1 UNIVERZITET U NIŠU MEDICINSKI FAKULTET Andrej R.Veljković BIOMARKERI APOPTOZE I ĆELIJSKE SIGNALIZACIJE U PATOGENEZI KOLOREKTALNOG KARCINOMA doktorska disertacija Mentor: Prof. dr Gordana Kocić Niš, 2013 Doktorska disertacija Andrej Veljković 2 UNIVERZITET U NIŠU MEDICINSKI FAKULTET Andrej R.Veljković BIOMARKERI APOPTOZE I ĆELIJSKE SIGNALIZACIJE U PATOGENEZI KOLOREKTALNOG KARCINOMA doktorska disertacija Niš, 2013 Doktorska disertacija Andrej Veljković 3 Za izradu ove doktorske disertacije iskrenu zahvalnost dugujem: Prof. dr Gordani Kocić, mentoru ovog rada, ujedno rukovodiocu doktorskih studija, za uložen trud, korisne sugestije i bezrezervnu podršku u izboru teme i stručnu i prijateljsku pomoć u svakom trenutku realizacije ovog rada. Svojim stručnim i ljudskim kvalitetima doprinela je da saradnja sa njom, još od mojih studentskih dana, bude ogromna privilegija Prof. dr Dušici Pavlović za visoke pedagoške kvalitete, preneseno znanje uz korisne stručne savete, intuitivne naučne ideje i iskrenu podršku u mom naučnom i stručnom usavršavanju Prof. dr Tatjani Jevtović-Stoimenov za ogromnu pomoć i podršku u radu i nesebičnost u prenosu znanja i iskustava uz veliko poverenje koje mi je pružila kao nastavnik i prijatelj od prvog dana rada na Katedri za biohemiju Prof. dr Goranu Stanojeviću, na uspešnoj saradnji, korisnim sugestijama, energiji i volji da se realizuje projekat istraživanja. Prof. dr Tatjani Cvetković, koja me je uvela u praktični rad u oblasti biohemije, dugujem zahvalnost za preneseno znanje, pre svega iz oblasti oksidativnog stresa. Doc. dr Dušanu Sokoloviću za bezrezervnu podršku, prijateljstvo i pomoć svake vrste tokom izrade teze Prof. dr Vidosavi Đorđević, Prof. dr Jelenki Nikolić, Prof. dr Ivani Stojanović, Ass. dr Jeleni Bašić, Ass. dr Mileni Marinković, Saradniku u nastavi Branki Djordjević, hemičaru Svetlani Stojanović i svom osoblju Katedre za biohemiju na velikoj i nesebičnoj pomoći i podršci u toku realizacije ovog projekta Autor Doktorska disertacija Andrej Veljković 4 I Autor Ime i prezime: Andrej Veljković Datum i mesto rođenja: 31.01.1980. godine, Graĉanica, BiH II Doktorska disertacija Naslov: Biomarkeri apoptoze i ćelijske signalizacije u patogenezi kolorektalnog karcinoma Broj stranica: 130 Broj šema: 17 Broj grafikona: 21 Broj bibliografskih podataka: 394 III Ocena i odbrana Datum odobrenja teme za izradu doktorske disertacije: 17.05.2011. godine Broj odluke: 04-MM-18/06 Komisija za ocenu i odbranu doktorske disertacije Prof. dr Goran Stanojević, predsednik Prof. dr Danijela Kostić, ĉlan sa PMF u Nišu Prof. dr Gordana Kocić, mentor i ĉlan Prof. dr Dušica Pavlović, ĉlan Prof. dr Tatjana Jevtović-Stoimenov, ĉlan Datum prihvatanja izveštaja o urađenoj doktorskoj disertaciji: 31.05.2013. godine Datum odbrane: ___________________ IV Nauĉni doprinos doktorske disertacije Veljkovic A, Kocic G, M Pavlovic D, Stanojevic G, Brankovic B, Stojanovic I, Cvetkovic T, Sokolovic D, Jevtovic T, Basic J, Marinkovic M. Lipid peroxidation, protein oxidation and antioxidant status in colorectal cancer. FEBS JOURNAL. 2011;278:405 Veljković A, Kocić G, Pavlović D, Stanojević G, Branković B, Stojanović I, Cvetković T, Sokolović D, Jevtović T, Bašic J, Marinković M. Lipidna peroksidacija, oksidacija proteina, ekspresija nuklearnog transkripcionog faktora B, aktivnost matriks metaloproteinaze 9 i katalaze u karcinomu debelog creva. Mitohondije i slobodni radikali u medicini. 2011. 25 Andrej Veljkovic,Gordana Kocic, Goran Stanojevic, Ivana Stojanovic, Branko Brankovic, Dusica Pavlovic, Tatjana Cvetkovic, Dusan Sokolovic, Tatjana Jevtovic, Jelena Basic, Milena Marinkovic, Branka Djordjevic. Parameters of oxidative stress and apoptosis in colorectal carcinogenesis. Oxidative stress and cancerogenesis: Diagnostic and therapeutic possibilites. 2012; 61-69. Doktorska disertacija Andrej Veljković 5 LISTA SKRAĆENICA KRK-Kolorektalni karcinoma HNPCC-Nasledna polipoza debelog creva FAP-Familijarna adenomatozna polipoza APC- Adenomatoza polipoza koli CIN- neoplazija hromozomske nestabilnosti MIN- neoplazije mikrosatelitske nestabilnosti RVK-Reaktivne vrste kiseonika VEGF- Vaskularni endotelni faktor rasta MDA-Malonil-dialdehid TBARS- TBA reagujuće supstance AOPP -uznapredovali oksidacioni produkti proteina GSH- Glutation CAT- Katalaza NF-kB- Nuklearni transkripcioni faktor B IKK- IκB kinaza MMP- Matriks metaloproteinaze TIMP- Tkivni inhibitori metaloproteinaza IL- Interleukin 5’-NT-5’-nukleotidaza ADA- Adenozin dezaminaza XO- Ksantin oksidaza Doktorska disertacija Andrej Veljković 6 Sadržaj 1 │ UVOD ........................................................................................................................................ 8 2 │ PREGLED LITERATURE ................................................................................................... 10 2.1 KOLOREKTALNI KARCINOM ...................................................................................................... 10 2.1.1 Anatomo-histološka gradja debelog creva ..................................................................... 10 2.1.2 Kliničke karakteristike kolorektalnog karcinoma ........................................................... 11 2.1.3 Etiopatogeneza kolorektalnog adenokarcinoma ............................................................. 14 2.1.4 Klasifikacija i klinički stadijumi kolorektalnog karcinoma ............................................ 15 2.1.5 Epidemiologija kolorektalnog karcinoma ....................................................................... 17 2.1.6 Faktori rizika za nastanak kolorektalnog karcinoma ..................................................... 18 2.1.7 Proliferacija ćelija i programirana ćelijska smrt u sluzokoži debelog creva ................. 22 2.2 OKSIDATIVNI STRES .................................................................................................................. 22 2.3 NUKLEARNI TRANSKRIPCIONI FAKTOR KAPA B ......................................................................... 26 2.3.1 Uloga RVK u TNF-α-NF-κB signalnom putu ................................................................. 28 2.3.2 Značaj NF-κB u povezivanju inflamacije i kancerogeneze ............................................. 30 2.3.3 Da li aktivacija NF-κB sprečava kancerogenezu? .......................................................... 32 2.4 PROCES APOPTOZE U PATOGENEZI KOLOREKTALNOG KARCINOMA ........................................... 32 2.4.1 Uloga DNaza u fragmentaciji molekula DNK u procesu apoptoze ................................ 36 2.4.2 Oksidativni stres kao induktor apoptoze ......................................................................... 38 2.4.3 Familije Bcl-2 i Bax proteina u apoptozi ........................................................................ 39 2.4.4 Apoptoza u sluzokoži kolona ........................................................................................... 42 2.5 MATRIKS METALOPROTEINAZE ................................................................................................. 43 2.5.1 Matriks metaloproteinaza-9 ............................................................................................ 44 2.6 METABOLIZAM PURINSKIH NUKLEOTIDA .................................................................... 50 2.6.1 5’-nukleotidaza ............................................................................................................... 51 2.6.2 Adenozin dezaminaza...................................................................................................... 53 2.6.3 Ksantin oksidaza ............................................................................................................. 54 3 │ CILJ......................................................................................................................................... 56 4 │ ISPITANICI I METODE ...................................................................................................... 58 4.1 ISPITANICI ................................................................................................................................. 58 4.2 METODE .................................................................................................................................... 59 4.2.1 Određivanje koncentracije TBARS u homogenatu .......................................................... 60 4.2.2 Određivanje koncentracije AOPP u homogenatu ........................................................... 60 4.2.3 Određivanje aktivnosti katalaze ...................................................................................... 60 4.2.4 Određivanje kvantitativne ekspresije NF-B, BCL-2 i Bax ............................................ 60 4.2.5 Određivanje aktivnosti alkalne i kisele DNaze ............................................................... 61 4.2.6 Određivanje aktivnosti MMP-9 ...................................................................................... 61 4.2.7 Određivanje aktivnosti adenozin dezaminaze ................................................................. 62 4.2.8 Određivanje aktivnosti 5´nukleotidaze ........................................................................... 62 4.2.9 Određivanje aktivnosti ksantin oksidaze ......................................................................... 62 4.2.10 Određivanje količine proteina ......................................................................................... 62 4.3 STATISTIĈKA OBRADA PODATAKA ............................................................................................ 62 5 │ REZULTATI .......................................................................................................................... 63 5.1 KONCENTRACIJA TBARS U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ................... 63 5.2 KONCENTRACIJA AOPP U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ...................... 64 5.3 AKTIVNOST KATALAZE U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ....................... 66 5.4 KVANTITATIVNA EKSPRESIJA NF-ΚB U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA.. 67 5.5 KVANTITATIVNA EKSPRESIJA BCL-2 U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ... 68 5.6 KVANTITATIVNA EKSPRESIJA BAX U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ...... 69 5.7 AKTIVNOST ALKALNE DNAZE U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ........... 70 5.8 AKTIVNOST KISELE DNAZE U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ............... 72 5.9 AKTIVNOST MMP-9 U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ........................... 73 Doktorska disertacija Andrej Veljković 7 5.10 AKTIVNOST ADENOZIN DEZAMINAZE U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ... 74 5.11 AKTIVNOST 5´NUKLEOTIDAZE U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA ............ 75 5.12 AKTIVNOST KSANTIN OKSIDAZE U TUMORSKOM, OKOLNOM I ZDRAVOM TKIVU KOLONA .......... 76 6 │ DISKUSIJA ............................................................................................................................ 77 6.1 INTENZITET OKSIDATIVNOG STRESA U KOLOREKTALNOM KARCINOMU .................................... 77 6.2 AKTIVACIJA NF-ΚB U KOLOREKTALNOM KARCINOMU ............................................................. 82 6.3 NIVO APOPTOZE U KOLOREKTAKTALNOM KARCINOMU ............................................................ 88 6.3.1 Promene ekspresija gena u kontroli apoptoze u kolorektalnom karcinomu ................... 90 6.3.2 Uloga DNaza u apoptozi kolorektalnog karcinoma ...................................................... 93 6.3.3 Apoptoza i prognoza kolorektalnog karcinoma. ............................................................. 95 6.4 MATRIKS METALOPROTEINAZE U KOLOREKTALNOM KARCINOMU ............................................ 97 6.5 METABOLIZAM PURINSKIH NUKLEOTIDA U KOLOREKTALNOM KARCINOMU .......................... 101 7 │ ZAKLJUĈAK ....................................................................................................................... 106 8 │ LITERATURA ..................................................................................................................... 108 SAŽETAK……………….………….……………………………………………………..138 SUMMARY…………………………….………………………………………….……....139 BIOGRAFIJA…………………………….…………………………………………….…140 Doktorska disertacija Andrej Veljković 8 1 │ Uvod olorektalni karcinom je drugi najĉešći tumor u ljudskoj populaciji, kod oba pola. Smatra se da poremećen nivo apoptoze i promene u proliferaciji tumorskih ćelija, imaju znaĉajnu ulogu u patogenezi ove bolesti. Oksidativni stres, izazvan povećanom produkcijom reaktivnih vrsta kiseonika i smanjenim nivoom antioksidativne zaštite, uĉestvuje u sve tri faze patogeneze tumora. Oksidativni stres utiĉe i na aktivaciju i produkciju drugih citokina i faktora rasta koji doprinose razvoju tumora. Jedan od znaĉajnijih redoks zavisnih faktora je i nuklearni transkripcioni faktor kapa B, koji utiĉe na ekspresiju mnogih inducibilnih gena ukljuĉenih u procese apoptoze proliferacije. Ekspresija najznaĉajnijih gena u regulaciji apoptoze, Bcl-2 i Bax, je poremećena kod kolorektalnog karcinoma, i udruţena je sa smanjenom aktivnošću DNaza, kao egzekutora procesa apoptoze. NF- B stimuliše oslobaĊanje matriks metaloproteinaza (MMP), enzima koji vrše degradaciju komponenti ekstracelularnog matriksa i omogućavaju procese lokalne invazije i metastaziranja tumora. Enzimi ukljuĉeni u metabolizam purinskih nukleotida su takoĊe ukljuĉeni u patogenezu tumora. Povećana aktivnost adenozin dezaminaze i ksantin oksidaze su znaĉajni u procesu nastanka i razvoja tumora. Veliki napredak u razumevanju mehanizama koji uĉestvuju u nastanku i razvoju bolesti, doveo je do potrebe ustanovljenja novih specifiĉnih biomarkera koji bi bili od koristi u postavljanju rane dijagnoze, ali naroĉito predikciji ponašanja tumora i njegove agresivnosti. Mali broj studija se bavio aktivnošću enzima i ekspresijom gena u tkivu koje neposredno okruţuje tumor i u kom se i dešavaju promene od zdravog ka tumorskom tkivu. Dokaz izmenjenih nivoa apoptoze i proliferacije sagledanih kroz molekule koji uĉestvuju u procesu signalne transdukcije, bi doveo do preciznijeg odreĊivanja margina tokom odstranjivanja tumorskog tkiva. Dobro je poznato da ne reaguju svi pacijenti podjednako na primenjenu K Doktorska disertacija Andrej Veljković 9 postoperativnu hemio- i radio- terapiju. Senzitivnost tj.rezistencija na pomenute vidove terapije bi mogla biti povezana upravo sa nivoom apoptoze u tumorskom tkivu. TakoĊe, po našim saznanjima, do sada ne postoje podaci koji ukazuju na vezu izmeĊu kvantitativne ekspresije NF-B i Bcl-2 i Bax, i aktivnosti matriks metaloproteinaze-9 i DNaza uz enzime purinskog metabolizma. Nadamo se da će rezultati ove doktorske disertacije dati svoj mali doprinos u rasvetljavanju odgovora na neka od ovih pitanja i pomoći u ustanovljenju novih tumorskih biomarkera, uz mogućnost kreiranja individualnog terapijskog pristupa pacijentima, postoperativno, ali i u odreĊivanju margina tokom operacije odstranjivanja tumora. Doktorska disertacija Andrej Veljković 10 2 │ Pregled literature 2.1 Kolorektalni karcinom 2.1.1 Anatomo-histološka gradja debelog creva ebelo crevo je završni deo donjeg digestivnog trakta i njegove glavne uloge su: apsorpcija vitamina koji se stvaraju pod dejstvom bakterijske flore kolona (preko 700 razliĉitih vrsta bakterija), apsorpcija preostale vode iz nesvarljivih ostataka hrane, odrţavanje nivoa teĉnosti u organizmu i skladištenje i ĉuvanje fekalnih materija dok se ne eliminišu kroz analni otvor. Glavni delovi debelog creva su cekum, apendiks, kolon i rektum. Cekum predstavlja vezu izmeĊu tankog i debelog creva i njegova glavna uloga je da prihvati i skladišti obraĊenu i nesvarenu hranu, vodu, vitamine i minerale i da ih prenosi ka debelom crevu. Apendiks je mala projekcija debelog creva koja i njegova funkcija nije poznata. Kolon je najveći deo debelog creva i ima 4 dela (rastući, popreĉni, silazni i sigmoidni) koji se nalaze u trbušnoj duplji. U kolonu, obraĊeni materijal se meša sa sluzi i bakterijama kolona u cilju formiranja fecesa. Pored toga, sluzokoţa kolona apsorbuje najveći deo vode, neke vitamine i minerale i bakterije hemijski razgraĊuju deo vlakana za proizvodnju hranljivih materija u cilju sopstvenog opstanka i ujedno hrane ćelije sluzokoţe debelog creva. Mišićnim pokretima debelog creva, fekalije se pomeraju duţ kolona i prelaze u rektum, koji je završni deo velikog creva, gde se one skladište pre nego se izluĉe crevnom peristaltikom. U histološkoj graĊi zida debelog creva zapaţaju se 4 osnovna sloja: 1) Adventicia, koja predstavlja spoljni sloj odgovoran za odrţavanje odgovarajućeg poloţaja digestivnog trakta u telu; 2) Muskularis eksterna, koja se sastoji od kontinuiranog unutrašnjeg sloja kruţnih mišića i isprekidanog spoljneg sloja uzduţnih mišića odgovornih za motilitet sadrţaja lumena creva; 3) Submukoza, koja predstavlja sloj vezivnog tkiva izmeĊu sloja kruţnog mišića i sluzokoţe; 4) Mukoza, D Doktorska disertacija Andrej Veljković 11 koja predstavlja unutrašnji sloj zida creva saĉinjen od jednog sloja cilindriĉnog epitela (površni epitel), vezivnog tkiva (lamina propria) i spoljnog sloja mišića (Lamina muscularis mukoze) i karakteriše je prisustvo brojnih invaginacija površine epitela u ţlezde lamine proprije, do dubine oko 50 ćelija (Liberkinijeve kripte). Ove kripte se koriste uglavnom za apsoprciju vode. Pored toga, ćelije debelog creva se umnoţavaju i direfenciraju (iz matiĉnih ćelija) u donjim delovima kripti, a zatim migriraju ka gornjim delovima da bi obnovili površinske epitelne ćelije (otprilike na svakih šest dana) (1). Nekoliko poremećaja moţe nastati u debelom crevu, kao što su: sindrom iritabilnog kolona, inflamatorne bolesti creva (Kronova bolest i ulcerozni kolitis), kolorektalni polipi i kolorektalni karcinom. 2.1.2 Kliničke karakteristike kolorektalnog karcinoma 2.1.2.1 Definicija kolorektalnog kancera "Kolorektalni karcinom je karcinom koji nastaje bilo u tkivu kolona, najduţem delu debelog creva, ili u tkivu rektuma, poslednjem delu velikog creva pre analnog otvora" (2). 2.1.2.2 Vrste kolorektalnog karcinoma Glavni tipovi tumora debelog creva su: 1) adenokarcinom, 2) planocelularni karcinom, 3) karcinoidni tumori, 4) sarkomi i 5) limfomi. Više od 95% kolorektalnih karcinoma su adenokarcinomi koji se formiraju u ţlezdanim ćelijama u zidu creva. Kolorektalni adenokarcinomi se mogu podeliti u dve vrste na osnovu morfologije ćelija raka: mucinozni (98-99% adenokarcinoma, ćelije se nalaze u sluzi) ili prsten tumori (1-2% adenokarcinoma, sluz je unutar ćelija raka). Planocelularni karcinomi su tumori koji nastaju od ćelija sliĉnih ćelijama koţe. Karcinoid je neuobiĉajena vrsta sporo rastućeg tumora i nazvan je neuroendokrinim tumorom. Ova vrsta tumora raste u hormonski aktivnim tkivima, obiĉno u digestivnom sistemu i vrlo je redak . Sarkomi su tumori kostiju, mišića, tkiva i većina kolorektalnih sarkoma su lejomiosarkomi (nastaju iz glatko-mišićnih ćelija debelog Doktorska disertacija Andrej Veljković 12 creva). Konaĉno, limfomi su tumori limfnog sistema, a ĉine samo 0,01% kolorektalnih karcinoma (1). 2.1.2.3 Klasifikacija kolorektalnog karcinoma Kolorektalni karcinomi se mogu svrstati u tri oblika prema naĉinu na koji nastaju: nasledni, familijarni i sporadiĉni kolorektalni karcinomi. Udeo svakog oblika moţe se razlikovati u razliĉitim populacijama, ali generalno većina sluĉajeva karcinoma debelog creva u svim populacijama jesu sporadiĉni, a nasledni karcinom debelog creva je najreĊi. Ukupno, za 10-30% sluĉajeva raka debelog creva se smatra da su povezani sa porodiĉnim rizikom nastanka (1). 2.1.2.4 Nasledni sindromi kolorektalnog karcinoma Nasledni sindromi kolorektalnog karcinoma koji nastaju usled nasleĊenih sklonosti zbog visoko penetrantnih mutacija javljaju se u do 5% svih sluĉajeva bolesti. Najĉešći nasledni sindrom je nasledna polipoza debelog creva (HNPCC), takoĊe poznata i kao Linĉov sindrom (2-5% sluĉajeva kolorektalnog karcinoma). Jedna od karakteristika ovog sindroma je neuobiĉajeno visoka incidenca kolorektalnog karcinoma i specifiĉnih tumora van debelog creva. Pored toga, HNPCC sindrom se javlja u ranijoj ţivotnoj dobi. Visoko penetrantna genska mutacija u genima “mismatch repair” sistema, hMLH1 (nalazi se na hromozomu 3p21-23) i hMSH2 (nalazi se na hromozomu 2p21) rezultira mikrosatelitskim nestabilnostima u tumoru koje su odgovorne za većinu sluĉajeva HNPCC. Ovi geni su deo DNK “mismatch repair”sistema i opseţni revijalni ĉlanak objavljen 2002 godine je identifikovao 45 polimorfizama u hMLH1 i 55 polimorfizama u hMSH2 (3). Pored toga, prema dostupnim podacima o varijacijama gena, ne postoje dokazi koji ukazuju na bilo koje razlike u uĉestalosti izmeĊu razliĉitih populacija, ili izmeĊu etniĉkih grupa (3). Objavljeno je da standardizovani odnos incidence kolorektalnog kancera za nosioce hMLH1ili hMSH2 mutacija u odnosu na opštu populaciju je 68 (5), a relativni rizik za kolorektalni kancer u prvom stepenu nosioca mutacije u odnosu na prvi stepen srodstva nenosioca mutacije je 8,1 (6). Doktorska disertacija Andrej Veljković 13 Drugi najĉešći nasledni sindrom je veoma penetrantni autozomno dominantni sindrom poznat kao familijarna adenomatozna polipoza kolona (FAP; 1% sluĉajeva raka debelog creva) i nastaje zbog genetske mutacije adenomatoza polipoza koli (APC) gena (tumor supresor gen, nalazi se na hromozomu 5q21-22)(7). APC protein suprimira signalizaciju Wnt signalnog puta vezujući se za β - katenin i aksin, dok je gubitak funkcije APC proteina usled mutacije APC u vezi sa nastankom tumora (8). Osnovna karakteristika FAP je pojava stotina, i u nekim sluĉajevima hiljada kolorektalnih adenoma, koji mogu da se razviju u karcinom ukoliko se ne leĉe (9). Postoji nekoliko reĊih, autozomno dominantnih poremećaja, ukljuĉujući juvenilni polipozni sindrom, Kovdenov sindrom i Peutz-Jeghers sindrom. Sindrom juvenilne polipoze se pojavljuje najĉešće kod osoba mlaĊih od 20 godina i pretpostavlja se da su mutacije u SMAD4 (18q), PTEN (10q22-24) i BMPRIA genima povezane sa ovim sindromom (10, 11). Kovden sindrom, s druge strane, karakteriše se multiplim hamartomima i utvrĊeno je da je povezan sa PTEN mutacijom (12). Konaĉno, pretpostavlja se da je Peutz-Jeghers sindrom povezan sa mutacijom u LKB/STK11 genu (19p13.3) (13). 2.1.2.5 Familijarni kolorektalni karcinom Ĉak 20% sluĉajeva raka debelog creva je povezano sa porodiĉnom istorijom kolorektalnog karcinoma (sa prvim stepenom srodstva bolesnika karcinom debelog creva ima otprilike 2-4 puta povećan rizik). Nisko prodorne APC mutacije su u vezi sa nekim vrstama porodiĉnih kolorektalnih karcinoma (14). Konkretno, najĉešće APC mutacije za koje je utvrĊeno da su povezane sa porodiĉnim kolorektalnim karcinomom su I1307K (15) i E1317K (16), gde je identifikovano najmanje 12 dodatnih varijanti APC (8 od njih su u egzonu 15) (17). Drugi porodiĉni oblik karcinoma debelog creva koji je prvi put opisan 2002. godine, je MZH povezana polipoza (MAP) (18). Ovaj oblik raka debelog creva je, zahvaljujući dvo-alelnoj mutaciji u genu MUTYH i fenotipu, kliniĉki komparabilan sa FAP fenotipom (18, 19). MeĊutim, MAP, koja se prenosi recesivno, generalno rezultira manjim brojem adenoma i kasnijim dobom nastanka (20). Doktorska disertacija Andrej Veljković 14 2.1.2.6 Sporadični kolorektalni karcinom Većina sluĉajeva karcinoma debelog creva se javlja sporadiĉno, i to bez porodiĉne istorija bolesti, genetskih faktora i uticaja sredine (21). Somatske (javljaju se tokom ţivota pojedinca), pre nego nasledne mutacije ovih gena, igraju ulogu u sporadiĉnim tumorima, sa somatskim mutacijama naĊenim u APC genu u ĉak 80% sporadiĉnih tumora (22). 2.1.3 Etiopatogeneza kolorektalnog adenokarcinoma 2.1.3.1 Adenom-karcinom sekvenca Kolorektalni adenokarcinom nastaje u unutrašnjem sloju i moţe se razviti preko pojedinih ili svih ostalih slojeva debelog creva. Velika većina njih proizilazi iz adenomatoznih polipa, koji predstavljaju ograniĉene agregacije epitelnog tkiva koje se karakterišu nekontrolisanom deobom ćelija, koju prati sekvenca poznata kao adenom- karcinom sekvenca (1). Prvi korak u razvoju tumora od normalnog epitela je obiĉno pojava displazije. Konkretno, u kripti kolona, normalan sled proliferacije i diferencijacije ćelija kolona je poremećen. Proliferisane ćelije ne diferenciraju, zauzimajući celu kriptu (displastiĉna kripta). Jedna displastiĉna kripta (Unikriptal adenoma) se smatra prvom manifestacijom razvoja tumora (hiperproliferativni epitel). Adenom (adenomatozni polip), onda moţe postepeno da raste i da se menja od tubularne do vilozne graĊe. Ćelije pokazuju znakove prvo blage, onda umerene, a zatim teške displazije praćene malignim promenama, dovodeći do lokalne invazije sa eventualnim metastazama na udaljenim lokacijama (21). MeĊutim, većina adenomatoznih polipa se ne razvije u maligne karcinome, već ostaju benigni i asimptomatski (1). Postoje dokazi koji sugerišu da kolorektalni karcinom moţe proisteći iz drugih vrsta kolorektalnih lezija osim adenomatoznih polipa, ukljuĉujući nazubljene polipe i ravne adenome (1). Ukratko, nazubljeni polipi obuhvataju više razliĉitih vrsta lezija, kao što su aberantne kripte, hiperplastiĉni polipi, mešoviti polipi, nazubljeni adenomi i kitnjasti nazubljeni adenomi. Ove lezije su obiĉno male, glatke i javljaju se uglavnom u rektumu i sigmoidnom kolonu. Doktorska disertacija Andrej Veljković 15 2.1.3.2 Molekularna genetika sporadične kolorektalne karcinogeneze Kao i u mnogim drugim vrstama tumora, kolorektalna karcinogeneza proistiĉe iz mutacija uglavnom onkogena i tumor supresor gena i u odnosu na nasledne i familijarne kolorektalne karcinome (genetske mutacije), sporadiĉni kolorektalni karcinomi su rezultat akumulacije više somatskih mutacija. Sporadiĉni kolorektalni karcinomi mogu imati dva razliĉita profila genoma, koji su poznati kao: 1) neoplazija hromozomske nestabilnosti (CIN) i 2) neoplazije mikrosatelitske nestabilnosti (MIN) (23). Većina sporadiĉnih kolorektalnih karcinoma (85-90%) nastaje zbog mutacija u APC-genima i karakterišu se hromozomskom nestabilnošću. Ovi tumori su uglavnom u vezi sa hiperploidijom, gubicima alela, ĉestom mutacijom tumor supresornih gena (APC, p53) i uglavnom se nalaze u levom delu debelog creva. Mutacije u APC-genu (gubitak heterozigotnosti na hromozomu 5q: 5qLOH) se javljaju rano u kolorektalnoj karcinogenezi i one su obiĉno praćene mutacijom u K- ras genu, a kasnije u p53 genu (17pLOH). Pored toga, u uznapredovalim adenomima pronaĊene sumutacije u tri dodatna gena (DCC,SMAD4, SMAD2) na hromozomu 18q (18qLOH). Preostalih 10-15% sporadiĉnih kolorektalnih tumora se odlikuju mikrosatelitskim nestabilnosti (MIN) i uglavnom se nalaze u proksimalnim delovima debelog creva. Oni su euploidni tumori bez alelnih gubitaka, prisutnih retkih mutacija supresor gena(p53, APC) i ĉešćih mutacija BRAF i PI3KCA onkogena i nekih drugih gena (TGB-RII, Bax, TCF4, Caspaza5, HIF1) (24). 2.1.4 Klasifikacija i klinički stadijumi kolorektalnog karcinoma Da bi se opisala proširenost kolorektalnog karcinoma u organizmu, mogu se primeniti 2 sistema: ”Djuksov" i sistem ameriĉkog zajedniĉkog komiteta za kancer (AJCC). Modifikovano sistem klasifikacije po Djuksu, koji je prvobitno objavljen od strane Djuksa CE 1932 godine, je patološki “stejdţing” na osnovu resekcije tumora i merenja dubine invazije sluznice i zida creva. MeĊutim, on ne uzima u obzir stepen ukljuĉivanja limfnih ĉvorova i gradus tumora. Postoje ĉetiri modifikovane Djuks faze (A-D): 1) faza A, gde tumor prodire u sluznicu zida creva, 2) faza B, gde tumor prodire u (B1) i kroz (B2) propriu muscularis (mišićni sloj) zida creva; 3) Faza C, gde tumor prodire u (C1) i kroz (C2) muscularis propriu zida creva i postoji patološki Doktorska disertacija Andrej Veljković 16 dokaz tumora debelog creva u limfnim ĉvorovima, 4) Faza D, gde se tumor proširio izvan granica limfnih ĉvorova (u organe kao što su jetra, pluća ili kosti). AJCC sistem je zasnovan na TNM klasifikaciji. U TNM klasifikaciji, T- opisuje stepen širenja tumorskog tkiva kroz slojeve koje formiraju zid creva, N se odnosi na limfne ĉvorove i oznaĉava da li se ili ne, karcinom proširio na obliţnje limfne ĉvorove i ako jeste, koliko je limfnih ţlezda zahvaćeno i M je skraćenica za metastaze i oznaĉava da li se ili ne karcinom proširio u udaljene organe. Svaki od ova tri elementa se posebno kategoriše i klasifikuje brojem. Postoji pet faza za opisivanje obima širenja tumora kroz zid creva (TIS, T1-T4): 1) TIS, gde tumor zahvata samo mukozu, 2) T1, gde tumor invadira submukozu; 3) T2, gde tumor zahvata muskularis propriju; 4) T3, gde tumor invadira preko muskularis proprije u subserozu, ili u perikoliĉno ili perirektalno tkivo; 5) T4, gde tumor direktno zahvata druge organe ili strukture, i / ili perforira. Postoje tri faze za opisivanje širenja tumora na obliţnje limfne ĉvorove (N0- N2): 1) N0, tamo gde nema širenja u regionalne limfne ţlezde, 2) N1, gde se širi u jednu do tri regionalne limfne ţlezde, 3) N2, gde se tumor širi u ĉetiri ili više regionalnih limfnih ĉvorova. Konaĉno, postoje dve faze za opisivanje metastaza, da li se karcinom proširio na udaljene organe (M0-M1): 1) M0, gde nema udaljenih metastaza, 2) M1, gde su udaljene metastaze prisutne. U sluĉaju nepotpunih informacija u vezi sa invazijom tumora, zahvaćenosti limfnih ĉvorova i prisustva metastaza ili ne, oznaka faze postaje Tx, Nx ili Mx. Kada su tri TNM broja u kombinaciji, AJCC se formira (0, I-IV): 1) faza 0 za TIS, N0 i M0, 2) faza I za T1 N0 M0 ili i T2, N0 i M0; 3) faza IIA za T3 N0 i M0, 4) faza II B za T4, N0 i M0, 5) faza IIIA za T1, N1 i M0 ili T2 N1 i M0, 6) faza IIIB za T3 N1 i M0 ili T4, N1 i M0;7) faza IIIC za bilo T N2 i M0, 8) faza IV za bilo T bilo N i M1(American Cancer Societi) (Slika 1) Slika 1. Stadijumi kolorektalnog karcinoma Doktorska disertacija Andrej Veljković 17 2.1.5 Epidemiologija kolorektalnog karcinoma Incidenca kolorektalnog karcinoma varira u raznim geografskim podruĉjima.U Evropi, kao i drugim razvijenim zemljama, karcinom kolona je jedan od glavnih uzroka smrtnosti izazvanih tumorima (25,26,27). Najveći faktor rizika nastanka karcinoma kolona jeste naĉin ishrane, pored genetske predispozicije, jer hrana moţe dovesti do poremećene ekspresije gena koji su ukljuĉeni u proces kancerogeneze. Epidemiološke studije su pokazale da ishrana bogata mastima i fiziĉka neaktivnost dovode do velikog rizika za nastanak oboljenja (28). U prilog tome govori i ĉinjenica da stanovnici koji migriraju iz zemalja sa malom incidencom oboljenja u bogate zemlje zapadnog sveta pokazuju povećan rizik nastanka karcinoma kolona (25). Ishrana sa malom koliĉinom zasićenih masti i velikom koliĉinom celuloznih vlakana voća i povrća dovodi do smanjenja rizika za nastanak oboljenja (29). Tome u prilog govori i ĉinjenica da vegetarijanci imaju manji rizik oboljevanja od ostatka populacije (30). Ipak, više studija nije uspelo da dokaţe da se dijetom moţesmanjiti incidenca pojava polipa i tumora debelog creva (31,32). Stopa incidence karcinoma debelog creva u zemljama Evropske Unije (EU) prema procenama iz 2006 godine (Cancer Research UK) se razlikovala, sa najniţim stopama incidencije u Grĉkoj (31/100 000 za muškarce i 21,3/100 000 za ţene), a najviša incidenca je u MaĊarskoj (106/100 000 za muškarce i 50,6/100 000 za ţene). Procene za EU su 59/100000 za muškarce i 35,6/100000 za ţene. Prema IARC, oko 1023152 novih sluĉajeva raka debelog creva je dijagnostikovano u 2010. godini (9% od svih novih sluĉajeva raka) ĉineći kolorektalni karcinom trećim najĉešćim tumorom širom sveta. 65 % novih sluĉajeva raka debelog creva u 2010. godini su bili zabeleţeni u razvijenijim regionima. Velike razlike u uĉestalosti stope su primetne, sa najniţom stopom incidencije u Africi 2,3/100000 za muškarce i 3,3/100000 za ţene) i najvišom stopom u Australiji, Americi i Evropi (najvišastopa incidence u Australiji / N. Zeland: 48,2/100000 za muškarce i 36,9/100000 zaţene). U Juţnoj Africi, od tumora debelog creva oboli jedan od 94 muškarca i jedna od 130 ţena. Kod azijskih muškaraca, on ima najveću uĉestalost u odnosu na sve ostale vrste karcinoma (1 od 43), kod ţena bele rase je drugi najrasprostranjeniji tumor (1 od 44), a treći najĉešći rak belih muškaraca (1 od 34) Doktorska disertacija Andrej Veljković 18 (33). Kolorektalni karcinom je odgovoran za 9 % od pribliţno 6,35 miliona invazivnih vrsta tumora godišnje. Obiĉno, stope incidencije karcinoma debelog creva imaju tendenciju da budu veće u razvijenim zemljama koje su ekonomski razvijenije. Istraţivanja su pokazala da se rizik nastanka kolorektalnog kancera menja kod migranata posle perioda 20-30 godina provedenog u zemljama visokog rizika, kao i da rizik od razvijanja raka debelog creva moţe da se smanji posle migracije iz zemalja visokog, u zemlje niskog rizika (34). Studije pokazuju da se 3% svih karcinoma kolona javlja u sigmoidnom kolonu, 2% u cekumu, 1% u ascendentnom delu debelog creva, 1% u popreĉnom delu debelog creva i 93% usilaznom delu debelog creva. Zanimljivo, u zemljama visoke stope incidencije raka debelog creva, postoji veći broj obolelih od tumora sigmoidnog dela kolona, a u zemljama sa niskim stopama, veći broj karcinoma cekuma i ascendentnog dela debelog creva (34). U Republici Srbiji, maligni tumori debelog creva predstavljaju drugu najĉešću lokalizaciju malignih tumora od koje svake godine pribliţno oboli 3800 i umre 2300 osoba oba pola. U 2006. godini u strukturi umiranja od svih malignih bolesti, karcinom kolona i rektuma sa uĉešćem od 11,9 % ĉinio je drugi najĉešći uzrok, odmah posle raka pluća kod muškaraca i raka dojke kod ţena. 2.1.6 Faktori rizika za nastanak kolorektalnog karcinoma Dokazano je da su mnogi faktori direktno ili indirektno povezani sa kolorektalnim tumorom. Godine, liĉna istorija prethodnih tumora debelog creva ili adenomatoznih polipa, porodiĉna istorija tumora debelog creva, hroniĉna zapaljenjska oboljenja creva, kao i prisustvo bilo HNPCC ili FAP smatraju se ustanovljenim faktorima rizika za nastanak karcinoma debelog creva. Povećan rizik za razvoj kolorektalnog karcinoma, prema “American Cancer Society”, imaju osobe koje: 1) imaju liĉnu istoriju karcinoma debelog creva, 2) imaju liĉnu istoriju adenomatoznih polipa, ili 3) imaju porodiĉnu istoriju raka debelog creva. Visok rizik za razvoj kolorektalnog karcinoma imaju pojedinci koji: 1) imaju istoriju inflamatorne bolesti creva (ukljuĉujući ulcerozni kolitis i Kronovu bolest) ili 2) imaju jedan od dva nasledna sindroma (HNPCC ili FAP). Doktorska disertacija Andrej Veljković 19 Za pojedince sa povećanim rizikom za nastanak karcinoma debelog creva skrining i nadzorne tehnike bi trebalo da obezbede smanjenje uĉestalost i smrtnost (35). Konaĉno, rizik od kolorektalnog karcinoma raste znatno nakon 50 godina starosti i zato su u mnogim zemljama preporuĉeni skrining programi za osobe starije od 50 godina. Ishrana, telesna teţina, fiziĉka aktivnost, pušenje, konzumiranje alkohola, nesteroidnih antiinflamatornih lekova (NSAIL), hormonska supstituciona terapija u post-menopauzi ţena, su takoĊe faktori rizika. 2.1.6.1 Starosno doba Rizik za nastanak kolorektalnog tumora se povećava sa godinama i veća je verovatnoća da se desi kod osoba starijih od 50 godina Pacijenti sa prethodnim kolorektalnim karcinomom su u riziku razvoja rekurentnog ili metahronog tumora i stoga je kod takvih pacijenata neophodan dugoroĉni kolonoskopski nadzor (36). MeĊutim, još uvek je nepoznata uĉestalost i epidemiološke karakteristike metahronog tumora (novog primarnog tumora osoba sa istorijom raka) kolorektalnog kancera. Prema nalazima populacione studije u Francuskoj, kumulativni rizik od metahronog karcinoma je 2% meĊu preţivelim u trajanju od 5-godina i 7% kod 20-godišnje preţivelih (37). Pored toga, još u ĉetiri populacione studije, zabeleţen je dva do tri puta veći rizik od pojave kolorektalnog karcinoma (Konektikat, Juta, Švedska i Finska) (38-41). 