UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Tanja R. Šćepović, dipl. inž. Osetljivost domaćeg miša (Mus musculus L.) na bromadiolon i mogućnost njegovog suzbijanja Doktorska disertacija Beograd, 2015. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Tanja R. Šćepović, MSc Susceptibility of house mice (Mus musculus L.) to bromadiolone and control options Doctoral dissertation Belgrade, 2015 Univerzitet u Beogradu Poljoprivredni fakultet Mentor: dr Petar Vukša, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet Drugi mentor: dr Marina Vukša, viši naučni saradnik Institut za pesticide i zaštitu životne sredine, Beograd Članovi komisije: dr Bojan Stojnić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet dr Dragan Kataranovski, redovni profesor Institut za biološka istraživanja “Siniša Stanković”, Beograd dr Goran Jokić, naučni saradnik Institut za pesticide i zaštitu životne sredine, Beograd Zahvalnica Zahvaljujem se svom mentoru, prof. dr Petru Vukši, na ukazanom poverenju i razumevanju. Veliko hvala na nesebičnoj podršci i pomoći u svim fazama izrade ove disertacije. Ogromnu zahvalnost dugujem dr Marini Vukši na ukazanom poverenju, slobodi u istraživačkom radu, ogromnoj podršci, brojnim stručnim savetima koje mi je pružala tokom izrade i pisanja ove doktorske disertacije. Prof. dr Bojanu Stojniću hvala na diskusijama i pomoći i na tome što je pravo zadovoljstvo sarađivati s njim. Prof. dr Draganu Kataranovskom se zahvaljujem na korisnim savetima i sadržajnim sugestijama pri konačnom formulisanju ove disertacije. Veliku zahvalnost dugujem dr Goranu Jokiću na saradnji, stručnoj pomoći i savetima pri izvođenju ogleda i tumačenju rezultata. Veliko hvala koleginici Suzani Đedović na stručnoj pomoći i prijatnoj radnoj atmosferi ali i neizmernoj prijateljskoj podršci i razumevanju. Ogromnu zahvalnost dugujem dr Alexandri Esther bez čije pomoći nije bilo moguće do kraja sprovesti veći deo ključnih eksperimenata. Posebnu zahvalnost dugujem svim kolegama iz Instituta za pesticide i zaštitu životne sredine na podršci, razumevanju i pomoći tokom izrade doktorske disertacije. Svojoj porodici i prijateljima, koji su bili moja glavna pokretačka snaga, dugujem zahvalnost za razumevanje i podršku u proteklom periodu. Posebno se zahvaljujem svom vereniku Velimiru čija ljubav i strpljenje su mi bili glavna podrška tokom izrade ove disertacije, što je olakšalo moj put ka ostvarenju ovog cilja. Osetljivost domaćeg miša (Mus musculus L.) na bromadiolon i mogućnost njegovog suzbijanja Apstrakt Ispitivanjem osetljivosti jedinki domaćeg miša izlovljenih iz divljih populacija sa sedam lokaliteta, primenom metode testa hranjenja u trajanju od 21 dan, utvrđena je rezistentnost na bromadiolon (0,005 %) na dva lokaliteta. Takođe, na jednom od ostalih lokaliteta utvrđen je znatno smanjen nivo osetljivosti na ovaj antikoagulant. Primenom istog eksperimentalnog dizajna na potomke rezistentnih jedinki utvrđena je rezistentnost kod 38,46 % jedinki. Manji procenat smrtnosti i duži period preživljavanja kod osetljivih jedinki utvrđen je kod ženki. Takođe, manja promena telesne mase utvrđena je kod osetljivih i rezistentnih ženki. Kod ženki je utvrđena veća letalna i neletalna doza u odnosu na mužjake u svim sprovedenim testovima hranjenja. Molekularnim metodama utvrđeno je prisustvo Leu128Ser i Tyr139Cys varijanti u trećem egzonu vkorc1 gena. Takođe, kod pojedinih jedinki utvrđeno je istovremeno javljanje obe varijante, odnosno kombinacija varijanti Leu128Ser/Tyr139Cys u pomenutom egzonu. VKOR varijanta Tyr139Cys i kombinacija varijanti Leu128Ser/Tyr139Cys potvrđene su i kod osetljivih i kod rezistentnih jedinki. Varijanta Leu128Ser utvrđena je samo kod osetljivih jedinki. U egzonu 2 nisu utvrđene promene u sekvenci vkorc1 gena, dok je u egzonu 1 utvrđena do sada neutvrđena promena u sekvenci ovog gena, Ala21Thr. Ova varijanta utvrđena je samo kod dve rezistentne jedinke. Kod jedne jedinke bila je u kombinaciji sa Tyr139Cys varijantom. VKOR varijanta u kombinaciji sa polom ispoljila je značajan uticaj na nivo osetljivosti jedinki na bromadiolon. Nosioci Tyr139Cys varijante samostalno ili u kombinaciji sa drugim varijantama imali su smanjen nivo osetljivosti na bromadiolon u odnosu na nosioce Leu128Ser varijante. Isto se odnosi i na nosioce nove, Ala21Thr, varijante. Smanjen nivo osetljivosti odražavao se preko dužeg vremena preživljavanja, veće konzumacije bromadiolon mamca i manjih promena u telesnoj masi. Mamci sa sadržajem difenakuma (0,005 %) ispoljili su 100 % efikasnost na jedinke domaćeg miša koje su bile rezistentne na bromadiolon u testovima hranjenja u trajanju od 21 dan. Takođe, mamci sa sadržajem brodifakuma (0,005 %) ispoljili su efikasnost od 90 % i 100 % u testovima sa kratkoročnim izlaganjima od 1 i 2 dana. Ključne reči: Mus musculus, antikoagulant, bromadiolon, rezistentnost, vkorc1, mutacije, polimorfizam, Leu128Ser, Tyr139Cys Naučna oblast: Biotehničke nauke Uža naučna oblast: Fitofarmacija UDK: 632.958:599.323.4(043.3) Susceptibility of house mice (Mus musculus L.) to bromadiolone and control options Abstract The susceptibility of house mice trapped at 7 locations was examined in 21-day feeding tests which revealed bromadiolone (0.005 %) resistance in two locations. In one of the other locations, we detected a significantly lower susceptibility to that anticoagulant. Applying the same experimental design on the offspring of resistant animals, we detected resistance in 38.46 % of the animals. Considering the susceptible animals, females had lower mortality percentages and longer survival intervals. Also, females sustained less variation in body weight both among the susceptible and resistant animals. Females also had higher lethal and non-lethal doses than males in all feeding tests. In molecular testing, the Leu128Ser and Tyr139Cys variants were detected in exon 3 of the vkorc1 gene. In some of the animals, both variants were found to occur simultaneously as the Leu128Ser/Tyr139Cys combination in exon 3. The VKOR variant Tyr139Cys and the combination of variants Leu128Ser/Tyr139Cys were confirmed both in susceptible and resistant animals. The variant Leu128Ser was only found in susceptible animals. No change in the vkorc1 gene sequence was detected in exon 2, while a so far unreported change in that gene sequence, the Ala21Thr, was detected in exon 1. The variant was found in two resistant animals only. In one of these animals, it occurred in combination with the Tyr139Cys variant. VKOR variant in combination with gender was found to affect significantly the susceptibility of animals to bromadiolone. Animals carrying the Tyr139Cys variant alone or its combination with the other showed a lower level of susceptibility to bromadiolone than those carrying the Leu128Ser variant. The same applies to the carriers of the new Ala21Thr variant. Lower susceptibility was detected through longer duration of survival, greater intake of bromadiolone baits and less variation in body weight. Baits containing difenacoum (0.005 %) demonstrated 100 % efficacy against the house mice previously found to be bromadiolone-resistant in the 21-day feeding tests. Baits containing brodifacoum (0.005 %) showed 90 % and 100 % efficacy in tests with brief exposure periods of 1 and 2 days. Keywords: Mus musculus, anticoagulant, bromadiolone, resistance, vkorc1, mutation, polymorphism, Leu128Ser, Tyr139Cys Scientific field: Biotechnical sciences Specific scientific filed: Phytopharmacy SADRŽAJ 1 Uvod.................................................................................................................... 1 2 Pregled literature............................................................................................ 4 2.1 Osnovne morfološke i biološke karakteristike domaćeg miša (Mus musculus L.).................................................................................................. 4 2.2 Štete od domaćeg miša.................................................................................. 5 2.3 Hemijsko suzbijanje domaćeg miša.............................................................. 7 2.3.1 Razvoj i primena antikoagulantnih rodenticida................................ 7 2.3.2 Pregled antikoagulantnih rodenticida................................................ 9 2.3.2.1 Bromadiolon........................................................................ 9 2.3.2.2 Difenakum........................................................................... 10 2.3.2.3 Brodifakum......................................................................... 10 2.3.3 Mehanizam delovanja antikoagulantnih rodenticida......................... 11 2.4 Mehanizam ispoljavanja rezistentnosti......................................................... 14 2.4.1 Farmakodinamička osnova rezistentnosti.......................................... 14 2.4.2 Farmakokinetička osnova rezistentnosti............................................ 16 2.4.3 Ostali faktori koji mogu uticati na mehanizam ispoljavanja rezistentnosti...................................................................................... 18 2.5 Pojava i razvoj rezistenosti domaćeg miša na antikoagulante.................... 19 2.5.1 Pojava i razvoj rezistentnosti na antikoagulante prve i druge generacije........................................................................................... 19 2.5.2 Genetska osnova rezistentnosti domaćeg miša na antikoagulante..... 21 2.5.2.1 VKOR varijanta Leu128Ser................................................ 23 2.5.2.2 VKOR varijanta Tyr139Cys................................................ 24 2.5.2.3 Spretus grupa (Arg12Trp/Ala26Ser/Ala48Thr/Arg61Leu).. 25 2.6 Mogućnost suzbijanja rezistentnih jedinki domaćeg miša............................ 26 2.6.1 Plejotropni efekat vkorc1 gena........................................................... 26 2.6.2 Uvođenje novih antikoagulanata u praktičnu primenu....................... 27 2.6.3 Potencijalni faktori uticaja na efikasnost antikoagulanata................. 29 3 Materijal i metode........................................................................................... 31 3.1 Lokaliteti i izlovljavanje jedinki..................................................................... 31 3.2 Čuvanje i aklimatizacija jedinki..................................................................... 34 3.3 Korišćeni mamci……………………………………………………………. 35 3.4 Utvrđivanje osetljivosti domaćeg miša na bromadiolon................................ 35 3.5 Utvrđivnje prisustva mutacija u vkorc1 genu................................................. 37 3.6 Utvrđivanje osetljivosti domaćeg miša na difenakum................................... 38 3.7 Ispitivanje osetljivosti domaćeg miša na brodifakum.................................... 39 3.8 Obrada podataka............................................................................................. 39 4 Rezultati.............................................................................................................. 41 4.1 Osetljivost domaćeg miša na bromadiolon.................................................... 41 4.1.1 Konzumacija placebo mamca............................................................. 41 4.1.2 Vreme preživljavanja.......................................................................... 45 4.1.3 Konzumacija bromadiolon mamca................................................... 48 4.1.3.1 Konzumacija mamca prema lokalitetima i poreklu domaćeg miša....................................................................... 48 4.1.3.2 Konzumacija mamca prema osetljivosti domaćeg miša...... 50 4.1.3.3 Konzumacija mamca domaćeg miša prema polu................ 53 4.1.3.4 Odstupanja u konzumaciji mamca tokom testa................... 55 4.1.4 Promena telesne mase......................................................................... 57 4.2 Polimorfizam vkorc1 gena............................................................................ 60 4.2.1 Utvrđene varijante vkorc1 gena.......................................................... 60 4.2.2 Uticaj VKOR varijante na vreme preživljavanja................................ 61 4.2.3 Uticaj VKOR varijante na konzumaciju mamca................................ 63 4.2.4 Uticaj VKOR varijante na promenu telesne mase.............................. 66 4.3 Osetljivost domaćeg miša na difenakum…………………………............... 69 4.3.1 Vreme preživljavanja……………………………………………….. 69 4.3.2 Konzumacija mamca.......................................................................... 73 4.3.3 Promena telesne mase......................................................................... 76 4.4 Osetljivost domaćeg miša na brodifakum………………………………….. 78 5 Diskusija............................................................................................................. 80 5.1 Test hranjanja bromadiolonom....................................................................... 80 5.2 Uticaj VKOR varijante na nivo rezistentnosti............................................... 