UNIVERZITETUBEOGRADU
BIOLOŠKI FAKULTET
Igor Lj. Golić
MOLEKULSKEOSNOVE STRUKTURNOG
REMODELIRANJAMITOHONDRIJA INDUKOVANOG
KALCIJUMOM I INSULINOMUMRKIM
ADIPOCITIMAPACOVA
DOKTORSKADISERTACIJA
Beograd, 2015.
UNIVERSITYOF BELGRADE
FACULTYOF BIOLOGY
Igor Lj. Golić
MOLECULARBASISOFMITOCHONDRIAL
STRUCTURALREMODELING INDUCEDBYCALCIUM
AND INSULIN IN RAT BROWNADIPOCYTES
DOCTORALDISSERTATION
Belgrade, 2015.
Komisija za odbranu doktorske disertacije
Mentori
dr Aleksandra Korać
redovni profesor, Biološki fakultet
Univerzitet u Beogradu
dr Vesna Otašević
viši naučni saradnik, Institut za biološka
istraživanja ”Siniša Stanković”
Univerzitet u Beogradu
Član komisije
dr Bato Korać
vanredni profesor, Biološki fakultet
naučni savetnik, Institut za biološka
istraživanja ”Siniša Stanković”
Univerzitet u Beogradu
Datum odbrane:
Zahvalnica
Ova doktorska disertacija je urađena u okviru projekta 173055: ”Belo ili/i mrko: značaj masnog tkiva u
održanju ukupne redoks zavisnemetaboličke kontrole u fiziološkim adaptacijama imetaboličkim poremećajima”
Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije, i to na Katedri za biologiju ćelija i tkiva i pri
Centru za elektronsku mikroskopiju Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Dio disertacije je realizovan u
okviru bilateralne saradnje između Republike Srbije i Republike Francuske (Pavle Savić/Hubert Curien).
Zadovoljstvo mi je da se zahvalim svima zaslužnima što je ova doktorska disertacija ugledala svjetlost
dana, i to:
Prof. dr Aleksandri Korać, mom mentoru i učitelju, što me naučila da u moru indirektnih i
zavodljivih činjenica ostanem nevjerni Toma, sve dok golim okom ne vidim dokaz i da je najvažniji princip za
nas - ”seeing is believing”. Hvala na velikoj intelektualnoj slobodi, ukazanom povjerenju, podršci i savjetima
tokom izrade i pisanja ove doktorske disertacije.
Dr Vesni Otašević, na prenesenom iskustvu, pomoći, savjetima i sugestijama u istraživačkom radu, a
i tokom pisanja disertacije.
Prof. dr Batu Koraću, što me je od početka naučio pravilnom izvođenjem eksperimenata i
neprestanom brigom za kvalitetom. A i na korisnim razgovorima, prenijetom znanju i savjetima pri pisanju ove
disertacije.
Dr Slavici Jonić, na nesebičnoj pomoći pri realizaciji dijela doktorske disertacije, prije svega
tomografskoj rekonstrukciji mitohondrija.
Kseniji i Milici, za nesebičnu pomoć i savjetima tokom istraživanja i realizacije ove disertacije, a i za
razumijevanje, momente razbibrige, drugarstvo i kolegijalnost.
Aleksandri, Ani i Milici, neizmjerno hvala na prenijetom znanju, malim laboratorijskim tajnama,
strpljenju i razumijevanju, a i za pomoć pri izradi ove disertacije.
Mariji što mi je bila pri ruci u posljednjim i kritičnim fazama eksperimentalnog dijela disertacije, a i za
drugarstvo. Aniti i Maji za nesebičnu pomoć pri pripremanju presjeka i izradi elektron mikrografija za rad.
Mojoj majci i kumi,
zahvalan na bezrezervnoj ljubavi
i neprestanoj podršci
Čim nauku i razum prezire ko,
A najveća je ljudska snaga to,
...
Pa da i nije đavlu dušu pred’o već,
Svejedno morao bi propasti!
J. W. Goethe (Faust)
Naučnik u svojoj laboratoriji nije samo tehničar;
on je i dijete koje se suočava sa prirodnim fenomenima
koji ga toliko impresioniraju kao da se radi o bajkama.
Marie Curie
Molekulske osnove strukturnog remodeliranja mitohondrija
indukovanog kalcijumom i insulinom umrkim adipocitima pacova
Rezime
Osnovna uloga mrkog masnog tkiva je održanje tjelesne temperature i održanje energetske
homeostaze organizma. Izlaganje hladnoći, a i povećan unos hrane, dovodi do stimulacije,
proliferacije i diferencijacije mrkih adipocita, što je praćeno remodeliranjem mitohondrija,
termogenih organela mrkih adipocita. U okviru strukturnog remodeliranja mitohondrije
pokazuju širok dijapazon morfoloških promjena (broj mitohondrija u ćeliji, srednji dijametar,
fuzija i fisija mitohondrija, volumenska gustina kristi) što je povezano sa prisustvom pojedinih
kompleksa elektron transportnog lanca, ATP sintaze, familije UCP proteina, posebno UCP1, a i
drugih proteina unutrašnje membrane mitohondrija.
Kalcijum igra veoma važnu ulogu u termogenezi, njegova koncentracija u citoplazmi i
organelama mrkih adipocita je hormonski regulisana, prije svega noradrenalinom.
Mitohondrije, s jedne strane, imaju važnu ulogu u oblikovanju signalnih puteva kalcijuma, a
kalcijum, s druge strane, u fiziološkim koncentracijama stimuliše mitohondrijalni metabolizam i
povećava produkciju energije, dok u visokim koncentracijama indukuje apoptozu.
Insulin je jedan od glavnih modulatora termogene funkcije mrkih adipocita, gdje
stimuliše sintezu i deponovanje lipida u mrkim adipocitima, proliferaciju mrkih adipocita,
angiogenezu i vazodilataciju. Pokazano je da insulin utiče na aktivnost elektron transportnog
lanca, a i da mitohondrije pojačavaju insulinsku osjetljivost putem redoks regulacije proteina
tirozin kinaze i insulinskog receptora.
Cilj ove doktorske disertacije je rasvjetljavanje kako kalcijum, s jedne strane, a insulin, s
druge strane, utiču na molekulske mehanizme koje su uključene u strukturno remodeliranje
mitohondrija mrkih adipocita pacova.
U eksperimentu su korišćeni Wistar pacovi, starosti dva mjeseca. U eksperimentu sa
Ca-SANDOZ, životinje su podijeljene u dve grupe, jedna je pila Ca-SANDOZ rastvoren u vodi,
a druga, kontrolna, česmensku vodu, tri dana. U eksperimentu sa insulinom, pacovi su
podijeljeni u šest grupa, četiri grupe su primale nisku (0.4 IU) ili visoku (4 IU) dozu insulina i to
jedan (akutno) ili tri dana (hronično). Ostale dvije grupe, kontrolne, su primale fiziološki
rastvor akutno ili hronično. Trećeg dana tretmana Ca-SANDOZ, odnosno tri sata poslije
posljednjeg tretmana insulinom, životinje su žrtvovane dekapitacijom, a interskapularni depo
BAT je izolovan i pripremljen za biohemijske, mikroskopske i molekularno-biološke analize, i za
izolaciju mitohondrijalnih frakcija. BAT i mitohondrijama bogata frakcija su analizirane
Western Blot analizom, imunohistohemijskom, imunofluorescentnom i imunogold analizama,
ultrastukturnim i stereološkim analizama, a analizirana je i aktivnost ATP sintaze.
Alizarin Red S bojenje je pokazao povećanu koncentraciju Ca2+ u mrkim adipocitima
tretiranih Ca-SANDOZ, a kalijum piroantimonat je lokalizovao Ca2+-bogate regione u
citoplazmi, mitohondrijama i oko lipidnih tijela. Ca-SANDOZ smanjio je broj mitohondrija, ali
je povećao njihovu veličinu i volumensku gustinu kristi. Transmisiona elektronska mikroskopija
je pokazala brojne izdužene i ”fuzionisane” mitohondrije u Ca-SANDOZ grupi, kao i
megamitohondrije u pojedinim mrkim adipocitima. Ca-SANDOZ utiče na mitohondrijalnu
fuziju povećanjem proteinske ekspresije Mfn1 i Mfn2, a smanjenjem Drp1. Konfokalna
mikroskopija je pokazala povećan stepen kolokalizacije mitohondrija i endoplazminog
retikuluma. Nivo UCP1 proteina je povećan, što je potvrđeno Western blot analizom i
imunohistohemijom. Ovi rezultati ukazuju da Ca-SANDOZ stimuliše fuziju mitohondrija,
povećava kontakte između mitohondrija i endoplazminog retikuluma i povećava termogeni
kapacitet mrkih adipocita pacova.
Western blot analiza mitohondrijama bogate frakcije je pokazala da akutni tretman
insulinom dovodi do povećanja, a hronični tretman insulinom do smanjenja proteinske
ekspresije svih kompleksa elektron transportnog lanca, osim kompleksa II i IV, kojima je
proteinska ekspresija takođe povećana primjenom niske, a hronične doze insulina. Proteinska
ekspresija UCP1 je smanjena poslije akutnog tretmana insulinom, ali je povećana hroničnim
tretmanom. Niska, hronična doza insulina dovodi do povećanja proteinske ekspresije UCP2
proteina, a visoka doza smanjuje. Proteinski sadržaj UCP3 je povećan i akutnim i hroničnim
tretmanom insulinom, nezavisno od doze. U slučaju ATP sintaze, promjena proteinske
ekspresije je praćena navedenom proteinskom ekspresijom kompleksa elektron transportnog
lanca, a proteinska ekspresija anti-ATPaznog inhibitornog faktora (IF1) je povećana u svim
tretiranim grupama, što se i poklapa sa aktivnošću ATP sintaze. Konfokalna mikroskopija je
pokazala, i u kontrolnoj grupi, da pojedini mrki adipociti posjeduju dominantno tip
mitohondrija koje su imunopozitivne na UCP1 ili pojedinačni kompleks elektron transportnog
lanca ili ATP sintazu, a drugi mrki adipociti posjeduju mitohondrije sa različitom
imunopozitivnošću na navedene proteine. Osim toga, uočeni su pojedini mrki adipociti sa
kolokalizacijom navedenih proteina u određenoj populaciji mitohondrija. Ovo ukazuje da se
mrki adipociti odlikuju funkcionom heterogenošću mitohondrija, odnosno prisutan je
mitohondrijalni mozaicizam. Štaviše, kompleksi elektron transportnog lanca, ATP sintaza i
UCP1 kolokalizuju u različitom stepenu u različitim mitohondrijama unutar pojedinačnog
mrkog adipocita, i taj efekat je i dozno i vremenski zavisan. Navedeni rezultati ukazuju da insulin
modulira bioenergetski i termogeni kapacitet mrkih adipocita in vivo modulacijom
mitohondrijalnog mozaicizma.
KLJUČNE RIJEČI:mitohondrije, mrki adipociti, insulin, kalcijum, ATP sintaza, IF1, elektron
transportni lanac, UCP1, mitohondrijalno remodeliranje
NAUČNAOBLAST: Biologija
UŽANAUČNAOBLAST: Biologija ćelija i tkiva
UDKBROJ: [546.41+612.349.8]:[577.112.82/.112.85:576.347](043.3)
Molecular basis of mitochondrial structural remodeling induced by
calcium and insulin in rat brown adipocytes
Abstract
Essential role of brown adipose tissue is maintaining body temperature and energy homeostasis
of organism. Exposure to cold and increased diet intake lead to stimulation, proliferation and
differentiation of brown adipocytes, what is followed by remodeling of mitochondria,
thermogenic organelles of brown adipocytes. In the context of structural remodeling,
mitochondria show wide repertoire of morphological changes (e.g. mitochondria number in
cell, mean diameter, fusion and fission of mitochondria, volume density of mitochondrial
cristae) what is connected with abundance of components of electron transport chain (ETC),
ATP synthase, UCP proteins - especially UCP1 protein, and other proteins of inner
mitochondrial membrane.
Calcium plays important role in thermogenesis, and its concentration in cytosol and
organelles of brown adipocytes is hormone regulated, particularly by noradrenaline.
Mitochondria has essential role in shaping calcium signaling pathways, and calcium, on other
hand, stimulates mitochondrial metabolism and increases energy production, but in high
concentrations induces apoptosis.
Insulin is one of major modulators of thermogenic function of brown adipocytes, and
stimulates synthesis and storage of lipids in brown adipocytes, proliferation of brown
adipocytes, angiogenesis and vasodilatation. It is showed that insulin has effect on electron
transport chain activity, but also mitochondria enhances insulin sensitivity via redox regulation
of tyrosine kinases and insulin receptor.
The aim of this doctoral dissertation is elucidation how calcium and insulin effect on
molecular mechanisms involved in structural remodeling of mitochondria of rat brown
adipocytes.
Two-month-old male Wistar rats were used. In Ca-SANDOZ study, they were divided
into two groups - Ca-SANDOZ drinking or tap water drinking for three days. In insulin
experiment, rats were divided into six groups, where four groups treated with low (0.4 IU) or
high (4 IU) dose of insulin, for one (acutely) or three (chronically) days. Another two groups
served as control, treated with 0.9% saline solution for one or three days. On third day of
Ca-SANDOZ treatment, or three hours after last administration of insulin, they were sacrificed
by decapitation, and interscapular portion of BAT was isolated and prepared for biochemical,
microscopic and molecular biology analyses, also for isolation of mitochondria-enriched BAT
fraction. BAT and mitochondria-enriched fraction were analyzed by Western blot analysis,
imunohistochemical, immunofluorescent, immunogold, ultrastructural and stereological
analyses. Also, ATP synthase activity was measured.
Alizarin Red S staining showed increased Ca2+ level in rat brown adipocytes, and
potassium pyroantimonate staining localized Ca2+-rich regions in the cytoplasm, mitochondria
and around lipid droplets. Ca-SANDOZ decreased mitochondrial number, but increased their
size and mitochondrial cristae volume. Transmission electron microscopy revealed numerous
enlarged and fusioned-like mitochondria in Ca-SANDOZ treated group compared to the
control, and megamitochondria in some brown adipocytes. Ca-SANDOZ affected
mitochondrial fusion increasing Mfn1 and Mfn2 protein level, and decreasing Drp1 protein
level. Confocal microscopy showed a higher colocalization rate between functional
mitochondria and endoplasmic reticulum (ER). The level of UCP1 was elevated, which was
confirmed by Western blot analysis and immunohistochemistry. These results suggests that
Ca-SANDOZ stimulates mitochondrial fusion, increases mitochondria-ER contacts and the
thermogenic capacity of rat brown adipocytes.
Western blot analysis of mitochondria-enriched BAT fraction revealed that acute insulin
treatment increased, whereas chronic insulin treatment decreased expression of all ETC
complexes except complex II and IV, which were up-regulated by a low insulin dose and chronic
treatment, respectively. UCP1 expression decreased after acute treatment but increased
following chronic insulin treatment. A chronic low dose of insulin increased UCP2 content, but
a high dose had the opposite effect. Protein content of UCP3 was increased by both acute and
chronic insulin treatment. ATP synthase expression mirrored that of the ETC complexes, while
the anti-ATPase inhibitory factor (IF1) expression was elevated in all treatment groups, in line
with ATP synthase activity. Confocal microscopy showed that some brown adipocytes from
control group contained only one type of mitochondria that were immunopositive for UCP1,
ETC complex or ATP synthase, while others were of mixed type that did or did not show
colocalization. These results indicated mitochondrial functional heterogeneity or mitochondrial
mosaicism in brown adipocytes. Furthermore, ETC complexes, ATP synthase and UCP1 were
found to colocalize differently in different mitochondria within a single brown adipocyte, and
this effect was both dose and time dependent. These results suggest that insulin modulates the
bioenergetic and thermogenic capacity of rat brown adipocytes in vivo by modulating
mitochondrial mosaicism.
KEYWORDS: mitochondria, brown adipocyte, insulin, calcium, ATP synthase, IF1, electron
transport chain, UCP1, mitochondrial remodeling
SCIENTIFIC FIELD: Biology
SPECIALTOPICS:Cell and Tissue Biology
UDCNUMBER: [546.41+612.349.8]:[577.112.82/.112.85:576.347](043.3)
Sadržaj
1 Uvod 1
1.1 Omitohondrijama... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Mrki adipociti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Mitohondrije i bioenergetika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3.1 Elektron transportni lanac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.1.1 Kompleks I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.1.2 Kompleks II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3.1.3 Kompleks III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3.1.4 Kompleks IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3.2 ATP sintaza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3.3 Inhibitorni faktor 1 (IF1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.4 UCP proteini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.4.1 UCP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.4.2 UCP2 i UCP3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 Energetska stanja izolovanih mitohondrija i njihov izgled . . . . . . . . . . . . 10
1.5 Unutrašnja arhitektura mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5.1 Uticaj ATP sintaze na arhitekturu kristi . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.5.2 Respiratorni superkompleksi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6 Remodeliranje mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.7 Mitohondrije, ER i kalcijum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.8 Mrki adipociti i kalcijum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.9 Mrki adipociti i insulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2 Cilj 22
3 Materijal i metodi 24
3.1 Eksperimentalne životinje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.2 Eksperimentalni dizajn Ca-SANDOZ tretmana . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.3 Eksperimentalni dizajn tretmana insulinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.4 Žrtvovanje životinja i izolacija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.5 Izolacija mitohondrijama bogate frakcije . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.6 Priprema tkiva za analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.6.1 Priprema tkiva zaWestern Blot analizu . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.6.2 Priprema tkiva za svjetlosnu i konfokalnu mikroskopiju . . . . . . . . . 27
3.6.3 Priprema tkiva za elektronsku mikroskopiju . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.7 Priprema krvnih razmaza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.8 Priprema mitohondrijama bogate frakcije za analize . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.8.1 Priprema mitohondrijama bogate frakcije za Western Blot analizu . . . 28
3.8.2 Priprema mitohondrijama bogate frakcije za elektronsku mikroskopiju . 28
3.9 Određivanje koncentracije proteina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.9.1 Određivanje koncentracije proteina tkiva . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.9.2 Određivanje koncentracije proteina iz mitohondrijama bogate frakcije . 28
3.10 SDS-PAGE iWestern Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.11 Detekcija proteina nakonWestern Blot analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.12 Određivanje aktivnosti ATP sintaze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.13 Lokalizacija proteina mikroskopskimmetodima . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.13.1 Imunohistohemijska lokalizacija proteina . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.13.2 Imunofluorescentna lokalizacija proteina . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.13.3 Imunogold lokalizacija proteina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.14 Lokalizacija kalcijuma mikroskopskimmetodama . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.14.1 Alizarin Red S bojenje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.14.2 Precipitacija kalijum piroantimonatom . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.15 Kolokalizaciona studija mitohondrija i endoplazminog retikuluma . . . . . . . 35
3.16 Ultrastrukturna analiza tkiva i mitohondrijama bogate frakcije . . . . . . . . . . 36
3.16.1 Tomografska rekonstrukcija mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.16.2 Ultrastrukturna analiza mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.17 Citohemijska analiza kompleksa I i II in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.18 Stereološke analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.18.1 Stereološka analiza mrkih adipocita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.18.2 Stereološka analiza lipidnih tijela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.18.3 Stereološka analiza mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.19 Statističke analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4 Rezultati 40
4.1 Ca-SANDOZ tretman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.1 Western blot analiza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.1.1 Proteinska ekspresija Mfn1 i Mfn2 . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.1.2 Proteinska ekspresija Drp1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.1.1.3 Proteinska ekspresija ATP sintaze . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.1.4 Proteinska ekspresija UCP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.1.1.5 Proteinska ekspresija VDAC . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.1.1.6 Proteinska ekspresija kalneksina . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.1.2 Mikroskopske analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.1.2.1 Lokalizacija kalcijuma u mrkim adipocitima . . . . . . . . . 43
4.1.2.2 UCP1 imunohistohemija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.1.2.3 Stereološka analiza mrkih adipocita i lipidnih tijela . . . . . 44
4.1.2.4 Kolokalizaciona analiza mitohondrija i ER . . . . . . . . . . 45
4.1.3 Ultrastrukturne analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.1.3.1 Egzovezikulacija eritrocita i ulaz eritrocitnih kompleksa u
mrke adipocite i mitohondrije . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.1.3.2 Ultrastrukturna analiza mitohondrija . . . . . . . . . . . . 46
4.1.3.3 Stereološka analiza mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.1.3.4 Distribucija mitohondrija po srednjem dijametru . . . . . . 47
4.1.3.5 Distribucija mitohondrija po volumenskoj gustini kristi . . . 47
4.2 Tretman insulinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2.1 Western blot analiza mitohondrijama bogate frakcije . . . . . . . . . . 47
4.2.1.1 Proteinska ekspresija kompleksa elektron transportnog
lanca i cyt c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2.1.2 Proteinska ekspresija ATP sintaze i IF1 . . . . . . . . . . . . 48
4.2.1.3 Proteinska ekspresija UCP1, UCP2 i UCP3 . . . . . . . . . 48
4.2.1.4 Proteinska ekspresija VDAC . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.2.2 Western blot analiza tkiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.2.2.1 Proteinska ekspresija kompleksa elektron transportnog
lanca i cyt c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.2.2.2 Proteinska ekspresija ATP sintaze i IF1 . . . . . . . . . . . . 52
4.2.2.3 Proteinska ekspresija UCP1 i UCP2 . . . . . . . . . . . . . 52
4.2.2.4 Proteinska ekspresija VDAC . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.2.2.5 Proteinska ekspresija katalaze . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.2.2.6 Proteinska ekspresija kalneksina . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.2.3 Biohemijska analiza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.2.3.1 Aktivnost ATP sintaze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.2.4 Mikroskopske analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.2.4.1 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa I i UCP1 . . . . 61
4.2.4.2 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa II i UCP1 . . . . 62
4.2.4.3 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa III i UCP1 . . . 63
4.2.4.4 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa IV i UCP1 . . . 64
4.2.4.5 Imunofluorescentna lokalizacija cyt c i UCP1 . . . . . . . . 65
4.2.4.6 Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i UCP1 . . . . 65
4.2.4.7 Imunofluorescentna lokalizacija IF1 i UCP1 . . . . . . . . . 66
4.2.4.8 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa III i IV . . . . . 67
4.2.4.9 Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i IF1 . . . . . . 68
4.2.4.10 Imunofluorescentna lokalizacija VDAC i kalneksina . . . . . 69
4.2.4.11 Imunofluorescentna lokalizacija katalaze . . . . . . . . . . . 70
4.2.4.12 Imunofluorescentna lokalizacija Mfn1 . . . . . . . . . . . . 70
4.2.4.13 Imunohistohemijska lokalizacija Mfn1 . . . . . . . . . . . . 71
4.2.4.14 Imunohistohemijska lokalizacija Drp1 . . . . . . . . . . . . 72
4.3 Ultrastrukturne analize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.3.0.1 TEMmitohondrijama bogate frakcije . . . . . . . . . . . . 84
4.3.0.2 Citohemijska analiza kompleksa I in situ . . . . . . . . . . . 85
4.3.0.3 Citohemijska analiza kompleksa II in situ . . . . . . . . . . 85
4.3.0.4 Citohemijska lokalizacija vodonik peroksida . . . . . . . . . 85
4.3.0.5 Tomografska rekonstrukcija mitohondrija . . . . . . . . . . 86
4.3.0.6 Imunogold lokalizacija kompleksa III i kompleksa IV . . . . 86
5 Diskusija 92
5.1 Ca-SANDOZ tretman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.1.1 Povećanje nivoa kalcijuma u mrkim adipocitima . . . . . . . . . . . . 92
5.1.2 Strukturno remodeliranje mitohondrija . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
5.1.3 Povećanje termogenog kapaciteta mrkih adipocita . . . . . . . . . . . 95
5.2 Tretman insulinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2.1 Modulacija kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c . . . . . . . . 96
5.2.2 Modulacija ATP sintaze i IF1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5.2.3 Modulacija UCP proteina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
5.2.4 Heterogenost mrkih adipocita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
6 Zaključci 102
Literatura 104
1 | Uvod
1.1 Omitohondrijama...
Mitohondrije kao strukture su prvi put zabilježene polovinom 19. vijeka (Henle,
1841), ali ove organele tek nakon pedesetak godina dobijaju sve veću pažnju kao ”elementarne
čestice” ili bioblasti (Altmann, 1894). Benda (1898), uočavajući ih kao granule povezane u niti u
spermatozoidima, daje im naziv – mitohondrije.
Sa otkrićem i primjenom elektronskog mikroskopa konačno se mogla rasvijetliti
ultrastrukturna građa mitohondrija (Palade, 1952, 1953; Sjostrand, 1953a,b). Pokazalo se da
mitohondrije posjeduju dvije membrane, spoljašnju i unutrašnju membranu. Unutrašnja
membrana zatvara matriks i gradi mnogobrojne nabore ili evaginacije, odnosno kriste koje se
pružaju duboko u matriks. Kriste su često lamelarne, ali mogu biti i tubularne, u zavisnosti od
tipa tkiva. Prostor između spoljašnje i unutrašnje mitohondrijalne membrane, intermembranski
prostor, može varirati u širini. Osim toga, unutar kristi je intrakristalni prostor, koji se proteže
sve do mjesta spajanja (engl. crista junction) sa unutrašnjom mitohondrijalnom membranom
(Scheffler, 2008).
Sam matriks nije homogen, pokazuje finu granuliranost i često se mogu uočiti
kristaloidne inkluzije ili elektron-guste partikule, čiji broj, u nekim slučajevima zavisi od
trenutnog metaboličkog stanja posmatranog tkiva (Scheffler, 2008).
Veličina mitohondrija varira u zavisnosti od vrste tkiva, ali i od metaboličkog stanja samih
ćelija. Dimenzije mitohondrija hepatocita, ”reprezentativnih” mitohondrija, su 3-4 µm u dužini,
a dijametra oko jedan µm. Naravno, oblik i veličina mitohondrija posmatranih elektronskim
mikroskopom zavise i od ravni sječenja u odnosu na dužu osu mitohondrija (Scheffler, 2008).
1
1.2 Mrki adipociti
U tkiva koja su bogata mitohondrijama spada i mrko masno tkivo (engl. brown adipose
tissue, BAT). U BAT dominiraju mrki adipociti (engl. brown adipocyte, BA), koji se odlikuju
veoma velikim brojem mitohondrija i malih lipidnih tijela, za razliku od bijelih adipocita. Mrki
adipociti, zbog svoje osnovne funkcije – regulacije toplote i energetskog metabolizma, veoma su
zavisni od mitohondrija, koje imaju veoma dobro razvijenu unutrašnju membranu, što ukazuje
na visok kapacitet respiracije.
BAT je organ koji omogućava termogenezu bez drhtanja (engl. non-shivering
thermogenesis) (Cannon i Nedergaard, 2004), evolutivnu sposobnost koja hibernatorima,
glodarima adaptiranim na hladnoću i novorođenim sisarima omogućuje da produkuju toplotu
bez drhtanja. Takođe, pokazano je prisustvo ovog organa i kod čovjeka (Nedergaard i sar.,
2007). BAT je pod inervacijom simpatikusa. Oslobađanje noradrenalina i njegovo vezivanje za
β3-adrenergičke receptore (Muzzin i sar., 1991) aktivira adenilat ciklazu što dovodi do
povećanja koncentracije cAMP u ćeliji (Slika 1). Povećan cAMP aktivira protein kinazu A
(PKA) koja aktivira hormon senzitivnu lipazu (HSL) (Holm i sar., 1987; Shih i Taberner, 1995;
Haemmerle i sar., 2002). Dolazi do hidrolize triacilglicerola i slobodne masne kiseline se
oksiduju u mitohondrijama. PKA takođe dovodi do transkripcije gena neophodnih za
termogenezu (Cannon i Nedergaard, 2004). Pokazano je da i natriuretski peptidi srca mogu da
aktiviraju termogenezu mišjih i humanih adipocita tako što se vezuju za receptor natriuretskih
peptida A (engl. natriuretic peptide receptor A, Npra), što dovodi do aktivacije guanilat ciklaze i
povećanja koncentracije cGMP u ćeliji. cGMP aktivira protein kinazu G (PKG), koja na sličan
način kao i PKA aktivira HSL i pokreće transkripciju termogenih gena (Bordicchia i sar., 2012;
Collins i Bordicchia, 2013).
1.3 Mitohondrije i bioenergetika
Za mitohondrije se često kaže da su ”ćelijske elektrane” jer produkuju ATP, univerzalnu
energetsku valutu za sve ćelije, u procesu oksidativne fosforilacije gdje je aktivnost elektron
transportnog lanca kuplovana sa produkcijom ATP (Slika 2). Tokom respiracije, protokom
elektrona kroz elektron transportni lanac, protoni se ispumpavaju iz matriksa mitohondrija u
intrakristalni (intermembranski) prostor čime se uspostavlja protonski gradijent između dvije
strane unutrašnje mitohondrijalne membrane (pozitivna i negativna strana). Sa
2
Slika 1. Indukcija termogeneze. Simpatički neuroni oslobađaju kateholamine (tamnozeleni kružići), koji
se vezuju za β-adrenergičke receptore, vodeći ka aktivaciji adenilat ciklaze (AC), što dovodi do povećanja
koncentracije cAMP (svijetlozeleni kružići) i pojačane aktivnosti PKA. Natriuretski peptid (NP, crveni
kružići) se vezuje za receptor natriuretskih peptida A (Npra), koji aktiviranjem guanilat ciklaze (GC) vodi
ka povećanju koncentracije cGMP(ljubičasti kružići) i aktivaciji PKG.Aktivirane PKAiPKGkoriste slične
mehanizme da pokrenu transkripcionu kaskadu mrkih adipocita fosforilacijom Creb i p38 Mapk. p38
Mapk fosforiliše i aktivira Atf2 i Pgc-1α, koji indukuju transkripciju termogenih gena, uključujući Ucp1.
Pgc-1α se vezuje za DNK putem interakcije sa Ppar-γ, Ppar-α, retinoidnih X receptora (Rxrs) i tiroidnog
receptora (TFx). Osim toga, kateholamini povećavaju količinu miR-196a, što dovodi do povećane
ekspresije C/ebpβ, takođe vodeći aktivaciji termogenih gena. Aktivacija PKA i PKG indukuje lipolizu.
Slobodne masne kiseline (FFA, plavi kružići) oslobođene iz lipidnih tijela se oksiduju u mitohondrijama
oslobađajući toplotu. Protok protona putem Ucp1 se aktivira masnim kiselinama dugih lanaca (LCFA,
zeleni kružići). AR, adrenergički receptor; P, fosfat; Gs, subjedinica G proteina. Adaptirano iz Harms i
Seale (2013).
termodinamičkog aspekta, mjera razlike koncentracije protona sa obe strane membrane je
protonski elektrohemijski gradijent, koji se sastoji od dvije komponente – hemijske razlike u
koncentraciji protona (kako su u pitanju H+ joni, te se izražava preko ΔpH) i razlike u
električnom potencijalu membrane (ΔΨm). U bioenergetici, protonski elektrohemijski
gradijent se izražava u mV i poznat je kao proton pokretačka sila (engl. proton motive force, pmf
ili Δp) (Nicholls i Ferguson, 2013).
3
Slika 2. Stvaranje i potrošnja proton pokretačke sile. Protok elektrona kroz elektron transportni lanac
kuplovan je sa pumpanjem protona od strane kompleksa I, III i IV. Rezultujući elektrohemijski protonski
gradijent može se iskoristiti na dva načina: 1) produkcijom ATP putem ATP sintaze; i 2) rasipanjem tog
gradijenta što ne dovodi do produkcije ATP, već do termogeneze bez drhtanja i zaštite od oksidativnog
oštećenja. UMM - unutrašnja membrana mitohondrija. Adaptirano iz Divakaruni i Brand (2011).
1.3.1 Elektron transportni lanac
1.3.1.1 Kompleks I
Kompleks I (NADH:ubikinon oksidoreduktaza, E.C. 1.6.5.3) je jedan od važnih enzima
za metabolizam ćelije. Oksiduje NADH, uglavnom iz Krebsovog ciklusa i β-oksidacije masnih
kiselina, pri čemu se regeneriše NAD+ pul u matriksu mitohondrija. Koristi dva elektrona za
redukciju ubikinona (Q) u ubikinol (QH2), snabdijevajući elektron transportni lanac
elektronima za redukciju kiseonika do vode. Potencijalna energija koja se oslobađa ovom
redoks reakcijom iskorištava se za prenos protona kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu
stvarajući proton pokretačku silu (Voet i Voet, 2004).
Do sada je identifikovano 45 proteina u kompleksu I sisara (B. taurus), mase veće od 900
kDa, što ga čini najvećim kompleksom u elektron transportnom lancu. Sastoji se od 14
konzervisanih osnovnih (engl. core) subjedinica koje su dovoljne za transdukciju energije i 31
dodatne (engl. supernumerary) subjedinice (Hirst, 2013). Osnovne subjedinice zajedno
formiraju dva domena koje imaju izgled slova L. Sedam hidrofilnih subjedinica čine redoks
domen koji se pruža u matriks, a ostalih sedam, koje su hidrofobne, nalaze se u unutrašnjoj
membrani mitohondrija (Efremov i Sazanov, 2011; Baradaran i sar., 2013; Hirst, 2013).
1.3.1.2 Kompleks II
Kompleks II (sukcinat:ubikinon oksidoreduktaza, sukcinat dehidrogenaza, E.C. 1.3.5.1)
je ključni membranski kompleks u Krebsovom ciklusu koji katalizuje oksidaciju sukcinata do
4
fumarata u mitohondrijalnom matriksu. Oksidacija sukcinata je kuplovana sa redukcijom
ubikinona do ubikinola. Na taj način kompleks II povezuje Krebsov ciklus sa elektron
transportnim lancem. Ovom reakcijom ne dolazi do prenosa protona tako da ne pridonosi
stvaranju proton pokretačke sile (Cecchini, 2003).
Kompleks II je molekulske mase oko 124 kDa. Sastoji se od solubilnog katalitičkog
heterodimera i integralnog membranskog regiona. Solubilni katalitički heterodimer se sastoji od
subjedinice A sa kovalentno vezanim kofaktorom FAD (Fp subjedinica) i B (Ip subjedinica)
koja sadrži 3 Fe-S klastera ([2Fe-2S], [4Fe-4S] i [3Fe-4S]). Integralni membranski domen čine
dva hidrofobna peptida (CybL i CybS) sa jednom hem grupom između njih (Sun i sar., 2005;
Maklashina i Cecchini, 2010).
1.3.1.3 Kompleks III
Kompleks III (ubikinol:citohrom c oksidoreduktaza, E.C. 1.10.2.2) poznat je i kao bc1
kompleks ili citohrom c reduktaza. Oksidacija ubikinola u ubikinon i prenos elektrona do cyt c
je kuplovan sa prenosom četiri protona kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu po
oksidovanom kinolu (Crofts, 2004).
Kompleks III, izolovan iz srca govečeta (B. taurus), sastoji se od 11 različitih polipeptida i
ima molekulsku masu od 240 kDa (Schagger i sar., 1986, 1995). Posjeduje četiri redoks centra,
i to: dvije hem grupe citohroma b (bH i bL), jednu hem grupu citohroma c1 i jedan Fe-S centar
unutar Rieske gvožđe sumpor proteina (Crofts, 2004).
1.3.1.4 Kompleks IV
Kompleks IV (citohrom c oksidaza, E.C. 1.9.3.1) je posljednji kompleks elektron
transportnog lanca. Oksidacijom citohroma c redukuje se molekulski kiseonik, krajnji akceptor
elektrona, do vode. Kompleks IV je takođe protonska pumpa, koja doprinosi sa još dva protona
koji se izmještaju iz matriksa, po redukujućem ekvivalentu (Kaila i sar., 2010).
Sisarski kompleks (monomer, molekulske mase 204 kDa) sadrži 13 subjedinica, gdje su
najveće subjedinice (I-III) produkti mitohondrijalnog genoma. Subjedinica I vezuje hem a i
hem a3, formirajući CuB redoks centar. Subjedinica II formira CuA centar. Ove subjedinice
zajedno sa subjedinicom III formiraju osnovu enzima (Tsukihara i sar., 1995, 1996; Saraste,
1999; Yoshikawa, 1999). Za subjedinicu III se pretpostavlja da održava strukturni integritet
kompleksa, a ostale subjedinice vjerovatno igraju ulogu u stabilizaciji, izolaciji ili formiranju
kompleksa (Yoshikawa, 1999; Branden i sar., 2006).
5
1.3.2 ATP sintaza
”Svi enzimi su divni, ali ATP sintaza je jedan od najljepših, kao i jedan od najneobičnjih i
važnih” enzima (Boyer, 1997), poznat i kao F0F1-ATPaza ili kompleks V (E.C. 3.6.3.14). Nalazi
se u unutrašnjoj membrani mitohondrija. Ovaj enzim je potrošač proton pokretačke sile, čijem
formiranju doprinose kompleksi I, III i IV elektron transportnog lanca. Protonski gradijent se
koristi za fosforilaciju ADP (Mitchell, 1979, 2011).
Strukturno, ATP sintaza predstavlja enzimski superkompleks molekulske mase više od
500 kDa i sastoji se od dvije subjedinice – F1 i F0. F1, molekulske mase oko 380 kDa, uronjen je
u matriks i predstavlja hidrofilni dio ATP sintaze. Odvajanjem od membranskog domena ATP
sintaze, ponaša se kao ATP vodeći motor, rotacijom unutrašnjih subjedinica dolazi do hidrolize
ATP, zato je i poznat kao F1-ATPaza. Druga subjedinica ATP sintaze – F0, mase oko 120 kDa,
uronjena je u membranu i njenom rotacijom dolazi do translokacije protona uslijed razlike u
protonskom elektrohemijskom gradijentu (Yoshida i sar., 2001; Suzuki i sar., 2002; Okuno i sar.,
2011).
F1 se sastoji od α3β3γδε subjedinica. Tri α i tri β subjedinice formiraju heksamerni prsten
u kome su subjedinice poređane naizmjenično. Osovinu rotora čini γ subjedinica, koja se nalazi
u šupljini α3β3 prstena. Subjedinica ε vezuje se za istureni dio γ subjedinice, osiguravajući na taj
način vezu između F1 i F0 (Menz i sar., 2001; Walker, 2013).
Bakterijski F0 sastoji se od ab2c10–15 subjedinica, dok mitohondrijalnu F0 čine i d, e, f, g,
OSCP, F6 i A6L subjedinice. Subjedinice c formiraju oligomerni rotirajući prsten. Broj c
subjedinica varira među vrstama, npr. u mitohondrijama sisara je 8 (Watt i sar., 2010), kod
kvasaca – 10 (Stock i sar., 1999), dok je najveći broj c subjedinica – 15, otkriven kod jedne vrste
algi (Pogoryelov i sar., 2005). Subjedinica a je lateralno prikačena za c prsten omogućavajući
rotaciju (Ono i sar., 2004). Kod sisara, stator je sačinjen od četiri subjedinice – OSCE, b, d i F6
(Collinson i sar., 1994). On se vezuje za a subjedinicu i c prsten, s jedne strane, i za δ
subjedinicu, s druge strane, tako povezujući F0 i F1 domene (Motz i sar., 2004; Walker, 2013).
