Мојим родитељима: оцу Бедру Прељевићу, проф. биологије у пензији (1933- ) у спомен на моју мајку Бранку Прељевић, наст. разредне наставе у пензији (1935-2009) мојим првим васпитачима и учитељима писмености Мојој породици: супрузи Шерифи, ћеркама Емини, Медини, Мерими, сину Денису и унуцима за пружену љубав и подршку да не посустанем. ЗАХВАљУЈЕМ: проф. др Небојши Митићу, свом ментору на помоћи у току израде овог рада, доц. др Милици Мијовић, на несебичној подршци током мог стручног усавршавања, проф. Др Милану Кнежевићу, на пријатељској наклоности и подршци да завршим овај рад, колегама и пријатељима који су ме разумели (др Фехим Јуковић, спец. судске медицине) Медицински факултет, Универзитет у Приштини, са привременим седиштем у Косовској Митровици Ибрахим Прељевић Квантитативна морфометријска и имунохистохемијска истраживања неоваскуларизације карцинома простате Докторска дисертација Косовска Митровица, 2014. године С А Д Р Ж А Ј......................................................................................................................... 2 1.УВОД.......................................................................................................................................... 4 1.1.АНАТОМИЈА И ХИСТОЛОГИЈА ПРОСТАТЕ............................................................. 4 1.2.ПРЕКУРСОРИ КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ................................................................... 5 1.2.1. Имунохистохемијска бојења у дијагнози PINа и карцинома простате............. 7 1.2.2. Атрофија као прекурсор рака простате.................................................................. 8 1.3.СПЕКТАР МОРФОЛОШКИХ НЕ - НЕОПЛАСТИНИХ ПРОМЕНА ПРОСТАТЕ КОЈЕ ДИФЕРЕНЦИОНАЛНО ДИЈАГНОСТИЧКИ ДОЛАЗЕ У ОБЗИР КОД КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ.................................................................................................... 9 1.3.1.Парцијална атрофија.................................................................................................. 11 1.3.2.Атипична аденоматозна хиперплазија (AAH, adenosis)....................................... 11 1.3.3.Склерозирајућа аденоза............................................................................................. 12 1.3.4.Атипична склерозирајућа аденоза............................................................................ 12 1.3.5.Пострадиционална атипија код бенигних жлезданих структура........................... 12 1.3.6.Хиперплазија мукозалних жлезда у верумонтануму.............................................. 13 1.3.7.Хиперплазија мезонефротичких остатака................................................................ 13 1.3.8.Нефрогени аденома.................................................................................................... 13 1.3.9.Муцинозна метаплазија............................................................................................. 13 1.3.10.COWPER (булбоуретралне) жлезде....................................................................... 13 1.4.ОГРАНИЧЕЊА У ДИЈАГНОЗИ АДЕНОКАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ........................ 14 1.4.1.Дијагностичке карактеристике аденокарцинома.................................................... 15 1.5.Gleason-ОВ СКОР......................................................................................................... 16 1.6.ХИСТОЛОШКЕ ВАРИЈАНТЕ КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ......................................... 19 1.6.1.Хистолошке варијанте ацинарног карцинома.................................................. 21 1.6.1.1.Атрофични аденокарцином............................................................................. 21 1.6.1.2.Псеудохиперпластични аденокарцином........................................................ 21 1.6.1.3.Аденокарцином пенастих жлезда (foamy gland)........................................... 21 1.6.1.4.Муцинозни (колоидни) аденокарцином........................................................ 22 1.6.1.5.„Signet ring“ аденокарцином........................................................................... 22 1.6.1.6. Онкоцитни аденокарцином............................................................................ 23 1.6.1.7. Limphoepithelioma – like аденокацином........................................................ 23 1.6.2.Хистолошке варијанте не-ацинарног карцинома простате............................. 23 1.6.2.1.Саркоматоидни карцином (карциносарком)................................................. 23 1.6.2.2.Дуктални аденокарцином............................................................................... 24 1.6.2.3.Сквамозни и аденосквамозни карцином........................................................ 25 1.6.2.4.Уротелијални карцином.................................................................................. 26 1.6.2.5.Ситноћелијски карцином простате................................................................ 26 1.6.2.6.Карцином базалних ћелија.............................................................................. 27 1.6.2.7.Светлоћелијски аденокарцином..................................................................... 27 1.6.3.Варијанте простатичног карцинома које су описане после WHО класификације 2004 године............................................................................................... 28 1.6.3.1.Микроцистични аденокарцином.................................................................... 28 1.6.3.2.Аденокарцином налик PIN-u......................................................................... 28 1.6.3.4.Крупноћелијски неуроендокрини карцином................................................ 28 1.6.3.5.Џиновскоћелијски аденокарцином................................................................ 28 1.7.СТАДИРАЊЕ КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ (СКП)......................................................... 29 1.7.1.Критеријуми за екстрапростатично ширење (PТ3a)............................................... 31 1.7.2.Стадијум T4 карцинома простате.............................................................................. 33 1.7.3.Стадијум pТ0 карцинома простате........................................................................... 33 1.7.4.Нодална класификација (N стадијум)...................................................................... 33 1.8.НЕОАНГИОГЕНЕЗА – ВАСКУЛАРНИ ЕНДОТЕЛНИ ФАКТОР РАСТА (VEGF)... 35 1.9.ДИЈАГНОСТИЧКИ И ПРОГНОСТИЧКИ МОЛЕКУЛАРНИ БИОМАРКЕРИ КОД КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ.................................................................................................... 37 1.9.1.Дијагностички маркери.............................................................................................. 37 1.9.2.Имунохистохемија као средство за дијагностику примарних карцинома........... 37 1.9.3.Позитивни маркери код примарних карцинома...................................................... 38 1.9.4.Имунохистохемија као средство дијагностиковања третираних карцинома....... 39 1.9.5.Имуноистохемија као средство доказивања простатичног порекла..................... 40 1.9.6.Прогностички маркери.............................................................................................. 41 2.ЦИЉ РАДА................................................................................................................................ 42 3.МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ........................................................................................................ 43 3.1.ИСПИТИВАНА ПОПУЛАЦИЈА..................................................................................... 43 3.2.ОПШТИ ПРОТОКОЛ ИСТРАЖИВАЊА....................................................................... 43 3.3.МЕТОДЕ............................................................................................................................. 44 3.4.СТАНДАРДНА ПАТОХИСТОЛОШКА ОБРАДА И АНАЛИЗА................................ 44 3.5.ИМУНОХИСТОХЕМИЈСКИ МЕТОД ........................................................................... 45 3.6.МЕТОДОЛОГИЈА ИМУНОХИСТОХЕМИЈСКОГ БОЈЕЊА...................................... 46 3.6.1.Контрола квалитета и специфичности имунохистохемијског бојења.................. 47 3.6.2.Очитавање резултата ткивне експресије.................................................................. 47 3.7.СТАТИСТИЧКА ОБРАДА ПОДАТАКА........................................................................ 49 4.РЕЗУЛТАТИ............................................................................................................................... 50 5.ПРИЛОГ РЕЗУЛТАТИМА – ХИСТОЛОШКЕ СЛИКЕ........................................................ 76 6.ДИСКУСИЈА.............................................................................................................................. 92 7.ЗАКЉУЧЦИ................................................................................................................................ 101 8.ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................................ 102 71. УВОД 1.1. АНАТОМИЈА И ХИСТОЛОГИЈА ПРОСТАТЕ Простата (кестењача) је непарна и највећа помоћна жлезда мушког гениталног система која је смештена у малој карлици око почетног дела уретре. Својом базом подупире дно мокраћне бешике, док надоле окренутим врхом допире до горње површине урогениталне мембране. Мокраћна цев и бризници – ductuli ejaculatorii деле жлездано ткиво на предњи, средњи и два бочна режња. Паренхим простате представља конгломерат тубулоалвеоларних жлезда различите величине и положаја чији се секрети уливају у простатични део уретре.1 Простатичне жлезде се деле на мукозне, субмукозне и главне, распоређене у три неправилне концентричне зоне. Мукозне жлезде су уврати уретралног епитела, најмање су по величини и налазе се у централној зони. Субмукозне жлезде су нешто веће и присутне су у прелазној зони. Главне жлезде простате су највеће и најбројније, локализоване у периферној зони, одвојене од субмукозних дебелим слојем строме. Изглед и активност жлезданог епитела зависи од концентрације тестостерона. Епител ацинуса и дуктуса жлездане компоненте је сачињен од унутрашњих, луминалних, високих цилиндричних, секреторних ћелија и спољашњих, ниских базалних ћелија.2 Цилиндричне, секреторне ћелије имају светлу, пенушаву цитоплазму и базално постављено еухроматично једро, неупадљивог једарца. Базалне ћелије су троугластог облика, укљештене између база цилиндричних ћелија. Уз поменуте ћелије у епителу могу бити присутне и ретке ендокрине ћелије чији хормони локално делују на глатку мускулатуру изводних канала. Дуктусни делови жлезда идући према уретри добијају форму прелазног епитела. Жлездани епител континуирано производи секрет који се накупља у лумену и који чини 30% волумена сперме, а садржи липиде, ензиме, фибринолизин, цинк, лимунску киселину као и ензиме простатe – простатични специфични антиген (PSA) и простатичну киселу фосфатазу (PAP).3 Заостали секрет се понекад кондензује око десквамованих епителних ћелија у лумену жлезданих структура формирајући простатичне каменце – симпексионе – амилачна тела. Секреторна активност жлезданог епитела је под директним утицајем 8хормона (углавном тестостерона), док активност глатких мишићних ћелија строме контролишу нервна влакна симпатикуса. 91.2. ПРЕКУРСОРИ КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ Простатична интраепителна неоплазија тешког степена (HGPIN) – раније PIN2 и 3 на скали градирања од 1 до 3 представља премалигну лезију ондосно прекурсор карцинома простате.4 Инциденца изолованих PINа у биопсијама простате је просечно 9% (између 4-16%) што представља 115.000 ново дијагностикованих случајева сваке године у САД (на 1.300.000 биопсија 217.730 су карциноми простате).5 Распон инциденце PINа у игленим биопсијама креће се од 4,4 до 25% према подацима уролога из различитих светских центара.6 Учесталост и обим PINа повећава се са годинама пацијента, са првим дијагностикованим случајевима у другој деценији (9%) у трећој деценији (22%) према респективним студијама преваленције и временским студијама са развојем карцинома од 5 до 10 година.7 Раса и географски положај такође учествују на развој PINа.8 Афроамериканци имају већу преваленцу PINа у старосној групи између 50 и 60 године од белаца. Јапанци и други азијати имају значајно нижу инциденцу PINа као и стопу клинички откривених карцинома простате у односу на мушку популацију у САД-а.9 Учесталост HGPINа код оболелих од карцинома простате је значајно повећана (73%) у Слика 1.1. Нормална простата, low grade PIN, high grade PIN, mikroinvazija 10 односу на здраву мушку популацију (32%). Узрочна повезаност PINа са аденокарциномом простате према предклиничким студијама, студијама преваленције и временским студијама, PIN претходи развоју аденокарцинома мање од једне декаде.7 PIN је ћелијска пролиферација у постојећим ацинусима и дуктусима секреторног епитела са цитолошким и архитектонским променама уз очувану хистоархитектуру.10 Четири главна хистолошка облика HGPIN-а су ресичаст (tufting), микропапиларни, крибриформни, заравњени (flat)11 Други ређи облици су: signet ring cell, small cell (неуроендокрини), микровакуоларни (foamy gland)12,инвертовани (hobnail)13 и PIN са сквамозном диференцијацијом14. Различити архитектонски облици немају доказани клинички значај већ само дијагностичку употребљивост.4 HGPIN као и карцином простате је мултицентрична лезија периферне зоне (у више од 70%), ређе прелазне, а врло ретко централне зоне простате7,11 11 Low grade PIN – LGPIN (раније градус 1) има ограничену клиничку употребу, ретко се дијагностикује и укључује редовно праћење. Хистолошке сличности PINа Диференцијалне карактеристике  Инфламаторне реактивне промене Еозинофилне промене, метапластичне и запаљенски инфилтрат  Уротелна метаплазија Нема проминентних нуклеолуса  Семене везикуле и дуктус ејакулаторијус Бизарне ћелије са липофусцинским елементом, нуклеарна хиперхромазија и полиморфизам ; вредности РSA и РАР  Крибриформна хипеpплазија Униформне ћелије светле цитоплазме уобичајених величина једра и једарцета што даје решеткаст изглед најчешће присутан у преланој зони  Постатрофична хиперплазија Нема проминентних нуклеолуса  Атипична хиперплазија базалних ћелија Мала солидна гнезда пролиферисаних базалних ћелија између нормалних секреторних ћелија и базалне мембране паралелно са базалном мембраном, увећаних једара са присутним жлебовима и мехурастим изгледом истих; често удружена са инфламацијом; цитокератин 34βЕ12 позитиван.  Неинванзивни дуктални карцином Крибриформни и папиларни раст у увећаним и проширеним дуктусима 11  Gleason хистолошки облик 3 – варијанта са крупним жлездама Инфилтративан раст, цитолошке карактеристике малигнитета (хиперхромазија, нуклеомегалија, анизонуклеоза) губитак слоја базалне ћелије  Хистолошки изглед нормалне централне зоне Компактна глатко-мишићна зона LGPIN HGPIN Архитектурни изглед Епителне ћелије згомилане и стратификоване са ирегуларним распоредом Слично као LGPIN са присутна четири хистолошка облика Цитолошке карактеристике: једра Увећана са варијацијама у величини Увећана са варијацијама у величини и облику Хроматин Нормалан Повећане густине, згуснут и згомилан Нуклеолуси Ретко проминентни (10%) Проминентни Слој базалних ћелија(53) Интактан Могућ прекид континуитета Базална мембрана Интактна Интактна 1.2.1. Имунохистохемијска бојења у дијагнози PINа и карцинома простате За доказивање базалних ћелија у ацинусима и дуктусима простате користе се за цитоплазматску експресију HMWCK и за једарну експресију p63. HMWCK је моноклонално антитело за кератине високе молекуларне тежине у базалним ћелијама који се не налазе у секреторним и стромалним ћелијама. Повећање градуса PINа повезано је са дисконтинуираношћу експресије у 56% HGPIN-а као и у ацинусима у околини карцинома. Користи се и за разликовање крибриформног облика PIN-а од крибриформне форме аденокарцинома. Поред PINа прекид континуитета или губитак базалних ћелија јавља се Tабела 1.2. Дијагностички критеријуми за PIN Tабела 1.1. Диференцијална дијагноза PIN-a 12 још код атипичне аденоматозне хиперплазије (AAH), постатрофичне хиперплазије (PAH), инфламације што се може погрешно протумачити ако се ослања само на имунохистохемијски профил сумњивог фокуса. Хиперплазија базалних ћелија је присутна у PIN-у и у карциному и употреба анти- кератина препоручује се у случајевима двосмислених лезија као дифереционално разматрање када позитивност није сасвим сигурна.15 Други маркери базалних ћелија укључују маркере пролиферације, диференцијације и генетичке маркере који нису присутни у секреторним ћелијама што сугерише њихову улогу у регулацији раста, а насупрот томе секреторне ћелије експримирају PSA и PAP. Racemase (alpha – methylacyl - CoA) је цитоплазматски маркер диференцијације бенигних од малигних ацинуса. Није строго специфичан маркер за карцином простате јер је присутан у 90% HGPINа те експресију истог треба тумачити са опрезом уз убедљиву хистолошку слику.16 Ген за AMACR је експримиран у ћелијама карцинома и врши конверзију разгранатих ланаца масних киселина у њихове стереоизомере. Оверекспресија AMACR предсказује повећану вероватноћу дијагностиковања карцинома у поновљеној биопсији.17 PIN је удружен са прогресивним променама фенотипа и генотипа између бенигног епитела и карцинома уз индикативно оштећење ћелијске диференцијације и контролних механизама са напредовањем фаза карциногенезе. Поред споменутих маркера индикатори ових промена су c-erbB-2, bcl-2 onkoprotein, чланови породице фактора раста и др. C-myc, транскрипциони фактор регулације ћелијске пролиферације, метаболизма протеина митохондријалне функције је високо експримиран у једрима ћелија PIN-а као и карцинома, а проценат позитивности корелира са Glesaon скором. Препоручени клинички одговори за дијагнозу PIN-а биопсијом, изоловани монофокуси PINа предпостављају поновну биопсију за једну годину. Екстензивна, мултифокални поља PIN-а удружена са ASAP-ом (атипичном ситноацинарном пролиферацијом) препоручују непосредну поновљену биопсију у периоду од 3 до 6 месеци уз мониторинг вредности PSA у серуму.10 Комбинација PINа и ASAP-а (присутна је у око 16% свих биопсија) са предиктивном вредношћу у око 33 – 60% за карцином простате.18,19,20 Многобројни фактори доводе до пада предиктвне вредности PIN-а пре свега стандардизована 13 проширена секстант биопсија са раним откривањем и већом стопом детекције карцинома у почетним биопсијама. Профилатичка радикална простатектомија, зрачна терапија и андрогена депривација су тренутни могући начини лечења ове лезије. Постоји значајан пад распрострањености и обима PIN-а након андрогене депривације, али и могућег рецидива након престанка ове терапије, тако да остаје питање дугорочне ефикасности (прогресија непотпуно искорењеног PIN-а).21 1.2.2. Атрофија као прекурсор рака простате Пролиферативне промене у епителу повезане су са карциногенезом у скоро свим епителним неоплазијама. Пролиферативне регенеративне промене у простати као пролиферативна инфламаторна атрофија (ПИА) је хипотетички још увек постављена као премалигна лезија. Хипотеза да ћелијска оштећења и регенерација као карактеристика ПИА изазване запаљењем, оксидативним стресом, хемијским путем, бактеријама, физичким факторима повећава ризик од мутација што предиспонира канцерогену иницијацију, промоцију и напредовању. До сада постоје неубедљиви докази да је ПИА прекурсор PIN-а, директни прекурсор карцинома који заобилази PIN или једноставно епифеномен.У досадашњим налазима RIA укључује различите хистопатолошке варијетете од обичне атрофије, постатрофичне хиперплазије (PAH).22 Међутим неке студије укључују само постатрофичну хиперплазију у спектру ПИА-е, тако да се сада сматра да атрофија може настати са или без инфламације и/или пролиферације. Елементи који подржавају удруженост атрофије и карцинома простате су: збијене и атипичне епителне ћелије, повећање једара и проминентни нуклеолуси,23 удруженост атрофије, PINа и карцинома, а 43% фокуса атрофије налази се у близини карцинома мање од 2 мм,24 повећана експресија биомаркера (SK5, GSTP1, p53, Ki67, цитоплазматска експресија Bcl-2) у поређењу са бенигним неатрофичним епителом. Докази против значајне удружености атрофије и карцинома простате су епифеномен (присутна атрофија у нормалним простатама одраслих),25 непостојање цитолошких абнормалности,26 непостојање топографске удружености атрофије и ПИАа, неповезаност атрофије са градусом и стадијумом тумора27 непостојање експресије биомаркера који су значајно повећани код ПИАа и карцинома (myc protein, spermine oxidase i TMPRSS2-ERG gen).28,29 14 1.3.СПЕКТАР МОРФОЛОШКИХ НЕ - НЕОПЛАСТИЧНИХ ПРОМЕНА ПРОСТАТЕ КОЈЕ ДИФЕРЕНЦИОНАЛНО ДИЈАГНОСТИЧКИ ДОЛАЗЕ У ОБЗИР КОД КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ Спектар морфолошких не-неопластичних промена простате које диференционално дијагносточки долазе у обзир код карцинома простате, може бити подељен на лезије које опонашају: карциноме простате Gleason градус ≤ 3 – lower grade и higher grade карциномe или на лезије порекла простате или не-простатичног епителног порекла. Не-неопластичне лезије простате које по својој архитектури имају ситногландуларни начин раста а могу имитирати карциноме простате нижег градуса и атрофични аденокарцином простате су: - Атрофија – парцијална атрофија, - Атипична аденоматозна хиперплазија (adenosis) - Склерозирајућа аденоза - Радијациона атипија код бенигних жлезда - Мукозална жлездана хиперплазија у верумонтануму - Хиперплазија базалних ћелија простате Лезије не-простатичног епителног порекла које имају ситножлездани начин раста а могу имитирати аденокарциноме простате ниског градуса су: - Епител ductusa ejakulatoriusa и семених кесица - Хиперплазија мезонефричких остатака - Нефрогени аденом - Муцинозна метаплазија 15 - COWPER (булбоуретралне) жлезде - Жлезде колона Не-неопластичне лезије простате које имају крупноћелијски и крибриформни жлездани изглед а могу личити на крибриформни Gleason хистолошки облик 3, 4 и 5, дуктални аденокарцином или псеудохиперпластични. - Хиперплазија базалних ћелија - Светлоћелијска крибриформна хиперплазија - Хиперплазија крупних и интермедијалне величине жлезда - Реактивна епителна атипија Не-неопластичне лезије простате које могу имитирати аденокарцином простате Gleason хистолошког облик 4 и 5, foamy жлездани аденокарцином или промене код карцинома после терапије а имају солидни начин раста: - Неспецифични грануломатозни простатитис са густом инфламацијом - малакоплакија - signet ring – like промене у неепителним ћелијама - простатични xantom. Атрофија укључује једноставну атрофију, пост-атрофичну хиперплазију и парцијалну атрофију.30 Промене су често удружене.31 Једноставна атрофија виђа се као добро ограничено поље жлезда распоређених као у нормалном ткиву, уобичајене величине. У поређењу са пост-атрофичном хиперплазијом састоји се од ситних, збијених ацинуса лобуларне конфигурације око централних дилатираних дуктуса. Ћелије су оскудне цитоплазме, збијених једара које оцртавају контуре жлезда и дају им базофилни изглед. У строми су присутни периацинарни депозити колагена које не треба помешати са дезмопластичном реакцијом код инванзивних карцинома. Запаљење је често за разлику од карцинома.