УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ФАКУЛТЕТ МЕДИЦИНСКИХ НАУКА Марина Т. Томовић Испитивање антимикробног, антиинфламаторног и антихистаминског дејства екстракта Potentilla reptans L Докторска дисертација Крагујевац, 2014. година 2 Најискреније се захваљујем свом ментору доц. др. Снежани Цупари, која је предложила тему, а своје знање и искуство несебично пружала у току израде и писања овог рада. Посебну захвалност упућујем проф. др. Слободану Јанковићу који је омогућио реализацију овог рада, а својим саветима и искуством ме усмеравао и подржавао током свих фаза његове израде. Желим да се захвалим доц. др. Биљани Љујић и асист др. Ани Радовановић на учешћу у експерименталном раду, као и асист. Снежани Бранковић са Природно – математичког факултета у Крагујевцу на смерницама из области ботанике. Овим путем се захваљујем свима који су на било који начин допринели изради ове докторске дисертације. Немерљиву захвалност упућујем мојој сестри дипл. пх. спец. Марији Поповић – Миленковић која је својом несебичном подршком, саветима и разумевањем учинила мој пут лакшим и бржим. Мом супругу и деци се захваљујем на љубави, стрпљењу, подршци и разумевању. Ову дисертацију посвећујем својим родитељима Оцу Томиславу и мајци Гордани. 3 Садржај 1. Увод ................................................................................................................................................ 7 1.1. Фамилија Rosaceae ................................................................................................................ 9 1.2. Род Potentilla.......................................................................................................................... 9 1.3. Ботаничке карактеристике рода Potentilla L. (Rosaceae) ................................................. 10 1.4. Ботаничке карактеристике врсте P. reptans L. .................................................................. 11 1.5. Хемијски састав биљака из рода Potentilla ....................................................................... 12 1.5.1. Секундарни метаболити рода Potentilla .................................................................... 12 1.5.1.1. Танини ......................................................................................................................... 12 1.5.1.2. Флавоноиди ................................................................................................................ 13 1.5.1.3. Фенолне киселине ...................................................................................................... 13 1.5.1.4. Тритерпеноиди .......................................................................................................... 13 1.5.2. Значај и порекло секундарних биљних метаболита ................................................ 14 1.5.3. Хемијски састав корена и ризома рода Potentilla .................................................... 15 1.5.4. Хемијски састав хербе рода Potentilla....................................................................... 16 1.5.5. Хемијски састав врсте P. reptans L. ........................................................................... 16 1.6. Употреба врсте рода Potentilla у традиционалној медицини .......................................... 17 1.7. Фармаколошко деловање рода Potentilla .......................................................................... 18 1.7.1. In-vitro фармаколошко деловање ............................................................................... 20 1.7.1.1. Анти-туморска активност................................................................................... 20 1.7.1.2. Антивирусна и антимикробна активност.......................................................... 20 1.7.1.3. Антиинфламаторна и хепатопротективна активност ...................................... 21 1.7.1.4. Антиоксидантна активност ................................................................................ 21 1.7.1.5. Антихипергликемијска активност ..................................................................... 22 1.7.2. In-vivo фармаколошко деловање ................................................................................ 22 1.7.2.1. Анти-улцерогена активност ............................................................................... 22 1.7.2.2. Анти-неопластична активност ........................................................................... 22 1.7.2.3. Антихипергликемијска активност ..................................................................... 22 1.7.2.4. Антиинфламаторна и хепатопротективна активност ...................................... 22 1.7.2.5. Антиоксидантна активност ................................................................................ 23 1.7.3. Клиничке студије ........................................................................................................ 23 1.7.3.1. Антидијароички ефекат ...................................................................................... 23 1.7.3.2. Анти-улцерогена активност ............................................................................... 24 1.8. Фармаколошко деловање врсте P. reptans ........................................................................ 24 4 1.8.1. Анти-улцерогена активност ....................................................................................... 24 1.8.2. Антиоксидантна активност ........................................................................................ 24 2. Циљеви и хипотезе ...................................................................................................................... 26 2.1. Циљеви ................................................................................................................................. 26 2.2. Хипотезе .............................................................................................................................. 26 3. Материјал и методе ..................................................................................................................... 27 3.1. Припрема узорака ............................................................................................................... 27 3.1.1. Порекло биљног материјала ....................................................................................... 27 3.1.2. Припрема биљног материјала за екстракцију .......................................................... 27 3.1.3. Добијање екстраката ................................................................................................... 27 3.2. Хемијска анализа водених екстраката P. reptans ............................................................. 28 3.2.1. Одређивање укупних фенола ..................................................................................... 28 3.2.2. Одређивање саржаја укупних флавоноида ............................................................... 30 3.2.3. Одређивање садржаја проантоцијанидина ............................................................... 33 3.2.4. Квалитативно и квантитативно одређивање фенолних једињења ......................... 35 3.2.5. Одређивање антиоксидантне активности ................................................................. 38 3.3. Испитивање антиинфламаторне активности .................................................................... 41 3.3.1. Експерименталне животиње ...................................................................................... 42 3.3.2. Поступак ...................................................................................................................... 42 3.4. Испитивање цитотоксичне активности ............................................................................. 43 3.5. Испитивање антихистаминске активности ....................................................................... 44 3.6. Испитивање антимикробне активности ............................................................................ 46 3.7. Статистичке методе ............................................................................................................ 47 3.7.1. Антиинфламаторна активност ................................................................................... 47 3.7.2. Цитотоксична активност ............................................................................................ 47 3.7.3. Антихистаминска активност ...................................................................................... 48 3.7.4. Статистичка анализа антимикробне активности ..................................................... 48 4. Резултати ...................................................................................................................................... 49 4.1. Хемијски састав водених екстраката хербе и ризома P. reptans .................................... 49 4.2. Антиоксидантна активност хербе и ризома P. reptans .................................................... 52 4.3. Aнтиинфламаторна активност хербе и ризома P. reptans ............................................... 54 4.4. Цитотоксична активност хербе и ризома P. reptans ........................................................ 54 4.5. Антихистаминска активност хербе и ризома P. reptans .................................................. 56 4.5.1. Спонтана активност и ефекти хистамина ................................................................. 56 5 4.5.2. Ефекти екстракта хербе P. reptans L ......................................................................... 57 4.5.3. Ефекти екстракта ризома P. reptans L ....................................................................... 57 4.6. Антимикробна активност хербе и ризома P. reptans ....................................................... 58 5. Дискусија ..................................................................................................................................... 63 6. Закључци ...................................................................................................................................... 76 7. Литература ................................................................................................................................... 78 6 Слика 1. Potentilla reptans L Увод 7 1. Увод Природни производи који потичу од биљака, животиња, микроорганизама, минерала заузимају значајно место у медицини. Записи старих Грка, Египћана, Кинеза, Индијанаца, као и Библијски текстови показују да су биљке од давнина коришћене у терапијске сврхе. Оне представљају важан извор добијања лековитих препарата још од времена када су први пут уочена и забележена њихова лековита својства све до данас (1). Лековите биљке су се користиле као дроге (осушени прописани делови биљака који садрже лековите супстанце) или као екстракати за добијање различитих лековитих препарата, тако да је терапија биљним екстрактима или једињењима изоловним из њих представљала у једном периоду историје дуго једини незаменљиви начин лечења. У XIX веку, који је обележен индустријском револуцијом дошло је и до развоја фармацеутске, хемијске и козметичке индустрије. Медицнски биоактивна једињења добијана из биљака коришћена су као модел за структурне измене као и за развој нових, функционалнијих једињења. Многе супстанце добијане изоловањем из биљака, су синтетисане хемијским путем као деривати или аналози, а синтетишу се и нови молекули који немају структуралну сличност са почетним једињењима из биљног света. Овакав вид добијања лековитих супстанци је дошао до изражаја средином XX века, када је осмишљавање нових синтетичких лекова било у циљу повећане безбедности и ефикасности терапије. Иако је у овом периоду настао огроман број синтетичких молекула, не сме се занемарити чињеница да тренутно око 250 000 биљних врста садрже много већу разноврсност биоактивних једињења и представљају супериорнији извор лековитих супстанци него постојећи ресурси фармацеутске и хемијске индустрије (2). Крајем XX и почетком XXI века долази до пораста интересовања и експлоатације биљака у медицини, пре свега због мање токсичности биљних препарата. Данас фитотерапија заузима важно место у медицини а у модерној фармацеутској пракси заступљени су и природни и синтетски лекови. Око 50% лекова на светском тржишту су биљни препарати (3). Фитотерапија се користи или као самостална терапија код блажих форми обољења или као комплементарна терапија. Интересовање за примену природних препарата је у порасту и у козметици са циљем смањења употребе синтетичких сировина и повећања апликације препарата који садрже екстракте биљних Увод 8 дрога. Употреба лековитих и зачинских биљака у прехрамбеној индустрији или биљних сировина у хемијској индустрији је такође у порасту (1). Филозофија савремене медицине заузима став да се сва обољења лече што једноставнијом терапијом. На основу овога у терапији се примењује кад год је то могуће једна врста лековитих супстанци ради постизања мање штетних ефеката. Овакав приступ имао је за последицу смањење ефикасности терапије код великог броја обољења услед повећања отпорности изазивача болести на саме лекове. Комплексне болести захтевају присуство више терапијски активних супстанци што је основа конвенционалне медицине. Данас је приступ лечењу заснован на примени комбинација биљних препарата и синтетских лекова који се прилагођавају пацијенту и стадијуму болести. На овај начин се омогућава постизање синергистичког ефекта различитих изолованих компоненти и комплексних биљних мешавина молекула (1). Постојање великог броја биоактивних једињења у биљкама је узроковано потребом за формирање одбрамбеног система биљке од биљоједа, микробиолошких и вирусних инфекција, као и за опстанак биљке у неповољним климатским условима. Биљке синтетишу структурно и функционално различита једињења која делују на патогене врсте и на тај начин превенирају развој резистенције. Са друге стране, поједини изоловани активни састојци биљака испољавају токсично деловање док ти исти састојци у смеши са другим молекулама у екстракту показују оптимално дејство. На тај начин екстракти биљака као комплексне смеше различитих биоактивних једињења често имају мању токсичност а већу ефикасност од појединачних супстанци изолованих из биљних екстраката (4). Деловање многих лековитих биљака често употребљаваних у традиционалној медицини је данас хемијски и фармаколошки потврђено, али је мало фармаколошких података о биљкама које се ређе користе. Од 250 000 познатих биљних врста у терапији се користи 119 једињења изолованих из 90 биљних врста. Чини се оправданим претпоставка да ће истраживања бити усмерена ка осталим врстама биљног света (3). Ово истраживање је имало за циљ да утврди и комплементира оскудне литературне податке о фармаколошком деловању врсте Potentilla reptans L. Rosaceae која се у традиционаланој медицини користи против различитих тегоба, сама или у комбинацији са другим биљкама, а у литератури је мало забележених истраживања. Увод 9 1.1. Фамилија Rosaceae Фамилија Rosaceae је распрострањена у различитим деловима света, садржи 115 родова и више од 3000 врста. Стабљике биљака ове фамилије се разликују и могу бити дрвенасте, грмолике или зељасте, једногодишње или вишегодишње. Према традиционалној подели по типу плода, ова фамилија је подељена на четири подфамилије: Rosoideae (орашица), Spiraeoideae (мешак), Amygdaloideae (коштуница) и Maloideae (јабука). Опсежна филогенетска истраживања су указала на извесне недостатке овакве поделе на основу типа плода и предложила другу класификацију, по којој је ова фамилија подељена на три подфамилије - Rosoideae, Dryodoideae, Spiraeoideae, при чему су подфамилији Spiraeoideae придодате субфамилије Amygdaloideae и Maloideae (5). У табели бр. 1. jе приказано филогенетско стабло рода Potentilla (6). Табела 1. Филогенетско стабло рода Potentilla Таксономске категорије Таксони Regnum (царство) Plantae Phylum (одељак) Tracheophyta Classis (разред) Magnoliopsida Subclassis (подкласа) Rosidae Ordo (ред) Rosales Familia (фамилија) Rosaceae Tribus (племе) Potentilleae Genus (род) Potentilla Linnaeus 1.2. Род Potentilla Род Potentilla припада фамилији Rosaceae и садржи преко двадесет врста. Врста reptans има неколико варијетета, Mollis (Borb.), Typica (Asch. et Graeb.) и Microphylla (Asch. et Graeb.). Назив рода потиче од латинске речи potens (моћан), која сугерише исцелитељску карактеристику рода (7). Стари Грци назвали су ову биљку pentáphyllon (πενταφυλλοη), а до 17. века широко распрострањен назив је био и quinquefolium, оба назива значе „петолиста“. У Словенији постоји велики број имена за овај род и скоро сва су везана за његове лековите карактеристике (8). У 18. веку након што је шведски Увод 10 ботаничар Linne израдио номенклатуру за родове и врсте, 1753. године P. reptans је добила ботанички назив - Potentilla reptans L. Род Potentilla се спомиње још у 16. веку, у књизи „New Kreuterbuch“ аутора Fuch-а који описује лековита својства неколико биљака из овог рода, као и P. reptans и лековите особине њеног надземног и подземног дела. Надземни део P. reptans се користи за припрему хомеопатских препарата према прописима америчке хомеопатске фармакопеје, немачке хомеопатске фармакопеје и других (9). У неким крајевима Србије ова биљка се назива челавица или трава од грознице, али најчешћи народни назив код нас је петопрсница, који потиче од карактеристичног распореда листова ове биљке (7). У Европи уобичајени називи за ову биљку су: европска цинквефолија, пузећа торментила, петопрста, петолиста трава. У Британији уобичајени назив је пузећа цинквефолија. 