Mitohondrije mrkih adipocita posjeduju nizak kapacitet za sintezu ATP (Houstek i
Drahota, 1977), gdje je stehiometrijski odnos između ATP sintaze i respiratornog lanca (ATP
sintaza/COX) 5-11 puta niži u odnosu na mitohondrije drugih tkiva (Houstek i sar., 1991).
Subjedinica c F0 domena je produkt gena P1 i P2, gdje je odnos P1/P2 transkripata veći u
tkivima sa većom aktivnošću ATP sintaze. P1 gen odgovara na razne fiziološke stimuluse, npr.
nakon izlaganja hladnoći (4 ºC) u mrkim adipocitima pacova dolazi do nagle ekspresije unutar
24 sata, pa potom opada sve dok ne dostigne 40% nivoa ekspresije kontrolnih životinja. Ovaj
6
efekat je bio primjećen samo u BAT, dok u srcu ili jetri nije bilo promjena (Andersson i sar.,
1997). Literaturni podaci su pokazali da je količina ATP sintaze u mrkim adipocitima regulisana
kako na transkripcionom, tako i na proteinskom nivou pojedinih subjedinica. Na primjer,
Kramarova i sar. (2008) su pokazali, na eksperimentima sa transgenim UCPp1 miševima gdje je
P1 gen kod kontrolom UCP1 promotora, da su te životinje imale povećan nivo ATP sintaze
nakon izlaganja hladnoći. Ovi eksperimenti pokazuju da je ograničena dostupnost subjedinica
ATP sintaze uzrok niske količine ATP sintaze u mitohondrijama mrkih adipocita.
Na ultrastrukturnom nivou, metodom negativnog bojenja, ATP sintaza se uočava kao
globularna struktura – ”elementarna čestica”, lokalizovana na matriksnoj strani unutrašnje
membrane mitohondrija (Fernandez Moran i sar., 1964; Kagawa i Racker, 1966). A intrigantan
podatak je da u vrijeme otkrića ”elementarne čestice”, Lindberg i sar. (1967) nisu uočili takvu
strukturu u mitohondrijama mrkih adipocita.
1.3.3 Inhibitorni faktor 1 (IF1)
ATP sintaza imamogućnost reverzne rotacije, pri čemudolazi do hidrolizeATPuuslovima
kada je narušena aktivnost elektron transportnog lanca, pri povećanom ”curenju” protona ili u
uslovima hipoksije (Nicholls, 1974; Weber i Senior, 2000).
IF1, inhibitorni faktor 1 ATPaze, inhibira ATPaznu aktivnost spriječavajući hidrolizu
ATP. IF1 je molekulske mase 10 kDa i uglavnom je lokalizovan unutar matriksa mitohondrija
(Campanella i sar., 2009). Pri kiselom pH (oko 6.7), formira se dimer koji je ujedno i aktivna
forma IF1, dok je pri baznom pH (oko 8.0) u vidu tetramera i ne interaguje sa ATP sintazom
(Galante i sar., 1981; Cabezon i sar., 2000; Aggeler i sar., 2002; Long i sar., 2015). Kristalna
struktura kompleksa ATP sintaze i IF1 pokazuje da se IF1 insertuje između α i β subjedinica F1
domena (Cabezon i sar., 2003). Inhibicija nije potpuna i prije svega zavisi od odnosa IF1/ATP
sintaze, a nema efekat na ATP sintaznu aktivnost (Campanella i sar., 2009).
Pokazano je da IF1 spriječava remodeliranje unutrašnje mitohondrijalne membrane koje
bi dovelo do redistribucije cyt c i do apoptoze (Campanella i sar., 2009; Faccenda i sar., 2013).
In vitro eksperimenti sa ćelijama osteosarkoma su pokazali da interakcija IF1, bilo direktno,
povećavanjem katalitičke aktivnosti ATP sintaze, bilo indirektno, poboljšanjem strukture
mitohondrijalnih kristi (interakcijom sa ATP dimerima), poboljšava bioenergetski kapacitet
pod normoksičnim uslovima (Barbato i sar., 2015). IF1, podsticanjem pada ΔΨm, dovodi do
aktivacije PINK-PARK2 zavisne mitofagije, što je i potvrđeno odsustvom mitofagije u IF1-KO
ćelijama (Lefebvre i sar., 2013). Međutim, još nije potpuno razjašnjena uloga IF1, jer IF1-KO
7
miševi nisu pokazali nikakvu fenotipsku promjenu u mitohondrijama (Nakamura i sar., 2013).
Proteomska analiza BAT miševa izloženih hladnoći pokazala je dvostruko povećanje IF1,
koja inhibira ATPaznu aktivnost ATP sintaze umitohondrijamamrkih adipocita u uslovima kada
je pojačano rasipanje protonskog gradijenta dekuplujućim proteinima (Forner i sar., 2009).
1.3.4 UCP proteini
1.3.4.1 UCP1
Sposobnost BAT da produkuje toplotu omogućena je zahvaljujući prisustvu
dekuplujućeg proteina 1 (engl. uncoupling protein 1, UCP1) koji se nalazi u unutrašnjoj
membrani mitohondrija (Heaton i sar., 1978; Aquila i sar., 1985; Bouillaud i sar., 1986). Sam
UCP1 rasipa protonski gradijent nastao radom elektron transportnog lanca i na taj način
pretvara energiju oksidacije supstrata u toplotu (Nicholls i Locke, 1984). UCP1 se aktivira
masnim kiselinama dugih lanaca dobijenih lipolizom lipidnih tijela nakon adrenergičke
aktivacije BAT (Cannon i Nedergaard, 2004). Osim noradrenalina, sintezu UCP1 stimulišu
cAMP, tiroidni hormoni i retinoidi (Cannon i Nedergaard, 1985; Silva i Rabelo, 1997; Cannon i
Nedergaard, 2004).
UCP1, molekulske mase 32 kDa, pripada genskoj familiji mitohondrijalnih proteinskih
anjonskih nosača (engl. mitochondrial anion carrier proteins, MACP) (Jezek i Garlid, 1998).
Kako se UCP1 aktivira masnim kiselinama, kao i jasan mehanizam funkcionisanja ovog proteina
ostaje spekulativan (Jezek i Garlid, 1998). Osim toga, pokazano je da se UCP1 inhibira
purinskim nukleotidima (Krauss i sar., 2005; Echtay, 2007; Woyda-Ploszczyca i Jarmuszkiewicz,
2014) ali mehanizam na koji način masne kiseline prevazilaze ovu inhibiciju ostaje nejasan
(Shabalina i sar., 2004; Nicholls, 2006; Klingenberg, 2010; Fedorenko i sar., 2012). Neki autori
smatraju da samUCP1 ne povećava respiratorni kapacitet ćelija u bazalnim uslovima (Shabalina
i sar., 2010; Jastroch i sar., 2012).
Predloženo je nekoliko modela funkcionisanja UCP1: (1) UCP1 funkcioniše kao H+
kanal, tj. uniporter koji se aktivira alosternim vezivanjem masnih kiselina (Rial i
Gonzalez-Barroso, 2001; Cannon i Nedergaard, 2004); (2) buffering model ili kofaktorna
teorija, gdje UCP1 funkcioniše kao H+ kanal, a masne kiseline se vezuju za odgovarajuće mjesto
unutar kanala i svojim karboksilnim grupama omogućavaju prenos protona (Winkler i
Klingenberg, 1994; Klingenberg i Huang, 1999); (3) model cikliranja masnih kiselina (engl.
fatty acid cycling model), UCP1 funkcioniše kao nosač anjona masnih kiselina koji prenose H+
indirektno: UCP1 prenosi anjon masnih kiselina ka spoljašnjoj strani unutrašnje
8
mitohondrijalne membrane gdje vezuje H+, i u protoniranoj formi, flip flop mehanizmom, vraća
se ka unutrašnjoj strani membrane i oslobađa H+ u matriks mitohondrija (Andreyev i sar., 1989;
Garlid i sar., 1998; Goglia i Skulachev, 2003); (4) LCFA (engl. long chain fatty acid, masne
kiseline dugih lanaca) shuttling model gdje UCP1 funkcioniše kao simporter anjona masnih
kiselina i H+, ali ne dolazi do disocijacije anjona masnih kiselina i UCP1 zbog interakcije
njihovih hidrofobnih krajeva, već nastavlja da ”funkcioniše” kao H+ nosač (Fedorenko i sar.,
2012).
1.3.4.2 UCP2 i UCP3
Dekuplujući proteini 2 i 3 (UCP2 i UCP3), homolozi UCP1 proteina, identifikovani su
reverznim kloniranjem (Boss i sar., 1997; Fleury i sar., 1997; Vidal-Puig i sar., 1997). Imaju
sličnu aminokiselinsku sekvencu kao i UCP1, tj. UCP2 pokazuje 59% sličnosti sa UCP1, a
UCP3 57% sličnosti sa UCP1, a njihova međusobna sličnost iznosi 73% (Krauss i sar., 2005).
Takođe pripadaju genskoj familiji mitohondrijalnih proteinskih anjonskih nosača (Krauss i sar.,
2005). Pored BAT (Rodriguez i sar., 2002; Hurov i sar., 2007) , UCP2 je prisutan i u skeletnim
mišićima (Simoneau i sar., 1998; Cadenas i sar., 1999; Schrauwen i sar., 1999), slezini (Horvath
i sar., 2002), srcu (Boehm i sar., 2001; Murray i sar., 2004; Bo i sar., 2008), bubrezima (Qiu
i sar., 2012; Jiang i sar., 2013), Langerhansovim ostrvcima pankreasa (Joseph i sar., 2004; Diao
i sar., 2008), makrofagima (Arsenijevic i sar., 2000; Wang i sar., 2009) i WAT (engl. white
adipose tissue, bijelo masno tkivo) (Harrold i sar., 2000; Rippe i sar., 2000). UCP3 uglavnom je
prisutan u skeletnim mišićima (Boss i sar., 1997; Krook i sar., 1998), srcu (Vettor i sar., 2002;
Murray i sar., 2004) i BAT (Gong i sar., 1997; Samec i sar., 1998; Krauss i sar., 2005).
Kako su Matthias i sar. (2000) pokazali da ekskluzivna uloga termogeneze u BAT pripada
UCP1 proteinu, postavljalo se pitanje funkcije UCP2 i UCP3 proteina. Smatra se da je jedna od
funkcija UCP2 i UCP3 proteina mild uncoupling što omogućava brži protok elektrona kroz
elektron transportni lanac, te smanjivanje membranskog potencijala dovodi do smanjenja
produkcije reaktivnih vrsta kiseonika (engl. reactive oxygen species, ROS) (Brand i Esteves, 2005;
Fisler i Warden, 2006). Pokazano je da UCP2-KO miševi imaju povećanu produkciju ROS u
makrofagima (Arsenijevic i sar., 2000), Langerhansovim ostrvcima pankreasa (Krauss i sar.,
2003), a UCP3-KO miševi povećan nivo ROS u skeletnim mišićima (Vidal-Puig i sar., 2000),
što ukazuje da ti dekuplujući proteini imaju zaštitnu ulogu od ROS.
Utvrđeno je da je genska ekspresija UCP2 i UCP3 povećana tokom gladovanja (Cadenas
i sar., 1999), kao i da UCP2- ili UCP3-KO miševi nisu gojazni (Arsenijevic i sar., 2000; Gong
9
i sar., 2000), što može ukazati da ne doprinose termogenezi. S druge strane, studije sa
prekomjernom ekspresijom UCP2/3 su pokazale da su ti miševi mršaviji u odnosu na divlji tip
(Fuller i sar., 2000; Horvath i sar., 2003). Miševi sa prekomjernom ekspresijom UCP3 u
skeletnim mišićima su bili mršaviji bez obzira na povećani unos hrane (Clapham i sar., 2000).
Neki autori smatraju da primjećeno dekuplovanje elektron transportnog lanca i ATP produkcije
u navedenim studijama prekomjerne genske ekpresije UCP2 i UCP3 zapravo artefakt i da ne
izražava pravu funkciju i fiziološku ulogu ovih proteina (Brand i Esteves, 2005; Esteves i Brand,
2005).
UCP2 igra značajnu ulogu u regulaciji sekrecije insulina (Brand i Esteves, 2005; Krauss
i sar., 2005; Mattiasson i Sullivan, 2006). Smatra se da UCP3 ima ulogu u eksportu masnih
kiselina van mitohondrija (Himms-Hagen i Harper, 2001). Ova tvrdnja je u saglasnosti sa
studijama u kojima je pokazana korelacija nivoa UCP3 sa povećanom oksidacijom masnih
kiselina u slučaju njihovog visokog unosa (dijeta bogata mastima, gladovanje) (Gong i sar.,
1999; Boss i sar., 2000; Krauss i sar., 2003; Schrauwen i Hesselink, 2004; Brand i Esteves, 2005).
U skeletnim mišićima dolazi do povećane ekspresije UCP3 kada su pacovi na dijeti bogatoj
triacilglicerolima dugih lanaca, što nije slučaj sa triacilglicerolima srednjih lanaca jer se na
drugačiji način oksiduju (Schrauwen i sar., 2003). Eksportom masnih kiselina iz mitohondrija,
UCP3 spriječava akumulaciju lipida i oštećenje mitohondrija (Fisler i Warden, 2006).
1.4 Energetska stanja izolovanih mitohondrija i njihov izgled
Kako je kiseonik krajni akceptor elektrona, moguća je primjena Clark kiseonične
elektrode u istraživanjima na izolovanim mitohondrijama ili permeabilizovanim ćelijama i
mišićnim vlaknima in vitro (Pesta i Gnaiger, 2012; Silva i Oliveira, 2012). Chance i Williams
(1955) su uveli konvenciju redosljeda dodavanja agenasa tokom mjerenja respiracije
mitohondrija i utvdili sljedeća respiratorna stanja: a) stanje 1 – mitohondrije su same u
medijumu, prisutan samo neorganski fosfat; b) stanje 2 – dodat ADP u medijum, respiracija je
niska zbog nedostatka supstrata; c) stanje 3 – ADP i supstrati su prisutni u medijumu, dolazi do
brze respiracije; d) stanje 4 – ceo ADP je konvertovan u ATP, usporava se respiracija; i e) stanje 5
– uslovi anoksije. Nicholls i Ferguson (2013) su iz praktičnih razloga izmijenili definiciju stanja
2 (u prisustvu supstrata) i stanja 3 (supstrat i ADP).
Hackenbrock (1966, 1968) je pokazao direktnu vezu između odgovarajućih respiratornih
stanja i mitohondrijalne ultrastrukture, gdje aktivacijom respiracije ortodoksne mitohondrije
10
postaju kondenzovane sa povećanim intrakristalnim prostorom (Slika 3). Ortodoksne
mitohondrije se odlikuju sljedećim karakteristikama: unutrašnja membrana je pravilno savijena
u organizovane kriste; matriks se odlikuje povećanom zapreminom i manjom gustinom; a
intrakristalni i intermembranski prostor je volumenski smanjen. Kondenzovane mitohondrije
se odlikuju nepravilnom savijenom unutrašnjom membranom; matriks ima smanjenu
zapreminu i povećanu gustinu; a intrakristalni i intermembranski prostor je volumenski uvećan
(Hackenbrock, 1968).
Slika 3. Transmisiona elektronska mikroskopija izolovanih mitohondrija iz jetre pacova. (A)
Kondenzovane mitohondrije. (B) Ortodoksne mitohondrije. Uveličanje: x27.000. Adaptirano iz
Hackenbrock (1968).
1.5 Unutrašnja arhitektura mitohondrija
Dobro poznata dvodimenzionalna slika mitohondrija prikazuje relativno otvoren prostor
između kristi i intermembranskog prostora mitohondrija. Međutim, posmatranje serijskih
presjeka na nivou elektronske mikroskopije visoke rezolucije i rekonstrukcija trodimenzionalne
strukture mitohondrija kompjuterskom tomografijom dovelo je u pitanje otvorenost kristi ka
intermembranskom prostoru (Slika 4A). Pokazano je da je unutrašnja membrana mitohondrija
sklona remodeliranju u zavisnosti od uslova. Scorrano i sar. (2002) su pokazali povezanost
remodeliranja unutrašnje membrane sa oslobađanjem cyt c u apoptozi. U istom tom ćelijskom
procesu, dolazi i do fragmentacije unutrašnje mitohondrijalne membrane (Sun i sar., 2007).
Na osnovu svega navedenog, postalo je jasno da kriste nisu puke invaginacije unutrašnje
mitohondrijalne membrane, već da su to jasni mikrokompartmenti, te je unutrašnja
11
Slika 4. Unutrašnja arhitektura mitohondrija. (A) Kompjuterski model dobijen trodimenzionalnom
tomografijom mitohondrija iz cerebeluma pilića, gdje se uočavaju kriste (žuto), unutrašnja granična
membrana (svijetloplavo) i spoljašnja mitohondrijalna membrana (tamnoplavo). Adaptirano iz Frey i
Mannella (2000). (B) Negativno obojen dimer ATP sintaze izolovan iz Polytomella spp. Bar: 10 nm.
Adaptirano iz Dudkina i sar. (2010). (C) Tomografska rekonstrukcija niza dimera ATP sintaze iz tubule
krista mitohondrija iz jetre pacova. Dužina tubule: 280 nm. Adaptirano iz Strauss i sar. (2008).
mitohondrijalna membrana podijeljena na dva poddomena - unutrašnja granična membrana
(engl. inner boundary membrane, IBM) i membrana kristi (engl. cristae membrane, CM). Dakle,
IBM je u bliskom kontaktu sa spoljašnjom mitohondrijalnom membranom, i zajedno zatvaraju
mitohondriju, što se na nivou TEM (transmisioni elektronski mikroskop) uočava kao dvije
membrane. CM su invaginacije IBM koje prodiru u matriksni prostor (Zick i sar., 2009). Kriste
su povezane sa IBM suženim strukturama u obliku tubula ili proreza, nazvanim kristalni spojevi
(engl. crista junction, CJ) koje su uočene elektronskom tomografijom mitohondrija (Mannella
i sar., 1994; Perkins i sar., 1997, 1998; Nicastro i sar., 2000; Frey i sar., 2002; Rabl i sar., 2009).
Dijametar kristalnih spojeva je svega 12 do 40 nm, što implicira da ti spojevi formiraju barijere
za transport proteina i metabolita između intrakristalnog i intermembranskog prostora, ali i
između CM i IBM (Rabl i sar., 2009). Smatra se da takva barijera ograničava unos ADP u
intrakristalni prostor (Mannella, 2008). Remodeliranje unutrašnje membrane uključuje i
petostruko proširivanje kristalnih spojeva, što može da dovede do transporta cyt c između
intrakristalnog i intermembranskog prostora (Scorrano i sar., 2002; Frezza i sar., 2006).
Topologija unutrašnje mitohondrijalne membrane, prema tome, može imati efekat na aktivnost
mitohondrija uticajem na kinetiku difuzije metabolita i proteina između dva navedena
kompartmenta (Mannella, 2008), ako se uzme u obzir da su proteini uključeni u oksidativnu
fosforilaciju lokalizovani u kristama (Vogel i sar., 2006; Benard i Rossignol, 2008).
1.5.1 Uticaj ATP sintaze na arhitekturu kristi
ATP sintaza ima direktan efekat na topologiju unutrašnje mitohondrijalne membrane.
Tretmanom blagim deterdžentima i nativnom gel elektroforezom srca miša (Wittig i sar., 2006)
12
i govečeta (Schagger i Pfeiffer, 2000) utvrđeno je da se ATP sintaza javlja i u vidu dimera (Slika
4B). Veliki nizovi dimera ATP sintaze su prisutni u unutrašnjoj membrani mitohondrija (Allen
i sar., 1989; Buzhynskyy i sar., 2007; Strauss i sar., 2008; Davies i sar., 2012), čak i do 80 dimera u
nizu (Slika 4C) dovodeći do pozitivnog zakrivljenja membrane sa dijametrom od oko 17 nm
(Strauss i sar., 2008). Fcj1 (engl. formation of CJ protein 1) protein, koji je koncentrisan u samoj
invaginaciji IBM, dovodi do negativnog zakrivljenja membrane prilikom formiranja CJ (Rabl
i sar., 2009; Korner i sar., 2012). Smatra se da ti nizovi ATP dimera dovode do savijanja
membrane što dalje vodi formiranju kristi. Zajedničkom lokalizacijom respiratornih kompleksa
u vidu superkompleksa i ATP sintaze sa membranom kristi dolazi do stvaranja mikrosredine
povoljne za reakcije prenosa elektrona i protona (Allen, 1995; Bornhovd i sar., 2006; Strauss
i sar., 2008; Zick i sar., 2009; Davies i sar., 2012). Kod kvasaca je pokazano da delecija
subjedinice e ili g ATP sintaze dovodi do nastanka abnormalnih mitohondrija čije unutrašnje
membrane poprimaju slojevit oblik nalik na luk umjesto kristi (Paumard i sar., 2002).
Rekonstitucijom ili prekomjernom ekspresijom IF1 dolazi do povećanja odnosa ATP dimera u
odnosu na ATP monomer, što ukazuje da IF1 ima ulogu u uspostavljanju ili stabilizaciji ATP
dimera (Garcia i sar., 2006). Pretpostavlja se da mitohondrijalne kriste služe kao neki vid zamke
za protone, sa ATP sintazama na vrhovima tih kristi što omogućava efikasnu ATP produkciju
(Strauss i sar., 2008). Kompjuterskim simulacijama je utvrđeno da je u regionima kristi u blizini
dimera ATP sintaze veća koncentracija protona što dovodi do povećanja lokalne razlike u pH
vrijednosti za oko 0.5 jedinica (Strauss i sar., 2008), što opet doprinosi stvaranju proton
pokretačke sile.
1.5.2 Respiratorni superkompleksi
Nativna gel elektroforeza (engl. blue native polyacrylamide gel electrophoresis, BN-PAGE),
nakon tretmana blagim deterdžentima radi izolacije proteina mitohondrijalnih membrana,
pokazala je da su kompleksi I, III i IV češće u formi superkompleksa, a naročito kompleks I koji
gotovo da je prisutan samo u superkompleksima (Schagger i Pfeiffer, 2000). Najčešći
superkompleksi koji su utvrđeni jesu kompleks I/IIIn (Dudkina i sar., 2005; Lenaz i sar., 2010),
kompleks I/IIIn/IVn (Stroh i sar., 2004; Dudkina i sar., 2011) i kompleks IIIn/IVn (Berry i
Trumpower, 1985; Zhang i sar., 2005). Za razliku od ostalih kompleksa elektron transportnog
lanca, kompleks II je prisutan uglavnom u slobodnoj formi, a samo mali udio je vezan za
superkompleks I/III/IV (Eubel i sar., 2003; Acin-Perez i sar., 2008; Muster i sar., 2010; Winge,
2012).
13
Lapuente-Brun i sar. (2013) su ustanovili da je dinamičko sklapanje superkompleksa
mehanizam kojim se ćelija jetre prilagođava na različite izvore ugljenika i tako modulira elektron
transportni lanac zadovoljavajući trenutne potrebe. Kako je odnos NADH/FAD elektrona viši
kada je glukoza primarni supstrat respiracije (5), a niži u slučaju oksidacije masnih kiselina
(palmitat – oko 2) (Speijer, 2011), pokazano je da ćelija ima sposobnost selektivnog kanalisanja
elektrona kroz komplekse (Lapuente-Brun i sar., 2013). Sklapanje i stabilnost respiratornih
superkompleksa zavisi i od oblika samih kristi, što implicira da je sklapanje respiratornih
superkompleksa veza između mitohondrijalne strukture i funkcije (Cogliati i sar., 2013).
1.6 Remodeliranje mitohondrija
Davno je primjećeno da se mitohondrije stalno mijenjaju, ”da se te granule međusobno
spajaju u štapiće ili lance, te se izdužuju u niti koje se spajaju sa drugim nitima stvarajući mrežu, a
zauzvrat mogu da se opet razlože na niti, štapiće, petlje i prstene” (Lewis i Lewis, 1914), a 80-ih
godina prošlog vijeka pokazano je da su mitohondrije visoko dinamičke organele koje mogu da
formiraju intracelularni retikulum (Bereiter-Hahn, 1990).
Mitohondrije stalno ulaze u igru spajanja procesom fuzije i razdvajanja procesom fisije
(Slika 5). Veći mitohondrijalni retikulum je veoma značajan u metabolički aktivnim ćelijama
gdje doprinosi npr. prenosu energije (Skulachev, 1990). Nasuprot tome, u mirujućim ćelijama
se mitohondrije često uočavaju kao brojne morfološki i funkciono definisane jedinice u vidu
sfera ili štapića (Collins i sar., 2002).
Mitohondrijalna dinamika omogućava mitohondrijama da se povezuju sa endoplazminim
retikulumom (ER) u visokospecijalizovanim regionima membrane (engl. mitochondria
associated membrane, MAM), koja prije svega omogućava prenos Ca2+ iz ER u mitohondrije.
MAM omogućava lokalizovano povećanje koncentracije Ca2+, neophodno za Ca2+ signalizaciju
(Patergnani i sar., 2011). Ova veza između mitohondrija i ER je važna za homeostazu Ca2+ i
njegov metabolizam. Blisko povezivanje ovih organela omogućava povećanje mitohondrijalne
koncentracije Ca2+ što može voditi apoptozi (Szabadkai i sar., 2004), ili u fiziološkim granicama,
povećati bioenergetski kapacitet aktivacijom piruvat dehidrogenaze (Denton, 2009). Ova veza
je omogućena zahvaljujući prisustvu Mfn2 (engl. mitofusin-2), jednog igrača mitohondrijalne
fuzije (de Brito i Scorrano, 2008; Yang i Frohman, 2012). Osim toga, ER sa mitohondrijama
formiraju mikrodomene koje omogućavaju fisiju mitohondrija (Yang i Frohman, 2012).
Da bi se ispunile energetske potrebe ćelije, broj mitohondrija je regulisan samom
14
Slika 5. Biološke funkcije mitohondrijalnog remodeliranja. (A) Životni ciklus mitohondrija počinje
rastom i diobom postojećih organela (biogeneza) i završava se degradacijom oštećenih ili nepotrebnih
organela mitofagijom. Između ta dva procesa, mitohondrije ulaze u stalan ciklus fuzije i fisije što
omogućava ćeliji da balansira između pojedinih mitohondrija i mitohondrijalnog retikuluma, u zavisnosti
od datih fizioloških uslova. (B) Fuzija i fisija mitohondrija su važne za mnoge biološke funkcije. Dioba je
neophodna za nasljeđivanje i preraspodjelu organela tokom ćelijske diobe, za oslobađanje proapoptotskih
faktora iz intermembranskog prostora, za unutarćelijsku distribuciju ili za razgradnju oštećenih organela
mitofagijom. Fuzionisani mitohondrijalni retikulum je važan za rasipanje metaboličke energije prenosom
membranskog potencijala duž mitohondrijalnih filamenata, i za komplementaciju genskih produkata
mtDNK u heteroplazmatičnim ćelijama izbjegavajući pad respiratornog kapaciteta tokom starenja (X i Y
se odnose na alele različitih mitohondrijalnih gena). Adaptirano iz Westermann (2010).
mitohondrijalnom biogenezom. Taj proces biogeneze je regulisan od strane PGC-1α (engl.
peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α), što je važno za ćeliju i mitohondrijalnu
dinamiku jer je transkripcioni koaktivator Mfn2 (Zorzano, 2009; Ryan i sar., 2013).
Mitohondrije posjeduju program kontrole kvaliteta, odnosno mitofagiju. Mitofagijom, tj.
autofagocitozom se ćelija ”riješava” oštećenih, depolarizovanih mitohondrija. Procesom fisije
izoluju se depolarizovane mitohondrije, a istovremenim smanjenjem medijatora fuzije
spriječava se njihovo spajanje sa drugim mitohondrijama (Zhang i Ney, 2010; Youle i Narendra,
2011; Kubli i Gustafsson, 2012; Zhang, 2013).
Fisija je proces formiranja manjih i jasno izdvojenih mitohondrija, što im omogućava
produkciju ROS (Yu i sar., 2008; Jheng i sar., 2012), eliminaciju mitohondrija mitofagijom i
ćelijsku proliferaciju (Marsboom i sar., 2012; Salabei i Hill, 2013). Fuzija, s druge strane, dovodi
do formiranja mitohondrijalnog retikuluma koji omogućava komunikaciju sa ER, ali i difuziju
15
matriksnog sadržaja među mitohondrijama ”razblažujući” stepen oštećenja mitohondrijalne
DNK (Santel i sar., 2003; Archer, 2013).
Procesi mitohondrijalnog remodeliranja su regulisani uz pomoć visokokonzervisanih
guanin trifosfataza (GTPaze) (Youle i van der Bliek, 2012; Ishihara i sar., 2013). Fisija je
posredovana uz pomoć Drp1 (engl. dynamin related protein 1) (Chen i sar., 2003; Cribbs i
Strack, 2009), citoplazmatičnog proteina koji aktivacijom formira prstenastu strukturu koja se
sužava i dijeli mitohondriju (Lee i sar., 2004; Zhu i sar., 2004). Za tu funkciju, uključeni su i
drugi proteini kao što su Fis1 (engl. mitochondrial fission 1 protein) (Lee i sar., 2004), Mff (engl.
mitochondrial fission factor)(Otera i sar., 2010), i Mef (engl. mitochondrial elongation
factor)(Zhao i sar., 2011). Kristalografska analiza Dnm1 oligomera (analoga Drp1 kod kvasaca)
pokazala je da je dijametar Dnm1 heliksa 110-130 nm (Chappie i sar., 2011; Faelber i sar., 2011;
Ford i sar., 2011), što je značajno manje od dijametra mitohondrija. ER uskače u pomoć tako
što svojim tubulama obavija mitohondriju i vrši suženje na tom mjestu (Friedman i sar., 2011),
smanjujući dijametar (138 i 146 nm) na vrijednosti približne dijametru Dnm1/Drp1 heliksa
omogućavajući oligomerizaciju Dnm1 proteina i time uspješnu fisiju mitohondrija (Labrousse
i sar., 1999; Legesse-Miller i sar., 2003; Ingerman i sar., 2005; Mears i sar., 2011). Aktivnost
Drp1 proteina regulisana je fosforilacijom Ser ostataka, i to fosforilacijom Ser600 i Ser616 dolazi
do povećanja njene aktivnosti, a fosforilacijom Ser637 do smanjenja aktivnosti Drp1 (Taguchi
i sar., 2007; Han i sar., 2008; Marsboom i sar., 2012). Postoje i drugi vidovi regulacije aktivnosti
Drp1 i to ubikvitinacijom (Yonashiro i sar., 2006; Wang i sar., 2011) i
sumoilacijom/desumoilacijom (Braschi i sar., 2009; Figueroa-Romero i sar., 2009; Zunino i sar.,
2009).
Glavni igrači fuzije su Mfn1 (engl. mitofusin-1) i Mfn2, izoforme koje se nalaze u
spoljašnjoj membrani mitohondrija, i Opa1 (engl. optic atrophy protein 1) prisutan u unutrašnjoj
membrani mitohondrija (Cipolat i sar., 2004). Homo- odnosno heterodimernom interakcijom
Mfn1 i/ili Mfn2 dolazi do inicijacije fuzije spoljašnjih membrana susjednih mitohondrija (Rojo
i sar., 2002; Chen i sar., 2003). Opa1 posreduje u fuzionisanju unutrašnjih membrana
mitohondrija (Song i sar., 2007; Westermann, 2010). Prvo dolazi do spajanja spoljašnjih
membrana mitohondrija posredstvomMfn1 i Mfn2, i potom do spajanja unutrašnjih membrana
mitohondrija posredstvom Opa1. Međutim, brojne studije su pokazale da ta dva procesa mogu
da funkcionišu nezavisno jedan od drugog, odnosno da u nekim slučajevima ne dolazi do
spajanja unutrašnjih membrana mitohondrija (Meeusen i sar., 2004; Malka i sar., 2005;
Meeusen i sar., 2006). Osim toga, pokazano je da je Mfn2 prisutan i u membrani ER,
16
omogućavajući bliski kontakt između ER i mitohondrija (de Brito i Scorrano, 2008). Fuzija
mitohondrija je prije svega regulisana fosforilacijom i ubikvitinacijom mitofuzina (Cohen i sar.,
2008; Gegg i sar., 2010; Poole i sar., 2010; Tanaka i sar., 2010; Leboucher i sar., 2012; Anton
i sar., 2013).
Fibroblasti embriona miševa, u kojima odsustvuje Mfn1 ili Mfn2, mogu da održavaju
mitohodrijalnu DNK, ali je primjećen gubitak mitohondrijalnog membranskog potencijala
(ΔΨm) u pojedinim mitohondrijalnim populacijama (Chen i sar., 2003). Ćelije, u kojima
odsustvuje fuzija mitohondrija, imaju smanjen respiratorni kapacitet (Chen i sar., 2005). U
eksperimentu sa dvjema respiratorno-deficijentnim HeLa ćelijama sa mutacijom u različitim
mitohondrijalnim genima za tRNK, pokazalo se da njihovi hibridi uspostavljaju respiraciju
nekoliko dana poslije fuzije njihovih mitohondrija (Ono i sar., 2001). Slični rezultati su dobijeni
i u eksperimentu sa miševima (Nakada i sar., 2001). Ovi rezultati ukazuju da fuzija
mitohondrija i razmjena mitohondrijalne DNK igraju važnu ulogu u održanju respiratornog
kapaciteta sisarskih ćelija. Osim toga, fuzijom se formira mitohondrijalni retikulum koji se može
posmatrati kao električni kuplovani sistem (Amchenkova i sar., 1988; De Giorgi i sar., 2000), tj.
mitohondrijalni retikulum funkcioniše kao sistem intracelularnih kablova koje prenose energiju
(Skulachev, 1990). Po toj hipotezi, kompleksi elektron transportnog lanca proizvode ΔΨm i to u
dijelovima ćelije sa većom koncentracijom O2, i taj ΔΨm se prenosi putem mitohondrijalnih
filamenata do udaljenih dijelova ćelije, gdje se može iskoristiti za aktivnost ATP sintaze u
produkciji ATP i obezbjeđivanju energije u dijelovima ćelije sa nižom koncentracijom O2
(Skulachev, 1990; Westermann, 2012).
In vitro, pokazano je da noradrenalin, snažan aktivator BAT, indukuje potpunu i brzu fisiju
mitohondrija u mrkim adipocitima putem fosforilacije Ser600 Drp1 proteina i razgradnjom
Opa1. Ta promjena mitohondrijalne arhitekture je primjećena u primarnoj kulturi mrkih
adipocita i u BAT miševa izloženih hladnoći. Štaviše, mitohondrijalna fisija mrkih adipocita
RNK interferencijom Mfn2 povećava kapacitet egzogenih slobodnih masnih kiselina da
povećaju potrošnju energije. Ovim je pokazano da noradrenalin, osim sposobnosti da stimuliše
lipolizu, indukuje potrošnju energije i putemmitohondrijalne fisije (Wikstrom i sar., 2014).
1.7 Mitohondrije, ER i kalcijum
Mitohondrijama pridružene membrane (MAM) su visokospecijalizovani kompartmenti
koji fizički i biohemijski povezuju ER i mitohondriju (Csordas i sar., 2006; Hayashi i sar., 2009;
17
Schon i Area-Gomez, 2013). Nastaju samim približavanjem ER i mitohondrije (de Brito i
Scorrano, 2008; Fujimoto i sar., 2012) i na taj način se omogućavaju specijalizovane funkcije u
koje su obe organele uključene (Hayashi i sar., 2009). Za razliku od drugih organela, MAM je
dinamički kompartment ćelije, čiji sastav se mijenja u realnom vremenu, u zavisnosti od datih
uslova. Identifikovano je 75 proteina koji su uključeni u MAM, kao što su proteini koji su
uključeni u homeostazu Ca2+ (npr. InsP3 receptori), metabolizam holesterola (npr.
acil-CoA:holesterol acetiltransferaza - ACAT1) i metabolizam fosfolipida (npr. fosfatidilserin
sintaza 2 - PTDSS2) (Schon i Area-Gomez, 2013). Kontakt između ER i mitohondrije se
održavaju proteinima kao što su: PACS2 (engl. phosphofurin acidic cluster sorting protein 2) koji
stabilizuje i reguliše interakciju dvije navedene organele, i Mfn2, o kojem je bilo ranije riječi
(Schon i Area-Gomez, 2013).
I ER imitohondrije su značajne organele koje su neophodne za održanje Ca2+ homeostaze
u ćeliji (Berridge, 2002), gdjeMAM igra ključnu ulogu u interorganelarnom toku Ca2+ (Hayashi
i sar., 2009). Do sad je identifikovano bar 11 proteina MAM koji su uključeni u Ca2+ trafficking
- rijanodinski receptori, inozitol-1,4,5-trifosfatni (InsP3) receptori i sigma-1 receptor (Schon i
Area-Gomez, 2013).
Pokazano je da presenilin 2, protein prisutan u membrani ER, favorizuje bliski kontakt
mitohondrija i ER, kao i njihovu razmjenu Ca2+ (Zampese i sar., 2011). Osim toga, utvrđeno je
bogato prisustvo ovog proteina u MAM (Area-Gomez i sar., 2009), a u fibroblastima embriona
miševa sa isključenim genom za presenilin 2 utvrđen je poremećaj mitohondrijalne funkcije,
prije svega smanjen mitohondrijalni membranski potencijal i smanjena respiracija (Behbahani
i sar., 2006). Upravo to pokazuje da je smanjen bioenergetski kapacitet posljedica smanjenog
toka Ca2+ uslijed gubitka bliskog kontakta između mitohondrije i ER.
Na ćelijskim modelima, Cardenas i sar. (2010) su pokazali da je stalna razmjena Ca2+
izmeđumitohondrije i ER neophodna da bi se održala funkcija mitohondrija, izbjegla mitofagija
i osigurala ATP produkcija.
