Универзитет у Крагујевцу Факултет медицинских наука Снежана С. Сретеновић УТИЦАЈ ГЕНСКОГ ПОЛИМОРФИЗМА BCL - 2 + И MYC + УТВРЂЕНИХ FISH – ОМ НА ПРОГНОЗУ БОЛЕСНИКА СА ДИФУЗНИМ Б КРУПНОЋЕЛИЈСКИМ ЛИМФОМОМ ЛЕЧЕНИХ ИМУНОХЕМИОТЕРАПИЈОМ ДОКТОРСКА ДИСЕРТАЦИЈА Ментор: Доц. Др Слободанка Митровић – патологија Крагујевац, 2015. II Захваљујем се колегама и целокупном особљу Клинике за хематолoгију и Службе за патолошку анатомску дијагностику Клиничког Центра у Крагујевцу. Захвалност за израду ове дисертације дугујем најпре свом ментору, Доц. др Слободанки Митровић, за стручну подршку, корисне савете и људску помоћ. Посебну захвалност за финансијску и моралну подршку дугујем супругу Војиславу, а за емотивни подстицај сину Алекси и ћерки Јани. Захваљујем се колегама, бившим и садашњим професорима Клинике за Хематологију КЦ Србије који су ме научили да мислим као хематолог. Захваљујем се својим родитељима који су ме научили колико је драгоцена слобода. III Докторску дисертацију посвећујем свом родном граду Горњем Милановцу, у години обележавања два века од другог српског устанка подигнутог лета гoсподњег 1815. године у Такову. „Свему има своје вријеме, и сваком послу под небом има вријеме. Има вријеме када се рађа и вријеме када се умире, вријеме када се сади и вријеме када се чупа посађено. Вријеме када се убија и вријеме кад се исцељује, вријеме када се разваљује и вријеме када се гради. Вријеме плачу и вријеме смјеху, вријеме ридању и вријеме игрању. Вријеме када се размеће камење и вријеме када се скупља камење, вријеме када се грли и вријеме када се оставља грљење. Вријме кад се тече и вријеме кад се губи, вријеме кад се чува и вријеме кад се баца. Вријеме кад се дере и вријеме кад се сашива, вријеме кад се ћути и вријеме кад се говори. Вријеме кад се љуби и вријеме када се мрзи, вријеме рату и вријеме миру.“ Књига Проповједника глава 3. IV САДРЖАЈ 1. УВОД ..................................................................................................................................... 1 1.1. Нехочкинови лимфоми ................................................................................................. 1 1.1.1. Историјат лимфома ................................................................................................. 1 1.1.2. Дефиниција нехочкинових лимфома (НХЛ) ........................................................ 3 1.1.3. Дифузни Б крупноћелијски лимфом: дефиниција и подела ............................... 5 1.1.4. Епидемиологија ДБКЛ ........................................................................................ 11 1.1.5. Патогенеза, генске аберације и експресије, морфолошке особине ДБКЛ ...... 11 1.1.6. Клиничка обележја и клинички дијагностички алгоритам ДБКЛ ................... 13 1.1.7. Лечење ДБКЛ ....................................................................................................... 15 1.1.8. Механизам деловања цитостатика протокола CHOP ........................................ 16 1.1.8.1. Циклофосфамид /EndoxanR/ .......................................................................... 16 1.1.8.2. Винкристин / OncovinR/ ................................................................................. 16 1.1.8.3. Доксорубицин / AdriablastinR/ ....................................................................... 17 1.1.8.4. Преднизон / Pronizon R / ................................................................................. 17 1.1.9. Механизам деловања моноклонског антитела ритуксимаб (Mabthera R) ........ 17 1.2. Технологија генског чипа и имунохистохемије у прогнози оболелих од ДБКЛ ....................................................................................................................... 20 1.3. Прогностички параметри ДБКЛ, детектовани флуерoсцентном in situ хибридизацијом ............................................................................................................ 21 1.3.1. Цитогенетске аберације ........................................................................................ 21 1.3.1.1. c-myc ................................................................................................................ 21 1.3.1.2. Bcl-2 ................................................................................................................. 23 1.3.1.3. Bcl-6 ................................................................................................................. 24 1.3.1.4. Bcl-2 /c- myc - double hit ДБКЛ .................................................................... 25 2. ЦИЉЕВИ И ХИПОТЕЗЕ ИСТРАЖИВАЊА .................................................................. 27 2.1. Циљеви истраживања .................................................................................................. 27 2.2. Хипотезе истраживања................................................................................................ 27 3. ИСПИТАНИЦИ, МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ ................................................................... 28 3.1. Испитивана популација ............................................................................................... 28 3.2. Обрада материјала за анализу .................................................................................... 29 V 3.3. Методе анализе материјала......................................................................................... 30 3.3.1. Имунохистохемијски метод ................................................................................. 30 3.3.2. Флуоросцентна in situ хибридизација ................................................................. 30 3.4. Статистичка анализа података ................................................................................... 34 4. РЕЗУЛТАТИ ....................................................................................................................... 35 4.1. Анализа клиничких особености испитаника у моменту дијагностиковања .......... 35 4.1.1. Анализа Б симптоматологије оболелих од ДБКЛ ............................................. 40 4.1.2. Анализа коморбидитета оболелих од ДБКЛ, различитог исхода .................... 43 4.2. Претерапијске лабораторијске анализе крви у оболелих од ДБКЛ ....................... 43 4.2.1. Анализа претерапијске крвне слике .................................................................... 43 4.2.2. Биохемијске анализе крви претерапијске ........................................................... 47 4.2.3. Биохуморални запаљенски синдром претерапијски.......................................... 54 4.3. Имунохистохемијска анализа и генски полиморфизам за bcl-2 и c-myc утврђен FISH-ом ......................................................................................................................... 57 4.4. Анализа преживљавања .............................................................................................. 62 4.4.1. Преживљавање у односу на IPI, перформанс статус болесника – ECOG и клинички стадијум ................................................................................................ 63 4.4.2. Преживљавање испитаника у односу на анализиране биохемијске параметре при дијагнози ДБКЛ ............................................................................................ 68 4.4.3. Анализа повезаности генског полиморфизама, IPI ризика и преживљавања у испитаника са ДБКЛ ............................................................................................ 72 4.4.4.Анализа терапијског одговора и преживљавања.....................................................................83 4.5. COX-ова регресиона анализа преживљавања ............................................................... 89 4.6. Генски полиморфизам и одговор на терапију: комплетна ремисија .......................... 92 4.6.1. Сензитивност и специфичност генског полиморфизма у предикцији постизања комплетне ремисије ..................................................................................................... 94 4.7. Генски полиморфизам и одговор на терапију: парцијални одговор .......................... 96 4.7.1. Сензитиност и специфичност генског полиморфизма у предикцији постизања парцијалног одговора .................................................................................................. 99 4.8. Генски полиморфизам и одговор на терапију : рефрактерност на терапију .......... 101 4.8.1. Сензитивност и специфичност генског полиморфизма у предикцији рефрактерности на терапију ..................................................................................... 104 VI 5. ДИСКУСИЈА: ................................................................................................................... 106 6. ЗАКЉУЧЦИ ...................................................................................................................... 117 7. ПОПИС ОЗНАКА И СКРАЋЕНИЦА ............................................................................ 119 8. ЛИТЕРАТУРА .................................................................................................................. 121 9. ПРИЛОГ............................................................................................................................138. 1 1. УВОД 1.1. Нехочкинови лимфоми 1.1.1. Историјат лимфома Британски патолог Thomas Hodgkin, је први 1832. године у свом раду описао лимфоме. Каснијом анализом утврђено је да су од седам узорака, три била Хочкинов лимфом, а четири узорка - Нехочкинови лимфоми (НХЛ), реактивна упала или туберкулоза (1). Тридесетак година касније не знајући за рад Thomasa Hodgkin-a британски лекар Samulel Wilks, поново описује болест лимфних чворова, те једна од лимфопролиферативних болести, у част првог аутора, добија назив Хочкинова болест. НХЛ су историјски обухватали све оне различите типове лимфома који нису имали патохистолошка обележја Хочкиновог лимфома. Новија историја НХЛ –а је историја различитих класификација којима се покушава постићи консензус патолога и клиничара у целом свету. Напредак науке и дијагностике је условљавао настајање нових ентитета, те је до последње класификације СЗО (Светска Здравствена Организација, енгл. World Haealth Organisation – WHO) из 2008.године промењено низ класификација. Прву модерну класификацију лимфома, базирану на морфолошким особинама ћелија, је предложио Rappaport са сарадницима 1956.године (2). Класификација Lukesa и Collinsa из 1974. уводи први пут поделу на Б и Т лимфоме, а подтипове одређују цитолошке особине (3). Kielska класификација уведена 1974 године, а потом ревидирана 1988.године, задржава поделу на Т и Б лимфоме (на основу имунофенотипа), а уводи поделу на ниско агресивне (енгл. Low grade) и високо агресивне (енгл. High grade) лимфоме, занемарујући клинички ток болести. Радна класификација (енгл. „Working Formulation of non – Hodgkin Lymphomas for Clinical Usage – WF“) за клиничку употребу из 1982. године, није дуго живела и била је модификована Rappaport-ова класификација (4). Ревидирана евро-америчка класификација лимфома (REAL) донета 1994.године имала је дуго практичну вредност и била прихваћена од стране патолога и клиничара. (5). СЗО доноси нову класификацију лимфоидних неоплазми 2001. године која је ревидирана 2008.године. Данас се у свакодневној пракси користи класификација зрелих хематолошких малигнитета СЗО из 2008. године (табела бр.1) (6). 2 Зреле Б ћелијске неоплазме Зреле Т и НК – ћелијске неоплазме - Хронична лимфоцитна леукемија /лимфом малих лимфоцита - Б- ћелијска пролимфоцитна леукемија - Спленични лимфом маргиналне зоне - Леукемија власастих ћелија - Спленични лимфом/леукемија, некласификован Спленични лимфом са дифузном инфилтрацијом црвене пулпе малим Б лимфоцитима - леукемија власастих ћелија – варијанта - Лимфоплазмоцитни лимфом / Waldenstrom макроглобулинемија - Болест тешких ланаца (alpha,gamma, mu) - Плазма ћелијске неоплазме - Екстранодални лимфом маргиналне зоне лимфног ткива придруженог мукози (MALT) - Нодални лимфом маргиналне зоне (MZL) - Фоликуларни лимфом - Примарни кутани лимфом центра фоликула - Мантле ћелијски лимфом - Дифузни Б – крупноћелијски лимфом (ДБКЛ), који није другачије одређен * ДБКЛ богат Т лимфоцитима/хистоцитима * ДБКЛ удружен са хроничном инфламацијом * Epstein-Barr вирус (EBV) + ДБКЛ старих * Примарни кутани ДБКЛ“ leg type“ * интраваскуларни ДБКЛ * Лимфоматоидна грануломатоза * АЛК позитивни ДБКЛ * Плазмобластни лимфом * Крупноћелијски Б лимфом настао у HHV8 мултицентричној Castelman-овој болести * Примарни ефузиони лимфом - Burkitt лимфом - Б ћелијски лимфом, некласификован,са заједничким особинама ДБКЛ и Burkitt лимфома - Б ћелијски лимфом, некласификован , са заједничким особинама ДБКЛ и класичног Hodgkin –овог лимфома - Т ћелијска пролимфоцитна леукемија - Т ћелијска леукемија великих гранулираних лимфоцита - Хронични лимфопролиферативни поремећај НК ћелија - Агресивна НК – ћелијска леукемија - Системска EBV позитивна Т ћелијска лимфопролиферативна болест дечијег доба - Хидроа вакциниформни –слични лимфом - Т ћелијска леукемија/лимфом одраслих (HTLV-I позитивни) - - Екстранодални НК/Т ћелијски лимфоми, назални тип - T ћелијски лимфом удружен са ентеропатијом - Хепатоспленични T ћелијски лимфом - Субкутани паникулитису сличан Т ћелијски лимфом - Mycosis fungoides - Sezary syndrom - Примарни кутани CD 30+ T ћелијски лимфопролиферативни поремећаји * Лимфоидна папулоза * Примарни кутани анапластични лимфом великих ћелија - Примарни кутани ϒσ Т ћелијски лимфом - Примарни кутани CD8+ агресивни епидермоидни T - лимфом цитотоксичних ћелија - Примарни кутани CD4+ T – лимфом малих /средњих ћелија - Периферни Т – ћелијски лимфом, NOS - Ангиоимунобластни Т ћелијски лимфом - Лимфом анапластичних великих ћелија, ALK - позитиван - Лимфом анапластичних великих ћелија, АLK - негативан Табела бр.1. СЗО 2008 класификација Б ,Т и НК – ћелијских неоплазми 3 1.1.2. Дефиниција нехочкинових лимфома (НХЛ) НХЛ су хетерогена група тумора која потиче од Б или Т, односно НК ћелија, заосталих у различитим стадијумима диференцијације (7). НХЛ су у 85% порекла Б лимфоцита, док преосталих 15% чини Т, НК и мешовито Б и Т ћелијско порекло. Нормални лимфоцити, као носиоци имунитета, непрекидно примају сигнале смрти и преживљавања, а њихов баланс обездеђује хомеостазу и спречава аутоимунитет. Из још не утврђених разлога, настанак функцијске дисрегулације ових ћелија води ка неопластичној промени и неконтролисаној пролиферацији. Oви лимфоми по учесталости заузимају пето место међу малигнитетима иза (карцинома плућа, простате, дојке и дебелог црева). Инциденца им је удвостручена за протеклих двадесет година (19,7%) за разлику од других лимфопролиферативних болести чија је инциденца готово непромењена (8,9). Постоје дефиниције које инсистирају на клоналности као основној карактеристици ових болести, уз осврт на клиничко понашање – нодални, екстранодални или леукемијски раст (10). Клоналност се тумачи као последица тзв. „развојног застоја“ који може настати на било ком нивоу диференцијације Б и Т лимфоцита, са дедиференцијацијом породице (клона) малигних ћелија порекла једне родитељске ћелије, са карактеристичним фенотипом свих ћелија једног клона. Са аспекта патогенезе ових болести, може се рећи да се лимфне ћелије једног клона препознају по одређеним абнормалностима кариотипа у току метафаза. Два основна механизма у основи поменутог процеса су: хромозомско преуређење (реаранжман) и генско појачање (амплификација). Као основни разлог за настанак хромозомског преуређења наводи се генска нестабилност. Под овим појмом се подразумева постојање осетљивих „ломљивих“ места у хромозому, која су носиоци ове нестабилности (10). Последице хромозомских транслокација су: поремећај испољавања функције у смислу повећаног или ненормалног испољавања и стварање нових тзв. фузионих секвенци које су резултат блиске међусобне позиције гена који иначе не припадају истом хромозому. Генско појачање је процес у коме малигна лимфна ћелија стиче способност за умножавање истих генских копија чиме се стиче способност за продукцију великих количина специфичних ћелијских протеина. Овај процес је ређа 4 појава у НХЛ. Пример је генско појачање REL екстранодалном ДБКЛ, у примарном медијастиналном ДБКЛ и фоликуларном НХЛ (11). Последње деценије клиничка и лабораторијска истраживања се допуњују новим молекуларним методама, као што је генско испитивање које ће помоћи у бољем разумевању биологије и диференцијације НХЛ-а. Ово се рефлектује у најновијој класификацији СЗO где, да би се дефинисала болест, патолог користи све доступне информације: морфологију, имунофенотип, генске карактеристике и клиничко обележје (7). НХЛ су на петом месту међу малигнитетима у САД, а непосредни узрок смрти су у 4% болесника (12). Учесталост у САД износи 19,1 на 100 000 људи годишње, виша је у мушкараца него у жена са односом 23,2 : 15,8 и расте са старосном доби (13). Србија је по инциденци лимфоидних неоплазми на двадесет седмом месту међу четрдесет и две земље Европе, уз сличан морталитет, на основу епидемиолошких података о НХЛ оба пола из 2012.године ( слика бр. 1). Слика бр. 1. Инциденца и морталитет од нехочкинових лимфома оба пола у Европи 2012. године 5 У Србији нема прецизних података о учесталости НХЛ-а, али анализа 1999 бипопсија, од јануара 2011. до децембра 2012.године показује највећу учесталост ДБКЛ међу лимфопролиферативним болестима, (слика бр.2). Слика бр.2. Учесталост лимфопролиферативних болести у Србији ( јануар 2011.г. –децембар 2012.г) Анализирана структура смртности од малигних хемопатија у централној Србији за период од 1990.године до 1999. године, показује учешће НХЛ-а од 20% (14). 1.1.3. Дифузни Б крупноћелијски лимфом: дефиниција и подела Дифузни Б крупноћелијски нехочкинов лимфом представља хетерогену групу агресивних лимфома, који се карактеришу присуством крупних, трансформисаних Б ћелија. Према најновијој класификацији СЗО, ДБКЛ је на основу морфолошких, биолошких и клиничких особина подељен на неколико варијанти и специфичних подтипова (табела 2). Међутим неке је тешко сврстати у одређену подгрупу, те се сврставају у групу без посебних карактеристика (енгл. „not otherwise specified“ – NOS ДБКЛ) чинећи трећину свих НХЛ- а (15). 6 ДБКЛ not otherwise specified (NOS) Честе морфолошке варијанте - центробластни - имунобластни - анапластични Ретке морфолошке варијанте Молекуларне варијанте (GCB тип и ABC тип) Имунохистохемијске подгрупе - CD5 позитивни ДБКЛ - GCB - Non- GCB Подтипови Б крупноћелијског лимфома - Б крупноћелијски лимфом богат Т лимфоцитима - Примарни ДБКЛ мозга - Примарни кутани ДБКЛ „ leg type “ - EBV позитивни ДБКЛ старих особа - Други лимфоми крупних Б ћелија - Примарни медијастинални Б ћелијски лимфом - Интраваскуларни ДБКЛ - ДБКЛ повезан са хроничном инфламацијом - Лимфоматоидна грануломатоза - АLK позитиван ДБКЛ - Плазмобластни лимфом - Крупноћелијски Б лимфом настао у HHV8 мултицентричној Custeman - ovoj болести - Примарни ефузини лимфом Гранични случајеви - Б ћелијски лимфом, некласификован, са особинама између ДБКЛ и Burkitt лимфома - Б ћелијски лимфом, некласификован, са особинама између ДБКЛ и класичног Hodgkin лимфома Табела бр. 2. Класификација ДБКЛ (СЗО, 2008.године) Начин стадирања ДБКЛ (енгл. „staging“ diffuse large B-cell lymphoma – DLBCL) предвиђа, поред претходно наведене класификације СЗО учињене на основу морфолошких, биолошких и клиничких особина неоплазми, и класификацију по Ann Arbor систему, која је иницијално усвојена 1971.године за Хочкинову болест. Ann Arbor класификација описује четри клиничка стадијума а према раширености болести. Први клинички стадијум описује захваћеност једног региона лимфних жлезда или екстралимфатичног органа, други подразумева захваћеност два или више органа са исте стране дијафрагме или локализовано захватање екстралимфатичних органа или места плус једног или више лимфних региона са исте стране дијафрагме, са назнаком а - позитивне лимфне регије су једна поред друге односно per continuitatem, или назнаком b - позитивне лимфне регије нису једна поред друге, али су и даљe са исте стране дијафрагме. Трећи клинички стадијум означава захваћеност лимфних региона са обе 7 стране дијафрагме. Дифузна или дисеминована захваћеност једног или више екстралимфатичних органа или ткива, са или без захваћености лимфних жлезда се означава као четврти клинички стадијум, ( табела бр.3). I Захваћеност једног региона лимфних жлезда или екстралимфатичног органа (места) II Захваћеност 2 (два) или више лимфних органа са исте стране дијафрагме или локализовано захватање екстралимфатичног органа или места плус једног или више лимфних региона са исте стране дијафрагме. II(a) - Per continuitatem – позитивне лимфне регије су једна поред друге II (b) - позитивне лимфне регије нису једна поред друге, али су и даљe са исте стране дијафрагме III Захваћеност региона лимфних жлезда са обе стране дијафрагме. IV Дифузна или дисеминована захваћеност једног или више екстралимфатичних органа или ткива, са или без захваћености лимфних жлезда. Табела. бр.3. Одређивање клиничког стадијума по Аnn Аrbor класификацији Уз клинички стадијум се додаје А или В, у зависности од присутних симптома. Ако је присутан било који од симптома, повишена телесна температура, презнојавање посебно изражено ноћу или губитак у телесној тежини већи од 10% у последњих шест месеци, уз клинички стадијум се додаје велико слово B. Ако нема претходно наведених симптома уз клинички стадијум се додаје велико слово А. Наглашава се посебно постојање екстранодалне локализације болести уз додатак великог слова Е . Масивна (енгл. „Bulky“) форма болести се посебно означава, истичући велику туморску масу (18). Користи се и Cotswolds модификована Ann Arbor класификација, која подразумева постојање четри клиничка стадијума, и то први стадијум означава захваћеност једне групе лимфних чворова, други стадијум означава захваћеност више група лимфних чворова али са исте стране дијафрагме без обзира на њихов међусобни однос, а трећи стадијум описује лимфне чворове са обе стране дијафрагме. Четврти клинички стадијум подразумева више екстранодалних локализација или екстранодал уз повећан пратећи патолошки измењен лимфни чвор. Cotswolds класификација посебно наглашава bulky форму болести ако се мери туморска маса промера већег од 10 cm, а ако је екстранодална локализација болести на само једном изолованом оболелом месту, 8 означава се са великим словом Е. Постојање неког од симптома или различите комбинације истих, ноћног презнојавања, губитка у тежини већег од 10% и повишене телесне температуре, у Cotswolds класификацији посебно се означавају и то великим словом В. Одсуство симптома се означава великим словом А, ( табела бр.4). Клинички стадијум I Једна група лимфних чворова II Више група лимфних чворова са исте стране дијафрагме III Више група лимфних чворова са обе стране дијафрагме IV Више екстранодалних места или екстранодал уз лимфни чвор X Bulky > 10 cm E Eкстранодал постоји на једном екстранодалном изолованом оболелом месту A/B B-симптоми:губитак у тежини> 10%, температура, ноћно презнојавање Tабела бр.4. Одређивање клиничког стадијума по Cotswolds модификованој Ann Arbor класификацији За сваког пацијента старијег од 60 година одређује се категорија степена ризика који се назива Интернационални Прогнозни Индекс (енгл. International Prognostic Index -IPI) и један негативан поен се додељује у случају присуства: ECOG статуса који је једнак или већи од два, повишеног нивоа лактат-дехидрогеназе у односу на граничне вредности референтне лабораторије, утврђеног трећег или четвртог клиничког стадијума по Ann Arbor класификацији и утврђене једне или више екстранодалне локализације болести, (табела бр.5). Сабирањем сваког од наведених негативних прогностичких фактора, одређује се индивидуални ризик болесника, (табела бр.5а). IPI ризик је низак ако је збир 0 или1, средње низак ако је 2, средње висок ако је збир 3, односно висок ако је збир негативних поена 4 или 5. Додатни Интернационални Прогнозни Индекс (енгл. age-adjusted International Prognostic Index) је утврђен за млађе од 60 година, и један негативан поен се додељује у случају присуства трећег или четвртог клиничког стадијума по Аnn Arbor класификацији, увећаних вредности лактат-дехидрогеназе више од дупло у односу на граничне вредности референтне лабораторије и уз ECOG статус од два до четри (табела бр.6). Присуство сваког од наведених негативних прогнозних фактора носи један поен, чији збир означава прогнозни ризик. IPI age adjusted ризик може бити низак ако нема негативних поена, средње низак ако је 1, средње висок ако је 2 или 9 висок ризик, ако су присутни сви негативни прогнозни параметри те је збир поена 3, (табела бр. 6а). Старост ≥ 60 година 1негативан поен Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status ≥ 2 1негативан поен Повишена вредност лактат дехидрогеназе (LDH) >1х од нормалних вредности 1 негативан поен Ann Arbor клинички стадијум III и IV 1 негативан поен екстранодална места болести ≥ од једне локализације 1негативан поен Табела бр.5. Стратификација ризика – IPI за старије од 60 година Низак 0 или 1 Средње низак 2 Средње висок 3 Висок 4 или 5 Табела бр. 5а. Степен ризика у зависности од IPI скора Аnn Arbor клинички стадијум III и IV 1 негативан поен Вредност лактат дехидрогеназе (LDH) >1х од нормалних вредности 1 негативан поен Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status 2 до 4 1 негативан поен Табела бр.6. Стратификација ризика – IPI age adjusted, за млађе од 60 година Низак 0 Средње низак 1 Средње висок 2 Висок 3 Табела бр. 6а. Категорије процене ризика млађих од 60 година IPI je користан клинички начин за поделу болесника према ризику, али не узима у обзир генетски спектар различитости, а узимајући у обзир ECOG функционално стање од (енгл. Eastern Cooperative Oncology Group performance status). 10 ECOG статус се рангира од 0 до 4. Перфоманс статус 0, означава способност болесника да обавља све нормалне послове без ограничења, статус означен са један значи спосоност за обављање лакших послова, али постоји ограничена способност за теже послове. ECOG статус два, добија болесник који се може старати о себи, али није способан за било какав посао, он је покретан и везан је за кревет мање од половине будног периода. Статус означен са три односи се на ограничену способност болесника да се стара о себи , везан је за кревет више од половине будног времена. Болесници који имају ECOG четри нису способни за било какву активност, нити се могу старати о себи, трајно су везани за кревет, (табела бр.7) (16). 0 Способност да обавља све нормалне послове безограничења (без симптома) 1 Способност за лакше послове, ограничена способност обављања тежих физичких активности 2 Способност за бригу о себи, али неспособност за било какав посао (покретни болесник везан за кревет мање од половине будног периода) 3 Способност за ограничену бригу о себи (везан за кревет више од половине будног периода) 4 Није спососбан ни за какву бригу о себи (трајно везан за кревет). Табела бр.7. ECOG скала функционалног стања болесника Високи IPI је повезан са лошом прогнозом и у периоду пре увођења ритуксимаба у стандардну терапију петогодишње преживљавање болесника са ДБКЛ и високим IPI скором, било је 22%, за разлику од болесника у категорији ниског ризика код којих је петогодишње преживљавање било 73% (17). Модерни терапијски протоколи који укључују ритуксимаб побољшали су прогнозу у свих болесника, али разлике према IPI ризику и даље постоје. Четворогодишње преживљавање са високим IPI скором је 59%, а за болеснике са ниским ризиком је 82% (19, 20, 21,22). 