ФАКУЛТЕТ МЕДИЦИНСКИХ НАУКА УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ Милена Д. Алексић УЛОГА IL-33/ST2 СИГНАЛНОГ ПУТА У ПАТОГЕНЕЗИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИХ ПЕРИАПЕКСНИХ ЛЕЗИЈА ДОКТОРСКА ДИСЕРТАЦИЈА КРАГУЈЕВАЦ, 2015. 1 САДРЖАЈ 1. УВОД .................................................................................................................................4 1.1. Периапексне лезије – дефиниција, етиологија и подела према патохистолошком налазу .....................................................................................................................................4 1.2. Експерименталне периапексне лезије ........................................................................9 1.2.1. Улога и значај цитокина у патогенези периапексних лезија............................ 10 1.2.2. Ефекторске ћелије периапексних лезија ........................................................... 20 1.3. IL-33/ST2 сигнални пут ............................................................................................ 25 1.3.1. Грађа и функција ST2 молекула ............................................................................ 25 1.3.2.Структура и функција IL-33 .................................................................................... 29 2. ЦИЉ РАДА ..................................................................................................................... 33 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ ............................................................................................ 34 3.1. Лабораторијске животиње ............................................................................................ 34 3.1.1. Поступак добијања knock-out мишева ................................................................... 34 3.1.2. BALB/c мишеви са циљаном делецијом гена за ST2 ............................................ 35 3.2. Индукција експерименталних периапексних лезија................................................... 36 3.3. Апликација IL-33 .......................................................................................................... 36 3.4. Патохистолошка анализа експерименталних периапексних лезија........................... 37 3.4.1. Бојење ткивних исечакахематоксилином и еозином (H&E) ................................. 37 3.4.2. Хистоморфометријска анализа периапексног региона ......................................... 38 3.5. Изолација мононуклеарних ћелија из експерименталних периапексних лезија и цервикалних лимфних чворова ........................................................................................... 40 3.6. Анализа мононуклеарних ћелија експерименталних периапексних лезија и дренирајућих лимфних чвора проточном цитометријом ................................................... 41 3.6.1. Бојење мембранских маркера ................................................................................ 42 3.6.2. Интрацелуларно бојење цитокина ......................................................................... 44 3.6.3. Интрацелуларно бојење транскрипционог фактора Foxp3 ................................... 47 3.7. Имунохистохемијска анализа експресије IL-33, ST2 и TRAP молекула у мишјем периапексном ткиву ............................................................................................................ 48 3.8. Имунохистохемијска анализа експресије IL-33 и ST2 молекула у хуманом периапексном ткиву ............................................................................................................ 49 2 3.9. Имунофлуоресцентна анализа ко-експресије IL-33 и ST2 молекула у хуманим периапексним лезијама........................................................................................................ 51 3.10. Статистичка обрада података ................................................................................... 51 4. РЕЗУЛТАТИ ................................................................................................................... 52 4.1. Делеција ST2 гена значајно појачава оштећење алвеоларне кости и интензитет инфламаторног инфилтрата у периапексном региону ....................................................... 52 4.2. Делеција ST2 гена узрокује масовни инфлукс мононуклеарних ћелија у периапексно ткиво и лимфне чворове врата након индукције лезија ............................... 60 4.3. Делеција ST2 гена повећава инфлукс ћелија које продукују про-инфламаторне цитокине у периапексно ткиво и лимфне чворове врата након индукције лезија ............ 69 4.4. Примена IL-33 смањује инфилтрацију CD3+CXCR3+, CD3+CCR6+ и CD4+ ћелија у периапексним лезијама BALB/c мишева ............................................................................ 75 4.5. IL-33 смањује инфлукс ћелија које продукују про-инфламаторне цитокине, а повећава удео CD3+IL-4+ ћелија .......................................................................................... 77 4.6. Експресија IL-33 и ST2 молекула у периапексном ткиву ST2+/+ BALB/c мишева . 80 4.7. Делеција ST2 гена повећава број TRAP-позитивних остеокласта у периапексном региону BALB/c мишева ..................................................................................................... 82 4.8. Експресија IL-33 и ST2 молекула у хуманом периапексном ткиву ............................ 83 4.9. Ko-eкспресија IL-33 и ST2 рецептора у хуманим периапексним лезијама ................ 87 5. ДИСКУСИЈА .................................................................................................................. 88 5.1. Делеција ST2 гена значајно појачава инфламаторну деструкцију експерименталних периапексних лезија ............................................................................................................ 89 5.2. Примена рекомбинантног IL-33 смањује периапексну инфламацију ..................... 100 5.3. Експресија IL-33 и ST2 рецептора у мишјем и хуманом периапексном ткиву ........ 101 6. ЗАКЉУЧЦИ ................................................................................................................. 104 СКРАЋЕНИЦЕ .................................................................................................................... 105 7. ЛИТЕРАТУРА .............................................................................................................. 108 3 Породици за подршку, љубав и стрпљење, менторки проф. др Александри Лукић на несебичној помоћи у свим фазама израде ове дисертације, проф. др Миодрагу Лукићу на инвентивним сугестијама током реализације и уобличавања рада, проф. др Нади Пејновић за кључну помоћ и идеје које су подигле ниво ове докторске дисертације, проф. др Слободанки Митровић за стручну и пријатељску подршку, доц. др Татјани Кањевац за увођење у прве кораке индуковања периапексних лезија, доц. др Гордани Радосављевић, доц. др Ивану Јовановићу и свим колегама и пријатељима из Центра за молекулску медицину и истраживање матичних ћелија на професионалној помоћи током извођења експеримената, технички најзахтевнијој фази овог истраживања, искрено и из срца велико хвала! 4 1. УВОД Предмет докторске дисертације су истраживања функције и значаја IL-33/ST2 сигналног пута на развој и ток експерименталних периапексних лезија. У уводном делу, пре описивања и дискусије добијених резултата, приказане су основне патохистолошке карактеристике периапексних лезија, општи биолошки ефекти IL-33/ST2 сигналног пута, као и имунопатогенетски механизми одговорни за деструкцију и репарацију апексног периодонцијума који могу бити од значаја за разматрање добијених резултата. 1.1. Периапексне лезије – дефиниција, етиологија и подела према патохистолошком налазу Периапексне лезије представљају реакцију периодонталног лигамента на бактеријску инфекцију пулпе корена зуба, која најчешће настаје као последица несанираног каријеса, фрактуре зуба, трауматских оперативних денталних процедура, као и услед дејства јатрогених и других фактора који омогућавају продор микроорганизама у комору пулпе (1). Зубну пулпу најчешће инфицирају патогене анаеробне бактерије Porphyromonas gingivalis, Actinobacilus Acitomycetemcomitans, Prevotella intermedia и Fusobacterium nucleatum. Заступљеност анаероба варира у зависности од степена оштећења крунице, па се осим њих могу наћи и различити сојеви Eubacterium-а, Peptostreptococcus-а, Lactobacilus-а, Staphylococcus-а, Streptococcus-а и Escherichia coli. Сваки микроорганизам који инфицира зубну пулпу има потенцијал да иницира инфламацију периодонталног ткива (2). Периодонтални лигамент je специјализовано везивно ткиво које у потпуности прекрива корен зуба (Схема 1). Осим фибробласта и фиброцита, везиво лигамента садржи и остеобласте, остеокласте, макрофаге, цементобласте, ћелије Маласезових острваца и Шарпејева влакна. Шарпејева влакна се највећим делом састоје од молекула колагена типа I и III, и у зависности од правца пружања и локализације деле на: хоризонтална, коса, периапексна, интер-радикуларна и влакна алвеоларног гребена. Периодонтално ткиво је 5 веома добро васкуларизовано и инервисано. Његова основна функција је фиксирање зуба у алвеоларну чашицу и снабдевање основним хранљивим материјама (3, 4). Инфламаторни процес периапексног ткива јавља се у виду фокалног периодонтитиса, али и комплекснијих инфламаторних лезија као што су грануломи и цисте, при чему пулпитис и некроза зубне пулпе представљају иницијални догађај за настанак и развој периапексних патоза (5). Фокални периапексни периодонтитис карактерише се хиперемијом, васкуларном конгестијом, едемом периодонталног лигамента и екстравазацијом неутрофилних гранулоцита. Интегритет алвеоларне кости, цемента и дентина у овој фази још увек није нарушен. Неутрофиле, поред фагоцитозе, карактерише продукција леукотријена и простагландина. Леукотријен B4 привлачи нове неутрофиле и макрофаге у област инфламације. Mакрофаги продукују бројне медијаторе, међу којима су најважнији про- Схема 1. Периодонтални лигамент. Лонгитудинални пресек другог доњег премолара; en – глеђ (енгл. enamel); de – дентин; pc – пулпа (енгл. pulp cavity); ас – ацелуларни цемент; сс – целуларни цемент; јb – вилична кост (енгл. jawbone); sf – Шарпејева влакна (енгл. Sharpey’s fibers); pdl – периодонтални лигамент; so – секундарни остеон, po – примарни остеон; vc – васкуларни канал; ab – aлвеоларна кост (енгл. аlveolar bone). (LeBlanc and Reisz, PloS One 2013; 8: e74697) 6 инфламаторни цитокини IL-1 (енгл. interleukin-1), IL-6 и TNF-α (енгл. tumor necrosis factor alpha) (6). Леукотријен B4 у комбинацији са простагландином Е2 и I2 активира остеокласте, ћелије одговорне за ресорпцију кости (2, 7-8). Остеокласти се од осталих коштаних ћелија разликују по ђиновским размерама и пореклу, пошто не потичу од остеопотентних ћелија. Претпоставља се да настају фузијом ћелија моноцитно- макрофагне линије. Смештени су на површини коштане масе, у улегнућима која се називају Хаушипове лакуне (енгл. Howship’s lacunae). Цитоплазма остеокласта је „пенушава“ усред високе концентрације везикула и вакуола. Вакуоле садрже лизозоме испуњене киселим фосфатазама, што омогућава карактеризацију ових ћелија различитим имунохистохемијским техникама (9-10). Тартрат резистентна кисела фосфатаза (енгл. tartrate resistant acid phosphatase, TRAP) је важан цитохемијски маркер остеокласта. Њена концентрација у серуму користи се као биохемијски маркер степена ресорпције кости (11). Остали важни маркери остеокласта су: RANK (енгл. receptor activator of nuclear factor κβ), катепсин К, рецептор калцитонина (енгл. calcitonin receptor, CTR), карбокситерминални телопептидни колаген типа 1 (енгл. carboxyterminal telopeptide of type 1 collagen, 1CTP), DAMP (енгл. acidotrophic amine 3-(2,4-dinitroanillino)-3'-amino-N-methyldipropylamine), ED1, E11 маркер, креатинин киназа ВВ, Kat1-антиген и рецептор витронектина (12-21). Открићем RANK сигналног пута направљен је велики продор у разумевању механизама остеокластогенезе и активације ресорпције кости. Остеобласти и стромалне ћелије продукују RANKL (енгл. receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand, такође познат и као ODF/OPGL/TRANCE) и фактор стимулације колонија макрофага (енгл. macrophage colony-stimulating factor, M-CSF, такође познат као colony-stimulating factor-1, CSF-1), молекуле који везивањем за рецептор RANK на површини хематопоетских прекусорских ћелија индукују експресију гена остеокластне линије, при чему настају зрели остеокласти. RANKL стимулише ресорптивну активност и преживљавање зрелих остеокласта. Након успостављања интеракције са RANK-ом овај молекул индукује интрацелуларне сигнале који активирају NF-κB (енгл. nuclear factor kappa-B) и MAP киназе (енгл. mitogen-activated protein kinases). Остеокласти при томе подлежу структурним променама које фацилитирају њихову ресорптивну активност (реаранжирају актински цитоскелет и формирају везу између базалне мембране и површине кости). 7 Синтезом хидролитичких ензима у Хаушиповим лакунама ове ћелије деминерализују коштани матрикс, при чему деградационе продукте (фрагменте колагена, солубилни цалцијум и фосфат) ослобађају у циркулацију (22-23). Остеокластогенезу регулише oстеопротегерин (енгл. оsteoprotegerin, OPG), солубилни протеин који везивањем RANKL-а блокира формирање остеокласта и ресорпцију кости (23). Повећани RANKL/OPG однос (енгл. RANKL/OPG ratio) је индикатор појачане остеокластне активности у коштаним обољењима, као што су постменопаузална остеопетроза, Пеџетова болест, реуматоидни артритис и пародонтопатија (24-26). Ресорпција кости представља једну од главних патолошких промена периапексних лезија и може се детектовати радиографијом зуба (27), хистоморфометријом, испитивањем експресије TRAP-а и одређивањем RANKL/OPG односа. Иницијалну периапексну ресорпцију може да спречи примена индометацина, нестероидног антиинфламаторног лека који инхибира ензим циклооксигеназу и на тај начин спречава синтезу простагландина (28). У случају пролонгираног присуства иритације (бактерија и њихових продуката) периапексни регион инфилтрише све већи број лимфоцита и процес поприма хроничан ток (29). Исход хроничног периапексног периодонтитиса може бити формирање периапексних гранулома или циста (Схема 2). Грануломи настају као одговор организма на антигене резистентне на деловање ефекторских ћелија урођеног имунског одговора. Ови антигени могу бити инфективни агенси или неке супстанце стране организму, а често је антиген непознат као што је случај код саркоидозе. Функција гранулома је стварање баријере за антигене који се не могу елиминисати (30). Патохистолошки, периапексне грануломе чини гранулационо ткиво инфилтрисано ћелијама које покрећу запаљенску реакцију, фибробластима, малим крвним судовима, а често и тракама епителног ткива (2). Већина података о ћелијама запаљенског инфилтрата потиче из претходних имунохистохемијских студија. Резултати ових студија показали су да лимфоцити, неутрофилни гранулоцити и макрофаги представљају предоминантне ћелије у запаљенском инфилтрату (31-33). У току сазревања гранулом мења своје карактеристике. Изграђује га зрело фиброзно ткиво, много сиромашније ћелијским елементима, и развија капсулу од колагених влакана која обухвата цео 8 запаљенски процес и одваја га од кости (34). Истраживања су показала да је више од 50% периапексних гранулома епителизовано (35). Eпителне ћелије у гранулому представљају Маласезове остатке епитела (36). Претпоставља се да током хроничне инфламације епителне ћелије Маласезових острваца, под утицајем цитокина и фактора раста, започињу пролиферацију (37). Eпител у гранулому представљен је у виду усамљених плажа и острваца. У око 15% случајева са епителизацијом настају радиксне цисте (2). Основне патохистолошке карактеристике правих циста су микрошупљина обложена епителом, везивна капсула и инфламирано везивно ткиво. Шупљина цисте садржи некротично ткиво и еритроците, чије присуство се доводи у везу са хеморагијом (34). Епителни покривач микрошупљине је у великој мери инфилтрисан неутрофилним гранулоцитима, док се у везивном ткиву претежно налазе лимфоцити (38). У шупљини и зиду радиксне цисте често су присутни и кристали холестерола, који се уочавају у виду узаних, издужених пукотина. Верује се да воде порекло од распаднутих еритроцита, лимфоцита, макрофага и липида Схема 2. Формирање периапексних лезија – гранулома и циста. Лонгитудинални пресек првог доњег молара; квар (енгл. decay); умртвљени живац (енгл. dead nerve); ширење инфекције (енгл. infection spreads); инфицирани корен и кост (енгл. infected root and bone); гранулом и периапексна циста. (преузето са www.biodentistrydrvizcarra.com) 9 крвне плазме. Радискне цисте код којих кристали холестерола чине највећи део означавају се као периапексни холестеатоми (39). У зависности од присутног клиничког налаза периапексне лезије подељене су на хроничне асимптоматске и хроничне симптоматске. Хроничне лезије могу дуго остати асимптоматске све док се, из неког разлога, не наруши ткивна хомеостаза када микроорганизми из коренског канала прелазе у периапексни простор и процес добија акутни ток. Бол, осетљивост зуба на загрижај и перкусију, локални оток, фистула, супурација и локални лимфаденит су најчешћи налази код пацијената са хроничним симптоматским лезијама (40). Терапија периапексних лезија је апикотомија, тј. хируршко одстрањење инфицираног, апикалног дела корена зуба и присутног периапексног патолошког процеса, гранулома или цисте. Изводи се након ендодонтске припреме зуба (41). Захвати као што је апикотомија омогућују санацију и очување зуба, који би се у противном морали вадити. 1.2. Експерименталне периапексне лезије До данас је публикован велики број радова у којима су периапексне лезије експериментално изазиване различитим животињским врстама, и то: мишевима (42), пацовима (27, 28), мајмунима (43), псима (44) и мачкама (45). Досадашња истраживања нису обухватила испитивање IL-33/ST2 сигналног пута у мишјем моделу периапексних лезија. Овај анимални модел добар је за проучавање динамике и функционално- фенотипске карактеризације локалног хроничног запаљења. Први велики продор у разумевању настанка и развоја хроничних периапексних лезија направљен је још шездесетих година прошлог века, када су Kakehashi и сарадници (46) утврдили да се овакве лезије не могу јавити код експерименталних животиња које се рађају и чувају у стерилним условима, а да се релативно лако индукују стварањем комуникације између зубне пулпе и усне дупље код конвенционално гајених животиња. Периапексна инфламаторна деструкција алвеоларне кости интензивира се након инокулације одређених бактерија у отворену зубну пулпу, као што су Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros и Streptococcus intermedius (47). 10 Највећа експанзија периапексних лезија је у прве две недеље након индукције (активна фаза), са споријом прогресијом после тог периода (хронична фаза) (27). Након две недеље јавља се некроза коронарне пулпе зуба, јака инфламација радикуларне пулпе и умерена инфламаторна деструкција периапексног ткива. Присуство бројних остеокласта дуж руба алвеоларне кости указује на процес ресорпције. Ресорбовани простор испуњава се грануломатозним ткивом богатим инфламаторним ћелијама - неутрофилним гранулоцитима и макрофагима. Неутрофили често формирају апсцес око самог врха корена зуба. Четири недеље након индукције лезија присутна је некроза целе пулпе зуба (коронарне и радикуларне) и јака инфламаторна деструкција периапексног ткива. Број остеокласта у периапексном региону опада, фиброзно ткиво на периферији лезије пролиферише, а у инфламаторним инфилтратима преовлађују мононуклеарне ћелије (48, 49). Да бисмо објаснили механизме одговорне за индуковану периапексну инфламаторну детрукцију, детаљно ћемо описати улогу и значај цитокина и ефекторских ћелија у патогенези периапексних лезија. 1.2.1. Улога и значај цитокина у патогенези периапексних лезија Инфламација је комплексан низ дешавања који обухвата многе типове ћелија које међусобно комуницирају на различите начине. Цитокини су откривени пре око скоро пола века као мали протеини или полипептиди који учествују у међућелијској комуникацији. У патогенези периапексних лезија важну улогу имају хемокини, IL-1, IL-6, TNF-α, RANKL, OPG, IFN-γ, IL-17 и IL-4. Хемокини су велика велика фамилија структурно хомологих цитокина чија је основна улога хемотакса. На основу броја и локације N-терминалних цистеинских остатака класификовани су у две главне субфамилије: СС и СХС. У СС субфамилији цистеински остаци су припојени, док су код СХС хемокина ови остаци одвојени једном аминокиселином. Хемокине синтетишу леукоцити, фибробласти, ендотелне и епителне ћелије. Њихова кључна улога је привлачење неутрофилних гранулоцита и осталих 11 имунокомпетентних ћелија на место инфламације. Поред тога, показано је да утичу на диференцијацију мијелоидних ћелија у остеокласте, што може бити важно за развој пародонтопатије и периапексних лезија (50). Највећи број истраживања до сада фокусиран је на улогу CXCL8 (IL-8) хемокина у периодонтитису. IL-8 пронађен је у деснима на месту деловања бактерија зубног плака уз присуство инфилтрата неутрофилних гранулоцита (51). Lukić и сарадници (52) показали су повишену продукцију IL-8 у хуманим периапексним лезијама, при чему су ниво IL-8 и пропорција неутрофила били значајно виши у групи симптоматских у поређењу са асимптоматским лезијама. Поред хемокина, у периапексним лезијама утврђено је присуство хемокинских рецептора које експримирају Th1 и Th2 субпопулација лимфоцита (53, 54). Присуство хемокинског рецептора Th17 лимфоцитне субпопулације показано је у инфламираном ткиву зубне пулпе (55). Th1 помагачки лимфоцити предоминантно експримирају CXCR3 и CCR5 хемокинске рецепторе, Th17 лимфоцити CCR6 рецептор, док су CCR2 иCCR3 хемокински рецептори присутни на Th2 лимфоцитима.Ови рецептори стимулишу миграцију Th1, Th2 и Th17 помагачких лимфоцита у инфламирана ткива. Silva и сарадници (54) показали су повишену експресију хемокинских рецептора Th2 лимфоцитне субпопулације у ткиву радиксних циста у поређењу са периапексним грануломима. Ови резултати указују на могућ значај Th2 хемокинских рецептора у еволуцији периапексних лезија. IL-1 фамилијa цитокина омогућује нормално функционисање урођене имуности, регулише стечени имунски одговор и посредује у оштећењу ткива у току хроничне инфламације (55). IL-1 продукују макрофаги, неутрофилни гранулоцити, епителне и ендотелне ћелије. Постоје две форме IL-1, IL-1α и IL-1β, које су око 30% хомологе једна другој, имају иста биолошка дејства и везују се за исти ћелијски рецептор. Активна форма IL-1β је секретовани, обрађени продукт, док је IL-1α активан и као прекурсор. IL-1β протеолитички обрађује цистеинска протеаза каспаза 1. Kаспазу-1 активира инфламазом - комплекс протеина чија је кључна компонента NALP3 фамилија (енгл. NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3). IL-1 везује се за мембранске рецепторе који се називају рецептори за IL-1 типа I. Ови рецептори су чланови фамилије интегралних мембранских протеина који садрже екстрацелуларни Ig домен за везивање лиганда и TIR сигнални домен (енгл. Toll- 12 Interleukin receptor domain) на цитоплазматском репу. Укључени су у путеве преноса сигнала који активирају транскрипционе факторе АP-1 (енгл. activation protein 1) и NF-кB (eнгл. nuclear factor кB) (Схема 3) (56). IL-1α испољава низ ефеката на остеобласте и остеокласте који могу бити важни за процес разградње алвеоларне кости. На тај начин остварује значајну улогу у патогенези експерименталних периапексних лезија (57, 58). Како се у екстрацелуларни простор ослобађа из некротичних ћелија, може да има улогу „алармина“ који обавештава имунски систем да постоји деструкција ткива (59). Вероватно делује и као аутокрини фактор раста важан за раст и диференцијацију фибробласта, ендотелних и епителних ћелија (60). Схема 3. Интрацелуларни пренос сигнала са рецептора за IL-1 (IL-1R). Након везивања IL-1 за рецепторски комплекс, који чине рецептор за IL-1 (IL-1R) и помоћни протеин IL-1R (енгл. IL-1R accessory protein, IL-1RAcP), регрутује се MyD88 адапторни протеин који се везује за TIR домен помоћног протеина IL-1R. Затим се регрутује IRAK киназа (енгл. IL-1 receptor associated kinase), која интерагује са TRAF-6 адапторним протеином (енгл. tumor necrosis factor receptor-associated factor 6). Сигнални пут који започиње на овај начин резултира активацијом NF-κB транскрипционог фактора. (Jagadeesh et al. Mol Psychiatry 2010; 15: 384-392) 13 IL-1β је од суштинског значаја у патогенези пародонтопатије и периапексних лезија. IL-1β је нормално присутан у lamina-и propria-и гингиве, при чему макрофаги везивног ткива и малобројне ћелије у епителу експримирају овај цитокин (61). Lee и сарадници показали су да ниво IL-1β расте у гингивалној екстраћелијској течности током развоја гингивитиса узрокованог плаком и активног периодонтитиса (62). У хуманим (63) и експерименталним периапексним лезијама (64) IL-1β стимулише ресорпцију алвеоларне кости. IL-6 је плејотропни цитокин који има значајну улогу и у урођеној и у стеченој имуности. Продукција IL-6 настаје као одговор на микроорганизме и цитокине IL-1β и TNF-α. Продукује га широк спектар имунокомпетентних ћелија - активирани Т лимфоцити, В лимфоцити и мијелоидне ћелије, пре свега макрофаги и дендритске ћелије. IL-6 продукују и неке ћелије које не припадају имунском систему, као што су фибробласти, кератиноцити и ендотелне ћелије. Рецептор за IL-6 припада фамилији рецептора за цитокине типа I. Састоји се од подјединице која везује цитокин и gp130 подјединице која преноси сигнал. Главни сигнални пут IL-6 укључује активацију протеина Jak1 i STAT3 (51). У урођеној имуности IL-6 стимулише синтезу протеина акутне фазе у хепатоцитима и сазревање неутрофила из прогенитора коштане сржи. У стеченој имуности IL-6 регулише пролиферацију и диференцијацију В лимфоцита (65), стимулише диференцијацију наивних CD4+T лимфоцита у правцу Th17 субпопулације (66), а важан је и за диференцијацију дендритских ћелија (67). Поред тога, показано је да учествује у регулацији ендокриних и метаболичких функција, укључујући и ремоделирање кости (68-70). IL-6 стимулише диференцијацију моноцита у остеокласте, и на тај начин утиче на пропадање коштаног ткива током пародонтопатије и хроничног периапексног периодонтитиса. Коришћењем IL-6 дефицијентних мишева којима је индукован периодонтитис и поређењем са контролном групом животиња утврђено је да је пропадање алвеоларне кости слабије изражено у одсуству гена за IL-6 (71). Такође је установљено да периапексне лезије настају брже и знатно су опсежније код IL-6 дефицијентних мишева (72). 