УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ФАКУЛТЕТ МЕДИЦИНСКИХ НАУКА др Олгица Михаљевић ПРОМЕНЕ У АПОПТОЗИ ЛИМФОЦИТА, ПАРАМЕТРИМА ОКСИДАТИВНОГ СТРЕСА И ПРОФИЛУ ЦИТОКИНА КОД БОЛЕСНИКА СА ДИФЕРЕНТОВАНИМ КАРЦИНОМОМ ШТИТАСТЕ ЖЛЕЗДЕ докторска дисертација Ментор: проф др Снежана Живанчевић Симоновић Крагујевац, 2014. САДРЖАЈ 1. УВОД 1.1. Диферентовани карциноми штитасте жлезде 1.1.1. Етиопатогенеза диферентованих карцинома штитасте жлезде 1.1.2. Лечење пацијената са диферентованим карциномом штитасте жлезде 1.2. Оксидативни стрес у малигним болестима 1.3. Микронуклеуси у малигним болестима 1.4. Апоптоза лимфоцита у малигним болестима 1.5. Цитокински профил у малигним болестима 2. ЦИЉЕВИ ИСТРАЖИВАЊА 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ 3.1. Испитивана популација 3.2. Општи протокол истраживања 3.3. Тиреоидни статус, концентрација тиреоглобулина и анти-тиреоидних аутоантитела 3.4. Сцинтиграфија целог тела 3.5. Параметри липидне пероксидације 3.6. Тотални антиоксидативни статус 3.7. Концентрација стандардних биохемијских параметара 3.8. Одређивање фреквенце микронуклеуса 3.9. Изолација мононуклеарних ћелија периферне крви 3.10. Анализа субпопулација мононуклеарних ћелија периферне крви 3.11. Одређивање процента апоптотичних и некротичних ћелија у узорцима мононуклеарних ћелија периферне крви 3.12. Одређивање цитокинског профила 3.13. Статистичка обрада података 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. Карактеристике пацијената са DTC 4.2. Оксидативни стрес код пацијената са DTC 4.2.1. Концентрација МDA, мокраћне киселине и ниво тоталног антиоксидативног статуса 4.2.2. Однос оксидативног стреса, апликоване дозе 131-I и импулса детектованих гама камером 4.3. Протеински и липидни профил пацијената са DTC 4.4. Фреквенца микронуклеуса код пацијената са DTC 4.4.1. Микронуклеусна фреквенца и “cytokinesis-block” пролиферациони индекс (CBPI) 4.4.2. Однос микронуклеуса, апликоване дозе 131-I и импулса детектованих гама камером 4.5. Апоптоза и некроза лимфоцита периферне крви пацијената са DTC 4.5.1. Рана, касна апоптоза и некроза 4.5.2. Однос апоптозе и микронуклеусне фреквенце 4.6. Ћелије периферне крви пацијената са DTC 4.7. Цитокински профил код пацијената са DTC 5. ДИСКУСИЈА 5.1. Оксидативни стрес код пацијената са DTC 5.2. Биохемијски параметри код пацијената са DTC 5.3. Фреквенца микронуклеуса код пацијената са DTC 5.4. Апоптоза код пацијената са DTC 5.5. Ћелије периферне крви код пацијената са DTC 5.6. Цитокински профил код пацијената са DTC 6. ЗАКЉУЧЦИ 7. ЛИТЕРАТУРА 8. ПРИЛОГ 8.1. Кључна документацијска информатика 8.2. Key words documentation 8.3. Биографски подаци аутора 8.4. Списак објављених радова 8.5. The list of published papers 8.6. Идентификациона страница докторске дисертације 1 1. УВОД 1.1. Диферентовани карциноми штитасте жлезде Карциноми штитасте жлезде чине око 1% свих малигних тумора (1). Реч је о најучесталијим туморима ендокриног система (око 95%) (2), чија се инциденца у току протеклих тридесетак година повећала у многим земљама (3). Тиреоидни карциноми могу бити пореклом од малигно измењених фоликуларних или нефоликуларних (парафоликуларних) тиреоидних ћелија. У карциноме фоликуларног порекла спадају папиларни, фоликуларни, анапластични и инсуларни тиреоидни карциноми, а у карциноме нефоликуларног порекла медуларни карцином (4). Диферентовани карциноми штитасте жлезде (енгл. differentiated thyroid cancers, DTC) обухватају папиларне и фоликуларне карциноме и чине више од 90% свих тиреоидних тумора. Папиларни карциноми су најучесталији карциноми штитасте жлезде (> 70%) (5). Обично метастазирају лимфогено, при чему су латерални лимфни чворови захваћени код 51-100% пацијената (6). Постоји неколико варијанти папиларног карцинома штитасте жлезде: фоликуларна, дифузно-склерозирајућа варијанта, високоћелијска (tall cell) и цилиндрична ћелијска (column cell) варијанта (7). Малигни епителни тумори са елементима диференцијације фоликуларних ћелија, али без дијагностичких особености папиларних карцинома, означени су као фоликуларни карциноми. Фоликуларни карциноми чине око 15% свих карцинома штитасте жлезде и сматрају се агресивнијим типом тумора. Фоликуларни карциноми се карактеришу васкуларном инвазијом и појавом удаљених метастаза, које се могу детектовати у моменту иницијалне дијагностике карцинома код 2-5% оболелих (8). Подтипови фоликуларног 2 карцинома су минимално инвазивна, широко инвазивна варијанта и карцином оксифилних ћелија (Hürthle cell карцином). Ћелије диферентованих карцинома штитасте жлезде задржавају извесна биолошка својства нормалног тиреоидног ткива и, зависно од степена диференцијације, показују способност синтезе тиреоглобулина (Tg) и тиреоидних хормона, експресију рецептора за тиреостимулишући хормон (TSH) и учешће у метаболизму јода (9). Иако метаболизам јода у туморском ткиву карактерише смањење органификације и ефективног полуживота јода (10), TSH може стимулисати преузимање и концентрисање јода у туморском ткиву. 1.1.1. Етиопатогенеза диферентованих карцинома штитасте жлезде Излагање зрачењу, повећан/смањен унос јода, хронични лимфоцитни тиреоидитис, хормонски фактори, геномска нестабилност и позитивна породична историја представљају факторе ризика за настанак диферентованог карцинома штитасте жлезде. Зрачење се сматра једним од најважнијих етиолошких фактора за настанак DTC, нарочито папиларних карцинома (4). Ризик од појаве карцинома штитасте жлезде зависи од дозе јонизујућег зрачења и најизраженији je у дечјем узрасту. Латентни период од експозиције до настанка карцинома може трајати и неколико десетина година, а најкритичнијим периодом за појаву малигнитета сматра се време од 20-30 година по експозицији (11). Прогноза болести углавном је добра, преко 90% пацијената преживи 10 година од постављања дијагнозе. Прогностички фактори укључују карактеристике самих пацијената (прогноза је лошија код особа старијег животног доба, мушког пола и позитивне породичне анамнезе), хистолошки тип тумора (лошија је прогноза код tall и column cell варијанте папиларног карцинома, широко инвазивног фоликуларног и анапластичног карцинома), раст тумора (лошија је прогноза код особа са инвазивним туморима који се 3 шире ван капсуле штитасте жлезде и туморима који метастазирају билатерално у регионалне нодусе или дају удаљене метастазе) и стадијум болести (12). Одређивање стадијума болести заснива се на TNM класификацији и подацима о величини и екстензивности примарног тумора (Т) (T1≤ 1 cm; 1 cm < T2≤ 4 cm; T3>4 cm; T4 директна инвазија тиреоидне капсуле), стању лимфних нодуса (N) (лимфни нодуси нису захваћени (N0) и регионални лимфни нодуси су захваћени (N1)), и метастатским променама (M) (одсуство метастаза (M0) или присуство метастаза (M1)). 1.1.2. Лечење пацијената са диферентованим карциномом штитасте жлезде Основна терапија код пацијената са DTC је тотална или скоро тотална (енгл. near total) тиреоидектомија и дисекција регионалних лимфних нодуса ако су метастазе присутне, или постоји висок ризик за појаву метастаза (13). С обзиром на то да DTC ћелије могу да акумулирају јод, постоперативно се код већине пацијената примењују велике дозе радиоактивног јода (131-I), са циљем да се 131-I акумулира у штитастој жлезди и проузрокује потпуну елиминацију постоперативно заосталог тиреоидног ткива и јодавидних метастаза (14). Терапија радиоактивним јодом подразумева системску администрацију 131-I (15). Употреба 131-I, чије је време полураспада од 8.02 дана (15), заснива се на емисији високо- енергетског β-зрачења, просечне енергије од 191 keV (9) које изазива радијационо оштећење тиреоидних ћелија. Поред емисије β-честица (90% терапијског ефекта 131-I), атом 131-I емитује и γ-зрачење (10% терапијског ефекта 131-I). Просечан домет β-честица у ткиву је 0.8 mm, максималан 2 mm, а величина функционалног оштећења ћелија пропорционална је апсорбованој дози (16). 4 Терапија 131-I се сматра оптималном код пацијената са туморима већих димензија (> 1.5cm), код хистолошки агресивних подтипова тумора, у случају присуства нодалних и/или удаљених метастаза, код особа са мултифокалном болешћу, код екстратиреоидне или васкуларне инвазије (13). Доза 131-I која се примењује код пацијената са DTC зависи од количине постоперативно заосталог ткива у тиреоидној ложи, и креће се у распону од 2.7 до 5.5 GBq. Веће дозе се препоручују уколико постоје метастазе у регионалним и медијастиналним лимфним нодусима (5.5 до 7.4 GBq), односно удаљене метастазе (> 7.4 GBq) (48). Радиоактивни 131-I апликује се 4-6 недељa након операције, и уколико постоји потреба, може се понављати на сваких 6 месеци (17). Да би се интензивирала апсорпција 131-I у тиреоидном ткиву, неопходно је да ниво TSH у серуму буде > 30 mIU/L. Уколико се 131-I апликује 4 до 6 недеља после тиреоидектомије, од операције до апликације аблационе дозе радиоактивног 131-I не уводи се супституциона терапија препаратима L- тироксина, а уколико је период од операције до апликације 131-I дужи, постоперативно се уводи супституциона терапија и обуставља 4-6 недеља пре апликације 131-I. На тај начин се постиже стимулација секреције ендогеног TSH (18), који је потребан за бољу акумулацију 131-I у нормалном или малигно измењеном тиреоидном ткиву. Осим стимулације секреције ендогеног TSH, акумулација 131-I у тиреоидном ткиву може се стимулисати и применом егзогеног, хуманог рекомбинантног TSH (19). Неопходно је да две недеље пре апликације 131-I пацијенти буду на дијети која је сиромашна јодом, а медикаменте који садрже јод или утичу на преузимање јода треба искључити из терапије пар недеља или месеци пре аблације, у зависности од степена утицаја на метаболизам јода (20). 5 Након тоталне тиреоидектомије, у серуму пацијената са DTC одређује се концентрација тиреоглобулина (Tg), специфичног туморског маркера за диферентоване карциноме штитасте жлезде. Детекција Tg код особа код којих је урађена тотална тиреоидектомија указује на присуство ткива које лучи Tg (резидуални тиреоидни карцином, локалне или удаљене метастазе тиреоидног карцинома или нормално тиреоидно ткиво). Осим масе тиреоидног ткива (бенигног или малигног), на концентрацију Tg у серуму утичу и интензитет стимулације преко рецептора за TSH, као и способност туморских ћелија да синтетишу и луче Tg (21). Администрација 131-I код пацијената са DTC повећава осетљивост и специфичност накнадних мерења концентрације Tg, а касније повећање серумске концентрације Tg указује на појаву рецидива тиреоидног карцинома. 1.2. Оксидативни стрес у малигним болестима Оксидативни стрес je поремећај у којем продукција слободних радикала превазилази капацитете биолошког система за њихову елиминацију, што за последицу може имати оштећење ћелија или ћелијску смрт (22). Слободни радикали су молекули/делови молекула који имају један или више неспарених електрона у спољашњем електронском омотачу. Неспарени електрони представљају слободне валенције, и узрок су високе и неселективне реактивности слободних радикала (23). Слободни радикали настају током оксидативне фосфорилације, у току фагоцитозе (у фагоцитним ћелијама), или могу бити узроковани дејством егзогених фактора, укључујући и јонизујуће зрачење (24). Слободни радикали обухватају реактивне облике кисеоника (енг. Reactive Oxygen Species – ROS), реактивне облике азота (енг. Reactive Nitrogen Species - RNS) и слободне радикале хлора. 6 Коначни ефекти деловања слободних радикала зависе од одбрамбених способости организма. Физиолошки заштитни механизми су антиоксиданси, антиоксидативни ензими и неензимски антиоксиданси (тзв. „хватачи” слободних радикала, укључујући и мокраћну киселину) (25,26). Антиоксиданси делују на више начина: блокирањем иницијалног формирања радикала, уклањањем већ формираних радикала и поправком радикалима- индукованих оштећења у ћелији (27). Деценијама уназад научници су се бавили проучавањем појединачних антиоксиданаса (28), занемарујући чињеницу да њихови ефекти могу бити адитивни. Потпуни увид у стање очуваности оксидо-редукционе равнотеже остварује се проценом тоталног антиоксидативног статуса (ТАS) тј. мерењем свеукупне активности различитих антиоксиданаса (29). Низак тотални антиоксидативни статус указује на повећану осетљивост на дејство фактора који проузрокују оксидативно оштећење (30). Најизраженија, и најбоље проучена штетна последица дејства слободних радикала је липидна пероксидација. Липидна пероксидација подразумева аутокаталитички, прогредијентан и најчешће иреверзибилан процес оксидације полинезасићених масних киселина у ћелијским мембранама, при чему долази до поремећаја у њеној грађи и функцији. Последица насталих промена је руптура мембране, ослобађање лизозомских ензима и смрт ћелије (31). У липидној пероксидацији настаје велики број цитотоксичних, примарних и секундарних оксидативних продуката: коњуговани диени, малондиалдехид (MDA), F2-изопростан и 4-хидроксиноненал (32). Степен оштећења биолошких структура изазван липидном пероксидацијом у in vivo и in vitro условима процењује се спектрофотометријским мерењем концентрације MDA са тиобарбитуратном киселином (33). МDА је стабилан продукт липидне пероксидације који може реаговати са слободним амино групама протеина и нуклеинских киселина доводећи 7 до нових оштећења ћелије. Другим речима, MDA се користи као биолошки маркер оксидативног стреса (34). До сада су многи аутори показали да код пацијената са различитим врстама карцинома постоји повећан оксидативни стрес (35,36) и смањен антиоксидативни капацитет плазме (37,38). Претпоставка је да ћелије карцинома продукују слободне радикале у мери која није довољна да индукује њихову смрт (39). У ћелијским линијама различитих хуманих карцинома (малигног меланома, карцинома колона, неуробластома, карцинома дојке и јајника) показана је повећана продукција водоник пероксида која није индукована егзогеним факторима (40). С друге стране, експресија гена за антиоксидативне ензиме редукована је у ћелијама неких карцинома (41). Otto von Warburg поставио је хипотезу да повећана продукција слободних радикала у ћелијама карцинома настаје због дисфункције митохондрија, а да интензивиран оксидативни стрес настаје као последица поремећаја респираторне функције митохондрија и инхибиције комплекса IV (цитохром „c“) у респираторном ланцу (42), што потврђују резултати недавно публикованих студија (43,44). Поремећај функције митохондрија последица је мутација митохондријалне ДНК и гена који кодирају компоненте респираторног ланца, чије је присуство показано код карцинома главе, плућа, желуца, леукемија и лимфома (45). Свакако да повећању оксидативног стреса доприноси и хронична инфламација, која се јавља код пацијената са узнапредовалим туморима (46), као и повећање ROS- генеришуће активности леукоцита периферне крви (47). Када је у питању ефекат радиотерапије на оксидативни стрес, у неким студијама је показано да радиотерапија води повећању оксидативног стреса код пацијената са карциномом (48-50), док је у другим показано његово смањење (51,52). Те студије су указале на различит одговор појединих антиоксиданаса на радиотерапију. 8 Примена радиотерапије код пацијената оболелих од карцинома може интензивирати оксидативни стрес исцрпљивањем ендогених резерви антиоксиданаса (53). С обзиром на то да јонизујуће зрачење индукује стварање слободних радикала (54,55), крајњи ефекат зависи од концентрације антиоксиданаса на месту продукције слободних радикала, брзине настанка слободних радикала, као и од њихове интеракције са критичним биомолекулима (56). 1.3. Микронуклеуси у малигним болестима Цитолошка последица хромозомских аберација насталих деловањем различитих штетних (анеугених и кластогених) агенаса је формирање микронуклеуса (MN) (57). Микронуклеуси представљају фрагменте хромозома или целе хромозоме који су издвојени у току митозе и у цитоплазми ћерки ћелија уочавају се као мало, додатно једро (58,59). Неки МN могу потицати од фрагмената насталих ломљењем анафазних мостова услед хромозомских реаранжмана као што су дицентричне хроматиде, прстенасти хромозоми или групе сестринских хроматида (60). Прва истраживања микронуклеуса у хуманим лимфоцитима периферне крви вршили су Fenech и Morley применом цитокинезис-блок микронуклеус теста (CBMN) (61), који представља једну од најбољих цитогенетских метода за процену оштећења ДНК. CBMN тест пружа могућност процене генотоксичног и мутагеног потенцијала различитих физичких и хемијских фактора (62). Meђутим, микронуклеуси нису само биомаркери хромозомског оштећења, већ они одражавају и општу геномску нестабилност (63). Очуваност интегритета генома је од пресудног значаја за нормално функционисање ћелија, а његово нарушавање повезано је са настанком ћелијске смрти и/или малигном трансформацијом ћелије (64). 9 Резултати многих студија указују на то да постоји директна повезаност између појаве карцинома и постојања геномске нестабилности (65,66), као и да се у ћелијама са нестабилним кариотипом хромозоми уклањају стварањем микронуклеуса (67). O томе сведочи висока учесталост микронуклеуса код пацијената оболелих од карцинома, постојање корелације између МN-индукујућих генотоксичних агенаса и канцерогенезе, и инверзна корелација између МN фреквенце и концентрације појединих микроелемената који смањују ризик од настанка карцинома (68). Iarmarcovai и сарадници су показали да постоји директна повезаност између МN фреквенце (која одражава геномску нестабилност) и склоности ка настанку карцинома (69). Повећана фреквенца микронуклеуса у лимфоцитима периферне крви утврђена је код нелечених пацијената са карциномом главе и врата, плућа, дојке, материце и једњака (69- 72). Код пацијената са карциномом радиотерапија води додатном повећању фреквенце микронуклеуса (73). Јонизујуће зрачење углавном делује као снажан кластогени фактор и индукује настанак микронуклеуса од ацентричних фрагмената хромозома (74,75), а у мањој мери изазива анеуплоидију и дислокацију целих хромозома из деобеног вретена (76). Зрачење проузрокује настанак хромозомских аберација, грешке у репликацији ДНК молекула и изостанак репарације насталих оштећења, што води стварању МN (77). Коначни ефекат зрачења зависи од грешака у грађи ДНК молекула и репарационог капацитета ћелија, који је значајно редукован код особа оболелих од карцинома (78). 1.4. Апоптоза лимфоцита у малигним болестима Апоптоза је процес програмиране ћелијске смрти којим се елиминишу ћелије како у физиолошким, тако и у неким патолошким условима. Типичне морфолошке промене код апоптотичних ћелија су смањење запремине цитоплазме, фрагментисање у више 10 апоптотских телашаца, и фагоцитоза од стране околних ћелија (79,80). У раној фази апоптозе долази до измештања фосфатидилсерина са унутрашње на спољашњу површину ћелијске мембране, чиме се омогућава неинфламаторно препознавање апоптотичних ћелија од стране фагоцита (81,82), а у каснијем стадијуму долази до губитка интегритета ћелијске мембране (83). С обзиром на то да апоптоза представља основни биолошки механизам којим се остварује ткивна хомеостаза (84), укључена је у процесе ембриогенезе, метаморфозе, ремоделовања ткива и имунског одговора. С друге стране, поремећаји регулације апоптозе могу бити укључени у патогенезу многих болести, као што су, на пример, малигне, аутоимунске и неуродегенеративне болести (85). Поред тога, неадекватно функционисање апоптотског апарата може проузроковати мутације гена који су директно или индиректно укључени у различите стадијуме апоптозе (86). Спонтана ex vivo апоптоза лимфоцита периферне крви до сада је проучавана код пацијената са карциномом главе и врата (87), дигестивног тракта (88) и репродуктивног система (89,90), карциномом дојке (91), меланомом (92) и мултиплим мијелом (93). Неке од поменутих студија указале су на то да код пацијената са различитим типовима карцинома (87,91,92) постоји већа заступљеност апоптотичних ћелија међу лимфоцитима периферне крви. Механизам одговоран за повећање степена спонтане апоптозе још увек је недовољно испитан. Једно од могућих објашњења је интензивирање Fas (APO-1, CD95)/FasL спољашњег пута активације апоптозе. Значајан број циркулишућих лимфоцита се код пацијената са карциномом главе и врата уклања процесом апоптозе, а ти лимфоцити су Fas-позитивни (87). Такође, показано је да ћелије карцинома појачано експримирају Fas лиганд (94). Изгледа да Fas/FasL активишући пут, укључујући и присуство серумског Fas лиганда, може бити укључен у индукцију процеса апоптозе у циркулишућим лимфоцитима. 11 Осим поменутог, постоји још пар механизама који би могли да буду укључени у индукцију апоптозе код пацијената са туморима, као што су присуство дивљег соја p53 гена, активација c-myc гена, прекомерна експресија проапоптотичних молекула Bax или Bak, и промене у продукцији цитокина (смањење концентрације IL6, IL10, INF-γ, односно повећање концентрације TNF-α) (95,96). Примена радиотерапије интензивира апоптозу лимфоцита код особа са различитим врстама тумора (97,98) деловањем на ћелијску мембрану и на генетски материјал. Први механизам подразумева разградњу мембранског сфингомијелина уз формирање церамида, стимулатора интерфазне смрти ћелије. Други механизам заснива се на радијационом оштећењу ДНК, које је праћено повећањем p53-зависне транскрипције и блокадом убиквитин-зависне разградње протеина, што такође индукује апоптозу (99). 