UNIVERZITET U NIŠU MEDICINSKI FAKULTET FARMAKOKINETIĈKA ISPITIVANJA TAKROLIMUSA KOD PACIJENATA SA PRESAĐENIM BUBREGOM Doktorska disertacija mentor: kandidat: Doc. dr Radmila Veličković- Radovanović Aleksandra Catić-Đorđević Niš, 2013. Najiskrenije se zahvaljujem svom mentoru, poštovanoj doc.dr Radmili Veličković-Radovanović za sav trud uložen u mene, neizmerno strpljenje i podstrek, otvorena vrata i pruženu ruku na putu nauke. Prof.dr Momiru Mikovu i prof.dr Milanu Jokanoviću zahvaljujem na pomoći i važnim sugestijama pri izradi teze. Zahvaljujem se prof.dr Slobodanu Jankoviću i doc.dr Jasmini Milovanović na pomoći oko populacione farmakokinetičke analize. Veliko hvala uvaženim kolegama sa Klinike za nefrologiju i Centra za medicinsku biohemiju KC Niš, članovima našeg istraživačkog tima. Za pruženu pomoć oko statističke obrade rezultata zahvaljujem se dr Marioli Stojanović. Takođe, želim da se zahvalim svojoj porodici- roditeljima, na beskrajnom razumevanju i podršci i sinovima, na ljubavi koja me vodi kroz život. Komisija za ocenu i odbranu doktorske disertacije: Prof. dr Milan Jokanović, predsednik _____________________________ Doc. dr Radmila Veliĉković- Radovanović, mentor i ĉlan _____________________________ Prof. dr Momir Mikov, ĉlan sa Medicinskog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu _____________________________ Prof. dr Tatjana Cvetković, ĉlan _____________________________ Doc. dr Branka Mitić, ĉlan _____________________________ Datum odbrane: _____________________________ LISTA SKRAĆENICA ALP - alkalna fosfataza ALT - alanin aminotransferaza AST - aspartat aminotransferaza AUC0-12 - dvanaestoĉasovna AUC AUCp - predviĊena vrednost ukupne AUC AUC (PIK)- površina ispod krive(area under the curve) BMI - indeks telesne mase C1 , C2 , C3 , .....,Cn- plazma koncentracije leka u vremenu t1, t2, t3 ,….,tn , , , ....., - plazma koncentracije leka u ravnotežnom stanju u vremenu t1, t2, t3 ,….,tn CD3-28 - antitela za odgovarajuće antigene CDK - ciklin zavisna kinaza CL - klirens leka CNI - inhibitori kalcineurina Cpt - plazma koncentracija leka u vremenu t CRP - C reaktivni protein CsA - ciklosporin CV - koeficijent varijacije CYP - enzim citohrom P450 D - doza leka DD - ukupna dnevna doza Tac DNK - dezoksiribonukleinska kiselina DV - izmerene vrednosti koncentracija Tac EDTA - etilendiamino tetrasirćetna kiselina EVE - everolimus F - stepen bioraspoloživosti FD - farmakodinamiĉka FK - farmakokinetiĉka FKBP-12 - takrolimus vezujući intracelularni protein GIT - gastrointestinalni trakt Hb - hemoglobin HPLC/MS/MS - teĉna hromatografija pod visokim pritiskom/ masena sprektroskopija/ masena sprektroskopija IL-1, IL-2, IL-6 - interleukini ILGF - faktor rasta sliĉan insulinu KS -kortikosteroidi KV - kardiovaskularni MDR-1 - gen za ekspresiju transportnih proteina MEIA - Microparticle Enzyme Immunoassay MM - mikofenolat mofetil MOF - minimum objektivne funkcije MPA - mikofenolna kiselina MPE - srednja greška predviĊenja MRT - srednje vreme zadržavanja leka u organizmu MSPE - srednja statistiĉka greška m-TOR -mamilarian target of rapamycin NF-AT - nuklearni faktor aktiviranog T-limfocita NONMEM - NONlinear Mixed Effects Modelling-softver za populacionu farmakokinetiĉku analizu p - nivo statistiĉke znaĉajnosti PFK- populaciona farmakokinetiĉka analiza P-gp - P glikoprotein PIK (AUC) - površina ispod krive PRED - predviĊene vrednosti koncentracija Tac PREDPP - PredPopulation Pharmacokinetics PRO - prednizolon r - Piersov koeficijent korelacije r 2 - koeficijent determinacije RMSE - rezidualna srednja greška predviĊanja SCr - serumski kreatinin SRL - sirolimus SS - ravnotežno stanje (stady state) t1, t2, t3 ,….., tn - vreme proteklo od primene leka u kojem je merena koncentracija t1/2 - vreme koje je potrebno da se organizam oĉisti od polovine unete koliĉine leka - poluvreme eliminacije leka Tac - takrolimus TDM - terapijski monitoring lekova TGF-beta1 - tkivni faktor rasta TMA - trombocitna mikroangiopatija TNF-α - tkivni nekrozis faktor-α Tx - dan transplantacije bubrega Vd - volumen distribucije WRES - rezidualna varijabilnost izmeĊu predviĊenih i izmerenih vrednosti koncentracija takrolimusa β (Kel)-konstanta brzine eliminacije leka θ1-3 - populacione vrednosti FK parametara takrolimusa SADRŢAJ: UVOD ........................................................................................................................................ 1 1. FARMAKOKINETIĈKA ANALIZA ................................................................................... 2 1.1. Uvod ................................................................................................................................ 2 1.2. Vrste farmakokinetiĉkih analiza ...................................................................................... 2 1.2.1. Model – zavisna ( prostorna ) farmakokinetiĉka analiza ......................................... 2 1.2.2. Neprostorna farmakokinetiĉka analiza ..................................................................... 3 1.2.3. Populaciona farmakokinetiĉka analiza ..................................................................... 5 1.2.4. Fiziološki (perfuzioni) model farmakokinetiĉke analize ......................................... 8 1.2.5. Pristup vremenskih konstanti (the time constant approach) ..................................... 8 1.2.6. FK/FD Modelovanje ................................................................................................ 9 1.3. Terapijski monitoring lekova (TDM) .............................................................................. 9 1.4. Imunosupresivni lekovi u terapiji pacijenata sa presaĊenim bubregom ....................... 11 1.4.1. Znaĉaj imunosupresivne terapije u transplantaciji ................................................. 11 1.4.2. Kortikosteroidi ....................................................................................................... 13 1.4.3. Inhibitori proliferacije limfocita ............................................................................. 14 1.4.3.1. Mikofenolna kiselina (MPA) .......................................................................... 14 1.4.3.2. Azatioprin ........................................................................................................ 15 1.4.3.3. Sirolimus (Rapamicin) i Everolimus ............................................................... 16 1.4.4. Antilimfocitna antitela ............................................................................................ 17 1.4.5. Monoklonalna antitela ............................................................................................ 17 1.4.6. Inhibitori kalcineurina (CNI) ................................................................................. 18 1.4.6.1. Ciklosporin (CsA) ........................................................................................... 18 1.4.6.2.Takrolimus (Tac) .............................................................................................. 19 1.5. Takrolimus .................................................................................................................... 19 1.5.1. Znaĉaj TDM takrolimusa ....................................................................................... 22 2. RADNA HIPOTEZA ........................................................................................................... 24 2.1. Radna hipoteza .............................................................................................................. 24 2.2. Pomoćne radne hipoteze ................................................................................................ 24 3. CILJEVI RADA ................................................................................................................... 25 4. PACIJENTI I METODE ...................................................................................................... 26 4.1. Pacijenti ......................................................................................................................... 26 4.2. Analitiĉke metode ......................................................................................................... 26 4.3. Farmakokinetiĉka analiza i statistiĉka obrada podataka ............................................... 27 5. REZULTATI ........................................................................................................................ 29 5.1. Rezultati farmakokinetiĉke analize prve doze Tac kod pacijenata sa presaĊenim bubregom .............................................................................................................................. 29 5.2. Rezultati neprostorne farmakokinetiĉke analize Tac u ravnotežnom stanju (SS) kod pacijenata sa presaĊenim bubregom ..................................................................................... 34 5.3. Rezultati populacione FK analiza (PFK) takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom .............................................................................................................................. 39 5.4. Rezultati praćenja interakcija i pojave neželjenih dejstava takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom ...................................................................................................... 44 5.5. Rezultati ispitivanja uticaja pola na farmakokinetiĉke parametre takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom ..................................................................................... 51 6. DISKUSIJA .......................................................................................................................... 56 6.1. Farmakokinetiĉka analiza takrolimusa nakon primene inicijalne doze i u ravnotežnom stanju (SS) kod pacijenata sa presaĊenim bubregom ........................................................... 56 6.2. Populaciona farmakokinetiĉka analiza takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom .............................................................................................................................. 63 6.3. Praćenje neželjenih efekata imunosupresivne terapije i interakcija takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom ..................................................................................... 65 7. ZAKLJUĈAK ...................................................................................................................... 69 8. LITERATURA ..................................................................................................................... 71 Uvod 1 UVOD Transplantacija bubrega predstavlja najbolju metodu leĉenja terminalne bubrežne insuficijencije (1). Jedan od preduslova uspešne transplantacije bubrega je optimalna imunosupresivna terapija. Terapijski cilj imunosupresije je postizanje imunotolerancije recipijenta uz minimiziranje neželjenih i toksiĉnih efekata. Kombinacijom imunosupresivnih lekova razliĉitih mehanizama delovanja smanjuju se pojedinaĉne doze lekova i minimiziraju se njihovi neželjeni efekti, što ima veliki znaĉaj za kvalitet i produženje života pacijenata sa presaĊenim bubregom. Optimalan izbor imunosupresivnog protokola treba da bude usklaĊen sa individualnim karakteristikama pacijenta, njegovom osnovnom bubrežnom bolešću, komorbiditetima i koterapijom, stepenom podudarnosti davaoca i primaoca organa (2). Na izbor imunosupresivnih lekova utiĉu brojni faktori: imunološki i neimunološki. Neimunološki aspekt obuhvata medicinske, socijalne, kulturološke i ekonomske specifiĉnosti transplantiranog pacijenta (3). Takrolimus (Tac  ) je efikasan imunosupresivni lek koji predstavlja deo standardnog imunosupresivnog protokola pacijenata sa presaĊenim bubregom. Njegova vodeća uloga u imunosupresivnoj terapiji se zasniva na dokazanoj prednosti u odnosu na ostale imunosupresive, u prevenciji akutne reakcije odbacivanja presaĊenog bubrega i oĉuvanju funkcije grafta (4). MeĊutim, pokazano je da Tac tokom dugotrajne upotrebe ispoljava nefrotoksiĉne i neurotoksiĉne efekte i utiĉe na pojavu post transplantacijskog dijabetesa, gastrointestinalnih tegoba i metaboliĉkog disbalansa. Zbog varijabilnosti farmakokinetike, malog terapijskog indeksa i korelacije koncentracije i toksiĉnog efekta, monitoring Tac je od posebnog znaĉaja. Primena razliĉitih farmakokinetiĉkih (FK) pristupa dovodi do novih saznanja o farmakokinetiĉkom profilu i populacionim FK karakteristikama Tac, što je posebno važno u cilju povećanja efikasnosti i bezbednosti terapije kod postojećih i de novo transplantiranih pacijenata(5).  Lista svih skraćenica nalazi se na poĉetku rada Uvod 2 1. FARMAKOKINETIĈKA ANALIZA 1.1. Uvod Farmakokinetiĉka analiza daje matematiĉki model procesa resorpcije, raspodele, metabolizma i ekskrecije, praćenjem koncentracija leka i njegovih metabolita u telesnim teĉnostima, pre svega u krvnoj plazmi (6). Osnovni pristup farmakokinetiĉkoj analizi predstavlja prostorna, kompartmentalna, model-zavisna FK analiza. U poslednje vreme sve više dobijaju na znaĉaju drugi pristupi kao što su model nezavisna FK analiza, farmakokinetiĉko-farmakodinamiĉko (FK/FD) modelovanje, pristup vremenskih konstanti, a posebno populaciona farmakokinetiĉka analiza (7,8). Farmakokinetiĉka ispitivanja se sprovode u cilju odreĊivanja FK parametara: klirensa leka (Cl), volumena distribucije (Vd), poluvremena eliminacije (t1/2 ), površine ispod krive (PIK, AUC), konstante brzina resorpcije i eliminacije (α,β) i drugih. Poznavanje FK parametara omogućava odreĊivanje koncentracije leka u željenom trenutku (Cpt) i bolje razumevanje farmakodinamike (FD) leka. Farmakokinetiĉka ispitivanja su osnova za:  izraĉunavanje i modifikovanje režima doziranja lekova  procenu biološke raspoloživosti leka  utvrĊivanje farmakokinetiĉko-farmakodinamiĉke (FK/FD) korelacije Slika 1.1. Shematski prikaz odnosa farmakokinetike i farmakodinamike leka 1.2. Vrste farmakokinetiĉkih analiza 1.2.1. Model – zavisna ( prostorna ) farmakokinetiĉka analiza Osnovni tip ispitivanja koji se koristi u farmakokinetici je model zavisna (prostorna) FK analiza, koja kvantitativno definiše procese kroz koje lek prolazi u organizmu. Prostorni modeli se klasifikuju na osnovu broja prostora potrebnih da se opiše ponašanje leka u organizmu (7). Prostor ili kompartment predstavlja deo organizma (nekada to može da bude Uvod 3 ceo organizam) koji u kinetiĉkom smislu predstavlja jedinstvenu i homogenu celinu, dok je u suštini hipotetiĉka struktura. Prostor je definisan volumenom i koncentracijom leka u njemu (6,7). č Definisanjem prostora stvoreni su preduslovi za matematiĉki model, jednaĉinu ili sistem jednaĉina koje daju opis datog prostora ili sistema prostora. Prostorna FK analiza nije uvek optimalan izbor farmakokinetiĉke analize za upotrebu u kliniĉkoj praksi. Strogo kontrolisani uslovi ispitivanja i veliki broj podataka po pacijentu koji su neizostavni deo prostorne FK analize ne odgovaraju specifiĉnostima kliniĉke prakse (8). Zbog toga se kompartmentalni farmakokinetiĉki pristup primenjuje najviše u pretkliniĉkim ispitivanjima. Farmakokinetiĉki modeli koji postavljaju manje zahteva u smislu sprovoĊenja ispitivanja pogodniji su za kliniĉka ispitivanja od prostornog FK modela. 