11 1.1.4. Епидемиологија ДБКЛ ДБКЛ је најучесталија малигна хематолошка неоплазма у САД и Европи, чинећи око 40% свих нехочкинових Б лимфома (23). Инциденца варира од 3,7 до 14 новооболелих на 100 000 становника годишње, чешћи је у мушкараца него у жена са односом (1,3:1). Најчешће се јавља у средњој животној доби и у старијих, а најучесталији је у седмој деценији живота са медијаном од 63 године (24). Дифузни Б крупноћелијски лимфом се презентује са екстранодалном локализацијом у чак 60% случајева (25). Појава ДБКЛ може бити повезана са неким стањима, лековима и хемијским супстанцама: 1. Урођена имунодефицијентна стања (атаксија - телеангиектазија синдром, Bruton- тип агамаглобулинемије, неколико комбинованих имунодефицијентних стања (SCID), Wiskott-Aldrich -синдром, Duncan –синдром и Chediak-Higashi синдром. 2. Инфекције вирусима : HIV, Epstein-Barr вирус (EBV), хепатитис С вирус (HCV), хумани Т ћелијски леукемија вирус (HTLV), хумани херпес вирус (HHVS),, хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) . 3. Аутоимуне болести као што су : реуматоидни артритис (RА), Sjögren синдром, системски еритемски лупус (SLE) 4. употреба лекова (имуносупресиви и хемиотерапеутици ) 5. изложеност токсинима као што су хербициди, винил – хлорид и органски растварачи (26,27) 1.1.5. Патогенеза, генске аберације и експресије, морфолошке особине ДБКЛ ДБКЛ су хетерогена група обољења са вишеструким генетским абнормалностима, који резултују поремећајем регулације ћелијског циклуса, апоптозе, пролиферације ћелија, репарације дезоксирибонуклеинске киселине (ДНК) диференцијације и других процеса (15). Посебно су значајне промене у контроли ћелијског циклуса и контроли апоптозе. Генске аберације се деле на примарне и секундарне. Примарне рекурентне хромозомске транслокације t(3;14)(q27;q32), t(8;14)(q24;q32) и t(14;18)(q32;q21), карактеришу генске подтипове у око 50% 12 болесника са ДБКЛ. Додатне секундарне промене укључују тризомију хромозома 3, 5, 7, 11, 12, 18 или X (присутне код > 10% случајева), монозомију хромозома 12,13,14 или 15, делеције хромозома 1p, 6q, 7q32ter, 8p, 9p, 11q или 17p. У ДБКЛ су честе и мутације или губитак оба алела p53 тумор супресор гена или 17p13.1, посебно у имунобластном типу (28, 29, 30, 31). Дијагноза лимфома уопште, па самим тим и ДКБЛ, искључиво је патохистолошка и обједињава цитомофологију, имунофенотип, начин раста тумора, генотип и клиничке податке, (табела бр. 8). Цитоморфолошки и по начину раста, ДКБЛ представља дифузну пролиферацију крупних и ћелија умерене величине, чија су једра већа или једнака једрима хистиоцита, или су по величини четри, пет или бар два пута већег дијаметра од малог лимфоцита. У складу са изгледом ћелија, морфолошке варијанте ДКБЛ су центробластна, имунобластна и анапластична. Имунофенотипски, ћелије експримирају Pan-В маркере (CD19,CD20) и мембранске или цитоплазматске имуноглобулине (Ig M>G>A). У 60% случајева експримирају bcl-6, у 50% bcl-2, у 20-40% CD10, у 10% експримира се CD5 као прогностички врло лош знак. CD30 и MUM-1 позитивност је хетерогена, експресија CD138 указује на плазмоцитну диференцијацију. Цитогенетски, ДКБЛ се карактеришу клоналним реаранжирањем имуноглобулинских гена, у 20% случајева је присутан реаранжман bcl-2 гена, у 10% с-myc гена. Bcl-6 ген је реаранжиран у 30%, а мутиран чак у 70% случајева ДКБЛ. Удруженост bcl-2 и с-myc мутација уводи ДКБЛ у посебну категорију double hit лимфома. EBV је увек негативан, осим у склопу имунодефицијенција. Пролиферациони индекс је варијабилан, увек је Ki- 67>20%, просечна вредност му је 55%, али пролиферативна активност је обично >40%, а може бити и до 90% (32). 13 ЦИТОМОРФОЛОШКЕ ВАРИЈАНТЕ ИМУНОФЕНОТИПСКЕ КАРАКТЕРИСТИКЕ ЦИТОГЕНЕТСКЕ ОСОБИНЕ центробластна Pan-B + , Ig с/m + bcl-2 (реаранжиран у 20%) имунобластна bcl-6+ (60%) CD5+ (10%) c-myc (реаранжиран у10%) анапластична CD10+ CD30+ MUM1+(варијабилна позитивност) bcl-6 (реаранжиран у 30%, мутиран у 70%) морфолошки ретка Ki-67 индекс >20% (просечно 55%) EBV- Табела бр. 8. Стандардни критеријуми за постављање дијагнозе ДКБЛ 1.1.6. Клиничка обележја и клинички дијагностички алгоритам ДБКЛ Клиничка слика НХЛ тиме и ДБКЛ, манифестује се, у почетку, безболним повећањем једног или више лимфних чворова. Симптоми се могу поделити на оне узроковане туморском масом и на опште симптоме. Симптоми узроковани туморском масом могу бити разнолики (диспноа, синдром горње шупље вене, оток једнострани или обострани доњих екстремитета, оток једнострани или обострани горњих екстремитета, неуралгије, абдоминални болови и друго). Општи, односно В симптоми, подразумевају ноћно презнојавање, повишену температуру без евидентне инфекције и губитак у телесној тежини већи од 10% за последњих шест месеци. Претходно наведени симптоми су ређе присутни у нехочкиновим лимфомима, па тиме и у ДБКЛ него у Хочкиновој болести, а узроковани су отпуштањем цитокина из туморских ћелија или ћелија имунолошког сисема (33). Дијагностичке процедуре у обради болесника оболелог од ДБКЛ подразумевају адекватну анамнезу, физикални преглед уз лабораторијске и различите додатне дијагностичке процедуре. Претходно учињеним дијагностичким процедурама се открива најприступачније место за биопсију туморског ткива, које ће бити потвргнуто припреми а потом хистолошкој анализи, имунофенотипизацији, цитогенетској класичној анализи или молекуларној генетској анализи ( in situ хибридизацији – FISH), генетскoj анализи микрочипова – DNA microarray, а постављена дијагноза сходно специфичности локализације захтеваће и додатне процедуре као што су лумбална пункција и анализа ликвора проточном флуоцитометријом уз фенотипизацију или нуклерану магнетну резонанцу централног нервног система. Како би се адекватно проценио клинички стадијум болести увек се 14 ради слепа биопсија кости, уобичајено карличне, уз потоњу припрему, хистолошку обраду и имунофенотипизацију. Клинички алгоритам дијаностике ДБКЛ приказан је схематски, ( табела бр. 9). р Табела бр.9. Клинички алгоритам дијагностике ДБКЛ * Анамнеза * Б симптоми *Лимфни чворови на предилекционим местима *Јетра ,* Слезина *Физикални преглед ЛАБОРАТОРИЈСКА ДИЈАГНОСТИКА  KKС са формулом  СE,фибриноген , CRP  Tестови бубрежне и јетрине функције  Електрофореза протеина, β2–микроглобулин  LDH, Ca, P, acidum urikum  Вирусологија (HIV, HCV, HBsAg, HTLV-1, EBV) *EHO г.абдомена → CT aбдомена и мале карлице * Rtg плућа и срца → CT грудног коша БИОПСИЈА ЛИМФНОГ ЧВОРА Хистологија , имунофенотипизација , цитогенетика, молекуларна тестирања (Sauthern blot, PCR-polimerase chain-reaction), In situ хибридизација – FISH, генетска анализа микрочипова – DNA microarray Билатерална биопсија косне сржи * Сцинтиграфија кости * MRI нервног система * Лумбална пункција (код болесника са више од два неповољна параметра према IPI скору, и са инфилтрацијом CNS- а, параназалних шупљина, кичмене мождине, периорбитално, база лобање) 15 1.1.7. Лечење ДБКЛ Након патохистолошке и имунохистохемијске анализе узоркованог ткива, комплетног стадирања болести, утврђује се клинички стадијум, IPI ризик, узимајући у обзир болесника са ДБКЛ који је обично старији од 60 година, разматрају се и неповољни параметри који нису ушли у претходне индексе као што су: волуминозна туморска маса, биолошки параметри болести попут пролиферативног индекса мереног преко експресије Кi-67, специфичне локализације (кичмена мождина, централни нервни систем, параназалне шупљине, периотбитални предео, база лобање, гастроинтестинални тракт) као и ризик трансформације. Приликом постављања дијагнозе око 80% болесника има узнапредовалу болест већ су у трећем или четвртом клиничком стадијуму, али и тада, основни циљ лечења ДБКЛ, јесте постизање излечења у што већем проценту. На основу претходног одређује се терапијски модалитет лечења и исти се спроводи уз поштовање одлуке болесника за прихватање истог. Терапија треба да задовољи прво и једино правило, излечити болесника терапијом прве линије. Хемиотерапија (ХТ) има главну улогу као терапијски избор, док радиотерапија (РТ) има превасходно палијативни карактер, изузев у нижим клиничким стадијумима где је компатибилна са ХТ. „Златни стандард“ лечења је протокол прве генерације CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон) који је уведен још 1976. године. Издржао је пробу времена и није изгубио на значају у односу на протоколе друге генерације COP – BLAM, ProMACE – MOPP и треће генерације ProMACE–CytaBOM (34, 35). Примена агресивних протокола ProMACE - CytaBOM, ProMACE – MOOP, MACOP – B, није показала значајан терапијски, али јесте знатан токсични ефекат. Иако су током деценија истраживања испитиване различите интезивније терапије од CHOP уз комбинацију са аутотрансплантацијом или без ње, постигнуто је побољшање исхода само код дела болесника (углавном млађих и високо ризичних) у односу на стандардни протокол CHOP – који је куративан у 40% свих болесника (36, 37). Задивљујуће је како је последњих година поље испитивања и лечења малигнитета изменила примена само једне молекуле, aнти-CD20 моноклонског антитела- ритуксимаба (38). 16 1.1.8. Механизам деловања цитостатика протокола CHOP CHOP протокол представља скраћеницу за употребу комбинације: цикофосфамид, винкристин, доксорубицин и преднизон. Наведени цитостатски лекови припадају различитим фармаколошким групама па је њихов механизам антитуморског дејства различит. 1.1.8.1. Циклофосфамид /EndoxanR/ Циклофосфамид je алкиријајући агенс из подгрупе азотних пликаваца. Слично другим лековима ове групе делује тако што директно, хемијским путем, оштећује ДНК. На тај начин се прекида синтеза ДНК и деоба ћелија. Циклофосфамид и други сродни лекови су врло реактивна хемијска једињења која, преко својих интермедијерних форми, формирају ковалентне везе са макромолекулама путем алкилације различитих нуклеофилних хемијских група као што су фосфатна, амино, сулфхидрилна, хидроксилна, карбоксилна и имидазолска група. Цитотоксични ефекат је у директној вези са алкилацијом ДНК а нарочито је осетљив угљеников атом на позицији седам унутар азотне базе, гуанина. Додатне хемијске везе се формирају и са другим атомима пуринских и пиримидинских база, посебно азотом на позицији 1 и 3 унутар аденина, а позицијом 3 унутар цитозина као и атомом кисеоника на позицији 6 унутар гуанозина. Унакрсно везивање ланаца ДНK је нарочито штетна последица дејства цикофосфамида на ћелије. Поред ДНК, циклофосфамид се везује и за реактивне групе других протеина, нарочито амино и сулфхидрилне групе. 1.1.8.2. Винкристин / OncovinR/ Винкристин jе лек природног порекла, изолован из биљке Catharanthus roseus (раније Vinca rosea), припада подгрупи винка акалоида и у хемијском погледу представља асиметрични димерички молекул. Дејство остварује блокирајући митозу. Винкристин се везује за бета тубулин и блокира његову полимеризацију са алфа тубулином, што је неопходно за формирање микротубула и деобног вретена. Последица тога је њихова дезинтеграција и заустављање ћелијског циклуса у метафази, са последичном дисперзијом хромозома и апоптозом ћелија. С обзиром да су микротубули важни и за друге физиолошке функције, на пример аксонални транспорт, овакво дејство винкристина условљава и његову токсичност као што је оштећење нервних влакана са последичном неуропатијом. 17 1.1.8.3. Доксорубицин / AdriablastinR/ Доксорубицин je такође лек природног порекла, изолован из гљивице Streptomyce speucetius var. caesius. У хемијском погледу је антрациклин, који поседује тетрациклични прстен, хинонске и хидрохинонске структуре које су врло активне у примопредаји електрона. Цитотоксично дејство доксорубицина је последица бројних биохемијских реакција. Неке од најважнијих су директна интерреакција са ланцем ДНК, формирање комплекса са топоизомеразом II и самом ДНК, стварање слободних радикала и стварање реактивних интермедијера који даље оштећују макромолекуле. Ове реакције имају значајне негативне последице по ћелију као што су прекид транскрипције ДНК, слабљење процеса репарације оштећене ДНК и оштећења ДНК формираним слободним радикалским хемијским врстама што све резултира програмираном ћелијском смрћу тј. апоптозом. 1.1.8.4. Преднизон / Pronizon R / Преднизон је синтетски гликокортикоидни хормон са снажним катаболичким дејством на лимфоидно ткиво где доводи до лизе и супресије митозе лимфоцита. Дејство глукокортикостероида се остварује путем интрацелуларних рецептора и утицајем на експресију гена. У зависности од типа ћелија од десет до око стотину гена је доступно глукокортикостероидима од којих су најзначајнији они за хемокине (IL-8, RANTES, MCP), цитокине (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 17, 18, TNFalfa, GM- CSF), индуцибилне ензиме (iNOS, COX-2, PLA2), рецепторе за ендотелне ћелије и неурокине, адхезиони молекули, инхибитори PLA2 (lipokortin-1, aneksin-1, CC10), SLPI, MAP киназа фосфатаза 1 (MKP-1), антагонисте рецептора за IL-1, инхибитор NF-kB (IkBalfa), β-2 рецептор, CD163 (рецептор хватач) и други. У основи, многи од ових механизама глукокортикостероида се рефлектују кроз утицај и на имуни инфламаторни одговор организма, што је биолошка подлога њиховог антилимфоцитног дејства. 1.1.9. Механизам деловања моноклонског антитела ритуксимаб (Mabthera R) Ритуксимаб je химеричко моноклонско антитело које припада групи билошких лекова који се употребљавају у оквиру пасивне имунотерапије. Генерално, имунотерапија подразумева стимулацију имуног система са циљем повећања броја ефекторских ћелија, продукције проинфламаторних медијатора и имуногености тумора. 18 Према начину деловања, поред пасивне, у којој се примењују преформирани продукти, најчешће антитела и in vitro стимулисани лимфоцити, имунотерапија може бити и активна, када се организам ангажује применом вакцина и биолошких агенаса. Пасивна имунотерапија, суштински се заснива на реакцији антиген-антитело, због чега су за ову врсту терапије погодни туморски антигени који су обилато и хомогено испољени, стабилни и од значаја за преживљавање тумора. Оваква примена моноклонских антитела, специфичних за онкогене производе који се експримирају код неких тумора, показала је велики успех у више од две деценије дугој клиничкој употреби (48). Данас представљају једну од најважнијих класа лекова у онкологији са веома брзим ширењем спектра деловања. По дефиницији, моноклонска антитела су хомогена популација идентичних молекула која су добијена од једне антиген- продукујуће ћелије са специфичношћу за један дати епитоп. У зависности од свог порекла, могу бити мишја, хумана, химерична и хуманизована, а означена су у фармакопеји специфичним суфиксима: -момаб, -умаб, -ксимаб и - зумаб. Употреба мишијих антитела код људи је лимитирана због њихове имуногености, кратког полуживота у циркулацији и неспособности ефикасног започињања ефекторских механизама. Насупрот њима, хумана антитела су нестабилни молекули и слаби имуногени са ограниченим обимом специфичности (49,50). Из ових разлога, а да би се ефикасност антитуморских антитела повећала, често се користе хуманизована и химеричка антитела, са до 90% и 65% хумане компоненте, који представљају хибридоме који су задржали антигену специфичност, а имају остале карактеристике хуманих антитела. Добијају се убацивањем сегмента ДНК, који кодира везујућа места за антиген на мишијим моноклонским антителима у ДНК пореклом из ћелије хуманог мијелома. Због тога не изазива антиген-антитело реакцију у људском телу, својствену моноклонским антителима пореклом из мишева (48,49). Моноклонска антитела могу да делују директно, као антагонисти, блокирањем рецептора за битне факторе раста тумора (рецептори за IL-2, TNF-α, HER-2, EGFR и тд.) ометањем функције површинских молекула (CD20, CD19) или активирањем Fas молекула који доводе до смрти туморских ћелија. Други механизам дејства је индиректан, активацијом цитотоксичних ћелија или коњугацијом моноклонских антитела са цитостатицима, токсинима или радиоизотопима, што омогућава циљану деструкцију тумрског ткива (47). Ритуксимаб се селективно и специфично везује за CD20 антиген који се налази на ћелијској мембрани Б лимфоцита (35). То је трансмембрански протеин присутан на пре- 19 Б и зрелим Б лимфоцитима, а одсутан на плазмоцитима, раним Б-лимфоцитним прекурсорима, Т лимфоцитима, мијелопоезним ћелијама и свим нехематопоезним ткивима и органима. Ове карактеристике омогућавају ефикасно везивање моноклонског антитела за лимфомске ћелије, а елиминише мијелотоксичност лека, утицај на Т ћелијски имунитет и продукцију других антитела код оболелих, уз истовремено обезбеђивање брзе обнове Б лимфоцита која је краћа од 6 месеци (38a). Тачна функција CD20 aнтигена није довољно позната а постоје докази који га везују са трансмембранским транспортом калцијума (35,37). Ритуксимаб и друга моноклонска антитела која се везују за CD20 антиген имају сложен механизам дејства а зна се да доводе у ћелији до активације трансмембранских сигналних путева који узрокују аутофосфорилацију и активацију серин/треонин киназа и индукцију експресије c-myc онкогена и молекула MHC комплекса класе II (39). Ритуксимаб представља химеричко антитело са мишијим варијабилним регионом и хуманим константним регионом, који се специфично везује за CD20 aнтиген, eкспримиран на површини ћелија Б лимфоцитног порекла. Као химеричко антитело, ритуксимаб je високо специфичан у мобилизацији ефекторних механизама домаћина са циљем уништења туморских ћелија, са минималном имуногеношћу и ниским степеном токсичности. CD20 aнтиген се испољава на више од 95% ћелија индолентног и више од 85% ћелија агресивног нехочкиновог лимфома. Ритуксимаб је прво терапијско моноклонско антитело које циљано убија туморске ћелије путем вишеструких механизама дејства. Крајње последице дејства ритуксимаба су процеси који се деле у три основне групе, цитотоксичност зависна од компламента, ћелијска цитотоксичност зависна од антитела и индукцијом апоптозе тј. програмиране ћелијске смрти (40, 41). Ритуксимаб смањује еспресију антиапоптозног bcl-2 протеина чиме подспешује апоптозу лимфомских ћелија и повећава њихову осетљивост на цитостатску терапију (42). Антитело- ритуксимаб има синергичко дејство са хемиотерапијским режимом CHOP и CVP и то без преклапања токсичности (43, 44, 45). Увођењем ритуксимаба први пут се постиже продужење преживљавања оболелих од ДБКЛ (46). Ритуксимаб плус CHOP je данас „златни стандард“ у терапији ДБКЛ-а. Ритуксимаб је прво моноклонско антитело уведено у стандардне протоколе лечења канцера, његова клиничка употреба је први пут одобрена 1997. године од стране FDA САД-а (енгл.Food&Drug Administration) (47, 48, 49, 50). Рандомизиране клиничке студије су потврдиле корист примене ритуксимаба у одабраним групама болесника US Intergroup trial и RICO-VER-60 студија код старих болесника, a MinT 20 студија код болесника млађих од 60 година са добрим прогностичким профилом), као и у неселекционираним групама болесника (47, 48, 49, 50). У студији Српске лимфомске групе, упоредна анлаиза хемиотерапије у односу на имуно-хемиотерапију код болесника са ДБКЛ указала је на статистички значајно успешнији терапијски одговор као и укупно преживљавање код болесника лечених комбинацијом ритуксимаба и CHOP-а и њему сличним протоколима (51, 52). 1.2. Технологија генског чипа и имунохистохемије у прогнози оболелих од ДБКЛ Развојем технологије генског чипа омогућена је анализа великог броја гена из туморског ткива, тако да су установљене три подгрупе ДБКЛ-а (53, 54). Независно од IPI ризика, прва подгрупа ДБКЛ-а је означена као група налик герминативном центару (енгл. Germinal center like) има експресију гена сличну лимфоцитима герминативног центра, друга, активиране Б ћелијама сличне (енгл. Activated B – cell like) има експресију гена као активирани Б лимфоцити, док је најмања, трећа група врло хетерогена. Претходно наведене групе прогнозно су не зависне од IPI ризика, група герминативног центра има бољу прогнозу од друге две, које заједно чине скупину са лошом прогнозом означену као група не герминативног центра (енгл. non-Germinal centre group) (55, 56, 57). Обзиром на тешку изводљивост и високу цену ове методологије, показано је да се и обичном имунохистохемијом, активацијским и диференцијацијским маркерима специфичним за ДБКЛ може учинити подела на повољну групу герминативног центра и неповољну групу не герминативног центра. Најчешће коришћени маркери су CD10, bcl-6, MUM-1, a у неким стадијумима и CD138. Најчешће коришћена класификација је по Hans-у : Герминални центар је : CD10+, MUM1-, bcl-6+. Не герминални центар је : CD10-, bcl-6- и MUM -1+. Ki -67 je пролиферативни индекс, као маркер лоше прогнозе, није завистан од осталих маркера и IPI ризика (58). 21 1.3. Прогностички параметри ДБКЛ, детектовани флуерoсцентном in situ хибридизацијом Око 40% свих Б ћелијских лимфома експонира рекурентне хромозомске транслокације и већина од њих се може лако детектовати употребом конвенционалне цитогенетике (одређивање кариотипа) или молекуларном цитогенетиком (на пр. флуоресцентном in situ хибридизацијом (енгл. Fluerescence in situ hybridization – FISH) (59, 60, 61). ДБКЛ са двоструким и троструким ударом (енгл. Double hit и Triple hit ) Б ћелијски лимфоми се карактеришу рекурентним хромозомским транслокацијама у комбинацији са с-myc (8q24) тачком прекида, касније углавном као секундарним догађајем. 1.3.1. Цитогенетске аберације 1.3.1.1. c-myc C-myc протоонкоген (енгл. Myelocytomatosis viral oncogene homolog) налази се на позицији 24 дугог крака хромозома 8 (8;q24). Поседује три ексона који кодирају синтезу три различита протеинска продукта, молекуларне масе 64, 67 и 45 kD. Откривен је пре пола века као ћелијски хомолог ретровиралног онкогена v-myc. Припада четворочланој фамилији myc гена, међу којима само један члан (v-myc) нема способност малигне трансфомације, док ову особину поседују преостала три члана (l- myc, n-myc и c-myc). C-myc је једарни продукт који своју улогу остварује као фактор транскрипције, учествујући у ћелијској регулацији диференцијације, пролиферације и програмиране ћелијске смрти. Овај фосфопротеин се експримира у скоро свим ћелијама ембриона и адулта, животиња и људи, а његова експресија је увек у корелацији са интензитетом ћелијске пролиферације. C-myc онкопротеин се са различитом учесталошћу, повећано експримира у бројним малигнитетима епителног и мезенхималног порекла. Познати механизми оштећења c-myc протоонкогена су хромозомске транслокације, инсерције, амплификације гена и тачкасте мутације. Свако од ових оштећења производи сличне ефекте, а то су промена нивоа транскрипције и промена стабилности информационе РНК. Сва оштећења хромозома која укључују c- myc ген, најчешће се виђају у прогностички лошој групи малигнитета. Амплификација c-myc се са највећом учесталошћу описује у истраживањима карцинома дојке, јајника, желуца и дебелог црева, од хематолошких малигнитета у мултиплом мијелому и НХЛ, и тада је скоро увек екпресија c-myc онкопротеина у позитивној корелацији са 22 узнапредовалим стадијумом болести, што га квалификује као негативан прогностички параметар (31,74,75). Транслокација t(8;14) (q24;q32) је прва карактеристична хромозомска аберација откривена у лимфопролиферативним болестима (62). Резултат је прекомерна експресија протеина c-myc, који осим транскрипционе улоге, има важну улогу и у метаболизму ћелије, синтези протеина, регулацији и индукцији апоптозе активацијом p53 или проапоптотичних сигналних путева (63, 64, 65). Ова транслокација је најчешћа и карактеристична је за Burkittov лимфом, међутим транслокација с-myc може се доказати у отприлике 5-10% ДБКЛ-а, као и у некласификованом Б – лимфому са особинама између Burkitt- овог лимфома и ДБКЛ-а, плазмобластичном и лимфобластичном лимфому то јест акутној лимфобластној леукемији (66, 15). У наведеној транслокацији партнер гену с-myc је ген који кодира синтезу тешког ланца имуноглобулина, међутим понекад у транслокацији учествује неки други ген, на пример ген за имуноглобилин kappa лаког ланца (2p12/IGK) као t(2;8)(p12;q24) или ген за имуноглобулин lambda лаког ланца (22q11/IGL) као t(8;22) (q24;q11). Као партнерски гени у транслокацији описани су и такозвани не имуноглобулински гени као што су: bcl-6, bcl-11A, PAX5 и IKAROS 49 (67). Тумори са морфологијом карактеристичном за ДБКЛ и транслокацијом с-myc према класификацији СЗО сврставају се у хетерогену групу ДБКЛ без посебних карактеристика (15). Већина студија које су истраживале прогностичку вредност с-myc транслокације утврдиле су да ови пацијенти имају агресивнију болест, лошији одговор на терапију и краће преживљавање (68). Истраживања која су показала корелацију лоше прогнозе и постојања с-myc транслокације, била су испитивања Niitsu и сарадника, учињена на 252 болесника, Savage-а и сарадника на 135, а такође и истраживања Barrans-а и сарадника на 245 оболелих од ДБКЛ (69, 70, 71). За разлику од претходних студијских резултата, у студији Kramer-a и сарадника утврђено је да се с-myc транслокација најчешће налази код болесника са екстранодалним ДБКЛ, посебно примарним лимфомима гастроинтестиналног тракта, а и ови болесници имају бољу прогнозу (72). Сличне резултате су објавили Gualco и сарадници, који су на пацијентима оболелим од ДБКЛ у дечијем узрасту (10 до 18 година) потврдили корелацију с-myc транслокације са повољном прогнозом (73). Значајне разлике у методологији вероватно су део објашњења за неподударност добијених резултата, с тога биологија и патогенеза новодијагностикованих ДБКЛ с транслокацијом с-myc данас још није потпуно 23 разјашњена. За разлику од њих, Tibiletti и сарадници су утврдили да транслокација с- myc нема прогностичко значење код болесника са ДБКЛ, али студија је обухватила 74 испитаника (74). FISH може бити користан у идентификацији с-myc гена, али није успела да идентификује с-myc измењен другим механизмима, а није ни доступан у свим клиничким лабораторијама. Напокон, ново моноклонско антитело, чија мета је N- терминални myc протеин показало је сензитивно и специфично нуклеарно бојење с-myc протеина у ткиву фиксираном у формалину и укалупљеном у парафин укључујући и ДБКЛ (75, 76, 77). 1.3.1.2. Bcl-2 Bcl-2 ген (енгл. B-cell CLL/lymphoma 2) се налази на хромозому 18, у регији 21 дугог крака (18 q21). Члан је bcl-2 фамилије од 25, до данас идентификованих гена, који кодирају синтезу протеина одговорних за контролу и регулацију пасивне ћелијске смрти односно апоптозе митохондријалним путем. Митоходријални, унутрашњи пут апоптозе покрећу непоправљива оштећења ДНК, узрокована грешком у репликацији, дејством јонизујућег зрачења, хемиотерапеутицима, лековима попут аналога нуклеозида и бројни ДНК реактивни токсини који укључују и реактивне кисеоничне радикале (77,78,79). Сви продукти bcl-2 фамилије гена учествују у апоптози, најчешће као контролори пермеабилности митохондријалне мембране. У зависности од улоге у апоптотском ланцу, могу бити про-апоптотични и анти-апоптотични. Неки од анти- апоптотичних молекула су: bcl-2, bcl-x, bcl-XL, bcl-XS, bcl-w, bag, а неки од про- апоптотичних су bcl-10, bax, bak, bid, bad, bim, bik и blk. Про-апоптотични протеини везују се за спољашњу мембрану митохондрија, мењајући јој интегритет. Резултат је повећање пропустљивости митохондријалне мембране, улазак јона калцијума и ослобађање различитих протеина из митохондрија, од којих је најважнији цитохром С. Након ослобађања у цитоплазму, цитохром С са ензимом формира комплекс који активира каспазу-9, те заједно са њом гради апоптозом. Резултат ове ланчане реакције је активација ефекторног протеина, каспазе 3, који изазива апоптотску деградацију ћелије, која подразумева цепање актинског цитоскелета ћелије, њено бубрење и формирање апоптотских телашаца која се одвајају и бивају фагоцитована без запаљенске реакције (78, 79,80). 