Амилачна тела чешће се виђају код атрофије, док кристалоиди и танак 16 плавичасти муцин су углавном присутни у малигним лезијама.Једноставна атрофија и постатрофична хиперплазија не представљају дијагностички проблем, дајући имунохистохемијски континуирано бојење за базалне ћелије (p63 и HMWCK - 34β Е12), док је AMACR негативан код атрофија а неуобичајено ретко се јавља код постатрофичне хиперплазије. 1.3.1. Парцијална атрофија Парцијална атрофија за разлику од обичне атрофије и постатрофичне хиперплазије има дифузни начин раста, одсуство базофилије, збијене жлезде,светле оскудне цитоплазме, са једрима која заузимају скоро целокупну висину ћелије, као код атрофије и постатрофичне хиперплазије. Карактеристике парцијалне атрофије које стварају тешкоће у разликовању од ацинарног аденокарцинома простате су:  инфилтративни раст,  збијене жлездане структуре,  висок нуклеоцитоплазматски однос,  заравњена луминална граница жлезда,  ретки проминентни нуклеолуси,  негативни маркер базалних ћелија у појединим жлезданим структурама  позитивност AMACR код појединих жлезда 1.3.2. Атипична аденоматозна хиперплазија (AAH, adenosis) Атипична аденоматозна хиперплазија (AAH) је лезија која се идентификује у 1,5 до 19,6% ТУРс и у 1% иглених биопсија.11 Представља мултифокалну лезију, нодуларну пролиферацију < од 5мм, јасно ограничену на периферији хиперпластичних нодулуса, коју чине густо збијени, згомилани, униформни, мали ацинуси. Ацинусе граде кубоидне и колумнарне ћелије назубљених граница, светле и слабо еозинофилне цитоплазме, 17 неупадљивих нуклеолуса.Амилачна тела могу бити присутна за разлику од кристалоида и плавичастог муцина који су врло ретки. Уколико је присутан дифузни раст за разлику од лобуларног „гурајућег“ раста онда говоримо о аденози. AAH представља премалигну лезију која се најчешће јавља у прелазној зони и која захтева клиничко праћење и контролу. Ова лезија је врло слична нискоградусним карциномима, Gleason хистолошког облика 1 и 2. За разлику од AAH карциноми имају инфилтративни раст, мале жлездане структуре између бенигних, амфофилну цитоплазму, местимично крупне нуклеолусе, одсутан слој базалних ћелија, са плавичастом муцинозном секрецијом. Слој базалних ћелија може бити дисконтинуиран чак и до 90% код AAH као и позитиван AMACR у 18%.32 1.3.3. Склерозирајућа аденоза Склерозирајућа аденоза (СА) је бенигна, ситно ацинарна пролиферација у густој вретенасто ћелијској строми коју чине сићушни микроацинуси, траке, гнезда, солидна поља и појединачне ћелије. Јавља се у 2% ТУР случајева, а ретко се виђа у игленим биопсијама и може створити тешкоћу за дифренцирање, рачуна се да се у 10% случајева ове лезије поставља дијагноза карцинома.33 СА има јасно дефинисан имунохистохемијски профил, а то је позитивност на p63, HMWCK (интактан базални слој), С100 протеин позитивност и СМА позитивност на глатко мишићни актин. 1.3.4. Атипична склерозирајућа аденоза Атипична склерозирајућа аденоза (АСА) је бенигна лезија која не захтева лечење и не спада у премалигне лезије, хистоморфолошки је слична СА само су присутна увећана једра са проминентним нуклеолусима што може да имитира карцином.34 1.3.5. Пострадиционална атипија код бенигних жлезданих структура Пострадијациона атипија код бенигних жлезданих структура представља степен хистолошке алтерације бенигних жлезда због брахитерапије и радиотерапије а у зависности од висине дозе, трајања зрачења и временског интервала између терапија.35 У овој лезији доминира стромална компонента, жлезде су редуковане, смањене, атрофичне, 18 не показују инфилтративни раст са присутном нуклеарном атипијом у гландуларном епителу. Слој базалних ћелија је интактан а АМАСРа је негативна. 19 1.3.6. Хиперплазија мукозалних жлезда у верумонтануму Хиперплазија мукозалних жлезда у верумонтануму је углавном случајни налаз у случајевима радикалне простатектомије, а такође се може видети у игленим биопсијама.36 Карактерише је добро ограничена пролиферација униформних, збијених, овалних жлезданих структура са често присутном еозинофилном секрецијом, континуираног базално ћелијског слоја. 1.3.7. Хиперплазија мезонефротичких остатака Хиперплазију мезонефричких остатака чине мале, гландуларне структуре обложене једноредним, кубоидалним ћелијама густе еозинофилне цитоплазме са присутном интралуминалном секрецијом.37 Недостатак PSA и PAP експресије може се користити за разликовање од карцинома.38 1.3.8. Нефрогени аденом Нефрогени аденом чине мале тубуларне структуре и цистично дилатирани тубулуси обложени једним редом кубоидалних ћелија, еозинофилне цитоплазме и често може имитирати карцином, али имунопозитивност на специфичне маркере PAX2 i PAX8 помаже у постављању праве дијагнозе.39 1.3.9. Муцинозна метаплазија Муцинозна метаплазија се понекад може погрешно интерпретирати као карцином. Лобуларни изглед и удруженост са атрофичним променама указује на бенигну природу ове лезије коју чине појединачне муцинозне ћелије вакуоларног изгледа. 1.3.10. COWPER (булбоуретралне) жлезде 20 COWPER (булбоуретралне) жлезде имају лобуларни изглед са централним дуктусом око кога су распоређене збијене овалне, муцинозне жлездане структуре, бледе цитоплазме, базално постављених једара које хистоморфолошки могу подсећати на пенасти (foamy) карцином.40 21 1.4. ОГРАНИЧЕЊА У ДИЈАГНОЗИ АДЕНОКАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ Уобичајени ацинарни аденокарцином простате је најчешћи у задњем режњу (75%), периферној зони субкапсуларно (70%), ређе у прелазној зони (24%) и најређе у централној зони (8%). Процењивање хистоархитектурних и цитолошких карактеристика атипичног фокуса треба посматрати у контексту укупног изгледа ткива. ФАВОРИЗУЈУЋЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ ЗА СА КАРАКТЕРИСТИКЕ КОЈЕ ИСКЉУЧУЈУ СА 1 Архитектурно инфилтративни раст Лобуларни изглед 2 Мале жлезде Велике жлезде 3 Густо спаковане умножене, згомилане Разгранате жлезде 4 Проминентни нуклеолуси (1 и 4) мада могу бити и одсутни у појединим туморима (foamy adenocarcinoma, код тумора третираних хормонском терапијом) Проминентни нуклеолуси само у околини HGPIN-а, СА, HBC-a 5 Увећана једра Нуклеарне промене само у околини СA 6 Хиперхромазија Нуклеарна атипија код инфламације – реактивне атипије 7 Митотске фигуре (1,5,6) само до 10% СА Gleason скор 6 аденокарцинома у игленим биопсијама имају митотске фигуре које се могу видети и код HGPIN у 12% и код жлезда у запаљења у 6% (1,5,6) - 8 Апоптотична телашца могу се видети у 34% тумора у игленим биопсијама(5) 13% HGPIN 9 Амфофилна цитоплазма Бледа светла и оскудна цитоплазма 10 Оштра луминална граница Таласаста луминална површина и папиларне пролиферације 11 Базофилни плавичасти, кисели муцин интралуминално (1) Corpora amylacea (10) 12 Аморфна PINк секреција - 13 Кристалоиди, густе еозинофилне структуре геометријских облика (1,7,9) Кристалоиди, могу се јавити и код аденозе али немају клинички значај (1,7,9) и код AAH. TАБЕЛА 1.3. Процењивање хистоцитолошких карактеристика атипичног фокуса fokfokusa 22 1.4.1. Дијагностичке карактеристике аденокарцинома 1. Перинеурална инвазија – могуће је и да се бенигни ацинуси налазе у перинеуралном простору.41 2. Гломерулације – не-транслуменска крибриформна пролиферација42 3. Ружичаст, бледо еозинофилни екстрацелуларни муцин 4. Имунохистохемијски код нормалне простате и код нодуларне хиперплазије присутна је униформна дистрибуција у цитоплазми PAP и PSA, а код карцинома простате ова дистрибуција је неравномерна. 5. Инванзивни аденокарцином простате не показује диференцијацију базалних ћелија тако да не постоји имунопозитивност на кератине високе молекуларне тежине у базалним ћелијама. 6.Ретко је присутна фокална базална експресија у карциномима43 7.α- Methylacyl – CoA racemase (AMACR) је позитиван цитоплазматски маркер код карцинома простате, у 80% малих фокуса аденокарцинома у игленим биопсијама, али није специфичан само за карциноме, може се наћи и код HGPIN, аденозе, парцијалне атрофије.44,45 Диференцијално дијагностичке разлике атрофичног карцинома и парцијалне атрофије као и пост-атрофијске хиперплазије су лобуларни или дифузни изглед, таласаста луминална ивица, базофилни изглед густо пакованих малих ацинуса, увећано једро које заузима целу висину ћелије које дају контуру жлездама, оскудна цитоплазма, псеудоинфилтративни раст – групе жлезданих ацинуса између великих жлезда и имунохистохемијска дисконтинуираност базалних ћелија. Три значајна критеријума за дијагнозу атрофичног карцинома су инфилтративни раст - индивидуалне жлезде између великих жлезда бенигних хистолошких карактеристика, присутни проминентни нуклеолуси и придружен неатрофични карцином.46 Аденоза је хистолошки ентитет који може довести до замке у патохистолошкој интерпретацији.У хистолошкој слици доминирају мале, згомилане жлезде, светле 23 цитоплазме бенигних цитолошких карактеристика интегрисане међу великим бенигним жлездама. Дисконтинуирано имунохистохемијско бојења базалних ћелија и неубедљива AMACR позитивност може се погрешно интерпретирати као карцином .„Cruch artefact“ механичке дисторзије изазване игленом биопсијом могу бити замка у постављању прецизне дијагнозе. „Атипична дијагноза“ подразумева блиску удруженост малих атипичних жлезда са знацима HGPIN-а и обележава се термином PINATYP.47 Присуство малих, умножених жлезда удаљених од поља HGPIN-а, уз потпун недостатак базалних ћелија (дисконтинуирана одсутност може бити и у оквиру PINа) сугерише постојење малигног процеса. Експресија AMACR није селективан маркер јер може да се јави и код HGPIN-а. Тангенционални пресек жлезда код PINа, такође може да симулира фокус карцинома. 1.5. GLEASON-ов СКОР Хистолошки градус тумора представља степен диференцијације малигног тумора. На основу распореда и изгледа малигних жлезда као и степена анаплазије туморских ћелија одређују се хистолошки критеријуми за процену хистолошког градуса који битно утиче на биолошко понашање и клиничку прогнозу болести. За одређивање хистолошког градуса тумора простате предлагани су различити хистолошки системи градирања. 1966 године Donald Gleason предложио је и развио систем градирања и скоринг систем за простатични аденокарцином. Ова класификација прерађена је 1974 године, стекла готово универзалну прихватљивост и сврстана у прву категорију прогностичких параметара удружења америчких патолога. Модификације ове класификације препоручене су од стране интернационалног друштва за уролошку патологију (International Society of Urological Pathology - ISUP) 2005 године. Према Gleason-овом систему градирања постоји пет хистолошких облика конвенционалног аденокарцинома простате који се означавају бројевима од 1 до 5. Морфолошки критеријуми за дијагнозу сваког од ових хистолошких облика су следећи: 1. Gleason хистолошки облик 1 – присутне су појединачне, униформне, мале, добро диферентоване, густо паковане и збијене жлезде, добро дефинисаних граница, 24 међусобно раздвојене стромом, бледе цитоплазме ћелија које облажу гландуларне структуре, униформних једара са мало митоза. 2. Gleason хистолошки облик 2 – присутна је мање ограничена групација жлезда које су мање уједначене по облику и величини, округлог и овалног облика више раздвојене стромом у односу на жлезде код хистолошког облика 1. 3. Gleason хистолошки облик 3 - у овом облику присутне су мале, средње и велике жлезде неправилног облика са папиларним и крибриформним структурама у појединим жлездама али и појединачним ћелијама које образују колоне и траке раздвојене међусобно стромом. Овај хистолошки облик је најчешћи и јавља се у 70% иглених биопсија. 4. Gleason хистолошки облик 4 – неправилне жлездане масе настале међусобним спајањем, са бројним луменима мале и средње величине, папиларним и крибриформним структурама, полигоналног ћелијског облика, бледе цитоплазме (подсећају на светлоћелијски карцином бубрега), са дифузном инфилтрацијом строме. 5. Gleason хистолошки облик 5 – присуство острва (са централном „comedo“ некрозом), трака, колона и појединачних малигних ћелија које дифузно инфилтришу строму. 25 Слика 5.1. Gleason-ovi oblici: 1-A, 2-B, 3-C,D,E, 4-F,G,H i 5-I,J,K fokfokusa 26 Gleason хистолошки облик 1 и 2 су ретки у игленим биопсијама, а хистолошки облици 1 и 5 се најређе налазе у биопсијском материјалу као и узорцима после простатектомије.У аденокарциному простате може да се истовремено налази више Gleason хистолошких облика, доминантан и највише заступљен хистолошки облик као примарни и други по заступљености као секундарни хистолошки облик. Према Gleason систему градирања одређени и бројем означени примарни и секундарни хистолошки облик се сабирају у Gleason скор. Gleason скор уобичајеног аденокарцинома простате може да буде од 2 до 10. Према Gleason систему за одређивање хистолошког градуса уобичајеног аденокарцинома простате, хистолошки градус је следећи:  Gleason score од 2 до 4-добро диферентован,  Gleason score од 5 до 7-средње диферентован и  Gleason score од 8 до10-слабо диферентован аденокарцином. Оцена је заснована на узорцима ткива добијеним игленом биопсијом, трансуреталном ресекцијом простате као и после простатектомије. Бројне студије потврдиле су прогностички значај Gleason градуса као једног од прогностичких фактора који корелира са биохемијским статусом, прогресијом болести, појавом удаљених метастаза, преживљавањем и појавом рецидива.48,49 Увођење рутинског PSA скрининга, „core” биопсија за дијагностику карцинома простате заједно са имунохистохемијском проценом за идентификацију базалних ћелија и развојем радикалне простактомије као рутинског хируршког лечења довео до већег разумевања природе тумора и прогностичког значаја Gleason градуса. Ово је за узврат довело до препоручених критеријума за прераду Gleason градуса и скор, што је и урађено марта 2005 године након консензус конференције ISUP-а.50 На овој конференцији је одлучено да се хистолошки облици 1 и 2 ретко користе у дијагностичке сврхе код иглених биопсија већ само у евалуацији студија као и да Gleason score 1+1=2 готово увек представља атипичну аденоматозну хипеплазију што се потврђује визуелизацијом базалних ћелија имунохистохемијским бојењем. Велика ирегуларна поља крибриформних жлезда већих димензија од бенигних жлезданих структура и мале жлезде слабо формираних лумена које се спајају у микроацинусе и hypernephroma – like структуре, класификују се као хистолошки облик 4 27 према модификованој Gleason класификацији (MGK).51,52 На конференцији су и дате препоруке у вези бодовања иглених биопсија и узорака добијених након радикалне простатектомије. Договорено је да код иглених биопсија секундарни хистолошки облик нижег градуса ако је мањи од 5% не треба обухватити скоровањем већ се тада дуплира примарни хистолошки облик, а само ако је вишег градуса и мањи од 5% прихвата се као секундарни. Уколико је присутан терцијални хистолошки облик вишег градуса усваја се као секундарни хистолошки облик. За разлику од финалног скора код узорака добијених радикалном простатектомијом где је препорука да се не тумаче као секундарни хистолошки облик да не би дошло до прекомерног оцењивања. На основу резултата новијих студија препоручено је укључивање терцијалног облика само ако је мањи од 5% целокупног тумора и већег хистолошког градуса од примарног и секундарног хистолошког облика,53 а ако је више од 5% третира се као секундарни хистолошки облик.54,55 Већина студија је показала да примена MGK повећава Gleason сцоре ≥ 7 са 32% на 46% код иглених биопсија и са 53% на 68% код узорака добијених радикалном простатектомијом,56 као и да постоји сагласност у скору између иглених биопсија и узорака добијених радикалном простатектомијом.57 Ниво PSA у серуму такође је у корелацији са MGK. Прогностички значај терцијалног стадијума потврђен је у резултатима многих студија и корелира са исходом обољења, екстрапростатичним ширењем нодалним метастазама, као и инфитрацијом семених кесица.58,59,60 MGK ISUP-a из 2005 године представља значајан напредак и огроман значај за патологе и урологе као и основу за имплементирање измена које своју валидност потврђују кроз многобројне студије везане за природу и исход тумора. 28 1.6. ХИСТОЛОШКЕ ВАРИЈАНТЕ КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ Највећи број карцинома простате су обични ацинарни аденокарциноми.61,62,63 Варијанте обичног ацинарног карцинома по класификацији WHO од 2004 године укључују: 62  атрофични,  псеудохиперпластични,  пенасти – foamy,  колоидни (муцинозни),  signet ring,  онкоцитни и  lymphoepithelioma – like карцином простате 29 Слика 6.1. а)класичан ацинарни, б)пенасти, ц)атрофични, д)муцинозни карцином простате fokfokusa 30 Не-ацинарни карциноми простате су заступљени у 5 до 10% примарних карцинома простате.61,63 и према WHO од 2004 године62 обухватају:  саркоматоидни карцином  дуктални аденокарцином  сквамозни и аденосквамозни карцином  уротелијални карцином  small cell carcinoma  basal cell carcinoma  clear cell adenocarcinoma Недавно описане варијанте карцинома простате које нису укључене у WHO класификацију из 2004 године су микроцистични аденокарцином, PIN лике аденокарцином,64,65 large-cell неуроендокрини карцином66 и плеоморфни џиновско- ћелијски аденокарцином.67 31 1.6.1. Хистолошке варијанте ацинарног карцинома 1.6.1.1. Атрофични аденокарцином Атрофични аденокарцином јавља се спорадично после зрачне и хормонске терапије, са учесталошћу од 2% у игленим биопсијама и 16% у случајевима после радикалне простатектомије.35 Ову хистолошку варијанту карактеришу инфилтративни архитектурни изглед, мали ацинуси фокално дилатирани, смањен волумен цитоплазме туморских ћелија, потпуна негативност на HMWCK и оверекспресија AMACR у 70% случајева.68 Имунохистохемијски профил треба опрезно тумачити и не доносити пренаглашене одлуке у игленим биопсијама. Атрофични аденокарцином одговара Gleason градус 3 карциному а прогноза овог типа је слична уобичајеном ацинарном аденокарциному одговарајућег градуса и патолошког стадијума. 1.6.1.2. Псеудохиперпластични аденокарцином Псеудохиперпластични аденокарцином заједно са атрофичном и пенастом гландуларном варијантом је у великом проценту присутан у игленим биопсијама.69 Микроскопски одликује се цистичном дилатацијом са интралуминалном папиларном и разгранатом морфологијом унутар периферне и прелазне зоне често у суседству уобичајеног ацинарног аденокарцинома.70 Инфилтративни раст, перинеурална инвазија, инталуминални кристалоиди и плавичасти танки муцински слој присутни су у мањем броју случајева. Ова хистолошка варијанта одговара Gleason хистолошком облику 3,62,63 а недовољно је описано колико је прогностични значајан утицај ове варијанте удружене са уобичајеним ацинарним аденокарциномом. У 70-83% ових тумора присутна је позитивност на AMACR.71 1.6.1.3. Аденокарцином пенастих жлезда (foamy gland) Пенасто (foamy) жлездани аденокарцином је варијанта ацинарног аденокарцинома који се карактерише обилном, пенастом цитоплазмом, пикнотичним једрима, уз слабодиферентоване жлездане структуре крибриформне слике, солидна поља, колоне, и појединачне туморске ћелије.72 У 13 до 23% анализираних случајева после радикалне 32 простатектомије удружен је са ацинарним аденокарциномом.Ретке су интрадукталне форме овог карцинома и „foamy gland“ HPIN.73 Имунохистохемијским бојењем са NMWCK и p63 потпуно је одсутан базални слој код инванзивних карцинома ове варијанте. AMACR експресија детектује се у 68%.71 Ова варијанта одговара Gleason скору 7, а патолошки стадијум је идентичан као и код уобичајеног ацинарног карцинома. Могућа је екстра простатична екстензија, а метастатски депозити имају хистолошку слику примарног тумора. 1.6.1.4. Муцинозни (колоидни) аденокарцином Муцинозни (колоидни) аденокарцином је врло ретка варијанта карцинома простате са инциденцом од 0.3% свих карцинома простате.74,75 Дефинише се као аденокарцином са више од 25% екстрацелуларног муцина не-простатичног порекла. Ако је проценат екстрацелуларног муцина мањи од 25% карактерише се као аденокарцином са фокалном муцинозном компонентом. То је мултинодуларан често цистичан тумор, лепљиве опалесцентне површине. Микроскопски присутне су малигне жлезде крибриформног изгледа, траке, колоне и „signet ring“ ћелије које плутају у језерцима екстрацелуларног муцина а често се могу наћи и колагени микронодули. Ова варијанта одговара Gleason скору 6 – 8.75 Питање порекла је врло важно и одређује га имунохистохемијски статус. Вредности PSA, PSAP, имунопозитивност на HMWCK потврђују простатично порекло, док експресија CK7 или CK20 може указати на примарни мукус продукујући аденокарцином уретре или мокраћне бешике или на примарни муцинозни аденокарцином колона. Ова варијанта се шири као и обични ацинарни аденокарцином у лимфне чворове и кости са иницирањем остеобластичног процеса. Раније претпоставке о већој агресивности од ацинарног карцинома простате су побијене на основу многих студија.74,75 1.6.1.5. „Signet ring“ аденокарцином „Signet ring“ аденокарцином је веома ретка варијанта карцинома простате, која подразумева присуство интрацитоплазматског муцина, а у одсуству муцина разликовати га треба од вакуоларне варијанте аденокарцинома.63,76 Овај облик одговара Gleasonovom 33 скору 5.56 Карактеристично је присуство „signet ring“ ћелија, цитоплазме испуњене светлим муцинозним вакуолама, периферно постављеног једра. Ова варијанта тумора има лош исход и одговор на радиотерапију и андрогену депривацију.76 34 1.6.1.6. Онкоцитни аденокарцином Онкоцитни аденокарцином укључује туморе онкоцитних цитоплазматских карактеристика које потичу од многобројних митохондрија, а не зна се тачно какве прогностичке импликације има оваква хистолошка слика. 1.6.1.7. Limphoepithelioma – like аденокацином Limphoepithelioma–like аденокарцином је врло редак, слабо диферентован аденокарцином који хистолошки подсећа на лимфоепителиом назофаринкса али није повезан са инфекцијом Epstein- Barr вирусом.77 Микроскопски, присутни су синцицијуми туморских ћелија, нејасних граница уз густ лимфоцитно-плазмоцитни инфилтрат. Ови карциноми су позитивни, за РСА, PSAP и AMACR у свим случајевима удруженим су са ацинарним аденокарциномом а проценат ове компоненте креће се од 10 до 90% у тумору. 1.6.2. Хистолошке варијанте не-ацинарног карцинома простате 1.6.2.1. Саркоматоидни карцином (карциносарком) Саркоматоидни карцином или карциносарком је редак малигни тумор бифазног карактера који садржи малигну епителну – карциномску и малигну мезенхималну компоненту. Карциносарком је термин за хомологи саркоматоидни карцином, при чему саркомску компоненту граде ткива хомолога за простату. Хетерологи тип укључује мезенхималне компоненте порекла кости и хрскавице мада могу да се користе и други термини као што је метапластични карцином или малигни мешовити мезодермални тумор. Тумор се презентује као сивкасто-беличаста маса са огњиштима хеморагије, некрозе, тенденцијом ширења у околне структуре као што су семене кесице и зид ректума. Микроскопски, карциномску компоненту у највећем броју случајева чини ацинарни аденокарцином а веома ретко дуктални аденокарцином, малигни тумор сквамозне или аденосквамозне диференцијације или уротелијални карцином.78,79,80 Аденокарциномска компонента је у већини случајева минимална са Gleason скором од 7 до 10. 35 Саркоматоидна компонента је израђена од плеоморфних и вретенастих ћелија које се организују у фасцикулусе, са наглашеним нуклеарним плеоморфизмом и бројним митотским фигурама. Најчешће је заступљена хетеролога варијанта овог тумора која укључује остеосаркомску и хондросаркомску компоненту а ретко поља фибросаркома, лејомиосаркома и ангиосаркома. Тумор је агресиван, инфилтрише околне органе и даје удаљене метастазе у плућа, мозак, јетру плеуру, бубреге. Обе компоненте се могу видети и у метатстатским депозитима. Тумори су униформно позитивни на виментин (саркомаска компонента) односно на CK, PSA, PAP (карциномска компонента). Хистолошки изглед није предиктор прогнозе и преживљавања. 