UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA HEMIJU Budimir S. Ilić HEMOMETRIJSKА АNАLIZА REZULTАTА HEMIJSKIH I BIOLOŠKIH ISTRАŽIVАNJА FАRMАKOLOŠKI ZNАČАJNIH BILJАKА Doktorska disertacija Niš, 2014 UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF CHEMISTRY Budimir S. Ilić CHEMOMETRIC ANALYSIS OF CHEMICAL AND BIOLOGICAL STUDIES OF PHARMACOLOGICALLY IMPORTANT PLANTS PhD thesis Niš, 2014 Eksperimentalni deo ove doktorske disertacije je urađen u laboratorijama Medicinskog fakulteta Univerziteta u Nišu, Instituta za javno zdravlje u Nišu, Prirodno-Matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu i Instituta za hemiju tehnologiju i metalurgiju Univerziteta u Beogradu. Izrada ove doktorske disertacije je realizovana u okviru projekta OI 171025 finansiranog od strane Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Vlade Republike Srbije. Najiskrenije se zahvaljujem svom mentoru dr Dragoljubu L. Miladinoviću, vanrednom profesoru Medicinskog fakulteta u Nišu, koji je predložio temu i rukovodio izradom ove doktorske disertacije. Veliku zahvalnost dugujem i Prof. dr Vesni P. Stankov- Jovanović, na nesebičnoj pomoći i nizu korisnih sugestija i saveta koji su uticali na kvalitet same disertacije. Sa zadovoljstvom se zahvaljujem profesorima i kolegama na izuzetnoj saradnji i stručnoj pomoći: Prof. dr Tatjani M. Mihajilov Krstev, Prof. dr Nikoli D. Nikoliću, Prof. dr Branislavi D. Kocić, Prof. dr Vidosavu L. Markoviću, Prof. dr Olgi G. Cvetković i Dejanu M. Nikoliću, spec. sanitarne hemije. Najsrdačnije se zahvaljujem mojoj porodici i prijateljima, na ogromnom strpljenju, razumevanju i nesebičnoj podršci u teškim trenucima svih ovih godina. Прилог 4/1 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: докторска дисертација Аутор, АУ: Будимир С. Илић Ментор, МН: Драгољуб Л. Миладиновић Наслов рада, НР: ХЕМОМЕТРИЈСКА АНАЛИЗА РЕЗУЛТАТА ХЕМИЈСКИХ И БИОЛОШКИХ ИСТРАЖИВАЊА ФАРМАКОЛОШКИ ЗНАЧАЈНИХ БИЉАКА Језик публикације, ЈП: Српски Језик извода, ЈИ: Енглески Земља публиковања, ЗП: Србија Уже географско подручје, УГП: Србија Година, ГО: 2014. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: 217 страна, 49 табела, 47 слика и 242 референце Научна област, НО: Хемија Научна дисциплина, НД: медицинска хемија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Хемометрија, биљке, биогени елементи, етарска уља, антибиотици, антибактеријска активност, синергизам, молекуларни докинг УДК (543.068 + 54 + 57) : (633.8 + 615.1) Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Експериментални део је урађен у лабораторијама Медицинског факултета Универзитета у Нишу, Института за јавно здравље у Нишу, Природно- Математичког факултета Универзитета у Нишу, Института за хемију технологију и металургију Универзитета у Београду. Извод, ИЗ: Биљке синтетишу примарне и секундарне метаболите помоћу једноставних молекула, међу којима значајно место заузимају неорганска једињења. Истраживање екстрактибилности и растворљивости елемената у земљишту помаже објашњењу механизама апсорпције истих од стране биљних врста.   Осим примарних и секундарних метаболита који имају доказана лековита својства, биљке су извор неопходних елемената битних за оптимално функционисање људског организма на биохемијском нивоу. Имајући у виду резистенцију бактерија на синтетичке антибиотике последњих деценија, неопходно је систематски трагати за новим антибактеријским агенсима, а етарска уља су потенцијално најбогатије налазиште природних антибиотика. Развој нових метода заснованих на комбинованој интеракцији синтетичких и природних антибиотика може помоћи у решавању бактеријске резистентности. Један број научних истраживања која се реализују последњих година, усмерена су ка анализи добијених експерименталних резултата хемометријским методама. У зависности од начина поставке проблема, тј. у зависности од одабира променљивих, хемометријске методе и тумачење корелационих односа можемо применити на експерименталне системе, у циљу објашњења њихове повезаности, сличности и разлика. Од недавно се хемометријске методе примењују у анализи екосистема, у циљу објашњења дистрибуције и акумулације појединих минерала у земљишту и биљкама. Такође се интензивно проучава зависност хемијске структуре природних и синтетичких анбиотика и њихове фармаколошке активности. Датум прихватања теме, ДП: 28.01.2013. године Датум одбране, ДО: Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан: Члан, ментор: Образац Q4.09.13 - Издање 1 Прилог 4/2 ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ KEY WORDS DOCUMENTATION Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: doctoral dissertation Author, AU: Budimir S. Ilić Mentor, MN: Dragoljub L. Miladinović Title, TI: CHEMOMETRIC ANALYSIS OF CHEMICAL AND BIOLOGICAL STUDIES OF PHARMACOLOGICALLY IMPORTANT PLANTS Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2014 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: 217 pages, 49 tables, 47 figures and 242 references Scientific field, SF: chemistry Scientific discipline, SD: medicinal chemistry Subject/Key words, S/KW: Chemometry, plants, biogenic elements, essential oils, antibiotics, antibacterial activity, synergism, molecular docking UC (543.068 + 54 + 57) : (633.8 + 615.1) Holding data, HD: Library Note, N: The experimental work was performed in the research laboratories of the: Faculty of Medicine, University of Niš; Institute for Public Health, Niš; Faculty of Science and Mathematics, University of Niš; Institute for Chemistry, Technology and Metallurgy, University of Belgrade. Abstract, AB: Plants synthesize primary and secondary metabolites from simple molecules, among which inorganic compounds are of great importance. Examining the extractability and solubility of the soil elements helps us explicate the mechanism of their adsorption by plants.   Besides primary and secondary metabolites, which were proven to have healing properties, plants are a source of necessary elements which are on a biochemical level important for optimal functioning of the human body. Taking into regard the bacterial resistance towards synthetic antibiotics, in the past few decades, it is necessary to systematically search for new antibacterial agents, and essential oils are potentially the most abundant reservoir of natural antibiotics. The development of new methods based on a combined interaction of synthetic and natural antibiotics can help us solve the issue of bacterial resistance. A number of scientific researches, which have been conducted in the past few years, have focused on analyzing the experimental results using chemometric methods. Depending on the angle from which the problem is approached; i.e. depending on the chosen variables, the chemometric method and the interpretation of correlations can be applied to experimental system, in order to determine its connections, similarities and differences. Recently, chemometric methods have started being used for ecosystem analysis, in order to determine the distribution and accumulation of specific minerals in the soil and plants. The dependance of chemical structures in natural and synthetic antibiotics and their pharmacological activities has also been a subject of intensive research. Accepted by the Scientific Board on, ASB: 28.01.2013. year Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member: Member, Mentor: Образац Q4.09.13 - Издање 1  SADRŽAJ 1. UVOD ................................................................................................................................................. 1 2. OPŠTI DEO ........................................................................................................................................ 5 2.1. Biogeni elementi u biljkama ........................................................................................................ 6 2.2. Etarska ulja ................................................................................................................................... 9 2.2.1. Literaturni pregled hemijskih i bioloških istraživanja terpenoida, odabranih biljnih vrsta ................................................................. 10 2.2.2. Antibakterijska aktivnost etarskog ulja ............................................................................... 12 2.2.2.1. Strukturna građa bakterija ............................................................................................ 12 2.2.2.2. Struktura i funkcija ćelijskog zida bakterije ................................................................. 12 2.2.2.3. Struktura i funkcija citoplazmatične membrane .......................................................... 14 2.2.2.4. Sinteza proteina i njeni inhibitori ................................................................................. 16 2.2.2.4.1. Hloramfenikol ....................................................................................................... 18 2.2.2.4.2. Tetraciklin ............................................................................................................. 19 2.2.2.4.3. Streptomicin .......................................................................................................... 21 2.2.2.5. Mehanizam toksičnosti na citoplazmatičnoj membrani ............................................... 22 2.3. Hemometrijske metode analize .................................................................................................. 25 2.3.1. Selektivna jon analiza (SIA) ............................................................................................... 25 2.3.2. Metoda glavnih komponenata (PCA) i klaster analize (HCA) ........................................... 25 2.3.3. Metoda molekularnog dokinga (SAR) ................................................................................ 26 3. EKSPERIMENTALNI DEO ............................................................................................................ 28 3.1. Biljni materijal, supstance i korišćene hemikalije ...................................................................... 29 3.2. Određivanje sadržaja metala ...................................................................................................... 29 3.2.1. Mikrotalasna digestija zemljišta i biljnog materijala .......................................................... 29 3.2.2. Analiza metala .................................................................................................................... 30 3.2.3. Sekvencionalna BCR ekstrakcija ........................................................................................ 30 3.2.4. Ispitivanje uzoraka zemljišta metodom rendgenske difrakcije (XRD-analiza) ................... 31 3.2.5. Određivanje kiselosti, redoks potencijala, provodljivosti, sadržaja organske materije i katjonsko izmenjivačkog kapaciteta zemljišta ................................................................... 31 3.3. Hemijski sastav etarskih ulja ...................................................................................................... 32 3.3.1. Izolovanje etarskog ulja ...................................................................................................... 32 3.3.2. Gasna hromatografija (GC) ................................................................................................. 32 3.3.3. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC-MS)..................................................... 32 3.3.4. Identifikacija komponenata etarskog ulja ........................................................................... 32 3.4. Antibakterijska aktivnost ispitanih supstanci ............................................................................. 33  3.4.1. Ispitane supstance ............................................................................................................... 33 3.4.2. Bakterijski sojevi ................................................................................................................ 33 3.4.3. Mikrodiluciona metoda ....................................................................................................... 33 3.4.4. Mikrodiluciona "checkerboard" metoda ............................................................................. 34 3.5. Hemometrijska obrada podataka ................................................................................................ 35 4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................................. 36 4.1. Sadržaj metala u zemljištu ......................................................................................................... 37 4.1.1. Hemometrijska analiza sadržaja metala karbonatne frakcije zemljišta ............................... 37 4.1.2. Hemometrijska analiza sadržaja metala Fe/Mn oksidne frakcije zemljišta ........................ 40 4.1.3. Hemometrijska analiza sadržaja metala organske frakcije zemljišta .................................. 42 4.1.4. Hemometrijska analiza zemljišta na osnovu ukupnog sadržaja metala .............................. 43 4.1.5. Hemometrijska analiza stepena zasićenja zemljišta (EF) ................................................... 44 4.1.6. X-ray difrakciona (XRD) i hemometrijska analiza mineralnog sastava zemljišta .............. 46 4.1.7. Hemijski parametri zemljišta .............................................................................................. 49 4.2. Sadržaj metala u ispitanim biljnim vrstama ............................................................................... 54 4.2.1. Hemometrijska analiza sadržaja metala u ispitanim biljakama .......................................... 58 4.3. Hemometrijska analiza koeficijenata izmene elemenata (TC) ................................................... 60 4.4. Hemometrijska analiza biokoncentracionog faktora elemenata (BF) ........................................ 62 4.5. Etarska ulja ................................................................................................................................. 65 4.5.1. Hemijski sastav etarskog ulja T. pulegioides ...................................................................... 65 4.5.2. Hemijski sastav etarskog ulja T. glabrescens ..................................................................... 67 4.5.3. Hemijski sastav etarskog ulja S. kitaibelii........................................................................... 69 4.5.4. Hemijski sastav etarskog ulja N. nuda ................................................................................ 71 4.5.5. Hemijski sastav etarskog ulja L. montana .......................................................................... 73 4.5.6. Hemijski sastav etarskog ulja P. longifolium ...................................................................... 75 4.5.7. Hemijski sastav etarskog ulja P. officinale ......................................................................... 77 4.5.8. Hemijski sastav etarskog ulja I. graveolens ........................................................................ 79 4.5.9. Hemometrijska analiza hemijskog sastava ulja na osnovu grupa jedinjenja....................... 79 4.5.10. Hemometrijska analiza ulja na osnovu svih hemijskih komponenata ............................... 82 4.6. Antibakterijska aktivnost ispitanih supstanci ............................................................................. 84 4.6.1. Hemometrijska analiza supstanci na osnovu MIC vrednosti .............................................. 93 4.6.2. Hemometrijska analiza supstanci na osnovu MBC vrednosti ............................................. 94 4.6.3. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema T. pulegioides ulje-antibiotik ................................................................................ 95 4.6.4. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema T. glabrescens ulje-antibiotik ................................................................................ 98   4.6.5. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema S. kitaibelii ulje-antibiotik ..... 101 4.6.6. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema N. nuda ulje-antibiotik .......... 103 4.6.7. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema L. montana ulje-antibiotik ..... 106 4.6.8. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema P. longifolium ulje-antibiotik .............................................................................. 108 4.6.9. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema P. officinale ulje-antibiotik ... 111 4.6.10. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema I. graveolens ulje-antibiotik .............................................................................. 113 4.6.11. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema geraniol-antibiotik ............... 116 4.6.12. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema timol-antibiotik.................... 118 4.6.13. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema linalool-antibiotik ................ 121 4.6.14. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema eukaliptol-antibiotik ............ 123 4.6.15. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema geranil acetat-antibiotik ....... 126 4.6.16. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema limonen-antibiotik ............... 128 4.6.17. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema geraniol-monoterpenoid ...... 130 4.6.18. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema timol-monoterpenoid ........... 133 4.6.19. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema linalool-monoterpenoid ....... 135 4.6.20. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema eukaliptol-monoterpenoid ... 138 4.6.21. Analiza antibakterijske aktivnosti sistema geranil acetat-monoterpenoid ...................... 141 4.6.22. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema limonen-monoterpenoid ...... 141 4.6.23. Analiza antibakterijske aktivnosti sistema limonen-geranil acetat ................................. 144 4.6.24. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema supstanca-antibiotik-bakterijski soj ................................................................... 145 4.7. Akumulacija ispitivanih terpenoida i antibiotika u citoplazmatičnoj membrani ..................... 149 4.8. Molekularni doking na ćelijske receptore ................................................................................ 152 4.8.1. Molekularni doking na receptore antibakterijske aktivnosti hloramfenikola .................... 152 4.8.2. Molekularni doking na receptore antibakterijske aktivnosti teraciklina i streptomicina ............................................................................... 155 4.8.3. Molekularni doking na važne receptore ćelijskog zida i citoplazmatične membrane ....... 157 4.8.4. Molekularni doking na citohrom C oksidazu i ATP-sintazu............................................. 161 5. ZAKLJUČAK ................................................................................................................................. 167 6. LITERATURA ............................................................................................................................... 171 7. PRILOG .......................................................................................................................................... 193 8. BIOGRAFIJA ................................................................................................................................. 212 9. IZJAVE AUTORA ......................................................................................................................... 214   1. U V O D  Primenа lekovitih biljаkа predstаvljа nerаzdvojivi deo kulturne bаštine čovečаnstvа. I pored vekovnog korišćenjа biljаkа u trаdicionаlnoj medicini, mаlo se znаlo o njihovom hemijskom sаstаvu. Početkom XIX vekа zаpočinju nаučnа ispitivаnjа hemijskog sаstаvа biljаkа i izolovаnje biološki аktivnih jedinjenjа u čistom stаnju. Poznаvаnje hemijskog sаstаvа određene biljne vrste omogućаvа pronаlаženje novih nаčinа njene primene u rаznim grаnаmа industrije, posebno u fаrmаceutskoj i prehrаmbenoj industriji. Biljke sintetišu primаrne i sekundаrne metаbolite pomoću jednostаvnih molekulа, među kojimа znаčаjno mesto zаuzimаju neorgаnskа jedinjenjа. Istrаživаnje ekstrаktibilnosti i rаstvorljivosti hemijskih elemenаtа u zemljištu pomаže objаšnjenju mehаnizаmа аpsorpcije, distribucije i akumulacije u biljnim organima. Osim toga, određene biljne vrste su izvor velikog broja elemenаtа koji su neophodni zа optimаlno funkcionisаnje ljudskog orgаnizmа nа biohemijskom nivou. Antibiotici su supstаnce koje se dobijаju iz rаzličitih vrstа mikroorgаnizаmа ili sintetičkim putem, а široko se primenjuju zа lečenje bolesti uzrokovаnih pаtološkim mikroorgаnizmimа, kаko kod ljudi, tаko i kod životinjа. Dobijeno je nа stotine аntibiotikа, koji se međusobno znаčаjno rаzlikuju u hemijskom sаstаvu, fаrmаkološkim svojstvimа, аntibаkterijskom spektru i mehаnizmu dejstvа. Fаktor koji ogrаničаvа primenu аntibiotikа je znаtnа toksičnost, posebno u toku dugotrаjne terаpije i/ili lečenjа visokim dozаmа. Rezistencijа bаkterijа nа sintetičke аntibiotike poslednjih decenijа smаnjuje procenаt izlečenjа infektivnih bolesti u svetu. Imаjući u vidu nаvedeno, neophodno je permаnentno i sistemаtski trаgаti zа novim аntibаkterijskim аgensimа i razmatrati nove metodološke pristupe. Etаrskа uljа, izolovana iz različitih biljnih organa su, u poređenju sa ostallim prirodnim proizvodima, bez svаke sumnje potencijаlno nаjbogаtije nаlаzište prirodnih аntibiotikа. Hemometrija je hemijska disciplina koja koristi matematičke i statističke metode, da oblikuje ili odabere optimalan postupak merenja ili eksperiment i omogući dobijanje maksimalnog broja informacija o analiziranom sistemu. U zаvisnosti od nаčinа postаvke problemа, tj. u zаvisnosti od odаbirа promenljivih, hemometrijske metode i tumаčenje korelаcionih odnosа možemo primeniti nа različitim sistemima, u cilju objаšnjenjа njihove povezаnosti, sličnosti i rаzlika. Od nedаvno se hemometrijske metode primenjuju u аnаlizi ekosistemа, u cilju objаšnjenjа distribucije i аkumulаcije pojedinih hemijskih elemenata u zemljištu i biljkаmа. Tаkođe se intenzivno proučаvа zаvisnost hemijske strukture prirodnih i sintetičkih аntibiotikа i njihove fаrmаkološke аktivnosti. Hemometrijskа analiza eksperimentаlnih rezultаtа pokаzаće značajnost genetskih i edafskih fаktora zа аkumulаciju pojedinih elemenаtа u biljkаmа. Tаkođe ispitivаnjа će pokаzаti dа li 2  je odnos nekih elemenаtа u zemljištu i biljci, konstаntаn i nepromenljiv ili međusobno uslovljen genetskom predispozicijom biljne vrste. Ovi rezultаti biće od znаčаjа zа potpuniju kаrаkterizаciju аpsorpcije i akumulacije elemenаtа u proučavanim biljnim vrstama. Sа аspektа proučаvаnjа hemijskog sаstаvа etаrskih uljа i njihove аntibаkterijske аktivnosti suštinski zadatak ovog rаdа je rаzrаdа i primenа hemometrijskih metodа zа ispitivаnje interаkcije аntibiotikа i etаrskih uljа i njihove kombinovаne upotrebe u fаrmаceutskim formulаcijаmа. Izbor biljnih vrsta, koje su obrađene u ovoj studiji je učinjen nakon preliminarnih istraživanja koja su obuhvatila više od 20 biljnih vrsta. Kriterijumi za konačni izbor su bili sledeći: izbor samoniklih vrsta biljaka cvetnica koje akumuliraju etarska ulja; izbor vrsta istog roda sa istog i/ili različitih lokaliteta; izbor vrsta poznatih po značajnoj antibakterijskoj aktivnosti; izbor vrsta koje nisu opisane u literaturi kao potencijalni izvor antibakterijskih agenasa. Imajući u vidu navedene kriterijume, izabrano je 8 biljnih vrsta sa 6 lokaliteta. Fаmilijа Lamiaceae: Thymus glabrescens Willd., Thymus pulegioides L., Satureja kitaibelii Wierzb. ex Heuff., Nepeta nuda L.; fаmilijа Apiaceae: Libanotis montana, Peucedanum longifolium Waldst. & Kit., Peucedanum officinale L. i fаmilijа Asteraceae: Inula graveolens L. Polazeći od hipoteze da bi odabrane biljne vrste mogle biti korišćene kao sirovine za farmaceutsku i prehrambenu industriju, preduzeta su detaljna hemijska, mikrobiološka i hemometrijska istraživanja. • Hemijska ispitivanja obuvataju: • Određivanje sadržaja metala: Na, K, Mg, Ca, Mn, Fe, Cu i Zn, u zemljištu i odabranim biljkama. • Hemijska analiza mineralnog sastava zemljišta. • Određivanje hemijskih parametara zemljišta (kiselost, elektrodni potencijal, električna provodljivost, katjonski izmenjivački kapacitet zemljišta i sadržaj organske materije). • Izolovаnje i аnаliza etаrskih uljа. • Biološka ispitivanja obuvataju: • Određivanje antibakterijske аktivnosti etаrskih uljа, čistih jedinjenja (dominantnih komponenata etarskih ulja) i odаbrаnih аntibiotikа (hloramfenikol, tetraciklin, streptomicin). • Proučavanje antibakterijske аktivnosti interakcija: etarsko ulje-antibiotik, čisto jedinjenje-antibiotik i čisto jedinjenje-čisto jedinjenje. 3  4 • Hemometrijska analiza obuvata: • Primena selektivne jon analize (SIA) kao metode u spektroskopskoj analizi hromatograma izolovanih etarskih ulja. • Formirаnje bаze podаtаkа sa promenljivima. • Klаsifikаciju ispitivаnih sistemа nа osnovu odаbrаnih promenljivih. • Primena hemometrijskih metodа, analize glavnih komponenata (PCA) i klaster analize (HCA) u klasifikaciji zemljišta i odabranih biljnih vrsta. • Primena hemometrijskih metodа PCA i HCA u ispitivаnju odnosа hemijske strukture komponenаtа etаrskog uljа i njihove аntibаkterijske аktivnosti. • Primena hemometrijskih metodа PCA i HCA u istrаživаnju interаkcijа etаrskih uljа i аntibiotikа. • Određivаnje termodinаmičkih pаrаmetаrа komponenаtа etаrskog uljа i diskusija mogućih mehаnizаmа njihovog delovаnjа primenom molekularnog dokinga (SAR metoda).   2. O PŠ T I D E O  2.1. Biogeni elementi u biljkama Nosioci farmakološke aktivnosti medicinskih biljaka su primarni i sekundarni metaboliti, pri čemu treba istaći da neorganske komponente mogu značajno uticati na povećanje terapijskog potencijala (Yemane et al., 2008; Subramanian et al., 2012). Određeni hemijski elementi su esencijalni za rast biljaka dok, s druge strane, njihove visoke koncentracije mogu delovati štetno (En et al., 2003). Uloga i značaj metala u biljci u velikoj meri zavisi od njihove koncentracije (Bennett et al., 2000; Kabata-Pendias, 2010). Metali imaju višestruku ulogu u životu biljaka, neke od najvažnijih su da ulaze u sastav brojnih organskih jedinjenja, direktno utiču na osmotski potencijal ćelija, učestvuju u katalizi biohemijskih procesa, deo su mehanizma zaštite od virusa, a to znači da posredno ili neposredno učestvuju u svim životnim procesima biljke (Miladinović et al., 2011a). Usvajanje elemenata u biljkama je regulisano nizom faktora, koji zavise od same vrste (genetska predispozicija, osobine korenovog sistema, osobine lista) ali i od staništa (hemijski i mineralni sastav zemljišta, kiselost, sadržaj kiseonika i organske materija u zemljištu, uzajamno dejstvo jona) (Sparks, 2003; Kabata-Pendias, 2010). Primenom hemometrijskih metoda pokušaćemo uočiti mehanizme akumulacije Na, K, Mg, Ca, Mn, Fe, Cu i Zn u odabranim biljnim vrstama i dati odgovor koji od navedenih faktora je odgovoran za takvo ponašanje. Ovi rezultаti biće od znаčаjа zа potpuniju kаrаkterizаciju аpsorpcije i akumulacije elemenаtа u određenim biljnim vrstama. Kod većine biljaka natrijum nije esencijalni elemenat, već se karakteriše kao koristan hemijski element. On se može smatrati esencijalnim samo kod nekih C4 biljaka (Atriplex spp., Kochia childsii), gde je odgovoran za unos piruvata u hloroplaste pomoću Na+-piruvat kotransportera (Furumoto et al., 2011). Jon Na+ ima vrlo važnu ulogu u biljkama, posebno u uslovima deficita jona kalijuma. Istraživanja su pokazala da nedovoljna količina kalijuma u zemljištu, uslovljava veći unos natrijuma (Subbarao et al., 2003). Takođe je pokazano da halofite biljke koje rastu na slanom zemljištu (Suaeda maritima i Salicornia spp.) pokazuju intenzivan rast u prisustvu visokih koncentracija Na+ jona. Pri niskim koncentracijama, Na+ ne samo da je bezopasan već može biti veoma koristan u uslovima niske koncentracije K+, imajući u vidu činjenicu da su odgovarajuće hidratne forme K+ i Na+ jona strukturno i hemijski vrlo slične (Amtmann & Sanders, 1999). Na osnovu ovoga možemo zaključiti da uloga K+ u procesima biljne ćelije može biti zamenjena Na+ jonom. Međutim ovo ne treba generalizovati i primenjivati na enzime u kojima K+ ima ulogu kofaktora. Istraživanja su pokazala da različite veličine jonskih radijusa, uslovljavaju različite energije vezivanja i različitu kordinaciju ova dva metala sa biomolekulima (Lindhauer & De Fekete, 1990). 6  Kalijum je najzastupljeniji katjon u biljnoj ćeliji. Brojne studije ispituju fiziološku ulogu K+ u biljci (Anschűtz et al., 2014; Demidchik, 2014), njegovu apsorpciju iz zemljišta (Nieves- Cordones et al., 2014), kao i njegovu distribuciju kroz različite delove biljke (Wigoda et al., 2014). Pojedine studije se bave proučavanjem izmene K+ jona Na+ jonom, usled povećanog saliniteta zemljišta. Na osnovu prethodnih istraživanja uočava se značaj kalijuma u metabolizmu skroba, procesu fotosinteze, apsorpciji vode, sintezi proteina, aktivaciji enzima, kao i povećanju otpornosti biljke na bolesti i hladnoću (Benito et al., 2014). Magnezijum je jedan od devet esencijalnih makronutrijenata značajan za rast i reprodukciju biljaka (Williams & Salt, 2009), sastavni je deo hlorofila i kofaktor više od 300 enzima (karboksilaze, fosfataze, kinaze, RNA-polimeraze i ATP-aze). Približno 3/4 magnezijuma u listu biljaka je odgovorno za sintezu proteina, 1/5 se nalazi u obliku hlorofila dok je ostatak smešten u vakuolama (Karley & White, 2009). Magnezijum ima veliki hidratacioni radijus, što uslovljava njegovo slabo adsorbovanje na koloidnim česticama zemljišta u uslovima njene velike kiselosti i malog katjonsko-izmenjivačkog kapaciteta (Grzebisz, 2011). Visoke koncentracije Ca2+, Na+ i K+ jona u zemljištu kao i visoka pH vrednost, može smanjiti dostupnost magnezijuma biljci (Broadley & White, 2010). Nedostatak magnezijuma utiče na rast i produktivnost biljaka čija je posledica hloroza listova (Ruan et al., 2012). Toksičnost magnezijuma može biti uočena kod biljnih vrsta koje rastu u sušnim predelima (Hawkesford et al., 2012). Literaturni podaci ukazuju da se sadržaj magnezijuma u biljci kreće u intervalu od 268 ppm do 24005 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 3300 ppm (Watanabe et al., 2007). Neke studije su povezale ove rezultate sa prosečnim sadržajem magnezijuma u organizmu (390 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Kalcijum je esencijalan makronutrijent, čija se koncentracija u citoplazmi biljne ćelije mora održavati niskom, zbog potencijalne toksičnosti (Marschner, 2012). Kalcijum učestvuje u prenosu ćelijskih signala i ima važnu ulogu u zaštiti biljke u uslovima biotskog i abiotskog stresa. Urađene studije ističu značaj kalcijuma u formiranju i deobi biljne ćelije, biljnoj respiraciji, metabolizmu azota i podsticanju antimikrobne aktivnosti biljke (Yang & Pooviah, 2002). Mangan je esencijalni mikronutrijent biljke koji učestvuje u mnogim metaboličkim procesima. Uloga mangana u biljkama je detaljno ispitana od strane brojnih autora (Millaleo et al., 2010; Kabata-Pendias, 2010). Njegov značaj je uočen u oksido-redukcionim procesima, sintezi hlorofila i fotosintezi. Pokazano je da utiče na dostupnost kalcijuma i fosfora, a takođe je i sastavni deo enzima arginaze i fosfotransferaze. Pri većim koncentracijama može biti toksičan za biljku, što se manifestuje oksidativnim stresom i smanjenjem biljne mase. Neke 7  od studija su ispitale izmenu mangana između biljke i zemljišta i zaključile da kisela zemljišta niskog elektrodnog potencijala su glavni uzrok toksičnosti mangana (Kogelmann & Sharpe, 2006). Takođe, su proučavani sistemi biljne zaštite u uslovima povećane koncentracije mangana (Tewari et al., 2013). Metabolizam gvožđa u biljkama je sistematski izučen i pouzdano se zna da je gvožđe neophodan element za dobijanje energije u ćeliji (Kabata-Pendias, 2010; Salter et al., 2012). Sa biohemijskog aspekta značaj gvožđa u biljci je veliki: a) proteini gvožđa (transferin i feritin) kao i siderofore imaju važnu ulogu u skladištenju i transportu supstanci, b) gvožđe je sastavni deo hem-proteina, c) učestvuje u formiranju hlorofila, d) kompleksi gvožđa i biomolekula imaju važnu ulogu u transportu elektrona, e) pojedini proteini gvožđa su odgovorni za redukciju nitrata i sulfata, f) gvožđe učestvuje u metabolizmu nukleinskih kiselina, g) Fe2+ i Fe3+ joni imaju katalitičku ulogu u brojnim reakcijama. Nedostatak gvožđa utiče na rast i produktivnost biljaka a zavisi od sastava zemljišta, genetske predispozicije biljne vrste, klimatskih faktora kao i vegetacionog stadijuma biljke (Ozores-Hampton, 2013). S druge strane, visok sadržaj gvožđa u zemljištu niske pH vrednosti, može imati toksične posledice po biljku, čiji je ishod sličan njegovom deficitu (Hodson, 2012; Elec et al., 2013). Utvrđeno je da su pojedine biljne vrste tolerantne na visok sadržaj gvožđa, što se najčešće objašnjava oksidacijom, imobilizacijom i uklanjanjem gvožđa putem korenovog sistema (Kabata-Pendias, 2010). Pokazano je da gvožđe u biljci može reagovati sa različitim elementima čiji je efekat uglavnom antagonistički, a rezultat može biti pozitivan ili negativan po biljnu vrstu (Meda et al., 2007; Kabata-Pendias, 2010). Bakar, esencijalni mikronutrijent biljaka, ulazi u sastav brojnih enzima koji učestvuju u procesima respiracije i fotosinteze. On ima važnu ulogu u metabolizmu ugljenih hidrata i nitrata, apsorpciji vode, reprodukciji biljaka kao i njihovoj zaštiti od bolesti (Salter et al., 2012). Nedostatak bakra, slično već opisanim elementima, utiče na rast i razviće biljaka a zavisi od vrste zemljišta, klimatskih uslova i genetske predispozicije biljne vrste (Kabata- Pendias, 2010). Na osnovu brojnih studija je utvrđeno da visoke koncentracije bakra u biljci mogu biti štetne po nju a toksičnost se ogleda u sledećem: a) oštećenje i izduživanje ćelija korenovog sistema, b) uticaj na permeabilnost K+ i PO43- jona u ćelijskoj membrani, c) peroksidacija lipida u hloroplastima i inhibicija transporta elektrona, d) oštećenje DNA i inhibicija fotosinteze (Zvezdanović et al., 2007; Chaffai et al., 2007). Pokazano je da bakar u biljci može reagovati sa različitim elementima čiji je efekat uglavnom antagonistički, a rezultat može biti pozitivan ili negativan po biljnu vrstu (Kabata-Pendias, 2010). 8  Cink je sastavni deo mnogih enzima (dehidrogenaze, proteinaze, fosfataze, fosfohidrolaze) i ima važnu ulogu u metaboličkim procesima biljke. Pojedina istraživanja su pokazala značaj cinka u metabolizmu ugljenih hidrata, proteina, fosfata kao i ulogu u formiranju auksina, RNA i ribozoma (Kabata-Pendias, 2010; Salter et al., 2012). Uočeno je da se nedostatak cinka u biljci javlja usled: a) niske koncentracije Zn u zemljištu, b) male količine organske materije u zemljištu, c) visoke vrednosti pH zemljišta, d) mikrobne inaktivacije cinka, e) klimatskih faktora i genetske predispozicije biljnih vrsta, f) antagonističkih interakcija sa ostalim metalima u biljci (Kabata-Pendias, 2010). Fitotoksičnost cinka i tolerantnost biljnih vrsti na cink je predmet brojnih studija (Beyer et al., 2013, Gomes et al., 2013; Yang et al., 2014). Bez obzira da li se radi o nedostatku ili višku cinka u biljci, ishod je identičan prethodno opisanim elementima. Pregledom dostupnih literaturnih podataka, nismo našli potvrdu da je do sada ispitivan hemijski i mineralni sastav zemljišta sa odabranih lokaliteta, kao i akumulacija navedenih metala u selektovanim biljnim vrstama. 2.2. Etarska ulja Etarska ulja su smeše terpenoida, koji su rasprostranjeni u velikom broju biljnih familija: Lamiaceae, Apiaceae, Asteracea, Myrtaceae, Pinaceae, Rosaceae i druge. Etarska ulja se odlikuju mirisom (većinom prijatnim) i specifičnim sastavom terpenoida. Osnovni sastav etarskih ulja čine monoterpeni i seskviterpeni. Na osnovu tipa funkcionalne grupe monoterpeni se mogu podeliti na: ugljovodonike, okside, alkohole, aldehide, ketone, kiseline, estre, laktone i fenole. Na osnovu građe ugljenikovog skeleta mogu se podeliti na aciklične, aliciklične, aromatične i heterociklične. Moguća je dalja podela monoterpena na aciklične, monociklične i biciklične (Miladinović, 2011b). Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive tečnosti, koje mogu nastati aktivnošću endogenih biljnih tkiva (uljne ćelije, sekretorne šupljine, sekretorni kanali) ili aktivnošću egzogenih sekretornih tkiva (žlezdane dlake). Količina i sastav etarskih ulja u biljkama zavisi od genotipa biljne vrste, ekoloških faktora, fenofaza ontogenetskog razvića, načina obrade biljne sirovine i načina izolovanja etarskog ulja. Etarska ulja su lipofilnog karaktera, dobro se rastvaraju u nepolarnim organskim rastvaračima, koncentrovanom i apsolutnom etanolu i masnim uljima. Rastvorljivost u razblaženom etanolu zavisi od koncentracije etanola i vrste etarskog ulja. Primenjuju se u medicini, farmaceutskoj i prehrambenoj industriji, kulinarstvu i poljoprivredi. U okviru medicine i farmacije etarska ulja se koriste kao antiseptici, sedativi, ekspektoransi, antiflogistici, karminativi, stomahici, holagozi, korigensi, diuretici i rubefacijensi (Worwood, 1993). 9  2.2.1. Literaturni pregled hemijskih i bioloških istraživanja terpenoida, odabranih biljnih vrsta Određeni broj studija se bavio analizom i ispitivanjem etarskog ulja biljne vrste T. pulegioides sa različitih područija (Michet et al., 2008; Radonić & Mastelić, 2008; Rǎdulescu et al., 2009; Pavel et al., 2010; Miladinović et al., 2013). Takođe je proučavana i antibakterijska aktivnost etarskog ulja T. pulegioides (Pinto et al., 2006; De Martino et al., 2009; Pavel et al., 2010; Tekoriene & Ložiene, 2012). Pojedine studije su se bavile proučavanjem antifungalne aktivnosti etarskog ulja T. pulegioides. Autori su konstatovali da etarsko ulje ove biljne vrste ispoljava značajnu antifungalnu aktivnost usled lize citoplazmatične membrane i uticaja na smanjen sadržaj ergosterola (Pinto et al., 2006). Izvestan broj studija bavio se analizom i ispitivanjem hemijskog sastava etarskog ulja T. glabrescens (Maksimović et al., 2008; Pluhár et al., 2008; Pavel et al., 2010; Pluhár et al., 2012, Ilić et al., 2014). Geraniol je glavna komponenta etarskog ulja T. glabrescens iz Rumunije (Pavel et al., 2010). Seskviterpeni (germakren D, β-kariofilen, kariofilen oksid) činili su glavne komponente etarskog ulja T. glabrescens iz Mađarske (Simkó et al., 2013). Nešto manji broj studija bavio se ispitivanjem antibakterijske aktivnosti etarskog ulja ove biljne vrste (Pavel et al., 2010; Toroglu, 2011). Slično ulju T. pulegioides, prva istraživanja kombinovane interakcije ulja T. glabrescens sa antibioticima objašnjeni su u publikaciji Ilić et al. (2014). Određeni broj studija se bavio proučavanjem hemijskog sastava etarskog ulja S. kitaibelii (Chalchat et al., 1999; Slavkovska et al., 2001; Konakchiev & Tsankova, 2002; Miladinović, 2005; Mihajilov-Krstev et al., 2011; Kundaković et al., 2011). Antibakterijska aktivnost etarskog ulja S. kitaibelii, je ispitana u studiji Mihajlov-Krstev et al. (2011). Autori su ispitali više od 30 bakterijskih sojeva i konstatovali da etarsko ulje S. kitaibelii predstavlja izvanredan prirodan antibakterijski agens koji može imati potencijalnu primenu u lečenju kožnih infekcija ili kao konzervans u prehrambenoj industriji. Citotoksična i antibakterijska aktivnost metanolnog ekstrakta ove biljne vrste je ispitana u studiji Stanojković et al. (2013). Autori su uočili izraženu citotoksičnu aktivnosti na ćelijama Fem-x malignog melanoma, dok je umerena citotoksična aktivnost zapažena na estrogen zavisnim kancer ćelijama tipa MDA- MB-361. Hemijski sastav etarskog ulja N. nuda je publikovan u određenom broju istraživačkih projekata (Kökdil et al., 1996; Sarer & Konuklugil, 1996; Mancini et al., 2009; Gkinis et al., 2010; Kilic et al., 2011; Radulović et al., 2011; Bozari et al., 2013; Gormez et al., 2013). Pojedina istraživanja su pokazala da je glavna komponenta N. nuda ulja 4aα,7α,7aα- 10  nepetalakton (Kökdil et al., 1996; Bozari et al., 2013; Gormez et al., 2013). Određene studije govore o nepetalaktonu i eukaliptolu kao dominantnim komponentama N. nuda ulja (Gkinis et al., 2010; Radulović et al., 2011). Literaturni podaci ukazuju na dominaciju eukaliptola, nerolidola i kamfora (Sarer & Konuklugil, 1996; Kilic et al., 2011). Takođe rezultati istraživanja govore o antibakterijskom i antikancerogenom dejstvu etarskih ulja i ekstrakata ove biljne vrste (Kirmizibekmez et al., 2011; Bozari et al., 2013; Yildirim et al., 2013; Gormez et al., 2013). Analiza i ispitivanje hemijskog sastava etarskog ulja L. montana je predmet malog broja studija (Ozturk & Ercisli, 2006; Masoudi et al., 2006; Kapetanos et al., 2008; Skalicka- Wozniak et al., 2010). Ispitivanje etarskog ulja ove biljne vrste iz Poljske ukazalo je na visok sadržaj sabinena i β-felandrena (Skalicka-Wozniak et al., 2010). Osim naših rezultata (Miladinović et al., 2014), literaturni pregled nije pružio podatke o antibakterijskoj aktivnosti etarskog ulja L. montana. Postoje veoma oskudni podaci o analizi i ispitivanju hemijskog sastava etarskog ulja P. longifolium (Kapetanos et al., 2008; Tepe et al., 2011). U etarskom ulju P. longifolium iz Turske seskviterpeni su dominantna klasa jedinjenja, sa najvišim sadržajem 8-kedren-13-ola (Tepe et al., 2011). Mali broj studija je proučavao antibakterijska i antioksidantna svojstva ekstrakata biljne vrste P. longifolium (Tepe et al., 2011; Matejić et al., 2013). Analiza i ispitivanje hemijskog sastava etarskog ulja P. officinale je predmet samo nekolicine studija (Jaimand et al., 2006; Kapetanos et al., 2008; Figuérédo et al., 2009). U etarskom ulju P. officinale iz Irana, utvrđen je visok procenat monoterpena fenčona (Jaimand et al., 2006). Slično etarskom ulju izolovanom iz P. longifolium, izvestan broj studija je proučavao antibakterijska, antioksidantna i histohemijska svojstva ekstrakata biljne vrste P. officinale (Roman et al., 2011; Matejić et al., 2013). Analiza i ispitivanje hemijskog sastava etarskog ulja I. graveolens je opisan u istraživanjima Blanc et al., 2004; Dohi et al., 2009; Djenane et al., 2012; Boudouda et al., 2013. Hemijski sastav ispitanog ulja je vrlo sličan etarskom ulju I. graveolens sa područija Korzike, Alžira i Francuske (Blanc et al., 2004; Dohi et al., 2009; Boudouda et al., 2013). Sva navedena ulja sadrže visok procenat borneola, bornil acetata i τ-kadinola. Određeni broj studija se bavio antibakterijskim, citotoksičnim, antioksidantnim i acetilholinesteraza-inhibitornim dejstvom etarskih ulja i ekstrakata ove biljne vrste (Topçu et al., 1993; Dohi et al., 2009; Guinoiseau et al., 2010; Omezzine et al., 2011; Al-Fartosy, 2011). 11  12 2.2.2. Antibakterijska aktivnost etarskog ulja Sintetički antibiotici (hloramfenikol, tetraciklin, streptomicin i ostali) su od svog otkrića u dvadesetom veku, značajno uticali na smanjenje rizika od nastanka infektivnih bolesti. Rezistencijа bаkterijа nа sintetičke аntibiotike poslednjih decenijа značajno smаnjuje procenаt izlečenjа u celom svetu. Poznаti su primeri rezistetnosti E. coli nа treću generаciju cefаlosporinа, zаtim pojаvа vаnkomicin-rezistetnih S. aureus i multirezistentne P. aeruginosa (Tenover, 2006). Imаjući u vidu nаvedeno, neophodno je permаnentno i sistemаtski trаgаti zа novim аntibаkterijskim аgensimа, а etаrskа uljа su bez svаke sumnje potencijаlno nаjbogаtije nаlаzište prirodnih аntibiotikа. Poznаto je dа terpenoidi, konstituenti etаrskih uljа delimično ili potpuno inhibirаju rаst bаkterijа (Griffin et al., 1999). U cilju ispitivanja antibakterijske aktivnosti etarskih ulja i njihove kombinovane primene sa antibioticima, kao i davanja odgovora na moguć mehanizam njihovog dejstva, izvršena je detaljna hemijska analiza. 2.2.2.1. Strukturna građa bakterija Da bi smo objasnili antibakterijske efekte etarskih ulja i njihovih dominantnih komponenata u kombinaciji sa antibioticima, potrebno je detaljno opisati strukturnu građu bakterija i farmakološke osobine korišćenih antibiotika. Osnovni cilj svih antibakterijskih lekova jeste selektivna toksičnost. Pod selektivnom toksičnošću se podrazumeva ciljano uništavanje bakterija (baktericidni agensi) ili inhibicija njihovog rasta ili deljenja (bakteriostatički agensi), usled različite strukturne građe patogena u odnosu na ćelije domaćina. Za razliku od eukariotskih ćelija, prokarioski organizmi (bakterije) nemaju ćelijsko jedro i organele (osim ribozoma), a njihova funkcija pokrivena je aktivnošću ćelijskog zida i citoplazmatične membrane. 2.2.2.2. Struktura i funkcija ćelijskog zida bakterije Pod ćelijskim zidom bakterije, podrazumevaju se sve komponente koje pokrivaju citoplazmatičnu membranu, tj. leže van citoplazmatične membrane čineći omotač oko ćelije. Zid bakterije funkcioniše kao omotač koji mehanički štiti protoplast, daje oblik bakterijama, ali sadrži na spoljnoj strani i mesta za adsorbciju bakteriofaga, mesta za prepoznavanje i transport određenih supstanci, kao i mesta odgovorna za prepoznavanje i kontakt ćelija-ćelija. Prema načinu bojenja po Gramm-u, sa bojama kristal-violet i šafraninom, bakterije se dele na Gram-pozitivne i Gram-negativne, što reflektira i različitost njihovih zidova (Slika 1). Mnoge Gram-pozitivne bakterije imaju relativno prost ćelijski zid debljine od 15-50 nm. Glavni konstituent je polimer, koji se sastoji od dve komponente međusobno kovalentno povezane. Jedna komponenta je polisaharid peptidoglikan (čineći 50% mase ćelije), dok je druga komponenta najčešće kiseli polimer - teikoična kiselina (čini 30-40% mase ćelije).   Slika 1. Šematski prikaz strukture ćelijskog zida i citoplazmatične membrane Gram- pozitivnih i Gram-negativnih bakterija. Teikoična kiselina je relativno kratak polimer (sačinjen od približno 30 ostataka glicero-3- fosfata), koja se može povezati sa citoplazmatičnom membranom u formi lipoteikoične kiseline. Zid Gram-pozitivnih bakterija je višeslojne strukture, gde se polimeri međusobno povezuju kako horizontalno tako i vertikalno, čineći mrežastu strukturu. Ova struktura omogućava da Gram-pozitivne bakterije imaju visok osmotski potencijal (do 20 att). Druge komponente ćelijskog zida Gram-pozitivnih bakterija, variraju u znatnoj meri od vrste bakterija. Proteini predstavljaju 5-10% ukupne mase zida i zajedno sa polisaharidima se nalaze na spoljnoj strani zida determinišući antigene ovih bakterija. Za razliku od Gram- negativnih bakterija, Gram-pozitivne u ćelijskom zidu nemaju lipopolisaharide, lipoproteine i fosfolipide (Slika 1). Zid Gram-negativnih bakterija je daleko složenije strukture u odnosu na Gram-pozitivne, a sastoji se od peptidoglikana i spoljne membrane. Peptidoglikan leži iznad citoplazmatične membrane, ali je daleko tanji (2 nm) u poređenju sa istom strukturom Gram- pozitivnih bakterija. On čini svega 5% mase zida, ali i pored toga doprinosi jačini zida Gram- negativnih bakterija, koje imaju osmotski potencijal od oko 6 att. Prostor između plazmatične membrane i peptidoglikanskog sloja naziva se periplazmatičan prostor (Slika 1). Spoljna membrana (debljine od 6-10 nm) je strukture po građi slična citoplazmatičnoj membrani, nalazi se iznad peptidoglikana i predstavlja složeni dvosloj lipida. Osim strukturne sličnosti, spoljna membrana se značajno razlikuje od citoplazmatične membrane po funkcionisanju i sastavu makromolekula koji ulaze u njen sastav. U strukturu spoljne membrane ulaze: a) lipopolisaharidi, b) lipoproteini, c) proteini i d) fosfolipidi. U spoljnem sloju spoljne 13  membrane nalaze se lipopolisaharidi i proteini, a u unutrašnjem sloju se nalaze fosfolipidi i lipoproteini (Slika 1). Struktura lipopolisaharida je veoma kompleksna a sastoji se od O-antigena (polisaharidnog lanca) i lipida A (fosforilovan disaharid glukozoamina). Jedna je od glavnih komponenata ćelijskog zida, odgovorna za očuvanje integriteta bakterije i zaštite od bilo kakvog neželjenog hemijskog uticaja. Lipopolisaharidi povećavaju negativno naelektrisanje spoljne membrane, čineći je nepropustljivom za difuziju mnogih hidrofobnih molekula. U potrazi za odgovorom kombinovanog dejstva etarskih ulja i antibiotika, metodom molekularnog dokinga ispitan je LptA protein. LptA je esencijalan periplazmatični protein važan u transportu lipopolisaharida iz citoplazmatične ka spoljnoj membrani Gram negativnih bakterija (Suits et al., 2008). Njegova inhibicija određenim komponentama etarskog ulja mogla bi objasniti smanjenu rezistentnost Gram-negativnih bakterija na antibiotike i sinergističke efekte ispitanih smeša. Lipoproteini su mali alifatični molekuli sa proteinskim delom od 58 aminokiselina, koji na C- terminalnom kraju imaju lizin a na N-kraju cistein. Oni omogućavaju povezivanje spoljne membrane sa peptidoglikanom, a locirani su u unutrašnjem delu membrane (Slika 1). Dva tipa proteina ulaze u sastav spoljne membrane: proteini odgovorni za transport specifičnih molekula i grupa transmembranskih proteina (locirani u oba sloja membrane). Transmembranski proteini su znatno zastupljeniji u spoljnoj membrani. To je grupa kiselih proteina molekulske mase od 32-38 kD i nazivaju se porini. Porini formiraju kanale, odnosno hidrofilne pore kroz hidrofobni lipidni dvosloj spoljne membrane Gram-negativnih bakterija, kroz koje mogu nespecifično difundovati mali hidrofilni molekuli. Pojedina istraživanja su pokazala da mutacije koje dovode do prestanka sinteze ili dovode do sinteze izmenjenih porina, obično čine te bakterije rezistentnim na antibiotike (hloramfenikol, tetraciklin) koji koriste hidrofilne pore za transport kroz spoljnu membranu (Anderson et al., 2012). Fosfolipidi spoljne membrane su uglavnom fosfatidiletanolamin i fosfatidilglicerol i po strukturi su istovetni sa istim molekulima u citoplazmatičnoj membrani. 2.2.2.3. Struktura i funkcija citoplazmatične membrane Membrane su lipoproteinske makromolekularne strukture, jer u njihov sastav ulaze različite varijante lipida i proteina. Na osnovu pojedinih studija pokazano je da je sastav citoplazmatičnih membrana sledeći: lipidi 6-37%, proteini 40-85%, heksoze 0.2-19% i RNA 0.8-15%, računajući na suvu težinu membrana. Lipidi koji ulaze u sastav bakterijskih membrana su uglavnom fosfolipidi, mala količina neutralnih lipida, glikolipidi i slobodne masne kiseline. Na osnovu fluidno-mozaičnog modela, citoplazmatična membrana je izgrađena od dva sloja fosfolipida. Nepolarni, hidrofobni krajevi fosfolipida su okrenuti jedan 14  prema drugom i zahvaljujući hidrofobnim interakcijama održavaju dvoslojnu strukturu membrane. Polarni, hidrofilni, krajevi fosfolipida su okrenuti ka spoljašnosti i u interakciji sa vodom stabilizuju dvoslojnu strukturu. Proteini su uronjeni u fosfolipidni dvosloj, a najveći antibiotski značaj imaju integralni proteini, koji ostvaruju kontakte sa obe strane membrane i prostiru se kroz oba sloja fosfolipida (Slika 1). Mobilnost fosfolipida i proteina u citoplazmatičnoj membrani je važan faktor koji može pomoći razumevanju delovanja nekih antibiotika na citoplazmatičnu membranu. Membrana je osmotska barijera između spoljne sredine i unutrašnjosti ćelije, koja je permeabilna za vodu. Druge supstance mogu prolaziti kroz membranu zahvaljujući specijalnim mehanizmima koji se razlikuju od ćelije do ćelije. Membranski transportni proteini omogućavaju selektivan prolaz različitih polarnih molekula u vidu uniportnog ili kotransportnog (simport/antiport) prenošenja. Transport kroz membranu se može odvijati na tri načina: Pasivna (prosta) difuzija. Supstance difunduju kroz membranu u smeru gradijenta koncentracije ili naelektrisanja. Za ovakav transport, supstance moraju biti dovoljno rastvorljive u hidrofobnom delu membrane da bi mogle biti transportovane. Difuzija se može odvijati i kroz vodene pore u membrani za hidrofilne supstance. U oba slučaja, koncentracija unutar ćelije ne sme da prevazilazi koncentraciju iste supstance van ćelije, jer u suprotnom neće doći do difuzije. Olakšana difuzija. Supstance koje su nerastvorljive u hidrofobnom delu membrane, ali su u stanju da reaguju sa nosačem lociranim u membrani (protein po prirodi), mogu biti transportovane tako što formiraju kompleks sa nosačem i tako se prenose do unutrašnje strane membrane, gde se oslobađaju u citoplazmu. Aktivan transport (transport zavistan od energije). Ovaj transport je neophodan za supstance koje nisu u stanju da se unose u ćeliju na gore pomenute načine. U prisustvu ATP-a dolazi do transporta, koji obavezno uključuje molekul nosača, a transport se može odigravati i nasuprot gradijenta koncentracije. Pojedine studije su pokazale da je unos streptomicina u citoplazmu ATP dirigovan za razliku od tetraciklina koji može u citoplazmu dospeti i prostom difuzijim (Anderson et al., 2012). Ova istraživanja su pokazala i da je ulazak hloramfenikola u citoplazmu isključivo posledica pasivne difuzije. Ove konstatacije nam mogu pomoći u objašnjenju kombinovanog dejstva etarskih ulja i antibiotika. Na osnovu mehanizma dejstva pojedinih antibiotika i načina njihovog delovanja na citoplazmatičnu membranu, antibakterijske agense možemo podeliti: a) supstance koje izazivaju dezorganizaciju membrane, b) supstance koje formiraju vodene pore u membrani, c) supstance koje izazivaju 15  specifične promene u permeabilnosti katjona, d) supstance koje inhibiraju enzime u membrani. Zajednički rezultat dejstva svih ovih supstanci jeste gubljenje funkcionalnosti citoplazmatične membrane usled narušavanja organizacije membrane, tako da membrana ne može više kontrolisati transport pojedinih molekula, što dovodi do naglog gubljenja malih molekula iz bakterijske ćelije i uginuća bakterije. Antibakterijska aktivnost etarskih ulja objašnjava se na identičan način, u vidu strukturnih promena i perforacije ćelijskog zida i membrane što se manifestuje lizom ćelija (Sikkema et al., 1995; Trombetta et al., 2005, Stanković et al., 2011, Miladinović et al., 2014; Ilić et al., 2014). 2.2.2.4. Sinteza proteina i njeni inhibitori Mnogi antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina (translaciju), poseduju svojstva bitna za primenu antibiotika u terapiji, a to je visoko specifično inhibitorno delovanje na senzitivne ćelije. Tako postoje kategorije antibiotika koji isključivo deluju na bakterijske ćelije, a ne deluju na eukariotske ćelije i obrnuto. Najveći broj inhibitora sinteze proteina ostvaruje svoje delovanje vezivanjem za ribozome senzitivnih organizama što rezultira u inhibiciji njihove funkcije na različitim stupnjevima sinteze proteina. Mehanizam sinteze proteina u bakterijama je dobro izučen i ovde će biti date samo neke osnovne postavke, koje će omogućiti lakše praćenje mehanizma hloramfenikola, tetraciklina i streptomicina na ovaj proces. Sinteza proteina se sastoji iz sledećih faza: • Transkripcija - prenos genetičke informacije sa molekula DNA na informacionu RNA (iRNA) • Translacija - iRNA nosi genetički kod u citoplazmu, gde služi kao matrica za sintezu proteina u ribozomima • Post - translaciona modifikacija aminokiselinskih ostataka formiranog proteina • Formiranje 3D strukture proteina Usled dejstva RNA polimeraze i nukleotid transferaznih enzima (Slika 2), dolazi do transkripcije molekula DNA, pri čemu nastaje iRNA (Mariani & Maffioli, 2009). Sam proces transkripcije sastoji se iz više faza, koje uključuju vezivanje RNA polimeraze za DNA molekul, otvaranje DNA molekula i sintezu iRNA u smeru 5'-3'. Formirana iRNA odlazi u citoplazmu i vezuje se za ribozom (ribonukleoprotein), koji katalizuje sintezu proteina na osnovu iRNA. Sastavljen od RNA i proteina (Steitz, 2008), ribozom ima dve subjedinice (oznake 30S i 50S kod prokariotskih organizama) koje učestvuju u translaciji proteina. 16   Slika 2. Šematski prikaz procesa transkripcije. Šematski prikaz sinteze proteina i odgovarajućih procesa dat je na Slici 3. U okviru veće subjedinice 50S i peptidil transferaznog centra (PTC) uočavamo aminoakceptorsko mesto (A), peptidilno mesto (P) i izlazno mesto tRNA (E). Slika 3. Šematski prikaz procesa translacije. Sinteza proteina započinje vezivanjem tRNA sa metioninom usled prepoznavanja AUG kodona na iRNA. Elongacija polipeptidnog lanca otpočinje ugradnjom druge aminokiseline u polipeptidnom lancu, i ponavlja se sve dok se ne pročita celokupna informacija sa iRNA 17  (sukcesivno se čitaju tripleti-kodoni u iRNA). Čitanje iRNA od strane ribozoma odvija se od od 5' ka 3' kraju iRNA a sinteza polipeptida se vrši od NH2-kraja ka COOH kraju polipeptidnog lanaca. Za proces elongacije potrebno je da oba mesta ribozoma, aminoakceptorsko mesto (A) i peptidilno mesto (P) budu zauzeti molekulima tRNA da bi došlo do formiranje peptidne veze. Na mestu P ribozoma mora da se nalazi peptidil-tRNA, dok se aminoacil-tRNA ubacuje na slobodno mesto A pomoću faktora elongacije (EF-Tu). Mehanizam formiranja peptidne veze podrazumeva prenos nascentnog peptida sa tRNA locirane na P mestu, na aminoacil-tRNA koja je locirana na A mestu ribozoma (proces transpeptidizacije). Na taj način polipeptidni lanac postaje duži za jednu aminokiselinu. Nakon transpeptidacije dolazi do translokacije, koji ima za cilj da se novonastala peptidil- tRNA prenese sa A na P mesto ribozoma, da se izbaci deacilirana-tRNA na E mestu i pomeri ribozom za jedan kodon prema 3' kraju iRNA. U toku rasta polipeptidnog lanca dolazi do njegovog usmeravanja ka izlazu iz 50S subjedinice, kroz kanal koji formiraju proteini te subjedinice. Proces translokacije se odigrava u prisustvu faktora elongacije EF-G. Terminacija sinteze polipeptidnog lanca je proces u kome se oslobađa kompletan sintetisani polipeptidni lanac. Signal za terminaciju je dolazak jednog od stop kodona (UAA, UAG, UGA) na A mesto ribozoma u procesu prenošenja informacije u iRNA na primarnu strukturu proteina. U interakciji faktora terminacije i ribozoma, dolazi do oslobađanja nascentnog polipeptidnog lanca ribozoma. Nakon toga dolazi do oslobađanja deacilirane tRNA i spadanje 70S ribozoma za iRNA. Oslobođeni ribozom disocira na subjedinice, koje se ponovo koriste za inicijaciju sinteze proteina. 