UNIVERZITET U NIŠU MEDICINSKI FAKULTET Miljana N. Ljubomirović MORFOMETRIJSKA I IMUNOHISTOHEMIJSKA ANALIZA STRUKTURA ADENOHIPOFIZE UKLJUČENIH U SISTEM HIPOTALAMO-HIPOFIZNO-ADRENALNE OSOVINE TOKOM STARENJA ČOVEKA DOKTORSKA DISERTACIJA Niš, 2014. godina UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF MEDICINE Miljana N. Ljubomirović MORPHOMETRIC AND IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF THE ADENOHYPOPHYSIS STRUCTURES INVOLVED IN THE SYSTEM OF THE HYPOTHALAMIC-PITUITARY-ADRENAL AXIS DURING THE AGING PROCESS DOCTORAL DISSERTATION Niš, 2014 I Autor Ime i prezime: Miljana Ljubomirović Datum i mesto roĊenja: 24.06.1980.g. Sadašnje zaposlenje: Asistent na predmetu Anatomija Medicinskog fakulteta u Nišu II Doktorska disertacija Naslov: Morfometrijska i imunohistohemijska analiza struktura adenohipofize ukljuĉenih u sistem hipotalamo-hipofizno-adrenalne osovine tokom starenja ĉoveka Broj stranica: 105 Broj šema / slika: 9 Broj tabela: 8 Broj grafikona: 15 Broj bibliografskih podataka: 155 Ustanova i mesto gde je rad izraĊen: Institut za anatomiju, Zavod za sudsku medicinu, Institut za patološku anatomiju i kliniĉku patologiju u Nišu Nauĉna oblast: Anatomija Mentor: Prof. dr Ivan Jovanović III Ocena i odbrana Broj odluke i datum prihvatanja doktorske disertacije: 04-MM-3/06, 17.04.2013. god. Komisija za ocenu podobnosti teme i kandidata: Prof. dr Rade Ĉukuranović Prof. dr Ivan Jovanović Prof. dr SlaĊana Ugrenović Komisija za ocenu i odbranu doktorske disertacije: Prof. dr SlaĊana Ugrenović, predsednik Prof. dr Ivan Jovanović, mentor i ĉlan Prof. dr Natalija Stefanović, ĉlan sa Fakulteta sporta i fiziĉke kulture Univerziteta u Nišu Datum odbrane doktorske disertacije: Nauĉni doprinos disertacije: Pavlović M, Jovanović I, Ugrenović S, Vasović Lj, Krstić M, Bakić M, Ţivković V, Stojanović V. Morphometric analysis of the human anterior pituitary’s folliculostellate cells during the aging process. Annals of Anatomy 2013;195:231-7. Pavlović M, Jovanović I, Pavlović S, Stojanović V, Ţivković V, Bakić M, Kundalić B, Antić V. Morphometric study of connective tissue in the human pituitary during aging process. Acta Facultatis Medicae Naissensis 2013;30(2):79-84.  Zahvalnost dugujem svojim roditeljima zbog dosadašnjeg usađivanja svesti o značaju intelektualnog usavršanja, sestrama na podršci.  Zahvalna sam suprugu Draganu, na psihičkoj podršci i razumevanju u mojim naporima do ostvarenja cilja.  Najveću zahvalnost dugujem svom mentoru prof. dr Ivanu Jovanoviću koji mi je, od početka do kraja, nesebično prenosio znanje i iskustvo i podržao me da istrajem na naučnom putu koji će biti prekretnica u mojoj karijeri. MORFOMETRIJSKA I IMUNOHISTOHEMIJSKA ANALIZA STRUKTURA ADENOHIPOFIZE UKLJUĈENIH U SISTEM HIPOTALAMO-HIPOFIZNO-ADRENALNE OSOVINE TOKOM STARENJA ĈOVEKA Rezime Proces starenja ĉoveka praćen je porastom prisustva vezivnog tkiva u svim orga- nima i tkivima, a u adenohipofizi i porastom kortikotropnih i folikulostelatnih ćelija, što moţe da utiĉe na funkciju HPA osovine kod zdravih starih individua. Cilj istraţivanja je bio da se na tkivu adenohipofiza dobijenih na autopsijama, primenom histohemijskih, imunohistohemijskih i morfometrijskih metoda izvrši kvanti- fikacija strukturnih promena koje nastaju tokom starenja (celularnosti, prisustva ve- zivnog tkiva i prokrvljenosti) kao i kolagena tipa IV, adrenokortikotropnih ćelija i foli- kulostelatnih ćelija. Histohemijski deo istraţivanja je pokazao da tokom normalnog procesa starenja u adenohipofizi dolazi do porasta veliĉine ćelija. Analizirane ćelije adenohipofize su zna- ĉajno krupnije i istovremeno se karakterišu znaĉajno pravilnijim oblikom kod sluĉajeva ţenskog u odnosu na sluĉajeve muškog pola. Uoĉene su razlike u celularnom sastavu tkiva adenohipofize sluĉajeva suprotnog pola i zapaţa se znaĉajnije prisustvo bazofila kod sluĉajeva muškog pola. Hipertrofija ćelija je praćena proliferacijom vezivnog tkiva adenohipofize, kao i njenom slabijom vaskularizacijom tokom starenja. Rezultati imunohistohemijskog dela istraţivanja potvrdili su da dolazi do porasta proseĉne zapreminske gustine folikulostelatnih ćelija kao i adrenokortikotropnih ćelija. Porast prisustva kolagena tipa IV takoĊe je prisutan i dobijeni rezultat je saglasan sta- tistiĉki znaĉajnom porastu prisustva vezivnog tkiva u adenohipofizi tokom procesa sta- renja, uoĉenom tokom histohemijskog dela istraţivanja. Kljuĉne reĉi: adenohipofiza, hipofiza, HPA osovina, starenje Nauĉna oblast: Medicina Uţa nauĉna oblast: Anatomija UDK: 611.814:612.67(043.3) MORPHOMETRIC AND IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF THE ADENOHYPOPHYSIS STRUCTURES INVOLVED IN THE SYSTEM OF THE HYPOTHALAMIC-PITUITARY-ADRENAL AXIS DURING THE AGING PROCESS Summary The aging in men is accompanied by an increase in the presence of connective tissue in all the organs and tissues, and with increase of corticotrophs and folliculostellate cells in adenohypophysis, which can affect the function of the HPA axis in healthy elderly individuals. Objective of the research was to perform quantification of structural changes during aging (cellularity, presence of the connective tissue and blood flow), collagen type IV, corticotrophs and folliculostellate cells on the pituitary tissue, obtained at autopsy, using histochemical, immunohistochemical and morphometric methods. Histochemical part of the research showed an increase of the cell size that occured during normal aging in the adenohypophysis. The analyzed cells of the adenohypophysis were significantly larger and, at the same time, they were characterized by a substantially more regular shape in female in comparison to the male patients cases. Differences in the cellular composition of the pituitary tissue were observed in cases of the opposite sex and the significant higher number of basophils in males was noted. Hypertrophy of the cells was accompanied by proliferation of the pituitary connective tissue, as well as by it’s poarer vascularization during aging. Results of the immunohistochemical part of the study confirmed that there was an increase in the average volume densities of the folliculostellate cells and corticotrophs. The increase in the presence of type IV collagen was also present and the obtained result is consistent to statistically significant increase in the presence of the connective tissue in the adenohypophysis during the aging process, which we observed in the histochemical part of our study. Key words: adenohypophysis, pituitary gland, HPA axis, aging The scientific field: Medicine Special topics: Anatomy UDC: 611.814:612.67(043.3) SADRŢAJ UVOD .................................................................................................................................1 STARENJE ..................................................................................................................... 1 Teorije starenja ........................................................................................................... 2 Evolucione teorije ................................................................................................... 2 Molekularne teorije ................................................................................................. 2 Celularne teorije ...................................................................................................... 4 Sistemske teorije ..................................................................................................... 4 ANATOMSKE KARAKTERISTIKE HIPOTALAMO-PITUITARNO-ADRENALNE OSOVINE ......................................... 5 Hipotalamus ................................................................................................................ 6 GraĊa hipotalamus-a ............................................................................................... 6 Anatomske karakteristike paraventrikularnog jedra hipotalamusa ......................... 9 Hipofiza ..................................................................................................................... 11 Adenohipofiza ....................................................................................................... 11 Funkcija adenohipofize ..................................................................................... 15 Kortikotropne ćelije .......................................................................................... 16 Folikulostelatne ćelije ....................................................................................... 17 Neurohipofiza ........................................................................................................ 19 Vaskularizacija hipofize ........................................................................................ 20 Inervacija hipofize ................................................................................................. 21 Nadbubrežna žlezda .................................................................................................. 21 GraĊa nadbubreţne ţlezde .................................................................................... 22 Kora nadbubreţne ţlezde .................................................................................. 22 Srţ nadbubreţne ţlezde ..................................................................................... 24 Funkcija kore nadbubreţne ţlezde ........................................................................ 24 Vaskularizacija nadbubreţne ţlezde ..................................................................... 25 Inervacija nadbubreţne ţlezde .............................................................................. 25 FUNKCIJA HIPOTALAMO-PITUITARNO-ADRENALNE OSOVINE ................... 26 STARENJE I HIPOTALAMO-PITUITARNO-ADRENALNA OSOVINA .................... 27 CILJ ISTRAŢIVANJA ...................................................................................................30 MATERIJAL I METODE .............................................................................................32 MATERIJAL ................................................................................................................. 32 METODE ...................................................................................................................... 32 Morfološka analiza .................................................................................................... 34 Morfometrijska analiza ............................................................................................. 35 Morfometrijska analiza histohemijski obraĊenih preparata .................................. 37 Morfometrijska analiza ćelija adenohipofize .................................................... 37 Morfometrijska analiza vezivnog tkiva adenohipofize ..................................... 37 Morfometrijska analiza krvnih sudova adenohipofize ...................................... 38 Morfometrijska analiza imunohistohemijski obraĊenih preparata ........................ 39 Statistička analiza ..................................................................................................... 41 REZULTATI ...................................................................................................................42 MORFOLOŠKA ANALIZA ......................................................................................... 42 Morfološka analiza histohemijski obrađenih preparata ........................................... 42 Morfološka analiza imunohistohemijski obrađenih preparata ................................. 45 Kolagen tipa IV ................................................................................................. 46 ACTH ćelije ...................................................................................................... 47 Folikulostelatne (FS) ćelije ............................................................................... 49 MORFOMETRIJSKA ANALIZA ................................................................................ 51 Morfometrijska analiza histohemijski obrađenih preparata ..................................... 51 Morfometrijska analiza imunohistohemijski obrađenih preparata ................................. 69 DISKUSIJA .....................................................................................................................76 ZAKLJUĈAK ..................................................................................................................92 LITERATURA ................................................................................................................93 LISTA SKRAĆENICA DNK – dezoksiribonukleinska kiselina HPA – hipotalamo-pituitarno-adrenalna osovina Nc – nucleus Tr – tractus HE metoda – Hematoksilin – eozin metoda GH – hormon rasta PRL – prolaktin ACTH – adrenokortikotropni hormon MSH – melanocitno stimulišući hormon TSH – tirotropni hormon FSH – folikulostimulišući hormon LH – luteinizirajući hormon GH – gonadotropni hormon iRNK molekul – molekul informacione ribonukleinske kiseline AMP – adenozin monofosfat PKA – adenilat ciklaza – cikliĉni AMP – protein kinaza A put Ca 2+ – joni kalcijuma PLC – fosfolipaza C PKC – protein kinaza C POMC – proopiomelanokortin PC – prohormon konvertaza CRH – kortikoropni oslobaĊajući (rilizing) hormon IL – 1 – interleukin 1 IL – 6 – interleukin 6 FS – folikulostelatne ćelije Na + kanali – natrijumovi kanali K + kanali – kalijumovi kanali VEGF (vascular endothelial growth factor) – vaskularni endotelijalni faktor rasta FGF-2 (fibroblast growth factor 2) – fibroblastni faktor rasta 2 GFAP (glial fibrillary acidic protein) – glijalni kiseli fibrilarni protein LDL (low-density lipoprotein) – lipoprotein niske gustine HDL (high-density lipoprotein) – lipoprotein svisoke gustine ACE – angiotenzin-konvertujući enzim PVN (nucleus paraventricularis) – paraventrikularno jedro TNF-α (tumor necrosis factor alpha) – faktor nekroze tumora - alfa IL-1α – interleukin 1α IL-1ß – interleukin 1ß IL-8 – interleukin 8 IL-1Ra (Interleukin 1 receptor antagonist) – antagonist interleukin-1 receptora sTNFR (Soluble Tumor Necrosis Factor Receptor) – receptor rastvorljivog faktora nekroze tumora - alfa CRP (C-reactive protein) – C reaktivni protein H2O2 – vodonik peroksid PBS – fosfatni pufer DAB – 3,3-diamino benzidin PAP metoda – peroksidaza-antiperoksidaza metoda AAH – area BAH – perimetar OF – oblikovni faktor MOD – proseĉna optiĉka gustina IOD – integralna optiĉka gustina MdOD – medijanska optiĉka gustina VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva PVT – koliĉnik broja taĉaka koje pogaĊaju vezivno tkivo PT – broj taĉaka testnog sistema VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova SVKS – površinska gustina krvnih sudova LVKS – duţinska gustina krvnih sudova AKS – area uoĉenih krvnih sudova ∑BKS – ukupan perimetar svih uoĉenih krvnih sudova ∑AT – ukupna testna površina svih analiziranih vidnih polja NAKS – broj uoĉenih krvnih sudova po jedinici površine testnog sistema NKS – ukupan broj uoĉenih krvnih sudova na svim analiziranim vidnim poljima jednog sluĉaja VVCol IV – zapreminska gustina kolagena tipa IV VVACTH – zapreminska gustina ACTH pozitivnih ćelija PCol IV – broj taĉaka koje pogaĊaju kolagen tipa IV imunopozitivne zone PACTH – broj taĉaka koje pogaĊaju ACTH imunopozitivne zone VVFSC – zapreminska gustina folikulostelatnih ćelija CT – kompjuterizovana tomografija MRI – magnetna rezonanca NF-kß – nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells IGF-1 – insulinu sliĉan faktor rasta CGRP (calcitonin gene-related peptide) – kalcitonin gen–zavisni peptid IFN-ɣ – interferon ɣ MHC – major histocompatibility complex LPS (lipopolysaccharide binding protein) – lipopolisaharid vezujući protein 1 UVOD STARENJE Starenje se moţe definisati kao multifaktorijalni proces okarakterisan heterogenim obrascima i povećanim rizikom za nastanak razliĉitih bolesti (Goncharova i Lapin, 2002). Ono vodi ka progresivnom, generalizovanom smanjenju funkcija ĉitavog organizma i rezulti- ra povećanjem njegove vulnerabilnosti u odgovoru na izazove spoljašnje sredine (Kirkwood, 2005). Starenje je praćeno multiplim internim homeostatskim alteracijama koje su isprvo- cirane dejstvom razliĉitih eksternih stimulusa ili stresora. Kao posledica toga dolazi do sma- njenja sposobnosti odgovora na stres i poremećaja homeostatske ravnoteţe, pri ĉemu se povećava incidenca pojave patoloških stanja, što vodi smrti kao konaĉnom ishodu (Seeman i Robbins, 1994; Weinert i Timiras, 2003). Pretpostavlja se da starenje poĉinje posle zrelog do- ba, iako većina znakova nije oĉigledna ni tokom kasnijih ţivotnih perioda. Tokom starenja ne dolazi do promene funkcije jednog regulatornog sistema, već do interakcije velikog broja procesa, od kojih se svaki odigrava u razliĉitom trenutku (Carlson i Riley, 1998). Konaĉno, narušavanje morfološkog integriteta i funkcionalnog kapaciteta endokrinog, nervnog i imu- nog sistema, kao i njihova redukovana sposobnost da odrţe homeostazu predstavljaju nepo- bitnu karakteristiku ovog procesa (Cónsole i sar., 2000). Poslednjih decenija došlo je do ekspanzije studija o starenju. Razlog za to je produţenje proseĉnog ljudskog ţivotnog veka, praćeno produţenjem maksimalne duţine ţivota, kao i povećanjem procenta starih ljudi u ukupnoj populaciji. Heterogenost fenotipa i razlike u duţini ţivotnog veka unutar jedne vrste navode na ĉinjenicu da su za duţinu ţivotnog veka odgovorni kako genetski, tako i faktori sredine (Weinert i Timiras, 2003). Danas je poznato preko tri stotine teorija starenja. Sve one teţe da identifikuju uzrok, objasne njegovu celularnu i molekularnu bazu i, na kraju, raspletu klupko multiplih mehanizama koji prouzru- kuju akumulaciju oštećenja prisutnu tokom ovog, za ljudsko društvo veoma bitnog procesa (Weinert i Timiras, 2003; Kirkwood, 2005). Uvod 2 Teorije starenja Svaka teorija o starenju posmatra ĉitav proces sa razliĉitog, sopstvenog aspekta: ge- netskog, biohemijskog ili fiziološkog, što ujedno i determiniše naĉin na koji se objašnjavaju promene uoĉene tokom starenja. Evolucione teorije Evolucione teorije zastupaju ideju da starenje nastaje kao rezultat opadanja snage prirodne selekcije. Kako evolucija primarno ima ulogu da poboljša reproduktivnu sposobnost individue, dugoveĉnost u tom sluĉaju bila bi favorizovana samo u cilju unapreĊenja repro- duktivne sposobnosti vrste. Duţina ţivota je specifiĉna za svaku ţivotinjsku vrstu. Ona je u funkciji njene sposobnosti preţivljavanja i reproduktivne strategije u kompetitivnom okru- ţenju. To znaĉi da bi duţina ţivotnog veka jedinke odreĊene vrste trebala biti usklaĊena sa njenim okruţenjem. Produţeni ţivotni vek moţe da pogoduje unapreĊenju reproduktivne funkcije, ali sa druge strane, u pojedinim okolnostima ţrtvovanje dugoveĉnosti u cilju opstanka vrste predstavlja neminovnost (Weinert i Timiras, 2003). U ovu grupu teorija spa- daju: teorija akumulacije mutacija, teorija potrošnog tela i teorija antagonistiĉke plejotropije. Teorija akumulacije mutacija sugeriše da se štetne mutacije akumuliraju u populaciji sa vre- menom i konaĉno dovode do pojave odreĊenih patoloških stanja sa starenjem. Preostale dve teorije su zasnovane na konceptu evolucionog kompromisa. Teorija potrošnog tela se bazira na pretpostavci optimalne preraspodele metaboliĉkih resursa u cilju oĉuvanja integriteta i re- paracije tela neophodnih za normalno obavljanje prvenstveno reprodukcije, kao i mnogih drugih funkcija. Po ovoj teoriji, po završetku reproduktivnog perioda dolazi do naglog po- rasta trošenja tela, smanjenja njegove regenerativne i reparativne sposobnosti i napredovanja procesa starenja sa pojavom onih patoloških stanja karakteristiĉnih za taj period ţivota. Teorija antagonističke plejotropije pretpostavlja da neki geni mogu imati korisne efekte u mladosti, dok njihova ekspresija u starosti ima štetne efekte koji doprinose starenju (Kirkwood, 2005). Molekularne teorije Molekularne teorije objašnjavaju starenje kao posledicu promena na nivou molekula DNK. Teorija genske regulacije starenja pripada ovim teorijama i zastupa stav da starenje nastaje kao posledica promena u genskoj ekspresiji. Naime, poznato je da se ekspresija mno- gih gena menja sa godinama. MeĊutim, postojanje gena ĉija ekspresija direktno dovodi do Uvod 3 starenja do danas nije potvrĊeno (Kirkwood, 2002). Na ţivotni vek utiĉu geni koji promovišu dugoveĉnost. Analize sprovedene u cilju dešifrovanja humanog genoma su omogućile istraţi- vaĉima da sastave transkripcioni obrazac normalnog starenja. Ovi podaci mogu da se dovedu u vezu sa pokušajima da se uspori ili ubrza starenje identifikacijom promene ekspresije gena bitnih za proces starenja. Razumevanjem naĉina na koji priroda odlaţe starenje, promenama genske ekspresije moţe se otkriti mnogo novih podataka o samom procesu starenja. Ta ĉinje- nica moţe predstavljati poĉetnu taĉku za dalja istraţivanja u cilju usporavanja nastanka onih promena u ĉoveĉjem organizmu koje se javljaju sa njim. Studije na stogodišnjacima i njihovim roĊacima pokazale su da genetski faktori znaĉajno više od socioekonomskih i faktora okoline utiĉu na duţinu ţivotnog veka. TakoĊe, nedavna studija je potvrdila da lokus na hromozomu 4 sadrţi gen ili gene koji pospešuju dugoveĉnost (Perls i sar., 2002). Teorija „katastrofalne greške“ zastupa stav da se tokom ţivota broj grešaka postepeno uvećava sve dok ne dostigne kritiĉan nivo kada nastupa smrt (katastrofa) ćelije, pri ĉemu krajnju posledicu ĉitavog ovog procesa predstavlja smrt organizma (Weinert i Timiras, 2003). Teorija oštećenja i popravke DNK navodi da tokom starenja nastanak somatskih mutacija i poslediĉno oštećenje ćelije nastaju usled smanjenja efikasnosti repair mehanizama koji bi to trebali da spreĉe. Oštećenje mitohondrijalne DNK npr. dovodi smanjenja efikasnosti mito- hondrija u produkciji energije, ireverzibilnog oštećenja i smrti ćelije (Gorbunova i sar., 2007). Teorija unakrsnog povezivanja (kolagenska teorija) podrazumeva da sa starenjem dolazi do meĊusobnog povezivanja makromolekula, koji su normalno odvojeni izuzetno jakim vezama. Primer za ovu teoriju su molekuli kolagena. Zbog unakrsnog povezivanja njegovih molekula, on postaje nerastvorljiv i rigidan, što rezultira promenom propustljivosti ćelijske membrane. Usled meĊusobnog povezivanja molekula elastina menja se i struktura vezivnog tkiva. Po- remećaji replikacije DNK i deobe ćelije mogu da se jave u sluĉaju zahvatanja strukturnih pro- teina i proteina deobnog vretena ovim procesom. Samo unakrsno povezivanje nastupa usled glikozilacije terminalnih aminokiselina proteinskih lanaca. Neki od napred navedenih produ- kata deluju toksiĉno. Njihovo toksiĉno dejstvo moţe da se ostvari na dva naĉina: inicijacijom stvaranja slobodnih radikala i njihovom povećanom sklonošću ka proteolizi i degradaciji, što dovodi do strukturalnih i funkcionalnih promena sliĉnih onima koje karakterišu starenje (Grillo i Colombatto, 2008). Uvod 4 Celularne teorije Teorija telomera pripada celularnim teorijama i po njoj ćelijsko starenje je opisano kao proces koji ograniĉava broj ćelijskih deoba humanih ćelija u kulturi (Weinert i Timiras, 2003). Ovo ograniĉenje replikativnog kapaciteta se javlja nakon odgovarajućeg broja će- lijskih deoba i rezultira zaustavljanjem deoba ćelija koje postaju fiziološki izmenjene (Campisi, 2003). Ćelijsko starenje takoĊe moţe da nastane kao odgovor na razliĉita molekularna zbivanja. Replikativno starenje je specifiĉan tip celularnog starenja koji rezultira gubitkom telomera. Sa svakom ćelijskom deobom dolazi do gubitka male koliĉine DNK na svakom kraju hromo- zoma, što rezultira skraćenjem telomera, izmenom njihove strukture i pojavom replikativnog starenja. Aktivacijom enzima telomeraze telomere se regenerišu, a primarne humane ćelijske kulture postaju besmrtne (Blackburn, 2000). Teorija slobodnih radikala, kao jedna od celularnih teorija, navodi da je povećano stvaranje slobodnih radikala bitan biološki proces koji rezultira kumulativnim oštećenjem ćelija i starenjem. Shodno tome, povišeni nivoi oksidativno oštećene DNK i proteina su pro- naĊeni kod starih organizama (Shringarpure i Davies, 2002). Teorija slobodnih radikala je podeljena na nekoliko hipoteza koje se fokusiraju na ulogu pojedinaĉnih organela i tipove oštećenih molekula u procesu starenja. Jedna od tih hipoteza zastupa stav da mutacije u mito- hondrijalnoj DNK ubrzavaju oštećenje izazvano slobodnim radikalima uĉešćem alterisanih komponenti enzima u lanac elektronskog transporta. Oštećen transport elektrona rezultira daljim povišenjem nivoa slobodnih radikala i sledstveno povećanom pojavom mutacija mito- hondrijalne DNK kao i povišenom produkcijom oksidanasa, što dovodi do starenja. Po drugoj hipotezi, slobodni radikali izazivaju starenje pojavom akumuliranja oksidisanih proteina u ćelijama (Mandavilli i sar., 2002; Shringarpure i Davies, 2002). Sistemske teorije Sistemske teorije povezuju proces starenja sa sniţenjem funkcija organskih sistema koji kontrolišu ostale sisteme u organizmu i koji su bitni za komunikaciju organizma sa spo- ljašnjom sredinom i adaptaciju na njene promene. Kod ĉoveka, nervni, imuni i endokrini sistem igraju vaţnu ulogu u koordinaciji svih ostalih sistema i regulaciji njihovog odgovora na stimuluse iz spoljašnje i unutrašnje sredine. Neuroendokrina teorija zastupa stav da se starosne promene javljaju paralelno sa pro- menama nervnih i endokrinih funkcija koje su krucijalne za: 1) koordinaciju komunikacije Uvod 5 svih organskih sistema sa spoljašnjom sredinom; 2) programiranje fizioloških odgovora na stimuluse spoljašnje sredine i 3) stvaranje optimalnih uslova za reprodukciju i preţivljavanje kao odgovor na zahteve spoljašnje sredine. Vaţna komponenta ove teorije je hipotalamo-pitu- itarno-adrenalna (HPA) osovina kao glavni generator i regulator signala za poĉetak i završe- tak svakog stadijuma ţivota. Jedna od glavnih funkcija HPA osovine je da obezbedi fizi- ološke uslove neophodne za oĉuvanje unutrašnje homeostaze uprkos promenama u spo- ljašnjoj sredini. Tokom ţivota, hroniĉna ekspozicija fiziĉkom, biološkom i emocionalnom stresu moţe iscrpiti i oslabiti kapacitet adaptacije organizma i dovesti najpre do “bolesti adaptacije” i na kraju njegove smrti. Nastanak starosnih promena se u tom sluĉaju moţe obja- sniti kao rezultat smanjenja sposobnosti organizma za preţivljavanje stresa. Hipotalamus, kao najviši centar ovog sistema, vrši integraciju odgovora na stimuluse spoljašnje sredine koji se stvaraju u razliĉitim delovima CNS-a (cerebralnom korteksu, limbiĉkom sistemu, retikularnoj formaciji) (Weinert i Timiras, 2003). Neuroendokrino-imunološka teorija potencira interakciju i integraciju neuroendokrinog i imunog sistema. Ova interakcija se odvija na sledeće naĉine: 1) putem neuropeptida i citokina prisutnih u imunom sistemu koji predstavljaju medijatore kako unutar samog imunog sistema, tako i izmeĊu neuroendokrinog i imunog sistema; 2) putem hormona prednjeg i zadnjeg reţnja hipofize koji kontrolišu brojne imune funkcije i 3) reciproĉnom interakcijom citokina neuroendokrinog sistema. Iako se neuroendokrini i imuni sistem karakterišu visokim stepe- nom plasticiteta, tj. sposobnosti da modifikuju svoju funkciju u zavisnosti od potrebe, ona opada tokom procesa starenja (Weinert i Timiras, 2003). To na kraju rezultira starosnim pro- menama imunog sistema koje se karakterišu smanjenjem rezistencije organizma na infektivne agense, slabljenjem zaštite od pojave malignih oboljenja i ĉešćom pojavom autoimunih bo- lesti (Franceschi i sar., 2000). ANATOMSKE KARAKTERISTIKE HIPOTALAMO-PITUITARNO-ADRENALNE OSOVINE Hipotalamo-pituitarno-adrenalnu (HPA) osovinu ĉine tri glavne komponente: hipotala- mus, adenohipofiza i nadbubreţna ţlezda. Ova osovina predstavlja jedan od najpouzdanijih homeostatskih mehanizama ljudskog tela, koji reguliše brojne procese, ukljuĉujući digestiju, funkciju imunog sistema, raspoloţenje i emocije, seksualnost, kao i stvaranje i potrošnju energije. Ona predstavlja kljuĉnu taĉku u povezivanju endokrinog, nervnog i imunog sistema (Ferrari i sar., 2001). Kao takva, ona kontroliše pojedine aspekte adaptacije, rasta i razvoja je- Uvod 6 dinke (Goncharova i Lapin, 2001) i koordiniše metaboliĉke i odgovore neuroendokrinog si- stema na stres (Seeman i Robbins, 1994). Stresori koji izazivaju aktivaciju HPA osovine mo- gu biti fiziĉki, zatim spoljašnji ili unutrašnji faktori kao sto su aktivacija imunog sistema, bol, zatim izlaganje tela toploti ili hladnoći. Veoma znaĉajne stresore mogu da predstavljaju i razliĉiti psihološki faktori. Hipotalamus Hipotalamus (hypothalamus) predstavlja veoma mali deo meĊumozga koji uĉestvuje u izgradnji poda i dela boĉnog zida treće moţdane komore. On se rostralno pruţa sve do optiĉke raskrsnice (chiasma opticum) i terminalne lamine (lamina terminalis). Zadnja moţda- na spojnica (commissura cerebri posterior) predstavlja njegovu kaudalnu granicu prema srednjem mozgu (mesencephalon). Dorzalnu granicu hipotalamusa predstavlja rostralno prednja moţdana spojnica (commissura cerebri anterior), a sulcus hypothlamicus i ventralni talamus kaudalno. Lateralno, hipotalamus se pruţa sve do subtalamiĉkog jedra (nc. subthala- micus). Na njegovoj ventralnoj strani koja naleţe na dorzalnu stranu tela klinaste kosti (os sphenoidale) uoĉavaju se idući od rostralnog ka kaudalnom kraju chiasma opticum, pepljasta kvrţica (tuber cinereum) i peteljka hipofize (infundibulum) i, na kraju, bradaviĉasta telašca (corpora mamillaria) (Kahle i Frotscher, 2002; Mills, 2007; Siegel i Sapru, 2011). GraĊa hipotalamus-a Hipotalamus se sastoji iz sive i bele mase. Siva masa je sistematizovana u nejasno razgra- niĉena jedra koja su, prema klasiĉnoj anatomskoj literaturi, vlaknima stubova moţdanog svoda (fornix) podeljena u medijalnu i lateralnu oblast (Standring i sar., 2008; Siegel i Sapru, 2011). Lateralnu oblast (regio hypothalamica lateralis) ĉine slabo definisana jedra (nc. perifornicalis, nc. tuberomamillaris i ncc. tuberales laterales) izmeĊu kojih prolaze vlakna medijalnog telencefaliĉnog snopa (fasciculus telencephalicus medialis). U njoj se nalaze bihejvioralni centri, kao i centar za glad i unošenje teĉnosti. Medijalni hipotalamus ĉini više grupa jedara sastavljenih od neurona ĉiji produkti regulišu funkciju hipofize, pa se zbog toga on oznaĉava i kao hipofiziotropna zona (Siegel i Sapru, 2011). Topografski i funkcionalno, medijalni hipotalamus je izdiferenciran na prednju (regio hypothalamica anterior), srednju (regio hypothalamica intermedia), zadnju (regio hypothalamica posterior) i manju dorzalnu (regio hypothalamica dorsalis) oblast (Standring, 2008). Uvod 7 Prednja oblast medijalnog hipotalamusa u svoj sastav ukljuĉuje preoptiĉka (nc. pre- opticus medianus, nc. preopticus periventricularis, nc. preopticus medialis i nc. preopticus lateralis), zatim supraoptiĉko (nc. supraopticus), suprahijazmatsko (nc. suprachiasmaticus) i paraventrikularno jedro (nc. paraventricularis). Ovaj region se grubo moţe podeliti na medi- jalni i lateralni deo. Za medijalni deo je ustanovljeno da uĉestvuje u regulaciji endokrinih funkcija i termoregulaciji, dok je funkcija lateralnog dela znatno slabije izuĉena. Suprahi- jazmatsko jedro se nalazi u ventromedijalnom delu prednje zone medijalnog hipotalamusa i zalazi delimiĉno u preoptiĉki region. Ono je vlaknima retinohipotalamiĉkog snopa (tr. retino- hypothalamicus) povezano sa retinom i odgovorno je za diurnalni ritam sekrecije hormona. Supraoptiĉko jedro se nalazi dorzalno od lateralnog dela optiĉke hijazme, dok se paraventri- kularno jedro nalazi u dorzomedijalnom delu prednje zone medijalnog hipotalamusa, nepo- sredno ispod ependima boĉnog zida treće moţdane komore. Oba ova jedra sastoje se iz krupnih neurona koji luĉe oksitocin i arginin-vazopresin. Ova dva hormona se preko hipota- lamo-hipofiznog snopa prenose u neurohipofizu, odakle se izluĉuju u njene vene i dalje u vensku cirkulaciju. Putem krvi oni dospevaju do ciljnih tkiva gde ostvaruju svoj efekat. Oksitocin stimuliše kontrakcije mioepitelnih ćelija dojke i uĉestvuje u izluĉivanju mleka u procesu dojenja. On takoĊe stimuliše na kontrakciju i glatko-mišićne ćelije uterusa tokom poroĊaja. Arginin-vazopresin ostvaruje svoj efekat na nivou distalnih tubula bubrega gde dovodi do resorpcije vode i samim tim koncentrovanja mokraće i ostalih telesnih teĉnosti (Kahle i Frotscher, 2003; Standring, 2008; Siegel i Sapru, 2011). Srednja zona medijalnog hipotalamusa oznaĉava se kao tubero – infundibularni region. U njenom ventromedijalnom delu, neposredno iznad infundibuluma, u nivou središnjeg uzviše- nja (eminentia mediana), kaudalno od suprahijazmatskog jedra nalazi se arkuatno jedro (nc. arcuatus s. infundibularis). Ovo jedro je izgraĊeno preteţno iz dopaminergiĉkih neurona koji sintetišu prolaktin inhibirajući hormon. Ventromedijalno jedro (nc. ventromedialis) se takoĊe nalazi u ventralnom delu ovog dela hipotalamusa. U njemu se nalazi centar za kontrolu agre- sivnog ponašanja, centar za sitost, kao i centar za endokrinu kontrolu. Neposredno dorzalno u odnosu na ventromedijalno nalazi se dorzomedijalno jedro (nc. dorsomedialis) koje je po gra- Ċi i funkciji veoma sliĉno napred opisanom jedru. Kontrolu oslobaĊanja rilizing hormona iz hipotalamusa u hipotalamo – hipofizni portni sistem i samim tim dalje u adenohipofizu vrše jedra koja se nalaze neposredno uz zid treće moţdane komore ove zone hipotalamusa koja se oznaĉavaju kao tuberalna jedra (Siegel i Sapru, 2011). Zadnja ili mamilarna zona medijalnog hipotalamusa nalazi se kaudalno u odnosu na intermedijarnu zonu, u nivou bradaviĉastih telašaca. Ona u svom sastavu sadrţi više bele Uvod 8 mase, pa je pojedini autori (Kahle i Frotscher, 2003) oznaĉavaju i kao dobro mijeliniziranu zonu, dok preostali deo medijalnog hipotalamusa oznaĉavaju kao slabo mijeliniziranu zonu. Najveći deo mamilarnih telašaca gradi medijalno mamilarno jedro (nc. mamillaris medialis) izgraĊeno od sitnih neurona. Dorzolateralno u odnosu na njega nalazi se znatno manje latera- lno mamilarno jedro (nc. mamillaris lateralis). Ova dva mamilarna jedra su okruţena slabije mijeliniziranim delom hipotalamusa unutar koga se nalaze premamilarna (nc. premamillaris ventralis et dorsalis), zadnje jedro hipotalamusa (nc. posterior hypothalami) i supramami- larno jedro (nc. supramamillaris) (Kahle i Frotscher, 2003). Hipotalamus predstavlja zonu CNS – a koja je primarno ukljuĉena u regulaciju rada unutrašnjih organa, zatim regulaciju endokrine sekrecije, funkcije autonomnog nervnog sistema i emocija. On dodatno vrši regulaciju telesne temperature, seksualne funkcije, ishrane i uzimanja teĉnosti, kao i ispoljavanja ofanzivnog (agresivnog) ili defanzivnog ponašanja jedinke (Siegel i Sapru, 2011). On je izgraĊen iz posebne vrste nervnih ćelija koje se ozna- ĉavaju kao neurosekretorne ćelije i predstavljaju prelaznu formu izmeĊu nervnih i sekretornih ćelija. Morfološki, one su sliĉne neuronima i sastoje se iz tela od koga polazi veći broj kraćih nastavaka, dendrita i jedan dugi nastavak, odnosno akson. Za razliku od neurona, u njihovom perikarionu se umesto neurotransmitera sintetišu peptidi koji se tu deponuju najpre unutar malih vezikula. Vezikule se zatim transportuju duţ njihovih aksona. U terminalnim delovima aksona sintetisani peptidi se stapanjem membrane vezikula sa membranom terminalnog dela aksona izluĉuju u krvotok putem koga dospevaju do hipofize. U njoj oni mogu da ispolje dva efekta. Pojedini peptidi deluju stimulativno na sekretornu aktivnost endokrinih ćelija adeno- hipofize i oznaĉavaju se kao rilizing („releasing“) hormoni. Nasuprot njima, drugi peptidi de- luju inhibitorno na napred navedene endokrine ćelije i oznaĉavaju se kao inhibitorni („inhibiting“) hormoni. OslobaĊanje rilizing odnosno inhibiting hormona iz neurosekretornih ćelija hipotalamusa vrši se pod uticajem nervnih impulsa ili humoralnih stimulusa. Ĉitav pro- ces sinteze i sekrecije gore navedenih hormona od strane hipotalamusnih neurona oznaĉava se kao neurosekrecija (Kahle i Fortscher, 2003; Siegel i Sapru, 2011). U okviru hipotalamusa razlikuju se dva velika i anatomski jasno diferencirana sekretorna sistema. U prvi sistem su ukljuĉena dva magnocelularna jedra prednje zone medijalnog hipotalamusa, supraoptiĉko i paraventrikularno jedro. Njihovi krupni neuroni produkuju oksi- tocin i vazopresin koji se vezuju za svoje transportne proteine neurofizin I i II u Goldţi apa- ratu. Iz Goldţi aparata ovakve, neaktivne forme dva napred navedena hormona dospevaju u transportne vezikule. One se zatim preko aksona ovih neurona transportuju do krvnih sudova neurohipofize gde se, pošto se prethodno razdvoje od svojih proteinskih transportera, oslo- Uvod 9 baĊaju iz vezikula kalcijum zavisnim procesom egzocitoze. Aksoni neurona supraoptiĉkog i paraventrikularnog jedra na putu ka neurohipofizi obrazuju supraoptikohipofizealni i para- ventrikulohipofizealni snop. Drugi sistem ĉine jedra tuberalnog regiona i njihove veze sa adenohipofizom. Ova jedra se, za razliku od supraoptiĉkog i paraventrikularnog, sastoje iz sitnih neurona u ĉijim telima se produkuju rilizing i inhibiting hormoni hipotalamusa. Njihovi aksoni obrazuju tuberoinfundibularni snop ĉija vlakna završavaju u bogato vaskularizovanom uzvišenju (eminentia mediana) zadnjeg dela drške hipofize (infundibulum). Terminalni delovi aksona u napred navedenom delu infundibuluma stupaju u odnose sa fenestriranim kapila- rima. U njih oni izluĉuju produkovane hormone koji zatim preko hipofiznog portog sistema dospevaju do adenohipofize na ĉije ćelije deluju (Kahle i Frotscher, 2003; Mills, 2007). U znaĉajnije hipotalamusne hormone spadaju: tireotropni rilizing hormon (sintetiše se uglavnom u levom ventromedijalnom, dorzomedijalnom i paraventrikularnom jedru), kortikotropni ri- lizing hormon (sintetiše se u periventrikularnom i medijalnom delu paraventrikularnog jedra), somatotropni rilizing hormon (sintetiše se u arkuatnom jedru), somatotropni inhibitorni hor- mon ili somatostatin (sintetiše se u periventrikularnom, paraventrikularnom i parvocelular- nom delu arkuatnog jedra), gonadotropni rilizing hormon (sintetiše se uglavnom u ventrome- dijalnom, dorzomedijalnom, arkuatnom i paraventrikularnom jedru), dopamin (sintetiše se u arkuatnom jedru), arginin-vazopresin (sintetiše se u supraoptiĉkom i paraventrikularnom jedru) i oksitocin (sintetiše se u supraoptiĉkom i paraventrikularnom jedru) (Mills, 2007). Anatomske karakteristike paraventrikularnog jedra hipotalamusa Paraventrikularno jedro ĉoveka predstavlja jedro koje ima najznaĉajniju ulogu u re- gulaciji aktivnosti hipotalamo-pituitarno-adrenalne osovine. Ono ima oblik vertikalno po- stavljene ploĉe lokalizovane u preoptiĉkom i delimiĉno intermedijarnom delu medijalnog hipotalamusa. Medijalno se pruţa neposredno ispod ependima treće moţdane komore, od ko- ga je odvojeno uskim slojem glije. Dorzolateralni deo ovog jedra je useĉen descendentnim delom forniksa. U njegov sastav ulazi proseĉno oko 56 000 neurona, dok mu proseĉna zapre- mina iznosi oko 6 mm 3 . Paraventrikularno jedro je mnogobrojnim aferentnim vezama pove- zano sa drugim delovima mozga. Kada su u pitanju aferentne veze, najveći broj vlakana do- lazi iz limbiĉkog sistema (nc. septalis lateralis, nc. striae terminalis, corpus amygdaloideum i subiculum), zatim iz hipotalamusa, moţdanog stabla, kao i prefrontalnog korteksa. Većina napred navedenih vlakana završava u parvocelularnom delu ovog jedra, osim vlakana po- reklom iz nc. dorsomedialis-a i nc. preopticus periventricularis-a koja završavaju u magno- celularnom delu ovog jedra. Eferentna vlakna paraventrikularnog jedra koja potiĉu iz nje- Uvod 10 govog magnocelularnog dela završavaju u zadnjem lobusu hipofize. Vlakna poreklom iz par- vocelularnog dela završavaju u nc. coeruleus-u, nc. tegmentalis ventralis-u, ncc. parabrachi- ales, nc. tractus solitarii, nc. dorsalis nervi vagi, periakveduktalnoj sivoj masi, nc. interme- diolateralis-u kiĉmene moţdine, spoljašnjoj zoni eminentia mediana-e, zadnjem reţnju hipo- fize i corpus amygdaloideum–u. Većina vlakana koja predstavljaju preteţno eferentne veze paraventrikularnog jedra ulazi u sastav fasciculus longitudinalis medialis-a. Na osnovu veza ovog jedra moţe se zakljuĉiti koliko je njegova uloga vaţna za normalno odvijanje endo- krinih procesa ĉoveka. Preko njega medijalni prefrontalni korteks velikog mozga modulira odgovor na stres. Na taj naĉin se vrši integracija kognitivno-afektivnih informacija i funkcija hipotalamo-hipofizno-adrenalne osovine (Turnbull i Rivier, 1999; Babović i sar., 2009). Prema Koutcherov-u i saradnicima (2000), humano paraventrikularno jedro se sastoji iz pet anatomski jasno definisanih delova: anteriornog parvocelularnog, parvocelularnog, magno- celularnog, dorzalnog i posteriornog. Anteriorni parvocelularni deo predstavlja najrostralniji deo ovog jedra. Sastoji se iz sitnih ili neurona srednje veliĉine, ovalnog oblika, lokalizovanih u ventralnom delu hipotalamusa. Oni poseduju jasno definisane nastavke i sekretuju arginin – vazopresin, neurofizin i dopamin. Parvocelularni deo je lokalizovan medijalno, neposredno ispod ependima treće moţdane komore, ventralno i dorzalno od descendentnog dela stubova moţdanog svoda. On se sastoji iz sitnih neurona koji sekretuju kortikotropin rilizing hormon i gonadotropin rilizing hormon. Magnocelularni deo zauzima ventrolateralni kvadrant paraven- trikularnog jedra i sastoji se iz krupnih ili srednje veliĉine multipolarnih neurona. On pred- stavlja njegov najupadljiviji deo i pruţa se put pozadi i dorzalno, doseţući nivo hipotala- miĉnog ţleba i ograniĉavajući lateralno parvocelularni i ventralno dorzalni odeljak ovog jedra. Neuroni ovog dela paraventrikularnog jedra sekretuju dopamin, arginin – vazopresin, neurofizin i u nešto manjoj meri oksitocin. Dorzalno od magnocelularnog dela nalazi se dor- zalni deo paraventrikularnog jedra. On zauzima njegov dorzolateralni kvadrant i sastoji se iz mešovite populacije sitnih i krupnih neurona koji preteţno luĉe dopamin, oksitocin, neuro- fizin i u znatno manjoj meri arginin-vazopresin. Konaĉno, kaudalno od descendentnog dela stubova moţdanog svoda, u nivou hipotalamiĉnog ţleba nalazi se posteriorni deo, koji je saĉinjen iz mešovite populacije krupnih bipolarnih i multipolarnih, kao i sitnih neurona. Se- kretuje dopamin, kortikotropin rilizing hormon, gonadotropin rilizing hormon, arginin-vazo- presin, oksitocin i neurofizin (Koutcherov i sar., 2000; Babović i sar., 2009). Uvod 11 Hipofiza Hipofiza (hypophysis s. gl. pituitaria) je glavna ţlezda endokrinog sistema koja produktima svoje sekrecije (hormonima) reguliše funkciju većine endokrinih ţlezda. Pojedini njeni hor- moni, kao što je npr. hormon rasta, mogu da deluju i direktno na odreĊena ciljna tkiva koja ne pripadaju endokrinom sistemu. Napred navedenim mehanizmima, hipofiza reguliše brojne vaţne procese u organizmu kao što su rast, metabolizam, razvoj u pubertetu, fertilitet, odgovor na stres i imunološki odgovor (Vankelecom, 2007; Ilić, 2009). Regulacija aktivnosti hipofize nastaje kao odgovor na stimulatorne i inhibitorne centralne i periferne signale (Chesnokova i Melmed, 2010). Hipofiza je mala ţlezda, preĉnika oko 1cm, teška od 0.5 do 1g. Ona se nalazi u turskom sedlu (sella turcica), koštanom udubljenju na gornjoj strani tela sfenoidalne kosti baze lo- banje. Hipofiza je dorzalno od mozga odvojena duplikaturom tvrde moţdanice (diaphragma sellae). Ventralno, od desnog i levog sfenoidalnog sinusa koji ĉine centralnu šupljinu tela klinaste kosti, odvojena je tankim koštanim zidom turskog sedla. Lateralno od nje nalaze se desni i levi kavernozni sinus i unutar njegovog lumena unutrašnja karotidna arterija i VI kranijalni ţivac. Kroz duplikaturu njegovog spoljašnjeg zida pruţaju se rasporeĊeni, idući odozgo put naniţe, III, IV,V1 i V3 moţdani ţivac. Na diaphragma sellae nalazi se otvor kroz koji prolazi peteljka hipofize (infundibulum), njena veza sa hipotalamusom. Iznad dijafragme nalazi se optiĉka raskrsnica (chiasma opticum) (Standring, 2008; Ilić, 2009). Hipofiza predstavlja strukturalnu i funkcionalnu vezu izmeĊu dva glavna regulatorna i integraciona sistema ĉoveĉijeg tela – nervnog i endokrinog. Ona nastaje integracijom ţlezdanog i nervnog tkiva tokom embrionalnog razvoja. Ţlezdani deo predstavlja adenohipofiza ili njen prednji reţanj (adenohypophysis s. lobus anterior), dok njen nervni deo ĉini neurohipofiza ili zadnji reţanj (neurohypophysis s. lobus posterior) (Henrikson i sar., 1997; AnĊelković, 2009). Adeno- i neurohipofiza su obavijene zajedniĉkom kapsulom, ĉineći na taj naĉin u anatomskom smislu jedinstvenu ţlezdu. Ipak, svaki od njena dva napred navedena dela se karakteriše razli- ĉitim embrionalnim poreklom, celularnim sastavom i funkcijom (Gartner i Hiatt, 2007). Adenohipofiza Adenohipofiza (adenohypophysis) ĉini oko 75% ĉitave ţlezde. Sastoji se iz tri dela: pars distalis, pars intermedia i pars tuberalis. Kod ĉoveka su pars intermedia i pars tuberalis za- krţljali, tako da je endokrina aktivnost gotovo iskljuĉivo vezana za distalni deo adenohi- pofize. Uvod 12 Histološki, adenohipofiza, taĉnije njen distalni deo, predstavlja klasiĉnu endokrinu ţlezdu koja luĉi šest veoma vaţnih hormona (Guyton i Hall, 2008; AnĊelković, 2009). Oni imaju veoma znaĉajnu ulogu u regulaciji funkcije većine endokrinih ţlezda ljudskog orga- nizma, kao i kontroli njegovih metaboliĉkih funkcija. Distalni deo adenohipofize (pars distalis) se sastoji iz parenhimskih ćelija, krvnih sudova, nervnih vlakana i mreţe kolagenih vlakana. Prema podacima iz klasiĉne histološke literature (Cross i Mercer, 1993; Kuehnel, 2003; Mills, 2007; Young i sar., 2007; Eroschenko, 2008) distalni deo adenohipofize se sa- stoji iz parenhimskih ćelija koje su rasporeĊene u vidu gredica ili acinusa izmeĊu kojih se na- laze vezivno-tkivne septe. Unutar vezivno-tkivnih septi uoĉava se bogata kapilarna mreţa sa- ĉinjena od fenestriranih sinusoidnih kapilara, što omogućava neometan prelazak produkata sekrecije endokrinih ćelija u krvotok. Na histološkim preparatima bojenim HE metodom, u adenohipofizi se razlikuju 2 tipa parenhimskih ćelija: hromofobne, ĉija se citoplazma boji veoma slabo i hromofilne ĉija se citoplazma intenzivno boji napred navedenim metodom. Hromofilne ćelije se dalje mogu podeliti u dve subpopulacije: prvu koja ukljuĉuje ćelije ĉija citoplazma ispoljava visok stepen acidofilije i boji se crveno (acidofili) i drugu u koju spadaju ćelije sa citoplazmom koja poseduje bazofilne karakteristike i boji se plavo nakon primene HE metode (bazofili). Hromofobne ćelije nisu prijemĉive ni za kisele ni za bazne boje. Nji- hova citoplazma se primenom HE metode veoma slabo boji i ne poseduje sekretorne granule koje se uoĉavaju u citoplazmi acidofila i bazofila. Ove ćelije se oznaĉavaju i kao foliku- lostelatne ćelije koje mogu da sekretuju veoma male koliĉine bilo kog hormona. U funkci- onalnom smislu hromofilne ćelije mogu da se podele na podgrupu ĉiji produkti sekrecije deluju na neendokrina tkiva i na one koje svojim hormonima regulišu rad većine endokrinih ţlezda (Young i sar., 2007). U prvu podgrupu spadaju:  Somatotropne ćelije  sekretuju hormon rasta (GH) i praktiĉno saĉinjavaju oko 50% svih endokrinih ćelija distalnog dela adenohipofize;  Mamotropne (laktotropne) ćelije  saĉinjavaju oko 20% svih endokrinih ćelija i sekre- tuju prolaktin (PRL) koji reguliše produkciju mleka u mleĉnim ţlezdama tokom peri- oda dojenja. U drugu grupu spadaju:  Kortikotropne ćelije  takoĊe ĉine oko 20% endokrinih ćelija prednjeg reţnja hipofize i sekretuju veliki polipeptidni molekul proopimelanokortin. Njegovim enzimskim razlaganjem nastaju kortikotropin (ACTH), zatim lipotropin (uĉestvuje u regulaciji Uvod 13 metabolizma lipida), endorfini (endogeni opioidi) i razliĉite forme melanocitno stimu- lišućeg hormona (MSH);  Tirotropne ćelije predstavljaju malobrojniju populaciju ćelija distalnog dela prednjeg reţnja (oko 5%) i luĉe tirotropin (TSH) koji reguliše rad štitne ţlezde;  Gonadotropne ćelije kojih takoĊe ima oko 5% u pars distalis-u adenohipofize odgo- vorne su za sekreciju folikulostimulišućeg (FSH) i luteinizirajućeg hormona (LH). Pars intermedia ĉini oko 3% adenohipofize i u njemu se uglavnom uoĉavaju bazofilne ćelije koje luĉe MSH. One mogu da se uoĉe i u dorzalnim delovima hipofize što se oznaĉava kao bazofilna invazija. Prisustvo koloidnih cista obloţenih prostim kubiĉnim ili višeslojnim stratifikovanim epitelom varijabilnog stepena diferencijacije predstavlja upadljivu struktu- ralnu karakteristiku ovog dela hipofize. One ukazuju na zajedniĉko embrionalno poreklo ovog i distalnog dela prednjeg reţnja adenohipofize od Rathke-ovog špaga primitivne usne duplje (Kuehnel, 2003). Pars tuberalis je deo adenohipofize levkastog oblika, koji okruţuje infundibulum ne- urohipofize. Većina njegovih ćelija luĉi gonadotropine (Junqueira i Carneiro, 2005). Sekretorna aktivnost većine napred navedenih tipova endokrinih ćelija adenohipofize se nalazi pod kontrolom ranije opisanih rilizing hormona hipotalamusa. Izuzetak predstavljaju jedino mamotropne ćelije ĉija se sekretorna aktivnost nalazi pod inhibitornom kontrolom do- pamina. Kontrolu sekrecije hormona rasta od strane somatotropnih ćelija pars distalis-a vrše kako rilizing tako i inhibiting (somatostatin) hormoni hipotalamusa (Young i sar., 2007). Prema Mills-u (2007), na preparatima hipofize bojenim klasiĉnim HE metodom uoĉava se pojaĉano prisustvo bazofilnih ćelija u središnjem, klinastom ili mukoidnom delu prednjeg reţnja, neposredno ventralno u odnosu na zadnji reţanj. One predominantno sekretuju ACTH, TSH, LH i FSH. Nasuprot njemu, lateralni delovi („lateralna krila“) prednjeg reţnja su saĉinjeni uglavnom od acidofilnih ćelija koje sekretuju najvećim delom GH, a u znatno manjoj meri PRL. Prema tome, primena ovog metoda samo delimiĉno omogućava razliko- vanje napred navedenih funkcionalnih tipova ćelija adenohipofize. Njihova definitivna vizu- alizacija je moguća samo primenom imunohistohemijskog i elektronomikroskopskog metoda. Elektronomikroskopskim metodom se uoĉava razliĉita veliĉina i elektronska gustina sekretor- nih granula kod razliĉitih ćelijskih tipova. Tako, somatotropi poseduju sekretorne granule srednje veliĉine (300 nm), dok tirotropi poseduju sitne granule (16 – 60 nm) koje su lo- kalizovane na periferiji ćelije. Gonadotropi predstavljaju krupne ćelije ĉije su sekretorne gra- nule varijabilne veliĉine (300 – 400 nm). Kortikotropi poseduju retke sekretorne granule Uvod 14 proseĉne veliĉine 200 – 500 nm koje su lokalizovane na krajnjoj periferiji ćelije (Kuehnel, 2003; Young i sar., 2007). Napred opisani tip histološke organizacije adenohipofize pojedini autori (Le Tissier i sar., 2012) poistovećuju sa strukturom difuznog neuroendokrinog sistema. Na tankim histološkim presecima, takav tip organizacije karakteriše heterogena distribucija razliĉitih funkcionalnih tipova endokrinih ćelija adenohipofize. I kod takvog modela njene graĊe navodi se prisustvo morfološke povezanosti kortikotropa i somatotropa, zatim tirotropa i somatotropa, kao i laktotropa i gonadotropa. Napred navedeni autori (Le Tissier i sar., 2012) takoĊe navode i po- datak da je najveća koncentracija laktotropa uoĉena u krajnjem rostralnom i krajnjem ka- udalnom delu distalnog dela prednjeg reţnja, dok su somatotropi najzastupljeniji u njegovim anterolateralnim krilima. Takva percepcija adenohipofize u vidu dezorganizovanog ćelijskog mozaika bi ukazivala da endokrine ćelije koje pripadaju istom funkcionalnom tipu mogu da oslobaĊaju hormon u krvotok bez neke izrazite potrebe za meĊusobnom koordinacijom. Iz svega napred opisanog bi se moglo zakljuĉiti da endokrine ćelije, u vidu sekundarnog oscila- tora, izvršavaju instrukcije prispele preko hipofiznog portnog krvotoka iz hipofiziotropnih ne- urona hipotalamusa (Fauquier i sar., 2002). Ipak, isti autori dalje tvrde da je verovatnoća da su parenhimske endokrine ćelije prednjeg reţnja hipofize razbacane bez nekog pravila unutar njega mala, što dodatno podupiru robustnost (sinteza i sekrecija hormona i u sluĉaju teţih po- remećaja kao što su lokalna ishemija ili inflamacija) i modularnost (odrţavanje normalne pro- dukcije hormona u promenljivim fiziološkim uslovima) njegove funkcije. To sve ukazuje na meĊusobnu povezanost (fiziĉku ili hemijsku) ĉak i prostorno udaljenih homotipskih endokri- nih ćelija i njihovu koordinaciju pomoću parakrinih faktora ili prenošenjem signala pomoću „gap“ spojeva (Mollard i sar., 2012). Strukturalno, adenohipofiza bi u najvećoj meri odgo- varala trodimenzionalnom lavirintu unutar koga vezivno tkivo, imune ćelije i fenestrirani kapilari grade „zidove“ koridora koji ispunjavaju parenhimske ćelije (Fauquier i sar., 2002). Funkcionalne mreţe homotipskih endokrinih ćelija adenohipofize su najbolje prouĉene kod eksperimentalnih ţivotinja (miševa). Do danas, takav tip povezanosti opisan je kod ĉetiri od pet funkcionalnih tipova endokrinih ćelija. Tako, somatotropne ćelije formiraju klastere unutar lateralnih delova prednjeg reţnja. Oni su naroĉito razvijeni u postpubertetskom periodu kod muškog pola. Klasteri koji se nalaze kako na istoj, tako i na suprotnim stranama prednjeg reţnja povezani su pomoću ćelijskih gredica saĉinjenih iz jednog reda ćelija istog funkcionalnog tipa. Prisustvo klastera u središnjem delu distalnog dela prednjeg reţnja nije uoĉeno. Ćelije koje eksprimiraju proopiomelanokortin, polipeptid koji će se kasnije proce- suirati u ACTH, javljaju se tokom razvoja najpre u obliku klastera u lateralnim partijama ka- Uvod 15 udalnog i ventralnog dela prednjeg reţnja. Kasnije se od njih pruţaju ćelijske trake ka središnjem delu ventralnog pars distalis-a lobus anterior-a i nastavljaju da penetriraju i ka njegovim dubljim (dorzalnim) delovima. Takav tip organizacije se zadrţava i u adultnom pe- riodu. Melanotropi, koji takoĊe eksprimiraju proopiomelanokortin, ali sekretuju MSH, za- uzimaju središnji deo prednjeg reţnja, izmeĊu infundibuluma i pituitarne fisure. Kortiko- tropne ćelije na tankim presecima izgledaju potpuno razdvojene. Ipak, one poseduju tanke na- stavke, tzv. citoneme, koje ih povezuju meĊusobno, kao i sa krvnim sudovima. Gonadotropne ćelije se javljaju, kao i kortikotropne ćelije, na ventralnoj strani prednjeg reţnja i tokom daljeg razvoja prate kortikotropne ćelije, sa kojima su i strukturalno povezane. Laktotropi se, kao i somatotropi, predominanto uoĉavaju u lateralnim delovima prednjeg reţnja, gde u adultnoj adenohipofizi formiraju „saćaste“ strukture. One su naroĉito upadljive kod ţenskog pola tokom perioda laktacije (Le Tissier i sar., 2012; Mollard i sar., 2012). Funkcija adenohipofize Yeung i sar. (2006) su u svom pregledu opseţno opisali funkciju endokrinih tipova ćelija prednjeg reţnja hipofize. Naime, pulsatilna ili epizodiĉna sekrecija trofiĉkih hormona adenohipofize se nalazi pod kontrolom sinhronizovanog sekretornog obrasca hipotalamusnih hormona. Ova hipotalamusno-adenohipofizna osovina reguliše sintezu i sekreciju trofiĉkih hormona od strane odreĊenih ćelijskih tipova integracijom centralnih i perifernih signala. Pored hipotalamusnih hormona koji do hipofize dospevaju preko hipofiznog portnog cirkula- tornog sistema, adenohipofizna sekretorna aktivnost moţe biti modifikovana nivoima samih hormona koji su izluĉeni, zatim cirkardijalnim ritmom i na kraju mehanizmom negativne povratne sprege. Hipotalamusni rilizing hormoni deluju na odgovarajući funkcionalni tip endokrinih ćelija vezujući se za receptore vezane za G–protein u njihovoj ćelijskoj membrani. To dalje dovodi do pojaĉane transkripcije gena odgovornih za sintezu hormona i stabilizacije molekula iRNK koji pri tome nastaju. Napred navedeni hormoni vezivanjem za membranske receptore ciljnih adenohipofiznih endokrinih ćelija pospešuju sekreciju trofiĉkih hormona i aktivacijom adenilat ciklaza – cikliĉni AMP–protein kinaza A (PKA) puta. Vezivanje hipota- lamusnog rilizing hormona za specifiĉan receptor aktivira AMP – PKA put, što na kraju re- zultira porastom nivoa Ca 2+ u pituitarnim ćelijama influksom ekstracelularnog Ca2+ preko membranskih kalcijumskih kanala. Alternativno, dolazi do aktivacije fosfolipaze C (PLC) – protein kinaze C (PKC) puta koji dovodi do bifaznog porasta nivoa intracelularnog Ca 2+ i to najpre njegovim oslobaĊanjem u citoplazmu iz depoa u endoplazmatskom retikulumu, a za- Uvod 16 tim influksom ekstracelularnog kalcijuma. Povišenje intracelularnog Ca2+ predstavlja ne- ophodan preduslov za egzocitozu trofiĉkih adenohipofiznih hormona. Sekrecija hormona kao što su hormon rasta, prolaktin, ACTH i TSH vrši se pomoću AMP – PKA puta, dok se po- moću PLC - PKC puta vrši sekrecija gonadotropina i TSH. Hipotalamusni inhibiting hormoni kao što su somatostatin i dopamin ostvaruju svoje dejstvo delimiĉno inhibicijom aktivnosti adenilat ciklaze, delimiĉno pomoću mehanizama kojima sniţavaju nivo intracelularnog Ca2+. Napred navedeni autori (Yeung i sar., 2006) dalje navode da su tradicionalni stavovi da odreĊeni hipotalamusni rilizing hormon reguliše oslobaĊanje samo jednog adenohipofiznog trofiĉkog hormona i da endokrine ćelije jednog funkcionalnog tipa adenohipofize mogu da budu stimulisane samo od strane samo jednog rilizing hormona modifikovani. Naime, pojedi- ne pituitarne ćelije su multifunkcionalne po prirodi i mogu da eksprimiraju više razliĉitih fe- notipova. Ove ćelije mogu da budu ukljuĉene u paradoksalnu sekreciju (sekrecija hormona pod uticajem neodgovarajućeg rilizing hormona) i transdiferencijaciju (promena fenotipa već diferentovanih ćelija bez izvršene ćelijske deobe). To ĉini ove ćelije osetljivim na prisustvo više razliĉitih rilizing hormona, zbog ĉega se pojedini funkcionalni tipovi endokrinih ćelija sastoje iz više diskretnih subpopulacija. Sve napred navedeno ukazuje da je hipotalamusna kontrola funkcije adenohipofize znatno sloţenija nego što se to ranije smatralo. Kortikotropne ćelije Kortikotropne (ACTH) ćelije su lokalizovane u anteromedijalnom delu prednjeg reţnja i ĉine 15 – 20% ćelijske populacije adenohipofize. Morfološki, ove ćelije se karakterišu poli- gonalnim ili elongiranim oblikom, dobro razvijenim endoplazmatskim retikulumom, promi- nentnim Golgi kompleksom, brojnim krupnim lizozomima, prisustvom tipa I filamenata i citoplazmom ispunjenom brojnim iregularnim sekretornim granulama (Ooi i sar., 2004; AnĊelković, 2009). Izuĉavanje ovog funkcionalnog tipa ćelija prednjeg reţnja vršeno je na AtT-20 ćelijama koje su dobijene presejavanjem ćelija ACTH-produkujućih pituitarnih tumora eksperi- mentalnih ţivotinja (miševa) u ćelijskim kulturama. Ćelije ove linije, kao i kortikotropne će- lije in situ produkuju prohormon i poseduju enzimski aparat koji vrši njegovu obradu do ni- voa zrelog molekula proopiomelanokortina (POMC). One takoĊe poseduju i mašineriju za dalju post-translacionu obradu proopiomelanokortina i njegovo razlaganje na molekule ACTH, β-lipotropni hormon, dok melanotropne ćelije intermedijarnog reţnja adenohipofize razlaganjem ovog molekula produkuju α-melanocitno stimulišući hormon, γ-lipotropni Uvod 17 hormon i β-endorfin. Razlaganje molekula POMC kataliziraju enzimi oznaĉeni kao prohor- mon konvertaze (PC), pri ĉemu kortikotropi eksprimiraju samo PC–1, a melanotropne ćelije PC–1 i PC–2 izoforme ovog enzima. Unutar kortikotropnih ćelija, produkovani hormoni se pakuju unutar granula iz kojih se sintetisani hormoni mogu oslobaĊati neposredno nakon nji- hove sinteze ili se mogu najpre deponovati i zatim izluĉiti kasnije. Kortikotropne ćelije eksprimiraju glikokortikoidne, somatostatinske, histaminske H3 receptore, zatim dopaminske i holinergiĉke muskarinske receptore. Vezivanjem za napred navedene receptore sinteza i se- krecija ACTH se nalazi pod kontrolom glikokortikoida, CRH, arginin-vazopresina i citokina (IL–1 i IL–6) (Ooi i sar., 2004; Perez-Castro i sar., 2012). Folikulostelatne ćelije Folikulostelatne (FS) ćelije predstavljaju agranularne, neendokrine ćelije adenohipofize zvezdastog oblika sa prisutnim dugim, tankim nastavcima na njihovoj površini, koji se pru- ţaju izmeĊu endokrinih ćelija (Pavlović i sar., 2013a). One predstavljaju njene parenhimske ćelije koje su najpre oznaĉavane kao hromofobne (Fauquier i sar., 2002). Iako se za njihovo prisustvo zna oko 60 godina unazad, tek se u poslednjih 20 godina otkrivaju njihove brojne bitne funkcije (Inoue i sar., 1999; Allaerts i Vankelecom, 2005; Devnath i Inoue, 2008; Perez-Castro i sar., 2012). Inicijalno, FS ćelije su klasifikovane u dva komplementarna, ali morfološki razliĉita tipa: „folikularne“ ćelije koje svojim nastavcima okruţuju šupljine ispu- njene koloidnim materijalom i „stelatne“ ćelije, koje takoĊe poseduju duge nastavke, ali nji- ma ne oblaţu šupljine ispunjene koloidom. Kasnije je predloţeno da ova dva tipa FS ćelija u stvari predstavljaju jedinstvenu populaciju oznaĉenu kao „folikulostelatne“ ćelije. TakoĊe je uoĉeno da su one svojim dugim nastavcima, koji se pruţaju izmeĊu sekretornih ćelija i kapi- lara, meĊusobno povezane i formiraju trodimenzionalnu mreţu koja se pruţa ĉitavom površi- nom prednjeg reţnja pituitarne ţlezde (Fauquier i sar., 2002; Acosta i sar., 2010). Folikuloste- latne ćelije ĉine 5 – 10% ĉitave populacije ćelija prednjeg reţnja adenohipofize (Gartner i Hiatt, 2007). Njihova uloga nije u potpunosti razjašnjena, ali se pretpostavlja da pruţaju potporu ţlezdanim ćelijama prednjeg reţnja, zatim da uĉestvuju u trofiĉkim procesima, transferu metabolita i jona i imaju nutritivnu ulogu. Njihova prostorna organizacija, poveza- nost sa endokrinim ćelijama i krvnim sudovima sugerišu na njihovu moguću ulogu u parakri- noj regulaciji (Console i sar., 2000; AnĊelković, 2009; Acosta i sar., 2010). Jedna od veoma vaţnih odlika FS ćelija jeste ekscitabilnost njihove ćelijske membrane zahvaljujući prisustvu Na + , zatim Ca 2+ i još najmanje dve vrste K+ kanala. Zahvaljujući tome, one su sposobne da se Uvod 18 spontano depolarizuju pri ĉemu nastaje akcioni potencijal. On predstavlja okidaĉ za porast koncentracije Ca 2+ u njihovoj citoplazmi. U porast intracelularnog Ca 2+ mogu da budu uklju- ĉeni i drugi mehanizmi kao npr. oni koji se odigravaju uz uĉešće inozitol-tri-fosfata. Veoma bitnu ĉinjenicu predstavlja i podatak da FS ćelije meĊusobno, kao i sa endokrinim ćelijama prednjeg reţnja komuniciraju preko „gap“ spojeva. To omogućava prenošenje porasta intra- celularnog Ca 2+ širom ţlezde, u vidu talasa koga karakteriše odreĊeni spacio – temporalni obrazac. Joni kalcijuma predstavljaju univerzalni signalni molekul koji je, kao što smo već napred naveli, veoma bitan za sekreciju sintetisanih trofiĉkih hormona iz endokrinih ćelija adenohipofize (Fauquier i sar., 2002). Pored porasta citoplazmatskog Ca 2+ , FS ćelije mogu da prenose