UNIVERZITET U BEOGRADU Fakultet veterinarske medicine Katedra za higijenu i tehnologiju namirnica animalnog porekla mr Radoslava R. Savić Radovanović, dipl.veterinar PROCENA RIZIKA OD NALAZA ENTEROTOKSINA STAFILOKOKA U MEKIM SIREVIMA Doktorska disertacija Beograd, 2015 UNIVERSITY OF BELGRADE Faculty of Veterinary Medicine Department of Food Hygiene and Technology Radoslava R. Savić Radovanović, Bsc, DVM RISK ASSESMENT OF STAPHYLOCOCCAL ENEROTOXINS OCCURRENCE IN SOFT CHEESES Doctoral dissertation Belgrade, 2015 Komisija za odbranu Doktorske disertacije Mentor : Dr Vera Katić, redovni profesor za užu naučnu oblast Higijena i tehnologija mleka, Fakultet Veterinarske medicine, Beograd Članovi: Dr Zora Mijačević, redovni profesor za užu naučnu oblast Higijena i tehnologija mleka, Fakultet Veterinarske medicine, Beograd Dr Branko Velebit, naučni saradnik, Institut za higijenu i tehnologiju mesa, Beograd Datum odbrane: Zahvaljujem se Prof. Dr Veri Katić na mentorskom radu, usmeravanju u toku rada, dragocenim savetima i pomoći prilikom izrade doktorske disertcije. Zahvaljujem se prof. Dr Zori Mijačević na pomoći i korisnim sugestijama, koje su doprinele boljem prikazu i tumačenju rezultata. Zahvaljujem se Dr Branku Velebitu, naučni saradnik na svesrdnoj pomoći u toku eksperimenta i primeni PCR tehnike za dobijanje rezultata. Zahvaljujem se Svetlani Čolović, specijalisti mikrobiologije na pomoći u toku dela eksperimenta, koji se odnosio na primenu ELFA tehnike. Zahvaljejem se Julijani Vrhunc i Siniši Bradonjiću, republičkim veterinarskim inspektorima Ministarstva poljoprivrede, vodoprivrede i šumarstva Vlade Republike Srbije, koji su mi pomogli oko uzorkovanja i koordinacije sa kolegama veterinarskim inspektorima na terenu. Hvala profesorki engleskog jezika Nevenki Bjelici, Bsc za korekturu teksta na engleskom jeziku. Hvala kolegama Nemanji Zdravkoviću, doktorandu i Tamásu Csordásu, studentu, koji su mi pomogli oko tehničke obrade teksta i kolegi Srećku Čupiću, dipl.veterinaru na podršci. Hvala svim prijateljima i kolegama, koji su me podržali, a posebnu zahvalnost dugujem mojoj deci Teodori i Dragutinu, jer su u bili uz mene. Rad posvećujem senima mojih predaka Radovanovića i Miljkovića. Sa posebnim pijetetom mom tati Radisavu V. Radovanoviću, dipl.ing. elektrotehnike i prof.DrVasiliju S.Miljkoviću, intelektualnim gromadama, koji su bili stubovi u mom životu. Žao mi je što moj učitelj prof.Dr Lazar Stojanović, koji je verovao u mene nije više meĎu nama. Procena rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekim sirevima Kratak sadržaj Procena rizika je naučno baziran proces koga čine identifikacija hazarda, karakterizacija hazarda, procena izloženosti i karakterizacija rizika. U kontekstu bezbednosti hrane rizik predstavlja verovatnoću i posledice da nastane štetno delovanje na zdravlje ljudi posle konzumiranja hrane. Sirevi kao hrana zauzimaju važno mesto u ishrani ljudi. U Evropi se danas oko 10% sireva proizvodi od sirovog mleka i ovi sirevi mogu da predstavljaju potencijalni rizik po javno zdravlje. U Republici Srbiji veliki broj sireva, prisutan na tržištu gradskih pijaca, proizvodi se u domaćinstvima i može se svrstati u grupu mekih sireva bez zrenja ili sa zrenjem. Budući da se odreĎen broj mekih sireva proizvodi od nekuvanog mleka, kao deo tradicije, postoji mogućnost da sa sirovim mlekom u sir dospeju patogeni mikroorganizmi kao što su koagulaza pozitivne stafilokoke. Glavni predstavnik koagulaza pozitivnih stafilokoka je Staphylococcus aureus subsp. aureus. Kao ubikvitarni mikroorganizam nalazi se na koži ljudi i životinja, a često kolinizuje ductus papillaris mlečne žlede muznih životinja. Sa aspekta bezbednosti hrane značaj ovog mikroorganizma se ogleda u tome što stvara termostabilne enterotoksine koji uneti u odreĎenoj količini, putem hrane, u organizam čoveka izazivaju intoksikacije. Cilj ove doktorske disertacije je bio da se, na osnovu broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u siru, uslova za njihovo razmnožavanje i stvaranje enterotoksina, kao i prisustva gena za sintezu enterotoksina kod koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sira, proceni rizik od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekim sirevima. Ispitivanjem je obuhvaćeno 555 uzoraka mekih sireva različite starosti proizvedenih od kuvanog ili nekuvanog mleka u individualnim domaćinstvima iz različitih geografskih lokaliteta u Srbiji, koji su uzeti sa 17 pijaca. Izolacija, identifikacija i odrĎivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka raĎeni su standardnom metodom (SRPS EN ISO 6888-2), a broj Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. je odreĎen metodom opisanom u standardu ISO 27205:2010 (IDF 149:2010). Identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka do vrste raĎena je na osnovu biohemijskih osobina pomoću BBLCrystal Identifikacionim sistemom-BD i ID 32 Staph-Biomerieux (Francuska). Sposobnost izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka da stvaraju klasične enterotoksine (SEA, SEB, SEC, SED, SEE), kao i prisustvo enterotoksina u siru ispitani su primenom ELFA tehnike VIDAS SET2 (BioMerieux, Francuska). Fenotipska identifikacija izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, za koje je ELFA tehnikom dokazano da stvaraju enterotoksine, raĎena je primenom ID 32 Staph- Biomerieux (Francuska). Prisustvo gena za sintezu enterotoksina safilokoka (SE) u dobijenim ekstraktima DNK iz 26 izolata enterotoksogenih koagulaza pozitivnih stafilokoka ispitano je konvencionalnom multipleks PCR tehnikom (za gene sea i seb), odnosno tehnikom Real-Time PCR (za gene sec, sed i see). Za dokazivanje prisustva sea gena korišćeni su prajmeri sea-f (5’-TCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAA-3’) i sea-r (5’-GAAGATCCAACTCCTGAACAGTTACA-3’), za prisustvo gena seb korišćeni su prajmeri seb-f (5’-AACAACTCGCCTTATGAAACGGGAT-3’) i seb-r (5’- CTCCTGGTGCAGGCATCATGTCA-3’), za dokazivanje gena sec korišćeni su prajmeri sec-f (5’-CGTATTAGCAGAGAGCCAACCA-3’) i sec-r (5’-GTGAATTT ACTCGCTTTGTGCAA-3’), za dokazivanje gena sed korišćeni su prajmeri sed-f (5’- AAACGTTAAAGCCAATGAAAACA-3’) i sed-r (5’-TGATCTCCTGTACTTTTATT TTCTCCTA-3’), a za dokazivanje gena see korišćeni su prajmeri see-f (5’-TACCAA TTAACTTGTGGATAGAC-3’) i see-r (5’-CTCTTTGCACCTTACCGC-3’). Od ukupno 555 uzoraka sireva različite starosti, proizvedenih od kuvanog ili nekuvanog mleka, koagulaza pozitivne stafilokoke su dokazane u 168 (30,27%) uzoraka sira. Od 168 uzoraka sira, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, 140 (83,33%) uzoraka sira proizvedeno je od nekuvanog mleka, a 28 (16,67%) uzoraka sira proizvedeno je od kuvanog mleka. Primenom skrining tehnike VIDAS SET2 (BioMerieux, Francuska) dokazano je da od 85 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka 26 (30,59%) izolata ima sposobnost da stvara klаsične enterotoksine (SEA-SEE). Od 26 enterotoksogenih primoizolata 20 (76,92%) izolata je bilo poreklom iz uzoraka sireva proizvedenih od nekuvanog mleka, a 6 (23,08%) izolata poreklom iz uzoraka sireva proizvedenih od kuvanog mleka. Primenom ID 32 Staph-Biomerieux (Francuska) testa izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka, koji su stvarali enterotoksine, najčešće su identifikovani kao S. aureus (61,54% izolata), zatim S. xylosus (15,38 % izolata), S. lentus (11,54% izolata) S. sciuri (11,54 % izolata). Kod svih 26 primoizolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, poreklom iz sireva proizvedenih od kuvanog ili nekuvanog mleka zа koje je ELFA tehnikom utvrĎeno dа stvаrаju enterotoksin, dokаzаn je gen zа enterotoksin A (sea), а kod 24 izolаtа je pored sea genа dokаzаn i gen zа sintezu enterotoksinа B (seb). Nijedаn izolаt nije posedovаo gene zа sintezu enterotoksinа C (sec), D (sed) i E (see). Od 26 uzoraka u kojima su dokazane enterotosogene koagulaza pozitivne stafilokoke, enterotoksini su dokazani u 2 (7,69%) uzorka slatko-koagulišućeg sira proizvedenog od nekuvanog mleka u kojima je broj enterotoksogenih koagulaza pozitivnih stafilokoka bio iznad 5 log cfu/g sira. Slatko-koagulišući sirevi proizvedeni od nekuvanog mleka u kojima je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka veći od 5 log cfu/g i u kojima je pH iznad 5,0 mogu da sаdrže enterotoksine u količinаmа koje izаzivаju intoksikаcije i predstаvljаju rizik po zrаvlje ljudi. Ključne reči: koagulaza pozitivne stafilokoke, S. aureus, meki sirevi, enterotoksini Naučna oblast: Veterinarska medicina Uža naučna oblast: Higijena i tehnologija mleka UDK 579.67:637.352. Risk assessment of staphylococcal enterotoxins occurrence in soft cheeses Summary Risk assessment is a scientifically based process consisting of hazard identification, hazard characterization, exposure assessment and risk characterization. A risk in the food safety context is the probability and the consequences of adverse health effects following the ingestion of food. Cheeses represent an important part in the human diet. Approximately 10% of cheese in Europe is made from raw milk, presenting a considereble potential risk to public health. In Serbia, a large number of cheeses present at the town markets is produced in households and can be classified as soft cheeses regardless ripening. Since some soft cheeses are produced from raw milk in acorrdance with our tradition, there is a possibility that the pathogenic microorganisms, such as coagulase-positive staphylococci pass into cheese from raw milk. The main representative of coagulase-positive staphylococci is Staphylococcus aureus subsp. aureus. As a ubiquitous microorganism is often present on the skin of humans and animals, and often colonizes ductus papillaris of dairy animals. From the point of view food safety this microrganism is significant brcase it may produce thermostable enterotoxins which ingested in a certain amount via food causes intoxication in the human organism. The aim of this PhD thesiss was to assess the risk of staphylococcal enterotoxin occurrence in soft cheeses on the basis of number of coagulase-positive staphylococci in cheese, conditions for their growth, synthesis of enterotoxins, and the presence of genes for enterotoxin synthesis in coagulase positive-staphylococci isolated from cheese, as well to asses the risk of staphylococcal enterotoxins occurrence in soft cheeses. The material consisted of 555 samples of soft cheeses of different ages produced of raw, or cooked milk in individual households at different geographic localities in Serbia, and obtained from 17 markets. In order to isolate and determine the number of coagulase-positive staphylococci, the standard method (SRPS EN ISO 6888-2) was used and the number of Lactococcus spp., Lactobacillus spp. was determined by the method described in ISO 27205: 2010 (IDF 149: 2010) standard. The BBL Crystal Identification Systems BD and ID 32 Staph-Biomerieux (France) were used to identify coagulase-positive staphylococci to the species level on the basis of their biochemical characteristics. The ELFA technique VIDAS SET2 (BioMerieux, France) was used for testing coagulase-positive staphylococci isolates to produce classical enterotoxins (SEA, SEB, SEC, SED, SEE), and the occurrence of enterotoxins in cheese samples. The phenotypic identification of coagulase-positive staphylococci isolates, which were positive enterotoxin producers, was used ID 32 Staph-Biomerieux test (France). The presence of se genes for synthesis of staphiloccocal enterotoxins (SE) in the obtained extracts of DNA from 26 enterotoxigenic coagulase isolates was detected by conventional multiplex PCR technique (for genes sea and seb) i.e the Real- Time PCR technique (for genes sec, sed and see). In order to prove the presence of the sea gene the following primers sea-f (5’-TCAA TTTATGGCTAGACGGTAAACAA-3’) and sea-r (5’-GAAGATCCAACTCCTGAA CAGTTACA-3’) were used; for the gene seb primers seb-f (5’-AACAACTCGCCT TATGAAACGGGAT-3’) and seb-r (5’-CTCCTGGTGCAGGCATCATGTCA-3’) were used; for the gene sec were used promers sec-f (5’-CGTATTAGCAGAGAGCCAA CCA-3’) and sec-r (5’-GTGAATTTACTCGCTTTGTGCAA-3’); for the gene sed were used the primers sed-f (5’-AAACGTTAAAGCCAATGAAAACA-3’) and sed-r (5’-TG ATCTCCTGTACTTTTATTTTCTCCTA-3’); and for the see were used the primers see-f (5’-TACCAATTAACTTGTGGATAGAC-3’) and see-r (5’-CTCTTTGCACCTT ACCGC -3’). Out of the total of 555 cheese samples different ages, made from raw or cooked milk, coagulase-positive staphylococci were present in 168 (30.27%) samples. Out of 168 samples of cheeses in which coagulase-positive staphylococci were present, 140 (83.33%) samples were produced from raw milk and 28 (16.67%) samples were produced from cooked milk. Using the screening method VIDAS SET2 (BioMeriéux, France), it was found that out of 85 isolates of coagulase-positive staphylococci 26 (30.59%) isolates produced classical enterotoxins (SEA-SEE). The isoaltes of enterotoxigenic coagulase-positive staphylococci were identified as S. aureus (61.54% of isolates), S. xylosus (15.38% of isolates), S. lentus (11.54% of isolates), S. sciuri (11.54% of isolates) by using the ID 32 Staph-Biomeriéux (France) test. In all 26 isolates of coagulase-positive staphylococci originating from cheeses produced from raw or cooked milk, which were enterotoxin producers the gene for enterotoxin A (sea) was present, and in 24 isolates in addition the sea gene, the gene for the synthesis of enterotoxin B (seb) was detected. None of the isolates posessed the genes for the synthesis of enterotoxin C (SEC), D (SED) and E (SEE). Out of 26 tested cheese samples positive for enterotoxigenic coagulase-positive staphylococci, enterotoxin was detected in 2 (7.69%) sample sweet-coagulating cheese, made from raw milk in which the number of enetrotoxigenic coagulase-positive staphylococci was more than 5 log cfu/g. In sweet-coagulated cheeses made from raw milk in which the number of coagulase-positive staphylococci was more than 5 log cfu/ g and the pH value was higher than 5.0, enterotoxins may be present in amounts sufficient to cause intoxication, thus they represent a risk to human health. Keywords: coagulase-positive staphylococci, S. aureus, soft cheeses, enterotoxins Scientific area: Veterinary Medicine Special topics: Milk Hygiene and Technology UDK number: 579.67: 637 352. 149 SADRŽAJ 1. UVOD......................................................................................................................... 1 2. PREGLED LITERATURE ..................................................................................... 4 2.1. Procena rizika .......................................................................................................... 4 2.1.1. Identifikacija hazarda ...................................................................................... 4 2.1.2. Karakterizacija hazarda ................................................................................ 11 2.1.3. Procena izloženosti ......................................................................................... 20 2. 2. Faktori koji utiču na rast S. aureus i stvaranje enterotoksina ........................ 41 2.2.1. Uticaj temperatura na rast S. aureus ........................................................... 41 2.2.2. Uticaj pH na rast S. aureus ............................................................................ 42 2.2.3. Uticaj organskih kiselina na rast S. aureus .................................................. 42 2.2.4. Uticaj soli i aktivnosti vode (aw) na rast S. aureus ....................................... 43 2.2.5. Uticaj atmosfere na rast S. aureus ................................................................ 44 2.2.6. Uticaj kompetetivnih mikroorganizma na rast S. aureus ........................... 44 2.2.7. Uticaj sadržaja masti na rast S. aureus ........................................................ 45 2.2.8. Uticaj tempeartura na stvaranje enterotoksina stafilokoka ....................... 45 2.2.9. Uticaj pH na stvaranje enterotoksina stafilokoka ....................................... 45 2.2.10. Uticaj aktivnost vode (aw) na stvaranje enterotoksina stafilokoka .......... 46 2.2.11. Uticaj kompetitivnih mikroorganizama na stvaranje enterotoksina stafilokoka ................................................................................................................. 46 2.2.12. Uticaj atmosfere na stvaranje enterotoksina stafilokoka ......................... 46 2.2.13. Uticaj hranljivih materija na stvaranje enterotoksina stafilokoka.......... 47 3. CILJ I ZADACI ISTRAŽIVANJA ....................................................................... 48 4. MATERIJAL I METODE RADA ........................................................................ 49 4.1. Materijal ................................................................................................................. 49 4.1.1. Sirevi ................................................................................................................ 49 4.1.2. Mikroorganizmi .............................................................................................. 49 4.1.3. Podloge ............................................................................................................. 51 4.1.3.1. Podloga za izolaciju i određivanje koagulaza pozitivnih stafilokoka i Staphylococcus aureus .............................................................................................. 52 150 4.1.3.2. Podloga za određivanje broja Lactococcus spp. ....................................... 52 4.1.3.3. Podloga za određivanje broja Lactobacillus spp. ...................................... 53 4.1.3.4. Sredstvo za razblaživanje i decimalna razblaženja uzoraka sira ........... 53 4.1.3.5. Podloga za umnožavanje Staphylococcus aureus i ispitivanje sposobnosti izolata da stvaraju enterotoksine ............................................................................ 54 4.1.3.6. Krvni agar za ispitivanje sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka da stvaraju hemolizine ............................................................................................. 54 4.1.3.7. Podloga za čuvanje izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka i Staphylococcus aureus .............................................................................................. 55 4.1.3.8. Plazma kunića za koagulaza test ................................................................ 55 4.1.4. Testovi za identifikaciju koagulaza pozitivnih stafilokoka ......................... 56 4.1.4.1. BBL Crystal Identifikacioni sistem (Gram-Positive ID Kit) ................... 56 4.1.4.2. ID 32 STAPH -Identifikacioni sistem (BioMerieux, Francuska) ............ 56 4.1.4.3. VIDAS Staphylococcal enterotoxin test SET 2, 30701 (BioMerieux, Francuska) ................................................................................................................. 57 4.1.5. Reagensi i oprema za ekstrakciju enterotoksina stafilokoka iz sira .......... 57 4.1.6. Reagensi za ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina stafilokoka (SEA-SEE) ................................................................................................................. 58 4.2. Metode .................................................................................................................... 59 4.2.1. Uzorkovanje sireva ......................................................................................... 59 4.2.2.1. Određivanje pH sira .................................................................................... 59 4.2.2.2. Određivanje aktivnosti vode (aw) ............................................................... 60 4.2.2.3. Određivanje sadržaja natrijum hlorida (NaCl) u siru ............................. 60 4.2.2.4. Određivanje sadržaja masti u siru ............................................................. 61 4.2.2.5. Određivanje suve materije sira .................................................................. 62 4.2.2.6. Određivanje sadržaja vode u siru .............................................................. 62 4.2.2.7. Određivanje sadržaja vode u bezmasnoj materiji sira ............................ 62 4.2.3. Dokazivanje enterotoksina ............................................................................ 63 4.2.4. Ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina kod izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva.............................................................. 63 4.2.5. Ispitivanje prisustva enterotoksina u sirevima ............................................ 66 4.2.6. Bakteriološke metode ..................................................................................... 68 151 4.2.6.1. Priprema osnovnog i decimalnih razblaženja uzoraka sireva ................ 68 4.2.6.2. Izolacija i određivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirevima .................................................................................................................................... 68 4.2.6.3. Ispitivanje sposobnosti izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka da stvaraju hemolizine .................................................................................................. 68 4.2.11.5. Određivanje ukupnog broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u sirevima ..................................................................................................................... 68 4.2.11.6. Identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva ... 69 5. REZULTATI ........................................................................................................... 72 5.1. Rezultati određivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevimа .............................................................. 72 a. Rezultati određivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u mekim sirevimа ..................................................................................................................... 72 b. Rezultati određivanja broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevimа proizvedenim od kuvаnog i nekuvаnog mlekа ....................................... 75 5.2. Rezultati određivanja fizičko-hemijskih pаrаmetara (pH, sаdržаj NaCl, mаsti, suve mаterije i аktivnost vode) u sirevimа proizvedenim od kuvаnog i nekuvаnog mlekа .............................................................................................................................. 77 5.3. Rezultati identifikacije odabranih izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva ............................................................................................ 82 5.3.1. Rezultati ispitivanja sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva da stavaraju hemolizu ................................................. 82 5.3.2. Rezultati biohemijske identifikacije odabranih izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka .......................................................................................................................... 82 5.4. Rezultati ispitivanja sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva da stvaraju enterotoksine ...................................................................... 83 5.5. Rezultati identifikacije gena za sintezu enterotoksina u koagulaza pozitivnim stafilokokama izolovanim iz mekih sireva ................................................................. 85 152 5.6. Rezlultati ispitivanja prisustva enetrotoksina u sirevima proizvedenim od kuvanog ili nekuvanog mleka ...................................................................................... 91 6. DISKUSIJA ............................................................................................................. 95 7. ZAKLJUČCI ......................................................................................................... 108 8. LITERATURA ...................................................................................................... 110 9. PRILOZI ............................................................................................................... 131 1 1. UVOD Sirevi kao hrana zauzimaju veoma vaţno mesto u ishrani ljudi. Proizvodnja sireva datira iz daleke prošlosti i imala je znaĉaja u svim civilizacijama. Sirevi se tradicionalno proizvode u Srbiji vekovima, predstavljaju kulturno nasleĊe i akumulirano iskustveno znanje, koje se prenosi sa generacije na generaciju. Istorijski gledano u srednjem veku glavna mesta gde se odvijala proizvodnja sireva su bili manastiri i feudalni posedi, tako da mnoge grupe današnjih sireva potiĉu iz tog vremena. Tradicionalan naĉin proizvodnje sira zadrţao se sve do XIX veka, a sticanjem znanja iz mikrobiologije i hemije mleka, upoznavanjem postupaka tokom dobijanja sireva i mogućnošću kontrole procesa, proizvodnja sireva se širila i razvijala poprimajući industrijski karakter. Danas je u zemljama razvijenog sveta više prisutna industrijska proizvodnja naspram tradicionalnog naĉina dobijanja sireva. U Srbiji je razvoj industrijske proizvodnje sireva zapoĉeo pocetkom XX veka, ali i danas znaĉajan deo sireva, koji se mogu naći na trţištu se proizvodi na tradicionalan naĉin u domaćinstvima i malim zanatskim pogonima za preradu mleka. Prema definiciji ekspertske grupe FAO/WHO, sir predstavlja sveţ, ili sazreo proizvod od mleka, koji se dobija posle koagulacije proteina i odvajanja surutke iz mleka, pavlake, delimiĉno obranog mleka, mlaćenice, ili mešavine ovih poluproizvoda. Sir spada u hranu spremnu za konzumiranje, što znaĉi da se ne podvrgava dodatnim termiĉkim tretmanima pre konzumiranja. Sirevi, koji se mogu naći na trţištu gradskih pijaca se proizvode u individualnim domaćinstvima od kuvanog ili nekuvanog mleka, a poreklom su iz razliĉitih geografskih lokaliteta u Srbiji. U procesu proizvodnje ovih sireva koagulacija se odvija dodavanjem sirila u mleko, bez dodavanja poznatih starter kultura, što znaĉi da u procesu zrenje uĉestvuje samo porirodna mikroflora mleka. Prema vaţećoj zakonskoj regulativi u našoj zemlji sirevi se u promet mogu staviti kao: sirevi sa zrenjem i sirevi bez zrenja. Sirevi sa zrenjem su sirevi, koji moraju imati proces zrenja sa definisanim periodom u toku kojeg se dešavaju odgovarajuće biohemijske i fiziĉke promene i na taj naĉin poprimaju svoje specifiĉne senzorne karakteristike, što mora biti naznaĉeno u proizvoĊaĉkoj specifikaciji. Nasuprot tome, sirevi bez zrenja su sirevi koji se mogu koristiti neposredno posle proizvodnje. U Evropi se danas oko 10% sireva proizvodi od sirovog mleka. Sa sirovim mlekom mogu da 2 dospeju patogeni mikroorganizmi i na taj naĉin ovi sirevi neposredno posle proizvodnje mogu da predstavljaju potencijalni rizik po javno zdravlje. U Republici Srbiji veliki broj sireva, prisutan na trţištu gradskih pijaca, se moţe svrstati u grupu sireva bez zrenja. Budući da se odreĊen broj sireva bez zrenja proizvodi od nekuvanog mleka kao deo tradicije, postoji mogućnost da sa sirovim mlekom u sir dospeju patogeni mikroorganizmi kao što su koagulaza pozitivne stafilokoke. Stafilokoke su aerobne, fakultativno anaerobne bakterije, koje se taksonomski svrstavaju u familiju Staphylococcaceae rod Staphylococcus. Do danas je opisano 50 vrsta i podvrsta stafilokoka. Na osnovu sposobnosti da stvaraju enzim koagulazu razvrstavaju se na koagulaza pozitivne i kogulaza negativne stafilokoke. Glavni predstavnik koagulaza pozitivnih stafilokoka je Staphylococcus aureus subsp. aureus. Kao ubikvitarni mikroorganizam Staphylococcus aureus (S. aureus) ţivi na koţi ljudi i ţivotinja, a ĉesto kolonizuje ductus papillaris mleĉne ţlezde krava i moţe da prouzrokuje supkliniĉke mastitise. Bitna karakteristika mikroorganizma je sposobnost da stvara ekstracelularne enzime i toksine, od kojih su mnogi patogeni za ĉoveka i ţivotinje. Sa gledišta higijene mleka znaĉaj ima sposobnost S. aureus da sintetiše termostabilne enerotoksine, koji mogu da izazovu alimentarna trovanja ljudi. Trovanja hranom izazvana stafilokokama su intoksikacije, koje nastaju konzumiranjem hrane koja sadrţi dovoljnu koliĉinu (1μg/kg telesne mase konzumenta) jednog, ili više enterotoksina. Do danas je opisano 11 enterotoksina stafilokoka (SE) i 11 enterotoksinima sliĉnih proteina (SEl). Prema izveštaju EFSA-e iz 2014. godine 777 epidemija zabeleţenih u 2012.godini su bile izazvane toksinima Bacillus spp., Clostridium spp. i koagulaza pozitivnih stafilokoka. Trovanja izazvana enterotoksinima stafilokoka su na drugom mestu oboljenja izazvanih hranom. Od ukupnog broja zabeleţenih oboljenja 346 je bilo izazvano enterotoksinima stafilokoka od kojih je u 20% sluĉajeva sir bio uzrok trovanja. Hrana, koja se dovodi u vezu sa trovanjima enterotoksinima stafilokoka je hrana bogata proteinima, koja se proizvodi u zanatskim uslovima, kod kojih je proces proizvodnje praćen manuelnom manipulacijom, ĉesto u kombinaciji sa neadekvatnom termiĉkom obradom i ĉuvanjem hrane. Ĉesto mnogi sluĉajevi ovih trovanja proĊu nezapaţeno iz razloga što je inkubacioni period kratak, male epidemije se ne prijavljuju, postoje greške u dijagnostici, nepravilnosti tokom uzimanja uzoraka i grešaka u laboratorijskoj 3 dijagnostici. Za nastajanje dovoljne koliĉine enterotoksina, koja moţe da izazove intoksikacije (1μg/kg telesne mase konzumenta) potrebno je više od 105 cfu S. aureus/g sira. Stoga je u Pravilniku o opštim i posebnim uslovima higijene hrane u bilo kojoj fazi proizvodnje, prerade i prometa (Sluţbeni glasnik RS 72/10) predviĊeno da se proizvodna partija sira mora ispitati na prisustvo enterotoksina stafilokoka ako se utvrdi više od 105 cfu koagulaza pozitivnih stafilokoka/g sira u fazi proizvodnje sira kada se oĉekuje da je njihov broj najveći. Budući da nema dovoljno podataka o intoksikacijama enterotoksinima stafilokoka posle konzumiranja sireva proizvedenih u domaćinstvu, a sirevi od nekuvanog mleka su prisutni na trţištu, smatarli smo da bi bilo korisno da se ispitaju sirevi, koji se proizvode od nekuvanog ili kuvanog mleka u zanatskim uslovima i domaćinstvu i na taj naĉin proceni da li postoji rizik od intoksikacija enterotoksinima stafilokoka nakon konzumiranja tako proizvedenog sira. 4 2. PREGLED LITERATURE 2.1. Procena rizika Procena rizika zajedno sa upravljanjem rizikom i obaveštavanjem o riziku ĉini proces analize rizika. U kontekstu bezbednosti hrane rizik predstavlja verovatnoću i posledice da nastane štetno delovanje na zdravlje ljudi posle konzumiranja hrane. Procena rizika obuhvata: 1. Identifikaciju hazarda, 2. Karakterizaciju hazarda, 3. Procenu izloţenosti i 4. Karakterizaciju rizika. U proceni rizika od stvaranja eneterotoksina koagulaza pozitivnih stafilokoka u mekim sirevima bez zrenja prvi korak bi bio identifikacija hazarda u okviru koga će biti opisane koagulaza pozitivne stafikoke i toksini koje stvaraju. Biologija, ekologija, patologenost koagulaza pozitivnih stafilokoka i problem, koji predstavljaju kao hazard u hrani su dobro prouĉeni i opisani u literaturi. 2.1.1. Identifikacija hazarda Stafilokoke su gram-pozitivne koke (preĉnika 0,5-1,5µm), koje su pojedinaĉne, u parovima, tetradama, kratkim lancima (tri, ili ĉetiri ćelije), i u nepravilnim paketićima kao grozdovi. Karakteristike stafilokoka Minimalni standardi za svrstavanje mikroorganizma u rod Staphylococcus obuhvataju genotipske i fenotipske kriterijume (Freney i sar. 1999). Genotipski kriterijumi DNK stafilokoka sadrţi guanin+citozina (G+C) od 30 do 39 mol%. Drugi genotipski kriterijumi, koji se uzimaju za svrstavanje nepoznatih vrsta u rod Staphylococcus se baziraju na filogenetskom stablu konstruisanom poreĊenjem sekvenci 16S rRNK, ili 23S RNK. Stafilokoke se mogu podeliti na osnovu analize gena 16S rRNK sekvenci i na osnovu ispitivanja celog genoma DNK na nekoliko filogenetskih grupa vrsta. Vrste u okviru ovih grupa obiĉno imaju zajedniĉke karakteristike, teško se razlikuju izmeĊu sebe i mogu da nastanjuju sliĉne ekološke niše, ili pokazuju isti patogeni potencijal. 5 Fenotipski kriterijumi Stvaranje katalaze je karakteristika svih Staphylococcus vrsta, izuzev Staphylococcus aureus subsp. anaerobius i Staphylococcus saccharolyiticus. Stafilokoke su fakultativni anaerobni mikroorganizmi, izuzev Staphylococcus aureus subsp. anaerobius i Staphylococcus sacharolyiticus, koji su striktni anareobi. Ultrastruktura i hemijski sastav ćelijskog zida stafilokoka su tipiĉni za gram-pozitivne bakterije i ĉine ga peptidoglukani, tejkonska kiselina i proteini (Bevaridge, 2000; Schleifer i Kandler, 1972). Na osnovu koagulaza testa, sposobnosti da stvaraju enzim koagulazu rod Staphylococcus se deli na koagulaza-pozitivne i koagulaza-negativne stafilokoke. Stvaranje koagulaze, enzima koji koaguliše plazmu kunića najĉešće se koristi i opšte je prihvaćen kriterijum u identifikaciji patogenih stafilokoka, koje se dovode u vezu s akutnim infekcijama. Stafilokoke su meĊu najĉešćim uzroĉnicima bakterijskih infekcija kod ljudi, a Staphylococcus aureus je najznaĉajnija patogena vrsta stafilokoka. U veterinarskoj medicini 3 vrste stafilokoka imaju znaĉaj kao patogeni uzroĉnici: S. aureus, S. intermedius i S. hyicus (Devriese, 1990). S. aureus i S. intermedius su koagulaza pozitivne, dok je stvaranje koagulaze varijabilno kod S. hyicus, uglavnom negativno, ili slabo pozitivno (Kloss i Schleifer, 1986). Još dve vrste stafilokoka imaju sposobnost da stvaraju koagulazu S. delphini i S. schleiferi. S. delphini je opisan kod delfina 1988. godine (Varaldo i sar. 1988). S. schleiferi je sve do 1990. godine svrstavan u koagulaza-negativne stafilokoke, kada je opisana nova podvrsta S. schleiferi subsp. coagulans posle izolacije kod otitisa pasa, koja je imala sposobnost da stavra koagulazu. Sve vrste stafilokoka, sem S. aureus pripadaju filogenetski blisko srodno S. intermedius-S. hyicus grupi vrsta. Opšte karakteristike Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus subsp. aureus pripada rodu Staphylococcus i familiji Staphylococcaceae (Euzéby, 2012). Mikroorganizam je prvi put opisao Sir Aleksandar Ogston, a dve godine kasnije Rozenbah je izolovao iz ĉiste kulture i dao ime Staphylococcus aureus, što potiĉe od grĉkih reĉi staphyle (grozd) i coccus (zrna, ili bobice). 6 S. aureus je aerobni, fakultativno anaerobni, nepokretan, katalaza i koagulaza pozitivan mikroorganizam. Na mikroskopskom preparatu bakterijske ćelije su sferiĉng oblika, pojedinaĉne koke, ili u parovima, koje formiraju klastere u vidu grozda (slika 2.1.1.). Na ĉvrstoj podlozi, krvnom agaru raste u vidu glatkih, konveksnih, sjajnih, okruglih kolonije preĉnika 0,5-1,5 µm. U zavisnosti od uslova za rast pigmentacija kolonija varira od sive, sivo-bele boje sa ţuţkastim do narandţastim odsjajem i β hemolizom. Za rast su neophodni vitamini B kompleksa (tiamin i nikotinska kiselina), neorganske soli i amino kiseline kao izvor azota, naroĉito arginin, cistein, prolin i valin. Glutaminska kiselina, leucin i tirozin nisu neophodni za rast, ali su vaţni za sintezu enterotoksina. Lišavanje ovog mikroorganizma bilo koje amino kiseline više utiĉe na sintezu enterotoksina A, nego na sintezu enterotoksina B i C. Arginin je esencijalan za sintezu enterotoksina B (Baird-Parker, 1990; Asperger i Zangerl, 2003; Jay, 2000). S. aureus spada u hemo-organotrofe sa respiratornim i fermentativnim metabolizmom. U aerobnim uslovima stvaraju kiselinu iz glukoze, laktoze, maltoze i manitola, dok se u anaerobnim uslovima kiselina dobija iz drugih šećera ili alkoholnih šećera. Većina vrsta stafilokoka hidrolizuje prirodne ţivotinjske proteine (kazein, ţelatin, fibrin), masti, fosfolipoproteine i Tween. Enzimska aktivnost S. aureus obuhvata stvaranje koagulaze, alkalne fosfataze, proteaze, lipaze i kod nekih sojeva lecitinaze (Baird-Parker, 1990; Asperger i Zangerl, 2003; Jay, 2000). Ćelijski zid je rezistentan na lizozim i osetljiv na lisostafin, koji specifiĉno cepa pentaglicinske mostove u zidu S. aureus. Ovaj mikroorganizam je ubikvitaran u prirodi i moţe se naći u vazduhu, prašini, vodi, na raznim površinama u okruţenju, na sluzokoţi nosa ljudi, koţi i dlaci toplokrvnih ţivotinja. Kod oko 20-30% humane populacije S. aureus stalno kolonizuje, dok kod 60% populacije povremeno kolonizuje koţu i sluzokoţu. Neki sojevi imaju sposobnost da stavaraju stafilokokne enterotoksine, koji mogu da prouzrokuju alimentarne intoksikacije. 