UNIVERZITET U NIŠU MEDICINSKI FAKULTET Ivana Pešić PATOFIZIOLOŠKI ASPEKTI GLOMERULSKIH I TUBULOINTESTICIJSKIH BUBREŽNIH OBOLJENJA: PROTEOMSKI PRISTUP DOKTORSKA DISERTACIJA Mentor: Prof. dr Vladisav Stefanović Niš, 2011. godina  Ničega se u životu ne treba plašiti. Potrebno je samo da se razume. Maria Curie  Posebno zahvaljujem o Mentoru, prof. dr Vladisavu Stefanoviću, na vremenu, strpljenju i nesebičnom pružanju znanja, o Prof. dr Gerhardu A. Mileru i prof. dr Klaudiji A. Miler, na prijateljstvu, stručnoj i nesebičnoj podršci i ukazanoj prilici za dalje stručno usavršavanje na Institutu za nefrologiju i reumatologiju, Medicinskog Univerziteta u Getingenu, Nemačka o Prof. dr Hasanu Dihaziju, na stručnoj i nesebičnoj podršci,kao i svim korisnim i prijateljskim savetima od početka mog istraživačkog boravka na Institutu za nefrologiju i reumatologiju, Medicinskog Univerziteta u Getingenu, Nemačka o Prof. dr Milanu Višnjiću na višegodišnjoj pomoći i podršci ukazanim prilikama u nastojanju da proširim svoja znanja, o Prof. dr Dušici Pavlović, na stručnoj i moralnoj podršci koju mi je pružala u toku mog celokupnog akademskog školovanja, o Prof. dr Veri Todorović, na stručnoj pomoći i podršci o Prof. dr Ljubinki Janković-Veličković na dugogodišnjoj saradnji i stručnoj pomoći prilikom izrade ove disertacije, o Docentu dr Tatjani Jeftović-Stojmenov i docentu dr Ivanu Jovanoviću, na stručnoj podršci i pomoći o Svojim nastavnicima i osoblju katedre za Patofiziologiju na kolegijalnoj i stručnoj podršci, o Elki Brunst-Knublih, na prijateljskoj i stručnoj pomoći tokom izrade ove disertacije o Svojim kolegama iz laboratorije za proteomska istraživanja, Asimi Bibi, Marvi Eltoveisi i Gri Dihazi na nesebičnoj prijateljskoj saradnji i podršci o Miletu Ž. Ranđeloviću, diplomiranom inženjeru elektronike, na dragocenoj pomoći u tehničkoj obradi ove disertacije, o Svojoj porodici, roditeljima i sestri za ogromno strpljenje,vremenu koje su uvek imali za mene, bezuslovno razumevanje i podršku tokom mog celokupnog akademskog rada i usavršavanja   I Autor Ime i prezime: Ivana Pešić Datum i mesto rođenja: 25.07.1980. Niš Sadašnje zaposlenje: Saradnik u nastavi na katedri za Patofiziologiju Medicinskog fakulteta u Nišu II Doktorska disertacija Naslov: Patofiziološki aspekti glomerulskih i tubulointesticijskih bubrežnih oboljenja: proteomski pristup Broj stranica: 131 Broj šema / slika: 41 Broj tabela: 6 Broj grafikona: 10 Broj bibliografskih podataka: 235 Ustanova i mesto gde je rad izrađen: Odeljenje za reumatologiju i nefrologiju Interna medicina, Medicinski fakultet u Getingenu, Nemačka Naučna oblast: Molekularna medicina, patofiziologija Mentor: Prof. dr Vladisav Stefanović III Ocena i odbrana Datum prijave teme: 21.12.2010. Broj odluke i datum prihvatanja doktorske disertacije: 04-MM-8/06 21.04.2011. Komisija za ocenu podobnosti teme i kandidata: 1. Prof. dr Vladmila Bojanić, predsednik, 2. Prof. dr Vladisav Stefanović, član, 3. Docent dr Tatjana Jeftović-Stojmenov Komisija za ocenu i odbranu doktorske disertacije: 1. Prof. dr Vladmila Bojanić, predsednik, 2. Prof. dr Vladisav Stefanović, mentor i član, 3. Prof. dr Vera Todorović, član sa Stomatološkog fakulteta u Pančevu, 4. Prof. dr Gerhard A. Miler, počasni član sa Medicinskog fakulteta u Getingenu, Nemačka, 5. Prof. dr Hasan Dihazi, počasni član sa Medicinskog fakulteta u Getingenu, Nemačka Datum odbrane doktorske disertacije: 15.06.2011. Naučni doprinos disertacije • Pešić I, Stefanović V, Mueller GA, Mueller CA, Čukuranović R, Jahn O, Bojanić V, Koziolek M, Dihazi H. Identification and validation of six proteins as markers for endemic nephropathy. Journal of Proteomics 2011; in press. 5  Lista skraćenica 2D-DIGE ⎯ dvodimenzionalna diferencijalna elektroforeza u gelu 2-DE ⎯ dvodimenzionalna elektroforeza u gelu 8-OHdG ⎯ 8-hydroxydeoxyguanosine, oksidisana forma DNK nukleozida AA ⎯ aristolohijska kiselina, ekstrakt biljaka iz vrste Aristolochia AA1 ⎯ aristolohijska kiselina 1, 8-metoksi-6-nitro-fenantro-(3,4-d)-1,3- dioksolo-5-karboksilna kiselina AA1-OTA ⎯ kombinovani tretman AA1 i OTA-om AA2 ⎯ aristolohijska kiselina 2, 6-nitro-fenantro-(3,4-d)-1,3-dioksolo- 5-karboksilna kiselina ACE inhibitori ⎯ angiotensin-convertujući enzim inhibitori ACTA2 ⎯ alfa aktin glatkih mišića AGEs ⎯ Advanced glycation end-products, krajnji produkti glikacije AKI ⎯ acute kidney injury, akutno oštećenje bubrega ALB ⎯ albumin AMBP ⎯ alfa-1-mikroglobulin ANOVA ⎯ analiza varijanse APOH ⎯ beta-2-glikoprotein ARE ⎯ antioksidativni regulatorni element AUC ⎯ Area under the curve, površina ispod linije B2M ⎯ beta-2-mikroglobulin BCL-2 ⎯ Regulatorni apoptotični protein BMI ⎯ body mass index, indeks telesne mase BSA ⎯ Kravlji serum albumin CDKN1A ⎯ Cyclin-dependent kinase inhibitor 1, inhibitor ciklin zavisne kinaze CFB ⎯ komplement faktor B CHAPS ⎯ 3-[(3-Cholamidopropil)dimetilamonijum]-1-propan-sulfonat CI ⎯ interval pouzdanosti COX1, COX2 ⎯ Prostaglandin H sintetaza, ciklooksigenaza CTGF ⎯ Connective tissue growth factor, faktor rasta vezivnog tkiva Cy2 ⎯ fluoroscentna boja talasne dužine 473 nm Cy3 ⎯ fluoroscentna boja talasne dužine 532 nm Cy5 ⎯ fluoroscentna boja talasne dužine 635 nm CYP ⎯ citohrom P450 (CYP) 1A1/2 dA-AA1 ⎯ 7-(deoksi-adenozin-N6-il)-aristolaktam-1 dA-AA2 ⎯ 7-(deoksi-adenozin-N6-il)-aristolaktam-2 DAPI ⎯ 4'-6-Diamidino-2-phenilindol Delta 2D 3.4 software ⎯ Program za odradu proteomskih mapa dG-AA1 ⎯ 7-(deoksi-guanozin-N2-il)-aristolaktam 2 DM ⎯ Diabetes mellitus, šećerna bolest DN ⎯ Dijabetesna nefropatija DTT ⎯ Ditiotreitol ECM ⎯ ekstracelularni matriks eEF1A-1 ⎯ Elongacioni faktor 1-alfa 1 EGR1 ⎯ Early growth response protein 1, protein ranog odgovora ćelijskog rasta Lista skraćenica 6 Eif5A ⎯ Eukariotski translacioni inicirajući faktor EN ⎯ endemska nefropatija ERKs ⎯ Ekstracelularnim signalom regulisane kinaze EuroKup/HKUPP ⎯ Evropska i internacionalna organizacija za istraživanje urinarnog u bubrežnog proteoma FCS ⎯ Foetal calf serum, komponenta standardnog medija za kultivaciju ćelija FN1 ⎯ fibronektin FOS ⎯ Protoonkogen c-FOS GC ⎯ vitamin D vezujuči protein GN ⎯ glomerulonefritis GraphPrism software ⎯ Program za statističku obradu podataka H2-ALPHA ⎯ Alpha-tubulin isotype H2-alpha, Alfa izotop H2 tubulin HDAC ⎯ Histon deacetilaza HEN ⎯ zdravi ispitanici koji naseljavaju endemska područja HGER ⎯ zdravi ispitanici koji naseljavaju ne-endemska područja HIST1H1C ⎯ Histon H1.2 HIST1H2AC ⎯ Histon H2A tip 1-C HIST1H3D ⎯ Histon H3.1 HIST1H3E ⎯ Histon H3.1 HIST1H4B ⎯ Histon H4 HIST1H4C ⎯ Histon H4 HK2 ćelije ⎯ sekundarna kultura humanih ćelija proksimalnih tubula, HK2 soj HLE ⎯ humana leukocitna elastaza HP ⎯ haptoglobin HPX ⎯ hemopeksin IARC ⎯ Međunarodna agencija za istraživanje kancera IEF ⎯ izoelektrično fokusiranje IGF ⎯ Insulin-like growing factor, insulinu sličan faktor rasta Image J software ⎯ Program za obradu digitalnih podataka iNOS ⎯ inducibilna azot oksid sintetaza IPG ⎯ gel trake za izoelektrično fokusiranje iRNK ⎯ informaciona ribonukleinska kiselina K-ALPHA-1 ⎯ Tubulin alpha-1B chain, alfa-1B lanac tubulina KDOQI ⎯ National Kidney Foundation - the Kidney Disease Outcomes Quality Initiative, nacionalna fondacija za bubrežne bolesti KLF10 ⎯ Krueppel-like factor 10 LCN2 ⎯ Neutrophil gelatinase-associated lipocalin, neutrofilni lipokain LMAN2 ⎯ vezikularni integralni membranski protein MALDI-TOF MS ⎯ Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry, maseni spektrometar MALDI-TOF-TOF-MS ⎯ Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry, maseni spektrometar MAPKs ⎯ Mitogen aktivirane protein kinaze MASCOT PMF software ⎯ Program za online pretragu peptidnih i proteinskih baza MCL-1 ⎯ antiapoptotični član BCL-2 familije MTT ⎯ 3-(4,5-dimetiltiazoil-2)-2,5-difeniltetrazolijum bromid Lista skraćenica 7 MYC ⎯ Myc protoonkogen protein N ⎯ broj ispitanika NAA ⎯ nefropatija aristolohijske kiseline NCBI ⎯ baza podataka za identifikaciju proteina Ndfus1 ⎯ NADH-ubikvinon oksidoreduktaza 75 kDa subjedinica, mitochondrijalna forma NECAP1 ⎯ Nukleoprotein NF-kB ⎯ nuklearni faktor, kapa B NQO1 ⎯ NAD(P)H:kvinon oksidoreduktaza Nrf2 ⎯ nuklearni transkripcioni eritroidni faktor 2 p45 vezan faktor 2 NS ⎯ nefroskleroza ORP 150 ⎯ HYOU1, Hipoksijom regulisan protein 1 OTA ⎯ Ohratoksin A p ⎯ stepen verovatnoće p38 ⎯ Mitogen aktivirana protein 38 kinaza PAGE ⎯ poliakrilamid gel elektrogoreza PARK7 ⎯ Protein DJ-1 PBS ⎯ fosfatna puferisana so PGHS ⎯ Prostaglandin-H sintaza pI ⎯ izoelektrična tačka PMF ⎯ peptide mass fingerprint, maseni peptidni spektar POR ⎯ NADPH:CYP reduktaza POT1 ⎯ DNK telomerni vezujući protein PRDX1 ⎯ Peroksiredoksin 1 PRDX6 ⎯ Peroksiredoksin 6 PSP/JNK ⎯ C-SEP N-terminalne kinaze Quantum 286 ⎯ vrsta hranljivog medijuma RAB5A ⎯ Ras-zavisan protein Rab-5A RAS ⎯ Ras-specific guanine nucleotide-releasing factor 2, protoonkogen RAS RBP4 ⎯ retinol vezujući protein ROC kriva ⎯ Receiver Operating Characteristic curve, ROC kriva SAPK ⎯ Stres aktivirane protein kinaze SD ⎯ standardna devijacija SDS ⎯ Sodijum dodecil sulfat SERPINA1 ⎯ alfa-1-antitripsin Sn ⎯ Senzitivnost SOD1 ⎯ superoksid dizmutaza [Cu-Zn] SOD2 ⎯ Mitohondrijalna superoksid dizmutaza Sp ⎯ Specifičnost Swiss-Prot ⎯ baza podataka za identifikaciju proteina TGF-β ⎯ Tumor growing factor beta, tumorski faktor rasta beta TK173 ćelije ⎯ sekundarna kultura humanih fibroblasta, TK173 soj TP53 ⎯ Cellular tumor antigen p53, ćelijski tumor antigen p53 Tris-HCl ⎯ tris(hidrokskimetil)aminometan, puferizovani rastvor Triton X-100 ⎯ nejozinirajući surfaktant sa redukujućim dejstvom Lista skraćenica 8 TTR ⎯ transtiretin TUBA-1 ⎯ Tubulin alpha-1 chain, alfa-1 lanac tubulina TUBA-3 ⎯ Tubulin alpha-3 chain, alfa-3 lanac tubulina Tween-20 ⎯ Polisorbat 20, deterdžent Ube2N ⎯ Ubikvitin konjugujući enzim E2 N UUTT ⎯ upper urothel tract tumour, tumor gornjih urotelnih puteva VCL ⎯ Vinkulin VEGF ⎯ Vezikulatni endotelijani faktor rasta A VIM ⎯ Vimentin vs ⎯ u odnosu, prema 9  Sadržaj 1. UVOD .................................................................................................................................... 11 1.1 Glomerulska oboljenja bubrega...................................................................................... 11 1.1.1 Dijabetesna nefropatija ......................................................................................... 12 1.2 Tubulointesticijska oboljenja bubrega............................................................................ 13 1.2.1 Endemska nefropatija............................................................................................ 14 1.2.1.1 Aristolohijska kiselina 1 (AA1) ................................................................ 16 1.2.1.2 Ohratoksin A (OTA) ................................................................................. 17 1.2.1 Prerenalno akutno oštećenje bubrega.................................................................... 19 1.3 Proteomska istraživanja u nefrologiji............................................................................. 20 2. CILJ ISTRAŽIVANJA .......................................................................................................... 22 3. MATERIJAL I METODE...................................................................................................... 23 3.1 Pacijenti .......................................................................................................................... 23 3.2 Kultura humanih ćelija epitela proksimalnih tubula bubrega (HK2 ćelijska kultura) ... 24 3.3 Sakupljanje uzoraka urina .............................................................................................. 25 3.4 Precipitacija proteina i određivanje koncentracije ......................................................... 25 3.5 Dvodimenzionalna gel elektroforeza (2-DE) ................................................................. 25 3.6 Bojenje gelova................................................................................................................ 26 3.7 Dvodimenzionalna diferencijalna in-gel elektroforeza (2D-DIGE)............................... 26 3.8 In-gel digestija i mass spektrometrijska analiza............................................................. 27 3.9 Western blot analiza ....................................................................................................... 27 3.10 Dot blot analiza............................................................................................................... 28 3.11 Test vijabilnosti ćelija (MTT test) .................................................................................. 29 3.12 Imunofluorescentna bojenja ćelija.................................................................................. 29 3.13 Histološki preparati tkiva tumora bubrega pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovane endemske nefropatije....................................................................... 30 3.14 Imunohistologija preparata tkiva .................................................................................... 30 3.15 Statistička analiza podataka............................................................................................ 30 4. REZULTATI.......................................................................................................................... 31 4.1 Pacijenti .......................................................................................................................... 31 4.2 Određivanje koncentracije proteina u urinu korišćenjem rutinskih laboratorijskih metoda ............................................................................................................................ 31 4.3 Mapiranje EN i HEN urinarnog proteoma ..................................................................... 32 4.4 Komparativna analiza urinarnih proteoma upotrebom 2D-DIGE i identifikacija EN proteinskih markera........................................................................................................ 36 4.5 Komparativna analiza urinarnih proteoma DN i EN pacijenata upotrebom 2D-DIGE i identifikacija proteinskih markera glomerularnog oštećenja u urinu EN pacijenata ... 39 4.6 Imunološko potvrđivanje identifikovanih EN proteinskih markera............................... 42 4.7 Validnost EN markera ispitivana na većem polulacionom uzorku ................................ 44 4.8 Test ćelijske vijabilnosti (MTT test) .............................................................................. 48 4.9 Kvantitativna i kvalitativna analiza proteina koji učestvuju u akutnom ćelijskom odgovoru na dejstvo toksina........................................................................................... 49 4.10 Imunološko potvrđivanje markera oksidativnog stresa u ćelijskim lizatima nakon akutnog izlaganja HK2 ćelija toksinima ........................................................................ 63 4.11 Kvantitativna i kvalitativna analiza proteina koji učestvuju u hroničnom ćelijskom odgovoru na dejstvo toksina........................................................................................... 65 Sadržaj 10 4.12 Imunološko potvrđivanje markera oksidativnog stresa u ćelijskim lizatima nakon hroničnog izlaganja HK2 ćelija toksinima ..................................................................... 73 4.13 Promene u morfologiji tretiranih ćelija .......................................................................... 75 4.14 Proteini koji su značajni u ćelijskom odgovoru na dejstvo toksina – imunobojenja ćelija kao metoda ispitivanja postojanja markera intoksikacije i njihove lokalizacije u ćeliji 77 4.15 Imunohistološka bojenja preparata tumora gornjeg urotelijuma pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovane endemske nefropatije..................................................... 80 5. DISKUSIJA............................................................................................................................ 82 5.1 Proteini u urinu pacijenata sa endemskom nefropatijom i zdrave populacije koja živi na područjima endemske nefropatije............................................................... 82 5.2 Urinarni proteinski markeri ranog oštećenja bubrežnog tkiva pacijenata sa endemskom nefropatijom........................................................................................... 83 5.3 Urinarni proteinski markeri glomerularnog oštećenja u toku razvoja dijabetesne nefropatije – nalaz markera u urinu EN pacijenata kao znak progresije oboljenja........ 86 5.4 Oksidativne lezije humanih tubulocita pri akutnom i hroničnom izlaganju aristolohijskom kiselinom .............................................................................................. 90 5.5 Pojava fibrotičnih markera u humanim tubulocitima nakon akutnog i hroničnog tretmana aristolohijskom kiselinom ............................................................................... 93 5.6 Specifični proteini u lizatu humanih tubulocita kao odgovor na prisustvo aristolohijske kiseline ..................................................................................................... 94 5.7 Ohratoksin A indukuje oksidativni stres pri hroničnom izlaganju humanih tubulocita ... 99 5.8 Pojava markera fibroze u humanim tubulocitima pri akutnom i hroničnom izlaganju ohratoksinom A ............................................................................................ 100 5.9 Specifični proteini u lizatu humanih tubulocita (HK2) kao odgovor na prisustvo ohratoksina A ............................................................................................................... 101 5.10 Aristolohijska kiselina i Ohratoksin A zajedno indukuju razvoj oksidativnog stresa i fibrozu pri akutnom i hroničnom izlaganju................................................................ 105 5.11 Prisustvo specifičnih proteina u lizatu humanih tubulocita nakon njihovog izlaganja aristolohijskom kiselinom i ohratoksinom A................................................ 105 5.12 Markeri ćelijske intoksikacije aristolohijskom kiselinom i ohratokisnom u tkivu tumora gornjeg urotelijuma pacijenta sa i bez predhodno dijagnostifikovanim EN-om 107 5. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 109 6. LITERATURA..................................................................................................................... 111 11  1. UVOD Bubrežna oboljenja predstavljaju jedan od najvećih zdravstvenih problema današnjice. Prevalenca hronične bubrežne insuficijencije u Evropi prelazi 10% svih bubrežnih oboljenja [1-4], što je direktna posledica velikog broja obolelih od šećerne bolesti i povišenog krvnog pritiska [5]. Savremene dijagnostičke procedure nisu dovoljno efikasne da se bolest otkrije u ranijem stadijumu i spreči razvoj komplikacija. Ovaj ograničavajući faktor nameće potrebu da- ljeg istraživanja i traganja za novim molekularnim parametrima koji poseduju mogućnost efi- kasne primene u ranoj dijagnostici i prevenciji. 1.1 Glomerulska oboljenja bubrega Oštećenjem normalne strukture glomerula remeti se njihova osnovna funkcija – filtracija krvi i uklanjanje štetnih materija iz organizma (eliminacija toksina i njihovih metabolita, kao i krajnjih produkata metabolizma ugljenih hidrata, masti i belančevina iz krvnog toka i njihova ekskrecija putem urina) uz očuvanje normalnog ćelijskog sastava krvi kao i vitalnih proteina. Po načinu nastanka, glomerularna oštećenja mogu biti akutna i hronična. Ona mogu zahvatiti samo glomerule, ili se pojaviti u okviru sistemskih ili bubrežnih oboljenja (sistemski lupus [6], dijabetes melitus [7], sistemska ili lokalna infekcija). U zavisnosti od težine oštećenja glomeru- la, glomerulska oboljenja su podeljena u dve osnovne grupe: glomerulonefritisi (zapaljenske reakcije praćene nefrotskim ili nefritskim sindromom) i glomeruloskleroze (progresivno hro- nično propadanje glomerula usled osnovne bolesti, koje dovode do razvoja hronične bubrežne insuficijencije) [8-10]. Glomerularno oštećenje izaziva pojavu različitih kliničkih sindroma: prisustvo asimpto- matske proteinurije i hematurije, masivne rekurentne hematurije, akutnog nefritičkog sindroma, brzog progresivnog glomerulonefritisa, hroničnog nefritičkog sindroma, akutne oligurične bu- brežne insuficijencije, nefrotskog sindroma, glomerulonefritisa u sistemskim bolestima (dijabe- tes melitus) udruženih sa razvojem smanjene glomerularne filtracije, pojavom hipoproteinemi- je, edema, hipertenzije i hiperlipidemije. Različita oboljenja mogu učestvovati u razvoju ošte- ćenja glomerula: direktna oštećenja bubrežnog tkiva (infekcije, intoksikacije, lokalno toksično dejstvo lekova, poremećaji funkcije imunog sistema, nasledne disfunkcije, idiopatska obolje- Uvod 12 nja) ili u sklopu sistemskih oboljenja (dijabetes melitus, kardiovaskularna oboljenja, oboljenja jetre i digestivnog trakta)[11, 12]. 1.1.1 Dijabetesna nefropatija Šećerna bolest (dijabetes melitus, DM) je najčešći uzrok nastanka hronične bubrežne insu- ficijencije širom sveta [5, 13, 14]. Njenu najznačajniju komplikaciju predstavlja dijabetesna ne- fropatija (DN), koja se definiše kao prisustvo perzistentne proteinurije (više od 0,5 g/24h) u di- jabetičnih bolesnika sa izraženom retinopatijom i povećanim krvnim pritiskom, a u odsustvu infekcije urotrakta ili srčane slabosti. Oko 10 – 50% svih pacijenata obolelih od DM tip 2 ima- ju razvijeno oštećenje bubrežnog tkiva u periodu od 15 – 30 godina od nastanka oboljenja [15]. Sve veći broj obolelih posledica je porasta broja starijeg stanovništva, gojaznosti, kao i smanje- noj fizičkoj aktivnosti [16]. Kako su vaskularne komplikacije pacijenata sa DM u terapijskom smislu danas sve manji problem, prevencija oštećenja bubrega kod pacijenata sa DM pred- stavlja terapijski izazov [17]. Dijabetesna nefropatija se može pojaviti i kod bolesnika sa dijabetes melitusom tip 1 i bo- lesnika sa dijabetes melitusom tip 2. Nastanak i razvoj bubrežnog oštećenja je multifaktorijalan. Faktori koji utiču na progresiju oštećenja bubrega u dijabetesnoj nefropatiji najčešće su: genet- ska predispozicija [18], sistemska hipertenzija [19, 20], aktivacija sistema renin-angiotenzin [21, 22], proteinurija [23, 24], hiperglikemija [25], hiperlipidemija [26, 27], kao i pušenje [28]. Patogeneza dijabetesne nefropatije. Dugotrajno povišene vrednosti glukoze u krvi dovode do nastanka mikro i makrovaskularnih lezija koje uzrokuju razvoj kliničkih komplikacija u tar- get organima (retina, srce, bubreg). Na nivo i brzinu razvoja oštećenja utiču i nasledna predi- spozicija, hipertenzija nastala kao posledica bubrežnog oštećenja, kao i poremećaji na moleku- larnom nivou (poremećaj aktivnosti faktora rasta). Dolazi do značajne akumulacije ekstracelu- larnog matriksa (ECM) sa poremećajem strukture bazalnih membrana u glomerulu i tubulima, kao i proliferacija mezangijalnog matriksa, što neizostavno vodi ka razvoju glomeruloskleroze i tubulointesticijalne fibroze [29]. Ovakve promene remete mehaničku i elektrostatičku funkci- ju glomerula, što se detektuje u kliničkoj slici poliurijom i mikroalbuminurijom. Sistemska hi- pertenzija i hiperglikemija dalje podržavaju razvoj teške glomeruloskleroze koja se dokazuje smanjenjem nivoa glomerularne filtracije i pojavom makroalbuminurije (ekskrecija albumina prelazi 300 mg za 24h) [20]. U preko 50% slučajeva ove promene vode opsežnom gubitku fun- kcionalno i strukturno zdravih nefrona što može rezultovati bubrežnom insuficijencijom [15]. Uvod 13 Mehanizmi nastanka ove nefropatije uključuju poremećaje na nivou kompleksnih intrace- lularnih proseca koji povezuju multiple metaboličke kao i transmitivne signalne puteve. Tu se podrazumeva direktan uticaj povećane koncentracije glukoze i njenog ulaska u ćeliju na meta- bolizam poliola [30], poremećaj u aktivnosti intracelularnih metaboličkih puteva [31], aktivaci- ja protein kinaze C [32], nastanak formacija reaktivnih kiseoničnih radikala i razvoj oksida- tivnog stresa [33], povećana produkcija krajnjih produkata glikacije (AGEs) [34] i poremećena ekspresija brojnih profibrotičnih faktora rasta kao što su TGF-beta [35], CTGF i IGF [36]. Promene koje se javljaju na bubregu mogu se podeliti na rane i kasne. Pod ranim prome- nama podrazumevamo funkcionalne poremećaje glomerularne filtracije, tubulske reapsorbcije i tubulske sekrecije. Kasne promene uključuju pojavu glomeruloskleroze (difuzne i nodularne), arteronefroskeproze, hroničnog intersticijskog nefritisa, papilarne nekroze i različitih lezija tu- bula [37]. Aktuelni dijagnostički kriterijumi. Najpouzdanija metoda praćenja razvoja dijabetesne ne- fropatije je otkrivanje mikroalbuminurije [38]. Mikroalbuminurija je definisana kao koncentra- cija izlučenih albumina u urinu između 30 – 300 mg u toku 24h. Specifičnost nalaza mikro- albuminurije kao markera rane dijagnostike je tema brojnih diskusija. Često prati i druga pato- loška stanja, kao što je zapaljenje, arterijska hipertenzija i srčana insuficijencija. Takva stanja posebno su prisutna kod starijih pacijenta koji imaju šećernu bolest. Rana dijagnostika dijabe- tesne nefropatije je od izuzetne važnosti, s tim pre što se pravovremena terapija ACE-inhibitori- ma i antagonistima angiotenzin II receptora pokazala uspešnom rezultujući usporenjem napredo- vanja bolesti ka hroničnoj bubrežnoj insuficijenciji, kao i smanjenjem mortalilteta [14, 17]. 1.2 Tubulointesticijska oboljenja bubrega Poremećaji funkcije tubula se prema nastanku dele na primarne (urođene) defekte ili se- kundarne u sklopu oboljenja bubrega ili drugog patološkog stanja. Sekundarne tubulopatije javljaju se češće nego primarne. Sreću se u tubulointesticiopatijama, glomerulonefritisima sa kliničkom prezentacijom teškog nefrotskog sindroma, sistemskim bolestima vezivnog tkiva, u transplantiranom bubregu u fazi odbacivanja, u amiloidozi, multiplom mijelomu i drugim pato- loškim stanjima. Sekundatno tubuli mogu biti oštećeni i dejstvom nefrotoksina i nefrotoksičnih lekova [39-41]. Tubulointesticijska oboljenja zahvataju bubrežni intesticijum i okolne tubule. Mogu se ja- vljati u akutnoj i hroničnoj formi, što vodi ka progresivnom razvoju hronične bubrežne insufi- cijencije. Najčešći uzroci su lokalna (bakterijski pijelonefritis) ili sistemska infektivna stanja, Uvod 14 direktna reakcija bubrežnog tkiva na dejstvo nekih lekova (analgetici, antibiotici), alergijske re- akcije (na lekove kao što su penicilin, cefaleksin, nesteroidni anti-inflamatorni lekovi) i drugi poremećaji rada imunološkog sistema, dejstvo toksina (aristolohijske kiseline, ohratoksina A). Simptomi i znaci pre svega zavise od osnovne bolesti koja je dovela do ovog stanja. Uopšteno, prisutna je proteinurija tubularnog tipa (proteini male molekularne mase, za opšte markere tu- bularnog oštećenja smatra se prisustvo B2M i AMBP proteina u urinu) [39-41]. 1.2.1 Endemska nefropatija Endemska nefropatija (EN) je hronična tubulointesticijalna nefropatija sa podmuklim po- četkom i sporim razvojem terminalne bubrežne slabosti. Opisana je pedesetih godina dvadese- tog veka kao bolest stanovnika aluvijalnih ravnica jugoistočne Evrope, duž reka pritoka Duna- va u Bosni i Hercegovini, Bugarskoj, Hrvatskoj, Rumuniji i Srbiji [42]. Incidenca EN-a se sve više pomera ka starijim uzrastnim grupama. Prevalenca bolesti se dugo vremena nije bitnije menjala, da bi u većini žarišta počela da se snižava. Najveći broj obolelih je između 55-59 godina starosti, a gotovo da nisu zabeleženi slučajevi obolelih koji su mlađi od 30 godina. Jasno ispoljena klinička slika se ne zapaža među decom i adolescentima. Poslednjih decenija postoji trend oboljevanja starijih uzrastnih grupa. Ne postoji značajna ra- zlika u oboljevanju među polovima. Rizik od umiranja muškaraca i žena od ove bolesti nije bitno različit [43-45]. Etiologija i patogeneza endemske nefropatije. Pravi uzrok nastanka bolesti je nepoznat iako se ističe značaj nasleđivanja, dejstvo činioca životne sredine kao i prisustvo poremećaja imunog sistema. Porodični karakter oboljenja smatran je jednim od osnovnih dijagnostičkih kriterijuma EN-a. Međutim, podjednake stope oboljevanja pripadnika različitih etičkih grupa u istom žarištu, pojava EN-a među migrantima, jednaka zastupljenost bolesti među članovima domaćinstva povezanih krvnim i bračnim srodstvom, govori u prilog da uloga nasleđa nije od presudnog značaja. Istaživanja su pokazala i mogućnost postojanja specifičnog hromozomskog markera (3q25) kod obolelih i osoba sa visokim rizikom od oboljevanja, ali rezultati nisu po- tvrđeni na većem broju ispitanika [46]. U ostalim genetskim istraživanjima ističe se značaj postojanja specifičnih aberacija veza- nih za X hromozom, razlika u pogledu niza fenotipskih osobina, poremećaj efikasnosti mehani- zama oksidativne zaštite, ali bez konačnih zaključaka [42]. Smatra se da odlučujuću ulogu ipak igraju faktori sredine. Uloga protozoa, bakterija, rike- cija pa čak i virusa isključena je kao mogućnost u nastajanju oboljenja. Posebnu pažnju je, ipak Uvod 15 izazvalo proučavanje uticaja mikotoksina (ohratoksin A) [47-49], Aristolochia-e (aristolohijska kiselina 1 i 2) [50], kao i brojnih zagađivača prisutnih u životnoj okolini. Urotelijalni tumori prelaznog epitela su prijavljeni kao česta komplikacija [51-63]. Patološki nalaz. Klasične morfološke promene bubrega u hroničnom stadijumu EN-a po- drazumevaju: jako izraženu acelularnu intesticijsku fibrozu, atrofiju i iščezavanje jednog broja tubula, ćelijsku inflaciju intesticijuma različitog stepena intenziteta i različite lokalizacije, oču- vane ili kolapsne i fokalno segmentno i globalno sklerozirane glomerule po tipu kolapsne (ishe- mične, vaskularne) rezidualnosti, čestu udruženost sa tumorima gornjeg urotelijuma (pijelon i ureteri), sklerotične promene na krvnim sudovima, limfostazu i proširenje limfnih sudova, izosta- nak nekroze papila, bez prisutnih znakova zapaljenja urinarnih puteva. U diferencijalnoj dijagno- zi najčešće se pominje hronični glomerulonefritis, analgezična nefropatija, hronični pijelonefritis, vaskularna nefroskleroza, promene u bubrezima izazvane silicijumom i druge promene [64, 65]. Aktuelni dijagnostički kriterijumi. Iako ne postoje specifični kriterijumi za dijagnozu EN- a, sledeće epidemiološke, kliničke, laboratorijske i patomorfološke karakteristike od značaja su u dijagnostici EN-a [51, 66-73]: − Epidemiološki podaci: bolest se javlja u žarištima, endemično kod seoskog stanovništva naselja duž reka Kolubare, Drine, Save, Morave u zemljama bivše Jugoslavije, Istar u Bugarskoj i pritoka Dunava u Rumuniji; ima familijaran karakter, a nije nasledna; za- hvata oba pola u približno istoj meri; najranije se bolest ispoljava nakon kraja druge de- cenije života − Klinički i laboratorijski podaci: neprimetan, podmukao početak, hroničan tok, bez ede- ma i febrilnih faza, arterijski pritisak umereno povišen u oko 40-50% slučajeva obično u odmaklijim fazama bolesti; laboratorijski nalazi govore o primarnom oštećenju tubula – proteinurija je oskudna i tubularnog tipa (β-2-mikroglobulin (B2M), α-1-mikroglobulin (AMBP)); u odmaklijim fazama bolesti postoji jače izražena anemija normohromnog tipa; letalan ishod nastupa tek posle više godina ili i decenija bolesti sa znacima uremije − Patološko-anatomski i patološko-histolološki nalazi: makroskopski – skoro simetrično obostrano smanjivanje bubrega; mikroskopski – tubulske i intesticijske promene sa ma- njim ćelijskim imfiltratima prisutne su u intesticijumu. Bolest je, usled nepostojanja markera rane dijagnostike, dijagnostifikovana u stadijumu ra- zvoja hronične bubrežne insuficijencije, gde primenjena terapija nije pokazala značajne re- zultate. Istraživanja markera velike specifičnosti i senzitivnosti rane dijagnostike oboljenja su neophodna da bi se bolje razumeo mehanizam nastanka i razvoja EN-a i njegovih posledica, kao i da bi efekat pravovremene terapije bio zadovoljavajući. Uvod 16 1.2.1.1 Aristolohijska kiselina 1 (AA1) Početkom devedesetih godina dvadesetog veka u Belgiji [74], pojavio se veliki broj obole- lih žena od rapidnog progresivnog glomerulonefritisa kao posledice konzumiranja tableta za mršavljenje uvezenih iz Kine, zbog čega je i bolest nazvana kineskom biljnom nefropatijom (CHN) [75]. Do ovakvog kobnog trovanja došlo je usled zamene glavnog sastojka, biljke Stephania tetranda-e, biljkom Aristolochia fangchi. Otkrivene su specifične lezije tkiva bubrega i urinar- nog trakta svih obolelih, kao i promene u naslednom materijalu po tipu AA-DNK adukta, koje su predstavljale neosporni dokaz unosa aristolohijske kiseline u organizam. Bolest se od tada naziva i nefropatijom aristolohijske kiseline (NAA) [76]. Aristolohijska kiselina (AA) kao ekstrakt biljaka iz vrste Aristolochia predstavlja smešu strukturno sličnih nitrofenantren-karboksilnih kiselina, gde su 8-metoksi-6-nitro-fenantro-(3,4- d)-1,3-dioksolo-5-karboksilne kiseline (AA1) i 6-nitro-fenantro-(3,4-d)-1,3-dioksolo-5-karbo- ksilne kiseline (AA2) glavne komponente [77]. Ispoljavaju izrazito nefrotoksično i kancero- geno dejstvo [78]. AA se smatra jednim od 2% najpotentnijih poznatih karcinogena kod ljudi. Biljni preparati koji sadrže koren biljaka iz vrste Arisctolochia klasifikovani su kao kancerogeni grupe I prema internacionalnoj agenciji za istraživanja kancera (IARC). Molekularni mehanizmi oštećenja bu- brega pod dejstvom AA, kao i nastanak urotelijalnih tumora, još uvek nisu do kraja razjašnjeni. S obzirom da oštećenje bubrega ne prati uvek pojava tumora i obrnuto, vrlo je verovatno da pa- tološka dejstva AA zavise i od individualne reakcije organizma na koji deluje [77]. Za razliku od ostalih tubulointesticijalnih bolesti, NAA se karakteriše sporom regenera- cijom epitela, a često i pojavom tubularne atrofije i intesticijalne fibroze. Usled negativnog dej- stva na rast samih ćelija, posledično se javlja usporena regeneracija tubula sa povećanom proli- feracijom ne-target ćelija, fibroblasta, i razvojem fibroze. NAA u osnovi predstavlja rapidnu progresivnu intesticijalnu renalnu fibrozu sa atrofijom i gubitkom proksimalnih tubula u super- ficijalnom korteksu sa progresijom ka dubljim strukturama a relativno očuvanim glomerulima, i brzim razvojem terminalne bubrežne insuficijencije. Inicijalno, početak je gotovo neprimetan, i poremećaj bubrežne funkcije se može utvrditi na osnovu laboratorijskih nalaza. U zavisnosti od veličine bubrežnog oštećenja, može se pojaviti anemija umerenog stepena. U najvećem bro- ju slučaja sediment urina ne pokazuje specifične promene, a albumin nije prisutan u povećanoj količini. Prisustvo proteina male molekularne mase, kao što su B2M, cistatin C, retinol vezuju- ći protein i AMBP, zabeleženo je kod gotovo svih pacijenata u značajnoj količini. Udružena je sa prisustvom urotelijalnih karcinoma. Veliki broj eksperimentalnih studija na životinjama Uvod 17 pokazale su da intoksikacija AA izaziva promene kod čoveka kao i u tkivu životinja bubrega po tipu bubrežne intersticijalne fibroze i urotelne atipije [79, 80]. Jedan od prvih kliničkih znakova NAA je eksrecija urinom proteina male molekularne ma- se, ukazujući na toksično oštećenje ćelija proksimalnih tubula [81]. AA1 inhibira receptor po- sredovanu endocitozu proteina male molekularne mase na nivou ćelija proksimalnih tubula, po- sledično nastalu usled smanjene ekspresije gena za megalin. Receptor megalina vezuje tran- sportni neutrofil-želatinaza-udružen lipokalin (LCN2) sa visokim afinitetom, i posreduje u će- lijskom preuzimanju proteina. Poremećaj u endozitozi proteina je dokazan na eksperimental- nim modelima, najverovatnije usled prisustva DNK-adukta u naslednom materijalu [82]. Oksidativni stres je prisutan, a takva reakcija ćelije samo produbljuje dalje oštećenje. Na- laz 8-OHdG u ćelijama koje su duži vremenski period i sa većom dozom izlagane direknim dejstvom toksina potvrđuje ovu tvrdnju. AA može izazvati formiranje mikronukleusa kao po- sledicu oštećenja naslednog materijala. Pojava ovih promena je veća, kako se primenjuje veća doza toksina [83]. Mehanizmom nastanka apoptoze možemo objasniti pojavu atrofije epitela u proksimalnim tubulima bubrega kod pacijenata obolelih od NAA. Smatra se da je apoptotični proces indukovan povećanom koncentracijom kalcijuma u ćeliji, preko AA1 uticaja na homeostazu kalcijuma (ak- tivacija oslobađanja kalcijuma (Ca2+) preko otvaranja kanala i inhibicijom kalcijum ATP-aze, kao posledica i izrok endoplazmatskog i mitohondtrijalnog stresa). Povećanje Ca2+ može uticati na modulaciju Ca2+ zavisnih neutralnih cistein proteaza (kalpana), koje posledično proteolizom kaspaza 3 dovode do razvoja apoptoze. Ali ovaj mehanizam nije do kraja razjašnjen [84, 85]. Alimentarni unos aristolohijske kiseline je svakako najčešći način ulaska toksina u organi- zam i aktivacija patogenih procesa [86]. Činjenica da se na endemskim područjima javlja i sta- novništvo koje nije obolelo od EN-a, ukazuje na multifaktorijalnost i kompleksnost patoge- netskih mehanizama oboljenja, što zahteva dalja istraživanja. 