83 5.3 Efikasnost difenakuma i brodifakuma........................................................... 88 6 Zaključak........................................................................................................... 91 7 Literatura........................................................................................................... 94 Biografija........................................................................................................... 110 Prilozi................................................................................................................... 111 1 1 UVOD Upotreba rodenticida predstavlja najviše primenjivan način suzbijanja štetnih glodara. Antikoagulanti (antikoagulansi) su napravili značajan pomak u suzbijanju glodara u odnosu na prethodno primenjivane akutne rodenticide s obzirom na sporiji mehanizam delovanja i postojanje antidota, pri čemu se povećala efikasnost i bezbednost u primeni rodenticida (Bentley, 1972; Hadler i Buckle, 1992; RRAG, 2012). Od otkrića 1940. godine pa do danas, antikoagulanti su najčešće korišćeni rodenticidi za suzbijanje populacija štetnih glodara (Bentley, 1972; Buckle i sar., 1994; Prescott, 2011; RRAG, 2012). Mehanizam delovanja antikoagulanata prve i druge generacije zasniva se na narušavanju normalnog funkcionisanja vitamin K ciklusa, što rezultira poremećajem u koagulaciji krvi i pojavom hemoragija u glodarima (Misenheimer i sar., 1994; Wllin i sar., 2001; Ishizuka i sar., 2008). Domaći miš (Mus musculus L.) u skladištima nanosi štete ishranom i oštećenjem uskladištenih proizvoda, kao i zagađenjem izmetom, urinom i dlakama (Meyer, 1994; Timm, 1994; White i Harris, 2002). Takođe, kao vektor humanih i animalnih patogena predstavlja opasnost po zdravlje ljudi i domaćih životinja. S obzirom na štete koje domaći miš nanosi, suzbijanje se nameće kao neophodna mera očuvanja uskladištenih prizvoda (Klimpel i sar., 2007; Fuehrer i sar., 2012). Pojava rezistentnosti na antikoagulantne rodenticide je najčešći uzrok smanjene efikasnosti suzbijanja. Smatralo se da učestala primena istog antikoagulanta dovodi do razvoja rezistentnosti kod nekih vrsta glodara na šta je ukazivao značajniji gubitak efikasnosti u praktičnim uslovima kada je antikoagulant primenjen pravilno (Rowe i Redfern, 1964, 1965; Greaves, 1994). Uvođenjem novih metoda utvrđeno je da rezistentnost predstavlja posledicu genetičke varijabilnosti unutar populacije u kojoj su pojedine jedinke manje osetljive na antikoagulantne rodenticide (Li i sar., 2004; Rost i sar., 2004). Antikoagulanti deluju selektivno prouzrokujući uginuće osetljivih jedinki, pri čemu utiču na širenje rezistentnih alela u populacijama glodara (Heiberg i sar., 2003, 2006; Buckle i Endepols, 2008). Otkriće mutacija u vkorc1 genu, za koje se smatra da dovode do smanjene osetljivosti na antikoagulante, dalo je nove mogućnosti za razvoj metodologije utvrđivanja rezistentnosti, pre svega molekularno-bioloških metoda. Ove metode omogućavaju 2 jednostavnije praćenje razvoja i distribucije rezistentnih populacija i sprečavaju upotrebu neefikasnih rodenticida (Li i sar., 2004; Rost i sar., 2004; Pelz i sar., 2005, 2007). Nedavna istraživanja dovela su u sumnju da rezistentnost glodara na antikoagulante predstavlja vrlo kompleksan mehanizam i da se ne može objasniti samo mutacijama u vkorc1 genu (Endepols i sar., 2012; Buckle i Prescott, 2012; Buckle, 2012). Genetska osnova antikoagulantne rezistentnosti kod domaćeg miša nije u potpunosti razjašnjena. Rezultati ranijih istraživanja su utvrdili postojanje jednog gena koji kontroliše rezistentnost slično kao i u sivom pacovu (Rattus norvegicus) (Wallace i MacSwiney, 1976). Međutim, skorija istraživanja ukazuju na komplikovaniju osnovu rezistentnosti koja nije u potpunosti razjašnjena, a takođe se smatra da je uključeno više mehanizama rezistentnosti (Endepols i sar., 2011; RRAG, 2012; Endepols i sar., 2013). Do danas je rezistentnost na antikoagulante u populacijama domaćeg miša registrovana u raznim delovima Evrope (Belgija, Danska, Finska, Francuska, Nemačka, Velika Britanija, Norveška, Švedska, Švajcarska i Portugal) i Amerike (Kanada, SAD i Argentina) (Pelz i sar., 2005; Rost i sar., 2009; Guidobono i sar., 2010; Pelz i sar., 2012). Utvrđivanje prisustva rezistentnosti u populacijama glodara na antikoagulantne rodenticide na području Srbije do sada je rađeno jedino u divljim populacijama sivog pacova (Kataranovski, 1988; Kataranovski i sar., 1988). Testovima hranjenja antikoagulantima prve generacije tada nije utvrđeno prisustvo rezistentnosti. Utvrđivanje prisustva rezistentnosti na antikoagulante u populacijama domaćeg miša (Mus musculus) do našeg istraživanja u Srbiji nije rađeno. U ovoj doktorskoj disertaciji je istraživanje bilo usmereno na utvrđivanje prisustva rezistentnosti u divljim populacijama domaćeg miša prvenstveno na bromadiolon, koji je jedan od antikoagulanata sa najintenzivnijom upotrebom na području Srbije. Takođe, cilj istraživanja bio je da se sprovede uporedna analiza rezultata testa hranjenja i sekvencioniranja vkorc1 gena kako bi se utvrdio stepen uticaja varijanti ovog gena na ispoljavanje rezistentnosti kod domaćeg miša, odnosno mogući uticaj drugih faktora u kombinaciji sa varijantama pomenutog gena. Konačni cilj istraživanja bio je da se predloži način suzbijanja jedinki koje su već razvile rezistentnost, odnosno suzbijanja populacija domaćeg miša u kojima bromadiolon više nije efikasan. Predlaganjem 3 alternativnih metoda suzbijanja ovakvih jedinki sprečiće se dalje širenje rezistentnih alela u populacijama domaćeg miša. 4 2 PREGLED LITERATURE 2.1 OSNOVNE MORFOLOŠKE I BIOLOŠKE KARAKTERISTIKE DOMAĆEG MIŠA (MUS MUSCULUS L.) Domaći miš (Mus musculus L.) pripada redu glodara (Rodentia), familiji mišolikih glodara (Muridae) i potfamiliji pravih miševa i pacova (Murinae) (Đukić i sar., 2005). Rasprostranjen je širom sveta i nastanjuje mesta u blizini ljudskih populacija (Battersby i sar., 2008). Mus musculus koji egzistira u našoj zemlji i Švajcarskoj kao i lokalizovanim delovima u Danskoj i Nemačkoj ima velike sličnosti sa evropskom prevalentnom vrstom Mus domesticus i manje zastupljenom vrstom Mus spretus koja opstaje u takođe lokalizovanim delovima Španije i Francuske. Glavna razlika je što vrsta Mus musculus nema izrazito zakrivljenu gornju vilicu kao ostale vrste. Hibridizaciju vrsta Mus musculus i Mus spretus prethodno nije utvrđena, već je ova pojava utvrđena jedino između vrsta Mus domesticus i Mus spretus uz takođe zabeležen manji nivo reprodukcije njihovih potomaka (Lund, 1994). Međutim, nedavno istraživanje Pelz-a i sar. (2012) potvrdilo je da do hibridizacije dolazi i između ove dve vrste. Domaći miš ima sposobnost reprodukcije tokom cele godine. Skotnost ženki traje 21 dan pa u toku godine mogu, teoretski, dati i do 13 legala. Broj novorođenih mladih u leglu kreće se od 3 do 12, sa prosekom od 5 do 6. Mladi se rađaju goli, zatvorenih očnih kapaka i slušnih kanala. Nakon 10 dana telo je u potpunosti prekriveno krznom, nakon 14 dana se otvaraju očni kapci, a sa 21 dan postaju skoro u potpunosti samostalni. Polnu zrelost jedinke domaćeg miša dostižu već sa 5 do 7 nedelja starosti. Prosečan životni vek jedinki u prirodi je oko godinu dana, dok u laboratorijskim uslovima mogu živeti i do 3,2 godine, sa prosečnim životnim vekom od 2 godine (Hrgović i sar., 1991; Timm, 1994; Vukša, 2008). Domaćeg miša odlikuje izrazita sposobnost adaptacije. Jedinke domaćeg miša koje opstaju u poljskim uslovima i izložene su uticaju spoljašne sredine imaju sezonski način reprodukcije, dok se u zatvorenom prostoru jedinke razmnožavaju tokom cele godine. Domaći miš se izuzetno adaptira na uslove suše duži vremenski period jer koristi takozvanu metaboličku vodu, za razliku od sivog pacova koji ne može opstati duže od par dana bez vode. Nedostatak vode dobrim delom uslovljava niži nivo reprodukcije ali 5 se normalna reprodukcija uspostavlja odmah nakon što voda postane dostupna ad libitum (Lund, 1994; Timm, 1994). Jedinke domaćeg miša pretežno su aktivne noću. Taktilne dlake ili vibrise (vibrisae) raspoređene po leđnoj, bočnim stranama tela i njušci, omogućavaju snalaženje u prostoru (Đukić i sar., 2005). Skloništa prave na mračnim i manje pristupačnim mestima koja su sa spoljašnom sredinom povezana malim otvorom. Iako postoje podaci o radijusu kretanja domaćeg miša i do 2 km ipak se uglavnom ne udaljavaju od svojih skloništa koja najčešće grade u blizini izvora hrane (Murphy i sar., 2005). Dobro razvijeno čulo sluha, odnosno sposobnost percepcije i proizvodnje ultrazvučnih talasa jedan je od bitnih načina komunikacije i zaštite od mogućih opasnosti i predatora (Đukić i sar., 2005). Domaći miš je omnivorna vrsta ali u ishrani preferira semena i zrnastu hranu. Kod ove vrste glodara nije izražena neofobija pa ne oklevaju da se hrane na novim izvorima hrane u svom okruženju. Ukoliko nema dostupnog zrnevlja preferira hranu bogatu mastima i proteinima (Timm, 1994). U prirodi se hrani semenjem i plodovima svih biljnih kultura, ali i štetnim insektima. Često konzumira tek posejana zrna žitarica i tako čini ogromne štete već pri samoj setvi. U stambenim objektima u ishrani koristi svu dostupnu hranu kao i delove građevinskog materijala pričinjavajući velike štete pogotovo u uslovima prenamnoženja (Đukić i sar., 2005; Battersby i sar., 2008). 2.2 ŠTETE OD DOMAĆEG MIŠA Najveće štete domaći miš nanosi u zatvorenom prostoru, mada može dovesti do ekonomski značajnih gubitaka prinosa u usevima (Brown i Singleton, 2000). Štete nanosi ishranom i zagađenjem proizvoda koji služe za pripremu i skladištenje kako stočne tako i ljudske hrane (Hrgović i sar., 1991; Lund, 1994; Battersby i sar., 2008). Domaći miš ne konzumira velike količine hrane, u proseku jedinki je potrebno da u toku dana pojede najmanje 10 % od svoje telesne mase (Meyer, 1994). Prema podacima jedna jedinka, sa prosečnim dnevnim unosom od oko 3 g, bi na godišnjem nivou pojela ili oštetila oko 1 kg hrane (Tim, 1994; Brooks i Fiedler, 1999). Međutim, urinom, fecesom i dlakama zagadi mnogo veće količine hrane. Jedna jedinka može da produkuje i do 50 fekalnih peleta u toku dana (White i Harris, 2002). 6 a) b) Slika 1. Oštećenja na uskladištenom semenskom kukuruzu (a) i soji (b) Precizna procena štete koju domaći miš nanosi u skladištima uglavnom nije izvodljiva. Podaci u literaturi o ekonomskim gubicima koje domaći miš nanosi u skladištima predstavljaju se kao ukupne štete koje nastaju usled prisustva glodara u skladištima, odnosno kao ekonomski gubici koje nanesu miševi i pacovi zajedno. Novijih podataka o gubicima koje glodari mogu naneti u zatvorenom prostoru i polju nema. Raniji podaci ukazuju na to da se godišnje izgubi i do 33 miliona tona cerealija kao posledica šteta od glodara (Meyer, 1994; Timm, 1994). U periodu od 1994. do 1995. godine u Australiji domaći miš naneo je štete u vrednosti od 60 miliona dolara (Brown i Singleton, 2000). Gubitak u proizvodnji pirinča od 6 %, koji u proseku na godišnjem nivou nanesu glodari, bio bi dovoljan da se prehrani 215 miliona ljudi, a pri tome se gubici mogu kretati i do 17 % (Battersby i sar., 2008). Pored hrane i drugih uskladištenih proizvoda domaći miš oštećuje i objekte. Štete koje domaći miš nanosi ponekad zahtevaju troškove sanacije koji prevazilaze štetu na uskladištenim proizvodima. Oštećenja na objektima smanjuju efikasnost i bezbednost čuvanja proizvoda (Meyer, 1994). 7 Kao domaćin i vektor većeg broja endo- i ektoparazita domaći miš ima izuzetan epizootiološko-epidemiološki značaj. Kao vektor virusa uzročnik je limfocitarnog horiomeningitisa, lasa groznice kao i američkog encefalitisa konja. Takođe domaći miš je vektor leptospira, salmonela, toksoplazmi i uzročnika kuge i tularemije. Ektoparaziti čiji je domaćin domaći miš, takođe mogu biti vektori raznih oboljenja (krpeljski encefalitis) (Hrgović i sar., 1991; Gratz, 1994; Battersby i sar., 2008; Kataranovski i sar., 2010; Vujanić i sar., 2011). Zoonoze se direktno ili indirektno prenose na ljude, kućne ljubimce ili stoku, pri čemu predstavljaju potencijalni rizik po zdravlje (Namue i Wongsawad, 1997; Klimpel i sar., 2007; Fuehrer i sar., 2012). Do direktnih infekcija kod ljudi dolazi usled konzumiranja kontaminirane hrane. Osim ovog direktnog načina infekcije se šire i indirektnim putem preko prelaznih domaćina, najčešće insekata. Predatorstvo i raspadanje leševa dodatno utiču na širenje zoonoznih agenasa (Rafique i sar., 2009; Fuehrer i sar., 2012). Životni ciklus, perzistentnost i prenos među jedinkama divljih populacija kao i prenos na čoveka za većinu patogena nije dovoljno proučen ili je nepoznat. Mnoge zoonoze glodara infektivne za ljude mogu inficirati stoku i kućne ljubimce, pri čemu je rizik po zdravlje ljudi veći (Klimpel i sar., 2007; Fuehrer i sar., 2012). Opasnost i štete koje glodari svojim prisustvom i povećanom brojnošću izazivaju, kao neophodnost nameću potrebu preduzimanja odgovarajućih mera suzbijanja, odnosno smanjenja brojnosti njihovih populacija (Hrgović i sar., 1991). 