1.2.2. Neprostorna farmakokinetiĉka analiza Matematiĉki model dobijen prostornom FK analizom je previše komplikovan kada se raspodela leka odvija u većem broju prostora a posebno u sluĉaju nelinearnih farmakokinetiĉkih procesa. Model-nezavisna, neprostorna FK analiza nametnula se kao pristup koji znatno više odgovara kliniĉkoj praksi i ĉesto je sastavni deo sprovoĊenja racionalne farmakoterapije (9). Ova vrsta analize zasniva se na odreĊivanju koncentracije leka u biološkom materijalu i izraĉunavanju farmakokinetiĉkih parametara. Vrednosti izmerenih koncentracija leka omogućavaju izraĉunavanje konstante brzine eliminacije (β) i vremena polueliminacije leka. Iz istih podataka, metodom trapezoida, dobija se površina ispod krive (AUC), koja predstavlja meru koliĉine leka u organizmu. Matematiĉkim izraĉunavanjima dobija se uvid u kompletnu kinetiku leka, pri ĉemu su izbegnuti strogi uslovi ispitivanja koji karakterišu prostornu analizu. Ukoliko se kao biološki materijal koristi krv/krvna plazma izmerene koncentracije leka omogućavaju matematiĉko dobijanje konstante brzine eliminacije leka prema sledećem obrascu: 1 12 21 )( lnln     h tt CC Kel C1, C2 izmerene koncentracije leka u vremenu t1 i t2 Uvod 4 Brzina eliminacije leka odreĊuje vreme za koje se koncentracija leka smanji na polovinu poĉetne vrednosti i to predstavlja vreme polueliminacije leka (poluvreme eliminacije leka): ht )( 693,0 2/1   Ukupnu koliĉinu leka u organizmu, a time i izloženost organizma leku moguće je izraĉunati metodom trapezoioda korišćenjem podataka o koncentraciji leka i vremenu merenja koncentracije (6,9). Na taj naĉin dobija se FK parametar površina ispod krive - AUC (PIK) koji se matematiĉki predstavlja izrazom: tn - vreme merenja koncentracija leka Cn - koncentracija leka u datom vremenu Klirens leka predstavlja teoretski volumen telesne teĉnosti koji se oĉisti od leka u jedinici vremena. Poznavanjem volumena distribucije leka i vremena polueliminacije moguće je izraĉunati klirens leka. Smanjena bubrežna funkcija uslovljava promenu ovog FK parametra, što je od posebnog znaĉaja za pacijente sa presaĊenim bubregom i za lekove koji pokazuju nefrotoksiĉnost, kakav je takrolimus. Klirens leka predstavljen je matematiĉki jednaĉinom: dVKelCl  Kel - konstanta eliminacijje leka Cl - klirens Vd - volumen distribucije Prednost neprostorne FK analize je što ne zahteva stroge uslove istraživanja kao klasiĉan, prostorni FK pristup. Farmakokinetiĉki parametri dobijeni neprostornom FK analizom pokazuju stalnost i pored manjih promena uslova ispitivanja. Ovaj farmakokinetiĉki pristup pogodan je za FK analizu takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom. Poznavanje farmakokinetiĉkih parametara takrolimusa omogućava adekvatnu imunosupresiju transplantiranih pacijenata uz minimiziranu nefrotoksiĉnost, pa je znaĉajno FK analizu obaviti nakon administracije prve doze leka. Za olakšanu individualizaciju režima doziranja takrolimusa kod transplantiranih bolesnika neophodno je u toku analize uspostaviti korelaciju izmeĊu odreĊene koncentracije Tac u krvi i vrednosti AUC (10,11). Definisanje vremena u kome koncentracija Tac najpreciznije predviĊa vrednost AUC predstavljalo bi indikator Uvod 5 ukupne izloženosti organizma leku, što bi omogućilo postavljanje optimalnog režima doziranja Tac kod transplantiranih pacijenata (10). 1.2.3. Populaciona farmakokinetiĉka analiza Populaciona farmakokinetiĉka analiza (PFK) je našla mesto u savremenoj farmakoterapiji zahvaljujući pronalaženju jedinstvenog modela za odreĊenu populaciju ispitanika. Sa razvojem kliniĉke farmakokinetike raste znaĉaj populacionog pristupa FK analizi, koji je u osnovi zadržao klasiĉan FK pristup sa dodatnim definisanjem patofizioloških, demografskih, inter- i intra- individualnih faktora varijabilnosti (6,13). Definisanjem matematiĉkog modela populacionim pristupom daje se zavisnost izmeĊu takozvanih ulaznih i izlaznih informacija za dati sistem. Sam proces modelovanja je traženje funkcije koja najbolje predviĊa izlazne informacije i procenjuje parametre modela (13). Kada govorimo o terapiji takrolimusom ulazne informacije može predstavljati režim doziranja ili doza leka dok je izlazna informacija koncentracija Tac ili njegov klirens u datom vremenu. Populaciono FK ispitivanje takrolimusa je od znaĉaja za kliniĉku praksu jer daje specifiĉne, populacione FK parametre ispitivane populacije transplantiranih pacijenata i definiše faktore koji mogu uticati na vrednosti FK parametara. Poznavanje populacionih vrednosti FK parametara i faktora varijabilnosti doprinosi pravilnijem definisanju režima doziranja kod de novo transplantiranih pacijenata. Karakteristiĉno za populacionu FK analizu je da individualni pacijent ne predstavlja centar ispitivanja, već se teži dobijanju populacinog profila leka, zbog ĉega je neophodna brojna i heterogena grupa pacijenata. Ispitanici se meĊu sobom razlikuju po polu, starosti, telesnoj masi, prisustvu/odsustvu drugog oboljenja i primeni drugih lekova (13,14). U populacionoj FK analizi Tac pored pola, uzrasta i telesne mase, varijablu predstavlja vremenski period protekao od transplantacije, dnevna doza kortikosteroida koja je deo imunosupresivne terapije, odnos enzima jetre, prisustvo drugih lekova u terapiji. Populaciona FK analiza zasnovana je na poznavanju parametara dobijenih klasiĉnom prostornom analizom. Osnovna razlika je u broju, uslovima i dužini trajanja ispitivanja. U prostornoj analizi uĉestvuje mali broj ispitanika koji ĉine homogenu grupu i pretežno su zdravi dobrovoljci, dok se u populacionom pristupu ispitivanje obavlja u brojnoj, heterogenoj grupi bolesnika. Klasiĉna analiza se sprovodi brzo, u kontrolisanim uslovima, dok populaciona analiza koristi podatke dobijene u toku rutinskih kontrola u dužem vremenskom intervalu. Broj podataka po ispitaniku koji su neophodni za prostornu analizu unapred je Uvod 6 definisan i uvek znatno veći od broja podataka po pacijentu za populacionu analizu (od jedan do šest). Zahvaljujući tim razlikama, populaciona FK analiza daje nove informacije o leku i omogućava dobijanje kliniĉki relevantnih podataka o farmakokinetici leka u ciljnoj populaciji ispitanika (13). Identifikacija demografskih, patofizioloških i drugih faktora koji utiĉu na vrednosti FK parametara daje nefrologu mogućnost kompletnijeg sagledavanja pacijenta i veću sigurnost postavljanja optimalnog terapijskog režima takrolimusa (15,16). Posebnu vrednost pokazuje populaciona FK analiza koja koristi i farmakodinamiĉke (FD) parametre leka i FK/FD populaciona analiza. Osnovu postavljanja populacionog modela ĉini statistiĉka obrada podataka ispitivane populacije pacijenata. Postoje tri osnovna statistiĉka pristupa u populacionoj analizi: 1. Pristup objedinjenih podataka 2. Dvostepeni pristup 3. Metod kombinovanih efekata Svaki od pomenutih pristupa ima za cilj dobijanje populacionih vrednosti FK parametara na osnovu individualnih podataka, a razlikuju se po naĉinu dobijanja tih vrednosti i mogućnostima procene interindividualnih i intraindividualnih varijabilnosti. U našem istraživanju korišćeno je nelinearno modelovanje kombinovanih efekata. Naziv Metod kombinovanih efekata potiĉe od dva nivoa efekata koji ostvaruju uticaj na vrednost FK parametara: stalni i sluĉajni. Stalni efekti imaju samo jednu vrednost parametra, i to je tipiĉna, proseĉna populaciona vrednost, dok sluĉajni efekti imaju raspon vrednosti i odreĊenu distribuciju vrednosti parametara (17,18). Ukoliko je distribucija parametara populacionog modela unapred zadata u pitanju je parametarski, linearni populacioni pristup, a u suprotnom je neparametarski, odnosno nelinearni pristup. Pristup nelinearnog modelovanja kombinovanih efekata - NONlinear Mixed Effects Modelling- (NONMEM) se danas najviše koristi, a uveden je 1979. godine od strane Lewisa B Sheinera i Stuarta L Beala (19,20). Velika prednost ovog pristupa je naĉin prikupljanja podataka za analizu. Podaci se prikupljaju u dužem vremenskom periodu u toku rutinskih kliniĉkih kontrola pacijenata. Uprkos složenosti algoritama i neophodnog iskustva u modelovanju, NONMEM predstavlja sve zastupljeniji populacioni FK pristup. Uvod 7 Prednosti NONMEM analize kod pacijenata sa presaĊenim bubregom  podaci dobijeni u razliĉito vreme mogu se ukljuĉiti u bazu podataka i koristiti za FK analizu populacije pacijenata sa presaĊenim bubregom  podaci su reprezentativni za populaciju i pomažu u postavljanju režima doziranja kod de novo pacijenata  omogućava ispitivanje razliĉitosti u farmakokinetici uzimajući u obzir godine, genetiku, faktore spoljašnje sredine, fiziološke i patofiziološke faktore  omogućava ispitivanje postojanja i znaĉaja uticaja drugih lekova neophodnih u terapiji transplantiranih pacijenata uz odreĊivanje minimalne doze leka koji ostvaruje uticaj na koncentraciju Tac Nedostaci NONMEM analize kod pacijenata sa presaĊenim bubregom  softver neophodan za NONMEM analizu je složen i zahteva struĉnost i obuku  za pouzdanost dobijenih podataka potreban je veliki broj pacijenata (preko ĉetrdeset, a poželjno je znatno veći broj – oko 100 pacijenata)  proces prikupljanja podataka traje dugo, nekada više godina U populacionoj NONMEM farmakokinetiĉkoj analizi postoje tri osnovna koraka: I korak- prikupljanje podataka potrebnih za analizu u populaciji transplantiranih bolesnika II korak- razvijanje modela III korak- validacija konaĉnog modela Prikupljanje podataka zahteva istrajnost i sistematiĉnost jer se odvija u toku rutinskih kontrola transplantiranih pacijenata. Razvijanje modela je najsloženiji proces u populacionom ispitivanju. Za populacionu FK analizu Tac koristi se odgovorajuća subrutina iz PREDPP (PRED Population Pharmacokinetics) biblioteke softvera izabrana na osnovu njegovih farmakokinetiĉkih karakteristika i naĉina primene. Povezivanje ovako definisanog modela sa izvršnim modelom omogućava dobijanje populacionih vrednosti FK parametara Tac i definisanje varijabli koje imaju uticaj na farmakokinetiku Tac u ispitivanoj populaciji. Validacija daje pouzdanost i pokazuje ispravnost dobijenog populacionog modela Tac. NONMEM se sastoji iz tri dela: strukturni ( opisuje osnovne FK parametre leka), kovarijatni (opisuje uticaj demografskih i ostalih karakteristika na FK parametre leka) i statistiĉki (opisuje interindividualnu i intraindividualnu varijabilnost parametara) (13,21). Poslednji korak u PFK modelovanju je validacija pomoću grupe pacijenata koji pripadaju ispitivanoj populaciji ali nisu ukljuĉeni u proces izgradnje modela. Ukoliko se Uvod 8 pokaže pouzdanost populacionih vrednosti FK parametara dobijenih u procesu izgradnje modela na novoj grupi podataka može se smatrati da je NONMEM modelovanje uspešno završeno, a faktori intraindividualne i interindividualne varijabilnosti unutar ispitivane populacije definisani. 1.2.4. Fiziološki (perfuzioni) model farmakokinetiĉke analize Osnovna odlika ovog pristupa FK analizi je integracija faktora hemodinamike ljudskog organizma. Prostore kod fiziološkog modela odreĊuje brzina protoka krvi i stepen prokrvljenosti tkiva, što je osnovna razlika u odnosu na prostornu analizu (22). Fiziološki model je pogodan za FK analizu pre svega u prekliniĉkim ispitivanjima leka na eksperimentalnim životinjama, jer može doprineti predviĊanju FK leka kod ljudi. Ovaj FK analitiĉki pristup daje mogućnost ekstrapolacije podataka izmeĊu razliĉitih životinjskih vrsta i izmeĊu ljudi i eksperimentalnih životinja, što nije moguće kod prostornog modelovanja upravo zbog definisanja prividnog volumena (6,22). 1.2.5. Pristup vremenskih konstanti (the time constant approach) Ovaj pristup karakteristiĉan je po tome što predstavlja sintezu prostorne i neprostorne FK analize, ukljuĉujući i statistiĉku obradu. Pristup vremenskih konstanti definiše vremensku konstantu kao vreme potrebno da se ekvivalent leka premesti iz jednog prostora u drugi. Time je dobijena kombinacija fizioloških prostora i FK procesa što ĉini jedinstvenost ovog pristupa (6). Kao rezultat analize uspostavlja se korelacija izmeĊu opisnih FK parametara (maksimalna izmerena koncentracija leka, biološko vreme polueliminacije i prividni volumen raspodele) i vremenskog trajanja pojedinaĉnih procesa kroz koje lek prolazi- oslobaĊanje iz farmaceutskog oblika, resorpcija, raspodela leka, zadržavanje u organizmu, trajanje efekta leka. Korelacija izmeĊu farmakokinetiĉkih procesa i farmakokinetiĉkih parametara daje mogućnost prilagoĊavanja terapije prema karakteristikama organizma (npr. ukoliko je povećana resorpcija leka, potrebno je dati nešto manju dozu od uobiĉajene kako se ne bi ispoljili neželjeni efekti terapije (7). Uvod 9 1.2.6. FK/FD Modelovanje Osnovni cilj FK/FD ispitivanja je uspostavljanje FK/FD odnosa za dati lek. Kako je ovaj odnos složen tako su i matematiĉki modeli koji se dobijaju vrlo složeni. Pomoću FK/FD modelovanja moguće je identifikovati kljuĉne osobine leka koje će omogućiti kvantifikovanje i predviĊanje vremenskog toka efekta leka pod fiziološkim i patološkim uslovima (23). Farmakokinetiĉko/farmakodinamiĉki model spaja FK model koji daje odnos izmeĊu doze i koncentracije u zavisnosti od vremena i FD model koji daje odnos izmeĊu koncentracije i efekta leka u funkciji vremena. Zadatak FK analize je pronalaženje funkcije koja spaja ove modele i statistiĉki ih opisuje (24,25). Kao rezultat FK/FD ispitivanja konstruiše se sigmoidni model efekta leka koji prikazuje zavisnost efekta leka od njegove koncentracije u odabranoj biološkoj teĉnosti. FK/FD modelovanje se pojednostavljuje kada lek ima direktno merljiv farmakodinamiĉki efekat. Savremena FK ispitivanja stavljaju akcenat na FK/FD populacionu analizu koja daje  procenu uticaja promenljivih (demografskih i farmakoterapijskih faktora ciljne populacije)  odreĊivanje ili potvrĊivanje odnosa doza– efekat leka kod ciljne populacije i  procenu podešavanja doza kod specifiĉnih populacija pacijenata. 1.3. Terapijski monitoring lekova (TDM) Terapijski monitoring lekova predstavlja precizno i unapred planirano praćenje koncentracije leka i/ili njegovih metabolita u krvnoj plazmi ili drugim biološkim teĉnostima, pri ĉemu je izmerena koncentracija u jasnoj vezi sa efektom leka (26). TDM se preporuĉuje kada postoji velika interindividualna varijabilnost u FK leka, što zahteva individualizaciju terapije. Monitoring je od velikog znaĉaja kada lek pokazuje mali terapijski indeks, saturacionu kinetiku i kod pacijenata sa patološkim stanjima koja mogu imati uticaj na FK procese leka, kao što je presaĊivanje bubrega (27, 28). Takrolimus, zbog malog terapijskog indeksa, varijabilne kinetike i visokog interakcijskog potencijala zahteva redovno praćenje koncentracija u krvi bolesnika nakon presaĊivanja bubrega. Terapijski monitoring omogućava modifikaciju terapijskog režima u zavisnosti od individualnih karakteristika bolesnika (29). Takrolimus pokazuje linearnu kinetiku u okviru terapijskih koncentracija, što omogućava modifikaciju doze na osnovu izmerene koncentracije leka u krvi u stanju ravnoteže (7). Uvod 10 - koncentracija leka koju želimo da postignemo u ravnotežnom stanju - koncentracija leka koja je izmerena u ravnotežnom stanju - doza leka potrebna za postizanje željene koncentracije leka - data doza Tac Terapijski monitoring podrazumeva pravilno uzorkovanje biološkog materijala i validiran analitiĉki postupak (28,30). Pravilna interpretacija dobijenih rezultata je od posebnog znaĉaja za modifikaciju terapije. Cilj sprovoĊenja monitoringa Tac je kreiranje optimalnog režima doziranja, što omogućava minimiziranje neželjenih efekata terapije transplantiranih bolesnika (5,29). Sakupljanjem podataka o izmerenim koncentracijama Tac u dužem vremenskom periodu kod većeg broja pacijenata stvara se baza podataka za populacionu farmakokinetiĉku analizu. Slika 1.2. Shematski prikaz TDM-a takrolimusa Na slici 2. je shematski prikazan pravilan TDM takrolimusa u nekoliko osnovnih koraka. Nakon primene inicijalne doze Tac, odreĊene na osnovu telesne mase pacijenta, vrši se kliniĉka procena i merenje koncentracije leka u krvi. Farmakokinetiĉka analiza omogućava modifikovanje postojećeg doznog režima u skladu sa individualnim karakteristikama pacijenta (30,31). Populacionim FK modelovanjem podataka o izmerenim koncentracijama Tac u toku terapijskog monitoringa dobijaju se specifiĉne, populacione vrednosti FK parametara i odreĊuju znaĉajne varijable, što predstavlja osnovu za kreiranje doznog režima kod de novo transplantiranih pacijenata. Uvod 11 1.4. Imunosupresivni lekovi u terapiji pacijenata sa presaĊenim bubregom 1.4.1. Znaĉaj imunosupresivne terapije u transplantaciji Cilj imunosupresivne terapije je postizanje imunotolerancije primaoca organa na presaĊeni organ uz minimiziranje neželjenih dejstava izabranih lekova (32). Veliki broj imunosupresivnih lekova mogu dovesti do akutne i hroniĉne intoksikacije, posebno nefrotoksiĉnosti, zbog ĉega je neophodna njihova racionalna primena (1,33). Imuni odgovor organizma na presaĊeni bubreg se ostvaruje kroz tri faze. To su: faza indukcije, faza održavanja i leĉenje epizoda akutnog odbacivanja bubrega (3). Imunosupresivni lekovi se koriste u sve tri