14 TNF-α је први пут откривен као цитокин важан у индукцији хеморагијске некрозе тумора, па је назван „фактор некрозе тумора“ (енгл. tumor necrosis factor) (73). Oсновни ћелијски извор TNF-α су макрофаги. Поред њих, TNF-α продукују и лимфоцити, мастоцити, ендотелне ћелије и фибробласти (74). На мембрани ћелија TNF-α експримира се као хомотример, а постоји и секретована форма овог цитокина која има облик тростране пирамиде, при чему сваку страницу пирамиде формира једна подјединица. На бази пирамиде налазе се места за везивање рецептора. Постоје два различита рецептора за TNF-α, рецептори за TNF типа I (TNF-RI, р55) и рецептори за TNF типа II (TNF-RII, р75). Оба рецептора присутна су на готово свим ћелијама у организму (75). Везивање лиганда за TNF-RI рецептор иницира регрутацију адаптерских молекула TRADD, TRAF2 и RIP и активира сигналне путеве посредоване IKK и МАР3K киназама. IKK киназа фосфорилише цитоплазматски протеин IкB, што узрокује његову деградацију и активацију NF-кB. МАР3K киназа фосфорилише и активира JNK киназе, које фосфорилишу c-Jun подјединицу АР-1 транскрипционог фактора и на тај начин га активирају. Везивање TNF-α за TNF-RI рецептор може такође да иницира апоптозу. Интеракција FADD (енгл. Fas-associated DD protein) и TRADD адаптерских молекула иницира регрутацију каспазе-8, што индукује ћелијску смрт. Везивање TNF-α за TNF-RII рецептор иницира регрутацију адаптерског молекула TRAF2, што такође резултира активацијом IKK и МАР3K киназа и транскрипционих фактора NF- кB и АР-1. Активација NF-кB настаје и након активације NIK киназа (енгл. NF-κB-inducing kinase) које интерагују са IKKα и IKKβ, и на тај начин активирају транскрипциони фактор (Схема 4) (76). TNF-α има значајну улогу у бројним биолошким процесима: регрутује неутрофиле и моноците на место инфекције, стимулише ћелије ендотела да секретују хемокине, стимулише секрецију протеина акутне фазе инфламације, главни је медијатор септичког шока, а има и улогу ендогеног пирогена. Ефекат TNF на ендотел и леукоците је кључни фактор у развоју локалних инфламаторних реакција које у склопу аутоимунских болести оштећују ткиво (77). Значајну улогу у патогенези периапексних лезија TNF-α постиже индукцијом продукције матрикс металопротеиназа и стимулацијом диференцијације остеокласта. Поред тога, индукцијом апоптозе фибробласта TNF-α ограничава репарацију ткива у периапексном региону (78). Kawashima и Stashenko (79) показали су да експресија 15 овог цитокина позитивно корелира са разградњом алвеоларне кости, због чега је TNF-α познат и као ресорптивни цитокин кости (енгл. bone resorptive cytokine). Насупрот томе, установљено је да применa анти-TNF-α антитела инхибира продукцију матрикс металопротеиназа и смањује степен периапексне деструкције, чиме остварује протективну улогу у развоју хроничног апексног периодонтитиса (80). RANKL је молекул TNF фамилије који везивањем за рецептор на површини пре- остеокласта промовише њихову матурацију, активацију и преживљавање (22, 81). Присутан је на мембрани активираних Т лимфоцита, остеобласта и стромалних ћелија коштане сржи (82, 83). Поред трансмембранске, постоји и секретована форма коју продукују Т лимфоцити и неке туморске ћелијске линије (84). Главни извор RANKL-а у пародонтопатичном гингивалном ткиву су Т и В лимфоцити (85). Његову експресију и продукцију модулирају разни цитокини (IL-1, IL-6, IL-11, TNF-α), гликокортикоиди и Схема 4. Активација TNF рецептора. Сигнални пут са TNF рецептора активира путеве посредоване IKK и МАР3K киназама, што резултира активацијом транскрипционих фактора NF-кB и АР-1. Везивање TNF-α за TNF-RI рецептор може такође да иницира регрутацију каспазе-8 и на тај начин индукује апоптозу. Поред тога, везивање лиганда за TNF-RII рецептор може да активира и NIK киназе које интерагују са IKKα и IKKβ, и на тај начин активирају NF-кB. (Moelants et al. Immunol Cell Biol 2013; 91: 393-401) 16 паратироидни хормон (86). RANKL има значајну улогу у патогенези коштаних обољења (24-26). У мишјем моделу артритиса показано је да делеција гена за RANKL у значајној мери инхибира губитак кости (87). OPG је солубилни молекул TNF рецепторске фамилије који везивањем RANKL-а инхибира диференцијацију остеокласта, и на тај начин остварује улогу рецептора „мамца“ (енгл. decoy receptor) (88). Продукују га како хематопоетске, тако и нехематопоетске ћелије (89). Продукцију OPG-а модулирају разни цитокини (TNF-α, IL-1, IL-18, TGF-β), гликокортикоиди, хормони (стероидни и паратиреоидни хормон) и простагландини (90). На значајну улогу OPG-а у регулацији активности остеокласта указали су Simonet и сарадници показавши да се код OPG трансгених мишева развија остеопетроза (повећана коштана густина) (91). У периапексним лезијама RANKL/OPG однос (енгл. RANKL/OPG ratio) је кључна детерминанта ресорпције алвеоларне кости посредоване RANKL-ом (92). Овај однос може да буде и индикатор активности лезија. RANKL/OPG однос значајно је већи у активним акутним лезијама, чији је пречник мањи од 5 mm, у поређењу са стабилним хроничним лезијама већег пречника (93). IFN-γ је про-инфламаторни цитокин карактеристичан за Th1 имунски одговор. Продукују га CD4+ и CD8+ T лимфоцити, NK и NKT ћелије. Рецептор за IFN-γ припада фамилији рецептора за цитокине типа II. Састоји се две структурно хомологе подјединице -α подјединице која везује цитокин и β подјединице која преноси сигнал. Oве подјединице удружене су са тирозин киназама Jak1 и Jak2 (енгл. janus kinase). Везивање IFN-γ изазива активацију ових киназа, које затим фосфорилишу два STAT1α молекула (енгл. signal transducers and activators of transcription alpha). Фосфорилисани молекули регрутују се до једрa, где формирају комплекс са GAF активационим фактором (енгл. interferon-gamma activator factor). Настали комплекс се у једру везује за GAS секвенце ДНК (енгл. interferon-gamma activator sequence) које индукују транскрипцију IFN-γ (Схема 5) (94).Посредством рецептора IFN-γ aктивира макрофаге, CD8+ T лимфоците и NK ћелије, утиче на промену класа антитела (IgM у IgG), стимулише продукцију IgG антитела и има важну улогу у апоптози. Заједно са IL-12, кога продукују активирани макрофаги и 17 дендритске ћелије, IFN-γ усмерава поларизацију имунског одговора у Th1 смеру. Уз то, IFN-γ стимулише сопствену продукцију и продукцију TNF-α и IL-2. Супримирајући продукцију IL-4 и IL-10 овај цитокин спречава поларизацију имунског одговора у Th2 смеру (95, 96). IFN-γ има значајну улогу у патогенези многих инфламаторних и аутоимунских болести: хроничне грануломатозне болести црева (97), инфламаторне болести јетре (98), дијабетеса типа 1 (99, 100), аутоимунског тиреоидитиса (101). У периапексним (79) и периодонталним лезијама (102) присутан је у високим концентрацијама и доводи се у везу са најдеструктивнијим облицима болести. У мишјем моделу периодонтитиса изазваног Схема 5. Активација IFN-γ рецептора. Везивање IFN-γ за рецептор узрокује активацију Jak киназа које су придружене α и β подјединици рецептора. Наком активације киназе фосфорилишу два STAT1α молекула, који се затим регрутују до једрa и формирају комплекс са GAF активационим фактором. Настали комплекс се у једру везује за GAS секвенце ДНК које индукују транскрипцију IFN-γ. (преузето са www.bio.davidson.edu) 18 анаеробним микроорганизмима Actinobacillus actinomycetemcomitans (103) и Porphyromonas gingivalis (104) показано је да IFN-γ промовише инфламацију и ресорпцију алвеоларне кости. In vivo истраживања нису потврђенa у in vitro експериментима, који су показали да IFN-γ систематски инхибира формирање остеокласта блокирајући сигналне путеве посредоване RANKL-ом (105). Ови in vitro резултати потврђују ранију хипотезу да Th1 имунски одговор предоминира у стабилним хроничним лезијама, док се Th2 лимфоцити доводе у везу са активним акутним лезијама (106). Данас у научној јавности преовлађује мишљење да проинфламаторни ефекти IFN-γ демонстрирани in vivo ипак имају већу тежину. IL-17 је један од главних медијатора урођене и стечене имуности. Продукују га γδ Т ћелије, CD8+ T лимфоцити, NK ћелије, неутрофилни и еозинофилни гранулоцити, а главни извор овог цитокина је Th17 субпопулација лимфоцита (107, 108). Доминантност Th17 субпопулације или регулаторних Т лимфоцита (енгл. regulatory T cells, Tregs) зависи од количине и односа цитокина који поред TGF-β (енгл. transforming growth factor beta) детерминишу развојни пут наивних Т лимфоцита. TGF-β у присуству IL-6, IL-21 и IL-23 индукује поларизацију имунског одговора у Th17 смеру, док у присуству IL-2 усмерава поларизацију наивних Т лимфоцита у правцу регулаторних Т ћелија (108, 109). IL-17 припада шесточланој фамилији цитокина од којих су највише проучавани IL-17А и IL-17F (110). Рецептори за које се везују, као и сигнални путеви које активирају још увек нису довољно описани. IL-17 има значајну улогу у патогенези многих инфламаторних болести: хроничне грануломатозне болести црева, мултипле склерозе и реуматоидног артритиса (111-113). Већина аутора сматра IL-17 проинфламаторним цитокином, јер делује синергистички са TNF-α и IL-1β и индукује продукцију IL-6 и IL-8 у макрофагима, фибробластима и кератиноцитима (114-116). IL-17 испољава проинфламаторни потенцијал и током пародонтопатије и хроничног апексног периодонтитиса. Делујући синергистички са IFN-γ, TNF-α и IL-1β и индукујући продукцију IL-6 и IL-8 у фибробластима IL-17 повећава експресију матрикс металопротеиназаи RANKL-a и доводи до последичног губитка меких и минерализованих ткива периодонцијума (117, 118). Недавно су Čolić и сарадници (119) указали на присуство IL-17 у периапексним лезијама. Cтимулишући продукцију IL-8 овај 19 цитокин доприноси егзацербацији хроничног запаљења и акутизацији инфламаторног процеса у периапексном региону. IL-4 је кључни цитокин који усмерава поларизацију наивних Т лимфоцита у правцу Th2 субпопулације. Истовремено је и главни је представник ове субпопулације (120). Своје дејство остварује посредством рецептора за IL-4 (IL-4R). Постоје два основна типа oвог рецептора. Рецептор за IL-4 типа 1 (енгл. IL-4R type I) формира се када се α ланац који везује цитокин (IL-4Rα) удружи са заједничким γ ланцем (енгл. common γ chain), док се рецептор за IL-4 типа 2 (енгл. IL-4R type II) формира када се IL-4Rα удружи са α1 ланцем рецептора за IL-13 (IL-13Rα1). Везивање IL-4 за рецептор иницира активацију Jak киназа које фосфорилишу STAT6 молекул. Фосфорилисани молекул регрутује се до једрa, где се везује за секвенце ДНК које регулишу транскрипцију 15-LO, MAO-A и CD36гена (121, 122). Ови гени важни су за биолошке функције IL-4: стимулацију синтезе IgE, учествовање у реакцијама преосетљивости и алтернативној активацији макрофага (123). IL-4 присутан је у инфламираном периодонталном ткиву где остварује протективну улогу и доводи се у везу са обољењем слабијег интензитета (102). У мишјем моделу периодонтитиса показано је да делеција гена за IL-4 повећава пријемчивост на пропадање алвеоларне кости (124). IL-4 слаби интензитет деструктивног периодонтитиса инхибицијом транскрипције информационе РНК (енгл. messenger RNA, mRNA) проинфламаторних цитокина урођене имуности и IFN-γ. Поред тога, IL-4 стимулише продукцију ткивних инхибитора металопротеиназа (енгл. tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) и OPG, и на тај начин инхибира ресорпцију алвеоларне кости (102). 20 1.2.2. Ефекторске ћелије периапексних лезија Главне ефекторске ћелије периапексних лезија су лимфоцити, неутрофилни гранулоцити и макрофаги. Поред њих, важну улогу у патогенези периапексних лезија имају и дендритске ћелије и NK ћелије. Постоје бројни радови o улози Т лимфоцита у настанку и развоју периапексних лезија. Фенотипске анализе указале су на доминацију Т лимфоцита у периапексним инфламаторним инфилтратима и кључну улогу механизама којима целуларна имуност располаже у хроничним запаљенским реакцијама које се одвијају код периапексних лезија (20, 125). Резултати анализе експериментално изазваних гранулома сугеришу на значај квантитативних и квалитативних промена Т лимфоцита у запаљенском инфилтрату. У раним фазама развоја денталних гранулома постоји доминација CD4+ T лимфоцита у односу на CD8+ T лимфоците, док у каснијим фазама постоји тенденција ка инверзији овог односа (126). Квантитативном анализом имунокомпетентних ћелија у периапексним грануломима показано је да су CD8+ T лимфоцити бројнији у дифузним инфилтратима, нарочито у епителио-грануломима, док су CD4+ T лимфоцити бројнији у фокалним (127). Rodini и Lara повезали су однос између CD4+ и CD8+ T лимфоцита са типом хроничне периапексне лезије. Они су у својој студији показали значајно већи број CD8+ T лимфоцита у цистама у поређењу са периапексним грануломима. Налаз CD8+ T лимфоцита у еволутивно развијенијим лезијама, које карактерише стабилизација, довели су у везу са имуносупресивним ефектима ових ћелија (128). Од раније је познато да CD8+ T лимфоцити испољавају цитотоксично дејство секрецијом перфорина и гранзима или посредством лиганда смрти. Перфорини разграђују ћелијску мембрану и праве поре кроз које гранзими улазе у циљну ћелију, активирају каспазе и покрећу апоптозу (129). Од познатијих лиганада и одговарајућих рецептора смрти издвајамо FasL/FasR, TNF-α/TNFR1 и Apo3L/DR3. Они играју важну улогу у преношењу сигнала смрти са ћелијске мембране на интрацелуларни сигнални систем (130- 132). 21 CD4 + T лимфоцити остварују eфекторску функцију у периапексним лезијама продукцијом цитокина. Овe ћелијe су на основу способности да секретују различите цитокине подељене на више функционалних фенотипа: Th1 лимфоцити секретују IFN-γ и TNF-α, који имају значајну улогу у индукцији целуларног имунског одговора, Тh17 лимфоцити продукују IL-17 и на тај начин стимулишу регрутовање неутрофилних гранулоцита и макрофага у инфламирано ткиво, док Th2 лимфоцити (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) и Tregs (TGF-β) продукцијом цитокина супримирају целуларну имуност (133-134). Нумеричка и функционална равнотежа између Th1/Th17 и Th2/Tregs у периапексним инфламаторним инфилтратима одређује обим периапексне деструкције. Th1/Th17 имунски одговор има значајну улогу у прогресији периапексних лезија, док су Th2 лимфоцити и Tregs одговорни за процес репарације у апексном периодонцијуму (135, 136). Akamine и сарадници (136) у својој студији показали су доминацију В лимфоцита у манифестним периапексним лезијама и указали на кључну улогу хуморалне имуности у каснијим фазама развоја болести које карактерише тенденција ка стабилизацији. У хуманим периапексним лезијама идентификоване су различите класе имуноглобулина (IgG, IgM и IgA) како у плазмоцитима, тако и у екстраћелијском простору, при чему су IgG-позитивни плазмоцити били најбројније ћелије (137). Lukić и сарадници (127) су квантитативном анализом заступљености ћелија које експримирају имуноглобулине различитих класа показали доминацију IgG-позитивних ћелија у мононуклеарним инфилтратима, при чему су ове ћелије биле заступљеније у фокалним у односу на дифузне инфилтрате. Појава великог броја В лимфоцита, а нарочито IgG-позитивних ћелија, указује да фокални инфилтрат настаје као последица егзацербације процеса. Постоје подаци и да су IgG-позитивни плазмоцити значајно бројнији у цистама у поређењу са грануломима. Овакав налаз упућује на могућ значај ових ћелија у еволуцији периапексних лезија (138). Неутрофилни гранулоцити представљају „прву линију одбране“ од бактеријских инфекција, те су значајни у патогенези периапексних лезија. У случају да се инфекција из канала корена прошири на периапексни регион неутрофили могу да елиминишу бактерије процесом фагоцитозе (25, 139). Поред протективне, продукцијом различитих медијатора 22 неутрофили остварују значајну улогу и у прогресији апексног периодонтитиса. Продукцијом леукотријена B4 и простагландина Е2 и I2 неутрофилни гранулоцити активирају остеокласте (2, 6, 7). Поред тога, активирани неутрофили продукују про- инфламаторне цитокине (IL-1, IL-6, TNF-α и RANKL) који интензивирају ресорпцију алвеоларне кости и хемотактичке цитокине (IL-8) који су значајни за акутну егзацербацију периапексних лезија (140-142) .Након обављене улоге, неутрофили умиру на месту инфламације где из својих цитоплазматских гранула ослобађају матрикс металопротеиназе, протеолитичке ензиме одговорне за деструкцију екстраћелијског матрикса везивног ткива (143). Резултати ранијих студија показали су да је број неутрофилних гранулоцита значајно већи у симптоматским у поређењу са асимптоматским лезијама, као и да позитивно корелира са бројем макрофага у периапексном региону (135). Присуство макрофага је од изузетне важности у oдбрамбеним реакцијама током иницијације, прогресије и акутне егзацербације хроничних запаљенских лезија. Макрофаги представљају мононуклеарне фагоците чија је примарна функција фагоцитоза. Карактерише их продукција бројних медијатора, међу којима су најважнији леукотријени, простагландини, матрикс металопротеиназе и цитокини (144). Про-инфламаторни (IL-1, IL-6 и TNF-α) и хемотактички цитокини (IL-8) интензивирају деструкцију екстраћелијског матрикса везивног ткива, ресорпцију кости и васкуларне реакције у ткиву (8). Истовремено се појачава синтеза протеина акутне фазе који са IL-6 стимулишу продукцију фактора стимулације колонија гранулоцита и макрофага (енгл. granulocyte- macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) (145). Макрофаги такође имају антиген- презентујућу улогу и значајни су у иницијацији имунских реакција (146). Постоје подаци да је број макрофага значајно већи у лезијама у којима постоји доминација Т лимфоцита у односу на В лимфоците (147). Дендритске ћелије (енгл. dendritic cells, DCs) обезбеђују CD4+ T лимфоцитима антиген-специфични „сигнал 1“ и костимулаторни „сигнал 2“, оба неопходна за активацију и пролиферацију антиген-специфичних Т лимфоцита. DCs обезбеђују и додатни трећи сигнал („сигнал 3“), који усмерава поларизацију стеченог имунског 23 одговора у правцу Th1, Th17, Th2 или Treg лимфоцита (Схема 6) (148). У периапексним лезијама показано је присуство и зрелих и незрелих DCs (135). Бројни медијатори, који су познати као матурациони стимулуси DCs (IL-1β, TNF-α, IL-6, простагландин Е2) присутни су у инфламираном периапексном ткиву где омогућују њихово локално сазревање, које се манифестује експресијом CD83 молекула (2, 149). Већина CD83- незрелих DCs након препознавања антигена у периапексним лезијама прелази у зрео облик и мигрира у регионалне лимфне чворове, где презентује антиген наивним Т лимфоцитима и индукује специфичан целуларни имунски одговор (149). У периапексним лезијама присутне су и плазмоцитоидне DCs (132). Како је познато да ове ћелије као одговор на антигене вирусног порекла секретују велике количине интерферона типа I (енгл. type I IFNs), претпоставља се да имају значајну улогу у патогенези периапексних лезија изазваних вирусима (150, 151). Схема 6. Поларизација CD4+ Т лимфоцита у правцу различитих субпопулација помагачких T лимфоцита посредством дендритских ћелија. Дендритске ћелије обезбеђују CD4+ T лимфоцитима 3 сигнала: антиген-специфични „сигнал 1“ и костимулаторни „сигнал 2“, који су неопходни за активацију и пролиферацију антиген- специфичних Т лимфоцита, и додатни трећи сигнал („сигнал 3“), који усмерава поларизацију стеченог имунског одговора у правцу различитих Th субпопулација. (преузето са www.physrev.psysiology.com) 24 Присуство NK ћелија у хуманим периапексним лезијама показано је још 90-тих година прошлог века. Ипак, и даље је непознато да ли и како ове ћелије утичу на патогенезу апексног периодонтитиса. Претпоставља се да контролишу ширење вирусних инфекција из канала корена зуба у периапексно ткиво (152). Баланс између активационих и инхибиторних рецептора регулише активност NK ћелија (Схема 7) (153). Најзначајнији рецептори NK ћелија су: NKG2D активациони рецептор и KIR (енгл. Killer cell Ig-like receptor) и CD94–NKG2 инхибиторни рецептори (154). Активациони рецептори NK ћелија препознају вирусне, оштећењем индуковане и тумор специфичне лиганде, док инхибиторни рецептори препознају MHC молекуле I класе и њихово ангажовање спречава активацију NK ћелија (155). Препознавање оштећених или „измењених“ ћелија покреће поларизовану егзоцитозу цитоплазматских гранула праћену ослобађањем перфорина и гранзима (129). Схема 7. Цитотоксичност NK ћелија одређена је балансом између инхибиторних и активационих сигнала. Активациони сигнал са оштећених или „измењених“ ћелија покреће егзоцитозу цитоплазматских гранула, праћену ослобађањем перфорина и гранзима. Апоптоза циљне ћелије наступа као последица активности гранзима. Инхибиторни рецептори на NK ћелијама препознају MHC молекуле I класе и њихово ангажовање спречава активацију NK ћелија, односно неангажовање ових рецептора фацилитира NK цитотоксичност. (преузето са www.research.peds.wustl.edu) 25 1.3. IL-33/ST2 сигнални пут Главни циљ планираног истраживања је испитивање улоге и значаја IL-33/ST2 сигналног пута у патогенези периапексних лезија. Зато су у уводном делу детаљно објашњени грађа и функција ST2 молекула и IL-33, као и биолошки ефекти IL-33/ST2 сигналног пута. 1.3.1. Грађа и функција ST2 молекула ST2 ген (познат још и као Т1, DER4 или Fit 1 ген) је члан IL-1R фамилије рецептора који је првобитно идентификован у мишјим фибробластима (156-158). Као и сви остали гени ове фамилије, и ST2 је код мишева локализован на 1. хромозому (159), а код људи на 2. хромозому (160). Транскрипцију ST2 гена контролишу два посебна промотера. „Горњи“ управља транскрипцијом у хематопоетским ћелијама, док „доњи“ промотер регулише експресију у фибробластима (161). Регулација ST2 експресије је еволутивно конзервиран процес, обзиром да поменути промотери контролишу ST2 експресију и код људи и код мишева (162). Различитом транскрипцијом мишјег ST2 гена настају двa молекула информационе РНК: краћи дужине 2,7 kb (кило-базних парова) чијом транслацијом настаје солубилна форма ST2 молекула (sST2), и дужи дужине 5 kb за трансмембранску ST2 форму (ST2L). Хумани ST2 ген, уз ове две формe, кодира и mRNA за варијантну форму ST2 молекула (ST2V) (163). Солубилни ST2 молекул структурно је хомолог са екстрацелуларним регионом ST2L, осим додатних 9 аминокиселина локализованих на C- терминалном крају sST2 молекула (164). Недавно је показано да је ST2L молекул мембрански рецептор за IL-33 (165). Иако је ST2L члан IL-1R фамилије рецептора, он не везује остале чланове IL-1 фамилије цитокина (IL-1, IL-1Rа и IL-18) (166-167). sST2 молекул функционише као тзв. „мамац“ рецептор, који везивањем IL-33 блокира његово дејство у циркулацији (Схема 8) (168). Солубилну форму ST2 молекула стварају многе ћелије у организму: Тh2 лимфоцити, макрофаги, фибробласти, ћелије карцинома дојке, многе ембрионалне ћелије (160, 161, 169-170), док је мембранска форма експримирана на Тh2 лимфоцитима, макрофагима, дендритским ћелијама, NK и NKT ћелијама, мастоцитима, базофилним и еозинофилним гранулоцитима (156, 170-171). 26 Велики број новијих студија указује да је ST2L молекул селективни маркер Тh2 лимфоцита. Yanagisawa и сарадници (172) су 1997. године први показали конститутивну експресију mRNA за ST2L у D10 ћелијској линији мишјих Th2 лимфоцита, док је у Th1 линији није било. На ћелијском нивоу присуство ST2L доказано је на Тh лимфоцитима који после стимулације продукују IL-4, IL-5 или IL-10, док га Тh лимфоцити који продукују IFN-γ и IL-2 не експримирају. Уз то, показано је и да је ST2L стабилно експримиран на мембрани Тh2 лимфоцита који продукују IL-4, док није уочен на Тh1 лимфоцитима који продукују IFN-γ (169). Иако је познато да је IL-4 кључан цитокин који усмерава имунски одговор у Th2 смеру, детекција ST2L молекула на Тh2 лимфоцитима IL-4 дефицијентних мишева указује да је базична експресија овог гена независна од IL-4 (169, 173). Ипак, егзогена апликација рекомбинантног IL-4 интензивира експресију ST2L рецептора и усмерава имунски одговор у Th2 смеру (174, 175). Насупрот томе, додавање IFN-γ, кључног Th1 цитокина, редукује ST2L експресију на Th2 лимфоцитима. IL-4 и IFN-γ остварују антагонистички ефекат на експресију ST2L рецептора модулацијом функције „доњег“ промотера ST2L Схема 8. Трансмембранска и солубилна форма ST2 молекула. ST2L молекул је мембрански рецептор за IL-33. Солубилни sST2 молекул везује IL-33 у циркулацији и на тај начин спречава његово везивање за ST2L рецептор. (преузето са www.biomarkerbliki.org) 27 гена (175). Модулација ST2L експресије преко IL-4 и IFN-γ, главних медиајтора Th2 и Th1 имунског одговора, објашњава селективно присуство ST2L молекула на Th2 лимфоцитима (157). Иако су бројне студије потврдиле да присуство ST2L дискриминише Th2 од Th1 лимфоцита, показало се да је његова примењивост као Th2 маркера ипак ограничена. Постоји субпопулација Th2 лимфоцита које продукују IL-4 и IL-10, у њима је активан транскрипциони фактор GATA3, а на својој мембрани не експримирају ST2L.Ове CD4 + ST2L - IL-4 + IL-10 + GATA3 + ћелије разликују се од осталих Th2 лимфоцита по томе што не продукују IL-5 (176). Експресија ST2 молекула нема никакав утицај на настанак или функцију наивних Т лимфоцита, а важна је за активацију ефекторских Th2 лимфоцита. Trajkovic и сарадници (177) показали су да у централним и периферним лимфним органима здравих ST2+/+ и ST2 -/- мишева нема разлике у броју Th2 лимфоцита који продукују IL-4, IL-5 и IL-10, као и да блокирање ST2 рецептора применом анти-ST2 антитела не мења значајно број ових ћелија. Делеција или блокада ST2 рецептора супримира Th2, а промовише развој Th1/Th17 имунског одговора. На тај начин остварује се протективна или проинфламаторна улога у патогенези различитих болести у зависности од доминантног имунског одговора који је у основи ових обољења. Brown и сарадници (177) показали су да делеција ST2 сигналног пута погоршава дијабетес индукован вишеструким малим дозама стрептозотоцина (енгл. multiple low dose streptozotocin, MLD-STZ), који се развија кроз Тh1/Тh17 имунски одговор, што је потврђено повећањем леукоцитног инфилтрата у панкреасним острвцима. У мишјем моделу карцинома дојке делеција гена за ST2 молекул одлаже појаву тумора и успорава његову прогресију поларизујући имунски одговор у Th1/Th17 смеру (178). Такође, показано је да блокирање ST2 рецептора применом анти-ST2 антитела редукује инфламацију у плућима узроковану респираторним синцицијалним вирусом преусмеравањем штетног Тh2 у заштитни Тh1 имунски одговор (178). Функција солубилног ST2 молекула још увек није у потпуности разјашњена. Познато је да ѕST2 блокира продукцију запаљенских медијатора макрофага (158). Везивање липополисахарида (енгл. lipopolysaccharide, LPS) за ,,рецептор сличан толу 4“ (енгл. Тoll like receptor, TLR4) на мембрани макрофага индукује синтезу и продукцију про- 28 инфламаторних цитокина IL-1β и TNF-α. Ови цитокини у фибробластима индукују синтезу и секрецију sST2 молекула. ѕST2 смањује експресију TLR4 на макрофагима, чиме редукује продукцију про-инфламаторних цитокина IL-1β, TNF-α, IL-6 и IL-12 (Cхема 9). Истовремено, ѕST2 не утиче на продукцију анти-инфламаторних медијатора IL-10, TGF-β, као ни на продукцију азотног оксида (енгл. nitrogen oxide, NO) у истом моделу стимулације LPS-ом (158, 180). Дакле, модулирањем активности макрофага sST2 функционише као механизам „негативне повратне спреге“ за спречавање неконтролисане запаљенске реакције. Поред наведеног, ѕST2 има анти-инфламаторну улогу и у обољењима посредованим Тh2 имунским одговором, као што је астма (181). Везивањем слободног IL-33 солубилни ST2 молекул блокира његово везивање за ST2L рецептор и спречава поларизацију имунског одговора у Тh2 смеру (168). Схема 9. Утицај sST2 молекула на активацију макрофага. Солубилни ST2 молекул смањује експресију TLR4 на макрофагима, чиме редукује секрецију про-инфламаторних цитокина IL-1β, TNF alpha, IL-6 и IL-12 и остварује своје анти-инфламаторно дејство. (Trajkovic et al. Cytokine & Growth Factor Reviews 2004; 15: 87–95) 29 1.3.2. Структура и функција IL-33 IL-33 (познат и као C9ORF26, DVS27, NF-HEV и IL-1F11) први пут је идентификован 2005. године, када су Schmitz и сарадници (165) анализирајући чланове IL-1 фамилије открили лиганд за ST2L који интеракцијом са рецепторским комплексом индукује Тh2 имунски одговор. Овакво деловање IL-33 је у супротности са карактеристикама других цитокина IL-1 фамилије, IL-1 и IL-18, који стимулишу Тh1 имунски одговор. Касније је установљено да је IL-33 идентичан нуклеарнoм фактору венула са високим ендотелом (енгл. nuclear factor of high endothelial venules, NF-HEV), који је повезан са хроматином и регулише транскрипцију, тако да истовремено делује и као цитокин и као нуклеарни фактор (182). Ген за IL-33 локализован је на 9.-ом хуманом, а 19.-ом мишјем хромозому. Ови гени кодирају протеине од 270, односно 266 аминокиселина, молекулске тежине 30 kDa. Између хуманог и мишјег IL-33 постоји 55%-тна структурна хомологија (168). IL-33 конститутивно је екпримиран у многим ткивима (плућа, мозак, кожа, кичмена мождина), при чему су његови главни извори фибробласти, ендотелне и епителне ћелије (180, 183). Код мишева је присутан и у макрофагима, дендритским и глатко- мишићним ћелијама (165, 168). У одсуству про-инфламаторних цитокина и инфламације локализован је у једру, где је за хроматин везан кратким мотивом локализованим на амино крају молекула (N terminus), који је хомологан Херпесвирусном протеину LANA (енгл. latency associated nuclear antigen) (182, 184). Необрађени IL-33 је биолошки активан молекул који своју активност остварује посредством домена сличног IL-1 (енгл. IL-1-like domain) локализованог на карбокситерминалном крају (С terminus). IL-33 се пасивно ослобађа из ћелија након њиховог оштећења или некрозе и алармира имунски систем о постојању деструкције ткива покретањем хемоатракције (185-186). Ослобођени IL-33 се затим ензимски разграђује дејством каспазе-7 и каспазе-3 (187-188), чиме настају биолошки инактивни продукти IL-33. Раније се сматрало да IL-33 тек након ензимске обраде стиче оптималну биолошку активност и да каспаза-1 обрађује про-IL-33, након чега настаје зрела форма IL-33. Међутим, недавно је показано да овај ензим није у стању да обради про-IL-33 (189). 