24 Најважнији и највише проучаван члан bcl-2 фамилије је bcl-2 ген. Постоје две изоформе протеина bcl-2, за које се због специфичне интерреакције са протеинима Bad и Bak сматра да имају улогу у најмање два различита антиапоптотска механизма (81). Ова транслокација нађена је у ДБКЛ, али и у другим лимфомима Б имунофенотипа, фоликуларном, примарном кожном лимфому, лимфому маргиналне зоне, хроничној лимфоцитној леукемији/лимфому малих лимфоцита, спленичном лимфому, моноклоналној лимфоцитози Б ћелија и хистиоцитном саркому насталом трансформацијом фоликуларног лимфома. Такође, оштећење bcl-2 гена доказано је присутно у око 90% карцинома дебелог црева, 60% карцинома дојке, 30% карцинома простате и ситноћелијског карцинома плућа, а у варијабилној инциденци бележи се и код других малигнитета гастроинтестиналног тракта, штитасте жлезде и тд. У свим наведеним туморима bcl-2 реаранжман резултује прекомерном експресијом онкопротеина bcl-2 (82, 83, 84, 85). Осим важне улоге у лимфомагенези и карциногенези уопште, транслокација bcl-2 доказана је и код здравих људи. Перзистентни клон нормалних, зрелих Б лимфоцита са овом транслокацијом чешће се јавља у старијој популацији (86). Постојање транслокације код здравих људи, као и њена релативно рана појава током сазревања Б лимфоцита, упућује на важну улогу транслокације bcl-2 у лимфогенези, као и на закључак да сам настанак транслокације није довољан за развијање лимфопролиферативне болести (87). У класификацији СЗО такође се истиче важност утврђивања транслокације bcl-2 приликом постављања дијагнозе агресивних лимфома с двоструким оштећењем - double hit које је потребно разликовати од ДБКЛ без посебних карактеристика (15). 1.3.1.3. Bcl-6 Bcl-6 ген (енгл. B-cell CLL/lymphoma 6) смештен је на хромозому 3, у регији 27 дугог крака ( 3q27) а кодира синтезу транскрипцијског фактора, који помоћу интерреакције са ћелијским протеинима има важну улогу у репресији транскрипције. Укључен је у репесију гена битних за активацију и диференцијацију лимфоцита, у контроли ћелијског циклуса и инфламацији (88, 89). Експресија bcl-6 гена је посебно важна за формирање и нормалну функцију герминативних центара, има улогу у заустављању апоптозе индуковане прекидима двоструке спирале ДНК у Б лимфоцитима а прекиди су потребни за соматску хипермутацију и рекомбинацију имуноглобулинских ланаца (90). Bcl-6 такође учествује у регулацији ћелијског циклуса, у различитим механизмима репарације ДНК, 25 апоптози, ћелијској пролиферацији и диференцијацији (91, 92). Осим тога има директан утицај на контролу бројних гена, као што су на пример bcl-2 и p53 (93, 94). Генске аберације bcl-6 у облику транслокација или тачкастих мутација најчешће се налазе код ДБКЛ и фоликуларног лимфома. Транслокација bcl-6 с неким од бројних могућих партнерских гена сматра се обележјем double hit лимфомима (15, 95). За разлику од bcl-1 и bcl-2 гена који су након завршене транслокације хромозомских фрагмената увек блиско лоцирани у односу на гене за кодирање синтезе лаких и тешких ланаца (IgH и IgL), bcl-6 ген се лоцира у близини различитих генских секвенци. У транслокацији је укључен хромозом 3 и Rho (TTF гена), хромозом 11 (BOB 1 / OBF 1 као „ партнер“ ген), хромозом 6 (H4 хистон ген у блиској позицији), хромозом 13 (LCP 1 ген у блиској позицији), као и већи број других не имуноглобулинских гена. Физиолошка функција гена bcl-6 је учешће у формирању герминативних центара секундарних лимфоидних фоликула, као и на другим местима Б ћелијског сазревања. Његова друга, такође значајна улога, је спречавање процеса преписивања ДНК као и регулација програмиране ћелијске смрти посредством адхезионог молекула CD 40. Хромозомска преуређења која захватају bcl-6 ген се јављају у различитим процентима. Када je у питању ДБКЛ, промене на нивоу bcl-6 се јављају код 49% до 61% болесника (96). У герминативном центру bcl-6 игра улогу репресије транскрипције многих таргет гена који учествују у апоптози, одговоран је за оштећење ДНК, контролу ћелијског циклуса, пролиферацију и диференцијацију (97, 98). Важне директне мете су bcl-2, p53, IRF4 и BLIMP-1 који касније постају неопходни у сазревању, односно матурацији плазма ћелија (99,100). Интересанто да је BLIMP-1 репресор истовремено bcl-6 и с-myc у плазма ћелијама. Резултатат je да су bcl-6 посредоване репресије p53, соматске хипермутације и класне рекомбинације олакшане (101). 1.3.1.4. Bcl-2 / c-myc - Double hit ДБКЛ Удруженост bcl-2+/с-myc+, генског преуређења, чини већину double hit лимфома чак и до 62% по наводима Mitelman базе података (102, 103). Транслокација с- myc гена, који учествује у бројним ћелијским функцијама укључујући и пролиферацију, показује лошу прогнозу (104, 105, 106). Уз додатак, транслокације bсl-2, као централног антиапоптотског гена, утиче на лошу прогнозу у неким студијама, али не у свим (107, 108). ДБКЛ са транлокацијом оба c-myc и bcl-2 одређује double hit лимфоме и карактерише се лошим одговором на стандардну терапију уз агресиван клинички ток (109,110,111). Ова два гена у комбинацији имају синергистички клинички ефекат, с- 26 myc као промотер ћелијске пролиферације и bcl-2 као блокатор ћелијске смрти. Данас истраживања комбинације c-myc и bcl-2 у лимфомима имају фокус на генским методама, углавном флуоресцентнoj in situ хибридизацији, али c-myc и bcl-2 се могу активирати другим механизмима, носећи повишену експресију протеинских продуката c-myc и bcl-2 (112, 113). Клинички прогностички ефекат комбинације експресије c-myc и bcl-2 у дифузном крупноћелијском лимфому је још непознат. 27 2. ЦИЉЕВИ И ХИПОТЕЗЕ ИСТРАЖИВАЊА 2.1. Циљеви истраживања Први циљ предложене студије јесте да утврди утицај генског полиморфизмa bcl-2+ и с-myc+, како појединачан тако и удружен, на терапијски одговор код болесника са ДБКЛ третираних стандардном имуно хемиотерапијом. Други циљ једа се утврди коју групу болесника, према IPI ризику, као признатом прогнозном параметру, треба обавезно тестирати на генски полиморфизам и тако индивидуализовати терапијски приступ без непотребног исцрпљивања болесника стандарном терапијом. 2.2. Хипотезе истраживања 1. Дифузни Б крупноћелијски лимфом који је bcl-2+, показује лошији одговор на примењену имунохемиотерапију од bcl-2- лимфома. 2. Дифузни Б крупноћелијски лимфом који је c- myc+ показује лошији одговор на имунохемиотерапију од c- myc- лимфома. 3. Постојање с-myc+ и bcl-2+ истовремено показује лошији одговор на терапију у односу на с- myc- и bcl-2- дифузне Б крупноћелијске лимфоме. 4. Постоји значајна разлика у присутности генског полиморфизма између болесника са ниским и средње ниским IPI скором и оних са средње високим и високим IPI-ом. 5. Упоредна анализа прогнозног значаја двоструких мутација (енгл. double hit mutation) и IPI скора у одговору на примењену имунохемиотерапију оболелих од ДБКЛ. 28 3. ИСПИТАНИЦИ, МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ 3.1. Испитивана популација Истраживање је спроведено у Клиници за Хематологију, Служби за патолошку анатомску дијагностику Клиничког Центра у Крагујевац и приватној лабораторији „Бео-лаб“ у Београду. Студија je ретроспективна клиничко-експериментална и компаративна, упоређуje тестиране параметре оболелих од ДБКЛ у оквиру стандардног испитивања болесника са ниским и средње ниским IPI - ом, који су контрола, анализиране групе са средње високим и високим IPI - ом. Подаци су прикупљени из писане медицинске документације (историје болести, лекарски извештаји и здравствени картони) који су били доступни за 90 болесника са нодалном и екстранодалном локализацијом од 01.01.2004. године до 30.03.2010. године. У болесника који су укључени у студију, анализирано је следеће : пол, старосна доб, клинички стадијум болести према Ann Arbor класификацији, В симптоматологија (повишена температура, презнојавање, губитак у телесној тежини већи од 10% за шест месеци), вредност IPI скора, који настаје збрајањем негативних поена и може бити: низак- 0 неповољних параметара, средње низак -1 неповољан параметар, средње висок са 2 неповољна параметра и висок, са 3 или 4 неповољна параметра. Интернационални Прогнозни Индекс за болеснике млађе од 60 година је age adjusted IPI, a може бити: низак са 0 неповољних параметара, средње низак са 1 неповољним параметром и средње висок са 2 неповољна параметра. ECOG перформанс статус је одређен на дан постављања дијагнозе, носећи оцене од 0 за болеснике у одличном општем стању до 4 што бодује трајну везаност за кревет и неспособност за бригу о себи. Утврђује се локализација, нодална и екстранодална и посебно наводи велика туморска маса >7cm, означена као „Bulky“ форма болести. Крв за анализу је узоркована наташте а одређивана је: седиментације (СE), лактат дехидрогеназа (LDH), укупни протеини, албумини, аспартат-аминотрансфераза у серуму (AST), аланин-аминотрансаминаза (АLТ), гама глутамил-транспептидаза 29 серума (гама GT), алкална фосфатаза (ALP), мокраћна киселина, гвожђе у серуму, и C реактивни протеин (CRP) на апарату за биохемијске анализе Beckman AU 600, оргиналним тестовима. Анализа фибриногена и D-димера, одређивана је на апарату ACL Elite PRO, уз оргиналне тестове. Комплетна крвна слика са леукоцитарном формулом је анализирана на аутоматском бројачу крвних елемената Beckman Coulter LH-780 Analyzer. Терапијски одговор на примењену иницијалну - прву терапијску линију (имунохемиотерапија по протоколу R-CHOP) oдређиван је као: одсуство болести - комплетна ремисија- CR (енгл.Complite Respons) што подразумева нестанак и најмањих биолошких и радиолошких абнормалности које су виђене на презентацији, парцијални одговор- PR (енгл. Partial Response) уз регресију свих параметара за више од 50% (од 50% до 75%) или као прогресија болести- PD (енгл. refracterio или Progressio Disease ) означавајући изостанак одговора или увећање туморске масе за најмање 25% у односу на презентацију након учињених претрага по завршеној терапији. Процена одговора код свих болесника је учињена четри недеље након примене последњег циклуса имунохемиотерапије, односно после шест недеља ако је у болесника додатно примењена и радиотерапија. 3.2. Обрада материјала за анализу Код свих болесника дијагноза је постављена на основу патохистолошке анализе узорака ткива, добијених хирушком интервенцијом и биопсијом кости. У рутинској обради препарата добијени узорци ткива су фиксирани у 4% неутралном пуферисаном раствору формалина, у току 24 часа, на собној температури. По завршеној фиксацији узорци су дехидратисани провођењем кроз серију алкохола растуће концентрације (70%, 96% и 100%), просветљавани у ксилолу и калупљени у парапласт. Попречни серијски пресеци, дебљине 4 µм, сечени су микротоми Leica RM2135, Austria. Биоптат кости декалцинисан је током три дана, а потом подвргнут претходном поступку. После депарафинисања у ксилолу и хидратације у опадајућем реду алкохола, исечци су бојени Haematoxylin –oм по Mayer- у, просветљавани у 2% раствору еозина, затим дехидратисани, просветљивани и монтирани на плочице са Canadabalsamom, ова класична H&E метода омогућила је микроскопским прегледом уз патохистолошку анализу узоркованог ткива. Патохистолошки тип лимфома одређен је на основу начина 30 раста, морфолошког изгледа ћелија и имунофенотипа, према критеријумима класификације СЗО. 3.3. Методе анализе материјала Класичном имунохистохемијом (ИХХ) анализирани су Б маркери, као и: bcl-2, bcl-6 и Ki-67, а FISH-oм је утврђивана генска мутација за bcl-2 и с-myc. 3.3.1. Имунохистохемијски метод Имунохистохемија (ИХХ), je метод који се заснива на реакцији антиген антитело. Применом одговарајућих моноклонских антитела, специфичних за одређене врсте рецептора у једру, цитоплазми или мембрани, нормалне или малигне ћелије, могућа је визуелизација комплекса антиген – антитело, а самим тим и одређивање броја ћелија које су експримирале туморски антиген, као и интезитет експресије на ткивним узорцима фиксираним и укалупљеним у парафин. Анализа је обављена применом палете моноклонских антитела различитих произвођача и карактеристика и то: CD20, CD22, MUM1, CD19, CD45, CD10 и CD 79 α. (DAKO, Gloustrup, Danmark). За имунохистохемијско одређивање нивоа експресије, позитивности коришћенa је гранична вредност за позитивност > од 30% (енг. Cut off), за bcl-2 и bcl-6 на имунохистохемијској анализи. Ki-67 позитивност изражена је у процентима, број позитивних ћелија на 100 избројаних, уз граничну вредност за анализу (енгл. Cut off ) од 50%. 3.3.2. Флуоросцентна in situ хибридизација FISH је метода детекције појединих гена или чак делова гена (појединих секвенци). Ово испитивање примењујемо када нас занима да ли део хромозома (поједина секвенца у молекулу ДНК) може да хибридизује, да створи дупли халикс са неком пробом, а проба је нека секвенца ДНК чије присуство нас интересује на хромозому, и обележена је флуоресцентном бојом. Када се ДНК денатурише утврђујемо да ли наша проба хибридизује са денатурисаним комплетним хромозомом. Ако хибридизује, то значи да та секвенца постоји на том хромозому, а ако не онда је та секвенца на хромозому изостала. На тај начин се бојењем утврђујемо присуство појединих секвенци на целом кариотипу. FISH је молекуларна цитогенетска техника која се заснива на хибридизацији одређене генске секвенце испитиваног хромозома и одговарајућег низа нуклеотида везаног за флуоресцентни маркер (проба). In situ хибридизација је техника која омогућава детекцију нуклеинских киселина односно 31 детекцију специфичних циљних секвенци унутар ћелије уз истовремено очување ћелијске и ткивне морфологије. In situ хибридизација се заснива на принципу комплементарности, тј. денатурисана проба ће се хибридизовати тачно на комплементарну циљну секвенцу нуклеинске киселине (ДНK или РНК). Термин in situ значи „ на месту”, што значи да се хибридизација одвија унутар ћелије само на месту где се циљна ДНK или РНK нормално и налази. Циљна регија може бити ген, хромозомска регија или цео хромозом. FISH–ом се може анализирати свеж ћелијски узорак, претходно фиксиран смешом метанола и сирћетне киселине, али и биоптирани материјал чуван у парафинским калупима који је најчешће фиксиран формалином. Материјал за анализу може се добити из узорака периферне крви, коштане сржи, ефузије перикарда, плеуре, перитонеума, ликвора, брисева слузница или биопсија лимфних чворова и солидних тумора. Није потребна култивација ћелија, па се резултати анализе могу добити за 24–48 сати. Значајно је да се методом могу визуализовати промене на хромозомимна и када су ћелије у интерфази, тако да се могу анализирати генетске промене у обољењима са ниским митотским индексом. FISH-ом се могу открити нумеричке и структурне промене на хромозомима (делеције, инверзије и транслокације хромозома), идентификовати генетска промена код маркер хромозома и урадити генско мапирање. Анализа је високоспецифична, пошто се проба везује искључиво за одговарајући низ нуклеотида анализиране ДНК. Сензитивност ове методе је велика због могућности анализе великог броја ћелија (слика бр. 3 и бр.4). Слика бр.3. Схематски изглед FISH – single color позитиван налаз Центромерна проба(Single color FISH) Нормална ћелија Нормална ћелија тризомија монозомија 32 Слика бр.4. Схематски изглед позитивнoг налаза – dual color FISH Лажно позитивни резултати настају као последица лоше обраде препарата и не адекватне микроскопске анализе. Лажно негативни резултати могу се јавити ако постоји анеуплоидија, уколико је једро ћелије оштећено или долази до преклапања ћелија и прекривање дела генома једне ћелије. За разлику од конвенционалне цитогенетике и молекуларних метода FISH омогућава корелацију између генетске промене и морфологије ћелија. На H & E бојеним плочицама одређивано је репрезентативно подручје тумора из којег је из парафинског блока узиман цилиндар ткива иглом дебљине 0,6 mm. Тако формирани ткивни цилиндри су пренесени у специјалан парафински блок, а читава технологија се назива технологија ткивних микрозона или ткивне мреже (енгл. tissue microarray tehnology-ТМА), слика бр. 5. Слика бр. 5. Припрема парафинских калупа Регион специфична проба (Dual color FISH) Нормална ћелија Транслокација 33 Из овако припремљеног парафинског блока, сечени су ткивни пресеци дебљине 2 µm и постављени на микроскопска стакла са позитивним наелектрисањем. Слика бр. 6. Ткивни цилиндри у парафинском блоку и припремљени препарати Ткивни исечци су депарафинисани у ксилолу и рехидрисани у опадајућим концентрацијама етанола (100%, 85%, 70%), а затим кувани у микроталасној рерни у 10 mM лимунској киселини pH 6.0, у трајању 30 минута. Истовремена денатурација FISH проба и ДНК узорка изведена је на 77 °C, 3 минута, након чега је уследила хибридизација на 37°C, 20 сати. Хибридизација је изведена помоћу комерцијалних китова BCL-2 Break Apart и C-MYC Break Apart FISH пробе кит (AbbottVysis, USA). BCL- 2 FISH проба обухвата 18q21 регион, директно обележен Spectrum Green и Spectrum Orange флуоресцентном бојом. C-MYC- FISH проба обухвата 8q24 регион који је, као и претходни, директно обележен Spectrum Green и Spectrum Orange флуоресцентном бојом. По завршетку хибридизације плочице су испиране у 2xSSC/0.3% NP-40 на 73°C, 2 минута и 2xSSC/0.3% NP-40 на собној температури, 1 минут. Микроскопска стакла, (слика бр.6), су анализирана помоћу DM 2500 флуоресцентног микроскопа (Leica, Wetzlar Germany) опремљеног појединачним и троструким band pass филтерима. Сликање флуоресцентних сигнала је рађено Leica DFC 3000 G флуоресцентном камером (Leica, Wetzlar, Germany), повезаном са Leica CW 4000 програмом за обраду слика. Детекција реаранжмана bcl-2 и myc гена одређивана је бројањем 100 или више интерфазних једара, за сваки од наведених гена. Доступно за адекватну анализу је било 62 узорка, 15 технички није адекватно обрађено, а у 13 узорака није био адекватан број 34 минимално 100 интерфазних једара за детекцију реаранжмана. На малом увећању микроскопа (10x) вршено је претраживање туморског поља, а затим објективом увећања (100x) бројани су фузиони (интактни региони bcl-2 и c-myc гена), као и појединачни црвени и зелени (тзв. разломљени) сигнали за сваку појединачну ћелију. У једрима која су негативна на присуство bcl-2 и с-myc реаранжмана, присутна су по два фузиона сигнала жуте боје. У једрима која су позитивна на присуство реаранжмана bcl- 2 и с-myc гена, присутно је по три или више фузионих сигнала или један фузиони, један црвени и један зелени сигнал. Резултат се сматрао позитивним уколико је >20% једара било позитивно на bcl-2 и/или с -myc реаранжман. 3.4. Статистичка анализа података У циљу извођења неопходних статистичких тестирања, коришћен је статистички програмски пакет SPSS for Windows (22.0). На почетку истраживања све варијабле описане су класичним дескриптивним методама статистике. Номиналне и ординалне варијабле описали смо расподелом учесталости њихових категорија. Мерне варијабле описане су класичним мерама централне тенденције, минималном и максималном вредношћу, аритметичком средином и стандардном девијацијом и медијаном. Приказ добијених резултата дат је табеларно и графички. За поређење атрибутивних обележја посматрања између испитаника са различитим исходом коришћен је Pirson-ov 2 тест (таблице контигенције). Код анализе вредности нумеричких обележја посматрања између посматраних група испитаника, избор теста зависио је од нормалности расподеле података. У случају нормалне расподеле података коришћен је t- тест, односно Mann Whitney U тест у случају расподеле података различите од нормале. Нормалност расподеле података испитиван је Koglomorov Smirnov-им тестом. Kaplan Majer-овим кривама преживљавања праћен је исход код анализиране групе испитаника Log Rank тестом испитивана је разлика у преживљавању у односу на посматране факторе. Cox-овом регресионом анализом испитивани су предиктори преживљавања у овој групи испитаника. ROC кривама и површином испод њих одређивана је валидност постигнутих посматраних генских полиморфизама, у процени одговора на примењену терапију. Гранична вредност за прихватање радне хипотезе постављена је на p< 0.05 . 35 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. Анализа клиничких особености испитаника у моменту дијагностиковања Ретроспективним истраживањем обухваћено је 90 оболелих од ДБКЛ током шест година, просечне старости 68,5 година. Испитивану популацију је чинило 48 припадника мушког пола и 42 припаднице женског пола, дијагностиковани, лечени и праћени редовно током 90 месеци, до 1. јуна 2014. године. До краја посматраног периода било је 52 болесника са смртним исходом и 38 живих испитаника. Просечна старост испитаника у групи оболелих са смртним исходом била је 65,29 +/- 12,37 година док је у групи живих 55,11 +/- 13,91 година. Међугрупном анализом утврђујемо статистички значајну разлику у старости (Mann Whitney тест, p=0,001), односно испитаници са смртним исходом били су значајно старији, (графикон бр.1). Графикон бр.1. Старост болесника са различитим исходом болести Од 48 мушкараца, 30 је имало смртни исход, чинећи 57,7% ове групе са неповољним исходом, а 18 мушкараца је било живо на крају посматраног периода. Са неповољним исходом биле су 22 жене, чинећи 42,3% ове групе, док је 20 жена било живо до краја посматраног периода. Није утврђена статистички значајна разлика оболелих од ДБКЛ преживелих и умрлих у односу на пол (χ2 тест, p=0,332). У обе групе, испитаници различитог пола су били приближно исто заступљени, (графикон бр.2). 36 Графикон бр. 2. Расподела оболелих од НХЛ ДБКЛ различитог исхода болести, према полу Између посматраних група испитаника а према исходу болести, уочена је статистички значајна разлика у клиничком стадијуму болести, одређеном по Ann Arbor класификацији (χ2 тест, p=0,008), (табела бр.10). Клиничка обележја Исход Значајност Мртви Живи IPI/ризик n (%) низак 4 (7,7%) 8 (21,1%) b p=0,003* Средње низак 11 (21,2%) 18 (47,4%) Средње висок 31 (59,6%) 11(28,9%) висок 6 (11,5%) 1 (2,6%) ECOG n (%) 0 18 (34,6%) 33 (86,8%) b p=0,000* 1 15 (28,8%) 4 (10,5%) 2 12 (23,1%) 0 (0%) 3 5 (9,6%) 1 (2,6%) 4 2 (3,8%) 0 (0%) CS n (%) 1 5 (9,8%) 3 (7,9%) b p=0,008* 2 1 (2,0%) 10 (26,3%) 3 14 (27,5%) 7 (21,1%) 4 31 (60,8%) 18 (44,7%) Екстранодалне локализ. n(%) не 15 (28,8%) 17 (44,7%) b p=0,120 дa 37 (71,2%) 21 (55,3%) Број екстранодалнихлокализација (Med, (min-max)) 1 (1-3) 1 (1-2) a p=0,434 Bulky n (%) нe 34 (66,7%) 27 (73,0%) b p=0,527 дa 17 (33,8%) 10 (27,0%) *статистички значајна разлика; aMann Whitney тест; bχ 2-тест Табела бр. 10. Клинички стадијум болести, IPI, ECOG, екстранодална локализација и „Bulky“ форма болести у болесника са ДБКЛ- различитог исхода 37 Испитаници са смртним исходом били су у скоро 90% случајева у клиничком стадијуму III или IV, и то дупло више испитаника је било у IV клиничком стадијуму. У групи преживелих испитаника статистички значајно више испитаника је било у II клиничком стадијуму, посматрано у односу на испитанике са смртним исходом, али и статистички значајно мање оних у IV клиничком стадијуму, (графикон бр.3). Графикон бр.3. Расподела учесталости клиничког стадијума оболелих од ДБКЛ различитог исхода Између испитаника преживелих и оних са смртним исходом, уочена је статистички значајна разлика у IPI ризику (χ2 тест, p=0,003), (табела бр.10). Испитаници са лошим, односно смртним исходом, били су и са вишим IPI ризиком. Мање од 30% испитаника са смртним исходом имало је IPI ризик описан као низак и средње низак, док је око 70% преживелих испитаника било са тако описаним ризиком, (графикон бр.4). Статистички значајан утицај на морталитет испитаника показао је и ECOG статус (χ2 тест, p=0,000), табела бр.10. Преживели испитаници у статистички значајно већем броју су били ECOG статуса 0, док су испитаници са смртним исходом били чешће ECOG статуса1 и 2. ECOG статус 3 и 4, био је нешто чешћи у групи са смртним исходом, али редак у обе групе, (графикон бр.5). Екстранодална локализација болести дијагностикована је код 58 болесника чинећи 64,4%, док је 32 односно 35,6% имало само нодалну локализацију болести. Код испитаника са присутним екстранодалним локализацијама, није уочена статистички значајна разлика у њиховом броју посматрано у односу на исход (Mann Whitney тест, p=0,434), (табела бр.10), а приказ учесталости је на графикону бр. 6. У групи са смртним исходом једну екстранодалну локализацију имало је 78,4%, две локализације истовремено 13,5% а три 38 8,1% оболелих. Међу живим испитаницима једну локализацију је имало 85,7% , две 14,3% испитаника, и нико није био са три локализације, (графикон бр.7). Графикон бр.4. Расподела IPI ризик скора болесника са различитим исходом болести Графикон бр.5. ECOG статус код болесника са различитим исходом болести 39 Графикон бр.6. Учесталост екстранодалне локализације код болесника са различитим исходом болести Графикон бр.7. Број екстранодалних локализација у испитаника са различитим исходом болести Није уочена статистички значајна разлика у „Bulky“ позитивном и негативном статусу у односу на морталитет испитаника (χ 2 тест, р=0,527), (табела бр.10). Код испитаника са оба посматрана исхода, испитаници са позитивним „Bulky“ статусом били су заступљени у једној трећини случајева, ( графикон бр.8). 40 Графикон бр.8.„ Bulky“ форма НХЛ ДБКЛ болесника различитог исхода болести У групи испитаника са смртним исходом 9,8% је било у клиничком стадијуму I, у стадијуму II-2,0%, стадијум III чинило је 27,5%, док је 60,8% имало одмакли IV клинички стадијум. Припадници ове групе имали су ECOG статус 0 у 34,6%, статус означен са 1-28,8%, 2-23,1%, 3-9,6%, 4-3,8%. Екстранодална локализација у групи са смртним исходом утврђена је у 71,2% испитаника, а „Bulky“форма болести у 33,8%. IPI ризик у овој групи, низак имало је 7,7%, средње низак 21,2%, средње висок 59,6% и висок ризик 11,5% оболелих од ДБКЛ. Анализа живих испитаника оболелих од ДБКЛ показује клинички стадијум I у 7,9%, стадијум II код 26,3%, стадијум III у 21,1% док је у одмаклом IV клиничком стадијуму било 44,7% оболелих. У овој групи ECOG статус 0 имало је 86,8%, статус 1- 10,5%, статус 2 и статус 4 није имао нико од оболелих у овој групи, док је ECOG -3 имао само један оболели односно 2,6%. Екстранодална локализација у групи живих утврђена је код 55,3% оболелих, а „Bulky“форма болести у 27%. Низак IPI ризик у овој групи имало је 21,1%, средње низак 47,4%, средње висок 28,9% а висок само један болесник, односно 2,6%. 4.1.1. Анализа Б симптоматологије оболелих од ДБКЛ Анализом присуства и одсуства В симптома у односу на исход болести, уочена је статистички значајна разлика у заступљености испитаника са присутним В симптомима (χ 2 тест, p=0,002). Анализом добијене разлике, уочавамо статистички 41 значајно већу учесталост испитаника са В симптомима у групи са смртним исходом, (графикон бр.9). Графикон бр. 9.Учесталост В симптома код оболелих од ДБКЛ различитог исхода Анализа постојања В симптома: повишена телесна температура, губитак у телесној тежини већи од 10% за последњих шест месеци, презнојавање код различитог исхода болести показала је значајне разлике. Између испитаника са смртним исходом и преживелих уочена је статистички значајна разлика у појави повишене телесне температуре, (χ 2 тест, p=0,014). Испитаници са смртним исходом скоро три пута чешће су имали температуру као симптом, него живи испитаници, (графикон бр.10). Испитаници са губитком у телесној тежини значајно су више били заступљени у групи са смртним исходом (χ2 тест, p=0,002). Губитак телесне тежине имало је упола мање преживелих испитаника, него они оболели са смртним исходом, (графикон бр.11). Презнојавање, као симптом, статистички значајно чешће се појављивало у групи са смртним исходом, (χ2 тест, p=0,001). Два пута више испитаника са смртним исходом је имало овај симптом приликом постављања дијагнозе, (графикон бр. 12). 