informacije širom prednjeg reţnja adenohipofize sintezom i sekrecijom brojnih faktora rasta, kao što su IL-6 (Lohrer i sar., 2000; Gloddek i sar., 2001; Correa-de-Santana i sar., 2009), VEGF, FGF-2, aneksin-1 (Theogaraj i sar., 2005), kao i ekspresijom receptora za hormone hipofize (Brokken i sar., 2004). Sekrecijom citokina i faktora rasta ove ćelije regu- lišu sekreciju prolaktina, hormona rasta, FSH, LH i ACTH (Mabuchi i sar., 2004; Henderson i sar., 2008). Demonstrirano je da FS ćelije takoĊe stvaraju lipokortin-1, koji deluje na nivou hipofize uĉestvujući u inhibiciji sinteze ACTH i na nivou hipotalamusa inhibicijom sinteze CRH, što na kraju rezultira smanjenjem sinteze glikokortikoida na nivou nadbubrega. U FS ćelijama, kao i u gonadotropima, sintetiše se folistatin koji indirektno, parakrinim dejstvom, reguliše biosintezu i sekreciju FSH (Danila, 2005). Koordinaciju aktivnosti kako lokalnih, tako i udaljenih grupa endokrinih ćelija, FS ćelije mogu da vrše i preko veza koje formiraju sa nastavcima hipotalamusnih neurona koji završa- vaju u pars tuberalis-u (Mabuchi i sar., 2004; Henderson i sar., 2008). One se povezuju i sa funkcionalnim plasticitetom hipofize zbog svoje sposobnosti da modifikuju broj meĊusobnih „gap“ intercelularnih spojeva, kao i modulacije veza sa hormonskim ćelijama u cilju ade- kvatnijeg odgovora adenohipofize na fiziološki izazov (Le Tissier i sar., 2012). Rezultati novijih studija ukazuju na uĉešće FS ćelija u komunikaciji izmeĊu imunog i endokrinog sistema (Herkenham, 2005). Naime, postoje tvrdnje da subpopulacija FS ćelija, morfološki bliska dendritiĉnim ćelijama, ima specifiĉnu ulogu u ostvarivanju komunikacije izmeĊu imu- nog sistema i endokrinih ćelija adenohipofize (Perez-Castro i sar., 2012). Grupa FS ćelija koje uĉestvuju u obrazovanju folikula delimiĉno sintetiše, a takoĊe i uĉestvuje u apsorpciji folikularnog koloida. Prisustvo PRL i LH u sastavu folikularnog kolo- ida moţe da navede na zakljuĉak da se sekretorne granule gonadotropa i laktotropa osloba- Ċaju usled celularne degradacije i predstavljaju supstrat fagocitne aktivnosti FS ćelija (Console Uvod 19 i sar., 2000; AnĊelković, 2009; Acosta, 2010). Pojedini autori smatraju da ove ćelije pred- stavljaju i stem ćelije prednjeg reţnja adenohipofize (Vankelecom, 2007). Folikulostelatne ćelije ispoljavaju imunoreaktivnost na S100 i glijalni kiseli fibrilarni protein (GFAP), što navodi da one mogu da potiĉu od astrocita ili mikroglije. Ova pretpo- stavka je poduprta i njihovom ulogom u fagocitozi celularnog debrija i apoptotiĉnih telašaca, kao i njihovom potpornom funkcijom sliĉnom istoj funkciji astrocita u mozgu, zatim ulogom u odrţavanju homeostaze, regulaciji transporta vode i zaštiti od mogućih oštećenja nastalih dejstvom generisanih slobodnih radikala (Vankelecom i sar., 1993; Perez-Castro i sar., 2012). Neurohipofiza Zadnji reţanj hipofize, neurohipofiza (neurohypophysis) po svojoj strukturi ne predstavlja pravu endokrinu ţlezdu, već ventralnu ekstruziju CNS-a. Ĉini kaudalnu petinu hipofize i sa- stoji se iz tri dela: nervnog (pars nervosa), peteljke hipofize (infundibulum) i središnjeg uzvišenja (eminentia mediana) (Mills, 2007). Nervni deo (pars nervosa) predstavlja najveći deo neurohipofize sagraĊen uglavnom od pituicita (ćelija sliĉnih glijalnim), snopova (fascikulusa) nemijeliniziranih nervnih vlakana, vezivnog tkiva i krvnih sudova (Mills, 2007; Young i sar., 2007; Eroschenko, 2008; AnĊelko- vić, 2009). Pituiciti predstavljaju najbrojnije ćelije neurohipofize. Morfološki, oni predstavljaju elongirane uni- i bipolarne ćelije, sa ĉije površine polaze jedan ili dva duga i tanka nastavka. Oni ispoljavaju pozitivnu reakciju na GFAP, zatim S-100 i na kraju na vimentin. Njihovi nastavci se, sliĉno glijalnim ćelijama, pruţaju sve do vezivnog tkiva, kao i zidova krvnih su- dova neurohipofize. Postoji pet glavnih formi pituicita: glavna, tamna, ependimalna, onko- citna i granularna. Njihova fiziološka uloga nije u potpunosti rasvetljena (Mills, 2007). Amijelinska nervna vlakna neurohipofize predstavljaju u najvećoj meri aksone neurona ĉija su tela lokalizovana u supraoptiĉkom i paraventrikularnom jedru i, u nešto manjoj meri, holinergiĉkih neurona hipotalamusa. Na ultrastrukturalnom nivou, dijametar ovih amijelin- skih nervnih vlakana se kreće od 0,05 – 1,0 µm i ona sadrţe longitudinalno rasporeĊene sno- pove mikrotubula i neurofilamenata. Opisana su dva tipa neurosekretornih aksona: tip A koji predstavlja brojniji tip vlakana i sadrţi krupnije sekretorne granule promera 100 – 300 nm i tip B, koji je nešto slabije zastupljen i poput aminergiĉkih neurona sadrţi sitnije sekretorne granule promera 50 – 100 nm. Neurosekretorna vlakna su tesno povezana sa pituicitima, koji formiraju njihov omotaĉ (Mills, 2007; Young i sar., 2007; Eroschenko, 2008). Uvod 20 Hormoni oksitocin i arginin – vazopresin izluĉuju se u krvotok preko neurohipofize. Nji- hova sinteza se, meĊutim, vrši u neuronima supraoptiĉkog i paraventrikularnog jedra hipo- talamusa. Oni se zatim, vezani za molekul neurofizina unutar sekretornih granula, transportu- ju amijelinskim aksonima ovih neurona koji obrazuju hipotalamo – hipofizni trakt u neurohi- pofizu. Distalni krajevi aksona ovog puta su distendirani i u njima se napred navedeni hormo- ni akumuliraju, formirajući Herring – ova telašca. Pod uticajem signala poreklom iz hipotala- musa, oksitocin i vazopresin se oslobaĊaju iz Herring – ovih telašaca u male kanale koji na- leţu na abluminalnu površinu bazalne membrane kapilara. Oni dalje iz perivaskularnog pro- stora dospevaju u lumen kapilara preko njihove bazalne membrane i endotela (Mills, 2007; Young i sar., 2007; Eroschenko, 2008). Vaskularizacija hipofize Arterijska vaskularizacija hipofize potiĉe od dve boĉne grane unutrašnje karotidne arterije (a. carotis interna), gornje i donje hipofizne arterije (a. hypophysialis superior et a. hypophy- sialis inferior). Gornja hipofizna arterija se odvaja od stabla unutrašnje karotidne arterije neposredno nakon njenog ulaska u lobanjsku duplju. Ona se nakon kratkog puta deli na prednju i zadnju granu, koje se spajaju sa istoimenim arterijama suprotne strane, formirajući arterijski prsten oko gornjeg dela infundibuluma. Od prednjih grana gornjih hipofiznih arte- rija odvajaju se trabekularne arterije. One najpre imaju descendentan tok pruţajući se preko gornjeg dela prednjeg reţnja. U tom delu svog puta one daju arteriju fibroznog jezgra kao boĉnu granu. Završne grane trabekularnih arterija predstavljaju duge infundibularne arterije. One se pruţaju ascendentno i završavaju u tuberalnom delu prednjeg reţnja. Pored trabeku- larnih, od prednje i zadnje grane gornje hipofizne arterije se u nivou gornjeg dela infundibu- luma odvajaju kratke infundibularne arterije, koje penetriraju u infundibulum i nastavljaju da se pruţaju ascendentno ili descendentno. Završni delovi dugih i kratkih infundibularnih arte- rija formiraju strukture koje se oznaĉavaju kao gomitoli. One se sastoje iz centralne arterije okruţene glomerulolikim strukturama saĉinjenim od kapilara. Vezu izmeĊu arterija i kapilara unutar gomitola predstavljaju specijalizovane arteriole obavijene glatko – mišićnim sfinkteri- ma, koji regulišu protok krvi kroz ove strukture. Kapilari gomitola dreniraju svoju krv u obilnu pampiniformnu vensku mreţu, koja obavija infundibulum i predstavlja deo hipofiznih portnih vena. Donja hipofizna arterija se odvaja od meningohipofiznog stabla unutrašnje ka- rotidne arterije u nivou njenog dela koji se nalazi u kavernoznom sinusu. Ona pristupa infero- lateralnom delu hipofize, nakon ĉega se deli na medijalnu i lateralnu završnu granu. One se spajaju sa istoimenim arterijama suprotne strane formirajući arterijski prsten oko neurohipo- Uvod 21 fize. Ova arterija vaskularizuje uglavnom neurohipofizu i donji deo infundibuluma. Od nje se odvajaju kapsularne grane koje vaskularizuju periferni deo adenohipofize (Mills, 2007). Komunikacija izmeĊu hipotalamusa i hipofize odvija se preko hipotalamo-hipofiznog portnog sistema. Preko njega se vrši distribucija hipofiziotropnih faktora poreklom iz hipota- lamusa do endokrinih ţlezda adenohipofize (Alves i sar., 2002; Perez-Castro i sar., 2012). U eminenciji medijani i infundibulumu grane gornje i donje hipofizne arterije formiraju bogatu mreţu sinusoidnih kapilara, oznaĉenu kao primarni kapilarni pleksus. U njega dospevaju ne- urohormoni hipotalamusa osloboĊeni iz terminalnih delova neurosekretnih vlakana hipotala- mo-infundibularnog trakta. Od primarnog kapilarnog spleta spuštaju se preko prednje strane infundibuluma duge portne vene do distalnog dela adenohipofize, gde njihovim grananjem nastaje sekundarni kapilarni pleksus. Preko njega neurohormoni hipotalamusa difunduju iz krvi ka ţlezdanim ćelijama adenohipofize ĉiju aktivnost kontrolišu. Hormoni adenohipofize difunduju u krvotok preko hipofiznih vena i dalje do subhipofiznog, kavernoznog i gornjeg cirkularnog sinusa. Slabije razvijen kapilarni pleksus grane gornje i donje hipofizne arterije obrazuju u donjem delu infundibuluma. Od njega polaze kratke portne vene koje završavaju u intermedijarnom delu adenohipofize, na granici izmeĊu prednjeg i zadnjeg reţnja. Prema to- me, adenohipofizu krvlju preteţno snabdevaju vene, dok neurohipofizu predominantno arteri- je (Mills, 2007; Young i sar., 2007; Eroschenko, 2008; Standring, 2008; AnĊelković, 2009). Inervacija hipofize Ţivci koji inervišu prednji reţanj hipofize predstavljaju postganglijska vlakna autonom- nog nervnog sistema sa vazomotornom funkcijom. Nervna vlakna koja dospevaju do infundi- buluma i zadnjeg reţnja potiĉu iz hipotalamiĉkih jedara i predstavljaju komponentu zadnjeg reţnja hipofize (Ross i sar., 2003). Nadbubreţna ţlezda Nadbubreţna ţlezda (glandula suprarenalis) je parna ţlezda sa unutrašnjom sekrecijom, lokalizovana izmeĊu superomedijalnog dela bubrega i istostranog stuba preĉage. In vivo je ţućkaste boje. Obavijena je bubreţnom fascijom, kojom je priĉvršćena za odgovarajući mi- šićno-tetivni stub dijafragme. Renalna fascija daje tanak septum koji nadbubreţnu ţlezdu razdvaja od gornjeg pola odgovarajućeg bubrega. Oblik i odnosi desne i leve nadbubreţne ţlezde razlikuju se meĊusobno. Tako, desna nadbubreţna ţlezda se karakteriše piramidalnim oblikom, superiornijim poloţajem u odnosu na istostrani bubreg, dok je leva nadbubreţna Uvod 22 ţlezda polumeseĉastog oblika i nalazi se medijalno u odnosu na gornji deo levog bubrega. Desna nadbubreţna ţlezda se nalazi anterolateralno u odnosu na desni mišićno-tetivni stub dijafragme i odnosi se sa jetrom anterolateralno, a anteromedijalno sa donjom šupljom ve- nom. Leva nadbubreţna ţlezda se napred odnosi sa ţelucem, slezinom, gušteraĉom, a pozadi sa levim mišićno-tetivnim stubom dijafragme. Na prednjoj strani obe nadbubreţne ţlezde uoĉava se hilus preko koga iz ţlezde izlaze vena i limfni sudovi, dok arterije i nervi ulaze u ţlezdu preko više razliĉitih mesta (Moore i sar., 2010). GraĊa nadbubreţne ţlezde Na preseku nadbubreţne ţlezde fiksirane u formalinu uoĉavaju se periferna ţuto prebo- jena zona, zatim braon prebojena zona ispod nje i na kraju sivo prebojena zona u unutrašnjo- sti ţlezde. Histološki, na površini nadbubreţne ţlezde se uoĉava vezivno – tkivna kapsula va- rijabilne debljine, saĉinjena od kolagenih i elastiĉnih vlakana. Kroz nju prolaze krvni sudovi i ţivci koji uĉestvuju u vaskularizaciji i inervaciji ţlezde. Ispod kapsule se nalazi parenhim koji je sistematizovan u periferni deo oznaĉen kao kora (cortex) i središnji deo koji predstavlja srţ nadbubreţne ţlezde (medulla) (Mills, 2007; Standring, 2008). Kora nadbubrežne žlezde Kora nadbubreţne ţlezde (cortex) je tradicionalno sistematizovana u tri zone: zona glo- meruloza (zona glomerulosa) koja produkuje aldosteron (mineralokortikoide), zona fasciku- lata (zona fasciculata) koja produkuje kortizol (glikokortikoide) i zona retikularis (zona reti- cularis) u kojoj se produkuju polni hormoni. Tokom adultnog perioda, dotrajale ćelije kore se zamenjuju novim. Mesto produkcije novih ćelija kore nadbubrega predstavlja zona fasciku- lata. Tako stvorene ćelije kore mogu dalje da se diferenciraju u ćelije zone glomeruloze ili zo- ne retikularis (Mills, 2007). Zona glomeruloza predstavlja najperiferniji deo kore, lokalizovan neposredno ispod kapsule. Njena debljina varira kod razliĉitih individua. Kod pojedinih sluĉajeva, ona se uoĉa- va u vidu jasno diferenciranog kontinuiranog perifernog pojasa, dok se kod drugih ona uoĉa- va u vidu diskontinuiranog subkapsularnog sloja kore. Kod sluĉajeva sa diskontinuiranom ovom zonom kore nadbubreţne ţlezde, na mestima gde ona nedostaje, subkapsularno se na- lazi sledeći sloj kore, tj. zona fascikulata. Ćelije zone glomeruloze poseduju jasne konture i grupisane su u klastere koje okruţuje oskudna fibrovaskularna stroma. One mogu biti još rasporeĊene i tako da formiraju trabekularne formacije saĉinjene od jednog reda ćelija, para- Uvod 23 lelne sa kapsulom nadbubreţne ţlezde. Citoplazma im je najĉešće acidofilna, dok su im jedra okrugla, nešto manja i tamnije prebojena u odnosu na jedra ostaih slojeva kore. Neretko jedra mogu biti elongirana, sa prisutnim longitudinalnim ţlebom. Nukleo – citoplazmatski odnos ćelija ove zone je visok (Rosol i sar., 2001; Mills, 2007). Ultrastrukturalno, citoplazma ćelija zone glomeruloze se karakteriše prisustvom okruglih, ovalnih ili elongiranih mitohondrija, ĉi- ja unutrašnja membrana svojim naborima daje lamelarne kriste koje imaju lestviĉast raspored, sliĉno kao i u drugim tkivima. Pored mitohondrija, u citoplazmi se uoĉava i dobro razvijen Goldţi kompleks (Rosol i sar., 2001). Zona fascikulata ĉini više od polovine ukupne debljine kore nadbubrega i nalazi se izme- Ċu zone glomeruloze, koja se nalazi površnije i zone retikularis, koja se nalazi izmeĊu nje i srţi nadbubreţne ţlezde. Ćelije ovog dela kore su rasporeĊene u gredice, saĉinjene iz dva re- da ćelija i pruţaju se perpendikularno u odnosu na kapsulu. Susedne celularne gredice u ovoj zoni su meĊusobno razdvojene kapilarima. Ćelije su krupne, sa jasno definisanom ćelijskom membranom, svetlom citoplazmom i centralno postavljenim jedrom. Jedro ovih ćelija je svetli- je prebojeno u odnosu na jedra ćelija zone glomeruloze i karakteriše se periferno lokalizova- nim grudvicama hromatina i centralno postavljenim nukleolusom. Citoplazma, naroĉito ćelija spoljašnje dve trećine zone fascikulate, sadrţi veliku koliĉinu lipida (holesterol, masne ki- seline i neutralne masti) koji se tokom histološke obrade tkiva ispiraju, zbog ĉega ćelije na hi- stološkim preparatima poprimaju sunĊerast izgled i svetlije su u odnosu na ćelije preostale dve zone kore. Bogat sadrţaj lipda uzrokuje ţutu prebojenost ove zone na makroskopskim presecima nadbubreţne ţlezde (Rosol i sar., 2001; Mills, 2007). Ultrastrukturalno, ćelije zone fascikulate sadrţe brojne lipidne kapljice u citoplazmi. Dodatno, karakteriše ih prisustvo sfe- riĉnih mitohondrija sa vezikularnim kristama i dobro razvijen glatki endoplazmatski retiku- lum (Rosol i sar., 2001). Zona retikularis se nalazi dublje u odnosu na zonu fascikulatu. Saĉinjena je od ćelija koje su nešto manje u odnosu na fascikulatnu zonu, sa kompaktnom, acidofilnom citoplazmom ko- ja sadrţi malo lipida. Ćelije su rasporeĊene tako da grade gredice saĉinjene od jednog reda ćelija. Gredice su, za razliku od prethodne zone, u zoni retikularis meĊusobno izukrštane i grade sunĊerastu mreţu ĉija okca ispunjavaju dilatirani kapilari. Citoplazma ćelija dubljih slojeva retikularne zone, neposredno do medule nadbubreţne ţlezde, obiĉno sadrţi lipofu- scin. Prisustvo ovog pigmenta uzrokuje braon prebojenost napred navedene zone kore nadbu- brega na makroskopskim presecima nadbubreţne ţlezde (Mills, 2007). Ultrastrukturalno, će- lije zone retikularis poseduju osobine ćelija koje produkuju steroidne hormone. Mitohondrije su elongirane, sa tubularnim ili vezikularnim kristama. U citoplazmi su prisutne lipofuscinske Uvod 24 granule, kao i membranom ograniĉene organele sa umereno kondenzovanim matriksom i pri- sutnim lipidnim globulama u njihovoj unutrašnjosti. Pored napred navedenog, uoĉava se pri- sustvo glikogena, kao i prominentnih lizozoma (Rosol i sar., 2001; Mills, 2007). Srž nadbubrežne žlezde Srţ (medulla) nadbubreţne ţlezde uglavnom luĉi adrenalin i funkcionalno je tesno pove- zana sa simpatiĉkim delom autnomnog nervnog sistema. Preteţno se sastoji iz feohromocita ili hromafinih ćelja. Dodatno u njoj mogu da se uoĉe ostrvca kortikalnih ćelija, zatim pojedinaĉne ili klasteri ganglijskih ćelija, nervna vlakna i fibrovaskularna stroma. Hromafine ćelije su rasporeĊene u vidu klastera ili trabekula koji su okruţeni potpornim ćelijama i fibro- vaskularnom stromom. One predstavljaju krupne poligonalne ili cilindriĉne ćelije, sa cito- plazmom koja je predominantno bazofilna sa prisutnim vakuolama. Jedra ovih ćelija najĉešće su ekscentriĉno lokalizovana, ispoljavaju pleomorfizam (najĉešće su okrugla, ali mogu imati i elipsoidan ili neki drugi oblik), sa periferno lokalizovanim grudvicama hromatina i centralno postavljenim acidofilnim nukleolusom. Ganglijske ćelije srţi nadbubrega su krupne i u po- jedinim sluĉajevima u njihovoj citoplazmi mogu da se uoĉe hijaline inkluzije lamelarne gra- Ċe. Napred navedene strukture se mogu uoĉiti u srţi i izvan citoplazme ganglijskih ćelija. U tom sluĉaju one se nalaze u njihovoj neposrednoj okolini i veoma ĉesto vrše pritisak na njih. Ultrastrukturalno, u srţi se razlikuju dva tipa feohromocita. Prvi tip sadrţi u citoplazmi membranozne granule ĉiji je dijametar u proseku 190 µm i sadrţe adrenalin. Drugi tip sadrţi krupnije granule, proseĉnog promera oko 250 µm, koje su lokalizovane ekscentriĉno unutar vezikularnih membranoznih struktura. One sadrţe noradrenalin (Mills, 2007). Funkcija kore nadbubreţne ţlezde Kora nadbubreţne ţlezde je odgovorna za sintezu steroidnih hormona. Prekursor stero- idnih hormona je holesterol. On moţe da se sintetiše „de novo“ u kortikalnim ćelijama iz ace- tata ili da se resorbuje preko LDL, odnosno reĊe HDL lipoproteina. Prvi steroidni hormon koji se sintetiše iz holesterola je pregnolon. On nastaje u mitohondrijama aktivnošću enzima citohroma P – 450. Ova reakcija se nalazi pod kontrolom ACTH sekretovanog od strane adeno- hipofize i veoma je bitna za ograniĉavanje koliĉine sintetisanih steroidnih hormona. ACTH se vezuje za receptore koji su povezani sa G-proteinom, što dovodi do porasta citoplazmatskog cAMP-a i sinteze pregnolona. Nakon toga, u mitohondrijama i naroĉito glatkom endopla- zmatskom retikulumu, aktivnošću enzima hidrolaza iz pregnolona se sintetiše kortizol, glavni Uvod 25 glikokortikoid kod ĉoveka. Kod ĉoveka, iz pregnolona se u ćelijama zone retikularis sintetišu androgeni hormoni, koji dalje mogu da se od strane samih kortikalnih ćelija ili u gonadama metabolišu u testosteron kod muškog, odnosno estrogen, kod ţenskog pola. Ćelije zone glo- meruloze sintetišu aldosteron. Njegovu produkciju stimulišu angiotenzin II i joni K+. Naime, hormon prekursor angiotenzina II, angiotenzinogen, se produkuje u jetri i pod uticajem renina produkovanog u jukstaglomerularnom aparatu bubrega se konvertuje u angiotenzin I. Angi- otenzin I zatim pod uticajem angiotenzin-konvertujućeg enzima (ACE) daje angiotenzin II. Angiotenzin II zatim stimuliše produkciju aldosterona koji deluje na nivou bubreţnih tubula dovodeći do resorpcije vode i jona Na+, a ekskrecije jona K+. Kortikalne ćelije ne poseduju strukture u kojima bi se deponovali sintetisani steroidni hormoni. Zbog toga je njihova sinte- za neposredno praćena njihovom sekrecijom u krvotok. U krvi oni se vezuju za transportni protein transkortin koji produţava njihov ţivotni vek i povećava rastvorljivost. Slobodni mo- lekuli steroidnih hormona u plazmi se ili vezuju za ciljne ćelije i ostvaruju svoje metaboliĉke efekte, ili se transformišu u inaktivne metabolite u jetri procesima konjugacije ili hidroksila- cije (Rosol i sar., 2001). Vaskularizacija nadbubreţne ţlezde Arterijska vaskularizacija nadbubreţne ţlezde potiĉe od gornje, srednje i donje nadbu- breţne arterije (a. suprarenalis superior, a. suprarenalis media et a. suprarenalis inferior), boĉnih grana donje preĉaţne arterije (a. phrenica inferior), trbušne aorte (aorta abdominalis) i bubreţne arterije (a. renalis). Ova tri krvna suda se dele na 50 – 60 manjih grana koje preko prednje i zadnje strane ţlezde probijaju kapsulu i daju neposredno ispod nje subkapsularni pleksus. Od ovog plekusa pruţaju se izmeĊu kolumni ćelija zone fascikulate sinusoidni kapi- lari koji završavaju u zoni retikularis. U njoj se nalazi sekundarni vaskularni pleksus, koji se drenira u sinusoide srţi nadbubreţne ţlezde. Sinusoidi srţi nadbubreţne ţlezde se preko vena koje u svom zidu imaju dobro razvijen glatko-mišićni sloj dreniraju u centralnu nadbubreţnu venu. Ona izlazi iz nadbubrega preko njegove prednje strane i uliva se u istostranu bubreţnu venu na levoj i donju šuplju venu, na desnoj strani. Prema tome, kora nadbubreţne ţlezde je vaskularizovana preteţno arterijama, a srţ venama (Mills, 2007; Standring, 2008). Inervacija nadbubreţne ţlezde Kora nadbubreţne ţlezde ne poseduje inervaciju, dok je srţ inervisana preganglijskim i postganglijskim simpatiĉkim vlaknima solarnog spleta (plexus coeliacus), koja potiĉu od Uvod 26 velikog splanhniĉkog ţivca (n. splanchnicus major), donjih grudnih i lumbalnih splanhniĉkih ţivaca (nn. splnachnici lumbales) gornjih slabinskih gangliona simpatiĉkog stabla (Mills, 2007; Standring, 2008). FUNKCIJA HIPOTALAMO-PITUITARNO-ADRENALNE OSOVINE Komponente HPA osovine funkcionišu po principu hijerarhijski integrisanog sistema. Uloga corpus amygdaloideum-a u stresnim i anksioznim situacijama koje prati aktivacija HPA sistema je pouzdano dokazana. On predstavlja deo ekstrahipotalamiĉnog CRH sistema koji posreduje u bihejvioralnoj ekspresiji napred navedenih stanja. Nasuprot paraventrikular- nom jedru hipotalamusa, glikokortikoidi u njemu pojaĉavaju ekspresiju CRH po principu po- zitivne povratne sprege, što je praćeno poslediĉnom dezinhibicijom HPA osovine (De Kloet i sar., 1998). U tom sluĉaju, neuroendokrine ćelije paraventrikularnog jedra hipotalamusa se- kretuju CRH i njegove sekretagoge, arginin-vazopresin i oksitocin. Porast sekrecije CRH i arginin-vazopresina naroĉito, ispoljavaju sinergistiĉki efekat na kortikotropne ćelije adenohi- pofize i vode ka njihovoj aktivaciji i poslediĉnoj sekreciji ACTH. OsloboĊeni ACTH putem cirkulacije dospeva do ćelija zone fascikulate kore nadbubrega i stimuliše sekreciju glikokor- tikoida tj. kortizola, od strane ovih ćelija (Vedder, 2007). Kortizol putem krvi dospeva do svih tkiva i ćelija ljudskog organizma i ostvaruje metaboliĉke efekte koji mu omogućavaju da se kao celina uspešno adaptira na prisustvo inicijalnog faktora, koji je konaĉno i doveo do aktivacije ĉitavog sistema. Deo kortizola dospeva putem cirkulacije do mozga. U njemu on deluje na strukture ĉije ćelije poseduju mineralokortikoidne (tip I) i glikokortkoidne receptore (tip II). Pored neurosekretornih ćelija paraventrikularnog jedra hipotalamusa i kortikotropnih ćelija adenohipofize, ove receptore poseduju i neuroni medijalnog prefrontalnog korteksa i naroĉito piramidalni neuroni hipokampusa. Mineralokortikoidni receptori poseduju pet puta veći afinitet za vezivanje kortizola u odnosu na isti glikokortikoidnih receptora. Glikokortiko- idi vezivanjem za ove receptore napred navedenih struktura inhibišu dalju sintezu CRH, a sa- mim tim ACTH i na kraju kortizola mehanizmom negativne povratne sprege. Prema tome, za razliku od corpus amygdaloideum-a hipokampus deluje inhibitorno na aktivnost HPA oso- vine. U bazalnom stanju, kada je aktivnost organizma niska (kod ĉoveka tokom spavanja), kortizol, ĉiji su nivoi u krvi tada niski, vezuje se predominantno za mineralokortikoidne re- ceptore i takav mod regulacije aktivnosti HPA osovine se oznaĉava kao „proaktivni“. Tokom dana, aktivnost organizma u celini, a samim tim i nivoa kortizola u krvi rastu. U tom periodu, aktivnost HPA osovine se reguliše vezivanjem kortizola i za mineralokortikoidne i glikokor- Uvod 27 tikoidne receptore, što se oznaĉava kao „reaktivni“ mod (De Kloet i sar., 1998; Turnbull i Rivier, 1999; Keenan i sar., 2001). Aktivacija HPA osovine dovodi do mobilizacije zaliha energije i podešavanja kardiovaskularnog tonusa, što ima za cilj da olakša kognitivnu i fi- ziĉku adaptaciju organizma na stres i predstavlja krucijalni momenat za preţivljavanje je- dinke (Seeman i Robbins, 1994). Mehanizam negativne povratne sprege ima ulogu da po pre- stanku dejstva inicijalnog stresora vrati nivoe osloboĊenih hormona na bazalne vrednosti i odrţava ih relativno konstantnim (Guyton i Hall, 2008). STARENJE I HIPOTALAMO-PITUITARNO-ADRENALNA OSOVINA Starenje predstavlja proces koji je praćen hroniĉnim izlaganjem razliĉitim oblicima stresa, što je praćeno dugoroĉnom aktivacijom HPA osovine (Seeman i Robbins, 1994). To- kom njega, i pored oĉuvanja bazalne endokrino-metaboliĉke funkcije, ipak dolazi do sma- njenja kapaciteta za oĉuvanje homeostaze u odgovoru na stresore (Cizza i sar., 1994). Stare- njem izazvane promene u sekreciji glikokortikoida mogu se uoĉiti na više nivoa HPA oso- vine. Centralnu kontrolu aktivnosti HPA osovine obavljaju najvećim delom neuroni PVN-a. Oni pokazuju brojne starenjem izazvane funkcionalne promene koje, na kraju, mogu biti odgovorne za alterisanu glukokortikoidnu sekreciju. Naime, sinteza i sekrecija CRH opadaju, dok je sekrecija ACTH povećana, što prema pojedinim autorima (Herman i sar., 2001) ukazu- je na povećanu osetljivost adenohipofize na CRH tokom starenja. TakoĊe, javlja se hipersen- zitivnost adrenalnog korteksa na ACTH kao i nemogućnost brzog prekida sekrecije glikokor- tikoida stimulisane dejstvom akutnih stresora. Kao posledica svega napred navedenog, odno- sno odgovora na hroniĉnu stimulaciju, nastaje hipertrofija zone fascikulate i zone retikularis nadbubreţne ţlezde (Hauger i sar., 1994). Cizza i sar. (1994) su kod eksperimentalnih ţivotinja uoĉili da tokom starenja jutarnji ni- voi bazalnog kortikosterona rastu, dok nakon stresa njegova koncentracija u plazmi usporeno pada. Seeman i Robbins (1994) navode da se kontrola aktivnosti HPA osovine primarno vrši na nivou hipokampusa preko mineralokortikoidnih i glikokortikoidnih receptora koji su prisutni na njegovim nervnim ćelijama. On, kao što je to već napred opisano, ima glavnu inhibitornu ulogu kada je u pitanju aktivnost HPA osovine (Smith i sar., 2005). MeĊutim, postoje i stavo- vi da se modifikacija aktivnosti HPA osovine moţe vršiti i na nivou adenohipofize (Seeman i Robbins, 1994). Prema Turnbull i Rivier-u (1999) citokini kao što su IL-1α, IL-1ß, IL-6, IL-8 i TNF-α mogu da stimulišu sekreciju ACTH delovanjem kako na same kortikotropne ćelije, Uvod 28 tako i dejstvom na FS ćelije koje pod njihovim uticajem oslobaĊaju u adenohipofizu produkte svoje parakrine aktivnosti. Efekat tih molekula na kortikotropne ćelije ĉoveka nije u potpu- nosti razjašnjen. Ipak, rezultati studija sprovedenih na eksperimentalnim ţivotinjama ukazuju da produkti parakrine aktivnosti FS ćelija predominantno ispoljavaju stimulatorni efekat na kortikotropne ćelije, stimulišu oslobaĊanje ACTH i na kraju sekreciju kortizola od strane ćelija zone fascikulate kore nadbubrega (Johnson i sar., 1990; Schwartz, 2000; Bilezikjian i sar., 2003; Herkenham, 2005; Gerez i sar., 2007). Hauger i sar. (1994), Seeman i Robbins (1994) i Goncharova i Lapin (2002) smatraju da sa starenjem dolazi do disregulacije funkcije HPA osovine koja se karakteriše slabljenjem procesa negativne povratne sprege, što na kraju rezultira hroniĉnim povišenjem nivoa korti- zola u krvi zdravih starih individua. Ferrari i sar. (2001) smatraju da je poremećaj negativne povratne sprege u okviru HPA osovine tokom fiziološkog starenja u osnovi posledica pore- mećaja na nivou hipokampusa. Naime, pojaĉano prisustvo stresa tokom starenja i poslediĉno dugotrajno povišenje nivoa kortizola u krvi rezultira slabljenjem negativne povratne sprege HPA osovine bilo preko pada broja glikokortikoidnih receptora na hipokampalnim neuroni- ma, ili pada broja hipokampalnih neurona uopšte, što moţe biti posledica neurotoksiĉnog efekta povišenih nivoa glikokortikoida u krvi. Sve to ima za posledicu slabljenje inhibitornog efekta glikokortikoida na sekreciju CRF-a, a samim tim i ACTH. Gust i sar. (2000) smatraju da napred navedene promene smanjuju osetljivost HPA osovine, tj. njenu sposobnost da od- govori na stres, što na kraju vodi ka poravnanju cirkadijalnog ritma kortizola (Gust i sar., 2000). Smith i sar. (2005) navode da izmenjeni odgovor na stres tokom starenja moţe biti po- sledica ne samo navedenih promena u broju glikokortikoidnih receptora u hipokampusu, već i posledica vaskularnih promena koje rezultiraju smanjenim dotokom glikokortikoida do mozga, kao i oštećenim signalnim transdukcionim putanjama. Promene aktivnosti HPA oso- vine koje se javljaju tokom starenja, dovode po principu pozitivne povratne sprege do daljih strukturalnih i funkcionalnih oštećenja na nivou hipokampusa (gubitak piramidalnih neuro- na), kako tokom fiziološkog starenja, tako i tokom Alchajmerove demencije. Zato, korigo- vanje osetljivosti HPA osovine moţe biti deo terapije koja će odloţiti ili usporiti progresiju starenjem i / ili Alchajmerovom bolešću izazvanog gubitka memorije (Raskind i sar., 1994). Adekvatna aktivacija HPA osovine kao odgovor na izazov (stres) je bitna, jer hipo- i hiperaktivacija mogu biti štetne. Podjednako je bitna i adekvatna deaktivacija HPA osovine nakon stresa. Produţeno izlaganje organizma neuralnim, imunološkim i endokrinim medija- torima stresa moţe izazvati razne patofiziološke konsekvence (Traustadóttir i sar., 2004; Ferrari i sar., 2001). Smanjenje kapaciteta za kompenzaciju promena u aktivnosti HPA osovi- Uvod 29 ne vodi poremećaju hormonske kontrole glavnih telesnih funkcija i moţe igrati veoma vaţnu ulogu u pojavi bolesti izazvanih poremećajem u regulaciji glikokortikoida u relativno ranom ţivotnom dobu. Ove bolesti mogu biti praćene strukturalnim, metaboliĉkim i kognitivnim oštećenjima (Herman i sar., 2001; Goncharova i Lapin, 2001). Povišeno prisustvo stresora tokom starenja je prema Bruunsgaard-u i sar. (2001) praćeno prisustvom hroniĉnog inflamatornog procesa niskog intenziteta i povišenim nivoima proinfla- matornih molekula kao što su TNF-α, IL-6, IL-1Ra, sTNFR, proteina akutne faze kao što su CRP i serum amiloid A, pa i porastom broja neutrofila u krvi zdravih starih individua. Kao što je napred navedeno, mnogi od ovih citokina ostvaruju svoj uticaj na funkciju HPA osovi- ne tako što dovode do aktivacije fibroblasta koji u tom pobuĊenom stanju i sami predstavljaju izvor citokina (Wolf i sar., 2012), zatim FS ćelija koje tada pojaĉano luĉe parakrine faktore i, na kraju, kortikotropnih ćelija adenohipofize. Sve napred navedeno vodi na kraju ka pojaĉa- noj produkciji i i sekreciji ACTH (Turnbull i Rivier, 1999). 30 CILJ ISTRAŢIVANJA S obzirom da su se dosadašnja istraţivanja starosnih promena HPA osovine preteţno fokusirala na njihov funkcionalni aspekt, cilj našeg istraţivanja je bio:  Da se primenom HE bojenja detektuje prisustvo i distribucija acidofilnih, bazofilnih i hromofobnih ćelija adenohipofize sluĉajeva razliĉite starosti i pola.  