1.2.1.2 Ohratoksin A (OTA) Ohratoksin A (OTA) je mikotoksin različitih vrsta gljivica Aspergillus-a i Penicillium-a, koje često kolonizuju veliki broj prehrambenih proizvoda, uključujući žitarice, kafu, vino, zači- ne, suvo voće, pivo, sok od grožđa, kao i proizvode životinjskog porekla. Ljudska populacija je time često izložena dejstvu OTA-e. Delom i zbog njegovog dugog poluvremena života u seru- mu čoveka, skoro 100% od svih ljudskih uzoraka krvi iz nekih geografskih regiona mogu biti pozitivni za OTA. Smatran je potencijalnim izrokom EN-a, što je bio predmet istraživanja Uvod 18 brojnih studija [87, 88]. Njegov uticaj na mehanizam razvoja ove bolesti još uvek je nepoznat, a činjenica da ne postoji strogo univerzalan način reagovanja organizma na prisustvo OTA-e čini dalju analizu pravim izazovom [47, 89, 90]. Međunarodna agencija za istraživanje kancera (IARC), klasifikovala je OTA kao karcinogen 2B klase. OTA se nakon unosa hranom pasivnim putem resorbuje preko ćelija digestivnog trakta, i na taj način ulazi u sistem vene porte, a preko jetre, gde se delom metaboliše, odlazi u sistem- sku cirkulaciju. U plazmi se vezuje za albumin. Preuzimanje OTA-e od strane hepatocita nasta- je putem pasivnog transporta, dok tubularne ćelije bubrega poseduju specifični proteinski no- sač koji omogućava tubulocitima preuzimanje toksina aktivnim transportom. Rezultati iz neko- liko studija i in vivo i in vitro pokazuju da se OTA delom metaboliše preko P450 citohrom oksidaze i peroksidaza u jetri. Nastaje mala koncentracija hidroksiliranih derivata koji se ne de- tektuju u urinu [48]. Metaboliti u obliku heksoza i pentoza konjugata prisutni su u velikoj količini u urinu osoba koje su unele OTA toksin u organizam. OTA metaboliti su manje toksičnog dejstva od same OTA-e. Glavni produkti krajnjeg metabolizma OTA-e su: hidroksilirani derivati, i hidroksi- ohratoksin koje formiraju P450 ili peroksidaza [prostaglandin-H sintaze (PGHS) i / ili lipoksi- genaze] prisutne u bubregu. Kako se oni dalje eliminišu iz organizma predmet je daljih istraži- vanja. Pretpostavka je da iz jetre putem žuči odlaze u digestivni trakt, odakle se dalje, putem fecesa eliminišu iz organizma, a jedan deo je podložan enterohepatičnoj cirkulaciji. Enterohe- patična cirkulacija, smanjeno preuzimanje OTA-e od strane ćelija procesom proste difuzije, kao i povećano preuzimanje OTA-e od strane tubulocita specifičnim aktivnim transportom, kao mehanizmi eliminacije nisu efikasni u brzoj eliminaciji toksina iz organizma, pa se njegove ni- ske koncentracije mogu naći u krvi u dužem vremenskom periodu nakon unosa toksina. Sa dru- ge strane, nalaz OTA-e u urinu može predstavljati znak akutne izloženosti toksinu. Akumulaci- ja toksina u organizmu doprinosi njegovom toksičnom dejstvu. Smatra se da je dnevni unos manji od 100 ng po kg telesne mase u toku jedne nedelje, bez patoloških posledica po organi- zam [48]. Regeneracija tkiva i proliferacija ćelija verovatno da igraju ulogu u OTA kancerogenosti. Još uvek nije moguće povezati izloženost pacijenata sa endemskom nefropatijom sa OTA-om i tumora urinarnog trakta, jer OTA je pronađena u krvi stanovnika drugih zemalja u kojima ne postoji EN. Međutim, OTA indukuje drugačiji proliferativni odgovor ćelija u odnosu na druge renalne karcinogene, koji nije po tipu regenerativne hiperplazije. Hronični unos OTA-e uzroku- je značajno smanjenje težine bubrega, dok je klasična proliferacija praćena povećanjem težine organa [88]. Uvod 19 Često se zaključuje da je proliferacija pre odgovor na degenerativne promene, nego di- rektan odgovor ćelije na prisustvo toksina. Usporena regeneracija posledica je i DNK oštećenja koje posledično, preko aktivacije TP53 gena, usporava normalan ćelijski ciklus. OTA preko poremećaja metabolizma citokina, može direktno da dovede do poremećaja razvojnog ciklusa ćelije i ometanja mitoze. Poremećaj može rezultirati prekidom mitotske deobe i ćelijskoj smrti, ili nenormalnom izlasku ćelije iz mitoze, endoreduplikacijom i produkcijom poliploidnih ćelija. Poliploidne ćelije su genetski nestabilne i vrlo brzo podležu apoptozi. Međutim, smatra se da ponovni ulazak takve ćelije u mitozu može rezultovati nastankom aneuploidnih ćelija i posle- dičnim razvojem tumora. OTA ne dovodi do nastanka genetskih malformacija po tipu hromo- zomskih aberacija, poremećaja u razmeni sestrinskih hromatida i stvaranje mikronukleusa [88]. OTA indukuje razvoj fibroze pri hroničnom izlaganju, što se manifestuje pojavom preko- merne ili smanjene ekspresije gena za aktin α-glatkih mišića, E i N kaderine i metaloproteinazu 9. Ovi proteini utiču na metabolizam kolagena i njegov promet u ćeliji. Prisutne su povišene vrednosti kolagena i njegove iRNK u tkivu bubrega. OTA koncentraciju dodatno povećava i smanjenje aktivnosti metaloproteinaze 9, čija sinteza je inhibirana pod dejstvom ovog toksina. Ovaj mehanizam se smatra ključnim za razvoj fibroze prilikom OTA hronične intoksikacije [215, 216]. U patološkom smislu promene u bubrežnom tkivu su opisane kao kortikalna tranzitivna nefropatija udružena sa difuznim fibrotičnim promenama. Kod hronične intoksikacije, osim di- fuznih fibrotičnih promena, prisutan je i nalaz maligniteta urotelijalnog trakta. 1.2.1 Prerenalno akutno oštećenje bubrega Akutno oštećenje bubrega (acute kidney injury, AKI) je klinički sindrom koji se karakte- riše brzim smanjenjem funkcije bubrega koje prouzrokuje progresivni porast azotnih materija u krvi kod osoba sa predhodno zdravim bubrezima. Obično je praćena oligurijom (diureza manja od 400 ml/24h), kao i znacima poremećene homeostatske i endokrine funkcije bubrega (pove- ćanje ekstraćelijskog volumena tečnosti, hiperkalijemija, metabolička acidoza, smanjena sinte- za eritropoetina, aktivne forme vitamina D3 i drugih supstanci). Na osnovu mesta gde se deša- vaju poremećaji koji dovode do AKI, razlikujemo prerenalnu, renalnu i postrenalnu akutnu bu- brežnu insuficijenciju [91]. Prerenalna AKI predstavlja brzo smanjenje glomerulske filtracije kao posledice hipoperfu- zije bubrega (kod hipovolemijskih stanja, kao što su krvarenja, povraćanja, opekotine, dehidra- tacije, zatim se viđa kod šoknih stanja, kod srčane insuficijencije, kod insuficijencije jetre, kod Uvod 20 sistemskih infekcija, kod poremećaja u metabolizmu proteina i drugo). Glavni poremećaj koji indukuje patološke promene jeste ishemijska reakcija tkiva. U patološkom smislu, prisutna je akutna tubularna nekroza, gde su promene smeštene duž celog nefrona. Bazalna membrana tu- bula je takođe oštećena. Nekroza tubulocita je praćena povećanim brojem ćelija u mitozi, kao znaka regeneracije [92]. U kliničkoj slici prisutni su simptomi i znaci opšte dehidratacije organizma (snižen cen- tralni venski pritisak, suva koža i vidljive sluzokože, oslabljen turgor kože, ortostatska hipo- tenzija, tahikardija), pacijent gubi na težini, venske pulsacije u uspravnom položaju su odsutne, pacijent se ne znoji i prisutna je opšta slabost i malaksalost organizma. Postoji veliki rizik od razvoja komplikacija od strane kardiovaskularnog sistema po tipu kongestivne srčane insufici- jencije, tamponade srca ili razvoja kardiogenog šoka. Laboratorijski nalazi ukazuju na hemo- koncentraciju, povišene vrednosti ureje u urinu, povišena osmolalnost urina i smanjeno izluči- vanje natrijuma putem urina [93]. Uprkos značajnim poboljšanjima u terapiji, mortalitet i morbiditet pacijenata sa AKI-jem su i dalje visoki. Glavni razlog za to je nedostatak ranih dijagnostičkih markera oboljenja, što za posledicu ima odlaganje pravovremene terapije i smanjenje njene efikasnosti. Funkcionalna genomika i proteomika humanih i životinjskih modela AKI omogućile su otkrivanje i definisanje novih biomarkera rane dijagnostike i potencijalnih terapijskih meta. Najčešće su otkriveni potencijalni markeri u plazmi (neutrofilna želatinaza, lipokalin i cistatin C) i u urinu (neutrofilna želatinaza, lipokalin, marker bubrežnog oštećenja 1, interleukin 18, ci- statin C, AMBP, fetuin i meprin). Ovim ispitivanjima moguće je i istražiti etiološku dife- rencijaciju oboljenja, kao i ispitivati parametre kojima bi se predvideo dalji klinički tok i ishod oboljenja [94]. Dalja istraživanja omogućiće pronalaženje odgovora na brojna postavljena pita- nja vezana za patofiziološki aspekt AKI-e i olakšati dosadašnji terapijski pristupi [95]. 1.3 Proteomska istraživanja u nefrologiji Proteomika je sistemska studija jednog proteoma koji predstavlja ukupni sadržaj belanče- vina jedne ćelije, organizma ili telesnih tečnosti (krv, urin, znoj, i drugo). Dok se genom jed- nog organizma smatra statičkom komponentom, proteom pokazuje dinamička svojstva, gde se proteinski profili menjaju u zavisnosti od prisustva brojnih ekstra i intracelularnih stimulusa. Primena proteomske tehnologije omogućila bi detaljniju analizu funkcije ispitivanih proteina i njihov značaj u brojnim fiziološkim stanjima, u bolesti, kao i tokom primene adekvatne terapi- je, a jednako je efikasna u istraživanju i radu na modelima kulture ćelija, kao i na humanom Uvod 21 materijalu sakupljenom od samih pacijenata. Klinička proteomika je primena proteomskih ana- liza u otkrivanju dijagnostičkih i prognostičkih biomarkera, praćenju stanja bolesnika i efika- snosti primenjenih terapijskih protokola i razumevanju mehanizama nastanka, razvoja i progre- sije oboljenja. Smatra se jednim od vodećih oblasti istraživanja današnjice [96-98]. Mokraća je važan materijal za naučno-istraživački rad kao indirektni pokazatelj ispravnosti bubrežne funkcije. Upotreba proteomskih tehnologija pri analizi belančevina u mokraći pacije- nata i zdravih ispitanika donela bi nova saznanja koja bi doprinela potpunijem razumevanju na- stanka i razvoja bolesti sa ciljem da se identifikuju potencijalni prognostički/dijagnostički mar- keri oboljenja i njihovom daljom primenom u kliničkoj praksi. Kreiranje eksperimentalnog modela ispitivanja efekata toksičnosti aristolohijske kiseline i ohratoksina A na humanim tubulocitima u toku akutnog i hroničnog kontinuiranog izlaganja ćelija adekvatnom koncentracijom ovih toksina, doprinelo bi boljem razumevanju patofizi- oloških mehanizama nastanka bolesti. 22  2. CILJ ISTRAŽIVANJA Radna hipoteza. Kod pacijenata sa bubrežnim oboljenjima kao što su Balkanska endemska nefropatija (EN), dijabetesna nefropatija (DN) i akutna prerenalna bubrežna insuficijencija (AKI), za razliku od grupa zdravih dobrovoljaca koji žive u endemskim (HEN) i ne-endemskim područjima (HGER), očekuju se značajne razlike u vrsti belančevina koje su mokraćom uklonje- ne iz organizma, što bi ukazivalo na specifične promene regulacije metabolizma belančevina u patogenezi ispitivanih oboljenja. U kulturi humanih tubulocita izloženih efektima aristolohijske kiseline i ohratoksina A, za razliku od netretiranih ćelija, očekuju se značajne razlike u broju i vr- sti belančevina, što bi ukazivalo na specifične promene regulacije metabolizma belančevina pod dejstvom ovih toksina, kao potencijanih etioloških faktora nastanaka endemske nefropatije. Ciljevi rada su: • Istraživanje proteina u urinu pacijenata sa endemskom nefropatijom i zdrave populacije koja živi na područjima endemske nefropatije • Istraživanje proteina u urinu pacijenata sa dijabetesnom nefropatijom • Istraživanje proteina u urinu pacijenata sa akutnom prerenalnom bubrežnom insufici- jencijom • Istraživanje proteina u urinu zdravih dobrovoljaca iz ne-endemskih područja • Upoređivanje dobijenih rezultata analize urina sa određivanjem uzroka i patofizioloških mehanizama endemske nefropatije • Ispitivanje potencijane uloge identifikovanih proteina kao prognostičkih ili dijagno- stičkih markera endemske nefropatije • Ispitivanje efekata aristolohijske kiseline na humane tubulocite (HK2 ćelije) pri aku- tnom i hroničnom izlaganju • Ispitivanje efekata ohratoksina A na humane tubulocite (HK2 ćelije) pri akutnom i hro- ničnom izlaganju • Ispitivanje efekata aristolohijske kiseline i ohratoksina A na humane tubulocite (HK2 ćelije) pri akutnom i hroničnom izlaganju ćelija toksinima • Ispitivanje postojanja identifikovanih specifičnih belančevina u akutnom i hroničnom modelu ćelijske intoksikacije aristolohijskom kiselinom i/ili ohratoksinom A na pato- histološkim preparatima tkivu bubrega EN pacijenata sa tumotima urotelijuma. 23  3. MATERIJAL I METODE 3.1 Pacijenti U ispitivanje je uključeno 360 osoba podeljenih u šest grupa: • I grupa – 60 zdravih ispitanika koji žive na područjima endemske nefropatije (Kutleš, okolina Leskovca) • II grupa – 60 pacijenata sa endemskom nefropatijom (EN), sa niskim vrednostima pro- teina u mokraći (ispod 150 mg/L), dijagnostikovanih na Institutu za nefrologiju, Kli- ničkog centra u Nišu, Srbija • III grupa – 60 pacijenata sa EN, sa visokim vrednostima proteina u mokraći (iznad 150 mg/L), dijagnostikovanih na Institutu za nefrologiju, Kliničkog centra u Nišu, Srbija • IV grupa – 60 pacijenata sa dijabetesnom nefropatijom, dijagnostikovanih na Odeljenju za nefrologiju i reumatologiju Univerzitetskog medicinskog centra Georg‐August Uni- verziteta u Getingenu, u Nemačkoj • V grupa – 60 pacijenata sa akutnim oštećenjem bubrega (AKI), dijagnostikovanih na Odeljenju za nefrologiju i reumatologiju Univerzitetskog medicinskog centra Georg‐August univerziteta u Getingenu, u Nemačkoj • VI grupa – 60 zdravih ispitanika koji ne žive na područjima endemske nefropatije Kontrolne grupe su obuhvatale zdrave dobrovoljce oba pola i istih godina kao i ispitivani bolesnici. Analizirani su pacijenti sa kompletnom dokumentacijom. Godine i pol pacijenata, dijagnoza oboljenja, laboratorijski nalazi, dobijeni su iz kompjuterski registrovanih podataka. Prilikom odabira ispitanika, korišćeni su sledeći kriterijumi: starost ispitanika između 30-85 godina i ispitanici bez akutne manifestacije bolesti. Da bi se postigla uniformna klasifikacija pacijenata i izbegao uticaj razlike u dijagnostičkim kriterijumima izmedju ova dva klinička centra, korišćeni su dijagnostički kriterijumi nacionalne bubrežne fondacije (National Kidney Foundation - the Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (KDOQI)). Endemska nefropati- ja je dijagnostikovana na Institutu za nefrologiju, Kliničkog centra u Nišu, Srbija na osnovu sledećih kriterijuma [66]: osobe koje naseljavaju endemska područja, anamnestički podatak o postojanju obolelih od EN u porodici, nalaz proteina sa malom molekularnom masom u mokra- ći (povećana urinarna ekskrecija beta-2-mikroglobulina (B2M) i/ili alfa-1-mikroglobulina Materijal i metode 24 (AMBP)), blaga proteinurija (vrednosti manje od 1g proteina za 24h), poremećena bubrežna funkcija, anemija i isključivanje postojanja bilo kojeg drugog poznatog bubrežnog oboljenja. Pacijenti sa akutnim oštećenjem bubrega i sa dijabetesnom nefropatijom dijagnostikovani su na Odeljenju za nefrologiju i reumatologiju Univerzitetskog medicinskog centra Georg‐August Univerziteta u Getingenu, u Nemačkoj. Pacijenti sa neoplastičnim promenama, postojanjem in- fekcije mokraćnih puteva tokom predhodna dva meseca, sa prisustvom hronične sistemske in- fekcije (HIV, HBV, HCV), zdravi dobrovoljci koji su u srodstvu sa EN pacijentima, kao i tru- dnice isključeni su iz daljeg ispitivanja. Proteomska analiza urina ispitanika odobrena je odlukom Etičkog odbora Medicinskog fa- kulteta u Nišu i lokalnog etičkog komiteta univerzitetske bolnice, Georg‐August univerziteta u Getingenu, u Nemačkoj. 3.2 Kultura humanih ćelija epitela proksimalnih tubula bubrega (HK2 ćelijska kultura) Proteomska analiza humanih tubularnih ćelija (ćelije epitela proksimalnih tubula bubrega, HK2 ćelijski tip, gotov soj, sekundarna kultura ćelija) pri izlaganju toksinima (aristolohijska kise- lina 1, ohratoksin A) vršena je na materijalu dobijenom iz četiri različite eksperimentalne grupe: • I grupa – HK2 ćelije izlagane toksičnim efektima aristolohijske kiseline 1 (AA1) • II grupa – HK2 ćelije izlagane toksičnim efektima ohratoksina A (OTA) • III grupa – HK2 ćelije izlagane efektima AA1 i OTA • IV grupa – HK2 ćelije bez tretmana Kontrolnu grupu činile su HK2 ćelije koje nisu izlagane efektima toksina. Ćelije su izlaga- ne dejstvu toksina u toku akutnog (72h) i hroničnog eksperimenta (1 mesec, 2 meseca). Dozira- nje toksina u toku eksperimenta zavisilo je od rezultata testa vijabilnosti (MTT). Kontrolnu grupu u ispitivanju nivoa parametara oksidativnog stresa, činile su HK2 ćelije tretirane vodonik peroksidom u toku 72h po predhodno uspostavljenom protokolu [99]. Ćelije su uzgajane kao monosloj u medijumu Quantum 286 za epitelne ćelije (PAA) sa 1% rastvorom Penicilina-Streptomicina (Gibco) bez prisustva seruma (FCS-free medijum), koristeći 75 cm2 posude za rad sa ćelijskom kulturom (Falcon) na temperaturi od 370C u 5% CO2-95% vazdu- šnom okruženju. Kontrolnu grupu prilikom ispitivanja nivoa markera fibroze činila je sekun- darna kultura humanih fibroblasta dobijenih iz zdravih bubrega (TK 173). Materijal i metode 25 3.3 Sakupljanje uzoraka urina Sakupljanje uzoraka urina izvršeno je prema preporukama EuroKup/HKUPP protokola (http://www.eurokup.org/). Za potrebe proteomskih istraživanja sakupljani su uzorci drugog jutarnjeg urina. Odmah nakon kolektiranja, uzorci su centrifugirani 10 minuta na 1.000xg i 40C da bi se uklonio talog ćelija iz mokraće. Supernatant je izdvojen od taloga, alikvotiran (10 mL po alikvotu) i skladišten na -800C do izvršenja analiza. Za dodatna laboratorijska istraživanja, od svakog uzorka mokraće izdvojeno je 10 mL. Svi laboratorijski parametri, uključujući merenja koncentracije proteina i albumina u mokraći, me- reni su standardnim biohemijskim metodama u laboratoriji za rutinsku dijagnostiku odeljenja za nefrologiju i reumatologiju Univerzitetskog medicinskog centra Georg‐August univerziteta u Getingenu, u Nemačkoj. 3.4 Precipitacija proteina i određivanje koncentracije Iz svake eksperimentalne grupe izdvojeno je slučajnim izborom 10 različitih uzoraka mo- kraće. Na osnovu vrednosti koncetracije proteina dobijene rutinskim laboratorijskim analiza- ma, iz svakog izabranog uzorka mokraće izdvojene su adekvatne zapremine (ona zapremina koja sadrži 200 µg proteina), od kojih je načinjen grupni uzorak (u jednom grupnom uzorku bi- lo je 2 mg proteina). Grupni uzorak je koncetrisan upotrebom 5 kDa spin kolona Vivaspin 20 (Sartorius, Nemačka). Od ostalih uzoraka urina formirana su dodatna četiri grupna uzorka za potrebe daljih ispitivanja. Da bi se smanjila količina soli u koncetrisanim uzorcima, kao i da bi se postigla izolacija proteina, korišćena je hloroform-metanol precipitaciona metoda po Wessel-u i Flugge-u [100]. Precipitirani proteini su nakon toga ponovo rastvoreni u adekvatnim količinama lizirajućeg pu- fera (ureja 9,5 M, CHAPS 2%, 2% amfolita, 1% DTT) za potrebe 2D gel elektroforeze. Ukupna koncetracija proteina u puferu određivana je upotrebom proteinskog eseja (Bio-Rad, Hercules, USA) prema Bradfordu [101]. Bovin serum albumin (Sigma Aldrich, Steinheim, Ne- mačka) je korišćen kao standard. 3.5 Dvodimenzionalna gel elektroforeza (2-DE) Prva dimenzija separacije belančevina u 2D elektroforezi podrazumeva razdvajanje belan- čevina na osnovu njihovih izoelektričnih tačaka (izoelektrično fokusiranje, IEF) (prolazeći kroz postavljeni pH gradijent na IPG trakama uz pomoć električne struje proteini se raspoređuju Materijal i metode 26 unutar traka). Druga dimezija podrazumeva razdvajanje belančevina na osnovu njihovih mole- kularnih masa i brzine kretanja kroz električno polje. 2-DE uzoraka izvršena je prema adaptira- nom protokolu [102] uz korišćenje 11 cm pI 4-7 IPG traka (Bio-Rad, Hercules, USA). IPG tra- ke su pasivno rehidrirane u toku 12h pomoću 185 µL rehidratacionog pufera koji sadrži 150 µg proteina ispitivanih uzoraka (8 M ureja, 1% CHAPS, 1% DTT, 0,2% amfolita pI 4-7, plavi brom fenol u tragu). IEF je izvršeno pomoću PROTEIN(R) IEF ćelije (Bio-Rad, Hercules, USA). Temperatura je podešena na 200C i fokusiranje izvedeno po sledećem programu: 500 V (1h), 1.000 V (1h), 2.000 V (1h) i 8.000 (50.000 Včasova). Nakon toga, da bi se redukovale di- sulfidne veze u fokusiranim proteinima, IPG trake su tretirane 20 minuta SDS ekvilibracionim puferom (6M ureja, 30% glicerol, 2% SDS, 0,05 M Tris-HCl pH 8,5 i 2% DTT) na šejkeru. Tra- ke su nakon toga alkilisane 20 minuta rastvorom 2.5% jodacetamida i 0,25% brom fenol plavog. Za razdvajanje proteina na osnovu njihove molekularne mase, korišćeni su SDS-PAGE, 12% BisTris Criterion precast gelovi (Bio-Rad, Hercules, USA) po protokolu proizvođača. 3.6 Bojenje gelova Nakon razdvajanja proteina, 2-DE gelovi su fiksirani u 50% metanolu i 12% sirćetnoj kise- lini preko noći, i 5h tretirani rastvorom Flamingo koji sadrži fluoroscentne gel boje (Bio-Rad, Hercules, USA). Nakon bojenja, gelovi su skenirani upotrebom FLA-5100 skenera (Fuji Photo, Kahagawa, Japan) u 50 µm rezoluciji, a slike analizirane u Delta 2D 3.4 software-u (Decodon, Grefswald, Nemačka). Za identifikaciju proteinskih tačaka na gelu, nakon skeniranja, gelovi su obojeni koloidnom Coomassie plavom bojom (Roth, Karlsruhe, Nemačka) preko noći. 3.7 Dvodimenzionalna diferencijalna in-gel elektroforeza (2D-DIGE) Da bi se izbegla razlika u interpretaciji rezultata na osnovu razlike u eksperimentalnim uslovima prilikom izvodjenja 2-DE, kao i da bi se potvrdili rezultati i statistički obradile razli- ke u proteinskoj ekspresiji, izveli smo 2D-DIGE. Proteini iz grupnih uzoraka urina precipitirani su hloroform-metanol metodom. Rezultujući talog je rastvoren u marker-puferu (30 mM Tris-HCl pH 8,5, 9,5 M urea, 2% CHAPS), a nakon 30 minuta, rastvor je centrifugiran (5 minuta na 13.000 x g i 40C). Koncen- tracija proteina određivana je na gore opisan način. Obeležavanje proteina i DIGE izvedeni su po adaptiranom protokolu [103]. 2-DE je izvedena na gore opisan način sa upotrebom 11 cm pI 4-7 IPG traka (Bio-Rad, Hercules, USA). CyDye obeleženi proteinski gelovi skenirani su upotrebom 50 µm rezolucije na FLA-5100 skeneru sa ekscitacijom lasera na 473 nm i filterom Materijal i metode 27 510LP (Cy2), sa ekscitacijom lasera na 532 nm i filterom 575LP (Cy3), kao i sa ekscitacijom lasera na 635 nm i filterom 665LP (Cy5). Skenirane slike su formirane u 16-bitnom TIFF formatu. Upoređivanje proteinskih mapa, sa identifikacijom zajedničkih tačaka, kao i statističkom obradom (upotreba Studentovog t testa, gde je signifikantna razlika utvrđena za p vrednost manju od 0.01) rađeno je upotrebom Delta 2D software-a (Decodon, Greifswald, Nemačka). Za identifikaciju proteinskih tačaka na gelu, nakon skeniranja, gelovi su obojeni koloidnom Coomassie plavom bojom (Roth, Karlsruhe, Nemačka) preko noći. 3.8 In-gel digestija i mass spektrometrijska analiza Nakon odabira proteinskih tačaka na ispitivanim gelovima, pažljivo je izvršena ekstrakcija i digestija rastvorom tripsina. Dobijena smeša peptida se meša sa kristaloidnim matriksom na eksperimantalnoj ploči. Identifikacija peptidnog spektra vršiće se pomoću mass spektrometra (MALDI-TOF i MALDI-TOF-TOF-MS). Proteini su identifikovani na osnovu podudarnosti u najmanje dve peptidne sekvence pomoću online baze podataka (Swiss-Prot primarna sekvenca baza podataka ograničena na Homo sapiens taksonomiju) koristeći MASCOT PMF software 2.2 (Matrix Science) [104-106]. Karboksimetilacija Cys rezidua je izabrana kao fiksna modifi- kacija, dok je oksidacija Met rezidua izabrana kao varijabilna modifikacija u sistemu pretrage. Minimalni kriterijum za pozitivnu identifikaciju proteina predstavljao je najmanje 20% identi- fikovane sekvence peptidnog lanca. 3.9 Western blot analiza Da bi se potvrdili rezultati dobijeni 2D-DIGE analizom, korišćena je Western blot analiza prema standardnom protokolu [107]. Iz svake eksperimentalne grupe izdvojeno je 20 uzoraka mokraće za dalju analizu. Uzorci su hloroform-metanol precipitirani na predhodno opisan na- čin. Koncetracija proteina određivana je Bradford esejom. Adekvatna količina uzoraka (ekviva- lent sadrži 100 µg proteina) korišćena je tokom blot analize. Inkubacija membrana sa primar- nim antitelom nakon blotiranja izvršena je na 40C u toku 8h (preko noći). Kao primarna antitela korišćena su: zečja poliklonalna anti-POT1 antitela protiv protektora telomera 1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), mišja monoklonalna anti-LMAN2 antitela protiv manoza-vezujućeg lektina (Abcam, U.K.), mišja monoklonalna anti-APOH antitela protiv beta-2-glikoproteina I (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), zečja poliklonalna anti-SOD1 antitela protiv superoksid dizmu- taze 1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), zečja poliklonalna anti-AMBP antitela protiv alfa-1- mikroglobulina (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) i zečja poliklonalna anti-B2M antitela protiv Materijal i metode 28 beta-2-mikroglobulina (Sigma Aldrich, St. Louis, USA). Inkubacija membrana 1h na sobnoj temperaturi (180C) izvršena je upotrebom odgovarajućih sekundarnih antitela: Alexa Fluor 647 kozja anti-mišja IgG antitela ili Alexa Fluor 647 kozja anti-zečja IgG antitela. Nakon toga, vi- šak sekundarnog antitela je uklonjen ispiranjem pomoću standardnih pufera (50 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7,4) tri puta to 10 minuta. Membrane su nakon toga osušene i skenirane pomoću FLA-5100 skenera (Fuji Photo, Kanagawa, Japan) sa upotrebom 635 nm emisije laserskog zraka. Digitalizovane slike su produkovane u 50 µm rezoluciji, a obrađene i dalje analizirane u Image J software-u (NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). 3.10 Dot blot analiza Da bi se ispitala dijagnostička vrednost identifikovanih proteina na velikom populacionom uzorku primenjena je dot blot analiza uzoraka urina [108]. Adekvatna količina uzorka (volu- men urina koji zadrži 10 µg proteina) nanesena je na nitroceluloznu membranu za blotiranje. Svaki uzorak je nanesen u triplikatu. Nakon sušenja membrana je tretirana rastvorom 5% suvog mleka u standardnom puferu (50 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,4) u toku 1h na sobnoj temperaturi (180C). Nakon toga, membrane su isprane tri puta po 10 minuta standard- nim puferom, i inkubirane sa rastvorima primarnih antitela u standarnom puferu, u koncentraci- ji koja je preporučena protokolom proizvođača. Kao primarna antitela korišćena su: zečja poli- klonalna anti-POT1 antitela protiv protektora telomera 1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), mi- šja monoklonalna anti-LMAN2 antitela protiv manoza-vezujućeg lektina (Abcam, U.K.), mišja monoklonalan anti-APOH antitela protiv beta-2-glikoproteina I (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), zečja poliklonalna anti-SOD1 antitela protiv superoksid dizmutaze 1 (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), zečja poliklonalna anti-AMBP antitela protiv alfa-1-mikroglobulina (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) i zečja poliklonalna anti-B2M antitela protiv beta-2-mikroglobulina (Sigma Aldrich, St. Louis, USA). Inkubacija membrana 1h na sobnoj temperaturi (180C) izvr- šena je upotrebom odgovarajućih sekundarnih antitela: Alexa Fluor 647 kozja anti-mišja IgG antitela ili Alexa Fluor 647 kozja anti-zečja IgG antitela. Nakon toga, višak sekundarnog anti- tela je uklonjen ispiranjem pomoću standardnih pufera (50 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7,4) tri puta po 10 minuta. Membrane su nakon toga osušene i skenirane pomo- ću FLA-5100 skenera (Fuji Photo, Kanagawa, Japan) sa upotrebom laserskog zraka talasne du- žine 635 nm. Digitalizovane slike su produkovane u 50 µm rezoluciji, a obrađene i dalje anali- zirane u Image J software-u (NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). Materijal i metode 29 3.11 Test vijabilnosti ćelija (MTT test) Ćelijska vijabilnost je testirana upotrebom ćelijskog proliferacionog kita (Proliferation Kit I (MTT)) kolorimetrijskog eseja za ne-radioaktivnu kvantifikaciju vijabilnosti ćelijske prolife- racije (Roche Applied Bioscience, Mannheim, Nemačka). Ćelije su kultivisane u 200 µL medi- juma pri koncentraciji od 5x103 ćelija po odeljku u 96-tnoj mikrotitracionoj posudi (tissue culture grade, Falcon), a MTT test je izveden upotrebom protokola proizvođača. GraphPad Prizm 4 software (GraphPad Software Inc, San Diego, CA) korišćen je za statističku analizu podataka. Upoređivanje vrednosti dve grupe izvršeno je korišćenjem t-testa. One-way ANOVA test korišćen je u upoređivanju vrednosti kod multiplih grupa, a statistička značajnost je po- stavljena za p vrednosti veće od 0,05. MTT je ponovljen tri puta za svaki postavljeni eksperi- ment. Date vrednosti su predstavljene srednjom vrednošću i standardnom devijacijom u pore- đenju sa ćelijama koje nisu podvrgavane tretmanom (kontrola). 