1.3. Ботаничке карактеристике рода Potentilla L. (Rosaceae) Иако се традиционална подела биљака фамилије Rosaceae у многоме разликује од новије класификације настале услед опсежних филогенетских испитивања, и по једној и по другој подели род Potentilla L припада подкласи Rosoidae, племену Potentilleae и обухвата преко 300 врста, углавном вишегодишњих, ређе двогодишњих или једногодишњих зељастих биљака (10). Биљке овог рода имају стабљику углавном пузећу, али се могу наћи мали жбунови или полужбунови различите длакавости. Листови су прстасто или перасто подељени. Цветови су двополни, петочлани, сакупљени у терминалне цвасти, или ређе смештени бочно на стабљици у облику звезде. Најчешће су жуте боје, али могу бити и бели, ружичасти, црвени и тамно црвени. Плод је орашица. Расте у умереној, алпској и арктичкој зони северне хемисфере. Неке врсте овог рода успевају само на кречњачком подручју, док другима такво подручје не погодује. Овај род може да опстане у отежаним условима животне средине, па неке врсте насељавају пустиње и степе, а друге тешко приступачне планинске венце или поларне пустиње (7, 8). Неке врсте овог рода се могу наћи и на високим планинским врховима Јужне Америке. Постојбином рода Potentilla се сматрају предели северо-западне Кине и европског дела Медитерана (11). Данас је овај род по својој распрострањености и разноликости врста највише заступљен у северном делу европског и азијског континента, а многе врсте се гаје и као украсне биљке (10, 12). Род Potentilla је подељен на 302 врсте које су груписане у две Увод 11 секције (Trichocarpae и Gymnocarpae) и велики број субсекција и група (13). У оквиру овог рода постоји велика морфолошка варијабилност врста, али и самог рода (појава хибридизације међу самим врстама, промена унутар самих врста, безполне репродукције - apomixis) (14). У табели бр. 2. jе приказан таксономски положај врсте Potentilla reptans (14). Табела 2. Таксономски положај врсте Potentilla reptans Таксономске категорије Таксони Genus (род) Potentilla Section (секција) Gymnocarpae Subsection (субцекција) Gomphostylae Group (група) Tormentillae Species (врста) P. reptans L. 1.4. Ботаничке карактеристике врсте P. reptans L. P. reptans је вишегодишња биљка са усправним ризомом. Ризом може бити различите дебљине, у зависности од станишта. У равничарским пределима ризом је танак и често се налази близу површине тла, док у планинским пределима ризом је дебео, разгранат и дубоко продире у земљу. Стабљика је зељаста, кончаста, пузећа и до 100 cm дугачка. Стабљика развија бочне изданке. Стабљика и изданци могу бити длакави или голи у зависности од поднебља (15). Планинске биљке су често прекривене густим длакама, док су у низијама стабљике углавном голе, црвенкасте боје и немају жлезде. Листови су прстасто распоређени, петочлани или седмочлани. Листови на врху стабљике могу бити трочлани или четворочлани и они се налазе на краћим дршкама. Листови су јајастог или дугуљасто-објајастог облика. Најчешће су назубљени или тестерасто назубљени. Цветови су жуте боје, петочлани, појединачно смештени у пазуху листова, са дугачким танким дршкама (15). P. reptans расте поред путева, у јарцима, поред обала, по влажним и мочварним ливадама. Налази се и у шумама храста и граба, као и по низинским шумама. Распрострањена је у великом делу Европе и Азије, а пренесена је у Северну и Јужну Америку, Аустралију и Нови Зеланд. У нашој земљи се сматра доста распрострањеном и коровском биљком (15). Увод 12 1.5. Хемијски састав биљака из рода Potentilla За одређивање хемијског састава представника рода Potentilla коришћени су екстракти различитих врста. Још 60-их година прошлог века утврђено је да су танини доминантна једињења овог рода, а касније су истраживања усмерена на одређивање и других секундарних метаболита (16-18). Присутни су флавоноиди, тритерпеноиди и фенолне киселине (19-23). 1.5.1. Секундарни метаболити рода Potentilla Најзаступљенија једињења овог рода су фенолна једињења (24). Она представљају хетерогену групу секундарних биљних метаболита широко распрострањену у биљном свету. По хемијској структури су ароматична једињења, са једним или више ароматичних прстенова, једном или више хидроксилних група. У фенолна једињења спадају фенолне киселине, флавоноиди, стилбени, кумарини и танини. Ова једињења се у биљкама налазе у слободном облику или у облику гликозида везани за различите шећерне остатке, или у облику комплекса са органским аминима, киселинама, липидима, угљеним хидратима и другим полифенолним једињењима. За биолошку активност гликозида је заслужан искључиво агликонски, фенолни део молекула. Нерастворни феноли су најчешће саставни део ћелијског зида, док се растворни феноли налазе унутар ћелијских структура. Ова једињења доприносе механичкој отпорности ћелијског зида, имају регулаторну улогу у расту и морфогенези биљке, као и у реакцији на стрес и патогене. Акумулација полифенолних једињења варира у зависности од физиолошког стања биљке. Ова група обухвата око 800 типова једињења. Они имају важну одбрамбену улогу, учествују као медијатори у реакцијама биљног метаболизма, а једна су од главних једињења која учествују у формирању боје, укуса и мириса. Најважнији представници ове групе за род Potentilla су: танини, флавоноиди и фенолне киселине (25). 1.5.1.1. Танини По својој хемијској структури танини спадају у полифенолна једињења која су растворна у води, опорог укуса и нетоксична, а деле се на хидтолизујуће и кондензоване танине. Хидролизујући танини су полиестри галне киселине и молекула шећера. Дејством киселина и ензима ови танини се разлажу на полифенолне киселине и шећер. Увод 13 Кондензовани танини настају кондензацијом неколико молекула флаван-3-ола (катехина и епикатехина) или ређе флаван-3,4-диола при чему настају проантоцијанидини (26). Фамилија Rosaceae се карактерише присуством кондензованих танина (26). Уколико су танини присутни у количини већој од 10 % дрога се сматра танинском дрогом. Код великог броја биљака танини су пратеће компоненте. Биолошки ефекти танина су последица стварања нерастворљивих комплекса тнина са беланчевинама, због чега поседују адстригентно, антимикробно, антиинфламаторно, антидијароично и антиоксидативно деловање. Користе се и као антидоти код тровања тешким металима или алкалоидима (26, 27). 1.5.1.2. Флавоноиди Највећа група биљних фенола, обухвата флавоноле, флавоне, флаваноне, флаваноле, изофлавоне и антоцианидине. Ова група једињења има широку примену у медицини. Флавоноиди позитивно утичу на смањење пермеабилности и повећање еластичности зида капилара (28). Испољавају диуретично деловање, и учествују у метаболизму арахидонске киселине узрокујући антиинфламаторну активност. Испољавају још и спазмолитичку, антимикробну, антиалергијску и хепатопротективну активност. Уочено је да флавоноиди инхибирају ензим фосфодиестеразу и на тај начин смањују агрегацију тромбоцита. Ова група једињења показује јаку антимикробну, цитостатску и антиоксидантну активност (28). 1.5.1.3. Фенолне киселине Фенолне киселине могу бити деривати бензојеве и деривати циметне киселине. У деривате бензојеве киселине спадају: бензојева, п-хидроксибензојева, протокатехинска, ванилинска, сирингинска и гална киселина. У деривате циметне киселине се убрајају: циметна, п-кумаринска, кафена, ферулна и синапинска киселина. Углавном се користе као конзерванси, антиинфламаторни агенси и антиоксиданси. Када су у питању антиоксидантна својства ових киселина доказано је да антиоксидантна активност расте са повећањем броја хидроксилних група (29). 1.5.1.4. Тритерпеноиди Изопренска јединица је основна структурна јединица терпена. Ова група секундарних метаболита улази у састав смола, могу бити слободни или се јављати као Увод 14 сапогенини сапонозида и агликони хетерозида. Испољавају антимикробно деловање (28). 1.5.2. Значај и порекло секундарних биљних метаболита Хемијска једињења која се синтетишу у биљкама могу се поделити на две велике групе. Прву групу чине примарни метаболити, који омогућавају раст и развој биљке, односно имају градивну улогу. У примарне метаболите се убрајају: угљени хидрати, липиди, беланчевине, амино киселине. Другу групу чине секундарни метаболити, једињења за која се сматра да помажу биљци да се прилагоди средини (земљиште, друге биљке, инсекти, суша, UV зрачење) и преживи у окружењу где се налази (присуство различитих патогена – бактерија, гљивица, или вируса). Једињења из ове групе настају као производи секундарног метаболизма биљака. Њихова количина у биљкама зависи од климатских фактора, времена бербе, сушења, чувања и врсте биљке. У овој групи се налази велики број једињења различитих хемијских структура али је уочена карактеристика да у оквиру једне биљне врсте, или рода, егзистирају у мањој или већој мери супстанце из исте хемијске групе (30). Синтеза секундарних метаболита је сложена и до сада није у потпуности разјашњена. Сматра се да секундарни метаболити настају преко неколико биосинтетских путева. Једињења сродне хемијске структуре се синтетишу преко дефинисаног пута, до одређене фазе. На који начин ће се синтетисати неко једињење зависи од присуства или активности ензима што је генски детерминисано, од услова спољашње средине као и од врсте биљке. Сматра се да постоје четири главна пута за синтезу секундарних биљних метаболита и то: 1) Пут шикиминске киселине. На овај начин настају цикличне амино киселине које представљају основни састојак и полазну сировину за синтезу алкалоида (алкалоиди поред тога што се синтетишу на овај начин могу бити синтетисани и преко алифатичних амино киселина). Фенолна једињења се такође синтетишу овим путем. 2) Пут малонске киселине. Значајан за синтезу фенолних једињења. 3) Пут мевалонске киселине. Овим путем настају стероиди терпеноиди и терпени. 4) Пут не-мевалонске киселине. Значајан је за синтезу терпена, слика 2 (31). Увод 15 Слика 2. Биосинтеза биљних секундарних метаболита. 1.5.3. Хемијски састав корена и ризома рода Potentilla У корену и ризому идентификовано је преко 60 једињења, која спадају у следеће хемијских групе: танини, флавоноиди, тритерпени, органске и фенолкарбонске киселине. Танини представљају добро испитану групу природних једињења. Уочен је висок садржај танина у ризому многих врста рода Potentilla. На пример, Potentilla Увод 16 erecta, најраније анализирана и најбоље проучена биљка из овог рода, у ризому садржи 17-22 % танина, 15-22 % кондензованих и 3,5 % хидролизујућих (32, 9). Идентификовани су прекурзори кондензованих танина: (+)-катехин, (−)-епикатехин, (+)-галокатехин и (−)-епигалокатехин. Хидролизујући танини су у мањој мери заступљени од кондензовних и идентификовани су у две врсте Potentilla (P. erecta и P. discolor). Овај род се карактерише и присуством тритерпеноида. Карактеристично једињење тритерпеноидне структуре је торментозид, изолован из ризома биљке Potentilla erecta, али је касније пронађен и у другим врстама Potentilla (P. anserina и P. discolor) (33, 34). Идентификовано је присуство флавоноида у ризому P. еrecta (35), међутим њихово присуство је карактеристично за надземне делове. Поред ових главних група једињења идентификоване су следећа једињења: органске и фенолкарбонске киселине, стероли, шећери, амино киселине и масне киселине. Хемијски састав ризома P. reptans до сада није документован. 1.5.4. Хемијски састав хербе рода Potentilla Херба рода Potentilla је проучавана код већег броја врста овог рода, него ризом. Идентификовано је 134 једињења. Доминантна једињења у надземном делу су флавоноиди. Идентификован је велики број различитих флавоноида. Карактеристично је присуство апигенина, кемпферола, лутеолина, кверцетина, мирцетина (24). У херби су присутни и танини, у мањем садржају него у ризому или корену. Присутни су мономери хидролизирајућих танина (потентилин, педункулагин, телимаграндин и касуариктин). Поред мономера идентификован је и димер агримонин у P. kleiniana као и деградациони продукти хидролизујућих танина (елагична киселина и њени деривати) (36-38). Прекурзори кондензованих танина катехин, галокатехин и епигалокатехин су детектовани у P. erecta (39). Тритерпени идентификовани у херби су сличне или исте структуре као они присутни у ризому и корену. Поред ових главних група једињења уочено је и присуство кумаринских деривата (P. erecta, P, anserine и P. argentea) као и органских и фенол карбонских киселина, стерола, есенцијалних уља и пектина (комарумана из P. palustris) (40, 41). 1.5.5. Хемијски састав врсте P. reptans L. Херба P. reptans је анализирана и идентификовано је осам једињења: четири флавоноида, елагинска киселина, и три карбонске киселине. Ризом ове биљке до сада Увод 17 није испитиван (24). Једињења идентификована у херби P. reptans приказана су на слици 3. Слика 3. Једињења идентификована у херби P. reptans. Флавоноиди (кемпферол, кверцетин, кверцетин-3,7-диглукуронид, 2’,4’,6’,4-тетрахидроксихалкон-2’-O- ß-д- глукозид), елагинска киселина, карбонске киселине (п-кумаринска киселина, кафена и ферулна киселина) 1.6. Употреба врсте рода Potentilla у традиционалној медицини За медицинску употребу биљке овог рода се користе углавном целе тј. корен (ризом) и херба. Традиционално се примењују у облику инфуза, декокта, мацерата, а као растварачи коришћени су вода или етанол. Забележено је и директно посипање спрашене дроге на ране или оболела места (42). Код азијских народа различите биљке овог рода (P. chinensis, P. multicaulis, P. atrosanguinea, P. kleiniana, P. peduncularis, P. Увод 18 freyniana, P. discolor, P. multifida) се користе у терапији дијареjе, кашља, вирусних инфекција, паротитиса, лимфадентитиса, укочености удова, дисменореје итд (24, 43- 45). У Америци и Канади најчешће употребљаване врсте су P. arguta и P. simplex у терапији вирусних и гљивичних инфекција (46). Врсте P. erecta, P. fruticosa, P. anserine, P. speciosa, P. recta, P. fulgens и друге које су заступљене на европском континенту, користе се у терапији бактеријских, вирусних и гљивичних инфекција, запаљенских процеса, против дизентерије, дијареjе, упале грла, кожних инфекција, тумора и дијабетеса (47, 48). Најчешће се користе у облику декокта или инфуза. Херба P. reptans се користи у терапији зубобоље, кожних инфекција, грчева у стомаку, запаљења грла и код појаве алергија (24). Ризом се користи у терапији дизентерије, реуматизма, гихта и шећерне болести, као и за регулацију метаболизма. Препоручује се и за лечење екцема, лишајева и других кожних обољења. У стоматологији се користи ризом P. reptans против упале десни, грла и ждрела. У народној медицини је коришћен против кожних осипа, екцема, нагњечења, за смањење крварења и брже зарастање, а забележено је посипање спрашеног корена директно на рану (42). 1.7. Фармаколошко деловање рода Potentilla С обзиром да је велики број биљака овог рода коришћен у традиционалној медицини различитих народа, објављене студије су имале за циљ фармаколошку потврду употребе. Студије су биле in vitro и in vivo, а због малог броја клиничких студија за већину лабораторијских резултата потребна је и клиничка потврда. Фармаколошка активност биљака из рода Potentilla приказана је у табели бр. 3 (24). Табела 3. Фармаколошка активност рода Potentilla Фармаколошка активност In vitro In vivo Клиничке студије Улцер Пептички улцер (P.reptans) Дијареја Антисекреторна активност (P. erecta) Антидијареична и антивирусна активност код дијареје изазване ротавирусом (P. erecta) Инфламација Јака инхибиција циклооксигеназе (P. erecta) Антиинфламаторна активност на уху миша (P. alba, P. erecta и P. malyana), и Антиинфламаторна активност на шапици пацова (P. palustris) Увод 19 Фармаколошка активност In vitro In vivo Клиничке студије Улцерозни колитис P. erecta Индуковани колитис код мишева: (P. palustris) P. erecta Канцер Инхибиција раста ћелија лимфома; (P. chinensis, P. ulticaulis, P. argentea) Активност на неопластичне туморе код мишева (P. fulgens) Вирусне инфекције Профилакса и терапија на Coxsackie virus B (P. fruticosa); респираторне вирусне инфекције (P. arguta); Herpes virus (P. erecta, P. anserina); Hepatitis B (P. anserina) Профилакса и терапија на Coxsackie вирус Б код мишева (P. fruticosa); антивирусни ефекти на Vaccine virus код мишева (P. erecta); Антивирусна активност на rotavirus код деце (P. erecta) Бактеријске инфекције Антибактеријска активност на Streptococcus mutans и Streptococcus sobrinus (P. erecta); умерена антибактеријска активност на Staphylococcus aureus, Bacillus substilis; не постоји или је веома слаба активност на Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae; висока активност на Campylobacter pylori (већи број Potentilla врста) Антиоксиданти Антиоксидантна активност (P.reptans, као и већи број Potentilla врста) Јака антиоксидантна активност на албино пацовима (P. erecta); код мишева (P. reptans, P. anserina). Гљивичне инфекције Умерена активност на Candida albicans, Candida krusei и Cryptococcus neoformans (већи број Potentilla врста); јака антигљивична активност на Candida glabrata (P. simplex); слаба активност на дерматофите и плесни (P. simplex) Ослабљен имунски систем Имуномодулаторне активности код мишева (P. fruticosa, P. erecta) Увод 20 Фармаколошка активност In vitro In vivo Клиничке студије Дијабетес мелитус Терапија и превенција оштећења изазваних дијабетесом (P. recta, танини из P. candicans и P.discolor) Смањење нивоа глукозе у крви код мишева (P. Fulgens, P.erecta) Спазми глатке мускулатуре Спазмолитички ефекти на изолованом илеуму и материци пацова (P. anserina) Деловање на јетру Хепатопротективни ефекат (P. erecta и P. fruticosa) 1.7.1. In-vitro фармаколошко деловање 1.7.1.1. Анти-туморска активност Анти-туморска активност је доказана код великог броја биљака овог рода и сматра се да тритерпеноидна једињења доприносе томе. Цитотоксична активност је доказана код надземног дела P. chinensis и корена P. multicaulis на ћелијским линијама хуманог хепатома и хумане промијелоцитне леукемије (33, 49, 50). Етанолни екстракт P. erecta показује високу цитотоксичну активност у концентрацији од 10 и 50 µg/ml (51). Полифенолна једињења као што су кемпферол, тилирозид и друга изолована из P. argentea показују цитотоксични ефекат на ћелијским линијама хуманог карцинома дојке (52). 1.7.1.2. Антивирусна и антимикробна активност Антивирусна активност је испитивана на великом броју биљака овог рода где је уочена активност на неке изазиваче вирусних инфекција. Екстракти појединих врста Potentilla (P. erecta, P. anserine) показују умерени антивирални ефекат против Herpes virus-а а P. arguta ублажава респираторне инфекције изазване респираторним синцицијалним вирусом (53). Антивирусно деловање је доведено у везу и са присуством танина (54). Водени екстракт ризома P. erecta је показао супресивни ефекат на ензим глукотрансферазу који је један од најважнијих фактора вирулентности стрептокока Streptococcus mutans и Streptococcus sobrinus (55). Испитивана је активност танина присутних у биљкама рода Potentilla на грам- позитивне, грам-негтивне бактерије и гљивице, при чему је уочена и антибактеријска и антифунгална активност (56). Надземни делови девет врста Potentilla (P. argentea, P. fruticosa, P. recta, P. rupestris, P. erecta, P. anserina, P. nepalensis, P. thuringiaca, P. Увод 21 grandiflora) показали су умерени ефекат на грам-позитивне бактерије (Staphylococcus aureus, Bacillus suptilis), при минималној инхибиторној концентрацији од 12,5-100 mg/ml, док ови екстракти нису деловали на грам-негативне бактерије (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae). Mинимална инхибиторна концентрација на Helicobacter pylori је висока (0,1–0,5 mg/ml). Умерени антифунгални ефекат је уочен против Candida albicans (57). Водени екстракт надземног дела P. simplex показао је слабу до умерену антифунгалну активност против Candida врста и Cryptococcus neoformans, а веома јако деловање против Candida glabrata (46, 58). Биљке из рода Potentilla имају слабо антифунгално деловање против дерматофита (Trichophyton sp., Epidermophyton floccosum, Microsporum canis), док биљке овог рода не делују против Aspergillus sp., Fusarium sp., Rhizopus sp (58, 59). 