faze. Najvažnije grupe imunosupresivnih lekova su:  kortikosteroidi  kalcineurinski inhibitori  inhibitori proliferacije limfocita  antilimfocitna antitela Shematski prikaz mesta delovanja imunosupresivnih lekova dat je na slici 1.3. Slika 1.3. Shematski prikaz mesta i mehanizma delovanja imunosupresiva Da bi se imunosupresivnom terapijom ostvarila efikasnost, uz zadovoljavajući bezbedonosni profil trebalo bi da ovi lekovi poseduju sledeće osobine : Uvod 12  mehanizam dejstva mora biti selektivan  treba da pokazuju adaptivnu specifiĉnost  ciljni molekul leka mora biti u limfocitu  biotransformacija leka treba da se odvija nezavisno od enzima citohroma P450  sinergistiĉko delovanje u kombinaciji sa drugim imunosupresivima Imunosupresivne lekove karakterišu ozbiljna neželjena dejstva i visok interakcioni potencijal, zbog ĉega je potreban terapijski monitoring i evaluacija doznog režima kod osetljivih transplantiranih pacijenata (34). Preduslov pravilnog izbora lekova koji će izvršiti optimalnu imunosupresiju nakon Tx bubrega je poznavanje njihovih farmakoloških karakteristika zbog ĉega je u tabeli 1.1. dat pregled imunosupresivnih lekova koji se koriste u savremenoj praksi (26,35). Tabela 1.1. Pregled imunosupresivnih lekova Farmakološka grupa Sastav Aktivnost u organizmu Neželjena dejstva Terapijski režim Glukokortikoidi Prednizon nespecifiĉna blokada imunog odgovora kušing – habitus, osteoporoza, dijabetes, leukocitoza, atrofija kože, otežano zarastanje rana terapija održavanja inicijalna terapija Kalcineurinski inhibitori Ciklosporin A inhibicija kalcineurina u izgradnji imunofila nefrotoksiĉnost, hipertenzija, hirzuitizam, hiperplazija gingive terapija održavanja Takrolimus inhibicija kalcineurina u izgradnji kompleksa sa FK506 vezujućim proteinom neurotoksiĉnost, nefrotoksiĉnost, dijabetes terapija održavanja Poliklon alna antitela Antitimocitni antiglobulin nespecifiĉna razgradnja limfocita alergijski šok, pancitopenija, oportinistiĉke infekcije, povećan rizik za nastanka maligniteta indukciona terapija inicijalna terapija Monoklonalna antitela Baziliksimab Daklizumab blokada IL-2 receptora nauzeja, edemi, hipertenzija, hiperkalijemija indukciona terapija m-TOR inhibitori Sirolimus Everolimus blokada T-limfocita aktiviranih preko IL-2 pancitopenija, hiperlipidemije otežano zarastanje rana terapija održavanja Antimetaboliti Azatioprin Mikofenolat- mofetil blokada inozin- monofosfat dehidrogenaze pancitopenija, alopecija, holestaza gastrointestinalne tegobe, leukopenija terapija održavanja Uvod 13 Odabir imunosupresivne terapije vrši se individualno, prema pacijentu, u cilju pronalaženja optimalne kombinacije imunosupresivnih lekova. U tabeli 1.2. dat je pregled preporuĉenih doza najĉešće primenjivanih imunosupresivnih lekova u savremenoj kliniĉkoj praksi (26). Tabela 1.2. Doziranje imunosupresiva Lek Doza Takrolimus 0,1 – 0,2 mg / kg TM / dnevno Ciklosporin A 3 – 6 mg / kg TM / dnevno Mikofenolat – mofetil 2 x 1g Metilprednizolon 0,5 mg / kg TM / dnevno redukcija u prvih 6 meseci do 0,1 mg / kg TM / dnevno Azatioprin inicijalna terapija: 3 - 6 mg / kg TM / dnevno produženje terapije 1-2 mg / kg TM / dnevno Baziliksimab 2 x 20mg (preoperativno i ĉetvrtog dana nakon transplantacije) Antitimocitni globulin 1,5 mg / kg TM / dnevno kumulativni max. 4,5mg/kg TM 1.4.2. Kortikosteroidi Prednizolon i metilprednizolon su kortikosteroidi (KS) koji se uspešno koriste za razvoj imunotolerancije transplantiranog pacijenta. Kortikosteroidi su efikasni u prevenciji i terapiji odbacivanja presaĊenog organa zbog ĉega se koriste neposredno pre i prolongirano nakon transplantacije (Tx). Prednizolon i njegov derivat metilprednizolon vrše inhibiciju transkripcionih faktora ĉime smanjuju transkripciju gena za interleukin-2 (IL-2) i druge citokine (IL-1, pirogen, kolagenaza, elastaza, aktivator plazminogena i faktor tumorske nekroze) (35,1). Kortikosteroidi se vezuju za citoplazmatske receptore preko ćelijske membrane, formirajući komleks lek-receptor koji putuje do ćelijskog jedra (slika 3.). Antiinflamatorno i limfolitiĉko delovanje zasnovano je na spreĉavanju proliferacije T- limfocita, stabilizaciji membrane lizozoma i blokadi sinteze antitela (36). Direktnim i indirektnim spreĉavanjem sinteze interferona i interleukina IL-1, IL-2, IL-6, kortikosteroidi interferiraju sa senzibilizacijom ćelija koje stvaraju antitela, smanjuju oslobaĊanje antigena iz presaĊenog tkiva i odlažu revaskularizaciju. Farmakokinetika: Biološka raspoloživost prednizolona, nakon oralne primene iznosi 70-80% , zbog brze biotransformacije prilikom prvog prolaza kroz jetru. U plazmi se vezuje za proteine plazme do 95%. Redukcijom i konjugacijom stvaraju se neaktivni metaboliti koji se zatim izluĉuju preko bubrega. U nepromenjenom obliku se eliminiše 3-5% unetog leka. Poluvreme eliminacije prednizolona iznosi 1,5-6 sati. Indukcijom mikrozomalnih enzime jetre Uvod 14 KS znatno utiĉu na koncentracije lekova koji se metabolišu posredstvom istih enzima (37,38). Induktori mikrozomalnih enzima ubrzavaju metabolizam KS, dok ga inhibitori usporavaju. U farmakoterapiji transplantiranih pacijenata doza KS se znaĉajno menja u zavisnosti od vremena proteklog od transplantacije ( na dan transplantacije primenjuje se udarna doza od 500 mg metilprednizolona, dok se 15. dana nakon Tx doza prednizolona redukuje na 40 - 60mg ) (39,40). Od posebnog znaĉaja je odreĊivanje doze KS kojom prestaje znaĉajan uticaj KS na indukciju mikrozomalnih enzima jetre, odnosno na farmakokinetiku Tac (16,41). Pri istovremenoj primeni KS i mikofenolne kiseline smanjuje se njena bioraspoloživost što može imati kliniĉki znaĉaj (42). Dugotrajnom upotrebom KS dolazi do supresije kore nadbubrega i potencijalnih neželjenih dejstava u vidu: Kušingovog sindroma, poremećaja u rastu, bolesti koštano- mišićnog sistema, katarakte, dijabetesa, poremećaja endogenih steroida, dislipidemije, peptiĉkog ulkusa, hipertenzije, povećanja telesne mase i sporog zarastanja rana. Savremeni farmakoterapijski pristup podrazumeva što ranije smanjenje doze KS i dužine trajanja terapije kako bi se brojni neželjeni efekti minimizirali (43). 1.4.3. Inhibitori proliferacije limfocita Ova grupa imunosupresiva smanjuje imuni odgovor organizma na presaĊeni organ spreĉavanjem proliferacije limfocita. Lekovi koji pripadaju ovog grupi pokazuju razliĉitost u hemijskoj strukturi i po mestu delovanja. 1.4.3.1. Mikofenolna kiselina (MPA) Mikofenolna kiselina je nekompetitivni i reverzibilni inhibitor inozin-monofosfat dehidrogenaze, a time i inhibitor de novo puteva za sintezu guanozin nukleotida i njegove ugradnje u DNK. Kako je proliferacija T i B limfocita zavisna od de novo sinteze purina, MPA ima citostatiĉki efekat na limfocite (44,45). Mikofolna kiselina selektivno inhibira proliferaciju i funkcije limfocita i formiranje antitela, adheziju i migraciju ćelija (slika 3). U farmaceutskim preparatima nalazi se u obliku estra, mikofenolat-mofetila, koji se dobija polusintetski od antibiotika izolovanog iz jedne vrste gljiva. U telu se konvertuje u aktivnu supstancu, MPA. Mikofenolat mofetil je deo kvaternarnog imunosupresivnog protokola, koji se sprovodi u Kliniĉkom centru Niš prilikom transplantacije bubrega. Uvod 15 Farmakokinetika: Mikofenolat-mofetil (MM) se odlikuje dobrom resorpcijom nakon peroralne primene. Istovremena primena MM i KS znaĉajno smanjuje njegovu bioraspoloživost. Aktivni oblik leka, MPA, podleže enterohepatiĉnom ciklusu i eliminiše se preko bubrega u obliku neaktivnog β-glukuronida. Bezbednost i podnošljivost MPA je velika (44,46,47). U praksi se koristi u kombinaciji sa drugim imunosupresivnim lekovima, koji mogu imati uticaj na koncentraciju MPA. Najĉešći neželjeni efekti MPA su poremećaji na nivou GIT-a:dijareja, muĉnina, povraćanje, bol u stomaku, a retko mogu da se jave krvarenja i crevne perforacije (48). Ĉesta je pojava leukopenije. Većina neželjenih efekata se brzo povlaĉi redukcijom doze ili prekidom terapije. Zbog nepostojanja toksiĉnih efekata na ekskretorne organe i kardiovaskularni sistem, kao i ĉinjenice da ne zahteva terapijski monitoring, MPA je u potpunosti zamenio azatioprin. 1.4.3.2. Azatioprin Azatioprin je imidazolski derivat mekaptopurina koji po mehanizmu delovanja pripada grupi antimetabolita. Azatioprin u organizmu oslobaĊa 6-merkaptopurin koji se konvertuje u tkivni inhibitor metaloproteinaze, zbog ĉega dolazi do ometanja sinteze DNK i genetskih oštećenja posredovanih tioguanin nukleotidom (30). Razaranjem stimulisanih limfoidnih ćelija blokira imuni odgovor i sekundarnu produkciju antitela u serumu bez izražene selektivnosti. Farmakokinetika: Azatioprin poseduje visok stepen bioraspoloživosti, dobro se resorbuje iz gastrointestinalnog trakta i brzo dostiže maksimalnu koncentraciju u plazmi. U jetri se metaboliše u 6-merkaptopurin. Enzim ksantin-oksidaza pretvara ovu aktivnu supstancu u tio-mokraćnu kiselinu, koja se zatim izluĉuje urinom (35). Poluvreme eliminacije kod pacijenata sa oĉuvanom bubrežnom funkcijom je 3 sata, a pri oštećenju bubrežne funkcije može biti produženo do 50 sati. Neželjeni efekti azatioprina manifestuju se kroz pojavu leukemije, anemije, trombocitopenije, kao i pojave gastrointestinalnih tegoba – muĉnine, povraćanja, dijareje i akutnog pankreatitisa, retko holestaze i nekroze jetre. Sa alopurinolom stupa u kliniĉki znaĉajnu interakciju ĉiji je rezultat povećana toksiĉnost azatioprina zbog inhibicije aktivnosti ksantin oksidaze. Primena azatioprina povećava rizik od nastajanja oportunistiĉkih infekcija i limfoproliferativnih poremećaja. Uvod 16 1.4.3.3. Sirolimus (Rapamicin) i Everolimus Sirolimus (rapamicin) i everolimus su makrolidni antibiotici, strukturno sliĉni Tac, ali po mehanizmu delovanja razliĉiti. Njihov imunosupresivni efekat nije baziran na inhibiciji kalcineurina već na inhibiciji odgovora organizma na IL-2 vezivanjem za ciljno mesto- mamalian target of rapamycin (m-TOR). Time se blokira aktivacija T- i B- limfocita, a sirolimus i everolimus su nazvani anti m-TOR imunosupresivni lekovi (49).Vezivanjem za protein takrolimus vezujući protein 12 (FKBP12) stvara se komleks koji ostvaruje inhibiciju signalnog puta meta-rapamicina i tako smanjuje produkciju IL-2 i proliferaciju T-limfocita (slika 3). Ovi savremeni lekovi su sve zastupljeniji u imunosupresivnim protokolima zbog protektivnog delovanja na presaĊeni bubreg i manjeg rizika maligniteta kod transplantiranih pacijenata. Primena sirolimusa (SRL) ili everolimusa (EVE) bez inhibitora kalcineurina dovodi do povećanog rizika odbacivanja grafta i nastanka hirurških komplikacija nakon Tx. Inicijalna terapija sa niskim dozama anti-mTOR i kalcineurinskih inhibitora usporava razvoj ateroskleroze ali povećava rizik nastanka uremijskog sindroma kod pacijenata sa presaĊenim bubregom (50,51,52). Lipidni status pacijenata zahteva kontinuirano praćenje zbog oĉekivane dozno zavisne dispidemije (53). Moguća neželjena dejstva su: pojava akni, usporeno zarastanje rana i produženi period oporavka od akutne tubularne nekroze kod transplantiranih pacijenata, smanjenje koncentracije testosterona, proteinurija, pojava tremora. Everolimus u retkim sluĉajevima izaziva leukopeniju. Farmakokinetika: Nakon peroralne primene SRL i EVE se brzo resorbuju a maximalnu koncentraciju u krvi postižu nakon dva sata kod pacijenata sa transplantiranim bubregom. Sirolimus je supstrat za CYP3A4 i P-gp, zbog ĉega nije preporuĉiva njegova istovremena primena sa snažnim inhibitorima ili induktorima CYP3A4 i P-gp. Metabolizam everolimusa se odvija u jetri, preko citohromalnih enzima CYP3A4 i 3A5 (50,51). Metaboliti se izluĉuju putem žuĉi i bubrega. Racionalni farmakoterapijski pristup upotrebi SRL podrazumeva TDM zbog izražene interindividualne farmakokinetiĉke varijabilnosti (54). Kliniĉke studije pokazuju da godine, pol i telesna masa nemaju uticaja na FK everolimusa, dok je kod pacijenata crne rase primećeno povećanje vrednosti klirensa za 20% u odnosu na pripadnike drugih rasa (55). Uvod 17 1.4.4. Antilimfocitna antitela Antilimfocitni serum se dobija imunizacijom konja humanim limfoidnim ćelijama. Znaĉajna je IgG frakcija antilimfocitnog seruma. Antilimfocitna antitela koja se nalaze u IgG frakciji deluju pre svega na male periferne limfocite blokadom specifiĉnih membranskih proteina - CD2, CD3, CD45, nakon ĉega dolazi do razaranja T-limfocita (slika 3). Delovanje ovih antitela uzrokuje specifiĉni poremećaj kasne preosetljivosti, dok stvaranje humoralnih antitela ostaje skoro nepromenjeno. Ĉesta pojava anafilaktiĉke reakcije i serumske bolesti prilikom primene antilimfocitnog seruma uslovila je pronalazak monoklonalnih antitela. 1.4.5. Monoklonalna antitela Monoklonalna antitela su imunoglobulini proizvodeni u ćelijskim kulturama odabranim da reaguju na antigene koji specifiĉno eksprimiraju ćelije kancera (56). U savremenim imunosupresivnim protokolima koriste se tri tipa monoklonalnih antitela: a- Anti CD3 antitela (blokiraju T limfocite) - muromonab-CD3 b- Anti CD20 antitela (blokira B limfocite) - rituksimab c- Anti CD25 antitela (antagonisti IL-2 receptora) - daklizumab, baziliksimab U Kliniĉkom centru Niš se pri transplantaciji bubrega sprovodi kvaternarna imunosupresija, koja podrazumeva i primenu antagonista IL-2 predstavnika. baziliksimaba. Baziliksimab se u terapiju ukljuĉuje u fazi indukcije imunosupresije, preoperativno i ĉetvrtog dana od Tx radi spreĉavanja ranog odbacivanja transplantiranog bubrega (26,57,58). Baziliksimab se vezuje za alfa lanac IL-2 receptora na aktiviranim T-limfocitima, što dovodi do njihovog uništenja. Hemijski, on predstavlja himarno monoklonalno antitelo koje se vezuje za IL2 receptor aktiviranih T-limfocita, odnosno IL-2R antitelo. Farmakokinetiĉki parametri basiliksimaba (Cmax, AUC) pokazuju doznu zavisnost, dok je proces raspodele leka za sada nedovoljno poznat (59). Volumen distribucije i klirens pokazuju interindividualnu varijabilnost. Maksimalna koncentracija se postiže 30 minuta nakon primene leka. Pol, uzrast ili rasa nemaju uticaja na poluvreme eliminacije, koje iznosi 7,2±3,2 dana. Istovremena upotreba mikofenolat mofetila i azatioprina može redukovati klirens basiliksimaba do 22% (60,61). Osnovni neželjeni efekat je reakcija preosetljivosti na lek. Od najnovijih monoklonalnih antitela znaĉajan je belatacept, koji se nalazi u drugoj fazi kliniĉkih istraživanja. Njegova specifiĉnost ogleda se u vezivanju za CD28, pri ĉemu ne Uvod 18 uslovljava razaranje antitela što omogućava dugotrajnu primenu sa perspektivno boljom funkcijom bubrega i smanjenim rizikom hroniĉne nefropatije alografta (61). 1.4.6. Inhibitori kalcineurina (CNI) Otkriće kalcineurinskih inhibitora (CNI) predstavljalo je veliki pomak u imunosupresivnoj terapiji. Na slici 3. prikazan je njihov mehanizam delovanja. Molekuli ovih lekova unutar ćelija grade kompleks sa imunofilom (imunofilin-vezujući lekovi), inhibirajući aktivnost kalcineurin fosfataze. Posledica ove inhibicije je defosforilacija i nuklearna translokacija u T-limfocitima i njihova smanjena aktivnost. T-pomoćni limfociti su glavna meta, iako i T-supresorske ćelije mogu biti pogoĊene. Inhibicijom kalcineurin fosfataze inhibira se stvaranje i otpuštanje citokina ukljuĉujući interleukin 2 (IL-2), interleukin 3 (IL-3) i interferon-γ. U grupu inhibitora kalcineurina spadaju ciklosporin, takrolimus i novootkriveni ISA 247 koji je još uvek u fazi kliniĉkih ispitivanja. 