3.12 Imunofluorescentna bojenja ćelija U inkubacionoj posudi (16 pregrada, 200 µL zapremine svaka) potrebno je postaviti 1-3x105 predhodno tretiranih ćelija, i inkubirati u medijumu bez prisustva seruma (karakteristike medijuma opisane su u predhodnim odeljcima). Nakon 24h-ovne inkubacije, ćelije su tretirane 3 x 5 minuta PBS rastvorom na sobnoj temperaturi, a zatim fiksirane u 4% rastvoru paraformalaldehida u PBS-u (200 µL rastvora po odeljku). Nakon 30 minuta, ponovo su isprane 3 x 5 minuta PBS-om. Za po- trebe ispitivanja lokalizacije i distribucije proteina unutar ćelija, permeabilizacija je izvršena 30" tretmanom 0,1% rastvorom Triton X-100 u PBS-u. Za potrebe ispitivanja proteina koji se izlučuju ekstracelularno, nije rađena permeabilizacija. Nakon toga, ćelije su isprane 3 x 5 minuta PBS-om, i inkubirane 1h u blokirajućem puferu (5% rastvor kozjeg seruma u 1% BSA) na sobnoj temperaturi. Korišćena su sledeća primarna antitela (Abcam, UK): Eef1A1 (antizečje antitelo), Ndfus1 (antimišje antitelo), Lamin-A/C (antizečje antitelo), Ube2N (antizečje antitelo), ORP 150 (anti- mišje antitelo), Eif5A (antizečje antitelo), kao i antitela (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) protiv fibronektina i aktina alfa glatkih mišića (antizečja antitela) [99]. Ćelije su inkubirane rastvorima primarnih antitela u blokirajućem puferu na temperaturi od 40C u toku 12h, 3x5 minuta isprane PBS-om i 1h inkubirane 1h na sobnoj temperaturi rastvorima odgovarajućih sekundarnih antitela u blokirajućem puferu (Alexa Fluor obeležena sekundarna kozja antizečja i antimišja antitela, Molecular probes, UK). Ćelije su isprane 3x10 minuta PBS-om, uklonjen je sabirni deo posuda, a staklena pločica sa ćelijama prekrivena je rastvorom DAPI-a i sahatnim stakalcem. Uzorci su na- kon toga analizirani upotrebom imunofluorescentne mikroskopije (Carl Zeiss Axiovert S100TV). Materijal i metode 30 3.13 Histološki preparati tkiva tumora bubrega pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovane endemske nefropatije Sakupljeni su patohistološki uzorci bubrežnog tkiva 20 pacijenata sa tumorom gornjeg urote- lijuma sa Instituta za Patologiju kliničkog centra u Nišu, podeljeni u dve eksperimentalne grupe: • Pacijenti sa EN • Pacijenti bez prisustva EN-a Fiksacija tkivnih uzoraka obavljena je u 10% rastvoru formaldehida za 24 časa [109]. Tkivo je rutinski obrađivano, kalupljeno u parafinu i sečeno na mikrotomu, debljine 4µm. 3.14 Imunohistologija preparata tkiva Nakon deparafinacije i procesiranja u graduisanim alkoholima na odabranim isečcima pri- menjena je imunohistološka metoda bojenja prema standardizovanom protokolu [109]. Ko- rišćena su sledeća primarna antitela (Abcam, UK): Eef1A1 (antizečje antitelo), Ndfus1 (anti- mišje antitelo), Lamin-A/C (antizečje antitelo), Ube2N (antizečje antitelo), ORP 150 (antimišje antitelo), Eif5A (antizečje antitelo), kao i antitela (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) protiv fibro- nektina i aktina alfa glatkih mišića (antizečja antitela). Alexa Fluor obeležena kozja antizečja i antimišja antitela, (Molecular probes, UK) ko- rišćena su kao sekundarna antitela. DAPI je korišćen za vizualizaciju nuklearnih struktura. Pločice su posmatrane pod imunofluorescentnim mikroskopom i 20x uvećanjem (Carl Zeiss Axiovert S100TV). 3.15 Statistička analiza podataka Statistička obrada podataka izvršena je korišćenjem GraphPrism softverskog paketa, verzi- ja 4. Deskriptivna statistika je prikazana srednjim vrednostima i standardnom devijacijom za kontinuirane podatke. Za upoređivanje varijabli iz pet eksperimentalnih grupa korišćena je one-way analiza vari- janse (ANOVA, Kruskal-Wallis test). Vrednost p<0,05 smatrana je za statistički značajnu. Klinička primenljivost ispitivanih parametara analizirana je ROC krivom. ROC krive su konstruisane i površina ispod krive (AUC), standardna greška, 95% konfidentni interval, senzi- tivnost i specifičnost izračunati su korišćenjem GraphPrism softverskog paketa, verzija 4. Gra- nične vrednosti, koje diskriminiraju slučajeve sa pozitivnom i negativnom dijagnozom, jasno su postavljene. 31  4. REZULTATI 4.1 Pacijenti Zdravi dobrovoljci iz EN regiona (n=60), EN pacijenti (n=120), pacijenti sa prerenalnom AKI (n=60), pacijenti sa DN (n=60) i zdravi dobrovoljci iz neendemskih područja (n=60) uklju- čeni su u ova ispitivanja. Bilo je ukupno 207 (57,50%) muškaraca i 153 (42,50%) žena, starosti 64±13 godina. Nije postojala statistički značajna razlika u vrednostima indeksa telesne mase (body mass index, BMI) i srednjih godina između ispitanika različitih grupa (Grafikon 1). Grafikon 1. Starosna distribucija i distribucija indeksa telesne mase (BMI) među ispitanicima: ne postoji stati- stički značajna razlika između ispitivanih grupa: HEN – zdravi ispitanici koji žive u regionima endemske nefropa- tije; EN – pacijenti sa endemskom nefropatijom; DN – pacijenti sa dijabetesnom nefropatijom; AKI – pacijenti sa prerenalnom akutnom bubrežnom insuficijencijom; HGER – zdravi ispitanici koji žive u ne-endemskim regionima 4.2 Određivanje koncentracije proteina u urinu korišćenjem rutinskih laboratorijskih metoda Ukupni proteini u urinu i koncentracija albumina u sakupljenim uzorcima urina kvanitifi- kovani su rutinskim laboratorijskim analizama (Grafikon 2). Rezultati 32 Grafikon 2. Rutinske laboratorijske analize: proteinurija i albuminurija: HEN – zdravi ispitanici koji žive u re- gionima endemske nefropatije; EN – pacijenti sa endemskom nefropatijom; DN – pacijenti sa dijabetesnom nefro- patijom; AKI – pacijenti sa prerenalnom akutnom bubrežnom insuficijencijom; HGER – zdravi ispitanici koji žive u ne-endemskim regionima; koncentracija proteina i albumina u urinu je značajno veća u uzorcima EN i DN pacijenata Na osnovu vrednosti proteinurije, uzorci urina EN pacijenata podeljeni su u dve eksperi- mentalne grupe za dalje 2-DE analize: pacijenti sa niskim (proteinurija je manja od 150 mg/L, EN L) i visokim vrednostima proteinurije (proteinurija je veća od 150 mg/L, EN H). 4.3 Mapiranje EN i HEN urinarnog proteoma Da bi kreirali mape proteoma ispitivanih uzoraka, prezipitirali smo proteine zbirnih uzora- ka i izveli 2-DE analizu na gore opisani način. Ispitivanjem mapa pet zbirnih uzoraka po grupi zaključujemo da su proteinski profili zbirnih uzoraka ispitivanih grupa su bili visoko reprodu- cibilni bez značajnih razlika unutar same grupe. Nakon kreiranja mapa, gelovi su obojeni pla- vim Coomassie da bi se nastavilo sa daljim procesom identifikacije. Delta 2D analiza digitalnih slika gelova je pokazala postojanje 417±12 i 481±34 različitih proteinskih tačaka u 4-7 pI rangu 2D gel regiona zbirnih uzoraka urina pacijenata EN L i EN H respektivno, a samo 369±11 proteinskih tačaka u 4-7 pI rangu 2D gel regiona zbirnih uzoraka urina HEN. Dodatno, analizirane su i proteinske mape zbirnih uzoraka ostalih eksperimentalnih grupa – EN, AKI i HGER. Delovi gelova sa određenim proteinskim tačkama uklonjeni su i analizirani preko tri- ptične in-gel digestije. Za pouzdanu identifikaciju proteina koristili smo MALDI-TOF/TOF- MS/MS i Mascot pretragu podataka [104]. Identifikovali smo ukupno 213 proteina koji odgovaraju zbirci od 61 ne-reduntantnog pro- teina (Slika 1, Tabela 1). Rezultati 33 Slika 1. Dvodimenzionalna diferencijalna in-gel elektroforeza (2D-DIGE) – digitalna slika urinarnog proteoma EN pacijenata: 213 identifikovanih proteina odgovara listi od 61 različitog ne-reduntantnog proteina (svaki identi- fikovan protein predstavljen je svoj genetičkim imenom i markiran na gel mapi). Proteini su razdvojeni preko 4-7 pI ranga korišćenjem IEF i 12% SDS PAGE (usled njihove očekivane molekularne težine) Tabela 1. Lista identifikovanih proteina u urinu analiziranih grupnih uzoraka korišćenjem masene spektrometrije i Mascot pretrage podataka; ulazni kodovi za Swiss-Prot i NCBI baze podataka su prikazani. Informacije o peptidnom masenom fingerprintu (PMF) i MS/MS podaci su takođe prikazani. Naziv proteina Gensko ime Ulazni kod UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna masa CPI PMF- skor PMF- pokrivenost sekvence MS/MS scor Pokrivenost MS/MS sekvence Peptidi Alfa-2-HS- glikoprotein AHSG gi|112910 P02765 FETUA_HUMAN 40098 5,7 60 37 135 3 7 Serum albumin ALB gi|11493459 P02768 ALBU_HUMAN 71317 5,9 234 44 263 9 8 Alfa-metilacil- CoA racemaza AMACR gi|13626118 Q9UHK6 AMACR_HUMAN 42675 6,7 56 23 34 11 5 Protein AMBP AMBP gi|4502067 P02760 AMBP_HUMAN 14795 5,9 67 29 121 24 17 Apolipoprotein A-I APOA1 gi|178775 P02647 APOA1_HUMAN 30759 5,5 94 67 79 8 10 Apolipoprotein A-IV APOA4 gi|178757 P06727 APOA4_HUMAN 45371 5,2 88 31 160 15 14 Apolipoprotein C-II APOC2 gi|157838337 P02655 APOC2_HUMAN 11277 4,5 58 28 25 1 3 Beta-2- glikoprotein APOH gi|28810 P02749 APOH_HUMAN 39584 9,5 107 57 116 37 1 Cink-alfa-2- glikoprotein AZGP1 gi|141596 P25311 ZA2G_HUMAN 34079 5,5 178 62 248 19 11 Beta-2- mikroglobulin B2M gi|34616 P61769 B2MG_HUMAN 13820 6,1 67 58 155 40 7 UPF0553 protein C9orf64 C9orf64 gi|110815802 Q5T6V5 CI064_HUMAN 39460 5,5 66 31 100 26 10 Coiled-coil domen-sadržujući protein 46 CCDC46 gi|82880656 Q8N8E3 CCD46_HUMAN 113192 6,2 65 24 158 14 20 CD59 glikoprotein CD59 gi|157836404 P13987 CD59_HUMAN 14795 6,1 45 26 98 18 2 Rezultati 34 Naziv proteina Gensko ime Ulazni kod UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna masa CPI PMF- skor PMF- pokrivenost sekvence MS/MS scor Pokrivenost MS/MS sekvence Peptidi Complement faktor B CFB gi|291922 P00751 CFAB_HUMAN 86847 6,7 72 24 99 21 3 Cistatin-C CST3 gi|181387 P01034 CYTC_HUMAN 16017 9,9 103 62 88 41 12 Cistatin-M CST6 gi|4503113 Q15828 CYTM_HUMAN 16785 9,5 76 46 135 34 4 Verovatna ATP- zavisna RNA helikaza DDX60 DDX60 gi|82880656 Q8IY21 DDX60_HUMAN 199680 8,4 59 22 68 16 24 Endonucleaza domen-sadržujući 1 protein ENDOD1 gi|148225659 O94919 ENDD1_HUMAN 55723 5,4 95 36 59 24 3 Masno kiselinski vezujući protein, jetra FABP1 gi|182356 P07148 FABPL_HUMAN 14256 7,5 57 59 178 53 4 Masno kiselinski vezujući protein, adipociti FABP4 gi|4557579 P15090 FABP4_HUMAN 14824 7,5 64 70 152 27 3 Masno kiselinski vezujući protein, epidermni FABP5 gi|4557581 Q01469 FABP5_HUMAN 15497 7,5 130 65 149 23 3 GAS2-kao protein 3 GAS2L3 gi|28372563 Q86XJ1 GA2L3_HUMAN 76022 10,4 71 23 29 1 10 Vitamin D- vezujući protein GC gi|139641 P02774 VTDB_HUMAN 54526 5,3 120 47 189 5 16 Gangliosid GM2 activator GM2A gi|31853 P17900 SAP3_HUMAN 21281 5 63 16 96 16 2 Guanin nucleotid- vezujući protein subjedinica alfa-11 GNA11 gi|115511049 P29992 GNA11_HUMAN 42400 5,4 59 37 75 28 10 Guanilin GUCA2A gi|157879468 Q02747 GUC2A_HUMAN 12839 4,4 65 43 132 18 4 Haptoglobin HP gi|296653 P00738 HPT_HUMAN 52385 6,1 66 24 58 24 8 Hemopeksin HPX gi|386789 P02790 HEMO_HUMAN 52385 6,6 90 25 82 2 1 Bazalna membrana- specifični heparan sulfat proteoglikan površni protein HSPG2 gi|184427 P98160 PGBM_HUMAN 479221 6,1 80 19 277 1 3 Ig alfa-1 lanac C region IGHA1 gi|113584 P01876 IGHA1_HUMAN 38486 6,1 75 43 94 25 10 Ig gama-1 lanac C region IGHG1 gi|34527666 P01857 IGHG1_HUMAN 36596 9,4 47 18 248 18 4 Ig gama-2 lanac C region IGHG2 gi|10799664 P01859 IGHG2_HUMAN 36505 8,8 96 39 150 13 8 Ig kapa lanac C region IGKC gi|218783338 P01834 IGKC_HUMAN 11773 5,5 71 48 313 31 7 Ig lambda lanac C regions IGLC1 gi|33700 P01842 LAC_HUMAN 11401 7,6 64 18 46 15 3 Inter-alfa-tripsin inhibitor teških lanaca H4 ITIH4 gi|1483187 Q14624 ITIH4_HUMAN 103521 6,5 94 22 78 21 11 Kininogen-1 KNG1 gi|4504893 P01042 KNG1_HUMAN 72996 6,4 196 54 131 3 2 Keratin, tip II citoskeletni 1 KRT1 gi|7331218 P04264 K2C1_HUMAN 66170 8,8 112 40 74 4 16 Keratin, tip I citoskeletni 10 KRT10 gi|28317 P13645 K1C10_HUMAN 59046 5 205 45 80 8 27 Alfa-laktalbumin LALBA gi|170684552 P01842 LAC_HUMAN 16692 7,6 86 69 117 49 3 Vezikularni integralni membranski protein VIP36 LMAN2 gi|5803023 Q12907 LMAN2_HUMAN 40545 6,5 106 50 114 16 16 Rezultati 35 Naziv proteina Gensko ime Ulazni kod UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna masa CPI PMF- skor PMF- pokrivenost sekvence MS/MS scor Pokrivenost MS/MS sekvence Peptidi Manan-vezujući lectin serin proteaza 2 MASP2 gi|50513645 O00187 MASP2_HUMAN 77224 5,4 87 13 175 5 10 Alfa-1-kiseli glikoprotein ORM1 gi|112877 P02763 A1AG1_HUMAN 23725 4,8 75 47 256 26 9 Pleckstrin homolog domen-sadržujući familija G član 4B PLEKHG4B gi|4504165 Q96PX9 PKH4B_HUMAN 141345 6,2 63 20 58 5 16 Protektor telomera protein 1 POT1 gi|56693609 Q9NUX5 POTE1_HUMAN 72309 6,3 61 27 117 7 13 Proteasom sub jedinica alfa tip-7 PSMA7 gi|116283481 O14818 PSA7_HUMAN 28041 9,3 56 42 93 14 7 Prostaglandin-H2 D-isomeraza PTGDS gi|32171249 P41222 PTGDS_HUMAN 21243 8,9 64 40 139 34 7 Receptor-tip tirosin-protein fosfataza delta PTPRD gi|4506309 P23468 PTPRD_HUMAN 215651 6,1 80 27 63 21 21 Retinol-vezujući protein 4 RBP4 gi|157830446 P02753 RET4_HUMAN 23337 5,7 132 77 196 25 17 Litostatin-1-alfa REG1A gi|623413 P05451 REG1A_HUMAN 19118 5,6 111 55 254 23 4 GTP-vezujući protein Rit2 RIT2 gi|4506533 Q99578 RIT2_HUMAN 24880 6,2 49 46 61 44 5 Ne-secretorna ribonukleaza RNASE2 gi|4506549 P10153 RNAS2_HUMAN 18855 10,6 44 21 116 19 4 Protein S100-A7 S100A7 gi|190668 P31151 S10A7_HUMAN 11578 6,4 110 55 127 33 3 Protein S100-A9 S100A9 gi|4506773 P06702 S10A9_HUMAN 13291 5,7 83 65 224 54 4 Sekretovani transmembranski protein 1 SECTM1 gi|4506869 Q8WVN6 SCTM1_HUMAN 27307 7,9 58 26 224 20 3 Semaphorin-3A SEMA3A gi|21669485 Q14563 SEM3A_HUMAN 89916 7,2 60 31 75 23 7 Alfa-1-antitripsin SERPINA1 gi|177827 P01009 A1AT_HUMAN 46878 5,3 62 25 247 13 12 SH3 domen- vezujući glutamični kiselinski-bogat protein 3 SH3BGRL3 gi|13775198 Q9H299 SH3L3_HUMAN 10488 4,7 108 83 186 17 9 Superoksid dizmutaza [Cu-Zn] SOD1 gi|2982080 P00441 SODC_HUMAN 16154 5,7 66 24 58 24 2 Spastin SPAST gi|11875211 Q9UBP0 SPAST_HUMAN 67497 10,3 57 24 76 23 12 Transtiretin TTR gi|17942890 P02766 TTHY_HUMAN 15991 5,4 123 65 129 24 5 Xin actin-vezujući protein 2 XIRP2 gi|134270875 A4UGR9 XIRP2_HUMAN 383888 6 102 48 254 20 38   Rezultati 36 4.4 Komparativna analiza urinarnih proteoma upotrebom 2D-DIGE i identifikacija EN proteinskih markera Da bi identifikovali proteine koji su diferencijalno izlučivani putem urina EN pacijenata u odnosu na zdravu populaciju i druge eksperimantalne grupe, sa visokom reproducibilnošću i statističkom značajnošću, uradili smo 2D-DIGE analize zbirnih uzoraka (5 zbirnih uzoraka po grupi) i uporedili medju grupama dobijene mape proteoma. Intenzitet svake proteinske tačke je semikvantifikovan upotrebom Delta 2D software-a a izražen je procentualnom vrednošću koja odgovara volumenu određene tačke na slici gela. Kreirane su 2D-DIGE proteinske mape u pI 4-7 rangu (Slika 2, 3). Kao što je i očekivano, veća količina proteina pronađena je u urinu bubrežnih bolesnika u poređenju sa zdravom populacijom (Slika 2, 3). Slika 2. 2D-DIGE slika proteina u HEN urinu (grupa 1, zelena boja) i pacijenata sa EN L (grupa 2, crvena boja) – slika levo; identifikovani proteini su obeleženi na gelu njihovim genskim imenima – slika desno. Proteini su razdvojeni na osnovu njihove izolelektrične tačke u 4-7 pI rangu upotrebom IEF, a u zavisnosti od njihove mole- kularne mase na 12% SDS PAGE gelu. Intezitet boje svake tačke indirekno odražava količinu ekskretovanog pro- teina u urinu. Proteini sa sličnom koncentracijom a istom pI i molekularnom masom, nalaze se na istom mestu na gelu i markirani su žutom bojom. HEN – zdravi dobrovoljci koji žive u endemskim područjima; EN L – pacijenti sa endemskom nafropatijom i niskim vrednostima proteinurije Rezultati 37 Kvantitativna i kvalitativna analiza 2D-DIGE mapa pomoću Delta 2D i Prizma4 sofware-a dokazala je značajnu razliku u ekskreciji 43 proteina u urinu EN pacijenata za razliku od zdra- ve populacije iz endemičkih područja (Tabela 2, Slika 2, 3), ali daljim ispitivanjem razlike u ekskreciji ovih proteina putem urina ispitanika u drugim grupama, izdvaja se patent od 6 razli- čitih proteina identifikovanih kao α1-mikroglobulin (AMBP), β-2-glikoprotein 1 (APOH), β2- mikroglobulin (B2M), manoza-vezujući lektin 2 (LMAN2), protektivni protein telomera 1 (POT1) i superoksid dizmutaza [Cu-Zn] (SOD1), značajno (p<0.001) veće koncentracije u uri- nu EN pacijenata u odnosu na ostale eksperimentalne grupe (Slika 4). Slika 3. 2D-DIGE slika proteina u HEN urinu (grupa 1, zelena boja) i pacijenata sa EN H (grupa 3, crvena boja) – slika levo; identifikovani proteini su obeleženi na gelu njihovim genskim imenima – slika desno. Proteini su razdvojeni na osnovu njihove izolelektrične tačke u 4-7 pI rangu upotrebom IEF, a u zavisnosti od njihove mo- lekularne mase na 12% SDS PAGE gelu. Intezitet boje svake tačke indirekno odražava količinu ekskretovanog proteina u urinu. Proteini sa sličnom koncentracijom a istom pI i molekularnom masom, nalaze se na istom mestu na gelu i markirani su žutom bojom. HEN – zdravi dobrovoljci koji žive u endemskim područjima; EN H – paci- jenti sa endemskom nafropatijom i visokim vrednostima proteinurije Rezultati 38 Tabela 2. Urinarni proteini identifikovani u uzorcima HEN, EN L i EN H koji se značajno različito eksprimiraju u zavisnosti od ispitivane grupe, predstavljeni su u tabeli. Odnos intenziteta gustine i volumena proteinskih tačaka na jednom gelu u poređenju sa drugim smatra se statistički značajnim za vrednosti veće od 2 ili vrednosti manje od 0,5. Analiza intenziteta gustine i volumena proteinskih tačaka, kao i izračunavanje odnosa vrednosti između ispitivanih grupa, izvršena je pomoću Delta 2D software-a. *proteini koji su takođe diferencijalno eksprimirani ali nisu spacifični za EN Protein (gensko ime) Odnos EN L/HEN Odnos EN H/HEN ALB* 2,53 4,24 AMBP* 1,95 2,24 APOA1 0,33 0,16 APOA4* 3,67 2,33 APOH* 2,21 2,73 AZGP1 2,00 0,59 B2M* 1,61 3,28 CCDC46 3,81 2,70 CD59 3,00 0,45 CFB 4,62 3,20 CST3 6,52 8,52 CST6 11,33 11,23 FABP1* 1,39 1,01 FABP4* 2,84 2,66 GC 2,06 1,62 GM2A 1,10 1,09 GUCA2A 0,56 0,16 HPX 2,33 0,81 HSPG2 1,96 1,72 IGHA1 20,24 10,23 IGHG1 0,97 0,38 IGHG2 4,80 2,43 IGKC 2,56 2,41 IGLC1 2,53 2,44 ITIH4 2,34 0,88 KNG1 0,57 0,29 KRT1 3,28 1,68 KRT10 11,20 4,78 LMAN2* 1,10 1,65 MASP2 2,46 1,42 POT1* 1,61 3,28 PSMA7 1,36 0,79 PTGDS 0,88 1,04 RBP4* 3,17 2,91 REG1A* 6,69 5,22 RNASE2 0,29 0,20 S100A7* 0,00 0,00 S100A9* 5,34 2,99 SECTM1 1,30 0,84 SERPINA1 0,92 0,53 SH3BGRL3 0,52 0,87 SOD1* 163,67 102,33 TTR 7,68 3,23 Rezultati 39 Slika 4. Grafička prezentacija razdvojenih proteinskih tačaka 2D-DIGE metodom sa uvećanjem ekvivalentnih re- giona na gelovima različitih grupa na kojima se nalaze proteini koji se u značajno većem volumenu ekskretuju uri- nom EN L i EN H pacijenata u odnosu na HEN, DN, AKI i HGER. Na y osi grafika prikazane su procentualne vrednosti volumena tačaka, dok je na x osi predstavljena distribucija vrednosti duž odgovarajuće grupe u odnosu na ispitivanu tačku. Proteini su predstavljeni njihovim genetičkim imenima. Proteini prezentovani na ovoj slici ispunjuju kriterijume da postanu EN potencijalni markeri: α1-mikroglobulin (AMBP), β-2-glikoprotein 1 (APOH), β2-mikroglobulin (B2M), manoza-vezujući lektin 2 (LMAN2), protektivni protein telomera 1 (POT1) i superoksid dizmutaza [Cu-Zn] (SOD1). Statistička analiza podataka urađena je u Prizma 4 software-u (**p<0,01, ***p<0,001). 4.5 Komparativna analiza urinarnih proteoma DN i EN pacijenata upotrebom 2D-DIGE i identifikacija proteinskih markera glomerularnog oštećenja u urinu EN pacijenata Da bi identifikovali proteine koji se smatraju markerima glomerularnog oštećenja (albu- min, α-1-antitripsin, haptoglobin, hemopeksin, retinol vezujući protein, vitamin D vezujući protein, transtiretin i komplement faktor B) i diferencijalno su izlučivani putem urina EN paci- jenata u odnosu na pacijente sa DN-om, sa visokom reproducibilnošću i statističkom značaj- nošću, uradili smo 2D-DIGE analize zbirnih uzoraka (5 zbirnih uzoraka po grupi) i uporedili među grupama dobijene mape proteoma. Rezultati 40 Intenzitet svake proteinske tačke je semikvantifikovan upotrebom Delta 2D software-a a izražen je procentualnom vrednošću koja odgovara volumenu određene tačke na slici gela. Kre- irane su 2D-DIGE proteinske mape u 4-7 pI rangu (Slika 5). Dobijeni rezultati su pokazali zna- čajne razlike u kvalitetu proteoma urina pacijenta sa dijabetesnom nefropatijom, zdravih ispitanika koji naseljavaju endemska područja, pacijenata sa endemskom nefropatijom i niskim (ispod 150 mg/L proteina u urinu) i visokim vrednostima (preko 150 mg/L proteina u urinu) proteinurije. Slika 5. 2D-DIGE slika proteina u urinu DN pacijenata (crvena boja) i HEN (slika gore), EN L (slika u sredini), EN H (slika dole). Proteini su razdvojeni na osnovu njihove izolelektrične tačke u 4-7 pI rangu upotrebom IEF, a u zavisnosti od njihove molekularne mase na 12% SDS PAGE gelu. Intezitet boje svake tačke indirekno odražava količinu ekskretovanog proteina u urinu. Proteini sa sličnom koncentracijom a istom pI i molekularnom masom, nalaze se na istom mestu na gelu i markirani su žutom bojom. HEN – zdravi dobrovoljci koji žive u endemskim područjima; EN LP – pacijenti sa endemskom nefropatijom i niskim vrednostima proteinurije i EN HP – pacijenti sa endemskom nefropatijom i visokim vrednostima proteinurije Rezultati 41 Kvantitativna i kvalitativna analiza 2D-DIGE mapa pomoću Delta 2D i Prizma4 sofware-a do- kazala je značajnu razliku u ekskreciji markera glomerularnog oštećenja. Prisustvo markera glome- rulskog oštećenja u urinu DN pacijenata značajno je povišeno u odnosu na urin EN pacijenata. Markeri glomerulskog oštećenja se značajnije javljaju u urinu EN pacijenata u odmaklom stadiju- mu bolesti u poređenju sa urinom zdravih dobrovoljaca uz endemskih područja, što pored oštećenja tubula ukazuje na dodatno oštećenje glomerula (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) (Slika 6). Slika 6. Grafička prezentacija razdvojenih proteinskih tačaka 2D-DIGE metodom sa uvećanjem ekvivalentnih re- giona na gelovima različitih grupa na kojima se nalaze proteini koji se u značajno većem volumenu ekskretuju uri- nom DN pacijenata u odnosu na EN L i EN H. Na y osi grafika prikazane su procentualne vrednosti volumena ta- čaka, dok je na x osi predstavljena distribucija vrednosti duž odgovarajuće grupe u odnosu na ispitivanu tačku. Proteini su predstavljeni njihovim genetičkim imenima. Proteini prezentovani na ovoj slici predstavljaju markere glomerularnog oštećenja: albumin (ALB), α-1-antitripsin (SERPINA1), haptoglobin (HP), hemopeksin (HPX), re- tinol vezujući protein (RBP4), vitamin D vezujući protein (GC), transtiretin (TTR) i komplement faktor B (CFB). Statistička analiza podataka urađena je u Prizma 4 software-u (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). Rezultati 42 4.6 Imunološko potvrđivanje identifikovanih EN proteinskih markera Da bi ispitali validnost proteomskih analiza i potvrdili potencijalnu ulogu ispitivanih prote- ina kao markera EN-a, koristili smo Western blot analizu. Podaci dobijeni nakon imunoblot ek- sperimenta potvrdili su rezultate dobijene proteomskim analizama (Slika 5). Rezultati prikazu- ju značajnu razliku u nivou ekskrecije šest proteina, AMBP, APOH, B2M, LMAN2, POT1 i SOD1 u zavisnosti od ispitivane grupe. Najveća količina izlučenih proteina pronađena je u uzorcima EN pacijenata, značajno veća u poređenju sa uzorcima DN pacijenata (p<0,001, ANOVA) i sa uzorcima HEN-a (p<0,001, ANOVA). Nalaz ovih proteina u uzorcima urina pa- cijenata sa prerenalnom AKI i HGER bio je gotovo negativan (p<0,001, ANOVA). Povišene vrednosti proteina nađene su u urinu zdravih dobrovoljaca iz EN regiona u odnosu na urin pa- cijenata sa prerenalnom AKI i HGER (p<0,001, ANOVA) (Grafikon 3). Grafikon 3. Fluorescentna Western blot analiza značajnih proteina koji su predhodno identifikovani 2-DE anali- zom u urinu ispitanika HEN, EN, DN, AKI i HGER. U ovoj analizi korišćena su specifična antitela protiv α1-mi- kroglobulina (AMBP), β-2-glikoproteina 1 (APOH), β2-mikroglobulina (B2M), manoza-vezujućeg lektina 2 (LMAN2), protektivnog proteina telomera 1 (POT1) i superoksid dizmutaze [Cu-Zn] (SOD1). Na y osi grafika prikazane su procentualne vrednosti volumena blot linija, dok je na x osi predstavljena distribucija vrednosti duž odgovarajuće ispitivane grupe. Slika detektovanih proteina na blot membrani prikazana je ispod svakog grafikona. Statistička analiza podataka urađena je u Prizma 4 software-u (***p<0,001). Rezultati 43 Uz pomoć ROC krive, AUC analize sa 95% intervalom pouzdanosti (CI) (Grafikon 4) ispitivana je značajnost istaknutih urinarnih proteina kao potencijalnih dijagnostičkih markera. Rezultati su pokazali da identifikovani proteinski markeri mogu da diferenciraju sa velikom specifičnošću (Sp) i senzitivnošću (Sn) EN od DN, AKI, HEN i HGER (Tabela 3). Izmerene koncentracije AMBP (95% CI, cut-off>2,687; (67% - 100%) Sn; (55% - 85%) Sp), APOH (95% CI, cut-off>0,4309; (84%-100%) Sn; (32%-78%) Sp), B2M (95% CI, cut-off>1,353; (84%-100%) Sn; (32%-78%) Sp), LMAN2 (95% CI, cut-off>0,0520; (84%-100%) Sn; (67%- 99%) Sp), POT1 (95% CI, cut-off>0,2885; (84%-100%) Sn; (37%-89%) Sp) i SOD1 (95% CI, cut-off>0,1348; (84%-100%) Sn; (32%-78%) Sp) u urinu EN pacijenata predstavljaju značajno veće vrednosti od onih u urinu HEN ispitanika (p<0,001) (Tabela 3). ROC grafikoni identifi- kovanih proteina ukazuju na njihovu prediktivnu ulogu u pravilnoj dijagnostici EN oboljenja i di- ferenciranju u odnosu na druge bolesti sa velikom pouzdanošću (95%CI, p<0,001, Grafikon 4). Tabela 3. Rezultati analize ekskrecije šest urinarnih proteina dobijenih tehnikom Western blota pomoću ROC krive: upoređivanje dobijenih vrednosti HEN, DN, AKI i HGER sa EN; Sn – senzitivnost, Sp – specifičnost, dif. AUC – razlika u površini ispod krive HEN vs. EN DN vs. EN Marker Granične vrednosti Sn Sp Dif. AUC p Granične vrednosti Sn Sp Dif. AUC p AMBP >2,687 67% to 100% 55% to 85% 1 p<0,01 <2,433 51% to 76% 29% to 99% 0,54 nije značajno APOH >0,4309 84% to 100% 32% to 78% 0,99 p<0,001 >0,7569 84% to 100% 57% to 96% 0,995 p<0,001 B2M >1,353 84% to 100% 32% to 78% 0,9825 p<0,001 <6,897 32% to 78% 75% to 99% 0,83 p<0,001 LMAN2 >0,0520 84% to 100% 67% to 99% 0,9213 p<0,001 >1,163 84% to 100% 57% to 96% 0,995 p<0,001 POT1 >0,2885 84% to 100% 37% to 89% 1 p<0,001 >0,8122 84% to 100% 32% to 89% 0,93 p<0,001 SOD1 >0,1348 84% to 100% 32% to 78% 0,9925 p<0,001 >0,9725 69% to 99% 35% to 70% 0,7125 p<0,05 AKI vs. EN HGER vs. EN Marker Cut-off Sn Sp Dif. AUC p Cut-off Sn Sp Dif. AUC p AMBP >6,652 48% to 100% 52% to 85% 1 p<0,01 >1,796 48% to 100% 86% to 94% 1 p<0,01 APOH >0,1499 84% to 100% 87% to 91% 1 p<0,001 >0,1142 84% to 100% 87% to 99% 1 p<0,001 B2M >6,255 62% to 97% 70% to 84% 0,6775 nije značajno >0,3140 84% to 100% 70% to 89% 0,9875 p<0,001 LMAN2 >0,8976 84% to 100% 8% to 49% 0,99 p<0,001 >0,3409 84% to 100% 86% to 100% 0,985 p<0,001 POT1 >0,1347 84% to 100% 3% to 37% 1 p<0,001 >0,1109 84% to 100% 87% to 100% 1 p<0,001 SOD1 >0,2615 84% to 100% 3% to 38% 0,9475 p<0,001 >0,2201 84% to 100% 81% to 100% 0,97 p<0,001 Rezultati 44 Grafikon 4. Grafikoni ROC funkcije: statistička analiza je izvedena u Prizma 4 software programu. Ispitivanjem su obuhvaćeni podaci Western blot analize šest specifičnih proteina koji diferenciraju urin EN pacijenata od osta- lih grupa (HEN, DN, AKI, HGER). Analizirana je specifičnost i senzitivnost sledećih proteina: AMBP, APOH, B2M, LMAN2, POT1 i SOD1, što je pokazalo da se mogu koristiti kao prediktori postojanja oboljenja sa visokom sposobnošću diskriminacije u odnosu na druge ispitivane bolesti (95% CI, p<0,001) 4.7 Validnost EN markera ispitivana na većem polulacionom uzorku Da bi se ispitala korisnost identifikovanih EN markera u dijagnostičke svrhe, dot blot analiza je izvršena na velikom uzorku ispitanika. Statistička analiza rezultata potvrdila je sa vi- sokom signifikantnošću povećanu ekskreciju ovih šest proteina putem urina EN L i EN H paci- jenata u odnosu na druge ispitivane grupe (AKI, DN, HGER) (p<0,001, ANOVA). Rezultati 45 Ovi proteini su pronađeni i u urinu HEN ispitanika, u značajno većoj koncentraciji u odnosu na vrednosti u urinu HGER ispitanika (Grafikon 5). Grafikon 5. Dot blot analiza šest značajnih proteina koji su prethodno identifikovani proteomskim ispitivanjima u urinu HEN, EN L i EN H na velikom broju ispitanika (HEN, EN L, EN H, DN, AKI, HGER). Korišćena su speci- fična antitela protiv AMBP, APOH, B2M, LMAN2, POT1 i SOD1. Na y osi svakog grafikona prikazane su pro- centualne vrednosti volumena blot krugova, dok je na x osi predstavljena distribucija vrednosti duž odgovarajuće ispitivane grupe. Slika detektovanih proteina na blot membrani prikazana je ispod svakog grafikona. Statistička analiza podataka urađena je u Prizma 4 software-u (***p<0,001). Uz pomoć ROC krive, AUC analize sa 95% intervalom pouzdanosti (CI) (Grafikon 6) ispitivana je značajnost istaknutih urinarnih proteina kao potencijalnih dijagnostičkih markera. Rezultati su potvrdili jasnu diskriminaciju pacijenata sa EN L i EN H u odnosu na grupe paci- jenata sa AKI i DN i zdravih dobrovoljaca HGER (Tabela 4). Nalazi APOH, POT1 i LMAN2 u urinu HEN gotovo da se nalaze u istoj količini bez stati- stičke značajne razlike, kao u uzorcima urina EN L pacijenta. U uzorcima EN H pacijenata, vrednosti AUC za B2M (0,780), (0,706) i SOD1 (0,808) ve- će su u odnosu na ostale markere, APOH (0,649), POT1 (0,554) i LMAN2 (0,567). DN paci- jenti imali su značajno niske vrednosti urinarnih AMBP, B2M, LMAN2, POT1 i SOD1 u od- nosu na obe grupe EN pacijenata (AUC je bio u rangu od 0,648 do 0,806). APOH (0,760) je imao značajno nižu vrednost u urinu DN pacijenata u poređenju sa EN H. Rezultati 46 U urinu EN L i EN H pacijenata AUC vrednosti za svih šest urinarnih markera bile su zna- čajno veće u odnosu na urin HGER, u rangu od 0,679 do 0,942. AUC vrednosti za urinarne markere B2M, LMAN2, POT1 i SOD1 bile su značajno niže kod pacijenata sa AKI u odnosu na EN L pacijente (u rangu od 0,653 do 0,838), dok su i vrednosti za APOH u poređenju sa na- lazom u urinu EN H pacijenta značajno niže (0,775). Grafikon 6. Grafikoni ROC funkcije: statistička analiza je izvedena u Prizma 4 software programu. Ispitivanjem su obuhvaćeni podaci dot blot analize šest specifičnih proteina koji diferenciraju urin EN pacijenata (EN L, EN H) od ostalih grupa (HEN, DN, AKI, HGER). Analizirana je specifičnost i senzitivnost sledećih proteina: AMBP, APOH, B2M, LMAN2, POT1 i SOD1, čime je dokazana validnost markera kao prediktora postojanja oboljenja sa visokom sposobnošću diskriminacije u odnosu na druge ispitivane bolesti (95% CI, p<0,001) Rezultati 47 Rezultati 48 4.8 Test ćelijske vijabilnosti (MTT test) Vijabilnost humanih tubulocita (HK2) ispitivana je MTT esejom nakon primenjenih tretma- na. HK2 su izlagane u različitim vremenskim intervalima rastućim koncentracijama toksina, ohratoksina A (OTA) (slika 7), aristilohijske kiseline 1 (AA1) (slika 8), kao i smešom toksina (AA1 i OTA) (slika 9). Smanjenje ćelijske vijabilnosti bilo je proporcijalno koncentraciji i du- žini izlaganja HK2 toksinima u svim eksperimentalnim grupama. OT1         Slika 7. MTT test: vijabilnost HK2 ćelija nakon izlaganja OTA toksinu – vijabilnost ćelija se smanjuje proporci- jalno većoj primenjenoj dozi i dužem vremenskom periodu AA1         Slika 8. MTT test: vijabilnost HK2 ćelija nakon izlaganja AA1 toksinu – vijabilnost ćelija se smanjuje proporci- jalno većoj primenjenoj dozi i dužem vremenskom periodu OT1+AA1          Slika 9. MTT test: vijabilnost HK2 ćelija nakon izlaganja AA1 toksinu – vijabilnost ćelija se smanjuje proporci- jalno većoj primenjenoj dozi i dužem vremenskom periodu Rezultati 49 4.9 Kvantitativna i kvalitativna analiza proteina koji učestvuju u akutnom ćelijskom odgovoru na dejstvo toksina Akutna oštećenja HK2 ćelija nastala su nakon 72h inkubacije sa AA1, OTA, i kombinova- nim tretmanom AA1 i OTA. Ćelije su kultivisane u medijumu bez seruma, da bi se izbegao uti- caj interakcije toksina sa proteinima plazme na ishod eksperimenta. Nakon 72-časovne inkuba- cije, ćelije su sakupljene (uz pomoć tripsina) i tri puta ispirane PBS rastvorom. Na osnovu vre- dnosti MTT eseja, u eksperimentu su korišćene sledeće koncentracije toksina: • I grupa: 2 µg/mL OTA • II grupa: 5 µg/mL AA1 • III grupa: 5 µg/mL AA1 i 2 µg/mL OTA Ćelije su kolektovane i ekstrakti su korišćeni za dalja proteomska istraživanja. Da bi kreirali proteomske mape tretiranih ćelija, koristili smo 2-DE analizu ekstrakta (pI 4-7 i pI 7-10, Slike 10-13). Identifikacija specifičnih proteina obavljena je upotrebom masene spektrometrije i pretragom baze podataka (Tabela 5, Slike 14-17). Proteinski profili su bili značajno reproducibilni i nisu otkrivene značajne razlike nakon trostrukog ponavljanja ma- piranja proteoma. Slika 10. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 72h u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove molekularne težine. Rezultati 50 Slika 11. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 72h u medijumu bez seruma i sa 2 µg/mL OTA. Proteini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove moleku- larne težine. Slika 12. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 72h u medijumu bez seruma i sa 5 µg/mL AA1. Proteini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove mole- kularne težine. Slika 13. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 72h u medijumu bez seruma i sa 5 µg/mL AA1 i 2 µg/mL OTA. Proteini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove molekularne težine. Rezultati 51 Tabela 5. Lista proteina HK2 ćelija identifikovana masenom spektrometrijom i pretragom baza podataka. Ulazni broj u Swiss-Prot i NCBI je dat za svaki protein. Informacije i peptidnom masenom fingerprintu (PMF), o nomi- nalnoj masi i vrednosti izoelektričnih tačaka za svaki protein su takođe navedene. 