42 Графикон бр.10. Дистрибуција учесталости повишене телесне температуре код различитог исхода болести Графикон бр.11. Дистрибуција учесталости губитка у телесној тежини код различитог исхода болести Графикон бр.12. Дистрибуција учесталости презнојавања код различитог исхода болести 43 4.1.2. Анализа коморбидитета оболелих од ДБКЛ, различитог исхода Између испитаника са смртним исходом и преживелих уочена је статистички значајна разлика у коморбидитету (χ2 тест, p=0,020), (табела бр.11). Придружене болести n (%) Исход Значајност Mртви Живи Без болести 13 (25,0%) 22 (57,9%) a p=0,020* Diabetes mellitus 8 (15,4%) 1 (2,6%) Кардиоваскуларне болести 25 (48,1%) 13 (34,2%) Болести плућа 2 (3,8%) 0 (0%) Системске реуматске болести 2 (3,8%) 0 (0%) Hepatitis 1 (1,9%) 0 (0%) Друге болести 1 (1,9%) 2 (5,3%) *статистички значајна разлика; aχ 2-тест Табела бр.11. Учесталост придружених болести испитиване популације оболелих од ДБКЛ различитог исхода Код испитаника са смртним исходом три четвртине испитаника имало је неки коморбидитет, док је у групи преживелих мање од половине испитаника било са неким коморбидитетом. Најчешћи коморбидитет у обе групе, било је постојање кардиоваскуларне болести. Oко 15% испитаника са смртним исходом имало је Diabetes mellitus, a свега око 3% живих било je са овим коморбидитетом. Све остале придружене болести биле су забележене у појединачним случајевима. 4.2. Претерапијске лабораторијске анализе крви у оболелих од ДБКЛ 4.2.1. Анализа претерапијске крвне слике Број леукоцита у болесника са смртним исходом био је 8,75±5,81 x 10 9, са распоном од 3,5-36,3 x 10 9, а у живих 6,98±2,36 x 109 са распоном од 3,1-14,2 x 10 9. Међугрупном анализом није утврђена статистички значајна разлика у броју леукоцита између болесника са смртним исходом и живих (Mann Whitney тест, p=0,345). Анализом леукоцитарне формуле утврђена је средња вредност неутрофила у групи са смртним исходом 5,14±3,35 x 109 и 4,26±1,91x 10 9 у живих испитаника, без статистички значајне међугрупне разлике (Mann Whitney тест, p=0,396). Лимфоцити су у групи са 44 смртним исходом били 2,04±1,99 x 10 9, групи живих 1,82±1,13 x 10 9, без статистички значајне међугрупне разлике (Mann Whitney тест, p=0,402). Средња вредност моноцита у групи са смртним исходом била је 1,13±2,34 x 10 9, а у групи живих 0,77±0,69 x 109, без статистички значајне међугрупне разлике (Mann Whitney тест, p=0,412). Анализа броја еритроцита показала је средњу вредност у групи са смртним исходом 3,74±0,64 x 10 12, a у групи живих 3,93±0,52 x 10 12, без статистички значајне међугрупне разлике (t- тест, p=0,133). Средња вредност, MCV (енгл. Main Сorpuscular Volume) 87,66±6,13 fl у групи са смртним исходом, а у групи живих 88,53±4,79 fl, без статистички значајне разлике (Mann Whitney тест, p=0,772). Вредности хемоглобина у болесника са смртним исходом биле су 115,01±20,54 g/l са распоном од 60 g/l до164 g/l, док је у групи живих средња вредност била 129,21±15,80 g/l са распоном од 93 g/l до 166 g/l, а међугрупна анализа је показала статистички значајну разлику (t-тест, p=0,001), уз значајно ниже вредности у групи са смртним исходом. Вредности тромбоцита имале су средњу вредност у групи са смртним исходом од 259,27±120,97 x 109, а у групи живих 265,92±104,08 x109 , без статистички значајне разлике међугрупном анализом (Mann Whitney тест, p=0,457), (табела бр. 12). 45 Опште карактеристике Исход Значајност Mртви Живи Леукоцити x109 (X+SD (Med, min-max)) 8,75±5,81 (6,85; 3,5-36,3) 6,98±2,36 (6,64; 3,1-14,2) a p=0,345 Неутрофили (X+SD (Med, min-max)) 5,14±3,35 (4,31; 0,51-17,62) 4,26±1,91 (4,1; 1,24-11,0) a p=0,396 Лимфоцити (X+SD (Med, min-max)) 2,04±1,99 (1,36; 0,06-10,85) 1,82±1,13 (1,50; 0,29-5,65) a p=0,402 Moноцити (X+SD (Med, min-max)) 1,13±2,34 (0,77; 0-16,8) 0,77±0,69 (0,68; 0-4,1) a p=0,412 Број еритроцита x1012 (X+SD (Med, min-max)) 3,74±0,64 (3,68; 2,30-5,35) 3,93±0,52 (3,94; 3,0-5,12) b p=0,133 Вредности хемоглобина g/l (X+SD (Med, min-max)) 115,01±20,54 (113,5; 60-164) 129,21±15,80 (129,55; 93-166) b p=0,001* MCV (X+SD (Med, min-max)) 87,66±6,13 (88,2; 69,5-100) 88,53±4,79 (89,08; 75-96,6) a p=0,772 Тромбоцити x109 (X+SD (Med, min-max)) 259,27±120,97 (232,05; 57,5-651) 265,92±104,08 (249,5; 83,4-525) a p=0,457 *статистички значајна разлика; aMann Whitney U тест; bt-тест; Табела бр.12. Претерапијске вредности крвне слике у оболелих од ДБКЛ На графиконима су приказани крвни елементи анализиране крвне слике пре примењене терапије, без статистички значајне разлике а у болесника са различитим исходом, (графикони од бр.13 до бр.19). 46 Графикон бр.13. Број леукоцита пре примењене терапије у односу на исход болести Графикон бр.14. Број неутрофила пре примењене терапије у односу на исход болести Графикон бр.15. Број лимфоцита пре примењене терапије у односу на исход болести Графикон бр.16. Број моноцита пре примењене терапије у односу на исход болести Графикон бр.17. Број еритроцита пре примењене терапије у односу на исход болести Графикон бр.18. Вредност MCV пре примењене терапије у односу на исход болести 47 Графикон бр.19. Број тромбоцита пре примењене терапије у односу на исход болести У групи испитаника са смртним исходом вредност хемоглобина је била 115,01±20,54g/l са распоном од 60g/l до 160g/l, у групи живих вредности су биле 129,21±15,80g/l са распоном од 93g/l до 166g/l. Статистички значајна разлика утврђена је између вредности хемоглобина болесника са смртним исходом и живих болесника, односно, статистички значајно су биле ниже претерапијске вредности хемоглобина у болесника са смртним исходом (t- тест, p=0,001), (графикон бр.20). Графикон бр.20. Вредност хемоглобина пре примењене терапије у односу на исход болести 4.2.2. Биохемијске анализе крви претерапијске Средња вредности укупних протеина у групи са смртним исходом претретмански била је 61,64±7,42 g/l, а у групи живих 67,00±6,67 g/l, уз статистички значајно ниже вредности у грпи са смртним исходом (t- тест, p=0,001), утврђена је и статистички значајна разлика у учесталости испитаника са вредностима укупних 48 протеина мањим и већим од 60 g/l (χ2 тест, p=0,007) у зависности од исхода, (табела бр.13). Биохемијски параметри Исход Значајност Mртви Живи Укупни протеини (X+SD (Med, min- max)) 61,64±7,42 (61; 51-77) 67.00±6,67 (67,5; 51-81) a p=0,001* Укупни протеини n (%) <60g/l 23 (46,0%) 7 (18,4%) b p=0,007* >60g/l 27 (54,0%) 31 (81,6%) Албумини (X+SD (Med, min-max)) 32,98±5,63 (32,5; 21-45) 37,37±5,35 (37,5; 24-47) a p=0,000* Албумини n (%) <30g/l 16 (32,0%) 6 (15,8%) b p=0,082 >30g/l 34 (68,0%) 32 (84,2%) AST (X+SD (Med, min-max)) 33,34±24,21 (25,0; 11-120) 24,50±15,35 (18,0; 9-87) c p=0,023* AST n (%) <40IU/l 40 (80,0%) 33 (86,8%) b p=0,398 >40IU/l 10 (20,0%) 5 (13,2%) ALT (X+SD (Med, min-max)) 27,84±23,12 (21,5; 7-151) 29,08±21,44 (22,0; 9-121) c p=0,717 ALT n (%) <40IU/l 42 (84,0%) 32 (84,2%) b p=0,979 >40IU/l 8 (16,0%) 6 (15,8%) Gama GT (X+SD (Med, min-max)) 64,43±90,25 (32,0; 10-489) 35,87±33,59 (26,0; 7-177) c p=0,156 Gama GT n (%) <30IU/l 29 (61,7%) 24 (77,4%) b p=0,146 >30IU/l 18 (38,3%) 7 (22,6%) ALP (X+SD (Med, min-max)) 101,11±98,82 (80,0; 45-658) 75,16±34,34 (71,0; 24-206) c p=0,309 ALP n (%) <100U/l 40 (85,1%) 27 (87,1%) b p=0,805 >100U/l 7 (14,9%) 4 (12,9%) Acidum uricum(X+SD (Med, min- max)) 374,33±172,98 (318,0; 128-769) 266,40±55,53 (250,0; 185-430) c p=0,014* Acidum uricum n (%) <400umol/l 31 (63,3%) 29 (96,7%) b p=0,001* >400umol/l 18 (36,7%) 1 (3,3%) LDH (X+SD (Med, min-max)) 1081,06±1099,88 (677,5; 130-5548) 536,74±540,79 (345,0; 214- 3020) c p=0,000* LDH n (%) <400U/l 15 (28,8%) 22 (57,9%) b p=0,006* >400U/l 37 (71,2%) 16 (42,1%) *статистички значајна разлика; at- тест; bχ 2-тест; aMann Whitney тест Табела бр.13. Вредности анализираних претерапијских биохемијских параметара 49 Статистички значајно веће вредности укупних протеина су у групи живих испитаника. Вредности протеина преко 60g/l имало је 54% испитаника у групи испитаника са смртним исходом и 81,6% у групи живих испитаника, (графикон бр. 21). Између анализираних група испитаника, није уочена статистички значајна разлика у учесталости испитаника са вредностима албумина мањим и већим од 30 g/l (χ2 тест, p=0,082), (графикон бр.22). Просечне вредности албумина у групи живих испитаника су биле 37,37±5,35g/l, са распоном од 24g/l до 47g/l и статистички значајно веће у односу на болеснике са смртним исходом (t- тест, p=0,000), (табела бр. 13). Графикон бр. 21. Расподела вредности укупних протеина у болесника са ДБКЛ различитог исхода Графикон бр. 22. Расподела вредности албумина у болесника са ДБКЛ различитог исхода 50 Између испитаника са смртним исходом и живих, уочена је статистички значајна разлика у просечним вредностима AST-a (Mann Whitney тест, p=0,023), и то тако да су веће просечне вредности овог параметра измерене код испитаника са смртним исходом 33,34±24,21 IU/l са распоном од 11 IU/l до 120 IU/l. Aнализом учесталости испитаника са вредностима овог параметра мањим и већим од 40 IU/l у односу на исход болести није показао статистички значајну разлику (χ 2 тест, p=0,398), (графикон бр. 23). Просечне вредности АLT у групи оболелих са смртним исходом су биле 27,84IU/l ± 23,12 IU/l, са распоном од 11 IU/l до120 IU/l, а у другој групи 29,08 IU/l ±21,44 IU/l , са распоном од 9 IU/l до121 IU/l, без статистички значајне међугрупне разлике (Mann Whitney тест, p=0,717), (табела бр.13). Није утврђена статистички значајна разлика ни учесталости у односу на граничне вредности, веће и мање од 40 IU/l (χ 2 тест, p=0,979) међу групама различитог исхода, (графикон бр.24). Просечне вредности gama-GT у групи са смртним исходом су биле 64,43±90,25 IU/l са распоном од 10-489 IU/l, а у групи живих 35,87±33,59 IU/l, са распоном од 7IU/l до 177 IU/l, без статистички значајне разлике између анализираних група (Mann Whitney тест, p=0,156), (табела бр.13). Није утврђена ни статистички значајна разлика у односу на граничне вредности gama-GT а у групама различитог исхода (χ 2 тест, p=0,146), (графикон бр.25). Алкална фосфатаза у групи оболелих са смртним исходом је била 101,11 U/l ± 98,82 U/l, са распоном од 45 U/l до 658 U/l, док је у групи живих била 75,16 U/l ± 34,34 U/l, са распоном од 24 U/l до 206 U/l, без статистичке значајности у међугрупној анализи (Mann Whitney тест, p=0,309), (табела бр13). Није утврђена ни статистички значајна разлика у учесталости у односу на граничне вредности, у групама различитог исхода (χ 2 тест, p=0,805), (графикон бр.26). Графикон бр. 23. Расподела вредности AST оболелих од ДБКЛ са различитим исходом 51 Графикон бр. 24. Расподела вредности ALT оболелих од ДБКЛ различитог исхода Графикон бр. 25. Расподела вредности gama- GT оболелих од ДБКЛ различитог исхода Графикон бр. 26. Расподела вредности ALP у оболелих од ДБКЛ различитог исхода Вредности LDH измерене у моменту постављања дијагнозе код живих испитаника и испитаника са смртним исходом, статистички су се значајно разликовале (Mann Whitney тест, p=0,000), (табела бр.13). Статистички значајно веће вредности овог 52 параметра измерене су код испитаника са смртним исходом. Између анализираних група оболелих, уочена је статистички значајна разлика и у заступљености испитаника са вредностима LDH мањим и већим од 400 U/l (χ2 тест, p=0,006). Око 70% испитаника са смртним исходом имало је вредности LDH веће од 400 U/l, док је овакве вредности LDH имало око 40% испитаника који су живи, (графикон бр.27). Анализом вредности мокраћне киселине (лат.аcidum urikum) у моменту постављања дијагнозе, између испитаника са смртним исходом и живих, уочена је статистички значајна разлика у просечним вредностима овог параметра, вредности су биле значајно веће у болесника са смртним исходом (Mann Whitney тест, p=0,014), (табела бр. 13). Утврђена је статистички значајна разлика и у учесталости испитаника са вредностима мокраћне киселине мањим и већим од граничних вредности од 400 umol/l (χ2тест, p=0,001). Вредности мокраћне киселине преко 400 umol/l имало је 36,7% испитаника са смртним исходом и 3,3% живих испитаника, ( графикон бр.28). Просечна вредност гвожђа у групи живих је 13,25umol/l±5,97umol/l, са распоном од 2umol/l до 25umol/l. Код овог параметра статистички значајно веће вредности иницијално су измерене у групи живих испитаника (Mann Whitney тест, p=0,002). Узимајући граничне вредности вредност за овај параметар од 10umol/l, уочена је значајно већа учесталост испитаника са вредностима гвожђа у серуму већим од 10umol/l у групи живих испитаника (χ2 тест, p=0,020), чак 61,3% живих има вредност гвожђа у серуму већу од граничне вредности, (графикон бр.29). Графикон бр. 27. Расподела вредности LDH оболелих од ДБКЛ различитог исхода 53 Графикон бр. 28. Расподела вредности аcidum urikum оболелих од ДБКЛ различитог исхода Статистички значајна разлика, посматрано у односу на исход уочена је и код претерапијских вредности гвожђа у серуму, (табела бр.14). Гвожђе у серуму X+SD (Med, min-max)) 9,3umol/l±6,97umol/l 7,20; 2-40 13,25umol/l±5,97umol/l 12,10; 2-25 p=0,002* Гвожђе у серуму n (%)<10umol/l 32 (65,3%) 12 (38,7%) p=0,020* Гвожђе у серуму n (%)>10umol/l 17 (34,7%) 19 (61,3%) p=0,020* Вредност гвожђа мртви живи значајност. * Mann Whitney тест, * χ 2-тест; Табела бр. 14. Претерапијске вредности гвожђа у серуму оболелих, различитог исхода Графикон бр. 29. Расподела вредности Fe у серуму у оболелих од ДБКЛ различитог исхода 54 4.2.3. Биохуморални запаљенски синдром - претерапијски Вредности CRP-a, статистички значајно су се разликовале посматрано у односу на исход оболелих, (табела бр.15). Параметри запаљења Исход Значајност Мртви Живи Седиментација (X+SD (Med, min- max)) 36,90±31,99 (30; 2-150) 33.47±43,26 (23; 3-250) a p=0,195 Седиментација n (%) <10mm/h 6 (11,5%) 9 (23,7%) b p=0,127 >10mm/h 46 (88,5%) 29 (76,3%) Фибриноген (X+SD (Med, min- max)) 4,51±1,51 (4,14; 2,18-10,80) 4,04±0,93 (3,81; 2,76-6,90) a p=0,121 Фибриноген n (%) <4g/l 19 (36,5%) 20 (54,1%) b p=0,101 >4g/l 33 (63,5%) 17 (45,9%) CRP (X+SD (Med, min-max)) 42,07±57,27 (15,0; 0-308) 17,66±38,36 (5,25; 1-218) c p=0,001* CRP n (%) <5mg/l 9 (17,3%) 15 (39,5%) b p=0,019* >5mg/l 43 (82,7%) 23 (60,5%) D-димер (X+SD (Med, min-max)) 1145,40±1011,18 (860; 0-4048) 420,35±287,76 (340,0; 116-1200) c p=0,000* D-димер n (%) <450ng/ml 10 (20,4%) 19 (61,3%) b p=0,000 >450ng/ml 39 (79,6%) 12 (38,7%) а Мann Whitney-тест,b χ 2 -тест Табела бр.15. Претретманске вредности параметара запаљења у групама различитог исхода Просечна вредност CRP-a групе болесника са смртним исходом била је 42,07mg/l ± 57,27mg/l са распоном од 0mg/l до 308mg/l, док су просечне вредности претретманске, у групи живих биле 17,66 mg/l ± 38,36 mg/l са распоном од 1mg/l до 218mg/l. Статистички значајно веће вредности овог параметра измерене су у групи са смртним исходом (Мann Whitney тест, p=0,001). Статистички значајна разлика, уочена је и у учесталости испитаника са вредностима CRP-a већим од граничних вредности 5 mg/l, и то тако да су високе вредности учесталије у групи са смртним исходом (χ 2 тест, p=0,019), (графикон бр.30). Просечне вредности претретманске D - димера у испитаника са смртним исходом биле су 1145,40ng/ml ± 1011,18ng/ml, са распоном од 0ng/ml-4048ng/ml, а просечне вредности у групи живих 420,35ng/ml ± 287,76ng/ml, са распоном од 116ng/ml до 1200ng/ml, те је утврђена статистички значајно већа вредност у групи са смртним исходом (Мann Whitney тест, p=0,000), (табела бр.15). Статистички значајна разлика 55 уочена је и у заступљености оболелих са вредностима D - димера мањим и већим од граничних вредности 450 ng/ml и то тако да су у групи са смртним исходом испитаници са вредностима већим од 450 ng/ml били статистички значајно више заступљени (χ 2 тест, p=0,000), (графикон бр. 31). Просечна вредност седиментације у првом сату у болесника са смрним исходом била је 36,90mm/h ± 31,99mm/h, са распоном од 2mm/h до 150mm/h. Међу живим испитаницима претретманске вредности седиментације биле су 33.47mm/h ± 43,26 mm/h, са распоном од 3mm/h до 250mm/h. Посматрано у односу на исход, није уочена статистички значајна разлика у вредностима седиментације (Мann Whitney тест, p=0,195), (табела бр.15). Није утврђена ни статистички значајна разлика у учесталости вредности седиментације у односу на граничне вредности од 5mm/h, међу групама различитог исхода (χ 2 тест, p=0,127), (графикон бр. 32). Просечне претретманске вредности фибриногена у групи болесника са смртним исходом биле су 4,51g/l ± 1,51g/l, са распоном од 2,18g/l до 10,8g/l. Просечне вредности у групи живих биле су 4,04g/l ± 0,93g/l, са распоном од 2,76 g/l до 6,90g/l. Између испитаника са смртним исходом и живих, није уочена статистички значајна разлика у вредностима фибриногена (Мann Whitney тест, p=0,121), (табела бр.15). Није утврђена ни разлика у заступљености овог парамера већег и мањег од граничне вредности од 4g/l у посматраним групама (χ 2 тест, p=0,101), ( графикон бр.33). Графикон бр. 30. Приказ расподеле CRP- а у анализираних испитаника различитог исхода у односу граничне вредности 56 Графикон бр. 31. Учесталост D– димер-а у односу на граничне вредности у групама различитог исхода Графикон бр. 32. Учесталост повишене седиментације у односу на граничне вредности у групама различитог исхода Графикон бр. 33. Учесталост повишеног фибриногена у односу на „cut off“ у групама различитог исхода 57 4.3. Имунохистохемијска анализа и генски полиморфизам за bcl-2 и c-myc утврђен FISH-ом Доступно анализи FISH-ом било је 62 технички адекватна узорка, од којих је 33 испитаника било са смртним исходом, а 29 испитаника је било живо на крају посматраног периода од 90 месеци. FISH анализом утврђена је bcl-2 позитивност код 48,5% испитаника са смртним исходом, а у 37,9% живих испитаника, (слика бр.7). Слика бр.7. Анализирани (репрезентативни) узорци оболелих од ДБКЛ који су FISH/ bcl-2 позитивни 58 Слика бр.8. Анализирани (репрезентативни) узорци оболелих од ДБКЛ који су FISH/ bcl-2 негативни Bcl-2 негативних на FISH анализи било је 51,5% у групи са смртним исходом и 62,1% у групи живих испитаника, (слика бр. 8). Посматрано у односу на исход болести није уочена статистички значајна разлика у учесталости испитаника са FISH bcl-2 позитивним налазом (χ2 тест, p=0,403), (табела бр.16). Тренд веће учесталости позитивног налаза овог параметра запажамо код испитаника са смртним исходом, (графикон бр. 34). Слика репрезентативног, позитивног налаза bcl-2 утврђена FISH-ом приказана је на слици бр.7. Графикон бр. 34. Учесталост FISH/bcl2 позитивности у групама различитог исхода 59 У испитиваној популацији c-myc позитивност утврђена је у 14 болесника, односно у 42,4% испитаника са смртним исходом, док је позитиван налаз у 11, односно 37,9% живих испитаника. Репрезентативна слика позитивног налаза за c-myc утврђеног FISH-ом оболелих од ДБКЛ приказана је на слици бр. 10. Слика бр.9. Репрезентативни анализирани узорци оболелих од ДБКЛ који су FISH/c-myc негативни Између иситаника, са смртним исходом и живих, није уочена статистички значајна разлика ни са позитивним налазом FISH c-myc-a (χ2 тест, p=0,719), (табела бр.16). Параметри IHH и FISH Исход Значајност Mртви Живи FISH/bcl-2 n (%) Негативан 17 (51,5%) 18 (62,1%) a p=0,403 Позитиван 16 (48,5%) 11 (37,9%) FISH c-myc n (%) Негативан 19 (57,6%) 18 (62,1%) a p=0,719 Позитиван 14 (42,4%) 11 (37,9%) bcl-2/ИХХ n (%) Негативан 12 (23,5%) 19 (50,0%) a p=0,010* Позитиван 39(76,5%) 19 (50,0%) Bcl-6/ИХХ n (%) Негативан 31 (60,8%) 22 (59,5%) a p=0,900 Позитиван 20 (39,2%) 15 (40,5%) Ki-67 (X+SD (Med, min-max)) 30,75±36,98 (0,80; 0,30-95,0) 31,92±37,19 (0,96; 0,30-95,0) b p=0,974 Ki-67 n (%) <50% 32 (61,5%) 25 (65,8%) a p=0,679 >50% 20 (38,5%) 13 (34,2%) *статистички значајна разлика; aχ 2-тест; bMann Whitney тест Табела бр.16. ИХХ и FISH анализа узоркованог ткива при постављању дијагнозе ДБКЛ 60 FISH/c-myc негативан налаз је утврђен у 19, односно у 57,6% испитаника са леталним исходом, док је у групи живих испитаника било 18 односно 62,1% негативних за овај испитивани полиморфизам, (слика бр.9). , Слика бр.10. Репрезентативни анализирани узорци оболелих од ДБКЛ који су FISH/ c-myc позитивни У обе анализиране групе испитаници са позитивним налазом овог параметра, били су приближно исто заступљени,( графикон бр. 35). Графикон бр. 35. Учесталост FISH/c-myc позитивности у болесника различитог исхода Имунохистохемијски анализирана bcl-2 позитивност, утврђена је у 76,5% болесника са смртним исходом и у 50% живих испитаника. Међугрупна анализа показала је статистички значајно већу позитивност у болесника са лошим исходом (χ 2- тест, p=0,010). Испитаници са позитивним налазом bcl-2/ИХХ, статистички значајно више су били заступљени код испитаника са смртним исходом. Половина живих испитаника 61 имала је позитиван налаз овог параметра и око три четвртине испитаника са смртним исходом, (графикон бр. 36). Графикон бр. 36. Учесталост bcl-2 позитивности у болесника са различитим исходом анализирано ИХХ Није уочена статистички значајна разлика у позитивном налазу bcl-6/ ИХХ између испитаника са различитим исходом (χ2 тест, p=0,900), (табела бр.16). Испитаници са позитивним налазом били су приближно исто заступљени у групи умрлих и у групи живих испитаника и то са око 40%, ( графикон бр.37). Графикон бр. 37. Учесталост bcl-6 позитивности у болесника различитог исхода анализирано ИХХ Посматрано у односу на исход, није уочена статистички значајна разлика у вредности Ki-67 (Mann Whitney тест, p=0,974), као ни у учесталости испитаника са Ki- 67% мањим и већим од 50% (χ2 тест, p=0,679), (табела бр.16). И код живих и код испитаника са смртним исходом учесталост оболелих са Ki-67 већим од 50% била је приближно иста. У групи живих 34,2% испитаника имало је вредност овог параметра преко 50%, a у групи умрлих њих 38,5%, ( графикон бр.38). 62 Графикон бр. 38. Позитивност Ki- 67 узоркованог материјала у болесника различитог исхода 4.4. Анализа преживљавања Време праћења за посматрану групу испитаника износило је 90 месеци (7,5 година). Преживљавање на крају прве године износило је 51,8%, на крају друге 45,5%, на крају пете 39,9% и није се мењало до краја периода праћења, (графикон бр.39). Медијана преживљавања износила је 16 месеци (95% CI 1,88-30,12 месеци). Графикон бр.39. Укупно преживљавање Није уочена статистички значајна разлика у преживљавању испитаника различитог пола (Log Rank тест, p=0,303), (графикон бр. 40). Једногодишње преживљавање код оболелих жена било је 73,8%, двогодишње 46,7% колико је остало 63 до краја периода праћења који је износио 90 месеци. Преживљавање после годину дана за испитанике мушког пола било је 47%, после две године 42,4%, после три 33,6%, колико је остало до краја периода праћења који је за ову групу испитаника износио 79 месеци. Медијана преживљавања за мушкарце износила је 11 месеци а за жене 24 месеца. Графикон бр. 40. Преживљавање оболелих испитаника различитог пола 4.4.1. Преживљавање у односу на IPI, перформанс статус болесника – ECOG и клинички стадијум Преживљавање испитаника је анализирано Log Rank тестом. Преживљавање испитаника у односу на IPI ризик, статистички значајно се разликовало (p=0,000). Међугрупном анализом, статистички значајна разлика уочена је између испитаника са ниским и средње високим ризиком (p=0,021) и високим ризиком (p=0,000), између испитаника са средње ниским и ниским и испитаника са средње високим ( p=0,001) и високим ( p=0,000) ризиком, док разлика у преживљавању између испитаника са средње ниским и ниским ризиком (p=0,919) и испитаника са средње високим и високим ризиком (p=0,053), није била статистички значајна. 64 Једногодишње преживљавање испитаника са ниским ризиком било је 66,7% и тако је остало до краја периода праћења који је износио 88 месеци. Код испитаника са средње ниским ризиком, једногодишње преживњавање износило је 75,9%, двогодишње 68,3% петогодишње 60,2% и тако је износило до краја 84 месеца праћења. Код испитаника са средње високим ризиком, преживљавање после годину дана износило је 34,3%, после две године 28,1%, после пет година 21,4% и тако је остало до краја 90 месеци праћења. Једногодишње преживљавање за испитанике са високим ризиком било је 28,6%. Нико од испитаника са овим ризиком није живео дуже од 14 месеци, (графикон бр.41). Графикон бр.41. Преживљавање оболелих од ДБКЛ у зависности од IPI ризика Прерасподелом испитаника у групе са ниским (низак и средње низак ризик) и високим ризиком (висок и средње висок ризик), уочена је статистички значајна разлика у преживљавању (p=0,000). Једногодишње преживљавање код испитаника са ниским IPI ризиком било је 73,2%, двогодишње 67,9%, петогодишње 62,5% колико је остало до краја периода праћења, који је за ову групу испитаника износио 88 месеци. Код испитаника са високим IPI ризиком преживљавање после годину дана било је 33,2%, после две године 25,3%, после три 19,2% и тако је било и на крају 90 месеци праћења, (графикон бр.42). 65 Графикон бр.42. Преживљавање болесника са високим и средње високим IPI у односу на преживљавање болесника са ниским и средње ниским IPI ризиком Анализа преживљавања болесника у односу на перформанс статус учињена је Log Rank тестом. Уочен је статистички значајан утицај ECOG статуса на преживљавање испитаника (p=0,000). Статистички најбоље преживљавање забележено је у групи испитаника са ECOG статусом 0, испитаници са овим статусом значајно дуже живе, и значајно су дуже живели у односу на испитанике са ECOG статусом 1 ( p=0,003), статусом 2 (p=0,000), статусом 3 (p=0,000) и статусом 4 (p=0,011). Испитаници са ECOG статусом 1 имали су значајно различито преживљавање у односу на испитанике са ECOG статусом 2 (p=0,041), док се нису статистички значајно разликовали од испитаника са ECOG статусом 3 (p=0,117) и ECOG статусом 4 (p=0,092). Између испитаника са ECOG статусом 2 и 3 није уочена статистички значајна разлика (p=0,959), као ни између испитаника са ECOG статусом 2 и 4 (p=0,791). Није уочена статистички значајна разлика ни између испитаника са ECOG статусом 3 и 4 (p=0,666), (графикон бр 43). Испитаници са ECOG статусом 0, најдуже су праћени 90 месеци и у овој групи испитаника једногодишње преживљавање износило је 70,2%, двогодишње 65,5%, трогодшње 62,8% колико је било и на крају посматраног периода. Код испитаника са ECOG статусом 1, преживљавање после годину дана износило је 36,8%, 66 после две године 31,6%, после три 21,1% колико је било и на крају периода праћења, који је за ову групу износио 78 месеци. У групи са ECOG статусом 2 преживљавање после годину дана износило је 16,7%, после две године 8,3%, док нико из ове групе испитаника није живео дуже од три године. Једногодишње преживљавање испитаника са ECOG статусом 3 било је 33,3%, a после 16 месеци 0%. Овај ECOG статус имало је шест испитаника и испитаник који је најдуже живео праћен је 16 месеци када је и егзитирао. ECOG статус 4 имало је два испитаника, један је испитаник умро после два месеца, а други после осам месеци, (графикон бр.43). Графикон бр.43. Преживљавање болесника са различитим ECOG статусом у моменту постављања дијагнозе ДБКЛ Статистичка анализа преживљавања болесника различитог клиничког стадијума учињена је Log Rank тестом. Између испитаника са различитим клиничким стадијумима уочена је статистички значајна разлика у преживљавању (p=0,030). Анализом међугрупном, уочена је статистички значајна разлика између испитаника у CS I и испитаника у CS II (p=0,022), док између испитаника са CS I и CS III (p=0,948) и CS IV (p=0,824), разлика није била статистички значајна. Статистички значајна разлика уочена је и између испитаника са CS II и испитаника са CS III (p=0,007) и CS IV (p=0,003), док између испитаника са CS III и IV разлика није била значајна (p=0,889). Једногодишње преживљавање у групи са CS I било јe 50% колико је било и 67 двогодишње, док је трогодишње преживљавање износило 25% и није се мењало до краја периода праћења који је за ову групу износио шест година (72 месеца). Преживљавање после годину дана у групи испитаника са CS II било је 90,9% и није се мењало до краја периода праћења у трајању од 88 месеци. У групи испитаника са CS III једногодишње преживљавање износило је 45,5%, двогодишње 40,4%, трогодишње 34,6% колико је било и на крају периода праћења од 90 месеци. У групи са CS IV преживљавање после годину дана било је 47%, после две године 36,7%, после три 31% и није се мењало до краја периода праћења који је износио 88 месеци, (графикон бр. 44). Графикон бр.44. Преживљавање болесника различитих клиничких стадијума ДБКЛ Није уочен статистички значајан утицај присуства екстранодалних локализација болести на преживљавање оболелих (Log Rank тест, p=0,119). Једногодишње преживљавање испитаника без екстранодалне локализације било је 59,4%, двогодишње 56,1%, трогодишње 52,3% колико је остало до краја периода праћења од 90 месеци. У групи са екстранодалном локализацијом болести, преживљавање после годину дана било је 47,6%, двогодишње 39,4%, трогодишње 32,7% колико је и остало до краја периода праћења који је за ову групу испитаника 68 износио 84 месеца, (графикон бр.45). Није нађена статистички значајна разлика у преживљавању испитаника са и без „Bulky“ форме болести (Log Rank тест, p=0,438). У групи испитаника без“Bulky“форме болести, преживљавање после годину дана износило је 50,7%, после две године 47%, после три 43% и није се мењало до краја деведесетомесечног периода праћења. Jедногодишње преживљавање испитаника са „Bulky “ формом болести је било 54,6%, двогодишње 42%, трогодишње 33,6% колико је било и на крају периода праћења које је за ову групу испитаника износило 84 месеца, (графикон бр.46). 