1.4.6.1. Ciklosporin (CsA) Od predstavnika CNI prvi je pronaĊen CsA, lek peptidne strukture koji blokira aktivaciju T- ćelija u ranom stadijumu njihove antigenom izazvane diferencijacije. Na molekularnom nivou CsA takoĊe inhibira stvaranje i oslobaĊanje limfokina inhibicijom transkripcije gena za IL-2, IL-3 i interferon-γ, pri ĉemu ne dolazi do spreĉavanja interakcije sa antigenom. Vezivanjem za ciklofilin CsA inhibira kalcineurin-fosfatazu, zbog ĉega dolazi do inaktivacije pomoćnih i supresorskih T-ćelija. Efikasnost CsA zavisi od specifiĉne i reverzibilne inhibicije limfocita u G0 i G1 fazi ćelijskog ciklusa. CsA ne utiĉe na funkciju fagocita i ne izaziva supresiju kostne srži (29,62). Farmakokinetika: Nakon oralnog davanja leka, resorpcija CsA je nekompletna, zavisno od vrste i koliĉine unete hrane. Procesom distribucije CsA dospeva duboko u tkiva i telesne teĉnosti sa volumenom distribucije u stanju ravnoteže 3-5 l/kg TM, pri ĉemu se vezuje za proteine plazme do 90%. Metabolizam se odvija preko mikrozomalnih enzima jetre, pre svega CYP 3A4 (63). Manji deo biotransformacije se odigrava u gastrointestinalnom traktu i preko bubrega. Ekskrecija CsA se primarno odvija putem bilijarnog trakta, dok se svega 6% unete doze u obliku nepromenjenog CsA i metabolita izluĉuje putem urina. Lek prolazi placentu i može se ekskretovati ljudskim mlekom (63). Istraživanja su pokazala da farmakokinetiku CsA karakteriše cikardijalni ritam (64). Uvod 19 Akutna toksiĉnost CsA je povezana sa bubrežnom vazokonstrikcijom a funkcionalne promene koje tada nastaju su potencijalno reverzibilne. Hroniĉna toksiĉnost je povezana sa strukturnim promenama u bubrezima (65,66). Kliniĉki relevantne koncentracije CsA mogu da ispolje direktan toksiĉni efekat na tubularne epitelijalne ćelije i potpomognu fibrogenezu stimulisanu autokrinom sekrecijom faktora rasta sliĉnih insulinu (insulin like growth factor- ILGF) i parakrinu sekreciju TGF-beta1 proksimalnog tubularnog epitela (67). Terapijskim monitoringom je moguće odrediti najnižu efektivnu dozu CsA i prevenirati nefrotoksiĉnost. Najĉešći neželjeni efekti CsA su: nefrotoksiĉnost, hepatotoksiĉnost, hipertenzija (zbog vaskularnih oštećenja i povećanja tonusa simpatikusa), hiperlipidemija, dijabetes, neurotoksiĉnost, glavobolje, ĉesto migrenozne prirode i tremor. CsA može da izazove hipertrofiju gingiva a kod žena hirzutizam (67,68). 1.4.6.2.Takrolimus (Tac) Takrolimus je uveden u terapiju nakon CsA kao predstavnik CNI sa boljim bezbedonosnim profilom. 1.5. Takrolimus Takrolimus je makrolidni antibiotik izolovan iz Streptomyces tsukubaenis. Njegov mehanizam delovanja zasniva se na vezivanju za FKBP12 ( takrolimus vezujući protein 12) koji inhibira kalcineurin znatno selektivnije od CsA. Takrolimus blokira aktivaciju T- limfocita u ranom stadijumu antigenom izazvane diferencijacije T-ćelija. Imuni odgovor organizma se modifikuje inhibicijom transkripcije gena za IL-2, IL-3, interferon gama i drugih produkata stimulisanih T-limfocita, dok interakcija sa antigenom ostaje nepromenjena. Takrolimus pokazuje veću specifiĉnost na T-ćelije limfocitne loze, posebno na T-pomoćne ćelije, a ne utiĉe na funkciju fagocita i kostne srži (69,70). Farmakokinetika: Bioraspoloživost peroralnih preparata Tac pokazuje visoku inter i intraindividualnu varijabilnost kod pacijenata sa presaĊenim bubregom. Hrana bogata mastima može smanjiti resorpciju i maksimalnu koncentraciju leka za 37-77%, dok unos ugljenih hidrata smanjuje njegovu bioraspoloživost za 28-65% kod transplantiranih pacijenata. Tac pokazuje visok afinitet vezivanja za albumine plazme, α1-kiseli glikoprotein i eritrocite (5,71). Proces raspodele Tac izmeĊu krvi i plazme zavisi od hematokrita, temperature, koncentacije leka i ukupne koliĉine proteina u plazmi. Tabela 1.3. pokazuje farmakokinetiĉke parametre takrolimusa u zavisnosti od naĉina primene i karakteristika ispitanika (preuzeto sa Rxlist). Uvod 20 Tabela 1.3. Farmakokinetički parametri Tac Grupa (naĉin primene) Doza Cmax (mg/mL) Tmax (h) t1/2 (h) AUC (ngh/mL) CL (L/h/kg) Vd (mL) zdravi (i.v.) 0,025mg/kg na 4 sata / / 34,2±17,7 598±125 0,040±0,009 1,91±0,31 zdravi (per os) 5mg 29,7±17,2 1,6±0,7 34,8±11,6 243±173 0,041±0,008 1,94±0,53 Tx pacijenti (i.v.) 0,02mg/kg na 12 sati / / 18,8±16,7 0294±262 0,083±0,050 1,41±0,66 Tx pacijenti (per os) 0,1mg/kg na 12 sati 19,2±10,3 3 / 0203±242 / / / nije dostupan podatak Tx- pacijenti sa presađenim bubregom Takrolimus se znatno selektivnije od CsA vezuje za proteine koji ulaze u sastav kalcineurina inhibirajući njegovu aktivnost (72,73). Formiranjem kompleksa takrolimus- FKBP-12, kalcijum, kalmodulin i kalcineurin dolazi do inhibicije kalcineurina. Ovo prevenira defosforilaciju i translokaciju nuklearnog faktora aktivisanih T-limfocita (NF-AT), nuklearne komponente preko koje se inicira transkripcija gena za formaciju citokina (IL-2, IL-3, gama interferon). Tac takoĊe inhibira transkripciju gena koji kodiraju interleukine ukljuĉene u ranu fazu aktivacije T-limfocita (74). Delovanjem Tac ostvaruje se inhibicija progresije ćelijskog ciklusa preko ciklina, koji su povezani sa ciklin-zavisnim kinazama (CDK), neophodnim u ćelijskoj deobi. Selektivni CDK inhibitori spreĉavaju ulazak ćelije u ćelijski ciklus ĉime ometaju aktivaciju T limfocita . Metabolizam Tac odvija se u jetri pod dejstvom citohromalnih enzima, pre svega CYP 3A4 i 3A5, pri ĉemu nastaje veći broj metabolita od kojih osam poseduju imunološku aktivnost. Demetilacija i hidroksilacija su primarni mehanizmi biotransformacije in vitro a glavni metabolit je 13-demetil takrolimus. 31-demetil derivat Tac u in vitro studiji pokazao je istu aktivnost kao Tac (71). Takrolimus je supstrat za P - transportni glikoprotein (P-gp), koji je ĉlan familije ABC transportera supstanci. Njegova aktivnost uslovljava izbacivanje leka iz ćelija refluks pumpom, što utiĉe na bioraspoloživost Tac (75,76). Lekovi koji inhibiraju aktivnost P-gp proteina mogu ostvariti znaĉajan uticaj na metabolizam lekova koji su supstrat za P-gp. Ekskrecija Tac se uglavnom odvija putem žuĉi, preko 90% unete koliĉine leka, dok se manje od 1% peroralno unetog leka izluĉuje putem urina u nepromenjenom obliku. Insuficijencija bubrega ili jetre zahteva korekciju doze Tac . Istovremena primena Tac i induktora enzima CYP3A4 (barbiturati, rifampicin, fenitoin, karbamazepin, metamizol, izoniazid, prednizolon i metilprednizolon) uslovljava smanjenje Uvod 21 koncentracije Tac (77). Zbog toga je neophodno odrediti stepen uticaja KS, koji su deo imunosupresivnog protokola na koncentraciju i FK parametre Tac (78,79). Studije su pokazale promenu koncentracije Tac i povećanje vrednosti njegove AUC nakon ukidanja prednizolona kod pacijenata sa presaĊenim organom, što dokazuje postojanje interakcije Tac izmeĊu njih (10,11). Lekovi koji inhibiraju aktivnost CYP3A4 (bromokriptin, ergotamin, etinilestradiol, gestoden, itrakonazol, lidokain, fenitoin, mikonazol, midazolam, nikardipin, nifedipin, noretisteron, hinidin, tamoksifen, verapamil) povećavaju koncentraciju Tac (80). Inhibitorno deluju: kaptopril, hloramfenikol, cimetidin, klaritromicin, ciklosporin, danazol, flukonazol, ketokonazol, metoklopramid, omeprazol i sulindak (77). Naringenin, sastojak soka od grejpfruta utiĉe na bioraspoloživost Tac inhibicijom prevashodno intestinalnog CYP3A4. Pri istovremenoj primeni inhibitora CYP3A4 enzima i Tac povećan je njegov toksiĉni potencijal. Polimorfizam CYP3A5 je važan faktor varijabilnosti farmakokinetike Tac (81). Postoje dokazi da je u opštoj populaciji dominantan CYP3A5*3/*3 genotip. Manje zastupljeni CYP3A5*1/*3 korelira sa signifikantno nižim plazma koncentracijama i većim volumenom distribucije Tac. Pacijenti sa CYP3A5*1/*3 genotipom zahtevaju korekciju doznog režima Tac u cilju postizanja zadovoljavajućeg imunosupresivnog efekta (81,82,83). Farmakogenetiĉko ispitivanje o zastupljenosti CYP3A5*1/*3 kod naše populacije omogućilo bi utvrĊivanje znaĉaja ove karakteristike za populaciono modelovanje takrolimusa. Nefrotoksiĉni i neurotoksiĉni efekti predstavljaju najznaĉajnija neželjena dejstva Tac. U toku primene takrolimusa moguća je pojava hipertenzije, posttransplantacijskog dijabetesa (PTDM) i dislipidemije. Terapija takrolimusom retko uzrokuje gastrointestinalne tegobe, hipertrofiju desni i hirzutizam (84). U poreĊenju sa CsA, Tac poseduje bolji bezbedonosni profil sa manjim rizikom od razvoja hipertenzije i hiperlipidemije, pojave hirzutizma i hiperplazije gingiva (67,85,86). Nefrotoksiĉnost Tac može biti akutna i hroniĉna. Akutna nefrotoksiĉnost Tac je dozno zavisna i vezana za vazokonstrikciju aferentne arteriole, što smanjenje perfuziju bubrega i brzinu glomerularne filtracije (87,88). Funkcio- nalne promene krvnih sudova i tubula koje se javljaju pri akutnoj intoksikaciji su dozno zavisne i reverzibilne prirode. Biohemijski parametri nefrotoksiĉnosti su povećane vrednosti serumskog kreatinina i uree. Elektrolitni i acidobazni disbalansa ukazuju na akutnu tubularnu disfunkciju. Usled smanjene ekskrecije kalijuma, vodoniĉnog jona i mokraćne kiseline dolazi do hiperkalijemije, metaboliĉke acidoze i hiperurikemije, dok smanjena resorpcija magnezijuma izaziva hipomagnezijemiju. Intrarenalna vazokonstrikcija se objašnjava istovremenom promenom ekspresije tromboksana i prostanglandina, endotelina i azot oksida. Uvod 22 UtvrĊene su promene u koncentraciji intracelularnog kalcijuma, u funkciji sistema renin- angiotenzin, dok je povećan tonus simpatikusa i produkcija slobodnih radikala (89,90). Patogeneza hroniĉne nefrotoksiĉnosti izazvane Tac nije u potpunosti razjašnjena, kao ni njena povezanost sa povišenim nivoom leka u krvi. Pretpostavlja se da je povezana sa povećanom produkcijom TGF-beta 1 koja dovodi do povećane sinteze matriksnih proteina i endotelina, povećane renalne simpatiĉke aktivnosti i produkcije angiotenzina II, potentnog vazokonstriktora, koji se smatra znaĉajnim za razvoj hroniĉne nefrotoksiĉnosti Tac (91,92). Biohemijski parametri hroniĉne nefrotoksiĉnosti su blago povećanje uree i kreatinina u serumu, zbog ĉega je bitan monitoring biohemijskih parametara bubrežne funkcije u post- transplantacijskom periodu (93). Morfološke promene su ireverzibilne i ogledaju se u nastanku mononuklearne infiltracije i vakuolizacije, intersticijalne fibroze i hijaline arteriolopatije. Animalne studije pokazale su da se funkcionalni parametri oštećenja bubrega mogu ustanoviti znatno ranije u odnosu na morfološke promene. Pretpostavlja se da Tac ima manji fibrogenski potencijal u poreĊenju sa CsA, zbog manje indukcije TGF-beta ( pokazano radom sa pacovima) (67,94). Studije sa izolovanim glomerulima, dobijenim biopsijom transplantiranih bubrega, pokazuju da je Tac manje stimulativan za profibrotske gene u odnosu na CsA (95). Trombocitna mikroangiopatija (TMP) predstavlja posebnu formu akutne vaskularne toksiĉnosti CNI. To je retka, ali ozbiljna komplikacija, koja se ogleda u akutnom pogoršanju renalne funkcije. Povezana je sa trombocitopenijom i hemolitiĉkom anemijom. Patogeneza ukljuĉuje oštećenje endotela uzrokovano lekom, sa poslediĉnim oslobaĊanjem citokina, aktivacijom trombocita i formiranjem mikrotromba. TMP povećava rizik ranog gubitka transplantata i ugrožava život primaoca organa (96, 97). 1.5.1. Znaĉaj TDM takrolimusa Terapijski monitoring Tac je neophodan uslov optimalnog farmakoterapijskog protokola transplantiranih bolesnika zbog njegove varijabilne farmakokinetike, malog terapijskog indeksa i postojanja korelacije izmeĊu akutne nefrotoksiĉnosti i nivoa leka (4). Poseban oprez zahtevaju pacijenti sa hroniĉnom infekcijom virusom hepatitisa B i C zbog moguće disfunkcije jetre. Nefrotoksiĉnost takrolimusa se povećava prilikom istovremene primene drugih lekova sa nefrotoksiĉnim potencijalom (aminoglikozidnih antibiotika, amfotericina B, nesteroidnih antiinflamatornih lekova). Redukcijom doze Tac neposredno Uvod 23 nakon uoĉavanja prvih znakova nefrotoksiĉnosti ili nefropatije presaĊenog bubrega moguće je smanjiti posledice toksiĉnih efekata leka. Nova formulacija preparata takrolimusa, sa modifikovanim oslobaĊanjem lekovite supstance, koja omogućava primenu leka jednom dnevno može znaĉajno da poboljša adherencu transplantiranih pacijenata. Ispitivanja su pokazala da formulacija sa modifikovanim oslobaĊanjem predstavlja efikasniji oblik terapije Tac sa boljim bezbedonosnim profilom (98,99). Takrolimus pokazuje visok interakcioni potencijal. Najvažnije kliniĉki znaĉajne interakcije Tac, njihov mehanizam nastanka i efekat prikazani su u tabeli 1.4. Tabela 1.4. Klinički značajne interakcije takrolimusa Lek koji stupa u interakciju sa Tac Mehanizam nastanka Efekat interakcije Trimetoprim+sulfametoksazol nejasan mehanizam ↓ konc.Tac Ditiazem kompeticija u metabolizmu ↑ konc.Tac Fenitoin indukcija enzima jetre ↓ konc.Tac Fenobarbiton indukcija enzima jetre ↓ konc.Tac Rifampicin indukcija enzima jetre ↓ konc.Tac Izoniazid indukcija enzima jetre ↓ konc.Tac Sirolimus adicija terapijskog efekta ↑ imunosupresija Ketokonazol inhibicija enzima jetre ↑ konc. Tac Eritromicin kompeticija u metabolizmu ↑ konc. Tac Kortikosteroidi indukcija enzima jetre ↓ konc. Tac Amfotericin B adicija toksiĉnog efekta ↑nefrotoksiĉnosti Aminoglikozidni antibiotic adicija toksiĉnog efekta ↑ nefrotoksiĉnosti Alopurinol inhibicija metabolizma ↑ konc. Tac Diklofenak povećana resorpcija diklofena ↑ konc diklofenaka Metotreksat povećana resorpcija metotreksata. ↑ konc.metotreksata Hyperici herba indukcija enzima jetre ↓ konc. Tac Echinaceae herba imunostimulacija kontraindikovana primena Naringenin inhibicija intestinalnog CYP 3A4 ↑ konc.leka Oralni kontraceptivi modifikacija metabolizma smanjen efekat kontraceptiva Nifedipin inhibicija metabolizma ↑ konc. Tac Bromokriptin inhibicija metabolizma ↑ konc. Tac Generalno, indukcija CYP3A4 enzima dovodi do smanjenja koncentracije i efikasnosti Tac što povećava mogućnosti odbacivanja grafta, dok za inhibitore CYP3A4 enzima važi suprotno, što povećava rizik pojave neželjenih efekata i toksiĉnih oštećenja ciljnih organa. Optimizacija doznog režima Tac pomoću terapijskog monitoringa predstavlja efikasnu prevenciju neželjenih efekata, povećava kvalitet života bolesnika i omogućava optimalnu funkciju grafta. Radna hipoteza 24 2. RADNA HIPOTEZA 2.1. Radna hipoteza Glavna radna hipoteza ovog rada bila je: H: Validnost farmakokinetiĉkih parametara dobijenih nakon analize prve doze takrolimusa potvrĊuje se u stanju ravnoteže kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Zasnovana je na ĉinjenici da takrolimus pokazuje visok stepen farmakokinetiĉke varijabilnosti. Zbog toga je neophodno odabrati odgovarajuću farmakokinetiĉku analizu ĉiji će rezultat definisati najvažnije faktore koji utiĉu na farmakokinetiĉke parametre takrolimusa. Obrzirom da imunosupresija transplantiranih pacijenata podrazumeva primenu većeg broja lekova, neophodno je sprovesti odgovarajuću farmakokinetiĉku analizu nakon primene inicijalne doze takrolimusa i u stanju ravnoteže. 2.2. Pomoćne radne hipoteze U toku istraživaĉkog rada postavljene su sledeće pomoćne hipoteze: H1: Primenjena doza kortikosteroida i prateća koterapija može uticati na nivo takrolimusa u krvnoj plazmi kod pacijenata sa presaĊenim bubregom H2: Moguće je postojanje znaĉajne razlike u farmakokinetici takrolimusa u zavisnosti od pola transplantiranih pacijenata. Ciljevi rada 25 3. CILJEVI RADA Postavljeni su sledeći ciljevi ovog istraživanja: 1. Izvršiti farmakokinetičku analizu nakon primene prve per os doze Tac kod pacijenata sa presađenim bubregom 2. Nakon postizanja ravnotežnog stanja ponoviti farmakokinetičku analizu takrolimusa i uporediti sa rezultatima dobijenim nakon prve doze 3. Populacionom farmakokinetičkom analizom odrediti populacione farmakokinetičke parametre takrolimusa i ispitati uticaj pojedinih činilaca na njihove vrednosti 4. Pratiti neželjena dejstva takrolimusa u toku imunosupresivne terapije pacijenata sa presađenim bubregom 5. Utvrditi da li postoji polna razlika u farmakokinetici takrolimusa kod pacijenata sa presađenim bubregom Pacijenti i metode 26 4. PACIJENTI I METODE 4.1. Pacijenti U studiji je uĉestvovalo 64 pacijenta starosti od 27 do 57 godina, kojima je presaĊivanje bubrega obavljeno u periodu od 2007. do 2011. godine. Ispitivanja su vršena na Klinici za nefrologiju i Centralnoj biohemijskoj laboratoriji Kliniĉkog centra Niš. Farmakokinetiĉka analiza je obavljena na odseku za farmaciju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Nišu. U toku ispitivanja pacijenti su bili na kontrolisanom, bolniĉkom dijetetskom režimu ishrane, koji podrazumeva adekvatan odnos ugljenih hidrata, masti i proteina sa odgovarajućim brojem kalorija. Obroci su servirani u 9.00, 13.00 i 18.00 ĉasova, a takrolimus je primenjivan u 8.00 i 20.00 ĉasova. Inicijalna doza Tac odreĊivana je prema telesnoj masi pacijenta (0,05mg/kg TM). Režim doziranja Tac je tokom ispitivanja modifikovan prema izmerenoj koncentraciji na kraju doznog intervala. U prvih šest nedelja nakon transplantacije (Tx) ciljna koncentracija Tac je iznosila 10-15ng/mL a nakon tog perioda 5-15ng/mL. Kod pacijenata je primenjivan kompleksan imunosupresivni protokol – takrolimus, mikofenolat mofetil, kortikosteroidi i monoklonalno antitelo baziliksimab. Baziliksimab je primenjivan prvog i ĉetvrtog dana u dozi od 20mg/dan. Doza mikofenolat mofetila iznosila je 1500-2000mg/dan. Kortikosteroidnu terapiju pacijenti su zapoĉinjali intravenskim metilprednizolonom, a tri dana nakon Tx nastavljali peroralno sa prednizolonom u dozi od 1mg/kgTM/dan u trajanju od sedam dana. U daljem periodu dnevna doza prednizolona je sukcesivno redukovana do dostizanja doze održavanja od 10mg/dan. Pored imunosupresivnih lekova pacijenti su imali prateću antihipertenzivnu i drugu koterapiju u zavisnosti od indikacija. Antihipertenzivna terapija transplantiranih pacijenata obuhvatala je primenu nifedipina (proseĉno 68mg za muškarce, 32mg za žene) i diltiazema (proseĉno 160mg za muškarce i 120mg za žene). 