7 2.1.1. Slika. Bakterijske ćelije Staphylococcus aureus pod elekronskim mikroskopom (20/000:1) (http://www.micronaut.ch/) Taksonomija Do danas je opisano 50 vrsta i podvrsta stafilokoka. Na osnovu sposobnosti za stavraje enzima koagulaze, razlikuju se koagulaza pozitivne stafilokoke (KPS) i koagulaza negativne stafilokoke (KNS). Od sedam opisanih vrsta, koje pripadaju grupi koagulaza pozitivnih stafilokoka (tabela 2.1.1), kao glavni uzroĉnik trovanja hranom navodi se S. aureus subsp. aureus. Tabela 2.1.1. Rod: Staphylococcus: koagulaza pozitivne vrste (Hennekinne i sar. 2010) Vrsta Glavni izvori Referenca S. aureus subsp. aureus ljudi, ţivotinje Rosenbach, 1884 S. aureus subsp. anaerobius ovce De la Fuente i sar., 1976 S. intermedius pas, konj, kuna, golub Hajek, 1976 S. hyicus svinje, ţivina Devriese i sar., 1978 S. delphini delfini Varaldo i sar., 1988 S. schleiferi subsp. coagulans pas (spoljašnji ušni kanal) Igimi i sar., 1990 S. lutra ostali Foster i sar., 1997 Sinteza enterotoksina i faktori virulencije Staphylococcus aureus karakterišu razliĉiti faktori virulencije, koji se mogu podeliti u tri razliĉite grupe, kao što su: ćelijske komponente, egzoenzimi, egzotoksini. 8 Ćelijske komponente Protein A je površinski protein, koji vezuje molekule IgG preko Fc regiona. U serumu mikroorganizam vezuje molekule IgG u pogrešnom smeru (orjentaciji) što onemogućava opsonizaciju fagocita (Grov, 1973). Kapsularni polisaharidi ĉine 11 serološki razliĉitih tipova, koji su identifikovani kod izolata S. aureus poreklom od ljudi i goveda. Ovi kapsularni polisaharidi imaju ulogu da reaguju sa odbrambenim mehanizmom domaćina onemogućavajući vezivanje antitela. TakoĊe se vezuju za epitelne, endotelne ćelije, monocite dovodeći do oslobaĊanja citokina (Soell i sar. 1995). Peptidoglukan i lipoteihoinska kiselina kao komponente ćelijskog zida se ponašaju kao faktori virulencije i najverovatnije stimulišu oslobaĊanje citokina. Mogu da izazovu šok, ali nikada pojedinaĉno kao preĉišćeni peptidoglukan, ili teihoinska kiselina nisu izazvali šok kod eksperimentalnih ţivotinja (Projan i Novick, 1997). Adhezini su proteini na površini bakterijske ćelije stafilokoka, koji omogućavaju vezivanje za proteine domaćina kao što su fibronektin, laminin, vitronektin i kolagen, koji ĉine ekstracelularni matriks epitelnih i endotelnih površina (Mamo i sar. 1988; Gillaspy i sar. 1998). OdreĊen broj izolata poseduje klamping-―clamping‖ faktor- fibrinogen vezujući protein, koji se vezuje za ćelije krvi i oštećeno tkivo. Interakcija sa kolagenom moţe takoĊe da bude vaţna za otpoĉinjanje vezivanja bakterije za oštećeno tkivo. Sposobnost S. aureus da stvara površinske faktore, kao što su bakterijske površinske komponente koje prepoznaju adhezivne molekule matriksa, protein A, polisaharid A, peptidoglukan i klamping faktor omogućava mikroorganizmu rezistenciju na opsonofagocitozu, da stvara biofilm i adherira na matriks ćelije domaćina. Posle kolonizacije sekretuje razliĉite egzotoksine i egzoenzime, koji su odgovorni za lezije tokom razvoja infekcije. Jednom kada S. aureus prodre u potkoţno tkivo i dospe u krvotok, moţe da inficira bilo koji organ, najĉešće koštano tkivo i srĉane valvule (Garzoni i Kelley, 2009). 9 Egzoenzimi 1) Koagulaza Koagulaza je ekstracelularni protein, koji se vezuje za protrombin u domaćinu i formira kompleks stafilotrombin. Aktivacija proteaze se odvija u kompleksu pri ĉemu fibrinogen prelazi u fibrin. Ovaj enzim ima sposobnost da koaguliţe palzmu razliĉitih vrsta ţivotinja i ĉoveka. Humani izolati i izolati poreklom od ţivotinja koagulišu plazmu kunića, konja, svinje i ĉoveka, dok ovĉiju i goveĊu plazmu koagulišu izolati poreklom od ţivotinja. Dokaz da je koagulaza faktor virulencije je ograniĉavajući premda bakterije mogu da štite sebe od fagocitoze i imunološke odbrane izazivajući lokalno koagulaciju (Projan i Novick, 1997). 2) Lipaze Lipaze su enzimi, koje stvaraju koagulaza pozitivne i koagulaza negativne stafilokoke. Sinteza se odvija za vreme logaritamske faze rasta i dostiţe maksimum za vreme stacionarne faze stafilokoka. Ovi enzimi deluju na razliĉite supstrate kao što su plazma, masne kiseline i ulja, koji se nalaze na površini koţe. Uloga lipaza je i da omoguće stafilokokama da koriste hranljive materije iz okruţenja (Projan i Novick. 1997). U identifikaciji S. aureus na podlozi po Baird-Parkeru se koristi delovanje ovih enzima na lipoprotein ţumance jajeta i lipovitelin. 3) Hijaluronat liaza i hijaluronidaza Hijaluronat liaza i hijaluronidaza predstavljaju grupu enzima, koje razlaţu hijaluronsku kiselinu i u vezi su sa virulentnošću. Depolarizacija hijaluronske kiseline u vezivnom tkivu doprinosi širenju infekcije kroz razgradnju tkiva (Farrell i sar. 1995). 4) Proteaze Najbolje opisana proteaza stafilokoka je serin-proteaza, poznata kao V8 proteaza. Proteaze bi trebalo da uĉestvuju u blokiranju aktivnosti antitela cepajući, ili inaktivišući ih što je dokazano u uslovima in vitro. Druga uloga proteaza moţe da bude zaštita od antimikrobnih peptida, kao što su defenzini neutrofila, ili proteini krvnih ploĉica sa mikrobicidnim delovanjem. Proteaze mogu da doprinesu uništavanju tkivnih proteina i 10 povećaju invazivnost. Proteaza V8 uĉestvuje u razgradnji fibronektin-vezujućeg proteina, tako izazivajući širenje bakterije posle adherencije. Još jedna uloga ovih proteaza je snabdevanje hranljivim materijama iz okruţenja (McGavin i sar. 1997). Neke stafilokoke, koje izazivaju mastitise ĉesto stvaraju u razliĉitom stepenu proteine molekulske mase 34-36 kDa sa citotoksiĉnom aktivnošću (Zhang i Maddox, 2000). Uloga enzima kao što su katalaza, hijaluronidaza, lipaza, termostabilna nukleaza, stafilokinaze i β-galaktozidaza je u narušavanju ćelijske strukture, razgradnji ćelijskih lipida i hijaluronske kiseline i prevodjenju fibrinogena u fibrin. Svi ovi mehanizmi ĉine da S. aureus deluje na leukocite, lojne ţlezde i potkoţno tkivo, povećava napredovanje infekcije i inaktiviše efekat β-laktamskih antibiotika (Halpin-Dohnalek i Marth,1989; Ote i sar. 2011; Post,1999). Egzotoksini 1) Hemolizini i leukocidin S. aureus moţe da stvara citotoksiĉne molekule, koji se mogu podeliti u ĉetiri klase u kojima su ĉetiri hemolozina (α, β, γ, i δ) i leukocidin (Dinges i sar. 2000). α-hemolizin je najbolje opisan hemolizin, koji najviše oštećuje ćelijsku membranu. Prijemĉive ćelije, naroĉito trombociti i monociti u krvi ljudi imaju posebne receptore za ovaj hemolizin, omogućavajući njegovo vezivanje, što ima za posledicu formiranje pora kroz koje prolaze katjoni i na taj naĉin oštećujući krvne ćelije. β-hemolizin je sfingomijelinaza, koja oštećuje membrane bogate ovim lipidom. Klasiĉan test za dokazivanje β-hemolizina je liza goveĊih i ovĉijih eritrocita (Cifrian i sar. 1996). Ovaj hemolizin omogućava prepoznavanje većine, ali ne svih sojeva S. aureus u zavisnosti od vrste domaćina. γ-hemolizin (leukotoksin) i leukocidin su proteini koji deluju udruţeno oštećujući leukocite i lipidne membrane. δ-hemolizin je veoma mali peptid koga stvara većina sojeva S. aureus. U literaturi je opisano da ima direktan, ili indirektan uticaj na aktivnost neutrofila i monocita, a time ima proinflamatorno delovanje (Schmitz i sar. 1997). 11 2) Toksini stafilokoka S. aureus pored površinskih faktora, enzima i citotoksina moţe da stvara enterotoksine i toxic shock syndrome 1 (TST 1) toksin. Enterotoksini mogu da izazovu trovanja ljudi hranom, a TSST1 modulira imunološki odgovor domaćina (Ote i sar. 2011). OslobaĊanje TSST-1 u krvotok moţe da dovede do pojave razliĉitih ozbiljnih kliniĉkih kompikacija, kao što su toksiĉni šok sindrom, iznenadne smrti novoroĊenĉadi i Kawasaki sindrom (Deurenberg i sar. 2005). 2.1.2. Karakterizacija hazarda Sa stanovišta higijene namirnica stvaranje jednog, ili više eneterotoksina (SE) je suštinsko za nastanak trovanja ljudi stafilokokama. Da bi došlo do stvaranja dovoljne koliĉine enterotoksina, koja moţe da izazove intoksikacije, potrebno je da broj S. aureus bude veći od 105 cfu/g namirnice (Jablonski i Bohach, 1997; Le Loir i sar. 2003). Do sada poznati enterotoksini stafilokoka ĉine grupu serološki razliĉitih ekstracelularnih proteina, kojima su zajedniĉke vaţne karakteristike: 1) sposobnost da izazovu emezu kod primata, 2) superanigenost kroz nespecifiĉnu aktivaciju T limfocita praćenu oslobaĊanjem citokina i sistemskim šokom, 3) otpornost na visoke temperature i digestiju pepsinom, 4) strukturna sliĉnost. Prema sposobnosti da izazovu emezu kod primata podeljeni su na prave (klasiĉne) enterotoksine (SEA-SEC) i toksine sliĉne enterotoksinima (Argudin i sar. 2010). Do danas je opisano 22 enterotoksina stafilokoka (staphylococcal enterotoxins-SEs) i enterotoksinima sliĉna toksina (staphylococcal enterotoxin-like toxins-SEl): enterotoksin A (SEA), B (SEB), C1 (SEC1), C2 (SEC2), C3 (SEC3), D (SED), E (SEE), G (SEG), H (SEH), I (SEI), J (SEJ) (Balaban i Rasooly, 2000), K (SElK) (Orwin i sar. 2001), L (SElL), M (SElM), N (SElN), O (SEIO), (Jarraud i sar. 2001), P (SlEP) (Omoe i sar. 2005), Q (SElQ) (Orwin i sar. 2002), R (SElR) (Omoe i sar. 2003), S (SElS), T (SElT) (Ono i sar. 2008), U (SElU) (Letertre i sar. 2003) i U2 i V, koji se nalaze na klasteru egc, koji kodira sintezu enterotoksinu sliĉnih toksina (Thomas i sar. 2006). Pet eneterotoksina SEA, SEB, SEC (SEC1,SEC2 i SEC3), SED i SEE, razliĉiti u antigenoj reakciji, koji su izazvali trovanja hranom u literaturi se navode kao klasiĉni eneterotoksini. 12 Enterotoksini i enterotoksinima sliĉni toksini su globularni, ili jednolanĉani polipeptidi sa molekulskom masom od 22-28 kDa. Hidrolizom se dobija 18 aminokiselina, preteţno aspartamska, glutaminska kiselina, lizin i tirozin. Za većinu ovih aminokiselina izoelektriĉna taĉka je pri pH 5,7-8,6. Na osnovu poreĊenja sekvenci amino kiselina enterotoksini stafilokoka (SE) i eneterotoksinima sliĉni toksini su svrstani u ĉetiri, odnosno 5 grupa, zavisno da li se eneterotoksin H (SEH) svrstava, ili ne u grupu 1 (Larkine i sar.2009; Thomas i sar.2007; Ono i sar.2008; Uschyama i sar. 2006) (Tabela 2.1.2.1.). Tabela 2.1.2.1. Grupisanje eneterotoksina stafilokoka i eneterotoksinima sliĉnih toksina (SE i SEl) poreĊenjem sekvenci aminokiselina (Modifikovano po Larkinu i sar. 2009) Grupa SE i SEl Grupa 1 SEA, SED, SEE, (SEH), SElJ, SElN, SElO, SElP, SES Grupa 2 SEB, SEC, SEG, SER, SElU,SElU2 Grupa 3 SEI, SElK, SElL, SElM, SElQ, SElV Grupa 4 SET (Grupa 5) (SEH) Sinteza eneterotoksina stafilokoka moţe biti kodirana profagima (Batley i Mekalanos, 1985), plazmidima (Bayles i Iandolo, 1989), ili hromozomskim ostrvcima patogenosti (Yarwood i sar. 2002). Geni za sintezu enterotoksina (se) imaju razliĉitu lokaciju. Sintezu klasiĉnih eneterotoksina kodiraju fagi (SEA), hromozomi (SEB i SEC), ili plazmidni geni (SED) (Tabela 2.1.2.2). Plazmidi su nosioci seb, sed, sej, ser, ses, set gena. Fagi su umereno nosioci za gen sea, ali ne za gen sec. Hromozomska ostrvca patogenosti su nosioci gena seb, sec, seg, seh, sei, sek, sel, sem, sen, seo, sep i seq. Gen sec moţe da se nalazi na plazmidu, ili hromozomskim ostrvcima patogenosti zavisno od porekla soja (Fitzgerald i sar. 2001). Lokacija se gena na mobilnim genetskim elementima moţe da dovede do horizontalnog transfera gena izmeĊu izolata S. aureus (Hennekinne i sar. 2012). Na primer gen seb se nalazi na hromozomima kod nekih kliniĉkih izolata (Shafer i Iandolo, 1978), dok je kod drugih izolata na plazmidu (Shalita i sar. 1977). Glavni regulatorni sistem, koji kontroliše ekspresiju faktora virulencije S. aureus, je agr sistem (―aksesorni gen regulator‖) (Kornblum i sar. 1990). Ovaj sistem deluje u kombinaciji sa sar sistemom (―stafilokokni akcesorni regulator‖) (Cheung i sar. 1992; Novick i sar. 2001). 13 Tabela 2.1.2.2. Karakteristike enterotoksina stafilokoka (Hennekinne i sar. 2010) Tip toksina Molekulska masa (Da) Genetska baza Superantigeno delovanje Emetiĉko delovanje SEA 27,100 Profag + + SEB 28,336 Hromozom, plazmid, Hromozomsko ostrvce patogenosti + + SEC1-2-3 ≈27,500 Plazmid + + SED 26,360 Plazmid (pIB485) + + SEE 26,425 Profag + + SEG 27,043 Enterotoksin gen cluster (egc), hromozom + + SEH 25,210 transpozon + + SEI 24,928 egc, hromozom + + SElJ 28,565 Plazmid (pIB485) + n SEK 25,539 Hromozomsko ostrvce patogenosti + n SElL 24,593 Hromozomsko ostrvce patogenosti + - SElM 24,842 egc, hromozom + n SElN 26,067 egc, hromozom + n SElO 26,777 egc, hromozom + n SElP 26,608 Profag (Sa3n) + n SElQ 25,076 Hromozomsko ostrvce patogenosti + - SER 27,049 Plasmid (pIB485) + + SES 26,217 Plasmid (pIB485) + + SET 22,614 Plasmid (pIB485) + + SElU 27,192 egc, hromozom + n SelU2 26,672 egc, hromozom + n SelV 24,997 egc, hromozom + n +: pozitivna raeakcija; -: negativna reakcija; n: nepoznato Većinu ekspresije eneterotoksina stafilokoka (SE) kontroliše sistem agr. Tako na primer ekspresija seb, sec i sed gena zavisi od agr sistema, dok ekspresija sea i sej gena ne zavisi od ovog sistema (Tremaine i sar. 1993; Zhang i sar. 1998). Sinteza enterotoksina je moguća tokom svih faza rasta S. aureus (SEB i SED), samo kao sekundarni metaboliti u kasnoj eksponencijalnoj ili stacionarnoj fazi rasta (SEB i SEC). Većina sojeva S. aureus moţe da stvara jedan, ili više eneterotoksina, koji su rezistentni 14 na proteolitiĉke enzime kao što su tripsin, himotripsin, renin i papain, a pri pH 2 su osetljivi na pepsin (Baird-Parker AC, 1990, Baird-Parker T 2000; Halpin-Dohnalek i Marth, 1989; Jay, 2000; Kérouanton i sar. 2007; Normanno i sar. 2007). Enterotoksin A (SEA), sam, ili u kombinaciji sa drugim enterotoksinima se najĉešće navodi kao uzrok trovanja hranom (Argudin i sar. 2010). Nasuprot tome, enterotoksin C (SEC) neki autori navode kao uzrok intoksikacija nastalih posle konzumiranja proizvoda od mleka (Norrmano i sar. 2007). Enterotoksin A (SEA) najĉeće stvaraju sojevi poreklom od ljudi, pa se nalaz ovog toksina u hrani objašnjava kontaminacijom hrane od osoba koje uĉestvuju u procesu proizvodnje hrane (Akineden i sar. 2008, Rosengren i sar. 2010). Trovanja eneterotoksinima stafilokoka su relativno blage intoksikacije, najĉešće dokazane u sluĉajevima alimentarnih intoksikacija nastalih posle konzumiranja mleka i proizvoda od mleka. Ranija istraţivanja su pokazala da je unošenje 20-25 µg SEB (0,4 µg/kg telesne mase) izazvalo povraćanje (Raj i Bergdoll, 1969). Proseĉna doza eneterotoksina A (SEA), koja je izazavala trovanje studenata ĉokoladnim mlekom u SAD, bila je 114±50 ng (Evenson i sar. 1988). Koliĉina 20-100 ng enterotoksina A (SEA) je izazavala trovanje pasterizovanim mlekom (Asao i sar. 2003), meĊutim neki autori smatraju da veoma mala koliĉina enterotoksina stafilokoka 0,5 ng/ml moţe da izazove oboljenje (Murray, 2005; Evenson i sar. 1988). Inkubacioni period zavisi od koliĉine unetog enterotoksina (Murray, 2005). Najĉešće je inkubacioni period kratak (2-8h), a simptomi su muĉnina, povraćanje, abdominalni bolovi praćeni sa ili bez dijareje. Oboljenje traje 24-48 h posle ĉega dolazi do oporavka obolelih. Komplikacije su moguće kod dece i starih osoba. Dijagnoza intoksikacija izazvanih enterotoksinima stafilokoka se potvrĊuje na osnovu: 1) nalaza 105 S. aureus/g hrane, 2) dokaza prisustva enterotoksina u hrani i i/ili 3) izolacije istog soja S. aureus kod pacijenta i iz hrane (Bryan i sar. 1997). 15 Hrana kao izvor trovanja stafilokoknim enterotoksinima Prvi sluĉaj trovanja enterotoksinima stafilokoka opisan je 1884. god. u Miĉigenu (SAD) nastao posle konzumiranja Cheddar sira. Nekoliko godina kasnije, 1914. godine Barber (1914) je dokazao da su enterotoksini stafilokoka bili uzrok trovanja nastalog posle konzumiranja mleka, koje je ostavljeno da stoji pri sobnoj temperaturi, a bilo je poreklom iz mleĉne ţlezde zahvaćene mastitisom. Hrana koja je izazvala trovanja enterotoksinima stafilokoka je razliĉita i zavisi od navika u ishrani. Hrana moţe da bude dobar medijum za razvoj S. aureus i postoje podaci da su mleko, kremovi, kolaĉi filovani kremom, maslac, šunka, sirevi, kobasice, meso u konzervama, salate, kuvana jela i nadev za sendviĉe dokazani kao izvor enterotoksina u sluĉajevima intoksikacija ljudi. Incidencija trovanja enterotoksinima stafilokoka je sezonske prirode, jer najveći broj intoksikacija nastaje krajem leta, kada je temperatura visoka, a hrana se ne ĉuva na temperaturama friţidera (Montville i Metthews, 2008). Da bi došlo do alimentarnih intoksikacija ljudi koagulaza pozitivnim stafilokokama treba da bude ispunjeno 5 uslova: 1) prisustvo izvora kontaminacije, koji sadrţi enterotoksogene stafilokoke (sirov materijal, zdravi, ili inficirani nosioci), 2) prenos stafilokoka iz izvora u hranu (slaba higijena tokom procesa dobijanja hrane), 3) hrana, ĉiji sastav i fiziĉko-hemijske osobine podrţavaju rast S. aureus i stvaranje eneterotoksina, 4) optimalna temperatura i dovoljno vremena za rast ovog mikroorganizma i stvaranje eneterotoksina i 5) unošenje hrane, koja sadrţi dovoljnu koliĉinu toksina i moţe da izazove simptome (Hennekinne i sar. 2010). U literaturi su opisani sluĉajevi trovanja enetrotoksinima stafilokoka (Bergdoll, 1989) gde je sir, proizveden od mleka konatminiranog posle pasterizacije, a pre dodavanja starter kultura, bio uzrok trovanja. Rast S. aureus i stvaranje enterotoksina su bili mogući zbog inhibicije rasta starter kultura i izostanka fermentacije. U zemljama EU u 2011. godini je zabeleţeno 0,07 sluĉajeva trovanja enterotoksinima stafilokoka na populaciju od 100 000 ljudi (<0,01-0,45/100 000 zavisno od zemlje). Prema izveštaju EFSA-e (2012) tokom 2010. godine u Evropi je prijavljeno 274 epidemije izazvane enterotoksinima stafilokoka. Najĉešće inkriminisana hrana u trovanjima stafilokoknim enterotoksinima se razlikuje od zemlje do zemlje. U Velikoj Britaniji 53% trovanja izazavanih stafilokokama, zabeleţenih u periodu od 1969-1990. 16 godine, bilo je izazvano proizvodima od mesa, jelima od mesa, naroĉito šunkom; 22% sluĉajeva je nastalo posle konzumiranja ţivinskog mesa i jela od ovog mesa; 7% ribom i školjkama i 3,5% jajima. Mleko i proizvodi od mleka su imali udeo od 8% do 53% trovanja izazvanih eneterotoksinima stafilokoka. Dokazano je da 79% izolata S. aureus stvara samo enterotoksin A (SEA), ili u kombinaciji sa još nekim od enetrotoksina. Broj S. aureus u hrani se kretao od 0 do 1,5x10 10 cfu/g (srednja vrednost 3x10 7 cfu/g). Enterotoksin je dokazan u sirevima koji su bili uzrok 2 epidemije, a da u tim sirevima nije dokazano prisustvo S. aureus (Wieneke i sar. 1993). U Francuskoj meĊu prijavljenim sluĉajevima trovanja enetrotoksinima stafilokoka tokom dve godine (1999-2000) mleko i proizvodi od mleka su bili najĉešći uzrok trovanja (32%), potom meso (22%), kobasice i pite (15%), riba i morski plodovi (11%), jaja i proizvodi od jaja (11%) i ţivinsko meso (9,5%) (Haeghebaert i sar. 2002). Udeo znaĉajnog broja proizvoda od mleka, dokazanih kao izvor enterotoksina u sluĉajevima trovanja, objašnjava se velikom potrošnjom sireva proizvedenih od sirovog mleka. U periodu od 1981-2002. godine u 31 epidemiji izazvanoj hranom u Francuskoj najĉešće je dokazan SEA (69,7%) (Kerouanton i sar. 2007). Prvi sluĉajevi trovanja eneterotoksinom E (SEE) su zabeleţeni krajem 2009. godine, kada je u 6 epidemija u razluĉitim disistriktima Francuske obolelo 23 osobe. Uzrok trovaja su bili sirevi proizvedeni od nepasterizovanog mleka. U nekim od uzoraka sireva je utvrĊen broj koagulaza pozitivnih stafilokoka >1,5x10 5 cfu/g. U Italiji, regija Pijemont u periodu od 2002. do 2010. godine, 181 osoba je obolela u epidemijama izazvanim S. aureus i enterotoksinima stafilokoka (Ferrari i sar. 2011). U literaturi je opisan sluĉaj porodice u kojoj su ĉetiri ĉlana obolela posle konzumiranja tardicionalnog jela „arancini―, koje se priprema od kuvanog pirinĉa i mesa i u kojem je utvrĊen broj stafilokoka >105/g i prisustvo eneterotoksina SEA i SEC (Bianchi i sar. 2013b). U Švedskoj u peiodu od 2003-2009. godine je zabeleţeno 111 sluĉajeva i 30 epidemija, što je predstavljalo 1%, odnosno 2% ukupno prijavljenih sluĉajeva i epidemija nastalih posle konzumiranja hrane (Lindqist i sar. 2004, 2005, 2006; Linbland i sar. 2008, 2009, 2010). U Austriji 2007. godine opisana je epidemija u kojoj je 30 dece obolelo posle konzumiranja proizvoda od mleka u kojima su dokazane stafilokoke, koje su stvarale enterotoksine A i D (SEA i SED) (Schmid i sar. 2009). 17 U Švajcarskoj je jula 2008. godine zabeleţeno trovanje troje dece 4 h posle konzumiranja kozijeg mleka u kojem je utvrĊeno 5x107cfu S aureus/ml. Dokazano je prisustvo gena za sintezu enterotoksina D u izolatima S aureus poreklom iz mleka (Giezendanner i sar. 2009). U Norveškoj je zabeleţena epidemija trovanja izazavna jelom od krompira pripremljenom sa sirovim mlekom. U jelu od krompira je dokazano 8x10 8 S. aureus/g, a S. aureus je dokazan i u sirovom mleku iz tanka na farmi koje je korišćeno za pripremu jela. Izolati S. aureus iz jela i mleka su nosili gen seh, a enterotoksina H (SEH) je dokazan u jelu, koje je izazvalo trovanje (Jorgensen i sar. 2005b). S. aureus je u SAD sa 240.000 oboljenja godišnje znaĉajan uzroĉnik trovanja hranom (Scallan i sar. 2011). Incidencija trovanja bi bila i veća da su zabeleţeni i sporadiĉni sluĉajevi (Bennett i sar. 2013). Trovanja zabeleţena ovim mikroorganizmom u SAD od 1975-1982. godine bila su izazvana crvenim mesom (36%), salatama (12,3%), ţivinskim mesom (11,3%), testeninom (5,1%) i samo u 1,4% trovanja mlekom i plodovima iz mora. U 17,1% trovanja nepoznat je uzrok (Genigeorgis, 1989). Ĉokoladno mleko je bilo uzrok trovanja zabeleţenog 1985. godine u Kentakiju (SAD). Ovo ĉokoladno mleko je bilo kontaminirano i ĉuvano pri visokim temperaturama 4-5h pre pasterizacije. Pasterizacijom su uništene stafilokoke, ali ne i eneterotoksini. Ovaj primer, kao i mnogi drugi ukazuju na znaĉaj iskljuĉivanja svih izvora kontaminacije tokom procesa proizvodnje i hladjenja hrane i sastojaka hrane kada god je to moguće. Proizvodi se mogu rashlaĊivati pre, kao i posle termiĉke obrade (pasterizacija). U hrani, koja je pravilno prošla proces proizvodnje stafilokoke bivaju uništene. Noviji podaci pokazuju da je S. aureus u SAD bio uzrok 2,6% oboljenja, koja su izazvana hranom (Scallan i sar. 2011). Najĉešće je u sluĉajevima intoksikacija, nastalih posle konzumiranja hrane, dokazan enterotoksin A (SEA) (77,8%), a zatim enterotoksin D i enterotoksin B (SED i SEB). U Brazilu je 2004. godine zabeleţena epidemija u kojoj je 4000 ljudi obolelo posle konzumiranja hrane u kojoj je dokazan S. aureus (Do Carmo, 2004). Ispitivanjem primoizolata stafilokoka, izolovanih u 16 epidemija iz proizvoda od mleka u Brazilu, najĉešće su dokazani geni sea i seb za sintezu enterotoksina A (SEA) i B (SEB) (Veras i sar. 2008). 18 U azijskim zemljama je sprovedeno nekoliko istraţivanja koja su pokazala da je u epidemijama izazvanim stafilokokama najzastupljeniji bio enterotoksin A (SEA). Izolati S. aureus poreklom od osoba obolelih tokom epidemija zabeleţenih od 2001-2003. godine u Tajvanu su nejĉešće nosili sea gen, zatim seb i sec gen (Chiang i sar. 2008). U Koreji oko 90% izolata S. aureus u trovanjima hranom su bili nosioci sea gena (Cha i sar. 2006). U Japanu je enterotoksin A (SEA) bio najĉešće uzrok trovanja (Shimizu i sar. 2000). U epidemijama zabeleţenim u ovoj zemlji u periodu od 1995. do 1999.godune proizvodi od mleka su bili uzrok u manje od 1% epidemija. Ikeda i sar. (2005) su opisali veliku epidemiju u Osaki 2000.godine kada je obolelo preko 10.000 ljudi posle konzumiranja pasterizovanog mleka sa niskim sadrţajem masti, za ĉije dobijanje je upotrebljeno mleko u prahu. U rekonstituisanom obranom mleku i mleku u prahu je dokazano prisustvo male koliĉine SEA (80ng) i sea gena. Pored sea gena dokazano je i prisutvo seh gena. U tabeli 2.1.2.3. hronološki su prikazane veće epidemije intoksikacija, izazvanih enterotoksinima stafilokoka, nastalih posle konzumiranja mleka i proizvoda od mleka, 19 Tabela 2.1.2.3. Epidemije trovanja eneterotoksinima stafilokoka nastale posle konzumiranja mleka i proizvoda od mleka (Cretenet i sar. 2011) Zemlja Godina Br. sluĉajeva Hrana Tip SE Vrsta mleka Referenca SAD 1884. - sir - - Bergdol (1979) SAD 1958. 200 sir - sirovo Johnson i sar. (1990) SAD 1965. - sir - - Zehren i Zehren (1968) Kanada 1977. 12 sir - - Johnson i sar. (1990) Kanada 1980. 62 sir SEA i SEC - Todd i sar. (1981) SAD 1981. 16 sir - pasteriz. Aleknuse i sar.(1998) Engleska 1983. 2 sir - pasteriz. Baret (1986) Francuska 1983. 20 sir SEA i SED sirovo De Buyser i sar.(1985) Škotska 1984. 27 sir SEA sirovo Bone i sar.(1989) Škotska 1985. 2 kozije mleko - nepasteriz. Sharp (1989) SAD 1985. 860 ĉokoladno mleko SEA pasteriz. Evenson i sar. (1988) Izrael 1987. 3 kozije mleko SEB sirovo Gross i sar. (1988) Engleska 1988. 155 sir - nepasteriz. Maguire i sar. (1991) Brazil 1994. 7 sir SEH - Pereira i sar. (1996) Francuska 1997. 140 sir - sirovo Kerouanton i sar. (2007) Francuska 1998. 62 sir - sirovo Kerouanton i sar. (2007) Francuska 1998. 37 polutvrdi sir nije dokazan sirovo Kerouanton i sar. (2007) Japan 2000. 13.420 mleko u prahu SEA i SEH - Asao i sar. (2003) Ikeda i sar. (2005) Francuska 2001. 4 meki sir SEA - Kerouanton i sar. (2007) Francuska 2001. 46 polutvrdi sir SED sirovo Kerouanton i sar. (2007) Francuska 2002. 104 sir od ovĉijeg mleka SEA sirovo Kerouanton i sar. (2007) Francuska 2009. 23 sir SEE nepasteriz. Ostyn i sar. (2010) 20 2.1.3. Procena izloţenosti Mleko i proizvodi od mleka predstavljaju dobar substrat za rast S. aureus i navode se kao izvor enterotoksina u sluĉajevima intoksikacija (De Buyser i sar. 2001). Nalaz Staphylococcus aureus u mleku i sirevima Staphylococcus aureus kao ubikvitarni mikroorganizam moţe se ĉesto naći u mleku i izolovati sa koţe vimene, papila, rana, opreme za muţu i iz okoline (Jorgensen i sar. 2005a). Ovaj mikroorganizam moţe da izazove mastitise kod muznih ţivotinja. U pomuţenom mleku broj S. aureus je 100-200 cfu/ml. Kod mastitisa broj ovog mikroorganizma moţe da raste do 104cfu/ml mleka (Euzéby, 2012). Kontaminacija mleka i proizvoda od mleka patogenim mikroorganizmima moţe da bude endogenog porekla, iz mleĉne ţlezde inficirane muzne ţivotinje ili egzogenog porekla iz okoline (Brisabois i sar. 1997). Prirodni rezervoar S. aureus predstavljaju latentno inficirane muzne ţivotinje i ĉovek. Ovaj mikroorganizam stalno kolonizuje 20-30% ljudske populacije, a 60% populacije povremeno. U stvari, samo 20% ljudi skoro nikada nije nosilac S. aureus (Kluytmans i Werheim, 2005). Kolonizacija S. aureus, ili gnojna infekcija bilo kog dela tela osobe, koja rukuje sa hranom sigurno ima za posledicu prisustvo ovog mikroorganizma na rukama, a poslediĉno kontaminaciju hrane. Izvor intoksikacija ljudi moţe da bude razliĉita hrana, kontaminirana od latentno inficiranih ljudi S. aureus, a kada sastav i fiziĉko hemijske osobine hrane kao i uslovi sredine pogoduju razmnoţavanju stafilokoka i stvaranju enterotoksina. U literaturi su prisutni podaci o kontaminaciji sirovog mleka i proizvoda od sirovog mleka S. aureus. Prema Boynukara i sar. (2008) i Pelisser i sar. (2008) uĉestalost nalaza S. aureus u sirovom mleku se kreće od 6 do 28%. Ovaj mikroorganizam je dokazan u 75% uzoraka kravljeg mleka i 96% uzoraka kozijeg mleka iz tankova za mleko na farmama u Norveškoj (Jørgensen i sar. 2005). Sliĉan nalaz navodi Rall i sar. (2008) po kojem je S. aureus dokazan u 70,4% uzoraka sirovog mleka. Prevalencija S. aureus u sirovom mleku prema drugim autorima je bila veća i kretala se od 31,9 do 90,4% (Tabela 2.1.3.1.) 21 Tabela 2.1.3.1. Prevalencija S.aureus u sirovom mleku iz tankova i silo tankova na farmama (Kousta i sar. 2010) Uzorak Prevalencija % (ukupan br.uzoraka) Zemlja porekla Referenca Mleko iz silo tanka 66,7 (24) Brazil Andre i sar. (2008) Mleko iz tanka na farmi 85,5 (433) Norveška Jørgensen i sar. (2005) Kozije mleko iz tanka 31,9 (407) Švajcarska Muehlherr i sar. (2003) Sirovo mleko iz tanka 90,4 (21) Brazil Tondo i sar. (2000) Na Novom Zelandu u 17% uzoraka sirovog mleka iz tanka je dokazano >500 cfu/ml S. aureus (Howard, 2006), a u Pensilvaniji je dokazan S. aureus u 31% uzorka sirovog mleka (Jayarao i sar. 2004). U Slovaĉkoj Zigo i sar. (2011) i Dobrikova i sar. (2010) navode da je incidencija S. aureus u sirovom mleku krava i ovaca 4-9%. Medvedova i Valik (2009) su dokazali S. aureus u 20% uzoraka mleka, od kojih je 33% izolata dokazano prisustvo gena za sintezu enterotoksina A (sea). Rajić (2014) je dokazala prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoke u 1,64 do 17,20% uzoraka mleka uzetih iz pojedinih ĉetvrti vimena krava sa tri farme. Svi izolati su stvarali hemolizine, najĉešće beta hemolizin (50% izolata), zatim alfa plus beta hemolizin (36% izolata), beta plus delta hemolizinon (8% izolata), delta hemolizin (4% izolata) i alfa hemolizin (2%). Na osnovu biohemijskih osobina izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka su najĉešće identifikovani kao S. aureus (88%), zatim S. chromogenes (4%), S intermedius (2%), S. xylosus (2%), S. sciuri (2%) i S. lentus (2%). Primenom ELFA tehnike utvrĊeno je da 20% izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, koji su na osnovu fenotipskih i genotipskih osobina, identifikovane kao S. aureus, ima sposobnost sinteze klasiĉnih enterotoksina (A, B, C, D i E). Od 10 izolata S. aureus, kod kojih je ELFA tehnikom utvrĊena sposobnost sinteze klasiĉnih enterotoksina (A, B, C, D i E), samo kod jednog izolata identifikovan je gen za sintezu enterotoksina B. Autor je zakljuĉila da ovaj nalaz ukazuje da ostalih 90% izolata S. aureus ima sposobnost da sintetiše enterotoksine grupe C i/ili E. Hunt i sar. (2012.) su ispitali, na prisustvo S. aureus, 117 uzoraka sirovog mleka i sireva iz razlicitih faza proizvodnje poreklom od 4 proizvoĊaĉa sireva i 5 snabdevaĉa mlekom u Irskoj. Autori su izvršili karakterizaciju 151 izolata iz 81 uzorka u kojima je dokazan ovaj mikroorganizam. Rezultati su pokazali da 83,2% izolata nisu nosioci se 22 gena, i ne poseduju sposobnost sinteze enterotoksina, a kod 16,78 % izolata iz uzoraka poreklom od jednog proizvoĊaĉa dokazan je sec gen. Korpysa-Dzirba i Osek (2011) su anlizirali 237 uzoraka sirovog mleka na prisustvo S. aureus i dokazali prisustvo ovog mikroorganizma u 77 (32,5%) uzoraka. Od 66 izolata 5 (7,6%) izolata su nosili gene za sintezu enterotoksina i to 3 izolata za sintezu enterotoksina C (sec) i 2 izolata za sintezu enterotoksina A (sea). Tokom perioda od 6 meseci Park i sar. (2000) su ispitali prisustvo koagulaza pozitivnih S. aureus u mleku i sposobnost stvaranja enterotoksina u uzorcima sirovog mleka. Iz 178 uzoraka sirovog mleka sa 7 farmi izolovano je 18 (10,1 %) izolata S. aureus i 8 (38%) izolata iz 21 uzorka mleka, kod kojih je broj somatskih ćelija bio manji od 500.000 u mililitru. Autori su dokazali da 7 (87,5%) od 8 izolata i 15 (83,3%) od 18 izolata stvara enterotoksine. Enterotosini su pripadali serotipu B (66,7%), tipu A (33,3%), a dva soja su stvarala enterotoksine A i B. Radovanović Savić (2000) je ispitujući prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka u uzorcima sirovog mleka, koje se koristi za proizvodnju kiselo-koagulišućeeg sira u individualnom domaćinstvu, dokazala prisustvo ovog mikroorganizma ĉiji je broj bio 3 log cfu/ml neposredno posle muţe i rastao sa udaljavanjem od muţe, da bi dostigao vrednost od 5,1 log cfu/ml mleka veĉernje muţe. S. aureus je preţivljavao tokom procesa proizvodnje kiselo-koagulišućeg sira. Populacija se uvećala od 5,69 log cfu/ml u mleku pri podsiravanju do 6,81 log cfu/g u grušu, 7,35 log cfu/g u grudi i siru 7,10 log cfu/g. U uzorcima sirovog mleka krava i jaka (Bos mutus) S. aureus je bio dokazan u velikom broju uzoraka, što su pokazali rezultati ispitivanja Urachimeg i sar. (2007) u Mongoliji. Stafilokoke su izolovane iz 72 (74%) uzorka sirovog mleka. Od uzoraka u kojima su dokazane stafilokoke 69,44% (50 od 72) uzoraka mleka je bilo poreklom od jaka a 30,5% (22 od 72) uzoraka je bilo poreklom od goveda. Tehnikom reverzne pasivne aglutinacije su dokazali enterotoksin C u 10% (7 od 72) uzoraka mleka jaka i 21 % (15 od 72) uzorka mleku goveda. Stephen i sar. (2002) su u uzorcima mleka uzetim iz tankova, na farmama u Švajcarskoj, utvrdili 1,0 x 101 do 3,0 x 103 cfu S. aureus /ml mleka. Veliĉina farme nije imala znaĉajnog uticaja (p >0,05) na broj S. aureus u mleku iz tankova. Genotipizacijom 59 primoizolata, primenom, Pulsed-field gel elektrophoresis (PFGE), 23 su dokazali 22 razliĉita genotipa S. aureus. Samo jedan od dva glavna tipa je dokazan na svakoj farmi, ukazujući na nedostatak genetskog diverziteta meĊu izolatima S. aureus sa farmi. Samo dva pulsotipa su se pojavila na više od jedne farme. Rezultati PFGE su pokazali da postoji genetska relacija izmeĊu izolata S. aureus dobijenih iz uzoraka mleka ĉetvrti i mleka u tankovima na dve farme, na kojima je bio veliki broj ktrava sa mastitisom. Daljim ispitivanjem multipleks PCR tehnikom dokazano je da 16 (27,1%) izolata S. aureus sadrţi se gene, od kojih je 15 bilo nosilac samo jednog gena, a jedan dva gena (seg i sei). Najĉešće dokazani geni su bili seb, sea, sec, dok ni kod jednog izolata nisu dokazani see, seh, sej, ili tst geni. Sa ciljem utvrĊivanja da li stafilokoke, uzroĉnici mastitisa mogu da izazovu intoksikacije ljudi hranom, Cenci-Goga i sar. (2003) su ispitali 160 izolata S. aureus, poreklom od 146 krava sa 18 farmi u Kaliforniji. Rezultati, koje su autori dobili pokazuju da je znaĉajan broj izolata S. aureus (22 od 160) stvarao enterotoksine. Sedam izolata je stvaralo SEC, 12 izolata SED, 3 izolata SEC i SED. Nijedan izolat nije stvarao SEA i SEB. Tkacikova i sar. (2003) su na prisustvo gena za enterotoksine, primenom multipleks PCR tehnike, ispitali 87 izolata S. aureus iz 53 uzorka ovĉijeg sirovog mleka, 21 uzorka sirovog kravljeg mleka, jednog uzorka kozijeg mleka sa farmi u istoĉnoj Slovaĉkoj i 12 uzoraka sira od ovĉijeg mleka. Dokazali su gene za 4 tipa enterotoksina. Tri tipa gena za enterotoksine (SEA, SEC i SED) su dokazana kod S. aureus izolovanih iz ovĉijeg sirovog mleka. Tri tipa (SEB, SEC i SED) su dokazana kod izolata iz uzoraka sireva od ovĉijeg mleka; gen za enterotoksin C (SEC) je dokazan kod izolata iz uzorka kozijeg sirovog mleka i dva gena (SEC i SED) su dokazana kod izolata iz kravljeg sirovog mleka. Najveći broj enterotoksogenih stafilokoka (98,8%), izolovan iz sirovog mleka, posedovao je gena za sintezu SEC i SED. Autori su zakljuĉili da je relativno visoka prevalencija enterotoksogenih sojeva S. aureus 28 (38,6%) od 75 izolata, verovatno u direktnoj korelaciji sa zdravstvenim stanjem mleĉne ţlezde ţivotinja od kojih su uzeti uzorci. Soriano i sar. (2002) su mikrobiološkim pregledom 504 uzoraka hrane (proizvodi od povrća, jaja, mesa, ribe, testa) prikupljenih iz kafeterija i restorana u završnom stadijumu pripreme, kada je hranu trebalo posluţiti, dokazali prisustvo enterotoksogenih stafilokoka u 19 (3,8%) uzoraka od kojih je 10 (52,6%) sojeva stvaralo enterotoksin C 24 (SEC), 4 (21,1%) soja enterotoksin D (SED), 3 (15,8%) soja je stvaralo enterotoksin B (SEB) i 2 (10,5%) soja je stavralo enterotoksin A (SEA). Tri uzorka hamburgera su sadrţavala SEA, SEB i SEC, dok su enterotoksini dokazani u ekstraktima hrane. Uzorci iz restorana su uzimani pre i posle implementacije sistema HACCP. Od 181 uzorka hrane prikupljenih iz 4 restorana pre implementacije sistema HACCP, u 7 (3,9%) uzoraka hrane su dokazane stafilokoke koje stvaraju enterotoksine. SED je stvaralo 4 (57,1%) izolata, 2 (28,6%) izolata SEC i 1 (14,3%) izolat SEA. U jednom uzorku kuglice od mesa iz restorana je dokazan SEC. Posle uvoĊenja sistema HACCP u 4 restorana ispitivanjem 196 uzoraka hrane nisu dokazane stafilokoke koje stvaraju enterotoksine, niti enterotoksini. Tokom monitoringa bakteriološke ispravnosti mleka i proizvoda od mleka De Reu i sar. (2004) su pregledali 143 uzorka sirovog mleka i 100 uzoraka proizvoda