1.8 Mrki adipociti i kalcijum
Poznato je da adrenergička stimulacija dovodi do povećanja citosolne koncentracije Ca2+
u mrkim adipocitima (Leaver i Pappone, 2002; Nicholls, 2006). Unos Ca2+ od strane mrkih
adipocita je pod kontrolom α1 i β adrenergičkih receptora, gdje α1 adrenergička stimulacija vodi
do intracelularnog povećanja Ca2+ (Connolly i sar., 1984; Bronnikov i sar., 1999), a β
18
adrenergička stimulacija vodi ka inhibiciji unosa Ca2+ u mitohondrije (Connolly i Nedergaard,
1988). Interesantno, kod mrkih preadipocita, primjena α1 agonista pokazala je slab efekat, a
β-selektivan agonist (isoprotenerol) inicirao je povećanje Ca2+ koncentracije identično kao i
primjena noradrenalina, pokazujući da se mrki preadipociti razlikuju od zrelih mrkih adipocita,
gdje je Ca2+ signalizacija posredovana α1 adrenergičkim receptorima (Dolgacheva i sar., 2003;
Turovskii i sar., 2011).
Primjenom noradrenalina, mrki adipociti in vitro pokazuju povećanje citosolne Ca2+
koncentracije (Wilcke i Nedergaard, 1989) kao rezultat toka i intracelularnih i ekstracelularnih
izvora Ca2+ (Lee i sar., 1993). Tuchiya i Nagai (1994) su pokazali, in vitro na svježe izolovanim
pojedinačnim mrkim adipocitima, korišćenjem kalcijumskog indikatora fura-2, da primjenom
noradrenalina dolazi do postepenog rasta citosolne Ca2+ koncentracije sa maksimumom pola
sata poslije aplikacije noradrenalinom. Zaključili su da noradrenalin povećava koncentraciju
Ca2+ u mrkim adipocitima i to uglavnom putem α-adrenergičkog receptora.
U eksperimentu na mrkim adipocitima životinja aklimatizovanih na hladnoću, Nakagaki
i sar. (2005) pokazali su da noradrenalin i forskolin (diterpenski aktivator adenilat ciklaze)
dovode do povećanja citosolne Ca2+ koncentracije, kao i do porasta koncentracije Ca2+ u
mitohondrijama, a akumulacija Ca2+ u mitohondrijama zavisi od protonskog gradijenta
dobijenog radom elektron transportnog lanca. To je u saglasnosti sa ranim studijama koje su
ukazale da mitohondrije mogu da akumuliraju veliku količinu Ca2+ u zavisnosti od
mitohondrijalnog energetskog metabolizma (Vasington i Murphy, 1962; Hittelman i sar., 1967).
1.9 Mrki adipociti i insulin
Brojne studije su pokazale da insulin reguliše aktivnost BAT (Rothwell i sar., 1981;
Rothwell i Stock, 1981; Mur i sar., 2003; Matsuo i sar., 2011), homeostazu glukoze i insulinsku
osjetljivost (Shackney i Joel, 1966; Orava i sar., 2011; Stanford i sar., 2013). Štaviše, insulin i
IGF-1 (engl. insulin growth factor-1) igraju važnu ulogu u razvoju BAT, metabolizmu adipocita i
termogenezi (Boucher i sar., 2012). Pokazano je da mrki adipociti fetusa pacova pokazuju visok
afinitet ka insulinu i IGF-1, što ukazuje da su glavni signali uključeni u uspostavljanje i održanje
adipogenih gena prisutni u fetalnimmrkim adipocitima (Teruel i sar., 1996). Akutna stimulacija
diferenciranih mrkih adipocita insulinom vodi do fosforilacije Tyr ostataka i aktivacije svih
elemenata uključenih u insulinsku signalizaciju, uključujući i insulin receptorne supstrate (IRS),
mitogen aktiviranu protein kinazu (MAPK), fosfatidilinozitol-3 kinazu i protein kinazu B
19
(PKB) (Klein i sar., 1999; Fasshauer i sar., 2000; Klein i sar., 2002). Na taj način insulin
indukuje unos glukoze, lipogenezu, sintezu glikogena i sintezu proteina (Klein i sar., 2002).
Uloga insulina i IGF-1 je dobro prostudirana korišćenjem primarne kulture mrkih adipocita
(Porras i sar., 1998; Valverde i sar., 1998a).
Insulin direktno stimuliše unos glukoze u BAT in vivo (Cooney i sar., 1985; Greco-Perotto
i sar., 1987; Slot i sar., 1991) i u mrke adipocite in vitro (Czech i sar., 1974; Ebner i sar., 1987;
Omatsu-Kanbe i sar., 1996). Insulin indukuje translokaciju intracelularnih GLUT4 ka ćelijskoj
membrani, modifikaciju samih GLUT4 proteina i povećanje biosinteze, odnosno smanjenje
razgradnje GLUT4, i na taj način povećava unos glukoze (Omatsu-Kanbe i Kitasato, 1992;
Valverde i sar., 1998b; Watson i Pessin, 2001). Unijeta glukoza se može iskoristiti za produkciju
glicerol fosfata potrebnih za sintezu triacilglicerola ili se skladišti u vidu glikogena (Cannon i
Nedergaard, 2004).
Sve veći značaj se pridaje vezi između mitohondrijalne homeostaze i insulinske
signalizacije. Studija na mitohondrijama izolovanim iz jetre dijabetičnih i nedijabetičnih pacova
pokazala je da je insulin važan za efikasnu ATP produkciju (Hall i sar., 1960). Osim toga, novije
studije su pokazale da insulin poboljšava mitohondrijalnu funkciju skeletnih mišića (Stump
i sar., 2003; Petersen i sar., 2005; Nisr i Affourtit, 2014). Sa druge strane, Boirie i sar. (2001) su
utvrdili da insulin pokazuje tkivno specifično dejstvo na mitohondrijalne proteine.
Insulin značajnije doprinosi nastanku insulinske rezistencije nego hiperglikemija, što je
pokazano u slučaju dijabetesa tipa 1 (Liu i sar., 2009). Blaga hiperinsulinemija može se tolerisati
kratko vrijeme, ali hronična hiperinsulinemija pokreće insulinsku rezistenciju i doprinosi
etiologiji dijabetesa (White, 2003). Uloga mitohondrija u insulinskoj rezistenciji je još uvijek
kontroverzna jer nije još uvijek jasno da li je disfunkcija mitohondrija uzrok ili posljedica
insulinske rezistencije, barem na studijama skeletnih mišića (Kelley i sar., 2002; Mootha i sar.,
2003; Boushel i sar., 2007; Montgomery i Turner, 2015).
Veza između termogeneze, insulina i mitohondrija mrkih adipocita, i njihova uloga u
dijabetesu i gojaznosti je dugo predmet debate, i to počevši od rezultata studija koje su pokazale
specifičan pad termogenog kapaciteta mitohondrija (Atgie i sar., 1993) i povezanost
poremećene termogeneze i insulinske rezistencije (Marette i sar., 1991a) u BAT gojaznih
dijabetičnih pacova (Marette i sar., 1991b). Osim toga, najnovija studija je pokazala da
disfunkcija mitohondrija ima mnogo veći efekat na insulinski odgovor, ali i zavisnost ovog
efekta od tipa ćelije (Martin i sar., 2014). U eksperimentu in vitro sa IRS-1 deficijetnim mrkim
adipocitima, pokazano je da insulin ima važnu ulogu u regulaciji ekspresije UCP1 (Valverde
20
i sar., 2003). Primjenom tiazolidinediona, kao što je rosiglitazon, kojim se povećava insulinska
osjetljivost, dolazi do mitohondrijalnog remodeliranja - povećanja mitohondrijalne mase i
promjene mitohondrijalne strukture, što je uočeno u bijelim adipocitima (Wilson-Fritch i sar.,
2003). Osim regulacije ćelijskog metabolizma kardiomiocita putem unosa glukoze, insulin
stimuliše proteinsku ekspresiju Opa1, mitohondrijalnu fuziju, povećava mitohondrijalni
membranski potencijal, ATP produkciju i potrošnju kiseonika in vitro i in vivo, a takođe je
pokazano da utišavanje Opa1 ili Mfn2 dovodi do gubitka navedenih metaboličkih efekata
insulina (Parra i sar., 2014).
21
2 | Cilj
Cilj ovog istraživanja jeste rasvjetljavanje molekulskih osnova strukturnog remodeliranja
mitohondrija indukovanog kalcijumom i insulinom umrkim adipocitima pacova.
Neophodno je razumijevanje na koji način, kalcijum, s jedne strane, i insulin, s druge
strane, utiču na aktivaciju termogeneze, odnosno povećanje termogenog kapaciteta mrkih
adipocita. Regulacija termogeneze i povećanje termogenog kapaciteta mitohondrija mrkih
adipocita u prvi plan ističu ulogu koju imaju kalcijum i insulin.
U tu svrhu, analiziraće se ultrastrukturno remodeliranje mitohondrija (oblik
mitohondrija, srednji dijametar, volumenska gustina kristi), dinamika remodeliranja
mitohondrija (fisija i fuzija mitohondrija, održanje mitohondrijalnog retikuluma, održanje
balansa ključnih proteina uključenih u mitohondrijalno remodeliranje), kao i ekspresija
proteina uključenih u remodeliranje mitohondrija, mitohondrijalnih markera, a i ERmarkera.
Kako postoji neraskidiva veza strukture i funkcije, cilj disertacije je i karakterizacija
bioenergetskog kapaciteta mitohondrija, odnosno promjena proteinske ekspresije, aktivnosti i
lokalizacije pojedinačnih kompleksa elektron transportnog lanca, ATP sintaze i inhibitornog
faktora 1, i to u direktnoj korelaciji sa promjenama mitohondrijalne strukture. Na nivou
konfokalne mikroskopije analiziraće se lokalizacija pojedinih ključnih mitohondrijalnih
proteina, i to na nivou BAT, mrkih adipocita, a i mitohondrija mrkih adipocita i upoređivaće se
sa istovremenom lokalizacijom UCP1. Biohemijski će se analizirati aktivnost ATP sintaze, a na
ultrastrukturnom nivou citohemijski će se analizirati kompleksi I i II. Osim toga, pratiće se
efekat insulina na remodeliranje kristi primjenom kompjuterizovane tomografije.
Kako u osnovi mehanizma termogeneze leži formiranje i potrošnja proton pokretačke
sile, analiziraće se efekat kalcijuma i insulina na bioenergetski kapacitet mrkih adipocita.
Aktivacija termogeneze kao dijela metabolizma ćelija uključuje brojne signalne puteve i
molekulske mehanizme, tako da je neophodno da se identifikuju ključni molekulski igrači koji
imaju ulogu u svim navedenim procesima, prije svega pod djelovanjem kalcijuma i insulina.
Osim analize proteinske ekspresije UCP1, ključnog termogenog proteina mrkih adipocita,
22
pratiće se i proteinska ekspresija njegovih homologa, UCP2 i UCP3.
Ovakvim širokim uvidom u strukturni, metabolički i molekulski nivo mitohondrijalne
homeostaze doprinjelo bi se razumijevanju uloge mitohondrija mrkih adipocita u patofiziologiji,
ali i potencijalnimmogućnostima liječenja metaboličkog sindroma.
23
3 | Materijal i metodi
3.1 Eksperimentalne životinje
U eksperimentu su korišćeni mužjaci Wistar soja starosti dva mjeseca. Po odvajanju u
kaveze, mjerena im je tjelesna masa. Imale su pristup česmenskoj vodi i briketiranoj hrani ad
libitum, u uslovima konstantne vlažnosti sa temperaturom oko 22 ±1 °C, dnevnog-noćnog
režima od 12 sati svjetlosti i 12 sati mraka. Sve navedene procedure na životinjama su urađene u
skladu sa EEC direktivom 86/609/EEC, odnosno EU direktivom 2010/63/EU, a odobrene su
od strane Etičke komisije za rad sa životinjama Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu.
3.2 Eksperimentalni dizajn Ca-SANDOZ tretmana
Pacovi, tjelesne mase od 160 do 240 g, podijeljeni su u dvije grupe. Jedna grupa je pila Ca-
SANDOZ® (Novartis, Švajcarska) rastvoren u vodi (480 mg/l Ca2+), a druga, kontrolna grupa,
česmensku vodu, u trajanju od tri dana.
3.3 Eksperimentalni dizajn tretmana insulinom
Eksperimentalne životinje, tjelesnemase od 190 do 260 g, podijeljene su u šest grupa, gdje
su dvije grupe – kontrolne, tretirane fiziološkim rastvorom, a ostale grupe tretirane insulinom
(Mixtard® 30, NovoNordisk, Danska) intraperitonealno (i.p.). Tretirane su akutno (1 dan) ili
hronično (3 dana) niskom (0.4 IU/kg tjelesnemase) ili visokom (4 IU/kg tjelesnemase) dozom
insulina (Slika 6).
24
Slika 6. Eksperimentalni dizajn tretmana insulinom.
3.4 Žrtvovanje životinja i izolacija
Životinjama jemjerena tjelesnamasa i žrtvovane su dekapitacijom, bez anestezije. Odmah
se pristupilo izolaciji interskapularnog depoa BAT, koji je očišćen od vezivnog tkiva i pripremljen
za odgovarajućemetode (Slika 7). Za izolacijumitohondrija uziman je cijeli interskapularni depo
BAT od 6 životinja po grupi.
Slika 7. Priprema BAT za odgovarajuće analize.
25
3.5 Izolacija mitohondrijama bogate frakcije
Interskapularni depo BAT je očišćen od veziva i okolnog bijelog masnog tkiva, potom
pulovan i stavljen u 250 mM rastvor saharoze. Svi koraci su rađeni na ledu. Izolacija
mitohondrijama bogate frakcije je rađena po opisanom protokolu (Cannon i Lindberg, 1979;
Cannon i Nedergaard, 2008) sa malim izmjenama. U uzorak BAT maceriran makazicama,
dodato je 40 ml saharoznog rastvora i homogenizovan je Glas-Col high speed homogenizerom,
15 poteza na 4000 rpm. Dobijeni homogenat je filtriran kroz dvostruku gazu, i centrifugiran na
8500 g na 4 ºC korišćenjem Optima L-100 XP ultracentrifuge (Beckman Coulter, SAD), deset
minuta. Dobijeni supernatant sa gustim gornjim slojem lipida je odbačen brzim invertovanjem
epruvete, a unutrašnjost epruvete je očišćena medicinskom gazom od nalijepljene masnoće.
Talog je resuspendovan u maloj zapremini saharoznog rastvora, potom prebačen u novu
epruvetu uz dodatak rastvora saharoze do 40 ml. Centrifugiran je na 800 g, deset minuta.
Supernatant je prebačen u novu epruvetu, a talog je odbačen (jedro i ostaci ćelije). Ponovno je
centrifugiran na 8500 g, deset minuta. Dobijeni talog je resuspendovan u 5 ml saharoznog
rastvora sa 0.6% FAF-BSA i 1% EDTA, i centrifugiran na 8500 g, deset minuta. Konačno
dobijeni talozi su resuspendovani u minimalnoj zapremini saharoznog rastvora, i proteinska
koncentracija je određivana po Bradfordu. Alikvoti mitohondrijama bogatih frakcija su stavljeni
u tečni azot i sačuvani na -80 ºC.
3.6 Priprema tkiva za analize
3.6.1 Priprema tkiva zaWestern Blot analizu
Odgovarajući isječci interskapularnog depoa BAT, koji su po izolaciji čuvani na -80 ºC, su
mjereni na vagi i očišćeni od preostalog vezivnog tkiva. Isječci iste mase od svake životinje su
pulovani u okviru odgovarajućih grupa, i dodat je RIPA pufer (engl. radio-imuno precipitation
buffer) (2 M NaCl, 10% Triton-X 100, 0.5 M Tris, 10% SDS, pH 7.5) sa koktelom proteaznih
inhibitora (Roche, Švajcarska). Tkivo je macerirano, a potom homogenizovano uz pomoćUltra-
Turrax® T18 basic homogenizera (Ika, Njemačka) tri puta po deset sekundi, sa deset sekundi
pauze. Dobijeni homogenat je sonifikovan na 10 kHz, tri puta po deset sekundi, sa deset sekundi
pauze. Svi navedeni koraci su rađeni na ledu. Homogenati su centrifugirani na 37500 g sat i po
vremena, na 4 ºCuOptimaL-100XPultracentrifugi. Pipetom je izdvojen supernatant i zamrznut
na -20 ºC. Dobijeni supernatanti su korišćeni za Western blot analizu.
26
3.6.2 Priprema tkiva za svjetlosnu i konfokalnu mikroskopiju
Odgovarajući dio tkiva je fiksiran u 4% paraformaldehidu u fosfatnom puferu (pH 7.4).
Nakon 12 sati, ispiran je u česmenskoj vodi preko noći, i dehidratisan kroz seriju etanola rastuće
koncentracije, prosvijetljen u ksilolu i ukalupljen u parafin. Ukalupljeno tkivo je potom sječeno
na rotacionom mikrotomu (Reichert, Austrija) na presjeke odgovarajuće debljine i prenijeto na
SuperFrost Plus mikroskopske pločice (Thermo Fisher Scientific, SAD).
3.6.3 Priprema tkiva za elektronsku mikroskopiju
Odgovarajući tkivni isječci, veličine oko 1mm3, fiksirani su u 2.5% rastvoru glutaraldehida
u Sørensen fosfatnom puferu (0.1M, pH 7.2) 4 sata na 4 ºC. Nakon ispiranja u fosfatnom puferu,
isječci su postfiksirani u 2% OsO4 u istom puferu, dva sata, na sobnoj temperaturi i zaštićeni od
svjetlosti. Potom su uzorci dehidratisani kroz seriju etanola rastuće koncentracije, prosvijetljeni
u propilen oksidu i ukalupljeni u Araldit smolu (SigmaAldrich, Njemačka), na temperaturi od 50
ºC, u trajanju od 72 sata.
Dio tkivnih isječaka, iste veličine kao i za elektronsku mikroskopiju, fiksiran je u rastvoru
2% paraformaldehida i 2% glutaraldehida u 0.1M fosfatnom puferu, sat vremena na sobnoj
temperaturi. Nakon ispiranja u fosfatnom puferu, uzorci su preinkubirani u 0.1%
diaminobenzidinu (DAB, SigmaAldrich, Njemačka) u istom puferu, pola sata na sobnoj
temperaturi u mraku. Potom je u preinkubacioni medijum dodat vodonik peroksid (finalno
0.01%), i uzorci su dalje inkubirani sat vremena u mraku na 37 ºC. Korišćene su dvije negativne
kontrole, i to – kontrola fiksacije (provjera da li je tkivo dobro fiksirano; prije preinkubacije), i
kontrola inkubacije – tkivo je inkubirano u odsustvu vodonik peroksida (provjera DAB
nespecifične reakcije). Uzorci su ponovno ispirani u fosfatnom puferu, i postfiksirani sat
vremena u 1% OsO4 u mraku, na sobnoj temperaturi. Konačno, dehidratisani su u etanolu
rastuće koncentracije i rutinski ukalupljeni u Araldit smolu.
3.7 Priprema krvnih razmaza
Odmah nakon žrtvovanja napravljeni su krvni razmazi, koji su ostavljeni na vazduhu da se
suše. Osušeni razmazi su fiksirani u metanolu 15 min. Rutinski su obojeni
May-Grünwald-Giemsa bojom, i posmatrani i slikani pod svjetlosnim mikroskopom Leica
DMLB (Leica Microsystems, Njemačka).
27
3.8 Priprema mitohondrijama bogate frakcije za analize
3.8.1 Priprema mitohondrijama bogate frakcije zaWestern Blot analizu
U odgovarajuće alikvotemitohondrijama bogatih frakcija, koji su prethodno bili čuvani na
-80 ºC, dodat je RIPA pufer (2 M NaCl, 10% Triton-X 100, 0.5 M Tris, 10% SDS, pH 7.5) sa
dodatim proteaznim inhibitorima (Roche, Švajcarska). Potom je vršena sonifikacija na 10 kHz,
tri puta po deset sekundi, sa deset sekundi pauze. Svi navedeni koraci su rađeni na ledu. Uzorci
su zamrznuti na -20 ºC, i kasnije korišćeni za Western blot analizu.
3.8.2 Priprema mitohondrijama bogate frakcije za elektronsku mikroskopiju
Po 50 µl finalne suspenzije mitohondrijama bogate frakcije fiksirano je dodavanjem 2.5%
glutaraldehida u 0.1 M Sørensen fosfatnom puferu 15 min na 4 ºC. Uzorci su centrifugirani na
14000 g deset minuta, i nakon odlivanja supernatanta ispirani u fosfatnom puferu. Postfiksirani
su u 1%OsO4, sat vremena na sobnoj temperaturi, zaštićeni od svjetlosti. Talozi su dehidratisani
u etanolu rastuće koncentracije i rutinski su ukalupljeni u Araldit smolu.
3.9 Određivanje koncentracije proteina
3.9.1 Određivanje koncentracije proteina tkiva
Količina proteina je određivana po metodu Lowry i sar. (1951). Metod se zasniva na
reakciji peptidnih veza i Cu2+ jona u alkalnoj sredini i reakciji Folin-Ciocalteu reagensa
(mješavina fosfovolframove i fosfomolibdenske kiseline) sa aromatičnim aminokiselinama (Trp
i Tyr) u polipeptidnim lancima. Nastalo kompleksno jedinjenje, plave boje, ima maksimum
apsorpcije na 500 nm. Intenzitet boje je proporcionalan koncentraciji proteina, koja se očitava
sa standardne krive, konstruisane mjerenjem apsorbancije rastvora goveđeg serumskog
albumina (engl. bovine serum albumin, BSA), poznate koncentracije na 500 nm. Koncentracija
proteina se izražava u mg/ml.
3.9.2 Određivanje koncentracije proteina iz mitohondrijama bogate frakcije
Koncentracija proteina iz mitohondrijama bogate frakcije određivala se po Bradford
(1976), korišćenjem Quick Start Bradford Protein Assay kita (Bio-Rad, SAD), po uputstvu
proizvođača.
28
3.10 SDS-PAGE iWestern Blot
Proteini su razdvajani na osnovu njihove molekulske mase na Na+-dodecil
sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) u Bio-Rad Mini-PROTEAN III sistemu. Korišćeni
gelovi za razdvajanje su bile različite procentnosti (pH 8.8) u zavisnosti od molekulske mase
ispitivanog proteina, a gelovi za koncentrisanje 5% (5% akrilamid/bisakrilamid, 0.1% SDS,
0.125 M Tris, pH 6.8). Polimerizacija gela je vršena dodavanjem 0.05% amonijum persulfata
(APS) i 0.033% N,N,N’,N’-tetraetilendiamina (TEMED). Pufer za rezervoare se sastojio od
0.192 M glicina, 0.1% SDS i 0.025 M Tris, pH 8.3. U određenu zapreminu proteinskog rastvora
dodata je jednaka zapremina pufera za uzorke (4% SDS, 20% glicerol, 10% β-merkaptoetanol,
0.125 M Tris, pH 6.8, i 0.025% bromofenol plavo), a zatim su uzorci kuvani 5 min. Na gelove je
nanošen i proteinski marker radi određivanja molekulskih masa (Thermo Fisher Scientific,
SAD). Elektroforeza je trajala do 120 minuta pri konstantnom naponu od 120V.
Potom je vršen transfer proteina sa gelova na PVDF (poliviniliden fluorid) membrane
(Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, UK). Membrane su aktivirane u 100% metanolu, i
to deset sekundi. Membrane i gelovi su pakovani i prebačeni u rezervoare sa transfer puferom
(0.192 M glicin, 20% metanol, 0.025 M Tris, pH 8.3). Prenos proteina sa gelova na membrane
odvijao se pri konstantnom naponu od 100V, 60 minuta. Uspješnost transfera je provjeravana
bojenjemmembrane 5% Ponceau S bojom, rastvorenoj u sirćetnoj kiselini. Potom sumembrane
inkubirane sat vremena na sobnoj temperaturi u serumu za blokiranje nespecifičnog vezivanja –
5% BSA u TBS-T (0.05% Tween-20 u 1.5 MNaCl, 0.2 M Tris, pH 7.4).
3.11 Detekcija proteina nakonWestern Blot analize
Nakon blokiranja, membrane su inkubirane sa odgovarajućim primarnim antitijelima
rastvorenim u 5% BSA u TBS-T, preko noći, na 4 ºC. Razblaženja su prikazana u Tabeli 1 i 2.
Nakon inkubacije i ispiranja nevezanog primarnog antitijela, membrane su inkubirane sa
odgovarajućim sekundarnim antitijelima konjugovanim sa peroksidazom rena (engl. horseradish
peroxidase, HRP), dobijenih imunizacijom koze na IgG zeca (ab6721, Abcam, UK; razblaženje
1:3000, u 5% BSA), odnosno miša (ab6789, Abcam; razblaženje 1:2000, u 5% BSA), dva sata, na
sobnoj temperaturi. Poslije inkubacije, membrane su ispirane TBS-T puferom, najmanje 60
minuta.
29
Tabela 1. Primarna antitijela korišćena zaWestern Blot analizu Ca-SANDOZ tretmana
Antigen Kataloški broj Proizvođač Porijeklo Klonalnost Razblaženje
Mfn1 ab57602 Abcam, UK mišje monoklonalno 5 µg/ml
Mfn2 ab56889 Abcam, UK mišje monoklonalno 5 µg/ml
Drp1 ab93942 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
VDAC ab34726 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
Calnexin ab22595 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
ATPB ab14730 Abcam, UK mišje monoklonalno 1 µg/ml
UCP1 ab10983 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:1000
Za vizuelizaciju proteina, membrane su inkubirane u hemiluminiscentnom supstratu,
luminolu, uz dodatak vodonik peroksida, i to tri minuta. Potom su rentgen filmovi (Hyperfilm,
Amersham Pharmacia Biotech, UK) izlagani ekscitovanom luminolu sa membrana u trajanju od
30 do 120 sekundi. Filmovi su razvijani, osušeni, i skenirani. Dobijeni skenovi su korišćeni za
kvantifikaciju proteinskih traka.
Alternativno, membrane su inkubirane u rastvoru 4-hloro-α-naftola uz dodatak vodonik
peroksida do pojave traka, u trajanju od dvije do deset minuta. Reakcija je prekidana ispiranjem
membrane u destilovanoj vodi, a te membrane su potom skenirane za kvantifikaciju proteinskih
traka.
Kvantifikacija je rađena u ImageQuant softveru (GE Healthcare, UK). Rezultati izraženi
putem integracije volumena predstavljaju sumu vrijednosti svih piksela pobuđenih signalom (1
piksel = 0.007744mm2) unutar označenog objekta, u našem slučaju – trake, koja je vizuelizovana
na prethodno objašnjen način. Ova vrijednost, umanjena za background odnosno fon pozadine,
predstavlja volume, tj. intenzitet zatamnjenja na cijeloj površini trake.
3.12 Određivanje aktivnosti ATP sintaze
Aktivnost ATP sintaze određivana je mjerenjem brzine hidrolize ATP pri konverziji
fosfoenolpiruvata (PEP) u piruvat posredstvom piruvat kinaze (PK). Piruvat se redukuje do
laktata posredstvom enzima laktat dehidrogenaze (LDH). Reakcioni medijum se sastojio od 40
mM TrisHCl, 10 mM EGTA, 0.2 mM NADH, 2.5 mM PEP, 25 µg/ml Antimycin A, 50 mM
MgCl2, 0.5 mg/ml LDH, 0.5 mg/ml PK, 2.5 mM ATP (pH 8.0). Pratila se stopa oksidacije
NADH u NAD+, spektrofotometrijski na 340 nm, na 30 ºC. Reakcija je započeta dodavanjem 5
µg mitohondrijalnih proteina u 1 ml reakcionog medijuma. Validnost reakcije je provjeravana
dodavanjem oligomicina. Dobijena aktivnost ATP sintaze tretiranih grupa je normalizovana u
30
Tabela 2. Primarna antitijela korišćena zaWestern Blot analizu kod tretmana insulinom.
Antigen Kataloški broj Proizvođač Porijeklo Klonalnost Razblaženje
Mitohondrijama bogata frakcija
NDUFA9 ab55521 Abcam, UK mišje monoklonalno 2.5 µg/ml
SDHA ab14715 Abcam, UK mišje monoklonalno 0.1 µg/ml
UQCRC2 ab14745 Abcam, UK mišje monoklonalno 0.5 µg/ml
Cyt c ab18738 Abcam, UK zečje poliklonalno 2.5 µg/ml
COXIV ab14744 Abcam, UK mišje monoklonalno 0.1 µg/ml
ATPB ab14730 Abcam, UK mišje monoklonalno 1 µg/ml
IF1 ab110277 Abcam, UK mišje monoklonalno 1 µg/ml
UCP1 ab10983 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
UCP2 ab67241 Abcam, UK mišje poliklonalno 2 µg/ml
UCP3 ab10985 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
VDAC ab34726 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
Interskapularni depo BAT
NDUFA9 ab55521 Abcam, UK mišje monoklonalno 2.5 µg/ml
SDHA ab14715 Abcam, UK mišje monoklonalno 0.1 µg/ml
UQCRC2 ab14745 Abcam, UK mišje monoklonalno 0.5 µg/ml
Cyt c ab18738 Abcam, UK zečje poliklonalno 2.5 µg/ml
COXIV ab14744 Abcam, UK mišje monoklonalno 0.1 µg/ml
ATPB ab14730 Abcam, UK mišje monoklonalno 1 µg/ml
IF1 ab110277 Abcam, UK mišje monoklonalno 1 µg/ml
UCP1 ab10983 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
UCP2 ab67241 Abcam, UK mišje poliklonalno 2 µg/ml
VDAC ab34726 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
Calnexin ab22595 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
Katalaza ab1877 Abcam, UK zečje poliklonalno 1 µg/ml
odnosu na odgovarajuću kontrolu.
3.13 Lokalizacija proteina mikroskopskim metodima
Za detekciju proteina mikroskopskim metodima korišćeni su parafinski presjeci debljine
7 µm, kao i aralditski polutanki presjeci debljine 2 µm. Svi parafinski presjeci su prethodno
sprovedeni kroz rutinski proces deparafinizacije i rehidratacije. Aralditski polutanki presjeci su
sprovedeni kroz proceduru uklanjanja smole u 1% rastvoru natrijum etoksida (1% natrijum
hidroksid u apsolutnom etanolu) 30 minuta na 37 ºC, a zatim i kroz rehidrataciju. U cilju
otkrivanja antigenih mjesta (epitopa), presjeci su inkubirani 10 minuta (3 min za aralditske
presjeke) u 10 mM citratnom puferu (pH 6.0) na 600 W u mikrotalasnoj pećnici i ispirani u
TBS.
31
3.13.1 Imunohistohemijska lokalizacija proteina
Poslije otkrivanja antigena i ispiranja u TBS, vršeno je blokiranje endogene peroksidaze u
3% rastvoru vodonik peroksida u metanolu deset minuta. Imunohistohemijska detekcija
proteina je vršena korišćenjem ABC kita (ab93697, Abcam). Poslije ispiranja, presjeci su
inkubirani u Protein Block (Abcam) radi spriječavanja nespecifičnog vezivanja, pola sata na
sobnoj temperaturi. Potom su presjeci inkubirani sa primarnim antitijelima odgovarajuće
dilucije, preko noći na 4 ºC. Nakon ispiranja u TBS-T, presjeci su inkubirani u univerzalnoj
smješi biotiniziranih sekundarnih antitijela koze (anti-mišje i anti-zečje antitijelo) – Biotinylated
Goat Anti-Polyvalent Plus (Abcam), deset minuta na sobnoj temperaturi. Prethodno ispirani
presjeci su inkubirani sa konjugatom streptavidina i peroksidaze rena (Streptavidin Peroxidase
Plus, Abcam) deset minuta, na sobnoj temperaturi. Detekcija mjesta vezivanja antitijela za
odgovarajuće proteine u tkivu izvršena je inkubacijom presjeka u 0.05% DAB rastvorenom u
TBS, u prisustvu 0.012% vodonik peroksida u mraku, sve do pojave bojene reakcije, najviše
deset minuta. Reakcija je prekinuta ispiranjem česmenskom vodom, a kontrastiranje je izvršeno
Majerovim hematoksilinom. Nakon rutinske dehidratacije, napravljeni su trajni preparati
montiranjem u DPXmedijumu (SigmaAldrich).
U slučaju polutankih presjeka, poslije otkrivanja epitopa i ispiranja u PBS (pH 7.4),
izvršeno je blokiranje endogene peroksidaze u 3% rastvoru vodonik peroksida u metanolu,
deset minuta na sobnoj temperaturi. Po ispiranju, presjeci su inkubirani sa primarnim zečjim
poliklonalnim anti-UCP1 antitijelom (ab10983, Abcam; razblaženje 1:1000), preko noći na 4
ºC. Nakon ispiranja u PBS, izvršena je inkubacija sa univerzalnom smješom sekundarnih kozjih
anti-mišjih i anti-zečjih IgG antitijela (LSAB universal kit, Dako Scientific, Danska; razblaženje
1:1) 25 minuta na sobnoj temperaturi. Potom su presjeci inkubirani sa konjugatom
streptavidina i peroksidaze rena, takođe 25 minuta na sobnoj temperaturi. Detekcija vezanih
antitijela u tkivu izvršena je inkubacijom presjeka u 0.05% DAB rastvorenom u PBS, u prisustvu
0.012% vodonik peroksida, do pojave bojene reakcije, i to do deset minuta. Reakcija je
prekinuta ispiranjem u česmenskoj vodi, i kontrastiranje je izvršeno Majerovim
hematoksilinom. Nakon dehidratacije, presjeci su montirani u DPXmedijumu.
Primarna antitijela korišćena za imunohistohemijsku detekciju proteina su navedena u
Tabeli 3.
Uzorci su analizirani i slikani svjetlosnim mikroskopom DMLB opremljen DFC295
digitalnom kamerom (Leica Microsystems).
32
Tabela 3. Antitijela korišćena za imunohistohemijsku detekciju proteina.
Antigen Kataloški broj Proizvođač Porijeklo Klonalnost Razblaženje
Mfn1 ab57602 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:500
Drp1 ab93942 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:1000
UCP1 ab10983 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:1000
3.13.2 Imunofluorescentna lokalizacija proteina
Poslije otkrivanja epitopa i ispiranja u TBS, presjeci su inkubirani u 10% normalnom
kozjem serumu i 1% BSA u TBS, radi blokiranja nespecifičnog vezivanja, sat vremena na sobnoj
temperaturi, a zatim sa odgovarajućim primarnim antitijelima (Tabela 4) preko noći na 4 ºC.
Poslije ispiranja u TBS-T (0.1% Tween-20), presjeci su bili inkubirani sa odgovarajućim
sekundarnim kozjim antitijelima konjugovanim sa fluorohromima sat vremena na sobnoj
temperaturi. Prethodno ispirani u TBS-T, presjeci su inkubirani fluorescentnim nukleusnim
bojama - propidijum jodidom (SigmaAldrich; razblaženje 1:500) ili Sytox Orange (S11368, Life
Technologies, SAD; razblaženje 1:1000) pet minuta. Konačno, presjeci su bili ispirani u TBS i
montirani u Mowiolu (SigmaAldrich).
Za kolokalizacione analize, u zavisnosti od primarnih antitijela, korišćene su dva metoda:
metod dvostruke simultane imunofluorescencije i metod dvostruke sekvencijalne
imunofluorescencije (u slučaju da oba primarna antitijela potiču iz istog domaćina).
Vizuelizacija je vršena korišćenjem Leica konfokalnog mikroskopa TCS SP5 II (Leica
Microsystems), i to u sekvencijalnom modu da bi se izbjeglo preklapanje između odgovarajućih
kanala. Dvostruko obojeni uzorci su bili ekscitovani Ar laserom talasne dužine od 488 nm i
HeNe laserom talasne dužine od 633 nm, a nukleusne boje su ekscitovane korišćenjem HeNe
lasera talasne dužine od 543 nm. Negativna kontrola dobijena je izostavljanjem primarnih
antitijela.
3.13.3 Imunogold lokalizacija proteina
Za lokalizaciju proteina na nivou elektronske mikroskopije, korišćeni su tanki presjeci (70
nm) tkiva ukalpljenih u Araldit smolu, koji su montirani na niklovane mrežice presvučene
olovkom za poboljšanje adhezije presjeka (Coat-Quick “G”, Agar Scientific Ltd, UK). Poslije
otkrivanja antigena u citratnom puferu (3 minuta na 600W) i ispiranja u TBS -T (0.1%
Tween-20), vršeno je blokiranje inkubacijom u 5% BSA u TBS-T, sat vremena na sobnoj
temperaturi. Mrežice su, potom, nanešene na kap primarnog antitijela odgovarajućeg
33
Tabela 4. Antitijela korišćena za imunofluorescentnu lokalizaciju proteina.
Antigen Kataloški broj Proizvođač Porijeklo Klonalnost Razblaženje
Primarna antitijela
NDUFA9 ab55521 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
SDHA ab14715 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
UQCRC2 ab14745 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
Cyt c ab18738 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:100
COXIV ab14744 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
ATPB ab14730 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
IF1 ab110277 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
UCP1 ab10983 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:1000
Mfn1 ab57602 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
VDAC ab34726 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:100
Calnexin ab22595 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:200
Katalaza ab1877 Abcam, UK zečje poliklonalno 1:300
Sekundarna antitijela
AlexaFluor 488 A-11034 LifeTech., USA kozje poliklonalno 1:400
anti-rabbit
AlexaFluor 488 A-11029 LifeTech., USA kozje poliklonalno 1:400
anti-mouse
AlexaFluor 633 A-21071 LifeTech., USA kozje poliklonalno 1:400
anti-rabbit
AlexaFluor 633 A-21052 LifeTech., USA kozje poliklonalno 1:400
anti-mouse
razblaženja i inkubirane preko noći na 4 ºC. Ispirane su deset puta po 1 minut u TBS-T, te
prebačene na kap odgovarajućeg sekundarnog antitijela, zapreminskog razblaženja 1:20,
obilježenog česticama zlata dijametra 10 ili 20 nm, i inkubirane sat vremena na sobnoj
temperaturi. Mrežice su ispirane deset puta po jedan minut u TBS-T, a potom pet puta po jedan
minut u redestilovanoj vodi.
U slučaju lokalizacije dva proteina, korišćen je metod sekvencijalnog imunogold
obilježavanja. Prvo je vršena inkubacija primarnim antitijelom, pa sekundarnim antitijelom sa
česticama zlata manjeg dijametra (10 nm), pa potom drugim primarnim antitijelom i
sekundarnim antitijelom sa česticama zlata većeg dijametra (20 nm). Primarna i sekundarna
antitijela korišćena za imunogold lokalizaciju proteina su prikazana u Tabeli 5.
Poslije sušenja, mrežice su posmatrane i slikane na Philips/FEI CM12 transmisionom
elektronskommikroskopu (FEI, Holandija).
34
Tabela 5. Antitijela korišćena za imunogold lokalizaciju proteina.
