UNIVERZITET U BEOGRADU STOMATOLOŠKI FAKULTET Sanja D. Matić UTICAJ POLIMORFIZAMA GENA ZA INFLAMATORNE CITOKINE I NJIHOVE RECEPTORE NA NIVO CIRKULIŠUĆIH CITOKINA I KLINIČKE PARAMETRE KOD PACIJENATA SA HRONIČNOM PARODONTOPATIJOM I DIAJBETES MELITUSOM TIPA 2 doktorska disertacija Beograd, 2016 UNIVERSITY OF BELGRADE SCHOOL OF DENTAL MEDICINE Sanja D. Matić INFLUENCE OF POLYMORPHISM OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES AND RECEPTORS ON SERUM CYTOKINE LEVEL AND CLINICAL PARAMETERS OF CHRONIC PERIODONTITIS AND DIABETES MELLITUS TYPE 2 Doctoral Dissertation Belgrade, 2016 Mentori: Prof dr Ana Pucar vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu, Stomatološki fakultet Klinika za parodontologiju i oralnu medicinu Prof dr Jelena Milašin redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Stomatološki fakultet Institut za humanu genetiku Članovi komisije: Prof. dr Saša Čakić, redovni professor, Klinika za parodontologiju i oralnu medicinu, Stomatološki fakultet, Univerzitet u Beogradu Prof. dr Zoran Aleksić, vanredni profesor, Klinika za parodontologiju i oralnu medicinu, Stomatološki fakultet, Univerzitet u Beogradu Prof. dr Branka Popović, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu, Stomatološki fakultet Institut za humanu genetiku Prof Dr Nebojša Lalić, redovni profesor, Klinika za endokrinologiju i bolesti metabolizma, Kliničkog centra Srbije, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu Datum odbrane: ___________________ Uticaj polimorfizama gena za inflamatorne citokine i njihove receptore na nivo cirkulišućih citokina i kliničke parametre kod pacijenata sa hroničnom parodontopatijom i dijabetes melitusom tipa 2 Uvod: Hronična parodontopatija (PD) i tip 2 dijabetesa melitusa (T2D) su hronična, inflamatorna poligena oboljenja, koja dele zajedničke patogenetske mehanizme. Već 30 godina parodontopatija se smatra šestom komplikacijom T2D, ali je sve više dokaza o uticaju inflamacije iz parodoncijuma na pojavu i kliničku sliku dijabetesa. S obzirom da je genska podložnos bitna u nastanku i progresiji oba oboljenja, sve je veće interesovanje da se ispita da li su neke varijacije genoma odgovorne za zajedničku podložnost i dvosmernu povezanost ovih oboljenja. Faktor nekroze tumora (TNFα) igra ključnu ulogu u patogenezi oba oboljenja i objašnjava pomenutu dvosmernu povezanost. Blisko strukturalno, funkcionalno odnosno genski povezani sa TNFα su limfotoksin alfa (LTα), kao i njihovi receptori -TNFR1 i TNFR2. Ciljevi studije: S ozirom da polimorfizmi gena ovih molekula utiču na ekspresiju, funkciju ili oslobađanje solubilnih formi ovih citokina/receptora, zanimljivo je bilo ispitati da li polimorfizam na ovim molekulima mogu uticati na rizik za oboljevanje od PD i/ili T2D. Takođe, ciljevi ove studije bili su ispitivanje uticaja kliničkih parodontoloških parametara (inflamacije iz parodoncijuma) ili polimorfizama (-308G/A TNFα, +252A/G LTα, +36A/G TNFR1 i +676T/G TNFR2) na sistemski nivo pomenutih molekula. Ispitanici, materijal i metode: Ispitanici (N=180) su raspoređeni u tri grupe: sistemski zdravi ispitanci bez kliničkih znakova PD (ZK grupa), sistemski zdravi ispitanici sa dijagnostikovanom PD (PD grupa) i ispitanici sa dijagnostikovanim T2D i PD (T2D grupa). Kliničkim pregledom parodoncijuma praćeni su plak indeks Silness-Loe (PI), krvarenja na provokaciju (KNP), dubina sondiranja (DS) i nivo pripojnog epitela (NPE). Uticaj inflamiranog parodoncijuma na sistemski nivo citokina kvantifikovan je PESA i PISA parametrima. Detekcija polimorfizama vršena RFLP-PCR metodom iz DNK izolovanih iz briseva bukalne sluzokože. Koncentracija ispitivanih molekula određivana je ELISA metodom. Pratili smo i uticaj bihejvioralnih faktora na kliničke parametre oboljenja i na sistemski nivo citokina putem regresionih modela. Rezultati: Polimorfizam -308G/A TNFα nije se izdvojio kao faktor rizika za oboljevanje od PD ili T2D. AA genotip (OR=0,173, CI=0,036-0,837, p=0,022) i alel A (OR=0,563, CI=0,334-0,936, p=0,029) ovog polimorfizma pokazao je protektivan efekat za oboljevanje od PD i T2D u odnosu na PD. AG genotip (OR=2,75, CI=1,184- 6,380, p=0,019) i alel G (OR=1,824, CI=1,047-3,176, p=0,032) +252A/G LTα polimorfizma izdvojili su se kao nosioci povećanog rizika za oboljevanje od PD. Nasuprot, AG (OR=0,261, CI=0,105-0,647, p=0,003) i GG genotip (OR=0,215, CI=0,084-0,547, p=0,000) ovog polimorfizma pokazali su protektivan efekat pri poređenju PD sa T2D grupom. Kod sistemski zdravih ispitanika, AA genotip +36A/G TNFR1 jedinstveno je predviđao varijanse promenljivih DS (8,9%) i NPE (5,9%). Ovaj genotip izdvojio se kao protektivan pri poređenju PD sa T2D grupom (OR=0,616, CI=0,384-0,991, p=0,046). TT genotip +676T/G TNFR2 polimorfizma pokazao je povećan rizik za oboljevanje od PD (OR=2,302, CI=1,075-4,926, p=0,031). Serumska koncentracija ispitivanih citokina/receptora nije bila pod uticajem pomenutih polimorfizama na našem uzorku. Koncentracija TNFR1 bila je značajno veća kod ispitanika T2D grupe u odnosu na druge dve grupe. Korelacije TNFα, LTα sa određenim kliničkim parodontološkim parametarima bile su pozitivne, dok je korelacija TNFR2 i parametara u PD grupi bila negativna, a u T2D grupi pozitivna. Zaključci: Nosioci G alela +252A/G LTα polimorfizma, kao i TT genotipa +676T/G TNFR2 pokazuju veći rizik za oboljevanje od PD. Na ovom uyorku nismo pokazali zajedničku gensku podložnost za pojavu oba oboljenja. U našoj studiji, kod sistemski zdravih ispitanika, parametric destrukcije parodoncijuma mogu biti pod malim uticajem genske osnove (AA genotip TNFR1), dok su ove promene kod obolelih od dijabetesa povezane sa parametrime higijene. Ovo navodi na razmišljanje da parodontopatija, odnosno stepen destrukcije parodoncijuma kod sistemski zdravih ispitanika može biti pod uticajem genski determinisan, dok je ova destrukcija kod ispitanika sa dijabetesom posledica patoloških promena tkiva kao posledica prisustva samog dijabetesa, bez obzira na gensku osnovu. Sinteza sTNFR2 i korelacija sa kliničkim parodontološkim parametrima u dijabetesu su izmenjeni u odnosu na sistemski zdrave ispitanike. Ključne reči: Hronična parodontopatija, Tip 2 dijabetesa, polimorfizmi, TNFα, LTα, TNFR1, TNFR2, PCR-RFLP, ELISA, genska podložnost Naučna oblast: Stomatologija Uža naučna oblast: Parodontalna medicina Influence of polymorphism of proinflammatory cytokines and receptors on serum cytokine level and clinical parameters of chronic periodontitis and diabetes mellitus type 2 Introduction: Chronic periodontitis (CP) and Type 2 Diabetes (T2D) are two common chronic inflammatory diseases. Although of different origin, they share some pathogenetic mechanisms. CP has been considered as the sixth complication of T2D for 30 years now, but also there is increasing evidence about the influence of inflammation from periodontium on T2D onset and progression. According that both diseases are polygenic and genetic susceptibility for CP or T2D is widely studied, it would be useful to explore if some genetic variations are responsible for cross-susceptibility or bidirectional relationship of mentioned diseases. Tumor Necrosis Factor (TNFα) plays key role in pathogenesis of both diseases and could explain their bidirectional relationship. TNFα is structurally, functionally or genetically related with Lymphotoxin alpha (LTα) and their receptors TNFR1 and TNFR2. Aims: According that Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) on genes for mentioned molecules regulates their expression, function or cleavage, it would be interesting to explore if SNPs of TNFα and its related molecules may be responsible for susceptibility for CP and/or T2D. Further, the aims of this study were to study if serum levels of TNFα, LTα, TNFR1 and TNFR2 are influenced by clinical periodontal parameters (inflammation from periodontium) or SNPs (-308G/A TNFα, +252A/G LTα, +36A/G TNFR1 and +676T/G TNFR2). Subjects, Materials and Methods: This study of association included 180 subjects divided into three groups: systematically health subjects without CP (HC group), systematically health subjects with CP (PD group) and patients with diagnosed CP and T2D (T2D group). Plaque Index (PI), Bleeding on Probing (BOP), Probing Pocket Depth (PPD) and Clinical Attachment Level (CAL) were measured at six points of each tooth except third molars. Impact of inflammation from periodontium on circulating levels were measured by Periodontal Epithelial, Surface Area (PESA) and Periodontal Inflamed Surface Area (PISA) parameters. SNPs were detected using Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) from DNA isolated from buccal epithelial cells. Serum concentrations of TNFα, LTα, TNFR1 and TNFR2 were measured by ELISA method. Impact of behavioral characetistic on clinical parameters and serum concentrations of cytokines were measured. Results: -308G/A TNFα SNP did not show risk effect for PD or T2D. AA genotype (OR=0.173, CI=0.036-0,837, p=0.022) and allele A (OR=0.563, CI=0.334-0.936, p=0.029) of this SNP showed protective effect for PD and T2D together in comparison with PD only. AG genotype (OR=2.75, CI=1.184-6.380, p=0.019) and allele G (OR=1.824, CI=1.047-3.176, p=0.032) of +252A/G LTα SNP showed risk effect for PD. On contrary, AG (OR=0.261, CI=0.105-0.647, p=0.003) and GG genotypes (OR=0.215, CI=0.084-0.547, p=0.000) were protective for having both PD and T2D in comparison to PD. AA genotype of +36A/G TNFR1 SNP predicted variances of PPD (8.9%) and CAL (5.9%) at systematically health subjects. This genotype was protective when comparing PD vs. T2D groups (OR=0.616, CI=0.384-0.991, p=0.046). TT genotype of +676T/G TNFR2 SNP showed risk effect for PD (OR=2.302, CI=1.075- 4.926, p=0.031). Serum concentrations of examined molecules were not influenced by SNPs. TNFR1 concentration was higher at T2D group. TNFα and LTα correlated positively with some of the clinical periodontal parameters. At systematically healthy periodontitis patients, correlations of TNFR2 and clinical periodontal parameters were negative, while at diabetics they were positive. Conclusions: Carriers of allele G +252A/G LTα SNP and TT genotype of +676T/G TNFR2 SNP are at higher risk for PD. In this study, similar genetic susceptibility for PD and PD and T2D both were not presented. At systematically healthy periodontitis patients, clinical periodontal parameters were influenced by genetic variations (presence of AA genotype of +36A/G TNFR1), while at diabetics they were influenced by oral hygiene parameters. This may lead to assumption that periodontal destruction at systematically healthy subject are genetically determined, while this destruction at diabetics are consequence of pathological changes in periodontium as result of diabetes, regardless of the genetic variations. Correlations and synthesis of TNFR2 at diabetic are changed compared to systematically healthy subjects with PD. Key words: Chronic Periodontitis, Type 2 Diabetes, SNP, TNFα, LTα, TNFR1, TNFR2, PCR-RFLP, ELISA, genetic susceptibility Scientific field: Dentistry Specific Scientific Field: Periodontal medicine 1. UVOD .......................................................................................................................... 1 1.1.DEFINICIJA I EPIDEMIOLOGIJA PARODONTOPATIJE ................................................... 1 1.1.1.Karakteristike parodontopatije ....................................................................... 1 1.2.ETIOLOGIJA PARODONTOPATIJE ............................................................................... 2 1.2.1.Dentalni biofilm i teorije etiologije parodontopatije ...................................... 2 1.2.2.Akcesorni faktori, modifikujući faktori i faktori rizika parodontopatija ......... 5 1.3.PATOGENEZA PARODONTOPATIJE ............................................................................ 6 1.3.1.Mehanizmi koštane resorpcije u patogenezi parodontopatije- M-CSF i RANK/RANKL/OPG sistem ...................................................................................... 8 1.3.1.1.Makrofagni kolonostimulišući faktor (M-CSF) ....................................... 8 1.3.1.2.RANK/RANKL/OPG sistem .................................................................... 9 1.3.2.MMP/TIMP sistem ........................................................................................... 9 1.4.DIJABETES MELITUS ............................................................................................... 10 1.5.TIP 2 DIJABETESA ................................................................................................... 11 1.5.1.Etiologija T2D ............................................................................................... 11 1.5.2.Patogeneza T2D ............................................................................................ 12 1.5.3.Komplikacije T2D .......................................................................................... 13 1.6.DVOSMERNA VEZA PARODONTOPATIJE I DIJABETESA ............................................ 13 1.6.1. Uticaj dijabetesa na stanje usne duplje i parodontalnih tkiva ..................... 13 1.6.1.Gingivitisi i parodontopatije ...................................................................... 14 1.6.2.Uticaj inflamacije iz parodoncijuma na glikoregulaciju- parodontalna medicina ................................................................................................................. 15 1.6.2.1.Longitudinalne (kohortne) studije .......................................................... 17 1.6.2.2.Intervencione studije .............................................................................. 18 1.7.PATOGENETSKE SLIČNOSTI DM I PDP ...................................................................... 19 1.7.1.Genski mehanizmi .......................................................................................... 19 1.7.2.Imunološki mehanizmi ................................................................................... 19 1.7.3.TNFα kao potencijalni citokin koji objašnjava dvosmernu vezu parodontopatije i dijabetesa ................................................................................... 21 1.8.INTERLEUKINI (CITOKINI) ...................................................................................... 21 1.8.1.TNF alfa/TNF receptor (TNF/TNFR) familija citokina ................................ 22 1.8.1.1.Faktor nekroze tumora- TNFα ................................................................ 22 1.8.1.2.Limfotoksin α (LTα) ............................................................................... 25 1.8.1.3.Receptori TNFR1 i TNFR2 ..................................................................... 25 1.8.1.4.Uloga TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2 u patogenezi dijabetesa ................ 29 1.8.1.5.Uloga TNF/TNFR u patogenezi parodontopatije ................................... 31 1.9.POLIMORFIZMI ....................................................................................................... 33 1.9.1.Polimorfizam u genu za TNFα (-308G/A, rs1800629) .................................. 35 1.9.2.Polimorfizam LTα+252A/G (rs909253) ........................................................ 37 1.9.3.Polimorfizam na genu za TNFR1 (+36A/G, rs767455) ................................. 38 1.9.4.Polimorfizam TNFR2 (rs1061622) ................................................................ 39 2. POLAZNA HIPOTEZA I CILJEVI STUDIJE ..................................................... 40 3. ISPITANICI, MATERIJAL I METODE ............................................................... 42 3.1. PODACI O STUDIJI .................................................................................................. 42 3.2.ISPITANICI .............................................................................................................. 42 3.2.1. Kriterijumi isključivanja iz studije ............................................................... 43 3.3. ANAMNEZA, ISTRAŽIVAČKI KARTON ..................................................................... 43 3.4.BIOHEMIJSKI I PARAMETRI KRVNE SLIKE ............................................................... 44 3.5.KLINIČKI PREGLED I DIJAGNOZA HRONIČNE PARODONTOPATIJE ............................ 45 3.6.POSTAVLJANJE DIJAGNOZE DIJABETESA MELITUSA TIPA 2 ..................................... 47 3.7.UZORKOVANJE ...................................................................................................... 48 3.8.ANALIZA POLIMORFIZAMA .................................................................................... 48 3.8.1.Izolacija DNK iz brisa bukalne sluzokože ..................................................... 48 3.8.2. Lančana reakcija polimeraze-PCR .............................................................. 49 3.8.3. Provera PCR produkata elektroforezom na 8% poliakrilamidnom gelu (PAGE) ................................................................................................................... 50 3.8.4. Restrikciona digestija PCR produkata i analiza dužine restrikcionih fragmenata (RFLP) (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) ...................... 52 3.8.5. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-alpha, LT alfa, TNFR1 i TNFR2 ..................................................................................................................... 52 3.8.6. RFLP u analizi polimorfizama za TNF alfa, LT alfa, TNFR1 i TNFR2 ........ 55 3.9. ELISA-ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ............................................ 57 3.9.1. Korišćeni komercijalni ELISA setovi za analizu koncentracije citokina ...... 58 3.10. STATISTIČKA OBRADA PODATAKA ...................................................................... 58 4.0 REZULTATI ........................................................................................................... 60 4.1.DEMOGRAFSKI PODACI ISPITANIKA ........................................................................ 60 4.2.KLINIČKI PARODONTOLOŠKI PARAMETRI ............................................................... 62 4.3.PODACI O TIPU 2 DIJABETESA ................................................................................. 68 4.4.KRVNA SLIKA I BIOHEMIJSKE ANALIZE .................................................................. 68 4.5.ANALIZA BIOHEMIJSKIH REZULTATA U ODNOSU NA KLINIČKE PARAMETRE PARODONTOPATIJE ...................................................................................................... 70 4.6.ANALIZA GENETIČKIH REZULTATA ........................................................................ 70 4.6.1.Odstupanje od Hardy-Weinberg-ovog ekvilibrijuma .................................... 70 4.6.2.Analiza polimorfizama u genu za TNFα (-308G/A TNFα, rs1800629) ......... 71 4.6.3Analiza polimorfizma u genu za LTα (+252G/A LTα, rs909253) ................. 74 4.6.4.Analiza polimorfizma u genu za TNFR1 (+36G/A TNFR1, rs767455) ......... 76 4.6.5.Analiza polimorfizma u genu za TNFR2 (+676 T/G ZNFR2, rs1061622) ..... 78 4.6.6.Analiza genetičkih rezultata i kliničkih parametara parodontopatije ........... 80 4.6.7.Povezanost polimorfizama sa karakteristikama tipa 2 dijabetesa ................ 80 4.7.ANALIZA BIOHEMIJSKIH REZULTATA ..................................................................... 81 4.7.1.Serumske koncentracije TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2 ................................... 81 4.7.2.Koncentracije citokina u odnosu na ispitivane parametre i karakteristike oboljenja ................................................................................................................. 83 4.8.ANALIZA BIOHEMIJSKIH I GENETIČKIH REZULTATA- POVEZANOSTI POLIMORFIZAMA I SERUMSKIH KONCENTRACIJA CITOKINA/RECEPTORA ................................................. 87 4.9.ODREĐIVANJE UTICAJA ISPITIVANIH PARAMETARA NA KLINIČKE PARAMETRE PARODONTOPATIJE (DS I NPE) KOD ISPITANIKA PD I T2D GRUPE- VIŠESTRUKA LINEARNA REGRESIJA................................................................................................... 90 4.9.1.Rezultati višestruke linearne regresije za dubinu sondiranja u grupi obolelih od parodontopatije ................................................................................................. 90 4.9.2.Rezultati višestruke linearne regresije za nivo pripojnog epitela u grupi obolelih od parodontopatije ................................................................................... 91 4.9.3.Rezultati višestruke linearne regresije za dubinu sondiranja u grupi obolelih od dijabetesa i parodontopatije .............................................................................. 