1-94 proteini značajno su eksprimirani u HK2 ćelijama kultivisanim u medijumu bez seruma; 95-150 i 235-244 proteini su značajno eksprimirani u HK2 ćelijama tretiranim AA1-om; 151-206 i 245-262 proteini su značajno eksprimirani u HK2 ćelijama tretiranim OTA-om; 207-219 i 263-300 proteini su značajno eksprimirani u HK2 ćelijama tretiranim AA1 i OTA-om (poređenje i ispitivanje razlika u ekspresiji proteina između različitih eksperimentalnih grupa urađeni su u Delta 2D programu). Proteini su razdvajani u pI 4-7 i pI 7-10 rangu. No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 1 Mali ubiquitin-sličan modifikator 2 SUMO2 P61956 SUMO2_HUMAN 10864 5,32 199 7(3) 2 Tioredoksin TXN P10599 THIO_HUMAN 11730 4,82 163 4(3) 3 Koaktozin-like protein COTL1 Q14019 COTL1_HUMAN 15935 5,54 59 6(2) 4 Miozin laki polipeptid 6 MYL6 P60660 MYL6_HUMAN 16919 4,56 30 2(1) 5 60S kiselo ribozomalni protein P2 RPLP2 P05386 RLA1_HUMAN 11658 4,42 78 2(2) 6 Miozin laki polipeptid 6 MYL6 P60660 MYL6_HUMAN 16919 4,56 95 5(2) 7 Delta podjedinica ATP sintaze ATP5D P30049 ARPD_HUMAN 17479 5,38 166 3(3) 8 Nukleofosmin NPM1 P06748 NPM_HUMAN 32555 4,77 148 1(1) 9 39S ribozomalni protein L12 MRPL12 P52815 RM12_HUMAN 21335 5,01 113 5(3) 10 Klatrin laki lanac A CLTA P09496 CLCA_HUMAN 27060 4,43 105 6(2) 11 Nascentni polipeptidno-asociran compleks podjedinica alfa NACA Q13765 NACA_HUMAN 23370 4,52 351 6(4) 12 14-3-3 protein epsilon YWHAE P62258 1433E_HUMAN 29155 4,63 179 5(3) 14 Hepatoma-derived faktor rasta HDGF P51858 HDGF_HUMAN 26772 4,70 60 5(2) 15 Alfa-amilaza 1 AMY1A P04745 AMY1_HUMAN 57731 6,47 543 21(13) 16 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 267 14(6) 17 Tubulin alfa-1A lanac TUBA1A Q71U36 TBA1A_HUMAN 50104 4,94 41 1(1) 18 UV ekscizioni reparacioni protein RAD23 homolog B RAD23B P54727 RD23B_HUMAN 43145 4,76 166 7(5) 19 Kalumenin CALU O43852 CALU_HUMAN 37084 4,47 117 6(3) 20 Ubikvilin-1 UBQLN1 Q9UMX0 UBQL1_HUMAN 62479 5,02 45 4(1) 21 Endoplazmin HSP90B1 P14625 ENPL_HUMAN 92411 4,76 284 22(13) 22 Endoplazmin HSP90B1 P14625 ENPL_HUMAN 92411 4,76 117 11(5) 23 Laminin podjedinica gama-1 LAMC1 P11047 LAMC1_HUMAN 177489 5,01 39 8(2) 24 Hipoksijom ushodno regulisani protein 1 HYOU1 Q9Y4L1 HYOU1_HUMAN 111266 5,16 350 24(12) 25 Kinektin KTN1 Q86UP2 KTN1_HUMAN 156179 5,52 106 11(5) 26 Kinektin KTN2 Q86UP2 KTN1_HUMAN 156179 5,52 72 9(3) 27 Rani endozom antigen 1 EEA1 Q15075 EEA1_HUMAN 162367 5,55 202 16(6) 28 Glavni valutni protein MVP Q14764 MVP_HUMAN 99266 5,34 135 9(4) 29 Miozin-9 MYH9 P35579 MYH9_HUMAN 226392 5,50 47 3(1) 30 Prelazni endoplazmatski retikulum ATP-aza VCP P55072 TERA_HUMAN 89266 5,14 361 16(10) 31 78 kDa glukozo-regulisani protein HSPA5 P11021 GRP78_HUMAN 72288 5,07 885 21(18) 32 Lamin-B1 LMNB1 P20700 LMNB1_HUMAN 66368 5,11 242 12(8) 33 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 48 2(1) 34 Tubulin beta lanac TUBB P07437 TBB5_HUMAN 49639 4,78 481 17(15) 35 Podjedinica beta ATP sintaze, mitohondrijalna ATP5B P06576 ATPB_HUMAN 56525 5,26 190 7(5) 36 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 385 19(10) Rezultati 52 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 37 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 772 31(19) 38 Tubulin alfa-1B lanac TUBA1B P68363 TBA1B_HUMAN 50120 4,94 245 13(6) 39 NSFL1 kofaktor p47 NSFL1C Q9UNZ2 NSF1C_HUMAN 40548 4,99 172 7(5) 40 Regulatorna podjedinica 6B 26S proteaze PSMC4 P43686 PRS6B_HUMAN 47337 5,09 199 10(6) 41 Regulatorna podjedinica 6A 26S proteaze PSMC3 P17980 PRS6A_HUMAN 49172 5,09 367 15(7) 42 Perilipin-3 PLIN3 O60664 PLIN3_HUMAN 47018 5,30 359 8(7) 43 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 148 7(4) 44 Sukcinil-CoA ligaza [GDP- formirajuća] podjedinica beta, mitohondrijalna SUCLG2 Q96I99 SUCB2_HUMAN 46481 6,15 166 7(5) 45 NSFL1 kofaktor p47 NSFL1C Q9UNZ2 NSF1C_HUMAN 40548 4,99 147 5(3) 46 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 186 10(5) 47 Proteinska disulfid-isomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 336 16(11) 48 UBX domen-sadržujući protein 1 UBXN1 Q04323 UBXN1_HUMAN 33305 5,23 146 5(3) 49 Proteinska disulfid-isomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 49 5(1) 50 Aneksin A5 ANXA5 P08758 ANXA5_HUMAN 35914 4,94 500 16(10) 51 Proteazomska podjedinica alfa tip-3 PSMA3 P25788 PSA3_HUMAN 28415 5,19 71 2(1) 52 Hloridni intracelularni kanalski protein 1 CLIC1 O00299 CLIC1_HUMAN 26906 5,09 178 12(6) 53 Heat shock kognat 71 kDa protein HSPA8 P11142 HSP7C_HUMAN 70854 5,37 280 8(5) 54 Sress-70 protein, mitohondrijalni HSPA9 P38646 GRP75_HUMAN 73635 5,87 162 8(4) 55 NADH-ubikvinon oksidoreduktaza 75 kDa podjedinica, mitohondrijalna NDUFS1 P28331 NDUS1_HUMAN 79417 5,89 193 11(6) 56 T-kompleks protein 1 podjedinica epsilon CCT5 P48643 TCPE_HUMAN 59633 5,45 140 6(3) 57 60 kDa heat shock protein, mitohondrijalni HSPD1 P10809 CH60_HUMAN 61016 5,70 987 28(22) 58 61 kDa heat shock protein, mitohondrijalni HSPD2 P10809 CH60_HUMAN 61016 5,70 439 17(12) 59 Dihidrolipoilizin -residualna acetiltransferazna komponenta piruvat dehidrogenaznog kompleksa, mitohondrijalna forma DLAT P10515 ODP2_HUMAN 68953 7,06 154 8(4) 60 Kopin-1 CPNE1 Q99829 CPNE1_HUMAN 59022 5,52 119 9(5) 61 Protein disulfidna-isomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 1023 31(25) 62 Protein disulfidna-isomeraza A3 PDIA3 P30101 PDIA3_HUMAN 56747 5,98 53 5(1) 63 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 107 6(3) 64 Aktinu sličan protein 6A ACTL6A O96019 ACL6A_HUMAN 47430 5,39 94 6(1) 65 Nuklearni migratorni protein nudC NUDC Q9Y266 NUDC_HUMAN 38219 5,27 49 4(1) 66 Citohrom b-c1 complex podjedinica 1, mitohondrijalna UQCRC1 P31930 QCR1_HUMAN 52612 5,94 199 14(5) 67 Stomatinu sličan protein 2 STOML2 Q9UJZ1 STML2_HUMAN 38510 6,88 455 10(5) 68 Endofilin-B1 SH3GLB1 Q9Y371 SHLB1_HUMAN 40771 5,78 121 6(4) 69 Statmin STMN1 P16949 STMN1_HUMAN 17292 5,76 124 5(4) 70 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein H2 HNRNPH2 P55795 HNRN2_HUMAN 49232 5,89 250 6(5) 71 T-kompleks protein 1 podjedinica alfa TCP1 P17987 TCPA_HUMAN 60306 5,80 185 9(6) Rezultati 53 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 72 Gelsolin GSN P06396 GELS_HUMAN 85644 5,90 87 4(3) 73 Kalponin-3 CNN3 Q15417 CNN3_HUMAN 36391 5,69 163 8(5) 74 Nikotidat-nukleotidna pirofosforilaza QPRT Q15274 NADC_HUMAN 30826 5,81 227 7(6) 75 Aneksin A3 ANXA3 P12429 ANXA3_HUMAN 36353 5,63 302 10(7) 76 Piruvat dehidrogenaza E1 komponenta podjedinica beta, mitohondrijalna PDHB P11177 ODPB_HUMAN 39208 6,20 317 10(7) 77 Guanine nukleotid-vezujući protein G (I)\G (S)\ G(T) GNB1 P62873 GBB1_HUMAN 37353 5,60 137 6(3) 78 Neorganska pirofosfataza PPA1 Q15181 IPYR_HUMAN 32639 5,54 209 5(5) 79 Peroksiredoksin-4 PRDX4 Q13162 PRDX4_HUMAN 30521 5,86 189 10(7) 80 Peroksiredoksin -2 PRDX2 P32119 PRDX2_HUMAN 21878 5,66 260 9(8) 81 Stahmin STMN1 P16949 STMN1_HUMAN 17292 5,76 154 5(4) 82 BAG familija molekularni regulator šaperona 2 BAG2 O95816 BAG2_HUMAN 23757 6,25 223 7(5) 83 Triosefosfat izomeraza TPI1 P60174 TPIS_HUMAN 26653 6,45 188 5(3) 84 Proteazomska podjedinica alfa tip-1 PSMA1 P25786 PSA1_HUMAN 29537 6,15 193 10(7) 85 Delta (3,5)-Delta (2,4)-dienoil-CoA izomeraza, mitohondrijalna ECH1 Q13011 ECH1_HUMAN 35793 8,16 304 9(7) 86 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A\B HNRNPAB Q99729 ROAA_HUMAN 36202 8,22 120 4(3) 87 Protein 2G4 povezan sa proliferacijom PA2G4 Q9UQ80 PA2G4_HUMAN 43759 6,13 207 9(7) 88 Alfa-enolaza ENO1 P06733 ENOA_HUMAN 47139 7,01 145 11(7) 89 Sukcinil-CoA: 3-ketoacid-koenzim A transferaza 1, mitohondrijalna OXCT1 P55809 SCOT1_HUMAN 56122 7,14 239 8(5) 90 T-kompleks protein 1podjedinica beta CCT2 P78371 TCPB_HUMAN 57452 6,01 72 4(1) 91 Aldehid dehidrogenaza X, mitohondrijalna ALDH1B1 P30837 AL1B1_HUMAN 57202 6,36 527 15(11) 92 Ezrin EZR P15311 EZRI_HUMAN 69370 5,94 164 19(7) 93 Endoplazmiski retikulum rezidentni protein 29 ERP29 P30040 ERP29_HUMAN 28975 6,77 428 14(10) 94 RuvB-sličan protein 1 RUVBL1 Q9Y265 RUVB1_HUMAN 50196 6,02 420 14(10) 95 Glukozidaza 2 podjedinica beta PRKCSH P14314 GLU2B_HUMAN 59388 4,33 281 15(5) 96 Kalretikulin CALR P27797 CALR_HUMAN 48112 4,29 91 8(3) 97 Kalretikulin CALR P27797 CALR_HUMAN 48112 4,29 471 25(11) 98 Miozinski laki polipeptid 6 MYL6 P60660 MYL6_HUMAN 16919 4,56 318 13(9) 99 Tioredoksin TXN P10599 THIO_HUMAN 11730 4,82 178 9(2) 100 Protein S100-A6 S100A6 P06703 S10A6_HUMAN 10173 5,33 125 7(3) 101 Ubikvitin-40S ribozomalni protein S27a RPS27A P62979 RS27A_HUMAN 17953 9,68 309 16(7) 102 Protein S100-A11 S100A11 P31949 S10AB_HUMAN 11733 6,56 232 6(5) 103 U6 snRNA-povezana Sm-u sličan protein LSm2 LSM2 Q9Y333 LSM2_HUMAN 10828 6,04 120 5(2) 104 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 809 31(20) 105 Nukleofosmin NPM1 P06748 NPM_HUMAN 32555 4,64 462 16(9) 106 Tropomiosin alfa-1 lanac TPM1 P09493 TPM1_HUMAN 32689 4,69 111 14(4) 107 Hloridni intracelularni kanalski protein 1 CLIC1 O00299 CLIC1_HUMAN 26906 5,09 402 10(6) 108 Proteinska disulfid-isomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 201 14(4) 109 Proteinska disulfid-isomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 129 18(5) Rezultati 54 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 110 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 457 17(10) 111 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 768 24(18) 112 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein F HNRNPF P52597 HNRPF_HUMAN 45643 5,38 616 17(11) 113 Polimeraza I i transkript oslobađajući factor PTRF Q6NZI2 PTRF_HUMAN 43450 5,51 112 16(3) 114 Regulatorna podjedinica 6A 26S proteaze PSMC3 P17980 PRS6A_HUMAN 49172 5,13 230 23(7) 115 Tubulin alfa-1B lanac TUBA1B P68363 TBA1B_HUMAN 50120 4,94 300 20(10) 116 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein K HNRNPK P61978 HNRPK_HUMAN 50944 5,39 840 25(21) 117 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein K HNRNPK P61978 HNRPK_HUMAN 50944 5,39 327 11(9) 118 Lamin-B1 LMNB1 P20700 LMNB1_HUMAN 66368 5,11 405 30(11) 119 Lamin-B1 LMNB1 P20700 LMNB1_HUMAN 66368 5,11 357 27(12) 120 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 55 10(2) 121 Hsc70-interagujući protein ST13 P50502 F10A1_HUMAN 41305 5,18 379 14(10) 122 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 556 28(17) 123 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 289 17(10) 124 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 502 29(18) 125 78 kDa glukozom regulisani protein HSPA5 P11021 GRP78_HUMAN 72288 5,07 675 23(17) 126 Heat shock 70 kDa protein 4 HSPA4 P34932 HSP74_HUMAN 94271 5,11 254 23(6) 127 Heat shock protein HSP 90-beta HSP90AB1 P08238 HS90B_HUMAN 83212 4,97 340 29(10) 128 Endoplazmin HSP90B1 P14625 ENPL_HUMAN 92411 4,76 200 38(10) 129 Gelsolin GSN P06396 GELS_HUMAN 85644 5,90 89 14(2) 130 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein H HNRNPH1 P31943 HNRH1_HUMAN 49198 5,89 424 17(9) 131 Proteazom podjedinica beta tip-7 PSMB7 Q99436 PSB7_HUMAN 29946 7,57 71 9(4) 132 Protein DJ-1 PARK7 Q99497 PARK7_HUMAN 19878 6,33 76 9(2) 133 Triozefosfat izomeraza TPI1 P60174 TPIS_HUMAN 26653 6,45 422 16(10) 134 Delta (3,5)-Delta (2,4)-dienoil-CoA izomeraza, mitohondrijalna ECH1 Q13011 ECH1_HUMAN 35793 8,16 226 12(6) 135 LIM i SH3 domen 1 LASP1 Q14847 LASP1_HUMAN 29698 6,61 181 16(7) 136 Proteazomska podjedinica alfa tip-6 PSMA6 P60900 PSA6_HUMAN 27382 6,34 351 15(8) 137 Triozefosfat izomeraza TPI1 P60174 TPIS_HUMAN 26653 6,45 472 7(5) 138 Splajsing faktor U2AF 35 kDa podjedinica U2AF1 Q01081 U2AF1_HUMAN 27854 9,09 159 3(2) 139 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein H3 HNRNPH3 P31942 HNRH3_HUMAN 36903 5,89 592 17(12) 140 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A\B HNRNPAB Q99729 ROAA_HUMAN 36202 8,22 85 8(4) 141 Katepsin D CTSD P07339 CATD_HUMAN 44524 6,10 56 15(1) 142 Alfa-enolaza ENO1 P06733 ENOA_HUMAN 47139 7,01 531 26(13) 143 D-3-fosfoglicerat dehidrogenaza PHGDH O43175 SERA_HUMAN 56614 6,29 425 20(10) 144 Lamin-A\C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 235 29(9) 145 T-kompleks protein 1 podjedinica zeta CCT6A P40227 TCPZ_HUMAN 57988 6,23 377 29(11) 146 Lamin-A\C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 55 8(3) 147 Lamin-A\C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 254 18(11) Rezultati 55 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 148 Lamin-A\C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 367 27(11) 149 Lamin-A\C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 310 26(11) 151 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 80 12(4) 152 Eukariotski translacioni inicijacioni faktor 5A-1 EIF5A P63241 IF5A1_HUMAN 16821 5,08 33 2(1) 153 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 226 11(6) 154 Eukariotski translacioni inicijacioni faktor 5A-1 EIF5A P63241 IF5A1_HUMAN 16821 5,08 64 5(2) 155 14-3-3 protein gama YWHAG P61981 1433G_HUMAN 28285 4,80 131 11(5) 156 14-3-3 protein epsilon YWHAE P62259 1433E_HUMAN 29155 4,63 341 18(8) 157 Proteinska disulfidna-izomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 135 12(5) 158 Tioredoksinu sličan protein 1 TXNL1 O43396 TXNL1_HUMAN 32231 4,84 97 13(5) 159 Splajsing faktor, arginin-serin-bogat protein 1 SFRS1 Q07955 SFRS1_HUMAN 27728 10,37 438 22(12) 160 Heat shock protein beta-1 HSPB1 P04792 HSPB1_HUMAN 22768 5,98 174 14(3) 162 Heat shock protein beta-1 HSPB1 P04792 HSPB1_HUMAN 22768 5,98 136 11(3) 163 Ubikvitinom konjugovani enzim E2 UBE2N P61088 UBE2N_HUMAN 17127 6,13 117 8(3) 164 Histon H2B tip 1-C\E\F\G\I HIST1H2BC P62807 H2B1C_HUMAN 13898 10,31 115 11(2) 165 Histon H2B tip 1-C\E\F\G\I HIST1H2BC P62807 H2B1C_HUMAN 13898 10,31 235 6(5) 167 Tioredoksin-zavisna peroksid reduktaza, mitohondrijalna PRDX3 P30048 PRDX3_HUMAN 27675 7,67 213 5(4) 168 Protein-L-izoaspartat (D-aspartat) O- metiltransferaza PCMT1 P22061 PIMT_HUMAN 24635 6,70 213 8(6) 169 Triozefosfat izomeraza TPI1 P60174 TPIS_HUMAN 26653 6,45 395 18(8) 171 Aldoza reduktaza AKR1B1 P15121 ALDR_HUMAN 35830 6,51 141 7(5) 172 Stres-indukovani-fosfoprotein 1 STIP1 P31948 STIP1_HUMAN 62599 6,20 97 6(3) 174 Ezrin EZR P15311 EZRI_HUMAN 69370 5,94 74 9(1) 176 Ziksin ZYX Q15942 ZYX_HUMAN 61238 6,22 56 3(1) 177 Mitohondrijalni unutrašnji membranski protein IMMT Q16891 IMMT_HUMAN 83626 6,08 54 6(1) 178 T-kompleks protein 1 podjedinica beta CCT2 P78371 TCPB_HUMAN 57452 6,56 71 8(2) 179 Triptofanil-tRNA sintetaza, citoplazmatska WARS P23381 SYWC_HUMAN 53132 5,83 86 8(3) 180 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A\B HNRNPAB Q99729 ROAA_HUMAN 36202 8,22 100 6(3) 181 DnaJ homologna subfamilija B član 11 DNAJB11 Q9UBS4 DJB11_HUMAN 40489 5,81 108 10(4) 183 Tubulin beta lanac TUBB P07437 TBB5_HUMAN 49639 4,78 263 16(10) 184 Makrofag-vezujući protein CAPG P40121 CAPG_HUMAN 38494 5,88 201 6(3) 185 Tubulin beta lanac TUBB P07437 TBB5_HUMAN 49639 4,78 61 6(2) 188 Kopin-1 CPNE1 Q99829 CPNE1_HUMAN 59022 5,52 130 17(5) 189 Protein NDRG1 NDRG1 Q92597 NDRG1_HUMAN 42808 5,49 56 2(1) 190 Heat shock cognat 71 kDa protein HSPA8 P11142 HSP7C_HUMAN 70854 5,37 274 21(7) 191 Laminin podjedinica gama-1 LAMC1 P11047 LAMC1_HUMAN 177489 5,01 226 19(7) 192 Ubikvitin-1 UBQLN1 Q9UMX0 UBQL1_HUMAN 62479 5,02 42 2(1) 193 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 547 19(14) 194 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 489 16(10) 195 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 81 7(1) Rezultati 56 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 196 Heterogeni nuklearni ribonukleoproteini C1/C2 HNRNPC P07910 HNRPC_HUMAN 33650 4,95 161 13(3) 197 Aktin, aortni glatki mišić ACTA2 P62736 ACTA_HUMAN 41982 5,29 33 5(1) 198 Aktin, citoplazmatski 1 ACTB P60709 ACTB_HUMAN 41710 5,29 361 12(8) 199a 40S ribozomalni protein RPSA P08865 RSSA_HUMAN 32833 4,79 156 10(5) 199b Nukleofosmin NPM1 P06748 NPM_HUMAN 32555 4,64 118 8(2) 200 Retikulokalbin-1 RCN1 Q15293 RCN1_HUMAN 38866 4,86 61 3(1) 202 Retikulokalbin-1 RCN1 Q15293 RCN1_HUMAN 38866 4,86 93 6(2) 203 Histon vezujući protein RBBP4 RBBP4 Q09028 RBBP4_HUMAN 47626 4,74 97 7(2) 204 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 81 17(3) 205 UV excizioni reaparacioni protein RAD23 homolog B RAD23B P54727 RD23B_HUMAN 43145 4,76 121 3(3) 205 Endoplazmin HSP90B1 P14625 ENPL_HUMAN 92411 4,76 51 6(2) 206 Proteinska disulfidna-izomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 526 27(22) 207 Kalumenin CALU O43852 CALU_HUMAN 37084 4,47 95 10(4) 208 Aktin, aortni glatki mišić ACTA2 P62736 ACTA_HUMAN 41982 5,29 64 3(2) 209 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein K HNRNPK P61978 HNRPK_HUMAN 50944 5,39 175 9(7) 210 Proteinska disulfidna-izomeraza A3 PDIA3 P30101 PDIA3_HUMAN 56747 5,98 535 25(15) 211 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein H2 HNRNPH2 P55795 HNRN2_HUMAN 49232 5,89 58 5(2) 212 Glutation S-transferaza P GSTP1 P09211 GSTP1_HUMAN 23341 5,43 151 8(4) 212 Peroksiredoksin-2 PRDX2 P32119 PRDX2_HUMAN 21878 5,66 97 8(3) 214 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein H3 HNRNPH3 P31942 HNRH3_HUMAN 36903 5,89 249 14(7) 216 Heterogeni nuklearni ribonukleoproteini C1/C2 HNRNPC P07910 HNRPC_HUMAN 33650 4,95 148 17(7) 218 Triptofanil-tRNA sintetaza, citoplazmatska WARS P23381 SYWC_HUMAN 53132 5,83 53 2(1) 219 Tubulin beta-3 lanac TUBB3 Q13509 TBB3_HUMAN 50400 4,83 114 14(4) 220 Triozefosfat izomeraza TPI1 P60174 TPIS_HUMAN 26653 6,45 90 7(5) 221 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 105 7(3) 222 Aldozoreduktaza AKR1B1 P15121 ALDR_HUMAN 35830 6,51 43 6(1) 225 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 169 11(9) 226 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 141 9(5) 227 Fruktozo-bisfosfat aldolaza A ALDOA P04075 ALDOA_HUMAN 39395 8,30 48 4(2) 229 Serpin H1 SERPINH1 P50454 SERPH_HUMAN 46411 8,75 89 5(2) 230 Alfa-enolaza ENO1 P06733 ENOA_HUMAN 47139 7,01 165 12(6) 233 Piruvat kinazni isoenzimi M1/M2 PKM2 P14618 KPYM_HUMAN 57900 7,96 31 8(0) 234 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A2/B1 HNRNPA2B1 P22626 ROA2_HUMAN 37407 8,97 155 9(5) 235 Histon H2B tip 1-B HIST1H2BB P33778 H2B1B_HUMAN 13942 10,31 98 8(5) 236 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 210 9(7) 237 Fosfoglicerat kinaza 1 PGK1 P00558 PGK1_HUMAN 44586 8,30 55 9(2) 239 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 48 5(1) Rezultati 57 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 241 Alfa-enolaza ENO1 P06733 ENOA_HUMAN 47139 7,01 152 16(5) 242 Piruvat kinazni isoenzimi M1/M2 PKM2 P14618 KPYM_HUMAN 57900 7,96 191 11(5) 243 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 200 16(9) 244 Kofilin-1 CFL1 P23528 COF1_HUMAN 18491 8,22 107 10(2) 245 Voltažno-zavisni anjon-selectivni kanalski protein 1 VDAC1 P21796 VDAC1_HUMAN 30754 8,62 232 14(7) 246 Malat dehidrogenaza, mitohondrijalna MDH2 P40926 MDHM_HUMAN 35481 8,92 582 24(15) 247 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A1 HNRNPA1 P09651 ROA1_HUMAN 38723 9,17 612 26(18) 248 Piruvat kinazni isoenzimi M1/M2 PKM2 P14618 KPYM_HUMAN 57900 7,96 578 22(15) 249 ATP sintaza podjedinica alfa, mitohondrijalna ATP5A1 P25705 ATPA_HUMAN 59714 9,16 329 23(10) 250 ATP sintaza podjedinica alfa, mitohondrijalna ATP5A1 P25705 ATPA_HUMAN 59714 9,16 126 7(4) 251 Piruvat kinazni isoenzimi M1/M2 PKM2 P14618 KPYM_HUMAN 57900 7,96 253 14(8) 252 ATP sintaza podjedinica alfa, mitohondrijalna ATP5A1 P25705 ATPA_HUMAN 59714 9,16 103 7(4) 253 78 kDa glukozo-regulisani protein HSPA5 P11021 GRP78_HUMAN 72288 5,07 675 23(17) 254 Endoplasmin HSP90B1 P14625 ENPL_HUMAN 92411 4,76 110 8(3) 255 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 252 13(4) 256 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 165 11(5) 257 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 28 3(0) 258 Tropomiozin alfa-1 lanac TPM1 P09493 TPM1_HUMAN 32689 4,69 86 2(2) 259 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 64 9(2) 260 Protein S100-A10 S100A10 P60903 S10AA_HUMAN 11196 6,82 128 5(3) 261 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 258 8(7) 262 Heterogeni nuklearni ribonukleoproteini A2/B1 HNRNPA2B1 P22626 ROA2_HUMAN 37407 8,97 100 6(3) 263 Malat dehidrogenaza, mitohondrijalna MDH2 P40926 MDHM_HUMAN 35481 8,92 364 12(9) 264 Fruktozo-bisfosfat aldolaza A ALDOA P04075 ALDOA_HUMAN 39395 8,30 48 4(2) 265 Non-PU domen-sadržujući oktamer- vezujući protein NONO Q15233 NONO_HUMAN 54197 9,01 58 3(1) 266 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein M HNRNPM P52272 HNRPM_HUMAN 77464 8,84 175 13(6) 267 Piruvat kinazni isoenzimi M1/M2 PKM2 P14618 KPYM_HUMAN 57900 7,96 243 11(9) 268 ATP sintaza podjedinica alfa, mitohondrijalna ATP5A1 P25705 ATPA_HUMAN 59714 9,16 274 15(8) 269 ATP sintaza podjedinica alfa, mitohondrijalna ATP5A1 P25705 ATPA_HUMAN 59714 9,16 274 15(8) 270 Fosfoglicerat kinaza 1 PGK1 P00558 PGK1_HUMAN 44586 8,30 676 18(11) 271 Fosfoglicerat kinaza 1 PGK1 P00558 PGK1_HUMAN 44586 8,30 472 18(10) 272 Voltažno-zavisni anjon-selektivni kanalski protein 1 VDAC1 P21796 VDAC1_HUMAN 30754 8,62 232 14(7) 273 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 183 10(3) 274 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 80 10(4) Rezultati 58 No Naziv proteina Genetički naziv UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Mass CPI PMF- scor Pokrivenost PMF-sekvence 275 Aldoza reduktaza AKR1B1 P15121 ALDR_HUMAN 35830 6,51 43 6(1) 276 F-aktin-vezujući protein podjedinica alfa-1 CAPZA1 P52907 CAZA1_HUMAN 32902 5,45 77 4(1) 277 Alfa-enolaza ENO1 P06733 ENOA_HUMAN 47139 7,01 228 17(7) 278 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 83 11(3) 279 60 kDa heat shock protein, mitohondrijalni HSPD1 P10809 CH60_HUMAN 61016 5,70 131 15(4) 279 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein L HNRNPL P14866 HNRPL_HUMAN 64092 8,46 37 8(1) 280 60 kDa heat shock protein, mitohondrijalni HSPD1 P10809 CH60_HUMAN 61016 5,70 124 12(4) 281 Nukleolin NCL P19338 NUCL_HUMAN 76568 4,6 206 9(6) 281 Tranzicionalna endoplazmatski retikulum ATPaza VCP P55072 TERA_HUMAN 89266 5,14 51 5(2) 282 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein L HNRNPL P14866 HNRPL_HUMAN 64092 8,46 32 9(1) 283 Apoptoza-indukujući faktor 1, mitohondrijalni AIFM1 O95831 AIFM1_HUMAN 66859 9,04 64 4(2) 284 Heterogeni nuklearni ribonukleoproteini A2/B1 HNRNPA2B1 P22626 ROA2_HUMAN 37407 8,97 56 4(2) 285 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 187 12(6) 286 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 228 15(7) 287 26S proteaza regulatorna podjedinica 10B PSMC6 P62333 PRS10_HUMAN 44145 7,1 66 7(3) 288 Poly (rC)-vezujući protein 1 PCBP1 Q15365 PCBP1_HUMAN 37474 6,66 116 7(2) 289 Glutamat dehidrogenaza 1, mitohondrijalna GLUD1 P00367 DHE3_HUMAN 61359 7,66 29 8(0) 290 Prelamin-A/C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 88 9(3) 291 Prelamin-A/C LMNA P02545 LMNA_HUMAN 74095 6,57 135 9(4) 292 Heat shock cognat 71 kDa protein HSPA8 P11142 HSP7C_HUMAN 70854 5,37 115 7(3) 293 Heterogeni nuklearni ribonukleoproteini A2/B1 HNRNPA2B1 P22626 ROA2_HUMAN 37407 8,97 223 13(5) 294 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 299 20(11) 295 Voltažno-zavisni anjon-selektivni kanalski protein 1 VDAC1 P21796 VDAC1_HUMAN 30754 8,62 267 14(7) 296 Nukleozid difosfate kinaza B NME2 P22392 NDKB_HUMAN 17287 8,52 44 8(2) 297 Piruvat kinaza izoenzimi M1/M2 PKM2 P14618 KPYM_HUMAN 57900 7,96 228 19(9) 298 ATP sintaza podjedinica alfa, mitohondrijalna ATP5A1 P25705 ATPA_HUMAN 59714 9,16 366 18(12) 299 Fruktozo-bisfosfat aldolaza A ALDOA P04075 ALDOA_HUMAN 39395 8,30 271 15(9) 300 Serpin H1 SERPINH1 P50454 SERPH_HUMAN 46411 8,75 118 8(1) Rezultati 59 Slika 14. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija bez tretmana (gore) i HK2 ćelija tretiranih 72h 5 µg/mL AA1 toksinom u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 4-7 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim imenima. Rezultati 60 Slika 15. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija bez tretmana (gore) i HK2 ćelija tretiranih 72h 5 µg/mL AA1 toksinom u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 7-10 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim imenima. Rezultati 61 Slika 16. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija tretiranih 72h 2 µg/mL OTA toksinom (gore) i HK2 ćelija tretiranih 72h 5 µg/mL AA1 i 2 µg/mL OTA toksinima u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 4-7 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim imenima. Rezultati 62 Slika 17. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija tretiranih 72h 2 µg/mL OTA toksinom (gore) i HK2 ćelija tretiranih 72h 5 µg/mL AA1 i 2 µg/mL OTA toksinima u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 7-10 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim imenima. Rezultati 63 4.10 Imunološko potvrđivanje markera oksidativnog stresa u ćelijskim lizatima nakon akutnog izlaganja HK2 ćelija toksinima 2-DE analiza uzoraka utvrdila je postojanje parametara oksidativnog stresa kao odgovor ćelije na prisustvo toksina u medijumu. Potvrda dobijenih 2-DE rezultata izvršena je Western blot analizom. Ispitivano je postojanje povišenog oksidativnog stresa u tretiranim ćelijama kao odgovor na dejstvo toksina upotrebom odgovarajućih antitela protiv superoksid dizmutaze 2 (SOD2) i proteina DJ-1 (PARK7). Kao pozitivna kontrolna grupa, korišćeni su lizati HK2 će- lija tretiranih 72h rastvorom vodonik peroksida (H2O2) i uzgajanih pod istim eksperimentalnim uslovima kao ostale ispitivane grupe [99]. Značajno povišene vrednosti ovih markera zabeležene su nakon ekspozicije HK2 ćelija AA1 toksinom, kao i tokom kombinovanog tretmana. OTA je takođe indukovao oksidativni stres, ali ne značajno (Grafikon 7). Grafikon 7. Western blot analiza ekspresije proteina SOD2 i PARK7 kao markera oksidativnog stresa; podaci ističu postojanje razlike između ekspresije ovih proteina u lizatu HK2 bez tretmana u odnosu na lizate 72h toksinima tretiranih ćelija (AA1, OTA, AA1-OTA) i lizat HK2 tretiranih vodonik peroksidom. Rezultati 64 Da bi ispitali efekte toksina na mogućnost fibrozne transformacije tubulocita, i potvrdili rezultate dobijene 2-DE analizom, analizirali smo i postojanje fibrotičnih markera u lizatima tretiranih ćelija (fibronektin, vimentin, vinkulin). Lizat TK173 ćelija, humanih fibroblasta, ko- ristio je kao pozitivna kontrola (Grafikon 8). Fibronektin je bio značajno povišen u lizatima svih tretiranih ćelija, dok su značajno veće vrednosti vinkulina nađene kao posledica kombino- vanog tretmana. Vimentin je bio značajno pojačano eksprimiran u HK2 ćelijama tretiranim AA1 i u kombinovanom tretmanu. Grafikon 8. Western blot analiza ekspresije proteina fibronektina, vimentina i vinkulina kao markera fibroze; podaci ističu postojanje razlike između ekspresije ovih proteina u lizatu HK2 bez tretmana u odnosu na lizate 72h toksinima tretiranih ćelija (AA1, OTA, AA1-OTA) i lizat TK173 ćelija. Rezultati 65 4.11 Kvantitativna i kvalitativna analiza proteina koji učestvuju u hroničnom ćelijskom odgovoru na dejstvo toksina Hronična oštećenja HK2 ćelija nastala su nakon desetodnevne, jednomesečne i dvome- sečne inkubacije sa AA1, OTA, i kombinovanim tretmanom AA1 i OTA. Ćelije su kultivisane u medijumu bez seruma, da bi se izbegao uticaj interakcije toksina sa proteinima plazme na is- hod eksperimenta. Nakon inkubacionog perioda, ćelije su sakupljene (uz pomoć tripsina) i tri puta ispirane PBS rastvorom. Na osnovu vrednosti MTT eseja, u eksperimentu su korišćene sledeće koncentracije toksina: • I grupa: 0,5 ng/mL OTA • II grupa: 0,5 µg/mL AA1 • III grupa: 0,5 µg/mL AA1 i 0,5 ng/mL OTA Ćelijski ekstrakti su dalje korišćeni u svrhe proteomskih istraživanja. Da bi kreirali prote- omske mape tretiranih ćelija, koristili smo 2-DE analizu ekstrakta (pI 4-7 i pI 7-10, Slike 18- 21). Identifikacija specifičnih proteina obavljena je upotrebom masene spektrometrije i pretra- gom baze podataka (Tabela 6, Slike 22-25). Proteinski profili su bili značajno reproducibilni i nisu otkrivene značajne razlike nakon trostrukog ponavljanja mapiranja proteoma.   Slika 18. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 30 dana u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove molekularne težine. Rezultati 66 Slika 19. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 30 dana u medijumu bez seruma i sa 0,5 ng/mL OTA. Pro- teini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove molekularne težine. Slika 20. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 30 dana u medijumu bez seruma i sa 0,5 µg/mL AA1. Pro- teini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove molekularne težine.   Slika 21. 2D slike proteoma HK2 ćelija kultivisanih 30 dana u medijumu bez seruma i sa 0,5 µg/mL AA1 i 0,5 ng/mL OTA. Proteini su razdvojeni duž pI 4-7 (slika levo) i pI 7-10 (slika desno) gradijenta i 12% SDS PAGE na osnovu njihove molekularne težine. Rezultati 67 Tabela 6. Lista proteina HK2 ćelija identifikovana masenom spektrometrijom i pretragom baza podataka. Ulazni broj u Swiss-Prot i NCBI je dat za svaki protein. Informacije i peptidnom masenom fingerprintu (PMF), o nominalnoj masi i vrednosti izoelektričnih tačaka za svaki protein su takođe navedene. 10-20 i 47-75 proteini značajno su ekprimirani u HK2 ćelijama kultivisanim u medijumu bez seruma; 25-30 i 34-46 proteini su značajno eksprimirani u HK2 ćelijama tretiranim AA1-om; 1-9 i 21-24 proteini su značajno eksprimirani u HK2 ćelijama tretiranim OTA-om; 31-33 proteini su značajno eksprimirani u HK2 ćelijama tretiranim AA1 i OTA-om (poređenje i ispitivanje razlika u ekspresiji proteina između različitih eksperimantalnih grupa urađeni su u Delta 2D programu). Proteini su razdvajani u pI 4-7 i pI 7-10 rangu. No Ime proteina Gensko ime UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Masa CPI PMF-scor PMF- pokrivenost sekvence 1 Miozin laki polipeptid 6 MYL6 P60660 MYL6_HUMAN 16919 4,56 255 11(8) 2 Tropomiozin alfa-3 lanac TPM3 P06753 TPM3_HUMAN 32799 4,68 140 5(4) 3 Retikulokalbin-1 RCN1 Q15293 RCN1_HUMAN 38866 4,86 35 4(1) 4 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 190 12(8) 5 Rani endozomni antigen 1 EEA1 Q15075 EEA1_HUMAN 162367 5,55 130 16(5) 6 Ubikvitin karboksil-terminalna hidrolaza izozim L1 UCHL1 P09936 UCHL1_HUMAN 24808 5,33 129 13(5) 7 Ubikvitin karboksil- terminalna hidrolaza izozim L1 UCHL1 P09936 UCHL1_HUMAN 24808 5,33 381 15(12) 8 Heat shock protein beta-1 HSPB1 P04792 HSB1_HUMAN 22768 5,98 56 4(2) 9 Heat shock protein beta-1 HSPB1 P04792 HSB1_HUMAN 22768 5,98 645 19(16) 10 Fosfoglicerat kinaza 1 PGK1 P00558 PGK1_HUMAN 44586 8,30 598 16(12) 11 3-ketoacil-CoA tiolaza, mitohondrijalna ACAA2 P42765 THIM_HUMAN 41898 8,32 81 5(2) 12 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 107 5(3) 13 Heterogeni nuclearni ribonukleoprotein A2/B1 HNRNPA2B1 P22626 ROA2_HUMAN 37407 8,97 451 17(13) 14 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 302 16(10) 15 Kofilin-1 CFL1 P23528 COF1_HUMAN 18491 8,22 76 8(4) 16 Profilin-1 PFN1 P07737 PROF1_HUMAN 15045 8,44 204 13(9) 17 10 kDa heat chock protein, mitohondrijalna forma HSPE1 P61604 CH10_HUMAN 10925 8,89 327 18(13) 18 Peptidil-prolil cis-trans isomeraza A PPIA P62937 PPIA_HUMAN 18001 7,68 97 11(4) 19 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 117 4(3) 21 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 29 2(0) 22 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 85 11(4) 23 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 156 11(7) 24 Cistatin-B CSTB P04080 CYTB_HUMAN 11133 6,96 84 1(1) 25 Elongacioni faktor 1-alfa 1 EEF1A1 P68104 EF1A1_HUMAN 50109 9,1 384 11(10) 26 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A3 HNRNPA3 P51991 ROA3_HUMAN 39571 9,1 366 7(6) 27 Peroksiredoksin-1 PRDX1 Q06830 PRDX1_HUMAN 22096 8,27 164 12(6) 28 Peptidil-prolil cis-trans isomeraza A PPIA P62937 PPIA_HUMAN 18001 7,68 222 11(6) 29 Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GAPDH P04406 G3P_HUMAN 36030 8,57 161 5(5) 30 Fosfoglicerat kinaza 1 PGK1 P00558 PGK1_HUMAN 44586 8,30 655 18(14) 31 Kofilin-1 CFL1 P23528 COF1_HUMAN 18491 8,22 73 1(1) 32 Peptidil-prolil cis-trans isomeraza A PPIA P62937 PPIA_HUMAN 18001 7,68 106 5(2) 33 Fosfoglicerat kinaza 1 PGK1 P00558 PGK1_HUMAN 44586 8,30 150 16(5) 34 Kalmodulin CALM1 P62158 CALM_HUMAN 16827 4,09 185 9(8) 35 Galektin-1 LGALS1 P09382 LEG1_HUMAN 14706 5,34 61 5(2) Rezultati 68 No Ime proteina Gensko ime UniProtKB/ Swiss-Prot Swiss-Prot Nominalna Masa CPI PMF-scor PMF- pokrivenost sekvence 36 Superoksid dismutaza [Mn], mitohondrijalna SOD2 P04179 SODM_HUMAN 24707 8,35 121 6(3) 37 UMP-CMP kinaza CMPK1 P30085 KCY_HUMAN 22208 5,44 291 10(7) 38 Ubikvitin karboksil- terminalna hidrolaza izoemzim L1 UCHL1 P09936 UCHL1_HUMAN 24808 5,33 505 12(10) 39 Ubikvitin karboksil- terminalna hidrolaza izoemzim L1 UCHL1 P09936 UCHL1_HUMAN 24808 5,33 41 3(0) 40 Enoil-CoA hidrataza, mitohondrialna ECHS1 P30084 ECHM_HUMAN 31367 8,34 396 12(9) 41 Tropomiozin beta lanac TPM2 P07951 TPM2_HUMAN 32831 4,68 170 5(4) 42 Protein disulfid-isomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 365 21(13) 43 Tubulin beta lanac TUBB P07437 TBB5_HUMAN 49639 4,78 547 20(16) 44 Vimentin VIM P08670 VIME_HUMAN 53619 5,06 177 14(8) 45 Aldehid dehidrogenaza X, mitohondrialna ALDH1B1 P30837 AL1B1_HUMAN 57202 6,36 277 17(9) 46 Aldehid dehidrogenaza X, mitohondrialna ALDH1B1 P30837 AL1B1_HUMAN 57202 6,36 40 12(0) 47 Miozin laki polipeptid 6 MYL6 P60660 MYL6_HUMAN 16919 4,56 255 11(8) 48 39S ribozomalni protein L12 MRPL12 P52815 RM12_HUMAN 21335 5,01 62 4(2) 49 Peroksiredoksin-4 PRDX4 Q13162 PRDX4_HUMAN 30521 5,86 274 11(9) 50 Enoil-CoA hidrataza, mitohondrialna ECHS1 P30084 ECHM_HUMAN 31367 8,34 68 8(2) 51 Proteazomna subjedinica beta 3 PSMB3 P49720 PSB3_HUMAN 22933 6,14 93 7(3) 52 Endoplasmatski retikulum locirani protein 29 ERP29 P30040 ERP29_HUMAN 28975 6,77 272 10(7) 53 Proteazom subjedinica alfa tip-1 PSMA1 P25786 PSA1_HUMAN 29537 6,15 138 10(4) 54 DnaJ homologna subfamilija B član 11 DNAJB11 Q9UBS4 DJB11_HUMAN 40489 5,81 49 5(1) 55 Kalponin-3 CNN3 Q15417 CNN3_HUMAN 36391 5,69 172 5(5) 56 Guanin nukleotid-vezujući protein G (I)\G (S)\ G(T) subjedinica beta-2 GNB2 P62879 GBB2_HUMAN 37307 5,6 130 5(3) 57 14-3-3 protein sigma SFN P31947 1433S_HUMAN 27757 4,68 203 6(6) 58 Retikulokalbin-1 RCN1 Q15293 RCN1_HUMAN 38866 4,86 40 5(1) 59 Glukozidazna 2 subjedinica beta PRKCSH P14314 GLU2B_HUMAN 59388 4,33 141 8(5) 60 Protein disulfid-izomeraza P4HB P07237 PDIA1_HUMAN 57081 4,76 384 29(12) 61 Tubulin beta lanac-2C TUBB2C P68371 TBB2C_HUMAN 49799 4,79 43 6(1) 62 Hipoksijom regulisan protein 1 HYOU1 Q9Y4L1 HYOU1_HUMAN 111266 5,16 417 27(15) 63 Lamin-B1 LMNB1 P20700 LMNB1_HUMAN 66368 5,11 320 15(8) 64 Heterogeni nuklearni ribonukleoprotein K HNRNPK P61978 HNRPK_HUMAN 50944 5,39 455 16(13) 65 Polimeraza I i transcriptni oslobađajući factor PTRF Q6NZI2 PTRF_HUMAN 43450 5,51 34 2(1) 66 Tioredoksin domen- sadržujući protein 5 LGALS12 Q96DT0 LEG12_HUMAN 48029 5,63 364 11(9) 67 Heat Shock kognat 71 kDa protein HSPA8 P11142 HSP7C_HUMAN 70854 5,37 176 4(4) 68 Stres-70 protein, mitohondrialni HSPA9 P38646 GRP75_HUMAN 73635 5,87 520 18(12) 69 Protein disulfid-izomeraza A3 PDIA3 P30101 PDIA3_HUMAN 56747 5,98 667 25(17) 70 Gelsolin GSN P06396 GELS_HUMAN 85644 5,90 73 1(1) 71 Ezrin EZR P15311 EZRI_HUMAN 69370 5,94 198 11(7) 71 Moesin MSN P26038 MOES_HUMAN 67778 6,08 160 6(5) 72 T-compleks protein 1 subjedinica beta CCT2 P78371 TCPB_HUMAN 57452 6,01 253 11(8) 73 Alfa-enolaza ENO1 P06733 ENOA_HUMAN 47139 7,01 102 4(2) 75 T-compleks protein 1 subjedinica zeta CCT6A P40227 TCPZ_HUMAN 57988 6,23 109 18(5) Rezultati 69 Slika 22. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija bez tretmana (gore) i HK2 ćelija tretiranih 30 dana 0,5 µg/mL AA1 toksinom u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 4-7 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim ime- nima. Rezultati 70 Slika 23. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija bez tretmana (gore) i HK2 ćelija tretiranih 30 dana 0,5 µg/mL AA1 toksinom u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 7-10 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim ime- nima. Rezultati 71 Slika 24. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija tretiranih 30 dana 0,5 ng/mL OTA toksinom (gore) i HK2 ćelija tretiranih 30 dana 0,5 µg/mL AA1 i 0,5 ng/mL OTA toksinima u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 4-7 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim imenima. Rezultati 72 Slika 25. 2D slike identifikovanih proteina HK2 ćelija tretiranih 30 dana 0,5 ng/mL OTA toksinom (gore) i HK2 ćelija tretiranih 30 dana 0,5 µg/mL AA1 i 0,5 ng/mL OTA toksinima u medijumu bez seruma. Proteini su razdvojeni u pI 7-10 rangu i duž 12% SDS PAGE (na osnovu njihove molekularne težine). Identifikovani proteini su obeleženi na gelovima svojim genskim imenima. Rezultati 73 4.12 Imunološko potvrđivanje markera oksidativnog stresa u ćelijskim lizatima nakon hroničnog izlaganja HK2 ćelija toksinima 2-DE analiza uzoraka utvrdila je postojanje parametara oksidativnog stresa kao odgovor ćelije na prisustvo toksina u medijumu. Potvrda dobijenih 2-DE rezultata izvršena je Western blot analizom. Ispitivano je postojanje povišenog oksidativnog stresa u tretiranim ćelijama kao odgovor na dejstvo toksina upotrebom odgovarajućih antitela protiv superoksid dizmutaze 2 (SOD2) i proteina DJ-1 (PARK7). Kao pozitivna kontrolna grupa, korišćeni su lizati HK2 ćeli- ja tretiranih 72h rastvorom vodonik peroksida (H2O2) i uzgajanih pod istim eksperimentalnim uslovima kao ostale ispitivane grupe. Značajno povišene vrednosti ovih markera zabeležene su nakon ekspozicije HK2 ćelija AA1, OTA toksinom, kao u tokom kombinovanog tretmana (p<0,01; p<0,001) (Grafikon 9). Grafikon 9. Western blot analiza ekspresije proteina SOD2 i PARK7 kao markera oksidativnog stresa; podaci ističu postojanje razlike između ekspresije ovih proteina u lizatu HK2 bez tretmana u odnosu na lizate toksinima tretiranih ćelija (AA1, OTA, AA1-OTA) u toku 10, 30 i 60 dana, kao i lizat HK2 tretiranih 72h vodonik peroksi- dom (pozitivna kontrola). Rezultati 74 Da bi ispitali efekte toksina na mogućnost fibrozne transformacije tubulocita, i potvrdili rezultate dobijene 2-DE analizom, analizirali smo i postojanje fibrotičnih markera u lizatima tretiranih ćelija (fibronektin, vimentin, vinkulin) nakon 10, 30 i 60 dana. Lizat TK173 ćelija, humanih fibroblasta, koristio je kao pozitivna kontrola (Grafikon 10). Fibronektin je bio zna- čajno povišen u lizatima svih tretiranih ćelija, dok su značajno veće vrednosti vinkulina nađene kao posledica kombinovanog tretmana. Vimentin je bio značajno pojačano eksprimiran u HK2 ćelijama tretiranim AA1 i u kombinovanom tretmanu. Grafikon 10. Western blot analiza ekspresije proteina fibronektina, vimentina i vinkulina kao markera fibroze; podaci ističu postojanje razlike između ekspresije ovih proteina u lizatu HK2 bez tretmana u odnosu na lizate toksinima tretiranih ćelija (AA1, OTA, AA1-OTA) u toku 10, 30 i 60 dana, kao i lizat TK173 ćelija (pozitivna kontrola). Rezultati 75 4.13 Promene u morfologiji tretiranih ćelija U toku izlaganja ćelija unapred zadatim dozama toksina, praćene su i njihove morfološke promene u zavisnosti od dužine izlaganja (Slika 26-29). Slika 26. HK2 ćelije pre tretmana (slika levo) i njihova prezentacija u medijumu bez seruma (slika desno) Slika 27. Izgled HK2 ćelija nakon 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 i 63 dana hroničnog izlaganja 0,5 nm/mL OTA svakodnevno Rezultati 76 Slika 28. Izgled HK2 ćelija nakon 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 i 63 dana hroničnog izlaganja 0,5 µm/mL AA1 svakodnevno Slika 29. Izgled HK2 ćelija nakon 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 i 63 dana hroničnog izlaganja 0,5 µm/mL AA1 i 0,5 nm/mL OTA svakodnevno Rezultati 77 4.14 Proteini koji su značajni u ćelijskom odgovoru na dejstvo toksina – imunobojenja ćelija kao metoda ispitivanja postojanja markera intoksikacije i njihove lokalizacije u ćeliji 2-DE analiza ćelijskih lizata nakon akutne i hronične intoksikacije ukazala je na postojanje značajnih razlika u ekspresiji proteina različitih eksperimentalnih grupa. Specifična grupa pro- teina koji neposredno učestvuju u specifičnim regulatornim mehanizmima preko kojih se ispo- ljava i dejstvo ispitivanih toksina AA1 (elongacioni faktor 1-alfa 1, Eef1A1 (slika 30), splaj- sing faktor U2AF 35 kDa subjedinica, Ndfus1 (slika 31), Lamin-A/C) ili OTA (ubikvitin ko- njugujući enzim E2, Ube2N (slika 33), hipoksija pozitivno regulisan protein 1 ORP 150 (slika 32), eukariotski translacioni iniciacioni faktor 5A-1, Eif5A). Uz pomoć imunofluorescentnih bojenja korišćenjem odgovarajućih specifičnih antitela u detekciji ovih proteina, dokazali smo njihovo prisustvo, u skladu sa 2-DE nalazima. Takođe smo ispitivali ekspresiju proteina alfa glatkomišićnog aktina (ACTA2) (slika 34) i fibronektina (FN1) (slika 35) da bi ispitali uticaj ovih toksina na ćelijsku transformaciju. Slika 30. Imunobojenje HK2 ćelija, tretiranih AA1, OTA i kombinovanim AA1-OTA u toku 30 dana. Antitelo protiv elongacionog faktora 1-alfa 1 (Eef1A1) je korišćeno. Rezultati 78 Slika 31. Imunobojenje HK2 ćelija, tretiranih AA1, OTA i kombinovanim AA1-OTA u toku 30 dana. Antitelo protiv splajsing faktora U2AF 35 kDa subjedinica (Ndfus1) je korišćeno. Slika 32. Imunobojenje HK2 ćelija, tretiranih AA1, OTA i kombinovanim AA1-OTA u toku 30 dana. Antitelo protiv hipoksija pozitivno regulisanog proteina 1 (ORP 150) je korišćeno. Rezultati 79 Slika 33. Imunobojenje HK2 ćelija, tretiranih AA1, OTA i kombinovanim AA1-OTA u toku 30 dana. Antitelo protiv ubikvitin konjugujućeg enzima E2 (Ube2N) je korišćeno. Slika 34. Imunobojenje HK2 ćelija, tretiranih AA1, OTA i kombinovanim AA1-OTA u toku 30 dana. Antitelo protiv alfa glatkomišićnog aktina (ACTA2) je korišćeno. Rezultati 80 Slika 35. Imunobojenje HK2 ćelija, tretiranih AA1, OTA i kombinovanim AA1-OTA u toku 30 dana. Antitelo protiv fibronektina (FN1) je korišćeno. 4.15 Imunohistološka bojenja preparata tumora gornjeg urotelijuma pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovane endemske nefropatije Sa ciljem da se ispita povezanost poznatih etioloških faktora u razvoju endemske nefropa- tije i posledica ove bolesti (maligna transformacija epitela i razvoj tumora urotela), kao što su toksična oštećenja tubulocita nastala izlaganjem ćelija aristolohijske kiseline i ohratoksina A, 60 tkivnih uzoraka koji su sadržali delove tumorskog tkiva gornjeg urotelijuma pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovane endemske nefropatije, ispitivana su imunohistološkim boje- njima upotrebom antitela protiv specifičnih proteina. Ispitivano je prisustvo specifičnih proteina (Eef1A1 (slika 37), Ndfus1 (slika 36), Lamin- A/C (Slika 38), Ube2N (slika 36), ORP 150 (slika 37), Eif5A (Slika 38)),.kao i njihova loka- lizacija unutar tumorskog tkiva i tumorskih ćelija. Sva tumorska tkiva, bez obzira na pripadnost ispitivanoj grupi, pokazala su pozitivnu re- akciju na primenjena antitela, što je ukazalo na prisustvo ovih proteina u ispitivanim izorcima. Ndufs1, Eef1A1 i Lamin-A/C su pronađeni u većem obimu i difuzno raspoređeni u tkivu tumora pacijenata sa endemskom nefropatijom u odnosu na tkivo tumora pacijenata bez predhodno dijagnostifikovanog EN-a. Rezultati 81 Lamin-A/C je predominantno prisutan u ćelijama tumorskog tkiva u odnosu na okolno tkivo obe ispitivane grupe. Ube2N je pokazao manju količinu vezanu za pojavu tumora pacijenata sa EN-om u odnosu na drugu eksperimentalnu grupu. ORP 150 i Eif5A prisutni u većoj količini u tumorima EN pacijenata. Slika 36. Imunofluorescentno bojenje tkiva urotelijalnog karcinoma pacijenata sa predhodno dijagnostifikovanom EN i pacijenata bez predhodno dijagnostifikovane EN (UUTT). Korišćena su antitela protiv Ndfus1 i Ube2N proteina   Slika 37. Imunofluorescentno bojenje tkiva urotelijalnog karcinoma pacijenata sa predhodno dijagnostifikovanom EN i pacijenata bez predhodno dijagnostifikovane EN (UUTT). Korišćena su antitela protiv ORP 150 i eEF1A1 proteina Slika 38. Imunofluorescentno bojenje tkiva urotelijalnog karcinoma pacijenata sa predhodno dijagnostifikovanom EN i pacijenata bez predhodno dijagnostifikovane EN (UUTT). Korišćena su antitela protiv eiF5A i Lamin A/C proteina 82  5. DISKUSIJA 5.1 Proteini u urinu pacijenata sa endemskom nefropatijom i zdrave populacije koja živi na područjima endemske nefropatije Kao hronična tubulointesticijalna nefropatija često dijagnostifikovana u kasnom stadijumu hronične bubrežne insuficijencije i sa razvojem komplikacija (urotelijalni karcinomi, termi- nalna bubrežna insuficijencija, dijaliza, izražena smrtnost pacijenata u okviru jedne godine od trenutka dijagnostifikovanja bolesti), endemska nefropatija (EN) predstavlja kritično polje istraživanja u poslednjih pedeset godina [42, 46, 110-113]. Posmatrano iz ugla epidemioloških istraživanja, pacijenti su pretežno naseljavali ograniče- ne regione Balkanskog poluostrva (naseobine duž reke Dunav u Bosni i Hercegovini, Bugar- skoj, Hrvatskoj, Rumuniji i Srbiji), što je ukazivalo na familijarni karakter oboljenja (registro- vani su slučajevi obolelih kod većeg broja članova istog domaćinstva, duž jedne ili više genera- cija) [46]. Prevalenca EN oboljenja u endemskim regionima iznosi od 0.5% do 4.4%, a sama di- jagnoza oboljenja postavlja se dosta kasno, često kod pacijenata starijih od 60 godina [114, 115]. Etiološki činioci koji učestvuju u nastanku i razvoju oboljenja još uvek nisu jasno definisani i često predstavljaju uzrok brojnih diskusija [53, 116-120]. Genetska predispozicija oboljenja dokazana je od strane nekih autora i opisana je postojanjem specifičnih genetskih markera na hromozomu 3, 3q25 koji ukazuju na mogućnost razvitka oboljenja kod nosioca [121]. Međutim, ovi podaci još uvek nisu potvrđeni na velikom populacionom uzorku. Rezulta- ti drugih istraživanja govore u prilog postojanju dve genetički različite populacije koje mogu u toku života da obole od EN-a, što indirektno ukazuje na značaj faktora okoline u nastajanju i progresiji oboljenja. Samim tim, ističe se veći značaj uticaja spoljnih faktora u razvoju obolje- nja od genetske predispozicije [114]. EN karakteriše prisustvo disfunkcije tubula, predominantno zahvatajući proksimalne tu- bule [42, 122]. Glikozurija i aminoacidurija, tubularni tip proteinurije su čest nalaz kod ovih pacijenata. Povišene vrednosti izlučenog beta-2-mikroglobulina (B2M) putem urina čest su na- laz kod pacijenata sa endemskom nefropatijom, njihovih klinički zdravih rođaka, odrasle dece EN pacijenata, ili osoba koje su u bliskom srodstvu sa EN obolelim [122, 123]. Konačna di- jagnoza EN-a zasnovana je na epidemiološkim podacima, prisustvom smanjenja glomerularne filtracije, proteinurije, mikroalbuminurije, prisustva markera tubularnog oštećenja (povišene Diskusija 83 vrednosti B2M i alfa-1-mikroglobulina (AMBP) u urinu), kao i na isključivanju mogućnosti postojanja nekog drugog poznatog bubrežnog oboljenja [66]. Ovakvi kriterijumi ne omogućavaju laku ranu i preciznu dijagnostiku EN-a, pa kasno postavljena dijagnoza bolesti onemogućava adekvatno dejstvo i efikasnost primenjene terapije. Proteom plazme sadrži nekoliko hiljada proteina [124], dok je i urinarni proteom zdrave osobe takođe kompleksan (delom reflektuje proteom plazme). DUP baza podataka, (http://www.sysdiag.cnrs.fr//index.php?page=dup), sadrži preko dve hiljade jedinstvenih uri- narnih proteina koji su identifikovani prilikom proteomskih analiza normalnog urina, među ko- jima se ne nalaze proteini opisani od strane drugih istraživača [125]. U istraživanju smo kori- stili proteomsku tehnologiju sa imunološkim konfirmacionim metodama da bi ispitali pouzda- nost urina kao dobrog supstrata za dokazivanje i identifikaciju markera koji bi diskriminisali EN od ostalih bubrežnih oboljenja i time olakšali njegovu ranu dijagnostiku sa značajnom si- gurnošću i pouzdanošću. Analiza proteinskog sastava urina se pokazala kao metoda izbora u istraživanju markera mnogih kako bubrežnih, tako i oboljenja drugih sistema i organa. Uz pomoć masene spektrometrije i pretrage verifikovaih baza podataka identifikovali smo ukupno 213 proteina u zbirnim uzorcima koji odgovaraju 61 jedinstvenom proteinu. Većina identifikovanih proteina vodi poreklo iz seruma i učestvuju u značajnim fiziološkim funkcija- ma u organizmu, kao što je transportna uloga hranljivih materija, hormona i krajnjih produkata metabolizma proteina i ugljenih hidrata, hemostatska uloga, regulacija acidobazne ravnoteže i metabolizma elektrolita. Deo proteina je ćelijskog porekla, sa značajnom ulogom u metabo- lizmu nukleinskih kiselina, procesima regulacije transkipcije naslednog materijala i translacije, postranslacionim modifikacijama proteina na nivou endoplazmatskog retikukuma, regulaciji oksido-reduktivne aktivnosti enzima na nivou mitohondrija, transportu materija iz ekstracelu- larnog prostora u ćeliju, i drugih funkcija. U poređenju kvalitativnih karakteristika proteomske mape urina pacijenata sa EN-om i proteomskih mapa urina drugih oboljenja (kao što je dijabe- tesna nefropatija, prerenalna bubrežna insuficijencija) na osnovu podataka iz literature, potvrdi- li smo podudarnost za 25-31 od 61 identifikovanog proteina [126-128]. 5.2 Urinarni proteinski markeri ranog oštećenja bubrežnog tkiva pacijenata sa endemskom nefropatijom U ovoj studiji, za razliku od predhodno opisanih u literaturi, rezultati otkrivaju listu prote- ina koji do sada nisu prijavljeni ni kao komponente urina zdravih osoba, ali ni kao potencijalni markeri specifičnih i do sada ispitivanih oboljenja. To se posebno odnosilo na manoza vezujući lektin (LMAN2), protektor telomera protein 1 (POT1) i superoksid dizmutaza [Cu-Zn] (SOD1) Diskusija 84 koji su tokom dalje analize naših podataka pokazali veliki značaj u diferencijaciji EN-a od ostalih oboljenja. Za razliku od zdravih ispitanika iz ne-endemskih regiona, ispitanici koji su živeli u EN regionima a nisu bili oboleli od ove bolesti takođe su izlučivali specifične proteine putem urina. Kao što je bilo dokazano predhodnim istraživanjima, rezultati su potvrdili značajno veće vrednosti AMBP i B2M u urinu pacijenata sa EN-om u poređenju sa kontrolom (HEN i HGER) i pacijenata sa AKI. U predhodnoj studiji [129] rutinskim laboratorijskim analizama urina istraživan je značaj B2M, AMBP, albumina i ukupnih proteina u urinu u dijagnozi EN-a, i dokazana je jasna diskriminaciju EN-a u odnosu na glomerulonefritise (GN), nefrosklerozu (NS) i zdrave ispitanike sa visokom specifičnošću i senzitivnošću. Kod pacijenata sa EN-om, AUC krive za urinarni B2M (0,828) i AMBP (0,782) bile su većih vrednosti u odnosu na urinarni albumin (0,740), dok je kod pacijenata sa GN-om AUC krive za urinarne proteine (0,854) i albumin (0,872) bile značajno veće u poređenju sa ova dva proteina male molekularne mase. AUC krive za sva četiri ispitivana parametra u pacijentima sa NS-om značajno su manje nego kod EN pacijenata, rangirajući se u opsegu od 0,500 do 0,595. Upoređujući EN sa zdra- vom kontrolom, B2M je bio veće senzitivnosti i specifičnosti sa istim graničnim vrednostima (p<0,001) u odnosu na AMBP (p<0,05). U poređenju EN sa GN, B2M se pokazao kao bolji marker. Iako su B2M, AMBP i albumin često korišćeni kao markeri EN-a, teško da se mogu iskoristiti u diferencijaciji EN od HEN ispitanika, jer se ovi markeri gotovo podjednako nalaze u urinu ispitanika obe grupe. Čak se jasno detektuju i u urinu pacijenata obolelih i od drugih bubrežnih oboljenja (na primer DN, reakcija na prisustvo alografta bubrega i druga) [130-133] i ne mogu se smatrati EN specifičnim. U našoj studiji, validacija B2M i AMBP kao EN markera je potvrđena, uz pronalazak četiri nova proteina u urinu kao potencijalnih markera EN-a. Posebno je SOD1 značajan u di- skriminaciji EN pacijenata sa viskom specifičnošću i senzitivnošću metode i može se smatrati čak i boljim markerom u odnosu na same B2M i AMBP. B2M i AMBP se ne mogu izolovano posmatrati kao specifični markeri EN-a s obzirom da su pronađeni u urinu pacijenata i drugih oboljenja (kao na primer kod pacijenata sa dijabetesnom nefropatijom) [126, 134]. B2M je protein molekularne mase 13,7 kDa. Čini komponentu (beta lanac) glavnog histo- kompatibilnog kompleksa (MCH) klase I i učestvuje u prezentaciji peptidnih antigena ćelijama imunog sistema. U osnovi je heterodimer koji se sastoji iz jednog alfa i jednog beta peptidnog lanca. B2M polimeri se mogu naći difuzno u tkivu pacijenata koji su na hroničnom hemodija- liznom tretmanu. Glikacija, kao česta ne-enzimska reakcija u toku hroničnih metaboličkih bolesti, najčešći oblik je patološke modifikacije B2M-a i može se koristiti u dijagnostičke svrhe [135]. Diskusija 85 AMBP je protein molekularne mase 39 kDa. Kao inter-alfa-tripsin-inhibitor učestvuje u inhibiciji tripsina, plazmina i lizozomalne granulocitne elastaze. Inhibira kristalizaciju kalcijum oksalata. Sastoji se od jednog ili dva teška lanca (H1, H2 ili H3) i jednog lakog lanca, bikunina. AMBP se pojavljuje kao monomer, ali i u sklopu kompleksa sa IgA antitelom ili gradi komple- kse sa albuminom. AMBP interaguje sa fibronektinom (FN1). Tripsatin je poseban oblik ovog proteina koji se takođe javlja u obliku kompleksa sa triptazom u mastocitima. AMBP i bikunin (preko SH3 domena) interaguju sa brojnim proteinima i učestvuju u njihovom transportu. Na- staje u jetri i sekretuje se u krv. U fiziološkom smislu, normalni je sastojak plazme, a u malim količinama nalazi se u urinu i cerebrospinalnoj tečnosti. Njegova intermedijerna forma, inter- alfa-tripsin inhibitor prisutan je u plazmi i u većoj količini u urinu. Oksidisan metabolit tripto- fana, 3-hidroksi-kinurenin, autokatalizacijom u prisustvu AMBP-a formira heterogene polici- stične hromofore uključujući hidroksiksantohromatin. Ova reakcija, kada humani proteini for- miraju hromofore posebno je izražena u prisustvu bakterijskih i insektnih ćelija. Hromoforama se delom pripisuje inhibitorna uloga broja intracelelularnih enzima, što je dokazano samo eksperimentalnim itraživanjima in vitro [136]. Beta-2-glycoprotein 1 (APOH) je protein molekularne mase 38,3 kDa, koji na osnovu svoje strukture pripada regulatorima familije proteina koji aktiviraju komplement. U ranijim istraživanjima istaknuta je njegova uloga kao markera akutnog oštećenja tubula [137]. U broj- nim radovima ističe se njegova antigenska uloga u nastajanju antifosfolipidnih antitela koja imaju značajnu ulogu kao reaktanti akutne faze. Vezuje se za brojne negativno naelektrisane substance u organizmu kao što je heparin, fosfolipidi i dektran sulfati. Može učestvovati u sprečavanju razvoja unutrašnjeg puta aktivacije koagulacije, vezujuči se za fosfolipide na povr- šini oštećenih ćelija. APOH nastaje u hepatocitima, gde su geni za ovaj protein značajno eksprimirani. Iz hepatocita, APOH se direkno sekretuje u krv [138]. Protektor telomera protein 1 (POT1) je DNK vezujući protein molekularne mase 71,4 kDa, koji je sastavni deo telomera i ima značajnu ulogu u održanju stabilnosti hromozoma, pre- venciji nekontrolosane ćelijske deobe i razvoja maligniteta. Kao komponenta telometaznog ri- bonukleoproteinskog (RNP) kompleksa esencijalan je u procesima replikacije terminalnih de- lova hromozoma. POT1 je i komponenta dvostrukog lanca DNK-vezujućeg TRF1 kompleska koji učestvuje u regulaciji dužine telomera preko cis-inhibicije telomerazne aktivnosti. Kao protein koji može i samostalno da se veže za telomerni lanac dvolančane DNK, smatra se i ne- gativnim regulatorom TRF1 kompleksa, gde učestvuje u kontroli dužine DNK lanca na termi- nalnom kraju telomera. Čini i komponentu šelterin kompleksa (telozoma) koji je takođe uklju- čen u kontrolu dužine telomera. Šelterin učestvuje u stvaranju dvostrukih repetitivnih lanaca Diskusija 86 koji se sastoje iz TTAGGG. Ovi repetitivni lanci postavljaju se na hromozomalne krajeve pomoću enzima telomeraze. Njihova protektivna uloga je veoma važna u prevenciji nastanka DNK oštećenja pod dejstvom brojnih genotoksičnih supstrata. POT1 se javlja u obliku homo- monomera ili homo-oligomera [139]. Superoksid dizmutaza [Cu-Zn] (SOD1) je homodimer molekularne mase 16 kDa, koji sa- drži bakar i cink u svojoj strukturi, i uvek je intracelularno lokalizovan. Pripada familiji Cu-Zn superoksid dizmutaza. Njegovo prisustvo u urinu ukazuje na postojanje akutnog oštećenja će- lija bubrega [140]. Neutrališe slobodne radikale nastale u toku normalnih metaboličkih procesa u ćeliji, i sprečava njihovo toksično dejstvo [141]. Vezikularni integralni membranski protein VIP36 (LMAN2, molekularna masa 40 kDa) je značajna komponenta svih epitelijalnih ćelija. Pripada grupi intracelularnih lektina i učestvuje u ranoj fazi ćelijske sekrecije. Učestvuje u transportu makromolekula, posebno glikoproteina koji sadrže manozu, preko ćelijske membrane u intracelularni prostor [142]. Eksprimiran je u svim ćelijama. Značajno veće koncentracije LMAN2-a pronadjene su u ćelijama skeletnih mi- šića i bubrega u odnosu na druga tkiva i organe [143], ali se povišene vrednosti javljaju u urinu pacijenata obolelih od IgA nefropatije, dijabetesne nefropatije, ishemijske tubularne nekroze i transpalntacije bubrega [144]. Usled kompleksnosti patogenetskih mehanizama EN-a, značaj grupe ispitivanih markera u ranoj dijagnostici i prevenciji veći je u odnosu na značaj svakog markera posebno. 2D-DIGE analiza u kombinaciji sa imunološkom konfirmacijom dobijenih rezultata, ukazuje na značaj upotrebe svih šest proteina kao markera u dijagnostici EN-a. U toku studije, jasno smo diskri- minisali pacijente sa EN-om od pacijenata sa AKI-om i DN-om. Rezultati su pokazali značajne razlike u ekskreciji proteina zdravih ispitanika iz endemskih i ne-endemskih područja. Pojava grupe ispitivanih proteina u urinu zdravih ispitanika koji žive u EN regionima, ukazuje na nji- hov potencijalni značaj i u ranoj dijagnostici oboljenja, kada još uvek nisu ispoljeni klinički znaci i simptomi razvoja oboljenja. 5.3 Urinarni proteinski markeri glomerularnog oštećenja u toku razvoja dijabetesne nefropatije – nalaz markera u urinu EN pacijenata kao znak progresije oboljenja Poslednjih pet godina dijabetesna nefropatija predstavlja žižu proteomskih istraživanja [145]. Ispitivanje proteomike urina pacijenata sa dijabetesnom nefropatijom česta je tema istra- živanja sa ciljem da se pronađu markeri nastanka i razvoja ovog oboljenja [146]. Diskusija 87 S obzirom da se prve promene bubrežnog oštećenja javljaju na strukturama glomerula, očekivano je detektovati proteine plazme u urinu koji su nastali kao posledica poremećaja glo- merularne filtracije i posledične povećane glomerularne propustljivosti, ćelijske proteine kao posledice oštećenja integriteta ćelijskih membrana i izlaska ovih proteina u spoljašnju sredinu (proteini podocita, endotela kapilara), proteine koji se javljaju u odgovoru organizma na za- paljensku reakciju (proteini akutne faze, citokini, limfokini) kao i u procesima sanacije oštećenja tkiva i ćelija (fibrotični markeri). Proteini mogu biti i poreklom iz urinarnih egzozo- ma [147], ali njihovo prisustvo u urinu nije značajno u patogenezi dijabetesne nefropatije. Ta- kođe se mogu naći i proteini poreklom iz deskvamiranih epitelijalnih ćelija iz gornjih i donjih partija urinarnog trakta. Značajno je postojanje specifičnih hemijskih promena u strukturi pro- teina tokom razvoja DN-e. To se naročito odnosi na prisustvo glikozilisanih proteina i peptida u urinu kao posledica neenzimske reakcije u kontaktu sa povišenim koncentracijama glukoze u krvi i urinu bolesnika sa DM [146, 148]. Brojni istraživači, proučavanjem patogenetskih mehanizama nastanka nekog oboljenja, kao i načina delovanja različitih etioloških faktora, pokušavaju da definišu potencijalne marke- re oboljenja [148]. Najveći broj potencijalnih markera oboljenja predstavljaju komponente ekstracelularnog prostora ili faktori rasta koji promovišu razvoj ekstracelularnog matriksa. Ko- lagen tipa IV i fibronektin, identifikovani su kao komponente ekstracelularnog matriksa koje se eliminišu urinom i mogu predstavljati potencijalne markere oštećenja bubrežnog tkiva, po- sebno u ranom stadijumu razvoja dijabetesne nefropatije [149, 150]. U slučajevima ekskre- tovanog tumorskog faktora rasta beta, TGF-β opisane su signifikantno povišene vrednosti kod pacijenata sa dijabetes melitusom tip 2 i postojanjem mikroalbuminurije ili makroalbuminurije [151]. Takođe su faktori rasta, urinarni faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF) i urinarni vezikular- ni endotelijalni faktor rasta 1 (VEGF) predloženi kao prediktori razvoja bubrežnog oštećenja usled postojanja šećerne bolesti [152, 153]. Povišene vrednosti albumina u urinu za sada su pouzdan parametar za praćenje postojanja glomerularnog oštećenja i razvoja oboljenja, ali je istaknuta potreba za markerom koji će uka- zati i na ranije promene, dok su glomeruli još uvek očuvane funkcije i strukture. Dosadašnja istraživanja ukazala su na postojanje određenih diferencijalno ekskretovanih proteina kod paci- jenata u različitim stadijumima bolesti. Analiza urina pacijenata sa dijabetes melitusom tip 2 i mikroalbuminurijom uz pomoć 2-DE pokazala je značajno povećanu eliminaciju putem urina cink α-2-glikoproteina, α-1-kiselog glikoproteina, AMBP, IgG antitela, pored samih albumina [154]. Autori su ih predložili kao potencijalne markere praćenja progresije bolesti. Diskusija 88 2D-DIGE analiza urina pacijenata sa uznapredovanom formom DN-e (nalaz makroalbumi- nurije) u poređenju sa analizom urinom zdrave populacije pokazala je značajne kvalitativne i kvantitativne razlike u proteinskim mapama [155]. Opisane su značajno povišene vrednosti α- 1-antitripsina u urinu pacijenata sa uznapredovanom DN-om [156]. Analizirani su i uzorci urina pacijenata sa DN-om i mikroalbuminurijom i pacijentata sa DM-om bez albuminurije, s tim što su svi uzorci urina predhodno oslobođeni prisustva visoko abutantnih proteina (albumin, imunoglobulini, haptoglobin, transferin i drugi) procesom deple- cije. Pojedine vrste proteina se nalaze u velikim količinama u urinu, sa značajnim povećanjem u toku specifičnog patološkog procesa. Nazivamo visoko abutantnim proteinima. Većina pred- stavlja markere glomerularnog oštećenja. Proteini su različitih molekularnih masa, a njihova prezentacija na proteinskim mapama u 2-DE analizi prikazana je pre određenim jasno ograni- čenim poljima nego samim tačkama. Proteinska polja u većini slučajeva prekrivaju i proteinske tačke onih molekula čija je koncentracija značajno manja u odnosu na abutantne proteine, te je njihova identifikacija otežana (skriveni proteom) [157]. Takav rezultat u stvari ne omogućava potpuni uvid u proteinski sadržaj nekog uzorka, te je neophodno ukloniti ove proteine depleci- onim metodama. U predhodnim studijama, pronađene su povišene vrednosti nisko abutantnih proteina u urinu pacijenata sa DN-om i makroalbuminurijom u poređenju sa urinom pacijenata sa DM-om ali bez albuminurije, kao što su α-1-glikoprotein, cink-α-2-glikoprotein, vitamin D vezujući protein, α-2-HS-glikoprotein, S100-kalcijum vezujući protein A9, α-1-anitripsin i he- mopeksin [128]. Neophodna je dalja analiza uloge i značaja ovih proteina u nastanku glome- rulskih oštećenja. Većina pronađenih proteina tokom ove i drugih studija, upotrebnom proteomske tehnolo- gije u analizi uzoraka urina pripada proteinima akutne faze čije su vrednosti inače povišene u opštem inflamatornom odgovoru. Usled toga, njihov nalaz se može smatrati manje specifičnim za postojanje ranog bubrežnog oštećenja u šećernoj bolesti. Danas se određeni proteini u urinu dijabetičnih pacijenata dogovorno smatraju markerima glomerularnog oštećenja. To su albumin [158, 159], α-1-antitripsin [128, 160], haptoglobin [126], hemopeksin [126], retinol vezujući protein [126], vitamin D vezujući protein [126], transtiretin [126] i komplement faktor B [128]. Albumin (ALB) je protein molekularne mase 69,4 kDa. Serumski albumin je glavni pro- tein plazme, i ima dobar afinitet za vezivanje molekula vode, kalcijuma, kalijuma, masnih kise- lina, hormona, bilirubina i nekih lekova. Njegova glavna uloga je regulacija koloidno-osmot- skog pritiska intravaskularnog prostora. Učestvuje i u transportu cinka, gde je preko 80% cika u plazmi vezano za ALB. Varijanse u strukturi albumina mogu rezultovati povećanim afinite- Diskusija 89 tom za vezivanje cinka i pojavom simptomatskog deficita cinka u krvi. Albumin vezuje mole- kul glukoze, a kod dijabetičnih pacijenata pojačana je glikacija (neenzimsko vezivanje gluko- ze) ovog proteina [161]. Alfa-1-antitripsin (SERPINA1) je protein molekularne mase 46,8 kDa. Predstavlja inhibitor serin proteaza. Njegov primarni supstrat je elastaza, ali postoji i povećan afinitet za proteine plazme kao što su plazmin i trombin. Ireverzibilno inhibira tripsin, himotripsin i plazminogen aktivator. Njegova glavna fiziološka uloga je zaštita donjih partija respiratornog trakta od proteolitičke destrukcije pod dejstvom enzima humane leukocitne elastaze (HLE). Po- stoji nekoliko funkcionalnih izomera ovog proteina, koji nastaju kao posledica različite kombi- nacije glikana koji se vezuju na N-terminalnim krajevima proteina. Deo molekula, kratka pe- ptidna forma AAT (SPAAT) je ireverzibilni inhibitor himotripsina i elastaze, ali ne i tripsina. Aberantna forma inhibira insulinom posredovanu sintezu NO u trombocitima, smanjuje vreme koagulacije i proteolitički deluje na insulin i plazmin u trombocitima [162]. Haptoglopin (HP) je protein molekularne mase 45,2 kDa. Vezuje se za tri molekula slo- bodnog hemoglobina u plazmi sprečavajući direkno oštećenje bubrega taloženjem ovog prote- ina. Vezivanjem slobodnog gvožđa prevenira njegov gubitak iz organizma putem bubrežne filtracije. Eksprimiran je u jetri a sekretuje se iz hepatocita u krv [163]. Hemopeksin (HPX) je protein molekularne mase 51,7 kDa. Vezuje hem i transportuje ga do jetre gde se vrši dalji katabolizam hema i oslobađanje gvožđa. Nakon oslobađanja hema, slobodan hemopeksin se vraća u cirkulaciju. Pojačano je eksprimiran u jetri, a izlučuje se u krv. N i O glikozilacijom se metaboliše do krajnjih produkata i eliminiše iz organizma preko glo- merularne filtracije [164]. Retinol vezujući protein (RBP4) je sekretorni protein molekularne mase 23 kDa. Prenosi retinol od jetre i depozita u jetri do perifernih tkiva i organa. U plazmi, kompleks RBP4-retinol interaguje sa transtiretinom i sprečava njegovu eliminacuju glomerularnom filtracijom iz orga- nizma [165]. Vitamin D vezujući protein (GC) je sekretorni protein molekularne mase 53 kDa. Ovaj vi- tamin je multifaktorijalan i čini važan element plazme, ascitne tečnosti, cerebrospinalne tečno- sti i urina, a prisutan je i vezan za komponente ćelijskih membrana brojnih ćelijskih vrsta. U plazmi učestvuje u transportu sterola vitamina D i sprečava polimerizaciju aktina vezujući se za njegove monomere. GC se vezuje i za imunoglobuline membrane B limfocita i za IgG Fc re- ceptor na membrani T limfocita. Postoji preko 80 varijanti humanog GC proteina [166]. Transtiretin (TTR) je tiroid-hormon-vezujući protein molekularne mase 15,9 kDa. Uče- stvuje u transportu tiroksina preko krvotoka do moždanog tkiva. Prisutan je i u serumu i u Diskusija 90 cerebrospinalnoj tečnosti. Povišeno je eksprimiran u epitelijalnim ćelijama horiodnog pleksusa, pigmentnim ćelijama retine i u jetri. Protein ima u svojoj strukturi dva vezujuća mesta za hor- mon tiroksin, gde L-tiroksin vezuje sa većim afinitetom. Oko 40% plazma transtiretina i pla- zma retinol vezujućeg proteina cirkuliše u čvrstom protein-protein kompleksu. Kompleks stabi- liše vezivanje retinola za RBP4 i sprečava njegov gubitak preko glomerularne filtracije. TTR ima u svojoj strukturi dva vezujuća mesta za RBP4 [167, 168]. Komplement faktor B (CFB) je protein molekularne mase 85,5 kDa. Deo je alternativnog puta aktivacije komplementa, koji se faktorom D deli na dva fragmenta: Ba i Bb. Bb je serin proteaza koja reaguje sa komplementnim faktorom 3b i generiše C3 ili C5 konvertazu. Uče- stvuje i u proliferaciji i u diferencijaciji preaktivisanih B limfocita, u brzom širenju monocita u perifernoj krvi, u stimulaciji limfocitne blastogeneze kao i u lizi eritrocita. Ba inhibira pro- liferaciju preaktivisanih B limfocita [169]. Pošto je poznato da je primarni patogentski supstrat u razvoju EN-a ćelija epitela proksi- malnih tubula bubrega, prisustvo markera glomerulskog oštećenja ukazivalo bi na dalji razvoj bolesti i progresiju oštećenja. Pojava glomerulskih markera u urinu EN pacijenata, kao i pove- ćanje njihove koncentracije u skladu sa razvojem oboljenja, predstavlja dobru metodu za praće- nje toka bolesti. Da bi identifikovali proteine koji se smatraju markerima glomerularnog ošte- ćenja (albumin, α-1-antitripsin, haptoglobin, hemopeksin, retinol vezujući protein, vitamin D vezujući protein, transtiretin i komplement faktor B) i diferencijalno su izlučivani putem urina pacijenata sa EN-om u odnosu pacijente sa DN-om, uradili smo 2D-DIGE analize zbirnih uzo- raka i uporedili dobijene mape proteoma. Prisustvo markera glomerulskog oštećenja u urinu DN pacijenata značajno je povišeno u odnosu na urin EN pacijenata sa niskim i visokim vre- dnostima proteinurije (Slika 4A, 4B). Markeri glomerulskog oštećenja se značajnije javljaju u urinu EN pacijenata u odmaklom stadijumu bolesti (visoke vrednosti proteinurije, slika 4B) u poređenju sa urinom zdravih dobrovoljaca uz endemskih područja, što pored oštećenja tubula ukazuje na dodatno oštećenje glomerula tokom razvoja hronične bubrežne insuficijencije. 