od mleka sa farmi u Belgiji, 64 uzorka maslaca, 9 uzoraka jogurta, 16 uzoraka sireva, 7 uzoraka sladoleda i 4 uzorka sveţeg sira. Rezultati su uporeĊeni sa maksimalnim vrednostima, koje propisuje EC direktiva 92/46/EC i maksimalnim vrednostima, koje propisuje regulativa u Belgiji. Enterotoksini stafilokoka su dokazivani u uzorcima u kojima je broj ovog mikroorganizma bio veći od dozvoljenih maksimalnih vrednosti propisanih direktivom i zakonskom regulativom. Adwan i sar. (2005) su ispitali prisustvo enterotoksogenih S. aureus u ukupno 205 uzoraka sirovog mleka, koji su poticali sa farmi u severnoj Palestini od kliniĉki zdravih krava (130) i ovaca (120). Od 100 izolata S. aureus kod 37 (37%) je dokazan gen za sitezu enterotoksina (se). Kod najvećeg broja izolata 20 (54,1%) je dokazan seb, zatim sea gen kod 4 izolata (10,8%), sec gen kod 4 izolata (10,8%) i see gen kod 3 izolata (8,19%). Nijedan od enterotoksogenih izolata nije bio nosilac više od jednog gena (se). Morandi i sar. (2007) su pregledom mleka (krava, koza, ovaca i bivolice) i proizvoda od mleka (gruš, sirevi stari 1-2 meseca, maslac i surutka) iz razliĉitih regiona u Italiji izolovali 112 izolata S. aureus od kojih je 86 izolata iz uzoraka sirovog mleka i 26 izolata iz uzoraka proizvoda od mleka. Svih 112 izolata su identifikovani kao S. aureus. Identifikacija 21 izolata (6 izolata poreklom od krava, 4 izolata poreklom od koza i 1 izolat poreklom od bivolice). Primenom metode reverzne pasivne lateks aglutinacije, dokazano je da S. aureus izolovane iz mleka stvaraju klasiĉne enterotoksine (SEA- SED). Prisustvo gena za sintesu enterotoksina (sea, sec, seg, seh, sei, sej i sel) su ispitali 25 Multiplex-PCR tehnikom. Prisustvo gena za sintezu enterotoksina (se) su dokazali kod 67% ilolata. Izolati stafilokoka iz mleka krava su ĉešće stvarale SEA, SED i nosile sej gen, a stafilokoke izolovane iz mleka koza i ovaca su ĉešće stvarale SEC i nosile sel gen. U cilju karakterizacije S. aureus izolovanih iz mleka, poreklom od krava sa subkliniĉkim mastitisom i iz sabirnih tankova za mleko, Peles i sar. (2007) su ispitali uzorke mleka sa 20 farmi u istoĉnoj MaĊarskoj. Mleko iz tankova sa 14 od 20 farmi je bilo kontaminirano ovim mikroorganizmom u broju 6 x 10 3 cfu S. aureus /ml. U Brazilu su Rall i sar. (2008) pregledali ukupno 162 uzorka mleka sa pet farmi i po 54 uzoraka sirovog mleka iz glavnih tankova za mleko pre pasterizacije, posle pastrizacije i na dan isticanja roka trajanja pasterizovanog mleka. S. aureus su dokazali u 38 (70,4%) od 54 uzoraka sirovog mleka. S. aureus su dokazalu i u 8 (14,7%) uzoraka mleka odmah posle pasterizacije i 11 (20,4%) uzoraka pasterizovanog mleka na dan isticanja roka upotrebe. Nalaz S. aureus u mleku posle pasterizacije prema mišljenju autora je posledica nepravilno izvedene pasterizacije. Genotipizacijom izolata S. aureus su utvrdili 12 genotipova. Najĉešće su dokazali gen, koji kodira sintezu enterotoksina A-sea kod 16 (41%) izolata, zatim seg gen kod 11 izolata (28,2%), gen sec kod 2 (5,1%) izolata, sed gen kod 5 (12,8%) izolata, seb gen kod 3 (7,7%) izolata i see gen kod 2 (5,1%) izolata. D'Amico i sar. (2008) su ispitali 133 uzorka sirovog mleka, koje se koristi za proizvodnju sireva na prisustvo S. aureus. Uzorci su prikupljani jednom nedeljno od juna do septembra 2006. godine sa 11 farmi, koje proizvode sireve od kravljeg, kozijeg i ovĉijeg mleka. U 34,6% (46 od 133) uzoraka mleka sa 8 farmi (73%) su dokazali S. aureus. U Brazilu Arcuri i sar. (2010) su iz 125 uzoraka mleka poreklom od krava sa mastitisom, 96 uzoraka sirovog mleka iz tankova i 70 uzoraka Minas sveţih sireva, izolovali 291 izolat S. aureus. Prisustvo gena za sintezu enterotoksina stafiloka (SE) (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, selj i sell) i tst-1 gen su ispitali primenom tehnike PCR. Kod 109 (37,5%) izolata je dokazano prisustvo bar jednog od 11 gena. Najĉešće su dokazali gene za sintezu enterotoksina kod izolata poreklom iz Minas sira (72,9%), zatim kod izolata poreklom iz uzoraka mleka iz tanka (41,7%) izolata i kod izolata poreklom iz mleka krava sa subkliniĉkim mastitisom (13,6%). Nalaz nedavno opisanih 26 SE gena (seg-sell) je bio znatno veći (87 od 109 PCR-pozitivnih sojeva) nego klasiĉnih SE gena (sea-see), koji su dokazani kod 15 izolata. Najĉešće dokazani SE geni su bili seg i sei, koji su bili pojedinaĉno, ili u kombinaciji sa drugim genima. Ni kod jednog izolata nije dokazano prisustvo see. Kod 8 izolata je dokazan tst-1 gen, ali nijedan nije bio poreklom iz mleka krava sa subkliniĉkim mastitisom. Veliki genotipski diverzitet potencijalno toksogenih izolata S. aureus, naroĉito iz Minas sireva ukazuje na razliĉite izvore kontaminacije. U Brazilu je uobiĉajeno konzumiranje mekih belih sireva, koji se proizvode od sirovog mleka, ĉija je pH vrednost visoka, sadrţaj vlage (55%) i niska koncentraciju soli (1,4- 1,6%). Ovi sirevi se proizvode na malim farmama-mlekarama, ili u domaćinstvima pri razliĉitim higijenskim uslovima, dok industrijska proizvodnja podrazumeva korišćenje pasterizovanog mleka, period zrenja od najmanje 60 dana, ako se za proizvodnju sireva koristi sirovo mleko. Budući da meki sirevi od sirovog mleka mogu da budu potencijalni nosioci patogenih mikroorganizama, u drugom ispitivanju Moraes Mendonca i sar. (2009) su mikrobiološki ispitali 55 uzoraka sireva, koji se proizvode od sirovog mleka. Doakazali su prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka u 17 (30,9%) uzoraka sireva u broju iznsd 10 4 cfu/g. Ovaj rezultat je ukazao na nizak kvalitet sirovog mleka, od kojeg su proizvedeni sirevi i da su uslovi proizvodnje neadekvatni. Aydin i sar. (2011) su analizirali 1070 uzoraka hrane sa pijaca i mlekara u regionu Marmara, Turska na prisustvo S. aureus. Od 147 izolata 92 (62,6%) je imalo sposobnost da stvara enterotoksine. Primenom PCR tehnike utvrĊeno je da 53,3% izolata nosi gene za eneterotoksinima sliĉne tosine seg, seh, sei, sej, sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq i seu, koji su bili više zastupljeni u odnosu na gene za klasiĉne enetrotoksine (sea-see). Daljom analizom dokazani su seo (37,0%), sei (32,7%), sem (30.4%), seg (29,3%), seu (29,3%) i sec geni kod 27,2% izolata. Sposobnost izolata da stvaraju enterotoksine (SEA-SEE) je ispitana ELISA tehnikom. Izolati S. aureus su stvarali 1 do 3 eneterotoksina, najĉešće SEA i SEC. Holeĉková i sar. (2002) su u Slovaĉkoj ispitali uzorke sira proizvedenog od ovĉijeg mleka, Bryndza sira, testenine, kobasica i briseve iz procesa proizvodnje (sa opreme, grlo i nos ljudi, koji uĉestvuju u procesu dobijanja hrane). Stvaranje enterotoksina je dokazano kod 20 (39,2%) izolata od ukupno 51 izolata S. aureus izolovanih iz ispitanih uzoraka. Stvaranje enterotoksina A (SEA) je dokazano kod 3 (5,9%), SEB kod 12 27 (23,5%), SEA i SEB kod 5 (9,8%) izolata S. aureus. Najveća zastupljenost enterotoksogenih izolata S. aureus bila je u siru proizvedeneom od ovĉijeg mleka (47,4%), sa prevalencijom SEB od 36,8%. Od 18 izolata S. aureus iz testenine 6 (33%) je bilo enterotoksogeno. Sinteza enterotoksina nije dokazana kod izolata poreklom iz uzoraka Brindza sira i kobasica. Iz uzoraka brisa sa opreme dokazan je jedan eneterotoksogeni izolat i 4 enterotoksogena izolata iz briseva grla i nosa ljudi, koji su uĉestvovali u procesu proizvodnje. Prevalencija S. aureus u razliĉitim vrstama sira u prometu prema podacima iz literature kretala se od 0 do 25% (Tabela 2.1.3.2.) Tabela 2.1.3.2. Prevalencija S. aureus u razliĉitim vrstama sira (Kousta i sar. 2010) Vrsta sira Vrsta mleka Mesto uzorkovanja Pevalencija % (ukupan br.uzoraka) Zemlja porekla Referenca Sir sa plesnima Paster. prodavnice 17,6 (34) Italija De Luca i sar.(1997) Meki sir Paster. prodavnice 8,3 (36) Italija De Luca i sar.(1997) Polutvrdi sir Paster. prodavnice 18,9 (53) Italija De Luca i sar.(1997) Mozarella tip Paster. prodavnice 25,0 (12) Italija De Luca i sar.(1997) Meki sir sa zrenjem - Lokalne pijace 3,8 (53) Egipat El-Sharound i Spano (2008) Sveţi meki sir - Lokalne pijace 0,0 (34) Egipat El-Sharound i Spano (2008) Meki sir - Supermarket 20,0 (45) Brazil Araújo i sar.(2002) Meki sir kozije prodavnice 8,0 (62) Nemaĉka Akineden i sar. (2008) Krem sir kozije prodavnice 8,0 (50) Nemaĉka Akineden i sar. (2008) Polutvrdi sir kozije prodavnice 5,4 (56) Nemaĉka Akineden i sar. (2008) Tvrdi sir kozije prodavnice 15,3 (13) Nemaĉka Akineden i sar. (2008) Normanno i sar. (2005) su u toku jednog opseţnog ispitivanja pregledali 11.384 uzoraka razliĉite hrane sa trţišta i briseva sa površina iz pogona industrijske proizvodnje hrane da bi utvrdili prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka. Rezultai su pokazali da 28 je 1971 (17,3%) uzorak bio pozitivan na prisustvo ovog mikroorganizma, od kojih je 541 uzorak dalje ispitan i iz 537 (99,3%) uzoraka je izolovan S. aureus. Ukupno 298 (55,5%) od 537 izolata je stvaralo enterotoksine. Od 3097 ispitanih uzoraka mleka i proizvoda od mleka, 641 (20,7%) uzorak je bio kontaminiran koagulaza pozitivnim stafilokokama. Od 364 odabrana izolata za dalju identifikaciju, 362 izolata je identifikovano kao S. aureus od kojih je 217 (59,9%) izolata stvaralo enterotoksine. Ovi sojevi su stvarali SEA (26,7%), SEB (0,9%), SEC (28,1%), SED (15,7%), SEA+SEB (1,8%), SEA+SED (26%), SEA+SEC (0,5%) i SEC+SED (0,5%). Bania i sar. (2006) su ispitali 50 izolata S. aureus poreklom iz sirovog mlevenog mesa i sirove kobasice na sposobnost stvaranja enterotoksina. Sposobnost stvaranja enterotoksina su dokazali kod 27 izolata. Samo 9 od 27 izolata su nosili gene, koji kodiraju klasiĉne enterotoksine SEA-SEE. Autori su dokazali prisustvo novih gena za sintezu enterotoksina kod 18 izolata koji nisu stvarali klasiĉne enterotoksine (SEA- SEE). Svi izolati za koje je dokazano da stvaraju klasiĉne enterotoksine (SEA-SEE) su bili i nosioci gena koji kodiraju SEIs. Najĉešće je bio dokazan gen, koji kodira SElH (stafilokoni enterotoksin-sliĉan enterotoksinu H) kod 14 izolata, a zatim geni koji kodiraju SElI i SElG. Autori su takoĊe dokazali prisustvo tri manje prouĉena gena: sep (8 izolata), sel (2 izolata) i sek (1 izolat). Borelli i sar. (2006) su ispitali prisustvo enterotoksogenih Staphylococcus spp. u Serra da Canastra sirevima u Brazilu. Ova vrsta sira se na tradicionalni naĉin proizvodi preko 200 godina u Minas Gerias oblasti od sirovog kravljeg mleka, dodavnjem surutke u kojoj je prisutna prirodna mikroflora (Lactobacillus spp., Lactococcus spp. i Streptococcus spp.). Proizvodnja sireva se odvija na malim farmama-mlekarama u razliĉitim higijenskim uslovima. Budući da ovi sirevi mogu da budu potencijalni nosioci patogenih mikroorganizama uzorci su prikupljeni sa 10 farmi i obuhvatili su vodu, korišćenu tokom procesa dobijanja sireva, sirovo mleko, surutku, gruš pre soljenja i sireve posle 5 dana zrenja. Broj Staphylococcus spp. u mleku se kretao od 2,0 do 4,9 log cfu/ml. Ovaj broj nije bio samo u vezi sa niskim higijenskim nivoom, već se moţe dovesti u vezu sa temperaturom ĉuvanja mleka, odsustvom hlaĊenja mleka pre procesa dobijanja sireva. Veliki broj S. aureus je dokazan u surutki, koja je koršćena kao starter kultura (2,0 do 5,7 cfu/ml), grušu (4,3-6,3 log cfu/g) i u 70% uzoraka sira (2,0 do 6,3 log cfu/g). Autori su zakljuĉili da tardicionalna upotreba, surutke kao izvora prirodne 29 mikroflore (Lactobacillus spp., Lactococcus spp. i Streptococcus spp.), predstavlja potencijalni opasnost za kontaminaciju Canastra sireva. Alternativu kontrole kontaminacije bi predstavljalo ĉuvanje prirodnih starter kultura pri temperaturama hlaĊenja sve do upotrebe. Od 75 izolata Staphylococcus spp. 70 (93,3%) je stvaralo barem jedan od toksina (SEA, SEB, SEC, SED i TSST-1), a najĉešće su stvarali SEB i SEC. Izolati S. intermedius i S. hyicus iz mleka i gruša su stvarali SEB i SEC. Alemida i sar. (2007) su uzorkovali 70 uzoraka sireva (mekih i tvrdih), koji se proizvodeni od sirovog kravljeg, ovĉijeg i kozijeg mleka, ili kombinacijom ovih vrsta mleka u razliĉitim regionima Portugalije. Mikrobiološkim pregledom dokazali su S. aureus u 37 uzoraka sireva, a u 11 uzoraka sireva broj S. aureus je bio iznad vrednosti potrebnih za formiranje enterotoksina u koliĉinama koje izazivaju intoksikacije ljudi. Cremonesi i sar. (2007) su ispitali 33 uzorka sveţih sireva, mekih, polutvrdih i tvrdih sireva proizvedenih od sirovog mleka na prisustvo S. aureus i enterotoksine stafilokoka (SE) primenom klasiĉne mikrobiološke i molekularne tehnike. U svim uzorcima je bilo dokazano prisustvo S. aureus koje su identifikovane fenotipskim i genotipskim metodama (23S rRNA, coa u nuc gen). Svi sirevi, kod kojih je broj S. aureus bio veći od 10 5 cfu/g, su bili ispitani na prisustvo enterotoksina primenom reverzne pasivne lateks aglutinacije (SET-RPLA) i ELFA VIDAS SET tehnike. Ni u jednom ispitanom uzorku sira nisu dokazani enterotoksini. Od 33 izolata 14 (42%) su imali sea gen. Izolati S. aureus poreklom iz 10 uzoraka sireva od kravljeg mleka su nosili sea ili sed gen, ili kombinaciju sea, sed i sej gena, dok je kombinacija sec i sel gena dokazana u 2 uzorka sira od kozijeg mleka. Samo kod jednog izolata S. aureus je dokazan seg gen. Tokom trogodišnjeg istraţivanaja (2003-2005), koje su sproveli Normanno i sar. (2007) su ispitali 1634 uzoraka mleka, proizvoda od mleka i mesa na prisustvo Staphylococcus aureus i izvršili karakterizaciju enterotoksogenih sojeva izolovanih iz ovih proizvoda. Od ukupno 1634 (641 uzorka mleka, proizvoda od mleka i 993 uzorka proizvoda od mesa) S. aureus je dokazan u 209 (12,8%) uzoraka od kojih je 109 (17%) uzoraka mleka i proizvoda od mleka, a 100 (10%) uzoraka proizvoda od mesa. Stopa kontaminacije mleka i proizvoda od mleka je bila znaĉajno veća u odnosu na proizvode od mesa (p<0,001). Od 209 izolata S. aureus (po jedan iz pozitivnog uzorka) 125 (59,8%) je stvaralo 1, ili više enterotoksina (SE). Najĉešće je dokazan enterotoksin D (SED) kod 42 (33,6%) od 125 izolata, zatim enterotoksin A (SEA) kod 23 (18,4%), 30 enterotoksin C (SEC) kod 19 (15,2%) i enterotoksin B (SEB) kod 8 (6,4%) izolata. Od 125 ispitanih enterotoksogenih sojeva najveći broj 63 (50,4%) izolata su bili humanog porekla, zatim izolata poreklom od ovaca 29 (23,2%), 22 (17,6%) izolata poreklom od nespecifiĉnog domaćina, 9 (7,2%) izolata poreklom od goveda i 2 (1,6%) izolata poreklom od ţivine. Poli i sar. (2007) su da bi utvrdili rizik od nalaza enterotoksogenih S. aureus u Monte Veronese siru (sa oznakom zaštićenog porekla), koji se proizvodi od sirovog kravljeg mleka pregledali 46 uzoraka (21 uzorak gruša i 16 uzoraka sireva posle 1 meseca zrenja i 9 uzoraka sireva posle 3 meseca zrenja) primenom standardnih kulturelnih metoda i real time PCR tehnike. Populacija S. aureus je bila veća od 103 cfu/g u 78% uzoraka sireva. Broj ovog mikroorganizma je bio veći tokom proleća, u uzorcima gruša (1 x 10 3 do 3,4 x 10 5 cfu/g) i sira (<10 2 do 3,3,4 x 10 5 cfu/g). Daljim ispitivanjem 37 izolata S. aureus, svaki iz razliĉitog uzorka, utvrĊeno je da izolati sadrţe barem jedan gen za sintezu enterotoksina. Najĉešće je bio dokazan gen, koji kodira sintezu SED (sed) i ser, sed, seg i sem geni. Autori su zakljuĉili da nalaz gena za stvaranje enterotoksina kod izolata S. aureus poreklom iz sira Monte Veronese, u sluĉaju kada se koagulaza pozitivne stafilokoke umnoţe iznad 103 cfu/g, moţe da predstavlja rizik po zdravlje ljudi. Akineden i sar. (2008) su ispitali 161 uzorak sira proizvedenog od kozijeg mleka sa trţišta u Nemaĉkoj (Hesse), koji su se mogli kupiti u prodavnicama, specijalizovanim radnjama za organsku hranu i na pijacama. Ispitivanjem je obuhvaćeno 50 uzoraka gruša, 62 uzorka mekih sireva, 56 uzoraka polutvrdih sireva i 13 uzoraka tvrdih sireva. Oko polovine (84) uzoraka je bilo poreklom iz Nemaĉke, dok su ostali sirevi bili poreklom iz Holandije (43 uzorka), Francuske (35 uzoraka), Austrije (7 uzoraka), Italije (4 uzorka), Norveške (3 uzorka), Španije (2 uzorka), Belgije (1 uzorak), Grĉke (1 uzorak) i Švajcarske (1 uzorak). Koagulaza pozitivne stafilokoke su dokazane (>10 cfu/g) u 14 uzoraka i njihov broj se kretao od 30 cfu/g u grušu (krem siru) od pasterizovanog mleka iz Nemaĉke do 8,6 x 105 cfu/g u polutvrdom siru od pasterizovanog mleka iz Francuske. El-Sharoud i Spano (2008) su ispitali 87 uzoraka sveţih Domiati sireva (egipatski sveţi sir) na prisustvo Staphylococcus spp. Izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka su najĉešće identifikovani kao S. chromogenes (5 izolata), zatim kao S. xylosus (4 izolata), 31 kao S. caprae (4 izolata) i kao S. aureus (2 izolata). Autori su dokazali da izolati S. aureus poseduju gene za enterotoksine (sea i seb) i SEl gene (selg, seli, selm i selo). Bendahou i sar. (2009) su bakteriološki pregledali 81 uzorak mleka i proizvoda od mleka, Iben (fermentisano mleko) i Jben (tradicionalni sir) u severnom Maroku na prisustvo S. aureus. Na sposobnost stvaranja enterotoksina (SEA-SED) i prisustvo se gena su ispitali 44 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka. Od 44 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka 40 izolata je identifikovano kao S. aureus, 2 izolata kao Staphylococcus hyicus i 2 izolata kao Staphylococcus intermedius. Dobijeni rezultati su pokazali da je 18 (38%) izolata S. aureus stvaralo jedan, ili više klasiĉnih enterotoksina (SEA, SEB, SEC i SED). Najveći broj izolata 11 (24%) je stvarao SEA, zatim SED 3(6,5%) izolata. Primenom PCR tehnike su dokazali da 39 od 44 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka ima jedan od gena za stvaranje enterotoksina (sea, seb, sec, sed i seh). Mikrobiološkim ispitivanjem sireva, proizvedenih na malim farmam u Irskoj, koje su sproveli OBrien i sar. (2009) obuhvaćen je 351 uzorak sira od 15 proizvoĊaĉa. Sirevi su bili proizvedeni od sirovog i pasterizovanog ovĉijeg, kozijeg i kravljeg mleka i to tvrdi, polutvrdi, meki sirevi, meki sirevi sa plesnima i sirevi sa maţom, a poticali su iz razliĉitih geografskih regiona. U 96% uzoraka sireva nalaz S. aureus je bio u skladu sa EU regulativom. Ovaj mikroorganizam nije dokazan, ili je bio u veoma malom broju (manje od 100.000 cfu/g za sireve od sirovog mleka, manje od 1000 cfu/g za termiĉki obraĊene sireve). Veliki broj (preko 10.000 cfu/g) ovog mikroorganizma je dokazan u 12 uzorka sira poreklom od jednog proizvoĊaĉa. U uzorcima sireva, koji su uzorkovani tokom prvih 6 meseci u godini nisu dokazani enterotoksini, a tokom drugih 6 meseci u godini nije dokazano ni prisustvo S. aureus. Pereira i sar. (2009) su izvršili karakterizaciju 206 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz razliĉite hrane u Portugaliji i ispitali da li izolati stvaraju enterotoksine i hemolizine. Sposobnost stvaranja enterotoksina i prisustvo gena za enterotoksine su ispitali kod 148 izolata koji su, na osnovu fenotipskih osobina identifikovani kao S. aureus poreklom iz sirovog mesa (15 izolata), tradicionalnih fermentisanih proizvod od mesa (65 izolata), sireva (9 izolata), iz mleka u sluĉajevima subkliniĉkih mastitisa (18 izolata), sirovog kravljeg mleka (20 izolata) i drugih proizvoda (21 izolat). Stvaranje enterotoksina je ispitano VIDAS tehnikom, a prisustvo 32 gena za stvaranje enterotoksina multipleks PCR tehnikom. Dobijeni rezultati su pokazali da je za 148 izolata potvrĊeno da su S. aureus. Genotipska identifikacija se u potpunosti slagala sa identifikacijom na osnovu fenotipskih osobina. Daljim ispitivanjem VIDAS tehnikom, utvrĊeno je da 59 (40%) izolata ima sposobnost da stvara enterotoksine. Ispitivanjem 148 izolata primenom mPCR tehnike kod 69% izolata je dokazan 1, ili više gena za stvaranje enterotoksina i to 12 % izolata je imalo jedan gen, a preostalih 88% više od jednog se gena. Ispitano je 11 genotipova i njĉešće su dokazani sea i seg (26%); sea, seg i sei (23%) i seg i sei (25%). Kod izolata poreklom iz sira, sirovog kravljeg mleka i mleka krava sa subkliniĉkim mastitisom je bila niska uĉestalost se gena. Nasuprot tome, kod izolata dobijenih iz fermentisanih proizvoda od mesa, ĉešće su dokazali gene za sintezu enterotoksina. Morandi i sar. (2009) su izvršili fenotipsku i genotipsku karakterizaciju primoizolata S. aureus izolovanih iz uzoraka mleka razliĉitih vrsta ţivotinja (81 izolat iz mleka krava, 22 izolata iz mleka koza, 17 izolata iz mleka ovaca i 2 izolata iz mleka bivolice). Svih 122 izolata je identifikovano kao S. aureus primenom PCR tehnike. MeĊutim, primenom Biolog GP identifikacije za 27 izolata su dobijeni sledeći rezultati: 2 izolata je identifikovano kao S. delphini, 1 izolat kao S. xylosus, 1 izolat kao S. intermedius i 1 izolat kao S. haemolyticus, 1 nije identifikovan i za 21 izolat identifikacija je bila samo do nivoa roda (Staphylococcus spp.). Fenotipizacijom, na osnovu rezultata dobijenih primenom Biolog GP, 78% izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka je identifikovano kao S. aureus. Za identifikaciju preostalih 22% izolata bilo je potrebno da se pored fenotipizacije uradi i genotipizacija. Prisustvo jednog, ili više se gena je dokazano kod 79 (65%) od 122 ispitana izolata S. aureus. Najĉešće je dokazan sed gen (40 izolata), zatim sea, sej, sec, sel i sei gen. Najmanje je bio zastupljen seh gen. Kod 21 izolata S. aureus dokazan je samo jedan gen (13 izolata sea, 3 izolata sed, 1 izolat seg, 3 izolata seh i 1 izolat sei), dok je kod preostalih 58 izolata dokazano više od jednog gena. Da bi utvrdili potencijalne izvore kontaminacije sireva S. aureus Jørgensen i sar. (2005a) su bakteriološki pregledali 144 uzorka sa jedne farme u Norveškoj na kojoj se proizvodi sir od sirovog kravljeg mleka. Uzorci su bili mleko krava, brisevi iz okoline, brisevi sa opreme za muţu, brisevi od ljudi koji su uĉestvovali u procesu dobijanja mleka i proizvodnji sira i sirevi iz razliĉitih faza proizvodnog procesa. S. aureus je bio prisutan u mleku od poĉetka procesa proizvodnje sira. Broj S. aureus u uzorcima mleka 33 uzetim iz tanka je bio 355 cfu/ml. Najveći broj je dokazan u grušu u fazi presovanja iznosio je 15 x 10 3 cfu/g, a potom se u sirevima 7. dana zrenja smanjio na 6 x 10 3 cfu/g. Iz sira posle 10 nedelja zrenja S. aureus nije izolovan. Autori su izvršili genotipizaciju 75 izolata S. aureus, ispitali da li stvaraju enterotoksine i prisustvo se gena. Identifikovali su 5 razliĉitih serotipova i dokazali da 11 izolata ima se gene, ali nijedan od tih izolata nije stvarao enterotoksine. Kao glavni izvor kontaminacije opreme, okoline i proizvoda od sirovog mleka autori su naveli prisustvo ovog mikroorganizma u mleku iz tanka. Ikeda i sar. (2006) su ispitivali sireve proizvedene na Hokaidu (Japan) na prisustvo S. aureus tokom perioda od 3 godine. S. aureus je izolovan iz 38 uzoraka sireva i to 3,6- 9,2% od ukupnog broja ispitanih uzoraka i 13-20% od ukupnog broja uzoraka sireva u tipu mocarela. Najveći broj ovog mikroorganizma je bio 2,0 x 104 cfu/g. Izolovani sojevi su dalje ispitani PCR tehnikom da bi se utvrdilo prisustvo se gena. Od 33 izolata kod 20 nisu dokazani se geni, dok je preostalih 13 izolata posedovalo seg gen i sei gen. Autori nisu, primenom komercijalnih kitova, dokazali prisustvo enterotosina u uzorcima sireva. Prema podacima iz literature hrana spremna za konzumiranje, koja je kontaminirana toksogenim S. aureus se navodi kao najĉešći uzroroĉnik oboljenja izazvanih hranom u Koreji. Da bi ispitali kontaminaciju hrane, Oh i sar. (2007) su ispitali ukupno 3332 uzoraka hrane spremne za konzumiranje. U 285 (8,6%) uzoraka je dokazan S. aureus, od toga u 31,6% krem kolaĉa, 19,8% sirove ribe i 19,3% kolaĉa od pirinĉa sa punjenjem. Fenotipska ispitivanja su pokazala da je 48% izolata stvaralo jedan, ili više toksina, kao što su stafilokokni enterotoksini A, B, C (SEA,SEB i SEC). Preko 90 % izolata je stvaralo SEA. TakoĊe su dokazani SEB, SEC, SED, SEA+SEC i SEC+SED enterotoksini. Za 13 izolata iz hrane je dokazano da stvaraju TSST-1 toksin. Genotipizacijom je dokazano prisustvo gena za toksine kod 22 izolata, kod kojih nije dokazano da stvaraju enterotoksine. Kod 69% izolata, za koje je dokazano da stvaraju enterotoksine dokazano je prisustvo barem jednog se gena. Najĉešće je bio zastupljen genotip sea+seh (34,4%), zatim sea (18,8%) i sea+seg+sei (15,6%). Gen tst, koji kodira TSST-1 je dokazan kod 13 (13,5%) izolata. Geni (ete i etb), koji kodiraju egzofolijativne toksine A i B nisu dokazani ni u jednom uzorku. 34 U Francuskoj su trovanja hranom izazvana stafilokoknim enterotoksinima na drugom mestu uzroka trovanja hranom, posle Salmonella (Kerouanton i sar. 2007). U periodu od 2001. do 2003. godine od ukupno 1787 zabeleţenih sluĉajeva oboljenja izazvanih hranom, kao uzroĉnik bolesti prenosivih hranom S. aureus je dokazan u 86 sluĉajeva, a za 173 sluĉaja postoji sumnja (Delmes i sar. 2005). Kerouanton i sar. (2007) su sproveli istraţivanje sa ciljem da izvrše karakterizaciju izolata, koji se dovode u vezu sa trovanjima stafilokoknim enterotoksinima. Ispitali su 178 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz hrane i kliniĉkog materijala u sluĉajevima trovanja hranom zabeleţenih u periodu od 1981. do 2002. godine u razliĉitim gradovima dve oblasti Francuske. Za fagotipizaciju i ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina (se) sea-sei i stvaranje enterotoksina (SEA-SED) odabrali su 33 izolata. Svi izolati (33) su identifikovani kao S. aureus, 27 izolata su bila poreklom od ljudi, 6 izolata poreklom od ovaca, ili poreklom od nespecifiĉnog domaćina. Dvadeset devet izolata je nosilo jedan ili više se gena. Gen sea je bio najĉešće zastupljen (n=23) i u kombinaciji sa sed (n=12) i seh (n=5). Dokazani su seg i sei zajedno sa sa sea-sed, sem jednog koji je sadrţavao samo seg-sei. Little i sar. (2008) su sproveli dva ispitivanja sveţih sireva, sireva sa zrenjem i polutvrdih sireva, proizvedenih od sirovog mleka, termiziranog, ili pasterizovanog mleka, u Velikoj Britaniji tokom 2004. i 2005.godine da bi utvrdili mikrobiološki kvalitet ovih proizvoda. Najveći broj prikupljenih uzoraka je proizveden od kravljeg mleka (63,9%). Prema mikrobiološkim kriterijumima, datim u Preporukama Evropske komisije (2004/24/EC) 95,8% pregledanih uzoraka sireva je bilo zadovoljavajućeg mikrobiološkog kvaliteta, 2,2% uzoraka je bilo na granici mikrobiološkog kvaliteta i 2% uzoraka su bili nezadovoljavajućeg mikrobiološkog kvaliteta zbog velikog broja S. aureus (u 2 uzorka je broj bio: 1,9 x 10 4 i 4 x 10 4 cfu/g). Svi izolati S. aureus poreklom iz 13 uzoraka sireva, proizvedenih od sirovog mleka, u kojima je broj ovog mikroorganizma bio ≥ 104 cfu/g su imali gene za sintezu enterotoksina. Rezultati su pokazali da najĉešće mikrobiološke kriterijume nisu zadovoljavali (4% uzoraka) sirevi proizvedeni od kozijeg sirovog ili termiziranog mleka, zatim sirevi od kravljeg mleka (2,7% uzoraka) i sirevi od ovĉijeg mleka (0,3% uzoraka). Prema poreklu sirevi su bili iz 21 zemlje. Najveći broj uzoraka sireva je bio poreklom iz Francuske (38,3%) i Velike Britanije (25,6%). Sirevi bez zrenja, koji su proizvedeni od sirovog i 35 termiziranog mleka, kao i polutvrdi sirevi od pasterizovanog mleka su bili ĉešće nezadovoljavajućeg mikrobiloškog kvaliteta. Ispitivanjem mikrobiološkog kvaliteta mleka i proizvoda od mleka iz restorana u Španiji (Valencija) prema Evropskim mikrobiološkim kriterijumima (92/46 EEC, 93/43/EEC i Pravilnikom Komisije No.20073/2005) Sospedra i sar. (2009) ni u jednom od 265 ispitanih uzoraka (95 uzoraka termiĉki obraĊenog mleka, 95 uzoraka mleka ĉuvanog pri sobnoj temperaturi i 75 uzoraka proizvoda od mleka) nisu dokazali S. aureus. U cilju utvrĊivanja prisustva S. aureus, tokom procesa dobijanja sireva od sirovog mleka u malim proizvodnim pogonima u Norveškoj, Jakobsen i sar. (2011) su pregledali uzorke mleka i sireva, koje su sakupili sa 9 farmi na kojima se proizvodi sir od kozijeg mleka i 8 farmi na kojima se proizvodi sir od kravljeg mleka. Ispitani su sirevi iz 49 proizvodnih partija sira od kozijeg mleka i 73 proizvodne partije sira od kravljeg mleka. Prevalencija S. aureus u siru proizvedenom od kozijeg mleka je bila razliĉita tokom procesa dobijanja sira, od 91,8% u mleku (0h), 95,9% posle 24 h, da bi se smanjivao posle 30 dana (42,9%). Tokom proizvodnje sira od kravljeg mleka prevalencija ovog mikroorganizma je bila u mleku iz 47,2% proizvodnih partija, posle 5-6 h od poĉetka procesa proizvodnje u 80,8% proizvodnih partija, a 30. dana proizvodnje u 24,7% proizvodnih partija. Najveći broj S. aureus je utvrĊen posle prvog presovanja (posle 5-6 h od otpoĉinjanja procesa proizvodnje) u siru proizvedenom od kozijeg mleka (1,26-5,07 log cfu/g), a siru od proizvedenom od kravljeg mleka (1,33- 3,58 log cfu/g). U cilju utvrĊivanja prisustva S. aureus i nivoa kontaminacije u sveţim sirevima i sirevima sa kratkim vremenom zrenja (<60 dana), koji se proizvode na farmama- mlekarama u Švedskoj, Rosengren i sar. (2010) su ispitali 151 uzorak sira. Izolate S. aureus su ispitali na prisustvo gena za sintezu enterotoksina i sakupili informacije o proizvodnoj praksi. Od ukupno 151 uzorka sira S. aureus su dokazali u 69% (38/55) uzoraka sireva od sirovog mleka i 6% (6/96) sireva od pasterizovanog mleka. Broj ovog mikroorganizma manji od 5 log cfu/g su dokazali u 16% (6/39) uzoraka sireva od sirovog mleka i ni u jednom uzorku sira od pasterizovanog mleka. Broj S. aureus je bio znaĉajno manji u sirevima proizvedenim od sirovog mleka sa dodatkom starter kultura, nego u sirevima proizvedenim od sirovog mleka bez dodatih starter kulture. Najveći broj (6,56 log cfu/g) dokazan je u siru od sirovog mleka proizvedenom bez 36 dodavanja starter kulture. Drugi faktori, kao što su pH, aw i vrsta mleka nisu znaĉajno uticali na broj koagulaza pozitivnih i S. aureus u sirevima. Za fenotipsku identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka, izolovanih iz 44 uzorka sira, odabrano je 156 izolata. Najveći broj izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka 152 (97%) je identifikovano kao S. aureus, zatim kao S. intermedius 3 (2%) izolata i kao S. hyicus1 (1%) izolat. Dalja karekterizacija je vršena samo za izolate S. aureus. Geni za sintezu enterotoksina (se) nisu dokazani kod 45 (30%) izolata, 67 (44%) izolata je bilo nosilac samo jednog gena (sec), a 40 (26%) izolata je nosilo više od jednog se gena u kombinaciji sea, seg, sei, ili sea i seh. Kod ispitanih izolata nisu dokazani seb, sed, see i sef geni. Od svih izolata, 113 (74%) izolata je nosilo tsst gen. U supernatantima kultura poreklom od 28 izolata su dokazani SEA i SEC. Najĉešće identifikovan biotip S. aureus je bio poreklom od ovaca (51%), ljudi (24%), nespecifiĉnog porekla (13%), ţivine (11%) i od goveda (1%). Izolati iz sira proizvedenog od kozijeg mleka su pripadali uglavnom biotipu poreklom od ovaca (73%). Izolati iz kravljeg mleka su uglavnom pripadali biotipu poreklom od ljudi (60%). Enterotoksine stafilokoka (SEA-SEE) nisu dokazali ni u jednom uzorku sira. U Turskoj Ertas i sar. (2010) su koristeći multipleks PCR (mPCR) tehniku utvrdili prisustvo S. aureus i gena za sintezu entertoksina stafilokoka (Ses) u sirevima proizvedenim od ovĉijeg mleka i mleĉnim dezertima. Prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka je dokzano u 86 (57,3%) ispitanih uzoraka. Ukupan broj S.aureus je odreĊivan na Baird Parker agaru i kretao se od 1x102 do 1x106 cfu/g. Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je bio manji od 10 5 cfu/g u 25 (25%) uzoraka sireva i 12 (24%) uzoraka mleĉnih dezerata. Primenom ELISA tehnike enterotoksini stafilokoka (SEs) su dokazani u 7 (2,3%) uzoraka sireva i 5 (3,8%) uzoraka mleĉnog dezerta. Enterotoksin A (SEA) je dokazan u 4 (1,3%) uzorka sira i 3 (2,3%) uzorka mleĉnog dezerta; enterotoksin B (SEB) je dokazana u 2 (0,6%) uzorka sira; enterotoksin C (SEC) je dokazan samo u 1 (0,76%) uzorku mleĉnog dezerta, enterotoksin D (SED) je dokazan u 1 (0,3%) uzorku sira i 1 (0,76%) uzorku mleĉnog dezerta. Korišćenjem mPCR tehnike dokazani su geni za sintezu enterotoksina kod 13 (3,02%) od 80 izolata. Najĉešće je dokazan sea gen kod 8 (1,8%) izolata, zatim seb gen kod 2 (0,46%) izolata, sec gen kod 1 (0,23%) izolata i sed gen kod 2 (0,46%) izolata. MeĊu izolatima iz sireva dokazani su 37 geni sea kod 5 (1,6%) izolata, seb gen kod 2 (0,6%) izolata i sed gen kod 1 (0,3%) izolata. Fooladi i sar. (2010) su bakteriološkim analizom 100 proizvoda od mleka, proizvedenih na tradicionalan naĉin u Iranu, izolovali 32 izolata S. aureus (18 izolata iz krema, 10 izolata iz sireva i 4 izolata iz mleka). Od 32% uzoraka u kojima je dokazan ovaj mikroorganizam najviše je bilo uzoraka krema (18%), a najmanje uzoraka mleka (4%). Broj ovog mikroorganizma u uzorcima je varirao. Najveći broj S. aureus (7x105 log cfu/g) je utvrĊen u kremu. Daljim ispitivanjem autori su dokazali da je 15,6% izolata iz proizvoda od mleka stvaralo enterotoksine (12,5% SEA i 3,1% SEB). Najveći broj ovih izolata je bio poreklom iz krema od kojih je 2 (6,2%) izolata S. aureus stvaralo SEA, ili SEB. Enterotoksin B (SEB) je stvarao samo 1 izolat (3,1%) iz sira. Nijedan izolat nije stvarao oba enterotoksina u isto vreme. Zocche i sar. (2010) su koristeći PCR tehniku ispitali prisustvo gena koji kodiraju sintezu enterotoksina stafilokoka i pripadaju egc klasteru (seg, sei, selm, seln i selo) kod izolata S. aureus poreklom iz razliĉite hrane ţivotinjskog porekla (ţivinsko meso, sirovo mleko, kobasice i sir). Autori su dokazali prisustvo egc klastera kod izolata S. aureus i nalaz razliĉitih genotipova, zavisno od vrste hrane iz koje je mikroorganizam izolovan. Kod izolata poreklom iz ţivinskog mesa su dokazani svi geni iz klastera, dok je kod druge vrste hane ovaj nalaz bio manji. U Francuskoj proizvodi od mleka su hrana, koja se najĉešće dovodi u vezu sa nalazom S. aureus. Meyranda i sar. (1998) su eksperimentalno inokulisali sirovo kozije mleko, koje se koristi za proizvodnju Camembert sira da bi ispitali sposobnost rasta S. aureus i stvaranje enterotoksina u toku proizvodnje i zrenja ovog sira. Kozije mleko je zagrevano do 34°C, a potom inokulisano sa sojem S. aureus 4890 1 A, koji je izolovan iz sira i ima sposobnost da stvara enterotoksin A (SEA) ≥1000 ng/ml i u tragovima enterotoksine B, C, D pri optimalnim uslovima. Poĉetni broj S.aureus je bio 2, 3, 4, 5 i 6 log cfu/ml mleka. Sirevi su proizvedeni po prozvoĊaĉkoj specifikaciji i zrenje je trajalo 41 dan. Ovaj mikroorganizam je bio koncentrisan u grušu i broj je rastao do momenta soljenja. Posle soljenja, populacija S. aureus je bila stabilna i u velikom broju. Zapaţena je redukcija za 1 log u sirevima sa poĉetnim inokulumom većom od 103cfu/ml na kraju zrenja (41. dan), uporeĊujući sa brojem odreĊenim 22 h posle inokulacije. Broj stafilokoka u unutrašnjosti sira nije bio znaĉajno veći u odnosu na broj na površini sira. 38 Ni iz jednog uzorka mleka, uzetih iz tankova za ĉuvanje mleka, negativne kontrole i salamure nije izolovan S. aureus. Enterotoksin A (SEA) je dokazan u uzorcima sira proizvedenog od mleka eksperimentalno kontaminiranog S. aureus. Koliĉina enterotoksina se kretala od 1 do 3,2 ng/g u siru proizvedenom od mleka sa poĉetnim brojem S. aureus 10 3 -10 6 cfu/g. Enterotoksin nije dokazan u sirevima proizvedenim od mleka sa najmanjim inokulumom. Rezultati odreĊivanja pH u sirevima pokazuju da se ova vrednost blago sniţavala tokom koagulacije i na ktraju ceĊenja, kada je bila 6,3. Tokom procesa zrenja sira pH vrednost je rasla i 20. dana dostigla 7,1, a 41. dana 7,3. Na površini sira pH vrednost je bila znatno viša u odnosu na unutrašnjost sira. Rast S. aureus i stvaranje enterotoksina tokom prozvodnje 3 tipa polutvrda sira (Saint- Nactaire tipa, Saint-Nactaire sa registrovanim geografskim poreklom i sira sa registrovanim geografskom poreklom Salers) od kravljeg sirovog mleka su ispitali Delbes i sar. (2006). Rezultati koje su dobili pokazuju da je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka rastao tokom prvih 6 h. IzmeĊu 6 i 24 h, broj koagulaza pozitivnih stafilokoka se uvećao za manje od 0,5 log cfu/ml. Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirovom mleku se kretao od <10 cfu/ml do 3,3 log cfu/ml. Maksimalan broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je dosignut u siru starom 1 dan (2,82-6,84 cfu/g). Na broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je uticao pH. Poĉetni broj stafilokoka u mleku bi trebalo da bude manji od 100 cfu/ml, a najbolje da je manji od 40 cfu/ml mleka. Autori su dali preporuku, da bi se ograniĉio rast koagulaza pozitivnih stafilokoka, pH vrednosti bi trebale da budu oko, ili niţe od 5,8 u 6 h za Saint-Nactaire sireve i 6,3 i niţe za Salers sireve. Enterotoksini su dokazani u dva Salers sira kod kojih je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka 1. dana bio 5,55 i 5,06 log cfu/g i u kojima je pH vrednost bila posle 6 h veća od 6,6, odnosno 6,5. Akkaya i Sancak (2007) su ispitali sposobnost rasta i stvaranja enterotoksina u Herby siru, koji se proizvodi od sirovog mleka uz dodavanje 25 razliĉitih biljaka iz Anadolije, Turska. Autori su eksperimentalno inokulisali sirovo i pasterizovano mleko za proizvodnju 10 sireva sa monokulturom i mešenom kulturom referentnih sojeva S. aureus (10 5 cfu/ml) koji sintetišu A, B, C, D enterotoksine. Spoosobnost rasta i stvaranja enterotoksina je praćeno tokom 90 dana zrenja. Broj S. aureus u uzorcima sira, proizvedenim od pasterizovanog mleka je rastao u koagulumu i grušu, dostiţući najveći broj od 7,778 log cfu/g sira starog 3 dana, a potom je došlo do smanjivanja broja posle 39 15 dana, da bi posle 90. dana zrenja broj S. aureus bio 2,146 log cfu/g. U sirevima proizvedenim od sirovog mleka broj S. aureus u koagulumu i grušu je bio visok ( 8,531- 9,431 log cfu/g), a najveći broj je bio u siru starom 3 dana ( 9,799 log cfu/g), a potom je došlo do smanjenja broja i u siru starom 90 dana broj se kretao od 5,954-6,278 log cfu/g. Enterotoksin A je dokazan u grušu tokom dobijanja sira od eksperimentalno kontaminiranog pasterizovanog mleka. Enterotoksini A, B, C i D su dokazani 3. dana zrenja, a enterotoksin C je dokazan 15. dana u siru proizvedenom od eksperimentalno kontaminiranog pasterizovanog mleka. Ni u jednom uzorku sira proizvedenog od eksperimentalno kontaminiranog sirovog mleka tokom proizvodnje nisu dokazani enterotoksini, iako je broj S. aureus dostizao vrednost od 10 7 cfu/g. Bianchi i sar. (2013a) su u periodu od januara 2010. do jula 2011. godine analizirali ukupno 1245 uzoraka (848 uzoraka sirovog mleka i 397 uzoraka proizvoda od mleka) na prisustvo 11 eneterotoksina stafilokoka i eneterotoksinima sliĉnih toksina (SEA, SEB, SEC,SED, SEE, SEG, SEH, SEI, SER SElJ i SElP). Iz 481 (39%) uzoraka je izolovan S. aureus. Od 481 izolata S. aureus iz sireva prisustvo jednog, ili više gena je dokazano kod 255 (53%) izolata, a utvrĊeno je 35 razliĉitih profila gena za sintezu eneterotoksina. Ni kod jednog izolata nije dokazano prisustvo seb i sec gena, dok je najĉešće dokazan ser gen kod 134 (28%) izolata, zatim sed (25%) i selj (25%). Rola i sar. (2013) su ispitali 82 uzorka (48 uzoraka sirovog mleka, poluproizvoda i proizvoda od mleka i 34 brisa iz okruţenja proizvodnje) sa 9 farmi-mlekara u Poljskoj. Uzorci su uzeti u fazama proizvodnje kada se oĉekuje najveći broj S. aureus. Koagulaza pozitivne stafilokoke su dokazane u 39 (81,3%) uzoraka mleka i sireva i 12 (35,3%) briseva. Od 39 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz mleka i sireva 27 (69.2%) je identifikovano kao S. aureus pomoću Api 32 Staph testa, a 12 (30.8%) kao Staphylococcus sp. Enterotoksogene koagulaza pozitivne stafilokoke su dokazane u uzorcima sa 6 farmi-mlekara. Primenom PCR tehnike ispitano je da li su prisutni geni za sintezu enterotoksina. Više od polovine (54,9%) izolata je nosilo gene za sintezu enterotoksina, od kojih je 17 (60,7%) izolata nosilo gene sed i sej a 5 izolata istovremeno i ser gen. Geni nisu bili prisutni pojedinaĉno ni u jednom ispitanom izolatu. Kod 3 (10,7%) izolata je utvrĊeno prisustvo seg i sei gena. 40 Isptivanjem 220 uzoraka mleka i proizvoda od mleka Hassani i sar. (2014) su dokazali S. aureus u 58 (26,36%) uzoraka. Gen sea su dokazali kod 25% izolata poreklom iz mleka i 18% izolata poreklom iz sireva. Ispitivanjem prevalncije S. aureus u proizvodima od mleka u Slovaĉkoj i prisustva se (sea, seb i sed) gena Medvedova i sar. (2014) su dokazali prisustvo sea gena kod 32% izolata. Ni kod jednog izolata S. aureus nisu dokazali seb gen i sed gen. Pedonese i sar. (2014) su prouĉili rast S. aureus i stvaranje enterotoksina posle eksperimentalne kontaminacije u toku proizvodnje Caciotta (Ricota) italijanskog mekog sira proizvedenog od sirovog mleka sa i bez dodavanja komercijalnih starter kultura. Za eksperimentalnu kontaminaciju korišćena su dva razliĉita inokuluma (5,03 i 3,22 log cfu/ml) S. aureus, koji ima sposobnost da stvara eneterotoksine. U eksperimentu je ispitan sir proizveden od sirovog mleka kontaminiranog sa 2,15 log cfu/ml koagulaza pozitivnih stafilokoka. U siru proizvedenom bez starter kulture sa većim inokulumom broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je dostigao 7,57 log cfu/g i veće vrednosti posle faze acidifikacije, nego u siru proizvedenom sa starter kulturom (manje od 6,5 log cfu/g). Enterotoksini su dokazani u sirevima proizvedenim sa i bez starter kultura. U siru sa manjim inokulumom i bez starter kultura broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je bio 5 do 6 log cfu/g i nije dokazano stvaranja enterotoksina. Ispitivanjem nivoa kontaminacije S. aureus sira Cotija u Meksiku i prisustva gena za stvaranje toksina Torbido-Jimenez i sar. (2014) su dokazali S. aureus u 27 (54%) od 50 uzoraka sira. Broj S. aureus se kretao se od 12x10 3 do 3x10 6 cfu/g. Primenom PCR tehnike su dokazali tstt-1 gen kod jednog izolata S. aureus. Vicosa i sar. (2013) su primenom PCR tehnike kod 91 (98,9%) od 92 izolata S. aureus poreklom iz sirovog mleka i sireva u Minas Gerisa oblasti, Brazil dokazali prisustvo bar jednog se gena. Najĉešće dokazan gen je bio sei (97,8%), a gen seu je dokazan kod 35 (38%) izolata. Geni seg i sei su dokazani istovremeno kod 49 izolata. U Poljskoj Lawrinowicz i sar. (2007) su ispitali prisustvo se i sel gena kod 53 izolata S. aureus iz uzoraka hrane prikupljenih u periodu od 2004-2005. godine, 18 izolata iz hrane prikupljenih u periodu od 1960-1970.godine i 30 izolata poreklom sa sluzokoţe nosa ljudi kliconoša u periodu od 2000-2002.godine. Kod 80% od svih ispitanih izolata je dokazano prisustvo se i sel gena, sa većom prevalencijom kod izolata porekom od ljudi kliconoša (93%) u odnosu na izolate iz hrane (76%). Gen sea je ĉešće dokazan 41 kod izolata poreklom od ljudi kliconoša (27%) u odnosu na izolate poreklom iz hrane (11%) u periodu od 2004-2005.godine. Od 18 izolata poreklom iz hrene u periodu 1960- 1970. godine sea gen je dokazan kod 10 izolata S. aureus. 2. 2. Faktori koji utiĉu na rast S. aureus i stvaranje enterotoksina U ovom delu pregleda literature će biti prikazani faktori, koji utiĉu na rast S. aureus i stvaranje enterotoksina. Staphylococcus aureus ima sposobnost da raste i stvara eneterotoksine pri razliĉitim uslovima u hrani. U literaturi je dobro prouĉena sposobnost rasta, umnoţavanja Staphylococcus aureus posle eksperimentalne kontaminacije mleka i sireva (Tabela 2.2.1.) Tabela 2.2.1. Limiti za rast i stvaranje enterotoksina (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1996). Faktor Rast Stvaranje toksina Optimum Raspon Optimum Raspon Temperatura °C 37 7-48 40-45 10-48 pH 6-7 4-10 7-8 4,5-9,6 Aerobno 5,0-9,6 Anaerobno Aktivnost vode (aw) 0,98 0,83->0,99 Aerobno 0,90->0,99 Anaerobno 0,98 0,87-->0,99 Aerobno 0,90->0,99 Anaerobno 2.2.1. Uticaj temperatura na rast S. aureus S. aureus je mezofilni mikroorganizam sa optimalnom temeperturom rasta pri 37°C. Minimalna temperaturta pri kojoj ovaj mikroorganizam raste u hrani je 5°C i to u slanini (Farrrel i Upton, 1978). Rast je bio moguć pri 6,7°C u ţivinskom mesu „á la king― (Angelotti i sar.1961). Rast pri 7°C je zabeleţen u UHT mleku (Medvedova i sar. 2009). U bujonu sa mešanom kulturom 5 enterotosogenih izolata S. aureus nije bilo rasta pri 7,5°C. Pri 8°C rast je bio zabeleţen kada su drugi uslovi bili optimalni (Valero i sar. 2009). Ispitujući sposobnost razliĉitih izolata da rastu unutar uskih interavala temperature Schmitt i sar. (1990) su zakljuĉili da je rast moguć pri 7°C. 42 Kao maksimalna temperatura pri kojoj je bio moguć rast S. aureus se navodi 48,9°C u obranom mleku (Stiles i Witter, 1965). Druga istraţivanja su pokazala da je to oko 45°C (Angelotti i sar. 1961, Vandesbosch i sar. 1973). Dalja istraţivanja su potvrdila da ovaj mikroorganizam moţe da raste pri 46°C samo ako je zaštićen rastvorom 1M NaCl (El-Banna and Hurst, 1983), iako su George i sar. (1959) zabeleţili rast u obranom mleku. Nije bilo rasta za jedan izolat pri 51°C, ali je rastao pri 46°C (Medvedova i sar. 2009). 2.2.2. Uticaj pH na rast S. aureus Većina izolata S. aureus raste u rasponu pH od 4,5 do 9,3 (Bergdoll i Lee Wong, 2006) sa optimalnim rastom pri pH 6-7 (Baird-Parker, 2000; Bremer i sar. 2004; Halpin- Dohnalek i Marth, 1989; Jay, 2000). Na rast pri niskim vrednostima pH utiĉu i drugi faktori sredine. Rast je inhibisan sa 0,1% rastvorom sirćetne kiseline i prisustvom masnih kiselina kratkih lanaca (C1-C4) (Normano i sar. 2007). S. aureus je više osetljiv na acidifikaciju kada je koncentracija soli povećana, iako je halotolerantan mikroorganizam. Brza acidifikacija do pH vrednosti pri kojima nije moguć rast je najefikasniji naĉin inhibicije ovog mikroorganizma. Kiseline nemaju isti kapacitet za inhibiciju pri odreĊenim pH vrednostima i uticaj zavisi od kiseline koja se koristi za inhibiciju. Veći efekat imaju organske kiseline pri pH vrednostima ekvivalentnim onim, koje su postignute neorganskim kiselinama. U mešanoj kulturi 5 enterotoksogenih izolata S. aureus je raslo pri 4,5 (Valero i sar. 2009). Sliĉne rezultate su dobili Charlier i sar. (2008) u eksperimentu u kojem je pH podešavan sa mleĉnom kiselinom. Prethodno izlaganje S. aureus 2 sata pri pH 4,5 i 30 minuta pri pH 9,5 su povećali preţivljavanje ove bakterije pri pH 2,5 i 12,0 (Cebrian i sar. 2010). 2.2.3. Uticaj organskih kiselina na rast S. aureus Uticaj organskih kiselina na rast S. aureus zavisi od koncentracije njihovih nedisisovanih jona. Konstanta disocijacije (pKa) je vrednost pH pri kojoj je odnos disosovanih i nedisosovanih oblika 50:50. Sirćetna kiselina i propionska kiselina ĉije su pKa 4,8 i 4,9 su jaĉi inhibitori od mleĉne kiseline ĉija je pKa 3,9 (Baird-Parker, 2000; 43 Charlier i sar. 2009). Otpornost S. aureus na pH vrednosti veće od 5,5 se objašnjava odrţavanjem intracelularnog pH disocijacijom, ili otpuštanjem protona iz citoplazme, a takoĊe i ekspresijom gena odgovornih za puferski kapacitet citoplazme. Ovi geni obuhvataju gene, koji kodiraju intracelularni haperoni, ureaza operon i geni za metabolizam i transport aminokiselina (histidin, lizin, arginin), ugljenih hidrata i fosforne kiseline (Charlier i sar. 2009; Baker-Austin i Dopson, 2007). Potpuna inhibicija se postiţe pri pH ispod 5,0. Sniţavanje intracelularnog pH i stres oštećuju strukturu zida bakterijske ćelije i vode ka smanjenoj aktivnosti enzima, koji su osetljivi na pH. Nedisosovani oblici kiselina uĉestvuju u respiratornom lancu. Protonski oblici difunduju u ćeliju pri niskim pH što je praćeno disocijacijom protona. Rast mikroorganizma je tada jako ugroţen, jer se onda raspoloţiva energija u ćeliji koristi za deacidifikaciju citoplazme aktivacijom proton gradijenta duţ cele citoplazmatiĉne membrane (Baker-Austin i Dopson, 2007). Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) sirćetne i mleĉne kiseline za S. aureus je 0,6 i 2,5 µl/ml (de Oliviera i sar. 2010). Pokazalo se da mleĉna kiselina ispoljava veći efekat u kontroli patogenih bakterija u mesnom bujonu kada je dodata u koliĉini, koja se navodi kao MIC. Inhibitorna aktivnost je dokazrana kada su organske kiseline korišćene u sub MIC koncentracijama u kombinaciji sa karvakrolom i timolom. Rast S. aureus u rekonstituisanom mleku je bio moguć pri pH 4,5 i temperaturi od 37°C kada je pH podešen sa HCl, ali je izostao pri istom pH podešenom sa mleĉnom kiselinom. 2.2.4. Uticaj soli i aktivnosti vode (aw) na rast S. aureus Iako je S. aureus halotolerantan mikrooganizam u poreĊenju sa drugim mikroorgamizmima so inhibiše rast S. aureus. Ovaj mikroorganizam moţe da raste pri koncentarciji NaCl od 2,5 do 20%. Valero i sar. (2009) su dokazali da je 5 enterotoksogenih sojeva stafilokoka u mešanoj kulturi raslo pri aw 0,867 kada je kao hjumektant korišćena so. S. aureus je rastao u testenini sa aw ispod 0,86 (Valik i Görner, 1993). Rast izolata S. aureus je dokazan pri aw 0,893 (15,25% NaCl), ali ne i pri aw 0,869 (18,17% NaCl) (Medvedova i sar. 2009). Kreisman i Labuza (1978) su dokazali da S. aureus moţe da raste u siru pri aw 0,94 i pH oko 5,7, ali ne i pri aw 0,91. Sniţavanje vrednosti za aw od 0,993 do 0,95 je uticalo na produţenje lag faze, stopu 44 rasta i maksimalnu koncentraciju, a efekat je bio izraţeniji pri sniţavanju tempreature. Rast S. aureus je zabeleţen u mesu pri koncentarciji NaCl od 20% (Tatini, 1973). 2.2.5. Uticaj atmosfere na rast S. aureus S. aureus je fakultativni anaerobni mikroorganizam koji moţe da raste usporeno u odsustvu kiseonika. Rast S.aureus u bujonu bio je brţi a maksimalna gustina populacije je veća u aerobnim u odnosu na anaerobne uslove (Belay i Rasooly, 2002). Oksigenacija, tokom sabiranja mleka posle muţe ili tokom proces proizvodnje sira, moţe da favorizuje umnoţavanje ovog mikroorganizma, dok mikro-anaerobni uslovi u siru mogu da budu nepovoljni za stvaranje enterotoksina (Cretenet i sar. 2011). 2.2.6. Uticaj kompetetivnih mikroorganizma na rast S. aureus Pitt i sar. (2000) su prouĉili kinetiku rasta S. aureus u sirovom i pasterizovanom mleku pri 37°C koja je bila ista u prvih 16 h inkubacije. Smanjenje broja ovog mikroorganizma posle dostignute maksimalne gustine populacije je bilo brţe u sirovom mleku a broj je bio za 2 log cfu/ml manji nego u pasterizovanom mleku posle 72 h inkubacije. Ovi podaci mogu da ukazuju da je rast isti u sirovom i pasterizovanom mleku u ranim fazama proizvodnje sireva. Posle inokulacije S. aureus u mleko, poreklom iz ĉetvrti zahvaćene mastitisom izazvanim streptokokama, rast ovog mikroorganizma je bio neznatno veći u odnosu na rast u sirovom mleku (Fang et. al. 1993). U sirevima proizvedenim od sirovog mleka bakterije mleĉne kiseline, kao kompetitivna mikroflora pokazuju inhibitorno delovanje prema patogenim mikroorganizmima (Ortolani i sar. 2010). Pereira i sar. (2009) su ispitali uticaj izolata tri vrste bakterija mleĉne kiseline tokom proizvodnje portugalskog sira. Izolat Lactococcus lactis je pokazao efiksano inhibitorno delovanje na S. aureus, dok su Lactobacillus brevis i Lb. plantarum pokazali manju inhibiciju. Radovanović i Katić (2009) su dokazale da mešana kultura Lb lactis i Lb. plantarum usporava rast S. aureus u sterilnom obranom mleku pri temperaturi od 30°C. 45 2.2.7. Uticaj sadrţaja masti na rast S. aureus Postoje dokazi da S .aureus raste u manjem broju u proizvodima od mleka sa većim sadrţajem masti, ali ovo zavisi od soja (Halpin-Dohnalek i Marth, 1989). Ova pojava se moţe dovesti u vezu sa osobinom da stvara lipaze i inhibicijom rasta, koja nastaje zbog slobodnih masnih kiselina. Slobodne masne kiseline se oslobaĊaju usled lipolitiĉke aktivnosti S. aureus i na taj naĉin deluju autoinhibitorno. 2.2.8. Uticaj tempeartura na stvaranje enterotoksina stafilokoka Minimalna i maksimalna temperatura pri kojoj S. aureus moţe da se stvara enterotoksin su 10°C i 45°C (Bergdoll i Lee Wong, 2006) sa optimalnom temperaturom 30-40°C. Aoyama i sar. (2008) su dokazali enterotoksin u BHI bujonu posle 5 dana inkubacije pri temperaturi od 10,8 °C, ali i ne pri temperaturi od 8,7°C posle 10 dana inkubacije. Iako mikroorganizam raste pri temeperaturama ispod 10°C ne znaĉi da će stvarati eneterotoksine. Enterotoksin nisu stvarala 2 eneterotoksogena soja S. aureus posle inkubacije 36 h pri temperaturi od 18°C kada je populacija S. aureus bila 10 9 cfu/g (Yang i sar. 2001). Termiĉka stabilnost enterotoksina zavisi od vrste hrane, pH, sadrţaja NaCl i od same vrste enterotoksina. Enterotoksin A (SEA) je otporniji na delovanje temperature pri pH 6,0 i višim vrednostima, nego pri pH 4,5-5,5, dok je enterotoksin D (SED) više stabilan pri pH 4,5-5,5, nego pri 6,0. Ako enterotoksin nije u potpunosti inaktivisan delovanjem temperature moţe da doĊe do reaktivacije tokom kuvanja, ĉuvanja, inkubacije (Tatini, 1976). 2.2.9. Uticaj pH na stvaranje enterotoksina stafilokoka Stvaranje enterotoksina je moguće u rasponu pH od 4,5 do 9,6 (ICMSF, 1996). Optimalna pH vrednost za sintezu enterotoksina je 5,0. Rast S. aureus je moguć pri 12% NaCl, ali nema sinteze enterotoksina. Carpenter i Silverman (1976) su zabeleţili stvaranje enterotoksina A (SEA) pri pH 6,5-7,0 u kulturi sa kontrolisanim pritiskom kiseonika. Posle eksperimentalne inokulacije sa 10 8 cfu S. aureus /ml bez dodavanja soli Genigeorgis i saradnici (1971) su dokazali sinezu enetrotoksina pri rasponu pH od 4,0 do 9,83. Minimalna vrednost pH pri kojoj moţe da se stvara enterotoksin zavisi da li je rast u aerobnim ili anaerobnim uslovima. Za osam sojeva S. aureus, koji su stvarali 46 enterotoksin A, minimalna pH vrednost je bila od 4,9 do 5,9 u aerobnim uslovima. U anaerobnim uslovima nema sinteze enterotoksina B i C pri pH 5,7. 2.2.10. Uticaj aktivnost vode (aw) na stvaranje enterotoksina stafilokoka Niske vrednosti za aktivnost vode više utiĉu na sintezu enterotoksia B (SEB), nego na enterotoksin A (SEA) (Qi i Miller, 2000). Rast tri soja S. aureus pri 37°C i stvaranje eneterotoksina A i B (SEA i SEB) su zabeleţeni pri aw 0,95. Koliĉina eneterotoksina A, koja je stvorena pri aw 0,996 i 0,95 je bila je pribliţno ista, dok je je sinteza eneterotoksina B bila smanjena pri niţim vrednostima (Paullin i sar. 2011). Sinteza enterotoksina A (SEA) je bila pri 35°C u svinjskom mesu sa aw 0,86, ali ne i pri aw 0,83. U goveĊem mesu stvaranje enterotoksina je bilo pri aw 0,88 (Tatini, 1973). Rast S. aureus je moguć u širem rasponu aw u odnosu na stvaranje enterotoksina. 2.2.11. Uticaj kompetitivnih mikroorganizama na stvaranje enterotoksina stafilokoka U literaturi su prisutni podaci o uticaj kompetitivnih mikroorganizama na sintezu enterotoksina (Smith i sar. 1983). Stvaranje enteretoksina zavisi od vrste mikroorganizma, koji je u kompeticiji sa S. aureus. Bakterije mleĉne kiseline (Lactobacillus, Streptococcus i Leuconostoc) su razgradile delimiĉno preĉišćen enterotoksin A. Opšte je prihvaćeno da se enterotoksin manje stvara kada je S. aureus u prisustvu drugih mikroorganizama i da je potreban veći broj ovog mikroorganizma da bi se stvorio enterotoksin (Tatini, 1973). 2.2.12. Uticaj atmosfere na stvaranje enterotoksina stafilokoka Anaerobni uslovi pri 37°C nisu inhibisali stvaranje eneterotoksina A (SEA), ali je koliĉina enterotoksina bila manja nego u aerobnim uslovima (Belay i Rasooly, 2002, Carpenter i Silverman, 1976). 47 2.2.13. Uticaj hranljivih materija na stvaranje enterotoksina stafilokoka Izvori uglejnika utiĉu na stvaranje enetrotoksina (Smith i sar. 1983). Dodavanje glukoze inhibiše stvaranje SEA, SEB i SEC, a objašnjava se sniţavanjem pH kao rezultat metabolizma šećera. Dodavanje amino kiselina je uticalo na stvaranje SEB. 48 3. CILJ I ZADACI ISTRAŢIVANJA Podaci iz literature pokazuju da su koagulaza pozitivne stafilokoke i Staphylococcus aureus prisutni u odeĊenom broju u mleku i sirevima. S aspekta bezbednosti hrane znaĉaj ovog mikroorganizma se ogleda u tome što stvara termostabilne enterotoksine koji uneti u odreĊenoj koliĉini, putem hrane, u organizam ĉoveka dovode do intoksikacije. Dovoljna koliĉina enterotoksina, koja dovodi do intoksikacije, nastaje pri broju koagulaza pozitivnih stafilokoka većem od 105 cfu/g hrane. Uslovi tokom proizvodnje mekih sireva slatkom koagulacijom pogoduju razmnoţavanju koagulaza pozitivnih stafilokoka. Za procenu rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekom siru, proizvedenom u domaćinstvu, vaţno je da se odrede fiziĉko hemijske karakteristike, broj laktobacila i laktokoka, broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u siru i ispita sposobnost stafilokoka izolovanih iz sira da stvaraju enterotoksine. Stoga je cilj ove doktorske disertаcije bio dа se, nа osnovu brojа koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа u siru, uslovа zа njihovo rаzmnoţаvаnje i stvаrаnje enterotoksinа, kаo i prisustvа genа zа sintezu enterotoksinа kod koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа izolovаnih iz sirа, proceni rizik od nаlаzа enterotoksinа stаfilokokа u mekim sirevimа. Zа ostvаrivаnje ovog ciljа postаvljeni su sledeći zаdаci: 3.1. Odrediti broj koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа, Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u sirevimа proizvedenim od kuvаnog i nekuvаnog mlekа. 3.2. Odrediti fiziĉko-hemijske pаrаmetre (pH, sаdrţаj NaCl, mаsti, suve mаterije i аktivnost vode) u sirevimа proizvedenim od kuvаnog i nekuvаnog mlekа. 3.3. Formirаti pul koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа izolovаnih iz sirevа i izvršiti njihovu identifikаciju ispitivаnjem mаkromorfoloških, mikromorfoloških i biohemijskih osobinа. 3.4. Ispitаti dа li koаgulаzа pozitivne stаfilokoke, izolovаne iz sirevа, stvаrаju klasiĉne enterotoksine (SEA, SEB, SEC, SED i SEE) . 3.5. Identifikovаti gen ili gene zа sintezu enterotoksinа. 3.6. Ispitаti nа prisustvo enterotoksinа sireve u kojimа je utvrĊen broj enterotoksogenih stаfilokokа iznаd 105 cfu/g. 49 4. MATERIJAL I METODE RADA 4.1. Materijal Materijal za ispitivanje predstavljalo je 555 uzoraka mekih sireva proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka od kojih je 10 sireva bilo proizvedeno od kozijeg mleka, a 545 sireva od kravljeg mleka. 4.1.1. Sirevi Uzorci sireva uzeti su na 17 pijaca (16 pijaca na teritoriji Beograda i 1 pijaca u Srbiji, selo Guĉa) (Tabela 4.1.1.). Ispitano je 555 uzoraka sireva razliĉite straosti, koji su proizvedeni u individualnim domaćinstvima iz razliĉitih geografskih lokaliteta u Srbiji (slika 4.1.1). Od 555 uzoraka sira, 389 uzoraka sira bili su slatko-koagulišući sirevi, a 166 uzoraka sira kiselo-koagulišući sirevi. Kriterijum po kojem su razvrstani sirevi u slatko-koagulišuće i kiselo-koagulišuĉe sireve je bla pH vrednost sira. Svi sirevi u kojima je pH vrednost bila viša od 4,6 su svrstani u slatko-koagulišuće, a sirevi sa pH vrednošću niţom od 4,6 u kiselo-koagulišuće (Jovanović i sar. 2000). Starost sireva je odreĊivana na osnovu ankete proizvoĊaĉa i svi sirevi starosti do 10 dana su svrstani u sireve bez zrenja, a sirevi ĉija je starost bila preko 10 dana u sireve sa zrenjem (Prilog 1 i 2.) 4.1.2. Mikroorganizmi U toku eksperimenta ispitivano je 168 primoizolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, izolovanih iz 555 uzorka sireva. Za dalja ispitivanja odabrano je 85 koagulaza pozitivnih stafilokoka iz uzoraka sireva proizvedenih od kuvanog ili nekuvanog mleka na osnovu sposobnosti da stvaraju hemolizine. Ispitivanjem biohemijskih osobina identifikovana su 45 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, a potom je kod 26 izolata, za koje je dokazano da stvaraju enterotoksine, ispitano prisustvo gena za sintezu enterotoksina. Kao referentni soj korišćeni su: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus aureus aureus CIP 67.8 koji stvara enterotoksin A i enterotoksin B. 50 Slika 4.1.1. Prikaz mesta iz kojih potiĉu ispitani uzorci mekih sireva sa pijaca 51 Slika 4.1.2. Pijace na teritoriji Beograda sa kojih su uzeti uzorci sireva za ispitivanje 4.1.3. Podloge U toku eksperimenta korišćene su sledeće mikrobiološke podloge: Podloge za izolaciju i odreĊivanje ukupnog broja mikroorganizama Mikrobiološke podloge, koje su korišćene tokom ispitivanja su pripremane iz praha komercijalnih hranljivih podloga. 52 4.1.3.1. Podloga za izolaciju i odreĊivanje koagulaza pozitivnih stafilokoka i Staphylococcus aureus Za izolacija i odreĊivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i Staphylococcus aureus korišćena je podloga po Baird-Parkeru. Sastav podloge po Baird Parkeru (LAB 85, Engleska) (g/l): Tripton 10.0 g Mesni ekstrakt 7,5 g Ekstrakt kvasca 1,0 g Glicin 12,0 g Natrijum piruvat 10,0 g Litijum hlorid (LiCl) 5,0 g Agar 20,0 g Podloga je pripremana tako što je 65,5 g praha rastvoreno u 1000 ml destilovane vode, a posle zagrevanja, podloga je sterilisana u autoklavu 15 minuta pri 121°C, krajnji pH je bio 6,8±0,2. U podlogu rashlaĊenu na oko 47°C je dodata suspenzija ţumanca jajeta (10 ml) i 1 ml 2% kalijum telurita na 100 ml podloge. 4.1.3.2. Podloga za odreĊivanje broja Lactococcus spp. Za odreĊivanje broja Lactococcus spp. korišćen je M-17 agar. Sastav M-17agara (Liofilchem, Italija) (g/l): Tripton 2,5 g Sojin pepton 5,0 g Ekstrakt mesa 5,0 g Laktoza 5,0 g Pepton 2,5 g Askorbinska kiselina 0,5 g Ekstrakt kvasca 2,5 g Magnezijum sulfat (MgSO4) 0,25 g Dinatrijum-β-glicerofosfat 19,0 g Agar 15,0 g 53 Podloga je pripremana tako što je 57,3 g praha rastvoreno u 1000 ml destilovane vode, potom je zagrevana da se otopi i sterilisana 15 minuta pri 121°C, krajnji pH je bio 7,2±0,2 pri 25°C. 4.1.3.3. Podloga za odreĊivanje broja Lactobacillus spp. Za odreĊivanje broja Lactobacillus spp. korišćen je M.R.S agar (De Man, Rogosa Sharpe agar). Sastav M.R.S agara (LAB, Engleska) (g/l): Pepton 10,0 g Ekstrakt mesa 8,0 g Ekstrakt kvasca 4,0 g D(+) glukoza 20,0 g Kalijum hidrogen fosfat (KH2PO4) 2,0 g Tween 80 1,0 g Diamonijumhidrogenacetat 2,0 g Natrijum acetat 5,0 g Magnezijum sulfat (MgSO4) 0,2 g Mangan sulfat (MnSO4) 0,004 g Agar 12,0 g Podloga je pripremana tako što je 70 g praha rastvoreno u 1000 ml destilovane vode. Podloga je zagrevana da se otopi i sterilisana 15 minut pri 121°C, krajnji pH je bio 6,4±0,2 pri 25°C. 4.1.3.4. Sredstvo za razblaţivanje i decimalna razblaţenja uzoraka sira Za pripremanje osnovnog i decimalnih razblaţenja korišćena je puferisana peptonska voda. Sastav puferisane peptonske vode (LAB, Engleska) (g/l): Produkt enzimskog razlaganja kazrina 10.0 g Natrijum hlorid (NaCl) 5,0g Dinatrijumhidrogenfosfat (anhidrat) 3,6 g Kalijumhidrogenfosfat 2,5 g 54 Podloga je pripremana tako što je 20,1 g praha rastvoreno u 1000 ml destilovane vode i ostavljeno da stoji 10 minuta, a potom je podloga sterilisana u autoklavu 15 minuta pri 121°C, krajnji pH bio je 7,0±0,2. 4.1.3.5. Podloga za umnoţavanje Staphylococcus aureus i ispitivanje sposobnosti izolata da stvaraju enterotoksine Za umnoţavanje Staphylococcus aureus i ispitivanje sposobnosti izolata da stvaraju enterotoksine korišćen je Brain Heart Infusion (BHI)-bujon (LAB, Engleska). Sastav BHIbujona (LAB, Engleska) (g/l): Moţdano srĉani infuz 17,5 g Triptoza 10,0 g Glukoza 2,0 g Natrijum hlorid (NaCl) 5,0 g Dinatrijumhidrogenfosfat 2,5 g Podloga je pripremana tako što je 37 g praha podloge rastvoreno u 1000 ml destilovane vode i ostavljeno da stoji 10 minuta, a potom uz mešanje podloga je blago zagrevana da se rastvori i razlivena u epruvete. Sterilizacija podloge vršena je u autoklavu 15 minuta pri 121°C, krajnji pH je bio 7,0±0,2. 4.1.3.6. Krvni agar za ispitivanje sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka da stvaraju hemolizine Za ispitivanje sposobnosti Staphylococcus aureus da stvara hemolizine korišćen je krvni agar, koji je pripreman od baze za krvni agar uz dodatak 8-10% ovĉije krvi. Sastav baze za krvni agar (Torlak) (g/l): Triptozni pepton 20,0 g Ekstrakt kvasca 3,0 g Natrijum hlorid (NaCl) 5,0 g 55 Agar 15,0 g Podloga je pripremana tako što je 43 g praha rastvoreno u 1000 ml destilovane vode, ostavljeno da da stoji 10 minuta, a zatim zagrevano do kljuĉanja da se potpuno rastvori. Sterilizacija podloge je vršena u autoklavu 15 minuta pri 121°C, krajnji pH je bio 7,2±0,2. 4.1.3.7. Podloga za ĉuvanje izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka i Staphylococcus aureus Izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka i Staphylococcus aureus su ĉuvani na kosom hranljivom agaru pri temperaturi 4°C. Sastav hranljivog agara (Torlak) (g/l): Pepton-1 15,0 g Ekstrakt mesa 3,0 g Natrijum hlorid (NaCl) 5,0 g Kalijum fosfat 0,3 g Agar 18,0 g Podloga je pripremana tako što je 41,3 g praha rastvoreno u 1000 ml destilovane vode, ostavljeno da stoji 10 minuta, a zatim zagrevano do kljuĉanja da se prah potpuno rastvori. Sterilizacija podloge je vršena u autoklavu 15 minuta pri 121°C, krajnji pH je bio 7,3. 4.1.3.8. Plazma kunića za koagulaza test Za kogulaza test je korišćena liofilizovana plazma kunića (Veterinarski zavod-Zemun i Himedia). Liofilizovana plazma rastvorena je u destilovanoj vodi (1:1), a potom je razblaţivana sa fiziološkim rastvorom u odnosu 1:4. 56 4.1.4. Testovi za identifikaciju koagulaza pozitivnih stafilokoka Identifikacija 45 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka iz sireva je vršena pomoću komercijalnih testova BBL Crystal Identifikacioni sistem (Gram-Positive ID Kit) i ID 32 STAPH - Identifikacioni sistem (BioMerieux, Francuska). 4.1.4.1. BBL Crystal Identifikacioni sistem (Gram-Positive ID Kit) Za identifikaciju 19 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka u toku prvog dela ispitivanja korišćen je sistem za identifikaciju (ID) gram-pozitivnih bakterija (GP). Komplet BBL Crystal Test GP ID se sastoji od: a) BBL Crystal GP ID poklopca za panele, b) BBL Crystal baza i c) BBL Crystal ANR, GP, RGP,N/HID epruveta za suspenyiju gram poyitivnih bakterija teĉnošću. Poklopac sadrţi 29 dehidriranih biohemijskih i enzimskih supstrata. Baza ima 30 reakcionih polja. Inokulum za ispitivanje je pripreman sa teĉnošću ya suspenyiju bakterija i njime je punjeno svih 30 reakcionih polja u bazi. U prvom reakcionom polju je bila negativna kontrola fluoroscencije (FCT), a preostalih 29 reakcionih polja je sadrţavalo sledeće supstrate: 4MU-β-D-glukozid (FGC), L-valin-AMC (FVA) L-fenilalanin-AMC (FPH), 4MU- α- D-glukozid (FGS), L-piroglutaminska kiselina-AMC (FPY), L-triptofan-AMC (FAR), 4MU-N-acetil-β-D-glukozamid (FGA), 4MU-fosfat (FHO), 4MU-β-D-glukoronid (FGN), L-izoleucin (FIS), treahaloza (TRE), laktoza (LAC), metil- α i β glukozid (MAB), saharoza (SUC), manitol (MNT), malotrioza (MTT), arabinoza (ARA), glicerol (GLR), fruktoza (FRU), p-n-p-β-D glukozid (BGL), p-n-p-β-D-celobiozid (PCE), prolin ileucin-p-nitroanilid (PLN), p-n-p-fosfat (PHO), p-n-p-α-D-maltoza (PAM), ONPG i p- n-p-α-D galaktozid (PGO), urea (URE), eskulin (ESC), arginin (ARG). 4.1.4.2. ID 32 STAPH -Identifikacioni sistem (BioMerieux, Francuska) Za identifikaciju 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka iz sireva, koji su stvarali enterotoksine, korišćen je ID 32 STAPH identifikacioni sistem (BioMerieux, Francuska), koji se sastoji od stripova sa 32 mikroepruvete, od kojih se 26 koriste u testu u kojima su dehidrovani supstrati: URE-urea, ADH-L-arginin, ODC-L-ornitin, ESC-eskulin, GLU-D-glukoza, FRU-D-fruktoza, MNE-D-manoza, MAL-D-maltoza, LAC-D-laktoza (goveĊeg porekla), TRE- D-trehaloza, MAN-D-manitol, RAF-D- 57 rafinoza, RIB-D-riboza, CEL-D-celobioza, NIT-kalijum nitrat, VP-natrijuum piruvat, βGAL-2-naftil-βD-galaktopirinozid, ArgA-L-arginin β-naftilamid, PAL-2-naftil fosfat, PyrA-piroglutaminska kiselina-β-naftil amid, NOVO-novobiocin, SAC-D-saharoza, NAG-N-acetil-glukozamin, TUR-D-turanoza, ARA-L-arabinoza, βGUR-4-nitrofenil- βD-glukuronid. Za prve tri mikrotube sa oznakama URE, ADH i ODC je bilo potrebno mineralno ulje. Za oθitavanje su korišδeni reagensi: VPA i VPB, NIT1 i NIT2 i FB reagensi. Suspenzija mikrooganizama za inokulaciju je pravljena u odnosu rastvor na 0,5 McFarland standard. 4.1.4.3. VIDAS Staphylococcal enterotoxin test SET 2, 30701 (BioMerieux, Francuska) ELFA tehnika VIDAS Staphylococcal enterotoxin test SET 2, 30701 (BioMerieux, Francuska) je automatizovani kvalitativni test, koji se koristi na VIDAS analajzeru za detekciju stafilokoknih enterotoksina (SEA, SEB, SEC, SED, SEE) u hrani. U toku ispitivanja korišćeni su stripovi (BioMerieux, Francuska) za ovaj test u kojima se nalazi standard, pozitivna i negativna kontrola, kojima je vršena kalibracija pre svakog ispitivanja. VIDAS Staphylococcal enterotoxin test SET2, 30701 (BioMerieux, Francuska) je korišćen za ispitivanje prisistva enterotoksina u 26 uzoraka sireva. U toku ispitivanje sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka da stavaraju eneterotoksine kao podloga je korišćen BHI bujon. 4.1.5. Reagensi i oprema za ekstrakciju enterotoksina stafilokoka iz sira Za dokazivanje entrotoksina stafilokoka u sirevima korišćeni su sledeći reagensi: 1. Dejonizovana voda; 2. 5N hlorovodoniĉna kiselina (HCl); 3. 5N rastvor natrijum hidroksida (NaOH); 4. PBS pufer (Phosphate Buffer Saline). Npr.: NaCl/Na2HPO4:145 mM/10 mM, pH 7,3 ± 0,2; 5. PolyEthylen Glycol 20000 (PEG); 6. Rastvor za ispiranje elektroda (npr: etanol 70%). Za ekstrakciju enterotoksina stafilokoka iz sireva korišćena je standardna laboratorijska oprema. Supernatant u toku ekstrakcije uzoraka dobijen je korišćenjem centrifuge 58 (3000-5000 obrtaja) i odgovarajućih kiveta (50 ml). Za koncentraciju uzoraka sireva bili su potrebni: dijalizna membrana (MWCO: 6.000 – 8.000 Daltona), zatvaraĉi za membranu, staklena vuna ili filter 4.1.6. Reagensi za ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina stafilokoka (SEA-SEE) U toku ispitivanja prisustva gena za sintezu enterotoksina stafilokoka kod 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, za koje je ELFA tehnikom dokazano da stvaraju enterotoksine korišćeni su sledeći reagensi: 1. MasterPure Complete DNA and RNA Purification kit (Tissue and Cell Lysis solution, MPC protein Precipitacion Reagent, TE buffer) - kit za izolaciju ukupnih nukleinskih kiselina, proizvoĊaĉ Epicentre, USA; 2. Proteinaza K (Merck, Nemaĉka); 3. Izopropanol (Aldrich, Nemaĉka); 4. Etanol 75% – (Sigma Aldrich, Nemaĉka); 5. Amplitaq Gold PCR Master Mix (2×) – kit za pripremu reakcione smeše, proizvoĊaĉ Invitrogen, USA; 6. SYBR Green MasterMix (2×) – kit za pripremu RealTimePCR reakcione smeše (Invitrogen, USA); 7. Agarozni gel u prahu– (Invitrogen, USA); 8. Etidijum bromid – (Sigma Aldrich, Nemaĉka); 9. Gel Loading Dye – marker za vizuelizaciju amplifikovanih sekvenci u elektroforetskom polju (Invitrogen, USA); 10. Set prajmera za ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina stafilokoka (SEA-SEE) (100 µM) (Invitrogen, USA). Spisak prajmera prikazan je u tabeli 4.1.6.1. 59 Tabela 4.1.6.1. Spisak prajmera korišćenih za ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina stafilokoka 4.2. Metode Uzorci sireva su ispitivani primenom standardnih fiziĉko-hemijskih, hemijskih, instrumentalnih i bakterioloških metoda. 4.2.1. Uzorkovanje sireva Uzorkovanja za mikrobiološka ispitivanja su vršena primenom tehnike aseptiĉnog uzorkovanja prema medjunarodnom standardu ISO 707:2008 (E) IDF 50:2008 (E). Uzorci su uzimani u koliĉini od oko 250 g pod aseptiĉnim uslovima u polietilenske kese, oznaĉavani i u ruĉnom friţideru pri 4 °C dostavljani u laboratoriju, gde su odmah zapoĉete analize. U istim uzorcima sireva su vršena fiziĉko-hemijska ispitivanja i hemijska ispitivanja. 4.2.2. FIZIĈKO-HEMIJSKE METODE 4.2.2.1. OdreĊivanje pH sira OdreĊivanje pH sira je vršeno potenciometrijski u rastvoru sira pripremljenom mešanjem jednakih koliĉina sira i destilovane vode (Carić i saradnici, 2000). Prajmer Target gen Duţina amplifikovane sekvence (bp) Sekvenca sea-f sea-r sea 93 5’-TCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAA-3’ 5’- GAAGATCCAACTCCTGAACAGTTACA -3’ seb-f seb-r seb 85 5’- AACAACTCGCCTTATGAAACGGGAT -3’ 5’- CTCCTGGTGCAGGCATCATGTCA -3’ sec-f sec-r sec 284 5’- CGTATTAGCAGAGAGCCAACCA - 3’ 5’- GTGAATTTACTCGCTTTGTGCAA -3’ sed-f sed-r sed 150 5’- AAACGTTAAAGCCAATGAAAACA -3’ 5’- TGATCTCCTGTACTTTTATTTTCTCCTA -3’ see-f see-r see 171 5’- TACCAATTAACTTGTGGATAGAC -3’ 5’- CTCTTTGCACCTTACCGC -3’ 60 Prethodno usitnjen sir u koliĉini od 10 g je izmešan u porcelanskoj posudi sa 10 ml destilovane vode i u tako pripremljenom uzorku je merena pH vrednost pH-metrom (Ex tech instruments) uz prethodnu kalibraciju standardnim rastvorima (pH 4,01 i 7,0). 