2.1.6.2 Porodična istorija raka debelog creva Kriterijumi za visok porodiĉni rizik raka debelog creva su: 1) najmanje tri ĉlana porodice pogoĊena rakom debelog creva, ili bar dva sa rakom debelog creva i jedan sa karcinomom endometrijuma u najmanje dve generacije, jedan mora biti mlaĊi od 50 godina pri postavljanju dijagnoze i jedan od roĊaka mora da bude prvi stepen srodstva u odnosu na druga dva, ili 2) prisustvo HNPCC sindroma, ili 3) neproverena rodbina prvog stepena kao znani nosioci gena. Kriterijumi za umeren rizik su: 1) jedan srodnik prvog stepena oboleo od kolorektalnog karcinoma, starosti ispod 45 godina ili 2) dva zahvaćena srodnika prvog stepena srodstva sa jednim ispod 55 godina ili 3) tri zahvaćena srodnika sa kolorektalnim ili endometrijalnim tumorom, koji su srodnici prvog stepena meĊusobno, a jedan od njih je srodnik prvog stepena ispitaniku. Pojedinci koji ne Doktorska disertacija Andrej Veljković 20 ispunjavaju sve gore navedene kriterijume se klasifikuju kao osobe niskog porodiĉnog rizika. Prema meta analizi, koja je objavljena u 2006. godini i ukljuĉuje 59 studija (objavljene od 1958 do 2004), zbirni kolorektalni rizik karcinoma kada je najmanje jedan srodnik prvog stepena oboleo, relativno je 2,24 (95% CI 2,06, 2,43), a porastao je na 3,97 (95% CI 2,60,6.06), kada je bilo najmanje dva roĊaka. Pored toga, apsolutni rizik za pojedinca od navršenih 70 godina ţivota bio je 3,4% (95% CI 2,8 do 4,0) sa najmanje jednim zahvaćenim ili 6,9% (95% CI 4,5 do 10,4) sa dva ili više, što je znatno veće od 1,8% rizik za 50-godišnjake (42). 2.1.6.3 Inflamatorne bolesti creva i prevalenca kolorektalnog karcinoma Inflamatorne bolesti creva jesu grupa idiopatskih (nepoznatog uzroka) zapaljenskih stanja debelog creva, a obuhvataju ulcerozni kolitis i Kronovu bolest. Ulcerozni kolitis uglavnom pogaĊa debelo crevo i uglavnom se javlja sa zapaljenjem sluzokoţe. Nasuprot tome, Kronova bolest moţe da se razvije u bilo kom delu gastrointestinalnog trakta, ali najĉešće zahvata distalni deo tankog creva i delove debelog creva. Pored toga, inflamacija kod Kronove bolesti zahvata mnogo dublje slojeve zida creva nego kod ulceroznog kolitisa (43). Prema meta-analizi 116 studija, prevalenca kolorektalnog karcinoma kod pacijenata sa ulceroznim kolitisom je 3,7%. Pored toga, procena kumulativnog rizika kolorektalnog karcinoma usled trajanja ulceroznog kolitisa ukazuje na to da je 2% na 10 godina, 8% na 20 godina, a 18% na 30 godina (44). Dokazi veze izmedju Kronove bolesti i tumora debelog creva su manje jasni nego kod ulceroznog kolitisa. Prema meta-analizi sprovedenoj u 2007. godini, pacijenti koji boluju od Kronove bolesti imaju 2,4 puta povećani rizik od tumora debelog creva, što je, meĊutim, povezano sa znaĉajnom heterogenošću. Posle stratifikacije mesta tumora, utvrĊeno je da je rizik od tumora debelog creva porastao za faktor 2,59 (bez znaĉajne heterogenosti), ali rizik nastanka tumora rektuma nije bio znaĉajno povezan sa obolelim od Kronove bolesti (45). 2.1.6.4 Povezanost ishrane i pojave kolorektalnog karcinoma Prema drugom izveštaju Ameriĉkog instituta za istraţivanje raka/Svetskog fonda za istraţivanje raka (AICR/VCRF), o hrani, ishrani, fiziĉkoj aktivnosti i prevenciji tumora, koja je objavljena u novembru 2007, ishrana ima veoma vaţnu ulogu u prevenciji i etiologiji tumora debelog creva (46). TakoĊe se smatra da je uloga Doktorska disertacija Andrej Veljković 21 ishrane u kolorektalnoj karcinogenezi posebno vaţna kada je loša ishrana u kombinaciji sa nezdravim naĉinom ţivota, i uopšte kada se unosi više kalorija i dobija na telesnoj teţini uz fiziĉku neaktivnost i konzumiranje alkohola (47). Dokazi o vezi tumora debelog creva i unosa crvenog i preraĊenog mesa su sasvim evidentni. U drugom izveštaju AICR / VCRF, meta-analizom observacionih analitiĉkih studija, rizici povezani sa unosom crvenog mesa i preraĊenog mesa pokazali su pozitivne korelacije sa kolorektalnim karcinomom (46). U nedavnoj monografiji IARC jenavedeno da se kolorektalni karcinom uzroĉno vezuje za konzumiranje alkohola (48), zakljuĉak je u skladu sa zakljuĉkom iz drugog AICR / VCRF izveštaja (2007). Konkretno, u drugom AICR / VCRF (2007) izveštaju, u meta-analizi od 24 studije o potrošnji alkoholnih pića i 13 kohortnih studija, dokazano je da je unos etanola u dozi većoj od 30g dnevno uzroĉno povezan sa tumorom debelog creva kod muške populacije i verovatno povezane sa ţenskim kolorektalnim karcinomom (46). Rezultati iz EPIC studije predlaţu da su i ţivotni vek i unos alkohola bili znaĉajno povezani sa uĉestalošću kolorektalnog karcinoma za doze alkohola od 30 do 59,9 g/dan u odnosu na 0,1-4,9 g/dan (23% i 26% povećanja rizika, retrospektivno) (49). Pušenje cigareta se povezuje sa rizikom nastanka adenomatoznih polipa debelog creva. Meta-analiza kombinujući saznanja iz 42 kontrolne studije (15,354 sluĉajeva i 100.011 kontrola) je izvestila da je pušenje više povezano sa visokim rizikom nastanka adenoma i zato je zakljuĉeno da je pušenje znaĉajan faktor rizika za formiranje i agresivnost adenomatoznih polipa (50). Zaštitni kratkoroĉni efekat NSAIL i/ili aspirina na kolorektalni adenom u bolesnika sa istorijom kolorektalnog adenoma ili kolorektalnog karcinoma je dokazan u dve randomizirane kliniĉke studije (51,52). Pored toga, rezultati randomiziranih kontrolnih studija pokazali su u 40% smanjenje recidiva kolorektalnih adenoma upotrebom inhibitora enzima ciklooksigenaze-2 (COKS-2) (53,54). MeĊutim, efekat NSAIL ili aspirina na rizik nastanka kolorektalnog karcinoma još uvek nije ustanovljen, verovatno zbog komplikovanog patogenetskog puta razvitka kolorektalnog karcinoma (55). Doktorska disertacija Andrej Veljković 22 2.1.7 Proliferacija ćelija i programirana ćelijska smrt u sluzokoži debelog creva Proliferacija ćelija, ali i programirana ćelijska smrt su neophodni, ali i suprotstavljeni procesi tkivne homeostaze. Odnos izmeĊu ovih procesa promoviše ravnoteţu izmeĊu proliferacije i ćelijske smrti i ograniĉava rast i preţivljavanje ćelija sa onkogenim mutacijama. Koordinacija i ravnoteţa izmeĊu ćelijske proliferacije i apoptoze od kljuĉnog je znaĉaja za normalan razvoj i tkivnu homeostazu (56). Ćelijska signalizacija se dešava izmeĊu proliferacije i mašinerije ćelijske smrti. Ovo ukljuĉuje zapaţanje da mutacije koje promovišu neodgovarajući ulazak u ćelijski ciklus ĉesto promovišu i apoptozu, i da preko povećane ekspresije antiapoptotiĉnih ĉlanova BCL-2 familije proteina moţe da se suzbije proliferacija i promoviše ulazak u G0. TakoĊe je dokazano da je apoptoza u kolorektalnom karcinomu povezana sa proliferativnim aktivnostima (57). Dakle, kancer nastaje kada klonovi mutirane ćelije opstaju i proliferišu nekontrolisano, remeteći ovu ravnoteţu. Proliferativna zona u osnovi kripti se sastoji od epitelnih prekursornih ćelija koje zadrţavaju sposobnost da se dele (58). Ove ćelije nastaju iz matiĉnih ćelija koje se nalaze na dnu kripte i migriraju ka luminalnoj površini kripte u kojoj se mnoţe (59). Matiĉne ćelije se dele asimetriĉno, sa novosintetisanim DNK doniranim ćerkama ćelija koje migriraju do kriptiu krajnjoj liniji, a "stara" DNK se zadrţava u populaciji matiĉnih ćelija (60). Kako ćelije migriraju iz kripti ka površini epitela, one nastavljaju proces diferencijacije i postaju zrele apsorptivne ćelije i peharaste ćelije sve dok se ne podvrgnu apoptozi, koja je poznata kao intraepitelna ćelijska smrt (58,59). Epitelne ćelije kripti takoĊe podleţu apoptozi nakon što napuste proliferativnu zonu; naime, obeleţavanje apoptotiĉnih DNK fragmenata u normalnoj mukozi kolona otkriva apoptotiĉne ćelije duţ cele duţine kripti sa najintenzivnijim bojenjem u gornjoj trećini (61). 2.2 Oksidativni stres Oksidativni stres predstavlja jedan od mehanizama ukljuĉenih u proces kancerogeneze. U fiziološkim uslovima u organizmu postoji balans izmeĊu stvaranja slobodnih radikala i antioksidativne odbrane, ĉime se spreĉava pojava oksidativnog stresa. Slobodni radikali su atomi, joni ili molekuli, sa jednim ili više nesparenih Doktorska disertacija Andrej Veljković 23 elektrona u spoljašnjoj orbitali, koji je odgovoran za njihovu nestabilnost i reaktivnost (62). U poslednje vreme se umesto naziva slobodni radikali sve ĉešće koristi naziv reaktivne vrste, koji pored slobodnih radikala obuhvata nestabilna jedinjenja lako podloţna redukciji, koja imaju karakter slobodnih radikala, mada po hemijskoj strukturi to nisu. Tako postoje reaktivne vrste kiseonika (RVK), azota, ugljenika i sumpora. U patogenezi razliĉitih bolesti (dijabetes melitus, Parkinsonova bolest, hroniĉne demijelinizirajuće bolesti centralnog nervnog sistema, ishemijsko- reperfuziona oštećenja tkiva, aterogeneza, kancerogeneza, alergijske manifestacije, reumatoidni artritis i druge), najznaĉajnije mesto zauzimaju RVK, gde spadaju radikali kao što su: superoksid anjon (O2 . ), hidroksil (HO . ), peroksil (RO2 . ), alkoksil (RO . ), hidroperoksil (HO2 . ) ali i neradikali: vodonik peroksid (H2O2), hipohlorna kiselina (HOCl), ozon (O3), singletni kiseonik ( 1 O2) (63). RVK se produkuju u ćeliji u razliĉitim procesima, kao što su oksidativna fosforilacija u mitohondrijama, fagocitoza, biotransformacija egzogenih i endogenih supstrata, metabolisanje etanola, enzimske reakcije koje katalizuju oksidaze, sinteza eikosanoida, reakcije oksidoredukcije u prisustvu metala s promenljivom valencom, lipidna peroksidacija nezasićenih masnih kiselina. Najvaţniji slobodni radikali kiseoniĉnog porekla su superoksid anjon (O2 · ), vodonik peroksid (H2O2), hidroksilni radikal (OH ·) i ˝singletni kiseonik˝ (1O2). Oni imaju sposobnost oštećenja skoro svih biomolekula u ćeliji (nukleinskih kiselina, nukleotida, tiola), narušavaju meĊumolekulske veze i strukture ćelijskih membrana. Nastajanje hidroksilnih radikala (oni su najreaktivniji kiseoniĉni radikali), vezano je za Haber-Weiss-ovu reakciju u kojoj reaguju H2O2 i O2 · , kao i za Fentonovu reakciju koja se odnosi na razgradnju H2O2 u prisustvu metala sa promenjivom valencom (Fe 2+ i Cu + ) (Slika 2) Doktorska disertacija Andrej Veljković 24 OH . GPx GRed I. II. III. IV. Slika 2. Mehanizam oksidativnog oštećenja Zahvaljujući sistemu antioksidativne zaštite, RVK se permanentno metabolišu u manje toksiĉne metabolite. Antioksidativni sistem zaštite od RVK ukljuĉuje enzimske i neenzimske antioksidante. Enzimi koji neutrališu superoksidne anjone, vodonik peroksid i lipidne perokside (superoksid dizmutaza, katalaza i glutation peroksidaza) zajedno ĉine prvu liniju antioksidativne zaštite. Neenzimski antioksidanti obuhvataju liposolubilne (vitamin A, β-karoten, vitamin E, koenzim Q) i hidrosolubine antioksidante (vitamin C, glutation (GSH), albumin, apoceruloplazmin, apotransferin, apoferitin, bilirubin, mokraćna kiselina, poliamini), koji predstavljaju sekundarnu liniju odbrane (62). Katalaza (EC 1.11.1.6) je oksidoreduktaza, tetramer, hemin enzim, koji je široko rasprostranjen u tkivima, ali ga najviše ima u jetri i eritrocitima i to pre svega u peroksizomima i mitohondrijama, dok se kod eritrocita nalazi u citoplazmi. Katalizuje reakciju razgradnje vodonik peroksida na vodu i molekulski kiseonik. Proces stvaranja i uklanjanja RVK je u fiziološkim uslovima u ravnoteţi. Kada doĊe do poremećaja ove ravnoteţe u korist prooksidanata, nastaje oksidativni stres, sa sledstvenom oksidativnom modifikacijom lipida, proteina i nukleinskih kiselina. Lipidna peroksidacija kao najizraţeniji negativan fenomen u delovanju slobodnih radikala, predstavlja autokatalitiĉki, progredijentan i najĉešće ireverzibilan proces. Peroksidacija polinezasićenih masnih kiselina protiĉe kroz stadijum Doktorska disertacija Andrej Veljković 25 inicijacije, propagacije i terminacije. Ovaj autokatalitiĉki ciklus moţe se propagirati sve dok se lanac reakcije ne prekine sjedinjavanjem dva radikala u neradikalski proizvod. MeĊutim, najĉešće jednom pokrenut proces lipidne peroksidacije na ćelijskim membranama od strane RVK i to najĉešće OH·, dalje teĉe kao autokatalitiĉki i završava ireverzibilnim oštećenjima funkcije i strukture ćelijske membrane (64). Inicijacija lipidne peroksidacije nastaje oduzimanjem atoma vodonika iz metilenske grupe (-CH2-) u α-poloţaju od mesta dvogube veze u ugljovodoniĉnom lancu polinezasićenih masnih kiselina u membranskim fosfolipidima, pri ĉemu nastaje alkil-radikal. Iz nastalog alkil-radikala u procesu intramolekulskog rasporeĊivanja dvogubih veza nastaju konjugovani dieni kao dalji primarni produkti lipidne peroksidacije. U reakciji izmeĊu konjugovanih diena i molekulskog kiseonika, odnosno alkil-radikala i aktivnog kiseonika stvara se peroksi radikal (ROO•). Nastali ROO• poseduje dovoljan oksidativni potencijal da oduzme vodonik iz susednog molekula nezasićene masne kiseline, pri ĉemu nastaju lipidni hidroperoksid i novi alkil radikal. Na ovaj naĉin se pokreće autokatalitiĉki ciklus lipidne peroksidacije (65). Lipidni hidroperoksidi, kao primarni molekulski produkti lipidne peroksidacije, predstavljaju stabilne molekule, ali u prisustvu gvoţĊa dolazi do njhove razgradnje i nastanka peroksi ili alkoksi radikala, koji dalje mogu inicirati proces lipidne peroksidacije. MeĊusobna reakcija dva peroksi radikala moţe biti izvor ekscitiranog singlentnog kiseonika koji moţe da deluje na susedne molekule nezasićenih masnih kiselina formirajući hidroperokside. Oksidacijom alkoksi radikala nastaje dihidroperoksid koji se spontano razgraĊuje do isparljivih kratkolanĉanih ugljovodonika (etan i pentan). Serijom kompleksnih reakcija daljom razgradnjom hidro- i dihidroperoksida dolazi do stvaranja produkata koji sadrţe karbonilnu grupu kao što su nonenal, 4-hidroksi pentenal i kratkolanĉani malondialdehid (MDA) (64). Visoko reaktivni sekundarni produkti lipidne peroksidacije, posebno MDA, reaguju sa slobodnim SH i NH2 grupama aminokiselina, peptida, proteina, nukleotida i fosfolipida, dovodeći do kovalentne modifikacije ovih makro-molekula, što rezultira promenom njihovih funkcionalnih svojstava. Peroksidaciju polinezasićenih masnih kiselina prati povećana permeabilnost plazma membrana, a obrazovanje unakrsnih veza izmeĊu MDA i fosfolipida tj. proteina narušava lipoproteinsku interakciju i menja adaptivnu sposobnost biomembrana; oksidacija tiolnih grupa enzima dovodi do inaktivacije enzima; oksidativna modifikacija molekula nukleinskih kiselina dovodi do mutacije i kancerogeneze (66). Doktorska disertacija Andrej Veljković 26 2.3 Nuklearni transkripcioni faktor kapa B Transkripcioni faktor NF-B je regulatorni protein koji kontroliše ekspresiju mnogih inducibilnih i tkivno specifiĉnih gena, uĉestvujući na taj naĉin u regulaciji proinflamatornih i imunskih odgovora ćelije, ćelijske proliferacije i apoptoze (67). NF-κB je otkriven od strane Baltimora i saradnika 1986. godine kao faktor u jedru B limfocita koji se vezuje za kapa laki lanac imunoglobulina (68). MeĊutim, danas je dokazano da je ubikvitarno prisutan u citoplazmi svih tipova ćelija, od drosofila do ĉoveka. On se translocira do jedra samo kada je aktivisan, gde reguliše ekspresiju preko 200 gena odgovornih za funkcionisanje imunog sistema, rast i inflamaciju. Aktivacija NF-κB je “maĉ sa dve oštrice”. Potreban je za pravilno funkcionisanje imunog sistema, dok neodgovarajuća aktivacija NF-κB moţe dovesti do inflamacije i kancerogeneze. Ta osobina je posebno upadljiva u odnosu na tumore i proinflamatorne bolesti (69). Većina inflamatornih agenasa deluje preko aktivacije NF-κB ali on moţe biti i suprimiran od strane antiinflamatornih agenasa. Sliĉno tome, većina kancerogena i promotera tumora aktiviraju NF-κB, dok ga hemopreventivni agensi inaktivišu, što ukazuje na jaku povezanost sa patogenezom tumora (70). Paradoksalno, većina agenasa, ukljuĉujući i citokine, hemoterapeutike i zraĉenje, koji indukuju apoptozu takoĊe aktiviraju NF-κB (71), što ukazuje da je NF-κB deo ćelijskog odbrambenog mehanizama i na taj naĉin moţe da posreduje desenzitizaciju , hemorezistenciju, i radiorezistenciju (72). Nalazi se u citoplazmi u vidu neaktivnog kompleksa sa IκB i moţe se aktivisati na tri naĉina: 1. Fosforilacijom IκB pomoću IκB kinaze (IKK) 2. Fosforilacijom tirozina u molekulu IκB 3. Inaktivacijom fosfataza oksidativnim stresom. Slika 3. Struktura molekula NF-B Doktorska disertacija Andrej Veljković 27 Neaktivni NF-κB je prisutan u citoplazmi svih ćelija, aktiviran je samo kada je translociran u jedro i to je uobiĉajen sled dogaĊaja njegovog generisanja. Poznato je da se NF-κB sastoji od porodice proteina koji sadrţe rel-domen, na primer, rela(takoĊe se zove p65), rel b, c-REL, p50 (takoĊe zove NF-κB1), i p52 (takoĊe poznat kao NF-κB2). Razlaganje p100 pod dejstvom fosforilaza proizvodi p52, dok se p105 razlaţe da bi formirao p50. Sliĉno tome, porodica anhorin-domena koji sadrţe proteine- IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBαε, BCL-3, p105, p100-a odrţavaju NF-κB u njegovom neaktivnom stanju u citoplazmi. U citoplazmi, NF-κB se sastoji od heterotrimera p50, p65, i IκBα (Slika 3). Fosforilacija, ubikvitinacija, i degradacija IκBα oslobaĊa p50-p65 heterodimer, koji se tada translocira do jedra i vezuje specifiĉnih 10 baznih parova na konsenzus mestu GGGPuNNPiPiCC. IκBα je fosforilisan na ostatcima serina 32 i 34 pod dejstvom IκBα kinaze (IKK), koja se sastoji od IKKα, IKKβ, i IKKγ (takoĊe se zove Nemo). Ispitivanja sa delecijom gena su dokazala da je IKKβ potreban za NF-κB aktivaciju preko TNF i većine drugih agenasa (72). NF-κB je konstitutivno aktivan u većini linija tumorskih ćelija, izvedenih bilo iz hematopoetskih tumora ili tkivnih tumora. On se retko nalazi konstitutivno aktivan u zdravim ćelijama, osim u proliferišućim T-ćelijama, B ćelijama, timocitima, monocitima, i astrocitima. Konstitutivno aktivan NF-κB je identifikovan ne samo u humanim ćelijskim linijama karcinoma već i u tkivima tumora poreklom od pacijenata sa multiplim mijelomom (73), akutnom mijeloproliferativnom leukemijom (74), akutnom limfocitnom leukemijom (75), hroniĉnom mijeloblastnom leukemijom (76). tumorom prostate (77) i rakom dojke (78). Supresija NF-κB u ovim tumorima inhibiše proliferaciju, izaziva prekid ćelijskog ciklusa, i dovodi do apoptoze (79), što ukazuje na kljuĉnu ulogu NF-κB u ćelijskoj proliferaciji i opstanku. Postoje dva razliĉita puta aktivacije NF-κB: klasiĉni i alternativni put (80). Iako oba puta mogu da utiĉu na razvoj tumora, većina saznanja se odnosi na pro- kancerogene efekte klasiĉnog puta aktivacije. Ovaj put se pokreće od strane bakterijske ili virusne infekcije, kao i pro-inflamatornih citokina (svih koji aktiviraju IKK kompleks). Ovaj kompleks se sastoji od dve katalitiĉke podjedinice, IKK-α (takoĊe poznat kao IKK1) i IKK-β (takoĊe poznat kao IKK2), kao i regulatorne subjedinice, IKK-γ (takoĊe poznat kao NEMO). IKK kompleks fosforiliše IκBs vezane za NF-κB, ĉime ih obeleţava za proteozomalnu degradaciju i oslobaĊanje NF- κB dimera koji se sastoji od RELa (takoĊe poznat kao p65), REL (takoĊe poznat kao Doktorska disertacija Andrej Veljković 28 cREL) i p50 subjedinice da udju u jedro i dovedu do transkripcije ciljnih gena(81) (Slika 4). Ova reakcija u najvećoj meri zavisi od katalitiĉke subjedinice IKK-β, koja vrši IκB fosforilaciju (82). Alternativni put aktivacije NF-κB- ukljuĉuje kinaza NF-κB indukujuće kinaze (NIK) koje aktiviraju IKK-α homodimere, nezavisno od IKK- β- ili IKK γ-dovodeći do fosforilacije i obrade p100, kao odgovor na odreĊene ĉlanove TNF familije(81). Prihvaćena je uloga klasiĉnog NF-κB aktivacionog puta u nastanku akutnog zapaljenja i mehanizmu opstanka malignih ćelija, takoĊe dokazana je i perzistentna aktivacija NF-κB u raznim malignim oboljenjima (83). Slika 4. Klasiĉni i alternativni put aktivacije NF-B Zahvaljujući razliĉitim ciljnim genima, aktivisanim klasiĉnim putem aktivacije, koji ukljuĉuju kodirane medijatore inflamacije, citokine, hemokine, proteaze i inhibitore apoptoze, predloţeno je da klasiĉni put aktivacije NF-B moţe da poveţe inflamaciju, promociju i progresiju tumora (84). Animalne studije o vezi inflamacije i karcinoma jetre i debelog creva daju podršku ovoj hipotezi i objašnjavaju kako upalni proces stimuliše promociju i progresiju tumora (85). 2.3.1 Uloga RVK u TNF-α-NF-κB signalnom putu Osim direktnih toksiĉnih efekata, koji su već navedeni, RVK predstavljaju modulatore signalne transdukcije posredovane TNF-α. Doktorska disertacija Andrej Veljković 29 MeĊu brojnim signalnim molekulima (TNF-α, IL-1β, virusi, mitogeni, lipopolisaharidi) koji aktivišu NF-κB spadaju i agensi koji uzrokuju oksidativni stres. RVK koje nastaju u respiratornom lancu mitohondrija u ulozi sekundarnih glasnika posreduju u aktivaciji NF-B, koju ostvaruje TNF-α. Aktivacija NF-B ostvaruje se prooksidativnim stanjem ćelije i posebno, povećanim sadrţajem H2O2 (86). Jedan od puteva aktivacije NF-B je preko inaktivacije fosfataza oksidativnim stresom, što omogućava fosforilaciju IB i ulazak NF-B u jedro (67). Da aktivnost NF-B zavisi od redoks stanja ćelije, pokazuje studija gde niska koncentracija glutationa dovodi do pozitivne regulacije aktivnosti ovog faktora, a inhibicija njegove aktivacije nastaje pri visokim koncentracijama ovog tiolnog jedinjenja (62). TakoĊe, postoje istraţivanja koja govore u prilog tome da alfa lipoinska kiselina, kao antioksidant inhibira TNF-α indukovanu NF-B aktivaciju inhibirajući aktivaciju IKK (87) (Slika 5). Ovaj antioksidant takoĊe inhibira NF-B transkripcionu aktivnost i blokira ekspresiju gena za MMP-9 onemogućavajući vezivanje ovog faktora za DNK (88). Slika 5. NF-B signalni put Antioksidanti spreĉavaju aktivaciju ovog signalnog puta, delujući kao „scavengeri“ RVK. U tom sluĉaju, fosfataze ostaju aktivne, što onemogućava aktivaciju IKK i oslobaĊanje NF-B iz kompeksa sa inhibitorom. Drugi mogući mehanizam dejstva antioksidanata je onemogućavanje vezivanja ovog transkripcionog Doktorska disertacija Andrej Veljković 30 faktora za NF-B vezujuće mesto u promotoru gena ĉiju transkripciju indukuje. Na ovaj naĉin, antioksidanti uĉestvuju u inhibiciji procesa inflamacije i proliferacije. Iako je nesumnjivo dokazana uloga RVK u TNF-α-NF-κB signalnom putu, pitanje je da li RVK deluju kao sekundarni glasnici u TNF-α posredovanoj aktivaciji NF-B ili TNF- α i RVK deluju sinergistiĉki. 2.3.2 Značaj NF-κB u povezivanju inflamacije i kancerogeneze Brojni su dokazi koji sugerišu da inflamacija dovodi do kancerogeneze (89). Kancerogeneza se moţe podeliti u tri faze: inicijalnu fazu (koja ukljuĉuje stabilne promene genoma), fazu promocije (koja podrazumeva proliferaciju genetski izmenjenih ćelija) i fazu progresije (koja ukljuĉuje povećanje veliĉine tumora, širenje tumora i sticanje dodatnih genetskih promena). Imajući u vidu ove korake, bitno je kako na svaki od njih utiĉe inflamacija i imuni sistem. U principu, inflamacija i imunitet mogu uticati na svaku od ovih faza na razliĉite naĉine, naime inflamacija i uroĊeni imunitet najĉešće vrše pro-kancerogene efekte, a sa steĉenim imunitetom potencijalno imaju antitumorske efekte. Ovi efekti su posredovani kroz razliĉite vrste leukocita, ukljuĉujući i normalne tkivne makrofage, tumor povezane makrofage (TAM), dendritiĉne ćelije (DCS), neutrofile, mast ćelije i T ćelije. Takve ćelije su regrutovane u tumorskoj mikrookolini kroz interakcije sa lokalnim stromalnim ćelijama i malignim ćelijama. Ti leukociti proizvode citokine, faktore rasta i angiogeneze, kao i matriks degradirajuće proteinaze (kao što su matriks metaloproteinaze MMP-1, MMP-3 i MMP-9 i njihovi inhibitori). Ovi proteini omogućavaju tumorskim ćelijama da se umnoţavaju, invadiraju i metastaziraju (69,90). Prema ovom gledištu, inflamatorne ćelije i uroĊeni imuni sistem su vaţni medijatori tumorske promocije i progresije. Nasuprot tome, prema “immunosurveillance” hipotezi Luis Tomas i F. Macfarlane Burnet (91), koji je prvobitno predloţio Paul Erlih 1909. godine, uroĊeni i adaptivni imuni sistem saraĊuju da smanje uĉestalost tumora prepoznavajući tumor-specifiĉne antigena, kao neo-antigene. Iako je “immunosurveillance” hipoteza dobila podršku u nekim eksperimentalnim rezultatima, efekat zapaljenja i / ili uroĊeni imuni sistem aktivišu stimulaciju rasta tumora u većini sluĉajeva (92). Ĉak i T-ćelije koje prepoznaju virusne antigene (na primer za površinski antigen HBV) mogu biti vaţan stimulator Doktorska disertacija Andrej Veljković 31 tumorske progresije (93), kao što B ćelije, koje su se pokazale kao vaţni uĉesnici procesa kancerogeneze odrţavanjem hroniĉne upale koja je neophodna za ovaj proces. Nekoliko pro-inflamatornih citokina i hemokina - kao što su TNF, IL-1, IL-6 i CXC-hemokin ligand 8 (CKSCL8, takoĊe poznat kao IL-8), koji su svi kodirani target genima IKK-β (inhibitor NF-κB (IκB) kinaze-β)-zavise od NF-κB aktivacionog puta ipovezani su sa razvojem tumora kod ljudi i miševa (69). Osim toga, mnogi onkogeni i kancerogeni uzrokuju aktivaciju NF-κB, dok hemikalije sa poznatim hemopreventivnim svojstvima mogu ometati njegovu aktivaciju (94). Taketomi i sar. su dokazali da su aktivisana zapaljenja netumoroznog dela jetre znaĉajan faktor rizika za recidiv kod bolesnika sa hepatocelularnim karcinomom (95). Upala je posredovana adhezionim molekulima, kao što su ICAM-1. U animalnim studijama, Pidgeon i sar. su 1999. godine primetili da je hirurško uklanjanje primarnog tumora ĉesto praćeno brzim rastom ranije “uspavane” metastaze (96). Oni su pretpostavili da je inflamacija odgovorna za ovaj efekat. Kao dokaz, BALB c miševe koji su dobili venoznu injekciju ćelija karcinoma dojke miša, su podvrgnuli hirurškim traumama ili LPS injekciji (intraperitonealno). Kod ovih ţivotinja je došlo do povećanja veliĉine i broja plućnih metastaza pet dana kasnije, u poreĊenju sa anestetisanim kontrolama. Proliferacija ćelija tumora se povećala a nivo apoptoze je smanjen u plućnim metastazama. Cirkulišući nivo angiogenetskih citokina VEGF je povišen u ovim grupama i u korelaciji je sa povećanim nivoima LPS u plazmi. Tretman endotoksinom direktno je povećao produkciju VEGF in vitro uslovima. Ovi podaci ukazuju da endotoksin uveden tokom operacije povećava rast metastaza. Signalizacija NF-κB takoĊe moţe biti presudna u tumorskoj progresiji. Za nekoliko gena koji kodiraju adhezivne molekule, MMP-e, serin proteaze, heparanaze i hemokine a ĉija je ekspresija regulisana od strane NF-κB je dokazano da su od suštinskog znaĉaja za invaziju tumora i razvoj metastaza (90,97). TakoĊe, proizvodnja reaktivnih vrsta azota (RNS) kao odgovor na NF-κB izazvanu povećanu ekspresiju iNOS, bi moglo dovesti do proizvodnje i akumulacije dodatnih DNK mutacija koje dovode do tumorske progresije (98). Makrofazi su vaţni proizvoĊaĉi RNS, mada ne samo proizvoĊaĉi, njihovo prisustvo i funkcionalna aktivnost pogoduju rastu tumorskog tkiva, invaziji i angiogenezi. Doktorska disertacija Andrej Veljković 32 2.3.3 Da li aktivacija NF-κB sprečava kancerogenezu? Moguće je da NF-κB ima razliĉite uloge u razliĉitim ćelijskim tipovima. Sajc i sar. su 1998. godine utvrdili da u ćelijama normalnog epiderma, NF-κB protein postoji u citoplazmi ćelija koje su bazalno lokalizovane, zatim u jedru suprabazalnih ćelija, što ukazuje da NF-κB dovodi do prelaska sa proliferacije na prekid ćelijskog ciklusa i diferencijaciju (99). Funkcionalna blokada NF-κB inhibiše proteine kod transgenih ţivotinja i kod ljudskog epidermalnog hiperplastiĉnog epitela. U skladu sa ovom ĉinjenicom, primena farmakološkog inhibitora NF-κB na intaktnu koţu indukuje epidermalnu hiperplaziju. Nasuprot tome, povećana ekspresija NF-κB subjedinica, aktivisanog p50 i p65 u transgenom epitelu dovodi do hipoplazija i inhibicije rasta. Ovi podaci ukazuju na prostorno ograniĉenu aktivaciju NF-κB u ovom tkivu koja se javlja u stratifikovanom epitelu i ukazuju na to da je aktivacija NF-κB u ovom tkivu, za razliku od njegove uloge u drugim procesima, vaţna za ćelijsku inhibiciju rasta. Dajee i sar. su 2003. godine dokazali da blokada NF-κB aktivira invazivni humani epidermalni tumor (100). Inhibicija NF-κB poboljšava apoptozu kod odreĊenih tumora, kao što blokada NF-κB predisponira animalnu koţu na nastanak planocelularnog karcinoma. Oni su pokazali da u normalnim humanim epidermalnim ćelijama, NF-κB pokreće proces prekida ćelijskog ciklusa. Dakle, ovi izveštaji ukazuju na to da inhibicija NF-κB moţe biti kancerogeni faktor u nekim uslovima. 2.4 Proces apoptoze u patogenezi kolorektalnog karcinoma Kolorektalni karcinom se u većini sluĉajeva, razvija iz već postojećeg adenoma (101). Ova sekvenca se karakteriše akumulacijom molekulski genetskih promena koje izazivaju poremećaje ćelijskog rasta,diferencijacije i apoptoze (102-104). Opšte je mišljenje da balans izmeĊu nivoa ćelijskog rasta i apoptoze odrţava homeostazu epitelnih ćelija creva (105), kao i da tokom razvoja tumora ta ravnoteţa postaje postepeno poremećena (106,107). Promene ćelijske proliferacije su dobro prouĉene u adenom-karcinom sekvenci i generalno je prihvaćeno da se broj proliferisanih ćelija povećava srazmerno teţini displazije (108,109). MeĊutim, manje se zna o promenama u uĉestalosti i regulacije apoptoze tokom razvoja karcinoma debelog creva. Apoptoza ili programirana ćelijska smrt, igra vaţnu ulogu u mnogim fiziološkim i patološkim procesima (110). IzmeĊu ostalog, vaţna funkcija apoptoze je Doktorska disertacija Andrej Veljković 33 otklanjanje oštećenih ćelija. Na primer, ćelije sa genetskim oštećenjem uzrokovanim izlaganjem kancerogenima mogu biti odstranjene apoptozom, ĉime se spreĉava njihova replikacija i akumulacija klonova abnormalne ćelije. Postoji sve više dokaza koji podrţavaju hipotezu da izostanak apoptoze moţe biti vaţan faktor u evoluciji kolorektalnog karcinoma i lošeg odgovora na hemoterapiju i radijacionu terapiju. (111). Apoptoza ili programirana ćelijska smrt predstavlja oblik "samoubistva" ćelija. Znaĉajna je za regulaciju fizioloških i patoloških procesa u organizmu (112). Apoptoza je regulatorni mehanizam tkivne homeostaze, koja zavisi od ravnoteţe izmeĊu proliferacije i smrti ćelije. Organizam je razvio komplikovani kontrolni sistem za balansiranje ravnoteţe izmeĊu ţivota i smrti. U organizmu ĉoveka svake sekunde se stvara nekoliko stotina hiljada ćelija procesom mitoze, a skoro isti broj umire procesom apoptoze u cilju odrţanja homeostaze. Disregulacija apoptotiĉke signalizacije ima znaĉajnu ulogu u patogenezi razliĉitih bolesti. Smanjenje procesa apoptoze vodi u kancer (ćelijska akumulacija), autoimunost (nesposobnost eliminacije autoreaktivnih limfocita), kao i infekciju (nemogućnost eliminacije inficiranih ćelija) (113). Poznato je da apoptozu mogu izazvati: fiziološki aktivatori (TNF, neurotransmiteri-glutamat i N-metil-D-aspartat, nedostatak faktora rasta, kalcijum, glikokortikoidi), aktivatori nastali usled oštećenja (virusna infekcija, bakterijski toksini, oksidansi, slobodni radikali), terapijski agensi (hemioterapeutski lekovi, mikrotalasno i UV zraĉenje) i toksini (etanol, β-amiloid peptid) (114). Delovanjem navedenih faktora ćelija ulazi u proces apoptoze, koja se odvija kroz tri faze: a) faza indukcije, b) faza egzekucije i c) faza degradacije. Iako navedeni faktori razliĉitim mehanizmima iniciraju apoptotiĉni proces, aktivacija kaspaza (cisteinskih proteza) predstavlja centralnu kariku apoptotiĉnog procesa. Do sada je otkriveno oko 14 razliĉitih kaspaza koje su, prema mehanizmu delovanja, podeljene u dve velike grupe. Prvu grupu, ili inicijatorne kaspaze, ĉine cisteinske proteaze sposobne da vrše aktivaciju pojedinih kaspaza, gde spadaju: kaspaza 1, 2, 8, 9, 10 i 12. Drugu grupu ĉine efektorne kaspaze (kaspaza 3, 6, 7 i 14), sposobne da vrše razgradnju brojnih ćelijskih proteina, rezultujući ćelijskom smrću (115). Sve kaspaze se sintetišu u svom inaktivnom obliku (kao prokaspaze), posedujući sopstveni inaktivni domen. Ovaj inaktivni domen, kod inicijatornih kaspaza je nekoliko puta veći, u odnosu na efektorne kaspaze (116). Inicijatorne kaspaze, u svom inaktivnom domenu, sadrţe Doktorska disertacija Andrej Veljković 34 CARD (caspase recruitment) domen (kaspaze 2 i 9) ili DED (death effector) domen (kaspaze 8 i 10). Zahvaljujući ovim domenima, kaspaze mogu da reaguju sa raznim drugim molekulima, koji mogu da regulišu njihovu aktivnost (116). Aktivacija inicijatornih kaspaza, rezultuje daljom aktivacijom efektornih kaspaza, dovodeći do kaskadne aktivacije kaspaza. Postoje dva naĉina aktivacije apoptoze, spoljašnji i unutrašnji put (117) (Slika 6). Spoljašnji put aktivacije apoptoze zapoĉinje aktiviranjem receptora smrti, što dovodi do indukovane ćelijske smrti ili ACID (activation induced cell death). To su površinski receptori koji prenose apoptotiĉke signale nakon vezivanja specifiĉnih liganda. Najznaĉajniji receptori smrti, koji se nalaze na površini ćelije i sposobni su da izazovu ACID su: Fas (CD95), Receptor 1 faktora nekroze tumora (TNF-R1), Car1, DR3 (TRAM), DR4 (TRAIL-R1), DR5 (TRAIL-R2) i DR6. Ligandi, sposobni da aktiviraju navedene receptore, su strukturno veoma sliĉni i pripadaju TNF superfamiliji (117). Svi receptori smrti, u svom intracelularnom segmentu, poseduju domene smrti (DD domeni). Kod CD95 receptora, intracelularni domen smrti je FADD (Fas associated detah domen) (116). Aktivacija CD95 receptora, od strane njegovog liganda (FasL), dovodi do stvaranja DISC kompleksa (dead inducing signaling complex), koji je sposoban da aktivira prokaspazu-8 u kaspazu-8. Stvorena velika koliĉina kaspaze-8, zajedno sa kaspazom-1, aktivira prokaspazu-3, koja potom ulazi u jedro ćelije i indukuje degradacionu fazu apoptoze (115). Ukoliko dodje do aktivacije apoptotiĉnog procesa, preko TNF-R1, dolazi do aktivacije kaspaze-3, ne preko DISC-a, već preko TRADD-a (TNF receptor-associated death domain), u kombinaciji sa FLICE-om (FADD like ICE domen) (118). TakoĊe, neki indukcioni ĉinioci, kao što su stres proteini, oksidativni metaboliti i gramzin B, deluju direktno na prokaspazu-3 i pretvaraju je u aktivni oblik, omogućujući dalji razvitak apoptotiĉnog procesa (119). Ćelije koje imaju kapacitet da indukuju ovaj direktni, kaspaza-zavisni put apoptoze se kvalifikuju kao ćelije tipa 1 (120). Doktorska disertacija Andrej Veljković 35 Slika 6. Spoljašnji i unutrašnji put aktivacije procesa apoptoze Kod ćelija tipa 2, signal koji dolazi sa aktiviranih receptora smrti ne izaziva kaskadnu aktivaciju kaspaza, dovoljno snaţnu za egzekuciju ćelijske smrti. Ovde apoptotiĉki signal mora biti pojaĉan preko mitohondrijalnog puta. Intracelularni ili unutrašnji ĉinioci, u koje spadaju nedostatak citokina, RVK indukovana oštećenja ćelije, dovode do pasivne ćelijske smrti ili ACAD (activated cell autonomous death) (120). Veza izmeĊu signalizacije kaspazama i mitohondrija se ostvaruje preko proteina Bid, ĉlana Bcl-2 familije. Bid se aktivira kaspazom-8, a zatim ulazi u mitohondriju gde deluje kao i Bax i Bak proapoptotiĉki proteini iz Bcl-2 familije proteina. Oni oslobaĊaju citohrom c i druge proapoptotiĉke proteine iz mitohondrije u citozol (121). Citozolarni citohrom c vezuje Apaf-1, koji podleţe konformacionim promenama (oligomerizaciji) i stvara strukturu koja se naziva apoptozom. To je kompleks nalik toĉku odgovoran za aktivaciju inicijatorne kaspaze-9 (122). Aktivirana kaspaza-9 inicira aktivaciju efektornih kaspaza (kaspaze 3, 7 i 6) i time završavaju proces apoptoze. Stvaranjem aktiviranih kaspaza i njihovim ulaskom u jedro ćelije, zapoĉinje degradaciona faza apoptoze. U degradacionoj fazi, kaspaza-3 i druge aktivirane kaspaze, dovode do razgradnje mnogih strukturalnih i drugih proteina unutar ćelije. MeĊutim, mnogi ciljni supstrati ćelije, na koje deluju aktivirane kaspaze i dalje su nepoznati. Najpoznatiji