4.2. Analitiĉke metode Koncentracija Tac je merena u Centralnoj biohemijskoj laboratoriji KC Niš na Imx - Abbott analajzeru (Imx, Abbot, Abbot Park,IL,USA) iz uzoraka pune krvi nakon dodatka precipitirajućeg reagensa (cink-sulfat u mešavini metanola i etilenglikola), sa EDTA kao antikoagulansom. OdreĊivanje koncentracije Tac vršeno je po Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA) tehnologiji, sa limitom kvantifikacije 1,5 ng/mL i linearnošću u rangu 3,7-24,3 ng/mL. Analitiĉka osetljivost metode omogućena je sa 1,5 ng/mL. Preciznost metode ustanovljena je i opisana u Nacionalnom komitetu za kliniĉke laboratorijske standarde. MEIA tehnologija omogućava rezultate sa koeficijentom varijacije CV<15%. Korelacioni koeficijent sa HPLC/MS/MS analitiĉkim metodom iznosi 0,987. Pacijenti i metode 27 OdreĊivanje standardnih biohemijskih parametara - urea, serumski kreatinin, aspartat amino transferaza (AST), alanin amino transferaza (ALT), alkalna fosfataza (ALP), holesterol, glukoza, trigliceridi, hematokrit kod pacijenata sa presaĊenim bubregom vršeno je u biohemijskoj laboratoriji Klinike za nefrologiju KC Niš. Istraživanja su odobrena od Etiĉkog komiteta Medicinskog fakulteta Univerziteta u Nišu. 4.3. Farmakokinetiĉka analiza i statistiĉka obrada podataka Podaci dobijeni tokom istraživaĉkog rada korišćeni su za 3 analitiĉke procedure. Procedura 1. Proceduru 1. predstavljala je neprostorna FK analiza dobijenih koncentracija Tac, nakon primene inicijalne doze leka (0,05mg/kgTM) i u ravnotežnom stanju (stady state - SS). Neprostorna FK analiza podataka obavljena je upotrebom farmakokinetiĉkog softvera WinNonLin, verzija 4.1 (Pharrsight, St Louis, MO, USA). Vrednosti za površinu ispod krive (AUC) dobijene su linearnim trapezoidnim pravilom. Korelacija izmerenih koncentracija Tac u odreĊenim vremenima i vrednosti AUC0-12 utvrĊena je regresionom analizom i izražena Pears-ov koeficijentom korelacije r. Predvidljivost koncentracije Tac u odreĊenom vremenu za vrednost AUCp odreĊena je koeficijentom determinacije r2. Procedura 2. Populaciona FK analiza obavljena je NONMEM softverom (verzija 5, nivo 1.1) na katedri za farmakologiju Medicinskog fakulteta u Kragujevcu. Analiza je obavljena upotrebom 89 podataka dobijenih od 63 pacijenta koji su bili podeljeni u dve grupe (grupa za izgradnju modela- 44 ispitanika, grupa za validaciju- 19 ispitanika). Izabrana je ADVAN2 programska subrutina za izraĉunavanje populacionih vrednosti klirensa, bioraspoloživosti i volumena distribucije Tac i odreĊivanje uticaja izabranih varijabli. Podaci o izmerenim koncentracijam i doznom režimu Tac su dobijeni u stanju ravnoteže na kraju doznog intervala, zbog ĉega nije odreĊena vrednost konstante resorpcije. Proces populacione farmakokinetiĉke analize (PFK) sastojao se od tri osnovne faze:  definisanje baznog modela  graĊenje modela uz analizu i ukljuĉivanje znaĉajnih izabranih varijabli u finalni model  validacija dobijenog finalnog modela. Rezultat prve faze su populacione vrednosti FK parametara - populaciona vrednost klirensa, volumena distribucije i bioraspoloživosti. U izgradnji baznog modela razmatrani su izabrani stalni efekti modela i odreĊena je interindividualna i intraindividualna varijabilnost u ispitivanoj populaciji. Interindividualna varijabilnost i rezidualna greška izmerenih koncentracija izražene su preko modela eksponencijalne i aditivne greške. Pacijenti i metode 28 U drugoj fazi je univarijantnom selekcijom utvrĊen znaĉaj pojedinaĉnih varijabli. Za svaki parametar je utvrĊen minimum objektivne funkcije u modelu koji se definiše kao negativni dvostruki logaritam verovatnoće podataka (Beal, Sneiner;1998). Osnovni kriterijum koji je korišćen za procenu statistiĉke znaĉajnosti varijable je redukcija u minimumu objektivne funkcije (MOF) izmeĊu modela (χ2=6,64; p<0,01). U sledećem koraku druge faze zahtevana je veća statistiĉka znaĉajnost varijable izražena preko MOF=10,83 (χ2=10,83; p<0,01). Formiranje konaĉnog modela zahtevalo je redukciju interindividualne i rezidualne varijabilnosti i procenu odnosa: 1) predviĊenih (PRED) i izmerenih vrednosti (DV) koncentracija Tac 2) utvrĊene rezidualne varijabilnosti (WRES) i predviĊenih koncentracija (PRED) Tac tokom celokupne druge faze, od baznog do finalnog modela. Treću fazu PFK predstavljala je validacija finalnog populacionog modela - proces koji je bio neophodan za potvrdu predvidljivosti konaĉnog modela. Validacioni set podataka nije ukljuĉivao podatke niti pacijente koji su uĉestvovali u izgradnji modela. Preciznost formiranog konaĉnog populacionog modela Tac i njegova validnost dobijeni su izraĉunavanjem grešaka u predviĊanju po sistemu koji su utvrdili Sheiner i Beal (izraĉunavane su srednja greška predviĊanja - MPE; srednja statistiĉka greška - MSPE i rezidualna srednja greška predviĊanja - RMSE) Procedura 3. Ispitivanje uticaja primenjene doze KS na koncentraciju Tac kod transplantiranih pacijenata je obavljeno statistiĉkom obradom podataka o primenjenim dozama KS, izmerenim koncentracijama Tac, vrednostima serumskog kreatinina, uree, glukoze, holesterola, AST, ALT i ALP. Biohemijski podaci dobijeni u ispitivanom periodu uporeĊivani su neparametarskim Fridmman-ovim testom za vezane uzorke, izraženim pomoću Friedman Shi- square vrednosti. Statistiĉki znaĉajnost je potvrĊena za vrednost p<0,05. Statistiĉkim Wilcox testom procenjen je uticaj dnevne doze KS na koncentraciju Tac u izabranim vremenskim intervalima. Mann-Witney test je korišćen za poreĊenje doze, koncentracije Tac i dozno korigovane koncentracije Tac unutar grupa. Statistiĉka obrada demografskih karakteristika ispitivanih pacijenata izvršena je Statistic R softverom i SPSS (verzija 10). Statistiĉkim t-testom odreĊena je znaĉajnost razlike u demografskim karakteristikama ispitivanih pacijenata razliĉitog pola. Statistiĉka znaĉajnost je potvrĊena za vrednost p<0,05. Dobijeni rezultati svih izvršenih analiza su klasifikovani i prikazani tabelarno i grafiĉki, sa izraženom statistiĉkom znaĉajnošću. Rezultati 29 5. REZULTATI 5.1. Rezultati farmakokinetiĉke analize prve doze Tac kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Ispitivanje je obuhvatilo 18 pacijenata (10 muškaraca i 8 žena) kojima je obavljeno presaĊivanje bubrega sa živog davaoca tokom 2008. u Kliniĉkom centru Niš. Inicijalna doza takrolimusa (0,05mg/kg TM) je primenjena ĉetvrtog dana nakon transplantacije. Koncentracija leka je odreĊivana 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 8 i 12 sati nakon peroralne primene radi izrade FK profila takrolimusa. Farmakokinetiĉko ispitivanje prve doze Tac obavljeno je neprostornom FK analizom prema proceduri 1. Demografski podaci pacijenata koji su uĉestvovali u ovom ispitivanju prikazani su u tabeli 5.1. Tabela 5.1. Demografski podaci transplantiranih pacijenata Starost (godine) BMI(kg/m 2 ) Scr (µmol/L) Muškarci Srednja vrednost ±SD 40±8,7 23,5±3,1 282,88 Min 31 17,53 185,64 Max 51 28,06 344,76 t-test p=0,69 p=0,81 Žene Srednja vrednost ±SD 39±5,7 23,7±3,0 229,84 Min 33 16,41 167,96 Max 47 25,39 274,04 Ukupno Srednja vrednost ±SD 40±7,4 23,6±2,9 245,66 Min 31 16,41 167,96 Max 51 28,58 344,76 Scr – serumski kreatinin; p- statistiĉki znaĉajnim se smatra vrednost manja od 0,05 Dobijeni podaci su pokazali sliĉne demografske karakteristike kod ispitivanih pacijenata, u pogledu starosti i indeksa telesne mase (BMI). Proseĉna starost ispitivanih pacijenata iznosila je kod žena 39±5,7,kod muškaraca 40±8,7 godina (31-51). Proseĉna vrednost BMI ispitanika iznosila je 23,5±3,1 kg/m2. Zapažena je statistiĉki znaĉajna razlika u nivou serumskog kreatinina izmeĊu muškaraca i žena (282,88 µmol/L kod muškaraca : 229,84 µmol/L kod žena; p<0,05), dok brzina glomerularne filtracije nije pokazala znaĉajne razlike u odnosu na pol (31,2 mL/min kod muškaraca : 30,8 mL/min kod žena). Izmerene koncentracija Tac nakon primene inicijalne doze prikazane su u tabeli 5.2. Rezultati 30 Tabela 5.2. Koncentracije Tac kod nakon primene prve doze kod transplantiranih pacijenata ukupno Vreme merenja koncentracije Tac (h) AUC0-12 (ngh/mL) 00,5 01 01,5 02 04 8 12 Cn±SD 09,7±5,1 19,6±7,1 19,7±6,1 12,8±4,5 06,5±2,8 3,6±2,2 02,2±1,6 078,90±25,7 Min 00,3 10,7 26,4 13,9 01,7 0,8 00,2 148,25 Max 21,3 30,0 26,6 19,5 11,3 7,9 05,3 128,62 Ţene Cn ±SD 11,6±5,6 18,7±8,1 16,6±6,3 10,9±5,5 04,6±2,7 1,8±1,2 1,2±1,1 060,50±20,8 Min 03,6 09,2 12,8 06,6 02,5 0,8 0,2 48,25 Max 21,3 25,6 23,2 18,6 10,2 3,5 3,1 78,97 Muškarci Cn ±SD 08,3±4,5 20,4±6,6 22,3±4,8 14,3±3,1 08,1±1,8 5,1±1,7 3,0±1,4 093,80±19,1 Min 00,3 11,2 16,5 09,3 05,7 2,9 1,1 175,95 Max 14,5 30,0 26,6 19,5 11,3 7,9 4,7 128,62 Cn – srednja vrednost izmerene koncentracije Tac (ng/mL) u vremenu n SD – standardna devijacija AUC0-12 - površina ispod krive u prvih 12 sati nakon peroralne primene Tac Min - minimalna vrednost izmerene koncentracije Tac Max - maksimalna vrednost izmerene koncentracije Tac Naši rezultati su pokazali veliku interindividualnu varijabilnost izmerenih koncentracija Tac kod pacijenata sa presaĊenim bubregom. Grafiĉki prikaz izmerenih koncentracija Tac nakon prve doze predstavljen je na slici 5.1. Slika 5.1. Interindividualna varijabilnost koncentracija Tac kod ispitivanih pacijenata Grafik c=f(t) jasno pokazuje farmakokinetiĉki profil i interindividualnu varijabilnost u farmakokinetici Tac kod ispitivanih pacijenata. Neprostornom FK analizom izmerenih koncentracija Tac prema proceduri 1. dobijeni su FK parametri koji su prikazani u tabeli 5.3. Rezultati 31 Tabela 5.3. Farmakokinetički parametri Tac dobijeni neprostornom FK analizom AUC0-12 (ngh/mL) AUC (ngh/mL) Kel (h -1 ) T1/2 (h) C max (ng/l) T max (h) MRT (h) Oba pola 78,98±25,72 102,84±41,77 0,17±0,10 5,89±3,35 22,96±5,26 1,19±0,35 7,81±4,79 ţene 60,48±20,82 072,94±30,87 0,21±0,12 5,07±3,46 21,40±6,03 1,06±0,42 7,56±5,50 muškarci 93,79±19,08 126,77±33,53 0,13±0,07 6,55±3,28 24,22±4,47 1,29±0,26 9,20±4,90 AUC0-12- skraćena vrednost površine ispod krive AUC – ukupna površina ispod krive Kel - konstanta eliminacije T1/2 – poluvreme eliminacije C max – maksimalna izmerena koncentracija Tac T max – vreme postizanja maksimalne koncentracije Tac MRT – srednje vreme zadržavanja Tac Neprostornom FK analizom podataka dobijeni su: konstanta eliminacije Tac, maksimalna koncentracija leka, vreme dostizanja Cmax, vreme polueliminacije (T1/2 ), srednje vreme zadržavanja Tac u organizmu (MRT), površina ispod krive u prvih 12 sati (skraćena AUC, AUC0-12) i ukupna AUC. Volumen distribucije i klirens Tac nisu odreĊivani zbog peroralne primene Tac. Pregledom dobijenih rezultata merenja koncentracija Tac kod Tx-pacijenata, ustanovljeno je da se maksimalna koncentracija Tac postiže sat i po nakon peroralne primene leka (srednja vrednost Tmax iznosi 1,19±0,35 h). Uoĉena je statistiĉki znaĉajna razlika vrednosti AUC0-12 izmeĊu muškaraca i žena (93,8±19,1 : 60,5±20,8; p<0,01). Ostali FK parametri nisu pokazali polom uslovljene statistiĉki znaĉajne razlike. Srednje koncentracije Tac i njihov odnos sa maksimalnom i minimalnom AUC kod Tx pacijenata prikazani su na slici 5.2. Slika 5.2. Komparacija maksimalne, minimalne i srednje vrednosti AUC0-12 kod Tx pacijenata Rezultati 32 Slika 5.2. pokazuje da su se srednje izmerene koncentracije Tac nalazile u terapijskom opsegu, uz pojedinaĉna odstupanja. Minimalna vrednost AUC0-12 je skoro ĉetiri puta manja od maksimalne, što prati izraženu varijabilnost izmerenih koncentracija Tac. Tabela 5.4. pokazuje korelaciju dobijenih srednjih vrednosti koncentracija Tac i srednje vrednosti AUC0-12 sa izraĉunatom statistiĉkom znaĉajnošću. Prema proceduri 1. je odreĊen Piersov koeficijent korelacije i pripadajući nivo statistiĉke znaĉajnosti za srednje koncentracije Tac u svim mernim vremenima. Rezultati su prikazani u tabeli 5.4. Tabela 5.4. Korelacija između srednjih vrednosti koncentracija Tac i AUC0-12 ispitanika Koncentracija Tac (ng/mL) r p C0,5 09,75±5,14 -0,195 0,219 >0,051 C1 19,63±7,13 0,518 0,014 <0,051 C1,5 19,74±6,07 0,768* 0,000 <0,001 C2 12,76±4,54 0,853* 0,000 <0,001 C4 06,51±2,82 0,911* 0,000 <0,001 C8 03,63±2,20 0,846* 0,000 <0,001 C12 02,22±1,56 0,665* 0,000 <0,005 Nivo značajnosti za korelaciju je p< 0,05 Izraĉunavanjem koeficijenta korelacije potvrĊena je statistiĉki znaĉajna korelacija srednje vrednosti koncentracija i AUC0-12 Tac u svim posmatranim vremenima osim koncentracije izmerene pola sata nakon peroralne primene Tac. Regresiona analiza je postavila sistem jednaĉina koje daju matematiĉki model sistema sukcesivnim uvoĊenjem nezavisno promenljivih. Srednje vrednosti izmerenih koncentracija Tac predstavljale su nezavisno promenljive, a vrednost AUC (AUCp) zavisnu promenljivu u dobijenim jednaĉinama. Jednaĉine regresione analize su prikazane u tabeli 5.5. Rezultati 33 Tabela 5.5. Regresiona analiza korelacije predviđene vrednosti AUC (AUC p) na osnovu srednjih vrednosti izmerenih koncentracija (C) sa vrednostima regresionog koeficijenta r i koeficijenta linearne determinacije r 2 Regresiona jednaĉina r r2 1 AUCp = 24,885 + 8,316* C4 0,911 0,829 2 AUCp = 09,638 + 6,454 * C4+ 1,386 * C1,5 0,946 0,895 3 AUCp = 11,231 + 4,164 *C4 + 1,304 * C1,5 + 4, 151* C8 0,974 0,949 4 AUCp = -3,263 + 3,962 * C4 + 1,444 * C1,5 + 5,034 * C8 + 0,996 * C0,5 0,991 0,982 5 AUCp = 0,739 + 3,020 * C4 + 0,983 * C1,5 + 5,114 * C8 + 0,770 * C0,5 + 1,145 * C2 0,996 0,991 6 AUCp = 0,242 + 2,972 * C4 + 0,719 * C1,5 + 5,155 * C8 + 0545 * C0,5 + 1,103 * C2 + 0,363 * C1 0,998 0,996 7 AUCp = 0,00014 + 3,000 * C4 + 0,5 * C1,5 + 4,000 * C8 + 0,500 * C0,5 + 1,250 * C2+ 0,500 * C1 + 2,00 C12 1,000 1,000 1 nezavisna promenljiva C4 i zavisno promenljiva AUCp 2 nezavisne promenljive: C4, C1.5 i zavisno promenljiva AUCp 3 nezavisne promenljive: C4, C1,5, C8 i zavisno promenljiva AUCp 4 nezavisne promenljive: C4, C1,5, C8, C0,5 i zavisno promenljiva AUCp 5 nezavisne promenljive: C4, C1,5, C8, C0,5, C2 i zavisno promenljiva AUCp 6 nezavisne promenljive: C4, C1,5, C8, C0,5, C2, C1 i zavisno promenljiva AUCp 7 nezavisne promenljive: C4, C1,5, C8, C0,5, C2, C1, C12 i zavisno promenljiva AUCp Za svaku regresionu jednaĉinu izraĉunat je regresioni koeficijent i koeficijent determinacije prema proceduri 1. radi procene znaĉajnosti. Koncentracija Tac izmerena ĉetiri sata nakon peroralno primenjene inicijalne doze (C4) je odreĊena kao najbolja nezavisna promenljiva za predviĊanje vrednosti zavisno promenljive AUCp, zbog najbolje korelacije izmeĊu AUCp i izraĉunate stvarne vrednosti AUC0-12. Na taj naĉin je pokazano da se korišćenjem ove koncentracije može postići zadovoljavajuća predvidljivost AUC, prediktora ukupne izloženosti pacijenta takrolimusu. Rezultati 34 5.2. Rezultati neprostorne farmakokinetiĉke analize Tac u ravnoteţnom stanju (SS) kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Farmakokinetiĉko ispitivanje je obuhvatilo 16 pacijenata (8 muškaraca i 8 žena) kojima je presaĊivanje bubrega obavljeno u Kliniĉkom centru Niš. Prilikom uvoĊenja takrolimusa u terapiju merene su koncentracije Tac 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 8 i 12 sati nakon peroralne primene, na osnovu kojih su neprostornom FK analizom odreĊene vrednosti njegovih FK parametara. Na osnovu izmerenih koncentracija Tac u krvi na kraju