4.2.2.2. OdreĊivanje aktivnosti vode (aw) Aktivnost vode merena je u uzorcima sireva pomoću aw-metra (aw-Wert-Messer, Lufft Durotherm, Stuttgart), koji radi na principu vlakna. Uzorci sira su homogenizovani i stavljani u donji deo instrumenta tako da bude prekriveno dno. Merenje je trajalo 4 h pri temeperaturi od 25°C. Za odreĊivanje aktivnosti vode u uzorcima sireva korišćen je i aw-metar (GBX Scientific Instrumewnts, FA-st/1 tastatura: Model MX 3700/ML 4700), koji radi na principu odreĊivanja taĉke rose. Homogenizovani uzorci su stavljani u plastiĉne posudice za jednokratnu upotrebu, tako da uzorak zauzme 3/4 zapremine posudice. Uzorak u otklopljenoj posudici je stavljan u leţište aparata, a potom je spuštena glava aparata u kome se nalazi komora u ĉijem gornjem delu se nalazi ogledalo. Optiĉki senzor je detektovao momenat u kome se na ogledalu pojavi kondenzat. Termokapl koji je dodat na ogledalo je merio i temperaturu u momentu pojave kondenza, a termofilni senzor je merio temperaturu uzorka. Temperatura ogledala u momentu pojave kondenza i temperatura uzorka odreĊivali su aktivnost vode. Instrument je ponavljao merenja temperature, dok se ne postigne ekvilibrijum. Pri postizanju ekvilibrijuma relativna vlaţnost vazduha u komori je identiĉna aktivnosti vode u uzorku. Rezultati merenja su dobijeni posle 3-5 minuta i oĉitavani na displeju aparata i štampani na traci. 4.2.2.3. OdreĊivanje sadrţaja natrijum hlorida (NaCl) u siru Za odreĊivanje sadrţaja natrijum hlorida (NaCl) u siru korišćena je titrimetrijska metoda (IDF/ISO/AOAC), koja se zasniva na razaranju organske supstance sira uz pomoć kalijum-permanganata (KMNO4) i kiseline (HNO3). Hloridni joni su odreĊivani titracijom sa 0,1 mol/l amonijum rodanidom ((NH4)2SCN). U erlenmajer sa odmerenim uzorkom sira u koliĉini od 2 g±0,001g, koji je prethodno usitnjen i homogenizovan je dodato 25 ml 0,1 mol/l rastvora srebro nitrata (AgNO3) i 25 ml conc HN03. Sadrţaj erlenmajera je zagrevan do kljuĉanja, potom je dodat 61 kalijumpermanganat (KMnO4). Postupak zagrevanja do kljuĉanja i dodavanje KMnO4 ponavljani su sve dok se reakciona smeša obezbojavala (oko 10-15 ml KMnO4). U trenutku kada je postignuta postojana tamna, smeĊa boja smeše dodata je glukoza da se smeša obezboji. Zatim je u erlenmajer dodato 100 ml destilovane vode i 5 ml indikatora gvoţĊe(III)-amonijum sulfata uz temeljno mešanje. Odmah potom, dok je rastvor topao višak AgNO3 titrovan je sa 0,1 mol/l (NH4)2SCN do pojave crveno-smeĊe boje (boja cigle), koja je postojana 30 sekundi (Carić i saradnici, 2000). Sadrţaj NaCl u siru izraĉunavan je po sledećoj formuli: m VV NaCl )(585,0 (%) 21   Gde je : V1-zapremina 0,1 mol/l rastvora srebro nitrata (AgNO3)-25 ml V2-zapremina 0,1 mol/l rastvora amonijum rodanida, koja je utrošena za titraciju (ml) m-masa uzorka sira 4.2.2.4. OdreĊivanje sadrţaja masti u siru Sadrţaj masti u siru odreĊivan je referentnom acidobutirometrijskom metodom u butirometru za sir po principu Schmidth-Bonzzmski-Ratzlaff-a. U ĉašicu butirometra za sir odmereno je 3 g homogenizovanog uzorka sira i ĉašica je vraćena u butirometar. Kroz gornji, uţi deo je sipano 10 ml sumporne kiseline (ρ=1,50-1,55 g/ml). Po zatvaranju butirometar je snaţno protresan i stavljan u vodeno kupatilo na 65°C. Uz postepeno mućkanje na svakih 15 minuta sve dok se sadrţaj potpuno ne rastvori. Potom je dodat 1 ml amil alkohola (ρ=0,815 g/ml) i iste H2SO4 do gornje crte na skali butirometra. Butirometri su stavljani u centrifugu po Gerberu i centrifugovanje je vršeno 10 minuta na 1100 obrtaja. Postupak centrifugovanja i drţanja u vodenom kupatilu 5 minuta na 65°C je ponavljan dva puta. Oĉitavanje rezulta odreĊivanja sadrţaja masti u masenim % je vršeno vizuelno na skali suţenog dela butirometra za sir u kojoj je bila izdvojena mast. 62 Sadrţaja masti u suvoj materiji sira je izraĉunat prema sledećem obrascu: 100 b a = sira materiji suvoju masti %  Gde je: - % masti u originalnoj materiji sira -% suve materije sira 4.2.2.5. OdreĊivanje suve materije sira Suva materija sira je odreĊivana metodom sušenja u sušnici pri 102±2°C. U aluminijumsku posudicu sa iţarenim kvarcnim peskom, koja je prethodno ohlaĊena i odmerena je izmereno oko 3 g sira sa taĉnošću ± 0.0001g. Posudica sa uzorkom je stavljana zajedno sa štapićem i otklopljenim poklopcem u zagrejanu sušnicu. Posle 2 h sušenja posudica je zaklopljena hlaĊena u eksikatoru, merena na analitiĉkoj vagi. Postupak sušenja ponavljan je u trajanju od 30 minuta, a hlaĊenje merenje i ponovno sušenje je ponavljano dok razlika izmeĊu dva poslednja merenja nije bila manja od 0,5 mg. Za izraĉunavanje sadrţaja suve materije korišćena je najniţa zabeleţena vrednost. Za izraĉunavanje sadrţaja suve materije korišćen je sledeći obrazac: 01 02 = SM(%) mm mm   Gde je: m0-masa aluminijumske posudice bez uzorka (g) m1-masa aluminijumske posudice sa uzorkom pre sušenja (g) m2-masa aluminijumske posudice sa uzorkom posle sušenja(g) 4.2.2.6. OdreĊivanje sadrţaja vode u siru Sadrţaj vode u siru izraĉunavan je raĉunskim putem pomoću obrasca: % H2O = 100 – SM(%) 4.2.2.7. OdreĊivanje sadrţaja vode u bezmasnoj materiji sira Sadrţaj vode u bezmasnoj materiji sira izraĉunavan je raĉunskim putem pomoću obrasca (Bylund, 1995): 63 % VBMS=% H2 O/ ( 100 – % MM ) x 100 Gde je: % VBMS- sadrţaj vode u bezmasnoj materiji sira % H2 O-sadrţaj vode u siru % MM- % masti u originalnoj materiji sira 4.2.3. Dokazivanje enterotoksina Da bi se utvrdila sposobnost primoizolata za sintezu enterotoksina stafilokoka korišćena je fluoroscentna imunoenzimska (ELFA) skrining metoda VIDAS SET2 (BioMerieux, Francuska). Izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka zasejavani su u BHI bujon, koji je inkubisan tokom 24 h pri 37°C. Prekonoćna bujonska kultura u kojoj je bilo rasta, termiĉki je inaktivisana tokom 15 min pri 95°C. Tokom termiĉke obrade dolazi do istovremene sterilizacije bujona, a ćelijski zidovi stafilokoka se raspadaju, što za posledicu ima znatno bolje vezivanje glikopolisaharidnih antigenih determinanti sa antistafilokoknim antitelima impregniranim u insuflacionim nastavcima. Inaktivisani bujon otpipetiran je u koliĉini od po 500µl u Vidas SET 2 strip. Tako pripremljen strip, postavljen je u Mini Vidas imunoenzimski analizator. Pre svakog ispitivanja vršena je kalibracija pomoću standarda enterotoksina, koji se nalaze u kitu. Rezultati su oĉitavani automatski na displeju aparata i štampani na traci. 4.2.4. Ispitivanje prisustva gena za sintezu enterotoksina kod izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva Nakon analize genoma koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva, koje su stvarale enterotoksine Staphylococcus aureus „BLAST― softverom za ispitivanje su izabrani sledeći geni: gen sea – koji kodira sintezu stafilokoknog enterotoksina A, seb – koji kodira sintezu stafilokoknog enterotoksina B, sec–koji kodira sintezu stafilokoknog enterotoksina C, gen sed–koji kodira sintezu stafilokoknog enterotoksina Di see – koji kodira sintezu stafilokoknog enterotoksina E. Softverskom analizom konstruisani su parovi prajmera koji se komplementarno veţu ispred i iza odgovarajuće sekvence odreĊenog gena. Prvog dana ispitivanja izolovane su ukupne nukleinske kiseline iz svih 26 ispitivanih primoizolata. U svaku od mini tubica 64 koje su sadrţavale precipitirane bakterijske ćelije dodato je po 0,3 ml Tissue and Cell rastvora i po 1 μl Proteinaze K koncentracije 50 μg/μl. Uzorci su potom postavljeni u vodeno kupatilo na temperaturu od 65°C u trajanju od 15 minuta. Nakon inkubiranja, uzorci su stavljeni na led u trajanju od 5 minuta, a zatim je u svaki uzorak dodato po 0,15 ml MPC Protein Precipitation reagensa. Uzorci su potom mešani na vibratoru za epruvete tokom 10 s. Nakon mešanja, uzorci su centrifugirani tokom 10 min pri 13.000 obrtaja/min. Dobijeni supernatant je pipetiran u nove minutube i u svaku je potom dodato po 0,5 ml izopropanola. Potom su nukleinske kiseline precipitirane centrifugiranjem tokom 10 minuta pri 13.000 obrtaja/min. Izopropanol je odliven, a precipitat je 2 puta ispran 75% etanolom, a potom je sav rezidualni etanol uklonjen. Dobijeni precipitat nukleinskih kiselina rastvoren je u 35 μl pufera za ĉuvanje DNK i stavljen u zamrzivaĉ na temperaturu od –30°C. Prisustvo gena za sintezu SE u dobijenim ekstraktima DNK ispitano je konvencionalnom multipleks PCR tehnikom (za gene sea i seb), odnosno tehnikom RealTime PCR (za gene sec, sed i see). Za gene ispitivane konvencionalnom multipleks PCR tehnikom pripremljena je posebna smeša ĉiji je sastav dat u Tabeli 4.2.4.1. Tabela 4.2.4.1. Sastav reakcione smeše za konvencionalni multipleks PCR Ukupni volumen smeše (μl) 25 Sastav i koncentracije komponenti: 2×Amplitaq Gold PCR Master Mix (μL) 12,5 SE gen-f (μL) 1,0 SE –r (μL) 1,0 Sterilna dd H2O (μL) 8,5 DNK ispitivanog uzorka 1,0 Program multipleks PCR reakcije prikazan je u tabeli 4.2.4.2. Tabela 4.2.4.2. Program za konvencionalni multipleks PCR Inicijalna denaturacija 95°C 5 min 30 ciklusa 95°C 30 s 55°C 30 s 72°C 60 s Finalna elongacija 72°C 7 min 65 Nakon amplifikacije, po 10 µl dobijenog amplifikata pomešano je sa 2 µl boje za elektroforezu i mešavina je pipetirana u bunarĉiće 2% agaroznog gela obojenog etidijum bromidom. Gel je stavljen u kadu i podvrgnut elektroforezi pri naponu od 120 V, jaĉini struje od 400 mA tokom 30 minuta. Nakon elektroforeze, gelovi su stavljeni na UV transiluminator radi vizuelizacije traka, nakon ĉega su snimljeni sistemom za fotografisanje gelova GelDoc (Eppendorf, Nemaĉka). Za gene ispitivane RealTime PCR tehnikom pripremljena je posebna smeša ĉiji je sastav dat u Tabeli 4.2.4.3. Tabela 4.2.4.3. Sastav reakcione smeše za za Real Time PCR Ukupni volumen smeše (μl) 25 Sastav i koncentracije komponenti: 2× SYBR Green MasterMix (μl) 12,5 SE gen-f (μl) 1,0 SE gen–r (μl) 1,0 Sterilna dd H2O (μl) 8,5 DNK ispitivanog uzorka 1,0 Program ispitivanja gena za sintezu enterotoksina Real Time PCR metodom dat je u tabeli 4.2.4.4. Tabela 4.2.4.4. Program za Real Time PCR Inicijalnadenaturacija 95°C 10 min 40 ciklusa 95°C 15 s 60°C(sva trigena) 30 s Ĉitanje ploĉe Nakon RealTime PCR reakcije oĉitane su Ct vrednosti sva tri ispitivana gena u svakom uzorku i uporeĊene sa Ct vrednosti referentnih SE-produkujućih sojeva Staphylococcus aureus. 66 4.2.5. Ispitivanje prisustva enterotoksina u sirevima Za dokazivanje prisutva enterotoksina u sirevima odabrano je 26 uzoraka sireva iz kojih su izolovane koagulaza pozitivne stafilokoke, koje su stvarale enterotoksin i ĉiji se broj kretao od 1,00 do 5,79 log cfu/g sira (Prilog 3 i 4). Protokol za ispitivanje prisustva enterotoksina stafilokoka u sirevima tekao je u 3 faze: I Ekstrakcija, II Koncentracija III Detekcija I Ekstrakcija: 1. Odvagano je 25 g sira (minimalna masa za ekstrakciju iznosi 12,5 g); 2. Dodato 40 ml dejonizovane vode, prethodno zagrejane na 38°C; 3. Uzorak je homogenizovan Ultraturaxom, blenderom ili Stomacherom; 4. Ostavljen pri sobnoj temperaturi 30 minuta kako bi toksini difundovali u slobodnu teĉnost; 5. Uzorak je zakišeljen 5N rastvorom HCl tako da finalna pH vrednost homogenizata bude u rasponu od 3,5-4,0; 6. Centrifugovan je pri 3000 g tokom 15 minuta pri sobnoj temperaturi; 7. Supernatant je prikupljen i izmeren njegov pH koji mora da se kreće u rasponu 3,5-4,5; 8. Mešavina je neutralizovana dodavanjem 5N NaOH tako da finalna pH vrednost uzorka bude u rasponu od 7,4-7,6; 9. Uzorak je centrifugiran pri 3000 g tokom 15 minuta pri sobnoj temperaturi; 10. Supernatant je prikupljen i prenet u novi sterilan sud. 67 II Koncentracija: 1. Pripremljno je 100 ml 30% rasvora polietilenglikola (PEG) (Mw=20.000); 2. Odrezano je 50 cm dijalizne membrane; 3. Dijalizna membrani je potapana u dejonizovanu voda tokom 30 minuta kako bi se rehidrirala; 4. Nakon rehidracije, jedan kraj dijalizne membrane je podvezan. 5. Na drugi kraj je stavljen levak i prenet prikupljeni supernatant iz taĉke I/10; 6. Zatvoren je i drugi kraj dijalizne membrane; 7. Napunjena dijalizna membrana je postavljena u rastvor PEG-a i ostavljena da se toksin koncentriše drţanjem pri 4°C tokom noći; 8. Nakon koncentrisanja, otvoren je jedan kraj membrane i dodat PBS, tako da finalna masa ekstrakta bude u rasponu od 5,0 do 5,5 g; 9. Ekstrakt je prenet u novi sterilni stakleni ili polipropilenski sud i ĉuvan pri 4°C max. 48 sati ili pri -18°C do poĉetka ispitivanja. III Detekcija: 1. Za detekciju je se korišćen VIDAS Staphylococcal enterotoxin test SET2, 30701 (BioMerieux, Francuska). VIDAS SET2 koristi ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) tehniku za direktnu simultanu detekciju sedam tipova enterotoksina (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED i SEE), koristeći monoklonska anti-stafilokokni enterotoksin antitela. Ovaj test je kvalitativan i semikvantitativan. Osetljivost testa VIDAS SET2 je manje od 0,5 ng/g za toksine A i B, manje od 1,0 ng/g za toksine C2 i E i blizu 1 ng/g za toksin D; 2. 500 μl je otpipetirano u Vidas SET2 strip. 3. Tako pripremljen uzorak postavljen je u aparat Mini Vidas. 4. Rezultati su oĉitavani direktno poreĊenjem dobijenih vrednosti sa standardom, što je i štampano. 68 4.2.6. Bakteriološke metode 4.2.6.1. Priprema osnovnog i decimalnih razblaţenja uzoraka sireva Priprema osnovnog i decimalnih razblaţenja uzoraka sireva je vršeno prema standardu ISO 8261:2001. Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination. 4.2.6.2. Izolacija i odreĊivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirevima OdreĊivanje broja koagulaza pozitivnih stafilokoka je vršeno prema standardu SRPS EN ISO 6888-2, Mikrobiologija hrane i hrane za ţivotinje-Horizontalnom metodom za odreĊivanje koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste)-Deo 1: Tehnika upotrebom agara po Baird-Parkeru. 4.2.6.3. Ispitivanje sposobnosti izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka da stvaraju hemolizine Ispitivanje sposobnosti da stvaraju hemolizine je vršeno zasejavanjem izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka na površinu krvnog agara, koji je inkubisan 24 h pri 37°C. Ploĉe su hlaĊene tokom 15-20 minuta na sobnoj temperaturi, kako bi se podstakao toplo- hladni efekat. Procena je vršena na sledeći naĉin: α hemoliza-potpuno prosvetljenje oko kolonija, β hemoliza-nepotpuno prosvetljenje oko kolonija, δ hemoliza-vrlo uska zona od oko 1 mm potpunog prosvetljenja oko kolonije, α+ β hemoliza potpuno i nepotpuno prosvetljenje oko kolonija 4.2.11.5. OdreĊivanje ukupnog broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u sirevima Ispitivanje je vršeno prema ISO 27205:2010 (IDF 149:10) standardu, odnosno ISO 20128:2005 (IDF 192:2006) standardu za Lactobacillus spp. OdreĊivanje ukupnog broja Lactococcus spp. vršeno je zasejavanjem 1 ml iz odgovarajućeg decimalnog razblaţenja (10-5,10-6i 10-7) u po 2 prazne Petri šolje za svako razblaţenje, a potom je uzorak prelivan M-17 agarom, koji je prethodno otopljen 69 i rashlaĊen na oko 45°C. Inkubacija zasejanih ploĉa je bila 24 h pri 30°C. Za brojanje su uzimane ploĉe iz dva susedna razblaţenja na kojim je izraslo 30-300 kolonija. OdreĊivanje ukupnog broja Lactobacillus spp. je vršeno zasejavanjem 1 ml iz odgovarajućeg decimalnog razblaţenja (104,10-5i 10-6) u po 2 prazne Petri šolje za svako razblaţenje, a potom je uzorak prelivan M.R.S.-agarom, koji je prethodno otopljen i rashlaĊen na oko 45°C. Zasejane ploĉe su inkubisane 48 h pri 37°C. Za brojanje su uzimane ploĉe iz dva susedna razblaţenja na kojim je izraslo 30-300 kolonija. Za izraĉunavanje ukupnog broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. korišćen je sledeća formula:  dnn c N )1,0( 21    Gde je: Σc-Zbir kolonija izbrojanih na svim podlogama odabranim za brojanje n1- broj Petri šolja odabranih u prvom razblaţenju n2- broj Petri šolja odabranih u drugom razblaţenju d- faktor prvog razblaţenja odabranog za brojanje 4.2.11.6. Identifikacija koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva Koagulaza pozitivne stafilokoke su identifikovane na osnovu ispitivanja makromorfoloških, mikromorfoloških i biohemijskih osobina. Po 5 tipiĉnih i atipiĉnih kolonija je presejano na kosi hranljivi agar, koji je inkubisan 24 h pri 37°C. Mikromorfološke osobine su ispitivane pravljenjem mikroskopskih preparata, koji su bojeni po Gramu i posmatrani pod imerzionim objektivom mikroskopa. Izolati su ispitani katalaza testom sa 3% vodonik peroksidom i da li stvaraju enzim koagulazu. Koagulaza test U epruvete je razlivano po 0,3-0,5 ml razblaţene plazme kunića u odnosu 1:4 sa fiziološkim rastvorom. U epruvete su zasejavani izolati i kontroni soj, inkubacija je vršena pri 37 °C, a rezultati su oĉitavani posle 2 h, 4 h, 6 h i 24 h. Identifikacija 19 izolata koagulaza pozitivnih stafiloka ispitivanjem biohemijskih osobina je vršena pomoću BBL Crystal Identifikacionim sistemom-BD. 70 BBL Crystal Identifikacioni sistem-BD, minimizovani metod identifikacije koristi modifikovane fluorogene i hromogene supstrate za identifikaciju aerobnih gram- pozitivnih mikroorganizama. Inokulum za ispitivanje je pripreman sa inokulacionom teĉnošću u koju je brisem preneseno 1-2 kolonije izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka sa krvnog agara, koji je prethodno inkubisan 24 h pri 37°C. Zamućenost inokuluma je bila jednaka 0,5 McFarland standardu. Inolulumom je punjeno svih 30 reakcionih polja u bazi. Kada se poklopac izravna sa bazom i ĉvrsto zatvori, inokulum za ispitivanje je rehidrirao isušene supstrate i pokretao test reakcije. Posle inkubacie panela 18-24 h pri 37°C ispitano je da li su u reakcionim poljima prisutne promene u boji ili fluorescencija kao posledica metaboliĉkih aktivnosti mikroorganizama. Enzimska hidroliza fluorogenih supstrata koji sadrţe kumarinske derivative 4-metilumbeliferona (4MU) ili 7-amino-4- metilkumarina (7-AMC) dovodi do povećane fluorescencije koja se lako moţe videti pomoću ultraljubiĉaste lampe. Hromogeni supstrati hidrolizom stvaraju vidljive promene u boji. Oĉitavanje promene boje je vršeno vizuelno pomoću vidljivog (belog) svetla (kolone E do J) i ultraljubiĉastog svetla i UV lempe (386 nm) (kolone A do D). Obrazac koji nastaje kao posledica 29 reakcija se prebacuje u desetocifreni broj profila koji se koristi kao osnova za identifikaciju. Obrasci biohemijskih i enzimskih reakcija za 29 BBL Crystal RGP ID supstrata se ĉuvaju u BBL Crystal RGP ID bazi podataka. Identifikacija je izvoĊena iz komparativne analize šifre reakcija test izolata i šema koje se ĉuvaju u bazi podataka. Za fenotipsku identifikaciju 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, koji su stvarali enterotoksine i koji su bili nosioci gena za sintezu enterotoksina korišćen je ID 32 STAPH (BioMerieux, Francuska). Slika 4.2.11.6. Kit ID 32 STAPH (BioMerieux, Francuska). 71 Inokulum sa izolatima koagulaza pozitivnih stafilokoka pripreman je u API inokulacionom medijumu (3 ml) u koju je prenet izolat sa krvnog agara prethodno inkubisan 24 h pri 37°C, tako da zamućenje bude jednako standardu 0.5 McFarlanda. Posle homogenizacije, inokulacioni medijum sa izolatom koagulaza pozitivnih stafilokoka je u koliĉini od po 55 µl pipetiran u mikrotube na stripu. Otvori mikrotuba sa testovima URE, ADH i ODC prekrivani su sa po 2 kapi mineralnog ulja. Po stavljanju poklopca, strip je inkubiran tokom 24 h pri 37°C. Oĉitavanje je vršeno vizuelno pomoću tabele za oĉitavanje. Testovi NIT, VP, od â-GAL do PYRA oĉitavani su posle ukapavanja reagenasa NIT 1 i NIT 2, VPA i VPB, odnosno FB reagenasa u roku od 5 minuta. Identifikacija je vršena formiranjem numeriĉkog profila-broj sa 9 cifara, koji je unošen u API WEB identifikacioni softver. 72 5. REZULTATI 5.1. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevimа a. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka u mekim sirevimа U cilju sagledavanja problematike procene rizika od stvaranja enterotoksina u mekim sirevima bez zrenja ispitani su sirevi, koji se proizvode razliĉitim tehnologijama u individualnim domaćinstvima sa više podruĉja u Srbiji, a iznose na trţište u Beogradu. Ispitivanjem su obuhvaćeni sirevi, koji se proizvode od kuvanog ili nekuvanog mleka, razliĉite starosti, a podeljeni su u 2 grupe na osnovu pH vrednosti. Grupu kiselo- koagulišućih sireva ĉinili su sirevi razliĉite starosti u kojima je izmerena pH vrednost bila 4,6 i niţa, dok su grupu slatko-koagulišućih sireva ĉinili sirevi, ĉija je vrednost pH bila viša od 4,6. Budući da je za stvaranje dovoljne koliĉine enterotoksina (najmanje 1 μg), koja moţe da izazove alimentarne intoksikacije potrebno da u siru bude više od 105 cfu/g koagulaza pozitivnih stafilokoka, ispitan je nalaz i nivo kontaminacije sireva ovim mikroorganizmom. Rezultati ispitivanja nalaza koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirevima prikazani su u Tabeli 5.1.1. Tabela 5.1.1. Nalaz koagulaza pozitivnih stafilokoka u mekim sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka Vrsta sira Broj Uzoraka (n) Dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke Sirevi od kuvanog mleka Sirevi od nekuvanog mleka Ukupno Broj % Broj % Broj % Kiselo-koagulišući 166 2 1,20 37 22,29 39 23,49 Slatko-koagulišući 389 26 6,68 103 26,48 129 33,16 Ukupno 555 28 5,05 140 25,23 168 30,27 Od ukupno 555 uzoraka sireva, razliĉite starosti, koji su proizvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka, koagulaza pozitivne stafilokoke su dokazane u 168 (30,27%) uzoraka sireva. Od 168 uzoraka sireva u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, 73 140 (83,33%) uzoraka sira proizvedeno je od nekuvanog mleka, a 28 (16,67%) uzoraka sireva proizvedeno je od kuvanog mleka. Najveći broj uzoraka sireva u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke je pripadao grupi slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka (n=103), a zatim grupi kiselo-koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka (n=37), grupi slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od kuvanog mleka (n=26), a najmanje grupi kiselo-koagulišućih sireva proizvedenih od kuvanog mleka (n=2). Rezultati ispitivanja nivoa kontaminacije koagulaza pozitivnih stafilokoka u slatko- koagulišućim i kiselo-koagulišućim sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka su prikazani u Tabeli 5.1.2. Tabeli 5.1.2. Nivoi kontaminacije mekih sireva koagulaza pozitivnim stafilokokama Slatko-koagulišući sirevi Kiselo-koagulišući sirevi Nivoi kontami- nacije Broj uzoraka (n) Od kuvanog mleka Od nekuvanog mleka Broj uzoraka (n) Od kuvanog mleka Od nekuvanog mleka n % n % n % n % ≤ 2 log cfu/g 12 4 33,33 8 66,66 11 1 0,09 10 99,91 2-4 log cfu/g 63 12 19,05 51 80,95 18 1 0,06 17 99,04 > 4 log cfu/g 54 10 18,52 44 81,48 10 0 0 10 100 Ukupno 129 26 20,15 103 79,84 39 2 0,05 37 99,05 Iz prikazanih rezultata se vidi da je od 168 uzoraka sira, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, bilo 129 uzoraka slatko-koagulišućeg sireva i 39 uzoraka kiselo-koagulišućeg sira. Kontaminacija od 2 log cfu/g i manje dokazana je u 12 uzoraka slatko-koagulišućih sireva od kojih je 4 (33,33%) uzoraka proizvedena od kuvanog mleka i 8 (66,66%) uzoraka od nekuvanog mleka. U 11 uzorka kiselo- koagulišućih sireva konataminacija je bila ≤ 2 log cfu/g i to u 1 (0,09%) uzorku proizvedenom od kuvanog mleka i u 10 (99,91%) uzoraka od nekuvanog mleka. U najvećem broju uzoraka sireva kontaminacija koagulaza pozitivnim stafilokokama se kretala od 2-4 log cfu/g i to u 63 uzoraka slatko-koagulušućih sireva od kojih je 51 (80,95%) uzorak sira bio proizveden od nekuvanog mleka i 12 (19,05%) uzoraka od 74 kuvanog mleka. U 18 uzoraka kiselo-koagulišućih sireva kontaminacija koagulaza pozitivnim stafilokokama se kretala od 2-4 log cfu/g i to u 17 (99,04%) uzoraka proizvedena od nekuvanog mleka i jednom (0,06%) uzorku od kuvanog mleka. Najveći nivo kontaminacije, preko 4 log cfu/g je dokazan u 54 uzorka slatko-koagulišućeg sira od kojih je najveći broj (n=44) pripadao grupi sireva proizvedenih od nekuvanog mleka, a 10 uzoraka je bilo proizvedeno od kuvanog mleka. Kod 10 uzoraka kiselo- koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka je utvrĊena konatminacija koagulaza pozitivnim stafilokokama više od 4 log cfu/g, a ni u jednom uzorku kiselo- koaguĉišućeg sira proizvedeng od kuvanog mleka nije dokazano više od 4 log cfu/g. Rezultati nalaza koagulaza pozitivnih stafilokoka u zavisnosti od straosti mekih sireva, odnosno da li su sirevi bez zrenja ili sa zrenjem, proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka su prikazani u Tabeli 5.1.3. Tabela 5.1.3. Nalaz koagulaza pozitivnih stafilokoka u mekim sirevima bez zrenja i sa zrenjem proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka Vrsta sira Broj uzoraka (n) Dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke Meki sirevi bez zrenja Meki sirevi sa zrenjem Broj % Broj % Kiselo-koagulišući 39 36 92,31 3 7,69 Slatko-koagulišući 129 121 93,80 8 6,20 Ukupno 168 157 93,45 11 6,55 Iz prikazanih rezultata se zapaţa da je najveći broj uzoraka sireva 157 (93,45%) u kojima su dokazane kogulatza pozitivne stafilokoke bio iz grupe mekih sireva bez zrenja. Od 129 uzoraka slatko koagulišućih mekih sireva bez zrenja u 121 (93,80%) dokazane su koagulaza pozitivne stafilokoke i 36 (92,31%) uzoraka kiselo-koagulišućih sireva. Koagulaza pozitivne stafilokoke su dokazane u 11 (6,55%) uzoraka mekih sireva sa zrenjem, od kojih su 8 (6,20%) uzoraka bili slatko-koagulišući, a 3 (7,69%) uzorka kiselo-koagulišuća sira. 75 b. Rezultati odreĊivanja broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevimа proizvedenim od kuvаnog i nekuvаnog mlekа Rezultati odreĊivanja broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u slatko- koagulišućim sirevima bez zrenja i sa zrenjam proizvedenim od kuvanog mleka i nekuvanog mleka su prikazani u Tabeli 5.1.4. Tabeli 5.1.4. Nalaz Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u slatko-koagulišućim sirevima bez zrenja i sa zrenjem proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka Vrsta sira Vrsta mikroorganizma Od kuvanog mleka Od nekuvanog mleka n ±SD (log cfu/g) n ±SD (log cfu/g) Sir bez zrenja Lactococcus spp.. 21 8,26±0,54 42 8,32±0,56 Lactobacillus spp. 21 6,58±0,95 42 6,50±1,06 Sir sa zrenjem Lactococcus spp.. 2 8,07±0,49 1 8,28 Lactobacillus spp. 2 6,59±0,61 1 6,96 Iz prikazanih rezultata se vidi da je srednja vrednost broja Lactococcus spp. u uzorcima slatko-koagulišućih sireva bez zrenja proizvedenim od kuvanog mleka bila 8,26 log cfu/g, a u uzorcima sireva proizvedenim od nekuvanog mleka neznatno viša 8,32 log cfu/g. Srednja vrednost broja Lactobacillus spp. u uzorcima slatko-koagulišućih sireva bez zrenja, koji su proizvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka je bila pribliţno ista, iznosila je 6,58, odnosno 6,50 log cfu/g. Srednja vrednost broja Lactococcus spp. u uzorcima slatko-koagulišućih sireva sa zrenjem, proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka je bila neznatno niţa u odnosu na vrednosti u sirevima bez zrenja. Srednja vrednost broja Lactococcus spp. u slatko-koagulišućim sirevima sa zrenjem proizvedenim od kuvanog mleka je bila 8,07 log cfu/g i 8,28 log cfu/g u siru sa zrenjem proizvedenom od kuvanog mleka. Srednja vrednost broja Lactobacillus spp. u slatko- koagulišućim sirevima sa zrenjem proizvedenim od kuvanog mleka je bila 6,59 log cfu/g, a u uzorku sira sa zrenjem od nekuvanog mleka 6,96 log cfu/g. 76 Rezultati odreĊivanja broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u uzorcima kiselo- koagulišućih sireva bez zrenja, koji su proizvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka prikazani su u Tabeli 5.1.5. Tabela 5.1.5 Nalaz Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u kiselo-koagulišućim sirevima bez zrenja proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka Vrsta sira Vrsta mikroorganizma Od kuvanog mleka Od nekuvanog mleka n ±SD (log cfu/g) n ±SD (log cfu/g) Sir bez zrenja Lactococcus spp.. 1 7,68 18 8,50±0,55 Lactobacillus spp. 1 6,07 18 6,99±0,74 Iz prikazanih rezultata se vidi da je srednja vrednost broja Lactococcus spp. u uzorku kiselo-koagulišućeg sira bez zrenja, koji je proizveden od kuvanog mleka bila 7,68 log cfu/g, a u sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka bila je 8,50 log cfu/g. Broj Lactobacillus spp. u uzorku kiselo-koagulišućeg sira proizvedenog od kuvanog mleka je bio 6,07 log cfu/g, a u uzorcima od nekuvanog mleka 6,99 log cfu/g. U toku ispitivanja nisu obuhvaćeni uzorci kiselo-koagulišućih sireva sa zrenjem, koji su proizvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka. Rezultati odreĊivanja broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevima proizveenim od nekuvanog i kuvanog mleka su prikazani u Tabeli 5.1.6. Tabela 5.1.6. Nalaz Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevima proizvedenim od nekuvanog i kuvanog mleka Vrsta sira Sir proizveden od Broj uzoraka (n) Lactococcus spp. ±SD (log cfu/g) Lactobacillus spp. ±SD (log cfu/g) Slatko-koagulišući nekuvanog mleka 103 8,35±0,49 6,30±1,09 kuvanog mleka 26 8,25±0,53 6,58±0,91 Kiselo-koagulišući nekuvanog mleka 37 8,41±0,57 6,88±0,76 kuvanog mleka 2 7,68 6,07 77 Iz prikazanih rezultata se vidi da je broj Lactococcus spp. bio pribliţno isti u slatko- koagulišućim i kiselo-koagulišućim sirevima proizvedenim od nekuvanog i kuvanog mleka i srednja vrednost broja ovog mikroorganizma iznosila je 8,35 log cfu/g, odnosno 8,41 log cfu/g. Srednja vrednost broja Lactococcus spp. u uzorcima slatko-koagulišućeg sira proizvedenim od kuvanog mleka je bila 8,25, a u uzorcima kiselo-koagulišućeg sira od kuvanog mleka je bila manja i iznosila je 7,68 log cfu/g. Srednja vrednost broja Lactobacillus spp. u slatko-koagulišućim i kiselo-koagulišućim sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka je dostizala 6 logaritamskih jedinica. Srednja vrednost broja Lactobacillus spp. u uzorcima slatko-koagulišućih sireva proizvedenog od nekuvanog i kuvanog mleka je bila pribliţno ista i iznosila je 6,30 log cfu/g, odnosno 6,58 log cfu/g. U uzorcima kiselo-koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka srednja vrednost broja Lactobacillus spp. je bila 6,88 log cfu/g. Najmanji broj Lactobacillus spp. je utvrĊen u uzorcima kiselo-koagulišućeg sira proizvedenog od kuvanog mleka u kojima je srednja vrednost broja bila 6,07 log cfu/g. 5.2. Rezultati odreĊivanja fiziĉko-hemijskih pаrаmetara (pH, sаdrţаj NaCl, mаsti, suve mаterije i аktivnost vode) u sirevimа proizvedenim od kuvаnog i nekuvаnog mlekа U drugom delu ispitivanja odreĊeni su fiziĉko-hemijski parametri u uzorcima sireva kod kojih je dokazano prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka, razliĉite starosti uzetih na 16 pijaca, koji su proizvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka. Rezultati odreĊivanja fiziĉko-hemijskih parametara (pH, aw, sadrţaj NaCl), u mekim sirevima proizvedenim od nekuvanog i kuvanog mleka prikazani su u Tabeli 5.2.1. 78 Tabela 5.2.1. Fiziĉko-hemijski parametri u mekim sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka Parametar Sir od nekuvanog mleka Sir od kuvanog mleka n ±SD Xmin Xmax n ±SD Xmin Xmax mast u SM (%) 79 57,05±10,21 25,29 76,84 4 42,63±17,68 16,47 55,25 voda u BM (%) 79 79,55±4,86 67,89 88,72 4 71,95±4,46 67,63 76,54 pH 140 5,06±0,63 4,10 6,94 28 5,35±0,49 4,50 6,25 aw 61 0,95±0,01 0,92 0,98 24 0,95±0,02 0,87 0,98 NaCl (%) 61 1,08±0,68 <0,01 3,04 24 1,14±0,79 <0,01 3,48 Iz prikazanih rezultata se vidi da se sadrţaj masti u suvoj materiji mekih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka kretao od 25,29 do 76,84% (srednja vrednost 57,05±10,21). U uzorcima mekih sireva proizvedenih od kuvanog mleka sadrţaj masti je bio niţi i kreatao se od 16,47% do 55,25% (srednja vrednost 42,63±17,68). Sadrţaj vode u bezmasnoj materiji u uzorcima mekih sireva, proizvedenih od nekuvanog mleka, kretao se od 67,89 do 88,72% (srednja vrednost 79,55±4,86). Sadrţaj vode u bezmasnoj materiji u uzorcima mekih sireva proizvedenih od kuvanog mleka kretao se od 67,63 do 76,54 (srednja vrednost 71,95±4,46). Izmerena pH vrednost u uzorcima mekih sireva od nekuvanog mleka se kretala od 2,10 do 6,94 (srednja vrednost 5,06±0,63), dok je u uzorcima mekih sireva proizvedenih od kuvanog mleka bila od 4,50 do 6,25 (srednja vrednost 5,35±0,49). Vrednost za aktivnost vode u uzorcima mekih sireva proizvedenih od kuvanog mleka je bila od 0,92 do 0,98 (srednja vrednost 0,95±0,01), dok se u uzorcima mekih sireva proizvedenih od kuvanog mleka kretala od 0,87 do 0,98 (srednja vrednost 0,95±0,02). Sadrţaj NaCl u ispitanim uzorcima mekih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka se kretao od 0,01 do 3,04% (srednja vrednost 1,08±0,68) a u uzorcima sireva proizvedenih od kuvanog mleka kretala se od 0,01 do 3,48% (srednja vrednost 1,14±0,79). Rezultati odrĊivanja fiziĉko-hemijskih parametara u uzorcima mekih sireva bez zrenja i sa zrenjem su prikazani u Tabeli 5.2.2. 79 Tabela 5.2.2. Fiziĉko-hemijski parametri u mekim sirevima bez zrenja i sa zrenjem Parametar Sir bez zrenja Sir sa zrenjem n ±SD Xmin Xmax n ±SD Xmin Xmax mast u SM (%) 76 55,85±11,03 16,47 76,84 7 61,33±9,43 48,42 74,05 voda u BM (%) 76 79,37±4,99 67,63 88,72 7 77,41±6,22 70,67 88,42 pH 156 5,12±0,63 4,10 6,94 12 4,88±0,31 4,39 5,50 aw 80 0,95±0.02 0,87 0,98 5 0,94±0,02 0,91 0,96 NaCl (%) 80 1,06±0,67 <0,01 3,04 5 1,74±1,06 0,73 3,48 Iz prikazanih rezultata se moţe videti da se sadrţaj masti u suvoj materiji mekih sireva bez zrenja kretao od 16,47 do 76,84% (srednja vrednost 55,85±11,03). Neznatno viša vrednost za isti parametar je dokazana u uzorcima sireva sa zrenjem u kojima se sadrţaj masti u suvoj materiji kretao od 48,42 do 74,05% (srednja vrednost 61,33±9,43). Sadrţaj vode u bezmasnoj materiji u uzorcima mekih sireva bez zrenja kretao se od 67,63 do 88,72% (srednja vrednost 79,37±4,99), a u uzorcima sireva sa zrenjem od 70,67 do 88,42% (srednja vrednost 77,41±6,22). Izmerena pH vrednost u uzorcima mekih sireva bez zrenja se kretala od 4,10 do 6,94 (srednja vrednost 5,12±0,63), dok je u uzorcima mekih sireva sa zrenjem bila u rasponu od 4,39 do 5,50 (srednja vrednost 4,88±0,31). Vrednost za aktivnost vode u mekim sirevima bez zrenja se kretala od 0,87 do 0,98 (srednja vrednost 0,95±0.02). Isti parametar u uzorcima mekih sireva sa zrenjem se kretao od 0,91 do 0,96 (srednja vrednost 0,94±0,02). Sadrţaj NaCl u uzorcima mekih sireva bez zrenja se kretao od 0,01 do 3,04% (srednja vrednost 1,06±0,67), a u sirevima sa zrenjem od 0,73 do 3,48% (srednja vrednost 1,74±1,06) Rezultati odreĊivanja fiziĉko-hemijskih parametara u slatko-koagulišućim sirevima su prikazani u Tabeli 5.2.3. 80 Tabela 5.2.3. Fiziĉko-hemijski parametri u slatko-koagulišućim i kiselo-koagulišućim sirevima Parametar Slatko-koagulišući sir Kiselo-koagulišući sir n ±SD Xmin Xmax N ±SD Xmin Xmax mast u SM (%) 64 55,70±11,79 16,47 76,84 19 58,36±7,42 43,72 69,86 voda u BM (%) 64 77,98±4,58 67,63 88,42 19 83,23±4,56 70,67 88,72 pH 130 5,32±0,54 4,61 6,94 38 4,39±0,14 4,10 4,60 aw 66 0,95±0,02 0,87 0,98 19 0,95±0,02 0,92 0,97 NaCl (%) 66 1,16±0,67 <0,01 3,48 19 0,87±0,80 <0,01 3,04 Iz prikazanih rezultata se vidi da se sadrţaj masti u suvoj materiji slatko-koagulišućih sireva kretao od 16,47 do 76,84% (srednja vrednost 55,70±11,79), a u uzorcima kiselo- koagulišućih sirevia od 43,72 do 69,86% (srednja vrednost 58,36±7,42). Sadrţaj vode u bezmasnoj materiji u uzorcima slatko-koagulišućih sireva je bila u rasponu od 67,63 do 88,42% (srednja vrednost 77,98±4,58), a u kiselo-koagulišućim sirevima od 70,67 do 88,72% (srednja vrednost 83,23±4,56). Izmerena pH vrednost u uzorcima slatko- koagulišućih sireva se kretala od 4,61 do 6,94 (srednja vrednost 5,32±0,54), a u kiselo- koagulišućim od 4,10 do 4,60 (srednja vrednost 4,39±0,14). Vrednost za aktivnost vode u uzorcima slatko-koagulišućih sireva je bila od 0,87 do 0,98 (srednja vrednost 0,95±0,02), a u kiselo-koagulišućim od 0,92 do 0,97 (srednja vrednost 0,95±0,02). SadrĊaj NaCl u uzorcima slatko-koagulišućih sireva se kretao od <0,01 do 3,48% (srednja vrednost 1,16±0,67), dok je u kiselo-koagulišućim sirevima najviša vrednost bila 3,04%, a najniţa manje od 0,01% (srednja vrednost 0,87). * * * Statistiĉki parametri broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, Lactococcus spp., Lactobacillus spp. i fiziĉko-hemijski parametri (pH, aktivnost vode i sadrĊaj NaCl) u sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka prikazani su u Tabeli 5.2.4. 