1.5. Цитокински профил у малигним болестима Још су Mosmann и Coffman 1989. године претпоставили да CD4+ Т лимфоцити нису јединствени, већ да се састоје од ћелијских популација које предоминантно секретују одређене цитокине и имају различите функције. Они су показали да се CD4+ Т-ћелијске линије могу поделити у 2 групе, од којих једна група као главни цитокин продукује интерферон гама (IFN-ɣ), а друга интерлеукин 4 (IL-4). Тиме су дефинисали два фенотипа CD4+ Т лимфоцита, Th1 и Th2 (100), при чему обе субпопулације настају из наивних CD4+ Т лимфоцита (Th0), чија је судбина детерминисана почетном интеракцијом са антигеном на мембрани антиген-презентујуће ћелије и цитокинима који су присутни у околној микросредини. Данас се CD4+ Т лимфоцити углавном деле на четири субпопулације, и то: Th1, Th2, Th17 и регулаторне Т (Тreg) лимфоците (101-105). Субпопулација Th1 лимфоцита предоминантно секретује IFN-ɣ и има важну улогу у имунском одговору против интраћелијских патогена, а субпопулација Th2 лимфоцита 12 секретује интерлеукин 4 (IL-4), интерлеукин 5 (IL-5), интерлеукин 13 (IL-13) и интерлеукин 25 (IL-25), и укључена је у елиминацију ектраћелијских патогена и паразита. Субпопулација Th17 ћелија лучи интерлеукин 17 (IL-17), интерлеукин 21 (IL-21) и интереукин 22 (IL-22) и има важну улогу у настанку ткивне инфламације и аутоимунских болести, док субпопулација регулаторних Т лимфоцита (Тreg) продукује цитокине који инхибишу имунски одговор, као што су интерлеукин 10 (IL-10) и трансформишући фактор раста бета (TGF-β). Полазећи од идеје Mosmannа и Coffmanа, Kidd (101) је претпоставио да у физиолошким условима у организму постоји избалансиран однос Th1 и Th2 лимфоцита, а да прекомерна активност једне субпопулације ћелија може омогућити развој болести, и уједно довести до нисходне регулације друге субпопулације лимфоцита, пре свега продукцијом контрарегулаторних цитокина. Истовремено, цитокини Th1 или Th2 типа усмеравају сопствени пут развоја продукцијом цитокина, регулацијом нивоа мембранских рецептора и нивоа експресије транскрипционих фактора (102). С обзиром на велики капацитет синтезе и секреције интерлеукина 12 (IL-12), дендритичне ћелије имају изузетно важну улогу у усмеравању наивних, CD4+ Th0 лимфоцита у Th1 лимфоците, док одсуство IL-12 и ослобађање IL-4, а према новијим сазнањима и IL-33, фаворизује настанак Th2 лимфоцита. У процесу функционалне поларизације наивних CD4+Т лимфоцита у Тh1 и Тh2 субпопулацију, дендритичне ћелије такође постају поларизоване (103). При том на процес поларизације не утичу само цитокини и хемокини, већ и простагландини (PGE2), као и други медијатори запаљења производени од стране макрофага, фибробласта, епителних и туморских ћелија. Наивне дендритичне ћелије изложене високим концентрацијама IFNɣ (продукованог од стране активираних NК ћелија и Тh1 лимфоцита) могу постати дендритичне ћелије типа 1, које обилно производе IL-12, и омогућавају развој Тh0 у Тh1 13 лимфоците, док дендритичне ћелије изложене релативно високим концентрацијама PGE2 поларишу у дендритичне ћелије тип 2 (104). Супресија продукције IL-12 у туморској микросредини повезује се са смањењем активности Тh1 лимфоцита код особа са туморима. С обзиром на то да цитокини Тh1 лимфоцита активишу цитотоксичне Т лимфоците, NК ћелије, макрофаге, моноците, и друге ћелије које могу бити укључене у борбу против тумора, а да је концентрација IFNɣ и других Th1 цитокина обично снижена код пацијената са узнапредовалим карциномима, при чему концентрација IL-4 може бити повећана или непромењена (105), то указује на смањење активности Th1 лимфоцита код особа са туморима. Пошто IL-10 супримира лучење Th1 цитокина, а повећана концентрација IL-10 детектована је код особа са лимфомом, карциномом јајника, меланомом, неуробластомом, и карциномом дебелог црева (104), то би могао да буде механизам којим се кочи Th1 тип имунског одговора који је усмерен према тумору. Осим тога, у присуству IL-4 у туморским ћелијама може настати усходна регулација IL-10, за који је показано да делује супресивно на ћелије убице из окружења (106). Улога Th17 лимфоцита у имунском одговору на туморе још увек је недовољно расветљена, а подаци у до сада публикованим радовима контраверзни (107,108). Према резултатима Kryczek и сарадника, број Th17 лимфоцита у туморској микросредини пропорционалан је броју CD4+ Th1 лимфоцита, цитотоксичних CD8+ T лимфоцита и NK ћелија, а обрнуто пропорционалан броју регулаторних Т лимфоцита (109). Th17 лимфоцити код пацијената са туморима продукују фактор који стимулише раст колонија гранулоцита и макрофага, фактор некрозе тумора алфа (TNFα), IL-2 и IFNɣ, a не продукују IL-10 (109). Просечно преживљавање пацијентиња са оваријалним карциномом код којих је у асциту детектована висока концентрација интерлеукина 17 (IL-17) је боље (78 месеци) од пацијенткиња код којих је концентрација IL-17 у асциту мања (27 месеци) 14 (108). Насупрот томе, код пацијената са хормон-резистентним карциномом простате показана је обрнута корелација између нивоа циркулишућих Th17 лимфоцита и прогресије болести (110), a код пацијената са назофарингеалним карциномом број тумор- инфилтришућих Th17 лимфоцита није утицао на преживљавање пацијената (111). Регулаторни Т лимфоцити (Тreg) се могу поделити на урођене и адаптивне (индуцибилне). За деловање урођених Тreg потребан је директан контакт, док адаптивни Тreg ослобађају имуносупресивне цитокине: IL-10 и трансформишући фактор раста бета (TGFβ) (112). Повећање броја Тreg лимфоцита подстиче стварање имуносупресивне микросредине (113) и повезано је са напредовањем болести (114), док уклањање Тreg лимфоцита појачава имунски одговор на туморске ћелије (115). Повећан број Тreg лимфоцита показан је у периферној крви пацијената са карциномом дојке, јетре, желуца и једњака, односно у инфилтрату бројних тумора (јајника, јетре, желуца и једњака, микроцелуларног карцинома плућа, панкреаса и тумора главе и врата), што је детаљно приказано у ревијском раду Радосављевић и сарадника (112). Међутим, осим имуносупресивног, код особа са туморима Тreg лимфоцити могу имати и проинфламаторно дејство. Наиме, TGFβ ослобођен од стране Тreg лимфоцита може индуковати стварање Th17 лимфоцита, или се Тreg лимфоцити могу трансформисати у Th17 лимфоците (116). Актуелна сазнања о ефектима зрачења на поларизацију CD4+ Т лимфоцита заснована су на анималним моделима. Примена јонизујућег зрачења изазива диференцијацију наивних CD4+ Т лимфоцита у Тh2 правцу и секрецију цитокина Тh2 типа (117-119). Bass и сарадници су показали да зрачење код мишева нарушава равнотежу између Тh1 и Тh2 лимфоцита и смањује однос између те две субпопулације ћелија (Th1/Th2) (120). Једна могућност је да зрачење инхибира активацију Th1 лимфоцита инхибицијом продукције IL- 12 од стране антиген презентујућих ћелија, смањењем секреције биолошки активног IL-12 15 и нисходном регулацијом експресије рецептора за IL-12 на површини CD4+ Т лимфоцита (117). С друге стране, повећава се продукција IL-4, а сматра се да је IL-4 главни покретач пострадијационе запаљењске реакције (121). У раним фазама након озрачивања главни извор IL-4 су Th2 лимфоцити (122), док касније вероватно настаје активација и других IL- 4 продукујућих ћелија, пре свега макрофага (122) и мастоцита (123). 16 2. ЦИЉЕВИ ИСТРАЖИВАЊА Основни циљ овог истраживања био је да се испитају целуларне и биохемијске промене у перифернoj крви пацијената са диферентованим карциномом штитасте жлезде пре и седам дана након апликације радиоактивног 131-I. У складу са основним циљем поставили смо следеће специфичне задатке: 1. Испитати да ли између групе пацијената са DTC пре апликације 131-I и контролне групе здравих испитаника постоје разлике у: 1.1 фреквенци микронуклеуса у лимфоцитима периферне крви 1.2 броју ћелија периферне крви и процентуалној заступљености лимфоцитних субпопулација (CD3+ Т лимфоцита, CD19+ В лимфоцита, и CD56+ NK ћелија) 1.3 проценту апоптотичних лимфоцита, 1.4 концентрацији биохемијских параметара (протеина, холестерола и триглицерида) 1.5 концентрацији одабраних цитокина (интерферона гама (IFN-ɣ), интерлеукина 1 бета (IL-1β), интерлеукина 2 (IL-2), интерлеукина 4 (IL-4), интерлеукина 5 (IL-5), интерлеукина 6 (IL-6), интерлеукина 9 (IL-9), интерлеукина 10 (IL-10), интерлеукина 12 (IL-12p70), интерлеукина 13 (IL- 13), интерлеукина 17 (IL-17A), интерлеукина 22 (IL-22) и фактора некрозе тумора алфа (TNF-α)) мерених у серуму и у супернатанту фитохемаглутитинином стимулисаних ћелија у култури пуне крви in vitro. 17 2. Испитати да ли између групе пацијената са DTC пре и седам дана након апликације 131-I постоје разлике у: 2.1 фреквенци микронуклеуса у лимфоцитима периферне крви 2.2 броју ћелија периферне крви и процентуалној заступљености лимфоцитних субпопулација (CD3+ Т лимфоцита, CD19+ В лимфоцита, и CD56+ NK ћелија) 2.3 проценту апоптотичних лимфоцита, 2.4 концентрацији биохемијских параметара (протеина, холестерола и триглицерида) 2.5 концентрацији цитокина Th1/Th2/Th17 помоћничких субпопулација T лимфоцита: IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-22, TNF-α мерених у серуму и у супернатанту фитохемаглутитинином стимулисаних ћелија у култури пуне крви in vitro 3. Испитати да ли промене у периферној крви пацијената са DTC седам дана након апликације 131-I зависе од: 3.1 апликоване дозе (3.7 GBq или 5.5 GBq 131-I) 3.2 ретенције 131-I у телу пацијента (у целом телу, тиреоидном и абдоминалном региону од интереса) 3.3 интензитета измереног оксидативног стреса. 18 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ Истраживање представља компаративну клиничко-експерименталну студију у којој су вредности тестираних параметара упоређиване између експерименталне групе пацијената са DTC и контролне групе здравих испитаника, као и између пацијената са DTC после апликације радиоактивног 131-I и истих пацијената пре апликације 131-I. Целокупно истраживање спроведено је у Центру за нуклеарну медицину, Хематолошкој лабораторији и Централној лабораторији Клиничког центра у Крагујевцу, Лабораторији за генетичка испитивања Природно-математичког факултета Универзитета у Крагујевцу и Институту за медицинска истраживања Војномедицинске академије у Београду. Истраживање је одобрено од стране Етичког комитета Клиничког центра у Крагујевцу (број 01-5868), који се у свом раду придржава правила Добре клиничке праксе (Good Clinical Practice, GCP). Сви пацијенти и контролни испитаници дали су писану сагласност за учешће у студији, сагласно Хелсиншкој Декларацији. 3.1. Испитивана популација У студију је укључено 24 пацијента (16 жена и 8 мушкараца) код којих је урађена тотална тиреоидектомија, а патохистолошки је потврђена дијагноза добродиферентованог тиреоидног карцинома (папиларни или фоликуларни карцином). Након одговарајуће конзилијарне одлуке, пацијенти су упућени у Центар за нуклеарну медицину Клиничког центра Крагујевац ради апликације радиоактивног 131-I. Просечна старост испитаника била је 50.83±13.22 година (најмлађи пацијент имао је 20, а најстарији 76 година). 19 Код 17 (70.83%) пацијената постављена је дијагноза папиларног карцинома, код 6 (25%) дијагноза фоликуларне варијанте папиларног карцинома, док је један испитаник (4.17%) имао фоликуларни карцином штитасте жлезде. Метастатске промене (у лимфним нодусима, плућима или костима) биле су присутне код 11 пацијената. Четири до шест недеља после тоталне тиреоидектомије, и 10 дана након дијете сиромашне јодом, пацијентима је у Центру за нуклеарну медицину апликована аблациона доза радиоактивног натријум јодида (131-I) сходно EANM водичу (15), и то 3.7 GBq (100 mCi) (13 пацијената) или 5.5 GBq (150 mCi) (11 пацијената). Код свих пацијената је, у време апликације 131-I, серумска концентрација тиреостимулишућег хормона (TSH) била већа од 30 mIU/L. При том, ни један од пацијената није био изложен познатим изворима јонизујућег зрачења (радиолошка испитивања или сцинтиграфија) најмање три месеца пре апликације 131-I. Четрнаест DTC пацијената дало је позитиван анамнестички податак о пушењу, док су преосталих десеторо били непушачи. У истраживање нису били укључени испитаници: млађи од 18 година, пацијенти са акутним инфекцијама (до месец дана пре апликације 131-I), пацијенти са раније дијагностификованим и/или леченим аутоимунским болестима, пацијенти са раније дијагностификованим и/или леченим хроничним инфламаторним болестима, и пацијенти са раније дијагностификованим и/или леченим другим малигним туморима. Контролну групу испитаника чинило је 24 здрава добровољца, 19 (79.16%) жена и 5 (20.84%) мушкараца просечне старости 46.37±12.79 година (од 28 до 70 година), који нису имали раније дијагностификоване туморе или хроничне инфламаторне болести, и који месец дана пре узимање узорка крви нису имали акутну инфекцију са повишеном температуром, а најмање три месеца нису били изложени дејству јонизујућег зрачења у дијагностичке или терапијске сврхе. Код свих контролних испитаника, пре укључења у студију, одређена је концентрација тиреоидних хормона, TSH и анти-тиреоидна антитела, 20 аутоантитела на тиреоглобулин (TgAt) и аутоантитела на тиреоидну пероксидазу (TPOAt). Просечна концентрација TSH била је 1.50±0.67 mIU/L (0.4-3.5 mIU/L), док су анти- тиреоидна антитела код свих контролних испитаника била у опсегу референтних вредности. 3.2. Општи протокол истраживања Узорци периферне крви су испитаницима из контролне групе узимани само једном, док су пацијенатима са DTC узимани у три наврата: непосредно пре апликације 131-I (0. дан), три дана после апликације 131-I (3. дан) и недељу дана после апликације 131-I (7. дан). Свим испитаницима је венепункцијом узимано по 5 mL крви у епрувете које нису садржале антикоагуланс и још по 10 mL крви у епрувете са антикоагулансом (хепарином). После 30 минута, из узорака крви без антикоагуланса издвајани су серуми (центрифугирањем на 2000 обртаја/мин у трајању од 15 минута), након чега су замрзавани и чувани на -20◦C до извођења одговарајућег есеја. Спонтана апоптоза лимфоцита изолованих из пуне хепаринизиране крви одређивана је код пацијената са DTC пре и седам дана након апликације 131-I (0. и 7. дан). И фреквенца микронуклеуса анализирана је пре и седам дана након апликације 131-I (0. и 7. дан), засејавањем пуне хепаринизиране крви у комплетни медијум за култивацију лимфоцита. У групи контролних испитаника спонтана апоптоза лимфоцита периферне крви и фреквенца микронуклеуса одређивана је само једном. 21 Методе 3.3. Тиреоидни статус, концентрација тиреоглобулина и анти- тиреоидних аутоантитела Концентрација слободног тироксина (fT4), слободног тријодтиронина (fT3), тиреоглобулина (Tg), анти-тиреоглобулинских аутоантитела (TgAt) и аутоантитела на тиреоидну пероксидазу (TPOAt) одређивана је пре апликације 131-I применом стандардних дијагностичких тестова фирме Cis Biointernational (Француска) према упутству произвођача. Концентрација тиреостимулишућег хормона (TSH) одређивана је пре апликације 131-I применом стандардног дијагностичког теста фирме ИНЕП (Земун, Србија). Опсег референтних вредности за наведене параметре је: fT4 7-18 pg/mL, fT3 2- 4.25 pg/mL, Tg 0-50 ng/mL, TgAt 0-30 IU/ mL, TPOAt 0-70 IU/ mL и TSH 0.3-5.5 mIU/L. 3.4. Сцинтиграфија целог тела Сцинтиграфија целог тела (енгл. whole body) урађена је код свих пацијената 72h након апликације дозе 131-I на гама камери „SIEMENS e.cam Duall Head“ са колиматорима за високу енергију (енгл. high energy), брзина скена 6 cm/min. Региони од интереса: регион тиреоидног остатка (без пљувачних жлезда), и регион абдомена (без мокраћне бешике) исцртавани су у пратећем софтверском пакету (Syngo MI Applications 2009A ver:8.2.26.8_VE32B16P30 IR26.5), у aнтериорно-постериорном (АП) и постериорно- антериорном (ПА) положају. Детектована радиоактивност приказана је као просечна радиоактивност, и то: укупна просечна радиоактивност и просечна радиоактивност 22 детектована у регионима од интереса (предео тиреоидне ложе и абдомена), добијене као средње вредности броја импулса забележених гама камером у АП и ПА позицији. 3.5. Параметри липидне пероксидације Интензитет липидне пероксидације одређиван је мерењем концентрације малондиалдехида (MDA) уз помоћ тиобарбитуратне киселине (TBA) (125). При ниским pH вредностима и повишеној температури MDA, који је крајњи продукт липидне пероксидације, учествује у реакцијама нуклеофилне адиције са 2-тиобарбитуратном киселином, при чему настаје црвени коњугат са високом моларном апсорпцијом на 532 nm, апсорпционог коефицијента 1.56×105 M-1 cm-1. Концентрација MDА код здравих испитаника одређивана је једнократно, а код пацијената са DTC у три наврата (пре апликације 131-I, три и седам дана након апликације 131-I). Једна запремина узорка серума мешана је са две запремине TBA реагенса, справљеног од 15% трихлорсирћетне киселине, 0.375% тиобарбитуратне киселине и 0.25 M хлороводоничне киселине. Добијена мешавина загревана је 5 минута у купатилу са кључалом водом. Након хлађења, супернатант је одвојен центрифугирањем на 1000 g у трајању од 10 мин, при температури од +4°C, после чега је у издвојеним супернатантима спектрофотометријски (на 535 nm) мерена абсорбанца. За израчунавање концентрације MDA коришћена је стандардна крива конструисана на основу познатих концентрација стандарда 1,1,3,3-тетраметоксипропана. Конструисана стандардна крива проверена је статистичком методом линеарне регресионе анализе, при чему је добијена једначина праве y = 0,0009 + 0.0139. 23 MDA y = 0,0009x + 0,0139 0 0,05 0,1 0,15 0 20 40 60 80 100 120 Слика 3.1. Стандардна крива за израчунавање концентрације MDA 3.6. Тотални антиоксидативни статус Тотални антиоксидативни статус (TAS) мерен је аутоматски, на Olympus AU 400 анализатору. За анализу је коришћен комерцијални TAS есеј (Fortress Diagnostics, UK). Принцип есеја заснива се на способности антиоксиданаса из серума да делују на продукт реакције 2.2′-азино-ди-3-етилбенз-тиазолин сулфоната, специфичног хромогена, са метмиоглобином и водоник-пероксидом (126). Настали продукт је плаво-зелене боје, која се може мерити колориметријски на таласној дужини од 600 nm, и чији интензитет бива редукован дејством антиоксиданаса, пропорционално њиховој концентрацији у узорку. Метода подразумева примену Troloxа (6-хидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2- карбоксилне киселине), аналога витамина Е, као стандарда. Добијене вредности тумачене су у односу на референтни интервал за TAS: 1.3-2.3 mmol/l. 3.7. Концентрација стандардних биохемијских параметара Концентрација стандардних биохемијских параметара (протеина, албумина, холестерола, триглицерида и мокраћне киселине) у серумима пацијената са DTC, као и у серумима здравих испитаника, одређивана је применом комерцијалних ензимских 24 реагенаса (Makler d.o.o, Belgrade, Serbia) на Olympus AU 400 анализатору. Референтне вредности за наведене параметре су: протеини 64-83 g/L, албумини 35-52 g/L, холестерол 3.10-5.20 mmol/L, триглицериди 0.10-1.70 mmol/L и мокраћна киселина 154- 428 µmol/L. 3.8. Одређивање фреквенце микронуклеуса Учесталост микронуклеуса у лимфоцитима периферне крви анализирана је применом „Cytokinesis-block” микронуклеусног теста (CBMN) описаног од стране Fenechа и Morley 1985. године (60). Пуна хепаринизирана крв (0.5 ml) додавана је у 5 ml комплетне подлоге за култивацију лимфоцита PBMax Karyotyping (Invitrogen, California, USA). Сваки узорак крви засејаван је у дупликату и инкубиран 72h на 37oC. Након 44h од почетка култивације културама је додаван цитохалазин B (Sigma, St Louis, MO, USA) у финалној концентрацији од 4µg/ml. Инкубација ћелијских култура је потом настављана још додатних 28h. По завршетку инкубације, узорци су центрифугирани 12 минута на 2000 обртаја/мин, након чега су ћелијске суспензије третиране хладним (4oC) хипотоничним, 0.56% раствором KCl два пута, и фиксиране три пута свежим фиксативом (сирћетна киселина:метанол = 1:3). Потом су узорци ресуспендовани у 0.5 ml фиксатива и разливани на хладне плочице. На осушенене плочице додаван је 2% раствор Giemse (Alfapanon, Нови Сад, Србија) и испиран после 12 минута. Учесталост микронуклеуса одређивана је анализом 1000 бинуклеарних ћелија (BN) сходно Fenech-овим критеријумима (127). „Cytokinesis-block” пролиферациони индекс (CBPI) одређен је према формули CBPI = (M1 + [2 x M2] + [3 x M3] + [4 x М4]) / N, у којој „M1 - M4“ представљају број ћелија са 1-4 нуклеуса, док је „N“ укупан број вијабилних ћелија (57). 25 3.9. Изолација мононуклеарних ћелија периферне крви Мононуклеарни леукоцити добијени су из венске крви по методи Boyum-a (128). Узорци хепаринизиране периферне крви центрифугирани су 10 минута брзином од 400g, на собној температури. Плазма и издвојени слој леукоцита су Пастеровом пипетом пренети на Lymphoprep (Lymphoprep 1.077, Nicomed Pharma AS, Oslo, Norway) и центрифугирани на 800g, 20 минута на собној температури. Мононуклеарни леукоцити (издвојени на граници плазме и Lymphoprepа) су пажљиво сакупљени Пастеровом пипетом, испрани три пута сланим фосфатним пуфером (BPS) и ресуспендовани у 500 µL истог пуфера. 3.10. Анализа популација мононуклеарних ћелија периферне крви Заступљеност појединих субпопулација у суспензији издвојених мононуклеарних ћелија периферне крви вршена је методом имунофенотипизације, на основу експресије одговарајућих мембранских CD маркера. По 100 µl финалног раствора мононуклеарних ћелија периферне крви (5x106-10x106 ћелија/ml раствора) инкубирано је са 10 µl моноклонског антитела примарно обележеног флуоресцентном бојом (анти CD3 ecd, анти- CD19 fitc, анти-CD56 pe, или анти-CD45 pc5), и са одговарајућом изотопском контролом (IgG1), током 15 минута на собној температури. После инкубације узорци су испрани два пута фосфатним пуферским раствором (BPS), фиксирани 2% (w/v) формалдехидом 10 минута на собној температури и анализирани на проточном цитометру. Регистровано је најмање 20.000 догађаја у свакој цитометријској анализи. 26 3.11. Одређивање процента апоптотичних и некротичних ћелија у узорцима мононуклеарних ћелија периферне крви Заступљеност апоптотичних и некротичних ћелија у суспензији свеже изолованих мононуклеарних ћелија периферне крви одређивана је методом двоструког бојења флуоресцентним бојама: Анексином V и 7-амино-актиномицином D (7-ADD), применом Annexin V-FITC/7-AAD комплета (Beckman Coulter, France). Припремљени узорци су анализирани на проточном цитометру, а резултати су приказани у процентима: проценат ћелија које су детектоване у раној и касној фази апоптозе у односу на укупан број анализираних ћелија. У раној фази апоптозе интегритет ћелијске мембране је очуван, али мембрана губи карактеристичну фосфолипидну асиметрију, те фосфатидилсерин, који је негативно наелектрисан и налази се на унутрашњој страни плазма мембране, бива измештен на површину ћелије. То омогућава везивање Анексина V, који је калцијум и фосфолипид везујући протеин, за фосфатидилсерин на површини ћелијске мембране. У касној фази апоптозе, као и у некрози, ћелијска мембрана губи свој интегритет те ДНК бива изложена вијабилним бојама (129). Annexin V-негативне и 7-AAD-негативне ћелије сматране су вијабилним неапоптотичним ћелијама, Annexin V-позитивне и 7-AAD-негативне ћелијама у раном стадијуму апоптозе, Annexin V-позитивне и 7-AAD-позитивне ћелијама у касном стадијуму апоптозе, док су Annexin V-негативне и 7-AAD-позитивне ћелије сматране некротичним ћелијама. Мононуклеарне ћелије су након издвајања центрифугиране током 5 минута на 500 обртаја/мин. По одливању супернатанта, ћелије су ресуспендоване у везујућем пуферу до 27 концентрације од 5x106-10x106 ћелија/ml раствора. Потом је у одговарајуће епрувете, запремине 5 ml, стављено по 100 µL ћелијске суспензије и по 10 µL Анексина V-FITC и 20 µL 7-ADD вијабилне боје. Садржај епрувета је инкубиран током 15 мин на температури 25°С, у мраку, после чега је у сваку епрувету додавано по 400 µL везујућег пуфера. Добијени узорци анализирани су на проточном цитометру FC500 Beckman Coulter, издвајањем популације лимфоцита на FS/SS дијаграму. Проценат ћелија у раној и касној апоптози, као и проценат некротичних ћелија очитани су уз помоћ пратећег CXP Cytometer софтвера. Слика 3.2. Дистрибуција ћелија добијена анализом узорака на проточном цитометру FC500 Beckman Coulter; популација лимфоцита на FS/SS дијаграму 3.12. Одређивање цитокинског профила Концентрација цитокина (IFN-ɣ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-22, TNF-α) одређивана је методом проточне цитометрије, применом ВМS817FF e-Bioscience кита. Мешавина 25 µL смеше зрнаца (енг. beads), 25 µL стандарда/узорка и 50 µL примарних антитела коњугованих са биотином инкубирана је 2 28 сата на собној температури (18-25°С) у мраку. Након инкубације у мешавину је додат 1mL пуфера, и добијена суспензија центрифугирана је 5мин на 2000 обртаја/мин. По уклањању супернатанта поступак испирања je поновљен, а добијени раствор третиран стрептавидин- фикоеритрином, те инкубиран на собној температури 1h. Уследило је двоструко испирање, и на крају ресуспендовање узорака серума и стандарда у 250 µL пуфера, те анализа на проточном цитометру FC500 Beckman Coulter. Концентрације одабраних цитокина одређиване су у серумима и у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви (whole blоod assay) (130) пацијената са DTC и контролних испитаника. Узорци серума пацијената са DTC издвојени су пре, као и три и седам дана након апликације 131-I. Супернатанти митогеном стимулисаних ћелија пуне крви добијени су пре и седам дана након апликације 131-I. Након инкубације пуне хепаринизиране крви у комплетаном медијуму за култивацију лимфоцита PBMax Karyotyping (Invitrogen, California, USA) у запреминском односу 1:10 током 72h, супернатанти су издвојени центрифугирањем на 2000 обртаја/мин током 15 минута, и до мерења чувани на -20оС. Концентрације цитокина које су измерене у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви пацијената са DTC упоређиване су са концентрацијама цитокина које су измерене у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви контролних испитаника, као измерене вредности помножене фактором разблажења и као вредности које су добијене прерачунавањем на 1000 леукоцита (измерене вредности помножене фактором разблажења и подељене бројем леукоцита израженим у хиљадама/mL). На исти начин су упоређиване и концентрације цитокина које су измерене у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви DTC пацијената пре и после апликације 131-I. 29 Процена цитокинског профила вршена је на основу концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (добијених прерачунавањем на 1000 леукоцита) и на основу односа концентрација контрарегулаторних цитокина (на 1000 леукоцита) (Th1/Th2) (130), и то: IL-12p70 и IL-13, IFN-ɣ и IL-4, IFN-ɣ и IL-5, IFN-ɣ и IL-10, TNF-α и IL-4, TNF-α и IL-5, и TNF-α и IL-10. Према упутству произвођача, мерни опсег ВМS817FF e-Bioscience кита је: 0-20 000 pg/mL за следеће цитокине: IL-12p70, IFN-ɣ, IL-2, IL-10, IL-6, IL-13, IL-4, IL-5, IL-1β, и TNF-α; 0-10 000 pg/mL за IL-17A; 0-2000 pg/mL за IL-9; и 0-80 000 pg/mL за IL-22. Слика 3.3. Дистрибуција зрнаца популације А и В (beads cluster) добијена анализом узорака на проточном цитометру FC500 Beckman Coulter применом ВМS817FF e-Bioscience кита 3.13. Статистичка обрада података Подаци су анализирани коришћењем статистичког програма SPSS ver 13.0 for Windows. Разлике у посматраним параметрима између контролне групе испитаника и групе пацијената са DTC пре терапије 131-I тестиране су применом независног Т теста (енгл. Independent samples t-test) или применом теста суме рангова (Mann Whitney test) 30 зависно од дистрибуције, док су разлике између пацијената пре и након терапије 131-I анализиране применом упареног Т теста, односно једнофакторском анализом варијанси (ANOVA) или Friedman-овим тестом поновљених мерења, у случају да дистрибуција није била нормална. Међусобна повезаност посматраних варијабли и јачина везе испитивана је тестовима линеарне регресије и корелације (одређивањем Pearson/Spearman коефицијената). Вредности p мање од 0.05 сматране су статистички значајним, а мање од 0.01 високо статистички значајним. 