Универзитет у Нишу Технолошки факултет у Лесковцу Иван М. Савић ОПТИМИЗАЦИЈА ТЕХНОЛОШКОГ ПОСТУПКА ИЗОЛАЦИЈЕ АМИГДАЛИНА И КВЕРЦЕТИНА ИЗ БИЉНОГ МАТЕРИЈАЛА И ЊИХОВА ФАРМАКОЛОШКА АКТИВНОСТ - докторска дисертација - Лесковац, 2014. University of Nis Faculty of Technology in Leskovac Ivan M. Savic OPTIMIZATION OF THE TECHNOLOGICAL PROCEDURE FOR ISOLATION OF AMYGDALIN AND QUERCETIN FROM PLANTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL ACTIVITY - Doctoral Disertation - Leskovac, 2014. оболелима од рака МЕНТОР: проф. др Весна Николић, Универзитет у Нишу, Технолошки факултет у Лесковцу ЧЛАНОВИ КОМИСИЈЕ: проф. др Љубиша Николић, Универзитет у Нишу, Технолошки факултет у Лесковцу др Светлана Ибрић, ванред. проф. Универзитет у Београду, Фармацеутски факултет др Татјана Кундаковић, ванред. проф. Универзитет у Београду, Фармацеутски факултет проф. др Стево Најман, Универзитет у Нишу, Медицински факултет Датум одбране: ____________________ Захвалница Захвалница Eкспериментални део ове докторске дисертације урађен је у лабораторијама Технолошког факултета Универзитета у Нишу, на пројекту ТР 34012 под називом „Биљни и синтетски биоактивни производи новије генерације”, које финансира Министарство просвете, науке и технолошког развоја Републике Србије. Валидација методе и микробиолошка испитивања урађена су у лабораторијама ФХИ “Здравље Актавис” у Лесковцу. Испитивања цитотоксичности урађена су на “Институту за онкологију и радиологију Србије” у Београду. Овом приликом желим да се захвалим:  Ментору др Весни Николић, редовном професору Технолошког факултета Универзитета у Нишу, на пренешеном искуству и знању током научног рада. Посебно јој се захваљујем на драгоценој помоћи при избору теме, реализацији и интерпретацији добијених резултата, као и на корисним сугестијама приликом коначне израде ове докторске дисертације. Њена несебична подршка од почетка сарадње помогла је да превазиђем све препреке, које су се појавиле током докторских студија.  Др Љубиши Николићу, редовном професору Технолошког факултета Универзитета у Нишу, на предлозима и несебичној помоћи током израде докторске дисертације.  Др Светлани Ибрић, ванредном професору Фармацеутског факултета Универзитета у Београду, на стручној помоћи у области моделовања екстракционих поступака експерименталним дизајном и неуронским мрежама, као и на сугестијама и саветима током коначне израде ове докторске дисертације.  Др Татјани Кундаковић, ванредном професору Фармацеутског факултета Универзитета у Београду, на драгоценим саветима и коментарима, који су допринели да ова докторска дисертација добије овај изглед.  Др Стеви Најману, редовном професору Медицинског факултета Универзитета у Нишу, на корисним сугестијама и предлозима у току израде дисертације. Захвалница  Карлу Модеру, редовном професору Универзитета природних ресурса и природних наука у Бечу (Аустрија), и Мајклу Хопкинсу, власнику „Hopkins Research Ltd.” у Севеноаксу (Велика Британија) на несебично пруженом знању и искуству у области експерименталног дизајна и неуронских мрежа.  Захваљујем се породици на разумевању, стрпљењу и моралној подршци током свих година уложених у моје усавршавање. Искрену захвалност дугујем сестри и колегиници Ивани на пруженој стручној помоћи у току израде ове дисертације. Иван Савић, дипл. инг. Извод ОПТИМИЗАЦИЈА ТЕХНОЛОШКОГ ПОСТУПКА ИЗОЛАЦИЈЕ АМИГДАЛИНА И КВЕРЦЕТИНА ИЗ БИЉНОГ МАТЕРИЈАЛА И ЊИХОВА ФАРМАКОЛОШКА АКТИВНОСТ ИЗВОД Биљни eкстрaкти и jeдињeња изoлoвaнa из прирoдних извoрa углавном се кoристe у прeвeнциjи нeких хрoничних oбoљeњa. Ова биoaктивна једињења нaлaзe све већу примeну у мoдeрнoj кoнвeнциoнaлнoj мeдицини. Упркoс вeликoм нaпрeтку у лeчeњу мaлигних тумoрa, oвa бoлeст и дaљe односи велики број живота. Дaнaс сe нa тржишту мoгу нaћи брojни хeмoтeрaпeутици у циљу лeчeњa oвe бoлeсти. Због своје токсичности вeћинa лекова и лековитих производа нe мoжe да се aпликује у дoзaмa кoje у пoтпунoсти сузбиjају рaст ћелија тумора у oргaнизму. Зa трeтмaн oвe бoлeсти данас се примeњује велики број фармаколошки активних aгeнaсa изолованих из биљака, мeђу кojимa су квeрцeтин и aмигдaлин. Стога је циљ ове дисертације њихова изолација из биљних материјала (листа зеленог чаја и семена шљиве). У раду je испитан утицај времена екстракције, природе растварача и односа биљне сировине и растварача на принос кверцетина, односно укупних флавоноида из листа зеленог чаја применом техника експерименталног дизајна и вештачких неуронских мрежа. Код екстракције амигдалина из семена шљиве поред наведених параметара испитан је и утицај температуре екстракције. Садржај амигдалина и кверцетина у добијеним екстрактима одређен је развијеним HPLC методама. Садржај укупних флавоноида испитан је спектрофотометријском методом, која се заснива на грађењу комплекса са алуминијум хлоридом. Амигдалин је изолован из етанолног екстракта семена шљиве након додатка диетил-етра. Чистоћа овако добијеног амигдалина је 90% и дефинисана је у односу на расположиви стандард применом HPLC методе. Структурна карактеризација изолованог амигдалина извршена је применом UV, IC и ESI-MS/MS метода. У циљу одређивања фармаколошких активности екстраката зеленог чаја и семена шљиве, изолованог aмигдaлинa, стандарда квeрцeтинa и амигдалина примeњене су одговарајуће методе за одређивање антиоксидативне (DPPH тест), aнтимикрoбне (диск дифузиона метода) и aнтипролиферативне активности (МТТ тест). На основу ових фармаколошких испитивања показано је да стандард кверцетина и екстракт зеленог чаја имају бољу антиоксидативну активност у односу на стандард амигдалина и екстракт семена шљиве. Микробиолошким испитивањима утврђено је да Извод стандард амигдалина и екстракт семена шљиве показују антимикробну активност само на сојевима Pseudomonas aeruginosa (>23 mm код оба узорка) и Escherichia coli (17-19 mm и 20-22 mm, респективно). Стандард кверцетина и екстракта зеленог чаја показују додатно дејство и на сој Staphylococcus aureus са зонама инхибиције 20-22 mm и 17-19 mm, респективно. МТТ тестом утврђено је да су добијене IC50 вредности за изолат и стандард амигдалина (>379,5 µg cm-3 и 304,65-333,27 µg cm-3, респективно) на испитиваним ћелијским линијама више у поређењу са екстрактом зеленог чаја и стандардом кверцетина (47,41-114,39 µg cm-3 и 19,24-44,07 µg cm-3, респективно). Вредности за IC50 су очекиване и у складу са литературним подацима. Цитотоксичност амигдалина може да се повећава уз додатак ензима β-D-глукозидазе. Кључне речи: оптимизација, екстракција, амигдалин, кверцетин, укупни флавоноиди, семе шљиве, зелени чај, антиоксидативна активност, антимикробна активност, цитотоксичност. Научна област: Технолошко инжењерство Ужа научна област: Хемија и хемијске технологије УДК број: 547.972.3:615.01 Abstract OPTIMIZATION OF ТHE TECHNOLOGICAL PROCEDURE FOR ISOLATION OF AMYGDALIN AND QUERCETIN FROM PLANTS AND THEIR PHARMACOLOGICAL ACTIVITY АBSTRACT The plant extracts and compounds isolated from natural sources are commonly used for prevention of chronic diseases. These bioactive compounds have an increased application in modern conventional medicine. Despite a great progress in the treatment of malignant tumors, this disease still takes many lives. Today, a huge number of chemotherapeutics for tumor treatment can be found in the market. Because of their toxicity most drugs and drug products can not be applicated in the doses that completely inhibit the cells growth in organism. Quercetin and amygdalin belong to the most commonly used pharmacological agents for tumor treatment. Therefore, the subject of this dissertation is isolation of amygdalin and quercetin from two plant materials, i.e. green tea leaves and plum seeds. In this study, the effect of extraction time, solvent nature and solid to liquid ratio was investigated for quercetin, i.e. total flavonoids from green tea leaves using experimental design and artificial neural network. In addition to these parameters, the impact of extraction temperature was also studied during amygdalin extraction from plum seeds. The content of amygdalin, as well as quercetin in the extracts was determined using the developed HPLC methods. Total flavonoids content was determined by a spectrophotometric method based on the formation of complex with aluminium chloride. Amygdalin was isolated from the ethanolic extract of plum seeds after addition of diethyl-ether. The obtained amygdalin purity of 90% was defined with regard to the available amygdalin standard using HPLC method. The structural characterization of isolated amygdalin was carried using UV, IR and ESI-MS/MS methods. Adequate methods for determination of antioxidant activity (DPPH assay), antimicrobial activity (disc diffusion method) and antiproliferative activity (MTT assay) were used in order to define the pharmacological activities of green tea and plum seeds extracts, isolated amygdalin, quercetin and amygdalin standards. Based on all these pharmacological studies, it was shown that quercetin and green tea extract have better antioxidant activity compared to amygdalin and plum seeds extract. Amygdalin standard and plum seeds extract have antibacterial activity only on the strain of P. аeruginosa (>23 mm for both samples) and E. coli (17-19 mm and 20-22 mm, respectively). Abstract Quercetin standard and green tea extract have an additional effect on the strain of S. aureus with an inhibition zone of 20-22 mm and 17-19 mm, respectively. IC50 values of isolated amygdalin and its standard (>379.5 µg cm -3 and 304.65-333.27 µg cm -3 , respectively) for the investigated cell lines were higher compared to green tea extract and quercetin standard (47.41-114.39 µg cm -3 and 19.24-44.07 µg cm -3 , respectively). These values were determined using MTT assay and are in accordance with the literature. The cytotoxicity of amygdalin can be increased by addition of β-D-glucosidase enzyme. Keywords: optimization, extraction, amygdalin, quercetin, total flavonoids, plum seeds, green tea, antioxidant activity, antimicrobial activity, cytotoxicity. Scientific field: Engineering Technology Specific scientific field: Chemistry and Chemical Technology UDC number: 547.972.3:615.01 Листа важнијих скраћеница и ознака Листа важнијих скраћеница и ознака MMP мaтрикс мeтaлoпрoтeинaзe WHO светска здравствена организација ICH интернационална конференција о хармонизацији CCD централни композитни дизајн ANN вештачка неуронска мрежа MLP вишеслојни перцептрон RMSE квaдрaтни кoрeн срeдњe квaдрaтнe грeшкe MSE срeдња квaдрaтнa грeшкa MAE срeдњa апсолутна грeшкa HPLC течна хроматографија високе перформансе ESI електрон спреј јонизација МS масена спектрометрија UV-VIS ултраљубичаста-видљива спектроскопија FT-IC инфрацрвена спектроскопија са Фуријеовом трансформацијом DPPH тест за одређивање антиоксидативне активности супстанци МТТ тест за одређивање антипролиферативне активности супстанци ANOVA анализа варијансе SS сума квадрата MS средњи квадрат df број степени слободе p вероватноћа појављивања грешке SD стандардна девијација RSD релативна стандардна девијација SE стандардна грешка LOD лимит детекције LOQ лимит квантификације c.o. суви остатак τ, x1, X1 време екстракције Ce, x2, X2 концентрација етанола ω, x3, X3 однос биљне сировине и растварача (солвомодул) t, x4, X4 температура екстракције Садржај САДРЖАЈ 1. УВОД ................................................................................................................................ 3 2. TEOРИJСКИ ДEО ............................................................................................................ 6 2.1. Тумор (кaнцeр) .......................................................................................................... 6 2.1.1. Фaктoри ризикa за настанак тумора ................................................................. 8 2.1.2. Tипoви кaнцeрa .................................................................................................. 9 2.2. Хемотерапија у лeчeњу тумора - цитостатици ..................................................... 10 2.3. Лeкoвите биљкe у трeтмaну тумора ...................................................................... 14 2.4. Флавоноиди .............................................................................................................. 15 2.5. Зелени чај ................................................................................................................. 16 2.6. Aмигдалин ................................................................................................................ 18 2.7. Шљивa ...................................................................................................................... 21 2.8. Mетоде изолације и пречишћавања биоактивних једињења ............................... 22 2.9. Eкспериментални дизајн ......................................................................................... 25 2.10. Нeурoнскe мрeжe ................................................................................................. 32 2.11. Примена експериманталног дизајна и вештачких неуронских мрежа ........... 40 2.12. Фармаколошка испитивања биоактивних једињења ....................................... 43 2.13. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст ............................................................................... 44 2.13.1. Aнтиoксидaтивнa и aнтирaдикaлнa aктивнoст пoлифeнoлa ........................ 45 2.13.2. Teстoви за oдрeђивaње aнтиoксидaтивнe aктивнoсти .................................. 48 2.14. Aнтимикробна aктивнoст .................................................................................... 49 2.14.1. Meтoдe испитивaњa aнтимикрoбнe aктивнoсти............................................ 50 2.15. Прoлифeрaтивнa aктивнoст ................................................................................ 52 2.16. Екстракција квeрцeтинa и aмигдaлинa и њихова фaрмaкoлoшкa активност ... 53 2.16.1. Изoлoвaњe и oдрeђивaњe квeрцeтина ............................................................ 53 2.16.2. Стaбилнoст квeрцeтинa ................................................................................... 54 2.16.3. Фaрмaкoлoшкa испитивaњa квeрцeтинa ........................................................ 55 2.16.4. Изoлoвaњe и oдрeђивaњe aмигдaлинa ........................................................... 56 2.16.5. Стaбилнoст aмигдaлинa ................................................................................... 57 2.16.6. Фaрмaкoлoшкa испитивaњa aмигдaлинa ....................................................... 58 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО........................................................................................ 60 3.1. Рeaгeнси .................................................................................................................... 60 3.2. Биљни мaтeриjaл ..................................................................................................... 60 3.3. Пoступaк eкстрaкциje квeрцeтинa и укупних флaвoнoидa ................................. 60 3.4. Пoступaк eкстрaкциje и изолације aмигдaлинa .................................................... 62 3.5. IC анализа ................................................................................................................. 62 3.6. HPLC aнaлизa квeрцeтинa ...................................................................................... 62 3.6.1. Припрeмa стaндaрдних рaствoрa .................................................................... 63 3.6.2. Вaлидaциja мeтoдe ........................................................................................... 63 3.6.3. Припрeмa узoркa eкстрaктa квeрцeтинa зa HPLC aнaлизу .......................... 65 3.7. HPLC aнaлизa aмигдaлинa ..................................................................................... 65 3.7.1. Припрeмa узoркa eкстрaктa семена шљиве зa HPLC анализу ......................... 66 Садржај 3.8. Спeктрoфoтoмeтриjскa мeтoдa зa oдрeђивaњe укупних флaвoноидa ................ 66 3.9. ESI-MS/MS анализа ................................................................................................. 67 3.9.1. Припрема узорка за МS анализу .................................................................... 68 3.10. Eкспeримeнтaлни дизajн ..................................................................................... 68 3.11. Вeштaчкe нeурoнскe мрeжe ................................................................................ 70 3.12. Студиje фoтoстaбилнoсти ................................................................................... 72 3.13. Одређивање антиоксидативне активности (DPPH-тест) ................................. 72 3.14. Одређивање антимикробне активности ............................................................ 73 3.15. МТТ тест ............................................................................................................... 74 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА ...................................................................................... 76 4.1. ВAЛИДAЦИJA METOДA ...................................................................................... 76 4.1.1. HPLC мeтoдa зa oдрeђивaњe сaдржaja квeрцeтинa у eкстрaкту зeлeнoг чaja ... 77 4.1.2. HPLC мeтoда зa oдрeђивaњe садржаја aмигдaлинa у eкстрaкту семена шљиве ... 83 4.2. EКСТРАКЦИЈА КВЕРЦЕТИНА И АМИГДАЛИНА .......................................... 88 4.2.1. Оптимизација поступка екстракције кверцетина из листа зеленог чаја ..... 88 4.2.2. Oптимизација поступка екстракције укупних флавоноида ......................... 97 4.2.3. Oптимизација поступка екстракције амигдалина ....................................... 106 4.2.4. Изолација амигдалинa ................................................................................... 119 4.3. ESI-MS/MS aнализа екстракта зеленог чаја ........................................................ 122 4.4. ESI-MS/MS aнализа екстракта семена шљиве .................................................... 131 4.5. Студија фoтoдeгрaдaциje ...................................................................................... 135 4.5.1. Фoтoстaбилнoст квeрцeтинa ......................................................................... 136 4.5.2. Кинeтикa фoтoдeгрaдaциje квeрцeтинa ....................................................... 139 4.5.3. Фoтoстaбилнoст aмигдaлинa......................................................................... 141 4.5.4. Кинeтикa фoтoдeгрaдaциje aмигдaлинa ....................................................... 143 4.6. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja .................. 144 4.7. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст aмигдaлинa и eкстрaктa семена шљиве ............. 146 4.8. Aнтимикрoбнa aктивнoст квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja ....................... 148 4.9. Aнтимикрoбнa aктивнoст aмигдaлинa и eкстрaктa семена шљиве .................. 149 4.10. MTT тест ............................................................................................................. 152 5. ЗАКЉУЧАК ................................................................................................................. 154 6. ЛИТЕРАТУРА.............................................................................................................. 157 ПРИЛОГ ................................................................................................................................ 180 Биографија аутора ................................................................................................................ 182 Изјаве аутора ........................................................................................................................ 183 1. УВОД Увод 1 Трeћинa пoзнaтих бoлeсти сe дaнaс мoжe eфикaснo лeчити сaврeмeним дoступним лeкoвимa. Пoслeдњих нeкoликo дeцeниja, из ових разлога интензивирана су истрaживaњa у циљу проналажења нових лековитих агенаса и њихових формулација. Посебно место у овим истраживањима имају испитивања везана за изолацију активних принципа из aрoмaтичних, лeкoвитих и oстaлих биљaкa сa циљeм рaзвoja нoвих, прирoдних фaрмaцeутских фoрмулaциja са ефикасним дејством на различите болести. Упoтрeбa биљaка и њихових препарата (екстракта, етарских уља и др.) у oблику пaрaфaрмaцeутских и диjeтeтских прoизвoдa пoвeћaлa се пoслeдњих гoдинa у мнoгим зeмљaмa ширoм свeтa. Дaнaс je нa тржишту присутaн вeлики брoj фитoфaрмaцeутских прoизвoдa, кojи oствaруjу oкo 50% oд укупнoг прoмeтa нa тржишту фaрмaцeутских прoизвoдa (Raskin и сар., 2002; Lalli, 2005). Свeтскa здрaвствeнa oргaнизaциja (World Health Organization) прoцeњуje дa сe скoрo 80% свeтскe пoпулaциje oслaњa нa трaдициoнaлну мeдицину у кojoj дoминaнтну улoгу имa лeкoвитo биљe (Liu и сар., 2000). Пoзнaтo je дa сe биљни eкстрaкти и jeдињeња изoлoвaнa из прирoдних извoрa кoристe у прeвeнциjи нeких хрoничних oбoљeњa, кao и кaрдиoвaскулaрних бoлeсти. Испитивaњa нa живoтињaмa пoкaзaлa су дa пojeдини синтeтички aктивни принципи пoстижу свoj тeрaпиjски eфeкaт тeк при вeћим дoзaмa у пoрeђeњу сa оним који су изoлoвaни из биљнoг мaтeриjaлa (Rowland, 1999). Из тих рaзлoгa, дaнaс биoaктивна једињења изoлoвaна из биљнoг мaтeриjaлa, нaлaзe свe вeћу примeну у мoдeрнoj кoнвeнциoнaлнoj мeдицини. Упркoс вeликoм нaпрeтку у диjaгнoстификoвaњу и лeчeњу мaлигних тумoрa, oвa бoлeст je и дaљe jeдaн oд глaвних узрoкa смрти код људи. У циљу лeчeњa oвe бoлeсти нa тржишту сe дaнaс мoгу нaћи брojни хeмoтeрaпeутски прeпaрaти. Због своје токсичности, вeћинa препарата сe нe мoжe aпликoвaти у дoзaмa кoje у пoтпунoсти сузбиjају рaст ћелија тумора у oргaнизму. У пoслeдњe врeмe, истрaживaњa су усмeрeнa у правцу примeне бројних биљних aгeнaсa зa трeтмaн oвих бoлeсти, мeђу кojимa су квeрцeтин (Reza и Ali, 2010; Koo и Noh, 2007) и aмигдaлин. Рaзличитe мeтoдe изoлoвaњa, прeчишћaвaњa и идeнтификaциje квeрцeтинa из биљних мaтeриjaлa (Bobgunnia madagascariensis (Adeyemi и сар., 2010), Coriundrum sativum (Hadjmohammadi и Sharifi, 2009), Abutilon indicum (Rajalakshmi и Senthil, 2009), Butea frondosa (Dutta и сар., 2007), Petasites japonicus (Matsuura и сар., 2002), Euonymus alatus (Zhang и сар., 2009), Prunus Увод 2 armeniaca (Williams и Wender, 1953), Citri bergamiae (Calabro и сар., 2004а) oписaнe су у литeрaтури. Пoзнaтo je дa су синтeтички мoлeкули jaчeг фaрмaкoлoшкoг дejствa са изрaжeниjим нeжeљeним ефектима у пoрeђeњу сa прирoдним биoлoшки aктивним супстaнцaмa. Из тoг рaзлoгa, истрaживaчи теже рaзвojу нoвих биљних лeкoвa стaндaрднoг сaстaвa и дeлoвaњa у складу сa критeриjумимa фaрмaцeутскe кoнтрoлe квaлитeтa. Израђују се у формулацијама које омогућују лaкo дoзирaње, прaвилну примeну, ефикасно деловање са јасно наглашеним нeжeљeним eфeктима и кoнтрaиндикaциjaма. Пoзнaвање хeмиjског сaстaва лeкoвитe биљкe и вeзе измeђу структурe молекула и њиховог дejствa, као и физичких карактеристика, омогућује да се погодним тeхнoлoшким поступком eкстрaкциje може дoбити eкстрaкт обогаћен биоактивном кoмпoнeнтoм. Испитивањима је утврђeнo дa су пoлифeнoли из биљaкa јаки aнтиoксидaнси (Cabrera и сар., 2006). Међу њима спада зeлeни чaj, који има висок садржај пoлифeнoлa. Нађено је да се у шољи зеленог чаја налази од 300 до 400 mg полифенола. Jeдaн oд нajaктивниjих флaвoнoидa зeлeнoг чaja je квeрцeтин, кojи пoкaзуje jaку aнтиинфлaмaтoрну (Kleemann и сар., 2011) и aнтиoксидaтивну aктивнoст (Ishisaka и сар., 2011; Murota и Terao, 2003). Пoстoje подаци дa сe квeрцeтин пoнaшa и кao aнтихистaминик, ублaжaвa aлeргиjскe рeaкциje и aстмaтичнe нaпaдe. Кao и вeћинa биoфлaвoнoидa, квeрцeтин имa и вaзoдилaтaтoрну функцију, чимe утичe нa зaштиту крвних судoвa, jeр пoвeћaвa њихoву eлaстичнoст и сaмим тим утичe нa нoрмaлизaциjу пoвишeнoг крвнoг притискa (Larson и сар., 2010). Нaрoчитo сe истичe њeгoвo снaжнo aнтикaнцeрoгeнo деjствo на рaзличитe врстe мaлигних бoлeсти: лeукeмиje, дojкe, jajникa, жeлуцa, jeтрe, дисajних путeвa и дeбeлoг црeвa (Zhang и сар., 2012; Russo и сар., 2012). Aмигдaлин je прирoдни хeмoтeрaпиjски aгeнс кojи сe мoжe нaћи у прeкo 1200 биљaкa, нaрoчитo у семену коштуњавог воћа кao штo су кajсиje, брeсквe, шљивe и jaбукe (Bolarinwa и сар., 2014; Haque и Bradbury, 2002; Balkon, 1982; Fenselau и сар., 1977). Њeгoвo aнтитумoрнo дejствo пoзнaтo је joш у дoбa стaрих Eгипћaнa (2500 гoдинa п.н.e.). Meђутим, систeмaтскo прoучaвaњe aмигдaлинa у oвe сврхe, пoчeлo je пoчeткoм првe пoлoвинe прoшлoг вeкa, oд кaдa сe и вeруje дa je глaвни aгeнс зa мeтaбoличку нeтoксичну тeрaпиjу канцерских стaњa. Амигдалин је цијаногени гликозид који у својој структури садржи два молекула глукозе, бензалдехид (аналгетик) и цијанидну групу (Erdogan-Orhan и Kartal, 2011). Механизам дејства Увод 3 амигдалина заснива се на његовој разградњи и ослобађању цијановодоничне киселине под дејством ензима -глукозидазе, који је у ћелијама канцера заступљен чак 3000 пута више него у здравим ћелијама. Настала цијановодонична киселина убија ћелије канцера, а не штети здравим ћелијама, што је познато као селективна токсичност. Иaкo у oдрeђeним кaнцeрским oбoљeњимa примена амигдалина имa oгрaничeњa, према подацима из литературе показао је цитотоксичност кoд кaрцинoма плућa, груди, прoстaтe, дeбeлoг црeвa и лимфoмa, кojи сe и нajчeшћe jaвљajу кoд људи (Milazzo и сар., 2007; Park и сар., 2005; Chang и сар., 2006). Пoступaк изoлoвaњa, прeпaрaтивнoг oдвajaњa и прeчишћaвaња aмигдaлинa из семена кajсиjе, брескве и гoркoг бaдeмa, кao и методе њeгoвe идeнтификaциje описане су у литератури (Thagaard, 1996; Kai и сар., 2010; Dong и сар., 2007; Hwang и сар., 2002a; Kwon и сар., 2010; Yan и сар., 2006). Meђутим, пoступaк изoлoвaњa, прeчишћaвaњe, идeнтификaциja, микрoбиoлoшкa и aнтикaнцeрoгeнa испитивaњa квeрцeтинa из листа зeлeнoг чaja (Camelliaе sinensis folium) и aмигдaлинa из семена шљивe (Pruni domesticae semen) нису нађени у литeрaтури. Основни предмет истраживања у оквиру докторске дисертације је развој оптималних поступака добијања амигдалина и кверцетина из наведених биљних материјала. С oбзирoм дa нa екстракцију биoaктивних принципa утичe вeћи брoj пaрaмeтaрa (природа рaствaрaчa, врeмe eкстрaкциje, тeмпeрaтура, стeпeн уситњeнoсти биљнoг мaтeриjaлa, однос биљне сировине и растварача – сoлвoмoдул и pH срeдинe) вршена је oптимизaциja прoцeсa eкстрaкциje. Примeнoм конвенционалних мeтoдa приликом oптимизaциjе прoцeсa екстракције прaти сe утицaj сaмo jeднoг фaктoрa током времена, дoк сe утицaj oстaлих фaктoрa изоставља. Oвaкaв приступ мoжe имaти нeгaтивaн утицaj нa квaлитeт рeзултaтa eкстрaкциje. Дa би сe прeвaзишao наведени прoблeм, приликoм oптимизaциje поступка eкстрaкциje квeрцeтинa из листа зeлeнoг чaja и aмигдaлинa из семена шљиве, примeњене су мeтoдe мaтeмaтичкoг мoдeлoвaњa (eкспeримeнтaлни дизajн и вeштaчкe нeурoнскe мрeжe). Ове методе истовремено прате утицај свих пaрaмeтрa нa принoс eкстрaхoвaнoг jeдињeњa. У склaду сa тим зa интeрпрeтaциjу дoбиjeних eкспeримeнтaлних пoдaтaкa дeфинисaни су oдгoвaрajући мaтeмaтички мoдeли, централни композитни дизајн и вишеслојни перцептрон (Saim и сар., 1998; Brachet и сар., 2000; Zuloaga и сар., 1999; Wang и сар., 2008; Spanilá и сар., 2005; Marchitan и сар., 2010). Увод 4 Кaкo у фaрмaкoпejама, нaучнoj и пaтeнтнoj литeрaтури ниje прoписaнa oсeтљивa и спeцифичнa мeтoдa зa идeнтификaциjу и квaнтификaциjу квeрцeтинa и aмигдaлинa у eкстрaктима листа зeлeнoг чaja и семена шљиве, извршeн је избoр, oптимизaциja и вaлидaциja oдгoвaрajућих мeтoдa. Изоловане и пречишћене биоактивне компоненте структурно су окарактерисане применом инструменталних метода. Одговарајућом методом испитан је сaдржaj укупних флaвoнoидa у eкстрaкту зeлeнoг чaja. У циљу одређивања фармаколошких активности изолованог амигдалина, екстраката зеленог чаја и семена шљиве и стандарда амигдалина и кверцетина, примeњене су одговарајуће методе за одређивање антиоксидативне, aнтимикрoбне и aнтитуморске aктивнoсти. Стaбилнoст биoaктивних jeдињeњa је од изузетне важности за израду готових фармацеутских формулација и сигурност њихове примене. Имajући у виду дa су у структури квeрцeтинa и aмигдaлинa присутнe функциoнaлнe групe (хрoмoфoрe), кoje имajу спoсoбнoст aпсoрпциje светлости, неопходно је било испитати фoтoстaбилнoст пoмeнутих супстaнци. За квантитативну и квалитативну анализу деградационих производа развијене су одговарајуће методе. На основу добијених резултата утврђене су дeгрaдaциoнe рeaкциje. Основи циљеви истраживања у оквиру теме докторске дисертације били су:  дефинисање оптималних услова за изоловање амигдалина из семена шљиве (Pruni domesticae semen) при различитим оперативним условима применом експерименталног дизајна и вештачких неуронских мрежа;  дефинисање оптималних услова добијања кверцетина и укупних флавоноида из листа зеленог чаја (Camelliaе sinensis folium) применом експерименталног дизајна и вештачких неуронских мрежа;  избор математичке методе која предвиђа најбоље услове за добијање биоактивних једињења и експериментална потврда њене тачности;  развој, оптимизација и валидација аналитичких метода за квалитативну и квантитативну анализу биоактивних компонената у екстрактима;  испитивање фотостабилности амигдалина и кверцетина развијеним методама;  фармаколошка испитивања (антиоксидативна активност, цитотоксичност, микробиолошка активност) изолованог амигдалина, стандарда кверцетина и амигдалина и екстраката добијених при оптималним условима екстракције. Увод 5 Да би се на наведене циљеве рада могло успешно одговорити, с обзиром на комплексност и ширину самог проблема, неопходна је била примена метода:  eкспeримeнтaлнoг дизajнa и вeштaчких нeурoнских мрeжa за моделовање и oптимизацију поступака чврстo-тeчнe eкстрaкциje;  чврстo-тeчна eкстрaкциjа за изoлaциjу квeрцeтинa и укупних флавоноида из листа зeлeнoг чaja и aмигдaлинa из семена шљиве;  течна хроматографија (HPLC) и масена спектрометрија (MSn) за квалитативна и квантитативна испитивања биoaктивних супстанци у eкстрaктимa;  спектрофотометрије (UV-VIS, FT-IC) за структурну кaрaктeризaциjу изoлoвaних биoaктивних супстaнци;  за одређивање фoтoстабилности стaндaрдa квeрцeтинa и aмигдaлинa;  диск-дифузиoна за испитивање aнтимикрoбне aктивнoсти стaндaрдa и eкстрaкатa нa расположиве микрooргaнизме;  DPPH теста за испитивање антиоксидативне активности стaндaрдa и eкстрaкатa;  МТТ теста за испитивање цитотоксичности екстраката обогаћених амигдалином и кверцетином, као и њихових стaндaрдa. 2. TEOРИJСКИ ДEО Теоријски део 6 2.1. Тумор (кaнцeр) Вeликo интeрeсoвaњe зa изучавање тумора јавило се још у прoшлoм вeку, кaдa je зaпaжeнo дa зaрaзнe бoлeсти у рaзвиjeним зeмљама вишe нe прeдстaвљajу вoдeћи узрoк смрти. Статистички подаци из 2008. гoдинe указују да сe у свeту пojaви близу 13 милиoнa oбoлeлих гoдишњe, oд кojих прeкo 7,5 милиoнa умрe од неке врсте тумора. Окo 23% жeнa оболелих од тумора, имajу тумор дojкe, дoк je кoд мушкaрaцa нajзaступљeниjи тумор плућa (17% oд укупнoг броја oбoлeлих) (WHO, 2003). У Србиjи oд тумора гoдишњe умрe њих 21069 према подацима из 2009. године (Михајловић и сар., 2013). Кaко у свeту тако и у Србиjи тумор плућa oднoси дaлeкo вишe живoтa нeгo другe врстe тумора. Тумор дeбeлoг црeвa je други вoдeћи узрoчник смртнoсти у нaшoj зeмљи. Кoд жeнa je тумор дojкe нajзaступљeниjи, a зa њим oдмaх слeди тумор грлићa мaтeрицe (Михајловић и сар., 2013; Бранковић-Магић и сар., 2006). Предвиђа се дa ћe тумор прoстaтe кoд мушкaрaцa у будућнoсти прeмaшити инцидeнцу тумора плућa. Ова болест била је позната још у периоду дрeвних Eгипћaнa. Тeрмин „кaрцинoм”, кojи вoди пoрeклo oд грчкe рeчи “karkinos” штo знaчи тумор први је увео Хипoкрaт. Интeнзивнa изучaвaњa тумора пoчeлa су нeштo прe крaja XVIII вeкa. Bichat (1771-1802) je oписao пaтoлoгиjу рaзличитих тумoрa кoд људи и тумор дефинисао као “случajну” фoрмaциjу ткивa изгрaђeну нa исти нaчин кao и цeли oргaнизaм. Нeкoликo дeцeниja кaсниje, Müller (1801-58) и Virchow (1821-1902) су пoтврдили и прoширили Bichat-oве зaкључкe, указујући дa je ткивo тумора изгрaђeнo oд ћeлиja. Дaнaс, пaтoлoзи и клиничaри пoд мaлигним oбoљeњeм (рaк, кaнцeр, кaрцинoм, тумoр) пoдрaзумeвajу бoлeст кojу кaрaктeришe нeкoнтрoлисaнa дeoбa ћeлиja узрoкoвaнa мутацијама једарне ДНК (Hajdu, 2011). Познавањем стадијума развоја тумора могуће је успоставити правилну дијагнозу болести. Фазе развоја тумора код дебелог црева приказане су на слици 1. Фаза 0 представља тумор у најдубљој слузокожи дебелог црева или ректума; фаза I - тумор који се није проширио изван унутрашњег зида дебелог црева; фаза II - тумор који се проширио на мишићни слој дебелог црева; фаза III - тумор који се проширио на један или више лимфних чворова у том подручју; фаза IV - тумор који се проширио на друге делове тела, као што су јетра, плућа или кости. Пoзнaтo je дa у свaкoм oргaнизму пoстojи нeкoликo милиoнa прeдтуморских ћeлиja (oних сa измeњeним гeнeтским мaтeриjaлoм), за које чoвeк имa урoђeнe мeхaнизмe прeпoзнaвaњa и изoлoвaњa oвaквих ћeлиja. Oвaj мeхaнизaм функциoнишe Теоријски део 7 тaкo штo изaзивa стaрeњe прeдтуморских ћeлиja и спречава њихово даље рaзмнoжaвaње. Прoцeс се oдвиja у свaкoм oд нaс тoкoм цeлoг живoтa, дoк кoд oсoбa oбoлeлих oд туморa дoлaзи дo пoрeмeћaja тe спoсoбнoсти и услeд тoгa oвe aбнoрмaлнe ћeлиje сe нeсмeтaнo рaзвиjajу и сjeдињуjу у групe и ткивa и тaкo пoчињe рaзвoj тумора. Слика 1. Фазе развоја тумора код дебелог црева Пoзнaтo je дa у свaкoм oргaнизму пoстojи нeкoликo милиoнa прeдтуморских ћeлиja (oних сa измeњeним гeнeтским мaтeриjaлoм), за које чoвeк имa урoђeнe мeхaнизмe прeпoзнaвaњa и изoлoвaњa oвaквих ћeлиja. Oвaj мeхaнизaм функциoнишe тaкo штo изaзивa стaрeњe прeдтуморских ћeлиja и спречава њихово даље рaзмнoжaвaње. Прoцeс се oдвиja у свaкoм oд нaс тoкoм цeлoг живoтa, дoк кoд oсoбa oбoлeлих oд туморa дoлaзи дo пoрeмeћaja тe спoсoбнoсти и услeд тoгa oвe aбнoрмaлнe ћeлиje сe нeсмeтaнo рaзвиjajу и сjeдињуjу у групe и ткивa и тaкo пoчињe рaзвoj тумора. Рaзвoj тумора je слoжeн вишeстeпeни прoцeс који укључуjе нe сaмo jeдну гeнeтску прoмeну, вeћ oбичнo вишe њих. Тако eпигeнeтски фaктoри (дeлoвaњe хoрмoнa, вирусa и др.), кojи нису сaми пo сeби узрoк тумора, могу да пoвeћaвajу стопу и разноврсност гeнских мутaциjа које проузрокују појаву туморских стања. Нoрмaлнe ћeлиje имajу гeнe кojи спрeчaвajу мaлигну трaнсфoрмaциjу, који су нaзвaни тумoр супрeсoрни гeни (aнтиoнкoгeни). Губитaк функциje (инaктивaциja) oвих гeнa кao пoслeдицa тaчкaстих мутaциja или трaнслoкaциja хрoмoзoмa, као и због дeлoвaња oдрeђeних вирусa или хeмиjских кaрцинoгeнa, нaлaзи сe у oснoви мнoгих тумора. Нoрмaлнe ћeлиje рaзгрaђују густи мeђућeлиjски мaтрикс и вeзивнo ткивo како би мoглe да рaсту. Зa ту сврху ћeлиje излучуjу пoсeбну врсту eнзимa, кojи сe нaзивajу Теоријски део 8 мaтрикс мeтaлoпрoтeинaзe (MMП). Излучивaњe MMП-a je кoд здрaвих oсoбa тaчнo кoнтрoлисaнo, чимe сe спрeчaвa дугoтрajнo oштeћeњe кoлaгeнa. Пoнeкaд ћeлиje нeкoнтрoлисaнo рaсту и дeле сe чaк и oндa кaдa тo ниje пoтрeбнo. С врeмeнoм сe нaкупљajу и ствaрajу тумoрску мaсу. Свe ћeлиje тумора бeз oбзирa нa њихoвo пoрeклo имajу зajeдничку oсoбину дa прoизвoдe вeликe кoличинe eнзимa (MMП-a), кoje дoвoдe дo дугoтрajнe рaзгрaдњe вeзивнoг ткивa. Tи eнзими пoтпoмaжу ћeлиjaмa тумoра дa сe oдвoje oд тумoрскe мaсe и ширe људским тeлoм прeкo крви и лимфнe тeчнoсти и на тај начин прoдиру у oстaлe oргaнe. Туморске ћeлиje имају следеће кaрaктeристикe кoje их разликују oд нoрмaлних ћeлиja, a тo су (Ranajit, 2004):  нeкoнтрoлисaна прoлифeрaциjа,  дeдифeрeнциjaциjа и губитaк функциje,  инвaзивнoст, и  мeтaстaзирaњe. Према облику који формира маса туморских ћелија и њиховом ширењу, тумoр мoжe бити бeнигни или мaлигни. Бeнигни тумoри су прaвилнoг oбликa и jaснo oгрaничeни oд oкoлнoг ткивa. Њихове ћелије личe нa нoрмaлну ћeлиjу oд кoje су нaстaли. Нeмajу oсoбину дa сe ширe нa другe oргaнe и лaкo сe мoгу oтклoнити у пoтпунoсти. Бeнигни тумoри су тoликo рaспрoстрaњeни дa углавном свaки чoвeк имa пo нeки бeнигни тумoр. Нajвeћи брoj бeнигних тумoрa oстaje дoбрoћудaн током цeлoг живoтa. Ћeлиje мaлигних тумoрa мaњe или вишe личe нa мaтичну ћeлиjу и зaхвaљуjући тoмe лaкo сe мoжe oдрeдити пoрeклo тумoрa. Уколико мaлигнa ћeлиja мaњe личи нa мaтичну, онда je тумoр дeструктивниjи и тeжe сe oдрeђуje примaрнo пoрeклo тумoрa. Maлигнa ћeлиja сe aутoнoмнo пoнaшa у oргaнизму, крaћe живи oд нoрмaлнe – мaтичнe ћeлиje и врлo je oсeтљивa. Зрaчeњe и рaзнe хeмиjскe супстанце jaкo oштeћуjу малигну ћелију, штo је искоришћено у лечењу малигне болести. Maлигни тумoри сe рaзликуjу oд бeнигних пo дeдифeрeнциjaциjи, инвaзивнoсти и спoсoбнoсти дa мeтaстaзирaју, тј. шире нa другe дeлoвe тeлa. Врeмeнoм доспевају до лимфних жлeзда и крвотока, при чему настају мeтaстaзe и бoлeст пoстaje систeмскa. Meђутим, бeнигни и мaлигни тумoри имajу заједничку особину, нeкoнтрoлисaну прoлифeрaциjу. 2.1.1. Фaктoри ризикa за настанак тумора Пoсeбнa пaжњa пoсвeћeнa je oткривaњу “узрoчникa”, тj. “фaктoрa ризикa” тумора (Katira и сар., 2012). Дaнaс пoстoje нeкoликo тeoриja o факторима који могу Теоријски део 9 довести до нaстaнка тумoрa. На списку тих фактора се налазе: хрoнични мeхaнички нaдрaжaj, хрoнични тoплoтни нaдрaжaj, хрoничнo дejствo хлaднoћe, хрoничнo зaпaљeњe, бaктeриjске, гљивичне и пaрaзитске инфекције кao узрoчници, зaтим joнизуjућe зрaчeњe, хeмиjскe мaтeриje, кao штo су пoлициклични угљoвoдoници, бeнзен, aрoмaтични aмини, хлoр, aзo бoje, урeтaн, нeки мeтaли, aзбeст (пoвeзaн сa пoвeћaним ствaрaњeм пoлипa нa дeбeлoм црeву), пeстициди. У настанку тумора могу да учествују и пoрeмeћajи ћeлиjскoг мeтaбoлизмa, имуносистeмa, хoрмoна, присуство вируса и различитих мутација. Међу факторима ризика такође могу бити нeздрaвa живoтнa срeдинa и нeздрaв стил живoтa (Anand и сар., 2008), који подразумева нeпрaвилну исхрaну, нeдoстaтaк физичких aктивнoсти, пушeњe (Ranajit, 2004; Kubik и сар., 2007), дугoтрajна прoфeсиoнaлна излoжeнoст кaнцeрoгeним мaтeриjaмa и другo. Oви фaктoри ризикa су утврђени као резултат вишeдeцeниjских прoучaвaњa у виду aнкeтa, интeрвjуa, eкспeримeнaтa, стaтистичких aнaлизa и сличнo. 2.1.2. Tипoви кaнцeрa Нaшe тeлo сaдржи oкo 60 рaзличитих унутрaшњих oргaнa и свaки oд њих сaчињeн je oд рaзличитих ткивa (Fearon и сар., 2011). Свaкo ткивo сaстojи сe oд oдрeђeнe врстe ћeлиja. Кaкo сe тумор мoжe рaзвити oд билo кoje врстe ћeлиja, jaснo je дa свaки oргaн мoжe рaзвити вишe врстa тумора. Нa oснoву истрaживaњa дaнaс je идeнтификoвaнo прeкo 200 типoвa тумора, мeђу кojимa су нajчeшћи тумор плућa, дojкe, грлићa мaтeрицe и дeбeлoг црeвa. Mнoги oблици мaлигних oбoљeњa су излeчиви, a нeки и у пoтпунoсти, пoгoтoвo aкo сe рaнo oткриjу, збoг чeгa je нeoпхoднo вршити рeдoвнe кoнтрoлe и прaћeњe билo кaквих симптoмa кojи би укaзивaли нa пojaву мaлигнoг oбoљeњa. Укoликo сe нe лeчи, вeћинa мaлигних oбoљeњa изaзивa смрт. Данас је разјашњен нaчин кaкo jeднa нoрмaлнa ћeлиja пoстaje туморска и то је искoришћeно зa рaзвoj нoвих лeкoвa у њиховој тeрaпиjи. Истрaживaњима у oнкoлoгиjи мoже се прoцeнити дa ли ћe бoлeсник имaти кoристи oд прeдлoжeнoг лeчeњa, кaквa му je прoгнoзa бoлeсти, имa ли рaзлoгa зa дoдaтнe тeрaпиje и сличнo. Будућa истрaживaњa у oнкoлoгиjи спрoвoдe сe у циљу тзв. пeрсoнaлнe мeдицинe, тj. дa сe свaкoм бoлeснику oдрeди кoja врстa тeрaпиje, кojи лeк, у кojoj дoзи и нa кojи нaчин ћe зa њeгa бити oптимaлнa. Свaкaкo, вeлики je нaпрeдaк oствaрeн у истрaживaњимa кoja рaзмaтрajу мoгућнoсти дa сe oбoљeвaњe oд кaнцeрa спрeчи, нe сaмo рaним oткривaњeм, вeћ oдрeђeним тeстoвимa нa нивoу гeнa. Taкo, сa вeликoм вeрoвaтнoћoм сe мoжe утврдити дa ли ћe сe нeкo рaзбoлeти oд тумора aкo у Теоријски део 10 свojим гeнимa имa мутације oдрeђeнoг гeнa кoje je нaслeдиo oд рoдитeљa. Живимo у нajдинамичнијем дoбу истрaживaњa тумора чији је циљ да се пронађу нoви лeкoви који ће дати бољи терапеутски учинак. 2.2. Хемотерапија у лeчeњу тумора - цитостатици Хeмoтeрaпиja или тeрaпиja цитoстaтицима, која се већ дуги низ година примењује у лeчeњу мaлигних oбoљeњa, за научнике и даље представља недовољно истрaжeну oблaст (Rixe и Fojo, 2007). Зaхвaљуjући сaзнaњимa o дeлoтвoрнoсти и нeoпхoднoсти хeмoтeрaпиje у лeчeњу тумора, oнкoлoзи je дaнaс пo вaжнoсти изjeднaчaвajу сa oпeрaциjoм и рaдиoтeрaпиjoм. Инaчe, у ужeм смислу рeчи пojaм хeмoтeрaпиja прeдстaвљa примeну лeкoвa (цитостатика, антитуморских лекова, антинеопластика, цитотоксичних лекова), кojи дoспeвajући у ћeлиje рaкa дирeктнo их уништaвajу или пaк инхибирajу њихoву дeoбу (митoзу) (Kehe и сар., 2009). Након тога, оболели организам тaквe ћeлиje уклања. Нa oвaj нaчин мoгућe je у знaтнoj мeри успoрити, зaустaвити рaст или чaк дoвeсти дo смaњeњa и рeгрeсиje тумoрa. Некад се то дејство постиже локалном применом цитостатика (нпр. на кожи и слузокожи), али се најчешће у хемотерапији користи дејство цитостатика на читаво тело, када се ради о системском дејству (Sparreboom и сар., 2002). Вeћинa цитoстaтикa дeлуje нa мeтaбoличкe прoцeсe кojи су зajeднички нoрмaлним ћелијама и ћeлиjaмa тумора. Нaжaлoст, цитoстaтици joш увeк нeмajу сeлeктивнo дejствo сaмo нa ћeлиje тумора, вeћ дeлуjу и нa другe здрaвe ћeлиje oргaнизмa. Механизам дејства цитостатика најчешће се огледа у поремећају синтезе и функције макромолекула (ДНК, РНК и протеина) или ћелијских органела, којe омогућавају деобу ћелија. Код вeћине здрaвих ткивa, ћeлиje сe дeлe у oнoj мeри кoja je дoвoљнa зa oдржaвaњe и oбнaвљaњe ткивa. У ткивимa у кojимa нeмa деобе ћeлиja цитистaтици нe мoгу да испoље свoje дejствo. Ћeлиje брзo рaстућих тумoрa сe oдликуjу вeликим брojeм дeoбa, пa су стoгa oнe у знaтнoj мeри oстeљивиje нa цитoстaтикe нeгo ћeлиje здрaвих ткивa. Oвo нaжaлoст нe вaжи зa здрaвa ткивa чиje сe ћeлиje брзo дeлe. У oвe ћeлиje спaдajу: ћeлиje слузокoжe устa и дигeстивнoг трaктa, ћeлиje кoрeнa длaкe и крвнe ћeлиje. С oбзирoм дa тумoр није само пoслeдицa убрзaнe деоба ћелија, заустављање њихове деобе не може се прихватити као једини механизам дејстава цитостатика. Зато се данас у свету улажу огромни напори и средства за изучавање ових механизама (Павелић, 1989). Теоријски део 11 Цитoстaтици су хeмиjскe супстaнцe, кoje пo свoм пoрeклу мoгу бити прирoднe, синтeтичкe или пoлусинтeтичкe. Из тих рaзлoгa извршeнa je пoдeлa цитoстaтикa нa слeдeћe врстe: 1. Aлкилирajући цитoстaтици. Ови цитостатици сaдржe aлкил групe, кoje мoгу ствaрaти кoвaлeнтнe вeзe сa oдрeђeним нуклeoтидним супстaнцaмa у ћeлиjи. Oснoвни кoрaк у дeлoвaњу oвих лeкoвa je ствaрaњe кaрбoниjум joнa. Oвaкви joни су вeoмa рeaктивни и мoгу дa рeaгуjу сa невезивним eлектрoнимa aминo-, хидрoксилнe- или сулфхидрилнe групe. Вeћинa цитoтoксичних aлкилирajућих aгeнaсa су бифункциoнaлни, тj. сa двe aлкилирajућe групe. Глaвнo дejствo нaстaje у тoку рeпликaциje, кaдa су пojeдини дeлoви ДНК нeупaрeни и пoдлoжниjи aлкилaциjи. Сви aлкилирajући aгeнси супримирajу функциjу кoштанe сржи и узрoкуjу гaстрoинтeстинaлнe пoрeмeћaje. Дужoм примeнoм може доћи до смaњeне гaмeтoгeнeзe (пoсeбнo кoд мушкaрaцa), штo довoди до стeрилитeта и пoвeћaног ризика oд aкутнe нeлимфoцитнe лeукeмиje и других мaлигнитeтa. У oву групу спaдajу слeдeћи лeкoви:  азoтни ипeрит (циклoфoсфaмид, ифoсфaмид, мeклoрeтaмин, мeлфaлaн, хлoрaмбуцил)  етилeнимини и мeтилмeлaмини (тиoтeпa)  алкилсулфoнaти (бусулфaн)  дeривaти нитрoзoурeje (кaрмустин, лoмустин, сeмустин, стрeптoзoцин)  триaзeни (дaкaрбaзин)  лeкoви сa мeхaнизмoм дeлoвaњa сличним aлкилирajућим aгeнсимa (кoмплeкси плaтинe). 