5.4 Oksidativne lezije humanih tubulocita pri akutnom i hroničnom izlaganju aristolohijskom kiselinom Dejstvo aristolohijske kiseline (AA) se ispoljava kroz dve međusobono povezane faze – faza akutne reakcije ćelije na prisustvo toksina (pojava prolazne tubularne nekroze) i faza hro- nične reakcije ćelije na prisustvo toksina (nastanak tubularne atrofije i razvoj fibroze). Usled povećanog stvaranja kiseoničnih radikala u ćeliji, kao jedan od prvih mehanizma toksičnog oštećenja AA nastaje razvoj oksidativnog stresa [83]. Diskusija 91 Mitohondrijalna superoksid dizmutaza (SOD2) ima molekularnu masu od 24,7 kDa. Pripa- da familiji gvožđe/mangan superoksid dizmutaza. Uništava slobodne radikale koji nastaju nor- malno u ćeliji prilikom brojnih metaboličkih procesa. Postranslaciona modifikacija molekula nutracijom ili oksidativnom modifikacijom inhibira njenu katalitičku aktivnost [170]. Posebna oštećenja molekula kao i inhibicija njegove osnovne uloge prisutna je kod pacijenata sa šećer- nom bolešću [171]. Parkinson disease protein 7 (PARK7) je protein molekularne mase 19,8 kDa, koji učestvuje u zaštiti ćelije od oksidativnog stresa i prevremene ćelijske smrti. Direkno reguliše ekspresiju i stabilnost mitohondrijalnih proteina SLC25A14 i SLC25A27 kao i oksidativno oštećenje induko- vano prolaskom kalcijuma kroz oštećenu mitohondrijalnu membranu. Učestvuje u eliminaciji vo- donik peroksida (H2O2) i zaštiti ćelije od H2O2 indukovane ćelijske smrti. Najverovatnije reaguje kao atipična peroksiredoksinu slična peroksidaza koja neutrališe H2O2. Sam protein nema prote- olitičku aktivnost. Nakon uklanjanja C-terminalnog peptida, PARK7 postaje aktivna proteaza ko- ja ispoljava citoprotektivno dejstvo u slučaju indukcije apoptoze oksidativnim stresom. Učestvuje u procesu ubikvitinacije proteina. Vezuje se za brojne mRNK koji sadrže multiple kopije GG ili CC motiva i delom inhibiše njihovu translaciju. Predstavlja pozitivni regulator androgen receptor zavisne transkripcije. Kontroliše promociju ćelijskog rasta i ćelijsku transformaciju. Definiše se i kao redoks-senzitivan čaperon. U fiziološkim uslovima, lociran je predominantno u citoplazmi, nešto manje u jedru i mitohondrijama. Kao nuklearni odgovor na pojavu oksidativnog stresa do- lazi do njegove translokacije u mitohondrijalni prostor. Prisutan je u velikim koncentracijama u tkivu pankreasa, bubrega, skeletnih mišića, jetre, testisa i srca [172-175]. Peroksiredoksin 1 (PRDX1) ima molekularnu masu od 22 kDa. Učestvuje u regulaciji oksido-redukcije u ćeliji. Redukuje perokside nastale tokom metaboličkih procesa u ćeliji, kao i u toku odgovora ćelije na toksine. Može učestvovati u prenosu signala faktora rasta i tumor ne- krotirajućeg faktora alfa preko regulacije intracelularne koncentracije vodonik peroksida. Konstitutivno je eksprimiran u brojnim humanim ćelijama. Aktivno mesto ovog proteina je re- doks-aktivni Cys-52 koji se oksidiše u Cys-SOH. Cys-SOH brzo reaguje sa Cys-173-SH druge subjedinice gradeći intermolekularnu disulfidnu vezu između dva homodimera. Regeneracija proteina nastaje pod dejstvom tioredoksina redukcijom disulfidne veze [176, 177]. Peroksiredoksin 6 (PRDX6) ima molekularnu masu od 25 kDa. Učestvuje u regulaciji oksido-redukcionih procesa u ćeliji. Redukuje H2O2 i kratke lance organskih, masnih kiselina, kao i fosfolipidne hidroperokside. Ima značajnu ulogu u zaštiti ćelije od oksidativnog ošteće- nja, i nespecifično je pojačano eksprimiran u brojnim ćelijama kao odgovor na oksidativni stres [176, 177]. Diskusija 92 Tokom akutnog i hroničnog izlaganja HK2 ćelija aristolohijskom kiselinom 1 (AA1) indukcija oksidativnog stresa (detektovane su povećane vrednosti markera oksidativnog stresa, SOD2, PARK7, PRDX1, PRDX6) je signifikantna. Proteini su identifikovani upotrebom 2-DE i masene spektrometrije, a rezultat potvrdjen imunološkim metodama. Upoređivali smo lizate ćelija HK2 bez tretmana i lizate HK2 čelija nakon akutnog tretmana (72h-nom inkubacijom toksinom u koncentraciji od 5µg/mL), dok smo za pozitivnu kontrolu na prisustvo parametara oksidativnog stresa koristili lizate HK2 ćelija predhodno 72h tretiranih vodonik peroksidom. Tokom hroničnog izlaganja HK2 ćelija aristolohijom, detektovan je postepeni porast ekspresije proteina koji učestvuju u antioksidativnoj zaštiti u zavisnosti od dužine perioda izlaganja ćelija toksinom (10 dana, 1 ili 2 meseca). Hronična intoksikacija aristolohijskom kiselinom je udružena sa poremećenom antioksida- tivnom zaštitom ćelije usled nepotpune aktivacije enzima antioksidativne zaštite, kao i na- stanka mitohondrijalnog oštećenja. Prisutna je prekomerna ekspresija inducibilne NO sintetaze (iNOS) što se manifestuje nalazom povećane ekskrecije azot monoksida (NO) u urinu. U hro- ničnom eksperimentu, iako je aktivnost glutation peroksidaze, katalaze i SOD2 očuvana, usled kontinuirane produkcije slobodnih radikala, antioksidativna zaštita nije dovoljna u spečavanju daljih oštećenja ćelijskih struktura. Nagomilavanje peroksinitrita usled prekomerne produkcije NO i H2O2, učestvuje u razvoju lipidne peroksidacije i posledično nastanku hronične intestici- jalne inflamacije [83, 178, 179]. Kao posledica lipidne peroksidacije i oksidativnog oštećenja u ćeliji, dolazi do destabiliza- cije intracelularnih membrana i poremećaja funkcije intracelularnih komponenti, posebno lizo- zoma i mitohondrija. Destabilizacija lizozomalne membrane može dovesti do oslobađanja lizo- zomalnih enzima i ireverzibilnih oštećenja. Fosfolipidi su normalni konstituensi mitohondri- jalne membrane i esencijalni za aktivnost određenih mitohondrijalnih enzima. Poremećaj inte- griteta ove membrane izazvan oksidativnom modifikacijom fosfolipida, dovodi do smanjenja membranskog potencijala i povećanja njene propustljivosti za jone kalcijuma. Povišena kon- centracija kalcijuma indukuje povišenu ekspresiju gena za kalpain, protein koji je povišeno eksprimiran u toku reakcije ćelije na prisustvo ovog toksina, a njegova pojava je posebno zna- čajna u primarnoj reakciji. Kalpaini deluju zaštitnički, gde vezivanjem intracelularnih jona kalcijuma, smanjuju njihovo akutno toksično dejstvo, dok pri hroničnoj intoksikaciji aristolohi- jom nemaju značajan efekat u zaštiti ćelije. Kao posledica poremećaja funkcije mitohondrija pri hroničnom izlaganju toksinom, remeti se njena sposobnost za proizvodnjom bioenergije, i brzo nastupa ćelijska smrt po tipu nekroze. Postoje istraživanja koja ukazuju na mogućnost po- većane ekspresije kalpaina u odgovoru ćelije na povećan oksidativni stres, što ima protektivnu ulogu u razvoju mitohondrijalnog oštećenja i ćelijske smrti [83, 179-181]. Diskusija 93 5.5 Pojava fibrotičnih markera u humanim tubulocitima nakon akutnog i hroničnog tretmana aristolohijskom kiselinom Hronična intoksikacija aristolohijskom kiselinom karakteriše se sporom regeneracijom epi- tela, a često i pojavom tubularne atrofije i intesticijalne fibroze. Usled negativnog dejstva na rast samih ćelija [182], posledično se javlja usporena regeneracija tubula sa povećanom prolife- racijom ne-target ćelija, fibroblasta, i razvojem fibroze [80]. Na osnovu proteomskih istraživanja homogenata humanih ćelija proksimalnih tubula (HK2 ćelije) nakon akutnog (72h) i hroničnog izlaganja (10, 30 i 60 dana) aristolohijskom ki- selinom 1, i potvrdom dobijenih rezultata imunološkim analizama tretiranih HK2 ćelija, prona- đene su značajno povišene vrednosti markera fibroze (fibronektin, vimentin, vinkulin, α-aktin glatkih mišića) nakon tretmana. Fibronektin (FN1) je protein molekularne mase 262,6 kDa. Vezuje se za spoljašnju površi- nu ćelijske membrane, ali i za druge brojne komponente kao što su kolagen, fibrin, heparin, DNK i aktin. Učestvuje u procesu ćelijske adhezije, ćelijskog motilitela, opsonizacije, oživlja- vanju rana i u organizaciji oblika ćelije. Anastelin vezuje fibronektin i indukuje nastanak fi- brilne formacije. Superfibronektin je polimer fibronektina i pokazuje pojačano adhezivno svoj- stvo. Anastelin i superfibronektin inhibiraju rast tumora, angiogenezu i metastaziranje. Plazma FN1 je sekretovan od strane hepatocita. Ćelijski FN1 je produkavan od strane fibroblasta, epi- telijalnih ćelija i drugih ćelija, a nalazi se u ekstracelularnom matriksu u formi fibrila. Posebne forme, Ugl-Y1, Ugl-Y2 i Ugl-Y3 pronađene su u urinu. Učestvuje u akutnom odgovoru ćelije na oštećenje; prilikom zapaljenskih reakcija koje ne uključuju aktivaciju specifičnog imunog odgovora i produkciju antitela [183, 184]. Vimentin (VIM) je fosfoprotein klase III intermedijalnih filamenata i molekularne mase 53,6 kDa. Pronađen je u brojnim ne-epitelnim, posebno u mezenhimnim ćelijama. Pojačano je eksprimiran u fibroblastima, nešto manje u T i B limfocitima, a gotovo da ga nema u ćelijama Burkitovog limfoma. Povišene vrednosti su prisutne u tumorskim hormonalno nezavisnim će- lijskim linijama (na primer kod karcinoma dojke). Učestvuje u procesima ćelijske deobe, gde je fosforilacija ovog proteina intenzivna [185, 186]. Vinkulin (VCL) je F-aktin vezujući protein molekularne mase 123,8 kDa, koji učestvuje u adheziji ćelije za celularni matriks i intraćelijsku adheziju. Značajan je i u očuvanju morfolo- gije ćelije kao i u regulaciji ćelijskih pokreta. Aktivna forma ovog proteina učestuje i u prenosu signala kroz ćeliju u toku ovih procesa [187]. Dezmin je protein molekularne mase 53,5 kDa. Pripada klasi III intermedilajnih filamenata pronađenih u mišićnim ćelijama. Može je pojačano eksprimirati od strane epitelijalnih ćelija u stanjima hronične hipoksije [188]. Diskusija 94 Alfa-aktin glatkih mišića (ACTA2) je protein molekularne mase 42 kDa. Aktini su evoluci- onarno visoko konzervatini proteini, uključeni su u regulaciju ćelijske motilnosti, i prisutni u svim eukariotskim ćelijama. Postoje tri aktivne izoforme kao što su alfa (mišićno tkivo), beta i ga- ma (u skoro svim ćelijama kao komponente citoskeleta) [189]. Prisustvo ACTA2 u lizatima epi- telijalnih ćelija, znak je metaplastičnih promena (mezenhimna transformacija) [79, 80, 180, 190]. Značaj strukturnih promena u ekstracelularnom matriksu (gubitak E kaderina kao epitelijalnog markera, pojava kolagena I i III) u razvoju intesticijalne fibroze pri AA1 intoksi- kaciji još uvek je nedovoljno proučen. Nalaz 5% strukturno promenjenih epitelnih ćelija koje produkuju veliku količinu fibrotičnih markera (posebno vimentina, ACTA2, kolagena tipa I i III) pod dejstvom AA1 od strane nekih naučnika smatra se potencijalnim izvorom intestici- jalnih fibroblasta. Aktivacija lokalnih fibroblasta i miofibroblasta kao odgovor tkiva na pri- sutno oštećenje ćelija u razvoju intesticilajne fibroze takođe nije isključena. AA intoksikacija tubulocita u eksperimentalnim ćelijskim modelima hronične AA1 intoksikacije rezultovala je gubitkom epitelijalnih markera i novom ekspresijom markera mezenhimne transofmacije, kao i poremećajem strukture tubularne bazalne membrane (nagomilavanjem kolagena tipa I i III). Takve promene mogu teoretski objasniti nastanak tubulointesticijalne fibroze, progresivnog oštećenja bubrega i brzog razvoja terminalne bubrežne insuficijencije kod pacijentata sa nefro- patijom aristolohijske kiseline (NAA). Aktivacija JNK/MAO kinaznog-Smad 3 signalnog puta je mahanizam kojim AA1 indukuje promene u tubularnim epitelnim ćelijama i posledično do- vodi do pojave kolagena I i III u međućelijskom prostoru i razvoja renalne fibroze. Značajno povišene vrednosti TGF-beta prilikom AA1 intoksikacije u ćeliji direkno aktiviraju ovaj signal- ni put koji vodi ka razvoju fibrogeneze i ćelijske transformacije preko aktivacije p38 i poveća- ne ekspresije profibrotičnih markera [79, 80, 180]. Dalja istraživanja su neophodna da bi se u potpunosti objasnio mehanizam fibrotične transformacije epitelijalnih ćelija pod dejstvom Aristolohia-e. 5.6 Specifični proteini u lizatu humanih tubulocita kao odgovor na prisustvo aristolohijske kiseline Istraživanjem proteoma humanih tubulocita prilikom akutnog izlaganja ćelija mikromolar- nim koncentracijama AA1 toksina pronađeno je značajno povišena ekspresija 6, a značajno snižena ekspresija 11 različitih proteina. AA1 se metaboliše primarno u jetri i tubularnim ćelijama bubrega nitroredukcijom u N-hi- droksi-aristolaktam 1. On formira ciklični N-acil-nitrenijum jon koji se kovalentno vezuje za egzocikličnu amino grupu purinske baze DNK. Diskusija 95 Tako nastaju 7-(deoksi-adenozin-N6-il)-aristolaktam-1 i 7-(deoksi-adenozin-N6-il)- aristolaktam-2 (dA-AA1, dA-AA2) i 7-(deoksi-guanozin-N2-il)-aristolaktam 2 (dG-AA2). Najzastupljeniji je dA-AA1. Važni enzimi koji učestvuju u aktivaciji AA1 nalaze se u citoplazmatskoj subcelularnoj frakciji ćelija (NAD(P)H:kvinon oksidoreduktaza (NQO1)), u mikrozomima hepatičnih ćelija (citohrom P450 (CYP) 1A1/2) i mikrozomima bubrežnih ćelija (NADPH:CYP reduktaza (POR)). Prostaglandin H sintetaza (ciklooksigenaza, COX1 i COX2) u ćelijama urotelijalnog epitela ima mogućnost aktivacije AA1. Najefikasnije metaboličko dejstvo ispoljava NQO1 [182, 191-193]. Poliformizam gena za NQO1 (genotip NQO1*2/*2 predisponira razvoj tumora) ima zna- čajnu ulogu u razvoju urotelijalnih maligniteta kod EN pacijenata. Aristolaktam se ne vezuje direkno za DNK lanac ako nije redukovan. Nizak nivo dA-AA1 u ćelijama bubrega eksperi- mentalnih životinja govori u prilog postojanja dodatnog metaboličkog puta aristolohije – aktivacija oksidazama (COX-1 i/ili COX-2), koje su značajno povišene u urotelijalnom tkivu. Acetilacija i sulfonacija nisu značajni mehanizmi metabolisanja AA1 u organizmu. Oksidacija AA1 je deo detoksikacionog puta ove kiseline. Tako su krajnji produkti, AA1a, konjugati O- glukuronid, O-acetat i O-sulfat estri, otkriveni u izlučenom urinu. Enzimske reakcije koje do- vode do nastanka aristolaktama 1a i njegovih metabolita su čisto detoksifikacionog tipa. Nisu otkriveni njihovi DNK adukti. Hepatična CYP oksidiše i demetiliše (O-demetilacija) najveći deo AA1 u organizmu stvarajući AA1a. Njegova konjugacija sa glukuronidom pomoću enzima UDP-glukuronoziltransferaze stvara produkt koji se izlučuje putem mokraće. Osobe koje nose CYP3A5*1 alel G6989 imaju nefunkcionalan enzim, što čini eleminaciju toksina iz organizma je usporenom. Enzim je posebno značajan u prvoj liniji zaštite organizma od dejstva toksina. AA1 može biti i aktivisana CYP-om pod anaerobnim uslovima, još uvek nepoznatim meha- nizmom (dolazi do nitroredukcije), gde nastaju DNK adukti. CYP1A1 i CYP1A2 su najefika- sniji u oksidaciji AA1, za razliku od ostalih enzima iz ove grupe, CYP1B1, CYP2C8, CYP3A4, CYP2B6 kao i citohroma b5 [191]. AA može izazvati direkno oštećenje ćelija tubularnog epitela bubrega preko poremećaja stabilnosti mitohondrijane membrane. Značajniji toksični efekti se pripisuju njenim metaboliti- ma. Stvaranje DNK adukta [193] može dovesti do maligne transformacije sa jedne strane, ali i nastanak ćelijski specifičnih alteracija na nivou transkripcije proteina i poremećaja normalnih ćelijskih funkcija. Potvrđeno je prisustvo DNK lezija kod pacijenata sa endemskom nefropati- jom (EN), zdravih osoba koje žive na endemskim područjima [60, 194], kao i kod pacijenata sa urotelijalnim karcinomima [195]. Prisustvo DNK-adukta smatra se markerom prokuženosti, tj. dokazom da je osoba bila izlagana ovom kiselinom. Kao posledica nastaje mutacija tumor su- Diskusija 96 presor gena TP53 po tipu transferzije A:T→T:A [196]. Mutacija TP53 gena, kao point mutaci- ja, najverovatnije predstavlja početni stepen u razvoju tumora, jer mutirani gen gubi tumor supresivnu funkciju [197]. Specifična promena u strukturi gena identifikovana je na 139 kodo- nu egzona 5, po tipu iz AAG u TAG (Lys→Sop), što dovodi do prekomerne ekspresije mutira- nog proteina. Još uvek nije utvrđeno da je upravo gen za ovaj protein specifično mesto delova- nja AA1. Uloga tumor supresora TP53 u organizmu je ključna u određivanju sudbine ćelije na- kon DNK oštećenja, pa njegova poremećena funkcija dovodi do daljih mutacija i razvoja tumo- ra [194]. Progresija ćelijskog ciklusa je regulisana preko dve glavne kontrolne tačke locirane u G1/S ili G2/M fazi. Kada ćelija primi anti-proliferativni signal, kao što je na primer DNK oštećenje, refleksno se aktivira kontrolni povratni mehanizam koji inhibira ciklusnu progresiju preko ovih kontrolnih tačaka sve dok se ne sanira nastalo oštećenje. TP53 kontroliše transkripciju gena ko- ji učestvuju u regulaciji apoptoze i DNK reparacije i na taj način štiti ćeliju od DNK oštećenja (npr. gen CDKN1A, koji kodira potentan inhibitor ćelijskog ciklusa koji reguliše progresiju će- lijskog ciklusa u G1 i G2 kontrolnu tačku kao odgovor na brojne stimuluse; ovaj gen je jako eksprimiran usled prisustva AA1 preko aktivacije PT53 gena). Između ostalog suprimira ekspre- siju gena koji kodiraju citoskeletne proteine (K-ALPHA-1, H2-ALPHA, TUBA-1 i TUBA-3). Međutim, vrednosti citoskeletnih proteina nisu bile značajno snižene u tretiranim HK2 ćelijama u odnosu na kontrolnu grupu (HK2 ćelije bez tretmana) tokom našeg eksperimenta. Što duže traje izlaganje dejstva toksinu i u većoj dozi, efekat postaje više TP53 zavistan. Najveća up re- gulacija posredstvom TP53 proteina detektovana je kod KLF10 i EGR1 gena. Veliki broj gena za histone je up regulisan (HIST1H1C, HIST1H2AC, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H4B i HIST1H4C). U našoj studiji ovi literaturni podaci su potvrđeni. Veliki broj ćelija je ovim efektom zaključano u S fazi ćelijskog ciklusa pri dejstvu AA1. Aktivacija transkripcije gena za histone prisutna je u ćelijama u G1/S tranziciji i tokom S faze. Ovo zadržavanje se objašnjava (mada nema još uvek potpunih dokaza za to, samo je predpostavka) nemogućnošću DNK poli- meraza kompleksa da izvrši replikaciju i/ili transkripciju preko AA-DNK, koji efikasno blo- kiraju njeno dejstvo. Inhibicija DNK replikacije može uvesti ćeliju u apoptozu. To je neka vrsta zaštitnog mehanizma oštećene ćelije, i nije obavezno posredovana aktivacijom PT53 puta. Pretpostavlja se da nedostatak G1 aresta nastaje usled nemogućnosti ćelija da eksprimiraju potentni inhibitor G1/G2 ćelijskog ciklusa, CDKN1A. Akumulacija ovog inhibitora se javlja u ćeliji tek nakon dužeg delovanja toksina (nakon 48h) kada ćelija već uđe u S fazu ciklusa. Ali što je veće oštećenje DNK (usled nastajanja adukta) to veći broj ćelija ostaje zaključano u G1 fazi, jer posledično usled ovog defekta nivo proteina koji su zaduženi za prelazak u sledeću Diskusija 97 fazu nije dovoljan da bi do nje i došlo. Replikacija tako oštećene DNK može da dovede do stvaranja mutacija zaslužnih za malignu transformaciju ćelije. Naročito ako dovode do amplifi- kacije gena, kao i mutacije gena za TP53 protein [182, 194]. Još su dva proteina, koja učestvuju u procesima endocitoze, regulisana su pod dejstvom AA1: nukleoprotein, NECAP1 (smanjeno) i Ras-zavistan protein, RAB5A (povišeno reguli- san). NECAP1 učestvuje u klaritin posredovanoj endocitozi, ali njegova funkcija nije do kraja razjašnjena. RAB5A, po funkciji je GTPaza, reguliše fuziju endozoma, ali njegova ključna ulo- ga u receptor posredovanoj endocitozi još uvek nije razjašnjena. Promene i njihovoj ekspresiji smatraju se značajnim za ispoljavanje efekata AA1 intoksikacije [182, 194]. Najznačajniji podaci iz literature ukazuju da je povišena ekspresija proteina u lizatu HK2 ćelija nakon AA tretmana bila je prisutna kod ornitin aminotransferaze, sorbitol dehidrogenaze, alfa aktina, aspartoacilaze, 3-hidroksiizobutitat dehidrogenaze i peroksiredoksina 1. Snižena ekspresija bila je zabeležena kod ATP sintaze subjedinice beta, glutamant dehidrogenaze 1, be- ta aktina, regukalcina, glutamat-cistein ligaze regulatorna subjedinica, dihidropteridin redukta- ze, hidroksliacil-koenzim A dehidrogenaze, proteina 1 voltažno-anjon zavisnog selektivnog ka- nala, prohibitina, adenilat kinaze izoenzima 4, i alfa-kristalina B lanca. Peroksiredoksin je bio značajno povišen u tkivu bubrega nakon administracije AA1, kao odbrana ćelije usled induko- vanog oksidativnog stresa. Najznačajniji detektovan protein koji je smanjeno eksprimiran u bu- brežnom tkivu bio je regukalcin, protein sa značajnom ulogom u metabolizmu kalcijuma. Sma- tra se da tim mehanizmom, preko oslobađanja kalcijuma i njegovog ulaska u mitohondrije, AA1 dodatno kompromituje njenu funkciju, već delom oštećenu usled povišenog oksidativnog stresa. ATP sintaza, neophodna za produkciju adekvatne količine ATP-a u ćeliji, takođe je smanjeno eksprimirana, a sličan nalaz je prisutan i u ispitivanju ćelijskog proteoma brojnih kancera [180]. Na slici 39 su prikazani identifikovani proteini u HK2 ćelijama i njihova lokalizacija u će- liji nakon AA1 hroničnog tretmana. Većina identifikovanih proteina prisutna je u povišenoj koncentraciji kao odgovor ćelije na direktna ili indirektno indukovana oštetećenja. Kvantita- tivnom analizom ekstrahovanih proteina iz AA1 tretiranih HK2 ćelija, ustanovili smo značajne razlike u njihovoj ekspresiji u odnosu na HK2 bez tretmana, OTA-HK2 ili AA1-OTA-HK2 će- lije. Dodatna potvrda rezultata imunološkim metodama izvršena je za one proteine koji di- rektno učestvuju u metaboličke promene nastale kao posledica prisustva aristolohije. Ispitivanje toksičnih efekata na HK2 ćelije toksina aristolohijske kiseline 1 proteomskim istraživanjima potvrdilo je postojanje proteina specifičnih za metabolizam AA1 (Eef1A1, Ndfus1, Lamin-A/C). Diskusija 98 Slika 39. Shematski prikaz ćelijske lokalizacije identifikovanih proteina u ćelijskom lizatu HK2 ćelija nakon hro- nične (1 mesec) intoksikacije aristolohijskom kiselinom. Proteini su imenovani njihovim genetičkim imenima. Elongacioni faktor 1-alfa 1 (EEF1A1) je protein molekularne mase 50 kDa, a učestvuje u vezivanju aminoacil-tRNK za A-mesto na ribozomima u toku aktivne sinteze proteina. Nalazi se u moždanom tkivu, placenti, plućima, jetri, bubregu i pankreasu. Posebno su povišene vredno- sti pri AA1 indukovanom oksidativnom stresu i sintezi proteina koji su neophodni za ade- kvatnu antioksidativnu zaštitu [198]. NADH-ubikvinon oksidoreduktaza 75 kDa subjedinica, mitochondrijalna forma (NDUFS1) je protein molekularne mase 79,5 kDa i deo mitohondrijalnog respiratornog kompleksa I na unu- trašnjoj membrani mitohondrija. Njegova ekspresija je povećana kao odgovor na povećane ener- getske potrebe (sinteza proteina u AA1 oksidativnom stresu) ćelije u patološkim stanjima [199]. Lamin A/C (LMNA) je nuklearni protein molekularne mase 70 kDa. Učestvuje u reorga- nizaciji nuklearnog materijala, organizaciji hromatina, nuklearne membrane i reorganizaciji te- lomera. Povišeno je eksprimiran u odgovoru na DNK oštećenje (prisustvo DNK adukta koji re- mete transkripciju gena), ali i kao odgovor na aktivaciju TP53. Učestvuje u G1 fazi ćelijske de- obe. U G2 fazi se detektuje u malim količinama. Normalno se nalazi u jedru, i uvek je povi- šenje negove ekspresije i akumulacije odgovor na prisutno oštećenje ćelije (oksidativni stres) i u procesima starenja [200, 201]. Diskusija 99 5.7 Ohratoksin A indukuje oksidativni stres pri hroničnom izlaganju humanih tubulocita OTA indukuje oksidativno oštećenje ćelija, što je dokazano vitro i in vivo eksperimentima. Nastaju specifična oštećenja DNK (formiranje 8-OHdG) pod dejstvom reaktivnih vrsta kiseoni- ka. Javljaju se i specifične lezije naslednog materijala po tipu kompletnog kidanja lanca [202]. Ove promene su posebno naglašene u ćelijama jetre i bubrega, gde je enzim koji učestvuje u reparaciji DNK, foraminido-piridin-glikozilaza, takođe oštećen procesima oksidacije ili direktnim toksičnim dejstvom OTA-e. U tkivu bubrega, geni čija je transkripcija povećana u odgovoru na oksidativni stres (u svojim promotornim regionima sadrže antioksidativni regulatorni element (ARE) koji pre- poznaje transkripcioni faktor, nuklearni eritroidni faktor 2 p45 vezan faktor 2 (Nrf2) i promoviše njihovu transkripciju), usled dejstva OTA-e, značajno su smanjeno regulisani [203]. Smatra se da na taj način OTA smanjuje prirodnu antioksidativnu zaštitu ćelije. Iako je oksidativni stres je pri- mećen u različitim tkivima, razvoj tumora javlja uglavnom u bubregu [204]. OTA indukuje i pove- ćanu ekspresiju inducibilne azot oksid sintetaze (iNOS), što ukazuje i na indukciju nitrozativnog stresa. Stimulacija proizvodnje NO dovodi do daljeg oštećenja DNK [204]. Akutno izlaganje HK2 ćelija mikromolarnom dozom ohratoksina A (OTA) nije dovelo do značajnog razvoja oksidativnog stresa u našem eksperimentu. Hronično izlaganje HK2 OTA toksinom dovodi do značajnog razvoja oksidatinog stresa. U eksperimentalnim modelima OTA intoksikacije u kulturi ćelija, oštećenje DNK struktu- ra je, za razliku od AA1 koja gradi DNK-adukte, posledica oksidativnih promena kao indi- rektnog oštećenja. Nivo oštećenja naslednog materijala u direknoj je korelaciji sa jačinom indukovanog oksidativnog stresa i posledičnom produkcijom reaktivnih kiseoničnih radikala. Oksidativni stres u patogenezi OTA ćelijskog oštećenja posledica je povećane produkcije kise- oničnih radikala sa jedne strane, kao i smanjene antioksidativne zaštite sa druge strane. OTA direktno oštećuje NADPH-citohrom P450 reduktazu, inicirajući procese lipidne peroksidacije. Direktno redukuje kvinon u formu semikvinona i hidrokvinona. Tako remeti ovaj antioksida- tivni sistem zaštite, aktivirajući dalju redoks cikličnu reakciju i formiranje reaktivnih kise- oničnih radikala. Istraživanja toksičnih efekata OTA na mitohondrijalne strukture, pokazala su značajan uticaj OTA-e na respiratornu funkciju i procese okisdativne fosforilacije preko po- remećaja integriteta mitohondrijalne membrane i inhibicije sukcinat posredovanog elektron- skog transfera u respiratornom lancu u mirkomolarnim koncentracijama. Nanomolarne koncen- tracije OTA-e nisu remetile integritet mitohondrijalne membrane, jer koncentracija toksina nije bila dovoljna da uzrokuje lipidnu peroksidaciju i mitohondrijalnu disfunkciju, pa je antioksida- tivna zaštita bila očuvana [205-207]. Takav rezultat je postignut i u toku ove studije. Diskusija 100 Geni proteina koji učestvuju u antioksidativnoj zaštiti poseduju ARE u svojim promotor regionima. ARE motivi su prepoznati od strane transkripcionih faktora, nuklearnih eritroidnih faktora 2 p45-povezanih faktora 2 (Nrf2) [205]. Faktori aktiviraju transkipciju gena proteina koji učestvuju u detoksikaciji, zaštiti ćelije i proteine antioksidativne zaštite). OTA inhibira transkripciju ovog transkripcionog faktora abazičnim oštećenjem DNK strukture, kao i di- rektnim oštećenjem ovog proteina i na taj način utiče na smanjenje antioksidativne zaštite ćeli- je [208, 209]. Sa druge strane, OTA povećava ekspresiju inducibilne azot oksid sintaze (iNOS) i dovodi do nitrozativnog stresa. Nitrozativni stres je posledica povećane produkcije NO usled indukcije iNOS-e, smanjenja detoksifikacije NO usled deplecije glutationa, kao i usled povećane pro- dukcije superoksid anjona kao posledica smanjenja SOD1 i SOD2 enzima u ćeliji. Najznačajni- ja posledica nitrozativnog oštećenja intracelularnih struktura je dalje oštećenje DNK struktura (pojava 8-nitro-guanina) i prisustvo većeg broja abazičnih lezija, kao i lipidna peroksidacija strukturnih makromolekula. Usled povećane propustljivosti oštećenih membrana za jone kalci- juma, poremećaj homeostaze ovog jona dovodi do dalje produkcije reaktivnih kiseoničnih radi- kala. Poremećaj u strukturi i propustljivosti ćelijske membrane dovodi do gubitka njenog inte- griteta i može imati za posledicu indukciju apoptoze ili nekroze [208, 210]. Upotreba antioksidanasa u predtretmanu ohratoksinom signifikantno je redukovala posle- dice oksidativnog oštećenja u eksperimentalnim modelima na humanom i animalnom materija- lu [211-213]. 5.8 Pojava markera fibroze u humanim tubulocitima pri akutnom i hroničnom izlaganju ohratoksinom A Na osnovu proteomskih istraživanja homogenata humanih ćelija proksimalnih tubula (HK2 ćelije) nakon akutnog (72h) i hroničnog izlaganja (10, 30 i 60 dana) ohratoksinom, kao i potvrdom dobijenih rezultata imunološkim analizama tretiranih HK2 ćelija, pronađene su zna- čajno povišene vrednosti markera fibroze (fibronektin, vimentin, vinkulin, α-aktin glatkih miši- ća) u lizatu HK2 ćelija nakon tretmana. HK2 ćelije u kontaktu sa toksinima produkovale su značajno povećanu količinu ACTA2 proteina u odnosu na kontrolnu grupu prilikom akutnog i hroničnog eksperimenta tretmanom OTA-om. ACTA2 kao marker epitelne mezenhimne tranzicije i fibroze ukazuje na prisustvo ovih procesa. Vrlo niske koncentracije OTA (u nanomolarnom rangu) u modelu hronične intoksikacije humanih proksimalnih tubulocita i humanih fibroblasta poreklom iz bubrežnog tkiva, uzroko- Diskusija 101 vale su ćelijsku hipertrofiju, dok je veća koncentracija toksina izazivala nekrozu (sa posle- dičnom inflamatornom reakcijom okolnog tkiva i migracijom ćelija zapaljenja, pri dozama ve- ćim od 1 µmola) i apoptozu ćelija (programirana ćelijska smrt uz pojavu DNK fragmentacije). Tubulociti su kao odgovor na toksin, počeli da produkuju kolagen tipa III kao i fibronektin, dok je nuklearni faktor NF-kB bio izrazito povišen. Druga grupa naučnika je pokazala povišene vrednosti ACTA2 (pojava tranzicije iz epitelnog fenotipa u mezenhimalni fenotip), dezmina, kolagena tipa IV, prekomernu ekspresiju TGF-beta, a smanjenje ekspresije gena za E kaderin, N kaderin i matriks metaloproteinazu 9. Povećanje količine kolagena objašnjeno je upravo smanjenjem aktivnosti matriks metaloproteinaza, čime je smanjena posttranslaciona modifika- cija kolagena i njegova degradacija, sa posledičnim nakupljanjem u intrećelijskom prostoru i progresije bolesti ka razvoju fibroze bubrežnog korteksa [214]. S obzirom da je za preuzimanje OTA-e od strane ćelija potreban poseban mehanizam aktivnog transporta koji se nalazi samo u tubulima bubrega, vrlo male količine prostom difuzijom dospevaju do ostalih ćelija. Zato se malo verovatnim smatra nastanak fibroze i hroničnog tubulointesticijalnog nefritisa kao posle- dica direkne stimulacije fibroblasta od strane ovog toksina. Razvoj fibroze usled aktivacije pro- liferacije bubrežnih fibroblasta može se jedino objasniti opštim reparacionim mehanizmom usled prisustva nekrotičnih ili apoptotičnih tubulocita (direknim delovanjem toksina na tubulo- cite pri većim, mikromolarnim dozama) i ožiljavanjem tkiva [215, 216]. Ispitivanjem uticaja OTA-e na aktivnost mitogen aktiviranih protein kinaza (MAPKs), mo- že se delom objasniti mehanizam njegovog profibrotičnog dejstva. Aktivacija ovog puta ima za posledicu pojačanu aktivaciju i drugih protein kinaza, kao što su ERK, JNK i p38 regulatora koji sada indukuje transkripciju profibrotičnih markera (sekrecija kolagena) i ćelijski rast. Stalna aktivacija ovih signalnih puteva može dovesti do nekontrolisane regulacije prolifera- tivne aktivnosti, intezivne ćelijske deobe i razvoja tumora [217-219]. 