Antigen Kataloški broj Proizvođač Porijeklo Klonalnost Razblaženje
Primarna antitijela
UQCRC2 ab14745 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
COXIV ab14744 Abcam, UK mišje monoklonalno 1:100
Sekundarna antitijela
Goat anti-mouse IgG ab27241 Abcam, UK kozje poliklonalno 1:20
(10 nmGold)
Goat anti-mouse IgG ab27242 Abcam, UK kozje poliklonalno 1:20
(20 nmGold)
3.14 Lokalizacija kalcijumamikroskopskim metodama
3.14.1 Alizarin Red S bojenje
Poslije uklanjanja smole u 1% natrijum etoksidu na 37 ºC pola sata, i rutinske
rehidratacije, polutanki presjeci su inkubirani u 2% rastvoru Alizarin Red S (pH 4.2) do pet
minuta, a potom ispirani u acetonu i smješi acetona i ksilola. Poslije prosvijetljenja u ksilolu,
presjeci su montirani u DPX smolu i posmatrani i slikani Leica DMLB mikroskopom. Alizarin
Red S pokazuje lokalizaciju kalcijuma formiranjem nerastvorljivih depozita sa Ca2+ jonima,
dajući crveno-narandžastu reakciju.
3.14.2 Precipitacija kalijum piroantimonatom
Isječci tkiva su fiksirani u 2.5% glutaraldehidu u 0.1MSørensen fosfatnompuferu (pH7.2)
u koji je dodat kalijum piroantimonat (finalne koncentracije 2%), četiri sata. Uzorci su ispirani
u istom fosfatnom puferu, postfiksirani u OsO4 u fosfatnom puferu sa antimonatom, dva sata na
sobnoj temperaturi. Poslije ispiranja u fosfatnompuferubez antimonata, uzorci sudehidratisani u
rastućoj koncentraciji etanola i rutinski ukalupljeni uAraldit smolu. U slučaju negativne kontrole,
uzorci su fiksirani i postfiksirani u fosfatnompuferu bez antimonata. Ovimmetodomsedetektuje
in situ lokalizacija kalcijuma, gdje antimonat formira crne precipitate sa Ca2+ jonima.
3.15 Kolokalizaciona studija mitohondrija i endoplazminog
retikuluma
Odmah nakon disekcije, interskapularni depo BAT je isjeckan na komadiće tkiva
korišćenjem vibratoma. Komadići tkiva su inkubirani u PBS sa 100 nM MitoTracker Orange
35
CMTMROS (M7510, Invitrogen, Darmstadt, Njemačka) i 1 µM ER-Tracker Green (E34251,
Invitrogen) i to 45 minuta na 37 ºC. Poslije inkubacije komadići su ispirani dva puta u PBS,
fiksirani u 4% paraformaldehidu u PBS. Poslije finalnog ispiranja u PBS, montirani su na
mikroskopske pločice u Mowiol medijumu, i posmatrani na Leica konfokalnom mikroskopu
TCS SP5 II, u sekvencijalnom modu, da bi se izbjeglo preklapanje između odgovarajućih
detekcionih kanala. MitoTracker Orange CMTMROS, koji se aktivno akumulira u
mitohondrijama tokom inkubacije, ekscitovan je HeNe laserom talasne dužine 543 nm. ER
Tracker Green je boja konjugovana sa glibenklamidom koja se vezuje za sulfonilurea receptore
ATP-zavisnih kalijumovih kanala, kojima je bogat ER. Ova boja je ekscitovana Ar laserom
talasne dužine 514 nm.
Kolokalizacija je određivana uz pomoć LAS AF softvera (Leica Microsystems),
korišćenjem sljedećih parametara: prag (engl. treshold) 30% i pozadina (engl. background) 20%.
Stopa kolokalizacije (engl. colocalization rate, %) je određivana dijeljenjem kolokalizacione
površine (engl. colocalization area) sa površinom u prvom planu (engl. area foreground).
Površina u prvom planu se dobija oduzimanjem površine pozadine (engl. area background) od
površine slike (engl. area image).
3.16 Ultrastrukturna analiza tkiva i mitohondrijama bogate
frakcije
Za analizu na nivou TEM, uzorci tkiva, odnosno mitohondrijama bogatih frakcija
kalupljeni u Aralditu, su trimovani i sječeni dijamantskim nožem (Diatome, Švajcarska) na
tanke presjeke od 70 do 150 nm, na UC6 ultramikrotomu (Leica Microsystems). Presjeci su
montirani na bakarne ili bakar-paladijumske mrežice, kontrastirani uranil acetatom i olovo
citratom na EM STAIN aparatu (Leica Microsystems), a potom posmatrani na FEI/Philips
CM12 transmisionommikroskopu, pri naponu od 60 kV.
Elektronske mikrografije su snimane uz pomoć digitalne kamere SIS MegaView III
(Olympus Soft Imaging Solutions, Njemačka), pri rezoluciji od 1,376 x 1,032 piksela.
3.16.1 Tomografska rekonstrukcija mitohondrija
Za tomografsku rekonstrukciju mitohondrija, korišćeni su presjeci mitohondrijama
bogatih frakcija debljine 100 ili 200 nm, montirani na niklovane mrežice presvučene formvarom.
Tako dobijeni presjeci su obilježeni partikulama zlata imunogold metodom (dijametra 10 nm za
36
kompleks III, a dijametra 20 nm za kompleks IV), radi dobijanja markera neophodnih za
tomografske rekonstrukcije. Snimana je tilt serija, pri veličini piksela od 4.67 nm. Tilt serija se
sastojala od mikrografija snimanih svaki stepen, od -45º do +45º. Poravnanje (engl. alignment)
takvih mikrografija ukrštenom korelacijom (engl. cross-correlation) i rekonstrukcijom vršeno je
pomoću IMOD eTomo softvera (http://bio3d.colorado.edu/imod/).
3.16.2 Ultrastrukturna analiza mitohondrija
Broj mitohondrija je određivan brojanjem mitohondrija na 100 μm2 površine mrkih
adipocita presječenih u nivou nukleusa. Ukupno je analizirano pedeset elektronskih
mikrografija po grupi, odabranih po principu slučajnosti.
Srednji mitohondrijalni dijametar je dobijen kao prosječna vrijednost mjerenih
dijametara u dvije ose (duži i kraći dijametar). Analizirano je 200 mitohondrija po grupi,
korišćenjem elektronskih mikrografija. Na osnovu srednjeg dijametra, mitohondrije su
podijeljene u odgovarajuće klase, i prikazivana je distribucija mitohondrijalnih klasa po
analiziranim grupama.
Navedene analize su rađene uz pomoć iTEM (Olympus Soft Imaging Solutions,
Njemačka) ili ImageJ (NIH, SAD) softvera.
3.17 Citohemijska analiza kompleksa I i II in situ
Reakcija se zasniva na redukciji fericijanida od strane kompleksa I i II u prisustvu
odgovarajućih supstrata. Protokol je rađen po Ogawa i sar. (1968). Ukratko, odmah poslije
izolacije BAT, parče tkiva veličine 1 mm3 inkubirano je dva sata u odgovarajućimmedijumima.
Za citohemijsku analizu kompleksa I u medijum je dodat NADH2, a za kompleks II u
medijum je dodat sukcinat. Osim toga, korišćeni su i inhibitori, i to: rotenon (specifičan
inhibitor kompleksa I) i oksaloacetat (specifičan inhibitor kompleksa II). Po jedan uzorak
kontrolnih grupa inkubiran je u odgovarajućimmedijumima uz dodatak navedenih inhibitora.
Uzorci su zatimfiksirani u 2.5%glutaraldehiduu 0.1MSørensen fosfatnompuferu, 5 sati na
4 ºC, ispirani u fosfatnompuferu i postfiksirani u 2%OsO4 u istompuferu, sat vremena na sobnoj
temperaturi. Nakon dehidratacije u rastućoj koncentraciji etanola uzorci su rutinski ukalupljeni
u Araldit smolu.
37
3.18 Stereološke analize
3.18.1 Stereološka analiza mrkih adipocita
U cilju određivanja volumenske gustine mrkih adipocita u BAT, korišćeni su presjeci tkiva
ukalupljenih u Araldit smolu, debljine 2 µm, koji su prethodno obojeni 1% rastvorom toluidin
plavog u 1% natrijum tetraboratu. Bojenje je vršeno nakapavanjem jednake zapremine toluidin
plavog i natrijum tetraborata na presjeke, uz zagrijavanje na grijnoj ploči dvijeminute, nakon čega
su presjeci ispirani u česmenskoj vodi. Volumenska gustina mrkih adipocita određena je Weibel
metodom (Weibel i sar., 1969), na po deset nasumično odabranih testnih polja od svake životinje
iz svih grupa. Analiza je vršena na svjetlosnom Leica DMLB mikroskopu, korišćenjem Weibel
višenamjenskog testnog okulara sa 42 tačke. Odnosom zbira svih tačaka koje padaju na mrke
adipocite i ukupnog broja tačaka koje padaju naBATodređena jeVvmrkih adipocita korišćenjem
sljedeće formule:
Vv =
Px
Ptotal
Gdje je Vv – volumenska gustina, Px – broj tačaka koje padaju na strukturu od interesa, a
Ptotal je ukupan broj tačaka koje padaju na tkivo, odnosno ćeliju.
3.18.2 Stereološka analiza lipidnih tijela
Volumenska gustina lipidnih tijela je određivana na sličan način kao i volumenska gustina
mrkih adipocita, s tim što je broj tačaka koje padaju na lipidna tijela računat u odnosu na broj
tačaka koje padaju na mrke adipocite.
3.18.3 Stereološka analiza mitohondrija
Volumenska gustina mitohondrija mrkih adipocita određena je kao odnos broja tačaka
Weibel višenamjenskog testnog sistema koje padaju na mitohondrije u odnosu na broj tačaka
koje padaju na mrke adipocite.
Volumenska gustina mitohondrijalnih kristi određena je na sličan način, s tim da se
računao odnos broja tačaka koje padaju na kriste i broja tačaka koje padaju na mitohondriju. Na
osnovu volumenske gustine kristi, mitohondrije su podijeljene u odgovarajuće klase i
prikazivana je distribucija mitohondrijalnih klasa po analiziranim grupama.
38
Navedene stereološke analize mitohondrija su rađene na elektronskim mikrografijama
korišćenjem iTEM softvera.
3.19 Statističke analize
U Ca-SANDOZ tretmanu razlike među grupama su testirane Studentovim t-testom, a u
tretmanu insulinom razlike među grupama su analizirane jednosmjernom (engl. one-way)
ANOVA, a potom Tukey post-hoc testom kako bi se utvrdile značajnosti između pojedinih
grupa. Za najniži stepen značajnosti uzeta je p ⩽ 0:05. Za navedene statističke analize korišćen
je GraphPad Prism 6.0 program (GraphPad Software, SAD) zaMac OS X.
39
4 | Rezultati
4.1 Ca-SANDOZ tretman
4.1.1 Western blot analiza
4.1.1.1 Proteinska ekspresijaMfn1 i Mfn2
Proteinski sadržajmolekulskih igračamitohondrijalne fuzije,Mfn1 iMfn2, značajno je veći
uCa-SANDOZgrupi u poređenju sa kontrolom(Slika 8), pri čemu je proteinska ekspresijaMfn2
proteina petostruko uvećana.
Slika 8. Promjene proteinske ekspresije Mfn1 i Mfn2 nakon Ca-SANDOZ tretmana. * poređenje sa
kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05; ** p ⩽ 0:01.
4.1.1.2 Proteinska ekspresija Drp1
Ekspresija Drp1, proteina neophodnog za mitohondrijalnu fisiju, smanjena je, mada bez
statističke značajnosti, u Ca-SANDOZ grupi u poređenju sa kontrolom (Slika 9).
40
Slika 9. Promjena proteinske ekspresije Drp1 nakon Ca-SANDOZ tretmana.
4.1.1.3 Proteinska ekspresija ATP sintaze
U poređenju sa kontrolom, proteinska ekspresija β subjedinice ATP sintaze je smanjena u
Ca-SANDOZ grupi, ali nije statistički značajna (Slika 10).
Slika 10. Promjena proteinske ekspresije ATP sintaze nakon Ca-SANDOZ tretmana.
4.1.1.4 Proteinska ekspresija UCP1
Western blot analiza je pokazala značajno povećanje proteinske ekspresije UCP1 proteina
u Ca-SANDOZ grupi u poređenju sa kontrolom (Slika 11).
41
Slika 11. Promjena proteinske ekspresije UCP1 nakon Ca-SANDOZ tretmana. * poređenje sa
kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001.
4.1.1.5 Proteinska ekspresija VDAC
Proteinska ekspresija VDAC, mitohondrijalnog markera, proteina koji se nalazi u
spoljašnjoj mitohondrijalnoj membrani, ostaje nepromjenjena nakon Ca-SANDOZ tretmana u
poređenju sa kontrolom (Slika 12).
Slika 12. Promjena proteinske ekspresije VDAC nakon Ca-SANDOZ tretmana.
4.1.1.6 Proteinska ekspresija kalneksina
U poređenju sa kontrolom, proteinski sadržaj kalneksina, integralnog proteina ER, ostaje
nepromjenjen nakon Ca-SANDOZ tretmana (Slika 13).
42
Slika 13. Promjena proteinske ekspresije kalneksina nakon Ca-SANDOZ tretmana.
4.1.2 Mikroskopske analize
4.1.2.1 Lokalizacija kalcijuma u mrkim adipocitima
Alizarin Red S histohemijsko bojenje pokazuje viši nivo Ca2+ soli u tretiranoj grupi, što se
uočava u vidu grupe mrkih adipocita sa jačim intenzitetom crvene boje (Slika 14).
Slika 14. Alizarin Red S bojenje BAT nakon Ca-SANDOZ tretmana. (A) Kontrola; (B) Ca-SANDOZ.
Bar: 20 µm.
Na ultrastrukturnom nivou, kalijum piroantimonat demonstrira lokalizaciju Ca2+ jona u
vidu elektron-gustih precipitata u citoplazmi, mitohondrijama i oko lipidnih tijela. Veća je
zastupljenost precipitata u Ca-SANDOZ grupi u odnosu na kontrolu. Negativna kontrola ne
pokazuje precipitate piroantimonata u mrkim adipocitima (Slika 15).
43
Slika 15. Lokalizacija kalcijuma kalijum piroantimonatom nakon Ca-SANDOZ tretmana. (A) Kontrola;
(B) Ca-SANDOZ; (C) negativna kontrola. Bar: 2 µm.
4.1.2.2 UCP1 imunohistohemija
Imunohistohemijska analiza pokazuje viši nivo ekspresije UCP1 proteina u Ca-SANDOZ
grupi (Slika 16), u poređenju sa kontrolnom grupom.
Slika 16. Imunohistohemijska analiza UCP1 proteina nakon Ca-SANDOZ tretmana. (A) Kontrola; (B)
Ca-SANDOZ; (C) negativna kontrola. Bar: 20 µm.
4.1.2.3 Stereološka analiza mrkih adipocita i lipidnih tijela
Stereološke analize mrkih adipocita i lipidnih tijela pokazuju značajan pad volumenske
gustine mrkih adipocita u BAT i lipidnih tijela u mrkim adipocitima nakon Ca-SANDOZ
tretmana (Tabela 6) u poređenju sa kontrolom.
Tabela 6. Efekat Ca-SANDOZ tretmana na volumensku gustinu mrkih adipocita i lipidnih tijela.
Kontrola Ca-SANDOZ
Volumenska gustina mrkih adipocita (%) 83.51 ± 0.69 57.89 ± 0.69*
Volumenska gustina lipidnih tijela (%) 43.63 ± 2.14 27.67 ± 0.87*
*poređenje sa kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05:
44
4.1.2.4 Kolokalizaciona analiza mitohondrija i ER
Konfokalna mikroskopija pokazuje viši stepen kolokalizacije između aktivnih
mitohondrija i ER u Ca-SANDOZ tretiranoj grupi u poređenju sa kontrolom (Slika 17).
Slika 17. Kolokalizaciona analiza mitohondrija i ER nakon Ca-SANDOZ tretmana. (A) Konfokalne
mikrografije BAT nakon inkubacije ER Tracker Green (zeleno) i MitoTracker Orange (crveno). Bar: 5 µm.
(B) Stopa kolokalizacije ER i mitohondrija. *poređenje sa kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001.
4.1.3 Ultrastrukturne analize
4.1.3.1 Egzovezikulacija eritrocita i ulaz eritrocitnih kompleksa u mrke
adipocite i mitohondrije
U Ca-SANDOZ grupi primjećeno je prisustvo i lokalizacija brojnih elektron-gustih,
hemihromnih kompleksa u vidu egzovezikula i to počevši od eritrocita u kapilarima, pa do
mitohondrija mrkih adipocita (Slika 18). Formiranje hemihromnih kompleksa započinje u
kapilarnim eritrocitima, nastale egzovezikule prolaze endotel i međućelijski prostor i ulaze u
citoplazmu i mitohondrije mrkih adipocita (Slika 18). Egzovezikulacija se veoma rijetko
primjećuje u kontrolnoj grupi.
Neki od tih hemihromnih kompleksa su razgranati, okruženi amorfnim materijalom i sa
vidljivom poroznošću (Slika 19), što detaljnije uočavamo u mrkim adipocitima, gdje jedan
kompleks ulazi u mitohondriju, a drugi kompleks je u bliskom kontaktu sa mitohondrijalnom
kristom (Slika 19A).
45
Slika 18. Egzovezikulacija eritrocita i migracija hemihromnih kompleksa u BAT pacova tretiranih Ca-
SANDOZ. (A) Degradacija hemoglobina i formiranje hemihromnih kompleksa unutar eritrocita (er),
formiranje eritrocitnih vezikula (strelice) i prolazak hemihromnog kompleksa (kvadrat) kroz endotelne
ćelije (en) i međućelijski prostor (IS). Uveličanje: x16.000. (B) Brojni Ca-SANDOZ indukovani
kompleksi (strelice) iz međućelijskog prostora ulaze u citoplazmu i mitohondrije (m) mrkih adipocita.
(ld) - lipidno tijelo. Uveličanje: x17.000. (C) Svjetlosna mikroskopija krvnih razmaza pokazuje
transformaciju eritrocita u ehinocite. Uveličanje: x20. (D) Na mjestu prolaza hemihromnih kompleksa,
zid endotela (en) je sužen. Uveličanje: x35.200.
4.1.3.2 Ultrastrukturna analiza mitohondrija
Mitohondrije mrkih adipocita pokazuju mnoge varijacije u unutrašnjoj strukturi, što se
vidi na elektronskim mikrografijama (Slika 20). U kontrolnoj grupi (Slika 20A), mitohondrije
su okrugle, sa nekoliko lamelarnih kristi. Ca-SANDOZ grupa se odlikuje većim
mitohondrijama, nalik na fuzionisane, sa većim brojem veoma dobro razvijenih lamelarnih kristi
(Slika 20B).
U Ca-SANDOZ grupi, megamitohondrije su uočene u pojedinim mrkim adipocitima
(Slika 21).
4.1.3.3 Stereološka analiza mitohondrija
Ca-SANDOZ tretman izaziva statistički značajan pad broja mitohondrija na 100 μm2
(Slika 22A), dok je volumenska gustina mitohondrija u mrkim adipocitima gotovo
nepromjenjena (Slika 22B).
46
Slika 19. Granati migratorni kompleksi indukovani Ca-SANDOZ tretmanom. (A) Dva kompleksa u
nabubreloj mitohondriji (m) mrkog adipocita, jedan u fazi ulaska, a drugi u mitohondriji u bliskom
kontaktu sa kristom. Uveličanje: x124.400. (B) Uočava se poroznost hemihromnih kompleksa (strelice).
Uveličanje: x123.200.
4.1.3.4 Distribucija mitohondrija po srednjem dijametru
U poređenju sa kontrolnom grupom, u Ca-SANDOZ grupi se uočava pomjeranje
srednjih mitohondrijalnih dijametara ka višim vrijednostima, odnosno uočava se sve veći broj
mitohondrija sa većim srednjim dijametrom (Slika 23).
4.1.3.5 Distribucija mitohondrija po volumenskoj gustini kristi
Analiza volumenske gustine mitohondrijalnih kristi pokazuje da Ca-SANDOZ stimuliše
formiranje kristi, što seuočava kaoveći brojmitohondrija sa većomvolumenskomgustinomkristi
u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 24).
4.2 Tretman insulinom
4.2.1 Western blot analiza mitohondrijama bogate frakcije
4.2.1.1 Proteinska ekspresija kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c
Nivo proteinske ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca u mitohondrijama
bogatoj frakciji BAT određivan je poslije akutnog (Slika 25) i hroničnog (Slika 26) tretmana
niskom (0.4 IU), odnosno visokom (4 IU) dozom insulina. Poslije akutnog tretmana,
47
Slika 20. Mitohondrije mrkih adipocita nakon Ca-SANDOZ tretmana. (A) Okrugle mitohondrije sa
nekoliko lamelarnih kristi u kontrolnoj grupi. Uočavaju se intimni kontakti između mitohondrija (bijele
strelice), i između mitohondrija i ER (crne strelice). (B) Veće mitohondrije sa brojnim kristama u Ca-
SANDOZ grupi. Detalj intimnog kontakta između mitohondrija i ER (kvadrat) u gornjem desnom uglu.
Bar: 2 µm.
proteinski sadržaj svih ispitivanih kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c je značajno
povećan primjenom niske doze insulina. Visoka akutna doza insulina indukuje značajno
povećanje proteinskog sadržaja kompleksa II, i blago povećanje kompleksa III i cyt c. Proteinski
sadržaj kompleksa I i IV ostaje na nivou kontrolne grupe.
Hronični tretman insulinom, kako niskom tako i visokom dozom, indukuje smanjenje
proteinskih sadržaja kompleksa I, kompleksa III i cyt c. Jedino je proteinski sadržaj kompleksa
IV povećan, bez obzira na primjenjenu dozu insulina. Proteinska ekspresija kompleksa II je
značajno povećana primjenom niske doze, a smanjena primjenom visoke doze insulina.
4.2.1.2 Proteinska ekspresija ATP sintaze i IF1
Akutni tretman insulinom značajno povećava proteinski sadržaj ATP sintaze i IF1,
nezavisno od primjenjene doze (Slika 27). Hronični tretman insulinom smanjuje proteinski
sadržaj ATP sintaze, a povećava sadržaj IF1 proteina (Slika 28), pri čemu je taj efekat izraženiji u
grupi tretiranoj visokom dozom insulina.
4.2.1.3 Proteinska ekspresija UCP1, UCP2 i UCP3
Proteinski sadržaj dekuplujućih proteina, odnosno UCP1, UCP2 i UCP3, u
mitohondrijama bogatoj frakciji BAT određivan je poslije akutnog (Slika 29) i hroničnog (Slika
48
Slika 21. Megamitohondrije u Ca-SANDOZ grupi. Mrki adipocit sa megamitohondrijom (zvjezdica) i
brojnim intermitohondrijalnim kontaktima (strelice). Bar: 1 µm.
Slika 22. Stereološka analiza mitohondrija nakon Ca-SANDOZ tretmana. (A) Broj mitohondrija
po jedinici površine mrkog adipocita; (B) volumenska gustina mitohondrija u mrkim adipocitima. *
poređenje sa kontrolnom grupom; ** p ⩽ 0:01.
30) tretmana niskom (0.4 IU), odnosno, visokom (4 IU) dozom insulina. Akutni tretman
insulinom indukuje blago povećanje proteinskog sadržaja UCP2 proteina, ali i značajno
povećanje proteinskog sadržaja UCP3 bez obzira na primjenjenu dozu. Proteinski sadržaj UCP1
je smanjen nakon primjene visoke doze insulina, a nepromjenjen nakon niske doze insulina.
Sa druge strane, hronični tretman značajnopovećava proteinski sadržajUCP1proteina, i to
obedoze, gdje je visokadoza efektivnija negoniskadoza insulina. Isto tako, povećan je i proteinski
sadržaj UCP3 proteina, ali više primjenom niske nego visoke doze insulina. Hronična niska doza
insulina povećava proteinsku ekspresiju UCP2 proteina, i to u odnosu na kontrolu, ali i u odnosu
na visoku dozu insulina, gdje je proteinski sadržaj smanjen u poređenju sa kontrolnom grupom
(mada bez statističke značajnosti).
49
Slika 23. Distribucija mitohondrijalnih klasa po srednjem dijametru nakon Ca-SANDOZ tretmana.
Slika 24. Distribucija mitohondrija po volumenskoj gustini kristi nakon Ca-SANDOZ tretmana.
4.2.1.4 Proteinska ekspresija VDAC
Western blot analiza je pokazala da akutni tretman insulinom dovodi do značajnog
povećanja proteinskog sadržaja VDAC u poređenju sa kontrolnom grupom, pri čemu je taj
efekat značajniji u grupi tretiranoj niskom dozom insulina (Slika 31).
Isto tako, hronični tretman insulina dovodi do povećanja proteinskog sadržaja VDAC u
odnosu na kontrolu, bez obzira na primjenjenu dozu (Slika 32).
50
Slika 25. Promjena proteinske ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c nakon akutnog
tretmana insulinom. * poređenje sa kontrolnom grupom; **p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između
0.4 IU i 4 IU; # p ⩽ 0:05; ## p ⩽ 0:01; ### p ⩽ 0:001.
4.2.2 Western blot analiza tkiva
4.2.2.1 Proteinska ekspresija kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c
Nivo proteinske ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca u BAT određivan je
poslije akutnog (Slika 33) i hroničnog (Slika 34) tretmana niskom (0.4 IU), odnosno visokom
(4 IU) dozom insulina. Poslije akutnog tretmana niskom dozom insulina, ne dolazi do značajne
promjene proteinskih sadržaja kompleksa I, IV i cyt c u odnosu na kontrolu. Ista doza vodi do
značajnog smanjenja ekspresije kompleksa II, ali i kompleksa III. Visoka, akutna doza insulina,
dovodi do značajnog smanjenja proteinskih sadržaja kompleksa I, kompleksa III i cyt c, a i dolazi
do povećanja ekspresije kompleksa II. Ekspresija kompleksa IV ostaje nepromjenjen nakon
primjene akutne visoke doze.
Sa druge strane, hronični tretman insulinom, bez obzira na dozu, dovodi do značajnog
povećanja proteinske ekspresije kompleksa I i kompleksa IV u odnosu na kontrolu. Proteinski
sadržaji kompleksa II, kompleksa III i cyt c ostaju nepromjenjeni primjenom niske doze.
Tretman hroničnom, visokom dozom insulina dovodi do značajnog smanjenja proteinskih
sadržaja kompleksa II i cyt c, a do povećanja u slučaju kompleksa III.
51
Slika 26. Promjena proteinske ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c nakon hroničnog
tretmana insulinom. * poređenje sa kontrolnom grupom; **p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između
0.4 IU i 4 IU; # p ⩽ 0:05; ## p ⩽ 0:01; ### p ⩽ 0:001.
4.2.2.2 Proteinska ekspresija ATP sintaze i IF1
U poređenju sa kontrolnom grupom, akutni tretman insulinom značajno smanjuje
proteinski sadržaj ATP sintaze i IF1, nezavisno od primjenjene doze (Slika 35). Sličan obrazac
proteinske ekspresije se uočava i nakon hroničnog tretmana insulinom (Slika 36).
4.2.2.3 Proteinska ekspresija UCP1 i UCP2
U poređenju sa kontrolom dolazi do značajnog smanjenja proteinskog sadržaja UCP1
nakon primjene akutnog tretmana insulinom (Slika 37), i to obe doze. UCP2 je isto smanjen, ali
značajnije u slučaju akutne, niske doze insulina.
U poređenju sa kontrolom, hronični tretman insulinom (Slika 38) dovodi do značajnog
povećanja proteinskog sadržaja UCP1 proteina, pogotovo nakon primjene visoke doze. Trend
smanjivanja ekspresije UCP2 ide u pravcu povećanja doze, ali bez statističke značajnosti.
52
Slika 27. Promjena proteinske ekspresije ATP sintaze i IF1 nakon akutnog tretmana insulinom. *
poređenje sa kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ### p ⩽ 0:001.
Slika 28. Promjena proteinske ekspresije ATP sintaze i IF1 nakon hroničnog tretmana insulinom. *
poređenje sa kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ### p ⩽ 0:001.
4.2.2.4 Proteinska ekspresija VDAC
Akutni tretman insulinom, u poređenju sa kontrolom, dovodi do smanjenja proteinskog
sadržaja VDAC, ali taj efekat je značajniji nakon primjene visoke doze (Slika 39). Hronični
tretman insulinom indukuje značajno smanjenje proteinske ekspresije VDAC i to u slučaju obe
doze (Slika 40).
4.2.2.5 Proteinska ekspresija katalaze
Nakon tretmana objema dozama insulina, a naročito niska doza dovodi do značajne
indukcije proteinskog sadržaja katalaze (Slika 41), u poređenju sa kontrolnom grupom. Sa
druge strane, hronični tretman insulinom dovodi do pada proteinske ekspresije katalaze, gdje je
taj efekat izraženiji u grupi sa visokom dozom insulina (Slika 42).
53
Slika 29. Promjena proteinske ekspresije UCP1, UCP2 i UCP3 nakon akutnog tretmana insulinom. *
poređenje sa kontrolnom grupom; ** p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ###
p ⩽ 0:001.
Slika 30. Promjena proteinske ekspresije UCP1, UCP2 i UCP3 nakon hroničnog tretmana insulinom. *
poređenje sa kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05; **p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4
IU; ## p ⩽ 0:01; ### p ⩽ 0:001.
4.2.2.6 Proteinska ekspresija kalneksina
Do blagog, ali značajnog pada proteinskog sadržaja kalneksina, u poređenju sa
kontrolnom grupom, dolazi primjenom akutnog tretmana insulinom, i to obe doze (Slika 43).
Hronični tretman dovodi do značajnog povećanja proteinske ekspresije kalneksina, ali efekat je
izraženiji primjenom visoke doze (Slika 44).
4.2.3 Biohemijska analiza
4.2.3.1 Aktivnost ATP sintaze
Mjerenje aktivnosti ATP sintaze pokazuje da akutni tretman insulinom dovodi do
povećanja relativne aktivnosti ATP sintaze u poređenju sa kontrolnom grupom, gdje je efekat
izražen primjenom visoke doze insulina (Slika 45). Sa druge strane, hronični tretman insulinom
54
Slika 31. Promjena proteinske ekspresije VDAC nakon akutnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ## p ⩽ 0:01.
Slika 32. Promjena proteinske ekspresije VDAC nakon hroničnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001.
dovodi do smanjenja relativne aktivnosti ATP sintaze u dozno zavisnommaniru (Slika 45).
55
Slika 33. Promjena proteinske ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca nakon akutnog tretmana
insulinom. * poređenje sa kontrolnom grupom; **p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4
IU; ## p ⩽ 0:01; ### p ⩽ 0:001.
Slika 34. Promjena proteinske ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca nakon hroničnog
tretmana insulinom. * poređenje sa kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05; **p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. #
poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ### p ⩽ 0:001.
56
Slika 35. Promjena proteinske ekspresije ATP sintaze i IF1 nakon akutnog tretmana insulinom.
* poređenje sa kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ## p ⩽ 0:01; ###
p ⩽ 0:001.
Slika 36. Promjena proteinske ekspresije ATP sintaze i IF1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
* poređenje sa kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ### p ⩽ 0:001
Slika 37. Promjena proteinske ekspresije UCP1 i UCP2 nakon akutnog tretmana insulinom. * poređenje
sa kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ### p ⩽ 0:001
57
Slika 38. Promjena proteinske ekspresije UCP1 i UCP2 nakon hroničnog tretmana insulinom.
* poređenje sa kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ### p ⩽ 0:001
Slika 39. Promjena proteinske ekspresije VDAC nakon akutnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; ** p ⩽ 0:01.
Slika 40. Promjena proteinske ekspresije VDAC nakon hroničnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; *** p ⩽ 0:001.
58
Slika 41. Promjena proteinske ekspresije katalaze nakon akutnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; ** p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; ## p ⩽ 0:01
Slika 42. Promjena proteinske ekspresije katalaze nakon hroničnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; ** p ⩽ 0:01; *** p ⩽ 0:001.
59
Slika 43. Promjena proteinske ekspresije kalneksina nakon akutnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05; ** p ⩽ 0:01.
Slika 44. Promjena proteinske ekspresije kalneksina nakon hroničnog tretmana insulinom. * poređenje sa
kontrolnom grupom; * p ⩽ 0:05; *** p ⩽ 0:001. # poređenje između 0.4 IU i 4 IU; # p ⩽ 0:05.
Slika 45. Relativna aktivnost ATP sintaze nakon akutnog i hroničnog tretmana insulinom. ATP sintazna
aktivnost je normalizovana u odnosu na odgovarajuću kontrolu.
60
4.2.4 Mikroskopske analize
4.2.4.1 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa I i UCP1
Radi utvrđivanja potencijalne udružene lokalizacije (kolokalizacije) bioenergetskih i
termogenih proteina mitohondrija u BAT, analizirana je imunoekspresija i specifična lokalizacija
kompleksa I elektron transportnog lanca i UCP1 na nivou konfokalne mikroskopije, nakon
akutnog (Slika 46) i hroničnog (Slika 47) tretmana niskom (0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom
insulina.
Slika 46. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa I i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija na UCP1 (zeleno) i kompleks I (crveno). Jedra su obojena Sytox Orange
(plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
Mrki adipociti u kontrolnim grupama pokazuju jasnu heterogenu imunoekspresiju
kompleksa I i UCP1, što je već poznato u literaturi kao Harlekin efekat, koja se gubi nakon
tretmana insulinom i uočava se jaka, homogena imunoekspresija kod većine mrkih adipocita.
Fluorescencija se uočava u mitohondrijama. U zavisnosti od imunoekspresije uočava se
nekoliko tipova mrkih adipocita. Pojedini mrki adipociti se odlikuju dominacijom ekspresije
UCP1 ili kompleksa I, dok u drugima potpuno odsustvuje UCP1, a neki iskazuju jasnu
kolokalizaciju oba proteina.
UCP1-imunopozitivne mitohondrije su uglavnom lokalizovane u citoplazmi zrelih mrkih
adipocita. Sitniji, manje zreli mrki adipociti pokazuju slabiju UCP1 imunoekspresiju u odnosu
61
Slika 47. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa I i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija na UCP1 (zeleno) i kompleks I (crveno). Jedra su obojena Sytox Orange
(plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
na susjedne, krupnije mrke adipocite.
Sa druge strane, kompleks I-imunopozitivne mitohondrije su lokalizovane oko nukleusa i
oko lipidnih tijela, gdje su jasno uočene u vidu mitohondrijalnih klastera u nekim mrkim
adipocitima. Uočavaju se i pojedini adipociti slični adipocitima WAT koji su rasuti po BAT, i
pokazuju jaču imunofluorescenciju kompleksa I, i to oko lipidnih tijela.
4.2.4.2 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa II i UCP1
U slučaju kompleksa II i UCP1, analizirala se njihova imunofluorescentna lokalizacija pod
djelovanjem akutnog (Slika 48) i hroničnog (Slika 49) tretmana niskom (0.4 IU) i visokom (4
IU) dozom insulina.
Mrki adipociti kontrolne grupe pokazuju jasnu heterogenu imunolokalizaciju kompleksa
II i UCP1 (Harlekin efekat) i taj efekat se gubi zbog homogenizacije među mrkim adipocitima
primjenom insulina. Fluorescencija se uočava u nivou mitohondrija. Neki mrki adipociti
pokazuju dominantnu imunofluorescenciju na UCP1, drugi dominantnu imunofluorescenciju
na kompleks II, a neki jasnu kolokalizaciju UCP1 i kompleksa II.
Manje zreli adipociti pokazuju slabiju UCP1 imunofluorescenciju u odnosu na krupnije
62
Slika 48. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa II i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i kompleks II (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
mrke adipocite.
Kompleks II-imunopozitivne mitohondrije su lokalizovane oko nukleusa i lipidnih tijela.
Osim toga, uočava se jasna imunolokalizacija kompleksa II i UCP1 u mitohondrijama oko
lipidnih tijela. Što se tiče adipocita sličnih adipocitima WAT, oko lipidnih tijela se uočava jasna
imunofluorescencija kompleksa II.
4.2.4.3 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa III i UCP1
Imunofluorescentna analiza kompleksa III i UCP1 u BAT životinja tretiranih akutno
(Slika 50) odnosno hronično (Slika 51) niskom (0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom insulina;
pokazuje jasnu heterogenu imunoekspresiju kompleksa III i UCP1. Ta heterogenost se gubi
uslijed homogenizacije među mrkim adipocitima nakon tretmana insulinom.
Imunofluorescencija kompleksa III i UCP1 se uočava u mitohondrijama. Uočava se
heterogenost mrkih adipocita, odnosno jedni se odlikuju imunofluorescencijom uglavnom
UCP1, drugi uglavnom kompleksa III, a treći jasnom kolokalizacijom i UCP1 i kompleksa III.
Ta kolokalizacija se jasno uočava u akutnoj grupi sa niskom dozom insulina (Slika 50B, E).
UCP1-pozitivne mitohondrije su homogeno raspoređene u citoplazmi, dok kompleks
63
Slika 49. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa II i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i kompleks II (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
III-pozitivne mitohondrije se jasnije uočavaju oko lipidnih tijela i oko nukleusa. Krupni i zreli
mrki adipociti pokazuju jaču imunofluorescenciju UCP1 proteina, u odnosu na susjedne, sitnije,
nezrele mrke adipocite. Kompleks III-pozitivne mitohondrije se takođe uočavaju oko lipidnih
tijela u adipocitima slični adipocitimaWAT.
4.2.4.4 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa IV i UCP1
Imunofluorescentna analiza kompleksa IV i UCP1 BAT nakon akutnog (Slika 52) i
hroničnog (Slika 53) tretmana insulinom pokazuje imunofluorescenciju UCP1 proteina, a i
kompleksa IV. Oba proteina su lokalizovane u mitohondrijama. Heterogenost mrkih adipocita
se uočava u svim grupama. Takođe se uočava kolokalizacija kompleksa IV i UCP1 u većini
mrkih adipocita.
UCP1-pozitivne mitohondrije su relativno ravnomjerno raspoređene u citoplazmi mrkih
adipocita, ali se i uočava klasterizacija mitohondrija oko lipidnih tijela u kojima se detektuje
kolokalizacija kompleksa IV i UCP1.
64
Slika 50. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa III i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima naUCP1 (zeleno) i kompleks III (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
4.2.4.5 Imunofluorescentna lokalizacija cyt c i UCP1
Analizirana je imunoekspresija i specifična lokalizacija cyt c i UCP1 primjenom
konfokalne mikroskopije nakon akutnog (Slika 54) i hroničnog (Slika 55) tretmana niskom
(0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom insulina.
U kontrolnim grupama se jasno uočava heterogena ekspresija cyt c i UCP1. Razlikuju se
mrki adipociti sa dominantnom imunoekspresijom UCP1, mrki adipociti sa dominantnom
ekspresijom cyt c, ali i mrki adipociti sa jasnom kolokalizacijom cyt c i UCP1. Oba analizirana
proteina se uočavaju u mitohondrijama.