1.7.1.3. Антиинфламаторна и хепатопротективна активност Биљке овог рода се користе за лечење дерматоза, микоза, вулвовагинитиса опекотина, промрзлина, гнојних и алергијских дерматитиса. Водени екстракт ризома P. erecta у in vitro условима инхибира циклооксигеназу (60). Етил-ацетатни екстракт надземног дела P. anserinae испољава значајну спазмолитичну активност на глатку мускулатуру црева и материце у in vitro условима, али не показује ефекат на глатке мишиће крвних судова и уринарног система. Екстракт P. anserinae стимулише секрецију жучи, а показује и хепатопротективно дејство (61). 1.7.1.4. Антиоксидантна активност Антиоксидантни ефекти врста из овог рода су испитивани у in vitro условима. Сматра се да је овај ефекат повезан са присуством великог броја полифенолних једињења, која доводе до неутралисања слободних радикала. Екстракти ових биљака се користе у терапији или превенцији хроничних болести изазваних слободним радикалима (кардиоваскуларна обољења, тумор, поремећаји згрушавања крви итд.) Значајане антиоксидантне ефекте показао је метанолни ектракт корена P. alba, водено- етанолни екстракт надземног дела P. atrosanguinea и различити екстракти (метанолни, ацетонски, етилацетатни) цветова P. fruticosa. Антиоксидантни потенцијал ових врста је мерен различитим тестовима DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилхидразил), ABTS (2,2′- азино-бис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонска киселина)), FRAP (ferric reducing antioxidant potential) (18, 62, 63). Увод 22 1.7.1.5. Антихипергликемијска активност Истраживања спроведена in vitro покaзала су да деривати елагичне киселине изоловани из P. candicans, као и метанолни екстракт надземног дела P. recta утичу ниво глукозе у крви (64, 65, 24). 1.7.2. In-vivo фармаколошко деловање 1.7.2.1. Анти-улцерогена активност Представници овог рода су показали гастропротективни и антидијароични ефекaт, који је проучаван на животињским моделима. Гастропротективно деловање се приписује присуству танина и пектина комарунама (66, 67). Комарунам изолован из надземних делова P. palustris, показао је протективне ефекте код колитиса на мишевима (67). 1.7.2.2. Анти-неопластична активност Метанолни екстракт корена P. fulgens показује дозно завистан ефекат на Далтонов лимфом албино мишева (52, 68). 1.7.2.3. Антихипергликемијска активност У in vivo експериментима показано је да метанолни екстракт корена P. fulgens у дози 150-450 mg/kg смањује гликемију у крви и код здравих и код дијабетичних мишева, при чему нису забележени никакви нежељени ефекти. Сличне ефекте је показао и екстракт ризома P. erecta што је доведено у везу са присуством торментозида (69, 70). 1.7.2.4. Антиинфламаторна и хепатопротективна активност У in vivo условима доказано је локално антиинфламаторно деловање екстракта ризома и корена P. alba и P. erecta на уху мишева, где је инфламација изазвана ацетонским раствором кротонског уља. Сличан ефекат је испољио и екстракт корена и ризома P. malyana (71, 72). Водени екстракт цветова P. fruticosa показује хепатопротективни ефекат. У in vivo студији на пацовима екстракт је позитивно утицао на микрозомални систем јетре, као и ксенобиотски метаболизам и плазма липидну пероксидацију. Поред овога, дошло је и до нормализације активности аланин- аминотрансферазе и нивоа билирубина у плазми (73). Увод 23 1.7.2.5. Антиоксидантна активност Полифенолна једињења брзо и лако реагују са оксидансима спречавајући пероксидацију масних киселина и оксидацију LDL честица које би довеле до оштећења крвних судова и патологије. Анализом различитих екстраката Potentilla врста уочено је да оне врсте које у себи садрже кондензоване танине (посебно димере и тримере) показују бољу антиоксидативну активност (74). У in vivo условима испитивани су екстракти ризома P. erecta и P. anserine као и етанолни и водени екстракти надземног дела P. reptans и сви су показали значајну антиоксидантну активност. Етанолни екстракт ризома P. erecta у дози од 0,05 и 0,1 ml/100g телесне масе пацова узрокује смањење малонилалдехида и ендогених липида (75,76). 1.7.3. Клиничке студије 1.7.3.1. Антидијароички ефекат Кондензовани танини или проантоцијанидини показују позитивне ефекте у третману дијареје. Сматра се да граде комплексе са мукозним протеинима и на тај начин стварају заштитни слој у цревима. Овај ефекат се може објаснити и стварањем комплекса између танина и неких секреторних једињења као што су токсин колере или инхибицијом интестиналне покретљивости (77-79). Спроведена је клиничка рандомизирана дупло слепа плацебо контролисана студија екстракта ризома P. erecta у терапији дијареје код деце изазване ротавирусом (80). Екстракт је стандардизован на 30-40% танина. Студија је пратила трајање дијареје, волумен столице и дехидратацију пацијената у испитиваној и контролној групи. Резултати спроведене студије су показали да је трајање дијареје у испитиваној групи било значајно краће него у контролној. Група која је третирана екстрактом (испитивана) примила је мању запремину електролита за надокнаду течности од контролне групе, а није било ни споредних нежељених ефеката као што је мучнина. Сматра се да висок садржај танина утиче на смањену дифузију воде кроз зидове црева и да се на тај начин смањује губитак електролита из организма. Аутори претпостављају да танини стварају комплексе са протеинима ротавируса, а антидијароичном ефекту су поред танина допринеле и друге компоненте из екстракта. Увод 24 1.7.3.2. Анти-улцерогена активност Клиничка студија која је истраживала ефикасност екстракта ризома P. erecta у третману активног улцерозног колитиса показала је да екстракт примењен у дози од 2400 mg/дан испољава оптимални ефекат (81). 1.8. Фармаколошко деловање врсте P. reptans 1.8.1. Анти-улцерогена активност Надземни делови P. reptans користе се у народној медицини у третману горушице и абдоминалних болова. Студија која је фармаколошки и хистопатолошки потврдила висок гастропротективни ефекат орално примењеног воденог екстракта надземног дела P. reptans код улцера пацова, је ефекат објаснила присуством танина и флавоноида у надземном делу (82). 1.8.2. Антиоксидантна активност Ефекти воденог и етанолног екстракта P. reptans су испитивани на мишевима а мерени су нивои укупног холестерола у серуму, триглицерида, HDL холесерола, LDL холестерола, глукозе. Етанолни екстракт је повећавао ниво серумског HDL холестерола а смањивао ниво азот оксида (NO), док етанолни и водени екстракти нису утицали на концентрацију холестерола у серуму (75, 76). С обзиром да се P. reptans у народној медицини употребљава за различита обољења а мали број студија је потврдио те ефекте, циљ овог истраживања је био да евалуира оправданост улоге ове биљке у народној медицини и да комплементира податке о овој врсти са хемијског и фармаколошког аспекта. У традиционалној медицини најчешће примењивани облици P. reptans су водени препарати хербе и (или) ризома, због тога су испитивани екстракти у овој студији били водени екстракти као најслични облици оним који се користе у народној медицини. Увод 25 Слика 4. Potentilla reptans L. (херба и ризом) Циљеви и хипотезе 26 2. Циљеви и хипотезе 2.1. Циљеви Циљ овог истраживања је испитивање антиинфламаторног, цитотоксичног, антихистаминског и антимикробног деловања водених екстраката хербе – Pot.r-h и ризома - Pot.r-r) P. reptans L. Ради спровођења циљева ове студије урађено је следеће: 1. Сакупљена је биљна дрога хербе и ризома P. reptans. 2. Направљени су водени екстракти биљних дрога. 3. Извршена је анализа хемијског састава добијених екстраката. 4. Спроведено је in vivo испитивање антиинфламаторног деловања екстраката на експерименталном животињском моделу. 5. Одређено је цитотоксично деловање водених екстраката (in vitro). 6. Одређено антихистаминско деловање водених екстраката (in vitro). 7. Испитано је антимикробно деловање водених екстраката (in vitro). 2.2. Хипотезе  Фенолна једињења доминирају по садржају у обе врсте екстраката.  Не постоји разлика у смањењу едема животиња третираних испитиваним екстрактима и контролних животиња.  Не постоји разлика у испољавању цитотоксичног ефекта екстраката и стандардних супстанци.  Испитивани екстракти не изазивају контрактилност изолованог јајовода.  Нема значајних разлика у зонама инхибиције раста микроорганизама при коришћењу екстраката и стандардних антибиотика. Материјал и методе 27 3. Материјал и методе 3.1. Припрема узорака 3.1.1. Порекло биљног материјала Биљни материјал коришћен за анализу сакупљан је у периоду од маја до октобра 2010. године. Ботаничка идентификација извршена је према дихотомним кључевима „Флоре СР Србије“. Хербарски примерци депоновани су у хербаријуму Природно- математичког факултета у Крагујевцу и Ботаничкој башти „Јевремовац“ Природно- математичког факултета у Београду, под бројем BEOU 16405. Сакупљање хербе је вршено у летњем периоду од маја до августа 2010. године, а ризома у априлу и октобру исте године. Биљни материјал је сакупљан са природних станишта на подручју Шумарица (Крагујевац), села Опланић (Кнић) и села Доброселица (Златибор). 3.1.2. Припрема биљног материјала за екстракцију Сакупљени биљни материјал је након раздвајања биљних органа сушен две недеље, на промајном месту, у хладу. Овако осушен биљни материјал до израде екстракта чуван је у стакленим посудама на температури 6-80C. Непосредно пре екстракције биљни материјал је уситњен млином (Ika® A11 B, Немачка). 3.1.3. Добијање екстраката Екстракцијом хербе и ризома добијени су инфузи Ph Jug IV (83). За екстракцију је коришћено 20 g осушене и уситњене хербе (Pot.r-h), односно ризома (Pot.r-r) и 300 ml дестиловане воде. 20 g дроге је наквашено са 20 g дестиловане воде и остављено на собној температури пет минута, како би дрога набубрела ради лакше екстракције. Преостала количина воде је загреајана до кључања и преливена преко дроге. Екстракти су уз повремено мешање остављени да одстоје 30 минута а затим процеђени. Дрога је преко навлажене вате на левку испрана кључалом водом, којом су добијени екстракти допуњени до 300 ml. Екстракти су остављени да одстоје 30 мин. како би се исталожиле баласте материје, а потом још једном процеђени преко навлажене вате. За добијање сувих екстраката коришћен је ротациони вакум упаривач на 400C, 90 rpm и 250 mbar вакум. (RV05 basic IKA, Немачка). Приноси екстракције добијених екстраката изражени су као проценат у односу на 100 g дроге, приказани у табели бр. 4. Материјал и методе 28 Табела 4. Принос добијених екстраката Ваучер Таксон Биљни делови Принос (%) Ознака узорка BEOU 16405 P. reptans L. Херба 4.70 Pot.r-h Ризом 3.07 Pot.r-r 3.2. Хемијска анализа водених екстраката P. reptans 3.2.1. Одређивање укупних фенола Одређивање садржаја укупних фенола рађено је по стандардној методи модификованој за рад на микроплочама (84, 85). Метода се заснива на примени Folin- Ciocalteu реагенса (FC). Реагенс представља смешу фосфоволфрамове и фосфомолибденске киселине. У присуству овог реагенса долази до оксидације фенолних једињења при чему се сам реагенс редукује до смеше волфрам-оксида и молибден-оксида. Реакција редукције (FC) реагенса је праћена променом боје из жуте у плаву услед настанка (фенол-MoW11O40) 4- јона. Na2WO4/Na2MoO4 + фенол → (фенол-MoW11O40) 4- Mo (VI) (жуто обојен) +e+ → Mo (V) (плаво обојен) Настала плава боја је стабилна и њен интензитет је сразмеран количини фенолних једињења. Интензитет боје је одређиван спектрофотометријски на таласној дужини 760 nm. Раствори и реагенси коришћени у експерименту су: 1. FC реагенс (Fisher Scientific, UK): смеша фосфоволфрамове (H3PW12O40) и фосфомолибденске киселине (H3PMo12O40). 0,1M раствора FC реагенса припремљен је додавањем 1,25 ml 2M FC реагенса у одмерни суд од 25 ml и допуни дестилованом. 2. Раствор натријум карбоната (Analytika, Чешка Република), припремљен је растварањем 1,875 g анхидрованог Na2CO3 у 25 ml дестиловане воде при чему се раствор загрева док се целокупна количина соли не раствори. На овај начин се добија концентрација од 75 g/l Na2CO3. Материјал и методе 29 3. Стандардни раствор галне киселине је припремљен на следећи начин: 25 mg галне (Sigma Aldrich, Немачка) киселине се пренесе у нормални суд од 25 ml и допуни дестилованом водом. Добијена концентрација износи 1 mg/ml. 4. Сваки екстракт је припремљен у четири различите концентрације (0,5 mg/ml 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml и 0,0625 mg/ml). Суви екстракти (5 mg) су квантитативно пренети у нормалне судове од 10 ml, растворени додавањем дестиловане воде. Овако је добијен раствор концентрације 0,5 mg/ml. 5 ml овог раствора је пренето у нормални суд од 10 ml и допуњено. На исти начин су добијена и остала потребна разблажења. Да би се експеримент спровео урађено је следеће: Калибрациона крива. Од стандардног раствора галне киселине концентрације 1 mg/ml се одмери 1 ml пренесе у нормални суд од 10 ml и допуни дестилованом водом, при чему се добија раствор концентрације 0,1 mg/ml. коришћене су следеће запремине 1 ml; 0,8 ml; 0,6 ml; 0,5 ml; 0,4 ml; 0,3 ml; 0,2 ml, што одговара маси галне киселине у свакој од ових запремина: 0,1 mg; 0,08 mg; 0,06 mg; 0,05 mg; 0,04 mg; 0,03 mg; 0,02 mg. Свакој запремини се додаје FC реагенс (0,25 ml), натријум карбонат (1 ml) и дестилованом водом се допуне до 10 ml. Након тога мерена је апсорбанца ових стандардних раствора на 760 nm таласне дужине. На основу добијених вредности апсорбанције стандардних раствора конструисана је калибрациона крива. Радна проба. У резервоаре микроплоче одмерене су следеће запремине раствора: 30 µl екстракта и 150 µl FC реагенса. Након 6 минута инкубације додато је 120 µl натријум карбоната, слика 5. Корекција. У резервоаре микроплоче одмерене су следеће запремине раствора: 30 µl екстракта и 150 µl дестиловане воде. Након инкубације од 6 минута додато је 120 µl натријум карбоната. Корекција је рађена за сваки екстракт ради елиминисања боје. Слепа проба. У рзервоаре микроплоче одмерене су следеће запремине раствора: 30 µl дестиловане воде и 150 µl FC реагенса. Након 6 минута инкубације додато је 120 µl натријум карбоната. На овај начин припремљене пробе су остављене 2 h, ради развијања боје, а затим измерене апсорбанце на спектрофотометру на таласној дужини 760 nm (Multiskan Материјал и методе 30 Spectrum, Thermo Corporation). За сваку концентрацију одређивање се вршило у три понављања. На основу измерених апсорбаци (средња вредност три мерења умањена за вредност апсорбанце корекције и слепе пробе), са калибрационе криве стандардног раствора галне киселине одређена је масена концентрација (μg/ml) полифенолних једињења коришћењем једначине праве А ꞊ 0,065cконцетрација галне киселине (μg/ml) + 0,025, n ꞊ 7, R ꞊ 0,998, а затим је садржај полифенолних једињења изражен као еквивалент галне киселине. Садржај укупних фенола је изражен као милиграм еквивалент галне киселине на 1g сувог екстракта. Слика 5. Микроплоча након развијања боје у тесту одређивања укупних фенола (стандард галне киселине и екстраката Pot.r-h и Pot.r-r) 3.2.2. Одређивање саржаја укупних флавоноида Одређивање садржаја укупних флавоноида рађено је по стандардној методи модификованој за рад на микроплочама (85, 86). Метода се заснива на особини флавоноида и флавоноидних гликозида да комплексирају јоне метала (Al3+), при чему долази до померања апсорпционих трака у UV и VIS области ка вишим таласним дужинама, а боја раствора прелази из жуте у жутозелену, слика 6. Pot.r-h Pot.r-r Гална киселина Материјал и методе 31 Слика 6. Настајање обојеног комплекса Al3+ јона и флавоноида Концентрација укупних флавоноида је одређена коришћењем AlCl3 као реагенса, а интензитет боје је одређиван спектрофотометријски на таласној дужини 415 nm. Раствори и реагенси коришћени у експерименту су следећи: 1. 0,75 mol/dm3 AlCl3(Centrohem, Србија): раствор AlCl3 припремљен је растварањем 4,5 g AlCl3 · 6H2O у 25 ml дестиловане воде. 2. 1 mol/dm3 CH3COONa (Centrohem, Србија): раствор CH3COONa припремљен је растварањем 3,4020 g CH3COONa · 3H2O у 25 ml дестиловане воде. 3. Стандардни раствор кверцетина припремљен је на следећи начин. 12,9 mg кверцетин-хидрата (Sigma-Aldrich, Немачка) пренето је у нормални суд од 25 ml и растворено у метанолу (J.T.Baker, USA). Нормални суд је допуњен до црте метанолом. На овај начин је добијен раствор концентрације 0,516 mg/ml кверцетин хидрата, односно 0,461 mg/ml безводног кверцетина. Из овог раствора је припремљена серија разблажења помоћу кога је конструисана калибрациона крива. 4. Сваки екстракт је припремљен у пет различитих концентрација (10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml и 0,625 mg/ml). Суви екстракти (100 mg) су квантитативно пренети у нормалне судове од 10 ml, растворени додавањем диметилсулфоксида (DMSO) и допуњени до црте. Овако је добијен раствор концентрације 10 mg/ml. Од овог раствора је узето 5 ml пренето у нормални суд од 10 ml и допуњено водом. На исти начин су добијена и остала потребна разблажења. 