81 Tabela 5.2.4. Statistiĉki parametri broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, Lactococus spp, Lactobacillus spp. i fiziĉko-hemijski parametri (pH, aktivnost vode i sadrţaj NaCl) u mekom siru Parametri Statistiĉki parametri n ±SD (log cfu/g) Xmin Xmax Cv(%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) 168 3,60±1,19 1,00 5,79 33,27 Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) 168 8,33±0.55 7,02 9,80 6,58 Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 168 6,62±0,95 4,00 9,19 14,43 pH 168 4,98±0,50 4,30 6,25 10,16 aw 85 0,95±0,02 0,82 0,977 2,42 Sadrţaj NaCl (%) 85 1,10±0,71 <0,01 3,48 64,31 Iz prikazanih rezultata se vidi da se broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u uzorcima sireva proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka kretao od 1 do 5,79 log cfu/g (srednja vrednost 3,60±1,19 log cfu/g), a da je koeficejent varijacije bio 33,27%. Broj Lactococcus spp. u istim uzorcima se kretao od 7,02 do 9,80 log cfu/g sira (srednja vrednost 8,33±0.55) sakoeficijentom varijacije od 6,58%. Broj Lactobacillus spp. se kretao u rasponu od 6 do 9,19 log cfu/g (srednja vrednost 6,62±0,95) sa koeficijentom varijacije od 14,43%. Izmerena pH vrednost u sirevima se kretala od 4,30 do 6,25 (srednja vrednost 4,98) sa koeficijentom varijacije od 10,16%. Vrednost za aktivnost vode u ispitanim uzorcima mekih sireva proizvedenim od nekuvanog i kuvanog mleka se kretala od 0,82 do 0,977 (srednja vrednist 0,95±0,02) sa koeficijentom varijacije od 2,42%. Sadrţaj NaCl se kretao od 0,01 do 3,48 (srednja vrednost 1,10±0,71) sa koeficijentom varijacije od 64,31%. 82 5.3. Rezultati identifikacije odabranih izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva 5.3.1. Rezultati ispitivanja sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva da stavaraju hemolizu U identifikaciji koagulaza pozitivnih stafilokoka korišćeno je ispitivanje sposobnosti izolata da stvaraju hemolizu. Ispitano je 102 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz sireva razliĉite starosti proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka. Rezultati ispitivanja hemolize na krvnom agaru prikazani su u Tabeli 5.3.1. Tabela 5.3.1. Rezultati ispitivanja odabranih izolata koagulaza pozitivnih stafilokokada stvaraju hemolizine na krvnom agaru Vrsta hemolize Broj izolata % α 5 4,90 β 52 50,98 δ 3 2,94 α + β 23 22.55 δ+ β 3 2,94 Odsustvo hemolize 16 15,69 Ukupno 102 100 Iz prikazanih rezultata moţe se videti da je od 102 izolata najveći broj koagulaza pozitivnih stafilokoka iz sireva proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka na krvnom agaru davao β hemolizu (50,98%), zatim α + β hemolizu (22,55%), α hemolizu (4,90%), a najmanji broj izolata δ (2,94% ) i δ+ β (2,94% ). Odsustvo hemolize je zapaţeno kod 15,69% izolata. 5.3.2. Rezultati biohemijske identifikacije odabranih izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva proizvedenih od kuvanog i nekuvanog mleka Na osnovu karakteristiĉnih makromorfoloških osobina, mikromorfoloških osobina, katalaza testa, hemolize, koagulza testa i broja stafilokoka u siru od 76 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz 83 uzorka sira odabrano je 18 izolata u 83 toku prvog dela ispitivanja, koji su ispitani BBL Crystal Identifikacionim sistemom-BD. Rezultati tih ispitivanja prikazani su u tabeli 5.3.2.1. Tabela 5.3.2.1. Rezultati identifikacije izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka do vrsteprimenom BBL Crystal Identifikacioni sistema-BD Vrsta stafilokoka Broj izolata % Staphylococcus aureus 17 94,44 S. cochnii ssp.cohnii 1 5,56 Ukupno 18 100 Rezultati prikazani u tabeli 5.3.2.1. pokazuju da je od 18 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka iz uzoraka sireva identifikovano kao Staphylococcus spp., najĉešće kao S. aureus (94,44% izolata), zatim S. cochnii ssp.cohnii ( 5,56% ). 5.4. Rezultati ispitivanja sposobnosti koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva da stvaraju enterotoksine Za ispitivanje sposobnosti tvaranja enterotoksina odabrano je 85 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz sireva razliĉite starosti. Nalaz koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine u mekim sirevima bez zrenja proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka dat je u Tabeli 5.4.1. Tabela 5.4.1. Nalaz koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine u mekim sirevima bez zrenja proizvedenim od kuvanog ili nekuvanog mleka Vrsta sira Broj uzoraka sira Dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, koje stvaraju enterotoksine u uzorcima sira Kuvano mleko Nekuvano mleko Broj % Broj % Kiselo-koagulišući 19 1 5,26 5 26,32 Slatko-koagulišući 66 5 7,58 15 22,73 Ukupno 85 6 7,06 20 23,53 Primenom skrining metoda VIDAS SET2 (BioMerieux, Francuska) dokazano je da od 85 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka 26 (30,59%) izolata stvaralo enterotoksine. 84 Od ukupno 85 ispitanih uzoraka sira razliĉite starosti, koji su proizvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka 19 uzoraka sireva su bili kiselo-koagulišući, a 66 uzoraka sireva su bili slatko-koagulišući. Koagulaza pozitivne stafilokoke, koje su stvarale enterotoksine su najĉešće izolovane iz uzoraka slatko-koagulišućih sireva, 15 (22,73%) uzoraka slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka i 5 (7,58%) uzoraka slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od kuvanog mleka. U 5 (26,32%) uzoraka kiselo-koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka i jednom uzorku (5,26%) kiselo-koagulišućeg sira od kuvanog mleka dokazane su koagulaza pozitivne stafilokoke sa sposobnošću da stvaraju enterotoksine (Tabela 5.4.1.). Tabela 5.4.2. Poreklo izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine u mekim sirevima bez zrenja Vrsta sira Broj uzoraka Poreklo koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje stvaraju enterotoksine Kuvano mleko Nekuvano mleko Broj % Broj % Kiselo-koagulišući 6 1 16,67 5 83,33 Slatko-koagulišući 20 5 20,00 15 80,00 Ukupno 26 6 23,08 20 76,92 Od 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, koji su stvarali enterotoksine, 20 (76,92%) izolata je bilo poreklom iz sireva proizvedenih od nekuvanog mleka, dok je 6 (23,08%) izolata bilo poreklom iz sireva proizvedenih od kuvanog mleka. Od 20 uzoraka slatko-koagulišućih sireva u 15 (80%) uzoraka proizvedenog od nekuvanog mleka i 5 (20%) uzoraka proizvedenog od kuvanog mleka dokazano je prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka koje stvaraju enterotoksine. Od 6 uzoraka kiselokoagulišućih sireva, prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka koje stvaraju enterotoksine dokazano je u 5 (83,33%) uzoraka proizvedenih od nekuvanog mleka i 1 (16,67%) uzorku proizvedenog od kuvanog mleka (Tabela 5.4.2). 85 5.4.1. Fenotipska karakterizacija entroksogenih koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva Fenotipska karakterizacija izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine, uraĊena je primenom ID 32 STAPH (BioMerieux, Francuska) testa Rezultati tih ispitivanja prikazani su u tabela 5.4.1.1. Tabela 5.4.1.1. Rezultati identifikacije izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka do vrsta primenom ID 32 STAPH (BioMerieux, Francuska) Vrsta stafilokoka Broj izolata % Staphylococcus aureus 16 61,54 S. xylosus 4 15,38 S. sciuri 3 11,54 S. lentus 3 11,54 Ukupno 26 100 Rezultati prikazani u tabeli 5.4.1.1. pokazuju da je od 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, za koje je ELFA tehnikom dokazano da stvaraju enterotoksine, identifikovano kao S. aureus (61,54% izolata), S. xylosus (15,38 % izolata), S. sciuri (11,54 % izolata), S. lentus (11,54% izolata). 5.5. Rezultati identifikacije gena za sintezu enterotoksina u koagulaza pozitivnim stafilokokama izolovanim iz mekih sireva Obzirom da korišćena ELFA tehnika u eksperimentu enterotoksine detektuje grupno (SEA-SEE), bilo je neophodno da se identifikuju geni koji kodiraju sintezu jednog, ili više toksina. Za identifikaciju gena za sintezu enterotoksina u koagulaza pozitivnim stafilokokama izolovanih iz mekih sireva odabrano je 26 izolata za koje je prethodno ELFA tehnikom dokazano da stvaraju enterotoksine (SE). Za ispitivanje je korišćena DNK stafilokoka ekstrahovana iz 26 izolata, koja je amplifikovana primenom konvencionalne multipleks PCR tehnike za gene sea i seb, odnosno tehnikom Real- Time PCR za gene sec, sed i see. 86 Validacija konvencionalne multipleks PCR tehnike za ispitivanje gena sea i seb za sintezu enterotoksina A (SEA) i eneterotoksina B (SEB) korišćenjem monotoskiĉnih referentnih sojeva, prikazana je na slici 5.5.1. Sa slike se jasno vidi da su trake amplifikovanih fragmenata gena za sintezu enterotoksina, jasno diferencirane, te da ne postoji unakrsna reakcija (laţno pozitivna) amplifikacije ispitivanih gena. Slika 5.5.1. Rezultati elektroforeze PCR proizvoda monospecifiĉnih referentnih sojeva dobijenih pomoću prajmera, specifiĉnih za ftsZ, sea i seb gen. Rezultati ispitivanja prisustva gena za stvaranje enterotoksina su prikazani u tabeli 5.5.1. Tabela 5.5.1. Rezultati ispitivanja prisustva gena za sintezu enterotoksina u izolatima koagulaza pozitivnih stafilokoka iz mekih sireva Vrsta stafilokoka Brouj izolata sea gen seb gen sec gen sed gen see gen Br. % Br. % Br. % Br. % Br. % S. aureus 26 26 100 24 92,31 0 0 0 0 0 0 87 Rezultati prikazani u tabeli 5.5.1. pokazuju da je kod svih primoizolata, za koje je ELFA tehnikom utvrĊeno da stvaraju klasiĉne enterotoksine (SEA-SEE), utvrĊeno prisustvo sea gena, a kod 92,31% izolata je dokazan i seb gen. Ni kod jednog od 26 ispitanih primoizolata nisu dokazani geni za sintezu enterotoksina C (sec), D (sed) i E (see). Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za sea sa izolatima koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva (izolati sa oznakama 31K, 43K, 70N, 79N, 93N, 111N, 116N, 132N, 168N, 222K, 227K, 229N, 254N, 260N, 263N, 327N, 342N, 367N, 370K, 391N, 392N, 393N, 400N, 401N i 414N) prikazani su na slikama 5.5.2a i 5.52b Slika 5.5.2.a. Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za sea gen. M marker (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder). Izolati iz sira: 31K, 43K, 70N, 79N, 93N, 111N, 116N, 132N, 168N, 222K, 227K, 116 N N 132 N 168 N 222 K 227 K 31K 43K 70N 79N 93N 111N 88 Slika 5.5.2.b. Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za sea gen. M marker (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder). Izolati iz sira: 229N, 254N, 260N, 263N, 327N,341K, 342N, 367N, 370K, 391N, 392N, 393N, 401N,400N, 414N, PC Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za seb sa primoizolatima koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz mekih sireva (izolati sa oznakama 31K, 43K, 70N, 79N, 93N, 111N, 116N, 132N, 168N, 222K, 227K, 229N, 254N, 260N, 263N, 327N, 342N, 367N, 370K, 391N, 392N, 393N, 400N, 401N i 414N) prikazani su na slikama 5.5.3a i 5.5.3b. 341K 342N 367N 370K 391N 392N 393N 401N 400N 414 N PC 229 N 254 N 260 N 263 N 327 N 89 Slika 5.5.3.a. Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za seb gen. M marker (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder).Izolati iz sira: 31K, 43K, 70N, 79N, 93N, 111N i pozitivna kontrola (PC) Slika 5.5.3.b. Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za seb gen. M marker (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder).Izolati iz sira: 168N, 222K, 227N, 229N, 254N, 260N,263N 31K 43K 70N 9N 93N 111N PC 168N 222K 227K 229N 254N 260N 263N 90 Slika 5.5.3.b. Rezultati elektroforeze PCR proizvoda dobijenih pomoću prajmera za seb gen. M marker (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder).Izolati iz sira: 341K, 342N, 367N, 370K, 391N, 392N, 393N, 401N,400N, 414N, 327 i 132. Ni kog jednog od 26 ispitivanih primoizolata koagulaza pozitivnih stafilokoka nisu dokazani geni za sintezu enterotoksina C (sec), D (sed) i E (see). Posmatranjem amplifikacionih signala iz DNK izolata, nedvosmisleno se zakljuĉuje da genom ovih izolata ne sadrţi sec, sed odnosno see gen. Grafikon 5.5.1. Amplifikaciona kriva gena za sintezu SEC, SED i SEE za uzorke i pozitivne kontrole 341K 342N 367N 370K 391N 392N 393N 401N 400N 414N 327 132 91 Grafikon 5.5.2. Disocijaciona kriva gena za sintezu SEC, SED i SEE za uzorke i pozitivne kontrole Sa grafikona 5.5.1. i 5.5.2. vidi se da su pozitivne kontrole za gene sec i see dale pozitivan signal pri Ct vrednosti od 10-12, što ukazuje da je amplifikacija uspešna. Pored toga, negativna kontrola nije dala signal, što ukazuje da u ispitivanom sistemu reagenasa nije bilo kontaminacije koja bi odavala sliku laţno pozitivnog signala. 5.6. Rezlultati ispitivanja prisustva enetrotoksina u sirevima proizvedenim od kuvanog ili nekuvanog mleka Za ispitivanje prisutva enterotoksina u sirevima odabrano je 26 uzoraka sireva, koji su prozvedeni od kuvanog i nekuvanog mleka, a kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke za koje je dokazano da stvaraju enterotoksine i utvrĊeno je prisustvo gena za sintezu enterotoksina A i B (sea i seb). Svih 26 izolata kod kojih je dokazano prisustvo gena za sintezu enetrotoksina su identifikovani kao Staphylococcus aureus, što potvrĊuje prisustvo ftsZ gena (slika 5.5.1.). Gen ftsZ funkcionalno uĉestvuje u deobi bakterijske ćelije, jer kodira sintezu proteina kontraktilnog prstena (Z prsten) na mestu razdvajanja buduće dve ćelije. Gen je visoko oĉuvan tokom evolucije Staphylococcus aureus i sluţi kao stabilan identifikacioni marker za pripadnost vrsti Staphylococcus aureus. 92 Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirevima kretao se od 1,00 do 5,97 log cfu/g. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine, Lactococcus spp., Lactobacillus spp., hemijskih parametara (pH, aktivnost vode, sadrţaj NaCl) i nalaz enterotoksina u sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka dat je u Tabeli 5.6.1 i 5.6.2. Dobijeni rezultati pokazuju da je od 26 ispitanih uzoraka sira enterotoksin dokazan u 2 (7,69%) uzorka slatko-koagulišuća sira proizvedena od nekuvanog mleka (sirevi sa oznakom 263 i 393). U ova 2 uzorka sira je prethodno dokazano prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje imaju sposobnost da stavarju eneterotoksine i izolati (263N i 393N) iz oba uzorka sira su bili nosioci gena za sintezu eneterotoksina SEA i SEB. (sea i seb). Sirevi u kojima je dokazano prisustvo enterotoksina bili su starosti 3-4 dana, odnosno 7 dana, a broj koagulaza pozitivnih stafilokoka bio više od 5 log cfu/g (Tabela 5.6.1. i 5.6.2.). Izolati 263N i 393N su ispitivanjem biohemijskih osobina identifikovani kao Staphylococcus aureus. 93 Tabela 5.6.1. Rezultati određivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine, Lactococcus spp., Lactobacillus spp., hemijskih parametara ( pH, aw, sadržaj NaCl ) i nalaz enterotoksina u sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka Redni broj Oznaka sira Starost sira (dani) Oznaka izolata stafilokoka Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (logcfu/g) pH sira aw NaCl (%) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) Nalaz enterotoksina u siru 1. 70 3 70N 3,90 4,62 0,965 0,117 8,33 6,58 - 2. 79 7 79N 4,02 4,69 0,960 0,351 8,74 7,41 - 3. 93 4 93N 5,20 4,59 0,960 0,241 8,81 7,72 - 4. 111 7 111N 5,78 5,40 0,940 1,433 8,45 6,78 - 5. 116 3 116N 5,79 5,01 0,977 1,346 8,48 5,48 - 6. 132 2 132N 2,48 4,52 0,942 2,194 8,60 7,32 - 7. 168 2 168N 3,40 4,95 0,920 0,907 8,32 6,02 - 8. 229 3-4 229N 3,63 4,42 0,950 0,613 7,78 6,49 - 9. 254 1 254N 2,30 5,07 0,965 1,580 8,29 4,30 - 10. 260 12 h 260N 4,36 4,84 0,970 1,492 7,02 4,90 - 11. 263 3-4 263N 5,08 4,83 0,960 1,872 7,84 5,32 + 12. 327 7 327N 2,48 4,55 0,946 1,726 8,02 6,26 - 13. 342 7 342N 2,30 5,78 0,940 2,779 7,19 6,99 - 14. 367 4-5 367N 3,30 4,73 0,956 0,965 8,36 7,26 - 15. 391 3-4 391N 2,95 5,15 0,951 1,463 8,45 7,09 - 16. 392 7 392N 2,60 4,81 0,953 0,995 8,32 6,99 - 17. 393 7 393N 5,35 4,76 0,962 0,497 8,23 6,73 + 18. 400 7 400N 5,38 4,65 0,955 1,082 8,19 6,91 - 19. 401 7 401N 3,52 4,77 0,960 0,468 7,29 6,18 - 20. 414 3 414N 2,78 4,36 0,969 0,497 8,32 6,38 - N-izolat iz sira proizvedenog od nekuvanog mleka 94 Tabela 5.6.2. Rezultati određivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje su stvarale enterotoksine, Lactococcus spp., Lactobacillus spp., hemijskih parametara (pH, aw, sadržaj NaCl ) i nalaz enterotoksina u sirevima proizvedenim od kuvanog mleka Redni broj Oznaka sira Starost sira (dani) Oznaka izolata stafilokoka Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (logcfu/g) pH sira aw NaCl (%) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) Nalaz enterotoksina u siru 1. 31 4 31K 4,20 5,11 0,955 1,170 8,71 6,00 - 2. 43 3 43K 2,48 5,20 0,940 1,320 8,84 7,33 - 3. 222 7 222K 1,00 4,76 0,935 2,135 8,23 6,16 - 4. 227 3-4 227K 1,00 4,50 0,960 0,731 7,68 6,07 - 5. 341 2 341K 4,94 5,79 0,945 1,784 7,85 7,04 - 6. 370 3-4 370K 3,00 5,63 0,956 0,848 8,30 7,21 - K-izolat iz sira proizvedenog od kuvanog mleka 95 6. DISKUSIJA Meki sirevi, a posebno meki sirevi bez zrenja proizvedeni slatkom koagulacijom zbog sastava i fiziĉko-hemijskih karakteristika predstvaljaju dobar medijum za razmnoţavanje S. aureus i stvaranje enterotksina. Prema podacima iz literature trovanja enterotoksinima stafilokoka su na trećem, a po nekim autorima na drugom mestu najĉešćih trovanja hranom. U zemljama EU u 2009. godin registrovano je 293 epidemije izazvane enterotoksinima stafilokoka što predstavlja 5,3% od svih zabeleţenih epidemija. Prema izveštajima iz 15 evropskih zemalja mleko i proizvodi od mleka su u 1-9% (proseĉno 4-8%) epidemija intoksikacija utvrĊeni kao izvor enterotoksina stafilokoka. Prema izveštaju EFSA-e iz 2014. godine od ukupnog broja zabeleţenih alimentarnih oboljenja 346 je bilo izazvano enterotoksinima stafilokoka od kojih je u 20% sluĉajeva sir bio izvor enterotoksina. Iako su meki sirevi, proizvedeni u domaćinstvu od nekuvanog ili kuvanog mleka, zastupljeni na trţištu u Republici Srbiji u velikom broju, u nauĉnoj i struĉnoj literaturi nema dovoljno podataka o riziku koji ta vrsta sireva, kada su u pitanju intoksikacije enterotoksinima stafilokoka, predstavlja po zdravlje ljudi. Stoga smo smatrali da bi bilo korisno izvršiti procenu rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekim sirevima proizvedenim u individualnim domaćinstvima. Bakteriološkim ispitivanjem, kojim je obuhvaćeno 555 uzoraka mekih sireva proizvedenih od kuvanog ili nekuvanog mleka, uzetih sa 17 pijaca, dokazano je prisustvo koagulaza pozitivnih stafilokoka u 168 (30,27%) uzoraka mekih sireva (Tabela 5.1.1). Ovaj nalaz se slaţe sa nalazom, koji su dobili Moraes Mendoca i sar. (2009) koji su dokazali koagulaza pozitivne stafilokoke u 30,9% pregledanih uzoraka sireva proizvedenih od sirovog mleka. Za razliku od rezultata dobijenih u našim istraţivanjima De Luca (1997), El-Sharound i Spano (2008) i Akineden i sar. (2008) su S. aureus dokazali u 0-25% ispitanih uzoraka razliĉitih vrsta sireva. Naši rezultati su pokazali da je od 168 uzoraka sireva, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, najveći broj 140 (83,33%) uzorka sira proizvedeno od nekuvanog mleka a 28 (16,67%) uzoraka sira je proizvedeno od kuvanog mleka. Nalaz koagulaza pozitivnih stafilokoka u uzorcima mekog sira proizvedenog od nekuvanog mleka od 5,05% je manji u odnosu na vrednost od 25% koju su dobili De Luca i sar. (1997) ispitivanjem sireva proizvedenih od pasterizovanog mleka. Prisustvo koagulaza pozitivnih 96 stafilokoka u uzorcima sireva proizvedenih od nekuvanog mleka je poreklom iz mleka. U mleku koje se dobija pravilnom muţom broj S. aureus se kreće od 100-200 cfu/ml, a u sluĉaju infekcije mleĉne ţlezde ovaj broj se povećava do 104 cfu/ml (Asperger i Zangerl, 2003). Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka veći od 104 cfu/g sira proizvedenog od nekuvanog mleka je posledica primarne kontaminacije mleka ovim mikroorganizmom usled latentne infekcije ili supkliniĉkoih mastitisa. U prilog poreklu koagulaza pozitivnih stafilokoka nam govore podaci iz leiterature o ĉestom nalazu koagulaza pozitivnih stafilokoka u mleku (Medvedova i sar. 2014; Rajić, 2014; Boynukara i sar. 2008; Mork i sar. 2010, Pelisser i sar. 2008, Rall i sar. 2008, Jorgensen i sar. 2005a; Hant i sar. 2012; Korpysa-Dzirba i Osek, 2011). Nalaz koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirevima proizvedenim od kuvanog mleka se moţe objasniti naknadnom kontaminacijom iz spoljne sredine, sa ruku radnika i opreme za prozvodnju sira, a visoka aktivnost vode (0,94-0,96) i visoka pH vrednost (6,0-6,2) u siru omogućavaju njihovo razmnoţavanje. U prilog kontaminaciji poreklom od ljudi govore podaci da je uĉestalost nalaza enterotoksogenih stafilokoka kod ljudi 40-60% (Medvedova i Valik, 2012). Proces proizvodnje sireva je kompleksan proces. Ponašanje S. aureus u siru zavisi od procesa proizvodnje i kapaciteta mikroorganizma da preţivi stres u matriksu sira (Cretenet i sar. 2011). Meki sirevi se na teritoriji Republike Srbije u individualnim domaćinstvima proizvode od kuvanog ili nekuvanog mleka. U nekim geografskim podruĉjima sir se iskljuĉivo proizvodi od kuvanog mleka, a u nekim od nekuvanog mleka. Za proizvodnju mekih sireva od nekuvanog mleka u individualnim domaćinstvima koristi se mleko jutarnje, veĉernje, ili mešano mleko jutarnje i veĉernje muţe. Ako se sir proizvodi mešanjem mleka obe muţe, mleko veĉernje muţe se tokom noći ĉuva u rashlaĊenom stanju, ali ĉesto se ĉuva i u ambijetalnim uslovima što pogoduje razmnoţavanju koagulaza pozitivnih stafilokoka. Po spajanju sa mlekom jutarnje muţe dodaje se komercijalno sirilo prema uputstvu proizvoĊaĉa, bez dodavanja starter kultura. Mleko sa dodatim sirilom se ostavi da stoji 2-4 h da bi se formirao gruš. Kada doĊe do koagulacije, gruš se seĉe da bi se izdvojila surutka i prebacuje u cedilo. U cedilu stoji 2-4 h u ambijetalnim uslovima, a potom se cedilo, zateţe i formira gruda, koja se presuje da bi se preostala surutka iscedila. Sir pod presom se ĉuva u friţideru. Neki proizvoĊaĉi dodaju so u mleko, a većina soli pre, ili za vreme seĉenja sira u kriške. 97 Meki sirevi od kuvanog mleka se proizvode takoĊe od mleka jutarnje, veĉernje, ili mešanjem mleka jutarnje i veĉernje muţe. Posle termiĉke obrade, mleko se ostavi da se ohladi i ĉuva u rashlaĊenom stanju, u friţideru 24 h. Posle skidanja kajmaka sa površine, mleko se zagreva do 25C° i dodaje sirilo, bez dodavanja komercijalnih strter kultura. Da bi se formirao gruš potrebno je 3-4 h. Gruš se prebacije u cedilo i cedi 3-4 h. CeĊenje se odvija u ambijetalnim uslovima pri temperaturi 20-25°C, a zatim se zategne cedilo i formira gruda. Soljenje se vrši na isti naĉin kao i sirevi proizvedeni od nekuvanog mleka. Ne postoji standard po kojem proizvoĊaĉi sole sir, već svaki proizvoĊaĉ na osnovu svog iskustva soli sir. Sagledavanjem procesa proizvodnje mekih sireva, moţe se zakljuĉiti da postoje uslovi za rast S. aureus, naroĉito u ranim fazama, kada su visoke pH vrednost i temperatura. Rast mikroorganizma je moguć sve dok fiziĉko-hemijski paramatri (pH, aktivnost vode, sadrţaj NaCl) i prisustvo kompetitivne mikroflore ne poĉnu da utiĉu na rast S. aureus. Naši rezultati pokazuju da je od 168 uzoraka sireva, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, 129 (76,78%) uzoraka sireva pripadalo grupi slatko-koagulišućih sireva, a 39 (23,21%) uzoraka grupi kiselo-koagulišućih. Ambijentalni uslovi u kojima se proizvode sirevi, naroĉito tokom toplih meseci godine pogoduju razmnoţavanju koagulaza pozitivnih stafilokoka, tako da tokom proizvodnje i skladištenja mekog sira koagulaza pozitivne stafilokoke mogu da se razmnoţavaju i stvaraju enterotoksine, posebno ako u proizvodnju sira nije ukljuĉena mleĉnokiselinska fermentacija, kao što je to kod slatko-koagulišućih sireva. Uslovi tokom proizvodnje mekih sireva slatkom koagulacijom, kada je pH sira iznad 4,6 pogodovali su rastu i razmnoţavanju koagulaza pozitivnih stafilokoka. Prema podacima iz literature (ICMSF, 1996) rast ovog mikroorganizma je moguć pri rasponu pH od 4 do 10, dok je optimalno pri pH 6-7. U zavisnosti od starosti sireva od 168 uzoraka sireva, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, najveći broj 157 (93,45%) uzoraka je pripadalo grupi mekih sireva bez zrenja, a 11 (6,55%) uzorka je pripadalo grupi sireva sa zrenjem (Tabela 5.1.3). Najveći nivo kontaminacije sireva koagulaza pozitivnim stafilokokama (>4 log cfu/g) je dokazan u 54 uzorka slatko-koagulišućih sireva od kojih je 44 (81,48%) uzorka proizvedeno od nekuvanog mleka i 10 (18,52%) uzoraka od kuvanog mleka (Tabela 98 5.1.2.). U najvećem broju uzoraka (n=63), od kojih je 51 (80,95%) uzorak pripadao grupi slatko-koagulušućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka, a 12 (19,05%) uzoraka je pripadalo grupi slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od kuvanog mleka, nivo kontaminacije nivo kontaminacije koagulaza pozitivnim stafilokokama se kretao od 2 do 4 log cfu/g. Naši rezultati se slaţu sa nalazima Polli i sar. (2007), koji su dokazali da je populacija S. aureus u 78% uzoraka Monte Veronese sira proizvedenog od sirovog kravljeg mleka veća od 103 cfu/g. Za razliku od rezultata dobijenih u našim ispitivanjima Borelli i sar. (2006), su dokazali veći nivo kontaminacije S. aureus (<4,8 do 6,3 log cfu/g) u 70% uzoraka Canastra sira. U prilog našim rezultatima su rezultati Rosengren (2012), koja je dokazala koagulaza pozitivne stafilokoke u 69% (38/55) uzoraka sireva proizvedenih od sirovog mleka i 6% (6/96) uzoraka sira proizvedenim od pasterizovanog mleka. Veći broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je dokazan u siru proizvedenom od sirovog mleka, naroĉito onim bez dodatka starter kultura. Nivo >5 log cfu/g je dokazan kod 16% (6/39) uzoraka sireva proizvedenih od sirovog mleka, a najveći broj, 6,56 log cfu/g Rosengren (2012) je dokazala u uzorku sira proizvedenom od sirovog mleka bez dodataka starter kultura. Naši rezultati pokazuju da je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka u sirevima proizvedenim od kuvanog i nekuvanog mleka bio od 1,0 do 5,9 log cfu/g. Najveći broj ovog mikroorganizma je dokazan u slatko-koagulišućem siru starosti 4 dana, koji je proizveden od nekuvanog mleka (Prilog 3.). Veliki sadrţaj vode u bezmasnoj materiji 82,34% i pH 4,76 su pogodovali rastu koagulaza pozitivnih stafilokoka u siru. Iako u literaturi postoje podaci da S. aureus raste u manjem broju u proizvodima od mleka sa većim sadrţajem masti (Halpin-Dohnalek i Marth, 1989) naš rezultat pokazuje da sadrţaj masti u suvoj materiji sira nije uticao na rast S. aureus, jer je ovaj mikroorganizam mogao da se umnoţi do vrednosti više od 5 log cfu/g. U 3 uzorka sira u kojima je utvrĊen najmanji broj koagulaza pozotivnih stafilokoka (1 log cfu/g) sadrţaj masti u suvoj materiji je bio 30,03%, 59,61% i 66,57%. Sva tri uzorka sira su na osnovu ove vrednosti mogla da se kategorišu kao masni, punomasni i ekstramasni sirevi. Na broj kaogulaza pozitivnih stafilokoka nije imala uticaja pH vrednost, jer je u sva tri uzorka izmerena visoka pH vrednost (5,50; 5,97 i 6,50). Budući da je starost dva uzorka sira bila jedan dan visoka pH vrednost se moţe objasniti ĉinjenicom da nije bilo dovoljno vremena za mleĉno-kiselinsku fermentaciju i sniţavanja pH. U uzorku sira 99 (17f/n), ĉija je starost bila 15 dana, fermentacija se odvijala sporije i u tom uzorku sira izmeren je pH 5,97. Preko 5 log cfu/g koagulaza pozitivnih stafilokoka je utvrĊeno u 2 uzorka kiselo- koagulišućeg sira (3/n i 72/n) starosti 2 i 15 dana, koji su proizvedeni od nekuvanog mleka (Prilog 5.). Iako je u siru došlo do sniţavanja pH vrednosti do 4,39, odnosno 4,41 to nije imalo uticaja na rast koagulaza pozitivnih stafilokoka. MeĊutim, u 2 uzorka sira (oznaka 71/n i 94/n) u kojima je izmeren pH 4,22 odnosno 4,25 broj koagulaza pozitivnih stafilokoka je bio 1,0 log cfu/g. Manji broj mikroorganizma se moţe objasniti zdruţenim uticajem pH i sadrţaja masti, jer je u ovim uzorcima sadrţaj masti u suvoj materiji bio visok (oko 60%) (Prilog 5). Rezultati koje smo dobili odreĊivanjem broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u mekim sirevima pokazuju da je broj Lactococcus spp. u uzorcima slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od kuvanog, ili nekuvanog mleka pribliţno isti oko 8 log cfu/g. Broj Lactobacillus spp. je bio pribliţno isti u slatko-koagulišućim sirevima sa zrenjem i bez zrenja (6,60 log cfu/g), a najveći broj, 6,96 log cfu/g je utvrĊen u uzorku slatko– koagulišućeg sira sa zrenjem proizvedenog od nekuvanog mleka. (Tabela 5.1.4.) Naši rezultati se slaţu sa rezultatima Akkaya i Sancak (2007), koji su odredili broj bakterija mleĉne kiseline u Herby siru. Veće vrednosti za broj bekterija mleĉne kiseline, oko 9 log cfu/g ovi autori su utvrdili u sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka. Populacija Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. u broju, koji smo mi utvrdili u sirevima je doprinela razvijanju mleĉno-kiselinske fermentacije i poslediĉno tome sniţavanju pH vrednosti u uzorcima mekih sireva. Bakterije mleĉne kiseline imaju krucijalnu ulogu u proizvodnji fermentisanih proizvoda kao što je sir i veliki broj literaturnih podataka govori u prilog inhibitornom delovanju, koje pokazuju Lactococcus spp. i Lactobacillus spp. prema S. aureus (Fang i sar. 1993, Ortolani i sar. 2010, Pereira i sar. 2009, Radovanović i Katić 2009). Inhibitorno delovanje bakterija mleĉne kiseline nije samo posledica sniţavanja pH, već i mehanizma kompeticije, smanjenja koliĉine esencijalnih hranljivih materija i stvaranja produkata (vodonik peroksid, orhanske kiseline, bakterocini, nizin). * * * 100 Rezultati odreĊivanja pH vrednosti u uzorcima mekih sireva, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, proizvedenih od kuvanog mleka pokazuju da se u uzorcima kiselo-koagulišuĉih sireva pH vrednost kretala od 4,10 do 4,60, a u uzorcima slatko-koagulišućih sireva od 4,61-6,94 (Tabela 5.2.3.). Pri ovim vrednostima pH je bio moguć rast koagulaza pozitivnih stafilokoka i njihov broj se kretao od 1 do 5,79 log cfu/g. Prema ICMSF (1996) S. aureus moţe da raste u rasponu pH 4 do 10, dok je stvaranje enterotoksina u aerobnim uslovima moguće pri pH vrednosti 4,5 do 9,6. Naši rezultati se slaţu sa nalazima Jakobsen i sar. (2011) koji su dokazali znaĉajno smiţavanje pH vrenosti u sirevima proizvedenim od sirovog mleka posle 5-6 h fermentacije. Posle 24 h u sirevima su izmerili pH vrednost niţu od 5,5 i utvrdili najveći broj S. aureus u uzorcima starosti 5-6 h kada je broj bio preko 4 log cfu/g. Poĉetni broj S. aureus u mleku znaĉajno utiĉe na broj ovog mikroorganizma tokom prvih faza proizvodnje sira. Rezultate sliĉne našim su dobili Akkaya i Sancak (2007) koji su u sira Herby proizvedenom od pasterizovanog mleka izmerili pH vrednost 4,25 do 5,24, a u siru proizvedenom od sirovog mleka 4,28 do 6,41. Bitna karakteristika stafilokoka je da ovaj mikroorganizam moţe da raste pri širokom rasponu aktivnost vode u odnosu na druge mikroorganizme. Najniţa vrednost aw pri kojoj mogu da rastu koagulaza pozitivne stafilokoke je 0,83-0,86, što je ekvivalentno koncentraciji od 20% NaCl (Hennekinne i sar. 2012). Naši rezultati odreĊivanja aktivnosti vode pokazuju da se aw u mekom siru proizvedenom od nekuvanog mleka kretala od 0,92 do 0,98, a u siru proizveom od kuvanog mleka od 0,87 do 0,98 (Tabela 5.2.1). Pri ovim vrednostima jaktivnosti vode bio je moguć rast koagulaza pozitivnih stafilokoka. Pribliţno iste vrednosti su dokazali Akkaya i Sancak (2007) u Herby siru starosti od 1 do 90 dana. U sirevima proizvedenim od pasterizovanog mleka aw se kretala od 0,91 do 0,97, a u sirevima proizvedenim od sirovog mleka od 0,89 do 0,97. Naši rezultati odreĊivanja sadrţaja NaCl u mekim sirevima pokazuju da je najveća dokazana vrednost bila 3,48. Iako je S. aureus halotolerantan mikroorganizam u poreĊenju sa drugim mikroorganizmima i bakterijama mleĉne kiseline NaCl zajedno sa drugim faktorima u siru moţe da inhibiše rast S. aureus. Rast je moguć pri koncentraciji NaCl 2,5-20% (Cretenet i sar. 2011), a kako smo u uzorcima mekih sireva dokazali sadţaj NaCl do 3,48%, ovaj fiziĉko-hemijski parametar nije uticao na rast koagulaza pozitivnih stafilokoka. Prema mišljenju (Cretenet i sar. 2011) sniţavanje aktivnosti 101 vode moţe da utiĉe na stvaranje enterotoksina. Opadanje aktivnosti vode manje utiĉe na stvaranje enterotoksina A i H (SEA i SEH) u odnosu na enterotoksine B i C (SEB i SEC). Stvaranje SEA je moguće pri vrednostima a w od 0,87 do 0,89, dok je stvaranje SEB moguće pri aktivnosti vode od 0,97 do 0,99 (Jay, 2000). Ispitivanjem fiziĉko-hemijskiog parametara, vode u bezmasnoj materiji 83 uzorka mekog sira, proizvedenih od kuvanog ili nekuvanog mleka, u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke prema Pravilniku o kvalitetu proizvoda od mleka i starter kultura (Sluţbeni glasnik RS 33/10) se moţe svrstati u kategoriju mekih sireva na osnovu sadraţaja vode u bezmasnoj materiji sira, koja je u svim uzorcima bila viša od 67%. Na osnovu rezultata odreĊivanja sadrţaja masti u suvoj materiji sira prema Pravilniku o izmenama i dopuni pravilnika o kvalitetu proizvoda od mleka i starter kultura (Sluţbeni glasnik RS 34/14) ispitani sirevi se mogu svrstati u polumasne sireve, jer je najmanja vrednost utvrĊena u uzorcima sireva bila 16,47%, što je u kategoriji ≥10 do <25%. Uzorci sireva koji su sadrţavali ≥25 do <45%. masti u suvoj materiji sira su svrstani u masne sireve, uzorci sireva koji su sadrţavali ≥45 do <60%. masti u punomasne i uzorci sireva, koji su sadrţavali >60% masti kategorisani su kao ekstra masni sirevi. (Prlog 3,4,5,6). * * * Hemoliza je znaĉajna karakteristika patogenih stafilokoka, pa je u fenotipskoj identifikaciji izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka korišćena ta njihova osobina. Naši rezultati pokazuju da je najveći broj izolata koаgulаzа pozitivnih stаfilokoka iz sirа nаjĉešće stvаrаo betа hemolizu (50,98%), zаtim аlfа plus betа hemolizu (22,55%), аlfа hemolizu (4,90%), a nаjreĊe deltа hemolizu i deltа plus betа hemolizu (2,94%). Hemolizu nа krvnom аgаru nije stvаrаlo 15,69% izolаtа (Tabela 5.3.1). Naši rezultati se slaţu sa rezultatima, koje je dobila Rajić (2014) ispitujući izolate koagulaza pozitivnih stafilokoka iz vimena krava i dokazala da je najĉešće daju beta hemolizu (50% izolata), zatim alfa plus beta hemolizu (36% izolata), beta plus delta hemolizu (8% izolata), delta hemolizu (4% izolata) i alfa hemolizin (2% izolata). Naši rezultati su u skladu sa rezultatima Morandi i sar. (2009), koji su utvrdili da 54% izolata, koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih u sluĉajevima mastitisa krava, na krvnom agaru stvara 102 beta hemolizu, a 40% izolata stvara alfa plus hemolizu. Naši rezultati se slaţu i sa rezultatima Akineden i sar. (2001) koji su dokazali da od 103 izolata S. aureus beta hemolizu na krvnom agaru stvara 50 izolata. Za stafilokoke koje izazivaju mastitise je karakteristiĉno da najĉešće na krvnom agaru daju beta hemolizu, alfa i beta hemolizu, ili samo alfa hemolizu, pa naš nalaz moţe da ukaţe da su izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka iz sira poreklom iz vimena. Ispitivanjem biohmijskih osobina 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka za koje je ELFA tehnikom dokazano da stvaraju enterotoksine, identifikovano kao S. aureus (61,54% izolata), S. xylosus (15,38 % izolata), S. sciuri (11,54 % izolata), S. lentus (11,54% izolata) (Tabela 5.4.1.1.). Naši rezultati su sliĉni rezultatima El-Sharoud i Spano (2008) koji su od 15 izolata Staphylococcus spp. iz Domiati sireva 2 identifikovali kao S. aureus, 4 izolata kao S. xylosus, ali i 4 izolata kao S. caprae i 5 izolata kao S. cromogenes, koje mi nismo dokazali. U najvećem broju, 40 izolata od 46 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka iz mleka i tradicionalnih frementisanih proizvoda su identifikovali kao S. aureus Bendahou i sar. (2009). Morandi i sar. (2009) su svih 122 izolata iz razliĉitih proizvoda od mleka indentifikovali kao S. aureus primenom PCR tehnike, meĊutim primenom Bilog GP identifikacije bila je moguţa identifikacija za 78% izolata S.aureus, dok je za preostalih 22% izolata bila potrebna primena PCR tehnike. Za razliku od naših rezultata Rajić (2014) je u većem procentu izolate koagulaza pozitivih stafilokoka iz melaka identifikovala kao S. aureus (88%), zatim S. chromogenes (4%), S. intermedius (2%), S. xylosus (2%), S. sciuri (2%) i S. lentus (2%). Rosengren (2012) je od 156 izolata iz sira 152 (97%) izolata identifikovala kao S. aureus. Medvedova i sar. (2014) su ispitivanjem biohemijskih osobina API Staph testom od 64 izolata poreklom iz mleka i tradicionalnih sireva 52 (81,3%) izolata identifikovali kao S. aureus. Preostale izolate su identifikovali kao S. caprae (4), S. lentus (2), S. epidermidis (2), S. hominis (2) i S. xylosus (2). Kod svih 26 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, kod kojih smo dokazali sposobnost sinteze enterotoksina, PCR metodom je potvrĊeno prisustvo 16S rRNK karakteristiĉne za stafilokoke. Izolati S. aureus razliĉitog porekla, koji imaju sposobnost da stvaraju eneterotoksine se ĉesto razlikuju po broju mobilnih genetskih elemenata, genima za sintezu enterotoksina (se), kao i enterotoksinima i enterotoksinima sliĉnim proteini koje stvaraju (Argudin i 103 sar. 2010). Izolati S. aureus, koji stvaraju enterotoksine nose razliĉite gene za sintezu enterotoksina (se geni) i ponekad mogu da budu nosioci više razliĉitih gena. Geni-se se nlaze na razliĉitim mobilnim genetskim elementima, kao što su plazmidi, profagi, egc (enterotoxin genetic cluster) klasteri, S. aureus ostrvcima patogenosti (SaPIs) hromozomskim kasetama stafilokoka (Hennekinne i sar. 2010; Schelin i sar. 2011). Enterotoksin A (SEA), pojedinaĉno, ili u kombinaciji sa drugim enterotoksinima i enterotoksinima sliĉnim toksinima je najĉešće dokazan enterotoksin u hrani i navodi se kao uzroĉnik alimentarnih itoksikacija ljudi. Predominantni nalaz enterotoksina A (SEA) u hrani se moţe objasniti izuzetno visokom otpornošću ovog toksina na proteolitiĉke enzime (Balaban i Rasooly, 2000; Bergdoll, 1988; Holmberg i Blake, 1984). Naši rezultai su pokazali da je od 85 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka 26 (30,59%) izolata imalo sposobnost da stvara enterotoksine. Primenom skrining metoda VIDAS SET 2 (BioMerieux, Francuska) klasiĉni enterotoksini (SEA-SEE) dokazuju se grupno. Budući da nismo mogli da utvrdimo koje od pet klasiĉnih enterotoksina stvaraju izolati koagulaza pozitivnih stafilkokoka odluĉili smo se da izvršimo identifikaciju gena za sintezu enterotoksina. U toku našeg istraţivanja izolate koagulaza pozitivnih stafilokoka, kod kojih je ELFA tehnikom potvrĊena sposobnost sinteze enterotoksina, analizirali smo PCR metodom na prisutvo gena za sintezu klasiĉnih enterotoksina A, B, C, D i E (sea, seb, sec, sed i see). Od 85 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka, koje u stvarale enterotoksine 26 (30,59%) izolata je nosilo gene za sintezu enterotoksina A (sea), dok je kod 24 izolata utvrĊeno istovremeno prisustvo gena za sintezu enterotoksina A (sea) i enterotoksina B (seb). Naši rezultati se slaţu sa rezultatima Medvedova i sar. (2014), koji su dokazali da 32% izolata S. aureus iz mleka i proizvoda od mleka nosi se gene za sintezu enterotoksina (SEA-AEE). Od 9 izolata, koji su stvarali enterotoksine 5 izolata je nosilo jedan gen (se), a 4 izolata dva gena za sintezu enterotoksina. Najveći broj, 4 izolata je nosilo sea gen, što se slaţe sa našim rezultatima, a 3 izolata su nosila sea i sec gen i po jedan izolat see, ili kombinaciju sea/see. Autori nisu dokazali seb i sed gen. Naši rezultati se slaţu sa podacima iz literature o predominaciji nalaza enterotoksina A (SEA), koji su zabeleţeni u razliĉitim zemljama sveta. U Velikoj Britaniji u toku opseţnog praćenja epidemija u periodu od 1969-1990.godine 79% izolata S. aureus je 104 stvaralo enterotoksin A (SEA) (Wieneke i sar. 1993). U Francuskoj se enterotoksin A (SEA) navodi kao najĉešći uzroĉnik trovanja (69,7%) u 31 epidemiji zabeleţenoj tokom perioda od 1981-2002. godine, a bila su izazvana razliĉitom hranom kao što su mleko, proizvodi od mleka, meso i salate (Kerouanton i sar. 2007). Najĉešće dokazan gen je bio sea, zatim sed, seg, sei i seh. U manjem broju su dokazani seb i sec, dok see gen nije uopšte dokazan. Naš nlaaz se slaţe sa nalazom Kerouantona i sar. (2007) u pogledu nalaza sea gena, ali se razlikuje u pogledu nalazu drugih gena, jer našim ispitivanjem nisu dokazani sec i sed geni. Našim nalazima govore u prilog i literarturni podaci o epidemijama izazvanim enterotoksinima stafilokoka, nalazu gena za sintezu enterotoksina (se). U Austriji je 2007. godine zabeleţena epidemija u kojoj je obolelo 40 dece, a bila je izazvana proizvodima od mleka. Izolati S. aureus su stvarali enterotoksine SEA i SED, a muzne ţivotinje su predstavljale rezorvoar ovog mikroorganizma (Schmid i sar. 2009). U SAD enterotoksin A (SEA) se najĉešće dovodi u vezu sa trovanjima hranom (77,8%), a prate ga SED i SEB (Casman, 1965). Naši rezultati se u potpunosti slaţu sa rezultatima (Veras i sar. 2008) koji su kod izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz proizvoda od mleka dokazali sea i seb gen. Izolati, koji su poticali od pacijenata obolelih u toku epidemija izazvanih hranom 2001-2003. godine u Tajvanu su bili najĉešće nosioci sea gena, a zatim seb i sec gena (Chiang i sar. 2008). Prema Cha i sar. (2006) oko 90% izolata, koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz hrane u sluĉaju epidemije trovanja, su nosioci sea gena. Enterotoksin A (SEA) je enterotoksin, koji je nejĉešće izazvao stafilokokna trovanja hranom u Japanu u periodu od 1980-1995. godine (Shimizu i sar. 2000). Velika epidemija u Japanu je zabeleţena 2000. godine, koja je izazvana pasterizovanim mlekom sa smanjenim sadrţajem masti u kojem je dokazan SEA (Asao i sar. 2003), dok je je epidemija zabeleţena 2009. godine bila izazvana palaĉinkama u kojima su dokazani SEA i SEC (Kitamoto i sar. 2009). Ĉest nalaz enetrotoksina A (SEA) se moţe objaniti uticajem aktivnosti vode. Vrednosti aktivnosti vode (aw) pri kojim moţe da se razmnoţava S. aureus se razlikuju od vrednosti pri kojim moţe da se stvara enterotoksin. Minimalna vrednost aw pri kojoj mikroorganizam moţe da raste je 0,83-0,86, što je ekvivalentno koncentraciji od 20% NaCl. Optimalna vrednost za rast S. aureus je >0,99. MeĊutim, stvaranje enterotoksina A i D (SEA i SED) je manje podloţno uticaju i moguće pri pribliţno istim vrednostima 105 aktivnosti vode, koje omogućavaju rast S. aureus kada su drugi uslovi optimalni. Nasuprot tome, stvaranje enterotoksina B (SEB) je vrlo osetljivo na sniţavanje vrednosti za aktivnosti vode i teško da SEB moţe da se stvara pri vrednosti od 0,93, uprkos intenzivnom rastu mikroorganizma (Hennekinne i sar. 2012). Sliĉan uticaj aw ima na stvaranje enterotoksina C (SEC). Pored aw, nizak pH moţe da izazove indukciju profaga, koja ima za posledicu povećanje ekspresije sea gena (Schelin i sar. 2011). Rezultati Rola i sar. (2013) se razlikuju od naših, jer su dokazali prisustvo sed gena kod 28 izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz sireva proizvedenih od nekuvanog mleka. Nasuprot našim rezultatima su i rezultati Bianchi i sar. (2013a), koji su kod 255 izolata S. aureus poreklom iz mleka i proizvoda od mleka dokazali prisustvo gena za sintezu enterotoksina ser (28%), sed (25%) i selj (25%). U Irskoj Hant i sar. (2012) su dokazali da 83,2% izolata S. aureus iz sirovog mleka i proizvoda od mleka ne nosi gene za sintezu enterotoksina (se). Od 26 izolata poreklom iz uzoraka od jednog proizvoĊaĉa je dokazan sec i potvrĊeno da izolati S. aureus imaju sposobnost da stvaraju eneterotoksin C (SEC). Naši rezultati se razlikuju od rezultata Morandi i sar. (2009), koji su od 122 izolata poreklom iz razliĉitih proizvoda od mleka u Italiji prisutvo jednog, ili više gena doakazali kod 79 (65%) izolata. Za razliku od nas dokazali su najĉešće sed gen (40 ozolata), sea gen i gene sej, sec, sel, sei i seh, koje mi nismo dokazali. Od naših rezultat se razlikuju i rezultati Rosengren (2012), koja je primenom PCR tehnike kod izolata koagulaza pozitivnih stafilokoka poreklom iz sireva u Švedskoj najĉešće dokazala sec gen i to kod 44% (67/152) izolata. Gen sec je u ovom istraţivanju dokazan pojedinaĉno i biotip je bio poreklom od ovaca. Za razliku od 26% (40/152) izolata drugog se-profila, koji su nosili kombinaciju sea, seg i sei, ili sea i seh gena bili su biotipa poreklom od ljudi i nespecifiĉnog domaćina. Kod 29% (40/152) nije dokazano prisustvo se gena. Naši rezultati se razlikuju od nalaza Vicosa i sar. (2013), koji su najĉešće dokazali sei gen kod izolata S. aureus poreklom iz sirovog mleka i sireva. U literaturi ima podataka da su enterotoksini SEB, SEC i SED izazvali alimentarne intoksikacije širom sveta (Wieneke i sar. 1993; Kérouanton i sar. 2007; Veras i sar. 2008). Naši rezultati ispitivanja prisustva enterotoksina u 26 uzoraka sireva, iz kojih su izolovane stafilokoke koje stvaraju enterotoksine, primenom ELFA tehnike (Tabela 106 5.6.1. i 5.6.2.) su pokazali da je enterotoksin stafilokoka dokazan u dva uzorka sira (oznake 263 i 393) proizvedena od nekuvanog mleka u kojima je broj koagulaza pozitivnih stafilokoka bio veći od 5 log cfu/g (Tabela 5.6.1.). Izolati koagulaza pozitivnih stafilokoka (263N i 393N) iz ova dva sira su stvarali enterotoksine i kod njih je dokazano prisustvo gena za sintezu enterotoksina A i B (sea i seb). Oba izolata su ispitivanjem biohemijkih osobina identifikovana kao Staphylococcus aureus. Vrednost pH u oba sira je bila 5,08 i 5,35, a vrednost za aktivnost vode je bila 0,960 i 0,962. Pri ovim vrednostima je moguć rast S. aureus, a s obzirom da je temperatura za rast bila optimalna u uslovima dobijanja sira, mikroorganizam je imao dovoljno vremena i povoljne uslove da se umnoţi do vrednosti iznad 5 log cfu/g i stvori dvoljnu koliĉinu enterotoksina, koja je detektovana. Sadrţaj NaCl u 2 uzorka sira u kojima su dokazani eneterotoksini je bio 0,497 i 1,872%. Budući da je S. aureus halotolerantan mikroorganizam i moţe da raste pri sadrţaju NaCl od 20%, izmerene vrednosti nisu inhibitorno uticale na rast i razmnoţavanje ovog mikroorganizma. Iako je broj Lactococcus spp. bio 7,84 i 8,23 log cfu/g u uzorcima sira nije uticao na smanjenje broja S. aureus. Broj Lactobacillus spp. u uzorku sira sa oznakom 263 je bio 5,32 log cfu/g što je bilo manje u odnosu na broj utvrĊen u drugom uzorku (oznaka 393)-6,73 log cfu/g. Manji broj Lactobacillus spp. u uzorcima sireva u kojima su dokazani enterotoksini je imao za posledicu sporije odvijanje mleĉno-kiselinska fermentacije, a time sporije sniţavanje pH vrednosti pri ĉemu je bilo moguće da se S. aureus umnoţi iznad 5 log cfu/g. Niska vrednost pH moţe da izazove indukciju profaga dovodeći do ekspresije sea gena (Schelin i sar. 2011) što objašnjava uĉestaliji nalaz sea gena i SEA toksina. Cretenet i sar. (2011) su dokazali da Lc. lactis moţe pozitivno ili negativno da moduliše ekspresiju se gena u matriksu sira. Ekspresija sea gena je blago povećana u prisustvu Lc. lactis, dok je jaka supresija sec4 zapaţena u matriksu sira u odsustvu Lc. lactis. U prisustvu Lc.lactis je smanjena regulacija agr sistema u vezi sa sniţavanjem pH vrednosti. Nasuprot našim rezultatima su rezultati Rola i sar. (2013), koji su dokazali prisustvo S. aureus u 56% uzoraka sireva proizvedenih od sirovog mleka. Iako je broj S. aureus bio ≥105 log cfu/g, a najveća vrednost 2,6 x107 log cfu/g autori nisu dokazali prisustvo enterotoksina ni u jednom uzorku sira. Prisustvo enterotoksina u 33 uzorka sira nisu dokazali ni Cremonesi i sar. (2007). TakoĊe, Rosengren (2012) nije dokazala 107 enterotoksine (SEA-SEE) u uzorcima sireva proizvedenim od sirovog mleka bez starter kultura u kojima je broj Staphylococcus aureus bio 5-6,5 log cfu/g i za koji je dokazano da stvara enterotoksin C (SEC). Procena rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka predstavlja kompleksan proces u kojem pored broja koagulaza pozitivnih stafilokokavaţno neophodno poznavanje faktora sredine, minimalnih i maksimalnih vrednosti pri kojima je moguć rast S. aureus i stvaranje enterotoksina. U proceni rizika treba ispitati da li S. aureus stvara enterotoksine, jer nisu svi izolati nosioci gena za sintezu enterotoksina, vrstu enterotoksina i korelacijiju izmeĊu broja S. aureus i stvaranja enterotoksina. Korelacija izmeĊu prisutva gena za sintezu enterotoksina (se) i sinteze enterotoksina je 70-80%, što se moţe objasniti nepotpunom ekspresijom gena za sintezu enterotoksina Na korelaciju utiĉu faktori sredine kao što su temperatura i aktivnost vode (aw), prisustvo drugih kompetitivnih mikroorganizama, koji su vaţni podjednako za rast i stvaranje enterotoksina (Medvedova i Valik, 2012). Budući da su naši rezultati pokazali da je od 26 uzorka mekih sireva u kojima su dokazane koagulaza pozitivne stafilokoke, koje stvaraju enterotoksine 15 (76,92%) uzoraka pripadalo grupi slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od nekuvanog mleka i 5 (23,08%) uzoraka grupi slatko-koagulišućih sireva proizvedenih od kuvanog mleka (Tabela 5.4.2), ova vrsta sira moţe da predstavlja rizik, zbog potencijalne mogućnosti nalaza enterotoksina. Nalaz enterotoksina u dva uzorka slatko-koagulišućeg sira proizvedenog od nekuvanog mleka ukazuje da posebnu opasnost mogu da predstavljaju ovi sirevi u kojima je pH veći od 5,0. Manji rizik predstavljaju kiselo-koagulišući sirevi, jer je od 26 izolata S. aureus u 5 (19,23%) izolata poreklom iz sira proizvedenog od nekuvanog mleka i jednom (3,85%) izolatu poreklom iz kiselo-koagulišućeg sira proizvedenog od kuvanog mleka dokazano prisustvo gena za stvaranje enterotoksina. Naši rezultai su potvrdili neophodnost dokazivanje enterotoksina stafilokoka u sirevima u kojima je dokazan broj koagulaza pozitivnih stafilokoka veći od 105 log cfu/g, što je predviĊeno našom i evropkom zakonskom regulativom. 108 7. ZAKLJUĈCI Nа osnovu rezultаtа ispitivаnjа mogu se izvesti sledeći zаkljuĉci: 1. Od ukupno 555 uzorаkа sirevа, koаgulаzа pozitivne stаfilokoke dokаzаne su u 168 (30,27%) uzorаkа sirа. Od 168 uzorаkа sirа kogаulаzа pozitivne stаfilokoke su dokаzаne u 140 (83,33%) uzorаkа sirа proizvedenoog od nekuvаnog mlekа i 28 (16,67%) uzorakа sirа proizvedenog od kuvаnog mlekа. 2. Broj koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа u 83 uzorkа sirа kretаo se od 1 do 5,90 log cfu/g. Nаjveći broj koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа (5,90 log cfu/g) utvrĊen je u uzorku slаtko-koаgulišućeg sirа. 3. Koаgulаzа pozitivne stаfilokoke izolovаne iz sirа nаjĉešće su stvаrаle betа hemolizu (50,98%), zаtim аlfа plus betа hemolizu (22,55%), аlfа hemolizu (4,90%), nаjreĊe deltа hemolizu i deltа plus betа hemolizu (2,94%), а hemolizu nа krvnom аgаru nije stvаrаlo 15,69% izolаtа. 5. Koаgulаzа pozitivne stаfilokoke izolovаne iz sirа, zа koje je utvrĊeno dа stvаrаju enterotoksine, nа osnovu biohemijskih osobinа identifikovаne su kаo S. aureus (61,54%), S. xylosus (15,38%), S. sciuri (11,54%) i S. lentus (11,54%). 6. ELFA tehnikom utvrĊeno je dа 26 (30,59%) izolаtа koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа stvаrа klаsiĉne enterotoksine (SEA-SEE). 7. Kod svih 26 izolаtа koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа, izolovаnih iz uzorkа sirа zа koje je ELFA tehnikom utvrĊeno dа stvаrаju enterotoksin, dokаzаn je gen zа enterotoksin A (sea), а kod 24 izolаtа je pored sea genа dokаzаn i gen zа sintezu enterotoksinа B (seb). Nijedаn izolаt nije posedovаo gene zа sintezu enterotoksinа C (sec), D (sed) i E (see). 109 8. Enterotoksin je dokаzаn u dvа uzorkа sirа u kojimа je broj koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа bio iznаd 5 log cfu/g . 9. Slаtko-koаgulišući sirevi proizvedeni od nekuvаnog mlekа, u kojimа je broj koаgulаzа pozitivnih stаfilokokа veći od 5 log cfu/g, mogu dа sаdrţe enterotoksine u koliĉinаmа koje izаzivаju intoksikаcije i predstаvljаju rizik po zrаvlje ljudi. 110 8. LITERATURA 1. Adesiyun A A, Stoute S and David B. 2007: Pre-processed bovine milk quality in Trinidad: Prevalence and characteristics of bacterial pathogens and occurrence of antimicrobial residues in milk from collection centres. Food Control, 18:312-320. 2. Adwan G, Abu-Shanab B, Adwan K. 2005: Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in a raw milk in the north of Palestine. Turk J Biol, 29, 229-232. 3. Ahmed AA-H, Moustafa MK, Marth EH. 1983: Growth and survival of Staphylococcus aureus in Egyptian Domiati cheese. Journal of Food Protection, 46:412-415. 4. Akineden Ö, C. Annemüller, A. A. Hassan, C. Lämmler,,W. Wolter, and M. Zschöck. 2001: Toxin Genes and Other Characteristics of Staphylococcus aureus Isolates from Milk of Cows with Mastitis. Clin Diagn Lab Immunol. 2001 September; 8(5): 959–964. 5. Akineden O, Hassan A, Scheider E, Usleber. 2008: Enterotoxigenic properties of Staphylococcus aureus isolated goats' milk cheese. Int J Food Microbiol, 124: 211- 216. 6. Akkaya L and Sancak YC. 2007: Growth abilities and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strains in herby cheese. Bulletin of the Veterinary Institute of Pulawy; 51:401-406. 7. Alemida G, Figueiredo A, Rola Marta, Baross R.M, Gibbs P, Hogg T, Teixeira Paula. 2007: Microbiological characterization of randomly selected Portuguese raw milk cheese with reference to food safety. J Food Prot, 70 (7), 1710-1716 8. Angelotti R, Foter MJ and Lewis KH. 1961: Time-temperature effects on salmonellae and staphylococci in foods. American Journal of Public Health, 51:76-83. 9. Aoyama K, Takahashi C, Yamauchi Y, Sakai F, Igarashi H, Yanahira S and Konishi H. 2008: Examination of Staphylococcus aureus survival and growth during cheese-making process. Journal of the Hygienic Society of Japan, 49:116-120. 111 10. Arbuthnott J, Coleman D, De Azavedo J. 1990: Staphylococcal toxins in human disease. J Appl Bacteriol Symp. suppl. 101S-107S. 11. Arcuri Edna Froeder, Fabiola Fonseca Angelo, Marta Fonseca Martins Guimarães, Régine Talon, Maria de Fatima Borges, Sabine Leroy, Gérard Loiseau, Carla Christine Lange, Nélio José de Andrade, Didier Montet. 2010: Toxigenic status of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk and Minas frescal cheese in Brazil. J Food Prot, 73(12): 2225-2231. 12. Argudin MA, Mendoza MC, Rodicio MR. 2010: Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins, 2(7): 1751–1773. 13. Asao T, Kumeda Y, Kawai T, Shibata T, Oda H, Haruki K, Nakazawa H, Kozaki S. 2003: An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimation of enterotoxin A in theincriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol Infect, 130, 33–40. 14. Asperger H, Zangerl P: Staphylococcus aureus. In: Roginski H, Fuquay J, Fox P, editors. Encyclopedia of Dairy Science. San Diego: Academic Press, 2003, 2563-2569. 15. Aydin A, Sudagidan M, Muratoglu K. 2011: Prevalence of staphylococcal enterotoxins, toxin genes and genetic relatedness of foodborne Staphylococcus aureus strains isolated in the Marmara region of Turkey. International Journal of Food Microbiology, 148: 99–106. 16. Baird-Parker AC: 1990. The staphylococci: an introduction. Pg 1S-8S In: Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement Series 19. D. Jones, R G Board, and M Sussman, ed. Blackwell Scientific Publications. Oxford. 17. Baird-Parker T: Staphylococcus aureus. In: Lund B, Baird-Parker T, Gould G, editors. The Microbiological Safety and Quality of Food. Gaithersburg: Aspen Publishers, 2000,1317-1330. 18. Baker-Austin C, Dopson M: Life in acid. 2007: pH homeostasis in acidophiles. Trends microbiol, 15: 165-171 19. Balaban N, Rasooly A. 2000: Staphylococcal enterotoxins. Int J Food Microbiol, 61, 1–10. 112 20. Bania J, Dubrowska A, Bystron J, Korzekova K, Chtazanowska J, Molenda J. 2006: Distribution of newly described eneterotoxin-like genes in Staphylococcus aureus from food. Int J of Food Micro, 10,36-41. 21. Barber MA. 1914: Milk poisoning due to a type of Staphylococcus albus occurring in the udder of a healthy cow. Philipp J Sci 9:515–519. 22. Bayles, KW, Iandolo JJ. 2002: Genetic and molecular analysis of gene encoding staphylococcal enterotoxin D. J Bacteriol, 1989, 171, 4799–4806. 23. Belay N. and Rasooly A: Staphylococcus aureus growth and enterotoxin A production in an anaerobic environment. Journal of Food Protection, 65:199- 204. 24. Bennett SD,Walsh KA, Gould LH. 2013: Foodborne disease outbreaks caused by Bacillus cereus, Clostridium perfringens, and Staphylococcus aureus— United States, 1998–2008. Clinical Infectious Diseases, 57, 425–433. 25. Bendahou Abdrezzak, Abid Mohammed, Bouteldoun Nadine, Carelejine Dierick, Lebbardi Mariam. 2009: Enterotoxigenic coagulase positive Staphylococcus in milk and milk products, Iben and jben, in Northern Morocco. J Infect developing countries, 3, 169-176. 26. Bergdoll, M.S. 1988: Monkey feeding test for staphylococcal enterotoxin. Meth. Enzymol. 165, 324–333. 27. Bergdoll MS and Lee Wong AC: Staphylococcal intoxications. In: Foodborne Infections and Intoxications, Ed: H. P. Reimann and D. O. Cliver, Elsevier, 2006, 523-562. 28. Bergdoll MS. 1979: Staphylococcal intoxications. In Foodborne Infections and Intoxications. Reimann H, Bryan FL (Eds), Academic Press Inc, New York, USA, 6. 29. Bergdoll MS. 1989: Staphylococcus aureus. In: Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed.). Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, pp. 463-523. 30. Betley MJ, Borst DW, Regassa LB. 1992: Staphylococcal enterotoxins, toxic shock syndrome toxin and streptococcal pyrogenic exotoxins: a comparative study of their molecular biology. Chem Immunol, 55, 1–35. 113 31. Betley MJ, Mekalanos JJ. 1985: Staphylococcal enterotoxin A is encoded by a phage. Science, 229, 185–187. 32. Beveridge TJ. 2000: The gram-positive cel wall. In: Gram-positive pathogens. Fischetti VA, Novick RP, Ferretti JJ, Portnoy DA, Rood JI (Eds.)Washington, DC, American Socety for Microbiology Press, 3 – 10. 33. Bianchi DM, Gallina S, Bellio1 A, Chiesa F, Civera T, Decastelli L. 2013a: Enterotoxin gene profiles of Staphylococcus aureus isolated from milk and dairy products in Italy. Letters in Applied Microbiology, 2013, 58, 190-196. 34. Bianchi DM, Gallina S, Macori G, Bassi P, Merlo P, Vencia W, Hennekinne JA, Decastelli L. 2013b: Enterotoxigenic strain of Staphylococcus aureus causing food-borne outbreak. Italian Journal of Food Safety, 113-116, 2:e32. 35. Bohach GA i Foster TJ: Staphylococcus aureus exotoxins. In: Gram-positive pathogens. Fischetti VA, Novick RP, Ferretti JJ et al.(Eds.), ASM Press, 2000, 367-368. 36. Boynukara B, Gulhan T, Alisarli M, Gurturk K, Solmaz H. 2008: Classical enterotoxinogenic characteristics of S. aureus strains isolated form bovine subclinical mastitis in Van, Turkey. International Journal of Food Microbiology, 125: 209–211. 37. Borelli Beatriz M, Elaine G Ferreira,Inayara CA Lacerda, Deise A Santos, Luiz S Carmo, Ricardo S Dias, Maria Crisolita C Silva, Carlos A Rosa. 2006: Enterotoxigenic Staphylococcus aureus spp. and other microbial contaminants during production of Canastra cheese, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 37:545-550. 38. Bremer P, Fletcher G, Osborne C: Staphylococcus aureus. Christchurch: New Zealand Institute for Crop and Food Research Limited, 2004, 6. 39. Brisabois A, Lafarge V, Brouillaud A, de Buyser ML, Collette C, Garin-Bastuji B. and Thorel MF. 1997: Pathogenic organisms in milk and milk products: the situation in France and in Europe. Reviews Science. & Technology, 16: 452-71. 40. Brooks JC, Martinez B, Stratton J, Bianchini A, Krokstrom R, Hudkins R. 2012: Survey of raw milk cheeses for microbiological quality and prevalence of foodborne pathogens. Food Microbiology, 31, 154-158. 114 41. Bryan FL, Guzewich JJ, Todd ECD. 1997: Surveillance of foodborne disease II. Summary and presentation of descriptive data and epidemiologic patterns; their value and limitations. J. Food Prot, 160, 567–578. 42. Carić Marija, Milanović Spasenija, Vucelja Dragica: Standardne metode analize mleka i mleĉnih proizvoda. Prometej, Novi Sad, 2000, 137-138. 43. Carlton L Gyles, John F Prescott, J Glenn Songer, Charles O Thoen, Hermans K, Devriese LA, Haesebrouck F. 1976: Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals, Chapter 4. Staphylococcus. Third Edition, 2008, Wiley-Blackwell. 44. Carpenter DF and Silverman GJ: Synthesis of staphylococcal enterotoxin A and nuclease under controlled fermentor conditions. Applied and Environmental Microbiology, 31:243-248. 45. Casman EP. 1965: Staphylococal enterotoxin. Ann. N.Y. Acad. Sci. 128, 124– 131. 46. Cebrián G, Sagarzazu N, Pagán R, Condón S and Mañas P, 2010: Development of stress resistance in Staphylococcus aureus after exposure to sublethal environmental conditions. International Journal of Food Microbiology; 140:26- 33. 47. Cenci-Goga BT, Karama M, Rossitto PV, Morgante RA, Cullor JS: Enterotoxin production by Staphylococcus aureus isolated from mastitic cows. J Food Prot, 2003, 66 (9), 1693-1696. 48. Cha JO, Lee JK, Jung YH, Yoo JI, Park YK, Kim BS, Lee YS. 2006: Molecular analysis of Staphylococcus aureus isolates associated with staphylococcal food poisoning in South Korea. J Appl Microbiol, 101, 864–871. 49. Charlier C, Cretenet M, Even S, LeLoir Y. 2009: Interactions between Staphylococcus aureus and lactic acid bacteria: An old story with new perspectives. Int J Food Microbiol, 131: 30-39. 50. Cheung AL, Koomey JM, Butler CA. 1992: Regulation of exoprotein expression in Staphylococcus aureus by a locus (sar) distinct from agr. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 6462–6466. 51. Chiang YC, Liao WW, Fan CM, Pai WY, Chiou CS, Tsen HY. 2008: PCR detection of staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of 115 SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan. Int J Food Microbiol, 121, 66–73. 52. Cifrian, E, Guidry A.J, Bramley AJ, Norcross NL, Bastida Corcuera FD, Marquardt WW. 1996: Effect of staphylococcal beta toxin on the cytotoxicity, proliferation and adherence of Staphylococcus aureus to bovine mammary epithelial cells. Vet Microbiol, 48:187–198. 53. Cremonesi P, Perez G, Pisoni G, Moroni P, Morandi S, Luyyana M, Brasca M. 2007: Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates in raw milk cheese. Letters in Applied Microbiology, 45, (6), 586-591. 54. Cretenet Marina, Even Sergine, Le Loir Yves. 2011: Unveiling Staphylococcus aureus enterotoxin production in dairy products: a review of recent advances to face new challenges. Dairy Sci. & Technol. 91:127–150, DOI 10.1007/s13594- 011-0014-9. 55. Cretenet M, Nouaille S, Thouin J, Rault L, Francois P, Hennekine JA, Piot M, Maillard MB, Fauquant J, Loubiere P, Loir YL, Even S. 2011: Staphylococcus aureus virulence and metabolism are dramatically affected by Lactococcus latis in cheese matrix. Environ Microbiol Rep, 3 (3), 340-351. 56. Czop JK, Bergdoll MS 1974: Staphylococcal enterotoxin synthesis during the exponential, transitional, and stationary growth phases. Infect Inmun, 9, 229– 235. 57. DAmico DJ, Groves E, Donnelly CW. 2008: Low incidence of foodborne pathogens of concern in raw milk utilized for farmstead cheese production. J Food Prot, 71 (8), 1580-1589. 58. De Buyser M L, Dufour B, Maire M, Lafarge V. 2001: Implication of milk and milk products in foodborne diseases in France and in different industrialised countries, Int. J. Food Microbiol., 67, 1-17. 59. De Reu K, Grijspeerdt K, Herman L. 2004: A Belgian survey of hygiene indicator bacteria and pathogenic bacteria in raw milk and direct marketing of raw milk farm products. Journal of Food Safety 24, 17-36. 60. Derzelle S, Dilasser F, Duquenne M, Deperrois V. 2009: Differential temporal expression of the staphylococcal enterotoxins genes during cell growth. Food Microbiol, 26, 896–904. 116 61. Delbes C, Alomar J, Chougui N, Martin JF, Montel MC. 2006: Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production during the manufacture of uncooked, semihard cheese from cows raw milk. J Food Prot, 69 (9), 2161-2167. 62. Deurenberg R, Nieuwenhuis R, Driessen C et al. 2005: The prevalence of the Staphylococcus aureus tst gene among community- and hospital-acquired strains and isolates from Wegener's Granulomatosis patients. FEMS microbiol. lett. 245: 185-189. 63. Devriese LA. 1990: Staphylococci in healthy and diseased animals. J. Appl. Bact. Symposium Supplement, 71S–80S. 64. Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. 2000: Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin. Microbiol. Rev. 13:16–34. 65. Do Carmo LS, Cummings C, Linardi VR, Dias RS, De Souza JM, De Sena MJ, Dos Santos DA, Shupp JW, Pereira RK, Jett M. 2004: A case of a massive staphylococcal food poisoning incident. Foodborne Pathog Dis, 1(4), 241-246 66. Dudríková E, Poľaková L, Pukáĉová J. 2010: Health and hygienic conditions of ewes' milk processeing from the aspect of food safety. Potravinarstvo, 4: 14-18. 67. El-Sharoud WM, Spano G. 2008: Diversity and eneterotoxigenicity of Staphylococcus spp. associated with domiaty cheese. J Food Prot, 71 (12), 2567- 2571. 68. Ertas N, Gonulalan Z, Yildirim Y, Kum E. 2010: Detection of Staphylococcus aureus enterotoxins in sheep cheese and dairy desserts by multiplex PCR technique. Int J Food microbiol, 142: 74-77. 69. Euzéby JP. 2012: List of procaryotic names with standing in nomenclature: - Genus Staphylococcus. http://www.bacterio.ciet.fr/s/staphylococcus.html. 70. Evenson ML, Ward Hinds M, Bernstein RS and Bergdoll MS. 1988: Estimation ofhuman dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk. Int J Food Microbiol, 7, 311–316. 71. Farrell GM and Upton ME. 1978: The effect of low temperature on the growth and survival of Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium when inoculated onto bacon. Journal of Food Technology, 13:15-23. 117 72. Farrell AM,Taylor D, Holland KT. 1995: Cloning, nucleotide sequence determination and expression of the Staphylococcus aureus hyaluronate lyase gene. FEMS Microbiol Lett, 130 : 81 – 85. 73. Ferrari P, Tiberti D, Rossi MV, Vencia W, Costa A, Magliola R, Demicheli V, Biorci F. 2011: [Il sistema di sorveglianza dei focolai epidemicidi malattie trasmesse da alimenti della regione Piemonte. Rapporto 2010 Centro M.T.A]. [Book in Italian]. Regione Piemonte ed., Torino, Italy 74. Fitzgerald JR, Monday SR, Foster TJ, Bohach GA, Hartigan PJ, Meaney WJ, Smyth CJ. 2001: Characterization of aputative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens. J Bacteriol, 183:63–70. 75. Fooladi Imani AA., Tavakoli HR, Naderi A. 2010: Detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates in domestic dairy producyts. Iranian Journal of Microbiology, 2 (3), 135-140. 76. Freney J, Kloos WE, Hajek V and JA. 1999: Webster, for the Subcommittee on the taxonomy of staphylococci and streptococci of the International Committee on Systematic Bacteriology, with the help of M. Bes' Y Brunl and Vernozy- Rozand C: Recommended minimal standards for description of new staphylococcal species. International Journal of Systematic Bacteriology, 49, 489-502. 77. Garzoni C, Kelley W. 2009: Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistance. Trends Mmicrobiol, 17: 59-65. 78. Genigeorgis C, Foda MS, Mantis A and Sadler WW. 1971: Effect of sodium chloride and pH on enterotoxin C production. Applied and Environmental Microbiology, 21:862-866. 79. Genigeorgis CA. 1989: Present state of knowledge on staphylococcal intoxication. Int J Food Microbiol 9: 327–360. 80. Giezendanner N, Meyer B, Gort M, Muller P. et Zweifel C. 2009: [Raw milkassociated Staphylococcus aureus intoxication in children]. Schweiz Arch Tierheilkd 151 (7), 329-31. 81. Gillaspy AF, Lee CY, Sau S, Cheung AL, and Smeltzer MS. 1998: Factors affecting the collagen binding capacity of Staphylococcus aureus. Infect Immun, 66: 3170 – 3178 . 118 82. Grov A. 1973: Studies on the interaction between staphylococcal protein A and the Fc region of immunoglobulin G . Acta Pathol Microbiol Scand, Suppl. 236 : 77 – 83 . 83. Haeghebaert S, Le Querrec F, Gallay A, Bouvet P, Gomez M. and Vaillant V. 2002: Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000. Bull. Epidémiol. Hebdo. 23: 105-109. 84. Halpin-Dohnalek M, Marth E. 1989: Staphylococcus aureus: Production of extracellular compounds and behaviour in foods - a review. J Food Prot, 52: 267-282. 85. Hassani S, Doust HR, Mobarez AM. 2014: Enterotoxin A gene barrier Staphylococcus aureus within tradicionally dairy produczts of Tehran. Int J Enteric Pathog, 2(4):e2096. 86. Hennekinne, JA, Ostyn Florence Guillier, Sabine Herbin, Anne-Laure Prufer, Sylviane Dragacci. 2010: How should staphylococcal food poisoning outbreaks be characterized? Toxins, 2, 2106-2016. 87. Hennekinne JA, De Buyser Marie-Laure, Dragacci Sylviane. 2012: Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins:characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 36, 815–836. 88. Hermans K, Devriese LA and Haesebrouck F: Staphylococcus. In: Gyles CL, John F, Prescott JF, Songer JG, Thoen CO editors. Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals Fourth Edition, Blackwell Publishing ISBN-13: 978-0- 8138-1237-3/2010 Ames, Iowa, USA, 2010, 75-89. 89. Holeĉková Beáta, Holoda E, Fotta M, Kalináĉová Viera, Gondol J, Grolmus. 2002: Occurrence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in food. Ann Agric Environ Med. 2002; 9:179–182. 90. Holmberg SD, Blake PA. 1984: Staphylococcal food poisoning in the United States. New facts and old misconceptions. JAMA, 251, 487–489. 91. Howard P. 2006: Mastitis pathogens present in bulk tank milk from seven dairy herds in the Waikato region, New Zealand. New Zealand Veterinary Journal 54, 41-43, 92. Hunt Karen, Jenny Schelin, Peter Rådström, Francis Butler, Kieran Jordan. 2012: Classical enterotoxins of coagulase-positive Staphylococcus aureus 119 isolates from raw milk and products for raw milk cheese production in Ireland. Dairy Sci and Technol, 92,5, 487-499. 93. Ikeda T, Naoto T, Yamaguchi K, Makino S. 2005: Mass Outbreak of food poisoning disease caused by small amounts of staphylococcal enterotoxins A and H. Applied and Environmental Microbyology, 71, 5, 2793-2795. 94. Ikeda T., Morimoto Y., Makino S., Yamaguchi K. 2006: Surveilllance of Staphylococcus aureus in cheese produced in Hokkaido. J Food Prot, 69 (3), 516-519. 95. International Commission on Microbiological Specifications for Foods: Staphylococcus aureus. In: Microorganisms in foods: Microbiological specifications of food pathogens, Ed: T. A. Roberts, A. C. Baird-Parker and R. B. Tompkin, 299-333. Blackie Academic, 1996, London. 96. ISO 8261:2001. Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination. 97. Jablonski LM & Bohach G: Staphylococcus aureus. In: Doyle MP, Beuchat LR, Montville TJ (Eds.), Food microbiology fundamentals and frontiers 2nd ed, Washington, DC, USA: ASM Press, 1997, 353–357. 98. Јablonski L, Bohach GA: Staphylococcus aureus. In Food microbiology fundamentals and frontiers, Doyle MP, Beuchat LR, Montville TJ (Eds): American society of Microbiology Press: Washington, DC, USA, 2001, 411– 434. 99. Jakobsen RA, Heggebo R, Sunde EB, Skjervheim M. 2011: Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in Norwegian raw milk cheese production. Food Microbiology, 28(3), 492-6. 100. Jarraud S, Peyrat MA, Lim A, Tristan A, Bes M, Mougel C, Etienne J, Vandenesch F, Bonneville M, Lina G. 2001: egc, a highly prevalent operon of enterotoxin gene, forms a putative nursery of superantigens in Staphylococcus aureus. J Immunol, 166: 669–677. 101. Jay J. 2000: Staphylococcal gastroenteritis. In: Jay J, editor. Modern Food Microbiology. Gaithersburg, Aspen Publishers, 441-459. 120 102. Jayarao BM, Pillai SR, Sawant AA, Wolfgang DR, Hegde NV. 2004: Guidelines for monitoring bulk tank milk somatic cell and bacterial counts. Journal of Dairy Science 87, 3561-3573. 