ciljni supstrati jesu: strukturalni proteini (aktin, fodrin, Gas2, Doktorska disertacija Andrej Veljković 36 gelsolin), filamentni proteini (keratin-18, plectin), signalni proteini (Raf-1, Akt-1, D4- GD1, MEKK-1), proteini koji regulišu transkripciju ili DNK replikaciju (MDM2, Rb, SREBP 1/2), kao i proteini koji regulišu DNK i RNK metabolizam (DNK-PK, PARP, DSEB/RF-C140) (122). MeĊu ciljnim proteinima, nalazi se i DNK fragmentacioni faktor (DFF) koji predstavlja heterodimer, koji se sastoji od dve subjedinice: 1) DFF40 ili CAD (kaspazom stimulisana DNaza) i 2) subjedinice DFF45 ili ICAD (inhibitor DN-aze). U fiziološkim uslovima, DFF40 subjedinica je inhibirana DFF45 subjedinicom. Aktivirana kaspaza-3 ili druge aktivne kaspaze, razlaganjem DFF-a osobaĊaju CAD, koja zatim ulazi u jedro i vrši fragmentaciju DNK (Slika 7), što predstavlja jedan od kljuĉnih morfoloških karakteristika apoptotiĉne smrti ćelija (123). Slika 7. Uloga egzekutora apoptoze - CAD (kaspazom stimulisane DNaze) u DNK fragmentaciji 2.4.1 Uloga DNaza u fragmentaciji molekula DNK u procesu apoptoze Krajnji rezultat procesa apoptoze je fragmentacija DNK molekula endonukleazama (DNaze, EC 3.1.4.5), koje vrše razgradnju DNK lanaca na taĉno odreĊenim mestima. Endonukleaze su enzimi koji katalizuju razgradnju meĊu- nukleotidnih veza istovremeno na više mesta unutar molekula nukleinskih kiselina. DN-aze spadaju u klasu hidrolaza i razlaţu kako nativne tako i denaturisane molekule DNK. Poslednjih godina se sve više govori o DNaza-ma kao glavnim egzekutorima apoptoze, odgovornim za internukleozomalnu fragmentaciju DNK ćelije u apoptozi. Doktorska disertacija Andrej Veljković 37 Internukleozomalna fragmentacija DNK molekula je marker apoptoze i predstavlja razlaganje hromozomske DNK na fragmente veliĉine oligonukleozoma (124). Sve DN-aze odgovorne za proces apoptoze mogu se klasifikovati u tri grupe: 1) bikatjonska (Ca 2+ /Mg 2+ zavisna) ili alkalna DNaza (poznata i kao DNaza I), 2) monokatjonska (Mg 2+ zavisna, takoĊe iz klase alkalne Dnaze) ili CAD (kaspaza 3- zavisna DNaza) i 3) kisela (katjon nezavisna DNaza) ili DNaza II (125). Do sada je izolovano i opisano nekoliko alkalnih DNaza (Ca 2+ /Mg 2+ zavisna ili Mg 2+ zavisna ili DNaza I koja se inhibira cinkom ili aktinom), sa optimalnom pH 7,4 ĉije je uĉešće u DNK fragmentaciji poznato. DNaza I hidrolizuje jedan ili oba lanca DNK pri ĉemu nastaju5'-fosfo -tri/tetra oligonukleotidi. U prisustvu Ca2+ i Mg2+ vrši se razlaganje jednog lanca, dok se razlaganje dvolanĉane DNK dešava u prisustvu Mn 2+ . Peitsch i sar. (126) su ukazali na uĉešće ovog enzima u degradaciji hromatina tokom procesa apoptoze. Kod ljudi je identifikovano prisustvo 4 ĉlana familije DNaza I i to: DNaza I i njena tri analoga DNK S1L1, DNK S1L2 i DNK S1L3. Dokazano je da humana DN-aza I sadrţi 2 cisteina (Cys u poloţaju 173 i 209), koji su odgovorni za disulfidne veze i stabilnost molekula. U aktivnom centru se nalaze dva histidina, glutaminska i asparaginska kiselina. Za aktivnost ovog enzima vaţni su i arginin (u poloţaju 41), kao i tirozin (u poloţaju 76), koji omogućavaju kontakt Dnaze I i DNK molekula (127). Identifikovana je i DNaza II, katjon nezavisna, ĉija je optimalna aktivnost na pH 5. DNaza II (EC 3.1.22.1) u kiseloj sredini stvara 3'-oligonukleotide. To je jedna od najranije otkrivenih nukleaza, sa biohemijskim karakteristikama poznatim od 1960. godine (128). Pokazano je da razliĉita tkiva i vrste imaju enzime koji se razlikuju strukturno i po hemijskim osobinama. Razlaganje fosfodiestarske veze se ostvaruje vezivanjem supstrata za aktivni centar enzima u kojem se nalaze ostaci histidina i ne zavisi od prisustva katjona (129). Delovanje DNaze II ostvaruje se kroz tri faze. Inicijalna faza se karakteriše indukcijom višestrukih jednolanĉanih prekida u predelu fosfodiestarske kiĉme. Srednja faza se karakteriše stvaranjem kiselih-rastvorljivih nukleotida i oslobaĊanjem oligonukleotida veliĉine oko 1000 bp ili manje. Terminalna faza se sastoji iz sporijeg, nelinearnog hiperhromnog pomeranja zbog dalje redukcije veliĉine oligonukleotida. Predominantna subćelijska lokalizacija Dnaze II u kiselim lizozomima ukazuje da se ovaj enzim moţe naći i u stanjima nekroze. Doktorska disertacija Andrej Veljković 38 2.4.2 Oksidativni stres kao induktor apoptoze Danas se veruje da mitohondrije predstavljaju jedne od mogućih aktera u mehanizmu aktivacije apoptoze (130). Dobro je poznato da u ćelijama, mitohondrija predstavlja glavno mesto generacije kiseoniĉkih radikala (131). Procenjeno je da od ukupne koliĉine kiseonika, koji uĉestvuje u respiratornom lancu, oko 4% kiseonika ulazi u produkciju superoksidnog anjona. Ostali izvori RVK-a, mogu nastati kao posledica dejstva zraĉenja, citotoksiĉnih hemikalija i pojedinih lekova (132). U fiziološkim uslovima, ćelije poseduju veoma jake antioksidativne mehanizme, koji je mogu zaštititi od štetnog delovanja stvorenih RVK-a. Enzimski deo antioksidativne zaštite (superoksid dizmutaza-SOD, katalaza-Cat i glutation peroksidaza-GPx), obuhvata enzime koji su sposobni da neutrališu O2 · , H2O2 i lipidne perokside, dok neenzimski deo ĉine vitamin E, vitamin C, melatonin, amino-kiseline i peptidi koji sadrţe tiol grupu. Kada prooksidansi nadvladaju zaštitni, antioksidativni kapacitet ćelije, dolazi do povećanja intenziteta oksidativnog stresa. U više modela apoptoze, detektovan je povećan intenzitet oksidativnog stresa, neposredno pre finalne aktivacije kaspaza, u programiranoj ćelijskoj smrti (132). Ovi nalazi su potvrĊeni i ispitivanjima koja su pokazala da aplikacija antioksidanasa, moţe znaĉajno inhibisati apoptozu ćelija, sliĉno kao i pri aplikaciji inhibitora kaspaza. Intenzivna produkcija slobodnih radikala dovodi do aktivacije transkripcionih faktora, kao što je NF-κB, koji su veoma vaţni u apoptozi i inflamaciji (131). Eksperimentalno je dokazano da RVK mogu da aktiviraju proces apoptoze. Dokazano je da veoma reaktivni slobodni radikal azot-monoksid (NO • ) izaziva oštećenje hromatina i DNK (tako povećava stepen mutagenosti), reakcijom sa superoksid anjon radikalom produkuje peroksinitrit koji ima znaĉajniu ulogu u citotoksiĉnim procesima, moţe da izazove inaktivaciju antioksidativnih enzima (Cat, SOD i GPx), a takoĊe moţe da pokrene proces apoptoze aktivacijom kaspaze-3, indukcijom propustljivosti mitohondrijalne membrane (MPT) i aktivacijom Fas receptora smrti (133). Doktorska disertacija Andrej Veljković 39 Slika 8. Uticaj RVK na pokretanje procesa apoptoze Predloţeno je nekoliko mehanizama za indukciju apoptoze od strane RVK-a (Slika 8). Dokazano je da H2O2 vrši atak na mitohondrije i uzrokuje povećanje propustljivosti mitohondrijalne membrane i izlazak citohroma c u citozol. Citohrom c se vezuje za Apaf-1 i postaje vaţan sastavni deo apoptozoma, koji pokreće kaskadnu aktivaciju kaspaze-9, a zatim i kaspaze-3. Jedan od alternativnih puteva je da H2O2 pobuĊuje apoptozu aktivacijom Fas/FasL sistema, ali druge studije govore da je on Fas-nezavisan molekul. Dokazano je da transkripcioni faktori mogu biti modulirani od strane H2O2. Nuklearna translokacija p53 je izazvana H2O2, a sveprisutni transkripcioni faktori NF-kB i AP-1 se aktiviraju takoĊe H2O2 . Jednom aktivisani ovi transkripcioni faktori mogu biti pokretaĉi transkripcije pro-apoptotiĉkih gena (133). 2.4.3 Familije Bcl-2 i Bax proteina u apoptozi Bcl-2 familija predstavlja jednu od najvaţnijih familija proteina u efektornoj fazi apoptoze. U većini sluĉajeva programirane ćelijske smrti Bcl-2 proteini donose odluku da li će ćelija preţiveti ili ući u apoptozu. Bcl-2 proteini se mogu podeliti u pro-i anti- apoptotiĉne ĉlanove (134,135) i oni se razlikuju po nivou ekspresije u tkivima kao i po strukturnim karakteristikama. Anti-apoptotski ĉlanovi porodice Bcl-2 su: Bcl-xl, Mcl1i Bfl -1, dok su pro- apoptotski ĉlanovi Bcl-xs, Bak, Bad, DIVA i Bid. Neki ĉlanovi Bcl-2 familije su Doktorska disertacija Andrej Veljković 40 eksprimirani u celom organizmu (Bcl-2, Bax, BCl-xs), dok je ekspresija drugih ograniĉena na samo jedno ili nekoliko tkiva (Boo, Bok, DIVA) (136). Slika 9. Kristalna struktura Bcl-2 proteina u kompleksu sa Bax proteinom Bcl-2 proteini mogu formirati homo- i hetero-dimere, što moţe znaĉiti da je deo njihove aktivnosti regulisan protein-protein interakcijom (137). Ĉlanovi porodice Bcl-2 se razlikuju po homologiji BH domena. Tri funkcionalno vaţna domena Bcl - 2(BH1, BH2 i BH3) su u neposrednoj blizini i prostorno formiraju izduţeni hidrofobni rascep koji predstavlja vezujuće mesto za druge ĉlanove Bcl-2 familije. Taĉkaste mutacije BH1 i BH2 domena potpuno remete antiapoptotske efekte Bcl-2 i njegovu heterodimerizaciju sa Bax-om (138). BH3 domeni pro-apoptotiĉnih proteina su dovoljni da inaktivišu kapacitet Bcl-2 u inhibiciji apoptoze naglašavajući centralnu ulogu ovog domena u apoptotskom procesu (139). Karboksi-terminalni hidrofobni region funkcioniše kao transmembranski domen. Transmembranski domen ĉesto odluĉuje o lokalizaciji ĉlanova porodice Bcl-2 i veruje se da je ukljuĉen u formiranje kanala od strane Bcl-2 proteina. Kao što je ranije pomenuto, Bcl-2 proteini ne regulišu smrt ćelije iskljuĉivo kroz nivo ekspresije Bcl-2 povezanih agonista i antagonista smrti. Homo - i heterodimeri Bcl-2 se uglavnom lociraju na spoljašnjoj mitohondrijalnoj membrani okrenutoj citozolu, gde mogu da komuniciraju sa citozolnim efektorima poput molekula koji uĉestvuju u signalnoj transdukciji (140). Bax je pro-apoptotiĉni ĉlan Bcl-2 familije. Ĉlanovi ove porodice mogu da promovišu bilo opstanak ćelija, kao u sluĉaju Bc-2 ili smrt ćelije, kao u sluĉaju Bax i Bak. Bax je prvi put identifikovan kao partner za vezivanje Bcl-2 Doktorska disertacija Andrej Veljković 41 imunoprecipitacijom (137). Kasnije se pokazalo da povećana ekspresija Bax moţe da poveća nivo apoptoze ćelija u odgovoru na razne apoptotske stimuluse(141). Fiziološki, Bax igra vaţnu ulogu u razvoju neurona i spermatogenezi. Ţivotinje koje su deficitarne u Bax-u su povećale broj neurona a muške jedinke su sterilne (142). Kod patoloških stanja kao što su srĉana i cerebralna ishemija, povećana ekspresija Bax-a dokazana je u zahvaćenim oblastima tkiva, što implicira uĉešće ovog proteina u promociji apoptoze neurona i kardiomiocita. U nekim sluĉajeva karcinoma debelog creva, pronaĊene su mutacije u kodirajućem genu za Bax, sugerišući da inaktivacija Bax promoviše tumorigenezu omogućavajući ćelijama tumora da budu manje podloţne apoptozi (143). Strukturno, Bax, kao i drugi ĉlanovi Bcl-2 porodice, poseduje tri regiona, poznata kao BH domeni 1-3. Dokazano je da ovi domeni imaju vaţnu regulatornu ulogu u apoptozi. Bax takoĊe sadrţi hidrofobni segment na karboksilnom terminalnom kraju. Kod zdrave ćelije, Bax je dominantno solubilni monomerni protein, pored ĉinjenice da sadrţi C terminalni hidrofobni segment, koji je sekvestriran u sklopu hidrofobnog jezgra (144). Nakon indukcije apoptoze mnoštvom agenasa, znaĉajna frakcija Bax se translocira iz citozola do membranskih frakcija, pogotovo mitohondrijalne membrane. Ovaj proces je ukljuĉen u konformacione promene koje dovode do izlaganja C-terminalnog hidrofobnog domena (145). Delecija pomenutog domena remeti sposobnost mutiranog proteina da translocira u mitohondrije i promoviše ćelijsku smrt (145). Sa druge strane, taĉkaste mutacije eksprimirane u mitohondrijama koje pogaĊaju protein, povećavaju toksiĉnost Bax. Translokacija Bax u mitohondrije je povezana sa oslobaĊanjem citohroma C i gubitkom potencijala mitohondrijalne membrane (146). Ovaj fenomen moţe biti povezan sa tezom da Bax moţe formirati jonske kanale ili pore u mitohondrijalnoj membrani i da moţe modulirati mitohondrijalnu propustljivost vezivanjem za komponente pora, VDAC kanale (147) ili adenin-nukleotid translokaze (148). Citohrom c aktiviše kaspazu 3, vodeći u proteolizu ćelije, dok gubitak potencijala mitohondrijalne membrane dovodi do smanjenja produkcije energije u ćeliji. Pro- apoptotska aktivnost Bax, meĊutim, moţe biti modulirana ko-ekspresijom anti- apoptotskog Bcl-2 koji moţe blokirati translokaciju Bax u mitohondrije tokom apoptoze (149). Ovaj “reostat” ţivota i smrti ćelije je posredovan, barem delimiĉno, konkurentnom dimerizacijom izmeĊu parova Bcl -2 porodice. Zbog toga, nivo ovih Doktorska disertacija Andrej Veljković 42 proteina igra znaĉajnu ulogu u regulaciji ćelijske homeostaze i sposobnosti ćelije da se podvrgne apoptozi pod dejstvom odgovarajućih stimulusa. 2.4.4 Apoptoza u sluzokoži kolona Rast i diferencijacija epitelnih ćelija kolona odvija se kroz razliĉite faze, u zavisnosti od poloţaja odreĊene ćelije u kripti. Matiĉne ćelije, koje se nalaze na dnu kripti, dele se i formiraju ćerke ćelije, koje se ubrzano umnoţavaju i migriraju duţ kripte, diferencirajući u cilindriĉni epitel, peharaste ćelije i enteroendokrine ćelije (150). U normalnoj mukozi kolona proliferativni odeljak je ograniĉen na manje od polovine do dve trećine kripte. Kako se ćelije kreću u gornje segmente, one se diferenciraju, gube sposobnost deljenja, i umiru u roku od nekoliko dana. Do nedavno se pretpostavljalo da se ćelije zatim pasivno izdvajaju u lumen kolona ili mehaniĉki odstranjuju pri prolasku crevnog sadrţaja. Iako to moţe biti sluĉaj za odreĊen broj ćelija, fiziološki glavni mehanizam kojim enterociti odumiru jeste apoptoza (151). Apoptoza epitelnih ćelija debelog creva je jasno dokazana preteţno u gornjem nivou kripti (150,152,153). Stopa apoptoze, raĉunajući prema broju ćelija u procesu apoptoze u svakoj kripti kolona, pribliţna je bilansu stope obnavljanja ćelija što podrţava ideju da je apoptoza odgovorna za homeostazu epitelnih ćelija (152). Na površini lumena, deo apoptotiĉnih ćelija je aktivno istisnut iz epitelnog sloja u lumen, dok su druge ćelije zahvaćene okolnim epitelnim ćelijama ili limfocitima (151). Ovaj obrazac je preteţno posmatran u bazalnim delovima kripti. Povremeni apoptotiĉni dogaĊaji koji su naĊeni u donjim, proliferativnim zonama kripti smatraju se odgovorom na genska oštećenja (154). Morfološka studija sugeriše da u procesu apoptoze epitelnih ćelija, one prolaze kroz “prozorĉiće” u bazalnoj membrani do lamine proprije gde bivaju preuzete od strane makrofaga (155). U kriptama kolona, spontana apoptoza je ĉesta i javlja se u manje ograniĉenim površinama. Samo nekoliko apoptotiĉnih ćelija je viĊeno na dnu kolona kripti, na mestu matiĉnih ćelija. Spontana apoptoza, koja je p53-nezavisna, tumaĉi se kao deo homeostatskih mehanizama matiĉnih ćelija (156). Proces apoptoze je pod strogom kontrolom (programiran) i moţe se aktivirati raznim okidaĉima ćelijske smrti. Neuspeh programirane ćelijske smrti, moţe da dovede do smanjenja normalnog procesa remodeliranja tkiva i do patološke akumulacije ćelija, što dovodi do razvoja hiperplazije i neoplazije (157). Oĉekivano je Doktorska disertacija Andrej Veljković 43 da povećanje proliferativne aktivnosti moţe da aktivira program ćelijske smrti (apoptoze) zbog nedostatka hranljivih materija, faktora rasta ili nedostatka kiseonika kao rezultat neregulisane proliferacije, pod uslovom da su osnovni mehanizmi apoptoze oĉuvani. Ovo takoĊe moţe objasniti zašto rast ranih adenoma traje nekoliko godina, uprkos visokoj proliferativnoj aktivnosti navedenoj u većini izveštaja (158). Povećana proliferaciju ćelija u kriptama kolona predstavlja jedan od najranijih prepoznatljivih znakova razvoja kolorektalnog karcinoma. Dokazano je da je procena proliferacije ćelija tumora najbolji prediktor ponašanja tumora (159) a dokumentovana je u studijama kod pacijenata sa limfomima, karcinomima dojke, ţeluca i sarkomima (160). Proteini koji će omogućiti nastavak ćelijskog ciklusa, kao što su ciklini i proteini koji ograniĉavaju širenje ćelija, ukljuĉujući i P16 i Rb, ĉesto su povećano eksprimirani u primarnim tumorima. Put kontrole ćelijskog ciklusa D-tipom ciklina je najĉešće mutiran u ćelijama tumora (161). Prekid kontrole normalnog ćelijskog ciklusa moţe takoĊe biti u osnovi genetske nestabilnosti koja pokreće evoluciju više malignih tumorskih fenotipova. Normalne ćelije koriste kontrolne taĉke ćelijskog ciklusa kao “fail-safe” mehanizme kako bi se izbeglo nagomilavanje genomskih grešaka tokom ćelijske deobe (162). Baziĉne studije in vivo i in vitro su pokazale da povećanje ćelijske proliferacije, kao manifestacija disregulacije ćelijskog ciklusa moţe biti praćeno sa nekoliko drugih promena u ćelijskoj signalizaciji i da direktno kontroliše napredovanje tumora. Geni sa ulogom u regulaciji ćelijskog ciklusa takoĊe imaju funkciju u regulaciji nekoliko drugih ćelijskih puteva signalizacije (163). Dakle, povećanje nivoa proliferacije se smatra kontinuiranim fenomenom u procesu onkogeneze i tumorske progresije. 2.5 Matriks metaloproteinaze Matriks metaloproteinaze (MMP) su porodica strukturalno i funkcionalno srodnih endoproteinaza koje su u stanju da razgraĊuju većinu komponenti ekstracelularnog matriksa. Ovi enzimi imaju zajedniĉke funkcionalne domene i mehanizame aktiviranja jer zavise od Ca i Zn jona i aktivni su na neutralnom pH. Strukturna organizaciju svih MMP-a predstavljena je pred-peptidnom sekvencom koja Doktorska disertacija Andrej Veljković 44 usmerava njihovo luĉenje u ekstracelularnu sredinu i pro peptidom, domenom koji ih odrţava u njihovom zimogenom obliku (164,165). Matriks metaloproteinaze razgraĊuju sve ekstracelularne komponente i prema supstratu na koji deluju se mogu podeliti na: 1. Kolagenaze 2. Ţelatinaze 3. Stromelizin 4. Matrizilin 5. Membranski tipovi enzima 6. Ostale vrste Dugo se smatralo da je degradacija ekstracelularnog matriksa njihova jedina uloga, meĊutim MMP-ze imaju mnogo drugih uloga u fiziološkim i patološkim procesima. Smatra se da uĉestvuju u oslobaĊanju liganada koji pokreću apoptozu (FasL), ćelijskoj proliferaciji, migraciji, diferencijaciji, angiogenezi, bolestima praćenim inflamacijom, malignim bolestima. (166). 2.5.1 Matriks metaloproteinaza-9 Sopata i Dancewicz su 1974. godine otkrili proteazu iz humanih neutrofila koja vrši degradaciju denaturisanog kolagena (ţelatina) (167). Kasnije su Murphy i sar. (168) identifikovali proteaze koje katalizuju razgradnju ţelatina, kao i kolagena tip IV i V iz kulture koštanog tkiva zeca i humanih neutrofila i nazvali ih metaloproteinaze 90-110 kDa. Konaĉno su Wilhelm i sar. (169) detektovali ţelatinolitiĉku aktivnost simian virusom (SV40) transformisanih humanih fibroblasta i pokazali da je enzim identiĉan onom od 92 kDa koji sekretuju monociti, ćelije fibrosarkoma, alveolarni makrofagi i neutrofili. Ovaj enzim pripada familiji MMP i pokazuje homologiju sa prethodno otkrivenom tip IV kolagenazom od 72 kDa. Oba enzima (72 kDa i 92 kDa) vrše degradaciju nativnog kolagena tipa IV i V i ţelatina. Zbog molekulske mase i specifiĉnosti prema supstratu, ovaj enzim nazvan je 92 kDa tip IV kolagenaza, 92 kDa ţelatinaza, ţelatinaza B, da bi kasnije dobila naziv matriks metaloproteinaza-9 (MMP-9) (170, 171) Doktorska disertacija Andrej Veljković 45 2.5.1.1 Struktura molekula MMP-9 Molekul MMP-9 sastoji se od nekoliko strukturnih domena, kodiranih od strane jednog ili više egzona (Slika 10). Slika 10. Struktura MMP-9 MMP-9 je Zn-zavisna endopeptidaza, koja se sintetiše i luĉi u monomernom obliku kao zimogen. Osnovni oblik proteina sadrţi N – terminalnu sekvencu signala ( " pre" domen ) koji nakon sinteze usmerava molekul ka endoplazmatskom retikulumu . Pre- domen se nastavlja u "pro" domen koji odrţava enzim inaktivnim do raskidanja SH veza izmeĊu njega i katalitiĉkog domena, koji sadrţi cink vezujuće mesto i fibronektinu sliĉan domen. Hinge region vezuje katalitiĉki domen za hemopeksinu sliĉan domen, koji ima vaţnu ulogu u procesu inhibicije enzima jer se njega vezuje inhibitor TIMP. (165). 2.5.1.2 Supstrati MMP-9 Kako je već pomenuto, MMP-9 katalizuje razgradnju denaturisanog kolagena (ţelatina), kolagena tip IV, koji je glavna komponenta bazalne membrane, kolagena tip V, ali i kolagena tip VII, X, XI, XVII i drugih molekula ekstracelularnog matriksa. Studije pokazuju da je aktivnost MMP-9 od suštinskog znaĉaja za regrutovanje osteoklasta u razvoju kostiju (172). Drugi radovi ukazuje da su MMP-9- deficijentni miševi otporni na stvaranje koţnih plikova u buloznom pemfigoidnom modelu. Ovaj efekat se pripisuje nemogućnosti ovih miševa da se oslobode SERPIN a1 – inhibitora Doktorska disertacija Andrej Veljković 46 proteinaza (173) . Konaĉno , novije studije na rip-tag2 transgenim miševima, modelu višestepene kancerogeneze, ukazuju da je MMP- 9 deo angiogenog "prekidaĉa" koji je neophodan za rast tumora (174) . Drugi izveštaji ukazuju da MMP-9 igraju ulogu u procesu inflamacije u nervnom sistemu, aktivnost MMP- 9 je povišena kod encefalomijelitisa (175) , u cerebrospinalnoj teĉnosti obolelih od multiple skleroze ( 176). 2.5.1.3 Inhibitori MMP-9 Tkivni inhibitori metaloproteinaza (TIMP) su polipeptidi molekulske mase 20- 29 kDa, koji formiraju nekovalentne veze i sa latentnim i aktivnim formama enzima i spreĉavaju njihovu aktivaciju. Do sada su otkrivena ĉetiri tkivna inhibitora (TIMP1- 4), koja imaju identiĉne sekvence oko 25% molekula i 12 rezidua cisteina neophodnih za formiranje sekundarne strukture molekula. Dok se MMP-2 sekretuje u kompleksu sa TIMP-2, za MMP-9 se vezuje TIMP-1 (171) (Slika 11). Slika 11. MMP-9 i inhibitor C-terminalni domen TIMP-1 vezuje se za hemopeksinu sliĉan domen MMP-9. Osim TIMP-1, inhibitornu aktivnost na MMP-9 pokazuje i α2-makroglobulin, glikoprotein koji se nalazi u krvnoj plazmi i smatra se glavnim inhibitorom MMP-9 u telesnim teĉnostima. S obzirom na to da se α2-makroglobulin/MMP-9 kompleks uklanja procesom endocitoze, ovaj molekul ima vaţnu ulogu u klirensu MMP i ima ireverzibilno dejstvo, dok TIMP-1 deluje po principu reverzibilne inhibicije (177). Kompleks MMP-9/TIMP-1 Doktorska disertacija Andrej Veljković 47 Osim endogenih, postoje i sintetski inhibitori ovog enzima. Razvoj sintetskih inhibitora MMP9 se oslanja strukturu peptidne sekvence koja, prepoznata od strane odreĊene proteaze, je u stanju da reaguje sa jonom Zn u aktivnom centru.20. Da bi neka supstanca bila efikasan inhibitor MMP-za mora imati: funkcionalnu grupu, karboksilat, tiolat i fosfnil koji su u stanju da heliraju Zn-vezujuće mesto. Zatim, najmanje jednu funkcionalnu grupu koja je u stanju da formira vodoniĉne ili Van der Valsove veze sa enzimskim domenima (178). Dokazano je da te zahteve ispunjavaju razliĉite klase inhibitora MMP, kao što su: marismatat, trokanid, prinomastat itd, otkriveni mnogobrojnim metodama kombinatorne hemije. Prirodni produkti, inhibitori aktivnosti MMP su: tetrtaciklini, neovastat, skvalamin, kurkumin, nikotinamid itd. (179). 2.5.1.4 Regulacija aktivnosti MMP-9 MMP-9 se u fiziološkim uslovima eksprimira samo u trofoblastima, osteoklastima, neutrofilima i makrofagima, dok razliĉiti faktori rasta, citokini, ekstracelularni molekuli, interakcije izmeĊu ćelija, kao i izmeĊu ćelija i adhezionih molekula mogu indukovati ekspresiju gena za MMP-9 i u drugim tipovima ćelija. Aktivnost MMP-9 regulisana je na razliĉitim nivoima: transkripcije, translacije, posttranslacione modifikacije, sekrecije, aktivacije i inhibicije (171). Mnogi citokini i faktori rasta indukuju ekspresiju MMP-9 u razliĉitim tipovima ćelija. Granulocitni hemotaktiĉni protein (GCP-2) iz IL-8 familije indukuje ekspresiju ţelatinaze B u neutrofilima, IL-2 dovodi do povećane ekspresije gena za MMP-9. IL-1, lipopolisaharidi, TGF-β, TNF-α takoĊe deluju na ovaj naĉin (180). MMP-9 nakon sinteze, podleţe i posttranslacionoj modifikaciji, koja se najĉešće dešava u vidu glikozilacije oligosaharidima koji se vezuju za kolagenu V sliĉan domen. Ovaj vid posttranslacione modifikacije štiti enzim od degradacije, stabilizuje ga i utiĉe na konformacione promene odreĊenih domena bitnih za samu interakciju enzima sa svojim supstratima. Drugi vid posttranslacione modifikacije je dimerizacija, bilo da se radi o homodimeru preko cisteinskih rezidua ili heterodimeru MMP-9-lipokalin. MMP-9 kao i drugi proteolitiĉki fermenti sintetisani u obliku neaktivnih proenzima (pro-MMP-9) za svoju aktivnost zahtevaju predhodnu aktivaciju, koja se odvija proteolizom propeptidnog domena ili, ĉešće, kidanjem interakcije izmeĊu SH Doktorska disertacija Andrej Veljković 48 grupe cisteina iz pro domena i cinka iz katalitiĉkog domena, pri ĉemu tiol grupa biva zamenjena molekulom vode, a aktivni centar enzima je dostupan za vezivanje supstrata. Dalje se proces nastavlja autokatalitiĉki, pri ĉemu nastaje aktivna forma enzima, molekulske mase od 82 kDa. U procesu aktivacije uĉestvuju razliĉite proteaze, kao i drugi ĉlanovi MMP familije (MMP-2, MMP-3), koji mogu samostalno aktivisati molekul MMP-9. 2.5.1.5 Uloga MMP-9 u fiziološkim i patološkim procesima Uloge MMP-9 u fiziološkim uslovima su brojne. Ovaj enzim uĉestvuje u procesu implantacije trofoblasta u epitel uterusa, procesu rasta kostiju tj. procesu endohondrijalne osifikacije koji zahteva invaziju krvnih sudova, degradaciju matriksa hrskavice i remodelovanje koštanog matriksa. U procesu resorpcije kosti i degradacije hrskavice uĉestvuju osteoklasti, koji eksprimiraju visok nivo MMP-9 (181). Ovaj enzim ima vaţnu ulogu u procesu angiogeneze omogućavajući migraciju endotelnih ćelija (degradacijom komponenti ekstracelularnog matriksa), stimuliše oslobaĊanje faktora angiogeneze (VEGF) ili smanjuje oslobaĊanje inhibitora angiogeneze (177). MMP-9 eksprimiraju ćelije koje uĉestvuju u inflamaciji, pri ĉemu lokalno dolazi do degradacije bazalne membrane, što olakšava proces ekstravazacije i infiltraciju ognjišta zapaljenja. Ovo je najĉešće posredovano medijatorima inflamacije. Visok nivo MMP-9 moţe se naći i kod pacijenata sa aneurizmom aorte, , bronhiektazijama, buloznim pemfigoidom, policistiĉnom bolešću bubrega, membranoznom nefropatijom, bolestima koštanog sistema (164). Zbog mogućnosti da vrši degradaciju ekstracelularnog matriksa, smatra se da ovaj enzim ima vaţnu ulogu u procesu rasta malignih tumora i metastaziranja. NaĊena je pozitivna korelacija izmeĊu MMP ekspresije i indikatora loše prognoze kod razliĉitih tipova kancera (182). Ekspresija MMP-a je povećana kod više tipova tumora u poreĊenju sa zdravim tkivom. Povećana aktivnost MMP-a moţe biti sekundarni efekat remodelovanja matriksa, odnosno karakteristika rasta tumora. MeĊutim, u sluĉajevima u kojima se povećanje nivoa MMP-a pokazalo kao pokazatelj negativne prognoze, to je više verovatno da će ovi enzimi imati uticaja na tumorsku progresiju; nekoliko Doktorska disertacija Andrej Veljković 49 studija ukazuje na moguću upotrebu MMP-a u budućnosti strategije tretiranja specifiĉnih vrsta karcinoma (182). Mehanizmi ekspresije MMP-a su veoma sloţeni. Transkripcija MMP moţe biti regulisana faktorima rasta, citokinima, i proizvodima onkogena, koji mogu biti osloboĊeni od strane strome ili ćelija samih tumora (178). MMP-e su pojaĉano eksprimirane u mnogim vrstama kanceroznog tkiva i ĉesto nisu produkt ćelija tumora, već ih okolna stroma proizvodi, sugerišući da tumor aktivno interreaguje i komunicira sa okolnom stromom, dovodeći do povećane ekspresije brojnih MMP-a. MMP-e pomaţu u tumorskoj invaziji remodelovanjem okolnog matriksa, i promocijom rasta tumora, gde jedna MMP-a razlaţe odreĊene komponente matriksa i aktivira druge latentne MMP-e. Razliĉite MMP-e su aktivne u razliĉitim fazama razvoja tumora. Kada se razmatraju prognostiĉke implikacije ekspresije MMP-a, od kliniĉkog znaĉaja u prognozi bi bio odgovor domaćina na sam tumor. MMP-e eksprimira sam tumor i takoĊe su vaţne za prouĉavanje prognostiĉkog znaĉaja, jer ekspresija MMP-a je povećana i u snaţnoj korelaciji sa tumorskom invazivnosću i lošom prognozom jaĉajući koncept koji one doprinose razvoju karcinoma u humanoj populaciji (183). Doktorska disertacija Andrej Veljković 50 2.6 METABOLIZAM PURINSKIH NUKLEOTIDA Prouĉavanje metabolizma purinskih nukleotida ukazuje na ogroman znaĉaj ovog procesa za opstanak svake ţive ćelije i za odrţavanje normalne ćelijske homeostaze. Vaţnost ovog metaboliĉkog puta proistiĉe iz brojnih uloga purinskih nukleotida. Purinski nukleotidi predstavljaju prekursore i strukturne elemente nukleinskih kiselina; ulaze u sastav makroenergetskih jedinjenja, energetske hrane ćelija; imaju ulogu kofaktora-aktivne forme vitamina i uĉestvuju u procesu neurotransmisije; omogućavaju delovanje razliĉitih hormona, faktora rasta i citokina u obliku sekundarnih glasnika (cAMP). S obzirom da purinski nukleotidi imaju uĉešće u regulaciji sopstvenog metabolizma (po tipu kompetitivne inhibicije), promene intracelularne koncentracije purinskih nukleotida, mogu biti vaţan pokazatelj biološkog stanja ćelije (184). Metabolizam nukleotida je sloţen, dinamiĉki proces koji podrazumeva sintezu i razgradnju purinskih nukleotida. Proces njihove biosinteze u ćelijama se moţe odvijati na dva naĉina: procesom de novo sinteze purinskih baza (A) i nukleotida; i procesom fosforibozilacije slobodnih purinskih baza i fosforibozil pirofosfata što je poznato kao proces reutilizacije baza ili “purine salvage pathway”(B)(184). Katabolizam purinskih nukleotida je kontinuirani proces u kojem se nukleotidi razlaţu preko nukleozida, purinskih baza, hipoksantina i ksantina do mokraćne kiseline ili alantoina u zavisnosti od biološke vrste (C) (Slika 12). Doktorska disertacija Andrej Veljković 51 Slika 12. Metabolizam purinskih nukleotida U metabolizmu purinskih nukleotida, purinski ciklus predstavlja svojevrstan proces katabolizma i ponovne reutilizacije purinskih baza u odgovarajuće purinske nukleotide (AMP, IMP, GMP). Primarnu ulogu u regulaciji ovog ciklusa imaju enzimi:  5’-nukleotidaza,  AMP-dezaminaza  adenozin dezaminaza  ksantin oksidaza. 2.6.1 5’-nukleotidaza 5’-ribonukleotidfosfohidrolazu-5’-nukleotidazu (5’-NT E.C.3.1.3.5.) je prvi put opisao Reis 1934 godine. Ubraja se u fosfomonoesteraze jer katalizuje hidrolitiĉku razgradnju 5’ monofosfatnih nukleotida (AMP, CMP, GMP, IMP, UMP) i njihovih dezoksi analoga. Doktorska disertacija Andrej Veljković 52 Po hemijskoj strukturi 5’-NT je glikoproteinski dimer sa subjedinicama ĉija molekulska masa varira od 68-72 kD (186), dimerna forma enzima moţe biti homologna ( forma, molekulske mase oko 140 000) i heterologna ( forma, molekulske mase oko 108.000) (186). Nosilac enzimske aktivnosti je  subjedinica. Dimerna struktura enzima se ostvaruje preko cisteina u poloţaju 9 (187)(Slika 13). Slika 13. Struktura 5’-nukleotidaze Na samom enzimu, ĉija nascentna forma sadrţi 574 amino kiseline i ima molekulsku masu od 63 kD, razlikujemo nekoliko domena. Na N-terminalnom kraju nalazi se 26 hidrofobnih amino kiselina, koje imaju ulogu signalnog peptida i koje poseduju 5 potencijalnih vezujućih glikozilacionih mesta. C terminalni kraj nezrelog proteina sadrţi deo od 25 nenaelektrisanih amino kiselina koje su vaţne za vezivanje sa glukozamin fosfatidilinozitolom (GPI), preko serina kao GPI vezujućeg mesta. Tokom postranslacione modifikacije na C terminalnom kraju ostaje 14 amino kiselina, koje se kovalentno vezuju za etanol amin, manozu, inozitol, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu i druge komponente GPI-vezujućih proteina (188). Razdvajanje glikoproteinskog dela od lipidnog, fosfatidilinozitol specifiĉnom fosfolipazom C (187), nesumnjivo je pokazalo da je fosfatidilinozitol vezujući fosfolipid, koji omogućava kontakt sa membranskim strukturama. Od amino kiselina 5’-NT u najvećem procentu sadrţi serin, glicin i glutaminsku kiselinu. Po strukturi je metaloenzim (189). Za normalnu enzimsku aktivnost neophodno je prisustvo ostataka histidina, serina i cisteina (190). Doktorska disertacija Andrej Veljković 53 Najbolji aktivatori su joni metala Mg 2+ , Ca 2+ , Co 2+ i Mn 2+ , a na aktivnost 5’- NT stimulatorno deluju AMP i redukovani koenzim NADH2 (191). 5’-NT je široko rasprostranjen enzim u mnogim tkivima: u jetri, slezini, bubrezima, plućima, mozgu i skeletnim mišićima (192). TakoĊe je dokazana visoka aktivnost na epitelnim ćelijama koţe, mukoze, urogenitalnog trakta, na sinciciotrofoblastu i velikim decidualnim ćelijama placente kao i na endotelnim ćelijama venula i ĉetkastoj strani enterocita jejunuma, ileuma i kolona (193). U poslednjih nekoliko godina izuĉavanje aktivnosti 5’-NT dobija novu dimenziju. Osim enzimske uloge u metabolizmu purina, membranski asocirani proteinski antigen CD73 koji zapravo pokazuje 5’-nukleotidaznu aktivnost, ima vaţnu ulogu u adheziji humanih limfocita za endotelne ćelije (194) kao i u interakciji fibroblasta sa okolnim matriksom (193) i u reakciji sa lamininom i fibronektinom (195). Ulogu 5’-NT kao adhezionog molekula potvrĊuju i ispitivanja Bermana i sar. (196), koji su dokazali da je na epitelnim ćelijama jetre poligonalnog oblika, koje rastu u tesnoj vezi sa okolnim ćelijama, aktivnost membranske 5’-NT velika za razliku od fibroblasta i stelatnih ćelija koje ne stupaju u kontakt sa drugim ćelijama a koje pokazuju visoku aktivnost ovog enzima u citoplazmi. 2.6.2 Adenozin dezaminaza Adenozin dezaminaza (adenozin aminohidrolaza; E.C. 3.5.4.4., ADA) je jedan od kljuĉnih enzima purinskog metabolizma koji katalizuje ireverzibilnu reakciju hidrolitiĉke dezaminacije adenozina i dezoksiadenozina prevodeći ih u inozin i dezoksiinozin uz oslobaĊanje amonijaka (197). To je glikoproteinski enzim koji u svojoj strukturi sadrţi veliki broj kiselih amino kiselina, glukozamin i galaktozamin. optimalni pH za odvijanje enzimske katalize je 6,3 a izoelektriĉna taĉka je na pH 4,8. Enzim je stabilan na pH od 4-10 i na temperaturi od 65 o C za 15 minuta. Ĉuva se na temperaturi od 2-8oC kada je stabilan 6-8 meseci. Aktivatori nisu poznati. Inhibitorno na enzim deluju katjoni Ag 2+ , Hg 2+ i Cu 2+ kao i sulfhidrilni reagensi (p-hloromerkuri-fenilsulfonat). Specifiĉna inhibicija izazvana blokiranjem SH grupa svedoĉi da humana ADA sadrţi esencijalne SH grupe za svoju punu aktivnost. Enzim se takoĊe inhibiše guanidinom, biuretom i guanil Doktorska disertacija Andrej Veljković 54 ureom po tipu kompetitivne inhibicije (198). Coformycin je takoĊe kompetitivni inhibitor enzima sa Ki oko 1x10 -8 M. Metodom gel filtracije izolovane su 4 razliĉite forme ovog enzima. Tri forme su odreĊene kao: velika, intermedijarna i mala. U tkivima velike aktivnosti ovog enzima dominira mala forma (intestinum i slezina) za razliku od tkiva sa manjom aktivnošću (pluća i bubreg) gde je prisutna velika forma (199). Adenozin dezaminaza je široko zastupljena u svim ćelijama i tkivima, kako sisara tako i niţih ţivotinjskih vrsta, što je rezultat dominantnog znaĉaja katalitiĉke reakcije produkcije inozina i hipoksantina kao i njihovog daljeg usmeravanja u katabolizam ili reutilizaciju purinskih nukleotida (200). Velike varijacije u aktivnosti ADA u ćelijama razliĉitih tkiva i organa (201), kao i visoka aktivnost ovog enzima u mladim ćelijama imunog sistema (kortikalni timociti, limfoblasti) (202,203) i tumorskim ćelijama progresivnog rasta (204) ukazuju na znaĉaj ovog enzima u procesu proliferacije. 