4.4.2. Преживљавање испитаника у односу на анализиране биохемијске параметре при дијагнози ДБКЛ Уочена је статистички значајна разлика у преживљавању испитаника са вредностима укупних протеина мањим и већим од 60g/l (Log Rank тест, p=0,002), (табела бр.17). Графикон бр. 45. Утицај екстранодалне локализације болести на преживљавање Графикон бр. 46. Утицај „Bulky“форме болести на преживљавање 69 Клиничка слика Време праћења (у годинама) Значајност Једна Две Три На крају периода праћења Укупни протеини <60g/l 36,4% 21,8% 21,8% 21,8% a p=0,002* >60g/l 61,6% 59,8% 51,2% 51,2% Албумини <30g/l 35,8% 25,6% 25,6% 25,6% a p=0,027* >30g/l 58,6% 53,5% 45,9% 45,9% AST <40IU/l 55,8% 49,8% 43,3% 43,3% a p=0,262 >40IU/l 38,1% 30,5% 30,5% 30,5% ALT <40IU/l 55,0% 47,6% 41,2% 41,2% a p=0,643 >40IU/l 41,7% 41,7% 41,7% 41,7% Gama GT <30IU/l 54,2% 49,8% 42,6% 42,6% a p=0,108 >30IU/l 43,2% 28,0% 22,4% 22,4% ALP <100U/l 51,7% 44,9% 37,3% 37,3% a p=0,643 >100U/l 45,5% 34,1% 34,1% 34,1% Acidum uricum <400umol/l 61,3% 51,4% 44,9% 44,9% a p=0,000* >400umol/l 10,5% 10,5% 5,3% 5,3% LDH <400U/l 70,3% 67,2% 57,4% 57,4% a p=0,001* >400U/l 38,5% 29,5% 27,3% 27,3% *статистички значајна разлика; aLog Rank тест Табела бр. 17. Преживљавање болесника и биохемијски параметри Преживљавање испитаника са вредностима укупних протеина мањим од 60g/l после годину дана износило је 36,4%, после две године 21,8% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци. Једногодишње преживљавање испитаника са укупним протеинима већим од 60g/l износило је 61,6%, двогодишње 59,8%, трогодишње 51,2% и није се мењало у периоду до 88 месеци колико су најдуже праћени испитаници из ове групе, (графикон бр.47). Преживљавање испитаника са вредностима албумина мањим и већим од 30g/l, статистички значајно се разликовало (Log Rank тест, p=0,027), болесници са већим вредностима албумина су дуже живели, (табела бр.17). У групи оболелих са вредностима албумина мањим од 30g/l, једногодишње преживљавање износило је 35,8%, двогодишње 25,6% и није се мењало до краја периода праћења у 70 трајању од 78 месеци. Код испитаника са албуминима већим од 30g/l, преживљавање после годину дана износило је 58,6%, после две године 53,5%, после три 45,9% и није се мењало у периоду до 90 месеци колико дуго су праћени оболели из ове групе, (графикон бр.48). Вредности мокраћне киселине веће од 400 umol/l биле су статистички значајно лош прогностички фактор за преживљавање испитаника оболелих од дифузног крупноћелијског лимфома (Log Rank тест, p=0,000), (табела бр.17). Преживљавање испитаника са вредностима овог параметра, мањим од 400 umol/l, после годину дана било је 61,3%, после две године 51,4%, после три године 44,9% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци. Једногодишње преживљавање испитаника са вредностима мокраћне киселине преко 400umol/l, било је 10,5%, колико је било и двогодишње, a трогодишње преживљавање у овој грпи оболелих било је 5,3%. Најдуже време праћења у овој групи испитаника било је 36 месеци, (графикон бр. 49). Статистички значајно краће преживљавање уочено је и код испитаника са вредностима LDH (лактат дехидрогеназa) већим од 400 U/l (Log Rank тест, p=0,001), (табела бр. 17). Једногодишње преживљавање испитаника са вредностима LDH мањим од 400 U/l било је до 70,3%, двогодишње 67,2%, трогодишње 57,4% колико је било и на крају периода праћења од 88 месеци. Преживљавање испитаника са вредностима LDH већим од 400 U/l, после годину дана износило је 38,5%, после две године 29,5%, после три године 27,3% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци, (графикон бр.50). Графикон бр. 47. Утицај укупних протеина у серуму на преживљавање Графикон бр. 48. Утицај албумина у серуму на преживљавање 71 Графикон бр.49. Утицај вредности аcidum uricum-а на преживљавање Графикон бр. 50. Утицај вредности LDH на преживљавање Није уочена статистички значајна разлика у преживљавању испитаника са вредностима AST (lat. Aspartat-aminotransferaza) мањим и већим од 40 IU/l (Log Rank тест, p=0,262), (табела бр.17). Преживљавање испитаника са вредностима AST мањим 72 од 40 IU/l, после годину дана износило је 55,8%, после две године 49,8%, после три 43,3% и на том нивоу је остало до краја периода праћења од 90 месеци. У групи оболелих са вредностима AST већим од 40 IU/l, једногодишње преживљавање износило је 38,1%, двогодишње 30,5%, и није се мењало до краја периода праћења од 84 месеца. Између испитаника са вредностима ALT мањим и већим од 40 IU/l није уочена статистички значајна разлика (Log Rank тест, p=0,643), (табела бр.17). Код испитаника са вредностима ALT мањим од 40 IU/l преживљавање после годину дана износило је 55%, после две године 47,6%, после три 41,2% и тако је било и после 90 месеци, колико су дуго испитаници праћени из ове групе. Једногодишње преживљавање испитаника са вредностима ALT већим од 40 IU/l износило је 41,7% и није се мењало до краја периода праћења од 78 месеци. На преживљавање испитаника нису утицале ни вредности гама-GT (Log Rank тест, p=0,108), (табела бр.17). У групи оболелих са вредностима гама-GT мањим од 30 IU/l, једногодишње преживљавање износило је 54.2%, двогодишње 44,9%, трогодишње 37,3% и на том нивоу је остало до краја периода праћења од 88 месеци. Преживљавање испитаника са вредностима гама-GT већим од 30 IU/l после годину дана износило је 43,2%, после две године 28%, после три 22,4% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци. Вредности ALP нису статистички значајно утицале на преживљавање посматраних испитаника (Log Rank тест, p=0,643), (табела бр. 17). Једногодишње преживљавање испитаника са вредностима ALP мањим од 100 U/l било је 51,7%, двогодишње 44,9%, трогодишње 37,3% колико je било и на крају деведесетомесечног периода праћења. У групи са вредностима ALP већим од 100 U/l, преживљавање после годину дана износило је 45,5%, после две године 34,1% и није се мењало до краја периода праћења од 84 месеца. 4.4.3. Анализа повезаности генског полиморфизама, IPI ризика и преживљавања у испитаника са ДБКЛ Није уочена статистички значајна разлика у генском полиморфизму FISH bcl-2 (χ 2 тест, p=0,492) и FISH c-myc (χ 2 тест, p=0,426) у односу на IPI ризик, (табела бр.18). 73 Генски полиморфизам ИПИ ризик Значајност Низак Висок FISH bcl-2 n (%) Негативан 16 (61,5%) 19 (52,8%) a p=0,492 Позитиван 10 (38,5%) 17 (47,2%) FISH c-myc n (%) Негативан 14 (53,8%) 23 (63,9%) a p=0,426 Позитиван 12 (46,2%) 13 (36,1%) FISHbcl2+FISHcmyc n (%) Оба позитивна 6 (23,1%) 7 (19,4%) a p=0,884 Бар један позитиван 10 (38,5%) 13 (36,1%) Оба негативна 10 (38,5%) 16 (44,4%) статистички значајна разлика; aχ 2-тест; Табела бр.18. Генски полиморфизам утвђен FISH-ом у болесника различитог IPI ризика И у групи испитаника са високим и у групи испитаника са ниским ризиком нешто мање од половине испитаника имало је позитиван налаз и за FISH bcl-2 и FISH c-myc. Код FISH bcl-2 полиморфизма запажамо нешто већу учесталост испитаника са позитивним налазом за овај ген у групи болесника са високим IPI ризиком, (графикон бр. 51). Графикон бр. 51. Учесталост FISH/bcl-2 у болесника са IPI високим vs ниским IPI ризиком Испитаници са позитивним налазом за FISH с-myc у нешто већем броју били су заступљени у групи са нижим IPI ризиком, (графикон бр.52). 74 Графикон бр. 52. Учесталост FISH/c-myc у болесника са ниским vs високим IPI ризиком Није уочена статистички значајна разлика у преживљавању испитаника са FISH bcl-2 позитивним и FISH bcl-2 негативним налазом (Log Rank тест, p=0,260), (табела бр. 19). FISH bcl-2 позитивних испитаника било је 27. FISH и ИХХ Време праћења (у годинама) Значајност Jедна Две Tри На крају периода праћења FISHbcl-2 n (%) Негативан 65,3% 58,6% 47,4% 47,4% a p=0,260 Позитива н 51,0% 42,8% 38,5% 38,5% FISHc-myc n (%) Негативан 58,5% 51,4% 44,0% 44,0% a p=0,900 Позитива н 60,0% 52,0% 42,5% 42,5% FISHbcl2+ FISH cmyc n (%) Оба + 53,8% 38,5% 30,8% 30,8% a p=0,431 Бар један + 56,7% 56,7% 51,5% 51,5% Оба - 64,9% 53,6% 41,7% 41,7% Bcl2/ИХХ n (%) Негативан 67,6% 60,8% 60,8% 60,8% a p=0,011* Позитива н 44,0% 37,7% 28,2% 28,2% Bcl6/ИХХ n (%) Негативан 58,4% 48,3% 40,1% 40,1% a p=0,610 Позитива н 41,5% 41,5% 41,5% 41,5% Ki67 n (%) <50% 53,6% 49,5% 40,8% 40,8% a p=0,524 >50% 48,5% 38,7% 38,7% 38,7% Табела бр. 19. Анализа преживљавања болесника у односу на генски полиморфизам и пролиферативни индекс 75 Једногодишње преживљавање испитаника са негативним FISH bcl-2 било је 65,3%, двогодишње 58,6%, трогодишње 47,4% и није се мењало до краја осамдесетомесечног периода праћења. Медијана преживљавања за FISH bcl-2 негативне испитанике износила је 33 месеца. У групи оболелих са позитивним налазом FISH bcl-2, преживљавање после годину дана било је 51%, после две године 42,8%, после три 38,5% и тако је остало до краја седамдесет девето месечног периода праћења, (графикон бр.53). Код испитаника са FISH bcl-2 позитивним налазом медијана преживљавања износила је 14 месеци (95%CI 3,62-46,38). Графикон бр. 53.Утицај FISH bcl-2 полиморфизма на преживљавање Анализом преживљавања испитаника са различитим налазом FISH bcl-2 у односу на IPI висок и низак, није утврђена статистички значајна разлика ни у групи са ниским (Log Rank тест, p=0,522), нити у групи са високим IPI ризиком (Log Rank тест, p=0,051). У групи са ниским IPI ризиком, преживљавање испитаника са позитивним FISH bcl-2, после годину дана било је 90%, после две године 80% и није се мењало до краја периода праћења oд седамдесет девет месеци. Једногодишње преживљавање испитаника са негативним налазом FISH bcl-2 и ниским IPI ризиком било је 81,3% колико је било и двогодишње, а трогодишње преживљавање 66,2% и није се мењало до 76 краја периода праћења од 88 месеци, (графикон бр.54). У подгрупи испитаника са високим IPI ризиком и FISH bcl-2 негативним налазом, преживљавање после годину дана било је 51%, после две године 36,5%, после три године 29,2% и није се мењало до краја периода праћења од осамдесет осам месеци. Једногодишње преживљавање оболелих са високим IPI ризиком и позитивним налазом FISH bcl-2 било је 26,5%, двогодишње 19,9%, трогодишње 9,9% и није се мењало до краја седамдесет деветомесечног периода праћења, (графикон бр. 55). Графикон бр. 54. Утицај резултата FISH анализе bcl-2 (+/-) на преживљавање код ниског IPI ризика Графиконбр. 55. Утицај резултата FISH анализе bcl-2 (+/-) на преживљавање код високог IPI ризика 77 Статистички значајна разлика у преживљавању ових болесника, није уочена ни у односу на FISH с-myc налаз (Log Rank тест, p=0,900), (табела бр.19). Позитивних FISH с-myc испитаника било је 25. Једногодишње преживљавање испитаника са негативним налазом било је 58,5%, двогодишње 51,4%, трогодишње 44% колико је било и после 84 месеца праћења. Медијана преживљавања за ову групу испитаника била је 25 месеци (95%CI 3,15-46,85). У групи са позитивним FISH с-myc налазом, преживљавање после годину дана било је 60%, после две године 52%, после три 42,5% колико је било и после 88 месеци праћења, (графикон бр.56). У групи FISH с-myc позитивних медијана преживљавања износила је 33 месеца (95%CI 0,50-65,50). Графикон бр. 56. Утицај резултата FISH анализе с-myc (+/-) на преживљавање Посматрано у односу на IPI ризик и налаз FISH с-myc-а, статистички значајне разлике у преживљавању између оболелих, са позитивним и негативним налазом за овај ген није уочена ни у групи са ниским (Log Rank тест, p=0,798), ни у групи са високим IPI ризиком (Log Rank тест, p=0,336). Једногодишње и двогодишње преживљавање испитаника са ниским IPI ризиком и негативним FISH с-myc налазом било је 78,6%, трогодишње је износило 70,7% и није се мењало до краја 84 месеца праћења. У групи оболелих са ниским IPI ризиком и позитивним FISH с-myc налазом преживљавање после годину дана било је 91,7%, после две године 83,3%, после три 72,9% и толико је било и на крају осамдесет осмо месечног периода праћења, (графикон бр. 57). Код испитаника са високим IPI ризиком и негативним налазом на 78 FISH с-myc, преживљавање после годину дана износило је 45,4%, после две године 30,2%, после три године 22,7% а толико је било и после 79 месеци праћења. Једногодишње преживљавање испитаника са високим IPI ризиком и позитивним налазом на FISH с-myc било је 30,89%, двогодишње 23,1%, трогодишње 15,4% и толико је било после 88 месеци праћења, (графикон бр.58). Графикон бр.57. Утицај резултата FISH с-myc (+/-) на преживљавање код ниског IPI ризика Графикон бр.58. Утицај резултата FISH с-myc (+/-) на преживљавање код високог IPI ризика 79 Анализом испитаника са оба позитивна генска полиморфизма (bcl-2 и с-myc) FISH анализом, са бар једним позитивним и са оба негативна налаза, није уочена статистички значајна разлика (Log Rank тест, p=0,431), (табела бр.19). Оба позитивна налаза и FISH bcl-2 и FISH с-myc имало је 13 испитаника. У групи испитаника са оба позитивна генска полиморфизма bcl-2 и с-myc, преживљавање после годину дана било је 53,8%, после две године 38,5%, после три 30,8% и толико је остало и на крају периода праћења од 78 месеци. Медијана преживљавања испитаника са оба позитивна налаза, била је 14 месеци (95%CI 0-35,14). Једногодишње и двогодишње преживљавање испитаника са позитивним или FISH bcl-2 или FISH с-myc, било је 56,7%, трогодишње 51,5% колико је било и на крају периода праћења од 88 месеци. У овој групи испитаника медијана преживљавања није постигнута. Код испитаника са оба негативна налаза и FISH bcl2 и FISH с-myc, преживљавање после годину дана је износило 64,9%, после две године 53,6%, после три 41,7% и није се мењало до краја праћења од 84 месеца, (графикон бр. 59). Медијана преживљавања испитаника са оба негативна налаза била је 25 месеци (95%CI 7,63- 42,37). Графикон бр.59. Утицај резултата FISH с-myc и bсl-2 на преживљавање Статистички значајан утицај позитивног налаза на оба генска полиморфизма bcl-2 и с-myc утврђених FISH-ом на преживљавање није уочен ни код испитаника са ниским ризиком (Log Rank тест, p=0,264) ни код испитаника са високим IPI ризиком (Log Rank тест, p=0,121). 80 У групи испитаника са оба позитивна полиморфизма bcl-2 и с-myc и ниским IPI ризиком, једногодишње преживљавање било је 83,3%, двогодишње 66,7% и није се мењало до краја 78-месечног периода праћења. Преживљавање испитаника са ниским IPI ризиком и негативним налазом на оба напред наведена генска полиморфизма, после годину дана и после две године износило је 70%, после три године 58,3% колико је било и после 84 месеца праћења. Једногодишње и двогодишње преживљавање испитаника са ниским IPI ризиком и бар једним позитивним полиморфизмом анализираних гена FISH–ом, било је 100%, трогодишње 87,5% и није се мењало до краја периода праћења од 88 месеци, (графикон бр. 60). Код испитаника са високим IPI ризиком и позитивним полиморфизмом bcl-2 и с-myc утврђених FISH-ом, преживљавање после годину дана износило је 28,6%, после две године 14,3%, док нико од оболелих из ове групе није живео дуже од три године. Једногодишње преживљавање испитаника са оба негативна налаза на FISH-у и високим IPI ризиком било је 60,6%, двогодишње 36,3%, трогодишње 24,2% колико је било и после 54 месеца праћења. У групи са високим ризиком и са бар једним позитивним полиморфизмом (bcl-2 или с-myc) утврђених FISH – ом, преживљавање после годину дана било је 27,8% и није се мењало до краја периода праћења од 88 месеци, (графикон бр.61). Графикон бр.60. Утицај резултата FISH с-myc+FISH bcl-2 на преживљавање код ниског IPI ризика 81 Графикон бр.61. Утицај резултата FISH с-myc + FISH bcl-2 на преживљавање код високог IPI ризика Између испитаника са позитивним и негативним налазом имунохистохемијске анализе за bcl-2, уочена је статистички значајна разлика у преживљавању (Log Rank тест, p=0,011), (табела бр.19). Bcl-2 ИХХ позитивних испитаника било је 58 односно 56,2%. Позитиван налаз на bcl-2 имунохистохемијски, представља лош прогностички знак, (графикон бр.62). Графикон бр. 62. Утицај резултата bcl-2/ ИХХ на преживљавање 82 Једногодишње преживљавање испитаника са негативним налазом било је 67,6%, двогодишње 60,8% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци и код ових испитаника није постигнута медијана преживљавања, обзиром да је током посматраног периода праћења више од половине испитаника преживело. У групи са позитивним налазом, преживљавање после годину дана било је 44%, после две године 37,7%, после три 28,2% колико је било и на крају периода праћења од 88 месеци. Медијана преживљавања испитаника bcl-2/ ИХХ позитивних била је 10 месеци (95%CI 6,89-13,11 месеци). Није уочен статистички значајан утицај позитивног налаза анализе bcl-6/ ИХХ на преживљавање испитаника оболелих од ДБКЛ (Log Rank тест, p=0,610), (табела бр.19). Једногодишње преживљавање испитаника са негативним налазом је било 58,4%, двогодишње 48,3%, трогодишње 40,1% и није се мењало до краја деведесето месечног периода праћења. Код испитаника са позитивним налазом преживљавање после годину дана износило је 41,5% и није се мењало до краја 84 месеца праћења, (графикон бр. 63). На преживљавање испитаника оболелих од ДБКЛ, вредности Ki-67%, нису статистички значајно утицале (Log Rank тест, p=0,524), (табела бр.19). Kод испитаника са вредностима Ki-67% мањим од 50%, jедногодишње преживљавање било је 53,6%, двогодишње 49,5%, трогодишње 40,8% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци. У групи оболелих са вередностима Ki-67% већим од 50%, преживљавање после годину дана било је 48,5%, двогодишње 38,7% и није било промене до краја периода праћења од 88 месеци, (графикон бр. 64). Графикон бр. 63. Утицај резултата bcl-6/ИХХ на преживљавање 83 Графикон бр. 64. Утицај резултата Ki-67%/ ИХХ на преживљавање 4.4.4. Анализа терапијског одговора и преживљавања Учесталост болесника са комплетном ремисијом статистички значајно се разликовао између испитаника са смртним исходом и преживелих (χ2 тест, p=0,000), (табела бр.20). Одговор на терапију Исход значајност мртви живи Kомплетна ремисија n (%) нe 45 (88,2%) 5 (13,2%) b p=0,000* дa 6 (11,8%) 33 (86,8%) Парцијална ремисија n (%) нe 48 (92,3%) 37 (97,4%) b p=0,301 дa 4 (7,7%) 1 (2,6%) Рефрактерност на терапију n (%) нe 11 (21,2%) 37 (97,4%) b p=0,000* дa 41 (78,8%) 1 (2,6%) Радио терапија n (%) нe 46 (88,5%) 33 (86,8%) b p=0,817 дa 6 (11,5%) 5 (13,2%) *статистички значајна разлика; bχ 2-тест; Табела бр.20. Одговор на терапију између оболелих са различитим исходом 84 Комплетна ремисија постигнута је код 86,8% преживелих испитаника а код 11,8% испитаника са смртним исходом, (графикон бр. 65). Између анализираних група испитаника није уочена статистички значајна разлика у учесталости испитаника са парцијалном ремисијом (χ2 тест, p=0,301), (табела бр.20). У обе групе, испитаника парцијалну ремисију имало је мање од 10% испитаника, (графикон бр.66). Између анализираних група испитаника уочена је статистички значајна разлика у појави рефрактерности на терапију (χ2 тест, p=0,000), (табела бр.20). Испитаници са смртним исходом значајно су чешће били рефрактерни на терапију. 78,8% испитаника са смртним исходом било је рефрактерно на терапију прве линије и свега 2,6% у групи преживелих, (графикон бр. 67). Графикон бр.65. Учесталост комплетне ремисије након примене прве терапијске линије у болесника са различитим исходом Графикон бр. 66. Парцијална ремисија болести након примене прве терапијске линије у болесника са различитим исходом 85 Графикон бр. 67. Учесталост рефрактерности на прву терапијску линију у болесника различитог исхода Између испитаника оболелих од ДБКЛ са различитим исходом било је оних који су поред имунохемиотерапије третирани и локалном зрачном терапијом. Статистичком анализом болесника са различитим исходом, није уочена значајна разлика у заступљености испитаника код којих је спровођена зрачна терапија (χ2 тест, p=0,817), (табела бр.20). У групи са смртним исходом РТ је имало 11,5% испитаника, a у групи преживелих 13,2%, (графикон бр.68). Графикон бр. 68. Заступљеност комбинације (зрачна терапија + имунохемиотерапија) у оболелих различитог исхода Између испитаника код којих је постигнута комплетна ремисија и оних код којих то није, уочена је статистички значајна разлика у преживљавању (Log Rank тест, p=0,000), (табела бр.21). 86 Одговор на терапију Време праћења (у годинама) Значајност Jедна Две Три На крају периода праћења Kомплетна ремисија нe 22,8% 12,4% 7,8% 7,8% a p=0,000* дa 89,7% 89,7% 83,2% 83,2% Парцијална ремисија не 51,3% 45,8% 41,3% 41,3% a p=0,637 да 60,0% 40,0% 20,0% 20,0% Рефрактерност на терапију не 85,3% 83,1% 75,4% 75,4% a p=0,000* да 12,4% 0,025% 0,0% 0,0% Радио терапија не 47,5% 43,2% 39,8% 39,8% ap=0,396 да 81,8% 63,6% 45,5% 45,5% Хирушка терапија n (%) Не 50,1% 43,5% 39,9% 39,9% a p=0,758 Да 56,5% 51,4% 40,0% 40,0% статистички значајна разлика; aLog Rank тест Табела бр.21. Упоредна анализа преживљавање болесника са различитим одговором на терапију, адјувантном РТ и хирушком терапијом Код испитаника без комплетне ремисије преживљавање после годину дана, износило је 22,8%, после две 12,4%, после три 7,8% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци. У групи са комплетном ремисијом, једногодишње преживљавање износило је 89,7%, колико је било и двогодишње. Трогодишње преживљавање за ову групу износило је 83,2% и није се мењало до краја периода праћења који је износио 88 месеци, (графикон бр. 69). Није уочена статистички значајна разлика у преживљавању испитаника са и без парцијалне ремисије (Log Rank тест, p=0,637), (табела бр. 21). Једногодишње преживљавање испитаника без комплетне ремисије износило је 51,3%, двогодишње 45,8%, трогодишње 41,3% и нa том нивоу је остало до краја деведесетомесечног праћења. Преживљавање после годину дана код испитаника са парцијалном ремисијом било је 60%, после две године 40%, после три 20% и није се мењало до краја шестогодишњег периода праћења, (графикон бр.70). Испитаници рефрактерни на терапију имали су статистички значајно краће преживљавање од 87 испитаника који су имали било какав одговор на примењено лечење (Log Rank тест, p=0,000), (табела бр. 21). Код испитаника који нису били рефрактерни на терапију, једногодишње преживљавање износило је 85,3%, двогодишње 83,1%, трогодишње 75,4% и није се мењало до краја деведесетомесечног периода праћења. Код испитаника рефрактерних на терапију преживљавање после годину дана имало је 12,4%, после две године 0,025% док нико из ове групе испитаника није живео дуже од 33 месеца, (графикон бр. 71). Графикон бр.69. Утицај комплетне ремисије на преживљавање Графикон бр. 70. Утицај постигнуте парцијалне ремисије након примене прве терапијске линије на преживљавање Графикон бр. 71. Преживљавање у болесника који су рефрактерни на прву терапијску линију рефрактерни на прву терапијску линију 88 Није уочен статистички значајан утицај примене зрачне терапије на преживљавање испитаника (Log Rank тест, p=0,396), (табела бр. 21). Код испитаника без радиотерапије, једногодишње преживљавање износило је 47,5%, двогодишње 43,2%, трогодишње 39,8% и није се мењало до краја периода праћења које је износило 90 месеци. У групи са радиотерапијом, преживљавање после годину дана износило је 81,8%, после две године 63,6%, после три 45,5% и тако је остало до краја периода праћења од 88 месеци, (графикон бр. 72). Није уочена статистички значајна разика између испитаника са и без хирушке интервенције (Log Rank тест, p=0,758), (табела бр. 21). У групи без хирушке интервенције једногодишње преживљавање износило је 50,1%, двогодишње 43,5%, трогодишње 39,9%, колико је било и на крају деведесетомесечног периода праћења, (графикон бр.73). Графикон бр. 72. Утицај комбинације (имунохемиотерапија + радиотерапија) на преживљавање болесника Графикон бр.73. Утицај комбинације (хирушка интервенција + имунохемиотерапија) на преживљавање 89 4.5. COX-ова регресиона анализа преживљавања Сox-овом униваријантном регресионом анализом, испитиван је утицај свих фактора на преживљавање. Овом анализом издвојени су статистички значајни фактори, који су даље тестирани Cox-овом мултиваријантном анализом, ради издвајања фактора са независним дејством на преживљавање. Униваријантном Cox-овом анализом израчунаван је и релативни ризик (exp (B)) који нам показује колико пута су испитаници код којих је присутан патолошки налаз, посматраног фактора, под већим ризиком за лошије преживљавање, односно под ризиком за лошију прогнозу и већим ризиком за нежељеним исходом. Старост, IPI, LDH, ECOG перформанс статус, комплетна ремисија, рефрактерност на терапију, број леукоцита, вредност хемоглобина, укупни протеини, албумини, АSТ, гама-GT, алкална фосфатаза, мокраћна киселина, bcl-2 одређен имунохистохемијски, В симптоми болести, постојање температуре, губитак у телесној тежини, презнојавање, CRP, D- димер и гвожђе у серуму су фактори који су се издвојили као статистички значајни, униваријантном Cox-овом регресионом анализом. Ови фактори ушли су у мултиваријантну Cox-ову анализу којом су се као предиктори преживљавања показали: ECOG, комплетна ремисија, рефрактерност на терапију, bcl2/ИХХ и CRP. Мултиваријантном Cox-овом анализом издвојени су независни фактори, који су од утицаја су на преживљавање, без обзира на присуство других фактора. Релативни ризик добијен мултиваријантном анализом показује колико су пута испитаници са већим ECOG статусом, без комплетне ремисије, рефрактерни на терапију, са bcl2/ИХХ налазом позитивним и са већим вредностима CRP-a под већим ризиком од смртног исхода (табела бр. 22) и (табела бр.23). 