Da se denzitometrijskom analizom, merenjem proseĉne, integralne i medijanske optiĉke gustine kvantifikuju promene celularnog sastava adenohipofize tokom procesa starenja.  Da se histohemijskom analizom, primenom Mallory trihromnog bojenja, detektuje prisustvo i distribucija krvnih sudova u adenohipofizi.  Da se primenom stereološkog metoda, odreĊivanjem zapreminske, površinske i du- ţinske gustine krvnih sudova kvantifikuje kako njihovo prisustvo, tako i njihova ve- liĉina u adenohipofizi tokom procesa starenja.  Da se histohemijskom analizom, primenom Mallory trihromnog bojenja, detektuje prisustvo i distribucija vezivnog tkiva u adenohipofizi.  Da se stereološkim metodom, merenjem zapreminske gustine vezivnog tkiva kvantifi- kuje dinamika njegovog prisustva u adenohipofizi tokom procesa starenja.  Da se astereološkim metodom, merenjem aree, perimetra i oblikovnog faktora kvanti- fikuju promene veliĉine i oblika ćelija adenohipofize kod sluĉajeva razliĉite starosti i pola.  Da se imunohistohemijskom analizom, primenom monoklonalnog antitela za kolagen tipa IV detektuje prisustvo kolagena tipa IV u adenohipofizi sluĉajeva razliĉite starosti.  Da se stereološkom metodom, na presecima bojenim imunohistohemijskim metodom i odogovarajućim monoklonalnim antitelom, merenjem zapreminske gustine kolagena tipa IV kvantifikuje dinamika njegovog prisustva u adenohipofizi tokom procesa starenja.  Da se imunohistohemijskom analizom i primenom monoklonalnog antitela za ACTH detektuje prisustvo, morfološke karakteristike i distribucija adrenokortikotropnih ćeli- ja u adenohipofizi tokom procesa starenja.  Da se stereološkom metodom, na presecima bojenim imunohistohemijskim metodom i odogovarajućim monoklonalnim antitelom, merenjem zapreminske gustine ACTH ćelija kod sluĉajeva razliĉite starosti kvantifikuje dinamika njihovog prisustva tokom procesa starenja. Cilj istraživanja 31  Da se imunohistohemijskom analizom, primenom poliklonalnog antitela za S-100 protein detektuje prisustvo, morfološke karakteristike i distribucija folikulostelatnih ćelija adenohipofiza sluĉajeva razliĉitog pola i starosti.  Da se stereološkim metodom, na presecima bojenim imunohistohemijskim metodom i odogovarajućim poliklonalnim antitelom, merenjem zapreminske gustine S-100 pozi- tivnih zona kvantifikuje prisustvo folikulostelatnih ćelija u adenohipofizi tokom pro- cesa starenja. 32 MATERIJAL I METODE MATERIJAL Kao materijal korišćeno je tkivo hipofize 29 kadavera oba pola (15 muškog i 14 ţenskog), starosti od 33 do 95 godina, koje je dobijeno sa autopsija izvedenih na Institutu za sudsku medicinu Medicinskog fakulteta u Nišu. Tkivo hipofize koje je korišćeno tokom istra- ţivanja poticalo je od kadavera kod kojih je, na osnovu rezultata autopsije utvrĊeno da uzrok smrti ne predstavlja oboljenje ili povreda mozga i na osnovu dostupne medicinske doku- mentacije i heteroanamnestiĉkih podataka potvrĊeno da za ţivota nije dijagnostikovano obo- ljenje mozga ili endokrinog sistema, odnosno bilo koji drugi poremećaj sistemskog karaktera. Vremenski period od trenutka smrti do uzimanja uzorka nije bio duţi od 12 h. METODE Na kadaveriĉnom materijalu je metodom disekcije nakon otklanjanja duralne dijafragme (diaphragma sellae) i presecanja drške (infundibulum) iz turskog sedla (sella turcica) uzimana hipofiza. Tkivo hipofize je zatim fiksirano u puferisanom 10% formalinu ne duţe od 24h. Na- kon toga, u nivou središnjeg dela sa maksimalnom vrednošću njenog dijametra pravljen je hori- zontalni presek debljine do 5 mm koji je zatim kalupljen u parafinu. Pomoću mikrotoma dobi- jeni preseci tkiva hipofize debljine do 5 µm su dalje obraĊivani klasiĉnim histološkim metodom i bojeni HE i Mallory trihromnim bojenjem. Dodatno, histološki preseci 15 od svih 29 analizi- ranih sluĉajeva su bojeni imunohistohemijskom metodom (streptavidin biotin imunoperoksida- za kit), monoklonalnim mišjim antitelom za kolagen tipa IV, zatim poliklonalnim zeĉijim anti- telom za S-100 protein i monoklonalnim mišjim antitelom za ACTH u cilju detekcije i kasnije kvantifikacije prisustva napred navedenog tipa kolagena, FS ćelija i kortikotropnih ćelija. Bojenje monoklonalnim mišjim antitelom za kolagen tipa IV i poliklonalnim zečijim antitelom za S-100 protein Tkivni preseci debljine 3 m montirani su na predmetna stakla, a zatim sušeni jedan sat na 60C u termostatu. Nakon toga vršena je njihova deparafinizacija i hidratacija sukcesivnim pro- voĊenjem kroz rastvor ksilola (25min) i rastvore etanola sa opadajućim koncentracijama (100%  22min, 96%  2min i 70%  2min) sve do destilovane vode. U sledećoj fazi vršeno je Materijal i metode 33 demaskiranje antigena. Kada je u pitanju kolagen tipa IV (Novocastra, UK) demaskiranje je vr- šeno u mikrotalasnoj pećnici, na visokoj temperaturi i 780W tokom 20 min., u 0,01M citratnom puferu (pH 6). Priprema za primenu antitela za S-100 protein (DAKO, Denmark) je podrazume- vala proteolitiĉku digestiju proteinazom K 10 minuta na sobnoj temperaturi. U daljem postupku vršena je blokada endogene peroksidaze tako što su pripremljeni preseci ispirani destilovanom vodom, inkubirani u 3% rasvoru H2O2 10 minuta na sobnoj temperaturi, zatim je vršeno njihovo ispiranje u destilovanoj vodi 5 minuta i na kraju u 0,1M PBS-u (fosfatni pufer) na pH 7,2. Inkubacija primarnim, monoklonalnim antitelom na kolagen tipa IV (Mouse monoclonal Collagen IV, Clone PHM-12; 1:100) i poliklonalnim antitelom na S-100 protein (Polyclonal rabbit anti-cow S-100, 1:400) vršena je 30 minuta na sobnoj temperaturi u vlaţnoj komori. Potom je vršeno ispiranje preseka u PBS-u 33 minuta, zatim njihova inkubacija sa biotinizi- ranim anti-mišijim, kada je u pitanju kolagen tipa IV i anti-zeĉijim, kada je u pitanju S100 protein, sekundarnim antitelom, 30 minuta na sobnoj temperaturi u vlaţnoj komori (Novo- castra Biotynulated Secondary Antibody, Novocastra Peroxidase Detection System, Novo- castra, UK) i na kraju je ponovljeno ispiranje u PBS-u 33 minuta. Nakon toga preseci su 30 minuta na sobnoj temperaturi u vlaţnoj komori inkubirani sa streptavidinskim konjugatom na peroksidazu rena (Streptavidin HRP, Novocastra Peroxidase Detection System, Novocastra, UK), a zatim ispirani u PBS-u 33 minuta. Sledeća faza je obuhvatala inkubaciju preseka u rastvoru supstrat-hromogena (H2O2 i 3- amino-9-etil-karbazol u N,N-dimetilformamidu; AEC+ Substrat-Hromogen ili 3,3-diamino benzidin – DAB), 3-5 minuta na sobnoj temperaturi. Ispiranje tako obraĊenih preseka je vršeno tekućom vodom, a kontrastno bojenje Mayer-ovim hematoksilinom trajalo je jedan minut, na- kon ĉega su preseci dodatno isprani tekućom vodom. Njihova dalja dehidracija vršena je etano- lom rastućih koncentracija (70%, 96% i 100%), nakon ĉega su potapani u ksilol i pokrivani odgovarajućom sintetskom smolom (dpx) i pokrovnim staklom. Ukoliko je kao hromogen ko- rišćen AEC+, obojeni preseci su bez dehidracije tkiva prepokrivani vodenim medijumom i po- krovnim staklom. Pozitivna reakcija i prisustvo ispitivanih antigena su se manifestovali kao braon ili crveno obojeni precipitati hromogena (u zavisnosti od vrste hromogen supstrata) na mestima njihovog prisustva, za razliku od okolnog tkiva koje je bilo sa negativnom reakcijom i plavo prebojeno. Kao pozitivna kontrola u toku imunohistohemijskog bojenja korišćeni su uzorci tkiva za koje je prethodno potvrĊeno da sadrţe ispitivane antigene koje je moguće vizuelizovati metodom primenjenom tokom sprovedenog istraţivanja. Negativnu kontrolu predstavljali su tkivni uzorci na koje je umesto primarnih antitela aplikovan neimuni serum. Materijal i metode 34 Bojenje monoklonalnim mišjim antitelom za ACTH (klon 02A3) Imunohistohemijska analiza ACTH vršena je peroksidaza-antiperoksidaza (PAP) meto- dom (Sternberger i sar, 1970). Tkivni preseci debljine 5 µm su najpre inkubirani u 0.3% rastvoru vodonik peroksida u metanolu tokom 15 min. na sobnoj temperaturi u cilju blokiranja aktivnosti endogene pero- ksidaze, a zatim je vršeno njihovo ispiranje u fosfatnom puferu (PBS) na pH 7,4 5 min. na sobnoj temperaturi. Nakon toga usledila je inkubacija u razblaţenom normalnom svinjskom serumu (NOS) 1:10 u PBS-u tokom 45 min. na sobnoj temperaturi kako bi se neutralisao efe- kat nespecifiĉnog bojenja pozadine. Tako tretirani tkivni preseci adenohipofize su zatim mo- difikovanom metodom prema Milošević i sar. (1994) inkubirani u primarnom antipacovskom ACTH antitelu (NIDDK, USA; 1:1000) tokom 24 h na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije u primarnom antitelu, obavljano je njihovo ispiranje u PBS-u 5 min. i inkubacija u sekundar- nom antitelu (svinja-antizec IgG; Dakopatts, Danska; 1:500) 45 min. na sobnoj temperaturi i zatim ponovo ispiranje u PBS – u 5 min. Inkubacija u PAP sistemu (Dakopatts, Danska; 1:100) je vršena tokom 45 min. na sobnoj temperaturi, nakon ĉega su preseci ponovo ispirani u PBS-u 5 min. Dalje obrada je obuhvatala njihovo inkubiranje u hromogenskom supstratu (DAB; Serva, Germany) rastvorenom u 0.3% vodonik peroksidu u TRIS-HCl puferu (pH 7,4) 5 min. na sobnoj temperaturi. Kontrastno bojenje je obavljeno Mayer-ovim hematoksilinom, na- knadna dehidratacija serijom rastvora etanola sa rastućim koncentracijama i na kraju je usledilo montiranje Canada balzamom (Merck−Alkaloid, Alkaloid, Skoplje, BJR Makedonija). Pozitivna kontrola bojenja ovim antitelom je vršena tako što su preseci tkiva prolazili kroz kompletnu proceduru imunohistohemijskog bojenja osim inkubacije u rastvoru primar- nog antitela. Morfološka analiza Histološka analiza obojenih preseka vršena je pomoću svetlosnog mikroskopa Olympus CHK2. Ona se je sastojala iz histohemijskog i imunohistohemijskog dela. Tokom histohemij- ske analize, pod uvećanjima mikroskopa 40, 100 i 400, na preparatima bojenim HE meto- dom analizirani su oblik, veliĉina, zastupljenost i distribucija acidofila, bazofila i hromofobnih ćelija, dok su na preparatima bojenim Mallory trihromnim bojenjem analizirani prisustvo i di- stribucija vezivnog tkiva, kao i prisustvo, distribucija i tip krvnih sudova adenohipofize sluĉa- jeva razliĉite starosti. Tokom imunohistohemijskog dela morfološke analize, pod uvećanjem 400, na preparatima bojenim monoklonalnim antitelom na kolagen tipa IV, kao i monoklonal- Materijal i metode 35 nim antitelom na ACTH ispitivani su zastupljenost i distribucija kolagena tipa IV i kortiko- tropnih ćelija adenohipofize tokom procesa starenja. Na preparatima bojenim poliklonalnim antitelom na S-100 protein, pod uvećanjem mikroskopa 1000, ispitivani su zastupljenost i di- stribucija folikulostelatnih ćelija adenohipofiza analiziranih sluĉajeva. Preparati su zatim foto- grafisani digitalnom kamerom priĉvršćenom za okular mikroskopa, rezolucije 1.3 megapiksela. Morfometrijska analiza Morfometrijska analiza vršena je pomoću specijalnog alata programa Adobe Photoshop CS5 za analizu i procesiranje digitalne slike Fovea Pro 4.0 (http://reindeergraphics.com/). Spacijalna kalibracija sistema je vršena pomoću objektnog mikrometra (1:100). Na digitalnim slikama objektnog mikrometra pod odgovarajućim uvećanjem i pri odgovarajućoj rezoluciji slike preko opcije Filter → IP*Measure Global → Calibrate Magnification selektovana je di- stanca od 10 µm na osnovu koje je program izraĉunavao broj piksela/µm (Slika 1). Slika 1. Spacijalna kalibracija softvera pomoću objektnog mikrometra (1:100) pri odgovarajućem uvećanju mikroskopa. Materijal i metode 36 Kalibracija optiĉke gustine je vršena pomoću crno – belih („grayscale“) fotografija oda- branih vidnih polja histoloških preseka bojenih HE metodom. U te svrhe korišćen je kao kanal sa najboljim kontrastom ispitivanih faza crveni kanal 24 bitne RGB kolor fotografije odabranog vidnog polja histološkog preseka (Slika 2A i 2B). U prvom koraku je pomoću pravougaone selekcije selektovana najtamnije prebojena zona datog vidnog polja, nakon ĉega je opcijom IP*Measure Global → Brightness meren nivo sive prebojenosti regiona od interesa (Slika 2C). Tako formirana nepromenjena selekcija je zatim premeštana pomoću kursora do najsvetlije pre- bojene zone preseka, pri ĉemu bi na isti naĉin kao i u prethodnom koraku bio meren nivo sive prebojenosti i ove zone. U sledećem koraku je preko opcije IP*Measure Global → Calibrate Density vršena aktivacija dijaloga za kalibraciju optiĉke gustine u kome su izmerene vrednosti nivoa sivog za najtamniju i najsvetliju zonu crvenog kanala digitalne slike ispitivanog vidnog polja ukucavane u koloni Pixel Value, dok su u koloni Density Val ukucavane odgovarajuće vrednosti optiĉke gustine, i to 0 za najsvetliju, odnosno 2.6 za najtamniju taĉku datog histološkog Slika 2. Kalibracija optiĉke gustine Fovea Pro 4.0 sistema za analizu i procesiranje digitalne slike; A – 24 bitna RGB kolor fotografija odabranog vidnog polja histološkog preseka bojenog HE metodom; B – Crno bela fotografija („grayscale“) crvenog kanala istog vidnog polja histološkog preseka; C – Proces merenja sive prebojenosti najtamnije zone crvenog kanala datog vidnog polja; D – Logaritamska kalibraciona kriva dobijena procesom interpolacije pomoću vrednosti sive prebojenosti najtamnije i najsvetlije taĉke crvenog kanala datog vidnog polja. Materijal i metode 37 preseka (Slika 2D), prema uputstvu datom na sajtu ImageJ softvera za analizu i procesiranje digitalne slike (http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/examples/calibration/index.html). Kao krajnji re- zultat, procesom interpolacije dobijana je logaritamska kalibraciona kriva. Ĉitav proces kalibra- cije je vršen zasebno za svako od ispitivanih vidnih polja. Kao i morfološka, i morfometrijska analiza je raĊena na preparatima bojenim histohe- mijskim i imunohistohemijskim bojenjem. Morfometrijska analiza histohemijski obraĊenih preparata je obuhvatala merenje astereoloških parametara ćelija adenohipofize, kao i stere- oloških parametara vezivnog tkiva i uoĉenih krvnih sudova u adenohipofizi. Morfometrijska analiza histohemijski obraĊenih preparata Morfometrijska analiza ćelija adenohipofize Morfometrijska analiza ćelija adenohipofize obuhvatala je analizu veliĉine i oblika. Na presecima bojenim HE metodom i slikanim pod povećanjem 400, metodom sluĉajnog izbora je odabrano 40 vidnih polja adenohipofize po jednom sluĉaju. Na svakom od analiziranih vidnih polja je istom metodom, pomoću alatke Magnetic lasso selektovano po 10 ţlezdanih ćelija, odnosno ukupno 400 ćelija po jednom sluĉaju. Korišćenjem opcija IP*Measure features → Measure regions merena je area (AAH), perimetar (BAH) i oblikovni faktor (OF) odabranih ćelija adenohipofize. Dobijene vrednosti su korišćene za izraĉunavanje proseĉnih vrednosti merenih parametara za svaki analizirani sluĉaj. Dodatno, svakom od napred navedenih vidnih polja bila je merena proseĉna (MOD), zatim integralna (IOD) i medijanska (MdOD) optiĉka gustina u cilju ispitivanja moguće promene celularnog sastava adenohipofiza ispitivanih sluĉajeva. Morfometrijska analiza vezivnog tkiva adenohipofize Digitalne slike preseka bojenih Mallory trihromnim bojenjem slikane su pod povećanjem 400 i u daljem postupku korišćene za merenje stereoloških parametara vezivnog tkiva i krvnih sudova adenohipofize. Metodom sluĉajnog izbora, odabrano je 40 vidnih polja po jednom sluĉaju. Preko digitalnih slika napred navedenih vidnih polja superponiran je prost linijski mreţni sistem generisan od strane softvera korišćenjem opcija IP*Lines and points → Line greeds → Square line greed. Broj taĉaka testnog sistema je iznosio Pt=108, površina At=31950,72 µm 2 , površina koja pripada jednoj taĉki testnog sistema a=295, 84 µm2, dok je rastojanje izmeĊu dve taĉke testnog sistema iznosilo d=17,20 µm. Pomoću alatke Count Tool Adobe Photoshop CS5 Materijal i metode 38 Analyze menija brojane su taĉke koje su pogaĊale zeleno prebojene zone sa prisutnim vezivnim tkivom (Slika 3). Taĉke koje su pogaĊale vezivno tkivo adenohipofize, a nalazile su se na preseku horizontalnih linija i desne i vertikalnih linija i donje ivice testnog sistema nisu uzimane u obzir prilikom merenja. Zapreminska gustina vezivnog tkiva (VVT) je izraĉu- navana kao koliĉnik broja taĉaka koje su pogaĊale vezivno tkivo (PVT) na datom vidnom po- lju i ukupnog broja taĉaka testnog sistema (PT) (VVT = PVT / PT) (Kališnik, 1985; Russ, 2004). Iz dobijenih vrednosti zapreminske gustine svih analiziranih vidnih polja izraĉunavana je proseĉna vrednost zapreminske gustine svakog sluĉaja koja je izraţavana u procentima. Morfometrijska analiza krvnih sudova adenohipofize Digitalne slike 40 vidnih polja svakog od ispitanih sluĉajeva korišćene za kvantifikaciju kolagena tipa IV korišćene su istovremeno i za analizu krvnih sudova adenohipofize tokom procesa starenja. Na svakom od analiziranih vidnih polja alatkom Polygonal Lasso selektovani su svi krvni sudovi ĉiji su se profili, ĉitavom svojom areom, nalazili unutar testne površine (Slika 3). Korišćenjem opcije programa IP*Measure features → Measure regions mereni su area i perimetar selektovanih krvnih sudova, da bi zatim pomoću metoda Manoonkitiwongsa i sar. (2001) izraĉunavana zapreminska (VVKS), površinska (SVKS) i duţinska gustina (LVKS) uoĉenih krvnih sudova adenohipofize sluĉajeva razliĉite starosti. Zapreminska gustina krvnih sudova svakog ispitanog sluĉaja je, prema napred navedenom metodu (Manoonkitiwongsa i sar., 2001), dobijana kao koliĉnik ukupne aree svih krvnih sudova (∑AKS) uoĉenih na 40 analiziranih vidnih polja i ukupne testne površine (∑AT) napred navedenih vidnih polja (VVKS = AKS / AT, gde AKS predstavlja areu uoĉenih krvnih sudova). Površinska gustina je dobijana pomoću sledeće formule: SVKS = (4/)  (BKS / AT), pri ĉemu ∑BKS predstavlja ukupan perimetar svih uoĉenih krvnih sudova na 40 analiziranih vidnih polja jednog sluĉaja, a ∑AT predstavlja ukupnu testnu površinu napred navedenih vidnih polja. Konaĉno, duţinska gustina krvnih sudova adenohipofiza ispitanih sluĉajeva je izraĉunavana prema formuli: LVKS = 2  NAKS, gde NAKS predstavlja broj uoĉenih krvnih sudova po jedinici površine testnog sistema i izraĉunava se prema formuli NAKS = NKS / AT (∑NKS predstavlja ukupan broj uoĉenih krvnih sudova na svih 40 analiziranih vidnih polja jednog sluĉaja, ∑AT predstavlja ukupnu testnu površinu napred navedenih vidnih polja). Materijal i metode 39 Slika 3. Kvantifikacija vezivnog tkiva i krvnih sudova adenohipofize kod analiziranih sluĉajeva. Morfometrijska analiza imunohistohemijski obraĊenih preparata Morfometrijska analiza imunohistohemijski obraĊenih preparata je obuhvatala kvantifi- kaciju ekspresije kolagena tipa IV, ACTH i S-100 proteina, kod 15 od 29 ukupno analiziranih sluĉajeva, merenjem zapreminske gustine imunopozitivnih zona na digitalnim fotografijama histoloških preseka. U sluĉaju kolagena tipa IV i ACTH analizirano je 40 vidnih polja kod svakog od 15 ukupno analiziranih sluĉajeva, slikanih pod povećanjem 400 svetlosnog mi- kroskopa. Preko digitalne fotografije svakog vidnog polja postavljan je, napred opisanim me- todom, korišćenjem opcija IP*Lines and points → Line greeds → Square line greed softvera, prost linijski mreţni testni sistem sa sledećim karakteristikama: PT = 252, AT = 209018,88 µm 2 , a = 829,44 µm 2, d = 28,8 µm. Tokom procesa kvantifikacije brojane su one taĉke testnog si- stema koje su pogaĊale braon prebojene imunopozitivne zone analiziranih vidnih polja. Sam proces kvantifikacije nije obuhvatao one taĉke testnog sistema koje su se nalazile na preseku horizontalnih linija i desne i vertikalnih linija i donje ivice testnog sistema (Slika 4A i B). Za- preminska gustina kolagena tipa IV (VVCol IV) i ACTH pozitivnih ćelija adenohipofize (VVACTH) je dobijana kao koliĉnik broja taĉaka koje su pogaĊale imunopozitivne zone i ukupnog broja taĉaka testnog sistema (VV Col IV = PCol IV / PT; VVACTH = PACTH / PT) za svako vidno polje zasebno. Zapreminska gustina jednog sluĉaja je dobijana kao proseĉna vrednost zapreminskih gustina svih 40 analiziranih vidnih polja tog sluĉaja. Zapreminska gustina foli- Materijal i metode 40 kulostelatnih ćelija (VVFSC) je merena korišćenjem istog metoda, na digitalnim fotografijama 40 vidnih polja svakog od 15 ukupno analiziranih sluĉajeva, slikanih pod uvećanjem 1000 svetlosnog mikroskopa. Preko digitalnih fotografija napred navedenih vidnih polja postavljan je prost linijski mreţni testni sistem generisan od strane programa sa sledećim karakteristika- ma: PT = 972, AT = 6016,68 µm 2 , a = 38.32 µm 2 , d = 6,19 µm. Zapreminska gustina folikulo- stelatnih ćelija svakog ispitanog sluĉaja je izraĉunavana po istom principu kao i zapreminska gustina kolagena tipa IV i ACTH ćelija adenohipofize (Slika 4C). Slika 4. A – kvantifikacija kolagena tipa IV; B – kvantifikacija ACTH pozitivnih ćelija; C – kvantifikacija folikulostelatnih ćelija. Materijal i metode 41 Statistiĉka analiza Dobijene vrednosti morfometrijskih parametara su statistiĉki analizirane pomoću stati- stiĉkog paketa NCSS – PASS 2007. Najpre je primenjena analiza glavnih komponenti kojom je izvršena klasifikacija ispitivanih morfometrijskih parametara u faktore. Dobijeni faktori su kasnije korišćeni kao parametri za klasifikaciju analiziranih sluĉajeva u starosne grupe pri- menom cluster analize (metoda k-proseka). Znaĉajnost razlika proseĉnih vrednosti morfome- trijskih parametara dobijenih starosnih grupa je ispitivana pomoću One Way ANOVA testa. Naknadne razlike izmeĊu ispitivanih grupa meĊusobno su ispitivane pomoću Tukey – Kramer – ovog i Games – Howell – ovog post hoc testa. Znaĉajnost razlika izmeĊu sluĉajeva suprotnog pola je ispitivana pomoću t-testa nezavisnih uzoraka. Veza izmeĊu dobijenih vrednosti morfo- metrijskih parametara adenohipofize i starosti ispitivanih sluĉajeva je ispitivana pomoću Pearson-ovog koeficijenta linearne korelacije i primenom linearne regresione analize. Rezultati morfometrijske i statistiĉke analize su prikazani tabelarno i grafiĉki pomoću programa MS Excel. 42 REZULTATI MORFOLOŠKA ANALIZA Morfološka analiza se sastojala iz histološke analize preseka tkiva adenohipofize bojenih histohemijskim metodama: HE metodom i trihromnom Mallory metodom i histološke analize preseka tkiva adenohipofize bojenih imunohistohemijskim metodama: poliklonalnim antite- lom na S-100 protein i monoklonalnim antitelima na kolagen tipa IV i na ACTH. Morfološka analiza histohemijski obraĊenih preparata Na histološkim preparatima humane adenohipofize mlaĊih sluĉajeva bojenih HE boje- njem (Slike 5A i 5B), u pars distalis-u uoĉene su brojne hromofilne ćelije grupisane u vidu traka ili acinusa. Acidofilne ćelije su bile zastupljenije kod većine sluĉajeva i karakterisale su se ravnomerno ruţiĉasto do svetlocrveno prebojenom citoplazmom i centralno postavljenim, okruglim, tamnoplavo prebojenim euhromatiĉnim jedrom. Ove ćelije su se karakterisale uniformnim izgledom i bile su pribliţno sliĉne veliĉine i oblika koji se kretao od okruglog do poligonalnog sa zaobljenim uglovima. Bazofilne ćelije su bile u nešto manjoj meri za- stupljene i karakterisale su se ljubiĉastoplavo prebojenom citoplazmom, neznatno obilnijom u odnosu na acidofilne ćelije. U citoplazmi su se mestimiĉno uoĉavale okrugle vakuole koje su potiskivale umereno plavo do tamnoplavo prebojeno jedro ka suprotnom polu ćelije. Jedro bazofilnih ćelija je u većini sluĉajeva bilo euhromatiĉno, a kod manjeg broja ćelija je ono bilo heterohromatiĉno. Distribucija acidofilnih i bazofilnih ćelija u pars distalis-u nije bila homo- gena i karakterisala se prisustvom brojnijih bazofilnih ćelija u srednjem delu ţlezde, nepo- sredno ispred tkiva zadnjeg reţnja (pars intermedia), dok su acidofilne ćelije predominirale svojim prisustvom u njenim lateralnim delovima. IzmeĊu hromofilnih ćelija uoĉavale su se retke hromofobne ćelije nejasno razgraniĉene od okolnih struktura adenohipofize, sa slabo uoĉljivom, bledoplavo prebojenom citoplazmom i krupnim, okruglim i tamnoplavo preboje- nim euhromatiĉnim jedrom. Acinuse ţlezdanih ćelija okruţavali su svetlocrveno prebojeni snopovi vezivnog tkiva, koji su se teško razlikovali od sliĉno prebojenih okolnih struktura. IzmeĊu tankih vezivno-tkivnih snopova uoĉavali su se predominantno sinusoidni kapilari koji su se u najvećem broju sluĉajeva karakterisali prisustvom širokih lumena, nepravilnošću Rezultati 43 oblika i tankim zidovima. Unutar lumena uoĉavali se se svetlocrveno prebojeni, okrugli eritrociti i mestimiĉno tamnoplavo prebojena, heterohromatiĉna jedra leukocita. Slika 5. (A) 1. Bazofilna ćelija poligonalnog oblika, 2. Krvni sud širokog lumena ispunjen eritrocitima, slučaj muškog pola starosti 35 godina, HE bojenje; uvećanje 400; (B) 1. Sitne acidofilne ćelije okruglog oblika, 2. Hromofobna ćelija, slučaj muškog pola starosti 45 godina, HE bojenje; uvećanje 400; (C) 1. Krvni sudovi širokog lumena ispunjeni eritrocitima, slučaj muškog pola starosti 35 godina, Mallory trihromno bojenje; uvećanje 400; (D) Tanka vezivno- tkivna pregrada, slučaj muškog pola starosti 44 godine, Mallory trihromno bojenje; uvećanje 400. Na histološkim preparatima mlaĊih sluĉajeva bojenim Mallory trihromnim bojenjem, (Slike 5C i 5D), acidofilne ćelije su se karakterisale tamnocrveno prebojenom citoplazmom i tamnoplavo prebojenim euhromatiĉnim jedrom. Bazofilne ćelije su se karakterisale tamnopla- vom prebojenošću citoplazme i tamnoplavo prebojenim, manje ili više ekscentriĉno postavlje- nim jedrom i, u pojedinim sluĉajevima, prisustvom vakuola u citplazmi. Ţlezdane ćelije su grupisane u acinuse izmeĊu kojih su uoĉavane neţne zelenkastoplavo prebojene vezivno- tkivne pregrade. Unutar vezivno-tkivnih septi, pored vezivno-tkivnih vlakana i retkih vrete- nastih tamnoplavo prebojenih euhromatiĉnih jedara fibroblasta uoĉavana je mreţa sinuso- Rezultati 44 idnih kapilara sa tankim zidovima, širokim lumenom ispunjenim narandţasto prebojenim eri- trocitima i ponekim tamnoplavo prebojenim jedrom leukocita. Oko sinusoidnih kapilara uoĉavan je uzan perikapilarni prostor. IzmeĊu ţlezdanih ćelija su, kao i na preparatima boje- nim HE bojenjem, uoĉavana tamnoplavo prebojena, euhromatiĉna jedra hromofobnih ćelija sa bledom, oskudnom citoplazmom oko njih. Na preparatima bojenim trihromnim bojenjem, distribucija acidofilnih i bazofilnih ćelija se nije razlikovala od iste uoĉene na preparatima bojenim HE bojenjem, sa predominantnim prisustvom bazofila u srednjem i acidofila u late- ralnim delovima ţlezde. Prednji reţanj hipofize starijih sluĉajeva se na preparatima bojenim HE metodom kara- kterisao izrazitijim prisustvom bazofilnih ćelija, kako u njenom središnjem, tako i u njenim lateralnim delovima. U njihovoj citoplazmi su znatno ĉešće uoĉavane krupne vakuole, ĉije je prisustvo uslovljavalo ekscentriĉan polaţaj nešto manjeg i sa slabije izraţenom euhromazi- jom jedra u odnosu na ista mlaĊih sluĉajeva. Acidofilne ćelije, koje su i kod ovih sluĉajeva predominirale u odnosu na ostale strukture adenohipofize su bile krupnije i nepravilnijeg oblika u odnosu na iste mlaĊih sluĉajeva. Porast njihove veliĉine je uglavnom bio posledica porasta veliĉine njihove citoplazme u odnosu na centralno, ili blago ekscentriĉno postavljeno, tamnoplavo prebojeno euhromatiĉno jedro. Kao i kod bazofila, euhromazija jedara acidofila je bila slabije izraţena u odnosu na ista mlaĊih sluĉajeva. Okrugla, tamnoplavo prebojena euhromatiĉna jedra hromofobnih ćelija, okruţena bledom i slabo ograniĉenom citoplazmom su uoĉavana u većoj meri naroĉito u središnjem delu ţlezde sa predominacijom bazofilnih će- lija (Slike 6A i 6B). Na preparatima adenohipofize starijih sluĉajeva bojenim Mallory trihromnim bojenjem pored napred navedenih promena u morfologiji i distribuciji ţlezdanih ćelija, zapaţeno je izrazito prisustvo intesticijalne i perivaskularne fibroze. Parenhim ţlezde se karakterisao deli- miĉnom narušenošću acinusne arhitekture sa izrazito zadebljalim vezivno-tkivnim septama unutar kojih su uoĉavana brojna i zadebljala vezivno-tkivna vlakna, kao i brojnija, vretenasta, sa varijabilnim stepenom euhromazije, tamnoplavo prebojena jedra fibroblasta, u odnosu na ista mlaĊih sluĉajeva. Unutar zadebljalih vezivno-tkivnih pregrada adenohipofiza ovih sluĉa- jeva su se uoĉavali krvni sudovi manjeg kalibra, pravilnijeg okruglastog oblika i zadebljalih zidova u odnosu na krvne sudove adenohipofize mlaĊih sluĉajeva (Slike 6C i 6D). Rezultati 45 Slika 6. (A) 1. Krupne bazofilne ćelije razliĉitih oblika, 2. Krvni sud malog lumena, slučaj ženskog pola starosti 73 godine, HE bojenje; uvećanje 400; (B) 1. Ţlezdani acinus, 2. Vezivno tkivo, 3. Vakuole u citoplazmi, slučaj muškog pola starosti 80 godina; HE bojenje; uvećanje 400; (C) 1. Krvni sud malog lumena, 2. Ţlezdani acinus nejasno ograniĉen, slučaj muškog pola starosti 89 godina, Mallory trihromno bojenje; uvećanje 400. (D) 1. Debela vezivno- tkivna pregrada, 2. Jedro fibroblasta, slučaj ženskog pola starosti 95 godina; Mallory tri- hromno bojenje; uvećanje 400. Morfološka analiza imunohistohemijski obraĊenih preparata Imunohistohemijska analiza je podrazumevala ispitivanje prisustva morfološkog tipa imunoreaktivnosti tkiva adenohipofize na monoklonalna antitela za kolagen tipa IV i ACTH, kao i na poliklonalno antitelo za S-100 protein u cilju detekcije kolagena tipa IV, kortiko- tropnih i folikulostelatnih ćelija kod sluĉajeva razliĉitog pola i starosti. Rezultati 46 Kolagen tipa IV Braon prebojeni snopovi vlakana kolagena tipa IV su uoĉavani predominantno kao sastavni strukturni element intersticijumskog vezivnog tkiva adenohipofize, u kojoj su oni uĉestvovali u formiranju iregularne dvodimenzionalne mreţe unutar koje su bili smešteni acinusi endokrinih ćelija. Dodatno, njegovo prisustvo je zapaţeno i unutar zidova krvnih sudova kao deo njihovih bazalnih membrana (Slike 7A, 7B, 7C, 7D). Slika 7. (A) Vlakna kolagena tipa IV, formacija oblika mreţe, slučaj ženskog pola starosti 46 godina; (B) Ţlezdani acinus, slučaj ženskog pola starosti 56 godina; (C) Zadebljala vlakna ko- lagena tipa IV, slučaj ženskog pola starosti 80 godina; (D) Široka polimerna mreţa kolagena tipa IV, slučaj muškog pola starosti 80 godina. Bojenje antitelima na kolagen tipa IV; uvećanje 400. Kod mlaĊih sluĉajeva, ova mreţa se sastojala iz tankih i reĊih kolagenih vlakana, koja su u pojedinim delovima parenhima pars distalis-a bila potpuno odsutna, što je granicu izmeĊu pojedinih acinusa ĉinilo slabije uoĉljivom ili potpuno odustnom. Krvni sudovi tipa sinusoida koji su se nalazili izmeĊu ţlezdanih acinusa, karakterisali su se širokim lumenom nepravilnog oblika, tankim zidovima unutar kojih su, kao sastavni deo njihovih bazalnih membrana, uoĉa- Rezultati 47 vani slabo izraţeni snopovi vlakana kolagena tipa IV koji su bili povezani sa znatno brojnijim vlaknima vezivno-tkivnih septi (Slike 7A i 7B). Sa starenjem, uoĉeno je prisustvo perivaskularne fibroze koja je bila najizraţenija u hilusu intermedijarnog dela parenhima, dok je u ostalim delovima adenohipofize ona bila slabije izraţena. U intersticijumu je uoĉena znatno gušća mreţa nepravilnog oblika saĉinjena od meĊusobno isprepletanih i znatno debljih u odnosu na mlaĊe sluĉajeve kolagenih vlakana. Unutar zadebljalih zidova uoĉenih krvnih sudova, koji su se karakterisali i znatno uţim lumenom pravilnijeg oblika, detektovana su znatno deblja i brojnija kolagena vlakna njihovih bazalnih membrana. Sa povećanjem prisustva kolagenih vlakana, na preparatima je uoĉeno istovremeno smanjenje broja i veliĉine ţlezdanih acinusa i to naroĉito u intermedijarnom delu adenohipofize (Slike 7C i 7D). ACTH ćelije