5.9 Specifični proteini u lizatu humanih tubulocita (HK2) kao odgovor na prisustvo ohratoksina A OTA izaziva širok spektar toksičnih efekata u animalnim modelima, uključujući nefro- toksičnost, kancerogenost, teratogenost, neurotoksičnost i imunotoksičnost. OTA uzrokuje toksično oštećenje bubrega kod svih vrsta sisara. Glavni mehanizmi dejstva uključuju direknu genotoksičnost (direkno oštećenje DNK strukture) i epigenetske efekte (indirekno oštećenje DNK). OTA oštećuje DNK direknim putem u malom procentu, dok su njegovi reaktivni me- taboliti izrazitog genotoksičnog efekta i sklonosti ka formiranju DNK-adukta. OTA inhibira sintezu proteina preko kompeticije sa fenilalaninom u reakciji koju katalizuje fenilalanin- Diskusija 102 tRNK-sintaza. Inhibicija sinteze proteina se smatra primarnim efektom ovog toksina, što posle- dično dovodi do inhibicije sinteze DNK i RNK. Povećana je i aktivnost gena koji učestvuju u negativnoj regulaciji sinteze proteina, kao što je gen za prostaglandin F2 receptor negativni re- gulator i gen za eukariotski inducibilni 4E faktor vezujući protein 1. Nasuprot tome, gen za elongacioni faktor 1-alfa 1 (eEF1A-1), protein koji promoviše GTP-zavisno vezivanje amino- kiseline-tRNK na strani ribozoma u toku sinteze proteina, smanjeno je eksprimiran. Smanjena je i količina svih RNK struktura nakon dejstva toksina, što za posledicu ima isključivanje odre- đenih gena iz funkcije. Preliminarni podaci su dokazali da OTA povećava aktivnost histon-de- acetilase (HDAC) u tkivu bubrega. HDAC su odgovorni za deacetilaciju nukleozomalnih histo- na što dovodi do inhibicije transkripcije gena. HDAC proteini imaju veliki značaj u razvoju maligniteta. Generalno smanjenje RNK ekspresije u ispitivanim ćeijama postavlja hipotezu o specifičnom efektu OTA-e na posttranslacionu modifikaciju gena, i zahteva dalja ispitivanja u tom pravcu [220, 221]. Visoka selektivnost bubrega na dejstvo OTA-e posledica je preuzimanja ovog toksina od strane tubulocita aktivnim transportom. Značajno smanjenje ekspresije gena za transkripcioni faktor HNF4a uzrokuje smanjenu transkripciju gena za proteine koji učestvuju u kseno- biotičkom metabolizmu (što dovodi do smanjenja detoksikacione uloge ćelije i izlučivanje toksina iz organizma) i transportu (kao što su Oat1, zob-K1, i Oatp1, proteini koji učestvuju u selektivnom transportu OTA-e u ćeliju). Na taj način OTA direkno utiče na sopsveni metabo- lizam u tubulocitima, sprečavajući veće toksično oštećenje. Suprotno tome, OTA značajno po- većava aktivnost NF-kB u ćeliji [204]. Poznato je da endogeni ili egzogeni ćelijski oksidansi aktiviraju transkripcioni faktor NF- kB što dovodi do transkripcije gena koji su uključeni u rast ćelija, regulatorne puteve i inhibi- ciju apoptoze. Stalna aktivacija NF-kB je povezana sa razvojem tumora. MAPKs su ključne komponente kaskadne signalizacije koje učestvuju u prenosu informativnog signala od ćelijske membrane do jedra. Ekstracelularnim signalom regulisane kinaze (ERKs), stres aktivirane pro- tein kinaze (SAPK), C-SEP N-terminalne kinaze (PSP/JNK) i mitogen aktivirane protein kina- ze (P38) su glavne kinaze koje kontrolišu mnoge ćelijske fiziološke procese. ERKs regulišu proliferaciju ćelija, dok JNK i P38 su značajne u stresnim situacijama i apoptozi. OTA podstiče fosforilaciju ERK1/2, PSP/JNK i P38, i na taj način aktivira ove puteve. Od ostalih proteina či- ja je ekspesija značajno poremećena pri izlaganju ćelija OTA-om, važno je spomenuti i regu- kalcin, neophodan u regulaciji intraćelijske homeostaze kalcijuma. U eksperimentalnim uslovi- ma regukalcin je ispoljio tumor-supresivni efekat u tumoru jetre [217-219]. Diskusija 103 Regulacija pomenutih signalnih puteva postignuta je već u nanomolarnim dozama ovog to- ksina, što je u najvećem slučaju imalo za posledicu indukciju apoptoze. Tri glavne komponente su uključene u transdukciju apoptotičnog signala: BCL-2 familija proteina, mitohondrijalni regula- torni proteini i kaspaze. OTA smanjuje nivo BCL-2 proteina inhibicijom njihove sinteze, ali po- većava aktivnost kaspaze 9 i kaspaze 3. Smatra se da i aktivacija apoptoze nastaje kao posledica DNK oštećenja i aktivacije TP53 odgovora, kao i intraćelijska oštećenja nastala oksidativnim stre- som, sa inicijalnim oštećenjem membrane mitohondrija i posledičnom aktivacijom kaspaze 9. Po- red indukcije pro-apoptotičnih procesa, paradoksalno pronađen je povišen nivo iRNK za anti-apo- ptotične proteine, kao što su survivin i MCL-1, antiapoptotični član BCL-2 porodice [222, 223]. Ispitivanjem efekata toksina u nanomolarnim dozama, došlo se do zaključka da je glavni efekat toksičnog delovanja apoptoza, dok je inhibicija sinteze proteina slabije izražena. Teško je zaključiti da li je inhibicija sinteze proteina posledica ili uzrok apoptoze. Međutim, sa pove- ćanjem doze ovog toksina u mikromolarnim veličinama, inhibicija sinteze proteina postaje evi- dentna u većini slučajeva, kao na primer, dovodi do evidentnog smanjenja tubulinskih traka u citoplazmi posmatrano pod elektronskim mikroskopom. Plato toksičnosti predstavlja koncen- tracija OTA-e od 6 mikrolarnih jedinica. Smatra se da se pri toj koncentraciji javljaju trajne promene i oštećenja u strukturi makromolekula, gde mehanizmi reparacije tkiva nisu u stanju da deluju a ćelija iscrpljuje sve mehanizme adaptacije. Apoptoza je tada glavni mehanizam eli- minacije oštećene ćelije [224, 225]. Imunosupresivna aktivnost OTA-e karakteriše smanjenje veličine vitalnih organa kao što je timus, slezina i limfni čvorovi, depresije odgovora na prisustvo odgovarajućih antitela, pro- mene u broju i funkcije imunih ćelija, kao i produkcije citokina. Imunotoksična aktivnost ve- rovatno je posledica degenerativnih promena, nekroze i apoptoze, a usled inhibicije sinteze proteina [226]. Ispitivanje toksičnih efekata ohratoksina A na HK2 ćelije proteomskim istraživanjima po- tvrđeno je postojanje proteina specifičnih za metabolizam ovig toksina (Ube2N, ORP 150, Eif5A) i njihovog dejstva na samu ćeliju. Ube2N je ubikvitin-konjugujući enzim E2 N, protein molekularne mase 17 kDa. Učestvuje u ubikvitinizaciji makromolekula i proteina na nivou endoplazmanskog retikuluma. Ovaj tip ubi- kvitinizacije ne zahteva dodatnu razgradnju proteina u proteazomima. Učestvuje u transkripci- onoj aktivaciji targentnih gena i tako kontroliše različite faze ćelijskog ciklusa u toku ćelijske deobe, ali i procesima diferencijacije. Učestvuje u reparaciji naslednog materijala i opštem pre- življavanju ćelije nakon DNK oštećenja. Pojačano je eksprimiran kao odgovor na DNK ošteće- nje, što je slučaj kod intoksikacije ohratoksinom [227-229]. Diskusija 104 Slika 40. Shematski prikaz ćelijske lokalizacije identifikovanih proteina u ćelijskom lizatu HK2 ćelija nakon hro- nične (1 mesec) intoksikacije ohratoksinom A. Proteini su imenovani njihovim genetičkim imenima. ORP 150 je hipoksijom up-regulisan protein 1 (HYOU1) molekularne mase 111,4 kDa. Neophodan je regulator protektivnog menahizma ćelije u stanjima koja dovode do smanjenog dopremanja kiseonika ćeliji ili usled nemogućnosti ćelije da adekvatno obavlja proces ćelijskog disanja. Takav impuls se javlja kod opsežnih oštećenja mitohondrijalnih struktura, kao i u slučaju intoksikacije ćelije OTA-om. Učestvuje u pakovanju i modifikaciji proteinskih lanaca u endo- plazmatskom retikulumu, gde se i najvećim delom nalazi. Visoko je eksprimiran u ćelijama koje sadrže dobro razvijen endoplazmatski retikulum i sintetišu veliku količinu sekretornih proteina, kao što su ćelije jetre i pankreasa, dok je u vrlo malim količinama pronadjen u moždanom tkivu i u bubregu. Visoke vrednosti prisutne su i u markofazima, kao i malignim ćelijama [109, 230]. Eif5A je eukariotski translacioni inicijalni faktor 5A-1, protein molekularne mase 16,8 kDa. Vezuje se za mRNK i učestvuje u regulaciji dužine pepridnog lanca u procesu translacije. Po- sebno je uklučen u regulaciju metabolizma aktina i progresije ćelijskog ciklusa, preko aktiva- cije brojnih regulatornih puteva. Reguliše p53/TP53-zavisnu apoptozu. Takođe reguliše i TNF- alfa regulisanu apoptozu. Predominantno se nalazi u citoplazmi, ali usled potreba i indukcije ovih apoptotičnih puteva, prelazi u nukleus. Diskusija 105 Nalazi se u velikim količinama u endotelnim ćelijama umbilikalne vene, ali posebno u brojnim kancerskim ćelijama. Postoji preporuka za korišćenje kao dobrog dijagnostičkog pre- diktora postojanja aberantne proliferacije u intraepitelijalnim neopalzijama vulve [231-233]. 5.10 Aristolohijska kiselina i Ohratoksin A zajedno indukuju razvoj oksidativnog stresa i fibrozu pri akutnom i hroničnom izlaganju Akutni kombinovani tretman HK2 ćelija AA1 i OTA toksinima indukuje povećanu pro- dukciju fibrotičnih markera (fibronektin, vimentin, vinkulin) i razvoj oksidativnog stresa (SOD2, PARK7). U toku dvomesečnog tretmana HK2 ćelija kombinacijom AA1 i OTA toksina, proteini koji učestvuju u odgovoru ćelije na postojanje oksidativnog stresa (SOD2, PARK7) kao i fibrotični markeri (fibronektin, vimentin, vinkulin) signifikantno su povišeni. Mehanizmi kojima bi se mogli objasniti efekti kombinovaog tretmana HK2 ćelija rastvorom AA1 i OTA-e nisu ponuđeni u dostupnoj literaturi. Brojne epidemiološke studije su opisivale moguću ulogu oba faktora u nastanku i razvoju tubulointesticijalnih lezija i pojave posledične fibroze. Usled nedostatka podataka o međusobnoj interakciji ovih toksina, ne mo- žemo pripisati značajnu indukciju oksidativnog oštećenja humanih tubulocita njihovom eventu- alnom zajedničkom dejstvu. Zato se dobijeni rezultati mogu objasniti samo patogenetskim me- hanizmima svakog toksina ponaosob, a oni ukazuju na povećanu produkciju kiseoničnih radi- kala (kod itoksikacije aristolohijom i ohratoksinom) ali i neadekvatnom indukcijom antioksida- tivne zaštite ćelije (ohratoksin inhibira sintezu proteina, ako i transkipciju specifičnih proteina). Prisustvo markera fibroze je posledica dejstva i AA1-e i OTA-a. Marker tranzicije iz epi- telnog u mezenhimni ćelijski tip je značajno povišen. HK2 ćelije u kontaktu sa toksinima produ- kovale su povećanu količinu ACTA2 proteina u odnosu na kontrolnu grupu prilikom akutnog i hro- ničnog eksperimenta kombinovanim tretmanom AA1 i OTA. Efekat se može pripisati dejstvu oba toksina. Dalja istraživanja su neophodna da bi se potpunije objasnio mehanizam ovih promena. 5.11 Prisustvo specifičnih proteina u lizatu humanih tubulocita nakon njihovog izlaganja aristolohijskom kiselinom i ohratoksinom A Distribucija identifikovanih proteina u HK2 ćeliji nakon hroničnog izlaganja kombinova- nom tretmanu prikazana je na slici 41. Nakon kvantitativnih i kvalitativnih analiza proteoma ćelija nisu pronađeni proteini koji bi ukazivali na specifičnost intoksikacije HK2 ćelija kombi- novanim tretmanom. Diskusija 106 Slika 41. Shematski prikaz ćelijske lokalizacije identifikovanih proteina u ćelijskom lizatu HK2 ćelija nakon hro- nične (1 mesec) intoksikacije aristolohijskom kiselinom 1 i ohratoksinom A. Proteini su imenovani njihovim ge- netičkim imenima. Ispitivanje toksičnih efekata na HK2 ćelije toksina aristolohijske kiseline 1 i ohratoksina A proteomskim istraživanjima potvrdilo je postojanje proteina specifičnih za metabolizam ovih toksina (AA1 (Eef1A1, Ndfus1, Lamin-A/C) ili OTA (Ube2N, ORP 150, Eif5A)) i njihovo dejstvo na samu ćeliju. Imunoćelijska bojenja HK2 nakon aplikovanog tretmana u toku akutnog izlaganja toksi- nom, i primenom odgovarajućih antitela ukazala su na postojanje povišene ekspresije ORP 150, Ube2N i Eif5A kao markera OTA intoksikacije i lamina A/C kao markera AA1 intoksika- cije. Medjutim, ekspresija Eef1A1 i Ndfus1 je bila značajno niska u odnosu na mono tretmane. Poznato je da direkno toksično dejstvo OTA-e utiće na smanjenje ovih proteina i na negativnu regulaciju ekspresije njihovih gena. Dalja istraživanja su neophodna da bi se potpunije objasnio mehanizam ovih promena. Diskusija 107 5.12 Markeri ćelijske intoksikacije aristolohijskom kiselinom i ohratokisnom u tkivu tumora gornjeg urotelijuma pacijenta sa i bez predhodno dijagnostifikovanim EN-om Aristolohijska kiselina se smatra potencijalnim uzročnikom urotelijalnih tumora udruženih sa pojavom NAA, kao i urotelijalnih tumora nastalih kao komplikacija EN-a [46, 195]. Ovi tu- mori poseduju AA-karakteristične TP53 mutacije. Funkcionalne analize indukovanih promena u brojnim eksperimentima uključivale su različite mehanizme regulacije ćelijskih procesa: re- gulacija ćelijskog ciklusa, apoptoze, odgovora na prissustvo oksidativnog stresa, aktivacija imu- nog odgovora, ćelijska proliferacija i drugo [194]. Upravo poremećaj ravnoteže između aktivacije i inhibicije tumor supresor gena i proto- onkogena dovodi do nekontrolisane ćelijske deobe. Ali to je samo početak na dugom putu ka malignoj transformaciji ćelije. Mutacija TP53 tumor supresor gena je poznati uzrok nastanka preko 50% vrsta kancera. AA1 predominantno vezuje purinske strukture i uzrokuje promene po tipu transferzije, najčešće A → T tipa, što uzrokuje mutaciju A:T → T:A na kodonu 61 gena za TP53. Ove mutacije dovode do pojave nefunkcionalnog proteina koji se dodatno akumulira u nukleusu ćelije. Progresija i razvoj promena su spori u slučaju EN-a za razliku od NAA, gde se maligne komplikacije javljaju vrlo brzo [234]. Osim mutacija TP53 gena, nekontrolisana deoba ćelije se smatra posledicom prekomerne aktivacije nekih protoonkogena, kao što je MYC onkogen. MYC gen je prekomerno eksprimi- ran u urotelijalnim tumorima, što je potvrđeno brojnim analizama. Genske analize humanog materijala su pokazale da prekomerna ekspresija gena za TP53, Rb1, Mdm2, Cdkn2a i MYC često prisutna baš u urotelijalnim karcinomima, što može biti od velikog značaja u analizi budućeg kliničkog markera oboljenja. Prekomerna ekspresija protoonkogena MYC je nađena u ćelijama tumora urotelijuma. Sličan nalaz potvrđen je u eksperimentima na tubularnim ćelija- ma nakon izlaganja toksinu aristolohijske kiseline. MYC je normalna komponenta ćelija koja učestvuje u regulaciji ćelijskog ciklusa, dok je njena prekomerna ekspresija ispoljena u tumor- skom tkivu i tokom angiogeneze. Od ostalih onkogena čija promena u ekspresiji gena značajna pri izlaganju ćelija ovim toksinom, prisutni su protoonkogeni FOS (smanjeno) i RAS (pojačano regulisan). Njihova prognostička uloga u AA1 karcinogenezi nije do kraja istražena. Dokazano je kod direknog dejstva AA1 na ćeliju, prisustvo istih mutacija u genu za protoonkogen H-ras na njegovom 61 kodonu, što dovodi do prekomerne aktivacije gena. Ove mutacije se sreću kod velikog broja humanih malignih ćelija [191, 235]. Diskusija 108 OTA i njegovi metaboliti ne vezuju se za strukture naslednog materijala kovalentnim vezama, već stvaraju abazične lezije. OTA indukuje endoreduplikaciju, vrlo kondenzovanu metafazu i abnormalno razdvajanje sestrinskih hromatida u metafazi. Endoreduplikacija podra- zumeva dve sukcesivne DNK sinteze bez ulaska ćelije u mitotičku deobu što uzrokuje formira- nje diplohromozoma i posledičnoj mitotičkoj metafazi, i nastanku tretraploidnih i poliploidnih ćelija. Poliploidne ćelije su genetski nestabilne te dolazi do random gubitka hromozoma pri sledećoj deobi i razvoj aneuploidije. Aneuploidija je čest nalaz kod ćelija humanih tumora i ka- rakteriše se visokim stepenom invazivnosti. Tetraploidne ćelije izlaze iz mitoze u odsustvu hro- mozomske segregacije ili razdvajanja citoplazme usled nedostataka ili inhibicije regulatornih mehanizama ćelijske deobe, inhibicije reorganizacije mikrotubula ili inhibicije DNK topoizo- meraze II [203, 225]. Rane promene podrazumevaju baš takvu jednu sliku, pojavu ćelija sa kariomegalijom, ogromnim nukleusom smeštenim u sredini ćelije. Ćelije sa tetraploidijom predstavljaju rani ko- rak u razvoju kancerogeneze, i formiranju aneoploidnih ćelija. OTA moze i da blokira mitozu na prelasku iz metafaze u anafazu, što može rezultovati apoptozom ćelije ili prevremenim izla- skom iz mitoze. Aberantni prekid ciklusa i prevremeni izlazak iz mitoze, objašnjava se aktiva- cijom signala za preživljavanje ćelije, preko NF-kB i EPK 1/2, koji sprečavaju nastanak apoptoze promocijom aberantnih puteva ćelijskog ciklusa. NF kapa B promoviše tranziciju iz G1 u S fazu i dozvoljava ponovni ulaz tretraploidne ćelije u ćelijski ciklus. Smatra se da je po- remećaj u sintezi i produkciji regulatora ćelijskog ciklusa, pod uticajem OTA-e, zaslužan za ovakva usporavanja i nemogućnost vršenja adekvatne mitotičke deobe. Pojava indukovanog oksidativnog stresa u ćeliji pri intoksikaciji OTA-om, i oksidativno oštećenje naslednog mate- rijala dodano može potencirati mutagene promene i nastanak maligne transformacije [88, 225]. Proteinski markeri karakteristični za metabolizam ispitivanih toksina (Eef1A1, Ndfus1, Lamin-A/C, Ube2N, ORP 150, Eif5A) na nivou ćellije, prisutni su u tkivu tumora gornjeg uro- telijuma pacijenata sa EN-om, dok su tkiva tumora gornjeg urotelijuma pacijenata koji nisu prednodno oboleli od EN-a izražavala smanjenu pozitivnost na ispitivane markere. Nalaz ovih markera ukazuje na potencijalnu ulogu toksina u razvoju komplikacija EN-a po tipu malignih lezija, i ukazuje na značaj daljih istraživanja. Nije postojala značajna razlika u ekspresiji proteina specifičnih za dejstvo određenog to- ksina (AA1 ili OTA) ispitivanih na tkivu tumora gornjeg urotelijuma pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovanog EN-a. 109  5. ZAKLJUČAK Na osnovu proteomskih istraživanja uzoraka urina 360 pacijenata i zdravih ispitanika upotrebom 2-DE, masene spektrometrije i identifikacije proteina na osnovu detektovanih pe- ptidnih spektara korišćenjem sistema pretrage u standardnim bazama podataka, i potvrđiva- njem dobijenih rezultata imunološkim ispitivanjima, mogu se izvesti sledeći zaključci: 1. Uspostavljene su proteinske mape urina pacijenata sa endemskom nefropatijom koje sa- drže signifikantne razlike u poređenju sa urinom zdravih ispitanika i obolelih od dijabe- tesne nefropatije i akutne prerenalne bubrežne insuficijencije. 2. Utvrđene su signifikantne razlike u proteomu urina zdravih ispitanika koji žive na endemskim područjima u odnosu na zdrave ispitanike iz ne-endemskih regiona 3. Prisustvo markera glomerulskog oštećenja u urinu pacijenata sa dijabetesnom nefropati- jom značajno je povišeno u odnosu na urin EN pacijenata. 4. Markeri glomerulskog oštećenja se značajnije javljaju u urinu EN pacijenata u od- maklom stadijumu bolesti u poređenju sa urinom zdravih dobrovoljaca iz endemskih područja, što pored oštećenja tubula ukazuje na dodatno oštećenje glomerula. 5. Identifikovano je šest jedinstvenih proteina (AMBP, APOH, B2M, LMAN2, POT1, SOD1) u uzorcima urina pacijenata sa endemskom nefropatijom, koji sa visokom speci- fičnošću i senzitivnošću metode diskriminišu EN od ostalih ispitivanih grupa, što ih čini dobrim dijagnostičkim markerima ovog oboljenja. 6. Nivo ekskretovanih specifičnih proteina AMBP, APOH, B2M, LMAN2, POT1 i SOD1 u urinu EN pacijenata signifikantno se povećava sa progresijom bolesti. Na osnovu proteomskih istraživanja homogenata humanih ćelija proksimalnih tubula (HK2 ćelije) nakon akutnog (72h) i hroničnog izlaganja (10, 30 i 60 dana) toksinima aristolo- hijske kiseline 1 i ohratoksina A, kao potencijalnim uzročnicima EN-a, i potvrdom dobijenih rezultata imunološkim analizama tretiranih HK2 ćelija i 60 tkivnih uzoraka tumora gornjeg urotelijuma pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovane EN, mogu se izvesti sledeći zaključci: Zaključak 110 1. Ispitivanje toksičnih efekata na HK2 ćelije toksina aristolohijske kiseline 1 i ohra- toksina A proteomskim istraživanjima potvrdilo je postojanje proteina specifičnih za metabolizam ovih toksina (AA1 (Eef1A1, Ndfus1, Lamin-A/C) ili OTA (Ube2N, ORP 150, Eif5A)) i njihovog dejstva na samu ćeliju. 2. Tokom akutnog izlaganja HK2 ćelija aristolohijskom kiselinom 1 (AA1) indukcija oksidativnog stresa (SOD2, PARK7) je signifikantna, kao i pojava fibrotičnih markera (FN1, VIM) u ćelijskom lizatu. 3. Akutno izlaganje HK2 ćelija ohratoksinom A (OTA) utiče na ekspresiju FN1 u će- lijskom lizatu, kao fibrotičnog markera ali bez značajne indukcije oksidativnog stresa. 4. Akutni kombinovani tretman HK2 ćelija AA1 i OTA toksinima indukuje povećanu produkciju fibrotičnih markera (FN1, VIM, VCL) i razvoj oksidativnog stresa (SOD2, PARK7). 5. Hronično izlaganje HK2 ćelija AA1 ili OTA toksinom dovodi do značajne ekspresije fibrotičnih markera (FN1, VIM) i razvoja oksidatinog stresa. 6. U toku dvomesečnog tretmana HK2 ćelija kombinacijom AA1 i OTA toksina, proteini koji učestvuju u odgovoru ćelije na postojanje oksidativnog stresa (SOD2, PARK7) kao i fibrotični markeri (FN1, VIM, VCL) signifikantno su povišeni. 7. HK2 ćelije u kontaktu sa toksinima produkovale su povećanu količinu ACTA2 proteina u odnosu na kontrolnu grupu prilikom akutnog i hroničnog eksperimenta pojedinačnim ili kombinovanim tretmanom AA1 i OTA. ACTA2, kao marker epitelno-mezenhimne tranzicije i fibroze, ukazuje na prisustvo ovih procesa. 8. Proteinski markeri karakteristični za metabolizam ispitivanih toksina (Eef1A1, Ndfus1, Lamin-A/C, Ube2N, ORP 150, Eif5A) na nivou ćelije prisutni su u tkivu tumora gor- njeg urotelijuma EN pacijenata, dok su tkiva tumora gornjeg urotelijuma pacijenata koji nisu predhodno oboleli od EN-a imala smanjenu pozitivnost na ispitivane markere. Na- laz ovih markera ukazuje na potencijalnu ulogu toksina u razvoju komplikacija EN-a. 9. Nije postojala značajna razlika u ekspresiji proteina specifičnih za dejstvo određenog toksina (AA1 ili OTA) ispitivanih na tkivu tumora gornjeg urotelijuma pacijenata sa i bez predhodno dijagnostifikovanog EN-a. 111  6. LITERATURA 1. Oosterlinck, W., et al., EAU guidelines on diagnosis and treatment of upper urinary tract transitional cell carcinoma. Eur Urol, 2004. 46(2): p. 147-54. 2. Oosterlinck, W., Guidelines on diagnosis and treatment of superficial bladder cancer. Minerva Urol Nefrol, 2004. 56(1): p. 65-72. 3. Oreopoulos, D., E. Thodis, and K.I. Paraskevas, The promising future of long-term peritoneal dialysis. Int Urol Nephrol, 2008. 40(2): p. 405-10. 4. Oreopoulos, D.G., S. Ossareh, and E. Thodis, Peritoneal dialysis: past, present, and future. Iran J Kidney Dis, 2008. 2(4): p. 171-82. 5. Stewart, J.H., M.R. McCredie, and S.M. Williams, Geographic, ethnic, age-related and temporal variation in the incidence of end-stage renal disease in Europe, Canada and the Asia-Pacific region, 1998-2002. Nephrol Dial Transplant, 2006. 21(8): p. 2178-83. 6. Davidson, A. and C. Aranow, Pathogenesis and treatment of systemic lupus erythematosus nephritis. Curr Opin Rheumatol, 2006. 18(5): p. 468-75. 7. Satchell, S.C. and J.E. Tooke, What is the mechanism of microalbuminuria in diabetes: a role for the glomerular endothelium? Diabetologia, 2008. 51(5): p. 714-25. 8. Makino, H., et al., Role of apoptosis in the progression of glomerulosclerosis. Contrib Nephrol, 1996. 118: p. 41-7. 9. McGrogan, A., C.F. Franssen, and C.S. de Vries, The incidence of primary glomerulonephritis worldwide: a systematic review of the literature. Nephrol Dial Transplant, 2011. 26(2): p. 414-30. 10. Troyanov, S., et al., Focal and segmental glomerulosclerosis: definition and relevance of a partial remission. J Am Soc Nephrol, 2005. 16(4): p. 1061-8. 11. Swinkels, D.W., et al., Glomerular filtration rate by single-injection inulin clearance: definition of a workable protocol for children. Ann Clin Biochem, 2000. 37 ( Pt 1): p. 60-6. 12. Robinson, B.E., Epidemiology of chronic kidney disease and anemia. J Am Med Dir Assoc, 2006. 7(9 Suppl): p. S3-6; quiz S17-21. 13. Barnes, D.J. and G.C. Viberti, Strategies for the prevention of diabetic kidney disease: early antihypertensive treatment or improved glycemic control? J Diabetes Complications, 1994. 8(3): p. 189-92. Literatura 112 14. Ritz, E., Diabetic nephropathy. Saudi J Kidney Dis Transpl, 2006. 17(4): p. 481-90. 15. Fioretto, P., et al., Renal protection in diabetes: role of glycemic control. J Am Soc Nephrol, 2006. 17(4 Suppl 2): p. S86-9. 16. Rathmann, W. and G. Giani, Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care, 2004. 27(10): p. 2568-9; author reply 2569. 17. Ritz, E. and R. Dikow, Hypertension and antihypertensive treatment of diabetic nephropathy. Nat Clin Pract Nephrol, 2006. 2(10): p. 562-7. 18. Krolewski, A.S., J.H. Warram, and L.M. Laffel, Genetic susceptibility to diabetic nephropathy. Adv Nephrol Necker Hosp, 1992. 21: p. 69-81. 19. Mogensen, C.E. and C.K. Christensen, Blood pressure changes and renal function in incipient and overt diabetic nephropathy. Hypertension, 1985. 7(6 Pt 2): p. II64-73. 20. Bell, D.S., Hypertension and diabetes: a toxic combination. Endocr Pract, 2008. 14(8): p. 1031-9. 21. Anderson, S., Role of local and systemic angiotensin in diabetic renal disease. Kidney Int Suppl, 1997. 63: p. S107-10. 22. Kennefick, T.M. and S. Anderson, Role of angiotensin II in diabetic nephropathy. Semin Nephrol, 1997. 17(5): p. 441-7. 23. Adler, S.G., et al., Glomerular mRNAs in human type 1 diabetes: biochemical evidence for microalbuminuria as a manifestation of diabetic nephropathy. Kidney Int, 2001. 60(6): p. 2330-6. 24. Remuzzi, G. and T. Bertani, Is glomerulosclerosis a consequence of altered glomerular permeability to macromolecules? Kidney Int, 1990. 38(3): p. 384-94. 25. Sugiyama, S., et al., Advanced glycation end-products in diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant, 1996. 11 Suppl 5: p. 91-4. 26. Samuelsson, O., et al., Apolipoprotein-B-containing lipoproteins and the progression of renal insufficiency. Nephron, 1993. 63(3): p. 279-85. 27. Attman, P.O., et al., Dyslipoproteinemia in diabetic renal failure. Kidney Int, 1992. 42(6): p. 1381-9. 28. Chase, H.P., et al., Cigarette smoking increases the risk of albuminuria among subjects with type I diabetes. JAMA, 1991. 265(5): p. 614-7. 29. Mason, R.M. and N.A. Wahab, Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol, 2003. 14(5): p. 1358-73. Literatura 113 30. Greene, D.A., S.A. Lattimer, and A.A. Sima, Sorbitol, phosphoinositides, and sodium- potassium-ATPase in the pathogenesis of diabetic complications. N Engl J Med, 1987. 316(10): p. 599-606. 31. Brownlee, M., Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature, 2001. 414(6865): p. 813-20. 32. Lee, T.S., et al., Activation of protein kinase C by elevation of glucose concentration: proposal for a mechanism in the development of diabetic vascular complications. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(13): p. 5141-5. 33. Hunt, J.V., C.C. Smith, and S.P. Wolff, Autoxidative glycosylation and possible involvement of peroxides and free radicals in LDL modification by glucose. Diabetes, 1990. 39(11): p. 1420-4. 34. Brownlee, M., A. Cerami, and H. Vlassara, Advanced glycosylation end products in tissue and the biochemical basis of diabetic complications. N Engl J Med, 1988. 318(20): p. 1315-21. 35. Border, W.A. and N.A. Noble, Interactions of transforming growth factor-beta and angiotensin II in renal fibrosis. Hypertension, 1998. 31(1 Pt 2): p. 181-8. 36. Twigg, S.M., et al., Connective tissue growth factor/IGF-binding protein-related protein- 2 is a mediator in the induction of fibronectin by advanced glycosylation end-products in human dermal fibroblasts. Endocrinology, 2002. 143(4): p. 1260-9. 37. Osterby, R., Renal changes in the diabetic kidney. Nephrol Dial Transplant, 1997. 12(6): p. 1282-3. 38. Mogensen, C.E., et al., Prevention of diabetic renal disease with special reference to microalbuminuria. Lancet, 1995. 346(8982): p. 1080-4. 39. Norden, A.G., et al., Tubular proteinuria defined by a study of Dent's (CLCN5 mutation) and other tubular diseases. Kidney Int, 2000. 57(1): p. 240-9. 40. Praga, M. and E. Gonzalez, Acute interstitial nephritis. Kidney Int, 2010. 77(11): p. 956-61. 41. Palm, F. and L. Nordquist, Renal Tubulointerstitial Hypoxia: Cause and Consequence of Kidney Dysunction. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2011. (u štampi) 42. Stefanovic, V. and M. Polenakovic, Fifty years of research in Balkan endemic nephropathy: where are we now? Nephron Clin Pract, 2009. 112(2): p. c51-6. 43. Bukvic, D., et al., Prevalence of Balkan endemic nephropathy has not changed since 1971 in the Kolubara region in Serbia. Kidney Blood Press Res, 2007. 30(2): p. 117-23. 44. Dimitrov, P.S., et al., Is the incidence of Balkan endemic nephropathy decreasing? Pathol Biol (Paris), 2002. 50(1): p. 38-41. Literatura 114 45. Dimitrov, P.S., V.A. Simeonov, and A.D. Stein, Balkan endemic nephropathy in Vratza, Bulgaria, 1964-1987: an epidemiologic analysis of population-based disease registers. Eur J Epidemiol, 2001. 17(9): p. 847-53. 46. Stefanovic, V., et al., Fifty years of Balkan endemic nephropathy: challenges of study using epidemiological method. Ren Fail, 2009. 31(5): p. 409-18. 47. Radic, B., et al., Ochratoxin A in human sera in the area with endemic nephropathy in Croatia. Toxicol Lett, 1997. 91(2): p. 105-9. 48. Fuchs, R. and M. Peraica, Ochratoxin A in human kidney diseases. Food Addit Contam, 2005. 22 Suppl 1: p. 53-7. 49. Vrabcheva, T., et al., Analysis of ochratoxin A in foods consumed by inhabitants from an area with balkan endemic nephropathy: a 1 month follow-up study. J Agric Food Chem, 2004. 52(8): p. 2404-10. 50. Peraica, M., A.M. Domijan, and M. Saric, Mycotoxic and aristolochic acid theories of the development of endemic nephropathy. Arh Hig Rada Toksikol, 2008. 59(1): p. 59-65. 51. Stefanovic, V., et al., Etiology of Balkan endemic nephropathy and associated urothelial cancer. Am J Nephrol, 2006. 26(1): p. 1-11. 52. Arsenovic, A., et al., Detection of renal dysfunctions in family members of patients with Balkan endemic nephropathy. Am J Nephrol, 2005. 25(1): p. 50-4. 53. Niagolova, N., et al., Nitrogen species in drinking water indicate potential exposure pathway for Balkan Endemic Nephropathy. Environ Pollut, 2005. 134(2): p. 229-37. 54. Atanasova, S., et al., MDR1 haplotypes modify BEN disease risk: a study in Bulgarian patients with Balkan endemic nephropathy compared to healthy controls. Nephron Exp Nephrol, 2004. 96(1): p. e7-13. 55. Petronic, V. and M. Savin, Apoptosis and p53 status of the upper urothelial carcinomas from Balkan endemic nephropathy regions. Nephrol Dial Transplant, 2001. 16 Suppl 6: p. 33-5. 56. Jelakovic, B., et al., Antibodies to Tamm-Horsfall protein in endemic nephropathy. Nephrol Dial Transplant, 1999. 14(11): p. 2645-9. 57. Tatu, C.A., et al., The etiology of Balkan endemic nephropathy: still more questions than answers. Environ Health Perspect, 1998. 106(11): p. 689-700. 58. Stefanovic, V., Balkan endemic nephropathy: a need for novel aetiological approaches. QJM, 1998. 91(7): p. 457-63. 59. Toncheva, D., T. Dimitrov, and S. Stojanova, Etiology of Balkan endemic nephropathy: a multifactorial disease? Eur J Epidemiol, 1998. 14(4): p. 389-94. Literatura 115 60. Nedelko, T., et al., TP53 mutation signature supports involvement of aristolochic acid in the aetiology of endemic nephropathy-associated tumours. Int J Cancer, 2009. 124(4): p. 987-90. 61. Zivcic-Cosic, S., et al., Urothelial cancer in patients with Endemic Balkan Nephropathy (EN) after renal transplantation. Ren Fail, 2007. 29(7): p. 861-5. 62. Long, D.T. and T.C. Voice, Role of exposure analysis in solving the mystery of Balkan endemic nephropathy. Croat Med J, 2007. 48(3): p. 300-11. 63. Stefanovic, V. and Z. Radovanovic, Balkan endemic nephropathy and associated urothelial cancer. Nat Clin Pract Urol, 2008. 5(2): p. 105-12. 64. Lezaic, V., et al., Comparison of kidney size between patients with Balkan endemic nephropathy and other kidney diseases. Kidney Blood Press Res, 2008. 31(5): p. 307-12. 65. Mantle, P.G., et al., Does apoptosis cause renal atrophy in Balkan endemic nephropathy? Lancet, 1998. 352(9134): p. 1118-9. 66. Stefanovic, V., et al., Diagnostic criteria for Balkan endemic nephropathy: proposal by an international panel. Ren Fail, 2007. 29(7): p. 867-80. 67. Stefanovic, V., et al., Increased urinary albumin excretion in children from families with Balkan nephropathy. Pediatr Nephrol, 2002. 17(11): p. 913-6. 68. Cvoriscec, D., Early diagnosis of endemic nephropathy. Clin Chim Acta, 2000. 297(1-2): p. 85-91. 69. Dimitrov, P.S., et al., Increased blood pressure in adult offspring of families with Balkan endemic nephropathy: a prospective study. BMC Nephrol, 2006. 7: p. 12. 70. Djukanovic, L., et al., Contribution to the definition of diagnostic criteria for Balkan endemic nephropathy. Nephrol Dial Transplant, 2008. 23(12): p. 3932-8. 71. Dimitrov, P., et al., Clinical markers in adult offspring of families with and without Balkan Endemic Nephropathy. Kidney Int, 2006. 69(4): p. 723-9. 72. Stefanovic, V., et al., Beta2-microglobulin and alpha1-microglobulin as markers of Balkan endemic nephropathy, a worldwide disease. Ren Fail, 2011. 33(2): p. 176-83. 73. Imamovic, G., et al., Microalbuminuria as a possible marker of risk of Balkan endemic nephropathy. Nephrology (Carlton), 2008. 13(7): p. 616-21. 74. Vanherweghem, J.L., et al., Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. Lancet, 1993. 341(8842): p. 387-91. 75. Vanhaelen, M., et al., Identification of aristolochic acid in Chinese herbs. Lancet, 1994. 343(8890): p. 174. Literatura 116 76. Solez, K., et al., Is "Chinese herbs nephropathy" a prejudicial term? Am J Kidney Dis, 2001. 38(5): p. 1141-2. 77. Stiborova, M., et al., Expression of cytochrome P450 1A1 and its contribution to oxidation of a potential human carcinogen 1-phenylazo-2-naphthol (Sudan I) in human livers. Cancer Lett, 2005. 220(2): p. 145-54. 78. Cheng, C.L., et al., Chronic renal failure rats are highly sensitive to aristolochic acids, which are nephrotoxic and carcinogenic agents. Cancer Lett, 2006. 232(2): p. 236-42. 79. Wang, Y., et al., TGF-beta1/Smad7 signaling stimulates renal tubulointerstitial fibrosis induced by AAI. J Recept Signal Transduct Res, 2008. 28(4): p. 413-28. 80. Yang, L., X. Li, and H. Wang, Possible mechanisms explaining the tendency towards interstitial fibrosis in aristolochic acid-induced acute tubular necrosis. Nephrol Dial Transplant, 2007. 22(2): p. 445-56. 81. Wen, Y.J., et al., Cytotoxicity of phenanthrenes extracted from Aristolochia contorta in human proximal tubular epithelial cell line. Nephron Exp Nephrol, 2006. 103(3): p. e95-e102. 82. Stiborova, M., et al., Human enzymes involved in the metabolic activation of carcinogenic aristolochic acids: evidence for reductive activation by cytochromes P450 1A1 and 1A2. Chem Res Toxicol, 2001. 14(8): p. 1128-37. 83. Wu, K., et al., Genotoxic effect and nitrative DNA damage in HepG2 cells exposed to aristolochic acid. Mutat Res, 2007. 630(1-2): p. 97-102. 84. Shibutani, S., et al., Selective toxicity of aristolochic acids I and II. Drug Metab Dispos, 2007. 35(7): p. 1217-22. 85. Tafani, M., et al., Cytochrome c-dependent activation of caspase-3 by tumor necrosis factor requires induction of the mitochondrial permeability transition. Am J Pathol, 2000. 156(6): p. 2111-21. 86. Ferguson, L.R., Role of dietary mutagens in cancer and atherosclerosis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2009. 12(4): p. 343-9. 87. Pfohl-Leszkowicz, A., et al., New molecular and field evidences for the implication of mycotoxins but not aristolochic acid in human nephropathy and urinary tract tumor. Mol Nutr Food Res, 2007. 