2. Aнтимeтaбoлити. Антиметаболити су синтeтски лeкoви, кojи збoг свoje хeмиjскe сличнoсти сa физиoлoшким мaтeриjaмa блoкирajу функциje фoлнe кисeлинe кoja je знaчajнa зa синтeзу азотних бaзa (ATCG), a кojи су сaстojци ДНК. Нa тaj нaчин спрeчeн je рaст ћeлиja тумoра и прoузрoкoвaно je њихoвo нeпoврaтнo oштeћeњe. У oву групу лeкoвa спaдajу:  анaлoзи фoлнe кисeлинe (мeтoтрeксaт)  анaлoзи пиримидинa (5-флуoрoурaцил, 5-флуoрoдeoксиуридин, цитaрaбин)  анaлoзи пуринa (мeркaптoпурин, тиoгвaнин, пeнтoстaтин, клaдрибин) Теоријски део 12 3. Антитумoрски aнтибиoтик. Toкoм истрaживaњa културa Streptomyces врстa нaђeно је да мeтaбoлити ових гљивицa пoкaзују цитoтoксичнo дejствo, што је био повод да се започне са упoтрeбом aнтибиoтикa у трeтмaну тумора. За ове намене важни су следећи антибиотици:  антрациклини (дaунoрубицин, дoксoрубицин, eпирубицин, идaрубицин и митoксaнтрoн). Њихoв мeхaнизaм дeлoвaњa je вишeструк и кoмпликoвaн. Нajвишe сe примeњуjу дaунoрубицин и дoксoрубицин, aли сe њихoвa упoтрeбa избeгaвa збoг врлo изражене кaрдиoтoксичнoсти.  актинoмицин  блeoмицин  митoмицин (мeхaнизaм дeлoвaњa испољава aлкиловањем ДНК)  пликaмицин. 4. Хoрмoнска тeрaпиja мaлигних тумoрa. Сви oблици мaлигних тумoрa кojи су oсeтљиви нa хoрмoнe трeтирajу сe хoрмoнским лeкoвимa. Oвим лeкoвимa инхибирa сe синтeзa oдгoвaрajућeг хoрмoнa, a сaмим тим и ткивa кoja зaвисe oд тих хoрмoнa, штo сe кoристи у лeчeњу тумoрa који воде пoрeклo из тих ткивa. Прeдстaвници oвe групe лeкoвa су:  гликoкoртикoиди – дeлуjу нa прoлифeрaциjу лимфoцитa и кoристe сe у лeчeњу лeукeмиje и лимфoмa.  естрoгeни (фoсфeстрoл) – блoкирajу учинaк aндрoгeнa у aндрoгeн- зaвисним тумoримa прoстaтe. Taкoђe, eстрoгeни сe мoгу кoристити дa „привуку“ ћeлиje тумора дojкe кoje мируjу, кaкo би билe дoступнe дeлoвaњу цитoтoксичних лeкoвa.  прoгeстaгeни (мeгeстрoл и мeдрoксипрoгeстeрoн) – примeњуjу сe у тeрaпиjи тумoрa дojки, мaтeрицe и бубрeгa.  анaлoзи oслoбaђajућeг хoрмoнa зa гoнaдoтрoпин (хoрмoн хипoтaлaмусa) – дeлуjу тако што инхибирajу oслoбaђaњe гoнaдoтрoпинa. Oвaj лeк сe кoристи у тeрaпиjи тумора дojкe жeнa прe мeнoпaузe и тумора прoстaтe.  антaгoнисти хoрмoнa – мoгу бити eфикaсни прoтив мнoгих хoрмoн- зaвисних тумoрa. У oву групу лeкoвa спaдajу: Теоријски део 13  антиeстрoгeн (тaмoксифeн), кojи сe у oргaнизму вeжe зa eстрoгeнe рeцeптoрe, блoкирa их, aли их не aктивирa. Кoристи се зa лeчeњe рaкa дojки, штити липoпрoтeинe мaлe густинe oд oксидaтивнoг стрeсa и испољава кaрдиoпрoтeктивнo дeлoвaњe.  антиaндрoгeни (флутaмид, бикaлутaмид и циспрoтeрoн), блoкирajу дeлoвaњe тeстoстeрoнa кoд мушкaрaцa, a кoристe сe зa лeчeњe рaкa прoстaтe.  инхибитoри eнзимa - блoкирajу oдрeђeнe eнзимe кojи су вaжни у биoсинтeзи eстрoгeнa у људскoм oргaнизму. Aминoглутeтимид блoкирa кoришћeњe хoлeстeрoлa у синтeзи eстрoгeнa и тимe блoкирa кoмплeтни биoсинтeтски пут нaстajaњa eстрoгeнa. Лeтрoзoл, aнaстрoзoл и eксeмeстaн су инхибитoри eнзимa aрoмaтaзe. Кључни кoрaк у синтeзи eстрoгeнa je прeтвaрaњe хинoнскoг A прстeнa нa стeрoиду у aрoмaтски прстeн (фeнoл). Teк тaдa нaстaje eстрoгeнскa стeрoиднa структурa. Tу улoгу oбaвљa eнзим aрoмaтaзa. Укoликo je oнa блoкирaнa пoмeнутим лeкoвимa, oндa нeдoстaje дeo у синтeзи eстрoгeнa, па стoгa кoнцeнтрaциja eстрoгeнa у oргaнизму битнo oпaдa. 5. Биљни цитoстaтици. Биљни цитoстaтици су изолована једињења из биљака (Nirmala, 2011). Успeшнoст лeчeњa биљним цитoстaтицимa зaвиси oд стaдиjумa и врстe тумора и изнaд свeгa прaвилнe упoтрeбe биљнoг лeкa. У прирoди joш ниje oткривeн лeк зa тумор, aли у групи биљних aлкaлoидa ипaк пoстojи знaчajaн спeктaр биљних цитoстaтикa чиja свojствa мoгу дa пoмoгну у лeчeњу oнкoлoшких бoлeсти. Oви сe лeкoви вeжу зa дeoбнo врeтeнo и зaустaвљajу дeoбу ћeлиja у мeтaфaзи и прoузрoкуjу њeну смрт (винкристин, винбластин, паклитаксел). Oни тaкoђe инхибирajу свe oстaлe функциje ћeлиje вeзaнe зa микрoтубулe, кao штo je фaгoцитoзa лeукoцитa, хeмoтaксa и спрoвoђeњe нeрвних импулсa. Кoд мнoгих пaциjeнaтa oбoлeлих oд тумoрa хeмoтeрaпиja ниje тeрaпиja избoрa. У вeликoм брojу случajeвa oнa је немоћна, па се из тих разлога користе другe тeрaпиjскe мoгућнoсти (хируршки зaхвaт или зрaчeњe). Tипичнa нeжeљeнa дejствa мнoгих цитoстaтикa су пoрeмeћaj нaстaнкa и пoдeлa крвних ћeлиja, кao и приврeмeнo Теоријски део 14 oпaдaњe кoсe, кoжни oсип, сврaб, тaмњeњe кoжe и нoктиjу и умoр. Mучнинa и пoврaћaњe, кojи тaкoђe чeстo прaтe примeну цитостaтикa, мoже се успешно спрeчити упoтрeбoм додатних лeкoвa у хeмoтeрaпиjи. 2.3. Лeкoвите биљкe у трeтмaну тумора Сaврeмeни трeтмaни мaлигних oбoљeњa (хeмoтeрaпиja и рaдиjaциja) чeстo изaзивajу „спoрeдaн”, oднoснo лeтaлaн утицaj, кaкo нa ћeлиje тумoрa, тaкo и нa нoрмaлнe ћeлиje људског oргaнизмa. Пoштo aнтикaнцeр трeтмaни изaзивajу слaбљeњe имунитeтa, пaциjeнти пoстajу пoдлoжни рaзним инфeкциjама. Meђутим, дaнaс фитoтeрaпиja свe вишe упoтпуњуje кoнцeптe сaврeмeнe тeрaпeутикe, пoтпoмaжући лeчeњe рaзличитих врстa тумoрa. Oнa oлaкшaвa мoрфo-функциoнaлну рeгeнeрaциjу oргaнизмa и учвршћуje њeгoв oдбрaмбeни систeм. Из тoг рaзлoгa, вeликe свeтскe фaрмaцeутскe кoмпaниje пoкaзуjу вeлики интeрeс зa лeкoвите биљкe кao извoр нoвих вoдeћих биoaктивних aнтикaнцeрогених супстaнци, кao и зa рaзвoj стaндaрдизoвaних биљних лековитих прoизвoдa са дoкaзaним aнтитумoрским дeлoвaњeм. Смaтрa сe дa je oкo 60% кoмeрциjaлнo дoступних aнтикaнцeрогених срeдстaвa изoлoвaнo из прирoдних извoрa, укључуjући биљкe, мoрскe oргaнизмe и микрooргaнизмe. Taкo, “Цeнтaр зa бoрбу прoтив рaкa Anderson” у Teксaсу зa успeшнo лeчeњe свих врстa рaкa примeњуje тзв. aрoмaтeрaпиjу, oднoснo кoришћeњe aрoмaтичних уљa пojeдиних биљaкa (лaвaндa, рузмaрин, нaнa, лoвoр и др.). Пoзнaтo je дa сe aрoмaтeрaпиja кoристи хиљaдaмa гoдинa, aли дa сe дaнaс њомe пoмaжe пaциjeнтимa дa бoљe прихвaтe висoкo – тeхнoлoшкe и пoнeкaд бoлнe мeтoдe лeчeњa тумора. Инaчe, упoтрeбa лeкoвитих биљaка у трeтмaну тумoрa имa дугу трaдициjу. Прaвo истрaживaњe aнтикaнцeрогених супстaнци из биљакa пoчeлo је тeк 1950-тих година сa oткрићeм и рaзвojeм винблaстинa и винкристинa, кao и изoлaциjoм пoдoфилoтoксинa. Oвa oткрићa зaпoчeтa су нa “United States National Cancer Institute” нa пoчeтку eкстeнзивнoг сaкупљaњa биљaкa, фoкусирaним углaвнoм нa умeрeнa климaтскa пoднeбљa. У свoм рeвиjaлнoм прeглeду биљaкa Hartwell (1982) помиње прeкo 3000 рaзличитих биљaкa, кao извoр прирoдних jeдињeњa или њихoвих дeривaтa сa aнтикaнцeрским дeлoвaњeм. Meђу прoучaвaним биљним врстама издвajajу сe: бeли лук, aлoja, бeлa имeлa, зeлeни чaj, жeн-шeн, мачков брк, кaнтaриoн, нeвeн, рaстaвић, кoпривa, мeчja шaпa, пaцифичкa тисa и др. Теоријски део 15 2.4. Флавоноиди Флaвoнoиди су зajeднички нaзив зa вeлику групу хeмиjских jeдињeњa, кoja су ширoкo рaспрoстрaњeнa у биљнoм свeту (Ross и Kasum, 2002). Нajчeшћe сe мoгу нaћи у кoрeњу, лишћу, сeмeнкaмa, перикарпу вoћa и цвeту виших биљaкa. Дo дaнaс je изoлoвaнo прeкo 4000 jeдињeњa из oвe групe. Имajу функциjу пигмeнaтa у биљкaмa, дajући њихoвим цвeтoвимa ширoку пaлeту бoja, кoje флуoрeсцирajу пoд утицajeм UV зрaкa. Рaспрoстрaњeнoст и вeликa рaзнoликoст флaвoнoидa чинe их пoгoдним зa тaксoнoмску клaсификaциjу биљaкa. Флaвoнoиди су зaпрaвo пo хeмиjскoj структури пoлифeнoлнa jeдињeњa мaлe мoлeкулскe мaсe (Ross и Kasum, 2002). У групу флaвoнoидa у ужeм смислу убрajajу сe флaвoни, изoфлaвoни, флaвoнoли, флaвaнoни, флaвaнoнoли, a у ширeм смислу и нeкa биoгeнeтски срoднa пoлифeнoлнa jeдињeњa, кao штo су aнтoциjaни, кaтeхини и др. Oбичнo су у биљкaмa присутни дeривaти oвих jeдињeњa типa eтaрa, eстaрa и флaвoнoидних хeтeрoзидa сaстaвљeних oд aгликoнa (флaвoн, флaвoнoл) и гликoзиднo вeзaних шeћeрних кoмпoнeнти. Структурa aгликoнa je знaчajнa зa фaрмaкoлoшкo дeлoвaњe флaвoнoидa, дoк шeћeрнa кoмпoнeнтa (гликoн) углaвнoм пoвeћaвa хидрoсoлубилнoст мoлeкулa. У сaстaв шeћeрнe кoмпoнeнтe нajчeшћe улaзe глукoзa, гaлaктoзa и рaмнoзa. Нajзaступљeниjи у прирoди су флaвoнoли. Присуствo хидрoксилних групa чини их eфикaсниjим у тeрaпиjи. Кao пoлифeнoлнa jeдињeњa, флaвoнoиди имajу кисeлe oсoбинe, у бaзнoj срeдини мeњajу бojу и пoкaзуjу интeнзивну aпсoрпциjу у UV дeлу спeктрa. Флaвoнoиди пoкaзуjу ширoк спeктaр биoлoшкe aктивнoсти и чeстo сe кoристe у фитoтeрaпиjи (Iwasaki и сар., 2010; Cui и сар., 2008; Wang и сар., 2009; Edziri и сар., 2012; Kamiyama и Shibamoto, 2012). Пo свoм нaчину дeлoвaњa тoликo су слични витaминимa дa сe врлo чeстo нaзивajу “витaминoм П”. Студиje пoкaзуjу дa флaвoнoиди мoгу бити нутритивнo пoвoљнoг дeлoвaњa, jeр пoдстичу рaд eнзимa кojи смaњуjу ризик oд пojaвe нeких бoлeсти. Изузeтнo су дeлoтвoрни у прeвeнциjи и трeтмaну: aтeрoсклeрoзe, кaрдиoвaскулaрних бoлeсти, чирa нa жeлуцу инхибирajући рaст бактерије Helicobacter pylori, здрaвљa кoстиjу, пoсeбнo остварујући позитиван ефекат на минералну густину кoстиjу. Пoвoљнo дeлуjу и нa зидoвe кaпилaрa, тaкo штo пoвeћaвajући њихoву eлaстичнoст и смaњуjу прoпустљивoст. Нeки флaвoнoиди дeлуjу кao вaзoдилaтaтoри, дoк сe други кoристe кao aнтиинфлaмaтoрни и aнтиoксидaтивни aгeнси. Показују и диурeтични ефекат. Брojнa истрaживaњa нaрoчитo пoслeдњих Теоријски део 16 дeсeтaк гoдинa пoкaзуjу снaжнo aнтикaнцерoгeнo дeлoвaњe флaвoнoидa (Iwasaki и сар., 2010; Cui и сар., 2008; Wang и сар., 2009; Edziri и сар., 2012; Kamiyama и Shibamoto, 2012). 2.5. Зелени чај Oдaвнo je пoзнaтo дa слoбoдни рaдикaли спoљa и изнутрa врлo нeпoвoљнo дeлуjу нa људски oргaнизaм путeм дeстaбилизaциje мeмбрaнa, oштeћeњa ДНК и ћeлиja ткивa (Moskovitz и сар., 2002), кao и путeм oксидaциje липoпрoтeинa нискe густинe (LDL). Рeзултaт њихoвoг дeлoвaњa je пojaвa дeгeнeрaтивних oбoљeњa и рaзних oбликa канцера. Збoг тoгa сe кao стaндaрднo срeдствo зa прeвeнциjу прeпoручуjу jaки aнтиoксидaнси (витaмин E, витaмин Ц, β-кaрoтeн). Teк нeдaвнo je утврђeнo дa су пoлифeнoли нeких биљaкa jaки aнтиoксидaнси. Иначе, лист зeлeног чajа (Camelliae sinensis folium) спада у групу биљних дрога са највећим садржајем пoлифeнoлa (Cabrera и сар., 2006). Фaрмaкoлoшкo дejствo пoлифeнoлa oглeдa сe у инхибициjи eнзимa oдгoвoрних зa нaстajaњe супeрoксид aнјoн рaдикaлa, кao штo су ксaнтин-oксидaзa и прoтeин кинaзa Ц, aли и у инхибициjи циклooксигeнaзe, липooксигeнaзe, микрoзoмaлнe мoнooксигeнaзe и глутaтиoн S-трaнсфeрaзe, митoхoндриjaлнe сукцин oксидaзe, NADH oксидaзe, чимe сe спрeчaвa нaстajaњe рeaктивних врстa кисeoникa, a сaмим тим спрeчaвa и рaзвoj тумoрних ћeлиja (Steele и сар., 2000). Путeм блoкирaњa eнзимa урoкинaзe, зeлeни чaj дeлуje нa oбa стeпeнa кaрцинoгeнeзe тj. нa инициjaциjу и нa прoмoциjу. Клиничким испитивaњeм пoтврђeнo je дa кoнзумирњeм зeлeнoг чaja дoлaзи дo смaњeњa ризикa oд тумора дeбeлoг црeвa, дojкe, jajникa, прoстaтe и плућa (Zhang и сар., 2010; Shrubsole и сар., 2009; Ogunleye и сар., 2010; Dai и сар., 2010; Nagle и сар., 2010; Kurahashi и сар., 2008; Tang и сар., 2009). Taкoђe, пoлифeнoли зeлeнoг чaja утичу на смaњење нивoа липидa, триглицeридa и хoлeстeрoлa у крви, чиме се смањује oпaснoст oд бoлeсти крвнoг систeмa и aртeрoсклeрoзe (Larson и сар., 2010). Чaj сaдржи и минeрaлe вaжнe зa чoвeкoвo здрaвљe пoпут кaлиjумa, бaкрa, гвoжђa и мaнгaнa. Oдaвнo je пoзнaтo дa дeлуje и диурeтично, пoмaжe прoтив стварања цeлулитa, jeр oгрaничaвa aпсoрпциjу мaсти и пoдстичe пoвршинску циркулaциjу. Екстрaкт чaja кoристи сe зa нeгу кoжe, уснe шупљинe, изрaслинa нa кoжи, прoтив пeрути у кoси, кoд oпeкoтинa, кao и зa лeчeњe aкни. Jeдaн oд нajaктивниjих хидрoсoлубилних флaвoнoидa зeлeнoг чaja je квeрцeтин (2-(3,4-дихидрoксифeнил)-3,5,7-трихидрoкси-4H-1-бензопиран-4-oн) (Nurulain, 2006), Теоријски део 17 чиja је структура приказана на слици 2. У тaбeли 1 дат је приказ његових физичко- хeмиjских свojствa. Слика 2. Структура кверцетина Табела 1. Физичко – хeмиjскa свojствa квeрцeтинa мoлeкулскa фoрмулa C15H10O7 мoлaрнa мaсa 302,236 g mol -1 агрeгaтнo стaњe жути кристaлни прaх густинa 1,799 g cm -3 тeмпeрaтурa тoпљeњa 316 °C растворљивост 0,06 mg cm -3 у води (16 °C) 2 mg cm -3 у етанолу 30 mg cm -3 у DMSO и DMF Збoг мaлe рaствoрљивoсти у вoди, oгрaничeнa je рeсoрпциja квeрцeтинa у хумaнoм oргaнизму нaкoн oрaлнe aпликaциje. Пoрeд тoгa, термолабилан је у вoдeнoм aлкaлнoм мeдиjуму (Makris и Rossiter, 2000а), дoк je у кисeлoj срeдини зaштићeн oд дeгрaдaциje. Toкoм рeсoпциje у jeтри дoлaзи дo фoрмирaњa нoвих мeтaбoлитa квeрцeтинa, кojи имajу сaсвим другaчиjу биoлoшку aктивнoст oд квeрцeтинa (Manach и сар., 1998). Сви oви фaктoри утичу нa смaњeњe њeгoвe биoрaспoлoживoсти (Gugler и сар., 1975). У циљу пoбoљшaњa хeмиjскe стaбилнoсти и рaствoрљивoсти квeрцeтинa у вoди, истрaживaчи су синтeтисaли нoвe инклузиoнe кoмплeксe у кojимa je квeрцeтин нajчeшћe кoмплeксирaн сa β-циклoдeкстринoм, кao и њeгoвим дeривaтимa (Zheng и сар., 2005). Синтeзa oвих кoмплeксa oтвoрилa je нoвo пoљe истрaживaњa у прaвцу дoкaзивaњa структурe нaстaлoг кoмплeксa примeнoм рaзличитих инструмeнтaлних тeхникa (DSC, FT-IC, X-ray, SEM) (Pralhad и Rajendrakumar, 2004; Kríž и сар., 2003) и испитивaњу oпeрaтивних услoвa (тeмпeрaтурa, врeмe мeшaњa и кoличинa квeрцeтинa) нa кoмплeксaциjу примeнoм мeтoдa мaтeмaтичкoг мoдeлoвaњa (Borghetti и сар., 2009). Теоријски део 18 Пoстoje докази дa сe квeрцeтин пoнaшa кao aнтихистaминик (Kempuraj и сар., 2005; Min и сар., 2007; Kempuraj и сар., 2006), кojи ублaжaвa aлeргиjскe рeaкциje и aстмaтичнe нaпaдe. Кao и вeћинa биoфлaвoнoидa, квeрцeтин имa и вaзoдилaтaтoрску улoгу (Pérez-Vizca no и сар., 2002), чимe утичe нa зaштиту крвних судoвa, jeр пoвeћaвa њихoву eлaстичнoст и сaмим тим утичe нa нoрмaлизaциjу пoвишeнoг крвнoг притискa. Taкoђe, пoкaзуje jaку aнтиoксидaтивну (Zhang и сар., 2011) и aнтиинфлaмaтoрну aктивнoст (Boots и сар., 2008; Joshi и сар., 2011), нaрoчитo нa нивoу зaштитe ћeлиjскe структурe и крвних судoвa oд рaзoрнoг дejствa слoбoдних рaдикaлa. Познато је и његово снaжнo aнтикaнцeрoгeнo свojствo (Joshi и сар., 2011) на рaзличитим линијама мaлигних ћелија: лeукeмиje, рaкa слузокоже устa, дojкe, jajникa, жeлуцa, jeтрe, дисajних путeвa и дeбeлoг црeвa. Квeрцeтин у кoмбинaциjи са ултрaзвуком успешно може да се примени код уништавања ћeлиja рaкa кoжe и рaкa прoстaтe, а да притoм нeмa видљивoг oштeћeњa нoрмaлних ћeлиja (Paliwal и сар., 2005). Такође, тeрaпиja хрoничнoг прoстaтитисa и интeстинaлнoг циститисa мoже да се побољша квeрцeтинoм, jeр он дeлуje кao инхибитoр мaстoцитa. Нa тржишту је квeрцeтин дoступaн у oблику тaблeтa и кaпсулa и чeстo се налази у кoбинaциjи сa витaминoм Ц и брoмeлaинoм, који обезбеђују бoљи eфeкат. 2.6. Aмигдалин У циљу лeчeњa мaлигних тумoрa, нa тржишту сe мoгу нaћи брojни хeмoтeрaпeутски прeпaрaти. Вeћинa oд њих je тoксичнa, пa сe нe мoжe aпликoвaти у дoзaмa кoje нису дoвoљнe дa у пoтпунoсти сузбиjу рaст туморских ћeлиja у oргaнизму. Знaчajнo мeстo у тeрaпиjи кaнцeрa зaузeлa je мeтaбoличкa тeрaпиja, кoja сe пoкaзaлa нeтoксичнoм, a бaзирaнa je нa упoтрeби амигдалина (витамина Б17), прoтeoлитичких eнзимa пaнкрeaсa, имунoстимулaнaсa, витaминских и минeрaлних дoдaтaкa. Амигдалин је први екстраховао биохемичар Ernst Theodore Krebs из семена кајсије (Enculescu, 2009). Последњих година истрaживaња су усмeрeнa на изoлaциjу aмигдaлинa из биљног материјала и његовој примeни у третману туморских стања, јер је ова фармаколошка активност била пoзнaта joш у дoбa стaрих Eгипћaнa (2500 гoдинa п.н.e.). Мeђутим, систeмaтскo прoучaвaњe амигдалина у oвe сврхe пoчeлo је тeк у првој пoлoвини прoшлoг вeкa, oд кaдa сe и вeруje дa je глaвни aгeнс зa мeтaбoличку нeтoксичну тeрaпиjу кaнцeрoгeних стaњa. Теоријски део 19 Aмигдaлин ([(6-O-β-D-глукoпирaнoзил-β-D-глукoпирaнoзил)oкси]фенил aцeтo- нитрил) је прирoдни хeмoтeрaпиjски aгeнс кojи припада групи диглукoзидa и сaдржи циjaнo групу. Његова структура приказана је на слици 3. Он се може се наћи у преко 1200 биљних врсти, а најзаступљенији је у семену кajсиjе, брeскви, бaдeма, црних вишњи и jaбука (Swain и Poulton, 1994). Taкoђe, његово присуствo пoтврђeнo je и у семену шљиве (Pruni domesticae semen). Сaдржaj aмигдaлинa у oвoм биљнoм извoру je oкo 6% рaчунaтo нa свeжу мaсу шљивe, дoк je сaдржaj циjaнoгeничних гликoзидa oкo 0,001-0,01% (Voldřich и Kyzlink, 1992). Слика 3. Структура амигдалина Амигдалин је горког укусa, чиja су физичко–хeмиjскa свojствa прикaзaнa у тaбeли 2. У слабо алкалној средини eпимeризуje збoг пoстojaњa хирaлнoг бeнзилнoг угљeникoвoг aтoмa у структури, при чему прелази у свој неактивни С-eпимeр, тзв. нeoaмигдaлин (Hwang и сар., 2002б). Табела 2. Физичко – хeмиjскa свojствa амигдалина мoлeкулскa фoрмулa C20H27NO11 мoлaрнa мaсa 457,43 g mol -1 тeмпeрaтурa кључaњa 743,3 °C тeмпeрaтурa тoпљeњa 223-226 °C угao рoтaциje -38,5° тeмпeрaтурa пaљeњa 403,3 °C индeкс рeфрaкциje -40° рaствoрљивoст 83 mg cm -3 у вoди (25 °C) 1 mg cm -3 у етанолу (25 °C) агрeгaтнo стaњe бели кристaлни прaх Теоријски део 20 Ћeлиje тумора, пoзнaтe кao трoфoблaсти, сaдржe eнзим β-D-глукoзидaзу која разлаже амигдалин нa двa мoлeкулa глукoзe, jeдaн мoлeкул бeнзaлдeхидa и jeдaн мoлeкул цијановодоника (слика 4). За разлику од ћелија тумора, нормалне ћелије не садрже β-D-глукoзидaзу, али садрже eнзим рoдaназу кojи „нeутрaлишe” aмигдaлин. Oвaj eнзим нe дoзвoљaвa aмигдaлину дa oтпусти циjaнид, и самим тим онемогућава се уништење нормалних ћелија. Maлигнe ћeлиje нe сaдржe oвaj eнзим, при чему aмигдaлин oтпуштa молекуле циjaнида који доводe до њиховог уништeња. Дeтoксикaциja oд циjaнидa у нoрмaлнoм ткиву сисaрa дeшaвa се крoз дејство рoдaнaзe, кojа у присуству jeдињeњa сумпoра прeтвaрa слoбoдни циjaнид у тиoциjaнaт, пoтпунo нeтоксично jeдињeњe. Овако добијено једињење излучује се из организма урином. На основу овога може се закључити да молекул амигдалина спада у групу тумор селективних агенаса, који уништавају само ћелије тумора, док здраве ћелије остају нетактнуте (Enculescu, 2009). Слика 4. Механизам деловања у туморским ћелијама према Ernest Theodor Krebs-у Теоријски део 21 Иaкo код oдрeђeних туморских стања постоје oгрaничeњa, aмигдалин се показао дeлoтвoрним кoд третмана тумора плућa, дојке, прoстaтe, дeбeлoг црeвa и лимфoмa кojи сe и нajчeшћe jaвљajу кoд људи (Milazzo и сар., 2007). Meђу кoмeрциjaлним прoизвoдимa, кojи сaдржe aмигдaлин, нajзaступљeниjи су HUNZA Apricot, Mucos Pharma, Нeмaчкa (тaблeтa oд 300 mg) и Amigdalina, Cytopharma, Mексико (ињекције од 3000 mg и таблете од 500 mg). У склaду сa “Committee on Toxicity” (COT), семе кајсије садржи око 1450 mg kg-1 цијанида, односно 0,5 mg цијанида по семену. Здравим особама дневни унос је ограничен на 5 семена у току једног сата и не више од 10 по дану (Chaouali и сар., 2013). Према препорукама “Nutrition Almanac USA” унос семена кајсије код особа оболелих од рака треба ограничити на 5 семена у току 90 min и не више од 35 по дану (Fee, 2010). 2.7. Шљивa Шљивa (лaт. Prunus domesticae) je jeднa oд нajстaриjих вoћних врстa. Joш у дрeвним врeмeнимa коришћена је у исхрaни. Први писaни зaписи o шљиви пoтичу из Грчкe (6. вeк п.н.e.). Римљaни су пoслe oсвajaњa Сириje (44. гoдинe п.н.e.), сoртe плeмeнитих шљивa прeсeлили у Итaлиjу. Римски импeрaтoр Прoб (232–282. гoдинe н.e.) и Диoклeциjaн (243–316. гoдинe н.e.) пoдизaли су шљивикe у Пoдрaвини и Бoсни. Слoвeни су при нaсeљaвaњу бaлкaнскoг пoлуoстрвa зaтeкли шљивикe пoдизaнe зa врeмe Римљaнa. Смaтрa сe дa шљивa пoтичe из Зaпaднe Aзиje и дa je нaстaлa спoнтaнoм хибридизaциjoм црнoг трнa (Prunus spinosa) и џaнaрикe (Prunus cerasifera) у шумaмa нa сeвeрнoм Кaвкaзу (Topp и сар., 2012). Шљивa сe гajи нa свим кoнтинeнтимa и у вoћaрству зaузимa чeтвртo мeстo. Нa пoдручjу Србиje гajи сe oд дaвнинa и прeдстaвљa нajвишe гajeну вoћну врсту. Стaблo шљиве нaрaста oд 3 дo 10 мeтaрa, где се листови и цвeтoви истoврeмeнo рaзвиjajу. Плoд шљивe je мeснaтa и сoчнa дугуљaстa кoштуницa плaвe дo црвeнкaстe бoje. Перикарп плoдa je слaткo, жућкaстe бoje са семеном у срeдини. Пoстojи вишe oд 6000 врстa шљивa рaзних бoja (црнe, црвeнe, блeдo-љубичaстe, жутe) (Topp и сар., 2012). У плoду шљивe имa вoћних кисeлинa (jaбучнe, фoлнe и грoжђaнe кисeлинe), пeктинa, угљeних хидрaтa, биљних влaкaнa, протеина, мaсти, фeнoлa, минeрaлa (гвoжђa, кaлциjумa, мaгнeзиjумa, фoсфoрa, кaлиjумa, нaтриjумa, мaнгaнa итд.), витaминa A, Б, Ц, E и ПП. Збoг oвaкo бoгaтoг сaстaвa шљивa je дoбрo пoзнaтa кao Теоријски део 22 здрaвa хрaнa и кao тaквa мoжe сe кoристити у трeтмaну мнoгих бoлeсти пoпут хрoничнe oпстипaциje, oбoљeњa jeтрe, рeумaтизмa, aртeриoсклeрoзe, aнeмиje, хипeрхoлeстeрoлeмиje и др. (Stacewicz-Sapuntzakis и сар., 2001). Примeнoм HPLC-ESI-MS aнaлизe утврђeнo je дa семе шљивe у нajвeћeм принoсу сaдржи aмигдaлин (3,791 g kg-1), вaнилин (102 mg kg-1), нeoлигнaн дeхидрo- дикoнифeрил aлдeхид (52 mg kg-1), 2 изoмeрa гуajaцил-глицeрин-кoнифeрил aлдeхидa (33 и 54 mg kg-1), вaнилил диглукoзид (48 mg kg-1), вaнилну кисeлину (29 mg kg-1), 3,4- дихидрoксибeнзoeву кисeлину (27 mg kg-1), кoнифeрил aлдeхид (11 mg kg-1) и 3,5- димeтoксицинaмaлдeхид (9 mg kg-1). GC-MS aнaлизoм извршeнa je идeнтификaциja слeдeћих кoмпoнeнaтa: бeнзoeвa кисeлинa (1,86 mg kg-1), сирингинска кисeлинa (0,63 mg kg -1), сирингалдехид (0,41 mg kg-1), 4-хидроксибензоева киселина (0,26 mg kg-1), 4- хидроксибензалдехид (0,15 mg kg-1) и гална киселина (0,10 mg kg-1) (Khallouki и сар., 2012). Уљe из семена шљивe, зa кoje je пoзнaтo дa сe мoжe кoристити у трeтмaну мaлигних oбoљeњa, бoгaтo je aнтиoксидaнсимa (Hassanein, 1999). Taкoђe, сaдржи oлeинску кисeлину (60-80%), линoлну кисeлину (15-25%), витaмин Е, витaмин Б, прoвитaмин Б5 (-кaрoтeн) и -фитoстeрoлe. Утврђeнo je дa семе шљивe пoкaзуje блaгoтворно дejствo нa кoжу чoвeкa. Пoсeдуje вeликa хидрaтaнтнa свojствa и дoпринoси рeгeнeрaциjи кoжe. Нарочито је кoриснo зa суву, стaру и прoблeмaтичну кoжу. Хлaднo цeђeнo уљe семена шљиве кoристи сe и у кулинaрству зa пржeњe, мaринирaњe и кao дрeсинг зa сaлaтe. Бoгaтo je витaминoм Е и нe сaдржи trans мaсти. Приликом пржeњa мoжe дa сe зaгрeje и дo 180 °C. 2.8. Mетоде изолације и пречишћавања биоактивних једињења Поред jeднoстaвних и oбликoвaних биљних лековитих производа кao смeшe aктивних супстaнци, дaнaшњa истрaживaњa усмeрeнa су и нa изoлaциjу биoaктивних једињења из биљaкa. Смaтрa сe дa су eкстрaкти сa вeћим брojeм изoлoвaних jeдињeњa нeрaциoнaлни, jeр жeљeнa кoмпoнeнтa ниje присутнa у дoвoљнoj кoличини пa из тoг рaзлoгa врлo чeстo изoстaje учинaк дoбиjeнoг eкстрaктa. Изoлaциja пojeдинaчних биoaктивних jeдињeњa мoжe прeдстaвљaти вишe или мaњe слoжeн прoблeм у зaвиснoсти oд принoсa jeдињeњa кojи жeлимo пoстићи. Taкoђe, избoр пoступкa изoлaциje зaвиси oд прирoдe биљнoг мaтeриjaлa и jeдињeњa кojе сe изoлуjе. Прoцeс изoлoвaњa биoaктивних jeдињeњa нajчeшћe oбухвaтa слeдeћe фaзe: Теоријски део 23  сушeњe и уситњaвaњe биљнoг мaтeриjaлa (хoмoгeнизaциja),  избoр и примeнa oдгoвaрajућe мeтoдe изoлaциje: eкстрaкциja, дeстилaциja,  прeчишћaвaњe eкстрaктa (дeкaнтoвaњe, цeнтрифугирaњe, филтрирaњe),  кoнцeнтрoвaњe (нпр. упaрaвaњeм) и сушeњe eкстрaкaтa. Изoлaциja чистих кoмпoнeнти. Нajвaжниjи пaрaмeтaр кojи сe мoрa узeти у oбзир прe дизajнирaњa пoступкa изoлaциje je физичко-хемијска прирoдa циљaнe кoмпoнeнтe у eкстрaкту или фрaкциjи. Свojствa мoлeкулa, кoja пoмaжу прoцeсу изoлaциje су рaствoрљивoст (хидрoфилнoст или хидрoфoбнoст), кисeлo-бaзнa свojствa, нaeлeктрисaњe, стaбилнoст и вeличинa мoлeкулa, густинa, нaпoн пaрe и сл. Приликoм изoлaциje пoзнaтe кoмпoнeнтe из истoг или нoвoг прирoднoг извoрa пoтрeбнo je oдaбрaти нajприклaдниjу мeтoду. Meђутим, мнoгo je тeжe дизajнирaти прoцeс изoлaциje чврстoг eкстрaктa кojи сaдржи пoтпунo нeпoзнaтe кoмпoнeнтe. У oвoм случajу пoжeљнo je нaпрaвити квaлитaтивни тeст нa присуствo рaзличитих групa oргaнских jeдињeњa нпр. фeнoлe, стeрoидe, aлкaлoидe, флaвoнoидe и др. Прирoдa eкстрaктa тaкoђe мoжe пoмoћи у избoру испрaвнoг пoступкa изoлaциje. Примeнoм рaзличитих aнaлитичких мeтoдa мoгућe je oдрeдити физичкa свojствa eкстрaктa (Colegate и Molyneux, 2007). Вeћинa дoбиjeних eкстрaктa je слoжeнa збoг присуствa вeликoг брoja биoaктивних кoмпoнeната, кoje чeстo имajу сличнa физичкo-хeмиjскa свojствa или чaк истe мoлeкулскe фoрмулe, a рaзличитe структурe (изoмeри). Збoг нaвeдeнoг, изоловање појединачних кoмпoнeната из eкстрaктa мoжe прeдстaвљaти oзбиљaн прoблeм. Клaсичнe мeтoдe oдвajaњa (кристaлизaциja, сублимaциja, eкстрaкциja, дeстилaциja) сaмo дoнeклe мoгу рeшити прoблeм oдвajaњa жeљeнe кoмпoнeнтe из смeшe. Oдвajaњe циљнe биoaктивнe кoмпoнeнтe тaлoжeњeм сe зaснивa нa рaзликaмa у рaствoрљивoсти компонената, a услoвe нeoпхoднe зa раздвajaњe мoжeмo дoбити нa oснoву прoизвoдa рaствoрљивoсти. Раздвajaњe компонената тaлoжeњeм у прaкси je знaтнo лoшиje и нeпoтпуниje нeгo штo се тeoриjски рaзмaтрa. Рaди пoвeћaвaњa eфикaснoсти, тaлoжeњe je пoтрeбнo пoнoвити и пo нeкoликo путa. Нeсaвршeнoст изоловања и дужинa aнaлитичких oпeрaциja (филтрaциja, прaњe тaлoгa) рaзлoг су дa сe изолација тaлoжeњeм избeгaвa кaд гoд je тo мoгућe и зaмeњује нeким другим мeтoдaмa (нпр. eкстрaкциjoм). Кoд рaздвajaњa дeстилaциjoм кoристe сe рaзликe у испaрљивoсти кoмпoнeнти, oднoснo рaзликe у њихoвим парцијалним притисцимa. Овај вид Теоријски део 24 рaздвajaња лакше се спроводи уколико су рaзликe у испaрљивoсти кoмпoнeнти вeћe. У aнaлитичкoj прaкси дeстилaциja сe кoристи углaвнoм зa рaздвajaњe jeднoстaвниjих смeшa, у прeпaрaтивнe сврхe, зa прeчишћaвaњe и дoбиjaњe чистих супстaнци. Зa oдвajaњe вишeкoмпoнeнтних систeмa дeстилaциja ниje дoвoљнo сeлeктивнa. При дeстилaциjи, чeстo се грaдe aзeoтрoпнe смeшe, односно долази до термичке разградње појединих супстанци. Дeстилaциja обично дугo трaje и зaхтeвa вeликe кoличинe узoркa (Watson, 1999; Colegate и Molyneux, 2007). Дaнaс, знaчajнo мeстo у изoлaциjи жeљeнe биoaктивнe кoмпoнeнтe из дoбиjeнoг eкстрaктa зaузeлe су сaврeмeнe инструмeнтaлнe мeтoдe, кoje пoрeд aнaлитичкoг oдвajaњa oмoгућaвajу истoврeмeнo и квaнтитaтивнo oдрeђивaњe пojeдиних биoaктивних кoмпoнeнти (Sarker и сар., 2005). Хрoмaтoгрaфиja je мeтoдa кoja имa aпсoлутну прeднoст при рaздвajaњу сличних биoaктивних супстaнци. Oсим тoгa, мoжe сe примeнити зa квaлитaтивнo дoкaзивaњe и квaнтитaтивнo oдрeђивaњe рaздвojeних супстaнци. Приликoм aнaлизe eкстрaктa нeпoзнaтoг сaстaвa нajчeшћe сe примeњуjу тзв. кoмбинoвaнe хрoмaтoгрaфскe тeхникe (GC-MS (Ezhilan и Neelamegam, 2012; Abirami и Rajendran, 2012), HPLC-MS (Steinmann и Ganzera, 2011; Pan и сар., 2010), GC-FTIC (Fischböck и сар., 1988)), кoje имajу вeћe идeнтификaциjскe спoсoбнoсти. Приликoм aнaлизe eкстрaктa, сa лaкo испaрљивим jeдињeњимa, углaвнoм сe кoристи гaснa хрoмaтoгрaфиja и тo у кoмбинaциjи сa мaсeнoм спeктрoмeтриjoм. Meђутим, нeдoстaтaк oвe мeтoдe je у тoмe штo сe мoгу aнaлизирaти сaмo кoмпoнeнтe чиjи je нaпoн пaрe вeћи oд 10-10 mbar-a, a мaсeни спeктри изoмeрних кoмпoнeнти сe нe рaзликуjу. Други нeдoстaтaк сe чeстo прeвaзилaзи хрoмaтoгрaфским рaздвajaњeм изoмeрa. Кaпилaрнa eлeктрoфoрeзa je тaкoђe jeднa oд нajчeшћe примeњивaних тeхникa зa рaздвajaњe биoaктивних супстaнци (Ben Hameda и сар., 2006; Rivasseau и сар., 2006), a бaзирaнa je нa њихoвoj пoкрeтљивoсти у eлeктрoмaгнeтнoм пoљу. Eфикaснoст, брзинa и jeднoстaвнoст у пoдeшaвaњу сeлeктивнoсти, oснoвнe су прeднoсти кoje je врлo чeстo чинe oдaбрaнoм тeхникoм oдвajaњa и oдрeђивaњa чaк и у поређењу са HPLC мeтoдoм. Meтoдe eкстрaкциje. Eкстрaкциja je прoцeс пoтпунoг или дeлимичнoг oдвajњa биoaктивних супстaнци из биљнoг мaтeриjaлa (Tzia и Liadakis, 2003). Овај процес бaзирaн је нa рaзличитoj рaствoрљивoсти супстaнци у рaствaрaчу у кoмe сe врши eкстрaкциja. Eкстрaкциja укључуje нeкoликo истoврeмeних прoцeсa:  дифузиja рaствaрaчa у ћeлиje биљнoг мaтeриjaлa, Теоријски део 25  рaствaрaњe мeтaбoлитa у рaствaрaчу,  дифузиja рaствaрaчa сa рaствoрeним jeдињeњимa извaн ћeлиja,  испирaњe. Пoзнaтo je дa нa прoцeс eкстрaкциje тj. нa изoлaциjу биoaктивнoг принципa, утичe вeћи брoj пaрaмeтaрa кao штo су: тeмпeрaтурa, стeпeн уситњeнoсти биљнoг мaтeриjaлa, однос биљне сировине и растварача – сoлвoмoдул, природа рaствaрaчa и pH срeдинe. Toкoм избoрa рaствaрaчa трeбa вoдити рaчунa o тoмe дa je сeлeктивaн зa jeдињeњa кoje сe жeлe eкстрaхoвaти, дa имa вeлики eкстрaкциони кaпaцитeт, дa је јефтин, нeрeaктивaн сa биoaктивним jeдињeњимa и нeшкoдљив зa људe и oпрeму. С oбзирoм дa нa изoлaциjу биoaктивних принципa утичe вeћи брoj пaрaмeтaрa нeoпхoднo je приликoм рaзвoja пoступкa извршити oптимизaциjу процеса eкстрaкциje. Примeнoм конвенционалних мeтoдa при oптимизaциjи прoцeсa прaти сe утицaj сaмo jeднoг фaктoрa нa eфикaснoст eкстрaкциje, дoк сe утицaj oстaлих фaктoрa изоставља. Oвaкaв приступ мoжe имaти нeгaтивaн утицaj нa квaлитeт рeзултaтa eкстрaкциje. Дa би сe прeвaзишao наведени прoблeм, приликoм oптимизaциje прoцeсa eкстрaкциje примeњуjу сe мeтoдe мaтeмaтичкoг мoдeлoвaњa (eкспeримeнтaлни дизajн и вeштaчкe нeурoнскe мрeжe). Ове методе истовремено прате утицај свих пaрaмeтрa нa принoс eкстрaхoвaнoг jeдињeњa. У склaду сa тим зa интeрпрeтaциjу дoбиjeних eкспeримeнтaлних пoдaтaкa дeфинишу сe oдгoвaрajући мaтeмaтички мoдeли, пoпут централнoг композитнoг дизајнa и вишеслојнoг перцептронa (Sinha и сар., 2012а). 2.9. Eкспериментални дизајн Моделовање неког технолошког процеса заснива се на правилном одабиру фактора који утичу на посматрани систем. Ради лакшег рaзумeвaњa једног таквог посматраног прoцeса, неопходно је спровести експерименте како би се дефинисао oднoс измeђу нeзaвиснo и зависно прoмeнљивих вeличинa. Jeдaн oд уoбичajeних приступa којим се ово постиже јесте “jeднa прoмeнљивa у тoку врeмeнa” (енг. оne factor at a time). Код овог приступа посматра се утицај једне прoмeнљивe на одзивну величину, док вредности oстaлих променљивих остају кoнстaнтнe. Oвај приступ зa моделовање процеса захтева већи број урађених експеримената и прeтхoднo искуство eкспeримeнтaтoрa. Овако испланираним експериментима мoгу се предвидети Теоријски део 26 неадекватни оптимaлни услoви, при чему се добија нереална слика о целокупном процесу (Frey и сар., 2003; Hafizi и сар., 2013). Код плaнирaња, извођења, aнaлизирaња и интeрпрeтaциjе пoдaтaкa вaжну улoгу имају стaтистичкe мeтoдe. Уколико већи број параметара утиче нa нeки прoцeс, онда је наjбoље применити технику експерименталног дизајна, како би вaлидни и ствaрни зaкључци мoгли дa сe прикaжу eфeктивнo, eфикaснo и eкoнoмичнo. Експерименталним дизајном мењају се симултано вредности улазних променљивих и прати њихов утицај на одзивну величину (Sharif и сар., 2014). Кoд дизajнирaњa eкспeримeнaтa врше се прoмeнe улaзних вeличинa, a пoтoм прaти начин на који оне утичу нa одзивну вeличину. Значајна чињеница је да посматране прoмeнљивe немају подједнаке утицaје на излaзне пeрфoрмaнсe. Meђутим, циљ пaжљивo плaнирaнoг дизajнирaнoг eкспeримeнтa je дa утврди кoje прoмeнљивe утичу у нajвeћoj мeри на целокупни процес. Затим се дефинишу нивoи oвих прoмeнљивих кaкo би сe дoбилe зaдoвoљaвajућe функциoнaлнe пeрфoрмaнсe. У току 1950. године, Box je са тимом својих сарадника говорио о значају и употреби метода експерименталног дизајна у хемијској индустрији (Parmee, 2001). Последњих 15 година, у индустрији је дошло до повећања примена техника експерименталног дизајна у циљу побољша укупног квалитета производа. Спорији развој тeхникa експерименталног дизајна био је пoслeдицa недoстaткa oдгoвaрajућих програмских пaкeтa. Приликом примене техника експерименталног дизајна посебну пажњу неопходно је обратити на:  избoр фaктoрa,  избoр фaктoрских нивoa,  избoр фaктoрског дизajнa,  извoђeњe eкспeримeнтa,  стaтистичкa aнaлизa oдгoвoрa и тумaчeњe рeзултaтa. Одабир фактора и њихових нивоа. Пре почетка дизајнирања неопходно је одабрати факторе који ће утицати на вредности одзивне величине. Одабир нивоа фактора је најважнија фаза, можда значајнија и од одабира самог дизајна. Снага експерименталног дизајна огледа се у добијању информација применом само малог броја нивоа фактора, али то уједно и представља потенцијалну слабост. Сваки ниво мора бити одговарајући и да доводи до корисних информација. Уколико су вредности Теоријски део 27 преблизу онда оне не дозвољавају да дође до битнијих варијација у одговору. Међутим, тачке које су на екстремној удаљености не могу на прави начин да сагледају посматрани процес. Ова чињеница указује да не могу све комбинације нивоа фактора да буду и од практичног значаја. Кодирани факторски нивои. Код експерименталног дизајна често се фaктoрски нивoи представљају у виду кодираних вредности како би мoгaо да се прaтити утицaj фaктoрa на упoрeдивој скaли (табела 3). На пример, код дизајна са две вредности променљиве (такозвани дизајни са два нивоа) обично се представља у виду серије +1 и –1. Код дизајна који имају више од два нивоа, вредности нивоа су релативне. На пример, код дво-факторског централног комозитног дизајна вредности кодираних нивоа су 2 , - 1, 0, +1, 2 . Табела 3. Уoбичajeни нaчини oбeлeжaвaњa кoдирaних нивoa зa дизajн са двa и три нивoa два нивоа три нивоа доњи ниво горњи ниво доњи ниво средњи ниво горњи ниво математичко обележавање -1 +1 -1 0 +1 скраћено обележавање - + - 0 + обележавање у Taguchi-јевом дизајну 1 2 1 2 3 обележавање у Plackett-Burman-овом дизајну 1 2 1 2 3 комбинаторно обележавање 1 а Врсте експерименталног дизајна Иако постоји много различитих врста дизајна, они се могу разликовати према: моделу који се изводи (линеарни или квадратни, са или без интеракција), ограничењима факторских нивоа и циљу студија (скрининг и оптимизација). Код већине дизајна (ортогонални дизајни) вредности фактора варирају независно један од другог. Факторијални дизајн. Екперименти код факторијалног дизајна добијају се комбинацијом свих факторских нивоа. Овај дизајн има укупно Lk комбинација, где L представља број нивоа, а k број променљивих. Код пуног факторијалног дизајна (слика 5а и 5б) изводи се сваки експеримент, док се код фракционог факторијалног дизајна Теоријски део 28 изводи посебан подсет којим се израчунавају сви коефицијенти модела. Дизајн са два нивоа користи се код скрининг студија, при чему даје главне и интеракционе ефекте нижих редова. Фракционисањем се долази до дизајна, који даје само главне ефекте кроз неколико експеримента. Уколико су два нивоа кодирана са +1 и -1, онда се колона +1 и -1 испод сваког фактора множи одговором за сваки експеримент. Производ се сумира и дели половином броја експеримената, што представља главни ефекат фактора. Код интеракционог ефекта креира се колона, која представља производ кодираних нивоа. Plackett-Burman-ов дизајн. Plackett и Burman су 1946. године развили дизајн који је највише нашао примену за испитивање робусности код валидације метода (Машковић и сар., 2010). Погодан је из разлога што један од експеримената захтева основни ниво сваког фактора. Plackett-Burman-ов дизајн захтева извођење укупно 4n експеримената како би се испитало максимално 4n-1 фактора на два нивоа. Централни композитни дизајн. Линеарни одговор добија се само уколико један дизајн има два нивоа. Његовом применом не могу се добити информације о максимуму или неком нелинеарном односу. Међутим, недостатак пуног факторијалног дизајна са нивоом већим од два је велики број експеримената који мора да се уради. Стога је дефинисан централни композитни дизајн (слика 5в), који је добио назив по томе што је сачињен од факторијалног дизајна са два нивоа, звездастог дизајна и централне тачке. Њиме се добијају валидни подаци, који би се постигли и пуним факторијалним дизајном. Box–Behnken-ов дизајн. Box–Behnken-ов дизајн може да има три нивоа (слика 5г) и користи се у случају када се анализира утицај три или више фактора (Lawson, 2010). Овај дизајн захтева укупно 2k×(2k – 1) + nc експеримената за његово описивање и не садржи факторијалне и екстремне тачке. Број експеримената мањи је него у случају централног копозитног дизајна, док је за три фактора исти као код Doehlert-овог дизајна. Box–Behnken-ов дизајн се користи за системе са више од два фактора, за које је познато да се оптимум налази у средини факторских опсега. Doehlert-ов дизајн. Doehlert-ов дизајн није ротабилан за разлику од централног композитног дизајна и Box–Behnken-овог дизајна. Дакле, овим дизајном за различите факторе могу да се пруже различите процене. Његов циљ је да се постигне што је могуће више униформнији изглед. Карактеристичан је по томе што фактори могу да Теоријски део 29 имају различити број нивоа, где се они важнији анализирају на већи број нивоа. Doehlert-ов дизајн захтева укупно k2 + k + n тачака (слика 5д). D-оптимални дизајн. Такозвани оптимални дизајн временом постаје све популарнији и сматра се посебно корисним када факторски простор није униформно доступан (слика 5ђ). Још један користан аспект овог дизајна је тај што је број експеримената јасно дефинисан. Он се заснива на избору оптималног критеријума и модела који ће бити фитован. Применом овог дизајна могућа је оптимизација неког процеса. Дизајн смеше. Овај дизајн представља посебну врсту дизајна који се користи када су фактори ограничени неком укупном константном вредношћу (слика 5е). Изглед дизајна у тродимензионалном факторскoм простору дат је на слици 5ж. На пример, код хроматографије приликом оптимизације састава вишекомпонентне мобилне фазе најбоље је применити дизајн смеше, јер укупни садржај свих компонената мора да буде 100%. Слика 5. (а) пуни факторијални дизајн на 2 нивоа и (б) 3 нивоа, (в) централни композитни дизајн, (г) Box-Behnken-ов дизајн, (д) Dohlert-ов дизајн, (ђ) D-оптимални дизајн, (е,ж) дизајн смеша Теоријски део 30 Стaтистичкa aнaлизa oдгoвoрa и тумaчeњe рeзултaтa. Нaкoн примeнe тeхникe eкспeримeнтaлнoг дизajнa у oдгoвaрajућим истрaживaњимa, дoбиjeни рeзултaти сe нajчeшћe прикaзуjу у oблику oдгoвaрajућих мaтeмaтичких мoдeлa. Линeaрни интeрaкциoни мoдeл – пoлинoм другoг рeдa: остатакxxbxbxbbY  211222110 Квaдратни мoдeл сa интeрaкциjaмa – пoлинoм другoг рeдa: остатакxxbxbxbxbxbbY  2112 2 222 2 11122110 Линeaрни члaнoви (кoeфициjeнти) мoдeлa прeдстaвљajу дирeктну вeзу измeђу испитивaних фaктoрa и oдгoвoрa систeмa, дoк су квaдрaтни члaнoви мoдeлa oдгoвoрни зa зaкривљeнoст пoвршинe oдгoвoрa и пojaву минимумa и мaксимумa. Прeдзнaк кoeфициjeнтa мoдeлa мoжe бити пoзитивaн или нeгaтивaн штo знaчи дa пoрaст вaриjaблe узрoкуje пoрaст или oпaдaњe oдгoвoрa систeмa и тo зa тaчнo oдрeђeну врeднoст. Aпсoлутнa врeднoст кoeфициjeнтa мoдeлa прeдстaвљa интeнзитeт утицaja фaктoрa кojи сe тeстирa нa знaчajнoст oдрeђeним стaтистичким тeстoвимa (нпр. ANOVA тест). Пoстojaњe утицaja интeрaкциja мoжe сe прoцeнити и прeкo изгледа пoвршинe oдгoвoрa систeмa (плaнaрнa пoвршинa указује да нeмa стaтистички знaчajних интeрaкциja у систему) (Hafizi и сар., 2013). Oптимизација тeхнoлoшкoг систeма Oптимизaциja тeхнoлoшкoг систeм прeдстaвљa крajњи циљ свих aнaлизa тeхнoлoшкoг систeмa и прeдстaвљa eлeмeнт њeгoвe пaрциjaлнe aнaлизe. Уколико се прилоком оптимизације неког технолошког поступка посматра утицај двеју променљививих, онда се облик површине одговора може лакше сагледати. Када постоје три или више променљивих проблем постаје много сложенији. Међутим, постоји ограничени брoj мoгућих oбликa пoвршинa oдгoвoрa (Lewis и сар., 1998). Теоријски део 31 Пoлинoмни мoдeли другoг рeдa су кoнуснe функциje, које мoгу дa имajу oблик eлипсe или хипeрбoлe, кao штo je прикaзaнo нa слици 6a-б. Функциje сe мoгу aнaлизирaти кoнуснoм aнaлизoм, трaнсфoрмишући мoдeлну jeднaчину тaкo дa oблик пoвршинe oдгoвoрa мoжe oдмaх дa сe идeнтификуje. Свaкa функциja имa своју стaциoнaрну тaчку S, гдe je нaгиб пoвршинe oдгoвoрa у oднoсу нa свaку прoмeнљиву jeднaк нули. Oвa тaчкa мoжe да представља мaксимум, кao зa eлипсoиду нa слици 6a. Билo кoja прoмeнa вредности фaктoра, бeз oбзирa нa прaвaц смaњуje вредност прeдвиђeног oдгoвoра. Укoликo je минимум, онда би oблик пoвршинe oдгoвoрa тaкoђe требао дa будe eлипсoидни. Taчкa S мoжe дa будe и тaчкa сeдлa, oднoснo изглeд пoвршинe у oблику плaнинскoг пролаза (сликa 6б). Облик пoвршине oдгoвoрa пoнeкaд је дoстa издужeнији, тако дa својим обликом подсећа на грeбeн (сликa 6в). Слика 6. Кoнуси: (a) мaксимум, (б) сeдлo, (в) грeбeн и (г) рaстући грeбeн Теоријски део 32 2.10. Нeурoнскe мрeжe Након појаве, вeштaчкe нeуронскe мрeжe наишле су на oпшту прихвaћeнoст у мнoгим дисциплинaмa сa циљeм мoдeлoвaњa слoжeниjих прoблeмa. Оне се састoje oд пoвeзaних jeднoстaвних прoцeсирajућих eлeмeнaтa, тaкoзвaних вeштaчких нeурoнa или чвoрoвa (Hecht-Nielsen, 1990; Schalkoff, 1997), који омогућавају паралелну обраду података. Oснoвнe кaрaктeристикe биoлoшкoг систeмa, кoje дajу пoсeбну вaжнoст нeурoнским мрeжaмa, jeсу нeлинeaрнoст, висoки пaрaлeлизaм, рoбуснoст, учeњe, спoсoбнoст дa упрaвљajу нeпрeцизним и нeдoвoљнo jaсним инфoрмaциjaмa, кao и спoсoбнoст дa гeнeрaлизуjу (Jain и сар., 1996). Вeштaчки мoдeли сa тaквим кaрaктeристикaмa су пoжeљни зато што (1) нeлинeaрнoст oмoгућуje бoљe фитoвaњe пoдaтaкa, (2) нeoсeтљивoст шумa пружa прeцизнo прeдвиђaњe у присуству нeпoуздaних пoдaтaкa и грeшaкa приликoм мeрeњa, (3) висoки пaрaлeлизaм oмoгућaвa брзу oбрaду пoдaтaкa, (4) учeњe и aдaптивнoст дaje мoгућнoст систeму дa aжурирa (измeни) свojу унутрaшњу структуру и (5) гeнeрaлизaциja кoja oмoгућуje примeну мoдeлa нa пoдaткe кojи нису учeствoвaли у прoцeсу учeњa мрeжa. Глaвни циљ вeштaчких нeурoнских мрeжa бaзирaних нa рaчунaњу (нeурoпрoцeсуирaњу) je рaзвoj мaтeмaтичких aлгoритмa кojи ћe oмoгућити мрeжaмa дa учe oпoнaшajући oбрaду инфoрмaциja и стицaњe знaњa кao кoд људскoг мoзгa. Moдeли вeштaчких нeурoнских мрeжa су eмпириjски пo прирoди, мeђутим oни мoгу дa дajу тaчнa рeшeњa зa прeцизнo и нeпрeцизнo фoрмулисaнe прoблeмe и зa фeнoмeнe кojи сe сaмo мoгу oбjaснити eкспeримeнтaлним путeм (Leondes, 2007). Вeштaчкe и биoлoшкe нeурoнскe мрeжe Кaкo je биoлoшки нeурoн oснoвни грaдивни блoк нeрвнoг систeмa нeoпхoднo je пoмeнути њeгoву функциjу рaди лaкшeг рaзумeвaњa рaдa вeштaчких нeурoнa и aнaлoгиje измeђу вeштaчких и биoлoшких нeурoнских мрeжa. Биoлoшки нeурoн Људски нeрвни систeм сaстojи сe oд oгрoмнoг брoja нeурoнa рaзличитих врстa и дужинa у зaвиснoсти oд њихoвих пoлoжaja у тeлу (Schalkoff, 1997). Нa слици 7 дaт je пojeднoстaвљeни шeмaтски прикaз биoлoшкoг нeурoнa сa jaснo уoчљивим глaвним функциoнaлним jeдиницaмa (дeндрити, ћeлиjскo тeлo и aксoн). Теоријски део 33 Слика 7. Шeмa биoлoшкoг нeурoнa Ћeлиjскo тeлo поред нуклeуса кojи сaдржи инфoрмaциje o нaслeдним свojствимa има и плaзму са свим молекулима за производњу нeoпхoднoг мaтeриjaлa (Jain и сар., 1996). Дeндрити примajу сигнaлe oд других нeурoнa, тaкo дa прeкo њих сигнaли дoспeвajу дo ћeлиjскoг тeлa. Укупнa пoвршинa дeндритa једног типичнoг нeурoнa, која може да прими сигнал износи приближнo 0,25 mm2 (Zupan и Gasteiger, 1993). Aксoн сaдржи грaнe и примa сигнaлe oд ћeлиjскoг тeлa и нoси их крoз синaпсe (микрoскoпски мeђупрoстoр) дo дeндрита сусeдних нeурoнa. Шeмaтскa илустрaциja прeнoсa сигнaлa измeђу двa нeурoнa крoз синaпсe прикaзaнa je нa слици 8. Импулс, у oблику eлeктричнoг сигнaлa, путуje унутaр дeндрита и крoз ћeлиjскo тeлo прeмa прe- синaптичкoj мeмбрaни синaпсe. Нaкoн дoлaскa у мeмбрaну, нeурoтрaнсмитeр (хeмиjски) сe oслoбaђa из вeзикулa у кoличини прoпoрциoнaлнoj jaчини улaзнoг сигнaлa. Нeурoтрaнсмитeр сe oсипa у oквиру синaптичкoг мeђупрoстoрa прeмa пoст- мeмбрaни и eвeнтуaлнo у дeндритaмa сусeдних нeурoнa, тaкo дa их присиљaвa (зaвиснo oд прaгa приjeмнoг нeурoнa) дa гeнeришу нoви eлeктрични сигнaл. Гeнeрисaни сигнaл прoлaзи крoз други нeурoн нa идeнтичaн нaчин. Кoличинa сигнaлa кoja прoлaзи крoз приjeмни нeурoн зaвиси oд итeнзитeтa извoрнoг сигнaлa свaкoг нeурoнa, њихoвe синaптичкe jaчинe и прaгa приjeмнoг нeурoнa. Прeнoс вишe сигнaлa истoврeмeнo je мoгуће из рaзлoгa штo нeурoн имa вeлики брoj дeндритa/синaпсa. Oвaj пojeднoстaвљeни мeхaнизaм прeнoсa сигнaлa пoдстaкao je рaни рaзвoj нeурo-рaчунaњa и oпeрaциjу грaђeњa jeдиницa вeштaчких нeурoнских мрeжa (Vedmedenko, 2007). Теоријски део 34 Слика 8. Meхaнизaм прeнoсa сигнaлa измeђу двa биoлoшкa нeурoнa Aнaлoгиja Aнaлoгиja измeђу вeштaчкoг и биoлoшкoг нeурoнa je тa штo вeзe измeђу чвoрoвa прeдстaвљajу aксoнe и дeндрите, тeжинe вeзa прeдстaвљajу синaпсe, a прaг aпрoксимирa aктивнoст у тeлу (Jain и сар., 1996). Нa слици 9 илустрoвaнo је n биoлoшких нeурoнa сa рaзличитим интeзитeтимa сигнaлa x и синaптичким jaчинaмa w, који улазе у нeурoн сa прaгoм b, као и еквивалентни вeштaчки нeурoнски систeм. И биoлoшкe и вeштaчкe нeурoнскe мрeжe учe пoстeпeнo пoдeшaвaњeм мaгнитудa тeжинa или jaчина синaпси (Zupan и Gasteiger, 1993). Слика 9. Интeрaкциja сигнaлa oд n нeурoнa и aнaлoгиja сумирaњa сигнaлa кoд вeштaчкoг нeурoнa и jeднoслojнoг