Primena monoklonalnog antitela za ACTH omogućila je histološku diferencijaciju adre- nokortikotropnih od ostalih bazofilnih ćelija (tireotropa i gonadotropa). Adrenokortikotropne ćelije su uoĉavane kao braon prebojene, preteţno ovalnog ili poligo- nalnog oblika, sa okruglim, euhromatiĉnim, i ekscentriĉno postavljenim plavo prebojenim jedrom (Slike 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F). Na većem uvećanju mikroskopa, u perifernom delu nji- hove citoplazme zapaţan je varijabilan broj krupnih, tamnobraon prebojenih sekretornih granu- la. Kod mlaĊih sluĉajeva, ţlezdani acinusi su se sastojali predominantno od ACTH negativnih, dok su izmeĊu njih detektovane pojedinaĉne ili grupe saĉinjene od dve do tri ili reĊe više ACTH pozitivnih ćelija. Njihovo prisustvo je bilo naroĉito izraţeno u intermedijarnom delu (Slike 8A i 8B), dok je njihov broj bio nešto manji u lateralnom delu adenohipofize (Slika 8E). Kod starijih sluĉajeva, ACTH pozitivne ćelije su predominirale svojim brojem i veliĉi- nom unutar ţlezdanih acinusa intermedijarnog dela pars distalis-a, dok su ACTH imunone- gativne ćelije u ovom delu adenohipofize bile znatno slabije zastupljene (Slike 8C i 8D). U njihovoj citoplazmi su znatno ĉešće uoĉavane vakuole varijabilnog oblika i veliĉine koje su dovodile do dislokacije jedra ka suprotnom polu ćelije. U pojedinim delovima parenhima koji su se karakterisali narušenom acinusnom arhitekturom, retke ACTH pozitivne ćelije su uoĉa- vane u perivaskularnim prostorima intersticijuma, što moţe predstavljati i posledicu procesa histološke obrade tkiva. Kod ovih sluĉajeva, znaĉajnije prisustvo adrenokortikotropnih ćelija je detektovano i unutar acinusa pars lateralis-a (Slika 8F). Kod jednog sluĉaja ţenskog pola starog 71 godinu, veliki broj ACTH imunopozitivnih ćelija je uoĉen kako u svim delovima pars distalis-a, tako i unutar neurohipofize, što predstavlja fenomen bazofilne invazije (Slika 8F). Rezultati 48 Slika 8. (A) Pojedinaĉne ACTH ćelije u pars distalis-u adenohipofize, slučaj ženskog pola starosti 46 godina; (B) ACTH ćelije u pars distalis-u adenohipofize, slučaj muškog pola starosti 44 godine; (C) 1. Ţlezdani acinus ispunjen ACTH ćelijama u pars distalis-u adenohipofize, slučaj muškog pola starosti 66 godina; (D) 1. Izraţene vezivno-tkivne pregrade; 2. ACTH ćelije u pars distalis-u adenohipofize, slučaj ženskog pola starosti 71 godinu; (E) 1. Pojedinaĉne ACTH ćelije u pars lateralis-u adenohipofize, slučaj muškog pola starosti 44 godine; (F) Bazofilna invazija ACTH ćelijama u pars lateralis-u adenohipofize, 1. Vakuole u citoplazmi ACTH ćelija, slučaj ženskog pola starosti 71 godinu; Bojenje antitelima na ACTH; uvećanje: 400. Rezultati 49 Folikulostelatne (FS) ćelije Na histološkim preparatima, FS ćelije su uoĉavane kao zvezdolike, crveno prebojene S- 100 imunopozitivne ćelije smeštene izmeĊu hormon sekretujućih ćelija acinusa adenohipo- fize (Slika 9A). Pozitivnom reakcijom na anti – S-100 antitelo su se karakterisali kako cito- plazma, tako i jedro ovih ćelija. Karakteristiĉan oblik ovih ćelija je uslovio da se na poje- dinim delovima histoloških preseka izmeĊu ţlezdanih ćelija acinusa uoĉavalo samo njihovo S-100 imunopozitivno jedro sa uzanim slojem citoplazme koja ga je okruţivala ili delovi S- 100 pozitivne citoplazme njihovih nastavaka. MlaĊi sluĉajevi su se karakterisali predominantno prisustvom pojedinaĉnih FS ćelija, ko- je su retko u pojedinim delovima parenhima formirale male grupacije saĉinjene od dve do tri S-100 pozitivne ćelije. U tom sluĉaju, dugi i tanki nastavci ovih ćelija su se pruţali izmeĊu endokrinih ćelija i meĊusobno su bili povezani (Slika 9A). Kod napred navedenih sluĉajeva nije uoĉena znaĉajnija predominacija prisustva S-100 imunopozitivnih ćelija u razliĉitim delovima pars distalis-a hipofize. Kod starijih sluĉajeva, zapaţene su znaĉajno brojnije S-100 pozitivne FS ćelije, koje su ĉesto meĊusobno bile povezane svojim nastavcima, zbog ĉega jasna granica izmeĊu njih nije mogla biti uoĉena (Slika 9B). Znaĉajnije prisustvo ovih ćelija je detektovano u intermedijar- nom u odnosu na lateralne delove adenohipofize (Slika 9C). U pojedinim delovima pa- renhima retko su se uoĉavale S-100 pozitivne zone saĉinjene od struktura koje nisu posedo- vale zvezdast oblik. Unutar ovih struktura detektovan je odreĊen broj malih S-100 negativnih plavo prebojenih jedara što indirektno moţe da ukaţe da one verovatno predstavljaju manje ili veće grupe FS ćelija ĉiji oblik i granice nisu jasno definisani (Slika 9D). U središtu pojedi- nih acinusa uoĉavan je lumen koji je ispunjen preteţno S-100 negativnim materijalom, tako da su u celini te formacije poprimale izgled folikula (Slika 9E). Ovakve strukture su ĉešće uoĉavane kod starijih sluĉajeva, posebno u delu pars intermedia lokalizovanom neposredno ispred lobus posterior-a. Pored S-100 negativnog koloida u njihovom središtu, okruţenog pre- dominantno S-100 negativnim kuboidnim ili cilindriĉnim ćelijama, u njihovoj okolini nalazile su se grupe FS ćelija. U pojedinim sluĉajevima, nastavci tih FS ćelija su se pruţali do foli- kularnog zida, provlaĉili izmeĊu ćelija njegovog zida i dospevali do perifernih delova koloida (Slika 9E). ReĊe, uoĉavane su FS ćelije koje su ulazile u sastav folikularnog zida (Slika 9F). Rezultati 50 Slika 9. (A) 1. Grupe FS ćelija u adenohipofizi, slučaj muškog pola starosti 44 godine; (B) FS ćelije adenohipofize, slučaj ženskog pola starosti 80 godina; (C) Grupe FS ćelija adenohipofize, slučaj ženskog pola starosti 71 godinu; (D) S-100 pozitivne strukture bez formiranja zvezdastih formacija, adenohipofiza slučaja muškog pola starosti 70 godina; (E) Adenohipofiza slučaja muškog pola starosti 80 godina; 1 – Folikul okruţen S-100 negativnim ćelijama; 2 – Folikul sa fokalnom S-100 pozitivnom reakcijom unutar zida; 3 – Grupa FS ćelija; (F) S-100 imunoreaktivne FS ćelije na ivici folikula u adenohipofizi slučaja muškog pola starosti 89 godina. S-100; uvećanje 1000. Rezultati 51 MORFOMETRIJSKA ANALIZA Morfometrijska analiza je raĊena na preparatima bojenim histohemijskom i imunohisto- hemijskom metodom. Morfometrijska analiza histohemijski obraĊenih preparata Ovaj deo morfometrijske analize obuhvatao je kvantifikaciju veliĉine i oblika ćelija adenohi- pofize, zatim kvantifikaciju promene celularnog sastava adenohipofize (acidofila, bazofila i hro- mofoba), kao i kvantifikaciju prisustva vezivnog tkiva u adenohipofizi i njene vaskularizacije to- kom procesa starenja. Analizirano je svih 29 sluĉajeva (15 muškog i 14 ţenskog pola) ĉija se sta- rost kretala izmeĊu 33 i 95 godina (proseĉno 64 godine). NajmlaĊi ispitivani sluĉaj muškog pola je bio star 33 godine, a najstariji 89 godina (proseĉno 61 godina), dok je najmlaĊi ispitivani sluĉaj ţenskog pola bio star 45 godina, a najstariji 95 godina (proseĉno 70 godina). Rezultati morfometrijske analize su prikazani u Tabeli 1. Starost ispitanih sluĉajeva, pol, area (AAH) i perimetar (BAH) ćelija adenohipofize, njihov oblikovni faktor (OF), zatim pro- seĉna (MOD), medijanska (MdOD) i integralna (IOD) optiĉka gustina tkiva adenohipofize, zapreminska gustina vezivnog tkiva (VVT) adenohipofize, zapreminska (VVKS), površinska (SVKS) i duţinska (LVKS) gustina krvnih sudova adenohipofize su podvrgnuti eksploratornoj faktor analizi u verziji 2007 NCSS-a sa ciljem ustanovljavanja veze izmeĊu starosti ispitiva- nih sluĉajeva i napred navedenih morfometrijskih parametara. Pre same analize izvršena je procena prikladnosti podataka za faktorsku analizu. Korelaciona matrica ispitivanih parame- tara (Tabela 2) je ukazala na prisustvo znaĉajnog broja koeficijenata korelacije ĉija je vrednost iznosila iznad 0.3. Vrednost Phi indeksa je iznosila 0.4, a Bartletov test sferiĉnosti je bio statistiĉki znaĉajan (p<0.0001), što sve ukazuje na faktorabilnost korelacione matrice. Analiza glavnih komponenti je otkrila prisustvo tri komponente ĉija je karakteristiĉna vrednost bila preko 1 i koje su objašnjavale svaka posebno 48.45%, 44.09% i 19.59% ukupne varijanse. Pregledom dijagrama prevoja, utvrĊeno je prisustvo jasne taĉke preloma nakon druge komponente. Na osnovu Katelovog kriterijuma zadrţane su tokom daljeg istraţivanja prve dve komponente, koje su objašnjavale 92.55% ukupne varijanse i to komponenta 1 48.45%, a komponenta 2 44.09%. Nakon izvršene oblimin rotacije uoĉeno je da obe kompo- nente sadrţe veliki broj znaĉajnih faktorskih teţina, pri ĉemu svi parametri daju znatnu teţinu samo po jednoj komponenti. U prvoj komponenti najveću teţinu poseduje površinska, zatim zapreminska gustina krvnih sudova adenohipofize. Potom slede area, perimetar adenohipofiznih Rezultati 52 Tabela 1. Proseĉne vrednosti morfometrijskih parametara svih 29 analiziranih sluĉajeva dobijenih kao rezultat morfometrijske analize. Sluĉaj Starost Pol AAH (mm 2 ) BAH (mm) OF IOD MOD MdOD VVT (%) VVKS (%) SVKS (mm -1 ) 10-3 LVKS (mm -2 ) 10-3 1 33 Muški 98.66 47.87 0.753 2823.27 0.151 0.034 11.31 5.25 15.35 0.35 2 35 Muški 99.01 48.05 0.757 5490.70 0.066 0.013 12.47 4.76 13.06 0.17 3 44 Muški 108.99 37.81 0.761 4299.07 0.124 0.039 13.98 4.95 15.23 0.30 4 45 Muški 103.73 46.42 0.747 3963.84 0.193 0.118 11.92 4.07 13.96 0.44 5 45 Ţenski 107.38 45.39 0.789 3753.26 0.174 0.080 12 2.62 10.53 0.32 6 46 Ţenski 124.96 46.17 0.754 5694.52 0.094 0.031 11.66 4.97 16.74 0.35 7 51 Ţenski 100.28 51.41 0.771 2743.98 0.030 0.009 14.62 5.53 14.92 0.16 8 52 Muški 110.05 40.47 0.745 6985.84 0.322 0.116 14.6 3.22 12.29 0.21 9 55 Muški 97.09 42.77 0.774 2680.88 0.205 0.061 15.18 5.87 16.86 0.26 10 56 Ţenski 103.34 46.79 0.768 3688.18 0.159 0.070 15.23 4.44 12.75 0.14 11 64 Muški 83.36 41.55 0.727 4053.39 0.116 0.024 19.53 5.3 15.92 0.28 12 66 Muški 131.43 45.42 0.748 5413.35 0.083 0.029 18.87 4.03 9.36 0.27 13 68 Ţenski 132.08 40.39 0.757 6300.20 0.161 0.057 19.65 3.94 16.42 0.24 14 70 Muški 119.68 44.88 0.739 12407.93 0.364 0.157 17.03 1.93 7.23 0.16 15 71 Ţenski 141.05 46.39 0.753 2157.18 0.205 0.084 14.61 3.02 9.34 0.28 16 73 Muški 97.95 42.73 0.743 10621.82 0.096 0.066 16.02 3.87 10.87 0.28 17 73 Ţenski 134.97 40.31 0.781 7013.25 0.080 0.017 17.63 4.3 14.08 0.28 18 75 Muški 116.13 43.74 0.757 3272.01 0.096 0.061 18.35 4.38 13.68 0.32 19 75 Muški 120.54 48.69 0.726 4228.82 0.023 0.005 19.56 0.14 0.57 0.21 20 75 Muški 101.83 42.30 0.756 5685.80 0.126 0.059 18.14 4.94 14.24 0.30 21 76 Ţenski 112.41 45.47 0.767 3278.75 0.124 0.023 22.6 4.97 14.78 0.01 22 78 Ţenski 160.44 40.94 0.755 967.59 0.108 0.060 16.77 4.96 11.17 0.22 23 78 Ţenski 119.08 40.90 0.766 2830.66 0.167 0.043 17.09 4.92 14.94 0.26 24 80 Muški 138.03 41.23 0.735 4923.35 0.110 0.035 16.38 3.99 8.71 0.26 25 80 Ţenski 129.12 39.38 0.753 3075.91 0.079 0.010 15.36 2.83 12.63 0.32 26 81 Ţenski 124.77 41.68 0.754 2847.30 0.081 0.033 19.49 3.66 12.42 0.25 27 83 Ţenski 119.28 44.32 0.756 2714.08 0.080 0.026 17.04 1.42 4.99 0.10 28 89 Muški 107.82 40.41 0.771 2781.03 0.083 0.006 17.31 2.92 10.29 0.28 29 95 Ţenski 144.04 43.96 0.756 778.48 0.083 0.010 20.05 2.4 8.79 0.28 AAH – area MdOD – medijanska optiĉka gustina BAH – perimetar VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva OF – oblikovni faktor VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova IOD – integralna optiĉka gustina SVKS – površinska gustina krvnih sudova MOD – proseĉna optiĉka gustina LVKS – duţinska gustina krvnih sudova Rezultati 53 ćelija i starost ispitanih sluĉajeva. Na kraju, u ovaj faktor su uvršteni i duţinska gustina krv- nih sudova, kao i zapreminska gustina vezivnog tkiva adenohipofize. Za razliku od prve kom- ponente u koju su svrstani oni morfometrijski parametri koji koreliraju sa starošću, u drugu komponentu su svrstani oni parametri koji koreliraju sa polom ispitanih sluĉajeva. Najveću faktorsku teţinu je posedovala integralna, zatim proseĉna i medijanska optiĉka gustina i, na kraju pol ispitanih sluĉajeva i oblikovni faktor adenohipofiznih ćelija (Tabela 3). Prema tome, rezultati eksploratorne faktor analize su ukazali da su koliĉina prisutnog vezivnog tkiva, pro- krvljenost i veliĉina ćelija adenohipofize povezani sa procesom starenja, dok su njena histo- loška struktura, oblik, a delimiĉno i veliĉina ćelija povezani sa polom ispitanih sluĉajeva. Tabela 2. Korelaciona matrica morfometrijskih parametara adenohipofize ispitanih sluĉajeva. Varijable Pol AAH BAH OF MOD IOD MdOD VVT VVKS SVKS LVKS Starost 0.25 0.52 0.53 -0.13 -0.13 -0.14 -0.05 0.76 -0.42 -0.44 -0.21 Pol 0.48 0.42 0.48 -0.37 -0.38 -0.15 0.12 -0.05 0.08 0.06 AAH 0.99 -0.04 -0.18 -0.19 -0.05 0.27 -0.31 -0.34 -0.17 BAH -0.15 -0.14 -0.15 -0.02 0.29 -0.36 -0.40 -0.21 OF -0.31 -0.30 -0.14 -0.19 0.29 0.39 0.27 MOD 1.00 0.89 -0.04 -0.13 -0.07 -0.01 IOD 0.88 -0.04 -0.13 -0.07 -0.02 MdOD 0.14 -0.08 0.04 0.10 VVT -0.20 -0.23 -0.14 VVKS 0.88 0.60 SVKS 0.81 AAH – area MdOD – medijanska optiĉka gustina BAH – perimetar VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva OF – oblikovni faktor VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova IOD – integralna optiĉka gustina SVKS – površinska gustina krvnih sudova MOD – proseĉna optiĉka gustina LVKS – duţinska gustina krvnih sudova Rezultati 54 Tabela 3. Matrica faktorskih teţina i korelacija promenljivih i dva faktora dobijenih tokom analize glavnih komponenti oblimin rotacijom. Parametar Faktorske teţine Koeficijenti korelacije promenljivih i faktora Deo varijanse objašnjen zajedniĉkim faktorima Komponenta 1 Komponenta 2 Komponenta 1 Komponenta 2 Starost 0.693 0.156 0.481 0.024 0.505 Pol 0.190 0.473 0.036 0.223 0.260 AAH 0.690 0.291 0.476 0.085 0.560 BAH 0.737 0.233 0.544 0.054 0.598 OF -0.316 0.382 0.100 0.146 0.246 MOD -0.007 -0.968 0.000 0.936 0.936 IOD -0.007 -0.970 0.000 0.941 0.941 MdOD 0.017 -0.765 0.000 0.585 0.585 VVT 0.456 0.023 0.208 0.001 0.209 VVKS -0.738 0.187 0.545 0.035 0.580 SVKS -0.817 0.162 0.668 0.026 0.694 LVKS -0.559 0.101 0.312 0.010 0.323 AAH – area MdOD – medijanska optiĉka gustina BAH – perimetar VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva OF – oblikovni faktor VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova IOD – integralna optiĉka gustina SVKS – površinska gustina krvnih sudova MOD – proseĉna optiĉka gustina LVKS – duţinska gustina krvnih sudova Proseĉne vrednosti analiziranih morfometrijskih parametara sluĉajeva muškog i ţenskog pola su prikazane u Tabeli 4. Rezultati 55 Tabela 4. Vrednosti analiziranih morfometrijskih parametara kod sluĉajeva muškog i ţenskog pola. Muški Varijable n Prosek Mediana SD SE 95% CI Starost 15 62 66 17 4 9 AAH (mm 2 ) 15 108.95 107.82 14.28 3.69 7.23 BAH (mm) 15 42.43 41.68 2.83 0.73 1.43 OF 15 0.749 0.748 0.014 0.004 0.007 MOD 15 0.157 0.126 0.084 0.022 0.042 IOD 15 5308.74 4299.07 2815.34 726.92 1424.73 MdOD 15 0.053 0.043 0.040 0.010 0.020 VVT (%) 15 16.04 16.38 2.73 0.70 1.38 VVKS (%) 15 3.97 4.07 1.47 0.38 0.74 SVKS (mm -1 ) 10-3 15 11.84 13.06 4.21 1.09 2.33 LVKS (mm -2 ) 10-3 15 0.25 0.26 0.09 0.02 0.048 Ţenski Starost 14 70 75 15 4 8 AAH (mm 2 ) 14 125.23 124.86 16.78 4.48 8.79 BAH (mm) 14 45.10 45.41 3.15 0.84 1.65 OF 14 0.763 0.757 0.011 0.003 0.006 MOD 14 0.102 0.089 0.055 0.015 0.029 IOD 14 3417.38 2961.61 1816.99 485.61 951.78 MdOD 14 0.042 0.030 0.034 0.009 0.018 VVT (%) 14 16.70 16.91 3.09 0.82 1.62 VVKS (%) 14 3.86 4.12 1.23 0.33 0.64 SVKS (mm -1 ) 10-3 14 12.46 12.69 3.27 0.87 1.890 LVKS (mm -2 ) 10-3 14 0.26 0.27 0.08 0.02 0.049 AAH – area MdOD – medijanska optiĉka gustina BAH – perimetar VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva OF – oblikovni faktor VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova IOD – integralna optiĉka gustina SVKS – površinska gustina krvnih sudova MOD – proseĉna optiĉka gustina LVKS – duţinska gustina krvnih sudova Rezultati 56 Napred navedene vrednosti su analizirane t-testom nezavisnih uzoraka. Proseĉna starost (Grafikon 1), zatim proseĉne vrednosti zapreminske gustine vezivnog tkiva, zapreminske, po- vršinske i duţinske gustine krvnih sudova adenohipofize nisu se statistiĉki znaĉajno razliko- vale (p>0.05) izmeĊu sluĉajeva muškog i ţenskog pola (Grafikoni 2A, 2B, 2C i 2D). Nasuprot napred navedenim parametrima, proseĉna vrednost aree ćelija adenohipofize sluĉajeva ţenskog pola je bila statistiĉki znaĉajno viša u odnosu na istu sluĉajeva muškog pola (t(27) = 2.82, p = 0.009). Uoĉena razlika (proseĉna vrednost razlike = 16.27 µm2, CI: 4.43  28.12 µm2) se karakterisala vrlo velikom veliĉinom uticaja (ƞ2 = 0.23), ukazujući da su analizirane ćelije adenohipofize znaĉajno krupnije kod sluĉajeva ţenskog u odnosu na sluĉajeve muškog pola (Grafikon 3A). Sliĉno proseĉnoj arei, proseĉan perimetar (Grafikon 3B) je bio statistiĉki znaĉajno viši kod sluĉajeva ţenskog u odnosu na sluĉajeve muškog pola (t(27) = 2.41, p = 0.024; proseĉna razlika = 2.67 µm; CI: 0.39  4.95 µm), kao i oblikovni faktor (Grafikon 3C) (t(27) = 2.88, p = 0.008; proseĉna razlika = 0.014; CI: 0.004  0.023), što u sluĉaju proseĉnog perimetra (ƞ2 = 0.18), kao i oblikovnog faktora (ƞ2 = 0.24) predstavlja vrlo veliku razliku i ukazuje da su ove ćelije kod sluĉajeva ţenskog pola krupnije i da se istovremeno karakterišu i znaĉajno pravilnijim oblikom. Nasuprot napred navedena dva parametra, proseĉna integralna optiĉka gustina (Grafikon 3D) (t(27) = 2.13, p = 0.042; proseĉna razlika = 1891.36; CI: 71.04  3711.67) i proseĉna optiĉka gustina (Grafikon 3C) (t(27) = 2.12, p = 0.045; proseĉna razlika = 0.06; CI: 0.001  0.110) analiziranih vidnih polja tkiva adenohipofize su statistiĉki znaĉajno više kod sluĉajeva muškog u odnosu na sluĉajeve ţenskog pola. Proseĉna medijanska optiĉka gustina (Grafikon 3C) se ne razlikuje statistiĉki znaĉajno izmeĊu sluĉajeva muškog i sluĉajeva ţenskog pola (p>0.05). Prema tome, ĉinjenica da su dva od napred navedena tri oblika optiĉke gustine statistiĉki znaĉajno viša kod sluĉajeva muškog u odnosu na sluĉajeve ţenskog pola, pri ĉemu se ta razlika u oba sluĉaja karakteriše velikim efektom veliĉine (ƞ2 = 0.14 i za IOD i za MOD), moţe indirektno da ukaţe na moguće razlike u celularnom sastavu tkiva adenohipofize sluĉajeva suprotnog pola i eventualno znaĉajnije prisustvo bazofila kod sluĉajeva muškog pola. Rezultati 57 Grafikon 1. Proseĉna starost ispitanih sluĉajeva muškog i ţenskog pola Grafikon 2. Proseĉna zapreminska gustina vezivnog tkiva (A), zapreminska (B), površinska (C) i duţinska gustina krvnih sudova adenohipofize (D) sluĉajeva muškog i ţenskog pola. Rezultati 58 Grafikon 3. Proseĉna area (A), perimetar (B) ćelija adenohipofize, proseĉan oblikovni faktor, proseĉna i medijanska (C), kao i proseĉna integrisana optiĉka gustina tkiva adenohipofize kod ispitanih sluĉajeva muškog i ţenskog pola (D). Veza izmeĊu ispitivanih morfometrijskih parametara adenohipofize i starosti ispitivanih sluĉajeva je ispitivana pomoću Pearson-ovog koeficijenta linearne korelacije (Tabela 5). Tabela 5. Korelaciona matrica Pearson-ovog koeficijenta linearne korelacije izmeĊu starosti ispitanih sluĉajeva s jedne i proseĉne aree i perimetra ćelija adenohipofize, proseĉne zapre- minske gustine vezivnog tkiva, proseĉne zapreminske, površinske i duţinske gustine krvnih sudova adenohipofize istih sa druge strane. Parametar AAH BAH OF MOD IOD MdOD VVT VVKS SVKS LVKS Starost R 0,52 0,53 -0,13 -0,13 -0,14 -0,05 0,76 -0,42 -0,44 -0,21 p 0,004 0,003 0,492 0,500 0,483 0,796 0,000 0,024 0,017 0,263 n 29 29 29 29 29 29 29 29 29 29 AAH – area MdOD – medijanska optiĉka gustina BAH – perimetar VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva OF – oblikovni faktor VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova IOD – integralna optiĉka gustina SVKS – površinska gustina krvnih sudova MOD – proseĉna optiĉka gustina LVKS – duţinska gustina krvnih sudova Rezultati 59 Rezultati korelacione analize su ukazali na prisustvo statistiĉki znaĉajnog i velikog porasta proseĉne aree (R = 0.52, n = 29, p = 0.004), proseĉnog perimetra (R = 0.53, n = 29, p = 0.003) i proseĉne zapreminske gustine vezivnog tkiva adenohipofize (R = 0.76, n = 29, p < 0.0001) tokom procesa starenja. Za razliku od napred navedenih parametara, proseĉna zapreminska i površinska gustina krvnih sudova adenohipofize su ispoljavale statistiĉki znaĉajan pad (proseĉna zapreminska gustina: R = 0.42, n = 29, p = 0.024; proseĉna povr- šinska gustina: R = 0.44, n = 29, p = 0.017) tokom procesa starenja. Veza izmeĊu ova dva parametra i starenja je bila umerenog intenziteta. Dodatno, primenom linearne regresione analize ispitana je prediktivna sposobnost stare- nja za one morfometrijske parametre koji su statistiĉki znaĉajno korelirali sa starošću analizi- ranih sluĉajeva. Tako, rezultati linearne regresione analize su ukazali da starenje predstavlja statistiĉki znaĉajan prediktor proseĉne aree ćelija adenohipofize (F(1,27) = 10.19, p = 0.004), prema modelu koji je identifikovan sledećom jednaĉinom: AAH = 80.25 µm 2 + 0.55  starost. Prema napred navedenom modelu, starost ispitanih sluĉajeva objašnjava 25% ukupne varijanse proseĉne aree ćelija adenohipofize (korigovani R2 = 0.25), što predstavlja veoma veliki efekat veliĉine (Grafikon 4A). Sliĉna veza, samo još jaĉeg intenziteta je ustanovljena izmeĊu starosti i proseĉnog perimetra. I u ovom sluĉaju starost predstavlja statistiĉki znaĉajan prediktor proseĉnog perimetra adenohipofiznih ćelija (F(1,27) = 10.66, p = 0.003). Identifikovana jednaĉina (BAH = 36.79 µm + 0.11  starost) je ukazala da starost objašnjava 26% ukupne varijanse ovog morfometrijskog parametra (korigovani R 2 = 0.26), što predstavlja veliki efekat (Grafikon 4B). Starost ispitanih sluĉajeva takoĊe predstavlja statistiĉki znaĉajan prediktor proseĉne zapreminske gustine vezivnog tkiva adenohipofize (F(1,27) = 37.88, p<0.0001). Prema identifikovanom modelu (VVT = 7.52 % + 0.13  starost ispitanog sluĉaja), starost ispitanih sluĉajeva bi objašnjavala 57% ukupne varijanse ovog parametra (korigovani R2 = 0.57), što takoĊe predstavlja vrlo veliki efekat (Grafikon 5). Kada je u pitanju proseĉna zapreminska gustina krvnih sudova adenohipofize, starost je takoĊe predstavljala statistiĉki znaĉajan prediktor (F(1,27) = 5.76, p = 0.024). MeĊutim, prema identifikovanom modelu (VVKS = 6.17 %  0.03  starost ispitanog sluĉaja), starost ispitanih sluĉajeva je objašnjavala samo 15% ukupne varijanse ovog parametra (korigovani R 2 = 0.15), što predstavlja slabiji u odnosu na prethodna dva, ali još uvek umereni efekat (Grafikon 6A). Rezultati 60 Konaĉno, starost takoĊe predstavlja statistiĉki znaĉajan prediktor proseĉne površinske gustine krvnih sudova adenohipofize (F(1,27) = 6.41, p = 0.017). Identifikovani model (SVKS = 19  10 -3 µm -2  0.01  10-3  starost) je ukazao da starost ispitanih sluĉajeva objašnjava 16% ukupne varijanse ovog parametra (korigovani R2 = 0.16), što predstavlja umereni efekat (Grafikon 6B). Grafikon 4. Scatter dijagram korelacije izmeĊu starosti ispitanih sluĉajeva i proseĉne aree (A), odnosno proseĉnog perimetra (B) adenohipofiznih ćelija. Rezultati 61 Grafikon 5. Scatter dijagram korelacije izmeĊu starosti i proseĉne zapreminske gustine vezivnog tkiva adenohipofize ispitanih sluĉajeva. Prema tome, iz svega napred navedenog moţe se zakljuĉiti da tokom procesa starenja do- lazi do znaĉajnog uvećanja veliĉine ćelija adenohipofize. Njihova hipertrofija, koja je izraziti- ja kod sluĉajeva ţenskog pola, je praćena proliferacijom vezivnog tkiva, kao i njenom slabi- jom vaskularizacijom. Morfometrijski parametri, kao i starost ispitanih sluĉajeva, koji su nakon izvršene eksplorato- rne faktor analize klasifikovani u komponentu 1 (Tabela 3) korišćeni su kao kriterijumi za klasi- fikaciju ispitanih sluĉajeva u tri starosne grupe, kako bi detaljnije bila ispitana njihova dinamika, kao i dinamika preostalih morfometrijskih parametara klasifikovanih u sastavu komponente 2, tokom procesa starenja. Sprovedena je klasifikaciona analiza metodom k-proseka. Vrednosti morfometrijskih parametara grupa dobijenih klaster analizom su prezentovani u Tabeli 6. Jednofaktorska analiza varijanse (One Way ANOVA) je primenjena za ispitivanje zna- ĉajnosti razlika izmeĊu vrednosti morfometrijskih parametara dobijenih grupa. Tako je usta- novljeno da se proseĉna starost ispitivanih grupa statistiĉki znaĉajno razlikuje (F(2,26) = 30.20, p<0.0001). Tukey-Kramer post hoc test je dodatno ukazao da je starost prve grupe bila statistiĉki znaĉajno niţa u odnosu na II i III (p<0.05), dok je III grupa bila neznatno starija od II, ali ta razlika nije bila statistiĉki znaĉajna (p>0.05) (Grafikon 7). Broj sluĉajeva muškog i ţenskog pola se nije razlikovao statistiĉki znaĉajno kod grupa dobijenih klasifikacionom ana- lizom (χ2 = 1.84, SS = 2, n = 29, p = 0.40). Rezultati 62 Tabela 6. Proseĉne vrednosti ispitivanih morfometrijskih parametara grupa dobijenih klasifi- kacionom analizom. Grupa I Varijabla N Prosek Md SD SE 95% CI Starost 12 50 49 11 3 6 AAH (mm 2 ) 12 102.90 101.81 9.89 2.85 5.60 BAH (mm) 12 41.08 40.7 1.87 0.54 1.06 OF 12 0.757 0.756 0.016 0.005 0.009 MOD 12 0.141 0.12 0.069 0.02 0.039 IOD 12 4733.23 4008.61 2263.54 653.43 1280.69 MdOD 12 0.047 0.048 0.032 0.009 0.018 VVT (%) 12 14.04 14.29 2.37 0.68 1.34 VVKS (%) 12 4.57 4.86 0.97 0.28 0.55 SVKS (mm -1 )  10-3 12 14.00 14.44 2.15 0.62 1.22 LVKS (mm -2 )  10-3 12 0.27 0.28 0.04 0.01 0.02 Grupa II Starost 7 77 75 10 4 7 AAH (mm 2 ) 7 133.78 131.43 15.59 5.89 11.55 BAH (mm) 7 47.09 46.79 2.5 0.94 1.85 OF 7 0.748 0.753 0.011 0.004 0.008 MOD 7 0.121 0.08 0.118 0.044 0.087 IOD 7 4095.35 2714.08 4027.05 1522.08 2983.23 MdOD 7 0.043 0.023 0.055 0.021 0.041 VVT (%) 7 17.71 17.04 1.9 0.72 1.41 VVKS (%) 7 2.56 2.4 1.62 0.61 1.20 SVKS (mm -1 )  10-3 7 7.35 8.79 3.56 1.35 2.64 LVKS (mm -2 )  10-3 7 0.14 0.16 0.06 0.02 0.04 Grupa III Starost 10 78 77 6 2 3 AAH (mm 2 ) 10 121.62 121.92 12.14 3.84 7.52 BAH (mm) 10 44.53 44.69 2.29 0.72 1.42 OF 10 0.760 0.757 0.012 0.004 0.007 MOD 10 0.125 0.096 0.049 0.015 0.030 IOD 10 4200.83 3275.38 1624.39 513.68 1006.79 MdOD 10 0.051 0.039 0.032 0.01 0.020 VVT (%) 10 18.20 17.89 2.02 0.64 1.25 VVKS (%) 10 4.09 4.14 0.78 0.25 0.48 SVKS (mm -1 )  10-3 10 13.22 13.88 2.3 0.73 1.43 LVKS (mm -2 )  10-3 10 0.31 0.28 0.06 0.02 0.04 AAH – area MdOD – medijanska optiĉka gustina BAH – perimetar VVT – zapreminska gustina vezivnog tkiva OF – oblikovni faktor VVKS – zapreminska gustina krvnih sudova IOD – integralna optiĉka gustina SVKS – površinska gustina krvnih sudova MOD – proseĉna optiĉka gustina LVKS – duţinska gustina krvnih sudova Rezultati 63 Grafikon 6. Scatter dijagram korelacije izmeĊu starosti i proseĉne zapreminske (A) i po- vršinske (B) gustine krvnih sudova adenohipofize ispitanih sluĉajeva. Rezultati 64 Grafikon 7. Proseĉna starost grupa dobijenih klasifikacionom analizom. Proseĉna area ćelija adenohipofize se statistiĉki znaĉajno razlikuje izmeĊu grupa dobije- nih klasifikacionom analizom (F(2,26) = 15.39, p<0.0001). Napred navedena razlika je vrlo velika, što potvrĊuje vrednost ƞ2 = 0.54. Tukey-Kramer post hoc test je dodatno ukazao da proseĉna area statistiĉki znaĉajno raste u II u odnosu na I grupu (p<0.05). Zatim njena vre- dnost opada u III grupi u odnosu na II grupu, ali taj pad nije statistiĉki znaĉajan (p>0.05). Ipak, vrednost ovog parametra u III grupi ostaje statistiĉki znaĉajno viša u odnosu na I grupu (p<0.05) (Grafikon 8A). Dakle, sluĉajevi II grupe, u proseku mlaĊi od sluĉajeva III grupe se ka- rakterišu nešto izrazitijom hipertrofijom analiziranih ćelija u odnosu na preostale dve grupe. Proseĉan perimetar ima sliĉan trend proseĉnoj arei adenohipofiznih ćelija (Grafikon 8B). On se statistiĉki znaĉajno razlikuje izmeĊu dobijenih grupa (F(2,26) = 17.90, p<0.0001), pri ĉemu i on statistiĉki znaĉajno raste u II u odnosu na I grupu (p<0.05), a zatim blago opada u III u odnosu na II grupu, pri ĉemu taj pad nije statistiĉki znaĉajan (p>0.05). I kod njega vrednost u III grupi ostaje statistiĉki znaĉajno viša u odnosu na I grupu (p<0.05). Vrednost eta kvadrat je dodatno ukazala da su ustanovljene razlike ovog parametra ispitivanih grupa takoĊe velike (ƞ2 = 0.58). Rezultati 65 Grafikon 8. Proseĉna area (A) i perimetar (B) adenohipofiznih ćelija grupa dobijenih klasi- fikacionom analizom. Vrednosti oblikovnog faktora ustanovljenih grupa se ne razlikuju staistiĉki znaĉajno (p>0.05) (Grafikon 9A). Za razliku od proseĉne aree i perimetra, vrednosti izmerenih optiĉkih gustina tkiva adenohipofize (MOD, MdOD i IOD) ispoljavaju suprotan trend. Njihove vre- dnosti su najviše u I grupi i opadaju u II u odnosu na I, nakon ĉega rastu u III grupi u odnosu Rezultati 66 na II, ali još uvek ostaju niţe u odnosu na I grupu (Grafikoni 9B, C i D). Ipak, ove razlike ni- su statistiĉki znaĉajne (p>0.05). Grafikon 9. Proseĉan oblikovni faktor (A), proseĉna (B), medijanska (C) i proseĉna integrisana optiĉka gustina (D) tkiva adenohipofize grupa dobijenih klasifikacionom analizom. Proseĉna zapreminska gustina vezivnog tkiva adenohipofize statistiĉki znaĉajno raste kod ispitivanih grupa (F(2,26) = 12.00, p = 0.0002). Uoĉene razlike ispoljavaju veliki efekat (ƞ2 = 0.48), pri ĉemu vrednost ovog parametra statistiĉki znaĉajno raste u II u odnosu na I, dok njegova vrednost u znatno manjoj meri raste u III u odnosu na II starosnu grupu. Taj porast nije statistiĉki znaĉajan (p>0.05), ali zato vrednost proseĉne zapreminske gustine vezivnog tkiva adenohipoize u ovoj grupi ostaje statistiĉki znaĉajno viša u odnosu na I grupu (p<0.05) (Grafikon 10A). Dakle, adenohipofize sluĉajeva dve starije grupe su se karakterisale izraziti- jom fibrozom u odnosu na I grupu. Kada su u pitanju krvni sudovi adenohipofize, vrednosti proseĉne zapreminske i povr- šinske gustine se statistiĉki znaĉajno razlikuju izmeĊu dobijenih grupa (VVKS: F(2,26) = 7.56, p = 0.003; SVKS: F(2,26) = 16.06, p<0.0001), pri ĉemu su ustanovljene razlike ispoljavale veliki efekat veliĉine (VVKS ƞ 2 = 0.37, SVKS ƞ 2 = 0.55). Vrednosti ovih parametara, sliĉno Rezultati 67 vrednostima merenih optiĉkih gustina tkiva adenohipofize, su u I i III grupi više u odnosu na II grupu, ali su za razliku od napred navedenih razlika optiĉkih gustina, ove razlike statistiĉki znaĉajne (p<0.05). Vrednosti ovih parametara III grupe ostaju niţe u odnosu na I grupu, ali ta razlika nije statistiĉki znaĉajna (p>0.05) (Grafikon 10A i B). Grafikon 10. Proseĉna zapreminska gustina vezivnog tkiva i proseĉna zapreminska gustina krvnih sudova (A); proseĉna površinska gustina krvnih sudova (B) adenohipofize kod grupa dobijenih klasifikacionom analizom. VVT VVKS Rezultati 68 Konaĉno, trend proseĉnih vrednosti duţinske gustine krvnih sudova adenohipofize ispiti- vanih grupa se blago razlikuje od trenda proseĉne zapreminske i površinske gustine. Ona se statistiĉki znaĉajno razlikuje izmeĊu dobijenih grupa (F(2,26) = 25.33, p<0.0001), pri ĉemu kao i kod dva napred navedena parametra njena vrednost je statistiĉki znaĉajno najniţa u II u odnosu na I i III grupu (p<0.05). Vrednost ovog parametra u III grupi je viša u odnosu na I grupu, ali ta razlika nije statistiĉki znaĉajna (p>0.05). Uoĉene razlike se karakterišu veoma velikim efektom velĉine (ƞ2 = 0.66) (Grafikon 11). Dakle, sluĉajevi II grupe se odlikuju slabi- jom vaskularizacijom u odnosu na I i III grupu. Grafikon 11. Proseĉna duţinska gustina krvnih sudova adenohipofize kod grupa dobijenih klasifikacionom analizom. Prema tome, klasifikacionom analizom dobijene su tri grupe, prva u proseku najmlaĊa i dve grupe znaĉajno starije u odnosu na I, ali ĉija se starost meĊusobno nije statistiĉki znaĉajno razli- kovala. Adenohipofize