90 Посматрани фактори ризика Униваријантна Мултиваријантна # expB (95%CI) Значајност expB (95%CI) Значајност Старост 1,052 (1,027-1,077) p=0,000* 1,042 (0,998-1,088) p=0,059 Пол 0,754 (0,434-1,308) p=0,315 / / Ризик IPI 2,283 (1,537-3,390) p=0,000* 0,959 (0,458-2,008) p=0,911 LDH 2,557 (1,396-4,681) p=0,002* 1,000 (0,999-1,000) p=0,108 ECOG 1,811 (1,451-2,261) p=0,000* 1,620 (1,044-2,514) p=0,031* CS 1,313 (0,959-1,798) p=0,089 / / Екстранодалне локализације 1,592 (0,872-2,906) p=0,130 / / Bulky 1,253 (0,699-2,245) p=0,449 / / CR 0,071 (0,030-0,171) p=0,000* 0,130 (0,024-0,696) p=0,017* PR 1,271 (0,458-3,530) p=0,645 / / Рефрактерност на терапију 14,939 (7,027-31,759) p=0,000* 4,946 (1,170-20,901) p=0,030* Радиотерапија 0,697 (0,297-1,636) p=0,407 / / Леукоцити 1,052 (1,000-1,107) p=0,050* 1,426 (0,802-2,537) p=0,227 Неутрофили 1,051 (0,969-1,140) p=0,232 / / Лимфоцити 1,073 (0,903-1,275) p=0,423 / / Моноцити 1,085 (0,952-1,238) p=0,223 / / Еритроцити 0,668 (0,415-1,074) p=0,096 / / Хемоглобин 0,974 (0,961-0,986) p=0,000* 0,991 (0,960-1,023) p=0,574 MCV 0,989 (0,939-1,042) p=0,678 / / Тромбоцити 1,000 (0,998-1,002) p=0,978 / / Укупни протеини 0,432 (0,247-0,758) p=0,003* 1,004 (0,914-1,102) p=0,937 Aлбумини 0,522 (0,287-0,948) p=0,033* 1,044 (0,916-1,190) p=0,521 AST 1,014 (1,002-1,025) p=0,021* 1,002 (0,967-1,037) p=0,933 ALT 1,192 (0,558-2,544) p=0,650 / / Gama-GT 1,003 (1,000-1,007) p=0,037* 1,002 (0,994-1,010) p=0,625 ALP 1,005 (1,002-1,008) p=0,004* 1,004 (0,998-1,010) p=0,241 Acidum urikum 3,223 (1,775-5,851) p=0,000* 1,000 (0,998-1,003) p=0,808 Седиментација(СЕ) 1,999 (0,852-4,689) p=0,111 / / Фибриноген 1,491 (0,847-2,624) p=0,166 / / bcl2/FISH 1,470 (0,741-2,913) p=0,270 / / сmyc/FISH 1,045 (0,522-2,090) p=0,901 / / bcl2/ИХХ 2,231 (1,163-4,279) p=0,016* 2,885 (1,051-7,920) p=0,041* bcl6/ИХХ 1,155 (0,656-2,031) p=0,618 / / Ki67% 1,195 (0,683-2,089) p=0,533 / / *статистички значајно; #релативан ризик Табела бр. 22. Уни- и мултиваријантна Cox-ова регресија анализе утицаја посматраних фактора на преживљавање 91 Посматрани ризик Фактори ризика Униваријантна Мултиваријантна # expB (95%CI) Значајност #expB (95%CI) Значајнос т Хирушка терапија 0,908 (0,484-1,702) p=0,763 / / Присутни симптоми (A/B) 2,425 (1,334-4,409) p=0,004* 2,619 (0,255-4,409) p=0,418 Температура 2,246 (1,245-4,052) p=0,007* 1,240 (0,380-4,041) p=0,721 Губитак у телесној тежини 2,215 (1,259-3,898) p=0,006* 0,576 (0,121-2,739) p=0,488 Презнојавање 2,464 (1,407-4,314) p=0,002* 1,240 (0,380-4,041) p=0,721 CRP 2,675 (1,299-5,510) p=0,008* 1,008 (1,000-1,015) p=0,038* D-димер 3,454 (1,716-6,951) p=0,001* 1,000 (1,000-1,001) p=0,086 Гвожђе у серуму 0,500 (0,277-0,904) p=0,022* 0,989 (0,911-1,073) p=0,787 *статистички значајно; #релативан ризик Табела бр. 23. Уни и мултиваријантна Cox-ова регресија анализе утицаја посматраних фактора на преживљавање 92 4.6. Генски полиморфизам и одговор на терапију: комплетна ремисија Није уочена статистички значајна разлика у учесталости испитаника са комплетном ремисијом између испитаника са различитим генским полиморфизмом FISH bcl-2 и FISH c-myc, (табела бр. 24). Између испитаника са и без комплетне ремисије није уочена статистички значајна разлика у учесталости оболелих са присутним FISH bcl-2 генским полиморфизмом (χ 2 тест, p=0,585), (табела бр.24) Параметри генске анализе Kомплетна ремисија Значајност нe дa FISHbcl2 n (%) Негативан 17 (53,1%) 18 (60,0%) a p=0,585 Позитиван 15 (46,9%) 12 (40,0%) FISHcmyc n (%) Негативан 18 (56,3%) 19 (63,3%) a p=0,570 Позитиван 14 (43,8%) 11 (36,7%) FISH(bcl2+cmyc) n (%) Oба позитивна 7 (21,9%) 6 (20,0%) a p=0,600 Oба негативна 10 (31,3%) 13 (43,3%) Бар један позитиван 15 (46,9%) 11 (36,7%) FISH(bcl2+cmyc) n (%) Оба позитивна 7 (21,9%) 6 (20,0%) a p=0,704 Оба негативна 10 (31,3%) 13 (43,3%) само FISHbcl2+ 10 (31,3%) 6 (20,0%) само FISHcmyc+ 5 (15,6%) 5 (16,7%) статистички значајна разлика;aχ 2-тест; Табела бр. 24. Генски полиморфизам и комплетна ремисија Графикон бр. 74. Учесталост FISH bcl-2 позитивности у болесника са различитим исходом а постигнутом комплетном ремисијом 93 У групи са постигнутом комплетном ремисијом и у групи болесника без комплетне ремисије, нешто мање од половине испитаника било је FISH bcl-2 позитивно, (графикон бр.74). Појава комплетне ремисије није се статистички значајно разликовала између испитаника FISH с-myc позитивних и негативних (χ 2 тест, p=0,570), (табела бр. 24). У обе посматране групе испитаника са и без комплетне ремисије позитиван FISH с-myc имало је око 40% испитаника, (графикон 75). Графикон бр. 75. Учесталост FISH с-myc позитивности у болесника са постигнутом комплетном ремисијом Учесталост испитаника са присутна оба полиморфизма FISH bcl-2 и FISH с- myc, са присутним бар једним полиморфизмом и са оба негативна FISH bcl-2 и FISH с- myc налаза, није се статистички значајно разликовао посматрано у односу на постизање комплетне ремисије (χ 2 тест, p=0,600), (табела бр. 24). Оба полиморфизма имало је око 20% испитаника у групи са и без комплетне ремисије, нешто више испитаника са бар једним полиморфизмом било је заступљено у групи са комплетном ремисијом, док су испитаници и са FISH bcl-2 и FISH с-myc негативним налазом били нешто више заступљени у групи са комплетном ремисијом 43,3%, него у групи без комплетне ремисије 31,3%, (графикон бр. 76). Посматрано у односу на постизање комплетне ремисије, статистички значајна разлика није уочена ни у заступљености испитаника са оба позитивна FISH bcl-2 и FISH с-myc налаза, са оба негативна налаза, са присутним само FISH bcl-2 позитивним налазом и са присутним само FISH с-myc позитивним налазом (χ 2 тест, p=0,704), (табела бр. 24). Нешто већа учесталост само FISH bcl-2 позитивних испитаника 31,3% уочена је код испитаника без постигнуте комплетне ремисије, него у испитаника са комплетном ремисијом 20%, (графикон бр.77). 94 Графикон бр. 76. Учесталост FISH bcl-2 + FISH с-myc у болесника са комплетном ремисијом Графикон бр. 77. Учесталост удружена и појединачна FISH bcl-2 и FISH с-myc у болесника са и без комплетне ремисије 4.6.1. Сензитивност и специфичност генског полиморфизма у предикцији постизања комплетне ремисије Анализа посматраних генских полиморфизама имала је за циљ одређивање сензитивности и специфичности сваког параметра, како би се одредила њихова валидност при процени ризика одговора на примењену терапију у смислу постизања 95 комплетне ремисије, парцијалне ремисије или могуће појаве рефрактерности на терапију. За сваки од ових полиморфизама FISH bcl-2 и FISH с-myc, као и за комбинацију оба одређивана је сензитивност и специфичност, (табела бр. 25). Генски полиморфизми Сензитивност Специфичност Површина испод ROC криве (95% CI) (AUC)* FISH/bcl2 0,469 0,600 0,534 (0,390-0,679) FISH/c-myc 0,438 0,633 0,535 (0,391-0,680) FISH/bcl-2+FISH/c-myc 0,462 0,510 0,491 (0,346-0,635) *AUC-Area under the Curve Табела бр. 25. Валидност посматраних генских полиморфизама и постизање комплетне ремисије Сензитивност у нашем случају представља вероватноћу непостизања комплетне ремисије код испитаника са присутним генским полиморфизмом. Она нам служи као показатељ могућности рађене имунохистохемије да открије испитанике са комплетном ремисијом на примењену терапију.У нашем случају сензитивност забележена код присутна оба полиморфизма као и сензтивност позитивног FISH bcl-2 или FISH с-myc налаза, била је приближно иста и износила је око 45%, (табела бр. 25). Специфичност теста овде представља вероватноћу постизања комплетне ремисије у групи испитаника без присутног генског полиморфизма. Иначе она је добра као показатељ могућности параметара да издвоји испитанике код којих је вероватна комплетна ремисија. Код свих посматраних параметара специфичност је била релативно мала, што значи да одсуство посматраних фактора ризика не значи и појаву комплетне ремисије. Специфичност је била приближно иста и код присутног и FISH bcl-2 и FISH с-myc генског полиморфизма и износила је око 60%, док је била најмања код присутна оба генска полиморфизма, ( графикон бр. 78). 96 Графикон бр.78. ROC криве – комплетна ремисија 4.7. Генски полиморфизам и одговор на терапију: парцијални одговор Парцијални одговор на примењену терапију имало је 4 испитаника. Није уочена статистички значајна разлика у учесталости испитаника са парцијалним одговором између испитаника са негативним и позитивним FISH bcl-2 и FISH с-myc, (табела бр. 26). Учесталост оболелих са присутним FISH bcl-2 генским полиморфизмом, између испитаника са и без парцијалне ремисије, није се статистички значајно разликовала (χ 2 тест, p=0,439), (табела бр. 26). У групи испитаника са постигнутим само парцијалним одговором FISH bcl-2 позитивних било је 25%, док је код осталих испитаника FISH bcl-2 позитивних испитаника било 44,8%, (графикон бр. 79). 97 Генски полиморфизам Парцијални одговор Значајност нe дa FISHbcl-2 n (%) Негативан 32 (55,2%) 3 (75,0%) a p=0,439 Позитиван 26 (44,8%) 1 (25,0%) FISHc-myc n (%) Негативан 35 (60,3%) 2 (50,0%) a p=0,683 Позитиван 23 (39,7%) 2 (50,0%) FISH(bcl-2+c-myc) n (%) Oба позитивна 12 (20,7%) 1 (25,0%) a p=0,772 Oба негативна 21 (36,2%) 2 (50,0%) Бар један позитиван 25 (43,1%) 1 (25,0%) FISH(bcl-2+c-myc) n (%) Оба позитивна 12 (20,7%) 1 (25,0%) a p=0,822 Oба негативна 21 (36,2%) 2 (50,0%) Само FISHbcl2+ 15 (25,9%) 1 (25,0%) Само FISHcmyc+ 10 (17,2%) 0 (0%) *статистички значајна разлика;aχ 2-тест; Табела бр. 26. Генски полиморфизам на FISH-у и парцијални одговор Графикон бр. 79. Учесталост FISH bcl-2 у испитаника са парцијалним одговором 98 Између испитаника FISH с-myc позитивних и негативних није уочена статистички значајна разлика у појави парцијалног одговора (χ 2 тест, p=0,683), (табела бр. 26). У групи са парцијалним одговором на примењену терапију половина испитаника било је FISH с-myc позитивна док је у групи преосталих испитаника, FISH с-myc позитивно било њих 40%, (графикон бр. 80). Графикон бр.80. Учесталост FISH с-myc у испитаника са парцијалним одговором Учесталост испитаника са присутна оба полиморфизма FISH bcl-2 и FISH с- myc, са присутним бар једним полиморфизмом и са оба негативна FISH bcl-2 и с-myc налаза, није се статистички значајно разликовала посматрано у односу на постизање само парцијалног одговора на примењену терапију (χ 2 тест,p=0,772), (табела бр. 26). Графикон бр.81. Учесталост FISH с-myc и FISH bcl-2 у испитаника са парцијалним одговором Оба полиморфизма имало је око 25% испитаника из групе са парцијалним одговором, половина испитаника из ове групе било је са FISH bcl-2 и FISH с-myc 99 негативним налазом, а само један полиморфизам имало је 25% испитаника. У преосталој групи испитаника, највише је било оболелих са бар једним полиморфизмом 43,1%, најмање испитаника имало је оба полиморфизма 20,7%, а бар један полиморфизам имала је трећина оболелих из ове групе, ( графикон бр. 81). Посматрано у односу на постизање парцијалног одговора, статистички значајна разлика није уочена, статистички значајна разлика није уочена ни у заступљености испитаника са оба позитивна FISH bcl-2 и FISH с-myc налаза, са оба негативна налаза, са присутним само FISH bcl-2 позитивним налазом и са присутним само FISH с-myc позтивним налазом (χ2 тест, p=0,822), (табела бр. 26). У групи са парцијалним одговором није било испитаника који су само FISH с-myc позитивни, (графикон бр. 82). Графикон бр.82. Учесталост удружене и појединачне позитивности за FISH с-myc и FISH bcl-2 у испитаника са парцијалним одговором 4.7.1. Сензитиност и специфичност генског полиморфизма у предикцији постизања парцијалног одговора За сваки од ових полиморфизама FISH bcl-2 и FISH с-myc, као и за комбинацију оба одређивана је сензитивност и специфичност, (табела бр. 27). 100 Генски полиморфизми Сензитивност Специфичност Површина испод ROC криве (95% CI) (AUC)* FISH/bcl-2 0,250 0,552 0,401 (0,128-0,674) FISH/c-myc 0,500 0,603 0,552 (0,256-0,848) FISH(bcl-2+c-myc) 0,781 0,207 0,478 (0,178-0,779) AUC-Area under the Curve Табела бр. 27. Валидност посматраних генских полиморфизама и постизање само парцијалног одговора Добијене вредности сензитивности и специфичности указују нам на малу валидност посматраних генских полиморфизама у предвиђању појаве парцијалног одговора на примењену терапију, што је делимично и последица чињенице да је само четри испитаника, из посматране групе оболелих од лимфома а са пратећим генским полиморфизмом, имало парцијални одговор на примењену терапију, (графикон бр. 83). Графикон бр. 83. ROC крива – парцијални одговор 101 4.8. Генски полиморфизам и одговор на терапију: рефрактерност на терапију Није уочена статистички значајна разлика у учесталости оболелих, а рефрактерних на терапију, у односу на негативан и позитиван налаз за bcl-2 и с-myc анализираних FISH методом, (табела бр. 28). Између испитаника рефрактерних и не рефрактерних на терапију, није било статистички значајне разлике у учесталости FISH-ом утврђеног bcl-2 генског полиморфизма (χ 2 тест, p=0,165), (табела бр.28). У групи испитаника рефрактерних на терапију FISH bcl-2 позитивних било је нешто мало више од половине оболелих, док је код осталих испитаника FISH bcl-2 позитивних испитаника било 36,1%. На основу добијених резултата, запажамо тренд нешто веће учесталости FISH bcl-2 позитивних испитаника у групи рефрактерних на терапију. Параметри FISH анализе Рефрактерност на терапију Значајност нe дa FISH/bcl-2 n (%) Негативан 23 (63,9%) 12 (46,2%) a p=0,165 Позитиван 13 (36,1%) 14 (53,8%) FISH/c-myc n (%) Негативан 21 (58,3%) 16 (61,5%) a p=0,800 Позитиван 15 (41,7%) 10 (38,5%) FISH(bcl-2+c-myc) n (%) Oба позитивна 7 (19,4%) 6 (23,1%) a p=0,681 Oба негативна 15 (41,7%) 8 (30,8%) Бар један позитиван 14 (38,9%) 12 (46,2%) FISH(bcl-2+c-myc) n (%) Оба позитивна 7 (19,4%) 6 (23,1%) a p=0,474 Oба негативна 15 (41,7%) 8 (30,8%) Само FISHbcl2+ 7 (19,4%) 9 (34,6%) СамоFISHmyc+ 7 (19,4%) 3 (11,5%) *статистички значајна разлика;aχ 2-тест; Табела бр. 28. FISH анализа bcl-2 и c-myc и рефрактерност на терапију 102 Графикон бр. 84. FISH bcl-2 учесталост међу испитаницима рефрактерним на терапију Између испитаника FISH с-myc позитивних и негативних није уочена статистички значајна разлика у односу на појаву рефрактерности оболелих на терапију (χ 2-тест, p=0,800), (табела бр. 28). У обе групе испитаника, оболели са позитивним FISH с-myc налазом, били су приближно исто заступљени, (графикон бр.85). Графикон бр. 85. Учесталост FISH с-myc међу испитаницимаи рефрактерним на терапију Учесталост испитаника са присутна оба полиморфизма FISH bcl-2 и FISH с- myc, са присутним бар једним или са негативна оба генска полиморфизма FISH bcl-2 и FISH с-myc-а, није се статистички значајно разликовала, посматрано на појаву рефрактерности на терапију (χ 2 тест, p=0,681), (табела бр. 28). Оба полиморфизма имало је око 20% испитаника из групе оболелих који су имали неки одговор на примењену терапију, док је у групи рефрактерних било нешто више 23,1%. Нешто више испитаника са бар једним полиморфизмом било је заступљено у групи 103 рефрактерних на терапију 46,2%, док је у групи са било каквим одговором на терапију било 38,9%. Испитаници који су били негативни за FISH bcl-2 и FISH с-myc више су били заступљени у групи са постигнутим неким одговором на примењену терапију 41,7%, док је у групи рефрактерних учесталост негативног налаза за генски полиморфизам bcl- 2 и c-myc била 30,8%, (графикон бр.86). Графикон бр. 86. Учесталост FISH bcl-2 и FISHс-myc међу испитаницима рефрактерним на терапију Посматрано у односу на појаву рефрактерности на терапију, статистички значајна разлика није уочена ни у заступњености испитаника са оба позитивна FISH bcl-2 и FISH с-myc налаза, са оба негативна налаза, са присутним само FISH bcl-2 позитивним налазом и са присутним само FISH с-myc позитивним налазом (χ 2 тест, p=0,474), (табела бр. 28). Анализом болесника са било каквим одговором на терапију (комплетна ремисија и парцијална ремисија) у односу на болеснике који су (одговор мањи од парцијалне ремисије, без прогресије или са прогресијом), утврдили смо да су FISH с- myc позитивни испитаници били више заступљени у групи са неким одговором на терапију - 19,4%, док је FISH bcl-2 позитивних испитаника било више у групи без одговора на терапију 34,6%. Одсуство оба генска полиморфизма било је учесталије у групи са било каквим одговором 41,7% у односу на оне који су били без одговора 30,8%. Позитивност за оба генска полиморфизма била је учесталија у групи болесника без одговора 23,1% у односу на оне са одговором 19,4%, (графикон бр. 87). 104 Графикон бр. 87. Учесталост FISH bcl-2 и с-myc међу испитаницима са било каквим, односно никаквим одговором на терапију 4.8.1. Сензитивност и специфичност генског полиморфизма у предикцији рефрактерности на терапију За сваки од ових полиморфизама FISH bcl-2 и FISH с-myc, као и за комбинацију оба одређивана је сензитивност и специфичност у предикцији рефрактерности на терапију, (табела бр.29). Генски полиморфизам Сензитивност Специфичност Површина испод ROC криве (95% CI) (AUC)* FISH/bcl-2 0,538 0,639 0,589 (0,444-0,734) FISH/c-myc 0,385 0,583 0,484 (0,337-0,631) FISH(bcl2+c-myc) 0,462 0,592 0,482 (0,335-0,629) AUC-Area under the Curve Табела бр. 29. Валидност посматраних генских полиморфизама и рефрактерност на терапију 105 И у случају предикције рефрактерности на терапију добијене вредности сензитивности и специфичности указују нам на малу ваљаност посматраних генских полиморфизама у предвиђању појаве рефрактерности на терапију, (графикон бр. 88). Графикон бр.88. ROC криве рефрактерности на терапију 106 5. ДИСКУСИЈА У нашем истраживању које се односило на новодијагностиковане болеснике оболеле од лимфопролиферативних болести, где је биопсијом туморског ткива, патохистолошком и имунохистохемијском анализом постављена дијагноза ДБКЛ нодалне и екстранодалне локализације, учињена је анализа клиничких, биохемијских параметара и комплетне крвне слике узорковане крви на презентацији, као и накнадна обрада парафинских калупа FISH методом, која се не ради рутински у оквиру стадирањa болести нигде у свету. Статистичка анализа добијених података је показала да се у оболелих од ДБКЛ на нашем простору, као значајно лоши прогнозни параметри, са негативним утицајем на преживљавање, као и са већом учесталошћу у групи са смртним исходом издвајају: старија популација оболелих, постојање коморбидитета, постојање В симптоматологије, висок клинички стадијум болести на презентацији (трећи и четврти), средње висок и висок IPI и висок ECOG статус болесника. Анализе крви које су на презентацији повезане са леталним исходом болести и краћим преживљавањем су: ниске вредности хемоглобина и гвожђа у серуму, високе вредности LDH, acidum uricum-а, С реактивног протеина и D-димера, ниске вредности укупних протеина и албумина. Имунохистохемијска анализа експресије bcl-2 протеина у туморском ткиву је показала директну корелацију са лошим укупним преживљавањем. Истоветна анализа експресије bcl-6 и Ki-67 (уз cutoff од 50%) није показала значајан утицај на преживњавање, нити на исход болести. Посебно учињено тестирање FISH методом за полиморфизме bcl-2 и c-myc (single и double mutation), није показало предиктивни значај за одговор на терапију, а признати прогнозни параметри, као што је IPI скор, није у могућности да сугерише кога треба тестирати на претходно наведене полиморфизме чије тестирање није јефтино, а могло би бити смерница за нове модалитете циљаног лечења. Дифузни Б крупноћелијски лимфом представља најчешћи подтип нехочкинских лимфома, чинећи око 40% свих до сада описаних лимфома (23). По неким истраживањима он обухвата до 30% нехочкинских лимфома у развијеним земљама запада, а чини већи проценат, чак до 50% у земљама у развоју и неразвијеним земљама. ДБКЛ је болест свих узраста, али најчешће се јавља у старосној доби између 65 и 69 године. (114). ДБКЛ се презентује као нодална локализација, али према литератури чак у 60% случајева утврђује се и екстранодална локализација болести (25). Наше истраживање је показало да је код 58 болесника односно 64,4% оболелих на презентацији утврђена екстранодална болест, што је нешто више у односу на 107 литературне податке. Многи болесници са ДБКЛ постижу дугу ремисију, али око трећине болесника релапсира након прве терапијске линије ритуксимаб + хемотерапијски протокол, а лимфом је чак у 30% случајева непосредни узрок смрти (115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122). Дијагноза болести се поставља анализом хирушког биоптата и детаљним хистопатолошким и имунохистохемијским анализама узорка. Неопходно је утврдити степен проширености болести, на основу одређивања клиничког стадијума према Ann Arbor класификацији. За даље планирање терапије, данас је од великог значаја утврђивање IPI индекса ризика, као и ECOG перформанс статуса за сваког болесника посебно. На презентацији око 80% болесника има узнапредовалу болест у трећем или четвртом клиничком стадијуму, али и тада, основни циљ лечења ДБКЛ, јесте постизање излечења у што већем проценту. Хемиотерапија има главну улогу као терапијски избор, док радиотерапија у лечењу ДБКЛ има превасходно палијативни карактер. Болест се јавља у свим узрастима, али старосна медијана је 64 године. Бележи се нешто већа учесталост у мушкараца него у жена (у односу 1,2:1), по резултатима Anderson JR и сарадника (123). У литератури се наводи и чешће обољевање припадника мушког пола са односом и до 1:1,5 по истраживању од 2001.године Manns –а и сарадника (124). У нашој студији није утврђена статистички значајна разлика међу половима, али је утврђена статистички значана разлика у старосној доби између испитаника са различитим исходом. Испитаници са леталним исходом били су старости од 32 до 82 године са просечном старошћу од 68,5 година, док је у групи живих старосна доб била од 21 до 80 година, са просечном старошћу од 53,0 године. Наше истраживање показује нешто старију популацију оболелих од ДБКЛ, у односу на литерарне податке, а при том не прати ни литерарно наведени однос обољевања међу половима. У овој студији утврђује се доминација високог клиничког стадијума на презентацији међу оболелима, а у испитаника са смртним исходом чак 90% је у клиничком стадијуму три или четири. У групи живих испитаника доминирају болесници у другом клиничком стадијуму. Претходно наведено, oдговара налазима у литератури који потичу са са неких других географских простора. Један од најважнијих клиничких предиктора преживљавања у болесника са ДБКЛ је IPI који подразумева године болесника, клинички стадијум болести утврђен по Ann Arbor класификацији, вредност серумске лактат дехидрогеназе, перформанс статус и број екстранодалних места, сврставајући болесника у групу ниског, средње ниског, 108 средње високог и високог IPI ризика. Студије које су следиле потврдиле су валидност прогностичког значаја IPI индекса у болесника са ДБКЛ (125, 126, 127). Не двосмислену предиктивну улогу у исходу испитаника у нашој студији имао је такође IPI ризик. Између испитаника преживелих и оних са смртним исходом уочена је статистички значајна разлика у IPI ризику. Испитаници са смртним исходом имали су виши IPI ризик. У нашем истраживању добијене су статистички значајне разлике између испитаника са ниским и испитаника са средње високим IPI ризиком и високим ризиком, имеђу испитаника са средње ниским и испитаника са средње високим и високим ризиком, док разлика у преживљавању са средње ниским и ниским ризиком и испитаника са средње високим и високим ризиком није била статистички значајна. Једногодишње преживљавање за испитанике са високим ризиком било је 28,6% и нико од испитаникa са овим ризиком није живео дуже од 14 месеци. Наши резултати су у сагласности са литерарним, који утврђују да је најрелевантнији прогностички алгоритам - IPI ризик, базирајући се на клиничким и биохемијским параметрима (128). ECOG перформанс статус је један од прогнозних параметара који предиктивно показује исход болести. Утврђује се приликом постављања дијагнозе болесника и одређује његово кондиционо стање. Овом студијом смо утврдили да је висок ECOG директно повезан са лошим исходом новооболелих од ДБКЛ без обзира на примењени исти третман. Повезаност коморбидитета и преживљавања је независтан лош предиктор преживљавања оболелих од ДБКЛ показала је наша студија као и студија коју је извео Charlson, а свака дисфункција органа односно коморбидитет повезан је и са годинама (129). Функционална скала, као што је ECOG - Zibrod skor – објављена је 1982.године и показује високу корелацију са лошим исходом болести, што смо потврдили и међу болесницима у овој студији. Ова скала носи име по C. Gordon Zubrod-у који ју је начинио са опсегом од 0 до 5. Нула (0) – репрезентује одлично стање док - 5 означава смрт, и у употреби је за процену код болесника са различитим врстама малигнитета (130). Статистички значајан утицај на морталитет показао је и ECOG статус, живи болесници су у значајно већем броју били ECOG статуса 0, док у групи испитаника са смртним исходом чеће су били ECOG статуса 1 и 2. ECOG статус 3 и 4, био је чешћи у болесника са смртним исходом. Анализом утицаја примарно нодалне и екстранодалне локализације болести међу нашим испитаницима дошло се до закључка да те варијабле немају утицаја на прогнозу болести и укупно преживљавање болесника (131). 