5. Диметилсулфоксид (DMSO) чистоће ≥99,9% (Sigma Aldrich, Немачка) Поступак спровођења експеримента је следећи: Материјал и методе 32 Калибрациона крива. Од стандардног раствора кверцетин хидрата концентрације 0,516 mg/ml, односно 0,461 mg/ml безводног кверцетина, се узимају следеће запремине: 1,5 ml; 1,25 ml; 1,0 ml; 0,8 ml; 0,6 ml; 0,5 ml; 0,4 ml; 0,3 ml; 0,2 ml; 0,1 ml; 0,01 ml, што одговара следећим концентрацијама безводног кверцетина: 138,3 µg/ml; 115,3 µg/ml; 92,2 µg/ml; 73,8 µg/ml; 55,3 µg/ml; 46,1 µg/ml; 36,9 µg/ml; 27,7 µg/ml; 18,4 µg/ml; 9,2 µg/ml; 0,9 µg/ml. Свака запремина се пренесе у нормални суд од 5 ml и дода метанол. Растворима кверцетина у запремини од 1 ml одговарајућих концентрација се додају рствори DMSO-а, алуминијум хлорида и натријум ацетата, а дестилованом водом се допуне до 10 ml. Апсорбанца раствора је мерена на 415 nm таласне дужине. На основу добијених вредности апсорбанције конструисана је калибрациона крива апсорбанце од масене концентрације кверцетина који представља калибрациону криву, слика 7. Радна проба. У резервоаре микроплоче одмерене су следеће запремине раствора: 30 µl екстракта одговарајуће концентрације, 90 µl метанола, 30 µl DMSO. Садржај је измешан и остављен 6 минута након чега је додат раствор 6 µl AlCl3 · 6H2O, 6 µl CH3COONa и 140 µl воде, слика 7. Корекција. За корекцију су направљени раствори као и за радне растворе, с тим што је уместо 6 µl AlCl3 · 6H2O додато 6 µl воде. Корекција је рађена за сваки екстракт ради елиминисања боје. Слепа проба. За слепу пробу је урађен раствор додавањем 30 µl DMSO, 90 µl метанола, по 6 µl раствора AlCl3 · 6H2O и CH3COONa и 170 µl воде. Апсорбанца припремљених проба мерена је спектрофотометром на таласној дужини 415 nm (Multiskan Spectrum Thermo Corporation). За сваку концентрацију одређивање је извршено у три понављања. На основу измерених апсорбанци (средња вредност три мерења умањена за вредност апсорбанце корекције и слепе пробе), са калибрационе криве стандардног раствора кверцетина одређена је масена концентрација (μg/ml) укупних флавоноида коришћењем једначине праве А ꞊ 0,045cкверцетина (μg/ml) - 0,024, n ꞊ 11, R ꞊ 0,998, а затим је садржај укупних флавоноида изражен као еквивалент кверцетина. Садржај укупних флавоноида је изражен као милиграм еквивалент кверцетина на 1g сувог екстракта. Материјал и методе 33 Слика 7. Микроплоча након развијања боје у тесту одређивања укупних флавоноида (стандард кверцетина и екстраката Pot.r-h и Pot.r-r) 3.2.3. Одређивање садржаја проантоцијанидина Одређивање садржаја кондензованих танина рађено је по стандардној методи (87). Метода се заснива на хидролизи проантоцијанидина до цијанидина у киселој средини, услед чега настаје црвено обојење чији се интензитет мери спектрофотометријски на таласној дужини 550 nm (Cecil CE 2021). Додатак јона Fe3+ побољшава поновљивост и осетљивост методе. Раствори и реагенси коришћени у експерименту су следећи: 1. Ацетон (JT Baker, USA): 70% ацетон је припремљен додавањем 70 ml ацетона у одмерни суд од 100 ml и допуњен дестилованом водом. 2. Бутанол–HCl реагенс: припремљен је мешањен 95 ml н-бутанола (Poch, Пољска) са 5 ml HCl (Lach Ner, Чешка република) у одмерној тиквици од 100 ml. 3. Gvožđe(III)-amonijum-sulfat: припремљен је одмеравањем 4,15 ml HCl у одмерни суд од 25,0 ml и допуњен дестилованом водом ради добијања раствора концентрације 2 mol/dm 3 . У овако припремљен раствор HCl одмери се и раствори 0,25 g гвожђе(III)- амонијум-сулфата (Merck, Немачка). Реагенс је чуван у тамној боци. 4. Цијанидин хлорид чистоће ≥ 97% (Carl Roth, Немачка): стандардни раствор цијанидин хлорида је прпремљен растварањем 10 mg цијанидин хлорида у 1 ml 50% метанола (J.T.Baker, USA). Potr-h Potr-r кверцетин Potr-h Potr-r кверцетин Материјал и методе 34 5. Сваки екстракт је припремљен у концентрацији од 10 mg/ml растварањем 100 mg сувог екстракта у 10 ml 70% ацетона. Екстракт Pot.r-h у концентрацији од 10 mg/ml је 20 пута разблажен 70% ацетоном при чему је добијена радна концентрација од 0,5 mg/ml. Од ове концентрације су добијене следеће радне концентрације: 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml и 0,0625 mg/ml. 10 mg/ml екстракта Pot.r-r је разблажено 200 пута при чему је добијена радна концентрација од 0,05 mg/ml. Од ове концентрације су добијене следеће радне концентрације: 0,025 mg/ml; 0,0125 mg/ml; и 0,00625 mg/ml. Поступак извођења експеримента је следећи: Калибрациона крива. Од стандардног раствора цијанидин хлорида концентрације 10 mg/ml одмери се 1 ml пренесе у нормални суд од 200 ml и допуни 70% ацетоном. Концентрција овако добијеног раствора је 50 µg/ml. Од овог раствора се одмери 5 ml пренесе у нормални суд од 10 ml и допуни 70% ацетоном. На исти начин је урађено и осталих пет разблажења. Добијени раствори имају следеће концентрације: 50,0 µg/ml; 25,0 µg/ml; 12,5 µg/ml; 6,25 µg/ml; 3,12 µg/ml; 1,56 µg/ml; 0,78 µg/ml. Од сваког раствора се узима 0,5 ml додаје 3,0 ml бутанол хлорида и 0,2 гвожђе амонијум сулфата. Након мешања раствора мери се апсорбанца на таласној дужини 550 nm. На основу добијених вредности абсорбанције конструисан је график зависности апсорбанце од масене концентрације цијанидина. Радна проба. Одмерене су следеће запремине раствора: 0,5 ml екстракта, 3,0 ml бутанол хлорида и 0,2 ml гвожђе амонијум сулфата. Корекција. Корекција се ради на исти начин као и радна проба са изузетком реагенса бутанол хлорида који изостаје и уместо њега се додаје 3,0 ml 70 % ацетона. Слепа проба. Слепа проба се изводи на исти начин као и радна проба где у њен састав уместо екстракта улази 0,5 ml 70 % ацетона. Све пробе су рађене у трипликатима, где су радне и слепе пробе инкубиране у воденом купатилу на 95°C 40 min, након чега су извађене и охлађене 5 минута у хладној води. Корекције су инкубиране 40 min. на собној температури. Абсорбанција свих узорака је читана на таласној дужини 550 nm. На основу измерених апсорбанци са калибрационе криве цијанидина одређена је масена концентрација (µg/ml) кондензованих танина коришћењем једначине праве Материјал и методе 35 А ꞊ 0,1089cцијанидин - 0,0021; n ꞊ 7; R꞊ 0,999 а затим је садржај танина изражен као еквивалент цијанидина. Кондензовани танини су представљени као милиграм еквивалент цијанидина на грам сувог екстракта. 3.2.4. Квалитативно и квантитативно одређивање фенолних једињења Високо ефикасна течна хроматографија (HPLC- Agilent Technologies 1200 Series, USA) уз масеноспектрометријску детекцију (LC-MS-MS) са електроспреј јонским извором (ESI) (Agilent Technologies 6410A TripleQuad, USA) коришћена је за раздвајање и квантитативно одређивање фенолних једињења у екстрактима. Хроматографско раздвајање је спроведено на колони Zorbax Eclipse XDB-C18 (50 mm x 4.6 mm, 1.8 μm). Мобилну фазу чини систем растварача A = 0,05 % HCOOH, Б = MeOH, чији је проток 1 ml/мин. Раздвајање компоненти је изведено у градијентном моду (0-6 мин 30 % Б, 6 мин 70 % Б, 9–12 мин 100 % Б, задњих 3 мин 30% Б). Инјектовано је 5 μl екстракта, односно раствора стандарда. Једињења су раздвојена на колони, термостатираној на 50 °C. Припремљени екстракти разблажени су мобилном фазом (0,05 % HCOOH: MeOH, 1:1) до концентрације од 20 mg/ml и 2 mg/ml. Референтни стандарди, 45 супстанци (Fluka chemie AG, Швајцарска), примењено је у опсегу концентрација од 1,5 ng/ml до 25 μg/ml. Параметри јонског извора били су: негативни поларитет, притисак гаса 40 psi, проток гаса за сушење (N2) 9 l/min и температура 350°C, напон на капилари 4 kV. Добијени резултати анализирани су употребом софтвера (MassHunter Workstation Software - Qualitative Analysis (B.03.01)). Фенолна једињења у узорцима идентификована су поређењем ретенционих времена ових једињења са ретенционим временом стандарда за сваку компоненту. Коришћени стандарди су приказани у табели бр. 5. За квантификацију једињења у узорцима коришћене су калибрационе криве у уском опсегу концентрација, 5–6 тачака у околини циљне концентрације. За сваки стандард конструисана је калибрациона крива зависности површине пика од масене концентрације. Масене концентрације једињења у узорцима израчунате су из једначине линеарне зависности одговарајућег стандарда. Материјал и методе 36 Табела 5. Стандарди коришћени у анализи Једињење Mw tR [min] Vf [V] m/z prekurso ra m/z produkta Vcol [V] хинска киселина 192 0.52 150 191 85 20 гална киселина 170 0.58 90 169 125 10 катехин 290 0.74 150 289 245 10 протокатехинска киселина 154 0.79 105 153 109 9 5-O-кафеоилхинска киселина 354 0.8 100 353 191 10 епигалокатехин галат 458 0.81 165 457 169 16 епикатехин 290 0.95 150 289 245 10 гентизинска киселина 154 1.03 100 153 109 9 п-хидроксибензоева киселина 138 1.08 80 137 93 10 ескулетин 178 1.13 105 177 133 15 кафена киселина 180 1.18 100 179 135 10 ванилинска киселина 168 1.24 100 167 108 15 сирингинска киселина 198 1.31 90 197 182 7 п-кумаринска киселина 164 1.69 90 163 119 9 умбелиферон 162 1.73 120 161 133 19 скополетин 192 1.77 80 191 176 8 ферулна киселина 194 1.9 90 193 134 11 витескин 432 1.9 200 431 311 22 синапинска киселина 224 1.92 100 223 193 17 цинарозид 448 2.13 230 447 285 30 хиперозид 464 2.16 200 463 300 30 Материјал и методе 37 изокверцетин 464 2.25 210 463 300 30 рутин 610 2.33 135 609 300 42 апиин 564 2.6 250 563 269 36 o-кумаринска киселина 164 2.62 100 163 119 5 мирцетин 318 2.67 150 317 179 20 кверцетин 448 2.75 190 447 300 27 астрагалин 448 2.8 190 447 284 30 косметин 432 2.81 135 431 268 41 секоизоларицирезинол 362 2.9 130 361 165 26 3,4-диметоксициметна киселина 208 2.99 110 207 103 7 бајкалин 446 3.4 140 445 269 22 даидзеин 254 3.43 145 253 208 31 матаирезинол 358 3.66 130 357 122 24 кверцетин 302 3.74 130 301 151 15 нарингенин 272 3.87 130 271 151 16 циметна киселина 148 3.91 100 147 103 5 лутеолин 286 4.03 135 285 133 25 генистеин 270 4.12 145 269 133 32 кемферол 286 4.55 130 285 285 0 апигенин 270 4.71 130 269 117 25 изорамнетин 316 4.79 160 315 300 21 кризоериол 300 4.82 125 299 284 20 бајкалеин 270 5.15 165 269 269 0 аментофлавон 538 5.78 220 537 375 35 Mw – молекулска маса једињења; tR – ретенционо време; Vf – напон фрагментора [V]; Vcol – колизиони напон Материјал и методе 38 3.2.5. Одређивање антиоксидантне активности Капацитет за неутралисање слободних радикала испитиваних екстраката одређен је DPPH тестом који мери способност екстракта да неутралише DPPH˙ (1,1-дифенил-2- пикрилхидразил) радикале (88). DPPH˙ је стабилан слободни радикал љубичасто обојен. Метода се заснива на праћењу трансформације DPPH˙ радикала у редуковану, жуто обојену форму (DPPH-H) која настаје у присуству антиоксидантне компоненте. Појава жуте боје раствора објашњава се способношћу појединих компонената из екстракта да делују као донори водоника или електрона при чему DPPH˙ радикал прелази у редуковани, неутрални DPPH-H облик. Неутрализација DPPH˙ радикала фенолним једињењима може се објаснити помоћу два механизма: 1. Фенолно једињење предаје H атом DPPH˙ радикалу, услед чега настаје редуковани, неутрални DPPH-H облик и арилокси радикал који је резонантно стабилизован што је приказано на слици 8. 2. Арилокси радикал може да реагује са још једним DPPH˙ радикалом при чему долази до кондензације и ствара се неутралан молекул. Реакција кондензације је приказана на следећи начин: DPPH˙ + ArO-H → DPPH-H + ArO˙ ArO˙ + DPPH˙ → DPPH··ArO OH OH R + + N + O - O N + O - O N + O - O N N N + O - O N + O - O N + O - O NH N OH O R Слика 8. Механизам неутралисања DPPH˙ радикала помоћу фенолних једињења. Интензитет жуте боје је одређен спектрофотометријски на таласној дужини 515 nm (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific). Раствори и реагенси коришћени у експерименту су следећи: 1. DPPH реагенси: Материјал и методе 39  Основни раствор DPPH, 3 mM (c=1,18 μmol/ml), припремљен је одмеравањем 11,8 mg DPPH реагенса (Fluka, Швајцарска) који је квантитативно пренет у нормални суд од 10 ml а затим је допуњен апсолутним етанолом (Зоркафарма, Србија). Овај реагенс је стабилан две недеље и чува се на тамном месту.  Радни DPPH реагенс 67,2 μM (c=26,4 μg/ml), је припремљен на дан мерења разблаживањем основног раствора. 560 μl основног DPPH реагенса је пренето у нормални суд од 25 ml који је потом допуњен метанолом (J.T. Baker, USA). 2. Стандардни раствори коришћених једињења припремљени су у метанолу (J.T. Baker, USA) при чему су добијене следеће концентрације: 2010 μg/ml бутилован хидрокси толуола чистоће 99% (Alfa Aesar, USA) (BHT), 500 μg/ml бутилован хидрокси анизола (Merck, Немачка) (BHA), 461 μg/ml кверцетина (Sigma Aldrich, Немачка), 470,3 μg/ml рутина (Fluka, Швајцарска), 552 μg/ml пропил-галата (Alfa Aesar, USA) (PG). Разблажења стандардних раствора за потребе DPPH теста, припремљена су у диметилсулфоксиду чистоће ≥ 99,9% (Sigma Aldrich, Немачка). 3. Испитивани екстракти су припремљени у седам различитих концентрација. Почетне концентрације екстракта Pot.r-h су следеће: 5,0 mg/ml; 2,5 mg/ml; 1,25 mg/ml; 0,625 mg/ml; 0,313 mg/ml; 0,156 mg/ml; 0,078 mg/ml). Суви екстракт (50 mg) је пребачен у нормални суд од 10 ml и додат раствор DMSO-a. Овако је добијен раствор концентрације 5 mg/ml. Од овог раствора је узето 5 ml пренето у нормални суд од 10 ml и допуњено водом. На исти начин су добијена и остала потребна разблажења. Почетне концентрације екстракта Pot.r-r су: 0,345 mg/ml; 0,172 mg/ml; 0,086 mg/ml; 0,043 mg/ml; 0,022 mg/ml; 0,011 mg/ml; 0,005 mg/ml. Разблажења су добијена на исти начин као и код предходног екстракта. 4. Диметилсулфоксид (DMSO) чистоће ≥ 99,9% (Sigma Aldrich, Немачка). Поступак извођења експеримента је следећи: За одређивање антиоксидантне активности припремљене су по три пробе за сваку концентрацију и једна корекција ради елиминисања боје на следећи начин: Радна проба. У резервоаре микроплоча за потребе радне пробе одмеравају се следеће запремине раствора: 100 µl радног раствора DPPH, 10 µl екстракта одговарајуће почетне концентрције, 190 µl метанола. На овај начин су све почетне концентрације оба екстракта разблажене тридесет пута па радне концентрације екстракта Pot.r-h су следеће: 166,7 µg/ml; 83,33 µg/ml; 41,67 µg/ml; 20,83 µg/ml; 10,42 µg/ml; 5,208 µg/ml; Материјал и методе 40 2,604 µg/ml, а за екстракт Pot.r-r су: 11,49 µg/ml; 5,747 µg/ml; 2,874 µg/ml; 1,437 µg/ml; 0,718 µg/ml; 0,359 µg/ml; 0,18 µg/ml. Корекција. У резервоаре микроплоча одмерава се 10 µl екстракта и 290 µl метанола. Апсорбанца овог раствора се мери ради кориговања боје екстракaта. Контрола. У резервоаре микроплоча се одмерава 100 µl радног раствора DPPH, додаје се 10 µl DMSO и 190 µl метанола. Након мешања направљени раствори морају да одстоје 60 мин на собној температури. Апсорбанца добијених раствора се мери спектрофотометријски на 515 nm (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific). Све пробе су рађене у три понављања. За сваку концентрацију екстракта израчунат је капацитет неутралисања DPPH радикала (RSC% - Radical Scavenging Capacity) према формули: RSC% ꞊ 100·(1- (Āпроба-Акорекција)/Āконтрола ) где је: RSC% - способност везивања радикала (проценат неутралисаних DPPH радикала) Āпроба- средња вредност апсорбанце радних проба за дату концентрацију Акорекција- апсорбанца корекције за дату концентрацију Āконтрола- средња вредност апсорбанце контролних проба За сваки испитани узорак графички је представљена зависност процента неутралисаних DPPH радикала од радне концентрације екстракта. Радна концентрација екстракта је концентрација екстракта у резервоару микроплоче, а однос почетне и радне концентрације је дат следећом формулом: Cрадна꞊ 1000·Cпочетна · Vек/Vук ꞊ 33,33 ·Cпочетна Cрадна- концентрација екстракта у резервоару микроплоче (µg/ml) Cпочетна- концентрација разблаженог екстркта која је одмерена у резервоару (mg/ml) Vек- запремина екстракта у резервоару 10 µl Vук- запремина реакционе смеше у резервоару, 300 µl 1000- фактор конверзије mg/ml у µg/ml. Методом најмањих квадрата одреди се једначина праволинијске зависности RSC% од концентрације (µg/ml). Антиоксидантна активност је изражена преко IC50 што представља концентрацију екстракта (µg/ml), односно стандарда потребну за Материјал и методе 41 неутралисање 50% DPPH радикала у in vitro условима. Што је вредност IC50 мања то је антиоксидантна активност екстракта већа. Једначина праволинијске зависности се одређује за сваки узорак. Вредности IC50 се могу добити из једначине праве или очитавањем са графика. Коришћени стандарди: BHT-а, BHA, кверцетин, рутин и PG су испитивани на исти начин као и узорци. Испитивања су рађена у седам различитих концентрација, а из добијених једначина праве су очитане одговарајуће IC50 вредности. 3.3. Испитивање антиинфламаторне активности Испитивање антиинфламаторне активности екстраката је изведено на животињском моделу (89, 90). Инфламација је изазвана наношењем средства за иритацију на ухо мишева. Наношењем ацетонског раствора фенола на површину уха долази до појаве локалне, акутне, запаљенске реакције (стварање едема) (91). Третираним животињама су апликовани екстракти, а контролним животињама дестилована вода односно дексаметазон, 15 минута пре апликације иритантног агенса. Свим тестираним групама поменуте супстанце су апликоване са спољашње и унутрашње стране десног уха. Један сат након индукције инфламације мишеви су жртвовани предозирањем у етарској анестезији и оба уха су уклоњена. Едем уха је мерен један сат након апликације иритантног агенса, а изражен је као разлика између тежине левог и десног уха. Експеримент је одобрен од стране етичког комитета Медицинског факултета у Крагујевцу број 016427/2. Раствори и реагенси коришћени у експерименту су: 1. Дексаметазон (Дексазон® 4 mg/ml, Галеника, Србија). За потребе експеримента се користи 0,08 mg дексаметазона који се на ухо експерименталне животиње наноси у облику 20 µl раствора концентрације 4 mg/ml. 2. 10 % фенол у ацетону. Овај раствор је припремљен на следећи начин. 1 g фенола (Зоркафарма, Србија) је одмерено и пренето у нормални суд од 10 ml. Фенол је растворен додатком ацетона (JT Baker, USA) и допуњен. 3. Сваки екстракт је припремљен у три различите концентрације 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml. Суви екстракт 500 mg је растворен у 1 ml дестиловане воде. Од овог раствора је узето 0,5 ml и разблажено водом до 1 ml, при чему је добијена концентрација од 250 mg/ml. На исти начин је направљено и треће разблажење. 4. Дестилована вода Материјал и методе 42 3.3.1. Експерименталне животиње У експерименту су коришћени мишеви BALB/c соја, оба пола, старости 5-6 недеља. Набављени из узгајалишта Војномедицинске академије у Београду, Србија. Животиње су боравиле у еколошки контролисаним и дефинисаним условима, на собној температури 220C уз 12-часовни циклус светла и таме и константну влажност ваздуха. До експеримента су чувани у металним кавезима у групама од по три животиње, где су имали неограничен приступ брикетираној храни (Ветеринарски завод Земун) и води. Животиње су 15 часова пре експеримента лишене хране, а воду су добијале у неограниченим количинама. Експеримент је спровођен у складу са смерницама Национаног института за здравље за третман лабораторијских животиња. 