30 IL-33 остварује своје дејство везујући се на мембрани ћелије за хетеродимерни рецепторски комплекс, кога чине ST2 рецептор и IL-1R помоћни протеин (енгл. IL-1R accessory protein, IL-1RAcP). Сигнал се посредством TIR домена IL-1R помоћног протеина и адаптерског myD88 молекула (енгл. myeloid differentiation primary-response protein 88, myD88) преноси унутар ћелије, активирају се IRAK1 иIRAK4 киназе, које затим активирају транскрипциони фактор NF-κB и/или МАР киназе (енгл. mitogen-activated protein kinases, MAPKs), и на тај начин индукују продукцију различитих цитокина и хемокина (Схема 10) (165, 168). Активација NF-κB индукује продукцију IL-1β, IL-3, IL-6, TNF, CXCL2, CCL2, CCL3, PGD2 и LTB4, а активацијом МАР киназа (p38, JNK и ERK) продукују се IL-5, IL-13, CCL5, CCL17 и CCL24 (157). Схема 10. IL-33/ST2 сигнални пут. IL-33 своје дејство остварује везујући се на мембрани ћелије за хетеродимерни рецепторски комплекс кога чине ST2 рецептор и IL-1RAcP. Сигнал се посредством TIR домена IL-1R помоћног протеина и адаптерског myD88 молекула преноси унутар ћелије, активирају се IRAK1 и IRAK4 киназе, које затим активирају МАР киназе и/или NF-κB. Солубилни ST2 може да веже IL-33, чиме спречава његово везивање за мембрански ST2 рецептор. (преузето са www.hindawi.com) 31 Активацију IL-33/ST2 сигналног пута регулише sST2 молекул механизмом негативне повратне спреге. Он се у ћелијама масовно ствара и ослобађа у присуству цитокина и хемокина продукованих након активације IL-33/ST2 сигналног пута. Солубилни ST2 молекул везује слободни IL-33, и на тај начин спречава његово везивање за мембрански ST2 рецептор (190). IL-33 може да модулира функцију свих ћелија које експримирају ST2 рецептор. Као што је већ поменуто, ST2 молекул се специфично експримира на Th2 лимфоцитима и представља важан ефекторски молекул Th2 имунског одговора (169, 172). Уколико се IL-33 делује на наивне Т лимфоците они диференцирају у Th2 лимфоците, чак и у одсуству IL-4 (191). Стимулација ефекторских Th2 лимфоцита IL-33 индукује продукцију IL-4, IL-5 и IL-13 и хемотаксу Th2 лимфоцита (192-193). Недавно је показано да NK и NKT ћелије експримирају ST2 рецептор. Иако је очекивано да изазове Th2 ефекат, третман IL-33 индуковао је продукцију и Th1 и Th2 цитокина у овим ћелијама (192). IL-33 је снажан активатор мастоцита, базофилних и еозинофилних гранулоцита (168). Третирање IL-33 у мастоцитима индукује продукцију IL-5, IL-13, гранулоцитно моноцитног фактора стимулације раста колонија (GM-CSF) иTNF-α, и подстиче сазревање и преживљавање ових ћелија у инфламираним ткивима (194). Базофилни гранулоцити након стимулације IL-33 секретују бројне цитокине, укључујући IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 и GM-CSF (195). Уз то, IL-33 функционише и као хемоатрактант базофила (192, 195). Еозинофилни гранулоцити третирани IL-33 појачано стварају IL-8 и имају продужен „животни век“ (196). IL-33 активира и антиген-презентујуће ћелије. Примена IL-33 амплификује поларизацију алтернативно активираних макрофага и стимулише продукцију CCL17 и CCL24 хемокина (197). Mayuzumi и сарадници (198) показали су да IL-33 подстиче развој дендритских ћелија. Дендритске ћелије добијене након стимулације IL-33 су фенотипски и функционално незреле са смањеним капацитетом активације наивних Т лимфоцита, али могућношћу поларизације имунског одговора у Th2 смеру (199). Обзиром да је ST2 рецептор експримиран на готово свим ћелијама имунског система, као и у многим ткивима и органима, IL-33/ST2 сигнални пут има важну улогу у патогенези бројних болести у којима углавном активација овог пута подстиче развој Th2, 32 и истовремено супримира Th1/Th17 имунски одговор (168). Volarevic и сарадници (200) у својој студији истичу протективну улогу IL-33/ST2 сигналног пута у патогенези Соncavalin-oм А индукованог хепатитиса, која се огледа у значајнијем оштећењу јетре, већем броју мононуклеара у јетри, као и повећању серумских нивоа про-инфламаторних цитокина и већем броју ћелија које продукују TNF-, IFN-и IL-17 код ST2 дефицијентних мишева. Недавно је показано да примена IL-33 инхибира деструкцију хрскавице и системски губитак кости, што указује на потенцијалну терапијску примену овог цитокина у третману ресорпције кости. IL-33 преко ST2 рецептора стимулише продукцију GM-CSF који делује на прекурсоре остеокласта и усмерава их у правцу сазревања алтернативно активираних макрофага (201). Администрација IL-33 ублажава експериментални аутоимунски енцефаломијелитис супресијом Тh1/Тh17 имунског одговора и индукцијом алтернативно активираних макрофага (202). Блокирање ST2 рецептора применом анти-ST2 антитела редукује инфламацију у плућима узроковану респираторним синцицијалним вирусом (179) и индукује резистенцију на бактерију Leishmania major код BALB/c мишева преусмеравањем штетног Тh2 у заштитни Тh1 имунски одговор (203). Коришћење рекомбинантног ST2 фузионог протеина смањује еозинофилну инфламацију дисајних путева и супримира продукцију Тh2 цитокина у мишјем моделу астме, пре свега кроз ометање интеракције IL-33 са ST2 рецептором на Тh2 лимфоцитима (204). Puspharaj и сарадници (205) детектовали су повишене вредности IL-33 у серуму болесника са анафилактичким шоком и доказали да је механизам дејства IL-33 директна индукција дегранулације IgE-сензибилисаних мастоцита преко ST2 рецептора, коју прати ослобађање хистамина, протеаза, про-инфламаторних цитокина и синтеза метаболичких продуката арахидонске киселине (простагландина и леукотријена). Исти аутори детектовали су повећану количину IL-33 mRNA у кожним променама пацијената са атопијским дерматитисом. Како је улога IL-33/ST2 сигналног пута позната у више модела у инфективном имунитету, алергијама и аутоимуности, али није испитивана у патогенези периапексних лезија, сматрали смо да је важно показати да ли делеција гена за ST2 молекул и апликација рекомбинантног IL-33 имају утицаја на развој и ток експериментално изазваних периапексних гранулома. 33 2. ЦИЉ РАДА Основни циљ планираног истраживања је испитивање улоге IL-33/ST2 сигналног пута у патогенези периапексних лезија. У складу са основним циљем постављени су следећи експериментални задаци: 1. Испитати утицај делеције гена за ST2 молекул на обим периапексне деструкције одређивањем површина експерименталних периапексних лезија хистоморфометријским методама; 2. Испитати утицај делеције ST2 гена на интензитет периапексне инфламације одређивањем броја инфламаторних ћелија (неутрофилних гранулоцита, макрофага и лимфоцита) по mm2 индукованих периапексних лезија; 3. Испитати утицај делеције гена за ST2 молекул или стимулације IL-33/ST2 сигналног пута на заступљеност леукоцита у експерименталним периапексним лезијама и регионалним лимфним чворовима; 4. Испитати утицај делеције гена за ST2 молекул или стимулације IL-33/ST2 сигналног пута на процентуалну заступљеност субпопулација Т лимфоцита у индукованим периапексним лезијама; 5. Испитати експресију IL-33 и ST2 молекула у здравом периодонталном лигаменту и индукованом периапексном гранулому ST2+/+ BALB/c мишева, као и у хуманом периапекном ткиву, и то: периодонталном лигаменту, периапексним грануломима и радиксним цистама. 34 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ 3.1. Лабораторијске животиње Ова студија изведена је на мишевима чистог соја BALB/c („wild type“, WT) и мишевима истог соја са циљаном делецијом гена за ST2 молекул („knock-out” или ST2-/- BALB/c), мушког пола, старости 6 до 8 недеља, телесне тежине 15-20 g. ST2-/- мишеви добијени су из Центра за биомедицинска истраживања Универзитета у Глазгову, љубазношћу проф. др Liew-a (FY, Glasgow Biomedical Research Centre, United Kingdom), док су WT мишеви уступљени са Института за медицинска истраживања Војномедицинске Академије (ВМА) у Београду. Све животиње одгајане су под стандардним условима у виваријумима Центра за молекулску медицину и истраживањe матичних ћелија Факултета медицинских наука Универзитета у Крагујевцу. 3.1.1. Поступак добијања knock-out мишева Knock-out мишеви поседују један или више нефункционалних гена. Они представљају идеалан анимални модел за проучавање гена чија функционалност још увек није довољно разјашњена или је сасвим непозната. Методологија стварања knock-out мишева се заснива на уношењу путем вектора страног, нефункционалног, хомологог гена у ембрионалне матичне ћелије са циљем хомологе рекомбинације и замене функционалног гена нефункционалним. У току хомологе рекомбинације долази до замене гена између пара хомологих секвенци два молекула ДНК које имају сличне или идентичне нуклеотиде (206- 207). У даљем поступку селекционишу се само ћелије у којима се одиграла жељена рекомбинација. Вектор садржи и два додатна гена за контролу рекомбинације: Neo ген, носилац резистенције на неомицин и ТК ген, ген за вирусну тимидин киназу (208-209). Вектор се убацује у културу ћелија гајених у медијуму који садржи неомицин, као и ganciklovir или FIAU (енгл. 1-(29-deoxy-29-fluoro-1-β-D-аrabinofuranosyl)-5-iodo-uracil) који се под утицајем тимидин киназе метаболишу у токсични продукт. Neo ген се увек уграђује у геном ћелије, док се ТК ген исказује само када се не догоди хомолога 35 рекомбинација. Ћелије резистентне на неомицин, а са активним ТК геном биће уништене помоћу ganciklovir-а или FIAU. Међутим, преживеће све ћелије у којима се одиграла хомолога рекомбинација јер ће бити резистентне и на неомицин и на ganciklovir или FIAU (208-209). 3.1.2. BALB/c мишеви са циљаном делецијом гена за ST2 Хомозиготни ST2-/- мишеви дизајнирани су у лабораторији проф. др Мекензија (Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, United Kingdom) векторским искључењем T1/ST2 гена. Вектор је тако конструисан да унесе ген одговоран за резистентност на неомицин између дефинисаних места: XbaI на четвртом и BamHI на петом егзону T1/ST2 гена, и на тај начин уклони већи део четвртог и петог егзона. Вектор има 5,1 kb (кило-базних) парова који обезбеђују 5ʼ хомологију и 2 kb пара који обезбеђују 3ʼ хомологију са ендогеним T1/ST2 геном. Хомологи крајеви направљени су PCR техником (енгл. Polymerase Chain Reaction), коришћењем Pfuturbo полимеразе (Stratagene). Хомологи 5ʼ крај инсертованог гена добијен је помоћу нуклеотида: 5ʼ-AGTGCATC- TAGAGATACTGATGAGGCACC и 5ʼ-CTTCTTTCTAGATTATTCAAGTTGGGGCTAT- TAAAAGAAGCC, а хомологни 3ʼ крај помоћу нуклеотида: 5ʼ-CCACCGGATCCT- TCACAGTTGAAGGTAAGCTCTTGGCTTCAACAAGGG и 5ʼ-GGAAGGAAAAAAGC- GGCCGCGATCTCGCTCCACAGAGATGAGGAACGGCC. Вектор је линеаризован и инсертован у E14.1 ембрионалне матичне ћелије (Аlberts et al., 2007). Од 1600 G418- резистентних клонова потврђених Southern анализом помоћу пробе А, свега 5 је имало коректно инсертован ген. Проба А је направљена PCR техником, помоћу прајмера: 5ʼ- TACGTAACCTCCCA-TGTGCAGTCCTTGCTGCC и 5ʼ-GTCACATCACAGGCATGAGGG. Хибридизацијом са пробом за секвенцу резистентну на неомицин потврђена је величина инсертованог сегмента као и присуство само једне инсерције. Затим су, у циљу стварања химера, две од третираних ембрионалних матичних ћелија убризгане у 3,5 дана старе бластоцисте добијене из BALB/c мишева. Овако добијени мишеви укрштани су са BALB/c мишевима и генотип ембрионалних матичних ћелија је преношен на потомство. Хомозиготи за нефункционалан T1/ST2 ген добијени су у наредним генерацијама инцестним спаривањем хетерозигота. 36 У овако добијеним ST2-/- мишевима није детектована разлика у броју ћелија крви у односу на ST2+/+ мишеве. Уз то, анализиране су и субпопулације лимфоцита у тимусу, слезини и лимфним чворовима, и показано је да је нема разлике у укупном броју лимфоцита, као и у односу CD4+/CD8+ ћелија код ST2-/- и код ST2+/+ мишева (210). 3.2. Индукција експерименталних периапексних лезија Периапексне лезије изазиване су излагањем зубне пулпе мандибуларних молара мишева деловању микроорганизама усне дупље. Мишеви су анестезирани интраперитонеалним убризгавањем следеће комбинације анестетика: кетаминхидрохлорид (енгл. ketaminhydrochlorid; Richter Pharma AG, Wels, Austria; 60 mg/kg телесне тежине) и ксилазин (енгл. xylazine; Lloyd Inc, USA; 10 mg/kg телесне тежине) растворени у стерилном PBS-у (енгл. phosphate-buffered saline), при чему је укупан волумен ињекције износио 100 μl. Након анестезирања, мишеви су фиксирани на постоље за интервенције, а затим је зубна пулпа мандибуларног првог и другог молара отворена уз помоћ техничког микромотора (W&H Dentalwer, Bürmoos, Austria) са ¼-ским округлим денталним карбидним сврдлом. Величина експозиције била је пропорционална дијаметру радног дела сврдла. Да је канал отворен проверено је Кер иглом величине 8. Са циљем убрзавања настанка лезија мишеви су добијали перорално 10%-ни раствор глукозе (Zorka Pharma, Šabac, Serbia) прве две недеље након индукције у периоду од 14h до 9h. 3.3. Апликација IL-33 У експериментима у којима je испитан утицај примене IL-33 на развој периапексних лезија коришћен је мишји рекомбинантни IL-33 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USА; 1 μg/ињекцији)ресуспендовану PBS-уса 1% BSA (енгл. bovine serum albumin; Sigma, USA). Укупан волумен ињекције износио је 100 μl. Групи WT мишева на BALB/c подлози, изабраној насумичним избором, након индукције лезија интраперитонеално је убризган IL-33 у четири термина: трећег, шестог, деветог и дванаестог дана експеримента. Животиње су жртвоване 14.-ог дана експеримента. 37 3.4. Патохистолошка анализа експерименталних периапексних лезија Мишеви су жртвовани у атмосфери засићеној диетилетром (BETA HEM, Београд) 14.-ог и 28.-ог дана експеримента, након чега су им изоловане мандибуле. Маказицама је уклоњено околно меко ткиво и направљен пресек између доњих централних секутића, тако да се добију хеми-мандибуле. Леве хеми-мандибуле фиксиране су у 4%-тни формалдехид у трајању од 24 часа. Након тога, ткиво је испрано текућом водом, потопљено у декалцинат (3%-тна мравља киселина) и остављено у циљу деминерализације кости. Након 24 часа ткиво је извађено из декалцината, испрано текућом водом и укалупљено у парафин. Лонгитудинални пресеци дебљине 4 μm добијени су коришћењем микротома. Од сваког миша обојен је сваки четврти пресек хематоксилин- еозин (hematoxylin-eosin, H&E) методом. Пресеци који обухватају круницу и дистални корен мандибуларног првог молара и истовремено пролазе кроз апикални форамен изабрани су за патохистолошку и хистоморфометријску анализу периапексних лезија. 3.4.1. Бојење ткивних исечака хематоксилином и еозином (H&E) Уследило је бојење парафинских ткивних пресека методом хематоксилин-еозин. На почетку су плочице са ткивним пресецима загрејане у термостату на температури од 58ᵒС у трајању од 60 минута. Након тога уследила је депарафинизација потапањем ткивних исечака у ксилол 2 пута по 10 минута. Рехидратација је постигнута потапањем ткивних исечака у серију опадајућих концентрација алкохола, и то следећим редом: 10 минута у апсолутном алкохолу, 10 минута у 96%-тном алкохолу, затим 1 минут у 86%-тном алкохолу, након чега су исечци испирани 5 минута у дестилованој води. Након испирања плочице са ткивним исечцима потопљене су 4 минута у Mayer-ов хематоксилин (Merck). Потом су ткивни исечци испирани 1 минут у текућој води и најзад су бојени алкохолним еозином (Merck) у трајању од 3 минута. Након бојења уследила је дехидратација исечака како би се у њима уклонила вода. Другим речима, исечци су потапани у серију растућих концентрација алкохола: најпре 1 минут у 86%-тном алкохолу, затим 10 минута у 96%- тном алкохолу и на крају 10 минута у апсолутном алкохолу. Након бојења и дехидратације уследио је поступак просветљавања када су исечци потпљени 10 минута у мешавину ксилола и алкохола у односу 1:1, а затим два пута по 10 минута само у ксилолу. 38 На крају је на ткивне исечке нанет Канада балзам (Canada balsam, Centrohem, Србија) и прекривена су покровним стаклима. Препарати су анализирани под светлосним микроскопом након 24-часовног сушења. 3.4.2. Хистоморфометријска анализа периапексног региона Хистоморфометријска анализа периапекног региона обухвата следеће параметре: дебљину периодонталног лигамента, ресорпцију алвеоларне кости у периапекном региону лезија и интензитет периапексног инфламаторног инфилтрата. Дебљина периодонталног лигамента и ресорпција алвеоларне кости анализирана је коришћењем програма Autodesk AutoCAD 2010. Препарати су, након бојења хематоксилин- еозином, посматрани светлосним микроскопом (Olympus BX51, Јаpan; увећање 100х) и фотографисани дигиталним апаратом. Поље које обухвата простор периодонталног лигамента, тј. простор разграђене алвеоларне кости у периапексном региону обележено је у Paint-у (Слика 1.А), након чега су фотографије пребачене у екстензију Autodesk AutoCAD 2010.dxf file коришћењем програма Img2 CAD. Пре приступања мерењу периапексног региона одређена је вредност референтне линије у програму Autodesk AutoCAD 2010 (Scale=1.0000). Затим су новокреирани dxf фајлови отворени у AutoCAD-у (Слика 1.В) и коришћењем опције ,,polylinе” означени периапексни региони (Слика 1.С). Помоћу опције „Hatch“ региони су маркирани, а селекцијом графираних региона одређена је њихова вредност (Слика 1.D). Резултати су претворени у μm 2 множењем односа ,,polylinе” регион/референтна линија са квадратом праве вредности референтне линије (Scale=100 μm). 39 На основу добијених резултата осми шљени су и публиковани (211) критеријуми за градирање експерименталних периапексних лезија код мишева. Ново-дизајнирани градациони критеријуми представљају значајну предност у односу на до сада описане дескриптивне методе (блага, јака и екстензивна деструкција алвеоларне кости у периапексном региону) (212-213), јер искључују субјективност, редукују могућност прављења грешки и олакшавају нумеричку презентацију података. Статистичком анализом одређени су квартили 25% и 75% и медијана 50% од података из свих експерименталних група што је омогућило градацију периапексних лезија, и то на следећи начин: Схема11. Семи-квантитативни метод за одређивање површине периапексног региона. (А) Обележавање периапексног региона у програму Paint; (B-D) Meтод рада у програму Autodesk AutoCAD 2010. (Velickovic et al. Ser J Exp Clin Res 2013; 14: 71- 76.) 40 Градус 0 – Нормална хистологија. Простор здравог периодонталног лигамента; Градус 1 – Блага ресорпција периапексне алвеоларне кости. Периапексни регион заузима мање од 25% просечне вредности периапексних лезија; Градус 2 - Умерена ресорпција периапексне алвеоларне кости. Периапексни регион заузима 25%-50% просечне вредности периапексних лезија; Градус 3 - Јака ресорпција периапексне алвеоларне кости. Периапексни регион заузима 50%-75% просечне вредности периапексних лезија; Градус 4 - Екстензивна ресорпција периапексне алвеоларне кости. Периапексни регион заузима више од 75% просечне вредности периапексних лезија. Интензитет периапексног инфламаторног инфилтрата одређен је коришћењем светлосног микроскопа Nikon Eclipse 50i и припадајућег програма NIS Elements D, Version 2.30. Репрезентативни пресеци посматрани су на увеличању 600х, при чему је периапексни регион подељен виртуелном мрежом у поља димензија 10 х 10 μm. У сваком од ових поља одређен је број инфламаторних ћелија (неутрофилних гранулоцита, макрофага и лимфоцита) за сваки пресек појединачно. Затим је израчунат просечан број појединих ћелијских типова по mm2 периапекних лезија. 3.5. Изолација мононуклеарних ћелија из експерименталних периапексних лезија и цервикалних лимфних чворова Четрнаестог и двадесет осмог дана од отварања пулпе мандибуларних молара мишеви су жртвовани у атмосфери засићеној диетилетром (BETA HEM, Београд), након чега су им изоловане десне хеми-мандибуле и цервикални лимфни чворови. Са хеми-мандибула маказицама је уклоњено околно меко ткиво, а затим је пажљиво под хируршким микроскопом уз помоћ скалпела и кирете изоловано периапексно ткиво које окружује коренове првог и другог мандибуларног молара са околном кости у блоку. Изоловани блокови кости пребачени су у епрувете од 50 ml уз додавање 5 ml медијума за дигестију који садржи 1 mg/ml колагеназе типа IV (енгл. collagenase type IV; Life Technologies, Carlsbad, United States), 100 μl говеђег феталног 41 серума (енгл. fetal bovine serum, FBS; Sigma-Aldrich, USA) и 25 μl EDTA (eнгл. еthylenediaminetetraacetic acid; Sigma-Aldrich, USA) и третирани 60 минута на 37ᵒС. Издвојене периапексне ћелије заједно са блоковима кости пребачене су у епрувете од 10 ml и центрифугиране на 1500 rpm 10 минута, након чега је одливен супернатант, талог ресуспендовали у 5 ml комплетног RPMI-1640 медијума (који садржи GlutaMax 1,25mM, HEPES i 10% FCS), добро извортексован и пропуштен кроз ћелијско сито (енгл. cellstrainer, BDPharmingen, USA). Раздвојене ћелије центрифугиране су на 1500 rpm 10 минута, након чега је одливен супернатант и талог ресуспендовали у 1 ml комплетног RPMI-1640 медијума. Поступак изолације ћелија из цервикалних лимфних чворова изведен је на следећи начин: најпре су клипом шприца хомогенизовани лимфни чворови и пропуштени кроз ћелијско сито у епрупету од 10 ml уз додавање 4 ml медијума који садржи 10 % FBS-а. Овако раздвојене појединачне ћелије центрифугиране су на 1500 rpm 5 минута. Затим је одливен супернатант и талог ресуспендован у 1 ml медијума са 10 % FBS-а. 3.6. Анализа мононуклеарних ћелија експерименталних периапексних лезија и дренирајућих лимфних чвора проточном цитометријом Применом проточне цитометрије одређена је релативна, односно процентуална заступљеност и апсолутан број мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама и цервикалним лимфним чворовима WT и ST2-/- мишева. Одређен је проценат и број различитих субпопулација Т лимфоцита, В лимфоцита, NK, NKT ћелија, макрофага, дендритских и мијелоидних ћелија. Уз то, испитиван је и функционални фенотип Т лимфоцита. Анализа је рађена на свеже изолованим мононуклеарним ћелијама периапексних лезија и дренирајућих лимфних чворова. Након изолације, приликом бројања ћелија, одређивана је вијабилност ћелија помоћу trypan blue-a под светлосним микроскопом и у свим експериментима вијабилност је износила између 90% и 95%. 42 3.6.1. Бојење мембранских маркера У идентификацији мембранских маркера за фенотипизацију и одређивање функционалног фенотипа субпопулација мононуклеарних ћелија периапексних лезија и дренирајућих лимфних чворова примењена су анти-мишија моноклонска антитела различите специфичности (Табела 1). Табела 1. Примарно коњугована моноклонска антитела за проточну цитометрију Специфичност антитела Обележивач Клон Изотип Произвођач CD3e PE 145-2C11 IgG eBioscience CD4 PerCP- Cy™5.5 RM4-5 IgG2a,κ eBioscience CD4 FITC RM4-5 IgG2a,κ eBioscience CD8a FITC 53-6.7 IgG2a,κ eBioscience CD8a APC 53-6.7 IgG2a,κ BDPharmingen CD19 FITC 1D3 IgG2a,κ BDPharmingen CD335 (NKp46) PerCP- Cy™5.5 29A1.4 IgG2a,κ BDPharmingen F4/80 FITC BM8 IgG2a,κ BioLegend CD11c PE HL3 IgG1, λ2 BDPharmingen CD11b PerCP- Cy™5.5 M1/70 IgG2b,κ BDPharmingen CD183 (CXCR3) PerCP- Cy™5.5 CXCR3-173 IgG eBioscience CD196 (CCR6) APC 39-2L17 IgG BioLegend Процедура бојења површинских маркера изведена је на следећи начин: На 1 х 106 мононуклеарних ћелија ресуспендованих у 50 μl пуфера за бојење (енгл. Staining buffer; BD) додата је одговараућа количина примарно коњугованих моноклонских антитела обележених различитим флуоресцентним бојама у следећим комбинацијама: 43 1. CD3e PE, CD4 FITC, CD8a APC 2. CD3e PE, CD183 (CXCR3) PerCP- Cy™5.5, CD196 (CCR6)APC 3. CD19 FITC, CD3e PE, CD335 (NKp46)PerCP- Cy™5.5 4. F4/80 FITC, CD11c PE, CD11b PerCP- Cy™5.5, CD8a APC 5. CD3e PE, CD183 (CXCR3) PerCP- Cy™5.5, CD196 (CCR6)APC, RANKL FITC Moнонуклеарне ћелије изоловане из периапексних лезија и цервикалних лимфних чворова су такође инкубиране и са одговарајућим изотипским контролама (Табела 2). Бојење изотипским контролама помаже да се разграничи специфично од неспецифичног бојења. Сва антитела за површинско бојење, као и изотипске контроле, коришћена су у таквим концентрацијама да њихова финална разблажења у суспензији мононуклеара (V≈80 μl) буду 1:100. Затим је талог ћелија са антителима краткотрајно вортексован и онда је уследила инкубација са примарним антителима у мраку на температури од +4˚C у трајању 20 минута. По истеку инкубације са примарно необележеним анти-RANKL антителoм (goat anti-RANKL, sc-7628; Santa Cruz Biotechnology, USA) уследила је инкубација са секундарним антителом (donkey anti-goat IgG-B (biotin), sc-2042, Santa Cruz) у концентрацији 1:400 у мраку на температури од +4˚C у трајању од 20 минута. Ћелије су затим "опране" додавањем 1,5 ml хладног пуфера за бојење (енгл. Staining Buffer, BD) и центрифугиране 5 минута на 2000 rpm. Потом је одливен супренатант и талог ћелија је ресуспендован у 350 µl пуфера за бојење. Непосредно након процедуре бојења ћелије су анализиране на проточном цитометру FACSCalibur (BD) помоћу CELLQUEST софтвера (BD). За цитометријску анализу коришћен је регион (енгл. Gate) мононуклеарних ћелија у FSC/SSC плоту. Регистровано је најмање 10000 догађаја у свакој цитометријској анализи. Подаци су анализирани помоћу CELLQUEST софтвера (BD) и Flowing 2.5 софтвера (Informer Technologies). 44 Taбела 2. Изотипске контроле Назив антитела Обележивач Клон Изотип Произвођач Hamster Isotype Control PE B81-3 IgG2a, κ BDPharmingen Rat Isotype Control FITC R35-95 IgG2a, κ BDPharmingen Rat Isotype Control APC R35-95 IgG2a, κ BDPharmingen Rat Isotype Control PerCP-Cy™5.5 R35-95 IgG2a, κ BDPharmingen Rat Isotype Control FITC B39-4 IgG1 λ BDPharmingen Табела 3. Карактеристике флуоресцентних обележивача назив флуорохрома ексцитациона таласна дужина емисиона таласна дужина напомена PE (Phicoerythrin) 488nm 575nm жути емитер FITC (Fluorescein isothiocyanate) 495nm 520nm зелени емитер APC (Allophycocyanin) 650nm 660nm црвени емитер PerCP-Cy™5.5 488nm 695nm црвени емитер 3.6.2. Интрацелуларно бојење цитокина Бојење интрацелуларних цитокина изведено је по BD Cytofix/CytopermTM методи. Литературни подаци упућују да се за добијање ћелија које продукују цитокине користе различите in vitro методе (214-221). Углавном се користе различити поликлонски активатори за индукцију и карактеризацију цитокин/хемокин-продукујућих ћелија. У ове активаторе спадају: конканавалин А (Con-A), фитохемаглутинин, стафилококни ентеротоксин β, липополисахарид (LPS), моноклонска антитела специфична за TCR/CD3 45 комплекс (са или без антитела на костимулаторне рецепторе, као што је CD28) и естри форбола са калцијум јонофором (енгл. phorbolesterspluscalciumionophore). У овом истраживању ћелије су стимулисне са форбол миристат ацетат-ом (енгл. Phorbol 12-myristate 13-acetate, РМА; Sigma) и јономицин-ом (енгл. Ionomycin; Sigma). Ово су веома моћни активатори који покрећу активност протеин киназе С (енгл. Proteinkinase C, PKC) и инфлукс јона калцијума у ћелију, што индукује експресију цитокина у ћелији претходно активираној физиолошким стимулусима (Pala et al., 2000). Инкубациони период од 4-6 часова је адекватан за индукцију већине цитокина. Дуже инкубације карактерише интензивнији цитопатогени ефекат поменутих активатора. Препоручује се да се током in vitro стимулације ћелија користе инхибитори интрацелуларног транспорта протеина. BDGolgyStopTM (садржи моненсин) и BDGolgyPlug TM (садржи брефелдин А) су инхибитори које препоручује BDCytofix/Cytoperm TM протокол. Поменути ихнибитори блокирају интрацелуларни транспорт што резултира акумулацијом већине цитокина у ендоплазматском ретикулуму или Голџи комплексу. Ово повећава могућност детекције ћелија које продукују цитокине. Како и моненсин и брефелдин А имају дозно и временски зависан цитотоксични ефекат, излагање ћелија овим агенсима мора бити ограничено. Инкубације са поменутим инхибиторима дуже од 12 часова су токсичне за ћелије. Управо зато, ради повећања могућности детекције ћелија које продукују цитокине коришћени су BD GolgyStopTM и BDGolgyPlugTM према BDCytofix/CytopermTM протоколу. 