UCP1-pozitivne mitohondrije se uočavaju svuda u citoplazmi, dok su mitohondrije sa
dominantnom imunoekspresijom cyt c uočene oko lipidnih tijela. Oko lipidnih tijela, u
mitohondrijalnim klasterima, uočava se kolokalizacija cyt c i UCP1 proteina.
4.2.4.6 Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i UCP1
Analizirana je imunoekspresija ATP sintaze i UCP1 na BAT pacova tretiranih akutno
(Slika 56), odnosno hronično (Slika 57) niskom (0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom insulina.
Mrki adipociti, pogotovo u kontrolnim grupama, pokazuju heterogenost imunoekspresije ATP
65
Slika 51. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa III i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima naUCP1 (zeleno) i kompleks III (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
sintaze, odnosno UCP1 proteina.
Akutni tretman niskom i visokom dozom insulina doveo je do vidljive heterogenosti
imunoekspresije ATP sintaze i UCP1. Detaljniije se uočava da su ATP sintaza i UCP1 protein
lokalizovani u mitohondrijama mrkih adipocita. Štaviše, uočava se i jasna i isključiva
imunolokalizacija ATP sintaze u mrkim adipocitima sa većim lipidnim tijelima, u odnosu na
susjedne mrke adipocite, koji pokazuju mitohondrije sa kolokalizacijom ova dva proteina, ali i
većinu mitohondrija sa dominantnom ekspresijomUCP1 (Slika 58).
BAT hronično tretiranih životinja pokazuje prisustvo heterogenosti imunoekspresije ATP
sintaze i UCP1.
4.2.4.7 Imunofluorescentna lokalizacija IF1 i UCP1
Analizirana je imunofluorescentna lokalizacija IF1 i UCP1 u mrkim adipocitima pacova
tretiranih akutno (Slika 59) i hronično (Slika 60) niskom (0.4 IU), odnosno visokom (4 IU)
dozom insulina.
U akutno tretiranim kontrolnim grupama, uočava se heterogenost imunolokalizacije IF1,
66
Slika 52. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa IV i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima naUCP1 (zeleno) i kompleks IV (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
odnosno UCP1. Heterogenost njihove ekspresije se gubi pod djelovanjem insulinskog
tretmana. Neki preadipociti ne pokazuju imunofluorescenciju na UCP1 protein (Slika 59D),
dok mitohondrije mrkih adipocita međusobno pokazuju velike razlike u imunoekspresiji UCP1
i IF1, čak i kod istog mrkog adipocita, dok se kod većine uočava i kolokalizacija ova dva proteina.
Hronično tretirane grupe pokazuju sličnu heterogenost imunolokalizacije IF1 i UCP1, ali
se uočava i postepeno povećanje imunofluorescencije IF1 proteina sa povećanjem doze insulina
u odnosu na odgovarajuću kontrolu (Slika 60).
4.2.4.8 Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa III i IV
Rezultati analize kolokalizacije mitohondrijalnih kompleksa – kompleksa III i kompleksa
IV, uBATnakonakutnog, odnosnohroničnog tretmananiskom(0.4 IU) i visokom(4 IU)dozom
insulina prikazani su na Slici 61, tj. Slici 62.
Uočena je imunolokalizacija kompleksa III i IV u mitohondrijama, pri čemu je najveća
gustina ovih mitohondrija oko lipidnih tijela. Kontrolne grupe se odlikuju heterogenošću
imunoekspresije kompleksa III i IV, odnosno uočavaju se mrki adipociti sa različitim nivoom
imunofluorescencije. Čak su prisutni i mrki adipociti bez imunofluorescentne lokalizacije
67
Slika 53. Imunofluorescentna lokalizacija kompleksa IV i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima naUCP1 (zeleno) i kompleks IV (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
navedenih kompleksa. Kolokalizovane mitohondrije su uglavnom pozicionirane oko lipidnih
tijela.
Nakon akutnog tretmana insulinom gubi se heterogenost među mrkim adipocitima u
odnosu na odgovarajuću kontrolu. Niska doza insulina stimuliše mitohondrijalnu heterogenost,
tj. razlikuju se mitohondrije sa dominantnom ekspresijom kompleksa III, mitohondrije sa
dominantnom ekspresijom kompleksa IV, i mitohondrije sa jasnom kolokalizacijom oba
kompleksa. Mitohondrije sa jasnom kolokalizacijom su uglavnom prisutne oko nukleusa, i
ponegdje oko lipidnih tijela (Slika 61E). Kompleks III-dominantne mitohondrije se mogu naći
ravnomjerno u citoplazmi i ponegdje oko lipidnih tijela, a kompleks IV-dominantne
mitohondrije su češće oko lipidnih tijela. Visoka doza uglavnom održava kolokalizaciju oba
kompleksa u mitohondrijama oko lipidnih tijela.
Hronični tretman insulinom dovodi do gubitka heterogenosti mrkih adipocita uslijed
pojave jake homogene reakcije u većini mrkih adipocita. U ovim grupama se uočavaju
preadipociti sa jasnom dominacijom imunoekspresije kompleksa IV (Slika 62E).
4.2.4.9 Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i IF1
Analizirana je zajednička imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i IF1 u BAT pacova
tretiranih akutno (Slika 63) i hronično (Slika 64) niskom (0.4 IU), odnosno visokom (4 IU)
68
Slika 54. Imunofluorescentna lokalizacija cyt c i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom. Dvostruka
imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i cyt c (crveno). Jedra su obojena Sytox Orange
(plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
dozom insulina. Imunofluorescencija pokazuje jasnu kolokalizaciju ATP sintaze i IF1 u
mitohondrijama mrkih adipocita, bez obzira na dužinu tretmana i primjenjenu dozu insulina.
Isti obrazac se uočava i u kontrolnim grupama.
4.2.4.10 Imunofluorescentna lokalizacija VDAC i kalneksina
Rezultati imunofluorescentne analize VDAC, proteina koji se nalazi u spoljašnjoj
membrani mitohondrija, i kalneksina, integralnog proteina ER, i to na BAT životinja tretiranih
akutnom, odnosno hroničnom niskom (0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom insulina prikazani su
na Slici 65 i Slici 66.
U kontrolnoj grupi akutno tretiranih životinja uočava se heterogenost mrkih adipocita kad
je u pitanju imunoekspresija VDAC i kalneksina. VDAC se lokalizuje u mitohondrijama, dok je
kalneksin više prisutan u citoplazmi (ER). Jasno se uočava i kolokalizacija VDAC i kalneksina uz
mitohondrije. Ta kolokalizacija je izraženija nakon primjene niske doze insulina.
Pri hroničnom tretmanu, i kontrola pokazuje heterogenost mrkih adipocita u
imunoekspresiji VDAC i kalneksina. U grupi tretiranoj niskom dozom insulina ta kolokalizacija
69
Slika 55. Imunofluorescentna lokalizacija cyt c i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom. Dvostruka
imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i cyt c (crveno). Jedra su obojena Sytox Orange
(plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
je nešto slabije izražena, ali se povećava sa povećanjem doze.
4.2.4.11 Imunofluorescentna lokalizacija katalaze
Katalaza, marker peroksizoma, se na nivou fluorescentne mikroskopije detektuje u mrkim
adipocitima samo kod hronično tretiranih grupa (Slika 67), i češće se uočava u blizini lipidnih
tijela i nukleusa. U poređenju sa kontrolom, imunoekspresija je povećana u grupama tretiranim
insulinom, ali ne značajno. Imunolokalizacija katalaze u mrkim adipocitima je značajno manja
kada se poredi sa jetrom, koja je uzeta kao pozitivna kontrola.
4.2.4.12 Imunofluorescentna lokalizacijaMfn1
Lokalizacija molekulskog posrednika mitohondrijalne fuzije, Mfn1, u BAT takođe je
analiziran nakon akutnog (Slika 68) i hroničnog (Slika 69) tretmana niskom (0.4 IU) i visokom
(4 IU) dozom insulina.
U kontroli akutnog tretmana, uočava se tipičan Harlekin efekat, odnosno heterogenost
imunofluorescencije mrkih adipocita naMfn1. Lokalizovane su u mitohondrijama, i uočavaju se
oko nukleusa i oko lipidnih tijela. Heterogenost imunoekspresije mrkih adipocita se djelimično
70
Slika 56. Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i ATP sintazu (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
gubi nakon insulinskog tretmana.
Hronično tretirane grupe se takođe odlikuju heterogenom imunoekspresijom Mfn1 u
mrkim adipocitima. Kontrola pokazuje tipičnu heterogenost među mrkim adipocitima
(Harlekin efekat), a nakon tretmana insulinom ta heterogenost se gubi zbog homogenizacije
među mrkim adipocitima. Mfn1-pozitivne mitohondrije se najviše uočavaju oko lipidnih tijela,
kao i oko nukleusa.
4.2.4.13 Imunohistohemijska lokalizacijaMfn1
Imunohistohemijska detekcijaMfn1 uBAT akutno tretiranih grupa (Slika 70) pokazuje da
se imunopozitivnost uočava oko lipidnih tijela, pa i u ostatku citoplazme. Kontrola (Slika 70A)
pokazuje jaču imunopozitivnost, a grupa tretirana niskom (0.4 IU) dozom insulina (Slika 70B)
manju imunopozitivnost u odnosu na kontrolu. Najmanju imunopozitivnost na Mfn1 pokazuje
grupa tretirana visokom dozom insulina (Slika 70C).
U slučaju hronično tretiranih grupa (Slika 71), u kontroli se uočava heterogenost gdje se
pojedini mrki adipociti odlikuju imunopozitivnošću, i to uglavnom oko lipidnih tijela (Slika
71A). Jača imunopozitivnost se uočava u grupi tretiranoj niskom dozom insulina (Slika 71B), i
71
Slika 57. Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i ATP sintaze (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
Slika 58. Heterogenost mrkih adipocita u imunoekspresiji ATP sintaze i UCP1.
to oko lipidnih tijela. Niska doza smanjuje heterogenost imunopozitivnosti među mrkim
adipocitima uslijed homogenizacije navedene imunoekspresije. Sa druge strane, visoka doza
insulina blago povećava heterogenost među mrkim adipocitima, pri čemu se uglavnom uočava
oko lipidnih tijela (Slika 71C).
4.2.4.14 Imunohistohemijska lokalizacija Drp1
Imunohistohemijski je takođe analiziran Drp1, neophodan za mitohondrijalnu fisiju, u
BAT pacova tretiranih niskom (0.4 IU), odnosno visokom (4 IU) dozom insulina akutno (Slika
72) ili hronično (Slika 73). U obe kontrole uočava se heterogenost mrkih adipocita u smislu
imunopozitivnosti na Drp1. Drp1-pozitivne mitohondrije su lokalizovane u citoplazmi i u vidu
72
Slika 59. Imunofluorescentna lokalizacija IF1 i UCP1 nakon akutnog tretmana insulinom. Dvostruka
imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i IF1 (crveno). Jedra su obojena Sytox Orange
(plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
klastera oko lipidnih tijela. Obe doze insulina, bez obzira na dužinu tretmana, smanjuju
imunopozitivnost na Drp1 u odnosu na odgovarajuće kontrole.
73
Slika 60. Imunofluorescentna lokalizacija IF1 i UCP1 nakon hroničnog tretmana insulinom. Dvostruka
imunofluorescencija sa antitijelima na UCP1 (zeleno) i IF1 (crveno). Jedra su obojena Sytox Orange
(plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
Slika 61. Imunofluorescentna lokalizacija CIII i CIV nakon akutnog tretmana insulinom. Dvostruka
imunofluorescencija sa antitijelimanakompleks III (zeleno) i kompleks IV(crveno). Jedra suobojenaSytox
Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
74
Slika 62. Imunofluorescentna lokalizacija CIII i CIV nakon hroničnog tretmana insulinom. Dvostruka
imunofluorescencija sa antitijelimanakompleks III (zeleno) i kompleks IV(crveno). Jedra suobojenaSytox
Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
Slika 63. Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i IF1 nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na IF1 (zeleno) i ATP sintazu (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 7.5 µm.
75
Slika 64. Imunofluorescentna lokalizacija ATP sintaze i IF1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na IF1 (zeleno) i ATP sintazu (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 7.5 µm.
Slika 65. Imunofluorescentna lokalizacija VDAC i kalneksina nakon akutnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na VDAC (zeleno) i kalneksin (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
76
Slika 66. Imunofluorescentna lokalizacija VDAC i kalneksina nakon hroničnog tretmana insulinom.
Dvostruka imunofluorescencija sa antitijelima na VDAC (zeleno) i kalneksin (crveno). Jedra su obojena
Sytox Orange (plavo). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
77
Slika 67. Imunofluorescentna lokalizacija katalaze nakon hroničnog tretmana insulinom.
Imunofluorescencija sa antitijelom na katalazu (zeleno). Jedra su obojena propidijum jodidom
(crveno). (A-F) BAT; (G) pozitivna kontrola katalaze (jetra). Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-G).
78
Slika 68. Imunofluorescentna lokalizacijaMfn1 nakon akutnog tretmana insulinom. Imunofluorescencija
sa antitijelom na Mfn1 (crveno). Jedra su obojena propidijum jodidom (crveno). Bar: 25 µm (A-C), 7.5
µm (D-F).
Slika 69. Imunofluorescentna lokalizacija Mfn1 nakon hroničnog tretmana insulinom.
Imunofluorescencija sa antitijelom na Mfn1 (crveno). Jedra su obojena propidijum jodidom (crveno).
Bar: 25 µm (A-C), 7.5 µm (D-F).
79
Slika 70. Imunohistohemijska lokalizacija Mfn1 nakon akutnog tretmana insulinom. Bar: 20 µm.
80
Slika 71. Imunohistohemijska lokalizacija Mfn1 nakon hroničnog tretmana insulinom. Bar: 20 µm.
81
Slika 72. Imunohistohemijska lokalizacija Drp1 nakon akutnog tretmana insulinom. Bar: 20 µm.
82
Slika 73. Imunohistohemijska lokalizacija Drp1 nakon hroničnog tretmana insulinom. Bar: 20 µm.
83
4.3 Ultrastrukturne analize
4.3.0.1 TEMmitohondrijama bogate frakcije
TEM pokazuje uspješnost izolacije mitohondrijama bogatih frakcija (Slika 74).
Morfološki, mitohondrije su okruglaste, sa jasno razvijenim lamelarnim kristama. U svim
grupama se uočavaju ortodoksne, ali i kondenzovane mitohondrije.
Slika 74. Transmisiona elektronska mikroskopija mitohondrijama bogatih frakcija BAT nakon akutnog i
hroničnog tretmana insulinom. Bar: 1 µm.
84
4.3.0.2 Citohemijska analiza kompleksa I in situ
U BAT životinja akutno i hronično tretiranih insulinom (Slika 75) se uočava pozitivna
reakcija u mitohondrijalnim kristama, gdje se nalazi kompleks I elektron transportnog lanca.
Jača reakcija se uočava u mitohondrijama životinja tretiranih akutno niskom (0.4 IU) (Slika
75B) odnosno visokom (4 IU) (Slika 75C) dozom insulina, u odnosu na kontrolu (Slika 75A).
Sa druge strane, hronični tretman insulinom dovodi do nešto manje reaktivnosti u grupi sa
niskom dozom insulina (Slika 75E) u odnosu na kontrolu (Slika 75D) kao i grupu tretiranu
visokom dozom insulina (Slika 75F). Citohemijska reakcija je potvrđena negativnom
kontrolom u odsustvu supstrata (Slika 76A), odnosno u prisustvu supstrata uz dodatak
rotenona, specifičnog inhibitora kompleksa I (Slika 76B).
4.3.0.3 Citohemijska analiza kompleksa II in situ
Citohemijska analiza kompleksa II mitohondrija BAT pacova tretiranih akutno, odnosno
hronično niskom (0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom insulina pokazuje lokalizaciju reakcije u
kristama (Slika 77). Akutna, visoka doza insulina dovodi do jače obojenosti reakcije (Slika
77C) u odnosu na kontrolu (Slika 77A), odnosno nisku dozu insulina (Slika 77B). Hronični
tretman insulinom pokazuju da grupe tretirane niskom dozom (Slika 77E) imaju jaču reakciju u
odnosu na grupu sa visokom dozom insulina (Slika 77F), ali su obe grupe nešto slabije obojene
u odnosu na kontrolu (Slika 77D). Ova citohemijska analiza je potvrđena odsustvom supstrata
u medijumu (Slika 76A), odnosno sa supstratom u prisustvu oksaloacetata, specifičnog
inhibitora kompleksa II (Slika 76C).
4.3.0.4 Citohemijska lokalizacija vodonik peroksida
Elektron mikroskopska analiza DAB inkubiranih uzoraka BAT pacova tretiranih
akutnom, odnosno hroničnom niskom (0.4 IU) i visokom (4 IU) dozom insulina pokazuje
citohemijsku lokalizaciju vodonik peroksida u mitohondrijama, pogotovo u kristama (Slika 78).
Akutni tretman insulinom dovodi do povećanja citohemijske reakcije u odnosu na kontrolnu
grupu, gdje je efekat izraženiji nakon primjene visoke doze. Hronični tretmani insulinom takođe
dovode do povećanja citohemijske reakcije u odnosu na kontrolu, pri čemu je izraženija reakcija
nakon hronične visoke doze insulina.
85
Slika 75. CItohemijska analiza kompleksa I u mitohondrijama BAT nakon akutnog i hroničnog tretmana
insulinom. Bar: 1 µm.
4.3.0.5 Tomografska rekonstrukcija mitohondrija
Na osnovu dobijenih mikrografija snimljenih svaki stepen od -45º do +45º (Slika 79),
urađena je rekonstrukcija mitohondrija.
4.3.0.6 Imunogold lokalizacija kompleksa III i kompleksa IV
Imunogold analiza mitohondrijama bogatih frakcija BAT pacova akutno, odnosno
hronično tretiranih niskom (0.4 IU) ili visokom (4 IU) dozom insulina pokazuje lokalizaciju
kompleksa III (čestica zlata dijametra 10 nm) i kompleksa IV (čestica zlata dijametra 20 nm) u
86
Slika 76. Kontrola citohemijske analize mitohondrija BAT. (A) Negativna kontrola, bez supstrata; (B)
rotenon, inhibitor kompleksa I; (C) oksaloacetat, inhibitor kompleksa II. Bar: 1 µm.
mitohondrijama u nivou kristi, a takođe se zapaža i njihova kolokalizacija (Slika 80).
87
Slika 77. Citohemijska analiza kompleksa II umitohondrijama BAT nakon akutnog i hroničnog tretmana
insulinom. Bar: 1 µm.
88
Slika 78. Citohemijska lokalizacija vodonik peroksida umitohondrijama BATnakon akutnog i hroničnog
tretmana insulinom. Bar: 1 µm.
89
Slika 79. Serija elektron mikrografija snimljenih svaki stepen od -45º do +45º. Bar: 1 µm.
90
Slika 80. Imunogold lokalizacija kompleksa III i IV umitohondrijama bogatim frakcijama nakon akutnog
i hroničnog tretmana insulinom. Bar: 1 µm.
91
5 | Diskusija
5.1 Ca-SANDOZ tretman
5.1.1 Povećanje nivoa kalcijuma u mrkim adipocitima
Naši rezultati lokalizacije Ca2+ ukazuju da Ca-SANDOZ tretman dovodi do povećanja
nivoa Ca2+ u pojedinim mrkim adipocitima, što je u saglasnosti sa opisanim Harlekin efektom
(Cinti i sar., 2002), upravo zbog različitih funkcionih kapaciteta mrkih adipocita. Pokazano je
da je u mnogim ćelijskim tipovima unos Ca2+ iz vanćelijske sredine neophodan za održanje
povećanog nivoa Ca2+ uslijed hormonskog odgovora (Pozzan i sar., 1986). Potrošnja Ca2+ iz
unutarćelijskih rezervi, kao što su ER i mitohodrije, uzrokuje unos Ca2+ preko Ca2+ kanala u
ćelijskoj membrani (Putney Jr., 2003), što je u saglasnosti sa našim rezultatima koji jasno
pokazuju da čak i kratak Ca-SANDOZ tretman indukuje unos Ca2+ od strane mrkih adipocita i
njihovo nagomilavanje u citoplazmi i mitohondrijama. Interesantno je da smo po prvi put
pokazali alternativni mehanizam unošenja Ca2+ u mrke adipocite i mitohondrije mrkih
adipocita putem egzozoma eritrocita. Naime, nakon tretmana Ca-SANDOZ uočava se masovna
egzovezikulacija eritrocita u brojnim kapilarima BAT. U sledećim koracima uočeni su
elektron-gusti kompleksi koji ulaze u citoplazmumrkih adipocita i stacioniraju se u neposrednoj
blizini, ali i u unutrašnjosti mitohondrija. Ne može se isključiti pojačan unos Ca2+ i ovim putem,
putem egzozoma i hemihromnih kompleksa poreklom iz eritrocita. In vitro, nakon aplikacije
noradrenalina, dolazi do povećanog nivoa Ca2+ u citoplazmi mrkih adipocita, koji je uzrokovan
unosom unutarćelijskog, ali i vanćelijskog Ca2+, i to preko α-adrenergičkog i/ili β-adrenergičkog
signalnog puta (Wilcke i Nedergaard, 1989; Lee i sar., 1993). Dekuplovanje mitohondrija od
strane UCP1, indukovano putem β3-adrenergičkog signalnog puta, uzrokuje oslobađanje Ca2+
iz mitohondrija, a zatim i iz ER putem inozitol 1,4,5-trifosfatnih InsP3 receptora, što dalje
aktivira i ulazak Ca2+ preko ćelijske membrane u citoplazmu mrkih adipocita pacova (Hayato
i sar., 2011). Prema tome, možemo da pretpostavimo da Ca-SANDOZ tretman ”oponaša”
92
hladnoću i utiče na strukturno remodeliranje mitohondrija, ali i na termogeni kapacitet mrkih
adipocita.
5.1.2 Strukturno remodeliranje mitohondrija
Naši rezultati su pokazali da Ca-SANDOZ tretman izaziva pojavu izrazito krupnih, više
desetina puta uvećanih mitohondrija (megamitohondrija) u odnosu na kontrolnu grupu.
Megamitohondrije se u literaturi najčešće opisuju u različitim patološkim stanjima ili
poremećenim fiziološkim uslovima (Chedid i sar., 1980; Sun i sar., 1969), najčešće u jetri i
mišićima. Često se povezuju sa alkoholnim oboljenjem jetre, hepatičnom steatozom, ali i
drugim oboljenjima (Iseri i Gottlieb, 1971; Petersen, 1977; Prieto i sar., 2005).
Predloženo je nekoliko mehanizama formiranja megamitohondrija. Hipertrofija
pojedinačnih mitohondrija je utvrđena u jetri eksperimentalnih životinja hranjenih
visokoproteinskom dijetom, uslijed povećanog metabolizma azota (Zaragoza i sar., 1987).
Hloramfenikol indukuje formiranje megamitohondrija u hepatocitima, najvjerovatnije zbog
inhibicije sinteze proteina u mitohondrijama (Albring i sar., 1975). Slobodni radikali iniciraju
formiranje megamitohondrija kada prevazilaze enzimatski i neenzimatski sistem odbrane protiv
ROS. Stopa potrošnje kiseonika i bioenergetski kapacitet megamitohondrija je često niži
(Karbowski i sar., 1999; Shishido i sar., 2003; Wakabayashi i sar., 1997) ili čak ostaje u
fiziološkim granicama (Wakabayashi i sar., 1984).
Kako TEM analiza nije pokazala patološke promjene u mitohondrijama i mrkim
adipocitima, nije moguće utvrditi šta je uzrokovalo pojavljivanje megamitohondrija, pogotovo
kada se imaju u vidu gore navedene kontroverze.
Pokazali smo da Ca-SANDOZ utiče na formiranje eritrocitnih egzovezikula sa
elektron-gustim hemihromnim kompleksima u BAT. Hemihromni kompleksi (produkti
degradacije hemoglobina) mogu se indukovati u eksperimentalnim uslovima (Waugh i Low,
1985) ali i u normalnim uslovima kao posljedica starenja ćelija (Sears i sar., 1975). Unos
kataboličkih produkata hemoglobina, odnosno hemina, u izolovane mitohondrije dovodi do
značajne inhibicije ATP-stimulisane degradacije produkata mitohondrijalne translacione
mašinerije (Desautels i Dulos, 1994). Pretpostavlja se da hem igra značajnu ulogu u BAT
mitohondriogenezi i to uticajem na sintezu i degradaciju proteina u mitohondrijama (Atamna
i sar., 2002).
Naši rezultati pokazuju da Ca-SANDOZ smanjuje broj mitohondrija po jedinici površine
mrkih adipocita, ali i da pomjera srednji dijametar mitohondrija ka višim vrijednostima, što je u
93
saglasnosti sa primjećenim procesom fuzije. Osim toga, stereološke analize su pokazale i
povećanje volumenske gustine kristi u mitohondrijama životinja tretiranih Ca-SANDOZ.
Navedeni rezultati su u saglasnosti sa studijama koje su pokazale da dolazi do povećanja broja
kristi, ali i njene gustine, u mitohondrijama mrkih adipocita poslije izlaganja hladnoći (Goglia
i sar., 1992; Petrovic i sar., 2008). Povećana volumenska gustina kristi, odnosno samo
remodeliranje kristi, može biti odgovor na mitohondrijalnu fuziju čime se izbjegava ”višak”
membrane i održava gustina mitohondrijalnog matriksa (Gazaryan i Brown, 2007). Tokom
remodeliranja mitohondrija, ćelije koriste razne strategije da bi povećale produkciju ATP, kao
što su: uvećanje samih mitohondrija, povećanje ukupnog broja mitohondrija u ćeliji, povećanje
volumenske gustine mitohondrija u ćeliji, a i povećanje površine membrana kristi mitohondrija.
Širok dijapazon ćelija koristi te strategije tokom prelaza iz normalnog fiziološkog miljea u
poremećeno stanje pod uticajem raznih farmakoloških ili toksikoloških tretmana, ili u razna
patološka stanja (Perkins i sar., 2003; Smith i Ord, 1983). Remodeliranje mitohondrija je veoma
važno za ulazak ćelije u apoptozu, prije svega za mobilizaciju cyt c iz kristi (Scorrano i sar.,
2002).
Volumenska gustina mitohondrija nije se promijenila nakon Ca-SANDOZ tretmana, što
je u saglasnosti sa odsustvompromjene proteinskog sadržaja VDACproteina, markera spoljašnje
membrane mitohondrija. Isto tako, nivo kalneksina, markera ER membrana, nije se promijenio.
Ovi rezultati ukazuju da kratak Ca-SANDOZ tretman ne stimuliše biogenezu mitohondrija niti
ER, ali indukuje njihov rearanžman i formiranje brojnih kontakata među njima.
Mitohondrije su dinamičke organele koje stalno ulaze u proces fisije i fuzije, pa im ER
obezbjeđuje stalan i dobro regulisan izvor fosfolipida, neophodan za integritet membrana i kristi
(Jungalwala i Dawson, 1970; Osman i sar., 2011; Twig i sar., 2008). Povećan proteinski sadržaj
Mfn2 ukazuje da je više Mfn2 proteina dostupno za uspostavljanje kontakata između
mitohondrija i ER, što je već pokazano na fibroblastima embriona miševa (de Brito i Scorrano,
2008). Da bi se osigurao optimalni bioenergetski status i efikasna respiracija u mitohondrijama,
kontakt između ER i mitohondrija je neophodan za konstantan unos Ca2+ putem InsP3
receptora. Na taj način Ca2+ podupire oksidativnu fosforilaciju snabdjevanjem redukujućih
ekvivalenata (Cardenas i sar., 2010). Osim toga, Ca2+ može da aktivira enzime Krebsovog
ciklusa, kao što su piruvat dehidrogenaza, α-ketoglutarat i izocitrat dehidrogenaza (Hayashi
i sar., 2009; Denton i sar., 1975), povećavajući protok kroz Krebsov ciklus. Štaviše, fuzija
mitohondrija može imati i ulogu u zaštiti od oštećenja mitohondrijalne DNK (Chen i sar.,
2005) uslijed povećane produkcije ROS koja nastaje kao rezultat povećane respiratorne
94
aktivnosti (Balaban i sar., 2005; Li i sar., 2013) i oksidacije masnih kiselina (Rosca i sar., 2012;
Schonfeld i Wojtczak, 2012).
Analiza na nivou konfokalne mikroskopije je pokazala višu stopu kolokalizacije između
aktivnih mitohondrija i ER u mrkim adipocitima grupa tretiranih Ca-SANDOZ, što ukazuje na
povećan broj kontakata između te dvije organele, vjerovatno zbog povećane potrebe za Ca2+
interorganelarnim crosstalk, kao što je ranije opisano (Jeyaraju i sar., 2009; Walter i Hajnoczky,
2005). Viši mitohondrijalni membranski potencijal je primjećen u Ca-SANDOZ grupi,
ukazujući na povećan unos Ca2+ u mitohondrije, što je u saglasnosti sa studijama koje su
pokazale da je visok mitohondrijalni membranski potencijal neophodan za unos Ca2+ u
mitohondrije (Rottenberg i Scarpa, 1974; Hajnoczky i sar., 1995; Kirichok i sar., 2004).
5.1.3 Povećanje termogenog kapaciteta mrkih adipocita
Imunohistohemijska i Western Blot analiza su pokazale povećanje ekspresije UCP1
proteina nakon Ca-SANDOZ tretmana, što vodi do povećane termogeneze (Bouillaud i sar.,
1984; Bukowiecki i sar., 1986; Matthias i sar., 2000). Broj kristi, u kojima su komponente
oksidativne fosforilacije smještene (Benard i Rossignol, 2008), je povećan što je u vezi sa
pojačanom aktivnošću elektron transportnog lanca i pojačanim ”curenjem” protona putem
UCP1 dekuplujućeg mehanizma. Međutim, tačni detalji ovog procesa još nisu razjašnjeni (Jezek
i sar., 2010; Divakaruni i Brand, 2011; Casteilla i sar., 2012).
Pokazana pojačana lipoliza pod Ca-SANDOZ tretmanom, na osnovu stereološke analize
lipidnih tijela, u saglasnosti je sa procesom adaptivne termogeneze, gdje
kateholaminima-stimulisana lipoliza obezbjeđuje masne kiseline za produkciju toplote u
odgovoru na hladnoću ili prekomjernu ishranu (Souza i sar., 2007). Isto tako, uslijed povećane
lipolize, dolazi i do smanjenja zapremine samih mrkih adipocita, što se uočava u smanjenju
volumenske gustine mrkih adipocita u BAT.
Mogući mehanizmi povoljnog efekta kalcijuma na tjelesnu težinu su istraženi
korišćenjem i animalnih i humanih modela (Schrager, 2005). Osim toga, Marotte i sar. (2014)
su pokazali da smanjen unos kalcijumamože dovesti do povećanja tjelesne težine, pogotovo kod
pacova sklonih gojaznosti. Kod ljudi, brojne studije su pokazale da visok unos kalcijuma ima
efekat na gubitak tjelesne težine (Davies i sar., 2000; Zemel, 2002; Parikh i Yanovski, 2003;
Teegarden, 2003; Zemel i sar., 2004). U slučaju ishrane bogate kalcijumom, predložena su dva
mehanizma: 1) inhibicija lipogeneze i stimulacija lipolize supresijom cirkulirajućeg 1α,
25-dihidroksiholekalciferola (Zemel i sar., 2000; Sun i Zemel, 2004; Sun i sar., 2007; He i sar.,
95
2011; Nobre i sar., 2011); i 2) povećanje fekalne ekskrecije masti formiranjem nerastvorljivih
soli kalcijuma i masnih kiselina (Jacobsen i sar., 2005; Lorenzen i sar., 2007). Naši rezultati
sugerišu da ishrana bogata kalcijumom ima povoljan efekat na kontrolu ili gubitak tjelesne
težine, i to povećanjem termogenog kapaciteta, tako da se na osnovu njih može postulirati i treći
mehanizam: ishrana bogata kalcijumom utiče na smanjenje tjelesne težine povećanjem
termogenog kapaciteta mrkih adipocita, i kao rezultat toga, povećanjem lipolize. Posebna
vrijednost ovih rezulatata leži u tome da, iako su dobijeni na modelu pacova, i s obzirom na
postojanje BAT i kod ljudi ukazuju na potencijalni benefit tretmana kalcijumskim suplementima
i u stanjima gojaznosti i dijabetesa tipa II.
5.2 Tretman insulinom
5.2.1 Modulacija kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c
Akutni tretman insulinom stimuliše proteinsku ekspresiju gotovo svih analiziranih
kompleksa elektron transportnog lanca, pogotovo u grupama tretiranom niskom dozom.
Poznato je da insulin stimuliše unos glukoze u mrke adipocite in vitro (Klein i sar., 2002),
glodara (Inokuma i sar., 2005) i ljudi in vivo (Orava i sar., 2011). Pošto povećan unos glukoze
vodi do povećane raspoloživosti acetil-CoA, koji je dobijen iz piruvata i koji ulazi u Krebsov
ciklus u vidu citrata, može se pretpostaviti da povećan nivo supstrata kompleksa I i kompleksa II
(NADH, odnosno sukcinat) povećava aktivnost elektron transportnog lanca.
Sa druge strane, hronični tretman insulinom smanjuje proteinsku ekspresiju kompleksa I,
III i cyt c. Moguće objašnjenje je da hronični insulinom stimulisani unos glukozemože dovesti do
previsokog nivoa NADH koja se više ne može efikasno ukloniti elektron transportnim lancem,
pri čemu dolazi do povećanja mitohondrijalnog protonskog gradijenta, i posljedično, pojedini
elektroni se prenose do kiseonika formirajući slobodne radikale (Murphy, 2009). Ćelijemogu da
smanje formiranje ROS i to supresijom produkcije NADH ili spriječavanjem ulaska energetskih
supstrata u mitohondrije (Van Gaal i sar., 2006).
Ekspresija kompleksa II povećana je hroničnom primjenom niske doze insulina, a
smanjena primjenom visoke doze. Ta očigledna nedosljednost može nastati kao rezultat
dvostruke uloge kompleksa II, koji povezuje elektron transportni lanac i Krebsov ciklus, gdje se
sukcinat oksiduje u fumarat.
Različiti ćelijski modeli su pokazali da insulin stimuliše produkciju vodonik peroksida,
molekula koji ima veoma značajnu ulogu u insulinskoj signalizaciji (Mahadev i sar., 2001; Yang
96
i sar., 2003; Pi i sar., 2007), čak i u mrkim adipocitima (May i de Haen, 1979). Pokazano je da je
produkcija H2O2 značajno viša pri oksidaciji sukcinata nego glutamata/piruvata, i to u
izolovanim mitohondrijama iz mozga pacova, srca i skeletnih mišića (Hansford i sar., 1997; Liu
i sar., 2002; Han i sar., 2003; Kudin i sar., 2004; Hirst i sar., 2008). U mitohondrijama
respirirajućim na sukcinatu, većina superoksida se produkuje u kompleksu II (Quinlan i sar.,
2012) a i kompleksu I tokom reverznog transporta elektrona od kompleksa II (Gyulkhandanyan
i Pennefather, 2004; Lambert i sar., 2007; Lee i sar., 2011). In vitro istraživanja na neuronima su
pokazala da insulinom stimulisana produkcija H2O2 dovodi do autofosforilacije insulinskog
receptora u maniru ”sve ili ništa” (Storozhevykh i sar., 2007; Persiyantseva i sar., 2013),
rezultujući u povećanoj aktivnosti receptora asociranih sa tirozin kinazom (Wei i sar., 1995).
Takođe, u prisustvu insulina u skeletnim mišićima, H2O2 antagonizuje insulinsku signalizaciju
aktivacijom različitih serin/treonin kinaza, rezultujući u insulinskoj rezistenciji (Henriksen,
2013).
Interesantno, proteinska ekspresija kompleksa IV je povećana pri hroničnim tretmanima
insulinom, dok je ekspresija većine analiziranih kompleksa smanjena. Nema literaturnih
podataka o efektu insulina na ekspresiju kompleksa IV umrkim adipocitima, prema tome, ovo je
prva studija koja analizira efekat insulina na kompleks IV mrkih adipocita. Skoro je objavljeno
da je snižena aktivnost kompleksa IV povezana sa pojačanom osjetljivošću na insulin i
insulinsku signalizaciju, ali i povećanu biogenezu mitohondrija u WATmiševa kojima nedostaje
Surf1 (Deepa i sar., 2013). Kod pacova, povećanje ekspresije kompleksa IV korišćenjem
agonista za β estrogenske receptore inhibira apoptotski signal u mitohondrijama (Hsieh i sar.,
2006). Mi smo pokazali da hronični tretman visokom dozom insulina indukuje apoptozu mrkih
adipocita (Korac i sar., 1999). Zajedno, ovi podaci sugerišu da mrki adipociti mogu povećati
ekspresiju kompleksa IV radi smanjenja osjetljivosti na insulin, ali i da povećaju šansu za
preživljavanjem u poremećenim fiziološkim uslovima uzrokovanih hiperinsulinemijom.
5.2.2 Modulacija ATP sintaze i IF1
Naša studija pokazuje da akutna doza insulina stimuliše ekspresiju ATP sintaze, što je u
saglasnosti sa povećanom ekspresijom kompleksa elektron transportnog lanca. To povećanje
ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca bi vodilo do povećane translokacije protona
kroz unutrašnju mitohondrijalnu membranu, i do povećane aktivnosti ATP sintaze kuplovane sa
protonskim gradijentom. Takođe, hronični tretman insulinom smanjuje ekspresiju ATP sintaze
kao i neke druge komponente elektron transportnog lanca (kompleksi I, III, cyt c i pri visokoj
97
dozi kompleks II), što može da bude posljedica smanjenja efikasnosti translokacije protona od
strane drugih kompleksa. Alternativno, to smanjenje ekspresije ATP sintaze može biti posljedica
povećane ekspresije UCP1 proteina, pošto je poznato je da je smanjenje ekspresije ATP sintaze
povezano sa povećanjem ekspresije UCP1 u BAT, pogotovo tokom izlaganja miševa hladnoći ili
tokom razvića BAT (Houstek i Drahota, 1977; Houstek i sar., 1991; Kramarova i sar., 2008).
Vrlo zanimljiv podatak iz naše studije je povećana ekspresija IF1, bez obzira na dozu ili
dužinu tretmana insulinom. U eksperimentu sa vezikulama sa invertovanom unutrašnjom
membranom mitohondrija jetre pacova, Schwerzmann i Pedersen (1986) su pokazali da IF1
inhibira tranziciju od ATP sintazne do ATPazne aktivnosti u prisustvu dekuplujućih agenasa,
kao što su karbonilcijanid-p-trifluorometoksifenilhidrazon (FCCP) i 2,4-dinitrofenol (DNP).