3.3.2. Поступак Све животиње су подељене у осам група, у свакој је било по осам животиња. Шест група је третирано са различитим концентрацијама испитиваних екстраката Pot.r-h и Pot.r-r, у запремини од 20 μl при чему су нанете следеће количине екстраката (2,5; 5,0 и 10,0 mg/уху). Једна контролна група је примала дестиловану воду, а друга дексаметазон у концентрацији од 0.08 mg/уху. 15 минута након апликације испитиваних супстанци на исти начин је нането и 20 μl ацетонског раствора фенола као иритирајућег агенса. Један сат након индукције инфламације животиње су жртвоване у етарској анестезији и оба уха су уклоњена, а маса уха је мерена на аналитичкој ваги. Разликом у маси између десног и левог уха третираних животиња, наспрам разлика у маси десног и левог уха контролне групе која је примала дестиловану воду мерен је постигнути антиинфламаторни ефекат. Антиинфламаторни ефект је рачунат као проценат инхибиције едема у третираној групи у поређењу са контролном групом уз коришћење једначине: % проценат инхибиције едема = 100 [(Rt-Lt)/(Rc-Lc)] Rt = средња тежина десног уха третираних животиња Lt = средња тежина левог уха третираних животиња Rc = средња тежина десног уха контролних животиња Lc = средња тежина левог уха контролних животиња Материјал и методе 43 3.4. Испитивање цитотоксичне активности Испитивање цитотоксичних ефеката екстракта Pot.r-h и Pot.r-r је изведено уз помоћ МТТ теста (92). Овај тест одређује вијабилност ћелија индиректном методом тако што прати редукцију МТТ [3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолијум бромид] (Sigma Aldrich, Немачка) у формазан. МТТ је једињење жуте боје, растворљиво у води, које лако пролази кроз ћелијске мембране. Услед присуства ензима митохондријалне редуктазе, МТТ се редукује до несолубилних кристала формазана љубичасте боје. С обзиром да је присуство ензима карактеристика само живих ћелија редукција МТТ-а је пропорционална броју ових ћелија (92). Редукција МТТ до формазана приказана је на слици 9. Слика 9. Реакција редукције МТТ до љубичастог формазана Ефикасност екстраката се одређује поређењем интензитета боје код ћелија изложених медијуму (негативна контрола) и интензитета ћелија изложених испитиваним екстрактима. Интензитет боје се одређује спектрофотометријски на таласној дужини 590 nm (Zenith 3100, Anthos Labtec Instruments GmbH, Аустрија). Због одсуства података о цитотоксичности за водени екстракт биљака из рода Potentilla обављен је пилот тест за одређивање ефективне концентрације која би довела до појаве цитотоксичности (52). Тестиране су концентрације 5-160 µg/ml, а позитиван резултат је примећен при концентрацији од 160 µg/ml. У експерименту су затим коришћене концентрације екстраката 100 – 800 µg/ml за процену цитотоксичности (100 µg/ml, 200 µg/ml, 400 µg/ml, 600 µg/ml, и 800 µg/ml) растварањем у RPMI-1640 медијуму (Gibco, Енглеска). Експеримент је спроведен на 4T1- ћелијској линији мишјег тумора дојки (ATCC-American Type Culture Collection). Ова ћелијска линија је одржавана у RPMI- 1640 медијуму у инкубатору 24 часа (37o C, 5% CO2). Ћелије су користиле 0,25 % trypsin (Hyclone) (93). формазан МТТ Материјал и методе 44 Ћелије су смештене у резервоаре микроплоче при густини од 4000 ћелија по резервоару, при чему је био присутан RPMI-1640 медијум на 37°C са 5 % CO2. Овако припремљена ћелијска култура је остављена да преноћи и након целоноћног раста, ћелије су третиране различитим тест концентрацијама екстракта ризома и хербе P. reptans L. Иста ћелијска линија гајена под истим условима без присуства екстракта је послужила као негативна контрола. Након инкубације течност из сваког резервоара је уклоњена, а додато је 100 µl 15 % MTT раствора. Овако припремљене ћелије су и инкубиране у влажној атмосфери на 5 % CO2, 37 oC, током 4 h. На крају инкубације MTT је уклоњен и додато је 150 μl DMSO/по резервоару ради растварања кристала формазана. Ова смеша је инкубирана 30 мин. на собној температури уз непрекидно мешање. Оптичка густина је мерена на 590 nm (Zenith 3100, Anthos Labtec Instruments GmbH, Аустрија) (92, 94). Сваки тест је рађен у трипликату. Цитотоксичност је представљена графички у функцији концентрације екстраката. Цитотоксичност екстраката је израчуната на основу једначине: % Виабилност = Ā третираних ћелија / Ā негативне контроле x100 % Цитотоксичност = 100 - % Виабилности Ā третираних ћелија - средња вредност апсорбанце третираних ћелија Ā негативне контроле - средња вредност апсорбанце негативне контроле 3.5. Испитивање антихистаминске активности Антихистаминска активност је одређивана мерењем контракције истмичних сегената изолованог јајовода, а ефекти тестираних супстанци изражени су као површина испод криве степена контракција (AUC) (95). Антихистаминска активност екстраката је испитивана на изолованим хуманим јајоводима, добијених током абдоминалне хистеректомије са аднексектомијом. У експерименту је коришћено једанаест јајовода, од једанаест различитих пацијената. Сви оперисани пацијенти су били у лутеалној фази менструалног циклуса, која је потврђена на основу дана циклуса и макроскопског посматрања. Просечна старост пацијената је била 40,2 ± 4,5 година. Експеримент је одобрен од стране етичког комитета Клиничког центра „Крагујевац“, а сви пацијенти су потписали пристанак. Материјал и методе 45 Јајоводи су сакупљани у периоду 2010 - 2011 године у Гинеколошкој клиници Клиничког центра „Крагујевац“, током осам месеци, при чему су сакупљени неоштећени узорци исте величине. Ниједан пацијент није примао полне хормоне два месеца пре операције. Сви пацијенти су оперисани у општој анестезији, где су били претходно третирани са 0,5 mg атропина интрамускуларно, 1 h пре доласка у операциону салу. Анестетици коришћени током анестезије код свих пацијената су били N2O, фентанил и дроперидол. Анестезија је индукована интравенском применом тиопентала, а релаксација мишића сукцинил-холином и панкуронијумом. Изоловани препарати: Око 15 минута после оперативног одстрањивања јајовода, изоловани препарати су смештени у резервоар са De Jalons-овим раствором (154 mM NaCl, 5.95 mM NaHCO3, 5.63 mM KCl, 0.54 mM CaCl2·2H2O, 2.78 mM глукозе) уз довод гаса (95% O2 и 5% CO2, 5 ml/мин) и транспортовани у лабораторију. Истмични сегмент јајовода је изолован при чему је сероза уклоњена. Само ови делови јајовода следећих димензија су коришћени у експерименту: 4 cm дужина, 1,3 mm дебљина зида и пречник лумена 1 mm. Препарати су смештени лонгитудинално у купатило, аналогно Магнус препаратима илеума пацова. Један крај изолованог препарата је био спојен са дном купатила, а други са полугом изометријског трансдјусера и тензија изолованих препарата је константно праћена преко трансдјусера (Palmer Bio Science, Los Angeles, CA, USA) и бележена на компјутеру уз коришћење софтвера (Majk Electronic, Mladenovac, Србија). Препарати су били изложени статичком оптерећењу од 1 mN, уз могућност уравнотежења 1 h пре експеримента (95). Реагенси коришћени у овом експерименту су: 1. хистамин дихидрохлорид (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA), За потребе студије хистамин је растворен у дестилованој води. 2. екстракт Pot.r-h и Pot.r-r. Суви остатак је растворен у физиолошком раствору 0,9 % NaCl. Агонисти и антагонисти. Контракција изолованих препарата мерена је као подручје испод криве (AUC). AUC за тоничне контракције је мерена од хоризонталне линије која је екстраполирана на базалну линију (регистровано пре додавања агониста у изоловано органско купатило) до линије настале након додавања агониста у Материјал и методе 46 изоловано органско купатило (линија која повезује јачину фазних контракција). AUC за фазне контракције након сваке концентрације агониста је мерена као сума свих AUC пикова снимљених после дате концентрације, а до додавања нове концентрације агониста у купатило. На почетку сваког експеримента, најмање један сат, бележена је спонтана активност у циљу евидентирања спонтаног смањења ритмичких контракција. Ако је код неког препарата уочен пад спонтаних контракција, то је узето у обзир приликом рачунања смањења ритмичких контракција добијених одговарајућом дозом агониста, да би се приказао чист ефекат агониста (96). Агонисти су додавани у изоловано купатило органа кумулативно, без испирања органа пре додавања наредне дозе агониста. Размак између давања наредне дозе агонисте је био увек 5-6 минута. Након кумулативног додавања свих доза агонисте, купатило је испрано три пута, а изоловани препарат је остављан да одстоји наредних 30 минута. У одвојеним експериментима антагонисти су додавани у каду 20 минута пре агониста. Ефекат сваке испитиване супстанце је посматран на најмање четири изолована препарата од различитих појединаца. Ефекат сваке концентрације хистамина на тонус и спонтане контракције је изражен као проценат од максималног добијеног ефекта и коришћен је за конструисање дозно – зависне криве (97, 98). 3.6. Испитивање антимикробне активности У циљу утврђивања могуће антимикробне активности у in vitro условима тестирани су водени екстракти Pot.r-h и Pot.r-r на једну гљивицу и четири стандардна ATCC бактеријска соја коришћењем агар-дифузионе методе (99). Стандардни бактеријски сојеви коришћени у тесту су: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Staphylococcus aureus ATCC 25923 и Escherichia coli ATCC 25922, као и гљивица Candida albicans ATCC 10231. Као стандарди су у тесту коришћени цефтриаксон (30 µg/диск) и нистатин (100 IJ/диск), а као негативна контрола дестилована вода. Испитивани узорци у концентрацијама од 100 mg/ml, 10 mg/ml, 1 mg/ml, 100 µg/ml, и 10 µg/ml су припремљени на следећи начин: 100 mg сувог екстракта се раствори додавањем 1 ml дестиловане воде при чему се добија концентрација од 100 Материјал и методе 47 mg/ml. Разблаживањем ове концентрације десет пута дестиливаном водом добија се 10 mg/ml. На исти начин се добијају и друга разблажења. Накнадно су припремљене на исти начин следеће концентрације: 50 mg/ml, 75 mg/ml и 150 mg/ml. За испитивање осетљивости бактерија коришћена је Милер-Хинтон агар подлога (HiMedia Laboratories, Индија, LOT 0000099844), а за гљивицу Candida albicans Sabouraud агар подлога (Институт за имунологију и вирусологију „Торлак“, Београд). Концентрација бактеријских бујона је разблажена (102 организма/ml) и од сваког бујона је коришћена запремина 0,1 ml, која је нанесена на плоче агара помоћу стерилних шприцева и равномерно распрострта по површини плоче. На плочи је било присутно око 104 бактерија. Потом је подлога са одговарајућим сојем разливана у стерилне Петријеве шоље промера 90 mm, тако да је дебљина агара након очвршћавања била око 4 mm. Резервоари пречника од 12 mm направљени су у агару и изведено је иницијално одређивање концентрације која инхибира раст бактерија пуњењем резервоара са 150 µl биљних екстраката. Позитиван резултат је детектован при концентрацији од 10 mg/ml, односно 100 mg/ml, тако да су даља испитивања настављена при већим концентрацијама. Овако припремљене агар плоче су инкубиране на 370C, 24 h. Дијаметри зоне инхибиције биљних екстраката су мерене и упоређиване са вредностима стандардних супстанци. Зона инхибиције је одређена мерењем пречника у милиметрима (приказане вредности пречника зоне инхибиције су умањене за пречник резервоара 12 mm), а у случајевима када је пречник инхибиторне зоне био мањи или једнак 12 mm, испитивани узорак се сматрао неактивним (99). 3.7. Статистичке методе 3.7.1. Антиинфламаторна активност Статистичка обрада резултата је извршена помоћу једнофакторске анализе варијансе (ANOVA) и теста Dunnett T3 post hoc. Индикатором статистичке значајности разлике између експерименталних група се сматра p < 0,05. Сва статистичка израчунавања су рађена уз употребу SPSS софтвера верзија 18. 3.7.2. Цитотоксична активност За статистичку анализу цитотоксичне активности је коришћен SPSS софтвер. Инхибиторне концентрације (IC50) су за оба екстракта одређиване линеарном Материјал и методе 48 регресионом анализом (p < 0,05). За статистичку анализу између тестираних концентрација оба екстракта коришћен је тест једнофакторске анализе варијансе (ANOVA) (p < 0.01). 3.7.3. Антихистаминска активност Дозно зависна повезаност је одређивана линеарном регресијом рачунатом према методи најмањих квадрата. Вредности коришћене у линеарној регресији су 15% - 85% максималног одговора. Концентрација агонисте која изазива 50% свог максималног одговора (EC50) и негов интервал поверења (1,96 x стандардна грешка) су одређивани графички (за сваку криву) линеарном интерполацијом. Резултати су изражени као средња вредност ± 95% интервал поверења. Статистичка разлика између (EC50) контролне криве и (EC50) у присуству екстракта су одређиване Студент Т-тестом. Вредност p < 0,05 је сматрана статистички значајном. 3.7.4. Статистичка анализа антимикробне активности Вредности зона инхибиције за сваки диск су приказане дијаграмом расипања, а линеарне регресионе праве су рачунате методом најмањих квадрата. Резултати 49 4. Резултати 4.1. Хемијски састав водених екстраката хербе и ризома P. reptans Хемијском анализом водених екстраката хербе и ризома P. rеptans уочено је присуство неколико важних група једињења. У оба екстраката су идентификована фенолна једињења, флавоноиди и процијанидини што је приказано у табели бр. 6. Табела 6. Квантитативна анализа водених екстраката P. rеptans (Pot.r-h и Pot.r-r) Групе једињења Pot.r-h Pot.r-r Укупни феноли (mg GAa/g) 116.0 ±16 468.6 ±60 Укупни флавоноиди (mg Qb/g) 10.1 ±1 3.9±2 Садржај проциjанидина (mg Cc/g) 1.11±0.30 98.4±4.3 a GA-гална киселина, bQ- кверцетин, cC- циjанидин-хлорид Једињења која су најзаступљенија у херби су: хлорогенска киселина 758 mg/kg, хинска киселина 164 mg/kg, кафена киселина 78.7 mg/kg, рутин 49,1 mg/kg кверцитрин 47,5 mg/kg. Садржај катехина у ризому је износио 20103 mg/kg. Садржај деривата фенолних киселина и флавоноида је приказан у табелама бр. 7 и 8. Слике 10 и 11 приказују хроматограме анализираних екстраката. Табела 7. Деривати фенолних киселина у воденим екстрактима хербе и ризома P. reptans Једињење Pot.r-r C(*) Pot.r-h C(*) п-хидроксибензоева киселина 4,52 Nd циметна киселина Nd Nd протокатехинска киселина 34,3 16,2 2,5-дихидроксибензоева Nd Nd п-кумаринска киселина 1,37 3,14 o-кумаринска киселина Nd Nd ванилинска киселина 10,5 5,28 гална киселина 65,9 5,30 кафена киселина 0,67 78,7 Резултати 50 Једињење Pot.r-r C(*) Pot.r-h C(*) хинска иселина 87,2 164 ферулна киселина 6,60 12,8 3,4-диметоксициметна киселина Nd Nd синапинска киселина Nd Nd 5-O-кафеохолинска киселина 1,75 758 * mg једињења по kg сувог екстракта Nd – није детектовано Табела 8. Флавоноиди и флавоноидни хетерозиди у воденим екстрактима хербе и ризома P. reptans Једињење Pot.r-r C(*) Pot.r-h C(*) ескулетин Nd 9,05 кемпферол Nd 3,72 катехин 20103 Nd епикатехин 39,7 Nd кверцетин Nd 1,01 изорамнетин Nd 0,53 витескин Nd 0,100 козметин 0,975 21,6 цинарозид 6,50 13,5 кверцитрин 150 47,5 астрагалин 0,60 27,5 хиперозид Nd Nd изокверцетин 1,75 38,3 аментофлавон 0,550 2,42 апиин Nd 2,70 рутин 1,05 49,1 * mg једињења по kg сувог екстракта Nd – није детектовано Резултати 51 Слика 10. HPLC хроматограм воденог екстракта Pot.r-r: 1- хинска киселина, 2 – гална киселина, 3 – катехин, 4 – протокатехуинска киселина, 5 – епикатехин, 6 – лутеолин- 7-o-глукозид, 7- кверцетин. Слика 11. HPLC хроматограм воденог екстракта Pot.r-h: 1- хинска киселина, 2- протокатехуинска киселина, 3- ескулетин, 4- кафена киселина, 5- п- кумаринска киселина, 6 - лутеолин-7-o-глукозид, 7- рутин, 8 - кверцетин-3-o- глукозид, 9 - апигенин-7-o-глукозид, 10 – кверцитрин, 11- кемферол-3-o-глукозид, 12- кемферол. Резултати 52 4.2. Антиоксидантна активност хербе и ризома P. reptans Оба истраживана екстракта P. reptans су показала да поседују антиоксидантну активност DPPH - тестом. Ризом је показао већи антиоксидантни ефекат од хербе. За екстракт хербе P. reptans примењен у концентрацији од 166,7 – 2,6 μg/ml, DPPH активност је била у опсегу 98,9 до 12,3% (IC50 вредност је 12,11 ± 0,216 μg/ml). Применом екстракта ризома P. reptans у концентрацији од 11,49 – 0,180 μg/ml DPPH активност је била од 91,2 – 1,1% (IC50 вредност 2,57 ± 0,340 μg/ml). Екстракт хербе P. reptans је показао најслабију активност у поређењу са стандардима, док је екстракт ризома показао већу активност од (BHT) и нешто слабију од (BHA). Проценат неутралисања DPPH радикала приказује се помоћу IC50 вредности, што представља концентрацију екстракта која је потребна да неутралише 50% DPPH радикала. Вредности IC50 за водене екстракте хербе и ризома P. reptans приказане су у табели бр. 9. Антиоксидантна активност екстраката и стандардних супстанци је на слици 12. Табела 9. Антиоксидантна активност екстраката P. reptans IC50 (μg/ml) Узорци Pot.r-h 12,11±0,216 Pot.r-r 2,57±0,340 BHT 11,65±1,144 Стандарди BHA 1,57±0,093 кверцетин 0,41±0,169 рутин 1,42±0,173 PG 0,61±0,030 BHT – бурил хидрокси толуол, BHA – бутил хидрокси анизол, PG – пропил галат. Резултати 53 Слика 12. Антиоксидантна активност екстраката и стандардних супстанци. а) Pot.r-h, б) Pot.r- r, в) BHT, г) BHA, д) кверцетин, ђ) рутин, е) пропил галат 0 2 4 6 8 10 12 14 0 20 40 60 80 100 I (d p p h ) - P R -K -I I p u t (% ) E_PR-K- II put (g/ml) I ( d p p h )- P o t. r -r ( % ) Pot.r r (µg/ml) 0 50 100 150 200 0 20 40 60 80 100 I ( d p p h ) -P R -L ( % ) E_PR-L (g/ml)Pot.r-h (µg/ml) I ( d p p h )- P o t. r -h ( % ) 0 1 2 3 4 5 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 I (d p p h ) -B H A ( % ) BHA (g/ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 I (d p p h ) -k v e rc e ti n ( % ) Kvercetin (g/ml) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 I (d p p h ) -R u ti n ( % ) Rutin (g/ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0 20 40 60 80 100 I (d p p h ) -P G ( % ) PG (g/ml) 0 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 I (d p p h ) -B H T ( % ) BHT (g/ml) а) б) г) в) д) ђ) е) Резултати 54 4.3. Aнтиинфламаторна активност хербе и ризома P. reptans Водени екстракт ризома P. reptans показао је дозно зависну редукцију едема на експерименталном животињском моделу. Максимални ефекат постигнут је применом дозе 10 mg/уху. У овој дози екстракт је супримирао инфламаторни одговор у степену од 61,37%. Дексаметазон, који представља позитивну контролу је довео до инхибиције едема од 68,77%. Екстракт хербе P. reptans није довео до смањења едема. Резултати антиинфламаторног деловања водених екстраката хербе и ризома P. reptans на моделу фенолом изазваног едема на уху мишева приказани су у табели бр. 10. Табела 10. Антиинфламаторно деловање водених екстраката ризома и хербе P. reptans (Pot.r-h) и (Pot.r-r). Врста узорака концентрација узорка (mg/уху) Едем (mg) Степен инхибиције (%) Pot.r-r 2,5 21,61±9,91 14,18 Pot.r-r 5 17,54±11,78 30,34 Pot.r-r 10 9,73±4,22 a 61,37 Pot.r-h 2,5 19,89±9,46 21,00 Pot.r-h 5 26,36±7,74 -4,71 Pot.r-h 10 18,47±17,75 26,62 Дексаметазон 0,08 7,86±4,74 a 68,77 Вода 0 25,18±9,24 0 a P < 0,05 поређење са контролном групом. 