2.3 HEMIJSKO SUZBIJANJE DOMAĆEG MIŠA 2.3.1 Razvoj i primena antikoagulantnih rodenticida Rodenticidi koji imaju najširu primenu u svetu i kod nas u suzbijanja domaćeg miša kao i ostalih štetnih glodara su antikoagulantni rodenticidi (Bentley, 1972; Hadler i Buckle, 1992; Đukić i sar., 2005; Prescott, 2011). Ova grupa rodenticida je otkrivena pedesetih godina 20. veka, a njihova prednost u efikasnosti i bezbednosti brzo je rezultirala njihovom dominantnom ulogom u suzbijanju glodara (Bentley, 1972). Izolacijom dikumarina u Americi (Link, 1944) nastala je serija sintetisanih jedinjenja od kojih je prvi registrovan kao rodenticid bio varfarin, predstavnik antikoagulanata prve generacije koji je registrovan u Velikoj Britaniji 1949. godine (Hadler i Buckle, 1992). Zahvaljujući činjenici da za razliku od svojih prethodnika akutnih rodenticida imaju 8 sporije delovanje i da su bezbedniji za upotrebu (postojanje antidota, vitamina K), antikogulanti prve generacije (varfarin, kumafuril, kumatetralil, kumahlor, hlofacinon, difacinon i pindon) imaju široku primenu u suzbijanju glodara širom sveta (Bentley, 1972; Đukić i sar., 2005; Berny, 2011). Antikoagulanti prve generacije, prvenstveno varfarin, imali su široku primenu u suzbijanju štetnih glodara u periodu od 1950. do 1965. godine (Hadler i Buckle, 1992). Prvi rezultat o rezistentnosti glodara na varfarin utvrđen je kod sivog pacova u Škotskoj (Boyle, 1960). Nakon ovog istraživanja rezistentnost je potvrđena i u drugim zemljama Evrope, Azije i Amerike (Lund, 1984; Hadler i Buckle, 1992; Pelz, 2001; Pelz i sar., 2005; Wang i sar., 2008; Guidobono i sar., 2010; Tanaka i sar., 2012). S obzirom da ostali antikoagulanti prve generacije nisu bili efikasni u suzbijanju štetnih glodara kao varfarin, pri čemu je takođe došlo i do pojave ukrštene rezistentnosti među pripadnicima ove grupe, usledio je razvoj antikoagulanata druge generacije (Boyle, 1960; Bentley, 1972). Ponašanje domaćeg miša tokom ishrane dodatno može umanjiti efikasnost antikoagulanata prve generacije uzimajući u obzir da domaći miš često menja izvor hrane, pri čemu ne unosi letalne doze. Prednost antikoagulanata druge generacije je u činjenici da su male količine mamca dovoljne da postignu letalni efekat i kod rezistentnih jedinki glodara (RRAG, 2012). Prvi sintetisani antikoagulanti druge generacije (bromadiolon, difenakum i brodifakum) su ispoljili bolju efikasnost u suzbijanju osetljivih, ali i rezistentnih populacija štetnih glodara (Hadler i sar., 1975; Redfer i Gill, 1980; Rowe i sar., 1981). Takođe, efikasniji način primene s obzirom da nije bilo neophodno višekratno izlaganje i dugotrajno konzumiranje, kao što je to bio slučaj sa antikoagulantima prve generacije, rezultirao je da antikoagulanti druge generacije zamene svoje prethodnike (Hadler i Buckle, 1992, Buckle, 1994; Buckle i sar., 1994; Prescott, 2011). U pojedinim zemljama se zastupljenost rezistentnih jedinki kreće i do 75 %, a suzbijanje ovakvih jedinki zahteva upotrebu potentnijih jedinjenja kao što su antikoagulanti druge generacije, odnosno bromadiolon, difenakum i brodifakum (Pelz, 2001). Međutim pojava rezistentnosti i na antikoagulante druge generacije, posebno na bromadiolon i difenakum, dovela je u 9 pitanje upotrebu ovih antikoagulanata (Rowe i sar., 1981; Prescott, 1996; Rost i sar., 2004; Pelz i sar., 2005; Lasseur i sar., 2007; Pelz i sar., 2012). Od 1975. godine pet antikoagulanata druge generacije je u svetu dostupno za suzbijanje štetnih glodara u svetu i to su bromadiolon, difenakum, brodifakum, flokumafen i difetialon (Berny, 2011; Prescott, 2011; RRAG, 2012). Od antikoagulanata druge generacije u našoj zemlji su registrovani bromadiolon, brodifakum, flokumafen i difetialon, pri čemu bromadiolon ima najširu upotrebu u suzbijanju glodara u skladištima (Janjić i Elezović, 2010; Anonimus, 2013). 2.3.2 Pregled antikoagulantnih rodenticida 2.3.2.1 Bromadiolon Bromadiolon je sintetisan 1968. godine, ali je tek nakon 1976. godine postao komercijalno dostupan. Bromadiolon je razvijen od strane francuske kompanije Lipha i pušten u prodaju 1977. godine. Uveden je u upotrebu ne samo zbog efikasnijeg suzbijanja rezistentnih jedinki već i poboljšanja postupka suzbijanja osetljivih jedinki glodara. Izuzetno visoku efikasnost ovaj antikoagulant je ispoljio na varfarin osetljive jedinke glodara nakon samo jednog dana hranjenja kao i blago veću efikasnost u suzbijanju pacova u odnosu na domaćeg miša (Marsh, 1977). Dobra efikasnost bromadiolona zabeležena je i na varfarin rezistentne jedinke glodara (Redfern i Gill, 1980). Bromadiolon je kratko vreme imao široku primenu sa dobrom efikasnošću na varfarin rezistentne jedinke. Smanjena efikasnost bromadiolona utvrđena je prvo na terenu a onda i u laboratorijskim testovima hranjenja bez alternativnog izbora hrane (Rowe i sar., 1981). Skorija istraživanja ukazuju na iste rezultate (Prescott, 1996; Guidobono i sar., 2010; Endepols i sar., 2012). Pre tri decenije bromadiolon je registrovan u našoj zemlji i ima najširu upotrebu u suzbijanju štetnih glodara (Janjić i Elezović, 2010; Anonimus, 2013). Kontinuirana i dugotrajna primena bromadiolona rezultirala je njegovom smanjenom efikasnošću u objektima, a koja je primećena na terenu tokom poslednjih godina. 10 2.3.2.2 Difenakum Difenakum predstavlja prvi komercijalno dostupan antikoagulant druge generacije u svetu. Preparate na bazi difenakuma proizvodila je firma Sorex Ltd. iz Velike Britanije, a za suzbijanje štetnih glodara uglavnom su korišćeni mamci sa 0,005 % aktivne supstance (Hadler i sar., 1975). Istraživanja su pokazala da je ovaj rodenticid bio efikasan u suzbijanju osetljivih populacija sivog pacova i domaćeg miša, odnosno populacija glodara koje nisu razvile rezistentnost na varfarin (Hadler i Shadbolt, 1975). Efikasnost difenakuma na varfarin rezistentne jedinke sivog pacova i domaćeg miša rezultirala je njegovom širokom primenom u svetu (Hadler i sar., 1975). Međutim, difenakum je ubrzo izgubio lidersku ulogu u suzbijanju glodara nakon pojave rezistentnosti na ovaj antikoagulant u Engleskoj i drugim zemljama sveta (Rowe i sar., 1981; Lund, 1984). Nakon što se prvo pojavio na tržištu Velike Britanije brzo je našao veliku primenu širom Evrope ali i Amerike. U Evropi je jedan od najviše korišćenih antikoagulanata druge generacije (Buckle i sar., 2012a). U našoj zemlji do 1991. godine ovaj antikoagulant je samo testitran ali nije našao praktičnu primenu u deratizaciji s obzirom da nije bio registrovan (Hrgović i sar., 1991). Do danas ovaj antikoagulant nije registovan za suzbijanje glodara u zatvorenom prostoru u našoj zemlji (Janjić i Elezović, 2010; Anonimus, 2013). 2.3.2.3 Brodifakum Ovaj antikoagulant je otkriven 1975. godine i proizveden od strane firme ICI u Velikoj Britaniji. Redfern i sar. (1976) i Rowe i sar. (1978) utvrdili su visoku efikasnost na varfarin rezistentne jedinke. Brodifakum mamci (0,005 %) postizali su 100 % smrtnost u suzbijanju populacija varfarin osetljivih i varfarin rezistentnih jedinki već nakon jednog ili dva dana hranjenja. Nakon visoke uspešnosti u suzbijanju varfarin rezistentnih glodara, ali i veće efikasnosti u odnosu na bromadiolon i difenakum, brodifakum se uvodi u primenu širom sveta (Greaves i Cullen-Ayres, 1988). Skorija terenska ispitivanja su utvrdila visoku efikasnost brodifakuma u rezistentnim populacijama sivog pacova (Buckle i sar., 2012b). U našoj zemlji brodifakum postao je dostupan pre više od tri decenije, pri čemu u periodu od 2004. do 2010. godine ovaj antikoagulant nije bio registrovan, odnosno nije 11 primenjivan u našoj zemlji (Janjić i Elezović, 2010; Anonimus, 2013). Međutim, njegova primena je do danas ostala na mnogo manjem nivou nego što je to primena bromadiolona. 2.3.3 Mehanizam delovanja antikoagulantnih rodenticida Svi sintetisani antikoagulantni rodenticidi predstavljaju derivate hidroksikumarina (varfarin, kumafuril, kumatetralil, kumahlor, bromadiolon, difenakum, brodifakum i flokumafen), indandiona (pindon, difacinon i hlorofacinon) i benzotiopirana (difetialon). Iako se međusobno razlikuju po hemijskoj strukturi, njihov fiziološki efekat je gotovo istovetan. Ova jedinjenja pripadaju grupi antivitamin K jedinjenja (AVK), jer svojom aktivnošću remete normalno funkcionisanje vitamin K ciklusa (MacNicoll, 1986; Lasseuer i sar., 2007; Berny, 2011; Buckle i Prescott, 2012; RRAG, 2012). Antikoagulanti pripadaju grupi sporodelujućih rodenticida (Đukić i sar., 2005). Ova jedinjenja ne dovode do brze pojave simptoma. Vremenski period između ingestije letalne doze i pojave prvih simptoma je dovoljno dug da se spreči širenje neofobije među jedinkama glodara i poveća efikasnost antikoagulanta. Jedna od najvećih prednosti upotrebe antikoagulanata jeste postojanje antidota. Sporiji mehanizam delovanja omogućava adekvatnu primenu antidota, vitamina K, u situacijama akcidentalnih trovanja (Hadler i Buckle, 1992; Fisher, 2005). Karboksilacija Vitamin K hidrokinon Vitamin K epoksid VKOR Vitamin K kinon Antikoagulant Slika 2. Ciklus vitamina K i mesto delovanja antikoagulantnih rodenticida 12 Antikoagulanti se veoma lako apsorbuju u tankom crevu i brzo dospevaju u jetru vezani za albumine plazme. Glavno mesto delovanja antikoagulanata su mikrozomi jetre, a meta je enzimski kompleks vitamin K epoksid reduktaze (VKOR). VKOR predstavlja emzimski sistem koji se nalazi u membrani endoplazmatičnog retikuluma (ER). Lipidi koji ga okružuju su od suštinskog značaja za njegovu enzimsku aktivnost. VKOR se nalazi u hidrofobnom lipidnom okruženju i njegov polipeptidni lanac čine hidrofobne aminokiseline. Ovaj enzim pripada grupi enzima prisutnih kod kičmenjaka, drozofila, biljaka, bakterija i arhea (Wallin i sar., 2003). Osnovni mehanizam delovanja antikoagulantnih rodenticida je antagonizam u odnosu na vitamin K koji se ispoljava preko inhibicije VKOR-a (Buckle, 1994; Misenheimer i sar., 1994). Aktivna forma vitamina K, hidrokinon (KH2), deluje kao koenzim enzima gama- glutamil karboksilaze (GGXC) koji učestvuje u sintezi protrombina (faktor II), prokonvertina (faktor VII), antihemofilnog globulina B (factor IX) i Stuart-Prover-ovog činioca (faktor X) koji su faktori koagulacije krvi. Svi činioci koagulacije krvi koji su zavisni od vitamina K sadrže u svom konačnom obliku karboksilovanu glutaminsku kiselinu, te se aktivnost ovog vitamina vezuje za postranslacionu fazu biosinteze ovih proteina. U postranslacionom ciklusu karboksilacije se ostaci glutaminske kiseline (GLU) prevode u gama-karboksiglutamat (GLA proteini). Ovu reakciju katalizuje GGXC. Posledica smanjenog nivoa GLA proteina je smanjeno vezivanje za fosfolipidne membrane na povređenim mestima, pri čemu se ne formira ugrušak. Za formiranje ugruška potrebni su joni kalcijuma koje mogu vezivati samo funkcionalni faktori koagulacije krvi (Fasco i Principe, 1982; Wallin i sar., 2001; Oldenburg i sar., 2007; Ishizuka i sar., 2008). U karboksilacionom ciklusu KH2 se oksiduje do vitamin K 2,3- epoksida (KO). Ovo je neaktivna forma vitamina K koja ne reaguje kao koenzim sve dok se ne vrati u oblik kinona posredstvom VKOR-a (slika 2). Manji deo KO se izluči iz organizma, dok se većina prevodi u vitamin K, kinon formu, uz pomoć VKOR-a. Antikoagulanti imaju jak afinitet vezivanja upravo za ovaj enzim, pa se na taj način remeti prevođenje oksidovanog u redukovani oblik vitamina K zbog čega se inhibira sinteza faktora koagulacije krvi (Wallin i sar., 2001). Prevođenje KO u formu kinona je neophodna faza i njena inhibicija dovodi do sprečavanja vitamin K ciklusa, dok faza prevođenja kinona u hidrokinon se može odvijati i bez VKOR-a putem drugih fizioloških reakcija u 13 organizmu. Inhibicija vitamin K ciklusa rezultira poremećajima u koagulaciji krvi u roku od 48/72 sata (Rowe i Redfern, 1968; Fasco i Principe, 1982; Berny, 2011). U prirodi su poznata dva oblika vitamina K, vitamin K1 (filohinon) koji je vezan u hloroplastima i vitamin K2 (menahinon) koji nastaje mikrobiološkom sintezom u digestivnom traktu (Damon i sar., 2005). Treća forma vitamina K (K3), menahinon, predstavlja sintetičku formu vitamina K. Ovaj oblik vitamina K je glodarima najčešće dostupan preko stočne hrane. Forme K1 i K3 deluju kao antidoti za pacove, dok je za miševe antidot samo vitamin K1 (MacNicoll i Gill, 1993). Glavni izvor vitamina K su reciklirajući procesi u jetri. Manjim delom organizam se snadbeva preko mikrobiološke sinteze u digestivnom traktu i konzumiranjem biljnih proizvoda bogatih hlorofilom. (Janjić, 2009; Kidd, 2010). Svi uzroci koji sprečavaju sintezu i apsorpciju vitamina K u tankom crevu, ili koji sprečavaju njihovu regulatornu ulogu u sintezi pomenutih faktora koagulacije krvi, mogu izazvati unutrašnje krvarenje. S obzirom da se antikoagulanti brže vezuju za enzim, odnosno imaju veći afinitet nego vitamin K, samim tim dolazi do sprečavanja sinteze faktora koagulacije krvi. Nedostak vitamina K klinički se ispoljava pojavom hemoragije, dok subklinički ima za rezultat probleme sa razvojem kostiju i kalcifikacijom arterija (Hrgović i sar., 1991; Kaneki i sar., 2006). S obzirom da je mehanizam dejstva isti za sve antikoagulante, ne postoji razlika u vremenu smrti pri delovanju različitih antikoagulanata nakon što je enzim blokiran. Ono što pravi razliku između delovanja različitih antikoagulanata jeste vreme koje je potrebno da se blokira enzim. Takođe, antikoagulanti se ne mogu razlikovati ni prema mestima na kojima nastaju hemoragije (Hadler i Buckle, 1992). Antikoagulantni rodenticidi deluju selektivno prouzrokujući uginuće samo osetljivih jedinki glodara, a samim tim favorizuju preživljavanje i umnožavanje rezistentnih jedinki. Nije dokazano da antikoagulantni rodenticidi prouzrokuju promene nasledne osnove koje bi bile odgovorne za rezistentnost, već se njihovom intenzivnom upotrebom vrši jak selekcioni pritisak na određenu populaciju glodara unutar koje se prouzrokuje uginuće osetljivih, a favorizuje opstanak i reprodukcija rezistentnih jedinki (Heiberg i sar., 2003, 2006; Buckle i Endepols, 2008). 