1.6.2.2. Дуктални аденокарцином Дуктални аденокарцином (папиларни) или папиларно-дуктални аденокарцином, чешће удружен са ацинарним аденокарциномом, чини 3% свих карцинома простате.81 Микроскопски карактерише га псеудостратификован колумнарни епител са папиларним и крибриформним изгледом а ретка су и поља „comedo carcinoma“ као и појединачне жлездане структуре које могу подсећати на PIN – like аденокарцином. Митотске фигуре су присутне у већем броју него код ацинарног аденокарцинома. Недавно су описани случајеви овог типа тумора који садржи муцинозне пехарасте ћелије, пенасте жлезде, Paneth cell – like неуроендокрине ћелије.82 Коегзистирајућа ацинарна компонента је Gleason скора 6-7, а дуктална компонента се креће од 5 до 100%.83 Према неким студијама дуктални аденокарцином Gleason хистолошког облика 3 је више агресивнији него Gleason skor 7 ацинарног аденокарцинома када је дуктална компонента већа од 10% у тумору.83 Дуктални карцином је доминантно локализован у периферној зони и Gleason хистолошки облик овог тумора је од 3 до 5 и увек је виши него код ацинарне компоненте ако су удружени. Имунофенотип дукталног аденокарцинома је сличан као код ацинарног аденокарцинома, хетерогене дистрибуције и интензитета бојења за PSA, PAP, HMWCK (дисконтинуирано бојење), AMACR је слабијег интензитета у односу на ацинарни.84,85 Дуктални аденокарцином је обично већег волумена него ацинарни, инфилтрише перипростатично ткиво, даје регионалне метастазе, удаљене метастазе у плућа и кости. 36 Исход и одговор на радикалну простатектомију, хормонску терапију и радиотерапију код овог тумора је лошији него код чистог ацинарног аденокарцинома као што је увек виши хистолошки облик и патолошки стадијум. 37 1.6.2.3. Сквамозни и аденосквамозни карцином Сквамозни и аденосквамозни карцином су веома ретки са инциденцом мањом од 1% свих карцинома простате. Инциденца аденосквамозног карцинома је нижа него сквамозног карцинома, а могућа је и често удруженост са уротелијалним карциномима. То су велики тумори, чврсти, солидни, ружичасто беличасте боје на пресеку који захватају целокупно ткиво простате са ширењем и компресијом на простатични део уретре, бешику семене кесице, ректум, регионалне лимфне чворове и кости са последичном остелитичном више него остеобластичном реакцијом.86 Микроскопски, чине га гнезда и поља полигоналних ћелија, са нуклеарном атипијом која показују централну или индивидуалну кератинизацију у зависности од степена диференцијације. Gleason градус користи се за жлездану компоненту и увек је виши ако је у питању аденосквамозни карцином. Слика 6.2. а)дуктални, б)сквамозни, ц)базалоидни, д)уротелијални карцином простате fokfokusa 38 1.6.2.4. Уротелијални карцином Уротелијални карцином или карцином прелазног епитела је обично удружен са примарним тумором уретре или мокраћне бешике и резултат је ширења из ових органа или као мултифокална болест у току уротелијалне карциногенезе.87 Примарни уротелијални карцином простате без присуства истог тумора у бешици је веома редак, са инциденцом од 0,2%.61 Микроскопски показује упадљиву склоност за раст у оквиру каналића и ацинуса простате, паџетоидно ширење, без стромалне инвазије, интрадукталну шапиломатозу, комедо некрозе и дистрофијске калцификације. Цитолошки присутан је ћелијски и једарни полиморфизам, еозинофилна, „сквамоидног изгледа“ цитоплазма. Имунофенотипски профил је од помоћи у разликовању овог карцинома од слабодиферентованих аденокарцинома простате. PSA, PSAP су негативни а CK7, CK20 и HMWCK су позитивни. Прогноза инванзивних форми овог томура је лоша за разлику од „in situ“ која је добра.88 1.6.2.5. Ситноћелијски карцином простате Ситноћелијски карцином простате као примарни тумор простате је изузетно агресиван тумор који се открива као узнапредовала болест, са инциденцом од 0,3 до 1% свих карцинома простате.89 У више од половине случајева удружен је са ацинарним аденокарциномом што је најчешће инцијална дијагноза. Присутна је значајна разлика између клиничких карактеристика овог и ацинарног аденокарцинома. Ниво PSA није у корелацији са стадијумом болести хормонским одзивом, временом преживљавања, присутним висцералним метастазама.90 Најчешћи симптоми се односе на дисеминацију болести и опструкцију мокраћне бешике, а може се јавити и паранеопластични синдром који укључује Cushing синдром због ектопичне адренокортикалне секреције, хиперкалцемијски синдром, тиреотоксикозу, хиперглукагонемију, лимбички енцефалитис. Једна трећина ових тумора има повећан PSA због присуства аденокарциномске компоненте. Тумор се веома брзо шири и даје метастазе необичне локализације: оментум, гласне жице, темпорална кост, аксиларни лимфни нодуси, епидидимис,перикард,кости. Три четвртине пацијената са овим тумором већ у току дијагностиковања има висцералне метастазе. Хистолошки, чине га поља, траке, колоне, полигоналних, овалних или 39 вретенастих ћелија, палисадне конфигурације, са стварањем розетоликих структура и присутним географским некрозама. Ћелије су сиромашне цитоплазмом, хиперхроматичних једара. Удео аденокарциномске компоненте је различит и најчешће одговара Gleason овом облику 4. Имунохистохемијски профил са доказивањем епителне и неуроендокрине диференцијације показао се користан у дијагнози ових тумора. PSA, PSAP су позитивни у мешовитим туморима, TTF-1 и CD44 користе за разликовање од слабо диферентованих аденокарцинома.91,92 1.6.2.6. Карцином базалних ћелија Карцином базалних ћелија је прилично редак тумор. Настаје неопластичном пролиферацијом базалних ћелија. Користе се различити термини (adenoid cystic like, adenoid basal cell tumor) у опису ове неоплазме. Микроскопски тумор чине цистични и солидни аранжмани са палисадно периферно распоређеним туморским ћелијама или у облику тубула са хијалиним ободом као и велика солидна гнезда са или без некрозе. Инфилтративни раст, некроза, дезмопластична реакција, перинеурална и екстрапростатична инвазија помажу у диферецијалној дијагнози од хиперплазије базалних ћелија. Имунохистохемијски маркери bcl-2 i Ki67 такође могу имати вредност у дијагностичкој диференцијацији.93 Тумор има спор ток, касно даје рецидив и удаљене метастазе. Најпоузданији предиктори агресивног понашања је присуство великих солидних гнезда са некрозом, висок пролиферативни индекс и смањена имуно позитивност за базалне ћелије. 1.6.2.7. Светлоћелијски аденокарцином Светлоћелијски аденокарцином је најчешће описиван као ренални тип светлоћелијског карцинома бубрега,94 тубулоцистични светлоћелијски карцином простате95 и светлоћелијски аденокарцином који подсећа на Milerov уретрални аденокарцином порекла простатичног утрикулуса.96 40 1.6.3. Варијанте простатичног карцинома које су описане после WHO класификације 2004 године 1.6.3.1. Микроцистични аденокарцином Микроцистични аденокарцином карактерише се цистичном дилатацијом жлезда и до десет пута већом него код обичног ацинарног аденокарцинома са присутним кристалоидима и плавичастим муцином у лумену. Инциденца тумора је око 11%, Gleason градус је 3. Имунохистохемијски карактерише га одсуство базалних ћелија, а у скоро 96% случајева присутна је експресија AMACR. 1.6.3.2. Аденокарцином налик PIN-u Аденокарцином налик PIN-у је недавно описана варијанта аденокарцинома која по својој хистолошкој архитектури подсећа на PIN где неопластичне ћелије образују флат, ресичасте и микропапиларне формације које у потпуности испуњавају ове жлезде, а могуће су и високе колумнарне ћелије које подсећају на туморске ћелије дукталног аденокарцинома (PIN – like duktalni adenokarcinom).64,65 За разлику од PIN – а, p63 и HMWCK имунохистохемијско бојење за базалне ћелије је потпуно негативно, а на AMACR је позитивно. Gleason градус ових тумора је 3, а ако је удружен са ацинарним аденокарциномом најчешће је Gleason scora 6. 1.6.3.3. Крупноћелијски неуроендокрини карцином Крупноћелијски неуроендокрини карцином је изузетно редак хистолошки облик, а најчешће се јавља у случају аденокарцинома лечених хормонском терапијом.66 Микроскопски присутна су поља и траке ћелија великих једара грубог хроматина, проминентних нуклеолуса са наглашеном митотском активношћу и туморском некрозом, често удружен са ацинарним аденокарциномом. Присутна је имунохистохемијска позитивност на хромогранин, синапрoтофизин, CD56, 57 и AMACR. 1.6.3.4. Џиновскоћелијски аденокарцином 41 Џиновскоћелијски аденокарцином је изузетно ретка варијанта аденокарцинома са присутним гигантским ћелијама крупних плеоморфних једара, удружен најчешће са уобичајеним аденокарциномом Gleason skor 9.67,97 Присутна је променљива имунопозитивност бизарних гигантских ћелија за PSA. Ови тумори су врло агресивни са преживљавањем од неколико месеци. 1.7. СТАДИРАЊЕ КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ (СКП) Карцином простате је најчешће дијагностикован карцином код мушкараца, 240.890 нових случајева дијагностиковано је 2011 год, а 33.720 је умрло у САД.98 Прецизно стадирање карцинома је од виталног значаја за предвиђање биолошког понашања и избора терапијских поступака, евалуацију одговора у експерименталним методама и размену података међу институцијама. Тумор, нодални и метастатски систем стадирања (TNM) за карциноме простате први пут је уведен 1992 године од стране Америчког заједничког комитета за рак (American Joint Committee on Cancer-AJCC) и Интернационалне уније против рака (International Union Against Cancer-UICC).99 Последње промене у стадирању карцинома простате AJCC је увела 2010 године.100 Патолошки стадијум захтева хистолошку идентификацију тумора унутар простате и у околном ткиву. Иако су критеријуми за процену клиничког стадијума јасно дефинисани још увек постоје недоумице у превођењу ових критеријума у рутинску хируршку патолошку праксу након радикалне простатектомије. Постоји неслагање између клиничког и патолошког стадирања тумора због недовољне прецизности података добијених дигиталним ректалним прегледом (ДРЕ), трансректалном ултрасонографијом (ТРУС) и другим имиџинг техникама, због мултифокалне природе карцинома, прецизног навођења екстензије карцинома у околне структуре што резултира одређеним проблемима у смислу прогнозе и лечења пацијента. Само у 36% случајева присутна је подударност између клиничког и патолошког стадијума. pT2 субкласификација на основу волумена тумора односно величине више је прихватљива од важеће класификације из 2010 године засноване на клиничком утиску и 42 процене захваћености простате.101,102 Величина тумора (максимални дијаметар тумора) као параметар за TNM стадирање користи се и за друге органе и у корелацији је са волуменом карцинома, тако да је сугерисано да се користи за pТ2 субстадирање.101 клиничка TNM класификација патолошкаTNM класификација ТX Примарни тумор Т примарни тумор се не може оценити Тx Примарни тумор рТ - Т0 Примарни тумор није присутан pТ0 Нема евидентираног тумора у простатектомији Т1 Клинички инапарентан тумор непалпабилан без визуелизације имиџинг методама pТ1 Није патолошка Т1 класификација Т1а Случајан хистолошки налаз у ≤ 5% ресектованог ткива pТ1а - Т1b Случајан хистолошки налаз у > 5% ресектованог ткива pТ1b - Т1c Тумор идентификован у игленој биопсији са присутном елевацијом РСа pТ1c - Т2 Тумор ограничен на простату pТ2 Тумор ограничен на орган Т2а Тумор присутан у ≤ поливини једног лобуса pТ2а Унилатералан захвата једну половину или мање – највећи дијаметар тумора ≤ 5мм Т2b Тумор присутан у више од пoловине једног лобуса али не у оба pТ2b Унилатералан захвата више од једне половине али не оба лобуса - > 5мм ≤ 16мм Т2c Тумор присутан у оба лобуса pТ2с Билатерална болест ≥ 16мм Т3 Тумор пробија капсулу и шири се изван ње pТ3 Екстрапростатично ширење Т3а Унулатерално и билатерално екстракапсуларно ширење тумора pТ3а Екстрапростатично ширење са микроскопском инвазијом врата бешике Т3b Тумор захвата семене кесице pТ3b Инвазија семених кесица Т3c - pТ3c - Т4 Захвата и фиксира суседне структуре: семене кесице, спољашњи свинктер, ректум, мокраћну бешику, м.леваторани и или пелични зид pТ4 Инвазија ректума, м.леваторани и или зид карлице, мокраћне бешике и спољашњег свинктера Т4а - pТ4а - Т4b - pТ4b - Регионални лимфни нодуси (NX) Регионални лимфни нодуси (рNX) NX Регионални лимфни нодуси нису процењени NX Регионални лимфни нодуси нису пронађени NО Нису присутне метастазе у регионалним лимфним нодусима N0 Метастазе нису присутне у регионалним лимфним нодусима N1 Метастазе су присутне у регионалним лимфним нодусима N1 Метастазе су присутне у регионалним лимфним нодусима N1а Један позитиван лимфни нодус највеће димензије ≤ 2мм N1b Један позитиван лимфни нодус > 2мм у највећој димензији N2 - N2 ≥ 2 позитивна лимфна нодуса N3 - N3 - Удаљене метастазе Удаљене метастазе 43 МХ - МX - М0 Нису присутне удаљене метастазе М0 Нису присутне удаљене метастазе М1а Метастазе у нерегионалним лимфним нодусима М1а Метастазе у нерегионалним лимфним нодусима М1b У костима М1b У костима М1c На другим местима са или без захватања костију М1c На другим местима са или без захватања кос 1.7.1. Критеријуми за екстрапростатично ширење (pТ3а) Екстрапростатично ширење карцинома изван капсуле одавно је препознато као лош прогностички фактор, како за карциномску прогресију, тако и за преживљавање, туморске метастазе, инвазију семених кесица и висок Gleason градус. На основу важности екстрапростатичне екстензије за туморску прогресију и прогнозу, AJCC i UICC укључиле су овај параметар у јединствен TNM систем стадирања 1992 године и сврстале овај параметар у Т3 категорију.99 Два кључна питања која се тичу pТ3а стадирања су дијагностични критеријуми за екстрапростатичну екстензију и оптимални субкласификациони систем. Екстрапростатичну екстензију патолошки дефинишу четири критеријума: 1. Инвазија перипростатичног масног ткива са или без дезмопластичног стромалног одговора, 2. Инвазија перинеуралних простора, великих неуроваскуларних снопова у постеролатералном делу простате, 3. Инвазија изван предњег дела простате, 4. Инвазија перивезикуларног ткива103 Простата нема добро дефинисану капсулу, а многи аутори су закључили да права капсула практично и не постоји, већ је само чине фасцикулуси фибромускуларног ткива који чине нераскидиву компоненту простатичне строме, а на спољашњој површини Табела 7.1. Упоредни приказ клиничке и патолошке TNM класификације из 2010 год (AJCC) фокуса 44 фузионишу се са перипростатичним везивним ткивом као и перипростатични масним ткивом у појединим областима.104 Фибромускуларно ткиво у пределу простате је одсутно. У одсуству заједничких стандарда користили су се различити термини: капсуларна инвазија, пенетрација, перфорација што је доводило до конфузије у тумачењу овог параметра. У новије време користи се термин „екстрапростатична екстензија“ који се ослања на идентификацију карцинома у перипростатичном масном ткиву.103,105 Међутим, дистрибуција масног ткива око површине простате није подједнака тако да се ова карактеристика не може користити поуздано. Највише масног ткива налази се око задњег дела простате, мање око предњег дела а практично га нема у пределу врха. TNM систем стадирања од 2010 године уједињује унилатералну и билатералну екстрапростатичну екстензију у јединствену субкласификацију pТ3а. Неки истраживачи су предложили субкласификацију Т3а на основу степена екстрапростатичног ширења. Присуство мањих фокуса неопластичних гландуларних структура описују као „фокално“ а више изражена дисеминација као установљено „ширење“. Epstein и сарадници су предложили униформну дефиницију фокалне екстрапростатичне екстензије на основу дубине инвазије перипростатичног масног ткива и глаткомишићних структура врата мокраћне бешике (L3) аналогно Т3 стадијуму TNM система.63 Фокална инвазија подразумева присуство туморског ткива само у једном пољу највећег микроскопског увеличања (L3F), док установљена инвазија подразумева присуство туморских плажа у два и више одвојена пресека (L3E). Један од предлога критеријума за субкласификацију pТ3а је радијално растојање екстрапростатичног ширења у околно ткиво (<0.75мм и ≥ 0.75мм) које се као важан предиктор појаве рецидива потврдило у многим студијама.106 Туморска инвазија глаткомишићних структура врата мокраћне бешике у претхоним издањима TNM система стадирања предстаљала је pТ4 стадијум док се сада ова карактеристика класификује у pТ3 стадијум. Неслагања између аутора у начину стадирања ове хистолошке карактеристике може се приписати различитости дизајна студија, избора популације, поступком са узорком, различитошћу статистичких метода, патохистолошких техника. Многи сугеришу да ова инвазија нема независан прогностички значај, док други аутори сугеришу корелацију ове патохистолошке карактеристике са неповољном 45 туморском прогнозом и брзом прогресијом.107,108 Овакви подаци указују на значај континуиране процене овог типа инвазије као и препознатљив параметар прогностичке импликације.109 Стадијум T3b дефинише инвазија карцинома простате у мишићни зид екстрапростатичног дела семених кесица, а не околно везивно и масно ткиво ових структура које се подводи под стадијум pТ3а. Тешкоћу у разликовању представља и погрешно тумачење инфилтрације интрапростатичног дела дуктуса ејакулаторијуса што спада у стадијум pТ3а. Туморска инвазија се може одвијати: дуж duktusa ejakulatorijusa (тип 1), директном инвазијом кроз околно ткиво и мишићни зид (тип 2) и врло ретко присуство дисконтинуираних метастатских огњишта (тип 3) Прогностички значај различитих типова инвазије није доказан, али истраживања сугеришу да је оправдано коришћење овог параметра у рутинској пракси.110 46 1.7.2. Стадијум т4 карцинома простате Стадијум Т4 тумора је дефинисан инвазијом у ректум, спољашњи свинктер, musculus levator anni и/или пелвични зид и мокраћну бешику. Даља субкласификација није предложена.100 1.7.3. Стадијум pТ0 карцинома простате Gross et al. су први увели термин феномен „нестанка“ карцинома, односно непостојање резидуалног карцинома након радикалне простатектомије код потврђених тумора биопсијом. Учесталост рТ0 је приближно о,4%, са просечном старошћу болесника око 62 године.111.112 Т1с клинички стадијум, преоперативни PSA≤15нг/мл, само једна позитивна „core“ биопсија, Gleason скор <7, тежина простате ≥60 грама са присутним пољима HGPIN-а и ASAP-а на оперативном материјалу подразумевајуће су карактристике овог туморског стадијума чија је прогноза одлична. Десетогодишња праћења ових болесника нису показала знаке прогресије болести, али је и број случајева 10 пута мањи у поређењу са периодом осамдесетих година прошлог века.113 Процена је да је садашња инциденца два случаја на 1000 радикалних простатектомија.113 Истраживања указују да pТ0 карцином практично не постоји и не треба га укључивати у следеће TNM системе стадирања. У принципу препоручује се прецизна хистолошка процена пре дијагнозе овог стадијума тумора а ако су у питању велики оперативни материјали није неопходно обавити комплетну анализу истих ако имамо потврђену дијагнозу у биопсији. 1.7.4. Нодална класификација (N стадијум) Нодални статус је већ одавно признат као важан индикатор прогнозе тумора и терапијског избора.114,115 Присуство метастаза у регионалним лифним чворовима 47 (хипогастричним, обтураторним пресакралним, дуж спољашње и унутрашње илијачне артерије) одређен је као pN1 стадијум. Тренутна TNM класификација не даје даљу субкласификацију pN1 стадијума болести.100 Једнострана и билатерална локализација позитивних лимфних чворова не мења нодални стадијум карцинома простате. Присуство туморских депозита у удаљеним лимфним чворовима (дуж трбушне аорте, заједничке илијачне артерије, суперфицијалне и дубоке ингвиналне регије) одређују М1 стадијум болести. Препорука појединих патолога је да проширену пелвичну лимфаденектомију треба радити само у случајевима у којима је Gleason sкор тумора већи од 7 у биоптичком материјалу,116 што повећава број нодуса за процену и могућност откривања окултних метастаза,као и обезбеђивање оптималног стадирања болести и најбољег терапеутског исхода.114 Осим тога, стопа најбоље предикције лимфонодалног статуса је уколико је број лимфних чворова ≥ 30.117 Биолошка агресивност карцинома простате тесно је повезана са волуменом тумора и представља битан предиктор системске прогресије.118У факторе значајне за предикцију исхода укључен је и дијаметар највећег метастатског фокуса као и укупна запремина метастатског жаришта. Један од нових критеријама за нодални статус је пречник метастатског депозита ≤ 2мм у само једном нодусу (класификује се као N1a), а ако је метастаза већа од 2мм N1b. Присуство туморских депозита у два или више лимфна чвора је N2 стадијум болести. Пацијенти у стадијуму N1a имају одличну прогнозу после радикалне простатектомије и хормонске терапије скоро 100%.Неки аутори су мишљења да је величина највећег метастатског депозита прогностички значајнија од броја укупно позитивних лимфних нодуса.119 Од недавно посебан се значај даје категорији микрометастаза. Гранична тачка микро и макрометастаза је различита код појединих аутора и креће се од 0,2 до 2мм, 3мм, 5мм,115,117,120 Поједини аутори укључују и појединачне или мање групе туморских ћелија не већих од 0,2мм визуелизованих цитокератинским имунохистохемијским бојењем.121 Густина лимфних нодуса дефинише се као број позитивних лимфних чворова у односу на укупан број нађених и анализираних лимфних жлезда чији прогностички значај је документован у појединим извештајима.122 48 Екстранодална екстензија кроз капсулу лимфног чвора у перинодално ткиво је чест хистолошки налаз али прогностички значај није утврђен. Значајност ове карактеристике може се оценити само у склопу других клиничких и патолошких карактеристика у случајевима који су били нодално позитивни. Многи аутори су нашли да је Gleason sкор тумора и екстранодална екстензија независни предиктори преживљавања код пацијената са позитивним нодалним статусом али постоје и супротна мишљења.Неслагање у погледу прогностичког значаја екстранодалне екстензије између студија може се приписати и разликама у броју студијске популације, статистичким методама, избору пацијената и терапијског поступка. Критично питање биолошког понашања тумора многих органа је дедиференцијација која је последица прогресије болести и може се јавити у примарним али и у метастатским туморима како епителног тако и мезенхималног порекла. Дедиференцијација на виши хистолошки градус удружена је са повећањем биолошке агресивности и код карцинома простате. Дедиференцијација је узрок разлике Gleason скорa примарног тумора у односу на метастатски депозит где је већег градуса. Важно је узети у обзир када се оцењује Gleason,у позитивним лимфним чворовима да се коначна процена доноси на основу прегледаних свих чворова у смислу повећања скора. Још увек је важећи став да Gleason sкор у метастатским депозитима није толико битан за прогнозу и стадијум тумора као што је то волумен метастатског депозита. Разумевање позитивног нодалног статуса код карцинома простате рапидно се повећава појавом нових молекуларних imidžing техника и система за детекцију циркулишућих туморских ћелија као и биолошка процена овог статуса што може развити даље субкласификације које би побољшале тачност процене прогнозе, и омогућиле боље лечење и клинички исход. Иако ревидирана pTN класификација AJCC/UICC из 2010 године представља побољшање у односу на претходне системе, још увек остају нерешена важна питања чији би одговори поткрепили мултифокалну, мултиклоналну природу карциногенезе простате и дали резултате у усаглашавању клиничког и патолошког стадијума тумора. 