4.4. Цитотоксична активност хербе и ризома P. reptans Водени екстракт ризома P. reptans је изазвао дозно – завистан цитотоксични ефекат, IC50 је била 280,51 + 1,16 µg/ml при (F = 27,16915; r = 0,87; p < 0,05). Водени екстракт хербе P. reptans је такође показао дозно – завистан цитотоксични ефекат са IC50 310,79 + 1,22 µg/ml где је (F = 17,79516; r = 0,79; p < 0,05). Цитотоксична активност екстраката ризома у концентрацији од 800 µg/ml је била већа од цитотоксичне активности екстраката концентрације 100 µg/ml и 600 µg/ml, док је цитотоксична активност екстракта хербе била већа за концентрацију од 800 µg/ml у Резултати 55 односу на концентрацију од 100 µg/ml. цитотоксични ефекти екстраката хербе и ризома P. reptans је приказана на сликама 13 и 14. Слика 13. – Цитотоксични ефект екстраката P. Reptans:ризом (•); херба (▲). Слика 14.- Цитотоксичност екстраката P. reptans (ризома и хербе) (%). * Значајност у поређењу екстракта ризома у концентрацијама од 100 µg/ml до 800 µg/ml (p = 0.000) ** Значајност у поређењу екстракта ризома у концентрацијама од 100 µg/ml до 600 µg/ml (p = 0.000) • Значајност у поређењу екстракта надземног дела у концентрацијама од 100 µg/ml до 800 µg/ml (p = 0.009) Резултати 56 4.5. Антихистаминска активност хербе и ризома P. reptans 4.5.1. Спонтана активност и ефекти хистамина Осам препарата (73%) je показалo спонтану активност која се састоји од спорих ритмичких контракција са амплитудом од 0,7  0,4 N и фреквенцијом од 3 до 6 циклуса у минуту. Хистамин (1,0 x 10-6 M – 1,1 x 10-4 M) је изазвао дозно – зависну контракцију изолованог истмичног сегмента (EC50 = 4,20  1,80 x 10 -6 M; r = 0,89; p < 0,001), при чему није утицао на спонтану активност изолованих препарата (F = 0,346, df1 = 6, df2 = 14, p >0.05), што је приказано на сликама 15 и 16. Слика 15. Тоничне контракције истмичног сегмента хуманог јајовода продуковане хистамином Резултати 57 Слика 16. Ефекат хистамина на тонус изолованог сегмента хуманог јајовода и спонтана активност F = сила; Време (s) = секунд; Црна трака– снага лонгитудиналне контракције; Црвена трака – тајмер; Бројеви од 1 до 7 представљају додавање наредних доза хистамина. Број 8 указује на прање купатила. 4.5.2. Ефекти екстракта хербе P. reptans L Екстракт хербе P. reptans у концентрацији од 13 g/ml показује антихистамински ефекат што је потврђено појавом померања хистаминске концентрација – ефекат криве у десно (EC50 = 2.48  3.53 x 10 -5 M; r = 2.370, df = 38, p < 0.05; F = 19.94, df1 = 6, df2 = 14, p < 0.01), слика 17. 4.5.3. Ефекти екстракта ризома P. reptans L Екстракт ризома P. reptans L примењен у концентрацији од 13 g/ml не показује антихистамински ефекат и не доводи до значајног померања хистаминске концентрација – ефекат криве у десно (EC50 = 4,30  1,97 x 10 -6 M; r = 0,049, df = 45, p > 0,05). Резултати 58 Слика 17. Ефекат екстракта хербе на контракције јајовода продуковане хистамином. а) Утицај екстракта хербе P. reptans L (13g/ml) (●); б) Тоничне контракције истмичног сегмента хуманог јајовода продуковане хистамином (■). 4.6. Антимикробна активност хербе и ризома P. reptans Резултати агар дифузионог теста су показали да водени екстракти хербе и ризома P. reptans у концентрацијама од 10 – 150 mg/ml испољавају значајну антимикробну активност према Escherichia coli и Staphylococcus aureus, док ни једна од примењених концентрација ових екстраката није довела до значајне инхибиције раста бактерије Klebsiella pneumoniae. Антимикробно деловање је било најизраженије при највећим примењеним концентрацијама. Екстракт хербе је испољио 95,24% активности цефтриаксона (30 µg/диск) за Escherichia-у coli, односно 68,75% за Staphylococcus aureus. Екстракт ризома у концентрацији од 150 mg/ml испољава чак 133,3% активности стандарда према Escherichia coli, а 87,5% акивности цефтриаксона (30 µg/диск) за Staphylococcus aureus. Сој Candida albicans је показала умерену осетљивост на ризом P.reptans где је највећа примењена концентрација испољила 50% активности референтне супстанце нистатина (25µg/диск). Резултати антимикробног деловања приказани су у табели бр. 11. Резултати 59 Табела 11. Антимикробна активност водених екстраката ризома и хербе P. reptans. Дијаметар зоне инхибиције (mm) Материјал Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Candida albicans ATCC 10231 Potr-h 10 mg/ml - 15 - - 50 mg/ml - 16 16 - 75 mg/ml - 17 18 - 100 mg/ml - 18 20 - 150 mg/ml - 20 22 - Potr-r 10 mg/ml - 19 22 - 50 mg/ml - 23 23 - 75 mg/ml - 25 26 - 100 mg/ml - 22 27 16 150 mg/ml - 28 28 17 Цефтриаксон 30 µg/диск 21 32 0 Нистатин 100 IJ/диск 0 0 0 34 Утицај екстраката ризома и хербе P. reptans L. у концентрацијама од 10 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml на раст стандардних сојева бактерија и гљивице приказан је на сликама 18-20. Резултати 60 а). б) Слика 18. Антимикробно деловање P. reptans на E. coli а) водени екстракт хербе б) водени екстракт ризома Резултати 61 а) б) Слика 19. Антимикробно деловање P. reptans на S. aureus а) водени екстракт хербе б) водени екстракт ризома Резултати 62 а) б) Слика 20. Антимикробно деловање P. reptans на гљивицу- C. albicans а) водени екстракт хербе б) водени екстракт ризом Дискусија 63 5. Дискусија Род Potentilla има широку употребу у традиционалној медицини многих народа, што је довело до истраживања која су имала за циљ фитохемијску карактеризацију овог рода као и повезивање фармаколошких својстава рода са присутним секундарним метаболитима у биљкама. Доминантни секундарни метаболити овог рода су: флавоноиди, хидролизовани танини, кондензовани танини (проциајнидини), тритерпеноиди, као и органске и фенолкарбонске киселине (24). Поједини секундарни метаболити попут флавоноида су карактеристични за надземне делове биљака, док су танини доминантни у корену и у ризому ових биљака. Закључује се да се водени екстракти разликују не само у хемијском саставу, већ и у фармаколошким ефектима (24). P. reptans припада роду Potentilla и широко је распрострањена на европском и азијском континенту. У народној медицини се користе ризом и херба биљке, у терапији запаљенских процеса, алергијских реакција, зарастања рана и др. Могуће је одређивање хемијског састава и дефинисање фармаколошких особина екстраката добијених одговарајућим екстракционим методама из појединих делова или из целе биљке. Од избора растварача и метода екстракције зависи принос одговарајућих једињења а самим тим и фармаколошки ефекти екстракта који се испитује. Циљ овог истраживања је био да се испитају екстракти који су најсличнији по облику и саставу традиционалном начину употребе ове биљке. феноли, флавоноиди и танини који су карактеристични за биљке овог рода се добро екстрахују поларним растварачима (вода, етил алкохол различитих односа воде и етанола). Недостатак воде као растварача је да поред фармаколошки активних компоненти раствара и баластне материје (31). Ефикасност и брзина екстракције зависе и од температуре на којој се она изводи. Сходно томе да су активне компоненте код Potentilla врста термо стабилне, овде можемо изводити екстракцију и на повишеним температурама. Тако да је екстраховање вршено кључалом водом (24). Квантитативном анализом екстраката утврђен је висок садржај фенолних једињења. А даљом HPLC анализом је утврђено да је најдоминантније једињење код ризома катехин, али поред њега су значајно заступљени и протокатехинска, гална, хинска киселина, епикатехин и кверцитрин а у херби хлорогенска, хинска, кафена киселина, рутин и кверцитрин. Дискусија 64 Резултати ове студије су показали да је водени екстракт ризома P. reptans четири пута богатији у садржају укупних фенола од хербе. Садржај флавоноида је виши у екстракту хербе у односу на ризом, што је у складу са резултатима добијених и код осталих биљака овог рода (24). Процијанидини представљају главне компоненте укупних фенола у ризому P. reptans (Табела 6.). Упоређујући садржај појединачних фенолних једињења хербе и ризома P. reptans уочено је да се већина фенолних једињења налази у већој количини у надземном делу него у ризому, са изузетком галне киселине, катехина, епикатехина, протокатехинске киселине и кверцитрина, чији садржај доминира у ризому. Литературни подаци указују да су флавоноиди (апигенин, лутеолин и кемпферол) заступљени у ризому Potentilla врста, међутим они нису нађени у ризому P. reptans. Садржај процијанидина у ризому је (98,4 g/kg) што је више од њиховог садржаја у корену P. alba (80 g/kg), али и других биљака које су извор процијанидина. (100). Поређења ради, плод ароније, биљке која припада истој фамилији као и P. reptans, а која је позната као веома богат извор процијанидина, садржи (52 g/kg) (18, 101). Резултати укупних фенола, флавоноида и процијанидина добијени у овом истраживању су поређењем са резултатима једне компаративне студије, која је истраживала надземне делове десет различитих врста Potentilla, показали да херба P. reptans садржи 116.0 mg/g укупних фенола, што се поклапа са највишим вредностима ове студије P. fruticosa-е (116.3 mg/g). Надземни део P. reptans је богатији у укупним флавоноидима (10,1 mg/g) од P. fruticosa-е, биљке у којој су такође идентификовани флавоноиди у највећој количини од свих испитиваних биљака (7,0 mg/g). Поређењем са биљкама поменуте студије надземни део P. reptans има најмањи садржај процијанидина (1,1 mg/g) (102). Резултати овог истраживања указују на присуство високе количине катехина у ризому (20,1 g/kg), што је у складу са подацима за неке врсте Potentilla. (24). Катехин спада у кондензоване танине и има антиинфламаторну, антимикробну, антитуморску активност и штити од оксидативног стреса (103). Студије које су квантификовале катехин у различитим биљкама дају различите резултате (104). Поједине биљке или њихови делови (воће) представљају оскудан извор катехина, док се друге биљке карактеришу богатим присуством овог једињења (105). Катехин се налази у великој количини у ризому, а насупрот томе, није пронађен у херби P. reptans. Ова неусаглашеност између садржаја надземног дела и ризома је уочена и код других Дискусија 65 фенолних једињења: епикатехина, кемпферола, кафене киселине и п-кумаринске киселине. Кемпферол, кафена киселина и п-кумаринска киселина су доминантно присутне у херби, док је епикатехин нађен само у ризому. Хидроксицинамске киселине и њени деривати су у значајној мери присутне у херби Potentilla (24). Из ове групе једињења у херби P. reptans су идентификоване: кафена, п-кумаринска, хинска и хлорогенска киселина. Хидроксицинамске киселине су донори водоника због присуства CH=CH-COOH групе при чему се у многоме повећавају антиоксидантна својства ових једињења (106). Слободни радикали су узроци патогенезе многих хроничних обољења (дијабетес, кардиоваскуларна обољења, различите врсте тумора, ХИВ инфекција, инфламаторна обољења и др.). Слободни кисеонични радикали могу бити молекули, атоми или јони, имају један или више неспарених електрона у својој структури, а настају као међупроизвод у кисеоничном метаболизму. Неспарени електрон код слободних радикала може да се нађе на C-атому (алкил радикали CH3•, CH3CH2•), на O-атому (RO•, HO•, ROO•, O2•-), на N-атому (NO•), на S-атому (RS•). Неспарене електроне могу да имају и атоми водоника (H•) халогена (Cl•), алкални метали (Na•). Ове структуре су нестабилне и реактивне и изазивају ланчане реакције у организму. Реактивна кисеонична једињења (Reactive oxygen species - ROS) су структуре у које спадају кисеонични радикали као и нека нерадикалске врсте које су оксидативна средства или се лако преводе у радикале као на пример: HOCl, HOBr, O3, ONOO - , H2O2. Ове структуре имају важну улогу у ћелијској сигнализацији, а учествују и у одбрани организма од инфективних болести. Са друге стране, излагање организма негативним утицајима спољашње средине као што су различите врсте зрачења, дувански дим, токсичне хемијске супстанце итд, утичу на повећање садржаја ових једињења у организму. Њихово присуство у великим концентрацијама изазива оштећење ћелијских структура, такозвани оксидативни стрес. Формирани слободни кисеонични радикали као што су супероксид анјон радикал (O2 ¯), пероксинитрит (ОNОО¯), хидроксилни радикал (OH¯) и други се ослобађају из различитих ћелијских извора у васкуларно или паренхимско ткиво и доводе до рзличитих обољења (107, 108). Под антиоксидантима се подразумевају све супстанце које смањују или спречавају оксидацију неког супстрата. Антиоксиданси могу да делују на један од следећих начина: делују као „хватачи“ слободних радикала, односно донори електрона или H-атома пероксил или хидроксил радикалима, делују као акцептори електрона или Дискусија 66 H-атома, разграђују хидропероксиде липида, комплексирају јоне метала (чиме је онемогућено стварање иницијатора оксидације, нпр. OH радикала), инхибирају неке ензиме (109). Природна једињења са антиоксидантним својствима играју важну улогу у реакцијама где се формирају реактивни облици кисеоника, при чему смањују штетан потенцијал ових реактивних структура. Полифенолна једињења се сматрају најзначајнијим фитокомпонентама која нису неопходна за опстанак биљке а поседују антиоксидантно деловање. У фенолна једињења која се карактеришу изразитим антиоксидантним својствима спадају: фенолне киселине, флавоноиди и танини. Они могу спречити или успорити развој хроничних болести попут кардиоваскуларних обољења, артериосклероза, реуматизама, разних форми канцера итд (109). Флавоноиди се понашају као донори водоника и на тај начин реагују са слободним радикалима, тако да представљају снажне антиоксидансе у поређењу са другим биљним фенолним дериватима. Кемпферол, кверцетин и рутин у биљним екстрактима показују снажан антиоксидантни ефекат (110). Фенолне киселине (кафена и п-кумаринска киселина) показују значајан антиоксидантни ефекат (111, 112). У овом истраживању је коришћен индиректни метод одређивања антиоксидантне активности (DPPH тест) екстраката P. reptans. Индиректне методе се употребљавају за одређивање способности антиоксиданаса да неутралишу радикале који нису увек повезани са оксидативном разградњом (DPPH радикали). Овај тест је поуздан метод одређивања антиоксидантних способности фенолних једињења присутних у екстрактима. Оба екстракта су показала значајну антиоксидантну активност. Антиоксидантна активност ризома P. reptans била је пет пута већа од антиоксидантне активности хербе. Супстанце које су коришћене као стандарди су показале већу активност од хербе P. reptans, док је екстракт ризома имао већу активност од BHT, а нижу од кверцетина, BHA, PG и рутина. Предходна истраживања биљног материјала показала су да постоји позитивна корелација између садржаја укупних фенола и антиоксидантне активности (113). Резултати овог истраживања су у складу са тим истраживањима јер постоје и друге Potentilla врсте, код којих су коришћени различити растварачи за добијање одговарајућих екстраката, а чији је антиоксидантни капацитет испитиван такође помоћу DPPH теста и потврђен (101, 62, 114, 115). Како литературни подаци указују на Дискусија 67 то да је катехин снажан антиоксиданс, при чему високи садржај катехина га чини водећом компонентом ризома P. reptans, може се предпоставити да је ово једињење одговорно за испољавање антиоксидантне активности (103). Ова претпоставка се заснива на чињеници да су резултати вредности IC50 екстракта ризома у доброј корелацији са резултатима добијеним у сличном експерименту где је испитиван водени екстракт ризома Bergenia crassifolia, а где је такође уочен позитиван однос садржаја катехина и добијених вредности IC50 (113). Из свега овога може се предпоставити да висок садржај укупних фенола, посебно садржај катехина у ризому P. reptans, значајно доприноси антиоксидантном ефекту воденог екстракта ризома. Супстанце тестиране DPPH тестом које поседују IC50 вредности ≤ 50 μg/ml сврставају се у активне антиоксидансе. Добијени резултати у овој студији сврставају и ризом и хербу у активне антиоксидансе (2,57 μg/ml ризом и 12,11 μg/ml херба) (116, 117). Антиоксидантни ефекат биљних екстраката не остварује се услед присуства појединачних компоненти у екстракту већ је резултат синергистичког деловања већег броја једињења присутних у биљном материјалу. У надземном делу присустна је и кафена киселина у већем садржају него друга фенолна једињења. Кафена киселина је категорисана као активни антиоксидант па се може сматрати да и она доприноси антиоксидативном ефекту у односу на друга присутна једињења (111). Процијанидини су истраживани као потенцијални антиоксиданси, због чега су у употреби у медицини и исхрани (118). Процијанидини су у већој количини заступљени у ризому него у херби P. reptans, па се може предпоставити да процијанидини доприносе показаном антиоксидантном ефекту ризома. Садржај укупних фенола је већи у ризому P. reptans него у херби што је у позитивној корелацији са антиоксидантном активношћу ових екстраката. У студијама појединих врста рода Potentilla антиоксидантна својства (P. alba корен) су доведена у везу са садржајем фенолних једињења (катехин, епикатехин итд.) (102). Резултати ове студије комплементирају тренутна сазнања о овом роду (24). Природни биљни деривати који поседују антиоксидантна својства се користе у терапији и исхрани ради превенције односно спречавања штетног деловања реактивних кисеоничних једињења која могу да покрену или убрзају деловање многих медијатора запаљенских процеса (119, 120). Антиоксиданси снижавају концентрацију Дискусија 68 реактивних кисеоничних једињења и тако умањују продукцију про-инфламаторних медијатора као што су: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, леукотријени и простагладини (121). У овој студији су проучавани ефекти водених екстраката хербе и ризома P. reptans на инфламаторне процесе изазване фенолом (91). Контакт фенола и коже доводи до оштећења мембране кератиноцита и доводи до ослобађања цитокина који ослобађају остале медијаторе запаљења (91). На овај начин се постиже добар локални инфламаторни одговор, тако да се фенол може сматрати добрим реагенсом за изазивање локалне инфламације (122). Секундарни метаболити попут фенолних једињења изолованих из биљака (флавоноиди и фенол карбонске киселине) показују антиинфламаторне карактеристике (123). Водени екстракт ризома P. reptans је показао антиинфламаторни ефекат, док екстракт надземног дела није показао никакву значајну антиинфламаторну активност. Инхибиција едема се постиже применом 10 mg/уху воденог екстракта ризома. При овој