3.6.2.1. Стимулација ћелија in vitro Једноћелијске суспензије периапексних лезија и цервикалних лимфних чворова (1x10 6 /ml) суспендоване су у комплетном медијуму и инкубиране на 37ᵒС у присуству 5% СО2. У суспензију су додати форбол миристат ацетат (енгл. Phorbol 12-myristate 13-acetate, РМА; Sigma; 50ng/ml) и јонофор (Ionomycin, Sigma; 500 ng/ml). Након два сата инкубације додат је BDGolgyStopTM (0,7 μl/ml), што блокира секрецију цитокина и повећава њихову интрацелуларну акумулацију. После шест сати инкубације, два сата само са активаторима, а следећа четири сата са активаторима и инхибиторима транспорта, ћелије су опране и ресуспендоване у комплетном медијуму, а потом пребачене у пластичне епрувете 46 (FALCON round-bottom test tubes, BD) за имунофлуоресцентно бојење. Током бојења и чувања, ћелије су држане на температури +4°С, у мраку. 3.6.2.2. Бојење мембранских антигена Епитопи површинских молекула могу бити оштећени фиксацијом и пермеабилизацијом, па је површинско бојење увек боље обавити пре фиксације ћелија. Тако је на 1х106 ћелија ресуспендованих у 50 μl пуфера за бојење (енгл. Staining Buffer; BD) додата одговарајућа количина примарно коњугованих моноклонских антитела специфичних за површинске антигене различитих субпопулација мононуклеара (Табела 1). Специфично од неспецифичног бојења одвојено је инкубацијом ћелија са одговарајућим изотипским контролама (Табела 2). Сва антитела за површинско бојење, као и изотипске контроле, коришћена су у таквим концентрацијама да њихова финална разблажења, у суспензији мононуклеара (V≈80 μl), буду 1:100. Ћелије су инкубиране 30 минута на температури +4°С, у мраку. 3.6.2.3. Фиксација и пермеабилизација ћелија Након инкубације са примарно коњугованим антителима, мононуклеари су опрани два пута у пуферу за бојење (1ml/епрувети) и центрифугирани 5 минута на 1500 rpm. Ћелијски талог ресуспендован је у 250 μl Cytofix/CytoPermTM раствора (BDPharmingen) и инкубиран 20 минута на температури +4°С. Затим су ћелије опране два пута у Perm/Wash TM пуферу (BDPharmingen; 1ml/епрувети) и центрифугиране 5 минута на 1500 rpm. 3.6.2.4. Бојење интраћелијских цитокина Ћелијски талог ресуспендован је у 50 μl Perm/WashTM пуфера. Додата супримарнa моноклонска антитела специфична за цитокине: анти-TNF (APC anti-mouse TNF, IgG1; Clone MP6-XT22; BDPharmingen), анти-IL-6 (PE anti-mouse IL-6, IgG1, κ; Clone MP5-20F3; eBioscience), анти-IFN gamma (APC anti-mouse IFN gamma, IgG1, κ; Clone XM61.2; 47 BioLegend), анти-IL-17 (PE anti-mouse IL-17F, IgG1, κ; Clone 079-289; BD Pharmingen), анти-IL-4 (PerCP- Cy™5.5 anti-mouse IL-4, IgG1; Clone 11B11; BD Pharmingen) и анти-OPG (goat anti-OPG, sc-8468, Santa Cruz). Коришћене су и одговарајуће изотипске контроле (Табела 2). Сва антитела коришћена су у таквим концентрацијама да њихова финална разблажења у суспензији мононуклеара (V≈80 μl) буду 1:100. Ћелије су инкубиране са примарним антителима 20 минута на +4°С, у мраку. По истеку инкубације са примарно необележеним анти-OPG антителoм уследила је инкубација са секундарним антителом (donkey anti-goat IgG-B (biotin), sc-2042, Santa Cruz) у концентрацији 1:400 у мраку на температури од +4˚C у трајању од 20 минута. Ћелије су затим опране у Perm/WashTM пуферу (1ml/епрувети; 1500 rpm 5 минута). Ћелијски талог ресуспендован је у 350 μl пуфера за бојење и анализиран на проточном цитометру. За цитометријску анализу коришћен је регион (енгл. Gate) мононуклеарних ћелија у FSC/SSC плоту. Регистровано је најмање 10 000 догађаја у свакој цитометријској анализи. Подаци су анализирани помоћу CELLQUEST софтвера (BD) и Flowing 2.5 софтвера (Informer Technologies). 3.6.3. Интрацелуларно бојење транскрипционог фактора Foxp3 Први корак у овој процедури је површинско бојење CD4 маркера: на 1 ×106 мононуклеара ресуспендованих у 50 μl пуфера за бојење (енгл. Staining Buffer, BDPharmingen) додата је одговарајућа количину FITC-анти-CD4 антитела у таквој концентрацији да његово финално разблажење буде 1:100. Ћелије су инкубиране 20 минута у мраку на температури од +4°С са поменутим антителом, а такође и са одговарајућом изотипском контролом. Након инкубације, ћелије су опране два пута у пуферу за бојење (1ml/епрувети; 1500 rpm 5 минута), а ћелијски талог је ресуспендован у 2 ml хладног пуфера за фиксацију (енгл. Mouse Foxp3 Fixation Buffer, BDPharmingen) и инкубиран 30 минута на +4°С у мраку. Затим су ћелије опране два пута у пуферу за пермеабилизацију (енгл. Mouse Foxp3 Permeabilizatio nbuffer, BDPharmingen), загрејаном до собне температуре (2ml/епрувети; 1500 rpm 5 минута). Након одливања супернатанта уследила је пермеабилизација ћелија у 2 ml пуфера за пермеабилизацију, 30 минута у мраку на температури 37°C. По завршеној инкубацији ћелије су опране у пуферу за бојење (2ml/епрувети; 1500 rpm 5 минута). На крају је уследила инкубација са коњугованим анти- 48 мишијем Foxp3 антителом коњугованим са PE (IgG2b; Clone MF23; BDPharmingen), које је претходно разблажено у пуферу за бојење тако да његово финално разблажење у суспензији ћелија буде 1:100. Након инкубације (20 минута у мраку на собној темпаратури) ћелије су опране у пуферу за бојење (2ml/епрувети; 1500 rpm 5 минута). Ћелијски талог је ресуспендован у 350 μl пуфера за бојење и анализиран на проточном цитометру. За цитометријску анализу коришћен је регион (енгл. Gate) мононуклеарних ћелија у FSC/SSC плоту. Регистровано је најмање 10 000 догађаја у свакој цитометријској анализи. Подаци су анализирани помоћу CELLQUEST софтвера (BD) и Flowing 2.5 софтвера (Informer Technologies). 3.7. Имунохистохемијска анализа експресије IL-33, ST2 и TRAP молекула у мишјем периапексном ткиву Имунохистохемијом је одређено присуство IL-33- и ST2-позитивних ћелија у периодонталном лигаменту (n=6) и периапексним лезијама WT мишева (n=6), као и присуство TRAP-позитивних остеокласта у периапексним лезијама ST2-/- и WT мишева (n=6/групи). Депарафинисани исечци периапексног ткива BALB/c мишева најпре су кувани 21 минут у цитратном пуферу (pH=6.0). Након тога, препарати су фиксирани су у хладном ацетону у трајању од 5 минута. На препаратe је затим нанет блокатор хидроген пероксида (енгл. Hydrogen Peroxide Block) са циљем инактивације ендогене пероксидазе. Неспецифично везивање инхибирано је третирањем препарата блокатором протеина (енгл. Protein Block). Тако припремљени исечци периапексног ткива инкубирани су са примарним антителима: зечјим анти-IL-33 антителом (енгл. rabbit anti-IL-33 antibody; sc- 98660, Santa Cruz Biotechnology, USA; разблажење 1:100), зечјим анти-ST2 антителом (eнгл. rabbit anti-ST2 antibody; PA5-20077, Thermo Scientific, USA; разблажење 1:500) и козјим анти-TRAP антителом (енгл. goat anti-TRAP antibody; sc-30833, Santa Cruz Biotechnology; разблажење 1:100). Препарати обележени анти-IL-33 и анти-ST2 антителом визуелизовани су коришћењем зечјег HRP/DAB детекционог кита за имунохистохемију (енгл. Expose Rb specific HRP/DAB detection IHC kit; аb80437, Abcam, Cambridge, UK), док су препарати обележени анти-TRAP антителом након инкубације са биотинисаним секундарним анти-козјим антителом (енгл. biotin conjugated secondary anti-goat antibody; 49 sc-2042, Santa Cruz; разблажење 1:100) визуелизовани коришћењем зечјег HRP/DAB детекционог кита за имунохистохемију (Abcam). Препарати су посматрани коришћењем светлосног микроскопа (Olympus BX51, Japan). Позитивне ћелије биле су браон боје, односно то су ћелије за које је сматрано да експримирају IL-33, ST2 или TRAP молекул. Просечан број IL-33- и ST2-позитивних ћелија по mm2 периапекног ткива одређен је након бројања ћелија у 5 различитих пресека по узорку и одређивања површина ових пресека коришћењем програма Image J 1.36 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Просечан број TRAP-позитивних остеокласта у периапексним лезијама на увеличању X400 (енгл. TRAP-positive cells per high-power field, TRAP + osteoclasts/hpf) одређен је након бројања ћелија у 5 различитих поља по узорку. 3.8. Имунохистохемијска анализа експресије IL-33 и ST2 молекула у хуманом периапексном ткиву Материјал за анализу добијен је од 36 болесника, оба пола, старости 19-64 година, са клиничком и радиографском дијагнозом хроничне периапексне лезије. Изабрани болесници нису имали системско обољење које би могло имати утицаја на развој периапексне лезије, нити су у последњих месец дана примали антибиотску терапију. Ткиво је добијено прилоком екстракције зуба (n=15) или апикотомије (n=21). Екстракција зуба била је индикована у случају пародонтопатије, финанскијских ограничења и недостатка мотивације пацијената за хируршки третман. Контролу су чинили узорци периодонталних лигамената добијени од 10 болесника, оба пола, старости 18-25 година. Ткиво за анализу изоловано је скалпелом са средње трећине корена здравих сталних премолара екстрахованих из ортодонтских разлога. Ткиво је одмах постављено у транспортни медијум који се састојао од RPMI-1640 медијума (Sigma, Munich, Germany), антибиотика (60 μg/ml gentamycin-а; ICN, Costa Mesa, CA, USA; 100U/ml penicillin-а, и 0.1 mg/ml streptomycin-а; Galenika, Beоgrad, Srbiјa) и антифунгицида (100 μg/ml amphotericin-а; Sigma) и смрзнуто у течном азоту на температури -70ᵒС. Криоисечци дебљине 5 μm добијени су коришћењем микротома. 50 Имунохистохемијском анализом одређено је присуство IL-33- и ST2-позитивних ћелија у хуманом периапексном ткиву (периапексном гранулому (n=20), радиксној цисти (n=16) и периодонталном лигаменту (n=10)). Препарати су најпре фиксирани у хладном ацетону у трајању од 5 минута. На препаратe је затим нанет блокатор хидроген пероксида (енгл. Hydrogen Peroxide Block) са циљем инактивације ендогене пероксидазе. Неспецифично везивање инхибирано је третирањем препарата блокатором протеина (енгл. Protein Block). Тако припремљени исечци периапексног ткива инкубирани су са примарним антителима: биотинисаним анти-хуманим-IL-33 (eнгл. biotinylated anti-IL-33 antibody; ab54384, Abcam, Cambridge, UK; разблажење 1:100) и зечјим анти-ST2 антителом (eнгл. rabbit anti-ST2 antibody; PA5-20077, Thermo Scientific, USA; разблажење 1:500). Препарати обележени биотинисаним анти-IL-33 антителом третирани су стрептавидин пероксидазом (енгл. streptavidin peroxidase), док су препарати у којима смо испитивали експресију ST2 молекула инкубирани у присуству козјег анти-зечјег HRP коњугата (енгл. goat anti-rabbit HRP conjugate). Реакција је визуелизована коришћењем DAB супстрата (енгл. 3,3-Diaminobenzidine, DAB) и хематоксилина. Негативне контроле чинили су препарати периапексног ткива у којима су примарна антитела преинкубирана са блокирајућим пептидима (human IL-33 protein fragment, ab82840, Abcam, UK и ST2 synthetic peptide, PEP-0195, Thermo Scientific) или изостављена и замењена одговарајућим изотипским контролама (mouse IgG1 biotin isotype control, ab37358, Abcam и rabbit IgG, ab27472). Позитивну контролу чинили су препарати здраве хумане коже у којима је имунохистохемијски испитана експресија IL-33 и ST2 молекула. Препарати су посматрани коришћењем светлосног микроскопа (Carl Zeiss Axioskop 40, Jena, Germany). Репрезентативни пресеци фотографисани су дигиталним апаратом (Canon PC 1089, USA). Просечан број IL-33- и ST2-позитивних ћелија по mm2 периапекног ткива израчунат је уз помоћ програма Image J 1.36. 51 3.9. Имунофлуоресцентна анализа ко-експресије IL-33 и ST2 молекула у хуманим периапексним лезијама Двоструким имунофлуоресцентним бојењем испитано је које ћелије у хуманим периапексним лезијама (периапексним грануломима и радиксним цистама) ко- експримирају IL-33 и ST2 рецептор. Хумани криоисечци загрејани су краткотрајним стајањем на собној температури, а затим фиксирани потапањем у хладном ацетону у трајању од 7 минута. Након екстензивног испирања препарата у PBS-у (енгл. phosphate buffered saline), неспецифично везивање блокирано је третирањем препарата PBS-ом који садржи 1% говеђег серумског албумина (енгл. bovine serum albumin, BSA) у трајању од 30 минута. Тако припремљени исечци периапексних лезија најпре су инкубирани са зечјим анти-хуманим ST2 антителом (Thermo Scientific) у трајању од 90 минута, након чега је уследила инкубација препарата са: магарећим анти-зечјим антителом обележеним FITC- ом (eнгл. donkey anti-rabbit IgG H&L (FITC); ab98492,Abcam; разблажење 1:250) у трајању од 60 минута, биотинисаним анти-хуманим-IL-33 антителом (Abcam) у трајању од 90 минута и стрептавидином обележеним РЕ-ом (енгл. streptavidin PE; разблажење 1:1000) у трајању од 60 минута. Покровна стакла постављена су на микроскопске плочице коришћењем медијума за монтирање (енгл. Mounting medium) који садржи DAPI боју за бојење нуклеуса. Плочице су посматране на конфокалном микроскопу (ZEISS AXIOVERT Microscope, Germany) и чуване натемператури од +4°С. 3.10. Статистичка обрада података Подаци су анализирани коришћењем статистичког програма SPSS верзија 13. Пре статистичке обраде података, прво је испитано да ли добијене вредности имају нормалну расподелу (величина узорка одређује који ћемо тест користити за ту проверу). Уколико су вредности имале нормалну расподелу коришћен је параметарски Student‟s-овt тест, док је у случају вредности које нису имале нормалну расподелу коришћен непараметарски Mann- Whitney-ев тест. Резултати експеримента изражени су као средња вредност ± стандардна грешка (енгл. Standard Error, SE). За статистички значајну разлику у добијеним вредностима између група сматра се када је p<0.05, док је статистички веома значајна разлика када је p<0.01. 52 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. Делеција ST2 гена значајно повећава оштећење алвеоларне кости и интензитет инфламаторног инфилтрата у периапексном региону У до сада објављеној и доступној литератури, није позната улога T1/ST2 молекула у патогенези периапексних лезија. Утицај делеције T1/ST2 молекула на патогенезу апексног периодонтитиса испитан је коришћењем инбредних мишева BALB/c соја ("wild type", WT, ST2 +/+) и knock-out (ST2-/-) мишева на BALB/c подлози, добијених циљаном делецијом гена за ST2. Свим ST2-/- и ST2+/+ мишевима, који су претходно насумично сврстани у експерименталне групе, отворена је пулпа првог мандибуларног молара. Животиње су жртвоване 14.-ог и 28.-ог дана експеримента. У циљу процене степена периапексног оштећења алвеоларне кости најпре је урађена патохистолошка и хистоморфометријска анализа. Некроза горње половине зубне пулпе мандибуларних првих молара уочена је код ST2-/- мишева жртвованих 14. дана експеримента (Слика 1. А). У периодонталном простору били су присутни ретки мононуклеари и гранулоцитни инфилтрат. Бројни гранулоцити око самог врха корена зуба формирали су микроапсцес (Слика 2). Присуство вишеједарних остеокласта дуж руба алвеоларне кости указивало је на процес ресорпције кости (Слика 3). Некроза целе зубне пулпе мандибуларних првих молара уочена је код ST2-/- мишева жртвованих 28. дана експеримента (Слика 1. В). У периодонталном простору била је присутна инфилтрација мононуклеарних ћелија и гранулоцита (Слика 4). Периапексни инфламаторни инфилтрат био је праћен ресорпцијом алвеоларне кости. Демаркациона зона везивно-ткивних влакана на периферији периапексних лезија била је чест налаз (Слика 5). У периодонталном простору молара ST2+/+ мишева уочен је инфламаторни процес истог типа, али слабијег интензитета у односу на ST2-/- мишеве у оба експериментална периода (Слика 1). 53 Слика 1. Репрезентативни исечци експерименталних периапексних лезија обојени стандардним патохистолошким бојењем (H&E). Лонгитудинални пресек дисталног корена мандибуларног првог молара ST2-/- (леви панел) и ST2+/+ миша (десни панел) 14.-ог (A) и 28.-ог дана од отварања зубне пулпе (В). N – некроза зубне пулпе; DR – дистални корен (енгл. distal root, DR); PDL – периодонтални лигамент; PL – периапексна лезија; B – кост (енгл. bone, B); увећање 100Х. 54 Слика 2. Изражен гранулоцитни инфилтрат (микроапсцес) у периодонталном простору мандибуларног првог молара ST2-/- миша 14. дана од отварања зубне пулпе. H&E, увећање лупом 400X. Слика 3. Вишеједарни остеокласти дуж руба алвеоларне кости ST2-/- миша 14. дана од отварања зубне пулпе. Остеокласти су означени стрелицама; H&E, увећање 600X. 55 Слика 4. Мононуклеарно-гранулоцитни инфилтрат у периодонцијуму ST2-/- миша 28. дана од отварања зубне пулпе. H&E, увећање 600X. Слика 5. Демаркациона зона везивно-ткивних влакана на периферији периапексних лезија 28. дана експеримента. H&E, увећање 100X. 56 Резултати дескриптивне хистологије потврђени су и семи-квантитативном методом коришћењем програма Autodesk AutoCAD 2010 и софтвера NIS Elements D, верзија 2.30. У поређењу са ST2+/+ мишевима статистички значајно повећање обима ресорпције алвеоларне кости у периапексном региону ST2-/- животиња утврђено је 14. дана од отварања зубне пулпе мандибуларних првих молара (р<0.05), док је 28. дана уочено статистички веома значајно повећање ресорпције у периапексу ST2-/- мишева (р<0.01) (Графикон 1). Морфометријска анализа дебљине периодонталног лигамента и обима ресорпције алвеоларне кости у периапексном региону лезија омогућила је градирање уочених промена на начин описан у поглављу Материјал и методе, при чему је простору периодонталног лигамента додељен градус 0 (Слика 6. А). Статистичка анализа података из експерименталних група омогућила је градирање периапексних лезија бројевима од 1 до 4 (Слика 6. В-Е). 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 14. дан 28. дан В ел и ч и н а л ез и је ( m m ²) ST2-/- ST2+/+ * ** Графикон 1. Обим ресорпције алвеоларне кости у периапексном региону ST2-/- и ST2+/+ мишева 14.-ог и 28.-ог дана од отварања зубне пулпе мандибуларних првих молара. Постоји статистички значајно већа ресорпција алвеоларне кости у периапексу ST2-/- мишева (црвени панели) у поређењу са ST2+/+ мишевима (плави панели) 14. дана експеримента (средња вредност +/- SE; * р<0.05), док је 28. дана утврђена статистички веома значајно повећана ресорпција кости у периапексном региону ST2-/- мишева (средња вредност +/- SE; ** р<0.01). 57 Градус 1 није био чест налаз. Био је присутан у свега 12,5% узорака. Најчешћи налази били су градус 2 и градус 3, и чинили су 62,5% свих узорака (Табела 4). Градирање периапексних лезија n % узорака Градус 1 2 12.5 Градус 2 5 31.25 Градус 3 5 31.25 Градус 4 4 25 Слика 6. Репрезентативни исечци појединих градуса периапексних лезија. А) градус 0; В) градус 1; С) градус 2; D) градус 3 и Е) градус 4. H&E, увећање 100Х. Табела 4. Преваленца појединих градуса експерименталних периапексних лезија. 58 Бројањем појединих типова инфламаторних ћелија (неутрофилних гранулоцита, макрофага и лимфоцита) по јединици површине (mm2) периапексних лезија утврђен је статистички значајно већи број неутрофилних гранулоцита код ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима 14. дана од отварања зубне пулпе (р<0.05), док је 28. дана уочено статистички веома значајно повећање број неутрофилних гранулоцита у периапексним лезијама ST2-/- животиња (р<0.01) (Графикон 2). Иако су бројеви макрофага (Графикон 3), као и бројеви лимфоцита по јединици површине (mm2) периапексних лезија били већи код ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима (Графикон 4), није било статистички значајних разлика између експерименталних група 14.-ог и 28. дана од изазивања обољења. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 14. дан 28.дан Б р о ј н еу т р о ф и л а /m m ² (x 1 0 ⁴) ST2-/- ST2+/+ * ** Графикон 2. Број неутрофилних гранулоцита по јединици површине (mm2) периапексних лезија ST2-/- и WT мишева 14.-ог и 28.-ог дана од отварања зубне пулпе мандибуларних првих молара. Постоји статистички значајно већи број неутрофилних гранулоцита у периапексном региону ST2-/- мишева (црвени панели) у поређењу са WT мишевима (плави панели) 14. дана експеримента (средња вредност +/- SE; *р<0.05), док је 28. дана уочен статистички веома значајно већи број неутрофила у периапексним лезијама ST2-/- мишева (средња вредност +/- SE; * p<0.05; ** р<0.01). 59 0 10 20 30 40 50 60 14. дан 28.дан Б р о ј м а к р о ф а га /m m ² (x 1 0 ⁴) ST2-/- ST2+/+ Графикон 3. Број макрофага по јединици површине (mm2) периапексних лезија ST2-/- и ST2 +/+ мишева 14.-ог и 28.-ог дана експеримента. Не постоји значајна разлика у броју макрофага у периапексним лезијама ST2-/- мишева (црвени панели) у поређењу са ST2+/+ мишевима (плави панели) 14.-ог и 28.-ог дана од изазивања обољења (средња вредност +/- SE; р>0.05). Графикон 4. Број лимфоцита по јединици површине (mm2) периапексних лезија ST2-/- и ST2+/+ мишева 14.-ог и 28.-ог дана експеримента. Не постоји значајна разлика у броју лимфоцита по mm2 периапексних лезија између експерименталних група 14.-ог и 28.-ог дана од отварања зубне пулпе мандибуларних молара (средња вредност +/- SE; р>0.05). 0 2 4 6 8 10 12 14 14. дан 28.дан Б р о ј л и м ф о ц и т а /m m ² (x 1 0 ⁴) ST2-/- ST2+/+ 60 4.2. Делеција ST2 гена узрокује масовни инфлукс мононуклеарних ћелија у периапексно ткиво и лимфне чворове врата након индукције лезија Статистички значајно већи проценат CD4+ ћелија и гејтованих CD3+ ћелија које експримирају хемокинске рецепторе CXCR3 и CCR6 био је присутан у периапексном ткиву ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима 14.-ог (p<0.05; Графикон 5) и 28. дана од отварања зубне пулпе мандибуларних молара (p<0.05; Графикон 6). Није било статистички значајне разлике у процентуалној заступљености F4/80+, NKp46+, CD8+, CD4 + Foxp3 + и CD19⁺ ћелија у периапексним лезијама ST2-/- и ST2+/+ мишевима 14.-ог дана експеримента (р>0.05; Графикон 5). Двадесет осмог дана није регистрована статистички значајна разлика у процентуалној заступљености CD19+ ћелија међу мишевима експерименталних група (р>0.05; Графикон 6). Уколико се анализира број мононуклеарних ћелија које инфилтришу периапексни регион, уочава се јасна, статистички значајна разлика која показује да је укупан број мононуклеара у периапексним лезијама ST2-/- мишева значајно већи у поређењу са ST2+/+ мишевима у оба експериментална термина (p<0.05; Графикони7 и 8). Уз то, у оба експериментална термина у периапексним лезијама ST2-/- мишева забележен је статистички значајан пораст апсолутног броја CD4+ ћелија (p<0.05; Графикони 7 и 8). Четрнаестог дана експеримента у периапексним лезијама није постојала статистички значајна разлика у апсолутном броју F4/80+, NKp46+, CD8+, CD4+Foxp3+ и CD19+ ћелија међу експерименталним групама (р>0.05; Графикон 7). Двадесет осмог дана није било статистички значајне разлике у апсолутном броју CD19+ ћелија међу мишевима експерименталних група (р>0.05; Графикон 8). * 61 Графикон 5. Проценат мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2-/- и ST2+/+ мишева 14.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат CD4+ ћелија и гејтованих CD3 + ћелија које експримирају хемокинске рецепторе CXCR3 и CCR6 у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у проценту F4/80+, NKp46+, CD8 + , CD4 + Foxp3 + и CD19⁺ B ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 62 Графикон 6. Проценат мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2-/- и ST2+/+ мишева 28.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат CD4+ ћелија и гејтованих CD3 + ћелија које експримирају хемокинске рецепторе CXCR3 и CCR6 у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у проценту CD19⁺ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 63 Графикон 7. Укупан број мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2-/- и ST2+/+ мишева 14.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи број мононуклеарних ћелија и апсолутни број CD4+ ћелија у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у апсолутном броју F4/80+, NKp46+, CD8+, CD4+Foxp3+ и CD19⁺ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 64 Индукција периапексних лезија изазвала је у лимфним чворовима значајно повећање удела гејтованих CD3+CXCR3+ и CD3+CCR6+ ћелија код ST2-/- мишева 14.-ог и 28. дана експеримента (p<0.05; Графикони 9 и 10). Поред тога, 14. дана од изазивања обољења регистровано је значајно повећање процентуалне заступљености CD11c+ и CD11b + ћелија у лимфним чворовима ST2-/- мишева. Истог, 14.-ог дана, у лимфним чворовима врата није постојала значајна разлика у процентуалној заступљености F4/80+, NKp46 + , CD4 + , CD8 + , CD4 + Foxp3 + и CD19+ ћелија међу експерименталним групама (р>0.05; Графикон 9). Двадесет осмог дана није било статистички значајне разлике у проценту CD4+, CD8+, CD4+Foxp3+ и CD19+ ћелија међу мишевима експерименталних група (р>0.05; Графикон 10). У лимфним чворовима ST2-/- и ST2+/+ мишева контролних група није било значајне разлике (р>0.05) у проценту свих анализираних популација мононуклеара (резултати нису приказани). Графикон 8. Укупан број мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2-/- и ST2+/+ мишева 28.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи број мононуклеарних ћелија и апсолутни број CD4+ ћелија у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у апсолутном броју CD19⁺ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 65 Графикон 9. Проценат мононуклеарних ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2+/+ мишева 14.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат гејтованих CD3+ ћелија које експримирају хемокинске рецепторе CXCR3 и CCR6, CD11c+ и CD11b+ ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у проценту F4/80 + , NKp46 + , CD4 + , CD8 + , CD4 + Foxp3 + и CD19⁺ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). * 66 Значајно повећање укупног броја мононуклеарних ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- мишева регистровано је у оба експериментална термина (p<0.05; Графикони 11 и 12). Четрнаестог дана експеримента у лимфним чворовима ST2-/- мишева забележен је статистички значајан пораст апсолутног броја CD11с+ и CD11b+ ћелија (p<0.05; Графикон 11). Графикон 10. Проценат мононуклеарних ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2+/+ мишева 28.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат гејтованих CD3+ ћелија које експримирају хемокинске рецепторе CXCR3 и CCR6 у лимфним чворовима врата ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у проценту CD4+,CD8+, CD4 + Foxp3 + и CD19⁺ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 67 Истог, 14.-ог дана, у лимфним чворовима није постојала статистички значајна разлика у апсолутном броју F4/80+, NKp46+, CD4+, CD8+,CD4+Foxp3+ и CD19+ ћелија међу Графикон 11. Укупан број мононуклеарних ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2+/+ мишева 14.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи број мононуклеарних ћелија и апсолутни број CD11с+ и CD11b+ ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- мишева у поређењу са ST2 +/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у апсолутном броју F4/80+, NKp46+, CD8+,CD4+Foxp3+ и CD19⁺ ћелиј ( р. вредност +/- SE; * р<0.05). 68 експерименталним групама (р>0.05; Графикон 11). Двадесет осмог дана није било статистички значајне разлике у апсолутном броју CD4+, CD8+, CD4+Foxp3+ иCD19+ ћелија међу мишевима експерименталних група (р>0.05; Графикон 12). У лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2+/+ мишева контролних група није било значајне разлике (р>0.05) у апсолутном броју свих анализираних популација мононуклеара (резултати нису приказани). Графикон 12. Укупан број мононуклеарних ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2+/+ мишева 28.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи број мононуклеарних ћелија у лимфним чворовима врата ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у апсолутном броју CD4+, CD8+, CD4+Foxp3+ и CD19⁺ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 69 4.3. Делеција ST2 гена повећава инфлукс ћелија које продукују про-инфламаторне цитокине у периапексно ткиво и лимфне чворове врата након индукције лезија Након што је уочено да значајно већи број лимфоцита инфилтрише периапексно ткиво и регионалне лимфне чворове ST2-/- мишева након индукције лезија, испитан је функционални фенотип ових ефекторских ћелија. Као што је приказано на графикону 13, 14.-ог дана од отварања пулпе мандибуларних молара проценат гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-17 је статистички значајно већи у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима (р<0.05). Не постоји статистички значајна разлика (р>0.05) у проценту гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују IL-4 и IL-5 и проценту гејтованих CD8⁺ ћелија које продукују TNF-α, IFN-γ и IL-17,а које су инфилтрисале периапексно ткиво ST2 -/- и ST2+/+ мишева 14.