2.6.3 Ksantin oksidaza Ksantin oksidaza (XO) je flavoprotein koji sadrţi Fe, S i Mo i u visokim koncentracijama se nalazi u endotelnim ćelijama. Postoji u 2 oblika: ksantin dehidrogenaza-XDH i ksantin oksidaza-XO. Dominantan obliku fiziološkim uslovima je XDH. Kada se za reakciju u kojoj se hipoksantin ili ksantin oksiduju do mokraćne kiseline koristi NAD + kao akceptor elektrona u reakciji nastaje NADH (XDH). Ako je akceptor e-molekulski O2 onda nastaje O2. ¯ - XO. U uslovima ishemije dominira XO kao i u uslovima povećanog nivoa oksidativnog stresa. Ksantin dehidrogenaza/oksidaza katalizuju transformaciju hipoksantina u ksantin i mokraćnu kiselinu u kataboliĉkom putu purinskih nukleotida. U normalnim fiziološkim uslovima ovu reakciju katalizuje uglavnom ksantin dehidrogenaza i ona ne produkuje slobodne radikale. MeĊutim, u izmenjenim uslovima favorizovana je ksantin oksidaza koja generiše superoksid anjon radikal i vodonik peroksid (205). U eksperimentima na hepatocitama, Nishinoi sar. (206) su pokazali da hipoksija indukuje povećanu transformaciju ksantin dehidrogenaze u ksantin oksidazu. TakoĊe, ksantin oksidaza u ćelijama aktivira se posredstvom povećane koliĉine slobodnog citozolarnog kalcijuma (207). Pored svih navedenih razloga koji Doktorska disertacija Andrej Veljković 55 idu u prilog povećanom stvaranju slobodnih kiseonikovih radikala, u stanjima hipoksije zbog inhibicije aerobne respiracije moguća je i smanjena produkcija ovih molekula. Naime, postoje podaci da se pod normalnim uslovima, u mitohondrijalnoj oksidativnoj fosforilaciji pribliţno 1 % od ukupnog elektronskog protoka koristi za obrazovanje superoksid anjon radikala (02) koji se u normalnim okolnostima eliminiše superoksid dismutazom (SOD) i glutationom. U akutnoj hipoksiji, zbog inhibicije elektronskog protoka, ova produkcija 02 - je delimiĉno ili u potpunosti inhibirana (208). Ksantin oksidaza je uglavnom eksprimirana u citoplazmi hepatocita, crevnoj sluzokoţi, vaskularnim endotelnim ćelijama i epitelu dojke. Karcinomi debelog creva kod miševa pokazuju znatno niţu aktivnost XO u poreĊenju sa analognim zdravim tkivom, ali do sada, nijedan izveštaj ne opisuje ekspresiju u malignim tumorima debelog creva u humanoj populaciji (199). Proizvodnja RVK posredovana dejstvom XO u kancerogenim tkivima moţe biti izazvana velikim povećanjem formiranja supstrata, koji se javlja sekundarno uz ubrzani metabolizam adenilnih nukleotida tokom progresa karcinoma. Visoka aktivnost XO moţe biti pokušaj da se smanji salvage put aktivnosti purina, koji je od vitalnog znaĉaja za brzu sintezu DNK (207). Razliĉiti rezultati studija o aktivnosti XO mogu biti posledica ispitivanja u razliĉitim vrstama tkiva i pod razliĉitim uslovima. Moţda postoji nekoliko razloga za razlike izmeĊu posmatranih kancerogenih i kontrolnih tkiva. One bi mogli proizaći iz samog procesa kancerogeneze, ali i nekih drugih faktora rizika za nastanak tumora poput zloupotrebe alkohola i duvanskog dima, koji takoĊe mogu uticati na aktivnost XO. Doktorska disertacija Andrej Veljković 56 3 │ Cilj pored dugogodišnjih istraţivanja enzimskih markera, markera proteomike i genomike, markera proliferacije, ćelijskog preţivljavanja, oksidativnog stresa, proteolize, inflamacije i apoptoze u tumorskom tkivu, još uvek nisu ustanovljeni precizni markeri rane dijagnoze, razvoja i progresije kolorektalnog karcinoma, ali i procene njegove agresivnosti i odgovora na terapiju. Ovo istraţivanje bi omogućilo da se proliferativno-apoptotiĉni potencijal malignog procesa sagleda u koordinisanoj vezi sa zdravim tkivom, ili tkivom koje samo makroskopski izgleda zdravo. Istraţivanje bi omogućilo da se ukaţe na mogućnost invazije tumora, tj da se ustanovi u kom pravcu adaptabilna sposobnost tkiva više progredira: ka aktivaciji proliferacije i preţivljavanja ili inhibicije apoptoze, što moţe biti od znaĉaja pri odreĊivanju margina pri operativnom uklanjanju tumora. Imajući u vidu da terapijska efikasnost nije ista kod svih bolesnika, vaţno je utvrditi potencijalne biomarkere koji bi mogli predvideti kvalitet terapijskog odgovora, ali i odabir odgovarajuće terapije. Cilj ovog istraţivanja je: 1. Ispitivanje parametara oksidativnog stresa u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona ali i tkivo koje okruţuje tumor. U tu svrhu, kao parametar oksidativne modifikacije lipida odreĊivana je koncentracija TBA-reagujućih supstanci (TBARS), kao parametar oksidativne modifikacije proteina odreĊivana je koncentracija AOPP, a kao parametar antioksidativne zaštite odreĊivana je aktivnost enzima katalaze. 2. Ispitivanje kvantitativne ekspresije NF-B u tumorskom tkivu kao transkripcionog faktora ukljuĉenog u regulaciju gena koji utiĉu na nivo apoptoze i proliferacije. 3. Ispitivanje stepena apoptoze u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona i okolno zdravo tkivo, izraţeno kroz kvantitativnu ekspresiju Bcl-2 i Bax proteina, kao i aktivnost alkalne i kisele DNaze. I Doktorska disertacija Andrej Veljković 57 4. Ispitivanje markera proliferacije i neovaskularizacije u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona i tkivo koje okruţuje tumor, izraţeno kroz produkciju MMP-9 i aktivnost enzima purinskog metabolizma (adenozin dezaminaza, 5´nukleotidaza i ksantin oksidaza) Doktorska disertacija Andrej Veljković 58 4 │ Ispitanici i metode spitivanje je organizovano po metodu prospektivne komparativne studije. Za istraţivanje je korišćen biološki materijal (uzorci malignog i zdravog tkiva) pacijenata sa kolorektalnim karcinomom. Istraţivanje je obavljeno na Institutu za biohemiju i Laboratoriji za funkcionalnu genomiku i proteomiku Nauĉnoistraţivaĉkog centra za biomedicinu, Medicinskog fakulteta u Nišu, kao i na Klinici za hirurgiju Kliniĉkog Centra u Nišu. Svi ispitanici su pre ukljuĉivanja u istraţivanje bili informisani o ciljevima istraţivanja i potpisali informisani pristanak za uĉešće u istraţivanju. Etiĉki komitet Medicinskog fakulteta u Nišu dao je saglasnost za sprovoĊenje ovog istraţivanja (rešenje broj 01-1591/8). 4.1 Ispitanici Ispitanike ĉini 50 pacijenata oba pola obolelih od kolorektalnog karcinoma, koji nisu primali nikakav vid terapije pre hirurške resekcije, obavljene iskljuĉivo u terapijske svrhe. Pacijenti su operisani na Klinici za hirurgiju Kliniĉkog Centra u Nišu, u periodu od aprila 2008. godine do juna 2009. godine. Pacijentima je nakon operacije sa odstranjenog dela debelog creva uziman uzorak tumorskog tkiva i to sa ne-nekrotiĉne, proliferativno aktivne regije, zatim makroskopski zdravog tkiva neposredno uz tumor, kao i minimum 10 cm udaljenog proksimalnog zdravog tkiva kolona. Kod svih pacijenata je Ph nalaz potvrdio postojanje adenokarcinoma, pacijenti sa drugim tipovima tumora su iskljuĉeni iz studije. Kriterijumi za iskljuĉenje iz studije su bili: trudnoća, drugi maligniteti, inoperabilnost, prethodna hemoterapija. MeĊu pacijentima je bilo 33 muškarca i 17 ţena, starosti od 39 do 74 godine (srednja vrednost 56,5 godina), operisanih na Klinici za hirurgiju, Kliniĉkog Centra u Nišu. I Doktorska disertacija Andrej Veljković 59 Pacijenti su biti podeljeni u 4 kliniĉke grupe u skladu sa TNM klasifikacijom i klasifikacijom po Djuks-u, u zavisnosti od stepena lokalne proširenosti tumorskog tkiva kroz slojeve zida creva, zahvaćenosti limfnih ĉvorova, kao i prisustva udaljenih metastaza. MeĊu pacijentima je bilo 3 pacijenta sa stadijumom T1, 11 pacijenata sa stadijumom T2, 33 pacijenta sa stadijumom T3 i 3 pacijenta sa stadijumom T4. Tabela 1. Stadijumi tumora (TNM klasifikacija) Stadijum tumora Pol m ž Starost (srednja vrednost) T1 2 1 50.5 T2 8 3 52.5 T3 20 13 63 T4 3 0 61.5 Ukupno 33 17 56.5 4.2 Metode Uzimana tkiva su višestruko ispirana u hladnom izotoniĉnom rastvoru NaCl, u cilju odstranjivanja krvi i ostataka fecesa, zatim je mukoza zdravog tkiva odvojena od ostalih slojeva tkiva kolona. Tkivo je, neposredno nakon uzorkovanja i ispiranja, zamrzavano na -20C do homogenizacije. Pripremani su 10% homogenati u destlovanoj vodi, koji su se koristili za analize, uz pomoć homogenizatora (IKA® Works de Brasil Ltda Taquara, RJ 22713-00). Homogenati (10% w/v) su centrifugiranini na 1500 x g, 10 minuta na 4 o C. Doktorska disertacija Andrej Veljković 60 4.2.1 OdreĎivanje koncentracije produkata lipidne peroksidacije (TBARS) u homogenatu Koncentracija TBARS u tkivu, odreĊivana je spektrofotometrijskom metodom po Andreevoj i sar. (209), koja bazira na reakciji MDA sa tiobarbiturnom kiselinom, na visokoj temperaturi i kiseloj sredini, pri ĉemu nastaje hromogen (MDA-TBA2), a intenzitet boje ĉita na 532nm. Koncentracija TBARS izraĉunava se korišćenjem molarnog ekstinkcionog koeficijena koji iznosi 1,54x 105M -1 cm -1 i izraţava u μmol/l. 4.2.2 OdreĎivanje koncentracije uznapredovalih produkata oksidacije proteina (AOPP) u homogenatu Koncentracija AOPP u tkivu odreĊivanaje spektrofotometrijskom metodom po Vitku i sar. (210), koja bazira na reakciji AOPP sa kalijum-jodidom u kiseloj sredini. Intenzitet boje se ĉita na 340 nm. Koncentracija se izraţava u μmol/mg hloramina T. 4.2.3 OdreĎivanje aktivnosti katalaze Aktivnost katalaze u plazmi odreĊivana je spektrofotometrijskom metodom po Gothu (211), koja se zasniva na sposobnosti katalaze da razlaţe supstrat (H2O2), pri ĉemu se enzimska reakcija stopira dodatkom amonijum molibdata, a nastali ţuti kompleks H2O2 i molibdata meri na 405 nm prema slepoj probi. Aktivnost enzima izraţena je u katalitiĉkim jedinicama na litar seruma (kU/L). 4.2.4 OdreĎivanje kvantitativne ekspresije NF-B, BCL-2 i Bax Kvantitativna ekspresija NF-κB, BCL-2 i Bax proteina, odreĊivana je metodom indirektne imunofluorescence, primarnim i sekundarnim FITC obeleţenim antitelima, proizvoĊaĉa Santa Cruz Biotechnology, u skladu sa metodom po Hafir Ahmedu, koja predstavlja ELISA standardni imunoabsorbentni esej (212, 213). Homogenati su stavljani u odgovarajuće velove zajedno sa bikarbonatnim puferom pH 9,6. Nakon toga su ispirani tri puta, a zatim inkubirani sa anti–NF-κB primarnim antitelom (p65 C-20: sc-372 epitope mapping at the C-terminus of NF-κB p65), isprani 3 puta, i inkubirani sa FITC-konjugovanim sekundarnim antitelima. Srednji intenzitet fluoresecence je odreĊivan i analiziran na Victor™ multiplate reader (Perkin Doktorska disertacija Andrej Veljković 61 Elmer-Wallace, Wellesley, MA). Rezultati su prikazani kao procentualna promena u odnosu na zdravo tkivo kolona, pri ĉemu je svaki uzorak imao svoju kontrolu (tkivo koje je tretirano sekundarnim antitelima) ĉije su vrednosti fluorescence oduzimane od analize a zatim izraţene na mg proteina. 4.2.5 OdreĎivanje aktivnosti alkalne i kisele DNaze Aktivnost DNaze (alkalne i kisele) odreĊivana je po metodi Bartholeynesa i sar. (214), pri ĉemu se kao supstrat koristila DNK, i koja se zasniva na merenju kiselih rastvorljivih nukleotida ĉija se ekstinkcija ĉita na 260 nm u UV spektru. Aktivnost alkalne DN-aze odreĊivanaje pri optimalnoj pH 7,8 uz korišćenje tris-HCl pufera, uz dodatak aktivatora jona Mg 2+ , a aktivnost kisele DNaze uz korišćenje acetatnog pufera pH 5,0. Aktivnost DNaze izraţavanaje u U/mg proteina. 4.2.6 OdreĎivanje aktivnosti MMP-9 Aktivnost MMP-9 u homogenatu merena je sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) metodom, prema uputstvu proizvoĊaĉa, (SensoLyte PlusTM 520 MMP-9 assay system (AnaSpec, San jose, CA, USA). U odgovarajuće velove koji sadrţe MMP-9 antitela dodato je 100 µL homogenata koji sadrţi MMP-9 i 100 µL standarda (razliĉitih koncentracija), a nakon toga je u sve velove dodato 100 µL aktivatora pro MMP-9. Nakon inkubacije velovi su isprani uz pomoć odgovarajućeg pufera 4 puta i u sve dodato 100 µL 5-FAM/QXL™ peptide 520 supstrata. Nakon 60 minuta, aktivnost MMP-9 je odreĊena na osnovu promene intenziteta fluorescence na ekscitaciji od 490 nm/emisija na 520 nm. Aktivnost enzima odreĊivana je uz pomoć standardne krive i izraţena u ng/mg. Senzitivnost testa iznosi 0,6 ng/mg. Minimalna detektabilna doza (MDD) manja je od 0,156 ng/mg. Prema uputstvu proizvoĊaĉa, ne postoji znaĉajna ukrštena reaktivnost ili interferencija sa drugim proteinima. Doktorska disertacija Andrej Veljković 62 4.2.7 OdreĎivanje aktivnosti adenozin dezaminaze Aktivnost adenozin dezaminaze odreĊivana je metodom po Pedersonu i Beriju (215), modifikovanoj u odnosu na odreĊivanje koliĉine amonijaka sa rastvorom salicilat-nitroprusid po metodi Lauber-a (216). Aktivnost enzima je izraţena u U/g proteina. 4.2.8 OdreĎivanje aktivnosti 5´nukleotidaze Aktivnosti 5´nukleotidaze odreĊivana je po metodi Wood i Wiliamsa (217), pri ĉemu se kao supstrat koristi AMP, pri optimalnom pH 7,5 uz korišćenje barbituratnog-HCL pufera. Aktivnost 5´nukleotidaze je izraţena kao IJ/mg proteina. 4.2.9 OdreĎivanje aktivnosti ksantin oksidaze Specifiĉna aktivnost ksantin oksidaze odredjivana je spektrofotometrijski po metodi Hashimoto i sar. (218). Aktivnost XO je izraţena u U/mg proteina 4.2.10 OdreĎivanje količine proteina Koliĉina ukupnih proteina u tkivima, odreĊivana je metodom po Lowry-u (219), sa bovinim serum albuminom kao standardom. 4.3 Statistiĉka obrada podataka Vrednosti parametara izraţene su kao srednja vrednost ± standardna devijacija. Statistiĉka znaĉajnost razlika vrednosti izmeĊu tumorskog, zdravog i okolnog tkiva odreĊivana je studentovim t-testom za dva nezavisna uzorka, dok je za statistiĉku znaĉajnost izmeĊu pacijenata po stadijumima oboljenja korišten ANOVA test. Vrednost p<0,05 je smatrana statistiĉki znaĉajnom. Statistiĉka obrada rezultata uraĊena je primenom kompjuterskog programa SPSS verzija 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Doktorska disertacija Andrej Veljković 63 5 │ Rezultati ezultati ispitivanja parametara apoptoze, parametara oksidativnog stresa i proliferacije, ukljuĉujući metabolizam purina i aktivnost MMP-9 kod pacijenata sa kolorektalnim karcinomom prikazani su grafiĉki. 5.1 Koncentracija TBARS u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Koncentracija TBARS u homogenatu tumorskog tkiva (12,43±9,39 nmol/mg) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na vrednost u zdravom tkivu kolona (7,25 ± 5,52 nmol/mg). Tkivo koje okruţuje tumor (11,57 ± 5,56 nmol/mg) ima znaĉajno veći nivo TBARS (p0,001) u odnosu na zdravo tkivo kolona (7,25 ± 5,52 nmol/mg). Tkivo koje okruţuje tumor ima manju koncentraciju TBARS u odnosu na tumorsko tkivo ali ta razlika nije bila statistiĉki znacajna (Grafikon 1). Grafikon 1. Koncentracija TBARS u tumorskom tkivu, okolnom i zdravom tkivu kolona. * p<0,001 prema zdravom tkivu 0 5 10 15 20 25 n m o l/ m g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * * R Doktorska disertacija Andrej Veljković 64 Koncentracija TBARS u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 2. Koncentracija TBARS u homogenatu tumorskog tkiva pacijenata sa stadijumom T4 (30,48 ± 7,81 nmol/mg) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na vrednost u stadijumima T1 (4,11 ± 0,87 nmol/mg), T2 (7,99 ± 4,26 nmol/mg), i u odnosu na stadijum T3 (p0,05), (12,67 ± 8,87 nmol/mg) (Grafikon 2). Grafikon 2. Koncentracija TBARS u tumorskom tkivu, u odnosu na stadijum tumora. * p<0,001 prema T1 i T2, **p<0,05 prema T3 5.2 Koncentracija AOPP u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Koncentracija AOPP u homogenatu tumorskog tkiva (3,63 ± 2,29 µmol/mg) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na vrednost u zdravom tkivu kolona (1,75 ± 0,92 µmol/mg). Tkivo koje okruţuje tumor (2,37 ± 1,56 µmol/mg) ima znaĉajno veći nivo AOPP (p0,01) u odnosu na zdravo tkivo kolona (1,75 ± 0,92 µmol/mg) (Grafikon 3). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 n m o /m g T1 T2 T3 T4 ** * Doktorska disertacija Andrej Veljković 65 Grafikon 3. Koncentracija AOPP u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona. * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu; ** p<0,01 okolno tkivo prema zdravom tkivu Koncentracija AOPP u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 4. Koncentracija AOPP u homogenatu tumorskog tkiva pacijenata sa stadijumom T2 (5,34 ± 2,26 µmol/mg) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na vrednost u stadijumu T1 (2,6 ± 0,87 µmol/mg) (Grafikon 4). Grafikon 4. Koncentracija AOPP u tumorskom tkivu, u odnosu na stadijum tumora. * p<0,001 prema T1,T3,T4 0 1 2 3 4 5 6 7 µ m o l/ m g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo ** * 0 1 2 3 4 5 6 7 8 µ m o /m g T1 T2 T3 T4 * Doktorska disertacija Andrej Veljković 66 5.3 Aktivnost katalaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Aktivnost katalaze u homogenatu tumorskog tkiva (2,62 ± 2,29 µmol/mg) statistiĉki je znaĉajno niţa (p0,001) u odnosu na aktivnost u zdravom tkivu kolona (4,21 ± 0,92 µmol/mg). Tkivo koje okruţuje tumor (3,51 ± 1,53 µmol/mg) ima manju aktivnost u odnosu na zdravo tkivo kolona (4,21 ± 0,92 µmol/mg), ali bez statistiĉke znaĉajnosti (Grafikon 5). Grafikon 5. Aktivnost katalaze u tumorskom tkivu, okolnom i zdravom tkivu kolona. * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu Aktivnost katalaze u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 6. Najmanju aktivnost imaju pacijenti sa T2 stadijumom tumora ali bez statistiĉke znaĉajnosti. Grafikon 6. Aktivnost katalaze u tumorskom tkivu, u odnosu na stadijum tumora 0 1 2 3 4 5 6 µ m o l/ m g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * 0 1 2 3 4 5 6 7 µ m o l/ m g T1 T2 T3 T4 Doktorska disertacija Andrej Veljković 67 5.4 Kvantitativna ekspresija NF-κB u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Kvantitativna ekspresija NF-κB u homogenatu tumorskog tkiva (180,3 ± 86,4%) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na kvantitativnu ekspresiju u zdravom tkivu kolona (100 %). Tkivo koje okruţuje tumor (118,2 ± 67,6%) ima statistiĉki znaĉajno višu kvantitativnu ekspresiju (p0,01) u odnosu na zdravo tkivo kolona (100 %) ( Grafikon 7). Grafikon 7. Kvantitativna ekspresija NF-kB u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona . * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu; ** p<0,01 okolno tkivo prema zdravom tkivu Kvantitativna ekspresija NF-κB u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 8. Kvantitativna ekspresija NF-κB u homogenatu tumorskog tkiva stadijuma T4 (230,3 %) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na kvantitativnu ekspresiju u zdravom tkivu kolona (100 %), i stadijumima tumora T1(146,3 %), T2(159,2 %), T3(152,3 %). T1, T2, T3 stadijumi tumora imaju višu kvantitativnu ekspresiju u odnosu na zdravo tkivo kolona, ali bez statistiĉke znaĉanosti (Grafikon 8). 0 50 100 150 200 250 300 % Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * ** Doktorska disertacija Andrej Veljković 68 Grafikon 8. Kvantitativna ekspresija NF-κB u tumorskom tkivu u odnosu na stadijum tumora. * p<0,001 T4 prema zdravom tkivu, T3, T2, T1 5.5 Kvantitativna ekspresija Bcl-2 u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Kvantitativna ekspresija Bcl-2 u homogenatu tumorskog tkiva (165,3 ± 76,6 %) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na kvantitativnu ekspresiju u zdravom tkivu kolona (100 %). Tkivo koje okruţuje tumor (118,3 ± 65,4 %) ima statistiĉki znaĉajno višu kvantitativnu ekspresiju (p0,01) u odnosu na zdravo tkivo kolona (100 %) ( Grafikon 9). Grafikon 9. Kvantitativna ekspresija Bcl-2 u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona . * p<0,001 tumor prema zdravo tkivo; ** p<0,01 okolno tkivo prema zdravom tkivu 0 50 100 150 200 250 300 % Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * ** 0 50 100 150 200 250 Zdravo tkivo T1 T2 T3 T4 % * Doktorska disertacija Andrej Veljković 69 Kvantitativna ekspresija Bcl-2 u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 10. Ne postoji statistiĉki znaĉajna razlika u odnosu na stadijume tumora. Grafikon 10. Kvantitativna ekspresija Bcl-2 u tumorskom tkivu u odnosu na stadijum tumora. 5.6 Kvantitativna ekspresija Bax u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Kvantitativna ekspresija Bax proteinau homogenatu tumorskog tkiva (64,3 ± 56,6 %) statistiĉki je znaĉajno niţa (p0,001) u odnosu na kvantitativnu ekspresijuu zdravom tkivu kolona (100 %). Tkivo koje okruţuje tumor (80,05 ± 67,4 %) ima statistiĉki znaĉajno niţu kvantitativnu ekspresiju (p0,01) u odnosu na zdravo tkivo kolona (100 %) ( Grafikon 11). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 % Zdravo tkivo T1 T2 T3 T4 * Doktorska disertacija Andrej Veljković 70 Grafikon 11. Kvantitativna ekspresija Bax proteina u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona . * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu; ** p<0,01 okolno tkivo prema zdravom tkivu Kvantitativna ekspresija Bax u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 12. Ne postoji statistiĉki znaĉajna razlika u odnosu na stadijume tumora. Grafikon 12. Kvantitativna ekspresija Bax proteina u tumorskom tkivu u odnosu na stadijum tumora 5.7 Aktivnost alkalne DNaze (DNaze I) u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Aktivnost alkalne DNaze u homogenatu tumorskog tkiva (1,62 ± 2,1 U/g) statistiĉki je znaĉajno niţa (p0,001) u odnosu na aktivnost u zdravom tkivu kolona 0 20 40 60 80 100 120 140 160 % Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo ** * 0 20 40 60 80 100 120 % Zdravo tkivo T1 T2 T3 T4 Doktorska disertacija Andrej Veljković 71 (4,2 ± 1,42 U/g). Tkivo koje okruţuje tumor (2,62 ± 1,85 U/g) ima statistiĉki znaĉajno niţu aktivnost (p0,001) u odnosu na zdravo tkivo kolona (4,2 ± 1,42 U/g) (Grafikon 13). Grafikon 13. Aktivnost alkalne DNaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona * p<0,001 prema zdravom tkivu Aktivnost alkalne DNaze u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 14. Najveću aktivnost imaju uzorci tumora T4 stadijuma, ali bez statistiĉke znaĉajnosti. Grafikon 14. Aktivnost alkalne DNaze u tumorskom tkivu u odnosu na stadijum tumora 0 1 2 3 4 5 6 U /g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * 0 1 2 3 4 5 6 U /g T1 T2 T3 T4 * Doktorska disertacija Andrej Veljković 72 5.8 Aktivnost kisele DNaze (Dnaze II) u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Aktivnost kisele DNaze u homogenatu tumorskog tkiva (1,82 ± 2,1 U/g) statistiĉki je znaĉajno niţa (p0,001) u odnosu na aktivnost u zdravom tkivu kolona (3,2 ± 1,52 U/g). Tkivo koje okruţuje tumor (2,42 ± 1,75 U/g) ima statistiĉki znaĉajno niţu aktivnost (p0,001) u odnosu na zdravo tkivo kolona (3,2 ± 1,52 U/g) (Grafikon 15). Grafikon 15. Aktivnost kisele DNaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona . * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu; p<0,01 okolno prema zdravom tkivu Aktivnost kisele DNaze u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 16. Ne postoji statistiĉka znaĉajnost izmeĊu stadijuma tumora. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 U /g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo ** * Doktorska disertacija Andrej Veljković 73 Grafikon 16. Aktivnost kisele Dnaze u tumorskom tkivu u odnosu na stadijum tumora 5.9 Aktivnost MMP-9 u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Aktivnost MMP-9 u homogenatu tumorskog tkiva (80,2 ± 64,3 ng/mg) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na aktivnostu zdravom tkivu kolona (6,21 ± 0,98 ng/mg). Tkivo koje okruţuje tumor (14,6 ± 10,1 ng/mg) ima statistiĉki znaĉajno veću aktivnost u odnosu na zdravo tkivo kolona (6,21 ± 0,98 ng/mg) (Grafikon 17). Grafikon 17. Aktivnost MMP-9 u tumorskom tkivu, okolnom i zdravom tkivu kolona. * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu** p<0,01 okolno tkivo prema zdravom tkivu 0 1 2 3 4 5 6 U /g T1 T2 T3 T4 0 20 40 60 80 100 120 140 160 n g /m g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * ** Doktorska disertacija Andrej Veljković 74 Aktivnost MMP-9 u homogenatu tumorskog tkiva u odnosu na stadijum tumora prikazana je na Grafikonu 18. Grafikon 18. Aktivnost MMP-9 u tumorskom tkivuu zavisnosti od stadijuma tumora * p<0,001 prema T1, T3, T4; # p<0,001 prema T1, T4 Aktivnost MMP-9 u homogenatu tumorskog tkiva stadijuma T2 statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na aktivnost MMP-9 u stadijumima T1, T3 i T4. Stadijum T3 ima statistiĉki znaĉajno veću aktivnost MMP-9 (p0,001) u odnosu na stadijume T1 i T4 (Grafikon 18). 5.10 Aktivnost adenozin dezaminaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Aktivnost adenozin dezaminaze u homogenatu tumorskog tkiva (24.42 ± 16.31 U/g) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na aktivnost u zdravom tkivu kolona (11,32 ± 4.49 U/g). Tkivo koje okruţuje tumor (25,38 ± 15,22 U/g) ima statistiĉki znaĉajno višu aktivnost (p0,001) u odnosu na zdravo tkivo kolona (11,32 ± 4,49 U/g) (Grafikon 19). 0 50 100 150 200 250 300 n g /m g T1 T2 T3 T4 * # Doktorska disertacija Andrej Veljković 75 Grafikon 19. Aktivnost adenozin dezaminaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona. * p<0,001 prema zdravom tkivu 5.11 Aktivnost 5´nukleotidaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Ne postoji statistiĉki znaĉajna razlika u aktivnosti 5´nukleotidaze u homogenatu tumorskog tkiva (38,45±12,6) u odnosu na zdravo tkivo kolona (35,89±15,84) i tkivo koje okruţuje tumor (40,64±9,54). (Grafikon 20). Grafikon 20. Aktivnost 5´nukleotidaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 U /g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo * * 0 10 20 30 40 50 60 IJ /g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo Doktorska disertacija Andrej Veljković 76 5.12 Aktivnost ksantin oksidaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona Aktivnost ksantin oksidaze u homogenatu tumorskog tkiva (8,22 ± 1,31 IJ/g) statistiĉki je znaĉajno viša (p0,001) u odnosu na aktivnost u zdravom tkivu kolona (2,92 ± 1,92 IJ/g), kao i na tkivo koje okruţuje tumor (p0,01) (3,6 ± 1,22 IJ/g) (Grafikon 21). Grafikon 21. Aktivnost ksantin oksidaze u tumorskom, okolnom i zdravom tkivu kolona . * p<0,001 tumor prema zdravom tkivu; # p<0,001 tumor prema okolnom tkivu 0 2 4 6 8 10 12 IJ /g Tumor Okolno tkivo Zdravo tkivo # * Doktorska disertacija Andrej Veljković 77 6 │ Diskusija 6.1 Intenzitet oksidativnog stresa u kolorektalnom karcinomu nicijalni dogaĊaj odgovoran za transformaciju normalne ćelije sluzokoţe kolona u neoplastiĉnu ćeliju još uvek nije u potpunosti razjašnjen. Hipermetilacija regiona promotora gena (ĉime se blokira transkripcija) i oksidativno oštećenje nuklearne DNK (oksidativni stres) su dva glavna mehanizama koji su povezani sa poĉetnim fazama kolorektalne kancerogeneze (220,221). Razvoj kolorektalnog karcinoma je povezan i sa navikama u ishrani. Poznato je da naĉin ishrane utiĉe na povećan nivo oksidativnog stresa, a epidemiološki studije pokazuju da crveno meso, masti i konzumiranje alkohola znatno povećavaju rizik nastanka ove bolesti, a redovno konzumiranje povrća i vlakana ĉini da se smanji rizik (220,222). Razvoj tumora je višestepen proces i sastoji se od najmanje tri faze: inicijacije, promocije i progresije. Oksidativni stres je u interakciji sa sve tri faze ovog procesa. Tokom faze inicijacije RVK mogu dovesti do oštećenja DNK mutacijom gena i strukturnim izmenama na DNK. U fazi promocije RVK mogu dovesti do poremećene ekspresije gena, blokade komunikacije izmeĊu ćelija i modifikacije sistema sekundarnih glasnika, što ima za rezultat povećanje ćelijske proliferacije ili smanjenje nivoa apoptoze kod ćelija koje su već prošle proces inicijacije. Konaĉno, oksidativni stres takoĊe moţe uĉestvovati u progresiji tumora dodavanjem dodatnih mutacija DNK tumorskim ćelijama (221). Dakle, povećano stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika u crevnom lumenu i kontinuirana izloţenost sluznice dejstvu slobodnih radikala promoviše oksidativno oštećenje DNK epitelnih ćelija, ĉime se aktivira pojava genskih mutacija (221). Kada te mutacije oštete gene odgovorne za kontrolu ćelijskog ciklusa ili sistema popravke DNK ćelija, klonovi ćelije sa proliferativnom autonomijom predstavljaju poĉetni mehanizam I Doktorska disertacija Andrej Veljković 78 u kolorektalnoj kancerogenezi. Hroniĉni agresivni procesi na sluzokoţi kolona izazvani reaktivnim vrstama kiseonika dovode do hroniĉnog zapaljenskog procesa koji, progresivno menja normalnu arhitekturu epitela kolona, promoviše pojavu podruĉja sa većim stepenom displazije tkiva. Prema pato-histološkoj graĊi, ova promena je predhodnik KRK. Blizak odnos koji postoji izmeĊu hroniĉnih upalnih crevnih bolesti (ulceroznog kolitisa i Kronove bolesti) i KRK dokazuju ovu hipotezu (223). Intenzivna i dugotrajna oksidativna agresija na sluznicu epitela debelog creva predstavlja veći rizik da će se neoplazija pojaviti. TakoĊe je poznato da se RVK formiraju u višku kod hroniĉnih oboljenja gastrointestinalnog trakta (224). Glavni izvor RVK u crevima su verovatno fagociti, koji su akumulirani u mukozi pacijenata sa oboljenjima creva i mogu generisati RVK nakon aktivacije, što bi moglo da doprinese povećanom riziku od nastanka karcinoma (225). Zbog toga, adekvatan nivo antioksidativne odbrane unutar i van ćelije je takoĊe veoma vaţan u procesu zaštite od oksidativnih oštećenja ćelijskih komponenti ukljuĉujući membranske fosfolipide (226). Produkcija RVK, koja raste sa kliniĉkom progresije bolesti, podrazumeva povećanu lipidnu peroksidaciju, kao rezultat toga nastaje degeneracija ćelijske membrane i oštećenje DNK molekula. Rezultati našeg istraţivanja pokazuju povećanje nivoa lipidnih peroksida kod tumorskog tkiva u odnosu na zdravo tkivo kolona, što je u skladu sa rezultatima istraţivanja Skrzydlevske i saradnika iz 2005. godine (227) koji su na uzorku od 81 kolorektalnog karcinoma dokazali povećan nivo MDA u odnosu na zdravo tkivo kolona. TakoĊe, rezultati našeg istraţivanja pokazuju da makroskopski zdravo tkivo koje okruţuje tumor, ima statistiĉki znaĉajno veći nivo TBARS u odnosu na proksimalno, udaljeno zdravo tkivo kolona. U poslednjih nekoliko godina, nekoliko grupa istraţivaĉa je usredsredilo svoja istraţivanja o strukturalnim izmenama proteina pod dejstvom slobodnih radikala (228). Dokazali su da RVK dovode do znaĉajnih promena u strukturi proteina.Rezultati našeg istraţivanja pokazuju povećanje nivoa oksidacionih produkata proteina (AOPP) u tumorskom tkivu. Proteini koji sadrţe ditirozine nastale unakrsnim povezivanjem produkata formiranih oksidacijom aminokiselina dejstvom RVK u plazmi su oznaĉeni kao uznapredovali oksidacioni produkti proteina (AOPP ). U plazmi, gde su u najvecoj koncentarciji zastupljeni od proteina krvne plazme albumini, AOPP su preteţno agregati albumina oštećeni oksidativnom modifikacijom (229). Avinash i sar. su 2009. Doktorska disertacija Andrej Veljković 79 godine, dokazali povećan nivo AOPP u plazmi koji je znaĉajno povišen u kolorektalnom karcinomu što je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja (230). Dokazano je da postoji negativna korelacija izmeĊu tiol-grupa u plazmi i AOPP u kolorektalnom karcinoma pokazujući da se oksidacija proteina i nivo AOPP povećavaju, dok se antioksidativna uloga tiolnih grupa smanjuje. Dokazano je da serumski albumini deluju kao antioksidansi, sniţavaju nivo oksidativnog stresa i spreĉavaju spontanu i indukovanu apoptozu kod tumora (231). Degradacija albumina usled oksidacije proteina igra vaţnu ulogu u hipoalbuminemiji kod pacijenata obolelih od karcinoma (232). Znaĉajan pad nivoa albumina u kolorektalnom karcinomu moţe biti uzrokovan, uz kaheksiju, i zbog povećane stope degradacije oksidacionih i konformaciono izmenjenih proteina plazme i albumina kao posledica oksidativnog stresa (229), što dovodi do povećanja nivoa AOPP. Nedavno je dokazano i da superoksid anjon kao i ostali slobodni radikali inaktiviraju jedan od antioksidativnih enzima katalazu i smanjuju efikasnost ćelija da se brani od dejstva RVK (233). Mayo i saradnici su 2003. godine dokazali da se tokom razvoja karcinoma debelog creva aktivnost katalaze smanjuje (233).To je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde smo ustanovili statistiĉki znaĉajan pad aktivnosti katalaze u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona. Okolno tkivo je imalo sniţenu aktivnost katalaze u odnosu na zdravo tkivo, ali bez statistiĉke znaĉajnosti. Katalazu koriste ćelije za odbranu od toksiĉnih efekata vodonik peroksida, koji se generiše u razliĉitim reakcijama agenasa iz ţivotne sredine i/ili delovanjem superoksid dismutaze, detoksikacijom superoksid anjon radikala (234). Povećana aktivnost superoksid dismutaze moţe unaprediti proces dizmutacije superoksid radikala, što dovodi do intenziviranja generacije vodonik peroksida. Pošto je aktivnost katalaze smanjena, nivo vodonik peroksida u tkivu tumora se povećava. Taj podatak je u skladu sa istraţivanjem, koje pokazuje da neke linije humanih tumora proizvode veliku koliĉinu hidrogen peroksida (235). Istovremeno, reaktivni kiseoniĉni radikali mogu povećati aktivnost MMP-a. Nedavno je dokazano u kulturi ćelija kancera kolona, da MMP-9 posreduje u oslobaĊanju vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF). Ovi faktori mogu promovisati ne samo lokalni rast tumora, već i proces metastaziranja kao i process neovaskularizacije. Poznato je da je VEGF prvi i najvaţniji stimulator angiogeneze u kolorektalnom kanceru (236). Oksidansi, ukljuĉujući vodonik peroksid, mogu da izazovu i povećanu ekspresiju gena koji kodiraju enzime antioksidativnog sistema, što nije bio sluĉaj u Doktorska disertacija Andrej Veljković 80 našem istraţivanju. Ova vrsta indukcije enzima antioksidativne zaštite izazvanih vodonik peroksidom je dokazana u kulturama fibroblasta. Ovo povećanje moţe biti uzrokovano većom prijemĉivošću i dostupnošću enzimskih kofaktora kao što su metalni joni. Kao rezultat oksidativnog stresa, joni gvoţĊa i bakra postaju dostupniji antioksidativnim enzimima (235). Nakon zapaljenskog stimulusa, sama inicijacija kancerogeneze posredovana RVK moţe biti direktna (oksidacija, nitriranje, halogenizacija nuklearnog DNK, RNK i lipida), ili posredovana signalnim putevima aktiviranim od strane RVK. Uz pomoć mitohondrijalnog respiratornog lanca, aerobni organizmi su u stanju da ostvare daleko veću energetsku efikasnost proizvodnje u poreĊenju sa anaerobnim organizmima. MeĊutim, jedna mana aerobnog disanja je neprekidno curenje elektrona do O2 tokom mitohondrijalne sinteze ATP. U stvari, 1-5 % od ukupnog kiseonika upotrebljenog u aerobnom metabolizmu dovodi do stvaranja superoksid anjon radikala (O2 -). Već pomenuti H2O2, još jedan primer RVK, moţe biti formiran dismutacijom iz superoksid anjona ili spontano u peroksizomima iz molekularnog kiseonika (228). Uprkos svojoj manjoj reaktivnosti u poreĊenju sa drugim RVK, H2O2 igra vaţnu ulogu u kancerogenezi, jer je u stanju da se širi duţ mitohondrija i preko ćelijskih membrana, dovodeći do mnogih ćelijskih poremećaja (237). Glavna negativna dejstva RVK u ćelijama sisara su posredovana hidroksilnim radikalom (• OH ). On ima veoma nestabilnu elektronsku strukturu i zato je u stanju da zahvati više od jednog ili dva molekula pre nego što reaguje sa bilo kojom ćelijskom komponentom (238). Većina •OH se proizvodi u prisustvu redukujućih prelaznih metala (jona Fe, Cu, Co, Ni), uglavnom preko Fentonove reakcije kada Fe 2+doĊe u kontakt sa H2O2. Poremećen proces autofagije mitohondrija (mitofagije) moţe takoĊe biti jedan od izvora RVK. Ove RVK proizvedene od strane oštećenih mitohondrija, mogu promovisati razvoj tumora, najverovatnije preturbacijom signala transdukcije adaptivne funkcije P62 - kontrolišućih puteva (239). Direktni efekti RVK, se uglavnom pripisuju visokim koncentracijama na mestu oštećenja, i ukljuĉuju DNK prekide, taĉkaste mutacije DNK, aberantno unakrsno povezivanje i mutacije u proto- onkogenima i tumor- supresornim genima, promovišući neoplastiĉnu transformaciju (240). Na primer, RVK mogu smanjiti ekspresiju i enzimsku aktivnost DNK "mismacth repair" gena mutS homologa 2 i 6 i mogu povećati ekspresiju DNK metiltransferaze, što dovodi do globalne hipermetilacije genoma (241). To dovodi do inkativacije promotora nekoliko gena, kao što su adenomatozna polipoza Doktorska disertacija Andrej Veljković 81 coli (APC), ciklin - zavisna kinaza inhibitora -2 ( CDKN -2), gen osetljivosti tumora dojke1(BRCA1), retinoblastom proteina (Rb) (242). S druge strane, nizak ili prelazni nivo RVK moţe aktivirati ćelijsku proliferaciju ili signalne molekule preţivljavanja, kao što su NF-kB, AP, ekstracelularni signal regulisana kinaze / mitogen aktivirane protein kinaze ( ERK / MAPK ) i posfoinositid 3 - kinazu/AKT8 virusne puteve onkogen ćelijskog homologa(PI3K/Akt).Na primer, H2O2 je u stanju da razgradi IkBa, inhibitornu subjedinicu NF-kB (243). Protein kinaza C, koja uĉestvuje u razliĉitim putevima regulacije transkripcije i kontrole ćelijskog ciklusa, se takoĊe aktivira dejstvom H2O2 (243). Pored toga, RVK dovode do aktivacije i sinteze AP -1, regulatora rasta ćelija, proliferacije i apoptoze i transkripcionih faktora, kao što su STAT3, FZO- 1a i p53 (244). Promocija tumora, na primer, moţe biti inhibirana, u ţivotinjskim modelima, korišćenjem agenasa, ukljuĉujući odreĊene antioksidanse, kao i steroide i retinoide koji mogu da inhibišu stvaranje RVK tokom fagocitoze (245). Osim toga, modifikacija DNK baza je primećena kao karakteristika napada reaktivnih kiseoniĉnih vrsta (246). RVK mogu da ispolje svoj kancerogeni efekat na osnovu njihove sposobnosti da povećaju nivo proliferacije ćelija, preţivljavanja i migracije ćelija. RVK mogu izazvati i oštećenja DNK, što dovodi do genetskih oštećenja koja pokreću tumorigenezu i kasnije napredovanje tumora. S druge strane, takoĊe mogu izazvati starenje ćelija i smrt i stoga mogu da funkcionišu i kao anti-kancerogeni agensi. Da li će RVK promovisati tumorski opstanak ćelije ili delovati kao anti-kancerogeni agens zavisi od ćelija i tkiva, lokacije produkcije RVK i individualne koncentracija RVK. Smanjene aktivnosti nikotinamid adenin dinucleotide fosfata (NADPH) oksidaze (NOk), porodice enzima, jednog od potencijalnih izvora proizvodnje RVK, promoviše opstanak tumora i rast ćelija (247). Serin- treonin kinaza Akt inhibiše odbranu antioksidansa i promoviše opstanak tumora. RVK aktiviraju Akt inhibirajući fosfataze i tenzin homologe iz hromozoma 10 (PTEN), fosfataze ukljuĉene u PI3K-zavisnu Akt aktivaciju. Akt je takoĊe znaĉajan inhibitor apoptoze zbog svoje sposobnosti da inaktiviše pro- apoptotiĉne molekule, ukljuĉujući kaspazu-9 i Bcl-2 homologe (BH3 - jedini protein Bcl-KSL/Bcl-2-porodice povezan sa apoptotiĉnim bad), itako što aktivira aktivnost transkripcionog faktora NF- kB . Pored toga, Akt promoviše nuklearnu translokaciju ubikuitin ligaze MDM2, koja se suprotstavlja p53 - posredovanoj apoptozi (248). RVK mogu povećati i invazivnost tumora i metastaziranje, povećanjem stope ćelijske migracije. Uznapredovali stadijumi tumora su u našem istraţivanju imali veće Doktorska disertacija Andrej Veljković 82 koncentracije TBARS i AOPP uodnosu na T1 stadijum tumora. Tokom transformacije u invazivni karcinom, epitelne ćelije prolaze duboke promene u morfologiji i adhezivnosti, što rezultira gubitkom normalne epitelne polarizacije i diferencijacije, i preobraţajem u više pokretne, invazivne fenotipe. Ovo moţe biti posledica smanjenog vezivanja tumorskih ćelija za bazalnu laminu, ili alternativno biti posledica povećane aktivnosti ili ekspresije proteina koji regulišu ćelijski motilitet. Na primer, oksidativni stres reguliše ekspresiju intercelularnog proteina adhezije-1 (ICAM-1), proteina sa površine ćelija u endotelnim i epitelnim ćelijama, najverovatnije zbog aktivacije NF-kB. ICAM-1, zajedno sa IL-8 reguliše transendotelnu migraciju neutrofila i ima moguću funkciju u tumorskom metastaziranju (249). Angiogenezu u tumorima kontroliše takozvani "angiogeni prekidaĉ",koji omogućava prelazak iz nisko invazivnih i slabo vaskularizovanih tumora na visoko invazivne i angiogene tumore. Da bi došlo do daljeg povećanje veliĉine, tumorske ćelije eksprimiraju grupu molekula koji pokreću tumorsku vaskularizaciju. Veliki broj ćelijskih stresnih faktora, ukljuĉujući hipoksiju, manjak hranljivih materija i RVK su znaĉajni stimulusi za antiangiogenu signalizaciju. Angiogeni faktori kao što su VEGF, fibroblastni faktor rasta (FGF) i trombocitno izvedeni faktor rasta (PDGF) su osloboĊeni u mikrosredinu tumora ili zapaljenskih ćelija kao odgovor na razliĉite nadraţaje, kao što su i RVK (250). To je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde su pacijenti sa stadijumom T4 imali statistiĉki znaĉajno veći koncentraciju TBARS u odnosu na ostale stadijume tumora. OsloboĊeni faktori rasta aktiviraju endotelne ćelije koje daju faktore rasta za nove krvne sudove (251). Monte i sar. su dokazali da angiogeneza indukovana limfocitima je izazvana stimulacijom RVK, i da ovaj odgovor moţe biti blokiran od strane antioksidanasa kod tumora miševa. Pored toga, administracija H2O2 ili lekova koji dovode do oksidativnog stresa (doksorubicin ) kod normalnih miševa aktivira in vivo angiogenezu (252). 