количини екстракта едем се редукује за 61,27 % што је у корелацији са резултатима других студија где применом водених екстраката различитих биљака такође долази до редукције едема (57,0 % применом 5 mg/уху (89), 36,3 % применом 200 mg/уху (117)). Водени екстракт ризома P. reptans у концентрацији од 10 mg/уху доводи до редукције едема за 89,24 % у односу на редукцију едема која је изазвана применом дексаметазона као стандардне супстанце (124). Катехин и кверцитрин инхибирају ослобађање проинфламаторних цитокина (IL- 1, TNF-α, и простагландина E2), при чему су оба једињења заступљена у екстракту ризома P. reptans (123, 125). Резултати овог истраживања показују да је екстракт ризома P. reptans активан при локалној примени у третману акутног дерматитиса индукованог фенолом, у сличном обиму као и дексаметазон. На основу резултата добијених DPPH тестом и садржаја фенолних једињења у ризому P. reptans, посебно катехина који је присутан у највећој мери, може се предпоставити да су ова једињења у ризому одговорна за анти-инфламаторни ефекат који је постигнут применом воденог екстракта ризома P. reptans. Водени екстракт хербе P. reptans иако сличног квалитативног састава (флавоноиди и фенол карбонске киселине) који спадају у групу једињења са антиинфламаторном активношћу није показао статистички значајне резултате при тестираним концентрацијама. Разлог за добијање оваквог резултата је највероватније Дискусија 69 присуство недовољних количина активних принципа у екстракту. Наиме кверцитрин који је дериват кверцетина и спада у јаке антиинфламаторне агенсе у ризому је заступљен у количини од 150 mg/kg, док је у херби заступљен свега 47,5 mg/kg (123). Рутин, као и кверцитрин, спада у гликозиде флавоноида кверцетина. Како је њихова хемијска структура веома слична, разлика је у једној хидроксилној групи, они показују и сличне фармаколошке ефекте (126). Иако је био очекиван његов утицај, у херби је изостао највероватније због ниских концентрација 49,1 mg/kg. Наиме концентрације рутина у биљном материјалу се крећу 4.879 mg/g до 171.82 mg/g (127). С обзиром да херба садржи активне принципе који би могли да доведу до испољавања антиинфламаторног ефекта будућа истраживања би могла да користе екстракте добијене или различитим методама или коришћењем поларних растварача попут алкохола или метанола где би се нашле веће количине флавоноидних једињења (31, 127). Туморска обољења спадају у једна од најраспрострањенијих, а најтеже контролисаних болести савременог света. У традиционалној медицини многих народа постоје биљни препарати чији је циљ смањење или превенција туморских обољења. Биљке из рода Potentilla су коришћене код многих народа у ту сврху. Скорашње студије су потврдиле могућност смањења ризика од туморских обољења применом различитих облика биљних екстраката добијених из биљака рода Potentilla (128). P. reptans није истраживана до сада на цитотоксичне карактеристике. Потенцијална антитуморска активност P.reptans је праћена специфичним тестом на туморским ћелијским културама (129). Хемијска карактеризација ризома указује да је садржај катехина доминантан. Катехин је инхибитор COX 1 и сматра се да може вршити превенцију туморских процеса. Студије које су имале за циљ доказивање активности катехина су уочиле да је катехин, сам или у комбинацији са инхибиторима COX 2, ефикасан против неколико врста тумора као што су естроген зависни тумори, тумори бешике, простате, панкреаса. Катехин поседује још један користан механизам деловања, он повећава рану апоптозну активност, чиме остварује анти-пролиферативни ефекат (130). Ова студија је показала да су од секундарних метаболита у херби P. reptans доминантни флавоноиди. Литературни подаци указују да флавоноиди испољавају јако антитуморско дејство, при чему могу да делују у различитим фазама настанка тумора. Механизам антитуморског деловања је комплексан и укључује антипролиферативну, Дискусија 70 антиоксидантну активност, индукцију апоптозе, блокаду ћелијског циклуса, па чак и елиминацију резистенције на лекове, што оправдава коришћење флавоноида током терапије антитуморским лековима (131, 132). У зависности од карактеристика растварача (поларност) зависи која једињења и у којој мери ће бити екстахована. Из овог разлога одабир растварача је веома битан фактор који у многоме утиче на резултате истраживања. Наиме, полифенолна једињења којима се приписују лековита својства и којих има доста у биљкама, ће се квантитативније екстраховати органским растварачима него водом (31). Вредности IC50 за цитотоксичност водених биљних екстраката и вредности IC50 за биљне екстракте добијене коришћењем органских растварача (етанола, метанола итд) могу се разликовати у великој мери. Етанолни екстракт P. erecta при концентрацији од 10 и 50 µg/ml испољава снажан цитотоксични ефекат, док водени екстракти биљке Geranium robertianum испољавају цитостатске ефекте тек при концентрацијама већим од 500 µg/ml (51,133). Иако су концентрације водених биљних екстраката које доводе до цитотоксичности обично веће од концентрација екстраката добијених уз помоћ других растварача овде је коришћена екстракција водом јер је то најчешћи начин справљања лековитих препарата у традиционалној медицини (134, 48). Антитуморска активност већине врста из рода Potentilla је мало истраживана, изузетак је P. erecta где је етанолни екстракт ризома показао цитотоксичност (51). Мотивација за процену потенцијалне антитуморске активности P.reptans базирана је на њеном коришћењу у народној медицини у третману инфламације и инфекције, које су у вези са туморским обољењима (134, 48). У овој студији је спроведено истраживање водених екстраката хербе и ризома P. reptans, што је у складу са начинима припремања биљних препарата у традиционалној медицини (134). Оба екстракта, и ризом и херба P. reptans су показала цитотоксични ефекат на 4T1 ћелијској линији канцера дојке код мишева. Код оба екстракта ефекат је детектован при концентрацијама од 100 µg/ml и 200 µg/ml. Водени екстракт ризома има већу активност од екстракта хербе дела. IC50 за екстракт ризома је био 280,51 ± 1,16 µg/ml, а IC50 за екстракт хербе је 310,79 ±1,22 µg/ml, сходно резултатима актуелних студија о цитотоксичности водени екстракти показују цитотоксични ефекат при вишим концентрацијама почевши од 250 µg/ml, при чему испољавају слабе цитотоксичне ефекте (51). С обзиром да је доминантно једињење у ризому катехин, може се претпоставити да је он и најодговорнији за испољавање овог цитотоксичног ефекта (130). Код хербе нема доминантне Дискусија 71 присутности неког једињења, али се може уочити да су од свих секундарних метаболита у највећој мери присутни флавоноиди па се њима може и приписати активност овог екстракта (131, 132). Резултати добијени овом студијом и подаци о антитуморском дејству P. reptans могу се сматрати прелиминарним и ови резултати отварају нова истраживачка питања везаних за ову биљку. По својој стуктури хистамин је биогени амин који се синтетише у организму из амино киселине хистидина и депонује у мастоцитима и у базофилним леукоцитима у крви. Под дејством антигена на IgE антитела која се налазе на мембранама ћелија у којима је депонован хистамин долази до његовог ослобађања. На овај начин хистамин се ослобађа у оквиру алергијске реакције типа 1. Други начин ослобађања хистамина ткзв. не-егзоцитостатски механизам се одвија под дејством различитих агенаса (лекови, отрови или физички агенаси). Услед њиховог деловања долази до оштећења мембрана ћелија које садрже хистамин. Након ослобађања хистамина долази до вазодилатације артериола, капилара и венула. Хистамин повећава пропустљивост капилара услед чега долази до едема, црвенила коже, свраба, контракције глатке мускулатуре респираторних путева, гастроинтестиналног и генитоуринарног тракта. Сви набројани ефекти се остварују услед везивања хистамина за H1 рецепторе. Поред активације H1 рецептора, хистамин може да активира и H2 рецепторе, при чему такође долази до вазодилатације, повећаног лучења хлороводоничне киселине, као и до смањења свог ослобађања из мастоцита и базофила (135). У овој студији је испитивана антихистаминска активност воденог екстракта хербе и ризома P. reptans. Херба је при концентрацији од 13 µg/ml показала значајно померање хистаминске криве, концентрација – ефекат у десно, што значи да веће концентрације хистамина (EC50 = 2,48  3,53 x 10 -5 M) доводе до истог интензитета контракције истмичног сегмента у присуству екстракта хербе него што је потребно самом хистамину (EC50 = 4,20  1,80 x 10 -6 M). Овај резултат је у корелацији са резултатима других студија где је показано значајно смањење контракције илеума замораца изазване хистамином приликом примене етанолних и водених екстраката биљке Striga orobanchioides. Применом ових екстраката у концентрационом опсегу од 2,5-25 µg/ml долази до значајног смањења контракције илеума, а концентрација од 25 µg/ml доводи до скоро потпуног прекида контракција код оба екстракта (136). Дискусија 72 Флавоноиди показују велику фармаколошку и биохемијску активност, а уочено је да утичу и на функционисање имуног система (137). Студије које су испитивале антихистаминско и антиалергијско деловање екстраката су спровођене у in vivo условима са циљем да одреде која једињења у екстрактима су одговорна за овакво њихово деловање. Уочено је да су флавоноиди показали највећу антихистаминску активност. Флавоноиди (кверцетин, кверцетин-3-o-глукозид, рутин) изоловани из Cressa cretica L. стабилишу ћелијске мембране мастоцитних и базофилних ћелија и на тај начин смањују ослобађање хистамина (138). Поред овог могућег механизма деловања флавоноида, зна се да они могу да утичу и на функционисање ензима попут киназа, фосфолипаза, липооксигеназа (139). На пример флавоноиди лутеолин или кверцетин испољавају антиалергјско деловање инхибирањем активације ензима протеин киназе C, међутим њих нема, односно налазе се у траговима испитиваних екстраката (140). Сви ови механизми деловања флавоноида доприносе ефекту које остварују у in vivo истраживањима. Међутим, мали је број студија које су испитивале директну антихистаминску активност биљака. Доказано је да свега неколико биљних врста и њихових екстраката испољава директну антихистаминску активност. Деривати кверцетина из силимарина, Striga orobanchioides, Rhamnus nakaharai али не и сам кверцетин инхибирају контракције изолованог трахеалног сегмента заморца индукованог хистамином (136, 141, 142). Поред флавоноида херба P. reptans, у значајној мери садржи и хлорогенску киселину за коју је такође утврђено да инхибира ослобађање хистамина из мастоцитних ћелија тако што стабилише мембране ових ћелија (143). С обзиром да је ова студија показала позитивне резултате хербе P. reptans на изолованом истмичном сегменту хуманог јајовода, може се претпоставити да екстракт хербе испољава директну антихистаминску активност и да се понаша као компетитивни антагониста хистамина. Добијени резултати отварају нова питања, посебно о ефикасности овог екстракта у in vivo условима, прецизније идентификације хемијских једињења, боље повезивање њихове хемијске структуре која је одговорна за ово деловање са фармаколошким ефектима. Литературни подаци указују на то да катехин и његови деривати имају антиалергијско деловање (144). Катехин из биљке Albizia lebbeck испољава јак Дискусија 73 инхибиторни ефекат ослобађања хистамина тако што доводи до стабилизације мастоцитних ћелија и смањењује експресију цитокина на мембранама сензибилисаних мастоцита (144, 147). Иако је екстракт ризома P. reptans богат катехином, он није показао значајно смањење контракција на изолованим препаратима. Овај резултат указује на чињеницу да катехин не испољава директну антихистаминску активност у in vitro условима. Студије које су испитивале антимикробну активност биљака из рода Potentillae показале су да врсте овог рода испољавју умерену или јаку антимикробну активност. Тако је P. recta примењена у концентрацији од 10 mg/ml показала умерену активност на сојевима бактерија S. aureus и E. coli, са зонама инхибиције 15, односно 12 mm, као и на гљивицама C. albicans, и C. krusei, са зонама инхибиције 21, односно 17 mm док испитивања на B. subtilis нису довела до значајног повећања зоне инхибиције (146). Студија која је испитивала девет врста рода Potentilla (P. argentea, P. fruticosa, P. recta , P. rupestris, P. erecta, P. anserina, P. nepalensis, P. thuringiaca, P. grandiflora.) показала је да ове биљке испољавају умерену активност на грам-позитивне бактерије, као и умерени антигљивични ефекат на Candida albicans, док антибактеријске активности није било против грам-негативних бактерија. Најјаче антимикробно дејство испитиване биљке су показала на H. pylori где се минимална инхибиторна концентрација кретала у опсегу од 0,1-0,5 mg/ml (57). Добијени резултати наше студије корелирају са литературним подацима о овом роду. Метанолни екстракт P. recta примењиван у концентрацији од 10 mg/ml довео је до појаве зоне инхибиције код S. aureus од 15 mm (146). Водени екстракт ризома P. reptans у овој студији је при концентрацији од 10 mg/ml такође довео до појаве зоне инхибиције код ове бактерије (22 mm), док екстракт надземног дела у овој концентрацији није показао заначајно деловање на S. aureus, он тек при концентрацији од 50 mg/ml показује зону инхибиције од 16 mm. Зоне инхибиције након примене 10 mg/ml екстраката хербе и ризома P. reptans на E. coli су 15 mm односно 19 mm. Ове вредности су знатно веће од резултата добијених применом 10 mg/ml екстракта P. recta (12 mm) (146). Минимална инхибиторна концентрација (МИК) је одређивана на неколико врста Potentilla при чему су постигнути значајни резултати при концентрацијама од 50, односно 100 mg/ml код E. coli, док је код S. aureus МИК у нешто ширем опсегу. Најмања инхибиторна концентрација је 12,5 mg/ml за P. nepalensis и P. anserine. Друге врсте попут P. argentea, P. fruticosa, P. recta имају МИК од 25 mg/ml, док остале врсте МИК испољавају у опсегу од 50-100 mg/ml. Иако је Дискусија 74 показано да биљке из рода Potentilla имају умерену антифугалну активност, на пример МИК за Candidu albicans се креће у опсегу од 25-100 mg/ml код испитиваних врста Potentilla (147), док P. recta при концентрацији од 10 mg/ml доводи до појаве зоне инхибиције од 21 mm у овој студији ниједан екстракт при овој концентрацији није показао јасну зону инхибиције. Тек у концентрацијама већим од 100 mg/ml код екстракта ризома може се уочити зона инхибиције од 16 mm. Истраживања су показала да су секундарни метаболити есенцијални за развој биљке. Истраживање које је вршено на три врсте пшенице је показало да се катехин и његови деривати синтетишу у већој количини код инфицираних биљака у односу на здраве, а такође и ниво катехина опада након завршетка инфекције, па се сматра да је синтеза катехина одбрамбени одговор на напад патогена (148). Једна студија је покушала да разјасни механизам деловања катехина на гљивицу C. albicans где је показано да катехин испољава фунгостатички ефекат. Доказано је да катехин делује на ћелијском нивоу тако што смањује пренос сигнала и на тај начин инхибира каскадни пут митоген активирајуће протеин киназе и смањује синтезу cAMP. Катехин посебно утиче на тзв. хифа форму C. albicans за коју се сматра да повећава патогеност ове гљивице, јер се прилагођава различитим условима средине. Катехин је доминантни метаболит ризома P. reptans и може се претпоставити да је главни носилац активности овог екстракта (149). Што се тиче антимикробног деловања, доказано је да катехин поседује антимикробну активност при чему механизам деловања још увек није разјашњен. Претпоставка је да хидроксилна група на катехинском молекулу услед дехидрогенације се преводи у карбоксилну групу која са своје стране може да оствари везу са фосфолипидима на ћелијској мембрани, а што доводи до оштећења мембране и физиолошких функција (150). У херби P. reptans доминантни секундарни метаболити су фенолна једињења од којих су најзаступљенији флавоноиди и деривати хлорогенске киселине. Деривати хлорогенске киселине показују антимикробну активност против грам-позитивних и грам-негативних бактерија (151). Међутим, екстракти биљака из којих су ова једињења изолована показала су бољу антимикробну активност од самих једињења. Може се предпоставити да деривати хлорогенске киселине делују синергистички са другим фенолним једињењима из екстракта у испољавању антимикробног деловања (151). Флавоноиди су ароматична фенолна једињења која се синтетишу у биљкама као одговор на микробиолошке инфекције. Претпоставља се да микробиолошка активност Дискусија 75 флавоноида потиче од њихове способности да стварају иреверзибилан комплекс са аминокиселинама у протеинима ћелијског зида микроорганизама, што доводи до инактивације протеина и губитка њихове функције а самим тим и уништења микроорганизама. Сматра се да флавоноиди могу градити комплекс и са мембранским ензимима при чему долази до ензимске инактивације. Флавоноиди садрже карбоксилну и хидроксилне групе а сматра се да флавоноиди који у својим структурама имају више хидроксилних група испољавају и већу микробиолошку активност. С обзиром да је уочена и антимикробна активност једноставних фенолних стуктура а може се уочити веза између степена хидроксилације и токсичности за микроорганизме. Микробиолошки ефекат водених екстраката P. reptans може бити резултат деловања већег броја секундарних метаболита различитих хемијских структура истовремено (152). Закључци 76 6. Закључци 1. Хемијском анализом воденог екстракта хербе P. reptans L. уочен је највећи садржај флавоноида, док су у екстракту ризома у највећој мери заступљени процијанидини и флавоноидни агликони. Ризом P. reptans L. се карактерише присуством велике количине катехина, а у херби су заступљени хинска, кафена као и деривати хлорогенске киселине. 2. Оба испитивана екстракта Potentilla reptans су показала значајан антиоксидантни ефекат. Ризом је показао јачи антиоксидантни ефекат од надземног дела. Екстракт хербе P. reptans је показао најслабији ефекат у односу на стандарде, док је екстракт ризома показао јачи ефекат од (BHT) а слабији ефекат од (BHA). 3. Водени екстракт ризома P. reptans је довео до редукције едема на експерименталном моделу уха миша. Највиша примењена доза екстрата (10 mg/уху), је довела до инхибиције едема од 61,37 %, што представља 89,24 % деловања дексаметазона. Водени екстркт хербе P. reptans није довео до значајне редукције едема. 