91 4.9.4.Rezultati višestruke linearne regresije za nivo pripojnog epitela u grupi obolelih od dijabetesa i parodontopatije ................................................................ 92 4.10.ODREĐIVANJE UTICAJA ISPITIVANIH PARAMETARA NA SERUMSKE KONCENTRACIJE ISPITIVANIH CITOKINA I RECEPTORA-VIŠESTRUKA LINEARNA REGRESIONA ANALIZA .. 92 4.10.1Rezultati višestruke regresione analize na serumski nivo TNFα .................. 93 4.10.2Rezultati višestruke regresione analize za serumski nivo LTα ..................... 93 4.10.3Rezultati višestruke regresione analize za serumski nivo TNFR1 ................ 93 4.10.4Rezultati višestruke regresione analize na serumski nivo TNFR2 ................ 94 4.11.UNIVARIJANTNA I MULTIVARIJANTNA REGRESIONA ANALIZA U PREDIKCIJI NASTANKA PARODONTOPATIJE I PARODONTOPATIJE I DIJABETESA .............................. 95 4.11.1.Rezultati regresionih analiza u predikciji nastanka parodontopatije ......... 95 4.11.2.Rezultati regresionih analiza u predikciji nastanka parodontopatije i dijabetesa ................................................................................................................ 96 4.11.3.Rezultati regresionih analiza u predikciji nastanka parodontopatije i dijabetesa u odnosu na ispitanike sa dijabetesom .................................................. 97 4.12.ANALIZA NERAVNOTEŽE POVEZANOSTI (LD) ...................................................... 98 5.0. DISKUSIJA .......................................................................................................... 101 6.0.Zaključci ................................................................................................................ 125 7.0.literatura ................................................................................................................ 127 UVOD 1 1. UVOD 1.1.Definicija i epidemiologija parodontopatije Oboljenja parodoncijuma predstavljaju heterogenu grupu oboljenja, a najčešće podrazumevaju zajednički termin za gingivitise i parodontopatije, zapaljenska stanja potpornog aparata zuba koja nastaju kao odgovor domaćina na prisutvo bakterija na površini zuba i desni [1]. Gingivitis predstavlja najblažu formu inflamatornih oboljenja parodoncijuma u kojem je proces inflamacije, reverzibilne prirode, ograničen na desni. Parodontopatija predstavlja ireverzibilno oboljenje kod kojeg se inflamacija širi u dublja parodontalna tkiva [2]. Epidemiološki podaci u literaturi se veoma razliku, s obzirom na nekonzistentne kriterijume definisanja i dijagnostikovanja samog oboljenja. Na našem području se rasprostranjenošću parodontopatije bavila „Beogradska studija“ u kojoj je pokazano da 84,6% ispitanika starijih od 18 godina pokazuje znake destrukcije potpornih tkiva zuba. Pri tome, čak 44,8% njih pokazuje oštećenja dubljih tkiva parodoncijuma [3]. Klasifikacija oboljenja parodoncijuma revidirana je 1999. godine. Najčešća forma parodontopatije je hronična parodontopatija o kojoj će i biti reči u ovoj disertaciji, i koja će, jednostavnosti radi, biti označena samo kao „parodontopatija“. 1.1.1.Karakteristike parodontopatije Kao što je rečeno, parodontopatije su heterogena grupa oboljenja. Klinička slika varira i u okviru jednog istog oboljenjao a takođe i kod istog pacijenta zavisno od faze same bolesti. Parodontopatija ima cikličan tok, periodi remisije i relapsa se smenjuju. Simptomi koje najčešće srećemo su inflamacija, apikalna migracija desni i stvaranje parodontalnih džepova (patognomoničan znak parodontopatije). U samom džepu nailazimo na konkremente, a može biti prisutna i supuracija iz džepa. U uznapredovalim fazama parodontopatije, klinički registrujemo labavljenje i patološku migraciju zuba. Prisustvo inflamacije i supuracije nam govori u prilog trenutnog stanja, aktivnosti oboljenja, dok su destrukcija kosti, dubina sondiranja i apikalna migracija desni kumulativne mere oboljenja iz prošlosti [4]. UVOD 2 1.2.Etiologija parodontopatije Usnu duplju naseljava oko 1000 različitih mikroorganizama [5] uključujući bakterije, gljivice, viruse, protozoe i arhea. Kao većina mikroorganizama u prirodi, ne nalaze se u planktonskom obliku nego organizovani u biofilmove. Veliki deo mikroorganizama usne duplje još uvek nije kultivisan. Prihvaćena teorija je da su glavni etiološki faktor parodontopatije bakterije dentalnog plaka, mada se u poslednje vreme sve više govori o prisustvu i potencijalnim ulogama virusa [6], gljivica [7] i arhea. 1.2.1.Dentalni biofilm i teorije etiologije parodontopatije Dentalni plak odnosno biofilm definiše se kao zajednica različitih mikroorganizama (mikrokolonija) koja su po tačno određenom sistemu ugrađena u matriks polimera salivarnog i sopstvenog porekla [8]. Biofilm predstavlja veoma dinamičnu strukturu složene građe. Stvara se prirodno na zubima i čini deo odbrambenog sistema organizma [9]. U odnosu na lokaciju na ivicu gingive, razlikujemo supragingivalni i subgingivalni dentalni biofilm. Mikrobiološki sastav ova dva biofilma se veoma razlikuje, a kada se govori o etiologiji parodontopatija, misli se na subgingivalni dentalni plak. Proces formiranja dentalnog plaka dešava se po tačno utvrđenom redosledu. Nakon formiranja pelikule sastavljene od organskih supstanci iz pljuvačke dolazi do kolonizacije primarnim (Streptococci spp, Actinomyces spp, Capnocytophaga spp, Eikenella spp, Haemophilus spp, Veillonella spp.), a zatim i sekundarnim (Fusobacterium nuclaetum, Treponema spp, P. Gingivalis spp, Aggregatibacter actinomycetemcomitans) mikroorganizmima [10]. Ono što povećava patogenost dentalnog biofilma nije samo raznovrsnost mikroorganizama već i njihova međusobna komunikacija. Veoma važnu ulogu u formiranju dentalnog biofilma igra i Fusobacterium nucleatum koji komunicirajući sa primarnim i sekundarnim mikroorganizmima predstavlja svojevrstan most između ove dve grupe bakterija. Iako je dentalni biofilm oduvek smatran glavnim etiološkim faktorom patogeneze parodontopatije, same teorije delovanja mikroorganizama dentalnog plaka su se vremenom menjale. Kasnih 50ih godina prošlog veka bila je zastupljena nespecifična teorija dejstva dentalnog plaka, koja je tvrdila da bilo koje bakterije u dovoljnom broju produkcijom metabolita mogu dovesti do destrukcije parodoncijuma [11]. Ovu teoriju je kasnih 70ih godina prošlog veka zamenila specifična teorija po kojoj je parodontopatija UVOD 3 rezultat umnožavanja i delovanja određenih specifičnih patogenih vrsta. Socranski i saradnici su izučavali mikroorganizme subgingivalnog plaka i svrstali ih u asocijacije prema osobinama, dinamici kolonizacije i faktorima virulencije [12]. Pomenute asocijacije mikroorganizama su obeležene bojama (Slika 1.1) a pripadnicima crvenog i narandžastog kompleksa pripisuje se najveća patogenost (gram negativni i anaerobni mikroorganizmi, tradicionalno označeni kao periopatogeni (Bacteroides forsythus, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Peptostreptococcus micros)). Slika 1.1: Šematski prikaz odnosa mikroorganizama unutar kompleksa i međusobni odnos samih asocijacija [8, 12]. Bazu piramide čine primarni kolonizatori, narandžasti kompleks čine bakterije čiji se broj povećava vremenom i predstavljaju most između pionira i patogenih bakterija crvenog kompleksa odgovornih za maturaciju biofilma. Iako je ova podela bakterija biofilma je u mnogim naučnim krugovima aktuelna i danas, savremene metode kultivisanja mikroorganizama su dovele do nekih saznanja koja su oprečna sa prethodno iznetim. Tako npr, bakterije crvenog kompleksa- tradicionalni periopatogeni su identifikovani i kod pacijenata sa klinički zdravim parodoncijumom. UVOD 4 Takođe, mikrobiološki sastav usne duplje je mnogo raznovrsniji nego što se mislilo i neke nove vrste mikroorganizama su pokazale iste ili čak bolje korelacije sa oboljenjem parodoncijuma od pomenutih mikroorganizama. Shodno iznetim saznanjima, dogma o gram negativnim mikrooranizmima kao etiološkim faktorima parodontopatije se menja, i isto tako bitno mesto u etiologiji počinju da zauzimaju i gram pozitivni anaerobni organizmi (Prevotella, Megasphaera, Selemonas, Desulfobulbus, Dialister i Synergistetes [13]). Najnovija teorija etiologije parodontopatije mogla bi se definisati kao polimikrobna sinergija i disbioza flore usne duplje [13]. Po ovoj teoriji, uzrok parodontopatije je sinergizam i komunikacija među bakterijama dentalnog biofilma. Mnogobrojne studije su pokazale sofisticiranu komunikaciju među bakterijama biofilma, definisanu kao fizičku, metaboličku, komunikaciju malim signalnim molekulima i razmenu genetičkog materijala [10]. Međubakterijska komunikacija u biofilmu za posledicu ima povećanje šansi za njihovo preživaljanaje u okviru zajednice. Klinički, kao posledica dolazi do povećanja otpornosti mikroorganizama biofilma na antimikrobne lekove. Osim sinergizma, u okviru biofilma prisutna je i kompeticija među mikroorganizmima, npr putem sinteze baktericina (Slika 1.2) Kao što je rečeno, poslednja teorija (sinergizma i disbioze) ne priznaje isključivo tradicionanle periopatogene kao jedine etiološke faktore parodontopatije. Po ovoj teoriji, raznovrsne kombinacije mikroorganizama stvaraju floru koja dovodi do oboljenja. S druge strane, ova teorija daje posebnu ulogu tzv “ključnim periopatogenima“. „Ključni patogeni“ će svojim prisustvom modifikovati komensalnu floru, odnosno „dirigovati“ florom i povećati patogenost celog biofilma, tačnije omogućiti drugim bakterijama da ispolje svoje štetne efekte Na ovaj način dolazi do narušavanja homeostaze između mikroorganizama biofilma i tkiva i svoje štetno dejstvo ispoljavaju disbionti- normalno nepatogene bakterije koje u uslovima narušene homeostaze postaju patogene. UVOD 5 Slika 1.2: šematski prikaz interkacija među bakterijama biofilma. Isprekidane linije označavaju sinergizam, dok neisprekidane linije označavaju inhibiciju među mikroorganizmima. 1.2.2.Akcesorni faktori, modifikujući faktori i faktori rizika parodontopatija Osim dentalnog plaka koji se smatra glavnim etiološkim faktorom parodontopatije, na nastanak, progresiju oboljenja i odgovor na terapiju znatno utiču akcesorni faktori, odnosno faktori rizika parodontopatije. Ovi faktori pomažu akumulaciju plaka/otežavaju njegovo uklanjanje ili olakšavaju dejstvo mikroorganizama. Definisani su kao lokalni i opšti. Lokalnim akcesornim faktorima smatraju se druge naslage na zubima, impakcije hrane, loši ispuni i protetski radovi, traumatska okluzija, anatomska odstupanja mekih i tvrdih tkiva parodoncijuma. Opšti akcesorni faktori- faktori rizika odnose se na neka oboljenja, ali i na bihejvioralne i faktore okoline. Dva faktora kojima se najviše pridaje značaj su dijabetes melitus i pušenje cigareta. Dokazan je uticaj duvanskog dima na sastav flore, dozno zavisna korelacija konzumacije duvana i gubitka parodontalne kosti (4x veći gubitak kosti nego kod nepušača), lošiji odgovor domaćina na terapeutkse procedure (zarastanje, regeneracija kosti, lošiji pripoj fibroblasta za koren zuba). Takođe dokazan je direktan efekat duvanskog dima na smanjenu funkciju neutrofila i smanjenje funkcije T i B limfocita [14]. U poslednje vreme sve je više istraživanja povezanih sa gojaznošću [15], fizičkim [16], a naročito mentalnim stresom i parodontopatijom. Stres putem UVOD 6 neuroendokrinog sistema deluje na imuni sistem i danas se zna da imunološki disbalans izazvan na ovaj način može biti u vidu umanjenog, ali i preterano povećanog imunološkog odgovora [17]. Unos raznih mikronutrijenata (vitamin C, E, folna kiselina, melatonin) [18, 19], kafe [20], vitamina D [21], zatim pol (muškarci) [22] i godine su takođe neki od faktora koji se pozitivno ili negativno povezuju sa hroničnom parodontopatijom. Zanimljivo je međutim da pacijenti sličnog zdravstvenog stanja, higijene i lokalnih akcesornih faktora mogu da imaju različite kliničke slike i različit odgovor na terapiju parodontopatije. Kod ovih pacijenta se govori o naslednoj podložnosti kao faktoru rizika, koja je za sada objašnjenja kroz postojanje polimorfizama u genima za određene citokine i njihove receptore. 1.3.Patogeneza parodontopatije Mnogi aspekti parodontopatije nisu još uvek objašnjeni ni najnovijim teorijama etiologije ovog oboljenja. Osim etiološkog faktora- mikroorganizama sigurno da je neophodan i podložan domaćin. I dalje ostaje pitanje zašto neki pacijenti kod kojih su detektovani tzv. ključni patogeni mogu da kontrolišu inflamaciju, dok kod drugih dolazi do narušavanja balansa biofilm-domaćin. Dobro je poznata činjenica da destruktivni procesi u parodoncijumu nisu posledica isključivo štetnih noksi koje produkuju same bakterije dentalnog biofilma nego su većim delom posledica dejstva supstanci koje sekretuje sam imuni sistem domaćina kao odgovor na prisustvo bakterija. Sam parodoncijum predstavlja strukturu jedinstvene anatomije- na tvrdo zubno tkivo koje je uvek prekriveno dentalnim plakom pripajaju se epitelne ćelije. Zahvaljujući stalnom prisustvu mikroorganizama, u pardoncijumu je pristuna stalna tzv. „fiziološka, kontrolisana inflamacija“ odnosno konstantna migracija leukocita (uglavnom fagocita) iz krvnih sudova u blizini. Urođeni imunitet (neutrofili i makrofagi) prepoznaje i reaguje na sve mikroorganizme u usnoj duplji (komensale i patogene). U slučaju parodoncijuma, komensali stimulišu konstantnu proizvodnju malih nivoa citokina neophodnih za održavanje primarnog imuniteta i održavanje integriteta tkiva [23]. U odbrani organizma od patogena učestvuju urođeni (primarni) i stečeni (sekundarni) imunitet koji komuniciraju putem veoma kompleksne i još uvek in vivo neistražene mreže citokina. UVOD 7 Rana faza odgovora urođenog imuniteta karakteriše se pojačanom sekrecijom citokina (TNFα, IL-1β, IL-17), koja će sa jedne strane voditi tkivnim promenama- vaskularnim, daljoj aktivaciji i migraciji neutrofila, i na kraju aktivaciji osteoklasta, a sa druge će dovesti do aktivacije antigen prezentujućih ćelija (APĆ) i aktiviranja specifičnog imuniteta [24]. Najvažniju ulogu u primarnom imunitetu u patogenezi parodontopatije imaju neutrofili. Pomalo je neuobičajeno da u jednom hroničnom oboljenju glavnu ulogu imaju ćelije koje su karakteristika akutnih infekcija, ali ova činjenica ide u prilog teoriji da parodontopatija predstavlja konstantan patološki proces smenjivanja relapsa (akutnih insulta) i remisija. Neutrofili uzrokuju destrukciju parodoncijuma oslobađanjem enzima (matriksne metaloproteinaze -MMP-), citotoksičnih supstanci (slobodni radikali, reaktivne kiseoničke i azotne vrste) i ekspresijom membranskih RANKL (Receptor aktivatora nuklearnog faktora β). Takođe, neutrofili indirektno učestvuju u destrukciji parodoncijuma i putem regrutacije Th17 ćelija. Tkivni makrofagi i dendritične ćelije predstavljaju glavne antigen prezentujuće ćelije. Epitelne ćelije, osim što predstavljaju fizičku barijeru, kao odgovor na prisustvo bakterija proizvode povećanu količinu citokina i eksprimiraju athezione molekule. Tkivni fibroblasti takođe produkuju povećanu količinu citokina i pojačavaju inflamatorni odgovor u parodoncijumu [23]. Pojačana sinteza citokina nije rezultat samo odgovora na prisustvo bakterija već i raspadnih produkata samog tkiva, što govori u prilog da je etiološki parodontopatija mikrobno i autoimuno oboljenje. Na ovaj način ulazi se u krug pozitivne povratne sprege stimulacije citokina. Ulogu u specifičnom imunitetu imaju T i manje B ćelije. Do skoro, ceo koncept patogeneze parodontopatije sa aspekta specifičnog imuniteta bio je objašnjen odnosom Th1 i Th2 ćelija. Smatrano je da u fazama remisije dominiraju Th1, dok su sa fazama progresije oboljenja povezivane Th2 ćelije. Kasnija istraživanja su pokazala sposobonst Th1 ćelija da eksprimira RANKL [25], kao i Th2 ćelija da putem sekrecije IL-4 i IL-13 inhibiraju osteoklastogenezu [26]. Otkriće Th17 i T regulatornih (T reg) ćelija, dodatno je objasnilo ulogu specifičnog imuniteta u patogenezi parodontopatije. Th17 ćelije čvrsto su povezane sa osteoklasnom aktivnošću. Citokin koji produkuju ove ćelije, Il- 17, indukuje ekspresiju MMP-a u fibroblastima, endotelnim i epitelnim ćelijama kao i ekspresiju RANKL-a na osteoblastima. Na ovaj način učestvuju u degradaciji mekih i UVOD 8 koštanih parodontalnih tkiva. Takođe, dokazana je uloga Th17 ćelija u aktivaciji B ćelija. Za razliku od Th1 i Th2 ćelije, koje su relativno fenotipski stabilne, ostale T ćelije pod određenim uticajem kombinacije citokina ispoljavaju funkcionalnu plastičnost. Tako npr. Th17 ćelije se mogu funckionalno transformisati u Th1 ćelije ili u Th2 ćelije. Isto tako, T reg ćelije u inflamiranom parodoncijumu mogu postati IL-17 sekretujuće ćelije. Glavnu ulogu u diferencijaciji, funkciji i održavanju T ćelija imaju citokini organizovani u kompleksnu mrežu. Do sada je dokazana najbitnije uloga IL-1β, TNFα, IL-6 i RANKL-a u patogenezi parodontopatije (Tabela 1.1). Uloga imunološkog sistema prepoznata je i u koštanom metabolizmu. S toga se danas razvila čitava grana koja proučava vezu imunološkog sistema i koštanog metabolizma, tzv. osteoimunologija [27]. Sa aspekta destrukcije nekalcifikovanog vezivnog tkiva parodoncijuma ključan je MMP/TIMP sistem, dok se RANK/RANKL/OPG sistem smatra glavnim za destrukciju koštanog tkiva. U poslednje vreme dokazan je i mehanizam koštane resorpcije nezavisan od RANK/RANKL/OPG sistema, i ovde glavnu ulogu igra TNFα. 1.3.1.Mehanizmi koštane resorpcije u patogenezi parodontopatije- M-CSF i RANK/RANKL/OPG sistem Metabolizam kosti je dinamičan proces, koji i u fiziološkim uslovima prolazi kroz stalan proces remodelacije- sinteze i degradacije koštanog tkiva za koje su zaduženi osteoblasti i osteoklasti. Osteoblasti se diferenciraju od mezenhimalnih stem ćelija, dok se osteoklasti diferenciraju od monocita i makrofaga. Osteoblasti i mezenhimalne ćelije koštane srži stimulišu diferencijaciju osteoklasta pod uticajem različitih stimulusa kao što su paratireoidni hormon, vitamin D, glukokortikoidi, i različiti inflamatorni citokini kao što su Il-1, IL-6 i TNFα. 1.3.1.1.Makrofagni kolonostimulišući faktor (M-CSF) Makrofagni kolonostimulišući faktor jedan je od najranijih medijatora koštane resorpcije. Produkuju ga uglavnom osteoblasti i stromalne mezenhimalne ćelije. Uloga mu je u inicijaciji osteoklastogeneze, kao i u preživljavanju zrelih osteoklasta [28]. UVOD 9 1.3.1.2.RANK/RANKL/OPG sistem Ovaj sistem deo je TNF/TNFR superfamilije citokina i receptora. Sa ovim sistemom stupaju u interakciju mnogi citokini i na taj način indukuju koštanu resorpciju. RANKL (ligand receptora aktivatora nulearnog faktora κB) u uslovima normalnog koštanog metabolizma eksprimiraju osteoblasti, dok ga u inflamaciji eksprimiraju i ostale ćelije npr. aktivirani T i B limfociti, fibroblasti i mononukelarne ćelije [29] i pod uticajem je proinflamatornih citokina kao što su IL-1 i TNFα. RANK (receptor aktivator nulearnog faktora κB) je površinski ćelijski transmembranski receptor, eksprimiran na monocitno/makrofagnoj liniji ćelija, B i T ćelijama, dendritičnim ćelijama, fibroblastima, kao i prekursorima i zrelim osteoklastima. Po vezivanju RANKL za RANK na površini osteoblasta, nakon direktnog ćelijskog kontakta, dolazi do transformacije preosteoklasta u osteoklaste kao i aktivacije zrelih osteoklasta. Treći član ovog sistema je osteprotežerin (OPG) koji predstavlja prirodni inhibitor- mamac receptor za RANKL. Sposoban je da se veže za RANKL i na taj način spreči vezivanje RANKL-a za RANK [29]. OPG produkuju gingivalni fibroblasti, epitelne i ćelije periodoncijuma. I ova sekrecija je pod kontrolom proinflamatornih citokina. Za homeostazu koštanog tkiva u stvari je bitan odnos RANKL/OPG. Dokazano je da OPG deluje na osteoklaste i direktno. Ovi, još nedovoljno istraženi mehanizmi dovode do inhibicije terminalne maturacije osteoklasta, supresije aktivacije već zrelih osteoklasta, kao i apoptoze samih osteoklasta [30]. 