109 Присуство или одсуство „Вulky “форме болести није показало статистички значајну разлику посматрано у односу на морталитет испитаника. Позитиван „ Bulky“ статус био је заступљен у једној трећини случајева у обе исходишно посматране групе болесника. У литератури у MinT студији присуство „Вulky“ форме болести је лош прогнозни параметар (132). Код болесника са присутним B симптомима (презнојавање, повишена температура и губитак у телесној тежини већи од 10% за последњих шест месеци) је утврђено, посматрано у односу на исход, статистички значајна разлика у заступњености испитаника са B симптомима, у односу на оне који симптоматологију немају. Овом студијом смо утврдили већу статистички учесталост испитаника са В симптоматологијом у групи са смртним исходом. Претходно наведено је у корелацији са литералним подацима, а посебно са две велике студије GELA и MinT , у којима такође, као и у нашој студији, није утврђен утицај екстранодалне локализације болести на преживљавање (132, 133). Учињеним испитивањем биохемијских параметара у нашој студији смо утврдили да вредности седиментације, фибриногена, алкалне фосфатазе, ALT, гама GT немају предиктиван значај на исход болести. Учињена анализа комплетне крвне слике, анализа леукоцита и леукоцитарне формуле, као и броја тромбоцита није показала статистички значајну разлику у посматраних испитаника са различитим исходом. Анализа LDH у болесника са различитим исходом показала је статистички значајну разлику као лош прогнозни параметар, значајно су биле више вредности LDH у болесника са леталним исходом. Претходно је потврђено и у ранијим студијама, као предиктивно лош параметар (131, 132, 134) Као лош прогнозни параметар у нашем истраживању се издвајају и: CRP, D - димер, acidum uricum, гвожђе у серуму и ниска вредност хемоглобина, показујући високо статистички значајну разлику између оболелих од ДБКЛ са леталним исходом и живих испитаника. Све претходно наведене анализе су узорковане претретмански у моменту постављања дијагнозе. Ki-67 je нуклеарни протеин блиско повезан са пролиферацијом. Пролиферативна фракција детектована имунохистохемијским маркером Ki-67 се креће од 40% до преко 90% код оболелих од ДБКЛ. У нашем узорку експресија Ki-67 је била је са распоном од 30% до 95%. Висок пролиферативни индекс установљен имунохистохемијском анализом Ki-67 је углавном повезан са лошијом прогнозом 110 болести. Са друге стране висок пролиферативни индекс чини лимфом остетљивијим на терапију. У нашем испитивању није утврђена корелација вредности пролиферативног индекса са исходом. Није уочена статистички значајна разлика у вредностима Ki-67, између групе са леталним исходом и живих испитаника, а није утвђена статистички значајна разлика имеђу испитаника са вредностима учесталости Ki-67% мањим и већим од 50%. И код живих и код испитаника са смртним исходом учесталост оболелих са Ki- 67 већим од 50% била је приближно иста. У групи живих 34,2% испитаника имало је вредност овог параметра преко 50%, a у групи умрлих њих 38,5%, испитивано 90 оболелих. Miller и сарадници су на 60 оболелих испитивали повезаност експресије Ki- 67 ипрогнозе и закључили да је експресија Ki-67 преко 80% повезана са лошијом прогнозом (135). Нашом студијом нисмо доказали да у оболелих од ДБКЛ, вредности Ki-67% веће и мање од 50%, статистички значајно утицале на преживљавање. Значај пролиферативне активности је контраверзан, по неким студијама висока пролиферативна активност била је знак лоше прогнозе Jerkmen и сарадници, по некима знак добре прогнозе Hasselblom и сарадници. Нека истраживања су показала као и наше, на пример Lianos и сарадници да вредност пролиферације, Кi-67 није имала утицај на прогнозу оболелих од ДБКЛ (136, 137, 138). Colomo и сарадници током испитивања 128 болесника такође нису пронашли корелацију експресије Ki-67 и прогнозе (139). DNA microarray технологија омогућава испитивање експресије хиљада гена одједном. Пун потенцијал microarray технологије се још не зна. Array генске скспресије и квантитативни PCR за анализу експресије многобројних гена се за сада не користе рутински у клиничкој пракси. Разлози су што захтевају свеже узорке тумора, пуно рада, добро обучено особље и скупо је. Транслокације t (14;18) (q32;q21)/ bcl-2 реаранжман се региструје код 15-20% болесника са ДБКЛ. Већина ових Дифузних Б крупноћелијских лимфома настаје трансформацијом из Фоликуларних лимфома, а код већине су присутне и додатне цитогенетске аберације укључујући 17p13/p53 (140). Програмирану ћелијску смрт или апоптозу контролише скуп гена којима се ефикасно одстрањују непотребне или оштећене ћелије. Апоптоза је неопходна за одржавање хомеостазе организма, одстрањење штетних ћелија спречавајући разна обољења међу којима су малигне болести најзначајније. Поремећена функција неког од гена који учествује у апоптози 111 може довести до бесмртности ћелија, те неконтролисаног бујања и раста малигних ћелија и настанка тумора. Bcl-2 протеин има антиапоптотско дејство и регулише све главне типове ћелијске смрти, апоптозу, некрозу и аутофагију. Bcl-2 је први ген "против смрти" који је откривен, означивши нову еру у истраживању ћелијске смрти (141). Bcl-2 као антиапоптотски протеин игра важну улогу у развоју и диференцијацији Б лимфоцита. Његова експресија у ДБКЛ је, у већини великих студија на болесницима лечених хемиотерапијом, повезана са резистенцијом на хемиотерапију и лошијом прогнозом (72, 142). Једна од генских лезија која је повезана са прогресијом и лошим исходом различитих тумора је генска амплификација. У ДБКЛ је утврђено присутво амплификације REL, myc, bcl-2, GLI, CDK4, као и амплификација MDM2 гена која је повезана са узнапредовалим клиничким стадијумом у моменту постављања дијагнозе (143). Студије профила генске експресије су потврдиле да постоје молекуларно различите подгрупе унутар ДБКЛ које имају различит исход након терапије са антрациклинским протоколима (144). После увођења имунотерапије – ритуксимаб је придодат стандардној хемиотерапији у ДБКЛ, a прогноза болесника са bcl-2+ дифузним Б крупноћелијским лимфомом се значајно поправила, што је најпре показано на узорцима великог броја болесника из рандомизиране GELA студије (145). Muris и сарадници током истраживања на 71 болеснику, повезали су експресију bcl-2 са лошијом прогнозом, Berglund и сарадници анализирајући 161 болесника, а Sjo и сарадници анализирајући 108 болесника повезали су експресију bcl-2 такође са лошијом прогнозом (146, 147, 148). Mounier и сарадници су дошли до закључка да употреба Rituximab-a омогућује успешност терапије и код болесника са bcl-2 експресијом (149, 150). Wilson и сарадници су истраживањем на 140 болесника, утврдили да додатак ритуксимаба стандардном протоколу CHOP поништава негативан прогностички утицај bcl-2 позитивности (151). Многа истраживања су показала лош прогностички ефекат експресије bcl-2 и пре и након увођења ритуксимаба у терапију. Учињеним нашим истраживањем нисмо утврдили значајну разлику у преживљавању и исходу болести, новодијагностикованих болесника од ДБКЛ у којих је FISH анализом утврђен генски полиморфизам t(14;18) односно утврђена позитивност или негативност bcl-2, иако је учесталост FISH- ом детектоване bcl-2 позитивности била учесталија у групи болесника са лошим исходом, али без статистичке значајности, а сви су третирани имунохемиотерапијом. Није утвђена статистички значајна разлика у 112 преживљавању bcl-2 позитивне и негативне групе болесника нодалне локализације ДБКЛ ни у испитивању Young-HaOh и сарадника (152). Међутим bcl-2 позитивни болесници утврђени класичном имунохистохемијом показали су значајно статистички лошије преживљавање у нашем испитивању у односу на негативне болеснике. Bcl-2 позитивност имунохистохемијски утврђена је у 58 болесника, чинећи 56,2% испитаника. Позитиван налаз у наших испитаника представља лош прогностички знак. Једногодишње преживњавање bcl-2 негативних испитаника било је 67,6%, двогодишње 60,8% и није се мењало до краја периода праћења од 90 месеци, а код ових испитаника није постигнута медијана преживљавања, обзиром да је током посматраног периода праћења више од половине болесника преживело. Али у групи са позитивним налазом преживљавање после годину дана је било 44%, после две године 37,7%, после три 28,2% колико је било и на крају периода праћења од 88 месеци. Медијана преживљавања испитаника bcl-2/ИХХ позитивних била је 10 месеци (95%CI 6,89-13,11 месеци). У нашој студији није утврђен статистички значајан утицај позитивног налаза на bcl-6/ИХХ на преживљавање испитаника оболелих од ДБКЛ. Једногодишње преживљавање испитаника са негативним налазом је било 58,4%, двогодишње 48,3%, трогодишње 40,1% и није се мењало до краја деведесето месечног периода праћења. Код испитаника са позитивним налазом преживљавање после годину дана износило је 41,5% и није се мењало до краја 84 месеци праћења. Наши резултати су у сагласности са резултатима Colomo и сарадника који током испитивања 128 болесника нису пронашли повезаност експресије bcl-6 са прогнозом (139). Нека истраживањима су показала да је позитивна експресија bcl-6 повезана са бољом прогнозом, на пример истраживање Berglund-а и сарадника (153). Bcl-6 је транскрипциони фактор на N- терминалном домену, a ген је локализован на позицији 3q27 на крају хромозома. FISH- ом се детектује транслокација t(3;14). Bcl-6 се нормално експримира у многим ткивима, али у Б ћелијама је углавном ограничен на Б ћелије герминативног центра. У герминативном центру bcl-6 игра улогу репресије транскрипције многих таргет гена који учествују у апоптози, одговоран је за оштећење ДНК, контролу ћелијског циклуса, пролиферацију и диференцијацију (154, 155, 156). Важне директне мете измењеног bcl- 6 су bcl-2, p53, IRF4 и BLIMP-1 који касније постају неопходни у сазревању, односно матурацији плазма ћелија (157, 158). Хромозомска преуређења која захватају bcl-6 ген се јављају у различитим процентима. Када су у питању ДБКЛ, промене на нивоу bcl- 6 113 се јављају у од 49 – 61% болесника, али се транслокација повезана са bcl-6 може наћи и у неких фоликуларних лимфома, чак и неки Б лимфоми маргиналне зоне. Bcl-6 ген је ген инхибитор транскрипције, а утиче на ћелијски циклус преко великог броја других гена (159). У Mitelman date base наводи се само 8% од свих испитаника са DH (c-myc+/ bcl-6+), а подаци су врло дискутабилни јер је прекид лоциран на хромозому 3, који се често током анализе изгуби. Свакако постојање bcl-6+ је од важности због губитка сопствене функције и индиректног учешћа у патологији лимфома. Транслокација t(8;14)(q24;q23), c-myc (MYC) промотер за IGH (енгл. immunoglobulin heavy chain) је прва транслокација детектована у лимфоидним неоплазмама (160). Ова транслокација се може идентификовати и у Burkitt–овом лимфому, посебно у ендемским случајевима, 30–50% некласификованих Б ћелијских лимфома који су по особинама између дифузног Б крупноћелијског лимфома и Burkitt лимфома и у малом проценту дифузних Б крупноћелијских лимфома без посебних карактеристика (енгл. not otherwise specified - NOS). У серијама неселектованих дифузних Б крупноћелијских лимфома, реаранжман c-myc гена се открива у 5 до 10% случајева (70, 72, 161, 162, 163, 164). Учесталост генског полиморфизма с-myc у нашој ретроспективној неселективној серији новооболелих од ДБКЛ из узорка при постављању дијагнозе билa је учесталија него што се у литератури описује утврђена код 25 болесника, а највероватније је последица високе пролиферативности, високог клиничког стадијума, доминантно утврђене екстранодалне локализације болести, која је присутна у 64,4% болесника, a вероватно и сензитивније методе детекције и напретка у технологији самих реагенаса. У групи са позитивним FISH с-myс налазом, преживљавање после годину дана било је 60%, после две године 52%, после три 42,5% колико је било и после 88 месеци праћења. За ову групу испитаника медијана преживљавања износила је 33 месеца (95%CI 0,50-65,50). Једногодишње преживљавање испитаника са негативним FISH с-myc налазом било је 58,5%, двогодишње 51,4%, трогодишње 44%, колико је било и после 84 месеца праћења. Медијана преживљавања ове групе испитаника била је 25 месеци (95%CI 3,15-46,85). Статистички значајна разлика у преживљавању између ове две групе наших испитаника, није уочена. Анализирајући FISH с-myc позитивне испитанике ниског и високог интернационалног прогностичког индекса није показало статистички значајну 114 разлику у преживљавању у нашој студији у праћеном периоду од 90 месеци. Наши резултати нису у сагласности са онима који се наводе у литератури. Аутори Savage KJ анализирајући 245 биопсија, а са FISH-ом позитивних 35 односно 14%, наводи да је c-myc позитивна транслокација повезана са лошијим преживљавањем. Rimsza LM са колегама анализирајући 36 различитих гена у ДБКЛ-у показује да постојање c-myc транслокације, доводи до лошег исхода и лошег укупног преживљавања у болесника лечених са R-CHOP, постављајући питање оптималног третмана ових високо ризичних болесника (70, 71, 165). Alexandar Tzankov са сарадницима, наводи да су сви типови myc реаранжмана повезани са лошијим преживљавањем, јер 20 од 39 је умрло, медијана преживљавања је била 42 месеца, што у поређењу са 98 од 393 умрлих међу онима који су без myc реаранжмана, медијана у овој групи није достигнута. Испитаници са myc реаранжманом који имају и висок ниво myc протеина су високо ризични независно од IPI ризика. Показало се да истовремено постојање и bcl-2 полиморфизма, амплификује лошу прогнозу, за разлику од постојања bcl-6 позитивности. Нашим испитивањем је такође показано да постојање генског реаранжмана c-myc, утврђеног FISH-ом није у корелацији са IPI ризиком, заправо није у корелацији са групом високог односно ниског ризика (166). Претходно описане су појединачне (енгл. singl mutation), генске промене, али генске анализе у ДБКЛ су показале постојање и више реаранжмана истовремено. Постојање bcl-2 и c-myc мутације истовремено, описује се као двострука мутација (енгл. Double –Hit mutation). Ово је најучесталија двострука мутација и чини 62% свих DH мутација у лимфомима у Мitelman datebase. У нашем истраживању FISH bcl-2+ и FISH с-myc+ имало је 13 испитаника. У групи оболелих са оба позитивна генска полиморфизма преживљавање после годину дана било је 53,8%, после две године 38,5%, после три године 30,8% и толико је било и на крају периода праћења од 78 месеци. Медијана преживљавања испитаника са оба позитивна налаза била је 14 месеци (95% CI 0-35,14). Наши резултати су у сагласности са литерарним резулататима медијане Over Survival са других простора на којима је она од 0,2 до 1,5 година односно од 2 месеца до 18 месеци (167, 168, 169, 170, 171, 172). У групи испитаника који су FISH bcl-2 и с-myc позитивни и ниским IPI ризиком, једногодишње преживљавање је било 83,3%, двогодишње 66,7% и није се мењало до краја периода праћења од 78 месеци. Код испитаника са високим IPI ризиком и позитивним налазом FISH bcl-2 и FISH с-myc геном, преживљавање после годину дана 115 износило је 28,6%, после две 14,3%, док нико од оболелих из ове групе није живео дуже од три године. Статистички значајан утицај када су оба позитивна генска реаранжмана FISH bcl-2 и с-myc на преживљавање није уочен ни код испитаника са ниским нити код испитаника са високим IPI ризиком. Испитаници код којих није детектован нити један генски реаранжман имали су медијану преживљавања од 25 месеци (95%CI 7,63-42,37), преживљавање након годину дана било је 64,9%, после две године 53,6%, после три 41,7% и није се мењало до краја праћења од 84 месеца. Учесталост 13/62 у нашем испитивању учињена на микроерејима флуоресцентном in situ хибридизацијом је већа, него истим начином утврђивана учесталост Double –Hit mutation у студијама неселектованих ДБКЛ као што је и наша. Оbermann са сарадницима 2009.године изналази на 220/1(0%), Copie-Bergman и сарадници 2009.године 71/0 (0%), van Imhorff и сарадници 2006.године 59/3 (5%), док Savage са сарадницима 2009.године од 117/3 (2%) (173, 174, 175, 176). У литератури се наводи различита учесталост „Double –Hit “ ДБКЛ, тако да Tina Marie Green са коауторима 2012.године, идентификује 21/189 болесника односно 11% болесника са double-hit и са лошим исходом, а слично наводе и друге студије потврђујући лоше клиничке и прогнозне карактеристике у оваквих болесника (71, 172, 177, 178). Висока експресија имунохистохемијски утврђене позитивности bcl-2 и c-myc повезана је такође са лошом прогнозом (179). Различита учесталост дијагностикованих „ Double –Hit “ ДБКЛ-а расте последњих деценија, посебно после 1994. године, до када се бележила учесталост до 3%. У периоду између 1980.године до 2009.године од 804 ДБКЛ / 109 су били Double –Hit лимфоми, док је само 12 од 445 ДБКЛ презентовано за период до 1995.године. Заправо претходно наведено је вероватно последица пораста интересовања за лимфоме, измењене класификације, а такође напретка и побољшаних саме технике генске анализе. DNA microarray технологија сада, омогућава испитивање експресије хиљада гена одједном. Какав је пун потенцијал microarray технологије још се незна. Array генске скспресије и квантитативни PCR за анализу експресије многобројних гена се за сада не користе рутински у клиничкој пракси. Разлози су следећи: захтевају свеже узорке тумора, пуно рада, добро обучено особље и скупо је. Анализом терапијског одговора испитаника који су третирани имунохемиотерапијом по протоколу RCHOP у 6 или 8 циклуса на 21 дан, показали смо да се постизање комплетне ремисије, односно одсуства болести између болесника са смртним исходом и живих значајно разликује. У испитиваној популацији комплетна ремисија постигнута је код 86,8% живих испитаника и код 11,8% испитаника са 116 смртним исходом у периоду праћења од 90 месеци, а то је у складу са литерарним подацима и великим студијама GELA и MinT. Публиковани радови Green-a и сарадника и Johnson-a и сарадника указују да популација оболелих од ДБКЛ-а карактерисана експресијом c-myc и bcl-2 протеина истовремено, утврђено класичном имунохистохемијом, показује лошију прогнозу ако су третирани стандардним протоколом - rituximab+CHOP (R-CHOP). Можда упозоравајући на потребу трагања за алтернативним третманом путем студија за овакве болеснике. Тим пре што је c-myc протеин експресија повезана са c-myc транслокацијом, па све c-myc протеин позитивне болеснике треба тестирати на c-myc транслокацију FISH анализом (180, 181). Трагајући за предикторима од којих зависи терапијски одговор, односно постозање комплетне ремисије терапијом прве линије, испитивањем смо утврдили да постоји статистичка значајаност утицаја клиничког стадијума болести по Ann Arboru и Интернационалног Прогнозног Ризика (IPI) на укупан терапијски одговор. Међугрупном анализом се показало да је бољи прогнозни фактор нижи клинички стадијум први или други, а лошији трећи и четврти, што је утврђено и великим студијама GELA и MinT. Анализом постизања комплетне ремисије и утврђеног IPI ризика међу нашим испитаницима, утврђена је висока међузависност. Испитаници са ниским IPI ризиком су постигли комплетну ремисију у 92,9%, са средње ниским IPI ризиком комплетна ремисија остварена је у 81,8%, а у оних са средње високим ризиком комплетна ремисија постигнута је у 69,2% испитаника, што је сагласности са литералним подацима (49, 115). 117 6. ЗАКЉУЧЦИ Наше истраживање је показало да генски полиморфизам bcl-2+ и c-myc+ утврђени FISH-ом нису показали предиктивни и прогнозни значај у оболелих од ДБКЛ-а лечених имунохемиотерапијом. На основу резултата нашег истраживања дошли смо до следећих закључака: 1. Генски полиморфизам bcl-2+ и c-myc+, како појединачни тако и удружени, немају утицаја на терапијски одговор и укупно преживљавање оболелих од ДБКЛ-а утвђених FISH- oм . 2. Код болесника са ДБКЛ, лечених имунохемиотерапијом, исход болести није у корелацији са постојањем позитивног полиморфизма за bcl-2. 3. Истовремено постојање c-myc+ и bcl -2+ не показује кореалцију са IPI ризиком. 4. IPI скор не може бити предиктор одлуке о обавезном тестирању на генски полиморфизам, који би омогућио индивидуалан терапијски приступ, без непотребног исцрпљивања болесника стандарном терапијом прве линије. 5. Не постоји разлика у исходу болести и укупном преживљавању између оболелих од ДБКЛ-а који су FISH/bcl-2 позитивни, у односу на оне који су негативни. 6. Не постоји разлика у исходу и укупном преживљавању оболелих од ДБКЛ-а који су FISH/c-myc позитивни у односу на оне који су c-myc негативни. 7. Оболели од ДБКЛ-а, који су истовремено FISH/c-myc и bcl-2 позитивни, показују лошији одговор на терапију у односу на c-myc и bcl-2 негативне, али без статистичке значајности. 8. Већа је учесталост FISH/bcl-2 позитивног полиморфизма код болесника са високим IPI ризиком у односу на оне са ниским IPI-ом, али без статистичке значајности. 9. Већа је учесталост FISH/c-myc позитивног полиморфизма код болесника са ниским IPI ризиком у односу на оне са високим IPI-ом, али без статистичке значајности. 10. Упоредна анализа прогнозног значаја двоструких мутација и IPI ризика, није показала статистички значајан утицај на преживљавање ни код испитаника са ниским, ни код испитаника са високим IPI ризиком. 118 11. У групи испитаника са оба позитивна FISH/bcl-2 и c-myc полиморфизма и ниским IPI-ом, једногодишње преживљавање било је 83,3%, двогодишње 66,7% и није се мењало до краја периода од 78 месеци праћења. 12. Код испитаника са високим IPI-ом и позитивним FISH/bcl-2 и c-myc полиморфизмом, преживљавање после годину дана износило је 28,6%, после две године 14,3%, док нико од оболелих из ове групе није живео дуже од три године. 13. Мултиваријантном Cox-овом анализом, као независни предиктори преживљавања показали су се: ECOG, комплетна ремисија, рефрактерност на терапију, bcl-2 позитивност утврђена имунохистохемијски и CRP. 14. Испитаници рефрактерни на терапију имали су статистички значајно краће преживљавање од испитаника који су имали било какав одговор на примењено лечење. Није утврђена корелација између постојања генских мутација и рефрактернoсти на терапију. И добијене вредности сензитивности и специфичности, указују на малу ваљаност посматраних генских полиморфизама у предвиђању рефрактерности на терапију. 15. Постизање комплетне ремисије, након прве терапијске линије, није зависило од присуства појединачних и удружених оштећења c-myc и bcl -2 гена. Све претходно наведено, сугерише да се резултати молекуларних анализа морају корелирати са клиничким и морфолошко-фенотипским информацијама, јер вероватно постоји истовремено више механизама који условљавају да једна трећина болесника и поред примењене терапије, умире од дифузног Б крупноћелијског лимфома. 119 7. ПОПИС ОЗНАКА И СКРАЋЕНИЦА НХЛ – нехочкинов лимфом ДБКЛ – дифузни Б крупноћелијски лимфом CS – клинички стадијум (енгл. Clinical stage) ECOG статус – функционални статус болесника (енгл.Eastern Oncology Cooperative Group) FISH – флуоросцентна in situ хибридизација (енгл. Fluerescence in situ hybridization) CHOP – акроним за терапију циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолон ИХХ - имунохистохемија ( енгл. Immunohistoсhemistry) GCB – тип ДБКЛ порекла лимфоцита герминативног центра (енгл. Germinative center like) Non-GCB - тип ДБКЛ порекла лимфоцита ван герминативног центра ( енгл. Non Germinative center ) NK - урођено-убилачке ћелије ( енгл. natural killer) NKT - урођено-убилачке T ћелије ( енгл. natural killer T) GEP – профил генска експресије (енгл. gene expression profiling) IPI – Интернационални прогностички индекс ( енгл. International Prognostic Index) LDH – лактат дехидрогеназа АST – аспартата трансаминаза Гама GT – гама глутамат трансаминаза ALP – алкална фосфатаза IL - интерлеукин OS – укупно преживљавање (енгл. Overall survival) CR – комплетна ремисија (енгл. Complite Remission) PR – парцијална ремисија (енгл. Partial Remission) RD – рефрактерна болест (енгл. Refracterio Disease) p – вероватноћа R – ритуксимаб 120 WHO – Светска Здравствена Органиција (енгл. World Helph Organisation) TMA – техника ткивних микрозона (енгл. tissue microarray ) 121 8. ЛИТЕРАТУРА 1. Louis Rosenfeld. Thomas Hodkin: Morbid Anatomist & Social Activist. Madison Books, Lanaham; 1993. 2. Rappaport H, Winter W, Hicks E. Follicular lymphoma A reevaluation of its position in the scheme of malignant lymphoma, based on survey of 253 cases. Cancer, 1956;9: 792-821. 3. Lukes R, Collins R. Immunologic characterization of human malignant lymphomas.Cancer, 1974; 34: 1488-1503. 4. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemothrapy for diffuse large B cell lymphoma. N Engl J Med, 2002; 346:25-31. 5. Hiddemann W, Longo DL, Coiffier B, et al: Lymphoma Classification –The Gap Between Biology and Clinical Management Is Closing. Blood, 1996; 88:4085-4094. 6. Lenz G, Wright GW, Emre NC, et al: Molecular subtipes of diffuse large B –cell lymphoma arise by distinct genetic patways. Proc Natl Acad Sci USA, 2008; 105: 36- 43. 7. Swerdlow SH. Word Health Organization, International Agency for Research on Cancer: WHO of tumors of Haematopoetic and Lymphoid Tissues. Word Health Organization Agency for Research on Cancer, Lyon, France, 2008. 8. Lenz G, Wright G, Dave SS, et al. Stromal gene signatures in large-B-cell lymphomas. N Engl J Med, 2008; 359:2313–2323. 9. Mihaljević B. New trends in non-Hodgkin‟s lymphoma diagnostics. In: Milenković P, editor. New trends in Hematology. Belgrade: Udruženje hematologa Jugoslavije; 2002; 287−299. 10. Lenz G and Staudt LM. Aggressive lymphomas. N Engl J Med, 2010; 362:1417–1429. 11. Rodriquez M, Cabanillas F, Deisseroth A: Non-Hodgkin Lymphoma. In: Hematology A Problem –Oriented Approach, Williams & Wilkins, Baltimore 1996, 325-337. 12. Clarke CA, Glaster Sl. Chaging incidence of non Hodgkin lymphomas in the United States.Cancer, 2002; 94:2105-20123. 122 13. Marković-Denić Lj, Živković S, Šipetić S. Umiranje od Malignih Hemopatija u Centralnoj Srbiji. Аcta Fac Med NAISS, 2002; 19(2) : 88-99. 14. Nathan D. Montgomery, and Yuri Fedoriw. Pathology Consultation on Intermediate-to- Large B-Cell Lymphomas Am J Clin Pathol, 2014; 3:305-317. 15. Pasqualucci L, Trifonov V, Fabbri G, et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet, 2011; 43:830–837. 16. Аlizadeh AA, Eisen MB, Davis Re, et al. Distinct types of diffuse large B cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature, 2000; 403: 6769-6773. 17. Nogai H, Dorken B, and Lenz G. Pathogenesis of non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol, 2011; 29:1803–1811. 18. Јaffe ES. The 2008 WHO classification of lymphomas: implications for clinical practice and translational research. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2009, 523- 531. 19. National Comprehensive Cancer Network. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Melanoma. 2011;V 2: Accessed March 28, 2011. Available at http://www.nccn.org/ professionals/physician_gls/pdf/nhl.pdf. 20. The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project. A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-Hodgkin's lymphoma. Blood, 1997; 89:3909-3918. 21. Sehn LH, Berry B, Chhanabhai M i sur. The revised International Prognostic Index (R- IPI) is a better predictor of outcome than the standard IPI for patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP. Blood, 2007; 109:1857-1861. 22. Fisher SG, Fisher RI. The epidemiology of non – Hodgkin´s lymphoma. Oncogene, 2004; 23: 38-43. 23. Wu XC, Andrews P, Chen VW, et al. Incidence of extranodal non- Hodgkin‟s lymphomas among whites, blacks, and Asian /Pacific Islanders in the United States: anatomic site and hystology differences. Cancer Epidemiol, 2009;33(5): 337-346. 24. Anderson JR, Armitage JO, Weisenburger DD. Epidemiology of the non-Hodgkin's lymphomas: distributions of the major subtypes differ by geographic locations. Non- Hodgkin's Lymphoma Classification Project. Ann Oncol, 1998; 9:717-720. 25. Clarke CA, Glaser SL.Chaging incidence of non Hodgkin lymphomas in United states. Cancer, 2002; 94: 2105-2123. 123 27. Bea S, Colomo L, Lopez-Guillermo A, Salaverria I, Puig X, et al.Clinicopathologic significance and prognostic value of chromosomal imbalances in diffuse large B-cell lymphomas. J Clin Oncol, 2004; 22: 3498-3506. 28. Dave BJ, Nelson M, Pickering DL,Chan WC, Greiner TC, et al. Cytogenetic characterization of diffuse large cell lymphoma using multi-color fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet, 2002; 132: 125-132. 29. Lossos IS. Molecular pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol, 2005; 23: 6351-6357. 30. Lossos IS, Morgensztern D. Prognostic biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol, 2006; 24: 995-1007. 31. Vafa O, Wade M, Kern S, et al. C-Myc can induce DNA damage, increase reactive oxygen species, and mitigate p53 function: A mechanism for oncogene-induced genetic instability. Mol Cell, 2002; 9:1031–1044. 32. Sehn LH. A decade of R-CHOP. Blood, 2010; 116: 2000–2001. 33. Fu K, Weisenburger DD, Choi WW, et al. Addition of rituximab to standard chemotherapy improves the survival of both the germinal center B-cell-like and non- germinal center B-cell-like subtypes of diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol, 2008; 26:4587–4594. 34. Fisher RI, Longo DL, DeVita JR, et al: Long – term follow –up of ProMACE-Cyta BOM in non-Hodgkin‟s lymphomas. Ann Oncol, 1991; 2 (suppl 1): 33. 35. Marcus R, Hagenbeek A. The therapeutic use of rituximab in non –Hodgkin „s lymphoma. Eur J Haematol, 2007; 67: 5-14. 36. Mitrović Z. Aurer I. Rituximab u lečenju B – staničnih ne Hodkinovih limfoma. Lijec Vjesn, 2006; 128: 36-42. 37. Coiffer B, Best HJ, Omnes JC, Hornberger JC. Cost-Effectivness of Rituximab in Treatment of Diffuse Large B cell lymphoma. Oncology, 2002; 16 (Suppl 2): 16-17. 38. Chabner BA, Amrein PC, Druker BJ, Dror Michaelson M, Mitsiades CS, Goss PE, Ryan DP, Ramachandra S, Richardson PG, Supko JG, Wilson WH. Antineoplastic agens. Section IX: Chemotherapy of neoplastic diseases. Chapter 51. In: Brunton LL, Lazo JS, Parker KL, eds. Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 11 th ed. New York: The McGraw-Hill Companies Inc.,2006;1315-1403. 124 38a Mihaljević B, Janković S, Jaković Lj, Peruničić M, et al. Application of monoclonal anti-CD20 antibody rituximab in the treatment of non-Hodgkin‟s lymphoma. Vojnosanit Pregl 2008; 65(3): 229–233. 39. Reff ME, Carner K, Chambers KS, et al. Deplation of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood, 1994; 83: 435-445. 40. Artron G, Waiter H, Golay J, Solal-Celigny P. From the bench to the bedside: ways to improve rituximab efficacy. Blood, 2004; 104: 2635-2642. 41. Grillo-López AJ. Rituximab (Rituxan/MabThera):the first decade(1993−2003). Expert Rev Anticancer Ther, 2003; 3(6):767−779. 42. Czucyman M, Weaver R, Alkuzweny B, et al. Prolonged clinical and molecular remission in patients with low-grade or follicular non Hodgkin's lymphoma treated with rituximab plus CHOP chemotherapy: 9-year follow –up. J Clin Oncol, 2004; 22: 4711- 4716. 43. Hidemann W, Kneba M, Dreyling M, et al. Fronte –line therapy with rituximab added to the combination of cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone (CHOP) significantly improves the outcome of patients with advanced stage follicular lymphomas as comparated to CHOP alone-results of prospective randomised study of German low grade lymphoma study group (SLSG). Blood, 2005;106: 3725-3732. 44. Marcus R, Imre K, Belch A, et al. CVP chemotherapy plus rituximab comparated with CVP as firist –line treatment for advanced follicular lymphoma. Blood, 2005; 105: 1417-1423. 45. Czuczman M, Grillo-Lopez AJ, White CA,et al: Progression – Free Survival After six Years (Median) Folloe up of the First Clinical Trial of Rituximab / CHOP Chemoimmunotherapy. Oncology, 2002; 16 (Suppl 2): 9-10. 