-ог дана експеримента. Двадесет осмог дана експеримента уочен је статистички значајан пораст у проценту гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују IFN-γ и IL-17, као и у проценту гејтованих CD3⁺ ћелија које експримирају RANKL у периапексним лезијама ST2-/- мишева, док је проценат гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују OPG био значајно већи у периапексном ткиву ST2+/+ мишева (р<0.05; Графикон 14). 70 Графикон 13. Проценат цитокин продукујућих ћелија у периапексним лезијама ST2+/+ и ST2-/- мишева 14.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-17 у периапексним лезијама ST2 -/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима. Не постоји значајна разлика у проценту гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују IL-4 и проценту гејтованих CD8⁺ ћелија које продукују TNF-α, IFN-γ и IL-17 (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 71 Када је анализирана процентуална заступљеност и апсолутни број RANKL- и OPG- позитивних мононуклеарних ћелија које су инфилтрисале периапексни регион 28.-ог дана од изазивања обољења, уочен је статистички значајан пораст у проценту и броју RANKL- позитивних ћелија у периапексним лезијама ST2-/- мишева, док је проценат и број OPG- позитивних ћелија био значајно већи у периапексним лезијама ST2+/+ мишева (р<0.05). Поређењем апсолутног броја RANKL- и OPG-позитивних мононуклеарних ћелија уочен је статистички значајно већи RANKL/OPG однос у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима 28.-ог дана експеримента (р<0.05; Графикон 15). Графикон 14. Проценат цитокин продукујућих ћелија у периапексним лезијама ST2+/+ и ST2-/- мишева 28.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују IFN-γ и IL-17, као и проценaт гејтованих CD3⁺ ћелија које експримирају RANKL у периапексним лезијама ST2-/- мишева, док је проценат гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују OPG значајно већи у периапексном ткиву ST2+/+ мишева (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 72 Иако је индукција периапексних лезија изазвала повећање процента гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-17 и процента гејтованих CD8⁺ ћелија које продукују TNF-α, IFN-γ и IL-17 у регионалним лимфним чворовима ST2-/- мишева, као и повећање процента гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују IL-4 и IL-5 у лимфним чворовима ST2+/+ мишева, није било статистички значајних разлика између експерименталних група 14.-ог дана од изазивања обољења (р>0.05; Графикон 16). Графикон 15. Проценат и апсолутни број RANKL- и OPG-позитивних мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2+/+ и ST2-/- мишева и RANKL/OPG однос. Постоји статистички значајно већи проценат и апсолутни број мононуклеарних ћелија које експримирају RANKL у периапексним лезијама ST2-/- мишева, док су проценат и апсолутни број мононуклеарних ћелија које продукују OPG значајно већи у периапексном ткиву ST2+/+ мишева. RANKL/OPG однос је статистички значајно већи у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 73 Графикон 16. Проценат цитокин продукујућих ћелија у лимфним чворовима врата ST2+/+ и ST2-/- мишева 14.-ог дана експеримента. Не постоји значајна разлика у проценту гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-17, CD8⁺ ћелија које продукују TNF-α, IFN-γ и IL-17 и CD3⁺ ћелија које продукују IL-4 (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 74 Двадесет осмог дана експеримента уочен је статистички значајан пораст у проценту гејтованих CD3⁺ ћелија које експримирају RANKL у лимфним чворовима врата ST2 -/- мишева, док је проценат гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују OPG био значајно већи у лимфним чворовима ST2+/+ мишева (р<0.05; Графикон 17). Није било статистички значајних разлика (р>0.05) у проценту гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују IFN-γ и IL-17 међу експерименталним групама. У лимфним чворовима ST2-/- и ST2+/+ мишева контролних група није било значајних разлика (р>0.05) у проценту анализираних цитокин продукујућих лимфоцита у оба експериментална термина (резултати нису приказани). Графикон 17. Проценат цитокин продукујућих ћелија у лимфним чворовима врата ST2+/+ и ST2-/- мишева 28.-ог дана експеримента. Постоји статистички значајно већи проценат гејтованих CD3⁺ ћелија које експримирају RANKL у лимфним чворовима врата ST2-/- мишева, док је проценат гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују OPG значајно већи у лимфним чворовима ST2+/+ мишева. Не постоји значајна разлика у проценту гејтованих CD4⁺ ћелија које продукују IFN-γ и IL-17 (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 75 4.4. Примена IL-33 смањује инфилтрацију CD3+CXCR3+, CD3+CCR6+ и CD4+ ћелија у периапексним лезијама BALB/c мишева Анализом фенотипа мононуклеарних ћелија које су инфилтрисале периапексно ткиво ST2 +/+ мишева којима је интраперитонеално дат рекомбинантни IL-33 након индукције хроничног периапексног периодонтитиса, утврђено је да примена IL-33 значајно смањује проценат гејтованих CD3+ ћелија које експримирају хемокинске рецепторе CXCR3 и CCR6 и проценат CD4+ ћелија 14.-ог дана од изазивања обољења (р<0.05; Графикон 18). Није било статистички значајне разлике (р>0.05) у процентуалној заступљености F4/80+, NKp46 + , CD8 + и CD4+Foxp3+ ћелија међу групама. Aнализираjући број мононуклеарних ћелија које су инфилтрисале периапексне лезије ST2 +/+ мишева, уочен је статистички значајно мањи број CD3+ и CD4+ ћелија у периапексном ткиву мишева којима је након индукције лезија дат IL-33 у поређењу са мишевима којима је само индуковано обољење (р<0.05; Графикон 19). Међу групама није постојала статистички значајна разлика (р>0.05) у укупном броју мононуклеарних ћелија, апсолутном броју CD8+, CD4+Foxp3+, F4/80+ и NKp46+ ћелија. 76 Графикон 18. Проценат мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2+/+ BALB/c мишева након примене IL-33. Постоји статистички значајно мањи проценат гејтованих CD3+CXCR3+ и CD3+CCR6+ ћелија, као и проценат CD4+ ћелија у периапексним лезијама BALB/c мишева којима је дат IL-33 (зелени панели). Не постоји значајна разлика у проценту F4/80+, NKp46+, CD8+ и CD4+Foxp3+ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 77 Графикон 19. Укупан број мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама ST2+/+ BALB/c мишева након примене IL-33. Постоји статистички значајно мањи број CD3+ и CD4+ ћелија у периапексним лезијама BALB/c мишева којима је дат IL-33 (зелени панели). Не постоји значајна разлика у укупном броју мононуклеарних ћелија, апсолутном броју CD8+, CD4 + Foxp3 + , F4/80 + и NKp46+ ћелија (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 78 4.5. IL-33 смањује инфлукс ћелија које продукују про-инфламаторне цитокине, а повећава удео CD3+IL-4+ ћелија Након што је уочено да превентивна примена IL-33 значајно смањује инфлукс CD3 + CXCR3 + , CD3 + CCR6 + и CD4+ ћелија (Графикон 18), проточном цитофлуорометријском анализом одређен је цитокински профил ћелија изолованих из периапексног ткива BALB/c мишева којима је апликован IL-33 након изазивања хроничног периапексног периодонтитиса. Као што је приказано на Графикону 20, значајно мањи проценат гејтованих CD4+ ћелија које продукују TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-17 инфилтрисао је периапексно ткиво мишева који су примили IL-33 након индукције лезија у поређењу са ST2+/+мишева којима је само индуковано обољење. Уз то, интраперитонеално дат IL-33 резултирао је већим уделом гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују IL-4 у периапексним лезијама BALB/c мишева (р<0.05). Међу групама није постојала статистички значајна разлика (р>0.05) у проценту гејтованих CD3⁺ ћелија које продукују IL-5 и проценту гејтованих CD8⁺ ћелија које продукују TNF-α, IFN-γ и IL-17. 79 Графикон 20. Проценат цитокин продукујућих ћелија у периапексним лезијама ST2+/+ BALB/c мишева након примене IL-33. Постоји статистички значајно мањи проценат гејтованих CD4+ ћелија које продукују TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-17, а значајно већи проценат гејтованих CD3+ ћелија које продукују IL-4 у периапексним лезијама BALB/c мишева којима је дат IL-33 (зелени панели). Не постоји значајна разлика у проценту гејтованих CD8⁺ ћелија које продукују TNF-α, IFN-γ и IL-17 (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 80 4.6. Експресија IL-33 и ST2 молекула у периапексном ткиву ST2+/+ BALB/c мишева Имунохистохемијска анализа је показала присуство IL-33- (Слика 7. А) и ST2- позитивних ћелија у периапексном ткиву ST2+/+ BALB/c мишева (Слика 8. А). Бројањем IL-33-позитивних ћелија по јединици површине (mm²) периапексног ткива утврђен је статистички значајно већи број ћелија у периапексним лезијама (235,52 ± 12,05 ћелија/mm²) у поређењу са периодонталним лигаментом (120,98 ± 6,96 ћелија/mm²) (р<0.05; Слика 7. В). Слика 7. Експресија IL-33 у периапексном ткиву ST2+/+ BALB/c мишева. А) Репрезентативни препарати периапексних лезија (горњи панели) и периодонталног лигамента (доњи панели); увећање Х100 (лево, референтна линија = 100 μm) и Х400 (десно, референтна линија = 50 μm). В) Постоји статистички знаћајно већи број IL-33-позитивних ћелија по јединици површине (mm²) периапексног ткива у периапексним лезијама (љубичасти панели) у поређењу са здравим периодонталним ткивом (браон панели) (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 0 50 100 150 200 250 300 периапексна лезија периодонтални лигамент IL -3 3 ⁺ ћ ел и је /m m ² * 81 Имунохистохемијска и семи-квантитативна анализа показале су и статистички значајно већи број ST2-позитивних ћелија у периапексним лезијама (152,33 ± 16,67 ћелија/mm²) у поређењу са периодонталним лигаментом (53,01 ± 4,38 ћелија/mm²) (р<0.05; Слика 8. В). A B 0 50 100 150 200 периапексна лезија периодонтални лигамент S T 2 ⁺ ћ ел и је /m m ² * Слика 8. Експресија ST2 молекула (IL-33R, рецептора за IL-33) у периапексном ткиву ST2+/+ BALB/c мишева. А) Репрезентативни препарати периапексних лезија (горњи панели) и периодонталног лигамента (доњи панели); увећање Х100 (лево, референтна линија = 100 μm) и Х400 (десно, референтна линија = 50 μm). В) Постоји статистички знаћајно већи број ST2- позитивних ћелија по јединици површине (mm²) периапексног ткива у периапексним лезијама (љубичасти панели) у поређењу са здравим периодонталним ткивом (браон панели) (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 82 4.7.Делеција ST2 гена повећава број TRAP-позитивних остеокласта у периапексном региону BALB/c мишева Обзиром да су претходне студије показале да TRAP+ остеокласти играју важну улогу у ресорпцији алвеоларне кости у периапексном региону (222-224), имунохистохемијом је потврђено присуство ових ћелија у индукованим периапексним лезијама ST2-/- и ST2+/+ BALB/c мишева. Као што је приказано на Слици 9. А, уочљиво већи број TRAP+ вишеједарних ћелија био је присутан дуж руба ресорбоване алвеоларне кости у периапексном региону ST2-/- мишева (горњи панели) у поређењу са ST2+/+ BALB/c мишевима (доњи панели). Слика 9. Присуство TRAP+ остеокласта у периапексном региону ST2-/- и ST2+/+ BALB/c мишева. А) Репрезентативни препарати периапексних лезија ST2-/- (горњи панели) и ST2+/+ BALB/c мишева (доњи панели); увећање Х100 (лево, референтна линија = 100 μm) и Х400 (десно, референтна линија = 50 μm). В) Постоји статистички знаћајно већи број TRAP+ ћелија у периапексном региону ST2-/- мишева (црвени панели) у поређењу са ST2+/+ BALB/c мишевима (плави панели) (ср. вредност +/- SE; * р<0.05). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ST2-/- ST2+/+ T R A P ⁺ о ст ео к л а ст и /h p f * 83 Бројањем TRAP+ остеокласта у 5 насумично изабраних поља на увеличању Х400 (енгл. TRAP + osteoclasts per hihg power field, osteoclasts/hpf), утврђен је статистички значајно већи број ћелија у периапексном ткиву ST2-/- мишева (6,83 ± 0,86 ћелија на увећању Х400) у поређењу са ST2+/+ BALB/c мишевима (4,11 ± 0,43 ћелија на увећању Х400) (р<0.05; Слика 10. В). 4.8. Експресија IL-33 и ST2 молекула у хуманом периапексном ткиву Након што је уочено присуство IL-33 и ST2 рецептора у индукованим периапексним лезијама и периодонталном лигаменту ST2+/+ BALB/c мишева (Слике 8 и 9), експресија ових молекула испитана је у хуманом периапексном ткиву. IL-33 био је присутан и у периапексним лезијама (периапексним грануломима и радиксним цистама) и у здравом периапексном ткиву (Слика 10). Експресија IL-33 уочена је у једру ћелија које по морфолошким критеријумима одговарају фибробластима и ендотелним ћелијама. Уз то, у радиксним цистама експресија IL-33 уочена је у једру и цитоплазми ћелија које по морфолошким критеријумима одговарају епителним ћелијама. Док је IL-33 био присутан у свим ендотелним и епителним ћелијама у периапексном ткиву, само поједини фибробласти показивали су позитивност у периодонталном лигаменту. У здравој хуманој кожи (позитивна контрола) IL-33 експримирали су кератиноцити и дермалне ендотелне ћелије. IL-33 бојење није било присутно (негативне контроле) након изостављања примарног антитела и замене одговарајућом изотипском контролом (mouse IgG1 biotin isotype control, ab37358, Abcam) и преинкубације примарног антитела са блокирајућим пептидом (human IL-33 protein fragment, ab82840, Abcam, UK). Бројањем IL-33-позитивних ћелија по јединици површине (mm²) периапексног ткива утврђен је статистички значајно већи број фибробласта у периапексним лезијама (14,38 ± 1,15 ћелија/mm² у периапексним грануломима и 12,63 ± 0,82 ћелија/mm² у радиксним цистама) у поређењу са периодонталним лигаментом (5,83 ± 0,8 ћелија/mm²) (р<0.05). Није утврђена статистички значајна разлика (р>0.05) у броју IL-33-позитивних ендотелних ћелија између периапексних лезија (9,41 ± 0,91 ћелија/mm² у периапексним грануломима и 8,81 ± 0,58 ћелија/mm² у радиксним цистама) и здравог периапексног ткива (9,95 ± 1,24 84 ћелија/mm²). Уз то, није било статистички значајних разлика (р>0.05) у броју IL-33- позитивних фибробласта и ендотелних ћелија између периапексних гранулома и радиксних циста. Епителне ћелије биле су најбројније IL-33-позитивне ћелије у радиксним цистама (47,39 ± 2,63 ћелија/mm²). Слика 10. Експресија IL-33 у хуманом периапексном ткиву. Репрезентативни препарати периапексних лезија (А) и периодонталног лигамента (В); увећање Х400 (референтна линија = 50 μm). Присуство IL-33 у фибробластима (Аа, Ва), ендотелним (Ас, Bb) и епителним ћелијама (Аb). С) Позитивна контрола (а) - експресија IL-33 у кератиноцитима и дермалним ендотелним ћелијама у здравој хуманој кожи; увећање Х100 (референтна линија = 100 μm) Негативне контроле - одсуство IL-33 позитивности у периапексном ткиву након преинкубације примарног антитела са блокирајућим пептидом (b) и замене примарног антитела одговарајућом изотипском контролом (c); увећање Х200 (референтна линија = 50 μm). a b c a b a b c 85 ST2 молекул показивао је исти образац експресије у периапексном ткиву као и IL-33, са додатном позитивношћу мононуклеарних ћелија које по морфолошким критеријумима одговарају лимфоцитима и макрофагима (Слика 11). У здравој хуманој кожи (позитивна контрола) ST2 молекул експримирали су кератиноцити, дермалне ендотелне ћелије и фибробласти. ST2 бојење изостало је (негативне контроле) након замене примарног антитела одговарајућом изотипском контролом (rabbit IgG, ab27472, Abcam) и преинкубације са блокирајућим пептидом (ST2 synthetic peptide, PEP-0195, Thermo Scientific). Бројањем ST2-позитивних ћелија по јединици површине (mm²) периапексног ткива утврђен је статистички значајно већи број фибробласта у периапексним лезијама (13,16 ± 0,79 ћелија/mm² у периапексним грануломима и 12,45 ± 1,04 ћелија/mm² у радиксним цистама) у поређењу са периодонталним лигаментом (10,2 ± 0,62 ћелија/mm²) (р<0.05). Није утврђена статистички значајна разлика (р>0.05) у броју ST2-позитивних ендотелних ћелија између периапексних лезија (8,25 ± 0,81 ћелија/mm² у периапексним грануломима и 7,89 ± 0,78 ћелија/mm² у радиксним цистама) и здравог периапексног ткива (7,69 ± 0,60 ћелија/mm²). Уз то, није било статистички значајних разлика (р>0.05) у броју ST2- позитивних фибробласта, ендотелних и мононуклеарних ћелија између периапексних гранулома и радиксних циста (15,30 ± 1,13 мононуклеарних ћелија/mm² у периапексним грануломима и 16,71 ± 1,81 мононуклеарних ћелија/mm² у радиксним цистама). За разлику од експресије IL-33 у свим епителним ћелијама (Слика 10. Аb), ST2 бојење било је присутно само у појединим епителним ћелијама у радиксним цистама (13,79 ± 1,45 ћелија/mm²) (Слика 11. Аb). 86 Слика 11. Експресија ST2 молекула у хуманом периапексном ткиву. Репрезентативни препарати периапексних лезија (А; увећање Х200, референтна линија = 50 μm) и периодонталног лигамента (В; увећање Х400, референтна линија = 50 μm). Присуство ST2 молекула у фибробластима (Аа, Ва), ендотелним (Ас, Bb), епителним (Аb) и мононуклеарним ћелијама (Аd). С) Позитивна контрола (а) - експресија ST2 молекулау кератиноцитима, дермалним ендотелним ћелијама и фибробластима у здравој хуманој кожи; увећање Х100 (референтна линија = 100 μm) Негативне контроле - одсуство IL-33 позитивности у периапексном ткиву након преинкубације примарног антитела са блокирајућим пептидом (b) и замене примарног антитела одговарајућом изотипском контролом (c); увећање Х200 (референтна линија = 50 μm). a b c d a b a b c 87 4.9. Ko-eкспресија IL-33 и ST2 рецептора у хуманим периапексним лезијама Двоструким имунофлуоресцентним бојењем испитано је које ћелије у хуманим периапексним лезијама ко-експримирају IL-33 и ST2 рецептор. Већина IL-33 јако/умерено позитивних ћелија које по морфолошким критеријумима одговарају фибробластима показивала је јаку ST2 позитивност (Слика 12. А). Уз то, већина IL-33 умерено/слабо позитивних ћелија које по морфолошким критеријумима одговарају ендотелним ћелијама показивала је јаку/умерену ST2 позитивност (Слика 13. В). ST2 јако/умерено позитивне мононуклеарне ћелије које по морфолошким критеријумима одговарају лимфоцитима и макрофагима биле су IL-33 негативне (Слика 12. С). Слика 12. Ко-експресија IL-33 и ST2 молекула у хуманим периапексним лезијама. Репрезентативни препарати периапексних лезија. IL-33/ST2 ко-експресија била је присутна у ћелијама које по морфолошким критеријумима одговарају фибробластима (А) и ендотелним ћелијама (В), док су мононуклеарне ћелије (С) биле једноструко ST2 позитивне (беле стрелице показују позитивност; увећање Х630). 88 5. ДИСКУСИЈА У до сада објављеној и доступној литератури улога и значај IL-33/ST2 сигналног пута у патогенези периапексних лезија није била испитана. Oва студија по први пут показује да делеција ST2 гена значајно појачава инфламаторну деструкцију експерименталних периапексних лезија, док примена рекомбинантног IL-33 смањује периапексну инфламацију. Уз то, указује и на истовремено присуство IL-33 и ST2 рецептора у хуманом и мишјем периапексном ткиву. У првом делу истраживања показано је да одсуство ST2 сигнализације значајно повећава обим ресорпције периапексне алвеоларне кости након индукције лезија (Графикон 1). Уз то, делеција ST2 гена значајно повећава инфлукс инфламаторних ћелија (неутрофилних гранулоцита, CD4+ Т лимфоцита, CD11c+ дендритских и CD11b+ мијелоидних ћелија) и стимулише CD4+ Т лимфоците да продукују про-инфламаторне цитокине у периапексним лезијама и лимфним чворовима врата BALB/c мишева (Графикони 2, 5-17). У другом делу истраживања показано је да егзогена администрација рекомбинантног IL-33 значајно смањује инфлукс CD3+CXCR3+ Th1, CD3+CCR6+ Th17 и CD4+ Т лимфоцита који продукују про-инфламаторне цитокине, а повећава удео IL-4-продукујућих CD3+Т лимфоцита у периапексним лезијама ST2+/+ BALB/c мишева (Графикони 18-20). Трећи део истраживања био је базиран на анализи експресије IL-33 и ST2 рецептора у хуманом и мишјем периапексном ткиву. Експресија ових молекула била је значајно већа у периапексним лезијама у поређењу са периодонталним лигаментом (Слике 7, 8, 10 и 11). 89 5.1. Делеција ST2 гена значајно појачава инфламаторну деструкцију експерименталних периапекснихлезија Експериментални апексни периодонтитис је добар модел за проучавање динамике и карактеристика локалног хроничног запаљења. Карактерише се ресорпцијом алвеоларне кости у периапексном региону, инкорпорацијом гранулaционог ткива и инфламаторном инфилтрацијом различитог интензитета (2, 27). Испитивањем утицаја делеције ST2 гена у многобројним експерименталним моделима утврђено је да одсуство ST2 сигнализације промовише инфламацију, али испољава и низ суптилних регулаторних ефеката који за циљ имају уклањање патогена уз минимално оштећење ткива домаћина (202, 225-226). Утицај делеције ST2 гена на патогенезу индукованих периапексних лезија испитан је жртвовањем експерименталних животиња у акутној (14. дана од отварања пулпе мандибуларних првих молара) и хроничној фази (28. Дана експеримента) експанзије апексног периодонтитиса (27). Боље познавање карактеристика инфламаторних лезија у периодонцијуму ST2-/- и ST2+/+ мишева, нарочито са аспекта квалитативне и квантитативне структуре имунокомпетентних ћелија, као и редоследа догађаја, може да допринесе разумевању биолошких механизама укључених у настанак и развој периапексних лезија. Анализирајући хистолошке препарате периапексних лезија уочено је да су 14. дана експеримента у периодонталном простору ST2-/- и ST2+/+ мишева били присутни ретки мононуклеари и јак гранулоцитни инфилтрат. Бројни гранулоцити око самог врха корена зуба формирали су микроапсцес (Слика 2). Вишеједарни остеокласти дуж руба алвеоларне кости указивали су на процес ресорпције (Слика 3). Двадесет осмог дана експеримента периодонтални простор инфилтрисале су бројне мононуклеарне ћелије и гранулоцити (Слика 4). Периапексни инфламаторни инфилтрат пратила је ресорпција алвеоларне кости. Слични резултати добијени су и у другим експерименталним моделима периапексних инфламаторних лезија (27, 48-49). Поред тога, патохистолошка анализа показала је да је делеција ST2 гена у оба експериментална термина узроковала појачану ресорпцију кости и инфламаторну инфилтрацију јачег интензитета у периапексном региону BALB/c мишева (Слика 1). 90 Резултати дескриптивне хистологије најпре су потврђени хистоморфометријом. Дебљина периодонталног лигамента и ресорпција алвеоларне кости одређена је уз помоћ програма Autodesk AutoCAD 2010. Autodesk AutoCAD је програм који се традиционално користи за мерење и дизајнирање у архитектури и инжењерингу (227). Коришћењем специјално креираних алатки у овом програму за прецизно обележавање и мерење површина смањује се могућност прављења грешки и повећава валидност података (228, 229). Концепт коришћења AutoCAD-а у денталним студијама представља релативно нов семи-квантитативни метод којим се испитује квалитет апексне оптурације после пуњења канала корена зуба и одређује дебљина периодонталног лигамента у току различитих ортодонтских померања зуба (230-233). Овај програм коришћен је и за квантификацију површина експерименталних периапексних лезија (211). Како још увек не постоји стандардизован и генерално прихваћен метод за хистоморфометрију, овај метод могао би да замени друге, који су знатно скупљи и укључују здравствене ризике, као што су компјутеризована томографија и радиографија (27, 234). Хистоморфометрија је показала статистички значајно повећање обима ресорпције алвеоларне кости у периапексном региону ST2-/- животиња 14. дана од отварања зубне пулпе мандибуларних првих молара (р<0.05), док је статистички веома значајно повећање ресорпције у периапексу ST2-/- мишева забележено 28. дана експеримента (р<0.01) (Графикон 1). Како су остеокласти ћелије одговорне за ресорпцију кости (2, 6, 7), имунохистохемијском анализом идентификовани су активирани остеокласти у периапексном ткиву BALB/c мишева коришћењем анти-TRAP антитела (Слика 9). Квантитативна анализа показала је да је број TRAP-позитивних остеокласта статистички значајно већи (р<0.05) у периапексним лезијама ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ животињама. Познато је да се RANKL везује за рецептор RANK на површини пре- остеокласта и промовише њихову матурацију, активацију и преживљавање, а да OPG инхибира ово везивање (81, 89). Поређењем апсолутног броја RANKL- и OPG-позитивних мононуклеарних ћелија у периапексним лезијама BALB/c мишева одређен је RANKL/OPG однос, основни регулаторни механизам активности остеокласта. Овај однос био је статистички значајно већи (р<0.05) у периапексним лезијама ST2-/- мишева (Графикон 15). 91 Повећани губитак периапексног коштаног ткива код ST2-/- мишева последица је повећаног RANKL/OPG односа, кључног показатеља ресорпције кости у периапексним лезијама (93), као и повећаног броја TRAP-позитивних остеокласта. Добијени резултати сагласни су са резултатима Schulze-а и сарадника (235), који су показали да IL-33 у потпуности блокира стварање TRAP-позитивних остеокласта, чак и у присуству RANKL-а (81). Исти аутори показали су да IL-33 супримира експресију нуклеарног фактора активираних Т лимфоцита 1 (енгл. nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, Nfatc1) кључног транскрипционог фактора остеокластогенезе (236). Уз то, Zais и сарадници (201) показали су да IL-33 преко ST2 рецептора стимулише продукцију GM-CSF, који делујући на прекурсоре остеокласта усмерава њихово сазревање у правцу алтернативно активираних макрофага (ААМ, М2). М2 макрофаги индукују ангиогенезу и обнављање оштећеног ткива (236). Дакле, примена IL-33 инхибира губитак кости, што објашњава зашто је одсуство гена за IL-33 рецептор (IL-33R) узроковало повећање броја остеокласта, а самим тим и повећану ресорпцију алвеоларне кости у периапексном региону BALB/c мишева. Поред тога, и патохистолошка и хистоморфометријска анализа показале су да не постоји разлика у грађи нормалног, здравог периодонталног лигамента између ST2-/- и ST2+/+ мишева контролних група (Слика 6. А), потврђујући да је тежа деструкција периапексног ткива код експерименталних животиња последица делеције ST2 гена. Недавно је такође показано да CD3+ Т лимфоцити који експримирају RANKL имају значајну улогу у ресорпцији кости у периапексним лезијама посредованој остеокластима (237). И заиста, проценат гејтованих CD3+ Т лимфоцита који експримирају RANKL био је значајно већи (р<0.05) у периапексним лезијама ST2-/- мишева, док је проценат гејтованих CD3 + Т лимфоцита који експримирају OPG био већи код ST2+/+ мишева (Графикон 14). Резултати претходних студија показали су да су најбројније ћелије у инфламаторним инфилтратима периапексних лезија неутрофилни гранулоцити, лимфоцити, плазмоцити и макрофаги. Остале ћелије, нарочито дендритске ћелије, NK ћелије, мастоцити и еозинофилни гранулоцити присутне су у мањем броју (40). Улога ћелија запаљенског инфилтрата и њихових продуката, посебно цитокина у имунопатогенези апексног периодонтитиса у великој мери је још увек нејасна. 92 Неутрофилни гранулоцити као ефекторске ћелије урођеног имунског одговора значајни су у раној фази инфекције јер први стижу на место продора микроорганизама, фагоцитују бактерије и секретују бројне медијаторе (леукотријене, простагландине и цитокине), а затим умиру процесом апоптозе. Продукцијом леукотријена B4 и простагландина Е2 и I2 неутрофилни гранулоцити активирају остеокласте (2, 6, 7), продукцијом про-инфламаторних цитокина (IL-1, IL-6, TNF-α и RANKL) интензивирају ресорпцију алвеоларне кости, док продукцијом хемотактичких цитокина, првенствено IL-8, остварују значајну улогу у акутној егзацербацији периапексних лезија (140-142). Квантификовањем инфламаторних ћелија по јединици површине (mm2) периапексних лезија установљен је статистички значајно већи број неутрофилних гранулоцита код ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима 14. дана (р<0.05), а статистички веома значајно већи 28. дана експеримента (р<0.01) (Графикон 2). Добијени резултати могу се тумачити у складу са доступном литературом о значају IL-33 за функцију неутрофила. Овај налаз сагласан је са резултатима Sakai-а и сарадника (238), који су показали да IL-33 супримира регрутацију неутрофила у експерименталном моделу исхемично-реперфузионог оштећења јетре. Насупрот томе, скорија истраживања показала су да IL-33 индукује миграцију неутрофила активацијом макрофага и мастоцита идиректном активацијом ових ћелија (239-240). Разлог неусаглашености ових података није познат. Анализирајући фенотипске и функционалне карактеристике мононуклеарних ћелија изолованих из периапексних лезија и регионалних лимфних чворова ST2-/- и ST2+/+ мишева показано је да делеција ST2 гена узрокује снажну инфламацију код експерименталних BALB/c животиња. Укупан број мононуклеарних ћелија које су инфилтрисале периапексно ткиво (Графикони 7 и 8) и цервикалне лимфне лимфне чворове BALB/c мишева 14.