sluĉajeva dve starije grupe su se karakterisale izrazitijom fibrozom u od- nosu na I grupu. Sadrţaj vezivnog tkiva se nije znaĉajno razlikovao izmeĊu napred navedene dve grupe. Proces starenja je praćen i porastom veliĉine ćelija adenohipofize. Ipak, taj porast nije line- aran. Sluĉajevi II grupe, u proseku mlaĊi od sluĉajeva III grupe se karakterišu nešto izrazitijom hipertrofijom analiziranih ćelija u odnosu na preostale dve grupe, ali i slabijom vaskularizacijom u odnosu na I i III grupu. Konaĉno, broj sluĉajeva muškog i ţenskog pola se ne razlikuje statisti- ĉki znaĉajno kod grupa dobijenih klasifikacionom analizom (χ2 = 1.84, SS = 2, n = 29, p = 0.40). Rezultati 69 Morfometrijska analiza imunohistohemijski obrađenih preparata Morfometrijska analiza imunohistohemijski obojenih preseka obuhvatala je kvantifika- ciju prisustva kolagena tipa IV, kortikotropnih i folikulostelatnih ćelija kod sluĉajeva razliĉi- tog pola i starosti. Rezultati imunohistohemijskog dela morfometrijske analize su prezentovani u Tabeli 7. Tabela 7. Proseĉne vrednosti zapreminske gustine kolagena tipa IV, zatim zapreminske gustine ACTH pozitivnih i zapreminske gustine S-100 pozitivnih ćelija adenohipofize svih 15 analiziranih sluĉajeva. Sluĉaj Starost Pol VVCol IV VVACTH VVFSC 1 44 Muški 9.68 5.08 1.71 2 46 Ţenski 10.30 6.03 3.48 3 51 Ţenski 10.52 10.37 3.73 4 55 Muški 13.57 11.53 3.57 5 56 Ţenski 13.03 6.59 3.75 6 66 Muški 15.23 12.33 4.21 7 70 Muški 18.19 10.81 2.36 8 71 Ţenski 19.67 16.52 4.17 9 73 Ţenski 14.27 12.98 3.11 10 75 Muški 20.29 12.64 2.38 11 80 Muški 17.74 17.50 4.28 12 80 Ţenski 13.74 17.90 6.33 13 81 Ţenski 16.05 4.91 14 83 Ţenski 16.33 14.35 3.34 15 89 Muški 18.13 14.80 6.34 VVCol IV – volumenska gustina kolagena tipa IV VVACTH – volumenska gustina ACTH pozitivnih ćelija VVFSC – volumenska gustina folikulostelatnih ćelija Korelaciona analiza je ukazala na prisustvo statistiĉki znaĉajne korelacije izmeĊu starenja i svih ispitanih morfometrijskih parametara. Tako je uoĉena statistiĉki znaĉajna korelacija iz- meĊu starosti ispitanih sluĉajeva i proseĉne zapreminske gustine kolagena tipa IV (R = 0.77, n = 15, p = 0.001), zatim proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih (R = 0.85, n = 14, p<0.0001) i na kraju proseĉne zapreminske gustine S-100 pozitivnih (R = 0.55, n = 15, p = 0.035) ćelija adenohipofize (Tabela 8). Rezultati 70 Tabela 8. Korelaciona matrica morfometrijskih parametara i starosti imunohistohemijski analiziranih sluĉajeva. Parametar VVCol IV VVACTH VVFSC Starost R 0.77 0.85 0.55 p 0.001 0.000 0.035 n 15 14 15 VVCol IV R 0.67 0.17 p 0.009 0.556 n 14 15 VVACTH R 0.61 p 0.022 n 14 VVCol IV – volumenska gustina kolagena tipa IV VVACTH – volumenska gustina ACTH pozitivnih ćelija VVFSC – volumenska gustina folikulostelatnih ćelija Dodatno, ustanovljena je i statistiĉki znaĉajna korelacija izmeĊu proseĉne zapreminske gustine kolagena tipa IV i proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih ćelija adenohipo- fize (R = 0.67, n = 14, p = 0.009), što se moţe objasniti kao posledica procesa starenja. Ko- naĉno, uoĉena je statistiĉki znaĉajna korelacija izmeĊu proseĉne zapreminske gustine ACTH i S-100 pozitivnih ćelija adenohipofize (R = 0.61, n = 14, p = 0.022). Uoĉene veze izmeĊu analiziranih morfometrijskih parametara i starosti ispitanih sluĉajeva, kao i izmeĊu proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih i S-100 pozitivnih ćelija ade- nohipofize, detaljnije su analizirane linearnom regresionom analizom. Veoma jaka i statistiĉki znaĉajna korelacija izmeĊu proseĉne zapreminske gustine kolagena tipa IV i starosti ispitanih sluĉajeva, kao i proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih ćelija adenohipofize i starosti ukazala je na moguće prisustvo multikolinearnosti, usled ĉega linearna regresiona analiza izmeĊu proseĉne zapreminske gustine kolagena tipa IV kao nezavisne i proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih ćelija adenohipofize kao zavisne promenljive nije izvršena. Tokom linearne regresione analize ispitivana je prediktivna sposobnost starosti ispitanih sluĉajeva, kao nezavisne promenljive, i proseĉne zapreminske gustine kolagena tipa IV, zatim proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih, kao i proseĉne zapreminske gustine S100 pozitivnih ćelija adenohipofize, kao zavisnih promenljivih. MeĊusobne veze su ispitivane po- moću zasebnih modela za svaku zavisnu promenljivu. Kada je u pitanju kolagen tipa IV, identifikovani model (VVCol IV = 2.82 + 0.18  starost) je objašnjavao 56% ukupne varijanse njegove zapreminske gustine (korigovani R2 = 0.56), što predstavlja veliki efekat (Grafikon 12A) i ukazuje na statistiĉki znaĉajan uticaj starenja na Rezultati 71 prisustvo kolagena tipa IV u adenohipofizi ispitanih sluĉajeva (F(1,13) = 18.34, p = 0.0008). Dobijeni rezultati su saglasni statistiĉki znaĉajnom porastu prisustva vezivnog tkiva u adeno- hipofizi tokom procesa starenja, uoĉenom tokom histohemijskog dela istraţivanja. Grafikon 12. Proseĉna zapreminska gustina kolagena tipa IV (A), proseĉna zapreminska gustina ACTH pozitvnih (B) i proseĉna zapreminska gustina S-100 pozitivnih ćelija (C) adenohipofize tokom procesa starenja. V V C o l I V ( % ) V V A CT H ( % ) V V FS C ( % ) Rezultati 72 Sliĉno proseĉnoj zapreminskoj gustini kolagena tipa IV, uoĉen je statistiĉki znaĉajan porast proseĉne zapreminske gustine ACTH pozitivnih ćelija adenohipofize tokom procesa starenja (F(1,12) = 30.49, p = 0.0001). Jednaĉina dobijena linearnom regresionom analizom (VVACTH = 0.24  starost  4.02) je ukazala da starost objašnjava 69% ukupne varijanse ovog parametra (korigovani R 2 = 0.69), što takoĊe predstavlja veoma veliki efekat (Grafikon 12B). Konaĉno, proseĉna zapreminska gustina S-100 pozitivnih ćelija adenohipofize takoĊe statistiĉki znaĉajno raste tokom procesa starenja (F(1,13) = 5.51, p = 0.035). Dobijeni model (VVFSC = 0.46 + 0.05  starost) je ukazao da starost objašnjava 24% ukupne varijanse ovog parametra (korigovani R 2 = 0.24), što predstavlja umereni efekat (Grafikon 12C). Prema tome, pored procesa starenja, na porast prisustva adrenokortikotropnih ćelija u adenohipofizi moţe da utiĉe povećano prisustvo folikulostelatnih ćelija u njoj. Rezultati linearne regresione analize su potvrdili napred navedenu pretpostavku i ukazali da porast prisustva folikulo- stelatnih ćelija prati statistiĉki znaĉajan porast prisustva adrenokotikotropnih ćelija kod ispitanih sluĉajeva (F(1,12) = 6.93, p = 0.022). Identifikovana jednaĉina (VVACTH = 5.05 + 1.87  VVFSC) je ukazala da proseĉna zapreminska gustina folikulostelatnih ćelija objašnjava 31% ukupne varijanse proseĉne zapreminske gustine adrenokortikotropnih ćelija (korigovani R 2 = 0.31), što predstavlja umereni efekat i sa 69% varijanse koju objašnjava starost ispitanog sluĉaja zajedno objašnjava 100% ukupne varijanse ovog parametra (Grafikon 13). Grafikon 13. Scatter dijagram korelacije proseĉne zapreminske gustine folikulostelatnih i proseĉne zapreminske gustine adrenokortikotropnih ćelija. Rezultati 73 Analiza razlika imunohistohemijskih morfometrijskih parametara sluĉajeva koji su pripadali grupama dobijenim tokom histohemijskog dela morfometrijske analize ispitivana je pomoću jednofaktorske analize varijanse. Na taj naĉin je detaljnije ustanovljavana dinamika ovih parametara tokom procesa starenja. Tako, proseĉna zapreminska gustina kolagena tipa IV se statistiĉki znaĉajno razlikuje izmeĊu imunohistohemijski ispitanih sluĉajeva grupa dobijenih tokom klasifikacione analize histohemijskog dela studije (F(2,12) = 14.47, p = 0.0006). Dodatno, Tukey-Kramer post hoc test je pokazao da su proseĉne vrednosti ovog parametra II i III grupe statistiĉki znaĉajno više u odnosu na I grupu (p<0.05). Proseĉna zapreminska gustina kolagena tipa IV II grupe je nešto viša u odnosu na III grupu koja je u proseku starija, ali ta razlika nije statistiĉki znaĉaj- na (p>0.05) (Grafikon 14A). To je saglasno rezultatima histohemijskog dela morfometrijske analize koji se odnose na sadrţaj vezivnog tkiva u adenohipofizi. Efekat veliĉine ove razlike je veoma veliki (ƞ2 = 0.71). Proseĉna zapreminska gustina adrenokortikotropnih ćelija se takoĊe statistiĉki znaĉajno razlikuje izmeĊu ispitivanih grupa (F(2,11) = 12.13, p = 0.002). Tukey-Kramer post hoc test je dodatno ukazao da su proseĉne vrednosti ovog parametra statistiĉki znaĉajno više u II i III u odnosu na I grupu (p<0.05). Zapreminska gustina ACTH pozitivnih ćelija III grupe je viša u odnosu na II grupu, ali ta razlika nije statistiĉki znaĉajna (p>0.05) (Grafikon 14B). Efekat veliĉine uoĉenih razlika je i u ovom sluĉaju bio veliki (ƞ2 = 0.69). Konaĉno, proseĉne vrednosti zapreminske gustine folikulostelatnih ćelija sluĉajeva I i II grupe su niţe u odnosu na sluĉajeve III grupe (Grafikon 14C), ali ta razlika nije statistiĉki znaĉajna (p>0.05). Prema tome, rezultati imunohistohemijske analize su u velikoj meri saglasni sa rezultati- ma histohemijske analize. Druga grupa, za koju je tokom histohemijske analize ustanovljeno da ukljuĉuje sluĉajeve pribliţno iste starosti, zatim koji se karakterišu pribliţno istim pri- sustvom vezivnog tkiva i sliĉnim stepenom hipertrofije ćelija adenohipofize, ali i slabijom vaskularizacijom u odnosu na III grupu, imunohistohemijski odlikuje sliĉan sadrţaj kolagena tipa IV, kao i adrenokortikotropnih ćelija, kao i u III grupi. Vrednosti ovih parametara su više kod ove dve grupe u odnosu na I grupu. Ipak, prisustvo folikulostelatnih ćelija kod sluĉajeva II grupe je znatno niţe u odnosu na III, a veoma sliĉno stepenu njihovog prisustva u I grupi. Rezultati 74 Grafikon 14. Proseĉna zapreminska gustina kolagena tipa IV (A), adrenokortikotropnih ćelija (B) i folikulostelatnih ćelija (C) kod grupa dobijenih klasifikacionom analizom. Konaĉno sadrţaj kolagena tipa IV, adrenokortikotropnih ćelija, kao i folikulostelatnih ćelija ne razlikuje se statistiĉki znaĉajno (p>0.05) izmeĊu imunohistohemijski analiziranih sluĉajeva muškog i sluĉajeva ţenskog pola (Grafikoni 15 A, B, C, D). V V C o l I V ( % ) V V A CT H ( % ) V V FS C ( % ) Rezultati 75 Grafikon 15. Proseĉna zapreminska gustina kolagena tipa IV (A), adrenokortikotropnih ćelija (B) i folikulostelatnih ćelija (C) kod imunohistohemijski analiziranih sluĉajeva muškog i ţenskog pola. V V C o l I V ( % ) V V A C TH ( % ) V V FS C ( % ) 76 DISKUSIJA U toku poslednjih decenija sve je više istraţivaĉa koji pretpostavljaju da su endokrine ţlezde odgovorne za nastanak pojedinih promena koje se uoĉavaju u ĉoveĉijem organizmu tokom starenja. Potporu za te svoje tvrdnje su našli u sliĉnoj kliniĉkoj slici i patološkom supstratu razliĉitih endokrinih poremećaja i odreĊenih kliniĉkih sindroma koji se ĉešće uoĉa- vaju kod starih individua. Šezdesetih godina XX veka znaĉajan napredak u razumevanju hi- potalamusnih regulatornih sistema je doprineo razvoju teorija koje su isticale u prvi plan ulo- gu alteracija neuroendokrinih regulatornih sistema u procesu starenja, što je bilo praćeno seri- jom eksperimenata u cilju njihovog daljeg širenja i potvrde. Tako su prikupljeni dokazi o uti- caju hormona iz cirkulacije na pojavu starosnih promena u mozgu. MeĊu njima se istiĉe i po- datak da je kod pacova ustanovljena veza izmeĊu obima starosnih promena mozga i intenzite- ta aktivnosti kore nadbubreţne ţlezde tokom starenja. Napred navedene interakcije mozga i endokrinog sistema mogu rezultirati njegovim ubrzanim oštećenjem i pojavom poslediĉnih neuroendokrinih poremećaja. Uprkos velikom interesovanju za izdvajanje onih endokrinih faktora ĉija bi uloga bila kljuĉna u starenju prvenstveno sisara, pokušaji da se to i eksperi- mentalno potvrdi su bili retki (Landfield i sar., 1980). Endokrina, kao i sva ostala tkiva trpe tokom starenja strukturalne promene sliĉnog ka- raktera koje na kraju dovode do promena sekrecije odgovarajućih hormona. Pri tome, obrazac sekrecije hipotalamusnih i perifernih hormona se bitno razlikuje. Nivoi nekih hormona sa sta- renjem rastu, drugih opadaju, dok se nivoi ostalih hormona tokom starenja bitnije ne menjaju. Starenje hipofize se u funkcionalnom pogledu uglavnom manifestuje padom njene sekretorne aktivnosti, što potvrĊuju rezultati pojedinih studija koje su detektovale sniţene nivoe hormo- na rasta, prolaktina, tireostimulišućeg hormona i gonadotropina u krvi. Takav poremećaj ravnoteţe u funkcionisanju endokrinih ţlezda vodi ka pojavi sindroma zbog kojih se on pre- dominantno karakteriše padom fizioloških funkcija (Landfield i sar., 1980; Rudman i sar., 1990; Herman i sar., 2001; Smith i sar., 2005). Tokom starenja, znaĉajne morfološke i funkcionalne promene se mogu uoĉiti na razliĉi- tim nivoima HPA osovine. Znaĉajan pad broja neurona i kompenzatorna glioza se mogu uoĉiti u delovima hipotalamusa, hipokampusa i limbiĉkog sistema. Degenerativne promene na nivou hipokampusa koje se javljaju tokom fiziološkog starenja, mogu biti odgovorne za njegovu slabiju osetljivost na glikokortikoide, što za rezultat ima odreĊeni stepen hiper- Diskusija 77 aktivnosti HPA osovine kod zdravih starih ljudi (Ferrari i sar., 2001). HPA osovina u starosti postaje manje fleksibilna i manje senzitivna na signale negativne povratne sprege koji bi nor- malno doveli do efikasnog završetka odgovora na inicijalni stimulus. To moţe rezultirati si- nergistiĉkom kaskadom promena tokom kojih prolongacija povišenih nivoa glikokortikoida u krvi poreklom iz nadbubreţne ţlezde moţe povećati rizik za nastanak pojedinih patoloških stanja koja se ĉešće javljaju sa starenjem (Seeman i Robbins, 1994). Uprkos velikom znaĉaju koji se pridaje adenohipofizi za odrţavanje homeostaze celo- kupnog ljudskog organizma, studije o njenim strukturnim promenama tokom procesa starenja su veoma oskudne. Još su reĊe kvantitativne studije koje bi ukazale na intenzitet istih. Ade- kvatne studije sprovedene na humanom materijalu napred navedenih promena hipofize su retke, tako da se u savremenoj literaturi mogu pronaći rezultati sliĉnih studija ali sprovedenih na eksperimentalnim ţivotinjama. MeĊu njima dominiraju kvantitativne imunohistohemijske, kao i elektronomikroskopske studije hipofize pacova (Takahashi i sar., 1983; Console i sar., 1994, 1995, 1997, 1998; Jurado i sar., 1998). Makroskopski, ispitivanje starosnih promena hipofize vršeno je in vivo pomoću kompju- terizovane tomografije (CT). Tako su Peyster i sar. (1983) prouĉavajući volumen hipofize otkrili da je ona kod adolescenata krupnija u odnosu na osobe mlaĊe i starije ţivotne starosti, kao i to da su njena proseĉna zapremina i visina više kod ţena u odnosu na muškarce. Prema njima, visina hipofize je pokazivala pad sa starenjem. Sliĉne rezultate su dobili i Suzuki i sar. (1990) tokom svog istraţivanja. Elster i sar. (1990) su tokom svog istraţivanja došli do sazna- nja da je zapremina hipofize znaĉajno viša kod adolescenata i odraslih u odnosu na decu. Lurie i sar. (1990) su koristivši magnetnu rezonancu (MRI) detektovali pad visine, volumena i popreĉnog preĉnika hipofize sa starenjem, dok polne razlike nisu uoĉili. Doraiswamy i sar. (1992) su merili visinu i popreĉni preĉnik hipofize, pri ĉemu su takoĊe došli do zakljuĉka da vrednosti ovih parametara opadaju sa starenjem. Najviše vrednosti visine hipofize izmerene su kod ţenskih osoba starosti od 20-40 godina. Najviše vrednosti visina hipofize dostiţe kod muškaraca i ţena u drugoj deceniji ţivota. Argyropoulou i sar. (1991) su ispitivali visinu hi- pofize mladih osoba na sagitalnim MRI snimcima i uoĉili linearni porast njenih vrednosti po- ĉev od prve godine do puberteta, nakon ĉega se njene vrednosti nisu znaĉajno menjale. U naj- većoj studiji do tada sprovedenoj na preko hiljadu sluĉajeva starosti od 10-78 godina, Tsuno- da i sar. (1997) su pratili visinu hipofiza na sagitalnim MRI snimcima. Generalno, rezultati ove studije su pokazali da je visina hipofize viša kod ţena u odnosu na muškarce i da raste do 29. godine, nakon ĉega njene vrednosti opadaju. Najviši porast visine hipofize, napred nave- deni autori su uoĉili kod ţena starosti od 50-59 godina, što moţe da predstavlja posledicu Diskusija 78 promena sekrecije gonadotropin rilizing hormona koje nastaju u tom periodu. Takano i sar. (1999) su prouĉavali volumen hipofiza osoba razliĉite starosti i zabeleţili nagli porast njego- vih vrednosti tokom puberteta i to posebno kod ţena. Volumen zadnjeg reţnja hipofize nije se menjao sa starenjem. Tien i sar. (1992) su ispitivali vrednosti istog parametra kod dece i nisu zabeleţili znaĉajne razlike u odnosu na pol. MacMaster i sar. (2007) su u svojoj studiji naveli da mlaĊe ţene imaju signifikantno viši volumen hipofize u odnosu na mlaĊe muškarce (starosti 14-17 godina). U ostalim starosnim grupama, nisu uoĉili razlike meĊu polovima. Kod sluĉajeva muškog, kao i ţenskog pola, mlaĊi subjekti su se karakterisali znaĉajno niţim vrednostima kvantitativnih parametara hipofize u odnosu na starije sluĉajeve i to znatno izra- zitije kod ţenskog u odnosu na muški pol. Statistiĉki znaĉajna pozitivna korelacija izmeĊu volumena hipofize i godina starosti uoĉena je i kod mlaĊih i kod starijih sluĉajeva ţenskog pola. Kod muškaraca ova korelacija nije uoĉena. Ovi rezultati su saglasni sa rezultatima ve- ćine prethodnih istraţivanja (Peyster i sar., 1983, 1986; Suzuki i sar., 1990; Doraiswamy i sar., 1992; Tsunoda i sar., 1997), osim u sluĉaju studije sprovedene od strane Lurie-a i sar. (1990), koji nisu pronašli razlike u volumenu hipofize meĊu polovima. Polne razlike u volu- menu hipofiza tokom odrastanja mogu biti objašnjene razliĉitim hormonskim promenama kod muškog i ţenskog pola u detinjstvu i adolescenciji. Ranija pojava puberteta kod ţenskog pola moţe predstavljati osnovu za nastanak razlika u volumenu hipofize u odnosu na sluĉaje- ve muškog pola istog uzrasta (Hayakawa i sar., 1989; Elster i sar., 1990; Argyropoulou i sar., 1991; Takano i sar., 1999). Za razliku od prethodnih studija, Terano i sar. (1996) su ispitivali predominantno starosne promene hipofize primenom MRI metode. Njihovi rezultati su uka- zali da su visina, širina i volumen hipofize starijih subjekata znaĉajno niţi u odnosu na iste mlaĊih sluĉajeva. Prazna sella turcica je mnogo ĉešće registrovana kod starih, i to naroĉito osoba ţenskog pola (19%) u odnosu na mlaĊe. U funkcionalnom smislu, nije ustanovljena ve- za izmeĊu veliĉine ili volumena hipofize i bazalnih nivoa njenih hormona. Kunihiko i sar. (2002) su se u svojoj kliniĉkoj MRI studiji bavili morfološkim promena- ma hipofize kod sluĉajeva razliĉitog uzrasta i pola. Njihovi rezultati su potvrdili da tokom pu- berteta dolazi do porasta njene visine, sa najvišim vrednostima tokom perioda od treće do pe- te decenije ţivota. To su objasnili ĉinjenicom da su u prvoj i drugoj deceniji ţivota dimenzije kranijuma manje, što neposredno uslovljava manje dimezije svih struktura unutar njega, pa samim tim i hipofize. Drugo, hipofiza je endokrinološki najaktivnija kod ţena za vreme re- produktivnog perioda izmeĊu treće i pete decenije ţivota. Konaĉno, kod starijih osoba dolazi do pojave ishemijske degeneracije adenohipofize (Roppolo i sar., 1983; Elster i sar., 1990; FitzPatrick i sar., 1999). Visina hipofize moţe da se menja i usled pritiska anatomskih stru- Diskusija 79 ktura u okolini turskog sedla. Kunihiko i sar. (2002) su prouĉavali i oblik hipofize. Kod 88% muškaraca mlaĊih od 20 godina hipofize su bile zaravnjene. Uĉestalost ovakve njene forme je padala tokom starenja i uoĉena je kod 52% muškaraca starosti od 20-49 godina, dok je kon- veksni tip hipofize naĊen u 26% sluĉajeva. U grupi muškaraca starijih od 50 godina konkavni tip hipofize je uoĉen kod 50%, dok je zastupljenost zaravnjenog tipa rasla i dostigla 35%. Kod ţena, oko polovina individua starosti ispod 20 godina karakterisalo je prisustvo kon- veksnog tipa hipofize, ĉemu je prethodio porast njene visine. On se moţe objasniti dispropor- cijom izmeĊu izrazitog povećanja endokrinološke aktivnosti u tom periodu ţivota, a nedo- voljnim uvećanjem volumena intraselarnog prostora. Distribucija ostalih morfoloških tipova hipofize u drugim starosnim grupama bila je ista kao kod muškaraca. Kada su u pitanju studije koje su se bavile ispitivanjem starosnih promena hipofize na mikroskopskom nivou, kao i kod sliĉnih studija sprovedenih na drugim endokrinim i neendo- krinim strukturama, u centru njihove paţnje nalazili su se dinamika celularnosti, zatim pri- sustva vezivnog tkiva i prokrvljenosti hipofize tokom ovog procesa. Što se celularnosti tiĉe, tokom našeg istraţivanja vršena je kvantifikacija veliĉine i oblika ćelija adenohipofize, kao i merenje optiĉke gustine tkiva adenohipofize. Rezultati su ukazali da veliĉina endokrinih ćelija adenohipofize znaĉajno raste tokom starenja, što se moţe pripi- sati njihovoj kompenzatornoj hipertrofiji. Porast njihove veliĉine nije praćen znaĉajnijom promenom njihovog oblika. Paralelno sa ovim promenama, uoĉen je i porast optiĉke gustine tkiva adenohipofize starijih sluĉajeva, što bi moglo indirektno da ukaţe na povećano pri- sustvo bazofilnih ćelija kod njih. Kada su u pitanju polne razlike, sluĉajevi ţenskog pola se karakterišu krupnijim endokrinim ćelijama, pravilnijeg oblika u odnosu na iste muškog pola, dok više vrednosti optiĉke gustine kod muškog pola mogu indirektno da ukaţu na veće pri- sustvo bazofila u odnosu na sluĉajeve ţenskog pola. Porast broja bazofila adenohipofize sta- rih ţivotinja uoĉili su i Danilova i sar. (1988). Oni takoĊe navode da je taj porast praćen isto- vremenim smanjenjem broja acidofila. Isti autori ne navode u rezultatima svoje studije pri- sustvo polnih razlika, kao ni moguće razloge porasta prisustva bazifila tokom starenja. Kako bazofili predstavljaju heterogenu populaciju ćelija, Danilova i sar. (1988) ne navode dalje da li je taj porast posledica porasta broja kortikotropa, tireotropa ili gonadotropa. Porast zapre- minske gustine kortikotropa koji je tokom našeg istraţivanja uoĉen kod najstarijih sluĉajeva moţe delimiĉno da objasni napred navedeni porast bazofila od strane Danilova i sar. (1988). Znaĉajne razlike izmeĊu sluĉajeva ţenskog i muškog pola, kada je u pitanju zapreminska gu- stina ACTH ćelija nisu uoĉene ni tokom naše studije. Uoĉeni porast prisustva kortikotropnih ćelija kod starih sluĉajeva tokom našeg istraţivanja indirektno podupire i porast nivoa ACTH Diskusija 80 u serumu zdravih starih individua od strane Herman-a i sar. (2001). Prema njima, porast se- krecije ACTH sa starenjem, a samim tim i porast broja kortikotropa, nastaje kao posledica poremećene sekrecije CRH iz parvocelularnog dela PVN-a hipotalamusa, koje predstavlja u hijerarhijskom smislu najviši centar HPA osovine. Njegovi neuroni pokazuju brojne stare- njem izazvane funkcionalne promene meĊu kojima je smanjena sinteza i sekrecija CRH od znaĉaja za funkcionisanje HPA osovine. Isti autori (Herman i sar., 2001) pretpostavljaju da je povišena sekrecija ACTH posledica povišene osetljivosti adenohipofize na CRH. Napred na- vedeni pad sekrecije CRH bi mogao da predstavlja i stimulus za paralelni kompenzatorni po- rast prisustva kortikotropnih ćelija adenohipofize, mehanizmom hiperplazije ili njihove hiper- trofije, uoĉen tokom našeg istraţivanja. To bi dodatno moglo da objasni porast nivoa ACTH tokom starenja registrovan od strane Herman-a i sar. (2001). Dodatno, Landfield i sar. (1980) navode da vrednosti ACTH rastu nakon dejstva akutnog stresa. Taj fenomen je praćen hiper- senzitivnošću adrenalnog korteksa na izluĉeni hormon, što na kraju onemogućava adekvatnu regulaciju i prekid sekrecije glikokortiokoida mehanizmom negativne povratne sprege. Hiper- trofija zone fascikulate i zone retikularis nadbubreţne ţlezde registrovana od strane Hauger-a i sar. (1994) verovatno bi mogla da predstavlja krajnju kariku u ĉitavom procesu. Starenje predstavlja proces tokom koga je ĉoveĉiji organizam izloţen dejstvu hroniĉnog stresa. Uoĉe- na pozitivna korelacija izmeĊu nivoa ACTH, kortikosterona i teţine nadbubreţne ţlezde sa jedne i starosti eksperimentalnih ţivotinja, sa druge strane od strane Landfield – a i sar. (1980) bi indirektno mogla da ukaţe da sliĉni mehanizmi mogu biti odgovorni za pojaĉanu aktivaciju HPA osovine kod zdravih starih individua. U savremenoj literaturi prisutni su podaci i o dinamici prisustva ostalih funkcionalnih ti- pova endokrinih ćelija adenohipofize tokom procesa starenja. Tako su Sun i saradnici (1984) tokom svog istraţivanja na humanim hipofizama konstatovali znaĉajan pad broja i veliĉine somatotropa sa starenjem. Console i saradnici (1993) su prouĉavali starosne promene morfo- logije i funkcije somatotropa (STH) kod pacova. Oni su kvantitativnom imunohistohe- mijskom analizom ustanovili signifikantan pad broja, volumenske i površinske gustine, kao i blaţi ali takoĊe signifikantan pad aree i perimetra somatotropa. Console i sar. (1994) su pro- uĉavali prisustvo gonadotropa tokom procesa starenja. Gonadotrope su opisali kao jasno defi- nisan tip ćelija sa heterogenom distribucijom u pars distalis-u hipofize svih starosnih grupa. Dobijene vrednosti stereoloških parametara (numeriĉka, volumenska i površinska gustina) oba tipa gonadotropnih ćelija (FSH i LH) pokazale su znaĉajan pad tokom starenja. Area i pe- rimetar gonadotropa starijih pacova su bili statistiĉki znaĉajno niţi u odnosu na iste ćelija mlaĊih ţivotinja. Ipak, zabeleţeni pad prisustva napred navedenih ćelija nije bio praćen odgo- Diskusija 81 varajućim padom nivoa LH i FSH. U narednoj svojoj studiji, Console i sar. (1995) su izuĉa- vali starosne promene tirotropa pacova. Rezultati imunohistohemijske i radioimunološke ana- lize adenohipofize ukazali su na znaĉajan pad broja, volumenske i površinske gustine, kao i pad aree i perimetra ovih ćelija tokom procesa starenja. Nasuprot ćelijama, bazalni nivoi TSH u serumu su tokom starenja pokazali porast. Konaĉno, Console i sar. (1997; 1998) su dokaza- li i signifikantan pad celularne i volumenske gustine laktotropa kod pacova muškog pola. Kod pacova ţenskog pola zabeleţen je znaĉajan pad samo celularne gustine istih. Ultrastru- kturna analiza laktotropa starih pacova ukazala je na hiperstimulaciju ovih ćelija kod njih, sa prisustvom prolaktotropa u fazi involucije. Nivoi prolaktina u serumu su tokom starenja po- kazali znaĉajan porast kod ţenskog, dok se kod muškog pola nisu znaĉajno menjali. Prema tome, na osnovu napred navedenog, moţe se zakljuĉiti da kod većine funkcionalnih tipova endokrinih ćelija adenohipofize dolazi do pada prisustva tokom starenja. Ipak, sekrecija od- govarajućih hormona ostaje stabilna, što ukazuje na moguću hipertrofiju preostalih ćelija i sa- glasno je porastu veliĉine ćelija adenohipofize koji je uoĉen kod starijih sluĉajeva tokom naše studije. Danilova i sar. (1988) su analizirali ultrastukturne promene tokom starenja svih funkci- onalnih tipova endokrinih ćelija adenohipofize pacova. Kortikotropne ćelije starih sluĉajeva karakterisale su se krupnim euhromatskim jedrima unutar kojih su se uoĉavala jedarca sa ra- zvijenom granularnom komponentom. Endoplazmatski retikulum je bio saĉinjen od sitnih va- kuola, koje su u pojedinim ćelijama bile veoma distendirane. Goldţijev aparat je bio dobro razvijen i u njegovoj okolini su se uoĉavale novoformirane sekretorne granule. Normalno, kod mlaĊih ţivotinja u kortikotropnim ćelijama uoĉavao se veći broj mitohondrija. Sekretor- ne granule su im bile rasporeĊene u vidu nizova, neposredno do plazma membrane, pri ĉemu je njihov broj bio donekle viši u odnosu na starije sluĉajeve. TakoĊe su uoĉena i mnogobrojna lizozomalna telašca i lipidne kapi. Dodatno, adenohipofize starih ţivotinja sadrţale su veći broj tamnih i distrofiĉno izmenjenih endokrinih ćelija, što govori u prilog njihovoj progre- sivnoj degeneraciji tokom starenja. Ostale, morfološki normalne ćelije su većinom ispoljavale ultrastrukturne znake pojaĉane funkcije. To je imalo za posledicu oĉuvanje bazalnih nivoa sekrecije hormona, ali i iscrpljivanje funkcionalne rezerve adenohipofize starih u poreĊenju sa mlaĊim sluĉajevima. Prema tome, u hipofizi se tokom starenja uoĉava kompenzatorna strukturalna reorganizacija usmerena ka odrţavanju njene normalne funkcije, što omogućava odrţavanje osnovnih homeostatskih mehanizama organizma koji stari i saglasno je rezulta- tima naše studije. Diskusija 82 Prema tome, iz gore navedenog moţe se zakljuĉiti da tokom procesa starenja dolazi do znaĉajnog pada broja većine funkcionalnih tipova endokrinih ćelija adenohipofize. To je pra- ćeno paralelnim procesom porasta veliĉine preostalih ćelija istog funkcionalnog tipa i moţe da se objasni procesom kompenzatorne hipertrofije kojim ljudski organizam pokušava da na- doknadi gubitak funkcionalnih ćelija. Na taj naĉin, nivoi hormona koji predstavljaju produkt sekrecije adenohipofize se uglavnom ne menjaju znaĉajno kod zdravih starih individua u odnosu na iste mlaĊeg uzrasta. Rezultati linearne regresione analize naše studije ukazali su na prisustvo statistiĉki znaĉajne pozitivne korelacije izmeĊu starosti ispitanih sluĉajeva i veliĉine ćelija adenohipofize, što je saglasno sa rezultatima napred navedenih studija. Proliferacija vezivno tkivnih struktura predstavlja veoma bitnu komponentu starosnih promena većine organa ljudskog organizma. Studije koje su se bavile prouĉavanjem vezivnog tkiva i komponentama ekstracelularnog matriksa adenohipofize tokom procesa starenja su malobrojne. Danilova i sar. (1988) su sproveli ultrastrukturnu analizu adenohipofize više vrsta ekspe- rimentalnih ţivotinja tokom procesa starenja. U hipofizi starih ţivotinja svih prouĉavanih vr- sta uoĉene su suštinske strukturalne promene strome. Njena kapsula se sastojala iz većeg bro- ja slojeva vezivnog tkiva, uz prisutna ţarišta hijalinoze. Vaskularizacija ţlezde je bila slabija u odnosu na mlaĊe sluĉajeve, dok su perikapilarni prostori bili prošireni, a bazalne membrane krvnih sudova zadebljane. Broj pseudofolikula sa sadrţajem sliĉnim koloidu glikoproteinske prirode je bio viši kod starih ţivotinja. Ayisi i sar. (1982) su takoĊe u svojoj studiji naveli da, kao direktna posledica starenja, dolazi do redukcije parenhima adenohipofize sa smanjenjem broja i atrofijom preostalih endokrinih ćelija, i istovremene proliferacije vezivnog tkiva, posebno kolagena. Osim periva- skularne fibroze, autori napred navedene studije navode da u hipofizama sluĉajeva starijih od 90 godina se mogu uoĉiti i sporadiĉno prisustvo fokalne nekroze, oţiljnog tkiva, adenoma, depozita gvoţĊa ili amiloida, bazofilne invazije, nakupina skvamoznih ćelija, kao i granular- nih ćelija nalik tumorskim. Mi tokom naše studije nismo uoĉili promene takve prirode u izu- ĉavanom materijalu. Sano i sar. (1993) su primenom semikvantitativnih metoda ustanovili prisustvo najpre intersticijalne i perivaskularne fibroze koja se zatim širila i zahvatala i parenhimalne strukture hipofize kod 88% sluĉajeva starosti preko 90 godina i to predominantno muškog pola. Isti autori ĉak navode da je kod nekoliko sluĉajeva praktiĉno cela ţlezda je bila zahvaćena fibro- zom. Proliferacija vezivnog tkiva je bila najintenzivnija u središnjem (medijalnom) delu ţle- zde, koji inaĉe karakteriše veće prisustvo vezivnog tkiva u odnosu na njene lateralne delove Diskusija 83 (“krila”). Zato su Sano i sar. (1993) procenu stepena fibroze adenohipofize vršili na osnovu intenziteta prisustva vezivnog tkiva u lateralnim delovima pars distalis-a. Umerenije forme fibroze karakterisale su se