doznog intervala pomoću terapijskog monitoringa modifikovan je dozni režim Tac kod Tx bolesnika do postizanja ravnotežnog stanja. Demografski podaci ispitivanih transplantiranih pacijenata u saglasnosti su u pogledu starosti i BMI sa podacima dobijenim tokom neprostorne FK analize prve doze Tac. Merenje koncentracija Tac je u SS stanju je vršeno u toku izabranog dvanaestoĉasovnog doznog intervala - 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 8 i 12 sati nakon peroralne primene leka. Neprostorna FK analiza Tac izvršena je prema proceduri 1. Izmerene koncentracija Tac nakon postizanja ravnotežnog stanja kod transplantiranih pacijenata prikazane su u tabeli 5.6. Tabela 5.6. Koncentracije Tac dobijene u SS stanju kod transplantiranih pacijenata ukupno Vreme merenja koncentracije Tac (h) (ngh/mL) 0,5 1 1,5 2 4 8 12 ±SD 7,72±3,5 13,33±6,9 14,55±5,1 12,34±3,54 9,61±2,27 7,24±1,25 5,99±1,53 104,49±20,02 Minss 12,1 24,7 26,2 16,5 16,3 5,2 3,7 173,45 Maxss 14,8 28,0 24,8 18,9 15,0 9,2 8,5 129,35 Ţene ±SD 8,89±4,35 14,98±8,76 15,14±6,2 12,66±3,91 9,8±2,15 7,34±1,48 6,06±1,91 107,72±23,44 Minss 13,8 25,8 26,2 16,5 16,3 5,2 3,7 173,45 Maxss 14,8 28,0 24,8 18,6 12,6 9,2 8,5 129,35 Muškarci ±SD 6,56±2,06 11,68±4,36 13,96±3,9 12,03±3,70 9,43±2,51 7,14±1,06 5,91±1,17 101,26±16,91 Minss 2,1 14,7 27,1 18,4 16,6 5,8 4,6 74,7 Maxss 8,2 18,4 20,1 18,9 15,0 8,8 8,2 125,13 - površina ispod krive u prvih 12 sati nakon peroralne primene Tac u ravnotežnom stanju - srednja vrednost izmerene koncentracije Tac (ng/mL) u vremenu n u ravnotežmom stanju SD - standardna devijacija Minss - minimalna vrednost izmerene koncentracije Tac Maxss - maksimalna vrednost izmerene koncentracije Tac Izmerene koncentracije Tac su nakon postizanja ravnotežnog stanja pokazale veliku interindividualnu varijabilnost kod ispitivanih pacijenata. Opseg izmerenih vrednosti Rezultati 35 koncentracija Tac u SS je znaĉajno manji u odnosu na prvu dozu. Grafiĉki prikaz izmerenih koncentracija Tac nakon postizanja ravnotežnog stanja predstavljen je na slici 5.3. Slika 5.3. Interindividualna varijabilnost koncentracija Tac u SS kod ispitivanih pacijenata Grafiĉki prikaz koncentracije Tac u funkciji vremena proteklog od peroralne primene leka pokazuje sliĉnost u interindividualnoj varijabilnosti kod ispitanika nakon primene inicijalne doze leka i u ravnotežnom stanju. Neprostornom FK analizom izmerenih koncentracija Tac prema proceduri 1. dobijeni su FK parametri ravnotežnog stanja koji su prikazani u tabeli 5.7. Tabela prikazuje FK parametre grupe ispitanika i parametre dobijene polno sektivnim FK pristupom. Tabela 5.7. Farmakokinetički parametri Tac dobijeni neprostornom FK analizom u ravnotežnom stanju kod pacijenata sa presađenim bubregom (ngh/mL) (ngh/mL) (h -1 ) (h) (ng/L) (h) (h) Oba pola 104,49±20,02 240,04±111,80 0,047 14,72±18,31 16,51±5,28 1,56±1,03 56,89±58,10 ţene 107,72±23,44 227,76±194,55 0,053 12,97±15,81 17,69±6,87 1,38±1,13 41,46±29,98 muškarci 101,26±16,91 252,32±132,29 0,042 16,47±10,36 15,34±3,07 1,75±0,96 72,32±76,09 -skraćena vrednost površine ispod krive -ukupna površina ispod krive -konstanta eliminacije -poluvreme eliminacije -maksimalna izmerena koncentracija Tac -vreme postizanja maksimalne koncentracije Tac -srednje vreme zadržavanja Tac Rezultati 36 Neprostornom FK analizom podataka dobijeni su: konstanta eliminacije Tac, maksimalna koncentracija leka, vreme dostizanja maksimalne koncentracije, vreme polueliminacije (T1/2 ), srednje vreme zadržavanja Tac u organizmu (MRT), površina ispod krive u prvih 12 sati (skraćena AUC, AUC0-12 ) i ukupna AUC koji karakterišu ravnotežno stanje. Pregledom dobijenih rezultata merenja koncentracija Tac kod Tx-pacijenata, ustanovljeno je da se maksimalna koncentracija Tac postiže sat i po nakon peroralne primene leka (srednja vrednost iznosi 1,34±0,83 h). Srednja vrednost ispitanika iznosila je 104,49 gh/mL. Srednja vrednost maksimalne koncentracije Tac u ravnotežnom stanju iznosila je 16,51±5,28 ng/L. Srednje koncentracije Tac i njihov odnos sa maksimalnom i minimalnom AUC kod ispitivanih pacijenata nakon postizanja SS prikazani su na slici 5.4. Slika 5.4. Komparacija maksimalne, minimalne i srednje vrednosti AUC ss 0-12 u SS kod Tx pacijenata Vrednosti dobijenih AUC0-12 su pokazale izraženu interindividualnu varijabilnost u ravnotežnom stanju u nakon neprostorne FK analize Tac. Statistiĉki znaĉajna polna razlika u vrednostima AUC0-12 nije potvrĊena u SS stanju. Tabela 5.8. pokazuje korelaciju dobijenih srednjih vrednosti koncentracija Tac i srednje vrednosti AUC0-12 sa izraĉunatom statistiĉkom znaĉajnošću. Regresiona analiza je izvršena prema proceduri 1. Srednjim vrednostima izmerenih koncentracija Tac u svim mernim vremenima je odreĊen Piersov koeficijent korelacije i pripadajući nivo statistiĉke znaĉajnosti. Rezultati 37 Tabela 5.8. Korelacija između srednjih vrednosti koncentracija Tac i AUC0-12 u stanju ravnoteže kod transplantiranih pacijenata Koncentracija Tac (ng/mL) r p C0,5 7,72±3,50 0,197 0,464 >0,05 C1 13,32±6,90 0,590 0,016 <0,05 C1,5 14,55±5,06 0,771 0,000 <0,001 C2 12,34±3,54 0,873 0,000 <0,001 C4 9,61±2,27 0,644 0,005 <0,01 C8 7,24±1,24 0,905 0,000 <0,001 C12 5,99±1,53 0,810 0,000 <0,001 Nivo značajnosti za korelaciju je p<0,05 Izraĉunavanjem koeficijenta korelacije r, potvrĊena je statistiĉki znaĉajna korelacija srednjih vrednosti koncentracija i AUC0-12 Tac u svim posmatranim vremenima osim za koncentraciju izmerenu pola sata nakon peroralne primene Tac. Regresiona analiza je postavila sistem jednaĉina koje daju matematiĉki model sistema sukcesivnim uvoĊenjem nezavisno promenljivih. U dobijenim jednaĉinama srednje vrednosti izmerenih koncentracija Tac predstavljale su nezavisne promenljive, a vrednost AUC (AUCp) zavisnu promenljivu. Jednaĉine regresione analize su prikazane u tabeli 5.9. Tabela 5.9. Regresiona analiza korelacije predviđene vrednosti AUC (AUC p) na osnovu srednjih vrednosti izmerenih koncentracija (C)u ravnotežnom stanju. Izražene su vrednosti regresionog koeficijenta r i koeficijenta linearne determinacije r 2 Regresiona jednaĉina r r2 1. AUCp = -0,427 + 14,289 * C8 0,905 0,819 2. AUCp = -3,999 + 12,751 * C8 + 1,104 * C1 0,979 0,959 3. AUCp = -0,509 + 10,655 * C8 + 0,775 * C1 + 1,301 * C2 0,987 0,975 4. AUCp = -0,452 + 7,608 * C8 + 0,857 * C1 + 1,503 * C2 + 1,914 * C4 0,998 0,995 5. AUCp = 2,356 + 5,471 * C8 + 0,833 * C1 + 1,582 * C2 + 2,295 * C4 + 1,394 * C12 0,998 0,997 6. AUCp = 0,573 + 4,225 * C8 + 0,679 * C1 + 1,581 * C2 + 2,694 * C4 + 2,344 * C12 + 0,433 * C0,5 0,999 0,999 7. AUCp = 0,000000497 + 4,0 * C8 + 0,5 * C1 + 1,25 * C2 + 3,0 * C4 + 2,0 * C12 + 0,50 * C0,5 + 0,50 C1,5 1,000 1,000 1 nezavisno promenljiva C8 u SS stanju ( ) i zavisno promenljiva AUCp 2 nezavisne promenljive:C1, C8 u SS stanju ( i ) i zavisno promenljiva AUCp 3 nezavisne promenljive:C1, C2, C8 u SS stanju ( , , ) i zavisno promenljiva AUCp 4 nezavisne promenljive:C1, C2, C4, C8 u SS stanju ( , , , ) i zavisno promenljiva AUCp 5 nezavisne promenljive:C1, C2, C4, C8, C12 u SS stanju ( , , , , ) i zavisno promenljiva AUCp 6 nezavisne promenljive:C0,5, C1, C2, C4, C8, C12 u SS stanju ( , , , , ) i zavisno promenljiva AUCp 7 nezavisne promenljive:C0,5, C1, C1,5, C2, C4, C8, C12 u SS stanju ( , , , , , , ) i zavisno promenljiva AUCp Za svaku regresionu jednaĉinu izraĉunat je regresioni koeficijent i koeficijent determinacije ukupne AUC prema proceduri 1. kako bi se procenila znaĉajnost date koncentracije za predviĊanje AUC. Koncentracija Tac izmerena osam sati nakon peroralne primene ( ) je odreĊena kao najbolja nezavisna promenljiva za predviĊanje vrednosti zavisno promenljive AUCp u ravnotežnom stanju. Korišćenjem ove koncentracije može se Rezultati 38 postići zadovoljavajuća predvidljivost AUCss, prediktora ukupne izloženosti pacijenta takrolimusu nakon postizanja ravnoteže kod transplantiranih pacijenata nezavisno od pola. Veću pouzdanost predviĊanja ukupne izloženosti organizma Tac omogućava metod tri taĉke- , , . Zbog znaĉajnosti polno selektivnog pristupa nakon primene prve doze Tac i pokazane razliĉitosti u predviĊanju AUC u odnosu na pol, selektivnom regresionom analizom su dobijene regresione jednaĉine predstavljene u tabeli 5.10.: Tabela 5.10. Selektivna regresiona analiza korelacije predviđene vrednosti AUC (AUC p) na osnovu srednjih vrednosti izmerenih koncentracija (C) muškaraca i žena sa izraženim vrednostima regresionog koeficijenta r i koeficijenta linearne determinacije r 2 u SS Regresiona analiza u grupi ţena r r2 A AUCp = 38,163 + 5,373 * 0,913 0,834 B AUCp = 26,309 + 3,494 * + 5,881 * 0,985 0,969 Regresiona analiza u grupi muškaraca r r2 A AUCp = -4,442 + 14,602 * 0,926 0,858 Rezultati regresione analize su potvrdili visok stepen predvidljivosti za koncentraciju , u grupi muškaraca, što je u skladu sa rezultatima dobijenim u SS za grupu ispitanika. U grupi Tx pacijenata ženskog pola najveću pouzdanost predviĊanja ukupne izloženosti organizma Tac pokazala je koncentracija . Metod dve taĉke koji ukljuĉuje koncentraciju na kraju doznog intervala i dva sata nakon primene leka ( i ) takoĊe poseduje visok stepen predviĊanja AUC Tac kod žena nakon postizanja ravnotežnog stanja. Rezultati 39 5.3. Rezultati populacione FK analiza (PFK) takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Kod pacijenata sa presaĊenim bubregom je sprovedena populaciona FK analiza takrolimusa korišćenjem retrospektivno, terapijskim monitoringom sakupljenih podataka. OdreĊene su populacione vrednosti FK parametara Tac i identifikovani faktori koji imaju uticaja na njegovu farmakokinetiku. Demografske karakteristike ispitivanih pacijenata predstavljene su tabelom 5.11. Tabela 5.11. Karakteristike ispitivanih pacijenata (N=63) Karakteristike Grupa pacijenata za građenje modela Opseg vrednosti grupe Validaciona grupa Opseg validacione grupe Broj pacijenata 46 17 Broj uzoraka 77 19 pol (muškarci/žene) 32/14 12/5 TM (kg) 69,03±11,23 45-97 68,50±10,71 49-95 uzrast (godine) 40,88±17,01 28-57 35,63±17,11 27-54 Tac dnevna doza (mg/dan) 06,53±14,94 01-22 34,95±13,10 21-11 Tac koncentracija (ng/mL) 08,34±14,49 0,5-25,7 37,85±10,88 25,7-12,4 Tac + mikofenolat mofetil 40 14 Tac + prednizolon>25mg 24 04 Tac + kotrimoksazol 39 07 Tac + omeprazol 12 03 Tac monoterapija 00 02 Tac politerapija 46 15 Vreme proteklo od Tx (dan) 514,32±688,77 7-2882 272,84±220,69 12-635 Hemoglobin (g/L) nedostaju podaci 126,89±216,2 90-163 AST/ALT nedostaju podaci 000,69±220,31 00,292-1,75 CRP (g/L) nedostaju podaci 004,86±213,48 0,3-59,8 Rezultati su izraženi preko srednjih vrednosti sa izraženom standardnom varijacijom i opsegom vrednosti Kod pacijenata je primenjivana kombinovana imunosupresivna terapija koja je ukljuĉivala Tac, prednizolon, mikofenolat mofetil i druge lekove u zavisnosti od stanja i karakteristika pacijenata, kao što je prikazano u tabeli 5.11.. Populaciona FK analiza zahtevala je podelu ispitanika u dve grupe:  grupa koja služi za graĊenje populacionog modela (46 pacijenata)  validaciona grupa (17 pacijenata) koja potvrĊuje ispravnost analitiĉke metode i dobijenog populacionog FK modela. Ukupno je obraĊeno 96 podataka, 77 za izgradnju populacionog modela, 19 za validaciju dobijenog modela. U obe grupe dominirali su muškarci (32 muškarca i 14 žena u grupi za modelovanje, a 12 muškaraca i 5 žena u validacionoj grupi). Proseĉna starost Rezultati 40 pacijenata iznosila je 40,88±7,01 u osnovnom setu i 35,63±7,11 godina u validacionom setu podataka. U tabeli 5.11. prikazane su varijable koje su podeljene u tri grupe: 1) varijable pacijenta - telesna masa, uzrast, pol i vremenski period protekao od transplantacije (u danima) 2) varijable leka - ukupna dnevna doza Tac (mg), prednizolona (mg) (PRO), mikofenolat mofetila (mg) i upotreba drugih lekova: kotrimoksazola (da/ne) i omeprazola (da/ne) 3) biohemijski podaci: odnos nivoa aspartat aminotransferaze i alanin aminotransferaze (AST/ALT), nivo C reaktivnog proteina (CRP) i hemoglobina (Hb). Populaciono FK modelovanje vršeno je prema predviĊenim fazama procedure 2. Prva faza populacionog FK modelovanja sastojala se u definisanju baznog modela. Za našu analizu iz NONMEM biblioteke izabrana je ADNVAN2 subrutina koja opisuje model sa jednim odeljkom, sa resorpcijom prvog reda. U FK analizu su ukljuĉene vrednosti koncentracija Tac u krvi dobijene na kraju doznog intervala. Bazni model je odredio populacione vrednosti FK parametara – tipiĉnu, populacionu vrednost klirensa CL (populacioni parametar θ1), tipiĉnu, populacionu vrednost volumena distribucije Vd (populacioni parametar θ2) i bioraspoloživost F (populacioni parametar θ3). U izgradnji baznog modela razmatrani su izabrani stalni efekti modela. Distribucija i znaĉaj ovih parametara dati su kroz raspodelu i varijansu 2 za svakog pacijenta individualno. Matematiĉki oblik baznog modela predstavljen je jednaĉinom klirensa Tac: CL= θ1 *EXP(ETA(1)) U toku NONMEM populacionog modelovanja Tac neophodno je ukljuĉivanje parametara sluĉajnih efekata. Oni predstavljaju odstupanje izmerene vrednosti pojedinca od populacione vrednosti grupe ispitanika. Interindividualna varijabilnost daje uvid u bezbednosni profil leka, dok intraindividualna varijabilnost podataka uglavnom potiĉe od greške u merenju ili pogrešno izabranog modela, a jednim delom i usled neobjašnjive varijabilnosti, što oznaĉavamo 2. Druga faza je predstavljala složeni proces modelovanja uz ukljuĉivanje izabranih varijabli i jednaĉina regresione analize. Ukljuĉivane varijable: telesna masa, uzrast, pol i vremenski period nakon Tx (u danima), nivo AST, ALT, CRP i Hb, ukupna dnevna doza Tac, dnevna doza prednizolona veća od 25mg, primena kotrimoksazola i omeprazola su prikazane u tabeli 5.11. Univarijantnom selekcijom je odreĊen statistiĉki znaĉaj izabranih varijabli. Krititerijum statistiĉke znaĉajnosti prikazan je kroz redukciju u minimumu objektivne Rezultati 41 funkcije (MOF) izmeĊu pojedinih univarijantnih modela a vrednosti su prikazane u tabeli 5.12. Zahtevana vrednost redukcije MOF-a iznosila je 6,64 (χ2=6,64; p<0,01). Simultanim ubacivanjem varijabli koje ispunjavaju kriterijum statistiĉke znaĉajnosti u bazni matematiĉki model dobijen je puni populacioni model Tac: CL= θ1*EXP(ETA(1)) + θ9* CRP + θ12* OME  θ14* PRO + θ15* DD Tabela 5.12. Nivo MOF baznog modela, univarijantnih modela i punog PFK modela takrolimusa MODEL MOF Razlika u MOF P-vrednost ** Zakljuĉak BAZNI MODEL CL= θ1 *EXP(ETA(1)) 478,122 UNIVARIJANTNI MODELI CL= θ1*EXP(ETA(1)) + θ4 * TM 477,313 0-0,809 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1)) + θ5 * POL 477,903 0-0,219 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ6* UZRAST 477,969 0-0,153 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1)) – θ7* Vreme 477,844 0-0,278 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ8* Hb 478,301 0-0,179 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ9* CRP 455,645 022,477 <0,01 SZ CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ10* ALT/AST 475,472 02,65 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ11* TMP 478,050 000,072 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ12* OME 422,835 055,287 <0,01 SZ CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ13* MFM 477,972 000,150 >0,01 NS CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ14* PRO 396,743 081,379 <0,01 SZ CL= θ1*EXP(ETA(1))  θ15* DD 333,290 144,832 <0,01 SZ PUNI MODEL CL= θ1*EXP(ETA(1)) + θ9* CRP + θ12* OME  θ14* PRO + θ15* DD 317,551 CL –klirens(L/h) θ1 -tipična, populaciona vrednost klirensa ETA (1) interindividuala varijabilnost u klirensu θ4 - θ15 izabrane varijable TM telesna masa (kg) POL - 1 za muškarce, 0 za žene Vreme - broj dana od transplantacije do određivanja koncentracija Tac Hb - nivo hemoglobina CRP - nivo C- reaktivnog proteina AST/ALT - odnos aspartat i alanin aminotransferaze DD - ukupna dnevna doza TAC (mg/dan) TMP, OME, MFM i PRO - komedikacija sa kotrimoksazolom, omeprazolom, mikofenolat mofetilom i prednizolonom u dozi većoj od 25 mg (uzimajući nivo 1 kada jesu i 0 kada nisu prisutni), **P-nivo MOF razlike između baznog i testiranog modela NS: bez statističkog značaja SZ: statistički značajno U tabeli 5.12. prikazani su:  bazni model koji predstavlja