14 2.4 MEHANIZAM ISPOLJAVANJA REZISTENTNOSTI 2.4.1 Farmakodinamička osnova rezistentnosti Pojava rezistetnosti na antikoagulante predstavlja problem kako u suzbijanju štetnih glodara tako i u humanoj medicini. S obzirom da varfarin ima široku primenu u lečenju tromboze, pojava rezistetnosti na ovaj antikoagulant dovodi do problema u lečenju ljudi (D΄Andrea i sar., 2005; Bodin i sar., 2005; Kovač i sar., 2009; Božina, 2010). Takođe, pojava rezistetnosti glodara na antikoagulante dovodi do značajnih problema u suzbijanju štetnih glodara na terenu (Rowe i sar., 1981; Endepols i sar., 2011; Endepols i sar., 2013). Prvi rezultati da se pojava rezistentnosti na atikoagulante nalazi pod kontrolom gena koji ima analognu poziciju kod domaćeg miša i sivog pacova, utvrđeni su sedamdesetih godina 20. veka u Engleskoj (Wallace i MacSwiney, 1976). Ovim istraživanjem je utvrđeno da se, tada nazvan „gen rezistentnosti“ kod domaćeg miša (War), nalazi na hromozomu 7 i da je njegova pozicija analogna genu rezistentnosti kod sivog pacova (Rw) sa pozicijom na hromozomu 1. Smatralo se da ovaj gen određuje sintezu proteina, odnosno enzima, koji je uključen u mehanizam rezistentnosti na antikoagulante. Iako je aktivnost ovog enzima zabeležena još 1974. godine, napori da se ovaj enzim izoluje bili su bezuspešni (Fasco i sar., 1983; Cain i sar., 1997; Wallin i sar., 2001). Saznanja o genetskoj osnovi mehanizma rezistentnosti na antikoagulantne rodenticide napravila su veliki pomak u ovoj istraživačkoj oblasti (Li i sar., 2004; Rost i sar., 2004). Istraživanjima je obuhvaćeno utvrđivanje genetske osnove enzimskog kompleksa za koji se smatralo da je odgovoran za mehanizam rezistentnosti (Pelz i sar., 2005, 2007; Pelz, 2007; Buckle i Prescott, 2012). Prve smernice za identifikaciju gena koji određuje sintezu VKOR-a dali su Kohn i Pelz (2000). Ubrzo su Li i sar. (2004) u svom istraživanju na ljudima uspeli da identifikuju prvi protein VKOR-a, nazvan vitamin K reduktazni kompleks podjedinica 1 (VKORC1). Ovaj protein predstavlja glavnu, a moguće i jedinu komponentu VKOR-a i glavnu metu antikoagulantnih rodenticida. Utvrđeno je da ovaj enzim predstavlja transmembranski protein koji se nalazi u membrani ER. Gen koji diktira sintezu ovog proteina nazavan je vkorc1 gen. Kod ljudi je gen za rezistentnost na varfarin utvrđen na hromozomu 16. 15 Rost i sar. (2004) obavili su istraživanje na sivom pacovu i uspeli da identifikuju vkorc1 gen pomoću PCR metode. Zapazili su da je grupa gena na hromozomu 16 kod čoveka ortogonalna u odnosu na gene u okolini lokusa Rw i War gena za koje se smatralo da su odgovorni za pojavu rezistentnosti na antikoagulante. Utvrdili su da celokupni transkript vkorc1 gena, koji kodira enzim vitamin K epoksid reduktazu dugu 163 aminokiseline, sadrži 5126 baznih parova i podeljen je u tri egzona. Kod ljudi, sivog pacova i domaćeg miša vkorc1 visoko je očuvan tokom evolucije i deli više od 85 % identičnosti u sekvenci (Garcia i Reitsma, 2008; Müller i sar., 2014). Vkorc1 gen je polimorfan i ima više od jednog, odnosno dva alela. Aleli predstavljaju različite oblike (varijante) gena i nalaze se na istom genskom mestu (lokusu) na homologim hromozomima i svojim interakcijama mogu uticati na fenotip (Li i sar., 2004; Rost i sar., 2004). Promene u sekvenci vkorc1 gena koje dovode do fenotipskih promena kod glodara i ljudi, odnosno do ispoljavanja rezistentnosti na antikoagulante predstavljaju tip „tačkastih“ mutacija (point mutation) u genu. Promene u sekvenci gena se odvijaju na nivou nukleotida gde se jedna baza zameni drugom. Kao posledica ovog procesa dobija se alel sa izmenjenom sekvencom (Marinković i sar., 1989; Snustad i sar., 1997). Promene u sekvenci vkorc1 gena se nasleđuju dominantno-recesivno, odnosno do ispoljavanja rezistentnosti na antikoagulante dolazi kod svih kombinacija u kojima je prisutan izmenjeni alel kao što je prikazano u tabeli 1. Za razliku od mutacija, DNK polimorfizam prestavlja više varijanti alela jednog hromozomskog lokusa koji se mogu razlikovati po nukleotidnoj sekvenci. Osim toga, smatra se da je polimorfizam varijacija sekvence DNK koja je česta u populaciji sa učestalošću većom od 1 %, dok manja učestalost karakteriše mutacije. Ukoliko ovakav proces rezultira promenom na nivou proteina čiju sintezu diktira novi izmenjeni gen, onda su to pojedinačni polimorfizmi nukleotida (SNP-Single nucleotide polymorphism) (Schorka i sar., 2000). Vkorc1 gen je polimorfan s fukcionalnim varijantama koje imaju farmakogenetičku značajnost. Polimorfizam ovog gena određuje dve kategorije fenotipa, odnosno osetljiva i rezistentna jedinka. Fenotip osetljivih jedinki karakteriše prisustvo oba alela „divljeg“ tipa, dok ostale kombinacije alela rezultiraju pojavom rezistentnosti. Smatra se da 16 različite varijante gena (SNP) i različita stanja u kojima se javljaju (heterozigot i homozigot) imaju veliku ulogu u modulaciji enzimske aktivnosti, što je predmet brojnih farmakogenetičkih istraživanja (Greaves i Cullen-Ayres, 1988; Pelz i sar., 2005; Lasseur i sar., 2008; Jacob i sar., 2012; Matagrin i sar., 2013). Tabela 1. Tipovi odnosa među alelima vkorc1 gena Odnos alela Genotip Fenotip AA homozigot Rezistentnost Aa heterozigot Rezistentnost aa homozigot Osetljivost A- dominantan, izmenjen alel; a- recesivan alel, „divlji“ tip Izmenjena sekvenca vkorc1 gena diktira sintezu proteina sa izmenjenom strukturom, što ima za posledicu nemogućnost vezivanja antikoagulanta za ciljno mesto enzima (Rost i sar., 2005). Međutim, smatra se da samo izmene na određenim kodonima, koji predstavljaju vezivna mesta antikoagulanata, „vruće tačke“ (hot spots), dovode do ove pojave (Pelz i sar., 2005). Nisu sve izmene na nivou nukleotida u vkorc1 genu povezane sa smanjenom osetljivošću na antikoagulante. Takođe, određene VKOR varijante, koje predstavljaju zamene aminokiselina na određenim kodonima, nemaju nikakav uticaj na rezistentnost jedinki što su neki istraživaći potvrđivali uginućem svih nosilaca date VKOR varijante u testovima hranjenja (Snustad i sar., 1997; Schorka i sar., 2000; Tanaka i sar., 2012). Ovakve promene u sekvenci gena predstavljaju „tihe“ mutacije (silent mutation) koje se javljaju kao posledica zamene na nivou nukleotida pri čemu aminokiselina ostaje nepromenjena, kao i sekvenca vkorc1 gena, pa ne dolazi do promena na nivou sintetisanog proteina. Rost i sar. (2009) utvrdili su „tihe“ mutacije u vkorc1 genu na miševima i pacovima i za njih je utvrđeno da nemaju uticaja na pojavu rezistentnosti kod ljudi i glodara. 2.4.2 Farmakokinetička osnova rezistentnosti Uporedo sa istraživanjem genetske osnove rezistentnosti glodara na atikoagulante teklo je i istraživanje o dodatnim mehanizmima koji bi mogli uticati na ispoljavanje ove 17 pojave kod glodara (Sutcliffe i sar., 1990; Misenheimer i sar., 1994; Ishizuka i sar., 2007). Sumnju o postojanju dodatnih faktora koji bi mogli uticati na ispoljavanje rezistentnosti kod glodara izazvalo je neslaganje rezultata drugih metoda za utvrđivanje rezistentnosti, kao što je to test koagulacije krvi (BCR - Blood Clotting Response Test), i molekularnih analiza (PCR - Polymerase Chain Reaction). Većina istraživača smatra da prisustvo promena u sekvenci vkorc1 gena kod jedinki koje su prema BCR metodi osetljive i obrnuto zapravo predstavljaju lažno negativne, odnosno lažno pozitivne rezultate BCR metode koji se tolerišu kod 1 % populacije (Pelz i sar., 2005). Međutim, u pojedinim istraživanjima broj takvih jedinki prevazilazi dozvoljenu granicu od 1 % (Endepols i sar., 2011, 2012, 2013). Takođe, rezultati istraživanja na sivom pacovu u Danskoj (Heiberg i sar., 2009) i domaćem mišu u Argentini (Espinosa, 2013) koji ukazuju na prisustvo rezistentnih populacija bez promena u vkorc1 genu, dodatno su pojačali sumnju o mogućem postojanju drugih mehanizama koji samostalno ili u sinergiji sa polimorfizmom vkorc1 gena utiču na rezistentnost glodara na antikoagulante. Određena jedinjenja koja mogu biti efikasni antikoagulanti kod jedne vrste mogu biti neefikasni kod druge vrste jedinki zbog mogućih razlika u metabolizmu. Ranija istraživanja ukazuju da je aktivnost citohrom P450 mnogo veća kod rezistentnih nego osetljivih jedinki, što rezultira i bržim metabolizmom antikoagulantnih jedinjenja (Sutcliffe i sar., 1990; Misenheimer i sar., 1994). Uporednim biohemijskim i molekularnim istraživanjima na crnom pacovu (Rattus rattus) u Tokiju utvrđeno je da kod ovog glodara rezistentnost nema genetske osnove već predstavlja posledicu bržeg metabolizma varfarina (Ishizuka i sar., 2007). Inhibicija enzima citohrom P450 utiče na veću efikasnost antikoagulanata pa s toga način metabolizma utiče i na njihovu efikasnost, odnosno pojavu rezistentnosti glodara na ove rodenticide (Buckle i Prescott, 2012). Istraživači koji se bave uticajem polimorfizma vkorc1 gena na terapiju antikoagulantima kod ljudi smatraju da postoji mogući zajednički uticaj polimorfizma ovog gena sa polimorfizmom gena CYP2C9 koji diktira sintezu enzima za metabolizam varfarina citohrom P450 (Božina, 2010). Rezultati do kojih su došli ovi istraživači ukazuju da su pojedine kombinacije polimorfizma vkorc1 i CYP2C9 gena povezane sa prekomernom 18 koagulacijom krvi. Literaturnih podataka o mogućem uticaju polimorfizma gena citohrom P450 kod domaćeg miša na pojavu rezistentnosti na antikoagulante nema. 2.4.3 Ostali faktori koji mogu uticati na mehanizam ispoljavanja rezistentnosti Prema nekim istraživačima vitamin K i varfarin imaju sličnu strukturu pa samim tim pretenduju da se vežu za isto mesto enzima. Istraživači ukazuju na postojanje proteina kalumenina koji ima jači afinitet vezivanja za VKOR, pa se na taj način ovaj enzimski kompleks čuva od vezivanja za antikoagulante, što bi rezultiralo određenim stepenom inhibicije VKOR-a. Koncentracija kalumenina u ER određuje stepen inhibicije VKOR- a, odnosno aktivnost karboksilacionog ciklusa i rezistentnost na antikoagulante (Wallin i sar., 2001). Rezultati ranijih istraživanja usmeravali su istraživače da, zbog veće stope preživljavanja ženki u odnosu na mužjake, smatraju da je mehanizam rezistetnosti pod kontrolom hormona (Rowe i Redfern, 1964, 1967; Wallace i MacSwiney, 1976; MacSwiney i Wallace, 1978). Heiberg i sar. (2003) su tokom svog istraživanja o uticaju primene bromadiolona na nivo rezistentnosti u populaciji sivog pacova utvrdili da su ženke manje osetljive na promene nivoa vitamina K u hrani, što se odražavalo na njihovu veću otpornost u odnosu na mužjake. Takođe, utvrđeno je da starosno doba ima uticaj na pojavu hemoragija kod jedinki, odnosno kod starijih ženki je utvrđeno da su bile osetljivije na promene sadržaja vitamina K u hrani, što su ovi istraživači objasnili činjenicom da je stariji organizam podložniji raznim bolestima koje mogu smanjiti sposobnost iskorišćavanja vitamina K u organizmu. Nakon potvrđenog uticaja promena u sekvenci vkorc1 gena na osetljivost glodara na antikoagulante, uticaj pola i starosti jedinki nije detaljnije ispitivan (Pelz i sar., 2005, 2007; Rost i sar., 2009; Pelz i sar., 2012). Garg i Singla (2014) primenom testova hranjenja bromadiolonom na jedinke crnog pacova utvrdili su veću osetljivost mužjaka. Međutim, ova istraživanja nisu upotpunjena molekularnim analizama, odnosno utvrđivanjem eventualnog prisustva VKOR varijanti kao i interakcije sa polom. 