NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETAUNIVERZITETA U BEOGRADUNa sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana 24.09.2015.godine, odluka broj 4600/16, imenovana je komisija za ocenu završene doktorskedisertacije pod naslovom:
„Biomarkeri odgovora na terapiju interferonom-β kod bolesnika sa relapsno-
remitentnom multiplom sklerozom“kandidata dr Emine Milošević, zaposlene na Medicinskom fakultetu u Beogradu kaoasistent na Katedri za imunologiju. Mentor je prof. dr Dušan Popadić, komentor je prof.dr Jelena Drulović.Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu:1. Prof. dr Marija Mostarica Stojković, profesor emeritus Medicinskog fakultetaUniverziteta u Beogradu2. Prof. dr Dragana Lavrnić, redovni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta uBeogradu3. Prof. dr Dejan Baskić, vanredni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta uKragujevcu.Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene doktorskedisertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicinskog fakulteta sledeći
IZVEŠTAJ
A) Prikaz sadržaja doktorske disertacijeDoktorska disertacija dr Emine Milošević napisanaje na 99strana i podeljena jena sledeća poglavlja: Uvod, Ciljevi rada, Materijal i metode, Rezultati, Diskusija, Zaključcii Literatura. U disertaciji se nalaze ukupno 23 slike. Doktorska disertacija sadrži sažetak
2na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisakskraćenica korišćenih u tekstu.U Uvoduje definisanamultipla skleroza (MS) iforme MS. Navedena su shvatanja oimunopatogenezi MS sa osvrtom na eksperimentalni model eksperimentalniautoimunski encefalomijelitis. Detaljno je opisana uloga pomoćničkih T-limfocita tipa 1 i17 (Th1 i Th17) u imunopatogenezi MS uz poseban naglasak na ulozi citokina koje ovećelije produkuju.Navedeni su terapijski modaliteti za MS, a zatim je dat pregled literature omehanizmima terapijskog dejstva interferona (IFN)-β kao prve terapijske linije urelapsno-remitentnoj (RR) formi MS, naročito delovanjem na ćelije imunskog sistema.Definisan je problem nepovoljnog kliničkog odgovora kod značajnog udela bolesnika saRRMS, kao i potreba za pronalaženjem parametara koji bi predvideli neadekvatanterapijski tok.
Ciljevi rada su precizno definisani. Sastoje se u određivanju ekspresije na nivouiRNK gena za proinflamatorne i antiinflamatorne molekule kod bolesnika sa RRMS prepočetka i tokom terapije sa IFN-β. Kao cilj rada navedeno je i utvrđivanje odnosa izmeđunivoa ekspresije ispitivanih gena tokom praćenja pacijenata i njihovih demografskihparametara i kliničkih pokazatelja težine bolesti, kao i da li bi se ekspresija nekih odispitivanih proinflamatornih i antiinflamatornih molekula pre započinjanja i tokomterapije sa IFN-β mogla koristiti kao biomarker odgovora na terapiju.U poglavlju Materijal i metode navedeno je da su bolesnici sa RRMS lečeninaKlinici za neurologiju Kliničkog centra Srbije, a analize genske ekspresije i enzimskiimunotestovi su urađeni u Laboratoriji za imunologiju Instituta za mikrobiologiju iimunologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Studija je izvedena u skladusa etičkim standardima Helsinške deklaracije i u skladu sa pravilima Etičkog komitetaMedicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Precizno su navedeni način praćenjaispitanika, uzorkovanja krvi, terapijski protokol i kriterijumi uključivanja i isključivana
3iz studije. Detaljno je opisana metodologija isptivanja genske ekspresije kojapodrazumeva način izolacije RNK iz izdvojenih mononuklearnih ćelija periferne krvi idalje određivanjegenske ekspresije primenom PCR u realnom vremenu,kao iodređivanje koncentracije citokina u plazmi primenom ELISA.U poglavlju Rezultati detaljno su opisanii jasno predstavljeni svi dobijenirezultati.
Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanjasa uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije. Dat je kritički osvrtna značaj dobijenih rezultata i mogućnost primene sličnih analiza u kliničkoj praksi radipraćenja odgovora na terapiju.