51(9): p. 1131-46. 88. Pfohl-Leszkowicz, A. and R.A. Manderville, Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans. Mol Nutr Food Res, 2007. 51(1): p. 61-99. 89. Petkova-Bocharova, T. and M. Castegnaro, Ochratoxin A in human blood in relation to Balkan endemic nephropathy and urinary tract tumours in Bulgaria. IARC Sci Publ, 1991(115): p. 135-7. Literatura 117 90. Dirheimer, G., R. Roschenthaler, and E. Creppy, [Mechanism of action of ochratoxin A, probable agent of endemic Balkan nephropathy]. Bull Acad Natl Med, 1983. 167(1): p. 67-74. 91. Martin, R.K., Acute kidney injury: advances in definition, pathophysiology, and diagnosis. AACN Adv Crit Care, 2010. 21(4): p. 350-6. 92. Hoste, E.A., et al., Epidemiology of acute kidney injury. Contrib Nephrol, 2010. 165: p. 1-8. 93. Choker, G. and J.B. Gouyon, Diagnosis of acute renal failure in very preterm infants. Biol Neonate, 2004. 86(3): p. 212-6. 94. Devarajan, P., Proteomics for biomarker discovery in acute kidney injury. Semin Nephrol, 2007. 27(6): p. 637-51. 95. Lameire, N., W. Van Biesen, and R. Vanholder, Acute renal failure. Lancet, 2005. 365(9457): p. 417-30. 96. Muller, G.A., C.A. Muller, and H. Dihazi, Clinical proteomics--on the long way from bench to bedside? Nephrol Dial Transplant, 2007. 22(5): p. 1297-300. 97. Dihazi, H. and G.A. Muller, Urinary proteomics: a tool to discover biomarkers of kidney diseases. Expert Rev Proteomics, 2007. 4(1): p. 39-50. 98. Dihazi, H., et al., Whole cell profiling and identification of galectin-1 as a potential marker of renal cell carcinoma. Proteomics Clin Appl, 2007. 1(2): p. 200-14. 99. Eltoweissy, M., et al., Proteomics analysis identifies PARK7 as an important player for renal cell resistance and survival under oxidative stress. Mol Biosyst, 2011. 7(4): p. 1277-88. 100. Wessel, D. and U.I. Flugge, A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem, 1984. 138(1): p. 141-3. 101. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54. 102. Dihazi, H., et al., Proteomic analysis of cellular response to osmotic stress in thick ascending limb of Henle's loop (TALH) cells. Mol Cell Proteomics, 2005. 4(10): p. 1445-58. 103. Dihazi, H., et al., Multipotent adult germline stem cells and embryonic stem cells: comparative proteomic approach. J Proteome Res, 2009. 8(12): p. 5497-510. 104. Jahn, O., et al., Technical innovations for the automated identification of gel-separated proteins by MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Bioanal Chem, 2006. 386(1): p. 92-103. 105. Werner, H.B., et al., Proteolipid protein is required for transport of sirtuin 2 into CNS myelin. J Neurosci, 2007. 27(29): p. 7717-30. Literatura 118 106. Reumann, S., et al., Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. Plant Cell, 2007. 19(10): p. 3170-93. 107. Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology, 1992. 24: p. 145-9. 108. Pitarch, A., C. Nombela, and C. Gil, Prediction of the Clinical Outcome in Invasive Candidiasis Patients Based on Molecular Fingerprints of Five Anti-Candida Antibodies in Serum. Mol Cell Proteomics, 2011. 10(1): M11. 109. Dihazi, H., et al., Proteomics characterization of cell model with renal fibrosis phenotype: osmotic stress as fibrosis triggering factor. J Proteomics, 2011. 74(3): p. 304-18. 110. Soderland, P., et al., Chronic kidney disease associated with environmental toxins and exposures. Adv Chronic Kidney Dis. 17(3): p. 254-64. 111. Schiller, A., et al., Balkan endemic nephropathy: a still unsolved puzzle. J Nephrol, 2008. 21(5): p. 673-80. 112. Bamias, G. and J. Boletis, Balkan nephropathy: evolution of our knowledge. Am J Kidney Dis, 2008. 52(3): p. 606-16. 113. Djukanovic, L., et al., Open questions on Balkan nephropathy. Nephrol Dial Transplant, 2001. 16 Suppl 6: p. 27-9. 114. Arlt, V.M., et al., Is aristolochic acid a risk factor for Balkan endemic nephropathy- associated urothelial cancer? Int J Cancer, 2002. 101(5): p. 500-2. 115. Miletic-Medved, M., A.M. Domijan, and M. Peraica, Recent data on endemic nephropathy and related urothelial tumors in Croatia. Wien Klin Wochenschr, 2005. 117(17): p. 604-9. 116. Ivic, M., [Etiology of endemic nephropathy]. Lijec Vjesn, 1969. 91(12): p. 1273-81. 117. Grollman, A.P., et al., Aristolochic acid and the etiology of endemic (Balkan) nephropathy. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(29): p. 12129-34. 118. Wogan, G.N., et al., Environmental and chemical carcinogenesis. Semin Cancer Biol, 2004. 14(6): p. 473-86. 119. Pfohl-Leszkowicz, A., et al., Balkan endemic nephropathy and associated urinary tract tumours: a review on aetiological causes and the potential role of mycotoxins. Food Addit Contam, 2002. 19(3): p. 282-302. 120. Toncheva, D., et al., Urinary neopterin concentrations in patients with Balkan endemic nephropathy (BEN). Kidney Int, 2003. 64(5): p. 1817-21. Literatura 119 121. Toncheva, D. and T. Dimitrov, Genetic predisposition to Balkan endemic nephropathy. Nephron, 1996. 72(4): p. 564-9. 122. Stefanovic, V., et al., Tubular marker excretion in children from families with Balkan nephropathy. Pediatr Nephrol, 2009. 24(11): p. 2155-66. 123. Stefanovic, V., et al., Beta 2-microglobulin in patients with Balkan nephropathy and in healthy members of their families. Kidney Int Suppl, 1991. 34: p. S21-6. 124. Saha, S., et al., HIP2: an online database of human plasma proteins from healthy individuals. BMC Med Genomics, 2008. 1: p. 12. 125. Coon, J.J., et al., CE-MS analysis of the human urinary proteome for biomarker discovery and disease diagnostics. Proteomics Clin Appl, 2008. 2(7-8): p. 964. 126. Bellei, E., et al., Proteomic analysis of early urinary biomarkers of renal changes in type 2 diabetic patients. Proteomics Clin Appl, 2008. 2(4): p. 478-91. 127. Ben Ameur, R., et al., Proteomic approaches for discovering biomarkers of diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant. 25(9): p. 2866-75. 128. Rao, P.V., et al., Proteomic identification of urinary biomarkers of diabetic nephropathy. Diabetes Care, 2007. 30(3): p. 629-37. 129. Stefanovic, V., et al., Beta2-microglobulin and alpha1-microglobulin as markers of balkan endemic nephropathy, a worldwide disease. Ren Fail. 33(2): p. 176-83. 130. Donadio, C., Serum and urinary markers of early impairment of GFR in chronic kidney disease patients: diagnostic accuracy of urinary beta-trace protein. Am J Physiol Renal Physiol. 299(6): p. F1407-23. 131. Meijer, E., et al., Association of urinary biomarkers with disease severity in patients with autosomal dominant polycystic kidney disease: a cross-sectional analysis. Am J Kidney Dis. 56(5): p. 883-95. 132. Metzger, J., et al., Urinary excretion of twenty peptides forms an early and accurate diagnostic pattern of acute kidney injury. Kidney Int. 78(12): p. 1252-62. 133. Oetting, W.S., et al., Urinary beta2-microglobulin is associated with acute renal allograft rejection. Am J Kidney Dis, 2006. 47(5): p. 898-904. 134. Batuman, V., Possible pathogenetic role of low-molecular-weight proteins in Balkan nephropathy. Kidney Int Suppl, 1991. 34: p. S89-92. 135. Gussow, D., et al., The human beta 2-microglobulin gene. Primary structure and definition of the transcriptional unit. J Immunol, 1987. 139(9): p. 3132-8. Literatura 120 136. Reisinger, P., et al., Human inter-alpha-trypsin inhibitor: localization of the Kunitz-type domains in the N-terminal part of the molecule and their release by a trypsin-like proteinase. Biol Chem Hoppe Seyler, 1985. 366(5): p. 479-83. 137. Flynn, F.V., et al., Urinary excretion of beta 2-glycoprotein-1 (apolipoprotein H) and other markers of tubular malfunction in "non-tubular" renal disease. J Clin Pathol, 1992. 45(7): p. 561-7. 138. Averna, M., et al., Liver is not the unique site of synthesis of beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H): evidence for an intestinal localization. Int J Clin Lab Res, 1997. 27(3): p. 207-12. 139. Baumann, P., E. Podell, and T.R. Cech, Human Pot1 (protection of telomeres) protein: cytolocalization, gene structure, and alternative splicing. Mol Cell Biol, 2002. 22(22): p. 8079-87. 140. Zelko, I.N., T.J. Mariani, and R.J. Folz, Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression. Free Radic Biol Med, 2002. 33(3): p. 337-49. 141. Banci, L., et al., Solution structure of Apo Cu,Zn superoxide dismutase: role of metal ions in protein folding. Biochemistry, 2003. 42(32): p. 9543-53. 142. Fiedler, K. and K. Simons, A putative novel class of animal lectins in the secretory pathway homologous to leguminous lectins. Cell, 1994. 77(5): p. 625-6. 143. Neve, E.P., et al., VIPL, a VIP36-like membrane protein with a putative function in the export of glycoproteins from the endoplasmic reticulum. Exp Cell Res, 2003. 288(1): p. 70-83. 144. Roos, A., et al., Mannose-binding lectin and the kidney. Nephrol Dial Transplant, 2007. 22(12): p. 3370-7. 145. Vlahou, A., et al., Establishment of a European Network for Urine and Kidney Proteomics. J Proteomics, 2008. 71(4): p. 490-2. 146. Giacco, F. and M. Brownlee, Oxidative stress and diabetic complications. Circ Res, 2010. 107(9): p. 1058-70. 147. Pisitkun, T., R.F. Shen, and M.A. Knepper, Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(36): p. 13368-73. 148. Choudhury, D., M. Tuncel, and M. Levi, Diabetic nephropathy -- a multifaceted target of new therapies. Discov Med, 2010. 10(54): p. 406-15. 149. Watanabe, H., et al., Urinary excretion of type IV collagen as a specific indicator of the progression of diabetic nephropathy. Nephron, 2000. 86(1): p. 27-35. Literatura 121 150. Takahashi, M., Increased urinary fibronectin excretion in type II diabetic patients with microalbuminuria. Nippon Jinzo Gakkai Shi, 1995. 37(6): p. 336-42. 151. Sharma, K., et al., Increased renal production of transforming growth factor-beta1 in patients with type II diabetes. Diabetes, 1997. 46(5): p. 854-9. 152. Riser, B.L., et al., Urinary CCN2 (CTGF) as a possible predictor of diabetic nephropathy: preliminary report. Kidney Int, 2003. 64(2): p. 451-8. 153. Kim, N.H., et al., Plasma and urinary vascular endothelial growth factor and diabetic nephropathy in Type 2 diabetes mellitus. Diabet Med, 2004. 21(6): p. 545-51. 154. Jain, S., et al., Proteomic analysis of urinary protein markers for accurate prediction of diabetic kidney disorder. J Assoc Physicians India, 2005. 53: p. 513-20. 155. Unlu, M., M.E. Morgan, and J.S. Minden, Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis, 1997. 18(11): p. 2071-7. 156. Sharma, K., et al., Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis analysis of the urine proteome in human diabetic nephropathy. Proteomics, 2005. 5(10): p. 2648-55. 157. Castagna, A., et al., Exploring the hidden human urinary proteome via ligand library beads. J Proteome Res, 2005. 4(6): p. 1917-30. 158. Mischak, H., et al., Proteomic analysis for the assessment of diabetic renal damage in humans. Clin Sci (Lond), 2004. 107(5): p. 485-95. 159. Rossing, K., et al., Impact of diabetic nephropathy and angiotensin II receptor blockade on urinary polypeptide patterns. Kidney Int, 2005. 68(1): p. 193-205. 160. Sharma, K., et al., Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis analysis of the urine proteome in human diabetic nephropathy. Proteomics, 2005. 5(10): p. 2648-55. 161. Kragh-Hansen, U., V.T. Chuang, and M. Otagiri, Practical aspects of the ligand-binding and enzymatic properties of human serum albumin. Biol Pharm Bull, 2002. 25(6): p. 695-704. 162. Kalsheker, N., Alpha 1-antitrypsin: structure, function and molecular biology of the gene. Biosci Rep, 1989. 9(2): p. 129-38. 163. Bensi, G., et al., Structure and expression of the human haptoglobin locus. EMBO J, 1985. 4(1): p. 119-26. 164. Liu, T., et al., Human plasma N-glycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction, hydrazide chemistry, and mass spectrometry. J Proteome Res, 2005. 4(6): p. 2070-80. 165. Kiernan, U.A., et al., Comparative phenotypic analyses of human plasma and urinary retinol binding protein using mass spectrometric immunoassay. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 297(2): p. 401-5. Literatura 122 166. Yang, F., et al., The vitamin D-binding protein gene contains conserved nucleotide sequences that respond to heavy metal, adipocyte and mitotic signals. Gene, 1987. 54(2-3): p. 285-90. 167. Chung, C.M., et al., Biophysical analysis of normal transthyretin: implications for fibril formation in senile systemic amyloidosis. Amyloid, 2001. 8(2): p. 75-83. 168. Monaco, H.L., Three-dimensional structure of the transthyretin-retinol-binding protein complex. Clin Chem Lab Med, 2002. 40(12): p. 1229-36. 169. Schwaeble, W., et al., Human complement factor B: functional properties of a recombinant zymogen of the alternative activation pathway convertase. Immunobiology, 1993. 188(3): p. 221-32. 170. Perry, J.J., et al., Contribution of human manganese superoxide dismutase tyrosine 34 to structure and catalysis. Biochemistry, 2009. 48(15): p. 3417-24. 171. Wojcik, M., I. Burzynska-Pedziwiatr, and L.A. Wozniak, A review of natural and synthetic antioxidants important for health and longevity. Curr Med Chem, 2010. 17(28): p. 3262-88. 172. Honbou, K., et al., The crystal structure of DJ-1, a protein related to male fertility and Parkinson's disease. J Biol Chem, 2003. 278(33): p. 31380-4. 173. Zhong, N., et al., DJ-1 transcriptionally up-regulates the human tyrosine hydroxylase by inhibiting the sumoylation of pyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor. J Biol Chem, 2006. 281(30): p. 20940-8. 174. Xu, J., et al., The Parkinson's disease-associated DJ-1 protein is a transcriptional co- activator that protects against neuronal apoptosis. Hum Mol Genet, 2005. 14(9): p. 1231-41. 175. Thomas, K.J. and M.R. Cookson, The role of PTEN-induced kinase 1 in mitochondrial dysfunction and dynamics. Int J Biochem Cell Biol, 2009. 41(10): p. 2025-35. 176. Molina, H., et al., Global proteomic profiling of phosphopeptides using electron transfer dissociation tandem mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(7): p. 2199-204. 177. Chevallet, M., et al., Regeneration of peroxiredoxins during recovery after oxidative stress: only some overoxidized peroxiredoxins can be reduced during recovery after oxidative stress. J Biol Chem, 2003. 278(39): p. 37146-53. 178. Shang, F. and A. Taylor, Ubiquitin-proteasome pathway and cellular responses to oxidative stress. Free Radic Biol Med, 2011. (u štampi) 179. Mittler, R., Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci, 2002. 7(9): p. 405-10. Literatura 123 180. Wu, H.Z., et al., Proteomics investigation on aristolochic acid nephropathy: a case study on rat kidney tissues. Anal Bioanal Chem, 2011. 399(10): p. 3431-9. 181. Pantopoulos, K., G. Weiss, and M.W. Hentze, Nitric oxide and oxidative stress (H2O2) control mammalian iron metabolism by different pathways. Mol Cell Biol, 1996. 16(7): p. 3781-8. 182. Li, Y., et al., Aristolochic acid I-induced DNA damage and cell cycle arrest in renal tubular epithelial cells in vitro. Arch Toxicol, 2006. 80(8): p. 524-32. 183. Kornblihtt, A.R., K. Vibe-Pedersen, and F.E. Baralle, Human fibronectin: cell specific alternative mRNA splicing generates polypeptide chains differing in the number of internal repeats. Nucleic Acids Res, 1984. 12(14): p. 5853-68. 184. Pataki, A., E. Madarasz, and I. Kurucz, Fibronectin quantification without antibodies: a bioassay for the detection of the gelatin-captured macromolecule. J Biochem Biophys Methods, 2006. 68(2): p. 113-26. 185. Eriksson, J.E., et al., Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci, 2004. 117(Pt 6): p. 919-32. 186. Herrmann, H. and U. Aebi, Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem, 1998. 31: p. 319-62. 187. Olsen, J.V., et al., Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell, 2006. 127(3): p. 635-48. 188. Li, Z.L., et al., Human desmin-coding gene: complete nucleotide sequence, characterization and regulation of expression during myogenesis and development. Gene, 1989. 78(2): p. 243-54. 189. Guo, D.C., et al., Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet, 2007. 39(12): p. 1488-93. 190. Huang, N.F., et al., Biophysical and chemical effects of fibrin on mesenchymal stromal cell gene expression. Acta Biomater, 2010. 6(10): p. 3947-56. 191. Stiborova, M., et al., The role of biotransformation enzymes in the development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid: urgent questions and difficult answers. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 2009. 153(1): p. 5-11. 192. Allen, P.G. and J.M. Kolesar, NAD(P)H: quinone oxidoreductase enhances proliferation inhibition by 4-hydroxytamoxifen. Anticancer Res, 2002. 22(3): p. 1475-80. 193. Lord, G.M., et al., DNA adducts and p53 mutations in a patient with aristolochic acid- associated nephropathy. Am J Kidney Dis, 2004. 43(4): p. e11-7. Literatura 124 194. Slade, N., et al., p53 mutations as fingerprints for aristolochic acid: an environmental carcinogen in endemic (Balkan) nephropathy. Mutat Res, 2009. 663(1-2): p. 1-6. 195. Nortier, J.L., et al., Urothelial carcinoma associated with the use of a Chinese herb (Aristolochia fangchi). N Engl J Med, 2000. 342(23): p. 1686-92. 196. Simoes, M.L., et al., Gene expression profiles modulated by the human carcinogen aristolochic acid I in human cancer cells and their dependence on TP53. Toxicol Appl Pharmacol, 2008. 232(1): p. 86-98. 197. Feldmeyer, N., et al., Further studies with a cell immortalization assay to investigate the mutation signature of aristolochic acid in human p53 sequences. Mutat Res, 2006. 608(2): p. 163-8. 198. Bischoff, C., et al., The human elongation factor 1 A-2 gene (EEF1A2): complete sequence and characterization of gene structure and promoter activity. Genomics, 2000. 68(1): p. 63-70. 199. Lazarou, M., et al., Analysis of the assembly profiles for mitochondrial- and nuclear- DNA-encoded subunits into complex I. Mol Cell Biol, 2007. 27(12): p. 4228-37. 200. Muralikrishna, B., et al., Distinct changes in intranuclear lamin A/C organization during myoblast differentiation. J Cell Sci, 2001. 114(Pt 22): p. 4001-11. 201. Moir, R.D. and T.P. Spann, The structure and function of nuclear lamins: implications for disease. Cell Mol Life Sci, 2001. 58(12-13): p. 1748-57. 202. Arbillaga, L., et al., Oxidative DNA damage induced by Ochratoxin A in the HK-2 human kidney cell line: evidence of the relationship with cytotoxicity. Mutagenesis, 2007. 22(1): p. 35-42. 203. Mally, A., et al., Ochratoxin a causes DNA damage and cytogenetic effects but no DNA adducts in rats. Chem Res Toxicol, 2005. 18(8): p. 1253-61. 204. Marin-Kuan, M., et al., A toxicogenomics approach to identify new plausible epigenetic mechanisms of ochratoxin a carcinogenicity in rat. Toxicol Sci, 2006. 89(1): p. 120-34. 205. Cavin, C., et al., Reduction in antioxidant defenses may contribute to ochratoxin A toxicity and carcinogenicity. Toxicol Sci, 2007. 96(1): p. 30-9. 206. Gautier, J., et al., Metabolism of ochratoxin A: absence of formation of genotoxic derivatives by human and rat enzymes. Chem Res Toxicol, 2001. 14(1): p. 34-45. 207. Omar, R.F. and A.D. Rahimtula, Possible role of an iron-oxygen complex in 4(S)-4- hydroxyochratoxin a formation by rat liver microsomes. Biochem Pharmacol, 1993. 46(11): p. 2073-81. 208. Marin-Kuan, M., et al., Ochratoxin A carcinogenicity involves a complex network of epigenetic mechanisms. Toxicon, 2008. 52(2): p. 195-202. Literatura 125 209. Delatour, T., et al., Absence of 2'-deoxyguanosine-carbon 8-bound ochratoxin A adduct in rat kidney DNA monitored by isotope dilution LC-MS/MS. Mol Nutr Food Res, 2008. 52(4): p. 472-82. 210. Soyoz, M., et al., The effects of ochratoxin A on lipid peroxidation and antioxidant enzymes: a protective role of melatonin. Cell Biol Toxicol, 2004. 20(4): p. 213-9. 211. Sutken, E., et al., Protective role of melatonin and coenzyme Q10 in ochratoxin A toxicity in rat liver and kidney. Int J Toxicol, 2007. 26(1): p. 81-7. 212. Meki, A.R. and A.A. Hussein, Melatonin reduces oxidative stress induced by ochratoxin A in rat liver and kidney. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2001. 130(3): p. 305-13. 213. Creppy, E.E., I. Baudrimont, and M. Anne, How aspartame prevents the toxicity of ochratoxin A. J Toxicol Sci, 1998. 23 Suppl 2: p. 165-72. 214. Sauvant, C., H. Holzinger, and M. Gekle, The nephrotoxin ochratoxin A induces key parameters of chronic interstitial nephropathy in renal proximal tubular cells. Cell Physiol Biochem, 2005. 15(1-4): p. 125-34. 215. Sauvant, C., et al., Exposure to nephrotoxic ochratoxin A enhances collagen secretion in human renal proximal tubular cells. Mol Nutr Food Res, 2005. 49(1): p. 31-7. 216. Schwerdt, G., et al., Long-term effects of ochratoxin A on fibrosis and cell death in human proximal tubule or fibroblast cells in primary culture. Toxicology, 2007. 232(1- 2): p. 57-67. 217. Al-Anati, L. and E. Petzinger, Immunotoxic activity of ochratoxin A. J Vet Pharmacol Ther, 2006. 29(2): p. 79-90. 218. Klaunig, J.E. and L.M. Kamendulis, The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2004. 44: p. 239-67. 219. Cohen, S.M., et al., Evaluating the human relevance of chemically induced animal tumors. Toxicol Sci, 2004. 78(2): p. 181-6. 220. Dai, J., et al., Detection and characterization of a glutathione conjugate of ochratoxin A. Chem Res Toxicol, 2002. 15(12): p. 1581-8. 221. Brow, M.E., et al., Photochemically catalyzed reaction of ochratoxin A with D- and L- cysteine. Photochem Photobiol, 2002. 76(6): p. 649-56. 222. Mally, A. and W. Dekant, Mycotoxins and the kidney: modes of action for renal tumor formation by ochratoxin A in rodents. Mol Nutr Food Res, 2009. 53(4): p. 467-78. 223. Gekle, M., et al., Ochratoxin A induces JNK activation and apoptosis in MDCK-C7 cells at nanomolar concentrations. J Pharmacol Exp Ther, 2000. 293(3): p. 837-44. Literatura 126 224. Horvath, A., et al., Determination of the epigenetic effects of ochratoxin in a human kidney and a rat liver epithelial cell line. Toxicon, 2002. 40(3): p. 273-82. 225. Kamp, H.G., et al., Ochratoxin A: induction of (oxidative) DNA damage, cytotoxicity and apoptosis in mammalian cell lines and primary cells. Toxicology, 2005. 206(3): p. 413-25. 226. Hanif, N.Q., et al., Clinico-pathomorphological, serum biochemical and histological studies in broilers fed ochratoxin A and a toxin deactivator (Mycofix Plus). Br Poult Sci, 2008. 49(5): p. 632-42. 227. Habelhah, H., et al., Ubiquitination and translocation of TRAF2 is required for activation of JNK but not of p38 or NF-kappaB. EMBO J, 2004. 23(2): p. 322-32. 228. Pruneda, J.N., et al., Ubiquitin in motion: structural studies of the ubiquitin-conjugating enzyme approximately ubiquitin conjugate. Biochemistry, 2011. 50(10): p. 1624-33. 229. Kobayashi, J., et al., Current topics in DNA double-strand break repair. J Radiat Res (Tokyo), 2008. 49(2): p. 93-103. 230. Stojadinovic, A., et al., HYOU1/Orp150 expression in breast cancer. Med Sci Monit, 2007. 13(11): p. BR231-239. 231. Taylor, C.A., et al., Eukaryotic translation initiation factor 5A induces apoptosis in colon cancer cells and associates with the nucleus in response to tumour necrosis factor alpha signalling. Exp Cell Res, 2007. 313(3): p. 437-49. 232. Park, M.H., et al., Functional significance of eIF5A and its hypusine modification in eukaryotes. Amino Acids, 2010. 38(2): p. 491-500. 233. Li, C.H., et al., eIF5A promotes translation elongation, polysome disassembly and stress granule assembly. PLoS One, 2010. 5(4): p. e9942. 234. Stiborova, M., et al., Contribution of biotransformation enzymes to the development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid: urgent questions, difficult answers. Interdiscip Toxicol, 2008. 1(1): p. 8-12. 235. Arlt, V.M., M. Stiborova, and H.H. Schmeiser, Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis, 2002. 17(4): p. 265-77. 127  BIOGRAFIJA Osnovni podaci Ivana Pešić Datum i mesto rođenja: 25. juli 1980. godine u Nišu Naučna oblast i uža specijalnost: molekularna medicina patofiziologija Obrazovanje Naziv završenog fakulteta: Medicinski fakultet Univerziteta u Nišu Studijska grupa – medicina 03. jul 2006. sa opštim uspehom 9,16 u toku studija ocena 10 na diplomskom ispitu Stipendije 1. Stipendija Ministarstva prosvete i sporta Republike Srbije (1999-2005) 2. Internacionalna stipendija UNESCO/L’oreal fondacije za mlade žene u nauci (2009-2011) za usavršavanje naučno-istraživačkog rada u laboratoriji za proteomska istraživanja instituta za nefrologiju i reumatologiju UMG, Getingen, Nemačka Nagrade 1. Nagrada Evropskog pokreta u Srbiji i Ambasade Austrije u Beogradu za 200 najboljih studenata Univerziteta u Srbiji, 2006. 2. Zahvalnica Medicinskog fakulteta univerziteta u Nišu za postignute rezultate nа 18. Еvropskoj studentskoj konferenciji u Berlinu, decembar 2007. 3. Nosilac prvog Srpskog pasoša, nagrada Vlade Republike Srbije, maj, 2008. 4. Priznanje Medicinskog fakulteta Univerziteta u Nišu kao autoru najboljeg naučnog rada povodom proslave 48 godina postojanja i rada Medicinskog fakulteta u Nišu, 17.10.2008. 5. UNESCO/L’oreal Co-sponsored International fellowships for Young Women in Life Sciences 2009, Paris, France 05.03.2009. 6. Nagrada opštine Mediana za dostignuća u oblasti biomedicinskih nauka, Niš, 10.10.2009. Biografija 128 Rezultati naučno-istraživačkog rada Izabrane publikacije: • Pešić I, Krstić M, Pavlović M, Ilić D, Dimitrios K. Hormonska senzitivnost tumora kod bolesnica sa rakom dojke. Acta Medica Medianae 2007; 46(2): 25-30. • Pešić I, Janković-Veličković Lj, Stokanović D, Dimov I. Urinary and Tissue Biomarkers in Early Detection of Upper Urothelial Tract Cancer. Facta Universitatis 2007; 14(2): 47-52. • Dimov I, Pešić I, Janković-Veličković Lj. Urinary and tissue proteomics of urothelial cancer. Acta facultatis medicae Naissensis 2008; 25(2): 75-80. • Petrović V, Jovanović I, Pesić I, Stefanović V. Role of stem cells in kidney repair. Renal Failure 2010; 32(10): 1237-1244. • Janković Velicković, L., Z. Doličanin, Hattori T, Pešić I, Djordjević B, Stojanović M, Stanković J, Visnjić M, Stefanović V. (2010). "Divergent Squamous Differentiation in Upper Urothelial Carcinoma—Comparative Clinicopathological and Molecular Study." Pathology & Oncology Research 2010: 1-5. • Pešić I, Dihazi GH, Müller GA, Jahn O, Hoffmann M, Eltoweissy M, Koziolek M, Dihazi H. Short-time increase of glucose concentration in PDS results in extensive removal and high glycation level of vital proteins during continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrology Dialysis Transplantation 2011; 1-10. • Stefanović V, Djukanović L, Cukuranović R, Bukvić D, Ležaić V, Marić I, Ogrizovic SS, Jovanović I, Vlahovic P, Pešić I, Djordjević V. Beta2-microglobulin and alpha1-microglobulin as markers of balkan endemic nephropathy, a worldwide disease. Renal Failure 2011; 33(2):176-83. • Dolićanin Z, Janković Veličković Lj, Djordjević B, Višnjić M, Pešić I, Ristić A, Marjanović V. Expression of regulatory proteins and proliferative acrivitz in relation to phenotypic characteristics of upper urothelial carcinoma. Vojnosanitetski pregled 2011; in press. • Pešić I, Stefanović V, Mueller GA, Mueller CA, Čukuranović R, Jahn O, Bojanić V, Koziolek M, Dihazi H. Identification and validation of six proteins as markers for endemic nephropathy. Journal of Proteomics 2011; in press. Biografija 129 Izabrana saopštenja na skupovima od nacionalnog i internacionalnog značaja: 1. Pešić I, Baumann C, Dihazi GH, Mueller GA, Dihazi H. Impact of dialysis membrane type on vital protein removal during hemodialysis: a proteomics approach. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Nephrologie (DGfN) 26-29.09.2009. Georg-August-Univerzitet Getingen, Nemačka 2. Pešić I, Dihazi GH, Streich JH, Hoffmann M, Mueller GA, Dihazi H. Proteome analysis of continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD) eluates: high glucose concentration results in increased removal of vital proteins. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Nephrologie (DGfN) 26-29.09.2009. Georg-August-Univerzitet Getingen, Nemačka 3. Gansz M, Pešić I, Streich JH, Dihazi GH, Koziolek M, Mueller GA, Dihazi H. The impact of urine protein depletion on the improvement of 2-DE analysis in case of diabetic nephropathy. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Nephrologie (DGfN) 26- 29.09.2009. Georg-August-Univerzitet Getingen, Nemačka 4. Pešić I, Stefanović V, Mueller GA, Čukuranović R, Jahn O, Bojanić V, Dihazi H. Proteomic analysis of urine samples from patients with Balkan endemic nephropathy. EuroKUP COST Meeting – 20-21.03.2010. Roterdam, Holandija 5. Pešić I, Stefanović V, Mueller GA, Čukuranović R, Jahn O, Bojanić V, Dihazi H. Proteome analysis of urine samples from patients with Balkan endemic nephropathy. XLVII ERA- EDTA Congress II DGfN Congress, 25-28.06.2010. Minhen, Nemačka 6. Pešić I, Baumann C, Dihazi GH, Mueller GA, Dihazi H. Proteomics analysis of hemodialysate revealed advantage of dialysis cellulose membranes in holding back vital proteins. XLVII ERA-EDTA Congress II DGfN Congress, 25-28.06.2010. Minhen, Nemačka 7. Pešić I, Dihazi GH, Jahn O, Hoffmann M, Mueller GA, Dihazi H. Proteome analysis of continuous ambulatory peritoneal dialysis (CAPD) eluates: high glucose concentration results in increased removal and high glycation level of vital proteins. XLVII ERA-EDTA Congress II DGfN Congress, 25-28.06.2010. Minhen, Nemačka 8. Pešić I, Stefanović V, Mueller GA, Čukuranović R, Jahn O, Bojanić V, Dihazi H. Balkan endemic nephropathy: urine protein pattern as a potential diagnostic biomarker. Human Proteome Organisation HUPO 2010, 9th Annual World Congress, 19-23 Septembar, 2010. Sidnej, Australija 130  PATOFIZIOLOŠKI ASPEKTI GLOMERULSKIH I TUBULOINTESTICIJSKIH BUBREŽNIH OBOLJENJA: PROTEOMSKI PRISTUP Sažetak Uvod: Bubrežna oboljenja predstavljaju jedan od najvećih zdravstvenih problema današnjice. Endemska nefropatija (EN) je hronična tubulointesticijska nefropatija sa neprimetnim početkom i sporim razvojem terminalne bubrežne slabosti. Pravi uzrok nastanka bolesti još uvek nije poznat iako se istražuje značaj nasleđivanja, dejstvo či- nioca životne sredine (aristolohijska kiselina, mikotoksin), kao i prisustvo poremećaja imunog sistema. Cilj istraživanja je utvrđivanje kvalitativnih i kvantitativnih razlika belančevina u mokraći pacijenata sa endemskom nefropatijom, dijabetesnom nefropatijom, akutnim prerenalnim bubrežnim oštećenjem, kao utvrđivanje njihovog značaja u dijagnostici oboljenja. Ispitivani su i efekti aristolohijske kiseline 1 i ohratoksina A na humane tu- bulocite pri akutnom i hroničnom izlaganju sa ciljem utvrđivanja mehanizama ošteće- nja bubrega, kao i potencijanih biomarkera. Metode: U toku istraživanja korišćena je proteomska tehnologija, a rezultati su potvrđeni Western blot-om, dot blot-om, imunofluoroscentnim i imunohistohemijskim analizama ćelija i tkiva. Značaj: Upotreba proteomskih tehnologija pri analizi belančevina u mokraći pa- cijenata i zdravih ispitanika donosi nova saznanja sa ciljem da se identifikuju potenci- jalni dijagnostički i prognostički markeri oboljenja. Ova studija pokazuje prisustvo značajnih razlika u sastavu proteina ispitanika, koje se mogu koristiti kao diferenci- jalno dijagnostički parametri. Ispitivanja efekata toksičnosti aristolohijske kiseline 1 i ohratoksina A na humanim tubulocitima doprinose boljem razumevanju patofizioloških mehanizama nastanka bubrežnih bolesti, prvenstveno razjašnjenju molekulskiih mehani- zama koji leže u osnovi nastanka i razvoja endemske nefropatije i njenih komplikacija. 131  PATHOPHYSIOLOGY OF GLOMERULAR AND TUBULOINTERSTITIAL KIDNEY DISEASES: PROTEOMIC APPROACH Summary Introduction: Kidney diseases are the biggest health problem nowadays. Endemic nephropathy (EN) is a chronic tubulointerstitial kidney disease, undetectable at the beginning and with slow development to terminal renal failure. The real cause of the disease is still not known. Although the importance of inheritance is underlined, the effects of environmental factors (aristolochic acid, a mycotoxin) and the presence of disorders of the immune system are more likely to be involved in disease pathway. Aim: We aimed to establish qualitative and quantitative differences of proteins in urine of patients with the endemic nephropathy, diabetic nephropathy, acute prerenal kidney injury, and their importance in the diagnostics. The acute and chronic effects of aristolochic acid 1 and ochratoxin A on tubulocytes are important for establishing the mechanisms of kidney damage and the potential biomarkers. Methods: Proteomic technology was used, and the results were confirmed by Western blot, dot blot, immunofluoroscence and immunohistochemisry analyses of cells and tissue samples. Importance: The use of proteomic technologies of urine proteins in patients and healthy controls gives a new data for the identification of diagnostic and prognostic markers of kidney damage. This study shows the presence of significant differences in the proteins of the respondents, which can be used as diagnostic and differential diagnostic parameters. Study of toxic effects of aristolochic acid 1 and ochratoxin A permited a better understanding of the mechanisms of kidney disease, but first of all, a better expanation of molecular pathway in the initiation and during development of endemic nephropathy and associated urothelial cancer.