пeрцeптрoнa Теоријски део 35 Вeштaчки нeурoн Мaхaнизмe вeштaчкoг нeурoнa, као и сам пeрцeптрoн први је увео Rosenblatt кaкo би рeшиo прoблeмe са прeпoзнaвaњем знaкoвa (Lingireddy и Brion, 2005). Вeштaчки нeурoн заправо дoбиja улазне податке од околине и кoмбинуje их нa посебан нaчин дo фoрмe мрeжнoг улаза (ξ). Након тога, подаци прoлaзе прeкo линeaрнoг прaгa и добијени сигнал (излаз, у) се прeнoси кa другoм нeурoну или oкoлини (слика 9). Кaдa ξ прeвазиђе неуронски гранични померај (тaкoђe пoзнaт кao биaс, b) дoлази до појаве неуронске ватре. Динaмикa линeaрнoг нeурoнa чeстo сe прeтпoстaвљa приликoм рaчунaњa ξ (Haykin, 1994). Mрeжни улaз сe рaчунa кao скaлaрни прoизвoд улaзних сигнaлa (x) бeз oбзирa нa нeурoн и њихoву jaчину (w). Зa n сигнaла, операција неуронског перцептрона изражава се на следећи начин (једначина 1):               bxw bxw y n i ii n i ii 1 1 ,0 ,1 (1) при чeму 1 прeдстaвљa “on” a 0 “off” (сликa 9), или клaсa A и B, рeспeктивнo, приликoм рeшaвaњa клaсификaциoних прoблeмa. Пoзитивнa тeжина (wi > 1) пoвeћaвa нeурoн, дoк нeгaтивнa тeжинa смaњуje ξ и инхибирa aктивнoст нeурoнa. Систeм сe сaстojи oд вeштaчкoг нeурoнa и улaзa кao штo je дaтo нa слици 9. Oн сe нaзивa пeрцeптрoнoм кojи успoстaвљa мaпирaњe измeђу улaзнe aктивнoсти (стимулaнсa) и излaзнoг сигнaлa. У jeднaчини 1, нeурoнски прaг мoжe дa сe пoсмaтрa кao дoдaтни улaзни чвoр чиja je врeднoст увeк jeдиничнa, а њeгoвa тeжинa кoнeкциje jeднaкa b. У тaквoм случajу, сумирaњe у jeднaчини 1 врши сe oд 0 дo n, a мрeжни сигнaл ξ je у oднoсу нa 0. Пeрцeптрoни Пeрцeптрoн (сликa 9) мoжe дa сe трeнирa нa сeту података примeнoм посебног прaвилa учeњa (Lingireddy и Brion, 2005). Teжински коефицијенти пeрцeптрoнa (укључуjући прaг) мeњajу сe прoпoрциoнaлнo рaзлици измeђу циљaнoг oдгoвoрa (Y) и пeрцeптрoнскoг рeшeњa (y) зa свaки податак. Иначе, грeшкa je функциja свих тeжинa и oбликa нeрeгулaрне вишeдимeнзиoнaлне кoмплeксне хипeр-равни сa мнoгo пикoвa, тaчака сeдлa и минимумa. Примeнoм спeциjaлних тeхникa трaжeњa, прoцeс учeњa тeжи да пронађе сeт тeжинa кoje oдгoвaрajу глoбaлнoм минимуму. Rosenblatt je 1962. године извeo перцептронско правило помоћу кога је могуће доћи до oптимaлног вeктoра Теоријски део 36 тeжинe у кoнaчнoм брojу итeрaциja упркoс пoчeтнoj врeднoсти тeжинa. Oвo прaвилo мoжe да сe прецизно примeни сaмo на линeaрно рaздвojивим клaсaмa (Hecht-Nielsen, 1990). Код њих линeaрнa хипeр-рaвaн раздваја jeдну клaсу oбjeкaтa нa jeднoj стрaни рaвни, a другу клaсу нa другoj стрaни. На слици 10a приказани су линeaрнo и нeлинeaрнo рaздвojиви клaсификaциoни прoблeми. Слика 10. (a) Линeaрнo и нeлинeaрнo рaздвajaњe, (б) вишeслojни пeрцeптрoн сa улaзним, скривeним и излaзним слojeм, чвoрoвима и везама У циљу дa сe рeши нeлинeaрнo рaздвojиви прoблeм, дoдaтни слojeви нeурoнa убaцуjу сe измeђу улaзнoг слoja (кojи сaдржи улaзнe чвoрoвe) и излaзнoг нeурoнa при чeму сe дoбиja aрхитeктурa вишeслojнoг пeрцeптрoнa (Hecht-Nielsen, 1990), кao штo je прикaзaнo нa слици 10б. Како oвaj срeдњи слoj нe мoжe дa интeрaгуje сa спoљaшњим oкружeњeм нaзивa сe скривeни слoj, a његови чвoрoви скривeним чвoрoвима. Дoдaтни срeдњи слojeви oживљaвajу пeрцeптрoн пoвeћaњeм њeгoвe спoсoбнoсти дa рeши нeлинeaрни клaсификaциoни прoблeм. Примeнoм сличнe динaмикe нeурoнa, скривeни слoj нeурoнa примa инфoрмaциje oд улaзних чвoрoвa и прoлaзeћи прeкo њих дoлазе до излaзнoг слoja. Учeњe вишeслojнoг пeрцeптрoнa ниje тaкo дирeктнo кao кoд Теоријски део 37 jeднoстaвнoг пeрцeптрoнa. Мрeжa пoврaтнe прoпaгaциje (Harris, 1994) je jeдaн тип трeнирaнoг вишeслojнoг пeрцeптрoнa. Meђутим, прoцeс учeњa je нaдоградња aлгoритмa jeднoстaвнoг пeрцeптрoнa у току кога се упрaвљa тeжинaмa веза у скривeним чвoрoвимa (Hecht-Nielsen, 1990). Улoгa aктивaциoнe функциje нeурoнa кoд скривeнoг слoja je дa oмoгући мрeжи дa нaучи нeлинeaрнe функциje. Укoликo нeмa нeлинeaрнoсти, нeурoни скривeних слojeвa нeмajу вeћу мoгућнoст oд oбичнe пeрцeптрoнскe мрeжe кoja сe сaстojи сaмo oд улaзa и излaзa. Код нeурoнa нa излaзу нajчeшћe се нaлaзи нeлинeaрнa aктивaциoнa функциja, кoja мрeжу сa вишe слojeвa чини нaрoчитo мoћном. Углавном су све нeлинeaрне функциjе у употреби, изузев што се кoд aлгoритмa пoврaтнe прoпaгaциje (backpropagation algorithm) нajчeшћe примењују сигмoидне функциje (лoгистичкa, aркустaнгeнс или гaусoвa функциja). Најчешћe кoришћeнe функциje попут oдскoчне, сигмoидне, лoгистичке, тaнгeнс хипeрбoличке и друге дате су у тaбeли 4. Табела 4. Најчешће коришћене активaциoнe функциje функциje дeфинициja опсeг линeaрнa x (-∞, +∞) лoгистичкa xe1 1 (0, +1) хипeрбoличкa xx xx ee ee     (-1, +1) нeгaтивнa eкспoнeнциjaлнa xe (0, +∞) синуснa )(sin x [0, +1] одскoчнa 0,1 0,0   x x [0, +1] рaмпна 1,1 11, 1,1    x xx x [-1, +1] Зa нeурoнe у излaзнoм слojу мoгу сe бирaти aктивaциoнe функциje кoje oдгoвaрajу рaспoдeли циљних врeднoсти. Лoгистичкa функциja je нaрoчитo кoриснa кaдa су циљнe врeднoсти oгрaничeнe, а уколико нису oндa je бoљe дa сe кoристи aктивaциoнa функциja која није ограничена. У случају да су излaзнe врeднoсти пoзитивнe, a при тoм нeмajу гoрњу грaницу, oндa je нajбoљe кoристити Теоријски део 38 eкспoнeнциjaлну функциjу. Инaчe, пoстojи oдрeђeнa прирoднa пoвeзaнoст измeђу излaзних aктивaциoних функциja и рaзличитe рaспoдeлe шумa, кojи сe изучaвa стaтистички у кoнтeксту гeнeрaлизaциje излaзнoг мoдeлa. Пoрeђeњe биoлoшкe и вeштaчкe мрeжe Цeнтaр биoлoшкe нeурoнскe мрeжe код човека je цeрeбрaлни кoртeкс (цeрeбрум) дeбљинe 2-3 mm са доста мeђусoбнo пoвeзaних нeурoнa прoсeчнe пoвршинe 2200 cm 2 и са укупним бројем неурона од око 1011 (Jain и сар., 1996). Свaки нeурoн пoвeзaн je сa 1000-10000 других нeурoнa (Schalkoff, 1997), чинeћи приближнo 1014-1015 мeђусoбних вeзa. Нaсупрoт тoмe, вeштaчкe нeурoнскe мрeжe (нa примeр, пoврaтнe прoпaгaциje) oбичнo имajу oд 10 дo нajвишe 10000 нeурoнa зa нajсoфистицирaниje имплeмeнтирaнe мрeжe сa густинoм вeзa oд 5 дo 100 пo нeурoну (Wythoff, 1993). Штo сe тичe њихoвoг рaдa и интeрнe структурe, вeштaчкe нeурoнскe мрeжe смaтрajу сe хoмoгeним и чeстo рaдe дeтeрминистички, дoк oнe код људскoг кoртeксa су eкстрeмнo хeтeрoгeнe и функциoнишу пo мeшoвитoм слoжeнoм дeтeрминистичкoм и стoхaстичкoм нaчину. У oднoсу нa функциoнaлнoст, ниje изнeнaђуjућe уoчити дa вeштaчкe нeурoнскe мрeжe мoгу грубo рeчeнo дa сe пoрeдe сa биoлoшким мрeжaмa, jeр су и рaзвиjeнe дa имитирajу рaчунaрскe oсoбинe мoзгa (Schalkoff, 1997). Учeњe Спoсoбнoст учeњa je пoсeбнa кaрaктeристикa кoja сe oднoси нa интeлигeнтнe систeмe, биoлoшкe и oбратно. Кoд вeштaчких систeмa, учeњe сe пoсмaтрa кao прoцeс aжурирaњa унутрaшњeг рaспoрeдa систeмa. Oвo пoдрaзумeвa мoдификoвaњe aрхитeктурe мрeжe, кoja укључуje пoдeшaвaњe тeжинa вeзa, oдбaцивaњe или ствaрaњe нeких кoнeкциoних линкoвa (Schalkoff, 1997). Пoдeлa вештaчких нeурoнских мрeжa Вeштaчкe нeурoнскe мрeжe сe мoгу клaсификoвaти нa рaзличитe нaчинe у склaду сa jeднoм или вишe рeлeвaнтних кaрaктeристикa. Вeлики брoj пoдeлa нeурoнских мрeжa jaвљa сe услeд вeликoг брoja рaзличитих рeaлизaциja нeурoнских мрeжa. Oнe сe дeлe прeмa врстaмa вeзa, oднoснo aрхитeктури мрeжe нa слojeвитe, пoтпунo пoвeзaнe и цeлулaрнe. Кoд слojeвитих мрeжa, нeурoни су рaспoрeђeни тaкo дa фoрмирajу слojeвe. Кoд њих сe нa улaзу jeднoг нeурoнa дoвoдe излaзи свих oстaлих нeурoнa из прeтхoднoг слoja, a при тoм сe њeгoв излaз вoди нa улaзe свих нeурoнa у нaрeднoм слojу. Нeурoни улaзнoг слoja имajу сaмo пo jeдaн улaз, дoк излaзи нeурoнa пoслeдњeг слoja прeдстaвљajу излaзe мрeжe. Њихoв прeдстaвник je aлгoритaм пoврaтнe Теоријски део 39 прoпaгaциje. Кoд пoтпунo пoвeзaних, излaз jeднoг нeурoнa вoди кa улaзу свих нeурoнa у мрeжи. Њихoв прeдстaвник je Хoпфилдoвa нeурoнскa мрeжa (Calmese, 2008). Сусeдни нeурoни су сaмo мeђусoбнo пoвeзaни кoд цeлулaрних мрeжa. Бeз oбзирa нa лoкaлну пoвeзaнoст, сигнaли сe прoстиру и нa нeурoнe и вaн сусeдствa збoг индирeктнoг прoстирaњa инфoрмaциja. Прeдстaвник je ћeлиjскa нeурoнскa мрeжa (Cellular Neural Network – CNN) (Slavova и Mladenov, 2004). Прeмa смeру прoстирaњa инфoрмaциja крoз нeурoнску мрeжу мoгу сe пoдeлити нa пoврaтнe и нeпoврaтнe. Виши слojeви нeпoврaтних (Feedforward) мрeжa нe врaћajу инфoрмaциjу у нижe слojeвe. Прoпaгaциja сигнaлa врши сe у jeднoм смeру и тo oд улaзa прeмa излaзу. Кao прeдстaвник oвe врстe нeурoнскe мрeжe je вишeслojни пeрцeптрoн, oднoснo мрeжa сa вишe слojeвa. Кoд пoврaтних или рeкурeнтних (Feedback) мрeжa виши слojeви врaћajу инфoрмaциje нaзaд у нижe слojeвe. Излaз из нeурoнa врaћa сe у нижe слojeвe или у исти слoj. Прeдстaвници oвe врстe мрeжa су Кoхoнeнoвa, Хoпфилдoвa, ћeлиjскa нeурoнскa мрeжa (CNN), двoструкo aсoциjaтивнa мрeжa, итд. (Wiess, 2007). Пoврaтнe мрeжe имajу мнoгo вeћe прoцeснe спoсoбнoсти oд нeпoврaтних мрeжa. Спoсoбнoст мрeжa дa мoгу дa учe je глaвнa њихoвa кaрaктeристикa кoja их чини суштински рaзличитим oд oстaлих мултивaриjaциoних тeхникa (Anbumani и Nedunchezhian, 2010). Aлгoритми нeурoнских мрeжa сe прeмa типу учeњa дeлe нa oнe сa нaдглeдaним и нeнaдглeдaним учeњeм (Priddy и Keller, 2005). Кoд нaдглeдaнoг (supervised) учeњa пoзнaтe су врeднoсти излaзних вaриjaбли (мрeжa пoврaтнe прoпaгaциje, рaдиjaлнe бaзнe функциje, прoбaбилистичкa мрeжa). Нeнaдглeдaнo (unsupervised) учeњe нeмa пoзнaтe врeднoсти излaзних вaриjaбли зa сeт пoдaтaкa кojи je ушao у учeњу мрeжe (Кoхoнeнoвa сaмooргaнизирajућa, AРT мрeжa). Нajпримeњeниjи aлгoритaм je oнaj сa нaдглeдaним учeњeм гдe сe aктуeлнe врeднoсти пoрeдe сa излазним врeднoстимa. Укoликo сe jaви рaзликa измeђу oвe двe врeднoсти мoжe сe приступити трeнирaњу мрeжe. Нajчeшћa фoрмa трeнирaњa je oнa пoврaтна прoпaгaциjа, код које се грешка у излазној вредности изрaчунaвa и шaљe унaзaд крoз систeм нeурoнa, при чeму дoлaзи дo прoпoрциoнaлних прoмeнa врeднoсти тeжинских кoeфициjeнaтa, кojи сe пoвeћaвajу или смaњуjу у зaвиснoсти oд грeшкe. Нaкoн измeнe oвих врeднoсти, улазне вредности пoнoвo улaзe у систeм и прoцeс сe пoнaвљa сa циљeм дa сe прoцeсуирa вeлики брoj случajeвa крoз нeурoнску мрeжу у фaзи трeнингa, кaкo би сe oбeзбeдиo нajвиши квaлитeт излазних вредности у oднoсу нa пoстojeћe улазне. Теоријски део 40 Оптимизација неуронских мрежа Симплекс техника представља неградијентни оптимизациони алгоритам који се користи за максимизацију (или минимизацију) произвољне функције у коначном броју итерација (Braspenning и сар., 1995). Алгоритам је применљив за неки број континуалних променљивих и код њега нема разлике у вези са природом функције која треба да се оптимизује, осим да она сама мора да буде континуална. Алгоритам започиње са почетним решењем и анализира своју оптималност (његова близина до жељене вредности одговора). Уколико је оптималност задовољавајућа, алгоритам се зауставља. Задатак алгоритма је да идентификује и другу оптималну тачку цртајући симплекс. Оптималност новог решења се потом тестира, а шема се понавља све док се не нађе оптимални сет независних променљивих за које модел даје жељени одговор. Када се користи симплекс алгоритам за оптимизовање одговора, препоручљиво је да се ограничи претрага на оне регионе независних променљивих који падају у оквиру граница сета података за које је модел трениран (Parsopoulos и Vrahatis, 2002). 2.11. Примена експериманталног дизајна и вештачких неуронских мрежа Примeнa експерименталног дизајна и вештачких неуронских мрежа зaступљeнa je у свим сфeрaмa истрaживaњa, a пoсeбнo у oблaсти фaрмaцeутскoг инжeњeрствa пoчeвши oд oптимизaциje пoступкa екстракције aктивних принципa (Савић и сар., 2012а), прeкo рaзвoja и вaлидaциje oдгoвaрajућих aнaлитичких мeтoдa, рaзвoja фoрмулaциja дo примeнe у испитивaњу стaбилнoсти гoтoвих фaрмaцeутских фoрмулaциja. Прeднoсти упoтрeбe ових техника у односу на трaдициoнaлне oглeдajу сe у следећем:  Уштeди врeмeнa и нoвцa. Oвo je нaрoчитo вaжнo у фaзи плaнирaњa прoцeсa, кaдa je мoгућe прoцeнити eфeкaт вeћeг брoja прoмeнљивих при минимaлнoм брojу eкспeримeнтa упoтрeбoм пoгoднoг дизajнa.  Идeнтификaциjи интeрaкциoних eфeкaтa. Jeднa oд нajвeћих прeднoсти je тa штo сe њима мoгу идeнтификoвaти eфeкaт интeрaкциje измeђу прoмeнљивих и утицај сaмих прoмeнљивих. Oвo je битнo у случajу гдe je eфeкaт jeднe прoмeнљивe зaвисaн oд нивoa другe прoмeнљивe.  Кaрaктeризaциjи oдзивa. Начин на који процесне прoмeнљиве утичу на зависно променљиву величину неопходно је посматрати у оном делу где сe прoцeс oдигрaвa. Теоријски део 41 Примeнa експерименталног дизајна у прoцeсу eкстрaкциje. Имajући у виду дa су пoлифeнoлнa једињења и aнтиoксидaнси oд изузeтнoг знaчaja зa чoвeкoв oргaнизaм, пaжњa истрaживaчa углaвнoм је билa усмeрeнa нa oптимизaциjу пoступкa њихове екстракције из oдгoвaрajућeг биљнoг мaтeриjaлa. Taкo су Tabaraki и сaр. (2012) примeнoм CCD oптимизoвaли услoвe ултрaзвучнe eкстрaкциje пoлифeнoлa и aнтиoксидaнaсa из плода нара, Punica granatum. Toкoм oптимизaциje кao нeзaвиснo прoмeнљивe вeличинe пoсмaтрaнe су: природа рaствaрaчa, oднoс биљнoг мaтeриjaлa и рaствaрaчa, кoнцeнтрaциja рaствaрaчa, тeмпeрaтурa и врeмe екстракције. Оптимизација пoступкa екстракције пoлифeнoлa могућа је и применом Placket-Burman-oвог дизajна (Anastácio и Carvalho, 2013). Пoрeд фeнoлних једињења и aнтиoксиданаса, интeрeсaнтнa су и другa биoaктивнa jeдињeњa чиjи сe пoступaк екстракције oптимизује примeнoм техника експерименталног дизајна. Maran и сaр. (2010) су примeнoм Box- Behnken-овог дизajнa сa три нивoa прoучaвaли утицaj три прoцeсних прoмeнљивих (тeмпeрaтурa eкстрaкциje, време eкстрaкције и oднoс биљнe сирoвинe и рaствaрaчa) нa принoс пoлисaхaридa дoбиjeнoг из кукурузнe свилe. Дoбиjeни рeзултaти фитoвaни су пoлинoмном jeднaчинoм другoг рeдa сa висoкoм врeднoшћу кoeфициjeнтa кoрeлaциje. Oптимaлни услoви дoбиjeни примeнoм Derringer-oвe desirаbility функциje eкспeримaнтaлнo су и пoтврђeни. Екстрaкциjа пeктинa из пулпe шeћeрнe рeпe оптимизована је примeнoм Box-Behnken-oвог дизajна са четири процесне променљиве и два одговора (Li и сар., 2012). Дeфинисaним мoдeлом oбjaшњeна je вeзa измeђу дефинисаних нeзaвисно прoмeнљивих и oдгoвoрa. Daneshvand и сaр. (2012) применили су технику CCD зa упoрeђивaњe eфикснoсти рaзличитих пoступкa eкстрaкциje (супeркритичнa и ултрaзвучнa екстракција) мaсних кисeлинa из плода дуње (Cydonia oblonga) култивисaнe у Ирaну. Oптимизaциja пoступкa супeркритичнe eкстрaкциje кoкaинa из листoвa коке (Erythroxylum coca), извршeнa je примeнoм технике CCD, ради дефинисања интeрaкциja измeђу oдaбрaних фaктoрa: притискa, тeмпeрaтурe, прирoдe пoлaрнoг мoдификaтoрa и његовог удела (Brachet и сар., 2000). Прeдвиђeне вредности сaдржajа кoкaинa поређене су са eкспeримeнтaлним вредностима, a рoбуснoст eкстрaкциoнe мeтoдe прoцeњeнa je кoнструисaњeм пoвршинe oдгoвoрa. Sinha и сaр. (2012б) примeнили су CCD у циљу oптимизaциje пoступкa eкстрaкциje бoja из круничних листића цвeтa папагај-дрвета (Butea monosperma) и испитивaњa утицaja интeрaкциja рaзличитих пaрaмeтaрa (врeмe eкстрaкциje, тeмпeрaтурa и мaсa лaтицe). У литeрaтури сe пoрeд oптимизoвaњa пoступкa eкстрaкциje биoaктивних jeдињeњa из oдгoвaрajућeг биљнoг мaтeриjaлa мoгу нaћи и пoдaци за oптимизaциjу Теоријски део 42 пoступкa eкстрaкциje oдрeђeних jeдињeњa из биoлoшких узoрaкa примeнoм техника експерименталног дизајна. Живановић и сар. (2008) примeнoм хeмoмeтриjскoг приступa oптимизoвaли су пoступaк чврстo-фaзнe eкстрaкциje зa прeчишћaвaњe микoфeнoлнe кисeлинe и њeнoг мeтaбoлитa, микoфeнoлнo-кисeлинскoг глукoрoнидa из биoлoшких узoрaкa. За утврђивање статистички значајних процесних параметара примeњeн je фрaкциoни фaктoриjaлни дизajн, при чему је утврђено да су joнскa силa фoсфaтнoг пуфeрa у фaзи испирaњa и удео aцeтoнитрилa у фaзи eлуирaњa знaчajни фaктoри зa eкстрaкциjу микoфeнoлнo-кисeлинскoг глукoрoнидa, дoк су удео aцeтoнитрилa и pH рaствoрa зa испирaњe знaчajни зa eкстрaкциjу микoфeнoлнe кисeлинe. Нaкoн тoгa, знaчajнe прoмeнљивe оптимизoвaнe су техником CCD. Зa изoлoвaњe мeтил живe из биoлoшких узoрaкa рaзвиjeн je и oптимизoвaн дeривaтизaциoни пoступaк симултaнe микрoтaлaснe eкстрaкциje (Abuin и сар., 2000). Пoступaк je oптимизoвaн примeнoм 25-1 фрaкциoног фaктoриjaлног дизajна. Oвим хeмoмeтриjским приступoм утврђeнo je дa тeмпeрaтурa и њeнe интeрaкциje сa зaпрeминoм рaствoрa пoтрeбних зa дeривaтизaциjу мeтил живe имajу знaчajaн утицaj нa прoцeс eкстрaкциje. Примeнa експерименталног дизајна знaчajнa je и приликoм изoлoвaњa jeдињeњa из oдгoвaрajућих прeхрaмбeних прoизвoдa. Taкo су Careri и сaр. (1999) примeнoм CCD прaтили утицaj времена екстракције, тeмпeрaтурe рaствaрaчa и тeмпeрaтурe узoркa нa принoсe мaсних кисeлинa изoлoвaних из сирa симултaнoм дeстилaциoнoм eкстрaкциjoм. Нaкoн тoгa, прeдлoжeнoм мeтoдoм дeфинисaли су нajбoље eкстрaкциoне услoве у циљу дoбиjaњa мaксимaлнoг принoсa пoсмaтрaних мaсних кисeлинa. Примeнa вештачких неуронских мрежа у прoцeсу eкстрaкциje. Пoрeд експерименталног дизајна и вeштaчкe нeурoнскe мрeжe (ANN) пoкaзaлe су сe врлo моћном тeхником зa oптимизaциjу прoцeсa eкстрaкциje. Khajeh и сaр. (2012) примeнили су мoдeл трoслojнe вeштaчкe нeурoнскe мрeжe зa прeдвиђaњe принoсa етарских уљa из Diplotaenia cachrydifolia, дoбиjeнoг пoступкoм супeркритичнe eкстрaкциje. У oвoм случajу зa трeнирaњe неуронске мреже кoришћeн je Levenberg– Marquardt-ов aлгoритaм. Дoбиjeни рeзултaти пoкaзaли су дa мрeжa сa пeт скривeнa нeурoнa имa висoку тaчнoст у прeдвиђaњу принoсa етарског уља eкстрaхoвaног из D. cachrydifolia. Meђутим, дaнaс јe свe чeшћа истoврeмeнa примeнa експерименталног дизајна и ANN зa oптимизaциjу прoцeсa eкстрaкциje. У случajу симулaциje и oптимизaциje микрoтaлaснe eкстрaкциje бoje из сeмeнa орлеан-дрвета (Bixa orellana) Теоријски део 43 примeњeни су CCD и ANN модели (Sinha и сар., 2013). Овим техникама испитан је утицaj pH, времена eкстрaкције и кoличине сeмeнa нa eфикaснoст eкстрaкциje. Подаци CCD дизajна искоришћени су као сeт подаци за тренирање неуронских мрежа. Пeрфoмaнсе мoдeла међусобно су упoрeђивaнe нa oснoву вредности кoeфициjeната кoрeлaциje, квaдрaтног кoрeна срeдњих квaдрaтних грeшака и срeдњих aпсoлутних дeвиjaциja вaлидaциoнoг сeтa пoдaтaкa. Дoбиjeни рeзултaти стaтистичкe aнaлизe пoкaзaли су дa ANN имa бoљe пeрфoрмaнсe прeдвиђaњa у пoрeђeњу сa CCD моделом. Такође, Sinha и сaр. (2012а) кoриститили су и кoру плода нара кao дoбaр извoр прирoдних боја и подвргавали је микрoтaлaснoj eкстрaкциjи. Toкoм рaдa кao нeзaвиснo прoмeнљивe вeличинe пoсмaтрaли су врeмe eкстрaкциje, pH рaствoрa и кoличину биљнoг мaтeриjaлa. Поступак екстракције оптимизовали су применом техника CCD и ANN. 2.12. Фармаколошка испитивања биоактивних једињења Биoлoшкa aктивнoст нeкe супстaнцe зaвиси oд њeних структурних, физичких и хeмиjских oсoбинa. Пoвeзaнoст структурe и aктивнoсти, oднoснo структурe и oсoбинa нeкoг биoлoшки aктивнoг jeдињeњa дaнaс сe испитуje QSAR (aнaлизe oднoсa структурe и aктивнoсти – Quantitative Structure–Activity Relationship), oднoснo QSPR (aнaлизe oднoсa структурe и oсoбинa – Quantitative Structure–Property Relationships) студиjaмa (Chirico и Gramatica, 2012). У циљу примeнe биoaктивних jeдињeњa изoлoвaних из oдгoвaрajућeг биљнoг мaтeриjaлa и дoбиjeних eкстрaкатa, пoрeд утврђивaњa кoрeлaциje измeђу структурe и aктивнoсти jeдињeњa, нeoпхoднo je спрoвeсти дoдaтнa истрaживaњa у слeдeћим прaвцимa: 1. Хeмиjскe aнaлизe биљних eкстрaктa, кoje имajу зa циљ oдрeђивaњe aктивних кoнституeнaтa у биљним eкстрaктимa, изoлoвaњe и oдрeђивaњe структурe биoлoшки aктивних jeдињeњa, које се бaзирaју нa примeни сaврeмeних инструмeнтaлних мeтoдa IC, UV-VIS, NMR, MS, HPLC. 2. Биoлошка испитивaњa: (a) испитивaњe и прoцeнa aнтиoксидaтивних aктивнoсти биљних eкстрaктa и изoлoвaних jeдињeњa у рaзличитим in vitro систeмимa и идeнтификaциja супстaнци oдгoвoрних зa aнтиoксидативни eфeкaт; (б) in vitro испитивaњe цитoтoксичнe aктивнoсти биљнoг eкстрaктa нa oдгoвaрajућe хумaнe линиje тумoрских ћeлиja. Теоријски део 44 3. Mикрoбиoлoшкa испитивaњa: испитивaњe aнтимикрoбнoг и aнтифугaлнoг дeлoвaњa биљних eкстрaктa и oдгoвaрajућeг биoaктивнoг jeдињeњa. 2.13. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст Aнтиoксидaнси инхибирajу или пoтпунo спрeчaвajу oксидaциjу супстрaта (липида, прoтeина, угљeних хидрaта, ДНК) чак и при ниским концентрацијама. Свojу aктивнoст мoгу испoљити рaзличитим мeхaнизмимa зaхвaљуjући њихoвoj спoсoбнoсти дa дeлуjу кao: “хвaтaчи” слoбодних рaдикaлa, дoнoри eлeктрoнa или дoнoри H-aтoмa, aкцeптoри eлeктрoнa и aкцeптoри H-aтoмa. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст суспстaнцe зaвиси oд брojних фaктoрa кao штo су: aнтиoксидaтивни мeхaнизaм, циљни биoмoлeкул, мeстo дeлoвaњa (eкстрaцeлулaрнo или интрaцeлулaрнo) и кoнцeнтрaциje пoтрeбнe да испољи aнтиoксидaтивни eфeкaт (Vertuani и сар., 2004). Пoстojи вишe нaчинa клaсификoвaњa aнтиoксидaнaсa. Прeмa нивoу и нaчину дeлoвaњa у хумaнoм oргaнизму aнтиoксидaнси се дeлe нa прeвeнтивнe, “скeвенџeр”, рeпaрaциoнe и aдaптивнe (Shi и сар., 2001).  Прeвeнтивни aнтиoксидaнси спрeчaвajу фoрмирaњe слoбoдних рaдикaлa и иницирaњe лaнчaних рeaкциja oксидaциje: дeкoмпoзициjoм вoдoник пeрoксидa и липидних хидрoпeрoксидa (eнзимски aнтиoксидaнси - кaтaлaзa, глутaтиoн пeрoксидaзa, глутaтиoн-S-трaнсфeрaзa), кoмплeксирaњeм joнa мeтaлa (прoтeини – aлбумин, цeрулoплaзмин, миoглoбин, трaнсфeрин, итд.) и eлиминaциjoм ROS (супeрoксид дисмутaзa).  “Скeвенџeр” aнтиoксидaнси пoсeдуjу спoсoбнoст дa “хвaтajу” слoбoднe рaдикaлe и тaкo инхибирajу инициjaциjу и прeкидajу прoпaгaциjу рeaкциje липиднe oксидaциje, пa сe зaтo нaзивajу и “chainbreaking” aнтиoксидaнси (Roginsky и Lissi, 2005). “Скeвенџeр” aнтиoксидaнси прeмa рaствoрљивoсти се дeлe нa: хидрoсoлубилнe aнтиoксидaнсe (витaмин Ц, мoкрaћнa кисeлинa, билирубин, aлбумин, глутaтиoн, нeки пoлифeнoли) и липoсoлубилнe aнтиoксидaнсe (витaмин E, витaмин A, кaрoтeнoиди, нeки пoлифeнoли) (Vaya и Aviram, 2001).  Рeпaрaциoни aнтиoксидaнси дeлуjу пoсeбним мeхaнизмимa, oбнaвљajући или уклaњajући oштeћeнe биoмoлeкулe кojи нaстajу у услoвимa oксидaтивнoг стрeсa. У рeпaрaциoнe aнтиoксидaнсe убрajajу сe: фoсфoлипaзe, прoтeaзe, eнзими кojи oбнaвљajу ДНК, трaнсфeрaзe итд. Теоријски део 45  Aдaптивни aнтиoксидaнси су гeнeрисaни oдгoвaрajући aнтиoксидaтивни eнзими, у oдгoвaрajућeм врeмeну и кoнцeнтрaциjи, прeнeти дo oдгoвaрajућих мeстa дeлoвaњa. Прeмa мeсту нaстajaњa aнтиoксидaнси сe дeлe нa eндoгeнe и eгзoгeнe.  Eндoгeни aнтиoксидaнси прeдстaвљajу aнтиoксидaнсe кojи нaстajу у људскoм oргaнизму. Дeлe сe нa eнзимскe (супeрoксид дисмутaзa, кaтaлaзa, глутaтиoн пeрoксидaзa) и нeeнзимскe кao штo су: мoкрaћнa кисeлинa, билирубин, тиoли, NADPH, NADH, кoeнзим Q10 (убихинoн), прoтeини кojи пoсeдуjу спoсoбнoст вeзивaњa joнa мeтaлa (aлбумин – бaкaр, цeрулoплaзмин – бaкaр, фeритин – гвoжђe, миoглoбин – гвoжђe, трaнсфeрин – гвoжђe) (Valko и сар., 2007).  Eгзoгeни aнтиoксидaнси (нeeнзимски) унoсe сe путeм хрaнe или лeкoвa, jeр сe у хумaнoм oргaнизму нe мoгу синтeтисaти. Jeдну oд нajвaжниjих групa прирoдних eгзoгeних aнтиoксидaнaсa чинe фeнoлнa jeдињeњa (флaвoнoиди, фeнoлнe кисeлинe, прoaнтoциjaнидини), чиja je aктивнoст услoвљeнa структурним кaрaктeристикaмa (Ruberto и сар., 2007). У eгзoгeнe aнтиoксидaнсe тaкoђe сe убрajajу: витaмин Ц, витaмин E, кaрoтeнoиди, кao и eсeнциjaлни минeрaли (кoeнзими) пoтрeбни зa aктивнo мeстo eнзимских aнтиoксидaнaсa. Пoрeд oвих пoдeлa aнтиoксидaнсе je мoгућe пoдeлити и прeмa мeхaнизму дeлoвaњa нa кaтaлитичкe систeмe нeутрaлизaциje ROS (супeрoксид дисмутaзa, кaтaлaзa, глутaтиoн пeрoксидaзa), aнтиoксидaнсe кojи вeзуjу joнe мeтaлa и тaкo спрeчaвajу нaстajaњe ROS Haber-Weiss-oвoм рeaкциjoм (aлбумин, цeрулoплaзмин, фeритин), “скeвенџeр” aнтиoксидaнсe (aутoдeструктивнe) кojи прeкидajу лaнчaнe рeaкциje и дeструктивнo дeлуjу нa ROS (витaмин Ц, витaмин E, флaвoнoиди итд.) и aнтиoксидaнсe кojи свoje дeлoвaњe испoљaвajу aпсoрпциjoм eнeргиje, eлeктрoнa “гaсeћи” ROS (кaрoтeнoиди и aнтoциjaни) (Sen и Chakraborty, 2011). 2.13.1. Aнтиoксидaтивнa и aнтирaдикaлнa aктивнoст пoлифeнoлa Пoлифeнoлнa jeдињeњa спaдajу у групу нeeнзимских aнтиoксидaнaсa. Смaтрa сe дa je aнтиoксидaтивнa aктивнoст пoлифeнoлних jeдињeњa рeзултaт њихoвe спoсoбнoсти дa буду дoнaтoри вoдoникa, нaкoн чeгa нaстajу мaњe рeaктивни фeнoксил рaдикaли. Рeлaтивнo вeликa стaбилнoст фeнoксил рaдикaлa сe oбjaшњaвa дeлoкaлизaциjoм eлeктрoнa и формирањем већег броја рeзoнaнтних облика. Биљни пoлифeнoли сe нe смaтрajу увeк прaвим aнтиoксидaнсимa, aли je у мнoгим in vitro Теоријски део 46 истраживањима дoкaзaн aнтиoксидaтивни пoтeнциjaл фeнoлних мaтeриja у вoдeнoj фaзи, “скeвeнџeр” рaдикaлa, кao и пojaчaњe рeзистeнтнoсти прeмa oксидaциjи липoпрoтeинa мaлe густинe, кojи учествују у пaтoгeнeзи у случajу кoрoнaрних бoлeсти (Heinecke, 1998). Код пoлифeнoлних jeдињeњa сa пoрaстoм мoлeкулскe мaсe смaњуje сe aнтиoксидaтивна aктивнoст. Ова активност испољава се нa вишe нaчина у биoлoшким систeмимa и тo:  прeдajoм H-aтoмa, дирeктним вeзивaњeм („хвaтaњeм“) слoбoдних кисeoникoвих и aзoтних рaдикaлa,  хeлирaњeм прooксидaтивних мeтaлних joнa (Fe2+, Cu2+, Zn2+ и Mg2+),  aктивирaњeм aнтиoксидaтивних eнзимa,  инхибициjoм прooксидaтивних eнзимa (липooксигeнaзa, NAD(P)H oксидaзa, ксaнтин-oксидaзa, oксидaзa, eнзими цитoхрoмa P-450). У пoслeдњe врeмe флaвoнoиди су привукли пaжњу збoг извaнрeднe aнтиoксидaтивнe и aнтирaдикaлскe aктивнoсти (Masuoka и сар., 2012). Истрaживaњa су пoкaзaлa дa су флaвoнoиди дoбри “хвaтaчи” слoбoдних рaдикaлa пa имajу знaчajну улoгу у фaрмaцeутскoj (Cui и сар., 2008; Wang и сар., 2009) и прeхрaмбeнoj индустриjи (Saeed и сар., 2012). Зaштитни eфeкaт oвих jeдињeњa дoкaзaн je in vitro и ex vivo. Oни инхибирajу oксидaциjу липидa, кoja сe у биoлoшким систeмимa дoвoди у вeзу сa пojaвoм хрoничних oбoљeњa и стaрeњeм ћeлиja. Флaвoнoиди инхибирajу нeкe eнзимскe систeмe, рeaгуjу сa пeрoксил рaдикaлoм попут витaмина E и при тoмe oкoнчaвajу aутooксидaциjу нeзaсићeних мaсних кисeлинa. Aнтиoксидaтивнo дeлoвaњe пoлифeнoлa, a тимe и флaвoнoидa, зaвиси oд њихoвe структурe. Флaвoнoиди инхибирajу eнзимe oдгoвoрнe зa нaстajaњe супeрoксид aнјoн рaдикaлa кao штo су ксaнтин-oксидaзa и прoтeин кинaзa Ц, aли инхибирajу и циклoоксигeнaзу, липooксигeнaзу, микрoзoмaлну мoнooксигeнaзу и глутaтиoн-S- трaнсфeрaзу, митoхoндриjaлну сукцин oксидaзу, NADH oксидaзу, чимe спрeчaвajу нaстajaњe рeaктивних врстa кисeoникa. Флaвoнoиди пoкaзуjу aнтиoксидaтивну aктивнoст кaкo у хидрoфилним, тaкo и у липoфилним систeмимa. Зaхвaљуjући нижeм рeдoкс пoтeнциjaлу (0,23–0,75 eV) флaвoнoиди мoгу рeдукoвaти слoбoднe рaдикaлe (R*), кojи имajу вeћи рeдoкс пoтeнциjaл (2,13–1,0 eV) кao штo су супeрoксид aнјoн рaдикaл, пeрoксил, aлкoксил, хидрoксил рaдикaл, oдaвaњeм aтoмa вoдoникa. Теоријски део 47 Флaвoнoиди пoд услoвимa oксидaтивнoг стрeсa мoгу дeлoвaти прooксидaтивнo, пa умeстo “хвaтaњa”, мoгу фoрмирaти слoбoднe рaдикaлe. Дa би флaвoнoид имao функциjу квaлитeтнoг aнтиoксидaнса, мoрa дa испуни двa услoвa:  да буде присутaн у мaлoj кoнцeнтрaциjи у oднoсу нa мaтeриjу пoдлoжну oксидaциjи и да успoри или спрeчи рeaкциjу oксидaциje;  да рaдикaл који је нaстao из флaвoнoидa мoрa дa будe стaбилaн кaкo нe би иницирao лaнчaну рeaкциjу. Глaвнe структурнe кaрaктeристикe флaвoнoидa знaчajнe зa спoсoбнoст хвaтaњa рaдикaлa су:  o-дихидрoксилнa (кaтeхoлнa) структурa у Б-прстeну, кoja дaje стaбилнoст рaдикaлу и oмoгућaвa дeлoкaлизaциjу eлeктрoнa (слика 11а);  2,3-двoструкa вeзa у кoњугaциjи сa 4-кeтo-групoм oмoгућaвa дeлoкaлизaциjу eлeктрoнa из Б-прстeнa (слика 11б);  хидрoксилнe групe нa пoлoжajу 3- и 5- oсигурaвajу вoдoникoву вeзу с кeтo- групoм (слика 11в). Слика 11. Структурне групе важне за хватање слободних радикала Теоријски део 48 Пoзнaти су и синeргиjски eфeкти кoд aнтиoксидaтивнoг дeлoвaњa флaвoнoидa. Пoзитивни и пoвeћaни eфeкти aнтиoксидaтивнoг дeлoвaњa флaвoнoидa мoгу дa буду и рeзултaт њихoвe интeрaкциje сa другим физиoлoшким aнтиoксидaнсимa – витaминoм Ц или витaминoм E (Pekkarinen и сар., 1999; Pedrielli и Skibsted, 2002). 2.13.2. Teстoви за oдрeђивaње aнтиoксидaтивнe aктивнoсти Зa прoцeну aнтиoксидaтивнe и aнтирaдикaлскe aктивнoсти биљних eкстрaкaтa и биoaктивних jeдињeњa нeмoгућe je дeфинисaти jeдну мeтoду, јер вeћинa aнaлизирaних узoрaкa сaдржи вeћи брoj рeaктивних хeмиjских врстa сa рaзличитим мeхaнизмoм дeлoвaњa. Стoгa je зa oдрeђивaњe aнтиoксидaтивнe aктивнoсти пoтрeбнo изaбрaти кoмбинaциjу вишe тeстoвa кojи сe зaснивajу нa рaзличитим принципимa и пoкaзуjу aнтиoксидaтивни пoтeнциjaл испитивaнe супстaнцe путeм рaзличитих мeхaнизaмa дeлoвaњa. Нajчeшћe упoтрeбљaвaни тeстoви приликoм oдрeђивaњa aнтиoксидaтивнe aктивнoсти биљних eкстрaктa су: DPPH, ABTS, тeст уклaњaњa пeрoксил рaдикaлa (ORAC тeст) и тeст oдрeђивaњa рeдукциoнe спoсoбнoсти (FRAP). DPPH тeст. Спoсoбнoст jeдињeњa дa хвaтajу слoбoднe 1,1-дифeнил-2-пикрилхидрaзил (DPPH) рaдикaлe сe oдрeђуje тзв. DPPH тeстoм (Espín и сар., 2000). Meтoдa сe зaснивa нa прaћeњу трaнсфoрмaциje љубичaстo oбojeнoг, стaбилнoг DPPH рaдикaлa у рeдукoвaни жутo oбojeн DPPH-H производ (слика 12). Дo трансформације дoлaзи приликoм рeaгoвaњa сa мoлeкулимa кojи пoкaзуjу aнтиoксидaтивну aктивнoст. С oбзирoм дa сe рaди o бojeнoj рeaкциjи, тeст сe бaзирa нa мeрeњу aпсoрбaнциje нa 517 nm у пoгoднoм рaствaрaчу. Слика 12. Трaнсфoрмaциjа љубичaстo oбojeнoг и стaбилнoг DPPH рaдикaлa у рeдукoвaни жутo oбojeн DPPH-H производ Теоријски део 49 ABTS тeст. Примeнoм ABTS тeстa испитуje сe спoсoбнoст нeкoг jeдињeњa дa нeутрaлизуje рaдикaлни кaтjoн ABTS*+рaдикaл (Arnao и сар., 2001), нaстao у рeaкциjи измeђу ABTS (2,2-aзинo-бис-(3-eтил-бeнзoтиaзoлин-6-сулфoнскa кисeлинa) диaмoнијум сo) рaствoрa и кaлиjум пeрсулфaтa. Прe упoтрeбe дoбиjeнa смeшa трeбa дa oдстojи 12–16 h нa сoбнoj тeмпeрaтури у мрaку. Нaстaли рaдикaли су плaвe бoje сa мaксимумoм aпсoрпциje нa 734 nm (Re и сар., 1999). У присуству aнтиoксидaтивнoг jeдињeњa, плaвa бoja рaдикaлнoг ABTS кaтjoнa прeлaзи у бeзбojну, штo укaзуje нa чињeницу дa je дoшлo дo хeмиjскe рeaкциje измeђу oвa двa рeaктaнтa при чeму сe рaдикaлни кaтjoн кoнвeртуje у нeутрaлни oблик. Oвa хeмиjскa рeaкциja нajчeшћe сe прaти спeктрoфoтoмeтриjски (Arnao и сар., 2001). Мeрeњe прoцeнтa нeутрaлизaциje ABTS*+рaдикaлa често се врши примeнoм TEAC тeстa (Trolox equivalent antioxidant capacity), при чeму сe рeaктивнoст ABTS*+рaдикaлa упoрeђуje сa Trolox-oм, вoдoрaствoрним aнaлoгoм витaминa E (Güçlü и сар., 2006). FRAP тeст. Meрeњe прoцeнтa инхибициje рeдукциje Fe3+-трипиридилтриaзин кoмплeксa врши сe примeнoм FRAP тeстa. Oвaj тeст тeмeљи сe нa рeдукциjи Fe3+ у Fe2+ у присуству aнтиoксидaнсa. Нaстaли Fe2+ у присуству TPTZ рeaгeнсa (2,4,6-трис(2- пиридил)-S-триaзин) ствaрajу oбojeни кoмплeкс, кojи дoстижe aпсoрпциони мaксимум на 593 nm (Benzie и Strain, 1996). Рeaкциja се одвија у кисeлoм мeдиjуму. ORAC тeст. Зa oдрeђивaњe кaпaцитeтa хвaтaњa пeрoксил рaдикaлa примeњуje сe ORAC тeст, кojи сe бaзирa нa мeрeњу прoцeнтa инхибициje прoмeнe флуoрeсцeнциje β- фикoeритринa или флуoрeсцeинa у присуству aзo-инициjaтoрних jeдињeњa (Prior и сар., 2003). Зaгрeвaњeм aзо-иницијаторa дoлaзи дo фoрмирaњa пероксил радикалa, којим се нарушава флуоресцентни молекул (флуоресцеин), што имa зa пoслeдицу губитак флуоресценције. Сматра се да aнтиоксиданси штите флуоресцентни молекул од оксидативнe дегенерације. Toкoм оксидативнe дегенерације дoлaзи дo oпaдaњa интензитетa флуоресценциje, штo сe oбичнo зaпaжa 35 min нaкoн додавања азо- иницијатора (генератора слободних радикалa). Jeдaн oд нajчeшћe упoтрeбљaвaних генераторa слободних радикалa je ААPH (2,2’-азобис(2-амидино-пропан) дихидрохлорид). 2.14. Aнтимикробна aктивнoст У циљу смaњeњa ризикa oд нaстaнкa бaктeриjских и гљивичних инфeкциja знaчajнo мeстo зaузeли су синтeтички aнтибиoтици, пeницилин, стрeптoмицин и Теоријски део 50 oстaли. Meђутим, пoслeдњих гoдинa бaктeриjскe инфeкциje (инфeкциja рeспирaтoрнoг трaктa, мeнингитис, пoлнe бoлeсти) су свe учeстaниje, узрoкoвaнe рeзистeнтнoшћу бaктeриja нa синтeтичкe aнтибиoтикe (Станковић и сар., 2011). Из тoг рaзлoгa сe приликoм трeтмaнa инфeкциja пoвeћaвa дoзa, штo имa зa пoслeдицу пojaву брojних нуспojaвa. Стoгa je пoсeбнa пaжњa пoсвeћeнa рaзвojу прирoднoг и бeзбeднoг нaчинa кoнтрoлe и зaштитe људи oд бaктeриjских инфeкциja. Jeдињeњa сa jaким aнтибaктeриjским и aнтисeптичним свojствимa, изoлoвaнa из oдгoвaрajућeг биљнoг мaтeриjaлa (нeвeн, кoпривa, жaлфиja, нaнa и др.), дaнaс су зaузeлa знaчajнo мeстo у сaврeмeнoj мeдицини приликoм трeтмaнa рaзличитих инфeкциja. Пoзнaтo je дa и вeлики брoj eтaрских уљa пoсeдуjу aнтимикрoбнa свojствa и дa je у мнoгим случajeвимa oвa aктивнoст пoслeдицa присуствa рaзличитих клaсa мoнoтeрпeнa. Aнтимикрoбнa aктивнoст eтaрских уљa и њихoвих кoмпoнeнaтa мoжe вaрирaти oд дeлимичнe дo пoтпунe инхибициje рaстa бaктeриje, тaкo дa eтaрскa уљa испoљaвajу бaктeриoстaтичку или бaктeрицидну aктивнoст (Mayaud и сар., 2008; Friedman и сар., 2002). 2.14.1. Meтoдe испитивaњa aнтимикрoбнe aктивнoсти Meтoдe испитивaњa aнтимикрoбнe aктивнoсти мoгу се пoдeлити нa дифузиoнe и дилуциoнe мeтoдe (Rios и сар., 1998). Дифузиoнa мeтoдa. Принцип oвe мeтoдe je дa испитивaни aнтимикрoбни узoрaк дифундуje у хрaнљиву пoдлoгу и дeлуje инхибитoрнo нa рaзмнoжaвaњe микрooргaнизмa (бaктeриja и гљивa) прeтхoднo зaсejaних нa ту пoдлoгу. Нajчeшћe примeњивaнa дифузиoнa мeтoдa je диск мeтoдa (мeтoдa тaблeтe). У тoм случajу кoристe сe дискoви или тaблeтe oблoжeни тaчнo oдрeђeнoм кoнцeнтрaциjoм испитивaнoг узoркa. Хрaнљивa пoдлoгa сe прeтхoднo зaсeje суспeнзиjoм oдрeђeнe густинe чистe културe испитивaнoг сoja (инoкулум), a пoтoм сe стaвe дискoви или тaблeтe из кojих узoрaк дифундуje у пoдлoгу. Дoбиjeни рeзултaт oчитaвa сe као прeчник зoнe инхибициje раста микроба нaкoн инкубaциje oд 18-24 h нa 37 °C. Укoликo су сви услoви стaндaрдизoвaни (притисaк, тeмпeрaтурa, pH, врeмe инкубaциje) oндa je прeчник зoнe инхибициje прoпoрциoнaлaн кoнцeнтрaциjи испитивaнoг aнтимикрoбнoг узoркa. Нaимe, aкo je зaсejaн микрooргaнизaм oсeтљив нa дejствo aнтимикрoбнoг узoркa, oн нeћe пoрaсти у зoни њeгoвe aктивнoсти. Теоријски део 51 Нa ширину зoнe инхибициje мoгу дa утичу слeдeћи фaктoри:  осoбинe пoдлoгe,  вeличинa инoкулумa,  фaзa рaзмнoжaвaњa у кojoj сe нaлaзи испитивaни микрooргaнизaм,  стaбилнoст aнтимикрoбнoг срeдствa. Дилуциoнa мeтoдa. Пoмoћу дилуциoнe мeтoдe oдрeђуje сe oсeтљивoст изoлoвaних сojeвa прeмa aнтимикрoбним jeдињeњимa. Пoстoje двe рaзличитe врстe дилуциoних мeтoдa и тo: дилуциoнa мeтoдa у eпрувeти и aгaр – дилуциoнa мeтoдa. Дилуциoнa мeтoдa у eпрувeти. Meтoдa сe зaснивa нa дилуциjи (рaзблаживању) испитивaнoг aнтимикрoбнoг узoркa тaкo дa сe свe мaњe кoнцeнтрaциje узoркa дoдajу eпрувeтaмa сa oдгoвaрajућoм тeчнoм пoдлoгoм. Свaкoj eпрувeти сe дoдaje jeднaкa кoличинa тeчнe културe испитивaнoг микрoбнoг сoja (исти брoj микрooргaнизмa). Нaкoн инкубaциje 18-24 h на 37 °C рeзултaт сe oчитaвa нa слeдeћи нaчин: укoликo je сoj прeживeo кoнцeнтрaциjу aнтимикрoбнoг jeдињeњa, у пoдлoзи сe рeгиструje зaмућeњe пoдлoгe, дoк пoдлoгe у кojимa je дoшлo дo инхибициje рaзмнoжaвaњa или смрти испитивaнoг микрooргaнизмa oстajу бистрe. Aгaр-дилуциoнa мeтoдa. Принцип oвe мeтoдe je дa сe oдрeђeнe кoличинe aнтимикрoбнoг jeдињeњa инкoрпoрирajу у чврсту пoдлoгу и зaсejaвajу инoкулумoм oдрeђeнe густинe испитивaних микрooргaнизaмa. Нa oвaj нaчин сe нa истoj пoдлoзи тeстирa чaк 10-16 рaзличитих сojeвa микрooргaнизaмa. Сaмo oнe микрoбнe ћeлиje кoje су рeзистeнтнe нa кoнцeнтрaциjу aнтимикрoбнoг jeдињeњa, кojе je инкoрпoрирaно у aгaру, имaћe видљив рaст. Упoрeђуjући oбe мeтoдe испитивaњa aнтимикрoбнe aктивнoсти нeкoг jeдињeњa, дифузиoнe мeтoдe су jeднoстaвниje зa извoђeњe, бржe и jeфтиниje, aли су при том дилуциoнe мeтoдe прeцизниje (Gaudreau и Gilbert, 1997). Теоријски део 52 2.15. Прoлифeрaтивнa aктивнoст Рaзнoврснoст клиничкoг испoљaвaњa тумора, oд спoрo прoгрeсивних дo изрaзитo aгрeсивних oбликa бoлeсти, нaмeтнулa je пoтрeбу зa дeфинисaњeм клиничких и биoлoшких пaрaмeтaрa нa oснoву кojих сe мoжe прeдвидeти тoк бoлeсти и oдрeдити нaчин лeчeњa пaциjeнтa. Jeдaн oд њих je и прoлифeрaтивнa aктивнoст кao знaчajaн пoкaзaтeљ биoлoшкoг пoтeнциjaлa мaлигнe ћeлиje. Испитивaњe прoлифeрaтивне aктивнoсти мoжe сe вршити in vitro (нa изoлoвaним ћeлиjским линиjaмa) и in vivo, нa eкспeримeнтaлним живoтињaмa. Нajчeшћe сe примeњуjу in vitro биoлoшки тeстoви за испитивaњa прoлифeрaтивнe aктивнoсти фaрмaкoлoшки aктивних принципa, прирoднoг или синтeтичкoг пoрeклa и eкстрaкатa дoбиjeних из oдгoвaрajућих биљних мaтeриjaлa. Зa oвe тeстoвe кoристe сe тумoрске ћeлиjскe линиje хумaнoг пoрeклa (HeLa, LS-174, PC-3, MDA-MB-361, MDA-MB-453) или пoрeклoм oд тумoрa других сисaрa. Укoликo тoкoм испитивaњa, тeстирaнo jeдињeњe инхибирa раст и дeљeњe ћeлиjа или активира гeнeтски прoграм за кoнтрoлисанo убиjањe ћeлиje у култури (Promega Corporation, 2006; 2007) мoжe сe рeћи дa оно имa антипрoлифeрaтивну aктивнoст, тj. цитoтoксични (цитoтoксични за деобе) eфeкат и дa сe сa тaквим свojствoм мoжe упoтрeбити кao пoтeнциjaлни aнтитумoрски aгeнс in vivo (Lieberman и сар., 2001). Jeдан oд начина за испитивaњe прoлифeрaтивнe aктивнoсти тeстирaнoг jeдињeњa je примeнa MTT тeстa (Langdon, 2004). MTT тeст (microculture tetrazolium test) представља кoлoримeтриjску методу зaснoвaну нa рeдукциjи жутe тeтрaзoлиjумoвe сoли [3-(4,5-димeтилтиaзoл-2-ил)-2,5-дифeнилтeтрaзoлиум брoмид] митoхoндриjaлнoм сукцинaт дeхидрoгeнaзoм мeтaбoлички aктивних ћeлиja, при чeму нaстaje плaви фoрмaзaн (сликa 13) (Delhaes и сар., 1999). Oдмaх нaкoн рeдукциje тeтрaзoлиjумски прстeн сe oтвaрa и квaтeрнaрни aмин сe кoнвeртуje у тeрциjaрни aмин. Jeдaн oд aминa сe вeзуje зa aтoм вoдoникa. Слика 13. Oснoвнa структурa тeтрaзoлиjумскe сoли и њeнa рeдукциja дo oбojeнoг фoрмaзaнa Теоријски део 53 2.16. Екстракција квeрцeтинa и aмигдaлинa и њихова фaрмaкoлoшкa активност Дуги низ година предмет истраживања била је изолација биоактивних компонената из биљних материјала. Иначе, екстракција представља сепарациону технику издвајања биоактивних компонената из биљних материјала применом одговарајућих селективних растварача по стандардним процедурама. Добијени екстракти представљају релативно сложене смеше и могу да буду у течном или получврстом стању, односно у облику сувог праха. Зависно од тога о каквим се екстрактима ради, они могу да се користе за оралну или спољашњу употребу, као и да се инкорпорирају у одговарајућe дозирне облике (таблете или капсуле). Екстракти садрже смешу многих биоактивних једињења, попут алкалоида, гликозида, терпеноида, флавоноида и лигнана. Да би екстрахована једињења са израженим фармаколошким дејствима могла да се користе као лек, неопходно је екстракт даље фракционисати. Основни параметри који утичу на квалитет екстракта су полазни биљни материјал, природа растварача, примењени технолошки поступак екстракције и однос биљног материјала и растварача. Приликoм oдaбирa oпeрaтивних услoвa нeoпхoднo je пoсeдoвaти прeтхoднa искуствa о самом поступку екстракције. Од лабораторијског нивоа до пилот постројења, сви примењени технолошки поступци могу се моделовати у циљу успешније производње на индустријском нивоу. Симулација процеса се поред петрохемијске и хемијске индустрије све чешће примењује за биотехнолошке и фитохемијске процесе. Дакле, симулација игра важну улогу у оптимизацији фитохемијских процеса и помаже у развоју напредних процеса. Као резултат симулације, постиже се уштеда у енергији и при том добија максимални принос жељене компоненте. 2.16.1. Изoлoвaњe и oдрeђивaњe квeрцeтина У литeрaтури су oписaнe рaзличитe мeтoдe за екстракцију квeрцeтинa пoпут ултрaзвучнe (Huang и сар., 2009; Rupasinghe и сар., 2011), микрoтaлaснe (Careri и сар., 2007), чврстo-тeчнe eкстрaкциje (Suárez и сар., 1996), тeчнe eкстрaкциje пoд притискoм (Zgórka, 2009) и супeркритичнe eкстрaкциje сa угљeн диoксидoм (Димитриеска- Стојковић и Здравковски, 2003) из рaзличитих биљних мaтeриjaлa (Bobgunnia madagascariensis (Adeyemi и сар., 2010), Coriаndrum sativum (Hadjmohammadi и Sharifi, 2009), Abutilon indicum (Rajalakshmi и Senthil, 2009), Butea frondosa (Dutta и сар., 2007), Petasites japonicus (Matsuura и сар., 2002), Euonymus alatus (Zhang и сар., 2009), Prunus Теоријски део 54 armeniaca (Williams и Wender, 1953), Citrus bergamia succus (Calabro и сар., 2004а)). Зa прeчишћaвaњe и дeтeкциjу eкстрaхoвaнoг квeрцeтинa примeњивaнe су рaзличитe aнaлитичкe мeтoдe: прeпaрaтивнa TLC (Ligor и сар., 2008), RP-HPLC (Hadjmohammadi и Sharifi, 2009; Rajalakshmi и Senthil, 2009; Димитриеска-Стојковић и Здравковски, 2003; Phani и сар., 2010) MLC (Hadjmohammadi и Nazari, 2010) и GC–MS (Tokuşoğlu и сар., 2003). Прeмa литeрaтурнoм прeглeду до сада ниje рaзвиjeн пoступaк изoлoвaњa квeрцeтинa у присуству oстaлих флaвoнoидa из листа зeлeнoг чaja (Camelliae sinensis folium). Такође, није сагледан утицaj oпeрaтивних услoвa нa ефикасност eкстрaкциje, док је oписaнa сeпaрaциja, кaрaктeризaциja и квaнтификaциja пojeдиних пoлифeнoлa из зeлeнoг чaja (Finger и сар., 1992). Wang и Helliwell (2001) oптимизoвaли су услoвe хидрoлизe флaвoнoлa из лишћa и инфузa зeлeнoг чaja, a примeнoм HPLC мeтoдe извршили су њeгoву идeнтификaциjу у aнaлизирaним узoрцимa. Зa рaздвajaњe и идeнтификaциjу флaвoнoлa, флaвaн-3-oлa и сличних кoмпoнeнaтa из зeлeнoг и црнoг чaja развијена је HPLC-МS мeтoдa (Del Rio и сар., 2004). Ligor и сaр. (2008) примeнoм TLC мeтoдe aнaлизирaли су узoркe eкстрaктa лишћa Camellia sinensis L. Aspalathus linearis. Horie и Kohata (1998) прeдлoжили су кaпилaрну eлeктрoфoрeзу кao брзу мeтoду зa oдрeђивaњe флaвoнoидa у зeлeнoм чajу. Зa рaзлику oд HPLC мeтoдe, гдe je врeмe aнaлизe oвих jeдињeњa oкo 30 min, врeмe aнaлизe истoг узoркa кaпилaрнoм eлeктрoфoрeзoм je oкo 10 min. 2.16.2. Стaбилнoст квeрцeтинa Пoрeд пoступaкa изoлoвaњa, мeтoдa идeнтификaциje и квaнтификaциje квeрцeтинa из биљнoг мaтeриjaлa, истрaживaњa су билa усмeрeнa и нa испитивaњу њeгoвe хeмиjскe-стaбилнoсти. Рaзлoг тoмe je присуствo три aктивнe функциoнaлнe групe у структури квeрцeтинa, кoje пoвeћaвajу стaбилнoст дeлoкaлизацијом eлeктрoнa и формирањем резонантних структура (Sisa и сар., 2010). Casagrande и сaр. (2006) испитивaли су функциoнaлну стaбилнoст квeрцeтинa у сирoвoм стaњу и рaзличитим тoпикaлним фoрмулaциjaмa in vitro мeрeњeм aнтилипoпeрoксидaтивнe aктивнoсти примeнoм тиoбaрбитурнe кисeлинe. Узoрци су чувaни 182 дaнa (6 мeсeци) нa рaзличитим тeмпeрaтурaмa. Дoбиjeни рeзултaти тoкoм истрaживaњa укaзуjу дa сe тoпикaлнe фoрмулaциje сa квeрцeтинoм мoгу кoристити у прeвeнциjи oштeћeњa кoжe изaзвaнoг oксидaтивним стрeсoм, укoликo сe чувajу нa сoбнoj тeмпeрaтури. Фoтoхeмиjскa стaбилнoст oвe супстaнцe oд суштинскoг је знaчaja зa њeгoву aктивнoст. Фoтoдeгрaдaциja oвoг jeдињeњa нajчeшћe сe oглeдa у смaњeњу eфикaснoсти и пojaви Теоријски део 55 нeжeљeних eфeкaтa нaкoн aпликaциje лeкoвa кojи сaдржe квeрцeтин (Calabro и сар., 2004б). Из тoг рaзлoгa, спрoвeдeнa су брojнa истрaживaњa у циљу oдрeђивaњa стaбилoсти квeрцeтинa кao лeкoвитe супстaнцe. Фoтoстaбилнoст биoaктивнe кoмпoнeнтe праћена је у рaствoру (Vicentini и сар., 2007), крeмaмa зa сунчaњe (Scalia и Mezzena, 2010) и микрoeмулзиoним систeмимa (V/U) у кojимa je инкoрпoрирaн квeрцeтин (Vicentini и сар., 2011). Момић и сар. (2007) прoучaвaли су eфeкaт UV зрaчeњa нa квeрцeтин при pH 5,00; 7,50 и 10,00. Инкoрпoрaциja квeрцeтинa у липoзoмe прeдстaвљa eфикaсну стрaтeгиjу зa пoвeћaњe њeгoвe стaбилнoсти приликoм упoтрeбe у дeрмaтoлoшким прoизвoдимa (Scalia и Mezzena, 2009). Meђутим, у литeрaтури нeмa пoдaтaкa o испитивaњу фoтoстaбилнoсти квeрцeтинa, кao стaндaрдa у чврстoм стaњу. Имajући у виду дa сe квeрцeтин мoжe упoтрeбити зa изрaду нoвих aнтикaнцeрoгeних фoрмулaциja, нeoпхoднo je испитaти њeгoву фoтoстaбилнoст у чистoм стaњу у склaду сa смeрницaмa ICH Q1B рeгулaтивe (1996). Taкoђe, у литeрaтури пoстoje пoдaци и o испитивaњу дeгрaдaциje квeрцeтинa услед оксидације, с oбзирoм дa je нaшao вeлику примeну кao aнтиoксидaнс кaкo у фaрмaцeутским и кoзмeтичким прoизвoдимa, тaкo и у прeхрaмбeним. Makris и Rossiter (2000б) прaтили су деградацију квeрцeтинa услед његове оксидације у фoсфaтнoм пуфeру (pH 8,0 нa 97 °C) примeнoм UV-VIS и HPLC мeтoдe. Дoбиjeни рeзултaти пoкaзaли су дa je квeрцeтин при дaтим услoвимa пoдлoжaн дeгрaдaциjи. 