31 4. РЕЗУЛТАТИ 4.1. Карактеристике пацијената са DTC Карактеристике пацијената са DTC (старост, пол, хистолошке карактеристике тумора и стадијум болести, вредности TSH и Tg), као и апликована доза 131-I, дате су у табели 4.1. Сви пацијенти били су хипотиреоидни са просечном концентрацијом TSH од 153.89±97.53 mIU/L (минимална концентрација 31 mIU/L, максимална концентрација 364 mIU/L), док је средња концентрација серумског Tg износила 9.48±11.70 mg/L (минимална концентрација 0.10 mg/L, максимална 38 mg/L). Табела 4.1. Карактеристике пацијената са диферентованим карциномом штитасте жлезде који су лечени 131-I *P- папиларни карцином, P/F- фоликуларна подтип папиларног карцинома, F- фоликуларни карцином Пацијент број Старост (год) Пол (Ж/M) Стадијум (TNM) Хистологија (P/F)* Tg (mg/L) TSH (mIU/L) Доза (GBq) 1 43 M T2N0M0 P 4.5 282 3.7 2 45 Ж T1N1M0 P/F 0.5 65.7 3.7 3 42 Ж T1N0M0 P 0.1 180 3.7 4 47 Ж T1N0M0 P 1.0 148 3.7 5 40 M T1N1M0 P 10.4 71 5.5 6 48 M T2N0M0 P 0.1 168 3.7 7 60 Ж T1N0M0 P 0.4 85 3.7 8 56 M T3N1M1 P 2.3 306 5.5 9 61 Ж T1N1M0 P/F 16.3 138 5.5 10 63 M T3N1M1 F 36.2 175 5.5 11 76 Ж T2N0M0 P 22 130 3.7 12 44 Ж T1N0M0 P 21.6 359 3.7 13 63 Ж T1N0M0 P/F 1.2 262 3.7 14 38 Ж T1N1M0 P/F 2.1 62 5.5 15 66 M T1N1M0 P 6.3 32.9 5.5 16 43 Ж T1N0M0 P 16.4 170 5.5 17 20 Ж T1N0M0 P/F 4.2 36.8 3.7 18 43 Ж T1N0M0 P 2.1 128 3.7 19 64 Ж T1N0M0 P 0.1 31 3.7 20 42 Ж T2N0M1 P 15 142 5.5 21 71 Ж T2N0M0 P 0.1 155 3.7 22 41 M T2N1M0 P/F 38 76.5 5.5 23 40 M T1N1M0 P 1.4 364 5.5 24 64 Ж T2N1M0 P 25.3 125.6 5.5 32 Контролну групу здравих испитаника чинило је 19 (79.16%) жена и 5 (20.84%) мушкараца просечне старости 46.37±12.79 година (од 28 до 70 година). Просечна концентрација TSH била је 1.50±0.67 mIU/L (минимална концентрација 0.4 mIU/L, максимална концентрација 3.5 mIU/L), док је средња концентрација серумског Tg износила 9.10±6.26 mg/L (минимална концентрација 0.10 mg/L, максимална 19.5 mg/L). У табели 4.2. приказане су просечне вредности укупног броја импулса детектованих гама камером при сцинтиграфији целог тела, као и просечан број импулса у регионима од интереса (регион тиреоиднe ложе и абдомена), добијени уз помоћ пратећег софтверског пакета Syngo MI Applications 2009A ver:8.2.26.8_VE32B16P30 IR26.5. Приказани подаци говоре о веома великој варијабилности броја импулса међу пацијентима који су примили исту дозу 131-I. Тако је у групи пацијената са DTC којима је апликована доза од 3.7 GBq 131-I укупан просечан број импулса био у распону од 762 500 до 7 681 643, док је у групи пацијената са DTC којима је апликована доза од 5.5 GBq 131-I, минимална вредност укупног просечног броја импулса износила 1 513 000, а максимална 14 294 000. Следи да је однос између највећег и најмањег броја импулса 10.07 код пацијената којима је апликована доза од 3.7 GBq 131-I, односно 9.47 код пацијената којима је апликована доза од 5.5 GBq 131-I. Најмања детектована просечна радиоактивност у пределу тиреоидне ложе износила је 11 500, а највећа 1 905 000 (по групама: 11 500–1 745 121 у групи пацијената са DTC којима је апликовано 3.7 GBq 131-I, односно 26 935–1 905 000 у групи пацијената којима је апликовано 5.5 GBq 26 935–1 905 000). Најмања детектована просечна радиоактивност у пределу абдомена била је 89 500, а највећа 3 588 500 (по групама: 89 500–3 025 719 у групи пацијената којима је апликовано 3.7 GBq 131-I, односно 375 500–3 588 500 у групи пацијената којима је апликовано 5.5 GBq 131-I). 33 Табела 4.2. Просечна радиоактивност у регионима од интереса (тиреоидне ложе и абдомена) и укупна просечна радиоактивност добијене са “whole body“ сцинтиграма 72h после апликације 131I (3.7 или 5.5 GBq 131-I) Пацијент број Доза (GBq) Тиреоидна ложа (импулси) Абдомен (импулси) Укупно (импулси) 1 3.7 227 500 89 500 762 500 2 3.7 14 083 208 490 920 842 3 3.7 31 000 581 500 1 091 500 4 3.7 142 000 256 500 1 178 000 5 5.5 99 500 621 500 1 513 000 6 3.7 11 500 523 500 1 600 500 7 3.7 27 479 495 927 1 753 918 8 5.5 36 500 375 500 2 080 000 9 5.5 72 841 601 480 2 380 382 10 5.5 26 995 659 500 2 514 000 11 3.7 726 500 1 178 500 3 221 000 12 3.7 72 841 1 429 332 3 240 314 13 3.7 791 214 1 150 183 4 228 839 14 5.5 1 445 000 781 500 4 460 000 15 5.5 1 905 000 708 500 4 832 000 16 5.5 633000 1 961 500 5 422 000 17 3.7 133 860 1 441 982 5 975 149 18 3.7 1 745 121 1 078 651 6 491 364 19 3.7 129 979 1 998 972 6 911 296 20 5.5 529 948 1 519 184 7 555 137 21 3.7 133 032 3 025 719 7 681 643 22 5.5 607 500 1 741 500 8 651 500 23 5.5 134 500 3 258 000 9 665 000 24 5.5 618 000 3 588 500 14 294 000 34 Пацијент бр. 1. (доза: 3.7 GBq Пацијент бр. 12. (доза: 3.7 GBq) TSH=282 mIU/L, Tg=4.5 mg/L TSH=359 mIU/L, Tg=21.6 mg/L Пацијент бр. 14. (доза: 5.5 GBq) Пацијент бр. 20 (доза: 5.5 GBq) TSH=62 mIU/L, Tg=2.1mg/L TSH=142 mIU/L, Tg=15 mg/L Слика 4.1. Репрезентативни “whole body” сцинтиграми регистровани код пацијената са DTC 72h после апликације 131-I: aкумулацијa 131-I у АП и ПА позицији код пацијента бр. 1 (стадијум: T2N0M0, TSH = 282 mIU/L, Tg = 4.5 mg/L) и бр. 12 (стадијум: T1N0M0, TSH = 359 mIU/L, Tg=21.6 mg/L) којима је апликовано 3.7 GBq 131-I, и код пацијената под редним бројем 14 (стадијум: T1N1M0, TSH = 62 mIU/L, Tg = 2.1 mg/L) и 20 (стадијум: T2N0M1, TSH = 142 mIU/L, Tg = 15 mg/L), којима је апликовано 5.5 GBq 131-I. 35 4.2. Оксидативни стрес код пацијената са DTC 4.2.1. Концентрација МDA, мокраћне киселине и тотални анти- оксидативни статус Процена интензитета оксидативног стреса код пацијената са DTC вршена је на основу концентрације MDА, а антиоксидативна заштита процењивана је на основу концентрације мокраћне киселине и тоталног антиоксидативног статуса (TAS). Сви наведени параметри анализирани су пре терапије 131-I и три, односно седам, дана након терапије 131-I, и упоређивани са вредностима измереним у контролној групи здравих испитаника. Применом Т теста независних узорака показана је статистички значајно већа концентрација MDА у групи пацијената са DTC пре терапије 131-I у односу на контролну групу здравих испитаника (2.85±1.29 nmol/ml vs. 1.74±0.39 nmol/mL; Independent samples t-test, p<0.001), док је тотални антиоксидативни статус био сличан у обе посматране групе (1.86±0.27 mmol/L vs. 1.85±0.31 mmol/L; Mann Whitney test; p=0.784) (Слика 4.2). Осим тога, утврђено је постојање негативне корелације између концентрације MDA и TAS код пацијената са DTC пре апликације 131-I (bivariate correlation test, Spearman r=- 0.478, p=0.018). 36 0 1 2 3 4 5 6 контроле DTC пацијенти контроле DTC пацијенти MDA TAS M D A (n m o l/m L ); T A S (m m o l/L ) 0. дан 3.дан 7.дан ** * Слика 4.2. Концентрација МDА и TAS у групи пацијената са DTC пре (0.дан), 3 дана (3.дан) и 7 дана (7.дан) после терапије 131-I и у контролној групи здравих испитаника. * статистички значајна разлика у концентрацији МDА у групи пацијената са DTC пре терапије у односу на контролну групу здравих испитаника ** статистички значајна разлика у концентрацији МDА у групи пацијената са DTC три дана након терапије у односу на претерапијске вредности Међугрупно тестирање разлика у концентрацији МDА код пацијената са DTC указало је на повећање оксидативног стреса три дана након терапије 131-I у односу на вредности пре терапије (3.32±1.60 nmol/mL vs. 2.85±1.29 nmol/mL; Wilcoxon test, p=0.001), са смањењем на 2.71±1.11 nmol/mL (Wilcoxon test, p=0.004) недељу дана после терапије, тј. показана је статистички значајна промена концентрације МDА код пацијената са DTC након апликације 131-I (c2(2, n = 24) = 13.067, p=0.001), за разлику од TASа који се није битније мењао (Friedman’s test, c2(2, n=24)=3.433, p=0.180). Иако су седам дана од апликације 131-I детектоване нешто ниже вредности МDА него пре терапије, ове разлике нису биле статистички значајне (2.71±1.11 nmol/mL vs 2.85±1.29 nmol/mL; Wilcoxon test, p=0.615). 37 Концентрација мокраћне киселине у групи пацијената са DTC и у контролној групи здравих испитаника приказана је на Слици 4.3. Пре терапије пацијенти са DTC имали су статистички значајно већу концентрацију мокраћне киселине од контролних испитаника (369.95±112.89 µmol/L vs. 261.66±84.03 µmol/L; Mann Whitney test, p<0.001). Једнофакторска анализа варијансе поновљених мерења показала је прогресивни пад концентрације мокраћне киселине у крви након примене 131-I (One way ANOVA, p=0.011), и то за око 17.73 % три дана након терапије (304.33±79.28 µmol/L; p=0.024) односно за 21.01% седам дана након терапије (292.21±85.71 µmol/L; p=0.010). У односу на период пре примене 131-I, ове разлике су статистички значајне. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 контроле DTC пацијенти м о к р а ћ н а к и се л и н а (m m o l/L ) 0.дан 3.дан 7.дан * ** *** Слика 4.3. Концентрација мокраћне киселине у групи пацијената са DTC пре (0.дан), 3 дана (3.дан) и 7 дана (7.дан) после терапије 131-I и у контролној групи здравих испитаника *статистички значајна разлика у концентрацији мокраћне киселине у групи пацијената са DTC пре терапије у односу на контролну групу здравих испитаника ** статистички значајна разлика у концентрацији мокраћне киселине у групи пацијената са DTC три дана након терапије 131-I у односу на концентрације пре терапије *** статистички значајна разлика у концентрацији мокраћне киселине у групи пацијената са DTC седам дана након терапије 131-I у односу на концентрације пре терапије У табели 4.3. дате су вредности МDА, TAS и мокраћне киселине код DTC пацијената који су класификовани на основу хистолошког типа тумора. 38 Због великих разлика у броју испитаника, евентуално постојање међугрупних разлика у наведеним параметрима није тестирано. Табела 4.3. Малондиалдехид (MDА), тотални антиоксидативни статус (TAS) и мокраћна киселина код пацијената са папиларним (P), фоликуларним (F) и фоликуларном варијантом папиларног (P/F) карцинома пре (0.дан), 3 дана (3.дан) и 7 дана (7.дан) после терапије 131-I Хистолошки тип DTC (P/F*) Анализирани параметар Време анализе P (n=17) P/F (n=6) F (n=1) 0.дан 2.95 ± 1.32 2.65 ± 1.42 2.23 3.дан 3.46 ± 1.69 2.95 ± 1.46 2.57 МDА (nmol/mL) X ± SD 7.дан 2.82 ± 1.15 2.30 ± 1.11 2.79 0.дан 1.85 ± 0.31 1.88 ± 0.14 2.04 3.дан 1.79 ± 0.37 1.88 ± 0.23 1.53 TAS (mmol/L) X ± SD 7.дан 1.88 ± 0.34 2.09 ± 0.11 2.04 0.дан 378.61 ± 124.42 338.0 ± 76.64 374 3.дан 313.72 ± 85.06 285.80 ± 55.80 228 Мокраћна киселина (µmol/L) X ± SD 7.дан 312.44 ± 82.92 225.20 ± 73.18 263 4.2.2. Однос оксидативног стреса, апликоване дозе 131-I и импулса детектованих гама камером Тестирали смо утицај дозе апликованог 131-I на смањење концентрације мокраћне киселине. Просечно смањење концентрације мокраћне киселине било је нешто више код пацијената са DTC којима је апликована доза од 5.5 GBq 131-I у односу на пацијенте са DTC којима је апликована доза од 3.7 GBq, како три (56.77±47.90 vs. 54.18±39.10 µmol/L), тако и седам дана (84.55±49.48 vs. 44.82±50.36 µmol/L) после терапије, али без статистичке значајности (p>0.05). Такође, није показан утицај дозе на промену концентрације МDА и TAS три, односно седам дана након апликације 131-I (p>0.05). С друге стране, показана је статистички значајна позитивна корелација између просечног броја импулса детектованих у области тиреоидне ложе и липидне пероксидације мерене концентрацијом МDА, седам дана после терапије 131-I у односу на претерапијске вредности (Bivariate correlation test, Spearman r =0.458, p=0.024). 39 4.3. Протеински и липидни профил пацијената са DTC Код пацијената са DTC одређивана је концентрација протеина и липида пре апликације 131-I, као и 3 и 7 дана након апликације 131-I, и добијене вредности су упоређиване међусобно, а вредности пре терапије су упоређиване и са контролном групом здравих испитаника. Код пацијената са DTC постоји статистички значајно већа концентрација протеина (87.16±6.04 g/L vs. 81.91±4.66 g/L; Independent samples T test, p=0.002), холестерола (8.84±2.09 mmol/L vs. 6.23±1.46 mmol/L; Independent samples T test, p<0.001) и триглицерида (2.26±1.08 mmol/L vs. 1.32±0.63 mmol/L, Mann Whitney test, p=0.001) у односу на контролну групу здравих испитаника (Табела 4.4.). Табела 4.4. Концентрација протеина и липида у групи пацијената са DTC пре терапије (0. дан), три дана (3. дан) и седам дана (7. дан) након 131-I терапије и у контролној групи здравих испитаника *статистички значајна разлика између групе пацијената са DTC пре терапије и контролне групе здравих испитаника ** статистички значајна разлика у групи пацијената са DTC три дана након терапије у односу на претерапијске вредности *** статистички значајна разлика у групи пацијената са DTC седам дана након терапије у односу на претерапијске вредности Када су у питању промене биохемијских параметара након апликације 131-I, евидентно је да три дана након апликације 131-I настаје статистички значајно смањење DTC пацијенти параметар Контролни испитаници 0. дан 3. дан 7. дан протеини (g/l) 81.91 ± 4.66 87.16 ± 6.04* 78.71 ± 6.71 ** 82.54 ± 4.54*** албумини (g/l) 55.21 ± 5.31 57.42 ± 5.23 52.54 ± 5.23 ** 53.83 ± 3.63 *** глобулини (g/l) 26.71 ± 4.88 29.71 ± 5.48 26.16 ± 6.37 ** 28.79 ± 4.23 холестерол (mmol/l) 6.23 ± 1.46 8.84 ± 2.09* 8.12 ± 2.13 ** 8.41 ± 2.13*** триглицериди (mmol/l) 1.32 ± 0.63 2.26 ± 1.08* 2.44 ± 1.07** 2.14 ± 1.11 40 концентрације протеина (78.71±6.71 g/L vs. 87.16±6.04 g/L; p<0.001), са непотпуним опоравком недељу дана након апликације 131-I, тако да су на крају испитиваног периода протеини и даље статистички значајно нижи у односу на вредности измерене пре апликације 131-I (82.54±4.54 g/L vs. 87.16±6.04 g/L; p=0.013). Сходно томе, терапија радиоактивним 131-I изазива значајне промене концентрације укупних протеина током посматраног периода (One way ANOVA, p<0.001). Слично, показано је да након примене 131-I настају значајне промене у концентрацији холестерола, статистички значајно смањење три дана после терапије у односу на концентрацију пре терапије (8.12±2.13 mmol/L vs. 8.84±2.09 mmol/L; p=0.001), са повећањем концентрације 7 дана након терапије (8.41±2.13 mmol/L vs. 8.84±2.09 mmol/L; p=0.032). Насупрот томе, нису регистроване значајне промене концентрације триглицерида након апликације 131-I (c2(2, n=24)=3.583, p=0.167). Накнадно међугрупно тестирање показало је статистички значајно повећање концентрација триглицерида три дана након терапије у односу на претерапијске вредности (2.44±1.07 mmol/L vs. 2.26±1.08 mmol/L; p=0.041), што није био случај са концентрацијом триглицерида седам дана након терапије 131-I (2.14±1.11 mmol/L vs. 2.26±1.08 mmol/L; p=0.225) у односу на претерапијске вредности. Смањење концентрације протеина и холестерола праћено је повећањем концентрације триглицерида три дана од апликације радиоактивног 131-I, са каснијим враћањем на вредности које су блиске претерапијским. Концентрације протеина и липида у групи пацијената са DTC приказане су на Слици 4.4. 41 а) 74 76 78 80 82 84 86 88 DTC пацијенти п р о т еи н и (g/ L ) 0.дан 3.дан 7.дан б) 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8 9 DTC пацијенти х о л е с т е р о л (m m o l/L ) 0.дан 3.дан 7.дан в) 1,9 2 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 DTC пацијенти т р и гл и ц ер и д и (m m o l/L ) 0.дан 3.дан 7.дан Слика 4.4. Концентрације протеина (а), холестерола (б) и триглицерида (в) у групи пацијената са DTC пре (0.дан), 3 дана (3.дан) и 7 дана (7.дан) после терапије 131-I 42 С обзиром на то да са годинама долази до успорења метаболичких процеса, анализирали смо ефекте старења на концентрацију протеина, холестерола и триглицерида код пацијената са DTC. Најпре смо пацијенте са DTC поделили у две подгрупе: прву подгрупу чинили су пацијенти са највише 50 година, а другу пацијенти старији од 50 година. Није уочена статистички значајна разлика у концентрацији протеина (87.58±5.36 g/L vs. 86.75±6.86 g/L; Independent T test, p=0.744), холестерола (8.97±0.65 mmol/L vs. 8.72±1.99 mmol/L; Independent T test, p=0.774), и триглицерида (2.41±1.29 mmol/L vs. 2.12±0.85 mmol/L;Mann Whitney test, p=0.671) између две подгрупе пацијената пре терапије 131-I. Такође, није било значајних разлика у смањењу концентрације протеина и холестерола три и седам дана после терапије 131-I. Када је реч о односу протеина и липида, утврђена је статистички значајна индиректна корелација између концентрације протеина и концентрације триглицерида три дана после апликације 131-I код пацијената старијих од 50 година (Bivariate correlation test, Spearman r=-0.583, p=0.048) (Слика 4.5.), што није био случај са групом испитаника испод 50 година живота (Pearson r=- 0.277, p=0.384). R = -0.583, p=0.048 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 5 10 15 20 протеини (g/L) т р и гл и ц ер и д и (m m o l/L ) Слика 4.5. Корелација протеина и триглицерида три дана после 131-I терапије код пацијената са DTC старијих од 50 година 43 4.4. Фреквенца микронуклеуса код пацијената са DTC 4.4.1. Микронуклеусна фреквенца и “cytokinesis-block” пролифера-циони индекс (CBPI) Применом CBMN есеја у групи пацијената са DTC (пре и 7 дана након апликације 131-I) и у контролниј групи здравих испитаника одређена је фреквенца микронуклеуса и вредност CBPI пролиферационог индекса. У бинуклеарним ћелијама пацијената са тиреоидним карциномом пре апликације 131-I било је од 7 до 33 микронуклеуса на 1000 анализираних ћелија, а 7 дана након апликације 131-I од 11 до 48 микронуклеуса на 1000 ћелија. Минимална вредност CBPI пре терапије била је 1.20 а максимална 2.17, док је након терапије минимална вредност CBPI била је 1.18 а максимална 1.99. У контролној групи здравих испитаника МN фреквенца варирала је од 0 до 10 микронуклеуса на 1000 бинуклеарних ћелија, док се пролиферациони индекс кретао у распону од 1.42 до 1.69 (Табела 4.5. и 4.6.). 44 Табела 4.5. Фреквенца микронуклеуса и CBPI код пацијената са DTC пре и 7 дана после апликације 131-I Пре терапије После терапије Пацијент Бр. Старост (год) Пол (Ж/M) Пушење (+/-) Доза (GBq) MN/1000 BN ћелија CBPI MN/1000 BN ћелија CBPI 1 43 M + 3.7 22 1.77 35 1.51 2 45 Ж - 3.7 16 1.49 21 1.41 3 42 Ж - 3.7 14 1.47 18 1.33 4 47 Ж + 3.7 18 1.36 24 1.29 5 40 M + 5.5 16 1.55 21 1.35 6 48 M + 3.7 7 2.17 11 1.99 7 60 Ж + 3.7 15 1.2 32 1.18 8 56 M - 5.5 22 1.5 29 1.44 9 61 Ж - 5.5 29 1.44 37 1.17 10 63 M - 5.5 28 1.28 38 1.2 11 76 Ж + 3.7 20 1.35 23 1.3 12 44 Ж - 3.7 17 1.5 22 1.43 13 63 Ж + 3.7 17 1.51 23 1.27 14 38 Ж + 5.5 12 1.49 16 1.37 15 66 M - 5.5 15 1.33 19 1.32 16 43 Ж + 5.5 26 1.53 32 1.42 17 20 Ж - 3.7 14 1.58 20 1.52 18 43 Ж + 3.7 28 1.62 41 1.59 19 64 Ж + 3.7 20 1.35 22 1.31 20 42 Ж - 5.5 33 1.74 48 1.31 21 71 Ж - 3.7 27 1.7 37 1.38 22 41 M + 5.5 29 1.37 44 1.28 23 40 M + 5.5 19 1.48 25 1.35 24 64 Ж + 5.5 8 1.54 16 1.36 45 Табела 4.6. Фреквенца микронуклеуса и CBPI у лимфоцитима периферне крви здравих испитаника Контрола Бр. Старост (год) Пол (Ж/M) Пушење (+/-) MN/1000 BN ћелија CBPI 1 38 Ж + 5 1.61 2 64 Ж + 5 1.51 3 44 Ж + 6 1.51 4 61 Ж - 5 1.55 5 30 Ж - 3 1.57 6 30 M - 0 1.69 7 52 Ж - 5 1.52 8 79 Ж - 10 1.51 9 36 Ж - 2 1.51 10 31 M - 3 1.42 11 56 Ж - 7 1.50 12 59 Ж - 6 1.49 13 50 Ж + 6 1.60 14 53 Ж + 8 1.58 15 49 Ж + 3 1.56 16 40 M + 2 1.53 17 30 Ж - 2 1.52 18 51 Ж - 4 1.55 19 54 M - 1 1.62 20 38 Ж + 5 1.60 21 40 Ж - 2 1.58 22 48 M + 4 1.66 23 52 Ж - 5 1.56 24 28 Ж + 2 1.66 Поређењем фреквенце микронуклеуса у групи пацијената са DTC пре терапије радиоактивним 131-I и контролној групи здравих испитаника утврђено је да пацијенти са DTC пре терапије садрже већи број МN, што указује на већа хромозомска оштећења у односу на контролну групу испитаника. 46 Просечна МN фреквенца код пацијената са DTC пре терапије била је статистички значајно већа него код контролних испитаника (Independent samples T test, 19.66±6.93 vs. 4.21±2.34, p<0.001), а седам дана након терапије 131-I дошло је до значајног повећања у односу на претерапијске вредности (Paired samples test, 27.33±9.82 vs. 19.66±6.93, p<0.001). У табели 4.7. приказана је дистрибуција микронуклеуса у BN ћелијама пре и 7 дана након терапије 131-I. У групи DTC пацијената након терапије било је укупно 455 BN ћелија са једним МN, у групи DTC пацијената пре терапије било је укупно 303 BN ћелије са једним МN, а у контролној групи здравих испитаника било је укупно 94 BN ћелије са једним МN. Број BN ћелија са 2 микронуклеуса био је знатно мањи у читавој студијској популацији (66 BN ћелија после терапије vs. 49 BN ћелија пре терапије и 6 BN ћелија код контролних испитаника), док су BN ћелије са 3 и 4 микронуклеуса нађене само код пацијената (не и здравих контрола) како пре, тако и након терапије 131-I. Табела 4.7. Дистрибуција микронуклеуса у групи пацијената са DTC пре и 7 дана после апликације 131-I и у контролној групи здравих испитаника Број BN ћелија Испитаници 1 МN 2 МN 3 МN 4 МN DTC пацијенти пре терапије 131-I 303 49 17 2 DTC пацијенти 7 дана после терапије 131-I 455 66 19 3 Контроле 94 6 - - Када је у питању индекс пролиферације ћелија, показано је да су претерапијске вредности CBPI у групи пацијената са DTC значајно ниже него у контролној групи здравих испитаника (Mann–Whitney test (1.51±0.19 vs. 1.56±0.06; p=0.027), и да примена 131-I води статистички значајном смањењу пролиферационог капацитета ћелија седам дана од апликације (1.51±0.19 vs. 1.38±0.16; p<0.001) (Табела 4.8.). 47 То значи да је ћелијски циклус успорен у лимфоцитима периферне крви пацијената са DTC, а терапија 131-I га додатно успорава. Статистичком анализом показано је да старост испитаника (p=0.707), пол (p= 0.831), хистолошки тип тумора (p=0.461), и присуство метастаза (p=0.190) не утичу значајно на МN фреквенцу. Иако су код пушача нађене нешто више вредности претерапијске и радиоактивним 131-I индуковане МN фреквенце у односу на непушаче, те разлике нису статистички значајне (binary logistic regression test, pбазална=0.286; pиндукована= 0.513). 