blagom proliferacijom perivaskularnog vezivnog tkiva. Teţe forme karakterisalo je prisustvo ekstenzivnije proliferacije vezivno tkivnih komponenti i u preosta- lim delovima parenhima adenohipofize, što je bilo praćeno narušavanjem njegove normalne arhitekture i na kraju degeneracijom i gubitkom plemenitog tkiva ţlezde. Napred navedene promene su prema Sano-u i saradnicima (1993) bile najupadljivije u onim partijama lateralnih “krila” pars distalisa, u kojima su normalno smeštene laktotropne ćelije. Izrazita fibroza, uoĉena kod najstarijih sluĉajeva, je prema njima bila udruţena sa znatnim povećanjem ra- stojanja izmeĊu krvnih sudova i parenhimskih ćelija u odnosu na sluĉajeve sa blaţom fibro- zom. Citoarhitektura hipofiza sluĉajeva muškog pola starosti preko 60 godina bila je u zna- ĉajno većoj meri narušena intenzivnom fibrozom u odnosu na iste ţenskog pola. Kada su u pitanju funkcionalni tipovi endokrinih ćelija, progresivna fibroza je bila praćena istovreme- nim padom broja somatrotropa u lateralnim delovima adenohipofize, dok se broj ćelija ostalih tipova nije menjao znaĉajnije tokom procesa starenja (Sano i sar., 1993). Podaci o eventu- alnom prisustvu hipertrofije preostalih ćelija koje sekretuju hormon rasta nisu prikazani od strane gore navedenih autora. Kada je u pitanju proliferacija vezivnog tkiva u adenohipofizi tokom starenja, Alves i sar. (2002) su tokom svog istraţivanja ustanovili da ona potiĉe predominanto od porasta kako me- Ċućelijskog, tako i perivaskularnog vezivnog tkiva, saĉinjenog preteţno od kolagenih vlaka- na. Nishimura i sar. (2004) su analizirali trodimenzionalnu strukturu kolagena adenohipofize eksperimentalnih ţivotinja, pri ĉemu su zakljuĉili da kolagena vlakna, sliĉno drugim endokri- nim ţlezdama, formiraju gnezda u kojima se nalaze grupe parenhimnih ćelija. Oni su u imu- nohistohemijskom delu svog istraţivanja ispitivali prisustvo kolagena tipa I, III, IV, V i VI u razliĉitim delovima adeno- i neurohipofize. Prisustvo kolagena tipa IV je detektovano u ba- zalnim membranama, dok su ostali tipovi kolagena registrovani u preostalim delovima pa- renhima hipofize i ispoljavali sliĉnu distribuciju vlakana. Trodimenzionalna organizacija ko- lagena je u endokrinom tkivu do tada bila dobro prouĉena jedino u nadbubreţnoj (Kikuta i sar., 1991) i tiroidnoj ţlezdi (Morita i sar., 1994). Nishimura i sar. (2004) su prvi prezentovali podatke o postojanju trodimenzionalne strukture kolagenih vlakana u pars distalis-u adenohi- pofize, sliĉne onoj opisanoj u meduli nadbubreţne i u okolini folikula tiroidne ţlezde. Na osnovu svega navedenog, oni su zakljuĉili da je arhitektura kolagenih vlakana zajedniĉka za razliĉite endokrine ţlezde. Dalje, Nishimura i sar. (2004) su uoĉili da se u pars distalis-u gu- stina rasporeda kolagenih vlakana koja oblaţu površinu krvnih sudova menja u zavisnosti od Diskusija 84 veliĉine krvnog suda. Zadebljanje bazalnih membrana, naroĉito sinusoidnih kapilara nastaje kao posledica proliferacije kolagenih vlakana i to naroĉito kod krvnih sudova većeg kalibra, a nešto reĊe kada su u pitanju krvni sudovi manjeg kalibra ili sinusoidi. Dodatno, ova studija je pokazala da se arhitektura kolagenih vlakana razlikuje u razliĉitim delovima adeno- i neuro- hipofize. Snopovi kolagenih vlakana koji su okruţivali velike grupe ćelija pars intermedia su posedovali atipiĉnu strukturu i razlikovali se od istih u ostalim delovima hipofize. Naime, mreţa kolagenih vlakana središnjeg dela je bila znatno grublja u odnosu na npr. dorzalni re- gion, dok je njihova konfiguracija u neurohipofizi poprimala sunĊeroliku konformaciju sa vlaknima koja su imala spiralan ili talasast pravac pruţanja. Bailey i sar. (1998) su se bavili izuĉavanjem mehanizama maturacije i starenja kolagena. Prema njima, sa starenjem dolazi do fiziĉkih promena kolagene mreţe u razliĉitim delovima tela, što rezultira slabijom elastiĉnošću koţe, ligamenata, tetiva i kostiju. Tkiva postaju ri- gidnija, krta i lomljiva. Promene ovog tipa oteţavaju optimalnu funkciju lokomotornog siste- ma, negativno utiĉu na elastiĉnost krvnih sudova i filtracionu sposobnost bazalnih membrana. TakoĊe, slabljenje interakcija izmeĊu ćelija i ekstracelularnog matriksa kod starih individua izaziva smanjenje efikasnosti bazalnih membrana. Gore navedeni autori takoĊe navode da sa starenjem raste otpornost kolagenih vlakana pri istezanju, dok njihov dijametar moţe da opa- da. Sa starenjem je moguća i promena hemijskog sastava vlakana (Mays i sar., 1991). Od po- sebnog znaĉaja je glikozilacija kolagena i elastina, što predstavlja kljuĉni momenat u patolo- giji vaskularnog sistema (Newton i Dixit, 2012). Bailey i sar. (1998) navode da glikozilaci- jom kolagena on postaje slabije rastvorljiv i rezistentan na dejstvo enzima. Bazalne membra- ne saĉinjene od kolagena tipa IV postaju krute zbog pojaĉanog unakrsnog povezivanja kola- genih vlakana. To rezultira njihovom povećanom permeabilnošću i slabijim priĉvršćivanjem endotelnih ćelija za njihovu površinu. Smanjenje elastiĉnosti retinalnih kapilara, renalnih glo- merula i zidova arterijskih krvnih sudova predstavljaju fenomene koji nastaju kao posledica napred navedenih procesa prisutnih tokom procesa starenja. Ayisi i sar. (1982) su naveli da kada je u pitanju proliferacija vezivnog tkiva u adenohipofizi tokom starenja, uglavnom se ra- di o kolagenu tipa IV. Ovi autori su biohemijski, u oviru fibroze hipofize starih sluĉajeva do- kazali znaĉajan porast nivoa hidroksiprolina u sastavu kolagena. Prema njima, sa starenjem, izrazitije promene ovog karaktera se detektuju u adeno- u odnosu na neurohipofizu, ali upr- kos svemu navedenom ne remete ozbiljnije sekreciju hipofiznih hormona. Izmenjene fiziĉke osobine kolagenih vlakana hipofize naroĉito remete funkciju bazalnih membrana krvnih su- dova dovodeći do poremećaja njihove permeabilnost i smanjenja priĉvršćenosti endotela, ta- Diskusija 85 ko da proliferacija vezivnog tkiva pored redukcije parenhima adenohipofize, povlaĉi za so- bom i poremećaj funkcije njenih krvnih sudova. Rezultati stereološke analize histohemijski i imunohistohemijski obraĊenih tkivnih prese- ka adenohipofize sprovedene tokom našeg istraţivanja (Pavlović i sar., 2013b) saglasni su sa rezultatima studija koje su se bavile analizom promena njenog vezivnog tkiva tokom procesa starenja (Sano i sar., 1993; Ayisi i sar., 1982). Zapreminska gustina vezivnog tkiva, kao i ko- lagena tipa IV u adenohipofizi je pozitivno korelirala sa starošću ispitanih sluĉajeva. Prednji reţanj adenohipofize starijih sluĉajeva karakterisao se upadljivom proliferacijom vezivnog tkiva, kao i kolagena tipa IV, znatno debljim vezivno-tkivnim pregradama saĉinjenim od znatno gušće rasporeĊenih vezivno-tkivnih i vlakana kolagena tipa IV izmeĊu kojih su uoĉa- vana retka vretenasta jedra fibrocita. Unutar pregrada uoĉavani su krvni sudovi okruglog lu- mena sa zadebljalim zidom unutar koga je uoĉavana znatno intenzivnija imunoreaktivnost na kolagen tipa IV u odnosu na mlaĊe sluĉajeve. Kalibar takvih krvnih sudova je bio znatno ma- nji u odnosu na isti mlaĊih sluĉajeva. Poremećaj vaskularizacije adenohipofize je bio povezan sa proliferacijom vezivnog tkiva, što je primenom stereološke analize kvantifikovano stati- stiĉki znaĉajnim padom zapreminske i površinske gustine njenih krvnih sudova. Sve to je in- direktno ukazivalo na mogući pad funkcije adenohipofize sa starenjem i bilo saglasno prome- nama opisanim od strane već pomenutih autora (Ayisi i sar., 1982; Bailey i sar., 1998). Brojne studije su ukazale na mogući funkcionalni pad sintetske i sekretorne aktivnosti pars distalis-a sa starenjem (Crew i sar., 1987; Ho i sar., 1987; Parenti i sar., 1987; Rudman i sar., 1990; Spik i sar., 1989; Urban i sar., 1988; Zbuzek i sar., 1991). Prema njima, proces starenja direktno dovodi do pada sekrecije hormona sa starenjem, što je praćeno i slabijim od- govorom ćelija koje ih luĉe na sekretagoge. Stavovi o nivoima adenohipofiznih hormona to- kom starenja su protivureĉni. Tako su Goldman i sar. (1988) našli da tokom starenja dolazi do uvećanja mase hipofize pacova pri ĉemu broj hormon sekretujućih ćelija ostaje uglavnom nepromenjen. Samo je blagi porast broja laktotropa uoĉen kod sluĉajeva ţenskog pola tokom procesa starenja. Ovaj podatak moţe da objasni ĉinjenicu da napred navedeni autori (Goldman i sar., 1988) nisu uoĉili znaĉajne promene koncentracije hormona u prve dve godine ţivota eksperimentalnih ţivotinja. U kasnijim periodima ţivota, uoĉena je redukcija parenhima ade- nohipofize i prateće sniţenje koncentracija pojedinih hormona. Ipak ukupni sadrţaj hormona ostaje konstantan, što napred navedeni autori (Goldman i sar., 1988) objašnjavaju mogućom relokacijom i proliferacijom gonadotropa i tirotropa. Konaĉno, promene funkcije hipofize tokom starenja neminovno utiĉu na rad brojnih target organa, kao i drugih endokrinih ţlezda, što na kraju rezultira poremećajem mehanizma negativne povratne sprege. Diskusija 86 Otkriće FS ćelija u adenohipofizi sredinom prošlog veka dovelo je do porasta intereso- vanja istraţivaĉa za njihovu strukturu i funkciju, kao i njihovu ulogu u funkciji hipofize to- kom procesa starenja. Cardin i sar. (2000) su utvrdili da FS ćelije ĉine 3-8% ćelija u adenohi- pofizi. Primenom anti – S-100 antitela uoĉena je pozitivna reakcija jedra i citoplazme u peri- nuklearnom regionu, dok su njene periferne zone bile slabo pozitivne, što smo i mi uoĉili to- kom našeg istraţivanja. Kada je u pitanju distribucija FS ćelija u parenhimu hipofize, Sato i sar. (2005) navode da su FS ćelije preteţno lokalizovane u bazalnoj regiji i tranzitornoj zoni hipofize pacova, istovremeno pokazavši povezanost izmeĊu distribucije FS ćelija i krvnih su- dova adenohipofize, što je u skladu sa navodima Soji i sar. (1994). Mi smo tokom našeg istra- ţivanja uoĉili najveću zastupljenost S-100 pozitivnih ćelija u intermedijarnom i u znatno ma- njoj meri u lateralnim delovima adenohipofize. Marin i sar. (1989) su ukazali na postojanje razliĉitih tipova FS ćelija u humanoj hipofizi na osnovu njihove lokalizacije i tinktorijalnih karakteristika. U pars intermedia hipofize paco- va, FS ćelije su posedovale iregularna jedra, zvezdast oblik i duge citoplazmatske produţetke preko kojih su ove ćelije bile u kontaktu sa melanotropima, folikulima ili sa Rathke-ovim špagom. U ovom delu hipofize vaskularizacija je bila oskudna, a prisutni folikuli široki (Acosta i sar., 2009), nasuprot sitnijim folikulima opisanim od strane Mohamed-a i sar. (2000) u pars distalis-u hipofize. Acosta i sar. (2010) su u pars distalis-u kao celini uoĉili postojanje pleomorfnih FS ćelija sa kratkim citoplazmatskim produţecima koji su bili u kontaktu sa endokrinim ćelijama i krvnim sudovima. Manja veliĉina folikula i kratki citoplazmatski pro- duţeci FS ćelija su, prema njima, verovatno povezani sa bogatom vaskularizacijom ovog dela hipofize. Folikulostelatne ćelije su pored S-100 proteina, eksprimirale GFAP (anti-glial fibrillary acidic protein) i vimentin, koji su poznati kao markeri zrelih i nezrelih glijalnih ćelija i astro- cita. Ovakve imunohistohemijske karakteristike FS ćelija upućuju na njihovo moguće neur- oektodermalno poreklo (Acosta i sar., 2009). Shodno tome, razliĉita ekspresija navedenih proteina u razliĉitim fazama ćelijskog ciklusa FS ćelija, prema Marin-u i sar. (1989), Cardin- u i sar. (2000) i Acosta-i i sar. (2009) navode na mogućnost postojanja razliĉitih funkci- onalnih stadijuma u njihovom ćelijskom ciklusu, koji su praćeni ekspresijom razliĉitih produ- kata njihove sintetske aktivnosti i manifestuju se njihovim razliĉitim imunohistohemijskim karakteristikama. Cardin i sar. (2000) su tokom svog istraţivanja na lasicama definisali pri- sustvo 2 tipa FS ćelija na osnovu njihovih morfoloških i imunohistohemijskih karakteristika. U tip 1 su svrstali ćelije koje su se karakterisale zvezdastim oblikom i dugim citoplazmatskim nastavcima koji su okruţivali endokrine ćelije. Tip 2 su predstavljale okrugle ćelije sa bledo ili tamno prebojenim okruglim jedrom, bez uoĉljivih citoplazmatskih nastavaka. Sliĉne re- Diskusija 87 zultate su prethodno u svojim radovima dali Kagayama (1965) i Orgnero i sar. (1993). Broj- nost ćelija ova dva tipa je bila srazmerna sa nivoom prolaktina i obrnuto srazmerna sa nivo- om gonadotropina i ispoljavala je sezonski karakter. Tako su ćelije tipa 1 bile mnogo brojnije i ispoljavale su jaku S-100 imunoreaktivnost tokom proleća, u vreme reproduktivnog perioda sa visokim nivoom prolaktina i niskim nivoom gonadotropina. Nasuprot njima, ćelije tipa 2 su bile organizovane u klastere koji su se uvećavali tokom zime, izvan reproduktivnog peri- oda koji se karakterisao niskim nivoom prolaktina i visokim nivoom gonadotropina. Ukupan broj FS ćelija se nije znaĉajno menjao tokom oba perioda, što navodi na zakljuĉak da dva napred navedena tipa FS ćelija predstavljaju, u stvari, dva razliĉita morfološka i funkcionalna stadijuma jedne iste vrste ćelija, što je zavisilo od endokrinog statusa jedinke (Cardin i sar., 2000). Kada je u pitanju starenje, Danilova i sar. (1988) su izuĉavali ultrastrukturalne starosne promene FS ćelija. Folikulostelatne ćelije starih ţivotinja su ispoljavale umeren stepen hiper- trofiije i sadrţale povećan broj slobodnih ribozoma i polizoma. Jedro je bilo euhromatiĉno i ispoljavalo je strukturalne znake biosintetske aktivnosti. Endoplazmatski retikulum je bio bla- go vakuoliziran. Sekretorne granule poreklom od Goldţijevog aparata, lizozomalna telašca i lipidne kapi su retko uoĉavani. U citoplazmi su uoĉavane brojne sitne mitohondrije. U poje- dinim FS ćelijama, sitne sekretorne granule su bile prisutne u citoplazmatskim nastavcima lo- kalizovanim u neposrednoj okolini kapilara. Egzocitoza je uoĉavana mestimiĉno. Uprkos sve većem interesovanju istraţivaĉa i otkrićima bitnih funkcija koje FS ćelije imaju, u savremenoj literaturi retki su podaci o kvantifikaciji njihovog prisustva tokom stare- nja kod ĉoveka. Istraţivanja takvog karaktera su izvoĊena iskljuĉivo na eksperimentalnim ţi- votinjama i njihovi rezultati su kontradiktorni (Weiss i sar., 1953; Sasaki, 1988; Allaerts i sar., 1997; Console i sar., 2000). Console i sar. (2000) su prouĉavali broj S-100 pozitivnih će- lija u adenohipofizi pacova tokom starenja. Njihova studija je pokazala progresivni pad pri- sustva FS ćelija kod starih u odnosu na mlaĊe eksperimentalne sluĉajeve. Naime, morfome- trijska analiza je ukazala na signifikantan pad volumenske i numeriĉke gustine ovih ćelija to- kom procesa starenja kod sluĉajeva oba pola. Nasuprot napred navedenoj, druge studije su fo- kusirale svoju paţnju na dinamiku prisustva S-100 pozitivnih ćelija tokom postnatalnog peri- oda ţivota eksperimentalnih ţivotinja. Tako su Allaerts i sar. (1997) otkrili upeĉatljiv porast broja S-100 pozitivnih ćelija tokom ovog perioda. Oni takoĊe navode porast broja S-100 po- zitivnih ćelija i tokom procesa starenja. Soji i sar. (1994) su u svojoj studiji pokazali da to- kom postnatalnog perioda raste gustina FS ćelija. Populacija S-100 pozitivnih ćelija u njiho- vim sluĉajevima bila je distribuirana unutar prednjeg reţnja hipofize kod mladih ţivotinja Diskusija 88 dok je broj ćelija na periferiji ţlezde rastao sa starenjem. Soji i sar. (1994) su takoĊe ustano- vili da se kod starijih ţivotinja S-100 imunoreaktivne ćelije nalaze u neposrednoj okolini krv- nih sudova u hipofizi. Scanes i sar. (2005) su tokom svoje eksperimentalne studije sprovede- ne na pacovima takoĊe zakljuĉili da postoji veza izmeĊu prisustva FS ćelija i starenja. Oni su naveli da u adenohipofizi tokom starenja znaĉajno raste broj folikula obloţenih napred nave- denim ćelijama ispunjenih koloidom. Oni dalje navode da FS ćelije verovatno uĉestvuju u produkciji dela folikularnog koloida i da postoji bliska povezanost ovih ćelija, folikularnog koloida i hormon-sekretujućih ćelija. Prema njima, FS ćelije nisu nasumiĉno razbacane u pars distalis-u. One okruţuju folikule i locirane su neposredno do laktotropa, gonadotropa i korti- kotropa, što navodi na pretpostavku da postoji dinamiĉka komunikacija FS ćelija i gore nave- dena tri tipa endokrinih ćelija i parakrina regulacija sekrecije njihovih hormona od strane FS ćelija (Luziga i sar., 2006; Luziga i sar., 2009; Kagayama, 1965; Kameda, 1991; Ogawa i sar., 1996; Ogawa i sar., 1997). Somatotropi, iako široko rasprostranjeni unutar parenhima pars distalis-a, nisu lokalizovani u blizini folikula. Tirotropi, koji su uglavnom prisutni u medi- jalnom regionu, nisu uoĉeni u blizini FS ćelija ili folikula. Folikulostelatne ćelije poseduju duge citoplazmatske nastavke preko kojih su ove ćelije u kontaktku sa sekretornim ćelijama i krvnim sudovima. MeĊusobno su povezane meĊućelijskim vezama tipa dezmozoma, a kod onih koje oblaţu lumen folikula, veliki broj mikrovila pruţao se od njihovog apikalnog pola do folikularnog lumena (Acosta i sar., 2010). Console i sar. (2000) su se bavili kvantitativnom imunohistohemijskom analizom progre- sivnih promena koje se javljaju na FS ćelijama pacova tokom starenja uopšte ili tokom odre- Ċenog perioda u toku starenja. Oni su zakljuĉili da je tokom starenja prisutan progresivan pad broja FS ćelija eksperimentalnih ţivotinja oba pola. Analiza morfoloških parametara pokaza- la je signifikantan pad njihove volumenske i numeriĉke gustine kod starih pacova u poreĊe- nju sa mlaĊim ţivotinjama oba pola. Oni su registrovali homogenu distribuciju FS ćelija u hi- pofizi, zatim njihov blizak odnos sa sekretornim ćelijama, što je u skladu sa navodima gore pomenutih autora. U završnom delu svoje studije, Console i sar. (2000) navode da proces sta- renja znaĉajno utiĉe na pojavu umerenih ultrastrukturnih promena FS ćelija, sliĉnih onim ko- je su registrovane i na njenim endokrinim ćelijama. Nasuprot prethodnoj studiji, Soji i sar. (1994) su u rezultatima svoje studije prezentovali znaĉajan porast broja FS ćelija kod pacova sa starenjem, dodatno sugerišući da stepen ekspre- sije S-100 proteina predstavlja indikator stadijuma njihovog morfološkog sazrevanja. Sliĉno tome, nekoliko studija je na osnovu morfoloških karakteristika i imunofenotipa demonstriralo Diskusija 89 postojanje razliĉitih fizioloških stadijuma FS ćelija (Cardin i sar., 2000; Marin i sar., 1989; Kagayama, 1965). Mi smo tokom naše studije, sliĉno Soji-u i sar. (1994) detektovali signifikantan rast za- preminske gustine FS ćelija kod najstarijih sluĉajeva. Odsustvo statistiĉki znaĉajnog porasta kod sluĉajeva srednje ţivotne dobi moţe se objasniti prisustvom individualnih razlika u pro- cesu starenja. U tom svetlu, veće prisustvo FS ćelija u III i najstarijoj starosnoj grupi moţe da predstavlja bilo komponentu uspešnog starenja ili neposredan znak predstojeće smrti. Line- arna regresiona analiza je pokazala da starost u umerenoj meri objašnjava varijansu prisustva FS. Ista analiza je dodatno ukazala da prisustvo FS u umerenoj meri objašnjava varijansu pri- sustva ACTH ćelija. Kako je tokom naše studije ustanovljena pozitivna korelacija izmeĊu prisustva ACTH ćelija i starosti ispitanih sluĉajeva, moţe se zakljuĉiti da postoji meĊusobna povezanost starenja, FS i ACTH ćelija u adenohipofizi i da se razjašnjenjem mehanizama koji stoje u njenoj osnovi mogu delimiĉno objasniti promene funkcije HPA osovine koje se javlja- ju sa godinama. Mnogi autori smatraju da imuni sistem ĉoveka trpi izvesne promene tokom procesa stare- nja (Salminen i Kaarniranta, 2010). Najpre se javljaju epigenetske promene pod uticajem fa- ktora sredine (Bayarsaihan, 2011). Ponavljani antigeni stres tokom ţivota individue podstiĉe odbrambene mehanizme u aktivaciji inflamatorne mreţe, što rezultira pojavom hroniĉne inflamatorne aktivnosti niskog intenziteta u pojedinim ili svim organima i tkivima. Ovaj fe- nomen istovremeno prate i omogućavaju njegovu detekciju povišeni nivoi inflamatornih komponenti u krvi, kao što su IL-6, TNF-α, IL-1Ra, sTNFR, proteina akutne faze kao što su CRP i serumski amiloid A, i na kraju porast broja neutrofila (Franceschi i sar., 2000; Bruunsgaard i sar., 2001; Salminen i sar., 2012). Iako su nivoi navedenih medijatora znaĉajno viši kod zdravih starih individua u odnosu na mlaĊe, mehanizmi odgovorni za nastanak tog fenomena, kao i posledice i promene koje oni izazivaju tokom starenja su, u najvećem broju sluĉajeva, ostali nerazjašnjeni (Gilmore i Wolenski, 2012). Osim uĉešća NF-k (Nuclear factor kB) sistema u aktivaciji i odrţanju ovog fenomena tokom starenja (Newton i Dixit, 2012), otkriveno je da njegovo prisustvo kod starih individua prati sve teţe odstranjivanje antigena iz organizma (Candore i sar., 2010), kao i povećan rizik od nastanka srĉanog udara, karcino- ma, ateroskleroze, metaboliĉkog sindroma, Alchajmerove bolesti, vaskularne demencije i drugih degenerativnih bolesti (Balistreri i sar., 2009; de Gonzalo-Calvo i sar., 2010). Pojava ovih bolesti, zajedno sa već prisutnim starosnim promenama imunog sistema, dalje slabi odbrambene sposobnosti starije populacije ĉineći ih vulnerabilnijim na inaĉe banalne infe- Diskusija 90 kcije. Imuni odgovor na prisutni patogen traje duţe odnosu na mlaĊe individue i moţe do- vesti do masivnog tkivnog oštećenja i lošeg ishoda kod bolesti kao što su influenca ili pne- umokokna pneumonija. Starenjem izazvan inflamatorni proces niskog intenziteta ubrzava progresiju hroniĉnih bolesti, a takoĊe ima i imunosupresivni efekat na celularni imuni odgo- vor (Chung i sar., 2009; Lang i sar., 2010). Kod jako starih osoba uoĉen je linearni porast serumskih vrednosti TNF-α, CRP i IL-6 (Bruunsgaard i sar., 2003). To je praćeno ĉitavom kaskadom promena u organizmu koji stari koje se oznaĉavaju kao inflamatorno starenje (“inflamm – aging”) (Franceschi i sar., 2000; Candore i sar., 2010). Bitni modulator imune funkcije i inflamacije prisutne tokom starenja predstavlja odgovor neuroendokrinog sistema na stres. Ustanovljeno je da stare osobe ka- rakterišu povišeni nivoi kortizola u krvi. Disfunkcionalna HPA osovina moţe da oslabi imuni sistem prilikom odgovora na stresore kao što je infekcija (Butcher i Lord, 2004; Meyer, 2005). Povezanost funkcije imunog sistema i HPA osovine moţe indirektno da potvrdi ĉinje- nica da IL-1α, IL-1ß, IL-6, IL-8 i TNF-α mogu da utiĉu na sekreciju ACTH u kultivisanim fragmentima adenohipofize pacova (Turnbull i Rivier, 1999). Ovi autori takoĊe smatraju da FS ćelije, ĉiji se broj, kao što smo to mi tokom našeg istraţivanja ustanovili, tokom starenja povećava, verovatno predstavljaju komponentu adenohipofize koja je umešana u proces regulacije funkcije HPA osovine medijatorima imunog sistema kod starih individua. Ovaj uticaj moţe biti objašnjen delovanjem FS ćelija na endokrine ćelije preko povišenog nivoa IL-6 i drugih produkata njihove parakrine aktivnosti kao što su IL-11, cilijarni neurotrofni faktor (Gerez i sar., 2007), insulinu sliĉan faktor rasta I (IGF-1) i kalcitonin gen–zavisni peptid (CGRP) (Schwartz, 2000), ĉiji su efekti na oslobaĊanje ACTH ostali nerazjašnjeni. Saglasno navodima Vankelecom-a i sar. (1993), imuni i neuroendokrini sistem formiraju integrisanu funkcionalnu mreţu. Postoje neuroendokrini mesendţeri (hormoni i neuropeptidi) koji su prisutni u odgovarajućim ćelijama imunog sistema i, sa druge strane, odgovarajući limfokini i monokini (IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-ɣ) prisutni u organima neuroendokrinog siste- ma, kao što su hipotalamus i hipofiza. Allaerts i sar. (1997) tvrde da intersticijalne FS ćelije adenohipofiza miševa i pacova pokazuju 10-20% preklapanja sa MHC-klasom II dendritiĉnih ćelija, što ukazuje na imunohistohemijsku heterogenost ove ćelijske grupe i njenu moguću povezanost sa ćelijama imunog sistema. TakoĊe, u normalnoj adenohipofizi, najveći izvor IL- 6 su, najverovatnije, FS ćelije koje mogu biti indukovane da sekretuju ovaj citokin pri- sustvom LPS-a, IL-1α, IL-1ß, TNF-α i agenasa koji podiţu nivo cAMP-a (Vankelecom i sar., 1993; Turnbull i Rivier, 1999). Po navodima Franceschi i sar. (2000), IL-6, glavni citokin parakrine aktivnosti FS ćelija adenohipofize definisan je kao „citokin gerontologa“. Njegovi Diskusija 91 nivoi u plazmi, koji su niski ili nedetektovani kod većine mladih ljudi, poĉinju da rastu kod zdravih ljudi starosti oko 50-60 godina, što korespondira sa prelaznim periodom izmeĊu prve i druge starosne grupe u našem istraţivanju. Ovaj porast je prisutan tokom fiziološkog stare- nja kod zdravih osoba, kao i kod visokog procenta stogodišnjaka oĉuvanog zdravlja ali i onih kod kojih je prisutno patološko starenje. Kod ovih subjekata, ostali proteini kao što su pro- teini akutne faze, lipoprotein a, fibrinogen i ostali koagulacioni faktori i proinflamatorni cito- kini takoĊe su povišeni. Povrh svega, u skladu sa navodima gore citiranih autora, ova situ- acija moţe biti oĉekivana u poslednjoj fazi ţivota kod ekstremno starih osoba, ĉija je vero- vatnoća nastanka smrti veoma visoka. Porast parakrine aktivnosti FS ćelija, koji je povezan sa povećanjem njihovog prisustva kod starijih sluĉajeva, nameće dilemu o uticaju ove njihove funkcije (pre svega sekrecije IL- 6) na funkciju kortikotropa i sekreciju ACTH. Rezultati studija koje su se bavile ovim proble- mom mogu biti klasifikovni u dve grupe. Prve i starije studije tvrde da FS ćelije svojom para- krinom aktivnošću imaju uglavnom inhibitorni efekat na kortikotrope, taĉnije na oslobaĊanje ACTH i, na kraju, na funkciju HPA osovine (Vankelecom i sar., 1990, 1993, 1997; Allaerts i Vankelecom, 2005). Druga grupa studija obuhvatala je predominantno one reĊe studije koje su isticale stimulatorni efekat parakrine aktivnosti FS ćelija na kortikotrope, oslobaĊanje ACTH i funkciju HPA osovine (Johnson i sar., 1990; Schwartz, 2000; Bilezikjian i sar., 2003; Herkenham, 2005; Gerez i sar., 2007). Statistiĉki znaĉajan porast prisustva ACTH ćeli- ja tokom starenja, paralelni porast prisustva FS ćelija i njihova meĊusobna povezanost idu u prilog stavovima onih autora (Johnson i sar., 1990; Schwartz, 2000; Bilezikjian i sar., 2003; Herkenham, 2005; Gerez i sar., 2007) koji pretpostavljaju postojanje stimulatornog efekta pa- rakrine aktivnosti FS ćelija na kortikotrope, oslobaĊanje ACTH i funkciju HPA osovine. Rezultati našeg istraţivanja će delimiĉno pruţiti uvid u obim prisustva razmatranih sta- rosnih promena adenohipofize i indirektno ukazati na njihovu moguću vezu sa literaturnim podacima o postojanju funkcionalnog dizbalansa HPA osovine kod zdravih starih osoba. Sve napred navedeno bi zajedno sa rezultatima prethodnih istraţivanja o funkcionalnim aspektima starosnih promena HPA sistema, pruţilo moguće objašnjenje za ĉešću pojavu pojedinih bo- lesti tokom procesa starenja. UnapreĊeno znanje i procena endokrinih funkcija tokom starenja će sledstveno dovesti do uspešnog poboljšanja farmakoloških terapija i unapreĊenja kvaliteta ţivota u starosti i borbi protiv bolesti povezanih sa disfunkcijom endokrinog sistema u celini kod starijih pacijenata i neminovno produţiti ţivotni vek. Zbog toga su endokrine funkcije u kontekstu starenja u fokusu mnogih budućih kliniĉkih i baziĉnih nauĉnih istraţivanja. 92 ZAKLJUĈAK 1. Celularni sastav adenohipofize se ne menja znaĉajno sa godinama ţivota; prisustvo bazofila je znaĉajno više kod sluĉajeva muškog u odnosu na sluĉajeve ţenskog pola. 2. Proces starenja je praćen generalno slabijom prokrvljenošću parenhima adenohipofize. 3. Starenje je praćeno proliferacijom vezivnog tkiva i prisustvom fibroze adenohipofize najstarijih sluĉajeva. 4. Fibroza je najizrazitija u intermedijarnom delu ţlezde, ali se uoĉava i u njenim lateralnim delovima i manifestuje se zadebljanjem vezivno-tkivnih pregrada i poslediĉnim narušavanjem normalne arhitekture adenohipofize. 5. Veliĉina endokrinih ćelija adenohipofize znaĉajno raste tokom procesa starenja ukazujući na njihovu hipertrofiju. 6. Porast veliĉine endokrinih ćelija distalnog dela prednjeg reţnja nije praćen znaĉajnijom promenom njihovog oblika tokom procesa starenja. 7. Endokrine ćelije sluĉajeva ţenskog pola su krupnije i pravilnijeg oblika u odnosu na iste sluĉajeva muškog pola. 8. Proliferacija vezivnog tkiva i poslediĉna fibroza adenohipofize tokom procesa starenja je delom posledica porasta prisustva kolagena tipa IV. 9. Prisustvo kortikotropnih ćelija raste tokom procesa starenja, a samim tim i njihov udeo u ukupnoj masi bazofilnih ćelija prednjeg reţnja hipofize. 10. Prisustvo folikulostelatnih ćelija prednjeg reţnja prati trend prisustva kortikotropnih ćelija i znaĉajno raste tokom procesa starenja. 11. Prisustvo folikulostelatnih ćelija znaĉajno pozitivno korelira i predstavlja znaĉajan prediktor prisustva kortikotropnih ćelija. 12. Sadrţaj kolagena tipa IV, kortikotropnih i folikulostelatnih ćelija se ne razlikuje znaĉajno izmeĊu sluĉajeva muškog i ţenskog pola. 93 LITERATURA 1. Acosta M, Mohamed F. Pituitary pars intermedia of male viscacha (Lagostomus maximus maximus): a morphometric study of seasonal and age-related changes in immunohistochemistry. Cells Tissues Organs. 2009;190:219–29. 2. Acosta M, Filippa V, Mohamed F. Folliculostellate cells in pituitary pars distalis of male viscacha: immunohistochemical, morphometric and ultrastructural study. Eur J Histochem. 2010;54(1):e1. 3. Allaerts W, Salomon B, Leenen PJ, van Wijngaardt S, Jeucken PH, Ruuls S, Klatzmann D, Drexhage HA. A population of interstitial cells in the anterior pituitary with a hematopoietic origin and a rapid turnover: a relationship with folliculo-stellate cells? J Neuroimmunol. 1997;78(1-2):184–97. 4. Allaerts W, Vankelecom H. History and perspectives of pituitary folliculo-stellate cell research. Eur J Endocrinol. 2005;153(1):1–12. 5. Alves LM, Werneck CC, Martins RC, Silva L-CF, Taffarel M, Borojevic R, Nasciutti LE. A continuous lineage of rat adenohypophysis stromal cells: characterization and effects on GH3B6 prolactin-secreting cell behaviour. Biol Cell. 2002;94(7–8):519–33. 6. AnĊelković Z, Somer Lj, Avramović V, Milosavljević Z, Tanasković I, Matavulj M, i dr. Histologija. Osmo izdanje. Niš: Impressum; 2009. 7. Argyropoulou M, Perignon F, Brunelle F, Brauner R, Rappaport R. Height of normal pituitary gland as a function of age evaluated by magnetic resonance imaging in children. Pediatr Radiol. 1991;21(4):247–9. 8. Ayisi K, Schmiegelow P, Lindner J, Sames K. Connective tissue ageing in the human hypophysis – gonadal system. Path Res Pract. 1982;173(3):294–302. 9. Babović SS, Ivanov D, Mijatov-Ukropina L, Toyonaga T, Dimitrijević I, Dordević M. Cytoarchitecture of the human paraventricular hypothalamic nucleus. Med Pregl. 2009;62(9-10):417–20. 10. Bailey AJ, Paul RG, Knott L. Mechanisms of maturation and ageing of collagen. Review. Mech Ageing Dev. 1998;106(1–2):1–56. 11. Balistreri CR, Colonna-Romano G, Lio D, Candore G, Caruso C. TLR4 polymorphisms and ageing: implications for the pathophysiology of age-related diseases. J Clin Immunol. 2009;29(4):406–15. Literatura 94 12. Bayarsaihan D. Epigenetic mechanisms in inflammation. J Dent Res. 2011;90(1):9–17. 13. Bilezikjian LM, Leal AM, Blount AL, Corrigan AZ, Turnbull AV, Vale WW. Rat anterior pituitary folliculostellate cells are targets of interleukin-1beta and a major source of intrapituitary follistatin. Endocrinology. 2003;144(2):732–40. 14. Blackburn EH. Telomere states and cell fates. Nature. 2000;408(6808):53–6. 15. Brokken LJ, Leendertse M, Bakker O, Wiersinga WM, Prummel MF. Expression of adenohypophyseal-hormone receptors in a murine folliculo-stellate cell line. Horm Metab Res. 2004;36(8):538–41. 