-ог и 28.-ог дана након отварања пулпе мандибуларних првих молара (Графикони 11 и 12) био је статистички значајно већи код ST2-/- у поређењу са ST2+/+ мишевима (р<0.05). CD11b је заједнички маркер мијелоидних ћелија (енгл. common myeloid marker). CD11b + ћелије биле су присутне знатно већем проценту (Графикон 9) и броју (Графикон 11) у цервикалним лимфним чворовима ST2-/- мишева у односу на ST2+/+ мишеве (р<0.05).Ове мијелоидне ћелије највероватније су предоминантно неутрофилни гранулоцити, обзиром на њихово присуство у значајном броју у периапексним лезијама (Графикон 2), где су доспели миграцијом из лимфних чворова. 93 NK ћелије представљају ,,прву линију одбране“ од вирусних инфекција. Њихову активност регулише баланс између активационих и инхибиторних рецептора (154). Активација NK ћелија покреће поларизовану егзоцитозу цитоплазматских гранула праћену ослобађањем перфорина и гранзима, који индукују смрт циљне ћелије, и секрецијом цитокина, пре свега IFN-γ (130). ST2 молекул експримирају и хумане и мишје NK ћелије (92, 95). Скорија истраживања показују да IL-33 посредством ST2 рецептора директно стимулише (95) или индиректно појачава активност NK ћелијa (92). Наиме, IL-33 у комбинацији са про-инфламаторним цитокином IL-12 појачава продукцију IFN-γ у овим ћелијaма. Улога NK ћелија у патогенези периапексних лезија није у потпуности разјашњена. Претпоставља се да контролишу ширење вирусних инфекција из канала корена зуба у периапексно ткиво (153). Резултати показују да делеција ST2 гена не утиче на број NK ћелија у периапексном ткиву BALB/c мишева (р>0.05) након отварања пулпе мандибуларних првих молара (Графикони 5 и 7). Подаци из литературе о улози и значају макрофага и лимфоцита у патогенези апексног периодонтитиса су контраверзни. Тако на пример, развој овог обољења код експерименталних животиња са одстрањеним тимусом сугерише на кључну улогу макрофага у иницијацији и прогресији периодонтитиса (241). Међутим, имунохистохемијске анализе показују да у хроничним запаљенским реакцијама које се одвијају код периапексних лезија доминирају Т лимфоцитии механизми којима располаже целуларна имуност (38, 125). Показано је да делеција ST2 гена стимулише инфлукс и макрофага и CD4+ Т лимфоцита у инфламирано периапексно ткиво BALB/c мишева (Графикони 5, 6, 7 и 8), при чему само разлика у броју CD4+ Т лимфоцита достиже статистичку значајност (р<0.05). Т1/ST2 рецептор је конститутивно експримиран на макрофагима и активација овог рецептора IL-33 индукује алтернативну активацију макрофага који продукцијом имуносупресивних цитокина остварују значајну улогу у индукцији Th2 имунског одговора. Делеција ST2 гена узрокује одсуство Т1/ST2 рецептора на мембрани макрофага, чиме онемогућава алтернативну активацију макрофага посредством IL-33/ST2 сигналног пута и стимулише инфлукс класично активираних М1 макрофага (172, 242-243). Сматра се да су класично активирани макрофаги (М1) про-инфламаторни и цитотоксични, а алтернативно активирани (М2) анти-инфламаторни (244). М1 макрофаги диференцирају у 94 присуству IFN-γ (Графикони 13, 14, 16 и 17) или продуката микроорганизама и представљају моћне ефекторске ћелије. Карактерише их појачана цитотоксична активност, продукција IL-12, слободних радикала кисеоника и индукција Th1 имунског одговора (245-245), чиме интензивирају деструкцију екстраћелијског матрикса везивног ткива, ресорпцију кости и васкуларне реакције у периапексним лезијама (8). Како је одсуство ST2 сигнализације узроковало значајно повећање (р<0.05) процента (Графикон 9) и броја CD11c+ дендритских ћелија у цервикалним лимфним чворовима BALB/c мишева (Графикон 11), масовни инфлукс CD4+ Т лимфоцита у периапексно ткиво експерименталних ST2-/- мишева вероватно је последица појачане способности дендритских ћелија да стимулишу пролиферацију антиген-специфичних CD4+ Т лимфоцита у одсуству T1/ST2 гена (198, 202). Mayuzumi и сарадници (198) показали су да су конвенционалне дендритске ћелије из културе третиране IL-33 незреле и да функционално и фенотипски не сазревају, као и да недостатак IL-33/ST2 сигналног пута може да „олакша“ сазревање дендритских ћелија. Иста студија показује да незреле дендритске ћелије могу да индукују или активирају имуносупресивне (регулаторне) CD4+ T лимфоците, док зреле дендритске ћелије индукују имуностимулаторне CD4+ T лимфоците. Скорије истраживање показало је да наивни CD4+ T лимфоцити након инкубације са дендритским ћелијама третираним IL-33 појачано продукују IL-5 и IL-13. Претпоставља се да дендритске ћелије реагују на IL-33 преко ST2 рецептора и да ова интеракција представља нови пут Th2 поларизације имунског одговора (199). Поларизација имунског одговора има вишеструк утицај на патогенезу периапексних лезија. Главни медијатори Th1 имунског одговора (IFN-γ, TNF-α, IL-1 и IL-6) стимулишу инфламацију и разградњу кости у инфламираном периапексном ткиву; IL-17 стимулацијом продукције IL-8 има важну улогу у егзацербацији периапексне инфламације; док Th2 цитокини (IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13) и регулаторни Т лимфоцити испољавају репаративно и анти-деструктивно дејство у апексном периодонцијуму (133- 135). T1/ST2 молекул је селективни мембрански маркер Th2 лимфоцита, па се у in vitro и in vivo истраживањима користио за идентификацију ових ћелија или за потврду њиховог присуства у инфламираним органима (247). И претходне (156, 165) и ова студија показују да одсуство ST2 сигнализације поларизује имунски одговор ка Th1/ Th17 смеру и супримира 95 Th2 имунски одговор. Уз то, показано је да уколико се моноклонским антителима блокира T1/ST2 рецептор CD4+ Т лимфоцити продукују про-инфламаторне цитокине (TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-17) (248). Проценат гејтованих CD4+ Т лимфоцита који експримирају TNF-α и IL-6 био је статистички значајно већи (р<0.05) како у периапексним лезијама (Графикон 13), тако и у регионалним лимфним чворовима (Графикон 16) ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима 14. дана након отварања пулпе мандибуларних молара. TNF-α је именован по способости да индукује хеморагијску некрозу у солидним туморима (73). Данас је познат као цитокин који има значајну улогу у бројним биолошким процесима: регрутацији неутрофила и моноцита на место инфекције, индукцији снажног ћелијског имунског одговора, стимулацији ћелија ендотела да продукују хемокине, стимулацији продукције протеина акутне фазе инфламације. Укључен је у патогенезу реуматоидног артритиса, дијабетеса типа 1, фулминантног хепатитиса и мултипле склерозе. Ефекат TNF на ендотел и леукоците је кључни фактор у развоју локалних инфламаторних реакција које у склопу аутоимунских болести оштећују ткиво (77). Деструктивну улогу у патогенези периапексних лезија остварује стимулацијом продукције матрикс металопротеиназа, индукцијом апоптозе фибробласта и стимулацијом диференцијације остеокласта (78). IL-6 је један од главних медијатора урођене и стечене имуности (51). У урођеној имуности стимулише синтезу протеина акутне фазе у хепатоцитима и сазревање неутрофила из прогенитора коштане сржи, док је у стеченој имуности важан за диференцијацију дендритских ћелија, пролиферацију и диференцијацију В лимфоцита и диференцијацију наивних CD4+T лимфоцита у правцу Th17 субпопулације (65-67). Стимулацијом диференцијације моноцита у остеокласте IL-6 индукује пропадање коштаног ткива током пародонтопатије и хроничног периапексног периодонтитиса (71). Kawashima и Stashenko (79) показали су да експресија TNF-α и IL-6 позитивно корелира са разградњом алвеоларне костиу периапексним лезијама, због чега су познати као ресорптивни цитокини кости (енгл. bone resorptive cytokines). Појачана продукција ових цитокина, поред повећаног RANKL/OPG односа (Графикон 15), одговорна је за повећан обим ресорпције алвеоларне кости у периапексном региону ST2-/- мишева (Графикон 1). 96 IFN-γ је про-инфламаторни цитокин типа 1. Продукују га CD4+, CD8+ Т лимфоцити, NK и NKT ћелије. Посредством рецептора за IFN-γ активира макрофаге, цитотоксичне Т лимфоците, NK ћелије, утиче на промену класа антитела (IgМ у IgG), стимулише продукцију IgG антитела и игра важну улогу у апоптози (249). Обзиром на значај који има у индукцији Th1 имунског одговора, сматра се да игра важну улогу у патогенези многих инфламаторних и аутоимунских болести: хроничне грануломатозне болести црева (98), инфламаторне болести јетре (99), дијабетеса типа 1 (100, 101), аутоимунског тиреоидитиса (102). Већи број студија показује да Th1 имунски одговор посредован IFN-γ генерално предоминира у периапексним лезијама, где се доводи у везу са најдеструктивнијим облицима болести (79, 103). Анализа експресије интрацелуларних цитокина у CD4+ Т лимфоцитима показала је да је проценат гејтованих CD4+ ћелија које експримирају IFN-γ статистички значајно већи (р<0.05) у периапексним лезијама (Графикони 13 и 14) и цервикалнимлимфним чворовима ST2 -/- мишева у оба експериментална термина (Графикони 16 и 17), чиме је потврдила претходне резултате (79, 103) о агресивној улози CD4+Th1 лимфоцита у периапексној инфламаторној деструкцији (Графикон 1). Супресивно дејство IL-33/ST2 сигналног пута на активност T-bet транскрипционог фактора, важног за диференцијацију Th1 лимфоцита и продукцију IFN-γ (156, 165), објашњава зашто је делеција ST2 гена значајно повећала проценат гејтованих CD4+ Т ћелија које експримирају IFN-γ у периапексним лезијама и регионалним лимфним чворовима BALB/c мишева. IL-17 припада шесточланој фамилији цитокина од којих су највише проучавани IL-17А и IL-17F (110). Продукују га γδ Т ћелије, CD8+ T лимфоцити, NK ћелије, неутрофилни и еозинофилни гранулоцити, а главни извор овог цитокина је Th17 субпопулација лимфоцита (107, 108). Посредством IL-17 рецептора (од којих су најважнији и најбоље описани IL-17RA и IL-17RC) експримираних на ендотелним ћелијама и макрофагима поспешује продукцију TNF-α и IL-1 (114-116). IL-17 има значајну улогу у патогенези хроничне грануломатозне болести црева, мултипле склерозе и реуматоидног артритиса (111-113). И поред релативно добро дефинисане улоге у аутоимунским феноменима, не зна се довољно о његовој улози у апексном периодонтитису. Čolić и сарадници (119) показали су да у периапексним лезијама постоји позитивна корелација између продукције IFN-γ и IL-17, као и да Th17 имунски одговор има значајну улогу у егзацербацији 97 инфламације у инфламираном периапексном ткиву. IL-17 индукује секрецију про- инфламаторних медијатора који промовишу регрутацију неутрофила на место инфламације (114). Добијени резултати такође указују на веће присуство (р<0.05) неутрофилних гранулоцита (Графикон 2) у периапексним лезијама са већим бројем IL-17- продукујућих CD4+ Т лимфоцита (Графикони 13 и 14). Значајно већи број неутрофила у периапексним лезијама ST2-/- мишева указује да појачана продукција IL-17 није једина одговорна за долазак гранулоцита на место инфламације. Сагласно овим резултатима, значајно већи (р<0.05) проценат гејтованих CXCR3 + CD3 + Th1 и CCR6+CD3+Th17 лимфоцита био је присутан у периапексним лезијама (Графикони 5 и 6) и регионалним лимфним чворовима ST2-/- мишева у оба експериментална термина (Графикони 9 и 10). CXCR3 и CCR6 су хемокински рецептори који усмеравају миграцију Th1 (53) и Th17 лимфоцита (250). Претходне студије (53, 54) указале су на присуство CD3+ лимфоцита у периапексним лезијама који експримирају хемокинске рецепторе карактеристичне за Th1 и Th2 субпопулацију. Th1 лимфоцити предоминантно експримирају CXCR3 и CCR5 хемокинске рецепторе, Th17 лимфоцити CCR6 рецептор, док су CCR2 и CCR3 хемокински рецептори присутни на Th2 лимфоцитима. Silva и сарадници (54) показали су повишену експресију хемокинских рецептора Th2 лимфоцитне субпопулације у ткиву радиксних циста у поређењу са периапексним грануломима и указали на могућ значај Th2 ћелија у еволуцији периапексних лезија. Добијени резултати први пут показују присуство CCR6+CD3+Th17 лимфоцита у периапексним лезијама, као и утицај делеције ST2 гена на инфлукс ових ћелија у периапексно ткиво BALB/c мишева (251). Присуство лимфоцита који експримирају CCR6 хемокински рецептор показано је у хуманој инфламираној пулпи (250). IL-4 je представник Th2 цитокина и сматра се кључним цитокином за индукцију Th2 имунског одговора (120). Појачана секреција овог цитокина покреће алтернативну активацију макрофага, активацију В лимфоцита који секретују IgE антитела која доминирају код паразитарних инфекција и индукцију алергијских реакција кроз активацију мастоцита, базофилних и еозинофилних леукоцита (123). У патогенези периодонтитиса IL-4 остварује протективно дејство инхибицијом транскрипције иРНК про-инфламаторних цитокина и стимулацијом продукције ткивних инхибитора металопротеиназа и OPG-а (102). Познато је да IL-33/ST2 сигнални пут подстиче 98 диференцијацију наивних Т лимфоцита у правцу Th2 субпопулације и да у активираним Т лимфоцитима стимулише продукцију IL-4 посредством активације транскрипционог фактора GATA-3 (156, 165). Добијени резултати то потврђују. Анализом процента гејтованих CD3+ Т лимфоцита који експримирају IL-4 у периапексним лезијама (Графикон 13) и цервикалним лимфним чворовима BALB/c мишева (Графикон 16) уочено је да су мишеви којима је избрисан ген за ST2 у недостатку активације IL-33/ST2 сигналног пута у мањој мери диференцирали ка Th2 субсету. Поред тога, повећана продукција IL-4 у CD3+ ћелијама ST2+/+ BALB/c мишева редуковала је оштећење периапексне алвеоларне кости (Графикон 1). CD4 + Foxp3 +регулаторни Т лимфоцити контролишу локалне имунске и инфламаторне процесе у периапексним лезијама и на тај начин превенишу њихов развој/егзацербацију (252, 253). Протективну улогу остварују инхибицијом ефекторских Т лимфоцита директним контактом са овим ћелијама (253) или индиректно – продукцијом TGF-β и IL-10 (134-135, 254). Функцију ефекторских Т лимфоцита инхибирају интеракцијом CTLA4 молекула експримираног на мембрани ових ћелија и његових лиганда CD80 и CD86 експримираних на ефекторским Т ћелијама (254). Уз то, продукцијом TGF-β и IL-10 регулаторни Т лимфоцити супримирају ефекторске Т ћелије које инфилтришу периапексне лезије (134, 254). АlShwaimi и сарадници (252) показали су да је број регулаторних Т лимфоцита значајно већи у индукованим периапексним лезијама у поређењу са здравим периодонталним лигаментом. Добијени резултати по први пут показују да делеција ST2 гена редукује инфлукс CD4+Foxp3+регулаторних Т лимфоцита у периапексне лезије (Графикони 5 и 7) и цервикалне лимфне чворове BALB/c мишева (Графикони 9, 10, 11 и 12), али без статистичке значајности (р>0.05). Већи број регулаторних Т лимфоцита у периапексним лезијама и регионалним лимфним чворовима ST2+/+ мишева вероватно је допринео редукцији деструкције инфламираног периапексног ткива (Графикон 1). Улога CD8+ Т лимфоцита у патогенези периапексних лезија је и даље дискутабилна. Познато је да су CD8+ T лимфоцити бројнији у дифузним у односу на фокалне периапексне инфилтрате (127). Уз то, показано је да је значајно већи број ових ћелија присутан у цистама у односу на периапексне грануломе (128). Ова студија показала је да је делеција ST2 гена стимулисала инфлукс CD8+ Т лимфоцита у периапексне лезије 99 BALB/c мишева (Графикон 7). Анализа цитокинског профила CD8+ Т лимфоцита присутних у периапексним лезијама (Графикон 13) и лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2 +/+ мишева 14. дана експеримента (Графикон 16) показала једа су гејтоване CD8+ ћелије биле TNF-α-, IFN-γ- и IL-17-позитивне и да су у већем проценту инфилтрисале периапекснo ткиво и лимфне чворове ST2-/- мишева, али без статистичке значајности (р>0.05). Како су претходне студије показале да CD8+ Т лимфоцити посредују у деструкцији ткива продукцијом перфорина и гранзима (129) и продукцијом про- инфламаторних цитокина (255, 256), пораст броја ових ћелија и појачана продукција про- инфламаторних цитокина вероватно је допринела оштећењу периапексног региона ST2-/- мишева (Графикон 1). Даљом анализом популација мононуклеарних ћелија показано је да су CD19+ B лимфоцити у већем броју инфилтрисали инфламирани периапексни регион и лимфне чворове врата ST2-/- мишева у поређењу са ST2+/+ мишевима у оба експериментална термина (Графикони 7, 8, 11 и 12), али разлика у њиховом броју није достигла статистичку значајност (р>0.05). Скорија студија показала је да in vivo администрација IL-33 наивним мишевима индукује синтезу Th2 цитокина и спленомегалију, упућујући на улогу IL-33 у активацији В лимфоцита (257). Насупрот томе, добијени резултати сугеришу да је интензивирана пролиферација В лимфоцита последица недостатка IL-33/ST2 сигналног пута. Уз то, уочено је да су CD19+ B лимфоцити били присутни у већем броју у периапексним лезијама и лимфним чворовима врата ST2-/- и ST2+/+ мишева 28. дана (Графикони 8 и 12) у поређењу са 14.-тим даном експеримента (Графикони 7 и 11), што се објашњава важном улогом ових ћелија у каснијим фазама развоја периапексних лезија (136, 138). 100 5.2. Примена рекомбинантног IL-33 смањује периапексну инфламацију Након везивања IL-33 за T1/ST2 рецептор на наивним Т лимфоцитима активира се IL-33/ST2 сигнални пут који утиче на диференцијацију Th0 у Th2 ћелије и усмерава имунски одговор у Th2 смеру (191, 205). Улога IL-33/ST2 сигналног пута позната је у више модела у инфективном имунитету, алергијама и аутоимуности (168), али није испитивана у патогенези апексног периодонтитиса. Ова студија први пут показује да ова сигнална осовина утиче на миграцију ћелија у експерименталним периапексним лезијама. Анализом популација мононуклеарних ћелија које су инфилтрисале периапексно ткиво ST2+/+ мишева 28. дана експеримента уочено је значајно смањење процента CD4+ T лимфоцита и гејтованих CD3+CXCR3+ Th1 и CD3 + CCR6 + Th17 лимфоцита након примене рекомбинантног IL-33 (р<0.05). Проценат CD8 + T лимфоцита, макрофага и NK ћелија био је такође смањен након примене IL-33, док је проценат CD4+Foxp3+ регулаторних Т лимфоцита био повећан, али разлика у броју ових ћелија није достигла статистичку значајност (р>0.05) (Графикон 18). Анализа експресије интрацелуларних цитокина у Т лимфоцитима који су инфилтрисали периапексне лезије IL-33 третираних мишева 28. дана након индукције обољења показала је да је егзогена апликација рекомбинантног IL-33 супримирала Th1/Th17 и истовремено индуковала Th2 имунски одговор. Проценат гејтованих CD4+ T лимфоцита који експримирају TNF-α-, IL-6-, IFN-γ- и IL-17 био је статистички значајно мањи, а проценат гејтованих CD3+T лимфоцита који експримирају IL-4 статистички значајно већи у периапексним лезијама BALB/c мишева којима је дат IL-33 (р<0.05). Уз то, проценат гејтованих CD8+ T лимфоцита који експримирају TNF-α-, IFN-γ- и IL-17 био је мањи након примене IL-33, али без статистичке значајности (р>0.05) (Графикон 20). Познато је да IL-33/ST2 сигнални пут у активираним Т лимфоцитима стимулише продукцију IL-4 посредством активације транскрипционог фактора GATA-3, a инхибира продукцију про-инфламаторних цитокина супресијом транскрипционог фактора T-bet (156, 165), што објашњава добијене резултате. У мишјем моделу периапексних лезија егзогено апликован IL-33 посредством IL-33/ST2 сигналног пута утицао је на Th2 поларизацију имунског одговора и повећану продукцију IL-4 у CD3+T лимфоцитима. 101 5.3. Експресија IL-33 и ST2 рецептора у мишјем и хуманом периапексном ткиву Ова студија по први пут показује присуство IL-33 у мишјем периапексном ткиву (251), хуманом периодонталном лигаменту и радиксним цистама (258). Досадашња истраживања периапексних лезија обухватила су једино испитивање експресије IL-33 на нивоу иРНК у периапексним грануломима (259), иако је неколико студија о улози овог цитокина у периодонталној болести недавно публиковано. Buduneli и сарадници(260) показали су да је концентрација IL-33 у гингивалној цервикалној течности значајно већа код особа са хроничним периодонтитисом у поређењу са здравом контролном групом. Поред тога, показано је да TNF-α индукује експресију IL-33 у хуманим фибробластима изолованим из гингиве особа са периодонтитисом (261). Повећана експресија IL-33 показана је и у експерименталном моделу периодонтитиса (262). Имунохистохемијском анализом испитан је образац експресије овог цитокина како у мишјем, тако и у хуманом периапексном ткиву. Бројањем имунопозитивних ћелија по јединици површине мишјег периапексног ткива (mm 2 ) показано је да је експресија IL-33 значајно већа (р<0.05) у индукованим периапексним лезијама у поређењу са здравим периодонталним лигаментом ST2+/+ BALB/c мишева (Слика 7). У хуманом периапексном ткиву IL-33 био је присутан у фибробластима и ендотелним ћелијама периодонталног лигамента и периапексних лезија (периапексних гранулома и радиксних цисти) и у епителним ћелијама радиксних циста (Слика 10). Moussion и сарадници (263) показали су да ендотелне и епителне ћелије конститутивно експримирају IL-33, што потврђују и добијени резултати. Иако овај цитокин није детектован у фибробластима изолованим из нормалних хуманих ткива, осим у лимфном ткиву (263), резултати показују његово присуство у фибробластима изолованим из хуманог периодонталног лигамента. Нуклеарно бојење ендотела у периапексним узорцима ткива сагласно је са резултатима претходних студија о присуству IL-33 у једру нормалних и хронично инфламираних хуманих ткива: хуманој кожи, интестинуму, плућима (265), синовији болесника са реуматоидним артритисом и интестинуму болесника са Кроновом болешћу (182). Ови 102 подаци заједно даље поткрепљују тврдњу Carriere-a и сарадника (182) да је IL-33 нуклеарни фактор ендотелних ћелија. Интересантно је да је експресија IL-33 у епителним ћелијама радиксних циста била присутна и у једру и у цитоплазми (Слика 10. Аb). Вероватно је IL-33 ослобођен у цитоплазму из једра ових ћелија како би остварио улогу „алармина“ (263). Морфометријска анализа показала је да је број IL-33-позитивних фибробласта/mm2 хуманог периапексног ткива значајно већи (р<0.05) у периапексним лезијама (Слика 10. А) у поређењу са здравим периапексним ткивом (Слика 10. В), што се објашњава чињеницом да про-инфламаторни стимулуси индукују експресију IL-33 у фибробластима (266-267). Анализа броја IL-33-позитивних ендотелних и епителних ћелија по mm2 хуманог периапексног ткива показала је да није биле значајне разлике (р>0.05) у броју ових ћелија између периапексних лезија и периодонталног лигамента. Познато је да IL-33 остварује своје дејство везујући са за ST2 рецептор на мембрани фибробласта, ендотелних и епителних ћелија (268-269). Ова студија показује да је ST2 молекул присутан како у мишјем (251), тако и хуманом периапексном ткиву (258). Бројањем имунопозитивних ћелија по јединици површине мишјег периапексног ткива уочено је да је експресија ST2 молекула значајно већа (р<0.05) у индукованим периапексним лезијама у поређењу са здравим периодонталним лигаментом ST2+/+ BALB/c мишева (Слика 8). Како је недавно показано да IL-33 посредством ST2 рецептора инхибира остеокластогенезу (253), већи број IL-33- и ST2-позитивних ћелија у периапексним лезијама BALB/c мишева указује на протективну улогу IL-33/ST2 сигналног пута у ресорпцији инфламираног периапексног региона (Графикон 1). Имунохистохемијска анализа хуманог периапексног ткива показала је експресију ST2 молекула у фибробластима и ендотелним ћелијама периапексних лезија (Слика 11. А) и здравог периапексног ткива (Слика 11. В), и епителу радиксних циста (Слика 11. Аb). Познато је да Th2 цитокини индукују експресију ST2 гена у епителним ћелијама (271). Одсуство имунопозитивности у свим епителним ћелијама (Слика 11. Аb) објашњава се истовременим учешћем Th1 и Th2 имунског одговора у патогенези ових лезија (272). Даљом анализом препарата периапексних лезија уочено је ST2 бојење мононуклеарних ћелија које по морфолошким критеријумима одговарају лимфоцитима или макрофагима (Слика 11. Аd), што није изненађујуће обзиром да је претходно показано да су ове ћелије 103 најзаступљеније у периапексним грануломима и цистама (273). Čolić и сарадници (274) су проточном цитофлуорометријском анализом мононуклеарних ћелија изолованих из хуманих периапексних лезија показали супротно - одсуство експресије ST2L молекула у CD3 + T лимфоцитима. Морфометријска анализа показала је да је број ST2-позитивних фибробласта/mm2 хуманог периапексног ткива статистички значајно већи (р<0.05) у периапексним лезијама (Слика 11. А) у поређењу са периодонталним лигаментом (Слика 11. В).Овај налаз сагласан је са резултатима Tajima-e и сарадника (275), који су показали да експресију ST2 гена у плућном моделу фиброзе индукују про-инфламаторни и Th2 цитокини. Анализом ST2-позитивних мононуклеарних, ендотелних и епителних ћелија по mm2 хуманог периапексног ткива уочено је да није биле значајне разлике (р>0.05) у броју ових ћелија између периапексних лезија и периодонталног лигамента. Већи број IL-33- и ST2- позитивних фибробласта у периапексним лезијама упућује на могућу улогу IL-33/ST2 сигналног пута у њиховом фиброзирањуу хроничној фази екпанзије (276-277). Даље је двоструком имунофлуоресцентном анализом испитана ко-експресија IL-33 и ST2 рецептора у хуманим периапексним лезијама. IL-33/ST2 ко-експресија недавно је показана у стромалним ћелијама материце у првом триместру трудноће (278), док је у периапексном ткиву непозната. Добијени резултати показују да фибробласти (Слика 12. А) и ендотелне ћелије (Слика 12. В) ко-експримирају IL-33 и ST2 молекул. IL-33 вероватно остварује аутокрино дејство везујући се за ST2 рецептор у овим ћелијама. Мононуклеарне ћелије које по морфолошким критеријумима одговарају лимфоцитима или макрофагима биле су једноструко ST2-позитивне (Слика 12. С), што није изненађујуће обзиром да ове ћелије не продукују IL-33. 104 6. ЗАКЉУЧЦИ На основу анализе добијених резултата изведени су следећи закључци: 1. Делеција ST2 гена значајно појачава инфламаторну деструкцију периапексног ткива у експерименталном моделу периапексних лезија у BALB/c мишева 1.1. Делеција ST2 гена повећава обим ресорпције алвеоларне кости у периапексном региону BALB/c мишева након индукције лезија 1.2. Делеција ST2 гена повећава RANKL/OPG однос и броj остеокласта у периапексним лезијама 1.3. ST2 делеција повећава инфлукс имунских ефекторских ћелија у периапексне лезије 1.4. ST2 делеција подстиче поларизацију ка Th1/Th17 имунском одговору, а инхибира Th2 имунски одговор у периапексним лезијама 2. Активација IL-33/ST2 сигналног пута смањује периапексну инфламацију, а повећава фиброзу у експерименталном моделу периапексних лезија у BALB/c мишева 2.1. Активација IL-33/ST2 сигналног пута смањује инфлукс ефекторских мононуклеарних ћелија и редукује инфламацију у периапексним лезијама BALB/c мишева 2.2. Егзогена примена рекомбинантног IL-33 у периапексним лезијама BALB/c мишева инхибира продукцију про-инфламаторних цитокина (TNF-α-, IL-6-, IFN-γ- и IL-17) у CD4+ и CD8+ T лимфоцитима, а подстиче продукцију IL-4 у CD3+ T лимфоцитима 2.3. Повећан број IL-33- и ST2-позитивних фибробласта у хуманим периапексним лезијама указује на могућу улогу IL-33/ST2 сигналног пута у фиброзирању инфламираног периапексног ткива 105 СКРАЋЕНИЦЕ en глеђ (enamel) de дентин pc комора пулпе (pulp cavity) ас ацелуларни цемент сс целуларни цемент јb вилична кост (jawbone) sf Шарпејева влакна (Sharpey’s fibers) pdl периодонтални лигамент so секундарни остеон po примарни остеон vc васкуларни канал ab aлвеоларна кост (аlveolar bone) TRAP тартрат резистентна кисела фосфатаза (tartrate resistant acid phosphatase) CTR рецептор калцитонина (calcitonin receptor) 1CTP карбокситерминални телопептидни колаген типа 1 (carboxyterminal telopeptide of type 1 collagen) DAMP acidotrophic amine 3-(2,4-dinitroanillino)-3'-amino-N-methyldipropylamine IL интерлеукин (interleukin) TNF фактор некрозе тумора (tumor necrosis factor) Th лимфоцити помоћнички Т лимфоцити (Т helper) Treg лимфоцити регулаторни Т лимфоцити NALP3 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 АP-1 activation protein 1 106 NF-κB nuclear factor κB IL-1R рецептор за IL-1 (IL-1 receptor) IL-1RacP помоћни протеин IL-1R (IL-1R accessory protein) IRAK IL-1 receptor associated kinase TRAF-6 tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 FADD Fas-associated DD protein NIK NF-κB-inducing kinase RANKL receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand RANK receptor activator of nuclear factor kappa-B OPG оsteoprotegerin Jak janus kinase STAT1α signal transducers and activators of transcription alpha GAF interferon-gamma activator factor GAS interferon-gamma activator sequence TGF-β transforming growth factor beta mRNA информационa РНК (messenger RNA) TIMPs ткивни инхибитори металопротеиназа (tissue inhibitors of metalloproteinases) GM-CSF фактор стимулације колонија гранулоцита и макрофага (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) DCs дендритске ћелије (dendritic cells) KIR killer cell Ig-like receptor MLD-STZ вишеструке мале дозе стрептозотоцина (multiple low dose streptozotocin) LPS липополисахарид (lipopolysaccharide) 107 TLR рецептор сличан толу (Тoll like receptor) NO aзотни оксид (nitrogen oxide) NF-HEV нуклеарни фактор венула са високим ендотелом (nuclear factor of high endothelial venules) LANA latency associated nuclear antigen myD88 myeloid differentiation primary-response protein 88 MAPKs mitogen-activated protein kinases WT wild type ST2 -/- ST2 knock-out PBS phosphate-buffered saline BSA bovine serum albumin H&E hematoxylin-eosin FBS говеђи фетални серум (fetal bovine serum) EDTA еthylenediaminetetraacetic acid hpf high-power field DAB диаминобензидин (3,3-Diaminobenzidine) SE стандардна грешка (Standard Error) Nfatc1 нуклеарни фактор активираних Т лимфоцита 1 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1) 108 7. ЛИТЕРАТУРА 1. Graves DT, Oates T, Garlet GP. Review of osteoimmunology and the host response in endodontic and periodontal lesions. J Oral Microbiol 2011; doi: 10.3402/jom.v3i0.5304. 