1.3.2.MMP/TIMP sistem Matriksne metaloproteinaze predstavljaju grupu endopepetidaza koje modeluju komponenete vezivnog tkiva-kolagen, elastin, želatin, matriksne glikoproteine i proteoglikane. Većina MMP se ne produkuje ili se pak produkuje u minimalnim količinama u fiziološkim stanjima u tkivu odraslih osoba. Do sada je otkriveno 25 raziličitih tipova MMP svrstanih u 6 grupa. Sa aspekta patogeneze parodontopatije, najbitnije su MMP-2, MMP-8, MMP-9 i u manjoj meri MMP-13 i MMP-14. MMP-8 i MMP-13 pripadaju grupi kolagenaza koje degradiraju kolagen tipa I, II i III. MMP-8 se može smatrati biohemijskim parametrom aktivnosti parodontopatije, dok se MMP-13 više smatra markerom reparacije parodoncijuma u toku parodontopatije [31]. MMP-2 i MMP-9 pripadaju grupi želatinaza i degradiraju uglavnom kolagen tipa IV. UVOD 10 MMP-14 pripada grupi membranskih MMP. Ispoljava kolagenaznu aktivnost na kolagen I, II i III. Dokazi o ulozi ovog enzima u destukciji parodoncijuma su još uvek oprečni, ali za sada se smatra da ima ulogu u ranim fazama destrukcije parodoncijuma, naročito zbog svoje sposobnosti da aktivira druge MMP. Održavanje homeostaze tkiva postiže se kontrolom ovih degradirajućih enzima endogenim inhibitiorima. Glavni endogeni inhibitori su tkivni inhibitori MMP- TIMP, zatim α2 makroglobulin, koji je najbitniji inhibitor u telesnim tečnostima. Za održavanje homeostaze tkiva bitan je odnos MMP/TIMP i u mnogim studijama je dokazan povećan odnos kod pacijenata sa parodontopatijom [32]. Tabela 1.1: Karakteristike najvažnijih citokina u patogenezi parodontopatije Citokin Poreklo Uloge IL-1α, IL-1β, IL-1Ra Monociti, makrofagi, neutrofili, keratinociti, epitelne ćć, fibroblasti Proinflamatorni citokin (stimulacija koštane resorpcije) TNFα Makrofagi, T ly, neutrofili, B ćć, fibroblasti, osteoklasti, endotelne ćć Proinflamatorni citokin, vazodilatacija, ↑permeabilnost ks, stimulacija koštane resoprcije IL-6 T ćć, B ćć, makrofagi, osteoblasti, dendritične ćć, keratinociti, endotelne ćć, fibroblasti, adipociti Proinflamatorni citokin, akutna inflamacija, koštana resorpcija IL-17A, B, C, D, E (IL-25), F T ćć, makrofagi, neutrofili, dendritične, mast ćć, NK ćć Proinflamatorni efekti, koštana resorpcija (indukcija ekspresija RANKL na osteoblastima), indukcija ekspresije MMP. Antiinflamatorna uloga (može stimulisati zaštitni primarni imunitet) IL-10 T reg Manje: Th1, Th2, Th17, CD8 + , monociti, makrofagi, dendritične ćć, B ćć Antiinflamatorna uloga (inhibira aktivnost Th1, Th2, NK ćć, makrofaga, i druge APĆ) Proinflamatorna uloga (aktivacija B ćelijske proliferacije i sekrecija Ig) 1.4.Dijabetes melitus Dijabetes melitus predstavlja grupu oboljenja koje karakteriše povećan nivo glukoze u krvi nastao kao posledica poremećaja sekrecije i/ili dejstva insulina. Danas se dijabetes klasifikuje (etiološki) u 4 grupe [33]: UVOD 11 1. Dijabetes tip 1 posledica je autoimune destrukcije β ćelija pankreasa i obično dovodi do apsolutnog nedostatka insulina. Iako se javlja uglavnom kod osoba do 30 godina, sporadično se može javiti kod odraslih kada se definiše kao latentni autoimuni dijabetes odraslih- LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults). 2. Dijabetes tip 2 3. Drugi oblici dijabetesa (genetski defekti u funkciji β ćelija pankreasa ili insulinskom dejstvu), oboljenja egzokrinog pankreasa (npr: cistična fibroza), dijabetes u okviru drugih endokrinih oboljenja (npr: akromegalija) dijabetes indukovan lekovima, infekcijama, i dr. 4. Gestacioni dijabetes (dijabetes dijagnostikovan u toku trudnoće) Dijabetes melitus je jedno od najčešćih oboljenja u skoro svim zemljama sveta; incidenca dijabetesa je u porastu zbog produženja životnog veka, promene životnog stila (sedentarni stil) i povećanja gojaznosti. Smatra se da će 2030. godine otprilike 439 miliona odraslih (7,7% svetske odrasle populacije između 20 i 79 godina) imati dijabetes [34]. Očekivani porast za period od 2010-2030. godine je 54%, gde se očekuje značajna razlika između razvijenih zemalja (porast od 20%) i zemalja u razvoju (porast od 69%) [34]. 1.5.Tip 2 dijabetesa Tip 2 dijabetesa (T2D) je hronični metabolički poremaćaj koji karakteriše progresivna hiperglikemija kao posledica smanjene osetljivosti ćelija na insulin koju kasnije prati poremećaj sekrecije insulina. Smatra se da 90-95% pacijenta obolelih od dijabetesa čine oboleli od T2D. 1.5.1.Etiologija T2D Etiološki, T2D smatra se oboljenjem životnog stila udruženo sa genetskim predisponirajućim faktorima [35]. Dijabetes je poligeno oboljenje koje je za genetičare i dalje misterija i već dugo se s pravom naziva „noćnom morom“ genetičara [36]. Studije na blizancima pokazale su da je udeo nasledne komponente čak 30-70% [37]. Studije genomskih asocijacija (Genome Wide Association Studies- GWAS) su identifikovale preko 70 lokusa potencijalno odgovornih za T2D [38]. Naravno, svaki pojedinačan lokus ima veoma malu ulogu u etiologiji dijabetesa, a čak i svi identifikovani lokusi zajedno objašnjavaju neznatan deo uloge nasleđa u dijabetesu. S druge strane postoji i UVOD 12 evolutivna teorija o tzv. „štedljivom genu“. Po ovoj teoriji, ljudski organizam je prilagođen na uslove gladovanja (6 hormona koji dovode do povećanja nivoa glukoze u krvi, a samo jedan hormon koji je snižava) i nosioci ovih gena mnogo bolje iskorišćavaju hranu i lakše akumuliraju masno tkivo [39]. Sa aspekta životnog stila, najveći fakori rizika za razvoj dijabetesa su visok kalorijski unos, nizak stepen fizičke aktivnosti [40, 41] i gojaznost (5-10 puta češća pojava dijabetesa kod gojaznih u odnosu na normalno uhranjene osobe). Osim ovih, i pušenje cigareta se smatra nezavisnom faktorom koji može da poveća rizik za nastanak T2D [42]. 1.5.2.Patogeneza T2D Insulinska rezistencija (IR) je ključni i primarni poremećaj koji se javlja u toku T2D. Prisustvo konstantne inflamacije niskog intenziteta dovodi do IR. Smanjenje sekrecije insulina je posledica povećane apoptoze β ćelija izazvane oksidativnim stresom i stresom endoplazmatskog retikuluma samih β ćelija. Do pojave oksidativnog i stresa endoplazmatskog retikuluma dolazi zbog visokog nivoa glukoze (glukotoksičan) i zasićenih masnih kiselina (lipotoksičan efekat) u krvi, povećanja amiloidnih depozita u pankreasu i inflamatornih citokina poreklom iz masnog tkiva. Glavni citokini i adipokini uključeni u patogenezu IR i povećanog odumiranja β ćelija su IL-1, IL-6, IL-18, TNFα, leptin, rezistin i adiponektin. I citokini i adipokini imaju svoje uloge u tesno povezanom imunološko-metaboličkom odgovoru, neophodnom za održavanje homeostaze organizma. Dokazano je na više nivoa da TNFα izaziva, odnosno pogoršava insulinsku rezistenciju u masnom i mišićnom tkivu [43] kao i da povećava lipolizu što opet može dovesti do IR. IL-6 dovodi do poremećaja metabolizma glukoze na više nivoa- smanjenjem signalnih molekula neophodnih za preuzimanje glukoze od strane ciljnih tkiva, ali i poremećajem samog signalnog sistema na nivou ovih tkiva [44]. S druge strane postoje dokazi da na nivou adipocita on podstiče preuzimanje glukoze i dovodi do smanjenja nivoa glukoze u plazmi [45]. IL-1 posreduje u smanjenju osetljivosti ćelija na insulin, ali isto tako pokazuje i citotoksičnost na β ćelije pankresa. On je jedan od najbitnijih proapoptotskih i proinflamatornih citokina zaduženih za odumiranje β ćelija pankreasa, a smanjuje i sintezu samog insulina u β ćelijama [46]. Povećani nivo IL-18 povezani su sa IR i T2D [47], a ovaj citokin smatra se i prediktorom makrovaskularnih dijabetičnih komplikacija. Glavni izvori UVOD 13 proinflamatornih citokina u dijabetesu su masno tkivo i kasnije u toku bolesti zapaljenske ćelije koje se nagomilavaju u samim Langerhansovim ostrvcima. Kao što je napomenuto, u patogenezi dijabetesa vremenom dolazi do smanjenja ili čak izostanska sekrecije insulina. U poslednje vreme je više dokaza da insulin ima mnoge druge uloge sem snižavanja glukoze u krvi. Tako, on deluje antiinflamatorno, indirektno putem smanjenja nivoa glukoze, ali i direktno, modualcijom ključnih inflamatornih molekula. Takođe, dokazano je da insulin inhibira aktivaciju oksidativnog stresa ali i da neutrališe prooksidativne efekte hiperglikemije [48, 49]. Iz ovih činjenica može se zaključiti da u slučaju nedostatka insulina, nedostaje još jedan mehanizam kontrole inflamacije i oksidativnog stresa. Rezultati odnosa inflamacije i T2D su oprečni. Postoje stavovi da se inflamacija u dijabetesu javlja sekundarno, odnosno kao posledica hiperglikemije [50]. S druge strane, istraživanja koja opovrgavaju teoriju o sekundarom povećanju citokina u dijabetesu, su ona koja pokazuju da kod pacijenata sa dijabetesom tip 1, nivo inflamatornih citokina nije povišen čak i kada imaju iste glikemija kao ispitanici sa T2D [51]. 1.5.3.Komplikacije T2D Najveći klinički i socijalno-ekonomski problem pacijenata sa dijabetesom su njegove komplikacije, akutne i hronične. Akutne komplikacije su dijabetička ketoacidoza, laktatna acidoza, dijabetesno neketogeno hiperosmolalno stanje i hipoglikemija u dijabetesu. Glavne hronične komplikacije dijabetesa su: dijabetesna retinopatija, nefropatija, neuropatija i one se definišu kao mikrovaskularne komplikacije. Postoje i makrovaskularne hronične komplikacije (arterijska hipertenzija, ishemijska bolest srca, cerebrovaskularna bolest, periferna vaskularna bolest-dijabetesno stopalo). Kod dijabetičara nisu retke urinarne infekcije, infekcije respiratonog trakta, gastrointestinalog trakta, infekcije mekih tkiva i kostiju; kožna oboljenja i dr. 1.6.Dvosmerna veza parodontopatije i dijabetesa 1.6.1. Uticaj dijabetesa na stanje usne duplje i parodontalnih tkiva Klinička slika T2D je često zamaskirana i praćena blagim simptomima (za razliku od tipa 1 dijabetesa), pa se dešava da je dobro obučen stomatolog taj koji uputi pacijenta na UVOD 14 eventualno postojanje oboljenja. Kod obolelih od dijabetesa, patologija oralnih tkiva je raznovrsna i zahvata i meka i čvrsta zubna tkiva. Dentalni karijes Veza između karijesa i dijabetesa je dosta dugo i ekstenzivno proučavana, ali su rezultati kontradiktorni. Dijabetes tip 1 se dijagnostikuje uglavnom u ranim godinama i kod ovih pacijenata je unos ugljenih hidrata limitiran od najranije mladosti [52]. Generalan je stav da je kod obolelih od dijabetesa tipa 2, koji se dijagnostikuje kasnije i povezan je sa povećanim kalorijskim unosom, povećana incidenca karijesa, što se objašnjava smanjenjom salivacijom, glikosijalijom i promenom flore i pH usne duplje, kao i neadekvatnom oralnom higijenom. Kserostomija Osećaj suvoće usta je čest oralni simptom pacijenta sa dijabetesom. Pretpostavlja se da može biti posledica poliurije, polidipsije, ili promena u bazalnom membrani samih pljuvačnih žlezda [53], kao i posledica drugih medikamenata koje pacijenti koriste ili starosti samog pacijenta. Oralni mukozni poremećaji Neke studije su dokazale povećanu incidencu lihen planusa i rekurentnog aftoznog stomatitisa [54] kod obolelih od dijabetesa. Pretpostavlja se da su ova oboljenja posledica imunološkog disbalansa koji se javlja u obolelih od dijabetesa. Oralna kandidioza Infekcije oportunističkim patogenima svrstavaju se u hronične komplikacije dijabetesa. Imunološki disbalans, hiposalivacija, glikosijalija i promene pH mogu biti neka od objašnjenja za pojavu ovih infekcija. Poremećaj ukusa Poremećaj ukusa kod pacijenata sa dijabetesom mogu biti posledica neuropatije, hiposalivacije ili promene načina ishrane. 1.6.1.Gingivitisi i parodontopatije Za razliku od prethodnih oboljenja usne duplje, dokazi o parodontopatiji kao oralnoj manifestaciji dijabetesa su konzistentni. Već preko 20 godina, ona se smatra šestom komplikacijom dijabetesa [55]. Pacijenti sa dobro kontrolisanim dijabetesom imaju 1,56 puta veće šanse da obole od parodontopatije u odnosu na zdrave ispitanike, dok je ovaj odnos kod pacijenata sa lošom glikoregulacijom čak 2,9 puta [56]. Neke studije su UVOD 15 pokazale da je parodontopatija prva klinička komplikacija dijabetesa kod dece i omladine i dokazale su povezanost između parodontalne destrukcije i loše glikoregulacije u dužem vremenskom periodu [57]. Postoji mnogo potencijalnih mehanizama koji objašnjavaju destrukciju parodontalnih tkiva kod pacijenata sa dijabetesom. Ranije se smatralo da se flora parodontalnih džepova sistemski zdravih i pacijenata sa dijabetesom razlikuje. Iako je veoma teško porediti sve studije koje su se bavile ovom tematikom, prihvaćen je stav da se mikrobiološka flora ove dve grupe pacijenata ne razlikuje [58]. Kod pacijenata sa dijabetesom, imunoinflamatorni odgovor na mikroorganizme je prenaglašen. Vezivanje AGE-RAGE (Advanced Glycation End Products, Receptor for Advanced Glycation End Products) sistema na više načina doprinosi destrukciji parodoncijuma: na površini endotelnih ćelija indukuje ekspresiju VCAM-1 (vaskualrni athezioni molekul tip 1) koji dodatno privlači monocite i pojačava imuni odgovor [52], putem aktiviranja RANKL sistema pojačava osteoklastogenezu [59], i dovodi do pojačanog/produženog imunog odgovora, transformišući makrofage u ćelije destruktivnog fenotipa (povećava koncentracije IL-6 i TNFα). Sa druge strane, sva tri pomenuta patološka procesa (AGE, ROS i TNFα) su proapoptotski signali. Pojačana apopotoza je mehanizam koji objašnjava mnoge komplikacije dijabetesa pa i destrukciju, tačnije poremećenu reparaciju parodoncijuma. Dokazano je da su ćelije parodoncijuma osetljive na fluktuacije nivoa glukoze [60]. Kod pacijenata sa dijabetesom povećana je koncentracija proinflamatornih citokina i TNFα, koji mogu dovesti do pogoršanja već postojeće parodontopatije različitim mehanizmima, kao što su stimulacija sekrecije MMP iz gingivalnih fibroblasta [61] ili stimulacija osteoklastogeneze [62]. 1.6.2.Uticaj inflamacije iz parodoncijuma na glikoregulaciju- parodontalna medicina Termin parodontalna medicina pojavljuje se u literaturi još 1996. godine i podrazumeva novu oblast parodontologije koja proučava dvosmernu vezu između oboljenja parodoncijuma i sistemskih oboljenja. Postoje mnogi načini koji pokušavaju da objasne povezanost parodontopatije i sistemskih oboljenja [63]. 1. Zajednički faktori rizika- faktori rizika za progresiju parodontopatije su često i najbitniji faktori rizika za nastanak mnogih sistemskih oboljenja, npr. pušenje UVOD 16 cigareta, stres, godine, rasa, pol, fizička aktivnost, a u poslednje vreme se pominju i zajednički genetski faktori (polimorfizmi). 2. Subgingivalni biofilm, rezervoar bakterija- dejstvo biofilma još 1984. godine je definisano na tri načina [64]: a. Metastatska infekcija- bazira se na tranzitnoj bakterijemiji. U normalnim uslovima, bakterije koje prodru u sistemsku cirkulaciju bivaju eliminisane retikuloendotelnim sistemom. b. Metastatska povreda- parodoncijum predstavlja konstantan izvor egzo- i endotoksina (lipopolisaharida-LPS) bakterija dentalnog biofilma. Sistemsko prisustvo LPS dovodi do vaskularnog odgovora [65, 66]. c. Metastatska inflamacija- bazira se na taloženju imunih kompleksa nastalih vezivanjem antigena bakterija dentalnog biofilma sa odgovorajućim antitelima u cirkulaciji i njihovim taloženjem u udaljena tkiva/organe. 3. Parodoncijum kao konstatnan izvor proinflamatornih citokina- mnogi proinflamatorni citokini (posebno IL-1β, TNFα, PGE2) se sintetišu pojačano u inflamiranom parodoncijumu. Zahvaljujući dobroj prokrvljenosti inflamiranog parodoncijuma i ulcerisanim parodontalnim džepovima, parodoncijum obolelih od parodontopatije može biti konstantan izvor svih pomenutih supstanci (bakterijskih toksina, antigena i citokina) i na taj način može doći do modifikovanja mnogih stanja i oboljenja. Procenjuje se da je površina ulcerisanog epitela kod pacijenata sa srednje teškim i uznapredovalim formama parodontopatije veličine površine šake [63]. Ova površina je individualna, i zavisi od broja zuba, morfologije korenova, dubine parodontalnih džepova, same inflamacije...Površina ulcerisanog epitela, tačnije površina inflamiranog ulcerisanog epitela bi bile dobra mera uticaja inflamiranog parodoncijuma na sistemsko zdravlje. Sistem koji za sada najbolje opisuje površinu inflamiranog parodoncijuma je PISA (Periodontal Inflamed Surface Area) [67], detaljnije opisan u poglavlju Materijal i metode. Ukratko, ovaj sistem koristi mere dubina sondiranja, nivoa pripojnog epitela i krvarenja na provokaciju na 6 tačaka po zubu u cilju izračunavanja konačne površine parodoncijuma koja utiče na sistemsko zdravlje. Mane ovih algoritama su što koristi prosečne dužine i površine korenova za izračunavanje i što računa količinu zapaljenog tkiva u dve dimenzije (mm 2 ), a sama inflamacija je trodimenzionalni proces, odnosno UVOD 17 zahvata tkivo u dubinu. Takođe, PISA nikako ne može da uzme u obzir i vrstu bakterija u samom biofilmu. Bez obzira na sve mane, ovo je za sada najprecizniji mehanizam merenja uticaja inflamacije iz parodoncijuma na sistemsko zdravlje. Sve je veći broj studija koje govore u prilog uticaja inflamacije iz parodoncijuma na glikoregulaciju kako obolelih od dijabetesa, tako i sistemski zdravih ispitanika, kao i o uticaju pomenute inflamacije na pojavu komplikacija dijabetesa. Različite studije su se bavile ovom problematikom. Opisani su brojni mehanizmi međusobnog recipročnog uticaja ova dva oboljenja. Epidemiološki podaci takođe govore u prilog uticaja parodontopatije na pojavu dijabetesa. Istraživanje Soskolne i sar. pokazalo je da pacijenti sa parodontopatijom imaju dva puta veću šansu da obole od dijabetesa u odnosu na pacijente bez kliničkih znakova parodontopatije (korišćeni podaci 13471 pacijenta u retrogradnoj studiji) [68]. 1.6.2.1.Longitudinalne (kohortne) studije Studije ovog tipa su retrospektivne i propektivne. Retrospektivne koriste informacije uglavnom iz velikih baza podataka. Problem predstavljaju sami kliničkih parameti koji se prate- različiti parametri od studije do studije, definisanje ovih parametara, kao i različite metode definisanja dijabetesa (anamenstički ili laboratorijski) i praćenja glikoregulacije. Retrospektivna studija [69] pratila je nivo HbA1c kod pacijenata sa dijabetesom sa/bez uznapredovale parodontopatije u periodu od 2-3 godine. Pogoršanje glikoregulacije uočava se kod pacijenata sa parodontopatijom u odnosu na ispitanike sa klinički zdravim parodoncijumom. Longitudinalna 10-ogodišnja studija koja je pratila normoglikemijske pacijente, pacijente sa IR i pacijente sa dijabetesom zaključila je da je povećanje dubine sondiranja bilo povezano sa prelaskom iz normoglikemijskog u IR stanje [70]. Taylor i sar. su praćenjem Pima Indijanaca u periodu od dve godine pokazali da T2D pacijenti sa uznapredovalom parodontopatijom imaju šest puta veće šanse da imaju lošu glikoregulaciju od pacijenata bez ovog stanja u usnoj duplji [71]. Veći rizik nastanka komplikacija (nefrološke i kardivaskularne) [72] kao i veća smrtnost od ovih komplikacija [73] pokazana je kod obolelih od dijabetesa sa uznapredovalom parodontopatijom u odnosu na pacijente sa dijabetesom i gingivitisom odnosno blagom formom parodontopatije (Tabela 1.2) UVOD 18 Tabela 1.2: Longitudinalne (retrospektivne i prospektivne) studije uticaja inflamacije iz parodoncijuma na glikoregulaciju Referenca Zemlja, grupe, period Stanje oralnih tkiva Glikoregulacija Zaključak C o ll in i s ar [6 9 ] Finska, KG (n=40) sistemski zdravi EG (n=26) T2D pacijenti t=15 godina PI, KNP, Rec, Indeks kamenca, DS, NPE, RA snimci, PCR HbA1c Uznapredovala PD povezana sa pogoršanjem glikoregulacije (HbA1c) S a it o i sa r [7 0 ] Japan 591 ispitanik, t=10 godina PI, DS, NPE, HbA1c, OGTT Povezanost ↑DS sa prelaskom normoglikemijskog stanja u IR T a yl o r i sa r [7 1 ] SAD t=6 godina NPE, radiološki gubitak kosti HbA1c Pogoršanje glikoregulacije kod pacijenata sa uznapredovalom PD u odnosu na one bez T h o rs le n ss o n i sa r [7 2 ] Slučaj-kontrola. Kontrola: T1D i blagaPD Slučaj: T1D i uznapredovala PD, t=6 godina PI, DS, NPE, radiološki gubitak kosti HbA1c Pacijenti sa uznapredovalom PD imaju veći rizik za bubrežne i kardivaskularne komplikacije S a re m i i sa r [7 3 ] SAD 628 ispitanika, t=11 godina Pregled oralne sluzokože, NPE, radiološki gubitak kosti HbA1c, glukoza našte PD se može smatrati prediktorom smrtnosti od kardiorenalnih komplikacija kod T2D KG=kontrolna grupa; EG=eksperimentalna grupa; t=period praćenja; OHi=instrukije o održavanju oralne higijene, PD=parodontopatije, RA= retroalveolarni radiogram 1.6.2.2.Intervencione studije Mnogobrojne intervencione studije govore u prilog poboljšanja HbA1c nakon kauzalne terapije parodontopatije sa/bez upotrebe antibiotika nakon tri meseca [74, 75, 76, 77, 78]. Nakon šest meseci ovaj efekat uglavnom ne postoji. Nepromenjene vrednosti HbA1c nakon šest meseci objašnjene su činjenicom da kad je parodontalna inflamacija pod kontrolom, tada dalja terapija parodontopatije nema uticaj na glikoregulaciju [79]. S druge strane, ukoliko se kauzalna faza sprovodila samo u nultom periodu posete, UVOD 19 p/ogoršanje glikoregulacije nakon šest meseci objašnjeno je naknadnom repopularizacijom džepova i posledičnom inflamacijom. (Tabela 1.3). 1.7.Patogenetske sličnosti dm i pdp 1.7.1.Genski mehanizmi Osim uticaja inflamacije iz parodoncijuma na glikoregulaciju, govori se i o zajedničkim patološkim defektima koji čine domaćina više podložnim jednom ili oba oboljenja. U prilog ovome govori činjenica da su i dijabetes melitus i parodontopatija oboljenja koja se viđaju u okviru porodica. S obzirom da nijednom oboljenju nije otkriven određeni gen odgovoran za pojavu oboljenja, smatraju se poligenskim bolestima [68]. Pretpostavlja se da je nemogućnost kontrole citokinske mreže, koja je inače pod genetskim uticajem, potencijalno objašnjenje ovih, u osnovi, inflamatornih oboljenja. U okviru ove hipoteze izučavaju se genske varijacije prisutne kod ispitanika sa oba oboljenja. 