6.2 Aktivacija NF-κB u kolorektalnom karcinomu Još uvek nije potpuno razjašnjeno šta uzrokuje konstitutivnu aktivaciju NF-κB u tumorskim ćelijama. Navedeni mogući razlozi su: mutacije IκBα (253), poboljšane proteozomalne aktivnost (253) ili povećana ekspresija inflamatornih citokina i sledstveni oksidativni stres (254). Aktivaciju NF-κB mogu izazvati i karcinogeni, kao što su 7,12 dimetil-benz Doktorska disertacija Andrej Veljković 83 antracen (DMBA) i duvanski dim, kao i promoteri tumora, kao što je forbol-estar (254). Faktor nekroze tumora alfa (TNF-α), koji moţe posredovati u karcinogenezi putem indukcije proliferacije, invazivnosti i metastaziranja tumorskih ćelija (255), je moţda najmoćniji aktivator NF-κB. Konstitutivna aktivacija NF-κB u tumorskim ćelijama ima brojne posledice (Slika 14). Slika 14. Geni ukljuĉeni u odgovor na NF-κB Geni koji su ukljuĉeni u odgovor na NF-κB, mogu se podeliti u ĉetiri funkcionalne grupe: gene koje imaju proizvode ukljuĉene u negativnu povratnu spregu aktivnosti NF-κB; geni koji imaju proizvode koji su zaduţeni za razne imunoregulatorne funkcije, gene ĉiji proizvodi spreĉavaju aktiviranje kaspaza i apoptozu, i gene koje promovišu proliferaciju ćelija: COX2, Flip, FLICE (FAS-u vezi smrti domen (fadd)- kao što je IL-1-konvertujući enzim) inhibitorni protein; cIAPs, mobilni inhibitor apoptoze, IKbB, inhibitor B IB inhibitor κBb; iNO, inducibilna azot oksid sintaza, MMP-9 i druge. Rezultati našeg istraţivanja su u skladu sa postojećim podacima o aktivnosti NF- κB u tumorskom tkivu. Naime tumorsko tkivo ima znaĉajno veću kvantitativnu ekspresiju NF-κB u odnosu na zdravo tkivo kolona. Tkivo koje okruţuje tumor, koje je praktiĉno u porcesu kancerogeneze, takoĊe ima statistiĉki znaĉajno veću kvantitativnu ekspresiju NF-κB u odnosu na zdravo tkivo kolona. Hromozomske translokacije povezane sa nastankom tumora, delecije i mutacije mogu takoĊe da dovedu do prekida gena koji kodiraju NF-κB i IκB proteine, i izazivaju konstitutivnu NF-κB aktivaciju. Konaĉno, autokrina i parakrina produkcija pro- inflamatornih citokina, onkogena aktivacija signalnih molekula i hroniĉne infekcije su pokazale da hroniĉna stimulacija aktivnosti IKK dovodi do konstitutivne aktivacije Doktorska disertacija Andrej Veljković 84 NFκB. Konstitutivno aktiviranje NFκB je povezano sa nekoliko aspekata kancerogeneze, ukljuĉujući promovisanje tumor-ćelijske proliferacije, spreĉavanje apoptoze i stimulisanje procesa angiogeneze i metastatskog potencijala tumora (256). Rezultati našeg istraţivanja pokazuju signifikantno povećanje kvantitativne ekspresije NF-κB kod pacijenata u stadijumu T4, u odnosu na druge pacijente sa drugim stadijumima bolesti. Naši rezultati govore u prilog ĉinjenici da je aktivnost NF-κB znaĉajna u svim procesima razvoja tumora, pa i u procesu metastaziranja. NF-κB kontroliše ćelijsku proliferaciju aktiviranjem ciljnih gena, kao što su interleukin2 (IL-2), Granulocit-makrofag kolonija-stimulišući faktor (GM-CSF) i CD40 ligand (CD40L), koji kodiraju faktore rasta uĉestvujući u stimulaciji proliferacije limfnih i mijeloidnih ćelija. Konstitutivna proizvodnja tih citokina moţe da stimuliše proliferaciju ćelija bilo autokrino ili parakrino. Pored tog indirektnog naĉina delovanja, NF-κB takoĊe direktno stimuliše transkripciju gena koji kodiraju G1 cikline. Ak-B mesto je prisutno u ciklinu D1c promoteru, a proteini ćelijskog ciklusa, kao što su ciklin D1, koji su potrebni za prelaz ćelija iz G1 u S fazu, takoĊe su regulisani od NF-κB (257). Brojni citokini ĉija regulacija podleţe dejstvu NF-κB su faktori rasta za ćelije tumora. IL-1β je faktor rasta za AML, TNF je faktor rasta za Hodgkinov limfom, koţni limfom T ćelija i gliome i IL-6 je faktor rasta za multipli mijelom izmeĊu ostalihi IL-1 i TNF posreduju proliferativne efekte kroz aktivaciju NF-κB (258). EGF, faktor rasta za mnoge razliĉite solidne tumore, aktivira NF-κB (259). HER2, receptor faktora rasta je povećano eksprimiran kod tumora dojke, kolona, prostate i karcinoma drugih organa, a takoĊe posreduje svoje efekte delom kroz aktivaciju NF-κB (260). Dakle, i citokini i receptori citokina su ili regulisani od strane NF-κB ili dovode do proliferacije putem aktivacije NF-κB. Invazivnost tumora regulisana je brojnim NF-κB-regulisanim produktima gena, ukljuĉujući matriks metaloproteinaze (MMP), urokinaza tip plazminogen aktivator (UPA), interleukin-8(IL-8), i drugim hemokinima (261). To je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja, gde ekspresija NF-κB raste sa stadijumima tumora, gde najvišu ekspresiju imaju upravo pacijenti sa T4 stadijumom tumora. Dokazano je i da je ekspresija MMP-9 regulisana transkriptivno kroz NF-κB elemente u sklopu MMP-9 gena (262). Bond i sar. su 1998 godine, koristeći adenovirus koji povećava ekspresiju inhibitorne subjedinice IκBα, otkrili da je aktivacija NF-κB apsolutno neophodna u ushodnoj regulaciji MMP-9 (261). UPA, još jedna proteaza Doktorska disertacija Andrej Veljković 85 koja je ukljuĉena u metastaziranje i invazivnost tumora, je transcripciono aktivisana od strane PMA, IL-1, i TNFα. Aktiviranje zahteva indukciju aktivnosti NF-κB i degradiranje IκBα (263). Vang i sar. su izvestili da je UPA povećano eksprimirana u ćelijama tumora pankreasa kroz konstitutivnu ReIA aktivnost (264).UPA promotor sadrţi NF-κB vezujuće mesto koje posreduje direktno indukciju UPA kroz ReIA. Metastaziranje zahteva migraciju kancerogenih ćelija u i van krvnih sudova koji ih prenose u druge delove tela. Sposobnost da prodiru u krvne sudove posredovana je specifiĉnim molekulima eksprimiranim na endotelnim ćelijama krvnih sudova kao odgovor na niz signala iz inflamatornih i tumorskih ćelija.Metastaze su posredovane kroz ekspresiju razliĉitih athezivnih molekula, ukljuĉujući i ICAM-1, VCAM-1, i ELAM-1 (265) koji su regulisani od strane NF-κB. Inducibilna azot oksid sintaza (iNOS), takoĊe je usko povezana sa metastatskom sposobnošću tumora (266), a takoĊe je regulisana preko NF-κB. Helbig i sar. su 2003. Godine dokazali da NF-κB reguliše pokretljivost ćelija raka dojke direktno povećanom ekspresijom receptora citokina CKSCR4 (267). Fujioka i sar. su 2003 godine dokazali da inhibicija konstitutivne NF- κB aktivnosti ekspresijom mutantog IκBα (IκBαM) suprimira metastaze jetre (268), što je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde pacijenti sa prisutnim udaljenim meatstazama, stadijuma T4 imaju signifikantno veću ekspresiju NF-κB u odnosu na pacijente sa drugim stadijumima tumora. Druga vaţna komponenta rasta tumora je angiogeneza - proces koji zahteva i migratorne i invazivne sposobnosti vaskularnih epitelnih ćelija. Hemokini - hemotaktiĉni faktori koji izazivaju migracije ćelija su vaţne klase gena koji su proizvodi aktivnosti NF-κB. Ćelije sa povišenom NF-κB aktivnošću remete proizvodnju hemokina, što povećava migratornu aktivnost. Za najmanje jedan NF-κB regulisan hemokin, IL-8, je dokazano da promoviše angiogenezu (269). Pored toga, kB mesta su identifikovana kod promotera gena koji kodiraju nekoliko MMP-za - proteolitiĉkih enzima koji promovišu invaziju tumora na okolno tkivo (261). Ju i sar. su 2003- godine dokazali da je ekspresija NF-κB direktno ukljuĉena u ekspresiju VEGF i regulisanje mikrovaskularne gustine kod humanog kolorektalnog karcinoma (270). Ova i sliĉne studije naglašavaju ulogu aktivacije NF-κB u posredovanju angiogeneze. NF-κB je takoĊe inhibitor programirane ćelijske smrti (271). Ovaj faktor aktivira transkripciju nekoliko ciljnih gena za koje se zna da blokiraju indukciju apoptoze od strane TNF-i drugih pro-apoptotiĉnih ĉlanova ove familije (272). Anti-apoptotiĉni Doktorska disertacija Andrej Veljković 86 faktori koji su indukovani od strane NF-κB ukljuĉuju ćelijske inhibitore apoptoze (cIAPs), caspase-8/FADD (FaS-povezan domen smrti)- kao što je IL-1beta konvertujući enzim (FLICE) inhibitorni protein (C-Flip ) i ĉlanovi porodice BCL-2 porodice (kao što su A1/BFL1 i BCL-xL) (272). NF-κB moţe takoĊe da ublaţi apoptotiĉni odgovor na genotoksiĉne lekove i jonizujuće zraĉenje (271,272). Tumorske ćelije u kojima je NF- κB konstitutivno aktivan su veoma otporne na lekove ili antitumorsko jonizujuće zraĉenje, i inhibicija aktivnosti NF-κB u ovim ćelijama u velikoj meri povećava njihovu osetljivosti na takve tretmane (272). Pored otpornosti na tumorsku terapiju, anti- apoptotiĉka aktivnost NF-κB moţe da ima vaţnu ulogu u pojavi neoplazmi, tako što spreĉava smrt ćelija koje su prošle hromozomske rearanţmane ili druge vrste oštećenja DNK. Takve ćelije su obiĉno eliminisane pomoću kontrolnog punkta, kao što p53 put (273). U stvari, postoje dokazi da postoji transkripcioni antagonizam izmeĊu NF-κB i p53 (273). Bez obzira na mehanizam, spreĉavanje apoptoze povećava fond genetski izmenjenih ćelija, koji će na kraju dovesti do transformisanog potomstva, što je u skladu sa našim rezulatatima gde je ekspresija povećana u svim fazama tumora ali i u tkivu neposredno uz tumor koje praktiĉno u procesu kancerogeneze. Karin i sar. su 2002. godine utvrdili da delecija IKKβ u mijeloidnim ćelijama smanjuje rast tumora bez uticaja na apoptozu (271). To je takoĊe smanjilo ekspresiju IL-1α, IL-1β, IL-6, KC, MIP2, TNF, COKS2, i ICAM-1 u makrofazima. Incidencija tumora je smanjena za polovinu. Iako je morfologija tumora bila sliĉna, procenat manjih tumora bio je veći. Apoptotiĉni i proliferativni indeksi se nisu promenili. Dok je enterocitno specifiĉna delecija IKK povećala COKS2 i MMP-9, mijeloidno- specifiĉna delecija IKKβ je smanjila njihovu ekspresiju. Dakle, IKKβ promoviše rast tumora u mijeloidnim ćelijama preko proizvodnje tumor-promovišućih parakrinih faktora, pre nego inhibicijom apoptoze ćelija tumora. Tako, u mijeloidnim ćelijama, IKKβ je ukljuĉen u proizvodnju inflamatornih medijatora koji promovišu rast tumora. Koji faktori rasta su bili ukljuĉeni nije bilo objavljeno. Tako, IKKβ u enterocitima je doprineo inicijaciji tumora i promociji eksprimirajući antiapoptotiĉne proteine (kao što je BCL-2), dok IKKβ u mijeloidnim ćelijama je doprineo ekspresiji faktora rasta tumora. Karin i sar. su 2003. Godine dokazali da aktivacija NF-κB endotoksinom u ćelijama tumora proizvodi inflamacijom izazvan tumorski rast kroz ekspresiju TNF, dok je inhibicija NF-κB posredovala tumorskoj regresiji kroz Trail (271). Da bi dokazali ovu tezu, oni su koristili eksperimentalni model metastaza tumora u kom Doktorska disertacija Andrej Veljković 87 generišu plućne metastaza u adenokarcinom ćelijskoj liniji. Njihov rast je podstaknut injekcijom LPS. Oni su ustanovili da inflamacijom indukovan metastatski rast u ovom modelu kroz proizvodnju TNF domaćina hematopoeze ćelija i aktivaciju NF-κB u ćelijama tumora. Inhicijom aktivnosti NF-κB kod karcinoma debelog creva i karcinoma mleĉne ćelije konvertuju inflamacijom indukovan odgovor na inflamacijom indukovanu tumorsku regresiju. Sve u svemu, ovi rezultati daju dokaze, na genetskom nivou, da inflamatorni odgovor generisan kroz aktivaciju NF-κB ima kritiĉnu ulogu u kancerogenezi. U eksperimentalnom modelu na miševima, kod tumora nastalih iz ulceroznog kolitisa, gde brisanje IKK-β (dovodi do smanjenja NF-κB aktivnost) u enterocitima, dokazano je da je tumorski rast i razvoj rezultat NF-κB i njegove sposobnosti da potisne apoptozu i hemijski transformiše pre- maligne ćelije. U ovom modelu, miševima je ubrizgavan prokarcinogen azokimethane (AOM), koji prolazi kroz metaboliĉku aktivaciju u enterocitima, i to je praćeno oralnim davanjem soli dekstran- sulfat natrijuma (DSS), koja izaziva hroniĉni kolitis kroz poremećaj crevne barijere i izloţenost makrofaga enteriĉnim bakterijama u lamini propriji. Izlaganje makrofaga bakterijama rezultuje aktiviranjem NF-κB u ovim ćelijama preko TLR signalizacije, što je dovelo do proizvodnje i luĉenja pro-inflamatornih citokina koji aktiviraju NF- κB u epitelnim ćelijama creva. (274). Enterocit specifiĉna ablacija IKK-β je dovela do znaĉajno smanjene uĉestalosti tumora, bez uticaja na veliĉinu i sastav tumora (to jest, progresiju), ili indukciju onkogenih mutacije (to jest, inicijaciju), što ukazuje da IKK- β zavisi od aktivacije NF-κB u toku rane tumorske promocije. Tumor promovišuća funkcija NF-κB u enterocitima nije povezana sa mogućnošću da aktivira pro-inflamatorne gene, već sa mogućnošću da suzbije apoptozu pre- neoplastiĉnih progenitora. Ipak, drugi mehanizam kroz koji NF-κB tumora moţe da utiĉe na promociju u KAK rezultira iz sposobnosti da podstakne proizvodnju pro-inflamatornih faktora mijeloidnih ćelija. Ovaj mehanizam je identifikovan delecijom IKK-β samo u mijeloidnim ćelijama, koje ne prolaze maligne transformacije, ali su vaţni za razvoj KAK. Ova delecija smanjuje ne samo broj tumora, već i veliĉinu tumora, rezultat koji nije viĊen nakon specifiĉne delecije enterocita. Smanjenje veliĉine tumora je posledica smanjene proliferacije transformisanih epitelnih ćelija, koji zahtevaju faktore rasta koji su proizvedeni od strane mijeloidnih ćelija. Jedan od ovih faktora je IL-6, jer ubrizgavanje neutrališućih antitela koja su Doktorska disertacija Andrej Veljković 88 specifiĉna za receptora za IL-6 takoĊe smanjuje broj i veliĉinu tumora u KAK modelu (275), ĉime se proizvodi efekat mijeloidne specifiĉne delecije IKK-β. Nekoliko onkogena posreduje svoje efekte aktiviranjem NF-κB. MeĊu njima je onkogeni Ras, koja je konstitutivno aktivan kod nekoliko tipova tumora ukljuĉujući i tumor prostate i tumor debelog creva (276). Sliĉno tome, c-mic, koji moţe posredovati kancerogenezu (277), regulisan je preko NF-κB. Pim-2, koji je transkripciono regulisana onkogena kinaza, promoviše ćelijski opstanak kroz aktivaciju NF-κB (278), što dodatno govori o ulozi NF-κB u procesu nastanka, rasta i razvoja tumora. 6.3 Nivo apoptoze u kolorektaktalnom karcinomu Transformacija normalne sluznice kolona do tumora sa metastatskim potencijalom napreduje kroz niz patoloških faza tokom perioda od nekoliko decenija. Rane faze koje dovode do karcinoma debelog creva, najĉešće poĉinju sa rasprostranjenom hiperproliferacijom epitelnih ćelija luminalne površine kolona (279). Ako enzimi“sistema popravke” ćelije ne mogu ispraviti oštećenja DNK, smatra se da ćelija umire da bi se izbegao rizik od maligne transformacije. Problem nastaje kada ćelije više ne reaguju na oštećenja DNK, i ne ulaze u programiranu ćelijsku smrt, ili apoptozu. Ove ćelije su u stanju da steknu dodatne genetske promene, što povećava rizik od tumorigeneze. Inhibicija apoptoze u tumorskim ćelijama moţe takoĊe dovesti do otpornosti ćelija tumora debelog creva na citotoksiĉne lekove i imuni nadzor, koji bi mogli da deluju tako što dovode do smrti ćelije (280,281). Prihvaćeno je da ravnoteţa izmeĊu stope ćelijskog obnavljanja i apoptoze odrţava veliĉinu i strukturu tkiva (282). Ovaj model sugeriše da tumor nastaje kada se ta ravnoteţa poremeti u korist povećanja ćelijske proliferacije. Da bi se utvrdilo da li je apoptoza promenjena kod tumora kolona u odnosu na normalnou sluzokoţu kolona ili adenoma, sprovedeno je mnoštvo studija koje su se bavile merenjem broja ćelija koje ulaze u proces apoptoze u uzorcima tkiva. Apoptoza je kvantifikovana u uzorcima tkiva kao apoptotski indeks, koji predstavlja broj apoptotiĉnih ćelija kao procenat od ukupnog broja prebrojanih ćelija. Nivo spontane apoptoze kod zdravog tkiva sluznice kolona je veoma promenljiv i indeksi su od 0,18% do 2,75% (283). Ove varijacije su ili posledica Doktorska disertacija Andrej Veljković 89 dnevnog ritma apoptoze ili su bile rezultat hirurških tehnika koje se koriste za uklanjanje tumora. Većina istraţivaĉa je ustanovila da apoptotiĉni indeks adenoma i karcinoma bio znatno veći nego u normalnoj mukozi kolona (284). Apoptotski indeksi su bili najveći kod karcinoma koji su metastazirali i kod metastatskih depozita (285). Rezultati našeg istraţivanja nivoa apoptoze izraţeni kroz aktivnost DNaza i kvantitativnu ekspresiju Bcl-2 i Bax proteina su pokazali smanjen nivo apoptoze u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona.Tkivo koje okruţuje tumor je takoĊe imalo smanjen nivo apoptoze u odnosu na zdravo tkivo kolona. Primetne su bile velika odstupanja od srednje vrednosti apoptoze. Povećan nivo apoptoze kod pojedinih pacijenata moţe biti pokušaj organizma da odstrani maligno izmenjene ćelije, ili je u pitanju sam naĉin uzorkovanja tkiva, gde delovi tumora koji su u hipoksiji imaju veći stepen apoptoze u odnosu na proliferativno aktivno tumorsko tkivo. U većini studija nije primećena razlika izmeĊu apoptotskih indeksa kod tumora kolona i njegove histološke diferencijacije (286). MeĊutim, Hokins i sar. (287), su dokazali pozitivnu korelaciju izmeĊu apoptotskog indeksa i Dukesovog stadijuma tumora. Rezultati našeg istraţivanja ne dokazuju razliku u stepenu apoptoze izmeĊu stadijuma tumora, iako su pacijenti sa T4 stadijumom imali manju aktivnost DNaza ali bez statistiĉke znaĉajnosti. Za razliku od navedenih studija, Bedi i sar. (288), i Mos i sar. (289), su dokazali progresivno smanjenje apoptoze tokom transformacije normalnog epitela kolona od benignog adenoma do adenokarcinoma, što je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja. Broj apoptotiĉnih ćelija u uzorcima karcinoma bio je znatno manji nego u normalnoj sluzokoţi i bio je povezan sa povećanim opstankom ćelija u poreĊenju sa normalnim i benignim tkivom (288). Razlog za razlike u stopama apoptotiĉnih poreĊenju sa drugim studijama moţe biti posledica niskog apoptotiĉnih indeksa i visoke tumorske varijabilnosti u svim studijama. Promene u odnosima apoptoze normalnog u odnosu na maligna tkiva nisu visoke, iako su statistiĉki znaĉajne. Razlog velikih razlika stope apoptoze meĊu uzorcima se moţe traţiti u samom naĉinu uzorkovanja, gde tumorska tkiva zbog hipoksije ulaze u process apoptoze i ukoliko je uzorkovani deo tumora u hipoksiji stopa apoptoze će biti veća nego kod proliferativno aktivnog tumorskog tkiva. Doktorska disertacija Andrej Veljković 90 6.3.1 Promene ekspresija gena koji učestvuju u kontroli apoptoze u kolorektalnom karcinomu Poremećaj apoptotske aktivnosti kod kolorektalnog karcinoma moţe biti uzrokovan poremećenom ekspresijom gena koji regulišu apoptozu. Rad na elegans nematodi Caenorabditis je identifikovao gene koji su potrebni za indukciju apoptoze, kao i one koji uĉestvuju u spreĉavanju samog procesa apoptoze. Homologi ovih gena sisara su izolovani i omogućili su otkrivanje daljih gena ukljuĉenih u apoptozu. Apoptotski geni koji su najviše ukljuĉeni u apoptozu kolorektalnog karcinoma su p53, Bcl -2 i Bax. Delecije i mutacije gena p53 su ĉeste u uznapredovalom kolorektalnom karcinomu (290) i obiĉno javljaju tokom tranzicije iz benignog adenoma do adenocarcinoma (291). Bcl-2, inhibitor ćelijske smrti, se obiĉno eksprimira samo u donjoj polovini kripti debelog creva (292,293), oblasti koja sadrţi matiĉne ćelije i otporna je na indukciju apoptoze. Većina adenomakolona eksprimira Bcl-2 protein na visokim nivoima širom neoplastiĉnog epipovećanje tela (293,294) dok ne-neoplastiĉni polipi imaju normalnu ekspresiju Bcl-2 (295). Prekomerna ekspresija Bcl-2 moţe da doprinese prelazu hiperplastiĉnog epitela u adenom. Rezultati našeg istraţivanja pokazuju povećanu kvantitativnu ekspresiju Bcl-2 u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona. Ujedno tkivo koje okruţuje tumor i praktiĉno predstavlja tkivo u procesu kancerogeneze, ima povećanu kvantitativnu ekspresiju Bcl-2 u odnosu na zdravo tkivo kolona. Bareton i sar. (296) su takoĊe dokazali da je ekspresija Bcl -2 proteina kod kolorektalnog karcinoma je veća nego u normalnom sluzokoţi, i da je manja nego kod adenoma. Ovo je verovatno zbog gubitka hromozomskog regiona koji sadrţi Bcl-2 gen. Bedi i sar. (288) su dokazali jaku Bcl-2 pozitivnost širom malignih ćelija, meĊutim,broj analiziranih tumora bio je mali u poreĊenju sa drugim studijama. Znaĉajna inverzna korelacija je dokazana izmeĊu prekomerne ekspresije Bcl-2 i apoptotskog indeksa tkiva kolona, ukazujući da Bcl-2 smanjuje nivo apoptoze kod adenoma i omogućava napredovanje tumora. To je podrţano u istraţivanjugde su Bcl-2 deficijentni miševi imali povećan nivo spontane apoptoze u kriptama kolona u poreĊenju sa wild type miševima (292). Bax gen je ĉlan Bcl-2 porodice gena, ali, za razliku od Bcl-2 koji inhibira apoptozu, Bax je promoviše (297). Bcl-2 i Bax protein formiraju komplekse, Doktorska disertacija Andrej Veljković 91 heterodimere, i odnos Bcl-2 i Bax moţe uticati na ishod pro-apoptotskog stimulusa. P53 protein, a takoĊe aktivira transkripciju Bax mRNA (298). Izvešteno je da je Bax gen mutirani u preko 50% kolorektalnih karcinoma mikrosatelitima mutator fenotipa (MMP+). Mutacije u Bax-u su detektovane u nizu od osam uzastopnih Guanozin (G8), ostataka, hot-spot-u za klizanje indukovanih grešaka replikacije. Sve ukljuĉene mutacije povećavaju ili smanjuje broju G ostataka u G8 sekvenci, što dovodi do smene na ĉitanju okvira za sintezu proteina (299). Ovi rezultati pruţaju dokaze da gubitak funkcije Bax proteina igra vaţnu ulogu u kolorektalnoj kancerogenezi i da ćelija kojoj nedostaje Bax protein moţe imati smanjenu sposobnost da se podvrgne apoptozi po prijemu signala smrti. To je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde je u tumorskom tkivu smanjena kvantitativna ekspresija Bax protein u odnosu na zdravo tkivo kolona. Nedostatak biološki aktivnog Bax proteina takoĊe moţe da objasni zašto tumori sa neispravnim mismatch repair sistemom obiĉno ne sadrţe p53 mutacije (300). Kod MMP tumorskih ćelija sa mutantnim Bax genom, aktiviranje Bax od p53 je neefikasno i apoptoza se ne moţe pokrenuti. Bcl-2, Bax i p53 proteini mogu normalno raditi zajedno na regulaciji apoptoze epitelnih ćelija debelog creva. Povećanje ekspresije Bcl-2, u kombinaciji sa gubitkom ili mutacijim Bax ili P53, bi onda prouzrokovalo smanjenje apoptotskog kapaciteta tkiva. Abnormalni ekspresija ili funkcija ovih gena u tumoru kolona takoĊe moţe dovesti do otpora tumora na hemioterapije ili zraĉenja.Većina ovih tretmana zahtevaju netaknut p53 da bi ubili ćelije (301). Kada su ćelije sa mutantnim p53 ili Bax, ili visokim nivoom Bcl-2, tretirane citotoksiĉnim agensima, biohemijski funkcije su oštećene i DNK je takoĊe poremećen. MeĊutim, ove ćelije su u stanju da prepoznaju štetu i zaobilaze apoptozu. Ova zapaţanja će, nadamo se dovesti do racionalnog projektovanja novih terapijskih agenasa, koji će ponovo uspostaviti osetljivost tumorskih ćelija na indukciju apoptoze. Jasno je utvrĊeno da kolorektalnu karcinogenezu karakteriše postepena akumulacija genetskih promena (302). Akumulacija genetskih promena tokom adenom-karcinom sekvence moţe da obezbedi osnovu za promene u stepenu apoptotske ćelijske smrti, kao što mnogi od ukljuĉenih gena regulišu apoptozu. Većina istraţivanja su usmerena, kao što je već navedeno, na moguće uloge tumor supresornih gena adenomatozna polipoza koli (APC), p53 i proto-onkogena BCL-2. Mutacije u genu APC su ukljuĉene i kod sporadiĉnog i familijarnog kolorektalnog karcinoma(302). Uĉestalost mutacija APC je sliĉna kod adenoma kolona i karcinoma (oko 60%), što ukazuje da APC-mutacija moţe da bude rani, ili ĉak inicirajući Doktorska disertacija Andrej Veljković 92 dogaĊaj u procesu kolorektalne karcinogeneze. Imunohistohemijske studije su pokazale da je APC-protein eksprimiran u normalnom epitelnim ćelijama, kada migriraju ka vrhu kripte (303). Ometanje normalne APC funkcije verovatno remeti ravnoteţu izmeĊu formiranja novih ćelija na bazi kripti i smrti ćelija na vrhu kripti, što dovodi do relativnog širenja APC-mutantih ćelija(304). Vaţna uloga APC gena u regulisanju apoptoze je dokazana na osnovu eksperimenta u kojem je ekspresija APC u ćelijama humanog kolorektalnog karcinoma koje sadrţe endogeno neaktivne APC alele rezultirala indukcijom ćelijskesmrti putem apoptoze (305). Funkcionalni znaĉaj APC gena verovatno leţi ne samo u regulaciji apoptoze, već i kontroli ćelijskog ciklusa, migracije i diferencijacije Mutacije gena p53 se javljaju u razliĉitim tumorima, ukljuĉujući i kolorektalni karcinom(273). Delecije i mutacije gena p53 se mogu otkriti u do 85% od kolorektalnih tumora i obiĉno se javljaju tokom tranzicije iz adenoma do adenokarcinoma. Više funkcija je pripisano p53 supresor genu, od strane Levina (273) i Sigala (306). Njegov proizvod, p53 protein, moţe da odgovori na DNK oštećenja dovodeći do prekida ćelijske deobe u toku G1 ili G2 faze ćelijskog ciklusa ili programirane ćelijske smrti. Na ovaj naĉin, p53 moţe da zaštiti normalne ćelije da ne doĊe do replikacije oštećenog DNK. Divlji tip p53 proteina, ali ne i mutantni, moţe da pokrene apoptozu. UvoĊenje divljeg tipa p53 gena u posredovanu apoptozu ćelijskim linijama karcinoma tumora i miševima pretrpeo je regresiju ako je izazvana ekspresija divljeg tipa p53 (301). Mutantni p53 protein moţe da blokira funkciju divljeg tipa p53 proteina i na taj naĉin spreĉava indukciju apoptoze. Ipak, ni ĉinjenica da imunohistohemijska ekspresija p53, niti da su p53 mutacije povezane sa uĉestalošću apoptotiĉnih ćeliji u većini studija, ne podrţava dominatnu ulogu mutantog p53 proteina kao inhibitora apoptoze u razvoju kolorektalnog karcinoma. Uzeti zajedno, ĉini se da se ekspresija Bcl-2 postepeno smanjuje u toku adenom-karcinom sekvence i obrnuto u vezi sa povećanom ekspresijom p53. Kao što većina studija pokazuje postepeno povećanje uĉestalosti apoptoze, moguća je veza sa smanjenim nivoom Bcl-2. MeĊutim, Bcl-2 je verovatno samo jedan od gena koji odreĊuju uĉestalost apoptotiĉne ćelijske smrti u kolorektalnom karcinomu. Zaista, dokazane su promene u ekspresiji drugih ĉlanova porodice Bcl-2 u toku razvoja kolorektalnog tumora, kao što su anti-apoptotiĉni proteini BCL-Xl, MCL-1 i pro- apoptotiĉnih protein Bax, koji moţe biti i vaţniji od BCL-2 (308). Doktorska disertacija Andrej Veljković 93 6.3.2 Uloga DNaza u apoptozi kolorektalnog karcinoma Razvoj tumora je usko povezan sa promenama aktivnosti DNaza u plazmi pacijenata. Pacijenti oboleli od malignih limfoma su svrstani u grupu onih koji imaju sniţen nivo DNaza (309), za razliku od tumora dojke kod kojih je aktivnost pomenutih enzima u tkivu karcinoma veća u poreĊenju sa zdravim osobama (310). Svetlana Tamković i sar. su dokazali da je aktivnost DNaza, kao i koncentracija cirkulišuće DNK kod pacijenata sa tumorom kolona i tumorom ţeluca manja u odnosu na kontrolne zdrave pacijente, delom zahvaljujući povećanoj koncentraciji Aktina- inhibitora DNaze u plazmi, koji formira stoihiometrijske komplekse sa DN- azama. To je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde smo dokazali statistiĉki signifikantno niţu aktivnost DNaza u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona. Velike razlike u aktivnosti izmeĊu uzoraka se mogu objasniti ĉinjenicom da tumori imaju regije koje su zbog hipoksije u nekrozi. Nekrotiĉne regije tumora pokazuju visoku aktivnost DNaza, što se moţe interpretirati kao indikacija prisustva inhibitora nukleaza u tumorskom tkivu. Njihova aktivnost u nekrotiĉnom tkivu moţe biti rezultat aktivacije nukleaza u samom tkivu tumora ili pak mogu nastati iz limfatiĉnog tkiva koje se nalazi u tim podruĉjima. Gubitak aktivnosti DNaza se javlja pre no što se parenhimske ćelije transformišu u preneoplastiĉne, dok se iznenadni gubitak aktivnosti DNaza povezuje sa procesom formiranja i rasta tumora. Moguća hipoteza je da su nukleaze konstitutivno prisutne u sklopu odbrambenog mehanizma ćelije, u sluĉaju gubitka njhove aktivnosti, strane nukleinske kiseline (virusne) mogu postati deo genetskog materijala i indukovati neoplastiĉnu transformaciju tkiva. Smanjena aktivnost nukleaza u malignim tumorima je potvrĊena histohemijskim (312) i biohemijskim metodama (313), kao i imunohemijskim tehnikama. Postavlja se pitanje u kojim fazama nastanka i razvoja tumora nastaju promene aktivnosti pomenutih enzima. Henryk Tapel i sar. (314), su dokazali da se pad aktivnosti nukleaza javlja otprilike od 38 do 59 dana karcinogeneze izazvane N- nitrosomorfolinom, a da se njihova aktivnost kompletno gubi u hiperplastiĉnim nodulima i malignom tkivu kasnijih stadijuma tumora. Smanjenje aktivnosti DN-aza se primećuje ĉak i pre formirana benignih promena, te se ova pojava ne moţe definisati sekundarnim fenomenom tumora. TakoĊe,to nam dokazuje da gubitak njihove aktivnosti nije posledica dejstva karcinogena jer se javlja kasnije u toku Doktorska disertacija Andrej Veljković 94 kancerogeneze. Kod tumora jetre, gubitak njihove aktivnosti se pripisuje dejstvu inhibitora, a ne smanjenju ekspresije pomenutih enzima. Dokaz tome je postojanje povećane koncentracije inhibitora DNaza u tumorskom tkivu (315). Daust i Amano su još 1963. godine dokazali da je aktivnost DNaza smanjena kod više od 60 vrsta malignih tumora kod ljudi i ţivotinja (316). Ovo otkriće je potvrĊeno korišćenjem histohemijskih metoda za odreĊivanje aktivnosti alkalne i kisele DNaze u ne-nekrotiĉnim ćelijama malignih tumora digestivnog trakta (317). Sliĉan nedostatak aktivnosti alkalne i kisele DNaze bio je pronaĊen u malignim ćelijama tumora kod drugih vrsta eksperimentalne kancerogeneze kod pacova: bubrezima (318), digestivnom sistemu (319) i jetri (320). Nedostatak DNaza pojavio se u veoma ranim fazama kancerogeneze, pre pojave malignih ćelija, dokazujući da igraju vaţnu ulogu u mehanizmima maligne transformacije, i nisu samo sekundarni marker. Kod pacova i u ljudskom digestivnom sistemu, najniţa aktivnost DNaza je detektovana u epitelnim ćelijama velikog creva sluznice, najĉešćem mestu nastanka karcinoma (64 %), dok je najveći aktivnost alkalne i kisele DNaze pronaĊena u epitelnim ćelijama sluznice tankog creva, gde su karcinomi veoma retki (0,9 %) (321). Ova zapaţanja su dovela do hipoteze da je spontana pojava malignih tumora obrnuto proporcionalna aktivnosti alkalne i kisele DNaze u normalnim ćelijama iz kojih ovi tumori potiĉu. Histohemijske analize aktivnosti alkalne i kisele DNaze u ţarištima spontane nekroze malignih tumora su pokazali reaktivacija ovih enzima u ranim fazama nekroze . Razliĉita reaktiviracija DNaza moţe se videti na periferiji nekrotiĉnog ognjišta, dok u centralnoj površini takvog ţarišta izostala aktivnost ovih enzima, najverovatnije zbog inaktivacije autolitiĉkim procesima (322). Ova zapaţanja dokazuju da su razliĉiti mehanizmi ukljuĉeni u deficit alkalne i kisele DNaze u malignim tumorima i da je njihova smanjena aktivnost reverzibilan fenomen, verovatno nastao od prirodnih inhibitora ovih enzima. Postojanje takvih prirodnih inhibitora kod tumora sa malom aktivnošću DNaza je dokazano histohemijski, gde su obiĉno veoma aktivne alkalna i kisela DNaza u zdravom tkivu jetre pacova potpuno inhibirane nakon in vitro inkubacije u homogenatu hepatokarcinoma (322). Pošto izgleda da je reaktivacija DNaza povezana sa spontanom ili indukovanom nekrozom i regresijom tumora (322), jedinjenja koja reaktiviraju DNaze u tumorskim ćelijama bi trebalo da imaju odreĊen potencijal u terapiji tumora. Zaista, dokazano je da je vitamin K3 selektivno reaktivirao alkalnu DNazu u malignim Doktorska disertacija Andrej Veljković 95 tumorima, dok je vitamin C (askorbinska kiselina ili natrijum askorbat) iskljuĉivo reaktivirao kiselu DNazu (322). Upravo mešavine oba vitamina, data kao jedna intraperitonealna doza od 1 g / kg telesne mase vitamina C i 0,01 g / kg telesne mase vitamina K3 znaĉajno inhibiraju rast tumora kod miševa (323).Tretman sa kombinovanim vitamina C i K3 znaĉajno inhibira razvoj metastaza u plućima i limfnim ĉvorovima tumora koji je intramuskularno implantiran kod miševa (324). MeĊu razliĉitim mehanizmima koji mogu biti ukljuĉeni u zajedniĉki terapijski efekat vitamina C i K3 protiv rasta tumora, najverovatniji je da stimulacija redoks sistema koji proizvodi hidrogen peroksid i druge reaktivne vrste kiseonika koje su ukljuĉeni u proces lipidne peroksidacije ćelijske membrane, aktivaciju DNaza i oštećenja DNK dovode do ćelijske smrti (325). Šta više, najvaţnija ĉinjenica je da je ovo zajednićko dejstvo vitamina C i K3 selektivno na tumorske ćelije. Za razliku od normalnih organa i tkiva, ćelije raka su obiĉno deficijentne u katalaznoj aktivnosti, aktivnosti superoksid dismutaze i / ili glutation peroksidaze, koji ĉine antioksidativni kapacitet (326), što je u skladu i sa rezultatima našeg istraţivanja gde tumorsko tkivo ima signifikantno manju aktivnost katalaze. Ova hipotezaje podrţana ĉinjenicom da istovremena administracija vitamina C i K3 sa katalazom, je suprimirala terapijski efekat ovih vitamina. Štaviše, nikakva dodatna sistemska i organska toksiĉnost nije izazvana nakon administracije vitamina C i K3 (323). Efekat vitamina C i K3 na inhibiciju tumorskog rasta su da dovode do nekroze, apoptoze ili, kako je opisano od strane Gilloteauk i sar. (325), nove vrste ćelijske smrti koja se zove autošiza. 