19 2.5 POJAVA I RAZVOJ REZISTENTNOSTI DOMAĆEG MIŠA NA ANTIKOAGULANTE 2.5.1 Pojava i razvoj rezistentnosti na antikoagulante prve i druge generacije Rezistentnost na antikoagulante rezultira smanjenjem efikasnosti antikoagulanata kada je on primenjen pravilno u praktičnim uslovima kao posledica prisustva rezistentnih jedinki glodara sa naslednom smanjenom osetljivošću na antikoagulante (Greaves, 1994). Domaći miš u odnosu na pacova poseduje određeni stepen smanjene osetljivosti na antikoagulantne rodenticide, odnosno ovi rodenticidi imaju manju efikasnost na osetljive jedinke domaćeg miša nego na sivog pacova (RRAG, 2012). Ovu tvrdnju upotpunjuju i testovi hranjenja za utvrđivanje rezistentnosti u kojima se sivi pacov izlaže antikoagulantima šest dana, dok kod miševa ovi testovi traju 21 dan (EPPO, 2004b). Vrednosti letalnog perioda hranjenja (LFP-Lethal Feeding Period) višestruko su veće kod jedinki domaćeg miša nego kod pacova (RRAG, 2012). Rezistentnost kod jedinki domaćeg miša se progresivno razvija u nekim zemljama, kao na primer u Velikoj Britaniji, pa je teže naći osetljive nego rezistentne jedinke u populacijama domaćeg miša (Buckle i Prescott, 2012; RRAG, 2012). Antikoagulanti prve generacije, pre svega najviše korišćeni varfarin, imali su široku primenu u suzbijanju sve do pojave smanjene osetljivosti populacija domaćeg miša širom sveta. Takođe, pojava ukrštene rezistentnosti jedinki domaćeg miša na varfarin i druge pripadnike prve generacije antikoagulanata dodatno je smanjila upotrebu ove grupe rodenticida (Boyle, 1960). Prvi rezultati o smanjenoj osetljivosti domaćeg miša u laboratorijskim istraživanjima na antikoagulante prve generacije utvrđeni su u Velikoj Britaniji šezdesetih godina 20. veka. Testovima bez izbora hrane potvrđena je smanjena osetljivost domaćeg miša na varfarin (Rowe i Redfern, 1964). Daljim istraživanjem potvrđeno je nasleđivanje ove pojave (Rowe i Redfern, 1965). S obzirom na brzo širenje rezistentnih jedinki domaćeg miša, kao posledica nasleđivanja smanjene osetljivosti na antikoagulante, usledila su istraživanja s ciljem pronalaska jedinjenja koja će biti efikasna u suzbijanju varfarin rezistentnih jedinki. U početku se smatralo da je prvi sintetisani antikoagulant druge generacije, difenakum, bio efikasan (Hadler i Shadbolt, 1975). Međutim, iste godine kada se difenakum pojavio 20 na tržištu rađena su istraživanja u kojima je utvrđeno da ovaj antikoagulant nema potpunu efikasnost na varfarin rezistentne jedinke domaćeg miša, odnosno da se razvila ukrštena rezistentnost između antikoagulanata prve i druge generacije. Međutim, difenakum je i dalje imao primenu u suzbijanju osetljivih i rezistentih jedinki s obzirom da je imao najveću efikasnost u odnosu na ostale, tada dostupne, antikoagulante (Hadler i sar., 1975; Rowe i Bradfield, 1976). Novija istraživanja takođe potvrđuju rezistentnost jedinki domaćeg miša na ovaj antikoagulant na terenu (Endepols i sar., 2011). Bromadiolon je bio efikasan na varfarin osetljive jedinke domaćeg miša nakon samo jednog dana hranjenja. Istraživanje Redfern-a i Gill-a (1980) potvrdilo je opravdanost upotrebe ovog antikoagulanta u suzbijanju varfarin rezistentnih jedinki domaćeg miša zajedno sa difenakumom. Nakon laboratorijskih testova hranjenja bez izbora hrane bromadiolon je ispoljio osobenosti vrlo efikasnog antikoagulanta u suzbijanju rezistentnih populacija domaćeg miša. Međutim, istraživanja koja su kasnije usledila utvrdila su ukrštenu rezistentnost varfarin rezistentnih jedinki domaćeg miša na bromadiolon i difenakum (Rowe i sar., 1981; Lund, 1984; Prescott, 1996). Skorija istraživanja takođe potvrđuju rezistetnost domaćeg miša na bromadiolon i difenakum (Guidobono i sar., 2010; Pelz i sar., 2012; Endepols i sar., 2011, 2013). Istraživači su utvrdili dobru efikasnost brodifakuma i predlagali njegovu upotrebu i u situacijama razvoja ukrštene rezistentnosti varfarin rezistentnih jedinki na bromadiolon i difenakum. Ovaj antikoagulant ispoljio je 100 % efikasnost na varfarin rezistentne jedinke domaćeg miša nakon samo jednog ili dva dana hranjenja. Utvrđeno je da se optimalne koncentracije brodifakuma u mamcima za efikasno suzbijanje varfarin rezistentnih jedinki domaćeg miša nalaze u intervalu od 0,002 % do 0,005 % (Redfern i sar., 1976). Takođe, u dugoročnim testovima ovaj antikoagulant bio je efikasan na varfarin rezistentne jedinke domaćeg miša u testovima bez izbora i sa izborom hrane. Dobra efikasnost u testovima sa prisustvom drugih izvora hrane potvrdila je da je brodifakum efikasan i pri malim unosima mamca (Rowe i Bradfield, 1976). Međutim Lund (1981) je zabeležio da je manji broj jedinki preživeo kratkoročne testove hranjenja brodifakum mamcima (0,005 %), ali i svakako mnogo veću efikasnost ovog antikoagulanta od bromadiolona na varfarin-osetljive i varfarin-rezistentne jedinke domaćeg miša. 21 Ispitivanje osetljivosti na antikoagulante u populacijama glodara na području Srbije rađeno je krajem osamdesetih godina 20. veka u populacijama sivog pacova (Kataranovki i sar., 1988). Istraživanje je urađeno primenom šestodnevnog testa hranjenja mamcima antikoagulanata prve generacije (varfarin i kumatetralil) pri čemu nije utvrđena rezistentnost kod jedinki izlovljenih na području Beograda, Požarevca, Pirota i Korčule. Istraživanja na istu temu u populacijama domaćeg miša do sada nisu rađena. 2.5.2 Genetska osnova rezistentnosti domaćeg miša na antikoagulante Ranija istraživanja na domaćem mišu potvrdila su postojanje gena, tada nazvanog War gen, na hromozomu 7. Ovim istraživanjima je utvrđena analognost u poziciji gena kod domaćeg miša i pacova i dato objašnjenje genske ekspresije rezistentnosti (Wallace i MacSwinney, 1976; Prescott, 1996). Nakon identifikacije vkorc1 gena promene u ovom genu smatraju se jednim od glavnih razloga promene osetljivosti domaćeg miša na antikoagulante (Li i sar., 2004; Rost i sar., 2004). U Nemačkoj je na većini ispitivanih lokaliteta zastupljenost jedinki domaćeg miša sa promenama u sekvenci vkorc1 gena iznosila i do 90 % (Pelz i sar., 2012). Nakon što je opisan vkorc1 gen, poznavanje sekvence ovog gena dalo je mogućnost utvrđivanja varijanti ovog gena koje bi mogle imati ulogu u pojavi rezistentnosti na antikoagulante kod glodara bez donošenja jedinki u laboratoriju za potrebe in-vivo istraživanja (Li i sar., 2004; Rost i sar., 2004; Pelz i sar., 2005, 2007). Do sada je utvrđeno 9 promena u sekvenci vkorc1 gena kod domaćeg miša. Tri tipa aminokiselinskih zamena (VKOR varijanti) povezuju se sa promenom osetljivosti domaćeg miša na antikoagulante: Leu128Ser (zamena leucina serinom na 128. kodonu), Tyr139Cys (zamena tirozina cisteinom na 139. kodonu) i Spretus grupa (grupa vezanih mutacija - Arg12Trp/Ala26Ser/Ala48Thr/Arg61Leu) (Pelz i sar., 2012). Za sve tri varijante poznato je da nose značajan stepen smanjene osetljivosti na kompletnu prvu generaciju antikoagulanata i neke antikoagulante druge generacije (Pelz i sar., 2012; RRAG, 2012). Postojanje promene na nivou nukleotida ne mora obavezno rezultirati pojavom rezistentnosti na antikogulante kod domaćeg miša. U terenskim ispitivanjima u 22 Nemačkoj potvrđeno je prisustvo aminikiselinske zamene Arg58Gly (zamena arginina sa glicinom) kod jedinki domaćeg miša pri čemu je utvrđeno da ova alelna varijanta vkorc1 gena ne može biti marker za rezistentnost (Endepols i sar., 2011). Takođe, utvrđene su nove VKOR varijante ovog gena, Glu37Gly (zamena glutamina sa glicinom), Trp59Leu (zamena triptofana sa leucinom), Trp59Ser (zamena triptofana sa serinom) i Leu124Gln (zamena leucina sa glutaminom), za koje do sada nije poznato da li imaju uticaja na pojavu rezistentnosti kod domaćeg miša (Pelz i sar., 2012). Takođe, u Nemačkoj je potvrđeno prisustvo „tihih“ mutacija u vkorc1 genu domaćeg miša Glu37Glu (zamena nukleotida u kodonu za glutaminsku kiselinu), pri čemu nije došlo do promene redosleda aminokiselina u VKORC1 proteinu. Za ovu mutaciju je, takođe, potvrđeno da nema uticaja na promenu osetljivosti na antikoagulante kod domaćeg miša (Rost i sar., 2009). Pored navedenih promena u sekvenci vkorc1 gena, koje se dešavaju u nekom od tri egzona ovog gena, moguće su i promene u intronima, nekodirajućim delovima gena. Ovakva promena utvrđena je u populaciji domaćeg miša u Nemačkoj. Kod ovih jedinki utvrđene su promene u intronu 1 na poziciji 398. Za ovu promenu je utvrđeno da nema uticaja na osetljivost jedinki domaćeg miša na antikoagulante (Endepols i sar., 2013). Potrebno je naglasiti da sam mehanizam ispoljavanja rezistentnosti kod domaćeg miša nije u potpunosti razjašnjen, ali da nesumnjivo postoji analognost sa rezultatima istraživanja na sivom pacovu (Misenheimer i sar., 1994). Takođe, o genetskoj osnovi rezistentnosti domaćeg miša zna se mnogo manje nego kod pacova. Smatra se da isti gen kontroliše sintezu istog proteina kao i kod jedinki sivog pacova. Takođe, promene u ovom genu rezultiraju promenama u osetljivosti na antikoagulante (RRAG, 2012). Međutim, potvrđeno prisustvo populacija rezistentnih jedinki domaćeg miša bez utvrđenih promena u vkorc1 genu ukazuje na mogući složeniji mehanizam razvoja i nasleđivanja rezistentnosti kod ovog glodara (Espinosa i sar., 2013). Osim mogućeg uticaja drugih faktora u kombinaciji sa polimorfizmom vkorc1 gena, postoji mogućnost uticaja i drugih gena na razvoj rezistentnosti kod domaćeg miša na šta su ukazali Song i sar. (2008) nakon neutvrđene jasne veze između varijacija u protrombinskom vremenu i sadržaju i gustini kostiju sa različitim genotipovima kao rezultat promena u vkorc1 genu kod domaćeg miša. 23 2.5.2.1 VKOR varijanta Leu128Ser Prve rezistententne jedinke domaćeg miša sa Leu128Ser varijantom utvrđene su u okolini Jorka 1976. godine u Velikoj Britaniji (Wallace i MacSwiney, 1976), ali je tek primenom novih molekularnih metoda na sačuvanim uzorcima potvrđeno da su te rezistentne jedinke domaćeg miša zapravo bile nosioci Leu128Ser VKOR varijante (Pelz i sar., 2005). U istraživanju Wallace i MacSwiney (1976) jedinke su bile rezistentne na antikoagulante prve generacije, što je tada potvrđeno primenom metode testa hranjenja. Jedinke domaćeg miša sa ovim tipom aminokiselinske zamene u vkorc1 genu najviše su zastupljene u Velikoj Britaniji u oblasti Jork (Wallace i MacSwiney, 1976; Pelz i sar., 2005), ali je i novijim istraživanjima ova VKOR varijanta potvrđena i kod jedinki domaćeg miša u Nemačkoj, Portugalu i Švajcarskoj (Rost i sar., 2009; Pelz i sar., 2012). Utvrđeno je da se ova varijanta javila zajedno sa Spretus grupom kod jedinki iz Nemačke, kao i u kombinaciji sa varijantom Tyr139Cys kod jedinki domaćeg miša iz Nemačke i Portugala (Pelz i sar., 2012) . Smatra se da je kodon 128 zapravo „vruća tačka“ na kojoj je detektovano više tipova aminokiselinskih zamena koje se povezuju sa pojavom rezistentnosti na atikoagulante kod više vrsta organizama. Prema Rost-u i sar. (2004) zamena leucina sa argininom na ovom kodonu povezana je sa rezistentnošću ljudi na antikoagulantnu terapiju. Takođe, zamena leucina sa glicinom kod sivog pacova dovodi do problema u suzbijanju ovih jedinki primenom antikoagulanata (Pelz i sar., 2005). Kod nosilaca Leu128Ser VKOR varijante utvrđena je niska bazalna aktivnost VKOR-a u poređenju sa jedinkama sa divljim tipom u odsustvu antikoagulanata. Aktivnost VKOR enzima se u prisustvu antikoagulanta dodatno smanjila ispod nivoa detekcije u poređenju sa aktivnošću enzima kod jedinki nosilaca divljeg tipa (Pelz i sar., 2005). Smatra se da smanjena aktivnost VKOR-a koja ima za posledicu manjak vitamina K kod rezistentnih jedinki, može voditi ka aktivaciji drugih za sada nepoznatih mehanizama kojima će jedinke nadoknađivati nedostatak vitamina K za nesmetano funkcionisanje vitamin K ciklusa (Pelz i sar., 2012). Prema rezultatima ranijih istraživanja, jedinke koje su bile nosioci ove VKOR varijante rezistentne su na antikoagulante prve generacije, kao i na bromadiolon i difenakum (Wallace i 24 McSwiney, 1976; Rowe i sar., 1981). Jedna jedinka u istraživanju Rowe i Bradfield (1976) preživela je 21 dan testa hranjenja sa brodifakum mamcima. 