1.7.2.Imunološki mehanizmi I T2D i parodontopatija se smatraju prenaglašenim imunim odgovorom na stresore. U slučaju parodontopatije, ovi stresori su dentalni biofilm, cigarete i mentalni stres. U T2D, to su hiperkalorijski unos hrane, mentalni stres i nedostatak fizičkog vežbanja [68]. Stresori ispoljavaju svoj efekat putem različitih ćelija uključenih u imunološki odgovor: makrofaga/monocita, limfocita, fibroblasta i endotelnih ćelija. Studije pokazuju da PgE2, TNFα i IL-1 pokazuju sličnu, povećanu produkciju kod obolelih od dijabetesa, parodontopatije ili oba oboljenja (Tabela 1.4). Tabela 1.3: Intervencione studije-uticaj inflamacije iz parodoncijuma na glikoregulaciju Refer enca Zemlja; (kg,eg) K li n p re g . H b A 1 c Terapijski protkol HbA1c:0→3 mes→6 mes Zaključak K ir a n M i s ar (2 0 0 6 )[ 7 4 ] Turska, N=44 (KG=22, EG=22) D S , N P E , P I, G I, K N P , G R 6 -8 % Početak: svi: OHi, endo th, kauz th EG: kauz th- 1. i 3. mes KG: 7,0±0,7→7,3±2,1 EG: 7,3±0,7→6,5±0,8 Kauz th PD poboljšava HbA1c i glukozu našte S in g h S i s ar (2 0 0 8 ) [7 5 ] Indija, N=44 (KG,EG, EG2=15) D S , N P E , P I, G I < 7 ,5 % KG: bez th EG1: OHi, kauz th EG2: EG1 doksiciklin KG:8,1±0,7→8,2 EG1:7.9±0.7→7,3 EG2:8,3±0,7→7,5 Poboljšanje klin. parametara→ poboljšanje glikoreg. UVOD 20 K a ta g ir i S i s ar . (2 0 0 9 ) [7 6 ] Japan, N=49 (KG=17, EG=32) D S , K N P 6 ,5 -1 0 % KG: OHi EG: kauz th i lokalna aplikacija monociklina KG: 6,9±0,9→7,06 EG: 7,2±0,9→7,06 Kauz th PD+ lokalni ab poboljšavaju glikoreg. i smanjenje CRP-a K o ro m a n tz o s P A i s ar . (2 0 1 1 )[ 7 7 ] Grčka, N=60 (KG=30, EG=30) D S , N P E , K N P , G I 7 -9 ,9 % KG: OHi i supragingival no uklanjenje naslaga EG: OHi i kauz th PD KG: 7,6±0,7→ 7,4±0,5 →7,5±0,6 EG: 7,9±0,7→7,1±0,5 →7,1±0,9 Kauz th PD dovodi do poboljšanja glikoreg. kod T2D pacijenata posle 1,3 i 6 meseci M o ei n ta g h a vi A i s ar . 2 0 1 2 [ 7 8 ] Iran, N=40 (KG=18, EH=22) P I, D S , N P E , G I > 7 % KG: OHi EG: OHi i kauz th KG: 8,72±2,22→ 8,97±1,82 EG: 8,15±1,18→ 7,41±1,18 Kauz th PD dovodi do poboljšanja glu i HbA1c kod pacijenata sa umerenom/lošom glikoreg E n g eb re ts o n S P i s ar . 2 0 1 3 [8 0 ] Amerika N=275 (KG=23 5, EG=240) D S , N P E , P I, K N P 7 -9 % Kg: OHi Eg: OHi, kauz th i hlorheksidin KG: 7,77±0,60→ 7,85→7,88 EG: 7,84±0,65→ 7,97→7,99 Kauz th PD nije poboljšala glikoreg kod T2D pacijenata C h en i s ar 2 0 1 2 [ 8 1 ] Kina, N=134 (KG=65 EG=69) D S , N P E , P I, K N P D o b ra g li k o re g KG:bez th EG1: kauz th (0 i 3 mes) EG2: kauz th (0mes)i supragingival ne naslage (3 mes) KG: 7,25→7,30 EG1: 7,31→7,30 EG2: 7,29→7,43 Poboljšanje kliničkih parametara PD u EG1 i EG2 nije bilo praćeno poboljšanjem glikoreg. R o d ri g u es i sa r. 2 0 0 3 [8 2 ] Brazil N=30 (EG1=15, EG2=15) P I, K N P , D S , N P E , su p u ra ci ja N ij e d ef in is an o EG1: OHi, kauz th +ab. EG2:= OHi, kauz th EG1: 9,5±2,4→9,2±1,6 EG2: 8,8±1,8→7,6±1,4 Stastistički značajno poboljšanje glikoregu. EG2 grupi OHi- instrukcije o održavanju oralne higijene; kauz th- kauzalna faza terapije; N- broj ispitanika; PD-parodontopatija; KG=kontrolna grupa; EG= eksperimentalna grupa, ab=antibiotik, glikoreg=glikoregulacija UVOD 21 Tabela 1.4: Studije koje povezuju parodontopatiju i/ili dijabetes melitus sa povećanom produkcijom PgE2, TNFα i IL-1. Citokin Dijabetes Parodontopatija Dijabetes i parodontopatija P g E 2 Inhibicija sinteze PgE2 inhibira streptozotocin indukovani DM kod miševa [83] Povećana sekrecija PgE2 u perifernim monocitima kod pacijenata sa PD [84] Povećana sekrecija PgE2 kod pacijenata sa PD i DM u odnosu na sistemski zdrave pacijente sa PD [85] IL -1 Selektivno citotoksičan za β- ćelije [86] Povećana sekrecija u perifernim monocitima u agresivnoj PD [84, 87] Polimorfizam na genu za IL-1 povezan sa PD [88] Povećana koncentracija IL-1 u sulkusnoj tečnosti i u perifernim monocicitma kod pacijenata sa DM i PD u odnosu na sistemske zdrave ispitanike sa PD [85] T N F -α TNF-α u sistemskoj IR putem inhibicije insulinskog receptora tirozin kinaze u mišićnom i masnom tkivu [89, 90] Serumski nivo TNFα znatno povišen kod pacijenata sa PD u odnosu na sistemski zdrave ispitanike [91] Pacijenti sa DM kod kojih je rađena kauzalna terapija PD pokazali su značajno smanjenje cirkulišućeg TNFα u odnosu na parodontološki netretirane pacijente sa DM [92] PD=parodontopatije, DM=dijabetes melitus 1.7.3.TNFα kao potencijalni citokin koji objašnjava dvosmernu vezu parodontopatije i dijabetesa Kao što je već pomenuto, povećane koncentracije cirkulišućeg TNF-α mogu dovesti do pogoršanja već postojeće parodontopatije putem stimulacije destrukucije mekih i tvrdih parodontalnih tkiva. Povećanje inflamacije u parodoncijumu zatim može povećati ekspresiju TNF-α u monocitima i tako dovesti do dodatne smanjene ostetljivosti na insulin, delujući na jetru, mišiće i masno tkivo direktnim mehanizmima, ali indirektnim, stimulacijom drugih molekula koji dovode do insulinske rezsitencije [93]. 1.8.Interleukini (Citokini) Interleukini (IL) su polipeptidni/glikoproteinski regulatorni molekuli koje može da produkuje praktično svaka ćelija sa jedrom. Odgovorni su za ćelijsku komunikaciju u fiziološkim i patološkim uslovima. Strukturalne analize omogućile su grupisanje IL u takozvane familije, npr. IL-2/IL-4, IL-6/IL-12, IL1, TNFα. UVOD 22 1.8.1.TNF alfa/TNF receptor (TNF/TNFR) familija citokina Faktor nekroze tumora α (TNFα) i limfotoksin alfa (LTα) su dva prva izolovana interleukina ove familije. Njihova prvootkrivena uloga bila je nekroza tumorskih ćelija, a zatim kaheksija životinja inficiranih parazitima [94]. Ubrzo zatim, otkriveno je da ovi citokini pripadaju familiji citokina koji moduliraju mnogobrojne imunološke funkcije. Iako među članovima ove superfamilije postoji mala homologija ekstracelularne komponente, njihova jedinstvena karakteristika je trostruko savijena struktura- trimerna forma. Ligandi su tip 2 proteini i mogu biti u „pro“- transmembranskoj formi ili u solubilnoj- zreloj formi. Obe forme su aktivne kao samostalni nekovalentni trimeri. Spoljašnje površine trimera pokazuju minimalnu sličnost, dok unutrašnje površine pokazuju analogiju u 25-30% amino kiselina. Receptori su tip 1 proteini. Putem disulfidnih veza formiraju domene bogate cisteinom u ekstracelularnom domenu, što je jedna od karakteristika TNFR familije. Ove receptore neki svrstavaju u tri grupe: receptore koji poseduju domen smrti (Death Domain- DD), receptore koji ne poseduju DD i one koji deluju kao „mamac“ (decoy) receptori. Poslednje karakteriše nedostatak transmembranskog i citoplazmatskog dela, pa samim tim vezuju ligand bez dalje indukcije ćelijskih signala [95]. Određeni ligandi odnosno receptori iz TNF superfamilije mogu se vezivati za više kompatibilnih receptora/liganada sa istom specifičnošću, što doprinosi regulatornoj fleksibilnosti i kompleksnosti. Glavne uloge ćelijske smrti indukovane putem DD su ćelijska citotoksičnost kao odgovor na prisustvo infektivnih agenasa i imuna homeostaza koja se ogleda u održavanju balansa ponavljane limfocitne ekspanzije kao odgovor na antigene u prostorno ograničenom tkivu limfnih organa. Među mnogobrojnim funkcijama ove familije, jedinstvena im je uloga sposobnosti destrukcije, izgradnje i remodelacije tkiva [96]. Danas je poznata i vitalna uloga ove familije u balansu ćelijskog umiranja i preživljavanja. 1.8.1.1.Faktor nekroze tumora- TNFα TNFα je potentni proinflamatorni citokin koji sekretuju mnogobrojne ćelije kao odgovor na inflamaciju, infekciju, povredu ili bilo koje druge nadražaje [97]. Prvenstveno ga produkuju aktivirani makrofagi, monociti, NK ćelije, a manje keratinociti, mast ćelije, fibroblasti, glatkomišićne i neke tumorske ćelije. U koštanom UVOD 23 tkivu ga produkuju osteoblasti i osteoklasti. TNFα se sintetiše kao propetid u transmembranskoj formi (26kDa, 212 AK). Solubilna forma (17kDa, 185 AK) se oslobađa pomoću TNFα konvertujućeg enzima (TNFα Converting Enzyme- TACE/ADAM17) [98]. TACE takođe može da uklanja TNF receptore sa površine ćelije. Solubilna i transmemebranska forma imaju različite funkcije, a njihovu bioaktivnost regulišu solublini receptori. Funkcije TNFα karakteriše kompleksnost i slojevitost, koje potiču od prisustva dve forme (s i tm) kako samog liganda tako i dva receptora, njihovog međusobnog odnosa kao i složene mreže intraćelijskog prenosa signala. Iako je uloga TNFα je od vitalnog značaja za odbrambene mehanizme domaćina, u višku TNFα ispoljava štetne efekte [99]. Putem svojih receptora on može aktivirati signale odgovorne za programiranu ćelijsku smrt ili signale za modulaciju apoptoze, ćelijsko preživljavanje i proliferaciju [100]. Primarna uloga TNFα je regulacija i razvoj imunološkog sistema. Uloga TNFα bila bi sinergističko izazivanje lokalnog imunološkog odgovora sa IL-1 i IL-6, i pokretanje urođenog i stečenog imuniteta sa ciljem borbe protiv infekcije [95]. TNFα ima bitne uloge u metabolizmu lipida, indukuje lipolizu i stimliše lipogenezu u jetri [101]. Solubilna i transmembranka forma TNFα vrše različite uloge-sforma zadužena je uglavnom za sistemske i štetne efekte, dok je tm forma zadužena za korisne efekte [102]. Biosinteza TNFα je strogo kontrolisan proces na transkripcionom, translacionom i posttranslacionom nivou, sa ciljem da organizam osigura produkciju malih količina ovog citokina u fiziološkim uslovima, a omogući brzu i značajnu ushodnu regulaciju u stimulisanim ćelijama i da ograniči dejstvo ovog citokina kada više nema potrebe za njegovim dejstvom. Na sintezu TNFα utiče mnogo faktora. Iako se starenje smatra stanjem udruženim sa povećanom produkcijom citokina, teško je razdvojiti uticaj samog starenja od uticaja komorbiditeta vrlo često prisutnih kod starijih osoba. Neke studije nalaze povećan nivo TNFα [103], neke nepromenjen [104] u odnosu na mlađe ispitanike. Iako je i starenje bez dijagnostikovanih komorbiditeta praćeno pojačanom ekspresijom TNFα,ovo povećanje je 2-4 puta, što je daleko manje od povećanja u akutnim zapaljenjima. Uticaj pola, tj polnih hormona na sintezu TNFα je predmet istraživanja od samog prepoznavanja ovog citokina. Iako je generalni stav da premenopauzalne žene pokazuju veću količinu sekretovanog TNFα, postoje dokazi da UVOD 24 uticaj estrogena na sintezu TNFα zavisi od koncentracije ovog hormona [105]. Bez obzira što su adipociti izvor samog TNFα, veze indeksa telesne mase (IMT) i koncentracije citokina su oprečne [106, 107]. Psihički stres modulira imuni odgovor u oba smera, zavisno od tipa stresa, ali i elemenata imunološkog sistema koje posmatramo kao ishodišne varijable. Neka istraživanja su pokazala povećan nivo TNFα u stresu [108], dok su druga pokazala njegov nepromenjen nivo [109]. Jedan od stavova je da je stimulacija imunog sistema u stresu samo prolazna faza, koja prethodi realnoj depresiji imuniteta [110]. Vežbanje je još jedan od faktora koji na različite načine utiče na nivo TNFα. I ovde je prisutna nekoznistentnost rezultata zbog različitih načina vežbanja i utreniranosti ispitanika, kao i kitova za određivanje koncentracija. Bez obzira na ove razlike, mogao bi se izdvojiti stav da jednokratno vežbanje slabog do umerenog intenziteta osoba nenaviknutih na aktivnosti prvo dovodi do povećanja, a zatim smanjenja nivoa TNFα u serumu [111], dok umereno kontinuirano vežbanje dovodi do smanjenja koncentracije TNFα [112]. Produkcija TNFα po uticajem je i duvanskog dima. Mnogobrojne studije izučavale su akutne i hronične uticaje cigara, cigareta i esktrakata različitih duvana na raznovrsnim modelima (humani, animalni, in vitro), tako da rezultati ovih studija nisu jednostavni za poređenje. Uticaji akutnog izlaganja duvanu zavise od doza i vremena ekspozicije kao i merenja samog citokina. U nekim studijama TNFα je opisan kao glavni medijator inflamacije izazvane akutnim dejstvom duvana [113]. U drugim je ovaj efekat definisam kao suprimirajući [114], što je objašnjeno antiinflamatornim dejstvom ugljenmonoksida. Dugoročan uticaj duvana na nivo TNFα u serumu uglavnom je definisan kao stimulativni. Dugo se smatralo da su jedini stimulus za sintezu TNFα bakterijski endotoksini (LPS- lipopolisaharid). Sada se zna da ushodnu regulaciju sinteze ovo citokina mogu podstaći i enterotoksin, granulocitni kolonostimulišući faktor, hipoksija, IL-1, leukotrijeni, melitin, azot oksid, C5a anafilotoksin, slobodni radikali, parazitarni i mikotični antigeni, radijacija, UV svetlo u epitelnim ćelijama. Supresori ekspresije TNFα u makrofagima suPgE2, transformišući faktor rasta β, IFNα, IFNγ, IL-4, IL-6, IL-10, kolonostimulišući faktor, određeni virusni produkti, deksametazon, glukokortikoidi, ciklosporin A, holinergički agonisti uključujući nikotin i acetil-holin [115]. Takođe, putem stimulacije određenih antiinflamatornih supstanci kao što su IL-10, kortikosteroidi i prostaglandini, sam TNFα negativnom povratnom spregom suprimira svoju ekspresiju. UVOD 25 1.8.1.2.Limfotoksin α (LTα) Limfotoksin α (prvobitno definisan kao TNFβ) otkriven je gotovo istovremeno kad i TNFα. Za razliku od TNFα, LTα sekretuju isključivo limfociti (CD4+ i CD8+), NK ćelije, makrofagi i B ćelije [116]. LTα je najbliži strukuturni homolog TNFα i homologija ova dva citokina je 30% u primarnom aminokiselinskom sastavu, ali je još većeg značaja međusobna visoka podudarnost tercijarne i kvaternerne strukture [117]. Kao i TNFα, LTα je trimer sastavljen iz tri monomera veličine 17kDa. Iako je sličnost velika, određene razlike postoje, pa se tako, sekretuje isključivo u solubilno formi, a vezan za ćelijsku membranu se može naći kao heterotrimer sa LTβ. Sa aspekta receptora, sličnost sa TNFα je reagovanje sa TNFR1 i TNFR2, a razliku predstavlja vezivanje ovog solubilnog citokina istim afinitetom za oba receptora [118]. LTα sa LTβ formira dve vrste heterotrimera, LTα2β1 (čini samo 2%) i dominantni LTα1β2 heterotrimer [119]. Geni za LTα i LTβ nalaze se sa obe strane gena za TNFα, na hromozomu 6. LTα1β2 kompleks poseduje sopstvene receptore i signalne puteve, a vezuje se za posebni receptor-LTαβR, tip 1 transmembrasnki receptor [120]. LTα1β2 kompleks eksprimiran je na B, T, NK i limfnim ćelijama koje učestvuju u formiranju limfoidnih organa. Ranije se smatralo da je uloga LTα u indukovanju nekroze određenih ćelija skoro identična sa ulogom TNFα, dok je njegova uloga u inflamaciji i citotoksičnosti tumorskih ćelija daleko manja- uloga parcijalnog agonista [121]. Danas se smatra da ova dva citokina dele neke zajedničke funkcije, ali poseduju i sopstvene uloge. LTα ima ulogu u velikom broju inflamatornih, imunostimulatornih i antivirusnih odgovora. Njegova uloga u formiranju sekundarnih limfnih organa je od vitalnog značaja, tako LTα nokaut miševi ne poseduju Pajerove ploče, dok su limfni nodusi poremećene arhitekture [122]. Osim uloge u formiranju sekundarnih limfnih organa, LTα ima ulogu i u obezbeđivanju adekvatnog mikrookruženja limfnim organima. LTα ima ulogu limfoangiogenezi u inflamaciji, i njegovo prisustvo neophodno je za diferencijaciju, regrutaciju i antitumorsku aktivnost NK ćelija [123]. Na animalnim modelima utvrđena je uloga ovog limfokina u odbrani od određenih patogena. 1.8.1.3.Receptori TNFR1 i TNFR2 TNFα i LTα dele dva zajednička receptora- TNFR1 (CD 120a, p55-R, p60) i TNFR2 (CD120b, p75-R, p80). UVOD 26 Gen za TNFR1 nalazi se na lokusu 12p13.31, poseduje 10 egzona i kodira 55/60kDa transmembranski receptor [124], dok se gen za TNFR2, takođe od 10 egzona, nalazi na lokusu 1p.36.22, i kodira transmembranski receptor 75/80kDa [125]. Oba receptora postoje u transmembranskoj (tm) i solubilnoj (s) formi. Za razliku od TNFα, sTNFR1 formira se i egzocitozom [126]. Solubilne forme receptora (poznate i kao BP-TNF od „Binding proteins“-vezujući proteini za TNF) mogu da se kompeticijski vezuju za tm i sTNFα, i na taj način blokiraju dalje dejstvo TNFα (u visokim koncentracijama), ali takođe funkcionišu i kao depo samog TNFα (u niskim koncentracijama prezerviraju TNFα). Takođe, solubilni receptori stabilizuju TNFα, sprečavajući inaktivaciju aktivnog trimera u neaktivni monomer [127], produžavajući mu poluživot. Osim ova dve mehanizma, i internalizacija receptora- mehanizam koji je ranije smatran isključivo odgovornim za degradaciju ili reciklažu receptora učestvuje kako u prenosu signala tako i u regulaciji funkcije liganada. Ovo znači da uloga receptora nije samo prosta ćelijska transdukcija, nego i regulacija biodostupnosti samog TNFα. Solubilni receptori su u niskoj koncentraciji prisutini u serumu i kod zdravih osoba. Iako i u ovim niskim koncentracijama deluju kao regulatori biodistupnosti TNFα, ova uloga posebno dolazi do izražaja u patološkim stanjima [128]. Ekspresija receptora je takođe pod uticajem mnogobrojnih faktora. Stimulišuće na njihovu ekspresiju deluju LPS, retionična kiselina, glukokortikoidi, TNFα, IL-2, IL-4, IL-6, INFα, INFβ, INFγ, GM-CSF i tireostimulišući hormon (TSH) [115]. Na stimulaciju oslobađanja solubilnih formi utiču TNF, IL-1, endotoksin. TNFR1 je konstitutivno prisutan na skoro svim ćelijama, sem eritrocita. Vezivanje solubilnog TNFα za TNFR1 je brzo i sa velikim afinitetom, dok je disocijacija sa receptora spora. TNFR1 aktivira se podjednako i solubilnom i transmembranskom formom TNFα [129]. TNFR2 je inducibilan i prisutan je u fiziološkim uslovima u malom broju samo na imunološkim, endotelnim i nekim ćelijama centralnog nervnog sistema, kao i kardiomiocitima. Funkcije TNFR2 kasnije su upoznate i potcenjene su baš zbog činjenice da je glavni ligand ovog receptora transmembranska forma. Podaci o afinitetu TNFα za receptor 2 su oprečni, ali se zna da je disocijacija liganda i TNFR2 20-30 puta brža u odnosu na disocijaciju od TNFR1 [129]. UVOD 27 Ukratko, TNFR1 se definiše kao induktor apoptoze i manjim delom ćelijskog preživljavanja dok je TNFR2 zadužen prevashodno za ćelijsko preživljavanje. TNF receptori nemaju metaboličke sposobnosti pa signale prenose putem vezivanja intracelularnih proteina. Oni su jednostavni glikoproteini sa 28% homologije u ekstracelularnom domenu i skoro bez homologih motiva u intraćelijskom delu. Receptori poseduju sekvence sposobne za vezivanje intraćelijskih adaptorskih proteina (TNF receptor-associating Factors-TRAFs). Ovi intraćelisjki adaptorski proteini prenose signal sa stimulisanog receptora i vrše aktivaciju mnogobrojih signalih procesa. TNFR1 receptor poseduje domen smrti (DD), koji ima ulogu u indukciji apoptoze i ukoliko dođe do delecije ovog domena, dobija se nefunkcionalni R1, što govori o neophodnosti DD u fiziološkim procesima [130]. Signali za izazivanje ćelijske smrti poreklom sa TNFR1 za posledicu imaju dve pojave- apoptozu, odnosno programiranu ćeijsku smrt i nekroptozu. Ukratko, kada postoji signal za apoptozu, a ne postoje ćelijski uslovi za njeno izvršenje, dolazi do programiranog umiranja ćelije ali sa karakteristikama nekroze [131]. Ovaj receptor nije citotoksičan za sve ćelije, pa osim ovih signala usmerenih ka apoptozi, aktivira i NFkβ-transkripcioni faktor, koji dalje aktivira transkripciju mnogih gena uključujući proinflamatorne citokine, hemokine i antiapoptotkse faktore. Uloga TNFR1 mogla biti opisana na tri nivoa: na ćelijskom nivou on izaziva apoptozu inficiranih i oštećenih ćelija, na nivou tkiva izaziva i kontroliše inflamatorni odgovor, dok na sistemskom nivou kontroliše funkcije kao što su spavanje i povišena telesna temperatura [102] (Slika 1.3). TNFR2 ne poseduje domen smrti i dugo se smatralo da on ne učestvuje u apoptotskim signalima. Međutim, proučavanjem mehanizama intraćelijskog prenosa signala i otkrićem adaptorskih proteina, konkretno TRAF-2, uočene su i ove funkcije R2. TRAF- 1 i TRAF-2 se uglavnom direktno vezuju za citoplazmatksi deo TNFR2. Preko TRAF- 1/TRAF-2 kompleksa se apoptotski adaptorski proteini vezuju za receptore. Putem TRAF-2, TNFR2 se indirektno vezuje i sa drugim molekulima koji iniciraju apoptotske signale. Osim ovih proapoptotskih funkcija, ranije otkrivene uloge TNFR2 su antiapoptotske. Ostavruju se putem mnoštva signala, ali najvažniji je putem TRAF2 koji se vezuje za NFkβ-indukujuću kinazu. Ova kinaza za ciljni molekul ima NFkβ- transkripcioni faktor čija je uloga transkripcija kao odgovor na stres i antiapoptotske UVOD 28 signale [132]. Aktivacija NFkβ sistema je osnovni način zaštite ćelije od ćelijske smrti. Mišljenja su da su ćelijski uslovi ti koji određuju da li će biti uključeni anti- ili proapoptotski signali receptora 2 [133]. Antiapoptotksim signalima TNFR2 je odgovoran za preživljavanje CD4+ i CD8+ ćelija tokom klonalne ekspanzije pri imunološkom odgovoru na IĆ bakterijske patogene, tj za formiranje većeg broja efektorskih ćelija. Indirektna uloga TNFR2 u apoptozi je tzv „prelazak liganda“ (ligand passing) odnosno pojačavanje dejstva receptora 1. Po ovoj teoriji, TNFR2 velikim