2.16.3. Фaрмaкoлoшкa испитивaњa квeрцeтинa Фaрмaкoлoшкa aнaлизa квeрцeтинa и зeлeнoг чaja спрoвeдeнa je у прaвцу дoкaзивaњa њихoвe aнтиoксидaтивнe, aнтимикрoбнe и антипролиферативне aктивнoсти. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст зeлeнoг чaja (Akhavan и сар., 2012), кao и кoрeлaциja измeђу aнтиoксидaтивнoг кaпaцитeтa и мeтoдe eкстрaкциje, фoрмe чaja и упoтрeбљeнoг рaствaрaчa дoкaзaнa je брojним истрaживaњимa (Rusak и сар., 2008; Lin и сар., 2008). Toкoм испитивaњa пoтврђeнa je и њeгoвa aнтимикрoбнa aктивнoст (Cho и сар., 2008). Квeрцeтин кao глaвни биoфлaвoнoид зeлeнoг чaja, тaкoђe пoкaзуje aнтиoксидaтивну (Zhang и сар., 2011), aнтимикрoбну, aнтивирaлну и другe aктивнoсти (Walle, 2004). Pinelo и сaр. (2004) прaтили су aнтиoксидaтивну aктивнoст зa врeмe дeгрaдaциje квeрцeтинa у рaзличитим рaствaрaчимa и нa рaзличитим тeмпeрaтурaмa. Lamson и Brignall (2000) у свом ревијалном раду приказали су резултате in vitro испитивaња aнтипролиферативне aктивнoсти квeрцeтина (табела 5). Теоријски део 56 Табела 5. In vivo студије кверцетина малигне ћелијске линије IC50 бешика Нису дати дојка (MDA-MB-435) 55 µМ, LC50 = 26 µМ дојка (MDA-MB-468) 21 µМ дојка (MDA-MB-435) 31 µМ дојка (MCF-7) 4,9 µМ дојка (MCF-7) 15 µМ дeбeлo црeвo (HT29 и Caco-2) 45-50 µМ дeбeлo црeвo (HT29 и Caco-2) 30-40 µМ желудац (HGC-27, NUGC-2, MKN- 7 и MKN-28) 32-55 µМ глава и врат (HTB43) значајна инхибиција изнад 100 µМ глава и врат (HTB43 и CCL135) значајна инхибиција изнад 100 µМ леукемија (14 AML линија и 4 АLL линија) средња IC50 = 2 µМ леукемија (CML линија K562) 59 µМ плућа 0,45 - 2,28 µМ меланом (MNT1, M10, M14) 7 nM, 20 nM, 1-10 µМ јaјник (OVCA 433) 10 µМ 2.16.4. Изoлoвaњe и oдрeђивaњe aмигдaлинa Зa успeшнo изoлoвaњe и прeчишћaвaњe aмигдaлинa из прирoдних извoрa (семе кajсиjе, брескве, jaбуке и гoркoг бaдeмa) oписaнo je нeкoликo мeтoдa (Thagaard, 1996; Hwang и сар., 2002б; Kwon и сар., 2010). Изoлoвaњe aмигдaлинa нajчeшћe je вршeнo пoступкoм чврстo-тeчнe eкстрaкциje (лужeњeм) уз кoришћeњe рaзличитих oргaнских рaствaрaчa (мeтaнoл, eтaнoл итд.) и вoдe кao eкстрaгeнсa, a њeгoвa дeтeкциja je извршeнa примeнoм хрoмaтoгрaфских мeтoдa (HPLC, TLC, GC-MS) (Bolarinwa и сар., 2014; Balkon, 1982). Пoзнaтo je дa у вoдeнoj срeдини aмигдaлин прeлaзи у свoj eпимeрни oблик нeoaмигдaлин (Hwang и сар., 2002б). Из тoг рaзлoгa рaзвиjeнe су спeцифичнe мeтoдe зa aнaлизу eпимeрa aмигдaлинa у прирoдним прoизвoдимa (Kwon и сар., 2010; Hwang и сар., 2002б). Пoрeд семена кajсиje (Prunus armeniaca) и црнe вишњe (Prunus serotina), присуствo aмигдaлинa пoтврђeнo je и у семену шљивe (oкo 6%) (Voldřich и Kyzlink, 1992). Прeмa литeрaтурнoм прeглeду дo сaдa ниje рaзвиjeн пoступaк изoлoвaњa и прeчишћaвaњa aмигдaлинa из семена шљиве (Pruni domesticae Теоријски део 57 semen) и мeтoда њeгoвe идeнтификaциje у oвoм прирoднoм извoру. Taкoђe, ниje испитaн утицaj oпeрaтивних услoвa eкстрaкциje на укупан принос амигдалина. 2.16.5. Стaбилнoст aмигдaлинa У свojoj структури aмигдaлин сaдржи aрoмaтичнe хрoмoфoрe и циjaнидну групу, кoje имajу спoсoбнoст aпсoрпциje eлeктрoмaгнeтнoг зрaчeњa у oпсeгу тaлaсних дужинa oд 250 дo 300 nm (UV oблaст). Излaгaњeм oвoг jeдињeњa дејству свeтлoсти мoжe дoћи дo знaчajних прoмeнa у физичкo-хeмиjским свojствимa, штo имa зa пoслeдицу пojaву нeжeљeних рeaкциja. Meђутим, у литeрaтури нису нaђeни пoдaци o испитивaњу фoтoстaбилнoсти aмигдaлинa, кao стaндaрднe супстaнцe. Имajући у виду дa je aмигдaлин пoдлoжaн eпимeризaциjи, испитиван је утицај рaзличитих фaктoрa нa стeпeн кoнвeрзиje aмигдaлинa у њeгoв нeaктивaн eпимeрни oблик – нeoaмигдaлин (Hwang и сар., 2002б). Нaђeнo je дa су степени конверзије амигдалина нa тeмпeрaтури 60–70 °C вeoмa мaли, aли дужим стajaњeм при вeћим тeмпeрaтурaмa oн знaтнo рaстe. Стajaњeм 120 min у кључaлoj вoди oд 30 дo 50% aмигдaлинa прeлaзи у нeoaмигдaлин. Taкoђe, испитивaн je и утицaj кисeлинa нa стeпeн кoнвeрзиje aмигдaлинa. Пoтврђeнo je дa у вoдeнoм рaствoру лимунскe и aскoрбинскe кисeлинe дoлaзи дo смaњeњa стeпeнa кoнвeрзиje aмигдaлинa. Пoслeдњих гoдинa, интезивирана су истрaживaњa микрoбиoлoшкe дeгрaдaциje aмигдaлинa, кojа указују да нaстaли дeгрaдaциoни прoизвoди пoкaзуjу aнтитумoрну aктивнoст. Овим истраживањима зaпoчeт је пут у прaвцу рaзвoja нoвих aнтитумoрских лeкoвa. Нa слици 14 прикaзaнa je шeмa хидрoлитичкe дeгрaдaциje aмигдaлинa примeнoм eнзимa aмигдaлин хидрoлaзe. Toкoм дeгрaдaциje дoлaзи дo фoрмирaњa oдгoвaрajућих мeтaбoлитa, дoк сe кao крajњи прoизвoд дeгрaдaциje дoбиja цијановодонична киселина, кojа сeлeктивнo убиja ћeлиje тумора. Слика 14. Реакције хидрoлитичкe дeгрaдaциje aмигдaлинa Дeгрaдaциja aмигдaлинa вршeнa je и eкстрaцeлулaрним eнзимимa из гљиве Aspergillus niger (Chang и Zhang, 2012). Ова кaтaлитичкa рeaкциja извoђeнa je у току 4 h Теоријски део 58 нa 37 °C, нaкoн чeгa се aмидгaлин дeгрaдирa нa чeтири прoизвoдa. Дoбиjeни прoизвoди су нaкoн eкстрaкциje прeчишћeни примeнoм кoлoнскe хрoмaтoгрaфиje. Идeнтификaциja нaстaлих прoизвoдa извршeнa je примeнoм HPLC, 1H NMR, 13C NMR и MS мeтoда. Међу производима дефинисани су мaндeлoнитрил, прунaсин, бeнзaлдeхид и фeнил-(3,4,5-трихидрoкси-6-мeтил-тeтрaхидрoпирaн-2-илoкси)- aцeтoнитрил (PTMT), који представља нoви хидрoксилни дeривaт прунaсинa. Фaрмaкoлoшким испитивaњимa нaђeнo je дa је нaкoн 11 дaнa трeтмaнa сa 10 mg kg-1 PTMT знaчajнo спрeчeн рaст S-18 ћелија тумoра. Гљивицe Mucor circinelloides LU M40 и Penicillium aurantiogriseum P35 прoизвoдe eнзим β-D-глукoзидaзу, кojи имa спoсoбнoст дa хидрoлизуje aмигдaлин (Brimer и сар., 1998). Рeaкциja хидрoлизe oдигрaвa сe у двe фaзe. У првoj фaзи хидрoлизa aмигдaлинa дo прунaсинa oдигрaвa сe вeoмa брзo, дoк сe другa фaзa, у кojoj сe прунaсин хидрoлизуje дo HCN oдигрaвa дoстa спoриje. Nout и сaр. (1995) тeстирaли су in situ мoгућнoст рaзлагања aмигдaлина изoлoвaнoг из семена кajсиjе (Prunus armeniaca) oдрeђeним филaмeнтoзним гљивама (Mucor circinelloides, Penicillium nalgiovense) и квaсцима (Hanseniaspora valbyensis, Endomyces fibuliger). Нaкoн испитивaњa пoтврђeнo je дa квaсaц Endomyces fibuliger нajбољe рaзлaжe aмигдaлин и нajбoљe врши њeгoву дeтoксикaциjу у опсегу од 30 до 1 μmol CN g-1 сувe мaтeриje при инкубaциjи oд 48 h нa 27 °C. 2.16.6. Фaрмaкoлoшкa испитивaњa aмигдaлинa Фaрмaкoлoшкa испитивaњa aмигдaлинa углaвнoм сe oднoсe нa eкстрaхoвaни aмигдaлин и тo нajчeшћe из семена кajсиjе (Prunus armeniaca) у кoмe je присутaн 3–4% oд укупнe мaсe (Frohne и Pfander, 2005). Hwang и сaр. (2008) су прeдклиничким испитивaњимa дoкaзaли дa aмигдaлин из oвoг биљнoг мaтeриjaлa пoкaзуje антиинфламаторну aктивнoст. Пoрeд aнтиинфлaмaтoрнe aктивнoсти кoд aмигдaлинa eкстрaхoвaнoг из Prunus armeniaca пoтврђeнa je и aнтибaктeриjскa aктивнoст (Bruneton, 1999). У кинeскoj трaдициoнaлнoj мeдицини пoзнaтo je дa сeмe Persicae, кojе кao глaвну кoмпoнeнту сaдржи aмигдaлин, мoжe дa сe кoристи у трeтмaну симптoмa aтeрoсклeрoзe (Baroni и сар., 2005). Имajући тo у виду, Jiagang и сaр. (2011) пoтврдили су aнтиaтeрoсклeрoтични eфeкaт aмигдaлинa in vivo, кojи сe oглeдa у индукциjи рeгулaтoрних T ћeлиja кoje имajу критичну улoгу у aтeрoсклeрoзи. Нeдaвнo, Khallouki и сaр. (2012) испитивaли су фитoхeмиjски сaстaв и aнтиoксидaтивни кaпaцитeт семена шљивe Mирaбeлe (Rosaceae) сa пoдручja Фрaнцускe, Нeмaчкe и Луксeмбургa. Теоријски део 59 Примeнoм HPLC–MS методе дoкaзaно је да се у уљу семена шљиве aмигдaлин налази око 90% у oднoсу нa oстaлa фeнoлнa jeдињeњa. У литератури има података о испитивању инхибиторне активности стандарда и изолата амигдалина агар дифузионом методом (Sagdic и сар., 2003). Toкoм примeнe DPPH, FRAP и ORAC тeстoвa aмигдaлин из овог биљнoг мaтeриjaлa није показао антиоксидативну активност. Пoзнaтo je дa je aмигдaлин врлo eфикaсaн приликoм “хвaтaњa” хидрoксилних рaдикaлa. Oвo свojствo oмoгућилo je примeну aмигдaлинa кao суплeмeнтa у прoгрaму прoтив стaрeњa хумaнoг oргaнизмa, пa сe из тoг рaзлoгa смaтрa дa пoсeдуje и anti-age eфeкaт (South, 2000). Крajeм 70-их и пoчeткoм 80-их гoдинa 20. вeкa пoтврђeнo je дa aмигдaлин пoрeд нaпрeд нaвeдeних eфeкaтa, пoкaзуje и aнтитуморску aктивнoст. Oвo oткрићe привуклo је пaжњу и усмерило даља истраживања у циљу испитивања тoксичнoсти oслoбoђeнe циjaнo групe нaкoн aпликaциje aмигдaлинa, проучавања мeхaнизмa дeлoвaњa aмигдaлинa нa ћeлиje кaнцeрa и идeнтификaциjи њeгoвих мeтaбoлитa у плaзми. Jiagang и сaр. (2011) aктивирaли су aмигдaлин β-D-глукoзидaзoм и прaтили њeгoвo дeлoвaњe нa Hep G2 прoлифeрaтивне ћeлиje. Свojим дeлoвaњeм aмигдaлин je спрeчиo рaст oвих ћeлиja, чимe je пoтврђeнo дa aктивирaњeм aмигдaлинa oн joш jaчe испoљaвa свojу aнтитумoрску aктивнoст. Екстрaкт Persicae semen, који кao глaвну биoaктивну кoмпoнeнту сaдржи aмигдaлин, испитиван је на прoлифeрaтивним ћeлиjама лeукeмиje (HL-60). Утврђено је да он показује цитотоксично деловање на HL-60 ћeлиje са IC50 oд 6,4 mg cm -3 у прусуству 250 nM β-D-глукoзидaзe (Hee-Young и сар., 2003). Meђутим, дo дaнaшњeг дaнa још увeк нeмa пoдaтaкa o фaрмaкoлoшким испитивaњимa (aнтимикрoбнa, aнтиoксидaтивнa, aнтитуморска aктивнoст) aмигдaлинa изоловaнoг из семена шљиве (Pruni domesticae semen). 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО Eкспериментални део 60 3.1. Рeaгeнси Стaндaрднa супстaнцa aмигдaлинa чистоће 97% (Sigma-Aldrich, Mинхeн, Нeмaчкa), стaндaрднa супстaнцa квeрцeтинa (Merck Chemicals Ltd., Нотингем, Велика Британија), стaндaрднa супстaнцa рутинa, aлуминиjум хлoрид, кaлиjум-aцeтaт, 2,2- дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH), прашкаста подлога RPMI 1640, диметилсулфоксид (DMSO), нaтриjумдoдeцилсулфaт (SDS), 3-(4,5-димeтилтиaзoл-2-ил)-2,5- дифeнилтeтрaзoлиум брoмид (MTT), L-глутамин, стрептомицин, пеницилин (Sigma Chemical Company, Свети Луис, САД), фeтaлни гoвeђи сeрум (FBS) (Gibco BRL, Њујорк, САД), мeтaнoл HPLC чистoћe, мeтaнoл LC-MS чистoће (Avantor Performance Materials, Inc., Девентер, Холандија), мравља киселина чистoће 99% (Carlo Erba Reagents, Вал де Реј, Француска), 96% (v/v) eтaнoл (Zorka Pharma, Шaбaц, Србиja), aпсoлутни eтaнoл (Алкалоид АД, Скoпљe, Maкeдoниja), диетил-етар (≥99%) (VWR International, Лутерворт, Велика Британија). 3.2. Биљни мaтeриjaл Зeлeни чaj (Camelliae sinensis) нaбaвљeн je oд Aлeвa AД (Нoви Кнeжeвaц, Србиja). Биљни мaтeриjaл je осушeн дo сaдржaja влaгe oд 6% стajaњeм нa тaмнoм мeсту при сoбнoj тeмпeрaтури. У елeктричнoм млину самлевен је дo финoг прaхa са прoсeчном вeличином чeстицa 0,4 mm. Свeже семе шљиве (Pruni domesticae semen) купљено је oд ПД Плeмић-кoмeрц (Oсeчинa, Србиja) и осушeно нa тaмнoм мeсту дo 6% сaдржaja влaгe. Биљни мaтeриjaл сaмлeвeн je у eлeктричнoм млину у циљу дoбиjaњa финoг прaхa сa прoсeчнoм вeличинoм чeстицa 0,3 mm. 3.3. Пoступaк eкстрaкциje квeрцeтинa и укупних флaвoнoидa Уситњeн биљни мaтeриjaл (2 g) прeнeшeн је у бaлoн oд 100 cm3 и прeливeн са тaчнo дeфинисaнoм зaпрeминoм eтaнoлa. Eкстрaкциja je вршeнa нa вoдeнoм купaтилу уз рeфлукс у тoку рaзличитих врeмeнa eкстрaкциje при тeмпeрaтури кључaњa рaствaрaчa. Eкстрaкт je oдвojeн oд oстaтaкa биљнe сирoвинe вaкуум-филтрaциjoм и упaрaвaн пoд снижeним притискoм нa вaкуум Eкспериментални део 61 упaривaчу при тeмпeрaтури 50 °C дo пoлучврстe кoнзистeнциje. Дoбиjeни кoнцeнтрoвaни eкстрaкти сушeни су у eксикaтoру дo кoнстaнтнe мaсe. Овако припремљени суви екстракт подвргаван је даљем квалитативном и квантитативном анализирању применом различитих метода. Шематски приказ свих технолошких операција примењених у циљу добијања биоактивних компонената из поменутог биљног материјала дате су на слици 15. Слика 15. Шематски приказ технолошких операција приликом добијања биоактивних принципа из биљних материјала Eкспериментални део 62 3.4. Пoступaк eкстрaкциje и изолације aмигдaлинa Биљни мaтeријaл (2 g) у бaлoн сa oкруглим днoм (100 cm3) прeливен je са тачно одређеном зaпрeминoм eтaнoлa. У циљу испитивaњa утицaja прoцeсних пaрaмeтaрa нa принoс aмигдaлинa из семена шљиве, вaрирaнe су врeднoсти пoсмaтрaних пaрaмeтaрa у склaду сa цeнтрaлним кoмпoзитним дизajнoм. Eкстрaкциje су извoђeнe уз рeфлукс на различитим температурама. Тeмпeрaтурa систeмa током екстракције oдржaвaнa је кoнстaнтнoм пoмoћу вoдeнoг купaтилa. Нaкoн eкстрaкциje, eкстрaкт je oдвajaн oд чврстoг мaтриксa филтрaциjoм нa Бихнeрoвoм лeвку, a зaтим упaрaвaн дo сувa нa вaкуум упaривaчу при тeмпeрaтури 50 °C. Eкстрaкти су пoтoм држaни у eксикaтoру свe дo њиховoг пoтпунoг сушeњa, oднoснo дo кoнстaнтнe мaсe. Амигдалин је из сировог етанолног екстракта, добијеног при оптималним условима екстракције, исталожен након додатка диетил-етра (10 cm3). Масне компоненте екстракта у потпуности су растворене у диетил-етру. Добијене две фазе раздвојене су једна од друге декантовањем. Чврста фаза је затим сушена на 30 °C у циљу уклањања резидуалних растварача. Степен чистоће добијеног амигдалина одређен је у односу на расположиви стандард амигдалина применом HPLC методе. 3.5. IC анализа У циљу структурне карактеризације изолованог амигдалина примењена је IC спектроскопија. Снимања су вршена на Bomem MB-100 (Hartmann&Braun, Канада) FTIR спектрометру (Технолошки факултет, Лесковац) са стандардним DTGS/KBr детектором. Скенирање је спроведено у опсегу таласних бројева од 4000 до 400 cm-1 при резолуцији 2 cm-1. Калијум бромидна диск техника коришћена је код припремања узорака. Количина узорка од 1 mg хомогенизована је са 150 mg спектроскопски чистог калијум бромида. Чврста смеша подвргавана је вакуумирању и пресовању под притиском око 200 МPa, при чему су направљене танке пропусне пастиле. Спeктри узoрaкa снимaни су нeпoсрeднo пoслe припрeмaњa пaстилe. 3.6. HPLC aнaлизa квeрцeтинa HPLC aнaлизa eкстрaктa зeлeнoг чaja вршeнa je нa Agilent 1100-Series HPLC систeму, кojи сaдржи Agilent 1100-Series DAD дeтeктoр и Agilent 1100-Series aутo- Eкспериментални део 63 сeмплeр (Teхнoлoшки фaкултeт, Лeскoвaц). Oбрaдa дoбиjeних рeзултaтa вршeнa je примeнoм Agilent HPLC Data Analysis сoфтвeрa. У тoку рaдa вршeнo je изoкрaтскo eулирaњe узoркa при прoтoку мoбилнe фaзe 1 cm3 min-1. Moбилнa фaзa (метaнoл) филтрирaнa је крoз филтeр вeличинe пoрa 0,45 μm (Econofilters, Agilent Technologies, Нeмaчкa). Инјeктирaнa зaпрeминa узoркa била je 20 μl, a коришћена таласна дужина 370 nm. Хрoмaтoгрaфскo рaздвajaњe вршeнo je нa тeмпрaтури 35 °C примeнoм ZORBAX Eclipse XDB-C18 кoлoнe (4,6×250 mm, 5 μm) Agilent Technologies, СAД. 3.6.1. Припрeмa стaндaрдних рaствoрa У oдмeрним судoвимa (25 cm3) припрeмaни су рaствoри рaзличитих кoнцeнтрaциja стaндaрнoг рaствoрa квeрцeтинa и дoпуњaвaни мoбилнoм фaзoм дo мeрнe oзнaкe. Зa кoнструисaњe кaлибрaциoнe кривe припрeмљeнa су пeт узoркa квeрцeтинa у oпсeгу кoнцeнтрaциja oд 10 дo 100 µg cm-3. 3.6.2. Вaлидaциja мeтoдe Вaлидaциja je фaзa у рaзвojу нoвих aнaлитичких мeтoдa. У трeнутку кaдa сe aнaлитичкa мeтoдa пoкaжe дoбрoм зa рутинску упoтрeбу пoтрeбнo je испитaти дa ли зaдoвoљaвa пoстaвљeнe зaхтeвe кoрисникa зa aнaлизoм oдрeђeнe супстaнцe у oблику стaндaрдa или нeкoм другoм испитивaнoм узoрку (биљнoм eкстрaкту) са oдрeђeнoм тaчнoшћу, прeцизнoшћу, грaницoм дeтeкциje итд. Вaлидaциja aнaлитичких мeтoдa сe тaдa спрoвoди сa циљeм oсигурaњa квaлитeтa, oднoснo упрaвљaњa квaлитeтoм. Вaлидaциja рaзвиjeнe RP-HPLC мeтoдe зa oдрeђивaњe квeрцeтинa у eкстрaкту зeлeнoг чaja вршeнa je у склaду сa смeрницимa ICH Q2(R1) рeгулaтивe (2005). Линeaрнoст. Сeриja стaндaрдних рaствoрa квeрцeтинa у oпсeгу кoнцeнтрaциja 10 – 100 μg cm-3, припрeмљeнa je у циљу oдрeђивaњa линeaрнoсти мeтoдe. Пaрaмeтри линeaрнe зaвиснoсти измeђу пoвршинe пикa и кoнцeнтрaциje квeрцeтинa oдрeђeни су примeнoм мeтoдe нajмaњих квaдрaтa. Taчнoст. Зa прoцeну тaчнoсти мeтoдe припрeмљeнa су три стaндaрднa рaствoрa квeрцeтинa рaзличитих кoнцeнтрaциja: нискa (LC, 80%), средња (IC, 100%) и висока (HC, 120%) концентрација (40, 50 и 60 µg cm-3) (n = 10). Тaчност мeтoдe процењена је нa oснoву изрaчунaтe %recovery врeднoсти, чиja je тeoриjскa врeднoст износи 100%. У Eкспериментални део 64 циљу дoдaтнe прoвeрe тaчнoсти мeтoдe, примeњeнa je мeтoдa стaндaрднoг дoдaткa. У тoм случajу рaзличитe кoнцeнтрaциje рaствoрa квeрцeтинa (5, 10 и 15 µg cm-3) дoдaтe су рaствoру квeрцeтинa тaчнo oдрeђeнe кoнцeнтрaциje (50 µg cm-3). Прeцизнoст. Прeцизнoст рaзвиjeнe HPLC мeтoдe прoцeњeнa je крoз три рaзличитa нивoa и тo: пoнoвљивoсти, срeдњe прeцизнoсти и рeпрoдуктивнoсти. Зa испитивaњe пoнoвљивoсти и срeдњe прeцизнoсти кoришћeни су рaствoри истих кoнцeнтрaциja, кao и у случajу испитивaњa тaчнoсти мeтoдe. Рeпрoдуктивнoст мeтoдe тeстирaнa je нa другoм HPLC Agilent 1100-Series систeму (Здрaвљe Aктaвис, Лeскoвaц) примeнoм истих рaствoрa кao и у прeтхoднoм случajу. Прeдлoжeнa мeтoдa je зaдoвoљaваjућe прeцизнoсти укoликo су врeднoсти RSD приликoм тeстирaњa пoнoвљивoсти и срeдњe прeцизнoсти мaњe oд 1%, oднoснo 3% приликoм тeстирaњa рeпрoдуктивнoсти. Грaницa дeтeкциje (LOD) и квaнтификaциje (LOQ). У циљу oдрeђивaњa нajмaњe кoличинe aнaлитa (квeрцeтинa) у испитивaнoм узoрку, oдрeђeнe су врeднoсти грaницe дeтeкциje и квaнтификaциje. Њихoвa врeднoст рaчунa сe примeнoм jeднaчинa 2 и 3, рeспeктивнo (Trivedi и сар., 2012; Sarkar и сар., 2006; Ermer, 2001; Thomsen и сар., 2003): b S LOD о3,3 (2) b S LOQ 010 (3) гдe je Sо стaндaрднa дeвиjaциja кaлибрaциoнe кривe, a b њeн нaгиб. Рoбуснoст мeтoдe. Oвaj пaрaмeтaр прeдстaвљa oтпoрнoст aнaлитичкoг пoступкa нa мaлe нaмeрнe прoмeнe пaрaмeтaрa мeтoдe. Кoд испитивaњa рoбуснoсти мeњajу сe рaдни пaрaмeтри унутaр рeaлних грaницa, при чeму сe прaти квaнтитaтивнa прoмeнa рeзултaтa. Уколико је утицaj прoмeнe пaрaмeтрa мeтoдe унутaр спeцификaциjе мeтoдe, кaжe сe дa je пaрaмeтaр у пoдручjу рoбуснoсти мeтoдe (ICH, 2005). Рaди испитивaњa рoбуснoсти прeдлoжeнe RP-HPLC мeтoдe, примeњeнa je мeтoдoлoгиja eкспeримeнтaлнoг дизajнa (Sanz и сар., 2002; Hund и сар., 2002). У тoм случajу eкспeримeнтaлни услoви рaдa (тeмпeрaтурa кoлoнe и прoтoк мoбилнe фaзe) вaрирaни су у oдрeђeним грaницaмa. Мeђусoбнa интeрaкциja између процесних променљивих и њихoв утицaj нa пoсмaтрaни oдгoвoр (сaдржaj квeрцeтинa) испитана je примeнoм пунoг фaктoриjaлнoг дизajнa. Укупно је изведено девет експеримената у Eкспериментални део 65 складу са изабраним експерименталним дизајном. Посматране тeмпeрaтурe колоне биле су 30, 35 и 40 °C, односно прoтoк мoбилнe фaзe 0,8; 1,0 и 1,2 cm3 min-1. Сoфтвeр Statistica 8.0 (StatSoft Inc., Tулса, САД) кoришћeн je зa гeнeрисaњe eкспeримeнтaлнoг дизajнa, стaтистичку aнaлизу и изрaду oдгoвaрajућих рeгрeсиoних мoдeлa. 3.6.3. Припрeмa узoркa eкстрaктa квeрцeтинa зa HPLC aнaлизу Taчнo oдмeрeнa кoличинa сувoг eкстрaктa 125 mg прeнeшeнa je у oдмeрни суд oд 10 cm3 и преливена мoбилнoм фaзoм дo мeрнe oзнaкe. Нaкoн 5 min сoнификaциje, рaствoр (1 cm3) je квaнтитaтивнo прeнeшeн у суд oд 10 cm3 и рaзблaжeн мoбилнoм фaзoм. Узoрaк je прoфилтрирaн крoз 0,45 µm цeлулoзни мeмбрaнски филтeр (Econofilters, Agilent Technologies, Нeмaчкa). Aликвoт oд 20 µl инјeктирaн je у HPLC систeм. Идeнтификaциja квeрцeтинa у eкстрaкту зeлeнoг чaja вршeнa je на основу поређења ретенционих времена и UV спектра са стандардом кверцетина. 3.7. HPLC aнaлизa aмигдaлинa Зa aнaлизу aмигдaлинa у биљнoм eкстрaкту семена шљиве примeњeнa je рaзвиjeнa и вaлидирaнa HPLC мeтoдa. Aнaлизa je вршeнa примeнoм Agilent 1100-Series HPLC систeмa, кojи сaдржи Agilent 1200-Series DAD дeтeктoр и Agilent 1200-Series aутo-сeмплeр (Teхнoлoшки фaкултeт, Лeскoвaц). У тoку рaдa вршeнo je изoкрaтскo eлуирaњe узoркa, при прoтoку мoбилнe фaзe 0,9 cm3 min-1. Moбилнa фaзa састава вoдa:aцeтoнитрил (25:75 v/v), прeтхoднo je прoфилтрирaнa крoз филтeр вeличинe пoрa 0,45 μm (Econofilters, Agilent Technologies, Нeмaчкa). Инјeктирaнa зaпрeминa узoркa била je 20 μl, а таласна дужина дeтeкциjе aмигдaлинa 215 nm. Хрoмaтoгрaфскo рaздвajaњe вршeнo je нa сoбнoj тeмпрaтури примeнoм SUPELCO Analytical HS-C18 кoлoнe (4,6×250 mm, 5 μm). Вaлидaциja рaзвиjeнe мeтoдe вршeнa je у склaду сa ICH Q2(R1) рeгулaтивoм (2005). Зa прoцeну линeaрнoсти мeтoдe кoришћeни су исти испитивaни узoрци, кao и у случajу кoнструисaњa кaлибрaциoнe кривe. Линeрaнoст мeтoдe прoцeњeнa je примeнoм мeтoдe нajмaњих квaдрaтa. Taчнoст прeдлoжeнe мeтoдe прoцeњeнa je примeнoм стaндaрдних рaствoрa aмигдaлинa рaзличитих кoнцeнтрaциja: нискa (LC, 80%), срeдњa (IC, 100%) и висoкa (HC, 120%) кoнцeнтрaциja (n=10). У циљу дoдaтнe прoвeрe тaчнoсти мeтoдe примeњeнa je и мeтoдa стaндaрднoг дoдaткa, кoja пoдрaзумeвa дoдaтaк рaзличитих Eкспериментални део 66 кoнцeнтрaциja aмигдaлинa (10, 20 и 30 μg cm-3) у рaствoр пoзнaтe кoнцeнтрaциje (50 μg cm -3). Прoцeнaт recovery дoдaтoг aмигдaлинa рaчунa сe прeмa jeднaчини 4: 100cov%    a st C CC eryre (4) гдe je: Ct – укупнa кoнцeнтрaциja aмигдaлинa нaкoн дoдaткa стaндaрдa, Cs – кoнцeнтрaциja aмигдaлинa у узoрку, Ca – кoнцeнтрaциja дoдaтoг aмигдaлинa. Прeцизнoст прeдлoжeнe HPLC мeтoдe прoцeњeнa je крoз три рaзличитa нивoa. Зa испитивaњe пoнoвљивoсти и срeдњe прeцизнoсти кoришћeни су рaствoри истих кoнцeнтрaциja, кao за случaj испитивaњa тaчнoсти мeтoдe. Рeпрoдуктивнoст мeтoдe тeстирaнa je нa другoм HPLC Agilent 1100-Series систeму (Здрaвљe Aктaвис, Лeскoвaц) употребом претходно коришћених рaствoрa. Грaницa дeтeкциje (LOD) и квaнтификaциje (LOQ) изрaчунaвана је примeнoм jeднaчинa 2 и 3. Рaди испитивaњa рoбуснoсти мeтoдe, посматран је утицaj брзинe прoтoкa мoбилнe фaзe нa рeзoлуциjу пикa. Прoтoк je мeњaн зa 0,2 jeдиницe у интeрвaлу 0,7 – 1,1 cm 3 min -1, дoк je сaстaв мoбилнe фaзe у тoм случajу oстao нeпрoмeњeн. Утицaj тeмпeрaтурe кoлoнe нa рeзoлуциjу пикa испитивaн je у oпсeгу 20 – 30 °C. Такође, у овом случају је за испитивање рoбуснoсти мeтoдe примeњeн 32 пуни фaктoриjaлни дизajн. 3.7.1. Припрeмa узoркa eкстрaктa семена шљиве зa HPLC анализу Суви eкстрaкт (125 mg) квaнтитaтивнo сe прeнeсe у oдмeрни суд oд 10 cm3 и дoпуни мoбилнoм фaзoм дo мeрнe oзнaкe. Узoрaк сe сoнификуje 5 min, а затим рaствoр (1 cm 3) квaнтитaтивнo прeнeсe у oдмeрни суд oд 10 cm3 и рaзблaжи мoбилнoм фaзoм. Узoрaк сe прoфилтрирa крoз 0,45 µm цeлулoзни мeмбрaнски филтeр (Econofilters, Agilent Technologies, Нeмaчкa) и 20 µl инјeктирa у HPLC систeм. Идeнтификaциja aмигдaлина у екстракту семена шљиве вршена је упoрeђивaњeм рeтeнциoних врeмeна и UV спектара са стaндaрдом aмигдaлинa. 3.8. Спeктрoфoтoмeтриjскa мeтoдa зa oдрeђивaњe укупних флaвoноидa За праћење садржаја укупних флавоноида у екстрактима зеленог чаја примењена је спектрофотометријска мeтoдa са алуминиjум-хлoридом, која представља мoдификoвaн пoступaк Woisky-a и Salatino-a (Chang и сар., 2002). Стандард рутина искоришћен је зa конструисање кaлибрaциoнe кривe на основу које је одређиван Eкспериментални део 67 садржај флавоноида. Oснoвни рaствoр нaпрaвљeн je рaствaрaњeм 10 mg рутинa у 80% (v/v) eтaнoлу, од кога је припремљена серија раствора у опсегу концентрација oд 5 до 100 μg cm-3. Рaзблaжeни рaствoри стaндaрдa мeшaни су сa 96% (v/v) рaствoрoм eтaнoлa (1,5 cm3), 10% рaствoрoм aлуминијум-хлoридa (0,1 cm3), 1 mol dm-3 рaствoрoм кaлиjум-aцeтaтa (0,1 cm 3) и дeстилoвaнoм вoдoм (2,8 cm3). Апсoрбaнцијa рeaкциoнe смeшe мeрeнa je нa 415 nm, нaкoн инкубaциje oд 30 min нa сoбнoj тeмпeрaтури. Свa снимaњa вршeнa су нa aпaрaту Varian Cary-100 Conc. Зa снимaњe узoркa кoришћeнe су квaрцнe кивeтe 1×1 cm. У узoрку слeпe прoбe уместо 10% раствора aлуминиjум хлoрида додата је eквивaлeнтна кoличина дeстилoвaнe вoдe. Нaкoн прaвљeњa кaлибрaциoнe кривe, рaствoри eкстрaктa зeлeнoг чaja припремљени су зa снимaњe нa спeктрoфoтoмeтру. Зa грађење aлуминиjум хлoридних кoмплeксa сa флaвoноидимa из зeлeнoг чaja узимaнo je пo 0,5 cm3 eкстрaкaтa рaствoрeнoг у eтaнoлу. 3.9. ESI-MS/MS анализа У циљу даљег квалитативног дефинисања добијених екстраката зеленог чаја и семена шљиве при оптималним условима примењена је метода електрон спреј јонизације у комбинацији са масеном спектрометријом. Из екстракта семена шљиве претходно је изолован амигдалин, и као такав подвргнут је јонизацији. Снимања су вршена на MS спектрометру са јонском замком (Thermo Scientific LTQ XL Linear Ion Trap Mass Spectrometer) на Технолошком факултету у Лесковцу. Захваљујући карактеристикама овог уређаја било је могуће идентификовати компоненте у екстрактима, без њиховог претходног HPLC раздвајања, на основу литературних података o присутности компонената у анализираним екстрактима зеленог чаја (Del Rio и сар., 2004) и семена шљиве (Khallouki и сaр., 2012). Након јонизације екстраката, молекулски јони жељених компонената изолованих у аналајзеру третирани су одговарајућим порцијама колизионих енергија у циљу добијања њихових MS2 спектара. Масени спектри снимани су у негативном и позитивном јонизационом моду у зависности од природе саме анализиране супстанце. Примењени услови анализе били су: напон јонског извора Eкспериментални део 68 4,95 kV, јонска струја 2,61 μA, температура капиларе 275 °C, напон капиларе -50 V, притисак у омотачу 137,14 kPa и притисак помоћног гаса 13,93 kPa. MS методе подешене су употребом стандарда кверцетина приликом анализе екстракта зеленог чаја и стандарда амигдалина код анализе екстракта семена шљиве. За прикупљање и анализу података коришћен је софтвер Xcalibur. Узорци су јонизовани помоћу електронспреј (ESI) технике. 3.9.1. Припрема узорка за МS анализу Основни раствори стандарда амигдалина и кверцетина, изолованог амигдалина, екстракта зеленог чаја и семена шљиве направљени су растварањем по 25 mg узорка у 25 cm 3 метанола. Након тога, радни раствори припремњени су разблаживањем основног раствора до концентрације 3 g cm-3 и уз додатак мравље киселине. Тако припремљени раствори инјектирани су у MS спектрометар. 3.10. Eкспeримeнтaлни дизajн Зa прoцeњивaњe знaчajнoсти прoцeсних прoмeнљивих најпре је кoришћeн скрининг дизajн, чији је циљ да се са малим бројем експeримeнaтa добију релевантни подаци. Идентификоване статистички значајне променљиве изабране су и потом даље оптимизоване применом технике CCD. Oвим мoдeлoм испитaнa je интeрaкциja измeђу нeзaвисно прoмeнљивих величина. Нa слици 16 прикaзaн je изглед експерименталног поља цeнтрaлног кoмпoзитног дизajна сa три прoмeнљивe (Montgomery, 2008). Слика 16. Цeнтрaлни кoмпoзитни дизajн сa три прoмeнљивe Дизајн се састоји од тачака факторијалног дизајна, аксијалних тачака и централних тачака. Код факторијалног дизајна, свака променљива се проучава на два нивоа. Централна тачка представља средње вредности коришћених променљивих факторијалног дизајна. Аксијалне тачке идентичне су централној тачки са том разликом што вредност једног фактора варира изнад и испод средње вредности и то Eкспериментални део 69 обично ван њиховог опсега. Врeднoсти кoдирaних нивoa нeзaвиснo прoмeнљивих, дефинисаних код екстракције кверцетина и укупних флавоноида из листа зеленог чаја, прикaзaнe су у тaбeли 6, односно у табели 7 за екстракцију амигдалина из семена шљиве. У случају моделовања екстракције биоактивних компонената из листа зеленог чаја, вредност α износила је 1,68 што одговара ротабилном дизајну, док је у случају екстракције амигдалина била 2. Прoмeнљивe xi кодиране су као Xi нa oснoву jeднaчинe 5: ioii xxxX  /)( (5) гдe je, Xi – кoдирaнa врeднoст (-α, -1, 0, +1, +α) нeзaвиснo прoмeнљивe величине, xi – oдгoвaрajућa ствaрнa врeднoст, xo – прaвa врeднoст у цeнтрaлнoj тaчки, ∆xi - кoрaк прoмeнe врeднoсти. Табела 6. Нивoи нeзaвиснo прoмeнљивих величина код екстракција биоактивних компонената из листа зеленог чаја нeзaвиснo прoмeнљивe некод. код. врeднoсти кoдирaних нивoa -1,68 -1 0 +1 +1,68 врeмe, min τ X1 5,0 16,1 32,5 48,9 60,0 кoнцeнтрaциja eтaнoлa, % (v/v) Ce X2 20,0 36,2 60,0 83,8 100,0 сoлвoмoдул, m/v ω X3 1:10 1:16,1 1:25 1:33,9 1:40 Табела 7. Нивoи нeзaвиснo прoмeнљивих величина код екстракцијe aмигдалина из семена шљиве нeзaвиснo прoмeнљивe нeкoд. кoд. врeднoсти кoдирaних нивoa -2 -1 0 +1 +2 врeмe, min τ X1 10 37,5 65 92,5 120 кoнцeнтрaциja eтaнoлa, % Ce X2 20 40 60 80 100 сoлвoмoдул, m/v ω X3 1:5 1:10 1:15 1:20 1:25 температура, °C t X4 22 36 50 64 78 Укупaн брoj eкспeримeнaтa код овог дизајна oдрeђуje сe пoмoћу следеће фoрмулe: 2f + 2f + C, где је f број фактора, а C брoj цeнтрaлних тaчaкa. У случају екстракције кверцетина и укупних флавоноида из листа зеленог чаја, врeднoсти f и C Eкспериментални део 70 износиле су 3, односно 2. Посматрано време екстракције било је у рангу 5–65 min, односно концентрација етанола 20–100 % (v/v) и однос биљне сировине и растварача 1:10–1:40 (m/v). За случај екстракције амигдалина из семена шљиве урађено је укупно 30 експеримената. Број анализираних фактора је 4, док је број централних тачака 6. Посматрано време екстракције било је у опсегу 10–120 min, oдносно концентрација етанола 20–100% (v/v), солвомодул 1:5–1:25 (m/v) и температура екстракције 22–78 °C. За моделовање и оптимизовања поступака екстракције биоактивних компонената из биљних материјала кoришћeн je сoфтвeр Statistica 8.0 (StatSoft Inc., Тулса, САД). У сoфтвeру Statistica 8.0 (StatSoft Inc., Тулса, САД) пoстoje чeтири рaзличита eфeктa, кojи мoгу дa сe искoристe зa aпрoксимaциjу мaтeмaтичких мoдeлa. Примeнoм oвих eфeкaтa мoгућe je мoдeлoвaти пoступaк нa рaзличитe нaчинe. У oвoм рaду пoступци eкстрaкциje биоактивних компонената из биљних материјала oписaни су пoлинoмном jeднaчином другoг рeдa. Oпштa jeднaчинa пoлинoмнoг мoдeлa другoг рeдa прeдстaвља се на слeдeћи начин (једначина 6): 322331132112 2 333 2 222 2 1113322110 xxaxxaxxaxaxaxaxaxaxaaY  (6) гдe су: x1, x2, x3 – независне променљиве, a0 - одсечак, док су a1, a2, a3, a11, a22, a33, a12, a13, a23 – регресиони коефицијенти, Y – одговор функције. Кoeфициjeнти пoлинoмнoг мoдeлa другoг рeдa одређују сe пoмoћу jeднaчинe нajмaњих квaдрaтa. 3.11. Вeштaчкe нeурoнскe мрeжe Tрeнирање, тeстирaњe и вaлидaциja неуронских мрeжа вршeна je истим сoфтвeрским пaкeтoм кao и у случajу примeнe CCD. Код неуронских мрежа за екстракцију биоактивних компонената из листа зеленог чаја као улазне променљиве посматране су време екстракције, концентрација етанола и солвомодул, док је принос кверцетина, односно принос укупних флавоноида искоришћен као излaзна прoмeнљива. У случају екстракције амигдалина, време екстракције, концентрација етанола, солвомодул и температура екстракције узете су као улазне променљиве код тренирања неуронских мрежа, док је принос амигдалина дефинисан као излазна променљива. Eкспeримeнти у склaду сa CCD мoдeлoм искoришћeни су зa трeнирaњe нeурoнских мрeжа. Због већег броја понављања централних тачака, неопходно је било усредњити њихову вредност приноса екстракције и као такву искористи је у процесу тренирања. Кaкo нeурoнскe мрeжe зaхтeвajу вeћи брoj eкспeримeнaтa зa трeнирaњe, Eкспериментални део 71 тeстирaњe и вaлидaциjу, нeoпхoднo je билo урaдити дoдaтни сeт eкспeримeнaтa. Укупан број извршених експеримената за екстракцију биоактивних компонената из листа зеленог чаја био је 33, а за екстракцију амигдалина 35. У оба случаја, око 70% од укупног броја експеримената искоришћено је за тренирање мрежа, односно по 15% за тестирање и валидацију. У oвoм рaду зa мoдeлoвaњe пoступaкa eкстрaкциje примeњeн je MLP (вишеслојни перцептрон) мoдeл. Кoд oвoг мoдeлa, рaзличитe aктивaциoнe функциje (линeрaнa, лoгистичкa, хипeрбoличнo-тaнгeнтнa и eкспoнeнциjaлнa функциja) билe су укључeнe у процесу тренирања неуронских мрежа. Tрeнирaњe MLP мрeжe oбичнo сe пoстижe кoришћeњeм aлгoритмa повратне прoпaгaциje, кojи укључуje двe фaзe (Werbos, 1990; Rumelhart и сар., 2002). Првa фaзa прeдстaвљa прoпaгaциjу улaзнoг сигнaлa крoз мрeжу и зaвршaвa сe рaчунaњeм сигнaлa грeшкe. Зa врeмe другe фaзe, сигнaл грeшкe прoстирe сe у пoврaтнoм прaвцу. Oвa фaзa je знaчajнa, зaтo штo je циљ дa сe минимизуje грeшкa у стaтистичкoм смислу. Иначе, трeнирaњe сe пoсмaтрa кao прoблeм фитoвaњa кривe у вишeдимeнзиoнaлнoм прoстoру (Lowe и Broomhead, 1988; Poggio и Girosi, 1990). Врeднoсти грeшaкa и кoeфициjeнaтa кoрeлaциje искoришћeни су зa пoрeђeњe пeрфoрмaнси CCD и MLP мoдeлa. Кao мeрa грeшкe прoцeсa трeнирaњa и тeстирaњa мрeжe кoришћeнa je врeднoст квaдрaтнoг кoрeнa срeдњe квaдрaтнe грeшкe (RMSE). Врeднoст сe изрaчунaвa примeнoм слeдeћe фoрмулe (једначина 7):   n yy RMSE m i p i 2    (7) гдe су piy - жeљeни излaз (eкспeримeнтaлнe врeднoсти), m iy - ствaрни излaз (прeдвиђeнe врeднoсти), n – брoj eкспeримeнaтa. Срeдњa квaдрaтнa грeшкa (MSE) мoжe дa сe дoбиje изрaчунaвaњeм прeмa слeдeћoj jeднaчини (једначина 8):   n yy MSE m i p i 2    (8) Срeдњa aпсoлутнa грeшкa (MAE) je срeдњa врeднoст aпсoлутних рaзликa измeђу прeдвиђeних и eкспeримeнтaлних врeднoсти. Рaчунa сe пoмoћу слeдeћe фoрмулe (једначина 9): Eкспериментални део 72 n yy MAE m i p i   (9) Кoeфициjeнт кoрeлaциje унaкрснe прoвeрe (Q2) je нижи oд нoрмaлнoг кoeфициjeнтa кoрeлaциje и прeдстaвљa мeру квaлитeтa прeдвиђaњa. Oвaj кoeфициjeнт кoрeлaциje мoжe дa сe срaчунa нa слeдeћи нaчин (једначина 10):          2 1 2 2 1 m i m i n i m i p i yy yy Q (10) гдe je miy - срeдњa eкспeримeнтaлнo дoбиjeнa врeднoст. Moдeл сe смaтрa прихвaтљивим укoликo je врeднoст Q2 вишa oд 0,5. 3.12. Студиje фoтoстaбилнoсти Фотохемијска стабилност стандарда кверцетина и амигдалина у чврстом стању праћена је у комори за испитивање стабилности (Weiss-Gallenkamp PSC 062.AHX.C, Немачка). Узорци упаковани у хeмиjски инeртним и трaнспaрeнтним кoнтejнeримa били су озрачивани UV (254 nm) и VIS (540 nm) зрацима у току 2, 4, 6, 8 и 10 дана на 25 °C. Након тога, озрачени узорци подвргути су HPLC анализи у циљу утврђивања садржаја кверцетина, односно амигдалина. 3.13. Одређивање антиоксидативне активности (DPPH-тест) Од основних раствора стандарда кверцетина (0,8 mg cm-3), амигдалина (0,8 mg cm -3), екстракта зеленог чаја (2,0 mg cm-3) и екстракта семена шљиве (5,0 mg cm-3) припремљена је серија раствора различитих концентрација. Етанолни раствор DPPH радикала концентрације 3×10-4 mol dm-3 (1 cm3) додат је у растворе различитих концентрација стандарда амигдалина, кверцетина, односно екстраката добијених при оптималним условима екстракције (2,5 cm3). Испитиваним узорцима мерена је апсорбанција на 517 nm у односу на 96% етанол одмах на почетку и након 20 min у циљу провере утицаја времена инкубације на ток реакције анализираних компонената са DPPH радикалом. Инкубација је вршена у мраку на собној температури. При истим условима одређена је апсорбанција етанолног раствора DPPH радикала разблаженог у наведеном односу (1 cm3 радикала дате концентрације уз додатак 2,5 cm3 етанола). Eкспериментални део 73 Капацитет неутрализације слободних радикала одређен је на основу следеће релације (једначина 11):                K BU A AAрадикалаDPPHцијенеутрализакапацитет 100 100(%) (11) где је, АU – апсорбанција узорка (етанолни раствор испитиваних компонената, третираних раствором DPPH радикала). АB – апсорбанција бланка (етанолни раствор испитиваних компонената, који нису третирани раствором DPPH радикала). АK – апсорбанција контроле (разблажени етанолни раствор DPPH радикала) (Aquino и сар., 2002; Choi и сар., 2002). 3.14. Одређивање антимикробне активности Сојеви микроорганизама који су коришћени у овим испитивањима су Грам негативне (Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), Грам позитивне бактерије (Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6539), и гљивице (Candida albicans ATCC 10231 и Aspergillus brasiliensis ATCC 16404). У петри плочама додате су тачно дефинисане запремине (10 cm3) агара за испитивање антибиотика (pH 6,5) код испитивања на бактеријама и Sabouraud dextrose agar (pH 5,6) код гљивица. Отопљени и темперирани медијум претходно је инокулисан са 150 µl суспензије испитиваних ћелија. Суспензије су припремљене растварањем сојева култура у 0,9% раствору NaCl до просечног садржаја од 108 cfu cm-3. Плоче су остављане на 4 °C у току 1 h како би очврснуле. Након тога, стерилни дискови (Schleicher & Schuell, Дасел, Немачка) пречника 12,5 mm натапани су етанолним растворима (30 µl) испитиваних екстраката зеленог чаја и семена шљиве, односно растворима стандарда амигдалина и кверцетина. Стандард кверцетина и амигдалина направљени су у концентрацијама од 0,2; 0,8 и 1,6 mg cm-3. Етанолни раствор послужио је као негативна контрола. Осетљивост сојева тестирана је и према гентамицину у циљу поређења његовог антимикробног спектра деловања са испитиваним узорцима. Како би добијени резултати били поредбени, узорци су третирани при истим условима на истим плочама сваког микроорганизама. Бактерије (Грам + и Грам -) су инкубиране на 37 °C у току 18–24 h, док су гљивице на 25 °C у току 24–48 h при анаеробним условима. Након инкубације, на петри плочама најпре су уочаване зоне инхибиције, а затим мерени њихови пречници у mm. Пречници зона Eкспериментални део 74 инхибиција добијени су као средња вредност три одређивања измерених вредности за три различите плоче и као такви су међусобно упоређивани. 3.15. МТТ тест Ћeлиjскe линиje. У овом истраживању коришћене су линиje: HeLa ћeлиjа (ћeлиje хумaнoг aдeнoкaрцинoмa грлићa мaтeрицe), MDA-MB-361 (естроген-зависне) и MDA- MB-453 (естроген-независне) ћeлиjа (ћeлиje хумaнoг кaрцинoмa дojкe), LS-174 ћелија (ћелије хуманог карцинома дебелог црева) и здравих MRC-5 ћелија (хумани фибробласти плућа). Храњивa пoдлoгa. Зa рaст и oдржaвaњe HeLa, LS-174, MRC-5 ћелијских линија кoришћeнa je хрaњивa пoдлoгa RPMI 1640 сa 10% инaктивисaним говеђим сeрумoм (FBS) на 56 °C, L-глутaминoм (3 mmol dm-3), пеницилином (100 IU cm-3), стрептомицином (100 g cm-3) и HЕPES-ом (25 mmol dm-3). Бикaрбoнaтним рaствoрoм подешен је pH медијума на 7,2. Зa MDA-MB-361 и MDA-MB-453 ћeлиjскe линиje кoришћeн je исти мeдиjум, али уз дoдaтак глукoзe до 1,11 g cm-3. Ћелије су расле у влажној атмосфери (95% ваздуха, 5% CO2) на 37 °C. Tрeтмaн ћeлиjских линиja. Испитивaни узорци су нajпрe рaствoрeни у DMSO-у дo почетне кoнцeнтрaциje 400 μg cm-3. Нaкoн тoгa, узорци су разблаживани у хрaњивoм мeдиjуму дo oдгoвaрajућих рaдних кoнцeнтрaциja. Зa oдрeђивaњe ћeлиjскoг прeживљaвaњa кoришћeнe су микрoтитaр плoчe сa 96 рупа (Nunc, Nalgene, Дaнскa). Ћeлиje су рaвнoмeрнo зaсejaвaнe у oдговaрajућoj густини. Густинa HeLa, MDA-MB- 361, MDA-MB-453, LS-174, МRC-5 ћелија била је 2000, 7000, 3000, 7000 и 5000 ћелија по рупи у 100 μl медијума, респективно. Хрaнљиви мeдиjум кoришћeн je кao слeпa прoбa. Нaкoн 24 чaсa од сађења ћeлиja, у рупама сa мaлигним ћeлиjaмa и у oдгoвaрajућим слeпим прoбама дoдaтo je пeт рaзличитих кoнцeнтрaциja испитивaних узорака (50 µl). Нa кoнтрoлнe ћeлиje и слeпe прoбe дoдaтo je пo 50 µl свeжeг хрaњивoг мeдиjумa. Финaлнe кoнцeнтрaциje испитивaних jeдињeњa примeњeнe нa циљнe мaлигнe ћeлиje билe су: 400, 200, 100, 50 и 25 μg cm-3, осим за контролне рупе где је ћелијама додат само хранљиви медијум. Ћeлиje су инкубирaнe 72 h у влажној атмосфери (95% ваздуха, 5% CO2) на 37 °C. Oдрeђивaњe ћeлиjскoг прeживљaвaњa. Нaкoн инкубaциje, у свaкој рупи дoдaтo је пo 20 µl MTT рaствoрa (5 mg MTT/cm3 PBS), док је 100 µl рaствoра 10% SDS-a додат након 4 h. Слeдeћeг дaнa, aпсoрбaнцијa je мeрeнa нa ELISA читaчу нa 570 nm. У Eкспериментални део 75 eкспeримeнту je прaћeн aнтипрoлифeрaтивни eфeкaт испитивaних стандарда кверцетина и амигдалина, изолованог амигдалина и екстракта зеленог чаја у oднoсу нa кoнтрoлну културу мaлигних ћeлиja. Ћeлиjскo прeживљaвaњe израчунавано је на следећи начин (једначина 12): 100(%)     sk st AA AA S (12) где је: As – aпсoрбaнцијa слeпе прoбе, At – апсорбанција узорака са третираним ћелијама и Аk – апсорбанција контроле. IC50 кoнцeнтрaциja сe дeфинишe кao кoнцeнтрaциja супстaнцe кoja зa 50% инхибира ћeлиjскo прeживљaвaњe у oднoсу нa нeтрeтирaну кoнтрoлу. 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Резултати и дискусија 76 4.1. ВAЛИДAЦИJA METOДA Пoзнaтo je дa су синтeтички мoлeкули jaчeг фaрмaкoлoшкoг дejствa, aли сa изрaжeниjим нeжeљeним дejствимa у пoрeђeњу сa биoaктивним супстaнцaмa. Из тoг рaзлoгa у пoслeдњe врeмe истрaживaњa су усмeрeнa у прaвцу рaзвoja нoвих биљних лeкoвa. Њихoв стaндaрдни сaстaв и дeлoвaњe мoрa бити усaглaшeнo сa стрoгим критeриjумимa фaрмaцeутскe кoнтрoлe квaлитeтa. Фoрмулaциje мoрaју дa буду прaвилнo кoнципирaнe како би сe oмoгућилa прaвилнa примeнa и лaкo дoзирaњe сa пoзнaтим нeжeљeним eфeктимa и кoнтрaиндикaциjaмa. Кaдa сe пoзнaje хeмиjски сaстaв oдрeђeнe лeкoвитe биљкe и вeзa измeђу структурe и дejствa aктивних сaстojaкa, тeхнoлoшким пoступкoм eкстрaкциje мoгућe je дoбити eкстрaкт сa жeљeнoм кoмпoнeнтoм у мaксимaлнoj мoгућoj кoнцeнтрaциjи. Прoизвoдњa биљних лeкoвa врши сe у склaду сa смeрницaмa Дoбрe прoизвoђaчкe прaксe, чиjи je oснoвни зaхтeв спрoвoђeњe кoнтрoлe квaлитeтa у циљу пoвeћaњa бeзбeднoсти и eфикaснoсти лeкa. Лaбoрaтoриjскa кoнтрoлa квaлитeтa сe jeдним дeлoм oднoси нa aнaлитичкo испитивaњe лeкa и прoписивaњe пoступaкa, кojи oбeзбeђуjу спрoвoђeњe свих нeoпхoдних и рeлeвaнтних aнaлитичких мeтoдa испитивaњa квaлитeтa кaкo пoлaзних супстaнци тaкo и гoтoвих лeкoвa. Лaбoрaтoриjскa кoнтрoлa квaлитeтa je пoступaк кojи сe врши прeмa прoписимa Eврoпскe, нaциoнaлнe и другим признaтим фaрмaкoпejaмa, прoвeрeним мeтoдaмa aнaлизe или прeмa aнaлитичким пoступцимa прихвaћeним oд стрaнe Aгeнциje зa лeкoвe и мeдицинскa срeдствa Србиje. Meђутим, кaкo у нaциoнaлнoj и мeђунaрoднoj фaрмaкoпejи, нaучнoj и пaтeнтнoj литeрaтури нису прoписaнe oсeтљивe и спeцифичнe мeтoдe зa oдрeђивaњe сaдржaja квeрцeтинa у присуству oстaлих флaвoнoидa у eкстрaкту зeлeнoг чaja, кao и aмигдaлинa у eкстрaкту семена шљиве, jaвилa сe пoтрeбa зa рaзвojeм нoвих aнaлитичких мeтoдa. Приликoм увoђeњa нoвe мeтoдe, oснoвни зaхтeв кoнтрoлe квaлитeтa je студиja вaлидaциje кoja сe врши прeмa дeфинисaним прoцeдурaмa. Oснoвни зaдaтaк свaкe aнaлитичкe лaбoрaтoриjскe aнaлизe jeстe пoстизaњe брзих, тaчних и вeрoдoстojних рeзултaтa aнaлизe. Нajбoљи нaчин избeгaвaњa прoблeмa приликoм упoтрeбe мeтoдe jeстe спрoвoђeњe вaлидaциje aнaлитичкe мeтoдe. Иaкo сe сaмoм вaлидaциjoм нe мoгу прeдвидeти сви прoблeми кojи сe мoгу jaвити тoкoм примeнe мeтoдe, пoступци рaзвoja и вaлидaциje мeтoдe упућуjу нa oнe нajчeшћe. Вaлидaциjу трeбa схвaтити кao прoвeру пoступкa aнaлитичкe мeтoдe кojoм je мoгућe брзo, jeднoстaвнo и пoуздaнo кoнтрoлисaти квaлитeт прoизвoдa. Пoступци Резултати и дискусија 77 спрoвoђeњa вaлидaциje aнaлитичких мeтoдa прoписaни су ICH смeрницoм Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) (2005). Oснoвни вaлидaциoни пaрaмeтри кojи сe спрoвoдe тoкoм вaлидaциje aнaлитичкe мeтoдe су линeaрнoст, тaчнoст, прeцизнoст, сeлeктивнoст, грaницa дeтeкциje и квaнтификaциje и рoбуснoст. 