46. Advani RH, Chen H, Habermann TM, et al. Eastern Cooperative Group; Cancer and Leukemia Group B; Southen west Oncology Group. Comparision of conventional prognostic indices in patients older than 60 years with diffuse large B cell lymphoma treated with R-CHOP in the US Intergroup Study (ECOG 4494,GALGB 9793): consideration of age greater than 70 years in an eldery prognostic index (E-IPI).Br J Haematol, 2010; 151(2): 143-151. 47. Pfreundschuh M, Schubert J, Ziepert M, et al. Six versus eight cycles of bi –weekly CHOP-14 with or without rituximab in eldery patients with agressive CD20+ B-cell 125 lymphomas:A randomised controlled trial (RICO-VER-60). Lancet Oncol, 2008; 9(2): 105-110. 48. Pfreundschuh M, Trumper L, Osteoborg A, et al. CHOP- like chemotherapy plus rituximab versus CHOP –like chemotherapy alone in younger patients with good- prognosis diffuse large B cell lymphoma: A randomised controlled trial by the MabThera International Trial (MinT) Group. Lancet Oncol, 2006; 7 (5): 379-391. 49. Gao G, Liang X, Jiang J, Zhou X, Huang R, Chu Z, Zhan Q. A systematic review and meta-analysis of immunochemotherapy with rituximab for B cell non Hodgkin‟s lymphoma. Acta Oncol, 2010; 49 (1): 3-12. 50. Mihaljević B, Sretenović S, Janković S, Anđelić B, Jaković B, Milicic B,et al. Long term results of CHOP-CHOPlike chemotherapy ± rituximab in patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Leukemia and Lymphoma, East and West Together. Leukemia Research, Clinical and Laboratory Studies, 2007; 31 (Supp 2): PO59. 51. Mihaljević B, Anđelić B, Jaković Lj, Janković S, Sretenović A, Bila J, et al. The influence of international prognostic score and bulky disease in patients with primary mediastinal B sclerosing lymphoma treated with immunochemotherapy, Leukemia and Lymphoma, East and West Together. Leukemia Research, Clinical and Laboratory Studies, 2007; 31 (Supp 2): PO60. 52. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, et al. Distanct types of diffuse large B-cell lymphoma idntified by gene expression profiling. Nature, 2000; 403: 503- 511. 53. Tomita N, Tokunaka M, Nakamura N, et al. Clini-copathological features of lymphoma/leukemia patients carrying both BCL2 and MYC translocations. Haematologica, 2009; 94(7): 935-943. 54. Chuang SS, Ye H, Du MQ, et al. Histopathology and immunohistochemistry in distinguishing Bur-kitt lymphoma from diffuse large B-cell lymphoma with very high proliferation index and with or with-out a starry-sky pattern: a comparative study with EBER and FISH. Am J Clin Pathol, 2007; 128(4): 558-564. 55. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, et al. Lymphoma/leukemia Molecular Profiling Project. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for large B-cell lymphoma. New Eng J Med, 2002; 346: 1937-1947. 126 56. Shipp Ma, Rossa KN, Tamayo P, Weng AP, et al. Diffuse large B-cell lymphoma outcome prediction by gene-expression profiling and supervised machine learning. Nat Med, 2002; 8(1): 68-74. 57. Hans CP, Weisenburg DD, Greiner TC, Gascoyne RD, et al. Confirmation of the molecular classifitation of diffuse large B cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray. Blood, 2004; 103: 275-282. 58. Kluin P, Schuuring E. Molecular cytogenetics of lymphoma: where do we stand in 2010? Histopathology, 2011; 58(1): 128–144. 59. Siebert R. Mature B- and T-cell neoplasms and Hodgkin lymphomas. In: Heim S, Mitelman F,eds. Cancer Cytogenetics. New York, NY: Wiley-Blackwell; 2009. 60. Siebert R, Rosenwald A, Staudt LM, Morris SW.Molecular features of B-cell lymphoma. Curr Opin Oncol, 2001;13(5): 316-324. 61. Tzankov A, Zlobec I, Went P, et al. Prognostic immunophenotypic biomarker studies in diffuse large B cell lymphoma with special emphasis on rational determination of cut- off scores. Leuk Lymphoma, 2010; 51:199–212. 62. Hyo R, Tomita N, Takeuchi K, et al. The therapeutic effect of rituximab on CD5 positive and CD5 negative diffuse large B cell lymphoma. Hematol Oncol, 2010; 28: 27-32. 63. Saez AI, Saez AJ, Artiga MJ i sur. Building an outcome predictor model for diffuse large B-cell lymphoma. Am J Pathol, 2004;164:613-622. 64. Linderoth J, Jerkeman M, Cavallin-Stahl E, Kvaloy S, Torlakovic E. Immunohistochemical expression of CD23 and CD40 may identify prognostically favorable subgroups of diffuse large B-cell lymphoma: A Nordic Lymphoma Group Study. Clin Cancer Res, 2003; 9: 722-728. 65. Choi WW, Weisenburger DD, Greiner TC, et al. A new immunostain algorithm classifies diffuse large B-cell lymphoma into molecular subtypes with high accuracy. Clin Cancer Res, 2009; 15: 5494–5502. 66. Tagawa H, Suguro M, Tsuzuki S, et al. Comparison of genome profiles for identification of distinct subgroups of diffuse large B-cell lymphoma. Blood, 2005; 106: 1770-1777. 127 67. Ennishi D, Takeuchi K, Yokoyama M i sur. CD5 expression is potentially predictive of poor outcome among biomarkers in patients with diffuse large B-cell lymphomareceiving rituximab plus CHOP therapy. Ann Oncol, 2008; 19:1921-1926. 68. Niitsu N, Okamoto M, Miura I, et al. Clinical Significance of 8q24/c-MYC translocations in diffuse large B cell lymphoma. Cancer Sci, 2009; 100: 233-237. 69. Zhang HW, Cheng NL, Chen ZW, Wang JF, et al. Clinical Impact of t(14;18) in Diffuse Large B-cell Lymphom. Chin J Cancer Res, 2011; 23(2):160-164. 70. Cheson BD, Pfistner B, Juweid ME, et al. Revised response criteria for malignant lymphoma. J Clin Onco,2007; 25:579–586. 71. Kramer MHH, Hermans J, Wijburg E i sur. Clinical Relevance of BCL2, BCL6, and MYC rearrangements in diffuse large B-cell lymphoma. Blood, 1998; 92:3152-3162. 72. Gualco G, Weiss LM, Harrington WJ, Bacchi CE. Nodal diffuse large B-cell lymphomas in children and adolescents: immunohistochemical expression patterns and c-MYC translocation in relation to clinical outcome. Am J Surg Pathol, 2009; 33: 1815- 1822. 73. Ventura RA, Martin-Subero JI, Jones M, et al. FISH analysis for the detection of lymphoma-associated chromosomal abnormalities in routine paraffin-embedded tissue. J Mol Diagn, 2006; 8:141–151. 74. Dang CV. MYC on the path to cancer. Cell, 2012; 149: 22–35. 75. Kluk MJ, Chapuy B, Sinha P, et al. Immunohistochemical detection of MYC-driven diffuse large B-cell lymphomas. PloS one, 2012; 7: e33813. 76. Kim S, Kim H, Kang H, Kim J, et al. Clinical significance of cytogenetic aberrations in bone marrow of patients with diffuse large B-cell lymphoma: prognostic significance and relevance to histologic involvement. J Hematol Oncol, 2013; 6:76. 77. Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death. Nature, 1990; 348: 334-336. 78. Gotow T, Shibata M, Kanamori S, et al. Selective localization of Bcl-2 to the innermitochondrial and smooth endoplasmic reticulum membranes in mammalian cells. Cell Death Differ, 2000; 7: 666-674. 79. Brunelle JK, Letai A. Control of mitochondrial apoptosis by the Bcl-2 family. J Cell Sci, 2009; 122: 437-441. 128 80. Petros AM, Medek A, Nettesheim DG, et al. Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2. Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98: 3012-3017. 81. Gascoyne RD, Adomat SA, Krajewski S, et al. Prognostic significance of Bcl-2 protein expression and Bcl-2 gene rearrangement in diffuse aggressive non-Hodgkin's lymphoma. Blood, 1997; 90: 244-251. 82. De Paepe P, De Wolf-Peeters C. Diffuse large B-cell lymphoma: a heterogenous group of non-Hodgkin lymphomas comprising several distinct clinicopathological entities. Leukemia, 2007; 21: 37-43. 83. Uccella S, Placidi C, Marchet S i sur. Large cleaved and immunoblastic lymphoma may represent two distinct clinicopathologic entities within the group of diffuse large B cell lymphomas. Leuk Lymphoma, 2008; 49: 1321-1328. 84. Schuetz JM, Johnson NA, Morin RD, et al. BCL2 expression in diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia, 2012; 26: 1383-1390. 85. Summers KE, Goff LK, Wilson AG. i sur. Frequency of the Bcl-2/IgH rearrangement in normal individuals: implications for the monitoring of disease in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol, 2001; 19: 420-424. 86. Jager U, Bocskor S, Le T, et al. Follicular lymphomas' BCL-2/IgH junctions containtemplated nucleotide insertions: novel insights into the mechanism of t(14;18) translocation. Blood, 2000; 95: 3520-3529. 87. Wilson KS, Sehn LH, Berry B, et al. CHOP-R therapy overcomes the adverseprognostic influence of BLC-2 expression in diffuse large B cell lymphoma. Leuk Lymphoma, 2007; 48: 1102-1109. 88. Pero R, Palmieri D, Abgrisano T, et al. POZ-, AT-hook-, and zinc finger-containing protein (PATZ) interacts with human oncogene B cell lymphoma 6 (BCL6) and isrequired for its negative autoregulation. J Biol Chem, 2012; 287: 18308-18317. 89. Parekh S, Polo JM, Shaknovich R, et al. BCL6 programs lymphoma cells for survival and differentiation through distinct biochemical mechanisms.Blood,2007;110:2067-2074 90. Basso K, Dalla-Favera R. BCL6: master regulator of the germinal center reaction and key oncogene in B cell lymphomagenesis. Adv Immunol, 2010; 105: 193-210. 91. Shaffer AL, Yu X, He Y, Boldrick J, Chan EP, Staudt LM. BCL-6 represses genes that function in lymphocyte differentiation, inflammation, and cell cycle control. Immunity, 2000; 13(2): 199-212. 129 92. Phan RT, Dalla-Favera R. The BCL6 proto-oncogene suppresses p53 expression ingerminal-centre B cells. Nature, 2004; 432: 635-639. 93. Basso K, Saito M, Sumazin P, et al. Integrated biochemical and computational approach identifies BCL6 direct target genes controlling multiple pathways in normal germinal center B cells. Blood, 2010;115: 975-984. 94. Ueda C, Akasaka T, Ohno H. Non-immunoglobulin/BCL6 gene fusion in diffuse large B- cell lymphoma: prognostic implications. Leuk Lymphoma, 2002; 43:1375-1381. 95. Tiong Ong S, Le Bean MM. Chiromosomal abnormalities and molecular genetics of Non-Hodgkins lymphoma. Seminars in Oncology, 1998; 25: 447-460. 96. Ahmad A, Groshong JS, Matta H, et al. Kaposhis sarcoma associated herpesvirus – encoded viral FLICE inhibitory protein (vFLIP) K13 cooperates with Myc to promote lymphoma in mice. Cancer Biol Ther, 2010;10(10):1033-1040. 97. Bubman D, Guasparri I, Ceserman E. Deregulatin of c-Myc in primary effusion lymphoma by Kaposi‟s sarcoma herpesvirus latency-assotiated nuclear antigen. Oncogene, 2007; 26(34): 4979-4986. 98. Van Rhee F, Stone K, Szmania S, Barlogie B. Castelman disease in the 21st centery: an update of diagnosis, assessment and therapy. Clin Adv Hematol Oncol, 2010; 8(7): 486- 498. 99. Seliem RM, Griffith RC, Harris NL, et al. HHV-8+,EBV+ multicentric plasmoblastic microlymphoma in an HIV+ man: The spectrum of HHV 8+ lymphoproliferative disorders expands. Am J Surg Pathol, 2007; 31(9): 1439-1445. 100. Rowe M, Kelly Gl, Bell Al, Rickinson AB. Burkitt´s lymphoma : the Rosetta Stone deciphering Epstain Barr virus biology.Semin Cancer Biol, 2009; 19(6): 377-388. 101. Salles G, de Jong D, Xie W, et al. Prognostic significance of immunohistochemical biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma: A study from the Lunenburg Lymphoma Biomarker Consortium. Blood, 2011; 117:7070–7078. 102. Tapia G, Lopez R, Muñoz-Mármol AM, et al. Immunohistochemical detection of MYC protein correlates with MYC gene status in aggressive B cell lymphomas. Histopathology, 2011; 59: 672–678. 103. Friedberg WJ. Double-Hit Diffuse Large B-Cell Lymphoma. J Clin Oncol, 2012; 30(28): 3439-3443. 130 104. Klapper W, Stoecklein H, Zeynalova S, et al. Structural aberrations affecting the MYC locus indicate a poor prognosis independent of clinical risk factors in diffuse large B-cell lymphomas treated within randomized trials of the German High-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma Study Group (DSHNHL). Leukemia, 2008; 22: 2226–2229. 105. Savage KJ, Johnson NA, Ben-Neriah S, et al. MYC gene rearrangements are associated with a poor prognosis in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with R-CHOP chemotherapy. Blood, 2009; 114: 3533–3537. 106. Barrans SL, Evans PA, O'Connor SJ, et al. The t(14;18) is associated with germinal center-derived diffuse large B-cell lymphoma and is a strong predictor of outcome. Clin Cancer Res,2003; 9:2133–2139. 107. Copie-Bergman C, Gaulard P, Leroy K, et al. Immunofluorescence in situ hybridization index predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R- CHOP: A GELA study. J Clin Oncol, 2009; 27:5573–5579. 108. Johnson NA, Savage KJ, Ludkovski O, et al. Lymphomas with concurrent BCL2 and MYC translocations: The critical factors associated with survival. Blood, 2009; 114: 2273–2279. 109. Snuderl M, Kolman OK, Chen YB, et al. B-cell lymphomas with concurrent IGH-BCL2 and MYC rearrangements are aggressive neoplasms with clinical and pathologic features distinct from Burkitt lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol, 2010; 34: 327–340. 110. Li S, Lin P, Fayad LE, et al. B-cell lymphomas with MYC/8q24 rearrangements and IGH&BCL2/t(14;18)(q32;q21): An aggressive disease with heterogeneous histology, germinal center B-cell immunophenotype and poor outcome. Mod Pathol, 2012; 25: 145– 156. 111. Bea S, Zettl A, Wright G, et al. Diffuse large B-cell lymphoma subgroups have distinct genetic profiles that influence tumor biology and improve gene-expression-based survival prediction. Blood, 2005; 106: 3183–3190. 112. Klapper W, Kreuz M, Kohler CW, et al. Patient age at diagnosis is associated with the molecular characteristics of diffuse large B-cell lymphoma. Blood, 2012; 119: 1882– 1887. 113. Greenlee RT, Hill-Harmon MB, Murray T, Thun M. Cancer statistics, 2001. CA Cancer J Clin, 2001; 51(1): 15-36. 131 114. Coiffier B, Lepage E, Briere J, et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med, 2002; 346:235-242. 115. Pfreundschuh M. CHOP intensification: not yet state of the art. Lancet Oncol 2013; 14: 445-447. 116. Delarue R, Tilly H, Mounier N, et al. Dose-dense rituximab-CHOP compared with standard rituximab-CHOP in elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma (the LNH03-6B study): a randomised phase 3 trial. Lancet Oncol, 2013; 14: 525-533. 117. Pfreundschuh M, Kuhnt E, Trumper L, et al. CHOP-like chemotherapy with or without rituximab in young patients with good-prognosis diffuse large-B-cell lymphoma: 6-year results of an open-label randomised study of the MabThera International Trial (MInT) Group. Lancet Oncol, 2011; 12: 1013-1022. 118. Tilly H, Dreyling M. Diffuse large B-cell non-Hodgkin's lymphoma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol, 2009; 20(4): 110- 112. 119. Mounier N, Heutte N, Thieblemont C, et al. Ten-year relative survival and causes of death in elderly patients treated with R-CHOP or CHOP in the GELA LNH-985 trial. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2012; 12: 151-154. 120. Habermann TM, Weller EA, Morrison VA, et al. Rituximab-CHOP versus CHOP alone or with maintenance rituximab in older patients with diffuse large B-cell lymphoma. J Clin Oncol, 2006; 24: 3121-3127. 121. Sehn LH, Donaldson J, Chhanabhai M, et al. Introduction of combined CHOP plus rituximab therapy dramatically improved outcome of diffuse large B-cell lymphoma in British Columbia. J Clin Oncol, 2005; 23: 5027-5033. 122. Anderson JR, Armitage JO, Weisenburger DD. Epidemiology of the non-Hodgkin's lymphomas: distributions of the major subtypes differ by geographic locations. Non- Hodgkin's Lymphoma Classification Project. Ann Oncol, 1998; 9: 717-720. 123. Manns A, Sqambati M: Epidemiology and pathogenesis of lymphoid malignancies. In: Annual of lymphoid Malignancies, Martin Dunitz, London, 2001, 1-15. 124. A predictive model for agressive non- Hodgkin ‟s lymphoma. The International Non- Hodgkin‟s Lymphoma Prognostic Factor Project. N Engl J Med, 1993; 329(14): 987-994. 132 125. Nicolaides C, Fountzilas G, Zoumbos N, et al. Diffuse large cell Lymphomas: identification of prognostic factors and validation of the International non –Hodgkin‟s Lymphoma Prognostic Index. A Hellenic Cooperative Oncology Group Study. Oncology, 1998; 55(5):405-415. 126. Wilder RB, Rodriguez MA, Medeiros LJ, et al. International prognostic index- based outcomes for diffuse large B cell lymphomas. Cancer, 2002; 94(12): 3083-3088. 127. Ziepert M, Hasenclever D, Kuhnt E, et al. Standard International prognostic index remains a valid predictor of outcome for patients with aggressive CD20+ B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol, 2011; 28:2373-2380. 128. Charlson ME, Pompei P, Ales KL, MacKenzie CR. A new method of classifying prognostic comorbidityin longitudinal studies: development and validation. J Chronic Dis, 1987; 40(5): 373-383. 129. Oken MM, Creech RH, Tormey DC, et al. Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982; 5 (6): 649–655. 130. Coiffier B, Feugier P, Sebban C, et al. Long term results of the GELA study, R-CHOP vs CHOP in eldery patients with diffuse large B – cell lymphoma. Blood, 2004; 104: 388. 131. Pfreundschuh M, Trumper L, Osterborg A, et al. Randomised intergroup trial of firist line treatment for patients <60 years with diffuse large B –cell non – Hodgkin's lymphoma (DBCL) with a CHOP – like regimen with or without the anti-CD20 antibody rituximab - early stopping after the firist interim analysis. J Clin Oncol, 2004; 22: 6500. 132. Feuger P, Van Hoof A, Sebbanc at al. Long term results of the R-CHOP study in the treatment of eldery patients with diffuse large B-cell lymphoma;a study by the Groupe de, Etude des lymphomes del Adulte. J Clin Oncol, 2005; 23: 4117-4126. 133. Lal A, Bhurgri Y, Vaziri I, Rizvi NB, Sadaf A, Sartajuddin S, et al. Extranodal non- Hodgkin's lymphomas--a retrospective review of clinico-pathologic features and outcomes in comparison with nodal non-Hodgkin's lymphomas. Asian Pac J Cancer Prev, 2008; 9(3):453-458. 134. Miller TP, Grogan TM, Dahlberg S, Spier CM, Braziel RM, Banks PM, et al. Prognostic significance of the Ki-67-associated proliferative antigen in aggressive non- Hodgkin's lymphomas: a prospective Southwest Oncology Group trial. Blood, 1994; 83(6): 1460-1466. 133 135. Jerkmen M, Anderson H, Dictor M, Kvaloy S, et al. Assessment of biological prognostic factors provides clinically relevant information in patients with diffuse large B cell lymphoma; Nordic Lymphoma group study. Ann Haematol, 2004; 83(7): 414-419. 136. Hasselblom S, Ridell B, Sigurdardottir M, Hansson U, et al. Low rather than high Ki-67 protein expression is an adverce prognostic factor in diffuse large B cell lymphoma. Leuk Lymphoma, 2008; 49(8): 1501-1509. 137. Lianos M, Alvarez-Arguelles H, Aleman R, Oramas J, et al. Prognostic significanse of Ki 67 nuclear proliferative antigen, Bcl2 protein, and p53 expression in follicular and diffuse large B cell lymphoma. Med Oncol, 2001; 18(1): 15-22. 138. Colomo L, Lopez-Guillermo A, Perales M, Rives S, et al. Clinical impact of the differentiation profile assessed by immunophenotyping in patients with diffuse large B- cell lymphoma. Blood, 2003; 101:78–84. 139. Lo Coco F, Gaidiano G, Louie DC, et al. p53 mutation are associated with histological transformation of follicular lymphoma. Blood, 1993; 82: 8-14. 140. Reed JC. Bcl-2-family proteins and hematologic malignancies: history and future prospects. Blood, 2008; 111(7): 3322-3330. 141. Iqbal J, Meyer PN, Smith LM, et al. BCL2 predicts survival in germinal center B-cell- like diffuse large B-cell lymphoma treated with CHOP-like therapy and rituximab. Clin Cancer Res, 2011; 17: 7785–7795. 142. Rao PH, Houldsworth J, Dyomina K, et al. Chromosomal and gene amplification diffuse large B cell lymphoma. Blood, 1998; 92: 234- 240. 143. Soures AJ, Leverson DJ, Boghaert RE, Ackler LS, et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nature Medicine, 2013; 19: 202–208. 144. Alas S, Emmanouilides C, Bonavida B. Inhibition of interleukin 10 by rituximab results in down-regulation of bcl-2 and sensitization of B-cell non-Hodgkin's lymphoma to apoptosis. Clin Cancer Res, 2001; 7: 709-723. 145. Muris JJ, Meijer CJ, Vos W, van Krieken JH, et al. Immunohistochemical profiling based on Bcl-2, CD10 and MUM1 expression improves risk stratification in patients with primary nodal diffuse large B cell lymphoma. J Pathol, 2006;208(5):714-23. 134 146. Sjö LD, Poulsen CB, Hansen M, Møller MB, et al. Profiling of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry: Identification of prognostic subgroups. Eur J Haematol, 2007; 79(6): 501-507. 147. Villela L, López-Guillermo A, Montoto S, Rives S, Bosch F, Perales M et al. Prognostic features and outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma who do not achieve a complete response to first-line regimens.Cancer,2001; 91(8):1557-62. 148. Perry AM, Alvarado-Bernal Y, Laurini JA, et al. MYC and BCL2 protein expression predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab. Br J Haematol, 2014; 165: 382–391. 149. Mounier N, Briere J, Gisselbrecht C, Reyes F, et al. Estimating the impact of rituximab on bcl-2-associated resistance to CHOP in elderly patients with diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica, 2006; 91(5): 715-716. 150. Wilson KS, Sehn LH, Berry B, Chhanabhai M, Fitzgerald CA, Gill KK, et al. CHOP-R therapy overcomes the adverse prognostic influence of BCL-2 expression in diffuse large B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma, 2007; 48(6): 1102-1109. 151. Young-Ha Oh and Chan-Kum Park. Prognostic Evaluation of Nodal Diffuse Large B Cell Lymphoma by Immunohistochemical Profiles with Emphasis on CD138 Expression as a Poor Prognostic Factor. J Korean Med Sci, 2006; 21(3): 397-405. 152. Berglund M, Thunberg U, Amini RM, et al. Evaluation of immunophenotype in diffuse large B-cell lymphoma and its impact on prognosis. Mod Pathol, 2005; 18(8): 1113-1120. 153. Lopez-Guillermo A, Colomo L, Jimenez M, et. al. Diffuse large B-cell lymphoma: clinical and biological characterization and outcome according to the nodal or extranodal primary origin. J Clin Oncol, 2005; 23(12):2797-804. 154. Bubman D, Guasparri I, Ceserman E. Deregulatin of c-Myc in primary effusion lymphoma by Kaposi‟s sarcoma herpesvirus latency –assotiated nuclear antigen. Oncogene, 2007; 26(34):4979-4986. 155. Dupin N, Diss TL, Kellam P, et al. HHV -8 is associated with a plasmablastic variant of Castelan disease that is linked to HHV -8 positive plasmablastic lymphoma. Blood, 2000; 95(4): 1406-1412. 156. Van Rhee F, Stone K, Szmania S,et al. Castelman disease in the 21 st centery: an update of diagnosis, assessment and therapy.Clin Adv Hematol Oncol,2010; 8:486-498. 135 157. Seliem RM, Griffith RC,Harris NL, et al.HHV-8+, EBV+ multicentric plasmoblastic microlymphoma in an HIV+ man: The spectrum of HHV 8+ lymphoproliferative disorders expands. Am J Surg Pathol, 2007; 31(9): 1439-1445. 158. Ott G, Rosenwald A, Campo E. Understanding MYC-driven aggressive B-cell lymphomas pathogenesis and classification. Blood, 2013; 122: 3884–3891. 159. Boerma EG, Siebert R, Kluin PM, et al. Translocations involving 8q24 in Burkitt lymphoma and other malignant lymphomas: a historical review of cytogenetics in the light of todays knowledge. Leukemia, 2009; 23: 225–234. 160. Klapper W, Stoecklein H, Zeynalova S, et al. German High-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma Study Group. Structural aberrations affecting the MYC locus indicate a poor prognosis independent of clinical risk factors in diffuse large B-cell lymphomas treated within randomized trials of the German High-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma Study Group (DSHNHL). Leukemia, 2008; 22: 2226–2229. 161. Niitsu N, Okamoto M, Miura I, et al. Clinical features and prognosis of de novo diffuse large B-cell lymphoma with t(14;18) and 8q24/c-MYC translocations. Leukemia, 2009; 23: 777–783. 162. Valera A, Lopez-Guillermo A, Cardesa-Salzmann T, Climent F, et al. MYC protein expression and genetic alterations have prognostic impact in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Haematologica, 2013; 98(10): 1554-1562. 163. Yoon SO, Jeon YK, Paik JH, et al. MYC translocation and an increased copy number predict poor prognosis in adult diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), especially in germinal centre-like B cell (GCB) type. Histopathology, 2008;53:205–217. 164. Rimsza LM, Leblanc ML, Unger JM, et al. Gene expression predicts overall survival in paraffin-embedded tissues of diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP. Blood, 2008; 112: 3425–3433. 165. Tzankov A, Xu-Monette ZY, Gerhard M, Visco C, et al. Rearrangements of MYC gene facilitate risk stratification in diffuse large B-cell lymphoma patients treated with rituximab-CHOP. Modern Pathology, 2014; 27: 958-971. 166. Le Gouill S, Talmant P, Touzeau, et al. The clinical presentation anad prognosis of diffuse large B cell lymphoma with t(14;18) and 8q24/c-Myc rearrangment. Haematologica, 2007; 92(10): 1335-1342. 136 167. Tomita N, Tokunaka M, Nakamura N, et al. Clinicopathological features of lymphoma/leukemia patients carrying both BCL2 and MYC translocations. Haematologica, 2009; 94(7): 935-943. 168. Nitsu N, Okamoto M, Miura I, Hirano M. Clinical features and prognosis of de novo diffusae large B cell lymphoma with t(14;18) and 8q24/c-MYC translocations. Leukemia, 2009; 23(4): 777-783. 169. Kanungo A, Medeiros LJ, Abruzzo LV, Lin P. Lymphoid neoplasmas associated with concurrent t(14;18) and 8q24/c-MYC translocation generally have a poor prognosis. Mod Pathol, 2006; 19(1): 25-33. 170. Snuderi M, Kolman Ok, Chen YB, et al. B –cell lymphomas with concurerent IGH- BCL2 and MYC clinical rearrangmenta are aggressive neoplasmas with clinical and pathologic features distinct from Burkitt lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol, 2010; 34(3): 327-340. 171. Johnson Na, Savage KJ, Luskovski O, et al. Lymphomas with concurrent BCL2 and MYC translocations: the clinical factors associated with survival. Blood, 2009; 114(11): 2273-2279. 172. Oberman EC, Csato M, Dirnhofer S, Tzankov A. Aberations of the MYC gene in unselected cases of diffuse large B cell lymphoma are rare and unpredictible by morfological or immunohistochemical assessment. J Clin Pathol, 2009; 62(8):754-756. 173. Copie-Bergman C, Gaulard P, Leroy K, et al. Immuno-fluorescence in situ hybridization index predicts survival in patients with diffuse large B cell lymphoma treated with RCHOP: a GELA study. J Clin Oncol, 2009; 27(33): 5573-5579. 174. Van Imhoff GW, Boerma EJ, van der Holt B, et al. Prognostic impact of germinal center associated proteins and chromosomal breakpoints in poor risk diffuse large B cell lymphoma. J Clin Oncol, 2006; 24(25): 4135-4142. 175. Johnson NA, Savage KJ, Ludkovski O, et al. Lymphomas with concurrent BCL2 and MYC translocations: The critical factors associated with survival. Blood, 2009; 114: 2273 - 2279. 176. Tibiletti MG, Martin V, Bernasconi B, et al. BCL2, BCL6, MYC, MALT 1, and BCL10 rearrangements in nodal diffuse large B-cell lymphomas: A multicenter evaluation of a new set of fluorescent in situ hybridization probes and correlation with clinical outcome. Hum Pathol, 2009; 40: 645–652. 137 177. Aukema SM, Siebert R, Schuuring E, et al. Double-hit B-cell lymphomas. Blood, 2011; 117: 2319–2331. 178. Green TM, Young KH, Visco C, et al. Immunohistochemical double-hit score is a strong predictor of outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol, 2012; 30: 3460-3467. 179. Johnson NA, Slack GW, Savage KJ, et al. Concurrent expression of MYC and BCL2 in diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone. J Clin Oncol, 2012; 30: 3460–3468. 180. Green TM, Nielsen O, de Stricker K, et al. High levels of nuclear MYC protein predict the presence of MYC rearrangement in diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol, 2012; 36: 612–619.