2.2.2.4.1. Hloramfenikol Hloramfenikol je antibiotik koji deluju bakteriostatički i baktericidno na veliki broj bakterija. U kliničkoj praksi se češće koristi u tretmanu Gram-pozitivnih bakterijskih sojeva. Eukariotske ćelije su rezistentne na hloramfenikol, mada dužim tretmanima hloramfenikol pokazuje značajne sporedne efekte kao što su disfunkcija jetre i eritropoetska depresija. On može da inhibira sintezu proteina u mitohondrijama eukariota ali i da utiče na sintezu DNA izazivajući supresiju koštane srži i fatalnu aplastičnu anemiju. I pored sadržaja dve hidroksilne grupe, njegova rastvorljivost u vodi je vrlo mala (2.5 g/l), što utiče na njegovu limitiranu kliničku primenu. Hloramfenikol inhibira sintezu proteina usled vezivanja za veću 50S subjedinicu ribozoma, u okviru aminoakceptorskog A mesta (Davidovitch et al., 2008). Na ovaj način sprečeno je pravilno pozicioniranje i unos sledeće aminoacil-tRNA i dalja sinteza proteina. Korišćenjem obeleženog 14C-hloramfenikola, kao i foto aktivnih derivata, ustanovljeno je da hloramfenikol formira reverzibilan kompleks sa mestom vezivanja na 70S 18  ribozomu, koga sačinjavaju proteini S3, S6, L6, L16 i L24. Međutim najobeleženiji protein je L16 i on je jedan od ključnih proteina za aktivnost peptidiltransferaznog centra 50S subjedinice. Rezistencija bakterija na hloramfenikol usled mutacija na ribozomalnoj 23S RNA (Mankin & Garret, 1991), takođe govore o značajnoj ulozi ovog mesta za antibakterijsku aktivnost hloramfenikola. Do danas su opisana dva glavna mehanizma rezistencije na hloramfenikol, aktivni efluks i enzimska inaktivacija. Pojedine studije su pokazale da je gradijent protona u membrani uzrok aktivnog efluksa i rezistencije na hloramfenikol (Moreira et al., 2005). Klinički najznačajniji mehanizam je O-acetilacija hloramfenikola posredovana enzimom hloramfenikol-O-acetiltransferazom (CAT). U literaturi se navode tri glavna tipa CAT, od kojih je najbolje opisan CAT3. Pokazano je da ovi enzimi inaktiviraju hloramfenikol acetilacijom primarne alkoholne grupe na C3 i C1 atomu stvarajući jedinjenja koja su neaktivna i ne mogu se vezati za 50S subjedinicu. Iako je hidrofoban molekul, hloramfenikol koristi pore spoljne membrane za penetraciju do periplazmatičnog prostora Gram-negativnih bakterija. Razlog za ovakvu pretpostavku leži u činjenici da odsustvo porina u bakterijama i njihova hemijska modifikacija rezultira u drastičnom smanjenju penetracije hloramfenikola (Anderson et al., 2012). Za razliku od tetraciklina i streptomicina, hloramfenikol je vrlo nepolaran molekul, čiji se transport iz periplazmatičnog prostora u citoplazmu do ribozoma, odvija njegovom solubilizacijom i difuzijom kroz citoplazmatičnu membranu (Mcmurry et al., 1994; Anderson et al., 2012). 2.2.2.4.2. Tetraciklin Tetraciklini su antibiotici širokog spektra koji deluju bakteriostatički i baktericidno na veliki broj bakterija (Barbour et al., 2010). Inhibitorno delovanje ostvaruju zaustavljanjem sinteze proteina u senzitivnim bakterijama, inhibirajući vezivanje aminoacil-tRNA za ribozom. Izučavanjem mesta vezivanja tetraciklina za ribozom, došlo se do zaključka da se tetraciklini mogu vezati za 30S subjedinucu kao i za 70S ribozom. Detaljna izučavanja su pokazala da se tetraciklini specifično vezuju za jedno mesto na 70S ribozomu sa konstantom disocijacije 2×10-5. Pored toga ustanovljeno je da radioaktivno obeleženi tetraciklin svoje vezivanje prefercijalno ostvaruje sa 30S subjedinicom ribozoma i to za protein S7 koji je u neposrednoj blizini aminoakceptorskog (A) mesta. Pored toga, smatra se da i visoko konzervisan region 16S rRNA može biti uključen u organizaciju mesta vezivanja tetraciklina, što se koristi i kao argument za objašnjavanje širokog antibakterijskog spektra tetraciklina. Stoga se smatra da je primarni inhibitorni efekat tetraciklina na sintezu proteina sprečavanje vezivanja aminoacil- tRNA za A mesto ribozoma, usled sprečavanja pravilnog prepoznavanja kodona na iRNA i antikodona na tRNA. Vezivanje antibiotika za ribozom dovodi do smanjenja fleksibilnosti 19  strukture ribozoma, odnosno do njegove steričke promene, koja onemogućava pravilnu interakciju i vezivanje aminoacil-tRNA za obe subjedinice ribozoma. Na osnovu jasno definisanih mesta antibiotske aktivnosti tetraciklina (16S rRNA i protein S7) i njihovih XRD struktura (Hosaka et al., 1997; Broderson et al., 2000) primenom molekularnog dokinga želeli smo posredno istaći aktivnost ulja u okviru ćelijskog zida i citoplazmatične membrane i eliminisati njihovu moguću interakciju sa ribozomima. Pokazano je da bakterije koriste tri strategije za postizanje rezistencije na tetraciklin: a) ograničavanjem pristupa tetraciklina ribozomima preko kojih ostvaruje svoj inhibitorni efekat, b) promena strukture ribozoma da bi se sprečilo efikasno vezivanje tetraciklina i c) sinteza enzima koji inaktiviraju tetraciklin. Da bi tetraciklin ostvario inhibitorni efekat potrebno je da se transportuje u ćeliju i da se akumulira do koncentracije koja omogućava njegovo vezivanje za ribozom, što izaziva prestanak sinteze proteina. Nađeno je da protonizovana forma tetraciklina može difundovati kroz citoplazmatičnu membranu. Međutim ova prosta difuzija ne može objasniti dostizanje dovoljne koncentracije da bi se spazio inhibitorni efekat na sintezu proteina. Eksperimenti su pokazali da pored difuzije dolazi i do faze transporta tetraciklina u procesu koji zahteva utrošak energije. Ovaj aktivan transport tetraciklina, ne zahteva protein nosač, već koristi protonski gradijent u citoplazmatičnoj membrani (ΔpH). Događaji koji se odvijaju pri prolasku tetraciklina kroz citoplazmatičnu membranu nisu sasvim jasni. Pokazano je da se ulazak tetraciklina u ćeliju sastoji iz dve faze – energetski nezavisna faza i energetski zavisna faza (Argast & Beck, 1984). Transport tetraciklina otpočinje veoma brzom energetski nezavisnom fazom. Ovaj proces posle izvesnog vremena dostiže ravnotežu i dalji sporiji ulazak tetraciklina u ćeliju je energetski zavisna faza. Supstance koje inhibiraju transport elektrona ili mutacije koje dovode do narušavanja transporta elektrona, inhibiraju energetsku zavisnu fazu transporta elektrona. Stoga se može zaključiti da za ulazak u ćeliju u ovoj fazi, tetraciklin može koristiti energiju ili iz transporta elektrona ili iz ATP-a dobijenog u toku transporta elektrona pri oksidativnoj fosforilaciji. Ovo nam je dalo mogućnost, da primenom molekularnog dokinga na citohrom C oksidazu i ATP-azu (Harrenga & Michel, 1999; Rastogi & Girvin, 1999), ispitamo interakcije komponenata ulja i objasnimo slabije rezultate antibakterijske aktivnosti ulja sa tetraciklinom u odnosu na hloramfenikol. Postojanje veoma brzog i energetski nezavisnog ulaska tetraciklina u bakteriju, objašnjava zašto su i anerobne bakterije dostupne delovanju tetraciklina. Naime u anerobnim uslovima inhibiran je samo spor energetski zavistan ulazak tetraciklina, dok je brz energetski nezavistan ulazak tetraciklina u bakteriju neometen. 20  Mehanizam transporta tetraciklina i streptomicina, međusobno se razlikuju i to daje objašnjenje različitog delovanja ovih antibiotika na bakterije. Streptomicin veoma efikasno koristi transportne molekule i membranski potencijal, koji je rezultat funkcionisanja respiratornog lanca, za inicijalni ulazak u ćeliju. Tako su anaerobne bakterije visoko rezistentne na aminoglikozide (streptomicin), ali su senzitivne na tetracikline pošto se tetraciklin može transportovati energetski nezavisnim putem. 2.2.2.4.3. Streptomicin Aminoglikozidi su antibiotici širokog spektra i deluju baktericidno na veliki broj bakterija. Inhibitorno delovanje ostvaruju zaustavljanjem sinteze proteina u različitim fazama, što zavisi od prirode molekula aminoglikozida. Prva istraživanja mehanizma delovanja streptomicina (aminoglikozida), pokazala su da ovaj antibiotik inhibira sintezu proteina usled vezivanja za 30S subjedinicu ribozoma. Njegova interakcija sa proteinom S12 i 16S rRNA, pored toga što inhibira ugradnju korektne aminokiseline za dati kodon u iRNA, indukuje i pogrešno čitanje kodona što omogućava inkorporaciju neke druge aminokiseline (Anderson et al., 2012). Zbog važnosti ova dva targeta za antibakterijsku aktivnost streptomicina, protein S12 i 16S rRNA (Carter et al., 2000; Connell et al., 2007) podvrgnuti su molekularnom dokingu u cilju sagledavanja mogućih interakcija komponenata ulja sa ovim važnim targetima. Testiranjem efekta streptomicina na pojedine reakcije u sintezi proteina ustanovljeno je da pored pogrešnog čitanja kodona na iRNA, streptomicin deluje i na proces inicijacije i terminacije sinteze proteina. Svi ovi podaci govore da streptomicin izaziva konformacionu promenu strukture ribozoma, što ima za posledicu njihovo neadekvatno delovanje u procesu sinteze proteina. Međutim za letalnost je takođe važan korak transfera streptomicina iz spoljne sredine do specifičnih mesta na ribozomu. Klinički potencijal aminoglikozida se značajno i ubrzano smanjuje usled širenja postojećih i sve većeg broja novih oblika rezistencije bakterija na ove antibiotike (Macmaster et al., 2010; Morić et al., 2010). Razlikujemo tri mehanizma rezistencije na antibiotike: a) smanjeni unos antibiotika u ćeliju b) ekspresija enzima kodiranih genima na plazmidima koji modifikuju hemijsku strukturu antibiotika acetilacijom i fosforilacijom što dovodi do inaktivacije antibiotika i c) promene na nivou ribozoma, što dovodi do smanjenja afiniteta vezivanja aminoglikozida za njih. Mehanizam transporta streptomicina kroz citoplazmatičnu membranu, značajan je faktor koji određuje dostupnost bakterija delovanju ovog agensa (Anderson et al., 2012). Aminoglikozidi, kao polikatjoni difunduju kroz pore spoljne membrane Gram-negativnih bakterija, dok je transport kroz citoplazmatičnu membranu sličan u Gram-negativnim i Gram- 21  pozitivnim bakterijama. Primarno mesto vezivanja streptomicina su polarne glave fosfolipida citoplazmatične membrane. Molekul transporter u membrani za koji se streptomicin vezuje, najverovatnije je komponenta citoplazmatične membrane koja je usko povezana sa uspostavljanjem gradijenta protona kroz membranu, odnosno predstavlja komponentu citoplazmatične membrane koja je direktno uključena (neki molekul respiratornog lanca) u formiranje tog gradijenta. Nakon vezivanja za transporter u membrani, streptomicin se prenosi kroz membranu u zavisnosti od vrednosti membranskog potencijala (Δψ). Ta faza transporta naziva se EDP-1 (proces zavistan od energije). Kada se posle prolaska kroz membranu, streptomicin veže za target u citoplazmi-ribozom koji učestvuje u sintezi proteina i koji deluje kao odstranjivač streptomicina iz membrane, indukuje se ubrzani transport streptomicina u citoplazmu (faza transporta EDP-2). Najefikasniji izvor energije za transport aminoglikozida je transport elektrona do kiseonika. Transport elektrona na ATP u fosforilaciji na nivou supstrata je neefikasan izvor energije za transport aminoglikozida. Proces inicijalnog transporta aminoglikozida kroz citoplazmatičnu membranu (EDP-1), posledica je polikatjonske strukture ovih antibiotika. Aminoglikozidi se vežu za membranu i transportuju kroz nju zahvaljujući većoj količini negativnog naelektrisanja u citoplazmi ćelije od sredine koja je okružuje. Stoga je vezivanje i transport aminoglikozida kroz citoplazmatičnu membranu, antagonizovan prisustvom dvovalentnih katjona, kao i velikom količinom negativnih jona u spoljnoj sredini. Faza transporta EDP-1, završava se otpočinjanjem inhibicije sinteze proteina. Očigledno je da ova faza predstavlja inicijalni transfer aminoglikozida do ribozoma, koji je zavistan od energije. Druga faza EDP-2, povezana je sa vezivanjem aminoglikozida za ribozome što za posledicu ima značajno povećanu brzinu ulaska aminoglikozida u ćeliju. I ovaj proces ima isti energetski zahtev kao i EDP-1. Sam mehanizam EDP-2 nije sasvim jasan, ali se pretpostavlja da u vreme otpočinjanja ove faze dolazi do značajnog gubitka K+ jona iz ćelije što uvećava (Δψ). Druga pretpostavka govori o tome da vezivanje aminoglikozida za ribozome omogućava odvlačenje antibiotika iz membrane. Na taj način se izaziva povećanje transporta kroz citoplazmatičnu membranu pošto se smanjuje koncentracija aminoglikozida u njoj. Poređenjem streptomicina sa prethodno diskutovanim antibioticima, uočavamo da je njegov ulazak u citoplazmu ćelije energetski zavistan, za razliku od tetraciklina i hloramfenikola čiji je ulazak delimično ili totalno nezavistan od membranskog potencijala. 2.2.2.5. Mehanizam toksičnosti na citoplazmatičnoj membrani Mnoge klase organskih jedinjenja ispoljavaju toksično dejstvo na ćelije usled njihovog akumuliranja u citoplazmatičnoj membrani. Pokazano je da je toksičnost ovih supstanci 22  korelirana sa particionim koeficijentom njihove raspodele u sistemu oktanol/voda (log Po/w). Supstance sa vrednostima 1≤ log Po/w ≤5 uglavnom se smatraju da su toksične po ćeliju (Liu et al., 1982). Većina bakterija je tolerantna na rastvore nižih alkohola i kiselina. Sa druge strane, uočeno je da i izrazit lipofilni karakter supstance ne dovodi do toksičnih efekata. Većina organskih supstanci na osnovu svoje rastvorljivosti i lipofilne prirode se nalaze između rastvornih alkohola i lipofilnih jedinjenja. Pokazano je da su rastvarači umerene hidrofobnosti izuzetno toksični u odnosu na ćelije. Istraživanja su pokazala da aromatična jedinjenja, fenoli i terpenoidi imaju izražena antibakterijska svojstva, što je uticalo na njihovu primenu u proizvodnji konzervanasa, dezinfekcionih sredstava itd.. (Heipieper et a., 1991; Sikkema et al., 1992). Antibakterijska aktivnost mnogih klasa organskih jedinjenja opisana je u brojnim studijama (Sikkema et al., 1994; Kabelitz et al., 2003). Sve studije su pokazale korelaciju između hidrofobnosti (log Po/w) i toksičnosti. Ovde treba naglasiti da je toksični efekat supstanci i njihova dozna zavisnost bila slična kod većine testiranih bakterija. Na osnovu ovoga, brojne studije su zaključile da je toksični efekat ugljovodonika posledica nespecifičnog poremećaja fluidnosti membrane usled njihovog akumuliranja u lipidnom dvosloju (Saito et al., 1994; Ferrante et al., 1995). Pokazano je da su supstance sa funkcionalnim grupama (alkoholi, aldehidi..) znatno toksičniji u odnosu na ugljovodonike, jer pored poremećaja fluidnosti membrane one pokazuju i specifičnu hemijsku toksičnost. Na osnovu istraživanja Sikkema et al. (1994) utvrđen je odnos između log Po/w vrednosti supstanci i particionog koeficijenta ćelijska membrana/pufer (log Pm/b). Na osnovu particionih koeficijenata pokazano je da je sadržaj supstance u membrani čak osam puta manji u odnosu na njen sadržaj u oktanolu. U cilju boljeg razumevanja akumulacije supstance i njenog efekta na membranu izračunati su (log Pm/b) koeficijenti: log Pm/b = 0.97 × log Po/w – 0.64 Na osnovu izraza uočavamo da je log Po/w važan parametar koji opisuje akumulaciju supstanci u membrani. Međutim pored hidrofobnosti supstance, sama struktura molekula utiče na njenu membransku rastvorljivost. Pokazano je da će se amfipatični molekuli rastvarati odlično u membranama usled amfipatične prirode fosfolipida u njoj. Toksičan uticaj supstanci na strukturu i funkciju ćelijske membrane objašnjava se na više načina. Najčešće opisivan način jeste akumulacija supstanci u lipidnom dvosloju koja dovodi do nespecifične izmene ćelijske membrane i njenog bušenja. Pojedine studije su uočile rasipanje K+ jona i ATP-a nakon tretiranja bakterije fenolom (Heipieper et al., 1991). Uočeno je curenje fosfolipida, proteina pa čak i RNA molekula usled dejstva toluena na pojedine 23  bakterije. Smatra se da je curenje ćelijske membrane posledica njenog značajnog oštećenja, pri čemu je struktura ćelijskog zida nepromenjena. Ispitivanja sa tetralinom su pokazala povećanu izmenu protona u veštačkim membranama (Heipieper et al., 1994). Pokazano je da supstance mogu izazvati pasivan fluks protona i jona koji mogu razoriti protonski gradijent (ΔpH) i membranski potencijal (Δψ). Važan mehanizam antibakterijske aktivnosti supstanci jeste razaranje energetskog statusa ćelije. Uticaj supstanci na prenošenje i pretvaranje energije u okviru ćelije, ispitano je na enzim citoplazmatične membrane citohrom C oksidazu. Pokazano je da je ovaj enzim odgovoran za formiranje protonskog gradijenta (ΔpH) i membranskog potencijal (Δψ). Eksperimenti tetralina sa citohrom C oksidazom su pokazali smanjenje protonskog gradijenta (ΔpH) za 80% i membranskog potencijal (Δψ) za 50% (Sikkema et al., 1994). U istoj studiji je pokazano da različite supstance, slične membranske koncentracije (log Pm/b) ispoljavaju sličan efekat. Smanjenje protonskog gradijenta (ΔpH) nije jedini uzrok smanjenja energetskog statusa i membranskog potencijala ćelije. Pokazano je da supstance inhibiraju nastanak ATP-a usled parcijalne inhibicije enzima ATP-aze i proteina uključenih u procesu prenosa energije (Uribe et al., 1990). Eksperimentalni rezultati ove doktorske teze, indikativno i nedvosmisleno ukazuju da je aktivnost etarskih ulja i njihovih komponenata usmerena na razaranje protonskog gradijenta i membranskog potencijala citoplazmatične membrane. Primenom molekularnog dokinga na definisane targete antibiotika, ćelijskog zida i citoplazmatične membrane pokušaćemo uočiti i potvrditi indikacije eksperimentalnih rezultata. Veoma je bitno naglasiti da je veza između toksičnosti supstance i njene hidrofobnosti jedino validna za određenu log Po/w vrednost. Pri većoj hidrofobnosti (više vrednosti log Po/w), drugi važan parametar koji doprinosi toksičnosti supstance jeste njena rastvorljivost. Pokazano je da supstance koje su jako hidrofobne (alkani, bifenili) nemaju toksičnu aktivnost upravo zbog njihove male rastvorljivosti. Mala rastvorljivost ovih supstanci onemogućava njihovu biodostupnost i postizanje koncentracija koje bi bile letalne za ćeliju. Upravo zbog ovoga uveden je koeficijent log Pm/b koji u kombinaciji sa rastvorljivošću supstance, određuje maksimalnu koncentraciju supstance (MMC) u ćelijskoj membrani (de Bont, 1998). Na osnovu iznetog uočavamo da maksimalna koncentracija supstance u ćelijskoj membrani zavisi od koncentracije supstance u vodenoj fazi, njenog prelaska iz vode u membranu i odnosa njihovih zapremina. Korišćenjem i transformacijom log Po/w vrednosti u log Pm/b moguće je odrediti maksimalnu koncentraciju supstanci u ćelijskoj membrani (Neumann et al., 2005). 24  2.3. Hemometrijske metode analize Kao što je istaknuto u uvodnom delu, hemometrija je hemijska disciplina koja koristi matematičke i statističke metode, da oblikuje ili odabere optimalan postupak merenja ili eksperiment i omogući dobijanje maksimalnog broja informacija o analiziranom sistemu (Mathias, 2007). Najčešća primena hemometrije je u analizi skupa podataka i prepoznavanju matematičkih modela. Područija primene mogu se podeliti u četiri grupe. Jedna od grupa metoda je postupak koji omogućava prikupljanje valjanih podataka. Drugu grupu čine metode odabira korisnih informacija iz valjanih podataka. Treću grupu metoda čine metode analize spektroskopskih podataka i četvrtu grupu čine metode veštačke inteligencije (Wold & Sjöström, 1998). 2.3.1. Selektivna jon analiza (SIA) U uslovima preklapanja pikova komponenata etarskog ulja na GC-MS hromatogramu, neophodno je primeniti hemometrijsku metodu selektivne jon analize (SIA). Selektivna jon analiza je rezoluciona hemometrijska metoda, zasnovana na teoriji različitih odgovora ispitivanih komponenata na određenim m/z vrednostima. Ispitane m/z vrednosti se nazivaju selektivne tačke. Osnovna ideja SIA metode je efikasno iskorišćavanje selektivnosti masenog spektra. Hemometrijska SIA metoda se sastoji iz sledećih koraka: 1) pronalazak selektivnih jona preklopljenih komponenata, 2) ekstrakcija hromatografskog profila preklopljenih komponenata na osnovu odgovarajućih selektivnih jona, 3) dobijanje čistih masenih spektara preklopljenih komponenata metodom najmanjih kvadrata, 4) validacija pouzdanosti dobivenih rezultata. Primena i princip SIA metode detaljno je objašnjena u studijama (Tan et al., 2010; Miladinović et al., 2012). 2.3.2. Metoda glavnih komponenata (PCA) i klaster analize (HCA) Analiza glavnih komponenata je metoda hemometrijske analize koja se koristi u cilju smanjenja dimenzije sistema (skupa) podataka uz što veće zadržavanje njegove varijabilnosti, kako bi se olakšalo predstavljanje podataka, bolje sagledala struktura sistema i odnosi među korišćenim promenljivim. Metoda glavnih komponenata koncentriše varijabilnost na prve glavne komponente. Prva glavna komponenta (PC1) objašnjava što je moguće veći deo varijabilnosti svih posmatranih osobina. Druga glavna komponenta (PC2), nezavisno od prve, objašnjava najveću varijabilnost od onog što preostaje kad se izdvoji prva komponenta. Izbacivanje iz sistema svih komponenta (svojstvenih vektora) koje imaju karakteristične svojstvene vrednosti manje od jedinice je jedan od načina izbora broja odgovarajućih posmatranih glavnih komponenata. Ponekad je potrebno izabrati za posmatranje onoliko glavnih 25  komponenti koliko je potrebno da bi se objasnio zadovoljavajući procenat varijabilnosti sistema. PCA analiza je linearnom kombinacijom promenljivih i formiranjem svojstvenih vektora omogućila zadržavanje maksimalne varijanse među uzorcima i smanjenje dimenzija ispitanih sistema. Primenom PCA metode omogućeno je uočavanje odgovornih promenljivih (varijabli) za HCA klasifikaciju uzoraka. Klaster analiza (HCA) je hemometrijska metoda čija je primarna svrha grupisanje objekata, bazirana na karakteristikama koje poseduju. Klaster analiza klasifikuje objekte tako da je svaki objekat veoma sličan drugima u klasteru uz poštovanje nekog unapred određenog kriterijuma selekcije. Nastali skupovi objekata bi trebalo da pokažu visoku sličnost unutar klastera i visoku eksternu različitost između klastera. Primarni cilj klaster analize je podela objekata u dve ili više grupa, na osnovu sličnosti promenljivih. Postoji veći broj različitih mera udaljenosti koje karakterišu sličnost/različitost između objekata u klasteru. Najčešće primenjivana je euklidska udaljenost koja se računa kao kvadratni koren iz sume kvadratnih razlika vrednosti za sve varijable. Jedan od načina povezivanja objekta u okviru klastera jeste postupak potpunog povezivanja koji je zasnovan na maksimalnoj udaljenosti objekata. Metodom potpunog povezivanja i primenom euklidske udaljenosti HCA analizom su konstruisani odgovarajući dendrogrami (Brereton, 2003). 2.3.3. Metoda molekularnog dokinga (SAR) U oblasti molekularnog modelovanja, SAR (Structure Activity Relationships) je metoda koja predviđa željenu orijentaciju jednog molekula u odnosu na drugi, u fazi povezivanja i formiraja stabilanog kompleksa. Poznavanje poželjne orijentacije može da se koristi za predviđanje snage udruživanja ili afiniteta vezivanja dva molekula (Lengauer & Rarey, 1996). U cilju određivanja afiniteta i energije vezivanja supstanci za važna mesta antibakterijske aktivnosti, primenjena je metoda molekularnog dokinga. Ova metoda je zasnovana na jasno definisanim NMR i XRD strukturama receptora (Hus et al., 2000), koji su u delu mehanizma dejstva antibiotika i etarskih ulja objašnjeni ili predloženi kao moguća ciljna mesta antibakterijske aktivnosti. Svi ispitani receptori su dostupni u bazi Protein Data Bank-PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) koja sadrži više od 70000 proteina sa jasno definisanim 3D strukturama. Većina dostupnih receptora ove baze je u obliku kompleksa sa supstratom ili inhibitorom, pružajući nam dodatne informacije o osobini vezujućeg mesta. U odnosu na ostale "in silico" pristupe (na primer QSAR), metoda molekularnog dokinga, na relativno brz i jednostavan način, pruža veliki broj informacija o afinitetu i energetski povoljnim konformacijama vezivanja supstanci za receptorska mesta. Slično ostalim "in silico" metodama i ova metoda se sreće sa problemima u vidu korišćenja rigidnih PDB 26  27 receptora, zanemarenog uticaja solvatacije, protonizacije i tautomerizacije. Međutim i pored nekih nedostataka, ovo je danas najkorišćenija "in silico" metoda. Prvi korak računarske simulacije SAR metode je stavljanje potencijalnog liganda na vezujuće mesto ispitivanog targeta. Ovaj korak je poznat kao doking. Cilj ovog koraka je određivanje konformacija koje sterno najbolje odgovaraju vezujućem mestu i koje su energetski najpovoljnije. Reddy et al. (2007) je podelio brojne doking programe na osnovu algoritma kojim se vrši proračun energetskih konformacija.   3. E K SP E R IM E N T A L N I D E O  3.1. Biljni materijal, supstance i korišćene hemikalije Nadzemni delovi biljnih vrsta sakupljani su na područiju istočne Srbije. Taksonomsku pripadnost populacija je determinisala dr Marija S. Marković sa Odseka za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu. Herbarijumski uzorci biljaka su deponovani u herbarijumu Odseka za botaniku, Biološkog fakulteta u Beogradu. U Tabeli 1, prikazan je detaljan opis biljnih vrsta, koje su bile predmet rada u ovoj studiji. Tabela 1. Pregled odabranih biljnih vrsta. Takson Lokalitet Datum sakupljanja Vaučeri br. (BEOU) Thymus glabrescens Willd. Kravlje 08. 06. 2011. god. 16642 Thymus pulegioides L. Suva Planina 07. 08. 2011. god. 16525 Satureja kitaibelii Wierzb. ex Heuff. Sićevačka klisura 12. 05. 2011. god. 16557 Nepeta nuda L. Suva Planina 07. 08. 2011. god. 16524 Libanotis montana Vidlič 23. 07. 2011. god. 16548 Peucedanum longifolium Waldst. & Kit. Rtanj 31. 07. 2011. god. 16537 Peucedanum officinale L. Stara Planina 04. 09. 2011. god. 16538 Inula graveolens L. Stara Planina 04. 09. 2011. god. 16532 Sve korišćene supstance i reagensi su bili visoke analitičke čistoće. Hemikalije korišćene za određivanje metala nabavljene su od proizvođača Carlo Erba. Referentni standard BCR-701 je isporučen od strane "Community Bureau of Reference Sample" (BCR). Standardni rastvori korišći u ICP-OES tehnici su dobijeni od Alfa Aesar, Nemačka. Odabrani antibiotici (tetraciklin, streptomicin, hloramfenikol) i čiste supstance (geraniol, timol, linalool, eukaliptol, geranil acetat, limonen) kupljeni su od Sigma-Aldrich i Carl-Roth dobavljača. 3.2. Određivanje sadržaja metala 3.2.1. Mikrotalasna digestija zemljišta i biljnog materijala Mikrotalasna digestija je izvedena u mikrotalasnoj peći ETHOS 1 (Milestone, Italija) u zatvorenim poli tetra fluoro etilenskim (PTFE) sudovima, pri čemu je korišćena smeša 4 ml HNO3, 4 ml H2SO4 i 2 ml HF, za 0.5 g uzorka zemljišta. Temperatura peći je prvih 20 minuta dostigla 220 °C, a zatim je održavana konstantnom sledećih 15 minuta (maksimalna snaga iznosila je 1250 W). Biljni uzorci mase 1 g su razoreni korišćenjem 7 ml HNO3 i 2 ml H2O2. U slučaju ispitivanja biljnih uzoraka, temperatura peći je prvih 15 minuta dostigla 200 °C, a zatim je održavana konstantnom sledećih 15 minuta. Ohlađeni rastvori su razblaženi dejonizovanom vodom u normalnim sudovima od 50 ml. 29  3.2.2. Analiza metala Sadržaj metala: Na, K, Mg, Ca, Mn, Fe, Cu, Zn u uzorcima je određen optičko emisionom spektroskopijom sa induktivno spregnutom plazmom - ICP-OES tehnika (Thermo Scientific iCAP 6500 Duo ICP spektrometar, Velika Britanija). Standardni rastvori su pripremani korišćenjem 1000 mg/l rastvora ispitanih metala Instrumentalna kalibracija je proveravana na svakih 3-4 uzorka. Za određivanje metala u BCR ekstraktima, korišćeni standardi i slepe probe pripremani su na identičan način kao i ispitivani uzorci, u cilju eliminacije uticaja rastvarača i korekcije pozadine. 3.2.3. Sekvencionalna BCR ekstrakcija Postupak ekstrakcije je izveden u poli tetra fluoro etilenskim čašama (50 ml) ispunjenim sa 1 g uzoraka zemlje i neophodnim reagenasima za ekstrakciju. Rastvor A (CH3COOH, 0.11 mol/l): 25 ml glacijalne CH3COOH (Fluka, puriss. p.a., ACS reagent, ≥99.8%) je dodato u 0.5 l H2O a zatim je razblaživanjem napravljen rastvor zapremine 1 l. Zapremina od 250 ml ovog rastvora (CH3COOH, 0.44 mol/l) je razblažena do 1 l da bi se dobio rastvor neophodne koncentracije (CH3COOH, 0.11 mol/l). Rastvor B (NH2OH × HCl, 0.5 mol/l): 34.7 g NH2OH × HCl (Fluka, puriss. p.a., for AAS, ≥99.0%) je rastvoreno u 400 ml H2O. Rastvor je zakišeljen sa 25 ml 2 mol/l HNO3 (pripremljene adekvatnim razblaživanjem HNO3(cc)) i razblažen do zapremine od 1 l. Ovaj rastvor je pripreman na isti dan sekvencionalne ekstrakcije. Rastvor C (H2O2, 8.8 mol/l): korišćen je čist H2O2 proizvođača (Fluka, Trace Select 30%). Rastvor D (CH3COONH4, 1.0 mol/l): 77.08 g CH3COONH4 (Carlo Erba, ACS reagent, ≥97%) je rastvoreno u 800 ml H2O. Rastvor je zakišeljen sa HNO3(cc) do pH 2 i razblažen do zapremine od 1 l. Kao što je pokazano u studijama (Zimmerman & Weindorf, 2010; Sutherland, 2010; Reid et al., 2011), sekvencionalnom BCR ekstrakcijom se kvantitativno određuju: a) metali u izmenljivoj/karbonatnoj frakciji (I faza), b) metali u obilku Fe/Mn oksida-redukujuća frakcija (II faza) i c) metali u obliku organske materije i sulfida-oksidujuća frakcija (III faza). Proces sekvencionalne ekstrakcije detaljno je opisan u narednom delu teksta. I faza: 1 g uzorka je prenet u čašu (50 ml). Dodato je 40 ml rastvora A i mešano 16 h na sobnoj temperaturi. Ekstrakt je odvojen od čvrstog ostatka centrifugiranjem i dekantovanjem supernatanta tečnosti. Ekstrahovana frakcija je čuvana na 4 °C do ICP-OES analize. Čvrst ostatak je ispiran dodavanjem 20 ml H2O. Rastvor je mešan 15 minuta a zatim je dodata H2O uklonjena centrifugiranjem i dekantovanjem, vodeći računa da se ne odbaci ispitivan čvrst ostatak. 30  II faza: 40 ml rastvora B je dodato na čvrst ostatak iz I faze. Ekstrakcija je izvedena kao što je opisano u fazi I. Ostatak je ispran dodavanjem 2 ml H2O, uz mešanje 15 min, a zatim je dodata H2O uklonjena centrifugiranjem i dekantovanjem. III faza: pažljivo u malim porcijama, u cilju izbegavanja burne reakcije, 10 ml rastvora C je dodato na čvrst ostatak iz faze II. Suspenzija ispitanog uzorka je povremeno mešana na sobnoj temperaturi, u toku 1 h, u cilju što potpunijeg rastvaranja uzorka. Digestija je nastavljena 1 h na 85±2 °C na vodenom kupatilu, a zatim je rastvor uparen na 3 ml. Još 10 ml rastvora C je dodato a digestija je ponovo nastavljena na 85±2 °C u trajanju od 1 h. Nakon uparavanja rastvora na zapreminu od 1 ml, ekstrakcija je nastavljena dodavanjem 50 ml rastvora D. Postupak ekstrakcije rastvorom D objašnjen je u I fazi sekvencionalne ekstrakcije. 3.2.4. Ispitivanje uzoraka zemljišta metodom rendgenske difrakcije (XRD-analiza) Uzorci su ispitani na difraktometru za prah PHILIPS PW 1710 pod sledećim uslovima: upotrebljeno je zračenje sa antikatode bakra talasne dužine CuKα = 1,54178 Å i grafitni monohromator. Radni napon na cevi bio je U = 40 kV, jačina struje I = 30 mA. Uzorak je ispitan u opsegu 3 – 70º 2θ sa korakom 0.02º i vremenskim zadržavanjem 2.0 sekunde na svakom koraku. Dobijeni podaci položaja difrakcionih maksimuma 2θ (º), kao i odgovarajući intenziteti I dati su grafički. Na osnovu dobijenih vrednosti intenziteta I/Imax i međupljosnih rastojanja d i upoređivanjem sa literaturnim podacima i JCPDS standardima identifikovane su prisutne kristalne faze. Učešće kristalnih faza određeno je semikvantitativno. 3.2.5. Određivanje kiselosti, redoks potencijala, provodljivosti, sadržaja organske materije i katjonsko izmenjivačkog kapaciteta zemljišta Potenciometrijska analiza i primena pH-metra (Hach-sensION 3), omogućila je određivanje pH vrednosti zemljišta. Kalibracija pH metra vršena je sistemom pufera: pH = 4 ± 0.02 (Titrisol, Merck, citrat pufer), pH = 7 ± 0.02 (Titrisol, Merck, fosfatni pufer) i pH = 10 ± 0.02 (Titrival, Kemika, borna kiselina-kalijum hlorid-natrijum hidroksid). Nakon 2 h mešanja na magnetnoj mešalici, izmerena je pH vrednost suspenzije uzoraka (25 ml destilovane vode/5 g zemljišta). Potenciometrijska analiza i primena pH-metra (Hach-sensION 3), omogućila je određivanje vrednosti redoks potencijala (Eh) zemljišta. Nakon 2 h mešanja na magnetnoj mešalici, izmerena je Eh vrednost suspenzije uzoraka (25 ml destilovane vode/5 g zemljišta). Konduktometrijska analiza i primena konduktometra (Hach-sensION 5) omogućila je određivanje vrednosti električne provodljivosti (EC) zemljišta. Kalibracija konduktometra vršena je standardnim rastvorom Hasch-NaCl (1000 μS/cm). Nakon 2 h mešanja na 31  magnetnoj mešalici, izmerena je EC vrednost suspenzije uzoraka (25 ml destilovane vode/5 g zemljišta). Gravimetrijskom analizom i žarenjem zemljišta na 815 °C, indirektno je određena količina organske materije u uzorcima na osnovu sadržaja mineralnih materija i količine pepela. Katjonsko izmenjivački kapacitet zemljišta (CEC), određen je nakon 16 h mešanja suspenzije uzoraka (25 ml CH3COONH4/5 g zemljišta). Ekstrakt je odvojen od čvrstog ostatka filtriranjem, a čvrst ostatak je ispiran 95% etanolom. U cilju određivanja CEC kapaciteta zemljišta, vršena je ekstrakcija NH4+ jona rastvorom KCl (0.1 mol/l), pri čemu je koncentracija NH4+ jona određena kolorimetrijski. 3.3. Hemijski sastav etarskih ulja 3.3.1. Izolovanje etarskog ulja Osušeni i usitnjeni biljni delovi podvrgnuti su procesu hidrodestilacije na Clavenger aparatu u trajanju od 4 sata. Izolovano etarsko ulje je osušeno anhidrovanim natrijum-sulfatom i čuvano na temperaturi od 4 °C. 3.3.2. Gasna hromatografija (GC) GC analiza etarskog ulja je urađena na gasnom hromatografu HP-5890 Series II, opremljenim split-splitless injektorom, kapilarnom kolonom sa HP-5MS stacionarnom fazom (30 m × 0.25 mm; debljina filma 0.25 µm), helijumom kao nosećim gasom (1 ml/min) i plameno- jonizujućim detektorom (FID). Temperatura injektora iznosila je 250 °C, detektora 280 °C, dok je temperatura kolone linearno povećavana od 50–250 °C (3 °C/min). 3.3.3. Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC-MS) GC-MS analiza je urađena na Agilent Technologies aparatu, model GS 6890N pri 70 eV, sa detektorom tipa MSD 5975C, pod istim gasno-hromatografskim uslovima. 3.3.4. Identifikacija komponenata etarskog ulja Identifikacija komponenata ulja vršena je masenospektrometrijski, poređenjem aritmetičkih retencionih indekasa, retencionih vremena i masenih spektara komponenti sa referentnim supstancama i/ili jedinjenjima iz raspoložive baze podataka (Wiley 275, NIST/NBS). Primenom programa AMDIS (ver. 2.64), u kombinaciji sa SIA hemometrijskom metodom dobijene su eksperimentalne vrednosti aritmetičkih indekasa (AIE), koje su bile u saglasnosti sa literaturnim vrednostima aritmetičkih (AIL) indeksa (Adams, 2007). Aritmetički retencioni indeksi su proračunati na osnovu koiniciranja sa standardnom smešom C7-C40 ugljovodonika. 32  3.4. Antibakterijska aktivnost ispitanih supstanci 3.4.1. Ispitane supstance Sva etarska ulja ispitanih biljnih vrsta, čiste supstance (geraniol, timol, linalool, eukaliptol, geranil acetat, limonen) i odabrani antibiotici (tetraciklin, streptomicin, hloramfenikol) podvrgnuti su ispitivanju antibakterijske aktivnosti. 3.4.2. Bakterijski sojevi Antibakterijska aktivnost etarskih ulja, dominantnih komponenata ulja i antibiotika ispitana je na trinaest referentnih ATCC sojeva. Ispitani Gram-negativni sojevi su: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 12453, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 i Enterobacter aerogenes ATCC 13048. Ispitani Gram-pozitivni sojevi su: Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 29213 i Listeria monocytogenes ATCC 15313. Od prekonoćnih kultura bakterijskih sojeva su pripremljene suspenzije turbiditeta 0.5 McFarlanda (gustine 108 CFU/ml), propisano od strane "Clinical and Laboratory Standards Institute" (CLSI, 2009). Turbiditet suspenzija određivan je korišćenjem DINKO McFarland kolorimetra. 3.4.3. Mikrodiluciona metoda Primenom mikrodilucione metode je određena minimalna inhibitorska koncentracija (MIC) i minimalna baktericidna koncentracija supstanci (MBC) (CLSI, 2009). U etanolu (70%) su pripremljene serije duplih razblaženja supstanci i zatim je 10 μl u 90 μl inokulisane tečne podloge (Mueller-Hinton bujon) unošeno u mikrotitar ploče sa 96 udubljenja. Ukupna zapremina u svakom udubljenju je bila 100 μl, konačna gustina bakterijskih ćelija 107 CFU/ml, a koncentracije proučavanih supstanci izražene su jedinicama μg/ml. Mikrotitar ploče su inkubirane 24 h na 37 °C. Svi eksperimenti su urađeni u tri ponavljanja. Korišćene su dve kontrole, hranljivi medijum sa rastvaračem etanolom (negativna kontrola) i ispitani antibiotici (pozitivna kontrola). Bakterijski rast je detektovan dodavanjem po 20 μl 0.5% vodenog rastvora trifenil-tetrazolium-hlorida (TTC). MIC je definisana kao najniža koncentracija supstanci pri kojoj nema vidljivog rasta bakterija, crveno obojenih kolonija na dnu udubljenja mikrotitar ploče nakon dodavanja TTC-a. Da bi se odredila MBC, sadržaj udubljenja u kojima nije bilo vidljivog rasta je prenet na petri ploče sa Mueller-Hinton agarom (MHA) i inkubiran 24 h na 37 °C, nakon čega su brojane porasle kolonije. MBC je ona koncentracija ulja pri kojoj je ubijeno 99.9% od početnog broja bakterijskih ćelija. 33  3.4.4. Mikrodiluciona "checkerboard" metoda Mikrodiluciona "checkerboard" metoda je tehnika koja se koristi u in vitro uslovima u cilju određivanja antibakterijske aktivnosti smeša (Dougherty et al., 1977; Van Vuuren et al., 2009). Na osnovu predhodno određenih MIC vrednosti, napravljene su serije standardnih rastvora supstanci [(0.1-0.9)×MIC], u cilju ispitivanja njihove kombinovane interakcije. Antibakterijska aktivnost proučavanih smeša (kombinacija supstanci), ispitana je na pet referentnih ATCC sojeva. Ispitani "checkerboard" sojevi su: E. coli ATCC 25922, K. pneumonia ATCC 700603, P. mirabilis ATCC 12453, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213. Ovi sojevi su odabrani kao najčešći uzročnici infektivnih bolesti. Slika 4. Šematski prikaz kombinovanja supstanci A i B u mikrotitar ploči. Sledeći smernice i preporuke standardnih procedura (CLSI, 2009), ispitane su kombinacije čistih supstanci i antibiotika, kao i međusobne kombinacije pojedinih supstanci. Raspored i način unošenja ispitanih rastvora, šematski je predstavljen na Slici 4. Inokulisane mikrotitar ploče su inkubirane 24 h na 37 °C, nakon čega je detektovan bakterijski rast. Tip interakcija između ispitanih supstanci jasno je definisan i objašnjen jednačinom koju su ustanovili Chou & Talalay (1984). Interakcije između supstanci se mogu definisati kao sinergističke, aditivne i antagonističke. U cilju kvantitatatativnog određivanja interakcija, uveden je pojam frakcione inhibitorne koncentracije (FIC). Na osnovu ispitivanja (Chou & Talalay, 1984), pokazano je da se FIC indeks smeša (supstance različitog mehanizma dejstva) računa na sledeći način: 34  35 FIC= MICA smeše MICA + MICB smeše MICB + MICA smeše×MICB smeše MICA×MICB FIC=FICA+FICB+FICA×FICB gde su: MICA i MICB - minimalne inhibitorske koncentracije supstanci MICA smeše i MICB smeše - minimalne inhibitorske koncentracije supstanci u smeši FICA i FICB - frakcioni indeksi pojedinačnih supstanci Primenom programa CalcuSyn (Biosoft) izračunate su FIC vrednosti ispitanih kombinacija, a rezultati su interpretirani kao: sinergizam (FIC <0.90), aditivno dejstvo (0.90≤ FIC ≤1.10) ili antagonizam ((FIC >1.10) (Wyles et al., 2007). 3.5. Hemometrijska obrada podataka U cilju pouzdane identifikacije komponenata i analize preklapljenih pikova na GC-MS hromatogramu, primenjena je hemometrijska metoda selektivne jon analize (SIA). Kombinovanom primenom programa Master Data Analysis, AMDIS i programa Mathworks MATLAB izvršena je detaljna analiza m/z vrednosti hromatograma. U cilju uočavanja odnosa i korelacija, eksperimentalni rezultati ove studije su hemometrijski ispitani kombinovanom primenom metoda glavnih komponenata (PCA) i klaster analize (HCA). Korišćenje programa Mathworks MATLAB i programa STATISTICA 8, omogućilo je detaljnu hemometrijsku analizu. Za određivanje afiniteta i energije vezivanja supstanci za važna mesta antibakterijske aktivnosti, primenjena je metoda molekularnog dokinga (SAR metoda). Na osnovu jasno definisanih NMR i XRD struktura receptora, dostupnih u bazi Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), primenom programa AutoDock Vina i Broyden– Fletcher–Goldfarb–Shanno iterativnog algoritma, definisane su energetski najpovoljnije konformacije ispitanih liganada.   4. R E Z U L T A T I I D IS K U SI JA  4.1.Sadržaj metala u zemljištu Kao što je poznato, genetska predispozicija biljne vrste i hemijski sastav zemljišta su odlučujući faktori koji determinišu akumulaciju hemijskih elemenata u biljci. U cilju boljeg sagledavanja i razumevanja akumulacije metala u biljnim vrstama izvršena je detaljna hemijska analiza zemljišta. Ukupan sadržaj metala u zemljištu ne daje podatke o njihovoj biološkoj dostupnosti, toksičnosti i distribuciji, međutim znanje o njihovoj interakciji sa ostalim materijama u zemljištu bi nam pomoglo u razumevanju njihove akumulacije u biljkama. Na osnovu navedenog, izvršena je sekvencionalna BCR analiza zemljišta, čiji je postupak opisan. Kao što je pokazano u studijama (Zimmerman & Weindorf, 2010; Sutherland 2010; Reid et al., 2011), BCR analizom se kvantitativno određuju: a) metali u izmenljivoj/karbonatnoj frakciji (I faza), b) metali u obilku Fe/Mn oksida-redukujuća frakcija (II faza) i c) metali u obliku organske materije i sulfida-oksidujuća frakcija (III faza). Rezultati sekvencionalne ekstrakcije i ukupna koncentracija makro i mikroelemenata ispitanih uzoraka, prikazani su u Tabelama 2 i 3. Pouzdanost i preciznost analize elemenata, proveravan je korišćenjem BCR-701 standarda a relativne standardna devijacija analize metala data je u Tabelama 2 i 3. Ukupna koncentracija ispitanih elemenata kretala se u intervalu: natrijum (289.06-2410.86 ppm), kalijum (4030.65-10871.18 ppm), magnezijum (1159.37-3229.80 ppm), kalcijum (10251.92-154250.35 ppm), mangan (11.03-1280.25 ppm), gvožđe (4786.97-15411.14 ppm), bakar (2.25-17.05 ppm) i cink (8.45-54.53 ppm). Koncentracije ispitanih metala nalaze se u granicama propisanih vrednosti za zemljište (Sparks, 2003). U cilju poređenja zemljišta na osnovu ukupnog sadržaja metala i sastava pojedinih frakcija izvršena je hemometrijska analiza. 4.1.1. Hemometrijska analiza sadržaja metala karbonatne frakcije zemljišta Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sadržaj metala u karbonatnoj frakciji u cilju procene sličnosti zemljišta na osnovu dostupnosti ispitivanih metala u biljci. Koncentracija ispitanih elemenata (Tabele 2 i 3), kretala se u intervalu: a) natrijum (5.59- 25.28 ppm), b) kalijum (73.73-313.81 ppm), c) magnezijum (103.89-606.23 ppm), d) kalcijum (829.93-78283.89 ppm), e) mangan (4.60-305.35 ppm), f) gvožđe (2.08-26.63 ppm), g) bakar (0.01-0.06 ppm) i h) cink (0.01-2.19 ppm). Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 53.82% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 32.53% (Slika 5A). Slika 5B, ilustruje uticaj ispitanih metala karbonatne faze, na klasifikaciju ispitanih zemljišta (Slika 5C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥77456 (Slika 5D), HCA analiza je podelila zemljišta 37   Tabela 2. Koncentracija alkalnih i zemnoalkalnih metala u zemljištu. Element (ppm) Frakcija (faza) Kravlje Suva Planina Sićevačka klisura Vidlič Rtanj Stara Planina BCR-701 standard RSD* (%) ZK** (ppm) Na I 18.71 10.64 25.28 12.19 12.69 5.59 57.01 1.94 23000 II 12.92 2.67 10.26 2.85 3.18 0.50 20.70 III 6.75 6.80 5.47 6.86 7.40 3.70 18.07 Ukupno 2162.47 2410.86 718.69 815.47 1266.73 289.06 97.64 K I 313.81 73.73 282.40 232.78 188.04 108.88 115.44 0.82 21000 II 286.03 95.41 155.93 179.57 204.63 74.51 150.34 III 104.99 48.51 41.96 86.73 127.01 27.31 53.69 Ukupno 6880.97 7315.09 4030.65 6740.61 4997.30 10871.18 322.09 Mg I 446.67 223.25 606.23 509.63 257.91 103.89 949.49 1.65 23000 II 443.78 325.68 445.86 234.55 307.64 15.46 889.61 III 395.97 325.66 126.25 282.63 516.17 42.88 421.62 Ukupno 3229.80 2459.54 1332.23 1466.49 1159.37 1463.56 2298.02 Ca I 76973.40 3762.50 78283.89 10463.60 13620.71 829.93 9579.74 1.08 41000 II 20810.92 2119.12 71498.55 6453.00 9339.65 146.50 1969.56 III 347.03 147.67 3786.20 198.56 311.85 26.60 142.62 Ukupno 99821.98 10251.92 154250.35 22115.18 25586.59 14308.62 11818.19 *RSD-relativna standardna devijacija koncentracije određivanih metala; **ZK-prosečan sadržaj elemenata u Zemljinoj kori (Sparks, 2003).   Tabela 3. Koncentracija prelaznih metala u zemljištu. Element (ppm) Frakcija (faza) Kravlje Suva Planina Sićevačka klisura Vidlič Rtanj Stara Planina BCR-701 standard RSD* (%) ZK** (ppm) Mn I 207.52 252.24 227.95 305.35 263.84 4.60 178.76 0.72 950 II 634.30 871.38 431.89 607.30 492.15 3.57 154.96 III 30.66 38.30 62.86 23.77 32.30 1.73 20.86 Ukupno 918.11 1280.25 736.86 1044.43 820.68 11.03 357.13 Fe I 2.08 3.04 2.83 2.60 4.83 26.63 79.75 1.68 41000 II 1405.60 2175.01 38.62 1288.67 1459.17 315.18 7864.44 III 1041.95 952.50 621.47 1241.44 2184.63 101.17 1047.75 Ukupno 13516.51 14745.34 8156.82 15411.14 9669.43 4786.97 9143.00 Cu I 0.01 0.01 0.01 0.06 0.01 0.01 49.41 0.90 50 II 0.97 1.94 1.03 0.82 1.10 0.24 116.45 III 2.63 1.20 2.99 3.13 2.67 0.16 51.00 Ukupno 16.11 11.46 5.79 17.05 10.45 2.25 218.81 Zn I 0.01 0.59 0.01 2.19 0.31 0.34 206.87 1.58 75 II 17.08 6.61 2.54 22.23 13.30 0.44 111.27 III 8.44 6.51 13.70 14.40 14.51 5.23 42.73 Ukupno 40.70 25.97 23.67 54.53 42.93 8.45 366.57 *RSD-relativna standardna devijacija koncentracije određivanih metala; **ZK-prosečan sadržaj elemenata u Zemljinoj kori (Sparks, 2003).  na dve grupe (A i B). Grupa A, zemljišta sa područija Kravlja i Sićevačke klisure, odlikovala su se izuzetno visokim sadržajem kalcijuma (Slike 5B, C). Ova zemljišta imala su i viši sadržaj izmenljivog natrijuma, kalijuma i magnezijuma u odnosu na zemljišta B grupe (Slike 5B, C).   Slika 5. Hemometrijska analiza sadržaja metala karbonatne frakcije zemljišta: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥12795 (Slika 5D), HCA analiza je podelila grupu B na dve podgrupe (B1 i B2). Vidlič, nosilac podgrupe B1, odlikovao se višim vrednostima izmenljivog Mn, Cu i Zn u odnosu na ostala zemljišta. Karbonatna frakcija zemljišta sa Stare Planine (podgrupa B2) karakterisala se visokim sadržajem gvožđa u odnosu na ostala zemljišta (Slika 5B, C). Najveću hemijsku sličnost u pogledu ispitivanih elemenata karbonatne frakcije imala su zemljišta Kravlja i Sićevačke klisure. 4.1.2. Hemometrijska analiza sadržaja metala Fe/Mn oksidne frakcije zemljišta Rezultati studije (Kabata-Pendias, 2010), pokazali su da oksidi gvožđa i mangana imaju značajnu ulogu u sorpciji i desorpciji hemijskih vrsta u zemljištu. Cilj primene sekvencijalne BCR analize, bio je utvrđivanje koja zemljišta imaju sličnu akumulaciju u okviru Fe/Mn 40    Slika 6. Hemometrijska analiza sadržaja metala Fe/Mn oksidne frakcije zemljišta: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. oksidne frakcije i sličan uticaj na biodostupnosti pojedinih elemenata. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sadržaj metala Fe/Mn oksidne frakcije u cilju procene sličnosti zemljišta. Koncentracija ispitanih elemenata u ovoj frakciji (Tabele 2 i 3) kretala se u intervalu: natrijum (0.50-12.92 ppm), kalijum (74.51-286.03 ppm), magnezijum (15.46- 445.86 ppm), kalcijum (146.50-71498.55 ppm), mangan (3.57-871.38 ppm), gvožđe (38.62- 2175.01 ppm), bakar (0.24-1.94 ppm) i cink (0.44-22.23 ppm). Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 45.88% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 31.89% (Slika 6A). Slika 6B, ilustruje uticaj ispitanih metala Fe/Mn oksidne faze, na klasifikaciju ispitanih zemljišta (Slika 6C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥20708 (Slika 6D), HCA analiza je podelila zemljišta na tri grupe (A, B i C). Grupa A, zemljište iz Sićevačke klisure, odlikuje se izuzetno visokim sadržajem kalcijuma (Slike 6B, C). Ovo zemljište je u okviru Fe/Mn oksidne frakcije sadržalo i visok sadržaj magnezijuma. Kravlje, grupa B, odlikovalo se visokim sadržajem natrijuma i kalijuma u odnosu na ostala zemljišta (Slike 6B, C). Suva Planina, nosilac grupe 41  C, odlikuje se višim vrednostima Mn, Fe i Cu, dok je Zn karakterisao zemljište Vidliča u okviru iste grupe (Slike 6B, C). Najveću hemijsku sličnost u pogledu ispitivanih elemenata Fe/Mn oksidne frakcije imala su zemljišta Suve i Stare Planine. 4.1.3. Hemometrijska analiza sadržaja metala organske frakcije zemljišta Na osnovu određenih studija, pokazano je da organska materija zemljišta igra značajnu ulogu u sorpciji i kompleksiranju hemijskih elemenata (Kabata-Pendias, 2010). Primenom sekvencionalne BCR analize, želeli smo utvrditi koja zemljišta imaju sličnu akumulaciju metala u okviru organske frakcije i sličan uticaj na biodostupnost pojedinih elemenata. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sadržaj metala organske frakcije u cilju procene sličnosti zemljišta. Koncentracija ispitanih elemenata u ovoj frakciji (Tabele 2 i 3) kretala se u intervalu: natrijum (3.70-7.40 ppm), kalijum (27.31-127.01 ppm), magnezijum (42.88-516.17 ppm), kalcijum (26.60-3786.20 ppm), mangan (1.73-62.86 ppm), gvožđe (101.17-2184.63 ppm), bakar (0.16-3.13 ppm) i cink (5.23-14.51 ppm).   Slika 7. Hemometrijska analiza sadržaja metala organske frakcije zemljišta: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. 42   Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 58.50% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 29.79% (Slika 7A). Slika 7B, ilustruje uticaj ispitanih metala organske faze, na klasifikaciju ispitanih zemljišta (Slika 7C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2158 (Slika 7D), HCA analiza je podelila zemljišta na tri grupe (A, B i C). Grupa A, zemljište iz Sićevačke klisure, odlikuje se izuzetno visokim sadržajem kalcijuma (Slike 7B, C). Ovo zemljište je u okviru organske frakcije sadržalo i visok sadržaj mangana. Rtanj, grupa B, odlikuje se višim sadržajem natrijuma, kalijuma, magnezijuma, gvožđa i cinka u odnosu na ostala zemljišta (Slike 7B, C). Zemljišta grupe C imala su niži sadržaj ispitanih metala, samo se Vidlič karakterisao nešto višim sadržajem bakra. Najveću hemijsku sličnost u pogledu ispitanih elemenata organske frakcije pokazala su zemljišta Kravlja i Suve Planine. 4.1.4. Hemometrijska analiza zemljišta na osnovu ukupnog sadržaja metala Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na ukupan sadržaj metala u zemljištu (Tabele 2 i 3). Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 54.55% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 20.92% (Slika 8A). Slika 8B, ilustruje uticaj ispitanih metala na klasifikaciju zemljišta (Slika 8C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥144202 (Slika 8D), HCA analiza je podelila zemljišta na dve grupe (A i B). Grupa A, zemljišta sa područija Kravlja i Sićevačke klisure, odlikovala suse izuzetno visokim sadržajem kalcijuma (Slike 8B, C). Visok sadržaj magnezijuma u odnosu na ostala zemljišta uočen je na područiju Kravlja. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥16416 (Slika 8D), HCA analiza je podelila grupu B na dve podgrupe (B1 i B2). Vidlič, nosilac podgrupe B1, odlikovao se višim vrednostima Fe, Cu i Zn u odnosu na ostala zemljišta (Slika 8B, C). Podgrupa B2, zemljišta sa Stare i Suve Planine, odlikovala su se visokim sadržajem Na, K i Mn (Slike 8B, C). Najveću hemijsku sličnost u pogledu ukupnog sadržaja elemenata imala su zemljišta Vidliča i Rtnja. Poređenjem hemometrijskih rezultata koji se odnose na sadržaj metala u zemljištu, uočena je sličnost dendrograma karbonatne frakcije i ukupne koncentracije. Na osnovu ukupne i frakcionih koncentracija metala (Tabele 2 i 3), uočavamo izražen procenat metala u obliku silikata. Na osnovu određenih studija, pokazano je da metali silikatne frakcije nisu biodostupni biljci i ne mogu uticati na njen rast (Kabata-Pendias, 2010). Zanemarujući ovu bio-inertnu frakciju, hemometrijskom analizom je pokazan snažan uticaj karbonatne frakcije na biodostupnost metala zemljišta (Slike 5D-8D). 43    Slika 8. Hemometrijska analiza ukupnog sadržaja metala zemljišta: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. 4.1.5. Hemometrijska analiza stepena zasićenja zemljišta (EF) Stepen zasićenja zemljišta (EF), detaljno je opisan u studiji Loska & Wiechula (2003) a jednačina njegovog proračuna data je izrazom: EF ൌ ቀ CxCFe ቁ zemljište ቀ CxCFe ቁ Zemljina kora g e j Cx C e d e: ቀ F ቁ ቀ Cx CFe zemljište odnos koncentracije ispitanog elementa i gvožđa u analiziranom zemljištu, ቁ Zemljina kora odnos koncentracije ispitanog elementa i gvožđa u Zemljinoj kori Stepen zasićenja je našao značajnu ulogu u geohemijskoj analizi zemljišta u vidu brzog uočavanja prirodnih (raspad stena) i veštačkih faktora (antropogeni uticaj) akumulacije metala u biljkama (Mohamed & Antia, 1998; Kabata-Pendias, 2010; Adaikpoh & Kaizer, 44  2012; Ren et al., 2014). Na osnovu sadržaja ispitanih elemenata u Zemljinoj kori i njihove koncentracije u zemljištu (Tabele 2 i 3), određen je stepen zasićenja za sve elemente. Tabela 4. Stepen zasićenja zemljišta (EF) ispitanim elementima. Element Kravlje Suva Planina Sićevačka klisura Vidlič Rtanj Stara Planina Na 0.29 0.29 0.16 0.09 0.23 0.11 K 0.99 0.97 0.97 0.85 1.01 4.44 Mg 0.43 0.30 0.29 0.17 0.21 0.54 Ca 7.39 0.70 18.91 1.44 2.65 2.99 Mn 2.95 3.77 3.93 2.95 3.69 0.10 Fe 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Cu 0.99 0.65 0.59 0.92 0.90 0.39 Zn 1.67 0.98 1.61 1.97 2.47 0.98 Prema pojedinim studijama (Loska & Wiechula, 2003), na osnovu vrednosti stepena zasićenja, zemljišta možemo podeliti na: a) minimalno obogaćena (EF< 2), b) umereno obogaćena (2 ≤ EF < 5), c) značajno obogaćena (5 ≤ EF < 20), d) jako obogaćena (20 ≤ EF ≤ 40) i e) ekstremno obogaćena (EF >40). Na osnovu rezultata u Tabeli 4, uočavamo da zemljišta u odnosu na većinu elemenata spadaju u minimalno obogaćena zemljišta. Takođe se uočava umereno i značajno obogaćenje zemljišta kalijumom, kalcijumom, manganom i cinkom. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve vrednosti stepena zasićenja u cilju procene sličnosti zemljišta na osnovu akumulacije metala. Primena hemometrijskih metoda u analizi i ispitivanju EF vrednosti zemljišta je predmet pojedinih studija (Loska & Wiechula, 2003; Chen et al., 2014). Ispitane EF vrednosti elemenata (Tabela 4), kretale su se u intervalu: natrijum (0.09-0.29), kalijum (0.85-4.44), magnezijum (0.17-0.54), kalcijum (0.70-18.91), mangan (0.10-3.93), bakar (0.39-0.99) i cink (0.98-2.47). Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 54.46% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 17.86% (Slika 9A). Slika 9B, ilustruje uticaj EF vrednosti metala na klasifikaciju ispitanih zemljišta (Slika 9C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥5.6 (Slika 9D), HCA analiza je podelila zemljišta na četiri grupe (A, B, C i D). Grupa A, zemljište iz Sićevačke klisure, odlikuje se znatnim obogaćenjem Ca i Mn u odnosu na ostala zemljišta (Slike 9B, C). Stara Planina (grupa B), može se smatrati zemljištem umereno obogaćeno kalijumom. Ovo zemljište je sadržalo i najviše EF vrednosti magnezijuma ali u granici minimalnog obogaćenja (Slike 9B, C). Rtanj, nosilac grupe C, odlikuje se umerenim obogaćenjem u pogledu sadržaja Zn (Slike 9B, C). Najviše EF vrednosti Na i Cu uočene su u zemljištu Kravlja ali samo u oblasti minimalnog obogaćenja (Slike 9B, C). Najveću hemijsku sličnost u pogledu stepena zasićenja elemenata imala su 45  zemljišta Vidliča i Rtnja. U cilju objašnjenja mineralnog obogaćenja zemljišta i eliminacije mogućeg antropogenog faktora, izvršena je detaljna X-ray difrakciona analiza uzoraka zemlje.   Slika 9. Hemometrijska analiza zemljišta zasnovana na stepenu zasićenja: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. 4.1.6. X-ray difrakciona (XRD) i hemometrijska analiza mineralnog sastava zemljišta Sadržaj metala u zemljištu, a samim tim i njihova dostupnost biljci, određena je prisustvom primarnih i sekundarnih minerala. Primarne minerale zemljišta na osnovu sposobnosti fizičke, hemijske i biološke razgradnje možemo podeliti u dve grupe: a) felzični minerali: plagioklas > K/Na-feldspat > muskovit > kvarc i b) mafični minerali: olivin > piroksen > amfibol > biotit (Kabata-Pendias, 2010). Mafični minerali se odlikuju višim sadržajem Mg i Fe u odnosu na felzične minerale čije su glavne komponente Si, O, Al, Na i K. Primarni minerali su karakteristika zemljišta krupnije teksture i nisu značajno uključeni u proces sorpcije jona u zemljištu. Pedohemijskom i geohemijskom modifikacijom primarnih minerala nastaju sekundarni minerali kao što su: minerali glina, kalcit, dolomit, gips, getit, hematit, gipsit i drugi. Svi sekundarni minerali, a naročito minerali glina (grupe kaolina, smektita, ilita i hlorita) igraju važnu ulogu u procesu sorpcije jona koja je uslovljena pH i Eh vrednošću 46  47 zemljišta (Kabata-Pendias, 2010). Pojedine studije su pokazale da je kvarc najzastupljeniji mineral zemljišta i da je najmanje rastvoran (pH >9) u odnosu na ostale silikatne minerale (Tan, 1998). Minerali feldspata su podložni rapadanju i transformaciji u zemljištu i daju odličan materijal za nastanak minerala glina. Zemljišta suvih klimatskih područija, odlikuju se višim sadržajem karbonata (kalcit, dolomit) i metalnih oksida/hidroksida, dok su glinovita zemljišta fine teksture, karakteristika vlažnog klimatskog podneblja (Sparks, 2003). X-ray difrakciona metoda (XRD) je nedestruktivna i najkorišćenija tehnika za identifikaciju mineralnih komponenata zemljišta. Svaki mineral se karakteriše specifičnim rasporedom atoma, stvarajući atomske ravni, koje su sposobne da difraktuju (reflektuju) X-zrake pod određenim uglom. Karakteristične vrednosti difrakcionih uglova i implementacija Bragove jednačine omogućava identifikovanje minerala (Tan, 1998). Na osnovu XRD analize (Slika 10), određeni su sledeći minerali u zemljištu: a) primarni minerali: kvarc {SiO2}, liskun {KAl3(Si3Al)O10(F,OH)2} i feldspat {KAlSi3O8 - NaAlSi3O8 - CaAl2Si2O8}, b) sekundarni minerali: kalcit {CaCO3}, kaolinit {Al2Si2O5(OH)4} i hlorit {(Mg5Al)(AlSi3)O10(OH)8}. Na osnovu XRD analize uočava se dominantno prisustvo kvarca u svim uzorcima. Kao što je već napomenuto, sam kvarc je prilično inertan na pH i Eh vrednosti zemljišta i tako reći ne učestvuje u sorpciji jona u zemljištu (Tan, 1998). Sa druge strane uočava se dominantno prisustvo kalcita na područiju Kravlja i Sićevačke klisure, što upravo objašnjava značajno obogaćenje (5 ≤ EF < 20) ovih zemljišta kalcijumom i eliminiše antropogeni uticaj njegove akumulacije. Većina zemljišta sadržala je i izvesnu količinu glinenih minerala koji zajedno sa karbonatima zavisno od Eh-pH vrednosti, igraju značajnu ulogu u sorpciji i desorpciji jona (Tan, 1998; Sparks, 2003; Kabata-Pendias, 2010). Primarni minerali podložni gohemijskom raspadu, feldspati i liskuni, mogu biti odgovorni za akumulaciju pojedinih jona (Tan, 1998). Hemometrijske metode su našle primenu u instrumentalnoj analitičkoj hemiji u vidu analize i poređenja spektara ispitivanih supstanci (Klein et al., 2012; Miladinović et al., 2012; Mueller et al., 2013). Primena PCA i HCA analize u ispitivanju zemljišta na osnovu XRD vrednosti je predmet pojedinih studija (Zhu et al., 2004; Padeletti & Fermo, 2010). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na mineralni sastav zemljišta u cilju određivanja njihovih sličnih mineroloških karakteristika. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 49.82% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 22.60% (Slika 11A). Slika 11B, ilustruje uticaj karakterističnih difrakcionih uglova faktorske analize, na klasifikaciju ispitanih zemljišta (Slika 11C).   Slika 10. XRD spektri ispitanih uzoraka zemlje. 48    Slika 11. Hemometrijska analiza zemljišta zasnovana na mineralnom sastavu: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih difrakcionih uglova; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. Ispitan mineralni sastav zemljišta prikazan je na Slici 10. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥4585 (Slika 11D), HCA analiza je podelila zemljišta na dve grupe (A i B). Grupa A, zemljište sa područija Stare Planine, odlikuje se izraženim sadržajem kvarca i niskim sadržajem ostalih minerala u odnosu na ispitana zemljišta. Karakterističan difrakcioni ugao kvaraca (26.72°) i odsutne/zanemarljive vrednosti uglova ostalih minerala su potvrda ove konstatacije (Slike 10 i 11B, C). U okviru zemljišta grupe B, uočava se mineralna sličnost Kravlja i Sićevačke klisure usled izraženog sadržaja kalcita i difrakcionog ugla (29.48°). Sva zemljišta grupe B odlikuju se prisustvom glinenih minerala i nešto višim sadržajem feldspata i liskuna u odnosu na zemljište Stare Planine. Najveću hemijsku sličnost u minerološkom pogledu imaju zemljišta Suve Planine i Rtnja (Slika 11D). 4.1.7. Hemijski parametri zemljišta Na osnovu brojnih studija, ispitivanja i analiza (Tan, 1998; Sparks, 2003; Kabata-Pendias, 2010), glavni parametri zemljišta koji regulišu proces sorpcije i desorpcije jona u zemljištu, a 49  samim tim utiču na njihovu dostupnost biljci su: a) kiselost zemljišta (pH), b) elektrodni potencijal zemljišta (Eh), c) električna provodljivost zemljišta (EC), d) katjonski izmenjivački kapacitet zemljišta (CEC), i e) sadržaj organske materije. Na osnovu stepena kiselosti/baznosti, zemljišta možemo podeliti na: a) ekstremno kisela (pH< 3), b) vrlo jako kisela (3< pH <4), c) jako kisela (4< pH <5), d) umereno kisela (5< pH <6), e) slabo kisela (6< pH <7), f) neutralna (pH 7), g) slabo bazna (7< pH <8), h) umereno bazna (8< pH <9), i) jako bazna (9< pH <10), j) vrlo jako bazna (10< pH <11) i k) ekstremno bazna (pH> 11). Kisela zemljišta su uglavnom karakteristika vlažnih klimatskih predela. Većina biljnih vrsta najbolje uspeva na zemljištu slabo kiselih uslova, dok pri pH <6, dostupnost pojedinih nutrijenata biljci može biti umanjeno. Dostupnost Ca, Mg i K, je naročito smanjeno u uslovima kisele sredine. Visoke koncentracije Fe i Mn usled jake kiselosti zemljišta su uglavnom toksične po biljku. Bazna zemljišta su uglavnom karakteristika suvih klimatskih predela. Zbog baznosti zemljišta, količine rastvornih formi Fe i Mn su male, usled njihove precipitacije u obliku nerastvornih hidroksida. Ispitani mikronutrijenti (Mn, Fe, Cu i Zn) su već u uslovima umerene alkalnosti zemljišta obično deficitarni za rast biljaka. Uopšte, visoke pH vrednosti zemljišta i dostupnost Ca su međusobno povezane. Ispostavilo se da su kiselost zemljišta i njegov elektrodni potencijal negativno korelirani (Bohrerova et al., 2004). Uticaj organske materije na pH vrednost zemljišta detaljno je opisan u studiji Brady and Weil (2010). Rezultati pH vrednosti ispitanih zemljišta dati su u Tabeli 5. Na osnovu rezultata možemo uočiti da su zemljišta Kravlja, Sićevačke klisure i Vidliča slabo bazna dok su ostala ispitana zemljišta kisela. Jako kisela sredina zemljišta Stare planine, može biti odgovorna za hiperakumulaciju i toksični efakat jona Fe i Mn u biljnim vrstama ovog područija. Tabela 5. Ispitani hemijski parametri zemljišta. Zemljište pH Eh (mV) EC (µS/cm) CEC (cmolc/kg) Pepeo (%) Kravlje 7.64 ± 0.3 -47.0 ± 2.0 250.0 ± 2.0 543.67 ± 6.31 73.29 Suva Planina 5.64 ± 0.2 72.0 ± 3.0 103.0 ± 2.0 90.52 ± 4.58 85.73 Sićevačka klisura 7.58 ± 0.3 -45.0 ± 2.0 321.0 ± 3.0 792.69 ± 8.78 62.08 Vidlič 7.02 ± 0.2 -10.0 ± 1.0 206.0 ± 2.0 140.08 ± 4.96 75.61 Rtanj 6.88 ± 0.2 -2.0 ± 0.1 254.0 ± 2.0 150.40 ± 4.57 70.09 Stara Planina 4.65 ± 0.2 130.0 ± 3.0 33.0 ± 1.0 111.61 ± 3.23 97.72 Na osnovu pojedinih studija, elektrodni potencijal zemljišta se obično kreće u intervalu od -300 mV do 900 mV (Huson, 2013). Na osnovu elektrodnog potencijala, zemljišta možemo 50  51 podeliti na: a) zemljišta bogata kiseonikom (Eh >400 mV), b) umereno redukciona zemljišta (100 mV< Eh <400 mV), c) redukciona zemljišta (-100 mV< Eh <100 mV) i d) jako redukciona zemljišta (-300 mV< Eh <-100 mV). Na osnovu rezultata datih u Tabeli 5, uočavamo da većina ispitanih zemljišta spada u zemljišta redukcionog tipa. Zemljište Stare Planine odlikuje se nešto višim vrednostima Eh potencijala, što ga svrstava u grupu umereno redukcionih zemljišta. Pojedina istraživanja su pokazala, da Eh zemljišta lako varira sa rastojanjem i dubinom zemljišnih uzoraka (Bohrerova et al., 2004; Hinsinger et al., 2009). Pojedina istraživanja su pokazala sezonsku varijaciju u elektrodnom potencijalu zemljišta usled promene klimatskih uslova i vlažnosti zemljišta (Sabiene et al., 2010). Pokazano je da porast organske materije u zemljištu utiče na na smanjenje elektrodnog potencijala zemljišta usled njene oksidacije kiseonikom (Macías & Camps Arbestain, 2010). Eh i pH faktori zemljišta snažno utiču na mobilnost metalnih jona u zemljištu i na njihovu biodostupnost biljci (Huson, 2013). Na osnovu elektrodnih potencijala i kiselosti zemljišta (Tabela 5), kreirani su odgovarajući Eh-pH dijagrama ispitanih elemenata (Slika 12). Na osnovu Slike 12, uočava se redukovana forma ispitanih elemenata koja ih čini biodostupnim biljci. Ova konstatacija se ne odnosi na natrijum i kalijum koji se isključivo javljaju kao jednovalentni. Vidimo da više pH vrednosti pojedinih zemljišta nisu dovele do taloženja jona u obliku hidroksida, i samim tim smanjile njihovu biodostupnost. Međutim, redukovane forme ispitanih metala mogu imati toksičan uticaj na biljnu vrstu usled izražene hiperakumulacije (Kabata-Pendias, 2010). Slana zemljišta su karakteristika suvog klimatskog područija. Usled obilnog isparavanja i male količine padavina, dolazi do akumuliranja pojedinih soli (NaCl, Na2SO4, CaCO3, MgCO3) koje zemljište mogu učiniti slanim. Električna provodljivosti zemljišta (EC) je odličan indikator ove pojave. Na osnovu pojedinih istraživanja, zemljišta se tretiraju slanim ukoliko je EC >4000 μS/cm (Tan, 1998). Slana zemljišta, snažno inhibiraju rast biljaka, usled indukcije plazmolize i istiskivanja vode iz biljaka u zemljišni rastvor. Na osnovu rezultata električne provodljivosti (Tabela 5) uočavamo da sva ispitana zemljišta spadaju u grupu neslanih zemljišta i da toksični efekti slanosti ne mogu uticati na biljne vrste ovih predela. Katjonski izmenjivački kapacitet (CEC) zemljišta se odnosi na količinu negativnog naelektrisanja prisutnog na površini minerala glina i organske materije koja elektrostatičkim silama drži pozitivno naelektrisane jone zemljišnog rastvora (Sparks, 2003). Veći sadržaj organske materije i glinenih minerala u zemljištu uslovljava i više CEC vrednosti. Visoka CEC vrednost ne znači i veću plodnost zemljišta, pošto negativna mesta mogu biti zauzeta i kiselim H+ i Al3+ jonima. Samo mali procenat esencijalnih katjona se nalazi slobodan u   Slika 12. Eh-pH dijagrami ispitanih metala. 52  u zemljišnom rastvoru. Katjonski izmenjivački kapacitet predstavlja rezervoar nutrijenata kojim se nadoknađuju potrošeni metali zemljišnog rastvora usled biljne apsorpcije ili izluživanja u periodu obilnih padavina. CEC igra važnu ulogu u puferovanju pH zemljišta, a u kombinaciji sa ostalim parametrima zemljišta može biti dobar indikator plodnosti zemljišta. Na osnovu rezultata (Tabela 5), najviše vrednosti katjonsko izmenjivačkog kapaciteta uočene su na područiju Kravlja i Sićevačke klisure a najniže na područiju Suve i Stare Planine. Ova pojava se može objasniti visokim sadržajem organske materije i mineralnim sastavom (Tabela 5, Slika 10) ispitanih zemljišta. (Tan, 1998, Sparks 2003, Kabata-Pendias, 2010). Organska materija je jedan od najznačajnijih faktora koji utiče na elektrodni potencijal zemljišta. Ona je elektronski rezervoar redukcionog kapaciteta i njen unos snižava vrednost potencijala (Chesworth, 2004). Pokazano je da organske materije imaju važnu ulogu u održavanju pH vrednosti i nastajanju slabo kisele i neutralne sredine zemljišta (Brady & Weil, 2010). Pri niskim pH vrednostima, organska materija gradi stabilne komplekse sa Al, što je najvažniji puferski proces zemljišta (Skyllberg et al., 2001). Kao što je već napomenuto, veći udeo organske materije značajno utiče na povećanje katjonsko izmenjivačkog kapaciteta zemljišta. Pokazano je da organske supstance (huminske i fulvo kiseline) igraju važnu ulogu u kompleksiranju i geohemijskom ciklusu metala (Kabata-Pendias, 2010; Tang et al., 2014). Jedna od čestih metoda određivanja količine organske materije je analiza pepela spaljenog zemljišta. Na osnovu rezultata (Tabela 5), uočavamo nizak sadržaj organske materije na područiju Stare Planine i znatno više vrednosti u ostalim uzorcima. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na hemijske parametre zemljišta u cilju određivanja sličnih zemljišnih uslova. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 89.20% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 8.64% (Slika 13A). Slika 13B, ilustruje uticaj hemijskih parametara, na klasifikaciju ispitanih zemljišta (Slika 13C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥761 (Slika 13D), HCA analiza je podelila zemljišta na dve grupe (A i B). Grupa A, zemljišta sa područija Kravlja i Sićevačke klisure, odlikuju se višim vrednostima pH, EC, CEC i nižim vrednostima Eh i pepela u odnosu na ostala zemljišta grupe B (Slika 13B, C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥262 (Slika 13D), HCA analiza je podelila grupu B na dve podgrupe (B1 i B2). Zemljišta Stare i Suve Planine (podgrupa B1), odlikuju se višim vrednostima Eh i pepela u odnosu na ostala zemljišta grupe B (Slika 13B, C). Najveću hemijsku sličnost u pogledu svih hemijskih parametara imaju zemljišta Vidliča i Rtnja (Slika 13D). Na osnovu hemometrijske analize potvrdili smo neke od literaturnih konstatacija vezane za međusobnu povezanost hemijskih parametara zemljišta: a) negativna korelacija pH i Eh vrednosti zemljišta, b) 53  54 negativna korelacija Eh i sadržaja organske materije i c) pozitivna korelacija CEC i sadržaja organske materije (Slika 13B).   Slika 13. Hemometrijska analiza zemljišta zasnovana na hemijskim parametrima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih parametara; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih zemljišta; (D) dendrogram HCA analize. 4.2. Sadržaj metala u ispitanim biljnim vrstama Sadržaj makro i mikro elemenata ispitanih biljaka dat je u Tabeli 6. Na osnovu rezultata vidimo da su analizirani nadzemni kao i pojedinačni delovi biljnih vrsta istih ili različitih familija na područiju istih ili različitih lokaliteta. Ovako postavljen sistem nam upravo može pružiti informaciju: a) da li isti delovi biljke slično/različito akumuliraju pojedine metale (L. montana, P. longifolium i I. graveolens), b) da li ista biljka u toku vegetacione sezone vrši sličnu/različitu akumulaciju metala (S. kitaibelii), c) da li biljne vrste istog roda a različitog geografskog položaja imaju sličnu/različitu akumulaciju metala (T. glabrescens/T. pulegioides i P. longifolium/P.officinale), d) da li biljne vrste iste familije i istog geografskog položaja imaju sličnu/različitu akumulaciju metala (T. pulegioides/N. nuda), e) da li biljne vrste iste familije a različitog geografskog položaja imaju sličnu/različitu akumulaciju metala, f) da li biljne vrste različite familije a istog geografskog položaja imaju sličnu/različitu   Tabela 6. Koncentracije metala (ppm) u nadzemnim i pojedinačnim delovima ispitanih biljaka. Planina Br. Biljka Na K Mg Ca Mn Fe Cu Zn Kravlje 1* T. glabrescens 3.20 9848.73 1624.03 8755.53 21.18 88.43 4.16 21.17 Suva Planina 2* T. pulegioides 6.55 7805.78 3609.30 9638.73 18.24 123.90 3.67 25.49 3* N. nuda 1.64 8659.51 1311.44 6988.03 34.49 39.23 4.25 15.85 Sićevačka klisura 4* S. kitaibelii (12.5.2011. god.) 14.28 8435.91 2349.86 10678.63 18.85 107.10 3.52 18.16 5* S. kitaibelii (17.7.2011. god.) 14.87 5911.65 2277.49 11717.72 16.06 45.73 2.60 11.41 6* S. kitaibelii (14.8.2011. god.) 6.17 5789.57 2446.64 12292.58 19.85 50.40 2.76 15.56 7* S. kitaibelii (28.9.2011. god.) 11.93 4663.23 3101.19 17455.03 19.85 85.29 2.25 16.08 8* S. kitaibelii (02.11.2011. god.) 27.13 4739.60 2994.59 15929.54 19.62 95.20 2.39 14.96 Vidlič 9* L. montana (list) 6.33 8011.79 2199.26 10545.32 36.35 42.82 6.03 22.35 10* L. montana (cvet) 10.82 8615.59 2170.32 11051.55 36.71 73.48 6.61 24.13 11* L. montana (plod) 11.36 8490.04 2406.55 11195.76 31.01 80.81 4.97 24.71 Rtanj 12* P. longifolium (list) 3.52 5891.94 1314.96 7010.00 42.71 24.40 1.80 12.16 13* P. longifolium (cvet) 8.83 11024.64 2051.94 3467.90 31.41 39.81 4.93 20.43 Stara Planina 14* P. officinale 0.45 8183.45 1322.72 11106.39 21.88 59.18 4.10 11.78 15* I. graveolens (list) 27.00 12333.56 1370.80 11672.56 50.85 132.76 2.49 12.26 16* I. graveolens (cvet) 9.32 9877.44 1328.02 7502.33 42.86 63.62 5.00 14.44 Relativna standardna devijacija (RSD) ispitanih metala data je u tabelama sekvencionalne BCR analize (Tabele 2 i 3).  akumulaciju metala (P. officinale/I. graveolens) i g) da li biljne vrste različitih familija i različitog geografskog položaja imaju sličnu/različitu akumulaciju metala (Lamiaceae/Apiaceae/Asteraceae). Na osnovu sadržaja metala u biljnim vrstama (Tabela 6), možemo uočiti visok sadržaj Cu i Zn u biljnoj vrsti L. montana (Vidlič) u odnosu na biljke ostalih lokaliteta. Sa druge strane sadržaj Mn u ovoj biljci nije najviši, što nam govori da je akumulacija metala uslovljena i genetskom predispozicijom biljke. Određena istraživanja su pokazala da se sadržaj natrijuma u biljci kreće u intervalu od 4.11 ppm do 39498 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 300 ppm (Watanabe et al., 2007). Pojedine studije su povezale ove rezultate sa prosečnim sadržajem natrijuma u ljudskom organizmu (2000 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Sadržaj natrijuma u ispitanim biljkama je bio u intervalu od 0.45 ppm do 27.13 ppm (Tabela 6). Najviši sadržaj natrijuma zabeležen je kod biljne vrste S. kitaibelii a najniži kod P. officinale. Poređenjem naših rezultata sa sadržajem natrijuma u nekim lekovitim biljkama (Subramanian et al., 2012) uočen je znatno niži sadržaj ovog elementa. Na osnovu prikazanih rezultata (Tabela 6), uočavamo nizak sadržaj natrijuma u biljnim vrstama T. glabrescens, N. nuda, P. longifolium (list) i P. officinale (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). Pojedina istraživanja su pokazala da se sadržaj kalijuma u biljci kreće u intervalu od 1080 ppm do 114234 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 11500 ppm (Watanabe et al., 2007). Jedan broj studija je komparirao ove rezultate sa prosečnim sadržajem kalijuma u organizmu (2900 ppm), u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Na osnovu naših istraživanja (Tabela 6), najviši sadržaj kalijuma uočen je u listu biljne vrste I. graveolens (12333.56 ppm), dok je minimalni sadržaj kalijuma uočen kod S. kitaibelii (4663.23 ppm). Pojedine lekovite biljke odlikuju se sličnim sadržajem ovog elementa (Soares Leal et al., 2013), sa koncentracijom kalijuma u intervalu od 3949 ppm do 17850 ppm. Sadržaj kalijuma u ispitanim biljakama nalazi se u propisanim granicama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). Najviši sadržaj magnezijuma (Tabela 6), uočen je u nadzemnom delu biljne vrste T. pulegioides (3609.30 ppm), dok je minimalni sadržaj magnezijuma zabeležen kod N. nuda (1311.44 ppm), na istom staništu. Pojedine lekovite biljke odlikuju se sličnim sadržajem ovog elementa (Soares Leal et al., 2013), sa koncentracijom magnezijuma u intervalu od 616 ppm do 5287 ppm. Sadržaj magnezijuma u ispitanim biljakama nalazi se u propisanim granicama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). 56  Sadržaj kalcijuma u biljci se kreće u intervalu od 668 ppm do 76420 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 13000 ppm (Watanabe et al., 2007). Pojedine studije su povezale ove rezultate sa prosečnim sadržajem kalcijuma u organizmu (20000 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Na osnovu naših istraživanja (Tabela 6), najviši sadržaj kalcijuma uočen je u nadzemnom delu biljne vrste S. kitaibelii (17455.03 ppm), dok je minimalni sadržaj kalcijuma uočen u cvetu biljne vrste P. longifolium (3467.90 ppm). Interesantno je uočiti da biljna vrsta S. kitaibelii sadrži najveću količinu kalcijuma, upravo usled njegove visoke koncentracije u izmenljivoj frakciji zemljišta u Sićevačkoj klisuri (Slika 5B, C; Tabela 2). Sa druge strane izražen sadržaj ovog metala nije uočen u biljnoj vrsti T. glabrescens na područiju Kravlja, što upravo potvrđuje činjenicu da je akumulacija metala uslovljena i genetskom predispozicijom biljke. Sadržaj kalcijuma u ispitanim biljkama nalazi se u propisanim granicama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). Određene lekovite biljke odlikuju se nešto višim sadržajem ovog elementa (Soares Leal et al., 2013), sa koncentracijom kalcijuma u intervalu od 9647 ppm do 22136 ppm. Pojedina istraživanja su pokazala da se sadržaj mangana u biljkama kreće u intervalu od 12.6 ppm do 5687 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 146.6 ppm (Watanabe et al., 2007). Pojedine studije su povezale ove rezultate sa prosečnim sadržajem mangana u organizmu (0.24 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Na osnovu naših istraživanja (Tabela 6), najviši sadržaj mangana uočen je u listu biljne vrste I. graveolens (50.85 ppm), dok je minimalni sadržaj mangana uočen u nadzemnom delu biljne vrste T. pulegioides (18.24 ppm). Brojna ispitivanja metala lekovitih biljaka, dala su slične rezultate (Meena et al., 2010; Kostić et al., 2011; Olowoyo et al., 2012; Soares Leal et al., 2013). Sadržaj mangana u ispitanim biljakama nalazi se u propisanim granicama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). Pojedina istraživanja su pokazala da se sadržaj gvožđa u biljci kreće u intervalu od 19.6 ppm do 12296 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 100 ppm (Watanabe et al., 2007). Određeni broj studija je povezao ove rezultate sa prosečnim sadržajem gvožđa u organizmu (86 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Na osnovu naših istraživanja (Tabela 6), najviši sadržaj gvožđa uočen je u listu biljne vrste I. graveolens (132.76 ppm), dok je minimalni sadržaj gvožđa uočen u listu biljne vrste P. longifolium (24.40 ppm). Interesantno je uočiti da je najviši sadržaj gvožđa određen u listu billjne vrste I. graveolens baš sa Stare planine. Biljna vrsta P. officinale sa istog lokaliteta nije pokazala akumulaciju ovog elementa, što još jedanput potvrđuje značaj genetskih faktora biljke na akumulaciju hemijskih elemenata. Brojna ispitivanja metala u lekovitim biljakama, dala su 57  58 slične rezultate (Meena et al., 2010; Kostić et al., 2011; Olowoyo et al., 2012; Soares Leal et al., 2013). Sadržaj gvožđa u ispitanim biljakama nalazi se u propisanim granicama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). Pojedina istraživanja su pokazala da se sadržaj bakra u biljci kreće u intervalu od 16.4 ppm do 288 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 43 ppm (Watanabe et al., 2007). Neke studije su povezale ove rezultate sa prosečnim sadržajem bakra u organizmu (1.5 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Na osnovu naših istraživanja (Tabela 6), najviši sadržaj bakra uočen je u cvetu biljne vrste L. montana (6.61 ppm), dok je minimalni sadržaj bakra uočen u listu biljne vrste P. longifolium (1.80 ppm). Brojna ispitivanja metala u lekovitim biljkama, dala su slične rezultate (Kostić et al., 2011; Olowoyo et al., 2012; Subramanian et al., 2012). Na osnovu prikazanih rezultata uočavamo nizak sadržaj bakra u ispitanim biljkama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). Pojedina istraživanja su pokazala da se sadržaj cinka u biljci kreće u intervalu od 2.21 ppm do 611 ppm sa prosečnom koncentracijom u listu od 20 ppm (Watanabe et al., 2007). Pojedine studije su povezale ove rezultate sa prosečnim sadržajem zinka u organizmu (47 ppm) u cilju nutritivne primene ispitanih biljaka (Salter et al., 2012). Na osnovu naših istraživanja (Tabela 6), najviši sadržaj cinka uočen je u listu biljne vrste T. pulegioides (25.49 ppm), dok je minimalni sadržaj cinka uočen u biljnoj vrsti S. kitaibelii (11.41 ppm). Brojna ispitivanja metala lekovitih biljaka, dala su slične rezultate (Kostić et al., 2011; Subramanian et al., 2012; Ebrahim et al., 2012; Soares Leal et al., 2013). Sadržaj cinka u ispitanim biljakama nalazi se u propisanim granicama (Watanabe et al., 2007; Salter et al., 2012). 4.2.1. Hemometrijska analiza sadržaja metala u ispitanim biljakama U cilju određivanja sličnog sadržaja metala u ispitanim biljnim vrstama i uočavanja odgovornih faktora njihove akumulacije, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza. Hemometrijski pristup analize sadržaja metala farmakološki značajnih biljaka je predmet pojedinih studija (Arumugam et al., 2012; Konieczynski, 2013). Usled svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa i koncentracije elemenata (Tabela 6), PC1 svojstveni vektor objasnio je 38.52% varijanse ispitanih biljaka, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 23.75% (Slika 14A). Dijagram odgovornih metala-varijabli (Slika 14B), ilustruje uticaj elemenata na klasifikaciju biljnih vrsti (Slika 14C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥15402 (Slika 14D), HCA analiza je identifikovala dve grupe biljaka (A i B). Grupa A, kojoj pripada najveći broj ispitanih biljaka, odlikovala se višim sadržajem Ca, Mg, Na, Fe i nižim sadržajem K i Mn u odnosu na biljne vrste grupe B (Slika 14B, C). Niske koncentracije Cu i Zn nisu zapaženo uticale na klasifikaciju biljaka. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti     Slika 14. Hemometrijska analiza biljnih vrsta zasnovana na njihovom sadržaju metala: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih biljaka; (D) dendrogram HCA analize. ≥9761 (Slika 14D), HCA analiza je podelila grupu A na dve podgrupe (A1 i A2). Kraj vegetacionog perioda odlikovao je S. kitaibelii vrstu (podgrupa A1), izuzetno visokim sadržajem Ca i niskim sadržajem K u odnosu na ostale biljne vrste grupe A. Pored opšte hemometrijske podele, na osnovu dendrograma (Slika 14D), možemo uočiti odgovore na neka od postavljenih pitanja u prethodnom odeljku a u vezi odgovornih faktora akumulacije metala u biljakama. Uočavamo da delovi biljne vrste L. montana (9*, 10* i 11*) i P. longifolium (12* i 13*) imaju sličan sadržaj metala, dok se list i cvet biljne vrste I. graveolens (15* i 16*) prilično razlikuju u sadržaju Ca, K i Fe. Na osnovu ovoga možemo zaključiti da je sadržaj metala u pojedinim delovima biljke upravo određen genetskom predispozicijom biljke. Ispitivanjem sadržaja metala vrste S. kitaibelii (4*, 5*, 6*, 7*, 8*) u toku vegetacione sezone uočava se izrazito smanjenje kalijuma i nagli skok kalcijuma na kraju vegetacione sezone. Ovo nam govori da pored genetske predispozicije biljne vrste, edafski uslovi sredine 59  60 (hemijski sastav i procesi u zemljištu) su drugi odlučujući faktor akumulacije metala. Poređenjem istih biljnih rodova u okviru različitih staništa {T. glabrescens/T. pulegioides (1*/2*) i P. longifolium/P.officinale (12*/14*)} možemo uočiti još izraženiju razliku u sadržaju metala biljnih vrsta kao posledicu združenog dejstva prethodna dva faktora (grupa A i B, Slika 14D). Ispitivanjem hemijskih elemenata biljnih vrsta T. pulegioides i N. nuda (2* i 3*), uočavamo da biljke iste familije i istog staništa imaju različitu akumulaciju metala usled drugačije genetske predispozicije biljne vrste (grupa A i B, Slika 14D). Poređenjem biljnih vrsta istih familija a različitih ekosistema {T. glabrescens/T. pulegioides (1*/2*), N. nuda/S. kitaibelii (3*/4*), P. longifolium/P. officinale (12*/14*), L. montana/P.longifolium (9*/12*)}, uočava se još izraženija razliku u sastavu metala biljaka usled združenog dejstva različite genetike biljaka i sadržaja metala u zemljištu (grupa A i B, Slika 14D). Biljne vrste različitih familija a istog ekosistema {P. officinale/I. graveolens (14*/16*) imaju različitu akumulaciju metala usled različitih genetskih faktora (grupa A i B, Slika 14D). Biljne vrste različitih familija a različitog ekosistema (Lamiaceae/Apiaceae/Asteraceae) mogu imati sličan ili različit sadržaj metala usled kombinovane interakcije genetike biljaka i mineralnog sastava zemljišta. Na osnovu svega izloženog možemo zaključiti da genetska predispozicija biljaka i edafski uslovi sredine (hemijski sastav i procesi u zemljištu) su nerazdvojivi i neraskidivi faktori koje treba istovremeno proučavati u cilju adekvatnog razumevanja sadržaja metala u biljnim vrstama. 4.3. Hemometrijska analiza koeficijenata izmene elemenata (TC) Koeficijent izmene elemenata (TC), detaljno je opisan u studiji Márquez-García & Córdoba (2010) a jednačina njegovog proračun izrazom: a data je TC ൌ ܥ௫biljka ܥ௫zemljište gd biljka - koncentracija ispitanog elementa u biljci e je: ܥ௫ ܥ௫zemljište - ukupna koncentracija ispitanog elementa u zemljištu U cilju određivanja akumulacije pojedinih elemenata u biljci (TC >1) i boljeg sagledavanja složenih odnosa između sadržaja metala u zemljištu i biljnim vrstama, izračunati su koeficijenti izmene (Tabela 7). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na TC koeficijente u cilju određivanja biljnih vrsta sa sličnom akumulacijom pojedinih elemenata. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 55.99% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 20.28% (Slika 15A). Slika 15B,   Tabela 7. Koeficijenti izmene elemenata (TC) ispitanih biljnih vrsta. Zemljište Br. Biljka Na K Mg Ca Mn Fe Cu Zn Kravlje 1* T. glabrescens 0.0015 1.4313 0.5028 0.0877 0.0231 0.0065 0.2582 0.5201 Suva Planina 2* T. pulegioides 0.0027 1.0671 1.4675 0.9402 0.0142 0.0084 0.3203 0.9815 3* N. nuda 0.0007 1.1838 0.5332 0.6816 0.0269 0.0027 0.3712 0.6102 Sićevačka klisura 4* S. kitaibelii (12.5.2011. god.) 0.0199 2.0929 1.7639 0.0692 0.0256 0.0131 0.6068 0.7671 5* S. kitaibelii (17.7.2011. god.) 0.0207 1.4667 1.7095 0.0760 0.0218 0.0056 0.4483 0.4819 6* S. kitaibelii (14.8.2011. god.) 0.0086 1.4364 1.8365 0.0797 0.0269 0.0062 0.4764 0.6575 7* S. kitaibelii (28.9.2011. god.) 0.0166 1.1569 2.3278 0.1132 0.0269 0.0105 0.3888 0.6794 8* S. kitaibelii (02.11.2011. god.) 0.0377 1.1759 2.2478 0.1033 0.0266 0.0117 0.4129 0.6321 Vidlič 9* L. montana (list) 0.0078 1.1886 1.4997 0.4768 0.0348 0.0028 0.3538 0.4098 10* L. montana (cvet) 0.0133 1.2782 1.4799 0.4997 0.0351 0.0048 0.3880 0.4425 11* L. montana (plod) 0.0139 1.2595 1.6410 0.5062 0.0297 0.0052 0.2913 0.4531 Rtanj 12* P. longifolium (list) 0.0028 1.1790 1.1342 0.2740 0.0520 0.0025 0.1722 0.2831 13* P. longifolium (cvet) 0.0070 2.2061 1.7699 0.1355 0.0383 0.0041 0.4714 0.4758 Stara Planina 14* P. officinale 0.0016 0.7528 0.9038 0.7762 1.9834 0.0124 1.8262 1.3943 15* I. graveolens (list) 0.0934 1.1345 0.9366 0.8158 4.6102 0.0277 1.1081 1.4511 16* I. graveolens (cvet) 0.0322 0.9086 0.9074 0.5243 3.8857 0.0133 2.2240 1.7092    Slika 15. Hemometrijska analiza biljnih vrsta zasnovana na TC koeficijentu izmene: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih koeficijenata; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih biljaka; (D) dendrogram HCA analize. ilustruje uticaj TC metala, na klasifikaciju biljnih vrsta (Slika 15C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥4.96 (Slika 15D), HCA analiza je podelila biljke na dve grupe (A i B). Grupa A, biljne vrste sa područija Stare Planine {P. officinale (14*) i I. graveolens (15* i 16*)}, pokazale su značajnu akumulaciju Mn, Cu i Zn u odnosu na ostale biljne vrste (Slika 15B, C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.86 (Slika 15D), HCA analiza je podelila grupu B na dve podgrupe (B1 i B2). Biljne vrste podgrupe B1, S. kitaibelii (4*-8*) i P. longifolium (13*), odlikovale su se izraženom akumulacijom Mg i K (Slika 15B, C). Akumulacija Mg i K uočena je i u ostalim biljnim vrstama grupe B ali u nešto manje izraženom obliku. Na osnovu TC vrednosti možemo konstantovati da ni jedna biljna vrsta nije akumulator natrijuma, kalcijuma i gvožđa. 4.4. Hemometrijska analiza biokoncentracionog faktora elemenata (BF) Biokoncentracioni faktor elemenata (BF), detaljno je opisan u studiji Márquez-García & Córdoba (2010) a jednačina njegovog proračuna data je izrazom: 62  63 BF ൌ ܥ௫biljka ܥ௫biodostupna frakcija zemljišta gd biljka - koncentracija ispitanog elementa u biljci e je: ܥ௫ ܥ௫biodostupna frakcija zemljišta - koncentracija ispitanog elementa u karbonatnoj frakciji zemljišta U cilju određivanja tolerantnosti biljaka (BF >1) na toksičan efekat elemenata biodostupne frakcije zemljišta (karbonatna frakcija) i boljeg sagledavanja složenih odnosa između sadržaja metala u zemljištu i biljnim vrstama, izračunat je biokoncentracioni faktor (Tabela 8). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na BF faktore u cilju određivanja biljnih vrsta sa sličnom tolerantnošću na metale. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacione matrice, PC1 svojstveni vektor objasnio je 55.65% ukupne varijanse, dok je PC2 vektor opisao ostalih 15.64% (Slika 16A). Slika 16B, ilustruje uticaj BF faktora, na klasifikaciju biljnih vrsta (Slika 16C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2130 (Slika 16D), HCA analiza je podelila biljke na dve grupe (A i B). Grupa A, biljne vrste sa područija Kravlja i Sićevačke klisure {T. glabrescens (1*) i S. kitaibelii (4*-8*)}, pokazale su značajnu tolerantnost na Fe i Zn u odnosu na ostale biljne vrste (Slika 16B, C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥423 (Slika 16D), HCA analiza je podelila grupu B na dve podgrupe (B1 i B2). Biljne vrste podgrupe B1 {T. pulegioides (2*), N. nuda (3*), P. longifolium (13*), P. officinale (14*) i I. graveolens (16*)} odlikovale su se izraženom tolerancijom na K, Mg i Cu (Slika 16B, C). Bitno je naglasiti da su sve biljne vrste u većoj ili manjoj meri tolerantne na prethodno navedene metale (Tabela 8). Visoke koncentracije Na, Ca i Mn karbonatne frakcije uticale su na smanjenu tolerantnost biljaka (BF <1), što se može manifestovati njihovom toksičnošću (Kabata-Pendias, 2010; Borer et al., 2012; Hasegawa 2013). Biljne vrste podgrupe B2 pokazale su jedan vid tolerancije u odnosu na ispitane metale. I pored niže tolerancije biljaka na Na, Ca i Mn, treba naglasiti da štetan uticaj ovih metala nije uočen prilikom njihovog sakupljanja i determinacije. Na osnovu kompletne hemijske, minerološke i hemometrijske analize zemljišta i odabranih biljnih vrsta možemo uočiti: a) sadržaj analiziranih metala u biljnim vrstama je uslovljen kombinovanim uticajem genetskih faktora i mineroloških/hemijskih karakteristika zemljišta, b) ispitani elementi biljnih vrsta se nalaze u okviru graničnih koncentracija lekovitog bilja, c) sadržaj određivanih metala u analiziranim zemljištima se nalazi u okviru njihovih uobičajenih koncentracija u Zemljinoj kori, d) snažan uticaj karbonatne frakcije na biodostupnost analiziranih metala zemljišta, e) obogaćenje zemljišta pojedinim elementima i identifikaciju   Tabela 8. Biokoncentracioni faktor elemenata (BF) ispitanih biljnih vrsta. Zemljište Br. Biljka Na K Mg Ca Mn Fe Cu Zn Kravlje 1* T. glabrescens 0.17 31.38 3.64 0.11 0.10 42.52 415.89 2116.83 Suva Planina 2* T. pulegioides 0.62 105.87 16.17 2.56 0.07 40.76 367.10 43.20 3* N. nuda 0.15 117.45 5.87 1.86 0.14 12.90 425.37 26.86 Sićevačka klisura 4* S. kitaibelii (12.5.2011. god.) 0.56 29.87 3.88 0.14 0.08 37.84 351.55 1815.65 5* S. kitaibelii (17.7.2011. god.) 0.59 20.93 3.76 0.15 0.07 16.16 259.70 1140.72 6* S. kitaibelii (14.8.2011. god.) 0.24 20.50 4.04 0.16 0.09 17.81 276.00 1556.35 7* S. kitaibelii (28.9.2011. god.) 0.47 16.51 5.12 0.22 0.09 30.14 225.25 1608.06 8* S. kitaibelii (02.11.2011. god.) 1.07 16.78 4.94 0.20 0.09 33.64 239.19 1496.28 Vidlič 9* L. montana (list) 0.52 34.42 4.32 1.01 0.12 16.47 100.51 10.20 10* L. montana (cvet) 0.89 37.01 4.26 1.06 0.12 28.26 110.24 11.02 11* L. montana (plod) 0.93 36.47 4.72 1.07 0.10 31.08 82.78 11.28 Rtanj 12* P. longifolium (list) 0.28 31.33 5.10 0.51 0.16 5.05 180.03 39.21 13* P. longifolium (cvet) 0.70 58.63 7.96 0.25 0.12 8.24 492.75 65.89 Stara Planina 14* P. officinale 0.08 75.16 12.73 13.38 4.76 2.22 410.39 34.65 15* I. graveolens (list) 4.83 113.28 13.19 14.06 11.05 4.99 249.01 36.06 16* I. graveolens (cvet) 1.67 90.72 12.78 9.04 9.32 2.39 499.78 42.48    Slika 16. Hemometrijska analiza biljnih vrsta zasnovana na BF faktoru: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih BF faktora metala; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih biljaka; (D) dendrogram HCA analize. odgovornih minerala XRD analizom, f) korelaciju pojedinih hemijskih parametara zemljišta (pH, Eh, CEC, EC, organska materija), g) dostupnost redukovanih oblika elemenata biljci (Eh-pH dijagrami), h) akumulaciju metala u pojedinim biljnim vrstama i i) tolerantnost pojedinih biljaka prema metalima. Analiza sadržaja metala u biljnom materijalu i kompletna geohemijska analiza zemljišta je potvrda da ispitane biljne vrste mogu biti značajne za ljudsku ishranu kao izvor neophodnih elemenata važnih za optimalno funkcionisanje ljudskog organizma na biohemijskom nivou. 4.5. Etarska ulja 4.5.1. Hemijski sastav etarskog ulja T. pulegioides Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste T. pulegioides, prinos etarskog ulja iznosio je 0.87%, što je u saglasnosti sa literaturnim podacima (European Pharmacopoeia, 2008). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 38 komponenata, koje predstavljaju 97.29% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 9). Komponente etarskog ulja 65   Tabela 9. Hemijski sastav etarskog ulja T. pulegioides. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc T. pulegioides (%) Monoterpenski ugljovodonici 0.64 α-Pinen 8.395 932.0 932.0 0.05 Kamfen 8.949 946.0 948.3 0.12 Mircen 10.314 988.0 988.8 0.22 Limonen 11.727 1024.0 1028.6 0.03 β-cis-Ocimen 11.977 1032.0 1035.5 0.08 β-trans-Ocimen 12.356 1044.0 1045.9 0.11 γ-Terpinen 12.775 1054.0 1057.5 0.03 Oksidovani monoterpeni 84.51 cis-Sabinen hidrat 13.241 1065.0 1070.3 0.07 trans-Linalool oksid 13.830 1084.0 1086.5 0.05 Linalool 14.349 1095.0 1100.7 1.91 Kamfor 16.039 1141.0 1147.6 0.15 Borneol 16.955 1165.0 1173.0 0.58 Nerol 18.872 1227.0 1227.1 5.18 Neral 19.277 1235.0 1238.8 0.56 Geraniol 20.102 1249.0 1262.6 66.59 Geranial 20.469 1264.0 1273.1 0.80 Bornil acetat 20.965 1287.0 1287.4 0.04 Neril acetat 23.356 1359.0 1359.0 0.11 Geranil acetat 24.105 1379.0 1381.6 8.47 Seskviterpenski ugljovodonici 9.60 δ-Elemen 22.483 1335.0 1332.6 0.06 β-Burbonen 24.198 1387.0 1384.4 0.41 β-Kariofilen 25.387 1417.0 1421.4 3.62 α-trans-Bergamoten 25.754 1432.0 1433.1 0.03 β-trans-Farnezen 26.371 1454.0 1452.7 0.05 α-Humulen 26.477 1452.0 1456.1 0.21 Alloaromadendren 26.605 1458.0 1460.2 0.07 Germakren D 27.277 1484.0 1481.6 1.20 Biciklogermakren 27.710 1500.0 1495.4 0.32 β-Bisabolen 28.120 1505.0 1508.9 3.45 δ-Kadinen 28.391 1522.0 1518.1 0.11 β-Seskvifelandren 28.559 1521.0 1523.7 0.07 Oksidovani seskviterpeni 0.93 Spatulenol 30.137 1577.0 1576.9 0.14 Kariofilen oksid 30.304 1582.0 1582.5 0.66 α-Kadinol 32.386 1652.0 1655.4 0.13 Fenolna jedinjenja 0.21 Timol 21.163 1289.0 1293.1 0.10 Karvakrol 21.436 1298.0 1301.0 0.11     66  67 Tabela 9. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc T. pulegioides (%) Ostala jedinjenja 1.40 1-Okten-3-ol 10.000 974.0 979.6 0.39 3-Oktanol 10.610 988.0 997.6 1.01 Ukupno 97.29 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. T. pulegioides možemo podeliti na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Oksidovani monoterpeni predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja etarskog ulja T. pulegioides (84.51%), sa dominantnim sadržajem geraniola (66.59%), geranil acetata (8.47%) i nerola (5.18%). Seskviterpenski ugljovodonici (9.60%), odlikovali su se višim sadržajem β-kariofilena (3.62%) i β-bisabolena (3.45%). Etarsko ulje T. pulegioides iz Srbije pripada hemotipu geraniol/geranil acetat (Sárosi et al., 2012). Hemijski polimorfizam etarskih ulja jeste bitna karakteristika roda Thymus. Poznato je da pored genetske predispozicije biljne vrste i sami uslovi sredine mogu uticati na različiti hemijski sastav etarskog ulja. Pokazano je da su fenolna jedinjenja karakteristika ulja biljaka koje rastu u toplim i suvim klimatskim zonama, dok je sadržaj fenolnih jedinjenja znatno niži kod biljka u hladnim i kišnim područijima (Ložiené et al., 2008). U Mađarskoj, opisano je šest hemotipova etarskog ulja T. pulegioides: karvakrol/timol, karvakrol/timol/metiletar/γ- terpinen, geranial/linalil-acetat/neral/linalool, p-cimen/spatulenol/geraniol, β- kariofilen/timol/germakren D, germakren D/β-kariofilen/α,β-farnezen/spatulenol (Pluhár et al., 2012). Ovakva hemijska različitost etarskih ulja iste biljne vrste, svakako će doprineti njihovoj drugačijoj biološkoj aktivnosti. 4.5.2. Hemijski sastav etarskog ulja T. glabrescens Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste T. glabrescens, prinos etarskog ulja iznosio je 0.59%, što je u saglasnosti sa podacima farmakopeje (European Pharmacopoeia, 2008). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 56 komponenata, koje predstavljaju 97.76% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 10). Komponente etarskog ulja T. glabrescens, slično ulju T. pulegioides, možemo podeliti na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Oksidovani monoterpeni predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja etarskog ulja T. glabrescens (57.14%), sa dominantnim sadržajem geraniola (22.33%), geranil acetata (19.38%) i linaloola (5.49%).  Tabela 10. Hemijski sastav etarskog ulja T. glabrescens. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc T. glabrescens (%) Monoterpenski ugljovodonici 11.07 α-Tujen 8.161 924.0 925.0 0.33 α-Pinen 8.400 932.0 932.1 0.29 Kamfen 8.951 946.0 948.4 0.15 Sabinen 9.734 969.0 971.6 0.09 β-Pinen 9.897 974.0 976.5 0.10 Mircen 10.320 988.0 989.0 0.59 α-Felandren 10.909 1002.0 1006.1 0.10 3-Karen 10.984 1008.0 1007.9 0.03 α-Terpinen 11.294 1014.0 1016.6 0.60 p-Cimen 11.620 1020.0 1025.6 4.73 Limonen 11.751 1024.0 1029.2 0.81 β-cis-Ocimen 11.980 1032.0 1035.6 0.15 β-trans-Ocimen 12.362 1044.0 1046.1 0.18 γ-Terpinen 12.822 1054.0 1058.7 2.75 Terpinolen 13.767 1086.0 1084.8 0.17 Oksidovani monoterpeni 57.14 Eukaliptol 11.861 1026.0 1032.3 0.56 trans-Linalool oksid 13.828 1084.0 1086.5 0.03 Linalool 14.437 1095.0 1103.2 5.49 α-Tujon 14.603 1101.0 1107.8 0.38 cis-p-Menta-2,8-dienol 15.697 1133.0 1138.4 0.01 Borneol 16.956 1165.0 1173.0 0.47 4-Terpineol 17.249 1174.0 1181.1 0.47 α-Terpineol 17.790 1186.0 1196.1 0.79 trans-Dihidrokarvon 18.088 1200.0 1204.5 0.02 Nerol 18.842 1227.0 1226.3 1.18 Izobornil formijat 18.990 1235.0 1230.5 2.87 Neral 19.311 1235.0 1239.8 2.25 Geraniol 19.936 1249.0 1257.8 22.33 Geranial 20.396 1264.0 1271.0 0.50 Bornil acetat 20.924 1287.0 1286.3 0.20 Neril acetat 23.364 1359.0 1359.2 0.21 Geranil acetat 24.244 1379.0 1385.8 19.38 Seskviterpenski ugljovodonici 14.56 α-Kubeben 23.065 1345.0 1350.2 5.51 α-Kopaen 23.927 1374.0 1376.2 0.03 β-Elemen 24.409 1389.0 1390.7 0.09 β-Kariofilen 25.384 1417.0 1421.3 1.04 α-trans-Bergamoten 25.770 1432.0 1433.6 0.05 Aromadendren 25.952 1439.0 1439.4 0.12 β-trans-Farnezen 26.376 1454.0 1452.9 0.22 α-Humulen 26.487 1452.0 1456.4 0.13 68  69 Tabela 10. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc T. glabrescens (%) γ-Muurolen 27.083 1478.0 1475.4 0.16 Germakren D 27.302 1484.0 1482.4 1.57 β-Selinen 27.567 1489.0 1490.8 0.14 Biciklogermakren 27.734 1500.0 1496.2 1.01 β-Bisabolen 28.153 1505.0 1510.0 4.08 γ-Kadinen 28.258 1513.0 1513.6 0.11 δ-Kadinen 28.410 1522.0 1518.7 0.21 β-Seskvifelandren 28.563 1521.0 1523.9 0.09 Oksidovani seskviterpeni 0.37 Spatulenol 30.140 1577.0 1577.0 0.29 Kariofilen oksid 30.300 1582.0 1582.3 0.08 Fenolna jedinjenja 14.00 Timol 21.350 1289.0 1298.6 13.79 Karvakrol 21.499 1298.0 1303.0 0.19 Eugenol 23.155 1356.0 1352.9 0.02 Ostala jedinjenja 0.62 trans-2-Heksenal 5.987 846.0 850.2 0.03 1-Okten-3-ol 10.010 974.0 979.8 0.45 3-Oktanol 10.596 988.0 997.2 0.14 Ukupno 97.76 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. Seskviterpenski ugljovodonici (14.56%), odlikovali su se višim sadržajem α-kubebena (5.51%) i β-bisabolena (4.08%). Za razliku od ulja T. pulegioides, sadržaj fenolnih jedinjenja i procenat timola (13.79%) u ispitanom ulju je znatno viši. Etarsko ulje T. glabrescens iz jugoistočne Srbije pripada hemotipu geraniol/geranil acetat/timol (Simkó et al., 2013). Kao što je već naglašeno, hemijski polimorfizam etarskih ulja roda Thymus je vrlo izražen. 4.5.3. Hemijski sastav etarskog ulja S. kitaibelii Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste S. kitaibelii, prinos etarskog ulja iznosio je 0.55%, što je u saglasnosti sa literaturnim podacima (Slavkovska et al., 2001). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 52 komponente, koje predstavljaju 97.65% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 11). U cilju hemometrijske analize ulja na osnovu hemijskog sastava, komponente S. kitaibelii ulja možemo podeliti na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Oksidovani monoterpeni predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja etarskog ulja S. kitaibelii (59.76%), sa dominantnim sadržajem geraniola (50.43%). Seskviterpenski ugljovodonici (26.61%), odlikovali su se visokim sadržajem germakrena D (12.22%) i β-kariofilena (6.52%).  Tabela 11. Hemijski sastav etarskog ulja S. kitaibelii. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc S. kitaibelii (%) Monoterpenski ugljovodonici 9.31 α-Tujen 8.157 924.0 924.9 0.02 α-Pinen 8.398 932.0 932.0 0.26 Kamfen 8.950 946.0 948.4 0.06 Sabinen 9.731 969.0 971.5 0.03 β-Pinen 9.895 974.0 976.4 0.03 Mircen 10.315 988.0 988.9 0.38 α-Felandren 10.904 1002.0 1005.9 0.08 α-Terpinen 11.284 1014.0 1016.4 0.14 p-Cimen 11.567 1020.0 1024.2 0.19 Limonen 11.756 1024.0 1029.4 2.75 β-cis-Ocimen 12.008 1032.0 1036.3 2.56 β-trans-Ocimen 12.378 1044.0 1046.5 1.61 γ-Terpinen 12.792 1054.0 1057.9 0.88 Terpinolen 13.759 1086.0 1084.5 0.06 p-Cimenen 14.001 1089.0 1091.2 0.03 Allocimen 15.318 1128.0 1127.7 0.23 Oksidovani monoterpeni 59.76 Eukaliptol 11.852 1026.0 1032.0 0.11 cis-Sabinen hidrat 13.246 1065.0 1070.4 0.64 Linalool 14.359 1095.0 1101.1 1.99 Borneol 16.955 1165.0 1173.0 0.52 4-Terpineol 17.249 1174.0 1181.1 0.71 α-Terpineol 17.771 1186.0 1195.6 0.13 Nerol 18.848 1227.0 1226.4 2.60 Neral 19.293 1235.0 1239.3 1.05 Geraniol 19.939 1249.0 1257.9 50.43 Geranial 20.482 1264.0 1273.5 1.47 Geranil acetat 24.004 1379.0 1378.5 0.11 Seskviterpenski ugljovodonici 26.61 δ-Elemen 22.487 1335.0 1332.8 0.49 α-Kubeben 22.972 1345.0 1347.4 0.03 α-Kopaen 23.926 1374.0 1376.2 0.43 β-Burbonen 24.197 1387.0 1384.4 0.77 β-Elemen 24.377 1389.0 1389.9 0.87 β-Kariofilen 25.420 1417.0 1422.4 6.52 β-trans-Farnezen 26.325 1454.0 1451.3 0.10 α-Humulen 26.474 1452.0 1456.0 0.24 Alloaromadendren 26.606 1458.0 1460.2 0.06 γ-Muurolen 27.131 1478.0 1477.0 0.16 Germakren D 27.393 1484.0 1485.3 12.22 β-Selinen 27.563 1489.0 1490.7 0.07 Biciklogermakren 27.767 1500.0 1497.2 2.99 70  Tabela 11. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc S. kitaibelii (%) β-Bisabolen 28.095 1505.0 1508.1 1.20 γ-Kadinen 28.241 1513.0 1513.0 0.09 δ-Kadinen 28.393 1522.0 1518.1 0.37 Oksidovani seskviterpeni 0.95 Spatulenol 30.145 1577.0 1577.1 0.49 Kariofilen oksid 30.305 1582.0 1582.5 0.26 α-Kadinol 32.384 1652.0 1655.3 0.20 Fenolna jedinjenja 0.59 Timol 21.160 1289.0 1293.1 0.54 Karvakrol 21.422 1298.0 1300.6 0.05 Ostala jedinjenja 0.43 trans-2-Heksenal 5.983 846.0 850.0 0.04 1-Okten-3-ol 9.998 974.0 979.4 0.30 6-Metil-5-hepten-2-on 10.144 981.0 983.8 0.05 3-Oktanol 10.589 988.0 997.0 0.04 Ukupno 97.65 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. Poznato je da pored genetske predispozicije biljne vrste i sami uslovi sredine mogu uticati na različiti hemijski sastav etarskog ulja roda Satureja (Lakušić et al., 2011). Glavna komponente etarskog ulja S. kitaibelli sa područija istočne Srbije je p-cimen (Chalchat et al., 1999; Kundaković et al., 2011). Dominantan sadržaj limonena uočen je u studiji Mihajilov- Krstev et al. (2011), dok su istraživanja (Palić & Gašić, 1993; Miladinović, 2005) upućivala na visok sadržaj geraniola u etarskom ulju. 4.5.4. Hemijski sastav etarskog ulja N. nuda Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste N. nuda, prinos etarskog ulja iznosio je 0.62%, što je u saglasnosti sa literaturnim podacima (Mancini et al., 2009; Gkinis et al., 2010). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 57 komponenata, koje predstavljaju 92.63% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 12). U cilju hemometrijske analize ulja na osnovu hemijskog sastava, komponente N. nuda ulja možemo podeliti na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenjaOksidovani monoterpeni predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja etarskog ulja N. nuda (57.77%), sa dominantnim sadržajem eukaliptola (45.96%). U okviru ove grupe identifikovan je 4aα,7α,7aα-nepetalakton (4.33%) i 4aα,7β,7aα-nepetalakton (0.48%). Seskviterpenski ugljovodonici (20.46%), odlikovali su se dominantnim sadržajem germakrena D (6.82%). 71  Tabela 12. Hemijski sastav etarskog ulja N. nuda. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc N. nuda (%) Monoterpenski ugljovodonici 8.62 α-Tujen 8.159 924.0 924.9 0.02 α-Pinen 8.408 932.0 932.3 1.36 Kamfen 8.954 946.0 948.5 0.03 Sabinen 9.755 969.0 972.3 1.74 β-Pinen 9.940 974.0 977.8 4.04 Mircen 10.328 988.0 989.2 0.84 α-Terpinen 11.310 1014.0 1017.3 0.10 β-trans-Ocimen 12.375 1044.0 1046.4 0.21 γ-Terpinen 12.795 1054.0 1057.9 0.20 Terpinolen 13.765 1086.0 1084.7 0.08 Oksidovani monoterpeni 57.77 Eukaliptol 11.873 1026.0 1026.3 45.96 cis-Sabinen hidrat 13.250 1065.0 1070.5 0.59 α-Kamfolenal 15.285 1122.0 1126.7 0.07 Nopinon 15.710 1135.0 1138.5 0.09 trans-Pinokarveol 15.798 1135.0 1141.0 0.23 Citronelal 16.207 1148.0 1152.2 0.07 Sabina keton 16.396 1154.0 1157.5 0.03 α-Felandren-8-ol 16.903 1166.0 1171.6 1.38 4-Terpineol 17.244 1174.0 1180.9 0.47 α-Terpineol 17.765 1186.0 1195.4 3.44 trans-Dihidrokarvon 17.949 1200.0 1200.5 0.23 trans-Karveol 18.572 1215.0 1218.5 0.06 Nerol 18.843 1227.0 1226.3 0.05 Neral 19.251 1235.0 1238.1 0.11 Geraniol 19.658 1249.0 1250.0 0.04 Geranial 20.275 1264.0 1267.5 0.14 4aα,7α,7aα-Nepetalakton 23.531 1357.0 1364.3 4.33 4aα,7β,7aα-Nepetalakton 24.625 1391.0 1397.2 0.48 Seskviterpenski ugljovodonici 20.46 α-Kopaen 23.917 1374.0 1375.9 0.22 β-Burbonen 24.204 1387.0 1384.6 2.38 β-Elemen 24.363 1389.0 1389.4 0.64 α-Gurjunen 24.927 1409.0 1406.7 0.10 β-Kariofilen 25.387 1417.0 1421.4 4.76 γ-Elemen 25.653 1434.0 1429.9 0.32 β-trans-Farnezen 26.402 1454.0 1453.7 2.16 α-Humulen 26.479 1452.0 1456.2 1.04 Alloaromadendren 26.598 1458.0 1460.1 0.03 Germakren D 27.334 1484.0 1483.4 6.82 β-Selinen 27.604 1489.0 1492.0 0.03 Biciklogermakren 27.706 1500.0 1495.3 0.18 72  73 Tabela 12. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc N. nuda (%) α-Selinen 27.800 1498.0 1498.2 0.08 α-trans-Farnezen 27.959 1505.0 1503.5 0.11 β-Bisabolen 28.079 1505.0 1507.5 0.67 γ-Kadinen 28.227 1513.0 1512.5 0.04 δ-Kadinen 28.376 1522.0 1517.5 0.31 β-Seskvifelandren 28.557 1521.0 1523.6 0.57 Oksidovani seskviterpeni 5.16 Hedikariol 29.391 1546.0 1551.7 0.29 Kariofilenil alkohol 29.944 1570.0 1570.4 0.04 Spatulenol 30.170 1577.0 1578.0 0.36 Kariofilen oksid 30.352 1582.0 1584.1 3.97 Ledol 30.945 1602.0 1604.3 0.17 α-Kadinol 32.384 1652.0 1655.3 0.33 Fenolna jedinjenja 0.02 Metil salicilat 17.616 1190.0 1191.1 0.02 Ostala jedinjenja 0.60 trans-2-Heksenal 6.045 846.0 852.4 0.05 1-Okten-3-ol 10.149 974.0 983.9 0.47 n-Trikozan 48.047 2300.0 2299.6 0.03 n-Pentakozan 52.090 2500.0 2499.6 0.05 Ukupno 92.63 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. 4.5.5. Hemijski sastav etarskog ulja L. montana Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste L. montana, prinos etarskog ulja iznosio je 0.67%. Prinos etarskog ulja je nešto viši u odnosu na prinos etarskog ulja Seseli libanotis iz Turske (0.35%) i Irana (0.13%) (Ozturk & Ercisli, 2006; Masoudi et al., 2006). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 50 komponenata, koje predstavljaju 93.84% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 13). U cilju hemometrijske analize ulja na osnovu hemijskog sastava, komponente L. montana ulja možemo podeliti na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Za razliku od prethodno diskutovanih ulja, seskviterpenski ugljovodonici predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja (67.30%), sa dominantnim sadržajem β-elemena (40.43%). Oksidovani seskviterpeni (12.29%), predstavljaju drugu najzastupljeniju grupu jedinjenja, i odlikuju se dominantnim sadržajem α-bisabolola (6.60%). Za razliku od naših ispitivanja (Miladinović et al., 2014), glavne komponente etarskih ulja S. libanotis iz Turske i Irana su trans-kariofilen (20.39%) i akorenon (35.50%) (Ozturk & Ercisli, 2006; Masoudi et al., 2006).  Tabela 13. Hemijski sastav etarskog ulja L. montana. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc L. montana (%) Monoterpenski ugljovodonici 10.95 α-Pinen 8.428 932.0 932.9 4.16 Kamfen 8.959 946.0 948.6 0.64 Sabinen 9.736 969.0 971.7 0.12 β-Pinen 9.943 974.0 977.8 0.92 trans-Izolimonen 10.214 980.0 985.9 0.05 Mircen 10.318 988.0 988.9 0.31 α-Felandren 10.929 1002.0 1006.6 2.17 p-Cimen 11.576 1020.0 1024.4 0.92 Limonen 11.748 1024.0 1029.1 1.34 β-trans-Ocimen 12.357 1044.0 1045.9 0.19 Terpinolen 13.765 1086.0 1084.7 0.13 Oksidovani monoterpeni 1.67 Eukaliptol 11.803 1026.0 1030.7 0.58 Linalool 14.328 1095.0 1100.2 0.62 4-Terpineol 17.246 1174.0 1181.0 0.05 α-Terpineol 17.769 1186.0 1195.5 0.13 Karvon 19.459 1239.0 1244.0 0.02 Piperiton 19.814 1249.0 1254.3 0.02 Bornil acetat 20.869 1287.0 1284.7 0.25 Seskviterpenski ugljovodonici 67.30 δ-Elemen 22.573 1335.0 1335.3 0.29 α-Kubeben 22.967 1345.0 1347.2 0.04 α-Kopaen 23.924 1374.0 1376.1 0.23 β-Elemen 24.611 1389.0 1396.8 40.43 α-Kedren 25.284 1410.0 1418.0 0.06 β-Kariofilen 25.432 1417.0 1422.8 6.46 α-trans-Bergamoten 25.764 1432.0 1433.3 0.02 α-Gvajen 25.835 1437.0 1435.7 0.11 Aromadendren 26.006 1439.0 1441.1 0.11 Sejšelin 26.286 1444.0 1450.0 0.22 β-cis-Farnezen 26.413 1440.0 1454.1 3.01 α-Humulen 26.519 1452.0 1457.5 2.56 γ-Muurolen 27.041 1478.0 1474.0 0.62 Germakren D 27.321 1484.0 1483.0 3.52 β-Selinen 27.562 1489.0 1490.7 1.97 α-Selinen 27.759 1498.0 1497.0 1.72 β-trans-Gvajen 27.922 1502.0 1502.3 0.44 β-Bisabolen 28.127 1505.0 1509.1 2.59 γ-Kadinen 28.251 1513.0 1513.3 0.12 δ-Kadinen 28.397 1522.0 1518.3 0.67 β-Seskvifelandren 28.565 1521.0 1523.9 0.93 Germakren B 29.631 1559.0 1559.9 1.18 74  75 Tabela 13. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc L. montana (%) Oksidovani seskviterpeni 12.29 Elemol 29.307 1548.0 1548.9 1.58 Spatulenol 30.177 1577.0 1578.2 0.88 Kariofilen oksid 30.347 1582.0 1583.9 2.80 α-Kadinol 32.408 1652.0 1656.2 0.43 α-Bisabolol 33.398 1685.0 1691.2 6.60 Fenolna jedinjenja 1.10 p-Krezol 13.373 1071.0 1073.9 1.10 Ostala jedinjenja 0.53 6-Metil-5-hepten-2-on 10.149 981.0 983.9 0.06 p-Metil anizol 11.359 1015.0 1018.4 0.06 Metil eugenol 24.708 1403.0 1399.8 0.19 Palmitinska kiselina 40.374 1959.0 1961.0 0.22 Ukupno 93.84 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. 4.5.6. Hemijski sastav etarskog ulja P. longifolium Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste P. longifolium, prinos etarskog ulja iznosio je 0.31%, što je u saglasnosti sa literaturnim podacima (Tepe et al., 2011). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 59 komponenata, koje predstavljaju 95.40% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 14). U cilju hemometrijske analize ulja na osnovu hemijskog sastava, komponente P. longifolium ulja smo podelili na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Za razliku od prethodno diskutovanih ulja, monoterpenski ugljovodonici predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja (61.60%), i odlikuju se dominantnim sadržajem mircena (15.88%), α- felandrena (11.28%), limonena (8.23%), sabinena (6.56%) i p-cimena (5.92%). Seskviterpenski ugljovodonici (15.51%), predstavljaju drugu najzastupljeniju grupu i odlikuju se višim sadržajem germakrena D (3.59%). U okviru oksidovanih monoterpena (14.37%) uočen je dominantan sadržaj cis-sabinen hidrata (7.27%). Hemijski sastav ispitanog ulja je vrlo sličan hemijskom sastavu P. longifolium ulja iz Orjena u Crnoj Gori (Kapetanos et al., 2008). Oba ulja akumuliraju monoterpenske ugljovodonike kao glavna jedinjenja. Za razlika od mircena, α-pinen je dominantna komponenta etarskog ulja iz Crne Gore.  Tabela 14. Hemijski sastav etarskog ulja P. longifolium. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc P. longifolium (%) Monoterpenski ugljovodonici 61.60 α-Tujen 8.169 924.0 925.2 1.93 α-Pinen 8.409 932.0 932.3 1.80 Kamfen 8.955 946.0 948.6 0.35 Sabinen 9.786 969.0 973.2 6.56 β-Pinen 9.933 974.0 977.6 2.11 Mircen 10.461 988.0 993.2 15.88 α-Felandren 11.014 1002.0 1008.9 11.28 3-Karen 11.050 1008.0 1009.9 0.43 α-Terpinen 11.307 1014.0 1017.0 0.24 p-Cimen 11.637 1020.0 1026.1 5.92 Limonen 11.837 1024.0 1031.6 8.23 β-Felandren 11.885 1025.0 1032.9 3.44 β-cis-Ocimen 11.996 1032.0 1036.0 0.72 β-trans-Ocimen 12.385 1044.0 1046.7 1.74 γ-Terpinen 12.794 1054.0 1058.0 0.66 Terpinolen 13.776 1086.0 1085.0 0.22 Allocimen 15.318 1128.0 1127.7 0.09 Oksidovani monoterpeni 14.37 cis-Sabinen hidrat 13.361 1065.0 1073.6 7.27 trans-Linalool oksid 13.901 1084.0 1088.4 3.36 Perilen 14.254 1102.0 1098.2 0.25 Linalool 14.321 1095.0 1100.0 0.56 β-Tujon 14.963 1112.0 1117.8 0.06 trans-Pinokarveol 15.799 1135.0 1141.0 0.12 α-Felandren-8-ol 16.918 1166.0 1171.9 0.06 Izomentol 17.175 1179.0 1179.0 0.04 4-Terpineol 17.252 1174.0 1181.2 0.85 Mirtenol 17.636 1194.0 1191.8 0.04 trans-Dihidrokarvon 18.072 1200.0 1204.0 1.16 trans-Piperitol 18.237 1207.0 1208.8 0.10 trans-Karveol 18.581 1215.0 1218.7 0.09 Neral 19.246 1235.0 1237.8 0.02 Kuminil aldehid 19.413 1238.0 1242.7 0.07 Karvon 19.453 1239.0 1243.9 0.06 Geranial 20.268 1264.0 1267.3 0.02 Perila aldehid 20.559 1269.0 1275.8 0.18 Bornil acetat 20.859 1287.0 1284.4 0.06 Seskviterpenski ugljovodonici 15.51 α-Kopaen 23.905 1374.0 1375.5 0.13 β-Burbonen 24.171 1387.0 1383.6 0.09 β-Elemen 24.373 1389.0 1389.7 1.77 β-Kariofilen 25.345 1417.0 1420.0 1.30 76  77 Tabela 14. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc P. longifolium (%) γ-Elemen 25.629 1434.0 1429.1 0.55 β-trans-Farnezen 26.374 1454.0 1452.8 0.34 α-Humulen 26.497 1452.0 1456.7 2.64 Alloaromadendren 26.602 1458.0 1460.1 0.07 γ-Muurolen 27.083 1478.0 1475.4 0.34 Germakren D 27.304 1484.0 1482.4 3.59 β-Selinen 27.552 1489.0 1490.3 2.51 α-Selinen 27.740 1498.0 1496.4 1.43 γ-Kadinen 28.226 1513.0 1512.4 0.04 δ-Kadinen 28.374 1522.0 1517.5 0.31 Germakren B 29.606 1559.0 1559.0 0.40 Oksidovani seskviterpeni 3.55 Spatulenol 30.177 1577.0 1578.2 1.89 Kariofilen oksid 30.318 1582.0 1583.0 1.35 α-Kadinol 32.385 1652.0 1655.3 0.31 Fenolna jedinjenja 0.32 Timol 21.049 1289.0 1289.8 0.07 Karvakrol 21.329 1298.0 1297.9 0.25 Ostala jedinjenja 0.05 Heksanal 4.683 801.0 801.4 0.02 trans-2-Heksenal 5.988 846.0 850.2 0.01 n-Trikozan 48.054 2300.0 2300.1 0.02 Ukupno 95.40 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. 4.5.7. Hemijski sastav etarskog ulja P. officinale Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste P. officinale, prinos etarskog ulja iznosio je 0.68%, što je u saglasnosti sa literaturnim podacima (Figuérédo et al., 2009). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 45 komponenata, koje predstavljaju 94.31% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 15). U cilju hemometrijske analize ulja na osnovu hemijskog sastava, komponente P. officinale ulja smo podelili na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Slično ulju P. longifolium, monoterpenski ugljovodonici predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja (62.36%), i odlikuju se dominantnim sadržajem α-felandrena (16.60%), limonena (13.75%), mircena (8.75%) i p-cimena (6.72%). Seskviterpenski ugljovodonici (23.89%), predstavljaju drugu najzastupljeniju grupu jedinjenja i odlikuju se dominantnim sadržajem β-elemena (10.83%). Hemijski sastav ispitanog ulja je vrlo sličan etarskom ulju P. officinale sa  Tabela 15. Hemijski sastav etarskog ulja P. officinale. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc P. officinale (%) Monoterpenski ugljovodonici 62.36 α-Tujen 8.167 924.0 925.2 0.77 α-Pinen 8.420 932.0 932.7 2.46 Kamfen 8.960 946.0 948.7 0.30 Sabinen 9.772 969.0 972.8 3.00 β-Pinen 9.960 974.0 978.4 4.43 Mircen 10.429 988.0 992.3 8.75 α-Felandren 11.063 1002.0 1010.3 16.60 α-Terpinen 11.321 1014.0 1017.4 0.15 p-Cimen 11.656 1020.0 1026.6 6.72 Limonen 11.902 1024.0 1033.4 13.75 β-Felandren 11.947 1025.0 1034.6 3.30 β-cis-Ocimen 12.004 1032.0 1036.2 0.19 β-trans-Ocimen 12.389 1044.0 1046.8 1.06 γ-Terpinen 12.798 1054.0 1058.1 0.28 Terpinolen 13.784 1086.0 1085.2 0.60 Oksidovani monoterpeni 7.34 cis-Sabinen hidrat 13.338 1065.0 1073.0 3.82 trans-Linalool oksid 13.883 1084.0 1087.9 1.73 Perilen 14.252 1102.0 1098.1 0.08 trans-Pinokarveol 15.796 1135.0 1140.9 0.09 Mentofuran 16.596 1159.0 1163.0 0.14 Izomentol 17.164 1179.0 1178.8 0.04 4-Terpineol 17.245 1174.0 1181.0 0.36 trans-Dihidrokarvon 18.072 1200.0 1204.0 0.88 trans-Karveol 18.585 1215.0 1218.8 0.06 Pulegon 19.257 1233.0 1238.2 0.05 Kuminil aldehid 19.422 1238.0 1243.0 0.03 Karvon 19.459 1239.0 1244.0 0.06 Seskviterpenski ugljovodonici 23.89 α-Kopaen 23.912 1374.0 1375.8 0.07 β-Elemen 24.483 1389.0 1393.0 10.83 β-Kariofilen 25.358 1417.0 1420.5 1.10 γ-Elemen 25.671 1434.0 1430.4 2.61 α-Gvajen 25.831 1437.0 1435.5 0.03 β-trans-Farnezen 26.374 1454.0 1452.8 0.07 α-Humulen 26.473 1452.0 1456.0 0.37 γ-Muurolen 27.017 1478.0 1473.3 0.20 Germakren D 27.291 1484.0 1482.1 1.81 β-Selinen 27.566 1489.0 1490.8 2.99 α-Selinen 27.743 1498.0 1496.4 1.02 β-Bisabolen 28.083 1505.0 1507.7 0.35 δ-Kadinen 28.377 1522.0 1517.6 0.10 78  79 Tabela 15. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc P. officinale (%) Germakren B 29.651 1559.0 1560.5 2.34 Oksidovani seskviterpeni 0.51 Spatulenol 30.131 1577.0 1576.6 0.19 Kariofilen oksid 30.295 1582.0 1582.2 0.32 Fenolna jedinjenja 0.18 Karvakrol 21.326 1298.0 1297.8 0.18 Ostala jedinjenja 0.03 Heksanal 4.686 801.0 801.6 0.03 Ukupno 94.31 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. područija severoistočnog Banata. Oba ulja akumuliraju monoterpenske ugljovodonike kao glavna jedinjenja i sadrže visok procenat α-felandrena, limonena i mircena (Figuérédo et al., 2009). 4.5.8. Hemijski sastav etarskog ulja I. graveolens Hidrodestilacijom nadzemnog dela biljne vrste I. graveolens, prinos etarskog ulja iznosio je 0.87%, što je znatno više u odnosu na literaturne podatke (Blanc et al., 2004). Na osnovu GC i GC/MS analize etarskog ulja, identifikovano je 49 komponenata, koje predstavljaju 93.11% ukupno detektovanih supstanci (Tabela 16). U cilju hemometrijske analize ulja na osnovu hemijskog sastava, komponente I. graveolens ulja smo podelili na šest grupa: 1) monoterpenski ugljovodonici, 2) oksidovani monoterpeni, 3) seskviterpenski ugljovodonici, 4) oksidovani seskviterpeni, 5) fenolna jedinjenja i 6) ostala jedinjenja. Slično etarskim uljima ispitanih vrsta familije Lamiaceae, oksidovani monoterpeni predstavljaju najzastupljeniju grupu jedinjenja (40.47%), i odlikuju se dominantnim sadržajem bornil acetata (21.66%) i borneola (18.66%). Oksidovani seskviterpeni (30.64%), predstavljaju drugu najzastupljeniju grupu jedinjenja i odlikuju se dominantnim sadržajem τ-kadinola (14.60%) i kariofilen oksida (9.58%). Za razliku od ovih ulja, uočen je visok procenat eukaliptola, bornil acetata, mircena i karvakrola u istraživanju Djenane et al. (2012). 4.5.9. Hemometrijska analiza hemijskog sastava ulja na osnovu grupa jedinjenja U cilju određivanja sličnog hemijskog sastava ulja i utvrđivanja veze hemijski sastav- antibakterijska aktivnost, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza ulja na osnovu dominantnih grupa jedinjenja (monoterpenski ugljovodonici, oksidovani monoterpeni, seskviterpenski ugljovodonici, oksidovani seskviterpeni, fenolna jedinjenja i ostale komponente). Prva istraživanja ovog tipa i procena sličnosti ulja na osnovu hemijskog sastava, objavljena su u studiji (Miladinović et al., 2012). Usled svojstvenih vrednosti  Tabela 16. Hemijski sastav etarskog ulja I. graveolens. Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc I. graveolens (%) Monoterpenski ugljovodonici 2.70 α-Pinen 8.407 932.0 932.3 1.24 Kamfen 8.951 946.0 948.4 0.03 Sabinen 9.734 969.0 971.6 0.30 β-Pinen 9.901 974.0 976.6 0.23 Mircen 10.312 988.0 988.8 0.31 α-Felandren 10.902 1002.0 1005.8 0.04 α-Terpinen 11.283 1014.0 1016.3 0.01 p-Cimen 11.558 1020.0 1023.9 0.02 Limonen 11.727 1024.0 1028.6 0.07 β-Felandren 11.779 1025.0 1030.0 0.01 β-trans-Ocimen 12.355 1044.0 1045.9 0.38 γ-Terpinen 12.778 1054.0 1057.5 0.04 Terpinolen 13.759 1086.0 1084.5 0.02 Oksidovani monoterpeni 40.47 Linalool 14.306 1095.0 1099.7 0.07 Borneol 16.956 1165.0 1173.1 18.66 4-Terpineol 17.231 1174.0 1180.6 0.08 Bornil acetat 20.869 1287.0 1284.7 21.66 Seskviterpenski ugljovodonici 18.08 δ-Elemen 22.457 1335.0 1331.9 0.08 β-Elemen 24.373 1389.0 1389.7 1.26 α-cis-Bergamoten 25.120 1411.0 1412.9 0.16 β-Kariofilen 25.345 1417.0 1420.0 0.79 γ-Elemen 25.628 1434.0 1429.1 0.24 α-trans-Bergamoten 25.743 1432.0 1432.7 0.20 Aromadendren 25.950 1439.0 1439.3 3.01 β-trans-Farnezen 26.401 1454.0 1453.7 2.61 α-Humulen 26.478 1452.0 1456.1 1.69 Alloaromadendren 26.605 1458.0 1460.1 0.33 Germakren D 27.285 1484.0 1481.8 2.18 β-Selinen 27.540 1489.0 1490.0 0.35 Biciklogermakren 27.723 1500.0 1495.8 0.62 β-Bisabolen 28.084 1505.0 1507.7 0.79 δ-Kadinen 28.386 1522.0 1518.0 2.88 β-Seskvifelandren 28.573 1521.0 1524.2 0.70 Germakren B 29.612 1559.0 1559.2 0.19 Oksidovani seskviterpeni 30.64 trans-Nerolidol 29.705 1561.0 1562.3 0.39 Kariofilen oksid 30.304 1582.0 1582.4 9.58 τ-Kadinol 31.884 1638.0 1637.6 14.60 α-Kadinol 32.401 1652.0 1655.9 3.25 α-Bisabolol 33.396 1685.0 1691.1 2.82 80  81 Tabela 16. (nastavak...) Identifikovana komponenta RTa (min) AILb AIEc I. graveolens (%) Fenolna jedinjenja 0.11 Benzil salicilat 38.090 1864.0 1869.0 0.11 Ostala jedinjenja 1.11 trans-2-Heksenal 5.983 846.0 850.1 0.09 cis-3-Heksenol 6.037 850.0 852.1 0.05 6-Metil-5-hepten-2-on 10.138 981.0 983.6 0.08 n-Dekan 10.697 1000.0 1000.2 0.02 Benzen acetaldehid 12.254 1036.0 1043.1 0.02 n-Nonanal 14.491 1100.0 1104.7 0.06 Decil acetat 24.996 1407.0 1408.9 0.24 cis-3-Heksenil benzoat 30.019 1565.0 1572.9 0.34 Benzil benzoat 35.454 1759.0 1767.7 0.21 Ukupno 93.11 a) RT = Retenciono vreme; b) AIL = Aritmetički (retencioni) indeks – literaturni podaci; c) AIE = Aritmetički (retencioni) indeks eksperimentalno određen na HP-5MS koloni. korelacionog matriksa i procenta grupa hemijskih jedinjenja (Tabele 9-16), PC1 svojstveni vektor objasnio je 43.83% varijanse ispitanih supstanci, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 27.62% (Slika 17A). Dijagram odgovornih grupa jedinjenja-varijabli (Slika 17B), ilustruje njihov uticaj na klasifikaciju posmatranih ulja (Slika 17C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥102 (Slika 17D), HCA analiza je identifikovala dve grupe ulja (A i B). Grupa A, sastavljena od P. longifolium, P. officinale i L. montana ulja, odlikovala se visokim sadržajem monoterpenskih i seskviterpenskih ugljovodonika i nižim sadržajem ostalih jedinjenja (Slika 17B, C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥74.1 (Slika 17D), HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (A1 i A2). P. longifolium i P. officinale ulja (podgrupa A1), odlikovala su se izuzetno visokim sadržajem monoterpenskih ugljovodonika i niskim sadržajem oksidovanih monoterpena i ostalih jedinjenja (Slika 17B, C). Podgrupa A2 (L. montana ulje), sadržala je najveću količinu seskviterpenskih ugljovodonika i vrlo nizak procenat oksidovanih monoterpena i ostalih jedinjenja (Slika 17B, C). Ostala ispitana ulja su svrstana u okviru grupe sa visokim sadržajem oksidovanih monoterpena, oksidovanih seskviterpena, fenolnih jedinjenja i ostalih jedinjenja (grupa B). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥53.8 (Slika 17D), HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). Podgrupa B1 (I. graveolens ulje), sadržala je najveću količinu oksidovanih seskviterpena i vrlo nizak procenat monoterpenskih ugljovodonika (Slika 17B, C). T. pulegioides, T. glabrescens, S. kitaibelii i N. nuda ulja (podgrupa B2), odlikovala su se izuzetno visokim sadržajem oksidovanih monoterpena i niskim sadržajem monoterpenskih ugljovodonika (Slika 17B, C).   Slika 17. Hemometrijska analiza hemijskog sastava etarskih ulja zasnovana na sadržaju dominantnih grupa jedinjenja: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih grupa jedinjenja; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih ulja; (D) dendrogram HCA analize. 4.5.10. Hemometrijska analiza ulja na osnovu svih hemijskih komponenata U cilju još temeljnije analize ulja i pronalaska komponenta koje bi mogle objasniti njihovu antibakterijsku sličnost, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza ulja na osnovu svih hemijskih jedinjenja. Kao što je u prethodnom poglavlju naglašeno, utvrđivanje odnosa hemijskog sastava etarskog ulja i njegove antibakterijske aktivnosti korišćenjem hemometrijskih metoda analize prvi put je započet a kasnije i proširen u istraživanjima Miladinović et al. (2012, 2013, 2014). Usled svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa i procenta svih hemijskih jedinjenja (Tabele 9-16), PC1 svojstveni vektor objasnio je 24.62% varijanse ispitanih supstanci, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 19.70% (Slika 18A). Dijagram odgovornih komponenata-varijabli (Slika 18B), ilustruje njihov uticaj na klasifikaciju posmatranih ulja (Slika 18C). Ovde treba naglasiti da su na Slici 18B, označene samo one komponente čiji je procenat u uljima iznad 5%, u cilju bolje preglednosti i uočavanja komponenti koje najviše doprinose varijansi. Na osnovu euklidske udaljenosti i 82     Slika 18. Hemometrijska analiza hemijskog sastava etarskih ulja zasnovana na sadržaju svih komponenata ulja: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih jedinjenja; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih ulja; (D) dendrogram HCA analize. sličnosti ≥43.3 (Slika 18D), HCA analiza je identifikovala šest grupa ulja (A, B, C, D, E i F). Na samom početku analize, vidimo da od 8 ispitanih ulja, postoje čak 6 grupa, koje se bitno razlikuju po sadržaju određenih komponenti. Grupa A, sastavljena od T. pulegioides i S. kitaibelii ulja, odlikovala se izrazito visokim sadržajem geraniola. Pored geraniola, sličnost je zapažena u sadržaju linaloola, nerola i β-kariofilena (Slika 18B, C). T. glabrescens, iako istog roda kao i T. pulegioides, svrstan je u okviru grupe B. Visok procenat timola (13.79%) i geranil acetata (19.38%), bio je osnovni uzrok njegovog podvajanja u odnosu na prethodno diskutovana ulja (Slika 18B, C). Grupa C, sastavljena od P. longifolium i P. officinale ulja, odlikovala se visokim sadržajem pojedinih monoterpena. Visok procenat α-felandrena, mircena, limonena, p-cimena, sabinena i cis-sabinen hidrata predstavlja karakteristiku ove grupe (Slika 18B, C). Jedino ispitano etarsko ulje familije Asteraceae, I. graveolens, svrstano 83  84 je u okviru grupe D. Visok procenat bornil acetata (21.66%), borneola (18.66%), τ-kadinola (14.60%) i kariofilen oksida (9.58%) bio je osnovni uzrok njegovog izdvajanja u odnosu na prethodno diskutovana ulja (Slika 18B, C). Usled izuzetno visokog sadržaja β-elemena (40.43%) i α-bisabolola (6.60%), etarsko ulje L. montana je svrstano u okviru grupe E. Hemometrijskom PCA i HCA analizom, etarsko ulje N. nuda je svrstano u okviru zasebne grupe (grupa F). Visok procenat eukaliptola (45.96%) bio je osnovni uzrok njegovog podvajanja u odnosu na prethodno diskutovana ulja (Slika 18B, C). Na osnovu ispitanih ulja rodova Thymus i Peucedanum, vidimo da biljne vrste u okviru istog roda mogu a i ne moraju imati sličan hemijski sastav. Kao što je već naglašeno, osim genetske predispozicije biljne vrste, edafski uslovi sredine i različita faza vegetacije mogu uticati na različiti hemijski sastav ulja. Ovo će biti još izraženije ukoliko se radi o biljnim vrstama različitih rodova ili različitih familija. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti etarskih ulja, zahteva sistematsku i detaljnu hemijsku analizu, primenom najsavremenijih metoda i tehnika. U cilju uočavanja i tumačenja odnosa između hemijskog sastava supstanci i njihovog biološkog efekta, hemometrijske i hemoinformatičke metode nesumnjivo zauzimaju značajno mesto (Miladinović et al., 2012; Ilić et al., 2014). 4.6. Antibakterijska aktivnost ispitanih supstanci Antibakterijska aktivnost etarskih ulja, dominantnih komponenata ulja i antibiotika ispitana je na trinaest referentnih ATCC sojeva. Ispitani Gram-negativni sojevi su: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 12453, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 i Enterobacter aerogenes ATCC 13048. Ispitani Gram-pozitivni sojevi su: Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 29213 i Listeria monocytogenes ATCC 15313. Rezultati antibakterijske aktivnosti ispitanih supstanci, prikazani su MIC i MBC vrednostima i izraženi su jedinicom µg/ml. Antibakterijska aktivnost ispitanih etarskih ulja familije Lamiaceae data je u Tabeli 17. Rezultati pokazuju izraženu antibakterijsku aktivnost ulja na sve proučavane bakterijske sojeve. Etarsko ulje T. pulegioides, je pokazalo antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 155.2-4966.4 µg/ml i MBC vrednostima 155.2- 9932.8 µg/ml. Vrednosti MIC etarskog ulja T. glabrescens su u intervalu 627.1-10033.6 µg/ml dok su MBC vrednosti u opsegu 627.1-20067.2 µg/ml. Na osnovu MIC i MBC ispitanih ulja, možemo uočiti nešto slabiju antibakterijsku aktivnost T. glabrescens ulja u odnosu na T. pulegioides, što se može objasniti njihovim različitim hemijskim sastavom.   Tabela 17. Antibakterijska aktivnost ispitanih etarskih ulja familije Lamiaceae (μg/ml). Br. Bakterijski soj T. pulegioides T. glabrescens S. kitaibelii N. nuda MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC 1 Escherichia coli ATCC 25922 1241.6 2483.2 2508.4 5016.8 1279.2 2558.4 5331.2 21324.8 2 Salmonella enteritidis ATCC 13076 310.4 310.4 627.1 627.1 1279.2 1279.2 2665.6 5331.2 3 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 620.8 620.8 1254.2 1254.2 2558.4 2558.4 2665.6 2665.6 4 Klabsiella pneumoniae ATCC 700603 1241.6 4966.4 5016.8 10033.6 2558.4 10233.6 5331.2 21324.8 5 Proteus mirabilis ATCC 12453 1241.6 1241.6 1254.2 2508.4 1279.2 1279.2 21324.8 42649.6 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 4966.4 9932.8 10033.6 20067.2 20467.2 40934.4 2665.6 42649.6 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1241.6 2483.2 5016.8 5016.8 2558.4 5116.8 10662.4 10662.4 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 620.8 620.8 5016.8 5016.8 40934.4 81868.8 21324.8 85299.2 9 Enterococcus faecalis ATCC 19433 1241.6 1241.6 2508.4 2508.4 1279.2 5116.8 1332.8 5331.2 10 Bacillus cereus ATCC 11778 155.2 155.2 627.1 1254.2 2558.4 10233.6 83.3 666.4 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 310.4 310.4 627.1 627.1 319.8 2558.4 1332.8 2665.6 12 Staphylococcus aureus ATCC 29213 2483.2 9932.8 2508.4 2508.4 2558.4 10233.6 1332.8 5331.2 13 Listeria monocytogenes ATCC 15313 310.4 310.4 627.1 1254.2 319.8 639.6 166.6 1332.8  Naša istraživanja proteklih godina, bila su usmerena na ispitivanju povećanja antibakterijske aktivnosti antibiotika etarskim uljima. Rezultati kombinovane interakcije ulja T. pulegioides i antibiotika, objašnjeni su u publikaciji (Miladinović et al., 2013). Na osnovu rezultata (Tabela 17), etarsko ulje S. kitaibelii je delovalo na sve testirane sojeve inhibitorno u intervalu 319.8-40934.4 µg/ml i baktericidno u opsegu 639.6-81868.8 µg/ml. Na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije etarskog ulja S. kitaibelii i antibiotika nisu proučene. Etarsko ulje N. nuda, je pokazalo antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 83.3-21324.8 µg/ml i MBC vrednostima 666.4-85299.2 µg/ml (Tabela 17). I pored iscrpnog istraživanja, rezultati kombinovane interakcije etarskog ulja N. nuda i antibiotika do sada nisu ispitani. Antibakterijska aktivnost etarskih ulja familija Apiaceae i Asteraceae data je u Tabeli 18. Rezultati pokazuju antibakterijsku aktivnost ulja na sve proučavane bakterijske sojeve. Etarsko ulje L. montana je pokazalo antibakterijsku aktivnost na sve testirane sojeve, sa MIC vrednostima u opsegu 337.7-43225.6 µg/ml i MBC vrednostima 675.4-43225.6 µg/ml. Vrednosti MIC etarskog ulja P. longifolium su u intervalu 2427.2-19417.6 µg/ml dok su MBC vrednosti u opsegu 2427.2-38835.2 µg/ml. Na osnovu rezultata (Tabela 18), etarsko ulje P. officinale je delovalo inhibitorno i baktericidno na sve testirane sojeve u intervalu 2406.2-76998.4 µg/ml. Na osnovu dostupne literature i naših saznanja, antibakterijska aktivnost P. officinale ulja i kombinacije istog sa antibioticima, do sada nije ispitana. Etarsko ulje familije Asteraceae, I. graveolens, je pokazalo antibakterijsku aktivnost na sve testirane sojeve, sa MIC vrednostima u opsegu 569.4-18220.8 µg/ml i MBC vrednostima 569.4-36441.6 µg/ml. I pored iscrpnog istraživanja, rezultati kombinovane interakcije etarskog ulja I. graveolens i antibiotika do sada nisu ispitani. Na osnovu hemijskog sastava ispitanih ulja i dostupnosti čistih supstanci, izvršena je antibakterijska analiza pojedinih komponenata ulja. Rezultati antibakterijske aktivnosti ispitanih supstanci i dominantnih komponenata ulja, dati su u Tabeli 19 i Tabeli 20. Antibakterijska aktivnost geraniola, glavne komponente etarskih ulja T. pulegioides, T. glabrescens i S. kitaibelii, data je u Tabeli 19. Geraniol je pokazao antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 1386.8-5547.2 µg/ml i MBC vrednostima 1386.8-11094.2 µg/ml. Aktivnost geraniola prema Gram-negativnim i Gram- pozitivnim sojevima je predmet mnogih studija (Kim et al., 1995; Jirovetz et al., 2007; Kotan et al., 2007). Značajan broj studija, povezuje antibakterijsku aktivnost etarskih ulja sa 86   Tabela 18. Antibakterijska aktivnost ispitanih etarskih ulja familija Apiaceae i Asteraceae (μg/ml). Br. Bakterijski soj L. montana P. longifolium P. officinale I. graveolens MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC 1 Escherichia coli ATCC 25922 21612.8 43225.6 9708.8 19417.6 76998.4 76998.4 9110.4 9110.4 2 Salmonella enteritidis ATCC 13076 675.4 10806.4 4854.4 9708.8 4812.4 9624.8 4555.2 9110.4 3 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 675.4 1350.8 9708.8 9708.8 9624.8 9624.8 9110.4 9110.4 4 Klabsiella pneumoniae ATCC 700603 21612.8 43225.6 19417.6 38835.2 76998.4 76998.4 18220.8 18220.8 5 Proteus mirabilis ATCC 12453 10806.4 21612.8 9708.8 19417.6 38499.2 76998.4 4555.2 4555.2 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 5403.2 5403.2 9708.8 19417.6 9624.8 19249.6 9110.4 36441.6 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 43225.6 43225.6 19417.6 38835.2 38499.2 38499.2 18220.8 18220.8 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 5403.2 10806.4 9708.8 19417.6 9624.8 19249.6 4555.2 9110.4 9 Enterococcus faecalis ATCC 19433 1350.8 1350.8 2427.2 2427.2 2406.2 2406.2 569.4 569.4 10 Bacillus cereus ATCC 11778 337.7 675.4 4854.4 4854.4 4812.4 4812.4 569.4 569.4 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 675.4 675.4 9708.8 9708.8 9624.8 9624.8 1138.8 1138.8 12 Staphylococcus aureus ATCC 29213 2701.6 10806.4 4854.4 4854.4 19249.6 19249.6 4555.2 18220.8 13 Listeria monocytogenes ATCC 15313 675.4 675.4 4854.4 9708.8 4812.4 9624.8 1138.8 1138.8   Tabela 19. Antibakterijska aktivnost ispitanih komponenata ulja (μg/ml). Br. Bakterijski soj Geraniol Timol Linalool Eukaliptol MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC 1 Escherichia coli ATCC 25922 1386.8 2773.6 1561.6 1561.6 1340.6 2681.2 5900.8 5900.8 2 Salmonella enteritidis ATCC 13076 2773.6 2773.6 24.4 24.4 5362.4 5362.4 737.6 5900.8 3 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 2773.6 5547.2 390.4 390.4 10724.8 10724.8 47206.4 47206.4 4 Klabsiella pneumoniae ATCC 700603 2773.6 5547.2 1561.6 3123.2 10724.8 21449.6 5900.8 5900.8 5 Proteus mirabilis ATCC 12453 1386.8 1386.8 1561.6 1561.6 5362.4 10724.8 5900.8 11801.6 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 5547.2 11094.4 1561.6 1561.6 10724.8 10724.8 23603.2 23603.2 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 2773.6 2773.6 3123.2 6246.4 10724.8 21449.6 94412.8 94412.8 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 5547.2 5547.2 195.2 195.2 10724.8 10724.8 11801.6 47206.4 9 Enterococcus faecalis ATCC 19433 1386.8 1386.8 195.2 195.2 5362.4 5362.4 1475.2 5900.8 10 Bacillus cereus ATCC 11778 1386.8 1386.8 24.4 24.4 5362.4 5362.4 92.2 184.4 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 2773.6 2773.6 97.6 97.6 2681.2 5362.4 5900.8 23603.2 12 Staphylococcus aureus ATCC 29213 2773.6 2773.6 780.8 1561.6 2681.2 5362.4 94412.8 94412.8 13 Listeria monocytogenes ATCC 15313 2773.6 2773.6 97.6 97.6 5362.4 5362.4 184.4 737.6  Tabela 20. Antibakterijska aktivnost geranil acetata i limonena (μg/ml). Br. Bakterijski soj Geranil acetat Limonen MIC MBC MIC MBC 1 Escherichia coli ATCC 25922 – – – – 2 Salmonella enteritidis ATCC 13076 5862.4 46899.2 10513.6 10513.6 3 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 11724.8 23449.6 10513.6 10513.6 4 Klabsiella pneumoniae ATCC 700603 – – – – 5 Proteus mirabilis ATCC 12453 – – – – 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 23449.6 93798.4 10513.6 21027.2 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – – – – 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 93798.4 93798.4 21027.2 21027.2 9 Enterococcus faecalis ATCC 19433 2931.2 2931.2 5256.8 5256.8 10 Bacillus cereus ATCC 11778 91.6 183.2 5256.8 5256.8 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 183.2 183.2 2628.4 2628.4 12 Staphylococcus aureus ATCC 29213 – – – – 13 Listeria monocytogenes ATCC 15313 183.2 732.8 5256.8 10513.6 aktivnošću glavne komponente-geraniolom (Mnif et al., 2011; Schmidt et al., 2012; Santos & Novales, 2012; Singh et al., 2012). U malom broju radova ispitana je antibakterijska aktivnost kombinacije geraniola i antibiotika (Shin, 2003; Shin & Lim, 2004; Khan, 2012). Prva istraživanja kombinove interakcije geraniola sa hloramfenikolom objašnjeni su u publikaciji Ilić et al. (2014). Na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije geraniola sa tetraciklinom i streptomicinom do sada nisu ispitane. Timol, druga po zastupljenosti komponenta etarskog ulja T. glabrescens, pokazala je antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 24.4-3123.2 µg/ml i MBC vrednostima 24.4-6246.4 µg/ml (Tabela 19). Aktivnost timola prema Gram- negativnim i Gram-pozitivnim sojevima je predmet mnogih studija (Braga 2005; Zarrini et al., 2010; Gniewosz & Synowiec, 2011). Značajan broj studija, povezuje antibakterijsku aktivnost etarskih ulja sa aktivnošću glavne komponente-timolom (Stefanakis et al., 2013; Ballester-Costa et al., 2013; Gokturk et al., 2013). U znatnom broju radova ispitana je antibakterijska aktivnost kombinacije timola i antibiotika (Guo et al., 2009; Palaniappan & Holley, 2010; Ahmad et al., 2013; Pemmaraju et al., 2013; Hamoud et al., 2013). Prva istraživanja kombinove interakcije timola sa hloramfenikolom objašnjeni su u publikaciji Ilić et al. (2014). Na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije timola sa tetraciklinom i streptomicinom do sada nisu ispitane. 89  Linalool, jedna od dominantnih komponenta etarskog ulja T. glabrescens, pokazala je antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 1340.6- 10724.8 µg/ml i MBC vrednostima 2681.2-21449.6 µg/ml (Tabela 19). Aktivnost linaloola prema Gram-negativnim i Gram-pozitivnim sojevima je predmet mnogih studija (Aprotosoaie et al., 2014; Beier et al., 2014). Značajan broj studija, povezuje antibakterijsku aktivnost etarskih ulja sa aktivnošću glavne komponente-linaloolom (Végh et al., 2012; Adaszyńska et al., 2013; Eryiğit et al., 2014). Na osnovu dostupne literature, antibakterijska aktivnost kombinacije linaloola i antibiotika ispitana je samo u jednoj studiji (Sook & Shin, 2007). Ispitivanje linaloola "checkerboard" metodom uglavnom se zasnivalo na njegovoj kombinaciji sa etarskim uljem, ili nekom od glavnih komponenata ulja (Iten et al., 2009; Tserennadmid et al., 2011). Na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije linaloola sa hloramfenikolom, tetraciklinom i streptomicinom do sada nisu ispitane. Eukaliptol, dominantna komponenta etarskog ulja N. nuda, pokazala je antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 92.2-94412.8 µg/ml i MBC vrednostima 184.4-94412.8 µg/ml (Tabela 19). Aktivnost eukaliptola prema Gram- negativnim i Gram-pozitivnim sojevima je predmet mnogih studija (Bosnić et al., 2006; Van Vuuren & Viljoen, 2007; Hendry et al., 2009). Značajan broj studija, povezuje antibakterijsku aktivnost etarskih ulja sa aktivnošću glavne komponente-eukaliptola (Hassine et al., 2013; Jianu et al., 2013; Ben Hsouna et al., 2013). Na osnovu dostupne literature, antibakterijska aktivnost kombinacije eukaliptola i antibiotika ispitana je u malom broju studija (Jedlicková et al., 1992; Hendry et al., 2009). Na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije eukaliptola sa hloramfenikolom, tetraciklinom i streptomicinom do sada nisu ispitane. Geranil acetat, jedna od dominantnih komponenata etarskog ulja T. glabrescens, pokazala je antibakterijsku aktivnost samo na određene bakterijske sojeve, sa MIC vrednostima u opsegu 91.6-93798.4 µg/ml i MBC vrednostima 183.2-93798.4 µg/ml (Tabela 20). Aktivnost geranil acetata prema ispitanim "checkerboard" sojevima nije zabeležena (Tabela 20). Potvrda slabe ili neaktivne uloge geranil acetata prema Gram-negativnim i Gram-pozitivnim sojevima je predmet nekih od studija (Duarte et al., 2007; Sarath Chandra Bose et al., 2013). Značajan broj studija, povezuje antibakterijsku aktivnost etarskih ulja sa aktivnošću glavnih komponenta, pa i sa sadržajem geranil acetata (El-Baky & El-Baroty, 2008; Farjam, 2012; Rokbeni et al., 2013). Mali broj studija govori o antibakterijskoj aktivnosti kombinacije antibiotika i ulja u kome je geranil acetat dominantna komponenta (Veras et al., 2011). Na 90  91 osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije geranil acetata sa ispitanim antibioticima i čistim supstancama nisu proučavane. Limonen, jedna od dominantnih komponenata etarskih ulja P. officinale i P. longifolium, pokazala je antibakterijsku aktivnost samo na određene bakterijske sojeve, sa MIC i MBC vrednostima u opsegu 2628.4-21027.2 µg/ml (Tabela 20). Aktivnost limonena prema ispitanim "checkerboard" sojevima nije zabeležena (Tabela 20). Ovo je u saglasnosti sa literaturnim podacima gde je potvrđena slaba antibakterijska aktivnost limonena (Burt, 2004; Bourgou et al., 2012; Maree et al., 2014). Značajan broj studija, povezuje antibakterijsku aktivnost etarskih ulja sa aktivnošću glavnih komponenta, pa i sa sadržajem limonena (Sonboli et al., 2012; Haj Ammar et al., 2012; Matan et al., 2014). Mali broj studija govori o antibakterijskoj aktivnosti kombinacija supstanci i ulja u kome je limonen dominantna komponenta (Tserennadmid et al., 2011; Bassolé et al., 2011; Zhang et al., 2014). Na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije limonena sa ispitanim antibioticima i čistim supstancama nisu istražene. Antibakterijska aktivnost ispitanih antibiotika data je u Tabeli 21. Rezultati pokazuju izraženu antibakterijsku aktivnost antibiotika na sve proučavane bakterijske sojeve. Hloramfenikol je pokazao antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterije, sa MIC vrednostima u opsegu 1.0-1024.0 µg/ml i MBC vrednostima 1.0-2048.0 µg/ml. Vrednosti MIC i MBC tetraciklina su u intervalu 0.5-1024.0 µg/ml, dok su kod streptomicina MIC vrednosti bile u opsegu 0.5-128.0 µg/ml a MBC vrednosti u opsegu 0.5-256.0 µg/ml. Na osnovu MIC i MBC ispitanih antibiotika možemo uočiti nešto slabiju antibakterijsku aktivnost u odnosu na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603, P. mirabilis ATCC 12453, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213. Ovo je upravo i razlog zašto smo se u "checkerboard" metodi opredelili baš za ove sojeve. Cilj istraživanja nam je bio povećanje antibakterijske aktivnosti antibiotika ka rezistentnim Gram-negativnim i Gram- pozitivnim sojevima, korišćenjem etarskih ulja ili dominantnih komponenata ulja. Poznate su brojne studije o antibakterijskoj aktivnosti ispitanih antibiotika i mehanizmu njihovog delovanja (Carter et al., 2000; Brodersen et al., 2000; Bulkley et al., 2010). Važna mesta antibakterijske aktivnosti ispitanih antibiotika, dostupni su na web adresi (http://www.drugbank.ca/drugs/). Znatan broj studija ispituju efekte kombinovanja sintetičkih antibiotika sa prirodnim supstancama (Olajuyigbe & Afolayan, 2012; Stefanović et al., 2012; Din et al., 2013; Gutiérrez-Fernández et al., 2013). U ovim studijama, nije sasvim jasan, niti objašnjen mehanizam antibakterijske aktivnosti etarskih ulja kao i mehanizam njihove kombinovane   Tabela 21. Antibakterijska aktivnost ispitanih antibiotika (μg/ml). Br. Bakterijski soj Hloramfenikol Tetraciklin Streptomicin MIC MBC MIC MBC MIC MBC 1 Escherichia coli ATCC 25922 128.0 512.0 128.0 256.0 8.0 8.0 2 Salmonella enteritidis ATCC 13076 4.0 8.0 1.0 8.0 4.0 4.0 3 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 2.0 2.0 1.0 1.0 16.0 16.0 4 Klabsiella pneumoniae ATCC 700603 512.0 1024.0 128.0 256.0 64.0 64.0 5 Proteus mirabilis ATCC 12453 4.0 64.0 1024.0 1024.0 128.0 256.0 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 4.0 16.0 4.0 32.0 8.0 8.0 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 1024.0 2048.0 128.0 256.0 16.0 16.0 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 1.0 1.0 0.5 8.0 0.5 0.5 9 Enterococcus faecalis ATCC 19433 2.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 10 Bacillus cereus ATCC 11778 1.0 4.0 0.5 0.5 0.5 0.5 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 1.0 8.0 1.0 1.0 0.5 0.5 12 Staphylococcus aureus ATCC 29213 8.0 32.0 128.0 256.0 4.0 32.0 13 Listeria monocytogenes ATCC 15313 8.0 8.0 1.0 2.0 1.0 1.0  interakcije sa antibioticima. Neke od studija upućuju na lakši prodor antibiotika do njihovih target mesta, usled porasta fluidnosti citoplazmatične membrane i njenog penetriranja komponentama ulja. Jedan deo naših publikovanih rezultata, vezan za interakcije ispitanih antibiotika, ulja i čistih supstanci dat je u prilogu ove doktorske disertacije (Ilić et al., 2014; Miladinović et al., 2014). Kao što je već rečeno, na osnovu naših saznanja i dostupne literature, kombinovane interakcije hloramfenikola, tetraciklina i streptomicina sa ispitanim uljima i supstancama do sada nisu proučavane. Klasifikacija i upoređivanje supstanci na osnovu njihove antibakterijske aktivnosti je jedino objektivno moguće korišćenjem odgovarajućih hemometrijskih metoda (Miladinović et al., 2012). Interpretacija i diskusija tabelarno prezentovanih rezultata je vrlo subjektivna. U cilju uočavanja određenih korelacija i eliminacije bilo kakve subjektivne analize, hemometrijske PCA i HCA metode su primenjene. 4.6.1. Hemometrijska analiza supstanci na osnovu MIC vrednosti U cilju određivanja slične inhibitorne aktivnosti supstanci i utvrđivanja veze hemijski sastav- antibakterijska aktivnost, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza supstanci na osnovu MIC vrednosti (Miladinović et al., 2012; Miladinović et al., 2013; Miladinović et al., 2014; Ilić et al., 2014). Usled svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa i MIC vrednosti (Tabele 17-21), izuzimajući rezultate geranil acetata i limonena, PC1 svojstveni vektor objasnio je 46.04% varijanse ispitanih supstanci, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 23.77% (Slika 19A). Dijagram odgovornih bakterijskih sojeva-varijabli (Slika 19B), ilustruje uticaj MIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih supstanci (Slika 19C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥37596 (Slika 19D), HCA analiza je identifikovala tri grupe supstanci (A, B i C). Grupa A, sastavljena od P. officinale ulja i eukaliptola, odlikovala se slabom antibakterijskom aktivnošću i visokim MIC vrednostima. Visoku rezistenciju na eukaliptol pokazali su sojevi K. pneumoniae ATCC 10031, P. aeruginosa ATCC 9027, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213 (Slika 19B, C). Vrlo slabi rezultati antibakterijske aktivnosti ulja P. officinale dobijeni su u odnosu na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 (Slika 19B, C). Grupa B, grupa najvećeg broja ispitanih ulja, odlikovala se umerenim i višim vrednostima inhibitorne koncentracije u odnosu na sve ispitane supstance. Razmatrajući sve bakterije, najjaču antibakterijsku aktivnost pokazali su antibiotici i ulja timusa sa svojim glavnim komponentama (Slika 19B, C). Ove supstance su svrstane u okviru grupe C. 93   Slika 19. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti supstanci zasnovana na MIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih bakterijskih sojeva; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih supstanci; (D) dendrogram HCA analize. 4.6.2. Hemometrijska analiza supstanci na osnovu MBC vrednosti U cilju određivanja slične baktericidne aktivnosti supstanci i pronalaska veze hemijski sastav- antibakterijska aktivnost, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza supstanci na osnovu MBC vrednosti. Usled svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa i MBC vrednosti (Tabele 17-21), izuzimajući rezultate geranil acetata i limonena, PC1 svojstveni vektor objasnio je 44.78% varijanse ispitanih supstanci, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 23.66% (Slika 20A). Dijagram odgovornih bakterijskih sojeva-varijabli (Slika 20B), ilustruje uticaj MBC vrednosti na klasifikaciju posmatranih supstanci (Slika 20C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥51696 (Slika 20D), HCA analiza je identifikovala tri grupe supstanci (A, B i C). Grupa A, sastavljena od P. officinale ulja i eukaliptola, odlikovala se slabom aktivnošću i visokim MBC vrednostima. Visoku rezistenciju na eukaliptol pokazivali su sojevi K. pneumoniae ATCC 10031, P. aeruginosa ATCC 9027, P. aeruginosa ATCC 27853, E. aerogenes ATCC 13048, S. aureus ATCC 25923 i S. aureus ATCC 29213 (Slika 94  20B, C). Vrlo slabi rezultati antibakterijske aktivnosti ulja P. officinale dobijeni su u odnosu na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 (Slika 20B, C). Grupa B, grupa najvećeg broja ispitanih ulja, odlikovala se umerenim i višim vrednostima baktericidne koncentracije u odnosu na sve ispitane supstance. Razmatrajući sve bakterije, najjaču baktericidnu aktivnost pokazali su antibiotici i ulja timusa sa svojim glavnim komponentama (Slika 20B, C). Ove supstance, hemometrijskom PCA i HCA analizom su svrstane u okviru grupe C. Slični rezultati dobijeni su analizom MIC vrednosti. Slika 20. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti supstanci zasnovana na MBC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih bakterijskih sojeva; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih supstanci; (D) dendrogram HCA analize. 4.6.3. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema T. pulegioides ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 22. Na osnovu 135 ispitanih odnosa (kombinacija) između etarskog ulja T. pulegioides i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 69 (51.11%) su pokazali sinergističko 95  delovanje, 36 (26.67%) aditivno dejstvo dok 30 (22.22%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Tabela 22. Antibakterijska aktivnost sistema T. pulegioides ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi T. pulegioides ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 1.04 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.32 0.32 0.56 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.92 0.82 1.10 0.95 0.92 1.04 1.16 1.28 3* 0.32 0.44 0.56 0.82 0.80 0.76 0.87 1.16 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.54 0.44 0.43 0.54 0.80 0.76 1.04 0.98 1.28 2* 0.76 0.56 0.95 0.82 0.95 1.08 1.04 1.34 1.28 3* 0.54 0.92 0.95 0.82 0.95 0.92 1.04 1.16 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.32 0.56 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.56 0.69 0.82 0.95 1.08 1.04 1.16 1.28 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.04 1.72 1.34 1.85 S. aureus ATCC 29213 1* 0.87 0.68 0.69 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom ispitanog etarskog ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 75.56%. Najviši procenat aditivnog dejstva (37.78%) zabeležen je u kombinaciji ulje- tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (51.11%) zabeležen u interakciji ulja sa streptomicinom. Najbolji rezultati kombinovane interakcije ispitanog ulja i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju S. aureus ATCC 29213. Na ovom soju, kombinacija ulje- antibiotik je pokazala 66.67% sinergističkih interakcija, 22.22% aditivnih interakcija i 11.11% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (11.11%), P. mirabilis ATCC 12453 (14.81%), E. coli ATCC 25922 (33.33%), P. aeruginosa ATCC 27853 (40.74%). Na osnovu rezultata u Tabeli 22, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 34 (75.56%) interakcija su sinergističke, 10 (22.22%) aditivne, dok 1 (2.22%) interakcija pokazuje antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje- tetraciklin su sledeći: 22 (48.89%) interakcije pokazuju sinergizam, 17 (37.78%) aditivno 96  dejstvo, dok 6 (13.33%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem ulje-streptomicin, dao je 13 (28.89%) sinergističkih, 9 (20.00%) aditivnih i 23 (51.11%) antagonističkih interakcija. Slika 21. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {T. pulegioides ulje-hloramfenikol (1*); T. pulegioides ulje-tetraciklin (2*); T. pulegioides ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. U cilju određivanja slične antibakterijske aktivnosti, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza (Ilić et al., 2014; Miladinović et al., 2014; Miladinović et al., 2013). PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema T. pulegioides ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 81.80% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 12.31% (Slika 21A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 21B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema T. pulegioides ulje-antibiotici (Slika 21C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.88 (Slika 21D), HCA analiza je 97  98 identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije T. pulegioides ulje-streptomicin, pokazivala je snažan antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922 i P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijske sojeve. Grupa B, takođe kombinacija ulje- streptomicin, ispoljavala je antagonizma prema bakteriji S. aureus ATCC 29213 za niske vrednosti FICA indeksa (Slika 21B, C). Vrednosti (FICA ≥0.40), karakterisala su se sinergističkim i aditivnim delovanjem u odnosu na ovu bakteriju. Grupa C, dominantnog sinergističkog i aditivnog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.16, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (C1 i C2). U podgrupi C1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan aditivan efekat, dok se podgrupa C2 karakterisala dominantnim sinergizmom. 4.6.4. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema T. glabrescens ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 23. Na osnovu 135 ispitanih kombinacija između etarskog ulja T. glabrescens i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 58 (42.96%) su pokazale sinergističko delovanje, 37 (27.41%) aditivno dejstvo dok 40 (29.63%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom ispitanog etarskog ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 55.56%. Najviši procenat aditivnog dejstva (37.78%) zabeležen je u kombinaciji ulje- tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (51.11%) zabeležen u interakciji ulja sa streptomicinom. Rezultati dominantnih interakcija su vrlo slični prethodno diskutovanim rezultatima etarskog ulja T. pulegioides. Za razliku od ulja T. pulegioides, najbolji rezultati kombinovane interakcije T. glabrescens ulja i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju K. pneumoniae ATCC 700603. Na ovom soju, kombinacija ulje-antibiotik je pokazala 59.26% sinergističkih interakcija, 25.93% aditivnih interakcija i 14.81% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: P. mirabilis ATCC 12453 (14.81%), E. coli ATCC 25922 (18.52%), P. aeruginosa ATCC 27853 (40.74%), S. aureus ATCC 29213 (59.26%). Na osnovu procenta antagonističkih interakcija u odnosu na bakterijski soj S. aureus ATCC 29213, vidimo da ulje T. glabrescens sa antibioticima, ima drugačiji efekat u odnosu na T. pulegioides ulje. Na osnovu rezultata u Tabeli 23, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 25 (55.56%) interakcija su sinergističke, 14 (31.11%) aditivne, dok 6 (13.33%) interakcija pokazuje antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje  Tabela 23. Antibakterijska aktivnost sistema T. glabrescens ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi T. glabrescens ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.32 0.44 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.66 1.70 0.76 0.87 0.98 1.09 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.80 0.95 1.10 1.10 1.08 1.21 1.16 1.47 3* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.28 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.76 0.68 0.82 0.82 0.80 0.92 1.04 1.16 1.28 2* 0.43 0.56 0.69 0.96 0.95 1.08 1.04 1.16 1.66 3* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.56 0.69 0.68 0.65 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.80 1.08 1.24 1.10 1.08 1.04 1.16 1.66 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 1.70 1.24 1.04 1.16 1.85 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 1.16 1.08 1.10 1.10 1.08 1.04 1.34 1.66 2* 0.65 0.68 0.82 0.96 1.10 1.24 1.04 1.16 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). tetraciklin su sledeći: 17 (37.78%) interakcija pokazuju sinergizam, 17 (37.78%) aditivno dejstvo, dok 11 (24.44%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem ulje-streptomicin, dao je 16 (35.56%) sinergističkih, 6 (13.33%) aditivnih i 23 (51.11%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema T. glabrescens ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 78.67% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 17.48% (Slika 22A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 22B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema T. glabrescens ulje-antibiotici (Slika 22C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.66 (Slika 22D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije T. glabrescens ulje-streptomicin, pokazivala je snažan antagonizam u odnosu na S. aureus ATCC 29213. Grupa B, takođe kombinacija ulje- streptomicin, ispoljavala je antagonizam prema E. coli ATCC 25922 i P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijskim sojevima. I pored dominantnog antagonizma, grupa B je za više FICA vrednosti (FICA ≥0.60) ispoljavala sve tri vrste ispitivanih interakcija (Slika 22B, C). 99   Slika 22. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {T. glabrescens ulje-hloramfenikol (1*); T. glabrescens ulje-tetraciklin (2*); T. glabrescens ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. Grupa C, grupa dominantnog sinergističkog i aditivnog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.79, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (C1 i C2). U podgrupi C1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan aditivan efekat, dok se podgrupa C2 karakterisala dominantnim sinergizmom. Rezultati hemometrijske analize kombinovane interakcije etarskog ulja T. glabrescens sa antibioticima su vrlo slični rezultatima ulja T. pulegioides. Oba ulja u kombinaciji sa streptomicinom, pokazuju loše rezultate u pogledu antibakterijske aktivnosti na E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213. Kombinacije ovih ulja sa ostalim antibioticima i svim ispitanim bakterijama pokazivali su dominantan sinergizam i aditivno dejstvo. Sinergističke interakcije kod oba timusa (podgrupe C1) 100  uglavnom su ostvarivane hloramfenikolom, dok je aditivan efekat (podgrupe C2) ostvarivan tetraciklinom (Slike 21D, 22D). 4.6.5. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema S. kitaibelii ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 24. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između etarskog ulja S. kitaibelii i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 72 (53.33%) su ispoljile sinergističko delovanje, 30 (22.22%) aditivno dejstvo dok 33 (24.44%) kombinacije su antagonističke. Tabela 24. Antibakterijska aktivnost sistema S. kitaibelii ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi S. kitaibelii ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.32 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.32 0.44 0.56 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.98 1.04 1.21 1.24 1.25 1.40 1.38 1.34 1.47 2* 0.43 0.56 0.69 0.82 0.95 0.92 1.21 1.34 1.66 3* 0.43 0.80 0.69 0.82 0.80 0.92 0.87 1.16 1.28 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.68 0.82 0.96 1.10 1.08 1.21 1.34 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.04 2.06 2.24 2.23 S. aureus ATCC 29213 1* 0.87 0.80 0.95 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.98 1.04 1.08 0.82 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti, za razliku od prethodno ispitanih timusa, su ostvareni kombinacijom ispitanog etarskog ulja sa tetraciklinom. Mada i kombinacija sa hloramfenikolom je dala veoma dobre rezultate. Ukupan procenat sinergističkih interakcija sistema ulje-tetraciklin iznosio je 62.22%. Najviši procenat aditivnog dejstva (24.44%) zabeležen je kod kombinacija ulje-tetraciklin i ulje-hloramfenikol, dok je najviši procenat antagonizma (44.44%) zabeležen u interakciji ulja sa streptomicinom. Visok procenat antagonističkih interakcija sa streptomicinom je karakteristika i predhodno opisanih etarskih ulja. Najbolji rezultati kombinovane interakcije ispitanog ulja i antibiotika su postignuti na 101  bakterijskom soju S. aureus ATCC 29213. Na ovom soju, kombinacija ulje-antibiotik je pokazala 62.96% sinergističkih interakcija, 37.04% aditivnih interakcija, dok antagonizam nije zabeležen. Sličan efekat je pokazalo i etarsko ulje T. pulegioides u kombinaciji sa opisanim antibioticima, ali sa nešto višim udelom antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija sistema S. kitaibelii ulje-antibiotici, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (bez antagonizma), E. coli ATCC 25922 (33.33%), P. mirabilis ATCC 12453 (44.44%), P. aeruginosa ATCC 27853 (44.44%). Na osnovu rezultata u Tabeli 24, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 27 (60.00%) interakcija su sinergističke, 11 (24.44%) aditivne, dok 7 (15.56%) interakcija pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje- tetraciklin su sledeći: 28 (62.22%) interakcija pokazuju sinergizam, 11 (24.44%) aditivno dejstvo, dok 6 (13.33%) interakcija pokazuju antagonizam. Slika 23. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {S. kitaibelii ulje-hloramfenikol (1*); S. kitaibelii ulje-tetraciklin (2*); S. kitaibelii ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 102  103 Sistem ulje-streptomicin, dao je 17 (37.78%) sinergističkih, 8 (17.78%) aditivnih i 20 (44.44%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema S. kitaibelii ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 90.88% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 7.66% (Slika 23A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 23B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema S. kitaibelii ulje-antibiotici (Slika 23C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.87 (Slika 23D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije S. kitaibelii ulje-streptomicin, pokazivala je izražen antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922 i P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijske sojeve. Slično ponašanje, sa izraženim antagonizmom ka ovim bakterijama, pokazivalo je i prethodno diskutovano T. pulegioides etarsko ulje. Grupa B, kombinacija ulje-hloramfenikol, ispoljavala je nešto nižu vrednost antagonizma prema bakteriji P. mirabilis ATCC 12453 za vrednosti FICA ≥0.30. Vrednosti (FICA ≤0.20), karakterisala su se aditivnim delovanjem u odnosu na ovu bakteriju (Slika 23B, C). Grupa C, dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. 4.6.6. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema N. nuda ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 25. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između etarskog ulja N. nuda i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 53 (39.26%) su pokazali sinergističko delovanje, 26 (19.26%) aditivno dejstvo dok 56 (41.48%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Na osnovu prethodno ispitanih etarskih ulja familije Lamiaceae, vidimo da se etarsko ulje N. nuda odlikuje znatno brojnijim antagonističkim interakcijama u odnosu na ispitane antibiotike. Slično etarskim uljima timusa, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom ispitanog etarskog ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 71.11%. Najviši procenat aditivnog dejstva (24.44%) zabeležen je u kombinaciji ulje-hloramfenikol, dok je najviši procenat antagonizma (62.22%) zabeležen u interakciji ulja sa tetraciklinom. Brojne antagonističke interakcije ulja sa tetraciklinom, odvaja etarsko ulje N. nuda od ulja ostalih Lamiaceae. Visok procenat sinergističkih interakcija (51.85%) ispitanih sistema, zapažen je na bakterijskim sojevima  Tabela 25. Antibakterijska aktivnost sistema N. nuda ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi N. nuda ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.06 2.06 2.42 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.21 0.32 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.09 1.40 1.47 1.80 2.00 1.56 1.55 1.16 1.47 3* 0.32 0.44 0.43 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.43 0.56 0.69 0.68 0.80 0.92 1.04 1.16 1.28 2* 1.09 1.04 0.95 1.24 0.95 1.08 1.04 1.16 1.47 3* 0.43 0.44 0.69 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.56 0.69 0.68 0.80 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.40 1.60 1.80 1.70 1.56 1.04 1.16 2.23 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 1.70 1.40 1.04 1.16 1.85 S. aureus ATCC 29213 1* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). E. coli ATCC 25922 i K. pneumoniae ATCC 700603. Međutim, najbolji rezultati kombinovane interakcije ispitanog ulja i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Na ovom soju, kombinacija ulje-antibiotik je pokazala 44.44% sinergističkih interakcija, 37.04% aditivnih interakcija i 18.52% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (29.63%), E. coli ATCC 25922 (33.33%), P. aeruginosa ATCC 27853 (59.26%), S. aureus ATCC 29213 (66.67%). Na osnovu rezultata u Tabeli 25, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 32 (71.11%) interakcije su sinergističke, 11 (24.44%) aditivne, dok 2 (4.44%) interakcije pokazuje antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje- tetraciklin su sledeći: 7 (15.56%) interakcija pokazuju sinergizam, 10 (22.22%) aditivno dejstvo, dok 28 (62.22%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem ulje-streptomicin, dao je 14 (31.11%) sinergističkih, 5 (11.11%) aditivnih i 26 (57.78%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema N. nuda ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni 104   Slika 24. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {N. nuda ulje- hloramfenikol (1*); N. nuda ulje-tetraciklin (2*); N. nuda ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. vektor objasnio je 88.51% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 9.31% (Slika 24A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 24B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema N. nuda ulje- antibiotici (Slika 24C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.99 (Slika 24D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena od kombinacija N. nuda ulje-streptomicin i N. nuda ulje-tetraciklin, pokazivala je snažan antagonizam za sve FICA vrednosti u odnosu na E. coli ATCC 25922 i S. aureus ATCC 29213. Grupa B, takođe sastavljena od kombinacije ulje-streptomicin i ulje-tetraciklin, ispoljavala je antagonizam u odnosu na sojeve K. pneumoniae ATCC 700603, P. mirabilis ATCC 12453 i P. aeruginosa ATCC 27853. Pojava aditivnog dejstva i nižih vrednosti antagonističkih interakcija za indekse FICA ≥0.60, činilo je katrakteristiku ove grupe (Slika 24B, C). Grupa C, 105  dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Najveći broj sinergističkih interakcija grupe C, je posledica kombinovane interakcije ulja sa hloramfenikolom (Slika 24C, D). 4.6.7. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema L. montana ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 26. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između etarskog ulja L. montana i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 77 (57.04%) su pokazali sinergističko delovanje, 34 (25.19%) aditivno dejstvo dok 24 (17.78%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Tabela 26. Antibakterijska aktivnost sistema L. montana ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi L. montana ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.43 0.44 0.69 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.80 0.95 1.10 1.10 1.08 1.21 1.16 1.28 3* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.80 0.92 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.32 0.56 0.43 0.54 0.80 0.92 0.87 0.98 1.28 2* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.32 0.44 0.56 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.32 0.68 0.69 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.56 0.69 0.82 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.28 1.60 1.66 1.25 1.40 1.04 0.98 1.09 S. aureus ATCC 29213 1* 0.87 0.56 0.69 0.82 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.80 0.95 0.54 1.25 0.76 1.55 0.98 1.28 3* 1.20 0.80 0.69 0.82 0.80 0.92 0.87 0.98 1.28 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). Slično etarskim uljima timusa i N. nuda, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom ispitanog etarskog ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, slično T. pulegioides ulju, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 75.56%. Najviši procenat aditivnog dejstva (31.11%) zabeležen je u kombinaciji ulje-tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (37.78%) zabeležen u interakciji ulja sa streptomicinom. Slično etarskom ulju N. nuda, najbolji rezultati kombinovane interakcije sa ispitanim antibioticima su postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Na ovom soju, 106  kombinacija ulje-antibiotik je pokazala 74.07% sinergističkih interakcija, 22.22% aditivnih interakcija i 3.70% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (11.11%), S. aureus ATCC 29213 (18.52%), P. aeruginosa ATCC 27853 (22.22%), E. coli ATCC 25922 (33.33%). Na osnovu rezultata u Tabeli 26, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 34 (75.56%) interakcija su sinergističke, 10 (22.22%) aditivne, dok 1 (2.22%) interakcija pokazuje antagonizam. Rezultati interakcija L. montana ulja sa hloramfenikolom su identični rezultatima kombinovane interakcije hloramfenikola sa T. pulegioides uljem. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje-tetraciklin su sledeći: 25 (55.56%) interakcija pokazuju sinergizam, 14 (31.11%) aditivno dejstvo, dok 6 (13.33%) interakcija pokazuju antagonizam. Slika 25. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {L. montana ulje-hloramfenikol (1*); L. montana ulje-tetraciklin (2*); L. montana ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 107  Sistem ulje-streptomicin, dao je 18 (40.00%) sinergističkih, 10 (22.22%) aditivnih i 17 (37.78%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema L. montana ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 81.06% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 11.82% (Slika 25A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 25B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema L. montana ulje-antibiotici (Slika 25C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.31 (Slika 25D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije L. montana ulje-streptomicin, pokazivala je snažan antagonizam za sve FICA vrednosti u odnosu na E. coli ATCC 25922. Grupa B, takođe kombinacija ulje- streptomicin, ispoljavala je antagonizam prema bakteriji P. aeruginosa ATCC 27853 za niže vrednosti FICA indeksa (FICA ≤0.60). Vrednosti FICA ≥0.70, karakterisala su se aditivnim delovanjem u odnosu na ovu bakteriju (Slika 25B, C). Grupa C, dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti, postignuti su kombinacijom ulje-hloramfenikol i ulje-tetraciklin na bakterijske sojeve tipa E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 (Slika 25C, D). 4.6.8. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema P. longifolium ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 27. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između etarskog ulja P. longifolium i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 50 (37.04%) su pokazali sinergističko delovanje, 29 (21.48%) aditivno dejstvo dok 56 (41.48%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Slično prethodno analiziranim uljima, izuzev ulja S. kitaibelii, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom P. longifolium ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 66.67%. Najviši procenat aditivnog dejstva (26.67%) zabeležen je opet u kombinaciji sa hloramfenikolom, dok je najviši procenat antagonizma (77.78%) zabeležen u interakciji ulja sa tetraciklinom. Visok procenat antagonizma sa tetraciklinom, zabeležen je i kod diskutovanog ulja N. nuda (62.22%). Sva ostala, predhodno opisana ulja, najviši procenat antagonizma su ostvarivala u kombinaciji sa streptomicinom. Najbolji rezultati kombinovane interakcije P. longifolium ulja 108  109 i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju K. pneumoniae ATCC 700603. Sličnu aktivnost, pokazalo je već opisano T. glabrescens ulje. Na ovom soju, kombinacija P. longifolium ulje-antibiotik je pokazala 51.85% sinergističkih interakcija, 22.22% aditivnih interakcija i 25.93% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: P. mirabilis ATCC 12453 (25.93%), S. aureus ATCC 29213 (37.04%), P. aeruginosa ATCC 27853 (55.56%), E. coli ATCC 25922 (62.96%). Tabela 27. Antibakterijska aktivnost sistema P. longifolium ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi P. longifolium ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.09 1.28 1.34 1.52 1.40 1.56 1.55 1.52 2.04 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.24 2.23 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.98 1.04 1.34 1.24 1.25 1.24 1.38 1.52 1.85 3* 0.32 0.44 0.56 0.54 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.54 0.68 0.69 0.82 0.95 1.08 1.04 1.16 1.28 2* 0.76 0.80 1.08 1.24 1.55 1.08 1.21 1.16 1.85 3* 0.54 0.68 0.69 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.80 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.92 1.08 1.24 1.40 1.40 1.38 1.52 2.04 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 1.85 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 0.68 0.69 0.82 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.06 2.24 2.42 3* 0.98 1.04 1.08 0.96 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). Na osnovu rezultata u Tabeli 27, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 30 (66.67%) interakcija su sinergističke, 12 (26.67%) aditivne, dok 3 (6.67%) interakcije pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje- tetraciklin su sledeći: 3 (6.67%) interakcije pokazuju sinergizam, 7 (15.56%) aditivno dejstvo, dok 35 (77.78%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem ulje-streptomicin, dao je 17 (37.78%) sinergističkih, 10 (22.22%) aditivnih i 18 (40.00%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema P. longifolium ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1   Slika 26. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {P. longifolium ulje-hloramfenikol (1*); P. longifolium ulje-tetraciklin (2*); P. longifolium ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. svojstveni vektor objasnio je 89.24% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 6.30% (Slika 26A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 26B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema P. longifolium ulje-antibiotici (Slika 26C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥3.81 (Slika 26D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena od kombinacija P. longifolium ulje-streptomicin i P. longifolium ulje-tetraciklin, pokazivala je dominantan antagonizam u odnosu na ispitane sojeve (Slika 26C, D). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.47, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (A1 i A2). U podgrupi A1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan antagonizam za sve FICA vrednosti. Podgrupa A2, sastavljena od kombinacije P. longifolium ulje-tetraciklin, pored dominantnog antagonizma, ispoljavala je pojavu sinergističkog i 110  aditivnog dejstva za vrednosti FICA ≤0.30 (Slika 26B, D). Grupa B, grupa dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Najveći broj sinergističkih interakcija grupe B, je posledica kombinovane interakcije ulja sa hloramfenikolom (Slika 26C, D). 4.6.9. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema P. officinale ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 28. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između etarskog ulja P. officinale i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 56 (41.48%) su pokazali sinergističko delovanje, 33 (24.44%) aditivno dejstvo dok 46 (34.07%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Tabela 28. Antibakterijska aktivnost sistema P. officinale ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi P. officinale ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.32 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.28 2* 0.21 0.44 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.23 1.70 2.23 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.68 0.82 0.96 0.95 1.08 1.21 1.34 1.66 3* 0.43 0.56 0.69 0.68 1.10 0.76 1.04 0.98 1.28 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.54 0.56 0.69 0.82 0.80 0.92 1.04 0.98 1.28 2* 0.65 0.56 0.69 0.68 1.10 0.92 1.04 0.98 1.28 3* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.80 0.92 0.87 0.98 1.28 2* 0.65 0.80 1.08 1.24 1.25 1.24 1.21 1.34 1.85 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 1.88 2.42 S. aureus ATCC 29213 1* 1.09 1.04 0.95 1.10 1.10 1.08 1.21 1.34 1.47 2* 0.65 0.68 0.82 0.96 1.10 1.08 1.04 1.34 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). Slično prethodno analiziranim uljima, izuzev ulja S. kitaibelii, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom P. officinale ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 55.56%. Najviši procenat aditivnog dejstva (31.11%) zabeležen je kod kombinacija ulje-hloramfenikol i ulje- tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (62.22%) zabeležen u interakciji ulja sa 111  streptomicinom. Slično etarskom ulju N. nuda i L. montana, najbolji rezultati kombinovane interakcije sa ispitanim antibioticima su postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Na ovom soju, kombinacija ulje-antibiotik je pokazala 59.26% sinergističkih interakcija, 33.33% aditivnih interakcija i 7.41% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (14.81%), E. coli ATCC 25922 (37.04%), S. aureus ATCC 29213 (51.85%), P. aeruginosa ATCC 27853 (59.26%). Na osnovu rezultata u Tabeli 28, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 25 (55.56%) interakcija su sinergističke, 14 (31.11%) aditivne, dok 6 (13.33%) interakcija pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje- tetraciklin su sledeći: 19 (42.22%) interakcija pokazuju sinergizam, 14 (31.11%) aditivno dejstvo, dok 12 (26.67%) interakcija pokazuju antagonizam. Slika 27. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {P. officinale ulje-hloramfenikol (1*); P. officinale ulje-tetraciklin (2*); P. officinale ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 112  Sistem ulje-streptomicin, dao je 12 (26.67%) sinergističkih, 5 (11.11%) aditivnih i 28 (62.22%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema P. officinale ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 94.36% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 2.66% (Slika 27A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 27B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema P. officinale ulje-antibiotici (Slika 27C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥4.08 (Slika 27D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije P. officinale ulje-streptomicin, pokazivala je snažan antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213 bakterijske sojeve. Slični rezulatati antagonizma sa streptomicinom, pokazani su kod ranije diskutovanog T. glabrescens etarskog ulja. Grupa B, dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.63, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). U podgrupi B1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan aditivan efekat, dok se podgrupa B2 karakterisala dominantnim sinergizmom. Najveći broj sinergističkih interakcija grupe B, je posledica kombinovane interakcije ulja sa hloramfenikolom, dok su aditivne interakcije karakteristične za tetraciklin (Slika 27C, D). 4.6.10. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema I. graveolens ulje-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između ispitanog ulja i antibiotika dati su u Tabeli 29. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između etarskog ulja I. graveolens i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 57 (42.22%) su pokazali sinergističko delovanje, 42 (31.11%) aditivno dejstvo dok 36 (26.67%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Slično prethodno analiziranim uljima, izuzev ulja S. kitaibelii, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom I. graveolens ulja sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 60.00%. Najviši procenat aditivnog dejstva (44.44%) zabeležen je u kombinaciji ulje-tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (55.56%) zabeležen u interakciji ulja sa streptomicinom. Slično etarskom ulju N. nuda, L. montana i P. officinale, najbolji rezultati kombinovane interakcije sa ispitanim antibioticima su postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Na 113  ovom soju, kombinacija ulje-antibiotik je pokazala 55.56% sinergističkih interakcija, 37.04% aditivnih interakcija i 7.41% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (11.11%), P. aeruginosa ATCC 27853 (29.63%), E. coli ATCC 25922 (40.74%), S. aureus ATCC 29213 (44.44%). Tabela 29. Antibakterijska aktivnost sistema I. graveolens ulje-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi I. graveolens ulja 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.68 0.69 0.82 0.95 0.92 1.04 1.16 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.32 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.92 0.82 0.82 0.95 1.08 1.21 1.34 1.47 3* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.43 0.56 0.69 0.82 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.68 0.82 0.96 0.95 1.08 1.04 1.16 1.28 3* 0.54 0.56 0.69 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.56 0.69 0.82 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.92 1.08 1.10 1.10 1.08 1.04 0.98 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 1.40 0.87 0.98 1.66 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 1.04 1.08 1.10 1.10 1.08 0.87 0.98 1.09 2* 0.43 0.56 0.69 0.82 0.95 0.92 1.04 1.16 1.28 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.04 * Ispitani sistemi: ulje-hloramfenikol (1*); ulje-tetraciklin (2*); ulje-streptomicin (3*). Na osnovu rezultata u Tabeli 29, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema ulje-hloramfenikol, 27 (60.00%) interakcija su sinergističke, 17 (37.78%) aditivne, dok 1 (2.22%) interakcija pokazuje antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema ulje- tetraciklin su sledeći: 15 (33.33%) interakcija pokazuju sinergizam, 20 (44.44%) aditivno dejstvo, dok 10 (22.22%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem ulje-streptomicin, dao je 15 (33.33%) sinergističkih, 5 (11.11%) aditivnih i 25 (55.56%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema I. graveolens ulje-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 86.10% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 10.65% (Slika 28A). 114   Slika 28. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {I. graveolens ulje-hloramfenikol (1*); I. graveolens ulje-tetraciklin (2*); I. graveolens ulje-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 28B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema I. graveolens ulje-antibiotici (Slika 28C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥4.08 (Slika 28D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije I. graveolens ulje-streptomicin, pokazivala je dominantan antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213 bakterijske sojeve. Slični rezulatati antagonizma sa streptomicinom, pokazani su kod ranije diskutovanih T. glabrescens i P. officinale ulja. U okviru grupe A, za vrednosti FICA ≥0.60, uočena je niža vrednost antagonizma i sinergističko dejstvo kombinacije na P. aeruginosa ATCC 27853 soj (Slika 28B, D). Grupa B, dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija ulja, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj 115  ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.53, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). U podgrupi B1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan aditivan efekat, dok se podgrupa B2 karakterisala dominantnim sinergizmom. Najveći broj sinergističkih interakcija grupe B, je posledica kombinovane interakcije ulja sa hloramfenikolom, dok su aditivne interakcije karakteristične za tetraciklin (Slika 28C, D). 4.6.11. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema geraniol-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između geraniola i antibiotika dati su u Tabeli 30. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između geraniola i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 50 (37.04%) su pokazali sinergističko delovanje, 36 (26.67%) aditivno dejstvo dok 49 (36.30%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom geraniola sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 57.78%. Sličan efekat sa hloramfenikolom su pokazala i sva prethodno ispitana ulja, izuzev ulja S. kitaibelii u kojem je geraniol sa 50.43% zastupljenosti činio glavnu komponentu. Visok procenat aditivnog dejstva (33.33%) zabeležen je u kombinaciji geraniol- hloramfenikol, dok je najviši procenat antagonizma (64.44%) zabeležen u interakciji geraniola sa streptomicinom. Najbolji rezultati kombinovane interakcije geraniola i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Interesantno je napomenuti, da su ulja sa visokim sadržajem geraniola (T. pulegioides, S. kitaibelii i T. glabrescens) najbolje rezultate kombinovane interakcije pokazivala na sojevima S. aureus ATCC 29213 i K. pneumoniae ATCC 700603. Na soju P. mirabilis ATCC 12453, kombinacija geraniol-antibiotik je pokazala 48.15% sinergističkih interakcija, 48.15% aditivnih interakcija i 3.70% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (25.93%), E. coli ATCC 25922 (37.04%), P. aeruginosa ATCC 27853 (48.15%), S. aureus ATCC 29213 (66.67%). Na osnovu rezultata u Tabeli 30, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema geraniol-hloramfenikol, 26 (57.78%) interakcija su sinergističke, 15 (33.33%) aditivne, dok 4 (8.89%) interakcije pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema geraniol-tetraciklin su sledeći: 15 (33.33%) interakcija pokazuju sinergizam, 14 (31.11%) aditivno dejstvo, dok 16 (35.56%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem geraniol- streptomicin, dao je 9 (20.00%) sinergističkih, 7 (15.56%) aditivnih i 29 (64.44%) antagonističkih interakcija. 116  Tabela 30. Antibakterijska aktivnost sistema geraniol-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi geraniola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.32 0.32 0.43 0.54 0.80 0.76 0.87 0.98 1.28 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.80 0.95 1.10 1.25 1.24 1.38 1.34 1.66 3* 0.32 0.44 0.56 0.68 0.80 1.08 1.04 1.16 1.28 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.43 0.56 0.69 0.68 0.80 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.80 0.82 0.96 0.95 0.92 1.04 0.98 1.47 3* 0.54 0.92 0.82 0.82 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.54 0.56 0.69 0.82 0.80 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.92 1.08 1.38 1.10 1.08 1.21 1.16 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 1.16 2.80 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 1.04 1.08 1.10 1.10 1.08 1.21 1.34 1.47 2* 0.76 0.80 0.95 1.10 1.25 1.24 1.21 1.34 1.85 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.06 2.24 2.23 * Ispitani sistemi: geraniol-hloramfenikol (1*); geraniol-tetraciklin (2*); geraniol-streptomicin (3*). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema geraniol-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 90.34% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 4.55% (Slika 29A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 29B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema geraniol- antibiotici (Slika 29C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.71 (Slika 29D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije geraniol-streptomicin, pokazivala je izražen antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213 bakterijske sojeve. Slični rezultati antagonizma sa streptomicinom, pokazani su kod ranije diskutovanih T. glabrescens i P. officinale ulja. Bitno je napomenuti, da sadržaj geraniola u ulju T. glabrescens iznosi 22.33%, dok prisustvo geraniola u ulju P. officinale nije zabeleženo. U grupi B, koja se pretežno odnosi na kombinaciju geraniol-tetraciklin, zabeležene su većim delom antagonističke interakcije, takođe, u manjem broju, su konstantovane aditivne i 117  118 sinergističke interakcije, sa vrednostima FICA ≤0.60 (Slika 29B, D). Grupa C, grupa dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija geraniola, antibiotika i ispitanih bakterija. Najveći broj sinergističkih interakcija grupe C, je posledica kombinovane interakcije ulja sa hloramfenikolom (Slika 29C, D). Slika 29. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {geraniol- hloramfenikol (1*); geraniol-tetraciklin (2*); geraniol-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 4.6.12. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema timol-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između timola i antibiotika dati su u Tabeli 31. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između timola i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 71 (52.59%) su pokazali sinergističko delovanje, 32 (23.70%) aditivno dejstvo dok 32 (23.70%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Slično geraniolu, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom timola sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 71.11%. Najviši procenat aditivnog dejstva (26.67%) zabeležen je u kombinaciji  Tabela 31. Antibakterijska aktivnost sistema timol-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi timola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 0.76 0.87 0.98 1.09 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.43 0.44 0.56 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.80 0.95 1.10 1.10 1.24 1.21 1.34 1.66 3* 1.20 1.40 1.60 1.10 0.65 0.76 0.87 0.98 1.28 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.43 0.56 0.69 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.68 0.69 0.54 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.54 0.68 0.69 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.92 1.21 1.24 1.10 0.76 0.87 0.98 1.47 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 1.88 0.87 0.98 1.66 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 1.40 1.21 0.82 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.40 1.60 1.80 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 0.95 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: timol-hloramfenikol (1*); timol-tetraciklin (2*); timol-streptomicin (3*). timol-tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (40.00%) zabeležen u interakciji timola sa streptomicinom. Slično geraniolu i pojedinim etarskim uljima, najbolji rezultati kombinovane interakcije timola i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Interesantno je napomenuti, da su najbolji rezultati kombinovane interakcije T. glabrescens ulja (timol-13.79%) sa antibioticima ostvareni na soju K. pneumoniae ATCC 700603. Na soju P. mirabilis ATCC 12453, kombinacija timol-antibiotik je pokazala 77.78% sinergističkih interakcija, 22.22% aditivnih interakcija, dok antagonizam nije zabeležen. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: E. coli ATCC 25922 (18.52%), K. pneumoniae ATCC 700603 (29.63%), S. aureus ATCC 29213 (33.33%), P. aeruginosa ATCC 27853 (37.04%). Na osnovu rezultata u Tabeli 31, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema timol-hloramfenikol, 32 (71.11%) interakcije su sinergističke, 10 (22.22%) aditivne, dok 3 (6.67%) interakcije su antagonističke. Rezultati kombinovane interakcije sistema timol- tetraciklin su sledeći: 22 (48.89%) interakcije pokazuju sinergizam, 12 (26.67%) aditivno dejstvo, dok 11 (24.44%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem timol-streptomicin, dao 119  je 17 (37.78%) sinergističkih, 10 (22.22%) aditivnih i 18 (40.00%) antagonističkih interakcija. Slika 30. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {timol- hloramfenikol (1*); timol-tetraciklin (2*); timol-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema timol-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 50.44% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 29.31% (Slika 30A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 30B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema timol-antibiotici (Slika 30C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.92 (Slika 30D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije timol-streptomicin, pokazala je dominantan antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922 i 120  P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijske sojeve. U okviru ove grupe, za vrednosti FICA ≥0.60, uočena je pojava aditivnog i sinergističkog dejstva (Slika 30B, C). Grupa B, grupa dominantnog sinergističkog i aditivnog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija timola, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.26, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). U podgrupi B1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan sinergistički i aditivan efekat, međutim, visok procenat antagonizma uočen je za FICA ≤0.40 (Slika 30B, C). Ispitane kombinacije podgrupe B2, usled dominantnih interakcija timola sa hloramfenikolom, odlikovale su se snažnim sinergizmom (Slika 30D). 4.6.13. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema linalool-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između linaloola i antibiotika dati su u Tabeli 32. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između linaloola i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 62 (45.93%) su pokazali sinergističko delovanje, 35 (25.93%) aditivno dejstvo dok 38 (28.15%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Slično geraniolu i timolu, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom linaloola sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 57.78%. Najviši procenat aditivnog dejstva (31.11%) zabeležen je u kombinaciji linalool-tetraciklin, dok je najviši procenat antagonizma (42.22%) zabeležen u interakciji linaloola sa streptomicinom. Najbolji rezultati kombinovane interakcije linaloola i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju K. pneumoniae ATCC 700603. Interesantno je napomenuti, da su ulja T. glabrescens (linalool-5.49%) i P. longifolium (linalool-0.56%) najbolje rezultate kombinovane interakcije pokazali u odnosu na K. pneumoniae ATCC 700603. Na ovom soju, kombinacija linalool-antibiotik je pokazala 55.56% sinergističkih interakcija, 33.33% aditivnih interakcija i 11.11% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: P. mirabilis ATCC 12453 (25.93%), P. aeruginosa ATCC 27853 (29.63%), S. aureus ATCC 29213 (29.63%), E. coli ATCC 25922 (44.44%). Na osnovu rezultata u Tabeli 32, pokazano je da od 45 interakcija sistema linalool- hloramfenikol, 26 (57.78%) interakcija su sinergističke, 10 (22.22%) aditivne, dok 9 (20.00%) interakcija pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema linalool-tetraciklin su sledeći: 21 (46.67%) interakcija pokazuje sinergizam, 14 (31.11%) aditivno dejstvo, dok 10 (22.22%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem linalool- streptomicin, dao je 15 (33.33%) sinergističkih, 11 (24.44%) aditivnih i 19 (42.22%) antagonističkih interakcija. 121  Tabela 32. Antibakterijska aktivnost sistema linalool-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi linaloola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.87 0.92 0.95 1.10 0.95 1.08 1.21 1.16 1.66 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.68 0.82 0.82 0.95 0.92 1.04 1.16 1.66 3* 0.76 1.16 0.95 0.96 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.68 0.69 0.82 0.80 0.92 0.87 0.98 1.47 3* 0.54 0.80 0.82 0.96 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.43 0.56 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.68 0.82 0.82 0.80 0.92 0.87 0.98 1.28 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 1.24 1.04 0.98 2.04 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 1.40 1.60 0.82 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.40 1.60 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: linalool-hloramfenikol (1*); linalool-tetraciklin (2*); linalool-streptomicin (3*). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema linalool-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 63.93% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 20.10% (Slika 31A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 31B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju ispitivanih antibakterijskih interakcija sistema linalool- antibiotici (Slika 31C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥4.11 (Slika 31D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena od kombinacija linalool-streptomicin i linalool-hloramfenikol, pokazivala je izražen antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, P. mirabilis ATCC 12453 i P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijske sojeve. U okviru ove grupe, kod oba antibiotika za vrednosti FICA ≥0.70, uočena je pojava aditivnih i sinergističkih interakcija (Slika 31B, C). Grupa B, dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija linaloola, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.87, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). U podgrupi B1 ispitane kombinacije pokazivale su sinergistički i aditivan efekat, međutim, 122  123 visok procenat antagonizma uočen je za FICA ≤0.30 (Slika 31B, C). Ispitane kombinacije podgrupe B2, odlikovale su se dominantnim sinergističkim interakcijama. Najviši procenat antagonističkih interakcija ove grupe javio se na soju E. coli ATCC 25922 za FICA ≥0.70 (Slika 31B, C). Slika 31. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {linalool- hloramfenikol (1*); linalool-tetraciklin (2*); linalool-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 4.6.14. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema eukaliptol-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između eukaliptola i antibiotika dati su u Tabeli 33. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između eukaliptola i tri antibiotika (hloramfenikol, tetraciklin i streptomicin), 43 (31.85%) su pokazali sinergističko delovanje, 32 (23.70%) aditivno dejstvo dok 60 (44.44%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Slično prethodno ispitanim supstancama, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom eukaliptola sa hloramfenikolom. Za ovaj antibiotik, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 51.11%. Najviši procenat aditivnog dejstva (31.11%)  Tabela 33. Antibakterijska aktivnost sistema eukaliptol-antibiotik, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi eukaliptola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.21 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.21 0.44 0.43 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.65 0.80 0.95 0.96 1.10 1.08 1.21 1.34 1.47 2* 0.87 0.92 1.08 1.24 1.85 1.40 1.55 1.70 2.04 3* 1.20 1.40 1.47 1.52 1.55 1.72 1.55 1.70 2.04 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.32 0.32 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.68 0.82 0.82 0.80 0.92 1.04 1.16 1.47 3* 1.20 1.04 0.82 0.82 0.80 0.92 1.04 1.16 1.47 S. aureus ATCC 29213 1* 1.20 1.40 1.21 1.10 1.10 1.08 1.04 1.16 1.47 2* 1.20 1.40 0.95 0.96 0.95 0.92 1.04 1.16 1.09 3* 0.87 1.04 0.69 0.82 0.80 0.92 1.04 1.16 1.47 * Ispitani sistemi: eukaliptol-hloramfenikol (1*); eukaliptol-tetraciklin (2*); eukaliptol-streptomicin (3*). zabeležen je u kombinaciji eukaliptol-hloramfenikol, dok je najviši procenat antagonizma (71.11%) zabeležen u interakciji eukaliptola sa streptomicinom. Najbolji rezultati kombinovane interakcije eukaliptola i antibiotika su postignuti na bakterijskom soju P. aeruginosa ATCC 27853. Važno je istaći, da su najbolji rezultati kombinovane interakcije ulja N. nuda (eukaliptol-45.96%) i antibiotika postignuti na bakterijskom soju P. mirabilis ATCC 12453. Na soju P. aeruginosa ATCC 27853, kombinacija eukaliptol-antibiotik je pokazala 55.56% sinergističkih interakcija, 25.93% aditivnih interakcija i 18.52% antagonističkih interakcija. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: E. coli ATCC 25922 (33.33%), S. aureus ATCC 29213 (37.04%), K. pneumoniae ATCC 700603 (66.67%), P. mirabilis ATCC 12453 (66.67%). Na osnovu rezultata u Tabeli 33, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema eukaliptol-hloramfenikol, 23 (51.11%) interakcije su sinergističke, 14 (31.11%) aditivne, dok 8 (17.78%) interakcija pokazuje antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema eukaliptol-tetraciklin su sledeći: 13 (28.89%) interakcija pokazuju sinergizam, 12 (26.67%) aditivno dejstvo, dok 20 (44.44%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem eukaliptol- 124  streptomicin, dao je 7 (15.56%) sinergističkih, 6 (13.33%) aditivnih i 32 (71.11%) antagonističke interakcije. Slika 32. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {eukaliptol- hloramfenikol (1*); eukaliptol-tetraciklin (2*); eukaliptol-streptomicin (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema eukaliptol-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 87.99% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 10.06% (Slika 32A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 32B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema eukaliptol-antibiotici (Slika 32C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥4.11 (Slika 32D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena od kombinacija eukaliptol-streptomicin i eukaliptol-tetraciklin, pokazivala je izražen 125  antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 bakterijske sojeve. U okviru ove grupe, za soj P. mirabilis ATCC 12453, uočene su nešto niže vrednosti antagonizma, kao i pojava aditivnih i sinergističkih interakcija za FICA ≤0.30 (Slika 32B, C). Grupa B, dominantnog sinergističkog i aditivnog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija eukaliptola, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.89, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). U podgrupi B1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan aditivan efekat, dok se podgrupa B2 odlikovala dominantnim sinergizmom. Visok procenat antagonizma odvojio je podgrupu B1 od podgrupe B2, gde pri svim FICA vrednostima, antagonizam nije detektovan (Slika 32B, C). 4.6.15. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema geranil acetat-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između geranil acetata i antibiotika dati su u Tabeli 34. Tabela 34. Antibakterijska aktivnost sistema geranil acetat-antibiotik, iskazana FICB i FCA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FCA indeksi geranil acetata 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.50 0.50 0.50 0.50 2* 0.50 0.50 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.50 0.50 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 2* 0.50 0.40 0.30 0.30 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 3* 0.40 0.40 0.30 0.30 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.90 0.80 0.70 0.70 0.60 0.60 0.60 0.50 0.50 2* 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.40 0.40 3* 0.90 0.90 0.70 0.70 0.60 0.60 0.60 0.50 0.50 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.90 0.90 0.80 0.80 0.80 0.80 0.70 0.70 0.70 2* 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.40 0.40 0.40 0.40 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.90 0.90 0.80 S. aureus ATCC 29213 1* 0.80 0.60 0.60 0.30 0.30 0.20 0.20 0.20 0.20 2* 0.50 0.40 0.40 0.40 0.40 0.30 0.30 0.30 0.30 3* 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.30 0.20 0.20 0.20 * Ispitani sistemi: geranil acetat-hloramfenikol (1*); geranil acetat-tetraciklin (2*); geranil acetat-streptomicin (3*). Kako geranil acetat nije pokazao antibakterijsku aktivnost u odnosu na ispitane "checkerboard" sojeve, ovde ne možemo govoriti o sinergizmu, aditivnim interakcijama ili 126  antagonizmu, već govorimo o pojačanju aktivnosti antibiotika (Chou, 2010). Za sinergističke, aditivne i antagonističke interakcije, koje su obostrane za kombinovane supstance, neophodno je odrediti minimalnu inhibitornu koncentraciju. Pošto kombinovani geranil acetat nema inhibitornu koncentraciju, ovde možemo govoriti samo o uvećanju aktivnosti antibiotika, koja se izražava stepenom uvećanja, procentom ili u našem slučaju FICB indeksom antibiotika (Chou, 2010). U cilju određivanja slične antibakterijske aktivnosti, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza (Ilić et al., 2014; Miladinović et al., 2014; Miladinović et al., 2013). PCA i HCA analiza je primenjena na sve FICB i FCA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema geranil acetat-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Slika 33. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {geranil acetat- hloramfenikol (1*); geranil acetat-tetraciklin (2*); geranil acetat-streptomicin (3*)} zasnovana na FICB vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FCA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 127  128 Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 89.35% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 8.89% (Slika 33A). Dijagram odgovornih FCA varijabli (Slika 33B), ilustruje uticaj FICB vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema geranil acetat-antibiotici (Slika 33C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.21 (Slika 33D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena od kombinacija geranil acetat-streptomicin i geranil acetat-hloramfenikol, pokazala je indiferentan ili neznatan uticaj na uvećanje aktivnosti antibiotika u odnosu na E. coli ATCC 25922, P. mirabilis ATCC 12453 i P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijske sojeve. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.11, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (A1 i A2). U podgrupi A1, izuzev vrednosti FCA ≥0.70, geranil acetat nije pojačao aktivnost streptomicina na ispitanim sojevima (Slika 33B, C). Ispitane kombinacije podgrupe A2, za sve FCA vrednosti, odlikovale su se neznatnim uvećanjem aktivnosti antibiotika (FICB ≥0.50), što je u najboljem slučaju iznosilo 2 puta. Grupa B, dominantnih vrednosti (0.20≤ FICB ≤0.50), sastojala se od svih ostalih kombinacija geranil acetata, antibiotika i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Ispitane kombinacije grupe B, sa dominantnim interakcijama geranil acetat-tetraciklin (Slika 33D), odlikovale su se uvećanjem aktivnosti antibiotika 2 do 5 puta. Na osnovu diskutovanih rezultata, vidimo da supstance koje nemaju antibakterijsku aktivnost, mogu uvećati aktivnost antibiotika. Ovo nam može pomoći u objašnjenju mehanizma antibakterijske aktivnosti etarskih ulja i njihovih komponenata, kao i objašnjenju mehanizma njihovog kombinovanog dejstva sa antibioticima. 4.6.16. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema limonen-antibiotik Rezultati odgovarajućih interakcija između limonena i antibiotika dati su u Tabeli 35. Kako limonen, slično geranil acetatu, nije pokazao antibakterijsku aktivnost u odnosu na ispitane "checkerboard" sojeve, ovde ne govorimo o sinergizmu ili antagonizmu, već o pojačanju aktivnosti antibiotika. Za sinergističke, aditivne i antagonističke interakcije, koje su obostrane za kombinovane supstance, neophodno je odrediti minimalnu inhibitornu koncentraciju. Pošto kombinovani limonen nema inhibitornu koncentraciju, ovde govorimo samo o uvećanju aktivnosti antibiotika, koja se izražava stepenom uvećanja, procentom ili FICB indeksom antibiotika (Chou, 2010). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FICB i FCA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema limonen-antibiotici u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 91.92% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio  Tabela 35. Antibakterijska aktivnost sistema limonen-antibiotik, iskazana FICB i FCA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FCA indeksi limonena 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2* 0.20 0.10 0.10 0.20 0.10 0.20 0.10 0.20 0.10 3* 0.90 0.90 0.50 0.50 0.30 0.10 0.10 0.10 0.10 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2* 0.80 0.70 0.70 0.50 0.40 0.30 0.30 0.30 0.20 3* 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.60 0.20 0.40 0.20 0.20 0.20 0.10 0.10 0.10 2* 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 3* 0.20 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 2* 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 S. aureus ATCC 29213 1* 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 2* 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 3* 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 * Ispitani sistemi: limonen-hloramfenikol (1*); limonen-tetraciklin (2*); limonen-streptomicin (3*). dodatnih 7.23% (Slika 34A). Dijagram odgovornih FCA varijabli (Slika 34B), ilustruje uticaj FICB vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema limonen- antibiotici (Slika 34C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.70 (Slika 34D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, sastavljena od kombinacija limonen-antibiotici, pokazala je indiferentan ili neznatan uticaj na uvećanje aktivnosti antibiotika u odnosu na P. mirabilis ATCC 12453, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213 bakterijske sojeve (Slika 34C, D). Ispitane kombinacije grupe A, za sve FCA vrednosti, odlikovale su se neznatnim uvećanjem aktivnosti antibiotika (FICB ≥0.50), što je u najboljem slučaju iznosilo 2 puta. Uticaj limonena na uvećanje antibakterijske aktivnosti streptomicina u ovoj grupi nije zabeležen. Grupa B, grupa dominantnih vrednosti (FICB ≤0.20), sastojala se od svih ostalih kombinacija limonena, antibiotika i ispitanih bakterija (Slika 34C, D). Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.28, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (B1 i B2). U podgrupi B1, za vrednosti FCA ≤0.40, uočen je slabiji uticaj limonena na aktivnost antibiotika (Slika 34B, C). Ispitane kombinacije podgrupe B2, za sve FCA vrednosti, 129  130 odlikovale su se znatnim uvećanjem aktivnosti antibiotika (FICB ≤0.20), što je u najboljem slučaju iznosilo 10 puta. Svi ovi rezultati, kao što je već napomenuto, mogu nam pomoći u objašnjenju mehanizma antibakterijske aktivnosti etarskih ulja i njihovih komponenata, kao i objašnjenju mehanizma njihovog kombinovanog dejstva sa antibioticima. Slika 34. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {limonen- hloramfenikol (1*); limonen-tetraciklin (2*); limonen-streptomicin (3*)} zasnovana na FICB vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FCA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 4.6.17. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema geraniol-monoterpenoid Rezultati odgovarajućih interakcija između geraniola i pojedinih terpenoida ulja, dati su u Tabeli 36. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između geraniola i tri monoterpenoida (timol, linalool i eukaliptol), 34 (25.19%) su pokazali sinergističko delovanje, 58 (42.96%) aditivno dejstvo dok 43 (31.85%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom geraniola sa linaloolom. Za ovaj monoterpenoid, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je  Tabela 36. Antibakterijska aktivnost sistema geraniol-monoterpenoid, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi geraniola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.76 0.92 0.95 0.96 1.10 1.08 1.04 1.16 1.28 2* 1.20 1.16 1.08 1.24 1.25 1.24 1.21 1.34 1.66 3* 1.20 1.40 1.60 1.24 1.25 1.24 1.21 1.16 1.28 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.98 1.04 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.47 2* 0.65 0.68 0.69 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 1.55 1.56 1.38 1.34 1.47 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 1.04 0.98 1.28 2* 0.76 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.28 3* 1.20 1.40 1.08 1.10 0.95 0.76 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.76 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.28 2* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 S. aureus ATCC 29213 1* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.87 1.04 0.95 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: geraniol-timol (1*); geraniol-linalool (2*); geraniol-eukaliptol (3*). 35.56%. Najviši procenat aditivnog dejstva (68.89%) zabeležen je u kombinaciji geraniol- timol, dok je najviši procenat antagonizma (64.44%) zabeležen u interakciji geraniola sa eukaliptolom. Najbolji rezultati kombinovane interakcije geraniola i monoterpenoida su postignuti na bakterijskom soju S. aureus ATCC 29213. Na ovom soju, kombinacija geraniol-monoterpenoid je pokazala 59.26% sinergističkih interakcija, 40.74% aditivnih interakcija, dok antagonizam nije zabeležen. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: P. mirabilis ATCC 12453 (14.81%), K. pneumoniae ATCC 700603 (37.04%), P. aeruginosa ATCC 27853 (37.04%), E. coli ATCC 25922 (70.37%). Na osnovu rezultata u Tabeli 36, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema geraniol-timol, 9 (20.00%) interakcija su sinergističke, 31 (68.89%) aditivna, dok 5 (11.11%) interakcija pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema geraniol- linalool su sledeći: 16 (35.56%) interakcija pokazuju sinergizam, 20 (44.44%) aditivno dejstvo, dok 9 (20.00%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem geraniol-eukaliptol, dao je 9 (20.00%) sinergističkih, 7 (15.56%) aditivnih i 29 (64.44%) antagonističkih interakcija. 131   Slika 35. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {geraniol-timol (1*); geraniol-linalool (2*); geraniol-eukaliptol (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. U cilju određivanja slične antibakterijske aktivnosti, izvršena je hemometrijska PCA i HCA analiza (Ilić et al., 2014; Miladinović et al., 2014; Miladinović et al., 2013). PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema geraniol-monoterpenoidi u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 80.68% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 14.52% (Slika 35A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 35B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema geraniol-monoterpenoidi (Slika 35C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.42 (Slika 35D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije geraniol-eukaliptol, pokazivala je snažan antagonizam u odnosu na P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijski soj. U grupi B, za vrednosti FICA ≥0.50, kombinacije geraniol-eukaliptol i 132  geraniol-linalool pokazale su slab antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922 i K. pneumoniae ATCC 700603 sojeve (Slika 35B, C). Grupa C, grupa dominantnog aditivnog i sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija geraniola, monoterpenoida i ispitanih bakterija. Ova grupa, ujedno je sadržala i najveći broj ispitanih interakcija. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.47, HCA analiza je podelila ovu grupu na dve podgrupe (C1 i C2). U podgrupi C1 ispitane kombinacije pokazivale su dominantan aditivan efekat, dok se podgrupa C2 karakterisala dominantnim sinergizmom. Najveći broj aditivnih interakcija podgrupe C1, je posledica kombinovane interakcije geraniola sa timolom. 4.6.18. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema timol-monoterpenoid Rezultati odgovarajućih interakcija između timola i pojedinih terpenoida ulja, dati su u Tabeli 37. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između timola i tri monoterpenoida (geraniol, linalool i eukaliptol), 41 (30.37%) su pokazali sinergističko delovanje, 60 (44.44%) aditivno dejstvo dok 34 (25.19%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Tabela 37. Antibakterijska aktivnost sistema timol-monoterpenoid, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi timola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 1.20 1.04 1.08 0.96 0.95 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 1.20 1.16 1.21 1.24 1.10 1.08 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.34 1.38 1.25 1.24 1.04 0.98 1.09 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 1.08 1.04 0.98 1.09 2* 0.76 0.80 0.82 0.82 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 1.55 1.56 1.38 1.34 1.47 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.98 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.38 1.25 1.08 0.87 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.87 0.80 0.82 0.82 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 S. aureus ATCC 29213 1* 0.76 0.80 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.87 1.04 0.82 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.43 0.44 0.56 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: timol-geraniol (1*); timol-linalool (2*); timol-eukaliptol (3*). Slično geraniolu, najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom timola sa linaloolom. Za ove terpenoide, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 51.11%. Najviši procenat aditivnog dejstva (75.56%) zabeležen je u kombinaciji timol- 133  134 geraniol, dok je najviši procenat antagonizma (64.44%) zabeležen u interakciji timola sa eukaliptolom. Slično geraniolu, najbolji rezultati kombinovane interakcije timola i monoterpenoida su postignuti na bakterijskom soju S. aureus ATCC 29213. Na ovom soju, kombinacija timol-monoterpenoid je pokazala 59.26% sinergističkih interakcija, 40.74% aditivnih interakcija, dok antagonizam nije zabeležen. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: P. mirabilis ATCC 12453 (18.52%), K. pneumoniae ATCC 700603 (33.33%), P. aeruginosa ATCC 27853 (33.33%), E. coli ATCC 25922 (40.74%). Na osnovu rezultata u Tabeli 37, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema timol-geraniol, 10 (22.22%) interakcija su sinergističke, 34 (75.56%) aditivne, dok 1 (2.22%) interakcija pokazuje antagonizam. Poređenjem ovih rezultata sa rezultatima prethodno diskutovanog sistema geraniol-timol (Tabela 36), uočavamo da iste FICA vrednosti supstanci različito doprinose sinergizmu. Drugim rečima, u kombinaciji geraniol-timol, doprinos timola sinergizmu i aditivnom efektu, je izraženiji nego doprinos geraniola. Ovo se može objasniti na osnovu hidrofobnosti, lipofilnosti kao i log P vrednosti supstanci, o čemu ćemo govoriti prilikom objašnjenja mehanizma antibakterijske aktivnosti ispitanih kombinacija. Rezultati kombinovane interakcije sistema timol-linalool su sledeći: 23 (51.11%) interakcija pokazuju sinergizam, 18 (40.00%) aditivno dejstvo, dok 4 (8.89%) interakcije pokazuju antagonizam. Sistem timol-eukaliptol, dao je 8 (17.78%) sinergističkih, 8 (17.78%) aditivnih i 29 (64.44%) antagonističkih interakcija. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema timol-monoterpenoidi u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 77.84% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 17.81% (Slika 36A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 36B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema timol- monoterpenoidi (Slika 36C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.42 (Slika 36D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije timol-eukaliptol, pokazala je snažan antagonizam u odnosu na P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijski soj. Slično ponašanje u vezi ove bakterije, imao je i prethodno diskutovani sistem geraniol-eukaliptol. U grupi B, za vrednosti FICA ≤0.50, kombinacije timol-monoterpenoidi pokazale su slab antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 sojeve. Sa povećanjem sadržaja   Slika 36. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {timol-geraniol (1*); timol-linalool (2*); timol-eukaliptol (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. timola u kombinacijama ispitane grupe (FICA ≥0.60), dominantan aditivan i sinergistički efekat je uočen (Slika 36B, C). Grupa C, grupa dominantnog aditivnog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija timola, monoterpenoida i ispitanih bakterija. Ova grupa, sadržala je najveći broj ispitanih interakcija i u okviru nje nije zabeležena pojava antagonizma. Visok procenat aditivnih i sinergističkih interakcija ove grupe je posledica interakcija timola sa geraniolom i linaloolom (Slika 36C, D). 4.6.19. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema linalool-monoterpenoid Rezultati odgovarajućih interakcija između linaloola i pojedinih terpenoida ulja, dati su u Tabeli 38. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između linaloola i tri monoterpenoida (geraniol, timol i eukaliptol), 47 (34.81%) su pokazali sinergističko delovanje, 49 (36.30%) aditivno dejstvo dok 39 (28.89%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. 135  Tabela 38. Antibakterijska aktivnost sistema linalool-monoterpenoid, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi linaloola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 1.20 1.40 1.21 1.24 1.25 1.08 1.21 1.16 1.28 2* 0.87 1.04 1.08 1.10 1.25 1.24 1.21 1.16 1.28 3* 1.20 1.40 1.34 1.38 1.40 1.40 1.38 1.34 1.47 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 0.65 0.68 0.69 0.68 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.80 0.82 0.82 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.24 1.10 0.76 0.87 0.98 1.09 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.24 1.10 0.92 1.04 0.98 1.09 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 0.87 0.92 0.95 0.96 0.95 0.92 0.87 0.98 1.09 2* 0.76 0.80 0.82 0.82 0.80 0.92 0.87 0.98 1.09 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 S. aureus ATCC 29213 1* 0.65 0.68 0.82 0.96 0.95 1.08 0.87 0.98 1.09 2* 0.54 0.68 0.82 0.82 0.95 1.08 0.87 0.98 1.09 3* 0.43 0.56 0.69 0.68 0.80 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: linalool-geraniol (1*); linalool-timol (2*); linalool-eukaliptol (3*). Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom linaloola sa timolom. Za ovaj monoterpenoid, ukupan procenat sinergističkih interakcija iznosio je 48.89%. Najviši procenat aditivnog dejstva (46.67%) zabeležen je u kombinaciji linalool-geraniol, dok je najviši procenat antagonizma (57.78%) zabeležen u interakciji linaloola sa eukaliptolom. Slično geraniolu i timolu, najbolji rezultati kombinovane interakcije linaloola i monoterpenoida su postignuti na bakterijskom soju S. aureus ATCC 29213. Na ovom soju, kombinacija linalool-monoterpenoid je pokazala 59.26% sinergističkih interakcija, 40.74% aditivnih interakcija, dok antagonizam nije zabeležen. Na osnovu procenta antagonističkih interakcija, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: K. pneumoniae ATCC 700603 (14.81%), P. mirabilis ATCC 12453 (14.81%), P. aeruginosa ATCC 27853 (33.33%), E. coli ATCC 25922 (81.48%). Na osnovu rezultata u Tabeli 38, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema linalool-geraniol, 16 (35.56%) interakcija su sinergističke, 21 (46.67%) aditivna, dok 8 (17.78%) interakcija pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema linalool-timol su sledeći: 22 (48.89%) interakcije pokazuju sinergizam, 18 (40.00%) aditivno dejstvo, dok 5 (11.11%) interakcija pokazuju antagonizam. Poređenjem ovih rezultata sa 136  rezultatima prethodno diskutovanih sistema geraniol-linalool i timol-linalool (Tabele 36 i 37), uočavamo da iste FICA vrednosti supstanci različito doprinose sinergizmu. Drugim rečima, u kombinaciji geraniol-linalool, doprinos linaloola aditivnom efektu je izraženiji nego doprinos geraniola. U kombinaciji timol-linalool, doprinos timola sinergizmu je izraženiji nego doprinos linaloola. Kao što je već rečeno, ovo se može objasniti na osnovu hidrofobnosti, lipofilnosti kao i log P vrednosti supstanci, o čemu ćemo govoriti kasnije. Sistem linalool- eukaliptol, dao je 9 (20.00%) sinergističkih, 10 (22.22%) aditivnih i 26 (57.78%) antagonističkih interakcija. Slika 37. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {linalool- geraniol (1*); linalool-timol (2*); linalool-eukaliptol (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema linalool-monoterpenoidi u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 78.77% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio 137  138 dodatnih 18.32% (Slika 37A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 37B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema linalool- monoterpenoidi (Slika 37C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥1.87 (Slika 37D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena samo od kombinacije linalool-eukaliptol, pokazala je snažan antagonizam u odnosu na P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijski soj. Slično ponašanje u vezi ove bakterije, pokazali su i prethodno diskutovani sistemi geraniol-eukaliptol i timol-eukaliptol. U grupi B, kombinacije linalool- monoterpenoidi pokazale su slab antagonizam u odnosu na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 sojeve sa pojavom aditivnih i sinergističkih interakcija. Sa povećanjem sadržaja linaloola u kombinacijama ispitane grupe (FICA ≥0.50), dominantan aditivan i sinergistički efekat je uočen u odnosu na K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 sojeve (Slika 37B, C). Grupa C, grupa dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od svih ostalih kombinacija linaloola, monoterpenoida i ispitanih bakterija. Ova grupa, sadržala je najveći broj ispitanih interakcija i u okviru nje zabeležena pojava antagonizma. Visok procenat sinergističkih i aditivnih interakcija ove grupe je posledica interakcija linaloola sa geraniolom i timolom (Slika 37C, D). 4.6.20. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema eukaliptol-monoterpenoid Rezultati odgovarajućih interakcija između eukaliptola i pojedinih terpenoida ulja, dati su u Tabeli 39. Na osnovu 135 ispitanih odnosa između eukaliptola i tri monoterpenoida (geraniol, timol i linalool), 24 (17.78%) su pokazali sinergističko delovanje, 22 (16.30%) aditivno dejstvo dok 89 (65.93%) odnosa su pokazali antagonističko delovanje. Najbolji rezultati antibakterijske aktivnosti su ostvareni kombinacijom eukaliptola sa linaloolom, gde je zbir sinergističkih i aditivnih interakcija iznosio 37.78%. Za sve ispitane monoterpenoide, procenat sinergističkih interakcija iznosio je 17.78%. Najviši procenat aditivnog dejstva (20.00%) zabeležen je u kombinaciji eukaliptol-linalool, dok je najviši procenat antagonizma (68.89%) zabeležen u interakciji eukaliptola sa timolom. Slično geraniolu, timolu i linaloolu, najbolji rezultati kombinovane interakcije eukaliptola i monoterpenoida su postignuti na bakterijskom soju S. aureus ATCC 29213. Na ovom soju,  Tabela 39. Antibakterijska aktivnost sistema eukaliptol-monoterpenoid, iskazana FIC i FICA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FICA indeksi eukaliptola 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 1.20 1.16 1.21 1.24 1.25 1.24 1.38 1.52 1.85 2* 0.98 1.04 1.21 1.24 1.25 1.40 1.38 1.34 1.85 3* 1.20 1.40 1.34 1.38 1.40 1.40 1.38 1.34 2.04 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 1.20 1.40 1.34 1.38 1.55 1.56 1.55 1.70 2.04 2* 1.20 1.40 1.34 1.38 1.55 1.56 1.55 1.70 2.04 3* 0.76 0.92 1.08 1.10 1.25 1.24 1.38 1.52 1.66 P. mirabilis ATCC 12453 1* 0.76 0.92 0.95 1.10 1.10 1.08 1.21 1.34 1.47 2* 0.87 1.04 1.08 1.24 1.25 1.40 1.38 1.52 1.85 3* 0.98 0.92 1.08 1.10 1.25 1.24 1.38 1.52 1.66 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 2* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3* 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 S. aureus ATCC 29213 1* 0.65 0.44 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 2* 0.65 0.44 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 3* 0.76 0.68 0.43 0.54 0.65 0.76 0.87 0.98 1.09 * Ispitani sistemi: eukaliptol-geraniol (1*); eukaliptol-timol (2*); eukaliptol-linalool (3*). kombinacija eukaliptol-monoterpenoid je pokazala 77.78% sinergističkih interakcija, 22.22% aditivnih interakcija, dok antagonizam nije zabeležen. Ovde je bitno istaći, da od ispitanih "checkerboard" sojeva, jedino S. aureus ATCC 29213 soj je predstavnik Gram-pozitivnih bakterija. Sasvim je poznato, da se slabija rezistentnost Gram-pozitivnih bakterija u odnosu na antibiotike, objašnjava odsustvom spoljne mebrane (McDonnell & Denver Russell, 1999). Na osnovu procenta antagonističkih interakcija sistema eukaliptol-monoterpenoid, redosled bakterijskih sojeva je sledeći: P. mirabilis ATCC 12453 (51.85%), K. pneumoniae ATCC 700603 (85.19%), E. coli ATCC 25922 (92.59%), P. aeruginosa ATCC 27853 (100.00%). Važno je uočiti, da svi ispitani monoterpenoidi u odnosu na P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijski soj, iskazuju antagonističke interakcije kombinovanja sa eukaliptolom. Na osnovu rezultata u Tabeli 39, pokazano je da od 45 kombinovanih interakcija sistema eukaliptol-geraniol, 8 (17.78%) interakcija su sinergističke, 7 (15.56%) aditivne, dok 30 (66.67%) interakcija pokazuju antagonizam. Rezultati kombinovane interakcije sistema eukaliptol-timol su sledeći: 8 (17.78%) interakcija pokazuju sinergizam, 6 (13.33%) aditivno dejstvo, dok 31 (68.89%) interakcija pokazuju antagonizam. Sistem eukaliptol-linalool, dao je 8 (17.78%) sinergističkih, 9 (20.00%) aditivnih i 28 (62.22%) antagonističkih interakcija. 139   Slika 38. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {eukaliptol- geraniol (1*); eukaliptol-timol (2*); eukaliptol-linalool (3*)} zasnovana na FIC vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FICA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. Poređenjem ovih rezultata sa rezultatima prethodno diskutovanih sistema (Tabele 36-38), uočavamo da iste FICA vrednosti supstanci različito doprinose sinergizmu i antagonizmu. Drugim rečima, u međusobnim kombinacijama čistih supstanci, doprinos eukaliptola sinergizmu i aditivnim interakcijama je manji nego doprinos ostalih monoterpenoida. Kao što je već rečeno, odgovor na ovu pojavu će se tražiti u hidrofobnosti, lipofilnosti i log P vrednosti ispitanih supstanci. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FIC i FICA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema eukaliptol-monoterpenoidi u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 92.30% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 5.90% (Slika 38A). Dijagram odgovornih FICA varijabli (Slika 38B), ilustruje uticaj FIC vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema eukaliptol- 140  141 monoterpenoidi (Slika 38C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.47 (Slika 38D), HCA analiza je identifikovala tri grupe interakcija (A, B i C). Grupa A, sastavljena od kombinacija eukaliptol-monoterpenoidi, pokazala je snažan antagonizam u odnosu na P. aeruginosa ATCC 27853 bakterijski soj. Grupa B, grupa dominantnog antagonizma, sadržala je najveći broj ispitanih interakcija na E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603 i P. mirabilis ATCC 12453 sojeve. U okviru ove grupe, zabeležene su nešto niže vrednosti antagonizma, kao i pojava dominantnih sinergističkih i aditivnih efekata (FICA≤0.40) kod soja P. mirabilis ATCC 12453 (Slika 38C, D). Grupa C, grupa dominantnog sinergističkog dejstva, sastojala se od kombinacija eukaliptola i monoterpenoida na soju S. aureus ATCC 29213. Kao što se može videti, sinergizam eukaliptola i ostalih monoterpenoida uočen je jedino kod Gram-pozitivne bakterije (Slika 38C, D). 4.6.21. Analiza antibakterijske aktivnosti sistema geranil acetat-monoterpenoid Rezultati odgovarajućih interakcija između geranil acetata i pojedinih terpenoida ulja dati su u Tabeli 40. Kako geranil acetat nije pokazao antibakterijsku aktivnost u odnosu na ispitane "checkerboard" sojeve, ovde ne govorimo o sinergizmu, aditivnim interakcijama ili antagonizmu, već govorimo o uvećanju i pojačanju antibakterijske aktivnosti terpenoida (Chou, 2010). Kao što je već rečeno, za sinergističke, aditivne i antagonističke interakcije, koje su obostrane za kombinovane supstance, neophodno je odrediti minimalnu inhibitornu koncentraciju. Pošto kombinovani geranil acetat nema inhibitornu koncentraciju, ovde govorimo samo o uvećanju aktivnosti monoterpenoida, koja se izražava stepenom uvećanja, procentom ili u našem slučaju FICB indeksom monoterpenoida (Chou, 2010). Na osnovu rezultata datih u Tabeli 40, uočavamo da geranil acetat nema uticaj na antibakterijsku aktivnost ispitanih monoterpenoida (FICB = 1.00). Ujedno, zbog jednoličnosti rezultata i odsustva varijanse, hemometrijska PCA i HCA analiza je zanemarena. Ishod ovog istraživanja nam ukazuju, da visok procenat geranil acetata u uljima poput T. glabrescens (19.38%) i T. pulegioides (8.47%) nema uticaj na aktivnost geraniola i ostalih proučavanih monoterpenoida. 4.6.22. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema limonen-monoterpenoid Rezultati odgovarajućih interakcija između limonena i monoterpenoida dati su u Tabeli 41. Kako limonen, slično geranil acetatu, nije pokazao antibakterijsku aktivnost u odnosu na ispitane "checkerboard" sojeve, ovde govorimo o uvećanju aktivnosti monoterpenoida, koja  Tabela 40. Antibakterijska aktivnost sistema geranil acetat-monoterpenoid, iskazana FICB i FCA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FCA indeksi geranil acetata 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 P. mirabilis ATCC 12453 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 S. aureus ATCC 29213 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 * Ispitani sistemi: geranil acetat-geraniol (1*); geranil acetat-timol (2*); geranil acetat-linalool (3*); geranil acetat-eukaliptol (4*). se izražava stepenom uvećanja, procentom ili FICB indeksom monoterpenoida (Chou, 2010). Na osnovu rezultata datih u Tabeli 41, uočavamo da limonen za razliku od geranil acetata utiče na antibakterijsku aktivnost pojedinih monoterpenoida (FICB ≠ 1.00). Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve FICB i FCA vrednosti u cilju pronalaska sličnog antibakterijskog ponašanja sistema limonen-monoterpenoidi u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 98.58% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 1.42% (Slika 39A). Dijagram odgovornih FCA varijabli (Slika 39B), ilustruje uticaj FICB vrednosti na klasifikaciju posmatranih antibakterijskih interakcija sistema limonen- monoterpenoidi (Slika 39C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥2.53 (Slika 39D), HCA analiza je identifikovala dve grupe interakcija (A i B). Grupa A, grupa najvećeg broja 142  Tabela 41. Antibakterijska aktivnost sistema limonen-monoterpenoid, iskazana FICB i FCA indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FCA indeksi limonena 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1* 0.50 0.30 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2* 0.70 0.30 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 3* 0.80 0.30 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 P. mirabilis ATCC 12453 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 S. aureus ATCC 29213 1* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 3* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4* 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 * Ispitani sistemi: limonen-geraniol (1*); limonen-timol (2*); limonen-linalool (3*); limonen-eukaliptol (4*). ispitanih interakcija, pokazala je indiferentan uticaj limonena na antibakterijsku aktivnost monoterpenoida na K. pneumoniae ATCC 700603, P. mirabilis ATCC 12453, P. aeruginosa ATCC 27853 i S. aureus ATCC 29213 sojeve (Slika 39C, D). Ispitane kombinacije grupe B, odlikovale su se povećanjem aktivnosti monoterpenoida u odnosu na E. coli ATCC 25922. Kombinacije grupe B, za vrednosti FCA ≥0.20, karakterisale su se znatnim uvećanjem aktivnosti monoterpenoida (FICB ≤0.30), što je u najvećem broju slučaja iznosilo 10 puta (Slika 39B, C). Pojačanje antibakterijske aktivnosti eukaliptola limonenom u odnosu na E. coli ATCC 25922 nije zabeležen. Ishod ovog istraživanja nam ukazuje, da visok procenat limonena u uljima poput P. officinale (13.75%) i P. longifolium (8.23%), može znatno povećati antibakterijsku aktivnost pojedinih komponenti ulja u odnosu na E. coli ATCC 25922. 143   Slika 39. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti ispitanih sistema {limonen- geraniol (1*); limonen-timol (2*); limonen-linalool (3*); limonen-eukaliptol (4*)} zasnovana na FICB vrednostima: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih FCA varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih interakcija; (D) dendrogram HCA analize. 4.6.23. Analiza antibakterijske aktivnosti sistema limonen-geranil acetat Rezultati odgovarajućih interakcija između limonena i geranil acetata dati su u Tabeli 42. Kako geranil acetat a ni limonen, nisu pokazali antibakterijsku aktivnost u odnosu na ispitane "checkerboard" sojeve, ovde ne možemo govoriti niti o sinergizmu, aditivnim interakcijama antagonizmu, niti o uvećanju i pojačanju antibakterijske aktivnosti supstanci. Na osnovu rezultata datih u Tabeli 42, uočavamo da kombinacija limonena i geranil acetat nema antibakterijsku aktivnost na ispitanim sojevima (FCB = 1.00). Ujedno, zbog jednoličnosti rezultata i odsustva varijanse, hemometrijska PCA i HCA analiza je zanemarena. Ishod ovog istraživanja ukazuje da kombinacija antibakterijsko neaktivnih supstanci, ne može posedovati antibakterijska svojstva i eliminiše bilo kakvu sumnju vezano za istraživanje "checkerboard" metodom. 144  145 Tabela 42. Antibakterijska aktivnost sistema limonen-geranil acetat, iskazana FCA i FCB indeksima ispitanih supstanci. Bakterija FCA indeksi limonena 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 E. coli ATCC 25922 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 K. pneumoniae ATCC 700603 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 P. mirabilis ATCC 12453 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 P. aeruginosa ATCC 27853 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 S. aureus ATCC 29213 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 4.6.24. Hemometrijska analiza antibakterijske aktivnosti sistema supstanca-antibiotik-bakterijski soj Na osnovu prethodno diskutovanih rezultata (Tabele 22-35), cilj ovog istraživanja je bio pronalazak supstanci sa sličnim efektom pojačanja antibakterijske aktivnosti antibiotika. Pojačanje aktivnosti antibiotika, izraženo stepenom smanjenja njihove MIC vrednosti na osnovu minimalnih FICA i FCA vrednosti supstanci, dato je u Tabeli 43. Hemometrijska PCA i HCA analiza je primenjena na sve vrednosti Tabele 43, u cilju pronalaska supstanci sa sličnim efektom pojačanja antibakterijske aktivnosti antibiotika u odnosu na ispitane sojeve. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 28.56% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 19.68% (Slika 40A). Dijagram odgovornih varijabli (Slika 40B), ilustruje uticaj sistema antibiotik-bakterijski soj na klasifikaciju posmatranih supstanci (Slika 40C). Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥24.90 (Slika 40D), HCA analiza je identifikovala tri grupe supstanci (A, B i C). Grupa A, sastavljena od etarskog ulja L. montana, timola i linaloola, pokazala je najbolju interakciju sa antibioticima na ispitanim sojevima. Ova grupa je u kombinaciji sa izabranim antibioticima smanjila njihovu MIC vrednost 10 puta i to u 11, od 15 ispitivanih sistema. Grupa B, grupa najvećeg broja ispitanih supstanci, sadržala je nešto niže vrednosti interakcija u odnosu na grupu A, ali i dalje je pokazala izuzetne rezultate u pogledu smanjenja MIC vrednosti antibiotika. Ustanovljeno je desetostruko amanjenje MIC vrednosti, u 10, od 15 proučavanih kombinacija. S druge strane, eukaliptol i geranil acetat, u okviru grupe C, nisu dali zadovoljavajuće rezultate. Grupa C se karakteriše neznatnim   Tabela 43. Stepen smanjenja MIC vrednosti antibiotika na testiranim bakterijskim sojevima, usled kombinovane interakcija sa ispitanim supstancama, minimalnih FICA i FCA vrednosti. Bakterija T . p u l e g i o i d e s T . g l a b r e s c e n s S . k i t a i b e l i i N . n u d a L . m o n t a n a P . l o n g i f o l i u m P . o f f i c i n a l e I . g r a v e o l e n s G e r a n i o l T i m o l L i n a l o o l E u k a l i p t o l G e r a n i l a c e t a t L i m o n e n E. coli ATCC 25922 1* 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 2.0 10.0 2* 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 – 10.0 3.3 10.0 10.0 1.4 10.0 2.5 10.0 3* – 10.0 – – – – – – – 10.0 – – – 10.0 K. pneumoniae ATCC 700603 1* 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 2.5 10.0 2* 2.5 2.0 10.0 – 2.5 – 2.5 3.3 2.0 2.0 3.3 – 5.0 5.0 3* 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 5.0 10.0 10.0 – 5.0 10.0 P. mirabilis ATCC 12453 1* 10.0 5.0 – 5.0 10.0 3.3 5.0 10.0 10.0 10.0 10.0 2.0 2.0 10.0 2* 3.3 3.3 3.3 – 10.0 2.0 5.0 2.5 2.5 10.0 10.0 1.4 2.5 1.1 3* 3.3 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 – 2.0 10.0 P. aeruginosa ATCC 27853 1* 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 1.4 2.0 2* 3.3 2.5 2.5 – 10.0 1.7 2.0 1.7 1.7 10.0 10.0 5.0 2.5 1.2 3* – – – – – – – 10.0 – 10.0 – 5.0 1.2 – S. aureus ATCC 29213 1* 10.0 – 10.0 10.0 10.0 10.0 – 10.0 – 10.0 10.0 – 5.0 1.4 2* 10.0 2.5 10.0 – 10.0 – 2.5 3.3 2.0 10.0 10.0 – 3.3 10.0 3* 10.0 – 10.0 – 10.0 10.0 – – – 10.0 10.0 5.0 5.0 10.0 * Ispitani antibiotici: hloramfenikol (1*); tetraciklin (2*); streptomicin (3*).   Slika 40. Hemometrijska analiza sinergističkog potencijala ispitanih supstanci zasnovana na stepenu smanjenja MIC vrednosti ispitanih antibiotika: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih supstanci; (D) dendrogram HCA analize. smanjenjem MIC vrednosti antibiotika ili indiferentnošću eukaliptola u odnosu na posmatrane sisteme (Slika 40B, D). Međutim, izuzev eukaliptola, rezultati grupe C su ohrabrujući, imajući na umu da geranil acetat iako nema antibakterijsku aktivnost snižava MIC vrednost antibiotika. Hemometrijskom analizom diskutovanih rezultata (Tabela 43), želeli smo objasniti ponašanje sistema supstanaca-antibiotik-bakterijski soj zavisno od ispitane supstance. Ovo bi pomoglo boljem sagledavanju kombinacija supstanci sa antibioticima i uočavanju rezistentnih bakterijskih sojeva. Na osnovu svojstvenih vrednosti korelacionog matriksa, PC1 svojstveni vektor objasnio je 42.60% varijanse ispitanih interakcija, dok je PC2 vektor objasnio dodatnih 18.67% (Slika 41A). Dijagram odgovornih varijabli (Slika 41B), ilustruje uticaj ispitanih supstanci na klasifikaciju sistema supstanaca-antibiotik-bakterijski soj (Slika 41C). 147   Slika 41. Hemometrijska analiza sistema supstanca-antibiotik-bakterijski soj zasnovana na sinergizmu ispitanih antibiotika i supstanci: (A) svojstvene vrednosti PCA korelacionog matriksa; (B) PCA dijagram odgovornih varijabli; (C) rezultujući PCA dijagram ispitanih sistema; (D) dendrogram HCA analize. Ispitan sinergizam (stepen smanjenja MIC vrednosti antibiotika) dat je u Tabeli 43. Na osnovu euklidske udaljenosti i sličnosti ≥26.40 (Slika 41D), HCA analiza je identifikovala tri grupe sistema (A, B i C). Sistem A, grupa sastavljena od dominantnih interakcija Gram- negativnih bakterija sa hloramfenikolom, pokazala je najbolje rezultate sa ispitanim supstancama. U ovoj grupi, u najlošijem slučaju, 7 od 14 ispitanih supstanci su uspele desetostruko da povećaju aktivnost antibiotika u odnosu na ispitane sojeve. Sistem B, grupa interakcija Gram-pozitivnih bakterija sa antibioticima, sadržala je nešto niže vrednosti interakcija u odnosu na grupu A. U ovoj grupi, u najlošijem slučaju, 6 od 14 ispitanih supstanci su uspele desetostruko da povećaju aktivnost antibiotika u odnosu na ispitane sojeve. Sistem C, grupa interakcija Gram-negativnih bakterija sa streptomicinom i tetraciklinom, imala je najlošije rezultate kombinovanja sa ispitanim supstancama. U ovoj grupi, u najboljem slučaju, 3 od 14 ispitanih supstanci su uspele desetostruko da povećaju 148  aktivnost antibiotika. Najlošiji rezultati uočeni su kombinovanjem supstanci sa streptomicinom na E. coli ATCC 25922 i P. aeruginosa ATCC 27853 sojeve (Slika 41C, D). Na osnovu svih dosada prezentovanih rezultata (Tabele 22-43), uočavamo da većina etarskih ulja, znatno nižeg antibakterijskog potencijala, u kombinaciji sa antibioticima ispoljavaju dominantna i vrlo jaka sinergistička dejstva. Takođe uočavamo i da mnoge čiste supstance i glavne komponente etarskih ulja, tipa timola i linaloola, pokazuju izvanredna sinergistička dejstva sa pojedinim antibioticima. Sa druge strane uočavaju se i dominantne antagonističke interakcije ulja N. nuda i njene glavne komponente eukaliptola sa antibioticima. Na osnovu interakcija supstanci sa antibioticima, možemo uočiti dominantan sinergizam sa hloramfenikolom, aditivne interakcije sa tetraciklinom i dominantan antagonizam sa streptomicinom. Uočavamo i pojavu jakih antagonističkih interakcija ispitanih supstanci sa streptomicinom na sojevima tipa E. coli ATCC 25922 i P. aeruginosa ATCC 27853. Na osnovu povećanja aktivnosti antibiotika ispitanim supstancama (Slika 41C, D), vidimo i odvajanje Gram-pozitivne bakterije S. aureus ATCC 29213 u odnosu na ostale "checkerboard" Gram negativne sojeve. Pokazano je da supstance koje nemaju antibakterijsku aktivnost (geranil acetat i limonen) u znatnoj meri mogu povećati aktivnost antibiotika na ispitanim sojevima. Takođe je pokazano da ove komponenate nemaju uticaj na aktivnost monoterpenoida ili je njihov uticaj neznatan. Na osnovu međusobne interakcije monoterpenoida ulja, izuzev eukaliptola, uočavamo dominantnu pojavu aditivnih interakcija. Takođe, njihovom međusobnom kombinacijom, uočavamo različit doprinos sinergističkim, aditivnim i antagonističkim interakcijama. Pokušaj objašnjenja svega navedenog, tražićemo u hidrofobnosti, lipofilnosti i log P vrednostima dominantnih komponenata ulja. Implementacijom SAR metode i molekulskim simulacijama na odgovarajućim receptorima bakterije, pokušaćemo objasniti antibakterijsku aktivnost ispitanih kombinacija. 4.7. Akumulacija ispitivanih terpenoida i antibiotika u citoplazmatičnoj membrani Rezultati maksimalnih koncentracija ispitanih antibiotika i dominantnih komponenata ulja dati su u Tabeli 44. Na osnovu MMC vrednosti, možemo uočiti i objasniti značajan deo eksperimentalnih rezultata. Antibiotici svoju antibakterijsku aktivnost ostvaruju na ribozomima, dok je aktivnost etarskog ulja i komponenta pripisana razaranju ćelijske membrane. Ovde se radi o različitom mehanizmu antibakterijskog dejstva, čija je potvrda značajna razlika MIC i MBC vrednosti antibiotika i ispitanih supstanci (Tabele 17-21). Različiti mehanizmi supstanci bili su povod za ispitivanje njihovog kombinovanog dejstva a uočene sinergističke interakcije bi smanjile toksične koncentracije antibiotika i precizirala 149  Tabela 44. Vrednosti logPo/w, logPm/b, S i MMC ispitanih supstanci. Ispitane supstance logPo/w a) (mM) logPm/bb) (mM) Sc) (mg/l) MMCd) (mg/l) Monoterpenski ugljovodonici Sabinen 3.10 2.37 2.49 0.58×103 Mircen 4.30 3.53 6.92 23.46×103 α-Felandren 3.20 2.46 2.86 0.83×103 p-Cimen 4.10 3.34 27.88 60.99×103 Limonen 3.40 2.66 4.58 2.09×103 Oksidovani monoterpeni Eukaliptol 2.50 1.79 3.32×102 20.48×103 cis-Sabinen hidrat 2.10 1.40 4.40×102 11.07×103 Linalool 2.70 1.98 15.90×102 151.84×103 Borneol 2.70 1.98 7.40×102 70.67×103 Nerol 2.90 2.17 2.56×102 37.84×103 Geraniol 2.90 2.17 1.00×102 14.79×103 Bornil acetat 3.30 2.56 9.72 3.53×103 Geranil acetat 3.50 2.76 18.24 10.50×103 Seskviterpenski ugljovodonici α-Kubeben 4.50 3.73 21.45×10-3 0.12×103 β-Elemen 6.10 5.28 11.72×10-3 2.23×103 β-Kariofilen 4.40 3.63 50.11×10-3 0.21×103 Germakren D 4.70 3.92 12.83×10-3 0.11×103 Oksidovani seskviterpeni Kariofilen oksid 3.60 2.85 2.21 1.56×103 τ-Kadinol 3.30 2.56 9.13 3.31×103 α-Bisabolol 3.80 3.05 1.69 1.89×103 Fenolna jedinjenja Timol 3.30 2.56 9.00×102 326.77×103 Antibiotici Tetraciklin -2.00 -2.58 2.31×102 607.53×10-3 Streptomicin -8.00 -8.40 1.00×106 3.98×10-3 Hloramfenikol 1.10 0.43 2.50×104 67.25×103 a) logPo/w = Particioni koeficijent oktanol/voda (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) b) logPm/b = Particioni koeficijent ćelijska membrana/pufer, izračunat na osnovu Sikkema et al. (1994) c) S = Rastvorljivost u vodi (mg/L) na 25 °C (http://www.thegoodscentscompany.com/) i (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) d) MMC = Maksimalna koncentracija supstanci u ćelijskoj membrani izračunata na osnovu de Bont (1998) i Neumann et al. (2005). tačna mesta napada komponenata ulja. Na osnovu rezultata (Tabela 44), uočavamo da među komponentama ulja najveću membransku koncentraciju ima timol (326.77×103 mg/l), a najnižu germakren D (0.11×103 mg/l). Zbog velike sposobnosti akumuliranja, timol bi trebao najviše da vrši dezorganizaciju citoplazmatične membrane, što bi trebalo da uslovi njegove najniže MIC i MBC vrednosti. Ova konstatacija je potvrđena na osnovu naših 150  eksperimentalnih rezultata (Tabela 19). Linalool, druga supstanca po sposobnosti akumulacije u membrani (151.84×103 mg/l), nema izraženu antibakterijsku aktivnost, što ukazuje da osim koncentracionog faktora i energetski uslovi interakcije sa targetom diktiraju antibakterijsku aktivnost supstance. Više reči o interakciji komponenata i određenih targeta biće u delu molekularnog dokinga. I pored slabije antibakterijske aktivnosti, linalool slično timolu je pokazao izvanredna sinergistička dejstva sa antibioticima (Slika 40). U poređenju sa timolom, membranska koncentracija geraniola je znatno niža (14.79×103 mg/l), što uslovljava i njegovu nešto slabiju antibakterijsku aktivnost (Tabela 19). Hemometrijskom analizom MIC i MBC vrednosti (Slike 19, 20) u grupu jakih antibakterijskih agenasa pored ispitanih antibiotika, svrstani su timol, geraniol i etarska ulja T. pulegioides i T. glabrescens. Pored izvesnog sadržaja timola i linaloola ova ulja kao dominantnu komponentu sadrže geraniol. I pored niže membranske koncentracije, izražena antibakterijska aktivnost geraniola u odnosu na linalool može se objasniti energetskim efektima interakcija sa definisanim targetima. Pokazano je da etarska ulja T. pulegioides i T. glabrescens imaju veću antibakterijsku aktivnost u odnosu na geraniol (Tabele 17, 19). Ovo se može prepisati membranskim koncentracijama timola, linalola, geraniola, i njihovim dominantnim aditivnim i sinergističkim interakcijama (Tabele 36-38). Interakcije ispitanih komponenata, nedvosmisleno ukazuju na identičan mehanizam njihovog antibakterijskog dejstva i vezivanje za identične targete citoplazmatične membrane. Na osnovu rezultata (Tabela 44), uočavamo da među ispitanim antibioticima najveću membransku koncentraciju ima hloramfenikol (67.25×103 mg/l), a najnižu streptomicin (3.98×10-3 mg/l). Međutim kao što je već pokazano, ispitani antibiotici deluju na nivou ribozoma a ne na nivou citoplazmatične membrane, tako da visoka koncentracija u njoj ne mora značiti veću i bolju antibakterijsku aktivnost antibiotika. Potvrda ove konstatacije su i naši eksperimentalni rezultati (Tabela 21), gde je hemometrijskom analizom (Slike 19, 20) pokazana slabija antibakterijska aktivnost hloramfenikola u odnosu na tetraciklin i streptomicin. Visoka membranska koncentracija antibiotika je povoljna u uslovima nastanka nespecifične izmene membrane i njene lize dejstvom komponenata ulja, usled koje antibiotik najviših koncentracija najlakše ostvaruje svoju aktivnost na ribozomu. Potvrda ove konstatacije su i naši eksperimentalni podaci, gde su najbolji rezultati ostvareni kombinovanom interakcijom ulja sa hloramfenikolom a najlošiji sa streptomicinom. Ovde nikako ne trebamo izostaviti energetsku zahtevnost ulaska antibiotika u citoplazmu, jer samo zajedničko promatranje ova dva faktora može objasniti uočene pojave i mehanizam dejstva ispitanih kombinacija. 151  152 4.8. Molekularni doking na ćelijske receptore U nastojanju da preciznije definišemo targete aktivnosti etarskih ulja i objasnimo mehanizam njihovog kombinovanog dejstva sa izabranim antibioticima, koristili smo hemometrijsku metodu molekularnog dokinga. Ispitani targeti citoplazmatične membrane su: proteini PBP- 1A i PBP-1B (Contreras-Martel, 2006; Sung et al., 2009), citohrom C oksidaza (Harrenga & Michel, 1999) i ATP sintaza (Rastogi & Girvin, 1999). 4.8.1. Molekularni doking na receptore antibakterijske aktivnosti hloramfenikola Kao što je u ranijim poglavljima jasno definisano, hloramfenikol inhibira sintezu proteina usled vezivanja za veću 50S subjedinicu ribozoma, u okviru aminoakceptorskog A mesta (Davidovitch et al., 2008). Na ovaj način sprečeno je pravilno pozicioniranje i unos sledeće aminoacil-tRNA i dalja sinteza proteina. Ispitivanja su pokazala da su protein L16 i 23S rRNA, delovi 50S subjedinice, upravo odgovorni za antibakterijsko dejstvo hloramfenikola (Mankin & Garret, 1991; Anderson et al., 2012). Ovo nas je navelo da molekularnim dokingom ispitujemo strukture 23S RNA i L16 (Bulkley et al., 2010; Tourigny et al., 2013) i uočimo afinitet vezivanja komponenata ulja na ove važne targete. Molekularnom dokingu podvrgnuti su antibiotici, čiste supstance i sve komponente ulja čiji je sadržaj bio viši od 5%. Strukture ispitanih molekula sa odgovarajućim Van der Waalsovim radijusom prikazane su na Slici 42. Rezistencija bakterija na hloramfenikol, usled njegove inaktivacije enzimima tipa CAT, i izražene sinergističke interakcije hloramfenikola sa etarskim uljem, navelo su nas da molekularnim dokingom ispitamo interakcije komponenata sa ovim enzimom. Ukoliko bi se molekularnim dokingom potvrdio veći afinitet vezivanja komponenata ulja, mogli bi opravdati manju CAT aktivnost, a samim tim i bolje rezultate antibakterijske aktivnosti smeše hloramfenikol-ulja. Predmet molekularnog ispitivanja bili su enzimi CAT1 i CAT3 (Leslie, 1990; Biswas et al., 2012). Ispitani targeti molekularnog dokinga važnih za hloramfenikol, prikazani su na Slici 43. Na osnovu rezultata u Tabeli 45, uočavamo znatno niže energetske afinitete vezivanja komponenata ulja u odnosu na receptorska mesta antibakterijske aktivnosti hloramfenikola (23S RNA i protein L16). Takođe možemo uočiti i veći afinitet vezivanja tetraciklina i streptomicina za ove targete u odnosu na hloramfenikol. Ovi rezultati nam potvrđuju prethodne literaturne navode da komponente etarskih ulja ne mogu ostvariti svoju aktivnosti na nivou ribozoma za razliku od ispitanih antibiotika. Molekularni doking na receptore CAT1 i CAT3 je potvrdio njihovu specifičnu interakciju sa hloramfenikolom, usled viših vrednosti afiniteta vezivanja u odnosu na tetraciklin i streptomicin (Tabela 45). Sa druge strane mnoge komponente ulja u odnosu na ove enzime imale su isti ili veći afinitet vezivanja   Slika 42. Strukture supstanci ispitane molekularnim dokingom. 153   Slika 43. Ispitani targeti antibakterijske aktivnosti hloramfenikola i njegove rezistencije. (α-bisabolol, τ-kadinol, kariofilen oksid, germakren D, β-kariofilen, β-elemen, α-kubeben, bornil acetat). Navedene komponente bi vezivanjem za CAT enzime smanjile njihovu aktivnost i sprečile inaktivaciju hloramfenikola. Objašnjenje za ovakvu pretpostavku leži u činjenici da su sve interakcije sa hloramfenikolom izrazito sinergističke. Bitno je istaći da su interakcije etarskih ulja L. montana (β-elemena 40.43%) i I. graveolens (bornil acetat 21.66%, τ-kadinol 14.60%, kariofilen oksid 9.58%) sa hloramfenikolom u 97.78% slučaja aditivne ili sinergističke. Velika količina dostupnih komponenata, visoke MMC vrednosti supstanci i pozitivne interakcije sa CAT enzimima, mogu opravdati pozitivne interakcije ovih ulja sa hloramfenikolom. Bitno je napomenuti da je hemometrijskom analizom sinergističkog potencijala ispitanih supstanci (Slika 40), etarsko ulje L. montana svrstano u grupu sa najvećim sinergističkim potencijalom zajedno sa timolom i linaloolom. Međutim, dominantan sinergistički i aditivan efekat interakcija sa hloramfenikolom je uočen i kod ostalih supstanci. Izuzev etarskog ulja T. pulegioides, sve ispitane supstance su imale nešto niže vrednosti sinergističkog i aditivnog dejstva sa hloramfenikolom u odnosu na ulja L. montana i I. graveolens. Navedene konstatacije upućuju da je inhibicija enzima CAT samo sekundarni i pomoćni faktor pojačanja sinergističkih interakcija, a da je osnovni faktor ranije pomenuta inhibicija citohrom C oksidaze i ATP-aze. 154  Tabela 45. Energetski afinitet vezivanja (kcal/mol) ispitanih terpenoida i antibiotika na receptore značajnih za aktivnost i inhibiciju hloramfenikola. Ispitane supstance i receptori Aktivnost Inhibicija 23S rRNA Protein L16 Enzim CAT1 Enzim CAT3 Monoterpenski ugljovodonici Sabinen -4.40 -5.00 -4.50 -3.70 Mircen -3.70 -4.20 -4.10 -3.20 α-Felandren -4.40 -5.10 -4.70 -3.70 p-Cimen -4.30 -5.00 -4.80 -3.80 Limonen -4.30 -4.90 -4.60 -3.70 Oksidovani monoterpeni Eukaliptol -4.80 -5.50 -4.70 -3.10 cis-Sabinen hidrat -5.00 -5.60 -4.70 -3.30 Linalool -4.00 -5.20 -4.00 -3.10 Borneol -4.90 -5.50 -4.40 -3.00 Nerol -4.30 -5.00 -4.10 -3.50 Geraniol -4.30 -4.70 -4.20 -3.20 Bornil acetat -5.10 -5.80 -5.10 -3.40 Geranil acetat -4.40 -4.90 -4.80 -3.70 Seskviterpenski ugljovodonici α-Kubeben -5.50 -6.20 -6.00 -4.70 β-Elemen -4.90 -5.90 -5.50 -4.20 β-Kariofilen -5.70 -6.40 -6.10 -4.10 Germakren D -5.80 -6.50 -5.80 -4.40 Oksidovani seskviterpeni Kariofilen oksid -5.90 -6.50 -5.90 -4.20 τ-Kadinol -6.10 -6.40 -6.20 -4.70 α-Bisabolol -5.40 -6.30 -5.40 -4.00 Fenolna jedinjenja Timol -5.00 -5.50 -4.60 -3.70 Antibiotici Tetraciklin -7.90 -8.50 -4.50 -3.80 Streptomicin -6.80 -7.00 -4.20 -2.80 Hloramfenikol -6.50 -6.70 -5.00 -4.00 4.8.2. Molekularni doking na receptore antibakterijske aktivnosti teraciklina i streptomicina Pristup molekularnog dokinga primenjen je i na važne receptore antibakterijske aktivnosti tetraciklina i streptomicina. Ispitani targeti molekularnog dokinga važnih za teraciklin i streptomicin, prikazani su na Slici 44. Za razliku od hloramfenikola, istraživanja mehanizma delovanja tetraciklina i streptomicina su pokazala da ovi antibiotici inhibiraju sintezu proteina usled vezivanja za 30S subjedinicu ribozoma (Anderson et al., 2012). 155  156 Slika 44. Ispitani targeti anibakterijske aktivnosti tetraciklina i streptomicina. Ustanovljeno je da tetraciklin svoje vezivanje ostvaruje sa proteinom S7 i ribozomalnom 16S rRNA čime je sprečeno vezivanja aminoacil-tRNA za A mesto ribozoma i pravilno prepoznavanja kodona na iRNA i antikodona na tRNA. Istraživanja mehanizma delovanja streptomicina su pokazala da ovaj antibiotik inhibira sintezu proteina vezivanjem za protein S12 i ribozomalnu 16S rRNA. Pored toga što inhibira ugradnju korektne aminokiseline za dati kodon u iRNA, indukuje i pogrešno čitanje kodona što omogućava inkorporaciju neke druge aminokiseline (Anderson et al., 2012). Na osnovu jasno definisanih mesta antibakterijske aktivnosti antibiotika (16S rRNA, protein S7, protein S12) i njihovih XRD struktura (Hosaka et al., 1997; Broderson et al., 2000, Carter et al., 2000; Connell et al., 2007) primenom molekularnog dokinga želeli smo posredno istaći aktivnost ulja u okviru ćelijskog zida i citoplazmatične membrane i eliminisati njihovu moguću interakciju sa ribozomima. Na osnovu rezultata u Tabeli 46, uočavamo znatno niže energetske afinitete vezivanja komponenata ulja u odnosu na ispitana receptorska mesta. Ova ispitivanja, slično prethodnim rezultatima molekularnog dokinga na receptore hloramfenikola, jasno ukazuju da meta dejstva etarskih ulja nisu ribozomi, već targeti citoplazmatične membrane ili ćelijskog zida bakterije.  Tabela 46. Energetski afinitet vezivanja (kcal/mol) ispitanih terpenoida i antibiotika na ribozomalnim 30S receptorima za tetraciklin i streptomicin. Ispitane supstance i receptori Tetraciklin Streptomicin 16S rRNA Protein S7 16S rRNA Protein S12 Monoterpenski ugljovodonici Sabinen -3.00 -5.20 -3.90 -4.50 Mircen -2.60 -4.30 -3.60 -4.20 α-Felandren -2.90 -4.90 -4.10 -4.50 p-Cimen -3.00 -5.00 -4.10 -4.50 Limonen -3.00 -5.10 -4.00 -4.60 Oksidovani monoterpeni Eukaliptol -3.50 -4.20 -4.10 -4.40 cis-Sabinen hidrat -3.80 -4.50 -4.40 -4.60 Linalool -3.30 -4.30 -3.90 -4.10 Borneol -3.50 -4.30 -4.00 -4.50 Nerol -3.10 -4.10 -3.80 -4.30 Geraniol -3.10 -4.50 -3.90 -4.10 Bornil acetat -4.20 -4.40 -4.30 -4.60 Geranil acetat -3.60 -4.80 -4.50 -4.50 Seskviterpenski ugljovodonici α-Kubeben -3.90 -5.70 -4.90 -5.70 β-Elemen -3.70 -5.20 -4.60 -5.00 β-Kariofilen -4.00 -4.90 -4.80 -5.50 Germakren D -3.60 -4.90 -5.00 -5.40 Oksidovani seskviterpeni Kariofilen oksid -4.10 -5.00 -5.00 -5.60 τ-Kadinol -4.20 -5.30 -5.60 -5.50 α-Bisabolol -4.20 -5.40 -5.30 -5.60 Fenolna jedinjenja Timol -3.60 -5.20 -4.40 -5.00 Antibiotici Tetraciklin -6.80 -6.00 -7.10 -6.60 Streptomicin -6.10 -5.90 -7.00 -6.10 Hloramfenikol -5.10 -5.80 -5.70 -5.90 4.8.3. Molekularni doking na važne receptore ćelijskog zida i citoplazmatične membrane Antibakterijska aktivnost etarskih ulja se pripisuje njihovom dejstvu na nivou ćelijskog zida ili citoplazmatične membrane (Sikkema et al., 1995). Najčešće opisivan način jeste njihova akumulacija u lipidnom dvosloju koja dovodi do nespecifične izmene ćelijske membrane i njenog bušenja. U ovom poglavlju želeli smo bliže da ispitamo neke od targeta, i možda uočimo neke od važnih interakcija. Receptore koje smo ispitivali bili su: porin OmpF i 157  158 protein LptA na ćelijskom zidu i proteini PBP-1A i PBP-1B na citoplazmatičnoj membrani. Strukture ovih targeta dati su na Slici 45. Slika 45. Važni receptori ćelijskog zida i citoplazmatične membrane. Porini su grupa kiselih proteina, koji formiraju hidrofilne pore kroz hidrofobni lipidni dvosloj spoljne membrane Gram-negativnih bakterija, kroz koje mogu nespecifično difundovati mali hidrofilni molekuli. Istraživanja su pokazala da hidrofobni hloramfenikol upravo koristi porine za transport kroz spoljnu membranu i dolazak do periplazmatičnog prostora (Anderson et al., 2012). Određeni energetskih afiniteti komponenata ulja sa porinima i ostalim targetima membrane i ćelijskog zida (Tabela 47), mogli bi nam pomoći u boljem sagledavanju mehanizma njihovog dejstva. Molekularnim dokingom je određena energija vezivanja hloramfenikola (-6.20 kcal/mol) za porin OmpF. Na osnovu rezultata u Tabeli 47, uočavamo da mnogi seskviterpeni imaju veće afinitete vezivanja za porine u odnosu na hloramfenikol. Ovo je veoma ohrabrujuće, jer ukazuje na moguć transport jako hidrofobnih komponenata etarskih ulja preko porina do ostalih targeta citoplazmatične membrane. Sa druge strane, prvi put imamo veće afinitete vezivanja komponenata za receptore u odnosu na antibiotike, što nam govori približnije o mestu njihovog dejstva. Lipopolisaharidi su jedne od glavnih komponenata ćelijskog zida (Slika 1), odgovorne za očuvanje integriteta bakterije i zaštite od bilo kakvog neželjenog hemijskog uticaja.  Tabela 47. Energetski afinitet vezivanja (kcal/mol) ispitanih terpenoida na važne receptore ćelijskog zida i citoplazmatične membrane. Ispitane supstance i receptori Ćelijski zid Citoplazmatična membrana Porin OmpF Protein LptA Protein PBP-1A Protein PBP-1B Monoterpenski ugljovodonici Sabinen -5.70 -4.90 -5.10 -5.90 Mircen -5.20 -3.80 -4.50 -5.40 α-Felandren -5.90 -5.50 -5.50 -6.30 p-Cimen -6.10 -5.70 -5.40 -6.30 Limonen -5.80 -5.50 -5.30 -6.10 Oksidovani monoterpeni Eukaliptol -5.40 -4.50 -5.20 -5.80 cis-Sabinen hidrat -5.00 -5.20 -5.60 -6.10 Linalool -4.50 -4.00 -4.80 -5.10 Borneol -5.50 -4.70 -5.20 -5.50 Nerol -4.80 -4.90 -5.10 -5.40 Geraniol -5.10 -4.70 -4.70 -5.70 Bornil acetat -5.70 -4.80 -5.70 -5.90 Geranil acetat -5.00 -4.60 -5.20 -5.90 Seskviterpenski ugljovodonici α-Kubeben -7.00 -5.90 -6.50 -7.40 β-Elemen -6.40 -5.30 -6.00 -6.40 β-Kariofilen -7.40 -6.00 -6.70 -6.70 Germakren D -6.90 -5.60 -6.50 -6.90 Oksidovani seskviterpeni Kariofilen oksid -6.10 -5.30 -6.40 -7.10 τ-Kadinol -6.90 -6.40 -6.70 -7.00 α-Bisabolol -6.80 -6.00 -6.50 -6.30 Fenolna jedinjenja Timol -5.50 -5.60 -5.60 -5.90 Lipopolisaharidi povećavaju negativno naelektrisanje spoljne membrane, čineći je nepropustljivom za difuziju mnogih hidrofobnih molekula. Kako su ispitani molekuli etarskih ulja hidrofobniji u odnosu na ispitane antibiotike (log Po/w komponenata > log Po/w antibiotika, Tabela 44), možemo zaključiti da je spoljna membrana ćelijskog zida delom odgovorna za veću rezistentnost Gram negativnih bakterija prema etarskim uljima i njihovim komponentama u odnosu na ispitane antibiotike (Tabele 17-21). Sa druge strane na osnovu hemometrijske analize stepena smanjenja MIC vrednosti (Tabela 43 i Slika 41), uočavamo izdvajanje Gram-pozitivne bakterije (S. aureus ATCC 29213) u odnosu na ostale Gram- negativne bakterije. Ovo nam govori o uticaju spoljne membrane i ulozi lipopolisaharida na 159  povišenu rezistentnost Gram negativnih bakterija. Kako su rezultati kombinovanih interakcija uglavnom bili sinergističke i aditivne prirode, pretpostavili smo da ulja mogu na neki način ometati sintezu lipopolisaharida i povećati prodornost antibiotika do njihovih targeta u citoplazmi. U potrazi za odgovorom kombinovanog dejstva etarskih ulja i antibiotika, metodom molekularnog dokinga ispitan je LptA protein (Slika 45). LptA je esencijalan periplazmatični protein važan u transportu lipopolisaharida iz citoplazmatične ka spoljnoj membrani Gram negativnih bakterija (Suits et al., 2008). Njegova inhibicija određenim komponentama ulja mogla bi objasniti smanjenu rezistentnost Gram-negativnih bakterija na antibiotike i sinergističke efekte ispitanih smeša. I pored jasno definisanog antibakterijskog dejstva streptomicina na 30S ribozom, molekularnim dokingom smo odredili afinitet njegovog vezivanja za LptA protein (-6.60 kcal/mol) što će nam koristiti kao referentna tačka u odnosu na koju ćemo posmatrati energije vezivanja komponenata ulja. Na osnovu afiniteta vezivanja, uočavamo nešto višu vrednost vezivanja streptomicina za LptA protein u odnosu na S12 protein (Tabela 46), što opravdava njegovo ispitivanje kao mogućeg inhibitora vezivanja lipopolisaharida za spoljni deo membrane (Neter et al., 1958). Međutim, najnovija istraživanja su ipak pokazala da streptomicin nije dobar inhibitor lipopolisaharida, usled njegove polikatjonske strukture, tendencije vezivanja za spoljni negativni deo membrane i slabog prodiranja u ćeliju (Anderson et al., 2012, Hobbs et al., 2013). Hloramfenikol i tetraciklin nemaju polikatjonsku strukturu za razliku od streptomicina, što opravdava njihovu višu akumulaciju i više MMC vrednosti u membrani a što je delom i odgovorno za bolje rezultate kombinovanog dejstva ovih antibiotika sa uljima. Na osnovu rezultata molekularnog dokinga na LptA protein (Tabela 47), uočavamo da sve ispitane komponente etarskih ulja imaju manje afinitete vezivanja u odnosu na streptomicin, što nas navodi na pretpostavku da etarska ulja i njihove komponente ne interferiraju sa prenošenjem lipopolisaharida i da se destrukcija ćelijskog zida i citoplazmatične membrane odigrava drugačijim mehanizmom. Pojedine studije su elektronskom mikroskopijom pokazale, da etarska ulja dovode do nepravilnih morfoloških promena u bakteriji, u vidu izduživanja ćelije (filamentozni rast), čija je posledica liza ćelije (Turgis et al., 2009). Slično dejstvo jeste karakteristika β- laktamskih antibiotika, tačnije penicilina, koji se vezuje za specifične proteina koji su locirani na citoplazmatičnoj membrani (PBP). Postoje više vrsta PBP proteina, međutim mi smo se u ovoj studiji koncentrisali na PBP-1A i PBP-1B koji su esencijalni za rast i funkcionisanje bakterije (Anderson et al., 2012). Pokazano je da su ovi proteini glavni kontrolori izduživanja ćelije i da su odgovorni za umrežavanje peptidoglikana u ćelijskom zidu. Molekularnim dokingom određeni su afiniteti vezivanja četiri vrste penicilina (penicilin G, penicilin X, 160  penicilin V i penicilin N) u odnosu na targete PBP-1A i PBP-1B (Contreras-Martel et al., 2005; Sung et al., 2009). Ove vrednosti će nam služiti kao referentna tačka u odnosu na koje ćemo proceniti da li pojedine komponente mogu imati sličan efekat kao penicilini. Afiniteti vezivanja penicilina za PBP-1A target su sledeći: penicilin G (-7.0 kcal/mol), penicilin X (- 7.2 kcal/mol), penicilin V (-7.7 kcal/mol) i penicilin N (-6.2 kcal/mol). Molekularnim dokingom ispitani su afiniteti vezivanja penicilina i za PBP-1B protein: penicilin G (-7.6 kcal/mol), penicilin X (-7.9 kcal/mol), penicilin V (-7.3 kcal/mol) i penicilin N (-7.2 kcal/mol). Na osnovu rezultata u Tabeli 47, uočavamo da naročito ispitani seskviterpeni imaju uporedive vrednosti afiniteta sa penicilinima. Ovo je naročito izraženo u slučaju dejstva penicilina N na PBP-1A protein gde možemo uočiti mnoge seskviterpene sa višim vrednostima afiniteta vezivanja (α-kubeben, β-kariofilen, germakren D, kariofilen oksid, τ- kadinol, α-bisabolol). Uporedive i više vrednosti vezivanja komponenata ulja u odnosu na peniciline opravdavaju eksperimentalno utvrđene činjenice u vezi uticaja etarskih ulja na morfološke promene bakterija (Turgis et al., 2009). Rezultati molekularnog dokinga na PBP- 1A i PBP-1B upućuju da etarska ulja i njihove seskviterpenske komponente, mogu uticati na slabljenje ćelijskog zida i lakšu dostupnost antibiotika ribozomima. Međutim, rezultati na ovim targetima ne mogu objasniti različitu zastupljenost sinergističkih, aditivnih i antagonističkih interakcija između hloramfenikola, tetraciklina i streptomicina. Sve ovo upućuje, da membranski potencijal i energetski faktor ulaska antibiotika u citoplazmu uslovljava zastupljenost određene vrste interakcija. Na osnovu ove konstatacije ispitaćemo molekule odgovorne za membranski potencijal citoplazmatične membrane. 4.8.4. Molekularni doking na citohrom C oksidazu i ATP-sintazu Ulazak streptomicina u citoplazmu ćelije je energetski zavistan, za razliku od tetraciklina i hloramfenikola čiji je ulazak delimično ili totalno nezavistan od membranskog potencijala. U ovoj studiji, najlošiji rezultati antibakterijske aktivnosti kombinovane primene ispitanih supstanci i antibiotika su postignuti sa streptomicinom a najbolji sa hloramfenikolom. Sve ovo upućuje da su enzimi citoplazmatične membrane, citohrom C oksidaza i ATP-aza, glavni targeti antibakterijske aktivnosti etarskih ulja i njihovih komponenata. Citohrom C oksidaza je transmembranski protein citoplazmatične membrane, koji je važna komponenta elektron transportnog lanaca. Kao sastavni deo elektron transportnog lanca, primanjem četiri elektrona od molekula citohroma C, vrši redukciju jednog molekula kiseonika u dva molekula vode, pri tome trošeći osam protona iz citoplazme (četiri u obliku vode i četiri koji ovim procesom odlaze u periplazmatičan prostor). Pokazano je da je ovaj enzim odgovoran za formiranje protonskog gradijenta (ΔpH) i membranskog potencijal (Δψ). 161  162 Šematski prikaz strukture citohrom C oksidaze i proces formiranja protonskog i membranskog gradijenta dat je na Slici 46. Kao što je već napomenuto u odeljku antibakterijske aktivnosti terpenoida, važan mehanizam antibakterijske aktivnosti supstanci jeste razaranje energetskog statusa ćelije. Eksperimenti tetralina sa citohrom C oksidazom su pokazali smanjenje protonskog gradijenta (ΔpH) za 80% i membranskog potencijal (Δψ) za 50% (Sikkema et al., 1994). U istoj studiji je pokazano da različite supstance, slične membranske koncentracije (log Pm/b) ispoljavaju sličan efekat. Molekularnim dokingom smo ispitali strukturu citohrom C oksidaze (Harrenga & Michel, 1999) i došli do vrlo važnih saznanja. Molekularnim modelovanjem smo pokazali da sve ispitane supstance imaju više vrednosti afiniteta vezivanja za citohrom C oksidazu nego za prethodno diskutovane targete citoplazme, ćelijskog zida i citoplazmatične membrane (Tabele 45-48). Slika 46. Citohrom C oksidaza i nastanak membranskog (Δψ) i protonskog gradijenta (ΔpH). Afinitet vezivanja komponenata ulja za ovaj receptor je viši u odnosu na ispitane antibiotike (Tabela 48), a takođe je pokazano da pojedine komponente ulja imaju i više vrednosti vezivanja u odnosu na antimicin (-7.2 kcal/mol), antibiotik koji svoju antibakterijsku aktivnost ostvaruje inhibicijom Citohroma C (Van Der Plas et al., 1976). Vezivanje komponenata etarskih ulja za citohrom C oksidazu, dovodi do konformacionih promena, što se manifestuje razaranjem membranskog i pH gradijenta koji je neophodan za ulazak streptomicina u citoplazmu. Nedovoljna količina energije uzrokuje i lošije rezultate kombinovane interakcije supstanci sa streptomicinom u odnosu na tetraciklin i hloramfenikol čiji je ulazak u citoplazmu delimično ili totalno nezavistan od membranskog potencijala.  Tabela 48. Energetski afinitet vezivanja (kcal/mol) ispitanih terpenoida i antibiotika na citohrom C oksidazu i ATP sintazu. Ispitane supstance i receptori Citoplazmatična membrana Citohrom C oksidaza ATP sintaza F0 Monoterpenski ugljovodonici Sabinen -6.20 -6.30 Mircen -5.50 -6.40 α-Felandren -6.80 -6.90 p-Cimen -6.60 -6.90 Limonen -6.60 -6.40 Oksidovani monoterpeni Eukaliptol -6.10 -6.10 cis-Sabinen hidrat -6.20 -6.50 Linalool -5.20 -5.80 Borneol -5.70 -6.10 Nerol -5.40 -5.40 Geraniol -5.60 -5.60 Bornil acetat -6.50 -6.90 Geranil acetat -6.60 -5.80 Seskviterpenski ugljovodonici α-Kubeben -8.40 -7.40 β-Elemen -7.40 -6.50 β-Kariofilen -7.70 -6.60 Germakren D -7.80 -7.30 Oksidovani seskviterpeni Kariofilen oksid -7.40 -6.30 τ-Kadinol -8.50 -7.60 α-Bisabolol -7.70 -7.60 Fenolna jedinjenja Timol -6.50 -6.70 Antibiotici Tetraciklin -5.00 -5.20 Streptomicin -4.10 -4.20 Hloramfenikol -4.30 -4.60 Protonski gradijent (ΔpH), formiran pravilnim funkcionisanjem elektron transportnog sistema, odgovoran je za rad ATP-sintaze, enzima koji je uključen u biosintezi najvažnijeg energetskog molekula živih sistema ATP-a, u procesu oksidativne fosforilacije. Za aktivnost ovog enzima potrebna je translokacija protona kroz sam enzim. ATP sintaza je smeštena u citoplazmatičnoj membrani i kao što možemo videti tesno je povezana sa respiratornim lancem. ATP sintaza sastoji se od dve funkcionalane jedinice F1 i F0, koje su međusobno 163  164 povezane F1-inhibitorom (Slika 47). Transmembranski protein F0 je hidrofobna komponenta ATP sintaze, koja formira kanal za translokaciju protona do hidrofilnog citoplazmatičnog F1 proteina u kome se vrši sinteza ATP-a iz ADP-a. Inhibiranje elektron transportnog lanca komponentama ulja, vodi do razaranja protonskog gradijenta ćelije a time utiče i na inhibiranje ATP sintaze, stvaranje ATP-a i smrti ćelije. Smanjenje protonskog gradijenta (ΔpH) nije jedini uzrok smanjenja energetskog statusa i membranskog potencijala ćelije. Pokazano je da supstance inhibiraju nastanak ATP-a usled parcijalne inhibicije enzima ATP- aze i proteina uključenih u procesu prenosa energije (Uribe et al., 1990). Pojedine studije su pokazale da karvakrol u koncentraciji od 2mM ili 1mM posle 10 do 14 minuta eliminiše sadržaj ATP-a u citoplazmi (Ultee et al., 1999). Dejstvom pojedinih etarskih ulja na različite bakterije uočeno je značajno smanjenja ATP-a u citoplazmi (Caillet & Lacroix, 2006; Caillet et al., 2009). Rezultati kombinovanih interakcija antibiotika i supstanci naveli su nas da ispitamo direktno vezivanje komponenata za ATP sintazu (Rastogi & Girvin, 1999). Slično citohrom C oksidazi, uočavamo znatno više vrednosti afiniteta vezivanja komponenata za ATP-sintazu nego za prethodno diskutovane targete citoplazme, ćelijskog zida i citoplazmatične membrane (Tabele 45-48). Afinitet vezivanja komponenata ulja za ovaj Slika 47. Šematski prikaz ATP-aze i odgovarajući mehanizma nastajanja ATP molekula.  receptor je viši u odnosu na ispitane antibiotike (Tabela 48), čiji mehanizam i nije zasnovan na ovim receptorima. Antibiotici grupe oligomicina, svoju antibakterijsku aktivnost ostvaruju upravo inhibicijom ATP-sintaze. Molekularnim dokingom želeli smo proceniti koliko je stvarno jaka inhibicija ATP-sintaze komponentama ulja u odnosu na oligomicin. Tabela 49. Energetski afinitet vezivanja (kcal/mol) ispitanih supstanci i antibiotika. Ispitane supstance Antibiotici Tetraciklin Streptomicin Hloramfenikol Monoterpenski ugljovodonici Sabinen -1.90 -1.90 -1.80 Mircen -2.50 -1.70 -2.00 α-Felandren -2.40 -2.00 -2.30 p-Cimen -2.40 -2.00 -2.30 Limonen -2.10 -2.00 -2.20 Oksidovani monoterpeni Eukaliptol -1.50 -1.90 -1.10 cis-Sabinen hidrat -2.30 -2.20 -1.60 Linalool -1.30 -1.70 -2.00 Borneol 1.30 -1.90 1.40 Nerol -2.10 -2.30 -2.30 Geraniol -2.50 -1.90 -2.10 Bornil acetat 1.60 -2.00 2.00 Geranil acetat -2.10 -2.50 -1.90 Seskviterpenski ugljovodonici α-Kubeben 2.10 -2.40 -1.60 β-Elemen 1.80 -2.10 -1.30 β-Kariofilen 11.50 -1.90 0.80 Germakren D 13.10 -1.70 -1.30 Oksidovani seskviterpeni Kariofilen oksid 12.30 -1.80 5.70 τ-Kadinol 3.80 -2.20 -2.00 α-Bisabolol -0.40 -2.10 -1.80 Fenolna jedinjenja Timol -2.50 -2.30 -2.00 Implementacijom SAR metode, određeni su afiniteti vezivanja tri vrste oligomicina (oligomicin A, oligomicin B i oligomicin C) u odnosu na target ATP-sintazu (F0 protein). Ove vrednosti će nam služiti kao referentna tačka u odnosu na koje ćemo proceniti da li pojedine komponente mogu imati sličan efekat kao oligomicini. Afiniteti vezivanja oligomicina za ATP-sintazu su sledeći: oligomicin A (-14.8 kcal/mol), oligomicin B (-14.7 kcal/mol) i oligomicin C (-14.9 kcal/mol). 165  166 Na osnovu rezultata u Tabeli 48, uočavamo da ispitane supstance i pored većeg afiniteta vezivanja za ATP-azu, imaju mnogo manji afinitet u odnosu na specijalizovane antibiotike ATP-azne inhibicije. I pored većeg afiniteta vezivanja monoterpena za ATP-sintazu (Tabela 48), možemo konstatovati da inhibicija citohrom C oksidaze više doprinosi antibakterijskoj aktivnosti etarskih ulja. Potvrda za ovu konstataciju jeste poređenje afiniteta komponenata i specijalizovanih antibiotika (antimicina i oligomicina) na ovim targetima, kao i ranija konstatacija da transport elektrona na ATP u fosforilaciji na nivou supstrata je neefikasan izvor energije za transport aminoglikozida (Anderson et al., 2012). Molekularnim dokingom ispitanih supstanci na antibiotike određeni su i energetski afiniteti njihovog vezivanja (Tabela 49). Na osnovu rezultata (Tabele 45-49) možemo uočiti znatno niže vrednosti afiniteta komponenata prema antibioticima, u odnosu na opisana receptorska mesta citoplazme, ćelijskog zida i citoplazmatične membrane. Ovi rezultati su potvrda da na nivou ćelije, primenjene smeše ulja i antibiotika deluje totalno nezavisno i da je eventualna modifikacija ispitanih antibiotika nemoguća.   5. Z A K L JU Č A K  U okviru ove doktorske disertacije izvršena su detaljna hemijska, mikrobiološka i hemometrijska ispitivanja zemljišta, etarskih ulja i njihovih glavnih komponenta, izolovanih iz osam biljnih vrsta, koje su sakupljene na šest lokaliteta Republike Srbije (Thymus glabrescens Willd., Thymus pulegioides L., Satureja kitaibelii Wierzb. ex Heuff., Nepeta nuda L., Libanotis montana, Peucedanum longifolium Waldst. & Kit., Peucedanum officinale L. i Inula graveolens L.). Na osnovu kompletne hemijske, minerološke i hemometrijske analize zemljišta možemo uočiti da: a) koncentracije metala u zemljištima se nalaze u okviru njihovih utvrđenih koncentracija u Zemljinoj kori, b) postoji snažan uticaj karbonatne frakcije zemljišta na biodostupnost metala, c) na osnovu hemometrijske analize zemljišta su podeljena na dve grupe. Karakteristika zemljišta svrstana u grupu A, (Kravlje i Sićevačke klisura) je izuzetno visok sadržaj kalcijuma. Grupa B je podeljena u dve podgrupe. Zemljište sa planine Vidlič, nosilac podgrupe B1, karakterisalo se višim vrednostima za sadržaje Fe, Cu i Zn. Podgrupa B2, zemljišta sa Stare i Suve Planine, odlikovala su se visokim sadržajem Na, K i Mn, d) na osnovu XRD analize mineralnog sastava zemljišta uočava se dominantno prisustvo kvarca u svim uzorcima. Takođe je većina zemljišta sadržala i izvesnu količinu glinenih minerala, e) hemometrijska analiza mineralnog sastava je podelila zemljišta na dve grupe. Grupa A, zemljište sa područija Stare Planine, odlikuje se izraženim sadržajem kvarca, dok je u okviru zemljišta grupe B, konstatovana sličnost Kravlja i Sićevačke klisure, usled izraženog sadržaja kalcita, f) ustanovljena je korelacija između pojedinih hemijskih parametara zemljišta (pH, Eh, CEC, EC, organska materija). Akumulacija ispitivanih metala u odabranim biljkama ukazuje da: a) sadržaj elemenata je u okviru utvrđenih koncentracija za samonikle lekovite biljke, b) hemometrijska analiza je identifikovala dve grupe biljaka. Grupa A, kojoj pripada najveći broj ispitanih biljnih vrsta, odlikovala se višim sadržajem Ca, Mg, Na, Fe i nižim sadržajem K i Mn u odnosu na biljne vrste grupe B, c) na osnovu Eh-pH dijagrama je ustanovljena biodostupnost redukovanih oblika ispitivanih elemenata, d) sadržaj metala u biljnim vrstama je uslovljen kombinovanim uticajem genetskih faktora, kao i minerološkom i hemijskom kompozicijom odgovarajućih zemljišta, e) postoji tolerantnost pojedinih biljaka prema povećanom sadržaju metala, f) sadržaj hemijskih elemenata u analiziranom biljnom materijalu je potvrda da ispitane biljne vrste mogu imati nutritivan značaj i biti izvor neophodnih elemenata, važnih za optimalno funkcionisanje ljudskog organizma. Na osnovu hemijskog sastava ispitanih etarskih ulja i hemometrijske analize, pokazano je da biljne vrste u okviru istog roda mogu, ali i ne moraju imati sličan hemijski sastav. Osim 168  genetske predispozicije biljne vrste, edafski uslovi sredine i faza vegetacije utiču na različiti hemijski sastav ulja. Ovo će biti još izraženije ukoliko se radi o biljnim vrstama različitih rodova, odnosno familija. Razmatrajući antibakterijsku aktivnost svih proučavanih supstanci, najjaču bakteriostatičku i baktericidnu aktivnost ispoljili su antibiotici i etarska ulja roda Thymus, kao i njihove glavne komponente. Sve ove supstance su svrstane u okviru zasebne grupe, primenom hemometrijske PCA i HCA analize. Utvrđeno je da većina etarskih ulja, u kombinaciji sa antibioticima ispoljavaju dominantna i vrlo jaka sinergistička dejstva. Takođe uočavamo i da mnoge čiste supstance, glavne komponente etarskih ulja, tipa timola i linaloola, pokazuju izvanredna sinergistička dejstva sa određenim antibioticima. S druge strane konstatovane su i antagonističke interakcije ulja N. nuda i njene glavne komponente eukaliptola sa antibioticima. Na osnovu analiziranih interakcija supstanci sa antibioticima, možemo uočiti dominantan sinergizam sa hloramfenikolom, aditivne interakcije sa tetraciklinom i dominantan antagonizam sa streptomicinom. Zabeležene su jake antagonističke interakcije ispitanih supstanci sa streptomicinom na sojevima E. coli ATCC 25922 i P. aeruginosa ATCC 27853. Na osnovu pojačanja antibakterijske aktivnosti antibiotika u kombinaciji sa ispitanim supstancama, izdvaja se ponašanje Gram-pozitivne bakterije S. aureus ATCC 29213, u odnosu na ostale korišćene sojeve. Pokazano je da čiste supstance koje nemaju antibakterijsku aktivnost (geranil acetat i limonen) u znatnoj meri mogu povećati aktivnost antibiotika na ispitanim sojevima, pri čemu je utvrđeno da ove komponenate nemaju uticaj na aktivnost monoterpenoida, ili je njihov uticaj neznatan. Na osnovu međusobne interakcije monoterpenoida etarskih ulja, izuzev eukaliptola, uočavamo dominantnu pojavu aditivnih interakcija. Takođe je, njihovom međusobnom kombinacijom, dokazan različit doprinos sinergističkim, aditivnim i antagonističkim interakcijama. Etarska ulja koja ne poseduju značajan antibakterijski potencijal (izolovana iz Libanotis montana, Peucedanum longifolium Waldst. & Kit. i Peucedanum officinale L), u kombinaciji sa odgovarajućim antibiotikom ispoljavaju signifikantan sinergistički efekat i značajno smanjuju njegovu terapijsku dozu. Eksperimentalni rezultati ove doktorske disertacije i hemometrijska analiza nedvosmisleno ukazuju da je antibakterijska aktivnost ispitanih etarskih ulja i glavnih komponenata uslovljena njihovim membranskim koncentracijama i da je usmerena na razaranje protonskog 169  170 gradijenta i membranskog potencijala citoplazmatične membrane. Primenom molekularnog dokinga na definisana ciljna mesta antibiotika, ćelijskog zida i citoplazmatične membrane objasnili smo i potvrdili uočene indikacije eksperimentalnih rezultata. Pokazano je da je visoka membranska koncentracija antibiotika povoljna u uslovima nastanka nespecifične izmene membrane i njene lize, dejstvom komponenata etarskog ulja, pri čemu antibiotik najviših koncentracija najlakše ostvaruje svoju aktivnost na ribozomu. Ovde nikako ne treba izostaviti energetski uslov ulaska antibiotika u citoplazmu, jer samo zajedničko razmatranje ova dva faktora može objasniti uočene pojave i mehanizam dejstva ispitanih kombinacija. Rezultati proučavanja antibakterijske aktivnosti etarskih ulja odabranih biljnih vrsta potvrđuju opravdanost njihove primene u tradicionalnoj i oficijalnoj medicini. Istovremeno je ukazano na potencijаlnu primenu dobijenih rezultаtа u procesu proizvodnje i primene antibakterijskih prepаrаtа, posebno u tretmanu rezistetnih sojeva. Korišćene metode hemometrijske analize jednoznačno ukazuju na neophodnost njihove aplikacije u savremenim hemijskim i biološkim istraživanjima.   6. L IT ER A TU R A  Adaikpoh, E.O., Kaizer, A.N., 2012. Trace metal enrichment in sediments from otofure and tebogawaste dump sites in Benin City, Nigeria. International Journal of Chemistry, 4, 14- 27. Adams, R.P., 2007. Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectrometry. Allured Publishing Corporation, Carol Stream, pp. 804. Adaszyńska, M., Swarcewicz, M., Dzięciol, M., Dobrowolskab, A., 2013. Comparison of chemical composition and antibacterial activity of lavender varieties from Poland. Natural Product Research, 27, 1497-1501. Ahmad, A., Khan, A., Manzoor, N., 2013. Reversal of efflux mediated antifungal resistance underlies synergistic activity of two monoterpenes with fluconazole. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 48, 80-86. Al-Fartosy, A.J.M., 2011. Antioxidant properties of methanolic extract from Inula graveolens L. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 35, 591-596. Ammar, A.H., Bouajila, J., Lebrihi, A., Mathieu, F., Romdhane, M., Zagrouba, F., 2012. Chemical composition and in vitro antimicrobial and antioxidant activities of Citrus aurantium L. flowers essential oil (Neroli oil). Pakistan Journal of Biological Sciences, 15, 1034-1040. Amtmann, A., Sanders, D., 1999. Mechanisms of Na+ uptake by plant cells. Advances in Botanical Research, 29, 75-112. Anderson, R.J., Groundwater, P.W., Todd, A., Worsley, A.J., 2012. Antibacterial agents: chemistry, mode of action, mechanisms of resistance and clinical applications. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex, pp. 378. Anschütz, U., Becker, D., Shabala, S., 2014. Going beyond nutrition: regulation of potassium homoeostasis as a common denominator of plant adaptive responses to environment. Journal of Plant Physiology, 171, 670-687. Aprotosoaie, A.C., Hǎncianu, M., Costache, I.I., Miron, A., 2014. Linalool: a review on a key odorant molecule with valuable biological properties. Flavour and Fragrance Journal, in press, DOI: 10.1002/ffj.3197. Argast, M., Beck, C.F., 1984. Tetracycline diffusion through phospholipid bilayers and binding to phospholipids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 26, 263-265. Arumugam, R., Kannan, R.R.R., Jayalakshmi, J., Manivannan, K., Devi, G.K., Anantharaman, P., 2012. Determination of element contents in herbal drugs: chemometric approach. Food Chemistry, 135, 2372-2377. 