afinitetom vezuje ligand, ali s obzirom na brzu disocijaciju TNFR2-TNF kompleksa, on povećava koncentraciju liganda u blizini TNFR1, koji dalje deluje svojim putevima za ćelijsku smrt. Što se tiče uloge ovih receptora u nekim procesima u usnoj duplji, dokazana je uloga TNFR1 i TNFR2 u patogenezi perikoronitisa [134], kao i uloga TNFR1 u ortodontskom pomeranju zuba [135]. Kao što je pomenuto, solubilni receptori prisutni su u niskoj koncentraciji i u serumu zdravih ispitanika [136]. Dokazano je takođe da koncentracije receptora variraju kod istih individua tokom vremena, ali da međusobni odnosi koncentracija R1 i R2 tokom vremena ostaju konstanti [128]. Kod osoba sa niskom koncentracijom solubilnih receptora, može doći do preterane ekspresije TNFα u oboljenjima, zbog nedostatka inhibitorne funkcije receptora. Slika 1.3: Interakcija TNFα sa TNFR1 i TNFR2 receptorima. Preuzeto iz [137] UVOD 29 1.8.1.4.Uloga TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2 u patogenezi dijabetesa Dugo je poznato da TNFα ima bitan uticaj na metabolizam lipida i glukoze u organizmu. Masno tkivo je važan endogeni izvor TNFα, i kod gojaznih produkcija ovog citokina povećana je na nivou i masnog i mišićnog tkiva. Uloga TNFα u patogenezi insulinske rezistencije kod gojaznih ostvaruje se putem inhibicije insulinskog receptora tirozin kinaze [89] i poremećene funkcije mitohondrija [138] u glatkim mišićnim i masnim ćelijama. TNFα utiče na IR i putem inhibicije supstrata insulinskog receptora (Insulin Receptor Substrate- IRS), tj. direktno fosforilacijom IRS i indirektno stimulacijom ekspresije supresora citokinske signalizacije [139]. TNFα putem svojih receptora u poprečno-prugastim mišićima smanjuje aktivnost 5’AMP- aktivisane protein kinaze koja daljim mehanizmima dovodi do smanjenja fosforilacije Acetil-koenzim A karboksilaze što zatim dovodi do smanjenja oksidacije masnih kiselina, povećane akumulacije diacilglicerola u skeletnim mišićima i povećanja IR [140]. Takođe, sinergistički sa IFNγ, deluje na Ca++ kanale, što dovodi do disfunkcije mitohondrija i aktivacije kaspaza [141]. Na nivou masnog tkiva, TNFα vrši nishodnu regulaciju gena za GLUT4, glukoznog transportera koji reaguje na insulin [142]. Na nivou adipocita TNFα inhibira PPAR (Peroxisome Proliferator –activator receptor), neophodan u adipogenezi, regulaciji funkcije adipocita, ali i osetljivosti masnih ćelija na glukozu. Postoje dokazi da je posledica hronične ekspozicije ovom citokinu, nishodna regulacija ekspresije gena za kodiranje insulinskog receptora i supstrata insulinskog receptora-IRS [143]. Osim ove direktne uloge, TNFα deluje i indirektno na IR, putem stimulacije hormona stresa. Među mnogobrojnim proinflamatornim citokinima, TNFα je prvi koji je povezao gojaznost, insulinsku rezistenciju i inflamaciju [138]. S obzirom na ulogu TNFα u smanjenju telesne mase, smatra se čak da je insulinska rezistencija cena koju organizam plaća zbog pokušaja smanjenja telesne mase posredovanog TNFα [144]. Neki animalni modeli pokazuju povećane koncentracije TNFα u Langerhansovim ostrvcima negojaznih miševa [145], kao i ubrzavanje razvoja dijabetesa kod negojaznih miševa [146], na ove načine pripisujući ulogu TNFα u patogenezi dijabetesa nezavisnoj od gojaznosti. Nalazi koncentracije sistemskog TNFα kod pacijenata sa poremećenom tolerancijom glukoze, IR i T2D su oprečni. Koncentracije TNFα u serumu obolelih od dijabetesa su povećane [61] ili nepromenjene [147]. Pacijenti sa poremećenom tolerancijom glukoze takođe pokazuju nepromenjen [148], ili povećan nivo TNFα UVOD 30 [149]. Povećanje koncentracije LTα nađeno je kod velikog broja pacijenata sa dijabetesom [150]. Poređenje koncentracija proinflamatornih citokina na ljudima je otežano zbog uticaja stila života (stres, vežbanje, pušenje cigareta...) i eventulano još neprepoznatih komorbiditeta na ekspresiju TNFα. S obzirom da TNFα deluje putem svojih receptora, za nastanak i progresiju oboljenja potrebna je i disfunkcija receptora. Studije na genetski gojaznim miševima pokazuju da je TNFR1 glavni medijator TNFα posredovane IR, ali da TNFR2 može da pojača ovaj efekat [151]. Smanjeno oslobađanje TNFR1 i povećanje TNFR2/TNFR1 odnosa povezano je sa IR [152]. Dokazana je inverzna korelacija nivoa sistemskih citokina sa insulinskom osetljivošću [153]. TNFα je jedan od glavnih medijatora patogeneze dijabetesne nefropatije (DN) [154]. TNFα sistem deluje putem ekspresije athezionih molekula i hemokina, apoptoze/nekroptoze oštećenih ćelija [155], alteracijama intraglomerularnog protoka krvi, povećane permeabilnosti endotela i indukcije oksidativnog stresa. Pokazana je snažna korelacija između cirkulišućih TNFR1 i TNFR2 i krajnjeg stadijuma dijabetesne nefropatije [156]. Proliferativna dijabetesna retinopatija (PDR), mikrovaskularna hronična komplikacija dijabetesa, karakteriše se aktivnom neovaskularizacijom retine, i formiranjem fibrovaskularnog tkiva u vitroretinalnom okruženju. TNFα dokazan je u ekstracelularnom matriksu, endotelu i krvnim sudovima novostvorenog fibrovaskularnog tkiva, kao i u staklastom telu pacijenata sa ovom komplikacijom [157]. Dijabetesna neuropatija (DN) je najčešća hronična komplikacija dijabetesa, i posebno je klinički značajna jer je u velikom broju slučajeva nezavisna od glikoregulacije. Zbog ovoga se smatra da do ove komplikacije dolazi zbog prisustva ranih biohemijskih medijatora koji kada jednom pokrenu proces, nezavisni su od inicijalnog stimulusa. Sve veći broj dokaza govori u prilog uticaja inflamatornih medijatora u nastanku i razvoju DN. Dokazi o ulozi TNFα u razvoju ove komplikacije su oprečni [158, 159]. Dokazana je uloga TNF sistema i u patogenezi makrovaskularnih komplikacija dijabetesa. TNFα povećava ekspresiju endotelina 1 i angiotenzina [160], medijatora odgovornih za ubrzavanje ateroskleroze. Oslobađanje receptora, koje predstavlja indikator aktivacije TNF sistema, je u pozitivnoj korelaciji sa hipertenzijom i kod zdravih i kod osoba sa dijabetesom [152]. UVOD 31 1.8.1.5.Uloga TNF/TNFR u patogenezi parodontopatije Već je dokazano da destrukcija u parodoncijumu nastaje većim delom kao posledica proinflamatornih citokina, eikosanoida, slobodnih radikala i ostalih efektorskih molekula koje sekretuje sam domaćin. Ključnu ulogu u inicijaciji i prolongaciji ovih mehanizama ima TNFα. Uloga TNFα u destrukciji mekih tkiva U parodontalnim tkivima, TNFα i TNFR1 pokazuju gotovo istu distribuciju i eksprimiraju se na endotelnim ćelijama i fibroblastima u zdravim tkivima, dok se u hroničnoj parodontopatiji eksprimiraju dodatno i na sulkusnim epitelnim i monocitno- makrofagnim infiltrišućim ćelijama. [161]. TNFR2 se u gingivi bez kliničkih znakova parodontopatije gotovo ni ne eksprimira, dok se kod hronične parodontopatije detektuje u manjoj meri na infiltrišućim monocitno-makrofagnim ćelijama [161], ali i gingivalnim fibroblastima in vitro [162]. LTα pokazana je na infiltrirajućim limfocitima u gingivi oboleleih od parodontopatije [163]. Lokalizacija TNFα, LTα i njihovih receptora u ovim tkivima omogućava autokrino i parakrino delovanje liganada. Na nivou sulkusnih epitelnih ćelija i gingivalnih fibroblasta, a putem R1 receptora, TNFα povećava ekspresiju matriksnih metaloproteinaza MMP1, MMP8, MMP13 [164]. U endotelnim ćelijama, ovim putem se stimuliše athezija polimorfonukleara, limfocita i makrofaga [161]. TNFα i LTα indukuju ekspresiju drugih medijatora koji pojačavaju i održavaju inflamatorni odgovor (npr. prostaglandini), stimulišu produkciju lizirajućih enzima i pojačavaju fagocitnu aktivnost [165]. Za razliku od štetnih efekata koje ispoljavaju TNFα i TNFR1, TNFR2 ublažava gubitak kosti u parodontopatiji na animalnom modelu [166] i modulira zapaljenje posredovano TNFα [162]. Na animalnom modelu pokazano je da Etanercept, solubilni agonist TNFR2 dovodi do smanjenja aktivacije TNFα, smanjenja infiltracije neutrofila, umanjenja apoptoze i stvaranja iNOS, kao i povrede gingivomukoznih tkiva pacova [165]. Oslobađanje TNFR2 iz fibroblasta u parodontopatiji može se tumačiti kao pokušaj neutralizacije samog TNFα [162]. Nedovoljne količine ovog receptora dovode do progresije parodontopatije. TNFα detektovan je u sulkusnoj tečnosti pacijenata obolelih od parodontopatije, ali je nađen i u obolelim mestima pre klinički dijagnostikovanog oboljenja [167]. Druga UVOD 32 istraživanja pokazuju niske koncentracije TNFα u sulkusnoj tečnosti obolelih od parodontopatije [168], ili čak manje vrednosti kod pacijenata sa T2D i PD u odnosu na sistemski zdrave ispitanike sa PD [169]. Neke studije pokazuju pozitivnu korelaciju TNFα sa TNFR1 i TNFα sa TNFR2 u sulkusnoj tečnosti [170]. Dokazana je i pozitivna korelacija između koncentracije TNFR1 i TNFR2 sa dubinom sondiranja, pri čemu sa porastom dubine sondiranja dolazi do disbalansa receptora, odnosno porast TNFR2 ne može da prati TNFR1 [170]. Odnos TNFR2/TNFR1 sa DS negativno korelira, što takođe govori u prilog zaštitne uloge TNFR2 na destrukciju parodoncijuma, odnosno veće destrukcije na mestima na kojima TNFR2 ne može da se proizvede u odgovarajućoj količini [170, 171]. Koncentracije receptora u gingivalnoj tečnosti smanjuju se nakon kauzalne faze terapije parodontopatije [171]. U svakom slučaju, istraživanja su pokazala da odnos stanja parodontalnog džepa i sekrecije citokina nije jednostavan, već da na njega utiče individualni imuni odgovor domaćina, proteolitički enzimi u ćelijama i drugi inflamatorni medijatori [170]. Uticaj TNFα na metabolizam kosti Tradicionalno opisivana uloga TNFα u patogenezi parodontopatije je osteoklasno indukovana resorpcija kosti kao i inhibicija osteogeneze [62]. TNFα je jedan od najpotentnijih induktora osteoklastogeneze u inflamaciji. TNFα stimuliše osteoklasnu resorpciju kosti in vivo [172] i in vitro [173]. Dokazano je da je TNFα glavni medijator lipopolisaharidima indukovane osteoklastogeneze i da se ova funkcija vrši putem TNFR1 receptora [174]. TNFα, zajedno sa IL-1 stimuliše stvaranje višejedarnih gigantskih ćelija sa karakteristikama osteoklasta u humanoj kosnoj srži [175]. U procesu geneze osteoklasta, uloga TNFα je u procesima determinisanja makrofagne linije ka osteoklastima, ali i kasnije u procesima fuzije monojedarnih u višejedarne gigantske ćelije. Ispitivanja molekularnih mehanizama putem kojih TNFα deluje na resorpciju su oprečna i pokazuju da ovaj citokin deluje putem RANKL mehanizma, a po nekim studijama i samostalno. Dodavanje TNFα in vitro sistemu pospešuje osteoklastogenezu pod uticajem RANKL; antiTNFα i antiTNFR1 antitela inhibiraju ovaj proces, dok dodavanje antiTNFR2 antitela ne remeti diferencijaciju osteoklasta [176]. Studije sa antiTNFR1 antitelima nisu konzistentne, tako neke pokazuju poremećaje osteoklastogeneze [177], dok druge nisu pokazale signifikantan uticaj ovih antitela [62]. UVOD 33 Rezultati uticaja antiTNFR2 antitela su konzistentiji i pokazuju pojačanu osteoklastogenezu kod TNFR2 nokaut miševa, što govori u prilog zaštitne uloge ovog receptora u koštanom metabolizmu [177]. Takođe, eksperimentalna parodontopatija tretirana Etanerceptom, agonistom TNFR2 pokazala je smanjen gubitak koštanog tkiva [165]. TNFα koji deluje na RANKL indukovanu osteoklastogenezu deluje autokrinim i parakrinim [178] mehanizmima, ali postoje dokazi i o uticaju sistemski sintetisanog TNFα na pojačanu osteoklastogenezu. S druge strane, postoje dokazi o pozitivnom ali slabom uticaju TNFα na osteoklastogenezu bez RANKL-a [176], i dokazi o formiranja malog broja osteoklasta kod RANK - / - životinja [179]. RANKL dovodi do povećanje ekspresije i sekrecija TNFα, dok sam TNFα ne utiče na ekspresiju RANKL-a [176]. OPG inhibira RANKL indukovanu osteoklastogenezu i ekspresiju TNFα, ali ne utiče na aktivnost već sekretovanog TNFα [176]. Osim dobro poznate uloge TNFα u diferenciranju osteoklasta, kao što je već pomenuto, poznata je i uloga ovog citokina i u inhibiciji osteoblastogeneze. In vitro studije pokazale su da je potentni inhibitor osteoblastogeneze iz prekursornih ćelija, da deluje distalno od koštanog morfogenog proteina (BMP) i da suprimira transkripciju izazvanu vitaminom D. Sve ove funkcije ostvaruju se putem TNFR1 receptora [180]. S druge strane, najnoviji dokazi govore u prilog stimulatornog delovanja niskih koncentracija TNFα na osteoblastogenezu [181]. Dokazano je stimulatorno dejstvo na ovaj proces putem povećavanja oslobađanja koštanog morfogenog proteina 2 (BMP-2) [182], kao i autokrinom stimulacijom osteoblasta [183]. 1.9.Polimorfizmi Polimorfizmi označavaju razlike u sekvenci molekula DNK koje postoje između zdravih individua jedne vrste. Tipični humani genom razlikuje se od referentnog genoma u 4,1-5 miliona mesta/pozicija. Preko 99% ovih razlika čine tačkasti polimorfizmi odnosno polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) i mali insercioni/delecioni polimorfizmi [184], dok sami SNP čine preko 85% genetičke varijabilnosti čoveka. Broj varijantih mesta razlikuje se među populacijama, pri čemu najveću stopu polimorfizama pokazuje afrička, a najmanju evropska populacija. Ukoliko posmatramo samo varijacije genoma koji utiču na funkciju gena- funkcionalne varijacije, tipični genom sadrži 149-182 mesta koja direktno skraćuju proteine, 10 000-12 000 mesta koja dovode do menjanja sekvenci UVOD 34 proteina i 459 000-565 000 mesta koja utiču na regulatorne genske sekvence (promotori, vodeće sekvence- UTR, pojačivači, sajlenseri i dr.) [184]. SNP, predstavljaju varijacije jednog baznog para DNK pri čemu su alternativne sekvence (aleli) prisutni u najmanje 1% normalnih individua određene populacije [185]. SNP koji se nalazi na promotorskom regionu ispred naziva ima negativan predznak („- “), dok onaj lociran u intronima ili egzonima nosi pozitivan predznak („+“) a broj označava mesto nukleotida u odnosu na početno transkripciono mesto. Drugi način, i danas zastupljeniji, nomenklature SNP je na osnovu jedinstvenog registarskog broja rs broj (Reference SNP Number). Učestalost alela se razlikuje od populacije do populacije, odnosno veoma učestao alel u jednoj populaciji u drugoj može biti veoma redak. Takođe, varijacije alela mogu biti „privatni polimorfizmi“ u slučajevima reproduktivno izolovanih populacija [186]. Populaciono zavisno je i definisanje mogućih genotipova na divlje (wild type) i mutirane (mutant) homozigote, odnosno divlji tip u jednoj populaciji se u drugoj definiše kao mutirani. Pri analiziranju polimorfizama kao modifikatora oboljenja, posebna pažnja obraća se i na gametksu neravnotežu povezanosti (Linkage disequilibirum (LD)), odnosno pojavu da dva polimorfizma nisu međusobno nezavisna, već se javljaju (nasleđuju) zajedno. I polimorfizmi koji pokazuju LD su u osnovi nastali nezavisno, ali se kroz generacije prenose i češće javljaju zajedno. Ova pojava je korisna jer omogućava predikciju polimorfizama lokusa koje nismo ispitivali na osnovu ispitivanih varijacija, odnosno omogućava postojanje surogata markera polimorfizama. Mana ovih analiza je nestabilnost LD, odnosno što se stepen nezavisnosti smanjuje kroz generacije [185], zahvaljujući rekombinacijama tokom mejoze. Što su dva lokusa prostorno bliža, veća je stabilnost LD-a. Najvažniji parametri za merenje LD su r2 i D’. Oba parametra se kreću u opsegu od 0 (odsustvo vezanosti neravnoteže) do 1 (potpuna vezanost-neravnoteža). Iako polimorfizmi po definiciji predstavljaju normalne varijacije, povezani su sa individualnom osetljivošću na različite stimuluse [187]. S obzirom na to da je sinteza citokina strogo programiran proces kontrolisan na mnoštvu nivoa, SNP-ovi mogu imati uticaj na transkripciju, stabilnost RNK, na stepen ekspresije ovih citokina [188], na oslobađanje njihovih solubilnih formi i dr. [189]. Ove varijacije utiču na individualni inflamatorni odgovor, urođeni i/ili stečeni imunitet, ili pak menjaju uslove za UVOD 35 kolonizaciju određenih mikroorganizama [190], što nekada dobija klinički značaj tek kada osoba postane podložnija oboljenjima npr. zbog starenja ili pridruženih stanja i oboljenja. Razumevanje i povezivanje polimorfizama sa određenim bolestima predstavlja veliki korak u objašnjavanju mnogobrojnih poligenih oboljenja. Problem poligenih oboljenja je potencijalno sinergističko delovanje stotina/hiljada polimorfizama i njihova interakcija sa faktorima sredine, životnim navikama koji se često razlikuju i u okviru homogenih grupa. Tako da pri analizi ovih varijacija treba voditi računa o potencijalnim specifičnim kombinacijama funkcionalnih polimorfizama, evaluaciji funkcionalnh posledica SNP-ova, postojanju neravnoteže povezanosti (LD), kao i mogućeg uplitanja epigenetskih varijacija [190]. Značaj ovih istraživanja nije samo u etiološkom povezivanju oboljenja sa određenim varijacijama, nego i razvoju preventivnih mera, ranih profilaktičkih i terapeutskih mera, kao i prognoza samog ishoda bolesti. Bez obzira što su neke studije asocijacije nedovosmisleno povezale određene tačkaste polimorfizme sa nekim oboljenjima, rezultati su i dalje prilično šaroliki. Nemogućnost poređenja rezultata i kreiranja jedinstvenog stava po ovom pitanju u nauci proističe iz različitosti populacija koje su ispitivane, studija koje uglavnom koriste mali uzorak i mali broj ispitivanih polimorfizama i različitih metodoloških pristupa. 1.9.1.Polimorfizam u genu za TNFα (-308G/A, rs1800629) Gen koji kodira TNFα, zajedno sa genom za LTα, deo je glavnog gena histokompatibilosti (eng. Major Histocompatibility Complex, MHC). Dužine 3kb, lociran je na kratkom kraku hromozoma 6 (6p21.32). MHC karakteriše najveća gustina lokusa koji su odgovorni za određivanje individualnog imunog odgovora i ujedno je region sa najvećim brojem polimorfizama u genomu [191]. Gen za TNFα sastoji se od 4 egzona , a više od 80% ovog citokina kodirano je četvrtim egzonom [192]. Do sada je identifikovan veći broj polimorfizama na ovom lokusu (na poziijama −1031,−863 −857 −574 −376, −308, −244, −238, +70, +489 itd.). Polimorfizam na poziciji -308G/A (naziv u bazi tačkastih polimorfizama: rs1800629) lociran je u promotorskom regionu na 5’ kraju lanca (Tabela 1.5). Ovde dolazi do zamene guanina adeninom, sa tri potencijalna genotipa: GG, homozigot 1 ili divlji tip kako ga definišemo u evropskoj populaciji, GA ili heterozigot i AA, homozigot 2, odnosno mutantni homozigot za evropsku populaciju. Približno 60-70% bele populacije UVOD 36 su GG homozigoti (TNFR1 alel), 30-40% su heterozigoti, dok su samo 1,5-3% ove populacije AA homozigoti (TNFR2 alel) [193]. Ovaj polimorfizam je većina studija povezala sa povećanom produkcijom TNFα [191, 194] Povezanost ovog promotorskog polimorfizma sa različitim oboljenjima i stanjima bila je predmet brojnih studija. Sa ovim polimorfizmom povezivani su odbacivanje kalema, hronična opstruktivna bolest pluća, glaukom, Gravesova bolest, migrene, psorijaza i mnoge druge. Uticaj ovog polimorfizma na patogenezu ateroskleroze nije dokazan, ali u sadejstvu sa pušenjem cigareta može biti bitan faktor [195]. A alel povezan je sa povećanim rizikom od astme [196], i Kronove bolesti [197]. Što se tiče uticaja na multiplu sklerozu, rezultati su vrlo oprečni, a neki čak govore u prilog protektivnoj ulozi A alela u ovom oboljenju [198]. Takođe, tok i ishod sepse povezani su sa ovim SNP-om [199]. Nije nađena veza ovog polimorfizma sa T2D ili gojaznošću u populaciji pacijenata iz Tunisa [200], niti je povezan sa dijabetesnom nefropatijom ispitanika kineske populacije [201]. I u evropskoj populaciji nalazimo rezultate nepostojanja asocijacije - 308G/A TNF sa dijabetesom, dijabetesnom nefopatijom [202], retinopatijom i hipertenzijom kod ispitanika sa T2D [203]. Na britanskoj populaciji velika studija asocijacije nije uspela da dokaže povezanost nijednog od 11 najčešće ispitivanih polimorfnih mesta TNF/LT lokusa [204] sa T2D. S druge strane, postoje i dokazi o povezanosti dijabetesa/komplikacija sa 308G/A TNF. Tako je u populaciji Severnih Indijanaca pokazana veza, ali zavisna od indeksa telesne mase [205]. U Hrvatskoj je takođe nađena veza ovog polimorfizma sa tipom 1 dijabetesa u porodicama [206]. U populaciji Kurda GA i AA genotip pokazali su 2,24 i 3,18 puta veći rizik za oboljevanje od T2D u odnosu na GG genotip [207], dok je na ispitanicima iz Indije polimorfizam povezan sa T2D, sa dijabetesnim stopalom i povećanom proizvodnjom citokina u dijabetesu [208]. Na beloj populaciji u Brazilu dokazana je veza dijabetične proliferativne retinopatije i -308G/A TNF [209], dok je na ispitanicima iz Skandinavije SNP povezan sa makrovaskularnim komplikacijama dijabetesa [210]. Iako je veza polimorfizama sa parodontopatijom počela kasnije da se ispituje, i na ovu temu postoji značajan broj radova, sa vrlo oprečnim rezultatima. Sam -308G/A polimorfizam nije povezan sa hroničnom parodontopatijom u evropskoj [211], turskoj [212], tajvanskoj [213] i kineskoj populaciji [214]. U evropskoj populaciji ovaj UVOD 37 polimorfizam ima uticaj na rizik od oboljevanja od parodontopatije kada je udružen sa +252A/G LT polimorfizmom [211]. S druge strane, AA genotip povezan je sa hroničnom parodontopatijom u kineskoj, kao i sa stepenom napredovanja parodontopatije u evropskoj populaciji [215, 216]. U beloj rasi dokazana je povezanost podložnosti hroničnoj parodontopatiji sa A alelom [217], kao i povezanost prisustva bakterije Prevotella intermedia kod nosilaca GA+AA genotipa i A alela [218]. Vrlo je ograničen broj radova koji ispituju ove polimorfizme kod obolelih od dijabetesa i parodontopatije. U kineskoj populaciji nađena je razlika u distribuciji genotipova kod sistemski zdravih i obolelih od dijabetesa sa parodontopatijom, i u obe grupe A alel povezan je sa većim vrednostima DS i NPE [219]. Na ispitanicima iz Indije pri ispitivanju zdravih kontrola, pacijenata sa parodontopatijom i obolelih od dijabetesa tipa 2 i parodontopatije, G alel bio je protektivan za oboljevanje od parodontopatije i zajedno parodontopatije i dijabetesa [220]. Tabela 1.5: Karakteristike polimorfizama TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2 Citokin Rs broj Alternativni naziv Hromozom Lokacija na genu TNFα rs1800629 -308 G/A TNF Hromozom 6 31651010 Promotor LTα rs909253 +252 A/G LT Hromozom 6 31648292 Intron 1 TNFR1 rs767455 +36 A/G Hromozom 12 6341779 Egzon 1 TNFR2 Rs1061622 +676T/G Hromozom 1 12192898 Egzon 6 1.9.2.Polimorfizam LTα+252A/G (rs909253) Gen koji kodira LTα smešten je zajedno sa genom za TNFα na hromozomu 6p21.3- 21.1. Otkriveno je nekoliko polimorfizama na ovom lokusu (+10G/A, +80A/C, +204G/C, +252A/G, +804 itd.) [221]. Polimorfizam +252A/G lociran je u prvom intronu (Tabela 1.5). Zamena adenina guaninom u procesu transkripcije rezultira zamenom aminokiseline asparagin treoninom [222]. Tri su potencijalna genotipa kao posledica ove zamene: AA, homozigot 1 ili divlji tip, heterozigot AG i GG genotip, homozigot 2, mutirani tip. U beloj populaciji 40% je nosilaca AA genotipa, 45% hetrozigotnog genotipa, a samo 15% pokazuje GG genotip [193]. UVOD 38 GG genotip povezan je sa povećanom produkcijom LTα in vitro [222] i in vivo [163, 223, 224] kao i sa povećanom produkcijom TNFα [225]. Rezultati povezanosti ovog polimorfizma i ankilozirajućeg spondilitisa su oprečni [226, 227], kao što su i za većinu oboljenja poput autoimunih oboljenja štitne žlezde [228], hronične limfocitarne leukemije [229], reumatoidnog artritisa i sistemskog lupusa eritematodusa [230], Behčetove bolesti [231] i mnogih drugih. Na evropskoj (Britanija) populaciji velika studija asocijacije nije uspela da dokaže povezanost nijednog od 11 najčešće ispitivanih polimorfizama TNF/LT lokusa sa hroničnom parodontopatijom [204]. Na tajvanskoj populaciji nije nađena razlika asocijacija između ovih polimorfizama i hronične parodontopatije [213]. U evropskoj populaciji su tri studije iz Češke našle ređi- GG genotip i/ili G alel kao protektivan za hroničnu parodontopatiju [163, 211, 232]. S druge strane, na Brazilskoj populaciji GG genotip, odnosno G alel povezan je sa 2,67 puta većim rizikom za nastanak parodontopatije, odnosno suprotno prethodnim studijama alel A je protektivan [233]. Takođe, +252A/G LT i -308G/A TNF nisu povezani sa gestacionim dijabetesom [234]. SNP u intronu 1 gena za LTα povezan je sa dijabetesnom nefropatijom, ali ne i sa neuropatijom, retinopatijom i makrovaskularnim komplikacijama [210]. Pojedine studije povezuju alel A sa povećanim rizikom za nastanak dijabetesa [235, 236], dok druge G alel povezuju sa komplikacijama dijabetesa i povećanom produkcijom LTα [223]. Pretragom literature nisu nađeni podaci o rezultatima istraživanja +252A/G LT polimorfizma i ispitanika sa dijabetesom i parodontopatijom. 1.9.3.Polimorfizam na genu za TNFR1 (+36A/G, rs767455) Gen koji kodira TNFR1 nalazi se na hromozomu 12 (pozicija 12p.13) i sastoji se od 10 egzona. U ovom genu otkriveno je više polimorfizama u promotorskom reginou, egzonu 1, kao i u intronima 1, 2, 4, 6, 7 i 8 (-609 G/T, -580A/G, -383A/C, -329T/G, -300A/G, - 102A/C +36 A/G,+49C/T) [237]. Zamena adenina sa guaninom u egzonu 1 na poziciji +36 dovodi do zamene poslednjeg nukleotida u kodonu 12 (CCA→CCG) i predstavlja sinonimni polimorfizam, odnosno ne utiče na proteinsku strukturu receptora (Prolin→Prolin) [238]. Tri su potencijalna genotipa kao posledica ove zamene: AA (homozigot 1), AG (heterozigot) i GG (homozigot 2), odnosno dva alela A alel i G alel. UVOD 39 Isptivan je uticaj ovog polimorfizma na mnoga oboljenja kao što su Gravesova bolest [238], plućna aspergiloza, reumatoidni artiritis [239], Kronova bolest [240] kao i uticaj na individualni odgovor na antiTNF terapiju kod pacijenata sa autoimunim oboljenjima gde je dokazan slabiji biološko odgovor kod ispitanika sa ovim polimorfizmom [241]. Pretragom pristupačnih baza podataka nađena je studija na japanskim ispitanicima koja nije dovela u vezu SNP-ove u genima za TNF receptore i agresivnu formu parodontopatije [242]. 1.9.4.Polimorfizam TNFR2 (rs1061622) Gen koji kodira TNFR2 nalazi se na hromozomu 1 ( pozicija 1p36.2) i takođe se sastoji od 10 egzona. U ovom genu otkriveno je više tačkastih polimorfizama (+593G/A, +598T/G, +620T/C, +676 T/G +1663 G/A, +1668 T/G itd.) [243]. Egzon 6 kodira mali deo transmembranskog regiona koji učestvuje u oslobađanju solubilnih formi receptora. Najizučavaniji SNP ovog gena, pri kojem dolazi do zamene timidina guaninom na poziciji +676 (kodon 196), nalazi se u ovom egzonu. Javljaju se tri genotipa, TT (homozigot 1), TG (heterozigot) i GG (homozigot 2), odnosno dva alela T i G alel. Kao posledica zamene ovih baza dolazi do promene u primarnoj proteinskoj strukturi, odnosno dolazi do zamene aminokiseline metionin argininom (196Met→Arg) u cisteinom bogatom ekstracelularnom delu receptora. Ova zamena aminokiselina utiče na oslobađanje solubilnih formi receptora [238], vezivanje receptora za ligand i/ili TNF- om indukovanu apoptozu putem poremećene signalizacije NF-κB [244]. Istraživanja su pokazala i povezanost ovog SNP-a sa povećanim koncentracijama sTNFR2 [189, 245], mada su rezultati oprečni [246]. Ovaj široko izučavani SNP povezan je sa mnogim oboljenjima, kao što su Gravesova bolest [238], reumatoidni artiritis [239], Kronova bolest [240] i dr. Iako je dokazana protektivna uloga TNFR2 na parodontalna tkiva, kao i uticaj +676T/G SNP-a na oslobađanje solubilnih formi ovog receptora, pretragom literature nismo našli istraživanje koje je povezivalo ovaj SNP sa hroničnom parodontopatijom. SNP u ovom //genu, ali na poziciji +587 u japanskoj populaciji povezan je sa hroničnom parodontopatijom [247]. Postoji puno dokaza o upletenosti TNFR2 u patogenezu dijabetesa i/ili njegovih hroničnh komplikacija, ali bez obzira na to, mali je broj istraživanja povezivalo +676T/G TNFR2 polimorfizam sa ovim oboljenjem. CILJEVI 40 2. POLAZNA HIPOTEZA I CILJEVI STUDIJE Već je pomenuto da su polimorfizmi populaciono i etnički definisane varijacije genoma. Ne postoji studija na ispitanicima populacije u Srbiji koja ispituje prisustvo ovih polimorfizama kod pacijenata sa tipom 2 dijabetesa i hroničnom parodontopatijom. 2.1.Polazna hipoteza Polazne hipoteze ovog istraživanja bile su: 1. Hronična parodontopatija i tip 2 dijabetesa dele zajedničke patogenetske mehanizme 2. Polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNP) TNF-α -308 G/A, LT-A +252A/G, TNFR2 +676 Т/G mogu imati uticaj na nivo cirkulišućih citokina 3. Produkcija citokina u inflamiranom parodoncijumu može imati uticaj na nivo sistemskih citokina 4. Polimorfizmi TNF-α -308 G/A, LT-A +252A/G, +36 A/G TNFR1, TNFR2 +676 Т/G mogu biti modulatori rizika za nastanak hronične parodontopatije i tipa 2 dijabetesa, kao i imati uticaja na kliničke slike ova dva oboljenja 2.2.Ciljevi istraživanja 1. Određivanje distribucije genotipova i alela za polimorfizme u genima za proinflamatorne citokine (TNF-α i LT-A) i njihove receptore (TNFR1 i TNFR2) kod tri grupe ispitanika (pacijenata sa hroničnom parodontopatijom, hroničnom parodontopatijom i dijabetes melitusom tip 2, i sistemski zdravih osoba bez kliničkih znakova parodontopatije). 2. Poređenje učestalosti genotipova i alela u tri grupe ispitanika i polimorfizama kao faktora koji povećavaju rizik za oboljevanje od hronične parodontopatije i tipa 2 dijabetesa 3. Određivanje nivoa cirkulišućih citokina/receptora kod tri grupe ispitanika 4. Određivanje odnosa sistemskih nivoa citokina/receptora u odnosu na stanje tkiva parodoncijuma kod dve grupe ispitanika sa dijagnostikovanom hroničnom parodontopatijom 5. Određivanje odnosa polimorfizama proinflamatornih citokina/receptora u odnosu na stanje tkiva parodoncijuma kod tri grupe ispitanika CILJEVI 41 6. Ispitivanje odnosa kliničkog stanja tkiva parodoncijuma sa stepenom glikoregulacije pacijenata sa dijabetes melitusom tip 2 i hroničnom parodontopatijom. MATERIJAL I METODE 42 3. ISPITANICI, MATERIJAL I METODE 3.1. Podaci o studiji Ova studija preseka sprovedena je u periodu od septembra 2012. godine do februara 2014. godine. Istraživanja su sprovedena na Klinici za oralnu medicinu i parodontologiju Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, Klinici za dijabetes i bolesti metabolizma Kliničkog centra Srbije, Laboratoriji za humanu genetiku Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, Biohemijskoj laboratoriji Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, Odeljenju za molekularnu biologiju Instituta za biološka istraživanaja „Siniša Stanković“. Doktorska disertacija predstavlja deo istraživanja koje se obavlja u okviru projekta Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Vlade RS, Ev. br. 41008 pod nazivom “Interakcija etiopatogenetskih mehanizama parodontopatije i periimplantitisa sa sistemskim bolestima današnjice” Istraživanje je odobreno od strane Etičkog komiteta Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu (36/9 od 20. februara 2013.) . Pacijenti su dobijali obrazac „Informacije za pacijenta“ i usmeno dodatno objašnjenje o studiji u kojoj učestvuju i potpisivali su obrazac „ Informisane saglasnosti“. Validnost obrazaca je kontrolisana na Etičkom komitetu od kojeg je dobijena saglasnost za istraživanje. 3.2.Ispitanici U studiji je učestvovalo 180 međusobno nesrodnih ispitanika bele rase srpske nacionalnosti podeljenih u tri grupe. Prvu grupu (zdrave kontrole-ZK, N=56) činili su sistemski zdravi pacijenti bez kliničkih znakova parodontopatije. Drugu grupu (parodontopatija grupa-PG, N=59) sačinjavali su takođe sistemski zdravi pacijenti, ali sa dijagnostikovanom hroničnom parodontopatijom. Prve dve grupe pacijenata činili su volonteri i pacijenti Klinike za oralnu medicinu i parodontologiju Stomatološkog fakulteta u Beogradu. Treća grupa pacijenata (Tip 2 dijabetesa grupa-T2D, N=65) formirana je od hospitalizovanih pacijenata sa dijagnostikovanim tipom 2 dijabetesa i hroničnom parodontopatijom Klinike za dijabetes i bolesti metabolizma Kliničkog MATERIJAL I METODE 43 centra Srbije, kao i ispitanika Klinike za oralnu medicinu i parodontologiju Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. 3.2.1. Kriterijumi isključivanja iz studije Da bi bili uključeni u istraživanje pacijenti su morali biti stariji od 18 godina. Kriterijumima isključenja iz studije smo pokušali da eliminišemo faktore koji utiču na kliničku sliku hronične parodontopatije, tipa 2 dijabetesa i nivo sistemskih citokina. Kriterijumi za isključivanje iz studije bili su: prisustvo sistemskih oboljenja sem T2D i njegovih komplikacija i pratećih promena u krvnoj slici i biohemiji, istorija bilo kog maligniteta, prisustvo bilo kog oralnog oboljenja sem karijesa i hronične parodontopatije, prisustvo manje od 14 zuba ne računajući treće molare, indeks telesne mase (ITM) 18,5kg/m 2 >ITM>30kg/m 2 , menstruacija, trudnoća, period dojenja, povrede u prethodne 2 godine. Takođe, ispitanici koji su u poslednjih 6 meseci koristili antibiotsku, kortikosteroidnu ili antiinflamatornu terapiju, oni koji svakodnevno koriste oralne antiseptike ili im je sprovedena kauzalna faza terapije parodontopatije u poslednjih godinu i po dana, isključeni su iz studije. 3.3. Anamneza, istraživački karton U okviru istraživačkog kartona pacijenti su popunjavali anamnestičke podatke od značaja za naše istraživanje prikupljanje u naše istraživačke kartone (Prilog 1). Davali su podatke o starosti, polu, obrazovanju (osnovno, srednje, visoko i više, student, magistri i doktori nauka), porodičnoj anamnezi (bez oboljenja, parodontopatije, dijabetes melitus, druga oboljenja od značaja za hereditet). Davali su podatke o svojoj visini i težini da bismo računali indeks telesne mase (ITM) (količnik telesne mase merene u kg sa kvadratom telesne visine u metrima). Prikupljali smo podatke o pušačkim navikama. Podelili pacijente na pušače i nepušače. Pušače smo dalje podelili na osnovu broja popušenih cigareta na dan, na podgrupe sa više odnosno manje od 10 cigareta na dan. Za trenutne pušače smo takođe računali i prosečan indeks paklo-godine. Indeks paklo-godina izračunava se kada se umnožak prosečnog broja popušenih cigareta na dan i broja godina pušačkog staža podeli sa brojem 20, odnosno brojem cigareta u kutiji [248]. Bivše pušače smo podelili u dve podgrupe, one koji su ostavili pušenje cigareta pre manje, odnosno više od 5 godina. MATERIJAL I METODE 44 Beležili smo i podatke o disanju na usta, grickanju stranih predmeta, bruksizmu i stiskanju zuba. Podatke o mentalnom stresu beležili smo na sledeći način: ispitanici su davali informacije o učestalosti stresa definisanom kao nikad/retko (dodeljena vrednost 0), na mesečnom nivou (vrednost 1), na nedeljnom (vrednost 2) i dnevnom nivou (vrednost 3). Davali su informacije i o intenzitetu stresa definisanom na sledeći način: bez stresa (dodeljena vrednost 0), nizak nivo stresa (vrednost 1), umeren (vrednost 2) i visok intenzitet stresa (vrednost 3). Konačan nivo stresa dobijen je kao zbir učestalosti i intenziteta i definisan je kao: 0-1=nizak nivo stresa, 2-4= umeren nivo stresa, 5-6=visok nivo stresa [249]. Ispitanici su davali i podatke o fizičkom vežbanju u smislu redovnosti (nikad, redovno odnosno > 2 puta nedeljno i neredovno odnosno <2 puta nedeljno), vrsti vežbi (aerobne, anaerobne, kombinovane) i intenzitetu (slab, umeren, jak). 3.4.Biohemijski i parametri krvne slike Pratili smo i parametre krvne slike i biohemijske analize. Od parametara krvne slike pratili smo broj eritrocita (Er), vrednosti hemoglobina (Hgb), MCV (Mean Corpusular Volumen), MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin), MCHC (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration), HCT (hematokrit), leukocita i leukocitarne formule. Takođe, pratili smo vrednosti sedimenatacije i biohemijske parametre: vrednosti glukoze našte, glikozilovanog hemoglobina (HbA1c), ukupnog holesterola, HDL, LDL i vrednosti triglicerida. Vrednosti fibrinogena definisane su dihotomno, kao veće odnosno manje od 3,7 g/l. Tabela 2.1: Referentne vrednosti biohemijskih parametara u odnosu na pol, grupe i podgrupe pacijenata (sve vrednosti su predstavljene kao mmol/l) Grupa Param. KG+PG T2D Bez makrovaskul. kompl. Sa makrovaskual. kompl. Fibrinogen 3,7 3,7 3,7 HDL M >1,42 >1,15 >1,15 F >1,68 >1,29 >1,29 LDL <3,3 <2,6 <1,8 HOL <5,2 <3,3 <2,6 TGC <1,7 <1,7 <1,7 MATERIJAL I METODE 45 U odnosu na biohemijske parametre, pacijenti su podeljeni na dve grupe, pacijente čiji su nalazi u referentnim granicama i one čiji nalazi to nisu. S obzirom na razlike u opštem zdravstvenom stanju ispitivanih pacijenata, same referentne vrednosti su različite po grupama [250] (Tabela 2.1). 3.5.Klinički pregled i dijagnoza hronične parodontopatije Klinički pregled parodoncijuma i stanja mekih tkiva obavljao je kandidat uz pomoć osobe koja je beležila parametre u istraživački karton. Pregled je obavljen parodontalnom graduisanom sondom (UNC 15, Hu Friedy, Chicago, IL, USA), na šest tačaka po zubu (mezijalno, medijalno i distalno sa vestibularne i oralne strane) na svim prisutnim zubima sem trećim molarima. Radi evaluiranja stanja oralne higijene i kliničkog stanja potpornih tkiva zuba, praćeni su sledeći parametri: Plak Indeks-PI (Silness-Löe) [251], Dihotomni indeks krvarenja na provokaciju (KNP) [252], dubina sondiranja (DS) i nivo pripojnog epitela (NPE). Plak indeks (Silness-Löe) predstavlja indeks oralne higijene. Prati se prisustvo dentalnog plaka na ivici gingive, gingivalnoj trećini zuba i u gingivalnom sulkusu/parodontalnom džepu. Koristi se vizuelizacija i sondiranje. Merenja se vrše na svih 6 tačaka na zubu. Pre početka merenja, pacijent vodom dobro ispere usta u cilju uklanjanja svih mekih naslaga izuzev dentalnog plaka. Nakon sušenja zuba vazduhom, pristupa se pregledu. Vrednosti su definisane u rasponu 0-3 na sledeći način:  0: odusustvo plaka pri pregledu i na sondi nakon sondiranja  1: mala količina plaka koja se ne vidi, ali ostaje na sondi nakon sondiranja  2: pri pregledu se uočava umerena količina plaka u gingivalnoj trećini zuba, na ivici gingive i u gingivalnom sulkusu/parodontalnom džepu  3: obilje plaka koji pokriva površinu zuba i ispunjava gingivalni sulkus/parodontalni džep i površinu zuba Prosečna vrednost dobija se kao aritmetička sredina svih izmerenih vrednosti i kreće se u rasponu od 0,00-3,00. Pri daljim analizama, konačni skor delimo u podgrupe (rangove)  Rang 1: 0,00-1,00  Rang 2: 1,01-2,00  Rang 3: 2,01-3,00 MATERIJAL I METODE 46 Krvarenje na provokaciju (KNP) predstavlja meru zapaljenja potpornih tkiva zuba. Beleži se pojava krvarenja 15 sekundi nakon sondiranja. Vrednosti se definišu kao nula (0) kad je krvarenje nakon sondiranja odsutno ili jedan (1) kada je krvarenje prisutno. Ukupan rezultat se izražava kao procenat (%) mesta koja krvare i može biti u rasponu od 0-100%. Pri daljim analizama, vrednosti smo klasifikovali u četiri podrupe (ranga):  1: 0-25,00%  2: 25,01-50,00%  3: 50,01-75,00%  4: 75, 01-100%. Dubina sondiranja (DS) predstavlja rastojanje između ivice gingive i mesta gde je vrh parodontalne sonde pri blagom pritisku zaustavljen u predelu dna gingivalnog sulkusa/parodontalnog džepa. Izražava se u milimetrima (mm) u celim brojevima. Prosečna dubina sondiranja predstavlja aritmetičku sredinu svih merenih vrednosti. Za dalje istraživanja smo dubine sondiranja podelili u potkategorije (rangove) 1. : < 3mm 2. 3,1-4,0mm (blaga parodontopatija) 3. 4,1-6,0mm (umerena parodontpatija) 4. >6,1 mm (uznapredovala parodontopatija) Nivo pripojog epitela (NPE) predstavlja rastojanje od gleđno-cementne granice do koronarnog kraja degenerisanog pripojnog epitela, odnosno mesta gde se vrh parodontalne sonde zaustavi na dnu parodontalnog džepa. Izražava se u milimetrima (mm). Prosečna vrednost nivoa pripojnog epitela predstavlja aritmetičku sredinu svih merenih vrednosti. Na osnovu dubine sondiranja, nivoa pripojnog epitela i dihotomnog indeksa krvarenja gingive, računali smo još dva parametra koji mere impakt inflamacije iz parodoncijuma na sistemsku inflamaciju: “Parodontalna epitelna površina” (PESA-Periodontal Epithelial Surface Area) i “Parodontalna inflamirana površina” (PISA-Periodontal Inflamed Surface Area) [253, 254]. Ove parametre osmislila je grupa naučnika iz Holandije (Univerzitet u Groningenu) u cilju objektiviziranja inflamatornog opterećenja poreklom iz parodoncijuma na celokupan organizam. Vrednosti dubina sondiranja, nivoa pripojnog epitela i dihotomnog indeksa krvarenja gingive unose se u logaritamske tabele koje su široko dostupne na sajtu http://parsprototo.info. PESA predstavlja MATERIJAL I METODE 47 površinu sulkusnog epitela obolelog od parodontopatije (računa se pomoću DS i NPE), dok PISA predstavlja inflamirani deo celokupne površine sulkusnog epitela pacijenta sa destrukcijom parodoncijuma (računa se pomoću DS, NPE i IKG). Obe vrednosti se izražavaju u kvadratnim milimetrima (mm2). S obzirom da se kroz literaturu javlja razmimoilaženje stavova po pitanju kliničkog definisanja dijagnoze hronične parodontoptije, mi smo se odlučili na zaključke velike pregledne studije iz 2009. godine [255] i američke Akademije za parodontologiju [256]. Za definisanje smo koristili kliničke parametre DS i NPE. Pacijentima je dijagnostikovana parodontopatija ukoliko imaju vrednosti NPE≥1mm i DS≥3mm na najmanje 3 mesta u dva različita kvadranta. U odnosu na broj zuba zahvaćenih ovakvim promenamama, parodontopatija je definisana kao lokalizovana (<30%) i generalizovana (>30% mesta zahvaćeno parodontopatijom). Na osnovu prosečne vrednosti NPE, parodontopatija je definisana kao blaga (NPE=1-2mm), umerena (NPE=3-4mm) i uznapredovala (NPE≥5mm). 