49 1.8. НЕОАНГИОГЕНЕЗА – ВАСКУЛАРНИ ЕНДОТЕЛНИ ФАКТОР РАСТА (VEGF) Откриће и изолација VEGF потврда је Folkmanove теорије о туморској ангиогенези. Процес ангиогенезе је комплексан и представља равнотежу проангиогених и антиангиогених фактора раста.123 Промотери ангиогенезе су VEGF,aFGF,bFGF,TGF,EGF,TNF, а инхибитори тромбоспондин ангиостатин, ендостатин, вазостатин, пролактин, хормон раста. Раст тумора завистан је од ангиогенезе која је одговорна за туморску прогресију, туморску инвазију и метастазирање. Продукција VEGF иницирана је тумором, онкогенском експресијом, туморском хипоксијом и некрозом. VEGF има централну улогу у туморској ангиогенези, под утицајем је а и утиче на друге проангиогене факторе, док његова инхибиција доводи до супресије и раста тумора. Хиперекспресија VEGF детектована је у великом броју тумора. Ферраре је открио васкуларни ендотелни фактор раста који је специфичан митоген за ендотелне ћелије и клонирао његов ген.124 VEGF је хомодимерски гликопротеин који се јавља у четири молекуларне изоформе: А, Б, Ц и Д. Иницијално су откривена два рецептора, специфични тирозин киназа рецептори (VEGFР-1, VEGFР-2) који везују VEGF са високим афинитетом а трећи је касније откривен (VEGFР-3). Ови рецептори налазе се на активисаним васкуларним ендотелним ћелијама, дендритичним, хематопоезним стем ћелијама појединим туморским ћелијама и лимфатичним ендотелним ћелијама (VEGFР-3). Физиолошка улога VEGF и ангиогенезе код одраслих ограничена је на зарастање рана, оштећених ткива на репродуктивне функције и развој жутог тела. Новоформирани крвни судови транспортују кисеоник и хранљиве материје до ткива која расту, фаворизујући такође миграцију инфлматорних ћелија дуж базалне мембране ендотела које су одговорне за формирање гранулационог ткива.125,126 Репродуктивне функције код жена, раст и развој фоликула и настанак жутог тела у јајницима зависи од пролиферације нових крвних капилара који настају као резултат ангиогенезе активиране од стране VEGF-а кога активира естрадиол.127 Физиолошка улога VEGF-а је у току ембрионалног развоја и раста, постнаталном развоју и енхондралном формирању костију где регулишу васкуларизацију у зони раста 50 која је важна у процесу хондро и остеогенезе. VEGF помоћу интерне аутокрине петље контролише преживљавање и репопулацију хематопоетских ћелија у костној сржи.127 Везивање VEGF са VEGFР-2 на ендотелним ћелијама доводи до покретања каскаде сигнала који за ефекат имају пролиферацију, миграцију и преживљавање ових ћелија што резултира формирањем нових крвних судова који спајајући се образују васкуларну мрежу.128 VEGF у току овог процеса доводи такође до индукције експресије антиапоптоптичких протеина bcl, bcl-2, A1, XIAP4 i survivina.129 Изостанак овог ефекта доводи до апоптозе и изумирања новонастале капиларне мреже јер су само незрели крвни судови зависни од VEGF стимулације да би преживели. VEGF познат као васкуларни фактор пропустљивости (VRF) индукује пропустљивост крвних судова, експресијом серин-протеаза и металопротеаза, разграђује интерстицијални колаген чиме се објашњава већа мобилност туморских ћелија и продирање истих у крвоток.130 Важна биолошка улога VEGF-а је модулација имуног одговора преко блокаде развоја дендритичних ћелија које су антиген презентујуће ћелије и које стимулишу продукцију антиген-специфичних цитотоксичних ћелија тако да разним механизмима спречавају раст тумора и инхибишу туморску ангиогенезу.131 Такође, доказано је на експерименталним моделима да доводи до повећања броја лимфоцита и незрелих мијелоидних ћелија. Значајну улогу има и у регулацији лимфангиогенезе која је стимулисана везивањем VEGF-а за VEGFР-3 рецепторе који се налазе на ендотелним лимфатичним ћелијама.132 Оверекспресија присутна је код тумора плућа, дигестивног тракта бубрега и мокраћне бешике, тумора порекла герминативног епитела и других. 1.9.ДИЈАГНОСТИЧКИ И ПРОГНОСТИЧКИ МОЛЕКУЛАРНИ БИОМАРКЕРИ КОД КАРЦИНОМА ПРОСТАТЕ Карцином простате је најчешћи малигни тумор код мушкараца и има растућу инциденцу, посебно у економски развијеним земљама, због уведених рутинских дијагностичких процедура. Задатак патолога није само да дијагностикује карцинома већ и да процени малигни потенцијал новодијагностикованог тумора што конвенционална 51 патохистологија назива градирањем тумора. Прецизна прогноза агресивности тумора и даље представља велики проблем упркос интензивном истраживању. 1.9.1. Дијагностички маркери Још од описа аутора Tottena 1953. године, дијагноза нискоградусног карцинома простате почива на три критеријума: насумична жлездана структура, изостанак базалних ћелија и нуклеарна атипија са израженим нуклеолусом.133 Ови критеријуми се могу означити као најважнији (главни), док су тзв. „минорни“ (споредни) критеријуми додати касније у радовима других аутора.134 Очигледно, конвенционална морфологија је прилично субјективна и у великој мери јој доприносе додатне информације ради доношења објективних закључака. 1.9.2. Имунохистохемија као средство за дијагностику примарних карцинома Маркери базалних ћелија су током година постали имунохистохемијски камен темељац у дијагностици карцинома простате.135,136 Међу њима су цитокератини базалних ћелија (34b12, CK5/6), p53 i p63. Могу се користити посебно или у комбинацији као основни маркери.137 p63 је више сензитиван и супериоран у обележавању жлезда у односу на транзационалну зону. Према Epstein-u и сарадницима код до 0,3 % случајева експримирају се цитокератини базалних ћелија.43,139 Јасно виђена инфилтрација и одсуство цитокератина базалних ћелија би требало да води тачној дијагнози, без обзира на p63 имуно-бојење. Међу осталим маркерима који се предлажу у дијагностици су: P- cadherin, D2-40, CD109 ili BCL-2. 52 1.9.3. Позитивни маркери код примарних карцинома Многи случајеви остају неразјашњени упркос базалним ћелијским маркерима. У тим случајевима би било пожељно размотрити додатне факторе малигнитета. 1) Alpha-methylacyl-CoA racemase: Alpha-methylacyl-CoA racemase (AMACR) је први откривени фактор регулације у развоју карцинома простате, помоћу супресионе суптракционе хибридизације.140 AMACR је митохондријални и пероксизмални ензим који је укључен у бета оксидацију масних киселина и у биосинтези жучних киселина.141 Његова експресија је присутна у нормалним ткивима (хепатоцитима, реналним тубуларним епителним ћелијама, ћелијама мукозе бешике) а такође и у неким малигним туморима, укључујући карцином колона и папиларни ренални карцином.142,143 Највећи степен прекомерне експресије AMACR (95%) забележен је у карциному простате и до данас је једино овај маркер клинички прихваћен. Овај маркер у комбинацији са базалним ћелијским маркерима значајно доприноси прецизности дијагнозе и захваљући њему Слика 9.1. Имунохистохемијска потврда дијагнозе карцинома простате: p63-, AMACR+ fokfokusa 53 избегавају се непотребне поновне биопсије. Неки аутори предлажу AMACR као маркер високоградусних PIN. 2) GOLM1 (GOLPH2,GP73): GOLM1 је фосфопротеин са до сада непознатом функцијом. До сада је био описиван у обољенима јетре и делимично код хепатоцелуларног карцинома.144,145 Прекомерна експресија GOLM1 mRNA је такође запажена у различитим студијама о карциному простате.146,147 Експресија GOLM1 је запажа се у 92,5 % случајева. GOLM1 је од велике помоћи у већини AMACR негативних случајева чак и до 84%, што оправдава његову примену као додатни маркер у дијагностици карцинома простате. 3) Fattyacidsynthase (FASN) – sintetaza masnih kiselina: FASN је кључни ензим одговоран за де ново синтезу масних киселина.148 Прекомерна експресија FASN протеина код карцинома простате је описана у радовима великог броја аутора.149,150,151 FASN би такође могао да се примењује као добар маркер у AMACR негативним случајевима. 4) ERG : Откриће биолишки веродостојне генске траслокације удружене са раком простате, посебно агресивнијом формом, довело је до трансформације поља истражиања ове области.152,153 Око 50% случајева свих карцинома простате скрива TMPRSS2-ERG генску фузију, која доводи до хиперпродукције оштећеног ERG продукта, који се може прецизно дијагностиковати специфичним антителом.154,155 Ориганалне студије су дијагностиковале ову алтерацију путем FISH-a i PCR-a. Сем ове две методе детековање ERG путем имунохистохемије се такође показало као веома сензитвна метода. Као други могући маркери за дијагностику карцинома простате намећу се и соматски цитохром Ц (somatic cytochrome C - CYCS), киназа интестицијалних ћелија (intestinal cell kinase - ICK) и инхибитор нуклеофактора кБ киназе субјединице (Inhibitor of nuclear factor kB kinase subunit - IKBKB).156 Ови макери могу бити посебно интересантни и наћи своју примену у случајевима који су AMACR негативни. 1.9.4. Имунохистохемија као средство дијагностиковања третираних карцинома 54 С обзиром на познате ефекте третмана карцинома простате андрогеном аблацијом и радиотрапијом на ткиво простате промене у виду атрофије и реактивних промена могу значајно променити претходну хистолошку слику.157 Према досадашњем искуству, третирани карциноми простате често губе AMACR експресију што онемогућава адекватну евалуацију лечења. Стога је у неким случајевима обично панцитокератинско бојење у комбинацији са стандардним маркерима базалних ћелија од велике помоћи у трагању за инвазивним остацима карцинома простате. 1.9.5. Имуноистохемија као средство доказивања простатичног порекла 1) Специфични антиген простате (Prostatic-specific antigen – PSA) je 33-kD тешка серин протеаза која се широко употребљава за имунохистохемијску потврду метастатских карцинома који потичу од простате.158 Иако није у потпуности специфичан за простату (среће се још у карцинома јајника и дојке), још увек је најчешће коришћен маркер. Ипак високоградусни тумори и метастазе могу бити PSA негативни, што ограничава његову вредност и дијагностички значај.159 2) Специфични мембрански антиген простате (Prostatic-specific membrane antigen – PSMA) је фолатна дехидролаза која се јако експримира у већини карцинома простате и њиховим метастазама и због тога се препорочује као дијагностички маркер. Он се експримира нарочито током туморске прогресије и такође није специфичан за простату, јавља се и у других солидних тумора, укључујући гастроинтестиналне и уроепителијалне карциноме.160,161 3) Prostein (kodiran genom SLC45a3), представља први идентификован специфичан маркер карцинома простате.162 При употреби овог маркера може да се јави проблем приликом диференцијалне дијагнозе високградусног карцинома простате и уротелијалног карцинома, који се превазилази комбинацином простеина и p63 маркера. 4) ERG је биомаркер који се експримира у око свега 50% случајева карцинома простате. Упркос томе, он има високу специфичност приликом утврђивања порекла метастатског ткива, односно ERG транслокација до сада није утврђена ни код једног 55 другог карцинома.163 Сензитивност утврђивања порекла метастатских карцинома из простате помоћу ERG-а је посебно валидна код ситноћелијских варијетета тумора.164 5) Андрогени рецептор (AR) не препоручује се као маркер због његове честе експресије на ћелијама других ткива. Међутим NKX3.1 представља андроген-регулишући ген углавном специфичан за простату. Примарно је нађен у секреторном епителу простате бенигних и неопластичних ћелија. Неки аутори описују NKX3.1 експресију у високо- градусним туморима. Данас је доступан широк спектар различитих туморских маркера који нам поможу да поставимо дијагнозу карцинома простате или секундарног депозита који води порекло из простате. И поред тога што се за дијагностику карцинома простате у највећој мери још увек користе морфолошке одлике, претходно описани тумор маркери могу бити од велике помоћи, посебно када је реч о утврђивању степена малигности или сумњи да је метастатски процес пореклом из простате. 1.9.6. Прогностички маркери Циљ прогнозе тока болести представља заправо тражење индувидуалног лека за сваког пацијента. Претходна истраживања су показала да ниско и средње градусни карциноми простате у високом проценту никад и не праве клиничке сметње, већ се откривају захваљујући добром скринингу у развијеним земљама. Услед тога стиче се утисак да су ови пацијенти ,,прелечени“. Управо из тог разога су нам неопходни биомаркери за утврђивање агресивности тумора. 1) генски маркери: TMPRSS2—ERG: Опис ове генске алтерације која доводи до модификације андрогених сигнала је у значајној мери променило оријентир у истраживању карцинома простате. Досадашњи резултати су прилично хетерогени. 2) епигенске алтерације, укључујући генску метилацију, модификацију хистона и експресију mikroRNA. Гени за које је добро познато да путем метилације утичу на настанак карцинома простате су: GST-pi, RARbeta2, APC, PITX2 i HOXD3. 56 3) microRNA су мале некодирајуће секвенце RNA које интерферирају са генском експресијом. Неколико студија је до сада анализирало значај microRNA у прогностици карцинома простате. Утврђено је да постоји дијагностичка вредност одређивања miR-191, miR-145, miR-191 i miR-100.165 57 2. ЦИЉ РАДА Циљ овог истраживања је испитивање могуће повезаности клиничких и хисто- патолошких параметара карцинома простате са нивоом експресије VEGF-а и микроваскуларном густином дефинисаном кроз експресију ендоглина (CD105), као и одређивање њиховог прогностичког значаја. У складу са основним циљем постављени су следећи конкретни задаци: 1. Испитивање нивоа експресије VEGF-а у карциномима простате 2. Анализа експресије ендоглина кроз одређивање микроваскуларне густине 3. Одређивање корелације између испитиваних маркера 4. Одређивање корелације између експресије испитиваних маркера и клиничко– морфолошких параметара (ниво серумског PSA, стадијум болести, волумен или величина тумора, нодални статус) 5. Одређивање корелације између експресије испитиваних маркера и хисто- патолошких параметара код карцинома простате (хистолошки тип карцинома, Gleason скор, перинеурална, лимфна, и васкуларна инвазија и тд.) 6. Одређивање утицаја експресије маркера и клиничко-хистопатолошких фактора на преживљавање без болести код пацијената са карциномом простате. 58 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ Истраживање је рађено као клиничко-ретроспективна студија, од 30.06.2007. до 30.06. 2012. године, у Центру за патологију, Клиничког Центра Крагујевац и Здравственом центру Нови Пазар. 3.1. ИСПИТИВАНА ПОПУЛАЦИЈА Истраживање представља ретроспективну, клиничко-експерименталну студију. Обухватило је 172 пацијента, биоптираних и оперисаних у Клиници за урологију и нефрологију Клиничког Центра Крагујевац, због промена у простати. На ткивном материјалу, који је добијен биопсијом или оперативно, радикалном простатектомијом, вршена је патохистолошка и имунохистохемијска анализа. У студији је одређивана и праћена експресија VEGF-а и ендоглина. Истовремено, праћени су односи између експресије ових маркера и различитих клиничких, морфолошко-хистопатолошких и других прогностичких фактора. Промене су класификоване на основу микроскопске дијагнозе у две групе; прву групу су чиниле бенигне лезије простате (аденостромална хперплазија), и то је контролна група истраживања, а другу, експерименталну су чинили малигни тумори. 1. Контролну групу је сачињавало 24 бенигне промене, код мушкараца просечне старости 72 године (најмлађи 61 , а најстарији 87 година) 2. Експерименталну групу је чинило 148 пацијената са карциномом простате, просечне старости од 75 година код 104 биоптирана (у распону од 66 до 83 године ), а 62 године код 44 оперисана болесника (у распону од 50 до 73 године). 3.2. ОПШТИ ПРОТОКОЛ ИСТРАЖИВАЊА Пре биоптичке процедуре и преоперативно, свим пацијентима је урађена комплетна биохемијска анализа крви и посебно анализа серумског новоа PSA, ултразвучни и клинички преглед, на основу којих су добијени подаци о волумену, 59 локализацији и палапаторним особинама тумора. Добијени ткивни материјал је достављан у Центар за патологију на анализу. Након фиксације и рутинске обраде биоптичког и оперативног ткивног материјала, вршена је микроскопска анализа Х&Е обојених препарата са постављањем завршне патохистолошке дијагнозе, као и имунохистохемијска анализа ткивне експресије примењених маркера. Након биопсије и постоперативно, пацијентима са карциномом простате, је одрађен ЦТ мале карлице, абдомена и грудног коша, као и сцинтиграфија скелета, у циљу дефинисања стадијума туморске болести. Сви пацијенти су праћени у оквиру Уролошког конзилијума, Клиничког Центра Крагујевац, на којима је одређивана даља адјувантна терапија, обављане прве две године тромесечне, а затим шестомесечне контроле и на којима су се у случају релапса болести, ординирале секундарне и терцијалне терапије. Преживљавање је додатно праћено кроз телефонски контакт са пацијентима и повремено, увидом у матичну књигу умрлих. 3.3. МЕТОДЕ Као методе су коришћене стандардна патохистолошка анализа са рутинским методом бојења Хематоксилин-Еозин (Х&Е) и имунохистохемијски метод.166,167 Након очитавања патохистолошких и имунохистохемијских резултата, извршена је статистичка обрада података. Микроскопска анализа тумора и оцењивање експресије маркера су вршени на микроскопу типа Carl Zeiss, Axioscop 40. Препарати са репрезентативним пољима, су сликани коришћењем три микроскопска увеличања (x10,x20,x40),помоћу камере Canon PC 1089. (прилог ….) 3.4. СТАНДАРДНА ПАТОХИСТОЛОШКА ОБРАДА И АНАЛИЗА У рутинској обради препарата, добијени узорци ткива су фиксирани у 4% неутралном пуферисаном раствору формалина, у току 24 часа, на собној температури. По завршеној фиксацији, узорци су дехидратисани провођењем кроз серију алкохола растуће концентрације (70%, 96% и 100%), просветљавани у ксилолу и калупљени у парапласт. 60 Попречни серијски пресеци, дебљине 4 μм, сечени су на микротому Leica RM 2135, Austria. После депарафинисања у ксилолу и хидратације у опадајућем реду алкохола, исечци су бојени Haematoxylin-om пo Mayer-u, просветљавани у 2% раствору еозина, затим дехидратисани, просветљивани и монтирани на плочице са Canada балзамом.167 Ова класична Х&Е метода,166 омогућила је микроскопским прегледом постављање дефинитивне дијагнозе, као и патохистолошку анализу ткивних узорака, која је укључивала одређивање стандардних и нестандардних параметара тј особина тумора. Хистопатолошки извештај садржи податке о патолошком стадијуму болести (pTNM), хистолошком типу и степену диференцијације тумора тј Gleason-овом скору, митотском индексу, присуству стромалне мононуклеарне реакције, некрозе и дезмоплазије, постојању лимфне, васкуларне и перинеуралне инвазије, стању хируршких ресекционих маргина, одсуству или присуству других патолошких лезија и преканцерозних стања у околини тумора. У биоптичком материјалу посебно се нотирала површина узорака ткива захваћена тумором, а у оперативном материјалу мерен је највећи пречник малигне промене. Gleason-ов скор је дефинисан одређивањем примарног и секундарног хистолошког облика, као и терцијарног облика резервисаног само за простатектомије. Патолошки стадијум туморске болести дефинисан је према препорукама из 2009. године, а на основу локализације тумора у једном или више лобуса (зона), постојања инфилтрације капсуле и екстрапростатичне екстензије, као и статуса семених кесица и лимфних нодуса.168 3.5. ИМУНОХИСТОХЕМИЈСКИ МЕТОД Имунохистохемијски метод се заснива на реакцији антиген-антитело. Применом одговарајућих моноклонских антитела, специфичних за одређене врсте рецептора у једру, цитоплазми или на мембрани, нормалне или малигне ћелије, могућа је визуелизација комплекса антиген-антитело, а самим тим и одређивање броја ћелија које су експримирале туморски антиген, као и интензитет те експресије. За имунохистохемијско одређивање нивоа експресије VEGF-а и ендоглина коришћени су ткивни узорци фиксирани и 61 укалупљени у парафин. Анализа је обављена применом палете моноклонских антитела различитих произвођача и карактеристика приказаних у табели. Име антитела Произвођач Кат.број Клон Разблажење Purified Mouse Anti- human CD105 Dako,Gloustrup, Danmark SN6h 1:20 Purified Mouse Anti-human VEGF BD Pharmingen 554169 PAb1801 1:2000 3.6. МЕТОДОЛОГИЈА ИМУНОХИСТОХЕМИЈСКОГ БОЈЕЊА Ткиво је 24 часа фиксирано у 4%-тном неутралном, пуферизованом формалдехиду и калупљено у парафин. Резови дебљине 3-4 μм, су монтирани на посебне високо адхерентне плочице SuperFrost® и сушени на температури од 56ºC у току 1 сата. За детекцију експресије ендоглина и VEGF-а примењена су моноклонска хумана антитела и високо сензитивна, специфична стрептавидин-биотин имунохистохемијска метода (LSAB+/HRP, DAKO, Denmark),у којој је стрептавидин обележен пероксидазом, а као хромоген је коришћен 3,3-диаминобензидин. У току бојења, истовремено су тестирани и познати негативни и позитивни ткивни узорци, а један ткивни пресек из испитиваног парафинског калупа, тестиран је реагенсом који је замењивао примарно антитело. Процедура је подразумевала поступке демаскирања антигена, блокирања ендогене пероксидазе, инкубирања препарата са примарним антисерумом и поступак извођења имунохистохемијске методе LSAB+/HRP. Након депарафинизације и рехидрације ткивних пресека вршено је демаскирање антигена одговарајућим поступцима. Формалдехид у току фиксације, као и парафин у току калупљења, изазивају конфигурацијске промене протеина у ткиву формирањем интермолекуларних веза. Дуготрајна формалинска Табела 3.2. Карактеристике антитела примењених у истраживању 62 фиксација може да маскира антигене и умањи ефекат специфичног бојења. Стога се поступком демаскирања антигена постиже обнављање примарне конфигурације антигена, уклањањем нежељених интермолекуларних веза. Демаскирање антигена вршило се високом температуром у микроталасној пећници Molinex Compact, у 0,1М цитратном пуферу, pH 6,0, на 800W, у трајању од 21 минут. Након демаскирања антигена је уследило блокирање ендогене пероксидазе, 3% воденим раствором H2O2 у трајању од 10 минута, а затим је наношено примарно антитело,са инкубацијом од 1h на собној температури, у влажној комори. DAKO LSAB+ kit, у коме је стрептавидин обележен пероксидазом (HRP) базира се на обележеној стрептавидин биотин методи, али користи високо рафинирану авидин- биотин комплексну тростепену технику, у којој биотинизирано секундарно антитело реагује са неколико стрептавидинских молекула коњугованих пероксидазом. Ради се о екстремно осетљивој и прилагодљивој имунохистохемијској методи, која је у поређењу са другим методама сензитивнија чак до 8 пута. Обзиром да се у киту налази појачан систем стварања сигнала за детекцију антигена присутних у ниским концентрацијама, тј. систем који омогућава повећање интензитета бојења као компензацију за низак титар примарног антитела, оптимално разблажење примарног антитела је до 20 пута веће него у класичној пероксидаза-антипероксидаза (PAP) техници, тј. неколико пута веће него у класичној ABC или SAB техници. Поступак извођења LSAB+/HRP састоји се у инкубирању, прво са биотинизираним везујућим антителом, а затим са стрептавидином обележеним пероксидазом. Поступак се завршава инкубацијом пресека у мешавини супстрат-хромогена (H2O2 i 3-amino-9-etil- karbazol u N,N,-dimetilformamidu;AEC+ Substrate-Chromogen kit ,Cat. No. K3469, DAKO- Denmark), 5 минута на собној температури. Као општи растварач антисерума и средство за испирање између различитих корака у току имунохистохемијске процедуре бојења коришћен је 0,1М фосфатни пуфер pH 7,4. На крају исечци су бојени Маyер-овим хематоксилином. 