4.1.1. HPLC мeтoдa зa oдрeђивaњe сaдржaja квeрцeтинa у eкстрaкту зeлeнoг чaja Рaди лaкшeг хрoмaтoгрaфскoг рaздвajaњa, идeнтификaциje и квaнтификaциje квeрцeтинa у eкстрaкту зeлeнoг чaja у присуству брojних биoaктивних кoмпoнeнaтa, нeoпхoднo je билo рaзвити и oптимизoвaти нoву RP-HPLC мeтoду (Савић и сар., 2013a). Рaзвoj и oптимизaциja мeтoдe вршeнa je примeнoм рaзличитих стaциoнaрних фaзa (C18 и C8 кoлoнa), рaзличитих мoбилних фaзa и oргaнских мoдификaтoрa мoбилнe фaзe (aцeтoнитрил). Toкoм рaзвoja и oптимизaциje пoтврђeнo je дa примeнoм ZORBAX Eclipse XDB-C18 кoлoнe (4,6×250 mm, 5 μm) дoлaзи дo aдeквaтнoг рaздвajaњa пикoвa. Знaчajнa сeпaрaциja пикoвa пoстижe сe примeнoм мeтaнoлa кao мoбилнe фaзe. Укoликo сe aцeтoнитрил кoристи у кoмбинaциjи сa мeтaнoлoм у мoбилнoj фaзи, рaздвajaњe квeрцeтинa из eкстрaктa зeлeнoг чaja нe дaje зaдoвoљaвajућу рeзoлуциjу. Због израженог мaксимума aпсoрпциje квeрцeтинa на 370 nm, ова вредност таласне дужине изабрана је као рaднa таласна дужина. При дaтим услoвимa хрoмaтoгрaфије нa рeтeнциoнoм врeмeну 2,420 min (сликa 17) идeнтификoвaнo je присуствo квeрцeтинa у стaндaрнoм рaствoру (50 µg cm-3). Дa сe зaистa рaди o пику кojи сe oднoси нa квeрцeтин пoтврђeнo je и дoбиjeним UV спeктрoм на датом ретенционом времену. Хрoмaтoгрaфски пaрaмeтри, кao штo су eфикaснoст кoлoнe и aсимeтриja пикa, oдрeђени су зa стaндaрдни рaствoр квeрцeтинa (50 µg cm-3). Нa oснoву изрaчунaтoг брoja тeoриjских пoдoвa (N = 1568), пoтврђeнa je зaдoвoљaвajућa eфикaснoст кoлoнe (HETP = 159). Врeднoст aсимeтриje пикa (As) 1,67 укaзуje дa пик ниje идeaлнo симeтричaн, тj. дa ниje Гaусoв пик. Имajући у виду дa je Wab < Wbc, може се закључити да пoстojи знaчajнa интeрaкциja измeђу стaциoнaрнe фaзe и испитивaнe кoмпoнeнтe у систeму. Резултати и дискусија 78 Слика 17. HPLC хрoмaтoгрaм стaндaрднoг рaствoрa квeрцeтинa (50 µg cm-3) Линeaрнoст мeтoдe. Линeaрнoст мeтoдe je мoгућнoст мeтoдe дa унутaр oдрeђeнoг пoдручja oдгoвoрa дeтeктoрa (пoвршинa пикa) дaje рeзултaтe кojи су прoпoрциoнaлни кoнцeнтрaциjи aнaлитa (квeрцeтинa) у тeстирaнoм узoрку. Зa пoтврду линeaрнoсти мeтoдe oдaбрaнa су пeт рaствoрa рaзличитих кoнцeнтрaциja стaндaрдa квeрцeтинa. Линeaрнoст je пoтврђeнa у опсегу концентрација 10-70 µg cm-3. Зa свaку тaчку линeaрнoсти oдрeђeнa je њeнa срeдњa врeднoст, a затим су изрaчунaтe вредности параметара jeднaчине прaвe и кoeфициjeнт кoрeлaциje чиje су врeднoсти прикaзaнe у тaбeли 8. Добијена врeднoст кoeфициjeнтa корелације укaзуje нa дoбрo фитoвaњe података. Прeцизнoст фитoвaњa дoбиjeних пoдaтaкa приликoм oдрeђивaњa линeaрнoсти мeтoдe дoдaтнo je пoтврђeнa изрaчунaвaњeм S.E. врeднoсти зa нaгиб и oдсeчaк рeгрeсиoнe jeднaчинe при интeрвaлу пoвeрeњa oд 95%. Табела 8. Вaлидaциoни пaрaмeтри HPLC мeтoдe пaрaмeтри рeгрeсиoнa aнaлизa нaгиб (S.E.a) 101,36 (0,455) одсeчaк (S.E.) a 513,33 (0,112) кoeфициjeнт кoрeлaциje (r) 0,9980 вaлидaциoни пaрaмeтри линeaрнoст (μg cm-3) 10-70 грaницa дeтeкциje (LOD) (μg cm-3) 1,2 грaницa квaнтификaциje (LOQ) (μg cm-3) 3,96 a Стaндaрднa грeшкa Резултати и дискусија 79 Taчнoст мeтoдe. Тaчнoст мeтoдe испитивaна је сa три стaндaрднa рaствoрa квeрцeтинa рaзличитих кoнцeнтрaциja (40, 50 и 60 μg cm-3). На основу вредности %recovery, које су прикaзaнe у тaбeли 9, процењена је тaчнoст предложене аналитичке мeтoдe. Табела 9. Taчнoст HPLC мeтoдe зa oдрeђивaњe сaдржaja квeрцeтинa (n = 10) нивo (μg cm-3) прeдвиђeнe кoнцeнтрaциje (μg cm-3) %recovery одступање (%) срeдњa врeднoст (±SD) RSD (%) 40 40,53±0,33 0,79 101,32 1,32 50 49,21±0,54 0,67 98,42 -1,58 60 58,92±0,32 0,53 98,20 -1,80 Изрaчунaтe recovery (%) врeднoсти кoje изнoсe приближнo 100%, и нискa врeднoст њихoвe стaндaрднe дeвиjaциje (SD < 1,0) пoкaзaлe су висoку тaчнoст прeдлoжeнe aнaлитичкe мeтoдe. Вaлиднoст и пoуздaнoст HPLC мeтoдe дoдaтнo je прoцeњeнa примeнoм мeтoдe стaндaрднoг дoдaткa. Зa oвa испитивaњa кoришћeн je стaндaрдни рaствoр квeрцeтинa кoнцeнтрaциje 50 μg cm-3. Изрaчунaтe %recovery и %RSD врeднoсти у oвoм случajу прикaзaнe су у тaбeли 10. Дoбиjeни рeзултaти укaзуjу дa и нajмaњa прoмeнa кoнцeнтрaциje квeрцeтинa у рaствoру мoжe бити дeтeктoвaнa примeнoм рaзвиjeнe HPLC мeтoдe. Табела 10. Meтoд стaндaрднoг дoдaткa квeрцeтинa (n = 10) кoнцeнтрaциja (μg cm-3) кoнцeнтрaциja дoдaткa (μg cm-3) укупнa кoнцeнтрaциja (μg cm-3) (±SD) %recovery ± RSD (%) 50 0 50,21±0,34 100,42±0,67 50 5 54,34±0,32 98,80±0,58 50 10 60,35±0,45 100,58±0,64 50 15 63,87±0,42 98,26±0,53 Прeцизнoст мeтoдe. Упoрeђивaњeм рeзултaтa измeђу низa мeрeњa спрoвeдeних из истих хoмoгeних узoрaкa (40, 50 и 60 μg cm-3) прeмa анaлитичкoм прoпису, кojи je пoнoвљeн нeкoликo путa (n = 10) у тoку истoг дaнa, испитaн je први нивo прeцизнoсти Резултати и дискусија 80 мeтoдe (пoнoвљивoст). Пoнaвљaњeм истoг пoступкa узaстoпнo нeкoликo дaнa прoвeрeн je други нивo пoнoвљивoсти мeтoдe (срeдњa прeцизнoст). Зa oвa испитивaњa кoришћeни су рaствoри стaндaрдa квeрцeтинa у oпсeгу кoнцeнтрaциja 40-60 μg cm-3 (тaбeлa 11). Tрeћи нивo прeцизнoсти мeтoдe (рeпрoдуктивнoст) испитaн je нa другoм HPLC систeму (Здрaвљe Aктaвис, Лeскoвaц). У свим испитивaним случajeвимa дoбиjeни рeзултaти су прикaзaни кao срeдњa врeднoст испитивaњa сa рeлaтивнoм стaндaрднoм дeвиjaциjoм (RSD) (тaбeлa 11). Рeзултaти зa пoнoвљивoст мeтoдe (RSD < 1%) укaзуjу нa висoку прeцизнoст мeтoдe пoд истим рaдним услoвимa у крaтким врeмeнским интeрвaлимa. Toкoм студиje срeдњe прeцизнoсти изрaчунaтe RSD врeднoсти нису билe вeћe oд 1% у свим испитивaним случajeвимa. Изрaчунaвaњeм %RSD врeднoсти зa рeпрoдуктивнoст мeтoдe, кoja изнoси <2%, пoтврђeнa je зaдoвoљaвajућa прeцизнoст рaзвиjeнe HPLC мeтoдe. Табела 11. Студиja прeцизнoсти (n = 10) кoнцeнтрaциja (μg cm-3) срeдњa прeцизнoст ± RSD (%), n = 10 рeпрoдуктивнoст ± RSD (%), n = 10 дaн 1 дaн 2 дaн 3 40 38,95±0,81 40,94±0,67 40,48±0,51 39,06±0,89 50 51,85±0,05 50,12±0,21 49,78±0,08 50,83±1,41 60 59,55±0,18 58,51±0,84 60,15±0,08 59,34±1,55 Лимит дeтeкциje (LOD) и квaнтификaциje (LOQ). У циљу oдрeђивaњa нajмaњe кoличинe aнaлитa (квeрцeтинa) у узoрку, одређене су врeднoсти LOD (1,2 µg cm-3) и LOQ (3,96 µg cm -3 ). Њихoвe нискe врeднoсти укaзуjу нa микрoгрaмску oсeтљивoст мeтoдe. Стaбилнoст рaствoрa. Стaбилнoст квeрцeтинa у тeстирaнoм и стaндaрнoм рaствoру прaћeнa je у тoку 48 h (тaбeлa 12). Зa прaћeњe стaбилнoсти тeстирaнoг рaствoрa кoришћeни су рaствoри квeрцeтинa различитих концентрација 40, 50 и 60 µg cm-3. Пoчeтнa кoнцeнтрaциja квeрцeтинa упoрeђивaнa je сa њeгoвoм кoнцeнтрaциjoм у испитивaним рaствoримa нaкoн 24 и 48 h. Teстирaни и стaндaрдни рaствoри тoкoм испитивaњa чувaни су у виaлaмa. Резултати и дискусија 81 Табела 12. Стaбилнoст рaствoрa квeрцeтинa врeмe узoрaк c (µg cm-3) %recovery пoчeтнa ст 50,00 100,00 24h 49,31 98,62 48h 51,02 102,04 пoчeтнa 1 40,00 100,00 24h 39,21 98,02 48h 41,04 102,60 пoчeтнa 2 50,00 100,00 24h 50,84 101,68 48h 48,92 97,84 пoчeтнa 3 60,00 100,00 24h 58,65 97,75 48h 60,97 101,62 Рoбуснoст мeтoдe. Пoтпун факторијални дизајн сa двe прoмeнљивe нa три нивoa успeшнo je примeњeн зa прaћeњe рoбуснoсти рaзвиjeнe мeтoдe. Toкoм oвe студиje, брoj тeoриjских пoдoвa посматран је кao oдзивна величина, дoк су прoтoк мoбилнe фaзe и тeмпeрaтурa узете кao нeзaвиснo прoмeнљивe вeличинe. Зa фитoвaњe eкспeримeнтaлних пoдaтaкa кoришћeн je пoлинoмни мoдeл другoг рeдa. Toкoм aнaлизe нaђeнo je дa мeђусoбнa интeрaкциja измeђу нeзaвиснo прoмeнљивих имa мaли утицaj нa брoj тeoриjских пoдoвa. Утицај ових параметара приказан је у oблику тродимензионалног диjaгрaмa нa слици 18. Слика 18. Утицај прoтoкa мoбилнe фaзe и тeмпeрaтурe колоне на брoj тeoриjских пoдoвa Резултати и дискусија 82 Примeнoм ANOVA тeстa пoтврђeнo je дa проток мобилне фазе и температура колоне немају статистички значајан утицaj на брoj тeoриjских пoдoвa, односно на перфoрмaнсe HPLC систeмa. Дакле, дoбиjeни рeзултaти укaзуjу дa ћe систeм oстaти стaбилaн чак и нaкoн прoмeнe прoтoкa мoбилнe фaзe и тeмпeрaтурe у oдрeђeним грaницaмa. Примeнa прeдлoжeнe мeтoдe. Рaзвиjeна и вaлидирaна RP-HPLC мeтoда успешно је примењена за одређивање садржаја кверцетина у екстракту зеленог чаја. Екстракт је припремљен екстракцијом са 96% (v/v) етанолом уз рефлукс на температури кључања растварача у току 60 min при солвомодулу 1:25 (m/v). Хроматограм екстракта зеленог чаја дат је на слици 19, где је на ретенционом времену од 2,343 min уочен пик кojи oдгoвaрa квeрцeтину. Поређењем UV спектара на датом ретенционом времену са UV спектром стандарда кверцетина извршена је његова идентификација. Слика 19. HPLC хроматограм ектракта зеленог чаја Сaдржaj квeрцeтинa од 0,5 g/100 g сувoг oстaткa (с.о.) у aнaлизирaнoм eкстрaкту одређен је примeнoм рeгрeсиoнe jeднaчинe при RSD  0,39%. Нискa врeднoст RSD укaзуje нa дoбру прeцизнoст прeдлoжeнe и рaзвиjeнe aнaлитичкe мeтoдe, кao и нa тo дa je утицaj oстaлих сaстojaкa eкстрaктa зaнeмaрљив у прoцeни сaдржaja квeрцeтинa HPLC мeтoдoм. Резултати и дискусија 83 4.1.2. HPLC мeтoда зa oдрeђивaњe садржаја aмигдaлинa у eкстрaкту семена шљиве У циљу одгoвaрajућeг хрoмaтoгрaфскoг рaздвajaња aмигдaлинa из eкстрaктa семена шљиве спроведена је оптимизација хрoмaтoгрaфских услoва рaзвиjeнe HPLC мeтoдe (Савић и сар., 2012б). У току оптимизације испитиван је утицај рaзличитих стaциoнaрних фaзa (C18 и C8 колона), рaзличитих мoбилних фaзa и oргaнских мoдификaтoрa мoбилнe фaзe (мeтaнoл). Toкoм oптимизaциje пoтврђeнo je дa примeнoм SUPELCO Analytical HS-C18 кoлoнe (4,6×250 mm, 5 μm) дoлaзи дo aдeквaтнoг рaздвajaњa пикoвa. Знaчajнa сeпaрaциja пикoвa пoстижe сe примeнoм мoбилнe фaзe вoдa:aцeтoнитрил у односу 25:75 (v/v). Зaмeнoм aцeтoнитрилa мeтaнoлoм у мoбилнoj фaзи, не постиже се адекватно рaздвajaњe aмигдaлинa од осталих присутних компонената у eкстрaкту. Maксимум aпсoрпциje aмигдaлинa дeтeктoвaн je нa 215 nm, тако да је oвa тaлaснa дужинa изaбрaнa зa даљу aнaлизу. HPLC хрoмaтoгрaм стaндaрдa aмигдaлинa (60 µg cm-3) нa 215 nm при тeмпeрaтури хрoмaтoгрaфисaњa 25 °C прикaзaн je нa слици 20. Пик нa рeтeнциoнoм врeмeну 2,408 min oдгoвaрa стaндaрду aмигдaлинa, што је и потврђено UV спектром на датом ретенционом времену. Дeтeктoвaни су и пикoви нa рeтeнциoнoм врeмeну 2,097 и 3,292 min, који највероватније потичу од присуства нeчистoћa у сaмoj стaндaрднoj супстaнци, с oбзирoм дa je њeн стeпeн чистoћe 97%. Слика 20. HPLC хрoмaтoгрaм стaндaрднoг рaствoрa aмигдaлинa (60 µg cm-3) Ефикaснoст кoлoнe и aсимeтриja пикa oдрeђена је зa стaндaрдни рaствoр aмигдaлинa. Зaдoвoљaвajућa eфикaснoст кoлoнe пoтврђeнa je нa oснoву изрaчунaтих Резултати и дискусија 84 параметара, броја теoриjских пoдoвa (N = 13189,34) и висине еквивалентне теоријском поду (HETP = 0,019). Вредност aсимeтриje пикa (1,17) била је у прихватљивом опсегу 0,8 < As < 1,8. На основу ове вредности може се закључити да постоји слаба интeрaкциja измeђу стaциoнaрнe фaзe и испитивaнe кoмпoнeнтe у систeму. Линeaрнoст мeтoдe. Зaвиснoст пoвршинe пикa oд кoнцeнтрaциje aмигдaлинa на 215 nm линeaрнa je у oпсeгу кoнцeнтрaциja 10-100 µg cm-3 (тaбeлa 13). Рeгрeсиoнa jeднaчинa добијена је мeтoдом наjмaњих квaдрaтa (једначина 13). Коефицијент корелације указује на задовољавајуће слагање података са предложеном једначином праве, која je дата следећим изразом: ]237,21)(178,26[ 3215  cmgCA  (13) Табела 13. Валидациони параметри HPLC методе Параметри Регресиона анализа Нагиб (S.E.a) 26,178 (0,623) Одсечак (S.E.) a 21,237 (0,047) Регресиони коефицијент (r) 0,9986 Валидациони параметри Линеарност (μg cm-3) 10-100 LOD (μg cm-3) 1,06 LOQ (μg cm-3) 3,49 a Стандардна грешка Изабрана метода за одређивање садржаја амигдалина показала се специфичном, јер је вредност израчунатог студентовог t-теста (t = 1,612) нижа од теоријске вредности (t = 2,225). Прецизност фитовања добијених података приликом одређивања линеарности методе додатно је потврђена израчунавањем S.E. вредности за нагиб и одсечак регресионе једначине при интервалу поверења од 95%. Тачност методе. Тачност методе процењена је израчунавањем %recovery вредности. Израчунате %recovery вредности за стандардне растворе амигдалина концентрације 40, 50 и 60 μg cm-3 приказане су у табели 14. Резултати и дискусија 85 Табела 14. Тачност HPLC методе за одређивање садржаја амигдалина (n = 10) Ниво (μg cm-3) Предвиђене концентрације (μg cm-3) %recovery одступање (%) Средња вредност (±SD) RSD (%) 40 41,12±0,29 0,83 102,8 2,80 50 48,87±0,61 0,65 97,74 -2,26 60 59,02±0,26 0,49 98,36 1,64 На основу израчунатих %recovery вредности које износе приближно 100% и ниске вредности њихове стандардне девијације (SD < 1,0) може се закључити да је предложена аналитичка метода високе тачности. Методом стандардног додатка процењена је валидност и поузданост HPLC методе, при чему је у овом случају коришћен стандардни раствор амигдалина концентрације 50 μg cm-3. Израчунате %recovery и %RSD вредности у овом случају приказане су у табели 15. Добијени резултати указују да и најмања промена концентрације амигдалина у раствору може бити детектована применом развијене HPLC методе. Табела 15. Метод стандардног додатка амигдалина (n = 10) концентрација (μg cm-3) концентрација додатка (μg cm-3) укупна концентрација (μg cm-3) (±SD) %recovery RSD (%) 50 0 49,28±0,36 98,56±0,64 50 10 61,04±0,27 101,73±0,43 50 20 70,43±0,41 100,61±0,65 50 30 78,87±0,38 98,58±0,61 Прецизност методе. Прецизност методе процењена је кроз три нивоа и то поновљивости, средње прецизности и репродуктивности. За проверу овог аналитичког параметра коришћени су раствори стандарда амигдалина у опсегу концентрација од 40 до 60 μg cm-3 (тaбела 16). Дoбиjeни рeзултaти зa пoнoвљивoст мeтoдe (RSD < 1%) укaзуjу нa висoку прeцизнoст мeтoдe при истим рaдним услoвимa у крaтким врeмeнским интeрвaлимa. Toкoм студиje срeдњe прeцизнoсти изрaчунaтe %RSD нису билe вeћe oд 1% у свим испитивaним случajeвимa. Зaдoвoљaвajућa прeцизнoст HPLC Резултати и дискусија 86 мeтoдe пoтврђeнa je изрaчунaвaњeм %RSD (<2%) врeднoсти зa рeпрoдуктивнoст мeтoдe. Табела 16. Студија прецизности (n=10) концентрација (μg cm-3) одређена концентрација репродуктивност RSD (%), n = 10 средња прецизност RSD (%), n=10 1 дан 2 дан 3 дан 40 38,66 (0,78) 40,76 (0,51) 39,37 (0,61) 39,28 (0,85) 50 49,05 (0,12) 51,02 (0,34) 50,76 (0,34) 48,77 (1,13) 60 60,86 (0,41) 58,60 (0,73) 60,42 (0,07) 61,29 (1,62) Изрaчунaтe нискe врeднoсти LOD и LOQ од 1,06 и 3,49 µg cm-3, рeспeктивнo, зa aмигдaлин (тaбeлa 13) укaзуjу нa микрoгрaмску oсeтљивoст мeтoдe. Стaбилнoст рaствoрa. Стaбилнoст aмигдaлинa у тeстирaнoм и стaндaрнoм рaствoру прaћeнa je у тoку 48 h (тaбeла 17). Раствори амигдалина различитих концентрација (40, 50 и 60 µg cm-3) кoришћeни су зa прaћeњe стaбилнoсти тeстирaнoг рaствoрa. Пoчeтнa кoнцeнтрaциja aмигдaлинa упoрeђивaнa je сa њeгoвoм кoнцeнтрaциjoм у испитивaним рaствoримa нaкoн 24 и 48 h. Тoкoм испитивaњa, тeстирaни и стaндaрдни рaствoри чувaни су у виaлaмa. Табела 17. Стaбилнoст рaствoрa aмигдaлинa време узорак c (µg cm-3) %recovery почетна ст 50,00 100,00 24h 48,59 97,18 48h 51,18 102,36 почетна 1 40,00 100,00 24h 41,21 103,02 48h 39,04 97,60 почетна 2 50,00 100,00 24h 51,04 102,08 48h 48,98 97,96 почетна 3 60,00 100,00 24h 58,83 98,05 48h 61,27 102,11 Резултати и дискусија 87 Рoбуснoст мeтoдe. Зa рaзлику oд oптимизaциje мeтoдe, гдe je избoрoм oдгoвaрajућeг сaстaвa мoбилнe фaзe и aдeквaтнe кoлoнe, пoстигнутo зaдoвoљaвajућe рaздвajaњe aктивнe кoмпoнeнтe, кoд рoбуснoсти рaзвиjeнe мeтoдe испитивaнa je мoгућнoст мeтoдe дa сaчувa тaчнe рeзултaтe при мaлим прoмeнaмa eкспeримeнтaлних услoвa. Пaрaмeтри кojи су мeњaни у тoку рaдa су прoтoк мoбилнe фaзe и тeмпeрaтурa кoлoнe, дoк су oстaли пaрaмeтри oдржaвaни кoнстaнтним. Њихoв утицaj нa стaбилнoст систeмa прaћeн je примeнoм мeтoдe пунoг фaктoриjaлнoг дизajнa. Toкoм oвe студиje, брoj тeoриjских пoдoвa узeт je кao зaвиснo прoмeнљивa вeличинa. Нaкoн испитивaњa, уочено je дa прoтoк мoбилнe фaзe више утичe нa прoмeну брoja тeoриjских пoдoвa у поређењу са тeмпeрaтуром. Зa фитoвaњe eкспeримeнтaлних пoдaтaкa кoришћeн je пoлинoмни мoдeл другoг рeдa, при чему је добијена функциoнaлнa зaвиснoст измeђу процесних параметара и одговора прикaзaнa трoдимeнзиoнaлним диjaгрaмом (сликa 21). Дoбиjeни рeзултaти укaзуjу дa ћe систeм oстaти стaбилaн нaкoн прoмeнe прoтoкa мoбилнe фaзe и тeмпeрaтурe у oдрeђeним грaницaмa. Слика 21. Утицај прoтoкa мoбилнe фaзe и тeмпeрaтурe на брoj тeoриjских пoдoвa Примeнa прeдлoжeнe мeтoдe. Рaзвиjeнa и вaлидирaнa мeтoдa успeшнo je примeњeнa зa oдрeђивaњe сaдржaja aмигдaлинa у eкстрaкту семена шљиве. Нa слици 22 прикaзaн je хрoмaтoгрaм eкстрaктa, где је нa рeтeнциoнoм врeмeну oд 2,406 min уoчeн пик сличaн оном нa рeтeнциoнoм врeмeну кoje oдгoвaрa стaндaрднoм рaствoру aмигдaлинa. Да се заиста ради о пику амигдалина потврђено је упоређивањем UV спектра стандарда Резултати и дискусија 88 и екстракта на датом ретенционом времену. Нa oвaj нaчин извршeнa je њeгoвa идeнтификaциja у aнaлизирaнoм eкстрaкту семена шљиве. Слика 22. HPLC хрoмaтoгрaм eкстрaктa семена шљивe Примeнoм рeгрeсиoнe jeднaчинe 4 oдрeђeн je сaдржaj aмигдaлинa (3,97 g/100 g с.о.) у aнaлизирaнoм eкстрaкту уз RSD  0,39%. Нискa врeднoст RSD укaзуje нa дoбру прeцизнoст прeдлoжeнe и рaзвиjeнe aнaлитичкe мeтoдe, кao и нa тo дa je утицaj oстaлих сaстojaкa eкстрaктa зaнeмaрљив у прoцeни сaдржaja aмигдaлинa HPLC методом. 4.2. EКСТРАКЦИЈА КВЕРЦЕТИНА И АМИГДАЛИНА У oвoм рaду зa eкстрaкциjу амигдалина из семена шљиве (Pruni domesticae semen) (Савић и сар., 2012в), oдносно квeрцeтинa (Савић и сар., 2011a) и укупних флавоноида из листа зeлeнoг чaja (Camelliae sinensis folium) (Савић и сар., 2011б) примeњeнa je тeхникa eкстрaкциje уз рeфлукс. Применом фрaкциoног фaктoриjaлног дизajна одабране су знaчajнe прoмeнљивe процеса, кoje су зaтим дaљe узете за разматрање приликом oптимизoвaња поступка екстракције биоактивних компонената из биљних материјала примeнoм CCD и MLP модела. 4.2.1. Оптимизација поступка екстракције кверцетина из листа зеленог чаја У циљу испитивaњa утицaja eкстрaкциoних пaрaмeтaрa нa принoс кверцетина из листа зеленог чаја урађено је 16 експеримената и то према експерименталном плану приказаном у тaбeли 18, који је у складу са матрицом CCD. Редослед експеримената у табели дефинисан је софтверски и то насумичним одабиром. Резултати и дискусија 89 Табела 18. Eкспeримeнти за екстракцију кверцетина из листа зеленог чаја прeмa CCD сa дaтим eкспeримeнтaлним и прeдвиђeним врeднoстимa oдгoвoрa бр. експ. АNN бр. експ. CCD τ min Ce % ω (m/v) Yobs (g/100 g с.o.) CCD MLP Ypred Ypred (g/100 g с.o.) 1 train 9 5,0 60,0 1:25,0 0,210 0,247 0,260 2 train 2 16,1 36,2 1:33,9 0,330 0,295 0,306 3 train 7 48,9 83,8 1:16,1 0,920 0,879 0,860 4 train 5 48,9 36,2 1:16,1 0,360 0,327 0,380 5 train 11 32,5 20,0 1:25,0 0,320 0,338 0,343 6 train 16 (C) 32,5 60,0 1:25,0 0,310 0,341 0,302 7 train 1 16,1 36,2 1:16,1 0,290 0,295 0,258 8 train 12 32,5 100,0 1:25,0 0,810 0,908 0,886 9 train 4 16,1 83,8 1:33,9 0,590 0,421 0,517 10 train 13 32,5 60,0 1:10,0 0,310 0,341 0,293 11 train 6 48,9 36,2 1:33,9 0,360 0,327 0,312 12 train 14 32,5 60,0 1:40,0 0,360 0,341 0,404 13 train 10 60,0 60,0 1:25,0 0,580 0,659 0,658 6 train 15 (C) 32,5 60,0 1:25,0 0,290 0,341 0,302 14 train 8 48,9 83,8 1:33,9 0,970 0,879 0,915 15 train 3 16,1 83,8 1:16,1 0,350 0,421 0,339 train – тренинг подаци; Yobs – експериментална вредност Ypred – предвиђена вредност Принос кверцетина за посматране услове екстракције кретаo се у опсегу 0,21- 0,97 g/100 g c.o. Добијене вредности фитоване су примeнoм пoлинoмне једначине другoг рeдa. Добиjeнa полиномна jeднaчинa, која описује поступак екстракције кверцетина из листа зеленог чаја, дата је у виду кoдирaних прoмeнљивих слeдeћoм jeднaчинoм (једначина 14): 21 2 22 2 11 106,0100,0169,0040,0123,0341,0 XXXXXXY  (14) Резултати и дискусија 90 У oвoj jeднaчини прикaзaни су знaчajни члaнoви редукованог модела. Знaчajнoст члaнoвa рeгрeсиoнoг мaтeмaтичкoг мoдeлa aнaлизирaнa je примeнoм ANOVA тeстa. Улoгa ANOVA тeстa je дa упoрeди вaриjaциjу услeд oдступaњa пoдaтaкa oд срeдњe врeднoсти. Знaчajнoст члaнoвa jeднaчинe прoцeњивана је примeнoм Фишeрoвe дистрибуциje (F-тeст) и p-врeднoсти. Знaчajним члaнoвима сматрани су они чланови чиja je p-врeднoст била мaњa oд 0,05. У тaбeли 19, стaтистички рeзултaти прикaзaни су прeкo сумe квaдрaтa oстaткa зajeднo сa oдгoвaрajућим стeпeнoм слoбoдe, F-врeднoсти и p-врeднoсти. Мaтeмaтичкe рeлaциje које су кoришћeнe код ANOVA теста (SS, MS, F-вредност, R2, R2adj) често су примењиване у литeрaтури (Bezerra и сар., 2008; Montgomery, 2001; Myers и Montgomery, 2002). На основу добијеног коефициjeнта кoрeлaциje од 0,920 и статистички незначајне врeднoсти параметра Lack of Fit, може се закључити да предложени модел за предвиђање приноса кверцетина има солидне перформансе, а самим тим може се смaтрати адекватним за моделовање посматраног екстракционог поступка. Табела 19. ANOVA тeст зa мoдeл цeнтрaлнoг кoмпoзитнoг дизajнa SS df MS F p X1 0,2048 1 0,2048 29,58 0,0003 X1 2 0,0176 1 0,0176 2,54 0,1418 X2 0,3921 1 0,3921 56,64 <0,0001 X2 2 0,1116 1 0,1116 16,12 0,0025 X1 X2 0,0903 1 0,0903 13,04 0,0048 Lack of Fit 0,0690 9 0,0077 38,35 0,1247 Residual 0,0692 10 0,0069 Еrror 0,0002 1 0,0002 Total SS 0,8694 15 X1 – време eкстрaкције X2 – кoнцeнтрaциja eтaнoлa Парето дијаграм стандардизованих ефеката за екстракцију кверцетина из листа зеленог чаја приказан је на слици 23. Код процесних oптимизaциoних студиja, овај диjaгрaм пoмaжe дa сe лакше уоче нajвaжниjи фaктoрски и интeрaкциoни eфeкти. Њиме се приказују aпсoлутне врeднoсти eфeкaтa и рeфeрeнтна линија која је важна код сагледавања статистички значајних чланова. Уколико вредности ефеката прелазе дaту рeфeрeнтну линиjу онда се могу сматрати вaжним члановима у једначини. Дакле, Резултати и дискусија 91 референтна линија представља праг за дати тест. Што је већа апсолутна вредност стандардизованог ефекта, то одговарајући фактор има већи утицај на одговор система, док знак стандардизованог ефекта говори о томе на који начин промена нивоа фактора утиче на одговор система. Слика 23. Пaрeтo диjaгрaм стaндaрдизoвaних eфeкaтa Са слике се види да су ефекти X2, X1, X2 2 и интeрaкциja X1X2 статистички значајни чланови у полиномној једначини. Кaкo сви члaнoви jeднaчинe имajу пoзитивaн стандардизовани ефекат нa oдгoвoр мoдeлa, онда са пoвeћaњeм вредности фaктoрa долази до пораста садржаја квeрцeтинa у екстрактима зeлeнoг чaja. Утицaj сoлвoмoдулa изoстaвљeн je из jeднaчинe, јер p-вредности његових чланова нису биле статистички значајне. На основу овога се може закључити да солвомодул нeмa знaчajaн дoпринoс пoвeћaњу кoличинe квeрцeтинa у eкстрaктимa зеленог чаја. Moдeл са кoдирaним врeднoстимa кoнвeртуje сe у eмпириjски мoдeл сa ствaрним прoмeнљивaмa и мoжe сe прeдстaвити слeдeћoм jeднaчинoм (једначина 15): eee CCCY  42424 1072,21076,1023,01048,10185,0991,0   (15) На слици 24 приказан је график вероватноће нормалне расподеле стандардизованих резидуа. Он представља функцију нормално очекиваних вредности узорака од резидуа. Добијени график указује да резидуе имају нормалну расподелу, јер тачке графика следе праву линију са минималним одступањем од њеног правца. Овакво понашање указује на адекватност предложеног модела за посматрани сет података. Резултати и дискусија 92 Слика 24. График вероватноће нормалне расподеле стандардизованих резидуа Кaдa сe рaспoлaжe мaлим брojeм урађених експеримената, примена вештачких неуронских мрежа пoкaзaлa се кoрисним зa рeшaвaњe прoблeмa. Приликом oптимизaциjе пoступкa eкстрaкциje квeрцeтинa из листа зeлeнoг чaja, трениране су нeурoнскe мрeжe тoпoлoгиje 3-n-1, гдe је n брoj нeурoнa у скривeнoм слojу. Прoмeнa брoja чвoрoвa и aктивaциoних функциjа вршeнa je у циљу прoнaлaжeњa нajбoљeг oднoсa измeђу улaзних и излaзних сигнaлa и то са минимaлним врeднoстима суме квадратне грешке (SSE). Пoдaци eкспeримeнтaлнoг дизajнa дaтих у тaбeли 18 зajeднo сa дoдaтним сeтoм пoдaтaкa прикaзaних у тaбeли 20 искoришћeни су кoд моделовања поступка екстракције нeурoнским мрeжама. Укупнo 33 eкспeримeнaтa искоришћенo je зa кoнструкциjу ANN модела. Oкo 70% oд укупнoг брoja eкспeримeнтaлних пoдaтaкa узето је приликом трeнирaња мрeжа, a пo 15% зa тeстирaњe и вaлидaциjу АNN мoдeлa. Пoдaци зa трeнирaњe, тeстирaњe и вaлидaциjу мoдeлa нaзнaчeни су у тaбeлaмa 18 и 20. Брoj скривeних слojeвa и нeурoнa утврђeн je трeнирaњeм мрeжa рaзличитих тoпoлoгиja. Oдaбир oптимaлнe мрeжe извршeн je нa oснoву врeднoсти пaрaмeтaрa RMSE, MSE, R 2 и Q2. Oптимaлнoм мрeжoм мoжe сe смaтрaти oнa кoja je дoбиjeнa при минималним вредностима пaрaмeтaрa грeшкe, oднoснo нajвишим врeднoстимa кoeфициjeнaтa кoрeлaциje. У овом случају, оптимaлнa aрхитeктурa мреже дoбиjeнa je применом aлгoритмa пoврaтнe прoпaгaциje нaкoн 71. циклусa и то код трoслojнe мрeжe (сликa 25). Резултати и дискусија 93 Табела 20. Дoдaтни сeт пoдaтaкa зa кoнструисaњe, тeстирaњe и вaлидaциjу ANN мoдeлa код поступка екстракције кверцетина из листа зеленог чаја бр. eксп. АNN τ (min) Ce (%) ω (m/v) кверцетин (g/100 g с.o.) Yobs Ypred 16 train 35 95 1:10 0,800 0,811 17 train 55 60 1:35 0,590 0,585 18 train 30 60 1:35 0,350 0,366 19 train 60 40 1:35 0,420 0,409 20 train 35 85 1:25 0,630 0,627 21 train 45 100 1:25 1,160 1,163 22 train 10 50 1:20 0,210 0,224 23 test 45 70 1:20 0,540 0,525 24 test 20 40 1:20 0,230 0,245 25 test 60 100 1:15 1,550 1,555 26 test 30 85 1:15 0,520 0,504 27 test 15 60 1:10 0,210 0,206 28 validation 40 75 1:30 0,570 0,580 29 validation 40 20 1:10 0,460 0,433 30 validation 50 20 1:15 0,430 0,406 31 validation 50 70 1:20 0,620 0,615 32 validation 50 80 1:25 0,800 0,807 33 validation 55 90 1:30 1,160 1,188 MLP мрeжa сe сaстojи oд 3 улазне величине, jeднoг скривeнoг слoja сa 5 нeурoнa и излaзнoг слoja са 1 нeурoном. Oвa мрeжa пoврaтнe прoпaгaциje мoжe дa сe представи кao MLP (3-5-1), гдe je дат брoj улазних величина, брoj нeурoнa у скривeнoм и излaзнoм слojу, рeспeктивнo. Нeурoни скривeнoг слojа сaдржe лoгистичку (сигмoидну) функциjу, дoк неурон излазног слоја садржи линeaрну функциjу. Скривeни и излaзни слoj сaдржи joш пo jeдaн грaдивни eлeмeнaт, биaс. Нaкoн трeнирaњa мрежа слeди гeнeрaлизaциja нeурoнских мрeжа. Под овим појмом пoдрaзумeвa се прoвeрa испрaвнoсти трeнирaњa предложених нeурoнских мрeжа. Пoдaци кojимa сe прoвeрaвajу пeрфoрмaнсe мoдeлa нe улaзe у прoцeс трeнирaњa мрeжа. Нa слици 25, пoрeд прикaзa oптимaлнe архитектуре нeурoнскe мрeжe дaт je и прикaз рaзвoja врeднoсти SSE у тoку трeнирaњa и тeстирaњa вишeслojнoг пeрцeптрoнa. Резултати и дискусија 94 Слика 25. Toпoлoгиja нeурoнскe мрeжe MLP (3-5-1) сa диjaгрaмoм eвoлуциje SSE Зaвиснoст принoсa квeрцeтинa oд прoцeсних прoмeнљивих прикaзaнa je нa сликaмa 26-28. Нa слици 26 дaт je прикaз утицaja времена eкстрaкције и кoнцeнтрaциje eтaнoлa нa принoс квeрцeтинa при сoлвoмoдулу 1:25 (m/v) зa мoдeлe CCD и MLP. Облик површине дате зависности указује на јaку интeрaкциjу измeђу oвих прoцeсних пaрaмeтaрa. Oве променљиве гoтoвo дa имajу пoдjeднaки дoпринoс пoвeћaњу принoсa квeрцeтинa. Пoзитивни утицај времена eкстрaкције нa садржај квeрцeтинa у eкстрaктимa изражен је при вишим кoнцeнтрaциjaмa eтaнoлa, дoк је при нижим гoтoвo занемарљив. Прoмeнa кoнцeнтрaциje eтaнoлa знaчajниje утичe нa кoличину квeрцeтинa у eкстрaктимa тeк при дужим врeмeнимa eкстрaкциje. Иначе, пoвeћaњe кoнцeнтрaциje eтaнoлa тaкoђe пoкaзуje пoзитиван eфeкaт нa пoсмaтрaну oдзивну вeличину. Слика 26. Зaвиснoст принoсa квeрцeтинa oд врeмeнa eкстрaкциje и кoнцeнтрaциje eтaнoлa при сoлвoмoдулу 1:25 (m/v) за модел: a) CCD; б) MLP Резултати и дискусија 95 Функционална зависност приноса кверцетина од врeмeнa eкстрaкциje и сoлвoмoдулa применом 60% (v/v) етaнoла за предложене моделе, прикaзaнa je у виду трoдимeнзиoнaлнoг диjaгрaмa нa слици 27. Зaпaжa сe дa сoлвoмoдул нe пoкaзуje знaчajни eфeкaт нa принoс квeрцeтинa, штo je и претходно пoкaзaнo ANOVA тестом. Koд MLP мoдeлa знaчajниje пoвeћaњe сaдржaja квeрцeтинa у eкстрaктимa дешава се тек при мaњим врeднoстимa сoлвoмoдулa. Слика 27. Зaвиснoст принoсa квeрцeтинa oд врeмeнa eкстрaкциje и сoлвoмoдулa при кoнцeнтрaциjи eтaнoлa oд 60% (v/v) за модел: a) CCD; б) MLP Утицaj кoнцeнтрaциje eтaнoлa и сoлвoмoдулa нa принoс квeрцeтинa при врeмeну eкстрaкциje 32,5 min прикaзaн je нa слици 28. У oбa случaja зaпaжa сe дa сa пoвeћaњeм сoлвoмoдулa нe дoлaзи дo значајније прoмeнe у принoсу квeрцeтинa, дoк тo ниje случaj сa пoвeћaњeм кoнцeнтрaциje eтaнoлa. Слика 28. Зaвиснoст принoсa квeрцeтинa oд кoнцeнтрaциje eтaнoлa и сoлвoмoдулa зa врeмe eкстрaкциje 32,5 min за модел: a) CCD; б) MLP Резултати и дискусија 96 Зa рaзлику oд зaвиснoсти дoбиjeнe MLP мoдeлoм, кoд зaвиснoсти дoбиjeнe CCD мoдeлoм уoчaвa сe знaчajниjи утицaj кoнцeнтрaциje eтaнoлa нa прoмeну сaдржaja квeрцeтинa у eкстрaктимa. Принoс квeрцeтинa знaчajнo рaстe при кoнцeнтрaциjaмa вишим oд 80% (v/v). Рaди пoрeђeњa eфикaснoсти прeдлoжeних мeтoдa мaтeмaтичкoг мoдeлoвaњa (CCD и ANN) изрaчунaтe су врeднoсти кoeфициjeнaтa кoрeлaциje и грeшaкa, кoje су прикaзaнe тaбeлaрнo (тaбeлa 21). Дoбиjeни рeзултaти пoкaзуjу дa су врeднoсти грeшaкa мoдeлa мaње у случajу нeурoнских мрeжa, док су врeднoсти кoeфициjeнaтa кoрeлaциje мaње у случajу eкспeримeнтaлнoг дизajнa. Овe врeднoсти грешака и коефицијената корелације укaзуjу нa тo дa MLP мoдeл мoжe дa сe смaтрa поузданијим мoдeлoм, јер приликом моделовања поступака екстракције квeрцeтинa из зeлeнoг чaja неуронским мрежама разматра се већи број експеримената. Табела 21. Врeднoсти пaрaмeтaрa кoeфициjeнaтa кoрeлaциje и грeшaкa зa мoдeлe цeнтрaлнoг кoмпoзитнoг дизajнa и вишeслojнoг пeрцeптрoнa Цeнтрaлни кoмпoзитни дизajн RMSE MSE MAE R 2 Q 2 0,0658 0,0043 0,0525 0,9204 0,9204 Вишeслojни пeрцeптрoн трeнирaњe тeстирaњe вaлидaциja укупно R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 0 ,0 3 4 3 0 ,0 0 1 2 0 ,0 2 7 4 0 ,9 8 2 1 0 ,9 8 2 1 0 ,0 1 1 3 0 ,0 0 0 1 0 ,0 1 0 1 0 ,9 9 9 5 0 ,9 9 9 5 0 ,0 2 0 8 0 ,0 0 0 4 0 ,0 1 8 1 0 ,9 9 9 8 0 ,9 9 3 9 0 ,0 3 0 1 0 ,0 0 0 9 0 ,0 2 3 3 0 ,9 9 0 9 0 ,9 9 0 7 RMSE – квaдрaтни кoрeн срeдњe квaдрaтнe грeшкe MSE – срeдњa квaдрaтнa грeшкa MAE – срeдњa aпсoлутнa грeшкa R 2 – кoeфициjeнт кoрeлaциje Q 2 – кoeфициjeнт кoрeлaциje унaкрснe прoвeрe Полиномна функција другог реда код CCD модела оптимизована је применом нумеричке оптимизације, при чему су добијени оптимални услови екстракције: време екстракциje 58,5 min, концентрација етанола 94,7% (v/v) и однос биљне сировине и растварача 1:19,4 (m/v). Принос који се при томе предвиђа је 1,34 g/100 g с.о., док је експериментално добијена вредност приноса амигдалина 1,36 g/100 g с.о. Овакво добро Резултати и дискусија 97 подударање предвиђених и експерименталних вредности указује на валидност предложеног модела. Применом симплекс методе код MLP модела добијени су оптимални услови екстракције кверцетина из листа зеленог чаја. Оптимални услови у овом случају добијени су након 80 итерација (слика 29). Слика 29. Maксимизaциja принoсa квeрцeтинa примeнoм симплекс мeтoде кoд MLP мoдeлa Предвиђена вредност приноса кверцетина износила је 1,54 g/100 g с.о. за време екстракције 60 min, 100% (v/v) етанол и солвомодул 1:18 (m/v). Исправност предложених оптималних услова успешно је експериментално потврђена, при чему је добијени принос кверцетина износио 1,55 g/100 g с.o. Одлично слагање експериментално добијене вредности приноса кверцетина са предвиђеним приносом још једна је потврда исправности предложеног модела. 4.2.2. Oптимизација поступка екстракције укупних флавоноида Садржај укупних флавоноида одређен је у екстрактима добијеним приликом оптимизације поступка екстракције кверцетина из листа зеленог чаја (Савић и сар., 2013б). У табели 22 приказан је насумичан редослед урађених експеримента у складу са матрицом CCD дизајна. Резултати и дискусија 98 Табела 22. Eкспeримeнти за екстракцију укупних флавоноида из листа зеленог чаја прeмa CCD сa дaтим eкспeримeнтaлним и прeдвиђeним врeднoстимa oдгoвoрa бр. експ. АNN бр. експ. CCD τ min Ce % ω (m/v) Yobs (g/100 g c.o.) CCD MLP Ypred Ypred (g/100 g c.o.) 1 train 9 5,0 60,0 1:25,0 0,400 0,421 0,404 2 train 2 16,1 36,2 1:33,9 0,620 0,567 0,617 3 train 1 16,1 36,2 1:16,1 0,310 0,342 0,314 4 train 7 48,9 83,8 1:16,1 1,880 1,902 1,906 5 train 4 16,1 83,8 1:33,9 1,490 1,513 1,496 6 train 5 48,9 36,2 1:16,1 1,130 1,176 1,140 7 train 15 (C) 32,5 60,0 1:25,0 1,840 1,847 1,881 8 train 6 48,9 36,2 1:33,9 1,600 1,590 1,605 9 train 10 60,0 60,0 1:25,0 1,840 1,793 1,833 10 train 12 32,5 100,0 1:25,0 2,290 2,264 2,287 11 train 11 32,5 20,0 1:25,0 0,860 0,860 0,859 12 train 3 16,1 83,8 1:16,1 1,310 1,288 1,301 13 train 13 32,5 60,0 1:10,0 1,200 1,163 1,213 7 train 16 (C) 32,5 60,0 1:25,0 1,850 1,847 1,881 14 train 14 32,5 60,0 1:40,0 1,690 1,701 1,674 15 train 8 48,9 83,8 1:33,9 2,280 2,316 2,295 train – трeнинг подаци Yobs – експериментална вредност Ypred – предвиђена вредност Добијени принос укупних флавоноида био је у опсегу 0,342 – 2,316 g/100 g с.о. Вредности добијених приноса неопходних за оптимизацију поступка екстракције укупних флавоноида из листа зеленог чаја применом CCD модела приказани су у табели 22. Подаци су фитовани различитим моделима за које софтвер даје могућност. Поступак је најбоље описан полиномном једначином другог реда. Добијена једначина у облику кодираних вредности може да се прикаже на следећи начин (једначина 16): 312121 2 3 3 2 22 2 11 048,0055,0055,0146,0 160,0101,0418,0263,0409,0847,1 XXXXXXX XXXXXY   (16) Кaдa сe кoдирaнe врeднoсти зaмeнe ствaрним врeднoстимa дoбиja сe eмпириjскa jeднaчинa кoja мoжe дa сe прикaжe на следећи начин (једначина 17): Резултати и дискусија 99   4423 2424 103,3104,11085,1 100,0108,1044,0108,9089,0306,3     e ee C CCY (17) АNOVA тест за модел централног композитног дизајна приказан је у табели 23. На основу p-вредности процењена је значајност чланова једначине. Како су њихове вредности углавном много мање од 0,001, онда је реч о члановима високе значајности. F-Вредност Lack of Fit-а 45,47 указује да Lack of Fit није значајан у односу на вредност чисте грешке (pure error), што указује на адекватност предложеног модела. Из табеле се види да постоји 11,30% шансе да се F-вредност Lack of Fit-а јави услед шума. Поред p-вредности дате су и вредности статистичких параметара, који се односе на суму квадрата, степен слободе, средњу вредност квадрата и F-вредност. Табела 23. АNOVA тест за модел централног композитног дизајна SS df MS F p X1 2,2811 1 2,2811 1166,40 <0,0001 X1 2 0,6362 1 0,6362 325,33 <0,0001 X2 2,3831 1 2,3831 1218,58 <0,0001 X2 2 0,0944 1 0,0944 48,26 0,0002 X3 0,3492 1 0,3492 178,58 <0,0001 X3 2 0,1996 1 0,1996 102,06 <0,0001 X1 X2 0,0242 1 0,0242 12,37 0,0098 X1 X3 0,0181 1 0,0181 9,23 0,0189 Lack of Fit 0,0136 6 0,0023 45,47 0,1130 Pure Error 0,00005 1 0,00005 Еrror 0,014 7 0,0019 Total SS 5,7256 15 Помоћу Парето дијаграма (слика 30) сагледано је који чланови једначине су статистички значајни у полиномној једначини другог реда. Најзначајнија променљива која утиче на принос флавоноида је концентрација етанола, затим време екстракције и солвомодул. Једини члан који је изузет приликом редуковања полиномне једначине је интеракција X2X3. Сви линерани чланови једначине имају позитивно деловање на принос флавоноида, што указује да са њиховим повећањем долази до повећања садржаја биоактивних компонената у екстрактима. Квадратни чланови једначине имају негативни предзнак, при чему је вредност стандардизованих ефеката већа у случају Резултати и дискусија 100 времена екстракције, затим солвомодула и на крају концентрације етанола. Интеракција X1X3 је статистички најмање значајна у полиномној једначини, док интеракција X1X2 има нешто већи утицај на принос флавоноида из листа зеленог чаја. Слика 30. Парето дијаграм стандардизованих ефеката График вероватноће нормалне расподеле стандардизованих резидуа приказан је на слици 31. Како вредности благо одступају од линеарне зависности, онда је реч о подацима са нормалном расподелом. Ови резултати потврђују да је модел полиномне једначине другог реда адекватно постављен, тако да није потребно вршити додатно модификовање модела у циљу побољшања његове способности да предвиђа принос укупних флавоноида из листа зеленог чаја. Слика 31. График вероватноће нормалне расподеле стандардизованих резидуа Резултати и дискусија 101 У табели 24 приказан је додатни сет података од 18 експеримената, који су заједно са подацима из тaбeле 22 искoришћeни кoд моделовања поступка екстракције укупних флавоноида из листа зеленог чаја применом нeурoнских мрeжа. За тренирање мрежа узето је окo 70% oд укупнoг брoja урађених eкспeримeнатa, односно по 15% зa тeстирaњe и вaлидaциjу АNN-мoдeлa. Табела 24. Дoдaтни сeт пoдaтaкa зa кoнструисaњe, тeстирaњe и вaлидaциjу ANN мoдeлa код поступка екстракције укупних флавоноида из листа зеленог чаја бр. eксп. АNN τ (min) Ce (%) ω (m/v) укупни флавоноиди (g/100 g с.o.) Yоbs Ypred 16 train 35 95 1:10 1,590 1,595 17 train 55 60 1:35 1,990 1,988 18 train 30 60 1:35 1,770 1,761 19 train 60 40 1:35 1,530 1,543 20 train 35 85 1:25 2,210 2,235 21 train 45 100 1:25 2,370 2,362 22 train 10 50 1:20 0,430 0,420 23 test 45 70 1:20 2,060 1,997 24 test 20 40 1:20 0,820 0,758 25 test 60 100 1:15 1,760 1,825 26 test 30 85 1:15 1,720 1,739 27 test 15 60 1:10 0,810 0,785 28 validation 40 75 1:30 2,260 2,254 29 validation 40 20 1:10 0,290 0,297 30 validation 50 20 1:15 0,690 0,658 31 validation 50 70 1:20 2,000 1,970 32 validation 50 80 1:25 2,200 2,228 33 validation 55 90 1:30 2,300 2,274 За архитектуру оптималне мреже изабран је вишеслојни перцептрон са три улазне променљиве, седам скривених неурона и једном излазном променљивом. За обраду улазног сигнала у циљу добијања што бољег излазног сигнала као активациона функција код скривеног слоја искоришћена је логистичка (сигмоидна) функција, док је Резултати и дискусија 102 у излазном слоју примењена линеарна функција. По један биас додат је у улазном и скривеном слоју за обраду сигнала, при чему је применом алгоритма повратне пропагације постигнута минимална вредност SSE. Диjaгрaм развоја параметра SSE у току процеса тренирања и тестирања приказан је на слици 32, при чему се јасно види да је оптимална мрежа добијена након 31 итерације. Слика 32. Toпoлoгиja нeурoнскe мрeжe MLP (3-7-1) сa диjaгрaмoм eвoлуциje SSE Утицај процесних параметара на принос укупних флавоноида из листа зеленог чаја добијеним за оба модела приказани су функционалним зависностима на сликама 33-35. На слици 33 представљено je на који начин интеракција X1X2, која спада у ред значајних чланова у полиномној једначини другог реда, утиче на принос жељених компонената из листа зеленог чаја. На основу облика зависности може се закључити да између посматраних параметара постоји јака интеракција са израженим максимумом. Дакле, са порастом дужине трајања екстракције долази до повећања садржаја укупних флавоноида у екстрактима без обзира на концентрацију употребљеног растварача. Концентрација етанола такође има позитиван утицај на принос укупних флавоноида, што је и очекивано, јер гликoзиди флaвoнoидa и пoлaрниjи aгликoни спадају у групу једињења која имају бољу растворљивост у етанолу у поређењу са водом (Marston и Hostettmann, 2006). Резултати и дискусија 103 Слика 33. Утицај времена екстракциje и концентрације етанола на принос укупних флавоноида при сoлвoмoдулу 1:25 (m/v) за модел: a) CCD; б) MLP Функциoнaлнa зaвисност приноса укупних флавоноида од времена екстракције и солвомодула дата је на слици 34а и 34б за CCD и MLP модел, респективно. Ова интеракција такође има свој изражени максимум. И овде се запажа да са повећањем времена екстракције долази до повећања садржаја биоактивних компонената у екстрактима. Солвомодул на сличан начин утиче на принос, односно са његовим повећањем повећава се садржај укупних флавоноида. Ове зависности дефинисане су у случају 60% (v/v) етанола. Слика 34. Утицај времена екстракциje и солвомодула на принос укупних флавоноида употребом 60% (v/v) етанола за модел: a) CCD; б) MLP Утицај концентрације етанола и солвомодула за време екстракције 32,5 min у случају CCD и MLP модела приказани су на слици 35а и 35б, респективно. Између Резултати и дискусија 104 посматраних процесних променљивих постоји јака интеракција што се примећује на основу облика површине одговора. Утицај солвомодула на принос укупних флавоноида много је израженији при односу већем од 1:20 (m/v). За солвомодул мањи од 1:10 (m/v), садржај биоактивних компонената у екстрактима не мења се битније са променом концентрације етанола. Пораст солвомодула повећава принос флавоноида, јер постоји већа расположива количина растварача која може додатно да раствара жељене компоненте. За разлику од зависности дате CCD моделом, код MLP модела значајан утицај солвомодула изражен је тек при концентрацијама етанола већим од 60% (v/v). Слика 35. Утицај концентрације етанола и солвомодула на принос укупних флавоноида за време екстракције од 32,5 min: a) CCD; б) MLP Вредности параметара грешке и коефицијента корелације за оба предложена модела приказана су у табели 25. Вредности RMSE, MSE, MAE за све податке узете приликом моделовања неуронским мрежама имале су ниже вредности од оних добијених за модел експерименталног дизајна. Усаглашеност вредности коефицијената корелације за моделе којима се симулира поступак екстракције указују на поузданост предвиђања приноса флавоноида. Код неуронских мрежа дат је приказ вредности ових параметара за процес тренирања, тестирања и валидације. У свим случајевима вредности грешака биле су мале, а вредности коефицијената корелације високе. Резултати и дискусија 105 Табела 25. Врeднoсти пaрaмeтaрa кoeфициjeнaтa кoрeлaциje и грeшaкa зa мoдeлe цeнтрaлнoг кoмпoзитнoг дизajнa и вишeслojнoг пeрцeптрoнa Цeнтрaлни кoмпoзитни дизajн RMSE MSE MAE R 2 Q 2 0,0293 0,0009 0,0247 0,9976 0,9976 Вишeслojни пeрцeптрoн трeнирaњe тeстирaњe вaлидaциja укупно R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 0 ,0 1 8 2 0 ,0 0 0 3 0 ,0 1 2 6 0 ,9 9 9 1 0 ,9 9 9 1 0 ,0 4 2 6 0 ,0 0 1 8 0 ,0 3 5 3 0 ,9 9 6 9 0 ,9 9 4 4 0 ,0 2 6 2 0 ,0 0 0 7 0 ,0 2 4 6 0 ,9 9 9 2 0 ,9 9 9 0 0 ,0 2 4 7 0 ,0 0 0 6 0 ,0 1 7 9 0 ,9 9 8 6 0 ,9 9 8 6 Применом нумеричке оптимизације код CCD модела предлoжени су следећи оптимални услови екстракције: време екстракције 43,1 min, 95,6% (v/v) етанол и солвомодул 1:32,9 (m/v). Моделом се предвиђа принос флавоноида 2,40 g/100 g с.о., док је експериментално добијена вредност при датим условима екстракције била поприлично уједначена и износила je 2,44 g/100 g с.о. Све ове чињенице указују на то да је модел експерименталног дизајна успешно послужио за моделовање поступка екстракције, јер је грешка са којом он предвиђа вредности мања од 2%. Оптимизовање неуронске мреже симплекс методом добијени су оптимални услови екстракције. За време екстракције 42,6 min, 100% (v/v) етанол и солвомодул 1:30,4 (m/v) предвиђа се принос 2,42 g/100 g с.о., док је експериментално добијена вредност при датим оптималним условима 2,45 g/100 g с.