Kim S. Obesity is the only independent factor associated with ultrasound-diagnosed non alcoholic fatty liver disease cross sectional case control study. Scand J Gastroenterol. 2006;41 (5) 566-72. 202. Duvnjak M, Lerotic I, Barsic N, Tomasic V, Jukic LV, Velagic V. Pathogenesis and management issues for non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2007,13:4539–50. 203. Salgado AL, Carvalho Ld, Oliveira AC, Santos VN, Vieira JG, Parise ER. Insulin resistance index (HOMA-IR) in the differentiation of patients with non- alcoholic fatty liver disease and healthy individuals. Arq Gastroenterol. 2010; 47(2):165-9. 204. Önnerhag K., Nilsson P, Lindgren S.Insulin resistance with impaired fasting glucose increases the risk of NAFLD. Open Journal of Gastroenterology. 2013; 3: 170-176. 205. Uslusoy HS, Nak SG, Gulten M, Biyikli Z. Non-alcoholic steatohepatitis with normal aminotransferase values. World J Gastroenterol 2009;15:1863-8. 206. Hu X, Huang Y, Bao Z, Wang Y, Shi D, Liu F, Gao Z, Yu X. Prevalence and factors associated with nonalcoholic fatty liver disease in Shanghai work- units. BMC Gastroenterol. 2012;12:123 207. Miyake T, Kumagi T, Hirooka M, Koizumi M, Furukawa S, Ueda T, Tokumoto Y, Ikeda Y, Abe M, Kitai K, Hiasa Y, Matsuura B, Onji M. Metabolic markers and ALT cutoff level for diagnosing nonalcoholic fatty liver disease: a community-based cross-sectional study. J Gastroenterol. 2012 ;47(6):696-703. 208. Pinidiyapathirage MJ, Dassanayake AS, Rajindrajith S, Kalubowila U, Kato N, Wickremasinghe AR, de Silva HJ. Non-alcoholic fatty liver disease in a rural, physically active, low income population in Sri Lanka. BMC Res Notes. 2011;4:513. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 171 209. Radu C, Grigorescu M, Crisan D, Lupsor M, Constantin D, Dina L. Prevalence and associated risk factors of non-alcoholic fatty liver disease in hospitalizedpatients. J Gastrointestin Liver Dis. 2008;17(3):255-60. 210. Kotronen A, Westerbacka J, Bergholm R, Pietilainen KH, Yki-Jarvinen H. Liver fat in the metabolic syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92 (9): 3490- 3497 211. Hamaguchi M, Kojima T, Takeda N, Nakagawa T, Taniguchi H, Fujii K, Omatsu T, Nakajima T, Sarui H, Shimazaki M, Kato T, Okuda J, Ida K. The metabolic syndrome as a predictor of nonalcoholic fatty liver disease. Ann Intern Med. 2005;143(10):722-8. 212. Scott Rector R, Thyfault JP, Wei Y, A Ibdah J.Non-alcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome: An update. World J Gastroenterol 2008; 14: 185-192. 213. Marchesini G, Moscatiello S, Di Domizio S, Forlani G. Obesity-associated liver disease. J Clin Endocrinol Metab 2008; 93: S74-S80. 214. Kang H, Greenson JK, Omo JT, Chao C, Peterman D, Anderson L, Foess- Wood L, Sherbondy MA, Conjeevaram HS. Metabolic syndrome is associated with greater histologic severity, higher carbohydrate, andlower fat diet in patients with NAFLD. Am J Gastroenterol. 2006;101(10):2247-53 215. Hernaez R, Lazo M, Bonekamp S, Kamel I, Brancati FL, Guallar E., Clark J. M. Diagnostic accuracy and reliability of ultrasonography for the detection of fatty liver: A meta-analysis. Hepatology. 2011; 54: 1082–1090. 216. Eguchi Y, Eguchi T, Mizuta T, Ide Y, Yasutake T, Iwakiri R, Hisatomi A, Ozaki I, Yamamoto K, Kitajima Y, Kawaguchi Y, Kuroki S, Ono N. Visceral fat accumulation and insulin resistance are important factors in nonalcoholic fatty liver disease. J Gastroenterol. 2006;41(5):462-9. 217. Ghamar-Chehreh ME, Khedmat H, Amini M, Taheri S. Predictive factors for ultrasonographic grading of nonalcoholic Fatty liver disease. Hepat Mon. 2012; 12(11):e6860. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 172 218. Razavizade M, Jamali R, Arj A, Talari H. Serum parameters predict the severity of ultrasonographic findings in non-alcoholic fatty liver disease. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2012;11(5):513-20. 219. Shen HC, Zhao ZH, Hu YC, Chen YF, Tung TH. Relationship between obesity, metabolic syndrome, and nonalcoholic fatty liver disease in the elderly agricultural and fishing population of Taiwan. Clin Interv Aging. 2014; 9:501-8. 220. McPherson S, Anstee QM, Henderson E, Day CP, Burt AD. Are simple noninvasive scoring systems for fibrosis reliable in patients with NAFLD and normal ALT levels? Eur J Gastroenterol Hepatol 2013;25:652–658. 221. McPherson S, Hardy T, Henderson E, Burt AD, Day CP, Anstee QM. Evidence of NAFLD progression from steatosis to fibrosing steatohepatitis using paired biopsies: implicationsfor prognosis and clinical management. J Hepatol. 2015;62(5):1148-55. 222. Angulo P, Bugianesi E, Bjornsson ES, Charatcharoenwitthaya P, Mills PR, Barrera F, et al. Simple noninvasive systems predict long-term outcomes of patients with nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2013;145:e784 223. Sobhonslidsuk A, Jongjirasiri S, Thakkinstian A, Wisedopas N, Bunnag P, Puavilai G. Visceral fat and insulin resistance as predictors of non-alcoholic steatohepatitis. World J Gastroenterol. 2007;13(26):3614-8. 224. Wasfy EA, Elwan NM, Bayomi SL, El- Sheikh TF, El-yamani SA , Talha BE. Study of Risk Factors Involved in the Progression of Non Alcoholic Fatty Liver Disease in Egyptian Patients Journal of American Science, 2010;6(12). 588- 596 225. Bookman ID, Pham J, Guindi M, Heathcote EJ. Distinguishing nonalcoholic steatohepatitis from fatty liver: serum-free fatty acids, insulin resistance, and serumlipoproteins. Liver Int. 2006 Jun;26(5):566-71. 226. Fierbinteanu-Braticevici C, Dina I, Petrisor A, Tribus L, Negreanu L, Carstoiu C, Noninvasive investigations for non alcoholic fatty liver disease and liver fibrosis, World J Gastroenterol, 2010, 16(38):4784–4791. 227. Yilmaz Y, Dolar E, Ulukaya E, Akgoz S, Keskin M, Kiyici M, Aker S, Yilmaztepe A, Gurel S, Gulten M, Nak SG. Soluble forms of extracellular Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 173 cytokeratin 18 may differentiate simple steatosis from nonalcoholicsteatohepatitis. World J Gastroenterol. 2007;13(6):837-44. 228. Cao W, Zhao C, Shen C, Wang Y. Cytokeratin 18, alanine aminotransferase, platelets and triglycerides predict the presence of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 2013;8(12):e82092. 229. Dvorak K, Stritesky J, Petrtyl J, Vitek L, Sroubkova R, Lenicek M, Smid V, Haluzik M, Bruha R. Use of non-invasive parameters of non-alcoholic steatohepatitis and liver fibrosis in daily practice--an exploratory case-control study. PLoS One. 2014;9(10):e111551. 230. Shen J, Chan HL, Wong GL, Chan AW, Choi PC, Chan HY, Chim AM, Yeung DK, Yu J, Chu WC, Wong VW. Assessment of non-alcoholic fatty liver disease using serum total cell death and apoptosis markers. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(11-12):1057-66. 231. Chen J, Zhu Y, Zheng Q, Jiang J. Serum cytokeratin-18 in the diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis: A meta-analysis. Hepatol Res. 2014;44(8):854-62. 232. Yang ZH, Yang SX, Qin CZ, Chen YX. Clinical values of elevated serum cytokeratin-18 levels in hepatitis: a meta-analysis. Hepat Mon. 2015 ;15(5):e25328. 233. Diab DL, Yerian L, Schauer P, Kashyap SR, Lopez R, Hazen SL, et al. Cytokeratin 18 fragment levels as a noninvasive biomarker for nonalcoholic steatohepatitis in bariatric surgery patients. Clin Gastroenterol Hepatol 2008;6:1249–54. 