6.3.3 Apoptoza i prognoza kolorektalnog karcinoma. Najvaţnije prognostiĉke varijable kolorektalnog karcinoma su stadijum tumora i preoperativni nivo karcinoembrionalnog antigena (327). Nekoliko izveštaja ukazuje na to da kinetika ćelija tumora moţe biti vaţan prognostiĉki faktor kolorektalnog karcinoma (328). Rutinski su za predviĊanje razvoja tumora i njegovu prognozu korišćeni pre povećanje nivoa ćelijske proliferacije, nego li promene nivoa apoptoze. MeĊutim, na animalnom modelu, kao najbolji prediktor razvoja tumora se pokazao stepen apoptoze (329). Iako postoji opšta saglasnost da loša regulacija apoptoze doprinosi malignoj transformaciji, potencijalna prediktivna ili prognostiĉka vrednost stepena apoptoze kolorektalnog karcinoma je kontroverzna. Nekoliko studija je ispitalo prognostiĉki znaĉaj apoptotiĉnih indeksa u kolorektalnom karcinomu, Doktorska disertacija Andrej Veljković 96 dobijajući razliĉite rezultate (330,331). Schvandner i sar. su dokazali da apoptotiĉni indeks nije prediktor prognoze na seriji od 160 sluĉajeva karcinoma rektuma (332). MeĊutim, stratifikacija na osnovu mesta tumora je otkrila da je apoptotiĉni indeks bio nezavisni prediktor preţivljavanja u seriji od 82 distalna tumora (distalni do spleniĉne fleksure) (333). U dve studije, pokazano je da je nizak apoptotiĉni indeks u tumoru povezan sa lošim preţivljavanjem (331,334). Rezultati našeg istraţivanja nisu pokazali razlike u aktivnosti DNaza izmeĊu pacijenata sa razliĉitim stadijumima tumora. Za razliku od našeg istraţivanja, dva izveštaja pokazuju da su apoptotiĉni indeksi veći u tumorima koji su bili visoko diferentovani i bez metastaza nego kod onih koji su slabo diferentovani i invazivni ili sa metastazama (330,335). Tanako i sar. takoĊe su dokazali da su veći apoptotiĉni indeksi u tumorima bez zahvaćenosti limfnih ĉvorova ili udaljenih metastaza tumora u odnosu na one koje su metastazirali ali bez ikakve veze sa stepenom diferencijacije tumora (331). S druge strane, Hokins je pokazao da su pacijenti sa A Dukes-ovim stadijumom karcinoma imali manji apoptotiĉni indeks od stadijuma B do D karcinoma(336). Metastatska širenja, mogu zavisiti od otpora metastatske ćelije na apoptozu, u nekoliko animalnih i ljudskih ćelijskih linija tumora agresivniji metastatski fenotip je bio povezan sa povećanom otpornošću na apoptozu (337). Rezultati našeg istraţivanja nisu pokazali da viši stadijumi tumora imaju veću aktivnost DNaza, ali jesu imali veću ekspresiju antiapoptotiĉnog Bcl-2. Dve studije treba pomenuti kada se ovori o apoptozi u kolorektalnoj kancerogenezi. Većina kolorektalnih karcinoma koji spadaju u grupu naslednih ne polipoznih kolorektalnih karcinoma (HNPCC) i odreĊen procenat sporadiĉnih kolorektalnih karcinoma pokazuju poseban oblik genetske nestabilnosti, nazvane mikrosatelitska nestabilnost (MSI), što dovodi do akumulacije mutacija i delecija u ponavljajućim sekvencama (338,339). Za pacijente obolele od kolorektalnog tumora sa MSI fenotipom je poznato da imaju bolju stopu preţivljavanja od pacijenata sa tumorima bez ovog fenotipa. Pretpostavlja se da kolorektalni tumori sa MSI fenotipom razvijaju drugaĉiji put u odnosu na kolorektalni tumora bez ovog fenotipa, i da ovi tumori imaju povećanu stopu mutacije kao posledicu inaktivacija gena popravke nepodudaranja (340). TakoĊe je dokazano da apoptoza moţe biti izazvana povećanom ko-ekspresijom gena neusklaĊene popravke hMSH2 ili hMLH1, što ukazuje da tumori sa MSI fenotipom gube sposobnost da prolaze kroz efikasnu apoptozu (339). Zaĉudo, meĊutim, pokazano je kod dve grupe da je apoptotiĉna Doktorska disertacija Andrej Veljković 97 ćelijska smrt u stvari ĉešća kod kolorektalnog tumora sa MSI nego kod onih bez MSI (341). Uzeto zajedno, iako većina istraţivanja sugeriše da je kolorektalni tumor sa visokim apoptotiĉnim indeksom povezan sa boljom prognozom i preţivljavanjem, ipak je potrebno više istraţivanja pre nego se apoptotiĉni indeks moţe smatrati potencijalnim prognostiĉki markerom ili indikatorom za izbor terapije u kolorektalnoj neoplazmi. 6.4 Matriks metaloproteinaze u kolorektalnom karcinomu Za MMP-e se dugo mislio da doprinese tumorskom metastaziranju preko njihovih aktivnosti u procesu degradacije matriksa, ali poslednjih godina, studije su dokazale aktivnost MMP-za u gotovo svim fazama progresije tumora od poĉetnog razvoja tumora, rasta, angiogeneze, invazije, kao i metastaza i rasta na udaljenim mestima (342). Rezultati naših istraţivanja pokazuju statistiĉki znaĉajno, višestruko uvećanje aktivnosti matriks metaloproteinaze 9 (MMP-9) u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo, ali i u odnosu na tkivo koje neposredno okruţuje tumor. Tkivo koje okruţuje tumor ima statistiĉki znaĉajno povećanje aktivnosti MMP-9 u odnosu na zdravo tkivo kolona, ali ne u toj meri kao kod tumorskog tkiva. Matriks metaloproteinaze generalno razgraĊuju proteoglikane i matriksne glikoproteine. Ovaj proces remodelovanja ekstracelularnog matriksa je integralni deo normalnog tkivnog obnavljanja i diferencijacije. MeĊutim, neregulisana degradacija ekstracelularnog matriksa u procesu karcinogeneze moţe da dovede do prednosti tumorskim ćelijama u odnosu na zdrave ćelije. Gubitak integriteta bazalne membrane moţe da korelira sa povećanom verovatnoćom udaljenih metastaza i lošom prognozom (343). Postoji nekoliko naĉina na koji MMP-e mogu da povećaju stopu proliferacije ćelija tumora: pre svega, MMP-e mogu osloboditi prekursore nekih faktora rasta koji su vezani za ćelijsku membranu, i mogu uĉiniti bioraspoloţivim peptidne faktore rasta koji su zarobljeni od strane ECM proteina i štaviše, oni mogu da kontrolišu širenje signala integrinima (344). One takoĊe uĉestvuju u borbi protiv apoptoze tumorskih ćelija, oslobaĊanjem Fas liganda (FasL) (345). Da bi ćelija tumora mogla da nastavi da raste i da migrira u udaljene lokacije, formiranje novih krvnih sudova je Doktorska disertacija Andrej Veljković 98 osnovnih korak i mnoge studije sa endogenim i sintetiĉkim inhibitorima ukazuju centralnu ulogu MMP-za u ovom procesu (346). One mogu da favorizuju rast i neoangiogenezu jednostavnim eliminisanjem fiziĉke barijere putem degradacije ECM strukturnih komponenti, ili generacijom pro- angiogenetskih faktora. U stvari, dokazano je da razlaganje kolagena tip IV izlaţe vezujuće mesto od suštinskog znaĉaja za migraciju endotelnih ćelija povećavajući bioraspoloţivost pro-vaskularnih angiogenetskih endotelnih faktora rasta (347). Zaĉudo, MMP-9 moţe takoĊe umanjiti formaciju novih krvnih sudova kroz generisanje angiogenetskih inhibitora. U stvari, razgradnja plazminogena i degradacija bazalne membrane kolagena tipa KSVIII generišu endostatin i angiostatin, a oba molekula poseduju kapacitet inhibicije angiogeneze (348). Za migraciju i metastaziranje tumorskih ćelija, neophodno je da se probije nekoliko ECM barijera, i ćelijska migracija je ĉvrsto povezana sa proteolizom i zahteva dvosmernu interakciju izmeĊu ćelija i ECM (345). MMP-e uĉestvuju u svim dogaĊajima koji dovode do odvajanja ćelija tumora, invazije bazalne membrane i okolne strome i kolonizaciju novih mesta što je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde statistiĉki najveću aktivnost imaju oboleli od T2 stadijuma bolesti koji podrazumeva obolele sa lokalno invadiranim tkivom kolona. Tumorske ćelije moraju prvo da se odvoje od primarnog tumora: oslobadjanjem e-cadherina sa ćelijske površine i smanjenom regulacijom ćelija-ćelija adhezionih mehanizama (342). Štaviše, ćelije tumora se moraju odvojiti od ECM i susednih ćelija i MMP zavisna razgradnja adhezionih receptora ćelijskog matriksa moţe favorizovati ovaj proces (344). Poznato je da kancerske ćelije imaju sposobnost rezistencije i “bekstva“ od imunog nadzora i postaje oĉigledno da su MMP-e ukljuĉene u ove mehanizame izbegavanja (349). MMP-e mogu da takoĊe doprinose smanjenju ili povećanju infiltracije i migracija leukocita, ali mogu i vezati nekoliko hemokina (CXC 1 4-7 i 12), u nekim sluĉajevima, povećati njihovu aktivnost, dok je u drugim sluĉajevima mogu smanjiti (350). Za rast ćelija tumora u novim, udaljenim lokacijama neophodna je jaka interakcija izmeĊu malignih ćelija i tkiva strome domaćina. Iako ćelija tumora izraţava svoju ekspresiju MMP-a, postaje oĉigledno da se na ekspresijom MMP-a moţe uticati preko endotelnih ćelija, fibroblasta i takoĊe, leukocita (345). MMP-e izluĉene iz strome su vaţne u remodelovanju tkiva pod uticajem tumora, ne samo putem fiziĉke strukturne promene, ali takoĊe i još mnogo vaţnije, kroz oslobaĊanje i Doktorska disertacija Andrej Veljković 99 povećanje bioraspoloţivosti molekula koji mogu da unaprede rast tumora, angiogenezu i tumor ćelijsku migraciju (342). Dakle, povećana ekspresija MMP-za moţe biti deo multistepenog procesa kojim maligne ćelije mogu da se umnoţavaju i metastaziraju. Do sada je dokazano da su tri MMP-e u vezi sa kolorektalnim adenomom i karcinomom. MMP-2 (gelatinaza) je povezana sa degradacijom tipa IV kolagena. Povećana ekspresija je dokazana u karcinomu ţeluca, pankreasa i kolorektalnom karcinomu (351). MMP-7 (matrilisin) moţe imati funkciju u ranim fazama neoplastiĉnih rasta. Ovo je dokazano kod kolorektalnog adenoma u poreĊenju sa normalnom sluznicom i mišjim modelom crevnih neoplazija (352). Skorašnji podaci su sugerisali da je povećan nivo MMP-9 (gelatinase B) u kolorektalnom karcinomu u poreĊenju sa normalnom sluznicom povezan sa znatno kraćim relapsom i ukupnim preţivljavanjem (353). Rezultati našeg istraţivanja su u skladu sa literaturnim podacima, jer tumorsko tkivo ima signifikantno mnogostruko veću aktivnost u odnosu na zdravo tkivo kolona, ali i tkivo koje okruţuje tumor. Najveću aktivnost su imali pacijenti sa T2 stadijumom tumora, što govori u prilog tezi da MMP-9 najveću ulogu ima u procesu lokalne invazije tkiva. Korelacija ovih degradativnih snaga u kolorektalnoj sluznici, adenomu i karcinomu još uvek nije potpuno shvaćena u kolorektalnoj neoplaziji. Konkretno, prekomerna ekspresija MMP-7 je poĉetni dogaĊaj u kancerogenoj kaskadi, tokom promene normalna sluznica ka adenomu. Kada adenom stekne mogućnost da postane invazivni adenokarcinom, MMP-7 su i dalje povišene, ali i MMP-2 i MMP-9 su povećano eksprimirane. Ovo moţe omogućiti invaziju ćelija tumora ili pojavu rasta novih krvnih sudova. Epitelni tumori se sastoje od tumorskih ćelija i okolne strome. Mesto ekspresije MMP-a i aktiviranja tumora izgleda da se razlikuje u zavisnosti od vrste MMP-e. Biološki, ekspresija MMP-a moţe biti indikacija procesa suštinskog za tumorske ćelije ili normalne okolne stromalne ćelije da indukuju eksprimiranje ili luĉenje MMP-a. Za MMP-9 je dokazano da je eksprimiranau stromi u okolini tumora (354), što moţe biti reakcija na MMP-7 i druge posrednike koji mogu da podstaknu ekspresiju MMP-9 (Slika 15). Ovaj proces regrutovanja normalnih stromalnih ćelija koje okruţuju ćelije tumora za proizvodnju MMP-a je vaţan mehanizam kojim se Doktorska disertacija Andrej Veljković 100 proteoliza i kasnije invazija mogu javiti. Svalou i sar.(355) su u elegantnoj in vitro studiji, ocenili linije kolorektalnog karcinoma sa i bez metastatskog potencijala, i njihovu sposobnost da podstaknu monocite u proizvodnji MMP-2 i MMP-9. Svaka od ćelijskih linija je tretirana monocitima i pritom je merena aktivnost MMP-2 i MMP- 9. Ni jedna MMP-a nije proizvedena od strane ćelije karcinoma debelog creva. Ova studija je pokazala da linije kolorektalnog karcinoma sa metastatskim potencijalom imaju sposobnost da podstaknu aktivnost MMP-2 i MMP-9 u stromi monocita, što je u skladu sa rezultatima našeg istraţivanja gde tkivo koje okruţuje tumor ima signifikantno povećanu aktivnost MMP-9 u odnosu na zdravo tkivo kolona. Slika 15. Ekspresija matriks metaloproteinaza i progresija tumora od normalne mukoze Kod nekoliko vrsta tumora je prouĉavana korelacija ekspresije MMP-a sa preţivljavanjem pacijenata. Zeng i sar. (353) su evaluirali odnos ekspresije MMP-9 Northern blot analizom u normalnoj sluzokoţi i karcinomima i korelirali ovaj pokazatelj sa relapsom i reemisijom pacijenata. UtvrĊeno je da je povećanje ekspresije znaĉajno u vezi sa Djuks-ovom fazom i prisustvom udaljenih metastaza u vreme prezentacija. TakoĊe MMP-e su nezavisan prognostiĉki faktor povezan sa smanjenjem reemisije. To je u skladu sa rezulatima našeg istraţivanja gde sa stadijumom tumora raste aktivnost MMP-9, meĊutim najveću aktivnost su imali pacijenti sa T2 i T3 stadijumima bolesti, što moţe biti povezano sa intenzivnim procesom lokalnog rasta tumora i predstavlja dokaz ukljuĉenosti MMP-9 u proces remodelovanja ekstracelularnog matriksa, pre nego li samog procesa metastaziranja. Dokumentovana je i uspešna upotreba MMP inhibitora u laboratoriji. Nekoliko kliniĉkih studija procenjivalo je njhovu efikasnost u kliniĉkim istraţivanjima. Brend i Doktorska disertacija Andrej Veljković 101 sar. (356) procenjuju ulogu adenoviralne transfekcije tkivnog inhibitora MMP-a (TIMP-2) u inhibiciji metastaza kolorektalnog karcinom u jetri. Oni su koristili visoko metastatske ćelijske linije (LS174T), za koje je dokazano da primarno luĉe MMP-9. Transfekcija TIMP-2 u jetru pre ili posle inokulacije tumora, smanjila je tumorsko opterećenje za 95% i 77%. Smanjenja proliferacije i povećanje apoptoze su takoĊe primećeni, što se moţe dovesti u vezu sa antiapoptotskim dejstvom MMP-9. Iz rezultata našeg istraţivanja se takoĊe moţe izvući veza izmeĊu MMP-9 i nivoa apoptoze, gde visoka aktivnost MMP-9 moţe da dovede do inhicije apoptoze. 6.5 Metabolizam purinskih nukleotida u kolorektalnom karcinomu Adenozin dezaminaza (ADA) je enzim purinskog metabolizma koji je široko rasprostranjen u tkivima i relativno visok nivo enzima se nalazi i u resicama epitelnih ćelija digestivnog trakta. Mnoge studije su dokazale promene aktivnosti ADA u tumorskom tkivu i serumu pacijenata sa tumorom pluća, glave i vrata, dojke i tumora ovarijuma (357). Kod tumora postoji povećan rast tumorskih ćelija koji je povezan sa rastom aktivnosti enzima purinskog metabolizma. ADA je naroĉito osetljiva na faktore rasta i citokine tokom intenzivne proliferacije tkiva (358). Znaĉajan broj studija je dokazao rast aktivnosti ADA kod brzorastućih tumora, dok kod tumora koji sporo rastu sa visokim stepenom diferencijacije ADA nije eksprimirana (359). Rezultati naših istraţivanja pokazuju signifikantno višu aktivnost adenozin dezaminaze u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona. Ovi rezultati verovatno odraţavaju promene u metabolizmu purina zbog rasta prometa DNK u kancerogenim tkivima. Ubrzanje ovog puta daje selektivnu prednost kancerogenim ćelijama da rastu i da se brţe razvijaju. Metaboliĉki i anaboliĉki procesi purina i pirimidina su intenzivirani kod kancerskih ćelija i to se manifestuje promenjenom aktivnošću jednog broja enzima, izmeĊu ostalih adenozin dezaminaze. Visok nivo aktivnosti ADA moţemo interpretirati kao kompenzatorni mehanizam tumora protiv visoko toksiĉnih adenozina, deoksiadenozina, i njegovih derivata, dADP i dATP, koji su potentni inhibitori ribonukleotidne reduktaze, limitirajućeg enzima u biosintezi nukleinskih kiselina (360,361), ĉija aktivnost moţe biti 755 puta veća kod tumorskog nego li kod normalnog tkiva debelog creva (362). Doktorska disertacija Andrej Veljković 102 Ĉvrsti tumori su obiĉno u ozbiljnoj hipoksiji i nekrozi zbog brzog rasta ćelija. Hipoksija u tumorima je prvenstveno patofiziološka posledica strukturno i funkcionalno poremećene mikrocirkulacije i loših uslova difuzije (363). Hipoksija tumora je snaţno povezana sa rastom tumora, malignom progresijom i otpornošću na terapiju (363). Hipoksija je jedan od razloga zašto maligni tumori više ne obavljaju funkcije neophodne za ćelijsku homeostazu, kao što su odgovarajuća proizvodnja ATP, što za posledicu ima degradaciju adenin nukleotida i oslobaĊanje adenozina. Adenozin se akumulira u visokim koncentracijama u solidnim tumorima, ispoljavajući niz efekata koji mogu ići u prilog tumorskom rastu, kao što su zaštita od ishemije, stimulacija rasta i angiogeneze i inhibicija sinteze citokina. Neki autori stoga zakljuĉuju da je adenozin glavni faktor promocije rasta tumora (364). Iako su direktni efekti adenozina na rast ćelija in vitro kontroverzni (365,366), postoje znaĉajni dokazi da ekstracelularni adenozin, bilo na parakrini ili autokrini naĉin, moţe promovisati rast tumora na nekoliko naĉina (367). Prvo, zna se da adenozin ima citoprotektivne efekte na rast nekoliko ćelijskih linija i da in vitro povećava rast tumorskih ćelija (368,370). Zatim, raspoloţivi podaci snaţno podrţavaju ulogu adenozina kao stimulatora angiogeneze (371,373). Treće, adenozin ima ulogu u supresiji inflamatornog i ćelijskog imunog odgovora i doprinosi formiranju tzv. tumorske imunološke barijere (373). TakoĊe moţe uĉestvovati u signalnoj transdukciji preko sprecifiĉnih adenozinskih receptora, koji dovode do promena u adenil ciklaznom sistemu i aktivnosti PLC (374). U pokušaju da objasne ove rezultate mnogi autori predlaţu da visoka aktivnost ADA pored toga što igra ulogu preţivljavanju tumora, moţe biti kompenzatorni mehanizam protiv toksiĉne akumulacije svojih supstrata, tj. adenozina. Postoje mnogi mogući izvori adenozina u tumorskim ćelijama, ukljuĉujući ubrzani metabolizam purina i pirimidina, ćelijsku smrt i degradaciju nukleotida, ishemiju i razlaganje ATP, oslobaĊanje AMP i hidrolize S- adenosil homocisteina. Ĉini se da je ovo sekundarni fenomen, koji odraţava snaţno ubrzanje prometa purina i salvage puteve aktivnosti metabolizma povezanog sa proliferacijom tkiva. Natsumeda i sar. su jos 1984. godine objavili da povišena aktivnost de novo enzima iz biosinteze purina i visoke aktivnosti “salvage” enzima bi trebalo da obezbede veću sposobnost biosinteze purina u KRK (362). TakoĊe su naglasili da potpuna blokada de novo puta ne moţe biti uspešna u hemoterapiji, zbog visokog “salvage” kapaciteta Doktorska disertacija Andrej Veljković 103 enzima KRK. Sliĉna zapaţanja ukazuju da su povećane aktivnosti de novo i “salvage” enzima biosinteze pirimidina dokazane u KRK (375). Ten Kate i sar. (376) su dokazali da je povećana aktivnost ADA kod tumora u odnosu na normalno tkivo. MeĊutim, u njihovoj studiji, nije bilo korelacija izmeĊu bilo kog od histopatoloških parametara i nivoa ADA. Podaci u vezi sa progresijom raka sugerišu da se nivoi ADA u tumorskim tkivima se smanjuje sa fazom tumora. Naši rezultati su u suprotnosti sa rezultatima Sanfilipa i sar. koji su dokazali da su nivoi ADA obrnuto proporcionalni fazi tumora, odnosno da su niski nivoi ADA kod bolesnika sa naprednim tumorima. Neki podaci ukazuju da ADA nije ukljuĉena direktno u kancerogenezu, ali da ima metaboliĉku ulogu u podrţavanju brzog rasta odgovarajućih tkiva, reutilizacijom nukleozida, koji se odnose kao RNK i DNK prekursori. Leĉenje karcinoma debelog creva ćelija deoksiformicinom, inhibitorom ADA, rezultiralo je inhibicijom rasta ćelija (377). Povećana aktivnost ADA je vezana za smanjenje ili deficijenciju ADA kompleksa proteina (ADBP), dimernog glikoproteina lokalizovanog u normalnoj sluzokoţi kolona (378). Progresivna tranzicija normalnog kolorektalnog epitela ka adenomu ili karcinomu je povezana sa nizom genetskih promena vezanih ne samo za proliferaciju već i apoptozu, koja ukljuĉuje aktivaciju onkogena i gubitak tumor supresornih gena (379). Ispitivanje gena sposobnih za regulisanje programirane ćelijske smrti kao što su p53 i Bcl porodice gena, dovodi do zakljuĉka da visoka ekspresija p53 i Bcl-2 ukazuje na visok stepen displazije sa gorim ishodom ili da indukcija p53 moţe inhibisati supresivni efekat novih antikancerogenih molekula. Najnoviji podaci ukazuju na znaĉajnu vezu izmeĊu aktivnosti ADA-e i regulacije programirane ćelijske smrti. Dokazano je da nedostatak ADA-e izaziva apoptotski proces zavisan od p53, kao i da je uvoĊenje p53 mutanata dovelo do višestruko povećane aktivnosti ADA-e. Uloga povišene ekspresije Bcl-2 u spreĉavanju apoptoze odnosi se na interakciju sa dATP, proizvodom koji se akumulira u odsustvu aktivnosti ADA (380, 381). 5' - Nukleotidaza (EK 3.1.3.5 .) (5' - NT) je još jedan enzim koji uĉestvuje u metabolizmu nukleotida. Ona generiše nukleozide iz raznih tipova nukleotida . Iako je u nekim studijama dokazano da je aktivnost ovog enzima smanjena u tkivima i ćelijama tumora (382, 383), neki istraţivaĉi su otkrili i visoku aktivnost 5' - NT u kancerskom tkivu u odnosu na okruţujuće normalno tkivo (384, 385). Doktorska disertacija Andrej Veljković 104 Aktivnost 5' -NT je odreĊivana u cilju procene enzima koji razgraĊuju mononukleotide do nukleozida. Iako su Sanfilippo i sar. izvestili da ne postoji znaĉajna razlika u aktivnosti 5'-NT izmeĊu tumorskog i zdravog kolorektalnog tkiva, u studiji Eroglua i sar. aktivnost 5' - NT u tumorskom tkivu bila je znatno veća nego uzdravom tkivu kolona. Štaviše, oni su ustanovili da je njen nivo u korelaciji sa stadijumom tumora. Rezultati našeg istraţivanja ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu promenu aktivnosti 5'-NT u tumorskom u odnosu na zdravo tkivo kolona i u odnosu na tkivo koje neposredno okruţuje tumor. Rezultati Vannonia i sar. takoĊe pokazuju znaĉajan porast u aktivnosti ekto 5' - NT (oko 50 %) u tumorskom tkivu. Rast aktivnosti povećava proizvodnju adenozina i njegovu dostupnost za interakciju sa G – protein receptorima na površini ćelije, podiţući nivo cAMP, koji je veoma znaĉajan za stimulisanje rasta ćelija kod neoplastiĉnih tkiva. Aktivnost ekto 5'- NT varira u malignim ćelijama. Raste kod karcinoma dojke, ţeluca, pankreasa i drugih ĉvrstih karcinoma, dok je ekspresija enzima niska u limfocitima, granulocitima, timocitima i hematopoetskim prekursorima ćelija (386). Treći enzim koji ima vaţnu ulogu u metabolizmu purina je ksantin oksidaza (XO, EK 1.2.3.2 ). Ona katalizuje reakciju konverziju hipoksantina u ksantin i ksantina do mokraćne kiseline, poslednje reakcije u katabolizmu purina, uz nastanak sporednog toksiĉnog produkta superoksid anjon radikala. U tom smislu, to je kljuĉni enzim koji povezuje metabolizam purina i slobodnih radikala. Postoji sve više dokaza da su superoksid radikali generisani od strane XO prvenstveno odgovorni za razgradnju ćelija povezanu sa nekoliko uslova. Dok je u nekim studijama aktivnosti enzima povećana (387), rezultati istraţivanja uglavnom dokazuju da je smanjena u razliĉitim neoplastiĉnim tkivima (388-340). Rezultati našeg istraţivanja pokazuju povećanu aktivnost XO u tumorskom u odnosu na zdravo tkivo kolona, ali i u odnosu na tkivo koje okruţuje tumor. Tkivo koje okruţuje tumor nije imalo statistiĉki znaĉajne razlike u aktivnosti enzima u odnosu na zdravo tkivo kolona. Kokoglu i sar. (387) su dokazali veću aktivnost XO u tumoru mozga i sugerisali da se nivoi XO u tkivu mozga mogu koristiti kao biohemijski markeri za diferencijaciju tkiva tumora od normalnog tkiva. MeĊutim, više autora je pronašlo niţe aktivnosti XO u kancerogenim tkivima (388). Aktivnost XO je manja u svim hepatomima nezavisno od stope rasta ili diferencijacije (391). Konaĉno, Veber i sar. (390) su objavili smanjen nivo aktivnosti XO kod sporo i brzo rastućih ljudskih kserografta karcinoma Doktorska disertacija Andrej Veljković 105 debelog creva. Uzeti zajedno, rezultati pokazuju da je aktivnost XO smanjena u mnogim kanceroznim tkivima, prouĉavanim do sada. Evaluacija prognostiĉkog znaĉaja nivoa XOR kod kolorektalnog karcinoma otkrila je da su pacijenti ĉije su tumorske ćelije izgubile imunoreaktivni XOR protein, imali za 70 % veći rizik umiranja od karcinoma debelog creva u poreĊenju sa onima ĉiji je tumor visoko ili umereno eksprimirao XOR. U multivarijacionim analizama preţivljavanja pacijenata, ekspresija XOR je u znaĉajnoj meri povezana sa specifiĉnim preţivljavanjem bolesnika ĉak i nakon korekcije za konvencionalne varijable kao što su Djuksova faza, histološki nivo diferentovanosti, lokacija tumora i starost pri dijagnozi. Izgleda da postoji korelacija izmeĊu povećane ekspresije XOR i markera enterocitne diferencijacije kod Caco-2 ćelija. Ova ćelijska linija pruţa mogućnost ispitivanja ekspresije XOR u vezi sa stepenom ćelijske diferencijacije (392). Postoje znaĉajni dokazi o ulozi XO u nekim ţivotinjskim eksperimentalnim modelima ulceroznog kolitisa i Kronove bolesti debelog creva, za koje se zna da su prekanceroze karcinoma debelog creva (393,394). Moguće je da bazalni nivoi XO (kada se konvertuju iz XDH), u prisustvu drugih izvora oksidativnog i nitrozativnog stresa kod kolitisa, doprinose razvoju bolesti, ĉak i u odsustvu jasne ushodne regulacije XO kod pacijenata. Povećane aktivnosti XO kod pacijenata obolelih od kolorektalnog karcinoma u našoj studiji sugeriše da nivo oksidativnog stresa moţe biti povećan kod kancerogenih procesa, i da moţe uticati na tok bolesti. Eksplozija RVK posredovanih XO u kancerogenim tkivima moţe biti izazvana velikim povećanjem stvaranja supstrata, koji se javlja kao posledica ubrzanog metabolizma nukleotida tokom procesa rasta tumora. Konverzija XOD u XO moţe biti posledica proteolitiĉkog razlaganja enzima. Degradacija ksantina posredovana ćelijskim i ekstracelularnim proteazama, za koje je već dokazano da se povećano eksprimiraju u tumorskom tkivu, takoĊe dovodi do stvaranja vodonik peroksida i hidroksilnih radikala. Stimulisana generacija RVK je potencijalno odgovorna za poremećaj ćelijske membrane i lipidnu peroksidaciju i dovodi do oštećenja tkiva i/ili organa. Povećana aktivnost XO u našem istraţivanju moţe donekle objasniti šta je izvor tako snaţnog generisanja slobodnih radikala, koje svoje konsekvence ima u dokumentovanoj oksidativnoj modifikaciji proteina i lipida u vezi sa povećanim nivoom TBARS i AOPP u tumorskom tkivu koji predstavljaju markere oksidativnog oštećenja. Doktorska disertacija Andrej Veljković 106 7 │ Zakljuĉak nalizom dobijenih rezultata mogu se izvesti sledeći zakljuĉci: 1. Oksidativni stres je aktivno ukljuĉen u patogenezu kolorektalnog karcinoma, što se ogleda kroz porast nivoa lipidne peroksidacije i oksidativne modifikacije proteina, kao i smanjenje aktivnosti antioksidativnog enzima katalaze. Tkivo koje neposredno okruţuje tumor takoĊe ima povećane nivoe lipidne peroksidacije i oksidativne modifikacije proteina. Viši stadijumi tumora su imali veći nivo oksidativnog stresa u odnosu na poĉetne stadijume tumora. 2. Kvantitativna ekspresije NF-κB, kao transkripcionog faktora ukljuĉenog u regulaciju gena koji utiĉu na stepen nivoa apoptoze i proliferacije, u tumorskom tkivu je povećana u odnosu na zdravo tkivo kolona. Tkivo koje neposredno okruţuje tumor takoĊe ima veću ekspresiju u odnosu na zdravo tkivo kolona. Najteţi stadijumi tumora imaju veću ekspresiju NF- κB u odnosu na ostale stadijume bolesti. 3. Nivo apoptoze u tumorskom tkivu, izraţen kroz kvantitativnu ekspresiju Bcl-2 i Bax proteina, kao i DNK fragmentaciju merenu kroz aktivnost alkalne i kisele DNaze je smanjen u odnosu na zdravo tkivo kolona i okolno zdravo tkivo. Tkivo koje neposredno okruţuje tumor ima smanjen nivo apoptoze u odnosu na zdravo tkivo kolona. Ne postoji statistiĉka razlika u nivou apoptoze u odnosu na stadijum tumora. 4. Nivo proliferacije u tumorskom tkivu u odnosu na zdravo tkivo kolona i tkivo koje okruţuje tumor, izraţen kroz produkciju MMP-9 i aktivnost enzima purinskog metabolizma (adenozin dezaminaza, 5´ nukleotidaza i A Doktorska disertacija Andrej Veljković 107 ksantin oksidaza) je povećan u odnosu na zdravo tkivo kolona. Tkivo koje neposredno okruţuje tumor ima povećanu aktivnost enzima, markera proliferacije, u odnosu na zdravo tkivo kolona. Stadijum tumora gde tumor ispoljava lokalnu agresivnost ima najveću aktivnost MMP-9, dok ne postoji statistiĉki znaĉajna razlika u aktivnosti enzima purinskog metabolizma u odnosu na stadijum oboljenja. Rana detekcija kolorektalnog karcinoma nameće sagledavanje znaĉaja novih mogućih markera. Sagledavanje relacije enzimskih markera, proteomike i genomike, markera neovaskularizacije i proliferacije, ćelijskog preţivljavanja, oksidativnog stresa, proteolize, inflamacije i apoptoze u tumorskom tkivu moţe dati doprinos u pronalaţenju biomarkera koji bi omogućio lakšu procenu teţine bolesti, odreĊivanja margina tokom operacije ali i odabira odgovarajuće postoperativne hemio- i radio- terapije. Komparativna analiza sa tkivom u neposrednom okruţenju, potencijalno potentnim za proliferaciju, kao i udaljenim zdravim tkivom mukoze kolona, koje bi predstavljalo odgovarajuću kontrolu, omogućilo je da se proliferativno-apoptotiĉni potencijal malignog procesa sagleda u kontekstu odgovarajućeg zdravog tkiva, kao i da se ukaţe na mogućnost invazije tumora, tj da se ustanovi u kom pravcu adaptabilna sposobnost tkiva više progredira: ka aktivaciji proliferacije i preţivljavanja ili inhibicije apoptoze, što moţe biti od znaĉaja pri odreĊivanju margina pri operativnom uklanjanju tumora, zatim pri kreiranju individualne terapijske strategije inoperabilnih stanja ili moguce predikcije ka pojavi metastaza. Korelacijom sa patohistološkim nalazom, stadijumom tumora kao i drugim kliniĉkim karakteristikama svakog pacijenta bi omogućila precizniju procenu invazivnosti i agresivnosti tumora ali i odabir odgovarajuće terapije. Doktorska disertacija Andrej Veljković 108 8 │ Literatura 1. Ponz de LM, Di GC. Pathology of colorectal cancer. Dig. Liver Dis. 2001; 33(4):372-388 2. www.cancer.gov 3. Mitchell RJ, Farrington SM, Dunlop MG, Campbell H. Mismatch repair genes hMLH1 and hMSH2 and colorectal cancer: a HuGE review. Am. J. Epidemiol 2002; 156(10):885-902. 4. Dunlop MG, Farrington SM, Nicholl I, Aaltonen L, Petersen G, Porteous M, Carothers A. Population carrier frequency of hMSH2 and hMLH1 mutations. Br. J. Cancer 2000;83(12):1643-1645. 5. Aarnio M, Sankila R, Pukkala E. Cancer risk in mutation carriers of DNA- mismatch-repair genes. Int. J. Cancer 1999; 81(2):214-218. 6. Millar AL, Pal T, Madlensky L, Sherman C, Temple L, Mitri A et al. Mismatch repair gene defects contribute to the genetic basis of double primary cancers of the colorectum and endometrium. Hum. Mol. Genet. 1999;8(5):823-829. 7. Diergaarde B, van Geloof WL, van Muijen GN, Kok FJ, Kampman E. Dietary factors and the occurrence of truncating APC mutations in sporadic colon carcinomas: a Dutch population-based study. Carcinogenesis 2003;24(2):283-290. 8. Senda T, Iizuka-Kogo A, Onouchi T, Shimomura A. Adenomatous polyposis coli (APC) plays multiple roles in the intestinal and colorectal epithelia. Med. Mol. Morphol 2007;40(2):68-81. 9. Segditsas S, Tomlinson I. Colorectal cancer and genetic alterations in the Wnt pathway. Oncogene 2006;25(57):7531-7537. 10. Olschwang S, Serova-Sinilnikova OM, Lenoir GM, Thomas G. PTEN germ-line mutations in juvenile polyposis coli. Nat. Genet 1998; 18(1):12-14. 11. Howe JR, Bair JL, Sayed MG, Anderson ME, Mitros FA, Petersen GM et al. Germline mutations of the gene encoding bone morphogenetic protein receptor 1A in juvenile polyposis. Nat. Genet. 2001;28(2):184-187. Doktorska disertacija Andrej Veljković 109 12. Gustafson S, Zbuk KM, Scacheri C, Eng C. Cowden syndrome. Semin. Oncol. 2007;34(5):428-434. 13. McGarrity TJ, Kulin HE, Zaino RJ. Peutz-Jeghers syndrome. Am. J. Gastroenterol 2000;95(3):596-604. 14. Xu Y, Pasche B. TGF-beta signaling alterations and susceptibility to colorectal cancer. Hum. Mol. Genet. 2007;16 Spec No 1:R14-R20. 15. Laken SJ, Petersen GM, Gruber SB, Oddoux C, Ostrer H, Giardiello FM et al. Familial colorectal cancer in Ashkenazim due to a hypermutable tract in APC. Nat. Genet. 1997;17(1):79-83. 16. White S, Bubb VJ, Wyllie AH. Germline APC mutation (Gln1317) in a cancer- prone family that does not result in familial adenomatous polyposis. Genes Chromosomes Cancer 1996;15(2):122-128. 17. Chen SP, Tsai ST, Jao SW, Huang YL, Chao YC, Chen YL et al. Single nucleotide polymorphisms of the APC gene and colorectal cancer risk: a case- control study in Taiwan. BMC Cancer 2006;6:83. 18. Al-Tassan N, Chmiel NH, Maynard J et al. Inherited variants of MYH associated with somatic G:C-->T:A mutations in colorectal tumors. Nat. Genet. 2002;30(2):227-232. 19. Sieber OM, Lipton L, Crabtree M. Multiple colorectal adenomas, classic adenomatous polyposis, and germ-line mutations in MYH. N. Engl. J. Med 2003; 348(9):791-799. 20. Kury S, Buecher B, Robiou-du-Pont S et al. The Thorough Screening of the MUTYH Gene in a Large French Cohort of Sporadic Colorectal Cancers. Genet. Test 2007. 21. Ilyas M, Straub J, Tomlinson IP, Bodmer WF. Genetic pathways in colorectal and other cancers. Eur. J. Cancer 1999;35(14):1986-2002. 22. Weitz J, Koch M, Debus J, Hohler T, Galle PR, Buchler MW. Colorectal cancer. Lancet 2005;365(9454):153-165. 23. Martin ES, Tonon G, Sinha R et al. Common and distinct genomic events in sporadic colorectal cancer and diverse cancer types. Cancer Res. 2007;67(22):10736-10743 24. Souglakos J. Genetic alterations in sporadic and hereditary colorectal cancer: implementations for screening and follow-up. Dig. Dis. 2007;25(1):9-19. 25. Silverber E. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 1985;35(1):19-35. 26. Boyle P. and Lagman JS. ABC of colorectal cancer:Epidemiology. MBJ 2000;321(7264):805-808. Doktorska disertacija Andrej Veljković 110 27. Gill C, And I. Rowland. Diet and cancer: assessing the risk. Br. J. Nutr. 2002;88(1):73-87. 28. Willett W. Dietary fat intake and cancer risk: a controversial and instructive story. Semin. Cancer Biol. 1998;8(4):245-253. 29. Howe GR, Benito E, Castelleto R, Cornée J, Estève J, Gallagher RP et al. Dietary intake of fiber and decreased risk of cancers of the colon and rectum: evidence from the combined analysis of 13 case-control studies. J. Natl. Cancer Inst. 1992;84(24):1887-1896. 30. Frentzel-Beyme R. and Chang Claude. Vegeterian diets and colon cancer:The Germa experience. Am. J. Clin. Nutr. 1994;59(5):1143S-52S. 31. MacLennan R, Macrae F, Bain C, Battistutta D, Chapuis P, Gratten H et al. Randomized tria; of intake of fat, fiber and beta carotene to prevent colorectal adenomas. The Australian Polyp Prevention Project. J. Natl. Cancer Inst. 1995;87(23):1760-1766. 32. Schatzkin A, Lanza E, Corle D, Lance P, Iber F, Caan B et al. Lack of effect of a low-fat, high-fiber diet on the rcurrence of colorectal adenomas. Polyp Prevention Trial Study Group. N. Engl. J. Med. 2000;342(16):1149-1155. 33. Sitas, F, Madhoo, J. and Wessie, J. Incidence of histologically diagnosed cancer in South Africa 1993-1995. Nacional registry of South Africa, SA Institute for Medycal research. South Africa.1998. 34. Schottenfeid, D. Epidemiology In Cancer of the Colon, Rectum and Anus. A.W. Cohen, S.J. Winawer, M.A. Friedman and L.L. Gunderson, eds. (New York, USA: McGraw-Hill Inc.) 1995;11-24. 35. Winawer S, Fletcher R, Rex D, Bond J, Burt R, Ferrucci J et al. Colorectal cancer screening and surveillance: clinical guidelines and rationale-Update based on new evidence. Gastroenterology 2003;124(2):544-560. 