dobijene populacione vrednosti FK parametara,  univarijantni modeli definisani za svaku varijablu  vrednosti MOF i  puni populacioni model Tac. Rezultati 42 Krajnji korak u ovoj fazi populacionog FK ispitivanja bio je proces pretvaranja punog u finalni model. Finalni model je razvijen uz zahtev ispunjenja strogih statistiĉkih kriterijumima za redukciju u MOF-u (χ2 = 10,83 za p<0,01), što je omogućilo smanjenje interindividualne i rezidualne varijabilnosti u ispitivanoj grupi. Smanjenje varijabilnosti predviĊenih i izmerenih vrednosti koncentracija Tac tokom matematiĉkog modelovanja grafiĉki je prikazano na slici 5.5. a) bazni b) finalni PRED - predviđena koncentracija Tac za datog pacijenta DV – izmerena koncentracija Tac za datog pacijenta Slika 5.5. Odnos predviđenih i izmerenih koncentracija Tac u ispitivanoj grupi za svakog pacijenta korišćenjem baznog (a) i finalnog (b) modela Slika 5.5. pokazuje znaĉaj redukovanja rezidualne varijabilnosti FK parametara, koja se postiže modelovanjem od baznog do finalnog modela, uz postizanje bolje raspodele rezultata na regresionoj pravoj. Rezultati 43 Matematiĉkim modelovanjem NONMEM softverom izvršena je redukcija varijabilnosti i formiran finalni populacioni model koji ukljuĉuje dve varijable koje su pokazale znaĉajnost za vrednost klirensa Tac - dnevna doza prednizolona veća od 25mg i dnevna doza Tac. Konaĉni matematiĉki model populacionog klirensa Tac predstavljen je jednaĉinom: CL (L/h) = 0,862 + 0,32 * DD + 1,16 * PRO Validacija je obavljena u trećoj fazi populacione FK analize Tac. Validacioni postupak je omogućio procenu predvidljivosti FK parametara dobijenih korišćenjem finalnog modela. Provera ispravnosti dobijenog populacionog FK modela izvršena je ukljuĉivanjem podataka validacione grupe pacijenata (karakteristike grupe su prikazane u tabeli 5.11.) u finalni populacioni FK model. Rezultati 44 5.4. Rezultati praćenja interakcija i pojave neţeljenih dejstava takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Ispitivanje je obuhvatilo 30 pacijenata (12 muškaraca i 18 žena) na imunosupresivnoj terapiji u trajanju od šest meseci nakon presaĊivanja bubrega. U okviru terapijskog monitoringa odreĊivana je koncentracija Tac u krvi, dok su neželjeni efekti imunosupresivne terapije praćeni prema opisanoj proceduri 3.,biohemijskim monitoringom koji je obuhvatao odreĊivanje vrednosti C-reaktivnog proteina (CRP), glukoze, holesterola, alanin amino transferaze (ALT), aspartat amino transferaze (AST), serumskog kreatinina (SCr), uree, i alkalne fosfataze (ALP). Demografski podaci ispitivanih transplantiranih pacijenata dati su u tabeli 5.13. Tabela 5.13. Karakteristike ispitivane grupe pacijenata Pol Muškarci 18 Žene 12 Starost (godine) 40,11 ± 7,35 Telesna masa (kg) Neposredno pre Tx 70,75 ± 13,81 7.dan nakon Tx 72,39 ± 14,64 14.dan nakon Tx 71,14 ± 14,63 21.dan nakon Tx 71,19 ± 14,55 60.dan nakon Tx 71,33 ± 13,97 180.dan nakon Tx 73,67 ± 12,60 Tip transplantacije Živi donor 26 Kadaveriĉna transplantacija 4 Proseĉna starost ispitanika iznosila je 40,11±7,35 godina. U toku ispitivanja nisu utvrĊene statistiĉki znaĉajne razlike u telesnoj masi kod ispitivanih pacijenata. Dozni režim Tac je modifikovan redovnim terapijskim monitoringom u posmatranom vremenskom periodu. Kortikosteroidna terapija kod ispitivanih pacijenata zapoĉeta je intravenskom primenom metilprednizolona prva tri dana nakon Tx, a zatim nastavljena peroralnom primenom prednizolona uz postepeno smanjenje dnevne doze. Sukcesivno smanjenje dnevne doze primenjenog KS u posmatranom periodu prikazano je grafiĉki slikom 5.6. Rezultati 45 a) srednje dnevne doze KS u ispitivanoj grupi transplantiranih pacijenata tokom prvih šest meseci nakon Tx bubrega b) srednje dnevne doze KS tokom prvih šest meseci nakon transplantacije bubrega u zavisnosti od pola ispitanika Slika 5.6. Prosečne dnevne doze kortikosteroida u posmatranom vremenskog perioda nakon transplantacije kod ukupnog broja ispitanika (a) i prema polu (b) Srednje vrednosti dnevnih doza KS u toku ispitivanog perioda kod muškaraca su iznosile: 93,18 ± 14,54; 47,92 ± 13,39; 31,54 ± 7,18; 23,13 ± 7,62; 13,96 ± 5,98 mg, a kod žena 94,44 ± 19,28; 39,50 ± 9,56; 31,50 ± 8,1; 27,78 ± 8,61; 10,83 ± 1,77 mg. Tokom posmatranog vremenskog perioda srednja dnevna doza KS smanjena je oko 4,5 puta (7.dan- 93,75mg; 180.dan- 12,61 mg). Obzirom na individualno doziranje, vrednosti izmerenih koncentracija Tac korigovane su datom dozom leka radi komparacije rezultata. Vrednosti srednje dnevne doze Tac, izmerenih koncentracija Tac i dozno korigovane srednje koncentracije Tac u odgovarajućim vremenskim intervalima posle transplantacije prikazane su tabelom 5.14. Rezultati 46 Tabela 5.14. Srednje dnevne doze Tac, koncentracije Tac i dozno korigovane srednje koncentracije Tac u toku ispitivanja kod Tx pacijenata a:p<0,01; b: p <0,05 Tabelom 5.14. je pokazana statistiĉki znaĉajna razlika u primenjenoj dnevnoj dozi Tac 180. dana u odnosu na 7.,14.,21. i 60. dan nakon Tx (Friedman Shi-square=23,64; p<0,0001), IzmeĊu ostalih vremenskih intervala nije pokazana statistiĉki znaĉajna razlika u primenjenoj dnevnoj dozi Tac. Pregledom rezultata prikazanih u tabeli 5.14. utvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika izmeĊu dozno korigovanih koncentracija Tac 7.dana nakon Tx u odnosu na ostale posmatrane vremenske intervale (Friedman Shi-square=15,2; p<0,004). Statistiĉki znaĉajna razlika ustanovljena je izmeĊu sledećih dozno korigovanih koncentracija Tac nakon Tx:  7. i 21. dana nakon Tx (58,01±31,78 ng/mL po mg/kg/dan : 82,84 ± 37,08 ng/mL po mg/kg/dan)  7. i 60. dana nakon Tx (58,01±31,78 ng/mL po mg/kg/dan : 82,45±32,78 ng/mL po mg/kg/dan)  7. i 180. dana nakon Tx (58,01±31,78 ng/mL po mg/kg/dan : 107,06±48,7 ng/mL po mg/kg/dan). MeĊutim, 7. i 14. dana nakon Tx nije pokazana statistiĉki znaĉajna razlika u dozno korigovanoj koncentraciji Tac. Dobijeni rezultati grupisani prema polu ispitanika prikazani su u tabeli 5.15. Dani nakon Tx Dnevna doza Tac (mg/kg/dan) Koncentracija Tac (ng/mL) Koncentracija Tac korigovana datom dozom (ng/mL po mg/kg/dan) 7.dan 0,15±0,05 08,57±4,22 058,01±31,78 14.dan 0,17±0,06 10,40±3,41 067,51±25,95 21.dan 0,19±0,16 10,83±3,44 0 82,84±37,08a 60.dan 0,13±0,06 09,65±2,06 0 82,45±32,78a 180.dan 0,08±0,04a 7,46±2,50 107,06±48,70b Rezultati 47 Tabela 5.15. Vrednosti srednje dnevne doze Tac, izmerenih koncentracija Tac i dozno korigovanih koncentracija Tac grupisane prema polu ispitanika Dani nakon Tx Doza Tac (mg/kg/dan) Muškarci Žene 7.dan 0,17 ± 0,05 0,14 ± 0,05 14.dan 0,17 ± 0,05 0,17 ± 0,07 21.dan 0,14 ± 0,05 0,16 ± 0,08 60.dan 0,11 ± 0,03 0,15 ± 0,07 180.dan 0,07 ± 0,03 0,09 ± 0,06 Koncentracija Tac (ng/mL) Muškarci Žene 7.dan 10,08 ± 3,49 6,71 ± 4,48 14.dan 11,04 ±3,73 9,62 ± 2,98 21.dan 12,05 ± 2,64 9,24 ± 3,83a 60.dan 09,61 ± 1,65 9,70 ± 2,63 180.dan 07,46 ± 3,04 7,47 ± 1,69 Koncentracija Tac korigovana datom dozom Tac (ng/mL po mg/kg/dan) Muškarci Žene 7.dan 066,44 ± 36,96 48,65 ± 23,40 14.dan 070,59 ± 23,31 63,82 ± 29,65 21.dan 095,55 ± 38,63 66,32 ± 28,87 60.dan 091,00 ± 26,47 71,05 ± 38,30b 180.dan 114,41 ± 49,33 96,03 ± 48,84 a : p <0,01; b: p <0,05 Rezultati našeg istraživanja nisu pokazali statistiĉki znaĉajnu razliku u primenjenoj dnevnoj dozi Tac izmeĊu muškaraca i žena. Pokazana je statistiĉki znaĉajna, polno zavisna razlika u koncentraciji Tac 21.dana nakon Tx (12,05±2,64 ng/mL kod muškaraca : 9,24±3,83ng/mL kod žena; p<0,01). U grupi muškaraca pokazana je statistiĉka znaĉajnost u primenjenim dnevnim dozama Tac (izmeĊu 180. i 7.; 14. i 21. dana; p<0,01 a izmeĊu 180. i 60. dana; 7. i 60. dana; 14. i 60. dana; p<0,05), Kod ispitanika ženskog pola ustanovljena je razlika u primenjenoj dozi Tac izmeĊu 60. i 180. dana (p<0,05). Statististiĉki znaĉajna razlika uslovljena polom u dozno-korigovanim koncentracijama Tac pokazana je 60. dana (91,00 ± 26,47 ng/mL po mg/kg/dan kod muškaraca u poreĊenju sa 71,05 ± 38,30 ng/mL po mg/kg/dan kod žena). Postojanje statistiĉki znaĉajne razlike u korigovanim koncentracijama Tac u grupi ispitanika muškog pola potvrĊeno je izmeĊu 7. i 60. dana (p<0,01). Kod žena nije uoĉena statistiĉki znaĉajna razlika u dozno korigovanim koncentracijama Tac u ispitivanom vremenskom intervalu. Rezultati 48 Biohemijski parametri funkcije grafta i jetre kod transplantiranih pacijenata prikazani su u tabeli 5.16. Tabela 5.16. Uporedne vrednosti nivoa uree, serumskog kreatinina (Scr), ALT, AST i alkalne fosfataze u krvi pacijenata neposredno pre transplantacije i određenim vremenskim intervalima posle Tx Vreme nakon Tx (dani) Urea (mmol/L) Scr (µmol/L) ALP (IU/L) AST (IU/L) ALT (IU/L) Tx dan 17,89 ± 7,34 613,14 ± 149,15 055,84 ± 21,80 17,95 ±05,86 17,71 ± 08,91 7 . dan 09,91 ± 4,61 153,84 ± 094,47 060,34 ± 26,45 21,23 ±14,96 47,01 ± 59,75 14. dan 09,64 ± 3,99 151,22 ± 079,56 062,47 ± 23,19 18,95 ±08,75 49,74 ± 58,64 21 . dan 10,28 ± 5,06 164,00 ± 114,52 113,29 ± 48,97 17,25 ±06,56 47,06 ± 32,83 60 . dan 08,06 ± 2,55 133,06 ± 038,48 087,00 ± 56,29 21,77 ±13,69 40,73 ± 36,96 180. dan 07,96 ± 3,39 138,59 ± 039,39 079,57 ± 48,75 22,14 ±08,76 41,38 ± 33,43 Fr 31,582 037,403 016,214 6,539 20,569 p 0,0001 0,0001 0,006 0,257 0,001 Tx dan – dan transplantacije ALT - alanin aminotransferaza AST – aspartat aminotransferaza ALP - alkalna fosfataza Fr- Friedman Shi-square test; p<0,05 je statistički značajno Procena funkcije grafta vršena je odreĊivanjem nivoa serumskog kreatinina i uree. Nivoi transaminaza jetre i alkalne fosfataze predstavljali su indikatore disfunkcije jetre. Rezultati praćenja biohemijskih parametara koji ukazuju na pojavu neželjenih dejstava Tac i koterapije prikazani su grafiĉki na slici 5.7. Slika 5.7. Uporedne vrednosti nivoa holesterola, triglicerida i glukoze u krvi pacijenata na dan transplantacije i određenim vremenskim periodima nakon Tx Rezultati 49 Tokom ispitivanog perioda uoĉen je porast nivoa serumskih lipida, holesterola i triglicerida, što je prikazano na slici 5.7. Prema proceduri 3. je pomoću Friedman Shi-square testa za poreĊenje vezanih neparametrijskih uzoraka, utvrĊena znaĉajnost promena odabranih parametara. Rezultati su pokazali statistiĉki znaĉajan porast nivoa holesterola (Friedman Shi-square=42,316; p<0,0001) i triglicerida kod transplantiranih pacijenata (Friedman Shi-square =21,865; p<0,001). UporeĊivanjem nivoa glukoze radi procene dijabetogenog delovanja Tac uoĉena je smanjena glikemija u ranom posttransplantacijskom periodu. Na slici 5.8. dat je grafiĉki prikaz biohemijskih parametara procene funkcije grafta. a) b) c) d) Slika 5.8. Prikaz nivoa ALP(a), serumskog kreatinina(b), enzima ALT, AST(c) i uree(d) u ispitivanom periodu kod pacijenata sa presađenim bubregom UtvrĊen je statistiĉki znaĉajan pad vrednosti nivoa Scr (Friedman Shi-square=37,403; p<0,0001 ) i uree (Friedman Shi-square=31,582;p<0,0001 ) tokom ispitivanog perioda. Rezultati 50 Naša istraživanja pokazala su statistiĉki znaĉajan porast aktivnosti ALP (Friedman Shi- square=16,214; p<0,006) dvadeset prvog dana nakon Tx. Komparacijom nivoa alanin amino transferaze utvrĊen je njen statistiĉki znaĉajan porast u ispitivanom periodu (Friedman Shi-square=20,569; p<0,001). U istom periodu nije utvrĊena statistiĉka znaĉajnost u promeni nivoa aspartat amino transferaze. Rezultati 51 5.5. Rezultati ispitivanja uticaja pola na farmakokinetiĉke parametre takrolimusa kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Ispitivanje uticaja pola na farmakokinetiku Tac sprovedeno je u grupi od 20 transplantiranih pacijenata, 10 muškaraca i 10 žena (proseĉne starosti 38,2±9,7 godina). Neprostorna FK analiza sprovedena je prema proceduri 1. na osnovu izmerenih koncentracija Tac nakon peroralne primene inicijalne doze leka i ponovljena nakon postignutog ravnotežnog stanja. Demografske karakteristike ispitivanih pacijenata prikazane su u tabeli 5.17. Tabela 5.17. Demografske karakteristike transplantiranih pacijenata Starost (godine) BMI Scr (µmol/L) Muškarci Srednja vrednost ±SD 38,2±9,7 23,5±3,1 282,88 Min 31 17,53 185,64 Max 51 28,58 344,76 t-test p=0,69 p=0,81 Žene Srednja vrednost ±SD 34,1±5,7 21,7±3,0 247,52 Min 28 16,41 185,64 Max 47 25,39 274,04 p- nivo značajnosti za statističku korelaciju je p<0,01 Demografski podaci ne pokazuju statistiĉki znaĉajne razlike izmeĊu muškaraca i žena. Grupa muškaraca pokazala je veće vrednosti serumskog kreatinina u odnosu na grupu žena (3,2mg/dL : 2,8mg/dL ili 282,88 µmol/L : 247,52 µmol/L), dok je brzina glomerularne filtracije (GFR) veoma sliĉna kod ispitanika oba pola (32,8 mL/min kod muškaraca i 31,6 mL/min kod žena). Srednja terapijska doza Tac je za muškarce iznosila 3,63 mg, a za žene 3,28 mg. Prateću antihipertenzivnu terapiju transplantiranih pacijenata saĉinjavali su nifedipin (srednja dnevna doza 68 mg za muškarce, 32mg za žene) ili diltiazem (srednja dnevna doza 160 mg za muškarce, 120mg za žene). Izmerene koncentracije Tac u krvi ispitivanih pacijenata i izraĉunate vrednosti AUC0-12 koje su dobijene nakon peroralne primene inicijalne doze Tac predstavljene su u tabeli 5.18. Rezultati 52 Tabela 5.18. Koncentracije Tac (ng/mL) u određenim vremenima i AUC0-12 (ngh/mL) kod Tx pacijenata nakon prve doze Tac Vreme proteklo od peroralne primene Tac (h) AUC0-12 (ngh/mL) 0,5 1 1,5 2 4 8 12 Ţene Cn±SD 11,1±5,3 18,5±7,5 15,8±6,2 09,9±5,4 04,3±2,5 1,8±1,1 1,2±1,1 58,2±23,3 Min 03,6 08,0 06,4 03,6 01,7 0,8 0,2 28,5 Max 21,3 30,9 23,2 18,6 10,2 3,5 3,1 91,2 Muškarci Cn±SD 08,3±4,5 20,4±6,6 22,3±4,8 14,3±3,1 08,1±1,8 5,1±1,7 3,1±1,4 094,4±19,3* Min 00,3 11,2 16,5 09,3 05,7 2,9 1,1 067,2 Max 14,5 30,0 29,3 19,5 11,3 7,9 4,7 128,6 Cn- koncentracija Tac u vremenu n *p<0,01 u poređenju sa ženama Na osnovu vrednosti izmerenih koncentracija Tac neprostornom farmakokinetiĉkom analizom izraĉunati su FK parametri i tabelarno prikazani u tabeli 5.19. Tabela 5.19. Farmakokinetički parametri Tac kod ispitivanih pacijenata nakon prve per os doze Tac AUC0-12(ngh/mL) AUCuk(ngh/mL) Kel(l/h) t½(h) Cmax(ng/mL) Tmax(h) MRT(h) Ţ 58,20±23,30 171,08±33,83* 0,18±0,11 5,51±3,17 20,83±6,70 1,04±0,40 6,25±3,73 M 94,40±19,3* 131,72±33,46* 0,12±0,05 7,08±3,02 24,22±4,46 1,30±0,26 9,44±4,10 *p<0,05 u poređenju sa ženama Kel -konstanta eliminacije Tac t½,- poluvreme eliminacije MRT -srednje vreme zadržavanja Cmax -maksimalna koncentracija Tac Tmax- vreme dostizanja Cmax AUC0-12 - skraćena, 12-časovna površina ispod krive AUCuk - ukupna vrednost AUC Podaci ukazuju na izraženu varijabilnost vrednosti dvanaestoĉasovne površine ispod krive (AUC0-12). Minimalna vrednost AUC0-12 iznosila je 28,2 ngh/mL, a maksimalna 128,6ngh/mL. U tabeli se uoĉava statistiĉki znaĉajna razlika u vrednosti AUC0-12 muškaraca i žena (p<0,05). Volumen distribucije i klirens Tac nisu raĉunati zbog peroralne upotrebe leka i ĉinjenice da je bioraspoloživost Tac mala i veoma varijabilna. Izmerene koncentracije Tac kod transplantiranih pacijenata predstavljene su grafiĉki na Slici 5.9.a. za muškarce i 5.9.b. za žene. Rezultati 53 Slika 5.8.a. Zavisnost koncentracije Tac u funkciji vremena kod ispitanika muškog pola Slika 5.8.b. Zavisnost koncentracije Tac u funkciji vremena kod ispitanika ženskog pola Izmerene vrednosti koncentracija Tac pokazale su korelaciju sa dvanaestoĉasovnom AUC. Postavljen je sistem regresionih jednaĉina koje omogućavaju predviĊanje vrednosti AUC na osnovu dobijenih koncentracija Tac u mernim vremenima. Korelacija izmerene koncentracije Tac i vrednosti AUC evoluirana je pomoću Pears-ovog korelacionog koeficijenta (r). Korelacija izmeĊu vrednosti izraĉunate AUC0-12 i predviĊene vrednosti AUC (AUCp) data je linearnim regresionim koeficijentom kompleksne determinacje (r 2 ). Rezultati 54 U tabeli 5.20. data je regresiona jednaĉina za AUC0-12 za ispitanike ženskog pola koja najbolje predviĊa vrednost AUC, uz izražen koeficijent korelacije r i koeficijent determinacije r 2 . Tabela 5.20. Regresiona jednačina koja predviđa vrednost AUC kod žena na osnovu izmerene koncentracije Tac u vremenu C2 Regresiona jednaĉina r r2 1 AUCp = 22,879 + 3,453 * C2 0,911 0,830 nezavisno promenljiva C2 i zavisno promenljiva AUCp Rezultati regresione analize u grupi ispitanika muškog pola prikazani su u tabeli 5.21. Tabela 5.21. Regresione