Proteomska analiza BAT miševa izlaganih hladnoći pokazala je dvostruko povećanje ekspresije
IF1, i autori su sugerisali da povećanje ekspresije IF1 možda služi da smanji hidrolizu ATP u
mitohondrijama mrkih adipocita sa povećanim termogenim kapacitetom (Forner i sar., 2009).
Pretpostavlja se da IF1 direktno interaguje sa ATP sintazom, i pokazano je da može povećati
stopu oksidativne fosforilacije ćelija osteosarkoma, i to stimulacijom katalitičke aktivnosti ATP
sintaze ili poboljšanjem strukture mitohondrijalnih kristi (Barbato i sar., 2015). U ćelijama
kancera, prekomjerna ekspresija IF1 stimuliše aerobnu glikolizu i inhibira oksidativnu
fosforilaciju (Sanchez-Cenizo i sar., 2010). Prekomjerna ekspresija IF1 u ćelijama kancera
debelog crijeva dovodi do mitohondrijalne hiperpolarizacije i prema tome, povećane produkcije
ROS (Formentini i sar., 2012), ali je takođe povezana i sa očuvanjem mitohondrijalne
morfologije i ultrastrukture ograničavajući apoptotski signal spriječavanjem oslobađanja cyt c
(Faccenda i sar., 2013).
Prema tome, insulin stimuliše metaboličko reprogramiranje, vodeći ka sniženoj aktivnosti
ATP sintaze i povećanoj produkciji ROS zbog mitohondrijalne hiperpolarizacije. Promjene u
ekspresiji različitih proteinskih kompleksa mogu biti rezultat kompenzatornih mehanizama
između različitih mitohondrijalnih respiratornih kompleksa (Havlickova Karbanova i sar., 2012;
Kovarova i sar., 2012; Yamamori i sar., 2012; Claus i sar., 2013). Iz naših rezultata proizilazi da
insulin uzrokuje promjene u ekspresiji glavnih proteina mitohondrija putem finog metaboličkog
reprogramiranja mrkih adipocita, gdje mitohondrijalna hiperpolarizacija remeti bioenergetski
kapacitet i povećava termogeni kapacitet.
98
5.2.3 Modulacija UCP proteina
Hipoteza po kojoj insulin uzrokuje promjene u ekspresiji mitohondrijalnih kompleksa
putem finog metaboličkog reprogramiranja mrkih adipocita, dodatno je potkrijepljena efektima
insulina na ekspresiju dekuplujućih proteina. Povećanje ekspresije UCP1 rezultuje u
povećanom termogenom kapacitetu mrkih adipocita (Matthias i sar., 2000), kao i u
dekuplovanju oksidativne fosforilacije. To je u saglasnosti sa primjećenim smanjenjem
ekspresije ATP sintaze i povećanjem ekspresije IF1, o čemu smo diskutovali ranije. UCP1 je
uključen u rasipanje protonskog gradijenta produkujući toplotu, i upravo zbog toga, ATP sintaza
produkuje manje ATP. Tokom tog procesa, mrki adipociti stimulišu ekspresiju IF1 proteina u
cilju spriječavanja nepoželjne degradacije ATP od strane ATP sintaze. Analiza BAT miševa, kod
kojih je indukovan dijabetes streptozotocinom, pokazala je veliko smanjenje proteinskog
sadržaja UCP1, ali i da je tretman insulinom tih miševa doveo do dvostrukog povećanja
proteinskog sadržaja UCP1 u BAT, što ukazuje da insulin ima važnu ulogu u UCP1 indukovanoj
termogenezi (Geloen i Trayhurn, 1990).
Himms-Hagen i Harper (2001) su postavili hipotezu da primarna uloga UCP3 proteina
nije povećanje termogenog kapaciteta mrkih adipocita, već regulacija metabolizma masnih
kiselina u ćeliji, što je i potvđeno u eksperimentima sa bijelim ruskim hrčcima (Liebig i sar.,
2004), a takođe i u mišićnim ćelijama (Bezaire i sar., 2005; MacLellan i sar., 2005). Osim toga,
UCP3 transportuje van mitohondrijalnog matriksa anjone masnih kiselina koje se ne mogu
oksidovati (Schrauwen i sar., 2003) da bi se spriječilo oštećenje mitohondrija lipidima, odnosno
lipidna peroksidacija (Schrauwen i Hesselink, 2004). Brand i Esteves (2005) su zaključili da
UCP2 i UCP3 generalno nisu odgovorni za adaptivnu termogenezu, već su veoma značajni za
umjereno dekuplovanje (engl. mild uncoupling), na taj način smanjujući produkciju ROS, i
štiteći ćeliju od ROS indukovanog oštećenja. Iako dobijene rezultate UCP2 ekspresije uzimamo
sa rezervom (jer proizvođač nije testirao specifičnost anti-UCP2 antitijela), smanjenje
proteinske ekpresije UCP2 u hroničnom tretmanu visokom dozom insulina, više nego u slučaju
smanjenja UCP3 ekspresije u hroničnom tretmanu niskom dozom, je moguća posljedica
mitohondrijalnog oštećenja i formiranja lipofuscina porijeklom iz mitohondrija, kao što smo
ranije pokazali (Markelic i sar., 2013).
99
5.2.4 Heterogenost mrkih adipocita
Iako Western Blot analiza mitohondrijama bogate frakcije daje najbolji uvid u promjenu
ekspresije proteina uključenih u uspostavljanje i održanje bioenergetskog i termogenog
kapaciteta mrkih adipocita, tačna ćelijska i mitohondrijalna lokalizacija ostaje nepoznata. Da bi
rasvijetlili ovaj aspekt remodeliranja mitohondrijalne populacije u BAT nakon tretmana
insulinom, analizirali smo in vivo moguću kolokalizaciju, ali i prisustvo i lokalizaciju mrkih
adipocita koji eksprimiraju analizirane proteine, odnosno komplekse. Harlekin efekat i
pretpostavljeni mozaicizam termogenog kapaciteta mrkih adipocita je dobro poznat (Cinti
i sar., 2002). Imajući ovo u uvidu, mi smo željeli da utvrdimo da li mrki adipociti takođe
pokazuju Harlekin efekat u slučaju kompleksa elektron transportnog lanca i ATP sintaze u
ćelijama sa različitim bioenergetskim profilom, i to primjenom fluorescentne odnosno
konfokalne mikroskopije.
Konfokalna mikroskopija je pokazala prisustvo UCP1-pozitivnih, a i UCP1-negativnih
mrkih adipocita u BAT. Ta dihotomija je posebno izražena u kontrolnim grupama, što ukazuje
na Harlekin efekat (Cinti i sar., 2002). Međutim, utvrdili smo heterogenost imunofluorescencije
u slučaju analize kompleksa elektron transportnog lanca, što implicira da mrki adipociti mogu
imati različite bioenergetske profile. Koekspresija, a i paralelne promjene u imunofluorescenciji
su primjećene i u grupama tretiranim insulinom. Značajne promjene su vidljive u različitim
mrkim adipocitima, što ukazuje da insulin modulira ekspresiju UCP1 proteina, odnosno
kompleksa elektron transportnog lanca. Takođe, imunofluorescencija je pokazala homogeniji
obrazac imunoekspresije u grupi hronično tretiranoj visokom dozom insulina.
Ova studija je pokazala da insulin modulira komplekse elektron transportnog lanca i
UCP1 proteina, i prema tome bioenergetski i termogeni kapacitet mrkih adipocita pacova
modulacijom ekspresije ključnih proteina mitohondrija. Pokazali smo da su ključni
bioenergetski proteini (kompleksi I, II, III, IV i ATP sintaza) i termogeni protein UCP1
imunolokalizovani ne samo u različitim mrkim adipocitima, već isto tako i u različitim
mitohondrijalnim populacijama unutar samog mrkog adipocita. Naši rezultati ukazuju na
funkcionu heterogenost mitohondrija u mrkim adipocitima, što je utvrđeno u drugim tipovima
ćelija (Collins i sar., 2002; Wikstrom i sar., 2007; Kuznetsov i Margreiter, 2009). Dominantno
prisustvo UCP1 ili kompleksa elektron transportnog lanca, odnosno ATP sintaze, u
mitohondrijama može se objasniti razlikom u bioenergetskom ili termogenom kapacitetu u
različitim mrkim adipocitima ili čak u različitim dijelovima BAT. Mitohondrije, koje sadrže
kolokalizovane bioenergetske, odnosno termogene proteine oko lipidnih tijela, pa čak i u mrkim
100
adipocitima sličnim adipocitimaWAT, ukazuju na metabolički mozaicizam.
Posmatrane paralelne, ali i suprotne promjene u ekspresiji ATP sintaze i njenog inhibitora
IF1 pod akutnim, odnosno hroničnim tretmanom, je vrlo značajno. Ovo je i prvi podatak o
ekspresiji IF1 u mrkim adipocitima nakon tretmana insulinom. Kako funkcionalni značaj
pretpostavljene koregulacije nije još uvijek jasan, pretpostavlja se da akutni tretman insulinom
povećava produkciju ATP, dok je obrnut slučaj za hronični tretman insulinom. Preokret u korist
produkcije ATP ostaje pod kontrolom IF1 da bi se spriječila prekomjerna produkcija ROS i
nepotrebna potrošnja ATP koje bi vodile do oštećenja mitohondrija ili mrkih adipocita. Da bi
ispunili tu ulogu, IF1 je kolokalizovan sa ATP sintazom, kao što smo i pokazali. Veoma visoka,
akutna doza insulina uzrokuje pad ekspresije ATP sintaze i IF1 u poređenju sa akutnom niskom
dozom insulina, što se dalje intenzivira hroničnim tretmanom u slučaju ATP sintaze. Kao što je
već opisano, pad u produkciji energije i akumulacija ROS pri insulinskom tretmanu vodi do
peroksidativnog oštećenja mitohondrija, lipofuscinogeneze (Markelic i sar., 2013) i apoptoze
mrkih adipocita (Korac i sar., 1999).
Dobijeni rezultati mogu da rasvijetle ulogu insulina ne samo u energetskoj homeostazi,
već i u raznim metaboličkim poremećajima u kojima insulin može biti glavni uzrok, kao što su
hiperinsulinemija, insulinska rezistencija i dijabetes. Takođe, oni mogu ukazati na nove
terapeutske intervencije koje kao ciljni organ koriste BAT. Veoma je interesantnan i skorašnji
podatak da mitohondrijalna struktura može da odredi efikasnost respiracije (Lapuente-Brun
i sar., 2013; Cogliati i sar., 2013), kao i da su UCP4 i ATP sintaza prostorno udaljeni jedan od
drugog u mitohondrijama neurona (Klotzsch i sar., 2015). Naši rezultati su u saglasnosti sa
ovim podacima, i ukazuju na jedan nov, budući pravac u našim istraživanjima - utvrđivanje in
vivo kolokalizacije svih ključnih molekula bioenergetskog i termogenog kapaciteta u
mitohondrijama BAT. Smatramo da će to doprinjeti rasvijetljavanju uloge insulina u razvoju
insulinske rezistencije ali i doprinjeti potencijalnim mogućnostima liječenja metaboličkog
sindroma, naročito imajući u vidu pokazane efekte kalcijuma i insulina na mitohondrije BAT.
101
6 | Zaključci
Ova doktorska disertacija je pokazala da se mitohondrije mrkih adipocita odlikuju
izuzetnom plastičnošću u strukturnom, ali i u funkcionom smislu, i to primjenom kalcijuma,
odnosno insulina.
Eksperimentalni tretman sa Ca-SANDOZ je pokazao:
Povećanje koncentracije Ca2+ u mrkim adipocitima. Sam Ca-SANDOZ tretman dovodi do
povećanja nivoa Ca2+ u mrkim adipocitima, što je pokazano Alizarin Red S bojenjem i
lokalizacijom kalijum piroantimonatom. Predložen je alternativni put unosa kalcijuma
egzovezikulacijom eritrocita.
Strukturno remodeliranje mitohondrija. Analize proteinske ekspresije, kao i ultrastrukturne
i stereološke analize su pokazale formiranje megamitohondrija, povećanje mitohondrijalne
fuzije i remodeliranje unutrašnje arhitekture mitohondrija, odnosno povećanje volumenske
gustine kristi nakon Ca-SANDOZ tretmana.
Povećanje komunikacije između mitohondrija i endoplazminog retikuluma. Proteinska
ekspresija Mfn2 proteina, ultrastrukturna analiza i kolokalizaciona studija su pokazale povećanje
intimnih kontakata između mitohondrija i ER.
Povećanje termogenog kapaciteta mrkih adipocita. Analiza proteinske ekspresije i
imunohistohemija na UCP1 protein su pokazali da dolazi do povećanja termogenog kapaciteta
mrkih adipocita.
Eksperimentalni tretman insulinom je pokazao:
Modulaciju ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca i cyt c. Pokazano je da insulin
ima značajan efekat na proteinsku ekspresiju svih komponenti elektron transportnog lanca, i taj
efekat zavisi od primjenjene doze insulina i dužine tretmana.
Modulaciju ekspresije i aktivnosti ATP sintaze i ekspresije inhibitornog faktora 1. Akutna doza
insulina je dovela do povećanja proteinske ekspresije ATP sintaze i IF1, a hronična doza je dovela
do smanjenja proteinske ekspresije ATP sintaze, a povećanja proteinske ekspresije IF1. Osim
toga, aktivnostATPsintaze je povećanaprimjenomakutne, a smanjenaprimjenomhroničnedoze
102
insulina.
Modulaciju ekspresije UCP proteina. Hronični tretman insulinom dovodi po povećanja
proteinske ekspresije UCP1 proteina, što ukazuje da dolazi do povećanja termogenog kapaciteta
mrkih adipocita. Osim toga, insulin utiče i na proteinsku ekspresiju UCP2 i UCP3 proteina.
Heterogenost mrkih adipocita. Pokazano je da se mrki adipociti ne odlikuju samo dobro
poznatim Harlekin efektom u slučaju UCP1 proteina, već i da se odlikuju heterogenošću
ekspresije kompleksa elektron transportnog lanca, cyt c, ATP sintaze i IF1, što je i pokazano
imunofluorescentnimmetodima.
Mitohondrijalni mozaicizam. Analiza na nivou konfokalne mikroskopije je pokazala da
postoji razlika u imunoekspresiji bioenergetskih i termogenih proteina između pojedinačnih
mitohondrija, što ukazuje da postoji i heterogenost u pogledu bioenergetskog i termogenog
kapaciteta ovih organela, ne samo na nivou tkiva već i na nivou jednog mrkog adipocita.
103
Literatura
Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A. i Enriquez, J. A.
(2008). Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell, 32(4):529–539.
Aggeler, R., Coons, J., Taylor, S.W., Ghosh, S. S., Garcia, J. J., Capaldi, R. A. iMarusich,
M. F. (2002). A functionally active human F1F0 ATPase can be purified by immunocapture
from heart tissue and fibroblast cell lines. Subunit structure and activity studies. J Biol Chem,
277(37):33906–33912.
Albring, M., Radsak, K. i Thoenes, W. (1975). Chloramphenicol-induced giant hepatic
mitochondria. Naturwissenschaften, 62(1):43–44.
Allen, R. D. (1995). Membrane tubulation and proton pumps. Protoplasma, 189(1-2):1–8.
Allen, R. D., Schroeder, C. C. i Fok, A. K. (1989). An investigation of mitochondrial inner
membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. J Cell Biol, 108(6):2233–2240.
Altmann, R. (1894). Die Elementarorganismen und ihre Beziehungen zu den Zellen. Verlag Von
Veit & Comp, Leipzig, 2. izdanje.
Amchenkova, A. A., Bakeeva, L. E., Chentsov, Y. S., Skulachev, V. P. i Zorov, D. B.
(1988). Coupling membranes as energy-transmitting cables. I. Filamentous mitochondria in
fibroblasts and mitochondrial clusters in cardiomyocytes. J Cell Biol, 107(2):481–495.
Andersson, U., Houstek, J. i Cannon, B. (1997). ATP synthase subunit c expression:
physiological regulation of the P1 and P2 genes. Biochem J, 323 ( Pt 2):379–385.
Andreyev, A., Bondareva, T. O., Dedukhova, V. I., Mokhova, E. N., Skulachev, V. P.,
Tsofina, L. M., Volkov, N. I. i Vygodina, T. V. (1989). The ATP/ADP-antiporter is
involved in the uncoupling effect of fatty acids on mitochondria. Eur J Biochem, 182(3):585–
592.
104
Anton, F., Dittmar, G., Langer, T. i Escobar-Henriques, M. (2013). Two deubiquitylases
act on mitofusin and regulate mitochondrial fusion along independent pathways. Mol Cell,
49(3):487–498.
Aquila, H., Link, T. A. i Klingenberg, M. (1985). The uncoupling protein from brown
fat mitochondria is related to the mitochondrial ADP/ATP carrier. Analysis of sequence
homologies and of folding of the protein in the membrane. EMBO J, 4(9):2369–2376.
Archer, S. L. (2013). Mitochondrial dynamics–mitochondrial fission and fusion in human
diseases. N Engl J Med, 369(23):2236–2251.
Area-Gomez, E., deGroof,A. J., Boldogh, I., Bird,T.D.,Gibson,G.E., Koehler,C.M., Yu,
W.H., Duff, K. E., Yaffe,M. P., Pon, L. A. i Schon, E. A. (2009). Presenilins are enriched in
endoplasmic reticulummembranes associatedwithmitochondria. Am J Pathol, 175(5):1810–
1816.
Arsenijevic, D., Onuma, H., Pecqueur, C., Raimbault, S., Manning, B. S., Miroux, B.,
Couplan, E., Alves-Guerra, M. C., Goubern, M., Surwit, R., Bouillaud, F., Richard,
D., Collins, S. i Ricquier, D. (2000). Disruption of the uncoupling protein-2 gene in mice
reveals a role in immunity and reactive oxygen species production. NatGenet, 26(4):435–439.
Atamna, H., Walter, P. B. i Ames, B. N. (2002). The role of heme and iron-sulfur clusters in
mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys, 397(2):
345–353.
Atgie, C.,Marette, A., Desautels,M., Tulp,O. i Bukowiecki, L. J. (1993). Specific decrease
of mitochondrial thermogenic capacity in brown adipose tissue of obese SHR/N-cp rats. Am
J Physiol, 265(6 Pt 1):C1674–80.
Balaban, R. S., Nemoto, S. i Finkel, T. (2005). Mitochondria, oxidants, and aging. Cell,
120(4):483–495.
Baradaran, R., Berrisford, J. M., Minhas, G. S. i Sazanov, L. A. (2013). Crystal structure
of the entire respiratory complex I. Nature, 494(7438):443–448.
Barbato, S., Sgarbi, G., Gorini, G., Baracca, A. i Solaini, G. (2015). The inhibitor protein
(IF1) of the F1F0-ATPase modulates human osteosarcoma cell bioenergetics. J Biol Chem,
290(10):6338–6348.
105
Behbahani, H., Shabalina, I. G., Wiehager, B., Concha, H., Hultenby, K., Petrovic, N.,
Nedergaard, J., Winblad, B., Cowburn, R. F. i Ankarcrona, M. (2006). Differential
role of Presenilin-1 and -2 onmitochondrial membrane potential and oxygen consumption in
mouse embryonic fibroblasts. J Neurosci Res, 84(4):891–902.
Benard, G. i Rossignol, R. (2008). Ultrastructure of the mitochondrion and its bearing on
function and bioenergetics. Antioxid Redox Signal, 10(8):1313–1342.
Benda,C. (1898). ÜberdieSpermatogenesederVertebratenundhöhererEvertebraten, II.Theil:
Die Histiogenese der Spermien. Arch Anat Physiol, 73:393–398.
Bereiter-Hahn, J. (1990). Behavior of mitochondria in the living cell. Int Rev Cytol, 122:1–63.
Berridge, M. J. (2002). The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell
Calcium, 32(5-6):235–249.
Berry, E. A. i Trumpower, B. L. (1985). Isolation of ubiquinol oxidase from Paracoccus
denitrificans and resolution into cytochrome bc1 and cytochrome c-aa3 complexes. J Biol
Chem, 260(4):2458–2467.
Bezaire, V., Spriet, L. L., Campbell, S., Sabet, N., Gerrits, M., Bonen, A. i Harper, M. E.
(2005). Constitutive UCP3 overexpression at physiological levels increases mouse skeletal
muscle capacity for fatty acid transport and oxidation. FASEB J, 19(8):977–979.
Bo, H., Jiang, N., Ma, G., Qu, J., Zhang, G., Cao, D., Wen, L., Liu, S., Ji, L. L. i Zhang, Y.
(2008). Regulation of mitochondrial uncoupling respiration during exercise in rat heart: role
of reactive oxygen species (ROS) and uncoupling protein 2. Free Radic Biol Med, 44(7):1373–
1381.
Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L. i Clarke, K. (2001). Increased
uncouplingproteins anddecreased efficiency inpalmitate-perfusedhyperthyroid rat heart. Am
J Physiol Heart Circ Physiol, 280(3):H977–83.
Boirie, Y., Short, K. R., Ahlman, B., Charlton, M. i Nair, K. S. (2001). Tissue-specific
regulation of mitochondrial and cytoplasmic protein synthesis rates by insulin. Diabetes,
50(12):2652–2658.
Bordicchia, M., Liu, D., Amri, E. Z., Ailhaud, G., Dessi-Fulgheri, P., Zhang, C.,
Takahashi, N., Sarzani, R. i Collins, S. (2012). Cardiac natriuretic peptides act via p38
106
MAPK to induce the brown fat thermogenic program in mouse and human adipocytes. J Clin
Invest, 122(3):1022–1036.
Bornhovd, C., Vogel, F., Neupert, W. i Reichert, A. S. (2006). Mitochondrial membrane
potential is dependent on the oligomeric state of F1F0-ATP synthase supracomplexes. J Biol
Chem, 281(20):13990–13998.
Boss, O., Hagen, T. i Lowell, B. B. (2000). Uncoupling proteins 2 and 3: potential regulators
of mitochondrial energy metabolism. Diabetes, 49(2):143–156.
Boss, O., Samec, S., Paoloni-Giacobino, A., Rossier, C., Dulloo, A., Seydoux, J.,Muzzin,
P. i Giacobino, J. P. (1997). Uncoupling protein-3: a new member of the mitochondrial
carrier family with tissue-specific expression. FEBS Lett, 408(1):39–42.
Boucher, J., Mori, M. A., Lee, K. Y., Smyth, G., Liew, C. W., Macotela, Y., Rourk, M.,
Bluher,M., Russell, S. J. i Kahn, C. R. (2012). Impaired thermogenesis and adipose tissue
development inmicewith fat-specific disruption of insulin and IGF-1 signalling.NatCommun,
3:902.
Bouillaud, F., Ricquier, D., Mory, G. i Thibault, J. (1984). Increased level of mRNA for
the uncoupling protein in brown adipose tissue of rats during thermogenesis induced by cold
exposure or norepinephrine infusion. J Biol Chem, 259(18):11583–11586.
Bouillaud, F., Weissenbach, J. i Ricquier, D. (1986). Complete cDNA-derived amino acid
sequence of rat brown fat uncoupling protein. J Biol Chem, 261(4):1487–1490.
Boushel, R., Gnaiger, E., Schjerling, P., Skovbro, M., Kraunsoe, R. i Dela, F.
(2007). Patients with type 2 diabetes have normal mitochondrial function in skeletal muscle.
Diabetologia, 50(4):790–796.
Boyer, P. D. (1997). The ATP synthase–a splendid molecular machine. Annu Rev Biochem,
66:717–749.
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72:248–254.
Brand,M. D. i Esteves, T. C. (2005). Physiological functions of themitochondrial uncoupling
proteins UCP2 and UCP3. Cell Metab, 2(2):85–93.
107
Branden, G., Gennis, R. B. i Brzezinski, P. (2006). Transmembrane proton translocation by
cytochrome c oxidase. Biochim Biophys Acta, 1757(8):1052–1063.
Braschi, E., Zunino, R. i McBride, H. M. (2009). MAPL is a new mitochondrial SUMO E3
ligase that regulates mitochondrial fission. EMBO Rep, 10(7):748–754.
Bronnikov, G. E., Zhang, S. J., Cannon, B. i Nedergaard, J. (1999). A dual component
analysis explains the distinctive kinetics of cAMP accumulation in brown adipocytes. J Biol
Chem, 274(53):37770–37780.
Bukowiecki, L. J., Geloen, A. i Collet, A. J. (1986). Proliferation anddifferentiation of brown
adipocytes from interstitial cells during cold acclimation. Am J Physiol, 250(6 Pt 1):C880–7.
Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N. i Scheuring, S. (2007). Rows of ATP
synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophys J, 93(8):2870–2876.
Cabezon, E., Arechaga, I., Jonathan, P., Butler, G. iWalker, J. E. (2000). Dimerization of
bovine F1-ATPase by binding the inhibitor protein, IF1. J Biol Chem, 275(37):28353–28355.
Cabezon, E., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. i Walker, J. E. (2003). The structure of
bovine F1-ATPase in complex with its regulatory protein IF1. Nat Struct Biol, 10(9):744–750.
Cadenas, S., Buckingham, J. A., Samec, S., Seydoux, J., Din, N., Dulloo, A. G. i Brand,
M. D. (1999). UCP2 and UCP3 rise in starved rat skeletal muscle but mitochondrial proton
conductance is unchanged. FEBS Lett, 462(3):257–260.
Campanella,M., Parker, N., Tan, C.H., Hall, A.M. i Duchen,M. R. (2009). IF(1): setting
the pace of the F(1)F(o)-ATP synthase. Trends Biochem Sci, 34(7):343–350.
Cannon, B. i Lindberg, O. (1979). Mitochondria from brown adipose tissue: isolation and
properties. Methods Enzymol, 55:65–78.
Cannon, B. i Nedergaard, J. (1985). The biochemistry of an inefficient tissue: brown adipose
tissue. Essays Biochem, 20:110–164.
Cannon, B. i Nedergaard, J. (2004). Brown adipose tissue: function and physiological
significance. Physiol Rev, 84(1):277–359.
Cannon, B. i Nedergaard, J. (2008). Studies of thermogenesis andmitochondrial function in
adipose tissues. Methods Mol Biol, 456:109–121.
108
Cardenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgo, J., Muller, M., Vais, H., Cheung,
K. H., Yang, J., Parker, I., Thompson, C. B., Birnbaum, M. J., Hallows, K. R. i Foskett,
J. K. (2010). Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+
transfer to mitochondria. Cell, 142(2):270–283.
Casteilla, L., Devin, A., Salin, B., Averet, N. i Rigoulet, M. (2012). UCP1 as a
water/proton co-transporter. Mitochondrion, 12(4):480–481.
Cecchini, G. (2003). Function and structure of complex II of the respiratory chain. Annu Rev
Biochem, 72:77–109.
Chance, B. i Williams, G. R. (1955). Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III.
The steady state. J Biol Chem, 217(1):409–427.
Chappie, J. S.,Mears, J. A., Fang, S., Leonard,M., Schmid, S. L.,Milligan, R.A.,Hinshaw,
J. E. i Dyda, F. (2011). A pseudoatomicmodel of the dynamin polymer identifies a hydrolysis-
dependent powerstroke. Cell, 147(1):209–222.
Chedid, A., Jao, W. i Port, J. (1980). Megamitochondria in hepatic and renal disease. Am J
Gastroenterol, 73(4):319–324.
Chen, H., Chomyn, A. i Chan, D. C. (2005). Disruption of fusion results in mitochondrial
heterogeneity and dysfunction. J Biol Chem, 280(28):26185–26192.
Chen, H., Detmer, S. A., Ewald, A. J., Griffin, E. E., Fraser, S. E. i Chan, D. C. (2003).
Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for
embryonic development. J Cell Biol, 160(2):189–200.
Cinti, S., Cancello, R., Zingaretti, M. C., Ceresi, E., De Matteis, R., Giordano, A.,
Himms-Hagen, J. i Ricquier, D. (2002). CL316,243 and cold stress induce heterogeneous
expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. J Histochem Cytochem,
50(1):21–31.
Cipolat, S., Martins de Brito, O., Dal Zilio, B. i Scorrano, L. (2004). OPA1 requires
mitofusin 1 topromotemitochondrial fusion. ProcNatlAcadSciUSA, 101(45):15927–15932.
Clapham, J. C., Arch, J. R., Chapman, H., Haynes, A., Lister, C., Moore, G. B., Piercy, V.,
Carter, S. A., Lehner, I., Smith, S. A., Beeley, L. J., Godden, R. J., Herrity, N., Skehel,
109
M., Changani, K. K., Hockings, P. D., Reid, D. G., Squires, S. M., Hatcher, J., Trail,
B., Latcham, J., Rastan, S., Harper, A. J., Cadenas, S., Buckingham, J. A., Brand, M. D.
i Abuin, A. (2000). Mice overexpressing human uncoupling protein-3 in skeletal muscle are
hyperphagic and lean. Nature, 406(6794):415–418.
Claus, C., Schonefeld, K., Hubner, D., Chey, S., Reibetanz, U. i Liebert, U. G. (2013).
Activity increase in respiratory chain complexes by rubella virus with marginal induction of
oxidative stress. J Virol, 87(15):8481–8492.
Cogliati, S., Frezza, C., Soriano,M. E., Varanita, T., Quintana-Cabrera, R., Corrado,
M., Cipolat, S., Costa, V., Casarin, A., Gomes, L. C., Perales-Clemente, E., Salviati,
L., Fernandez-Silva, P., Enriquez, J. A. i Scorrano, L. (2013). Mitochondrial cristae
shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell,
155(1):160–171.
Cohen,M.M., Leboucher,G. P., Livnat-Levanon,N., Glickman,M.H. iWeissman, A.M.
(2008). Ubiquitin-proteasome-dependent degradation of a mitofusin, a critical regulator of
mitochondrial fusion. Mol Biol Cell, 19(6):2457–2464.
Collins, S. i Bordicchia,M. (2013). Heart hormones fueling a fire in fat. Adipocyte, 2(2):104–
108.
Collins, T. J., Berridge, M. J., Lipp, P. i Bootman, M. D. (2002). Mitochondria are
morphologically and functionally heterogeneous within cells. EMBO J, 21(7):1616–1627.
Collinson, I. R., Runswick, M. J., Buchanan, S. K., Fearnley, I. M., Skehel, J. M., van
Raaij, M. J., Griffiths, D. E. iWalker, J. E. (1994). Fomembrane domain of ATP synthase
from bovine heart mitochondria: purification, subunit composition, and reconstitution with
F1-ATPase. Biochemistry, 33(25):7971–7978.
Connolly, E., Nanberg, E. i Nedergaard, J. (1984). Na+-dependent, alpha-adrenergic
mobilization of intracellular (mitochondrial) Ca2+ in brown adipocytes. Eur J Biochem,
141(1):187–193.
Connolly, E. iNedergaard, J. (1988). Beta-adrenergicmodulationofCa2+uptakeby isolated
brownadipocytes. Possible involvementofmitochondria. J BiolChem, 263(22):10574–10582.
110
Cooney, G. J., Caterson, I. D. i Newsholme, E. A. (1985). The effect of insulin and
noradrenaline on the uptake of 2-[1-14C]deoxyglucose in vivo by brown adipose tissue and
other glucose-utilising tissues of the mouse. FEBS Lett, 188(2):257–261.
Cribbs, J. T. i Strack, S. (2009). Functional characterization of phosphorylation sites in
dynamin-related protein 1. Methods Enzymol, 457:231–253.
Crofts, A. R. (2004). The cytochrome bc1 complex: function in the context of structure. Annu
Rev Physiol, 66:689–733.
Csordas, G., Renken, C., Varnai, P., Walter, L., Weaver, D., Buttle, K. F., Balla, T.,
Mannella,C.A. iHajnoczky,G. (2006). Structural and functional features and significance
of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol, 174(7):915–921.
Czech, M. P., Lawrence Jr., J. C. i Lynn, W. S. (1974). Hexose transport in isolated brown
fat cells. A model system for investigating insulin action on membrane transport. J Biol Chem,
249(17):5421–5427.
Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D. i Kuhlbrandt, W. (2012).
Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial
cristae. Proc Natl Acad Sci U S A, 109(34):13602–13607.
Davies, K. M., Heaney, R. P., Recker, R. R., Lappe, J. M., Barger-Lux, M. J., Rafferty, K. i
Hinders, S. (2000). Calcium intake and body weight. J Clin Endocrinol Metab, 85(12):4635–
4638.
de Brito, O. M. i Scorrano, L. (2008). Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to
mitochondria. Nature, 456(7222):605–610.
De Giorgi, F., Lartigue, L. i Ichas, F. (2000). Electrical coupling and plasticity of the
mitochondrial network. Cell Calcium, 28(5-6):365–370.
Deepa, S. S., Pulliam, D., Hill, S., Shi, Y., Walsh,M. E., Salmon, A., Sloane, L., Zhang, N.,
Zeviani, M., Viscomi, C., Musi, N. i Van Remmen, H. (2013). Improved insulin sensitivity
associated with reduced mitochondrial complex IV assembly and activity. FASEB J, 27(4):
1371–1380.
Denton, R. M. (2009). Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim
Biophys Acta, 1787(11):1309–1316.
111
Denton, R. M., Randle, P. J., Bridges, B. J., Cooper, R. H., Kerbey, A. L., Pask, H. T.,
Severson,D. L., Stansbie, D. iWhitehouse, S. (1975). Regulation ofmammalian pyruvate
dehydrogenase. Mol Cell Biochem, 9(1):27–53.
Desautels,M. iDulos, R. (1994). Hemin inhibits protein synthesis anddegradation in isolated
brown adipose tissue mitochondria. Can J Physiol Pharm, 72(9):970–978.
Diao, J., Allister, E. M., Koshkin, V., Lee, S. C., Bhattacharjee, A., Tang, C., Giacca, A.,
Chan, C. B. iWheeler,M. B. (2008). UCP2 is highly expressed in pancreatic alpha-cells and
influences secretion and survival. Proc Natl Acad Sci U S A, 105(33):12057–12062.
Divakaruni, A. S. i Brand, M. D. (2011). The regulation and physiology of mitochondrial
proton leak. Physiology, 26(3):192–205.
Dolgacheva, L. P., Abzhalelov, B. B., Zhang, S. J., Zinchenko, V. P. i Bronnikov, G. E.
(2003). Norepinephrine induces slow calcium signalling in murine brown preadipocytes
through the beta-adrenoceptor/cAMP/protein kinase A pathway. Cell Signal, 15(2):209–216.
Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra,W., Boekema, E. J. i Braun,H. P. (2005). Structure of a
mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Natl Acad
Sci U S A, 102(9):3225–3229.
Dudkina, N. V., Kouril, R., Peters, K., Braun, H. P. i Boekema, E. J. (2010). Structure and
function of mitochondrial supercomplexes. Biochim Biophys Acta, 1797(6-7):664–670.
Dudkina, N. V., Kudryashev, M., Stahlberg, H. i Boekema, E. J. (2011). Interaction
of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron
tomography. Proc Natl Acad Sci U S A, 108(37):15196–15200.
Ebner, S., Burnol, A. F., Ferre, P., de Saintaurin, M. A. i Girard, J. (1987). Effects of
insulin and norepinephrine on glucose transport and metabolism in rat brown adipocytes.
Potentiation by insulin of norepinephrine-induced glucose oxidation. Eur J Biochem, 170(1-
2):469–474.
Echtay, K. S. (2007). Mitochondrial uncoupling proteins–what is their physiological role? Free
Radic Biol Med, 43(10):1351–1371.
Efremov, R. G. i Sazanov, L. A. (2011). Structure of the membrane domain of respiratory
complex I. Nature, 476(7361):414–420.
112
Esteves, T. C. i Brand,M. D. (2005). The reactions catalysed by themitochondrial uncoupling
proteins UCP2 and UCP3. Biochim Biophys Acta, 1709(1):35–44.
Eubel, H., Jansch, L. i Braun, H. P. (2003). New insights into the respiratory chain of plant
mitochondria. Supercomplexes and aunique compositionof complex II. Plant Physiol, 133(1):
274–286.
Faccenda,D., Tan,C.H., Seraphim, A., Duchen,M.R. i Campanella,M. (2013). IF1 limits
the apoptotic-signalling cascade by preventing mitochondrial remodelling. Cell Death Differ,
20(5):686–697.
Faelber, K., Posor, Y., Gao, S., Held, M., Roske, Y., Schulze, D., Haucke, V., Noe, F. i
Daumke, O. (2011). Crystal structure of nucleotide-free dynamin. Nature, 477(7366):556–
560.
Fasshauer, M., Klein, J., Ueki, K., Kriauciunas, K. M., Benito, M., White, M. F. i Kahn,
C. R. (2000). Essential role of insulin receptor substrate-2 in insulin stimulation of Glut4
translocation and glucose uptake in brown adipocytes. J Biol Chem, 275(33):25494–25501.
Fedorenko,A., Lishko, P.V. iKirichok, Y. (2012). Mechanismof fatty-acid-dependentUCP1
uncoupling in brown fat mitochondria. Cell, 151(2):400–413.
Fernandez Moran, H., Oda, T., Blair, P. V. i Green, D. E. (1964). A Macromolecular
Repeating Unit of Mitochondrial Structure and Function. Correlated Electron Microscopic
and Biochemical Studies of Isolated Mitochondria and Submitochondrial Particles of Beef
Heart Muscle. J Cell Biol, 22:63–100.
Figueroa-Romero, C., Iniguez-Lluhi, J. A., Stadler, J., Chang, C. R., Arnoult, D.,
Keller, P. J., Hong, Y., Blackstone, C. i Feldman, E. L. (2009). SUMOylation of the
mitochondrial fission proteinDrp1 occurs atmultiple nonconsensus siteswithin theBdomain
and is linked to its activity cycle. FASEB J, 23(11):3917–3927.
Fisler, J. S. i Warden, C. H. (2006). Uncoupling proteins, dietary fat and the metabolic
syndrome. Nutr Metab, 3:38.
Fleury, C., Neverova, M., Collins, S., Raimbault, S., Champigny, O., Levi-Meyrueis,
C., Bouillaud, F., Seldin, M. F., Surwit, R. S., Ricquier, D. i Warden, C. H. (1997).
113
Uncoupling protein-2: a novel gene linked to obesity and hyperinsulinemia. NatGenet, 15(3):
269–272.
Ford, M. G., Jenni, S. i Nunnari, J. (2011). The crystal structure of dynamin. Nature,
477(7366):561–566.
Formentini, L., Sanchez-Arago, M., Sanchez-Cenizo, L. i Cuezva, J. M. (2012). The
mitochondrial ATPase inhibitory factor 1 triggers a ROS-mediated retrograde prosurvival and
proliferative response. Mol Cell, 45(6):731–742.