3.6.1. Контрола квалитета и специфичности имунохистохемијског бојења 63 Сва имунохистохемијска бојења изведена су уз контролу квалитета и специфичности бојења, применом позитивних и негативних контрола према пропозицијама UK NEQAS-a (UK National External Quality Assessment for Immunocytochemistry). Као позитивни контролни узорци за тестирање коришћени су исечци примарног карцинома дојке, хемангиома и пиогеног гранулома, који су се раније вишеструко тестирани и сигурно садрже испитиване антигене. Припремани су на исти начин као и испитивани узорци у овом истраживању. Као негативна контрола у току имунохистохемијског бојења послужили су узорци ткива третирани не имуним серумом уместо примарног антитела. 3.6.2. Очитавање резултата ткивне експресије Иако је у употреби више различитих система за очитавање експресије туморских маркера у различитим ткивима,169,170 према препорукама а због усаглашавања међу лабораторијма, најчешће се употребљава брзи збир (quick Allred score)171 Други системи подразумевају само очитавање процента позитивних ћелија, без обзира на интензитет, а гранична вредност за позитивност је 50%.172,173 У нашем очитавању резултата ткивне експресије VEGF-а, користили смо Allred score, који подразумева збир бодовања, где се проценат ћелија са експримираним маркером класификује у пет група, а интензитет бојења у три групе. Комбиновањем збира ова два параметра добијају се крајње вредности од 0 до 8. (табела) Вредност скора 2 сматра се као позитивност ткива тј. тумора за одређени маркер. У исто време бележили смо и само процентуалну заступљеност имунореактивних ћелија. 64 % експресије Интензитет бојења 0 = нема експресије 0 = нема бојења 1 = експресија >1% 1 = слаб интензитет бојења 2 = експресија од 1-10% 2 = умерен интензитет бојења 3 = експресија од 11-33% 3 = висок интензитет бојења 4 = експресија од 34-66% 5 = експресија од 67-100% Имунохистохемијском анализом експресије ендоглина (CD105), маркера ендотелних ћелија, вршена је процена степена ангиоганезе. Прави показатељ интензитета ангиогенезе је густина интра и перитуморске микроциркулације или микроваскуларна густина (енгл: microvessel density). Анализа је вршена квантитативно, бројањем крвних судова у зонама са њиховом највећом густином (“вруће тачке” енгл: hot spot areas). Користили смо препоруке које је дао Weidner о величини видног поља и начину бројања.174,175,176 Фокуси највеће густине крвних судова су одређени на малом микроскопском увеличању (x4). Одређивање фокуса највеће микроваскуларне густине је вршило два патолога независно, при чему им нису били доступни клинички и патохистолошки подаци о пацијентима. Након тога, бројање појединачних крвних судова рађено је на средњем микроскопском увеличању (x20) што подразумева површину од 0,739мм2. Средња вредност резултата добијених бројањем у 3 видна поља био је коначан резултат. Приликом бројања крвних судова у свакој “врућој зони” рачунале су се и експресије појединачних ендотелних ћелија, као и њихови трачци, а не само лумен крвног суда са видљивим еритроцитима. Након добијених података о броју крвних судова за сваки скучај посебно, израчуната је средња вредност 3 очитана поља, а затим и медијана у Табела 3.2. Allred score метод очитавања VEGF маркера 65 односу на коју су сви карциноми сврстани у две групе, оних са ниским степеном и оних са високим степеном ангиогенезе, према томе да ли је број крвних судова мањи или једнак односно већи од вредности израчунате медијане. 3.7. СТАТИСТИЧКА ОБРАДА ПОДАТАКА Статистичка обрада резултата извршена је помоћу комерцијалног програмског пакета ЅРЅЅ (verzija 15.0, ЅRЅЅ Inc.,Chicago,IL). У анализи добијених резултата најпре је коришћена дескриптивна статистика за опис општих карактеристика узорка: апсолутни бројеви и пропорције (фреквенције, проценти), мере централне тенденције (аритметичке средине) и мере варијабилитета (стандардна девијација). Нормалност расподеле евалуирана је Kolmogorov-Smirnov-им тестом. За поређење средњих вредности променљиве двеју популација коришћен је независни Т тест, Kruskal-Wallis-ov i Mann- Whitney -jev тест. За поређење средњих вредности променљиве више популација коришћена је Анализа варијанси. Испитивање зависности две описне променљиве реализовано је помоћу Хи-квадрат теста и Fisher-овог теста. Зависности две нумеричке променљиве испитивано је помоћу Pirson-ovog i Spearman -ovog коефицијента корелације. Испитивање утицаја више променљивих на бинарну променљиву урађено је помоћу мултиваријантне бинарне логистичке регресије. Могућност да нека променљива буде маркер испитивана је помоћу ROC криве, при чему су, за погодно утврђен cut-off, одређивани сензитивност и специфичност. Одређивањем сензитивности и специфичности теста за поједине онкогене дат је ниво поузданости ових анализа. Процена функције преживљавања је вршена методом Kaplan-Meier-a, a Log-ранк тест је коришћен за поређење скала (curve) п - вредности <0,05 су сматране статистички значајним. 66 4. РЕЗУЛТАТИ Резултати дескриптивне анализе Наше истраживање је представљало ретросспективну, клиничко-експерименталну студију. Обухватило је 172 пацијента, биоптираних и оперисаних у Клиници за урологију и нефрологију Клиничког Центра Крагујевац, због промена у простати. На ткивном материјалу, који је добијен биопсијом или оперативно, радикалном простатектомијом, вршена је патохистолошка и имунохистохемијска анализа. У студији је одређивана и праћена експресија VEGF-а и ендоглина. Истовремено, праћени су односи између експресије ових маркера и различитих клиничких, морфолошко-хистопатолошких и других прогностичких фактора. Промене су класификоване на основу микроскопске дијагнозе у две групе; прву групу су чиниле бенигне лезије простате (аденостромална хперплазија), и то је контролна група истраживања, а другу, експерименталну су чинили малигни тумори. 1. Контролну групу је сачињавало 24 бенигне промене, код мушкараца просечне старости 72 године (најмлађи 61 , а најстарији 87 година) 2. Експерименталну групу је чинило 148 пацијената са карциномом простате, просечне старости од 75 година код 104 биоптирана (у распону од 66 до 83 године ), а 62 године код 44 оперисана болесника (у распону од 50 до 73 године). Резултати добијени статистичком анализом података групе биоптираних пацијената Статистичка обрада резултата извршена је помоћу комерцијалног програмског пакета ЅРЅЅ (верзија 15.0, ЅРЅЅ Inc.,Chicago,IL). Просечна старост у групи биоптираних пацијената (Н=104) износила је 74,46±4,23 при чему је најстарији 83 а најмлађи 66. Волумен је измерен код 94 пацијената, просечна вредност је износила 52,62±25,74. Највећа запремина је била 165 а најмања 17. Вредност PSA је утврђивана код свих 67 пацијената (Н=104). Средња вредност је износила 79.46±91,33 при чему је највећа вредност износила 490 а најмања 7,62. Учесталост и процентуална заступљеност према Gleason score-u је приказана у табели: На основу вредности Gleason скора пацијенти су груписани у три категорије, групу са ниским збиром до 5, групу са умерено високим Gleason скором (6 и 7) и групу пацијената са високим скором преко 7. Перинеурална инвазија је забележена код 50% пацијената тј.код 52 пацијента. Табела 4.1. Заступљеност Gleason skorova у групи биоптираних пацијената 68 Лимфна инвазија је забележена у 14 биоптичких узорака карцинома простате (13,46%). Метстатска болест је утврђена код 48,08% биоптираних пацијената. Заступљеност према стадијуму болести: Табела 4.2. Заступљеност Gleasona класираних у 3 прогностичке групе Табела 4.3. Заступљеност лимфне и перинеуралне инвазије у групи биоптираних пацијената 69 Микроваскуларна густина је очитавана кроз експресију ендоглина (CD105) код 76 биоптираних пацијената. Средња вредност MVG износила је 31,69±22,38. Минимална вредност износила је 3 а максимална 70. Екпресија VEGF-а је утврђивана код 76 биоптираних пацијената. Средња вредност у екпсресији VEGF-а износила је 63,68±26,57. Минимална вредност је 20 а максимална 90. Заступљеност скорова у екпресији VEGF-а је дата табеларно и графички: Табела 4.4. Заступљеност стадијума болести у групи биоптираних пацијената 70 Утврдили смо да ли су очитавања MVG од стране два патолога у колизији, компарацијом средњих вредности очитавања. Тестом Kolmogorov Smirnov утврдили смо природу дистрибуције података. Дистрибуција података одступа од нормалне. Средња вредност (медијана) очитавања првог патолога износила је 21 (12,33; 57) а код другог 21,50 (11,67; 57). Применом Mann Whitney теста доказано је да не постоји значајна разлика у очитавању резултата (p=0,889). Очитавање је валидно и у просеку дискрепанца између очитавања два патолога износила је 0,5%. Test Statistics(а) CD105 Mann-Whitney U 2850,000 Wilcoxon W 5776,000 Z -,140 Asymp. Sig. (2- tailed) ,889 a Grouping varuiable: Патолог Табела 4.5. Заступљеност ВЕГФ експресије очитане „score“ методом pacijenata 71 Patolog 1,00,00 C D 10 5 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Дистрибуција података (Kolmogorov Smirnov) одступа од нормалне, па је за испитивање корелације MVG и волумена простате, коришћен Spearman-ов коефицијент корелације. Доказано је да постоји слаба, позитивна корелација између ових параметара (p<0,01, r=0,376). Табела 4.6. Разлика између два патолога у очитавању MVG Табела 4.7. Корелација између MVG и волумена простате 72 Колмогоров Smirnov-им тестом није утврђена нормална расподела, због чега је примењен Sperman-ов коефицијент корелације. Утврђено је да постоји умерена, позитивна корелација између MVG и серумског нивоа PSA (p<0,01, r=0,569). Анализиран је и однос MVG и Gleason-овог скора. Није утврђена нормална расподела Kolmogorov Smirnov-им тестом, па је коришћен Spermanov коефицијент корелације, који доказује да постоји умерена, позитивна корелација између MVG и Gleason-овог скора (p<0,01, r=0,596). Табела 4.8. Корелација између MVG и серумског нивоа PSA Табела 4.9. Корелација између MVG i Gleason-ovog skora 73 Анализа односа између MVG и Gleason-овог скора извршена је и груписањем пацијената у три групе. Прву групу су чинили пацијенти са вредношћу Gleason-овог скора до 5, другу групу чине они са Gleason скором 6 и 7, а трећу оболели са скором већим од 7. Тестом Shapiro-Wilk утврдили смо да подаци немају нормалну дистрибуцију, због чега је примењен Kruskal Wallis-ов тест. Утврђено је да постоји статистички значајна разлика у средњим вредностима између три категорије у које су пацијенти груписани на основу Gleason score-а и MVG.(p<0,0005). Gleason_2 2,001,00,00 C D 10 5_ sr .v r 60.00 40.00 20.00 0.00 33 85 3890 Анализа утицаја MVG на перинеуралном и лимфном инвазијом започета је тестирањем расподеле података. Тестом Shapiro-Wilk утврдили смо да расподела података одступа од нормалне, због чега је примењен Mann-Whitney-јев тест. Добијени резултат указује да не постоји значајна разлика у нивоу MVG у и присуства перинеуралне инвазије (p=0,755). Међутим анализа односа MVG и постојања лимфне инвазије указује да постоји статистички значајна разлика између ова два параметра (након Kolmogorov-Smirnov-овог теста расподеле података, Mann-Whitney тест, p<0.0005). Табела 4.10. Однос између MVG и прогностичких група према Gleason skoru 74 li 1,00,00 C D 10 5_ sr .v r 60.00 40.00 20.00 0.00 Анализа података о MVG и присуству метастаза показује да не постоји нормална расподела (Shapiro-Wilk), због чега је примењен Mann-Whitney тест. Добијена је статистички значајна зависност између ова два параметра (p<0,0005). meta 1,00,00 C D 10 5_ sr .v r 60.00 40.00 20.00 0.00 34 86 Табела 4.11. Однос између MVG и присуства лимфне инвазије Табела 4.12. Однос између MVG и присуства метастатске болести 75 Следећа анализа је дефинисала однос између стадијума болести и MVG. Shapiro- Wilk тестом утврдили смо да подаци немају нормалну расподелу и применили смо Kruskal Wallis-ов тест.Добијени резултат показује да постоји статистички значајна разлика у MVG у зависности од стадијума (p<0,0005). Test Statisticsa,b 41,643 3 ,000 Chi-Square df Asymp. Sig. CD105_sr.vr Kruskal Wallis Testa. Grouping Variable: stadijumb. stadijum 3,002,001,00,00 C D 10 5_ sr .v r 60.00 40.00 20.00 0.00 34 86 Подаци о MVG и процентуално израженој експресији VEGF-а немају нормалну расподелу (Kolmogorov Smirnov). Применом Spearman-овог коефицијента корелације утврдили смо да постоји статистички значајна, позитивна, јака корелација између ових параметара (p<0,0005; r=0,731). Корелација је још јаче изражена, а статистичка значајност већа када се експресија VEGF-а изрази преко осмостепеног скора (p<0,0005; r=0,745). Табела 4.13. Однос између MVG и стадијума туморске болести 76 Анализа односа експресије VEGF-а и других клиничко-морфолошких параметара Kolmogorov-Smirnov показује да распоедела података о експресији VEGF-а и волумена простате није нормална. Sperman-ов коефицијент корелације показује да постоји умерена, позитивна корелација (п<0,0005; р=0,426). Sperman-ов коефицијент корелације показује умерену, позитивну корелацију и између VEGF експресије и серумског нивоа PSA (p<0,0005; r=0.531). Такође, укључивањем Gleason-овог скора у статистичку анализу добијени су слични резултати. Sperman-ов коефицијент корелације показује умерену, позитивну корелацију између експресије VEGF-а и Gleason-овог скора (p<0,0005; r=0.591). Табела 4.14. i 4.15. Корелација између MVG и експресије VEGF-a(izrаžеne % i skorom) Табела 4.16. i 4.17. Корелација између експресије VEGF-a и волумена односно PSA 77 Тестом Shapiro Wilk доказујемо да нормална расподела изостаје. Примењујемо Mann Whitney-ев тест, који показује да не постоји значајна разлика у средњим вредностима експресије VEGF-а у зависности од присуства перинеуралне инвазије (p=0,848). Међутим, Mann Whitney-евим тестом показујемо да постоји статистички значајна разлика у средњим вредностима експресије VEGF-а и присуства лимфне инвазије. li 1,00,00 VE G F_ pr oc 80.00 60.00 40.00 20.00 37 89 Tабела 4.18. Корелација између експресије VEGF-a i Gleason skora Табела 4.19. Однос између експресије VEGF-a и лимфне инвазије 78 Тестом Shapiro Wilk показујемо да подаци о експресији VEGF-а и присуству метастаза у костима немају нормалну расподелу. Mann Whitney тестом налазимо да постоји статистички значајна разлика у средњим вредностима екпресије VEGF-а и присутва удаљених метастаза (p<0.0005). meta 1,00,00 VE GF _p ro c 80.00 60.00 40.00 20.00 13 3765 89 Логичан следи је и резултат Kruskal Wallis-овог теста који указује да експресија VEGF-а статистички значајно зависи и од стадијума болести, што је већи већа је и експресија VEGF-а (p<0.0005). Подаци немају нормалну расподелу (Shapiro Wilk). Test Statisticsa,b 37,130 3 ,000 Chi-Square df Asymp. Sig. VEGF_proc Kruskal Wallis Testa. Grouping Variable: stadijumb. Клинички, кроз Уролошки конзилијум је праћено укупно 100 пацијената у периоду од 36 месеци. Након периода од 36 месеци прогресија болести је забележена код 60 пацијената тј.код 60%. Применом Log rank теста анализирали смо разлике у преживљавању у односу на медијану MVG ( низак степен вс. висок степен). Постоји значајна разлика између ове две групе пацијената (p<0,0005). Наиме у групи пацијената код којих је постојао низак степен неоангиогенезе прогресија болести је забележена код Tабела 4.20. Однос између експресије VEGF-a и присуства метастаза 79 38,89% (14/36), а у другој групи, високог степена неоангиогенезе, прогресија је забележена код 90% (36/40) болесника. relaps 30.0020.0010.000.00 Cu m S ur vi va l 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Survival Function relaps 40.0030.0020.0010.000.00 C u m S u rv iv al 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1,00-censored ,00-censored 1,00 ,00 CD105_medijana Survival Functions Tабела 4.21. Утицај MVG на време до појаве првог релапса болести Tабела 4.22. Утицај MVG на време до прогресије болести 80 Резултати добијени статистичком анализом података групе оперисаних пацијената У групи оперисаних пацијената (N=44) најстарији пацијент је имао 73 а најмлађи 50 година. Просечна старост износила је (аритметичка средина ± стандардна девијација) 62,23±5,31. Просечна вредност серумског маркера PSA била је 5,68±2,99. Nајвиша забележена вредност била 13,10 а најнижа 2,10. У I стадијуму болести било је 30 пацијената тј. 68,2% а у II стадијуму било је 14 пацијента тј.31,8%. Просечна величина тумора у милиметрима била је 17±8,64 (распон од највећег 43 а најмањег 8мм). Учесталост и заступљеност Gleason скора у групи оперисаних пацијената је био следећи: Tабела 4.23. Заступљеност стадијума болести код оперисаних пацијената Tабела 4.24. Заступљеност вредности Gleason скора код оперисаних пацијената 81 Када смо све пацијенте на основу Gleason sкор класификовали у три групе добили смо следећу заступљеност. У групи оперисаних пацијената просечна вредност MVG (измерене преко експресије CD105), израчуната као аритметичка средина екпресије у три жаришта била је 24±12,57. Просечна вредност екпресије VEGF изражена у процентима била је 44,09±27,73. Због природе добијених података за испитивање корелације између MVG и вредности серумског PSA индиковано је утврђивање Spearman-овог коефицијента корелације. Испитивањем нормалности расподеле тестом Shapiro Wilk утврдили смо да испитиване варијабле одступају од нормалне дистрибуције. Spearman- овим тестом, нашли смо да постоји позитивна, јака, статистички значајна корелација (p = 0,807, r = 0,000) Tабела 4.25. Заступљеност Gleasona класираних у 3 прогностичке групе Tабела 4.26. Корелација између MVG и серумског нивоа PSA 82 Како бисмо утврдили разлику у MVG у зависности од стадијума, испитали смо нормалност расподеле уз одређивање неких дескриптивних параметара. Тестом Shapiro Wilk смо запазили да једна од варијабли MVG за стадијум 1 нема нормалну расподелу због чега је индикована примена Mann Whitney-евог теста. У I стадијуму било је 30, а у II стадијуму било је 14 пацијената. Применом Mann Whitney-евог теста утврдили смо да постоји статистички значајна разлика у експресији CD105 у зависноти од стадијума (p<0,0005). Stadijum 1,00,00 C D 10 5_ sr .v r 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 6 28 1 23 За утврђивање корелације између MVG и величине тумора применили смо Сперман-ов коефицијент корелације због природе добијених података. Дистрибуција одступа од нормалне. Постоји јака, позитивна корелација између ових параметара (p<0,0005, r=0,828) Tабела 4.27. Однос између MVG i стадијума туморске болести 83 Како смо утврдили да изостаје нормална дистрибуција података, Sperman-овим коефицијентом корелације смо утврђивали везу између Gleason-овог скора и MVG. Постоји јака, позитивна корелација између ових параметара (p<0,0005, r=0,729). Како су пацијенти класификовани на основу Gleason скора у три групе занимало нас је да утврдимо да ли постоји статистички значајна разлика у MVG између поменутих група. Испитали смо нормалност расподеле тестом Shapiro Wilk, а како није утврђена нормална расподела применили смо Kruskal Wallis-ов тест који указује да постоји статистички значајна разлика у MVG између ових група (p<0,0005). Tабела 4.29. Корелација између MVG i Gleason skora Tabela 4.28. Korelacija između MVG i veličine tumora 84 Занимала нас је и корелација између MVG и процентуалне експресије VEGF-а. Испитали смо и утврдили да подаци немају нормалну расподелу. Примењен је Spearman- ов коефицијент корелације којим смо утврдили да постоји јака, позитивна корелација између ових параметара (p<0,0005, r=0,826). Gleason_2 2,001,00,00 C D 10 5_ sr .v r 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 12 34 Tабела 4.30. Однос између MVG i Gleason прогностичких група Tабела 4.31. Корелација између MVG i експресије VEGF-a (%) 85 Занимала нас је и корелација између MVG и екпресије VEGF-а изражене кроз осмостепени скор. Испитали смо и утврдили да подаци немају нормалну расподелу. Применом Spearman-овог коефицијента корелације утврдили смо да, постоји јака, позитивна корелација између испитиваних параметара (p<0,0005, r=0,746). Пошто су два патолога очитавала MVG на почетку смо желели да утврдимо да ли постоји значајна разлика у очитавању резултата. Утврдили смо да вредности немају нормалну дистрибуцију, због чега је примењен Mann Whitney-ев тест. Test Statistics(a) CD105_ocitano Mann-Whitney U 956,000 Wilcoxon W 1946,000 Z -,100 Asymp. Sig. (2- tailed) ,920 a Grouping Variable: patolog Nе постоји значајана разлика у очитавању резултата (p>0,05) што интерпретацију резултата чини валидном. Средња вредност (медијана)у очитавању код првог патолога Tабела 4.32. Корелација између MVG и експресије VEGF-a (score) 86 износила је 20,83% (13,33; 33,67) а код другог 17,65% (13,33; 35) што значи да је неслагање у просеку мање од 3%. Подаци о нивоу PSA и експресији VEGF-а немају нормалну расподелу (тест Shapiro Wilk), због чега смо применили Spermanov коефицијент корелације. Резултат теста је показао да постоји јака, позитивна корелација између ова два параметра (p<0,0005; r=0,886). Тестом Shapiro Wilk показујемо да подаци о експресији VEGF-а у односу на друге параметре (величина тумора, Gleason-овог скора и стадијума болести) немају нормалну patolog 1,00,00 C D 10 5_ oc ita no 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 Tабела 4.34. Корелација између експресије VEGF-a и серумског нивоа PSA Tабела 4.33. Разлика у очитавању резултата између два патолога 87 дистрибуцију. Mann Whitney-евим тестом показујемо да постоји значајна разлика у средњим вредностима у екпресији VEGF-а у односу на стадијум болести (p<0,0005). Spearman-овим коефцијентом корелације показали смо да постоји позитивна, јака корелација између ових параметара (p<0,0005; r=0,775). Spearmanovim коефицијентом корелације показујемо да постоји јака, позитивна корелација између експресије VEGF-а и Gleason-овог скора (p<0,0005; r=0,836). Stadijum 1,00,00 VE GF _p ro c 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Tабела 4.36. Корелација између експресије VEGF-a и величине тумора Tабела 4.35. Однос између експресије VEGF-a i стадијума туморске болести 88 Слична зависност се добија и Kruskal Wallis-овим тестом којим доказујемо да постоји статистички значајна разлика у експресији VEGF-а у зависности од категорија у које су пацијенти груписани на основу Gleason score-а (p<0,0005). Gleason_2 2,001,00,00 VE GF _p ro c 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Резултати добијени поређењем података групе оперисаних пацијената према групи биоптираних пацијената Tабела 4.37. Корелација између експресије VEGF-a i Gleason skora Tабела 4.38. Однос експресије VEGF-a и прогностичких група према Gleason skoru 89 Медијана на основу које је класификована варијабла MVG је вредност од 19.835. Тестом Shapiro Wilk утврдили смо да подаци имају нормалну дистрибуцију и за поређење аритметичких средина применићемо Studentov t тест. Постоји статистички значајна разлика у старости пацијената у ове две групе. У групи биоптираних пацијената старoст је износила 74,46±4,23 а у групи оперисаних 62,23±5,31. Подаци о вредности серумског PSA и Gleason-овом скору немају нормалну расподелу (Shapiro Wilk). Применом Mann Whitney-евог теста, показујемо да постоји статистички значајна разлика у средњим вредностима PSA, као и Gleason-овом скору између групе биоптираних и оперисаних пацијената. Tабела 4.39. Разлика у старости између биоптираних и оперисаних пацијената 90 biop_op 1,00,00 PS A 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 biop_op 1,00,00 G le as on _1 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 20 72 Како су пацијенти класификовани на основу Gleason-овог скора у три групе занимало нас је да утврдимо да ли постоји статистички значајна разлика између поменутих група. Применом Pearson-ovog χ2 теста показали смо да постоји статистички значајна веза између ових група код биоптираних и оперисаних пацијената (p<0.0005). Tабела 4.40. Разлика у вредности PSA између биоптираних и оперисаних пацијената Tабела 4.41. Разлика у Gleason скору између биоптираних и оперисаних пацијената 91 Такође, у ове две испитиване групе постоји и разлика између стадијума болести,. Применом Pearson-ovog χ2 теста показали смо да постоји статистички значајна разлика (p<0.0005). Првенствено нас је у овом сегменту анализе интересовало да ли постоји разлика у MVG између група биоптираних наспрам оперативних случајева карцинома простате. Анализирани подаци немају нормалну расподелу (Shapiro-Wilk). Применом Mann Tабела 4.42. Разлика у прогностичким Gleason групама Tабела 4.43. Заступљеност стадијума болести код биоптираних и оперисаних пацијената 92 Whitney-евог теста показали смо да не постоји разлика у MVG у групама оперисаних и биоптираних пацијената (p=0.076). Међутим, ако MVG класификујемо на основу медијане у групу карцинома са ниским тј високим степеном неоангиогенезе, онда постоји разлика статистичког значаја између група оперисаних и биоптираних пацијената (p=0.0036). Разлика у екпресији VEGF-процента између биопсија и операција Применом Shapiro-Wilk теста утврђујемо да подаци немају нормалну расподелу Test Statisticsa 1038,000 2028,000 -3,499 ,000 Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) VEGF_proc Grouping Variable: biop_opa. Tабела 4.44. Однос MVG код биоптираних и оперисаних пацијената 93 Mann Whitney-евим тестом показујемо да постоји значајна разлика у средњим вредностима VEGF-а између оперативних и биоптираних узорака. biop_op 1,00,00 VE G F_ pr oc 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Разлику у VEGF-скор између биопсија и операција није било могуће урадити због величине узорка и константи које се јављају. Tабела 4.45. Однос експресије VEGF-a код биоптираних и оперисаних пацијената 94 5. ПРИЛОГ РЕЗУЛТАТИМА – ХИСТОЛОШКЕ СЛИКЕ Слика 5.1. Ацинарни аденокарцином простате, Gleason 5 (HE,x10) Слика 5.2. Ацинарни аденокарцином простате, Gleason 8 (HE,x10) 95 Слика 5.3.