3.6.Postavljanje dijagnoze dijabetesa melitusa tipa 2 Dijagnoza dijabetesa postavljena je prema savetima Svetske zdravstvene organizacije (SZO) i Američke dijabetološke asocijacije (ADA) iz 2013 [33]. Prema SZO, određivanje glikemije iz venskog uzorka plazme je osnova testiranja glukozne tolerancije. Kod ispitanika kod kojih su vrednosti jutarnje glikemije između 6,1-6,9 mmol/l, radi se i test opterećenja glukozom (OGTT-Oral Glucose Tolerance Test). S druge strane, ADA smatra glikozilovani hemoglobin za pouzdanu meru izloženosti pacijenta hiperglikemiji u prethodna 2-3 meseca i pouzdanu meru za postavljanje dijagnoze dijabetesa. Zajednički kriterijumi tj preporuke za dijagnozu dijabetesa su, shodno prethodno iznesenom, sledeći [250]: 1. HbA1c ≥ 6.5% ili, 2. Glikemija našte ≥ 7,0 mmol/L (126 mg/dL) ili, 3. Glikemija u toku OGTT-a sa 75 g glukoze u 120. minutu ≥ 11,1 mmol/L (126 mg/dL) ili, 4. Glikemija u bilo kom slučajnom uzorku krvi (bez obzira na obrok) ≥ 11,1 mmol/L (126 mg/dL) uz prisustvo tipičnih dijabetesnih simptoma (poliurija, polidipsija, gubitak u telesnoj težini). MATERIJAL I METODE 48 3.7.Uzorkovanje Za analize uzimane su dve vrste uzoraka: bris bukalne sluzokože i uzorak periferne venske krvi. Uzimanjem brisa bukalne sluzokože u cilju prikupljanja deskvamiranih epitelnih ćelija dobijen je material za izolaciju DNK. Brisevi su stavljeni u sterilne plastične tubice i odmah transportovani u zamrzivač na -70ºC do daljih analiza. Uzorak periferne venske krvi uziman je ujutru između 7:30-9h pre doručka nakon noćnog gladovanja iz vene u kubitalnom predelu. Uzimano je 5 ml krvi u plastične epruvete sa aktivatorom koagulacije (D-VAC, clot activator, 9ml, DEMOPHORIUS). Iz ove krvi određivani su pomenuti biohemijski i hematološki parametri i izolovan serum za ispitivanje nivoa citokina. Serum je izolovan centrifugiranjem na 3000 obrtaja u trajanju od 5 minuta. U što kraćem periodu, zbog izuzetno kratkog poluživota TNFα, serum je prebacivan u sterilne plastične tubice i čuvan na -70 ºC do daljih analiza. 3.8.Analiza polimorfizama Analiza polimorfizama rađena je metodom lančane reakcije polimeraze i dužine restrikcionih fragmenata PCR/RFLP (Polymerase Chain Reaction/-Restriction Fragment Length Polymorphism). Procedura podrazumeva izolaciju DNK iz briseva bukalne sluzokože, zatim klasičnu PCR reakciju (umnožavanje sekvenci DNK), proveru produkata PCR na poliakrilamidnom gelu elektroforezom, zatim digestiju nastalih produkata restrikcionim enzimima i na kraju analizu restrikcionih produkata takođe na poliakrilamidnom gelu. 3.8.1.Izolacija DNK iz brisa bukalne sluzokože Izolacija DNK vršena je pomoću izolacionog kompleta KAPA Express Extract Kit® (Kapa Biosystems, Inc. Wilmington, MA). Sterilnom pincetom se odvoji vata sa brisa, stavi u sterilnu plastičnu tubicu i zatim se doda reakciona smeša koju sačinjavaju:  2 µl enzima (KAPA Express Extract Enzyme (1 U/µL))  15 µl pufera (10X KAPA Express Extract Buffer)  283 µl dejonizovane vode Smesa se vorteksuje u trajanju od 5 sekundi, zatim centrifugira na 13400 obrataja u trajanju od 1 minut. Sledi inkubacija u PCR aparatu po sledećem režimu: 10 minuta na MATERIJAL I METODE 49 75 ºC (aktivacija enzima), a zatim još 5 minuta na 95 ºC (deaktivacija proteaze iz kita). Sterilnim plastičnim pipetorima se izdvaja supernatant u sterilne plastične tubice i ovaj izolat se čuva na -20 ºC do daljih analiza. 3.8.2. Lančana reakcija polimeraze-PCR Lančana reakcija polimeraze predstavlja in vitro amplifikaciju tačno definisanih sekvenci DNK. Ovu revolucionarnu metodu razvio je 1980tih godina Kari Mulis (Kary Mullis) [257]. PCR u stvari predstavlja imitaciju procesa replikacije DNK. Bazira se na mogućnosti DNK polimeraze da sintetiše novi komplementarni lanac DNK. S obzirom na to da DNK polimeraza dodaje nukleotide samo na slobodne 3-OH grupe, za izvođenje PCR neophodni su i prajmeri-kratki oligonukleotidi komplementarni sa delovima DNK koje želimo da umnožimo. Sama specifičnost amplifikacije se postiže korišćenjem prajmera. Na taj način krajevi amplifikata su odredjeni 5‘ krajevima prajmera, dok je veličina (dužina) amplifikata određena rastojanjem između sekvenci koje prajmeri prepoznaju. Lančana reakcija polimeraze izvodi se u plastičnim tubicama u totalnoj zapremini od 25µl, a sadržaj svake tubice čine sledeće komponente  Uzorak DNK  DNK polimeraza- enzim koji je sposoban da sintetiše željene sekvence gena. Najčešće korišćena polimeraza je Taq polimeraza. Prednosti ove polimeraze su što može da generiše nove lance DNK uz pomoć prajmera i što je otporna na visoke temperature neophodne za izvođenje samog PCR-a.  Prajmeri- oligonukleotidi komplementarni 3’ kraju sekvence koju želimo da umnožimo.  Deoksiribonukleotidi  Mg+ joni- katalizatori Taq polimeraze  Pufer- neophodan za optimalnu aktivnost Taq polimeraze  Voda Sama reakcija podrazumeva tri sukcesivno ponavaljauća procesa, denaturaciju, hibridizaciju i elongaciju koji se ponavalju u 25-40 ciklusa. MATERIJAL I METODE 50  Denaturacija- proces “topljenja” dvolančane DNK odnosno zagrevanja na 95 ºC pri čemu se raskidaju vodonične veze između baznih parova odnosno komplemetarnih lanaca. Rezultat ovog procesa su jednolančane DNK.  Hibridizacija (eng. annealing) podrazumeva sparivanje prajmera sa matričnim DNK lancem. Temperatura neophodna za hibridizaciju je od 42°C do 65°C što zavisi od sekvence prajmera. Previsoka temperature može dovesti do ometanja sparivanja prajmera sa matričnim lancem, dok preniska temperature može dovesti do lošeg sparivanja baza. Obično se koristi temperatura koja je 2-3°C niža od tačke topljenja prajmera.  Elongacija (ekstenzija) predstavlja ugradnju nukleotida pri čemu se 5’fosfatna grupa nukleotida vezuje za 3’hidroksilnu grupu prajmera odnosno lanca u formiranju. Ova faza je katalizovana DNK polimerazom pa se u slučaju korišćenja Taq polimeraze odvija na 72 °C. Na kraju svih ciklusa sledi faza finalne elongacije na istoj temperaturi kao i elongacija, a sa ciljem da svi jednolančani matrični lanci budu umnoženi do kraja. S obzirom na to da u svakom ciklusu od jednog dobijamo dva nova lanca, količina DNK eksponencijalno raste (u optimalnim uslovima, odnosno pri dovoljnoj količini svih reagenasa) tako da na kraju PCR dobijamo oko 10 7 -10 9 kopija željenog fragmenata. 3.8.3. Provera PCR produkata elektroforezom na 8% poliakrilamidnom gelu (PAGE) Elektroforeza nukleinskih kiselina je metoda kojom se određuje veličina fragmenata nukleinskih kiselina na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. S obzirom na mnogobrojne prednosti poliakrialmidnog gela (hemijska inertnost i stabilnost u širokom opsegu fizičko-hemijskih uslova) najčešće se koristi ova metoda [258]. Ona koristi razlike koje postoje između markomolekula u njihovoj pokretljivosti u gelu kada se nađu u kolu jednosmerne struje. Razlike u pokretljivosti zavise od molekualrne mase (manji molekuli brže putuju), prostorne konformacije molekula (linearni molekuli putuju sporije od spiralnih) i najbitnije od naelektrisanja (nukleinske kiseline su negativno naelektrisane zbog prisustva fosfatnih grupa pa putuju od katode ka anodi). U analizama smo koristili veritkalnu elektroforezu u kontinuiranom sistemu (isti pufer se koristi za pravljenje samog gela i kao provodnik). Poliakrilamidni gel nastaje MATERIJAL I METODE 51 kopolimerizacijom akrilamida i bisakrilamida (Serva, Nemačka). Katalizatori polimerizacije su amonijumpersulfat (APS) (Serva, Nemačka) i N,N,N’,N’-tetrametilendiamin (TEMED) (BioChemica, AppliChem) (Tabela 2.1). Gel se polimerizuje na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 minuta (Tabela 2.2). Pripremljeni gel se potapa u kadicu za elektroforezu u kojoj se nalazi odgovarajući pufer (provodnik), u našem slučaju 1X Tris-Borat EDTA (5xTBE). Uzorci koji se analiziraju prvo se pomešaju sa puferom za nalivanje uzoraka (engl. loading buffer) (u našem slučaju 6X DNA Loading Dye®, Thermo Scientific) koji povećava gustinu uzorka (čime je omogućeno da uzorak padne na dno bunarića), boji uzorak i samim tim omogućava praćenje elektroforeze. Nakon mešanja, uzorci se nalivaju u bunariće na gelu (1 bunarić = 1 uzorak) i uključuje se kolo jednosmerne struje (230 V). Za proveru dužine fragmenta nalivaju se i markeri (lenjiri, ladder engl.) (u našem slučaju GeneRuler 100 bp DNA Ladder®, Thermo Scientific) koji predstavljaju isečene fragmenteDNK poznatih dužina. Leder poseduje sekvence u rasponu od 100 do 1000 baznih parova sečene na svakih 100 bp. Leder u sebi poseduje inkorporiranu boju neophodnu za prepozanvanje na gelu. Po završetku elektroforeze vrši se vizuelizacija razdvojenih fragmenata bojenjem gela 1% etidijum–bromidom (Ethidium Bromide Solution 1%®, BioChemica BC), supstancom koja se ugrađuje između lanaca DNK molekula i koja fluorescira kada se osvetli UV svetlom (266 nm) na transiluminatoru. Poređenjem brzine kretanja molekula koji ispitujemo sa brzinom kretanja molekula poznatih dužina, elektroforezom procenjujemo veličinu ciljne sekvence koja je predmet identifikacije. Na osnovu toga se može reći da li je ciljna sekvenca prisutna ili ne u ispitivanom uzorku. Tabela 2.2: Sastojci za pripremu 8% poliakrilamidnog gela Supstanca Količina ddH20 3,9 ml 5xTBE 1,3 ml Akrilamid / Bis-akrilamid 40 % 1,3 ml APS 10% 46 µl TEMED 8,4 µl MATERIJAL I METODE 52 3.8.4. Restrikciona digestija PCR produkata i analiza dužine restrikcionih fragmenata (RFLP) (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Ova metoda zasniva se na sposobnosti restrikcionog enzima (endonukleaze) da izvrši digestiju odnosno iseče PCR produkt na karakterističnoj poziciji, specifičnoj za dati enzim i nagradi dva ili više fragmenata koji se potom vizualizuju na poliakrilamidnom gelu. Kod ovih polimorfizama dolazi do gubitka postojećeg ili stvaranja novog restrikcionog mesta, tako da u zavisnosti od polimorfizma dobijamo produkte različite veličine [259]. Restrikciona smeša (20 µl) se sastoji od  PCR amplifikata  Restrikcionog enzima (endonukleaze)  Pufera Nakon inkubacije (na 37ºC u trajanju od sat-dva), produkti restrikcije se podvrgavaju elektroforezi na istovetan način kao produkti PCR-a. Kao rezultate analize svakog SNP- a dobijamo tri mogućnosti: nesečeni fragment (sekvenca nema restrikciono mesto), heterozigot (jedan lanac je isečen a drugi nije) i isečeni fragmenti (postoji restrikciono mesto). 3.8.5. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-alpha, LT alfa, TNFR1 i TNFR2 Reakcionu smešu od 25 µl u svakoj tubici činili su reagensi prikazani u Tabeli 2.3. U našem slučaju korišćeni su sledeći reagensi:  MgCl2 (Kappa Biosystems)  10XPCR puffer (KAPA Taq Buffer A and B (10X, with 1.5 mM MgCl2 at 1X, Kappa Biosystems)  Nukleotidi: dNTP Mix, 10 mM each ®, Thermo Scientific  DMSO-Dimetil Sulfoksid (Serva, Nemačka)  Prajmeri (Metabion GmbH, Nemačka)  dd H20 (Galenika, Srbija)  Taq polimeraza (KAPA Taq DNA Polymerase (5 U/µL)®, Kappa Biosystems) MATERIJAL I METODE 53 Tabela 2.3: Reakciona smeša za PCR analizu produkata TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2. Reagens Količina (µl) TNF alfa LT alfa TNFR1 TNFR2 MgCl2 (25mM) 0,5 2,5 0,5 0,5 10xPCR pufer 2,5 2,5 2,5 2,5 dNTP (10mM) 0,5 1,0 0,5 0,5 DMSO 2,5 Fw prajmer 1,0 1,0 1,0 1,0 Rw prajmer 1,0 1,0 1,0 1,0 ddH20 16,3 11,3 16,3 16,3 Taq polimeraza 0,2 0,2 0,2 0,2 Uzorak DNK 3,0 3,0 3,0 3,0 Svaka sekvenca zahteva po dva specifična oligonukletoidna prajmera (Tabela 2.4). PCR reakcija odvija se u 35 ciklusa denaturacije, hibridizacije i elongacije uz po jedan ciklus početne denaturacije i finalne elongacije (Tabela 2.5). Dobijeni PCR produkti koji se vizuelizuju na transiluminatoru korišćenjem PAGE su sledećih veličina:  TNFα- 117bp (Slika 2.1)  LTα- 782bp (Slika 2.2)  TNFR1- 183bp  TNFR2- 242 bp (Slika 2.3) Tabela 2.4: Specifični prajmeri neophodni za amplifikaciju produkata TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2. Fw prajmer Rv prajmer -308G/A TNFα Fw: 5’ AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT 3’ Rv: 5’ ACA CTC CCC ATC CTC CCT GCT3’ +252A/G LTα Fw: 5’CCGTGCTTCGTGCTTTGGAC TA 3’ Rv: 5’ AGAGGGGTGGATGCTTG GGTTC 3’ +36G/A TNFR1 Fw: 5’GAC CCC AAA TGG GGG AGT GAG AGG 3’ Rv: 5’ ACC AGG CCC GGG CAG GAG AG 3’ +676T/G TNFR2 Fw: 5’ TCC TGG AGT TGG CTG CGT GT 3’ Rv: 5’ACT CTC CTA TCC TGC CTG CT 3’ MATERIJAL I METODE 54 Tabela 2.5: Uslovi reakcije lančane polimeraze za amplifikaciju produkata TNFα, LTα, TNFR1 i TNFR2. Početna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna elongacija TNF α 3 min 95ºC 45 sec 94 ºC 45 sec 59 ºC 45 sec 72 ºC 7 min 72 ºC LT α 3 min 95ºC 30 sec 95 ºC 30 sec 56 ºC 1 min 72 ºC 5 min 72 ºC TNFR1 3 min 94 ºC 30 sec 94 ºC 30 sec 65 ºC 30 sec 72 ºC 7 min 72 ºC TNFR2 3 min 95ºC 30 sec 95 ºC 30 sec 60 ºC 30 sec 72 ºC 7min 72 ºC Slika 2.1: Prikaz PCR produkta na PAA gelu za TNFα Slika 2.2: Prikaz PCR produkata na PAA gelu za LTα Slika 2.3: Prikaz PCR produkata na PAA gelu za TNFR2 MATERIJAL I METODE 55 3.8.6. RFLP u analizi polimorfizama za TNF alfa, LT alfa, TNFR1 i TNFR2 Kao što je već pomenuto, za svaki polimorfizam postoje indivudualni uslovi (Tabela 2.6). Zapremina restrikcione smeše se dodaje celokupnom preostalom amplifikatu nakon provere (maksimalno do 16 µl amplifiakta). Tabela 2.6: Uslovi restrikcije ispitivanih polimorfizama TNFα LTα TNFR1 TNFR2 Pufer (µl) Tango (2) Tango (2) MultiCore10x (2) Tango (2) Enzim (µl) NcoI (0,5) NcoI (0,3) MSPA1I (0,3) Hin1II (0,5) Inkubacija, 37 ºC 10 min 10 min 2,5h 1,5h Proizvođač Thermo Scientific New England Biolabs Thermo Scientific U slučaju TNFα-308 G/A polimorfizma, pomenuti NcoI enzime prepoznaje specifičnu sekvencu 5’…C ↓ CATG G…3’. Ukoliko zamena baza ne postoji, enzim će prepoznati restrikiono mesto i produkt dužine 117 bp će digestovati na dva manja produkta (97 bp+20 bp). Kao rezultat ove analize na poliakrilamidnom gelu dobijamo sledeće mogućnosti (Slika 2.4)  Homozigot bez SNP, homozigot 1, (divlji tip, wild type-wt, za Evropsku populaciju) čiji je genotip G/G . Na gelu ovaj genotip prepoznajemo kao dve trake dužine 97 bp i 20 bp.  Heterozigot -sa SNP (het) čiji je genotip G/A. Na gelu ovaj genotip prepoznajemo kao tri trake dužine 117 bp, 97 bp i 20 bp.  Homozigot za SNP, homozigot 1 (mutantnti tip-mut za evropsku populaciju) čiji je genotip A/A. Ovaj genotip na gelu prepoznajemo kao jednu traku dužine 117 bp. Slika 2.4: Prikaz produkata digestije na PAA gelu za TNFα (Da bi PCR fragmenti dužine 117 bp i 97 bp bili vizuelizovani (“razdvojeni”) na gelu, traku dužine 20 bp nije moguće prikazati na gelu) 200 bp 117 bp 97 bp MATERIJAL I METODE 56 U slučaju LT +252A/G polimorfizma, pomenuti NcoI enzim prepoznaje specifičnu sekvencu.... 5’…C ↓ CATG G…3’. Ukoliko ne postoji polimorfizam, enzim prepoznaje restrikciono mesto i fragment dužine 782 bp će digestovati na dva manja (586 bp+196 bp). Na poliakrialmidnom gelu vizuelizacijom dobijamo sledeće mogućnosti (Slika 2.5):  Homozigot bez SNP, homozigot 1, nesečeni homozigot (divlji tip-wt za evropsku populaciju) čiji je genotip A/A. Ovaj genotip na gelu prepoznajemo kao jedan fragment dužine 782 bp.  Heterozigot sa SNP-(het) čiji je genotip GA. Posmtranjem ovog genotipa na gelu uočavamo tri fragmenta dužine 782 bp, 586 bp i 196bp.  Homozigot bez SNP, homozigot 2, sečeni homozigot (divlji tip-wt za evropsku populaciju) čiji je genotip GG. Na gelu ovaj genotip prepoznajemo kao dve trake dužine 586 bp i 196 bp. Slika 2.5: Prikaz produkata digestije na PAA gelu za LTα (Da bi PCR fragmenti dužine 782 bp i 586 bp bili vizuelizovani (“razdvojeni”) na gelu, traku dužine 196 bp nije moguće prikazati na gelu) Kada se radi o TNFR1 +36A/G polimorfizmu, enzim MspA1I prepoznaje specifično restrikcionu sekvencu 5’...CMG↓CKG...3. U ovom slučaju će enzim prepoznati sekvencu u slučaju prisustva zamene baze i produkt od 183 bp će digestovati produkte od 108 bp i 75 bp. kao rezultat na PAA gelu pratimo sledeće mogućnosti:  Homozigot bez SNP, homozigot 1 (divlji tip-wt za evropsku populaciju) gde nije došlo do zamene baza i genotip je A/A. Na gelu ovaj genotip pokazuje jednu traku dužine samog PCR produkta odnosno 183 bp.  Heterozigot sa SNP (het) čiji je genotip AG jer je došlo do zamene baze u jednom lancu. Na PAA gelu ovaj genotip pokazuje tri fragmenta dužine 183 bp, 108 bp i 75 bp. 782 bp 586 bp 500 bp MATERIJAL I METODE 57  Homozigot za SNP, homozigot 2 (mutant-mut za evropsku populaciju) čiji je genotip GG (na oba lanca došlo do zamene baze. Pri vizuelizaciji na gelu ovaj genotip pokazuje dva fragmenta dužine 108 bp i 75 bp. Digestija PCR produkta za analizu TNFR2 +676 T/G polimorfizma vršena je pomenutim Hin 1II enzimom koji prepoznaje specifičnu 5’…CATG↓…3’ sekvencu. Ukoliko zamena baza ne postoji, enzim će prepoznati restrikciono mesto i produkt dužine 242 bp će digestovati na dva manja (134 bp+108 bp). Pri analizi na PAA gelu možemo očekivati sledeće mogućnosti (Slika 2.6):  Homozigot bez SNP-divlji tip (wild type-wt) gde nije došlo do zamene baze i genotip je TT. Pri analizi na gelu ovaj genotip pokazuje dva fragmenta dužine 134 bp i 108 bp.  Heterozigot sa SNP (het) čiji je genotip TG jer je došlo do zamene baze na jednom lancu DNK. Na PAA gelu ovaj genotip daje tri fragmenta dužina 242 bp, 134bp i 108bp.  Homozigot za SNP- mutant (mut) čiji je genotip GG jer je došlo do zamene baze na oba lanca DNK. Pri vizuelizaciji na PAA gelu ovaj genotip poseduje jedan fragment dužine 242 bp. Slika 2.6: Prikaz produkata digestije na PAA gelu za TNFR2 3.9. ELISA-Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ELISA reakcija predstavlja imunoesej (upotreba antitela (At) kao reagenasa) koji koriste enzim vezan za jedan od reagenasa u cilju kvantifikacije ispitivane supstance kroz formiranje boje nakon dodavanja supstrata/hromogena [260]. Tako da je osnovna karakteristika ELISE obeležavanje jednog od reagenasa enzimom. ELISA je heterogeni sistem, odnosno podrazumeva postepeno dodavanje i reagovanje reagenasa na supstrat vezan za čvrstu podlogu, kroz korake inkubacije i ispiranja u cilju 242 bp 134 bp 108 bp MATERIJAL I METODE 58 razdvajanja vezanog i slobodnog supstrata. Enzimska reakcija služi da nagradi boju i na taj način kvantifikuje reakciju, upotrebom reagensa obeleženog enzimom. 3.9.1. Korišćeni komercijalni ELISA setovi za analizu koncentracije citokina Sva četiri ELISA seta su proizvođača eBioscience i predstavljaju direktne sendvič ELIZE (Tabela 2.7). Absorbanca se za sva 4 seta očitava na 450 nm. Sastoje se od ploče sa 96 bunarića. Od 96 bunarića, jedan služi za tzv „blank“ čija je absorbanca jednaka nuli, a u 8 se pripremaju standardna razblaženje pomoću kojih se formira standardna kriva, tako da se po ploči dobija 88 rezultata. Tabela 2.7: Korišćeni ELISA setovi za određivanje serumskih koncentracija TNFα, LTα, TNFR1, TNFR2 Citokin Naziv seta jedinice senzitivnost TNFα Human TNF alpha ELISA Ready-SET-Go!® (88‐ 7346) pg/ml 4,000 LTα Human TNF-β Instant ELISA® (BMS202INST) pg/ml 4,600 TNFR1 Human sTNF-R (60kDa) Instant ELISA® (BMS203INST) ng/ml 0,053 TNFR2 Human sTNF-R (80 kDa) Platinum ELISA® (BMS211) ng/ml 0,100 Absorbanca se očitava na TECAN čitaču u kombinaciji sa Microsoft Excel programom. Nakon formiranja standardne krive u Microsoft EXCEL programu, na osnovu absorbanci dobijaju se željene koncentracije. 