2.5.2.2 VKOR varijanta Tyr139Cys Rezistentnost kod jedinki domaćeg miša sa Tyr139Cys VKOR varijantom prvi put je utvrđena u Velikoj Britaniji (Prescott, 1996). Kasnijim istraživanjima i analizom sačuvanih uzoraka primenom molekularnih metoda utvrđeno je da su jedinke domaćeg miša koje su preživele testove hranjenja zapravo bile nosioci ove VKOR varijante (Pelz i sar., 2005). Jedinke domaćeg miša sa ovom varijantom najviše su rasprostranjenje u Nemačkoj i Velikoj Britaniji (Prescott, 1996; Pelz i sar., 2005), a novija istraživanja su potvrdila prisustvo ove varijante u vkorc1 genu i kod jedinki domaćeg miša u Švajcarskoj i Portugalu (Rost i sar., 2009; Pelz i sar., 2012). Osim što je ova VKOR varijanta utvrđena zajedno sa Leu128Ser varijantom, takođe je potvrđeno i njeno istovremeno javljanje u kombinaciji sa Spretus grupom kod jedinki domaćeg miša u Nemačkoj i Švajcarskoj (Pelz i sar., 2011, 2012). Kodon 139 istraživači takođe smatraju „vrućom tačkom“ jer su samo kod sivog pacova registrovane tri vrste zamena tirozina na istom kodonu (Tyr139Cys, Tyr139Ser, Tyr139Phe) koje se povezuju sa pojavom rezistentnosti (Pelz i sar., 2005; RRAG, 2012; Buckle i sar., 2012a; Buckle, 2013). Aminokiselina tirozin na 139. kodonu predstavlja visoko očuvano mesto u vkorc1 genu obzirom da se javlja kod kičmenjaka i komaraca, pa se smatra da sve izmene na ovom kodonu utiču na promenu aktivnosti enzima (Rost i sar., 2009). U nekim in-vitro istraživanjima utvrđeno je da je Tyr139 zapravo vezivno mesto antikoagulanata. Smatra se da zamena tirozina drugom aminokiselinom rezultira nemogućnošću antikoagulanta da se veže za VKORC1. U istraživanju Lasseuer-a i sar. (2007) sa varfarin-rezistentnim pacovima potvrđeno je da su jedinke sa Tyr139Phe zamenom rezistentne na varfarin bez obzira što je razlika između tirozina i fenilalanina u samo jednoj hidroksilnoj grupi. Do istih rezultata došli su Grandemange i sar. (2009). Kod nosilaca Tyr139Cys varijante utvrđeno je da imaju bazalnu aktivnost VKOR enzima manju od divljeg tipa (Pelz i sar., 2005). U prisustvu antikoagulanata aktivnost enzima se dodatno smanjuje, ali je i dalje veća od aktivnosti VKOR-a u poređenju Leu128Ser varijantom. Druge zamene tirozina na ovom kodonu, takođe, imaju visoku bazalnu aktivnost VKOR-a (Lasseur i sar., 2007; Matagrin i sar., 2013). Zamena 25 tirozina sa fenilalaninom pokazala je aktivnost enzima veću od bazalne aktivnosti divljeg tipa za 16 % (Pelz i sar., 2005). Tyr139Cys varijanta je dosta istraživana kod sivog pacova i prevalentna je u populacijama sivog pacova u evropskim državama kao što su Nemačka, Danska, Francuska, Velika Britanija, Belgija i Norveška, a njeno prisustvo je potvrđeno u Mađarskoj, što je do sada predstavljao jedini rezultat o rezistentnosti glodara uopšte na ovim prostorima (Rost i sar., 2009; Buckle i sar., 2012b). Utvrđeno je da su jedinke domaćeg miša, nosioci ove VKOR varijante, rezistentni na prvu generaciju antikoagulanata i bromadiolon (Prescott, 1996; Pelz i sar., 2005). Rezultati skorijih istraživanja ukazuju na uginuće manjeg broja nosilaca ove varijante tokom tretmana bromadiolonom ali u populacijama sivog pacova (Endepols i sar., 2012). Efikasnost ostalih antikoagulanata druge generacije na ovu varijantu do sada nije utvrđivana na domaćem mišu. 2.5.2.3 Spretus grupa (Arg12Trp/Ala26Ser/Ala48Thr/Arg61Leu) Prvi slučaj hibridizacije vrsta alžirskog miša (Mus spretus) sa domaćim mišem (Mus musculus) utvrdili su Geen-Till i sar. (2000). Kasnija istraživanja pokazala su da se ovim putem prenose rezistentni aleli sa Mus spretus na Mus domesticus i Mus musculus (Song i sar., 2011; Pelz i sar., 2012). Ukrštanjem dolazi do prenosa grupe vezanih mutacija, odnosno Spretus grupe sa alžirskog na domaćeg miša. Prisustvo Spretus grupe potvrđeno je u Nemačkoj, Švajcarskoj i Portugalu (Rost i sar., 2009; Pelz i sar., 2012). Kod domaćeg miša ova varijanta može se javiti u kombinaciji sa Leu128Ser i Tyr139Cys varijantama (Pelz i sar., 2011; Pelz i sar., 2012). Varijanta Ala26 u potpunosti je očuvana kod kičemenjaka (Rost i sar., 2009). Takođe, varijanta Arg61Trp nije snažno vezana za ovu grupu vezanih mutacija, pa se Spretus grupa može sresti i bez ove varijante (Pelz i sar., 2012). U in-vitro istraživanjima pojedinačno je potvrđen uticaj svake VKOR varijante koja se nalazi u Spretus grupi (Rost i sar., 2009). Za Arg12Trp i Arg61Leu utvrđen je jak uticaj na VKOR aktivnost čija je bazalna aktivnost bila na nivou 33 % i 49 % u odnosu na osetljivu varijantu. Za varijante Ala26Ser i Ala48Thr utvrđena je visoka bazalna aktivnost VKOR-a od 67 % i 118 %. U kombinaciji sa Spretus grupom sreće se i 26 Arg58Gly varijanata koja takođe ima jak uticaj samo na bazalnu VKOR aktivnost, dok se u prisustvu antikoagulanta ne održava aktivnost VKOR-a (Pelz i sar., 2012). Za Spretus VKOR varijantu utvrđeno je da dovodi do rezistentnosti na prvu generaciju antikoagulanata i poseduje određeni stepen rezistentnosti na difenakum (Song i sar., 2011). 2.6 MOGUĆNOST SUZBIJANJA REZISTENTNIH JEDINKI DOMAĆEG MIŠA 2.6.1 Plejotropni efekat vkorc1 gena Osim razlike u sekvenci vkorc1 gena, između osetljivih i rezistentnih jedinki utvrđene su razlike u raznim fiziološkim procesima. Osetljive jedinke nalaze se u biološkoj prednosti u odnosu na rezistentne jedinke (Greaves i Cullen-Ayres, 1988; Smith i sar., 1991; Heiberg i sar., 2003; Pelz i sar., 2005; Heiberg i sar., 2006; Kaneki i sar., 2006; Lasseuer i sar., 2007; Kohn i sar., 2008; Jacob i sar., 2012; Matagrin i sar., 2013). Pored toga što utiče na ispoljavanje rezistentnosti, za polimorfizam vkorc1 gena je ustanovljena i povezanost sa izmenjenom aktivnošću enzima čiju sintezu diktira ovaj gen, odnosno da se aktivnost enzima sa izmenjenom sekvencom razlikuje u odnosu na „divlji“ tip. Kao posledica plejotropnog efekta vkorc1 gena rezistentne jedinke imaju prirodno smanjenu aktivnost VKOR-a (Pelz i sar., 2005). Lasseuer i sar. (2007) su utvrdili različite parametre za aktivnost enzima između osetljivih i rezistentnih jedinki za različite antikoagulantne rodenticide. Takođe, razlike u vrednostima parametara za enzimsku aktivnost rezistentnih jedinki za različite antikoagulante direktno su ukazivale i na različite nivoe rezistentnosti na različite antikoagulante kod jedinki sa istim tipom vkorc1 varijante. Polimorfizam vkorc1 gena može uticati i na druge vitamin K zavisne reakcije u organizmu kao što su mineralizacija i arterosklerotična kalcifikacija. Smanjena aktivnost VKOR-a može dovesti do smanjenja kostne gustine i sadržaja zbog smanjene sinteze osteokalcina, jednog od vitamin K zavisnih proteina koji ulazi u sastav kostiju (Song i sar., 2008). Posledice nedostatka vitamina K se kod rezistentnih glodara mogu odraziti i preko smanjenog nivoa reprodukcije i zaostajanja u porastu, što ukazuje na evolutivnu prednost osetljivih jedinki (Smith i sar., 1991; Kaneki i sar., 2006; Jacob i sar., 2012; 27 Buckle i Prescottt, 2012). Rezultati do kojih su došli Jacob i sar. (2012) su potvrdili da smanjen nivo reprodukcije kod Tyr139Cys jedinki sivog pacova, za 20 % u odnosu na osetljive, nije posledica anomalija u građi genitalija zbog promena u vkorc1 genu, već povećanih zahteva u vitaminu K kod jedinki rezistentnih na bromadiolon. Razlike u potrebama za vitaminom K posebno su izražene između različitih genotipova, odnosno heterozigotnih i homozigotnih jedinki. Zbog drastično smanjene aktivnosti VKOR enzima homozigotne jedinke imaju zahteve u vitaminu K veće nego heterozigotne jedinke (Bishop i sar., 1977; Greaves i Cullen-Ayres, 1988; Jacob i sar., 2012). Ovakvi zahtevi imaju za posledicu izraženiju kalcifikaciju aorte (Kohn i sar., 2008), kao i manji reproduktivni potencijal homozigotnih jedinki (Heiberg i sar., 2006). U prilog tvrdnji da i rezistentne jedinke mogu uginuti zbog pojave hemoragija zbog nedostatka vitamina K je i istraživanje koje su sproveli Heiberg i sar. (2003) na rezistentnim jedinkama sivog pacova. U ovom istraživanju su kod jedinki koje su tokom 2 godine držane po principu poluotvorenih sistema i na koje nije primenjivan bromadiolon, ipak tokom trajanja testa zabeležena uginuća jedinki sa simptomima krvarenja usled nedostatka vitamina K. Takođe, primećeno je da se ovakva pojava češće dešava kod mlađih mužjaka nego kod ženki. Nivo rezistentnosti u datoj populaciji ostao je nepromenjen što su istraživači pokušali objasniti dostupnim alternativnim izvorima vitamina K u prirodi koji deluje kao antidot. Isti istraživači smatrali su da bi se ograničavanjem izvora vitamina K moglo uticati na brojnost jedinki rezistentnih na bromadiolon zbog negativnog plejotropnog efekta vkorc1 gena što za posledicu ima povećane potrebe u vitaminu K. Ipak, ishod ovakvih postupaka zavisio bi od većeg broja faktora kao što su uslovi sredine, tip rezistentnosti koji bi definisao visinu potreba u vitaminu K kod jedinki, kao i učestalost genotipa. Zbog negativnih posledica plejotrofnog efekta vkorc1 gena, rezistentne jedinke glodara su u prednosti u odnosu na osetljive samo u uslovima primene antikoagulantnih rodenticida na koje su te jedinke već razvile rezistentnost (Jacob i sar., 2012; RRAG, 2012). 2.6.2 Uvođenje novih antikoagulanata u praktičnu primenu S obzirom na štete koje jedinke domaćeg miša mogu naneti, njihovo suzbijanje se nameće kao neophodna mera koja se mora sprovoditi. Razvojem rezistentnosti na 28 određeni rodenticid smanjuje se efikasnost suzbijanja. Dodatna opasnost zbog prisustva rezistentnih jedinki u prirodi javlja se zbog činjenice da ovakve jedinke predstavljaju veliku opasnost posmatrano i sa ekotoksikološkog stanovišta. Sadržaj rodenticida u rezistentnim jedinkama može biti i do 5 puta veći u odnosu na osetljive jedinke (MacVicker i sar., 2005). Takođe, količine primene neefikasnih antikoagulanata mogu biti i 10 puta veće nego što bi to bio slučaj sa antikoagulantima na koje nije razvijena rezistentnost. Dodatni problem je činjenica da rezistentne jedinke, koje u sebi nose ostatke antikoagulanata, višestruko duže preživljavaju nego što bi preživele tretman sa za njih efikasnim antikoagulantom i samim tim predstavljaju opasnost za druge neciljne organizme (Daniells i sar., 2011). Nema razlike između osetljivih i rezistentnih jedinki u načinu i stepenu akumulacije antikoagulanata, ali se rizik od sekundarnog trovanja povećava zbog izuzetno značajnih razlika u dužini preživljavanja između ove dve grupe jedinki (Berny i sar., 2011; Vein i sar., 2013). Prvi korak nakon utvrđene rezistentnosti na neki antikoagulant jeste njegovo isključivanje iz primene i zamena sa drugim efikasnijim rodenticidima. U Nemačkoj se brodifakum, flokumafen i difetialon predlažu kao rešenje za suzbijanje populacija u kojima su prisutne neke od tri poznate VKOR varijante za koje se vezuje smanjena osetljivost domaćeg miša. Primena ovih antikoagulanata se preporučuje samo u oblastima gde je registrovana rezistentnost na bromadiolon i difenakum, kako bi se izbegao potencijalni rizik po neciljne vrste zbog velike toksičnosti ovih antikoagulanata (Esther i sar., 2014). Skorija istraživanja vezana za donošenja novih rešenja za suzbijanje Tyr139Cys jedinki, koje se povezuju sa visokim nivoom rezistentnosti na bromadiolon, sprovođena su samo na pacovima gde je utvrđeno da se ove jedinke mogu uspešno suzbiti uvođenjem difenakuma u primenu (Buckle i sar., 2012a). Takođe, brodifakum je ispoljio veću efikasnost od difenakuma u suzbijanju istih jedinki (Buckle i sar., 2012b). Komitet za rezistentnost na rodenticide (RRAC-Rodenticide Resistance Action Committee) dao je predlog da se brodifakum koristi za suzbijanje jedinki sivog pacova u populacijama koju čine nosioci Tyr139Cys varijante (RRAC, 2010). Istraživanje Grandemange-a i sar. (2009) ukazalo je na činjenicu da primena antikoagulanata prve generacije u populacijama sa niskim stepenom rezistentnosti, odnosno koju karakteriše prisutnost heterozigotnih i eventualno manja zastupljenost 29 homozigotnih jedinki, može dovesti do značajnog povećanja učestalosti rezistentnih alela, odnosno prisustva homozigotnih jedinki. Isključivanje antikoagulanta, na koji je rezistentnost već razvijena, iz primene ima veliki značaj za gubitak rezistentnih alela u populaciji. Zbog svih nedostataka koje rezistentne jedinke trpe u odnosu na osetljive kao posledica nedostataka vitamina K, osetljive jedinke mogu biti favorizovane u prirodi ukoliko ne bi bilo primene antikoagulanata na koje su jedinke već razvile rezistentnost. Broj homozigota bi se smanjivao u korist heterozigota, dok bi se broj heterozigota smanjivao usled gubljenja alela u osetljivim populacijama. Smatra se da bi period od 2 do 4 godine bio dovoljan da se izgube rezistentni aleli ukoliko bi se isključila primena antikoagulantnih rodenticida. Ovo naročito važi za početak pojave rezistentnosti s obzirom da su početni stadijumi uvek odražavaju preko pojave heterozigota (Greaves, 1994). Međutim, potpuno isključivanje antikoagulanata na ovako dug period uglavnom nije ekonomski prihvatljivo. Takođe, neprimenjivanje antikoagulanata u smislu očekivanog „oporavka“ populacije odnosno gubitka rezistentnih alela u nekim istraživanjima nije dalo očekivane rezultate jer je i nakon 2 godine neprimenjivanja bromadiolona nivo rezistentnostu u populaciji sivog pacova bio isti (Heiberg i sar., 2003). U prilog tome su i rezultati istraživača Heiberg-a i sar. (2006) koji ukazuju da heterozigotne ženke imaju veći reproduktivni potencijal od homozigotnih u situacijama kada antikoagulant nije bio primenjivan. Do gubitka rezistentnih alela može doći ali u primenu treba uvesti neki drugi efikasniji antikoagulant s obzirom da heterozigotne jedinke nemaju negativne biološke posledice kao što je slučaj sa homozigotima u situacijama odsustva antikoagulanata (Endepols i sar., 2013). 