48 Табела 4.8. Обједињени приказ вредности микронуклеусне фреквенце и пролиферационог индекса у групи пацијената са DTC (n=24) и у контролној групи здравих испитаника (n=24) Пацијенти Контроле МN фреквенца CBPI МN фреквенца CBPI Анализа n пре 131-I после 131-I X ± S.D. пре 131-I после 131-I X ± S.D. n X ± S.D. Просечна старост Распон година 24 50.83±13.22 20-76 24 46.37±12.79 28-70 укупно Пол Мушкарци Жене Пушење Да Не Терапијска доза (GBq) 3.7 5.5 Метастазе Да Не Стадијум T1N0M0/N1M0 T2N0M0/N1M0/ N0M1 T3N1M1 8 16 14 10 13 11 11 13 15 7 2 19.66±6.93 a 27.33±9.82 б 19.25±7.63 27.37±11.45 19.87±6.80 27.31±9.31 21.27±6.87 28.72±9.94 18.30±6.94 26.15±9.95 18.07±5.57 25.31±8.46 21.54±8.11 29.73±11.14 21.63±8.05 29.90±10.25 18.00±5.61 25.15±8.57 18.40±6.03 25.26±9.21 20.85±10.09 30.57±14.1 25 33.5 1.51±0.19в 1.38±0.16г 1.54±0.28 1.43±0.24 1.49±0.14 1.35±0.11 1.52±0.24 1.40±0.20 1.50±0.13 1.35±0.10 1.54±0.24 1.42±0.20 1.47±0.12 1.33±0.08 1.49±0.11 1.34±0.08 1.53±0.25 1.42±0.21 1.49±0.12 1.38±0.09 1.66±0.28 1.45±0.25 1.39 1.32 5 19 10 14 / / / / / / / 4.21±2.34 2.00±1.58 4.78±2.17 4.60±1.89 3.93±2.64 1.56±0.06 1.58±0.11 1.55±0.04 1.58±0.05 1.54±0.06 а) p = 0.00 vs контроле, б) p = 0.00 vs. пре 131-I , в) p = 0.027 vs. контроле, г) p = 0.00 vs. пре 131-I 49 а) б) в) г) Слика 4.6. Репрезентативни снимци ћелија добијених применом CBMN есеја: а) моно- и биједарне ћелије без микронуклеуса, б) биједарна ћелија са једним микронуклеусом, в) биједарна ћелија са једним микронуклеусом и једарним пупољком, г) биједарна ћелија са два микронуклеуса 50 4.4.2. Однос микронуклеуса, апликоване дозе 131-I и импулса детектованих гама камером Имајући у виду да је пацијентима са DTC апликовано 3.7 или 5.5 GBq радиоактивног 131-I, испитиван је утицај дозе 131-I на МN фреквенцу. Пацијенти са DTC којима је апликовано 5.5 GBq 131-I, имали су у просеку нешто више вредности и претерапијске и радиоактивним 131-I индуковане МN фреквенце у односу на пацијенте којима је апликовано 3.7 GBq 131-I (пре терапије 21.54±8.11 vs. 18.07±5.57 и након терапије 29.73±11.14 vs. 25.31±8.46), али те разлике нису биле статистички значајне (Independent samples T test, pпре=0.229; pпосле=0282). Слично МN фреквенци, није било значајнијих разлика у вредностима CBPI између групе пацијената са DTC којима је апликовано 3.7 GBq и 5.5 GBq 131-I (Wilcoxon test, p=0.649), чиме је искључен статистички значајан утицај апликоване дозе на вредности пролиферационог индекса (Binary logistic regression, p=0.146). Анализом односа броја детектованих импулса добијених са “whole body” сцинтиграма и фреквенце микронуклеуса индуковане 131-I утврђено је постојање позитивне корелације између просечне радиоактивности детектоване у пределу тиреоидне ложе и броја микронуклеуса након терапије, и то у групи пацијената са DTC који су примили дозу од 3.7 GBq 131-I (bivariate correlation test, p=0.026, Spearman r=0.612). У истој групи пацијената утврђено је да просечна абдоминална радиоактивност позитивно корелира са концентрацијом TSH (bivariate correlation test, p=0.011, Spearman r=0.972). За разлику од просечног броја детектованих импулса у регионима од интереса, просечна вредност укупног броја импулса детектованих 72h након апликације 131-I није показала статистички значајан ефекат нити на 131-I индуковану МN фреквенцу (bivariate correlation test, p=0.345, 51 Spearman r=0.202) нити на CBPI вредности у лимфоцитима периферне крви (bivariate correlation test, p=0.979, Spearman r =- 0.06). 4.5. Апоптоза и некроза лимфоцита периферне крви пацијената са DTC 4.5.1. Рана, касна апоптоза и некроза Резултати који се односе на апоптозу лимфоцита периферне крви приказани су као проценат ћелија у раној фази апоптозе, касној фази апоптозе и укупан број апоптотичних ћелија. Пре апликације 131-I код пацијената са DTC значајно је већи проценат лимфоцита у стадијуму ране апоптозе у односу на контролну групу здравих испитаника (9.88±4.99 % vs. 6.64±2.07 %, p=0.003), што није случај са процентом ћелија детектованих у касној фази апоптозе и некрозе. Иако је проценат лимфоцита у стадијуму касне апоптозе у групи пацијената са DTC пре апликације 131-I био већи него у контролној групи здравих испитаника (0.42±0.91 % vs. 0.30±0.24 %), као и проценат лимфоцита у некрози (0.11±0.32 % vs. 0.025±0.04 %), те разлике нису биле статистички значајне (табела 4.9.). Табела 4.9. Просечна процентуална заступљеност лимфоцита у апоптози/некрози у групи пацијената са DTC пре терапије 131-I и у контролној групи здравих испитаника Пацијенти Контроле Статистичка значајност рана апоптоза 9.88 ± 4.99 6.64 ± 2.07 p = 0.003 касна апоптоза 0.42 ± 0.91 0.30 ± 0.24 p = 0.319 укупна апоптоза 10.30 ± 5.38 6.94 ± 2.15 p = 0.004 некроза 0.11 ± 0.32 0.025 ± 0.04 p = 0.584 52 Након апликације радиоактивног 131-I код пацијената са DTC регистровано је повећање процента лимфоцита који су били у стадијуму ране и касне апоптозе. Седам дана након апликације 131-I у раној фази апоптозе било је 13.53±6.57 % лимфоцита, а у касној апоптози 0.46±0.55 % лимфоцита, док је у исто време у периферној крви било просечно 0.09±0.24 % некротичних лимфоцита. Очигледно је да 131-I узрокује значајно повећање процента лимфоцита у раној апоптози (Wilcoxon test, p=0.008), док је проценат лимфоцита у касној апоптози (Wilcoxon test, p=0.276) и некрози 7 дана након апликације 131-I (Wilcoxon test, p=0.801) сличан претерапијским вредностима (табела 4.10.) Табела 4.10. Просечна процентуална заступљеност лимфоцита у апоптози/некрози у групи пацијената са DTC пре и 7 дана након терапије 131-I Анализом процентуалне заступљености лимфоцита у раној и касној апоптози у односу на стадијум тумора и присуство метастаза, није показана зависност процента апоптотичних ћелија од проширености тумора (One Way ANOVA test, пре 131-I терапије pрана=0.978, pкасна=0.683, и после 131-I терапије pрана=0.743, pкасна=0.459) и присуства метастаза (Binar logistic regression, пре 131-I терапије pрана=0.648, pкасна= 0.337, и после 131-I терапије pрана=0.743, pкасна=0.459). На слици 4.7. приказана је процентуална заступљеност лимфоцита периферне крви у апоптози и некрози код два контролна испитаника и два пацијента са DTC, пре и 7 дана након 131-I терапије. Пацијенти пре 131-I Пацијенти после 131-I Статистичка значајност рана апоптоза 9.88 ± 4.99 13.53 ± 6.57 p = 0.008 касна апоптоза 0.42 ± 0.91 0.46 ± 0.55 p = 0.276 укупна апоптоза 10.30 ± 5.38 13.99 ± 6.61 p = 0.008 некроза 0.11 ± 0.32 0.09 ± 0.24 p = 0.801 53 a) Контрола 1. б) Контрола 2. Пацијент 1. в) Пре терапије г) После терапије Пацијент 2. д) Пре терапије ђ) После терапије Слика 4.7. Хистограми фреквенције са процентуалном заступљеношћу лимфоцита периферне крви у раној и касној фази апоптозе и некрози код два контролна испитаника (a,б) и два пацијента са DTC, пре (в,г) и 7 дана након 131-I терапије (д,ђ) добијени применом анексин-7-амино-актиномицин D есеја. 54 4.5.2. Однос апоптозе и микронуклеусне фреквенце Анализом односа између микронуклеусне фреквенце и процента апоптотичних лимфоцита показали смо да постоји позитивна корелација између МN фреквенце и процента лимфоцита у раној апоптози пре терапије 131-I (bivariate correlation test, Spearman r=0.540, p=0.021) као и између МN фреквенце и укупног процента апоптотичних лимфоцита (рана+касна апоптоза) пре терапије 131-I (bivariate correlation test, Spearman r=0.549, p=0.018). Осим тога, утврдили смо статистички значајну корелацију између 131-I индуковане разлике у фреквенци микронуклеуса (број MN после терапије умањен за број МN пре терапије) и 131-I индуковане разлике у проценту ћелија у раној апоптози (рана апоптоза после терапије умањена за вредност ране апоптозе пре терапије) (bivariate correlation test, Spearman r=0.585, p=0.014), и разлике у укупном проценту апоптотичних ћелија (после минус пре терапије 131-I) (bivariate correlation test, Spearman r=0.579, p=0.015). 4.6. Ћелије периферне крви пацијената са DTC У табели 4.11. приказан је просечан број ћелија периферне крви у групи пацијената са DTC пре 131-I терапије и у контролној групи здравих испитаника. Према нашим резултатима, не постоји статистички значајна разлика у броју еритроцита (Independent samples T test, p=0.859), тромбоцита (Independent samples T test, p=0.532), леукоцита (Independent samples T test, p=0.094) и мононуклеарних ћелија (Independent samples T test, p=0.882) између пацијената са DTC пре терапије и контролне групе здравих испитаника. 55 Табела 4.11. Просечан број ћелија периферне крви у групи пацијената са DTC пре терапије 131I и у контролној групи здравих испитаника Пацијенти Контроле Статистичка значајност еритроцити (x1012/l) 4.67 ± 0.50 4.62 ± 0.61 p = 0.859 тромбоцити (x109/l) 233.78 ± 59.02 250.25 ± 45.15 p = 0.532 леукоцити (x109/l) 7.03 ± 1.23 7.66 ± 1.21 p = 0.094 мононуклеари (x109/l) 2.23 ± 0.63 2.13 ± 0.43 p = 0.882 У односу на број еритроцита пре терапије, који је у просеку износио 4.67±0.50 x 1012 (интервал 3.97-5.52 x 1012), након 131-I терапије регистровано је статистички значајно смањење просечног броја еритроцита (4.37±0.36 x 1012, интервал 3.80-4.90 x 1012, Paired Samples T test, p=0.012). Просечан број тромбоцита пре терапије био је 233.78±59.02 x 109 (интервал 118-303 x 109), а седам дана после терапије 213.67±56.26 x 109 (интервал 82-275 x 109) (Paired Samples T test, p=0.042). Слично еритроцитима и тромбоцитима, показана је статистички значајна разлика у просечном броју леукоцита пре и након 131-I терапије (7.03±1.23 vs. 6.33±1.29, Paired Samples T test, p<0.001), као и у просечном броју мононуклеарних ћелија седам дана после терапије 131-I у односу на претерапијске вредности (22.27±6.26 vs. 17.45±5.08, Wilcoxon test, p< 0.001) (Табела 4.12.). 56 Табела 4.12. Просечан број ћелија периферне крви у групи пацијената са DTC пре и 7 дана после терапије 131-I Пацијенти пре 131-I Пацијенти после 131-I Статистичка значајност еритроцити (x1012/l) 4.67 ± 0.50 4.37 ± 0.36 p = 0.012 тромбоцити (x109/l) 233.78 ± 59.02 213 ± 56.26 p = 0.042 леукоцити (x109/l) 7.03 ± 1.23 6.33 ± 1.29 p < 0.001 мононуклеари (x109/l) 2.23 ± 0.63 1.74 ± 0.51 p < 0.001 Слика 4.8. Ћелије периферне крви 7 дана после 131-I терапије (%) у односу на вредности пре терапије (100%) код осам репрезентативних пацијената са DTC Табела 4.13. даје приказ просечне експресије CD3, CD19 и CD56 маркера на лимфоцитима периферне крви у групи пацијената са DTC пре терапије и у контролној групи здравих испитаника. Статистичка анализа показала је да пацијенти са DTC пре апликације 131-I имају мању експресију CD3 маркера у односу на контролне испитанике 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 пацијенти еритроцити леукоцити мононуклеари % ћ ел и ја п р е т ер а п и је 57 (72.49±7.26% vs. 77.21±6.80%) (Mann Whitney test, p=0.036). Насупрот томе, нису утврђене статистички значајне разлике у експресији CD19 (5.82±3.21% vs. 6.04±3.22%) (Independent samples T test, p=0.808) и CD56 мембранских маркера (16.79 ±6.74% vs. 13.57±4.67%, Mann Whitney test, p=0.054) између две посматране субпопулације. Табела 4.13. Експресија CD3, CD19 и CD56 маркера на лимфоцитима периферне крви у групи пацијената са DTC пре терапије 131-I и контролној групи здравих испитаника a статистички значајна разлика Терапија 131-I изазива значајно смањење процентуалне заступљености CD19+ В лимфоцита код пацијената са DTC седам дана након апликације131-I (3.93±2.60% после терапије 131-I према 5.82±3.21% пре терапије 131-I ) (Wilcoxon test, p=0.008), док је процентуална заступљеност CD3+ (72.49±7.26 % vs. 73.41±8.43%, Wilcoxon test, p=0.265) и CD56+ лимфоцита (16.79±6.74% vs. 17.26±7.12%, Wilcoxon test, p=0.710) остала непромењена. Није показан утицај дозе 131-I на процентуалну заступљеност CD3+, CD19+, и CD56+ лимфоцита код пацијената са DTC након 131-I терапије (Binar logistic regression; pcd3=0.216, pcd19=0.973, pcd56=0.305), али је детектована разлика у броју CD3+ (p=0.024) и CD56+ (p=0.033) лимфоцита пре терапије код пацијената са и без метастаза (Табела 4.14.) Пацијенти (пре 131-I терапије) Контроле Анализа n mean % ± SD n mean % ± SD 24 24 CD3 72.49 ± 7.26a 77.21 ± 6.80a CD19 5.82 ± 3.21 6.04 ± 3.22 CD56 16.79 ± 6.74 13.57 ± 4.67 58 Табела 4.14. Сумарни приказ просечног броја CD3+, CD19+ и CD56+ лимфоцита у групи пацијената са DTC пре и 7 дана после 131-I терапије. a статистички значајна разлика у CD3 експресији пре терапије у присуству метастаза (p = 0.024), б статистички значајна разлика у CD19 експресији пре и после терапије (p = 0.008). в статистички значајна разлика у CD56 експресији пре терапије у присуству метастаза (p = 0.033). С обзиром на то да је након терапије радиоактивним 131-I показано статистички значајно повећање процента ћелија у раној и укупној апоптози, анализиран је утицај апоптозе на заступљеност појединих лимфоцитних субпопулација периферне крви. Анализом односа 131-I-индуковане апоптозе (укупна апоптоза после 131-I терапије умањена за вредност укупне апоптозе пре терапије) и 131-I-индукованог смањења CD19 експресије (CD19 експресија пре 131-I терапије умањена за вредност CD19 експресије после терапије), показано је да постоји позитивна корелација између посматраних Пацијенти Анализа n пре терапије после терапије mean ± SD mean ± SD CD3 укупно Метастазе одсутне присутне Терапијска доза (GBq) 3.7 5.5 CD19 укупно Метастазе одсутне присутне Терапијска доза (GBq) 3.7 5.5 CD56 укупно Метастазе одсутне присутне Терапијска доза (GBq) 3.7 5.5 24 13 11 13 11 24 13 11 13 11 24 13 11 13 11 72.49 ± 7.26 73.41 ± 8.43 75.33 ± 5.28 a 74.48 ± 8.68 66.82 ± 7.65 a 71.26 ± 7.90 74.6 ± 5.45 72.54 ± 7.71 69.54± 8.68 74.62 ± 9.63 5.82 ± 3.21б 3.93 ± 2.60 б 5.76 ± 3.15 4.03 ± 2.81 5.92 ± 3.54 3.70 ± 2.27 6.37 ± 3.6 4.51 ± 2.89 5.03 ± 2.5 3.11 ± 1.97 16.79 ± 6.74 17.26 ± 7.12 14.13 ± 4.36 в 16.13 ± 6.85 22.11 ± 7.74 в 19.5 ± 7.58 14.21 ± 4.68 16.56 ± 7.24 20.39 ± 7.71 18.24 ± 7.22 59 варијабли (Bivariate correlation test, Spearman r=0.563, p=0.013), што указује на то да се број CD19+ В лимфоцита смањује процесом апоптозе. 4.7. Цитокински профил код пацијената са DTC У спроведеном истраживању испитивана је концентрација одабраних цитокина у серумима пацијенатa са DTC, као и концентрација цитокина у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви (whole blood assay) у групи пацијената са DTC и у контролној групи здравих испитаника. Концентрације цитокина у серумима пацијената са DTC мерене су пре, као и три и седам дана након апликације радиоактивног 131-I. Са изузетком IL-6 (код 6 пацијената), IL-2 (код једног пацијента) и IL-9 (код једног пацијента), све серумске вредности мерених цитокина биле су испод детекционог лимита. При том су вредности IL-6 биле детектабилне код два пацијента пре терапије, док је код преосталих пацијената IL-6 измерен у серуму три дана после терапије (код 2 пацијента), односно три и седам дана након терапије (код 2 пацијента) или само седам дана након терапије (код једног пацијента). Концентрације IL-6 измерене у серумима пацијената са DTC приказане су у Табели 4.15. Немерљиве концентрације IL-6 код преосталих 18 пацијената нису приказане, као ни немерљиве концентрације IL-6 код свих контролних испитаника. 60 Табела 4.15. Концентрација IL-6 у серумима пацијената са DTC Концентрација IL-6 (pg/ml) Пацијент 0 дан 3 дан 7 дан Пацијент А Н.Д. 6.13 6.13 Пацијент Б 6.59 Н.Д. Н.Д. Пацијент В Н.Д. 7.78 Н.Д. Пацијент Г Н.Д. 7.01 Н.Д. Пацијент Д Н.Д. Н.Д. 7.46 Пацијент Е 6.26 5.94 6.94 *Н.Д. није детектована Концентрације одабраних цитокина у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви у групи пацијената са DTC пре терапије радиоактивним 131-I и у контролној групи здравих испитаника приказане су у Табели 4.16. Иако су за већину цитокина у супернатантима пацијената са DTC детектоване више вредности него у супернатантима контролних испитаника, статистички значајне разлике показане су за само два цитокина, и то за: IL-13 (5463.5±3457 vs. 1453.5±1579.4 pg/ml, p=0.010) и IL-5 (7721.6±6163.2 vs. 2808.8±2905.3 pg/ml, p=0.046). Табела 4.16. Концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија крви у групи пацијената са DTC пре 131-I терапије и у контролној групи здравих испитаника DTC пацијенти Контроле Цитокин Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) p IL-12p70 0.0 – 1928 605.2 ± 690.1 0.0 – 1242.3 247.6 ± 477.8 p = 0.161 IFN-γ 15191.6 – 135783.6 88666.2 ± 45320.8 1132.0 – 167439.3 74507.7 ± 62202.6 p = 0.611 IL-17A 3324.5 – 61433 26350.9 ± 17905.3 2892.3 – 43198.6 15505.2 ± 12925.4 p = 0.186 IL-2 1524.7 – 37333.2 14630.5 ± 12889.4 0.0 – 2343.91 6780.7 ± 9302.7 p = 0.083 IL-10 486.8 – 22108.8 4850.8 ± 7183.3 0.0 – 5902.3 2468.0 ± 2204.4 p = 0.574 IL-9 0.0 – 847.2 417.5 ± 272.2 0.0 – 491.8 164.3 ± 231.2 p = 0.083 IL-22 0.0 – 2102.8 1352.6 ± 615.5 0.0 – 1812.8 580.1 ± 811.6 p = 0.105 IL-6 3728.8 – 45931.8 17327.2 ± 15973 452.6 – 48358.7 16515.5 ± 17496.3 p = 0.959 IL-13 1077.4 – 11412.3 5463.5 ± 3457 0.0 – 4510.7 1453.5 ± 1579.4 p = 0.010 IL-4 614.2 – 3289.9 1655.8 ± 971.5 0.0 – 2856.7 914.2 ± 996.7 p = 0.154 IL-5 1756.5 – 19537.8 7721.6 ± 6163.2 0.0 – 8372.9 2808.8 ± 2905.3 p = 0.046 IL-1 1815.1 – 5443.9 3292.6 ± 1342 0.0 – 20586.1 6285.3 ± 6996.0 p = 0.574 TNF-α 0.0 – 33097.3 5156.2 ± 11305.4 0.0 – 2450.5 1015.9 ± 882.0 p = 0.442 61 С обзиром на то да лучење цитокина у фитохемаглутинином стимулисаној култури пуне крви зависи од броја ћелија, измерене концентрације цитокина су прерачунате на 1000 леукоцита, а добијене вредности приказане су у Табели 4.17. Статистички значајне разлике показане су за три цитокина. Поред IL-13 (1602.4±953.8 vs. 460±474.8 pg/ml, p=0.012) и IL-5 (2232.1±1608.5 vs. 869±842.4 pg/ml, p=0.046), статистички значајна разлика између пацијената са DTC и контролних испитаника показана је и за IL-9 (125.8±87.3 vs. 42.4±60.7 pg/ml, p=0.038). Табела 4.17. Концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (на 1000 леукоцита) у групи пацијената са DTC пре 131-I терапије и у контролној групи здравих испитаника DTC пацијенти Контроле Цитокин Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) p IL-12p70 0.0 – 662 189.6 ± 233.9 0.0 – 455.9 83.4 ± 167.7 p = 0.161 IFN-γ 4468 – 48493 27342.8 ± 15691.2 430.5 – 58035 22939.7 ± 19181.7 p = 0.623 IL-17A 976 – 14983 7742.6 ± 4561.4 1101– 14970 4890.9 ± 4364.9 p = 0.227 IL-2 447 – 10893 4321.8 ± 3767.8 0.00 – 8124 2140.6 ± 3013.6 p = 0.105 IL-10 144 – 5390 1318.5 ± 1744.0 0.0 – 1415 702.1 ± 512.9 p = 0.721 IL-9 0.0 – 293 125.8 ± 87.3 0.0 – 142 42.4 ± 60.7 p = 0.038 IL-22 0.0 – 724 416.6 ± 222.3 0.0 – 828 214 ± 312.3 p = 0.195 IL-6 1185 – 10753 5191.5 ± 4691.5 172 – 16759 5117.9 ± 5446.4 p = 0.959 IL-13 317 – 2730 1602.4 ± 953.8 0.0 – 1300 460 ± 474.8 p = 0.012 IL-4 181 – 1134 494.4 ± 311.5 0.0 – 823 286.2 ± 292.5 p = 0.190 IL-5 518 – 4763 2232.1 ± 1608.5 0.0 – 2412 869 ± 842.4 p = 0.046 IL-1 603 – 1861 992.4 ± 438.6 0.0 – 5993 1995.6 ± 2102.9 p = 0.505 TNF-α 0.0 – 8071 1329.9 ± 2731.6 0.0 – 849 336 ± 290.5 p = 0.505 Концентрације свих мерених цитокина код пацијената са DTC биле су мање у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви после терапије 131-I у односу на концентрације пре терапије. Међутим, статистички значајне разлике између концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви пре и после 131-I терапије показане су за: IL-17A (Wilcoxon test, p=0.012), IL-2 62 (Paired samples T test, p=0.042), IL-10 (Wilcoxon test, p=0.036), IL-6 (Wilcoxon test, p= 0.012), IL-13 (Wilcoxon test, p=0.017) и IL-5 (Paired samples T test, p=0.012) (Табела 4.18). Табела 4.18. Концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви у групи пацијената са DTC пре и 7 дана после терапије 131-I DTC пацијенти пре терапије DTC пацијенти после терапије Цитокин Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) p IL-12p70 0.0 – 1928 605.2 ± 690.1 0.0 – 683.1 193.0 ± 290.3 p = 0.233 IFN-γ 15191.6 – 135783.6 88666.2 ± 45320.8 12718.8 – 130057.6 83000.7 ± 40639.2 p = 0.221 IL-17A 3324.5 – 61433 26350.9 ± 17905.3 3018.8 – 41572.7 14119.0 ± 13289.5 p = 0.012 IL-2 1524.7 – 37333.2 14630.5 ± 12889.4 1370.6 – 8482.2 4663.6 ± 2768.7 p = 0.042 IL-10 486.8 – 22108.8 4850.8 ± 7183.3 788.4 – 9032.3 2332.4 ± 2777.7 p = 0.036 IL-9 0.0 – 847.2 417.5 ± 272.2 0.0 – 789.2 260.1 ± 274.1 p = 0.106 IL-22 0.0 – 2102.8 1352.6 ± 615.5 0.0 – 1812.8 605.8 ± 841.1 p = 0.161 IL-6 3728.8 – 45931.8 17327.2 ± 15973 2526.4 – 29693.1 10023.8 ± 9368 p = 0.012 IL-13 1077.4 – 11412.3 5463.5 ± 3457 1084.9 – 5829.3 2131.5 ± 1593.6 p = 0.017 IL-4 614.2 – 3289.9 1655.8 ± 971.5 0.0 – 1351.8 587.0 ± 547.2 p = 0.059 IL-5 1756.5 – 19537.8 7721.6 ± 6163.2 0.0 – 9689.9 2900.5 ± 3509.4 p = 0.012 IL-1 1815.1 – 5443.9 3292.6 ± 1342 1523 – 6952.7 2915.6 ± 1942.7 p = 0.237 TNF-α 0.0 – 33097.3 5156.2 ± 11305.4 640.3 – 2579.8 1048.2 ± 640.8 p = 0.093 С обзиром на то да смо раније показали се број леукоцита периферне крви смањује после терапије 131-I (Табела 4.12), капацитет леукоцита да продукују цитокине смо процењивали тако што смо концентрације цитокина у супернатантима митогеном стимулисане пуне крви поделили са бројем леукоцита за сваког пацијента и тестирали значајност разлика пре и после терапије 131-I. Када су измерене концентрације цитокина прерачунате на број леукоцита, добијене су вредности приказане у Табели 4.19. 63 Табела 4.19. Концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (на 1000 леукоцита) у групи пацијената са DTC пре и 7 дана после терапије 131-I DTC пацијенти пре терапије DTC пацијенти после терапије Цитокин Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) Опсег (мин. – макс.) (pg/ml) X±SD (pg/ml) p IL-12p70 0.0 – 662 189.6 ± 233.9 0.0 – 234 63.8 ± 92.0 p = 0.234 IFN-γ 4468 – 48493 27342.8 ± 15691.2 4386 – 54188 30145 ± 16658 p = 0.734 IL-17A 976 – 14983 7742.6 ± 4561.4 1041 – 25465 7261.9 ± 8258.9 p = 0.574 IL-2 447 – 10893 4321.8 ± 3767.8 472 – 2423 1419.0 ± 655.8 p = 0.067 IL-10 144 – 5390 1318.5 ± 1744.0 304 – 2580 770.4 ± 777.7 p = 0.574 IL-9 0.0 – 293 125.8 ± 87.3 0.0 – 226 89.1 ± 87.9 p = 0.417 IL-22 0.0 – 724 416.6 ± 222.3 0.0 – 629 211.2 ± 297.4 p = 0.234 IL-6 1185 – 10753 5191.5 ± 4691.5 973 – 8483 3472.8 ± 2823.1 p = 0.505 IL-13 317 – 2730 1602.4 ± 953.8 450 – 1666 709.4 ± 417.1 p = 0.037 IL-4 181 – 1134 494.4 ± 311.5 0.0 – 393 192.8 ± 169.7 p = 0.031 IL-5 518 – 4763 2232.1 ± 1608.5 0.00 – 2769 825.5 ± 1134.5 p = 0.038 IL-1 603 – 1861 992.4 ± 438.6 619 – 2104 1020.0 ± 638.6 p = 0.878 TNF-α 0.0 – 8071 1329.9 ± 2731.6 194 – 734 359.9 ± 168.8 p = 0.462 Иако су укупне концентрације свих мерених цитокина у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви после терапије 131-I биле мање у односу на концентрације пре терапије (Табела 4.18), са статистички значајним разликама за 6 мерених цитокина (IL-17A, IL-2, IL-10, IL-6, IL-13 и IL-5), када се анализирају концентрације цитокина прерачунате на број стимулисаних леукоцита (Табела 4.19), евидентно је да је смањено лучење неких цитокина (IL-17A, IL-2, IL-10, IL-6) детектовано после терапије 131-I последица смањења броја леукоцита, а смањено лучење других цитокина (IL-13, IL-5 и IL-4) последица смањеног капацитета лучења од стране леукоцита периферне крви при неспецифичној стимулацији фитохемаглутинином in vitro. У Табели 4.20 приказан је однос контрарегулаторних цитокина (Th1/Th2) у групи пацијената са DTC пре 131-I терапије и у контролној групи здравих испитаника. За процену баланса излучених Th1 и Th2 цитокина коришћене су концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (на 1000 леукоцита). 