2. Nair PN. Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Crit Rev Oral Biol Med 2004; 15: 348-381. 3. LeBlanc AR, Reisz RR. Periodontal ligament, cementum, and alveolar bone in the oldest herbivorous tetrapods, and their evolutionary significance. PLoS One 2013; 8: e74697 4. Angelraud R. Аnatomy and histology of periodontium. Cah Odontostomatol Touraine 1973; 5: 41-45. 5. Angelraud R. Histological study of inflammation during periodontolysis. Rev Fr Odontostomatol 1970a; 17: 549-56. 6. Bar-Shavit Z. Taking a toll on the bones: regulation of bone metabolism by innate immune regulators. Autoimmunity 2008; 41: 195–203. 7. МcNicholas S, Torabinejad M, Blankenship J, Bakland L. The concentration of prostaglandin E2 in human periradicular lesions. J Endod 1991; 17: 97-100. 8. Torabinejad M, Cotti E, Jung T. Concentrations of leukotriene B4 in symptomatic and asymptomatic periapical lesions. J Endod 1992; 18: 205-208. 9. Holtrop M. E, G. J. King G. J. The ultrastructure of the osteoclast and its functional implications. Clin Orthop Relat Res 1977; 123: 177–196. 10. Väänänen H, Zhao H, Mulari M, Halleen J. The cell biology of osteoclast function. J Cell Sci 2000; 113: 377–381. 11. Ballanti P, Minisola S, Pacitti MT, Scarnecchia L, Rosso R, Mazzuoli GF, Bonucci E. Tartrate-resistant acid phosphate activity as osteoclastic marker: sensitivity of cytochemical assessment and serum assay in comparison with standardized osteoclast histomorphometry. Osteoporosos Int 1997; 7: 39-43. 12. Atkins GJ, Kostakis P, Vincent C, Farrugia AN, Houchins JP, Findlay DM, Evdokiou A, Zannettino AC. RANK expression as a cell surface marker of human osteoclast precursors in peripheral blood, bone marrow, and giant cell tumors of bone. J Bone Miner Res 2006; 21: 1339-1349. 13. Dodds RA. A cytochemical assay for osteoclast cathepsin K activity. Cell Biochem Funct 2003; 21: 231-234. 109 14. Lee SK, Goldring SR, Lorenzo JA. Expression of the calcitonin receptor in bone marrow cell cultures and in bone: a specific marker of the differentiated osteoclast that is regulated by calcitonin. Endocrinology 1995; 136: 4572-4581. 15. Gough A, Abraha H, Li F, Purewal TS, Foster AV, Watkins PJ, Moniz C, Edmonds ME. Measurement of markers of osteoclast and osteoblast activity in patients with acute and chronic diabetic Charcot neuroarthropathy. Diabet Med 1997; 14: 527-531. 16. Inoue M, Yoshida H, Akisaka T. Visualization of acidic compartments in cultured osteoclasts by use of an acidotrophic amine as a marker for low pH. Cell Tissue Res 1999; 298: 527-537. 17. Wildemann B, Sander A, Schwabe P, Lucke M, Stöckle U, Raschke M, Haas NP, Schmidmaier G. Short term in vivo biocompatibility testing of biodegradable poly (D,L- lactide)-growth factor coating for orthopaedic implants. Biomaterials 2005; 26: 4035-4040. 18. Kurihara N, Gluck S, Roodman GD. Sequential expression of phenotype markers for osteoclasts during differentiation of precursors for multinucleated cells formed in long-term human marrow cultures. Endocrinology 1990; 127: 3215-3221. 19. Whyte MP, Chines A, Silva DP Jr, Landt Y, Ladenson JH. Creatine kinase brain isoenzyme (BB-CK) presence in serum distinguishes osteopetroses among the sclerosing bone disorders. J Bone Miner Res 1996; 11: 1438-1443. 20. Kukita T, Kukita A, Xu L, Watanabe T, Iijima T. Kat1-antigen - a reliable immunological marker for identifying osteoclast precursors of rats: detection of subpopulations among precursors and initiation of osteoclastogenesis. Histochem Cell Biol 2001; 115: 215-222. 21. Sakiyama H, Masuda R, Inoue N, Yamamoto K, Kuriiwa K, Nakagawa K, Yoshida K. Establishment and characterization of macrophage-like cell lines expressing osteoclast- specific markers. J Bone Miner Metab 2001; 19: 220-227. 22. Theill LE, Boyle WJ, Penninger JM. RANK-L and RANK: T cells, bone loss, and mammalian evolution. Annu Rev Immunol 2002; 20: 795–823. 23. Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K,Udagawa N, Takahashi N, Suda T. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 3597–3602. 24. Goltzman D, Karaplis AC, Kremer R, Rabbani SA. Molecular basis of the spectrum of skeletal complications of neoplasia. Cancer 2000; 88: 2903-2908. 25. Goltzman D: Osteolysis and cancer. J Clin Invest 2001; 107: 1219-1220. 110 26. Gouin F, Moreau A, Guicheux J, Passuti N, Heymann D: Mechanism of tumor-induced osteolysis. Rev Chir Orthop 1999; 85:58-68. 27. Wang CY, Stashenko P. Kinetics of bone-resorbing activity in developing periapical lesions. J Dent Res 1991; 70: 1362-1366. 28. Oguntebi BR, Barker BF, Anderson DM, Sakumura J. The effect of indomethacin on experimental dental periapical lesions in rats. J Endod 1989; 15: 117-121. 29. Маrton IJ, Kiss C. Protective and destructive immune reactions in apical periodontitis. Oral Microbiol Immunol 2000; 15: 139-150. 30. Angelraud R. Gingivitis and periodontitis. The gingival lesion: histopathology. Rev Stomatoodontol Nord Fr 1970b; 25: 235-241. 31. Piattelli A, Artese L, Rosini S, Quaranta M, Musiani P. Immune cells in periapical granuloma: morphological and immunohistochemical characterization. J Endod 1991; 17: 26−29. 32. Rodini CO, Lara VS. Study of the expression of CD68+ macrophages and CD8+ T cells in human granulomas and periapical cysts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92: 221−227. 33. Liapatas S, Nakou M, Rontogianni D. Inflammatory infiltrate of chronic periradicular lesions: an immunohistochemical study. Int Endod J 2003; 36: 464−471. 34. Nair PN. Apical periodontitis: a dynamic encounter between root canal infection and host response. Periodontol 2000 1997; 13: 121–148. 35. Nair PN, Pajarola G, Schroeder HE. Types and incidence of human periapical lesions obtained with extracted teeth. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1996; 81: 93-102. 36. Gao Z, Mackenzie IC, Rittman BR, Korszun AK, Williams DM, Chruchley AT. Immunocytochemical examination of immune cells in periapical granulomata and odontogenic cysts. J Oral Pathol 1988; 17: 84-90. 37. Takahashi K, MacDonald D, Murayama Y, Kinane D. Cell synthesis, proliferation and apoptosis in human dental periapical lesions analysed by in situ hybridization and immunohistochemistry. Oral Dis 1999; 5: 313-320. 38. Torabinejad M, Kettering JD. Identification and relative concentration of B and T lymphocytes in human chronic periapical lesions. J Endod 1985; 11: 122-125. 39. Shear M. Cysts of the oral regions. 3rd edition. Oxford: Wright; 1992. 111 40. Lukić A, Danilović V, Petrović R. Comparative immunohistochemical and quantitative analysis of inflammatory cells in symptomatic and asymptomatic chronic periapical lesions. Vojnosanit Pregl 2008; 65: 435-440. 41. Surwillo EJ. Periapical lesions, diagnosis and treatment. Images Marguette Univ Dent Reflections 1966; 6: 4-5. 42. Wan C, Yuan G, Yang J, Sun Q, Zhang L, Zhang J, Zhang L, Chen Z. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. J Endod 2014; 40: 658-664. 43. Walton RE, Ardjmand K. Histological evaluation of the presence of bacteria in induced periapical lesions in monkeys. J Endod 1992; 18: 216-227. 44. Silva LA, Novaes AB Jr, de Oliveira RR, Nelson-Filho P, Santamaria M Jr, Silva RA. Antimicrobial photodynamic therapy for the treatment of teeth with apical periodontitis: a histopathological evaluation. J Endod 2012; 38-360-366. 45. Torabinejad M, Kiger RD. Experimentally induced alterations in periapical tissues of the cat. J Dent Res 1980; 59: 87-96. 46. Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ. The effects of surgical exposures of dental pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1965; 20: 340– 349. 47. Teles R, Wang CY, Stashenko P. Increased susceptibility of RAG-2 SCID mice to dissemination of endodontic infections. Infect Immun 1997; 65: 3781-3787. 48. Yamasaki M, Kumazawa M, Kohsaka T, Nakamura H. Effect of methotrexate-induced neutropenia on rat periapical lesion. Оral Surg Oral Med Oral Pathol 1994; 77: 655-661. 49. Kaneko T, Okiji T, Kan L, Suda H, Takagi M. An immunoelectron-microscopic study of class II major histocompatibility complex molecule-expressing macrophages and dendritic cells in experimental rat periapical lesions. Arch Oral Biol 2001; 46: 713-720. 50. Silva TA, Garlet GP, Fukada SY, Silva JS, Cunha FQ. Chemokines in oral inflammatory diseases: apical periodontitis and periodontal disease.J Dent Res 2007; 86: 306–319. 51. Taylor J.J. Cytokine regulation of immune responses to Porphyromonas gingivalis. Periodontology 2000 2010; 54: 160–194. 52. Lukić A, Vojvodić D, Majstorović I, Čolić M. Production of interleukin-8 in vitro by mononuclear cells isolated from human periapical lesions. Oral Microbiol Immunol 2006; 21: 296–300. 53. Kabashima H, Yoneda M, Nagata K, Hirofuji T, Ishihara Y, Yamashita M, Maeda K. The presence of chemokine receptor (CCR5, CXCR3, CCR3)-positive cells and chemokine 112 (MCP1, MIP-1 alpha, MIP-1 beta, IP-10)-positive cells in human periapical granulomas. Cytokine 2001; 16: 62-66. 54. Silva TA, Garlet GP, Lara VS, Martins Jr W, Silva JS, Cunha FQ. Differential expression of chemokines and chemokine receptors in inflammatory periapical diseases. Oral Microbiol Immunol 2005; 20: 310-316. 55. Barksby HE, Lea SR, Preshaw PM, Taylor JJ. The expanding family of interleukin- 1cytokines and their role in destructive inflammatory disorders. Clin Exp Immunol 2007; 149: 217–225. 56. Jagadeesh S. Rao, G. Jean Harry, Stanley I. Rapoport, Hyung-Wook Kim. Increased excitotoxicity and neuroinflammatory markers in postmortem frontal cortex from bipolar disorder patients. Mol Psychiatry 2010; 15: 384-392. 57. Tanabe N, Maeno M, Suzuki N, Fujisaki K, Tanaka H, Ogiso B, Ito K. IL-1 alpha stimulates the formation of osteoclast-like cells by increasing M-CSF and PGE2 production and decreasing OPG production by osteoblasts. Life Sci 2005; 77: 615–626. 58. Fouad AF. IL-1 alpha and TNF-alpha expression in early periapical lesions of normal and immunodeficient mice. J Dent Res 1997; 76:1548-1554. 59. Chen CJ, Kono H, Golenbock D, Reed G, Akira S, Rock KL. Identification of a key pathway required for the sterile inflammatory response triggered by dying cells. Nat Med 2007; 13: 851–856. 60. Dinarello C.A. Immunological and inflammatory functions of the interleukin-1 family. Annu Rev Immunol 2009; 27: 519–550. 61. Matsuki Y, Yamamoto T, Hara K. Localization of interleukin-1 (IL-1) iRNK-expressing macrophages in human inflamed gingiva and IL-1 activity in gingival crevicular fluid. J Periodontal Res 1993; 28: 35–42. 62. Lee HJ, Kang IK, Chung CP, Choi SM. The subgingival microflora and gingival crevicular fluid cytokines in refractory periodontitis. J Clin Periodontol 1995; 22: 885–890. 63. Barkhordar RA, Hussain MZ, Hayashi C. Detection of interleukin-1 beta in human periapical lesions.Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1992; 73 :334-336. 64. Hamachi T, Anan H, Akamine A, Fujise O, Maeda K. Detection of interleukin-1 beta mRNA in rat periapical lesions. J Endod 1995; 21: 118-121. 65. Kishimoto T. Interleukin-6: from basic science to medicine – 40 years in immunology. Annu Rev Immunol 2005; 23: 1–21. 113 66. Bettelli E, Carrier Y, Gao W, Korn T, Strom TB, Oukka M, Weiner HL, Kuchroo VK. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature 2006; 441: 235–238. 67. Park SJ, Nakagawa T, Kitamura H, Atsumi T, Kamon H, Sawa S, Kamimura D, Ueda N, Iwakura Y, Ishihara K, Murakami M, Hirano T. IL-6 regulates in vivo dendritic cell differentiation through STAT3 activation. J Immunol 2004; 173: 3844–3854. 68. Girasole G, Jilka RL, Passeri G, Boswell S, Boder G, Williams DC, Manolagas SC. 17 beta- estradiol inhibits interleukin-6 production by bone marrow-derived stromal cells and osteoblasts in vitro: a potential mechanism for the antiosteoporotic effect of estrogens. J Clin Invest 1992; 89: 883-891. 69. Passeri G, Girasole G, Manolagas SC, Jilka RL. Endogenous production of tumor necrosis factor by primary cultures of murine calvarial cells: influence on IL-6 production and osteoclast development. Bone Miner 1994; 24: 109-126. 70. Binkley NC, Sun WH, Checovich MM, Roecker EB, Kimmel DB, Ershler WB. Effects of recombinant human interleukin-6 administration on bone in rhesus monkeys. Lymphokine Cytokine Res 1994; 13: 221-226. 71. Baker PJ, Dixon M, Evans RT, Dufour L, Johnson E, Roopenian DC. CD4(+) T сells and the proinflammatory cytokines gamma interferon and interleukin-6 contribute to alveolar bone loss in mice. Infect Immun 1999; 67: 2804–2809. 72. Huang GTJ, Do M, Wingard M, Park JS, Chugal N. Effect of interleukin-6 deficiency on the formation of periapical lesions after pulp exposure in mice. Oral surg Oral med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92: 83-88. 73. Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, Green S, Fiore N, Williamson B. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 1975; 72: 3666–3670. 74. Wajant H, Pfizenmaier K, Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling. Cell Death Differ 2003; 10: 45–65. 75. MacEwan DJ. TNF receptor subtype signalling: differences and cellular consequences. Cell Signal 2002; 14: 477–492. 76. Moelants EA, Mortier A, Van Damme J, Proost P. Regulation of TNF-α with a focus on rheumatoid arthritis. Immunol Cell Biol 2013; 91: 393-401. 77. Grivennikov SI, Tumanov AV, Liepinsh DJ, Kruglov AA, Marakusha BI, Shakhov AN, Murakami T, Drutskaya LN, Forster I, Clausen BE, Tessarollo L, Ryffel B, Kuprash DV, Nedospasov SA. Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects. Immunity 2005; 22: 93-104. 114 78. Ware CF. The TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev 2003; 14: 181-184. 79. Kawashima N, Stashenko P. Expression of bone-resorptive and regulatory cytokines in murine periapical inflammation. Arch Oral Biol 1999; 44: 55-66. 80. Hong CY, Lin SK, Kok SH, Cheng SJ, Lee MS, Wang TM, Chen CS, Lin LD, Wang JS. The role of lipopolysaccharide in infectious bone resorption of periapical lesion. J Oral Pathol Med 2004; 33: 162-169. 81. Theill LE, Boyle WJ, Penninger JM. RANK-L and RANK: T cells, bone loss, and mammalian evolution. Annu Rev Immunol 2002; 20: 795-823. 82. Kong YY, Feige U, Sarosi I, Bolon B, Tafuri A, Morony S, Capparelli C, Li J, Elliott R, McCabe S, Wong T, Campagnuolo G, Moran E, Bogoch ER, Van G, Nguyen LT, Ohashi PS, Lacey DL, Fish E, Boyle WJ, Penninger JM. Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. Nature 1999; 402: 304–309. 83. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature 2003; 423: 337–342. 84. Lum L, Wong BR, Josien R, Becherer JD, Erdjument-Bromage H, Schlöndorff J, Tempst P, Choi Y, Blobel CP. Evidence for a role of a tumor necrosis factor-(TNF)-converting enzyme- like protease in shedding of TRANCE, a TNF family member involved in osteoclastogenesis and dendritic cell survival. J Biol Chem 1999; 274: 13613-13618. 85. Kawai T, Matsuyama T, Hosokawa Y, Makihira S, Seki M, Karimbux NY, Goncalves RB, Valverde P, Dibart S, Li YP, Miranda LA, Ernst CW, Izumi Y, Taubman MA. B and T lymphocytes are the primary sources of RANKL in the bone resorptive lesion of periodontal disease. Am J Pathol 2006; 169: 987-998. 86. Kong YY, Boyle WJ, Penninger JM. Osteoprotegerin ligand: a regulator of immune responses and bone physiology. Immunol Today 2000; 21: 495-502. 87. Pettit AR, Ji H, von Stechow D, Müller R, Goldring SR, Choi Y, Benoist C, Gravallese EM. TRANCE/RANKL knockout mice are protected from bone erosion in a serum transfer model of arthritis. Am J Pathol 2001; 159: 1689-1699. 88. Wittrant Y, Theoleyre S, Chipoy C, Padrines M, Blanchard F, Heymann D, Rédini F. RANKL/RANK/OPG: new therapeutic targets in bone tumours and associated osteolysis. Biochim Biophys Acta 2004; 1704: 49-57. 89. Tan KB, Harrop J, Reddy M, Young P, Terrett J, Emery J, Moore G, Truneh A. Characterization of a novel TNF-like ligand and recently described TNF ligand and TNF receptor superfamily genes and their constitutive and inducible expression in hematopoietic and non-hematopoietic cells. Gene 1997; 204: 35–46. 115 90. Schoppet M, Preissner KT, Hofbauer LC. RANK ligand and osteoprotegerin: paracrine regulators of bone metabolism and vascular function. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22 :549-53. 91. Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang M-S, Luethy R, Nguyen HQ, Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R,Colombero A, Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D, Pattison W, Campbell P, Sander S, Van G, Tarpley J, Derby P,Lee R, Boyle WJ. Osteoprotegerin: A novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 1997; 89: 309–319. 92. Fan R, Sun B, Zhang CF, Lü YL, Xuan W, Wang QQ, Yin XZ. Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin expression in chronic apical periodontitis: possible association with inflammatory cells. Clin Med J 2011; 124: 2162-2166. 93. Menezes R, Garlet TP, Letra A, Bramante CM, Campanelli AP, Figueira Rde C, Sogayar MC, Granjeiro JM, Garlet GP. Differential patterns of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand/osteoprotegerin expression in human periapical granulomas: possible association with progressive or stable nature of the lesions. Ј Еndod 2008; 34: 932-938. 94. Shuai Ke, Horvath CM, Tsai Hung LH, Qureshi SA, Cowburn D, Darnell JE. Interferon activation of the transcription factor Stat91 involves dimerization through SH2- phosphotyrosyl peptide interactions. Cell 1994; 76: 821-828. 95. Billiau A. Interferon-gamma: biology and role in the pathogenesis. Adv Immunol 1996;62: 61–130. 96. Seymour GJ, Gemmell E. Cytokines in periodontal disease: where to from here? Acta Odontol Scand 2001; 59: 167–173. 97. Ito R, Shin-Ya M, Kishida T, Urano A, Takada R, Sakagami J, Imanishi J, Kita M, Ueda Y, Iwakura Y, Kataoka K, Okanoue T, Mazda O. Interferon-gamma is causatively involved in experimental inflammatory bowel disease in mice. Clin Exp Immunol 2006; 146: 330-338. 98. Thomsen MK, Bakiri L, Hasenfuss SC, Hamacher R, Martinez L, Wagner EF. JUNB/AP- 1controls IFN-γ during inflammatory liver disease. J Clin Invest 2013; 123: 5258-5268. 99. Nicoletti F, Zaccone P, Di Marco R, Di Mauro M, Magro G, Grasso S, Mughini L, Meroni PL, Garotta G. The effects of a nonimmunogenic form of murine soluble interferon gamma receptor on the development of autoimmune diabetes in NOD mouse. Endocrinology 1996; 137: 5567–5575. 100. Nicoletti F, Zaccone P, Di Marco R, Lunetta M. Magro G, Grasso S, Meroni PL, Garotta G. Prevention of spontaneous autoimmune diabetes in diabetes-prone BB rats by prophylactic treatment with anti-rat interferon-y antibody. Endocrinology 1997; 138: 281– 288. 116 101. Tang H, Mignon-Godefroy K, Meroni PL, Garotta G, Charreire J, Nicoletti F. The effects of a monoclonal antibody to interferon-y on Experimental Autoimmune Thyroiditis (EAT): prevention of disease and decrease of EAT-specific T cells. Eur J Immunol 1993; 23: 275– 279. 102. Garlet GP. Destructive and Protective Roles of Cytokines in Periodontitis: A Reappraisal from Host Defense and Tissue Destruction Viewpoints. J Dent Res 2010; 89: 1349-1363. 103. Garlet GP, Cardoso CR, Campanelli AP, Garlet TP, Avila-Campos MJ, Cunha FQ, Silva JS. The essential role of IFN-gamma in the control of lethal Aggregatibacteractinomycetemcomitans infection in mice. Microbes Infect 2008; 10: 489- 496. 104. Houri-Haddad Y, Soskolne WA, Shai E, Palmon A, Shapira L. Interferon-gamma deficiency attenuates local P. gingivalis-induced inflammation. J Dent Res 2002; 81: 395- 398. 105. Takayanagi H, Ogasawara K, Hida S, Chiba T, Murata S, Sato K. T-cell-mediated regulation of osteoclastogenesis by signalling cross-talk between RANKL and IFN gamma. Nature 2000; 408: 600-605. 106. Gemmell E, Yamazaki K, Seymour GJ. Destructive periodontitis lesions are determined by the nature of the lymphocytic response. Crit Rev Oral Biol Med 2002; 13: 17-34. 107. He D, Wu L, Kim HK, Li H, Elmets CA, Xu H. CD8+ IL-17-producing T cells are important in effector functions for the elicitation of contact hypersensitivity responses. J Immunol 2006; 177: 6852-6858. 108. Korn T, Bettelli E, Oukka M, Kuchroo VK. IL-17 and Th17 cells. Annu Rev Immunol 2009; 27: 485–517. 109. Dorhoi A, Kaufmann SH. Fine-tuning of T cell responses during infection. Curr Opin Immunol 2009; 21: 367–377. 110. Kolls JK, Linden А. Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity. 2004; 21: 467–476. 111. Fujiyama Y. Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease. Gut 2003, 52: 65-70. 112. Tzartos JS, Friese MA, Craner MJ, Palace J, Newcombe J, Esiri MM, Fugger L. Interleukin-17 production in central nervous system infiltrating T cells and glial cells is associated with active disease in multiple sclerosis. Am J Pathol 2008, 172: 146-155. 117 113. Chabaud M, Garnero P, Dayer JM, Guerne PA, Fossiez F, Miossec P: Contribution of interleukin 17 to synovium matrix destruction in rheumatoid arthritis. Cytokine 2000; 12: 1092-1099. 114. Fossiez F, Djossou O, Chomarat P, Flores-Romo L, Ait-Yahia S, Maat C, Pin JJ, Garrone P, Garcia E, Saeland S, Blanchard D, Gaillard C, Das Mahapatra B, Rouvier E, Golstein P, Banchereau J, Lebecque S. T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines. J Exp Med 1996; 183: 2593-2603. 115. Jovanovic DV, Di Battista JA, Martel-Pelletier J, Jolicoeur FC, He Y, Zhang M, Mineau F, Pelletier JP. IL-17 stimulates the production and expression of proinflammatory cytokines, IL-b and TNF-a, by human macrophages. J Immunol 1998; 160: 3513-3521. 116. Teunissen MB, Koomen CW, de Waal Malefyt R, Wierenga EA, Bos JD. Interleukin-17 and interferon- γ synergize in the enhancement of proinflammatory cytokine production by human keratinocytes. J Invest Dermatol 1998; 111: 645-649. 117. Beklen A, Ainola M, Hukkanen M, Gurgan C, Sorsa T, Konttinen YT. MMPs, IL-1, and TNF are regulated by IL-17 in periodontitis. J Dent Res 2007; 86: 347–351. 118. Sato K, Suematsu A, Okamoto K, Yamaguchi A, Morishita Y, Kadono Y. Th17 functions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation andbone destruction. J Exp Med 2006; 203: 2673-2682. 119. Čolić M, Vasilijić S, Gazivoda D, Vucević D, Marjanović M, Lukić A. Interleukin-17 plays a role in exacerbation of inflammation within chronic periapical lesions. Eur J Oral Sci 2007; 115: 315-320. 120. Fallon PG, Jolin HE, Smith P, Emson CL, Townsend MJ, Fallon R, Smith P, McKenzie AN. IL-4 induces characteristic Th2 responses even in the combined absence of IL-5, IL-9, and IL-13. Immunity 2002: 17: 7–17. 121. Hosoyama T, Aslam MI, Abraham J, Prajapati SI, Nishijo K, Michalek JE, Zarzabal LA, Nelon LD, Guttridge DC, Rubin BP, Keller C. IL-4R drives dedifferentiation, mitogenesis, and metastasis in rhabdomyosarcoma. Clin Cancer Res 2011; 17: 2757-2766. 122. Bhattacharjee A, Shukla M, Yakubenko VP, Mulya A, Kundu S, Cathcart MK. IL-4 and IL-13 employ discrete signaling pathways for target gene expression in alternatively activated monocytes/macrophages. Free Radic Biol Med 2013; 54 :1-16. 123. Abbas AK, Murphy KM, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 1996; 383: 787. 124. Alayan J, Ivanovski S, Farah CS. Alveolar bone loss in T helper 1/T helper 2 cytokine- deficient mice. J Periodontal Res 2007; 42: 97-103. 118 125. Nilsen R, Johannessen AC, Skaug N, Matre R. In situ characterization of mononuclear cells in human dental periapical inflammatory lesions using monoclonal antibodies. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1984; 58: 160−165. 126. Stashenko P, Yu SM, Wang CY. Kinetics of immune cell andbone resorptive responses to endodontic infections. J Endod 1992; 18: 422−426. 127. Lukić A, Arsenijević N, Vujanić G, Ramić Z. Quantitative analysis of the immunocompetent cells in periapical granuloma: correlation with the histological characteristics of the lesions. J Endod 1990; 16: 119–122. 128. Rodini CO, Lara VS. Study of the expression of CD68+ macrophages and CD8+ T cells in human granulomas and periapical cysts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001; 92: 221−227. 129. Trapani JA, Smyth MJ. Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway. Nat Rev Immunol 2002; 2: 735-747. 130. Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors: signaling and modulation. Science 1998; 281: 1305-1308. 131. Chicheportiche Y, Bourdon PR, Xu H, Hsu YM, Scott H, Hession C, Garcia I, Browning JL. TWEAK, a new secreted ligand in the tumor necrosis factor family that weakly induces apoptosis. J Biol Chem 1997; 272: 32401-32410. 132. Peter ME, Krammer PH. Mechanisms of CD95 (APO-1/Fas)- mediated apoptosis. Curr Opin Immunol 1998; 10: 545-551. 133. Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol 2005; 6: 1123–1132. 134. Lukić A. Transforming growth factor-β is a major down-regulatory cytokine in periapical lesions. Balkan Journal of Stomatology 2000; 4: 157-160. 135. Čolić M, Gazivoda D, Vučević D, Vasilijić S, Rudolf R, Lukić A. Proinflammatory and immunoregulatory mechanisms in periapical lesions. Mol Immunol 2009; 47: 101–113. 136. Akamine A, Hashiguchi I, Toriya Y, Maeda K. Immunohistochemical examination on the localization of macrophages and plasma cells in induced rat periapical lesions. Endod Dent Traumatol 1994; 10: 121−128. 137. Kuntz DD, Genco RJ, Guttuso J, Natiella JR. Localization of immunoglobulins and the third component of complement in dental periapical lesions. J Endod 1977; 3: 68–73. 119 138. Grover N, Rao NN, Kotian MS. Evaluation of immunoglobulin G synthesizing plasma cells in periapical granuloma and cyst. Indian J Dent Res 2001; 12: 35-39. 139. Kaufmann SH. Immunity to intracellular bacteria. Annu Rev Immunol 1993; 11: 129– 163. 140. Ataoglu T, Ungor M, Serpek B, Haliloglu S, Ataoglu H, Ari H. Interleukin-1 beta and tumour necrosis factor-alpha levels in periapical exudates. Int Endod J 2002; 35: 181–185. 141. Radics T, Kiss C, Tar I, Marton IJ. Interleukin-6 and granulocyte macrophage colony- stimulating factor in apical periodontitis: correlation with clinical and histologic findings of the involved teeth. Oral Microbiol Immunol 2003; 18: 9–13. 