Forner, F., Kumar, C., Luber, C. A., Fromme, T., Klingenspor, M. i Mann, M. (2009).
Proteome differences between brown andwhite fat mitochondria reveal specializedmetabolic
functions. Cell Metab, 10(4):324–335.
Frey, T. G. i Mannella, C. A. (2000). The internal structure of mitochondria. Trends Biochem
Sci, 25(7):319–324.
Frey, T. G., Renken, C. W. i Perkins, G. A. (2002). Insight into mitochondrial structure and
function from electron tomography. Biochim Biophys Acta, 1555(1-3):196–203.
Frezza, C., Cipolat, S., Martins de Brito, O., Micaroni, M., Beznoussenko, G. V.,
Rudka, T., Bartoli, D., Polishuck, R. S., Danial, N. N., De Strooper, B. i Scorrano,
L. (2006). OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial
fusion. Cell, 126(1):177–189.
Friedman, J. R., Lackner, L. L., West, M., DiBenedetto, J. R., Nunnari, J. i Voeltz, G. K.
(2011). ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science, 334(6054):358–362.
Fujimoto, M., Hayashi, T. i Su, T. P. (2012). The role of cholesterol in the association
of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem Biophys Res Commun,
417(1):635–639.
Fuller, P. M., Warden, C. H., Barry, S. J. i Fuller, C. A. (2000). Effects of 2-G exposure on
temperature regulation, circadian rhythms, and adiposity in UCP2/3 transgenic mice. J Appl
Physiol, 89(4):1491–1498.
Galante, Y. M., Wong, S. Y. i Hatefi, Y. (1981). Resolution and reconstitution of complex
V of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: properties and composition of the
membrane sector. Arch Biochem Biophys, 211(2):643–651.
114
Garcia, J. J., Morales-Rios, E., Cortes-Hernandez, P. i Rodriguez-Zavala, J. S. (2006).
The inhibitor protein (IF1) promotes dimerization of the mitochondrial F1F0-ATP synthase.
Biochemistry, 45(42):12695–12703.
Garlid, K. D., Jaburek, M. i Jezek, P. (1998). The mechanism of proton transport mediated
by mitochondrial uncoupling proteins. FEBS Lett, 438(1-2):10–14.
Gazaryan, I.G. i Brown,A.M. (2007). Intersectionbetweenmitochondrial permeability pores
and mitochondrial fusion/fission. Neurochem Res, 32(4-5):917–929.
Gegg, M. E., Cooper, J. M., Chau, K. Y., Rojo, M., Schapira, A. H. i Taanman, J. W. (2010).
Mitofusin 1 and mitofusin 2 are ubiquitinated in a PINK1/parkin-dependent manner upon
induction of mitophagy. HumMol Genet, 19(24):4861–4870.
Geloen, A. i Trayhurn, P. (1990). Regulation of the level of uncoupling protein in brown
adipose tissue by insulin. Am J Physiol, 258(2 Pt 2):R418–24.
Goglia, F., Geloen, A., Lanni, A., Minaire, Y. i Bukowiecki, L. J. (1992). Morphometric-
stereologic analysis of brown adipocyte differentiation in adult mice. Am J Physiol, 262(4 Pt
1):C1018–23.
Goglia, F. i Skulachev, V. P. (2003). A function for novel uncoupling proteins: antioxidant
defense of mitochondrial matrix by translocating fatty acid peroxides from the inner to the
outer membrane leaflet. FASEB J, 17(12):1585–1591.
Gong, D. W., He, Y., Karas, M. i Reitman, M. (1997). Uncoupling protein-3 is a mediator
of thermogenesis regulated by thyroid hormone, beta3-adrenergic agonists, and leptin. J Biol
Chem, 272(39):24129–24132.
Gong, D. W., He, Y. i Reitman, M. L. (1999). Genomic organization and regulation by dietary
fat of the uncoupling protein 3 and 2 genes. Biochem Biophys Res Commun, 256(1):27–32.
Gong,D.W.,Monemdjou, S., Gavrilova,O., Leon, L. R.,Marcus-Samuels, B., Chou,C. J.,
Everett, C., Kozak, L. P., Li, C., Deng, C., Harper, M. E. i Reitman, M. L. (2000). Lack
of obesity and normal response to fasting and thyroid hormone in mice lacking uncoupling
protein-3. J Biol Chem, 275(21):16251–16257.
Greco-Perotto, R., Zaninetti, D., Assimacopoulos-Jeannet, F., Bobbioni, E. i
Jeanrenaud, B. (1987). Stimulatory effect of cold adaptation on glucose utilization by brown
115
adipose tissue. Relationship with changes in the glucose transporter system. J Biol Chem,
262(16):7732–7736.
Gyulkhandanyan, A. V. i Pennefather, P. S. (2004). Shift in the localization of sites of
hydrogen peroxide production in brain mitochondria by mitochondrial stress. J Neurochem,
90(2):405–421.
Hackenbrock, C. R. (1966). Ultrastructural bases for metabolically linkedmechanical activity
in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in
isolated liver mitochondria. J Cell Biol, 30(2):269–297.
Hackenbrock, C. R. (1968). Ultrastructural bases for metabolically linkedmechanical activity
inmitochondria. II. Electron transport-linkedultrastructural transformations inmitochondria.
J Cell Biol, 37(2):345–369.
Haemmerle, G., Zimmermann, R., Hayn, M., Theussl, C., Waeg, G., Wagner, E., Sattler,
W.,Magin, T.M.,Wagner, E. F. i Zechner, R. (2002). Hormone-sensitive lipase deficiency
in mice causes diglyceride accumulation in adipose tissue, muscle, and testis. J Biol Chem,
277(7):4806–4815.
Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B. i Thomas, A. P. (1995). Decoding of
cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell, 82(3):415–424.
Hall, J. C., Sordahl, L. A. i Stefko, P. L. (1960). The effect of insulin on oxidative
phosphorylation in normal and diabetic mitochondria. J Biol Chem, 235:1536–1539.
Han, D., Canali, R., Rettori, D. i Kaplowitz, N. (2003). Effect of glutathione depletion
on sites and topology of superoxide and hydrogen peroxide production in mitochondria. Mol
Pharmacol, 64(5):1136–1144.
Han, X. J., Lu, Y. F., Li, S. A., Kaitsuka, T., Sato, Y., Tomizawa, K., Nairn, A. C., Takei, K.,
Matsui, H. iMatsushita,M. (2008). CaMkinase I alpha-induced phosphorylation ofDrp1
regulates mitochondrial morphology. J Cell Biol, 182(3):573–585.
Hansford, R. G., Hogue, B. A. i Mildaziene, V. (1997). Dependence of H2O2 formation by
rat heartmitochondria on substrate availability anddonor age. J Bioenerg Biomembr, 29(1):89–
95.
116
Harms, M. i Seale, P. (2013). Brown and beige fat: development, function and therapeutic
potential. Nat Med, 19(10):1252–1263.
Harrold, J. A., Widdowson, P. S., Clapham, J. C. i Williams, G. (2000). Individual severity
of dietary obesity in unselected Wistar rats: relationship with hyperphagia. Am J Physiol
Endocrinol Metab, 279(2):E340–7.
Havlickova Karbanova, V., Cizkova Vrbacka, A., Hejzlarova, K., Nuskova, H.,
Stranecky, V., Potocka, A., Kmoch, S. i Houstek, J. (2012). Compensatory upregulation
of respiratory chain complexes III and IV in isolated deficiency of ATP synthase due to
TMEM70mutation. Biochim Biophys Acta, 1817(7):1037–1043.
Hayashi, T., Rizzuto, R., Hajnoczky, G. i Su, T. P. (2009). MAM: more than just a
housekeeper. Trends Cell Biol, 19(2):81–88.
Hayato, R., Higure, Y., Kuba, M., Nagai, H., Yamashita, H. i Kuba, K. (2011). beta(3)-
Adrenergic activation of sequential Ca(2+) release from mitochondria and the endoplasmic
reticulum and the subsequent Ca(2+) entry in rodent brown adipocytes. Cell Calcium, 49(6):
400–414.
He, Y.H., Song, Y., Liao, X. L.,Wang, L., Li, G., Alima, Li, Y. i Sun,C.H. (2011). The calcium-
sensing receptor affects fat accumulation via effects on antilipolytic pathways in adipose tissue
of rats fed low-calcium diets. J Nutr, 141(11):1938–1946.
Heaton, G. M., Wagenvoord, R. J., Kemp Jr., A. i Nicholls, D. G. (1978). Brown-adipose-
tissue mitochondria: photoaffinity labelling of the regulatory site of energy dissipation. Eur J
Biochem, 82(2):515–521.
Henle, J. (1841). Allgemeine Anatomie. Verlag von Leopold Voss, Leipzig.
Henriksen, E. J. (2013). Effects of H2O2 on insulin signaling the glucose transport system in
mammalian skeletal muscle. Methods Enzymol, 528:269–278.
Himms-Hagen, J. i Harper, M. E. (2001). Physiological role of UCP3 may be export of fatty
acids from mitochondria when fatty acid oxidation predominates: an hypothesis. Exp Biol
Med, 226(2):78–84.
Hirst, J. (2013). Mitochondrial complex I. Annu Rev Biochem, 82:551–575.
117
Hirst, J., King, M. S. i Pryde, K. R. (2008). The production of reactive oxygen species by
complex I. Biochem Soc Trans, 36(Pt 5):976–980.
Hittelman, K. J., Fairhurst, A. S. i Smith, R. E. (1967). Calcium accumulation as a parameter
of energy metabolism in mitochondria of brown adipose tissue. Proc Natl Acad Sci U S A,
58(2):697–702.
Holm, C., Fredrikson, G., Cannon, B. i Belfrage, P. (1987). Hormone-sensitive lipase in
brown adipose tissue: identification and effect of cold exposure. Biosci Rep, 7(11):897–904.
Horvath, B., Spies, C., Horvath, G., Kox, W. J., Miyamoto, S., Barry, S., Warden, C. H.,
Bechmann, I., Diano, S., Heemskerk, J. i Horvath, T. L. (2002). Uncoupling protein 2
(UCP2) lowers alcohol sensitivity and pain threshold. Biochem Pharmacol, 64(3):369–374.
Horvath, T. L., Diano, S., Miyamoto, S., Barry, S., Gatti, S., Alberati, D., Livak,
F., Lombardi, A., Moreno, M., Goglia, F., Mor, G., Hamilton, J., Kachinskas, D.,
Horwitz, B. i Warden, C. H. (2003). Uncoupling proteins-2 and 3 influence obesity and
inflammation in transgenic mice. Int J Obes Relat Metab Disord, 27(4):433–442.
Houstek, J. i Drahota, Z. (1977). Purification and properties of mitochondrial adenosine
triphosphatase of hamster brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta, 484(1):127–139.
Houstek, J., Tvrdik, P., Pavelka, S. i Baudysova, M. (1991). Low content of mitochondrial
ATPase in brown adipose tissue is the result of post-transcriptional regulation. FEBS Lett,
294(3):191–194.
Hsieh, Y. C., Yu, H. P., Suzuki, T., Choudhry, M. A., Schwacha, M. G., Bland, K. I. i
Chaudry, I. H. (2006). Upregulation of mitochondrial respiratory complex IV by estrogen
receptor-beta is critical for inhibiting mitochondrial apoptotic signaling and restoring cardiac
functions following trauma-hemorrhage. J Mol Cell Cardiol, 41(3):511–521.
Hurov, J. B., Huang, M., White, L. S., Lennerz, J., Choi, C. S., Cho, Y. R., Kim, H. J.,
Prior, J. L., Piwnica-Worms, D., Cantley, L. C., Kim, J. K., Shulman, G. I. i Piwnica-
Worms, H. (2007). Loss of the Par-1b/MARK2 polarity kinase leads to increased metabolic
rate, decreased adiposity, and insulin hypersensitivity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A,
104(13):5680–5685.
118
Ingerman, E., Perkins, E. M., Marino, M., Mears, J. A., McCaffery, J. M., Hinshaw, J. E.
i Nunnari, J. (2005). Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J
Cell Biol, 170(7):1021–1027.
Inokuma, K., Ogura-Okamatsu, Y., Toda, C., Kimura, K., Yamashita, H. i Saito, M.
(2005). Uncoupling protein 1 is necessary for norepinephrine-induced glucose utilization in
brown adipose tissue. Diabetes, 54(5):1385–1391.
Iseri, O. A. i Gottlieb, L. S. (1971). Alcoholic hyalin and megamitochondria as separate and
distinct entities in liver disease associated with alcoholism. Gastroenterology, 60(6):1027–
1035.
Ishihara,N.,Otera,H.,Oka,T. iMihara,K. (2013). Regulation andphysiologic functions of
GTPases in mitochondrial fusion and fission in mammals. Antioxid Redox Signal, 19(4):389–
399.
Jacobsen, R., Lorenzen, J. K., Toubro, S., Krog-Mikkelsen, I. i Astrup, A. (2005). Effect
of short-term high dietary calcium intake on 24-h energy expenditure, fat oxidation, and fecal
fat excretion. Int J Obes (Lond), 29(3):292–301.
Jastroch, M., Hirschberg, V. i Klingenspor, M. (2012). Functional characterization of
UCP1 in mammalian HEK293 cells excludes mitochondrial uncoupling artefacts and reveals
no contribution to basal proton leak. Biochim Biophys Acta, 1817(9):1660–1670.
Jeyaraju, D. V., Cisbani, G. i Pellegrini, L. (2009). Calcium regulation of mitochondria
motility and morphology. Biochim Biophys Acta, 1787(11):1363–1373.
Jezek, P. i Garlid, K. D. (1998). Mammalian mitochondrial uncoupling proteins. Int J Biochem
Cell Biol, 30(11):1163–1168.
Jezek, P., Jaburek, M. i Garlid, K. D. (2010). Channel character of uncoupling protein-
mediated transport. FEBS Lett, 584(10):2135–2141.
Jheng,H. F., Tsai, P. J., Guo, S.M., Kuo, L.H., Chang, C. S., Su, I. J., Chang, C. R. i Tsai, Y. S.
(2012). Mitochondrial fission contributes tomitochondrial dysfunction and insulin resistance
in skeletal muscle. Mol Cell Biol, 32(2):309–319.
Jiang, L., Qiu, W., Zhou, Y., Wen, P., Fang, L., Cao, H., Zen, K., He, W., Zhang, C., Dai,
C. i Yang, J. (2013). A microRNA-30e/mitochondrial uncoupling protein 2 axis mediates
119
TGF-beta1-induced tubular epithelial cell extracellular matrix production and kidney fibrosis.
Kidney Int, 84(2):285–296.
Joseph, J. W., Koshkin, V., Saleh, M. C., Sivitz, W. I., Zhang, C. Y., Lowell, B. B., Chan,
C. B. i Wheeler, M. B. (2004). Free fatty acid-induced beta-cell defects are dependent on
uncoupling protein 2 expression. J Biol Chem, 279(49):51049–51056.
Jungalwala, F. B. i Dawson, R. M. (1970). Phospholipid synthesis and exchange in isolated
liver cells. Biochem J, 117(3):481–490.
Kagawa, Y. i Racker, E. (1966). Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative
phosphorylation. X. Correlation of morphology and function in submitochondrial particles.
J Biol Chem, 241(10):2475–2482.
Kaila, V. R., Verkhovsky, M. I. i Wikstrom, M. (2010). Proton-coupled electron transfer in
cytochrome oxidase. Chem Rev, 110(12):7062–7081.
Karbowski, M., Kurono, C., Wozniak, M., Ostrowski, M., Teranishi, M., Nishizawa,
Y., Usukura, J., Soji, T. i Wakabayashi, T. (1999). Free radical-induced megamitochondria
formation and apoptosis. Free Radic Biol Med, 26(3-4):396–409.
Kelley, D. E., He, J., Menshikova, E. V. i Ritov, V. B. (2002). Dysfunction of mitochondria in
human skeletal muscle in type 2 diabetes. Diabetes, 51(10):2944–2950.
Kirichok, Y., Krapivinsky, G. i Clapham,D. E. (2004). Themitochondrial calciumuniporter
is a highly selective ion channel. Nature, 427(6972):360–364.
Klein, J., Fasshauer, M., Ito, M., Lowell, B. B., Benito, M. i Kahn, C. R. (1999). beta(3)-
adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced
glucose uptake in brown adipocytes. J Biol Chem, 274(49):34795–34802.
Klein, J., Fasshauer, M., Klein, H. H., Benito, M. i Kahn, C. R. (2002). Novel adipocyte
lines from brown fat: a model system for the study of differentiation, energy metabolism, and
insulin action. Bioessays, 24(4):382–388.
Klingenberg, M. (2010). Wanderings in bioenergetics and biomembranes. Biochim Biophys
Acta, 1797(6-7):579–594.
120
Klingenberg, M. i Huang, S. G. (1999). Structure and function of the uncoupling protein
from brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta, 1415(2):271–296.
Klotzsch, E., Smorodchenko, A., Lofler, L., Moldzio, R., Parkinson, E., Schutz, G. J. i
Pohl, E. E. (2015). Superresolutionmicroscopy reveals spatial separation ofUCP4 andF0F1-
ATP synthase in neuronal mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A, 112(1):130–135.
Korac, A., Radovanovic, J., Davidovic, V., Koko, V. i M., N. (1999). Apoptosis in the rat
brown adipose tissue after insulin treatment. JTherm Biol, 24(5-6):461–464.
Korner, C., Barrera, M., Dukanovic, J., Eydt, K., Harner, M., Rabl, R., Vogel, F.,
Rapaport, D., Neupert, W. i Reichert, A. S. (2012). The C-terminal domain of Fcj1
is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in
mitochondria. Mol Biol Cell, 23(11):2143–2155.
Kovarova, N., Cizkova Vrbacka, A., Pecina, P., Stranecky, V., Pronicka, E., Kmoch, S.
i Houstek, J. (2012). Adaptation of respiratory chain biogenesis to cytochrome c oxidase
deficiency caused by SURF1 gene mutations. Biochim Biophys Acta, 1822(7):1114–1124.
Kramarova, T. V., Shabalina, I. G., Andersson, U., Westerberg, R., Carlberg, I.,
Houstek, J., Nedergaard, J. i Cannon, B. (2008). Mitochondrial ATP synthase levels in
brown adipose tissue are governed by the c-Fo subunit P1 isoform. FASEB J, 22(1):55–63.
Krauss, S., Zhang, C. Y. i Lowell, B. B. (2005). The mitochondrial uncoupling-protein
homologues. Nat Rev Mol Cell Biol, 6(3):248–261.
Krauss, S., Zhang, C. Y., Scorrano, L., Dalgaard, L. T., St-Pierre, J., Grey, S. T. i Lowell,
B. B. (2003). Superoxide-mediated activation of uncoupling protein 2 causes pancreatic beta
cell dysfunction. J Clin Invest, 112(12):1831–1842.
Krook, A., Digby, J., O’Rahilly, S., Zierath, J. R. i Wallberg-Henriksson, H. (1998).
Uncoupling protein 3 is reduced in skeletalmuscle ofNIDDMpatients. Diabetes, 47(9):1528–
1531.
Kubli, D. A. i Gustafsson, A. B. (2012). Mitochondria andmitophagy: the yin and yang of cell
death control. Circ Res, 111(9):1208–1221.
121
Kudin, A. P., Bimpong-Buta, N. Y., Vielhaber, S., Elger, C. E. i Kunz, W. S. (2004).
Characterization of superoxide-producing sites in isolated brain mitochondria. J Biol Chem,
279(6):4127–4135.
Kuznetsov, A. V. iMargreiter, R. (2009). Heterogeneity ofmitochondria andmitochondrial
function within cells as another level of mitochondrial complexity. Int J Mol Sci, 10(4):1911–
1929.
Labrousse, A. M., Zappaterra, M. D., Rube, D. A. i van der Bliek, A. M. (1999). C. elegans
dynamin-related protein DRP-1 controls severing of the mitochondrial outer membrane. Mol
Cell, 4(5):815–826.
Lambert, A. J., Boysen, H. M., Buckingham, J. A., Yang, T., Podlutsky, A., Austad, S. N.,
Kunz, T. H., Buffenstein, R. i Brand, M. D. (2007). Low rates of hydrogen peroxide
production by isolated heartmitochondria associatewith longmaximum lifespan in vertebrate
homeotherms. Aging Cell, 6(5):607–618.
Lapuente-Brun, E., Moreno-Loshuertos, R., Acin-Perez, R., Latorre-Pellicer, A.,
Colas, C., Balsa, E., Perales-Clemente, E., Quiros, P. M., Calvo, E., Rodriguez-
Hernandez,M.A.,Navas, P., Cruz, R., Carracedo, A., Lopez-Otin,C., Perez-Martos,
A., Fernandez-Silva, P., Fernandez-Vizarra, E. i Enriquez, J. A. (2013). Supercomplex
assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science,
340(6140):1567–1570.
Leaver, E. V. i Pappone, P. A. (2002). Beta-adrenergic potentiation of endoplasmic reticulum
Ca(2+) release in brown fat cells. Am J Physiol Cell Physiol, 282(5):C1016–24.
Leboucher, G. P., Tsai, Y. C., Yang,M., Shaw, K. C., Zhou,M., Veenstra, T. D., Glickman,
M. H. i Weissman, A. M. (2012). Stress-induced phosphorylation and proteasomal
degradation of mitofusin 2 facilitates mitochondrial fragmentation and apoptosis. Mol Cell,
47(4):547–557.
Lee, S., Tak, E., Lee, J., Rashid,M. A., Murphy,M. P., Ha, J. i Kim, S. S. (2011). Mitochondrial
H2O2 generated from electron transport chain complex I stimulates muscle differentiation.
Cell Res, 21(5):817–834.
Lee, S. C., Nuccitelli, R. i Pappone, P. A. (1993). Adrenergically activated Ca2+ increases in
brown fat cells: effects of Ca2+, K+, and K channel block. Am J Physiol, 264(1 Pt 1):C217–28.
122
Lee, Y. J., Jeong, S. Y., Karbowski, M., Smith, C. L. i Youle, R. J. (2004). Roles of the
mammalian mitochondrial fission and fusion mediators Fis1, Drp1, and Opa1 in apoptosis.
Mol Biol Cell, 15(11):5001–5011.
Lefebvre, V., Du, Q., Baird, S., Ng, A. C., Nascimento, M., Campanella, M., McBride,
H. M. i Screaton, R. A. (2013). Genome-wide RNAi screen identifies ATPase inhibitory
factor 1 (ATPIF1) as essential for PARK2 recruitment and mitophagy. Autophagy, 9(11):
1770–1779.
Legesse-Miller, A., Massol, R. H. i Kirchhausen, T. (2003). Constriction and Dnm1p
recruitment are distinct processes in mitochondrial fission. Mol Biol Cell, 14(5):1953–1963.
Lenaz, G., Baracca, A., Barbero, G., Bergamini, C., Dalmonte, M. E., Del Sole, M.,
Faccioli, M., Falasca, A., Fato, R., Genova, M. L., Sgarbi, G. i Solaini, G. (2010).
Mitochondrial respiratory chain super-complex I-III in physiology and pathology. Biochim
Biophys Acta, 1797(6-7):633–640.
Lewis, M. R. i Lewis, W. H. (1914). Mitochondria in Tissue Culture. Science, 39(1000):330–
333.
Li, X., Fang, P., Mai, J., Choi, E. T., Wang, H. i Yang, X. F. (2013). Targeting mitochondrial
reactive oxygen species as novel therapy for inflammatory diseases and cancers. J Hematol
Oncol, 6:19.
Liebig, M., von Praun, C., Heldmaier, G. i Klingenspor, M. (2004). Absence of UCP3
in brown adipose tissue does not impair nonshivering thermogenesis. Physiol Biochem Zool,
77(1):116–126.
Lindberg, O., de Pierre, J., Rylander, E. i Afzelius, B. A. (1967). Studies of the
mitochondrial energy-transfer system of brown adipose tissue. J Cell Biol, 34(1):293–310.
Liu, H. Y., Cao, S. Y., Hong, T., Han, J., Liu, Z. i Cao, W. (2009). Insulin is a stronger inducer
of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol
Chem, 284(40):27090–27100.
Liu, Y., Fiskum, G. i Schubert, D. (2002). Generation of reactive oxygen species by the
mitochondrial electron transport chain. J Neurochem, 80(5):780–787.
123
Long, Q., Yang, K. i Yang, Q. (2015). Regulation of mitochondrial ATP synthase in cardiac
pathophysiology. Am J Cardiovasc Dis, 5(1):19–32.
Lorenzen, J. K., Nielsen, S., Holst, J. J., Tetens, I., Rehfeld, J. F. i Astrup, A. (2007). Effect
of dairy calcium or supplementary calcium intake on postprandial fat metabolism, appetite,
and subsequent energy intake. Am J Clin Nutr, 85(3):678–687.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. i Randall, R. J. (1951). Protein measurement
with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 193(1):265–275.
MacLellan, J. D., Gerrits, M. F., Gowing, A., Smith, P. J., Wheeler, M. B. i Harper, M. E.
(2005). Physiological increases in uncoupling protein 3 augment fatty acid oxidation and
decrease reactive oxygen species production without uncoupling respiration in muscle cells.
Diabetes, 54(8):2343–2350.
Mahadev, K., Zilbering, A., Zhu, L. i Goldstein, B. J. (2001). Insulin-stimulated hydrogen
peroxide reversibly inhibits protein-tyrosine phosphatase 1b in vivo and enhances the early
insulin action cascade. J Biol Chem, 276(24):21938–21942.
Maklashina, E. i Cecchini, G. (2010). The quinone-binding and catalytic site of complex II.
Biochim Biophys Acta, 1797(12):1877–1882.
Malka, F., Guillery, O., Cifuentes-Diaz, C., Guillou, E., Belenguer, P., Lombes, A. i
Rojo, M. (2005). Separate fusion of outer and inner mitochondrial membranes. EMBO Rep,
6(9):853–859.
Mannella, C. A. (2008). Structural diversity of mitochondria: functional implications. Ann N
Y Acad Sci, 1147:171–179.
Mannella, C. A., Marko, M., Penczek, P., Barnard, D. i Frank, J. (1994). The
internal compartmentation of rat-liver mitochondria: tomographic study using the high-
voltage transmission electron microscope. Microsc Res Tech, 27(4):278–283.
Marette, A., Deshaies, Y., Collet, A. J., Tulp, O. i Bukowiecki, L. J. (1991a). Major
thermogenic defect associatedwith insulin resistance in brown adipose tissue of obese diabetic
SHR/N-cp rats. Am J Physiol, 261(2 Pt 1):E204–13.
124
Marette, A., Tulp, O. L. i Bukowiecki, L. J. (1991b). Mechanism linking insulin resistance to
defective thermogenesis in brown adipose tissue of obese diabetic SHR/N-cp rats. Int J Obes,
15(12):823–831.
Markelic, M., Velickovic, K., Golic, I., Klepal, W., Otasevic, V., Stancic, A., Jankovic,
A., Vucetic, M., Buzadzic, B., Korac, B. i Korac, A. (2013). The origin of lipofuscin in
brown adipocytes of hyperinsulinaemic rats: the role of lipid peroxidation and iron. Histol
Histopathol, 28(4):493–503.
Marotte, C., Bryk, G., Gonzales Chaves, M. M., Lifshitz, F., de Portela, M. L. i Zeni,
S. N. (2014). Low dietary calcium and obesity: a comparative study in genetically obese and
normal rats during early growth. Eur J Nutr, 53(3):769–778.
Marsboom, G., Toth, P. T., Ryan, J. J., Hong, Z., Wu, X., Fang, Y. H., Thenappan, T.,
Piao, L., Zhang, H. J., Pogoriler, J., Chen, Y., Morrow, E., Weir, E. K., Rehman, J.
i Archer, S. L. (2012). Dynamin-related protein 1-mediated mitochondrial mitotic fission
permits hyperproliferationof vascular smoothmuscle cells andoffers a novel therapeutic target
in pulmonary hypertension. Circ Res, 110(11):1484–1497.
Martin, S. D., Morrison, S., Konstantopoulos, N. i McGee, S. L. (2014). Mitochondrial
dysfunctionhas divergent, cell type-dependent effects on insulin action.MolMetab, 3(4):408–
418.
Matsuo, K., Bettaieb, A., Nagata, N., Matsuo, I., Keilhack, H. i Haj, F. G. (2011).
Regulation of brown fat adipogenesis by protein tyrosine phosphatase 1B. PLoS One, 6(1):
e16446.
Matthias, A.,Ohlson,K.B., Fredriksson, J.M., Jacobsson,A.,Nedergaard, J. iCannon,
B. (2000). Thermogenic responses in brown fat cells are fully UCP1-dependent. UCP2 or
UCP3 do not substitute for UCP1 in adrenergically or fatty scid-induced thermogenesis. J
Biol Chem, 275(33):25073–25081.
Mattiasson, G. i Sullivan, P. G. (2006). The emerging functions of UCP2 in health, disease,
and therapeutics. Antioxid Redox Signal, 8(1-2):1–38.
May, J. M. i de Haen, C. (1979). Insulin-stimulated intracellular hydrogen peroxide production
in rat epididymal fat cells. J Biol Chem, 254(7):2214–2220.
125
Mears, J. A., Lackner, L. L., Fang, S., Ingerman, E., Nunnari, J. i Hinshaw, J. E. (2011).
Conformational changes in Dnm1 support a contractile mechanism for mitochondrial fission.
Nat Struct Mol Biol, 18(1):20–26.
Meeusen, S., DeVay, R., Block, J., Cassidy-Stone, A., Wayson, S., McCaffery, J. M. i
Nunnari, J. (2006). Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires
the dynamin-related GTPaseMgm1. Cell, 127(2):383–395.
Meeusen, S., McCaffery, J. M. i Nunnari, J. (2004). Mitochondrial fusion intermediates
revealed in vitro. Science, 305(5691):1747–1752.
Menz, R. I., Walker, J. E. i Leslie, A. G. (2001). Structure of bovine mitochondrial F(1)-
ATPase with nucleotide bound to all three catalytic sites: implications for the mechanism of
rotary catalysis. Cell, 106(3):331–341.
Mitchell, P. (1979). Keilin’s respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences.
Science, 206(4423):1148–1159.
Mitchell, P. (2011). Chemiosmotic coupling inoxidative andphotosyntheticphosphorylation.
1966. Biochim Biophys Acta, 1807(12):1507–1538.
Montgomery, M. K. i Turner, N. (2015). Mitochondrial dysfunction and insulin resistance:
an update. Endocr Connect, 4(1):R1–R15.
Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J.,
Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M. J.,
Patterson, N., Mesirov, J. P., Golub, T. R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E. S.,
Hirschhorn, J. N., Altshuler, D. i Groop, L. C. (2003). PGC-1alpha-responsive genes
involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in humandiabetes. Nat
Genet, 34(3):267–273.
Motz, C., Hornung, T., Kersten, M., McLachlin, D. T., Dunn, S. D., Wise, J. G. i Vogel,
P. D. (2004). The subunit b dimer of the FOF1-ATP synthase: interaction with F1-ATPase as
deduced by site-specific spin-labeling. J Biol Chem, 279(47):49074–49081.
Mur, C., Arribas, M., Benito, M. i Valverde, A. M. (2003). Essential role of insulin-
like growth factor I receptor in insulin-induced fetal brown adipocyte differentiation.
Endocrinology, 144(2):581–593.
126
Murphy,M. P. (2009). Howmitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J, 417(1):
1–13.
Murray, A. J., Anderson, R. E., Watson, G. C., Radda, G. K. i Clarke, K. (2004).
Uncoupling proteins in human heart. Lancet, 364(9447):1786–1788.
Muster, B., Kohl, W., Wittig, I., Strecker, V., Joos, F., Haase, W., Bereiter-Hahn, J. i
Busch, K. (2010). Respiratory chain complexes in dynamic mitochondria display a patchy
distribution in life cells. PLoS One, 5(7):e11910.
Muzzin, P., Revelli, J. P., Kuhne, F., Gocayne, J. D., McCombie, W. R., Venter, J. C.,
Giacobino, J. P. i Fraser, C.M. (1991). An adipose tissue-specific beta-adrenergic receptor.
Molecular cloning and down-regulation in obesity. J Biol Chem, 266(35):24053–24058.
Nakada, K., Inoue, K., Ono, T., Isobe, K., Ogura, A., Goto, Y. I., Nonaka, I. i Hayashi,
J. I. (2001). Inter-mitochondrial complementation: Mitochondria-specific system preventing
mice from expression of disease phenotypes by mutant mtDNA. Nat Med, 7(8):934–940.
Nakagaki, I., Sasaki, S., Yahata, T., Takasaki, H. i Hori, S. (2005). Cytoplasmic and
mitochondrial Ca levels in brown adipocytes. Acta Physiol Scand, 183(1):89–97.
Nakamura, J., Fujikawa, M. i Yoshida, M. (2013). IF1, a natural inhibitor of mitochondrial
ATP synthase, is not essential for the normal growth and breeding of mice. Biosci Rep, 33(5):
735–741.
Nedergaard, J., Bengtsson, T. i Cannon, B. (2007). Unexpected evidence for active brown
adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab, 293(2):E444–52.
Nicastro, D., Frangakis, A. S., Typke, D. i Baumeister, W. (2000). Cryo-electron
tomography of neurospora mitochondria. J Struct Biol, 129(1):48–56.
Nicholls, D. G. (1974). The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-
electrochemical gradient across the inner membrane of rat-liver mitochondria as determined
by ion distribution. Eur J Biochem, 50(1):305–315.
Nicholls, D. G. (2006). The physiological regulation of uncoupling proteins. Biochim Biophys
Acta, 1757(5-6):459–466.
Nicholls, D. G. i Ferguson, S. (2013). Bioenergetics. Academic Press, London, 4. izdanje.
127
Nicholls, D. G. i Locke, R. M. (1984). Thermogenic mechanisms in brown fat. Physiol Rev,
64(1):1–64.
Nisr, R. B. i Affourtit, C. (2014). Insulin acutely improves mitochondrial function of rat and
human skeletalmuscle by increasing coupling efficiency of oxidative phosphorylation. Biochim
Biophys Acta, 1837(2):270–276.
Nobre, J. L., Lisboa, P. C., Santos-Silva, A. P., Lima, N. S., Manhaes, A. C., Nogueira-
Neto, J. F., Cabanelas, A., Pazos-Moura, C. C., Moura, E. G. i de Oliveira, E. (2011).
Calcium supplementation reverts central adiposity, leptin, and insulin resistance in adult
offspring programed by neonatal nicotine exposure. J Endocrinol, 210(3):349–359.
Ogawa, K., Saito, T. i Mayahara, H. (1968). The site of ferricyanide reduction by reductases
within mitochondria as studied by electron microscopy. J Histochem Cytochem, 16(1):49–57.
Okuno,D., Iino, R. iNoji, H. (2011). Rotation and structure of FoF1-ATP synthase. J Biochem,
149(6):655–664.
Omatsu-Kanbe,M. i Kitasato, H. (1992). Insulin and noradrenaline independently stimulate
the translocation of glucose transporters from intracellular stores to the plasma membrane in
mouse brown adipocytes. FEBS Lett, 314(3):246–250.
Omatsu-Kanbe, M., Zarnowski, M. J. i Cushman, S. W. (1996). Hormonal regulation of
glucose transport in a brown adipose cell preparation isolated from rats that shows a large
response to insulin. Biochem J, 315 ( Pt 1):25–31.
Ono, S., Sone, N., Yoshida, M. i Suzuki, T. (2004). ATP synthase that lacks F0a-subunit:
isolation, properties, and indication of F0b2-subunits as an anchor rail of a rotating c-ring. J
Biol Chem, 279(32):33409–33412.
Ono, T., Isobe, K., Nakada, K. i Hayashi, J. I. (2001). Human cells are protected from
mitochondrial dysfunction by complementation ofDNAproducts in fusedmitochondria. Nat
Genet, 28(3):272–275.
Orava, J., Nuutila, P., Lidell, M. E., Oikonen, V., Noponen, T., Viljanen, T., Scheinin,
M., Taittonen, M., Niemi, T., Enerback, S. i Virtanen, K. A. (2011). Different metabolic
responses of human brown adipose tissue to activation by cold and insulin. Cell Metab, 14(2):
272–279.
128
Osman, C., Voelker, D. R. i Langer, T. (2011). Making heads or tails of phospholipids in
mitochondria. J Cell Biol, 192(1):7–16.
Otera, H.,Wang, C., Cleland,M.M., Setoguchi, K., Yokota, S., Youle, R. J. iMihara, K.
(2010). Mff is an essential factor formitochondrial recruitment of Drp1 duringmitochondrial
fission in mammalian cells. J Cell Biol, 191(6):1141–1158.
Palade, G. E. (1952). The fine structure of mitochondria. Anat Rec, 114(3):427–451.
Palade, G. E. (1953). An electronmicroscope study of themitochondrial structure. J Histochem
Cytochem, 1(4):188–211.
Parikh, S. J. i Yanovski, J. A. (2003). Calcium intake and adiposity. Am JClinNutr, 77(2):281–
287.
Parra, V., Verdejo, H. E., Iglewski, M., Del Campo, A., Troncoso, R., Jones, D., Zhu,
Y., Kuzmicic, J., Pennanen, C., Lopez-Crisosto, C., Jana, F., Ferreira, J., Noguera,
E., Chiong, M., Bernlohr, D. A., Klip, A., Hill, J. A., Rothermel, B. A., Abel, E. D.,
Zorzano, A. i Lavandero, S. (2014). Insulin stimulates mitochondrial fusion and function
in cardiomyocytes via the Akt-mTOR-NFkappaB-Opa-1 signaling pathway. Diabetes, 63(1):
75–88.
Patergnani, S., Suski, J. M., Agnoletto, C., Bononi, A., Bonora, M., De Marchi,
E., Giorgi, C., Marchi, S., Missiroli, S., Poletti, F., Rimessi, A., Duszynski, J.,
Wieckowski,M. R. i Pinton, P. (2011). Calcium signaling aroundMitochondria Associated
Membranes (MAMs). Cell Commun Signal, 9:19.
Paumard, P., Vaillier, J., Coulary, B., Schaeffer, J., Soubannier, V., Mueller, D. M.,
Brethes, D., di Rago, J. P. i Velours, J. (2002). The ATP synthase is involved in generating
mitochondrial cristae morphology. EMBO J, 21(3):221–230.
Perkins, G., Renken, C., Martone, M. E., Young, S. J., Ellisman, M. i Frey, T.
(1997). Electron tomography of neuronal mitochondria: three-dimensional structure and
organization of cristae and membrane contacts. J Struct Biol, 119(3):260–272.
Perkins, G. A., Ellisman,M. H. i Fox, D. A. (2003). Three-dimensional analysis of mouse rod
and cone mitochondrial cristae architecture: bioenergetic and functional implications. Mol
Vis, 9:60–73.