172  Ballester-Costa, C., Sendra, E., Fernández-López, J., Pérez-Álvarez, J.A., Viuda-Martos, M., 2013. Chemical composition and in vitro antibacterial properties of essential oils of four Thymus species from organic growth. Industrial Crops and Products, 50, 304-311. Barbour, A., Scaglione, F., Derendorf, H., 2010. Class-dependent relevance of tissue distribution in the interpretation of anti-infective pharmacokinetic/pharmacodynamic indices. International Journal of Antimicrobial Agents, 35, 431-438. Bassolé, I.H.N., Lamien-Meda, A., Bayala, B., Obame, L.C., Ilboudo, A.J., Franz, C., Novak, J., Nebié, R.C., Dicko, M.H., 2011. Chemical composition and antimicrobial activity of Cymbopogoncitratus and Cymbopogongiganteus essential oils alone and in combination. Phytomedicine, 18, 1070-1074. Beier, R.C., Allen Byrd, J., Kubena, L.F., Hume, M.E., McReynolds, J.L., Anderson, R.C., Nisbet, D.J., 2014. Evaluation of linalool, a natural antimicrobial and insecticidal essential oil from basil: effects on poultry. Poultry Science, 93, 267-272. Ben Hsouna, A., Ben Halima, N., Abdelkafi, S., Hamdi, N., 2013. Essential oil from Artemisia phaeolepis: chemical composition and antimicrobial activities. Journal of Oleo Science, 62, 973-980. Benito, B., Haro, R., Amtmann, A., Cuin, T.A., Dreyer, I., 2014. The twins K+ and Na+ in plants. Journal of Plant Physiology, 171, 723-731. Bennett, J.P., Chiriboga, E., Coleman, J., Waller, D.M., 2000. Heavy metals in wild rice from northern Wisconsin. Science of the Total Environment, 10, 261-269. Beyer, W.N., Green, C.E., Beyer, M., Chaney, R.L., 2013. Phytotoxicity of zinc and manganese to seedlings grown in soil contaminated by zinc smelting. Environmental Pollution, 179, 167-176. Biswas, T., Houghton, J.L., Garneau-Tsodikova, S., Tsodikov, O.V., 2012. The structural basis for substrate versatility of chloramphenicol acetyltransferase CATI. Protein Science, 21, 520-530. Blanc, M.C., Muselli, A., Bradesi, P., Casanova, J., 2004. Chemical composition and variability of the essential oil of Inula graveolens from Corsica. Flavour and Fragrance Journal, 19, 314-319. Bohrerova, Z., Stralkova, R., Podesvova, J., Bohrer, G., Pokorny, E., 2004. The relationship between redox potential and nitrification under different sequences of crop rotations. Soil and Tillage Research, 77, 25-33. 173  Borer, C.H., Hamby, M.N., Hutchinson, L.H., 2012. Plant tolerance of a high calcium environment via foliar partitioning and sequestration. Journal of Arid Environments, 85, 128-131. Bosnić, T., Softić, D., Grujić-Vasić, J., 2006. Antimicrobial activity of some essential oils and major constituents of essential oils. Acta Medica Academica, 35, 19-22. Boudouda, H.B., Kabouche, A., Aburjai, T., Kabouche, Z., 2013. GC-MS analysis of Inula graveolens (L.) Desf. from Algeria. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 16, 651-654. Bourgou, S., Rahali, Z.F., Ourghemmi, I., Saïdani, T.M., 2012. Scientific World Journal, 2012, 1-10. Bozari, S., Agar, G., Aksakal, O., Erturk, F.A., Yanmis, D., 2013. Determination of chemical composition and genotoxic effects of essential oil obtained from Nepeta nuda on Zea mays seedlings. Toxicology and Industrial Health, 29, 339-348. Brady, N.C., Weil, R.R., 2010. Elements of the nature and properties of soils, third edition. Prentice Hall, NewJersey, pp. 624. Braga, P.C., 2005. Thymol: antibacterial, antifungal and antioxidant activities. Giornale Italiano di Ostetricia e Ginecologia, 27, 267-272. Brereton, R.G., 2003. Chemometrics: data analysis for the laboratory and chemical plant. John Wiley & Sons, Chichester, pp. 504. Broadley, M.R., White, P.J., 2010. Eats roots and leaves. Can edible horticultural crops address dietary calcium, magnesium and potassium deficiencies? Proceedings of the Nutrition Society, 69, 601-612. Brodersen, D.E., Clemons J.W.M., Carter, A.P., Morgan-Warren, R.J., Wimberly, B.T., Ramakrishnan, V., 2000. The structural basis for the action of the antibiotics tetracycline, pactamycin, and hygromycin B on the 30S ribosomal subunit. Cell, 103, 1143-1154. Bulkley, D., Innis, C.A., Blaha, G., Steitz, T.A., 2010. Revisiting the structures of several antibiotics bound to the bacterial ribosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unated States of America, 107, 17158-17163. Burt S., 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods- a review. International Journal of Food Microbiology, 94, 223-253. Caillet, S., Lacroix, M., 2006. Effect of gamma radiation and oregano essential oil on murein and ATP concentration of Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection, 69, 2961- 2969. 174  Caillet, S., Ursachi, L., Shareck, F., Lacroix, M., 2009. Effect of gamma radiation and oregano essential oil on murein and ATP concentration of Staphylococcus aureus. Journal of Food Science, 74, 499-508. Carter, A.P., Clemons J.W.M., Brodersen, D.E., Morgan-Warren, R.J., Wimberly, B.T., Ramakrishnan, V., 2000. Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature, 407, 340-348. Chaffai, R., Elhammadi, M.A., Seybou, T.N., 2007. Altered fatty acid profile of polar lipids in maize seedlings in response to excess copper. Journal of Agronomy and Crop Science, 193, 207-217. Chalchat, J.C., Gorunović, M.S., Maksimović, Z.A., 1999. Essential oil of Satureja kitaibelii Wierzb. f. aristata (Vand.) hayek, Lamiaceae from eastern Serbia. Journal of Essential Oil Research, 11, 691-692. Chen, H., Lu, X., Li, L.Y., Gao, T., Chang, Y., 2014. Metal contamination in campus dust of Xi'an, China: a study based on multivariate statistics and spatial distribution. Science of the Total Environment, 484, 27-35. Chesworth, W., 2004. Redox, soil and carbon sequestration. Edafologia, 11, 37-43. Chou, T.C., 2010. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou- Talalay method. Cancer Research, 70, 440-446. Chou, T.C., Talalay, P., 1984. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Advances in Enzyme Regulation, 22, 27-55. CLSI M07-A08, 2009. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, pp. 63. Connell, S.R., Takemoto, C., Wilson, D.N., Wang, H., Murayama, K., Terada, T., Shirouzu, M., Rost, M., Schuler, M., Giesebrecht, J., Dabrowski, M., Mielke, T., Fucini, P., Yokoyama, S., Spahn, C.M., 2007. Structural basis for interaction of the ribosome with the switch regions of GTP-bound elongation factors. Molecular Cell, 25, 751-764. Contreras-Martel, C., Job, V., Di Guilmi, A.M., Vernet, T., Dideberg, O., Dessen, A., 2006. Crystal structure of penicillin-binding protein 1A (PBP1A) reveals a mutational hotspot implicated in beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae. Journal of Molecular Biology, 355, 684-696. Davidovich, C., Bashan, A., Yonath, A., 2008. Structural basis for cross-resistance to ribosomal PTC antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 20665-20670. 175  de Bont, J.A.M., 1998. Solvent-tolerant bacteria in biocatalysis. Trends in Biotechnology, 16, 493-499. De Martino, L., Bruno, M., Formisano, C., De Feo, V., Napolitano, F., Rosselli, S., Senatore, F., 2009. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils from two species of Thymus growing wild in southern Italy. Molecules, 14, 4614-4624. Demidchik,V., 2014. Mechanisms and physiological roles of K+ efflux from root cells. Journal of Plant Physiology, 171, 696-707. Din, W.M., Jin, K.T., Ramli, R., Khaithir, T.M.N., Wiart, C., 2013. Antibacterial effects of ellagitannins from Acalypha wilkesiana var. macafeana hort.: surface morphology analysis with environmental scanning electron microcopy and synergy with antibiotics. Phytotherapy Research, 27, 1313-1320. Djenane, D., Yangüela, J., Gómez, D., Roncalés, P., 2012. Perspectives on the use of essential oils as antimicrobials against Campylobacter jejuni CECT 7572 in retail chicken meats packaged in microaerobic atmosphere. Journal of Food Safety, 32, 37-47. Dohi, S., Terasaki, M., Makino, M., 2009. Acetylcholinesterase inhibitory activity and chemical composition of commercial essential oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 4313-4318. Dougherty, P.F., Yotter, D.W., Matthews, T.R., 1977. Microdilution transfer plate technique for determining in vitro synergy of antimicrobial agents. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 11, 225-228. Duarte, M.C.T., Leme, E.E., Delarmelina, C., Soares, A.A., Figueira, G.M., Sartoratto, A., 2007. Activity of essential oils from Brazilian medicinal plants on Escherichia coli. Journal of Ethnopharmacology, 111, 197-201. Ebrahim, A.M., Eltayeb, M.H., Khalid, H., Mohamed, H., Abdalla, W., Grill, P., Michalke, B., 2012. Study on selected trace elements and heavy metals in some popular medicinal plants from Sudan. Journal of Natural Medicines, 66, 671-679. El-Baky, H.H.A., El-Baroty, G.S., 2008. Chemical and biological evaluation of the essential oil of Egyptian Moldavian balm. International Journal of Essential Oil Therapeutics, 2, 76-81. Elec, V., Quimio, C.A., Mendoza, R., Sajise, A.G.C., Beebout, S.E.J., Gregorio, G.B., Singh, R.K., 2013. Maintaining elevated Fe2+ concentration in solution culture for the development of a rapid and repeatable screening technique for iron toxicity tolerance in rice (Oryza sativa L.). Plant and Soil, 372, 253-264. 176  En, Z., Vasidov, A., Tsipin, V.V., Tillaev, T., Jumaniyazova, G.I., 2003. Study of element uptake in plants from the soil to assess environmental contamination by toxic elements. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research-Section A, 505, 462-465. Eryiğit, T., Okut, N., Ekici, K., Yildirim, B., 2014. Chemical composition and antibacterial activities of Juniperus horizontalis essential oil. Canadian Journal of Plant Science, 94, 323-327. Farjam, M.H., 2012. Antibacterial activity and composition of essential oil of Nepeta pungens Benth. from Iran. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2, 103-105. Ferrante, A.A., Augliera, J., Lewis, K., Klibanov, A.M., 1995. Cloning of an organic solvent- resistance gene in Escherichia coli: the unexpected role of alkylhydroperoxide reductase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92, 7617-7621. Figuérédo, G., Chalchat, J.C., Petrović, S., Maksimović, Z., Gorunović, M., Boža, P., Radić, J., 2009. Composition of essential oils of flowers, leaves, stems and rhizome of Peucedanum officinale L. (Apiaceae). Journal of Essential Oil Research, 21, 123-126. Furumoto, T., Yamaguchi, T., Ohshima-Ichie, Y., 2011. A plastidial sodium-dependent pyruvate transporter. Nature, 476, 472-475. Gkinis, G., Bozin, B., Mimica-Dukić, N., Tzakou, O., 2010. Antioxidant activity of Nepeta nuda L. ssp. nuda essential oil rich in nepetalactones from Greece. Journal of Medicinal Food, 13, 1176-1181. Gniewosz, M., Synowiec, A., 2011. Antibacterial activity of pullulan films containing thymol. Flavour and Fragrance Journal, 26, 389-395. Gokturk, R.S., Sagdic, O., Ozkan, G., Unal, O., Aksoy, A., Albayrak, S., Arici, M., Durak, M.Z., 2013. Essential oil compositions and bioactivities of Thymus revolutus and Cyclotrichium origanifolium. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 16, 795-805. Gomes, M.P., Duarte, D.M., Carneiro, M.M.L.C., Barreto, L.C., Carvalho, M., Soares, A.M., Guilherme, L.R.G., Garcia, Q.S., 2013. Zinc tolerance modulation in Myracrodruon urundeuva plants. Plant Physiology and Biochemistry, 67, 1-6. Gormez, A., Bozari, S., Yanmis, D., Gulluce, M., Agar, G., Sahin, F., 2013. Antibacterial activity and chemical composition of essential oil obtained from Nepeta nuda against phytopathogenic bacteria. Journal of Essential Oil Research, 25, 149-153. Griffin, S.G., Wyllie, S.G., Markham, J.L., Leach, D.N., 1999. The role of structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity. Flavour and Fragrance Journal, 14, 322-332. 177  Grzebisz, W., 2011. Magnesium-food and human health. Journal of Elementology, 16, 299- 323. Guinoiseau, E., Luciani, A., Rossi, P.G., Quilichini, Y., Ternengo, S., Bradesi, P., Berti, L., 2010. Cellular effects induced by Inula graveolens and Santolina corsica essential oils on Staphylococcus aureus. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 29, 873-879. Guo, N., Liu, J., Wu, X., Bi, X., Meng, R., Wang, X., Xiang, H., Deng, X., Yu, L., 2009. Antifungal activity of thymol against clinical isolates of fluconazole-sensitive and - resistant Candida albicans. Journal of Medical Microbiology, 58, 1074-1079. Gutiérrez-Fernández, J., García-Armesto, M.R., Álvarez-Alonso, R., del Valle, P., de Arriaga, D., Rúa, J., 2013. Antimicrobial activity of binary combinations of natural and synthetic phenolic antioxidants against Enterococcus faecalis. Journal of Dairy Science, 96, 4912- 4920. Hamoud, R., Zimmermann, S., Reichling, J., Wink, M., 2014. Synergistic interactions in two- drug and three-drug combinations (thymol, EDTA and vancomycin) against multi drug resistant bacteria including E. coli. Phytomedicine, 21, 443-447. Harrenga, A., Michel, H., 1999. The cytochrome C oxidase from Paracoccus denitrificans does not change the metal center ligation upon reduction. The Journal of Biological Chemistry, 274, 33296-33299. Hasegawa, P.M., 2013. Sodium (Na+) homeostasis and salt tolerance of plants. Environmental and Experimental Botany, 92, 19-31. Hassine, D.B., Ismail, H.B., Jribi, C., Khouja, M.L., Abderrabba, M., 2013. Eucalyptus oleosa f. muell essential oil: extraction, chemical composition and antimicrobial activity. Acta Horticulturae, 997, 77-82. Hawkesford, M., Horsi, W., Kichey, T., Lambers, H., Schjoerring, J., Skrumsager Møller, I., White, P., 2012. Functions of macronutrients. In: Mineral nutrition of higher plants, third edition, Marschner, P., (Ed.). Academic Press, San Diego, pp. 135-189. Heipieper, H.J., Keweloh, H., Rehm, H.J., 1991. Influence of phenols on growth and membrane permeability of free and immobilized Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 57, 1213-1217. Heipieper, H.J., Weber, F.J., Sikkema, J., Keweloh, H., de Bont, J.A.M., 1994. Mechanisms of resistance of whole cells to toxic organic solvents. Trends in Biotechnology, 12, 409- 415. 178  Hendry, E.R., Worthington, T., Conway, B.R., Lambert, P.A., 2009. Antimicrobial efficacy of eucalyptus oil and 1,8-cineole alone and in combination with chlorhexidine digluconate against microorganisms grown in planktonic and biofilm cultures. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 64, 1219-1225. Hinsinger, P., Bengough, A.G., Vetterlein, D., Young, I.M., 2009. Rhizosphere: biophysics, biogeochemistry and ecological relevance. Plant and Soil, 321, 117-152. Hobbs, M.M., Anderson, J.E., Balthazar, J.T., Kandler, J.L., Carlson, R.W., Ganguly, J., Begum, A.A., Duncan, J.A., Lin, J.T., Sparling, P.F., Jerse, A.E., Shafer, W.M., 2013. Lipid A’s structure mediates Neisseria gonorrhoeae fitness during experimental infection of mice and men. American Society for Microbiology (mBio), 4, 1-5. Hodson, M.J., 2012. Metal toxicity and tolerance in plants. Biochemist, 34, 28-32. Hosaka, H., Nakagawa, A., Tanaka, I., Harada, N., Sano, K., Kimura, M., Yao, M., Wakatsuki, S., 1997. Ribosomal protein S7: a new RNA-binding motif with structural similarities to a DNA architectural factor. Structure, 5, 1199-1208. Hus, J.C., Marion, D., Blackledge, M., 2000. De novo determination of protein structure by NMR using orientational and long-range restraints. Journal of Molecural Biology, 298, 927-936. Husson, O., 2013. Redox potential (Eh) and pH as drivers of soil/plant/microorganism systems: a transdisciplinary overview pointing to integrative opportunities for agronomy. Plant and Soil, 362, 389-417. Ilić, B.S., Kocić, B.D., Ćirić, V.M., Cvetković, O.G., Miladinović, D.L., 2014. An in vitro synergistic interaction of combinations of Thymus glabrescens essential oil and its main constituents with chloramphenicol. The Scientific World Journal, 2014, 1-10. Iten, F., Saller, R., Abel, G., Reichling, J., 2009. Additive antmicrobial [corrected] effects of the active components of the essential oil of Thymus vulgaris - chemotype carvacrol. Planta Medica, 75, 1231-1236. Jaimand, K., Ashorabadi, E.S., Dini, M., 2006. Chemical constituents of the leaf and seed oils of Peucedanum officinale L. cultivated in Iran. Journal of Essential Oil Research, 18, 670- 671. Jedlicková, Z., Mottl, O., Serý, V., 1992. Antibacterial properties of the Vietnamese cajeput oil and ocimum oil in combination with antibacterial agents. Journal of Hygiene, Epidemiology, Microbiology and Immunology, 36, 303-309. Jianu, C., Pop, G., Gruia, A.T., Horhat, F.G., 2013. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of lavender (Lavandula angustifolia) and lavandin (Lavandula x 179  intermedia) grown in western Romania. International Journal of Agriculture and Biology, 15, 772-776. Jirovetz, L., Buchbauer, G., Schmidt, E., Stoyanova, A.S., Denkova, Z., Nikolova, R., Geissler, M., 2007. Purity, antimicrobial activities and olfactoric evaluations of geraniol/nerol and various of their derivatives. Journal of Essential Oil Research, 19, 288- 291. Kabata-Pendias, A., 2010. Trace elements in soils and plants, fourth edition. CRC Press, New York, pp. 548. Kabelitz, N., Santos, P.M., Heipieper, H.J., 2003. Effect of aliphatic alcohols on growth and degree of saturation of membrane lipids in Acinetobacter calcoaceticus. FEMS Microbiology Letters, 220, 223-227. Kapetanos, C., Karioti, A., Bojović, S., Marin, P., Veljić, M., Skaltsa, H., 2008. Chemical and principal-component analyses of the essential oils of Apioideae taxa (Apiaceae) from central Balkan. Chemistry and Biodiversity, 5, 101-119. Karley, A.J., White, P.J., 2009. Moving cationic minerals to edible tissues: potassium, magnesium, calcium. Current Opinion in Plant Biology, 12, 291-298. Khan, M.S.A., Ahmad, I., 2012. Antibiofilm activity of certain phytocompounds and their synergy with fluconazole against Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 67, 618-621. Kilic, O., Hayta, S., Bagci, E., 2011. Chemical composition of essential oil of Nepeta nuda L. subsp. nuda (Lamiaceae) from Turkey. Asian Journal of Chemistry, 23, 2788-2790. Kim, J.M., Marshall, M.R., Cornell, J.A., Preston, J.F., Wei, C.I., 1995. Antibacterial activity of carvacrol, citral, and geraniol against Salmonella typhimurium in culture medium and on fish cubes. Journal of Food Science, 60, 1364-1368. Kirmizibekmez, H., Atay, I., Kaiser, M., Yesilada, E., Tasdemir, D., 2011. In vitro antiprotozoal activity of extracts of five Turkish Lamiaceae species. Natural Product Communications, 6, 1697-1700. Klein, O., Roth, A., Dornuf, F., Schöller, O., Mäntele, W., 2012. The good vibrations of beer. The use of infrared and UV/VIS spectroscopy and chemometry for the quantitative analysis of beverages. Zeitschrift fur Naturforschung - Section B, 67, 1005-1015. Kogelmann, W.J., Sharpe, W.E., 2006. Soil acidity and manganese in declining and nondeclining sugar maple stands in Pennsylvania. Journal of Environmental Quality, 35, 433-441. 180  Kökdil, G., Kurucu, S., Topçu, G., 1996. Composition of the essential oil of Nepeta nuda L. ssp. albiflora (Boiss.) gams. Flavour and Fragrance Journal, 11, 167-169. Konakchiev, A., Tsankova, E., 2002. The essential oils of Satureja montana ssp. kitaibelii Wierzb. and Satureja pilosa var. pilosa Velen from Bulgaria. Journal of Essential Oil Research, 14, 120-121. Konieczynski, P., 2013. Principal component analysis in interpretation of the results of HPLC-ELC, HPLC-DAD and essential elemental contents obtained for medicinal plant extracts. Central European Journal of Chemistry, 11, 519-526. Kostić, D., Mitić, S., Zarubica, A., Mitić, M., Veličković, J., Ranđelović, S., 2011. Content of trace metals in medicinal plants and their extracts. Hemijska Industrija, 65, 165-170. Kotan, R., Kordali, S., Cakir, A., 2007. Screening of antibacterial activities of twenty-one oxygenated monoterpenes. Zeitschrift fur Naturforschung - Section C Journal of Biosciences, 62, 507-513. Kundaković, T., Milenković, M., Zlatković, S., Kovačević, N., Goran, N., 2011. Composition of Satureja kitaibelii essential oil and its antimicrobial activity. Natural Product Communications, 6, 1353-1356. Lakušić, B., Ristić, M., Slavkovska, M., Milenković, V., Lakušić, D., 2011. Environmental and seasonal impacts on the chemical composition of Satureja horvatii Šilić (Lamiaceae) essential oils. Chemistry and Biodiversity, 8, 483-493. Lengauer, T., Rarey, M., 1996. Computational methods for biomolecular docking. Current Opinion in Structural Biology, 6, 402-406. Leslie, A.G.W., 1990. Refined crystal structure of type III chloramphenicol acetyltransferase at 1.75 Å resolution. Journal of Molecural Biology, 213, 167-186. Lindhauer, M.G., De Fekete, M.A.R., 1990. Starch synthesis in potato (Solanum tuberosum) tubers: activity of selected enzymes in dependence of potassium content in storage tissue. Plant and Soil, 124, 291-295. Liu, D., Thomson, K., Kaiser, K.L., 1982. Quantitative structure-toxicity relationship of halogenated phenols on bacteria. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 29, 130-136. Loska, K., Wiechula, D., 2003. Application of principle component analysis for the estimation of source of heavy metal contamination in surface sediments from the Rybnik reservoir. Chemosphere, 51, 723-733. 181  Ložiené, K., Šakalyté, J., Paškevičius, A., Venskutonis, P.R., 2008. Anti-Candida activity of Thymus pulegioides (Lamiaceae) essential oils depends on the plant chemotype. Herba Polonica, 54, 79-92. Macías, F., Camps Arbestain, M., 2010. Soil carbon sequestration in a changing global environment. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 15, 511-529. Macmaster, R., Zelinskaya, N., Savić, M., Rankin, C.R., Conn, G.L., 2010. Structural insights into the function of aminoglycoside-resistance A1408 16S rRNA methyltransferases from antibiotic-producing and human pathogenic bacteria. Nucleic Acids Research, 38, 7791- 7799. Maksimović, Z., Stojanović, D., Šoštarić, I., Dajić, Z., Ristić, M., 2008. Composition and radical-scavenging activity of Thymus glabrescens Willd. (Lamiaceae) essential oil. Journal of the Science of Food and Agriculture, 88, 2036-2041. Mancini, E., Arnold, N.A., De Feo, V., Formisano, C., Rigano, D., Piozzi, F., Senatore, F., 2009. Phytotoxic effects of essential oils of Nepeta curviflora Boiss. and Nepeta nuda L. subsp. albiflora growing wild in Lebanon. Journal of Plant Interactions, 4, 253-259. Mankin, A.S., Garrett, R.A., 1991. Journal of Bacteriology, 173, 3559-3563.Maree, J., Kamatou, G., Gibbons, S., Viljoen, A., Van Vuuren, S., 2014. The application of GC-MS combined with chemometrics for the identification of antimicrobial compounds from selected commercial essential oils. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 130, 172-181. Mariani, R., Maffioli, S.I., 2009. Bacterial RNA polymerase inhibitors: an organized overview of their structure, derivatives, biological activity and current clinical development status. Current Medicinal Chemistry, 16, 430-454. Márquez-García, B., Córdoba, F., 2010. Antioxidative system in wild populations of Erica andevalensis. Environmental and Experimental Botany, 68, 58-65. Marschner, P., 2012. Mineral nutrition of higher plants, third edition. Academic Press, San Diego, pp. 672. Masoudi, S., Esamaeili, A., Khalilzadeh, M.A., Rustaiyan, A., Moazami, N., Akhgar, M.R., Varavipoor, M., 2006. Volatile constituents of Dorema aucheri Boiss., Seseli libanotis (L.) W.D. Koch var. armeniacum Bordz. and Conium maculatum L. three Umbelliferae herbs growing wild in Iran. Flavour and Fragrance Journal, 21, 801-804. Matan, N., Nisoa, M., Matan, N., 2014. Antibacterial activity of essential oils and their main components enhanced by atmospheric RF plasma. Food Control, 39, 97-99. 182  Matejić, J.S., Džamić, A.M., Ćirić, A.D., Krivošej, Z., Ranđelović, V.N., Marin, P.D., 2013. Antioxidant and antimicrobial activities of extracts of four Peucedanum L. species. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 8, 655-665. Matthias, O., 2007. Chemometrics. Wiley-VCH, Weinheim, pp. 343. McMurry, L.M., George, A.M., Levy, S.B., 1994. Active efflux of cloramphenicol in susceptible Escherichia coli strains and in multiple-antibiotic-resistant (Mar) mutants. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38, 542-546. Meda, A.R., Scheuermann, E.B., Prechsl, U.E., 2007. Iron acquisition by phytosiderophores contributes to cadmium tolerance. Plant Physiology, 143, 1761-1773. Meena, A.K., Bansal, P., Kumar, S., Rao, M.M., Garg, V.K., 2010. Estimation of heavy metals in commonly used medicinal plants: a market basket survey. Environmental Monitoring and Assessment, 170, 657-660. Michet, A., Chalchat, J.C., Figuérédo, G., Thébaud, G., Billy, F., Pétel, G., 2008. Chemotypes in the volatiles of wild thyme (Thymus pulegioides L.). Journal of Essential Oil Research, 20, 101-103. Mihajilov-Krstev, T., Kitić, D., Radnović, D., Ristić, M., Mihajlović-Ukropina, M., Zlatković, B., 2011. Chemical composition and antimicrobial activity of Satureja kitaibelii essential oil against pathogenic microbial strains. Natural Product Communications, 6, 1167-1172. Miladinović, D., 2005. Antimicrobial activity of some medicinal plants from Serbia. Pharmacia, 52, 46-49. Miladinović, D., 2011b. Antioksidantni sistem biljaka. Tehnološki fakultet Univerziteta u Nišu, Niš, pp. 127. Miladinović, D.L., Ilić, B.S., Mihajilov-Krstev, T.M., Jović, J.L., Marković, M.S., 2014. In vitro antibacterial activity of Libanotis montana essential oil in combination with conventional antibiotics. Natural Product Communications, 9, 281-286. Miladinović, D.L., Ilić, B.S., Mihajilov-Krstev, T.M., Nikolić, N.D., Miladinović, L.C., Cvetković, O.G., 2012. Investigation of the chemical composition-antibacterial activity relationship of essential oils by chemometric methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 403, 1007-1018. Miladinović, D.L., Ilić, B.S., Miladinović, L.C., Kocić, B.D., Ćirić, V.M., Stankov-Jovanović, V.P., Cvetković, O.G., 2013. Antibacterial activity of Thymus pulegioides essential oil and its synergistic potential with antibiotics: a chemometric approach. In: Recent Progress in Medicinal Plants vol. 38: Essential Oils III and Phytopharmacology, Govil, J.N., Bhattacharya, S., (Eds.). Studium Press LLC, Houston, pp. 101-136. 183  Miladinović, D.L., Ilić, B.S., Milosavljević, V.N., 2011a. Trace elements and antioxidants in Astragalus onobrychis L. subsp. chlorocarpus (Griseb.) S. Kozuharov et D.K. Pavlova. Hemijska Industrija, 65, 323-327. Millaleo, R., Reyes-Díaz, M., Ivanov, A.G., Mora, M.L., Alberdi, M., 2010. Manganese as essential and toxic element for plants: Transport, accumulation and resistance mechanisms. Journal of Soil Science and Plant Nutrition, 10, 476-494. Mnif, W., Dhifi, W., Jelali, N., Baaziz, H., Hadded, A., Hamdi, N., 2011. Characterization of leaves essential oil of Pelargonium graveolens originating from Tunisia: Chemical composition, antioxidant and biological activities. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 14, 761-769. Mohamed, A.M.O., Antia, H.E., 1998. Geoenvironmental engineering. Elsevier, Amsterdam, pp. 706. Moreira, M.A.S., Oliveira, J.A., Teixeira, L.M., Moraes, C.A., 2005. Detection of a chloramphenicol efflux system in Escherichia coli isolated from poultry carcass. Veterinary Microbiology, 109, 75-81. Morić, I., Savić, M., Ilić-Tomić, T., Vojnović, S., Bajkić, S., Vasiljević, B., 2010. rRNA methyltransferases and their role in resistance to antibiotics. Journal of Medical Biochemistry, 29, 165-174. Mueller, D., Ferrão, M.F., Marder, L., Da Costa, A.B., Schneider, R.C., 2013. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and multivariate analysis for identification of different vegetable oils used in biodiesel production. Sensors, 13, 4258-4271. Neter, E., Gorzynski, E.A., Westphal, O., Lüderitz, O., 1958. The effects of antibiotics on enterobacterial lipopolysaccharides (endotoxins), hemagglutination and hemolysis. The Journal of Immunology, 80, 66-72. Neumann, G., Kabelitz, N., Zehnsdorf, A., Miltner, A., Lippold, H., Meyer, D., Schmid, A., Heipieper, H.J., 2005. Prediction of the adaptability of Pseudomonas putida DOT-T1E to a second phase of a solvent for economically sound two-phase biotransformations. Applied and Environmental Microbiology, 71, 6606-6612. Nieves-Cordones, M., Aleman, F., Martinez, V., Rubio, F., 2014. K+ uptake in plant roots. The systems involved, their regulation and parallels in other organisms. Journal of Plant Physiology, 171, 688-695. Olajuyigbe, O.O., Afolayan, A.J., 2012. Synergistic interactions of methanolic extract of Acacia mearnsii De Wild. with antibiotics against bacteria of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences, 13, 8915-8932. 184  Olowoyo, J.O., Okedeyi, O.O., Mkolo, N.M., Lion, G.N., Mdakane, S.T.R., 2012. Uptake and translocation of heavy metals by medicinal plants growing around a waste dump site in Pretoria, South Africa. South African Journal of Botany,78, 116-121. Omezzine, F., Daami-Remadi, M., Rinez, A., Ladhari, A., Haouala, R., 2011. In vitro assessment of Inula spp. organic extracts for their antifungal activity against some pathogenic and antagonistic fungi. African Journal of Microbiology Research, 5, 3527- 3531. Ozores-Hampton, M., 2013. Effective strategies to correct iron deficiency in Florida vegetable crops. HortTechnology, 23, 548-552. Ozturk, S., Ercisli, S., 2006. Chemical composition and in vitro antibacterial activity of Seseli libanotis. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22, 261-265. Padeletti, G., Fermo, P., 2010. A scientific approach to the attribution problem of renaissance ceramic productions based on chemical and mineralogical markers. Applied Physics A, 100, 771-784. Palaniappan, K., Holley, R.A., 2010. Use of natural antimicrobials to increase antibiotic susceptibility of drug resistant bacteria. International Journal of Food Microbiology, 140, 164-168. Palić, M.R., Gašić, J.M., 1993. Hemijski sastav etarskog ulja biljaka roda Satureja L. Farmaceutsko-hemijska industrija "Zdravlje", 3, 14-19. Pavel, M., Ristić, M., Stević, T., 2010. Essential oils of Thymus pulegioides and Thymus glabrescens from Romania: chemical composition and antimicrobial activity. Journal of Serbian Chemical Society, 75, 27-34. Pemmaraju, S.C., Pruthi, P.A., Prasad, R., Pruthi, V., 2013. Candida albicans biofilm inhibition by synergistic action of terpenes and fluconazole. Indian Journal of Experimental Biology, 51, 1032-1037. Pinto, E., Pina-Vaz, C., Salgueiro, L., Gonçalves, M.J., Costa-de-Oliveira, S., Cavaleiro, C., Palmeira, A., Rodrigues, A., Martinez-de-Oliveira, J., 2006. Antifungal activity of the essential oil of Thymus pulegioides on Candida, Aspergillus and dermatophyte species. Journal of Medical Microbiology, 55, 1367-1373. Pluhár, Z., Kocsis, M., Kuczmog, A., Csete, S., Simkó, H., Sárosi, S., Molnár, P., Horváth, G., 2012. Essential oil composition and preliminary molecular study of four Hungarian Thymus species. Acta Biologica Hungarica, 63, 81-96. 185  Pluhár, Z., Sárosi, S., Novák, I., Kutta, G., 2008. Essential oil polymorphism of Hungarian common thyme (Thymus glabrescens Willd.) populations. Natural Product Communications, 3, 1151-1154. Pluhár, Z., Sárosi, S., Simkó, H., 2012. Environmental conditions and essential oil diversity of native Thymus pulegioides populations in highlands of Hungary and in the Carpathians. Acta Horticulturae, 955, 65-71. Radonić, A., Mastelić, J., 2008. Essential oil and glycosidically bound volatiles of Thymus pulegioides L. growing wild in Croatia. Croatica Chemica Acta, 81, 599-606. Rǎdulescu, V., Pavel, M., Teodor, A., Tǎnase, A., Ilieş, D.C., 2009. Analysis of volatile compounds from infusion and hydrodistillate obtained from the species Thymus pulegioides L. (Lamiaceae). Farmacia, 57, 282-289. Radulović, N., Blagojević, P.D., Rabbitt, K., De Sousa Menezes, F., 2011. Essential oil of Nepeta x faassenii Bergmans ex Stearn (N. mussinii Spreng. x N. nepetella L.): a comparison study. Natural Product Communications, 6, 1015-1022. Rastogi, V.K., Girvin, M.E., 1999. Structural changes linked to proton translocation by subunit c of the ATP synthase. Nature, 402, 263-268. Reddy, A.S., Pati, S.P., Kumar, P.P., Pradeep, H.N., Sastry, G.N., 2007. Virtual screening in drug discovery - a computational perspective. Current Protein and Peptide Science, 8, 329-351. Reid, M.K., Spencer, K.L., Shotbolt, L., 2011. An appraisal of microwave-assisted Tessier and BCR sequential extraction methods for the analysis of metals in sediments and soils. Journal of Soils and Sediments, 11, 518-528. Ren, W., Xue, B., Geng, Y., Sun, L., Ma, Z., Zhang, Y., Mitchell, B., Zhang, L., 2014. Inventorying heavy metal pollution in redeveloped brownfield and its policy contribution: case study from Tiexi District, Shenyang, China. Land Use Policy, 38, 138-146. Rokbeni, N., M'rabet, Y., Dziri, S., Chaabane, H., Jemli, M., Fernandez, X., Boulila, A., 2013. Variation of the chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of natural populations of Tunisian Daucus carota L. (Apiaceae). Chemistry and Biodiversity, 10, 2278-2290. Roman, I., Rusu, M.A., Puicǎ, C., Deliu, C., 2011. Some histoenzymological (histochemical) and biochemical changes induced by Peucedanum herbal extracts upon the liver and kidney in rats. Annals of the Romanian Society for Cell Biology, 16, 69-73. Ruan, J., Ma, L., Yang, Y., 2012. Magnesium nutrition on accumulation and transport of amino acids in tea plants. Journal of the Science of Food and Agriculture, 92, 1375-1383. 186  Sabiene, N., Kusliene, G., Zaleckas, E., 2010. The influence of land use on soil organic carbon and nitrogen content and redox potential. Zemdirbyste, 97, 15-24. Saito, H., Koyasu, J., Shigeoka, T., Tomita, I., 1994. Cytotoxicity of chlorophenols to goldfish GFS cells with the MTT and LDH assays. Toxicology in Vitro, 8, 1107-1112. Salter, A., Wiseman, H., Tucker, G., 2012. Phytonutrients. Wiley-Blackwell, Hoboken, New Jersey, pp. 312. Sarath Chandra Bose, N., Ammani, K., Ratakumari, S., 2013. Chemical composition and its antibacterial activity of essential oil from Cymbopoton jwarancusa. International Journal of Bio-Pharma Research, 2, 97-100. Sarer, E., Konuklugil, B., 1996. Composition of the essential oil from Nepeta nuda ssp. albiflora (Boiss.) gams. Journal of Essential Oil Research, 8, 687-688. Sárosi, S., Bernáth, J., Bertoli, A., Pistelli, L., Benvenuti, S., 2008. Essential oil polymorphism of Thymus pulegioides collected in Monti Pisani, Italy. Acta Horticulturae, 955, 59-64. Schmidt, E., Wanner, J., Höferl, M., Jirovetz, L., Buchbauer, G., Gochev, V., Girova, T., Stoyanova, A., Geissler, M., 2012. Chemical composition, olfactory analysis and antibacterial activity of Thymus vulgaris chemotypes geraniol, 4-thujanol/terpinen-4-ol, thymol and linalool cultivated in Southern France. Natural Product Communications, 7, 1095-1098. Shin, S., 2003. Anti-Aspergillus activities of plant essential oils and their combination effects with ketoconazole or amphotericin B. Archives of Pharmacal Research, 26, 389-393. Shin, S., Lim, S., 2004. Antifungal effects of herbal essential oils alone and in combination with ketoconazole against Trichophyton spp. Journal of Applied Microbiology, 97, 1289- 1296. Sikkema, J., de Bont, J.A., Poolman, B., 1994. Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes. The Journal of Biological Chemistry, 269, 8022-8028. Sikkema, J., de Bont, J.A.M., Poolman, B., 1995. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiological Reviews, 59, 201-222. Sikkema, J., Poolman, B., Konings, W.N., de Bont, J.A., 1992. Effects of the membrane action of tetralin on the functional and structural properties of artificial and bacterial membranes. Journal of Bacteriology, 174, 2986-2992. Simkó, H., Sárosi, S., Ladányi, M., Marton, B., Radácsi, P., Csontos, P., Gosztola, B., Kun, R., Pluhár, Z., 2013. Studies on occurence, essential oil data and habitat conditions of 187  Hungarian Thymus pannonicus and Thymus glabrescens populations. Medicinal and Aromatic Plants, 2, 1-7. Singh, D., Kumar, T.R.S., Gupta, V.K., Chaturvedi, P., 2012. Antimicrobial activity of some promising plant oils, molecules and formulations. Indian Journal of Experimental Biology, 50, 714-717. Skalicka-Wozniak, K., Los, R., Glowniak, K., Malm, A., 2010. Comparison of hydrodistillation and headspace solid-phase microextraction techniques for antibacterial volatile compounds from the fruits of Seseli libanotis. Natural Product Communications, 5, 1427-1430. Skyllberg, U., Raulund-Rasmussen, K., Borggaard, O.K., 2001. pH buffering in acidic soils developed under Picea abies and Quercus robur-effects of soil organic matter, adsorbed cations and soil solution ionic strength. Biogeochemistry, 56, 51-74. Slavkovska, V., Jančić, R., Bojović, S., Milosavljević, S., Đoković, D., 2001. Variability of essential oils of Satureja montana L. and Satureja kitaibelii Wierzb. ex Heuff. from the central part of the Balkan peninsula. Phytochemistry, 57, 71-76. Soares Leal, A., Prado, G., Bomfim Gomes, T.C., Peixoto Sepe, F., Dalmázio, I., 2013. Determination of metals in medicinal plants highly consumed in Brazil. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 49, 599-607. Solórzano-Santos, F., Miranda-Novales, M.G., 2012. Essential oils from aromatic herbs as antimicrobial agents. Current Opinion in Biotechnology, 23, 136-141. Sonboli, A., Gholipour, A., Yousefzadi, M., 2012. Antibacterial activity of the essential oil and main components of two Dracocephalum species from Iran. Natural Product Research, 26, 2121-2125. Sook, L., Shin, S., 2007. Synergism in antifungal activity against Candida and Trichophyton species in combination with the essential oil of Coriandrum sativum L. and antibiotics. Natural Product Sciences, 13, 85-89. Sparks, D. L., 2003. Environmental soil chemistry, second edition. Academic Press, San Diego, pp. 352. Stanković, N.S., Čomić, L.R., Kocić, B.D., Nikolić, D.M., Mihajilov-Krstev, T.M., Ilić, B.S., Miladinović, D.L., 2011. Antibacterial activity chemical composition relationship of the essential oils from cultivated plants from Serbia. Hemijska Industrija, 65, 583-589. Stanković, T., Kolundžija, B., Ćirić, A., Soković, M., Nikolić, D., Kundaković, T., 2013. Cytotoxicity and antimicrobial activity of Satureja kitaibelii Wierzb. ex Heuff (Lamiaceae). Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 8, 845-854. 188  Stefanakis, M.K., Touloupakis, E., Anastasopoulos, E., Ghanotakis, D., Katerinopoulos, H.E., Makridis, P., 2013. Antibacterial activity of essential oils from plants of the genus Origanum. Food Control, 34, 539-546. Stefanović, O.D., Stanojević, D.D., Čomić, L.R., 2012. Synergistic antibacterial activity of Salvia officinalis and Cichorium intybus extracts and antibiotics. Acta Poloniae Pharmaceutica, 69, 457-463. Steitz, T.A., 2008. A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 9, 242-253. Subbarao, G.V., Ito, O., Berry, W.L., Wheeler, R.M., 2003. Sodium: a functional plant nutrient. Critical Reviews in Plant Sciences, 22, 391-416. Subramanian, R., Gayathri, S., Rathnavel, C., Raj, V., 2012. Analysis of mineral and heavy metals in some medicinal plants collected from local market. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2012, 74-78. Suits, M.D.L., Sperandeo, P., Dehò, G., Polissi, A., Jia, Z., 2008. Novel structure of the conserved gram-negative lipopolysaccharide transport protein A and mutagenesis analysis. Journal of Molecular Biology, 380, 476-488. Sung, M.T., Lai, Y.T., Huang, C.Y., Chou, L.Y., Shih, H.W., Cheng, W.C., Wong, C.H., Ma, C., 2009. Crystal structure of the membrane-bound bifunctional transglycosylase PBP1B from Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106, 8824-8829. Sutherland, R.A., 2010. BCR-701: a review of 10-years of sequential extraction analyses. Analytica Chimica Acta, 680, 10-20. Tan, K.H., 1998. Principles of soil chemistry, third edition. CRC Press, New York, pp. 560. Tang, W.W., Zeng, G.M., Gong, J.L., Liang, J., Xu, P., Zhang, C., Huang, B.B., 2014. Impact of humic/fulvic acid on the removal of heavy metals from aqueous solutions using nanomaterials: a review. Science of the Total Environment, 468, 1014-1027. Tekoriene, R., Ložiene, K., 2012. Disinfecting capacity of essential oil of Thymus pulegioides L. (Lamiaceae) chemotypes against phytopathogenic Pseudomonas species. Acta Alimentaria, 41, 257-264. Tenover, F.C., 2006. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. The American Journal of Medicine, 119, 62-70. Tepe, B., Akpulat, H.A., Sokmen, M., 2011. Evaluation of the chemical composition and antioxidant activity of the essential oils of Peucedanum longifolium (Waldst. & Kit.) and P. palimbioides (Boiss.). Records of Natural Products, 5, 108-116. 189  Tewari, R.K., Kumar, P., Sharma, P.N., 2013. Oxidative stress and antioxidant responses of mulberry (Morus alba) plants subjected to deficiency and excess of manganese. Acta Physiologiae Plantarum, 35, 3345-3356. Topçu, G., Öksüz, S., Shieh, H.L., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M., Bozok-Johansson, C., 1993. Cytotoxic and antibacterial sesquiterpenes from Inula graveolens. Phytochemistry, 33, 407-410. Toroglu, S., 2011. Antimicrobial activity of essential oil of Thymus kotschyanus subsp. glabrescens. Asian Journal of Chemistry, 23, 1072-1074. Tourigny, D.S., Fernandez, I.S., Kelley, A.C., Ramakrishnan, V., 2013. Elongation factor G bound to the ribosome in an intermediate state of translocation. Science, 340, 1235490- 1235490. Trombetta, D., Castelli, F., Sarpietro, M.G., Venuti, V., Cristani, M., Daniele, C., Saija, A., Mazzanti, G., Bisignano, G., 2005. Mechanisms of antibacterial action of three monoterpenes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, 2474-2478. Trott, O., Olson, A.J., 2010. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading. Journal of Computational Chemistry, 31, 455-461. Tserennadmid, R., Takó, M., Galgóczy, L., Papp, T., Pesti, M., Vágvölgyi, C., Almássy, K., Krisch, J., 2011. Anti yeast activities of some essential oils in growth medium, fruit juices and milk. International Journal of Food Microbiology, 144, 480-486. Turgis, M., Han, J., Caillet. S., Lacroix, M., 2009. Antimicrobial activity of mustard essential oil against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhi. Food Control, 20, 1073-1079. Ultee, A., Kets, E.P.W., Smid, E.J., 1999. Mechanisms of action of carvacrol on the food- borne pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology, 65, 4606-4610. Uribe, S., Rangel, P., Espinola, G., Aguirre, G., 1990. Effects of cyclohexane, an industrial solvent, on the yeast Saccharomyces cerevisiae and on isolated yeast mitochondria. Applied and Environmental Microbiology, 56, 2114-2119. Van Der Plas, L.H.W., Jobse, P.A., Verleur, J.D., 1976. Cytochrome C dependent, antimycin- A resistant respiration in mitochondria from potato tuber (Solanum tuberosum L.). Influence of wounding and storage time on outer membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 430, 1-12. Van Vuuren, S.F., Suliman, S., Viljoen, A.M., 2009. The antimicrobial activity of four commercial essential oils in combination with conventional antimicrobials. Letters in Applied Microbiology, 48, 440-446. 190  Van Vuuren, S.F., Viljoen, A. M., 2007. Antimicrobial activity of limonene enantiomers and 1,8-cineole alone and in combination. Flavour and Fragrance Journal, 22, 540-544. Végh, A., Bencsik, T., Molnár, P., Böszörményi, A., Lemberkovics, É., Kovács, K., Kocsis, B., Horváth, G., 2012. Composition and antipseudomonal effect of essential oils isolated from different lavender species. Natural Product Communications, 7, 1393-1396. Veras, H.N.H., Campos, A.R., Rodrigues, F.F.G., Botelho, M.A., Coutinho, H.D.M., da Costa, J.G.M., 2011. Lippia alba (Mill.) N.E. essential oil interfere with aminoglycosides effect against Staphylococcus aureus. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 14, 574- 581. Watanabe, T., Broadley, M.R., Jansen, S., White, P.J., Takada, J., Satake, K., Takamatsu, T., Tuah, S.J., Osaki, M., 2007. Evolutionary control of leaf element composition in plants. New Phytologist, 174, 516-523. Wigoda, N., Moshelion, M., Moran, N., 2014. Is the leaf bundle sheath a “smart flux valve” for K+ nutrition? Journal of Plant Physiology, 171, 715-722. Williams, L., Salt, D.E., 2009. The plant ionome coming into focus. Current Opinion in Plant Biology, 12, 247-249. Wold, S., Sjöström, M., 1998. Chemometrics, present and future success. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 44, 3-14. Worwood, V.A., 1993. The complete book of essential oils and aromatherapy. New World Library, Novato, pp. 421. Wyles, D.L., Kaihara, K.A., Vaida, F., Schooley, R.T., 2007. Synergy of small molecular inhibitors of hepatitis C virus replication directed at multiple viral targets. Journal of Virology, 81, 3005-3008. Yang, J., Tam, N.F.Y., Ye, Z., 2014. Root porosity, radial oxygen loss and iron plaque on roots of wetland plants in relation to zinc tolerance and accumulation. Plant and Soil, 374, 815-828. Yang, T., Poovaiah, B.W., 2002. Hydrogen peroxide homeostasis: activation of plant catalase by calcium/calmodulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 4097-4102. Yemane, M., Chandravanshi, B.S., Wondimu, T., 2008. Levels of essential and non-essential metals in leaves of the tea plant (Camellia sinensis L.) and soil of Wushwush farms, Ethiopia. Food Chemistry, 107, 1236-1243. 191  192 Yildirim, A.B., Karakas, F.P., Turker, A.U., 2013. In vitro antibacterial and antitumor activities of some medicinal plant extracts, growing in Turkey. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 6, 616-624. Zarrini, G., Delgosha, Z.B., Moghaddam, K.M., Shahverdi, A.R., 2010. Post-antibacterial effect of thymol. Pharmaceutical Biology, 48, 633-636. Zhang, Z., Vriesekoop, F., Yuan, Q., Liang, H., 2014. Effects of nisin on the antimicrobial activity of D-limonene and its nanoemulsion. Food Chemistry, 150, 307-312. Zhu, J., Shan, J., Qiu, P., Qin, Y., Wang, C., He, D., Sun, B., Tong, P., Wu, S., 2004. The multivariate statistical analysis and XRD analysis of pottery at Xigongqiao site. Journal of Archaeological Science, 31, 1685-1691. Zimmerman, A.J., Weindorf, J.D., 2010. Heavy metal and trace metal analysis in soil by sequential extraction: a review of procedures. International Journal of Analytical Chemistry, 2010, 1-7. Zvezdanović, J., Marković, D., Nikolić, G., 2007. Different possibilities for the formation of complexes of copper and zinc with chlorophyll inside photosynthetic organelles: chloroplasts and thylakoids. Journal of the Serbian Chemical Society, 72, 1053-1062.   7. P R IL O G Research Article An In Vitro Synergistic Interaction of Combinations of Thymus glabrescens Essential Oil and Its Main Constituents with Chloramphenicol Budimir S. IliT,1 Branislava D. KociT,2 Vojislav M. SiriT,3 Olga G. CvetkoviT,4 and Dragoljub L. MiladinoviT1 1 Department of Pharmacy, Faculty of Medicine, University of Nisˇ, 18000 Nisˇ, Serbia 2 Center for Microbiology, Institute for Public Health, 18000 Nisˇ, Serbia 3 Clinic for Endocrinology, Diabetes and Diseases of Metabolism, Clinical Center Nisˇ, 18000 Nisˇ, Serbia 4Center of Chemistry, ICTM, University of Belgrade, 11000 Belgrade, Serbia Correspondence should be addressed to Budimir S. Ilic´; bucabule@yahoo.com Received 23 August 2013; Accepted 20 November 2013; Published 28 January 2014 Academic Editors: L. Kong and D. Ruzek Copyright © 2014 Budimir S. Ilic´ et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. The chemical composition and antibacterial activity ofThymus glabrescensWilld. (Lamiaceae) essential oil were examined, as well as the association between it and chloramphenicol. The antibacterial activities of geraniol and thymol, the main constituents of T. glabrescens oil, individually and in combination with chloramphenicol, were also determined. The interactions of the essential oil, geraniol, and thymol with chloramphenicol toward five selected strains were evaluated using the microdilution checkerboard assay in combination with chemometric methods. Oxygenated monoterpenes were the most abundant compound class in the oil, with geraniol (22.33%) as the major compound. The essential oil exhibited in vitro antibacterial activity against all tested bacterial strains, but the activities were lower than those of the standard antibiotic and thymol. A combination of T. glabrescens oil and chloramphenicol produced a strong synergistic interaction (FIC indices in the range 0.21–0.87) and a substantial reduction of the MIC value of chloramphenicol, thus minimizing its adverse side effects. The combinations geraniol-chloramphenicol and thymol- chloramphenicol produced synergistic interaction to a greater extent, compared with essential oil-chloramphenicol association, which may indicate that the activity of the thyme oil could be attributed to the presence of significant concentrations of geraniol and thymol. 1. Introduction Antimicrobial resistance (AMR) represents a rapidly growing public health concern worldwide. AMR has been observed following the introduction of every antimicrobial agent into clinical practice. For example, resistance of the bacterium Staphylococcus aureus to penicillin was encountered in hospi- tals in the mid-1940s, only a few years after the introduction of penicillin [1]. Amultifaceted approach is needed to combat AMR, including the discovery of novel antimicrobial drugs and/or new methodological concepts. Many studies have shown significant antibacterial activity of essential oils against a wide range of resistant microbial strains [2]. The antibacterial activity of essential oils could reflect all the molecules present or only those present in high amounts. For the same reasons, no particular bacterial resistance or adaptation to essential oils has been described and secondary effects have not been confirmed. To enhance the efficacy of antimicrobial drugs and avoid their potentially toxic side effects, their combination with an essential oil may be an innovative alternative and promising strategy [3]. The genus Thymus contains about 350 species, most commonly used in traditional medicine as antibacterial and antifungal remedies [4]. The Serbian flora recognizes 30 species of theThymus genus, with more than 60 varieties [5]. Given the importance of Thymus species as useful antibacterial remedies, the aim of the present study was to examine the chemical composition and antibacterial effect Hindawi Publishing Corporation e Scientific World Journal Volume 2014, Article ID 826219, 12 pages http://dx.doi.org/10.1155/2014/826219 194 2 The Scientific World Journal of the essential oil of Thymus glabrescens (thyme), as well as the association between it and chloramphenicol. The antibacterial activities of geraniol and thymol, themain active principles of thyme oil, in combinationwith chloramphenicol were also determined. 2. Materials and Methods 2.1. PlantMaterial and Chemicals. The aerial parts ofThymus glabrescens Willd. (Lamiaceae) were collected in June 2011 from natural populations at the Kravlje village, southeast Serbia. A voucher specimen, with the accession number 16642, is deposited at the Herbarium of the Department of Botany, Faculty of Biology, University of BelgradeHerbarium Code BEOU. All chemicals, reagents, and standards were of analytical reagent grade and were purchased from the Sigma- Aldrich Chemical Company. 2.2. Oil Isolation. The aerial parts of the plant (dried and ground) were subjected to hydrodistillation for 4 h, using a Clevenger-type apparatus to obtain the oil. The resulting essential oil was dried over anhydrous sodium sulphate and stored at 4∘C. 2.3. Chemical Analysis. Quantitative and qualitative data of the essential oil were obtained by gas chromatography (GC) and gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS) analyses. 2.4. Gas Chromatography. The GC analysis of the oil was performed on a GCHP-5890 II apparatus, equipped with the split-splitless injector, an HP-5MS capillary column (30m × 0.25mm, 0.25 𝜇m film thickness) using helium as the carrier gas (1mL/min), and an FID. Operating conditions were as follows: injector temperature 250∘C, interface temperature of 280∘C, temperature program from 50∘C (3min) to 250∘C at a rate of 3∘C/min. 2.5. Gas Chromatography/Mass Spectrometry. GC-MS anal- yses were performed on an Agilent Technologies apparatus, Model GS 6890N at 70 eV coupled with a mass selective detector MSD 5975C, under the same gas-chromatographic conditions. 2.6. Identification of Compounds. Identification of the com- pounds was based on comparison of arithmetic retention indices (applying calibrated automated mass spectral decon- volution and identification system software AMDIS ver. 2.64) in combination with the selective ion analysis (SIA) resolution method by Tan et al. [6], comparison with the spectral data from the available literature [7], and comparison of their mass spectra to those fromWiley 275 and NIST/NBS libraries using various search engines. The retention indices were obtained by coinjection with a standard aliphatic hydro- carbons C 7 –C 40 mixture. 2.7. Antibacterial Testing. Theactivity of the essential oil sam- ples was tested towards 13 different bacteria. Gram-negative bacteria were represented by Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 12453, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and Enterobacter aerogenes ATCC 13048, while the researched Gram-positive strains were Enterococcus faecalisATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylo- coccus aureusATCC29213, andListeriamonocytogenesATCC 15313. The inocula of the bacterial strains were prepared from overnight broth cultures and the suspensions were adjusted to 0.5 McFarland standard turbidity (corresponding to 108 CFU/mL, depending on genera-consensus standard by the Clinical and Laboratory Standards Institute) [8]. 2.8.Microwell DilutionAssay. Abrothmicrodilutionmethod was used to determine the minimum inhibitory concentra- tion (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) according to the Clinical and Laboratory Standards Institute [8]. Serial double dilutions of the tested oil, as well as the geraniol and thymol, were prepared in 70.0% ethanol and then transferred into a 96-well microtiter plate over the con- centration range of 0.025–50.0𝜇L/mL in inoculated nutrient broth. The final volume was 100 𝜇L and the final bacterial concentration was 107 CFU/mL in each well. The plate was incubated for 24 h at 37∘C. All experiments were performed in triplicate. Two controls were included, a medium with solvent/ethanol (negative control) and amediumwith antibi- otic chloramphenicol (positive control). Bacterial growthwas determined by adding 20 𝜇L of an aqueous 0.5% triphenyl tetrazolium chloride (TTC) solution.Theminimal inhibitory concentration was defined as the lowest concentration of the oil inhibiting visible growth (red collared pellet on the bottom of the wells after the addition of TTC), while the minimal bactericidal concentration was defined as the lowest oil concentration killing 99.9% of the bacterial cells. To determine the MBC, the broth was taken from each well without visible growth and inoculated inMuellerHinton agar (MHA) for 24 h at 37∘C. 2.9. Microdilution Checkerboard Assay. The microdilution checkerboard method is the technique used most frequently to assess antimicrobial combinations in vitro [9, 10]. Dilutions of T. glabrescens oil, geraniol, thymol, and the examined antibiotic were made for evaluation of their combined inter- actions. The type of interaction was studied on the E. coli ATCC25922,K. pneumoniaATCC700603,P.mirabilisATCC 12453, P. aeruginosaATCC 27853, and S. aureusATCC 29213. These strains were selected based on their importance in fre- quently occurring infections. Dilutions from the logarithmic- growth phase of the bacterial culture were prepared and distributed into microtiter trays containing combinations of varying concentrations: chloramphenicol-T. glabrescens oil, chloramphenicol-geraniol, and chloramphenicol-thymol. The CLSI [8] guidelines were used to ensure that accurate microbiological assay and transfer techniques were followed. The inoculated trays were incubated at 37∘C for 24 h and then 195 The Scientific World Journal 3 evaluated for bacterial growth. Determinations of essential oil-antibiotic interactions were based on the median-effect principle and multiple drug effect equation as described by Chou and Talalay [11]. Three effects can be highlighted: synergetic, additive, or antagonist as a result of the combined effects of theT. glabrescens oil, geraniol, thymol, and chloram- phenicol. For quantitative purposes the concept of fractional inhibitory concentrations (FIC) is frequently used. In order to assess the activities of combinations of two drugs that are mutually nonexclusive (have different modes of action), the FIC indices were calculated as FIC = MICA combination MICA alone + MICB combination MICB alone + MICA combination ×MICB combination MICA alone ×MICB alone FIC = FICA + FICB + FICA × FICB, (1) whereMICA are theminimumconcentrations of the essential oil, geraniol, and thymol, while MICB are the minimum concentrations of the examined antibiotic that inhibited the bacterial growth, respectively. The FIC indices were calculated using CalcuSyn (Biosoft), and the results were interpreted as follows: synergistic (<0.90), additive (0.90 ≤ FIC ≤ 1.10), or antagonistic (>1.10) [12]. 2.10. Statistical Analysis of Data. The experimental data (FIC values) were analyzed by chemometric methods: principal components analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA), using Mathworks MATLAB. 3. Results To eliminate any kind of subjective analysis, interpreta- tions and discussions of the results, presented by tables and/or graphics, and the chemometric methods: principal component analysis, and hierarchical cluster analysis were employed. Furthermore, the use of chemometric methods allows the maximum number of experimental results to be obtained and moreover enables the detection of connec- tions, similarities, and differences among variables in the researched experimental system [4]. 3.1. Chemical Composition of the Essential Oil. The yield of T. glabrescens essential oil was 0.59% (w/w). Based on GC and GC-MS analysis of the thyme essential oil, 56 components were identified that represented 97.76% of the total detected constituents (Table 1). The components of T. glabrescens essential oil were separated into six classes, that is, monoterpene hydrocarbons, oxygenated monoter- penes, sesquiterpene hydrocarbons, oxygenated sesquiter- penes, phenolic compounds, and others. The oxygenated monoterpenes were the most abundant compound class in the oil (57.14%), and they were dominated by geraniol (22.33%), geranyl acetate (19.38%), and linalool (5.49%). The group of phenolic compounds (14%) was mainly dom- inated by thymol (13.79%). 