Ацинарни аденокарцином простате, са перинеуралном инвазијом (HE,x20) Слика 5.4.Ацинарни аденокарцином простате, Gleason skor 8 (HE, x40) 96 Слика 5.5.Ацинарни аденокарцином простате, Gleason skor 8 (HE,x20) Слика 5.6.Ацинарни аденокарцином простате, Gleason skor 4 (HE,x20) 97 Слика 5.8.Ацинарни аденокарцином простате, инвазија капсуле без пробијања (HE, x20) Слика 5.7.Ацинарни аденокарцином простате, без инвазије капсуле (HE,x20) 98 Слика 5.9.Ацинарни аденокарцином простате, инвазија нерва у капсули (HE, x20) Слика 5.10.Ацинарни аденокарцином простате, Gleason skor 10 (HE,x40) 99 Слика 5.11. Експресија VEGF-a у биоптичком узорку простате (IHH,VEGF, x10) Слика 5.12. Експресија VEGF-а у биоптичком узорку простате (IHH,VEGF, x10) 100 Слика 5.13. Eкспресија VEGF-a у биоптичком узорку простате (IHH,VEGF, x20) Слика 5.14. Експресија VEGF-a у биоптичком узорку простате (IHH,VEGF, x40) 101 Слика 5.15. Експресијa VEGF-a у оперативном материјалу (IHH,VEGF, x40) Слика 5.16. VEGF негативност у оперативном материјалу (IHH,VEGF, x20) 102 Слика 5.17. Експресија VEGF-a са негативном унутрашњом контролом (IHH,VEGF,x20) Слика 5.18.Експресијa VEGF-a са позитивном унутрашњом контролом (IHH,VEGF,x20) 103 Слика 5.19. Eкспресија VEGF-a u оперативном материјалу (IHH, VEGF, x40) Слика 5.20. VEGF негативан карцином простате (оперативни материјал) (IHH,VEGF, x40) 104 Слика 5.21. Eкспресија VEGF-a у узорку бенигне,контролне простате (IHH, VEGF, x40) Слика 5.22. VEGF негативност, са + унутрашњом контролом, у бенигној простати (IHH,VEGF,x20) 105 Слика 5.23. Зона највеће MVG - „hot spot area“ (IHH, CD105, x10) Слика 5.24. MVG – васкуларни простори обележени ендоглином (IHH, CD105, x40) 106 Слика 5.25. MVG – васкуларни простори обележени ендоглином (IHH, CD105, x40) Слика 5.26. MVG – васкуларни простори обележени ендоглином (IHH, CD105, x40) 107 Слика 5.27. MVG граничне интра-перитуморске зоне (IHH, CD105, x40) Слика 5.28. MVG перитуморске зоне (IHH, CD105, x40) 108 Слика 5.29. MVG, низак степен неоангиогенезе (IHH, CD105, x40) Слика 5.30. MVG, висок степен неоангиогенезе (IHH, CD105, x40) 109 Слика 5.31. MVG, низак степен неоангиогенезе (IHH, CD105, x40) Слика 5.32. MVG, висок степен неоангиогенезе (IHH, CD105, x40) 110 6. ДИСКУСИЈА Аденокарцином простате је најчешћи малигнитет код мушкараца у Америци, док се у Европи налази на другом месту по учесталости.177 Његова инциденција расте са старошћу, при чему у највећем броју случајева има дугогодишњи индолентни ток, а само мали проценат показује велику клиничку агресивност и лошу прогнозу.177,178 Управо из ових разлога, проучавање прогностичких и предиктивних фактора има велики значај за селекцију пацијената који ће имати највећи бенефит од цитотоксичних хемиотерапијских протокола лечења. Прогностички фактори су индикатори биолошке агресивности тумора и могу се користити за предикцију тока и исхода болести. Дефинишу се као било које мерење доступно у времену дијагнозе или операције које је повезано са генералним или преживљавањем без болести у одсуству адјувантне терапије и укључују карактеристике пацијента и тумора. Предиктивни фактори се дефинишу као карактеристике повезане са одговором или недостатком одговора на терапију. Код карцинома простате нема правих предиктивних фактора, као што је то случај са малигнитетима неких других локализација. Рецимо, статус андрогених рецептора не предвиђа одговор на хормонску терапију, као што то чини статус естрогених рецептора код карцинома дојке који је један од најснажнијих познатих предиктора. Зато је код карцинома простате фокус у истраживања усмерен ка прогностичким факторима и они се стандардно деле у три категорије.179 Прва категорија обухвата факторе препоручене за рутински рапорт и чине их вредност иницијалног серумског PSA, Gleason-ов скор или хистолошки градус, стадијум болести и статус хируршких маргина. У другу и трећу категорију спадају фактори који се рутински не препоручују због мање или више инсуфицијентних података о њиховом значају и то су ДНК-плоидија, волумен тумора у игленој биопсији или радикалној простатектомији, хистолошки тип, микроваскуларна густина, генетски и неуроендокрини маркери, пролиферациони и апоптотски маркери, статус андрогених рецептора, перинеурална, лимфна и васкуларна инвазија. Простатични специфични антиген (PSA) је протеин чију синтезу кодира ген лоциран на 19 хромозому. Продукују га епителне ћелије дуктуса и ацинуса простате и 111 директно га излучују у каналикуларни систем. Кључни је фактор у скринингу за детекцију карцинома простате, а ниво PSA у серуму у тренутку постављања дијагнозе је важан маркер који сврастава пацијенте у различите прогностичке категорије. Бројна истраживања доказују да је висок ниво PSA у корелацији са лошом прогнозом и већим степеном раширености туморске болести.180 Основни недостатак овог дијагностичког маркера је могућност да се увећане вредности могу срести и код неких бенигних стања, првенствено хиперплазије и запаљенских процеса у простати, када су у случају дијагностикованих карцинома могућа одступања у корелацијама са клиничким параметрима. Hаши резултати потврђују ове, већ добро познате чињенице које се и рутински користе у клиничкој пракси; серумски PSA се налази у корелацији са Gleason- овим скором, волуменом и стадијумом болести. Између биоптираних и оперисаних пацијената постоји велика статистички значајна разлика у старости пацијената, нивоу PSA и Gleason-овом скору, што је и логично с обзиром да су ови параметри уједно и критеријуми за операбилност. Имунохистохемијска анализа је показала статистички значајну, умерену корелацију између PSA и MVG односно експресије VEGF-а, у испитиваној популацији, која обухвата и биоптички и оперативни материјал. Hакон терапије ниво PSA омогућава процену клиничког статуса, са дефинисањем комплетне или парцијалне ремисије, као и рецидива или прогресије болести. Gleason-ов скор је други моћан прогностички фактор, а означава модификовани хистолошки градус. Осим прогностичког значаја, битан је и за предвиђање ризика након простатектомије или радиотерапије.181 На основу вредности скора пацијенти се групишу у зону ниског ризика (скор од 2-4), високог степена ризика (скор од 8-10) и интермедијерну групу средњег и не баш потпуно предвидљивог ризика (скор 5-7).182 Hајлошију прогнозу имају пацијенти са Gleason-овим скором од 8-10, а најбољу са вредношћу скора од 2-4.181 Најзначајније корелације су присутне између високог Gleasonовог скора, укупног преживљавања и стадијума болести.183 У нашој испитиваној популацији, у анализираном биоптичком материјалу најзаступљенија вредност Gleason-овог скора је 7 у 40,4% случајева, док је на оперативном материјалу најзаступљенији Gleason-ов скор 6 и то код 41% оболелих, са статистички значајном разликом у вредностима скора између ове две испитиване популације. Такође, у обе испитиване групе постоји статистички значајна позитивна корелација између Gleason-овог скора и микроваскуларне густине односно 112 експресије VEGF-а. Важно је истаћи да су у нашој студији хистолошке Gleason-ове облике очитавала два патолога и да је слагање постигнуто у 97% случајева, а за случајеве неслагања конзензус је постизан заједничком анализом на дискусионом микроскопу и трећим мишљењем. Стадијум туморске болести је трећи главни прогностички фактор за карциноме простате, а поред дефинисања нодалног статуса и присуства тј. одсуства метастаза, кључни су моменти одређивање екстрапростатичне екстензије и инфилтрације семених кесица. Екстрапростатична екстензија означава инфилтрацију капсуле и перипростатичног ткива, и ако је присутна помера болест у вишу категорију, што имплицира и промену утицаја на преживљавање. Ми нисмо добили статистички значајан утицај овог параметра на време до појаве првог релапса, као ни битну корелацију са другим прогностичким факторима. Ово је вероватно повезано са тешкоћама у хистолошком дефинисању присуства перипростатичне инвазије. Hаиме, у постеролатералном сегменту простата нема праву капсулу, а у апексу и антериорном сегменту нема јасне демаркације према околним структурама, што доводи до погрешне интерпретације постојања екстензије.138Грешке у одређивању екстрапростатичне екстензије нема ако је присутна инфилтрација перипростатичног масног ткива, чак и фокално присутна има статистички значајан утицај на преживљавање. Инвазија семених кесица се дефинише кроз присуство малигних ћелија у њиховој мишићној строми и значајан је индикатор прогресије болести. Описују се три механизма инвазије: преко ејакулаторног дуктуса, директно ширење преко перипростатичног масног ткива и појава изолованих туморских плажа без контунуитета са тумором у простате. Резултати и значај су контраверзни, осим у случају документоване екстрапростатичне екстензије.184 Генерално, стадијум болести је велики предиктор прогнозе. Пацијенти у Т3 стадијуму нису кандидати за радикалну простатектомију и обично се третирају радио, хормоно или хемиотерапијом. Међу њима, 50-60% у време дијагнозе има метастазе у лимфним чворовима. Више од половине пацијената развија метастазе унутар 5 година, а око 75% умире унутар 10 година. Код пацијената са стартно дијагностикованом метастатском болешћу трогодишњи морталитет износи око 15%, петогодишњи 80%, што првенствено зависи од одговора на прву линију хормонотерапије. Hасупрот овоме, код пацијената у Т1а стадијуму ризик за прогресију болести унутар 4 године је врло низак и 113 износи око 2%. Ако се не лече, прогресија се бележи од 16 до 25% а клинички ток је индоленатан и дугогодишњи (8-10 година).178 Т1b стадијум је много хетерогенији у градусу, локализацији и волумену од Т2 карцинома. Чешће су нижег градуса, већег волумена и чешће локализовани у прелазној зони, у поређењу са палпабилним карциномима, који су мањег волумена, али локализовани периферно, што омогућава релативно бржу екстензију у перипростатично ткиво.185 Hаша студија је случајним одабиром укључила пацијенте свих стадијума. Од укупно 104 биоптирана испитаника, у IV стадијуму болести се налазило 48,1% оболелих. Већина радикално оперисаних пацијената је била у I стадијуму (68,2%), док се 31,8% налазило у II стадијуму болести. Hашли смо његову статистички значајну везу са нивоом PSA, величином тумора и Gleason-овим скором. Стадијум болести, у обе групе, је статистички значајно утицао на MVG и експресију VEGF-а. Перинеурална инвазија је један од најчешће описиваних прогностичких фактора треће групе значајности. Присутна је у чак 75-84% простатектомија, због чега се и њен прогностички значај губи у анализама. Само једна студија описује да дијаметар перинеуралне инвазије као независтан параметер статистички значајно утиче на време до појаве првог релапса.186 Бројне студије су проучавале и значај присуства перинеуралне инвазије у биоптичком материјалу. Осим чврстих доказа о корелацији са екстрапростатичном екстензијом и повећаном инциденцом прогресије болести након простатектомије, сви остали подаци су опречни.187 Ипак, без обзира на публиковане резултате, препорука је да се перинеурална инвазија и њена опсежност увек нотирају у патохистолошким рапортима. У нашем испитиваном материјалу перинеурална инвазија је била присутна у 52 случаја (50%) ово је у сагласности са литературним подацима, где се инциденца овог параметра креће од 14-53%. Лимфну инвазију смо детектовали у биоптичким узорцима у 13,5%, а у исечцима са простатектомија у 90% случајева. Присуство инвазије лимфних судова статистички значајно утиче на MVG и експресију VEGF-а, док перинеурална инвазија нема утицаја на ове две варијабле. У литератури, велика разлика у добијеним резултатима се објашњава неконзистентним критеријумима за процену лимфноваскуларне инвазије, због могућих артефактно-насталих ретракционих простора на ХЕ обојеним препаратима или строго бројање само имунохистохемијски обележених ендотелом-обложених простора. Hеки аутори су презентовали статистички 114 значај лимфноваскуларне инвазије, а само две референце указују на независтан прогностички значај овог параметра добијен мултиваријансном анализом.188 Биологија карцинома простате је и данас слабо разумљива. Његов настанак је сагледан као вишестепени процес, а обухвата прогресивне промене од нормалног епитела, преко хиперплазије, простатичне интраепителне неоплазије, in situ карцинома, до иназивног карцинома и метастазирања. Суштински, трансформација нормалне у малигну ћелију је резултат бројних генетских алтерација.У стварању малигног фенотипа учествују алтерације великог броја гена, оне се међу собом комбинују, што има за последицу различито клиничко понашање морфолошки идентичних карцинома простате. У центру овог процеса су такозване онкогене мутације или канцер-узрокујуће мутације на критичним генима, који имају водећу улогу у покретању и одржавању пролиферационог циклуса, сигнализирајући ћелијама инхибицију раста или изазивајући ћелијску смрт. Доказано је да један онкоген није довољан за малигну трансформацију, док сарадња између најмање две или више различитих онкогених мутација може да је изазове. Латентни период од појаве прве иницијализоване ћелије до формирања малигног фенотипа (имортализација, митогенеза, антиапоптоза, ангионеогенеза, инвазивност и метастазирање) износи више година, чак и деценију. Управо из ових разлога и највећи број прогностичких фактора карцинома простате другог и трећег реда важности су резултат молекуларних истраживања. То су статус андрогених рецептора, дефинисање неуроендокрине диференцијације, пролиферациони и апоптотски маркери, ДHК-плоидија и микроваскуларна густина као најподеснија мера ангиогенезе. Ангиогенеза је процесс формирања нових крвних судова који обезбеђују нутритивне факторе неопходне за туморски раст и елиминишу продукте метаболизма туморских ћелија.189,190 Hовостворени, туморски крвни судови су аберантни, фенестрирани капилари са тањом базалном мембраном у односу на нормалне.191 Ове особине условљавају повећање пермеабилитета и олакшавање уласка малигних ћелија у циркулацију, чиме се покреће процес метастазирања.192 Ангиогенеза може бити активирана у различитим стадијумима туморске прогресије.193 Folkman је давно показао да су раст, инвазивност и метастазирање зависни од ангиогенезе, и да је захтева сваки раст тумора од једног кубног милиметра.194 Hеки аутори показују да је њено активирање могуће у преинвазивној, па чак и у диспластичној фази туморогенезе.195 Контролишу је 115 бројни ангиогенетски фактори које углавном секретују туморске ћелије. Квантификација васкулатуре у хуманим туморима датира од давне 1991 године када су крвни судови почели да се имунохистохемијски обележавају антителима.196 Ангиогенеза представља још увек само обећавајући прогностички фактор, јер су резултати бројних истраживања код различитих тумора неконзистентни. Рецимо, док су Bossi i Pietra презентовали у својим радовима да ангиогенеза у колоректалним карциномима не пружа ни једну прогностичку информацију, Saclarides i Choi са сарадницима налазе сигнификантно значајну корелацију између неоваскуларизације и преживљавања облелих од ове врсте тумора.197,198 Слични резултати су добијени и проучавањем васкуларизације карцинома грлића материце, ендометријума и дојке коришћењем пан-ендотелијалних маркера, где су потврђене везе између бројности новостворених крвних судова и градуса тумора, дубине инвазије, присуства лифоваскуларне инвазије, стадијума болести и укупног преживљавања.199,200 Бројна истраживања су проучавала и значај неоангиогенезе у карциномима простате.175,201,202,203 Hеке од тих студија указују на повезаност стадијума болести и Gleason-овог скора са ангиогенезом, при чему је васкуларна густина одређивана коришћењем пан-ендотелијалних маркера, као што су вон Willebrand-ov faktor (factor VIII– related antigen), VEGF, CD31 или CD34.201,202 Међутим, разултати истраживања на туморском ткиву других локализација указују да ниједан од ових пан-ендотелијалних маркера није идеалан за проучавање туморске нео-ангиогенезе јер не обележавају само новоформиране крвне структуре и нису специфични само за ендотелне ћелије.204,205 Ендоглин (CD105) је 180kDa хомодимерични гликопротеин изграђен од две субјединице међусобно повезане дисулфидним везама. Функционише као саставни део рецепторског комплекса трансформишућег фактора раста бета. Сматра се да је туморска ангиогенеза стимулисана ендоглином регулисана преко хипоксије, мада нису поуздано познати фактори који индукују продукцију овог молекула.206 Интезивно га експримирају ендотелне ћелије за време туморске ангиогенезе и инфламације, док га васкуларни ендотел слабо или уопште не експримира.207 Малигне ћелије такође продукују ендоглин, мада у знатно мањој концетрацији у односу на ендотелне ћелије.206 Нaкон ове констатације са краја прошлог века, следе бројне молекуларне и имунохистохемијске анализе, са више хиљада публикованих радова и углавном сви они показују много већу 116 сензитивност и специфичност ендоглина у односу на све друге пан-ендотелне маркере.199,208,209,210 VEGF је моћни ангиогенетски фактор раста који стимулише пролиферацију ендотелних ћелија и повећава пермеалибитет микроваскулатуре, а бројни резултати истраживања указују на корелацију између експресије VEGF-а и васкуларне густине.211 Већи број спроведених истраживања указује да је микроваскуларна густина (MVG) значајно већа у примарним туморима код пацијената са метастатском болешћу него код оних без метастаза.212 Такође, разултати указују и на везу између Gleason скор и микроваскуларне густине, а вредности оба параметра у биоптичком материјалу су у позитивној корелацији са екстрапростатичном екстензијом и могу бити снажни предиктори операбилности.205 Добијени резултати зависе од врсте маркера којим се обележавају васкуларне структуре; коришћењем CD31, Rubin и сарадници су нашли статистички значајну повезаност између MVG и стадијума болести или Gleason-овог скора, док рецимо коришћењем фактора VIII, Barth и неки други аутори не проналазе ову повезаност.201,213 Wikstrom sa сарадницима је показао да је MVG у карциномима простате дефинисана коришћењем ендоглина налази у значајној корелацији са преживљавањем, постојањем удаљених и нодалних метастаза, стадијумом болести и Gleason-овим скором.214 Мултиваријансне анализе указују да овако измерена MVG значајно утиче на преживљавање, независно од других прогностичких маркера, што имплицира закључак да је ангиогенеза круцијалан фактор у метастатском процесу и прогресији карцинома простате.214 Наши резултати се делимично сагласни са закључцима Wикстрома; MVG измерена преко експресије ендоглина је у корелацији са PSA, Gleason-овим скором, присуством лимфне инвазије и стадијумом болести.214 Суштински, већина аутора се слаже да су два кључна проблема разлог за добијање не конзистентних резултата. Први је селектована популација, а други је врста маркера ангиогенезе који се користи у истраживању и начин очитавања микроваскуларне густине. На пример, у неким студијама су укључени пацијенти само са Gleason скором од 5 до 7, у другим само пацијенти у Т2 стадијуму болести или само са метастатском болешћу, а анализа се често ограничавала само на биоптичком или само на оперативном материјалу.215 Наше истраживање нема ових ограничења; укључени су пацијенти у различитим фазама туморске болести, са различитим Gleason-овим скором, клинички ток 117 код свих је праћен преко конзилијарних одлука, датум смрти преко матичне књиге умрлих, а коришћен је и биоптички и оперативни материјал. Други веома важан моменат је избор антитела у евалуацији MVG. У литератури још увек не постоји консензус који маркер микроваскулатуре је најподесији за овакву врсту истраживања. За сада је познато да је основни недостатак CD34, CD31 и фактора VIII маркирање нормалних крвних судова.216 Фаkтор VIII са великом сензитивношћу боји велике крвне судове, мање се експримира у капиларима и неоангиогенетској васкулатури, а специфичан је и за лимфатике, што условљава да у резултатима бројних студија не показује битне корелације са преживљавањем и другим клиничким параметрима.214 Трансмембрански гликопротеин CD31 (platelet-endothelial cell adhesion molecule) је други ендотелни маркер који се често употребљава у обележавању васкулатуре, као један од најсензитивнијих пан-ендотелијалних маркера.216 Маркира велике и мале крвне судове различитим интензитетом, како у нормалном тако и у туморском ткиву. Међутим, експримирају га и плазмоцити, запаљенске ћелије, чак и туморске ћелије, што знатно отежава имунохистохемијску анализу. Некада изостаје маркирање интратуморских крвних судова и доводи до појаве лажно негативних резултата, што му је највећи недостатак.217 Неке студије управо из ових разлога дају предност CD34 молекулу у детекцији неоваскулатуре. CD34 представља антиген мијелоидно-ћелијских прогенитора који се детектује на свим типовима ендотела.216 Осим ендотелних ћелија експримирају га друге мезенхималне ћелије, периваскуларне стромалне ћелије, а некад и лимфних судови, што доводи до грешке у интерпретацији резултата.218 Због ових чињеница CD34 се све ређе користи у анализи