16. Bruunsgaard H, Pedersen M, Pedersen BK. Aging and proinflammatory cytokines. Curr Opin Hematol. 2001;8(3):131–6. 17. Bruunsgaard H, Andersen-Ranberg K, Hjelmborg JB. Elevated levels of tumor necrosis factor alpha and mortality in centenarians. AM J Med. 2003;115(4):278–83. 18. Butcher SK, Lord JM. Stress responses and innate immunity: aging as a contributory factor. Aging Cell. 2004;3(4):151–60. 19. Candore G, Caruso C, Colonna-Romano G. Inflammation, genetic background and longevity. Biogerontology. 2010;11(5):565–73. 20. Campisi J. Cellular senescence and cell death. In: Physiological Basis of Aging and Geriatrics (3rd ed.), edited by Timiras PS. Boca Raton, FL: CRC, 2003, p. 47–59. 21. Cardin J, Carbajal ME, Vitale ML. Biochemical and morphological diversity among folliculo-stellate cells of the mink (Mustela vison) anterior pituitary. Gen Comp Endocr. 2000;120(1):75–87. 22. Carlson JC, Riley JC. A consideration of some notable aging theories. Exp Gerontol. 1998;33(1-2):127–34. 23. Chesnokova V, Melmed S. Pituitary senescence: The evolving role of Pttg. Mol Cell Endocrinol. 2010;326:55–9. 24. Chung HY, Cesari M, Anton S, Marzetti E, Giovannini S, Seo AY, Carter C, Yu BP, Leeuwenburgh C. Molecular inflammation: underpinnings of aging and agerelated diseases. Ageing Res Rev. 2009;8(1):18–30. 25. Cizza G, Calogero AE, Brady LS, Bagdy G, Bergamini E, Blackman MR, Chrousos GP, Gold PW. Male Fischer 344/N rats show a progressive central impairment of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis with advancing age. Endocrinology. 1994;134(4): 1611–20. Literatura 95 26. Cónsole GM, Gómez Dumm CL, Goya RG. Impact of aging on the morphology and function of the somatotroph cell population in rats. Mech Ageing Dev. 1993;70(1–2): 45–51. 27. Cónsole GM, Gómez Dumm CL, Goya RG. Immunohistochemical and radioimmunological study of pituitary gonadotrophs during aging in male rats. Mech Ageing Dev. 1994; 73(2):87–95. 28. Cónsole GM, Gómez Dumm CL, Goya RG. Immunohistochemical and radioimmunological assessment of thyrotrophs in the pituitary of aging rats. Acta Anat. 1995; 152(1): 28–32. 29. Cónsole GM, Gómez Dumm CL, Brown OA, Ferese C, Goya RG. Sexual dimorphism in the age changes of the pituitary lactotrophs in rats. Mech Ageing Dev. 1997;95(3): 157–66. 30. Cónsole GM, Jurado SB, Gómez Dumm CL. Immunohistochemical and ultrastructural age-related changes in rat lactotroph cells. Biocell. 1998; 22(3):197–205. 31. Cónsole GM, Jurado SB, Riccillo FL, Gómez Dumm CL. Immunohistochemical and ultrastructural study of pituitary folliculostellate cells during aging in rats. Cells Tissues Organs. 2000;167(1):25–32. 32. Correa-de-Santana E, Fröhlich B, Labeur M, Páez-Pereda M, Theodoropoulou M, Monteserin JL, Renner U, Stalla GK. NOD2 receptors in adenopituitary folliculostellate cells: expression and function. J Endocrinol. 2009;203(1):111–22. 33. Crew MD, Spindler SR, Walford RL, Koizumi A. Age-related decrease of growth hormone and prolactin gene expression in the mouse pituitary. Endocrinology. 1987; 121(4):1251–5. 34. Cross PC, Mercer KL. Cell and tissue ultrastructure. First edition. New York: W.H. Freeman and company; 1993. 35. Danila DC. The folliculostellate cells in the pituitary gland. Acta Endo (Buc). 2005;I(1):86–93. 36. Дaниловa OB, Koзирицкий ВГ, Гордиенко BM, Баймут ФТ. Сравнительная ультраструктурная xaрактeриcтика передней доли гипофиза, щитовидной железьі и гонад у некоторьіx млекопитающих при старении. Цитология и генетика. 1988; 22(2):11–7. 37. Devnath S, Inoue K. An insight to pituitary folliculo-stellate cells. J Neuroendocrinol. 2008;20(6):687–91. 38. Doraiswamy PM, Potts JM, Axelson DA, Husain MM, Lurie SN, Na C, Escalona PR, McDonald WM, Figiel GS, Ellinwood Jr EH. MR assessment of pituitary gland Literatura 96 morphology in healthy volunteers: age- and gender-related differences. AJNR Am J Neuroradiol. 1992;13(5):1295–9. 39. Elster AD, Chen MY, Williams DW 3rd, Key LL. Pituitary gland: MR imaging of physiologic hypertrophy in adolescence. Radiology. 1990;174(3 Pt 1):681–5. 40. Eroschenko VP. di Fiore's Atlas of Histology with Functional Correlations. 11th ed. Baltimore: Wolters Kluwer|Lippincott Williams & Wilkins; 2008. 41. Fauquier T, Lacampagne A, Travo P, Bauer K, Mollard P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 2002;13(7):304–9. 42. Ferrari E, Cravello L, Muzzoni B, Casarotti D, Paltro M, Solerte SB, Fioravanti M, Cuzzoni G, Pontiggia B, Magri F. Age-related changes of the hypothalamic-pituitary- adrenal axis: pathophysiological correlates. Eur J Endocrinol. 2001;144(4):319–29. 43. FitzPatrick M, Tartaglino LM, Hollander MD, Zimmerman RA, Flanders AE. Imaging of sellar and parasellar pathology. Radiol Clin North Am. 1999;37(1):101–21. 44. Franceschi C, Bonafe´ M, Valensin S, Olivieri F, De Luca M, Ottaviani E, Benedictis G. Inflamm-aging. An evolutionary perspective on immunosenescence. Ann N Y Acad Sci. 2000;908:244–54. 45. Gartner LP, Hiatt JL. Color textbook of histology. Third edition. Baltimore: Saunders Elsevier; 2007. 46. Gerez J, Bonfiglio J, Sosa S, Giacomini D, Acuña M, Nagashima AC, Perone MJ, Silberstein S, Renner U, Stalla GK, Arzt E. Molecular transduction mechanisms of cytokine-hormone interactions: role of gp130 cytokines. Exp Physiol. 2007;92(5):801–6. 47. Gilmore TD, Wolenski FS. NF-κB: where did it come from and why? Immunol Rev. 2012;246(1):14–35. 48. Gloddek J, Lohrer P, Stalla J, Arzt E, Stalla GK, Renner U. The intrapituitary stimulatory effect of lipopolysaccharide on ACTH secretion is mediated by paracrine- acting IL-6. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2001;109(8):410–5. 49. Goldman JM, Cooper RL, Rehnberg GL, McElroy WK, Hein JF, Booth KC. Age- related changes in the regional distribution of hormones in the male rat anterior pituitary. Biochem Biophys Res Commun. 1988;152(3):1213–20. 50. Goncharova ND, Lapin BA. Effects of aging on hypothalamic-pituitary-adrenal system function in non-human primates. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):1191–201. 51. de Gonzalo-Calvo D, Neitzert K, Fernández M, Vega-Naredo I, Caballero B, García- Macía M, Suárez FM, Rodríguez-Colunga MJ, Solano JJ, Coto-Montes A. Differential Literatura 97 inflammatory responses in aging and disease: TNF-alpha and IL-6 as possible biomarkers. Free Radic Biol Med. 2010;49(5):733–7. 52. Gorbunova V, Seluanov A, Mao Z, Hine C. Changes in DNA repair during aging. Nucleic Acids Res. 2007;35(22):7466–74. 53. Grillo MA, Colombatto S. Advanced glycation end-products (AGEs): involvement in aging and in neurodegenerative diseases. Amino Acids. 2008;35:29–36. 54. Gust DA, Wilson ME, Stocker T, Conrad S, Plotsky PM, Gordon TP. Activity of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis is altered by aging and exposure to social stress in female rhesus monkeys. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85(7):2556–63. 55. Guyton A, Hall J. Medicinska fiziologija. 11. izdanje. Beograd: Savremena administracija; 2008. 56. Hauger RL, Thrivikraman KV, Plotsky PM. Age-related alterations of hypothalamic- pituitary-adrenal axis function in male Fischer 344 rats. Endocrinology. 1994;134(3): 1528–36. 57. Hayakawa K, Konishi Y, Matsuda T, Kuriyama M, Konishi K, Yamashita K, Okumura R, Hamanaka D. Development and aging of brain midline structures: assessment with MR imaging. Radiology. 1989;172(1):171–7. 58. Henderson HL, Hodson DJ, Gregory SJ, Townsend J, Tortonese DJ. Gonadotropin- releasing hormone stimulates prolactin release from lactotrophs in photoperiodic species through a gonadotropin-independent mechanism. Biol Reprod. 2008;78(2):370–7. 59. Henrikson RC, Kaye GI, Mazurkiewicz JE. Histology. First edition. London: Williams & Wilkins. The science of review; 1997. 60. Herkenham M. Folliculo-stellate (FS) cells of the anterior pituitary mediate interactions between the endocrine and immune systems. Endocrinology. 2005;146(1):33–4. 61. Herman JP, Larson BR, Speert DB, Seasholtz AF. Hypothalamo-pituitary-adrenocortical dysregulation in aging F344/Brown-Norway F1 hybrid rats. Neurobiol Aging. 2001; 22(2):323–32. 62. Ho KY, Evans WS, Blizzard RM, Veldhuis JD, Merriam GR, Samojlik E, Furlanetto R, Rogol AD, Kaiser DL, Thorner MO. Effects of sex and age on the 24-hour profile of growth hormone secretion in man: importance of endogenous estradiol concentrations. J Clin Endocrinol Metab. 1987;64(1):51–8. 63. Ilić S. Interna medicina. Drugo izdanje. Niš: Galaksija; 2009. 64. Inoue K, Couch EF, Takano K, Ogawa S. The structure and function of folliculostellate cells in the anterior pituitary gland. Arch Histol Cytol. 1999;62(3):205–18. Literatura 98 65. Kagayama M. The follicular cell in the pars distalis of the dog pituitary gland: an electron microscope study. Endocrinology. 1965;77(6):1053–60. 66. Kahle W, Frotscher M. Color Atlas of Human Anatomy. Nervous System and Sensory Organs Vol 3. 5th ed. New York: Thieme; 2002. 67. Kališnik M. Temelji stereologije. Prvo izdanje. Stereološka sekcija Zveze društev anatomov Jugoslavije. Ljubljana, SFRJ, 1985. 68. Kameda Y. Occurrence of colloid-containing follicles in the pars distalis of pituitary glands from aging guinea pigs. Cell Tissue Res. 1991;263:115–24. 69. Keenan DM, Licinio J, Veldhuis JD. A feedback-controlled ensemble model of the stress responsive hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 27;98(7):4028–33. 70. Kikuta A, Ohtani O, Murakami T. Three-dimensional organization of the collagen fibrillar framework in the rat adrenal gland. Arch Histol Cytol. 1991;54(2):133–44. 71. Kirkwood TB. New science for an old problem. Trends Genet. 2002;18(9):441–2. 72. Kirkwood TB. Understanding the Old Science of Aging. Cell. 2005;120(4):437–47. 73. De Kloet ER, Vreugdenhil E, Oitzl MS, Joëls M. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease. Endocr Rev. 1998;19(3):269–301. 74. Koutcherov Y, Mai JK, Ashwell KW, Paxinos G. Organization of the human paraventricular hypothalamic nucleus. J Comp Neurol. 2000;423(2):299–318. 75. Kuehnel W. Color Atlas of Cytology, Histology, and Microscopic Anatomy. 4th ed. Stuttgart: Thieme; 2003. 76. Kunihiko K, Naokatsu S, Akira Y. Morphological changes on MR imaging of the normal pituitary gland related to age and sex: main emphasis on pubescent females. J Clin Neurosci. 2002;9(1),53–6. 77. Landfield PW, Sundberg DK, Smith MS, Eldridge JC, Morris M. Mammalian aging: Theoretical implications of changes in brain and endocrine systems during mid- and late-life in rats. Peptides. 1980;1(1):185–96. 78. Lang PO, Mitchell WA, Lapenna A, Pitts S, Aspinall R. Immunological pathogenesis of main age-related diseases and frailty: role of immunosenescence. Eur Geriatr Med. 2010;1(2):112–21. 79. Lohrer P, Gloddek J, Nagashima AC, Korali Z, Hopfner U, Pereda MP, Arzt E, Stalla GK, Renner U. Lipopolysaccharide directly stimulates the intrapituitary interleukin-6 production by folliculostellate cells via specific receptors and the p38alpha mitogen- Literatura 99 activated protein kinase/nuclear factor-kappaB pathway. Endocrinology. 2000;141(12): 4457–65. 80. Lurie SN, Doraiswamy PM, Husain MM, Boyko OB, Ellinwood EH Jr, Figiel GS, Krishnan KR. In vivo assessment of pituitary gland volume with magnetic resonance imaging: the effect of age. J Clin Endocrinol Metab. 1990;71(2):505–8. 81. Luziga C, Yoshimi Y, Yoichiro H, Gabriel M, Koichi M. Phagocytotic removal of apoptotic endocrine cells by folliculostellate cells and its functional implications in clusterin accumulation in pituitary colloids in helmeted guinea fowl (Numida meleagris) Acta Histochem. 2006;108(1):69–80. 82. Luziga C, Kipanyula MJ, Mbassa G, Koichi M. Colloid in the anterior pituitary of helmet guinea fowl (Numida meleagris galeata): morphometric analysis and pattern of occurrence in relation to apoptosis. Vet Res Commun. 2009;33(7):681–91. 83. Johnson MD, Gray ME, Pepinsky RB, Stahlman MT. Lipocortin-1 immunoreactivity in the human pituitary gland. J Histochem Cytochem. 1990;38(12):1841–5. 84. Junqueira LC, Carneiro J. Osnovi histologije – Tekst i atlas. Jedanaesto izdanje. Beograd: Data status; 2005. 85. Jurado SB,. Cónsole GM, Gómez Dumm CLA. Sexually dimorphic effects of aging on rat somatotroph cells. An immunohistochemical and ultrastructural study. J Vet Med Sci. 1998;60(6):705–11. 86. Mabuchi Y, Shirasawa N, Sakuma E, Hashimoto Y, Kuno M, Coombs RJ, Herbert DC, Soji T. Intercellular communication within the rat anterior pituitary: relationship between LH-RH neurons and folliculo-stellate cells in the pars tuberalis. Cell Tissue Res. 2004;317(1):79–90. 87. MacMaster FP, Keshavan M, Mirza Y, Carrey N, Upadhyaya AR, El-Sheikh R, Buhagiar CJ, Taormina SP, Boyd C, Lynch M, Rose M, Ivey J, Moore GJ, Rosenberg DR. Development and sexual dimorphism of the pituitary gland. Life Sci. 2007;80(10): 940–4. 88. Mandavilli BS, Santos JH, and Van Houten B. Mitochondrial DNA repair and aging. Mutat Res. 2002;509(1-2):127–51. 89. Manoonkitiwongsa PS, McMillan PJ, Schultz RL, Jackson-Friedman C, Lyden PD. A simple stereologic method for analysis of cerebral cortical microvessels using image analysis. Brain Res Brain Res Protoc. 2001;8(1):45–57. Literatura 100 90. Marin F, Boya J, López-Carbonell A, Borregón A. Immunohistochemical localization of intermediate filament and S-100 proteins in several non-endocrine cells of the human pituitary gland. Arch Histol Cytol. 1989;52(3):241–8. 91. Mays PK, McAnulty RJ, Campa JS, Laurent GJ. Age-related-changes in collagen- synthesis and degradation in rat tissues-importance of degradation of newly synthesized collagen in regulating collagen production. Biochem J. 1991;276(Pt 2):307–13. 92. Meyer KC. Aging. Proc Am Thorac Soc. 2005;2(5):433–9. 93. Mills SE. Histology for pathologists. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2007. 94. Milošević V, Brkić B, Velkovski S, Starĉević V. Somatostatin-induced changes of the ACTH and STH cells in the hypophysis of the male rats. J Med Biochem. 1994; 13:102–6. 95. Mohamed F, Fogal T, Dominguez S, Scardapane L, Guzmán J, Piezzi RS. Colloid in the pituitary pars distalis of viscacha (Lagostomus maximus maximus): ultrastructure and occurrence in relation to season, sex, and growth. Anat Rec. 2000;258(3):252–61. 96. Mollard P, Hodson DJ, Lafont C, Rizzoti K, Drouin J. A tridimensional view of pituitary development and function. Trends Endocrinol Metab. 2012;23(6):261–9. 97. Moore KL, Dalley AF, Agur AMR. Clinically Oriented Anatomy. 6th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2010. 98. Morita M, Ogata T, Araki K. Scanning electron microscopic study of the collagen sheath of the human thyroid gland and its disorders. Scanning Microsc. 1994;8(3):695–704. 99. Newton K, Dixit VM. Signaling in innate immunity and inflammation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012;4(3). 100. Nishimura S, Tabata S, Nakamura Y, Okano K, Iwamoto H. Three-dimensional architecture and distribution of collagen components in the goat hypophysis. Anat Rec. 2004; 277(2):275–86. 101. Ogawa S, Couch EF, Kubo M, Sakai T, Inoue K. Histochemical study of follicles in the senescent porcine pituitary gland. Arch Histol Cytol. 1996;59(5):467–78. 102. Ogawa S, Ishibashi Y, Sakamoto Y, Kitamura K, Kubo M, Sakai T, Inoue K. The glycoproteins that occur in the colloids of senescent porcine pituitary glands are clusterin and glycosylated albumin fragments. Biochem Biophys Res Commun. 1997;234(3):712–8. 103. Ooi GT, Tawadros N, Escalona RM. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Mol Cell Endocrinol. 2004;228(1–2):1–21. Literatura 101 104. Orgnero de Gaisán EM, Maldonado CA, Aoki A. Fate of degenerating lactotrophs in rat pituitary gland after interruption of lactation: a histochemical and immunocytochemical study. Histochem J. 1993;25(2):150–65. 105. Parenti M, Dall'ara A, Rusconi L, Cocchi D, Müller EE. Different regulation of growth hormone-releasing factor-sensitive adenylate cyclase in the anterior pituitary of young and aged rats. Endocrinology. 1987;121(5):1649–53. 106. Pavlović M, Jovanović I, Ugrenović S, Vasović Lj, Krstić M, Bakić M, Ţivković V, Stojanović V. Morphometric analysis of the human anterior pituitary’s folliculostellate cells during the aging process. Ann Anat. 2013;195(3):231–7. 107. Pavlović M, Jovanović I, Pavlović S, Stojanović V, Ţivković V, Bakić M, Kundalić B, Antić V. Morphometric study of connective tissue in the human pituitary during aging process. Acta Facultatis Medicae Naissensis. 2013;30(2):79–84. 108. Perez-Castro C, Renner U, Haedo MR, Stalla GK, Arzt E. Cellular and molecular specificity of pituitary gland physiology. Physiol Rev. 2012;92(1):1–38. 109. Perls TT, Wilmoth J, Levenson R, Drinkwater M, Cohen M, Bogan H, Joyce E, Brewster S, Kunkel L, and Puca A. Life-long sustained mortality advantage of siblings of centenarians. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99(12):8442–7. 110. Peyster RG, Hoover ED, Viscarello RR, Moshang T, Haskin ME. CT appearance of the adolescent and preadolescent pituitary gland. AJNR Am J Neuroradiol. 1983;4(3):411-4. 111. Peyster RG, Adler LP, Viscarello RR, Hoover ED, Skarzynski J. CT of the normal pituitary gland. Neuroradiology. 1986;28(2):161–5. 112. Raskind MA, Peskind ER, Wilkinson CW. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation and human aging. Ann N Y Acad Sci. 1994;30;746:327–35. 113. Roppolo HMN, Latchaw RE, Meyer JD, Curtin HD. Normal pituitary gland. AJNR. 1983;4:170–99. 114. Rosol TJ, Yarrington JT, Latendresse J, Capen CC. Adrenal gland: structure, function, and mechanisms of toxicity. Toxicol Pathol. 2001;29(1):41–8. 115. Ross MH, Kaye GI, Pawlina W. Histology - A text and atlas. Fourth edition. Baltimore: Lippincott, Williams & Wilkins; 2003. 116. Rudman D, Feller AG, Nagraj HS, Gergans GA, Lalitha PY, Goldberg AF, Schlenker RA, Cohn L, Rudman IW, Mattson DE. Effects of human growth hormone in men over 60 years old. N Eng Med J. 1990; 323(1):1–6. 117. Russ JC. Image Analysis of Food Microstructure. CRC Press, Boca Raton, FL; 2004. Literatura 102 118. Salminen A, Kaarniranta K. Genetics vs. entropy: longevity factors suppress the NF- kappaB-driven entropic aging process. Ageing Res Rev. 2010;9(3):298–314. 119. Salminen A, Kauppinen A, Kaarniranta K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 2012; 24(4):835–45. 120. Sano T, Kovacs KT, Scheithauer BW, Young WF Jr. Aging and the human pituitary gland. Mayo Clin Proc. 1993;68(10):971–7. 121. Sasaki F. Changes with age in the number and size of anterior pituitary cells in female mice from suckling to adulthood. J Endocrinol. 1988;117(1):5–10. 122. Sato G, Shirasawa N, Sakuma, Sato Y, Asai Y, Wada I, Horiuchi O, Sakamoto A, Herbert DC, Soji T. Intercellular communications within the rat anterior pituitary XI: an immunohistochemical study of distributions of S-100 positive cells in the anterior pituitary of the rat. Tissue Cell. 2005;37(4):269–80. 123. Scanes CG, Jeftinija S, Glavaski-Joksimovic A, Proudman J, Arámburo C, Anderson LL. The anterior pituitary gland: lessons from livestock. Review. Domest Anim Endocrinol. 2005;29(1):23–33. 124. Schwartz J. Intercellular communication in the anterior pituitary. Endocr Rev. 2000; 21(5):488–513. 125. Seeman TE, Robbins RJ. Aging and hypothalamic-pituitary-adrenal response to challenge in humans. Endocr Rev. 1994;15(2):233–60. 126. Shringarpure R, Davies KJ. Protein turnover by the proteasome in aging and disease. Free Radic Biol Med. 2002;32(11):1084–9. 127. Siegel A, Sapru HN. Essential Neuroscience. 2nd ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Lippincott Williams & Wilkins; 2011. 128. Smith RG, Betancourt L, Sun Y. Molecular endocrinology and physiology of the aging central nervous system. Endocr Rev. 2005;26(2):203–50. 129. Soji T, Sirasawa N, Kuroni C, Yashiro T, Herbert DC. Immunohistochemical study of the post-natal development of the folliculo-stellate cells in the rat anterior pituitary gland. Tissue Cell. 1994;26(1):1–8. 130. Spik K, Sonntag WE. Increased pituitary response to somatostatin in aging male rats: relationship to somatostatin receptor number and affinity. Neuroendocrinology. 1989; 50(5):489–94. 131. Standring S, editor. Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Clinical Practice. 40th ed. Churchill Livingstone: Elsevier; 2008. Literatura 103 132. Sternberger LA, Hardy PH Jr, Cuculis JJ, Meyer HG. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry: preparation and properties of soluble antigen– antibody complex (horseradish peroxidase–antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes. J Histochem Cytochem. 1970;18:315–33. 133. Sun YK, Xi YP, Fenoglio CM, Pushparaj N, O'Toole KM, Kledizik GS, Nette EG, King DW. The effect of age on the number of pituitary cells immunoreactive to growth hormone and prolactin. Hum Pathol. 1984;15(2):169–80. 134. Suzuki M, Takashima T, Kadoya M, Konishi H, Kameyama T, Yoshikawa J, Gabata T, Arai K, Tamura S, Yamamoto T. Height of normal pituitary gland on MR imaging: age and sex differentiation. J Comput Assist Tomogr. 1990;14(1):36–9. 135. Takahashi S, Kawashima S. Age-related changes in prolactin cells in male and female rats of the Wistar/Tw strain. J Sci Hiroshima Univ Ser B Div 1.1983;31:185–91. 136. Takano K, Utsunomiya H, Ono H, Ohfu M, Okazaki M. Normal development of the pituitary gland: assessment with three-dimensional MR volumetry. AJNR Am J Neuroradiol. 1999;20(2):312–5. 137. Terano T, Seya A, Tamura Y, Yoshida S, Hirayama T. Characteristics of the pituitary gland in elderly subjects from magnetic resonance images: relationship to pituitary hormone secretion. Clin Endocrinol (Oxf). 1996;45(3):273–9. 138. Theogaraj E, John CD, Christian HC, Morris JF, Smith SF, Buckingham JC. Perinatal glucocorticoid treatment produces molecular, functional, and morphological changes in the anterior pituitary gland of the adult male rat. Endocrinology. 2005;146(11):4804–13. 139. Tien RD, Kucharczyk J, Bessette J, Middleton M. MR imaging of the pituitary gland in infants and children: changes in size, shape, and MR signal with growth and development. AJR Am J Roentgenol. 1992;158(5):1151–4. 140. Le Tissier PR, Hodson DJ, Lafont C, Fontanaud P, Schaeffer M, Mollard P. Anterior pituitary cell networks. Front Neuroendocrinol. 2012;33(3):252–66. 141. Traustadóttir T, Bosch PR, Cantu T, Matt KS. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis response and recovery from high-intensity exercise in women: effects of aging and fitness. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89(7):3248–54. 142. Tsunoda A, Okuda O, Sato K. MR height of the pituitary gland as a function of age and sex: especially physiological hypertrophy in adolescence and in climacterium. AJNR Am J Neuroradiol. 1997;18(3):551–4. 143. Turnbull AV, Rivier CL. Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis by cytokines: actions and mechanisms of action. Physiol Rev. 1999;79(1):1–71. Literatura 104 144. Urban R, Veldhuis JD. Hypothalamo-pituitary concomitants of aging. In: Sowers JR, Felicetta JV, editors. The endocrinology of aging. New York: Raven Press; 1988:41–74. 145. Vankelecom H, Carmeliet P, Heremans H, Van Damme J, Dijkmans R, Billiau A, Denef C. Interferon-gamma inhibits stimulated adrenocorticotropin, prolactin, and growth hormone secretion in normal rat anterior pituitary cell cultures. Endocrinology. 1990;126(6):2919–26. 146. Vankelecom H, Matthys P, Van Damme J, Heremans H, Billiau A, Denef C. Immunocytochemical evidence that S-100-positive cells of the mouse anterior pituitary contain interleukin-6 immunoreactivity. J Histochem Cytochem. 1993;41(2):151–6. 147. Vankelecom H, Matthys P, Denef C. Inducible nitric oxide synthase in the anterior pituitary gland: induction by interferon-gamma in a subpopulation of folliculostellate cells and in an unidentifiable population of non-hormone-secreting cells. J Histochem Cytochem. 1997;45(6):847–57. 148. Vankelecom H. Non-hormonal cell types in the pituitary candidating for stem cell. Semin Cell Dev Biol. 2007;18(4):559–70. 149. Vedder H. Physiology of the hypothalamic–pituitary–adrenocortical axis. NeuroImmune Biology. 2007;7:17–31. 150. Weinert BT, Timiras PS. Theories of aging. J Appl Physiol. 2003;95(4):1706–18. 151. Weiss J, Lansing AI. Age changes in the fine structure of anterior pituitary of the mouse. Proc Soc Exp Biol Med. 1953;82(3):460–6. 152. Wolf J, Weinberger B, Arnold CR, Maier AB, Westendorp RG, Grubeck-Loebenstein B. The effect of chronological age on the inflammatory response of human fibroblasts. Exp Gerontol. 2012;47(9):749–53. 153. Yeung CM, Chan CB, Leung PS, Cheng CH. Cells of the anterior pituitary. Int J Biochem Cell Biol. 2006;38(9):1441–9. 154. Young B, Lowe JS, Stevens A, Heath JW. Wheater's Functional Histology : A Text and Colour Atlas. 5th ed. Philadelphia: Elsevier Churchill Livinstone; 2007. 155. Zbuzek V, Arnetz BB, Eneroth P, Zbuzek VK. Age-related differences in concomitant hormone release from the superfused rat adenopituitary. Gerontology. 1991;37(5):253–61. BIOGRAFIJA Osnovni podaci Ime i prezime: Miljana Ljubomirović Datum i mesto roĊenja: 24.06.1980. godine, Niš Nauĉna oblast i uţa specijalnost: medicina; anatomija Obrazovanje Naziv završenog fakulteta: Medicinski fakultet Univerziteta u Nišu Studijska grupa: medicina Diplomirala 2006. godine sa proseĉnom ocenom 9.49 u toku studija i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Ĉlanstvo Ĉlan je Udruţenja anatoma Srbije, Srpskog lekarskog društva i Sekcije za kliniĉku anatomiju. Uĉesnik je II kongresa Srpskog anatomskog društva, 2008. godine u Vrnjaĉkoj Banji, BH simpozijuma "Morfologija u nauci i praksi", 2009. godine u Sarajevu, III kongresa Srpskog anatomskog društva Srbije sa meĊunarodnim uĉešćem, 2012. godine u Nišu kao i Simpo- zijuma kliniĉke i funkcionalne anatomije, 2013. godine u Novom Sadu. LISTA IZABRANIH PUBLIKACIJA 1. Pešić I, Pavlović M, Krstić M. Hormonska senzitivnost tumora kod bolesnica sa rakom dojke u KC Niš. Acta Medica Medianae Vol 46, No 2, April, 2007. 2. Ţivković V, Stefanović N, Đurović-Filipović T, Pavlović S, Stojanović V, Bakić M, Kundalić B, Pavlović M. Oblici akumulacije lipofuscina u ganglijskim ćelijama gornjeg vratnog gangliona kod ĉoveka,Vojnosanitetski pregled 2008;65(10):738-43. 3. Pavlović S, Stefanović N, Malobabić S, Babić Z, Kostić A, Pavlović M. Longitudinal striae of the human fornix: shape, relations and variations. Surg Radiol Anat 2009; 31:501-6. 4. Pavlović S, Stefanović N, Pavlović M, Janjić D. Cytochemical and immunocytochemical characteristics of Meckel’s diverticulum with heterotopic rests of pancreatic tissue. A case raport. Vojnosanitetski pregled 2010;67(12):953-1042. 5. Pavlović S, Zdravković D, Stefanović N, Pavlović M, Bakić M, Ţivković V. Anatomohistološke karakteristike Mekelovog divertikuluma fetusa. Vojnosanitetski pregled. 2008;65(8):606-11. 6. Stojanović V, Jovanović I, Ugrenović S, Vasović Lj, Ţivković V, Jocić M, Kundalić B, Pavlović M. Morphometric analysis of nonsclerosed glomeruli size and connective tissue content during the aging process. The Scientific World Journal. Volume 2012, Article ID 845046. 7. Antić V, Stefanović N, Antić M, Veliĉković M, Virijević D, Pavlović M, Kundalić B, Ţivković V, Gligorijević N. Morfološke karakteristike apendiks vermiformisa u prenatalnom periodu kod ĉoveka. Acta Medica Medianae 2012;51(4):26-31. 8. Pavlović M, Jovanović I, Pavlović S, Stojanović V, Ţivković V, Bakić M, Kundalić B, Antić V. Morphometric study of connective tissue in the human pituitary during aging process. Acta Facultatis Medicae Naissensis 2013;30(2):79-84. 9. Pavlović M, Jovanović I, Ugrenović S, Vasović Lj, Krstić M, Bakić M, Ţivković V, Stojanović V. Morphometric analysis of the human anterior pituitary’s folliculostellate cells during the aging process. Annals of Anatomy 2013;195:231-7. 10. Bakić M, Jovanović I, Ugrenović S, Vasović Lj, Krstić M, Stefanović N, Pavlović M, Ţivković V. Parahippocampal corpora amylacea and neuronal lipofuscin in human aging. Central European Journal of Medicine. 2013;8(6):749-61. ������ 1. ������ � ��������� ���������� �� �� ��������� �����������, ��� �������� � �������� ���������� ������������� ����, � �� ���������� �����������, �� � ������, �� � ��������, ���� ���� ���������� �� �������� ���� ���� �������, ����� ���������� ���������� ������ �������������� ��������, � �� �� ��������� �������� �������� � � �� ����� �����/�� �������� �����, ���� ������������/�� ������������� ������� ������ ����. � ����, _________________ ����� �����������: ____________________________________________________ ������ ����������: ______________________________ Морфометријска и имунохистохемијска анализа структура аденохипофизе укључених у систем хипоталамо-хипофизно-адреналне осовине током старења човека Миљана Љубомировић 20. 03. 2014. ������ 2. ������ � �������������������� � ����������� ������� ��������� ����������� ��� � ������� ������: _______________________________________________________ ��������� �������: __________________________________________________________ ������ ����: ________________________________________________________________ ������: ___________________________________________________________________ ���������� �� �� �������� ������� ���� ��������� ����������� ��������� ������������ �������, ���� ��� ������/�� �� ������� � ��������� ������������� ������������ � ����. ���������� �� �� ������ ���� ����� ������, ���� �� � ���� �� ��������� ���������� ����� ������� �����, ��� ��� �� ��� � �������, ������ � ����� ������ � ����� ������� ����, � �� � �������� ����������, ���������� �������������� ������������ � ����, ��� � � ������������� ������������ � ����. � ����, _________________ ����� �����������: ____________________________________________________ ������ ����������: ______________________________ Морфометријска и имунохистохемијска анализа структура аденохипофизе укључених у систем хипоталамо-хипофизно-адреналне осовине током старења човека Миљана Љубомировић Миљана Љубомировић ДАС - Клиничка медицина Проф. др Иван Јовановић 20. 03. 2014. ������ 3. ������ � ��������� ���������� �������������� ���������� „������ �����“ ��, � ��������� ������������� ������������ � ����, ����� ���� ��������� �����������, ��� ��������: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ���� �� ���� �������� ����. ����������� �� ���� ��������� ������/�� ��� � ������������ �������, �������� �� ������ ����������. ���� ��������� �����������, ����� � ��������� ������������� ������������ � ����, ���� ��������� ��� ���� ������� ������� �������� � ��������� ���� ������� ��������� ��������� (Creative Commons), �� ���� ��� �� �������/��. 1. ��������� 2. ��������� – �������������� 3. ��������� – �������������� – ��� ������� 4. ��������� – �������������� – ������ ��� ����� �������� 5. ��������� – ��� ������� 6. ��������� – ������ ��� ����� �������� (������ �� ��������� ���� ����� �� ���� ��������� �������; ������ ���� ������� �� � �������� ������). � ����, _________________ ����� �����������: ____________________________________________________ ������ ����������: ______________________________ Морфометријска и имунохистохемијска анализа структура аденохипофизе укључених у систем хипоталамо-хипофизно-адреналне осовине током старења човека Миљана Љубомировић 20. 03. 2014.