3.10. Statistička obrada podataka Statističkom analizom podataka obuhvaćeni su svi ispitivani parametri. Baza podataka kao i obrada samih rezultata vršeni su u SPSS 18.0 statističkom paketu (SPSS inc., Chicago, IL, USA). Od metoda deskriptivne statistike korišćene su mere centralne tendencije i mere disperzije, za numerička obeležja posmatranja, a apsolutni i relativni brojevi za atributivna obeležja posmatranja. Hi-kvadrat (χ2, Chi-square Test) , odnosno Fišerovim testom egzaktne verovatonoće (Fisher’s exact Test) poredili smo učestalost pojavljivanja analiziranih atributivnih obeležja posmatranja, između analiziranih grupa. MATERIJAL I METODE 59 Izbor testa za analizu numeričkih obeležja posmatranja zavisio je od prirode raspodele podataka. U cilju određivanja normalnosti raspodele korišćen je Kolmogorov-Smirnov test (Kolmoglorov-Smirnov Test). U slučaju normalne raspodele koristili smo Studentov T test (Student’s t-Test), jednofaktorsku analizu varijanse (ANOVA) i sa Bonferroni korekcijom (Bonferroni correction) za analizu razlika između grupa. Kod raspodele različite od normalne koristili smo Kraskal-Volisov test (Kruskal-Wallis Test), a za međugrupnu analizu Man Vitnijev U test (Mann Whitney U Test). Korišćeni su i Spirmanovi (Spearman’s rank correlation coefficient) i Pirsonovi (Pearson’s rank correlation coefficient) koeficijenti korelacije, u zavisnosti od toga da li su obrađivani parametarske ili neparametarske vrednosti. Regresionim modelima (univarijantim pa multivarijantim) određivali smo zavisne odnosno nezavisne prediktore razlike rizika za nastanak oboljenja. Logističku regresionu analizu koristili smo za računanje odnosa verovatnoća (eng. Odds Ratio-OR) za utvrđivanje rizika oboljevanja od istraživanih oboljenja. Interval poverenja (engl. Confidence Interval-CI) bio je 95%. Višestrukom linearnom regresijom određivali smo kretanje vrednosti zavisnih promenljivih (dubine sondiranja, nivoa pripojnog epitela i serumske koncentacije citokina) u zavisnosti od menjanja nezavisnih promenljivih. Odstupanje od Hardi-Vajnergovog ekvilibrijuma (Hardy-Weinberg equilibrium-HWe) računato Hi kvadrat testom pomoću online dostupnih kalkulatora. Vrednosti ravnoteže nepovezanosti (LD) su računate i grafički predstavljene za polimorfizme na istom lokusu pomoću programa Haploview 4.2. Pacijenti sa nedostajućim podacima nisu uključeni u studiju. Statistička signifikantnost definisana je za p<0,05 REZULTATI 60 4.0 REZULTATI 4.1.Demografski podaci ispitanika U studiju je bilo uključeno ukupno 180 ispitanika, 81 muškog ( 45,0%) i 99 ženskog (55,0%) pola. Prosečna starost ispitanika bila je 44,53±9,087, raspona od 26-72 godine. Demografske karakteristike ispitanike po grupama predstavljene su u tabeli 3.1. Grupe ispitanika bile su usklađene po polu (χ2, p=0,179) i starosti (ANOVA, p=0,242). Obrazovanje ispitanika definisano je kao osnovno, srednje, student i visoko. Grupe nisu bile usklađene po obrazovanju (χ2, p=0,000). Ispitanici srednjeg obrazovanjem preovladavali su u T2D grupi, dok su visoko obrazovani ispitanici preovladali u grupama sistemski zdravih ispitanika. Tabela 3.1: Demografske karakteristike ispitanika po grupama Grupa ZK (n=57) PD (n=58) T2D (n=65) Ukupno Pol (N(%)) Muški 23 (40,4) 24 (41,4) 34 (52,3) 81 (45,0) Ženski 34 (59,6) 34 (58,6) 31 (47,7) 99 (55,0) Starost (SV±SD; raspon) 43,47±4,22 6 (26-57) 46,15±12,5 3 (28-72) 44,00±8,48 2 (27-61) 44,53±9,08 7 (26-72) Stepen obrazovan ja (N (%)) Osnovno 0 (0) 2 (3,4) 6 (9,2) 8 (4,4) Srednje 2 (3,5) 15 (25,9) 44 (67,7) 61 (33,9) Student 25 (43,9) 7 (12,1) 0 (0) 32 (17,8) Visoko 30 (52,6) 34 (58,6) 15 (23,1) 78 (43,3) ITM(kg/m 2 ) 22,6±2,932 24,3±3,589 27,0±2,789 24,7±3,620 Intenzitet stresa Nizak 4 (7,0) 1 (32,8) 31 (47,7) 54 (30,0) Umeren 35 (61,4) 26 (44,8) 18 (27,7) 79 (43,9) Visok 18 (31,6) 13 (22,4) 16 (24,6) 47 (26,1) Prosek 2,25±0,576 1,9±0,742 1,77±0,825 1,96±0,750 Fizička aktivnost- frekvenca Nema 26 (45,6) 25 (43,1) 38 (58,5) 89 (49,4) Redovna 24 (42,1) 26 (44,8) 19 (29,2) 69 (39,3) Neredovna 7 (12,3) 7 (12,1) 8 (12,3) 22 (12,2) Fizička aktivnost- intenzitet Slab 4 (12,9) 14 (42,4) 21 (77,8) 39 (42,9) Umeren 19 (63,1) 16 (48,5) 3 (11,1) 38 (41,8) Jak 8 (25,8) 3 (9,1) 3 (11,1) 14 (15,4) Fizička aktivnost- vrsta Aerobna 27 (87,1) 23 (69,7) 23 (82,1) 73 (79,3) Anaerobna 1 (3,2) 6 (18,2) 4 (14,8) 11 (12,1) Kombinovan 3 (9,7) 4 (12,1) 0 7 (7,6) ITM-Indeks telesne mase Iako je ulaznim kriterijumima studije indeks telesne mase definisan u rasponu od 18-30 kg/m 2, uočena je statistički značajna razlika u ovom parametru među grupama (ANOVA sa Bonferoni korekcijom, p<0,05 za ZK>PD>T2D). Nivo stresa značajno je REZULTATI 61 veći (Man-Vitnijev test) u grupi zdravih kontrola u odnosu na PD grupu (p=0,008) i na T2D grupu (p=0,000). Ispitanici su davali podatke i o redovnosti, intenzitetu i vrsti fizičke aktivnosti. Grupe se međusobno razlikuju samo po podacima o intenzitetu vežbanja, sa tendencijom jačeg intenziteta u grupi zdravih kontrola (χ2, ZK/PD:p=0,018, ZK/T2D:p=0,000, PD/T2D:p=0,007). Osnovna podela pacijenata na osnovu konzumiranja cigareta je na pušače i nepušače (Tabela 3.2). U odnosu na ovu podelu, grupe pacijenata su međusobno usklađene (χ2, p=0,202). Pušačima je dalje računat indeks paklo/godina, i u ovoj podeli pušača uočena je razlika između ispitanika ZK i T2D grupe (ANOVA sa Bonferoni korekcijom, p=0,003). Nepušači su definisani kao oni koji nikada nisu pušili, a bivši pušači podeljeni su na osnovu vremena kada su ostavili cigarete. U grupi zdravih kontrola dominiraju pacijenti koji nisu nikada pušili (χ2, ZK/PD: p=0,001, ZK/T2D: p=0,000). Beležili smo i podatke o disanju na usta (noću ili danju) i dobili smo statistički značajno veći broj ispitanika sa ovom navikom u T2D grupi (38,5%), nego u PD (17,2%) i ZK (15,3%) grupi (χ2, ZK/T2D:p=0,045, T2D/PD: p= 0,027). Navika stiskanja zuba zabeležena je statistčki češće kod ispitanika kontrolne grupe (33,3%) nego u PD (17,2%) i T2D grupi (13,8%) (χ2, ZK/PD:p=0,047, ZK/T2D: p=0,011). Tabela 3.2: Pušački status ispitanika Grupa ZK (n=57) PD (n=58) T2D (n=65) Ukupno Pušači 19 (33,3) 24 (41,4) 17 (26,2) 60 (33,3) ■N<10 cig/d 4 (21,1) 11 (45,8) 6 (35,3) 21 (35,0) ■N≥10 cig/d 15 (78,9) 13 (54,2) 11 (54,7) 39 (65,0) ■PPY (x±SD (min-max) 7,6±7,151 (0,5-23,0) 16,6±10,604 (1,20-40,0) 29,0±26,743 (5,0-120,0) 17,9±18,157 (0,5-120,0) Nepušači 38 (66,7) 34 (58,6) 48 (73,8) 120 (66,7) ■Nikad 35 (92,1) 22 (64,7) 22 (45,8) 79 (65,8) ■Ostavili<5god 3 (7,9) 4 (11,8) 11 (22,9) 18 (15,0) ■Ostavili≥5god 0(0) 8 (23,5) 15 (33,3) 23 (19,2) Sve vrednosti, sem PPY indeksa su izražene kao N(%). PPY-indeks paklo-godina. Sa aspekta porodične anamneze, beležili smo podatke o postojanju dijabetesa i/ili parodontopatije u porodicama (Tabela 3.3). Sa veoma nesigurnim podacima o prisustvu REZULTATI 62 parodontopatije u porodicama ispitanika, podaci govore o većoj zastupljenosti parodontopatije u grupi zdravih kontrola i većoj zastupljenosti dijabetesa u porodicama obolelih od dijabetesa (χ2, p=0,001; ZK>PDP=0,000; PDP4,1mm 14 27 0 5 10 15 20 25 30 35 B ro j p ac ij e n at a Rangovne vrednosti NPE (mm) 0.8 1.6 2.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Zdrave kontrole Parodontopatija Tip 2 dijabetesa Plak Indeks REZULTATI 65 Grafikon 3.5: Stepenovane vrednosti plak indeksa (PI) po grupama Krvarenje na provokaciju izražavano je kao broj mesta koji krvare 30 sekundi nakon sondiranja izraženo u procentima. Prosečan procenat mesta koja krvare nakon sondiranja iznosio je 38,3±18,418 u ZK grupi, 59,3±25,905 u PD grupi i 64,9±27,633 u T2D grupi. Poredeći vrednosti KNP dobili smo statistički značajnu razliku u ovom parametru između zdravih kontrola u odnosu na grupe pacijenata sa dijagnostikovanom parodontopatijom (ANOVA sa Bonferoni korekcijom, ZK75% 0 13 18 0 5 10 15 20 25 30 B ro j i sp it an ik a Nivoi krvarenja na provokaciju (%) REZULTATI 67 statistički značajne razlike u vrednosti PISA parametra među grupama pacijenata sa dijagnostikovanom parodontopatijom (T test, p=0,007) (Grafikon 3.8, Tabela 3.4). PISA je pokazala neznatno veće vrednosti kod ispitanika sa dobro (554,74±348,758 mm2) u odnosu na ispitanika sa loše kontrolisanim dijabetesom (481,93±316,231mm2) (T test za nevezane uzorke, p=0419). Grafikon 3.8: Srednje vrednosti PISA I PESA (mm2) kod pacijenata sve tri grupe. Tabela 3.4 Klinički parodontološki parametri ispitanika Parametar Grupa x±SD Med (Min-Max) P vrednost DS (mm) ZK 1,95±0,462 1,85(1,17-3,1) ¶0,000 ZKT2D T2D 702,9±289,990 659,6 (213,6-1854,4) PISA (mm 2 ) PDP 676,6±359,007 648,8 (171,5-2080,7) ʆ0,000PDP>T2D T2D 504,4± 332,300 431,8 (65,1-2126,1) ¶ANOVA (Bonferoni korekcija), ǂMann-Whitney U Test, ʆT test (nezavisni uzorci) 676.3 504.4 0 200 400 600 800 1000 1200 Parodontopatija Tip 2 dijabetesa PESA i PISA parametri (mm2) PESA PISA REZULTATI 68 Merenja svih kliničkih parodontoloških parametara sumirana su u Tabeli 3.4 gde su prikazane srednje vrednosti, standardne devijacije, mediane, minimalne i maksimalne vrednosti pomenutih parametara. 4.3.Podaci o tipu 2 dijabetesa Grupu pacijenata obolelih od tipa 2 dijabetesa činilo je ukupno 65 ispitanika. Prosešna dužina trajanja dijabetesa u godinama bila je 11,46±7,399 godine (med(min-max)= 10,00(1,00-35,00)). 31 pacijent (47,7%) bio je na terapiji oralnim hipoglikemicima, njih 22 (33,8%) bilo je na terapiji insulinom, dok je 12 (18,5) koristilo kombinovanu terapiju. Većina pacijenata (njih 45, odnosno 69,2%) imalo je lošu glikoregulaciju. Najmanji broj ispitanika T2D grupe (17 (26,2%)) nije imalo dijagnostikovanu nijednu hroničnu komplikaciju, njih 22 (33,8%) imalo je jednu, dok je čak 26 (40,0%) ispitanika imalo dijagnostikovano dve ili više hronične komplikacije (Grafikon 3.9). Makrovaskularne komplikacije imalo je 28 (43,1%) ispitanika, dok je prisustvo mikrovaskularnih hroničnih komplikacija detektovano kod 37 (56,9%) pacijenata. Daljom podelom hroničnih mikrovaskularnih promena zabeleženo je da 21 (32,3%) ispitanika ima očne, 9 (13,8%) nefrološke, dok 29 (44,6%) ima periferne neurološke komplikacije. Grafikon 3.9: Distribucija pacijenata sa dijabetesom u odnosu na prisustvo hroničnih komplikacija 4.4.Krvna slika i biohemijske analize Prosečne vrednosti broja eritrocita po grupama bile su u granicama normale (ZK=4,53±0,559, PD=4,69±0,646, T2D=4,63±0,486), iako su maksimalne vrednosti u grupama PD i T2D dostizale do 6,70x10 12 /l. Srednje vrednosti hemoglobina takođe su 26% 34% 40% Distribucija ispitanika T2D grupe prema postojanju hroničnih komplikacija Bez komplikacija 1 komlikacija ≥2 komplikacije REZULTATI 69 bile u granicama normale (ZK=137,00±13,043, PD=138,93±13,447, T2D=138,43±14,97), iako su minimalne vrednosti bile čak 76,70 g/l. Srednje vrednosti hemoglobina (ANOVA, p=0,741) i eritrocita (Kraskal Volis, p=0,150) su usklađene među grupama. Parametri krvne slike- MCH (Kraskal Volis, p=0,095), MCHC (Kraskal Volis, p=0,590), HCT (ANOVA, p=0,608) su takođe usklađeni međugrupno. Srednje vrednosti svih ovih parametara su bile u granicama normale, iako su u svim grupama minimalne i maksimalne vrednosti bile van referentnih vrednosti. Jedini parametar krvne slike koji je bio smanjen u T2D grupi u odnosu na ostale dve grupe je MCV (Man Vitni test: ZK/T2D:p=0,026, PD/T2D:p=0,023). Pokazatelji inflamacije u analizama krvne slike, prosečne vrednosti leukocita i leukocitarne formule, takođe su u granicama referentnih vrednosti. Vrednosti leukocita (ZK=6,92±1,717, PD=7,57±2,207, T2D=7,39±1,807) međugrupno su usklađene, a maksimalne vrednosti su iznad gornjih granica referentnih vrednosti u svim grupama. Parametri leukocitarne formule (procentualni odnos monocita, neutrofila i limfocita) pokazuju veće vrednosti u PD grupi nego u ZK i T2D grupi. Iako su i kod ovih pokazatelja inflamacije srednje vrednosti u referentnim granicama, pojedine maksimalne i minimalne vrednosti izlaze iz propisanih okvira. Povećanje brzine sedimentacije u prvom satu i vrednosti fibrinogena su dodatni parametri koji pokazuju stepen sistemske inflamacije. Vrednosti fibrinogena definisali smo kao dihotomne vrednosti- veće, odnosno manje od 3,7 g/l. Broj ispitanika sa vrednostima fibrinogena većim od 3,7 g/l u grupi ZK bio je 2 (3,5%), u grupi PD 5 (8,6%) a u grupi T2D bio je 34 (53,8%). Statističkom obradom ovih podataka dobijena je značajna razlika u učestalosti povećanih vrednosti fibrinogena kod pacijenata sa dijabetesom u odnosu na dve grupe sistemski zdravih ispitanika (χ2, ZK G) single nucleotide polymorphism with head and neck cancer risk in the Serbian population. Archives of Biological Sciences 2013;65:387-93. [277] Sakellari, D, Katsares, V, Georgiadou, M, Kouvatsi, A, Arsenakis, M, Konstantinidis, A. No correlation of five gene polymorphisms with periodontal conditions in a Greek population. Journal of Clinical Periodontology 2006;33:765-70. [278] Al-Azzam, SI, Khabour, OF, Alzoubi, KH, Ghanma, MW, Alhasan, AY. The role of TNF-α G-308A promoter polymorphism in glycemic control in Type 2 diabetes patients. J Endocrinol Invest 2014;37:113-8. [279] Gordon, A, Lagan, A, Aganna, E, Cheung, L, Peters, C, McDermott, M, et al. TNF and TNFR polymorphisms in severe sepsis and septic shock: a prospective multicentre study. Genes and immunity 2004;5:631-40. [280] Sainz, J, Salas-Alvarado, I, Lopez-Fernandez, E, Olmedo, C, Comino, A, Garcia, F, et al. TNFR1 mRNA expression level and TNFR1 gene polymorphisms are predictive markers for susceptibility to develop invasive pulmonary aspergillosis. International journal of immunopathology and pharmacology 2010;23:423-36. LITERATURA 154 [281] Vendrell, J, Broch, M, Fernandez-Real, JM, Gutiérrez, C, Simón, I, Megia, A, et al. Tumour necrosis factor receptors (TNFRs) in Type 2 diabetes. Analysis of soluble plasma fractions and genetic variations of TNFR2 gene in a case-control study. Diabetic Medicine 2005;22:387-92. [282] Heesen, M, Kunz, D, Bachmann-Mennenga, B, Merk, HF, Bloemeke, B. Linkage disequilibrium between tumor necrosis factor (TNF)-α–308 G/A promoter and TNF-βNco I polymorphisms: Association with TNF-α response of granulocytes to endotoxin stimulation. Critical Care Medicine 2003;31:211-4. [283] Wu, TL, Tsai, CC, Wang, YY, Ho, KY, Wu, YM, Hung, HC, et al. The association between the RAGE G82S polymorphism, sRAGE and chronic periodontitis in Taiwanese individuals with and without diabetes. Journal of Periodontal Research 2015;50:881-9. [284] Lucena, KCR, Corrêa, MP, Leão, JC, de Souza, PRE, Cimões, R, Carvalho, AdAT. Influence of polymorphisms in osteoprotegerin on susceptibility to periodontal disease in patients with type 2 diabetes. Revista Odonto Ciência (Journal of Dental Science) 2013;28:41-6. [285] Costa Araújo, N, De Aguiar Bello, DM, Crovella, S, De Souza, PRE, Donos, N, Cimões, R. Mannose binding lectin genes (MBL2) polymorpshisms and the periodontal disease in diabetic patients. Revista Odonto Ciencia 2011;26:203-8. [286] Fernández-Real, J, Gutierrez, C, Broch, M, Casamitjana, R, Vendrell, J, Ricart, W. Insulin response to intravenous glucose correlates with plasma levels of the tumor necrosis factor receptor-1. Diabetes care 1999;22:868-70. [287] Nguyen-Khac, E, Houchi, H, Daoust, M, Dupas, JL, Naassila, M. Lack of association between tumour necrosis factor receptor types 1 and 2 gene polymorphism and severe acute alcoholic hepatitis. European journal of gastroenterology & hepatology 2010;22:794-800. [288] Ortiz, P, Bissada, NF, Palomo, L, Han, YW, Al-Zahrani, MS, Panneerselvam, A, et al. Periodontal Therapy Reduces the Severity of Active Rheumatoid Arthritis in Patients Treated With or Without Tumor Necrosis Factor Inhibitors. Journal of Periodontology 2009;80:535-40. LITERATURA 155 [289] Kiortsis, DN, Mavridis, AK, Vasakos, S, Nikas, SN, Drosos, AA. Effects of infliximab treatment on insulin resistance in patients with rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis. Annals of the rheumatic diseases 2005;64:765-6. [290] Dominguez, H, Storgaard, H, Rask-Madsen, C, Steffen Hermann, T, Ihlemann, N, Baunbjerg Nielsen, D, et al. Metabolic and Vascular Effects of Tumor Necrosis Factor-α Blockade with Etanercept in Obese Patients with Type 2 Diabetes. Journal of Vascular Research 2005;42:517-25. [291] Winzen, R, Wallach, D, Kemper, O, Resch, K, Holtmann, H. Selective up- regulation of the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor and its mRNA by TNF and IL-1. The Journal of Immunology 1993;150:4346-53. [292] Aderka, D, Engelmann, H, Maor, Y, Brakebusch, C, Wallach, D. Stabilization of the bioactivity of tumor necrosis factor by its soluble receptors. The Journal of experimental medicine 1992;175:323-9. 1 EVIDENCIONI KARTON Karton broj: Grupa: 1. Kontrolna 2. Parodontopatija+sistemski zdravi 3. Parodontopatija+dm2 1. Generalije Ime: Pol m□ ž□ Broj telefona: Datum rođenja: Zaposlenje, zanimanje 2. Kriterijumi za isključenje pacijenata iz studije antibiotici u prethodna 3 meseca antiinflamatorni lekovi u prethodna 3 meseca terapija parodontopatije u prethodnih godinu i po dana menstruacija, dojenje, trudnoća prisustvo sistemskih oboljenja osim dijabetesa gojaznst ( BMI index > 30kg/m 2 ) svakodnevna upotreba lokalnih oralnih antiseptika prisustvo bilo kog oralnog oboljenja sem karijesa i parodontopatije istorija bilo kog maligniteta manje od 20 zuba (ne računaju se treći molari) prisustvo oraalnih oboljenja sem karijesa i parodontopatije povreda u prethodnih 6 meseci PRILOG 1 2 3. Lična anamneza BMI (kg/m 2 )=  Telesna masa=  Telesna visina= Krvna slika i biohemijske analize  Glukoza  HbA1C=  HDL  LDL  Hol  Tgc  Er  Hgb  MCV  MCH  MCHC  Fibrinigen  Sedimentacija 3a- Dijabetes melitus grupa Godina dijagnostikovanja dijabetesa Godina početka terapije Terapija  Oralni hipoglikemici  Kombinovana terapija  Insulin Komplikacije dijabetesa  Retinopatija  Nefropatija  Periferna neuropatija  Komplikacije na perifernim ks  Makrovaskularne komplikacije o Oboljenja koronarnih ks/infarkt miokarda o Cerebrovaskularna oboljenja/šlog 3b- nivo stresa Intenzitet stresa Nivo stresa 0= bez stresa ( intenzitet + frekvenca) 1=nizak 2=umeren 0-1=nizak nivo stresa 3=visok intenzitet Učestalost stresa 2-4= umeren nivo stresa 0= nikad/retko 1= mesečno 5-6=visok nivo stresa 2= nedeljno 3= dnevno 3 3c. Fizička aktivnost:  Vrsta o Aerobno vežbanje o Anaerobno vežbanje  Učestalost o Redovno (>2 puta nedeljno) o Neredovno/povremeno o Bez fizičke aktivnosti  Intenzitet o Slab o Umeren o Jak 4. Porodična anamneza 5. Loše navike Reumatoidna i autoimuna oboljenja Pušenje* Dijabetes tip 1 tip2 Alkohol Parodontopatija A C Disanje na usta Bruksizam/stiskanje zuba Grickanje stranih predmeta *Pušenje cigara:  pušači o N<10 cigareta na dan o N≥10 cigareta na dan  nepušači ( nikad nisu pušili cigare )  bivči pušači o ostavili pušenje pre manje od 5 godina o ostavili pušenje pre više od 5 godina Broj zuba u ustima:_____ Prisustvo protetskih nadoknada u ustima:  ne  da o mobilne o fiksne PPY= 4 KLINIČKA MERENJA PI KNP DS NPE 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23 24 25 26 27 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23 24 25 26 27 PI KNP DS NPE 5 PI KNP DS NPE 47 46 45 44 43 42 41 31 32 33 34 35 36 37 47 46 45 44 43 42 41 31 32 33 34 35 36 37 PI KNP DS NPE uzorke uzeo potpis ispitanika Datum PI= BOP= DS= NPE= PESA= PISA= PODACI O AUTORU Doktor stomatologije Sanja Matić je rođena 16. februara 1984. godine u Negotinu. Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu upisala je 2003. godine, a diplomirala 2009. godine sa prosečnom ocenom 9,64. U toku studija bavila se studentskim naučno-istraživačkim radom i kao autor ili koautor učestvovala na pet studentskih kongresa. Akademske 2008/2009. godine učestvovala u nastavi kao demonstrator na Klinici za bolesti zuba. Nakon obavljenog pripravničkog staža na klinikama Stomatološkog fakulteta u Beogradu i Doma zdravlja Vračar u Beogradu, stručni ispit za doktore stomatologije je položila 28. aprila 2010. godine. Doktorske studije upisala je akademske 2009/2010. godine iz naučne oblasti Oralna medicina i parodontologija. Položila je sve ispite predviđene planom i programom sa prosečnom ocenom 9,69. Od upisa doktorksih studija do januara 2011. godine bila je stipendista Fondacije za razvoj naučnog i umetničkog podmlatka i stipendista Ministarstva nauke i tehnološkog razvoja (angažovana na projektu broj 145042). Januara 2011. godine angažovana je kao pripravnik na projektu Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije pod nazivom „Interakcija etiopatogenetskih mehanizama parodontopatije i periimplantitisa sa sistemskim bolestima današnjice“ broj 41008. Kao student doktorskih studija od 2011. godine volonterski je učestvovala u praktičnoj nastavi studenata IV i V godine studija na Klinici za oralnu medicinu i parodontologiju. Dr Sanja Matić je autor ili koautor deset radova saopštenih na domaćim i međunarodnim studentkim kongresima i osam radova saopštenih na međunarodnim naučnim skupovima (M34). Autor je dva rada objavljena časopisima indeksiranim u bazi SCI liste (M23). Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Сања Матић ______________________ број индекса 4011/2009 _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом «Утицај полиморфизама гена за инфламаторне цитокине и њихове рецепторе на ниво циркулишућих цитокина и клиничке параметре код пацијената са хроничном пародонтопатијом и дијабетес мелитусом типа 2»  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, ___април 2016. _________________________ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора ___________Сања Матић___________________ Број индекса _________________4011/2009________________________________ Студијски програм ______________________Доктoрске студије______________ Наслов рада «Утицај полиморфизама гена за инфламаторне цитокине и њихове рецепторе на ниво циркулишућих цитокина и клиничке параметре код пацијената са хроничном пародонтопатијом и дијабетес мелитусом типа 2» Ментор ___Проф Ана Пуцар, Проф Јелена Милашин_________ Потписани/а ______Сања Матић_______________________ Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, ___________април 2016.________ _________________________ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: «Утицај полиморфизама гена за инфламаторне цитокине и њихове рецепторе на ниво циркулишућих цитокина и клиничке параметре код пацијената са хроничном пародонтопатијом и дијабетес мелитусом типа 2» која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, ____април 2016. ____________________ 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.