3.2. Antibacterial Activity. The essential oils were tested for their antibacterial activity by broth microdilution method to determine the MIC and MBC values against thirteen model bacteria (Table 2). The results from the antibacterial assay show that thyme essential oil possessed antimicrobial activities against all the tested microorganisms with MIC values ranging from 627.1 to 10033.6 𝜇g/mL and MBC values from 627.1 to 20067.2𝜇g/mL. Gram-positive bacteria were generally found to be more sensitive than the Gram-negative ones. Geraniol was active with MIC values ranging from 1386.8 to 5547.2 𝜇g/mL and MBC values from 1386.8 to 11094.4 𝜇g/mL. Thymol exhibited antibacterial activity with MIC values ranging from 24.4 to 3123.2 𝜇g/mL and MBC values from 24.4 to 6246.4 𝜇g/mL. The reference antibiotic was active in the range of concentration 1 to 2048 𝜇g/mL. 3.3. Interactions between the Essential Oil, Geraniol, and Thymol with the Reference Antibiotic. The results of the possible interactions between the essential oil, geraniol, and thymol with the reference antibiotic are given in Figures 1–3. Of the 45 combinations of T. glabrescens essential oil- chloramphenicol, 25 (55.6%) showed synergism, while 14 (31.1%) had an additive and 6 (13.3%) had an antagonistic effect (Figure 1). Studies on E. coli ATCC 25922 and K. pneumoniae ATCC 700603 showed a synergistic pattern for seven ratios (FIC indices in the range 0.21–0.87). Synergy was also noted when tested against P. aeruginosaATCC 27853 (six ratios, FIC indices in the range 0.43–0.87) and P. mirabilis ATCC 12453 (five ratios, FIC indices in the range 0.68–0.82). Combinations with S. aureus ATCC 29213 indicated additive (five ratios) and antagonistic (four ratios) effects. From all the tested combinations of geraniol-reference antibiotic (Figure 2), 26 (57.8%) showed synergism, 15 (33.3%) had an additive effect, and 4 (8.9%) had an antagonistic effect. Studies on E. coli ATCC 25922 and K. pneumoniae ATCC 700603 showed a synergistic pattern for seven ratios (FIC indices in the range 0.21–0.87). Synergy was also noted when tested againstP.mirabilisATCC 12453 andP. aeruginosa ATCC 27853 (six ratios, FIC indices in the range 0.43–0.87). Combinations with S. aureus ATCC 29213 indicated additive (five ratios) and antagonistic (four ratios) effects. The combination profiles of thymol with chlorampheni- col are presented in Figure 3. A predominantly synergistic profile was noted against all the studied pathogens. Synergy was best noted for 32 (71.1%) ratios, an additive effect was recorded for 10 (22.2%), ratios and three combinations (6.7%), against S. aureus ATCC 29213, exhibited an antago- nistic effect. To evaluate the correlation among the antibacte- rial activities of the essential oil-chloramphenicol, geraniol- chloramphenicol, and thymol-chloramphenicol combina- tions, the FIC values were subjected to PCA and HCA analysis. 196 4 The Scientific World Journal Table 1: Composition of the essential oil of T. glabrescens. Component RTa (min) AILb AIEc T. glabrescens (%) Monoterpene hydrocarbons 11.07 𝛼-Thujene 8.161 924.0 925.0 0.33 𝛼-Pinene 8.400 932.0 932.1 0.29 Camphene 8.951 946.0 948.4 0.15 Sabinene 9.734 969.0 971.6 0.09 𝛽-Pinene 9.897 974.0 976.5 0.10 Myrcene 10.320 988.0 989.0 0.59 𝛼-Phellandrene 10.909 1002.0 1006.1 0.10 3-Carene 10.984 1008.0 1007.9 0.03 𝛼-Terpinene 11.294 1014.0 1016.6 0.60 o-Cymene 11.620 1022.0 1025.6 4.73 Limonene 11.751 1024.0 1029.2 0.81 𝛽-cis-Ocimene 11.980 1032.0 1035.6 0.15 𝛽-trans-Ocimene 12.362 1044.0 1046.1 0.18 𝛾-Terpinene 12.822 1054.0 1058.7 2.75 Terpinolene 13.767 1086.0 1084.8 0.17 Oxygenated monoterpenes 57.14 Eucalyptol 11.861 1026.0 1032.3 0.56 trans-Linalool oxide 13.828 1084.0 1086.5 0.03 Linalool 14.437 1095.0 1103.2 5.49 𝛼-Thujone 14.603 1101.0 1107.8 0.38 cis-p-Mentha-2,8-dienol 15.697 1133.0 1138.4 0.01 Borneol 16.956 1165.0 1173.0 0.47 4-Terpineol 17.249 1174.0 1181.1 0.47 𝛼-Terpineol 17.790 1186.0 1196.1 0.79 trans-Dihydrocarvone 18.088 1200.0 1204.5 0.02 Nerol 18.842 1227.0 1226.3 1.18 Isobornyl formate 18.990 1235.0 1230.5 2.87 Neral 19.311 1235.0 1239.8 2.25 Geraniol 19.936 1249.0 1257.8 22.33 Geranial 20.396 1264.0 1271.0 0.50 Bornyl acetate 20.924 1287.0 1286.3 0.20 Nerol acetate 23.364 1359.0 1359.2 0.21 Geranyl acetate 24.244 1379.0 1385.8 19.38 Sesquiterpene hydrocarbons 14.56 𝛼-Cubebene 23.065 1345.0 1350.2 5.51 𝛼-Copaene 23.927 1374.0 1376.2 0.03 𝛽-Elemene 24.409 1389.0 1390.7 0.09 𝛽-Caryophyllene 25.384 1417.0 1421.3 1.04 𝛼-trans-Bergamotene 25.770 1432.0 1433.6 0.05 Aromadendrene 25.952 1439.0 1439.4 0.12 (Z)-𝛽-Farnesene 26.376 1440.0 1452.9 0.22 𝛼-Humulene 26.487 1452.0 1456.4 0.13 𝛾-Muurolene 27.083 1478.0 1475.4 0.16 Germacrene D 27.302 1484.0 1482.4 1.57 𝛽-Selinene 27.567 1489.0 1490.8 0.14 Bicyclogermacrene 27.734 1500.0 1496.2 1.01 𝛽-Bisabolene 28.153 1505.0 1510.0 4.08 𝛾-Cadinene 28.258 1513.0 1513.6 0.11 𝛿-Cadinene 28.410 1522.0 1518.7 0.21 𝛽-Sesquiphellandrene 28.563 1521.0 1523.9 0.09 197 The Scientific World Journal 5 Table 1: Continued. Component RTa (min) AILb AIEc T. glabrescens (%) Oxygenated sesquiterpenes 0.37 Spathulenol 30.140 1577.0 1577.0 0.29 Caryophyllene oxide 30.300 1582.0 1582.3 0.08 Phenolic compounds 14.00 Thymol 21.350 1289.0 1298.6 13.79 Carvacrol 21.499 1298.0 1303.0 0.19 Eugenol 23.155 1356.0 1352.9 0.02 Others 0.62 trans-2-Hexenal 5.987 846.0 850.2 0.03 1-Octen-3-ol 10.010 974.0 979.8 0.45 3-Octanol 10.596 988.0 997.2 0.14 Total 97.76 a RT: retention time; bAIL: arithmetic (retention) index-literature data, and cAIE: arithmetic (retention) index experimentally determined onHP-5MS column. Table 2: Antibacterial activity of T. glabrescens essential oil, chloramphenicol, geraniol, and thymol (𝜇g/mL). Number Bacterial species T. glabrescens Chloramphenicol Geraniol Thymol MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC 1 Escherichia coli ATCC 25922 2508.4 5016.8 128.0 512.0 1386.8 2773.6 1561.6 1561.6 2 Salmonella enteritidis ATCC 13076 627.1 627.1 4.0 8.0 2773.6 2773.6 24.4 24.4 3 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 1254.2 1254.2 2.0 2.0 2773.6 5547.2 390.4 390.4 4 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 5016.8 10033.6 512.0 1024.0 2773.6 5547.2 1561.6 3123.2 5 Proteus mirabilis ATCC 12453 1254.2 2508.4 4.0 64.0 1386.8 1386.8 1561.6 1561.6 6 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 10033.6 20067.2 4.0 16.0 5547.2 11094.4 1561.6 1561.6 7 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 5016.8 5016.8 1024.0 2048.0 2773.6 2773.6 3123.2 6246.4 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 5016.8 5016.8 1.0 1.0 5547.2 5547.2 195.2 195.2 9 Enterococcus faecalis ATCC 19433 2508.4 2508.4 2.0 4.0 1386.8 1386.8 195.2 195.2 10 Bacillus cereus ATCC 11778 627.1 1254.2 1.0 4.0 1386.8 1386.8 24.4 24.4 11 Staphylococcus aureus ATCC 25923 627.1 627.1 1.0 8.0 2773.6 2773.6 97.6 97.6 12 Staphylococcus aureus ATCC 29213 2508.4 2508.4 8.0 32.0 2773.6 2773.6 780.8 1561.6 13 Listeria monocytogenes ATCC 15313 627.1 1254.2 8.0 8.0 2773.6 2773.6 97.6 97.6 3.4. PCA and HCA Analysis of the Total FIC Indices of the Essential Oil, Geraniol, Thymol, and Chloramphenicol Combi- nations. PCA andHCAwere applied on all FIC data (Figures 1–3) in order to evaluate similar antibacterial behaviour among studied combinations. According to the eigenvalues of the obtained correlation matrix, the PC1 horizontal axis explained 81.14% of the total variance among the tested interactions, while the PC2 vertical axis showed a further 12.77% (Figure 4(a)).The loading plot (Figure 4(b)) illustrates the influence of the FIC values, marked by FICA equivalents, responsible for the classification of the interaction in the score plot (Figure 4(c)). Based on the Euclidean distance and dissimilarity ≥0.42 (Figure 4(d)), the HCA method indicated two groups of interaction (A and B). Group A, constituted only by S. aureus ATCC 29213, was characterized mainly by strong antagonistic interactions with the applied combinations. In this group, only the association thymol- chloramphenicol showed some percent of synergistic inter- action. In contrast, in group B, formed by the rest of the examined bacteria strains and studied combinations, mainly synergistic or additive interactions were detected. 4. Discussion The essential oil of T. glabrescens from southeast Serbia belongs to the geraniol/geranyl acetate/thymol chemotype [13]. Chemical polymorphism of the essential oils is a characteristic of the species of the Thymus genus. Except for genetic factors, environmental conditions also have an influence on the chemical composition of an essential oil. It was established that the production of phenolic compounds is favoured in warmer and drier climatic zones, while the other, nonphenolic compounds usually accumulate in higher quantities in cooler and damper areas [14]. Geraniol is the dominant component of T. glabrescens essential oil from Romania [15]. In Hungarian T. glabrescens essential oil, the major compounds were sesquiterpenes: germacrene D, 𝛽- caryophyllene, and caryophyllene oxide [13]. The release of cellular content in the treated bacteria led to the hypothesis that the first effect of an essential oil ismem- brane disruption. However, the fact that some interaction with other targets of the bacterial cell might play a key role in the observed antibacterial effects of the essential oil should not be ignored [16].The antibacterial activity of T. glabrescens 198 6 The Scientific World Journal 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (T. glabrescens) (a) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (T. glabrescens) (b) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (T. glabrescens) (c) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (T. glabrescens) (d) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (T. glabrescens) (e) Figure 1: The derived isobolograms for the interaction of T. glabrescens oil-chloramphenicol and their treatment outcomes against the following: (a) E. coli ATCC 25922, (b) K. pneumoniae ATCC 700603, (c) P. mirabilis ATCC 12453, (d) P. aeruginosa ATCC 27853, and (e) S. aureus ATCC 29213. 199 The Scientific World Journal 7 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (geraniol) (a) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FICA (geraniol) (b) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FICA (geraniol) (c) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FICA (geraniol) (d) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FICA (geraniol) (e) Figure 2: The derived isobolograms for the interaction of geraniol-chloramphenicol and their treatment outcomes against the following: (a) E. coli ATCC 25922, (b) K. pneumoniae ATCC 700603, (c) P. mirabilis ATCC 12453, (d) P. aeruginosa ATCC 27853, and (e) S. aureus ATCC 29213. 200 8 The Scientific World Journal 0.0 FICA (thymol) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) (a) FICA (thymol) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) (b) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (thymol) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0 (c) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (thymol) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0 (d) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI C B (c hl or am ph en ic ol ) FICA (thymol) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0 (e) Figure 3: The derived isobolograms for the interaction of thymol-chloramphenicol and their treatment outcomes against the following: (a) E. coli ATCC 25922, (b) K. pneumoniae ATCC 700603, (c) P. mirabilis ATCC 12453, (d) P. aeruginosa ATCC 27853, and (e) S. aureus ATCC 29213. 201 The Scientific World Journal 9 81.14% 12.77% Eigenvalue number Ei ge nv al ue 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 −1.0 −1.0 (a) 0.0 0.5 1.0 0.0 0.5 1.0 0.1 0.20.3 0.4 0.5 0.6 0.70.8 0.9 −1.0 −1.0 −0.5 −0.5 PC1: 81.14% PC 2: 1 2. 77 % (b) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 −1.0 −2.0 −3.0 −9.0−8.0−7.0−6.0−5.0−4.0−3.0−2.0−1.0 PC 2: 1 2. 77 % PC1: 81.14% E. coli∗ E. coli∗∗ K. pneumoniae∗∗∗ K. pneumoniae∗ E. coli∗∗∗ P. mirabilis∗ P. mirabilis∗∗∗ P. mirabilis∗∗ K. pneumoniae∗∗ P. aeruginosa∗∗∗P. aeruginosa∗ S. aureus∗∗∗ S. aureus∗∗ S. aureus∗ P. aeruginosa∗∗ (c) A B Linkage distance 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 E. coli∗ E. coli∗∗ K. pneumoniae∗∗∗ K. pneumoniae∗ E. coli∗∗∗ P. mirabilis∗ P. mirabilis∗∗ P. mirabilis∗∗∗ K. pneumoniae∗∗ P. aeruginosa∗∗∗ P. aeruginosa∗ S. aureus∗∗∗ S. aureus∗∗ S. aureus∗ P. aeruginosa∗∗ (d) Figure 4: PCA and HCA of the antibacterial activity of the studied combinations {T. glabrescens oil-chloramphenicol (∗); geraniol- chloramphenicol (∗∗); thymol-chloramphenicol (∗∗∗)} based on their FIC values: (a) eigenvalues of the correlation matrix, (b) the loading plot of the responsible FIC values, (c) the score plot of the examined bacteria, and (d) the corresponding dendrogram. The examined FIC values are presented in Figures 1–3. essential oil displayed variation among the different bacteria species but remained lower than the activities of the standard antibiotic and thymol. A correlation of the antibacterial activity of the oil and its chemical composition suggests that the activity of the oil could be attributed to the presence of significant concentrations of geraniol and thymol. Therefore, it was decided to study also the antibacterial activity of thymol and geraniol individually and in combination with chloramphenicol. The essential oil of T. glabrescens from Romania inhibited microbial growth in a range of concentrations from 10.8 to 27𝜇L/mL [15]. As noted, the main antibacterial agent of the T. glabrescens essential oil from southeast Serbia is not only geraniol but also thymol (13.79%); together they represent 36.12% of T. glabrescens essential oil. It is interesting to emphasize that the antibacterial activity of T. pulegioides essential oil with geraniol (66.59%) as themajor constituent is significantly higher in comparison with antibacterial activity of T. glabrescens essential oil towards the same bacterial strains [17]. In a study of the inhibitory activity of terpenes on slime producing methicillin resistant strains, the authors found MIC values for geraniol of 5.8mg/mL against the methi- cillin resistant S. aureus (MRSA) and 23.4mg/mL against methicillin sensitive S. aureus (MSSA) [18]. In the same study, thymol exhibited inhibitory activities against MRSA and MSSA strains with an MIC value of 3.17mg/mL. These values are generally higher compared to the values of the antibacterial activity of geraniol and thymol found in the present research. In the current investigation, it was confirmed that Gram- positive bacteria were more sensitive with all tested antibac- terial agents than Gram-negative ones. Most Gram-negative bacteria are intrinsically less susceptible to many antibiotics than are Gram-positive bacteria. This difference could be explained by the presence of an outer membrane in Gram- negative bacteria. The structure and composition of the layer of cells differ greatly between bacteria. On the outer envelope, the cells may have polysaccharide capsules or protein layers 202 10 The Scientific World Journal which protect bacteria under unfavourable conditions and affect their adhesion [19]. The interaction of essential oils with antibiotics is one of the novel ways to overcome bacterial resistance. Essential oils are combined with antibiotics in order to improve the antimicrobial effect and to reduce the required antibiotic concentration [20]. In the present study, the antimicrobial activity of T. glabrescens essential oil was evaluated in asso- ciation with chloramphenicol on five bacterial strains. The combination of thyme oil and chloramphenicol against all the tested bacteria, except S. aureusATCC 29213, exhibited a pre- dominantly synergistic effect and decreased theMIC value of chloramphenicol 10-fold (5-fold for P. mirabilisATCC 12453). Based on the present analyses, it can be assumed that in research of the antibacterial effects of essential oil-antibiotic combinations, the choice of Gram-negative or Gram-positive bacterial species is not decisively significant. In other words, the proper essential oil-antibiotic association will act equally stronger or weaker against all Gram-positive and Gram- negative bacterial strains. In this case, the outer membrane of the Gram-negative bacteria is not a predominant factor of their resistance. The essential oil of P. graveolens and its main components (geraniol and citronellol) exhibited strong synergism with norfloxacin against B. cereus and S. aureuswith FIC indices of 0.50, 0.37, and 0.38, respectively [21]. According to Prashara et al. [22], the antimicrobial action of Cymbopogon martinii essential oil (mainly attributed to its geraniol content) against S. cerevisiae occurs via a two-step process. The first step involves the passive entry of the oil into the plasmamembrane in order to initiate membrane disruption. The second step is reactionwith the active sites of the enzymes or action as anH+ carrier, thereby depleting the adenosine triphosphate pool. There are some generally accepted mechanisms of antibacterial interaction that produce synergism, including inhibition of protective enzymes, combination of membrane active agents, sequential inhibition of common biochem- ical pathways, and the use of membranotropic agents to enhance the diffusion of other antimicrobials [23]. The results obtained in the present study indicate that chloram- phenicol, not currently used as a therapeutic agent against Gram-negative bacteria, in combination with an appropriate essential oil, has significant antimicrobial activity, especially against Gram-negative bacteria. Moreover, its minimum effective dose is significantly reduced, and consequently possible toxic side effects are decreased. The results for the antibacterial activity of a combina- tion of geraniol-chloramphenicol are very similar to the results for a combination of thyme oil-chloramphenicol. The difference is in the increased percentage of interac- tions that produce synergistic and additive effects, with a decrease in the percentage of antagonistic effects. The combination of geraniol and chloramphenicol against all the tested bacteria, except S. aureus ATCC 29213, exhibited predominantly synergistic effects and decreased the MIC value of chloramphenicol 10-fold.The associations of geraniol with penicillin against MRSA and E. coli were shown to be indifferent, independently of each antimicrobial activity when they were used alone [24]. In a study of changes in the antibacterial activity and the mode of action of farnesol against S. aureus when geraniol was added to a bacterial suspension, the authors assumed that geraniol increased the growth-inhibitory activity of farnesol but suppressed its ability to damage cell membranes, which is one of the predominant features of the growth-inhibitory activity of farnesol. Their results revealed that terpenes might interact with each other andwith bacterial cells to increase or decrease the antibacterial activity of each other [25]. Geraniol signifi- cantly increased the efficacy of chloramphenicol by targeting efflux mechanisms and produced significant restoration of susceptibility of the multidrug resistance strain EAEP289 to chloramphenicol by as much as 16-fold [26]. Combinations of geraniol and norfloxacin toward B. cereus and S. aureus exhibit synergistic effects with FIC indices of 0.50 [21]. The present findings and published data led to the speculation that the antibacterial effect of geraniol may result through interaction with the membrane structure and the function of the bacteria. Furthermore, geraniol might cross the cell membranes penetrating into the interior of the cell and interacting with intracellular sites critical for antibacterial activity [27]. The combination of thymol and chloramphenicol against all the tested bacteria exhibited a predominantly synergistic effect and decreased the MIC value of chloramphenicol 10- fold. Antagonism (only three combinations) was evidenced only against S. aureus ATCC 29213. Studies on the antibacte- rial action of thymol showed that it can cause a disturbance of the cytoplasmic membrane, disrupting the proton motive force, electron flow, and coagulation of cell contents. Thymol also impaired the citrate metabolic pathway and affected the enzymes involved in the synthesis of ATP [28]. The results obtained with the combinations of thymol-penicillin toward MRSA were antagonistic, while association between thymol and penicillin against E. coli showed synergistic activity with FIC values of 0.15 [24]. It could be argued that these results correspond to the results of the present research. If the results obtained from the study of the antibacterial activity of geraniol-chloramphenicol and thymol-chloramphenicol associations are compared, a similar pattern can be found. This leads to the speculation that geraniol and thymol in combination could not show any antagonistic effect. If all combinations of the examined essential oil, geraniol, and thymol with chloramphenicol towards the five bacterial strains are taken into consideration, a possible hypothesis is that the components of thyme essential oil, with the geraniol and thymol as the main active principles, favour the mechanism of action of chloramphenicol, the main effect of which is inhibition of the bacterial enzyme peptidyl transferase, thereby preventing the growth of the polypeptide chain during protein synthesis [29]. It could be stated that all associations against S. aureusATCC29213were characterized by a number of ratios of antagonistic interactions. In the PCA and HCA analyses this strain stands out and forms a separate group. In contrast, the other combinations exhibited mostly synergistic or additive interactions toward the other bacterial strains, whichmay indicate, an already supposed assumption, that the activity of the thyme oil could be attributed to the presence of significant concentrations of geraniol and thymol. 203 The Scientific World Journal 11 5. Conclusions In the present study, the chemical composition of T. glabrescens essential oil was examined and a correlation among the antibacterial activities of the essential oil- chloramphenicol, geraniol-chloramphenicol, and thymol- chloramphenicol combinationswas realized by the utilization of chemometric methods. It was shown that oxygenated monoterpenes, with geraniol as the dominant constituent, were the most abundant compound class of the essential oil of T. glabrescens from Southeast Serbia. The researched essential oil exhibited in vitro antibacterial activity against all the tested bacterial strains, but the activities were lower than those of the standard antibiotic and thymol.The combination of thyme oil and chloramphenicol produced predominantly synergistic interactions and substantial reductions in the MIC values of chloramphenicol against Gram-negative bac- teria, the pharmacological treatment of which is very diffi- cult nowadays. The combinations geraniol-chloramphenicol and thymol-chloramphenicol produced synergistic interac- tion to a greater extent, compared with the essential oil- chloramphenicol association. All the examined combinations reduced the minimum effective dose of the antibiotic and, consequently, minimized its adverse side effects. Conflict of Interests The authors declare that they have no conflict of interests regarding the publication of this paper. Acknowledgment This research was supported by the Ministry of Education, Science and Technological Development of the Republic of Serbia (Grant nos. 171025 and 176006). References [1] H. F. Chambers and F. R. DeLeo, “Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era,” Nature Reviews Microbiology, vol. 7, no. 9, pp. 629–641, 2009. [2] D. L. Miladinovic´, B. S. Ilic´, T. M. Mihajilov-Krstev, N. D. Nikolic´, and V. N. Milosavljevic´, “Antibacterial potential of the essential oil from Sideritis montana L., (Lamiaceae),” Hemijska Industrija, vol. 66, no. 4, pp. 541–545, 2012. [3] H. Wagner, “Synergy research: approaching a new generation of phytopharmaceuticals,” Fitoterapia, vol. 82, no. 1, pp. 34–37, 2011. [4] D. L. Miladinovic´, B. S. Ilic´, T. M. Mihajilov-Krstev, N. D. Nikolic´, L. C. Miladinovic´, and O. G. Cvetkovic´, “Investigation of the chemical composition-antibacterial activity relationship of essential oils by chemometric methods,” Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 403, no. 4, pp. 1007–1018, 2012. [5] N. Diklic´, “Thymus L.,” in Flora of the Republic of Serbia, M. Josifovic´, Ed., pp. 475–509, Serbian Academy of Sciences and Arts, Belgrade, Serbia, 1974. [6] B. Tan, Y. Liang, L. Yi et al., “Identification of free fatty acids profiling of type 2 diabetes mellitus and exploring possible biomarkers by GC-MS coupled with chemometrics,” Metabolomics, vol. 6, no. 2, pp. 219–228, 2010. [7] R. P. Adams, Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation, Carol Stream, Ill, USA, 2007. [8] CLSI, “Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically,” Tech. Rep.M07-A08, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Mich, USA, 2009. [9] P. F. Dougherty, D. W. Yotter, and T. R. Matthews, “Microdilu- tion transfer plate technique for determining in vitro synergy of antimicrobial agents,” Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 11, no. 2, pp. 225–228, 1977. [10] S. F. van Vuuren, S. Suliman, and A. M. Viljoen, “The antimi- crobial activity of four commercial essential oils in combination with conventional antimicrobials,” Letters in Applied Microbiol- ogy, vol. 48, no. 4, pp. 440–446, 2009. [11] T.-C. Chou and P. Talalay, “Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors,” Advances in Enzyme Regulation, vol. 22, pp. 27–55, 1984. [12] D. L.Wyles, K. A. Kaihara, F. Vaida, andR. T. Schooley, “Synergy of small molecular inhibitors of hepatitis C virus replication directed at multiple viral targets,” Journal of Virology, vol. 81, no. 6, pp. 3005–3008, 2007. [13] H. Simko´, S. Sa´rosi, M. Lada´nyi et al., “Studies on occurence, essential oil data and habitat conditions of Hungarian Thymus pannonicus and Thymus glabrescens populations,” Medicinal and Aromatic Plants, vol. 2, no. 1, pp. 1–7, 2013. [14] K. Lozˇiene´, J. Sˇakalyte´, A. Pasˇkevicˇius, and P. R. Venskutonis, “Anti-Candida activity of Thymus pulegioides (Lamiaceae) essential oils depends on the plant chemotype,”Herba Polonica, vol. 54, no. 4, pp. 79–92, 2008. [15] M. Pavel, M. Ristic´, and T. Stevic´, “Essential oils of Thymus pulegioides and Thymus glabrescens from Romania: chemical composition and antimicrobial activity,” Journal of the Serbian Chemical Society, vol. 75, no. 1, pp. 27–34, 2010. [16] M. Fadli, A. Saad, S. Sayadi et al., “Antibacterial activity of Thymus maroccanus and Thymus broussonetii essential oils against nosocomial infection–bacteria and their synergistic potential with antibiotics,”Phytomedicine, vol. 19, no. 5, pp. 464– 471, 2012. [17] D. L. Miladinovic´, B. S. Ilic´, L. C. Miladinovic´ et al., “Antibacte- rial activity ofThymus pulegioides essential oil and its synergistic potential with antibiotics: a chemometric approach,” in Recent Progress inMedicinal Plants, J. N. Govil, Ed., vol. 38, pp. 101–136, Studium Press, Houston, Tex, USA, 2013. [18] N. Gallucci, M. Oliva, E. Carezzano, J. Zygadlo, and M. Demo, “Terpenes antimicrobial activity against slime producing and non-producing staphylococci,”Molecular Medicinal Chemistry, vol. 21, pp. 132–136, 2010. [19] H. L. Alakomi, Weakening of the Gram-Negative Bacterial Outer Membrane: a Tool for Increasing Microbiological Safety, University of Helsinki, Helsinki, Finland, 2007. [20] H. Wagner and G. Ulrich-Merzenich, “Synergy research: approaching a new generation of phytopharmaceuticals,” Phy- tomedicine, vol. 16, no. 2-3, pp. 97–110, 2009. [21] A. Rosato, C. Vitali, N. de Laurentis, D. Armenise, and M. Antonietta Milillo, “Antibacterial effect of some essential oils administered alone or in combination with Norfloxacin,” Phy- tomedicine, vol. 14, no. 11, pp. 727–732, 2007. [22] A. Prashara, P. Hili, R. G. Veness, and C. S. Evans, “Antimi- crobial action of palmarosa oil (Cymbopogon martinii) on Saccharomyces cerevisiae,” Phytochemistry, vol. 63, no. 5, pp. 569–575, 2003. 204 12 The Scientific World Journal [23] S. M. Sokolova, G. N. Buzuk, M. Y. Lovkova, and Y. V. Tyutekin, “Membranotropic compounds and alkaloid accumulation in plants,” Doklady Biochemistry and Biophysics, vol. 402, no. 1–6, pp. 220–222, 2005. [24] N. Gallucci, C. Casero, M. Oliva, J. Zygadlo, and M. Demo, “Interaction between terpenes and penicillin on bacterial strains resistant to beta-lactam antibiotics,”MolecularMedicinal Chemistry, vol. 10, pp. 30–32, 2006. [25] N. Togashi, Y. Inoue, H. Hamashima, and A. Takano, “Effects of two terpene alcohols on the antibacterial activity and the mode of action of farnesol against Staphylococcus aureus,”Molecules, vol. 13, no. 12, pp. 3069–3076, 2008. [26] V. Lorenzi, A. Muselli, A. F. Bernardini et al., “Geraniol restores antibiotic activities against multidrug-resistant isolates from gram-negative species,” Antimicrobial Agents and Chemother- apy, vol. 53, no. 5, pp. 2209–2211, 2009. [27] M. A. Abdel Rasoul, G. I. K. Marei, and S. A. M. Abdelgaleil, “Evaluation of antibacterial properties and biochemical effects of monoterpenes on plant pathogenic bacteria,” African Journal of Microbiology Research, vol. 6, no. 15, pp. 3667–3672, 2012. [28] M. Hyldgaard, T. Mygind, and R. L. Meyer, “Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with foodmatrix components,” Frontiers in Microbiology, vol. 3, no. 12, pp. 1–24, 2012. [29] H. E. Hopps, J. C. L. Wisseman, F. E. Hahn, J. E. Smadel, and R. Ho, “Mode of action of chloramphenicol IV.: failure of selected natural metabolites to reverse antibiotic action,” Journal of Bacteriology, vol. 72, no. 4, pp. 561–567, 1956. 205 μμ μ β β β ranges: tetracycline 0.5 to 1024.0 μg/mL, streptomycin 0.5 to 256.0 μ 206 282 Natural Product Communications Vol. 9 (2) 2014 Miladinovi et al. Table 1: Composition of the essential oil of Libanotis montana. Component AILa AIEb L. montana (%) Monoterpene hydrocarbons 10.9 -Pinene 932 933 4.2 Camphene 946 949 0.6 Sabinene 969 972 0.1 -Pinene 974 978 0.9 trans-Isolimonene 980 986 0.05 Myrcene 988 989 0.3 -Phellandrene 1002 1007 2.2 p-Cymene 1020 1024 0.9 Limonene 1024 1029 1.3 -trans-Ocimene 1044 1046 0.2 Terpinolene 1086 1085 0.1 Oxygenated monoterpenes 1.8 Eucalyptol 1026 1031 0.6 Linalool 1095 1100 0.6 4-Terpineol 1174 1181 0.05 -Terpineol 1186 1196 0.1 Carvone 1239 1244 0.02 Piperitone 1249 1254 0.02 Bornyl acetate 1287 1285 0.2 Methyl eugenol 1403 1400 0.2 Sesquiterpene hydrocarbons 67.2 -Elemene 1335 1335 0.3 -Cubebene 1345 1347 0.04 -Copaene 1374 1376 0.2 -Elemene 1389 1397 40.4 -Cedrene 1410 1418 0.06 -Caryophyllene 1417 1423 6.5 -trans-Bergamotene 1432 1433 0.02 -Guaiene 1437 1436 0.1 Aromadendrene 1439 1441 0.1 Seychellene 1444 1450 0.2 -cis-Farnesene 1440 1454 3.0 -Humulene 1452 1458 2.6 -Muurolene 1478 1474 0.6 Germacrene D 1484 1483 3.5 -Selinene 1489 1491 2.0 -Selinene 1498 1497 1.7 -trans-Guaiene 1502 1502 0.4 -Bisabolene 1505 1509 2.6 -Cadinene 1513 1513 0.1 -Cadinene 1522 1518 0.7 -Sesquiphellandrene 1521 1524 0.9 Germacrene B 1559 1560 1.2 Oxygenated sesquiterpenes 12.3 Elemol 1548 1549 1.6 Spathulenol 1577 1578 0.9 Caryophyllene oxide 1582 1584 2.8 -Cadinol 1652 1656 0.4 -Bisabolol 1685 1691 6.6 Phenolic compounds 1.1 p-Cresol 1071 1074 1.1 Others 0.3 6-Methyl-5-heptene-2-one 981 984 0.06 p-Methyl anisole 1015 1018 0.06 Palmitic acid 1959 1961 0.2 Total 93.6 a) AIL=Arithmetic index – literature and library data; b) AIE=Arithmetic index experimentally determined on HP-5MS column. oil/tetracycline combination, while the highest percentage of the antagonistic effect (70.8%) was noted for the oil/streptomycin association. The maximum combination effect of essential oil and antibiotic was expressed toward P. mirabilis ATCC 12453. The results of the checkerboard assay showed a synergistic effect of 77.8%, an additive effect of 18.5% and an antagonistic effect of 3.7% for this bacterial strain. The numbers of combinations that exhibited an antagonistic effect were: K. pneumoniae ATCC 700603 (11.1%), S. aureus ATCC 29213 (18.5%), P. aeruginosa ATCC 27853 (22.2%) and E. coli ATCC 25922 (33.3%). The combination profiles of L. montana essential oil with tetracycline are presented in Figure 1. From 45 combinations, 26 (57.8%) showed synergism, 13 (28.9%) had an additive and 6 (13.3%) an antagonistic effect. E. coli ATCC 25922 and P. mirabilis ATCC 12453 showed a synergistic pattern for seven ratios (FIC indices in the range 0.32-0.87). Synergy was also noted when tested against P. aeruginosa ATCC 27853 and S. aureus ATCC 29213 (five ratios, FIC indices in the range 0.54-0.87). Combinations with K. pneumoniae ATCC 700603 indicated additive (four ratios), antagonistic (three ratios) and synergistic effects (two ratios). Synergy was highest for the ratio FICA 0.1 (FIC 0.54). Figure 1: The derived isobolograms for the interaction of L. montana oil–tetracycline and their treatment outcomes against: (a) E. coli ATCC 25922; (b) K. pneumoniae ATCC 700603; (c) P. mirabilis ATCC 12453; (d) P. aeruginosa ATCC 27853; (e) S. aureus ATCC 29213. The combination profiles of the essential oil with streptomycin are presented in Figure 2. Of all tested combinations, 18 (40.0%) showed synergism, 10 (22.2%) had an additive and 17 (37.8%) an antagonistic effect. E. coli ATCC 25922 showed antagonism for all ratios (FIC indices in the range 1.20-2.80). A predominantly synergistic profile was noted against P. mirabilis ATCC 12453, while P. aeruginosa ATCC 27853 showed a pattern, with six ratios having an antagonistic effect. Synergy was also noted when tested against K. pneumoniae ATCC 700603 (six ratios), and S. aureus ATCC 29213 (five ratios). It is important to emphasize that the first ratio of L. montana oil and streptomycin exhibited antagonism against S. aureus ATCC 29213 (FIC 1.20). The combination profiles of moon carrot essential oil with chloramphenicol are presented in Figure 3. A predominantly synergistic profile was noted against all the studied pathogens. Synergy was best noted for 35 (77.8%) ratios, an additive effect was recorded for 9 (20.0%) ratios and only one combination (2.2%) exhibited an antagonistic effect. To evaluate the correlation between the antibacterial activities of the essential oil-antibiotic combinations, the FIC values were subjected to PCA and HCA analysis [4]. PCA and HCA were applied (Figure 4) to all the FIC data (Figures 1-3) in order to evaluate similar antibacterial interactions of the L. montana oil–antibiotic combinations against the tested bacteria. According to the eigenvalues of the obtained correlation matrix, the PC1 horizontal axis explained 81.06% of the total variance among the tested interactions, while the PC2 vertical axis showed a further 11.82% (Figure 4a). The loading plot (Figure 4b) illustrates the influence of the FIC values responsible for the classification of the interaction in the score plot (Figure 4c). Based on the Euclidean distance and dissimilarity 2.94 (Figure 4d), the HCA method indicated two groups of interaction (A and B). Group A, constituted only by the association of L. montana oil– streptomycin, was characterized by strong antagonistic interactions against E. coli ATCC 25922. In contrast, in group B, formed by the 207 μ4.0 64.0128.0 256.01024.01024.021612.810806.4ATCC 12453 208 284 Natural Product Communications Vol. 9 (2) 2014 Miladinovi et al. Figure 4: PCA and HCA of the antibacterial activity of the essential oil–antibiotics {tetracycline (*); streptomycin (**); chloramphenicol (***)} based on their FIC values: (a) eigenvalues of the correlation matrix; (b) the loading plot of the responsible FIC values; (c) the score plot of the examined bacteria; (d) the corresponding dendogram. The examined FIC values are presented in Figures 1-3. to many antibiotics than Gram-positive bacteria. This difference could be explained by the presence of an outer membrane in Gram- negative bacteria. The structure and composition of the layer of the cells differ greatly between bacteria. On the outer envelope, the cells may have either polysaccharide capsules or protein layers which protect them in unfavorable conditions and affect their adhesion [16]. The interaction of essential oils with antibiotics is one of the novel ways to overcome bacterial resistance. Essential oils are combined with antibiotics in order to improve the antimicrobial effect and to reduce the required antibiotic concentration [4]. Bearing in mind the very slight antibacterial activity of L. montana essential oil, the next phase of the research was an estimation of the antimicrobial effect of moon carrot oil in association with the three antibiotics on five bacterial strains. The presented results of the total effects of essential oil/antibiotic combinations fully justifying the purpose of the study and indicated an encouraging fact, i.e., an essential oil with low antibacterial activity may exhibit significant synergistic and additive effects in association with conventional antibiotics. This is even more important if the essential oil is derived from plants used in human diet. The combination of L. montana oil and tetracycline against E. coli ATCC 25922 and P. mirabilis ATCC 12453 exhibited a predominantly synergistic effect and decreased the MIC value of tetracycline 10-fold. In contrast, the oil– tetracycline association against S. aureus ATCC 29213 decreased the MIC value of tetracycline 2-fold. Based on the results of the chemometric analyses, it is assumed that in research of the antibacterial effects of essential oil-antibiotic combinations, the choice of Gram-negative or Gram-positive bacterial species is not decisively significant. In other words, the proper essential oil- antibiotic association will act equally strongly or weakly against all Gram-positive and Gram-negative bacterial strains. In this case, the outer membrane of the Gram-negative bacteria is not a predominant factor of their resistance. There are some generally accepted mechanisms of antibacterial interaction that produce synergism, including inhibition of protective enzymes, combination of membrane active agents, sequential inhibition of common biochemical pathways and the use of membranotropic agents to enhance the diffusion of other antimicrobials [17]. As already noted, the combinations of the tested essential oil and streptomycin showed a high percentage of antagonistic effects. A very strong antagonistic effect was especially registered against E. coli ATCC 25922. It should be mentioned that the essential oil in these combinations had no effect on the decreasing of the MIC values of streptomycin. It is interesting that the intensity of the antagonistic effect was more pronounced with increasing content of the essential oil in combination with streptomycin. In a study that investigated the antibacterial interactions of an ethanol extract of Ocimum gratissimum and six antibiotics against Gram-negative bacteria, the authors recorded only antagonistic effects in combinations with streptomycin [18]. The explanation of the mechanism of interactions that produce antagonistic effects has been less studied. Hypotheses discussed in some studies included the use of antibacterial compounds (or mixtures) that act on the same site of the bacteria, and chemical interactions among the antibacterial compounds [19]. Streptomycin exerts its activity by binding to the 16S rRNA of the bacterial ribosome, interfering with the binding of formyl–methionyl–tRNA to the 30S subunit. This prevents initiation of protein synthesis. The overall effect of streptomycin seems to be one of distorting the ribosome so that it can no longer perform its normal functions [20]. By comparing the results obtained for antagonistic effects in this study, only two bacteria, E. coli ATCC 25922 and P. aeruginosa ATCC 27853, appear in numerous combinations. This finding can support the hypothesis that the essential oil and the antibiotics could react with the same bacterial targets. This assumption would relate only to certain bacterial species. In addition, in our opinion, the choice of antibiotics, in terms of their mechanism of action, is an important factor for research of antibacterial activity of essential oil-antibiotic associations. The combination of L. montana oil and chloramphenicol against all the tested bacteria exhibited a predominantly synergistic effect and decreased the MIC value of chloramphenicol 10-fold, for all the 209 Libanotis montana essential oil Natural Product Communications Vol. 9 (2) 2014 285 tested bacterial strains. Elucidation of the mechanism of antibacterial action based on the synergism of essential oil/chloramphenicol is not simple. All interactions between antibacterial compounds could change the effectiveness and relationships (synergistic, additive or antagonistic) in competition for the possible primary target. On the other hand, a synergistic multi-target effect could occur by involving proteins, enzymes, ribosomes, nucleic acids, receptors and ion channels [21]. Based on the present results, it could be hypothesized that the antibacterial activity and hence the synergistic effect of L. montana essential oil is connected with the high percentage of -elemene, its major component. According to chemical structure, -elemene is a derivative of cyclohexane. It is known that cyclic hydrocarbons impair the growth of bacteria and fungi. Cyclohexane inhibited oxygen uptake by intact cells and isolated mitochondria. Studies on isolated mitochondria showed that ATP synthesis was impaired, as well as the uptake of potassium ions and dissipation of the mitochondrial membrane potential were observed. The final effect of the cyclohexane action was disruption of the permeability barrier of the inner mitochondrial membrane [22]. In this way “the door was open” for the performance of chloramphenicol activity. All these considerations prompted the hypothesis that the components of moon carrot essential oil, with -elemene as the major compound, favor the mechanism of action of chloramphenicol, the main effect of which is inhibition of the bacterial enzyme peptidyl transferase, thereby preventing the growth of the polypeptide chain during protein synthesis [23]. The obtained results indicate that chloramphenicol, not currently used as a therapeutic agent against Gram-negative bacteria, in combination with an appropriate essential oil has significant antimicrobial activity, especially against Gram-negative bacteria. Moreover, its minimum effective dose is significantly reduced, and consequently possible toxic side effects are decreased. If all combinations of the examined essential oil and the antibiotics toward five bacterial strains are taken into consideration, it could be stated that the combinations of moon carrot oil–chloramphenicol and moon carrot oil–tetracycline exhibited mostly synergistic or additive interactions. In contrast, the association of L. montana essential oil and streptomycin was characterized by strong antagonistic interactions against E. coli ATCC 25922. In the PCA and HCA analyses, streptomycin against this bacterial strain stands out and forms a separate group. Finally, in the present study, the chemical composition of L. montana essential oil was examined and a correlation among the antibacterial activities of the essential oil–antibiotic combinations was realized by the utilization of chemometric methods. It was shown that sesquiterpene hydrocarbons, with -elemene as the dominant constituent, were the most abundant compound class of the essential oil of L. montana from Serbia. The essential oil exhibited slight antibacterial activity against the tested bacterial strains in vitro. On the contrary, associations between L. montana essential oil and standard antibiotics produced predominantly synergistic interactions against selected bacterial strains. These combinations reduced the minimum effective dose of the antibiotics and, consequently, minimized their adverse side effects. The association of moon carrot oil and chloramphenicol produced a very strong synergistic interaction toward all the tested bacteria, especially Gram-negative bacteria, the pharmacological treatment of which is very difficult nowadays. Experimental Plant material and chemicals: The flowers of Libanotis montana Crantz subsp. leiocarpa (Heuff.) Soó. (Apiaceae) were collected in August 2011 from natural populations at the Vidli mountain, Serbia. A voucher specimen, with the accession number 16548 is deposited at the Herbarium of the Department of Botany, Faculty of Biology, University of Belgrade-Herbarium Code BEOU. All chemicals, reagents and standards were of analytical reagent grade and were purchased from the Sigma-Aldrich Chemical Company. Extraction and isolation of oil: The flowers (dried and ground) were subjected to hydro-distillation for 4 h, using a Clevenger-type apparatus to obtain the oil. The resulting essential oil was dried over anhydrous sodium sulfate and stored at 4°C. Gas chromatography, Gas chromatography/mass spectrometry and Identification of compounds: The GC, GC-MS analyses and identification of oil compounds were performed as previously described [3]. Antibacterial testing: The activity of the essential oil samples was tested towards 13 bacterial strains. Gram-negative bacteria were represented by Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 12453, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Enterobacter aerogenes ATCC 13048, while the Gram-positive strains were Enterococcus faecalis ATCC 19433, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 29213 and Listeria monocytogenes ATCC 15313. The inocula of the bacterial strains were prepared from overnight broth cultures and the suspensions were adjusted to 0.5 McFarland standard turbidity (corresponding to 108 CFU/mL, depending on genera-consensus standard by the Clinical and Laboratory Standards Institute) [24]. Micro-well dilution assay: A broth microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) according to the Clinical and Laboratory Standards Institute [24], as previously described [3]. Microdilution checkerboard assay: The microdilution checkerboard method is the technique used most frequently to assess antimicrobial combinations in vitro [25]. Dilutions of L. montana oil and the examined antibiotics were made for evaluation of their combined interactions. The type of interaction was studied on E. coli ATCC 25922, K. pneumonia ATCC 700603, P. mirabilis ATCC 12453, P. aeruginosa ATCC 27853 and S. aureus ATCC 29213. These strains were selected based on their importance in frequently occurring infections. Dilutions from the logarithmic- growth phase of the bacterial culture were prepared and distributed into microtiter trays containing varying concentrations of the different antibiotics and L. montana oil. The inoculated trays were incubated at 37°C for 24 h and then evaluated for bacterial growth. Determinations of essential oil–antibiotic interactions were based on the median-effect principle and multiple drug effect equation, as described by Chou and Talalay [26]. Three effects can be highlighted: synergetic, additive or antagonist as a result of the combined effects of the L. montana oil and antibiotics. For quantitative purposes the concept of fractional inhibitory concentrations (FIC) is frequently used. In order to assess the activities of combinations of two drugs that are mutually non- exclusive (have different modes of action), the FIC indices were calculated as: 210 286 Natural Product Communications Vol. 9 (2) 2014 Miladinovi et al. where MICA and MICB are the minimum concentrations of the essential oil and examined antibiotic that inhibited the bacterial growth, respectively. The FIC indices were calculated using CalcuSyn (Biosoft), and the results were interpreted as follows: synergistic (<0.90), additive (0.90 FIC 1.10), and antagonistic (>1.10) [27]. Statistical analysis of data: The experimental data (FIC values) were analyzed by chemometric methods: principal components analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA), using Mathworks MATLAB. Acknowledgements - This research was supported by the Ministry of Education, Science and Technological Development of the Republic of Serbia (Grant No. 171025). References [1] Bockstael K, Van Aerschot A. (2009) Antimicrobial resistance in bacteria. Central European Journal of Medicine, 4, 141-155. [2] Miladinovi D, Miladinovi L, Najman S. (2011) A study of the antioxidants in Oxytropis pilosa (L.) DC. Journal of the Serbian Chemical Society, 76, 505-512. [3] Miladinovi DL, Ili BS, Mihajilov-Krstev TM, Nikoli DM, Cvetkovi OG, Markovi MS, Miladinovi LC. (2013) Antibacterial activity of the essential oil of Heracleum sibiricum. Natural Product Communications, 8, 1309-1311. [4] Miladinovi DL, Ili BS, Miladinovi LC, Koci BD, iri VM, Stankov-Jovanovi VP, Cvetkovi OG. (2013) Antibacterial activity of Thymus pulegioides essential oil and its synergistic potential with antibiotics: a chemometric approach. In Recent progress in medicinal plants. Vol. 38, Govil JN, Bhattacharya S. (Eds). Studium Press LLC, Houston, 101-136. [5] Miladinovi DL, Ili BS, Najman SJ, Cvetkovi OG, Šajnovi AM, Miladinovi MD, Nikoli ND. (2013) Antioxidative responses to seasonal changes and chemiluminescence assay of Astragalus onobrychis leaves extract. Central European Journal of Chemistry, 11, 123-132. [6] Rosato A, Piarulli M, Corbo F, Muraglia M, Carone A, Vitali ME, Vitali C. (2010) In vitro synergistic antibacterial action of certain combinations of gentamicin and essential oils. Current Medicinal Chemistry, 17, 3289-3295. [7] Khan MSA, Ahmad I. (2011) Antifungal activity of essential oils and their synergy with fluconazole against drug-resistant strains of Aspergillus fumigatus and Trichophyton rubrum. Applied Microbiology and Biotechnology, 90, 1083-1094. [8] Singh PK, Verma NS, Tandon PK. (2012) Antibacterial activity of essential oils of Seseli indicum a wild weed of family Apiaceae. WebmedCentral, 3, 1-5. [9] Dikli N. (1974) Libanotis montana Crantz. In Flora of the Republic of Serbia. Josifovi M. (Ed.). Serbian Academy of Sciences and Arts, Belgrade, 249-252. [10] Miladinovi DL, Ili BS, Mihajilov-Krstev TM, Nikoli ND, Miladinovi LC, Cvetkovi OG. (2012) Investigation of the chemical composition- antibacterial activity relationship of essential oils by chemometric methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 403, 1007-1018. [11] Ozturk S, Ercisli S. (2006) Chemical composition and in vitro antibacterial activity of Seseli libanotis. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22, 261-265. [12] Masoudi S, Esamaeili A, Khalilzadeh MA, Rustaiyan A, Moazami N, Akhgar MR, Varavipoor M. (2006) Volatile constituents of Dorema aucheri Boiss., Seseli libanotis (L.) W. D. Koch var. armeniacum Bordz. and Conium maculatum L. three Umbelliferae herbs growing wild in Iran. Flavour and Fragrance Journal, 21, 801-804. [13] Fadli M, Saad A, Sayadi S, Chevalier J, Mezrioui NE, Pagès JM, Hassani L. (2012) Antibacterial activity of Thymus maroccanus and Thymus broussonetii essential oils against nosocomial infection-bacteria and their synergistic potential with antibiotics. Phytomedicine, 19, 464-471. [14] Syed M, Chaudhary FM, Bhatty MK. (1989) Antimicrobial activity of essential oils of Umbelliferae family, Part VIII, Seseli libanotis, Ligusticum stewartii and Pycnocycla aucheriana oils. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research, 32, 316-319. [15] Rahman MM, Garvey M, Piddock LJ, Gibbons S. (2008) Antibacterial terpenes from the oleo-resin of Commiphora molmol (Engl.). Phytotherapy Research, 22, 1356-1360. [16] Alakomi HL. (2007) Weakening of the Gram-negative bacterial outer membrane: A tool for increasing microbiological safety. University of Helsinki, Finland, 1-124. [17] Sokolova SM, Buzuk GN, Lovkova MY, Tyutekin YV. (2005) Membranotropic compounds and alkaloid accumulation in plants. Doklady Biochemistry and Biophysics, 402, 220-222. [18] Nweze EI, Eze EE. (2009) Justification for the use of Ocimum gratissimum L in herbal medicine and its interaction with disc antibiotics. BMC Complementary and Alternative Medicine, 9, 1-6. [19] Goñi P, López P, Sánchez C, Gómez-Lus R, Becerril R, Nerín C. (2009) Antimicrobial activity in the vapour phase of a combination of cinnamon and clove essential oils. Food Chemistry, 116, 982-989. [20] Busse HJ, Wöstmann C, Bakker EP. (1992) The bactericidal action of streptomycin: membrane permeabilization caused by the insertion of mistranslated proteins into the cytoplasmic membrane of Escherichia coli and subsequent caging of the antibiotic inside the cells due to degradation of these proteins. Journal of General Microbiology, 138, 551-561. [21] Wagner H, Ulrich-Merzenich G. (2009) Synergy research: approaching a new generation of phytopharmaceuticals. Phytomedicine, 16, 97-110. [22] Sikkema J, De Bont JA, Poolman B. (1995) Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 59, 201-222. [23] Hopps HE, Wisseman JCL, Hahn FE, Smadel JE, Ho R. (1956) Mode of action of chloramphenicol IV.: Failure of selected natural metabolites to reverse antibiotic action. Journal of Bacteriology, 72, 561-567. [24] CLSI M07-A08. (2009) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, 1-65. [25] Van Vuuren SF, Suliman S, Viljoen AM. (2009) The antimicrobial activity of four commercial essential oils in combination with conventional antimicrobials. Letters in Applied Microbiology, 48, 440-446. [26] Chou TC, Talalay P. (1984) Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Advances in Enzyme Regulation, 22, 27-55. [27] Wyles DL, Kaihara KA, Vaida F, Schooley RT. (2007) Synergy of small molecular inhibitors of hepatitis C virus replication directed at multiple viral targets. Journal of Virology, 81, 3005-3008. 211 8. B IO G R A FI JA    Radna biografija B Adresa Univerz Medicin Integris Bulevar 18000 N Srbija e-mail: Lični p Datum Državlj Obrazo Diplom prosečn Trenut Asisten Akadem Realiza predme Naučno Učešće Srbije b interesa Učešće Srbije, b udimira S. : itet u Nišu ski fakulte ane akadem Dr Zorana iš bucabule@ odaci: i mesto rođ anstvo: srps vanje: irani hemič a ocena tok na pozicija t za užu nau ske aktiv cija praktič ta Katedre z istraživač na projekt r. 142069, “ (2008-20 na projekt r. 171025, Ilića t ske studije Đinđića br yahoo.com enja: 06.02 ko ar, Prirodn om studira : čnu oblast nosti: ne nastave a hemiju, M ke aktivno u Ministar „Geohemij 10). u Ministar „Električni farmacije . 81 ; budimir.il .1982. god. o-matemati nja, 9.48). Hemija na na integr edicinsko sti: stva prosve a tragova m stva prosve proboj gas ic@medfak , Kruševac, čki fakultet Medicinsko isanim aka g fakulteta, te, nauke etala mod te, nauke ova, površi .ni.ac.rs Srbija , Odsek za m fakultetu demskim s Univerzite i tehnološk ernih i dre i tehnološk nski proces hemiju, Niš (2001/2002-2007, , Univerziteta u Nišu. tudijama f t u Nišu. armacije, u okviru og razvoja vnih sedim Vlade Re enata od po publike sebnog og razvoja i i primene Vlade Re “ (2012-). publike 213     9. I ZJ A V E A U TO R A   3 Прилог 1. ИЗЈАВА О АУТОРСТВУ Изјављујем да је докторска дисертација, под насловом • резултат сопственог истраживачког рада, • да предложена дисертација, ни у целини, ни у деловима, није била предложена за добијање било које дипломе, према студијским програмима других високошколских установа, • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио/ла ауторска права, нити злоупотребио/ла интелектуалну својину других лица. У Нишу, _________________ Аутор дисертације: ____________________________________________________ Потпис докторанда: ______________________________ 215 4 Прилог 2. ИЗЈАВА О ИСТОВЕТНОСТИ ШТАМПАНЕ И ЕЛЕКТРОНСКЕ ВЕРЗИЈЕ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ Име и презиме аутора: _______________________________________________________ Студијски програм: __________________________________________________________ Наслов рада: ________________________________________________________________ Ментор: ___________________________________________________________________ Изјављујем да је штампана верзија моје докторске дисертације истоветна електронској верзији, коју сам предао/ла за уношење у Дигитални репозиторијум Универзитета у Нишу. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци, који су у вези са добијањем академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада, и то у каталогу Библиотеке, Дигиталном репозиторијуму Универзитета у Нишу, као и у публикацијама Универзитета у Нишу. У Нишу, _________________ Аутор дисертације: ____________________________________________________ Потпис докторанда: ______________________________ 216 5 Прилог 3. ИЗЈАВА О КОРИШЋЕЊУ Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Никола Тесла“ да, у Дигитални репозиторијум Универзитета у Нишу, унесе моју докторску дисертацију, под насловом: _________________________________________________________________________ _______________________________________________________ која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату, погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију, унету у Дигитални репозиторијум Универзитета у Нишу, могу користити сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons), за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство – некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да подвучете само једну од шест понуђених лиценци; кратак опис лиценци је у наставку текста). У Нишу, _________________ Аутор дисертације: ____________________________________________________ Потпис докторанда: ______________________________ 217