234. Wagenknecht LE, Palmer ND, Bowden DW, Rotter JI, Norris JM, Ziegler J, Chen YD, Haffner S, Scherzinger A, Langefeld CD. Association of PNPLA3 with non-alcoholic fatty liver disease in a minority cohort: the Insulin Resistance Atherosclerosis Family Study. Liver Int 2011; 31: 412-416 235. He S, McPhaul C, Li JZ, Garuti R, Kinch L, Grishin NV, Cohen JC, Hobbs HH. A sequence variation (I148M) in PNPLA3 associated with nonalcoholic fatty liver disease disrupts triglyceride hydrolysis. J Biol Chem 2010; 285: 6706-6715 Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 174 236. Kumari M, Schoiswohl G, Chitraju C, et al. Adiponutrin functions as a nutritionally regulated lysophosphatidic Acid acyltransferase. Cell Metab 2012; 15: 691-702. 237. Pirazzi C, Adiels M, Burza MA, Mancina RM, Levin M, Ståhlman M, Taskinen MR, Orho-Melander M, Perman J, Pujia A, Andersson L, Maglio C, Montalcini T, Wiklund O, Borén J, Romeo S. Patatin-like phospholipase domain- containing 3 (PNPLA3) I148M (rs738409) affects hepatic VLDL secretion in humans and in vitro. J Hepatol 2012; 57: 1276-1282 238. Chen LZ, Xin YN, Geng N, Jiang M, Zhang DD, Xuan SY. PNPLA3 I148M variant in nonalcoholic fatty liver disease: Demographic and ethnic characteristics and the role of the variant in nonalcoholic fatty liver fibrosis. World J Gastroenterol 2015; 21(3): 794-802 239. Valenti L, Alisi A, Nobili V. I148M PNPLA3 variant and progressive liver disease: A new paradigm in hepatology. Hepatology 2012; 56: 1883-9. 240. Romeo S, Huang-Doran I, Baroni MG, Kotronen A. Unravelling the pathogenesis of fatty liver disease: patatin-like phospholipase domain-containing 3 protein. Curr Opin Lipidol 2010;21(3):247—52. 241. Rotman Y, Koh C, Zmuda JM, Kleiner DE, Liang TJ. The association of genetic variability in patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3) with histological severity of nonalcoholic fatty liver disease. HEPATOLOGY 2010;52:894-903. 242. Kotronen A, Johansson LE, Johansson LM, et al. A common variant in PNPLA3, which encodes adiponutrin, is associated with liver fat content in humans. Diabetologia 2009;52(6):1056—60. 243. Sookoian S, Castaño GO, Burgueño AL, Gianotti TF, Rosselli MS, Pirola CJ. A nonsynonymous gene variant in the adiponutrin gene is associated with nonalcoholic fatty liver disease severity. J Lipid Res. 2009;50(10):2111-6. 244. Petit JM, Guiu B, Masson D, et al. PNPLA3 polymorphism influences liver fibrosis in unselected patients with type 2 diabetes. Liver Int 2011;31(9):1332—6. Докторска теза Гордана Петровић, спец. др мед. 175 245. Romeo S, Sentinelli F, Dash S, et al. Morbid obesity exposes the association between PNPLA3 I148M (rs738409) and indices of hepatic injury in individuals of European descent. Int J Obes(Lond) 2010;34(1):190—4. 246. Valenti L, Alisi A, Galmozzi E, Bartuli A, Del MB, Alterio A, et al. I148M patatin-like phospholipase domain-containing 3 gene variant and severity of pediatric nonalcoholic fatty liver disease. HEPATOLOGY 2010;52:1274-1280. СКРАЋЕНИЦЕ AASLD Америчко удружење за проучавање болести јетре (енгл. American Association for The Study of Liver Diseases) ALP Алкална фосфатаза ALT Аланин аминотрансфераза apo B Аполипопротеин Б AST Аспартат аминотрансфераза ATP Аденозин трифосфат Bax Митохондријални протеин BMI Индекс телесне масе (енгл. body mass index) bp Базни парови CK-18 Цитокератин-18 CoA Koenzim A CRN Clinical Research Network CRP C реактивни протеин CT Компјутеризована томографија DBIL Директни билирубин DKP Дијастолни крвни притисак DM tip 2 Дијабетес мелитус тип 2 FIB Фибриноген GGT Гама-глутамил транспептидаза HCC Хепатоцелуларни карцином HDL Липопротеин високе густине (енгл. High Density Lipoprotein) HNE Хидроксиноненал HOL Холестерол HOMA-IR Хомеостатски модел инсулинске резистенције (енгл. Homeostasis Model