2.6.3 Potencijalni faktori uticaja na efikasnost antikoagulanata Glavni uzrok kojim se objašnjava neefikasnost nekog antikoagulanta na terenu jeste postojanje rezistentnih jedinki glodara (Rowe i sar., 1981; Endepols i sar., 2011; Buckle i sar., 2012a, 2012b; Endepols i sar., 2013). Međutim, razlog smanjene efikasnosti nekog antikoagulanta na terenu nije uvek prisustvo rezistentnih jedinki. Više činilaca može objasniti neefikasnost nekog antikoagulanta na terenu iako je njegova efikasnost u laboratorijskim testovima zadovoljavajuća. Greške prilikom izvođenja deratizacije su 30 jedan od čestih uzroka neuspeha tokom suzbijanja štetnih glodara. Kratak period izlaganja mamaca, mali broj kutija u kojima se vrši izlaganje mamca, pogrešno procenjena oblast u kojoj će se sprovesti suzbijanje, nedovoljno atraktivan mamac, kontaminacija mamca od strane insekata ili mikroorganizama koji mogu smanjiti atraktivnost, vrlo nepovoljno utiču na efikasnost suzbijanja (Timm, 1991, 1994). Imigracija novih jedinki kao i prisustvo alternativnih izvora hrane i samo ponašanje jedinki tokom ishrane dodatno utiču na nespeh u izvođenju deratizacije (Humphries i sar., 1992; Quy i sar., 1992; Humphries i sar., 2000; Clapperton, 2006; Buckle i sar., 2012a, 2012b; Espinosa, 2013). Uzimajući u obzir da se vitamin K (K1 i K2) može naći u povrću tj. zelenim delovima biljaka, mlečnim proizvodima, mesu, jajima i da je domaći miš omnivorna vrsta, vrlo je moguće da jedinke u isto vreme unose i antikoagulant i antidot. Takođe, iako je antikoagulant primenjen jedinke mogu izbegavati njegovu ingestiju ukoliko su prisutni alternativni i atraktivniji izvori hrane što je u skladišnim objektima čest slučaj (Damon i sar., 2005). Neefikasnost antikoagulantnih rodenticida koja predstavlja posledicu izmenjenog ponašanja jedinki do sada je kod glodara registrovana jedino kod domaćeg miša. U nekim populacijama domaćeg miša je ustanovljen problem sa konzumiranjem mamaca na bazi žitarica jer, usled smanjenog nivoa ili nedostatka enzima alfa amilaze u digestivnom traktu, nisu mogli da svare hranu na bazi žitarica. Ovaj fiziološki problem je nasledan i s obzirom na brzinu razmnožavanja kućnog miša vrlo brzo se širi unutar populacije. U ovom slučaju glodari su osetljivi na antikoagulante ali preživljavaju zahvaljujući izmenama u njihovom ponašanju za razliku od rezistentnih glodara koji konzumiraju mamce sa antikoagulantima ali ne uginjavaju (Humphries i sar., 1992, 2000). 31 3 MATERIJAL I METODE 3.1 LOKALITETI I IZLOVLJAVANJE JEDINKI Divlje jedinke koje su korišćene u eksperimentima1 izlovljavane su u skladištima na lokalitetima Surčin, Zemun Polje, Stara Pazova, Uljma, Bački Jarak, Barajevo i Smederevska Palanka. Takođe, u oglede su uključivane jedinke domaćeg miša koje su po poreklu bile potomci divljih jedinki dobijeni u laboratorijskim uslovima. Jedinke domaćeg miša su izlovljavane u skladištima u kojima je suzbijanje glodara proteklih godina vršeno rodenticidima. Najintenzivnija primena rodenticida bila je na lokalitetima Surčin, Zemun Polje i Smederevska Palanka, s obzirom da se na ovim lokalitetima skladišti i priprema semenski materijal i stočna hrana tokom cele godine u većem ili manjem obimu. Na lokalitetima Stara Pazova, Uljma i Bački Jarak, takođe su za suzbijanje glodara primenjivani rodenticidi, ali u manjoj meri s obzirom da skladišni materijal nije bio prisutan konstantno u toku godine. Izlovljavanje jedinki na lokalitetu Barajevo vršeno je na privatnom gazdinstvu na kome nikada ranije nije primenjivan bilo koji rodenticid. Primena rodenticida uglavnom je vršena bez prethodne kontrole brojnosti glodara i bez kontrole konzumacije primenjenih mamaca. Najčešće primenenjivani rodenticidi bili su antikoagulanti, prvenstveno bromadiolon. U svim objektima u kojima je korišćen bromadiolon primećena je njegova značajno smanjena efikasnost tokom suzbijanja domaćeg miša. Jedinke domaćeg miša izlovljene su u objektima za pripremu i skladištenje stočne hrane, semenskog materijala kao i u objektima za proizvodnju i skladištenje prehrambenih proizvoda (tabela 2). Izlovljavanje je sprovođeno u periodima mart-april i septembar-oktobar. Za izlovljavanje su korišćene klopke živolovke Longworth. U klopke je postavljan mamac pripremljen od pržene slanine, luka i hleba prema Vukićević-Radić i sar. (2005). Klopke živolovke postavljane su u svim objektima gde su primećeni tragovi prisustva domaćeg miša kao što su feces, miris urina, tragovi stopala ali i oštećenja na uskladištenim proizvodima ili na samom objektu. Klopke 1 Svi eksperimenti sprovedeni su u skladu sa etičkim principima koje je usvojila Etička komisija pri Institutu za biološka istraživanja “Siniša Stanković” (broj protokola: 9-04/2013). 32 živolovke su postavljane uz ivice zidova, na razmaku od približno 5 m. Na svakom lokalitetu izlovljavanje je sprovedeno u periodu od 4 uzastopna dana. Klopke su proveravane dva puta u toku dana. Tabela 2. Osnovni podaci o lokalitetima na kojima je vršeno izlovljavanje Svi objekti u kojima je vršeno izlovljavanje jedinki domaćeg miša bili su okruženi oranicama i pašnjacima koji obiluju alternativnim izvorima hrane pružajući pogodne uslove za održavanje i širenje populacije ovog glodara. Sa svakog lokaliteta u laboratoriju je odnešeno po 20 adultnih jedinki (10 mužjaka i 10 ženki). Uhvaćene jedinke za koje se sumnjalo da su gravidne, bolesne ili nisu bile polno Lokalitet Koordinate Izlovljavanje Skladišteni materijal Surčin 44°50'N 20°17'E Mart-april Septembar-oktobar Stočna hrana Zemun Polje 44°52'N 20°20'E Mart-april Septembar-oktobar Semenski material (kukuruz) Stara Pazova 44°59'N 20°08'E Mart-april Septembar-oktobar Prehrambeni proizvodi Uljma 45°03'N 21°09'E Septembar-oktobar Semenski material (pšenica) Bački Jarak 45°15'N 19°51'E Septembar-oktobar Uljane kulture (suncokret) Barajevo 44°36'N 20°26'E Septembar-oktobar Ratarske i povrtarske kulture Smederevska Palanka 44°21'N 20°57'E April Semenski material (povrtarske kulture) 33 zrele nisu odnošene u laboratoriju. Takođe, u laboratoriju nisu odnošene jedinke koje su pokazivale znakove stresa (drhtanje, slaba pokretljivost). Slika 3. Lokaliteti na kojima je vršeno izlovljavanje jedinki domaćeg miša (1-Bački Jarak; 2-Stara Pazova; 3-Zemun Polje; 4-Surčin; 5-Uljma; 6-Barajevo; 7- Smederevska Palanka) Slika 4. Klopka živolovka Longworth 34 3.2 ČUVANJE I AKLIMATIZACIJA JEDINKI Pre početka eksperimenta svih 140 divljih jedinki domaćeg miša prilagođavane su laboratorijskim uslovima tokom perioda aklimatizacije u trajanju od 21 dan. Jedinke su čuvane pojedinačno u standardnim plastičnim kavezima dimenzija 320·200·135 mm pod kontrolisanim laboratorijskim uslovima: sobna temperatura 20 °C ± 2 °C, relativna vlažnost od 40 % do 70 % i dvanaestočasovni režim svetlosti (12 h svetlo/tama). Tokom perioda aklimatizacije jedinke su hranjene laboratorijskom hranom za miševe (proizvođač Veterinarski zavod Subotica). Voda je bila dostupna ad libitum. Takođe, u periodu nakon tretiranja antikoagulantima su sve preživele jedinke vraćene na isti režim čuvanja kao i tokom perioda aklimatizacije. Pod istim laboratorijskim uslovima čuvane su i jedinke F1 generacije. Ove jedinke dobijene su ukrštanjem divljih jedinki domaćeg miša koje su preživele test hranjenja bromadiolonom. Sparivanje preživelih divljih jedinki vršeno je isključivo između jedinki poreklom sa istog lokaliteta. Iz ukupno sedam okota dobijeno je 26 jedinki F1 generacije od kojih su devet jedinki (tri ženke i šest mužjaka) predstavljale potomke preživelih jedinki sa lokaliteta Surčin i 17 jedinki (devet ženki i osam mužjaka) koje su bile potomci jedinki iz Zemun Polja. Sve jedinke F1 generacije, starosti tri meseca, uključivane su u oglede sa bromadiolonom po istoj eksperimentalnoj šemi kao i njihovi roditelji. Slika 5. Održavanje domaćeg miša tokom perioda aklimatizacije Takođe, jedinke preživele test hranjenja bromadiolonom ukrštane su u svrhu dobijanja potomstva sa smanjenom osetljivošću na bromadiolon s ciljem utvrđivanja osetljivosti 35 na difenakum i brodifakum. Za potrebe ovih ogleda nakon većeg broja ukrštanja tri rezistentna mužjaka i šest rezistentnih ženki tokom perioda od godinu dana dobijeno je 65 jedinki F1 generacije. Sa tri meseca starosti ove jedinke su uključivane u testove hranjenja bromadiolonom nakon kojih su dobijene 24 jedinke sa smanjenom osetljivošću na bromadiolon koje su dalje uključivane u oglede sa difenakumom i brodifakumom u cilju ispitivanja ukrštene rezistentnosti na ove antikoagulante. Slika 6. Jedinke F1 generacije starosti od 7 i 14 dana 3.3 KORIŠĆENI MAMCI Svi mamci pripremani su u skladu sa metodom EPPO standarda (2004a). Placebo mamci dobijenu su mešanjem usitnjenog pšeničnog zrna, kukuruznog ulja i pšeničnog brašna u odnosu 90:5:5. Mamci na bazi bromadiolona, difenakuma i brodifakuma dobijeni su po istom principu kao i placebo mamci uz dodavanje odgovarajuće količine aktivne supstance rodenticida do sadržaja u mamcima od 0,005 %. Za pripremanje mamaca korišćeni su tečni koncentrati aktivnih supstanci proizvođača Duochem. Svi mamci pripremljeni su u Laboratoriji za primenjenu zoologiju, a sadržaj aktivne supstance proveren je u Laboratoriji za primenjenu hemiju Instituta za pesticide i zaštitu životne sredine. 3.4 UTVRĐIVANJE OSETLJIVOSTI DOMAĆEG MIŠA NA BROMADIOLON Utvrđivanje osetljivosti domaćeg miša na bromadiolon izvedeno je prema metodama EPPO standarda (2004b) i Guidobono-a i sar. (2010). Jedinke domaćeg miša nakon 36 perioda aklimatizacije prvo su izlagane placebo mamcima u trajanju od četiri dana. Placebo mamcima izlagane su sve divlje jedinke. Jedinke F1 generacije nisu izlagane placebo mamcima neposredno pred izlaganje antikoagulantima jer su tokom odgajanja bile podvrgnute procesu privikavanja na način izlaganja mamca. U test hranjenja je uključivano po 20 divljih adultnih jedinki (10 mužjaka i 10 ženki) sa svakog lokaliteta. Nakon četvorodnevnog hranjenja placebo mamcima, divljim jedinkama je ponuđen mamac sa 0,005 % bromadiolona u testu hranjenja bez izbora hrane u trajanju od 21 dan. Tokom testa praćen je dnevni unos mamca. Svakodnevno je jedinkama ponuđen svež mamac u čistim čašicama. Voda je bila dostupna ad libitum. Pored konzumacije mamca svakodnevno su praćeni simptomi trovanja antikoagulantima. Kod svih uginulih jedinki vršena je autopsija kako bi se utvrdilo da li su prisutni simptomi trovanja antikoagulantima prema Kataranovski i sar. (1980). Tokom trajanja testa sve jedinke su držane pojedinačno u kavezima. Kontrolisani parametri (temperatura, vlažnost i svetlost) održavani su u laboratoriji kao i tokom perioda aklimatizacije. Slika 7. Kavezi u kojima su jedinke domaćeg miša izlagane mamcima antikoagulanata Po završetku testa hranjenja preživele jedinke su vraćene na normalan režim ishrane uz 37 stalno praćenje pojave simptoma trovanja antikoagulantima tokom perioda opservacije u trajanju od 21 dan. Jedinke domaćeg miša koje prežive test hranjenja antikoagulantima bez izbora hrane u trajanju od 21 dan i dodatni opservacijski period u istom trajanju, smatraju se rezistentnim jedinkama. Ista šema eksperimenta primenjena je i na jedinke F1 generacije preživelih divljih jedinki. Prema metodi EPPO standarda (2004a) da bi antikoagulant bio efikasan na sve jedinke u jednoj populaciji, u testovima sa divljim jedinkama se uključuju jedinke različite telesne mase. Početna telesna masa divljih jedinki bila je u intervalu od 10,4 g do 22,9 g, dok je interval telesne mase jedinki F1 generacije bio od 11,0 g do 18,3 g. Svim jedinkama, osim početne telesne mase, zabeležena je i telesna masa na kraju testa. Promena telesne mase utvrđivana je prema metodi Guidobono-a i sar. (2010). 3.5 UTVRĐIVANJE PRISUSTVA MUTACIJA U VKORC1 GENU Za ekstrakciju DNK korišćeni su delovi ušne školjke. Uzorci za DNK analizu uzimani su sa uginulih jedinki koje su prethodno čuvane na -70 °C. Uzeti uzorci ušne školjke do same analize čuvani su u 80 % rastvoru alkohola. Ukupno su analizirana 33 uzorka (9 divljih i 24 jedinke F1 generacije). U tabeli 3 dat je prikaz uzoraka koji su analizirani. Tabela 3. Opis uzoraka za ekstrakciju DNK i sekvencioniranje vkorc1 gena Rezistentne Osetljive Divlje jedinke Lokalitet Surčin Zemun Polje Surčin Zemun Polje Pol ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ Broj uzoraka 1 2 2 4 - - - - F1 generacija Lokalitet Surčin Zemun Polje Surčin Zemun Polje Pol ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ Broj uzoraka 3 1 - 4 3 1 8 4 Ekstrakcija DNK urađena je u Julius Kühn Institute, Vertebrate Research (Munster, Nemačka) po protokolu za Puregene Core Kit A (Qiagen). Sekvencioniranje tri egzona vkorc1 gena urađeno je u Nemačkoj kompaniji GATC po metodi Pelz-a i sar. (2012) 38 prema kojoj su promene u sekvenci vkorc1 gena utvrđivane na osnovu poređenja sa sekvencom NM_178 600 koja je uzeta kao divlji tip iz banke gena. Očitavanja sekvenci vršena su pomoću automatskog aparata Beckman Coulter CEQ8000. Sve jedinke domaćeg miša čiji su uzorci uzeti za analizu su prethodno bile uključene u testove hranjenja bromadiolonom, odnosno fenotipski status tj. osetljivost na bromadiolon kod svih analiziranih jedinki bio je poznat pre molekularnih analiza. Sekvencioniranje sva tri egzona vkorc1 gena urađeno je s ciljem utvrđivanja prisustva nekih od već poznatih VKOR varijanti u egzonu 3 ovog gena, koje se smatraju razlogom pojave rezistentnosti kod domaćeg miša, kao i eventualno prisustvo do sada neutvrđenih promena u sekvenci vkorc1 gena kod domaćeg miša. 3.6 UTVRĐIVANJE OSETLJIVOSTI DOMAĆEG MIŠA NA DIFENAKUM Utvrđivanje osetljivosti domaćeg miša na difenakum rađeno je prema metodama EPPO standarda (2004b) i Rowe-a i sar. (1981) prema kojima su jedinke domaćeg miša izlagane difenakum mamcima u testu hranjenja u trajanju od 21 dan bez izbora hrane. U oglede su uključivane isključivo jedinke koje su prethodno preživele testove hranjenja bromadiolonom u trajanju od 21 dan s ciljem utvrđivanja prisustva ukrštene rezistentnosti. Vremenski period između tretmana bromadiolonom i difenakumom bio je sedam meseci, čime su zadovoljene preporuke EPPO standarda (2004b) o minimalnom vremenskom periodu od 21 dan koji je potreban da bi se uspostavila normalna koagulacija krvi između dva tretmana antikoagulantima. U test hranjenja uključeno je 20 adultnih jedinki (9 mužjaka i 11 ženki) od kojih je za 16 jedinki bila poznata sekvenca vkorc1 gena. Svakodnevno je jedinkama ponuđen svež difenakum mamac (0,005 %) u čistim čašicama. Tokom testa praćen je dnevni unos mamca. Način izlaganja mamca bio je isti kao i tokom testa hranjenja bromadiolon mamcima. Voda je bila dostupna ad libitum. Na početku i na kraju testa zabeležena je telesna masa svih jedinki. Promena telesne mase utvrđivana je prema metodi Guidobono-a i sar. (2010). Sve jedinke su držane pojedinačno u kavezima tokom trajanja testa hranjenja. Kontrolisani laboratorijski parametri (temperatura, vlažnost i svetlost) održavani su kao i tokom perioda aklimatizacije. Nakon 21 dan testa hranjenja, preživele jedinke se 39 vraćaju na normalan režim ishrane uz stalno praćenje pojave simptoma trovanja antikoagulantima tokom perioda opservacije u trajanju od 21 dan. 3.7 ISPITIVANJE OSETLJIVOSTI DOMAĆEG MIŠA NA BRODIFAKUM Ispitivanje osetljivosti jedinki domaćeg miša na brodifakum urađeno je prema metodama EPPO standarda (2004b) i Redfern-a i sar. (1976). Jedinke su izlagane mamcima sa 0,005 % aktivne supstance u trajanju od jedan i dva dana. U oglede su uključivane isključivo jedinke koje su prethodno preživele test hranjenja bromadiolonom u trajanju od 21 dan s ciljem utvrđivanja osetljivosti ovakvih jedinki na mamce sa sadržajem brodifakuma od 0,005 %. Vremenski period između tretmana bromadiolonom i brodifakumom bio je sedam meseci. U periodima od 24 i 48 sati jedinke su bile izlagane mamcima sa brodifakumom u testu bez izbora hrane. U oba ogleda uključeno je po 10 adultnih jedinki (5 mužjaka i 5 ženki). Jedinkama je u plastičnim čašicama bio ponuđen mamac sa brodifakumom bez izbora hrane. Voda je bila dostupna ad libitum. Kao i tokom ogleda sa bromadiolonom i difenakumom, sve jedinke su držane pojedinačno u kavezima tokom trajanja testa hranjenja. Kontrolisani laboratorijski parametri (temperatura, vlažnost i svetlost) održavani su kao i tokom perioda aklimatizacije. Nakon isteka 24 sata, odnosno 48 sati jedinke su vraćane na normalan režim ishrane uz kontrolisane laboratorijske uslove i stalno praćenje pojave simptoma trovanja tokom perioda opservacije od 21 dan. 3.8 OBRADA PODATAKA Vreme preživljavanja između različitih grupa jedinki domačeg miša poređena su korišćenjem Log-rank testa (Survival analysis). Nivo značajnosti bio je p<0,05. Vrednosti ukupne i prosečne konzumacije izračunate su za ceo period hranjenja za svaku jedinku pojedinačno prema sledećim formulama: Ukupna konzumacija = suma konzumacije mamca tokom celog perioda hranjenja (g)/početna masa (g) 40 Prosečna konzumacija = prosečna konzumacija mamca tokom celog perioda hranjenja (g)/početna masa (g) Za utvrđivanje uticaja različitih faktora na ukupnu konzumaciju mamca sa antikoagulantima, kao i za prosečnu konzumaciju mamca za sve jedinke iz testa hranjenja korišćen je Studentov t-test i faktorijalna analiza varijanse (ANOVA). Daljom post hoc analizom poređenja su vršena korišćenjem Tukey HSD testa. Nivo značajnosti za sva poređenja bio je p<0,05. Promena telesne mase (tm) u procentima izračunata je za svaku jedinku pojedinačno prema formuli koju su dali Guidobono i sar. (2010): [(početna telesna masa−krajnja telesna masa)/početna telesna masa]×100. Za podatke o telesnoj masi koji nisu imali normalnu raspodelu i nakon logaritamske transformacije, za statističku obradu su korišćeni neparametrijski testovi (Manh-Whitney U test i Kruskal Wallis test). Dobijeni podaci su obrađeni prema uputstvima Sokal i Rohlf-a (1995) i pomoću softverskog paketa Statistika for Windows 6.0 (Stat Soft Italia, 1997). Iste slovne oznake na box plot graficima koji su korišćeni za grafički prikaz rezultata (centralna linija box plot grafika predstavlja medijanu, dok donja i gornja linija predstavljaju vrednosti Q1- prvih 25 % podataka od ostalih većih u nizu i Q3- prvih 75 % podataka u nizu; srednja vrednost- ▪; minimum- ┴; maksimum- ┬ ) označavaju sličnosti u Tukey testu. U pojedinim graficima nedostaju slovne oznake iz razloga što su grupe, u kojima nije bio dovoljan broj jedinki, bile isključene iz statističke analize. 41 4 REZULTATI 4.1 OSETLJIVOST DOMAĆEG MIŠA NA BROMADIOLON 4.1.1 Konzumacija placebo mamca Tokom četvorodnevnog testa hranjenja mužjaci su ukupno pojeli 890 g, dok su ženke pojele 807,9 g placebo mamca. Prosečne vrednosti konzumacije za mužjake i ženke iznosile su 12,76±2,52 g i 11,68±2,11 g. Konzumacija placebo mamca kod mužjaka na svim lokalitetima, izuzev jedinki izlovljenih na lokalitetu Bački Jarak, bila je veća u odnosu na ženke (tabela 8). Između mužjaka i ženki utvrđene su statistički značajne razlike u ukupnoj konzumaciji placebo mamaca (t=2,75; df=138; p<0,0066). U tabelama je prikazana konzumacija placebo mamca tokom četiri dana i bromadiolon mamca prvog dana testa za svaku jedinku pojedinačno. Tabela 4. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Surčin Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 1 14,0 2,8 3,8 3 12,0 2,4 3,2 2 13,5 2,7 3,6 7 11,4 2,3 2,8 4 13,1 2,6 3,5 9 11,9 2,4 3,1 8 14,2 2,8 4,7 12 12,9 2,6 3,5 10 13,2 2,6 3,6 19 12,2 2,4 3,0 13 12,5 2,5 3,5 51 8,3 1,7 2,3 17 14,0 2,8 3,4 53 13,6 2,7 3,8 18 12,4 2,5 3,2 54 11,9 2,4 3,0 50 14,2 2,8 3,8 55 9,7 1,9 2,5 59 14,6 2,9 4,9 92 12,3 2,5 2,9 Ms 13,6 2,7 3,8 Ms 11,6 2,3 3,0 Sd 0,7 0,1 0,5 Sd 1,5 0,3 0,4 42 Tabela 5. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Zemun Polje Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 25 13,4 2,7 3,5 26-1 8,8 1,8 2,1 26-2 12,6 2,5 3,2 28 10,5 2,1 2,7 26-3 11,8 2,4 2,9 39 12,3 2,5 3,0 26-4 8,5 1,7 2,1 40 14,4 2,9 3,7 32 13,6 2,7 3,5 44 11,2 2,2 2,9 36 14,1 2,8 3,8 58 13,2 2,6 3,3 38 12,0 2,4 3,0 86 12,7 2,5 3,2 57 14,0 2,8 3,5 87 8,8 1,8 2,5 90-4 11,6 2,3 2,8 88 14,6 2,9 3,9 91 15,6 3,1 3,9 89 11,0 2,2 2,7 Ms 12,7 2,5 3,2 Ms 11,7 2,3 3,0 Sd 1,9 0,4 0,5 Sd 2,1 0,4 0,5 Tabela 6. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Stara Pazova Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 20 12,6 2,5 3,0 14 12,7 2,5 3,2 21-2 14,2 2,8 4,0 15 12,0 2,4 2,8 21-4 16,3 3,3 5,2 21 14,0 2,8 3,7 21-6 16,4 3,3 4,2 21-1 12,7 2,5 3,5 21-7 16,2 3,2 4,3 21-3 15,6 3,1 4,2 23-1 15,8 3,2 4,5 21-5 16,6 3,3 4,8 23-2 16,5 3,3 4,8 22 12,9 2,6 3,3 23-5 16,0 3,2 4,2 23 12,0 2,4 3,0 23-7 15,6 3,1 4,0 23-3 13,6 2,7 3,7 23-8 13,8 2,8 3,6 23-4 16,7 3,3 4,9 Ms 15,3 3,1 4,2 Ms 13,9 2,8 3,7 Sd 1,3 0,3 0,6 Sd 1,8 0,3 0,7 43 Tabela 7. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Uljma Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 67 12,9 2,6 3,4 68 13,4 2,7 3,5 73 12,5 2,5 3,2 69 14,0 2,8 4,0 78-1 16,7 3,3 4,5 70 12,5 2,5 3,4 78-2 13,3 2,7 3,9 74 12,5 2,5 3,4 78-3 15,8 3,2 4,4 75 11,9 2,4 3,1 79 15,6 3,1 4,2 76 8,3 1,7 1,9 81 14,1 2,8 3,7 77 16,7 3,3 4,7 83 16,0 3,2 4,4 78 13,4 2,7 3,6 84 16,5 3,3 4,1 78-4 11,8 2,4 3,2 85 15,9 3,2 4,3 78-5 13,0 2,6 3,7 Ms 14,9 3,0 4,0 Ms 12,7 2,6 3,4 Sd 1,6 0,3 0,4 Sd 2,1 0,4 0,7 Tabela 8. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Bački Jarak Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 98 8,5 1,7 2,9 108 8,1 1,6 1,9 99 10,5 2,1 3,0 109 7,9 1,6 2,4 100 12,2 2,4 3,3 110 11,2 2,2 2,3 101 7,5 1,5 1,6 111 11,7 2,3 3,1 102 8,0 1,6 2,2 112 9,1 1,8 2,9 103 11,8 2,4 3,1 113 8,2 1,6 2,3 104 11,8 2,4 3,0 114 12,0 2,4 3,2 105 6,7 1,3 2,0 115 9,1 1,8 2,9 106 7,2 1,4 2,3 116 11,4 2,3 3,0 107 8,2 1,6 2,3 117 12,3 2,5 3,4 Ms 9,2 1,8 2,6 Ms 10,1 2,0 2,7 Sd 2,1 0,4 0,6 Sd 1,8 0,4 0,5 44 Tabela 9. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Barajevo Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 201 12,3 2,5 3,0 211 11,2 2,2 2,8 202 12,5 2,5 3,3 212 12,0 2,4 3,0 203 13,4 2,7 4,1 213 9,9 2,0 3,1 204 13,6 2,7 3,8 214 11,0 2,2 3,3 205 10,9 2,2 3,0 215 9,2 1,8 2,9 206 14,2 2,8 4,1 216 11,1 2,2 3,0 207 13,6 2,7 4,1 217 13,1 2,6 3,7 208 13,0 2,6 3,9 218 12,8 2,6 3,4 209 12,4 2,5 3,8 219 8,7 1,7 2,9 210 13,3 2,7 3,3 220 13,3 2,7 3,7 Ms 12,9 2,6 3,6 Ms 11,2 2,2 3,2 Sd 0,9 0,2 0,4 Sd 1,6 0,3 0,3 Tabela 10. Konzumacija placebo mamca (g) tokom četvorodnevnog testa hranjenja za divlje mužjake i ženke domaćeg miša sa lokaliteta Smederevska Palanka Mužjaci Ženke Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan Jedinka (šifra) Ukupno (∑) ∑ 20 % Prvi dan 303 8,1 1,6 2,9 301 8,9 1,8 2,7 304 9,4 1,9 3,3 302 8,3 1,7 2,8 305 8,7 1,7 2,9 306 12,2 2,4 3,3 309 12,4 2,5 3,2 307 9,8 2,0 3,0 310 12,5 2,5 3,3 308 10,1 2,0 3,0 311 9,7 1,9 2,8 312 10,9 2,2 4,0 314 10,6 2,1 3,3 313 12,6 2,5 3,3 315 10,6 2,1 2,9 316 12,5 2,5 3,4 318 11,9 2,4 3,0 317 9,3 1,9 2,9 320 12,2 2,4 2,9 319 9,7 1,9 3,3 Ms 10,6 2,1 3,0 Ms 10,4 2,1 3,2 Sd 1,6 0,3 0,2 Sd 1,5 0,3 0,4 45 4.1.2 Vreme preživljavanja Test hranjenja preživelo je 10 divljih jedinki domaćeg miša sa lokaliteta Surčin i Zemun Polje (tabela 11). Veći broj preživelih zabeležen je u grupi jedinki koje su izlovljene na lokalitetu Zemun Polje. Preživelih jedinki, koje su izlovljavane na sa ostalim lokalitetima, nije bilo ali se dužina perioda preživljavanja razlikovala u zavisnosti od lokaliteta. Najduži period preživljavanja osetljivih jedinki zabeležen je kod onih sa lokaliteta Smederevska Palanka (<=18 dana). Kod jedinki sa lokaliteta Uljma i Bački Jarak takođe je utvrđen dug period preživljavanja od <=15 dana. Period preživljavanja osetljivih jedinki sa ostalih lokaliteta bio je <=10 dana. Test hranjenja preživelo je 10 jedinki F1 generacije. Osetljive jedinke iz Surčina uginule su do šestog dana testa, dok je kod osetljivih jedinki sa lokaliteta Zemun Polje utvrđen period preživljavanja od <=18 dana. Na oba lokaliteta ukupno je preživeo veći broj ženki u odnosu na mužjake. Kod jedinki F1 generacije, koje su dobijene ukrštanjem preživelih jedinki sa lokaliteta Zemun Polje, nije bilo preživelih mužjaka. Tabela 11. Vreme preživljavanja (h) i smrtnost jedinki domaćeg miša tokom testa hranjenja bromadiolonom za divlje jedinke (D) i njihove potomke (F1) Lokalitet Ms ±Sd Broj uginulih Broj preživelih Ukupan broj Ženke (D/F1) Mužjaci (D/F1) Ženke (D/F1) Mužjaci (D/F1) Surčin 284,7±169,1 7/1 9/3 3/2 1/3 29 Z.Polje 286,7±160,1 6/4 8/8 4/5 2/0 37 S.Pazova 151,2±47,4 10/0 10/0 0/0 0/0 20 Uljma 153,6±66,7 10/0 10/0 0/0 0/0 20 B.Jarak 140,4±71,1 10/0 10/0 0/0 0/0 20 Barajevo 133,2±34,4 10/0 10/0 0/0 0/0 20 S.Palanka 224,4±78,4 10/0 10/0 0/0 0/0 20 Ukupno 68 78 14 6 166 Najkraće vreme preživljavanja zabeleženo je kod jedinki sa lokaliteta Barajevo. Takođe, niski periodi preživljavanja (140,4 h do 153,6 h) utvrđeni su za jedinke sa lokaliteta Bački Jarak, Stara Pazova i Uljma. Najduže vreme preživljavanja zabeleženo je kod 46 jedinki sa lokaliteta Zemun Polje sa prosečnom srednjom vrednošću od 286,7 h. Kod jedinki sa lokaliteta Surčin i Smederevska Palanka utvrđeno je vreme preživljavanja od 284,7 h i 224,4 h. Na kraju testa, odnosno nakon isteka 504. sata testa preživelo je 31 % jedinki sa lokaliteta Surčin i 29,7 % jedinki sa lokaliteta Zemun Polje (grafik 1). Uginuli Živi 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 Vreme (sati) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 K u m u la ti v n a p ro p o rc ij a p re ži v lj av an ja Grafik 1. Kumulativna proporcija preživljavanja za sve jedinke domaćeg miša tokom testa hranjenja bromadiolon mamcima sa lokaliteta: Surčin (▬), Zemun Polje (▬), Stara Pazova (▬), Uljma (▬), Bački Jarak (▪▪▪), Barajevo (▪▪▪) i Smederevska Palanka (▬) Vreme preživljavanja jedinki domaćeg miša sa različitih lokaliteta statistički se značajno razlikovalo (tabela 12). Između lokaliteta Stara Pazova, Uljma, Bački Jarak i Barajevo, odnosno lokaliteta koje je karakterisalo kraće vreme preživljavanja, nije bilo statistički značajnih razlika. Razlika između lokaliteta Surčin, Zemun Polje i Smederevska Palanka, koje je karakterisalo duže vreme preživljavanja, nije bilo. Između ove dve grupe lokaliteta postojale su statistički značajne razlike. Kod ženki je utvrđeno duže vreme preživljavanja u odnosu na mužjake (tabela 13). Na kraju testa preživelo je 17,1 % ženki od ukupnog broja ženki i 7,1 % mužjaka od ukupnog broja mužjaka (grafik 2). Između mužjaka i ženki utvrđene su statistički značajne razlike u vremenu preživljavanja (WW=12,769; p<0,0202). 47 Tabela 12. Statistička značajnost razlika za vreme preživljavanja domaćeg miša sa različitih lokaliteta prema Log-rank testu Surčin Z.Polje S.Pazova Uljma B.Jarak Barajevo S.Palanka Surčin - 0,289 nz -8,326 ** -8,526 ** -9,600 ** -9,651 ** -4,345 nz Z.Polje 0,289 nz - -9,690 ** -9,678 ** -10,460 ** -10,980 ** -5,445 nz S.Pazova -8,326 ** -9,690 ** - -0,238 nz -1,914 nz -4,009 nz 8,353 ** Uljma -8,526 ** -9,678 ** -0,238 nz - -1,305 nz -3,402 nz 7,684 ** B.Jarak -9,600 ** 10,460 ** -1,914 nz -1,305 nz - -1,522 nz 8,376 ** Barajevo -9,651 ** 10,980 ** -4,009 nz -3,402 nz -1,522 nz - 10,178 ** S.Palanka -4,345 nz -5,445 nz 8,353 ** 7,684 ** 8,376 ** 10,178 ** - Napomena: nz Nije značajno (p<0,05); * Značajno (0,01