129
Perkins, G. A., Song, J. Y., Tarsa, L., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H. i Frey, T. G. (1998).
Electron tomography of mitochondria from brown adipocytes reveals crista junctions. J
Bioenerg Biomembr, 30(5):431–442.
Persiyantseva, N. A., Storozhevykh, T. P., Senilova, Y. E., Gorbacheva, L. R., Pinelis,
V. G. i Pomytkin, I. A. (2013). Mitochondrial H2O2 as an enable signal for triggering
autophosphorylation of insulin receptor in neurons. J Mol Signal, 8(1):11.
Pesta, D. i Gnaiger, E. (2012). High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human
cells andpermeabilized fibers from small biopsies of humanmuscle.MethodsMolBiol, 810:25–
58.
Petersen, K. F., Dufour, S. i Shulman, G. I. (2005). Decreased insulin-stimulated ATP
synthesis and phosphate transport in muscle of insulin-resistant offspring of type 2 diabetic
parents. PLoSMed, 2(9):e233.
Petersen, P. (1977). Abnormal mitochondria in hepatocytes in human fatty liver. Acta Pathol
Microbiol Scand A, 85(3):413–420.
Petrovic, V., Korac, A., Buzadzic, B., Vasilijevic, A., Jankovic, A., Micunovic, K. i
Korac, B. (2008). Nitric oxide regulates mitochondrial re-modelling in interscapular brown
adipose tissue: ultrastructural and morphometric-stereologic studies. J Microsc, 232(3):542–
548.
Pi, J., Bai, Y., Zhang, Q., Wong, V., Floering, L. M., Daniel, K., Reece, J. M., Deeney, J. T.,
Andersen, M. E., Corkey, B. E. i Collins, S. (2007). Reactive oxygen species as a signal in
glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes, 56(7):1783–1791.
Pogoryelov, D., Yu, J., Meier, T., Vonck, J., Dimroth, P. i Muller, D. J. (2005). The c15
ring of the Spirulina platensis F-ATP synthase: F1/F0 symmetry mismatch is not obligatory.
EMBO Rep, 6(11):1040–1044.
Poole, A. C., Thomas, R. E., Yu, S., Vincow, E. S. i Pallanck, L. (2010). The mitochondrial
fusion-promoting factor mitofusin is a substrate of the PINK1/parkin pathway. PLoS One,
5(4):e10054.
Porras, A., Alvarez, A.M., Valladares, A. i Benito,M. (1998). p42/p44mitogen-activated
protein kinases activation is required for the insulin-like growth factor-I/insulin induced
130
proliferation, but inhibits differentiation, in rat fetal brown adipocytes. Mol Endocrinol, 12(6):
825–834.
Pozzan, T., Di Virgilio, F., Vicentini, L.M. iMeldolesi, J. (1986). Activation ofmuscarinic
receptors in PC12 cells. Stimulation ofCa2+ influx and redistribution. Biochem J, 234(3):547–
553.
Prieto, I., Jimenez, F., Aller, M. A., Nava, M. P., Vara, E., Garcia, C. i Arias, J.
(2005). Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta and nitric oxide: induction of liver
megamitochondria in prehepatic portal hypertensive rats. World J Surg, 29(7):903–908.
Putney Jr., J. W. (2003). Capacitative calcium entry in the nervous system. Cell Calcium, 34(4-
5):339–344.
Qiu,W., Zhou, Y., Jiang, L., Fang, L., Chen, L., Su,W., Tan, R., Zhang,C. Y., Han, X. i Yang,
J. (2012). Genipin inhibits mitochondrial uncoupling protein 2 expression and ameliorates
podocyte injury in diabetic mice. PLoS One, 7(7):e41391.
Quinlan, C. L., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Treberg, J. R., Ackrell, B. A. i Brand,
M. D. (2012). Mitochondrial complex II can generate reactive oxygen species at high rates in
both the forward and reverse reactions. J Biol Chem, 287(32):27255–27264.
Rabl, R., Soubannier, V., Scholz, R., Vogel, F., Mendl, N., Vasiljev-Neumeyer, A.,
Korner, C., Jagasia, R., Keil, T., Baumeister, W., Cyrklaff, M., Neupert, W. i
Reichert, A. S. (2009). Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends
on antagonism between Fcj1 and Su e/g. J Cell Biol, 185(6):1047–1063.
Rial, E. i Gonzalez-Barroso,M.M. (2001). Physiological regulation of the transport activity
in the uncoupling proteins UCP1 and UCP2. Biochim Biophys Acta, 1504(1):70–81.
Rippe, C., Berger, K., Boiers, C., Ricquier, D. i Erlanson-Albertsson, C. (2000).
Effect of high-fat diet, surrounding temperature, and enterostatin on uncoupling protein gene
expression. Am J Physiol Endocrinol Metab, 279(2):E293–300.
Rodriguez, V.M., Portillo,M. P., Pico, C., Macarulla,M. T. i Palou, A. (2002). Olive oil
feeding up-regulates uncoupling protein genes in rat brown adipose tissue and skeletal muscle.
Am J Clin Nutr, 75(2):213–220.
131
Rojo, M., Legros, F., Chateau, D. i Lombes, A. (2002). Membrane topology
and mitochondrial targeting of mitofusins, ubiquitous mammalian homologs of the
transmembrane GTPase Fzo. J Cell Sci, 115(Pt 8):1663–1674.
Rosca, M. G., Vazquez, E. J., Chen, Q., Kerner, J., Kern, T. S. i Hoppel, C. L. (2012).
Oxidation of fatty acids is the source of increased mitochondrial reactive oxygen species
production in kidney cortical tubules in early diabetes. Diabetes, 61(8):2074–2083.
Rothwell, N. J. i Stock, M. J. (1981). A role for insulin in the diet-induced thermogenesis of
cafeteria-fed rats. Metabolism, 30(7):673–678.
Rothwell,N. J., Stock,M. J. iWyllie,M.G. (1981). Sympatheticmechanisms indiet-induced
thermogenesis: modification by ciclazindol and anorectic drugs. Br J Pharmacol, 74(3):539–
546.
Rottenberg,H. i Scarpa,A. (1974). Calciumuptake andmembranepotential inmitochondria.
Biochemistry, 13(23):4811–4817.
Ryan, J. J., Marsboom, G., Fang, Y. H., Toth, P. T., Morrow, E., Luo, N., Piao, L., Hong, Z.,
Ericson, K., Zhang, H. J., Han, M., Haney, C. R., Chen, C. T., Sharp, W. W. i Archer,
S. L. (2013). PGC1alpha-mediated mitofusin-2 deficiency in female rats and humans with
pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med, 187(8):865–878.
Salabei, J. K. i Hill, B. G. (2013). Mitochondrial fission induced by platelet-derived growth
factor regulates vascular smooth muscle cell bioenergetics and cell proliferation. Redox Biol,
1:542–551.
Samec, S., Seydoux, J. i Dulloo, A. G. (1998). Role of UCP homologues in skeletal muscles
and brown adipose tissue: mediators of thermogenesis or regulators of lipids as fuel substrate?
FASEB J, 12(9):715–724.
Sanchez-Cenizo, L., Formentini, L., Aldea, M., Ortega, A. D., Garcia-Huerta, P.,
Sanchez-Arago, M. i Cuezva, J. M. (2010). Up-regulation of the ATPase inhibitory factor
1 (IF1) of themitochondrial H+-ATP synthase in human tumorsmediates themetabolic shift
of cancer cells to aWarburg phenotype. J Biol Chem, 285(33):25308–25313.
Santel, A., Frank, S., Gaume, B., Herrler, M., Youle, R. J. i Fuller, M. T. (2003).
Mitofusin-1 protein is a generally expressed mediator of mitochondrial fusion in mammalian
cells. J Cell Sci, 116(Pt 13):2763–2774.
132
Saraste, M. (1999). Oxidative phosphorylation at the fin de siecle. Science, 283(5407):1488–
1493.
Schagger, H., Brandt, U., Gencic, S. i von Jagow, G. (1995). Ubiquinol-cytochrome-c
reductase from human and bovine mitochondria. Methods Enzymol, 260:82–96.
Schagger,H., Link, T. A., Engel,W.D. i von Jagow,G. (1986). Isolation of the eleven protein
subunits of the bc1 complex from beef heart. Methods Enzymol, 126:224–237.
Schagger, H. i Pfeiffer, K. (2000). Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and
mammalian mitochondria. EMBO J, 19(8):1777–1783.
Scheffler, I. E. (2008).Mitochondria. JohnWiley&Sons, Inc.,Hoboken,New Jersey, 2. izdanje.
Schon, E. A. i Area-Gomez, E. (2013). Mitochondria-associated ERmembranes in Alzheimer
disease. Mol Cell Neurosci, 55:26–36.
Schonfeld, P. iWojtczak, L. (2012). Brown adipose tissuemitochondria oxidizing fatty acids
generate high levels of reactive oxygen species irrespective of the uncoupling protein-1 activity
state. Biochim Biophys Acta, 1817(3):410–418.
Schrager, S. (2005). Dietary calcium intake andobesity. JAmBoardFamPract, 18(3):205–210.
Schrauwen, P. i Hesselink, M. K. (2004). The role of uncoupling protein 3 in fatty acid
metabolism: protection against lipotoxicity? Proc Nutr Soc, 63(2):287–292.
Schrauwen, P., Hoeks, J., Schaart, G., Kornips, E., Binas, B., Van De Vusse, G. J., Van
Bilsen,M., Luiken, J. J., Coort, S. L., Glatz, J. F., Saris,W.H. i Hesselink,M. K. (2003).
Uncoupling protein 3 as a mitochondrial fatty acid anion exporter. FASEB J, 17(15):2272–
2274.
Schrauwen, P., Troost, F. J., Xia, J., Ravussin, E. i Saris, W. H. (1999). Skeletal muscle
UCP2 and UCP3 expression in trained and untrained male subjects. Int J Obes Relat Metab
Disord, 23(9):966–972.
Schwerzmann, K. i Pedersen, P. L. (1986). Regulation of the mitochondrial ATP
synthase/ATPase complex. Arch Biochem Biophys, 250(1):1–18.
133
Scorrano, L., Ashiya, M., Buttle, K., Weiler, S., Oakes, S. A., Mannella, C. A. i
Korsmeyer, S. J. (2002). A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes
cytochrome c during apoptosis. Dev Cell, 2(1):55–67.
Sears, D. A., Friedman, J. M. i White, D. R. (1975). Binding of intracellular protein to the
erythrocyte membrane during incubation: the production of heinz bodies. J Lab Clin Med,
86:722–732.
Shabalina, I. G., Jacobsson, A., Cannon, B. i Nedergaard, J. (2004). NativeUCP1 displays
simple competitive kinetics between the regulators purine nucleotides and fatty acids. J Biol
Chem, 279(37):38236–38248.
Shabalina, I. G., Ost,M., Petrovic,N., Vrbacky,M., Nedergaard, J. i Cannon, B. (2010).
Uncoupling protein-1 is not leaky. Biochim Biophys Acta, 1797(6-7):773–784.
Shackney, S. E. i Joel, C.D. (1966). Stimulation of glucosemetabolism in brown adipose tissue
by addition of insulin in vitro. J Biol Chem, 241(17):4004–4010.
Shih, M. F. i Taberner, P. V. (1995). Selective activation of brown adipocyte hormone-
sensitive lipase and cAMP production in themouse by beta 3-adrenoceptor agonists. Biochem
Pharmacol, 50(5):601–608.
Shishido, S., Koga, H., Harada, M., Kumemura, H., Hanada, S., Taniguchi, E.,
Kumashiro, R., Ohira, H., Sato, Y., Namba, M., Ueno, T. i Sata, M. (2003). Hydrogen
peroxide overproduction in megamitochondria of troglitazone-treated human hepatocytes.
Hepatology, 37(1):136–147.
Silva, A. M. i Oliveira, P. J. (2012). Evaluation of respiration with clark type electrode in
isolated mitochondria and permeabilized animal cells. Methods Mol Biol, 810:7–24.
Silva, J. E. i Rabelo, R. (1997). Regulation of the uncoupling protein gene expression. Eur J
Endocrinol, 136(3):251–264.
Simoneau, J. A., Kelley, D. E., Neverova, M. i Warden, C. H. (1998). Overexpression of
muscle uncoupling protein 2 content in humanobesity associateswith reduced skeletalmuscle
lipid utilization. FASEB J, 12(15):1739–1745.
Sjostrand, F. S. (1953a). Electron microscopy of mitochondria and cytoplasmic double
membranes. Nature, 171(4340):30–32.
134
Sjostrand, F. S. (1953b). The ultrastructure of the outer segments of rods and cones of the eye
as revealed by the electron microscope. J Cell Physiol, 42(1):15–44.
Skulachev, V. P. (1990). Power transmission along biological membranes. J Membr Biol,
114(2):97–112.
Slot, J. W., Geuze, H. J., Gigengack, S., Lienhard, G. E. i James, D. E. (1991). Immuno-
localization of the insulin regulatable glucose transporter in brown adipose tissue of the rat. J
Cell Biol, 113(1):123–135.
Smith, R. A. i Ord, M. J. (1983). Mitochondrial form and function relationships in vivo: their
potential in toxicology and pathology. Int Rev Cytol, 83:63–134.
Song,Z., Chen,H., Fiket,M., Alexander,C. iChan,D.C. (2007). OPA1processing controls
mitochondrial fusion and is regulated by mRNA splicing, membrane potential, and Yme1L. J
Cell Biol, 178(5):749–755.
Souza, S. C., Christoffolete, M. A., Ribeiro, M. O., Miyoshi, H., Strissel, K. J.,
Stancheva, Z. S., Rogers, N. H., D’Eon, T. M., Perfield 2nd, J. W., Imachi, H., Obin,
M. S., Bianco, A. C. i Greenberg, A. S. (2007). Perilipin regulates the thermogenic actions
of norepinephrine in brown adipose tissue. J Lipid Res, 48(6):1273–1279.
Speijer, D. (2011). Oxygen radicals shaping evolution: why fatty acid catabolism leads
to peroxisomes while neurons do without it: FADH(2)/NADH flux ratios determining
mitochondrial radical formation were crucial for the eukaryotic invention of peroxisomes and
catabolic tissue differentiation. Bioessays, 33(2):88–94.
Stanford, K. I., Middelbeek, R. J., Townsend, K. L., An, D., Nygaard, E. B., Hitchcox,
K. M., Markan, K. R., Nakano, K., Hirshman, M. F., Tseng, Y. H. i Goodyear, L. J.
(2013). Brown adipose tissue regulates glucose homeostasis and insulin sensitivity. J Clin
Invest, 123(1):215–223.
Stock, D., Leslie, A. G. i Walker, J. E. (1999). Molecular architecture of the rotary motor in
ATP synthase. Science, 286(5445):1700–1705.
Storozhevykh, T. P., Senilova, Y. E., Persiyantseva, N. A., Pinelis, V. G. i Pomytkin, I. A.
(2007). Mitochondrial respiratory chain is involved in insulin-stimulated hydrogen peroxide
135
production andplays an integral role in insulin receptor autophosphorylation inneurons. BMC
Neurosci, 8:84.
Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R. i Kuhlbrandt, W. (2008). Dimer ribbons of
ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J, 27(7):1154–1160.
Stroh,A., Anderka,O., Pfeiffer,K., Yagi, T., Finel,M., Ludwig, B. i Schagger,H. (2004).
Assembly of respiratory complexes I, III, and IV into NADH oxidase supercomplex stabilizes
complex I in Paracoccus denitrificans. J Biol Chem, 279(6):5000–5007.
Stump, C. S., Short, K. R., Bigelow, M. L., Schimke, J. M. i Nair, K. S. (2003). Effect
of insulin on human skeletal muscle mitochondrial ATP production, protein synthesis, and
mRNA transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(13):7996–8001.
Sun,C.N., Dhalla,N. S. iOlson, R. E. (1969). Formation of giganticmitochondria in hypoxic
isolated perfused rat hearts. Experientia, 25(7):763–764.
Sun, F., Huo, X., Zhai, Y., Wang, A., Xu, J., Su, D., Bartlam, M. i Rao, Z. (2005). Crystal
structureofmitochondrial respiratorymembraneprotein complex II.Cell, 121(7):1043–1057.
Sun, M. G., Williams, J., Munoz-Pinedo, C., Perkins, G. A., Brown, J. M., Ellisman,
M. H., Green, D. R. i Frey, T. G. (2007). Correlated three-dimensional light and electron
microscopy reveals transformation of mitochondria during apoptosis. Nat Cell Biol, 9(9):
1057–1065.
Sun, X. i Zemel, M. B. (2004). Calcium and dairy products inhibit weight and fat regain during
ad libitum consumption following energy restriction in Ap2-agouti transgenic mice. J Nutr,
134(11):3054–3060.
Suzuki, T., Ueno, H., Mitome, N., Suzuki, J. i Yoshida, M. (2002). F(0) of ATP synthase is a
rotary proton channel. Obligatory coupling of proton translocation with rotation of c-subunit
ring. J Biol Chem, 277(15):13281–13285.
Szabadkai, G., Simoni, A. M., Chami, M., Wieckowski, M. R., Youle, R. J. i Rizzuto, R.
(2004). Drp-1-dependent division of themitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+
waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell, 16(1):59–68.
136
Taguchi,N., Ishihara,N., Jofuku, A., Oka, T. iMihara, K. (2007). Mitotic phosphorylation
of dynamin-related GTPase Drp1 participates in mitochondrial fission. J Biol Chem, 282(15):
11521–11529.
Tanaka, A., Cleland, M. M., Xu, S., Narendra, D. P., Suen, D. F., Karbowski, M. i Youle,
R. J. (2010). Proteasome and p97 mediate mitophagy and degradation of mitofusins induced
by Parkin. J Cell Biol, 191(7):1367–1380.
Teegarden, D. (2003). Calcium intake and reduction in weight or fat mass. J Nutr, 133(1):
249S–251S.
Teruel, T., Valverde, A. M., Benito, M. i Lorenzo, M. (1996). Insulin-like growth factor
I and insulin induce adipogenic-related gene expression in fetal brown adipocyte primary
cultures. Biochem J, 319 ( Pt 2):627–632.
Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh,
K., Nakashima, R., Yaono, R. i Yoshikawa, S. (1995). Structures of metal sites of oxidized
bovine heart cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science, 269(5227):1069–1074.
Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh,
K.,Nakashima,R., Yaono,R. i Yoshikawa, S. (1996).Thewhole structureof the13-subunit
oxidized cytochrome c oxidase at 2.8 A. Science, 272(5265):1136–1144.
Tuchiya, K. i Nagai, M. (1994). Increase in intracellular calcium in freshly-dispersed, single
brown adipocytes of the rat by adrenergic stimulation. Biomed Res, 15(5):347–355.
Turovskii, E. A., Konakov, M. V., Berezhnov, A. V., Zinchenko, V. P., Bronnikov, G. E.
i Dolgacheva, L. P. (2011). Change in Ca2+-responses of cultivated brown adipocytes at
adrenergic activation. Cell Tissue Biol, 5(5):511–519.
Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L.,
Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu,M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey,
B. E. i Shirihai, O. S. (2008). Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation
and elimination by autophagy. EMBO J, 27(2):433–446.
Valverde, A. M., Arribas, M., Mur, C., Navarro, P., Pons, S., Cassard-Doulcier, A. M.,
Kahn, C. R. i Benito, M. (2003). Insulin-induced up-regulated uncoupling protein-1
137
expression is mediated by insulin receptor substrate 1 through the phosphatidylinositol 3-
kinase/Akt signaling pathway in fetal brown adipocytes. J Biol Chem, 278(12):10221–10231.
Valverde, A. M., Lorenzo, M., Pons, S., White, M. F. i Benito, M. (1998a). Insulin
receptor substrate (IRS) proteins IRS-1 and IRS-2 differential signaling in the insulin/insulin-
like growth factor-I pathways in fetal brown adipocytes. Mol Endocrinol, 12(5):688–697.
Valverde, A. M., Navarro, P., Benito, M. i Lorenzo, M. (1998b). H-ras induces glucose
uptake in brown adipocytes in an insulin- and phosphatidylinositol 3-kinase-independent
manner. Exp Cell Res, 243(2):274–281.
Van Gaal, L. F., Mertens, I. L. i De Block, C. E. (2006). Mechanisms linking obesity with
cardiovascular disease. Nature, 444(7121):875–880.
Vasington, F. D. i Murphy, J. V. (1962). Ca ion uptake by rat kidney mitochondria and its
dependence on respiration and phosphorylation. J Biol Chem, 237:2670–2677.
Vettor,R., Fabris, R., Serra,R., Lombardi, A.M.,Tonello,C.,Granzotto,M.,Marzolo,
M. O., Carruba, M. O., Ricquier, D., Federspil, G. i Nisoli, E. (2002). Changes in
FAT/CD36, UCP2, UCP3 and GLUT4 gene expression during lipid infusion in rat skeletal
and heart muscle. Int J Obes Relat Metab Disord, 26(6):838–847.
Vidal-Puig, A., Solanes, G., Grujic, D., Flier, J. S. i Lowell, B. B. (1997). UCP3: an
uncoupling protein homologue expressed preferentially and abundantly in skeletalmuscle and
brown adipose tissue. Biochem Biophys Res Commun, 235(1):79–82.
Vidal-Puig, A. J., Grujic, D., Zhang, C. Y., Hagen, T., Boss, O., Ido, Y., Szczepanik, A.,
Wade, J., Mootha, V., Cortright, R., Muoio, D. M. i Lowell, B. B. (2000). Energy
metabolism in uncoupling protein 3 gene knockoutmice. J Biol Chem, 275(21):16258–16266.
Voet, D. i Voet, J. G. (2004). Biochemistry. JohnWiley & Sons, Inc., New York, 4. izdanje.
Vogel, F., Bornhovd, C., Neupert, W. i Reichert, A. S. (2006). Dynamic
subcompartmentalization of themitochondrial innermembrane. J Cell Biol, 175(2):237–247.
Wakabayashi, T., Adachi, K., Matsuhashi, T., Wozniak, M., Antosiewicz, J. i
Karbowsky, M. (1997). Suppression of the formation of megamitochondria by scavengers
for free radicals. Mol Aspects Med, 18 Suppl:S51–61.
138
Wakabayashi, T., Horiuchi, M., Sakaguchi, M., Misawa, K., Onda, H., Iijima, M. i
Allmann, D. W. (1984). Mechanism of hepatic megamitochondria formation by ammonia
derivatives. Correlation between structure of chemicals and their ability to induce the
formation of megamitochondria. Eur J Biochem, 143(2):455–465.
Walker, J. E. (2013). The ATP synthase: the understood, the uncertain and the unknown.
Biochem Soc Trans, 41(1):1–16.
Walter, L. i Hajnoczky, G. (2005). Mitochondria and endoplasmic reticulum: the lethal
interorganelle cross-talk. J Bioenerg Biomembr, 37(3):191–206.
Wang, H., Song, P., Du, L., Tian, W., Yue, W., Liu, M., Li, D., Wang, B., Zhu, Y., Cao,
C., Zhou, J. i Chen, Q. (2011). Parkin ubiquitinates Drp1 for proteasome-dependent
degradation: implication of dysregulated mitochondrial dynamics in Parkinson disease. J Biol
Chem, 286(13):11649–11658.
Wang, Y., Huang, L., Abdelrahim, M., Cai, Q., Truong, A., Bick, R., Poindexter,
B. i Sheikh-Hamad, D. (2009). Stanniocalcin-1 suppresses superoxide generation in
macrophages through induction of mitochondrial UCP2. J Leukoc Biol, 86(4):981–988.
Watson, R. T. i Pessin, J. E. (2001). Subcellular compartmentalization and trafficking of the
insulin-responsive glucose transporter, GLUT4. Exp Cell Res, 271(1):75–83.
Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G. i Walker, J. E. (2010).
Bioenergetic cost ofmaking an adenosine triphosphatemolecule in animalmitochondria. Proc
Natl Acad Sci U S A, 107(39):16823–16827.
Waugh, S. M. i Low, P. S. (1985). Hemichrome binding to band 3: nucleation of heinz bodies
on the erythrocyte membrane. Biochemistry, 24(1):34–39.
Weber, J. i Senior, A. E. (2000). ATP synthase: what we know about ATP hydrolysis and what
we do not know about ATP synthesis. Biochim Biophys Acta, 1458(2-3):300–309.
Wei, L., Hubbard, S. R., Hendrickson,W. A. i Ellis, L. (1995). Expression, characterization,
and crystallization of the catalytic core of the human insulin receptor protein-tyrosine kinase
domain. J Biol Chem, 270(14):8122–8130.
139
Weibel, E. R., Staubli, W., Gnagi, H. R. i Hess, F. A. (1969). Correlated morphometric and
biochemical studies on the liver cell. I.Morphometricmodel, stereologicmethods, andnormal
morphometric data for rat liver. J Cell Biol, 42(1):68–91.
Westermann, B. (2010). Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol
Cell Biol, 11(12):872–884.
Westermann, B. (2012). Bioenergetic role ofmitochondrial fusion and fission. BiochimBiophys
Acta, 1817(10):1833–1838.
White, M. F. (2003). Insulin signaling in health and disease. Science, 302(5651):1710–1711.
Wikstrom, J. D., Katzman, S. M., Mohamed, H., Twig, G., Graf, S. A., Heart, E., Molina,
A. J., Corkey, B. E., de Vargas, L. M., Danial, N. N., Collins, S. i Shirihai, O. S.
(2007). beta-Cell mitochondria exhibit membrane potential heterogeneity that can be altered
by stimulatory or toxic fuel levels. Diabetes, 56(10):2569–2578.
Wikstrom, J. D., Mahdaviani, K., Liesa, M., Sereda, S. B., Si, Y., Las, G., Twig, G.,
Petrovic, N., Zingaretti, C., Graham, A., Cinti, S., Corkey, B. E., Cannon, B.,
Nedergaard, J. i Shirihai, O. S. (2014). Hormone-inducedmitochondrial fission is utilized
bybrownadipocytes as an amplificationpathway for energy expenditure. EMBOJ, 33(5):418–
436.
Wilcke, M. i Nedergaard, J. (1989). Alpha 1- and beta-adrenergic regulation of intracellular
Ca2+ levels in brown adipocytes. Biochem Biophys Res Commun, 163(1):292–300.
Wilson-Fritch, L., Burkart, A., Bell, G., Mendelson, K., Leszyk, J., Nicoloro, S.,
Czech, M. i Corvera, S. (2003). Mitochondrial biogenesis and remodeling during
adipogenesis and in response to the insulin sensitizer rosiglitazone.Mol Cell Biol, 23(3):1085–
1094.
Winge, D. R. (2012). Sealing themitochondrial respirasome. Mol Cell Biol, 32(14):2647–2652.
Winkler, E. i Klingenberg, M. (1994). Effect of fatty acids on H+ transport activity of the
reconstituted uncoupling protein. J Biol Chem, 269(4):2508–2515.
Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M. i Schagger, H. (2006). Supercomplexes and
subcomplexes of mitochondrial oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta, 1757(9-
10):1066–1072.
140
Woyda-Ploszczyca, A. M. i Jarmuszkiewicz, W. (2014). Different effects of guanine
nucleotides (GDP and GTP) on protein-mediated mitochondrial proton leak. PLoS One,
9(6):e98969.
Yamamori, T., Yasui, H., Yamazumi, M., Wada, Y., Nakamura, Y., Nakamura, H. i
Inanami, O. (2012). Ionizing radiation induces mitochondrial reactive oxygen species
production accompanied by upregulation of mitochondrial electron transport chain function
and mitochondrial content under control of the cell cycle checkpoint. Free Radic Biol Med,
53(2):260–270.
Yang, C. Y. i Frohman, M. A. (2012). Mitochondria: signaling with phosphatidic acid. Int J
Biochem Cell Biol, 44(8):1346–1350.
Yang, M., Yang, Y., Zhang, S. i Kahn, A. M. (2003). Insulin-stimulated hydrogen peroxide
increases guanylate cyclase activity in vascular smooth muscle. Hypertension, 42(4):569–573.
Yonashiro, R., Ishido, S., Kyo, S., Fukuda, T., Goto, E., Matsuki, Y., Ohmura-Hoshino,
M., Sada, K., Hotta, H., Yamamura, H., Inatome, R. i Yanagi, S. (2006). A novel
mitochondrial ubiquitin ligase plays a critical role in mitochondrial dynamics. EMBO J,
25(15):3618–3626.
Yoshida, M., Muneyuki, E. i Hisabori, T. (2001). ATP synthase–a marvellous rotary engine
of the cell. Nat Rev Mol Cell Biol, 2(9):669–677.
Yoshikawa, S. (1999). X-ray structure and reaction mechanism of bovine heart cytochrome c
oxidase. Biochem Soc Trans, 27(4):351–362.
Youle, R. J. i Narendra, D. P. (2011). Mechanisms ofmitophagy. Nat RevMol Cell Biol, 12(1):
9–14.
Youle, R. J. i van der Bliek, A. M. (2012). Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science,
337(6098):1062–1065.
Yu, T., Sheu, S. S., Robotham, J. L. i Yoon, Y. (2008). Mitochondrial fission mediates high
glucose-induced cell death through elevated production of reactive oxygen species. Cardiovasc
Res, 79(2):341–351.
141
Zampese, E., Fasolato, C., Pozzan, T. i Pizzo, P. (2011). Presenilin-2 modulation of
ER-mitochondria interactions: FADmutations, mechanisms and pathological consequences.
Commun Integr Biol, 4(3):357–360.
Zaragoza, R., Renau-Piqueras, J., Portoles, M., Hernandez-Yago, J., Jorda, A. i
Grisolia, S. (1987). Rats fed prolonged high protein diets show an increase in nitrogen
metabolism and liver megamitochondria. Arch Biochem Biophys, 258(2):426–435.
Zemel, M. B. (2002). Regulation of adiposity and obesity risk by dietary calcium: mechanisms
and implications. J Am Coll Nutr, 21(2):146S–151S.
Zemel, M. B., Shi, H., Greer, B., Dirienzo, D. i Zemel, P. C. (2000). Regulation of adiposity
by dietary calcium. FASEB J, 14(9):1132–1138.
Zemel,M. B., Thompson,W., Milstead, A., Morris, K. i Campbell, P. (2004). Calcium and
dairy acceleration of weight and fat loss during energy restriction in obese adults. Obes Res,
12(4):582–590.
Zhang, J. (2013). Autophagy andMitophagy in Cellular DamageControl. Redox Biol, 1(1):19–
23.
Zhang, J. i Ney, P. A. (2010). Reticulocyte mitophagy: monitoring mitochondrial clearance in
a mammalian model. Autophagy, 6(3):405–408.
Zhang,M.,Mileykovskaya, E. i Dowhan,W. (2005). Cardiolipin is essential for organization
of complexes III and IV into a supercomplex in intact yeast mitochondria. J Biol Chem,
280(33):29403–29408.
Zhao, J., Liu, T., Jin, S., Wang, X., Qu, M., Uhlen, P., Tomilin, N., Shupliakov, O.,
Lendahl, U. i Nister, M. (2011). Human MIEF1 recruits Drp1 to mitochondrial outer
membranes and promotes mitochondrial fusion rather than fission. EMBO J, 30(14):2762–
2778.
Zhu, P. P., Patterson, A., Stadler, J., Seeburg, D. P., Sheng, M. i Blackstone, C. (2004).
Intra- and intermolecular domain interactions of the C-terminal GTPase effector domain of
the multimeric dynamin-like GTPase Drp1. J Biol Chem, 279(34):35967–35974.
Zick, M., Rabl, R. i Reichert, A. S. (2009). Cristae formation-linking ultrastructure and
function of mitochondria. Biochim Biophys Acta, 1793(1):5–19.
142
Zorzano, A. (2009). Regulation ofmitofusin-2 expression in skeletal muscle. Appl Physiol Nutr
Metab, 34(3):433–439.
Zunino, R., Braschi, E., Xu, L. i McBride, H. M. (2009). Translocation of SenP5 from the
nucleoli to the mitochondria modulates DRP1-dependent fission during mitosis. J Biol Chem,
284(26):17783–17795.
143
Biografija autora
Igor Golić rođen je 19. marta 1981. godine u Bosanskoj Gradišci, Bosni i Hercegovini.
Diplomirao je na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, smjer Biologija, 2008. godine
pod mentorstvom prof. dr Aleksandre Korać, sa prosječnom ocjenom u toku studija 9.59.
Sljedeće godine upisuje doktorske studije biologije na modulu Biologija ćelija i tkiva.
Od 2010. godine zaposlen je na Katedri za biologiju ćelija i tkiva, prvo kao istraživač
pripravnik na projektu 143059 Ministarstva nauke Republike Srbije, a već sljedeće godine kao
istraživač saradnik na projektima 173054 i 173055 Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog
razvoja Republike Srbije. Osim navedenih domaćih projekata, angažovan je na međunarodnim
projektima (COST akcije), i bilateralnoj saradnji između Republike Srbije i Republike
Francuske (Pavle Savić/Hubert Curien).
Član je Srpskog društva za mikroskopiju, Evropskog društva za mikroskopiju (European
Microscopy Society), Srpskog društva za mitohondrijalnu i slobodno-radikalsku fiziologiju, i
Društva za mitohondrijalnu fiziologiju (Mitochondrial Physiology Society).
Autor je deset radova u vrhunskim međunarodnim časopisima (M21), tri rada u
istaknutim međunarodnim časopisima (M22), šest radova u međunarodnim časopisima
(M23), jednog rada u međunarodnom časopisu na SCI listi bez impakt faktora (M23a), dva
saopštenja sa međunarodnog skupa štampano u cjelini (M33), dvadeset kongresnih saopštenja
sa skupova međunarodnih značaja štampanih u izvodu (M34), jednog saopštenja sa skupa
nacionalnog značaja štampan u cjelini (M63), i sedamnaest saopštenja sa skupova nacionalnih
značaja štampanih u izvodu (M64).
144
f lpunor 1.
V$aea o ayropcrBy
flornucaHn-a l4rop Ib. l-onrh
Spojynrca 6340212009
14sjaenyjeu
Aa je AorropcKa rqncepraqnja noA HacnoBoM
M one ryn cre ocxose crpvrrypFr or perur oaen n pa tua [a nroxoHap nj a il Hayxo aa Ho r
ranuiljyMoru n uHcvnrHoM v rr,tpxhlu aannouhrn[lta nauoaa
' pe3ynrar concrBeHor ncrpaxnBaqKor paAa,
' Aa npe4noxeHa 4ucepraqnja y qenilHn HtA y AenoBuMa nraje 6una
npeAnoxeHa 3a 4o6njaue 6rno roje .qhnfloMe npeMa cry4rajcrrarrl t
n porpa M u Ma rqpyrhx B l4coKouJ KoncKnx ycTa Ho Ba,
' Aa cy pe3ynTaTu KopeKTHo HaBe.qeHn il
' Aa HhcaM rpuro/na ayropcKa npaBa h Kopt4cn4o r4HTeneKTyanHy caojurHy
Apyrux nrqa.
llotnnc AoKropaHAa
V Eeorpagy, 10.08.201 5.
flpunor 2.
Vsjaea o ncroBerHocrr4 uJTaMnaHe h eneKTpoHcKe
Bep3hje AoKropcKor paAa
Vlve n npesuMe ayropa l4rop Jb. l-onrah
Epojynuca 8340212009
Cry4njcrn nporpaM Eilonorilja hennja il rrhea
Hacnoa paAa Moneryncre ocHoae crpyrrypHor per\aoaennpaFba MlhroxoHnpnja
nHavroeaFror xanuriyr\4orvr 14 il cynnHoMr y fi,rprm]u aar4nourthMa
nauoBa
Menropn flpo$. !p AnexcaHapa Kopah. oeaoeFtn npo$ecop
SilonouJrr darynrer. YHhaepsnrer y Seoroaay
llp BecHa OrauJeshh. eruJn FrayqFth capaaFtltx
[4Hcrilryt ga 6nonouJra nctpaxnsaba "CnHruJa CtaFtroailh"
YHheeoshrer v Beoroaav
flornncanr k1roo Jb. l-onvrh
nsjaaruyjeu 4a je urananana eporja Mor AoKTopcKor paAa ncroBerHa enerrponcroj
aepsrju Kojy caM npe4ao/na 3a o6jaaruraaue Ha noprany 
.[ururanuor
peno3yrropnjyua Ynu aepenrera y Eeorpagy.
fioseoruaaaM Aa ce o6jaae uojr nuuxn noAar]n Be3aH[ sa 4o6rrrjarue aKaAeMcKor
3Baba,qoKTopa HayKa, Kao uro cy ilMe n npe3uMe, ro,qilHa il Mecro pol;erua il AaryM
o.q6pane pa4a.
Oen nnqHn no4aqu Mory ce o6jaewu Ha MpexHnM crpaHhqaMa Anrnranle
6n6nnorexe, y eneKTpoHcKoM Karanory v y nyOnraraqnjaua Ynnaepsrrera y
6eorpagy.
llornnc 
.qoKTopaHAa
V Seorpagy, 10.08.201 5.
Ilpnnor 3.
l'lsjaea o Kopt4rxheruy
Oananrhyjeu YnnaepsnrercKy 6u6nnorery ,,Caeto3ap Maproenh" Aa y ffnrntantu
penmnroprajyrvr YHraaep3hrera y EeorpaAy Hece rvrojy goxropcKy Ahcepraqujy noA
HacnoBoMl
Monervncre ocHoae ctpvrrypFror peuoaenn paFba [r rroxoFrapilja h HayxoeaHor
ranuilivtvtotu h rHcvnrHo[,t v tupxnM a.annouhrhMa nauoaa
KOJa Je MOJe ayTOpCKO AenO,
,Qracepraqnjy ca cBuM npilno3hMa npegao/na caM y eneKrpoHcKoM $optrrary
noroAHoM oa rpajno apxilBnpabe.
Mojy AoKropcKy Ancepraqhjy  noxpaFbeHy y Aurnranai l  peno3nropujy l
Ynraepsnrera y Eeorpagy Mory Aa Kopr4cre cara xojn nouryjy onqpeA6e caApxaHe y
oga6paxonn rhny nnqenrle Kpearnene saje4unqe (Creative Commons) sa xojy caut
ce ognyuno/na.
1. Ayropcrao
2. AyropcrBo - HeKoMepqujanno
@nyropcrBo - HeKoMepqr,rjanxo - 6es npepaAe
4. AyropcrBo - HeKoMepqrjanno - Aen rn no4 ncrilM ycnoBilMa
5. Ayropcrao - 6es npepaAe
6. AyropcrBo - Aenurn noA hcn4M ycnoBilMa
(Monruo 
.qa 3aoKpyxnre caMo je4ny oA uJecr nouyfieHnx nnLleHllt4, KparaK ontac
nnqeHll4 ,qar je na noneflrnr nncra).
flornuc AoKTopaHAa
V Eeorpa4y, 1 0.08.201 5.