36. Rex DK, Kahi CJ, Levin B, Smith RA, Bond JH, Brooks D et al. Guidelines for colonoscopy surveillance after cancer resection: a consensus update by the American Cancer Society and the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer. Gastroenterology 2006;130(6):1865-1871. 37. Bouvier AM, Latournerie M, Jooste V, Lepage C, Cottet V, Faivre J. The lifelong risk of metachronous colorectal cancer justifies long-term colonoscopic follow-up. Eur. J. Cancer 2008; 44(4):522-527. 38. Enblad P, Adami HO, Glimelius B, Krusemo U, Pahlman L. The risk of subsequent primary malignant diseases after cancers of the colon and rectum. A nationwide cohort study. Cancer 1990;65(9):2091-2100. Doktorska disertacija Andrej Veljković 111 39. Hoar SK, Wilson J, Blot WJ, McLaughlin JK, Winn DM, Kantor AF. Second cancer following cancer of the digestive system in Connecticut, 1935-82. Natl. Cancer Inst. Monogr. 1985;68:49-82. 40. Slattery ML, Mori M, Gao R, Kerber RA. Impact of family history of colon cancer on development of multiple primaries after diagnosis of colon cancer. Dis. Colon Rectum 1995;38(10):1053-1058. 41. Teppo L, Pukkala E, Saxen E. Multiple cancer-an epidemiologic exercise in Finland. J. Natl. Cancer Inst 1985;75(2):207-217. 42. Butterworth AS, Higgins JP, Pharoah P. Relative and absolute risk of colorectal cancer for individuals with a family history: a meta-analysis. Eur. J. Cancer 2006; 42(2):216-227. 43. Xie J and Itzkowitz SH. Cancer in inflammatory bowel disease. World J. Gastroenterol 2008;14(3):378-389. 44. Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut 2001;48(4):526-535. 45. von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. The risk of cancer in patients with Crohn's disease. Dis Colon Rectum 2007;50(6):839- 855. 46. Food, Nutrition, Physical Activity and the Prevention of Cancer. American Institute for Cancer Research, World Cancer Research Fund. 2007. 47. Ryan-Harshman M, Aldoori W. Diet and colorectal cancer: Review of the evidence. Can. Fam. Physician 2007;53(11):1913-1920. 48. Toriola AT, Kurl S, Laukanen JA, Mazengo C, Kauhanen J. Alcohol consumption and risk of colorectal cancer: the Findrink study. Eur. J. Epidemiol. 2008;23(6):395-401. 49. Ferrari P, Jenab M, Norat T, Moskal A, Slimani N, Olsen A et al. Lifetime and baseline alcohol intake and risk of colon and rectal cancers in the European prospective investigation into cancer and nutrition (EPIC). Int. J. Cancer 2007; 121(9):2065-2072. 50. Botteri E, Iodice S, Raimondi S, Maisonneuve P, Lowenfels AB. Cigarette smoking and adenomatous polyps: a meta-analysis. Gastroenterology 2008; 134(2):388-395. 51. Baron JA, Cole BF, Sandler RS. A randomized trial of aspirin to prevent colorectal adenomas. N. Engl. J. Med. 2003;348(10):891-899. 52. Sandler RS, Halabi S, Baron JA, Budinger S, Paskett E, Keresztes R et al. A randomized trial of aspirin to prevent colorectal adenomas in patients with previous colorectal cancer. N. Engl. J. Med. 2003;348(10):883-890. Doktorska disertacija Andrej Veljković 112 53. Bertagnolli MM, Eagle CJ, Zauber AG, Redston M, Solomon SD, Kim Ket al. Celecoxib for the prevention of sporadic colorectal adenomas. N. Engl. J. Med. 2006; 355(9):873-884. 54. Baron JA, Sandler RS, Bresalier RS, Quan H, Riddell R, Lanas A et al. A randomized trial of rofecoxib for the chemoprevention of colorectal adenomas. Gastroenterology 2006;131(6):1674-1682. 55. Chan AT, Giovannucci EL, Meyerhardt JA, Schernhammer ES, Wu K, Fuchs CS. Aspirin dose and duration of use and risk of colorectal cancer in men. Gastroenterology 2008;134(1):21-28. 56. Guo M,Hay BA. Cell proliferation and apoptosis. Curr. Opin. Cell Biol. 1999;6:745-752. 57. Takano Y, Saegusa M, Ikenaga M, Mitomi H & Okayasu I. Apoptosis of colon cancer:comparison with Ki-67 proliferative activity and expression of p53. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1996:166-170. 58. Levine DS and Haggitt RC. Normal histology of the colon. Am. J. Surg. Pathol. 1989;11:966-984. 59. Potten CS and Loeffler M. Stem cells: attributes, cycles, spirals, pitfalls and uncertainties.Lessons for and from the crypt. Development 1990;4:1001-1020. 60. Potten CS, Owen G, Booth D. Intestinal stem cells protect their genome by selective segregation of template DNA strands. J. Cel.l Sci. Pt. 2002;11:2381- 2388. 61. Strater J, Koretz K, Gunthert AR, Moller P. In situ detection of enterocytic apoptosis in normal colonic mucosa and in familial adenomatous polyposis. Gut 1995;6:819-825. 62. ĐorĊević V, Pavlović D, Kocić G. Karakteristike slobodnih radikala. U: Biohemija slobodnih radikala. Niš: Sirius-print; 2000. p7-12. 63. Mahajan A, Tandon V. Antioxidants and rheumatoid arthritis. J. Indian Rheumatol Assoc. 2004;12:139-142. 64. Pavlović D. Biološka oksidacija. U: Koraćević D, Bjelaković G, ĐorĊević V, Nikolić J, Pavlović D, Kocić G, urednici. Biohemija. Beograd: Savremena administracija; 2006. p678-705. 65. Porter N, Caldwell S, Mills K. Mechanisms of free radical oxidation of unsaturated lipids. Lipids 1995;30(4):277-290. Doktorska disertacija Andrej Veljković 113 66. Sodergren E. Lipid peroxidation in vivo. Evaluation and application of methods for measurement [Acta Universitatis Upsaliensis. Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine ]. Uppsala 2000. 67. Pavlović D, ĐorĊević V, Kocić G. Ćelijska signalna transdukcija-modulacija slobodnim radikalima. Jugoslov. Med. Biohem. 2002;21(2):69-84. 68. Sen R and Baltimore D. Inducibility of κ immunoglobulin enhancer – binding protein Nf-κB by a posttranslational mechanism. Cell 1986;47:921–928. 69. Balkwill F and Mantovani A. Inflammation and cancer: Back to Virchow? Lancet 2001;357:539–545. 70. Bharti A. and Aggarwal B. Nuclear factor-κB and cancer: Its role in prevention and therapy. Biochem. Pharmacol. 2002;64:883–888. 71. Beg A and Baltimore D. An essential role for NF-κB in preventing TNF-α induced cell death. Science 1996;274:782–784. 72. Wang C, Cusack J, Liu R, Baldwin J. Control of inducible chemoresistance: Enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-κB. Nat. Med. 1999;5:412–417. 73. Feinman R, Koury J, Thames M, Barlogie B, Epstein J and Siegel D. Role of NF- κB in the rescue of multiple myeloma cells from glucocorticoid-induced apoptosis by bcl-2. Blood 1999;93:3044–3052. 74. Griffin, J.D. Leukemia stem cells and constitutive activation of NF- κB. Blood 2001;98:22-29. 75. Kordes, U, Krappmann D, Heissmeyer V, Ludwig WD, Scheidereit C. Transcription factor NF-κB is constitutively activated in acute lymphoblastic leukemia cells. Leukemia 2000;14:399–402. 76. Baron, F, Turhan,A.G, Giron-Michel J, Azzarone B, Bentires-Alj M, Bours V, Bourhis JH, Chouaib S, Caignard A. Leukemic target susceptibility to natural killer cytotoxicity: Relationship with BCRABL expression. Blood 2002;99:2107 – 2113. 77. Palayoor ST, Youmell MY, Calderwood SK, Coleman CN, and Price B.D. Constitutive activation of IκB kinase α and NF-κB in prostate cancer cells is inhibited by ibuprofen. Oncogene 1999;18:7389–7394. 78. Nakshatri H, Bhat-Nakshatri P, Martin DA, Goulet RJ, Jr and Sledge G.W. Constitutive activation of NF-κB during progression of breast cancer to hormone- independent growth. Mol. Cell. Biol. 1997;17:3629–3639. 79. Bharti A and Aggarwal B.Nuclear factor-κB and cancer: Itsrole in prevention and therapy. Biochem. Pharmacol. 2002;64:883–888. Doktorska disertacija Andrej Veljković 114 80. Bonizzi G and Karin M. The two NF-κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 2004;25:280–288. 81. Hayden M. S. and Ghosh S. Signaling to NF-κB. Genes Dev. 2004;18:2195– 2224. 82. Ghosh S. and Karin M. Missing pieces in the NF-κB puzzle. Cell2002;109: S81 – S96. 83. Lawrence T, Bebien M, Liu GY, Nizet V, and Karin M. IKKα limits macrophage NF-κB activation and contributes to the resolution of inflammation. Nature2005434,1138–1143. 84. Karin M, Cao Y, Greten FR. and Li ZW. NF-κB in cancer: from innocent bystander to major culprit. Nature Rev. Cancer 2002;2:301–310. 85. Greten FR, Eckmann L, Greten TF, Park JM, Li ZW, Egan LJ, Kagnoff MF, Karin M. IKKβ links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis- associatedcancer. Cell 2004;118:285–296. 86. Schmidt K, Amstad P, Cerutti P, Baeuerle P. The roles of hydrogen peroxide and superoxide as messengers in the activation of transcription factor NF-B. Chem Biol 1995;2(1):13-22. 87. Lee C, Lee E, Kim Y, Mun S, Moon H, Yoo B. Alpha-lipoic acid inhibits TNF- induced NF-B activation through blocking of MEKK1–MKK4–IKK signaling cascades. Int Immunopharmacol 2008;8(2):362-370. 88. Kim HS, Kim HJ, Park KG, Kim YN, Kwon TK, Park JY, Lee KU, Kim JG, Lee IK. Alpha-lipoic acid inhibits matrix metalloproteinase-9 expression by inhibiting NF-kappaB transcriptional activity. Exp Mol Med 2007;39(1):106-113. 89. Vakkila J, and Lotze MT. Inflammation and necrosis promote tumour growth. Nat. Rev. Immunol. 2004;4:641–648. 90. Coussens LM, and Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature 2002;420:860– 867. 91. Burnet FM. The concept of immunological surveillance. Prog. Exp. Tumor Res. 1970;13:1–17. 92. Philip M, Rowley D and Schreiber H. Inflammation as a tumor promoter in cancer induction. Semin. Cancer Biol. 2004;14:433–439. 93. Chisari FV. Hepatitis B virus transgenic mice: insights into the virus and the disease. Hepatology 1995;22:1316–1325. 94. Bharti A, and Aggarwal B. Chemopreventive agents induce suppression of nuclear factor-κB leading to chemosensitization. Ann. NY Acad. Sci. 2002;973:392–395. Doktorska disertacija Andrej Veljković 115 95. Taketomi A, Takenaka K, Matsumata T, Shimada M, Higashi H, Shirabe K, Itasaka H, Adachi E, Maeda T, Sugimachi K. Circulating intercellular adhesion molecule-1 in patients with hepatocellular carcinoma before and after hepatic resection. Hepatogastroenterology 1997;44:477–483. 96. Pidgeon G, Harmey J, Kay E, Da Costa M, Redmond H, and Bouchier-Hayes D. The role of endotoxin/lipopolysaccharide in surgically induced tumour growth in a murine model of metastatic disease. Br. J. Cancer.1999;81:1311–1317. 97. Pollard J W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Rev. Cancer 2004;4:71–78. 98. Goodman J, Hofseth J, Hussain SP, and Harris C. Nitric oxide and p53 in cancer- prone chronic inflammation and oxyradical overload disease. Environ.Mol. Mutagen. 2004;44:3–9. 99. Seitz C, Lin Q, Deng H. and Khavari P. Alterations in NF-κB function in transgenic epithelial tissue demonstrate a growth inhibitory role for NF-κB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998;95:2307–2312. 100. Dajee M, Lazarov M, Zhang J, Cai T, Green C, Russell A, Marinkovich M.P, Tao S, Lin Q, Kubo Y and Khavari P. NF-κB blockade and oncogenic Ras trigger invasive human epidermal neoplasia. Nature 2003;421:639–643. 101. Midgley R, Kerr D. Colorectal cancer. Lancet 1999;353:391-399. 102. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990;61:759-767. 103. Kinzler KW, Vogelstein B. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 1996;87:159-170. 104. Sinicrope FA, Roddey G, McDonnell TJ, Shen Y, Cleary KR, Stephens LC. Increased apoptosis accompanies neoplastic development in the human colorectum. Clin Cancer Res 1996;2:1999-2006. 105. Kerr JF, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 1994;73:2013-2026. 106. Bedi A, Pasricha PJ, Akhtar AJ, Barber JP, Bedi GC, Giardiello FM, et al. Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer. Cancer Res. 1995;55:1811-1816. 107. Hao X, Du M, Bishop AE, Talbot IC. Imbalance between proliferation and apoptosis in the development of colorectal carcinoma. Virchows Arch. 1998;433:523-527. Doktorska disertacija Andrej Veljković 116 108. Diebold J, Lai MD, Lohrs U. Analysis of proliferative activity in colorectal mucosa by immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Methodological aspects and application to routine diagnostic material. Virchows Arch B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 1992;62:283-289. 109. Johnston PG, O’Brien MJ, Dervan PA, Carney DN. Immunohistochemical analysis of cell kinetic parameters in colonic adenocarcinomas, adenomas, and normal mucosa. Hum. Pathol. 1989;20:696-700. 110. Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 1995;267:1456-1462. 111. Watson AJ. Review article: manipulation of cell death-the development of novel strategies for the treatment of gastrointestinal disease. Aliment Pharmacol Ther 1995;9:215-226. 112. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000;407(6805):770- 776. 113. Reed JC. Apoptosis-based therapies. Nat. Rev. Drug. Discov. 2002;1(2):111-121. 114. Lang F, Gulbins E, Szabo I, Lepple-Wienhues A, Huber SM, Duranton C, Lang KS, Lang PA, Wieder T. Cell volume and the regulation of apoptotic cell death. J Mol Recognit 2004;17:473-480. 115. Danial NN, Korsmeyer SJ. Cell death: critical control points. Cell 2004;116:205- 219. 116. Yuan J, Horvitz HR. A first insight into the molecular mechanisms of apoptosis. Cell 2004;116:S53-S56. 117. Hildeman DA, Mitchell T, Aronow B, Wojciechowski S, Kappler J, Marrack P. Control of Bcl-2 expression by reactive oxygen species. PNAS 2003; 100:15035- 15040. 118. Screaton G, Xu NK. The cell life and death signaling via TNF-receptor family members. Curr. Opin. Immunol. 2000;12:316-322. 119. Stepp SE, Porunellor A, Mathew A, Bennett M, De Saint Basile G. Perforin more that just an effector molecule. Immunol. Today. 2000;21:254-256. 120. Scaffidi C, Schmitz I, Krammer PH, Peter ME. The role of c-FLIP in modulation of CD95-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 1999;274(3):1541-1548. 121. Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 1998;94(4):481-490. 122. Acehan D, Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW. Three- dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase- 9 binding, and activation. Mol Cell 2002; 9(2):423-432. 123. Woo EJ, Kim YG, Kim MS, Han WD, Shin S, Robinson H, Park SY, Oh BH. Structural mechanism for inactivation and activation of CAD/DFF40 in the apoptotic pathway. Mol. Cell. 2004;14531-14539. Doktorska disertacija Andrej Veljković 117 124. Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 1980;284:555-560. 125. Counis MF and Torriglia A. DNases and apoptosis. Biochem. Cell. Biol. 2000; 78(4):405-414. 126. Peitsch MC, Polzar B, Stephan H, Crompton T, MacDonald HR, Mannherz HG, Tschopp J. Characterization of the endogenous deoxyribonuclease involved in nuclear DNA degradation during apoptosis (programmed cell death). EMBO J 1993;12(1):371-377. 127. Kishi K, Yasuda T, Takeshita H. DNase I: structure, function, and use in medicine and forensic science. Leg Med (Tokyo) 2001;3(2):69-83. 128. Bernardi G, Griffe M. Studies on acid deoxyribonuclease II. Isolation and characterization of spleen-acid deoxyribonuclease. Biochemistry 1964;3:1419- 1426. 129. MacLea KS, Krieser RJ, Eastman A. Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease II alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 292(2):415-421. 130. Ravagnan L, Roumier T, Kroemer G. Mitochondria, the killer organelles and their weapons. J. Cell. Physiol. 2002;192:131-137. 131. Morel Y, Barouki R. Repression of gene expression by oxidative stress. Biochem J 1999;342:481-496. 132. Tripathi P, Hildeman D. Sensitization of T cells to apoptosis-a role for ROS? Apoptosis 2004;9:515-523. 133. Chandra J, Samali A, Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine 2000; 29:323-333. 134. Chao DT and Korsmeyer SJ. BCL-2 family: regulators of cell death. Annu. Rev. Immunol. 1998;16:395-419. 135. Minn AJ, Swain RE, Ma A, Thompson CB. Recent progress on the regulation of apoptosis by Bcl2 family members. Adv. Immunol. 1998;70:245-279. 136. Adams JM and Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 1998; 281:1322-1326. 137. Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 1993; 74:609-619. 138. Yin XM, Oltvai ZN, Korsmeyer SJ. BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax. Nature 1994;369:321-323 139. Cosulich SC, Worrall V, Hedge PJ, Green S, Clarke PR: Regulation of apoptosis by BH3 domains in a cell-free system. Curr. Biol. 1997;7:913-920. 140. Wang HG, Rapp UR, Reed JC. Bcl-2 targets the protein kinase Raf-1 to mitochondria. Cell 1996;87:529-538. 141. Yang E, and Korsmeyer S. Molecular thanatopsis: a discourse on the Bcl2 family and cell death. Blood 1996;88:386-401. Doktorska disertacija Andrej Veljković 118 142. Knudson M, Tung K, Tourtellotte, Brown J and Korsmeyer S. Bax-deficient mice with lymphoic hyperplasia and male germ cell death. Science 1995;270:96- 99. 143. Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC, Perucho M. Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science 1997;275: 967-969. 144. Gross A, Jockel J, Wei C and Korsmeyer S. Enforced dimer-ization of Bax results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis. EMBO J. 1998;17:3878-3885. 145. Wolter K, Hsu Y, Smith C, Nechushtan A, Xi X, and Youle R. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis. J. Cell Biol. 1997;139:1281- 1292. 146. Manon S, Chaudhuri B, and Guerin M. Release of cytochrome c and decrease of cytochrome c oxidase in Bax-expressing yeast cells, and prevention of these effects by coexpression of Bcl-XL. FEBS Lett. 1997;415:29-32. 147. Shimizu S, Narita M and Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. Nature 1999; 399:483-487. 148. Marzo I, Brenner C, Zamzami N, Jürgensmeier JM, Susin SA, Vieira HL, et al. Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis. Science 1998;281:2027-2031. 149. Murphy K, Ranganathan V, Farnsworth M, Kavallaris M and Lock R. Bcl-2 inhibits bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells. Cell Death Dif-fer. 2000;7:102-111. 150. Bach S, Renehan A, Potten C. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis 2000;21:469-476. 151. Strater J, Koretz K, Gunthert AR, Moller P. In situ detection of enterocytic apoptosis in normal colonic mucosa and in familial adenomatous polyposis. Gut 1995;37:819-825. 152. Hall PA, Coates PJ, Ansari B, Hopwood D. Regulation of cell number in the mammalian gastrointestinal tract: the importance of apoptosis. J. Cell. Sci. 1994;107:3569-3577. 153. Kikuchi Y, Dinjens WN, Bosman FT. Proliferation and apoptosis in proliferative lesions of the colon and rectum. Virchows Arch. 1997;431:111-117. 154. Potten CS, Wilson JW and Booth C. Regulation and significance of apoptosis in the stem cells of the gastrointestinal epithelium. Stem Cells 1997;15:82-93. 155. Barkla DH and Gibson PR. The fate of epithelial cells in the human large intestine. Pathology 1999;31:230-238. 156. Merritt AJ, Allen TD, Potten CS and Hickman JA. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M- associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene 1997;23:2759-2766. 157. Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science 1995:5203:1456-1462. Doktorska disertacija Andrej Veljković 119 158. Bedi A, Pasricha PJ, Akhtar AJ, Barber JP, Bedi GC, Giardiello FM, Zehnbauer BA, Hamilton SR and Jones RJ. Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer. Cancer Res 1995;9:1811-1816. 159. Hilska M, Collan YU, O Laine VJ, Kossi J, Hirsimaki P, Laato M and Roberts PJ. The significance of tumor markers for proliferation and apoptosis in predicting survival in colorectal cancer. Dis. Colon Rectum 2005;12:2197-2208. 160. Hoos A, Stojadinovic A, Mastorides S, Urist MJ, Polsky D, Di Como CJ, Brennan MF & Cordon-Cardo C. High Ki-67 proliferative index predicts disease specific survival in patients with high-risk soft tissue sarcomas. Cancer 2001;4:869-874. 161. Lukas J, Aagaard L, Strauss M and Bartek J. Oncogenic aberrations of p16INK4/CDKN2 and cyclin D1 cooperate to deregulate G1 control. Cancer Res 1995;21:4818-4823. 162. Hartwell LH, and Weinert TA. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science 1989;4930:629-634. 163. Chen KY. Transcription factors and the down-regulation of G1/S boundary genes in human diploid fibroblasts during senescence. Front Biosci 1997;2:417-426. 164. Nelson AR, Fingleton B, Rothenberg ML, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. Clin. Oncol. 2000;18:1135-1149 165. Vu TH, Werb Z. Matrix metalloproteinases: development and normal physiology. Genes and Development 2000;14:2123-2133. 166. Stamenkovic I. Extracellulat matrix remodelling: the role of matrix metalloproteinases. J Pathol 2003;200:448-464 167. Sopata I, Dancewicz A. Presence of a gelatin-specific proteinase and its latent form in human leucocytes. Biochim. Biophys. Acta. 1974;370(2):510-523. 168. Murphy G, Reynolds J, Bretz U, Baggiolini M. Partial purification of collagenase and gelatinase from human polymorphonuclear leucocytes. Analysis of their actions on soluble and insoluble collagens. Biochem. J. 1982;203(1):209-210. 169. Wilhelm S, Collier I, Marmer B, Eisen A, Grant G, Goldberg G. SV40- transformed human lung fibroblasts secrete a 92-kDa type IV collagenase which is identical to that secreted by normal human macrophages. J. Biol. Chem. 1989;264(29):17213-17221. 170. Nagase H, Barrett A, Woessner Jr J. Nomenclature and glossary of the matrix metalloproteinases. Matrix. Suppl. 1992;1:421-424. 171. Jelena Bašić. Oksidativni stres, matriks metaloproteinaza-9 i polimorfizam gena za faktor nekroze tumora i njegov receptor u juvenilnom idiopatskom artritisu.Doktorska disertacija. Niš 2010 Doktorska disertacija Andrej Veljković 120 172. Engsig M. T., Chen Q. J., Vu T. H., Pedersen A. C., Therkidsen B. et al. Matrix metalloproteinase 9 and vascular endothelial growth factor are essential for osteoclast recruitment into developing bones. J. Cell Biol. 2000;151:879–889 173. Liu Z, Zhou X, Shapiro S. D, Shipley J. M, Twining S. S, Diaz L. A, Senior R. M.,Werb Z. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. Cell 2000;102:647–655 174. Bergers G, Brekken R, Mcmahon G, Vu T. H, Itoh T, Tamaki K, Benefits of targeting both pericytes and endothelial cells in the tumor vasculature with kinase inhibitors Nat. Cell Biol. 2000;2:737–744. 175. Gijbels K, Proost P, Carton M, Billiau C. A, Opdenakker G. Reversal of experimental autoimmune encephalomyelitis with a hydroxamate inhibitor of matrix metalloproteases. J. Neurosci. Res. 1993;36:432–440 176. Leppert D, Ford J, Stabler G, Grygar C, Lienert C, Huber S, et al. Matrix metalloproteinases contribute to brain damage in experimental pneumococcal meningitis. Brain. 1998:121:2327–2334 177. Sternlicht M and Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2001;17(1):463-516. 178. Whittaker M, Floyd D, Brown P, Gearing H. Design and therapeutic application of matrix metalloproteinase inhibitors. Chem. Rev. 1999;99:27-35 179. Shuttleworth, S. In Advances in Drug Discovery Techniques ; Harvey , A.L. , Ed.; Wiley : NewYork ,1998;p 35. 180. Ito A, Nose T, Takahashi S, and Mori Y. Cyclooxygenase inhibitors augment the production of pro-matrix metalloproteinase 9 (progelatinase B) in rabbit articular chondrocytes. FEBS Lett. 1995;360(1):75-79 181. Ishiguro N, Ito T, Oguchi T, Kojima T, Iwata H, Ionescu M, Poole AR. Relationships of matrix metalloproteinases and their inhibitors to cartilage proteoglycan and collagen turnover and inflammation as revealed by analyses of synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2001;44(11):2503-2511 182. Sternlicht M, Bergers G. Matrix metalloproteinases as emerging targets in anticancer therapy: status and prospects. Expert. Opin. Ther. Targets 2000;4(5):609-633 183. Lynch CC and Matrisian LM. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation 2002;70:561-573 184. Fox IH.: Adenosine triphosphate degradation in specific disease. J. Lab. Clin. Med. 1985;106:101-110. 185. Le Hir M, Gandhi R, Dubach UC. Purification and properties of a 5’-nucleotidase from rat renal membranes. Enzyme 1989;41:87-93. Doktorska disertacija Andrej Veljković 121 186. Bailyes E M, Sos M, Jackson P, Newby S, Siddle K, Paul Luzio J.The existence and properties of two dimers of rat liver ecto-5’ nucleotidase. Biochem. J. 1984;221:369-377. 187. Low MG. Biochemistry of the glucosyl-phosphatidylinositol membrane protein anchors. Biochem J 1987;244:1-13. 188. Thompson LF, Resta R. CD 73 and lymphocyte development. Med. Immunol. 1994;27(3):247-258. 189. Harb J, Meflah K, Duflos J, Bernard J. Purification and properties of bovine liver plasma membrane 5’-nucleotidase. Eur. J. Biochem. 1983;137:131-138. 190. Harb J, Meflah K, Bernard J. Structural difference between plasma-membrane 5’- nucleotidase in different cells types as evedenced by antibodyes. Bioch. J. 1985; 232:859-862. 191. Tarakhovsky AM, Umansky VJ, Shlyakhovenko VA, Balitsky KP. Redox- dependent activation of 5’-nucleotidase in rat liver plasma membranes. FEBS Lett 1985;189(2):338-340. 192. Riemar BL, Widnell CC. The demonstration on a specific 5’-nucleotidase activity in rat tissues. Arch. Biochem. 1975;171:343-347. 193. Airas L, Niemela J, Salmi M, Puurunen T, Smith DJ, and Jalkanen S. Differential Regulation and Function of CD73, a Glycosyl-Phosphatidylinositol-linked 70-kD Adhesion Molecule, on Lymphocytes and Endothelial Cells. J. Cell. Biol. 1997;136(2):421-431. 194. Resta R, Yamashita Y, Thompson LH. Ecto-enzyme and signaling functions of lymphocyte CD73. Immunol. Rew. 1998;161:95-109 195. Stochaj U, Diechoff J, Mollenhauer J, Kramer M, and Mannherz HG.Evidence for the direct interaction of chicken gizzard 5'-nucleotidase with laminin and fibronectin. Biochim. Biophys. Acta 1989;992(3):385-392 196. Berman JJ, Tong, C, Williams GM. 5’-Nucleotidase activities in cultured rat liver epithelial and fibroblast cells. J. Histochem. Cytochem. 1980;28(2):174-180. 197. Fischer D, Van der Weyden MB, Snyderman R, and Kelley WN.: A Role for Adenosine Deaminase in Human Monocyte Maturation. J. Clin. Invest. 1976;58: 399-407. 198. Ronca G. Competitive inhibition of adenosine deaminase by urea, guanidine, biuret and guanil urea. Biochim. Biophys. Acta 1968;132:214-216. 199. Soberman RJ and Karnovsky ML. Metabolism of purines in macrophages. J. Exp. Med. 1980;152:241-246. Doktorska disertacija Andrej Veljković 122 200. Wilson DK, Rudolf FB, Quiocho FA. Atomic structure of adenosine deaminase complexed with tranition state analog: understanding catalysis and immunodeficiency mutations. Science 1991;252:1278-1284. 201. Berkvens TM, Schoute F, Ormondt H, Meera KP, Van der Eb AJ.: Adenosin deaminase gene expression is regulated posstranscriptionally in the nucleus. Nucleic Acids Res 1988;16(8):3255-3268. 202. Ben BI, Simoni F, Holtzman F, Ramot B. Adenosine deaminase activity of normal lymphocytes and leukemic cells. Isr. J. Med. Sci. 1979;15(11):925-927. 203. Kizaki H, Habu S, Ohsaka F, Sakaruda T.: Purine nucleoside metabolizing enzime activities in mouse thymocytes at different stages of differentiation and maturation. Cell. Immunol. 1983;82(2):343-351. 204. Jackson RC, Morris HP, Weber G. Adenosine deaminase and adenosine kinase in rat hepatomas and kidney tumors. Br. J. Cancer 1978;37(5):701-713. 205. Sarnesto A, Linder N, Raivio KO. Organ distribution and molecular forms of human xanthine dehydrogenase/xanthine oxidase protein. Lab. Investig. 1996;74:48–56. 206. Nishino T, Nakanishi S, Okamoto K, Mizushima J, Hori H, Iwasaki T, Nishino T, Ichimori K, Nakazawa H. Conversion of xanthine dehydrogenase into oxidase and its role in reperfusion injury. Biochem. Soc. Trans. 1997;25:783–786. 207. McCord JM. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury. N. Engl. J. Med. 1985;17(312):159–163. 208. Ikeda T, Shimokata K, Daikoku T, Fukatsu T, Tsutsui Y, Nishiyama Y. Pathogenesis of cytomegalovirus-associated pneumonitis in ICR mice: possible involvement of superoxide radicals. Arch. Virol. 1992;127:11–24. 209. Andreeva LI, Kozhemiakin LA, Kishkun AA. Modification of the method of determining lipid peroxidation in a test using thiobarbituric acid. Laboratornoe delo 1988;11:41-43. 210. Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeillere-Blandin C. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kid. Int. 1996;49:1304-1305 211. Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision reference range. Clin. Chim. Acta. 1991;196:143-152. 212. G. Kocic, R. Pavlovic, S. Najman, G. Nikolic, D. Sokolovic, T. Jevtovic- Stoimenov et al.Circulating ribonucleic acids and metabolic stress parameters may reflect progression of autoimmune or inflammatory conditions in juvenile type 1 diabetes. Scientific World Journal 2011;11:1496–1508. Doktorska disertacija Andrej Veljković 123 213. Hafiz A. Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, and Characterization 2004;234-239 214. J. Bartholeyns C, Peeters-Joris H, Reychler, P. Baudhuin, “Hepatic nucleases 1. Method for the specific determination and characterization in rat liver”, European Journal of Biochemistry 1975;57(1):205-211. 215. Pederson RC, Berry AJ. Sensitive, optimised assay for serum AMP deaminase. Clin. Chem. 1977;23:1726-1733 216. Lauber K. Photometric determination of nitrogen: Wet incineration followed by formation of indophenol blue with salicylate/hypochlorite. Clin. Chem. 1976;67: 107-110. 217. Wood RJ, Williams DG. Colorimetric determination of serum 5'-nucleotidase without deproteinization. Clin. Chem. 1981;27(3):464-565. 218. Hashimoto J. New spectrophotometric assay method of xanthine oxidase in crude tissue homogenate. Anl. Biochem. 1974;62:426-435. 219. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ. “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, The Journal of Biological Chemistry1951;193(1):265- 275. 220. Glei M, Latunde-Dada GO, Klinder A, et al. Iron-overload induces oxidative DNA damage in the human colon carcinoma cell line HT29 clone 19A. Mutat. Res. 2002; 519:151-161. 221. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990; 61:759-767. 222. Malheiros AP, Teixeira MG, Habr-Gama A. Resultados do tratamento cirúrgico do câncer colo-retal em doentes de idade até64 anos e de 65 anos ou mais. Rev. Bras. Coloproc.t 2005;25:128-136. 223. Seril DN, Liao J, Yang GY, Yang CS. Oxidative stress and ulcerative colitis-associated carcinogenesis: studies in humans and animals models. Carcinogenesis 2003; 24:353-362. 224. Girgin F, Karaoglu O, Erkus M, Tuzun S, Ozutemiz O, Dincer C, BaturY, Tanyalcin T. Effects of trimetazidine on oxidant/antioxidant status in trinitrobenzene sulfonicacid-induced chronic colitis. J. Toxicol. Environ. Health 2000;59:641-652. 225. Wiseman H and Halliwel B. Damage to Dna by reactive oxygen and nitrogen species: Role in inflamatory disease and progression to cancer. Biochem. J. 1996;313:17-29 Doktorska disertacija Andrej Veljković 124 226. Sun Y. Free radicals, antioxidant enzymes and carcinogenesis. Fre. Radic. Biol. Med. 1990;8:583-599. 227. Elzbieta Skrzydlewska, Stanislaw Sulkowski, Mariusz Koda, Bogdan Zalewski, Luiza Kanczuga-Koda, Mariola Sulkowska. Lipid peroxidation and antioxidant status in colorectal cancer. World J. Gastroenterol. 2005;11(3):403-406 228. Du J and Gebicki JM. DNA degradation and protein peroxidation in cells exposed to hydroxyl free radicals. Redox Rep. 2002;7:329-331. 229. Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeillère-Blandin C, Nguyen-Khoa T, Nguyen AT, Zingraff J et al. AOPP as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kidney Int. 1996;49(5):1304–1313. 230. Avinash SS, Anitha M, Vinodchandran, Rao GM, Sudha K, Shetty BV. Advanced oxidation protein products and total antioxidant activity in colorectal carcinoma. Indian J Physiol Pharmacol. 2009;53(4):370-374. 231. Moran EC, Kamiguti AS, Cawley JC, Pettitt AR. Cytoprotective antioxidant activity of serum albumin and autocrine catalase in chronic lymphocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2002;116(2):316-328. 232. Fearon CH, Falconer JS, Slater C. Albumin synthesis rates are not decreased in hypoalbuminaemic cachectic cancer patients with an ongoing acute phase protein response. Ann. Surg. 1998;227:249–254. 233. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Oxidative damage to catalase induced by peroxyl radicals: functional protection by melatonin and other antioxidants. Free Radic. Res. 2003;37:543-553. 234. Michiels C, Raes M, Toussaint O, Remacle J. Importance of Se-glutathione peroxidase, catalase, and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress. Free Radic. Biol. Med. 1994;17:235-248. 235. Szatrowski TP and Nathan CF. Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer Res. 1991;51:794-798. 236. Lukas JA, HawinkelsW, Kim Z, Hein W, Eveline S.M, Wim VD et al. VEGF release by MMP-9 mediated heparan sulphate cleavage induces colorectal cancer angiogenesis. European Journal of Cancer. 2008;44(13): 1904-1913 237. Ray G, Husain SA. Oxidants, antioxidants and carcinogenesis. Indian J. Exp. Biol. 2002;40:1213–1232. Doktorska disertacija Andrej Veljković 125 238. Valko M, Izakovic M, Mazur M, Rhodes CJ, Telser J. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. Mol. Cell. Biochem. 2004;266:37–56. 239. Mathew R, Karp CM, Beaudoin B, Vuong N, Chen G, Chen HY, Bray K, Reddy A, Bhanot G, Gelinas C, Dipaola RS, Karantza-Wadsworth V, White E. Autophagy suppresses tumorigenesis through elimination of p62. Cell 2009;137:1062–1075. 240. Meira LB, Bugni JM, Green SL, Lee CW, Pang B, Borenshtein D et al. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice. J. Clin. Invest. 2008;118:2516–2525. 241. Schetter AJ, Heegaard NH, Harris CC. Inflammation and cancer: interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways. Carcinogenesis 2002;31:37–49. 242. Fleisher AS, Esteller M. Microsatellite instability in inflammatory bowel disease-associated neoplastic lesions is associated with hypermethylation and diminished expression of the DNA mismatch repair gene, hMLH1. Cancer Res. 2000;60:4864–4868. 243. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 2002;82:47–95. 244. Kerr LD, Inoue J, Verma IM. Signal transduction: the nuclear target. Curr. Opin. Cell. Biol. 1992;4:496–501. 245. Frenkel K. Carcinogen-mediated oxidant formation and oxidative DNA damage. Pharmacol. Ther. 1992;53:127–166. 246. Dizdaroglu M, Olinski R, Doroshow JH, Akman SA. Modification of DNA bases in chromatin of intact target human cells by activated human polymorphonuclear leukocytes. Cancer Res. 1993;53:1269–1272. 247. Kamata T. Roles of Nox1 and other Nox isoforms in cancer development. Cancer Sci. 2009;100:1382–1388. 248. Los M, Maddika S, Erb B, Schulze-Osthoff K. Switching Akt: from survival signaling to deadly response. Bioessays 2009;31:492–495. 249. Roebuck KA. Oxidant stress regulation of IL-8 and ICAM-1 gene expression: differential activation and binding of the transcription factors AP-1 and NF-kappaB (Review). Int. J. Mol. Med. 1999;4:223–230. Doktorska disertacija Andrej Veljković 126 250. Longo R, Sarmiento R, Fanelli M, Capaccetti B, Gattuso D, Gasparini G. Anti-angiogenic therapy: rationale, challenges and clinical studies. Angiogenesis 2002;5:237–256. 251. Alon T, Hemo I, Itin A, Pe'er J, Stone J, Keshet E. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nat. Med. 1995;1:1024– 1028. 252. Monte M, Davel LE, Sacerdote de Lustig E. Hydrogen peroxide is involved in lymphocyte activation mechanisms to induce angiogenesis. Eur. J. Cancer 1997;33:676–682. 253. Wood KM, Roff M, Hay R.T. Defective IκBα in Hodgkin cell lines with constitutively active NF-κB. Oncogene 1998;16:2131–2139. 254. Banerjee S, Bueso-Ramos C, Aggarwal B. Suppression of 7,12- dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinogenesis in rats by resveratrol: Role of nuclear factor-κB, cyclooxygenase 2, and matrix metalloprotease 9. Cancer Res. 2002;62:4945–4954. 255. O’Connell MA, Cleere R, Long A, O’Neill LA, Kelleher, D. Cellular proliferation and activation of NF κB are induced by autocrine production of tumor necrosis factor α in the human T lymphoma ine HuT 78. J. Biol. Chem. 1995;270:7399–7404. 