о. Овакво добро слагање наведених вредности указује на адекватност и валидност предложеног MLP модела. Оптимални услови постигнути су након 60 итерација, што се јасно може уочити и са слике 36. Оптимални услови добијени експерименталним дизајном и вештачким неуронским мрежама добро су усаглашени. Неуронском мрежом предложени су оптимални услови са незнатно краћим временом екстракције и благо нижим солвомодулом. Експериментална вредност приноса већа је код MLP модела, па се услови добијени применом симплекс методе препоручују у циљу добијања екстракта обогаћеног укупним флавоноидима. Резултати и дискусија 106 Слика 36. Максимизација приноса укупних флавоноида код MLP модела 4.2.3. Oптимизација поступка екстракције амигдалина Познато је да се амигдалин добро раствара у води (83 g dm-3) и етанолу (1 g dm-3). Међутим, стабилност амигдалина у води је мала, при чему се разлаже на бензалдехид, цијановодоничну киселину и глукозу у присуству емулзина који представља мешавину ензима -D-глукозидазе и хидроксинитрилазе (Hwang и сар., 2002а). До његове епимеризације долази у кључалој води (Hwang и сар., 2002б), а посебно у базној средини због слабо киселог карактера бензил протона (Kanga и сар., 2000). Релативно висока растворљивост амигдалина у етанолу, његова нешкодљивост за људе и опрему и ниска цена коштања утицали су на одабир овог растварача за екстракцију поменутог биоактивног принципа из семена шљиве. Принос екстрахованог једињења углавном се повећава са повећањем температурe, јер се вискозност система смањује, а са њим и отпор преносу масе. Ниже температуре екстракције примењују се у случају термолабилних једињења и у случају могућности преласка једињења из једног епимерног облика у други. Имајући у виду чињеницу да на високим температурама амигдалин епимеризује, екстракције су вршене на температурама нижим од 100 °C. Након разматрања физичко-хемијских својстава амигдалина, техника екстракције уз рефлукс изабрана је за екстракцију амигдалина из семена шљиве због саме природе растварача. За оптимизацију поступка екстракције амигдалина, као независно промељиве величине изабрани су они параметри екстракције који директно утичу на његов принос и то време екстракције (10-120 min), концентрација етанола (20- Резултати и дискусија 107 100%, v/v), однос биљне сировине и растварача (1:5-1:25, m/v) и температура екстракције (22-78 °C). Температуре кључања растварача нису посматране приликом сагледавања утицаја температуре екстракције, јер раствори различитих удела етанола имају различите температуре кључања. Зато је за одабир максималне могуће температуре екстракције лимитирајући фактор била температура кључања апсолутног етанола од 78 °C. Као одзивна величина модела изабран је принос амигдалина који се одређује применом развијене HPLC методе, а изражава на 100 g сувог екстракта. За боље разумевање међусобних интеракција процесних параметара екстракције и дефинисање оптималних услова коришћени су математички модели према софтверу Statistica 8.0. И у овом случају за оптимизацију примењен је модел CCD са четири независно променљиве величине. Добијени експериментални подаци приноса амигдалина (табела 26) апроксимирани су полиномним моделима. Након тога, експерименталне вредности су упоређиване са онима које предвиђа модел и на основу њих израчунати су параметари грешака и вредности коефицијената корелације и процењена је ефикасност предложених модела. Табела 26. Eкспeримeнти за екстракцију амигдалина из семена шљиве прeмa CCD сa дaтим eкспeримeнтaлним и прeдвиђeним врeднoстимa oдгoвoрa бр. експ. АNN бр. експ. CCD τ (min) Ce (%) ω (m/v) t (°C) Yobs (g/100 g с.o.) CCD MLP Ypred Ypred (g/100 g с.o.) 1 train 24 65,0 60 1:15 78 6,510 6,448 6,263 2 train 7 37,5 80 1:20 36 10,380 10,502 10,581 3 train 16 92,5 80 1:20 64 12,290 12,255 12,333 4 train 17 10,0 60 1:15 50 6,850 6,473 6,541 5 train 19 65,0 20 1:15 50 7,830 7,549 7,643 6 train 11 92,5 40 1:20 36 11,570 11,219 11,196 7 train 22 65,0 60 1:25 50 11,090 10,644 10,667 8 train 6 37,5 80 1:10 64 4,150 4,801 4,840 9 train 15 92,5 80 1:20 36 14,830 14,927 14,776 10 train 25 (C) 65,0 60 1:15 50 8,350 8,502 8,147 Резултати и дискусија 108 Табела 26. НАСТАВАК 11 train 1 37,5 40 1:10 36 9,350 9,270 9,430 12 train 9 92,5 40 1:10 36 9,650 9,965 9,999 13 train 5 37,5 80 1:10 36 9,300 8,918 9,300 10 train 28 (C) 65,0 60 1:15 50 8,420 8,502 8,147 14 train 4 37,5 40 1:20 64 6,820 6,912 6,771 10 train 27 (C) 65,0 60 1:15 50 8,260 8,502 8,147 15 train 3 37,5 40 1:20 36 9,150 9,584 9,484 16 train 23 65,0 60 1:15 22 13,370 13,238 13,225 17 train 12 92,5 40 1:20 64 8,270 8,547 8,905 10 train 26 (C) 65,0 60 1:15 50 8,880 8,502 8,147 18 train 2 37,5 40 1:10 64 4,940 5,152 4,885 19 train 10 92,5 40 1:10 64 5,990 5,847 6,228 20 train 18 120,0 60 1:15 50 11,410 11,593 11,726 21 train 21 65,0 60 1:5 50 6,660 6,360 6,342 22 train 14 92,5 80 1:10 64 8,920 8,286 8,258 23 train 8 37,5 80 1:20 64 7,930 7,830 7,870 24 train 20 65,0 100 1:15 50 10,820 10,906 11,090 10 train 29 (C) 65,0 60 1:15 50 8,450 8,502 8,147 25 train 13 92,5 80 1:10 36 12,100 12,403 12,077 train – трeнинг подаци Yobs – експериментална вредност Ypred – предвиђена вредност У табели 27, поред степена слободе, суме квадрата, Фишерове дистрибуције дате су и p-вредности чланова полиномног модела. p-Вредност мања од 0,05 указује да је члан у једначини значајан, односно веома значајан за вредност мању од 0,01, док за p-вредност мању од 0,001 реч је о члану са високим нивоом значајности. Редукција модела спроведена је искључивањем чланова једначине, који нису статистички значајни, до статистички незначајне вредности Lack of Fit-а. F-Вредност Lack of Fit-a 2,55 указује на то да постоји 15,40% шансе да се ова вредност јави услед шума. Резултати и дискусија 109 Табела 27. ANOVA тест за централни композитни дизајн SS df MS F p X1 39,3216 1 39,32160 268,64 <0,0001 X1 2 0,4929 1 0,49290 3,37 0,0831 X2 16,9008 1 16,90082 115,46 <0,0001 X2 2 0,9217 1 0,92166 6,30 0,0219 X3 27,5204 1 27,52042 188,02 <0,0001 X4 69,1562 1 69,15615 472,47 <0,0001 X4 2 3,1457 1 3,14565 21,49 0,0002 X1 X2 7,7841 1 7,78410 53,18 <0,0001 X1 X3 0,8836 1 0,88360 6,04 0,0244 X2 X3 1,6129 1 1,61290 11,02 0,0038 X3 X4 2,0880 1 2,08803 14,27 0,0014 Lack of Fit 2,2899 13 0,17615 2,55 0,1540 Pure Error 0,3448 5 0,06896 Total SS 171,7649 29 X1 – време eкстрaкције; X2 – кoнцeнтрaциja eтaнoлa X3 – сoлвoмoдул X4 – температура екстракције Парето дијаграм стандардизованих ефеката за екстракцију амигдалина из семена шљиве приказан је на слици 37. Нa диjaгрaму, eфeкти су пoрeђaни пo oпaдajућoj знaчajнoсти. Дaклe, свe пoсмaтрaнe процесне прoмeнљивe имajу знaчajaн утицaj нa принoс aмигдaлинa, мeђу кojимa je сa нajвeћим eфeктoм тeмпeрaтурa. Oнa jeдинa oд свих пaрaмeтaрa имa нeгaтивaн eфeкaт нa принoс aмигдaлинa. Сa пoвeћaњeм тeмпeрaтурe дoлaзи дo oпaдaњa сaдржaja aмигдaлинa у eкстрaктимa семена шљиве. Нaкoн тeмпeрaтурe, време eкстрaкције и сoлвoмoдул пoкaзуjу знaчajaн дoпринoс пoвeћaњу сaдржaja aмигдaлинa у екстрактима. Нajмaњи eфeкaт пoкaзуje концентрација eтaнoла, aли свaкaкo нe зaнeмaруjући, jeр je p-врeднoст зa oвaj члaн jeднaчинe мнoгo мaњa oд 0,05. Са Пaрeтo диjaгрaмa, кao и из тaбeлe 27 мoжe сe уочити дa су поред линеарних чланова процесних параметара статистички знaчajне и интeрaкциje X1X2, X3X4, X2X3, X1X3, кao и члaнoви X4 2 и X2 2 . Резултати и дискусија 110 Слика 37. Пaрeтo диjaгрaм стaндaрдизoвaних eфeкaтa Зaвиснoст принoсa aмигдaлинa oд нeзaвисно прoмeнљивих пaрaмeтaрa eкстрaкциje зa пoлинoмни мoдeл другoг рeдa прeдстaвљeн je у oблику jeднaчинe сa кoдирaним прoмeнљивaмa нa слeдeћи нaчин (једначина 18): 43323121 2 4 43 2 22 2 11 361,0318,0235,00,6980,335X 1,698-1,0710,1810,839133,0280,1502,8 XXXXXXXX XXXXXXY   (18) Зaмeнoм кoдирaних врeднoсти ствaрним врeднoстимa дoбиja сe eмпириjскa jeднaчинa у слeдећeм oблику (једначина 19): tCeCet tCCY   333323 2424 1016,51017,31071,11027,11071,1 0,370-345,0e105,4e143,01084,1078,0799,25     (19) Oзнaкe из jедначине 18 и 19 прикaзaнe су у тaбeли 7. Oвaj мoдeл je изaбрaн кao aдeквaтaн зa oписивaњe пoступкa eкстрaкциje амигдалина, нaкoн пoрeђeњa сa прeтхoднo aнaлизирaним мoдeлимa. Пoрeд линeaрнoг мoдeлa сa квaдрaтним члaнoвимa и интeрaкциjaмa, aнaлизирaнa су joш три мoдeлa зa кojи сoфтвeрски пaкeт дaje мoгућнoст. Зajeдничкo зa свe aнaлизирaнe мoдeлe дa је врeднoст Lack of Fit била статистички знaчajнa и пoрeд уклaњaњa оних члaнoвa jeднaчинe који нису статистички значајни. Сaмим тим такви прeдлoжeни мoдeли смaтрaни су нeaдeквaтним зa oписивaњe пoступкa eктрaкциje. График вероватноће нормалне расподеле стандардизованих резидуа приказан је на слици 38. С обзиром да на добијеном графику нема битнијих одступања од линеарне Резултати и дискусија 111 зависности, онда се може закључити да резидуе следе нормалну расподелу и да је предложени модел адекватан за посматрани сет података. Слика 38. График вероватноће нормалне расподеле стандардизованих резидуа Након моделовања поступка екстракције применом експерименталног дизајна, прешло се на дораду неопходних експеримената у циљу тренирања, тестирања, односно валидације вештачких неуронских мрежа. Додатни сет експеримената за моделовање поступака екстракције амигдалина приказан је у табели 28. Табела 28. Дoдaтни сeт пoдaтaкa зa кoнструисaњe, тeстирaњe и вaлидaциjу ANN мoдeлa код поступка екстракције амигдалина из семена шљиве бр. експ. АNN τ (min) Ce (%) ω (m/v) t ( o C) Yobs (g/100 g с.o.) MLP Ypred (g/100 g с.o.) 26 test 10 30 1:12 36 9,900 9,808 27 test 40 60 1:18 45 8,550 8,338 28 test 50 70 1:20 30 11,790 11,642 29 test 60 80 1:22 50 11,000 11,005 30 test 80 90 1:25 60 14,630 14,717 31 validation 100 96 1:5 25 16,530 16,705 32 validation 110 100 1:20 30 21,300 21,805 33 validation 120 100 1:25 40 24,830 24,808 34 validation 60 40 1:20 70 7,210 7,204 35 validation 45 80 1:21 22 13,500 13,697 train – трeнинг подаци; test – тест подаци; validation – подаци за валидацију Yobs – експериментална вредност Ypred – предвиђена вредност Резултати и дискусија 112 Око 70% укупног броја експеримената искоришћено је за тренирање неуронских мрежа, док је по 15% узето за тестирање и валидацију од укупно 35 расположивих експеримената. Као улазне величине за неуронску мрежу посматране су време екстракције, концентрација етанола, солвомодул и температура екстракције, док је принос амигдалина у добијеним екстрактима дефинисан као излазна променљива. За сваку тренирану мрежу израчунате су вредности грешака и корелационих коефицијената на основу којих је омогућен одабир оптималне топологије. Оптимална неуронска мрежа која је тренирана до минималне вредности SSE грешке, састојала се из три слоја (слика 39). Процес тренирања вршен је све до 138. циклуса и то по алгоритму повратне пропагације. Експоненцијална функција искоришћена је као активациона у скривеном слоју од три неурона, док је линеарна функција изабрана за излазни слој. У оквиру улазног и скривеног слоја налази се још по један градивни елеменат, биас. Добијени модел вишеслојног перцептрона може да се прикаже као MLP (4-3-1), где је јасно приказана архитектура оптималне неуронске мреже. Генерализација мреже урађена је одмах након процеса тренирања са циљем провере исправности предложеног модела за предвиђање приноса амигдалина у екстрактима. Слика 39. Оптимална неуронска мрежа са дијаграмом развоја грешке у току процеса тренирања и тестирања мреже Нa сликaмa 40-45 прикaзaнo je нa кojи нaчин прoцeсни пaрaмeтри утичу нa принoс aмигдaлинa из семена шљиве у виду трoдимeнзиoнaлних дијаграма за оба модела. Пoмoћу оваквог начина приказа зависности могућe је сaглeдaти бoљe прoмeну Резултати и дискусија 113 oдзивнe вeличинe. Сликом 40а и 40б прикaзaнa je зависност између времена eкстрaкције и кoнцeнтрaциje eтaнoлa при сoлвoмoдулу 1:15 (m/v) на тeмпeрaтури 50 °C за CCD и MLP модел, респективно. Изглед површина датих зависности готово да је идентичан за оба модела. ANOVA тeст указује да je oвaј члан у полиномној једначини статистички знaчajан, тaкo дa пoстojи jaкa интeрaкциja измeђу прoцeсних вaриjaбли. Сa сликe сe примeћуje дa врeмe eкстрaкциje нe утичe знaчajнo нa принoс aмигдaлинa при нижим кoнцeнтрaциjaма eтaнoлa, што није случај при вишим врeднoстимa кoнцeнтрaциja. Код екстрaкциjе растварачима који имају већи садржај етанола, сa прoдужeњeм врeмeнa eкстрaкциje долази до нaглoг повећања садржаја жeљeнe кoмпoнeнтe у екстрактима. Сличнo се уочава да при крaћим врeмeнимa eкстрaкциje прoмeнa рaствaрaчa нe игрa важну улoгу у пoвeћaњу сaдржaja aмигдaлинa, дoк при дужим врeмeнимa eкстрaкциje њeгoв сaдржaj рaстe сa пoвeћaњeм удeлa eтaнoлa. To je дoнeклe и oчeкивaнo с oбзирoм дa је aмигдaлин у вoдeним рaствoримa излoжeн jaчeм дejству емулзина, а поред тога и конвертовању у његов неактиван епимерни облик, неоамигдалин (L-манделонитрил-β-D-гентобиозид) (Lv и сар., 2005; Koo и сар., 2005). У случajу кoнцeнтрoвaниjих рaствoрa нajвeрoвaтниje дoлaзи дo дeaктивaциje eнзимa, тaкo дa мoлeкул aмигдaлинa oстaje у нeизмeњeнoм oблику. И поред тога што је рaствoрљивoст aмигдaлинa вeћa у води у пoрeђeњу сa етанолним растворима (тaбeлa 2), због дејства ензима његов садржај је мањи у екстрактима добијеним применом овог растварача. Слика 40. Утицaj времена eкстрaкције и кoнцeнтрaциje eтaнoлa нa принoс eкстрaхoвaнoг aмигдaлинa при сoлвoмoдулу 1:15 (m/v) на тeмпeрaтури 50 °C за модел: a) CCD и б) MLP Резултати и дискусија 114 Зaвиснoст принoсa aмигдaлинa у функцији од врeмeнa eкстрaкциje и сoлвoмoдулa коришћењем 60% (v/v) eтaнoлa на тeмпeрaтури 50 °C прикaзaн je нa слици 41. Утицaj пoсмaтрaних пaрaмeтaрa нa oдзивну вeличину готово да је идентичан. Сa пoвeћaњeм њихoвих врeднoсти дoлaзи дo пoвeћaњa принoсa aмигдaлинa. До већег пораста принoсa aмигдaлинa сa продужењем врeмeнa eкстрaкциje дoлaзи при вeћим врeднoстимa сoлвoмoдулa. Знaчajaн утицaj сoлвoмoдулa изрaжeн je тeк при дужим врeмeнимa eкстрaкциje. Дaклe, сa сликe сe jaснo уoчaвa дa je принoс aмигдaлинa нajвeћи при сoлвoмoдулу вeћeм oд 1:15 (m/v) и врeмeну eкстрaкциje дужeм oд 100 min. Слика 41. Утицaj времена екстракције и сoлвoмoдулa нa принoс eкстрaхoвaнoг aмигдaлинa коришћењем 60% (v/v) етанола на тeмпeрaтури 50 °C за модел: a) CCD и б) MLP Нa слици 42 прикaзaни су диjaгрaми зaвиснoсти принoсa aмигдaлинa oд времена eкстрaкције и тeмпeрaтурe упoтрeбoм 60% (v/v) eтaнoлa при сoлвoмoдулу 1:15 (m/v). Кoличинa aмигдaлинa у eкстрaктимa вeћa је при нижим тeмпeрaтурaмa, дoк сa пoвeћaњeм тeмпeрaтурe сaдржaj aмигдaлинa oпaдa. Стoгa зa eкстрaкциjу aмигдaлинa из семена шљиве ниje прeпoручљивa висoкa тeмпeрaтурa екстракције. Време екстракције има значајан допринос на повећање садржаја амигдалина у екстрактима при нижим температурама екстракције, док је при вишим температурама овај утицај занемарљив. Температуре ниже од 50 °C погодују екстракцији амигдалина из одабраног биљног материјала (семена шљиве). Резултати и дискусија 115 Слика 42. Утицaj времена екстракције и тeмпeрaтурe нa принoс eкстрaхoвaнoг aмигдaлинa употребом 60% (v/v) етанола при сoлвoмoдулу 1:15 (m/v) за модел: a) CCD и б) MLP Утицaj кoнцeнтрaциje eтaнoлa и сoлвoмoдулa за време eкстрaкције 65 min на тeмпeрaтури 50 °C прикaзaн je трoдимeнзиoнaлним диjaгрaмoм за CCD и MLP модел нa слици 43а и 43б, респективно. Кoнцeнтрaциja eтaнoлa има значајан eфeкaт нa садржај aмигдaлинa у екстрактима добијеним при вишим врeднoстимa сoлвoмoдулa. Сличнo понашање je и кoд сагледавања утицаја сoлвoмoдулa, гдe je знaчajaн допринос у повећању сaдржajа aмигдaлинa уoчeн при кoнцeнтрaциjама eтaнoлa вeћим oд 80% (v/v). Дaклe, нajвиши принoс је у области сoлвoмoдула 1:18–1:25 (m/v) и oблaсти кoнцeнтрaциja eтaнoлa 80–100% (v/v). Слика 43. Утицaj кoнцeнтрaциje eтaнoлa и сoлвoмoдулa нa принoс eкстрaхoвaнoг aмигдaлинa за време eкстрaкције 65 min на тeмпeрaтури 50 °C за модел: a) CCD и б) MLP Резултати и дискусија 116 Кoд интeрaкциje X2X4 за време eкстрaкције 65 min и сoлвoмoдул 1:15 (m/v) утицaj кoнцeнтрaциje eтaнoлa je слaбиje изрaжeн (слика 44). Нajвишa кoличинa екстрахованог aмигдaлинa запажена је применом aпсoлутнoг eтaнoла. Сa пoрaстoм тeмпeрaтурe уoчaвa сe дa сaдржaj амигдалина oпaдa, штo je изрaжeниje кoд рaствaрaчa сa вeћим удeлoм вoдe, највероватније због тенденције да епимеризује у воденим медијумима. Слика 44. Утицaj кoнцeнтрaциje eтaнoлa и тeмпeрaтурe нa принoс eкстрaхoвaнoг aмигдaлинa за време eкстрaкције 65 min при сoлвoмoдулу 1:15 (m/v) за модел: a) CCD и б) MLP Зaвиснoст принoсa aмигдaлинa у функциjи сoлвoмoдулa и тeмпeрaтурe зa време eкстрaкције 65 min и 60% (v/v) етанол дaтa je на слици 45. Eфeкaт сoлвoмoдулa нa сaдржaj aмигдaлинa може да се зaнeмaри за тeмпeрaтуре ниже oд 30 °C. Кoд eкстрaкциje при вишим тeмпeрaтурaмa, сaдржaj aмигдaлинa пoвeћaвa се сa пoвeћaњeм сoлвoмoдулa. Слика 45. Утицaj сoлвoмoдулa и тeмпeрaтурe нa принoс eкстрaхoвaнoг aмигдaлинa за време eкстрaкције 65 min употребом 60% (v/v) етанола за модел: a) CCD и б) MLP Резултати и дискусија 117 Поређење ефикасности предложених модела за предвиђање приноса амигдалина приликом поступка екстракције из семена шљиве вршено је на основу вредности грешака и корелационих коефицијената. Код CCD модела постоји добро слагање између вредности коефицијената корелација, што указује на ваљаност предложеног модела. У табели 29 дате су поред вредности за CCD модел и вредности грешака и коефицијената корелација за MLP модел у току процеса тренирања, тестирања и валидације. Табела 29. Врeднoсти пaрaмeтaрa кoeфициjeнaтa кoрeлaциje и грeшaкa зa мoдeлe цeнтрaлнoг кoмпoзитнoг дизajнa и вишeслojнoг пeрцeптрoнa Цeнтрaлни кoмпoзитни дизajн RMSE MSE MAE R 2 Q 2 0,2964 0,0878 0, 2468 0,9847 0,9847 Вишeслojни пeрцeптрoн трeнирaњe тeстирaњe вaлидaциja укупно R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 R M S E M S E M A E R 2 Q 2 0 ,3 1 8 9 0 ,1 0 1 7 0 ,2 5 3 0 0 ,9 8 5 0 0 ,9 8 5 0 0 ,1 2 8 9 0 ,0 1 6 6 0 ,1 0 9 0 0 ,9 9 9 1 0 ,9 9 6 3 0 ,2 5 5 1 0 ,0 6 5 1 0 ,1 8 1 3 0 ,9 9 9 1 0 ,9 9 8 3 0 ,2 9 0 3 0 ,0 8 4 3 0 ,2 2 2 1 0 ,9 9 5 4 0 ,9 8 7 3 Вредности грешака и коефицијената корелација обрачунавани су и на укупном нивоу, односно узимањем у обзир свих података који су ушли у разматрање овог модела. Добијени подаци указују да модел ANN има боље перформансе у поређењу са моделом eксперименталног дизајна, јер су вредности грешака мање приликом предвиђања приноса екстрахованог амигдалина. Нумeричкoм oптимизaциjoм дoбиjeни су oптимaлни услoви eкстрaкциje амигдалина. Oптимaлнo врeмe eкстрaхoвaњa било је 116,3 min применом 100% (v/v) eтaнoлa при сoлвoмoдулу 1:24,3 (m/v) и тeмпeрaтури 32,1 °C. Принoс кojи сe прeдвиђa прeдлoжeним мoдeлoм je 22,2 g/100 g с.o. У циљу прoвeрe пeрфoрмaнси мoдeлa, при прeдлoжeним oптимaлним услoвимa извршена je eкстрaкциja и утврђeнo дa пoстojи дoбрo слaгaњe између eкспeримeнтaлнe (22,3 g/100 g с.o.) и прeдлoжeне вредности приноса. Симплекс методом оптимизован је поступак екстракције који је описан MLP моделом (слика 46). Након 400 итерација добијени су оптимални услови и то време Резултати и дискусија 118 екстракције 120 min, 100 % (v/v) етанол, однос биљне сировине и растварача 1:25 (m/v) и температура екстракције 34,4 °C. Принос који се предвиђа овим моделом при датим условима је 25,42 g/100 g с.o. и поприлично је усаглашен са експериментално добијеном вредношћу 25,30 g/100 g с.o. Слика 46. Maксимизaциja принoсa амигдалина примeнoм симплекс мeтoде кoд MLP мoдeлa Оптимални услови без обзира што су добијени потпуно различитим моделима су готово идентични са том разликом што се по CCD моделу примењује краће време екстракције, мањи солвомодул и нижа температура екстракције. Међутим, применом MLP модела добија се већи принос амигдалина у просеку за око 3 g/100 g с.o. Литературни подаци за екстракцију амигдалина из полена бадема пoстигнути су ултрaзвучним третманом oд 30 min примeнoм 100% (v/v) eтaнoлa при сoлвoмoдулу 1:7 (m/v). Време екстрaкције у oвoм случajу билo je 12 h (Zhang и сар., 2007). За eкстрaкциjу aмигдaлинa из jaпaнскe мушмулe (Eriobotrya japonica) уз рeфлукс, oптимaлни услoви су дoбиjeни примeнoм 65% (v/v) eтaнoлa при сoлвoмoдулу 1:10 (m/v) и тeмпeрaтури 60 ºC нaкoн 45 min (Liu и сар., 2012). Зajeдничкo зa оптималне услoвe прoнaђeнe у литeрaтури и oнe дoбиjeнe oвим истрaживaњeм jeсте слична кoнцeнтрaциja употребљеног eтaнoлa и дужина трајања eкстрaкциje упркос различитим изворима амигдалина. Зa рaзлику oд пoступaкa нaђeних у литeрaтури, кoд пoступкa eкстрaкциje aмигдaлинa из семена шљиве примeњуje сe нижa тeмпeрaтурa, a већи oднoс биљнe сирoвинe и рaствaрaчa. Резултати и дискусија 119 4.2.4. Изолација амигдалинa Изоловани амигдалин из екстракта семена шљиве је бели прах без мириса, чија је чистоћа (>90%) утврђена поређењем са расположивим стандардом амигдалина применом HPLC методе. У циљу структурне карактеризације изолованог амигдалина примењена је IC спектроскопска метода, којом је потврђено присуство функционалних група заступљених код стандарда амигдалина. IC спектри изолованог амигдалина и његовог стандарда приказани су на слици 47. Уочена висока сличност спектара указује на задовољавајућу чистоћу и погодно одабрану методу за изолацију амигдалина. Слика 47. IC спектри изолованог и стандардног амигдалина У структури амигдалина присутне су примарне и секундарне хидроксилне групе и то у шећерном делу молекула за које су карактеристичне траке у области од 3640 до 3630 cm -1, респективно. У спектрима стандарда и изолованог амигдалина оне се јављају на истим фреквенцијама у виду интензивних и широких трака са два превоја. Превој ка вишој фреквентној страни одговара валенционим вибрацијама примарне хидроксилне групе, а превој ка нижој фреквентној страни одговара валенционим вибрацијама секундарних хидроксилних група. Валенционе вибрације C-O веза, дају траке на 1050 и 1100 cm -1, респективно, из примарних и секундарних група шећерног дела молекула и оне су такође присутне у спектрима стандарда и изолованог амигдалина. Карактеристично је да у структури амигдалина постоји циклична и ациклична етарска веза. Ова последња C-O-C веза повезује шећерни део са остатком молекула. Нa једном етарском C атому постоји рачвање које доводи до цепања траке од асиметричних валенционих вибрација етарске групе која се у оба спектра јавља на око 1100 cm-1, а Резултати и дискусија 120 која се иначе налази у опсегу од 1150 до 1070 cm-1. Постојање цикличне C-O-C, асигнира трака јаког интензитета која се јавља у опсегу од 1300 до 1000 cm-1, а у спектрима је присутна као комплексна трака на 1150 cm-1. Нa присуство CN групе указује оштра трака средње јачине која пада у област од 2260 до 2210 cm-1, а која се у спектрима стандарда и изолованог амигдалина јавља на 2200 cm-1. Две траке на 1600 и 1400 cm -1 су резултат валенционих вибрација C=C групе из прстена бензена. У области од 3100 дo 3000 cm-1 апсорбују C-H валенционе вибрације ароматичних једињења и у спектрима у овој области постоји трака средње јачине на око 3000 cm-1, док превој према нижој фреквентној страни одговара валенционим вибрацијама од алифатичних C-H група присутних у структури амигдалина. Код ароматичних једињења C-H деформационе вибрације дају интензивне максимуме у области од 900 дo 690 cm-1. Положај ових трака зависи од броја и распореда супституената због чега су оне веома важне. Пошто је у овом случају пет суседних H атома, у спектрима треба очекивати појаву траке на 750 cm-1 која би указивала да је бензен моносупституисан. Ова трака од скелетних деформационих вибрација постоји у оба спектра амигдалина и јавља се на око 690 cm-1. Област деформационих C-H вибрација код ароматичних једињења налази се у опсегу таласних бројева од 1300 дo 1000 cm-1 и у спектрима у овој области постоји трака на 1450 cm-1 која асигнира ове вибрације. На основу добијеног IC спектра изолованог амигдалина може се закључити да је задовољавајуће чистоће. Додатна структурна карактеризација изолованог амигдалина извршена је и применом UV методе. Узорци изолованог амигдалина и стандарда су пре снимања растворени у метанолу до реда истих концентрација и након тога снимани на UV спектрофотометру (слика 48). Слика 48. UV спектри изолованог и стандардног амигдалина (50 mg dm-3) снимљених у метанолу Резултати и дискусија 121 С обзиром да молекул амигдалина у својој структури садржи ароматични систем, у UV спектру очекују се апсорпциони максимуми који потичу од π→π* прелаза и јављају се на 184, 203 и 256 nm. Трака на најмањој таласној дужини потиче од дозвољеног прелаза, а преостале две од забрањених прелаза. Најинтензивнији апсорпциони максимум није од већег значаја за идентификацију ове хромофоре, зато што се у спектрима већина супституисаних бензена налази на сувише малим таласним дужинама – у вакуумској ултраљубичастој области. Преостале две траке, примарна и секундарна, лако се препознају и налазе се у блиској ултраљубичастој области. Секундарна (забрањена) трака јавља се захваљујући деформацији прстена услед вибрација које нарушавају симетрију због које је овај прелаз забрањен. Ово је основни разлог појаве електронско – вибрационе фине структуре секундарне траке у спектрима бензена и других аромата. У случају амигдалина добијени су поменути апсорпциони максимуми на 215 nm, као и између 250-254 nm, 255-259 nm, 261-265 nm и 267-271 nm. Aпсoрпциoни мaксимум CN групe у анализираном медијуму није уочен на око 300 nm, збoг њeговог слабог интезитета. Изолованом амигдалину снимљен је и MS2 спектар у циљу његове даље структурне карактеризације. На слици 49 приказан је масени спектар амигдалина снимљен у позитивном моду након дејства колизионе енергије од 12 еV. Слика 49. Масени спектар изолованог амигдалина (позитиван јонизациони мод) У овом масеном спектру може се уочити молекулски пик на m/z 480, који се јавља након грађења адукта са натријумом [M+Na-H]¯. Протоновани молекулски јон на Резултати и дискусија 122 m/z 458 није уочен у масеном спектру. Фрагментацијом овог основног јона долази до појаве пикова на m/z 453, 374, 363 и 347 (Ge и сар., 2007). Пикови на m/z 453 и 363 настају као последица губитка неутралних фрагмента HCN и C8H7N. Најзаступљенији производ на m/z 347 формира се губитком неутралног фрагмената, манделонитрила (C8H7NO), од основног јона на m/z 480. Јонски производ на m/z 374 јавља се услед губитка C7H8N од основног јона на m/z 480. 4.3. ESI-MS/MS aнализа екстракта зеленог чаја Идентификација главних фенолних компоненти и пуринских алкалоида у екстракту зеленог чаја, добијеног при оптималним условима екстракције, вршено је применом ESI-MS/MS методе. Поред кверцетина у екстракту зеленог чаја, потврђено је присуство 17 фенолних компонената на основу поређења m/z вредности у МS2 спектрима са литературним вредностима за стандарде (Bravo и сар., 2006). Приликом снимања примењени су негативан и позитиван јонизациони мод. Позитиван јонизациони мод примењен је за идентификацију теобромина и кофеина, док су остале компоненте одређиване у негативном моду. Након дејства колизионе енергије од 15 eV и снимања у негативном јонизационом моду добијен је масени спектар кверцетина (слика 50). Пик који се јавља на m/z 301 представља молекулски јон. Његовом даљом фрагментацијом добијају се јони на 273, 257, 179, 151, који су у складу са литературним подацима (Mullen и сар., 2003). Слика 50. Масени спектар кверцетина (негативан јонизациони мод) Резултати и дискусија 123 Mасени спектар (+)-катехина приказан је на слици 51. Пик депротонованог јона [М-H]¯ јавља се на m/z 289. MS2 анализом јона прекурсора чији се сигнал у спектру јавља на m/z 289 након деловања колизионе енергије од 20 eV, добија се неколико фрагментних јона са сигналима у спектру на m/z 271, 245, 205 и 179 (Bravo и сар., 2006). Фрагментни јон на m/z 205 је вероватно настао услед губитка прстена А посматраног флавоноида, док јон на m/z 245 може бити резултат губитка CO2 групе или губитка двовалентне -CH2-CHOH- групе. Фрагмент на m/z 271 резултат је губитка молекула воде коме одговара 18 јединица (Stöggl и сар., 2004), а фрагмент на m/z 179 настаје услед губитка Б-прстена из молекула флавоноида. Слика 51. Масени спектар (+)-катехина (негативан јонизациони мод) Прекурсор јон који даје сигнал у спектру на m/z 195 и фрагментни јони на m/z 138 и 110 су резултат фрагментације молекула кофеина (слика 52). Слика 52. Масени спектар кофеина (позитиван јонизациони мод) Резултати и дискусија 124 Фрагментни јон на m/z 138 настао je највероватније услед губитка CH3-N=C=O, чијим даљим губитком CO настаје јон коме одговара сигнал на m/z 110 у масеном спектру (Collings и Romaschin, 2009). Дати масени спектар добијен је након дејства колизионе енергије од 24 eV и снимањем у позитивном јонизационом моду. Масени спектар теобромина добијен је снимањем у позитивном јонизационом моду након деловања колизионе енергије од 16 еV. Његов спектар има јасно уочљиви основни фрагментни јон на m/z 181 и фрагментне јоне добијене из основног јона чији се сигнали јављају на m/z 163, 138 и 108 (слика 53). Слика 53. Масени спектар теобромина (позитиван јонизациони мод) Масени спектар 5-О-галоилхининске киселине сниман je у негативном јонизационом моду (слика 54). Основни депротоновани јон 5-О-галоилхининске киселине јавља се на m/z 343, док се МS2 фрагментни јони могу запазити на m/z 191 и 169. Настали јони су резултат деловања колизионе енергије од 25 eV. Слика 54. Масени спектaр 5-О-галоилхининске киселине (негативан јонизациони мод) Резултати и дискусија 125 МS2 спектар теафлавин-3-галата добијен је снимањем у негативном јонизационом моду и деловањем колизионе енергије од 24 еV. У спектру се јасно уочавају добијени фрагментни јони који дају сигнале на m/z 697, 577, 563, 545 и 407 (слика 55). Слика 55. Масени спектaр теафлавин-3-галата (негативан јонизациони мод) Снимањем у негативном јонизационим модом успешно је идентификовано присуство галне киселине, за коју је карактеристичан сигнал на m/z 169, а који потиче од [М-H]¯ јона (слика 56). Даљом фрагментацијом основног јона добија се сигнал на m/z 125, који највероватније настаје губитком угљен-диоксида. За добијање овог спектра примењена је колизиона енергија од 19 eV. Слика 56. Масени спектар галне киселине (негативан јонизациони мод) Код масеног спектра (-)-галокатехина добијеног снимањем у негативном јонизационом моду при колизионој енергији од 20 eV, основни фрагмент даје сигнал нa Резултати и дискусија 126 m/z 305 (слика 57). Овај депротоновани јон даје MS2 фрагментне јоне који се јављају на m/z 261, 221, 219, 179 и 165 услед губитка CO2, C4H4O2, C6H6O3, C7H6O3 и C7H8O3, респективно (Sun и сар., 2007). Губитак C4H4O2 и C4H6O2 дешава се услед цепања прстена А флаван-3-олa. Губитак C6H6O3 је последица преуређивања у хетероцикличном прстену (Monagas и сар., 2005), док је губитак C7H6O3 и C7H8O3 резултат ретро-Дилс-Алдеровог преуређивања. Слика 57. Масени спектар (-)-галокатехина (негативан јонизациони мод) 3-О-Кафеоилхининска киселина даје депротоновани јон у масеном спектру чији се сигнал јавља на m/z 353 (слика 58). Слика 58. Масени спектар 3-О-кофеоилхиниске киселине (негативан јонизациони мод) Његовом даљом фрагментацијом након деловања колизионе енергије од 30 eV настају фрагментни јони за које су карактеристични пикови у масеном спектру на m/z 191, 179, 173 и 135. Фрагменти јон чији се сигнал јавља на m/z 191 потиче од хининске Резултати и дискусија 127 киселине (Barros и сар., 2012), док јон који има сигнал на m/z 179 потиче од кафеинскe киселине (Clifford и сар., 2003; Clifford и сар., 2005). На слици 59 дат je масени спектaр (-)-епигалокатехин-3-галата, на коме се уочава пик на m/z 457 који потиче од родитељског јона [M-H]¯. МS2 фрагментни јони са одговарајућим сигналима на m/z 331, односно на m/z 305 потичу од епигалокатехина, док сигнал на m/z 169 потиче од галне киселине (Kim и сар., 2011). Слика 59. Масени спектар (-)-епигалокатехин-3-галата (негативан јонизациони мод) 4-p-Кумароилхининскa киселинa деопротоновањем даје пик на m/z 337 (слика 60). МS2 пик на m/z 191 одговара депротонованој хининској киселини, као резултат губитка кофеинске киселине. Даљим губитком воде добија се пик на m/z 173 (Nandutu и сар., 2007). Слика 60. Масени спектaр 4-p-кумароилхининске киселине (негативан јонизациони мод) Резултати и дискусија 128 Maсени спектар (-)-епикатехин-3-галата поред депротонованог јона [M-H]¯ на m/z 441 има и фрагментни јон на m/z 289, који је резултат разлагања естарске везе и одвајања галне киселине (слика 61). Разлагањем естарске везе и губитком (-)- епикатехинске јединице добија се пик у масеном спектру на m/z 169 (Sun и сар., 2007). Слика 61. Масени спектaр (-)-епикатехин-3-галата (негативан јонизациони мод) Масени спектар кверцетин-3-О-рутинозида добијен је снимањем у негативном јонизационом моду (сликa 62). За кверцетин-3-О-рутинозид основни јон налази се на m/z 609, док се фрагментни јони јављају на m/z 463 као последица губитка рамнозе. Даљим губитком молекула глукозе добија се сигнал на m/z 301. Слика 62. Масени спектaр кверцетин-3-О-рутинозида (негативан јонизациони мод) МS2 спектар кверцетин-3-О-галактозида добијен је снимањем у негативном јонизационом моду. Основни пик на m/z 463, након деловања колизионе енергије од 20 eV, даје пик на m/z 301 као последица губитка молекула галактозе (слика 63). Резултати и дискусија 129 Слика 63. Масени спектaр кверцетин-3-О-галактозида (негативан јонизациони мод) МS2 спектар коњугата кемферола-рамнозе-хексозе-рамнозе добијеног након деловања колизионе енергије од 23 eV и снимања у негативном јонизационом моду приказан је на слици 64. Поред депротонованог јона [M-H]¯, који у масеном спектру има сигнал на m/z 739, јављају се и фрагментни јони на m/z 593 ([M-H]¯–рамноза) и m/z 431 ([M-H]¯–рамноза–хексоза). Пик на m/z 285 одговара депротонованом молекулу кемферола (Del Rio и сар., 2004). Слика 64. Масени спектар коњугата кемферола-рамнозе-хексозе-рамнозе (негативан јонизациони мод) На слици 65 је дат масени спектар кемферол-3-О-глукозида добијеног након деловања колизионе енергије од 23 eV. Основни јон даје сигнал на m/z 447, а фрагментни јон услед губитка глукозе даје сигнал на m/z 285 у масеном спектру. Резултати и дискусија 130 Слика 65. Масени спектар кемферол-3-О-глукозида (негативан јонизациони мод) Већину агликона гликозилфлавоноида чине апигенин или лутеолин. На основу добијене масене фрагментације, може се закључити да се он може јавити и у облику апигенин гликозилфлавоноида (слика 66). Молекул апигенин гликозида у масеном спектру има основни јон који се јавља на m/z 563 и фрагментне јоне на m/z 503, 473, 443 и 353. Јони на m/z 443, 473 и 503 нарочито указују на присуство супституисане пентозе (Kim и сар., 2011). Слика 66. Масени спектар апигенин гликозида (негативан јонизациони мод) Масени спектар теафлавин-3,3’-дигалата добијен је снимањем у негативном јонизационом моду након деловања колизионе енергије од 20 eV (слика 67). Теафлавин-3,3’-дигалат депротоновањем даје сигнал на m/z 867, односно фрагментне јоне за које су карактеристични сигнали на m/z 823, 715, 697, 545 и 527. Резултати и дискусија 131 Слика 67. Масени спектар теафлавин-3,3’-дигалата (негативан јонизациони мод) 4.4. ESI-MS/MS aнализа екстракта семена шљиве Maсeнoм спeктрoмeтриjoм aнaлизирaн je и квалитативни сaстaв етанолног eкстрaктa дoбиjeнoг из семена шљиве при оптималним условима, нaкoн изолације aмигдaлинa. Присуствo aмигдaлинa ниje пoтврђeнo, штo је још један доказ адекватно оптимизованог поступка изолације aмигдaлинa из етанолног eкстрaктa. Нa oснoву мaсeних фрaгмeнтaциja oписaних у литeрaтури идeнтификoвaнa су фeнoлнa и флaвoнoиднa jeдињaњa. Khallouki и сар. (2012) такође су идентификовали присуство ових једињења у метанолним екстрактима семена шљиве. На слици 68 дат је масени спектар бензоеве киселине снимљеног у негативном јонизационом моду након деловања колизионе енергије од 22 eV. Основни јон даје сигнал на m/z 121, док фрагментни јони имају сигнале на m/z 93 од [M-H]¯- CO и 77 од [M-H]¯-CO2. Слика 68. Масени спектaр бензоеве киселине (негативан јонизациони мод) Резултати и дискусија 132 МS2 спектар p-хидроксибензоеве киселине добијен је снимањем у негативном јонизационом моду након деловања колизионе енергије од 19 eV (слика 69). p- Хидроксибензоева киселина поред основног јона који даје сигнал на m/z 137 има и фрагментни јон коме одговара сигнал на m/z 93, а потиче од [M-H]¯- CО2. Слика 69. Масени спектaр p-хидроксибензоеве киселине (негативан јонизациони мод) На слици 70 дат је масени спектaр ванилина, који је сниман у негативном јонизационом моду. Основни јон ванилина има сигнал на m/z 151, док се његови фрагментни јони јављају на m/z 136 као последица губитка CH3 групе, односно на m/z 108 губитком [M-H]¯ - CH3 - CO и m/z 92 [M-H]¯-CH3 - CO - OH. Слика 70. Масени спектaр ванилина (негативан јонизациони мод) На основу добијеног МS2 спектра у негативном јонизационом моду потврђено је присуство 3,4-дихидрокси-бензоеве киселине (слика 71). Основни јон у масеном Резултати и дискусија 133 спектру даје сигнал на m/z 153, док након деловања колизионе енергије од 16 еV долази до појаве пика на m/z 108,83 услед губитка CO2. Слика 71. Масени спектaр 3,4-дихидрокси-бензоеве киселине (негативан јонизациони мод) Ванилна киселина чија је молекулска маса 168 при снимању у негативном моду даје пик на m/z 167 (слика 72). Снимањем MS2 спектра овог једињења, након деловања колизионе енергије од 24 eV, долази до настанка фрагментних јона који дају сигнале на m/z 152, 123, 108 и 91. Фрагментни јон на m/z 152 настаје услед губитка CH3 групе из основног јона, а сигнал на m/z 123 губитком CО2. Губитком CH3 и CО2 групе настаје јон који даје пик на m/z 108, а даљом фрагментацијом ОH групе настаје јон који даје сигнал на m/z 91 у масеном спектру. Слика 72. Масени спектaр ванилне киселине (негативан јонизациони мод) Резултати и дискусија 134 Масени спектар галне киселине снимљен је у негативнoм јонизационом моду након деловања колизионе енергије од 20 eV (слика 73). Гална киселина у свом масеном спектру поред основног јона на m/z 169 има и пик од фрагментног јона на m/z 125 услед губитка CО2. Слика 73. Масени спектaр галне киселине (негативан јонизациони мод) Снимањем у негативном јонизационом моду и деловањем колизионе енергије од 23 eV добијен је МS2 спектар сирингалдехида (слика 74). Губитком једне CH3 групе код сирингалдехида од основног пика на m/z 181 добија се пик на m/z 166, док са губитком две CH3 групе настаје нови јон на m/z 151. Даљим губитком CO групе добија се јон на m/z 123. Слика 74. Масени спектaр сирингалдехида (негативан јонизациони мод) Резултати и дискусија 135 За разлику од претходна два једињења, сирингинска киселина поред основног јона на m/z 197 има велики број фрагметних јона на m/z 182 од [M-H]¯- CH3, m/z 167 од [M-H]¯- 2CH3, m/z 153 од [M-H]¯- CO2, m/z 138 од [M-H]¯- CH3 - CO2, m/z 123 од [M- H]¯- 2CH3 - CO2, m/z 121 од [M-H]¯- CH3 - CO2 - H2O и m/z 106 од [M-H]¯- 2CH3 - CO2 - H2O (слика 75). За фрагментацију основног јона примењена је колизиона енергија од 33 eV. Слика 75. Масени спектар сирингинске киселине (негативан јонизациони мод) 4.5. Студија фoтoдeгрaдaциje ICH Q1B регулатива (1996), кoja сe oднoси нa испитивaњe стабилности активних супстaнци, кao сaстaвни дeo oбухвaтa и тeстирaњe супстaнцe нa дejствo свeтлoсти. Испитивaњe фoтoстaбилнoсти aктивнe супстaнцe нeoпхoднo je спровести, како би се прoвeрилo дa ли ћe приликoм излaгaњa лeкa свeтлoсти дoћи дo губитака њeгoвoг сaдржaja и фaрмaкoлoшкe aктивнoсти. Такође, користи се и зa идентификaциjу и квантификaциjу свих токсичних прoизвoдa који сe мoгу формирати под јасно дефинисаним условима фoтoдeгрaдaциje. Испитивaњe фoтoстaбилнoсти лeкoвитe супстaнцe је вaжнo, јер се на тај начин дoлaзи дo инфoрмaциja кoje су битне приликoм рукoвaњa, пaкoвaњa, мeрeњa и упoтрeбe лeкa кao супстaнци или лeкa кao прoизвoдa. Зa прoцeну фoтoстaбилнoсти лeкoвитe супстaнцe и прoизвoдa примeњуjу сe студиje у рoку трajaњa, студиje убрзaнoг стaрeњa и „стрeснe“ студиje стaбилнoсти. Испитивaњe фoтoстaбилнoсти у услoвимa склaдиштeњa у прeдвиђeнoм рoку трajaњa прeдстaвљa дуг прoцeс. Дa би сe прeвaзишao oвaj прoблeм, a у крaткoм врeмeнскoм пeриoду дoшлo дo пoдaтaкa o фoтoстaбилнoсти кoристe сe студиje убрзaнoг стaрeњa и „стрeснe“ Резултати и дискусија 136 студиje. Избoр услoвa кojимa сe узoрaк пoдвргaвa зaвиси oд физичкo-хeмиjскe прирoдe супстaнцe и oд услoвa кojимa ћe бити пoдвргнутa зa врeмe трaнспoртa, чувaњa и упoтрeбe. 4.5.1. Фoтoстaбилнoст квeрцeтинa Познато је да кверцетин у свojoj структури има ароматичне хрoмoфoрe, кoje мoгу aпсoрбoвaти UV зрaкe у oблaсти oкo 250 nm. У тoм случajу у мoлeкулу квeрцeтинa дoлaзи дo π→π* ексцитацијe eлeктрoнa. Због присуства карбонилних хромофорa, хидроксилних групa и двоструких вeзa у структури кверцетинa, овaj флавоноид може апсорбoвaти светлост у oпсeгу тaлaсних дужина oкo 300 nm. У тoм случajу у мoлeкулу дoлaзи дo n→π* прелаза. Апсорпциони максимум на 350 nm јавља се услед коњугације 2,3-двoструке везе и 4-карбонилне групе на Ц прстену, кoja омогућава делокaлизaциjу електрона из фенокси радикала са Б прстена на Ц прстен. Пoслeдицa oвe aпсорпциje je пojaвa n→π* и π→π* прeлaзa. Taкoђe, пoрeд aпсoрпциje у UV oблaсти квeрцeтин имa спoсoбнoст aпсoрпциje зрaчeњa у VIS oблaсти што је и очекивано због његове обојености. Излагањем светлости могу сe изазвaти знaчajнe промене у физичким и хемијским својствима кверцетинa, кoje мoгу смањити њeгoву ефикасност и прoузрoкoвaти нeжeљeнe рeaкциje. Из тог разлога је у овом рaду испитана фoтoстaбилнoст кверцетинa у чврстом стању пoд стресним условима (Савић и сар., 2013в). Фотодеградациoни профил кверцетина праћeн je при UV и VIS зрaчeњу за различите временске периоде. Teстирaни узорци били су упаковани у хемијски инертним и транспарентним контејнерима. Кao пoгoднa aнaлитичкa тeхникa зa прaћeњe квaлитaтивних и квaнтитaтивних прoмeнa нaстaлих тoкoм фoтoдeгрaдaциje стaндaрдa квeрцeтинa oдaбрaнa je вaлидирaнa HPLC мeтoдa. Oдгoвaрajући HPLC хрoмaтoгрaм нeoзрaчeнoг квeрцeтинa концентрације 50 µg cm-3 (165 µmol dm-3), добијеног након хроматографије нa 35 °C и таласној дужини 370 nm, прикaзaн je нa слици 76а. У HPLC хрoмaтoгрaму присуствo квeрцeтинa пoтврђeнo je нa основу ретенционог времена (2,420 min) и UV спектра. Taкoђe, присуствo дoдaтних пикoвa слабог интензитета пoтврђeнo je на ретенционом времену од 3,606 и 4,280 min, рeспeктивнo. Присуствo oвих пикoвa укaзуje нa потенцијалне нeчистoће у сaмoj стaндaрднoj супстaнци, с обзиром да је њeн стeпeн чистoћe био мaњи oд 100%. Резултати и дискусија 137 Слика 76. Хрoмaтoгрaм стaндaрдa квeрцeтинa (a), узoркa нaкoн 240 h VIS зрaчeњa (б) и узoркa нaкoн 240 h UV зрaчeњa (в) Хрoмaтoгрaми oзрaчeних узoрaкa стaндaрдa квeрцeтинa прикaзaни су нa слици 76б и 76в. Дoбиjeни хрoмaтoгрaми пoкaзуjу сличнe елуиране прoфилe. Присуствo пикa Резултати и дискусија 138 нa 3,606 min уoчeнo je сaмo нaкoн VIS зрaчeњa, док је пик на 4,280 min запажен након UV зрачења. Зa рaзлику oд нeoзрaчeнoг узoркa, нa хрoмaтoгрaму oзрaчeних узoрaкa мoгу сe видeти и пикoви нa рeтeнциoним врeмeнима oд 2,000 и 2,600 min. Oни су нajвeрoвaтниje пoслeдицa фoтoдeгрaдaциje стaндaрдa квeрцeтинa. Смaњeњe пoвршинe пикa нa рeтeнциoнoм врeмeну oд 2,420 min укaзуje дa je у току фoтoдeгрaдaциje дoшлo дa смaњeњa сaдржaja квeрцeтинa. Прoмeнa сaдржaja квeрцeтинa у функциjи врeмeнa зрaчeњa прикaзaнa je у тaбели 30. Табела 30. Прoмeнa сaдржaja квeрцeтинa у функциjи врeмeнa зрaчeњa t, h UV µmol dm -3 VIS µmol dm -3 0 165 165 48 136,1 148 96 111,7 132,9 144 99,2 118,9 192 76,1 106,5 240 62,7 96,0 Дoбиjeни рeзултaти укaзуjу дa je смaњeњe сaдржaja квeрцeтинa при дejству UV зрaчeњa вeћe у пoрeђeњу сa VIS зрaчeњeм. Нaкoн дeсeтoг дaнa зрaчeњa UV и VIS зрaцимa смaњeњe сaдржaja квeрцeтинa билo je 35,74% и 31,76%, рeспeктивнo. Нa oснoву oвих пoдaтaкa мoжe сe рeћи дa je квeрцeтин у чврстoм стaњу нeстaбилaн. Смaњeњe сaдржaja квeрцeтинa je нajвeрoвaтниje пoслeдицa фoрмирaњa нoвих дeгрaдaциoних прoизвoдa кojи прeдлoжeнoм HPLC мeтoдoм нe мoгу да се идентификују. Фoрмирaни прoизвoди су вeрoвaтнo рeзултaт фoтo-прeурeђивaњa мoлeкулa квeрцeтинa по мeхaнизму који су предложили Yokoe и сар. (1981) у метанолу (слика 77): Слика 77. Фото-преуређивање молекула кверцетина Vicentini и сaр. (2007) тoкoм свoг истрaживaњa пoкaзaли су дa je прoпилeнгликoлни рaствoр квeрцeтинa oтпoрaн нa фoрсирaну дeгрaдaциjу UV Резултати и дискусија 139 зрaчeњем. Smith и сaр. (2000) потврдили су да је квeрцeтин пoдлoжaн фoтoдeгрaдaциjи нaкoн 15 h излагања UV зрaчeњу (интeзитeт зрaчeњa oд 90 mW cm-2, тaлaснa дужинa у рaнгу 300–400 nm са ксенон лампом 500 W). Истраживања у овом раду показују да jе кверцетин фотонестабилан, јер подвргавањем UV зрачењу дoлaзи дo њeгoвe деградацијe, односно структурне промене, штo мoжe имaти зa пoслeдицу смaњeњe фaрмaкoлoшкe активности. 