jednačine koje daju vrednost zavisno promenljive AUCp kod grupe muških ispitanika na osnovu poznatih koncentracija Tac u određenom vremenu, sa izraženim koeficijentom korelacije r i koeficijentom determinacije r 2 Regresiona jednaĉina r r2 1. AUCp = 20,664 + 9,073 * C4 0,878 0,770 2. AUCp = -5,342 + 8,488 * C4 + 0,982 * C1 0,940 0,884 3. AUCp = -2,406 + 7,351 * C4 + 1,209 * C1 + 4,043 * C12 0,977 0,954 4. AUCp = -5,390 + 4,082 * C4 + 0,895 * C1 + 5,001 * C12 + 2,302 * C2 0,990 0,981 5. AUCp = -0,791 + 1,982 * C4 + 0,708 * C1 + 3,670 * C12 + 2,550 * C2 + 2,979 * C8 0,999 0,998 1- nezavisno promenljiva: C4 2- nezavisne promenljive: C4, C1 3- nezavisne promenljive: C4, C1, C12 4- nezavisne promenljive: C4, C1, C12, C2 5- nezavisne promenljive: C4, C1, C12, C2, C8 zavisno promenljiva: AUCp Na osnovu regresione analize odreĊeno je vreme merenja koncentracija Tac kod pacijenata ženskog, odnosno muškog pola, pomoću kojih se brzo i jednostavno može predvideti vrednosti AUC, što predstavlja znaĉajan doprinos racionalnoj farmakoterapiji pacijenata sa presaĊenim bubregom jer se time omogućava uvid u ukupnu izloženost organizma leku. Jednostavnim merenjem koncentracije Tac dva sata nakon peroralne primene kod pacijenata ženskog pola je moguće predvideti ukupnu izloženost organizma leku (r=0,911; r²=0,830), što je predstavljeno matematiĉki pomoću jednaĉine: AUCp = 22,879 + 3,453 * C2 Kod ispitivanih pacijenata ženskog pola C2 ostaje dobar prediktor za AUC i nakon postizanja ravnotežnih stanja, pri ĉemu jednaĉina za izraĉunavanje AUCp izgleda: Rezultati 55 AUCp = 38,163 + 5,373 * Kod muškaraca je pri uvoĊenju Tac u terapiju neophodno primeniti metod ograniĉenih uzoraka, koji podrazumeva merenje koncentracije 1, 4 i 12 sati nakon peroralne primene leka u cilju dobijanja vrednosti AUC (r=0,977; r²=0,954) prema jednaĉini: AUCp = -2,406 + 7,351 * C4 + 1,209 * C1 + 4,043 * C12 Prilikom polno selektivnog FK razmatranja Tac u ravnotežnom stanju, uoĉena je promena korelacije u grupi muškaraca, pa jednaĉina dobija jednostavniji oblik, korišćenjem koncentracije : AUCp = -4,442 + 14,602 * Diskusija 56 6. DISKUSIJA 6.1. Farmakokinetiĉka analiza takrolimusa nakon primene inicijalne doze i u ravnoteţnom stanju (SS) kod pacijenata sa presaĊenim bubregom Procena farmakokinetiĉkog profila Tac predstavlja važan segment farmakoterapije transplantiranih pacijenata. Dosadašnja istraživanja pokazala su izraženu varijabilnost u bioraspoloživosti i sistemskoj izloženosti organizma leku nakon peroralne primene Tac. Bioraspoloživost Tac zavisi od aktivnosti intestinalnog enzima CYP3A4 i transportnog P-gp glikoproteina, dok se njegov metabolizam odvija uz uĉešće CYP3A4 i CYP3A5 (40,100). Novije populacione FK studije i farmakogenetiĉka istraživanja posvećuju posebnu pažnju polimorfizmu CYP3A5 kod primaoca i donora bubrega (41). U oblasti kliniĉke farmakokinetike i farmakogenetike za sada postoje nedovoljno jasni stavovi vezani za polne razlike u metabolizmu lekova, zbog ĉega su poslednjih godina intenzivirana istraživanja koja se bave tom problematikom (101,102). U toku naših istraživanja obavljena je neprostorna farmakokinetiĉka analiza takrolimusa nakon primene inicijalne doze i u ravnotežnom stanju u cilju optimizacije imunosupresije kod pacijenata sa presaĊenim bubregom. Jedan od ciljeva našeg istraživanja je predstavljalo utvrĊivanje polne diferencijacije u farmakokinetiĉkom profilu Tac. Neprostorna FK analiza prve peroralne doze Tac je pokazala veliku interindividualnu varijabilnost u ispitivanoj grupi transplantiranih pacijenata. Izmerene koncentracije Tac u ispitivanom dvanaestoĉasovnom periodu su pokazale širok opseg vrednosti (Tabela 5.2., Slika 5.1.). Maksimalna vrednost površine ispod krive (AUCmax) je pokazala ĉetiri puta veću vrednost u odnosu na minimalnu (AUCmin), što potvrĊuje interindividualnu razliĉitost u sistemskoj izloženosti leku i važnost praćenja koncentracija Tac (10). Pokazana varijabilnost koncentracija Tac i FK parametara u skladu je sa istraživanjima Chen i sar. sprovedenim kod 16 kineskih pacijenata sa presaĊenim bubregom (11). Veće vrednosti koncentracija Tac kod kineskih transplantiranih ispitanika u odnosu na našu populaciju pacijenata se mogu objasniti razlikom u primenjenom imunosupresivnom protokolu. Kod kineskih ispitanika, imunosupresivni protokol je podrazumevao primenu metilprednizolona 500mg/dan, mikofenolat mofetila 2000mg/dan i anitilimfocitnog globulina 300mg/dan prva tri dana nakon Tx, dok je Tac ukljuĉen ĉetvrtog dana nakon Tx u dozi od 0,075mg/kg TM. Kod naših pacijenata je primenjivan kvaternarni imunosupresivni protokol– metilprednizolon 500mg/dan, mikofenolat mofetil 1500mg/dan i baziliksimab 20mg prvog i ĉetvrtog dana od Tx, dok je Tac ukljuĉen ĉetvrtog dana nakon Tx u dozi od 0,05mg/kg TM. Kvaternarna Diskusija 57 terapija je našim pacijentima omogućila postizanje adekvatne imunosupresije sa manjim dozama pojedinaĉnih imunosupresivnih lekova. Ponovljenom neprostornom FK analizom takrolimusa u ravnotežnom stanju, utvrĊena je veća izloženost organizma leku (78,9±25,7ngh/mL nakon prve doze prema 104,49±20,02ngh/mL nakon postizanja SS), sa manjom varijabilnošću vrednosti AUC. U ravnotežnom stanju smanjene su varijacije u koncentracijama leka, dok je srednja vrednost maksimalne koncentracije Tac statistiĉki znaĉajno niža kod ispitivanih pacijenata (16,51±5,28ng/L u ravnotežnom stanju prema 22,96±5,28ng/mL nakon prve doze) (Tabela 5.2.,5.6). Time je smanjen rizik od neželjenih efekata takrolimusa, što poboljšava bezbedonosni profil leka. Novija istraživanja su pokazala da se izostavljanjem KS iz imunosupresivnog protokola postižu sliĉne vrednosti AUC, uz istovremeno veće maksimalne koncentracije Tac, što može imati kliniĉke posledice u vidu ispoljavanja njegovih toksiĉnih efekata (103). Ovakvi rezultati upućuju da je racionalnije smanjenje doze KS u odnosu na njihovu obustavu iz farmakoterapijskog imunosupresivnog protokola transplantiranih pacijenata. Neprostornom FK analizom Tac nakon primene prve doze utvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika u vrednostima AUC muškaraca i žena, što je ukazalo na potrebu selektivnog FK ispitivanja. U istraživanju Chen i sar. kod kineskih ispitanika nije uoĉena razlika u vrednostima AUC izmeĊu polova, što se može delimiĉno objasniti neadekvatnim odnosom polova ispitanika (12 muškaraca i 4 žene) (11). Prethodnim istraživanjima je potvrĊena razlika farmakokinetiĉkih parametara ciklosporina kod žena i muškaraca (104). Istraživanjima kod zdravih dobrovoljaca i kod transplantiranih pacijenata pokazana je polno zavisna razlika u bioraspoloživosti, maksimalnoj koncentraciji, AUC i klirensu CsA (105,106). Malobrojna su istraživanja koja se bave razlikom u farmakokinetici Tac meĊu polovima. Smatra se da je varijabilnost bioraspoloživosti Tac povezana sa aktivnošću intestinalnog CYP3A4 enzima i kapacitetom transportnog proteina P-gp, koji je determinisan MDR-1 genom (100,107). Dosadašnja istraživanja su utvrdila da je ekspresija enzima CYP3A4 determinisana izloženošću organizma leku i polom ispitanika. Zbog toga je moguća polna razlika u klirensu lekova ĉiji se metabolizam odvija preko CYP3A4, ukljuĉujući i takrolimus. Dosadašnji podaci ukazuju na to da je kod pacijenata ženskog pola prisutna veća aktivnost enzima CYP3A4. Wolbold R. i sar. su utvrdili da je kod žena dva puta veći nivo CYP3A4 u poreĊenju sa muškarcima (p<0,0001) (102). Veći hepatiĉki sadržaj CYP3A4 kod žena predstavlja fiziološki razlog povećanog klirensa i nižih koncentracija lekova koji se metabolišu preko njega. UtvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika u nivou CYP3A4 kod pre i post menopauzalnih žena (p=0,01), što pokazuje da hormonalni status žena vezan za starosno Diskusija 58 doba može imati znaĉaj (40,107). Kod premenopauzalnih žena je klirens lekova (korigovan telesnom masom) metabolizovanih pomoću CYP3A4 veći 20 do 30% u odnosu na muškarce sliĉnih godina. U postmenopauzalnom periodu sadržaj ovog enzima je oko 20% manji ĉime se njegov uticaj smanjuje. U našem istraživanju su uĉestvovale žene u pre menopauzalnom dobu (proseĉna starost ispitanica iznosila je 31,4 ± 5,7 godina). Sliĉno rezultatima Wolbold i sar., rezultati našeg istraživanja su pokazali oĉekivanu, statistiĉki znaĉajno manju srednju vrednost AUC kod žena (58,18±23,33 : 94,40 ±19,32, p<0,05). Izmerene koncentracije nakon primene prve doze Tac kod oba pola kretale su se u terapijskom opsegu, pri ĉemu su koncentracije Tac kod muškaraca bile veće u odnosu na koncentracije kod žena, dok je srednje vreme zadržavanja Tac bilo znaĉajno manje kod žena u odnosu na muškarce (Tabela 5.14.). Nakon postizanja ravnotežnog stanja, ponovljena je neprostorna FK analiza Tac u ispitivanoj grupi pacijenata, ĉime je potvrĊeno postojanje interindividualne varijabilnosti u izmerenim koncentracijama leka. Srednja vrednost maksimalne koncentracije Tac je statistiĉki znaĉajno manja u ravnotežnom stanju, dok je ukupna izloženost organizma leku veća. Vrednosti AUC u ravnotežnom stanju nisu pokazale polno zavisne statistiĉki znaĉajne razlike. Moguće objašnjenje je smanjena dnevna doza KS nakon postizanja ravnotežnog stanja a u skladu sa vremenskim periodom proteklim od Tx, ĉime je smanjen znaĉaj dozno i polno zavisne interakcije KS i Tac. Vreme dostizanja maksimalne koncentracije Tac nije statistiĉki znaĉajno promenjeno, dok je poluvreme eliminacije Tac znaĉajno produženo u ravnotežnom stanju. Rezultati farmakokineticke analize Tac u SS su potvrdili prethodno utvrĊenu korelaciju vrednosti srednjeg vremena zadržavanja Tac u odnosu na pol bolesnika. Telesna masa pacijenata nije pokazala znaĉajan uticaj na FK parametre Tac. Dobijeni rezultati potvrĊuju znaĉaj TDM-a Tac u cilju postizanja optimalne imunosupresije i povećanja bezbednosti terapije. U cilju kvantifikacije i razjašnjenja molekularnih mehanizama koji su uzrok varijabilnosti u farmakokinetici takrolimusa, ukazala se potreba za identifikacijom novih bioloških faktora. Farmakogenomiĉka istraživanja CYP3A5 imaju veliki znaĉaj za farmakokinetiĉki profil Tac kod populacija kod kojih je veća zastupljenost CYP3A5*1/1* genoma. Press i sar. su pokazali da CYP3A5*1/1* genom zahteva 1,5 puta veću inicijalnu dozu Tac u odnosu na zastupljeniji CYP3A5*3/3* genom (108,109,110). Dosadašnja saznanja u oblasti farmakogenomike pokazala su da pol i genotip donora takoĊe imaju znaĉajnu ulogu u farmakokinetici i farmakodinamici lekova. Istraživanje Kuypersa i sar. zasnovano na malom broju transplantiranih pacijenata je pokazalo da je statistiĉki znaĉajno manja inicijalna doza Tac kada je donor bubrega ženskog pola (89). Da bi se odredio praktiĉni znaĉaj potencijalne Diskusija 59 razlike u farmakokinetiĉkim parametrima Tac uslovljene polom donora kod naših transplantiranih pacijenata potrebna su ispitivanja na većem broju ispitanika. Ustanovljena razlika vrednosti AUC muškaraca i žena nakon primene inicijalne doze Tac može se delom objasniti primenjenom antihipertenzivnom terapijom kod transplantiranih pacijenata. Naši transplantirani pacijenti muškog pola su dobijali veće srednje terapijske doze nifedipina (proseĉno 68mg za muškarce, 32mg za žene) i diltiazema ( proseĉno 160mg za muškarce i 120mg za žene) u odnosu na ispitanike ženskog pola. Primenjeni antagonisti kalcijuma su znaĉajni inhibitori CYP3A4/5. Nifedipin inhibitornim uticajem na enzime CYP3A4/5 smanjuje metaboliĉku transformaciju takrolimusa za 61-70%, a diltiazem za 41- 50%. FK studije lek-lek interakcija pokazale su da istovremena primena inhibitora enzima CYP3A4 (nifedipin, diltiazem) i takrolimusa može inhibitorno da utiĉe na njegov metabolizam, što povećava njegovu koncentraciju i potencira ispoljavanje neželjenih efekata povećanjem ukupne izloženosti organizma leku (80,111). Istraživanja koja omogućavaju simulaciju populacionog FK ispitivanja Tac upotrebom odgovarajućih softvera, pretpostavila su pol kao znaĉajnu varijablu u japanskoj populaciji transplantiranih pacijenata (19,112). Rezultati dobijeni PFK analizom srpske populacije transplantiranih pacijenata nisu potvrdili pol kao znaĉajnu varijablu u izgradnji populacionog FK modela Tac (16). Ulogu pola u farmakokinetici Tac je potrebno razmatrati u kombinaciji sa genetikom, starošću, pridruženim bolestima i socijalno-ekonomskim statusom pacijenata, zbog ĉega za sada predstavlja nedovoljno razjašnjen fenomen koji zahteva dalja istraživanja. Neophodnost optimizacije terapijskog režima Tac proizilazi iz njegove male terapijske širine, varijabilne kinetike i neželjenih dejstava (10,85). Poznavanje ukupne izloženosti organizma takrolimusu je preduslov prevencije njegovih neželjenih i toksiĉnih efekata. Monitoring AUC kao metod optimizacije još uvek nije prihvaćen u rutinskom tretmanu transplantiranih pacijenata zbog ekonomskih razloga i složenosti postupka. Zbog toga se nametnula potreba predviĊanja ukupne izloženosti organizma leku na osnovu koncentracije Tac u odreĊenom vremenu nakon primene leka (113,114). Pronalaženje najbolje predvidive koncentracije Tac za AUC je cilj velikog broja istraživanja. Koncentracija Tac koja predviĊa ukupnu izloženost organizma leku treba da obezbedi odgovarajuću korelaciju sa 12-ĉasovnom AUC na osnovu koje može da predvidi vrednost AUC (AUCp). Time je omogućeno korigovanje doznog režima Tac u cilju sprovoĊenja racionalne imunosupresivne farmakoterapije kod transplantiranih pacijenata, uzimajući u obzir njihove karakteristike, ukljuĉujući i pol. Diskusija 60 Rezultati prethodnih istraživanja ukazali su na razliĉita vremena merenja koncentracija Tac u cilju predviĊanja AUC. Sprovedena istraživanja nisu ukljuĉivala polno selektivan pristup FK analizi Tac. Chen i sar. su pokazali znaĉajnost C5 (r=0,92; r 2=0,85) za predviĊanje ukupne izloženosti organizma leku nakon primene inicijalne doze takrolimusa. Prema ovim autorima, metod merenja dve koncentracije (C1,5 i C5), omogućava znaĉajno viši nivo predvidljivosti i bolje odreĊuje AUC (r=0,97; r2=0,94) (11). Prema nekim autorima, minimalna koncentracija Tac (C0) pokazuje dobru korelaciju sa AUC u ranom posttransplantacijskom periodu, dok se metod dve taĉke (C2 i C3), pokazao boljim u smislu predvidljivosti vrednosti skraćene AUC (9). Prospektivne studije novijeg datuma su pokazale važnost praćenja ukupne izloženosti organizma Tac u funkciji proteklog vremenskog perioda nakon Tx (115,116,117). AUC je pokazala veću pouzdanost kao indikator stepena ispoljavanja neželjenih efekata takrolimusa u odnosu na minimalnu koncentraciju na kraju terapijskog intervala(Co), zbog ĉega je od važnosti potvrĊivanje stepena korelacije izmeĊu koncentracija Tac i AUC (117). Wong i sar. su utvrdili pouzdanost metod dve taĉke (C2 i C4), za predviĊanje vrednosti AUC radeći istraživanje u prvih šest meseci nakon transplantacije (114). Rezultati istraživanja Sholten i sar. su potvrdili veći stepen pouzdanosti predviĊanja upotrebom dve u odnosu na jednu izmerenu koncentraciju Tac (118). Prema rezultatima drugih istraživaĉa, koncentracija Tac izmerena dva sata nakon peroralne primene Tac (C2) ne pokazuje veću pouzdanost u predviĊanju AUC u odnosu na koncentracije izmerene u nekom drugom vremenu (119). Istraživanja sprovedena u ranom posttrasplantacijskom periodu ukazala su na potrebu uvoĊenja metoda dve ili tri taĉke radi predviĊanja AUC i skrenula pažnju na C9, u kojoj se javlja sekundarni porast koncentracije Tac (120). Istraživanje sprovedeno u toku prve godine nakon transplantacije srca potvrdilo je veću pouzdanost C4 u smislu predviĊanja ukupne izloženosti organizma takrolimusu (r²=0,88), u odnosu na koncentraciju C0 (r²=0,74) (121). Ku i sar. su potvrdili da je C4 pouzdan indikator ukupne izloženosti takrolimusu nakon uvoĊenja u ravnotežno stanje kod pacijenata sa transplantiranom jetrom (r²=0,99) (122). Methew i sar. potvrdili su prednost metoda dve taĉke u odnosu na C0 u ravnotežnom stanju kod pacijenata sa transplantiranim bubregom i naveli dve mogućnosti- merenje C0 i C4 ili C1,5 i C4. Prema rezultatima njihovog istraživanja koncentracije Tac merene dva i više sati nakon peroralne primene leka bolje koreliraju sa AUCp u odnosu na C0, dok metod ograniĉenih uzoraka daje znaĉajno bolju predvidljivost AUCp (0,75