103. Jørgensen HJ, Mørk LM, Rørvik LM. 2005a: The occurrence of Staphylococcus aureus on a farm of small-scale production of raw milk cheese. J Dairy Sci 88 (11), 3810-3817. 104. Jørgensen HJ, Mathisen T, Løvseth A, Omoe K, Qvale KS, Lonarevic S. 2005b: An outbreak of staphylococcal food poisoning caused by enterotoxin H in mashed potato made with raw milk. FEMS Microbiol Lett, 15, 252(2):267-72. 105. Kérouanton A, Hennekinne JA, Letertre C, Petit L, Chesneau O, Brisabois A, De Buyser ML:: Characterization of Staphylococcus aureus strains associated with food poisoning outbreaks in France. Int J Food Microbiol, 2007,115, 369–375. 106. Kitamoto M, Kito K, Niimi Y, Shoda S, Takamura A, Hiramatsu T, Akashi T, Yokoi Y, Hirano H, Hosokawa M, Yamamoto A, Agata N, Hamajima N. 2009: Food poisoning by Staphylococcus aureus at a university festival. Jpn. J. Infect. Dis, 62, 242–243. 107. Kloos WE and Schleifer KH. 1986: Genus IV. Staphylococcus. In Bergey’s manual of systematic bacteriology. Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG (Eds.). Baltimore:Williams and Wilkins, Vo 2, 1013-1035. 108. Kluytmans, JAJW, Wertheim HFL. 2005: Nasal carriage of Staphylococcus aureus and prevention of nosocomial infections. Infection, 33, 3–8. 109. Kornblum J, Kreiswirth B, Projan SJ, Ross H and Novick RP. 1990: Agr : a polycistronic locus regulating exoprotein synthesis in Staphylococcus aureus. In Molecular Biology of the Staphylococci. Novick, R.P. (ed.). New York: VCH Publishers, pp. 373–402. 110. Korpysa-Dzirba Weronika and Osek Jacek. 2011: Identification of genes encoding classical staphylococcal enterotoxins in Staphylococcus aureus isolated from raw milk. Bull Vet Inst Pulawy, 55-58. 111. Kousta M, Mataragas M, Skandamis P, Drosinos HE. 2010: Prevalence and sources of cheese contamination with pathogens at farm and processing levels. Food Control, 21: 805-815. 121 112. Larkin EA, Carman RJ, Krakauer T, Stiles BG: Staphylococcus aureus: the toxic presence of a pathogen extraordinaire. Curr Med Chem, 2009, 16, 4003–4019. 113. Lawrinowitz-Paciorek M, Kochman M, Piekarska K, Grochowska A, Windyga B. 2007: The distribution of enterotoxin and enterotoxin-like genes in Staphylococcus aureus strains isolated from nasal carriers and food samples. International Journal of Food Microbiology, 117, 319-323. 114. Le Loir Y, Baron F, Gautier M. 2003: Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and Molecular Research, 2, 7–28 115. Letertre C, Perelle S, Dilasser F, Fach P. 2003: Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by the egc cluster of Staphylococcus aureus. J. Appl. Microbiol. 95, 38–43. 116. Lindblad M, Karnehed N, Lindqvist R, Hjertqvist M. 2010: Rapporterade misstänkta matförgiftningar 2009: National Food Agency. www.slv.se. 117. Lindblad M, Westöö A, Lindqvist R, Hjertqvist M, Andersson Y. 2008: Rapporterade misstänkta matförgiftningar 2007: www.slv.se. 118. Lindblad M, Westöö A, Lindqvist R, Hjertqvist M, Andersson Y. 2009: Matförgiftningar i Sverige - analys av rapporterade matförgiftningar 2003-2007 (Foodborne disease in Sweden - analysis of reported incidents in 2003-2007). Uppsala: National Food Administration. www.slv.se. 119. Lindqvist, R., A. Westöö, M. Hjertqvist and Y. Andersson. 2004: Rapporterademisstänkta matförgiftningar 2003. www.slv.se. 120. Lindqvist R, Westöö A, Hjertqvist M. and Andersson Y. 2005: Rapporterade misstänkta matförgiftningar 2004. www.slv.se. 121. Lindqvist R, Westöö A, Hjertqvist M, Andersson Y. [Reported suspected food poisonings 2005]. 12 oktober 2006 {In Swedish]. Available from: http://www.slv.se/upload/dokument/rapporter/matforgiftning_mathantering/200_ Rapporterade_Matforgiftningar_2005.pdf. 122. Little CL, Rhoades JR, Sagoo SK, Harris J, Greenwood M, Mithani V, et al. 2008: Microbial quality of retail cheese made from raw, thermised or pasteurized milk in UK. Food Microbiology, 25, 304–312. 122 123. Mamo W, Froman G,Wadstrom T. 1988: Interaction of sub-epithelial connective tissue components with Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci from bovine mastitis . Vet Microbio, 18 : 163 – 176 . 124. Mc Gavin MJ, Zahradka C, Rice K,. Scott JE. 1997: Modification of the Staphylococcus aureus fibronectin binding phenotype by V8 protease. Infect Immun, 65 : 2621 – 2628. 125. Medvedova Alţibeta, Valik L, Studeniĉová A. 2009: The effect of temperature and water activity on the growth of Staphylococcus aureus. Czech Journal of Food Science, Special Issue 2: S2-28-S2-35. 126. Medvedova A, Studenicova A, Valik L, Horvathova Z. 2014: Prevalence and growth dynamics of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates in Slovakian dairy products. Czech J Food Sci, Vol 32, No 4, 337-341. 127. Medvedova A,Valik L. 2012: Staphylococcus aureus: Characterization and quantitative growth description in milk and artisanal raw milk production. Chapter 4, Licensee InTech http://dx.doi.org/10.5772/48175 128. Montville TJ, Matthews KR. 2008: Food microbiology: 2nd ed, ASM Press, Washington D.C. 129. Meyrand A, Boutrand-Loei S, Ray-Gueniot S, Mazuy C, Gaspard C E, Jaubert G, Perrin G, Lapeyre C and Vernozy-Rozand C. 1998: Growth and enterotoxin production of Staphylococcus aureus during the manufacture and ripening of Camembert-type cheeses from raw goats' milk. Journal of Applied Microbiology, 85:537-544. 130. Moraes Mendonca Paula, Vicosa Gabriela Nogueira, Yamazi KA, Ortolani Tassinari Maria Beatriz, Nero AL. 2009: Food borne pathogens and microbiological characteristics of raw milk soft cheese produced and on retail sale in Brazil. Foodborne Pathogens and Disease, 6 (2), 245-249. 131. Morandi S, Brasca M, Lodi R, Cremonesi P, Castiglioni B. 2007: Detection of classical enterotoxins and identification of enterotoxin genes in Staphylococcus aureus from milk and dairy products. Veter Microbiol. 124:66–72. 132. Murray RJ. 2005: Recognition and management of Staphylococcus aureus toxin-mediated disease. Internal Medicine Journal, 35, supplement 2, S106– S119. 123 133. Normanno G, Firinu A, Virgilio S, Mula G, Dambrosio A, Poggiu A, Decastelli V, Mioni R, Scuota S, Bolzoni G, Di Giannatale E, Salinetti AP, La Salandra G, Bartoli M, Zuccon F, Pirino T, Sias S, Parisi A, Quaglia NC, Celano GV. 2005: Coagulase positive staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy. Int J of Food Micro, 98, 73-79. 134. Normanno G, La Salandra G, Dambrosio A, Quaglia NC, Corrente M, Parisi A, Santagada G, Firinu A, Crisetti E, Celano GV. 2007: Occurrence, characterization and antimicrobial resistance of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from meat and dairy products. International Journal of Food Microbiology, 115:290–296. 135. Notermans S, Heuvelman CJ. 1983: Combined effect of water activity, pH and sub-optimal temperature on growth and enterotoxin production of Staphylococcus aureus. J Food Sci, 48:1832-1840. 136. Novick RP, Schlievert P, Ruzin A. 2001: Pathogenicity and resistance islands of staphylococci. Microbes Infect, 3: 585–594. 137. O’Brien M, Hunt K, McSweeney S, & Jordan K. 2009: Occurrence of foodborne pathogens in Iris farmhouse cheese. Food Microbiology, 26, 910-914. 138. Oh SK, Lee N, Cho YS, Shin DB, Choi SY, Koo M. 2007: Occurrence of toxigenic Staphylococcus aureus in ready-to-eat food in Korea. J Food Prot, 7(5), 1153-1158. 139. Omoe K, Hu DL, Takahashi-Omoe H, Nakane A, Shinagawa K. 2003: Identification and characterization of a new staphylococcal enterotoxin-related putative toxin encoded by two kinds of plasmids. Infect Immun, 71, 6088–6094. 140. Omoe K, Imanishi K, Hu DL, Kato H, Fugane Y, Abe Y, Hamaoka S, Watanabe Y, Nakane A, Uchiyama T, Shinagawa K. 2005: Characterization of novel staphylococcal enterotoxin-like toxin type P. Infect. Immun, 73, 5540–5546. 141. Ono HK, Omoe K, Imanishi K, Iwakabe Y, Hu DL, Kato H, Saito N, Nakane A, Uchiyama T, Shinagawa K. 2008: Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins types S and T. Infect Immun, 76, 4999–5005. 142. Orwin PM, Leung DY, Donahue HL, Novick RP, Schlievert PM. 2001: Biochemical and Biological Properties of Staphylococcal Enterotoxin K. Infect Immun, 69, 360–366. 124 143. Orwin PM, Leung DYM, Tripp TJ, Bohach GA, Earhart CA, Ohlendorf DH, Schlievert PM. 2002: Characterization of a novel staphylococcal enterotoxin- like superantigen, a member of the group V subfamily of pyrogenic toxins. Biochemistry, 41, 14033–14040. 144. Ostyn A, De Buyser ML, Guillier F, Groult J, Felix B, Salah S, Delmas G, Hennekinne JA. 2009: First evidence of a food poisoning outbreak due to staphylococcal enterotoxin type E, France, Euro Surveill 15:1–4. 145. Ote I, Taminiau B, Duprez JN, Dizier I, Mainil JG. 2011: Genotypic characterization by polymerase chain reaction of Staphylococcus aureus isolates with bovine mastitis. Vet Microbiol, 153: 285-292. 146. Otero A, García ML, García MC, Moreno B, Bergdoll MS. 1990: Production of staphylococcal enterotoxins C1 and C2 and thermonuclease throughout the growth cycle. Appl Environ Microbiol, 56, 555–559. 147. Park JK, Lim JH, Seo YD, Kim NY, Lim DY, Yoon SJ, Choi JS,Koh HB. 2000: Studies on the enterotoxin-production and coagulase serotyping of Staphylococcus aureus isolated from cows in Chonnam province. Korean J Vet Serv, 23(4), 313-320. 148. Paullin Susan, Beverley Horn, John Andrew Hudson. 2012: Factors influencing staphylococcal enterotoxin production in Dairy Products. Prepared for the Ministry of Agriculture and Forestry under project MFS/10/10, Client report no. FW 11034. 149. Peles F, Wagner M, Varga L, Hein I, Rieck P, Gutser K, Kereszturi P, Kardos G,Turcsanyi I, Beri B, Szabo A. 2007: Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine milk in Hungary. Int J of Food Micro, 118, 186-193. 150. Pelisser M, Klein C, Ascoli KR, Zotti TR, Arisi ACM. 2008: Occurence of S. aureus and multiplex PCR detection of classic enterotoxin genes in chceese and meat products. Brazilian Journal of Microbiology, 40: 145–148. 151. Pereira V, Lopes C, Castro J, Silva J, Gibbs PM, Teixeira P. 2009: Characterization for enterotoxin production,virulence facrors and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from various foods in Portugal. Food Microbyology, 26, 278-282. 125 152. Poli A, Guglielmini E, Sembeni S, Spiazzi M, Dellaglio F, Rossi F, Torriani S. 2007: Detection of Staphylococcus aureus and enterotoxin genotype diversity in Monte-Veronese, a protected disignation of origin Italian cheese. Letters in Appl Micro, 45, 529-534. 153. Post D. 1999: S. aureus. Food-borne pathogens. Basingstoke, Oxoid, 6 p. 154. Pravilnik o opštim i posebnim uslovima higijene hrane u bilo kojoj fazi proizvodnje, prerade i prometa. Sluţbeni glasnik RS 72/10. 155. Pravilnik o kvalitetu proizvoda od mleka i strter kultura. Sluţbeni glasnik RS 33/10. 156. Pravilnik o izmenama i dopuni pravilnika o kvalitetu proizvoda od mleka i starter kultura. Sluţbeni glasnik RS 34/14. 157. Pedonese Francesca, D’ascenzi C, Torracca Beatrice, Zingoni Clizia, Turchi Barbara, Fratini F, Rnuvaloni Roberta. 2014: Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in Italian caciotta cheese. Turk J Vet Anim Sci (2014) 38: 318-324. doi:10.3906/vet-1307-2. 158. Projan SJ and Novick RP. 1997: The molecular basis of pathogenicity. In The staphylococci in human disease . Crossley KB and Archer GL (eds.). New York, Churchill Livingstone Inc, 55 – 81. 159. Qi Y and Miller KJ. 2000: Effect of low water activity on staphylococcal enterotoxin A and B biosynthesis. Journal of Food Protection, 63:473-478. 160. Radovanovic SR and Katic V. 2009: Influence of lactic acid bacteria isolates on Staphylococcus aureus growth in skimmed milk. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 15:196-203. 161. Radovanovic SR: Identifikacija mehanizama koji utiĉu na destrukciju zajednice Staphylococcus aureus u sirevima. Magistrska teza.Veterinarski fakultet, 2000, Beograd. 162. Raj HD and Bergdoll MS. 1969: Effect of enterotoxin B on human volunteers. J Bacteriol, 98, 833–834. 163. Rajić SN: Fenotipske i genotipske karakteristike koagulaza pozitivnih stafilokoka izolovanih iz vimena krava. Doktorska disertacija, Fakultet veterinarske medicine, 2013, Beograd. 126 164. Rall VL, Vieira FP, Rall R,Vieitis RL,Fernandes JrA, Candeias JMG,Cardoso KFG,Araujo JrJP. 2008: PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Veterinary Microbiology, 132, 408-413. 165. Rola JG, Korpysa-Dzirba W, Osek J. 2013: Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins at different stages of production of raw milk cheeses - preliminary results. Bull Vet Inst Pulawy, 57, 341-345. 166. Rosengren A, Fabricius A, Guss B, Sylvén, S, Lindqvist R. 2010: Occurence of food-borne pathogens and characterizations of Staphylococcus aureus in cheese produced in farm-dairies. Int J Food Microbiol, 144: 263-269. 167. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M, Roy SL, Jones JL, Griffin PM. 2011: Foodborne illness acquired in the United States-Major pathogens. Emerging Infectious Diseases, 17(1):7–11. 168. Schelin J, Crlquist-Wailin N, Cohn Thorup M, Lindquist R, Barker CG, Radstrom P. 2001: The formation of Staphylococcus aureus enterotoxin in food environments and advances in risk assessment. Virulence, 2(6), 580-592. 169. Schleifer KH and Kandler O. 1972: Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol. Rev. 36:407–477. 170. Schmid D, Gschiel E, Mann M, Huhulescu S, Ruppitsch W, Boehm G, Pichler J, Lederer I, Hoeger G, Heuberger S, Allerberger F. 2007: Outbreak of acute gastroenteritis in an Austrian boarding school, September 2006. Eurosurveillance, 12(3):5. 171. Schmid D, Fretz R, Winter P, Mann M, Höger G, Stöger A, Ruppitsch W, Ladstätter J, Mayer N, de Martin A, Allerberger F. 2009: Outbreak of staphylococcal food intoxication after consumption of pasteurized milk products, June 2007, Austria. Wien. Klin. Wochenschr. 121, 125–131. 172. Schmitt M, Schuler-Schmid U. and Scmidt-Lorenz W. 1990: Temperature limits of growth, TNase, and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strains isolated from foods. Int. J. Food Microbiol. 11: 1-19 173. Schmitz FJ,. Veldkamp KE, Van Kessel KPM, Verhoef J, Van Strijp JAG. 1997: Delta-toxin from Staphylococcus aureusas a costimulator of human neutrophil oxidative burst . J Infect Dis, 176:1531 – 1537. 127 174. Shafer WM & Iandolo JJ. 1978: Chromosomal locus for staphylococcal enterotoxin B. Infect Immun, 20: 273–278. 175. Shalita Z, Hertman, Sarid S. 1977: Isolation and characterization of a plasmid involved with enterotoxin B production in Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 129: 317–325. 176. Shimizu A, Fujita M, Igarashi H, Takagi M, Nagase N, Sasaki A, Kawano J. 2000: Characterization of Staphylococcus aureus coagulase type VII isolates from staphylococcal food poisoning outbreaks (1980–1995) in Tokyo, Japan, by pulsed field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 38, 3746–3749. 177. Smith JL, Buchanan RL, Palumbo SA. 1983: Effect of food environment on staphylococcal enterotoxin synthesis: A review. Journal of Food Prot, 46:545- 555. 178. Soell M, Diab M, Haan-Archipoff G, Beretz A, Herbelin C, Poutrel B, and Klein JP. 1995: Capsular polysaccharide types 5 and 8 of Staphylococcus aureus bind specifically to human epithelial (KB) cells, endothelial cells, and monocytes and induce release of cytokines. Infect. Immun. 63: 1380–1386. 179. Soriano JM, Font G, Rico H, Molto JC, Manes J. 2002: Incidence of enterotoxigenic staphylococci and their toxins in food. J of Food Prot, 65 (5), 857-860. 180. Soell M, Diab M,. Haan AG, Beretz A, Herbelin C, Poutrel B, Klein JP. 1995: Capsular polysaccharide types 5 and 8 of Staphylococcus aureus bind specifically to human epithelial (KB) cells, endothelial cells, and monocytes and induce release of cytokines . Infect. Immun, 63 : 1380 – 1386. 181. Sospedra I, Rubert VJ, Soler C, Soriano MJ, Manes J. 2009: Microbial contamination of milk and dairy products from restaurants in Spain. Foodborne Pathogens and disease, 6 (10), 1269-1272. 182. SRPS EN ISO 6888-2, Mikrobiologija hrane i hrane za ţivotinje-Horizontalnom metodom za odreĊivanje koagulaza pozitivnih stafilokoka (Staphylococcus aureus i druge vrste)-Deo 1: Tehnika upotrebom agara po Baird-Parkeru. 183. Stephan R, Buehler K, Lutz C. 2002: Prevalence of genes encoding enterotoxins, exfoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus 128 strains isolated from bulk-tank milk samples in Switzerland. Milchwissenschaft 57, 502–504. 184. Tatini SR. 1973: Influence of food environments on growth of Staphylococcus aureus and production of various enterotoxins. Journal of Milk and Food Technology, 36:559-563. 185. Tatini SR. 1976: Thermal stability of enterotoxins in food. J of Milk Technology, 39,432-438 186. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Foodborne Outbreaks in 2009. EFSA J, 2011, 9: 378. 187. Thomas DV, Jarraud S, Lemercier B, Cozon G, Echasserieau K, Etienne J, Gougeon MI, Lina G. and Vandensch F. 2006: Staphylococcal enterotoxin-like toxins U2 and V, two new staphylococcal superantigens arising from recombination within the enterotoxin gene cluster. Infect. Immun. 74: 4724- 4734. 188. Thomas D, Chou S, Dauwalder O, Lina G. 2007: Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins. Chem Immunol Allergy, 93, 24–41. 189. Tkacikova L, Tesfaye A, Mykula I. 2003: Detection of the genes for Staphylococcus aureus enterotoxin by PCR. Acta Vet Brunensis. 72:627– 630. 190. Tremaine MT, Brockman DK, Betley MJ. 1993: Staphylococcal enterotoxin A gene (sea) expression is notaffected by the accessory gene regulator (agr). Infect Immun, 61: 356–359. 191. Uchiyama T, Imanishi K, Miyoshi-Akiyama T, Kato H. 2006: Staphylococcal superantigens and the diseases they cause. In The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, 3rd ed, Alouf JE, Popoff MR, Eds. Academic Press, Burlington, VT, USA, 830–843. 192. Urachimeg T, Giovanni N, Marit P, Karel K. 2007: Occurrence of enterotoxic Staphylococcus aureus in raw milk from Yaks and Cattle in Mongolia, J of Food Prot, 70(7), 1726-1729. 193. Valero A, Rodriguez-Perez F, Carrasco E, Alventosa-Fuentes JM, Gimeno- Garcia RM, Zurera G. 2009: Modelling the growth boundaries of 129 Staphylococcus aureus effect of temperature, pH and water activity. Int J of Food Micro, 133, 186-194. 194. Varaldo PE, Kilpper-Balz R, Biavasco F, Satta G, Schleifer KH. 1988: Staphylococcus delphini sp. nov. a Coagulase-Positive Species Isolated from Dolphins Int J of Systemic Bacteriology, 38, 436-439. 195. Veras JF, do Carmo LS, Tong LC, Shupp JW, Cummings C. Dos Santos DA, Cerqueira MM, Cantini A, Nicoli JR, Jett M. 2008: A study of the enterotoxigenicity of oagulase-negative and coagulase-positive staphylococcal isolates from food poisoning outbreaks in Minas Gerais, Brazil. Int. J. Infect. Dis. 12, 410–415. 196. Vicosa NG, Le Loir A, Le Loir Y, de Cavalho AF, Nero LA. 2013: egc characteriyation of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates obtained from raw milk and cheese. International Journal of Food Microbilogy, 165, 227- 230. 197. Vojtov N, Ross HF, Novick RP. 2002: Global repression of exotoxin synthesis by staphylococcal superantigens. P Natl Acad Sci USA, 99: 10102–10107. 198. Wieneke AA, Roberts D, Gilbert RJ: Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom, 1969–90. Epidemiol Infect, 1993, 110, 519–531. 199. Yang SE, Yu RC and Chou CC. 2001: Influence of holding temperature on the growth and survival of Salmonella spp. and Staphylococcus aureus and the production of staphylococcal toxin in egg products. International Journal of Food Microbiology, 63:99-107. 200. Yarwood JM, McCormick JK, Paustian ML, Orwin PM, Kapur V, Schlievert PM. 2002: Characterization and expression analysis of Staphylococcus aureus pathogenicity island 3. Implications for the evolution of staphylococcal pathogenicity islands. Biol Chem, 277, 13138–13147. 201. Zhang S, Iandolo JJ, Stewart GC. 1998: The enterotoxin D plasmid of Staphylococcus aureus encodes a second enterotoxin determinant (sej). FEMS Microbiol Lett, 168: 227–233. 202. Zhang S, Maddox CW. 2000: Cytotoxic activity of coagulase-negative staphylococci in bovine mastitis. Infect Immun, 68(3), 1102-1108. 130 203. Zigo F, Vasiľ M, Kadáši M, Eleĉko J, Earkašova Z. 2011: Bacteria Staphylococcus spp. isolated from from mastitis of sheep and their enterotoxigenic properties. Potravinarstvo, 5: 70-72. 204. Zocche F, Bastos CP, da Silva WP. 2010: Detection of genes of egc cluster in Staphylococcus aureus isoalated from foods of animala origin. Ciencia rural, Santa Maria, 40 (5), 1134-1140. 131 9. PRILOZI Prilog 1. Broj uzoraka sireva uzorkovanih na pijacama u toku ispitivanja Redni broj Pijaca Broj sireva Ukupno Od kuvanog mleka Od nekuvanog mleka 1 Novi Beograd-blok 44 31 39 70 2 Banjica 27 34 61 3 Zemun 9 38 47 4 Kalenić 6 26 32 5 Zeleni venac 12 22 34 6 Skadarlija 9 27 36 7 Cvetko 27 18 45 8 Banovo brdo 10 26 36 9 Novi Beograd-Merkator 4 4 8 10 Lazarevac 21 - 21 11 Palilula 11 14 25 12 Guĉa 16 - 16 13 Vidikovac 16 13 29 14 Bele vode 8 7 15 15 Ţeleznik 14 6 20 16 Sremĉica 17 6 23 17 Đeram 15 22 37 Ukupno 253 302 555 Prilog 2. Broj i vrsta uzoraka sireva koji su korišćeni za ispitivanja na osnovu dokazanog prisustva koagulaza pozitivnih stafilokoka Vrsta sira Od kuvanog mleka Od nekuvanog mleka Ukupno Bez zrenja Sa zrenjem Bez zrenja Sa zrenjem Kiselo- koagulišući 2 - 36 1 39 Slatko- koagulišući 24 2 98 5 129 Ukupno 26 2 134 6 168 132 Prilog 3. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i hemijskih parametara (pH, sadrţaj masti u suvoj materiji, sadrţaj vode i vode u bezmasnoj materiji)u slatko-koagulišućim sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 1. 5a/n Ub 12 h 1,00 5,27 50,98 76,89 2. 9b/n Ub 12 h 2,30 5,77 75,47 86,07 3. 21/n Ub 2-3 dana 2,84 5,96 36,43 72,77 4. 23/n Sopot-Kosmaj 7 dana 5,57 4,77 72,08 78,95 5. 25/n Selevac- Smed.Palanka 2 dana 3,00 5,37 59,38 85,49 6. 26/n Brankovina- Valjevo 3 dana 4,56 5,80 40,60 67,89 7. 34/n Kosmaj 7 dana 3,04 4,77 43,45 75,21 8. 36/n Sjenica 30 dana 4,12 4,82 63,23 73,87 9. 11c/n Veliki Mokri lug 12h 3,00 5,32 52,48 74,30 10. 12d/n Zuce 4h 3,52 6,65 49,88 82,27 11. 13d/n Zuce 1-2 dana 5,77 4,79 57,32 76,88 12. 13e/n Zuce 4 dana 5,90 4,76 57,06 82,34 13. 17f/n Ub 1 dan 1,00 5,97 66,57 83,70 14. 37/n Banja Trepĉa- Ĉaĉak 15 dana 1,00 5,50 59,61 74,94 15. 38/n Uţice 7 dana 5,29 5,83 25,29 77,76 16. 40/n Valjevo 5 dana 5,17 5,15 57,04 81,17 133 Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 17. 41/n Trlić-Ub 7 dana 2,90 5,11 54,92 75,48 18. 42/n Trlić-Ub 1 dan 4,34 5,58 46,74 71,51 19. 44/n Trlić-Ub 1 dan 3,93 5,18 62,83 80,28 20. 45/n Trlić-Ub 4-5 dana 4,81 5,69 63,99 80,74 21. 46/n Ub 12 h 5,32 5,46 46,35 72,85 22. 51/n Orašac- Obrenovac 7 dana 5,19 4,91 52,26 72,60 23. 52/n Orašac- Obrenovac 3 dana 3,84 6,15 63,98 78,1s1 24. 55/n Ranilović- AranĊelovac 15 dana 3,00 5,12 63,57 75,44 25. 58/n Priĉević- Valjevo 1-2 dana 4,48 6,52 43,09 78,50 26. 59/n Priĉević- Valjevo 3 dana 3,90 6,25 57,77 79,38 27. 62/n Jagnjilo- Mladenovac 12h 5,66 6,03 62,89 84,32 28. 64/n Banjani-Ub 1 dan 2,48 5,83 54,52 77,82 29. 65/n Banjani-Ub 3 dana 3,00 5,73 66,45 81,33 30. 66/n Banjani-Ub 7 dana 2,00 4,78 76,84 84,44 31. 73/n Ovĉa 1 dan 1,00 6,30 30,03 74,12 32. 75/n Vranić- Barajevo 1 dan 5,68 6,10 63,17 74,36 33. 76/n Krnješevci- Stara Pazova 1 dan 2,30 5,89 76,68 84,95 34. 84/n Stubline-Ub 7 dana 5,67 4,95 57,32 81,39 35. 85/n Ĉedovo-Sjenica do 1m. 3,18 4,79 74,05 83,51 36. 88/n Trlić-Ub 1-2 dana 2,00 5,42 64,65 82,74 134 Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 37. 89/n Trlić-Ub 15 dana 3,00 5,11 69,99 88,42 38. 93/n Vojka-Stara Pazova 1 dan 2,48 4,90 56,74 78,50 39. 95/n Vojka-Stara Pazova 5 dana 4,70 5,29 36,28 69,01 40. 104/n Liplje-Ljig 12h 4,60 6,42 40,31 77,87 41. 105/n Kosmaj- Rogaĉevo 12h 4,58 5,09 55,34 77,24 42. 107/n Kosmaj- Nemenikuće 1-2 dana 2,30 5,34 61,01 81,97 43. 111/n Sopot- Nemenikuće 2 dana 5,46 5,15 61,56 79,18 44. 115/n Sopot- Nemenikuće 3 dana 5,37 5,66 61,21 82,50 45. 116/n Sopot 7 dana 4,39 5,30 56,89 78,63 46. 118/n Valjevo 5 dana 4,60 5,33 51,32 74,02 47. 120/n Valjevo 7 dana 3,90 5,04 55,80 80,20 48. 121/n Orašac- Obrenovac 7 dana 3,69 5,62 62,19 80,80 49. 122/n Crvenka-Ub 12h 4,30 6,60 59,09 80,47 50. 123/n Crvenka-Ub 7 dana 3,52 4,73 51,03 78,22 51. 124/n Bajevac- Valjevo 7 dana 4,14 4,69 59,61 78,60 52. 125/n Arnajevo- Kosmaj 12h 4,60 5,92 50,69 74,92 53. 127/n Bajevac- Valjevo 3-5 dana 3,04 4,73 61,58 72,62 54. 130/n Drlupa-Kosmaj 12h 3,69 5,63 46,24 69,10 55. 131/n Drlupa-Kosmaj 7 dana 2,30 4,77 68,00 74,66 135 Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 56. 132/n Drlupa-Kosmaj 1 dan 4,30 5,86 60,96 81,93 57. 133/n Drlupa-Kosmaj 3-5 dana 3,30 4,89 64,19 80,40 58. 134/n Drlupa-Kosmaj 1 dan 3,48 6,31 54,76 81,86 59. 135/n Stubline- Obrenovac 1 dan 3,74 6,94 37,55 77,32 60. 137/n Stubline Obrenovac 12h 3,86 6,31 53,80 77,18 Prilog 4. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i hemijskih parametara (pH,sadrĊţaj masti u suvoj materiji,sadrţaj vode i vode u bezmasnoj materiji) u slatko-koagulišućim sirevima proizvedenim od kuvanog mleka Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 1. 82/k Belanovica -Ljig 7 dana 2,00 5,55 48,33 76,54 2. 91/k radnja 7 dana 5,19 5,08 16,47 67,63 3. 92/k radnja 5 dana 3,84 5,82 55,25 73,00 136 Prilog 5. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i hemijskih parametara (pH, sadrţaj masti u suvoj materijii vode u bezmasnoj materiji) u kiselo- koagulišućim sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 1. 3/n Valjevo- Lukavac 15 dana 5,46 4,39 48,42 75,01 2. 32/n Ub 3 dana 2,00 4,10 43,72 81,61 3. 43/n Trlić-Ub 7 dana 2,00 4,59 63,07 80,48 4. 53/n Kusadak 4 dana 3,70 4,31 60,55 82,15 5. 67/n Resnik 7 dana 2,78 4,45 53,75 79,15 6. 70/n Trlić-Ub 7 dana 4,63 4,61 59,67 73,72 7. 71/n Ovĉa 3 dana 1,00 4,22 65,21 88,20 8. 72/n Jagnjilo- Mladenovac 2 dana 5,54 4,41 52,17 87,02 9. 74/n Jagnjilo- Mladenovac 2 dana 4,08 4,30 66,66 86,71 10. 78/n Jagnjilo- Mladenovac 5-6 dana 2,00 4,30 69,51 82,94 11. 81/n Zuce-Avala 2 dana 3,95 4,30 62,44 84,01 12. 94/n Vojka- Stara Pazova 2 dana 1,00 4,25 59,19 85,88 13. 96/n Sopot- Nemenikuće 2 dana 2,00 4,39 48,81 82,93 14. 102/n Vojka 4 dana 2,00 4,28 57,34 83,64 15. 103/n Belegiš 3 dana 4,30 4,25 64,49 88,72 16. 109/n Krnješevci 12h 2,00 4,44 59,46 86,04 17. 112/n Vojka 2 dana 3,00 4,13 69,86 87,83 18. 114/n Krnješevci 1 dan 2,60 4,12 58,46 84,46 19. 98/m Ugrinovci 1 dan 3,04 4,25 55,27 84,01 137 Prilog 6. Rezultati odreĊivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka i hemijskih parametara (pH, sadrţaj masti u suvoj materijii vode u bezmasnoj materiji) u kiselo- koagulišućim sirevima proizvedenim od kuvanog mleka Redni broj Oznaka uzorka Poreklo (mesto) Starost sira Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) pH Mast u SM (%) Voda u bezmasnoj materiji (%) 1. 99/k Pljevlja 30 dana 2,84 4,50 50,46 70,67 138 Prilog 7. Rezultati odreĎivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, fizičko-hemijskih parametara (pH, aw, sadržaj NaCl), broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp.u slatko-koagulišućim sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 1. 4 Rogača-Sopot 1 dan 6,05 0,970 1,316 5,60 8,70 7,04 2. 17 Gornja Bukovica 2-3 dana 4,66 0,965 0,527 4,23 9,54 9,20 3. 20 Belosavac-Topola 7 dana 5,65 0,940 1,404 2,90 8,90 6,90 4. 45 Kusadak 3 dana 4,68 0,970 0,263 4,49 9,17 8,25 5. 47 Kusadak 6 dana 5,03 0,945 1,697 2,21 8,55 7,43 6. 50 Jagnjilo 2 dana 4,62 0,940 1,199 2,70 8,52 6,20 7. 70 Nemenikuće-Sopot 3 dana 4,62 0,972 0,117 3,90 8,33 6,58 8. 79 Nemenikuće-Sopot 7 dana 4,69 0,963 0,351 4,02 8,74 7,41 9. 90 Zuce-Avala 12 h 5,01 0,940 1,433 2,90 9,17 5,23 10. 92 Lazarevac 7 dana 4,96 0,930 1,989 5,59 8,58 6,93 11. 95 Vrelo-Ub 4-5 dana 4,96 0,928 1,989 4,54 8,48 6,83 12. 98 Zuce-Avala 1 dan 5,15 0,950 0,234 5,29 8,64 7,35 13. 111 Čačak 7 dana 5,40 0,961 1,433 5,78 8,45 6,78 14. 116 Požega 3 dana 5,01 0,965 1,346 5,79 8,48 5,48 15. 124 Ripanj 2 dana 5,56 0,956 1,521 3,90 8,56 5,18 16. 125 Ripanj 7 dana 4,95 0,970 0,322 3,26 8,45 6,70 17. 148 Ub 2-3 dana 4,64 0,977 1,141 5,60 8,67 5,93 18. 156 Vranić 7 dana 4,66 0,925 1,404 2,00 9,29 7,45 139 Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 19. 168 Jagnjilo-Mladenovac 2 dana 4,95 0,920 0,907 3,40 8,32 6,02 20. 181 Beli Potok 12 h 4,93 0,920 0,907 2,60 8,60 4,00 21. 182 Beli Potok 2 dana 4,90 0,930 0,878 2,00 8,48 5,08 22. 188 Jagnjilo-Mladenovac 2 dana 5,54 0,961 1,814 5,09 8,34 7,85 23. 189 Jagnjilo-Mladenovac 12 h 5,07 0,965 0,416 3,43 8,56 6,53 24. 225 Brović,Obrenovac 3-4 dana 4,96 0,928 0,731 4,32 7,74 5,59 25. 237 Brović,Obrenovac 3-4 dana 5,28 0,950 0,585 4,60 7,51 5,15 26. 242 Kusadak 7 dana 4,82 0,935 1,667 2,78 7,23 6,18 27. 254 Rabrovac- Mladenovac 1 dan 5,07 0,930 1,580 2,30 8,29 4,30 28. 259 Trlić-Ub 5-6 dana 4,81 0,950 0,965 3,90 8,29 6,03 29. 260 Jagnjilo-Mladenovac 12 h 4,84 0,935 1,492 4,36 7,02 4,90 30. 263 Jagnjilo-Mladenovac 3-4 dana 4,83 0,962 1,872 5,08 7,84 5,32 31. 271 Kusadak 12 h 5,44 0,961 1,492 3,00 7,99 6,51 32. 272 Kusadak 7 dana 5,05 0,940 1,609 4,77 7,99 7,11 33. 302 Joševa-Ub 10 dana 5,17 0,954 1,901 3,57 8,17 7,39 34. 315 Veliki Borak- Barajevo 3 nedelje 4,65 0,957 1,404 2,85 8,28 6,96 35. 342 Takovo-Ub 7 dana 5,78 0,940 2,779 2,30 7,19 6,99 36. 357 Planinica-Divčibare 7 dana 5,63 0,948 1,784 2,60 7,38 6,27 37. 367 Velika Moštanica 4-5 dana 4,73 0,956 0,965 3,30 8,36 7,26 38. 391 Kusadak 3-4 dana 5,15 0,951 1,463 2,95 8,45 7,09 39. 392 Kusadak 7 dana 4,81 0,953 0,995 2,60 8,32 6,99 140 Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 40. 393 Kusadak 7 dana 4,76 0,962 0,497 5,35 8,23 6,73 41. 400 Azanja 7 dana 4,65 0,955 1,082 5,38 8,19 6,91 42. 401 Kusadak 7 dana 4,77 0,960 0,468 3,52 7,29 6,18 43. 65 Krnješevci 3 dana 4,69 0,962 0,205 3,62 8,63 7,64 Prilog 8. Rezultati odreĎivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, fizičko-hemijskih parametara (pH, aw, sadržaj NaCl), broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp.u slatko-koagulišućim sirevima proizvedenim od kuvanog mleka Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 1. 5 Ugrinovci 1 dan 5,23 0,965 1,521 4,27 9,00 8,39 2. 31 Zlatarić-Valjevo 4 dana 5,11 0,962 1,170 4,20 8,71 6,00 3. 43 Ranilović- AranĎelovac 3 dana 5,20 0,96 1,316 2,48 8,84 7,33 4. 44 Ranilović- AranĎelovac 10 dana 4,83 0,956 0,731 3,74 8,51 7,09 5. 53 Ključ-Mionica 4-5 dana 5,32 0,963 0,526 5,39 9,57 6,71 141 Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 6. 57 Ljubić-Čačak 1 dan 5,91 0,976 0,087 5,30 8,50 7,11 7. 110 Čačak 7 dana 5,26 0,965 1,404 5,18 8,56 5,04 8. 112 Čačak 50 dana 4,67 0,934 3,481 2,00 8,41 7,02 9. 164 Gornja Bukovica 1 dan 6,25 0,869 0,614 2,95 8,19 5,54 10. 186 Zagorica-Topola 2 dana 5,53 0,932 1,696 3,83 8,30 6,93 11. 187 Zagorica-Topola 7 dana 5,57 0,93 0,117 3,56 8,38 6,60 12. 202 Bistrica-Lazarevac 12 h 5,86 0,938 0,029 3,60 7,43 6,13 13. 207 Ba,Suvobor 3-4 dana 5,73 0,932 1,813 2,60 7,56 5,40 14. 222 Brović-Obrenovac 7 dana 4,76 0,935 2,135 1,00 8,23 6,16 15. 243 Piroman,Obrenovac 7 dana 4,82 0,93 1,667 2,78 7,23 6,18 16. 245 Pambukovica-Ub 15 dana 4,95 0,905 1,199 2,48 7,72 6,15 17. 248 Gornja Bukovica- Valjevo 2 dana 5,66 0,97 0,322 3,60 8,29 4,30 18. 299 Baćevac-Barajevo 2-3 dana 4,95 0,965 1,492 4,39 8,21 7,29 19. 301 Jasenak-Obrenovac 3 dana 6,21 0,975 0,322 2,00 7,73 7,27 20. 341 Takovo,Ub 2 dana 5,79 0,945 1,784 4,94 7,85 7,04 21. 353 Lukavac,Valjevo 4 dana 5,60 0,955 1,375 2,00 8,02 7,21 22. 370 Zvizdar,Ub 3-4 dana 5,63 0,956 0,848 3,00 8,30 7,21 23. 371 Zvizdar-Ub 7 dana 5,63 0,952 0,907 2,84 8,15 7,29 142 Prilog 9. Rezultati odreĎivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, fizičko-hemijskih parametara (pH, aw , sadržaj NaCl), broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp.u kiselo-koagulišućim sirevima proizvedenim od nekuvanog mleka Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 1. 11 Vojka-Srem 1 dan 4,32 0,959 1,316 2,84 9,81 8,83 2. 41 Gvozdenović-Valjevo 3-4 dana 4,46 0,96 0,292 4,38 8,83 6,43 3. 42 Kraljevo 7 dana 4,43 0,946 1,609 2,00 8,38 7,53 4. 64 Nemenikuće-Sopot 1 dan 4,32 0,969 0,205 5,51 8,93 7,17 5. 93 Lazarevac 4 dana 4,59 0,967 0,241 5,20 8,81 7,72 6. 97 Zuce-Avala 3 dana 4,30 0,97 0,001 4,83 9,36 6,23 7. 132 Jagnjilo 2 dana 4,52 0,945 2,194 2,48 8,60 7,32 8. 195 Vojka-Stara Pazova 2 dana 4,45 0,92 0,322 2,84 8,64 6,81 9. 229 Zuce 3-4 dana 4,42 0,95 0,613 3,63 7,78 6,49 10. 230 Zuce 2-3 dana 4,38 0,925 0,351 5,51 8,11 5,54 11. 231 Zuce 2 dana 4,59 0,96 3,042 3,20 7,68 6,93 12. 239 Gvozdenović-Ub 7 dana 4,56 0,92 1,091 3,39 7,81 6,78 13. 327 Milorci-Ub 7 dana 4,55 0,946 1,726 2,48 8,02 6,25 14. 388 Kusadak 4 dana 4,50 0,964 0,760 3,88 8,45 7,27 15. 389 Kusadak 6 dana 4,60 0,961 1,024 2,00 8,56 6,99 16. 414 Šimanovci 3 dana 4,36 0,969 0,497 2,78 8,32 6,38 17 60 Vojka-Srem 4 dana 4,57 0,96 0,585 2,48 8,78 7,53 18 80 Vojka-Srem 12 h 4,35 0,965 0,001 3,00 8,20 7,56 143 Prilog 10. Rezultati odreĎivanja broja koagulaza pozitivnih stafilokoka, fizičko-hemijskih parametara (pH, aw, sadržaj NaCl), broja Lactococcus spp. i Lactobacillus spp.u kiselo-koagulišućim sirevima proizvedenim od kuvanog mleka Redni br. Oznaka uzorka Poreklo Starost sira pH aw Sadržaj NaCl (%) Broj koagulaza pozitivnih stafilokoka (log cfu/g) Broj Lactococcus spp. (log cfu/g) Broj Lactobacillus spp. (log cfu/g) 1. 227 Brović-Obrenovac 3-4 dana 4,50 0,957 0,73125 1,00 7,68 6,07 144 BIOGRAFIJA AUTORA Mr Radoslava Savić Radovanović je roĊena 23.7.1968. godine u Beogradu. Osnovnu školu i Poljoprivrednu školu-smer veterinarski tehniĉar završila je Beogradu. Na Veterinarski fakultet Univerziteta u Beogradu upisala se 1987/1988. školske godine, a diplomirala 1993. godine sa proseĉnom ocenom 8,57. Kao stipendista Vlade Republike Srbije upisala je 1992/1994.god. posledidplomske studije i magistarku tezu pod naslovom: „Identifikacija mehanizama koji utiĉu na destrukciju zajednice Staphylococcus aureus u sirevima― odbranila je 2000. godine. Posle volontiranja i poloţenog struĉnog ispita angaţovana je za ispomoć u izvoĊenju praktiĉne nastave na Katedri za higijenu i tehnologiju mleka. Za asistenta pripravnika na predmetu Higijena mleka izabrana je 1996. godine, za asistenta na istom predmetu prvi put je izabrana 2001. godine, ponovo je izabrana 2005. i 2008. i 2013. godine. U periodu od izbora u zvanje asistenta pripravnika bila je dva puta na porodiljskom odsustvu. Kao istraţivaĉ uĉestvovala je u realizaciji zadataka iz projekata koje je finansiralo Ministarstvo za nauku i tehnologiju: Od diplomiranja do danas Mr Radoslava Savić Radovanović objavila je u zajednici sa drugim autorima 20 radova. 145 Прилог 1. ИЗЈАВА О АУТОРСТВУ Потписани-a Mr Radoslava Savić Radovanović број уписа ________________________________________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Procena rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekim sirevima  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, __28.1.2015._______ _________________________ 146 Прилог 2. ИЗЈАВА O ИСТОВЕТНОСТИ ШТАМПАНЕ И ЕЛЕКТРОНСКЕ ВЕРЗИЈЕ ДОКТОРСКОГ РАДА Име и презиме аутора Mr Radoslava Savić Radovanović_______________________ Број уписа ____________________________________________________________ Студијски програм _____________________________________________________ Наслов рада Procena rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekim sirevima____ Ментор __________Prof. Dr Vera Katić_____________________________________ Потписани ________________________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, __28.1.2015.___________ _________________________ 147 Прилог 3. ИЗЈАВА О КОРИШЋЕЊУ Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић― да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Procena rizika od nalaza enterotoksina stafilokoka u mekim sirevima која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, __28.1.2015.________________ ____________________ 148 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.