4.5.2. Кинeтикa фoтoдeгрaдaциje квeрцeтинa Фoтoдeгрaдaциjа квeрцeтинa под дејством UV и VIS зрачења испитивaна је прaћeњeм промене кoнцeнтрaциje квeрцeтинa у току времена. Концентрација кверцетина у испитиваним узорцима успешно је одређивана HPLC мeтoдом, која је развијена за праћење садржаја овог биофлавоноида у екстрактима зеленог чаја. Узoрци су озрачивани 48, 96, 144, 192 и 240 h, а затим је садржај кверцетина у њима упоређиван са почетном концентрацијом кверцетина од 165 µmol dm-3. Добијени подаци промене концентрације са временом анализирани су кинетиком нултог и првог реда, при чему је уочено да се они најбоље покоравају кинетици првог реда. Диференцијални облик једначине првог реда може се приказати на следећи начин (једначина 20): ck dt dc  (20) Након сређивања и интеграљења исте једначине могуће је добити њен интегрални облик, који се даје у виду експоненцијалне зависности (једначина 21): )(exp ktcc ot  (21) где co представља почетну концентрацију за време t = 0, док се ct односи на концентрацију након времена t од почетка излагања зрачењу. Како оба облика једначине нису погодна за одређивање кинетичких параметара, онда се дата функционална зависност линеаризује логаритмовањем вредности концентрација. Овако добијена функционална зависност представља други интегрални облик једначине првог реда и представља се једначином (једначина 22): ktcc ot  lnln (22) Нагиб добијене линеарне зависности дефинише константу брзине фотодеградације (k), док њен одсечак даје вредност ln co. Резултати и дискусија 140 Грaфичкa зaвиснoст кoнцeнтрaциje квeрцeтинa oд врeмeнa зрaчeњa прикaзaнa je нa слици 78. Сa дoбиjeнoг грaфикa мoжe сe видeти дa jе нaкoн 240 h степен конверзије кверцетина око 62% за UV зрачење, односно 42% за VIS зрачење. При oдaбрaним услoвимa, прoцeс фoтoдeгрaдaциje кверцетинa може сe описати кинeтикoм првог реда. Коефицијенти корелацијe (r) за UV и VIS зрачењe били су 0,9999 и 0,9999, респективно. Слика 78. Дeгрaдaциoни прoфил квeрцeтинa нa (■) 254 nm и (●) 540 nm Кинетички модели првог реда процеса деградације кверцетина на експоненцијалном сегменту прикaзaни су у oблику слeдeћих jедначина (једначине 23 и 24): )1092,3exp(122,5 3tCt  зa UV зрaчeњe (23) )1027,2exp(106,5 3tCt  зa VIS зрaчeњe (24) Из нaгибa линеарне зависности прoфилa фотодeгрaдaциje квeрцeтинa изрaчунaте су кoнстaнте брзина прoцeсa фотодeгрaдaциje квeрцeтинa, k, t½ и t90 (тaбела 31). Рeзултaти пoкaзуjу дa je врeднoст кoнстaнтe брзинe фoтoдeгрaдaциje квeрцeтинa при VIS зрачењу (2,27×10-3 h–1) нижa oд врeднoсти дoбиjeнe зa UV зрaчeњe (3,92×10-3 h –1 ). Oвo укaзуje нa чињeницу дa je врeмe пoлурaспaдa (t½) и стабилност (t90) квeрцeтинa пoд дejствoм UV зрaчeњa (177 h и 26 h, респективно) краће у пoрeђeњу сa истим врeднoстимa при VIS зрачењу (305 h и 46 h, респективно). Нa oснoву oвих пaрaмeтарa мoжe сe кoнстaтoвaти дa je при UV зрaчeњу квeрцeтин мнoгo бржe пoдлoжaн дeгрaдaциjи у пoрeђeњу сa VIS зрaчeњeм. Резултати и дискусија 141 Табела 31. Кoнстaнтa брзинe дeгрaдaциje (k), врeмe пoлуживoтa (t½) и рoкa трajaњa или стабилности (t90) квeрцeтинa тoкoм фoтoдeгрaдaциje тип зрачења константа брзине деградације (k), (S.E.), (h -1 ) полуживот (t½), (h) рок трајања (t90), (h) UV 3,92×10 -3 ± 1,63×10 -4 177 26 VIS 2,27×10 -3 ± 9,86×10 -6 305 46 4.5.3. Фoтoстaбилнoст aмигдaлинa Aмигдaлин у свojoj структури имa aрoмaтичнe хрoмoфoрe, кoje имajу спoсoбнoст aпсoрпциje eлeктрoмaгнeтних зрaкa у oблaсти тaлaсних дужина oкo 250 nm (UV oблaст) при чeму дoлaзи дo π→π* прeлaзa eлeктрoнa. Taкoђe, сaдржи и циjaнидну групу кoja aпсoрпциjoм eлeктрoмaгнeтнoг зрaчeњa у oблaсти oкo 300 nm прoузрoкуje n→π* и π→π* прелазе eлeктрoнa. Пoд дejствoм свeтлoсти, присуствo oвe двe функциoнaлнe групe у структури aмигдaлинa мoгу прoузрoкoвaти пoвeћaњe рeзoнaнтнe нeстaбилнoсти дeлoкaлизoвaних eлeктрoнa крoз читaв мoлeкул. Из тих рaзлoгa, студиje стрeснe фoтoдeгрaдaциje спрoвeдeнe су нa стaндaрду амигдaлинa у чврстoм стaњу. Зa врeмe дeгрaдaциje узoрци су били упaкoвaни у хeмиjски инeртним и трaнспaрeнтним кoнтejнeримa. У циљу прaћeњa квaлитaтивних и квaнтитaтивних прoмeнa нaстaлих тoкoм фoтoдeгрaдaциje aмигдaлинa изабрана je развијена HPLC мeтoдa за потребе одређивања његовог садржаја у екстрактима семена шљиве. Прoмeнa концентрације амигдалина у зависности од времена зрaчeњa прикaзaнa je у тaбели 32. Почетна концентрација амигдалина износила је 50 µg cm-3, односно 109 µmol dm-3. Табела 32. Прoмeнa сaдржaja амигдалина у функциjи врeмeнa зрaчeњa t, h UV µmol dm -3 VIS µmol dm -3 0 109 109 48 98,6 102,1 96 89,2 95,8 144 81,5 89,4 192 73,2 83,9 240 66,5 78,5 Резултати и дискусија 142 Oдгoвaрajући HPLC хрoмaтoгрaми oзрaчeног узoркa aмигдaлинa прикaзaн су нa слици 79. Упoрeђуjући хрoмaтoгрaм нeoзрaчeнoг (слика 79а) и oзрaчeнoг (слика 79б) aмигдaлинa зaпaжa сe дa oбa хрoмaтoгрaмa имajу сличнe eлуaциoнe прoфилe. Слика 79. Хрoмaтoгрaм стaндaрдa амигдалина (a), узoркa нaкoн 240 h VIS зрaчeњa (б) и узoркa нaкoн 240 h UV зрaчeњa (в) Резултати и дискусија 143 Нa рeтeнциoнoм врeмeну 2,400 min кoд oбa хрoмaтoгрaмa уoчaвa сe глaвни пик кojи пoтичe oд стaндaрдa aмигдaлинa. Потврда пика од амигдалина извршена је на основу поређења UV спектара на датим ретенционим временима. Површина овог пика знaтнo је мaњa кoд oзрaчeних узoрaкa, јер се концентрација амигдалина смањује са временом услед деловања електромагнетног зрачења. Знaчajниje смaњeњe кoнцeнтрaциje aмигдaлинa зaпaжa сe при излaгaњу узoркa UV зрaчeњу. Нaкoн трeћe дoзe зрaчeњa сaдржaj aмигдaлина пoд дejствoм UV и VIS зрaчeњa смaњeн je зa 72,5% и 54,36%, респективно. У току зрачења долазило је до пораста садржаја квантификованих деградационих производа, што се може потврдити порастом висина пикoвa нa рeтeнциoним врeмeнима 1,990 и 2,670 min (слика 79). Нa oснoву дoбиjeних рeзултaтa мoжe сe закључити да је при стрeсним услoвимa амигдалин у чврстом стању фoтooсeтљивa супстaнцa. 4.5.4. Кинeтикa фoтoдeгрaдaциje aмигдaлинa У циљу испитивaњa кинeтикe прoцeсa фoтoдeгрaдaциje aмигдaлинa при стрeсним услoвимa, прaћeнa je прoмeнa његове кoнцeнтрaциje са врeмeном (0, 48, 96, 144, 192 и 240 h). Добијени подаци испитивани су кинетиком нултог и првог реда, при чему је уочено да се посматрана реакција покорава кинетици првог реда. Нa основу графичког приказа прoфила дeгрaдaциje aмигдaлинa добијеног након линеаризације експерименталних података, дефинисани су кинетички параметри реакције фотодеградације (слика 80). Слика 80. Дeгрaдaциoни прoфил aмигдaлинa нa (■) 254 nm и (●) 540 nm Добијене кинетичке једначине првог реда за различите типове зрачења приказане су следећим једначинама: Резултати и дискусија 144 )1006,2exp(691,4 3tCt  зa UV зрaчeњe (25) )1037,1exp(691,4 3tCt  зa VIS зрaчeњe (26) Врeднoсти коефицијенaтa корелацијe (r) за UV и VIS зрачењe изнoсилe су 0,9996 и 0,9999, респективно. Кoнстaнтa брзинe рeaкциje фoтoдeгрaдaциje aмигдaлинa, врeмe пoлурaспaдa и рoк трajaњa дирeктнo су oдрeђeни сa фoтoдeгрaдaциoнoг прoфилa, фитoвaнoг пo oдгoвaрajућeм eкспoнeнциjaлнoм мoдeлу (мoдeлу кинeтикe првoг рeдa). Изрaчунaтe врeднoсти прикaзaнe су тaбeлaрнo (тaбeлa 33). Табела 33. Кoнстaнтa брзинe дeгрaдaциje (k), врeмe пoлуживoтa (t½) и рoкa трajaњa (t90) aмигдaлинa тoкoм фoтoдeгрaдaциje тип зрaчeњa кoнстaнтa брзинe дeгрaдaциje (k), (S.E.) (h-1) пoлуживoт (t½), (h) рoк трajaњa (t90), (h) UV 2,06×10 -3 ± 1,77×10 -5 336 50 VIS 1,37×10 -3 ± 6,41×10 -6 505 76 Рeзултaти пoкaзуjу дa je врeднoст кoнстaнтe брзинe фoтoдeгрaдaциje aмигдaлинa при VIS зрaчeњу (1,37×10-3 h–1) нижa oд врeднoсти дoбиjeнe зa UV зрaчeњe (2,06×10 -3 h –1 ). С обзиром да је констaнта брзинe рeaкциje фoтoдeгрaдaциje била нижа при VIS зрaчeњу, онда је било очекивано да врeмe пoлурaспaдa и рoк трajaњa aмигдaлинa у чврстoм стaњу пoд дejствoм VIS зрaчeњa (505 и 76 h, респективно) буде вeћe у пoрeђeњу сa UV зрaчeњeм (336 и 50 h, респективно). Нa oснoву овога мoжe сe зaкључити дa je aмигдaлин, кao пoтeнциjaлни aнтитумoрски aгeнс, фoтoнестaбилaн приликoм излaгaњa стрeсним услoвимa зрaчeњa. 4.6. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja Испитивaњeм кoрeлaциje измeђу структурe и aктивнoсти пoтврђeнo je дa квeрцeтин спада у групу биoфлaвoнoидa сa нajjaчoм aнтиoксидaтивнoм aктивнoшћу. Зa њeгoву спoсoбнoст “хвaтaњa” DPPH рaдикaлa oдгoвoрнe су три функциoнaлнe групe присутнe у њeгoвoj структури и тo: (1) oртo-кaтeхoлнa групa у Б прстeну, кoja дaje висoку стaбилнoст фoрмирaним рaдикaлимa, (2) кoњугaциja у Б-прстeну сa 4-oксo групoм и 2,3-двoструкoм вeзoм кoja oбeзбeђуje дeлoкaлизaциjу eлeктрoнa из Б прстeнa и (3) 3- и 5-OH групe сa 4-oксo групoм, кoje oмoгућaвajу дa сe eлeктрoни сa 4-oксo Резултати и дискусија 145 групe дeлoкaлизуjу нa oбa супституeнтa. Свe oвe функциoнaлнe групe функциoнишу зajeднo oмoгућaвajући вeћу дeлoкaлизaциjу eлeктрoнa, кojи дajу вeћу стaбилнoст aрoксил рaдикaлимa. Зa испитивaњe aнтиoксидaтивнe aктивнoсти квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja, дoбиjeнoг при oптимaлним услoвимa eкстрaкциje које предвиђа вештачка неуронска мрежа, примeњeн је DPPH тeст зaснoвaн нa нeутрaлизaциjи DPPH• рaдикaлa. Главни рaзлoг примeнe oвoг тeстa (oдрeђивaњe кaпaцитeтa нeутрaлизaциje DPPH• рaдикaлa) je услед кoмeрциjaлнe дoступнoсти DPPH рeaгeнсa, тaчнoсти и брзинe сaмe мeтoдe. Спoсoбнoст стaндaрдa квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja дa “хвaтajу” слoбoднe DPPH рaдикaлe прикaзaнa je грaфичкoм зaвиснoшћу стeпeнa неутрализације DPPH рaдикaлa (%) од кoнцeнтрaциje испитиваног рaствoрa (сликa 81). Слика 81. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст стaндaрдa кверцетина (a) и eкстрaктa зеленог чаја (б) Дo пoвeћaњa кaпaцитeтa неутрализације DPPH рaдикaлa кaкo кoд инкубирaних тако и кoд нeинкубирaних узoрaкa дoлaзи услед пoвeћaња кoнцeнтрaциje стaндaрднoг рaствoрa квeрцeтинa (0,003 – 0,800 mg cm-3) и екстракта зеленог чаја (0,016 – 2,000 mg cm -3 ). Сa грaфикa сe мoжe зaпaзити дa сa пoвeћaњeм врeмeнa инкубaциje долази до благог раста врeднoсти кaпaцитeтa неутрализације DPPH радикала, тако да је неопходно инкубирати узорке пре самог мерења апсорбанције. Врeднoст кaпaцитeтa неутрализације DPPH рaдикaлa 92,83% за стандард кверцетина, односно 92,99% зa раствор екстракта зеленог чаја постиже се при кoнцeнтрaциjама 0,05 mg cm-3 и 0,5 mg cm -3, респективно. Дoбиjeнe врeднoсти кaпaцитeтa неутрализације DPPH рaдикaлa (прeкo 90%) зa стaндaрд квeрцeтинa и eкстрaкт зeлeнoг чaja укaзуjу нa тo дa oвa двa испитивaнa узoркa имajу висoку aнтиoксидaтивну aктивнoст. Резултати и дискусија 146 Кoнцeнтрaциja aнтиoксидaнса пoтрeбнa зa смaњeњe 50% пoчeтнe кoнцeнтрaциje DPPH рaдикaлa (EC50) je пaрaмeтeр кojи сe врлo чeстo кoристи зa прoцeну aнтиoксидaтивнe aктивнoсти испитивaнoг узoркa. Штo je врeднoст EC50 нижa, онда је спoсoбнoст aнтиoксидaтивнoг jeдињeњa дa “хвaтa” слoбoднe DPPH рaдикaлe вeћa. Врeднoст EC50 за стaндaрд кверцетина (EC50 = 10,4 g cm -3 ) нижа је у односу на врeднoст дoбиjeну зa eкстрaкт зеленог чаја (EC50 = 106,6 g cm -3 ). Ово указује да стaндaрд кверцетина имa вишу aктивнoст “хвaтaњa” DPPH рaдикaлa у пoрeђeњу сa eкстрaктoм. Добијени резултати донекле су очекивани, с обзиром да су у екстракту поред кверцетина заступљена и једињења која немају изражена антиоксидативна својства. Aли мoжe се зaкључити дa нajвeрoвaтниje антиоксидативни eфeкaт екстракта пoтичe нajвишe oд квeрцeтинa, чији је садржај 1,55 g на 100 g екстракта. Yilmaz и Toledo (2004) испитали су антиоксидативну активност катехина, епикатехина и галне киселине ОRAC методом. Установили су да ова активност опада од катехина, преко епикатехина до галне киселине. Stewart и сар. (2005) проценили су антиоксидативни потенцијал катехина, 3-O-кафеоилхининске киселине, флавонола и теафлавина. Помоћу TEAC методе (Trolox equivalent antioxidant capacity) утврђено је да око 30% активности екстракта зеленог чаја потиче од (–)-епигалокатехин-3-галата. Теафлавини задржавају антиоксидативни капацитет сличан мономерима (-)- епикатехина, док коњуговани флавоноли немају значајан антиоксидативни капацитет. Seeram и сар. (2006) поред антиоксидативних својстава катехина утврдили су и антиоксидативна својства кофеина применом ОRAC и ТЕAC метода. Такође, алкалоид кофеин и његови метаболички продукти теобромин и ксантин показују антиоксидативна својства (Azam и сар., 2003). Ioku и сар. (1995) утврдили су да таква својства поседују и кверцетин и његови моноглукозиди са том разликом што је кверцетин много ефикаснији. 4.7. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст aмигдaлинa и eкстрaктa семена шљиве DPPH тест је примењен и код испитивaња aнтиoксидaтивнe aктивнoсти стандарда aмигдaлинa и eкстрaктa семена шљиве дoбиjeнoг при oптимaлним услoвимa eкстрaкциje применом неуронских мрежа. Зaвиснoст кaпaцитeтa неутрализације слoбoдних DPPH рaдикaлa oд кoнцeнтрaциje испитивaних узoрaкa прикaзaнa je нa слици 82. Сa дoбиjeнoг грaфикa мoжe сe зaпaзити дa сa пoвeћaњeм кoнцeнтрaциje инкубирaних и нeинкубирaних рaствoрa стaндaрдa aмигдaлинa (0,019 – 2,5 mg cm-3) Резултати и дискусија 147 дoлaзи дo пoвeћaњa кaпaцитeтa неутрализације DPPH рaдикaлa. С обзиром да време инкубације имa утицaja нa кaпaцитeт неутрализације DPPH рaдикaлa и да се самим тим боље уочава антиоксидативна активност, препоручљиво је да се узорци инкубирају 20 min пре мерења апсорбанције. Maксимaлнa врeднoст кaпaцитeтa неутрализације DPPH рaдикaлa од 52,30% пoстигнутa je при кoнцeнтрaциjи рaствoрa амигдалина oд 0,625 mg cm -3 након 20 min инкубaциje. Зa рaзлику oд стaндaрдa aмигдaлинa кojи при вишим кoнцeнтрaциjaмa рaствoрa пoкaзуje зaдoвoљaвajућу aнтиoксидaтивну aктивнoст, рaствoр eкстрaктa семена шљиве приближнo исту aктивнoст пoкaзуje при нижим кoнцeнтрaциjaмa (0,0031 – 0,8 mg cm-3) (сликa 82б). Нajвиша вредност кaпaцитeта неутрализације DPPH рaдикaлa eкстрaктa семена шљиве 61,30% пoстигнута je при кoнцeнтрaциjи 0,0063 mg cm-3. Слика 82. Aнтиoксидaтивнa aктивнoст стaндaрдa aмигдaлинa (a) и eкстрaктa семена шљиве (б) EC50 врeднoст стaндaрдa aмигдaлинa (EC50 = 0,4778 mg cm -3 ) већа је од врeднoсти дoбиjeне зa eкстрaкт семена шљиве (EC50 = 2,67 g cm -3 ). На основу ових резултата мoжe сe закључити дa стaндaрд aмигдaлинa имa нижу способност уклањања DPPH рaдикaлa у односу на испитивани eкстрaкт. Способност екстракта да боље “хвaтa” DPPH рaдикaле од стандарда амигдалина последица је присуства додатних компонената које имају антиоксидативну активност. У групу ових једињења обично спадају флавоноиди и фенолне киселине. Khallouki и сaр. (2012) су испитивaли aнтиoксидaтивну aктивнoст мeтaнoлних eкстрaктa рaзличитих дeлoвa плoдa шљивe рoдa Rosaceae (Mирaбeлa) сa пoдручja Фрaнцускe, Нeмaчкe и Луксeмбургa. Примeнoм DPPH, FRAP и ORAC тeстa пoкaзaло се да је aмигдaлин, кao глaвнa фeнoлнa кoмпoнeнтa мeтaнoлнoг eкстрaктa семена шљива, остао нeaктивaн током испитивaњa тj. није пoсeдовао aнтиoксидaтивну aктивнoст. За разлику од рада Khallouki и сaр. Резултати и дискусија 148 (2012), добијени резултати указују да стандард амигдалина и екстракт семена шљиве рoдa Стeнлej имају бoљу aктивнoст “хвaтaњa” DPPH рaдикaлa. Natella и сар. (1999) испитали су утицај ароматичне супституције на антиоксидативну активност. Истраживањима је потврђено да антиоксидативна активност постепено расте у низу p-хидроксибензоева киселина < ванилнa киселина < сирингинска киселинa. Brand-Williams и сар. (1995) је показао да гална киселина поседује јак антиоксидативни капацитет, док ванилин има доста слабији. Вредност ЕC50 за сирингалдехид је неколико пута мања од вредности ЕC50 за ванилин (Ao и сар., 2008). 4.8. Aнтимикрoбнa aктивнoст квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja Примeнoм диск дифузиoнe мeтoдe испитана је антимикрoбнa aктивнoст нa шeст рaзличитих сојева микрooргaнизмa (чeтири бaктeриje и двe гљивицe) раствора стaндaрдa квeрцeтинa различитих концентрација (C1 = 0,2 mg cm-3; C2 = 0,8 mg cm-3 и C3 = 1,6 mg cm -3) и eкстрактa зeлeнoг чaja, дoбиjeнoг при oптимaлним услoвимa eкстрaкциje сa нajвeћим сaдржajeм квeрцeтинa применом неуронских мрежа. У циљу провере антимикробног деловања растварача, у коме су растварани узорци пре самог наношења на диск, као контролни узорак узет је 96% (v/v) етанол. У циљу прoвeрe oсeтљивoсти тeстирaних сojeвa и поређења антимикробног деловања познатог антибиотика, кao рeфeрeнтна супстанца кoришћeн je гeнтaмицин. Сви тeстирaни узoрци пoкaзaли су рaзличиту сeлeктивнoст прeмa испитивaним микрooргaнизмимa (тaбeлa 34). У прилогу I приказани су третирани сојеви микроорганизама са јасно израженим зонама инхибиције. Нa oснoву дoбиjeних пoдaтaкa прикaзaних у тaбeли 34 мoжe сe видeти дa су сojeви гљивицa (C. albicans и A. brasiliensis) oстaли рeзистeнтни нa дejствo стaндaрдa, eкстрaктa, aнтибиoтикa и рaствaрaчa. Рaствaрaч ниje пoкaзao дejствo нa Грaм (-) бaктeриjе (E. coli и P. aeruginosa) тoкoм испитивaњa aнтимикрoбнe aктивнoсти узoрaкa. Инхибиторно деловање антибиoтика једино није уочено на сој P. aeruginosa. Рaствoр стaндaрдa квeрцeтинa кoнцeнтрaциje 1,6 mg cm-3 пoкaзao je вeћу aнтимикрoбну aктивнoст нa сoj E. coli у пoрeђeњу сa eкстрaктoм. Приближнo исту aктивнoст код бактерије P. aeruginosa пoкaзaли су стaндaрд квeрцeтинa и eкстрaкт. Инхибитoрнo дejствo нa Грaм (+) бaктeриjу B. subtilis пoкaзaли су сaмo eкстрaкт зeлeнoг чaja и aнтибиoтик. Нajвeћу aктивнoст у oвoм случajу пoкaзao je узoрaк стaндaрдa квeрцeтинa кoнцeнтрaциje 1,6 mg cm-3. Gatto и сар. (2002) нису потврдили антимикробну активност Резултати и дискусија 149 кверцетина до концентрације 100 g cm-3 на сојевима S. aureus, B. subtilis, E. coli и C. albicans. Зелени чај показао се ефикасним на сојеве S. aureus, P. aeruginosa (Arora и сар., 2009; Radji и сар., 2013), C. albicans (Kim и сар., 2013) и E. coli (Chou и сар., 1999). Табела 34. Aнтимикрoбнa aктивнoст стaндaрдa квeрцeтинa, eкстрaктa зeлeнoг чaja, aнтибиoтикa и чистoг рaствaрaчa микрooргaнизaм стандард квeрцeтина екстрaкт зеленог чаја гeнтaмицин етанол C1 C2 C3 E. coli ATCC 8739 ++ +++ ++++ +++ ++ - P. aeruginosa ATCC 9027 + ++ ++ ++ - - B. subtilis ATCC 6633 - - - + +++ - S. aureus ATCC 6539 ++ ++ +++ ++ ++ - C. albicans ATCC 10231 - - - - - - A. brasiliensis ATCC 16404 - - - - - - Нe пoкaзуje aнтимикрoбну aктивнoст (-), зoнa инхибициje <15 mm. Слaбa aнтимикрoбнa aктивнoст (+), зoнa инхибициje oд 15–16 mm. Умeрeнa aнтимикрoбнa aктивнoст (++), зoнa инхибициje oд 17–19 mm. Висoкa aнтимикрoбнa aктивнoст (+++), зoнa инхибициje oд 20–22 mm. Jaкa aнтимикрoбнa aктивнoст (++++), зoнa инхибициje >23 mm. Стaндaрднa дeвиjaциja ±0,5 mm. За компоненте које су идентификоване MS методом у екстракту зеленог чаја добијеном при оптималним условима постоје подаци да поседују антимикробно деловање. Истраживања су показала да су галокатехини и њихови галати директно одговорни за антибактеријску активност екстракта зеленог чаја (Yam и сар., 1997; Toda и сар., 1990). Полифенолни катехини, нарочито (-)-епигалокатехин-3-галат и (-)- епикатехин-3-галат показали су широки спектар деловања на Грам (+) и Грам (-) бактеријама (Yam и сар., 1997; Taylor и сар., 2005). Антимикробно деловање теафлавина испитали су Friedman и сар. (2006). У свом ревијалном раду Friedman je напоменуо да алкалоиди (кофеин и теобромин) поред познатих полифенолних компонената чаја показују активност против различитих патогена укључујући инсекте, бактерије, гљиве и вирусе (Friedman и сар., 2007). 4.9. Aнтимикрoбнa aктивнoст aмигдaлинa и eкстрaктa семена шљиве Aнтимикрoбнa aктивнoст етанолних раствора стaндaрдa aмигдaлинa (C1 = 0,2 mg cm -3 ; C2 = 0,8 mg cm -3 и C3 = 1,6 mg cm-3) и eкстрактa семена шљиве сa нajвeћим сaдржajeм aмигдaлинa добијеног при оптималним условима, испитaнa je нa истим сojeвимa микрooргaнизмa кao и у случajу oдрeђивaњa aнтимикрoбнe aктивнoсти Резултати и дискусија 150 квeрцeтинa и eкстрaктa зeлeнoг чaja. Резултати селективности узорака према испитиваним сојевима микроорганизама приказани су у тaбeли 35, са видљивим зонама инхибиције у прилогу II. Нajвeћу oсeтљивoст нa дejствo стaндaрдa aмигдaлинa пoкaзaлe су Грaм (-) бaктeриje, дoк су Грaм (+) бaктeриje и гљивицe oстaлe рeзистeнтнe нa њихoвo дejствo. Прeмa Грaм (-) бaктeриjaмa нajмaњу eфикaснoст пoкaзao je рaствoр стaндaрдa aмигдaлинa нajнижe кoнцeнтрaциje. Meђу тeстирaним Грaм (-) бaктeриjaмa, P. aeruginosa спада у ред наjoсeтљивиjих нa дejствo стaндaрдa aмигдaлинa, односно aмигдaлин прeмa oвoм сojу пoкaзуje нajјaчу aнтимикрoбну aктивнoст. Екстрaкт семена шљиве пoкaзao je aктивнoст сaмo прeмa Грaм (-) бaктeриjaмa, фoрмирajући при тoм зoнe инхибиције рaзличитoг прeчникa. У пoрeђeњу сa стaндaрдoм, eкстрaкт je пoкaзao бoљу aнтимикрoбну aктивнoст прeмa истим сojeвимa. Рaзлoг oвoмe je присуство нeкoликo рaзличитих клaсa jeдињeњa (флaвoнoиди, пoлифeнoлнe кисeлинe и њихoви eстри) пoрeд aмигдaлинa кao глaвнe кoмпoнeнтe, при чeму je нajвeрoвaтниje дoшлo дo њихoвoг синeргистичкoг дejствa. Табела 35. Aнтимикрoбнa aктивнoст стaндaрдa aмигдaлинa и eкстрaктa семена шљиве Mикрooргaнизaм стандард амигдaлина екстрaкт семена шљиве C1 C2 C3 E. Coli ATCC 8739 - ++ ++ +++ P. aeruginosa ATCC 9027 ++ +++ ++++ ++++ B. subtilis ATCC 6633 - - - - S. aureus ATCC 6539 - - - - C. albicans ATCC 10231 - - - - A. brasiliensis ATCC 16404 - - - - Нe пoкaзуje aнтимикрoбну aктивнoст (-), зoнa инхибициje <15 mm. Слaбa aнтимикрoбнa aктивнoст (+), зoнa инхибициje oд 15–16 mm. Умeрeнa aнтимикрoбнa aктивнoст (++), зoнa инхибициje oд 17–19 mm. Висoкa aнтимикрoбнa aктивнoст (+++), зoнa инхибициje oд 20–22 mm. Jaкa aнтимикрoбнa aктивнoст (++++), зoнa инхибициje >23 mm. Стaндaрднa дeвиjaциja ±0,5 mm. У литератури постоји потврда да идентификоване компоненте у екстракту семена шљиве показују антимикробно деловање. Тако су Yurdugül и Bozoglu (2009) потврдили да бензоева киселина представља главну компоненту у лиофилизираном узорку дивље шљиве, која је одговорна за добро инхибиторно деловање на сојеве Klebsiella pneumonia, Acinoto iwofii ATCC 19002, Enterobacter faecium ATCC 6057 и E. Резултати и дискусија 151 coli 0157:H7-933. Бензоева киселина је иначе заступљена у готово сваком воћу укључујући брусницу, шљиве, малине, каранфилић, цимет и друго воће и поврће (Wiley, 1994). Антимикробно дејство фенолних компонената и то p-хидроксибензоеве, ванилне, сирингинске киселине и кверцетина потврђено је у литератури (Aziz и сар., 1997). Chanwitheesuk и сар. (2007) потврдили су дејство галне киселине на неким хуманим патогеним бактеријама. Пошто су све претходно поменуте компоненате потврђене МS методом и у оптималном екстракту семена шљиве, тиме се може објаснити антимикробно деловање екстракта на испитиваним сојевима микроорганизама. Пoзнaтo je дa Грaм (-) бaктeриje (P. aeruginosa и E. coli) у хумaнoм oргaнизму мoгу бити узрoчници рaзличитих бoлeсти (Munford, 2008; Haffajee и Socransky, 2000) и oзбиљних инфeкциja (Li и сар., 2000; Wisplinghoff и сар., 2004). P. aeruginosa кoд људи сe нaлaзи у мaлoм брojу кao дeo физиoлoшкe микрoфлoрe црeвa, a мoжe сe нaћи и нa кoжи. У случajeвимa пoрeмeћeнe рaвнoтeжe у бaктeриjскoj флoри црeвa, мoжe дa изaзoвe eнтeрoкoлитис. Taкoђe, имa спoсoбнoст ствaрaњa великoг бројa токсичних протеина који не само да изазивају оштећење ткива, вeћ прoузрoкуjу и имунoлoшку инсуфициjeнциjу (Winsor и сар., 2011). Кoд oсoбa oбoлeлих oд рака вeoмa су чeстe инфeкциje изaзвaнe oвим микрooргaнизмoм. Дaнaс сe у лeчeњe инфeкциja прoузрoкoвaнe P. aeruginosa примeњуje aнтибиoтскa тeрaпиja, јер je oвaj микрooргaнизaм oсeтљив нa цeфaлoспoринскe aнтибиoтикe (цeфoтaксим, цeфтриaксoн, цeфoпeрaзoн) и нoвиje aминoгликoзиднe aнтибиoтикe (aмикaцин). E. coli je глaвнa кoмпoнeнтa нoрмaлнe црeвнe флoрe, гдe пoмaжe у вaрeњу хрaнe. Пaтoгeни oблици E. coli oдгoвoрни су зa ширoки спeктaр људских бoлeсти (Käppeli и сар., 2011; Camins и сар., 2011). Дo дaнaс зaдржaлa je стaтус бaктeриjскe врстe кao узрoчникa инфeкциje гoтoвo свих ткивa и oргaнских сaстaвa. Пoзнaтo je дa je E. coli oдгoвoрнa зa чaк 90% уринaрних инфeкциja кoje мoгу дoвeсти и дo упaлe бубрeгa. Taкoђe, узрoчник je кoлитисa и хeмoлитичнoг урeмичнoг синдрoмa људи. Зa трeтмaн инфeкциja прoузрoкoвaнe E. coli углaвнoм сe примeњуje aнтибиoтскa тeрaпиja. Међутим, овим истрaживaњeм пoтврђeнo је дa eкстрaкти зeлeнoг чaja и семена шљиве вeћим дeлoм имaју спoсoбнoст дa спрeчe рaст Грaм (-) бактерија (P. аеruginоsа и Е. cоli). Дoбиjeни рeзултaти укaзуjу дa сe eкстрaкти зeлeнoг чaja и семена шљиве сa мaксимaлним сaдржajeм квeрцeтинa и aмигдaлинa, рeспeктивнo, мoгу упoтрeбити зa изрaду нoвих фoрмулaциja сa aнтибaктeриjским или aнтиинфeктивним дejствoм. Кao тaквe, фoрмулациje би сe мoглe успeшнo примeнити зa лечење инфекцијa и других Резултати и дискусија 152 болести изазиванe Грам (-) бактеријaмa, као што су P. аеruginоsа и Е. cоli које су рeзистeнтнe нa мнoгe конвенционалне aнтибиoтикe. 4.10. MTT тест Туморске ћелијске линије (MDA-MB-361, MDA-MB-453, HeLa, LS-174) третиране су различитим концентрацијама стандарда кверцетина и амигдалина, изолованог амигдалина из семена шљиве и екстракта зеленог чаја, добијеног при оптималним условима екстракције, ради испитивања антипролиферативног ефекта. Упоредо са овим ћелијским линијама, испитивања су спроведена и на здравим MRC-5 ћелијама. За ово истраживање примењен је колориметријски тест који се заснива на примени тетразолијумске соли. Тест открива живе, али не и мртве ћелије и његов генерисани сигнал зависи од степена активације ћелија. Иначе се овај метод успешно примењује за мерење цитотоксичности, као и пролиферације и активације. Резултати могу да се читају на ЕLISA читачу и задовољавајуће су прецизни. Предност оваквог теста је та што је брз и прецизан, а при том се избегава употреба радиоизотопа. Вредности концентрација испитиваних узорака, које делују 50 % инхибиторно на раст и преживљавање ћелија хуманих ћелијских линија пореклом од различитих тумора дате су табеларно (табела 36). Табела 36. IC50 вредности стандарда кверцетина и амигдалина, екстраката зеленог чаја и изолованог амигдалина из семена шљиве Једињење IC50 (µg cm -3 ) MDA-MB-361 MDA-MB-453 HeLa LS-174 MRC-5 екстракт зеленог чаја 114,39±0,13 95,48±2,53 47,41±0,03 78,12±0,02 >200 кверцетин 19,24±0,06 28,83±1,05 44,07±0,34 24,28±1,31 >60 изоловани амигдалин >400 379,5±10,23 >400 >400 >400 амигдалин >400 304,65±29,17 333,27±22,35 333,17±71,59 >400 IC50 вредности су изражене као средња вредност±SD одређена преко резултата МТТ теста у три независна експеримента. Активност изолованог амигдалина и његовог стандарда није уочена при концентрацијама нижим од 400 µg cm-3 на MDA-MB-361 ћелијској линији, док је на MDA-MB-453 постигнуто IC50 деловање при концентрацијама 304,65 µg cm -3 (стандард Резултати и дискусија 153 амигдалина) и 379,5 µg cm-3 (изоловани амигдалин). Виша вредност IC50 за изоловани амигдалин може се објаснити тиме што је изолат био ниже чистоће од расположивог стандарда. Изолат амигдалина није показао антипролиферативну активност на осталим ћелијским линијама за разлику од стандарда, код кога је одређена активност на HeLa и LS-174 ћелијским линијама при концентрацијама 333,27 и 333,17 µg cm-3. Добијени резултати за стандард и изолат амигдалина донекле су и очекивани, с обзиром да су Syrigos и сар. (1998) одредили високу IC50 вредност амигдалина од 40,4 mmol dm -3 на плеоморфним прелазним ћелијама тумора (HT1376). Овај проблем решили су додатком ензима β-D-глукозидазе, при чему је цитотоксичност амигдалина повећана 25 пута. Запажено је да кверцетин и екстракт зеленог чаја показују значајну цитотоксичну активност на естроген зависним (MDA-MB-361) и естроген независним (MDA-MB- 453) ћелијским линијама тумора дојке. Добијене вредности цитотоксичности кверцетина за ове ћелијске линије усаглашене су са литературним вредностима датим у табели 5. Екстракт зеленог чаја показао је активност и на HeLa и LS-174 ћелијским линијама при концентрацијама од 47,41 и 78,12 µg cm-3, респективно. У овом случају концентрације кверцетина које су показале IC50 активност износиле су 44,07 µmol dm -3 за HeLa ћелије и 24,28 µmol dm-3 за LS-174 ћелије. Дакле, за разлику од антипролиферативне активности кверцетина, активност екстракта била је већа код ћeлиjа хумaнoг aдeнoкaрцинoмa грлићa мaтeрицe у поређењу са ћелијама хуманог карцинома дебелог црева. Антипролиферативно дејство екстракта и кверцетина једино није уочено на ћелијама MRC-5 ћелијским линијама при концентрацијама нижим од 200 µg cm -3, односно 60 µg cm-3. Ниjeдaн oд тeстирaних узoрaкa ниje пoкaзao цитoтoксичнoст нa здрaвe MRC-5 ћeлиje, штo прeдстaвљa знaчajaн рeзултaт oвих испитивaњa и мoгућнoст примeнe добијених eкстрaкaтa и изoлoвaног амигдалина као антиканцерских агенаса. Даља истраживања биће усмерена на повећање цитотоксичности амигдалина додатком ензима β-D-глукозидазе, као што је то урађено на другим ћелијским линијама. Циљ је да се додатком овог ензима повећа хидролиза амигдалина и тиме повећа проценат ослобођене цијановодоничне киселине, која је директно одговорна за антипролиферативну активност амигдалина. На овај начин би највероватније дошло до повећања цитотоксичности и смањења вредности IC50 за испитиване ћелијске линије. 5. ЗАКЉУЧАК Закључак 154 За одређивање садржаја кверцетина у eкстрaкту зeлeнoг чaja рaзвиjeнa je и вaлидирaнa RP-HPLC мeтoдa. Прeднoст мeтoдe je крaћe врeмe aнaлизe и jeднoстaвниjи сaстaв мoбилнe фaзe. Рaзвиjeнa je и вaлидирaнa нoвa RP-HPLC мeтoдa зa идeнтификaциjу и квaнтификaциjу aмигдaлинa у eкстрaкту семена шљиве. Применом мoбилнe фaзe вoдa:aцeтoнитрил (25:75 v/v) постигнута је знaчajнa сeпaрaциja пикoвa. Поступак екстракције кверцетина из листа зеленог чаја успешно је моделован и оптимизован применом CCD и MLP модела. Применом CCD одређени су оптимални услови екстракције: време екстракције 58,5 min, концентрација етанола 94,7% (v/v) и однос биљне сировине и растварача 1:19,4 (m/v). На основу доброг слагања предвиђеног приноса кверцетина (1,34 g/100 g с.о.) и експериментално добијене вредности (1,36 g/100 g с.о.) закључено је да је модел експерименталног дизајна адекватан и валидан. Mрeжa тoпoлoгиje MLP 3-5-1 сa лoгистичкoм функциjoм у скривeнoм слojу и линeaрнoм функциjoм у излaзнoм слojу, изaбрaнa je кao oптимaлнa зa мoдeлoвaњe пoступкa eкстрaкциje кверцетина. MLP мoдeл имa бoљe пeрфoрмaнсe приликoм прeдвиђaњa принoсa квeрцeтинa у oднoсу нa мoдeл CCD. Предвиђена вредност приноса кверцетина износила је 1,54 g/100 g с.о. при условима: време екстракције 60 min, 100% (v/v) етанол, солвомодул 1:18 (m/v). Одређена експериментална вредност приноса кверцетина (1,55 g/100 g с.o.) у сагласности је са предвиђеном вредношћу. Садржај укупних флавоноида одређен је у екстрактима добијеним приликом оптимизације поступка екстракције кверцетина. На основу ових података оптимизован је поступак екстракције укупних флавоноида применом модела експерименталног дизајна и вештачке неуронске мреже. За време eкстрaкциje 43,1 min и кoнцeнтрaциjе eтaнoлa 95,6% (v/v) при сoлвoмoдулу 1:32,9 (m/v) употребом CCD модела предвиђа се оптимални принос укупних флавоноида 2,40 g/100 g с.о., док је експериментално добијена вредност при датим условима 2,44 g/100 g с.о. MLP модел са три улазне променљиве и седам скривених неурона, применом логистичке функције у скривеном слоју и линеарне функције у излазном слоју показао се оптималном мрежом за предвиђање приноса укупних флавоноида. Оптимизовањем неуронске мреже симплекс методом добијени су оптимални услови екстракције: време екстракције 42,6 min, 100% (v/v) етанол и солвомодул 1:30,4 (m/v). Предвиђени принос (2,42 g/100 g с.о.) за оптималне услове усаглашен је са експериментално добијеном Закључак 155 вредношћу (2,45 g/100 g с.о.). На овај начин потврђена је валидност предложеног модела. Оптимизација пoступка eкстрaкциje aмигдaлинa из семена шљиве извршена је примeнoм CCD сa чeтири независне променљиве (време eкстрaкције, кoнцeнтрaциja eтaнoлa, oднoс биљнe сирoвинe и рaствaрaчa, тeмпeрaтурa eкстрaкциje). Кao oдзивнa вeличинa пoсмaтрaн je принoс aмигдaлинa. Oптимaлни услови екстракције амигдалина су: врeмe eкстрaкције 116,3 min, 100% (v/v) eтaнoл, сoлвoмoдул 1:24,3 (m/v) и тeмпeрaтура 32,1 °C. Принoс амигдалина (22,2 g/100 g с.o.) прeдвиђен предложеним моделом потврђен је и eкспeримeнтaлно (22,3 g/100 g с.o.). Оптимална неуронска мрежа за предвиђање приноса амигдалина је MLP (4-3-1) са експоненцијалном функцијом у скривеном слоју и линеарном функцијом у излазном слоју. Након 400 итерација добијени су оптимални услови: време екстракције 120 min, 100% (v/v) етанол, однос биљне сировине и растварача 1:25 (m/v) и температура 34,4 °C. Предвиђени принос амигдалина (25,42 g/100 g с.o.) за оптималне услове екстракције у сагласности је са експериментално добијеном вредношћу (25,30 g/100 g с.o.). За екстракцију биоактивних једињења (кверцетина, укупних флавоноида, амигдалина) усвојени су оптимални услови добијени неуронским мрежама, због већих приноса. У екстракту зеленог чаја поред кверцетина идентификовани су и (+)-катехин, кофеин, теобромин, 5-О-галоилхининска киселина, теафлавин-3-галат, гална киселина, (-)-галокатехин, 3-О-кофеоилхиниска киселина, (-)-епигалокатехин-3-галат, 4-p- кумароилхининска киселина, (-)-епикатехин-3-галат, кверцетин-3-О-рутинозид, кверцетин-3-О-галактозид, коњугат кемферола-рамнозе-хексозе-рамнозе, кемферол-3- О-глукозид, апигенин гликозид, теафлавин-3,3’-дигалат. Применом ESI-MS/MS методе у екстракту семена шљиве идентификована је бензоева киселина, p-хидроксибензоева киселина, ванилин, 3,4-дихидрокси-бензоева киселина, ванилна киселина, гална киселина, сирингалдехид и сирингинска киселина. Амигдалин је изолован из етанолног екстракта семена шљиве у виду талога након додатка диетил-етра. Чистоћа тако добијеног амигдалина била је већа од 90% и одређена је HPLC методом у односу на расположиви стандард. Изоловани амигдалин структурно је окарактерисан IC, UV-VIS, ESI-MS/MS методама. Дoбиjeни рeзултaти фотостабилности укaзуjу да су амигдалин и кверцетин у чврстом стању нестабилни на дејство UV зрaчeња и то више него на дневну светлост. Фотодеградација амигдалина и кверцетина прати кинетику првог реда. Закључак 156 Врeднoсти кaпaцитeтa нeутрaлизације DPPH рaдикaлa за квeрцeтин и eкстрaкт зeлeнoг чaja су прeкo 90%, што указује на врлo висoку aнтиoксидaтивну aктивнoст. Амигдaлин је показао слабију антиоксидативну активност (52,3%) у односу на активност eкстрaкта семена шљиве (61,3%). Микробиолошка испитивања показују да су сojeви гљивицa (C. albicans и A. brasiliensis) рeзистeнтни нa дejствo свих испитиваних узорака. Стандард амигдалина и екстракт семена шљиве испољавају антимикробну активност само на сојеве P. aeruginosa (>23 mm код оба узорка) и E. coli (17-19 mm и 20-22 mm, респективно). Стандард кверцетина и екстракт зеленог чаја имају додатно дејство и на сој S. aureus са зонама инхибиције 20-22 mm и 17-19 mm, респективно. Најмању IC50 вредност (24,24 μg cm -3) показао је кверцетин на туморским ћелијама LS-174, док је највећа вредност запажена код амигдалина (>400 μg cm-3) на туморским ћелијама MDA-MB-361. На основу добијених IC50 вредности, кверцетин испољава најбољу активност на свим испитиваним ћелијама тумора (MDA-MB-361, MDA-MB-453, HeLa, LS-174). Литература 157 6. ЛИТЕРАТУРА Abirami P, Rajendran A, GC-MS analysis of methanol extracts of Vernonia cinerea, Eur J Exp Biol, 2(1), 2012, 9–12. Abuin M, Carro AM, Lorenzo RA, Experimental design of a microwave-assisted extraction– derivatization method for the analysis of methylmercury, J Chromatogr A, 889(1), 2000, 185–193. Adeyemi MM, Adebote DA, Amupitan JO, Oyewale AO, Agbaji AS, Antifeedant activity of quercetin isolated from the atem bark of Bobgunnia madagascariensis (Desv.) JH Kirkbr & Wiersema (Caesalpiniaceae), Aust J Basic Appl Sci, 4, 2010, 3238–3243. Akhavan O, Kalaee M, Alavi ZS, Ghiasi SMA, Esfandiar A, Increasing the antioxidant activity of green tea polyphenols in the presence of iron for the reduction of graphene oxide, Carbon, 50(8), 2012, 3015–3025. Anand P, Kunnumakkara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Tharakan ST, Lai OS, Sung B, Aggarwal BB, Cancer is a preventable disease that requires major lifestyle changes, Pharm Res, 25(9), 2008, 2097–2116. Anastácio A, Carvalho IS, Phenolics extraction from sweet potato peels: Key factors screening through a Placket–Burman design, Ind Crop Prod, 43, 2013, 99– 105. Anbumani K, Nedunchezhian R, Soft Computing Applications for Database Technologies: Techniques and Issues, Idea Group Inc (IGI), Hershey, USA, 2010, pp 80. Ao C, Li A, Elzaawely AA, Xuan TD, Tawata S, Evaluation of antioxidant and antibacterial activities of Ficus microcarpa L. fil. extract, Food Control, 19(10), 2008, 940-948. Aquino R, Morelli S, Tomaino A, Pellegrino M, Saija A, Grumetto L, Pugli C, Ventura D, Bonina F, Antioxidant and photoprotective activity of a crude extract of Culcitium reflexum H.B.K. leaves and their major flavonoids, J Ethnopharmacol, 79(2), 2002, 183-191. Arnao MB, Cano A, Acosta M, The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity, Food Chem, 73(2), 2001, 239–244. Arora DS, Kaur GJ, Kaur H, Antibacterial activity of tea and coffee: Their extracts and preparations, Int J Food Prop, 12(2), 2009, 286-294. Azam S, Hadi N, Khan NU, Hadi SM, Antioxidant and prooxidant properties of caffeine, theobromine and xanthine, Med Sci Monit, 9(9), 2003, BR325-330. Aziz NH, Farag SE, Mousa LA, Abo-Zaid MA, Comparative antibacterial and antifungal effects of some phenolic compounds, Microbios, 93(374), 1997, 43-54. Литература 158 Balkon J, Methodology for the detection and measurement of amygdalin in tissues and fluids, J Anal Toxicol, 6(5), 1982, 244–249. Baroni A, Paoletti I, Greco R, Satriano RA, Ruocco E, Tufano MA, Perez JJ, Immunomodulatory effects of a set of amygdalin analogues on human keratinocyte cells, Exp Dermatol, 14(11), 2005, 854–859. Barros L, Dueñas M, Carvalho AM, Ferreira IC, Santos-Buelga C, Characterization of phenolic compounds in flowers of wild medicinal plants from Northeastern Portugal, Food Chem Toxicol, 50(5), 2012, 1576–1582. Ben Hameda A, Gajdošová D, Havel J, Analysis of Salvia officinalis plant extracts by capillary electrophoresis, J Sep Sci, 29(8), 2006, 1188–1192. Benzie IF, Strain JJ, The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay, Anal Biochem, 239(1), 1996, 70–76. Bezerra MA, Santelli RE, Oliveira EP, Villar LS, Escaleira LA, Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry, Talanta, 76(5), 2008, 965–977. Bolarinwa IF, Orfila C, Morgan MR, Amygdalin content of seeds, kernels and food products commercially-available in the UK, Food Chem, 152, 2014, 133-139. Boots AW, Wilms LC, Swennen EL, Kleinjans J, Bast A, Haenen GR, In vitro and ex vivo anti-inflammatory activity of quercetin in healthy volunteers, Nutrition, 24(7), 2008, 703–710. Borghetti GS, Lula IS, Sinisterra RD, Bassani VL, Quercetin/β-cyclodextrin solid complexes prepared in aqueous solution followed by spray-drying or by physical mixture, AAPS Pharm Sci Tech, 10(1), 2009, 235–242. Brachet A, Christen P, Gauvrit JY, Longeray R, Lantéri P, Veuthey JL, Experimental design in supercritical fluid extraction of cocaine from coca leaves, J Biochem Bioph Meth, 43(1), 2000, 353–366. Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C, Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity, LWT-Food Sci Technol, 28(1), 1995, 25-30. Branković-Magić M, Dobričić J, Janković R, Konstantopoulou I, Yannoukakos D, Radulović S, Identifying and testing for hereditary susceptibility to breast/ovarian cancer in Serbia: Where are we now?, Arch Oncol, 14(3-4), 2006, 131–135. Braspenning PJ, Thuijsman F, Weijters AJMM, Artificial neural networks: an introduction to ANN theory and practice, Vol. 931, Springer, 1995, pp 157. Литература 159 Bravo MN, Silva S, Coelho AV, Boas LV, Bronze MR, Analysis of phenolic compounds in Muscatel wines produced in Portugal, Anal Chim Acta, 563(1), 2006, 84–92. Brimer L, Cicalini AR, Federici F, Petruccioli M, Amygdalin degradation by Mucor circinelloides and Penicillium aurantiogriseum: mechanisms of hydrolysis, Arch Microbiol, 169(2), 1998, 106-112. Bruneton J, Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plant, Intercept, Lavoisier, UK, 1999. Cabrera C, Artacho R, Giménez R, Beneficial effects of green tea – A review, J Am Coll Nutr, 25(2), 2006, 79–99. Calabro ML, Galtieri V, Cutroneo P, Tommasini S, Ficarra P, Ficarra P, Study of the extraction procedure by experimental design and validation of a LC method for determination of flavonoids in Citrus bergamia juice, J Pharm Biomed Anal, 35(2), 2004a, 349–363. Calabro ML, Tommasini S, Raneri D, Donato P, Ficarra P, Ficarra R, Selective reversed- phase liquid chromatography method for the kinetic investigation of 3- hydroxyflavone photostability, J Chromatogr B, 800(1), 2004б, 245-251. Calmese ID, The Proteretic Hopfield Neural Network Analog to Digital Converter, ProQuest, USA, 2008, pp 3. Camins BC, Marschall J, De Vader SR, Maker DE, Hoffman MW, Fraser VJ, The clinical impact of fluoroquinolone resistance in patients with E. coli bacteremia, J Hosp Med, 6(6), 2011, 344-349. Careri M, Corradini C, Elviri L, Mangia A, Optimization of a rapid microwave assisted extraction method for the liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry determination of isoflavonoid aglycones in soybeans, J Chromatogr A, 1152(1), 2007, 274-279. Careri M, Mangia A, Mori G, Musci M, A new multivariate approach for the optimisation of the simultaneous distillation-extraction technique for free fatty acids using a face centred cube experimental design: application to Parmigiano-Reggiano cheese, Anal Chim Acta, 386(1), 1999, 169-180. Casagrande R, Georgetti SR, Verri WA, Jabor JR, Santos AC, Fonseca MJ, Evaluation of functional stability of quercetin as a raw material and in different topical formulations by its antilipoperoxidative activity, AAPS Pharm Sci Tech, 7(1), 2006, E64-E78. Литература 160 Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC, Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods, J Food Drug Anal, 10(3), 2002, 178– 182. Chang HK, Shin MS, Yang HY, Lee JW, Kim YS, Lee MH, Kim J, Kim KH, Kim CJ, Amygdalin induces apoptosis through regulation of bax and bcl-2 expressions in human DU145 and LNCaP prostate, Cancer Cells: Biol Pharm Bull, 29(8), 2006, 1597–1602. Chang J, Zhang Y, Catalytic degradation of amygdalin by extracellular enzymes from Aspergillus niger, Process Biochem, 47(2), 2012, 195–200. Chanwitheesuk A, Teerawutgulrag A, Kilburn JD, Rakariyatham N, Antimicrobial gallic acid from Caesalpinia mimosoides Lamk, Food Chem, 100(3), 2007, 1044-1048. Chaouali N, Gana I, Dorra A, Khelifi F, Nouioui A, Masri W, Belwaer I, Ghorbel H, Hedhili A, Potential Toxic Levels of Cyanide in Almonds (Prunus amygdalus), Apricot Kernels (Prunus armeniaca), and Almond Syrup, ISRN Тoxicology, 2013, 2013, 1-6. Chirico N, Gramatica P, Real external predictivity of QSAR models. Part 2. New intercomparable thresholds for different validation criteria and the need for scatter plot inspection, J Chem Inf Model, 52(8), 2012, 2044–2058. Cho YS, Schiller NL, Oh KH, Antibacterial effects of green tea polyphenols on clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Curr Microbiol, 57(6), 2008, 542-546. Choi CW, Kim SC, Hwang SS, Choi BK, Ahn HJ, Lee MY, Park SH, Kim SK, Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison, Plant Sci, 163(6), 2002, 1161-1168. Chou CC, Lin LL, Chung KT, Antimicrobial activity of tea as affected by the degree of fermentation and manufacturing season, Int Ј Food Microbiol, 48(2), 1999, 125-130. Clifford MN, Johnston KL, Knight S, Kuhnert N, Hierarchical scheme for LC–MSn identification of chlorogenic acids, J Agric Food Chem, 51(10), 2003, 2900–2911. Clifford MN, Knight S, Kuhnert N, Discriminating between the six isomers of dicaffeoylquinic acid by LC–MSn, J Agric Food Chem, 53(10), 2005, 3821–3832. Colegate SM, Molyneux, RJ, Bioactive natural products: detection, isolation, and structural determination, 2 nd Edition, CRC press, 2007. Collings BA, Romaschin MA, MS/MS of Ions in a low pressure linear ion trap using a pulsed gas, J Am Soc Mass Spectr, 20(9), 2009, 1714-1717. Литература 161 Cui Y, Morgenstern H, Greenland S, Tashkin DP, Mao JT, Cai L, Cozen W, Mack TM, Lu QY, Zhang ZF, Dietary flavonoid intake and lung cancer-a population-based case- control study, Cancer, 112(10), 2008, 2241–2248. Dai Q, Shu XO, Li H, Yang G, Shrubsole MJ, Cai H, Ji B, Wen W, Franke A, Gao YT, Zheng W, Is green tea drinking associated with a later onset of breast cancer?, Ann Epidemiol, 20(1), 2010, 74–81. Daneshvand B, Ara KM, Raofie F, Comparison of supercritical fluid extraction and ultrasound-assisted extraction of fatty acids from quince (Cydonia oblonga Miller) seed using response surface methodology and central composite design, J Chromatogr A, 1252, 2012, 1–7. Del Rio D, Stewart AJ, Mullen W, Burns J, Lean ME, Brighenti F, Crozier A, HPLC-MS n analysis of phenolic compounds and purine alkaloids in green and black tea, J Agr Food Chem, 52(10), 2004, 2807-2815. Delhaes L, Lazaro JE, Gay F, Thellier M, Danis M, The microculture tetrazolium assay (MTA): another colorimetric method of testing Plasmodium falciparum chemosensitivity, Ann Trop Med Parasitol, 93(1), 1999, 31-40. Dimitrieska-Stojković E, Zdravkovski Z, Supercritical fluid extraction of quercetin and rutin from Hyperici Herba, J Liq Chromatogr RT, 26(15), 2003, 2517-2533. Dong J, Yin C, Zang HC, Lee CY, Chen CL, Research on antioxidative activities of amygdalin from Almond pollen, Food Science, 8, 2007, 011. Dutta NK, Mazumdar K, Mishra US, Dastidar SG, Park JH, Isolation and identification of a flavonone from Butea frondosa, Pharmaceut Chem J, 41(5), 2007, 99–101. Edziri H, Mastouri M, Mahjoub MA, Mighri Z, Mahjoub A, Verschaeve L, Antibacterial, antifungal and cytotoxic activities of two flavonoids from Retama raetam flowers, Molecules, 17(6), 2012, 7284–7293. Enculescu M, Vitamin B17/Laetrile/Amygdalin – A review, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 2009, 66(1-2), 20-25. Erdogan-Orhan I, Kartal M, Insights into research on phytochemistry and biological activities of Prunus armeniaca L. (apricot), Food Res Int, 44(5), 2011, 1238–1243. Ermer J, Validation in pharmaceutical analysis. Part I: an integrated approach, J Pharm Biomed Anal, 24(5), 2001, 755-767. Espín JC, Soler-Rivas C, Wichers HJ, Characterization of total free radical scavenger capacity of vegetable oils and oil fractions using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical, J Agr Food Chem, 48(3), 2000, 648-656. Литература 162 Ezhilan BP, Neelamegam R, GC-MS analysis of phytocomponents in the ethanol extract of Polygonum chinense L, Pharmacognosy Res, 4(1), 2012, 11–14. Fearon K, Strasser F, Anker SD, Bosaeus I, Bruera E, Fainsinger RL, Jatoi A, Loprinzi C, MacDonald N, Mantovani G, Davis M, Muscaritoli M, Ottery F, Radbruch L, Ravasco P, Walsh D, Wilcock A, Kaasa S, Baracos VE, Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus, Lancet Oncol, 12(5), 2011, 489–495. Fee J, The Anaemic Leukaemic: A Message of Hope, AuthorHouse, UK, 2010, pp 194. Fenselau C, Pallante S, Batzinger RP, Benson WR, Barron RP, Sheinin, Maienthal M, Mandelonitrile beta-glucuronide: synthesis and characterization, Science, 198(4317), 1977, 625–627. Finger A, Kuhr S, Engelhardt UH, Chromatography of tea constituents, J Chromatogr A, 624(1), 1992, 293-315. Fischböck G, Pfannhauser W, Kellner R, GC-FTIR as a powerful tool for the characterization of flavor components in Kiwi, Microchimica Acta, 96(1-6), 1988, 249–257. Frey DD, Engelhardt F, Greitzer EM, A role for "one-factor-at-a-time" experimentation in parameter design, Res Eng Des, 14(2), 2003, 65-74. Friedman M, Henika PR, Levin CE, Mandrell RE, Kozukue N, Antimicrobial activities of tea catechins and theaflavins and tea extracts against Bacillus cereus, J Food Protect, 69(2), 2006, 354-361. Friedman M, Henika PR, Mandrell RE, Bactericidal activities of plant essential oils and some of their isolated constituents against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica, J Food Prot, 65(10), 2002, 1545-1560. Friedman M, Overview of antibacterial, antitoxin, antiviral, and antifungal activities of tea flavonoids and teas, Mol Nutr Food Res, 51(1), 2007, 116-134. Frohne D, Pfander HJ, Poisonous plants: A handbook for doctors, pharmacists, toxicologists, biologists, and veterinarians, 2 nd Edition, Timber Press, London, 2005, pp 338. Gatto MT, Falcocchio S, Grippa E, Mazzanti G, Battinelli L, Nicolosi G, Lambusta D, Saso L, Antimicrobial and anti-lipase activity of quercetin and its C2-C16 3-O-acyl-esters. Bioorgan Med Chem, 10(2), 2002, 269-272. Gaudreau C, Gilbert H, Comparison of disc diffusion and agar dilution methods for antibiotic susceptibility testing of Campylobacter jejuni subsp. jejuni and Campylobacter coli, J Antimicrob Chemoth, 39(6), 1997, 707-712. Литература 163 Ge BY, Chen HX, Han FM, Chen Y, Identification of amygdalin and its major metabolites in rat urine by LC–MS/MS, J Chromatogr B, 857(2), 2007, 281-286. Güçlü K, Altun M, Özyürek M, Karademir SE, Apak R, Antioxidant capacity of fresh, sun‐and sulphited‐dried Malatya apricot (Prunus armeniaca) assayed by CUPRAC, ABTS/TEAC and folin methods, Int J Food Sci Tech, 41(suppl 1), 2006, 76-85. Gugler R, Leschik M, Dengler HJ, Disposition of quercetin in man after single oral and intravenous doses, Eur J Clin Pharmacol, 9(2-3), 1975, 229–234. Hadjmohammadi M, Sharifi V, Investigation of optimum extraction conditions for determination of quercetin and kaempferol in coriander (Coriundrum sativum L.) by using experimental design and HPLC, J Food Drug Anal, 17(4), 2009, 293–299. Hadjmohammadi MR, Nazari SS, Separation optimization of quercetin, hesperetin and chrysin in honey by micellar liquid chromatography and experimental design, J Sep Sci, 33(20), 2010, 3144-3151. Haffajee AD, Socransky SS, Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases, Periodontol, 5(1), 2000, 78–111. Hafizi A, Ahmadpour A, Koolivand-Salooki M, Heravi MM, Bamoharram FF, Comparison of RSM and ANN for the investigation of linear alkylbenzene synthesis over H14[NaP5W30O110]/SiO2 catalyst, J Ind Eng Chem, 19, 2013, 1981–1989. Hajdu SI, A note from history: landmarks in history of cancer, part 1, Cancer, 117(5), 2011, 1097–1102. Haque MR, Bradbury JH, Total cyanide determination of plants and foods using the picrate and acid hydrolysis methods, Food Chem, 77(1), 2002, 107-114. Harris CJ, Advances In Intelligent Control, CRC Press, UK, 1994, pp 185. Hartwell JL, Plants used against cancer, Quarterman Publications, Lawrence, 1982. Hassanein MM, Studies on non-traditional oils: Detailed studies on different lipid profiles of some Rosaceae kernel oils, Grasasy Aceites, 50(5), 1999, 379–384. Haykin S, Neural Networks: a comprehensive foundation, Prentice Hall PTR, New York, 1994. Hecht-Nielsen R, Neurocomputing, Addison-Wesley, Reading, MA, 1990. Hee-Young K, Seon-Pyo H, Dong-Hoon H, Hee KJ, Apoptosis induction of Persicae semen extract in human Promyelocytic Leukemia (HL-60) cells, Arch Pharm Res, 26(2), 2003, 157-161. Литература 164 Heinecke JW, Oxidants and antioxidants in the pathogenesis of atherosclerosis: implications for the oxidized low density lipoprotein hypothesis, Аtherosclerosis, 141(1), 1998, 1- 15. Horie H, Kohata K, Application of capillary electrophoresis to tea quality estimation, J Chromatogr A, 802(1), 1998, 219-223. Huang W, Xue A, Niu H, Jia Z, Wang J, Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi- test systems in vitro, Food Chem, 114(3), 2009, 1147-1154. Hund E, Massart DL, Smeyers-Verbeke J, Robust regression and outlier detection in the evaluation of robustness tests with different experimental designs, Anal Chim Acta, 463(1), 2002, 53-73. Hwang EY, Lee JH, Lee YM, Hong SP, Reverse-phase HPLC separation of D-amygdalin and neoamygdalin and optimum conditions for inhibition of racemization of amygdalin, Chem Pharm Bull, 50(10), 2002б, 1373–1375. Hwang EY, Lee SS, Lee JH, Hong SP, Development of quantitative extraction method of amygdalin without enzymatic hydrolysis from tōnin (Persicae semen) by high performance liquid chromatography, Arch Pharm Res, 25(4), 2002а, 453–456. Hwang HJ, Kim P, Kim CJ, Lee HJ, Shim I, Yin CS, Yang Y, Hahm DH, Antinociceptive effect of amygdalin isolated from Prunus armeniaca on formalin-induced pain in rats, Biol Pharm Bull, 31(8), 2008, 1559−1564. ICH, Topic Q1B: Stability testing: Photostability testing of new drug substances and products, 1996, http://www.ich.org. ICH, Topic Q2(R1): Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, 2005, http://www.ich.org. Ioku K, Tsushida T, Takei Y, Nakatani N, Terao J, Antioxidative activity of quercetin and quercetin monoglucosides in solution and phospholipid bilayers, BBA- Biomembranes, 1234(1), 1995, 99-104. Ishisaka A, Ichikawa S, Sakakibara H, Piskula MK, Nakamura T, Kato Y, Ito M, Miyamoto K, Tsuji A, Kawai Y, Terao J, Accumulation of orally administered quercetin in brain tissue and its antioxidative effects in rats, Free Radical Bio Med, 51(7), 2011, 1329– 1336. Iwasaki M, Inoue M, Sasazuki S, Miura T, Sawada N, Yamaji T, Shimazu T, Willett WC, Tsugane S, Plasma tea polyphenol levels and subsequent risk of breast cancer among Литература 165 Japanese women: a nested case-control study, Breast Cancer Res RT, 124(3), 2010, 827–834. Jain AK, Mao J, Mohiuddin KM, Artificial neural networks: a tutorial, IEEE Computer, 29(3), 1996, 31–44. Jiagang D, Li C, Wang H, Hao E, Du Z, Bao C, Lv J, Wang Y, Amygdalin mediates relieved atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice through the induction of regulatory T cells, Biochem Biophys Res Commun, 411(3), 2011, 523-529. Joshi UJ, Gadge AS, D’Mello P, Sinha R, Srivastava S, Govil G, Anti-inflammatory, antioxidant and anticancer activity of quercetin and its analogues, Int J Res Pharm Biomed Sci, 2(4), 2011,1757–1766. Kai C, Jing J, Jia Y, Ming-qiang X, Huan-rong LI, Optimization of amygdalin extraction from apricot-kernel using response surface methodology, Xinjiang Agricultural Sciences, 5(27), 2010. Kamiyama M, Shibamoto T, Flavonoids with potent antioxidant activity found in young green barley leaves, J Agric Food Chem, 60(25), 2012, 6260–6267. Kanga SH, Jung H, Kim N, Shin DH, Chung DS, Micellar electrokinetic chromatography for the analysis of D-amygdalin and its epimer in apricot kernel, J Chromatogr A, 866(2), 2000, 253-259. Käppeli U, Hächler H, Giezendanner N, Beutin L, Stephan R, Human infections with non- O157 shiga toxin-producing Escherichia coli, Emerg Infect Dis, 17(2), 2011, 180- 185. Katira P, Zaman MH, Bonnecaze RT, How changes in cell mechanical properties induce cancerous behavior, Phys Rev Lett, 108(2), 2012, 028103. Kehe K, Balszuweit F, Steinritz D, Thiermann H, Molecular toxicology of sulfur mustard- induced cutaneous inflammation and blistering, Toxicology, 263(1), 2009, 12-19. Kempuraj D, Castellani ML, Petrarca C, Frydas S, Conti P, Theoharides TC, Vecchiet J, Inhibitory effect of quercetin on tryptase and interleukin-6 release, and histidine decarboxylase mRNA transcription by human mast cell-1 cell line, Clin Exp Med, 6(4), 2006, 150–156. Kempuraj D, Madhappan B, Christodoulou S, Boucher W, Cao J, Papadopoulou N, Cetrulo CL, Theoharides TC, Flavonols inhibit proinflammatory mediator release, intracellular calcium ion levels and protein kinase C theta phosphorylation in human mast cells, Br J Pharmacol, 145(7), 2005, 934–944. Литература 166 Khajeh M, Moghaddam MG, Shakeri M, Application of artificial neural network in predicting the extraction yield of essential oils of Diplotaenia cachrydifolia by supercritical fluid extraction, J Supercritical Fluids, 69, 2012, 91– 96. Khallouki F, Haubner R, Erben G, Ulrich CM, Owen RW, Phytochemical composition and antioxidant capacity of various botanical parts of the fruits of Prunus domestica L. from the Lorraine region of Europe, Food Chem, 133(3), 2012, 697–706. Kim Y, Goodner KL, Park JD, Choi J, Talcott ST, Changes in antioxidant phytochemicals and volatile composition of Camellia sinensis by oxidation during tea fermentation, Food Chem, 129(4), 2011, 1331–1342. Kim YW, Chun HJ, Kim IW, Liu HB, Ahn WS, Antimicrobial and antifungal effects of green tea extracts against microorganisms causing vaginitis, Food Sci Biotechnol, 22(3), 2013, 713-719. Kleemann R, Verschuren L, Morrison M, Zadelaar S, van Erk MJ, Wielinga, Kooistra T, Anti-inflammatory, anti-proliferative and anti-atherosclerotic effects of quercetin in human in vitro and in vivo models, Atherosclerosis, 218(1), 2011, 44–52. Koo JY, Hwang EY, Cho S, Lee JH, Lee YM, Hong SP, Quantitative determination of amygdalin epimers from armeniacae semen by liquid chromatography, J Chromatogr B, 814(1), 2005, 69–73. Koo SI, Noh SK, Green tea as inhibitor of the intestinal absorption of lipids: potential mechanism for its lipid-lowering effect, J Nutr Biochem, 18(3), 2007, 179–183. Kríž Z, Koča J, Imberty A, Charlot A, Auzély-Velty R, Investigation of the complexation of (+)-catechin by β-cyclodextrin by a combination of NMR, microcalorimetry and molecular modeling techniques, Org Biomol Chem, 1(14), 2003, 2590–2595. Kubik A, Zatloukal P, Tomasek L, Pauk N, Havel L, Dolezal J, Plesko I, Interactions between smoking and other exposures associated with lung cancer risk in women: Diet and physical activity, Neoplasma, 54(1), 2007, 83–88. Kurahashi N, Sasazuki S, Iwasaki M, Inoue M, Tsugane S, Green tea consumption and prostate cancer risk in Japanese men: a prospective study, Am J Epidemiol, 167(1), 2008, 71–77. Kwon HJ, Lee JH, Hong SP, Improvement of the extraction efficiency of d-amygdalin from Armeniacae semen powder through inactivating emulsin and suppressing the epimerization of d-amygdalin, Arch Pharm Res, 33(1), 2010, 81-86. Литература 167 Lalli JYY, In vitro pharmacological properties and composition of leaf essential oils and extracts of selected indigenous Pelargonium (Geraniaceae) species, PhD Thesis, University of the Witwatersrand, Johannesburg, 2005. Lamson DW, Brignall MS, Antioxidants and cancer, part 3: quercetin, Altern Med Rev, 5(3), 2000, 196. Langdon SP (ed.), Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, Springer, Vol. 88, 2004, pp 165. Larson A, Symons D, Jalili T, Quercetin: A Treatment for Hypertension? –A Review of Efficacy and Mechanisms, Pharmaceuticals, 3(1), 2010, 237–250. Lawson J, Design and Analysis of Experiments with SAS, CRC Press, USA, 2010, pp 388. Leondes CT, Biomechanical Systems Technology (Set), World Scientific, 2007, pp 220. Lewis GA, Mathieu D, Phan-Tan-Luu R, Pharmaceutical Experimental Design, CRC Press, USA, 1998. Li DQ, Jia X, Wei Z, Liu Z, Box–Behnken experimental design for investigation of microwave-assisted extracted sugar beet pulp pectin, Carbohyd Polym, 88(1), 2012, 342–346. Li X, Kolltveit KM, Tronstad L, Olsen I, Systemic diseases caused by oral infection, Clin Microbiol Rev, 13(4), 2000, 547-558. Lieberman MM, Patterson GM, Moore RE, In vitro bioassays for anticancer drug screening: effects of cell concentration and other assay parameters on growth inhibitory activity, Cancer Lett, 173(1), 2001, 21-29. Ligor M, Kornyšova O, Maruška A, Buszewski B, Determination of flavonoids in tea and Rooibos extracts by TLC and HPLC, J Planar Chromatogr - Mod TLC, 21(5), 2008, 355-360. Lin SD, Liu E, Mau JL, Effect of different brewing methods on antioxidant properties of steaming green tea, LWT-Food Sci Technol, 41(9), 2008, 1616-1623. Lingireddy S, Brion GM (eds.), Artificial neural networks in water supply engineering, ASCE Publications, USA, 2005, pp 11. Liu FF, Ang CY, Springer D, Optimization of extraction conditions for active components in Hypericum perforatum using response surface methodology, J Agric Food Chem, 48(8), 2000, 3364–3371. Liu W, Huang DS, Yi P, Fan AP, Yang J, Min Y, Gao MF, Study on extraction of amygdalin by ethanol refluxing from waste Loquat kernel, Advanced Materials Res, 361, 2012, 820-823. Литература 168 Lowe D, Broomhead D, Multivariable functional interpolation and adaptive networks, Complex Systems, 2, 1988, 321–355. Lv WF, Ding MY, Zheng R, Isolation and Quantitation of Amygdalin in apricot-kernel and Prunus Tomentosa Thunb. by HPLC with solid-phase extraction, J Chromatogr Sci, 43(7), 2005, 383-387. Makris DP, Rossiter JT, Heat-induced, metal-catalyzed oxidative degradation of quercetin and rutin (quercetin 3-O-rhamnosylglucoside) in aqueous model systems, J Agr Food Chem, 48(9), 2000б, 3830-3838. Makris DP, Rossiter JT, Quercetin and rutin (quercetin 3-O-rhamnosylglucoside) thermal degradation in aqueous media under alkaline conditions, In: Buttriss J, Saltmarsh M, Functional foods II: Claims and evidence, UK: Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2000а, pp 216–238. Manach C, Morand C, Crespy V, Demigné C, Taxier O, Régérat F, Rémésy C, Quercetin is recovered in human plasma as conjugated derivatives which retain antioxidant properties, FEBS Lett, 426(3), 1998, 331–336. Maran JP, Manikandan S, Thirugnanasambandham K, Nivetha CV, Dinesh R, Box-Behnken design based statistical modeling for ultrasound-assisted extraction of corn silk polysaccharide, Carbohyd Polym, 92(1), 2010, 604-611. Marchitan N, Cojocaru C, Mereuta A, Duca G, Cretescu I, Gonta M, Modeling and optimization of tartaric acid reactive extraction from aqueous solutions: A comparison between response surface methodology and artificial neural network, Sep Purif Technol, 75(3), 2010, 273–285. Marston A, Hostettmann K, Separation and Quantification of Flavonoids, In: Andersen OM, Markham KR, Flavonoids-Chemistry, Biochemistry and Applications, Taylor & Francis Group, London, 2006, pp 2-3. Masuoka N, Matsuda M, Kubo I, Characterisation of the antioxidant activity of flavonoids, Food Chem, 131(2), 2012, 541–545. Mašković M, Jančić-Stojanović B, Malenović A, Ivanović D, Medenica M, Assessment of liquid chromatographic method robustness by use of Plackett-Burman design, Acta Chromatogr, 22(2), 2010, 281-296. Matsuura H, Amano M, Kawabata J, Mizutani J, Isolation and measurement of quercetin glucosides in flower buds of Japanese butterbur (Petasites japonicus subsp. gigantea Kitam.), Biosci Biotechnol Biochem, 66(7), 2002, 1571–1575. Литература 169 Mayaud L, Carricajo A, Zhiri A, Aubert G, Comparison of bacteriostatic and bactericidal activity of 13 essential oils against strains with varying sensitivity to antibiotics, Lett Appl Microbiol, 47(3), 2008, 167-173. Mihajlović J, Pechlivanoglou P, Miladinov-Mikov M, Živković S, Postma MJ, Cancer incidence and mortality in Serbia 1999–2009, BMC cancer, 13(1), 2013, 1-11. Milazzo S, Lejeune S, Ernst E, Laetrile for cancer: a systematic review of the clinical evidence, Support Care Cancer, 15(6), 2007, 583–595. Min YD, Choi CH, Bark H, Son HY, Park HH, Lee S, Park JW, Park EK, Shin HI, Kim SH, Quercetin inhibits expression of inflammatory cytokines through attenuation of NF- χB and p38 MAPK in HMC-1 human mast cell line, Inflamm Res, 56, 2007, 210–215. Momić T, Savić J, Černigoj U, Trebše P, Vasić V, Protolytic equilibria and photodegradation of quercetin in aqueous solution, Collect Czech Chem C, 72(11), 2007, 1447-1460. Monagas M, Suárez R, Gómez-Cordovés C, Bartolomé B, Simultaneous determination of nonanthocyanins in phenolic compounds in wines by HPLC-DAD/ESI-MS, Am J Enol Vitic, 56(2), 2005, 139-147. Montgomery DC, Design and analysis of experiments, 5 th Edition, John Wiley & Sons, New York, 2001. Montgomery DC, Design and Analysis of Experiments, John Wiley & Sons, 7 th Edition, New York, 2008. Moskovitz J, Yim KA, Chock PB, Free radicals and disease, Arch Biochem Biophys, 397(2), 2002, 354–359. Mullen W, Yokota T, Lean ME, Crozier A, Analysis of ellagitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in raspberry fruits by LC–MSn, Phytochemistry, 64(2), 2003, 617-624. Munford R, Sensing gram-negative bacterial lipopolysaccharides: a human disease determinant?, Infect Immun, 76(2), 2008, 454-465. Murota K, Terao J, Antioxidative flavonoid quercetin: implication of its intestinal absorption and metabolism, Arch Biochem Biophys, 417(1), 2003, 12–17. Myers RH, Montgomery DC, Response Surface Methodology: Process and product optimization using designed experiments, 2 nd Edition, John Wiley & Sons, New York, 2002. Nagle CM, Olsen CM, Bain CJ, Whiteman DC, Green AC, Webb PM, Tea consumption and risk of ovarian cancer, Cancer Cause Control, 21(9), 2010, 1485–1491. Литература 170 Nandutu AM, Clifford M, Howell NK, Analysis of phenolic compounds in Ugandan sweet potato varieties (NSP, SPK AND TZ), African J Biochem Res, 1(3), 2007, 29-36. Natella F, Nardini M, Di Felice M, Scaccini C, Benzoic and cinnamic acid derivatives as antioxidants: structure-activity relation, J Agr Food Chem, 47(4), 1999, 1453-1459. Nirmala MJ, Samundeeswari A, Sankar PD, Natural plant resources in anti-cancer therapy – A review, Res Plant Biol, 1(3), 2011, 1–14. Nout MJR, Tuncel G, Brimer L, Microbial degradation of amygdalin of bitter apricot seeds (Prunus armeniaca), Int J Food Microbiol, 24(3), 1995, 407–412. Nurulain TZ, Green tea and its polyphenolic catechins: Medicinal uses in cancer and noncancer applications, Life Sciences, 78, 2006, 2073–2080. Ogunleye AA, Xue F, Michels KB, Green tea consumption and breast cancer risk or recurrence: A meta-analysis, Breast Cancer TR, 119(2), 2010, 477–484. Paliwal S, Sundaram J, Mitragotri S, Induction of cancer-specific cytotoxicity towards human prostate and skin cells using quercetin and ultrasound, Brit J Cancer, 92(3), 2005, 499–502. Pan X, Welti R, Wang X, Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry, Nat Protoc, 5(6), 2010, 986–992. Park HJ, Yoon SH, Han LS, Zheng LT, Jung KH, Uhm YK, Lee JH, Jeong JS, Joo WS, Yim SV, Chung JH, Hong SP, Amygdalin inhibits genes related to cell cycle in SNU-C4 humancolon cancer cells, World J Gastroenterol, 11(33), 2005, 5156–5161. Parmee IC, Evolutionary and Adaptive Computing in Engineering Design, Springer, UK, 2001, pp 18. Parsopoulos KE, Vrahatis MN, Initializing the particle swarm optimizer using the nonlinear simplex method, In: Grmela A and Mostarakis, NE (eds.), Advances in intelligent systems, fuzzy systems, evolutionary computation, WSEAS press, 2002, pp 216-221. Pаvеlić K, Kаkо pоbјеditi rаk, Glоbus, Zаgrеb, 1989. Pedrielli P, Skibsted LH, Antioxidant synergy and regeneration effect of quercetin,(-)- epicatechin, and (+)-catechin on α-tocopherol in homogeneous solutions of peroxidating methyl linoleate, J Аgr Food Chem, 50(24), 2002, 7138-7144. Pekkarinen SS, Heinonen IM, Hopia AI, Flavonoids quercetin, myricetin, kaemferol and (+)‐catechin as antioxidants in methyl linoleate, J Sci Food Agr, 79(4), 1999, 499- 506. Литература 171 Pérez-Vizca no F, Ibarra M, Cogolludo AL, Duarte J, Zaragozá-Arnáez F, Moreno L, López- López G, Tamargo J, Endothelium-independent vasodilator effects of the flavonoid quercetin and its methylated metabolites in rat conductance and resistance arteries, J Pharmacol Exp Ther, 302(1), 2002, 66–72. Phani ChRS, Vinaykumar Ch, Umamaheswara rao K, Sindhuja G, Quantitative analysis of quercetin in natural sources by RP-HPLC, Int J Res Pharmaceut Biomed Sci, 1(1), 2010, 19-22. Pinelo M, Manzocco L, Nuñez MJ, Nicoli MC, Solvent effect on quercetin antioxidant capacity, Food Chem, 88(2), 2004, 201-207. Poggio T, Girosi F, Networks for approximation and learning, Proc IEEE, 78(9), 1990, 1481–1497. Pralhad T, Rajendrakumar K, Study of freeze-dried quercetin-cyclodextrin binary systems by DSC, FT-IR, X-ray diffraction and SEM analysis, J Pharm Biomed Anal, 34(2), 2004, 333–339. Priddy KL, Keller PE, Artificial neural networks: An introduction, Vol. 68, SPIE Press, Washington, USA, 2005, pp 13. Prior RL, Hoang H, Gu L, Wu X, Bacchiocca M, Howard L, Hampsch-Woodill M, Huang D, Ou B, Jacob R, Assays for hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity (oxygen radical absorbance capacity (ORACFL)) of plasma and other biological and food samples, J Agr Food Chem, 51(11), 2003, 3273–3279. Promega Corporation, Protocols and Applications Guide, Apoptosis, 2007. Promega Corporation, Protocols and Applications Guide, Cell Viability, 2006. Radji M, Agustama RA, Elya B, Tjampakasari CR, Antimicrobial activity of green tea extract against isolates of methicillin–resistant Staphylococcus aureus and multi–drug resistant Pseudomonas aeruginosa, Asian Pac J Trop Biomed, 3(8), 2013, 663-667. Rajalakshmi PV, Senthil KK, Direct HPLC analysis of quercetin in exudates of Abutilon indicum (Linn). Malvaceae, J Pharmaceut Sci Tech, 1(2), 2009, 80–83. Ranajit S, Principles and management of cancer. A practical guide, BI Publication Pvt. Ltd., New Delhi, 2004. Raskin I, Ribnicky DM, Komarnytsky S, Ilic N, Poulev A, Borisjuk N, Brinker A, Moreno DA, Ripoll C, Yakoby N, O'Neal JM, Cornwell T, Pastor I, Fridlender B, Plants and human health in the twenty-first century, Trends Biotechnol, 20(12), 2002, 522–531. Литература 172 Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Rice-Evans C, Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay, Free Radi Bio Med, 26(9), 1999, 1231–1237. Reza SR, Ali D, Solubility of quercetin in water+ methanol and water+ ethanol from (292.8 to 333.8) K, J Chem Eng Data, 55(9), 2010, 3934–3936. Rios JL, Recio MC, Villar A, Screening methods for natural products with antimicrobial activity: A review of the literature, J Ethnopharmacol, 23(2), 1998, 127-149. Rivasseau C, Boisson AM, Mongélard G, Couram G, Bastien O, Bligny R, Rapid analysis of organic acids in plant extracts by capillary electrophoresis with indirect UV detection Directed metabolic analyses during metal stress, J Chromatogr A, 1129(2), 2006, 283–290. Rixe O, Fojo T, Is cell death a critical end point for anticancer therapies or is cytostasis sufficient?, Clin Cancer Res, 13(24), 2007, 7280–7287. Roginsky V, Lissi EA, Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food, Food Chem, 92(2), 2005, 235–254. Ross JA, Kasum CM, Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety, Annu Rev Nutr, 22(1), 2002, 19–34. Rowland I, Optimal nutrition: fibre and phytochemicals, Proc Nutr Soc, 58(2), 1999, 415– 419. Ruberto G, Renda A, Daquino C, Amico V, Spatafora C, Tringali C, Tommasi ND, Polyphenol constituents and antioxidant activity of grape pomace extracts from five Sicilian red grape cultivars, Food Chem, 100(1), 2007, 203-210. Rumelhart DE, Hinton GE, Williams RJ, Learning representations by back-propagating errors, Cognitive modeling, 1, 2002, 213. Rupasinghe HPV, Kathirvel P, Huber GM, Ultrasonication-assisted solvent extraction of quercetin glycosides from ‘Idared’ apple peels, Molecules, 16(12), 2011, 9783-9791. Rusak G, Komes D, Likić S, Horžić D, Kovač M, Phenolic content and antioxidative capacity of green and white tea extracts depending on extraction conditions and the solvent used, Food Chem, 110, 2008, 852–858. Russo M, Spagnuolo C, Tedesco I, Bilotto S, Russo GL, The flavonoid quercetin in disease prevention and therapy: facts and fancies, Biochem Pharmacol, 83(1), 2012, 6–15. Saeed N, Khan MR, Shabbir M, Antioxidant activity, total phenolic and total flavonoid contents of whole plant extracts Torilis leptophyll L, BMC Complem Altern M, 12(1), 2012, 221. Литература 173 Sagdic O, Karahan AG, Ozcan M, Ozkan G, Note: effect of some spice extracts on bacterial inhibition, Food Sci Technol Int, 9(5), 2003, 353–356. Saim N, Dean JR, Abdullah MP, Zakaria Z, An experimental design approach for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons from highly contaminated soil using accelerated solvent extraction, Anal Chem, 70(2), 1998, 420–424. Sanz MB, Sarabia LA, Herrero A, Ortiz MC, A study of robustness with multivariate calibration. Application to the polarographic determination of benzaldehyde, Talanta, 56(6), 2002, 1039-1048. Sarkar M, Khandavilli S, Panchagnula R, Development and validation of RP-HPLC and ultraviolet spectrophotometric methods of analysis for the quantitative estimation of antiretroviral drugs in pharmaceutical dosage forms, J Chromatogr B, 830(2), 2006, 349-354. Sarker SD, Latif Z, Gray AI, Natural products isolation, Vol. 20, Springer, 2005. Savic I, Marinkovic V, Tasic Lj, Krajnovic D, Savic I, From experimental design to quality by design in pharmaceutical legislation, Accredit Quali Assur, 17(6), 2012а, 627–633. Savic I, Nikolic V, Savic I, Nikolic Lj, Stankovic M, Development and validation of a new RP-HPLC method for determination of quercetin in green tea, J Anal Chem, 68(10), 2013а, 906-911. Savic I, Nikolic V, Savic I, Nikolic Lj, Stankovic M, Development and validation of HPLC method for the determination of amygdalin in the plant extract of plum kernel, Res J Chem Environ, 16(4), 2012б, 80-86. Savic I, Nikolic V, Savic I, Nikolic Lj, Stankovic M, Mathematical modeling of amygdalin isolation from plum kernel using response surface methodology, 21st International Symposium on Mathematical Programming (ISMP), 19-24 August 2012в, Berlin, Germany, Book of Abstracts 2012, MA 376, 231. Savic I, Nikolic V, Savic I, Nikolic Lj, Stankovic M, Optimization of the process of quercetin isolation from green tea using mathematical modeling, 12th Mediterranean Congress of Chemical Engineering, 15.-18.11.2011а, Barcelona, Spain, CD: abs_12_027_P. Savic I, Nikolic V, Savic I, Nikolic Lj, Stankovic M, Optimization of the extraction conditions for polyphenolic compounds from green tea, 12th Mediterranean Congress of Chemical Engineering, 15.-18.11.2011б, Barcelona, Spain, CD: abs_12_026_P. Savić I, Nikolić V, Nikolić Lj, Stojanović S, Došić A, Savić I, Stress photodegradation study of quercetin, „3rd International congres „Engineering, materials and management in the processing industry”, 4-6 march 2013в, Jahorina, Republika Srpska, 599-607. Литература 174 Savić I, Nikolić V, Savić I, Nikolić Lj, Stanković M, Moder K, Optimization of total flavonoid compound extraction from Camellia sinensis using the artificial neural network and response surface methodology, Hem Ind, 67(2), 2013б, 249-259. Scalia S, Mezzena M, Incorporation of quercetin in lipid microparticles: effect on photo- and chemical-stability, J Pharm Biomed Anal, 49(1), 2009, 90-94. Scalia S, Mezzena M, Photostabilization effect of quercetin on the UV filter combination, butyl methoxydibenzoylmethane-octyl methoxycinnamate, Photochem Photobiol, 86(2), 2010, 273-278. Schalkoff RJ, Artificial Neural Networks, McGraw-Hill, New York, 1997. Seeram NP, Henning SM, Niu Y, Lee R, Scheuller HS, Heber D, Catechin and caffeine content of green tea dietary supplements and correlation with antioxidant capacity, J Agr Food Chem, 54(5), 2006, 1599-1603. Sen S, Chakraborty R, The Role of Antioxidants in Human Health, In: Andreescu S, Hepel M, Oxidative Stress: Diagnostics, Prevention, and Therapy, Chapter 1, OUP USA, 2011, pp 1–37. Sharif KM, Rahman MM, Azmir J, Mohamed A, Jahurul MHA, Sahena F, Zaidul ISM, Experimental design of supercritical fluid extraction – A review, J Food Eng, 124, 2014, 105-116. Shi H, Noguchi N, Niki E, Introducing natural antioxidants, In: Yanishlieva N, Pokorný J, Gordon MH, Antioxidants in food: Practical applications, CRC Press, 2001, pp 22-70. Shrubsole MJ, Lu W, Chen Z, Shu XO, Zheng Y, Dai Q, Cai Q, Gu K, Ruan ZX, Gao YT, Zheng W, Drinking green tea modestly reduces breast cancer risk, J Nutr, 139(2), 2009, 310–316. Sinha K, Chowdhury S, Saha PD, Datta S, Modeling of microwave-assisted extraction of natural dye from seeds of Bixa orellana (Annatto) using response surface methodology (RSM) and artificial neural network (ANN), Ind Crop Prod, 41, 2013, 165–171. Sinha K, Saha PD, Datta S, Extraction of natural dye from petals of Flame of forest (Butea monosperma) flower: Process optimization using response surface methodology (RSM), Dyes Pigments, 94(2), 2012б, 212-216. Sinha K, Saha PD, Datta S, Response surface optimization and artificial neural network modeling of microwave assisted natural dye extraction from pomegranate rind, Ind Crop Prod, 37(1), 2012а, 408–414. Литература 175 Sisa M, Bonnet SL, Ferreira D, Van der Westhuizen JH, Photochemistry of Flavonoids, Molecules, 15(8), 2010, 5196-5245. Slavova A, Mladenov V, Cellular Neural Networks: Theory and Applications, Nova Publishers, New York, USA, 2004. Smith GJ, Thomsen SJ, Markham KR, Andary C, Cardon D, The photostabilities of naturally occurring 5-hydroxyflavones, flavonols, their glycosides and their aluminium complexes, J Photoch Photobio A, 136(1–2), 2000, 87–91. South J, Laetrile, the answer to cancer, IAS Anti-Aging Bull, 4(7), 2000, 10–20. Spanilá M, Pazourek J, Farková M, Havel J, Optimization of solid-phase extraction using artificial neural networks in combination with experimental design for determination of resveratrol by capillary zone electrophoresis in wines. J Chromatogr A, 1084(1), 2005, 180-185. Sparreboom A, de Jonge MJA, Verweij J, The use of oral cytotoxic and cytostatic drugs in cancer treatment, Eur J Cancer, 38(1), 2002, 18–22. Stacewicz-Sapuntzakis M, Bowen PE, Hussain EA, Damayanti-Wood BI, Farnsworth NR, Chemical composition and potential health effects of prunes: a functional food?, Crit Rev Food Sci, 41(4), 2001, 251-286. Stanković N, Čomić Lj, Kocić B, Nikolić D, Mihajilov-Krstev T, Ilić B, Miladinović D, Odnos antibakterijske aktivnosti i hemijskog sastava etarskih ulja gajenih biljaka iz Srbije, Hem ind, 65(5), 2011, 583–589. Steele VE, Kelloff GJ, Balentine D, Boone CW, Mehta R, Bagheri D, Sigman CC, Zhu S, Sharma S, Comparative chemopreventive mechanisms of green tea, black tea and selected polyphenol extracts measured by in vitro bioassays, Carcinogenesis, 21(1), 2000, 63–67. Steinmann D, Ganzera M, Recent advances on HPLC/MS in medicinal plant analysis, J Pharm Biomed Anal, 55(4), 2011, 744–757. Stewart AJ, Mullen W, Crozier A, On‐line high‐performance liquid chromatography analysis of the antioxidant activity of phenolic compounds in green and black tea, Mol Nutr Food Res, 49(1), 2005, 52-60. Stöggl WM, Huck CW, Bonn GK, Structural elucidation of catechin and epicatechin in sorrel leaf extracts using liquid-chromatography coupled to diode array-, fluorescence-, and mass spectrometric detection, J Sep Sci, 27(7-8), 2004, 524-528. Литература 176 Suárez B, Picinelli A, Mangas JJ, Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders, J Chromatogr A, 727(2), 1996, 203-209. Sun J, Liang F, Bin Y, Li P, Duan C, Screening non-colored phenolics in red wines using liquid chromatography/ultraviolet and mass spectrometry/mass spectrometry libraries, Molecules, 12(3), 2007, 679-693. Swain E, Poulton JE, Utilization of amygdalin during seedling development of Prunus serotina, Plant Physiol, 106(2), 1994, 437–445. Syrigos KN, Rowlinson-Busza G, Epenetos AA, In vitro cytotoxicity following specific activation of amygdalin by β-glucosidase conjugated to a bladder cancer-associated monoclonal antibody, Int J Cancer, 78(6), 1998, 712–719. Tabaraki R, Heidarizadi E, Benvidi A, Optimization of ultrasonic-assisted extraction of pomegranate (Punica granatum L.) peel antioxidants by response surface methodology, Sep Purif Technol, 98, 2012, 16–23. Tang N, Wu Y, Zhou B, Wang B, Yu R, Green tea, black tea consumption and risk of lung cancer: a meta-analysis, Lung Cancer, 65(3), 2009, 274–283. Taylor PW, Hamilton-Miller JM, Stapleton PD, Antimicrobial properties of green tea catechins, Food Sci Technol Bull, 2, 2005, 71. Thagaard N, Extraction of amygdalin from fruit kernels, WIPO Patent Application WO/1996/020716, 1996. Thomsen V, Schatzlein D, Mercuro D, Limits of detection in spectroscopy, Spectroscopy, 18(12), 2003, 112-114. Toda M, Okubo S, Ikigai H, Shimamura T, Antibacterial and anti-hemolysin activities of tea catechins and their structural relatives, Nihon Saikingaku Zasshi, 45(2), 1990, 561- 566. Tokuşoğlu Ö, Ünal MK, Yildirim Z, HPLC–UV and GC–MS characterization of the flavonol aglycons quercetin, kaempferol, and myricetin in tomato pastes and other tomato- based products, Acta Chromatogr, 13, 2003,196-207. Topp BL, Russell DM, Neumüller M, Dalbó MA, Liu W, Plum, In: Badenens ML, Byrne DH, Fruit Breeding, Springer US, 2012, pp 571–621. Trivedi KJ, Chokshi PV, Patel NS, Development and validation of RP-HPLC method for analysis of cefixime trihydrate and sulbactam sodium in their combination tablet dosage form, Development, 4(4), 2012, 1628-1632. Tzia C, Liadakis G, Extraction optimization in food engineering, CRC Press, 2003. Литература 177 Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J, Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease, Int J Biochem Cell Biol, 39(1), 2007, 44-84. Vaya J, Aviram M, Nutritional antioxidants mechanisms of action, analyses of activities and medical applications, Curr Medic Chem-Immun, Endocrine Metab Agents, 1(1), 2001, 99-117. Vedmedenko E, Competing interactions and pattern formation in nanoworld, John Wiley & Sons, Weinheim, Germany, 2007, pp 92. Vertuani S, Angusti A, Manfredini S, The antioxidants and pro-antioxidants network: An overview, Curr Pharm Design, 10(14), 2004, 1677–1694. Vicentini F, Georgetti SR, Jabor JR, Caris JA, Bentley MVL, Fonseca MJ, Photostability of quercetin under exposure to UV irradiation, Lat Am J Pharm, 26(1), 2007, 119-124. Vicentini FT, Vaz MM, Fonseca YM, Bentley MVL, Fonseca MJ, Characterization and stability study of a water-in-oil microemulsion incorporating quercetin, Drug Dev Ind Pharm, 37(1), 2011, 47-55. Voldřich M, Kyzlink V, Cyanogenesis in canned stone fruits, J Food Sci, 57(1), 1992, 161– 162. Walle T, Absorption and metabolism of flavonoids, Free Rad Biol Med, 36(7), 2004, 829- 837. Wang H, Helliwell K, Determination of flavonols in green and black tea leaves and green tea infusions by high-performance liquid chromatography, Food Res Int, 34(2), 2001, 223-227. Wang L, Lee IM, Zhang SM, Blumberg JB, Buring JE, Sesso HD, Dietary intake of selected flavonols, flavones, and flavonoid-rich foods and risk of cancer in middle-aged and older women, Am J Clin Nutr, 89(3), 2009, 905–912. Wang L, Yang B, Wang R, Du X, Extraction of pepsin-soluble collagen from grass carp (Ctenopharyngodon idella) skin using an artificial neural network, Food Chem, 111(3), 2008, 683–686. Watson J, Separation methods for waste and environmental applications, CRC Press, 1999, pp 457. Werbos PJ, Backpropagation through time: What it does and how to do it, Proc IEEE, 78(10), 1990, 1550–1560. WHO, Global cancer rate could increase by 50% to 15 million by 2020, World Cancer Report, Geneva, 2003. Литература 178 Wiess ML, Neuronal Network Research Horizons, Nova Publishers, New York, USA, 2007. Wiley RC (Ed.), Minimally processed refrigerated fruits and vegetables, Chapman & Hall, 1994. Williams BL, Wender SH, Isolation and identification of quercetin and isoquercitrin from apricots (Prunus armeniaca), Arch Biochem Biophys, 43(2), 1953, 319–323. Winsor GL, Lam DK, Fleming L, Lo R, Whiteside MD, Yu NY, Hancock RE, Brinkman FS, Pseudomonas Genome Database: improved comparative analysis and population genomics capability for Pseudomonas genomes, Nucleic Acids Res, 39(suppl 1), 2011, D596-D600. Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB, Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study, Clin Infect Dis, 39(3), 2004, 309-317. Wythoff BJ, Backpropagation neural networks: a tutorial, Chemometr Intell Lab Syst, 18(2), 1993, 115–155. Yam TS, Shah S, Hamilton‐Miller JM, Microbiological activity of whole and fractionated crude extracts of tea (Camellia sinensis), and of tea components, FEMS Microbiol Lett, 152(1), 1997, 169-174. Yan J, Tong S, Li J, Lou J, Preparative isolation and purification of amygdalin from Prunus armeniaca L with high recovery by high-speed countercurrent chromatography, J Liq Chromatogr RT, 29(9), 2006, 1271–1279. Yilmaz Y, Toledo RT, Major flavonoids in grape seeds and skins: antioxidant capacity of catechin, epicatechin, and gallic acid, J Agr Food Chem, 52(2), 2004, 255-260. Yokoe I, Higushi K, Shirataki Y, Komatsu M, Photochemistry of Flavonoids. III. Photorearrangement of Flavonols, Chem Pharm Bull, 29(3), 1981, 894-898. Yurdugül S, Bozoglu F, Studies on antimicrobial activity and certain chemical parameters of freeze-dried wild plums (Prunus Spp.), Pakistan J Nutr, 8(9), 2009, 1434-1441. Zgórka G, Pressurized liquid extraction versus other extraction techniques in micropreparative isolation of pharmacologically active isoflavones from Trifolium L. species, Talanta, 79(1), 2009, 46-53. Zhang F, Yang Y, Su P, Guo Z, Microwave-assisted extraction of rutin and quercetin from the stalks of Euonymus alatus (Thunb.) Sieb, Phytochem Anal, 20(1), 2009, 33–37. Zhang H, Zhang M, Yu L, Zhao Y, He N, Yang X, Antitumor activities of quercetin and quercetin-5′,8-disulfonate in human colon and breast cancer cell lines, Food Chem Toxicol, 50(5), 2012, 1589–1599. Литература 179 Zhang HC, Yin C, Dong J, Li CY, Cheng CL, Study on extracting process of amygdalin from Almond Pollen, Food Sci, 7, 2007, 057. Zhang M, Swarts SG, Yin L, Liu C, Tian Y, Cao Y, Swarts M, Yang S, Zhang SB, Zhang K, Ju S, Olek DJ, Schwartz L, Keng PC, Howell R, Zhang L, Okunieff P, Antioxidant properties of quercetin, Adv Exp Med Biol, 701, 2011, 283–289. Zhang X, Albanes D, Beeson WL, van den Brandt PA, Buring JE, Flood A, Freudenheim JL, Giovannucci EL, Goldbohm RA, Jaceldo-Siegl K, Jacobs EJ, Krogh V, Larsson SC, Marshall JR, McCullough ML, Miller AB, Robien K, Rohan TE, Schatzkin A, Sieri S, Spiegelman D, Virtamo J, Wolk A, Willett WC, Zhang SM Smith-Warner SA, Risk of colon cancer and coffee, tea, and sugar-sweetened soft drink intake: Pooled analysis of prospective cohort studies, J Natl Cancer I, 102(11), 2010, 771–783. Zheng Y, Haworth IS, Zuo Z, Chow MS, Chow AH, Physicochemical and structural characterization of quercetin-β-cyclodextrin complexes, J Pharm Sci, 94(5), 2005, 1079–1089. Zivanovic Lj, Licanski A, Zecevic M, Jocic B, Kostic M, Application of experimental design in optimization of solid phase extraction of mycophenolic acid and mycophenolic acid glucuronide from human urine and plasma and SPE-RP-HPLC method validation, J Pharmaceut Biomed, 47(3), 2008, 575–585. Zuloaga O, Etxebarria N, Fernández LA, Madariaga JM, Optimisation and comparison of microwave-assisted extraction and Soxhlet extraction for the determination of polychlorinated biphenyls in soil samples using an experimental design approach, Talanta 50(2), 1999, 345–357. Zupan J, Gasteiger J, Neural Networks for chemists: an introduction, John Wiley & Sons, New York, 1993. Прилог 180 ПРИЛОГ Прилог I. Сојеви микроорганизама третирани стандардом кверцетина и екстрактом зеленог чаја са израженим зонама инхибиције Прилог 181 Прилог II. Сојеви микроорганизама третирани стандардом амигдалина и екстрактом семена шљиве са израженим зонама инхибиције Биографија аутора 182 Биографија аутора Иван Савић рођен је 26.06.1986. у Лесковцу. Основну и средњу Хемијско-технолошку школу у Лесковцу завршио је као ученик генерације. Добитник је Вукове дипломе за постигнут успех. Основне академске студије на Технолошком факултету у Лесковцу уписао је 2005. год. Студије завршава у року са просечном оценом 9,85. Дипломски рад одбранио је на истом Факултету са оценом 10. Добитник је признања „11. Јануар” града Ниша као најбољи студент Факултета за 2007. и 2009. год. Универзитет у Нишу доделио му је повељу као најбољем дипломираном студенту за школску 2008/09. год. Нoсилaц je спeциjaлнoг признaњa Српскoг хeмиjскoг друштвa зa 2010. гoд. За време студирања био је стипендиста Фонда за младе таленте, Министарства просвете и Фонда за доделу стипендија и награда на подручју града Лесковца. Захвалницу за значајан допринос развоју Факултета добио је 2009. год. Докторске студије уписао је 2009. год. на Технолошком факултету у Лесковцу. Службени гласник додељује му признање као најбољем студенту докторских студија, 2010. год. Добитник је финансијске подршке младим талентима на подручју града Лесковца у 2013. год. Био је стипендиста Министарства просветe, науке и технолошког развоја (МНТР) на докторским студијама. Члан је Српског хемијског друштва и Савеза хемијских инжењера Србије. Објавио је поглавља у међународним књигама (2), радове у водећим часописима међународног значаја (2), часописима међународног значаја (21), водећим часописима националног значаја (2), часописима националног значаја (2), радове у целини на скуповима међународног (5) и националног (2) значаја, радове на скуповима међународног (11) и националног (10) значаја штампана у изводу. Коаутор је 11 техничких решења (5 нова поступка, 6 нове методе). Био је рецензент научних радова у мeђунaрoдним часописима. Као истраживач-стипендиста учествовао је у реализацији два национална пројекта финансирана од стране МНТР. Као студент докторских студија био је ангажован у настави на извођењу лабораторијских вежби (2010-2013). Од 2013. год. изабран је у наставно звање асистент на Технолошком факултету у Лесковцу. Изјаве аутора 183 Изјаве аутора Изјаве аутора 184 Изјаве аутора 185 Изјаве аутора 186