Zaključci sažeto i jasno prikazuju najvažnija saznanjakoja su proisteklaizrezultata rada.Korišćena literatura sadrži spisak od 248 referenci.
B) Kratak opis postignutih rezultata
Ovo istraživanje je pokazalo da se tokom tri godine IFN-β terapije nivo ekspresijesvih ispitivanih gena značajno menjao, što treba imati u vidu pri tumačenju rezultatastudija preseka koje analiziraju gensku ekspresiju kod obolelih od MS. Genska ekspresijaje merena u mononuklearnim ćelijama periferne krvi za markere biološkog odgovora naIFN-β (MX1, OAS2), marker T-limfocita (CD3ε), Th1/17- polarišuće citokine (IL-12/23p40, IL-12p35, IL-23p19), odgovarajuće subjedinice receptora za ove citokine (IL-12Rβ1, IL-12Rβ2, IL-23R), opredeljujuće transkripcione faktore Th1, Th17 iregulatornih T limfocita (T-bet, RORγt, FoxP3), efektorske citokine (IFN-γ, IL-17A, IL-17F, GM-CSF, TNF, IL-10) kao i endogeni IFN-β pre početka IFN-β terapije i nakon 6, 12,
424 i 36 meseci trajanja terapije. Slična kinetika ekspresije kod pacijenata koji dobroodgovaraju na terapiju i kod pacijenata koji suboptimalno odgovaraju na terapiju nijeomogućila razdvajanje ovih grupa. Interesantno je da je ekspresija iRNK mnogih genameđusobno korelisali pre početka terapije sa IFN-β, a manji broj je nastavio da korelišeu nekim od narednih vremenskih tačaka.Zatim, IFN-β terapija nije statistički značajno uticala na koncentracije merenihproinflamatornih citokina (GM-CSF, IL-17A i IL-17F) u plazmi bolesnika sa RRMS. Nijenađena povezanost ekspresijeiRNK, kao ni koncentracije citokina u plazmi sa kliničkim idemografskim parametrima bolesnika.Koncentracija citokina u plazmi nije korelisala sasopstvenom iRNK u mononuklearnim ćelijama periferne krvi.Međutim, kada su podaci analizirani u zavisnosti od pojave relapsa, nađena jepovezanost niže ekspresije β2 subjedinice receptora za IL-12 (IL-12Rβ2) sa višimrizikom za pojavu relapsa. Navedeni rezultati mogu biti od kliničkog značaja u smisludaljeg ispitivanja ekspresije IL-12Rβ2 kao potencijalnog biomarkera kliničkog odgovorana terapiju sa IFN-β1b na većem broju bolesnika.
C)Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature
Iako su brojne studije analizirale kinetiku genske ekspresije tokom terapije IFN-β, samo nekoliko je analiziralo gene za citokine, njihove receptore i pridruženetranskripcione faktore poredeći nivoe ekspresije kod pacijenata koji dobro ineadekvatno odgovaraju na terapiju. Generalno, ekspresija gena za citokine se retkopovezivala sa odgovorom na terapiju. Od gena koji su analizirani u ovoj disertaciji IFN-γ,IL-10 i IL-12β1 su prethodno identifikovani kao prediktori (pojedinačno ili ukombinaciji) povoljnog terapijskog odgovora. U ovoj doktorskoj disertaciji takvapovezanost nije potvrđena. Mogući razlozi su razlike u odnosu na grupu bolesnika idizajn studije, trajanje praćenja i metodologiju.