256. Pikarsky E. NF-κB functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer. Nature 2004;431:461–466. 257. Hinz M. NF- B function in growth control: regulation of cyclin D1 expression and G0/G1-to-S-phase transition. Mol. Cell Biol. 1999;19:2690–2698. 258. Osborn L, Kunkel S, Nabel G.J. Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 stimulate the human immunodeficiency virus enhancer by activation of the nuclear factor κB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989;86:2336–2340. 259. Biswas D, Cruz A, Gansberger E and Pardee A.B. Epidermal growth factor- induced nuclear factor κB activation: A major pathway of cell-cycle progression in estrogen-receptor negative breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000;97:8542–8547. 260. Bhat-Nakshatri P, Sweeney C, Nakshatri H. Identification of signal transduction pathways involved in constitutive NF-κB activation in breast cancer cells. Oncogene 2002;21:2066–2078. 261. Bond M, Fabunmi RP, Baker AH, Newby A. Synergistic upregulation of metalloproteinase-9 by growth factors and inflammatory cytokines: An absolute requirement for transcription factor NF-κB. FEBS Lett. 1998;435:29–34. Doktorska disertacija Andrej Veljković 127 262. Farina, Tacconelli A, Vacca A, Maroder M, Gulino A, Mackay A. Transcriptional up-regulation of matrix metalloproteinase- 9 expression during spontaneous epithelial to neuroblast phenotype conversion by SK-N-SH neuroblastoma cells, involved in enhanced invasivity, depends upon GT-box and nuclear factor κB elements. Cell. Growth Differ. 1999;10:353–367. 263. Novak U, Cocks B and Hamilton J. A labile repressor acts through the NFkB- like binding sites of the human urokinase gene. Nucleic Acids Res. 1991;19:3389–3393. 264. Wang W, Abbruzzese J, Evans D and Chiao P. Overexpression of urokinase- type plasminogen activator in pancreatic adenocarcinoma is regulated by constitutively activated RelA. Oncogene 1999;18:4554–4563. 265. Van de Stolpe A et al.12-Otetradecanoylphorbol- 13-acetate- and tumor necrosis factor α-mediated induction of intercellular adhesion molecule-1 is inhibited by dexamethasone. Functional analysis of the human intercellular adhesion molecular-1 promoter. J. Biol. Chem. 1994;269:6185–6192. 266. Thomsen L, and Miles D. Role of nitric oxide in tumour progression: Lessons from human tumours. Cancer Metastasis Rev. 1998;17:107–118. 267. Helbig G, Christopherson KW 2nd, Bhat-Nakshatri P, Kumar S, Kishimoto H, Miller KD, et al. NF- κB promotes breast cancer cell migration and metastasis by inducing the expression of the chemokine receptor CXCR4. J. Biol. Chem. 2003;278:21631–21638. 268. Fujioka S, Sclabas GM, Schmidt C, Frederick WA, Dong QG, Abbruzzese JL et al. Function of nuclear factor κB in pancreatic cancer metastasis. Clin. Cancer Res. 2003;9:346 –354. 269. Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, et al. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. Science 1992;258:1798–1801. 270. Yu HG, Yu LL, Yang Y, Luo HS, Yu JP, Meier JJ et al. Increased expression of RelA/nuclear factor-κB protein correlates with colorectal tumorigenesis. Oncology 2003;65:37–45. 271. Karin M and Lin A. NF- B at the crossroad of Life and Death. Nature Immunol. 2002;3:221–227. 272. Van Antwerp D, Martin S, Kafri T, Green D, Verma I. Suppression of TNF - induced apoptosis by NF- B. Science 1996;274:787–789. 273. Levine AJ. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997;88: 323–331. Doktorska disertacija Andrej Veljković 128 274. Greten FR, Eckmann L, Greten TF, Park JM, Li ZW, Egan LJ et al. IKKbeta links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer. Cell 2004;118:285–296. 275. Pollard JW. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Rev. Cancer 2004;4:71–78. 276. Mayo M, Norris J, Baldwin A. Ras regulation of NF- κB and apoptosis. Methods Enzymol. 2001;333:73–87. 277. Kim DW, Gazourian L, Quadri SA, Romieu-Mourez R, Sherr DH, Sonenshein GE. The RelA NF-κB subunit and the aryl hydrocarbon receptor (AhR) cooperate to transactivate the c-myc promoter in mammary cells. Oncogene 2000;19:5498–5506. 278. Fox C, Hammerman P, Cinalli R, Master S, Chodosh A, Thompson C. The serine/threonine kinase Pim-2 is a transcriptionally regulated apoptotic inhibitor. Genes Dev. 2003;17:1841–1854. 279. Terpstra OT, van-Blankstein M, Dees J and Eilers GA. Abnormal patterns of cell proliferation in the entire colonic mucosa of patients with colon adenoma or cancer. Gastroenterology 1987;92:704–8. 280. Hickman JA. Apoptosis and chemotherapy resistance. Eur. J. Cancer 1996;32A:921–926. 281. Podack ER. Functional significance of two cytolytic pathways of cytotoxic T lymphocytes. J.Leuk.Biol.1995;57:548–552. 282. Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis:Its significance in cancer and cancer therapy.Cancer 1994;73:2013–2026. 283. Koike M. Significance of spontaneous apoptosis during colorectal tumorigenesis. J.Surg.Oncol.1996;62:97–108. 284. Potten CS. What is an apoptotic index measuring? A commentary. Br.J.Cancer1996;74:1743–1748. 285. Tatebe S, Ishida M, Kasagi N,Tsujitani S, Kaibara N, ItoH. Apoptosis occurs more frequently in metastatic foci than in primary lesions of human colorectal carcinomas: Analysis by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP- biotin nick endlabeling. Int.J.Cancer1996;65:173–177. 286. Ikenaga M, Takano Y, Saegusa M, Ohtani Y, Hiki Y, Kakita A, Okayasu I. Apoptosis of colon cancers assessed by in situ DNA nick end-labeling method. Pathol.Int.1996;46:33–37. 287. Hawkins N ,Lees J, Hargrave R,O’Connor T, Meagher A, Ward R. Pathological and genetic correlates of apoptosis in the progression of colorectal neoplasia. Tumor Biol.1997;18:146–156. Doktorska disertacija Andrej Veljković 129 288. Bedi A, Pasricha PJ, Akhtar AJ, Barber JP, Bedi GC, Giardiello FM, etal.Inhibition of apoptosis during development of colorectal cancer. CancerRes.1995;55:1811–1816. 289. Moss SF, Scholes JV, and Holt PR. Abnormalities of epithelial apoptosis in multistep colorectal neoplasia demonstrated by terminal deoxyuridine nickend labeling. Dig.Dis.Sci.1996;41:2238–2247. 290. Scott N, Martin I, Jack AS, Dixon MF, Quirk P. Genes mediating programmed cell death: An immunohistochemical study of bcl-2, c-myc and p53 expression in colorectal neoplasia. J. Clin. Pathol. Mol.Pathol.1996;49:151–158. 291. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert Metal.Genetic alterations during colorectal tumor development. N. Engl. J. Med. 1988;319:525–32. 292. Merritt AJ, Potten CS, Watson AJ, Loh DY, Nakayama K, Nakayama K, Hickman JA. Differential expression of bcl-2 inintestinal epithelia. J. Cell Sci.1995;108:2261–2271. 293. Bosari S, Moneghini L, Graziani D, Lee AK, Murray JJ, Coggi G, Viale G. Bcl-2 oncoprotein in colorectal hyperplastic polyps, adenomas, and adenocarcinomas. Hum. Pathol.1995;26:534–540. 294. Flohil CC, Janssen PA, Bosman FT. Expression of Bcl-2 protein in hyperplastic polyps, adenomas and carcinomas of the colon. J. Pathol.1996;178:393–397. 295. Nakamura T, Sakai T, Nariya S. Cell death in colorectal polypsas evaluated by in situ 3-tailing reaction and its relationship to BCL-2 expression. Pathol. Int. 1995;45:721–728. 296. Baretton GB, Diebold J, Christoforis G, Vogt M, Müller C, Dopfer K et al. Apoptosis and immunohistochemical bcl-2 expression in colorectal adenomas and carcinomas. Cancer1996;77:255–264. 297. Oltvai ZN, Milliman CL,Korsmeyer SJ. Bcl-2heterodimerises in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programed cell death. Cell 1993;74:609–619. 298. Miyashita T and Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene.Cell 1995;80:293–299. 299. Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC, Perucho M. Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutatorphenotype. Science1994;275:967–969. 300. Kim H, Jen J, Vogelstein B, Hamilton SR. Clinical and pathological characteristics of sporadic colorectal carcinomas with DNA replication errors in microsatellite sequences. Am.J.Pathol.1994;145:148–156. Doktorska disertacija Andrej Veljković 130 301. Lowe SW, Ruley HE, JacksT, and Housman DE. P53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell 1993;74:957–967. 302. Chung DC. The genetic basis of colorectal cancer: insights into critical pathways of tumorigenesis. Gastroenterology 2000;119:854-865. 303. Groden J, Thliveris A, Samowitz W, Carlson M, Gelbert L, Albertsen H et al. Identification and characterization of the familial adenomatous polyposis coli gene. Cell 1991;66:589-600. 304. Miyashiro I, Senda T, Matsumine A, Baeg GH, Kuroda T, Shimano T et al. Subcellular localization of the APC protein: immunoelectron microscopic study of the association of the APC protein with catenin. Oncogene 1995;11:89-96. 305. Morin PJ, Vogelstein B, and Kinzler KW. Apoptosis and APC in colorectal tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1996;93:7950-7954. 306. Sigal A, Rotter V. Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: the demons of the guardian of the genome. Cancer Res 2000;60:6788-6793. 307. Shaw P, Bovey R, Tardy S, Sahli R, Sordat B, Costa J. Induction of apoptosis by wild-type p53 in a human colon tumor-derived cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1992;89:4495-4499. 308. Krajewska M, Moss SF, Krajewski S, Song K, Holt PR, Reed JC. Elevated expression of Bcl-X and reduced Bax in primary colorectal adenocarcinomas. Cancer Res. 1996;56:2422-2427. 309. Economidou-Karaoglou A, Lans M, Taper HS, Michaux JL, Roberfroid M. Variations in serum alkaline DNasea-Activity: a new means for therapeutic monitoring of malignant lymphomas. Cancer 1988;61:1838-1843. 310. Ramandanis G, Agnantis N, Garas J, Spandidos DA. Correlation between serum and tissue deoxyribonuclease levels in breast cancer patients. Anticancer Res. 1982;2:213-218. 311. Tamkovich SN, Cherepanova AV, Kolesnikova EV, Rykova EY, Pyshnyi DV, Vlassov VV, Laktionov PP. Circulating DNA and Dnase Activity in Human Blood. Ann.N.Y.Acad.Sci. 2006;1075:191-196. 312. Daoust R, and Amano H. Ribonuclease and Deoxyribonuclease Activities in Experimental and Human Tumors by the Histochemical Substrate Film Method. Cancer Res. 1963;23:131-134. 313. Ambellan E and Hollander VP. The Role of Ribonuclease in Regression of Ascites Hepatoma Cells. Can. J. Biochem. 1968;46:1121-1129. 314. Henryk ST, Leonard F, and Jean-Marie B. Histochemical Activity of Alkaline and Acid Nucleases in the Rat liver Parenchyma during N-Nitrosomorpholine Carcinogenesis. Cancer research 1971;78:913-916. Doktorska disertacija Andrej Veljković 131 315. Nagao M, and Ichikawa Y. Systemic Effect of Mouse Leukemia on RNase and Its Inhibitor of Host Liver and Spleen. Gann. 1969;60:279-285. 316. Daoust R and Amano H: Ribonuclease and deoxyribonuclease activities in experimental and human tumors by histochemical substrate film method. Cancer Res. 1963;23:131-134. 317. Taper HS: The relation between the histochemical activity of nucleases and neoplasms in rat and man. Vander, Louvain, 1975. 318. Taper HS. L’activité des nucleases et phosphatases acideset alcalines dansles tumeursrénales induites chezleratparla diméthylnitrosamine (Etude histochimique). Path.Eur. 1967;2:406-420. 319. Fort L, Taper HS, Brucher JM. Gastric carcinogenesis induced in rats by methylnitrosourea ( MNU) . Morphology and histochemistry of nucleases. Z Krebsforsch 1974;81:51-62. 320. Taper HS and Bannasch P. Histochemical correlation between glycogen, nucleic acids and nucleases in preneoplastic lesions of rat liver after short-term administration of N-nitrosomorpholine. Z. Krebsforsch 1976;87:53-65. 321. Fort L, and Taper HS: Nucleases activity in different segments of the human digestive tube compared to the incidence of carcinomas (histochemical study). Histochemie 1969;20:150-158. 322. Taper HS. Reversibility of acid and alkaline deoxyribonuclease deficiency in malignant tumor cells. J.Histochem.Cytochem.1980;29:1053-1060. 323. Taper HS, de Gerlache J, Lans M, Roberfroid M. Non-toxic potentiation of cancer chemotherapy by combined C and K3 vitamin pre-treatment. Int. J. Cancer 1987;40:575-579. 324. Taper HS, Jamison JM, Gilloteaux J, Summers JL, Buc Calderon P. Inhibition of the development of metastases by dietary vitamin C/K3 combination. Life Sci. 2004;75:955-967. . 325. Gilloteaux J, Jamison JM, Venugopal M, Giammar D, Summers JL. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy aspects of synergistic antitumor activity of vitamin C-vitamin K3 combinations against human prostatic carcinoma cells. Scanning Microscop Intern1995;9:159-173. 326. Sinha BK and Mimmaugh EG. Free radicals and anticance rdrug resistance. Oxygen free radicals in the mechanisms of drug cytotoxicity and resistance by certain tumors.Free Rad.Biol.Med. 1990:8;567-581. 327. Compton CC, Fielding LP, Burgart LJ, Conley B, Cooper HS, Hamilton SR et al. Prognostic factors in colorectal cancer. College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch. Pathol. Lab. Med. 2000;124:979-994. Doktorska disertacija Andrej Veljković 132 328. Witzig TE, Loprinzi CL, Gonchoroff NJ, Reiman HM, Cha SS, Wieand HS et al. DNA ploidy and cell kinetic measurements as predictors of recurrence and survival in stages B2 and C colorectal adenocarcinoma. Cancer 1991;68:879- 888. 329. Chang WC, Chapkin RS, Lupton JR. Predictive value of proliferation, differentiation and apoptosis as intermediate markers for colon tumorigenesis. Carcinogenesis 1997;18:721-730. 330. Hashimoto S, Koji T, Kohara N, Kanematsu T, Nakane PK. Frequency of apoptosis relates inversely to invasiveness and metastatic activity in human colorectal cancer. Virchows Arch. 1997;431:241-248. 331. Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, Toyoda M, Tenjo T, Tanigawa N. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer. Cancer Res. 1998;58:5071-5074. 332. Schwandner O, Schiedeck TH, Bruch HP, Duchrow M, Windhoevel U, Broll R. Apoptosis in rectal cancer: prognostic significance in comparison with clinical histopathologic, and immunohistochemical variables. Dis. Colon Rectum 2000;43:1227-1236. 333. Sinicrope FA, Hart J, Hsu HA, Lemoine M, Michelassi F, Stephens LC. Apoptotic and mitotic indices predict survival rates in lymph node- negative colon carcinomas. Clin. Cancer Res. 1999;5:1793-1804. 334. Langlois NE, Lamb J, Eremin O, and Heys SD. Apoptosis in colorectal carcinoma occurring in patients aged 45 years and under: relationship to prognosis, mitosis, and immunohistochemical demonstration of p53, c-myc and bcl-2 protein products. J Pathol 1997;182:392-397. 335. Sugamura K, Makino M, Kaibara N. Apoptosis as a prognostic factor in colorectal carcinoma. Surg. Today 1998;28:145-150. 336. Hawkins N, Lees J, Hargrave R, O’Connor T, Meagher A, Ward R. Pathological and genetic correlates of apoptosis in the progression of colorectal neoplasia. Tumour Biol 1997;18:146-156. 337. Glinsky GV. Apoptosis in metastatic cancer cells. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1997;25:175-186. 338. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998;58:5248-5257. 339. Wheeler JM, Bodmer WF, Mortensen NJ. DNA mismatch repair genes and colorectal cancer. Gut 2000;47:148-153. Doktorska disertacija Andrej Veljković 133 340. Lengauer C, Kinzler KW, and Vogelstein B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature 1997;386:623-627. 341. Dolcetti R, Viel A, Doglioni C, Russo A, Guidoboni M, Capozzi E, et al. High prevalence of activated intraepithelial cytotoxic T lymphocytes and increased neoplastic cell apoptosis in colorectal carcinomas with microsatellite instability. Am. J. Pathol. 1999;154:1805-1813. 342. Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Cancer 2002;2:163-176. 343. Forster SJ, Talbot IC, Clayton DG, Critchley DR. Tumour basement membrane laminin in adenocarcinoma of rectum: an immunohistochemical study of biological and clinical significance. Int. J. Cancer 1986;37:813–817. 344. McCawley LJ, and Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: they’re not just for matrix anymore! Curr. Opin. Cell Biol. 2001;13:534-540. 345. Mannello F, Luchetti F, Falcieri E, Papa S. Multiple roles of matrix metalloproteinases during apoptosis. Apoptosis 2005;10:19-24. 346. Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996;86:353-364. 347. Xu J, Rodriguez D, Petitclerc E, Kim JJ, Hangai M, Moon YS, et al. Proteolytic exposure of a cryptic site within collagen type IV is required for angiogenesis and tumor growth in vivo. J. Cell Biol. 2001;154:1069-1080. 348. Cornelius LA, Nehring LC, Harding E, Bolanowski M, Welgus HG, Kobayashi DK et al. Matrix metalloproteinases generate angiostatin: effects on neovascularization. J. Immunol. 1998; 88:801-810. 349. Sheu BC, Hsu SM, Ho HN, Lien HC, Huang SC, Lin RH. A novel role of metalloproteinase in cancer-mediated immunosuppression. Cancer Res 2001; 61:237-242. 350. Overall CM, McQuibban GA, Clark-Lewis I. Discovery of chemokine subtrates for matrix metalloproteinases by exosite scanning: a new tool for degradomics. Biol. Chem. 2002;383:1059-1066. 351. Théret N, Musso O, Campion JP, Turlin B, Loréal O, L'Helgoualc'h A, Clément B. Overexpression of matrix metalloproteinase -2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 in liver from patients with gastrointestinal adenocarcinoma and no detectable metastasis. Int. J. Cancer 1997;74:426–432. 352. Tsujii M, Kawano S, Tsuji S, Sawaoka H, Hori M, DuBois RN. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells [published erratum appears in Cell 1998 Jul 24;94(2): following 271]. Cell 1998; 93:705–716. Doktorska disertacija Andrej Veljković 134 353. Zeng ZS, Huang Y, Cohen AM, Guillem JG. Prediction of colorectal cancer relapse and survival via tissue RNA levels of matrix metalloproteinase- 9. J Clin. Oncol. 1996; 14:3133–3140. 354. Pyke C, Ralfkiaer E, Tryggvason K, Dano K. Messenger RNA for twotype IV collagenases is located in stromal cells in human colon cancer. Am. J. Pathol. 1993; 142:359–365. 355. Swallow CJ, Murray MP, Guillem JG. Metastatic colorectal cancer cells induce matrix metalloproteinase release by human monocytes. Clin. Exp. Metastasis 1996;14:3–11. 356. Brand K, Baker AH, Perez-Cantó A, Possling A, Sacharjat M, Geheeb M, Arnold W. Treatment of colorectal liver metastases by adenoviral transfer of tissue inhibitor of metalloproteinases- 9 into the liver tissue. Cancer Res 2000; 60:5723–5730. 357. Aghaei M, Karami T, Salami S, Atri M. Adenosine deaminase activity in the serum and malignant tumors of breast cancer; the assessment of isoenzyme ADA1 and ADA2 activities. Clin.Biochem. 2005;38(10):887-91. 358. Kocic G, Vlahovic P, Djordjevic V, Bjelakovic G, Koracevic D, Savic V. Effect of growth factors on the enzymes of purin metabolism in culture of regenerating rat live cells. Arch. Physiol. Biochem. 1995;103:715-719. 359. Balis E. Adenosine deaminase and malignant cells . Ann. NY Acad. Sci. 1985;45:142-9. 360. Zeleznikar RJ, Heyman RA, Graeff RM, Walseth TF, Dawis SM, Butz EA, Goldberg ND. Evidence for compartmentalized adenylate kinase catalysis serving a high energy phosphoryl transfer function in rat skeletal muscle J.Biol.Chem.1990;265:300–311. 361. Matsuura S, Igarashi M, Tanizawa Y, Yamada M, Kishi F, Kajii T et al. Human adenylate kinase deficiency associated with hemolytic anemia. J. Biol. Chem.1989;264:10148–10152. 362. NatsumedaY, Prajda N, Donohue JP, Glover JL, Weber G. Enzymic capacities of purine denovo and salvage pathways for nucleotide synthesis in normal and neoplastic tissues. CancerRes.1984;44:2475–2479. 363. Hockel M, Vaupel P. Tumour hypoxia: definitions and cur- rent clinical, biologic and molecular aspects. J. Natl. Cancer Inst.2001;93:266–276. 364. Spychala J. Tumour-promoting function of adenosine. Pharmacol. Therapy 2000;87:161–173. 365. Weisman GA, LustigKD, Lane E, Huang NN, Belzer I, FriedbergI. Growth inhibition of transformed mouse fibroblasts by adenine Nucleotides occurs via generation of extracellular adenosine. J.Biol.Chem. 1988;263:12367–12372. Doktorska disertacija Andrej Veljković 135 366. Fishman P, Bar-Yehuda S, Vagman L. Adenosine and other low molecular weight factors released by muscle cells inhibit tumor cell activities ofa denosine deaminase, 5V-nucleotidase, guanase, and cy-growth. Cancer Res. 1998; 58:3181–3187. 367. Spychala J. Tumor-promoting functions of adenosine. Pharmacolo. Ther. 2000;87:161-173 368. Tey H, Khoo H. Adenosine modulates cell qrowth in human epidermoid carcinoma cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992;187:1486-1492. 369. Fanier M, Vanoverschelde J. Adnosine protects ischemic and reperfused myocardium by receptor-mediated mechanism. Am. J. Physiol. 1993;264:163- 170 370. Levievre V, Caigneaux E. Extracellular adenosine deprivation induces epithelial differentiation of HT29 cells:evidence for a concomitant adenosine A1-A2 receptor balance regulation. Eur. J. Pharmacol. 2000;392:21-29. 371. Pueyo M, Chen Y, Dangelo G. Regulation of vascular endothelial qrowth factor expression by cAMP in rat aortic smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 1998;238:354-358. 372. Barcz E, Sommer E. The influence of theobromin on angiogenic activity and proangiogenic cytokines production oh human ovarian cells. Oncol. Rep. 1998;5:517-520. 373. Cronstein BN, Kubersky SM, Weissmann G, Hirschhorn R. Engagement of adenosine receptors inhibits hydrogenperoxide release by activated human neutrophils. Clin. Immunol. Immunopathol. 1987;42:4276–4285. 374. Schulte G, Fredholm BB. Signalling from adenosine receptor to mitogen activated protein kinases. Cell. Signalling. 2003;15:15813–15827. 375. Natsumeda Y, Lui MS, Emrani J, Faderan MA, Reardon MA, Eble JN et al. Purine enzymology of human colon carcinomas. Cancer Res.1985;45:2556- 2559. 376. Ten Kate J, Wijnen JT, van der Goes RG, Quadt R, Griffioen G, Bosman FT, Khan PM. Quantitative changes in adenosine deaminase isoenzymes in human colorectal adenocarcinomas. Cancer Res.1984;44:4688-4692. 377. Bemi V, Tazzini N, Banditelli S, Giorgelli F, Pesi R, Turchi G, Mattana A, Sgarrela F, Tozzi MG, Camici M. Deoxyadenosine metabolism in a human colon-carcinoma cell line (LoVo) inrelation to its cytotoxic effect in combination with deoxycoformycin. In. J. Cancer 1998;75:713-720. 378. Kate J, Ingh HF, Khan PM, Bosman FT. Adenosine deaminase complexing protein (ADCP) immunoreactivity in colorectal adenocarcinoma. Int. J. Cancer 1986;15:479-485. Doktorska disertacija Andrej Veljković 136 379. Fearon ER, and Vogelstein B. A genetic model of colorectal tumorogenesis. Cell 1990;61:759-767. 380. Benveniste P, and Cohen A. p53 expression is required forthymocite apoptosis induced by adenosine deaminase deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA;92:8373-8377. 381. Khramsatova SN, Osovskaia VS, Semeniak OI, Potapova GI,Chumakov PM, Kopnin BP. Opposite effect of p53 on nucleotide metabolyzing enzyme activity in Rat cells and their sublines, transformed by N-RAS or v-mos oncogenes. Biokhimia 1995;60:1881-1888. 382. Camici M, Tozzi MG, Allegrini S, Del Corso A, Sanfilippo O, Daidone MG et al. Purine salvage enzyme activities in normal and neoplastic human tissues. Cancer Biochem.Biophys.1990;11:201-209. 383. Durak I, Isik AU, Canbolat O, Akyol B,Kavutcu M. Adenosine deaminase,5'- nucleotidase, xanthine oxidase, superoxide dismutase and catalase activities in cancerous and noncancerous human laryngeal tissues. Free Radic. Biol. Med 1993;15:681-684. 384. Durak I, Perk H, Kavutçu M, Canbolat O, Akyol O, Bedük Y. Adenosine deaminase, 5'-nucleotidase, xanthine oxidase, superoxide dismutase, and catalase activities in cancerous and noncancerous human bladder tissues. Free Radic.Biol.Med.1994;16:825-831. 385. Canbolat O, Durak I, Cetin R, Kavutcu M, Demirci S, Oztürk S. Activities of adenosine deaminase, 5'- nucleotidase, guanase, and cytidine deaminase enzymes in cancerous and non-cancerous human breast tissues. Breast Cancer Res.Treat.1996;37:189-193. 386. Spychala J, Mitchell BS, Barankiewicz J.Adenosine metabolism during phorbol myristate acetate-mediated induction of HL-60 cell differentiation. J.Immunol.1997;158:4947–4952. 387. Kokoglu E, Belce A, Ozyurt E, Tepeler Z. Xanthine oxidase levels in human brain tumors. Cancer Lett. 1990;50:179–181. 388. Prajda N, and Weber G. Malign transformation-linked imbalance: decreased XO activity in hepatomas. FEBS Lett. 1975;59:245–249. 389. Prajda N, Donohue JP, Weber G. Increased amido phosphoribosyl- transferase and decreased xanthine oxidase activity in human and rat renal cell carcinoma. Life Sci. 1981;29:853–860. Doktorska disertacija Andrej Veljković 137 390. Weber G, Hager JC, Lui MS, Prajda N, Tzeng DY, Jackson RC, et al. Biochemical programs of slowly and rapidly growing human coloncarcinoma xenografts. Cancer Res1981;41:854–859. 391. NatsumedaY, Prajda N, Donohue JP,Glover JL,Weber G. Enzymic capacities of purine de novo and salvage pathways for nucleotide synthesis in normal and neoplastic tissues. Cancer Res.1984;44:2475–2479. 392. Chantret I, Trugnan G, Dussaulx E, Zweibaum A, Rousset M. Monensin inhibits the expression of sucrase-isomaltase in Caco-2 cells at the mRNA level. FEBS Lett. 1988;235:125–128. 393. Keshavarzian A, Morgan G, Sedghi S, Gordon JH, Doria M. Role of reactive oxygen metabolites in experimental colitis. Gut 1990;31:786–790. 394. Ben Hamida A, Man WK, McNeil N, Spencer J. Histamine, xanthine oxidase generated oxygen-derived free radicals and Helicobacter pylori in gastroduodenal inflammation and ulceration. Inflamm. Res. 1998;47:193–199. Doktorska disertacija Andrej Veljković 138 SAŽETAK BIOMARKERI APOPTOZE I ĆELIJSKE SIGNALIZACIJE U PATOGENEZI KOLOREKTALNOG KARCINOMA Kolorektalni karcinom je jedno od najĉešćih malignih oboljenja ljudske populacije i jedan od najĉešćih uzroka smrti. Mnogi patološki faktori su ukljuĉeni u proces inicijacije, propagacije i progresije kolorektalnog karcinoma, izmeĊu ostalih i reaktivne vrste kiseonika, koje mogu aktivisati nuklearni transkripcioni faktor kapa B, koji kontroliše gene ukljuĉene u proces razvoja tumora. Apoptoza je proces ukljuĉen u razvoj tumora, gde se blokadom apoptoze izbegava odstranjivanje malignih ćelija. Matriks metaloproteinaze imaju ulogu da razgrade proteoglikane i matiksne glikoproteine i omoguće razvoj i metastaziranje tumora. Enzimi metabolizma purinskih nukleotida mogu imati veliki znaĉaj u proliferaciji tumora. Cilj ovog istraţivanja bio je da se kod 50 pacijenata obolelih od kolorektalnog karcinoma, odredi nivo oksidativnog stresa, kvantitativne ekspresije nuklearnog transkripcionog faktora kapa B, nivo apoptoze izraţen kroz aktivnost endonukleaza i Bcl/Bax odnos, aktivnost matriks metaloproteinaze-9, i aktivnost enzima purinskih nukleotida u homogenatu tumorskog tkiva, tkiva koje neposredno okruţuje tumor kao i zdravog tkiva kolona. Koncentracije TBARS i AOPP, kao i aktivnosti enzima su odreĊene odgovarajućim spektrofotometrijskim metodama, kvantitativna ekspresija NF-B, Bcl-2 i Bax proteina, kao i aktivnost MMP-9 odreĊeni su odgovarajućim imunofluorescentnim metodama. Koncentracije TBARS, AOPP, aktivnost MMP-9, ksantin oksidaze, adenozin dezaminaze, kao i kvantitativna ekspresija NF-B i Bcl-2 u tumorskom tkivu su povećane u odnosu na zdravo tkivo kolona. Aktivnost katalaze i kvantitativna ekspresija Bax su sniţeni u tumorskom tkivu odnosu na zdravo tkivo kolona. Tkivo koje okruţuje tumor takoĊe je imalo statistiĉki znaĉajno veće vrednosti TBARS, AOPP, NF-B, Bcl-2, i veće aktivnosti MMP-9, ADA, XO u odnosu na zdravo tkivo. Rezultati našeg istraţivanja pokazuju da tumorsko tkivo ima povećan nivo oksidativnog stresa, povećan nivo markera proliferacije, ali sniţen nivo apoptoze u odnosu na zdravo tkivo kolona. Okolno tkivo je takoĊe proliferativno aktivno uz smanjen nivo apoptoze. Ove ĉinjenice mogu biti od znaĉaja pri odreĊivanju margina pri operativnom uklanjanju tumora,zatim pri kreiranju individualne terapijske strategije inoperabilnih stanja ili kod pacijenata sa metastazama. Korelacija sa patohistološkim nalazom, stadijumom tumora kao i drugim kliniĉkim karakteristikama svakog pacijenta bi omogućila precizniju procenu invazivnosti i agresivnosti tumora ali i odabir odgovarajuće terapije. Kljuĉne reĉi: Kolorektalni karcinom, oksidativni stres, apoptoza, proliferacija Doktorska disertacija Andrej Veljković 139 SUMMARY BIOMARKERS OF APOPTOSIS AND CELL SIGNALING IN COLON CANCER PATHOGENESIS Colorectal cancer is one of the most frequent neoplastic diseases in human population and one of the most frequent causes of death. There are a lot of pathological factors, involved in the process of colon cancer initiation, propagation and progression, among other ROS, who can activate Nuclear transcriptional factor kappa B (NF-B), who controls genes involved in tumor progression.Apoptosis is a process involved in the development of tumors, where blocking apoptosis avoids removal of malignant cells.The matrix metalloproteinase’s generally function to degrade proteoglycans and matrix glycoprotein’s and facilitate the development and metastasis of tumors. Enzymes of purine nucleotide metabolism may be very important in tumor proliferation. The aim of the present study wasthat in 50 patients with colorectal cancer to assess the levels of oxidative stress , quantitative expression of NF-B, level of apoptosis expressed in endonuclease activity and Bcl2 / Bax ratio, the activity of matrix metalloproteinase 9, and the activity of the enzyme of purine nucleotides in homogenates of tumor tissue, the tissue immediately surrounding the tumor and healthy colon tissue. The concentrations of TBARS and AOPP, and enzyme activities were determined by appropriate spectrophotometric methods, quantitative expression of NF-B, Bcl2 and Bax, and the activity of MMP-9 were determined by appropriate immunofluorescence methods. The concentrations of TBARS, AOPP, MMP-9 activity, xanthine oxidase, adenosine dezaminaze and quantitative expression of NF-B and Bcl2 in the tumor tissue increased compared to healthy colon tissue. Catalase activity and quantitative expression of Bax was decreased in tumor tissue compared to healthy colon tissue. The tissue surrounding the tumor also had significantly higher TBARS, AOPP, NF- B, Bcl2, and increased activity of MMP-9, ADA, XO compared to healthy tissue. Our results show that the tumor has an increased level of oxidative stress, increased levels of markers of proliferation, but decreased levels of apoptosis compared to healthy colon tissue. The surrounding tissue is also proliferativeactive with reduced levels of apoptosis. These facts may be relevant in determining the operating margin removal of the tumor, followed by the creation of individual therapeutic strategies in inoperable condition or in patients with bone metastases. Correlation with histological findings, tumor stage and other clinical characteristics of each patient would enable a more accurate assessment of invasiveness and aggressiveness of the tumor and the selection of appropriate therapy. Key words: Colorectal cancer, oxidative stress, apoptosis, proliferation Doktorska disertacija Andrej Veljković 140 BIOGRAFIJA Osnovni podaci Ime i prezime Andrej Veljković Datum i mesto rođenja 31.01.1980, Graĉanica, BiH Naučna oblast i uža specijalnost Medicina, Biohemija Obrazovanje 2010-2013 Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu, asistent za UNO biohemija 2008-2010 Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu, saradnik u nastavi za UNO biohemija 2006-2010 Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu, akademske doktorske studije-smer molekularna medicina, proseĉna ocena 9,85 2013- Specijalizacija iz kliniĉke biohemije 2005-2006 Kliniĉki centar Niš, obavezan lekarski staţ, poloţen struĉni ispit 1998-2005 Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu, doktor medicine,proseĉna ocena 9,59 Stipendije, usavršavanja i nagrade Stipendije 2006-2008 Stipendija Ministarstva nauke Republike Srbije Nagrade 2006 Nagrada Ministarstva nauke Republike Srbije 2004 Nagrada za najbolji rad na kongresu studenata medicine i stomatologije 2004 Pohvalnica od strane Medicinskog fakulteta u Nišu za istaknut nauĉno- istraţivaĉki rad Doktorska disertacija Andrej Veljković 141 Rezultati naučnoistraživačkog rada (izabrane publikacije) 1. Veljkovic AR, Nikolic RS, Kocic GM, Pavlovic DD, Cvetkovic TP, Sokolovic DT, Jevtovic TM, Basic JT, Laketic DM, Marinkovic MR, Stojanovic SR, Djordjevic BS, Krsmanovic MM. Protective Effects of Glutathione and Lipoic Acid against Cadmium-Induced Oxidative Stress in Rat's Kidney. Ren Fail 2012;34(10):1281-7. SCI 2. Veljkovic A, Kocic G, M Pavlovic D, Stanojevic G, Brankovic B, Stojanovic I, Cvetkovic T, Sokolovic D, Jevtovic T, Basic J, Marinkovic M. Lipid peroxidation, protein oxidation and antioxidant status in colorectal cancer. FEBS JOURNAL. 2011;278:405-5 3. Sokolovic D, Djordjevic B, Kocic G, Veljkovic A, Marinkovic M, Basic J, Jevtovic-Stoimenov T, Stanojkovic Z, Sokolovic DM, Pavlovic V, Djindjic B, Krstic D. Melatonin protects rat thymus against oxidative stress caused by exposure to microwaves and modulates proliferation/apoptosis of thymocytes. Gen Physiol Biophys. 2013;32(1):79-90 SCI 4. A. Šmelcerović, M. Rangelov, Ţ. Šmelcerović, A. Veljković, E. Cherneva, D. Yancheva, G.M. Nikolić, Ţ. Petronijević, G. Kocić, Two 6-(propan-2-yl)-4-methyl- morpholine-2,5-diones as new non-purine xantine oxidase inhibitors and anti- inflammatory agents. Food and Chemical Toxicology 2013; DOI: 10.1016/j.fct.2013.01.052 SCI 5. Kocic G, Kocic R, Pavlovic R, Jevtovic-Stoimenov T, Sokolovic D, Nikolic G, Pavlovic V, Stojanovic S, Basic J, Veljkovic A, Pavlovic D, Kamenov B. Possible Impact of Impaired Double-stranded RNA Degradation and Nitrosative Stress on Immuno-inflammatory Cascade in Type 2 Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2009;117(9):480-485. SCI Projekti Istraživač na projektima Ministarstva nauke Republike Srbije 2006-2010 Projekat broj: 145081: Modulatori target mesta genomiksa i proteomiksa redoks ćelijske signalizacije, proliferacije i inflamacije: nove dijagnostiĉke i terapeutske mogućnosti. Rukovodilac: Prof. dr Dušica Pavlović 2008-2011 Projekat broj: 19042: Uticaj tehnoloških postupaka prerade na biohemizam mleka i medicinska opravdanost proizvodnje novih dijetetskih proizvoda za riziĉne populacije. Rukovodilac: Prof. dr Gordana Kocić 2011-2014 Doktorska disertacija Andrej Veljković 142 Projekat broj: 31060: Proizvodnja novih dijetetskih mleĉnih proizvoda za riziĉnr populacije zasnovana na kvalitativnoj i kvantitativnoj analizi biohemijskih markera zdravstvenog rizika konzumiranja mleka. Rukovodilac: Prof. dr Gordana Kocić 2011-2014 Projekat broj: 41018: Preventivni i terapijski pristup prekliniĉkim i kliniĉkim istraţivanjima gena i modulatora redoks ćelijske signalizacije u imunskom, inflamatornom i proliferativnom odgovoru ćelije. Rukovodilac: Prof. dr Dušica Pavlović 2012-2013 Project Nо. DMU-03/66: Synthesis and biological activity of cyclodepsipeptides (Young Researchers) National Science Fund of Bulgaria. Pedagoški rad Asistent za UNO Biohemija na predmetima: Biohemija (medicina, stomatologija) Opšta biohemija (farmacija) Medicinska biohemija (farmacija) Uvod u NIR (medicina, stomatologija, farmacija) Medicinska fiziologija sa biohemijom (osnovne strukovne studije) Januar 2008 Pedagoško metodiĉko usavršavanje fakultetskih saradnika, Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu 2001-2004 Demonstrator na predmetu biohemija, Medicinski fakultet, Univerzitet u Nišu Članstva Ĉlan društva medicinskih biohemiĉara Srbije (DMBS) i meĊunarodnog udruţenja Federation of European biochemical societies (FEBS)