64 Анализом односа IL-12p70/IL-13, IFN-γ/IL-4, IFN-γ/IL-5, IFN-γ/IL-10, TNF-α/IL-4, TNF-α/IL-5 и TNF-α/IL-10 показано је да нема статистички значајне разлике између односа тестираних Th1 и Th2 цитокина у групи пацијената са DTC у односу контролну групу здравих испитаника. Табела 4.20. Однос контрарегулаторних цитокина у групи пацијената са DTC пре терапије и контролној групи здравих испитаника пре и 7 дана након 131-I терапије Th1/Th2 DTC пацијенти (пре терапије) Контроле Статистичка значајност IL-12p70/IL-13 0.16 ± 0.24 0.10 ± 0.19 p = 0.234 IFN-γ/IL-4 66.59 ± 60.41 46.19 ± 46.35 p = 0.645 IFN-γ/IL-5 17.85 ± 13.96 24.03 ± 21.86 p = 0.512 IFN-γ/IL-10 43.38 ± 31.27 29.42 ± 22.82 p = 0.325 TNF-α/IL-4 3.98 ± 8.66 0.67 ± 0.63 p = 0.279 TNF-α/IL-5 0.45 ± 0.52 0.34 ± 0.27 p = 0.959 TNF-α/IL-10 0.77 ± 0.54 0.48 ± 0.50 p = 0.284 У Табели 4.21 приказан је однос контрарегулаторних цитокина (Th1/Th2) у групи пацијената са DTC пре и после терапије 131-I. За процену баланса излучених Th1 и Th2 цитокина коришћене су концентрација цитокина у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (на 1000 леукоцита). Анализом односа IL-12p70/IL-13, IFN-γ/IL-4, IFN-γ/IL-5, IFN-γ/IL-10, TNF-α/IL-4, TNF-α/IL-5 и TNF-α/IL-10 показано је да нема статистички значајне разлике између односа тестираних Th1 и Th2 цитокина код пацијената са DTC пре и после терапије 131-I. 65 Табела 4.21. Однос контрарегулаторних цитокина у групи пацијената са DTC пре и 7 дана након 131-I терапије DTC пацијенти Th1/Th2 пре терапије после терапије Статистичка значајност IL-12p70 / IL-13 0.16 ± 0.24 0.09 ± 0.17 p = 0.382 IFN-γ / IL-4 66.59 ± 60.41 47.88 ± 53.64 p = 0.574 IFN-γ / IL-5 17.85 ± 13.96 18.20 ± 21.31 p = 0.645 IFN-γ / IL-10 43.38 ± 31.27 59.46 ± 39.15 p = 0.379 TNF-α / IL-4 3.98 ± 8.66 0.84 ± 0.79 p =0.442 TNF-α / IL-5 0.45 ± 0.52 0.56 ± 1.01 p = 0.574 TNF-α / IL-10 0.77 ± 0.54 0.64 ± 0.29 p = 0.564 66 5. ДИСКУСИЈА 5.1. Оксидативни стрес код пацијената са DTC Оксидативни стрес проузрокован неравнотежом између стварања и уклањања слободних радикала може проузроковати повреду ћелије. Слободни радикали се у ћелијама стварају током физиолошких процеса (131,132), или настају дејством спољашњих фактора, као што је јонизујуће зрачење (133). Примена великих доза радиоактивног 131-I води настанку оксидативног стреса и оштећењу ћелија директно, нарушавањем интегритета ДНК, или индиректно, формирањем реактивних врста кисеоника (енгл. reactive oxygen species, ROS) (134). Настали метаболити кисеоника реагују са полинезасићеним масним киселинама ћелијске мембране изазивајући липидну пероксидацију и стварање цитотоксичних продуката, попут малондиалдехида (MDA) (135), чија продукција може бити редукована деловањем мокраћне киселине. Мокраћна киселина обезбеђује већи део антиоксидативног капацитета плазме и, за разлику од других антиоксиданаса, не подлеже даљој оксидацији (136). У нашем раду испитивали смо интензитет оксидативног стреса и антиоксидативни статус код пацијената са DTC три и седам дана после терапије великим дозама 131-I (3.7 и 5.5 GBq). Процена интензитета оксидативног стреса вршена је на основу мерења концентрације МDА, док је антиоксидативна заштита процењивана на основу серумске концентрације мокраћне киселине и вредности тоталног антиоксидативног статуса (ТAS). Тиме је омогућено добијање потпунијег увида у оксидо-редукционо стање пацијената са DTC. Наиме, тотални антиоксидативни капацитет серума не представља прост збир активности различитих антиоксиданаса, већ је реч о динамичном еквилибријуму који се остварује садејством појединачних компоненти антиоксидативне заштите (29,30). 67 Досадашња истраживања показала су да је код особа са разним врстама карцинома (36,137), укључујући и диферентоване карциноме штитасте жлезде (138-140), интензитет оксидативног стреса повећан и пре зрачне терапије. У нашем раду показали смо да је концентрација МDА статистички значајно већа у групи пацијената са DTC пре апликације 131-I у односу на контролну групу здравих испитаника, што је у складу са резултатима раније спроведених студија (141,142). Концентрација мокраћне киселине такође је била статистички значајно већа код пацијената са DTC пре 131-I терапије у односу на контролне испитанике, док је тотални антиоксидативни статус био сличан у обема посматраним групама. Интензитет оксидативног стреса код пацијената са DTC након терапије радиоактивним 131-I испитивали су бројни аутори (141,143,144). Њихови резултати су доста неуједначени, највероватније због анализе различитих, појединачних маркера оксидативног стреса и антиоксидативне заштите, или због разлике у времену које је протекло од апликације радиоактивног 131-I до мерења. У неким студијама је показано повећање оксидативног стреса код пацијената са DTC након апликације 131-I (144), док у другим студијама то није нађено (145). Наши резултати потврђују налазе Konukoğlu и сарадника (144), који су показали да се концентрација МDА значајно повећава после терапије радиоактивним 131-I, с том разликом што је у њиховом раду концентрација МDА мерена 2 дана после апликације 131-I, а у нашем раду 3 и 7 дана после апликације 131-I. Други аутори су детектовали транзиторно повећање концентрације МDА пет дана након апликације 131-I (146), односно мало иницијално повећање МDА месец дана после апликације 131-I, са статистички значајним смањењем 6 месеци после терапије (147). Иако смо у нашем раду желели да испитамо ране ефекте терапије 131-I, а највећи интензитет оксидативног стреса може се очекивати у првим сатима и данима након апликације131-I, 68 концентрацију МDА нисмо мерили пре него што је прошло 72h од апликације 131-I из техничких разлога (велике радиоактивности у телу пацијената, због које су они били изоловани). Поред тога, ми смо недвосмислено показали да се концентрација мокраћне киселине прогресивно смањује три, односно седам дана од aпликације 131-I. Претпостављамо да је ово смањење концентрације мокраћне киселине последица радијацијом индуковане продукције ROS и ангажовања мокраћне киселине као важног сегмента антиоксидативне заштите организма (139). При том, нису уочене значајније промене тоталног антиоксидативног статуса, што указује на то да у условима снажне јонизације коју проузрокује унутрашњи извор јонизујућег зрачења, укупни антиоксидативни статус остаје релативно стабилан. Како су сви пацијенти обухваћени нашом студијом били хипотиреоидни (TSH >30mIU/L), анализирали смо могући утицај хипотиреозе на интензитет липидне пероксидације. За разлику од Pereira и сарадника, који су показали да хипотиреоза смањује ниво липидне пероксидације код мишева (148), ми смо показали да је код пацијената са DTC присутна интензивнија продукција MDA, што је највероватније последица недовољне антиоксидативне заштите и измењеног метаболизма липида (149). У нашем раду нису нађене разлике у интензитету липидне пероксидације и испитиваним параметрима антиоксидативне заштите између пацијената којима је апликовано 3.7 и 5.5 GBq радиоактивног 131-I, те претпостављамо да је преклапање у броју импулса регистрованих са сцинтиграма целог тела пацијената којима су апликоване две различите дозе 131-I дало овакав резултат. Насупрот томе, показана је позитивна корелација између просечне тиреоидне радиоактивности и степена липидне пероксидације, што указује на то да је већа резидуална активност у области тиреоидне ложе праћена интензивнијом јонизацијом и оксидативним оштећењем липида. 69 5.2. Биохемијски параметри код пацијената са DTC Бољу акумулацију радиоактивног 131-I у тиреоидном ткиву и јодавидним метастазама омогућава висока концентрација TSH (16). У клиничкој пракси висок ниво TSH остварује се двојако: егзогеном применом TSH (18), или стимулацијом ендогене секреције TSH, са развојем пролазне хипотиреозе (19). С обзиром на то да тиреоидни хормони утичу на синтезу, оксидацију и мобилизацију липида (150), као и синтезу и разградњу протеина, хипотиреоза код пацијената са DTC може бити праћена бројним метаболичким променама (151). Метаболички ефекти краткотрајне хипотиреозе, са посебним освртом на метаболизам липида, приказани су у неколико раније објављених студија (152-155), међутим промене у концентрацији протеина и њихов однос према липидима у серуму болесника са DTC пре и после терапије 131-I до сада нису испитиване. Стога је један од циљева спроведеног истраживања био да се испита концентрација протеина и липида код пацијената са DTC пре, као и три и седам дана након 131- I терапије. У време апликације радиоактивног 131-I, сви пацијенти обухваћени нашим истраживањем били су хипотиреоидни са значајно већим концентрацијама холестерола и триглицерида у односу на контролну групу здравих испитаника. Добијени резултати сагласни су са резултатима раније публикованих студија у којима је испитивана повезаност тиреоидног статуса и концентрације липида (156,157). Попут Regalbuto и сарадника (158), и ми смо показали да пацијенти са DTC имају повећану концентрацију холестерола пре апликације 131-I, што не изненађује ако се има у виду утицај хормона штитасте жлезде на метаболизам липида. 70 Сматра се да је у хипотиреози основни механизам повећања концентрације холестерола смањење броја LDL рецептора на површини ћелија (159), док се смањена активност липопротеинске липазе може повезати са повећањем концентрације триглицерида (160). Три дана након апликације радиоактивног 131-I код пацијената са DTC детектовано је смањење серумске концентрације укупних протеина и албумина, уз смањење концентрације холестерола. Иако механизам којим настаје смањење концентрације протеина код наших пацијената није испитиван, можемо претпоставити да смањење концентрације протеина три дана након апликације 131-I настаје као последица оксидативног стреса, јер су извесни аутори показали да оксидација (161) и оксидативна оштећења протеина (162) могу бити одговорни за смањење концентрације протеина код пацијената оболелих од карцинома. Исти механизам би могао бити одговоран и за смањење концентрације холестерола три дана након апликације 131-I, мада се не може искључити ни могућност да радиоактивним јодом индукован оксидативни стрес изазива промене у структури молекула липида чинећи их немерљивим. За разлику од холестерола, код наших пацијената дошло је до статистички значајног повећања концентрације триглицерида три дана након апликације 131-I, што можда представља покушај да се компензује смањење концентрације протеина, у циљу очувања колоидно- осмотског притиска. Добро је познато да процес старења изазива низ метаболичких промена, које су праћене повећањем концентрације серумских липида (163). Смањење функције штитасте жлезде такође може допринети променама у метаболизму липида (164,165). Имајући то на уму, ми смо наше пацијенте са DTC поделили у две групе: прву групу чинили су пацијенти млађи од 50 година (≤ 50 година), а другу пацијенти старији од 50 година (>50 година). 71 Статистичка обрада података није показала значајне разлике у концентрацији серумских протеина, холестерола и триглицерида између две групе пацијената пре терапије 131-I. Међутим, код пацијената старијих од 50 година утврђена је индиректна веза између смањења концентрације протеина и повећања концентрације триглицерида три дана после терапије. Овај резултат подржава нашу претпоставку да повећање концентрације триглицерида настаје у одговору на смањење концентрације серумских протеина, у циљу одржавања колоидно-осмотског притиска. 5.3. Фреквенца микронуклеуса код пацијената са DTC Микронуклеуси представљају маркере генотоксичног оштећења проузрокованог дејством јонизујућег зрачења (57), а тест којим се одређује фреквенца микронуклеуса (engl. сytokinesis-blocked micronucleus assay, CBMN assay) је стандардни тест за детекцију нестабилности генома у молекуларним и цитогенетским студијама (166). Веза између фреквенце микронуклеуса и изложености дејству јонизујућег зрачења први пут је описана 1959. године од стране Evansа и сарадника (167). Међутим, иако је повећање броја микронуклеуса код пацијената са DTC добро документовано (168-170), однос између дозе апликованог 131-I, као и повезаност фреквенце микронуклеуса са другим индикаторима оштећења ћелије, недовољно су испитани. У оквиру наше студије анализирали смо утицај терапије радиоактивним 131-I на степен цитогенетских оштећења, МN фреквенцу и индекс пролиферације ћелија (CBPI), код пацијената са DTC. С обзиром на то да се 131-I специфично везује и задржава у резидуалном тиреоидном ткиву, а да део 131-I перзистира и у другим деловима тела, нарочито у гастроинтестиналном тракту данима након апликације, желели смо да испитамо да ли ретенција 131-I у одабраним регионима од интереса и организму као целини утиче на 72 МN фреквенцу. Иако је у лимфоцитима периферне крви пацијената са DTC лечених радиоактивним 131-I показан настанак хромозомских аберација (171-173), повећање MN фреквенце (168-170,174) и промена пролиферационог индекса (CBPI) (69,76,175) остало је неразјашњено зашто те промене нису зависне од дозе апликованог јода. Према нашем сазнању, ни у једној до сада објављеној студији није анализиран утицај 131-I који перзистира у телу пацијената са DTC на MN фреквенцу и CBPI. Сем тога, постоји несагласност до сада публикованих резултата (176,177), највероватније због разлика у дизајну спроведених студија и времену протеклом од апликације 131-I. Ballardin и сарадници (174) су утврдили да 7 до 15 дана од апликације радиоактивног 131-I код пацијената са DTC настаје повећање MN фреквенце, које се постепено смањује и враћа на претерапијске вредности 6 месеци после терапије, док су Livingston и сарадници (168) показали да се повећање MN фреквенце код пацијената са DTC одржава и до 8 месеци након терапије 131-I. Насупрот томе, Joseph (178) је проучавао дугорочне ефекте терапије радиоактивним 131-I, анализирајући МN фреквенцу до 3 године после апликације 131-I. Наша истраживање показало је да DTC пацијенти пре терапије радиоактивним 131-I имају већи степен генетских оштећења, тј. статистички значајно већу МN фреквенцу и статистички значајно мањи CBPI, у односу на контролну групу здравих испитаника. Овакав резултат у сагласности је са претходно публикованим подацима да је претерапијска МN фреквенца значајно већа код пацијената са тиреоидним карциномом (69) и код пацијената са другим малигним туморима (68,70) него код контролних, здравих испитаника. Претпоставља се да се већи проценат биједарних лимфоцита са микронуклеусима код пацијената оболелих од карцинома може повезати са геномском нестабилношћу и дефектима у ћелијском циклусу (71). 73 Као и други аутори (174,179) и ми смо показали да примена 131-I води статистички значајном повећању МN фреквенце. После апликације радиоактивног 131-I повећава се проценат биједарних лимфоцита периферне крви са једним или више микронуклеуса. У исто време, смањује се пролиферациони капацитет лимфоцита периферне крви. Овакви резултати одговарају закључцима до којих су дошли Ramirez (76) и Jianlin (180) проучавајући особе са карциномом штитасте жлезде и другим врстама тумора. Утицај ретенције 131-I у телу пацијената са DTC на МN фреквенцу није испитиван ни у једној до сада публикованој студији. У нашој студији ретенција 131-I процењивана је на основу броја импулса из „whole body“ сцинтиграма регистрованих три дана после апликације 131-I. Акумулација 131-I у пределу тиреоидне ложе наших пацијената са DTC указује на присуство значајне количине резидуалног јодавидног ткива, упркос претходно урађеној тоталној тиреоидектомији, при чему велике индивидуалне разлике у броју импулса детектованих у тиреоидном региону највероватније одражавају количину преосталог тиреоидног ткива и степен диференцијације туморских ћелија. Код неких пацијената уочена је велика радиоактивност и у области гастроинтестиналног тракта, углавном код оних са већим концентрацијама TSH, те сматрамо да је задржавање 131-I у региону абдомена последица споре и одложене елиминације интестиналног садржаја у клинички испољеној хипотиреози (181). Код пацијената са DTC којима је апликована иста доза 131-I детектоване су велике разлике у укупном броју импулса на сцинтиграму целог тела. Великим индивидуалним варијацијама укупне количине радиоактивног јода који се задржава у телу пацијената лечених истом дозом 131-I, уз знатно преклапање броја импулса који је регистрован на сцинтиграмима целог тела пацијената лечених са 3.7 GBq и 5.5 GBq 131-I, може се објаснити одсуство утицаја апликоване дозе на МN фреквенцу показано у нашој, али и у студијама других аутора (176, 182). 74 Статистичком обрадом наших резултата показано је да у групи пацијената који су лечени дозом од 3.7 GBq 131-I, постоји корелација МN фреквенце са ретенцијом 131-I у тиреоидном ткиву, али не и корелација МN фреквенце са укупном ретенцијом 131-I у телу пацијената. Очигледно је да укупна количина радиоактивног 131-I који се задржава у телу пацијената има мањи утицај на фреквенцу микронуклеуса од количине радиоактивног 131-I који је акумулиран у тиреоидној ложи. Овакав резултат могао би се објаснити већим интензитетом зрачења коме су изложени лимфоцити који пролазе кроз тиреоидно ткиво. Како бројни егзогени и ендогени фактори могу допринти оштећењу генома и хромозомској нестабилности, проучавали смо утицај старости, пола, пушења и хистолошког типа тумора на вредност МN фреквенце пре и након терапије 131-I. Ефекти старења и пола на МN фреквенцу у лимфоцитима периферне крви предмет су истраживања још од 1980-их година (183,184). Општи је став да се фреквенца МN у лимфоцитима периферне крви повећава са старењем, и то код особа оба пола, вероватно као последица кумулативног ефекта стечених мутација у генима одговорним за репарацију ДНК и хромозомских аберација изазваних излагањем генотоксинима. Повећање учесталости МN код жена може се објаснити и поседовањем две копије X хромозома, те већом вероватноћом да један од њих буде изгубљен. Када је у питању ефекат пушења, већина популационих студија указала је на то да код пушача током живота настаје повећање МN фреквенце, али без статистички значајне разлике у односу на непушаче (185). Осим тога, пушење може индуковати оштећења лимфоцита које би могла бити одговорна за губитак способности деобе током култивисања у CBMN есеју, са изостанком формирања биједарних ћелија (186). Наше 75 истраживање је показало да старост, пол, пушење и хистолошки тип тумора не утичу на фреквенцу микронуклеуса пре, као ни после терапије радиоактивним 131-I. 5.4. Апоптоза лимфоцита код пацијената са DTC Апоптотски облик ћелијске смрти је активан процес који игра важну улогу у регулисању и одржавању броја ћелија у физиолошким условима, али може имати важну улогу и у настанку поремећаја хомеостазе у патолошким стањима. У физиолошким условима, апоптоза је усклађена са пролиферацијом ћелија, и тако доприноси ткивној хомеостази, а патолошко стање може настати услед повећања или смањења броја апоптотичних ћелија (187). Током апоптозе ћелија пролази кроз низ морфолошких промена. Најраније промене огледају се у асиметрији интактне ћелијске мембране, са експресијом фосфатидилсерина на њеној спољашњој страни. Касније долази до иреверзибилне кондензације цитоплазме и органела, кондензације хроматина, фрагментације једра и деградације ДНК, са губитком интегритета ћелијске мембране (188). У нашем раду испитиван је проценат лимфоцита периферне крви у раној фази апоптозе (коју карактерише експресија фосфатидилсерина на спољашњој страни ћелијске мембране уз очуван интегритет) и касној фази апоптозе (коју карактерише губитак интегритета ћелијске мембране) лимфоцита. Показано је да се апоптотични лимфоцити периферне крви код пацијената са DTC углавном налазе у стадијуму ране апоптозе, што доприноси повећању укупног броја апоптотичних лимфоцита, при чему је проценат ћелија у раној апоптози и укупан проценат апоптотичних ћелија значајно већи него у контролној групи здравих испитаника. Велика разлика у проценту лимфоцита у раној и касној фази апоптозе која је показана у нашем истраживању могла би да се објасни разликама у трајању наведених стадијума апоптозе. 76 Наиме, сматра се да програмирана ћелијска смрт може трајати од неколико сати до неколико дана зависно од типа ћелије (79,189) и присуства иницијатора апоптозе (190), док касна апоптоза траје око један сат (191). Наши резултати сагласни су претходно публикованим радовима (87,91,92), али у поређењу са спонтаном апоптозом која је детектована у лимфоцитима периферне крви код пацијената са другим врстама тумора (88-90), код пацијената са DTC добијене су више вредности ex vivo апоптозе лимфоцита периферне крви пре терапије. Иако је ефекат радиотерапије на апоптозу лимфоцита код особа са различитим врстама тумора проучаван и раније (97,98), утицај радиоактивног 131-I на апоптозу лимфоцита периферне крви код пацијената са DTC до сада није испитиван. Оксидативни стрес, настао као последица излагања јонизујућем зрачењу, изазива оштећења ДНК. Одговор ћелија на та оштећења може бити заустављање ћелијског циклуса, са активацијом механизама за поправку ДНК и потпуним биолошким опоравком ћелије или ћелијска смрт (189). Према томе, број ћелија који је усмерен у правцу програмиране ћелијске смрти може зависити од количине насталих слободних радикала с једне, и антиоксидативних способности организма, с друге стране. У нашем раду је недвосмислено показано да терапија радиоактивним 131-I изазива повећање процента апоптотичних лимфоцита периферне крви, које је проузроковано повећањем процента ћелија у раној фази апоптозе. Када је у питању међусобни однос апоптозе и микронуклеуса, показали смо да МN фреквенца позитивно корелира са раном апоптозом лимфоцита како пре, тако и 7 дана након апликације 131-I. Апоптоза и микронуклеуси се јављају након прве митозе и везани су за оштећења генетског материјала. До сада су бројни аутори покушали да разјасне однос између заступљености апоптотичних ћелија и фреквенце микронуклеуса (192,193). Тако је у неким студијама 77 показано да апоптоза позитивно корелира са МN фреквенцом (194), док је у другима показана негативна корелација (195,196). Објашњење међусобног односа апоптозе и микронуклеуса доста је комплексно и подразумева добро познавање механизама настанка ћелијског оштећења и одговора ћелије на то оштећење. У принципу, апоптоза, као активан процес праћен кондезацијом хроматина, може допринети формирању микронуклеуса, чиме се врши сегрегација неактивног генетског материјала (197,198), док постојеће микронуклеус-носеће ћелије могу представљати својеврсни сигнал за активацију програмиране ћелијске смрти (199). Meintieres и сарадници (200) су показали да инхибиција апоптозе код прекомерне експресије антиапоптотичног Bcl-2 протеина води опстанку ћелија са значајним оштећењем генетског материјала, које настављају ћелијски циклус и касније се јављају у форми МN-носећих ћелија. Насупрот томе, повећан апоптотски капацитет може елиминисати ћелије са микронуклеусима и смањити МN фреквенцу. Из свега наведеног следи да МN фреквенца, као маркер оштећења ДНК молекула, зависи од тога да ли оштећујући агенс делује као промотор или инхибитор апоптозе (201), при чему се не сме занемарити ни ефекат других чинилаца, укључених у регулацију процеса апоптозе. У нашем раду показано је да примена 131-I код пацијената са DTC води повећању процента апоптотичних ћелија, што је у позитивној корелацији са МN фреквенцом. На основу добијених резултата могло би да се тумачи да и поред повећања процента апоптотичних ћелија међу лимфоцитима периферне крви, то повећање апоптозе није довољно да елиминише повећан број ћелија са хромозомским оштећењима, те се детектује повећање броја ћелија са микронуклеусима. Свакако да би анализа порекла МN омогућила боље разумевање односа апоптозе и МN фреквенце, али то није било предмет нашег истраживања. 