неоангиогенезе, а предност се све више даје ендоглину. Ендоглин (CD105) као површинско-ћелијски рецептор за трансформишући фактор раста, експримира се само у пролиферишућим ендотелним ћелијама у оквиру туморске неоангиогенезе. У нашем истраживању, ендоглин је присутан у свим случајевима, и заиста интензивно маркира интратуморске и перитуморске крвне судове, док је његова експресија слаба или не постоји у ненеопластичном ткиву. Даље, ендоглин не реагује са стромалним и запаљенским ћелијама, што олакшава очитавање резултата. Овај налаз је у сагласности са извештајима других аутора, што му редукујући број лажно негативних налаза даје огромну предност у односу на друге пан-ендотелијалне маркере. Такође, 118 прегледом литературе и резултата студија које су се бавиле поређењем различитих панендотелних маркера, углавном се добијају подаци који указују на знатно јачу корелацију ендоглином измерену MVG са клиничко-прогностичким параметрима. Неке од тих студија чак показују да је ендоглинска MVG независтан прогностички фактор у карцинома простате.214,216 Могући разлог за различитост у добијеним резултатима лежи и у комплексности тј. начину одређивања MVG. У нашем истраживању, MVG су очитавала два патолога, независно један од другог и без приступа клиничким подацима. За имунохистохемијско обележавање васкулатуре је коришћен ендоглин, евалуација се вршила на једном хистолошком пресеку сваког случаја након заједнички дефинисаних зона најгушће експресије само унутар тумора тј. након дефинисања такозваних “врућих тачака” (hot spot areas). Због прецизне идентификације и лакше квантификације микроваскулатуре коришћено је увек средње увеличање микроскопа (x200, 0,739мм2). Раст малигног тумора и његов метастатски потенцијал првенствено зависе од индукције ангиогенезе, која је посредована бројним ангиогенетским факторима раста. Један од најмоћнијих међу њима је васкуларни ендотелни фактор раста (VEGF).205 VEGF је високо специфичан и селективан митоген за васкуларни ендотел. Индукује пролиферацију и миграцију ендотелних ћелија ин витро, уз инхибирање апоптозе. In vivo VEGF промовише ангиогенезу повећавајући пермеабилност крвних судова, а његова овер експресија је увек повезана са израженом неоангиогенезом. У експерименталним условима, терапијска блокада VEGF-а инхибира раст примарног и метастатског тумора. И на моделу тумора простате доказана је веза између експресије VEGF и метастатског капацитета. Показано је да инхибиција VEGF-а супримира раст и метастатску дисеминацију карцинома простате.219 Такође, серумска концетрација VEGF-а је значајно већа код пацијената са метастатском болешћу него код оних са локализованим процессом.205,168 Експресију VEGF-а могу индуковати различити фактори: хипоксија, оштећења тумор-супресорских гена (мутација p53), цитокини (интерлеукин 1 и интерлеукин 6), онкогени (v-Raf i v-Src), фактори раста (трансормишући фактор бета и инсулински фактор раста), хормоне (прогестини) итд. Резултати нашег истраживања показују да је VEGF у статистички значајној корелацији са вредношћу серумског PSA, Gleason-овим скором, лимфатичном инвазијом, 119 стадијумом болести и временом до појаве првог релапсе болести. Овакав налаз сугерише да је VEGF значајан фактор у покретању и одржавању туморске ангиогенезе у простатичним карциномима. Истовремено експресија VEGF-а је у снажној позитивној корелацији са експресијом ендоглина тј. MVG, што је раније већ презентовано бројним истраживањима на малигним туморима других локализација.220,221 Поред чињенице да је у нашем истраживању, просечна вредност експресије VEGF-а код испитиваних оперативно лечених карцинома била 44% а код биоптираних узорака 64%, важна је и чињеница да је та експресија у значајној, снажној позитивној корелацији са MVG. Ово потврђује улогу VEGF-а у формирању микроваскулатуре, вероватно преко подстицања пролиферације и миграције ендотелних ћелија, мада се не искључује ни утицај на улазак туморских ћелија у циркулацију повећањем пермеабилитета новостворених крвних судова. Огроман број истраживања се бавила утицајем експресије VEGF-а на друге клиничке параметре. Објављени резултати су делом опречни, и крећу се од налаза да је експресија VEGF-а независан прогностички фактор у предикцији прогнозе, до не постојања никаквих статистички значајних веза. VEGF и MVG измерена преко експресије ендоглина су обећавајући прогностички маркери за карциноме простате, и вероватно ће у будућности постати стандард за селекцију пацијената високог степена ризика за развој метастатске болести. У исто време нађене снажне корелације са преживљавањем и другим прогностичким параметрима, првенствено Gleason-овим скором и стадијумом болести, имплицирају неопходност даљих истраживања, првенствено у смеру могућности да се у оквиру рандомизованих трајала дефинишу могућности употребе ових резултата у откривању нових модалитета антиангиогенетске терапије. 120 7. ЗАКЉУЧЦИ  У групи биоптираних пацијената просечна вредност MVG израчунате кроз аритметичку средину броја васкуларних структура у три жаришта износила је 31,69±22,38, док је у групи оперисаних пацијената износила 24±12,57, са нађеном статистички значајном разликом између ових група.  Дискрепанца између очитавања експресије од стране два патолога износила је 0,5% на биоптичком тј. 3% на оперативном материјалу, што не показује статистички значајну разлику и чини резултате валидним.  У групи биоптираних пацијената просечна вредност експресије VEGF-а износила је 63,68±26,57, док је у групи оперисаних пацијената износила 44,09±27,73, са нађеном статистички значајном разликом између ових група.  Између испитиваних група (оперисани и биоптирани пацијенти), присутна је и статистички значајна разлика у старости, серумском нивоу PSA, вредности Gleason овог скора и стадијума болести.  У обе испитиване групе (оперисани и биоптирани пацијенти), MVG и експресија VEGF-а (изражена % и методом скора) су у позитивној корелацији са серумским нивоом PSA, волуменом простате односно величином тумора и Gleason-овим скором.  У обе испитиване групе (оперисани и биоптирани пацијенти), присутна је статистички значајна разлика између експресије VEGF-а (изражене % и методом скора) и MVG и присуства лимфне инвазије, стадијума болести и присуства метастатских депозита.  У обе испитиване групе (оперисани и биоптирани пацијенти), присутна је статистички значајна позитивна корелација између експресије VEGF-а (изражене % и методом скора) и MVG.  Након клиничког праћења од 36 месеци, прогресија болести је забележена код 60% биоптираних пацијената и код 100% оперисаних пацијената. 121  MVG тј. степен неоангиогенезе статистички значајно утиче на време до прогресије болести; код биоптираних пацијената са ниским степеном неоангиогенезе (MVG), прогресија болести је забележена у 38,89% случајева, а код биоптираних пацијената са високим степеном неоангиогенезе (MVG), прогресија је забележена у 90%. 122 8. ЛИТЕРАТУРА 1. Bumbarasević V, Lačković V, Milićević NM, Milićevic Ž, Mujović S, Obradović M, Pantić SB, Stefanović BD, Tripac D. Histologija Medicinski fakultet, Beograd 2005. 2. Gartner I.P, Hiaatt JL. Color textbook of Histology. WB Saunders Company, Philadelphia-Tokio, 2006. 3. Popov I, Radošević Jelić Lj, Prostate specific antigen (PSA) in the diagnosis and treatment of prostate carcinoma, advances and controversies. Srp Arh Celok lek, 2001; 129(5-6):159-162. 4. Bostwick DG, Liu L, Brawer MK, Qian J. High-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Rev Urol, 2004; 6:171–179. 5. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer statistics, 2010. CA Cancer J Clin 2011; 60: 277–300. 6. Steiner MS. High grade prostatic intraepithelial neoplasia is a disease. Curr Urol Rep, 2001; 2: 195–198. 7. Sakr WA, Billis A, Bostwick DG, Ekman P, Wilt T. Epidemiology of high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Scand J Urol Nephrol, 2000; 205: 11–18. 8. Stamatiou K, Alevizos A, Agapitos E, Sofras F. Incidence of impalpable carcinoma of the prostate and of non-malignant and precarcinomatous lesions in Greek male population: an autopsy study. Prostate, 2006; 66: 1319–1328. 9. Tan PH, Tan HW, Tan Y, Lim CN, Cheng C, Epstein JI. Is high-grade prostatic intraepithelial neoplasia on needle biopsy different in an Asian population: a clinicopathologic study performed in Singapore. Urology, 2006; 68: 800–803. 10. Bostwick DG, Qian J. High-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Mod Pathol, 2004; 17: 360–379. 11. Bostwick DG, Amin MB, Dundore P, Marsh W, Schultz DS. Architectural patterns of high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Hum Pathol, 1993; 24: 298–310. 12. Berman DM, Yang J, Epstein JI. Foamy gland high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol, 2000; 24: 140–144. 123 13. Argani P, Epstein JI. Inverted (hobnail) high-grade prostatic intraepithelial neoplasia (PIN): report of 15 cases of a previously undescribed pattern of high-grade PIN. Am J Surg Pathol, 2001; 25: 1534–1539. 14. Melissari M, Lopez Beltran A, Bostwick DG et al. High grade prostatic intraepithelial neoplasia with squamous differentiation. J. Clin. Pathol. 2006; 59: 437–439. 15. Bonkhoff H, Stein U, Remberger K. The proliferative function of basal cells in the normal and hyperplastic human prostate. Prostate, 1994; 24: 114–118. 16. Gologan A, Bastacky S, McHale T, Yu J, Cai C, Monzon- Bordonaba F, Dhir R. Age- associated changes in alpha-methyl CoA racemase (AMACR) expression in nonneoplastic prostatic tissues. Am J Surg Pathol, 2005; 29: 1435–1441. 17. Wu CL, Yang XJ, Tretiakova M et al. Analysis of alphamethylacyl-CoA racemase (P504S) expression in high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Hum Pathol, 2004; 35: 1008–1013. 18. Amin MM, Jeyaganth S, Fahmy N et al. Subsequent prostate cancer detection in patients with prostatic intraepithelial neoplasia or atypical small acinar proliferation. Can Urol Assoc J, 2007; 1: 245–249. 19. Oderda M, Gontero P. High-grade prostatic intraepithelial neoplasia and atypical small acinar proliferation: is repeat biopsy still necessary? BJU Int, 2009; 104: 1554–1556. 20. Ploussard G, Plennevaux G, Allory Y, Salomon L, Azoulay S, Vordos D, Hoznek A. High-grade prostatic intraepithelial neoplasia and atypical small acinar proliferation on initial 21- core extended biopsy scheme: incidence and implications for patient care and surveillance. World J Urol, 2009; 27: 587– 592. 21. Thompson IM, Lucia MS, Redman MW et al. Finasteride decreases the risk of prostatic intraepithelial neoplasia. J Urol, 2007; 178: 107–109. 22. De Marzo AM, Marchi VL, Epstein JI et al. Proliferative inflammatory atrophy of the prostate: implications for prostatic carcinogenesis. Am J Pathol, 1999; 155: 1985–1992. 23. Bostwick DG, Kochar P, Hossain D et al. High-grade prostatic intraepithelial neoplasia and atypical small acinar proliferation are significant cancer risk factors: Follow-up study of 1476 cases. J Urol, 2009; 181: 752-757. 124 24. Tsujimoto Y, Takayama H, Nonomura N, Okuyama A, Aozasa K.Postatrophic hyperplasia of the prostate in Japan: histologic and immunohistochemical features and p53 gene mutation analysis. Prostate, 2002; 52: 279–287. 25. Mikuz G, Algaba F, Beltran AL, Montironi R. Prostate carcinoma: atrophy or not atrophy that is the question. Eur Urol, 2007; 52: 1293–1296. 26. Bostwick DG, Ma J. Over-diagnosis of high-grade prostatic intraepithelial neoplasia: a prospective study of 251 cases. BJU Int, 2007; 100: 1036–1039. 27. Tomas D, Kruslin B, Rogatsch H, Scha¨fer G, Belicza M, Mikuz G. Different types of atrophy in the prostate with and without adenocarcinoma. Eur Urol, 2007; 51: 98–103. 28. Gurel B, Iwata T, Koh CM et al. Nuclear MYC protein overexpression is an early alteration in human prostate carcinogenesis. Mod Pathol, 2008; 21:1156–1167. 29. Perner S, Mosquera JM, Demichelis F et al. TMPRSS2-ERG fusion prostate cancer: an early molecular event associated with invasion. Am J Surg Pathol, 2007; 31:882–888. 30. De Marzo AM, Platz EA, Epstein JI et al. A working group classification of focal prostate atrophy lesions. Am J Surg Pathol, 2006; 30: 1281–1291. 31. Hameed O, Humphrey PA. Pseudoneoplastic mimics of prostate and bladder carcinomas. Arch Pathol Lab Med, 2010; 134: 427–443. 32. Przybycin CG, Kunju LP, Wu AJ, Shah RB. Partial atrophy in prostate needle biopsies: a detailed analysis of its morphology, immunophenotype, and cellular kinetics. Am J Surg Pathol, 2008; 32: 58–64. 33. Berney DM, Fisher G, Kattan MW et al. Pitfalls in the diagnosis of prostatic cancer: retrospective review of 1791 cases with clinical outcome. Histopathology, 2007; 51: 452– 457. 34. Cheng L, Bostwick DG. Atypical sclerosing adenosis of the prostate: a rare mimic of adenocarcinoma. Histopathology, 2010; 56: 627–631. 35. Bostwick DG, Meiers I. Diagnosis of prostatic carcinoma after therapy. Arch Pathol Lab Med, 2007; 131: 360–371. 36. Gaudin PB, Wheeler TM, Epstein JI. Verumontanum mucosal gland hyperplasia in prostatic needle biopsy specimens: a mimic of low grade prostatic adenocarcinoma. Am J Clin Pathol, 1995; 104: 620–626. 125 37. Bostwick DG, Qian J, Ma J, Muir TE. Mesonephric remnants of the prostate: incidence and histologic spectrum. Mod Pathol, 2003; 16: 630–635. 38. Hameed O, Humphrey PA. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology of the prostate. Semin Diagn Pathol, 2005; 22: 88–104. 39. Tong GX, Weeden EM, Hamele-Bena D et al. Expression of PAX8 in nephrogenic adenoma and clear cell adenocarcinoma of the lower urinary tract: evidence of related histogenesis? Am J Surg Pathol, 2008; 32: 1380–1387. 40. Paner GP, Luthringer DJ, Amin MB. Best practice in diagnostic immunohistochemistry: prostate carcinoma and its mimics in needle core biopsies. Arch Pathol Lab Med, 2008; 132: 1388– 1396. 41. Ali TZ, Epstein JI. Perineural involvement by benign prostatic glands on needle biopsy. Am J Surg Pathol, 2005; 29: 1159– 1163. 15. 42. Varma M, Lee MW, Tamboli P et al. Morphologic criteria for the diagnosis of prostatic adenocarcinoma in needle biopsy specimens. A study of 250 consecutive cases in a routine surgical pathology practice. Arch Pathol Lab Med, 2002; 126: 554–561. 43. Ali TZ, Epstein JI. False positive labeling of prostate cancer with high molecular weight cytokeratin: p63 a more specific immunomarker for basal cells.Am J Surg Pathol, 2008; 32: 1890–1895. 44. Luo J, Zha S, Gage WR et al. Alpha-methylacyl CoA racemase: a new molecular marker for prostate cancer. Cancer Res, 2002; 62: 2220–2226. 45. Rubin MA, Zhou M, Dhanasekaran SM et al. Alpha-Methylacyl coenzyme A racemase as a tissue biomarker for prostate cancer.JAMA, 2002; 287; 1662–1670. 46. Epstein JI, Netto GJ. Biopsy interpretation of the prostate, 4th edn. Philadelphia, PA: Lippincott William Wilkins, 2008. 47. Kronz JD, Shaikh AA, Epstein JI. High-grade prostatic intraepithelial neoplasia with adjacent small atypical glands on prostate biopsy. Hum Pathol, 2001; 32: 389–395. 48. Eggener SE, Scardino PT, Walsh PC et al. Predicting 15-year prostate cancer specific mortality after radical prostatectomy. J Urol, 2011; 185: 869–875. 49. Andren O, Fall K, Fransen L, Andersson SO, Johansson JE, Rubin MA. How well does the Gleason score predict prostate cancer death? A 20-year follow up of a population based cohort in Sweden J Urol, 2006; 175: 1337–1340. 126 50. Delahunt B, Srigley JR, Lamb DS. Gleason grading: consensus and controversy. Pathology, 2009; 41: 613–614. 51. Latour M, Amin MB, Billis A et al. Grading of invasive cribriform carcinoma on prostate needle biopsy. An interobserver study among experts in genitourinary pathology. Am J Surg Pathol, 2008; 32: 1532–1539. 52. Epstein JI. An update of the Gleason grading system. J Urol, 2010; 183: 433–440. 53. Rasiah KK, Stricker PD, Haynes AM et al. Prognostic significance of Gleason pattern in patients with Gleason score 7 prostate carcinoma. Cancer, 2003; 98: 2560–2565. 54. Trock BJ, Guo CC, Gonzalgo ML et al. Tertiary Gleason pattern and biochemical recurrence after prostatectomy: proposal for a modified Gleason scoring system. J Urol, 2009; 182: 1364– 1370. 55. Hattab EM, Kock EO, Eble JN, Lin H, Cheng L. Tertiary Gleason pattern 5 is a powerful predictor of biochemical relapse in patients with Gleason score 7 prostatic adenocarcinoma. J Urol, 2006; 175: 1695–1699. 56. Zareba P, Zhang J, Yilmaz A, Trpkov K. The impact of the 2005 International Society of Urological Pathology (ISUP) Consensus on Gleason grading in contemporary practice. Histopathology, 2009; 55: 384–391. 57. Wu AJ, Daignault S, Wasco MJ et al. Correlation of biopsy and radical prostatectomy Gleason score in contemporary extended ‡12 core biopsy practice: improved correlation with biopsy worst Gleason score.Mod Pathol,2008;21:190A. 58. Whittemore DE, Hick EJ, Carter MR et al. Significance of tertiary Gleason pattern 5 in Gleason score 7 radical prostatectomy specimens. J Urol, 2008; 179: 516–522. 59. Pan CC, Potter SR, Partin AW, Epstein JI. The prognostic significance of tertiary Gleason patterns of higher grade in radical prostatectomy specimens: a proposal to modify the Gleaso, Trock BJ, Guo CC, Gonzalgo ML et al. Tertiary Gleason pattern and biochemical recurrence after prostatectomy: proposal for a modified Gleason scoring system. J Urol, 2009; 182: 1364– 1370. 60. Isbarn H, Ahyai SA, Chun FKH et al. Prevalence of a tertiary Gleason grade and its impact on adverse histopathologic parameters in a contemporary radical prostatectomy series. Eur Urol, 2009; 55: 394–403. 127 61. Humphrey PA. Variants of prostatic carcinoma. Prostate pathology. Chicago, IL: ASCP Press, 2003; 390–429. 62. Eble JN, Sauter G, Epstein JI, Sesterhenn IA. Tumours of the prostate. In Eble JN, Sauter G, Epstein JI, Sesterhenn IA eds. Tumours of the urinary system and male genital organs. Lyon: IARC Press, 2004; 159–214. 63. Epstein JI, Cubilla AL, Humphrey PA. Tumors of the prostate gland, seminal vesicles, penis, and scrotum. AFIP Atlas of Tumor Pathology. Washington, DC: American Registry of Pathology, 2011; 239–267. 64. Hameed O, Humphrey PA. Stratified epithelium in prostatic carcinoma: a mimic of high- grade prostatic intraepithelial neoplasia. Mod. Pathol, 2006; 19: 899–906. 65. Tavora F, Epstein JI. High-grade prostatic intraepithelial-like ductal adenocarcinoma of the prostate: a clinicopathologic study of 28 cases. Am J Surg Pathol, 2008; 32: 1060– 1067. 66. Evans AJ, Humphrey PA, Belani J, van der Kwast TH, Srigley JR. Large cell carcinoma of prostate: a clinicopathologic summary of 7 cases of a rare manifestation of advanced prostate cancer. Am J Surg Pathol, 2006; 30:684–693. 67. Lopez-Beltran A, Eble JN, Bostwick DG. Pleomorphic giant cell carcinoma of the prostate. Arch Pathol Lab Med, 2005; 129: 683–685. 68. Farinola MA, Epstein JI. Utility of immunohistochemistry for alpha-methylacyl-CoA racemase in distinguishing atrophic prostate cancer from benign atrophy. Hum Pathol, 2004; 35: 1272–1278. 69. Levi AW, Epstein JI. Pseudohyperplastic adenocarcinoma on biopsy and needle and simple prostatectomy. Am J Surg Pathol, 2000; 24: 1039–1046. 70. Arista-Nasr J, Martinez-Benitez B, Fernanadez-Amador JA et al. Pseudohyperplastic prostatic adenocarcinoma in simple prostatectomy. Ann Diagn Pathol, 2011; 15: 170– 174. 71. Zhou M, Jiang Z, Epstein JI. Expression and diagnostic utility of alpha methylacyl-CoA- racemase (P504S) in foamy gland and pseudohyperplastic prostate cancer. Am J Surg Pathol, 2003; 27: 772–778. 72. Zhao J, Epstein JI. High grade foamy gland prostatic adenocarcinoma on biopsy or transurethral resection. Am J Surg Pathol, 2009; 33: 583–590. 128 73. Berman DM, Yang X, Epstein JI. Foamy gland high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol, 2000; 24: 1401–1444. 74. Lane BR, Magi-Galluzi C, Reuther AM et al. Mucinous adenocarcinoma of the prostate does not confer poor prognosis. Urology, 2006; 68: 825–830. 75. Osunkoya AO, Nielsen ME, Epstein JI. Prognosis of mucinous adenocarcinoma of the prostate treated by radical prostatectomy. A study of 47 cases. Am J Surg Pathol, 2008; 32: 468– 472. 76. Warner JN, Nakamura LY, Pacelli A, Humphreys MR, Castle EP. Primary signet ring carcinoma of the prostate. Mayo Clin Proc, 2010; 85: 1130–1136. 77. Lopez-Beltran A, Cheng L, Prieto R, Blanca A, Montironi R.Lymphoepithelioma-like carcinoma of the prostate. Hum Pathol, 2009; 40: 982–987. 78. Hansel DE, Epstein JI. Sarcomatoid carcinoma of the prostate: a study of 42 cases. Am J Surg Pathol, 2006; 30: 1316–1321. 79. Poblet E, Gomez-Tierno A, Alfaro L. Prostatic carcinosarcoma: a case originating in a previous ductal adenocarcinoma of the prostate. Pathol Res Pract, 2000; 196: 569–572. 80. Rogers CG, Parwani A, Tekes A, Schoenberg MP, Epstein JI. Carcinosarcoma of the prostate with urothelial and squamous components. J Urol, 2005; 173: 439-40. 81. Brinker DA, Potter SR, Epstein JI. Ductal adenocarcinoma of the prostate diagnosed on needle biopsy. Correlation with clinical and radical prostatectomy findings and progression. Am J Surg Pathol, 1999; 23: 1471–1479. 82. Lee TK, Miller JS, Epstein JI. Rare histological patterns of prostatic ductal adenocarcinoma. Pathology, 2010; 42:319–324. 83. Amin A, Epstein JI. Pathologic stage of prostatic ductal adenocarcinoma at radical prostatectomy: effect of percentage of the ductal component and associated grade of acinar adenocarcinoma. Am J Surg Pathol, 2011; 35: 615–19. 84. Beach R, Gown AM, DePeralta-Venturina MN et al. P504Simmunohistochemical detection in 405 prostatic specimens including 376 18-gauge needle biopsies. Am J Surg Pathol, 2002; 26: 1588–1596. 85. Kelemen K, Adley B, Yang XJ, Wang HL, Humphrey PA. Ductal adenocarcinoma of the prostate. A clinicopathologic study of 50 cases. Lab Invest 2006; 86: 144A. 129 86. Little NA, Wiener JS, Walther PJ, Paulson DF, Anderson EE. Squamous cell carcinoma of the prostate: 2 cases of a rare malignancy and review of the literature. J Urol, 1993; 149: 137–139. 87. Cheville JC. Urothelial carcinoma of the prostate. An immunohistochemical comparison with high grade prostatic adenocarcicomaand reviewof the literature. J Urol Pathol, 1998; 9: 141–154. 88. Cheville JC, Dundore PA, Bostwick DG et al. Transitional cell carcinoma of the prostate. Clinicopathologic study of 50 cases. Cancer, 1998; 82:703–707. 89. Stein ME, Bernstein Z, Abacioglu U et al. Small cell (neuroendocrine) carcinoma of the prostate: etiology, diagnosis, prognosis, and therapeutic implications—a retrospective study of 30 patients from the rare cancer network. Am J Med Sci, 2008; 336: 478–488. 90. Papandreou CN, Daliani DD, Thall PF et al. Results of a phase II study with doxorubicin, etoposide, and cisplatin in patients with fully characterized small cell carcinoma of the prostate. J Clin Oncol, 2002; 20: 3072–3080. 91. Yao JL, Madeb R, Bourne P et al. Small cell carcinoma of the prostate: an immunohistochemical study. Am J Surg Pathol, 2006; 20: 705–712. 92. Simon RA, di Sant’Agnese PA, Huang LS et al. CD44 expression is a feature of prostatic small cell carcinoma and distinguishes it from its mimickers. Hum Pathol, 2009; 40: 252– 258. 93. Yang XJ, McEntee M, Epstein JI. Distinction of basaloid carcinoma of the prostate from benign basal cell lesions by using immunohistochemistry for bcl-2 and Ki-67. Hum Pathol, 1998; 29: 1447–1450. 