5IFN-β terapija je značajno menjala ekspresiju svih analiziranih gena tokomtrogodišnjeg praćenja, ali nije bilo statistički značajne razlike ni za jedan od ispitivanihgena među pacijenatima koji dobro i neadekvatno odgovaraju na terapiju. Ipak, višaekspresija IL-12Rβ2 tokom praćenja je bila povezana sa nižim rizikom za pojavu relapsa.Ovakav nalaz je u skladu sa rezultatima koji analiziraju uticaj IFN-β na ekspresiju IL-12Rβ2 Fahey i sar. su prethodno pokazali da tretman T-ćelija zdravih donorainterferonom-β povećava ekspresiju β1 i β2 subjedinice IL-12R, koju prati povećanjefosforilisanog STAT4 (pSTAT4) i indukcija antiinflamatornog citokina IL-10. Ovirezultati su zatim potkrepljeni nalazom da se povećava IL-12Rβ2 i pSTAT4 u CD4+ T-limfocitima pacijenata sa MS ex vivo, nakon tretmana sa IFN-β.Među citokinima koje produkuju Th1 i Th17 ćelije, noviji podaci ukazuju da je zaencefalitogenost ovih ćelija u modelu na životinjama neophodan GM-CSF.Na osnovudostupne literature se zaključuje da je u ovoj disertaciji prvi put dugoročno analiziranobrazac ekspresije GM-CSF iRNK ex vivo u mononuklearnim ćelijama perifernekrvipacijenata sa RRMSprimenom qPCR, kao i kinetika koncentracije GM-CSF proteina uplazmi. GM-CSF ekspresija u mononuklearnim ćelijama periferne krvije imala istivremenski obrazac kod pacijenata koji dobro i neadekvatno odgovaraju na terapiju, sapadom u terminu 6 meseci, praćenim porastom do nivoa uporedivog sa početnim nakon12 i 24 meseca i porastom nakon 36 meseci. Nisu detektovane promene koncentracijaGM-CSF u plazmi, kao ni razlike u koncentraciji kod pacijenata koji dobro i neadekvatnoodgovaraju na terapiju. Studije preseka su našle povišene koncentracije GM-CSF tokomrelapsa u likvoru, ali bez razlike u odnosu na druge neurološke bolesti. Diskrepanca sarezultatima ove teze se može objasniti različitim dizajnom studije (korišćenjem likvoranasuprot krvnoj plazmi) i činjenicom da je za rezultate u tezi uzorkovanje obavljanokada je pacijent u remisiji da bi se izbegao uticaj glukokortikoida koji se daju kaoterapija u relapsu.Među pacijentima sa MS koji se leče sa IFN-β 2-40% razvije neutrališuća antitelana lek koja utiču na njegovu biološku raspoloživost. Iako je ograničenje ove studije bila
6činjenica da nisu određivana neutrališuća antitela, slična ekspresija IFN-β-indukovanihgena MX1 i OAS2 kod pacijenata koji dobro i suboptimalno odgovaraju na terapijusugerišu da biološka raspoloživost IFN-β nije značajno uticala na rezultate.
D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije
Milosevic E, Dujmovic I, Markovic M, Mesaros S, Rakocevic G, Drulovic J,MostaricaStojkovic M, Popadic D. 2015. Higher expression of IL-12Rβ2 is associated
with lower risk of relapse in relapsing–remitting multiple sclerosis patients on
interferon-β1b therapy during 3-year follow-up. Journal of Neuroimmunology 287:64-70.
E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa)
Doktorska disertacija „Biomarkeri odgovora na terapiju interferonom-β kod
bolesnika sa relapsno-remitentnom multiplom sklerozom“dr Emine Miloševićpredstavlja originalni naučni doprinos razumevanju dejstva terapije IFN-β na genskuekspresiju Th1/Th17 citokina, receptora za citokine i transkripcionih faktora za koje sepretpostavlja patogenetska uloga u MS. Prvi put je dugoročno analiziran obrazacekspresije GM-CSF iRNK ex vivo u mononuklearim ćelijama periferne krvi RRMSpacijenata primenom qPCR, kao i kinetika nivoa GM-CSF proteina u plazmi, što može bitiznačajno za procenjivanje rezultata primene anti-GM-CSF antitela, koje je u fazi kliničkihispitivanja za MS.Povezanost ekspresije IL-12Rβ2 sa rizikom za pojavu relapsa ukazujena potencijal IL-12Rβ2 ekspresije kao biomarkera kliničkog odgovora na terapiju sa IFN-β1b. Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnogistraživanja. Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo
7izabran, a metodologija rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematičnoprikazani i diskutovani, a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci.Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata,komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu daprihvati doktorsku disertaciju drEmine Milošević i odobri njenu javnu odbranu radisticanja akademske titule doktora medicinskih nauka.
U Beogradu, 12.10.2015.
Članovi Komisije:
Prof. dr Marija Mostarica Stojković Mentor: Prof. dr Dušan Popadić
______________________________________________
Prof. dr Dragana Lavrnić Komentor: Prof. dr Jelena Drulović
Prof. dr Dejan Baskić