78 5.5. Ћелије периферне крви код пацијената са DTC Иако се терапија радиоактивним 131-I сматра релативно безбедним видом терапије, његова примена може имати бројне нежељене ефекте, укључујући и промене у костној сржи и периферној крви (202,203). Степен супресије костне сржи зависи од више фактора, као што су укупна апликована доза 131-I, поновљени третмани радиоактивним јодом, резерва костне сржи и степен њене захваћености малигним процесом (202). С обзиром на то да су бубрежни клиренси код пацијената у хипотиреози снижени, то би могло да допринесе дужем задржавању 131-I у организму и повећању укупне апсорбоване дозе. Иако је у бројним студијама испитивана пролазна анемија и тромбоцитопенија које су показане након примене 131-I (204,205), јонизујуће зрачење највећи утицај испољава на леукоците периферне крви (206). Већина објављених резултата указала је на то да ефекат 131-I на лимфоците периферне крви зависи од типа ћелије и времена протеклог од апликације 131-I. Међутим, нагло смањење броја лимфоцита периферне крви после терапије 131-I још није у потпуности разјашњено. Пошто смо у периферној крви наших пацијената са DTC након терапије 131-I показали повећање процента апоптотичних лимфоцита (207), испитивали смо евентуални утицај апоптозе на заступљеност лимфоцитних субпопулација. Примена радиоактивног 131-I код пацијената са DTC проузрокује промене у броју целуларних елемената крви које могу перзистирати месецима (204), што указује на супресивни ефекат 131-I на костну срж (203,206). У раније публикованим радовима показано је смањење броја свих ћелија периферне крви код пацијената са DTC који су лечени 131-I: смањење броја еритроцита и концентрације хемоглобина (203), тромбоцита (203,204) и леукоцита (202). 79 И у нашем истраживању показано је статистички значајно смањење свих крвних елемената недељу дана након примене 131-I. Узимајући у обзир животни век еритроцита (преко 100 дана), ово смањење се не би могло објаснити дејством јонизујућег зрачења на незреле прекурсоре у костној сржи. Исто тако, мало је вероватно да је узрок смањења броја еритроцита радиосензитивност зрелих еритроцита. Поред смањења броја еритроцита, код наших пацијената са DTC показано је и смањење броја тромбоцита седам дана после апликације 131-I, што је у корелацији са раније објављеним подацима других аутора (203,204). Међутим, у поређењу са другим студијама код наших пацијената детектовано је мање изражено смањење броја тромбоцита, највероватније због разлике у времену протеклом од апликације 131-I. За разлику од студија сличног дизајна у којима је број тромбоцита анализиран неколико месеци после апликације 131-I, у нашем раду су испитивани рани ефекти јонизујућег зрачења, и то 7 дана од апликације 131-I. Molinaro и сарадници (206) су показали да примена 131-I изазива смањење броја тромбоцита које траје најмање годину од аблације, док је Rosario (208) показао пролазно смањење броја тромбоцита у прва 3 месеца после терапије. Према њиховим резултатима, краткорочни ефекти радиактивног јода на костну срж зависе од дозе апликованог 131-I, док је за касне ефекте углавном одговорна индивидуална осетљивост пацијената са DTC. Пошто у нашој студији није испитиван животни век тромбоцита, не можемо рећи да ли је смањење броја тромбоцита проузроковано њиховим повећаним уклањањем из периферне крви или не. Ако се има у виду нормалан животни век тромбоцита од око 7 до 10 дана, могли бисмо претпоставити да је смањење броја тромбоцита показано 7 дана након терапије бар делимично проузроковано смањеним стварањем у костној сржи и/или повећаним уклањањем из периферне крви. 80 Најинтересантнији и до сада највише проучаван је ефекат 131-I на број леукоцита и дистрибуцију лимфоцитних субпопулација у периферној крви пацијената са DTC. И у ранијим (202), као и у недавно публикованим студијама (206) показано је да примена 131-I у терапији пацијената са DTC проузрокује смањење броја леукоцита које је детектовано у периферној крви испитаника. И у нашем раду показано је статистички веома значајно смањење броја леукоцита седам дана након апликације 131-I, знатно израженије од смањења еритроцита или тромбоцита. Lloyd и Dolphin (209) су претпоставили да нагло смањење броја лимфоцита периферне крви после озрачивања целог тела није последица унутрашње радиосензитивности и радијацијом индуковане смрти тих ћелија. Они сматрају да смањење броја ћелија представља одраз њихове појачане миграције из крвних судова у друга ткива. Међутим, резултати већине објављених студија (210,211) указују на то да постоје разлике у радиосензитивности лимфоцитних субпопулација. Пре 131-I терапије наши пацијенти са DTC имали су значајно већи проценат CD3+ Т лимфоцита од контролне групе здравих испитаника, и приближно једнаку заступљеност CD19+ B лимфоцита и CD56+ NK ћелија као и контролни испитаници. Литературни подаци о уделу NK ћелија у укупном броју ћелија периферне крви код пацијената са DTC су контрадикторни. У једној студији је показано повећање процента NК ћелија код пацијената са DTC (212), док је у другој утврђена повећана осетљивост NК ћелија на апоптотичне сигнале и смањење броја NК ћелија након прекида супституционе терапије тироксином (213). Иако су пацијенти који су укључени у нашу студију били изразито хипотиреоидни, нисмо открили статистички значајну разлику у проценту CD56+ NК ћелија између пацијената са DTC пре терапије и контролних испитаника. Међутим, у нашем раду је показано да пацијенти са метастазама имају значајно већи проценат CD56+ NК ћелија од 81 пацијената без нодалних или удаљених метастаза, што је у складу са чињеницом да NК ћелије имају важну улогу у одбрани организма од тумора, и да могу допринети регресији тумора и елиминацији туморских ћелија из крви (211,214). При том, ми нисмо анализирали активност NК ћелија нити проценат NК ћелија са регулаторним и цитолитичним фенотипом, док је Wulff (215) показао смањење процента регулаторних NК ћелија у периферној крви оболелих од карцинома главе и врата. Када су у питању CD19+ B лимфоцити, у нашем раду смо показали да 7 дана након апликације 131-I код пацијената са DTC долази до значајног смањења броја B лимфоцита у периферној крви. Овај резултат је у складу са раније објављеним резултатима да су хумани B лимфоцити знатно осетљивији на зрачење од Т лимфоцита (210). Blomgren (216) је показао да се проценат B лимфоцита у укупној лимфоцитној популацији код особа изложених X зрачењу смањује за половину. Имајући у виду повећање процента апоптотичних лимфоцита периферне крви код пацијената са DTC којима је апликован 131-I (207), анализирали смо и утицај програмиране ћелијске смрти на број CD19+ B лимфоцита. Наши резултати указују на то да апоптоза доприноси смањењу броја B лимфоцита у периферној крви пацијената са DTC који су лечени радиоактивним 131-I. 5.4.Цитокински профил код пацијената са DTC Oчекивани ефекат примене великих доза 131-I је јонизација материје праћена стварањем слободних радикала и настанком оксидативног стреса (133). Најновији радови указују на то да оксидативни стрес може подстаћи ослобађање IL-1β и IL-18 (217), односно TNF и IL-6 (218), као и да цитокини могу бити маркери радијационог оштећења ћелија/ткива (219). 82 У раније публикованим студијама показана је повећана серумска концентрација IL-4 и IL-6 код пацијената са колоректалним карциномом (220), IL-6, IL-8 и IL-10 код пацијената са карциномом дојке (221), IL-6 и IL-10 код пацијената са не- Хочкиновим лимфомом (222) и IL-4 код пацијената са карциномом плућа (223). Концентрације цитокина у серумима наших пацијената углавном су биле испод детекционог лимита, са изузетком IL-6, IL-2 и IL-9, и то код веома малог броја пацијената. Сличне податке добили су Kim и сарадници који су показали да су IL-9 и IL- 12p70 недетектибилни код већине пацијената са хепатоцелуларним карциномом (224). Добијени резултати указују на то да код пацијената са карциномом не постоје промене у серумским концентрацијама цитокина, или да методе које су коришћене нису биле довољно сензитивне да детектују серумске концентрације цитокина. У нашем раду, концентрације одабраних цитокина мерили смо методом проточне цитометрије а не ELISA тестом, те се не може искључити могућност да би ELISA тест дао нешто другачије резултате, бар за IL-6, чије је повећање показано у неким студијама (220-222). Код малог броја наших пацијената са DTC детектовано је рано повећање концентрације IL-6 три и/или седам дана након апликације 131-I, што би могло да буде последица отпуштања цитокина из зрачењем оштећеног резидуалног ткива или метастатских депозита (225,226). Наши резултати сагласни су са резултатима ɣzata (227), који је анализирао ефекат 131-I терапије код пацијената са DTC на серумску концентрацију IL-6, али је у његовој студији концентрација IL-6 мерена до неколико месеци након апликације радиоактивног 131-I, док је у овом раду концентрација IL-6 анализирана само 3. и 7. дана после апликације 131-I. С обзиром на то да 131-I проузрокује пострадијационо запаљење, које би могло да буде праћено продукцијом протеина акутне фазе запаљења, анализирали смо концентрацију C реактивног протеина (CRP) (резултати нису приказани). Повишена 83 вредност CRP пре апликације 131-I детектована је код 6 пацијената са DTC, тј. код 3 пацијента са DTC три дана после терапије, од којих је двоје имало повишен CRP и седам дана након терапије. Савремени литературни подаци указују на постојање неколико механизама којима би се могло објаснити повећање серумске концентрације CRP код особа са туморима. У току раста, тумор може индуковати запаљење околног ткива и продукцију CRP, али повишен ниво CRP може бити и последица одговора организма на туморске антигене (228,229). Неки аутори су утврдили да ћелије извесних тумора продукују CRP (230,231), или поседују могућност секреције IL-6 и IL-8 који потом индукују стварање CRP (232). Међутим, код већине пацијената са DTC обухваћених нашим радом није забележено повећање концентрације CRP ни пре, нити након терапије радиоактивним 131-I. Наши резултати сагласни су резултатима неких раније публикованих студија других аутора (228, 233). Када je у питању концентрација цитокина у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви, показано је да ћелије пуне крви пацијената са DTC пре апликације 131-I, у односу на контролну групу здравих испитаника, при неспецифичној стимулацији митогеном in vitro луче статистички значајно веће концентрације IL-13 и IL-5, односно IL-13, IL-5 и IL-9 (концентрација цитокина/1000 леукоцита). Исто је показано и када су концентрације цитокина прерачунате на 1000 мононуклеарних ћелија (статистички значајно веће концентрације IL-13, IL-5 и IL-9 код пацијената са DTC пре терапије 131-I у односу на контролну групу здравих испитаника, резултати нису приказани). С обзиром на то да наша студија није била дизајнирана тако да се може одредити извор секретованих цитокина, а да неке цитокине (на пример, IL-12, IL-4, IL-5, IL-6) могу лучити и друге, а не само мононуклеарне ћелије крви (234), определили смо се да прикажемо резултате који су добијени израчунавањем концентрације цитокина на 1000 стимулисаних леукоцита. 84 У односу на контролну групу здравих испитаника, при неспецифичној стимулацији ћелија пуне крви пацијената са DTC детектована је статистички значајно већа концентрација два Th2 цитокина (IL-13 и IL-5), као и IL-9 (који је најпре описан као Th2 цитокин, а данас се издваја у посебну групу Th9 цитокина) (235). У бројним радовима анализирана је улога Th2 цитокина у анти-туморском имунском одговору (236-239) или дејство Th2 цитокина на туморске ћелије (240). Високе концентрације Th2 цитокина су детектоване у туморској микросредини и периферној крви пацијената са карциномом простате и мокраћне бешике (241,242). У серуму пацијената са планоцелуларним карциномом главе и врата Sparano и сарадници (236) су испитивали концентрације одабраних Th1 и Th2 цитокина и показали да пацијенти са III и IV стадијумом тумора имају мање концентрације IL-12 и веће концентрације IL-10 у односу на пацијенте у I и II стадијуму болести. У експерименталним анималним моделима показано је да недостатак ST2 молекула или интерлеукина 33 (IL-33) који поларизује наивне Т лимфоците да синтетишу IL-4, IL-5 и IL-13 (Th2 цитокине) води појачању анти- туморског имунског одговора (239,243). IL-5 могу синтетисати активисани Т лимфоцити, мастоцити или NK ћелије, a његово основно биолошко дејство је стимулација продукције еозинофилних леукоцита у костној сржи, као и регулација преживљавања и активације еозинофилних леукоцита (244). Улога IL-5 и еозинофилних леукоцита у анти-туморском имунском одговору недовољно је испитана. Присуство еозинофилних леукоцита у перитуморском инфилтрату показана је у бројним туморима (карциному колона, планоцелуларном карциному, плућном аденокарциному, карциному мокраћне бешике) и обично је повезано са бољом прогнозом (ревијски приказано у референци: 245). У експерименталним анималним моделима показано је да еозинофилни леукоцити активисани IL-5 супримирају раст хепатоцелуларног карцинома in vivo и in vitro (237), 85 односно да еозинофилни леукоцити in vitro могу директно убити ћелије генетски модификованог мишјег фибросаркома (238). Сем тога, показано је и да тумор- специфични СD4+ T лимфоцити са цитокинским Th2 профилом могу уклонити успостављене плућне и висцералне метастазе меланома и да је при том индукована дегранулација еозинофилних леукоцита у туморском ткиву (246). С обзиром на то да два цитокина, IL-13 и IL-4, који припадају Th2 типу цитокина, али их луче и друге ћелије, имају заједничке, али и различите рецепторе, њихова појединачна улога у имунском надзору тумора недовољно је разјашњена (247). До сада је добро документовано да IL-4 углавном има негативан ефекат на раст тумора (248, 249, 250), док су подаци о улози IL-13 контрадикторни (251-253). Према резултатима радова који се односе на антитуморско дејство IL-13, тај ефекат је највероватније посредован акумулацијом неутрофилних леукоцита и макрофага (251,252), мада се ни дејство IL-13 преко еозинофилних леукоцита не може искључити (247). IL-9 је првобитно описан као Th2 цитокин, и многа његова дејства слична су дејству IL-4 (235). У присуству цитокина IL-4 и ТGF-β, Th0 и Th2 лимфоцити могу диферентовати у Th9 лимфоците који секретују интерлеукине IL-9 и IL-10. Осим Th9 лимфоцита, под одређеним условима и друге субпопулације Т лимфоцита могу секретовати IL-9. Улога IL-9 у патогенези аутоимунских болести добро је документована (ревијски приказано у референци 235), a недавно је показано и да има важну улогу у анти-туморском имунском одговору (254). Према литературним подацима, код нелечених пацијената са различитим малигним туморима постоји поремећај равнотеже између Th1 и Th2 лимфоцита: инхибиција Тh1 лимфоцита локалном продукцијом IL-10, и стимулација Th2 лимфоцита (105,220,234, 236,241,256). Процена баланса контрарегулаторних цитокина (Th1/Th2) код пацијената са DTC пре 131-I терапије у односу на контролну групу здравих испитаника вршена је на 86 основу концентрација цитокина које су измерене у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (на 1000 леукоцита). Анализом односа IL-12p70/IL-13, IFN-γ/IL-4, IFN-γ/IL-5, IFN-γ/IL-10, TNF-α/IL-4, TNF-α/IL-5 и TNF-α/IL-10 показано је да нема статистички значајне разлике између односа тестираних Th1 и Th2 цитокина у групи пацијената са DTC пре терапије 131-I у односу контролну групу здравих испитаника. Иако је у супернатантима фитохемаглутинином стимулисане пуне крви код DTC пацијената показано статистички значајно повећање концентрација IL-13 и IL-5 у односу на контролну групу здравих испитаника, код DTC пацијената су повећане и концентрације Th1 цитокина, тако да однос тестираних Th1 и Th2 цитокина остаје непромењен. Pellegrini (220) је код пацијената са колоректалним карциномом показао промену равнотеже између Th1 и Th2 лимфоцита, али он сматра да је поремећен однос између Тh1 и Тh2 лимфоцита настао посредством IL-4. У неким студијама (104,257) је показано да особе са туморима имају повећан капацитет продукције и секреције Th2 цитокина и процентуални удео Th2 лимфоцита међу CD4+ Т лимфоцитима. Пошто је стимулација ћелија пуне крви у нашим експериментима урађена in vitro, добијени резултати могу само да нам укажу на то да ће при неспецифичној стимулацији код DTC пацијената Th2 (односно Th2/Th9) тип цитокина бити подстакнут. При том, не бисмо могли да кажемо да ли се тај резултат може повезати са смањеним имунским одговором организма на туморе (који није у могућности да се супротстави настанку малигног тумора), или можда делу имунског одговора који је подстакнут присуством тумора, односно туморским антигенима. Укупне концентрације свих мерених цитокина у супернатантима фитохемаглутинином стимулисаних ћелија пуне крви после терапије 131-I биле су мање у односу на концентрације пре терапије, са статистички значајним разликама за 6 87 мерених цитокина (IL-17A, IL-2, IL-10, IL-6, IL-13 и IL-5). Када су концентрације цитокина измерене у супернатантима фитохемаглутинином стимулисане пуне крви помножене фактором разблажења и прерачунате на 1000 стимулисаних леукоцита, добијено је статистички значајно смањење концентрације Тh2 цитокина (IL-13, IL-4 и IL-5). Ови резултати нам указују на то да је смањење концентрације неких цитокина (IL- 17A, IL-2, IL-10, IL-6) детектовано после терапије 131-I последица смањења броја леукоцита, а смањење концентрације других цитокина (IL-13, IL-5), бар делом, проузроковано смањењем капацитета лучења тих цитокина од стране in vitro стимулисаних леукоцита, а не само смањењем броја ћелија, које су показали и други аутори (255). Резултати раније публикованих студија које су урађене на анималним моделима, у којима су анализирани узорци ткива (118,119), указују на то да јонизујуће зрачење изазива диференцијацију наивних CD4+ Т лимфоцита у Тh2 лимфоците и повећање продукције Тh2 цитокина. У нашем раду показано је смањење концентрације Тh2 цитокина у супернатанту фитохемаглутином стимулисане пуне крви пацијената са DTC 7 дана након апликације 131-I. Процена баланса контрарегулаторних цитокина (Th1/Th2) код пацијената са DTC после 131-I терапије вршена је на основу концентрација цитокина које су измерене у супернатантима митогеном стимулисаних ћелија пуне крви (на 1000 леукоцита). Анализом односа IL-12p70/IL-13, IFN-γ/IL-4, IFN-γ/IL-5, IFN-γ/IL-10, TNF-α/IL-4, TNF- α/IL-5 и TNF-α/IL-10 показано је да нема статистички значајне разлике између односа тестираних Th1 и Th2 цитокина код пацијената са DTC после у односу на вредности пре терапије 131-I. Иако је у супернатантима фитохемаглутинином стимулисане пуне крви пацијената са DTC после терапије 131-I показано статистички значајно смањење 88 концентрација IL-13, IL-4 и IL-5 у односу на вредности пре терапије, однос тестираних Th1 и Th2 цитокина после терапије 131-I остаје непромењен. Наши резултати нису сагласни са раније публикованим резултатима који се односе на ефекте јонизујућег зрачења на поларизацију CD4+ Т лимфоцита и секрецију цитокина, а добијени су на анималним моделима (117-119). Према резултатима једне студије (120), зрачење код мишева нарушава равнотежу између Тh1 и Тh2 лимфоцита и смањује однос између те две субпопулације ћелија. У тумачењу добијених резултата, аутори су претпоставили да смањење лучења Тh1 цитокина може настати услед инхибиције продукције IL-12 од стране антиген презентујућих ћелија, или услед смањене секреција биолошки активног IL-12, или услед нисходне регулације експресије рецептора за IL-12 на површини CD4+ Т лимфоцита (117). Кад је у питању повећана продукција IL-4, а сматра се да је IL-4 главни покретач пострадијационе запаљењске реакције (121), непосредно након озрачивања IL-4 би могао да буде продукован од стране Th2 лимфоцита (122), а касније и од стране других IL-4 продукујућих ћелија, пре свега макрофага (122) и мастоцита (123). Насупрот томе, у нашем раду је после апликације радиоактивног 131-I код пацијената са DTC показано смањење капацитета лучења и укупне секреције Тh2 цитокина. Разлике између наших и раније публикованих резултата могле би да се објасне разликама у дизајну студија: у анималним моделима концентрације цитокина мерене су у узорцима ткива (слезине, интестиналне мукозе) озрачених мишева (117-119) а у нашој студији концентрације цитокина мерене су у супернатанту митогеном стимулисане пуне крви in vitro. С обзиром на то да је повећана секреција Тh2 цитокина код пацијената са DTC показана пре апликације радиоактивног 131-I, а смањење секреције Тh2 цитокина код истих пацијената 7 дана после апликације 131-I, и да су цитокини мерени у 89 супернатантима фитохемаглутинином стимулисане пуне крви in vitro, о значају добијених резултата можемо само спекулисати. Међутим, ако имамо у виду да Тh1 цитокини подстичу активацију цитотоксичних Т лимфоцита, NК ћелија, макрофага, и других ћелија које имају важну улогу у имунском надзору тумора (105), повећана концентрација Тh2 цитокина код особа са DTC могла би да укаже на измењену/ослабљену одбрану од тумора, док би апликација радиоактивног 131-I праћена смањењем продукције и смањењем капацитета лучења Тh2 цитокина, могла да води појачању имунског одговора на тумор. Уколико би овакви резултати добили потврду при анализи перитуморског инфилтрата или серумских концентрација цитокина код пацијената са DTC, смањење секреције Тh2 цитокина после апликације 131-I могло би да буде још један користан ефекат терапије радиоактивним јодом пацијената са диферентованим тиреоидним карциномом. 90 6. ЗАКЉУЧЦИ На основу добијених резултата може се закључити следеће: 1. Оксидативни стрес интензивиран је код пацијената са DTC, а примена радиоактивног I-131 индукује додатни оксидативни стрес. • Код пацијената са DTC постоји статистички значајно већа концентрација МDА и мокраћне киселине у односу на контролне испитанике, док је TAS сличан код обе групе испитаника. • МDА достиже највећу вредност три дана након апликације 131-I. Повећање концентрације МDА праћено је смањењем концентрације мокраћне киселине, уз незнатне промене тоталног антиоксидативног статуса. • Не постоји разлика у интензитету оксидативног стреса између групе пацијената којима је апликовано 3.7 GBq и групе пацијената којима је апликовано 5.5 GBq радиоактивног 131-I. • Интензитет оксидативног стреса позитивно корелира са ретенцијом радиоактивног 131-I у пределу тиреоидне ложе. 2. Код пацијената са DTC повећана је геномска нестабилност, коју одражава повећана фреквенца микронуклеуса у лимфоцитима периферне крви. Након апликације 131-I настају додатна генетска оштећења, са повећањем фреквенце микронуклеуса и смањењем пролиферационог капацитета ћелија. • Фреквенца микронуклеуса већа је код пацијената са DTC пре терапије 131-I него у контролној групи здравих испитаника. 91 • Апликација 131-I проузрокује повећање фреквенце микронуклеуса, уз смањење пролиферационог капацитета ћелија. • Пол, старост, пушење и хистолошки тип тумора не утичу на фреквенцу микронуклеуса код пацијената са DTC. • Код пацијената са метастазама, фреквенца микронуклеуса позитивно корелира са акумулацијом 131-I у региону тиреоидне ложе. 3. У односу на здраве особе, лимфоцити DTC пацијената подложнији су спонтаној апоптози. Апликација радиоактивног 131-I индукује додатну апоптозу лимфоцита. • Проценат лимфоцита у раној фази апоптозе већи је код пацијената са DTC него у контролној групи здравих испитаника. • Након апликације 131-I повећава се проценат лимфоцита у раној фази апоптозе и укупан проценат апоптотичних лимфоцита, док проценат лимфоцита у касној фази апоптозе и проценат некротичних ћелија остаје непромењен. • Радиоактивним јодом индукована рана апоптоза позитивно корелира са радиоактивним јодом индукованом микронуклеусном фреквенцом. 