94. Singh H, Flores-Sandoval N, Abrams J. Renal-type clear cell carcinoma occurring in the prostate. Am J Surg Pathol, 2003; 27: 407–410. 95. Pan CC, Chiang H, Chang Y H et al. Tubulocystic clear cell adenocarcinoma arising within the prostate. Am J Surg Pathol, 2000; 24: 1433–1436. 96. Guaclo G, Ortega V, Ardao G, Cravioto F. Clear cell adeocarcinoma of the prostatic utricle in an adolescent. Ann Diagn Pathol, 2005; 9: 153–156. 97. Parwani AV, Herawi M, Epstein JI. Pleomorphic giant cell adenocarcinoma of the prostate: report of 6 cases. Am J Surg Pathol, 2006; 30: 1254–1259. 130 98. Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths. CA Cancer J Clin, 2011; 61: 212– 236. 99. Beahrs OH, Henson DE, Hutter RP, Kennedy BJ. American Joint Committee on Cancer staging manual for staging of cancer, 4th edn. Philadelphia, PA: Lippincott, 1992. 100.Edge S, Byrd DR, Compton CC et al. American Joint Committee on Cancer staging manual, 7th edn. New York: Springer, 2010. 101.Eichelberger LE, Koch MO, Daggy JK, Ulbright TM, Eble JN, Cheng L. Predicting tumor volume in radical prostatectomy specimens from patients with prostate cancer. Am J Clin Pathol, 2003; 120: 386–391. 102.Marks RA, Lin H, Koch MO, Cheng L. Positive-block ratio in radical prostatectomy specimens is an independent predictor of prostate-specific antigen recurrence. Am J Surg Pathol, 2007; 31: 311–318. 103. Bostwick DG. Staging prostate cancer – 1997: current methods and limitations. Eur Urol, 1997; 32: 2–14. 104.Sakr WA, Wheeler TM, Blute M et al. Staging and reporting of prostate cancer – sampling of the radical prostatectomy specimen.Cancer,1996;78:366–68. 105.Hong H, Koch MO, Foster RS, Bihrle R, Gardner TA, Fyffe J. Anatomic distribution of periprostatic adipose tissue: a mapping study of 100 radical prostatectomy specimens. Cancer, 2003; 97: 1639–1643. 106.Sung MT, Lin H, Koch MO, Davidson DD, Cheng L. Radial distance of extraprostatic extension measured by ocular micrometer is an independent predictor of prostate-specific antigen recurrence: a new proposal for the substaging of pT3a prostate cancer. Am J Surg Pathol, 2007; 31: 311– 318. 107.Pierorazio PM, Epstein JI, Humphreys E, Han M, Walsh PC, Partin AW. The significance of a positive bladder neck margin after radical prostatectomy: the American Joint Committee on Cancer Pathological Stage T4 designation is not warranted. J Urol, 2010; 183: 151–157. 108.Zhou M, Reuther AM, Levin HS et al. Microscopic bladder neck involvement by prostate carcinoma in radical prostatectomy specimens is not a significant independent prognostic factor. Mod Pathol, 2009; 22: 385–392. 131 109.Yossepowitch O, Sircar K, Scardino PT et al. Bladder neck involvement in pathologic stage pT4 radical prostatectomy specimens is not an independent prognostic factor. J Urol, 2002; 168: 2011–2015. 110.Billis A, Teixeira DA, Stelini RF, Quintal MM, Guimaraes MS, Ferreira U. Seminal vesicle invasion in radical prostatectomies: which is the most common route of invasion? Int Urol Nephrol, 2007; 39: 1097–1102. 111.Gross JL, Masterson TA, Cheng L, Johnstone PA. pT0 prostate cancer after radical prostatectomy. J Surg Oncol, 2010; 102: 331–333. 112.Montironi R, Cheng L, Lopez-Beltran A et al. Stage pT0 in radical prostatectomy with no residual carcinoma and with a previous positive biopsy conveys a wrong message to clinicians and patients: why is cancer not present in the radical prostatectomy specimen? Eur Urol, 2009; 56: 272–274. 113.Bostwick DG, Bostwick KC. ‘Vanishing’ prostate cancer in radical prostatectomy specimens: incidence and long-term follow-up in 38 cases. BJU Int, 2004; 94: 57–58. 114.von Bodman C, Godoy G, Chade DC et al. Predicting biochemical recurrence-free survival for patients with positive pelvic lymph nodes at radical prostatectomy. J Urol, 2010; 184: 143–148. 115.Boormans JL, Wildhagen MF, Bangma CH, Verhagen PC, van Leenders GJ. Histopathological characteristics of lymph node metastases predict cancer-specific survival in node-positive prostate cancer. BJU Int, 2008;102:1589–1593. 116.Berney DM, Wheeler TM, Grignon DJ et al. International Society of Urological Pathology (ISUP) Consensus Conference on Handling and Staging of Radical Prostatectomy Specimens. Working group 4: seminal vesicles and lymph nodes. Mod Pathol, 2011; 24: 39–47. 117.Briganti A, Blute ML, Eastham JH et al. Pelvic lymph node dissection in prostate cancer. Eur Urol, 2009; 55:1251– 1265. 118. Cheng L, Zincke H, Blute ML, Bergstralh EJ, Scherer B, Bostwick DG. Risk of prostate carcinoma death in patients with lymph node metastasis. Cancer,2001; 91:66–73. 119.Cheng L, Bergstralh EJ, Cheville JC et al. Cancer volume of lymph node metastasis predicts progression in prostate cancer. Am J Surg Pathol,1998; 22: 491–1500. 132 120.Fleischmann A, Schobinger S, Markwalder R et al. Prognostic factors in lymph node metastases of prostatic cancer patients: the size of the metastases but not extranodal extension independently predicts survival. Histopathology,2008; 53:468–475. 121.Weckermann D, Dorn R, Trefz M, Wagner T, Wawroschek F, Harzmann R. Sentinel lymph node dissection for prostate cancer: experience with more than 1,000 patients. J Urol,2007; 177:916–920. 122.Steinberg GD, Epstein JI, Piantadosi S, Walsh PC. Management of stage D1 adenocarcinoma of the prostate: the Johns Hopkins experience 1974 to 1987. J Urol,1990; 144:1425–1432. 123.Ferrara N. Role of vaskular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis. Kidney Int, 1999; 56: 794-814. 124.Ferrara N, Henzel W. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin binding growth factor specific for vaskular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1989; 161: 851-88. 125.Ferrera N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature Med, 2003; 9: 669-676. 126.Li J, Zhang YP, Kirsner R. Angiogenesis in wound repair: angiogenetic growth factors and the extracellular matrix. Microsc Res Tech, 2003; 60: 107-114. 127.Gerber HP, Ferrera N. The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoesis. J Mol Med, 2003; 81: 20-31. 128.Bergers G, Benjamin LE. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer, 2003; 3: 401-410. 129.Tran J, Rak J, Sheehan C, et al. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin an XIAP by VEGF in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1999; 264: 781-788. 130.Pepper MS, Ferrera N, Orci L, Montesano R. Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro. Biochem Biophys Res Commun, 1992; 189, 824-831. 131.Hattori K, Dias S, Heissig B, et al. Vascular endothelial growth factor and angiopoetin-1 stimulate postnatal hematopoesis by recruitment of vasculogenic and hematopetic stem cells. J Exp Med, 2001; 193:1005-1014. 133 132.Alitalo K, Carmeliet P. Molecular mechanisms of lymphangiogenesis in health and disease. Cancer Cell, 2002, 1:219-27. 133.Totten RS, Heinemann M, Hudson B, Sproul EE, Stout AP. Microscopic differential diagnosis of latent carcinoma of prostate. AMA Arch Pathol, 1953; 55: 131–141. 134.Epstein JI. Diagnosis and reporting of limited adenocarcinoma of the prostate on needle biopsy. Mod Pathol, 2004; 17: 307–315. 135.Brawer MK, Peehl DM, Stamey TA, Bostwick DG. Keratin immunoreactivity in the benign and neoplastic human prostate. Cancer Res, 1985; 45: 3663–3667. 136.Weinstein M, Signoretti S, Loda M. Diagnostic utility of immuno histochemical staining for p63, a sensitive marker of prostatic basal cells. Mod Pathol, 2002; 15: 1302–1308. 137.Zhou M, Shah R, Shen R, Rubin MA. Basal cell cocktail (34betaE12+p63) improves the detection of prostate basal cells. Am J Surg Pathol, 2003; 27:365-71. 138. Ayala AG, Ro JY, Babaian R, Troncoso P, Grignon DJ. The prostatic capsule: does it exist? Its importance in the staging and treatment of prostatic carcinoma. Am J Surg Pathol, 1989; 13: 21-27. 139.Osunkoya AO, Hansel DE, Sun X, Netto GJ, Epstein JI. Aberrant diffuse expression of p63 in adenocarcinoma of the prostate on needle biopsy and radical prostatectomy: report of 21 cases. AmJ Surg Pathol, 2008; 32: 461–467. 140.Xu J, Stolk JA, Zhang X et al. Identification of differentially expressed genes in human prostate cancer using subtraction and microarray. Cancer Res, 2000; 60: 1677–1682. 141.Loyd MD, Darley DJ, Wierzbicki AS, Threadgill MD. Alphamethylacyl-CoA racemase – an ‘obscure’ metabolic enzyme takes centre stage. FEBS J, 2008; 275: 1089–1102. 142.Went PT, Sauter G, Oberholzer M, Bubendorf L. Abundant expression of AMACR in many distinct tumour types. Pathology, 2006; 38: 426–432. 143.Sonwalkar SA, Rotimi O, Scott N et al. A study of indefinite for dysplasia in Barrett’s oesophagus: reproducibility of diagnosis, clinical outcomes and predicting progression with AMACR (alpha-methylacyl-CoA-racemase). Histopathology, 2010; 56: 900–907. 144.Bachert C, Fimmel C, Linstedt AD. Endosomal trafficking and proprotein convertase cleavage of cis Golgi protein GP73 produces marker for hepatocellular carcinoma. Traffic, 2007; 8: 1415–1423. 134 145.Marrero JA, Romano PR, Nikolaeva O et al. GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma. J Hepatol, 2005; 43: 1007–1012. 146.Lapointe J, Li C, Higgins JP et al. Gene expression profiling identifies clinically relevant subtypes of prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 2004; 101: 811–816. 147.Kristiansen G, Pilarsky C, Wissmann C. Expression profiling of microdissected matched prostate cancer samples reveals CD166/MEMD and CD24 as new prognostic markers for patient survival. J Pathol, 2005; 205:359-76. 148.Menendez JA, Lupu R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis. Nat Rev Cancer, 2007; 7: 763–777. 149.Prowatke I, Devens F, Benner A et al. Expression analysis of imbalanced genes in prostate carcinoma using tissue microarrays.Br J Cancer, 2007;96:82–88. 150.Fiorentino M, Zadra G, Palescandolo E et al. Overexpression of fatty acid synthase is associated with palmitoylation of Wnt1and cytoplasmic stabilization of beta-catenin in prostate cancer. Lab Invest, 2008; 88: 1340–1348. 151.Migita T, Ruiz S, Fornari A et al. Fatty acid synthase: a metabolic enzyme and candidate oncogene in prostate cancer. J Natl Cancer Inst, 2009; 101:519-532. 152.Tomlins SA, Rhodes DR, Perner S et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. Science, 2005; 310: 644-48. 153.Demichelis F, Fall K, Perner S et al. TMPRSS2:ERG gene fusion associated with lethal prostate cancer in a watchful waiting cohort. Oncogene, 2007; 26: 4596–4599. 154.Park K, Tomlins SA, Mudaliar KM et al. Antibody-based detection of ERG rearrangement-positive prostate cancer. Neoplasia, 2010; 12: 590–598. 155.Miettinen M, Wang ZF, Paetau A et al. ERG transcription factor as an immunohistochemical marker for vascular endothelial tumors and prostatic carcinoma. Am J Surg Pathol, 2011; 35: 432–441. 156.Haggarth L, Hagglof C, Jaraj SJ et al. Diagnostic biomarkers of prostate cancer. Scand J Urol Nephrol, 2011; 45: 60–67. 157.Petraki CD, Sfikas CP. Histopathological changes induced by therapies in the benign prostate and prostate adenocarcinoma. Histol Histopathol, 2007; 22: 107–118. 158.Bostwick DG. Prostate-specific antigen. Current role in diagnostic pathology of prostate cancer. Am J Clin Pathol, 1994; 102: S31–S37. 135 159.Renshaw AA, Granter SR. Metastatic, sarcomatoid, and PSA and PAP-negative prostatic carcinoma: diagnosis by fine-needle aspiration. Diagn Cytopathol, 2000; 23: 199–201. 160. Samplaski MK, Heston W, Elson P, Magi-Galluzzi C, Hansel DE. Folate hydrolase (prostate-specific antigen) 1 expression in bladder cancer subtypes and associated tumor neovasculature. Mod Pathol, 2011; 24: 1521–1529. 161.Fleischmann A, Rocha C, Schobinger S, Seiler R, Wiese B, Thalmann GN. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down- regulated in matched lymph node metastases. Prostate, 2011; 71: 453–460. 162.Xu J, Kalos M, Stolk JA et al. Identification and characterization of prostein, a novel prostate-specific protein. Cancer Res, 2001; 61: 1563–1568. 163.Scheble VJ, Braun M, Beroukhim R et al. ERG rearrangement is specific to prostate cancer and does not occur in any other common tumor. Mod Pathol, 2010; 23: 1061– 1067. 164.Clark JP, Cooper CS. ETS gene fusions in prostate cancer. Nat Rev Urol, 2009; 6: 429– 439. 165.Leite KR, Tomiyama A, Reis ST et al. MicroRNA-100 expression is independently related to biochemical recurrence of prostate cancer. J Urol, 2011; 185: 1118–1122. 166.Heidenhain M. Noch einmal uber die darstellung der centralkorper durch eisnhamotoxylin. Nebst einigen allgemeinen bemerkungen uber die hamatoxylinfarben. 2. Wiss. Mikrosk., 1896; 13:186. 167.Bancroft JD and Gamble M. Theory and practice of histological techniques. 5th edition. Churchill Livingstone, Edeinburgh, London, New York, Oxford, 2002. 168.AJCC Cancer Staging Manual, Seventh Edition (2010) published by Springer Science and Business Media LLC, www.springerlink.com. 169.Leake R, Barnes D, Pinder S, Ellis I, Anderson L, Anderson T, Adamson R, Rhodes T, Miller K, Walker R. Immunohistochemical detection of steroid receptors in breast cancer: a working protocol. UK Receptor Group, UK NEQAS, The Scottish Breast Cancer Pathology Group, and The Receptor and Biomarker Study Group of the EORTC. J Clin Pathol 2000; 53:634–635. 170.Rhodes A, Jasani B, Balaton AJ et al. Study of interlaboratory reliability and reproducibility of estrogen and progesterone receptor assays in Europe. Documentation of 136 poor reliability and identification of insufficient microwave antigen retrieval time as a major contributory element of unreliable assays. Am JClin Pathol, 2001; 115: 44–58. 171.Harvey JM, Clark GM, Osborne CK, Allred DC. Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol, 1999; 17:1474–1481. 172.Regan MN, Viale G, Mastropasqua MG, et al. Re-evaluating adjuvant breast cancer trials: assessing hormone receptor status by immunohistochemical versus extraction assays. J Natl Cancer Inst, 2006; 98:1571–81. 173.Remmele W, Schisketanz KH. Immunohistochemical detection of estrogen and progesterone receptor content in human breast cancer. Computer-assisted image analysis (QIC score) versus subjective grading (IRS). Pathol Res Pract, 1993; 189: 862–6. 174.Weidner N, Folkman J, Pozza F and al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma. J Natal Cancer Inst, 1992; 84:1875-87. 175.Weidner N, Carroll PR, Flax J, Blumenfeld W and Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. Am J Pathol, 1993; 143: 401- 409. 176.Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol, 1995; 147(9):19-22. 177.Tangen CM, Faulkner JR, Crawford ED. Ten-year survival in patients with metastatic prostate cancer. Clin Prostate Cancer, 2003;2:41-45. 178.Punglia RS, D’Amico AV, Catalona WJ. et al. Impact of age, benign prostate hyperplasia and cancer on PSA level. Cancer, 2006;106:1507-1513. 179.Bostwick DG, Grignon DJ, Hammond EH, et al. Prognostic factors in prostate cancer. College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med, 2000;124:995–1000. 180.Stamey TA, Johnstone IM, McNeal JE, Lu AY, Yemoto CM. Preoperative serum prostate specific antigen levels between 2 and 22 ng/ml correlate poorly with post-radical prostatectomy cancer morphology: prostate specific antigen cure rates appear constant between 2 and 9 ng/ml. J Urol, 2002; 167: 103-111. 137 181.Egevad L, Granfors T, Karlberg L, Bergh A, Stattin P. Prognostic value of the Gleason score in prostate cancer. BJU Int, 2002; 89: 538-542. 182.Lau WK, Bergstralh EJ, Blute ML, Slezak JM, Zincke H. Radical prostatectomy for pathological Gleason 8 or greater prostate cancer: influence of concomitant pathological variables. J Urol, 2002; 167: 117-122. 183.Egevad L, Granfors T, Karlberg L, Bergh A, Stattin P. Percent Gleason grade 4/5 as prognostic factor in prostate cancer diagnosed at transurethral resection. J Urol, 2002; 168: 509-513. 184.Epstein JI, Partin AW, Potter SR, Walsh PC. Adenocarcinoma of the prostate invading the seminal vesicle: prognostic stratification based on pathologic parameters. Urology, 2000; 56: 283-288. 185.Greene DR, Wheeler TM, Egawa S, Dunn JK, Scardino PT. A comparison of the morphological features of cancer arising in the transition zone and in the peripheral zone of the prostate. J Urol, 2001; 146: 1069-1076. 186.Maru N, Ohori M, Kattan MW, Scardino PT, Wheeler TM. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol, 2001; 32: 828-833. 187.Bastacky SI, Walsh PC, Epstein JI. Relationship between perineural tumor invasion on needle biopsy and radical prostatectomy capsular penetration in clinical stage B adenocarcinoma of the prostate. Am J Surg Pathol, 1993; 17: 336-341. 188.Herman CM, Wilcox GE, Kattan MW, Scardino PT, Wheeler TM. Lymphovascular invasion as a predictor of disease progression in prostate cancer. Am J Surg Pathol, 2000; 24: 859-863. 189.Folkman J, Shing Y. Angiogenesis. J Biol Chem, 1992;267:10931-10934. 190.Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst, 1990;82:4-6. 191.Mahadevan V, Hart IR. Metastasis and angiogenesis. Acta Oncol, 1990; 29:97-102. 192.Dvorak HF, Brown LF, Detmar M, et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability and angiogenesis. Am J Pathol, 1995;146:1029-1039. 138 193.Bergers G, Benjamin LE. Tumorigenesis and the Angiogenic Switch Nat Rev Cancer, 2003;3:401-10. 194.Folkman J. Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of research on angiogenesis. N Engl J Med, 1995; 333:1757-1763. 195.Smith-McCune K, Zhu Y-H, Hanahan D, Arbeit J. Cross-species Comparison of Angiogenesis during the Premalignant Stages of Squamous Carcinogenesis in the Human Cervix and K14-HPV16 Transgenic Mice. Cancer Res. 1997;57:1294–300. 196.Fox SB and Harris AL. Histological Quantitation of Tumour Angiogenesis. APMIS. 2004;112:413–30. 197.Pietra N, Sarli L, Caruana P, et al. Is tumor angiogenesis a prognostic factor in patients with colorectal cancer and no involved nodes? Eur J Surg 2000; 166:552–556. 198.Choi HJ, Hyun MS, Jung GJ, et al. Tumor angiogenesis as a predictor in colorectal carcinoma with special reference to mode of metastasis and recurrence. Oncology, 1998;55:575–581. 199.Brewer CA, Setterdahl JJ, Li MJ, et al. Endoglin expression as a measure of microvessels density in cervical cancer. Obstet Gynecol 2000;96:224–228. 200.Saad RS, Jasnosz KM, Silverman JF. Endoglin (CD105) expression in endometrial carcinoma. Int J Gynecol Pathol, 2003;22:248–253. 201.Rubin MA, Buyyounouski M, Bagiella E, et al. Microvessel density in prostate cancer: lack of correlation with tumor grade, pathologic stage and clinical outcome. Urology, 1999;53:542-547. 202.Bettencourt MC, Bauer JJ, Sesterhenn IA, et al. CD34 immunohistochemical assessment of angiogenesis as a prognostic marker for prostate cancer recurrence after radical prostatectomy. J Urol, 1998;160:459-465. 203.Bostwick DG, Wheeler TM, Blute M, et al. Optimized microvessel density analysis improves prediction of cancer stage from prostate needle biopsies. Urology, 1996; 48:47- 57. 204.Fanelli M, Locopo N, Gattuso D, et al. Assessment of tumor vascularization: immunohistochemical and non-invasive methods. Int J Biol Markers, 1999;14:218-231. 139 205.Haggstrom S, Bergh A, Damber JE. Vascular endothelial growth factor content in metastasizing and nonmetastasizing Dunning prostatic adenocarcinoma. Prostate, 2000; 45:42-50. 206.Dallas NA, Samuel S, Xia L, Fan F, Gray MJ, Lim SJ, et al. Endoglin (CD105): a marker of tumor vasculature and potential target for therapy. Clin Cancer Res, 2008;14:1931–7. 207.Kumar P, Wang JM, Bernabeu C. CD105 and angiogenesis. J Pathol, 1996;178:363-366. 208.Kumar S, Ghellal A, Li C, et al. Breast carcinoma: vascular density determined using CD105 antibody correlates with tumor prognosis. Cancer Res, 1999;59:856-861. 209.Saad RS, Jasnosz KM, Silverman JF. Endoglin (CD105) expression in endometrial carcinoma. Int J Gynecol Pathol, 2003; 22:248-253. 210.Akagi K, Ikeda Y, Sumiyoshi Y, et al. Estimation of angiogenesis with anti-CD105 immunostaining in the process of colorectal cancer development. Surgery, 2002;131(1suppl): S109-S113. 211.Ferrer FA, Miller LJ, Lindquist R, et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptors in human prostate cancer. Urology, 1999;54:567-572. 212.Rogatsch H, Hittmair A, Reissigl A, et al. Microvessel density in core biopsies of prostatic adenocarcinoma: a stage predictor? J Pathol. 1997;182:205-210. 213.Barth PJ, Weingartner K, Kohler HH, et al. Assessment of vascularization in prostatic carcinoma: a morphometric investigation. Hum Pathol, 1996;27:1306-1310. 214.Wikstrom P, Lissbrant IF, Stattin P, et al. Endoglin (CD105) is expressed on immature blood vessels and is a marker for survival in prostate cancer. Prostate, 2002;51:268-275. 215. Gettman MT, Bergstralh EJ, Blute M, et al. Prediction of patient outcome in pathologic stage T2 adenocarcinoma of the prostate: lack of significance for microvessel density analysis. Urology, 1998; 51: 79-85. 216.de la Taille A, Katz AE, Bagiella E, et al. Microvessel density as a predictor of PSA recurrence after radical prostatectomy: a comparison of CD34 and CD31. Am J Clin Pathol, 2000;113:555-562. 217.Giatromanolaki A, Sivridis E, Koukourakis MI, et al. Intratumoral angiogenesis: a new prognostic indicator for stage I endometrial adenocarcinoma? Oncol Res, 1999;11:205- 212. 140 218.Lindenmayer AE, Miettinen M. Immunophenotypic features of uterine stromal cells: CD34 expression in endocervical stroma. Virchows Arch, 1995;426:457-460. 219.Melnyk O, Zimmerman M, Kim KJ, et al. Neutralizing anti–vascular endothelial growth factor antibody inhibits further growth of established prostate cancer and metastases in a preclinical model. J Urol, 1999;161:960-963. 220.Obermair A, Kucera E, Mayerhofer K, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in human breast cancer: correlation with disease-free survival. Int J Cancer,1997;74:455- 458. 221.Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, et al. Vascular endothelial growth factor is a marker of tumor invasion and metastasis in squamous cell carcinomas of the head and neck. Cancer, 1999;5:775-782. I Аутор: прим. др Ибрахим Прељевић, 15.07.1959.год. Кикинда, 141 спец. патолог, у Служби за патолошкоанатомску дијагностику ОБ Нови Пазар. II Докторска дисертација: Квантитативна морфометријска и имунохистохемијска истраживања неоваскуларизације карцинома простате. број страница: 139: број слика 37: број библиографских података: 221: установа и место где је рад израђен: Медицински факултет, Универзитет у Приштини, са привременим седиштем у Косовској Митровици научна област (УДК): медицина, патолошка анатомија, онкологија ментор: проф. Др Небојша Митић, редовни професор патолошке анатомије на Медицинском факултету Универзитета у Приштини са привременим седиштем у Косовској Митровици III Оцена и одбрана, датум пријаве теме: 20.10.2010.год. Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: 05-1989, од 01.11.2010.године комисија за оцену теме и кандидата: проф. др Небојша Митић, проф. др Милан Кнежевић, доц. др Милица Ванчетовић Комисија за оцену докторске дисертације: проф. др Милан Кнежевић, доц. др Милица Мијовић, 142 проф. др Небојша Митић комисија за одбрану докторске дисертације: проф. др Милан Кнежевић, председник, доц. др Милица Мијовић, члан, проф. др Небојша Митић, члан-ментор Датум одбране докторске дисертације: 01.07.2014. године