142. Vernal R, Dezerega A, Dutzan N, Chaparro A, Leon R, Chandia S, Silva A, Gamonal J. RANKL in human periapical granuloma: possible involvement in periapical bone destruction. Oral Dis 2006; 12: 283–289. 143. Garlet GP, Martins W Jr, Fonseca BA, Ferreira BR, Silva JS. Matrix metalloproteinases, their physiological inhibitors and osteoclast factors are differentially regulated by the cytokine profile in human periodontal disease. J Clin Periodontol 2004; 31: 671-679. 144. Ma J, Chen T, Mandelin J, Ceponis A, Miller NE, Hukkanen M, Ма GF, Konttinen YT. Regulation of macrophage activation. Cell Mol Life Sci 2003; 60: 2334−2346. 145. Lerner UH. Regulation of bone metabolism by the kallikreinkinin system, the coagulation cascade, and acute phase reactions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1994; 78:481-493. 146. Suzuki N, Okiji T, Suda H. Enhanced expression of activation associated molecules on macrophages of heterogeneous populations in expanding periapical lesions in rat molars. Arch Oral Biol 1999; 44: 67−79. 147. Lukić A, Vasilijić S, Majstorović I, Vucević D, Mojsilović S, Gazivoda D, Danilović V, Petrović R, Čolić M. Characterization of antigen-presenting cells in human apical periodontitis lesions by flow cytometry and immunocytochemistry. Int Endod J 2006; 39: 626−636. 148. de Jong EC, Smits HH, Kapsenberg ML. Dendritic cell-mediated T cell polarization. Springer Semin Immunopathol 2005; 26: 289–307. 149. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Pulendran B, Palucka K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000; 18: 767–811. 150. Slots J, Sabeti M, Simon JH. Herpesviruses in periapical pathosis: anetiopathogenic relationship? Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2003; 96: 327–331. 120 151. Sabeti M, Simon JH, Slots J. Cytomegalovirus and Epstein-Barr virus are associated with symptomatic periapical pathosis. Oral Microbiol Immunol 2003; 18: 327–328. 152. Kettering JD, Torabinejad M. Presence of natural killer cells in human chronic periapical lesions. Int Endod J 1993; 26: 344–347. 153. Lanier LL. Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol 2008; 9: 495-502. 154. Pegram HJ, Andrews DM, Smyth MJ, Darcy PK, Kershaw MH. Activating and inhibitory receptors of natural killer cells. Immunol Cell Biol 2011; 89: 216-224. 155. Lanier LL. NK cell recognition. Annu Rev Immunol 2005; 23: 225-274. 156. Bergers G, Reikerstorfer A, Braselmann S, Graninger P, Busslinger M. Alternative promoter usage of the Fos responsive gene Fit-1 generates mRNA isoforms coding for either secreted or membrane-bound proteins related to the IL-1 receptor. EMBO J 1994; 13: 1176- 1188. 157. Trajkovic V, Sweet MJ, Xu D. T1/ST2-an IL-1 receptor-like modulator of immune responses. Cytokine & Growth Factor Reviews 2004; 15: 87-95. 158. Sweet MJ, Leung BP, Kang G, Sogaard M, Schulz K, Trajković V, Campbell CC, Xu D, Liew FY. A novel pathway regulating lipopolysaccharide-induced shock by ST2/T1 via inhibition of Toll-like receptor 4 expression. J Immunol 2001; 166: 6633-6639. 159. Brint EK, Xu D, Liu H, Dunne A, McKenzie ANJ, O‟Neill AJ, Liew FY. ST2 is an inhibitor of IL-1R and TLR4 signaling and maintains endotoxin tolerance. Nat Immunol 2004; 5: 373-379. 160. Klemenz R, Hoffman S, Werenskiold AK. Serum and oncoprotein-mediated induction of a gene with sequence similarity to the gene encoding carcinoembryonic antigen. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 5708-5712. 161. Gachter T, Werenskiold AK, Klemenz R. Transcription of the interleukin-1 receptor- related T1 gene is initiated at different promoters in mast cells and fibroblasts. J Biol Chem 1996; 271: 124-129. 162. Iwahana HK, Yanagisawa A, Ito-Kosaka K, Kuroiwa K, Tago H, Komatsu N, Katashima R, Itakura M, Tominaga S. Different promoter usage and multiple transcription inatination sites of the interleukin-1 receptor related human ST2 gene in UT-7 and TM12 cells. Eur J Biochem 1999; 264: 397-406. 163. Tago K, Noda T, Hayakawa M, Iwahana H, Yanagisawa K, Yashiro T, Tominaga S. Tissue distribution and subcellular localization of a variant form of the human ST2 gene product, ST2V. Biochem Biophys Res Commun 2001; 285: 1377-1383. 121 164. Tominaga S. A putative protein of growt specific cDNA from BALB/c-3T3 cells is higly similar to the extracellular portion of mouse interleukin 1 receptors. FEBS Lett 1989; 258: 301-304. 165. Schmitz J, Owyang A, Oldham E, Song Y, Murphy E, McClanahan TK, Zurawski G, Moshrefi M, Qin J, Li X, Gorman DM, Bazan JF, Kastelein RA. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2- associated cytokines. Immunity 2005; 23: 479–490. 166. Kumar S, Minnich MD, Young PR. ST2/T1 protein functionally binds to two secreted proteins from Balb/c 3T3 and human umbilical vein endothelial cells but does not bind interleukin 1. J Biol Chem 1995; 270: 27905–27913. 167. Gayle MA, Slack JL, Bonnert TP, Renshaw BR, Sonoda G, Taguchi T, Testa JR, Dower SK, Sims JE. Cloning of a putative ligand for the T1/ST2 receptor. J Biol Chem 1996; 271: 5784–5789. 168. Liew FY, Pitman NI, McInnes IB. Disease-associated functions of IL-33: the new kid in the IL-1 family. Nat Rev Immunol 2010; 10: 103-110. 169. Löhning M, Stroehmann A, Coyle AJ, Grogan JL, Lin S, Gutierrez-Ramos JC, Levinson D, Radbruch A, Kamradt T. T1/ST2 is preferentially expressed on murine Th2 cells, independent of interleukin 4, interleukin 5, and interleukin 10, and important for Th2 effector function. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 6930-6935. 170. Pecaric-Petkovic T, Didichenko SA, Kaempfer S, Spiegl N, Dahinden CA. Human basophils and eosinophils are the direct target leukocytes of the novel IL-1 family member IL-33. Blood 2009; 113: 1526-1534. 171. Lecart S, Lecointe N, Subramaniam A, Alkan S, Ni D, Chen R, Boulay V,Pène J, Kuroiwa K, Tominaga S, Yssel H. Activated, but not resting human Th2 cells, in contrast to Th1 and T regulatory cells, produce soluble ST2 and express low levels of ST2L at the cell surface. Eur J Immunol 2002; 32: 2979-2987. 172. Yanagisawa K, Naito Y, Kuroiwa K, Arai T, Furukawa Y, Tomizuka H, Miura Y, Kasahara T, Tetsuka T, Tominaga S. The expression of ST2 gene in helper T cells and the binding of ST2 protein to myeloma-derived RPMI8226 cells. J Biochem (Tokyo) 1997;121:95–103. 173. Dale M, Nicklin MJ. Interleukin-1 receptor cluster: gene organization of IL1R2, IL1R1, IL1RL2 (IL1Rrp2), IL1RL1 (T1/ST2) and IL18R1 (IL-1Rrp) on human chromosome 2q. Genomics 1999; 57: 177-179. 174. Carter RW, Sweet MJ, Xu D, Klemenz R, Liew FY, Chan WL. Regulation of ST2L expression on T helper (Th) type 2 cells. Eur J Immunol 2001; 31: 2979-2985. 122 175. Meisel C, Bonhagen K, Lohning M, Coyle AJ, Gutierrez-Ramos JC, Radbruch A,Kamradt T. Regulation and function of T1/ST2 expression on CD4+ T cells: induction of type 2 cytokine production by T1/ST2 cross-linking. J Immunol 2001;166: 3143-3150. 176. Kropf P, Herath S, Tewari R, Syed N, Klemenz R, Muller I. Identification of two distinct subpopulations of Leishmania major specific T helper 2 cells. Infect Immunol 2002; 70: 5512–5520. 177. Mensah-Brown E, Shahin A, Parekh K, Hakim AA, Shamisi MA, Hsu DK, Lukic ML. Functional capacity of macrophages determines the induction of type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci 2006; 1084: 49-57. 178. Jovanović I, Radosavljević G, Mitrović M, Juranic VL, McKenzie AN, Arsenijevic N, Jonjic S, Lukic ML. ST2 deletion enhances innate and acquired immunity to murine mammary carcinoma. Eur J Immunol 2011; 41: 1-10. 179. Walzl G, Mathews S, Kendall S, Gutierrez-Ramos JC, Coyle AJ, Openshaw PJ, Hussell T. Inhibition of T1/ST2 during respiratory syncytial virus infection prevents T helper cell type 2 (Th2)-but not Th1-driven immunopathology. J Exp Med 2001; 193: 785-792. 180. Oshikawa K, Yanagisawa K, Tominaga S, Sugiyama Y. ST2 protein induced by inflammatory stimuli can modulate acute lung inflammation. Biochem Biophys Res Commun 2002; 299:18–24. 181. Oshikawa K, Kuroiwa K, Tago K, Iwahana H, Yanagisawa K, Ohno S, Tominaga SI, Sugiyama Y. Elevated soluble ST2 protein levels in sera of patients with asthma with an acute exacerbation. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164: 277–81. 182. Carriere V, Roussel L, Ortega N, Lacorre DA, Americh L, Aguilar L, Bouche G, Girard JP. IL-33, the IL-1-like cytokine ligand for ST2 receptor, is a chromatin-associated nuclear factor in vivo. Proc Natl Acad Sci 2007; 104: 282-287. 183. Moussion C, Ortega N, Girard JP. The IL-1-like cytokine IL-33 is constitutively expressed in the nucleus of endothelial cells and epithelial cells in vivo: a novel „alarmin‟? PLoS One. 2008; 3: e3331. 184. Roussel L, Erard M, Cayrol C, Girard JP. Molecular mimicry between IL-33 and KSHV for attachment to chromatin through the H2A-H2B acidic pocket. EMBO 2008; 9: 1006– 1012. 185. Lamkanfi M, Dixit VM. IL-33 raises alarm. Immunity 2009; 31: 5–7. 186. Oppenheim JJ, Yang D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol 2005; 17: 359-365. 123 187. Cayrol C, Girard JP. The IL-1-like cytokine IL-33 is inactivated after maturation by caspase-1. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106: 9021-9026. 188. Lüthi AU, Cullen SP, McNeela EA, Duriez PJ, Afonina IS, Sheridan C, Brumatti G, Taylor RC, Kersse K, Vandenabeele P, Lavelle EC, Martin SJ. Suppression of interleukin-33 bioactivity through proteolysis by apoptotic caspases. Immunity 2009; 31: 84-98. 189. Talabot-Ayer D, Lamacchia C, Gabay C, Palmer G. Interleukin-33 is biologically active independently of caspase-1 cleavage. J Biol Chem 2009; 284: 19420-19426. 190. Arend WP, Palme, G, Gabay C. IL-1, IL-18, and IL-33 families of cytokines. Immunol Rev 2008; 223: 20–38. 191. Kurowska-Stolarska M, Kewin P, Murphy G, Russo RC, Stolarski B, Garcia CC, Komai- Koma M, Pitman N, Li Y, Niedbala W, McKenzie AN, Teixeira MM, Liew FY, Xu D. IL-33 induces antigenspecific IL-5+ T cells and promotes allergic-induced airway inflammation independent of IL-4. J Immunol 2008; 181: 4780–4790. 192. Smithgall MD, Comeau MR, Yoon BR, Kaufman D, Armitage R, Smith DE. IL-33 amplifies both Th1- and Th2-type responses through its activity on human basophils, allergen-reactive Th2 cells, iNKT and NK cells. Int Immunol 2008; 20: 1019–1030. 193. Komai-Koma M, Xu D, Li Y, McKenzie AN, McInnes IB, Liew FY. IL-33 is a chemoattractant for human Th2 cells. Eur J Immunol 2007; 37: 2779–2786. 194. Allakhverdi Z., Smith DE., Comeau MR, Delespesse G. Cutting edge: the ST2 ligand IL- 33 potently activates and drives maturation of human mast cells. J Immunol 2007; 179: 2051–2054. 195. Suzukawa M, Iikura M, Koketsu R, Nagase H, Tamura C, Komiya A, Nakae S, Matsushima K, Ohta K, Yamamoto K, Yamaguchi M. An IL-1 cytokine member, IL-33, induces human basophil activation via its ST2 receptor. J Immunol 2008; 181: 5981–5989. 196. Cherry WB, Yoon J, Bartemes KR, Iijima K, Kita H. A novel IL-1 family cytokine, IL- 33, potently activates human eosinophils. J Allergy Clin Immunol 2008; 121: 1484–1490. 197. Kurowska-Stolarska M, Stolarski B, Kewin P, Murphy G, Corrigan CJ, Ying S, Pitman N, Mirchandani A, Rana B, van Rooijen N, Shepherd M, McSharry C, McInnes IB, Xu D, Liew FY. IL-33 amplifies the polarization of alternatively activated macrophages that contribute to airway inflammation. J Immunol 2009; 183: 6469–6477. 198. Mayuzumi N, Matsushima H, Takashima A. IL-33 promotes DC development in BM culture by triggering GM-CSF production. Eur J Immunol 2009; 39: 3331–3342. 124 199. Rank MA, Kobayashi T, Kozaki H, Bartemes KR, Squillace DL, Kita H. IL-33-activated dendritic cells induce an atypical TH2-type response. J Allergy Clin Immunol 2009; 123: 1047-1054. 200. Volarevic V, Mitrovic M, Milovanovic M, Zelen I, Nikolic I, Mitrovic S, Pejnovic N, Arsenijevic N, Lukic ML. Protective role of IL-33/ST2 axis in Con A-induced hepatitis. J Hepatol 2012; 56: 26–33. 201. Zaiss MM, Kurowska-Stolarska M, Böhm C, Gary R, Scholtysek C, Stolarski B, Reilly J, Kerr S, Millar NL, Kamradt T, McInnes IB, Fallon PG, David JP, Liew FY, Schett G. IL-33 shifts the balance from osteoclast to alternatively activated macrophage differentiation and protects from TNF-α-mediated bone loss. J Immunol 2011; 186: 6097-6105. 202. Milovanovic M, Volarevic V, Ljujic B, Radosavljevic G, Jovanovic I, Arsenijevic N, Lukic ML. Deletion of IL-33R (ST2) abrogates resistance to EAE in BALB/c mice by enhancing polarization of APC to inflammatory phenotype. PloS One 2012; 7:e45225. 203. Kropf P, Herath S, Klemenz R, Müller I. Signaling through the T1/ST2 molecule is not necessary for Th2 differentiation but is important for the regulation of type 1 responses in nonhealing Leishmania major infection. Infect Immun 2003; 71: 1961-1971. 204. Coyle AJ, Lloyd C, Tian J, Nguyen T, Erikkson C, Wang L, Ottoson P, Persson P, Delaney T, Lehar S, Lin S, Poisson L, Meisel C, Kamradt T, Bjerke T, Levinson D, Gutierrez-Ramos JC. Crucial role of the interleukin 1 receptor family member T1/ST2 in T helper cell type 2-mediated lung mucosal immuneresponses. J Exp Med 1990; 190: 895–902. 205. Pushparaj PN, Tay HK, H'ng SC, Pitman N, Xu D, McKenzie A, Liew FY, Melendez AJ. The cytokine interleukin-33 mediates anaphylactic shock. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 9773–9778. 206. Alberts B, Johnson A, Lewis J. Chapter 8: Manipulating proteins, DNA and RNA. In: Alberts B, Johnson A, Lewis J. Molecular Biology of the Cell. Fifth edition Science Taylor & Francis Group 2007; 501-578. 207. Alberts B, Johnson A, Lewis J. Chapter 5: DNA replication, repair and recombination. In: Alberts B, Johnson A, Lewis J. Molecular Biology of the Cell. Fifth edition Science Taylor & Francis Group 2007; 263-328. 208. Smith CM. Technical Knockout: Gene-targeting strategies provide an avenue for studying gene function. The Scientist 2000; 14: 32. 209. Rutherford A. The life history of the mouse in genetics. Nature 2002; 420: 510. 210. Townsend MJ, Fallon PG, Matthews DJ, Jolin HE, McKenzie AN. T1/ST2-deficient mice demonstrate the importance of T1/ST2 in developing primary T helper cell type 2 responses. J Exp Med 2000; 191: 1069-1076. 125 211. Velickovic M, Mitrovic S, Kanjevac T, Radosavljevic G, Pavlovic S, Lukic A. Gradation criteria for experimentally induced periapical lesions in mice. Ser J Exp Clin Res 2013; 14: 71-76. 212. Balto K, Sasaki H, Stashenko P. Interleukin-6 deficiency increases inflammatory bone destruction. Infection and Immunity 2001; 69: 744-750. 213. Teixeira RC, Rubira CM, Assis GF, Lauris JR, Cstari TM, Rubira Bullen IR. Radiological and histopatological evaluation of experimentally-induced periapical lesions in rats. Journal of Applied Oral Science 2011; 19: 500-504. 214. Jung T, Schauer U, Heusser C, Neumann C, Rieger C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J Immunol Meth 1993; 159: 197-207. 215. Prussin C, Metcalfe D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Meth 1995; 188: 117-128. 216. Sander B, Hoiden I, Andersson U, Moller E, Abrams JS. Similar frequencies and kinetics of cytokine producing cells in murine peripheral blood and spleen. J Immunol Meth 1993; 166: 201-214. 217. Carter LL, Swain SL. Single cell analyses of cytokine production. Curr Opin Immunol 1997; 9:177-182. 218. Vikongson A, Pederson K. and Muller D. Enumeration of IFN-γ producing lymphocytes by flow cytometry and correlation with quantitative measurement of IFN-γ. J Immunol Meth 1994; 173: 219-228. 219. Elson LH, Nutman TB, Metcalfe DD, Prussin C. Flow cytometric analysis for cytokine production identifies Th1, Th2 and Th0 cells within human CD4+CD27- lymphocyte subpopulation. J Immunol 1995; 154: 4294-4301. 220. Assenmacher M, Schmitz J, Radbruch A. Flow cytometric determination of cytokines in activated murine T helper lymphocytes: Expression of interleukin-10 in interferon-γ and in interleukin-4-expressing cells. Eur J Immunol 1994; 24: 1097-1101. 221. Pala P, Hussel T, Openshaw PJM. Flow cytometric measurement of intracellular cytokines. J Immunol Meth 2000; 243: 107-124. 222. Xiong H, Wei L, Peng B. Immunohistochemical localization of IL-17 in induced rat periapical lesions. J Endod 2009; 35: 216-220. 223. Silva MJ, Kajiya M, AlShwaimi E, Sasaki H, Hong J, Ok P, Rezende TM, Pagonis TC, White RR, Paster BJ, Stashenko P, Kawai T. Bacteria-reactive immune response may induce 126 RANKL-expressing T cells in the mouse periapical bone loss lesion. J Endod 2012; 38: 346- 350. 224. AlShwaimi E, Berggreen E, Furusho H, Rossall JC, Dobeck J, Yoganathan S, Stashenko P, Sasaki H. IL-17 receptor A signaling is protective in infection-stimulated periapical bone destruction. J Immunol 2013; 191: 1785-1791. 225. Zdravkovic N, Shahin A, Arsenijevic N, Lukic ML, Mensah-Brown EP. Regulatory T cells and ST2 signaling control diabetes induction with multiple low doses of streptozotocin. Mol Immunol 2009; 47: 28-36. 226. Zdravkovic N, Pavlovic S, Zdravkovic V, Pejnovic N, Arsenijevic N, Lukic ML. ST2 gene-deletion reveals a role of Foxp3+ regulatory T cells in diabetes modulation in BALB/c mice. Transl Res 2013; 161: 118-129. 227. Volarevic A, Ljujic B, Volarevic V, Milovanovic M, KanjevacT, Lukic A, Arsenijevic N. A new semiquantitativemethod for evaluation of metastasis progression. JBUON 2012; 17: 585-590. 228. Volarevic V, Milovanovic M, Arsenijevic N, Lukic M. The new semi-quantitative method for determination of liver damage after Concavalin A administration. Ser J Exp Clin Res 2010; 11: 45-48. 229. Letafatkar A, Amirsasan R, Abdolvahabi Z, Hadadnezhad M. Reliability and validity of the AutoCAD software method in lumbar lordosis measurement. J Chiropr Med 2011; 10: 240-247. 230. Duran-Sindreu F, GarcIa M, Olivieri JG, Mercade M, Morello S, Roig M. A comparison of apical transportation between FlexMaster and Twisted Files rotary instruments. J Endod 2012; 38: 993-995. 231. Garcoa M, Duran-Sindreu F, Mercade M, Bueno R, Roig M. A comparison of apical transportation between ProFile and RaCe rotary instruments. J Endod 2012; 38: 990-992. 232. Ravindranath M, Neelakantan P, Karpagavinayagam K,Subba Rao CV. The influence of obturation techniqueon sealer thickness and depth of sealer penetration into dentinal tubules evaluated by computer-aided digitalanalysis. Gen Dent 2011; 59: 376-382. 233. Vikram NR, Senthil Kumar KS, Nagachandran KS, Hashir YM. Apical stress distribution on maxillary central incisor during various orthodontic tooth movements by varying cemental and two different periodontal ligament thicknesses: a FEM study. Indian J Dent Res 2012; 23: 213-220. 234. Oseko F, Yamamoto T, Akamatsu Y, Kanamura N,Iwakura Y, Imanishi J, Kita M. IL-17 is involved in boneresorption in mouse periapical lesions. Microbiol Immunol 2009; 53: 287- 294. 127 235. Schulze J, Bickert T, Beil FT, Zaiss MM, Albers J, Wintges K, Streichert T, Klaetschke K, Keller J, Hissnauer TN, Spiro AS, Gessner A, Schett G, Amling M, McKenzie AN, Horst AK, Schinke T. Interleukin-33 is expressed in differentiated osteoblasts and blocks osteoclast formation from bone marrow precursor cells. Ј Bone Miner Res 2011; 26: 704-717. 236. Mills CD, Kincaid K, Alt JM, Heilman MJ, Hill AM. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol 2000; 164: 6166-6173. 237. Silva MJ, Kajiya M, AlShwaimi E, Sasaki H, Hong J, Ok P, Rezende TM, Pagonis TC, White RR, Paster BJ, Stashenko P, Kawai T. Bacteria-reactive immune response may induce RANKL-expressing T cells in the mouse periapical bone loss lesion. J Endod 2012; 38: 346-350. 238. Sakai N, Van Sweringen HL, Quilin RC, Schuster R, Blanchard J, Burns JM, Tevar AD, Edwards MJ, Lentsch AB. Interleukin-33 is hepatoprotective during liver ischemia/reperfusion in mice. Hepatology 2012; 56: 1468-1478. 239. Verri Jr WA, Souto FO, Vieira SM, Almeida SC, Fukada SY, Xu D, Alves-Filho JC, Cunha TM, Guerrero AT, Mattos-Guimaraes RB, Oliveira FR, Teixeira MM, Silva JS, McInnes IB, Ferreira SH, Louzada-Junior P, Liew FY, Cunha FQ. IL-33 induces neutrophil migration in rheumatoid arthritis and is a target of anti-TNF therapy. Ann Rheum Dis 2010; 69: 1697-1703. 240. Enoksson M, Mӧller-Westerberg C, Wicher G, Fallon PG, Forsberg-Nilsson K, Lunderius-Andersson C, Nilsson G. Intraperitoneal influx of neutrophils in response to IL-33 is mast cell dependent. Blood 2013; 121: 530-536. 241. Waterman PA. Development of periapical lesions in immunosupressed rats. Loma Linda: University; 1992. 242. Miller A, Asquith D, Hueber A, Anderson L, Holmes W, McKenzie A, Sattar D, McInnes I and Liew FY. Interleukin-33 induces protective effects in adipose tissue inflammation during obesity in mice. Circ Res 2010; 107: 650-658. 243. McLaren J, Michael D, Salter R, Ashlin T, Calder C, Miller A, Liew FY and Ramji D. IL-33 reduces macrophage foam cell formation. J Immunol 2010; 185: 1222-1229. 244. Goerdt S, Politz O, Schledzewski K, Birk R, Gratchev A, Guillot P, Hakiy N, Klemke CD, Dippel E, Kodelja V, Orfanos CE. Alternative versus classical activation of macrophages. Pathobiology 1999; 67: 222-226. 245. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol 2003; 3: 23-35. 128 246. Mantovani A, Sica A, Locati M. Macrophage polarization comes of age. Immunity 2005; 23: 344-346. 247. Xu D, Chan WL, Leung BP, Huang F, Wheeler R, Piedrafita D, Robinson JH, Liew FY. Selective expression of a stable cell surface molecule on type 2 but not type 1 helper T cells. J Exp Med 1998; 187: 787–794. 248. Peritt D, Robertson S, Gri G, Showe L, Aste-Amezaga M, Trinchieri G. Differentiation of human NK cells into NK1 and NK2 subsets. J Immunol 1998; 161: 5821–5824. 249. Billiau A. Interferon-gamma: biology and role in the pathogenesis. Adv Immunol 1996; 62: 61–130. 250. Nakanishi T, Takahashi K, Hosokawa Y, Adachi T, Nakae H, Matsuo T. Expression of macrophage inflammatory protein 3 alpha in human inflamed dental pulp tissue. J Endod 2005; 31: 84-87. 251. Velickovic М, Pejnovic N, Mitrovic S, Radosavljevic G, Jovanovic I, Kanjevac T, Jovicic N, Lukic A.ST2 deletion increases inflammatory bone destruction in experimentally induced periapical lesions in mice. J Endod 2015; 41(3):369-375. 252. AlShwaimi E, Purcell P, Kawai T, Sasaki H, Oukka M, Campos-Neto A, Stashenko P. Regulatory T cells in mouse periapical lesions.J Endod 2009; 35 :1229-1233. 253. Colić M, Gazivoda D, Vucević D, Majstorović I, Vasilijić S, Rudolf R, Brkić Z, Milosavljević P. Regulatory T-cells in periapical lesions. J Dent Res. 2009; 88: 997-1002. 254. Wei HX, Chuang Y, Li B, Wei H, Sun R, Moritoki Y, Gershwin M, Lian ZX, Tian Z. CD4+CD25+ Foxp3+ regulatory T cells protect against T cell-mediated fulminant hepatitis in a TGF-β-dependent manner in mice. J Immunol 2008; 181: 7221-7229. 255. Setoguchi R, Matsui Y, Mouri K. mTOR signaling promotes a robust and continuous production of IFN-γ by human memory CD8(+) T cells and their proliferation. Eur J Immunol 2015; 45: 893-902. 256. Teunissen MB, Yeremenko NG, Baeten DL, Chielie S, Spuls PI, de Rie MA, Lantz O, Res PC.The IL-17A-producing CD8+ T-cell population in psoriatic lesional skin comprises mucosa-associated invariant T cells and conventional T cells. J Invest Dermatol 2014; 134: 2898-2907. 257. Komai-Koma M, Gilchrist DS, McKenzie ANJ, Goodyear CS, Xu D and Liew FY. IL-33 Activates B1 Cells and Exacerbates Contact Sensitivity. J Immunol 2011; 186: 2584-2591. 258. Velickovic М, Pejnovic N, Mitrovic S, Petrovic R, Jeftic I, Kanjevac T, Lukic A. Expression of interleukin-33 and its receptor ST2 in periapical granulomas and radicular cysts. J Oral Pathol Med 2015 Feb 11. doi: 10.1111/jop.12312. [Epub ahead of print] 129 259. Araujo-Pires AC, Francisconi CF, Biguetti CC, Cavalla F, Aranha AM, Letra A, Trombone AP, Faveri M, Silva RM, Garlet GP. Simultaneous analysis of T helper subsets (Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh, Tr1 and Tregs) markers expression in periapical lesions reveals multiple cytokine clusters accountable for lesions activity and inactivity status. J Appl Oral Sci 2014; 22: 336–346. 260. Buduneli N, Ozcaka O, Nalbantsoy A. Interleukin-33 levels in gingival crevicular fluid, saliva, or plasma do not differentiate chronic periodontitis. J Periodontol 2012; 83: 362–368. 261. Beklen A, Tsaosus Memet G. Interleukin-1 superfamily member, interleukin-33, in periodontal disease. Biotech Histochem 2014; 89: 209–214. 262. Köseoğlu S, Hatipoğlu M, Sağlam M, Enhoş S, Esen HH. Interlukin-33 could play an important role in the pathogenesis of periodontitis. J Periodontol Res 2014; doi: 10.1111/jre.12235 [Epubahead of print]. 263. Moussion C, Ortega N, Girard JP. The IL-1-like cytokine IL-33 is constitutively expressed in the nucleus of endothelial cells and epithelial cells in vivo: a novel „alarmin‟? PLoS ONE 2008; 3: e3331. 264. Link A, Vogt TK, Favre S, Britschgi MR, Acha-Orbea H, Hinz B, Cyster JG, Luther SA. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nat Immunol 2007; 8: 1255–1265. 265. Küchler AM, Pollheimer J, Balogh J, Sponheim J, Manley L, Sorensen DR, De Angelis PM, Scott H, Haraldsen G. Nuclear interleukin-33 is generally expressed in resting endothelium but rapidly lost upon angiogenic or proinflammatory activation. Am J Pathol 2008; 173: 1229–1242. 266. Palmer G, Talabot-Ayer D, Lamacchia C, Toy D, Seemayer CA, Viatte S, Finckh A, Smith DE, Gabay C. Inhibition of interleukin-33 signaling attenuates the severity of experimental arthritis. Arthritis Rheum 2009; 60: 738–749. 267. Sponheim J, Pollheimer J, Olsen T, Balogh J, Hammarström C, Loos T, Kasprzycka M, Sørensen DR, Nilsen HR, Küchler AM, Vatn MH, Haraldsen G. Inflammatory bowel disease-associated interleukin-33 is preferentially expressed in ulceration-associated myofibroblasts. Am J Pathol 2010; 177: 2804–2815. 268. Tominaga S. A putative protein of a growth specific cDNA from BALB/c-3T3 cells is highly similar to the extracellular portion of mouse interleukin 1 receptor. FEBS Lett 1989; 258: 301–304. 269. Klemenz R, Hoffmann S, Werenskiold AK. Serum- and oncoprotein-mediated induction of a gene with sequence similarity to the gene encoding carcinoembryonic antigen. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 5708–5712. 130 270. Schulze J, Bickert T, Beil FT, Zaiss MM, Albers J, Wintges K, Streichert T, Klaetschke K, Keller J, Hissnauer TN, Spiro AS, Gessner A, Schett G, Amling M, McKenzie AN, Horst AK, Schinke T. Interleukin-33 is expressed in differentiated osteoblasts and blocks osteoclast formation from bone marrow precursor cells. J Bone Miner Res 2011; 26: 704-717. 271. Yagami A, Kanami O, Morita H, Futamura K, Hashimoto N, Matsumoto K, Saito H, Matsuda A. IL-33 mediates inflammatory responses in human lung tissue cells. J Immunol 2010; 185: 5743–5750. 272. Teixeira-Salum TB, Rodrigues DB, Gervasio AM, Souza CJ, Rodrigues V Jr, Loyola AM. Distinct Th1, Th2 and Treg cytokines balance in chronic periapical granulomas and radicular cysts. J Oral Pathol Med 2010; 39: 250–256. 273. de Paula-Silva FW, D‟Silva NJ, da Silva LA, Kapila YL. High matrix metalloproteinase activity is a hallmark of periapical granulomas. J Endod 2009; 35: 1234–1242. 274. Čolić M, Lukić A, Vučević D, Milosavljević P, Majstorović I, Marjanović M, Dimitrijević J. Correlation between phenotypic characteristics of mononuclear cells isolated from human periapical lesions and their in vitro production of Th1 аnd Th2 cytokines. Arch Oral Biol 2006; 51: 1120–1130. 275. Tajima S, Bando M, Ohno S, Sugiyama Y, Oshikawa K, Tominaga S, Itoh K, Takada T, Suzuki E, Gejyo F. ST2 gene induced by type2 helper T cell (Th2) and proinflammatory cytokine stimuli may modulate lung injury and fibrosis. Exp Lung Res 2007; 33: 81–97. 276. Garlet GP, Horwat R, Ray HL Jr, Garlet TP, Silveira EM, Campanelli AP, Trombone AP, Letra A, Silva RM. Expression analysis of wound healing genes in human periapical granulomas of progressive and stable nature. J Endod 2012; 38: 185–190. 277. Tschumperlin DJ. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology 2013; 28: 380– 390. 278. Hu WT, Li MQ, Liu W, Jin LP, Li DJ, Zhu XY. IL-33 enhances proliferation and invasiveness of decidual stromal cells by up-regulation of CCL2/CCR2 via NF-kB and ERK1/2 signaling. Mol Hum Reprod 2014; 20: 358–372.