4. Терапија 131-I праћена је смањењем броја свих целулураних елемената периферне крви. На дејство јонизујућег зрачења најосетљивија је субпопулација CD19+ В лимфоцита, чије смањење корелира са повећањем броја ћелија у раној фази апоптозе. 5. Код пацијената са DTC серумске концентрације цитокина: IFN-ɣ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-22 и TNF-α, углавном су немерљиве, а терапија радиоактивним 131-I не индукује повећање њихове серумске концентрације. 92 6. Ћелије периферне крви пацијената са DTC при неспецифичној стимулацији фитохемаглутинином in vitro луче веће концентрације Th2 цитокина (IL-13 и IL-5) и IL-9 у односу на контролну групу здравих испитаника. Терапија радиоактивним 131-I праћена је смањеним капацитетом ћелија да при неспецифичној стимулацији фитохемаглутинином in vitro секретују Th2 цитокине (IL-13, IL-4 и IL-5) . 7. Терапија радиоактивним 131-I праћена је променама серумске концентрације протеина и липида. • Код пацијената са DTC повећане су концентрације протеина, холестерола и триглицерида у односу на контролну групу здравих испитаника. • После апликације 131-I код DTC пацијената долази до значајног смањења серумске концентрације протеина и холестерола, које је праћено повећањем концентрације триглицерида три дана након терапије 131-I . • Код DTC пацијената старијих од 50 година постоји негативна корелација између концентрације протеина и триглицерида. Укупан закључак овог истраживања је да код пацијената са DTC пре терапије радиоактивним 131-I постоји појачан оксидативни стрес, повећана геномска нестабилност и спонтана апоптоза лимфоцита периферне крви, као и извесно фаворизовање лучења Th2 цитокина у одговору на неспецифичну стимулацију. Терапија радиоактивним 131-I индукује повећање оксидативног стреса, генских оштећења и апоптозе, смањење броја свих целуларних елемената крви, а нарочито В лимфоцита, и смањено лучење Th2 цитокина у одговору на неспецифичну стимулацију in vitro. 93 7. ЛИТЕРАТУРА 1. Sipos JA, Mazzaferri EL. Thyroid cancer epidemiology and prognostic variables. Clinical Oncology 2010;22:395–404. 2. Kebebew E, Clark OH. Differentiated thyroid cancer: “complete” rational approach. World J Surg 2000;24:942–951. 3. Kolfoy BA, Zheng T, Holford TR, et al. International patterns and trends in thyroid cancer incidence, 1973-2002. Cancer causes Control 2009;20:525–31. 4. Ćurčin N, Mihaljević O, Jeftić I, et al. Diferentovani karcinomi štitaste železde - epidemiologija, etiopatogeneza, dijagnostika i terapijske smernice. Medicinski časopis, in press. 5. Sherman SI. Thyroid carcinoma. Lancet 2003;361:501-511. 6. van Tol KM, de Vries EGE, Dullaart RPF, Links TP. Differentiated thyroid carcinoma in the elderly. Critical Reviews in Oncology:Hematology 2001;38:79–91. 7. Živančević-Simonović S, Mijatović-Teodorović Lj. In: Ilić M. Maligni tumori-odabrana poglavlja. 1st ed. Kragujevac: Interprint, 2012:498-543. 8. Nam M, Chu YC, Choe W, et al. Metastatic follicular thyroid carcinoma to the thymus in a 35-year-old woman. Yonsei Medical Journal 2002;43(5):665-669. 9. Vrndic О, Savin S, Mijatovic Lj, Djukic A, Jeftic I, MD,1 Zivancevic Simonovic S. Concentration of thyroglobulin and thyroglobulin-specific autoantibodies in patients with differentiated thyroid cancer after treatment with radioactive iodine 131. Labmedicine 2011;42(1):9-13. 10. De La Vieja A, Dohan O, Levy O, Carrasco N. Molecular analysis of the sodium/iodide symporter: impact on thyroid and extrathyroid pathophysiology. Physiol Rev 2000;80:1083–1105. 94 11. Caron NR, Clark OH. Well differentiated thyroid cancer. Scandinavian journal of surgery 2004;93(4):261-71 12. DeGroot LJ, Kaplan EL, McCormick M, Straus FH. Natural history, treatment, and course of papillary thyroid carcinoma.J Clin Endocrinol Metab 1990;71:414-423. 13. Management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid 2006;16(2):1-33. 14. Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, et al. Revised american thyroid association management guidelines for patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid 2009;19:1167–1214. 15. Luster M, Clarke SE, Dietlein M, et al. Guidelines for radioiodine therapy of differentiated thzroid cancer. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2008;35:1941-1959. 16. Woodrum DT, Gauger PG. Role of 131I in the treatment of well differentiated thyroid cancer. Journal of Surgical Oncology 2005;89:114–121. 17. Mazzaferri EL. Thyroid remnant 131I ablation for papillary and follicular thyroid carcinoma. Thyroid 1997;7:265-271. 18. Vrachimis A, Schober O, Riemann B. Radioiodine remnant ablation in differentiated thyroid cancer after combined endogenous and exogenous TSH stimulation. Nuklearmedizin 2012;51(3):67-72. 19. Luster M, Lippi F, Jarzab B, et al. rhTSH-aided radioiodine ablation and treatment of differentiated thyroid carcinoma: a comprehensive review. Endocrine Related Cancer 2005;12(1):49-64. 95 20. Ravishankar U, Pande S, and Savita N. I-131 in the management of differentiated thyroid cancer – an update on current recommendations and practices. Apollo Medicine 2009;6(4):347-354. 21. Savin S, Cvejic D, Mijatovic Lj, Zivancevic Simonovic S. Measuring thyroglobulin concentrations in patients with differentiated thyroid carcinoma. J Med Biochem 2010;29:245 –253. 22. Sies H. Oxidative stress: from basic research to clinical application. Am J Med 1991;91:31S-38S. 23. Close GL, Ashton TA, McArdie A, MacLaren DP. The emerging role of free radicals in delayed onset muscle soreness and contranction-induced muscle injury. Comparative Bioch And Phys 2005;142:257-66. 24. Ralph S, Rodriguez-Enriquez S, Neuzil J, Saavedra E, Moreno-Sanchez R. The causes of cancer revisited: ”mitohondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation – why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine 2010;31:145-170. 25. Mates JM, Perez-Gomez C, De Castro IN. Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem 1999;32:595–603. 26. McCall MR, Frei B. Can antioxidant vitamins materially reduce oxidative damage in humans? Free Rad Biol Med 1999;26:1034–1053. 27. Cadenas E. Basic mechanisms of antioxidant activity. Biofactors 1997;6:391–397. 28. Ferrari CKB. Oxidative stress pathophysiology: searching for an effective antioxidant protection. Int Med J 2001;8:175-184. 96 29. Erel O. A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clinical Biochemistry 2005;38:1103–1111. 30. Koracevic D, Koracevic G, Djordjevic V, Andrejevic S, and Cosic V. Method for the measurement of antioxidant activity in human fluids. Journal of Clinical Pathology 2001;54:356-361. 31. Denisov ET, Afanasev IB. Oxidation and antioxidants in organic chemistry and biology. Boca Raton, London, New York, Singapore:Taylor&Francis group, 2005. 32. Leonarduzzi G, Chiarpotto E, Biasi F, Poli G. 4-Hydroxynonenal and cholesterol oxidation products in atherosclerosis. Mol Nutr Food Res 2005;49(11):1044-9. 33. Kagan VE. Lipid peroxidation in biomembranes. Florida: CRC Press, Inc. Boca Raton 1988. 34. Mono T, Shinohara R, Iwase K, et al. Changes in free radical scavengers and lipid peroxide in thyroid glands of various thyroid disorders. Horm Metab Res 1997;29: 351-354. 35. Gorozhanskaya EG, Sviridova SP, Dobrovolskaya MM, Zubrikhina GN, Kashiya ShR. Selenium and oxidative stress in cancer patients. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry 2013;7(1):32-39. 36. Alkhenizan A, Hafez K. The role of vitamin E in the prevention of cancer: a meta-analysis of randomized controlled trials. Annals Saudi Med 2007;27:409-414. 37. Sener DE, Gönenç A, Akinci M, and Torun M. Lipid peroxidation and total antioxidant status in patients with breast cancer. Cell Biochemistry and Function 2007;25:377-382. 38. Di Giacomo C, Acquaviva R, Lanteri R, et al. Nonproteic antioxidant status in plasma of subjects with colon cancer. Experimental Biology and Medicine 2003;228:525-528. 39. Toyokuni S, Okamotо K, Yodoib J, Hiai H. Persistent oxidative stress in cancer. IFEBS Letters 1995;358:1-3. 97 40. Szatrowski TP, Nathan CF. Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer Res 1991;51(3):794-8. 41. Sato K, Ito K, Kohara H, Yamaguchi Y, et al. Negative regulation of catalase gene expression in hepatoma cells. Mol Cell Biol 1992;12 (6): 2525-2533. 42. Warburg O."On the origin of cancer cells". Science 1956;123(3191):309–14. 43. Singh KK. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in aging and cancer. Ann NY Acad Sci 2004;1019:260–264. 44. Laurent A,Nicco C, Chereau C, et al. Controlling tumor growth by modulating endogenous production of reactive oxygen species. Cancer Res 2005;65:948–956. 45. Copeland WC, Wachsman JT, Johnson FM, and Penta JS. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Invest 2002;20:557–569. 46. Arnold R, Shi J, Murad E, et al. Hydrogen peroxide mediates the cell growth and transformation caused by mitogenic oxidase Nox1. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98: 5550- 5. 47. Pustovidko AV, Podselueva MM, Evtodinko YV. Generation of reactive oxygen species by polymorphonuclear leukocytes and its modulation by calcium ions during tumor growth. IUBMB Life 2000;50:69-73. 48. Sabitha KE, Shyamaladevi CS. Oxidant and antioxidant activity changes in patients with oral cancer and treated with radiotherapy. Oral Oncol 1999;35:272-77. 49. Kasapovic J, Pejic S, Todorovic A, et al. Antioxidant status in breast cancer patients of different ages after radiotherapy. Arch Biol Sci Belgrade 2009;61:23-8. 50. Chitra S, Shyamaladevi CS. Effect of α-tocopherol on pro-oxidant and antioxidant enzyme status in radiation-treated oral squamous cell carcinoma. Indian J Med Sci 2008;62:141- 148. 98 51. Gupta A, Bhatt MLB, Misra MK. Assessment of free radical-mediated damage in head and neck squamous cell carcinoma patients and after treatment with radiotherapy. Indian J Biochem Biophys 2010;47:96-99. 52. Cartmel B, Bowen D, Ross D, Johnson E, Mayne ST. A randomized trial of an intervention to increase fruit and vegetable intake in curatively treated patients with early-stage of head and neck cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14: 2848-54. 53. Мalathi М, Vijay M, Shivashankara AR. The Role of oxidative stress and the effect of radiotherapy on the plasma oxidant-antioxidant status in head and neck cancer. Journal of Clinical and Diagnostic Research 2011;5(2):249-251. 54. Iyer R, and Lehnert BE. Factors underlying the cell growth-related bystander response to a particles. Cancer Res 2000;60:1290–1298. 55. Yoon YS, Lee JH, Hwang SC, Choi KS, and Yoon G. TGF beta1 induces prolonged mitochondrial ROS generation through decreased complex IV activity with senescent arrest in Mv1Lu cells. Oncogene 2005;24:1895–1903. 56. Spitz DR, Azzam EI, Li JJ, Gius D. Metabolic oxidation/reduction reactions and cellular responses to ionizing radiation: a unifying concept in stress response biology. Cancer Metastasis Rev 2004;23(3-4):311-22. 57. Fenech M, Chang WP, Kirsch-Volders M, et al. Human Micronucleus project. "HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures." Mutat Res 2003;534(1-2):65-75. 58. Bombail V, Aw D, Gordon E, Batty J. Application of the comet and micronucleus assays to butterfish (Pholis gunnellus) erythrocytes from the Firth of Forth, Scotland. Chemosphere 2001;44(3):383-92. 99 59. Fenech M. The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutat Res 1993;285(1):35-44. 60. Saunders WS, Shuster M, Huang X, et al. Chromosomal instability and cytoskeletal defects in oral cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:303-308. 61. Fenech M, and Morley AA. Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat Res 1985;147:29-36. 62. Jagetia GC, Jayakrishnan A, Fernandes D, Vidyasagar MS. Evaluation of micronuclei frequency in the cultured peripheral blood lymphocytes of cancer patients before and after radiation treatment. Mutation Research 2001;491:9–16. 63. Beetstra S, Salisbury C, Turner J, et al. Lymphocytes of BRCA1 and BRCA2 germ-line mutation carriers, with or without breast cancer, are not abnormally sensitive to the chromosome damaging effect of moderate folate deficiency. Carcinogenesis 2006;27:517- 524. 64. Solomon E, Borrow J, and Goddard AD. Chromosome aberrations and cancer. Science 1991;254:1153–1160. 65. Widel M, Kolosza Z, Jedrus S, et al. Micronucleus assay in-vivo provides significant prognostic information in human cervical carcinoma: the updated analysis. Int J Radiat Biol 2001;77:631–636. 66. Venkatachalam P, Paul S, Mohankumar M, et al. Higher frequency of dicentrics and micronuclei in peripheral blood lymphocytes of cancer patients. Mutat Res 1999;425:1–8. 67. Norppa H, Luomahaara S, Heikanen H, et al. Micronucleus assay in lymphocytes as a tool to biomonitor human exposure to aneuploidogens and clastogens. Environ Health Perspect 1993;101:139-43. 100 68. Murgia E, Ballardin M, Bonassi S, Rossi AM, Barale R. Validation of micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes as early cancer risk biomarker in a nested case- control study. Mutat Res 2008;639(1-2):27-34. 69. Iarmarcovai G, Ceppi M, Botta A, Orsiere T, Bonassi S. Micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes of cancer patients: a meta-analysis, Mutat Res 2008;659:274–283. 70. Milošević-Djordjević O, Grujičić D, Vasković Ž, Marinković D. High micronucleus frequncy in peripheral blood lymphocytes of unterated cancer patients irrespective of gender, smoking and cancer sites. Tohoku J of Med Exp 2010;220:115-120. 71. Baciuchka-Palmaro M, Orsiere T, Duffaud F, et al. Acentromeric micronuclei are increased in peripheral blood lymphocytes of untreated cancer patients. Mutat Res 2002;520:189– 198. 72. Duffaud F, Orisiere T, Villani P, et al. Comparison between micronucleated lymphocyte rates observed in healthy subjects and cancer patients. Mutagenesis 1997;12:227–231. 73. Fenech M, Denham J, Francis W, Morley A. Micronuclei in cytokinesis-blocked lymphocytes of cancer patients following fractionated partial-body radiotherapy. Int J Radiat Biol 1990;57:373–383. 74. Pala FS, Alkaya F, Tabakcioglu K, et al. The effects of micronuclei with whole chromosomes on biological dose estimation. Turk J Biol 2008;32:283–290. 75. Thierens H, Vral A, De Ridder L, et al. Scoring of different cytogenetic endpoints after in vitro low dose c-exposure: interlaboratory comparison for biomonitoring of radiological workers. Int J Radiat Biol 1999;75:23–34. 76. Ramirez MJ, Surralles J, Galofrе P, Creus A, and Marcos R. Radioactive iodine induces clastogenic and age-dependent aneugenic effects in lymphocytes of thyroid cancer patients as revealed by interphase FISH. Mutagenesis 1997;12(6):449-455. 101 77. Willems P, Claes K, Baeyens A, et al. Polymorphisms in non homologous end-joining genes associated with breast cancer risk and chromosomal radiosensitivity. Genes Chromosomes Cancer 2009;47:137-148. 78. Palyvoda O, Polañska J, Wygoda A, and Rzeszowska-Wolny J. DNA damage and repair in lymphocytes of normal individuals and cancer patients: studies by the comet assay and micronucleus tests. Acta Biochimica Polonika 2003;50(1):181-190. 79. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide- ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239-257. 80. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovascular Research 2000;45:528-537. 81. Fadok VA, De Cathelineau A, Daleke DL, Henson PM, Bratton DL. The loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by macrophages and fibroblasts. J Biol Chem 2001;276:1071-7. 82. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516. 83. Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods 2000;243:167-190. 84. Knight RA and Melino G. Cell death in disease: from 2010 onwards. Cell Death Dis 2011;2:e202. 85. Rastogi RP, Richa, Sinha RP. Apoptosis: molecular mechanisms and pathogenicity. EXCLI Journal 2009;8:155-181. 86. Mullauer L, Gruber P, Sebinger D, et al. Mutations in apoptosis genes: a pathogenetic factor for human disease. Mutat Res 2001;488(3):211-31. 102 87. Hoffmann TK, Dworacki G, Tsukihiro T, et al. Spontaneous apoptosis of circulating T lymphocytes in patients with head and neck cancer and its clinical importance. Clin Cancer Res 2002;8:2553-2562. 88. Muneaki S, Tachibana M, Dhar DK, et al. Spontaneous apoptosis in advanced esophageal carcinoma: its relation to Fas expression. Clin Cancer Res 2000;6:4755-4759. 89. Kupryjanczyk J, Dansonka- Mieszkowska A, Szymanska T, et al. Spontaneous apoptosis in ovarian carcinomas: a positive association with p53 gene mutation is dependent on growth fraction. Br J Cancer 2000;82:579-583. 90. Mandoky L, Syende B, Geczi L, et al. Apoptosis regulation and spontaneous apoptosis index of testicular germ cell tumors are associated with differentiation and resistance to systemic treatment. Anticancer Res 2008;28:1641-1650. 91. Pinzon-Charry A, Maxwell T, Mcguckin MA, et al. Spontaneous apoptosis of blood dendritic cells in patients with breast cancer. Breast Cancer Res 2006;8:R5. 92. Saito T, Dworacki G, Gooding W, Lotze MT, Whiteside TL. Spontaneous apoptosis of CD8+ T lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced melanoma. Clin Cancer Res 2000;6:1351-1364. 93. Xu JL, Lai R, Kinoshita T, Nakashima N, Nagasaka T. Proliferation, apoptosis, and intratumoral vascularity in multiple myeloma: correlation with the clinical stage and cytological grade. J Clin Pathol 2002;55:530-534. 94. Gastman BR, Atarashi Y, Reichert TE, et al. Fas ligand is expressed on human squamous cell carcinomas of the head and neck and it promotes apoptosis of T lymphocytes. Cancer Res 1999;59:5356–5364. 95. Lowel SW, Lin AW. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis 1999;21:485-495. 103 96. Djurdjevic P, Zelen I, Ristic P, et al. Role of decreased production of interleukin-10 and interferon-gamma in spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia lymphocytes in vitro. Archives of Medical Research 2009;40(5):357-363. 97. Bordón E, Hernández LA, Lara PC, et al. Prediction of clinical toxicity in localized cervical carcinoma by radio-induced apoptosis study in peripheral blood lymphocytes (PBLs). Radiat Oncol 2009;4:58-64. 98. Pinar B, Henrĩquez-Hernández LA, Lara PC, et al. Radiation induced apoptosis and initial DNA damage are inversely related in locally advanced breast cancer patients. Radiat Oncol 2010;5:85-89. 99. Ross GM. Induction of cell death by radiotherapy. Endocrine-Related Cancer 1999;6:41- 44. 100. Mosmann TR, Coffman RL. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 1989;7:145-173. 101. Kidd P: Th1/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease. Altern Med Rev 2003;8:223- 246. 102. Abbas AK, Lichtman AH. Cellular and molecular immunology, 5 th ed., Saunders, 2003. 103. Shevach EM. From vanilla to 28 flavors: multiple varieties of T regulatory cells. Immunity 2006;25:195-201. 104. Moser M, Murphy KM. Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development. Nat Immunol 2000;1:199-205. 105. Shurin MR, Lu L, Kalinski P, et al. Th1/Th2 balance in cancer, transplantation and pregnancy. Springer Semin Immunopathol 1999;21:339-359. 106. Sato M, Goto S, Kaneko R, et al. Impaired production of Th1 cytokines and increased frequency of Th2 subsets in PBMC from advanced cancer patients. Anticancer Res 1998;18:3951-3955. 104 107. Zamarron BF, Chen WJ. Dual roles of immune cells and their factors in cancer development and progression. Int J Biol Sci 2011;7:651-658. 108. Wilke CM, Kryczek I, Wei S, et al. Th17 cells in cancer: help or hindrance? Carcinogenesis 2011;32:643– 649. 109. Kryczek I, Banerjee M, Cheng P, et al. Phenotype, distribution, generation, and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments. Blood 2009;114:1141–1149. 110. Derhovanessian Е, Adams V, Hahnel K, et al. Pretreatment frequency of circulating IL- 17+ CD4+ T-cells, but not Tregs, correlates with clinical response to whole-cell vaccination in prostate cancer patients. Int J Cancer 2009;125(6):1372-9. 111. Zhang YL, Li J, Mo HY, et al. Different subsets of tumor infiltrating lymphocytes correlate with NPC progression in different ways. Mol Cancer 2010;9:4. 112. Радосављевић ГД, Јовановић ИП, Кањевац ТВ, Арсенијевић НН. Улога регулаторних Т лимфоцита у модулацији имунског одговора на малигне ћелије. Srp Arh Celok Lek 2013;141:262-267. 113. Radosavljevic G, Jovanovic I, Majstorovic I, et al. Deletion of galectin-3 in the host attenuates metastasis of murine melanoma by modulating tumor adhesion and NK cell activity. Clin Exp Metastasis 2011;28(5):451-462. 114. Kawaida H, Kono K, Takahashi A, et al. Distribution of CD4+CD25high regulatory T- cells in tumor-draining lymph nodes in patients with gastric cancer. J Surg Res 2005;124(1):151-157. 115. Sutmuller RPM, van Duivenvoorde LM, van Elsas A, et al. Synergism of cytotoxic T lymphocyte–associated antigen 4 blockade and depletion of Cd25+ regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses. J Exp Med 2001;194:823–832. 105 116. Xu L, Kitani A, Fuss I, Strober W. Cutting Edge: Regulatory T cells induce CD4+CD25– Foxp3– T cells or are self-induced to become Th17 cells in the absence of exogenous TGF- . J. Immunol 2007;178:6725- 6729. 117. Park HR, Jo SK, Paik SG. Factors effecting the Th2-like immune response after gamma-irradiation: low production of IL-12 heterodimer in antigen-presenting cells and small expression of the IL-12 receptor in T cells. Int J Radiat Biol 2005;81: 221-231. 118. Han SK, Song JY, Yun YS, Yi SY. Effect of gamma radiation on cytokine expression and cytokine-receptor mediated STAT activation. Int J Radiat Biol 2006; 82:686-697. 119. Gremy O, Benderitter M, Linard C. Caffeic acid phenethylester modifies the Th1/Th2 balance in ileal mucosa after gamma-irradiation in the rat by modulating the cytokine pattern. World J Gastroenterol 2006;12:4996-5004. 120. Bass H, Mosmann T, Strober S. Evidence for mouse Th1- and Th2-like helper T cells in vivo. Selective reduction of Th1-like cells after total lymphoid irradiation. Journal of Experimental Medicine 1989;170:1495-1511. 121. Westermann W, Schobi R, Rieber EP, Frank KH. Th2 cells as effectors in postirradiation pulmonary damage preceding fibrosis in the rat. International Journal of Radiation Biology 1999;75:629-638. 122. Huang M, Wang J, Lee P, et al. Human nonsmall cell lung cancer cells express a type 2 cytokine pattern. Cancer Res 1995;55:3847-3853. 123. Buttner C, Skupin A, Reimann T, et al. Local production of interleukin-4 during radiation-induced pneumonitis and pulmonary fibrosis in rats. Macrophages as predominant source of interleukin-4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 1997;17:315-325. 106 124. Aldenborg F, Nilsson K, Jarlshammar B, Bjermer I, Enerback L. Mast cells and biogenic amines in radiation-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 1993;8:112-117. 125. Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978;52:302- 310. 126. Miller NJ, Rice-Evans C, Davies MJ, Gopinathan V, Milner A. A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin Sci 1993;84:407-412. 127. Fenech M. The in vitro micronucleus assay. Mutat Res 2000;455:81-95. 128. Boyum A. A one-stage procedure for isolation of granulocytes and lymphocytesfrom human blood. General sedimentation properties of white blood cells in a 1g gravity field. Scand J Clin Lab Invest Suppl 1968;97:51-76. 129. Shounan Y, Feng X, and O’Connell PJ. Apoptosis detection by annexin V binding: a novel method for the quantitation of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods 1998; 217:61-70. 