Insulin Resistance Assessment Index) hs-CRP Високо сензитивни C реактивни протеин (engl. High sensitive-C reactive protein) Hus Хоунсфилдова јединица IDF Интернационална федерација за дијабетес (engl. International Diabetes Federation) IKK-β Инхибитор Нуклеарног фактора kappa B IL Интерлеукин INR Интернационални нормализован однос IP Интервал поузданости (engl. confindence interval) IR Инсулинска резистенција KVB Кардиоваскуларне болести LDL Липопротеин ниске густине (енгл. Low Density Lipoprotein) MDA Малондиалдехид MR Магнетна резонанца MRS Магнетно резонантна спектроскопија MS Метаболички синдром MTP Микрозомални трансфер протеин NAFL Неалкохолна масна јетра (енгл. Non-alcoholic Fatty Liver) NAFLD Неалкохолна масна болест јетре (енгл. Non-alcoholic Fatty Liver Disease) NAS NAFLD activity score NASH Неалкохолни стеатохепатитис (енгл. Non-alcoholic Steatohepatitis) NCEP-ATP III The National Cholesterol Educational Programm Adult Treatment Panel III NF-kB Нуклеарни фактор kappa B NHANES National Helth and Nutrition Examination Survey OR Однос шанси (енгл. Odds Ratio) OS Обим струка PCR Ланчана реакција полимеразе (енгл. Polymerase chain reaction) PNPLA3 Patatin like phospholipase domain conteining-3 PPAR γ Параксизомални пролиферативни активирани рецептор гама (енгл. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) SAD Сједињене Америчке Државе SKP Систолни крвни притисак SNP Полиморфизам једног нуклеотида (енгл. single nucleotide polymorphism) SREBP-1c Стерол регулаторни елемент везујући протеин-1c (енгл. Sterol regulatory element binding protein-1c) TE Транзијентна еластографија TG Триглицериди TGF β Трансформишући фактор раста бета TNF-α Фактор некрозе тумора алфа TR Тромбоцити TT Телесна тежина TV Телесна висина UBIL Укупни билирубин UZ Ултразвук VLDL Липопротеин врло ниске густине (енгл. Very Low Density Lipoprotein) vs. У односу на (енгл. versus) SZO Светска здравствена организација Биографија аутора Гордана Петровић, спец. др. мед. рођена је 1972. године у Лесковцу. Основну школу и гимназију "С. Вељковић-Зеле", Природно-математичког смера завршила је са одличним успехом и носилац је Вукове дипломе. Медицински факултет, Универзитета у Нишу завршила је 1999. године са просечном оценом 9,05 у току студија и оценом 10 на дипломском испиту. Дана 28.08.2000. године засновала је радни однос на неодређено време у "Клиничком центру Ниш" у Нишу. Стручни испит положила је 26.12.2000. године. Решењем директора Клиничког центра Ниш, дана 01.01.2001. године распоређена је у ОЈ Клиника за гастроентерологију и хепатологију. Специјалистички испит из Интерне медицине положила је 2007. године са одличном оценом. Школске 2008/2009. године уписала је докторске студије, одсек Клиничка медицина. Тема докторске дисертације под насловом ’’Клиничко-биохемијске карактеристике неалкохолне масне болести јетре као манифестације метаболичког синдрома’’ усвојена је уз сагласност Универзитета у Нишу 28.06.2012. године. Школске 2012. године уписала је субспецијалистичке студије област Гастроентерологија и хепатологија. Усмени субспецијалистички испит положила је 2014. године. Тема субспецијалистичког рада под насловом „Неинвазивни предиктори постојања и величине варикозитета једњака у пацијената са цирозом јетре’’ одобрена је одлуком Научно-наставног већа Медицинског факултета у Нишу јула 2014. године. Аутор је и коаутор већег броја стручних и научних радова. Учествовала је на симпозијумима и конгресима посвећеним разноврсној тематици у области гастроентерологије и хепатологије. Члан је Српског лекарског друштва, Удружења Интерниста Србије и Удружења гастроентеролога Србије. Влада енглеским језиком. Др Гордана Петровић живи у Нишу, са супругом Милошем, ћерком Миленом и сином Растком.