130. Kallmann BA, Hüther M, Tubes M, et al. Systemic bias of cytokine production toward cell-mediated immune regulation in IDDM and toward humoral immunity in Graves' disease. Diabetes 1997;46:237-243. 131. Valko М, Leibfritz D, Moncol J, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2007;39:44–84. 132. Stevanović J, Borozan S, Jović S, Ignjatović I. Fiziologija slobodnih radikala, Vet. glasnik 2011;65 (1-2):95-107. 107 133. Yamamori T, Yasui H, Yamazumi M, et al. Ionizing radiation induces mitochondrial reactive oxygen species production accompanied by upregulation of mitochondrial electron transport chain function and mitochondrial content under control of the cell cycle checkpoint. Free Radic Biol Med 2012;53:260-270. 134. Riley PA: Free radicals in biology: oxidative stress and the effects of ionizing radiation. Int J Radiat Biol 1994;65:27-33. 135. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2005;15:316–328. 136. Davies KJ, Seranian A, Muakkassah KFS, Hoshhstein P. Uric acid- iron complex. A new aspect of the antioxidant function of uric acid. Biochem J 1986;235:747-754. 137. Abiaka C, Al-Awadi F, Al-Sayer H, et al. Serum antioxidant and cholesterol levels in patients with different types of cancer. J Clin Lab Anal 2001;15:324-330. 138. Du ZX, Zhang HY, Meng X, Guan Y, Wang HQ. Role of oxidative stress and intracellular glutathione in the sensitivity to apoptosis induced by proteasome inhibitor in thyroid cancer cells. BMC Cancer 2009;9:56–67. 139. Erdamar H, Cimen B, Gülcemal H, Saraymen R, Yerer B, Demirci H. Increased lipid peroxidation and impaired enzymatic antioxidant defense mechanism in thyroid tissue with multinodular goiter and papillary carcinoma. Clin Biochem 2010;43:650–654. 140. Laatikainen LE, Castellone MD, Hebrant A, et al. Extracellular superoxide dismutase is a thyroid differentiation marker downregulated in cancer. Endocr Rel Cancer 2010;17:785– 796. 141. Akinci M, Kosova F, Cetin B, et al. Oxidant/antioxidant balance in patients with thyroid cancer. Acta Cir Bras 2008;23:551-554. 108 142. Sadani GR, Nadkarni GD. Role of tissue antioxidant defence in thyroid cancers. Cancer Lett 1996;109:231-235. 143. Young O, Crotty T, O'Connell R, O'Sullivan J, Curran AJ. Levels of oxidative damage and lipid peroxidation in thyroid neoplasia. Head Neck 2010;32:750-756. 144. Konukoğlu D, Hatemi HH, Arican S, Demir M, Akcay T. Radioiodine treatment and oxidative stress in thyroidectomised patients for differentiated thyroid cancers. Pharmacol Res 1998;8:311-315. 145. Makarewicz J, Lewiński A, Karbownik-Lewińska M. Radioiodine remnant ablation of differentiated thyroid cancer does not further increase oxidative damage to membrane lipids - early effect. Thyroid Res 2010;3:7-10. 146. Bartoc R, Dumitrescu C, Belgun M, Olinescu R. Oxidative and antioxidative factors in the serum of thyroid cancer patients treated with 131I. Rom J Endocrinol 1993;31:85-87. 147. Monteiro GO, Oliveira NG, Rodrigues AS, et al. Cytogenetic alterations and oxidative stress in thyroid cancer patients after iodine-131 therapy. Mutagenesis 2000;15:69-75. 148. Pereira B, Rosa LF, Safi DA, Bechera ES, Curi R. Control of superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase activities in rat lymphoid organs by thyroid hormones. J Endocrinol 1994;140:73-77. 149. Torun AN, Kulaksizoglu S, Kulaksizoglu M, Pamuk BO, Isbilen E, Tutuncu NB. Serum total antioxidant status and lipid peroxidation marker malondialdehyde levels in overt and subclinical hypothyroidism. Clin Endocrinol 2009;70:469-474. 150. Pucci E, Chiovalto L, Pinchera A. Thyroid and lipid metabolism. Int J Obesity 2004;24:109-12. 151. Duntas LH, and Biondi B. Short-term hypothyroidism after levothyroxine-withdrawal in patients with differentiated thyroid cancer: clinical and quality of life consequences. European Journal of Endocrinology 2007;156:13-19. 109 152. Gullu S, Sav H, and Kamel N. Effects of levothyroxine treatment on biochemical and hemostasis parameters in patients with hypothyroidism. European Journal of Endocrinology 2005;152:355–61. 145 153. Prakash A, and Lal AK. Serum lipids in hypothyroidism: our experience. Indian Journal of Clinical Biochemistry 2006;21(2):153-5. 146 154. Wu H, Zuo S, Ma C, et al. Short-term overt hypothyroidism affect on lipids after thyroxine-withdrawal in patients with differentiated thyroid carcinoma. The Chinese- German Journal of Clinical Oncology 2009;8(11):647-9. 147 155. Sunanda V, Sangeeta S, Prabhakar rao B. Study of lipid profile in hypothyroidism. Int J Biol Med Res 2012;3(1):1373-6. 148 156. Canaris GJ, Manowitz NR, Mayor G, Ridqway EC. The Colorado thyroid disease prevalence study. Arch Intern Med 2000;160(4):526-34. 157. Pearce EN. Hypothyroidism and dyslipidemia: modern concepts and approaches. Curr Cardiol Rep 2004;6:451-6. 158. Regalbuto C, Alagona C, Maiorana R, et al. Acute changes in clinical parameters and thyroid function peripheral markers follow ing L-T4 withdrawal in patients totally thyroidectomized for thyroid cancer. J Endocrinol Invest 2006;29(1):32-40. 159. Saini V, Yadav A, Arora S, Singh R, and Bhattacharjee J. Association between different degrees of hypothyroidism and serum lipids. Internet Journal of Medical Update 2012;7(2):3-8. 160. Regmi A, Shah B, Rai BR, and Pandeya A. Serum lipid profile in patients with thyroid disorders in central Nepal. Nepal Med Coll J 2010;12(4):253-6. 161. Yilmaz IA, Akçay T, Cakatay U, Telci A, Ataus S, Yalçin VR. Relation between bladder and protein oxidation. Int Urol Nephrol 2003;35:345–50. 110 162. Chandran V, Anitha M, Avinash SS, Rao GM, Shetty BV, Sudha K. Protein oxidation: a potential cause of hypoalbuminemia in oral cancer. Biomed Res 2012;23:227-30. 163. Gälman C, Matasconi M, Persson L, Parini P, Angelin B, and Rudling M. Age-induced hypercholesterolemia in the rat relates to reduced elimination but not increased intestinal absorption of cholesterol. Am J Physiol Endocrinol Metab 2007;293:E737–E742. 164. Gesing A, Lewiński A, and Karbownik-Lewińska M. The thyroid gland and the process of aging: what is new? Thyroid Research 2012;5:16. 165. Bremner AP, Feddema P, Leedman PJ, et al. Age-related changes in thyroid function: a longitudinal study of a community-based cohort. J Clin Endocrinol Metab 2012;97(5):1554–62. 166. Fenech М, Bolognesi C, Kirsch-Volders M, et al. Harmonisation of the micronucleus assay in human buccal cells-a Human Micronucleus (HUMN) project (www.humn.org) initiative commencing in 2007. Mutagenesis 2007;22: 3-4. 167. Evans HJ, Neary GJ, and Williamson FS. The relative biological efficiency of single doses of fast neutrons and gamma-rays on Vicia faba roots and the effect of oxygen. Part II. Chromosome damage: the production of micronuclei. Int J Radiat Biol 1959;1:216-229. 168. Livingston GK, Foster AE, Elson HR. Effect of in vivo exposure to iodine-131 on the frequency and persitence of micronuclei in human lymphocytes. J Toxicol Environ Health 1993;40:367-375. 169. Watanabe N, Yokoyama K, Kinuya S, et al. Radiotoxicity after iodine-131 therapy for thyroid cancer using the micronucleus assay. J Nucl Med 1998;39:436–440. 170. Hooman A, Mogharrabi M, Mosaffa N, Tabeie F, Shafiee B, Neshandar AE. Cytological radiotoxicity of radioiodine therapy in patients with differentiated thyroid carcinoma. Iranian J Endocrinol Metab 2008;9:351-356. 111 171. Baugnet-Mahieu L, Lemaire M, Leonard A, Gerber GB. Chromosome aberrations after treatment with radioactive iodine for thyroid cancer. Radiat Res 1994;140:429–431. 172. Gundy S, Katz N, Fuzy M, Esik O. Cytogenetic study of radiation burden in thyroid disease patients treated with external irradiation or radioiodine. Mutat Res 1996;360:107- 113. 173. Puerto S, Marcos R, Ramírez MJ, Galofré P, Creus A, Surrallés J. Equal induction and persistence of chromosome aberrations involving chromosomes 1, 4 and 10 in thyroid cancer patients treated with radioactive iodine. Mutat Res 2000;469:147-158. 174. Ballardin M, Gemignani F, Bodei L, et al. Formation of micronuclei and of clastogenic factor(s) in patients receiving therapeutic doses of iodine-131. Mutat Res 2002;514:77–85. 175. Gutierrez S, Carbonell E, Galofre P, Xamena N, Creus A, Marcos R. A cytogenetic follow -up study of thyroid cancer patients treated with 131I. Cancer Letters 1995;91:199- 204. 176. Erselcan T, Sungu S, Ozdemir S, Turgut B, Dogan D, Ozdemir O. Iodine-131 treatment and chromosomal damage: in vivo dose–effect relationship. Eur J Nucl Med Mol Imag 2004;31:676–684. 177. Sigurdson AJ., Hauptmann M, Alexander BH,et al. DNA damage among thyroid cancer and multiple cancer cases, controls and long-lived individuals. Mutat Res 2005;586:173-188. 178. Joseph LJ, Bhartiya US, Raut YS, Kand P, Hawaldar RW, Nair N. Micronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes of thyroid cancer patients after radioiodine therapy and its relationship with metastasis. Mutat Res 2009;675: 35-40. 179. Popova L, Hadjidekova V, Hadjieva T, Agova S, Vasilev I. Cytokinesis-block micronucleus test in patients undergoing radioiodine therapy for differentiated thyroid carcinoma. Hell J Nucl Med 2005;8:54-57. 112 180. Jianlin L, Jiliang H, Lifen J, Wei Z, Baohong W, Hongping D. Measuring the genetic damage in cancer patients during radiotherapy with three genetic end-points. Mutagenesis 2004;19:457-464. 181. Monsieurs M, Thierens HM, Vral A, Van De Wiele C, De Ridder LI, Dierckx R. Adaptive response in patients treated with 131I. J Nucl Med 2000;41:17-22. 182. Kita T, Yokoyama K, Higuchi T, et al. Multifactorial analyses on the short-time side effects occuring within 96 hours after radioiodine-131 therapy for differentiated thyroid carcinoma. Ann Nucl Med 2004;18:345-349. 183. Fenech M, Morley AA. Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in vivo ageing and low dose X irradiation. Mutat Res 1986;161:193- 198. 184. Fenech M, Neville S, Rinaldi J. Sex is an important variable affecting spontaneous micronucleus frequency in cytokinesis-blocked lymphocytes. Mutat Res 1994;313:203– 207. 185. Touil N, Aka PV, Buchet JP, Thierens H, Kirsch-Volders M. Assessment of genotoxic effects related to chronic low level exposure to ionizing radiation using biomarkers for DNA damage and repair. Mutagenesis 2002;17(3):223-32. 186. Bonassi S, Neri M, Lando C, et al. Effect of smoking habit on the frequency of micronuclei in human lymphocytes: results from the Human MicroNucleus project. Mutation Research 2003;543:155-166. 187. Favaloro B, Allocati N, Graziano V, Di Ilio C, and De Laurenzi V. Role of apoptosis in disease. Aging 2012;4(5):330-349. 188. Vaux DL,Korsmeyer SJ. Cell death in development. Cell 1999;96:245-54. 113 189. Reinhardt HC, Schumacher B. The p53 network: cellular and systemic DNA damage responses in aging and cancer. Trends Genet 2012;28(3):128-36. 190. Willingham MC. Cytochemical methods for the detection of apoptosis. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 1999;47(9):1101-1109. 191. Bursch W, Paffel S, Putz B, Barthel G, and Schulte-Hermann R. Determination of the length of the histological stages of apoptosis in normal liver and in altered hepatic foci of rats. Carcinogenesis 1990;11(5):847-853. 192. Guo GZ, Sasai K, Oya N, et al. Simultaneous evaluation of radiation-induced apoptosis and micronuclei in five cell lines. Int J Radiat Biol 1998;73:297-302. 193. Belyakov OV, Prise KM, Trott KR, Michael BD. Delayed lethality, apoptosis and micronuclei formation in human fibroblast irradiated with X-rays or α-particles. Int J Radiat Biol 1999;75:985-993. 194. Simko M, Kriehuber R, Weiss DG, Luben RA. Effects of 50Hz EMF exposure on micronucleus formation and apoptosis in transformed and non transformed human cell line. Bioelectromagnetics 1998;19:85-91. 195. Liu Z, Huang WY, Li XS, et al. Prediction value of radiosensitivity of hepatocarcinoma cells for apoptosis and micronucleus assay. World J Gastroenterol 2005;11:7036-7039. 196. Utani K, Konho Y, Okamoto A, Shimizu N. Emergence of micronuclei and their effects on the fate of cells under replication stress. PLoS ONE 2010;5:e10089. 197. Crompton NEA, Shi Y, Emery GC, et al. Sources of variation in patient response to radiation treatment. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001;49:547-554. 198. Solomon WL, Meehan KA, Gihwala D, Slabbert JP. Leukocyte apoptosis and micronuclei induction in individuals with varying sensitivity to ionizing radiation. Medical Technol SA 2010;24:29-32. 114 199. Decordier I, Dillen L, Cundari E, Kirsch-Volders M. Elimination of micronucleated cells by apoptosis after treatment with inhibitors of microtubules. Mutagen 2002;17:337- 344. 200. Meintieres S, Biola A, Pallardym M, Marzin D. Using CTLL-2 and CTLL-2 bcl2 cells to avoid interference by apoptosis in the in vitro micronucleus test. Environ Mol Mutagen 2003;41:14-27. 201. Fenech M, Crott J, Turner J, Brow S. Necrosis, apoptosis, cytostasis and DNA damage in human lymphocytes measured simultaneously within the cytokinesis-block micronucleus assay: description of the method and results for hydrogen peroxide. Mutagenesis 1999;14:605-612. 202. Van Nostrand D. The benefits and risks of I-131 therapy in patients with well- differentiated thyroid cancer. Thyroid 2009;19:1381-91. 203. Sönmez B, Doğan İ, Yavruoğlu C, Can G, Sönmez M. The changes in complete blood count in thyroid cancer patients treated with radioactive iodine ablation therapy. Turk J Hematol 2010;27:269-74. 204. Keldsen N, Mortensen BT, Hansen HS. Haematological effects from radioiodine treatment of thyroid carcinoma. Acta Oncol 1990;29:1035-9. 205. Grunwald F, Schomburg A, Menzel C, et al. Changes in the blood picture after radioiodine therapy of thyroid cancer. Med Klin (Munich) 1994;89:522-8. 206. Molinaro E, Leboeuf R, Shue B, et al. Mild decreases in white blood cell and platelet counts are present one year after radioactive iodine remnant ablation. Thyroid 2009;19:1035-41. 207. Vrndic O, Milosevic-Djordjevic O, Djurdjevic P, et al. Radioiodine therapy accelerates apoptosis in peripheral blood lymphocytes of patients with differentiated thyroid cancer. Neoplasma 2013;60(5):568-575. 115 208. Rosário PW, Borges MA & Purisch S. Preparation with recombinant human thyroid- stimulating hormone for thyroid remnant ablation with 131I is associated with lowered radiotoxicity. J Nucl Med 2008;49:1776-82. 209. Lloyd DC & Dolphin GW. Radiation-induced chromosome damage in human lymphocytes. Occup Environ Med 1977;34:261-73. 210. Prosser JS. Survival of human T and B lymphocytes after X-irradiation. Int J Radiat Biol 1976;30:459-65. 211. Bauernhofer T, Kuss I, Henderson B, Baum AS, Whiteside TL. Preferential apoptosis of CD56dim natural killer cell subset in patients with cancer. Eur J Immunol 2003;33:119-24. 212. Hossain S, Bhimani C, Chen Z, et al. Comparison of native and adaptive immunity profiles of healthy volunteers and patients with well-differentiated thyroid cancer. ASCO Meeting Abstr 2011;29:5585. 213. Botella-Carretero JI, Prados A, Manzano L, et al. The effect of thyroid hormones on circulating markers of cell-mediated immune response, as studied in patients with differentiated thyrod carcinoma before and during thyroxine withdrawal. Eur J Endocrinol 2005;153:223-30. 214. Whiteside TL & Herberman RB. The role of natural killer cells in immune surveillance of cancer. Curr Opin Immunol 1995;7:704-10. 215. Wulff S, Pries R, Borngen K, Trenkle T, Wollenberg B. Decreased levels of circulating regulatory NK cells in patients with head and neck cancer throughout all tumor stages. Anticancer Res 2009;29:3053-8. 216. Blomgren H, Wasserman J, Littbrand B. Blood lymphocytes after radiation therapy of carcinoma of prostate and urinary bladder. Acta Radiol (Therapy Phys Biol) 1974;13:357- 367. 116 217. Martinon F, Major A, Tschopp J. The inflammasomes guardians of the body. Annu Rev Immunol 2008;27:229-265. 218. Balua AC, Simon A, Maddipati R, et al. Mitochondrial reactive oxigen species promote production of proinflammatory cytokines and are elevated in TNR1-associated periodic synrome (TRAPS). J Exp Med 2011;208:519-533. 219. Okunieff P, Chen V, Maguire DJ, Huser AK. Molecular markers of radiation-related normal tissue toxicity. Cancer Metastasis Res 2008;27:363-374. 220. Pellegrini P, Berghella AM, Del Berto T, et al. Disregulation in TH1 and TH2 subsets of CD4+ T cells in peripheral blood of colorectal cancer patients and involvement in cancer establishment and progression. Cancer Immunol Immunother 1996;42:1-6. 221. Kozlowski L, Zakrzewska I, Tokajuk P, Wojtukiewicz MZ. Concentrations of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and interleukin-10 (IL-10) in blood serum of breast cancer patients. Rocz Akad Med Bialymst 2003;48:82-84. 222. Guney N, Soydinc HO , Basaran M, et al. Serum levels of interleukin-6 and interleukin- 10 in Turkish patients with aggressive non-Hodgkin’s lymphoma. Asian Pacific J Cancer Prev 2009;10:669-674. 223. Yamazaki K, Yamo T, Kameyama T, et al. Clinical significance of serum TH/1TH2 cytokines in patients with pulmonary adenoma. Surgery 2002;131:S236-241. 224. Kim МЈ, Jang ЈW, Oh BS, et al. Change in inflammatory cytokine profiles after transarterial chemotherapy in patients with hepatocellular carcinoma. Cytokine 2013;64:516–522. 225. Bartalena L, Brogioni S, Grasso L, et al. Interleukin-6: a marker of thyroid destructive processes? J Clin Endocrinol Metabol 1994;79:1424-1427. 117 226. Murai H, Murakami S, Ishida K, Sugawara M. Elevated serum interleukin-6 and decreased thyroid hormone levels in postoperative patients and effects of IL-6 on thyroid cell function in vitro. Thyroid 1996;6:601-606. 227. Özata M, Ergun H, Özişik G, et al. Effect of radioiodine therapy on several hematological and immune parameters in patients with differentiated thyroid carcinoma. Turkish Journal of Endocrinology and Metabolism 2000;2:45-50. 228. O’Hanlon DM, Lynch J, Cormican M, Given HF. The acute phase response in breast carcinoma. Anticancer Res 2002;22:1289–93. 229. Alexandrakis MG, Passam FH, Moschandrea IA, et al. Levels of serum cytokines and acute phase proteins in patients with essential and cancer-related thrombocytosis. Am J Clin Oncol 2003;26:135–40. 230. Jabs WJ, Busse M, Kruger S, et al. Expression of C-reactive protein by renal cell carcinomas and unaffected surrounding renal tissue. Kidney Int 2005;68:2103–10. 231. Nozoe T, Korenaga D, Futatsugi M, et al. Immunohistochemical expression of C reactive protein in squamous cell carcinoma of the esophagus—significance as a tumor marker. Cancer Lett 2003;192:89–95. 232. Wigmore SJ, Fearon KC, Sangster K, et al. Cytokine regulation of constitutive production of interleukin-8 and -6 by human pancreatic cancer cell lines and serum cytokine concentrations in patients with pancreatic cancer. Int J Oncol 2002;21:881–6. 233. Lehrer S, Diamond EJ, Mamkine B, et al. C-reactive protein is significantly associated with prostate-specific antigen and metastatic disease in prostate cancer. BJU Int 2005;95:961-2. 234. Lucey DR, Clerici M, Shearer GM. Type 1 and type 2 cytokine dysregulation in human infectious, neoplastic, and inflammatory diseases. Clin Microbiol Rev 1996;9:532–562. 118 235. Li H, Rostami A. IL-9: basic biology, signaling pathways in CD4+ T cells and implications for autoimmunity. J Neuroimmune Pharmacol 2010;5(2):198-209. 236. Sparano A, Lathers DMR, Achille N, Petruzzelli GJ, Young MRI. Modulation of Th1 and Th2 cytokine profiles and their association with advanced head and neck squamous cell carcinoma. Otolaryngology - Head and Neck Surgery 2004;131:573– 576. 237. Kataoka S, Konishi Y, Nishio Y, Fujikawa-Adachi K, Tominaga A. Antitumor activity of eosinophils activated by IL-5 and eotaxin against hepatocellular carcinoma. DNA Cell Biol 2004;23(9):549-60. 238. Simson L, Ellyard JI, Dent LA, et al. Regulation of carcinogenesis by IL-5 and CCL11: a potential role for eosinophils in tumor immune surveillance. J Immunol 2007;178:4222 - 4229. 239. Jovanovic IP, Pejnovic NN, Radosavljevic GD, Arsenijevic NN, Lukic ML. IL-33/ST2 axis in innate and acquired immunity to tumors. Oncoimmunology 2012;1(2):229-231. 240. Hallett МА, Venmar KT, Fingleton B. Cytokine stimulation of epithelial cancer cells: the similar and divergent functions of IL-4 and IL-13. Cancer Res 2012;72:6338-6343. 241. Elsasser-Beile U, Kolble N, Grussenmeyer T, et al. Th1 and Th2 cytokine response patterns in leukocyte cultures of patients with urinary bladder, renal cell and prostate carcinomas. Tumour Biol 1998;19:470–6. 242. Wise GJ, Marella VK, Talluri G, Shirazian D. Cytokine variations in patients with hormone treated prostate cancer. J Urol 2000;164:722–5. 243. Jovanovic I, Radosavljevic G, Mitrovic M, et al. ST2 deletion enhances innate and acquired immunity to murine mammary carcinoma. Eur J Immunol 2011;41(7):1902-12. 244. Fujisawa T, Terada A, Atsuta J, Iguchi K, Kamiya H, Sakurai M. IL-5 as a strong secretagogue for human eosinophils. Int Arch Allergy Immunol 1997;114(1):81–83. 119 245. Gatault S, Legrand F, Delbeke M, Loiseau S, Capron M. Involvement of eosinophils in the anti-tumor response. Cancer Immunol Immunother 2012;61(9):1527-34. 246. Mattes J, Hulett М, Xie W, et al. Immunotherapy of cytotoxic T cell-resistant tumors by T helper 2 cells: an eotaxin and STAT6-dependent process. J Exp Med 2003;197: 387–393. 247. Ellyard JI, Simson L, Parish CR. Th2-mediated anti-tumour immunity: friend or foe? Tissue Antigens 2007;70(1):1-11. 248. Modesti A, Masuelli L, Modica A, et al. Ultrastructural evidence of the mechanisms responsible for interleukin-4-activated rejection of a spontaneous murine adenocarcinoma. Int J Cancer 1993:53:988–93. 249. Musiani P, Allione A, Modica A, et al. Role of neutrophils and lymphocytes in inhibition of a mouse mammary adenocarcinoma engineered to release IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IFN- alpha, IFN-gamma, and TNF-alpha. Lab Invest 1996:74:146–57. 250. Tepper RI, Coffman RL, Leder P. An eosinophil-dependent mechanism for the antitumor effect of interleukin-4. Science 1992:257:548–51. 251. Lebel-Binay S, Laguerre B, Quintin-Colonna F, et al. Experimental gene therapy of cancer using tumor cells engineered to secrete interleukin-13. Eur J Immunol 1995:25:2340–8. 252. Ma HL, Whitters MJ, Jacobson BA, Donaldson DD, Collins M, Dunussi-Joannopoulos K. Tumor cells secreting IL-13 but not IL-13Ralpha2 fusion protein have reduced тumorigenicity in vivo. Int Immunol 2004:16:1009–17. 253. Terabe M, Matsui S, Noben-Trauth N, et al. NKT cell-mediated repression of tumor immunosurveillance by IL-13 and the IL-4R-STAT6 pathway. Nat Immunol 2000:1:515– 20. 254. Purwar R, Schlapbach C, Xiao S, et al. Robust tumor immunity to melanoma mediated by interleukin-9-producing T cells. Nat Med 2012;18:1248-1253. 120 255. Jones BM, Kwok CCH, Kung AWC. Effect of radioactive iodine on cytokine production in Graves disease: transient increases in interleukin 4 (IL-4), IL-6, IL-10, and tumor necrosis factor-α, with longer term increases in interferon-ɣ production. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:4106-4110. 256. Ito N, Nakamura H, Tanaka Y, Ohgi S. Lung carcinoma: analysis of T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1 and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry. Cancer 1999;85:2359-236. 257. Mori T, Takada R, Watanabe R, Okamato S, Ikeda Y. T-helper Th/1Th2 imbalance in patients with previously untreated B-cell diffuse large cell lymphoma. Cancer Immunol Immunother 2001;50:566-568. 121