4. Оба екстракта хербе и ризома P. reptans испољавају цитотоксичну активност. Цитотоксична активност ризома у концентрацији од 800 µg/ml је била већа од цитотоксичне активности екстраката концентрација 100 µg/ml и 600 µg/ml. цитотоксична активност екстракта хербе била је већа при концентрацији од 800 µg/ml у односу на концентрацију од 100 µg/ml. 5. Водени екстракт хербе P. reptans примењен у концентрацији од 13 µg/ml показује антихистаминско деловање. За разлику од хербе екстракт ризома није показао значајну антихистаминку активност. 6. Водени екстракт хербе P. reptans у концентрацијама 10 – 150 mg/ml испољава антимикробну активност према Escherichia coli а 50 – 150 mg/ml према Staphylococcus aureus, док ни једна од примењених концентрација није довела до инхибиције раста бактерије Klebsiella pneumoniae. Екстракт ризома P. reptans у концентрацији 10 – 150 mg/ml делује антимикробно против Escherichia coli и Staphylococcus aureus, а не показује ефекат на Klebsiella pneumoniae. 7. Антимикробно деловање хербе забележено при највећим примењеним концентрацијама (150 mg/ml) је било 95,24 % активности цефтриаксона за Закључци 77 Escherichia-у coli, односно 68,75 % за Staphylococcus aureus. Екстракт ризома у концентрацији од 150 mg/ml испољава чак 133,3 % активности цефтриаксона према Escherichia coli, а 87,5 % акивности цефтриаксона за Staphylococcus aureus. Екстракт ризома има антифунгално деловање (Candida albicans) при највишој примењеној концентрацији (150 mg/ml) која је испољила 50 % активности нистатина. Литература 78 7. Литература 1. Dhami N. Trends in Pharmacognosy: A modern science of natural medicines. J Herbal Med. 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.hermed.2013.06.001 2. Raskin I, Ribnicky DM, Komarnytsky S et al. Plants and human health in the twenty- first century. Trends Biotechnol. 2002; 20: 522-31. 3. Lalli JYY. In vitro Pharmacological Properties and Composition of leaf Essential Oils and Extracts of Selected Indigenous Pelargonium (Geraniaceae) Species. PhD Thesis, University of the Witwatersrand, Johannesburg. 2005. 4. Tao X, Younger J, Fan FZ, Wang B, Lipsky PE. Benefit of an Extract of Tripterygium Wilfordii Hook F in Patients With Rheumatoid Arthritis A Double-Blind, Placebo- Controlled Study. Arthritis & Rheumatism. 2002; 46(7): 1735-43. 5. Potter D, Eriksson T, Evans RC, et al. Phylogeny and classification of Rosaceae. Plant Syst Evol. 2007; 266(1–2): 5–43. 6. Systema Naturae. 2000; http://sn2000.taxonomy.nl/ 7. Gajic M, Josifovic M. Flora Srbije. Beograd: SANU; 1972. 8. Hegi G. Illustrierte Flora von Mitteleuropa. 3th ed. Hamburg: Aufl. Verlag Paul Parey; 1980. 9. Hiller K. Potentilla. In: Hager`s Handbuch der Pharmazeutischen Praxis. vol. 6, 5th ed. Berlin, Heidelberg, New York: Springer; 1994; 254-269. 10. Chaoluan L, Ikeda H, Ohba H. Potentilla Linnaeus. Flora of China. 2003; 9: 291–327. 11. Shah M, Sinwari ZK, Leghari MK. et al. A note on centres of diversity of the genus Potentilla (Rosaceae). Bull. Nat. Sci. Mus. Tokyo B (Botany). 1992; 18: 117–22. 12. Dobeš C, Paule J. A comprehensive chloroplast DNA-based phylogeny of the genus Potentilla (Rosaceae): Implications for its geographic origin, phylogeography and generic circumscription. Mol Phylogenet Evol. 2010; 56: 156–75. 13. Wolf T. Monographie der Gattung Potentilla. Stuttgart: Bibliotheca Botanica; 1908. 14. Goswami AD, Matfield B. Cytogenetic studies in the genus Potentilla. New Phytol. 1975; 75(1): 135-46. 15. Josifović M. Flora srbije. Beograd: SANU; 1973. 16. Feng W, Zheng X, Yoshida T, Okuda T. Five hydrolyzable tannins from Potentilla discolor Bunge. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 1996; 8: 26–30. 17. Gritsenko OM, Smik GK. Phytochemical study of Potentilla alba. Farmatsevtichnii Zhurnal (Kiev). 1977; 1: 88–9. Литература 79 18. Oszmianski J, Wojdylo A, Lamer-Zarawska E, Swiader K. Antioxidant tannins from Rosaceae plant roots. Food Chem. 2007; 100: 579–83. 19. Kombal R, Glasl H. Flavan-3-ols and flavonoids from Potentilla anserina. Planta Medica 1995; 61: 484–5. 20. Xue PF, Luo G, Zeng WZ, Zhao YY, Liang H. Secondary metabolites from Potentilla multifida L. (Rosaceae). Biochemical Systematics and Ecology 2005; 33: 725–8. 21. Jang DS, Yoo NH, Kim JM et al. An ellagic acid rhamnoside from the roots of Potentilla discolor with protein glycation and rat lens aldose reductase inhibitory activity. Natural Product Sciences 2007; 13: 160–3. 22. Grujic-Vasic J, Ramic S, Bosnic T, Rimpapa Z. Phytochemical investigation of the Tormentil—Potentilla tormentilla. Folia Medica Facultatis Medicinae Universitatis Saraeviensis 1982; 17: 89–98. 23. Liu Y, Yannan SS, Zhu T. Antibacterial components in Potentilla discolor. Zhongcaoyao 1984; 15: 333. 24. Tomczyk M, Latté KP. Potentilla—A review of its phytochemical and pharmacological profile. J Ethnopharmacol. 2009; 122 (2-18): 184-204. 25. Cheynier V, Comte G, Davies KM, Lattanzio V, Martens S. Plant phenolics: Recent advances on their biosynthesis, genetics, and ecophysiology. Plant Physiol Biochem. 2013; doi: 10.1016/j.plaphy.2013.05.009. 26. Kovačević N. Osnovi farmakognozije. 3th ed. Београд: Srpska školska knjiga Beograd; 2004. 27. Crozier A, Clifford MN, Ashihara H. Plant Secondary Metabolites: Occurrence, Structure and Role in the Human Diet. Blackwell Publishing; 2006. 28. Peng B, Qiao CF, Zhao J, Huang WH, Hu DJ, Liu HG, Li SP. Simultaneous Determination of Flavonoids, Isochlorogenic Acids and Triterpenoids in Ilex hainanensis Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with Diode Array and Evaporative Light Scattering Detection. Molecules 2013; 18: 2934-41. 29. Mahmood T, Anwar F, Abbas M, Saari N. Effect of Maturity on Phenolics (Phenolic Acids and Flavonoids) Profile of Strawberry Cultivars and Mulberry Species from Pakistan. Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 4591-607. 30. Vasconsuelo A, Boland R. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary metabolites in plants. Plant Science. 2007; 172: 861–75. Литература 80 31. Azmir J, Zaidul ISM, Rahman MM, at al. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A review. J Food Eng. 2013; http://dx.doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2013.01.014 32. Schleep S, Friedrich H, Kolodziej H. The first natural procyanidin with a 3,4-cis- configuration. J Chem Soc Chem Commun. 1986; 392–6. 33. Li Q, Hui J, Shang D,Wu L, Ma X. Investigation of the chemical constituents of the roots of Potentilla anserina L. in Tibet. Chin. Pharm. J. 2003; 55: 179–84. 34. Li YY, Xiao CM, Yao M, Zeng XY, Xiao XH, Zhu CQ. Study on chemical constituents of triterpenoids from Potentilla discolor. Zhong Yao Cai. 2013; 36(7):1099-101. 35. Selenina LV, Zozulya RN, Yakovleva TN. Polyphenols of Potentilla erecta and their biological activity. Rastitel’nye Resursy. 1973; 9: 409–14. 36. Okuda T, Yoshida T, Hatano T et al. Hydrolysable tannins as chemotaxonomic markers in the Rosaceae. Phytochemistry 1992; 31: 3091–6. 37. Okuda T, Yoshida T, Kuwahara M, Memon MU, Shingu T. Agrimoniin and potentillin, an ellagitannin dimer and monomer having an _-glucose core. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 1982; 153–64. 38. Okuda T, Yoshida T, Kuwahara M, Memon MU, Shingu T. Tannins of rosaceous medicinal plants. I. Structures of potentillin, agrimonic acids A and B, and arimoniin, a dimeric ellagitannin. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1984; 32: 2165–73. 39. Goncharov NF, Stupakova EP, Komissarenko NF. Polyphenol composition Of the the epigeal part of Potentilla erecta. Khimiya Prirodnykh Soedinenii. 1989; 25: 431–2. 40. Goncharov NF, Stupalova EP, Komissarenko NF, Gella EV. Coumarins of the epigeal part of Potentilla erecta. Khimiya Prirodnykh Soedinenii. 1987; 23: 299–300. 41. Popov SV, Popova GY, Ovodova RG, Ovodov YS. Antiinflammatory activity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre. Fitoterapia 2005; 76: 281–7. 42. Vilfort R. Lekovito bilje I njegova upotreba. Beograd: Sezam book; 2009. 43. Long ChL, Li R. Ethnobotanical studies on medicinal plants used by the Red-headedYao People in Jinping,Yunnan Province, China. Journal of Ethnopharmacology 2004; 90: 389–95. 44. Manandhar NP. A survey of medicinal plants of Jajarkot district, Nepal. Journal of Ethnopharmacology 1995; 48: 1–6. Литература 81 45. Xue PF, Yin T, Liang H, Zhao YY. Study on chemical constituents of Potentilla discolor. Chinese Pharmaceutical Journal. 2005; 40: 1052–4. 46. Webster D, Taschereau P, Belland RJ, Sand C, Rennie RP. Antifungal activity of medicinal plant extract; preliminary screening studies. Journal of Ethnopharmacology 2008; 115: 140–6. 47. Ivancheva S, Stantcheva B. Ethnobotanical inventory of medicinal plants in Bulgaria. Journal of Ethnopharmacology 2000; 69: 165–72. 48. De Natale A, Pollio A. Plants species in the folk medicine of Montecorvino Rovella (inland Campania, Italy). J Ethnopharmacol. 2007; 109: 295–303. 49. Li PL, Lin CJ, Zhang ZX, Jia ZJ. Three new triterpenoids from Potentilla multicaulis. Chemistry and Biodiversity 2007; 4: 17–24. 50. Wang QH, Li ZY, Shen Y, Lin HW, Shu W, Zhou JB. Studies on triterpenoids from Potentilla chinensis. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006; 31(17):1434-6. 51. Spiridonov NA, Konovalov DA, Arkhipov VV. Cytotoxicity of some Russian ethnomedicinal plant compounds. Phytother Res. 2005; 19: 428–32. 52. Syiem D, Syngai C, Kharbuli B, Kayang H, Khongwir BS. Anti-tumor activity of crude root extract of Potentilla fulgens. Indian Drugs. 2003; 40: 124–5. 53. McCutcheon AR, Roberts TE, Gibbons E et al. Antiviral screening of British Columbian medicinal plants. J Ethnopharmacol. 1995; 49: 101–10. 54. Tackechi M, Tanaka Y, Takehara M, Nonaka GI, Nishioka I. Structure and antiherpetic activity amongs the tannins. Phytochemistry. 1985; 24: 2245–50. 55. Pleszczyn ska M, Wiater A, Szczodrak J, Bachanek T. Searching for natural substances inhibiting glucosyltransferases from mutans streptococci. Nowa Stomatologia. 2003; 8: 163–7. 56. Kołodziej H, Kayser O, Latte KP, Ferreira D. Evaluation of the antimicrobial potency of tannins and related compounds using the microdilution broth method. Planta Med. 1999; 65: 444–6. 57. Tomczyk M, Leszczynska K, Tomczykowa M, Jakoniuk P. Screening of antimicrobial activity of aqueous extracts of the selected Potentilla L. species. Planta Med. 2007; 73: 854–5. 58. Hamza OJM, Carolien JP, Beukel B, et al. Antifungal activity of some Tanzanian plants used traditionally for the treatment of fungal infections. Journal of Ethnopharmacology, 2006;108(1):124-32. Литература 82 59. Latte KP, Kołodziej H. Antifungal effects of hydrolysable tannins and related compounds on dermatophytes, mould fungi and yeasts. Zeitschrift fur Naturforschung 2000; 55: 467–72. 60. Tunon H, Olavsdotter C, Bohlin L. Evaluation of anti-inflammatory activity of some Swedish medicinal plants. Inhibition of prostaglandin biosynthesis and PAF-induced exocytosis. J Ethnopharmacol. 1995; 48: 61–76. 61. Youngken JHW, Neva AC, Dauben JHJ, Chang YW, Wenkert E. The muscle relaxant effects produced by Potentilla anserina extracts. I. Fractionation studies. J Am Pharm Assoc. 1949; 38 (8): 448–51. 62. Kalia K, Sharma K, Singh HP, Singh B. Effects of extraction methods on phenolic contents and antioxidant activity in aerial parts of Potentilla atrosanguinea Lodd. and quantification of its phenolic constituents by RP-HPLC. J Agric Food Chem. 2008; 56 (21): 10129–34. 63. Miliauskas G, VanBeek TA, Venskutonis PR, Linssen JPH, deWaard P, Sudholter JRE. Antioxidant activity of Potentilla fruticosa. J Sci Food Agric. 2004; 84: 1997– 2009. 64. Terashima S, Shimizu M, Nakayama H, et al. Studies on aldose reductase inhibitors from natural products. Part III. Studies on aldose reductase inhibitors from medicinal plant of “Sinfito,” Potentilla candicans, and further synthesis of their related compounds. Chem Pharm Bull. 1990; 38: 2733–6. 65. Enomoto S, Okada Y, Guvenc A, Erdurak CS, Coskun M, Okuyama T. Inhibitory effects of traditional Turkish folk medicine on aldose reductase (AR) and hematological activity, and on AR inhibitory activity of quercetin-3-Omethyl ether isolated from Cistus laurifolius L. Biol Pharm Bull. 2004; 27: 1140–3. 66. Borrelli F, Izzo AA. The plant kingdom as a source of anti-ulcer remedies. Phytother Res. 2000; 14: 581–91. 67. Popov SV, Ovodova RG, Markov PA, Nikitina IR, Ovodov YS. Protective effect of comaruman, a pectin of cinquefoil Comarum palustre L., on acetic acidinduced colitis in mice. Dig Dis Sci. 2006; 51: 1532–7. 68. Laloo D, Prasad SK, Krishnamurthy S, Hemalatha S. Gastroprotective activity of ethanolic root extract of Potentilla fulgens Wall. ex Hook. Journal of Ethnopharmacology 2013;146: 505–14. Литература 83 69. Syiem D, Syngai C, Khup PZ, Khongwir BS, Kharbuli B, Kayang H. Hypoglycemic effects of Potentilla fulgens L. in normal and alloxan-induced diabetic mice. J Ethnopharmacol. 2002; 83: 55–61. 70. Stachurski L, Strzelecka H. Quantitative determination of tormentoside and two of its isomers in Potentilla erecta L. rhizomes. Herba Pol. 1994; 40: 99–105. 71. Pilipovic S, Bosnic T, Redzic S, Mijanovic M. Topical anti-inflammatory effect of acetone rhizome/root extract of Potentilla mal´yana Borbas. Planta Med. 2007; 73: 829–30. 72. Pilipovic S, Grujic-Vasic J, Ibrulj A, Redzic S, Bosnic T. Antiinflammatory effect of rhizome and root of Potentilla erecta (L.) Raeuschel and Potentilla alba L. (Rosaceae). Abstract P164, p. 192, 53. Joint meeting of the Society of Medicinal Plant Research, Florence. 2005. 73. Kolpakov MA, Grek OR. Bashkirova YV, Lyubarskii MS, Ravilova YR. Hepatoprotective properties of aqueous extract from Pentaphylloides fruticosa during chronic toxic hepatitis. Bull Exp Biol Med. 2001; 131: 470–2. 74. Vennat B, Bos MA, Pourrat A, Bastide P. Procyanidins from Tormentil: Fractionation and study of the anti-radical activity towards superoxide anion. Biol Pharm Bull. 1994; 17: 1613–5. 75. Teftyuyeva N. Effects of Potentilla tormentilla spirituous tincture on lipoperoxidation of rats blood. Annales Universitatis Mariae Curie-Skodowska. Sectio DDD, Pharmacia 2004; 17: 189–91. 76. Avci G, Kupeli E, Eryavuz A, Yesilada E, Kucukkurt I. Antihypercholesterolaemic and antioxidant activity assessment of some plants used as remedy in Turkish folk medicine. J Ethnopharmacol. 2006; 107: 418–23. 77. Hor M, Rimpler H, Heinrich M. Inhibition of intestinal chloride secretion by proanthocyanidins from Guazuma ulmifolia. Planta Med. 1995; 61: 208–12. 78. Verhaeren EHC, Lemli J. The effect of gallotannins and (+)-catechin on the stimulated fluid secretion on the colon, following a rhein perfusion in guinea pigs. Planta Med. 1986; 52: 269–72. 79. Galvez J, Zarzuelo A, Crespo ME et al. Antidiarrhoeic activity of Sclerocarya birrea bark extract and its active tannin constituent in rat. Phytother Res. 1991; 5: 276–8. 80. Subbotina MD, Timchenko VN, Vorobyov MM, Konunova YS, Aleksandrovih YS, Shushunov S. Effect of oral administration of tormentil root extract (Potentilla Литература 84 tormentilla) on rotavirus diarrhea in children: a randomized, double blind, controlled trial. Pediatr Infect Dis J. 2003; 22: 706–11. 81. Huber R, Ditfurth AV, Amann F et al. Tormentil for active ulcerative colitis: an open- label, doseescalating study. J Clin Gastroenterol. 2007; 41: 834–8. 82. Gurbuz I, Ozkan AM, Yesilada E, Kutsal O. Anti-ulcerogenic activity of some plants used in folk medicine of Pinarbasi (Kayseri, Turkey). J Ethnopharmacol. 2005; 101: 313–8. 83. Farmakopeja SFRJ IV. Beograd: savezni zavod za zdravstvenu zastitu; 1984. 84. Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 1999; 299: 152–78. 85. Beara NI, Lesjak MM, Jovin ĐE, et al. Plantain (Plantago L.) Species as Novel Sources of Flavonoid Antioxidants. J. Agric. Food Chem. 2009; 57: 9268–73. 86. Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colori-metric methods. J. Food Drug Anal. 2002; 10: 178–82. 87. Porter LJ, Hristich LN, Chan BG. The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin. Phytochemistry 1986; 25(1): 223-30. 88. Soler-Rivas C, Espin JC, Wichers HJ. An easy and fast test to compare total free radical scavenger capacity of foodstuffs. Phytochem. Anal. 2000; 11: 330–8. 89. Okoli CO, Akah PA, Onuoha NJ, Okoye TC, Nwoye AC, Nworu CS. Acanthus montanus: An experimental evaluation of the antimicrobial, anti-inflammatory and immunological properties of a traditional remedy for furuncles. BMC Complement Altern Med. 2008; 8: 27. 90. Leite GO, Leite L, Sampaio RS, et al. (−)-α-Bisabolol attenuates visceral nociception and inflammation in mice. Fitoterapia. 2011; 82: 208–11. 91. Wilmer JL, Burleson FG, Kayama F, Kauno J, Luster MI. Cytokine induction in human epidermal keratinocytes exposed to contact irritants and its relation to chemical-induced inflammation in mouse skin. J Invest Dermatol. 1994; 102: 915–22. 92. Mosmann TR. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays J. Immunol. Methods. 1983; 65: 55-63. 93. Le HK, Graham L, Cha E, Morales JK, Manjili MH, Bear HD. Gemcitabine directly inhibits myeloid derived suppressor cells in BALB/c mice bearing 4T1 mammary Литература 85 carcinoma and augments expansion of T cells from tumor-bearing mice. Int. Immunopharmacol. 2009; 9: 900–9. 94. Hussain RF, Nouri AME, Oliver RTD. A new approach for measurement of cytotoxity using colorimetric assay Original Research Article. J. Immunol. Methods. 1993; 160 (1): 89-96. 95. Jankovic SM, Jankovic SV, Lukic G, Radonjic V, Cupara S, Stefanovic S. Contractile effects of endothelins on isolated ampullar segment of human oviduct in luteal phase of menstrual cycle. Pharmacol Res. 2009; 59: 69-73. 96. Bowman WC, Rand MJ. Principles of Drug Action. In: Textbook of Pharmacology. Oxford: Blackwell Scientific Publication; 1980; 1-46. 97. Kenakin TP. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol Rev. 1984; 36: 165-222. 98. Jankovic SM, Milovanovic DR, Jankovic SV. Schild's equation and the best estimate of pA2 value and dissociation constant of an antagonist. Croatian Med J. 1999; 40: 67- 70. 99. Cheruiyot KR, Olila D, Kateregga J. In-vitro antibacterial activity of selected medicinal plants from Longisa region of Bomet district, Kenya. African Health Sciences 2009; 9: S42-6. 100. Xue P, Zhao Y, Wang B, Liang H. Simultaneous determination of seven flavonoids in Potentilla multifida by HPLC. J Chromatogr Sci. 2007; 45(4): 216-9. 101. Shahat AA, Marzouk MS. Tannins and Related Compounds from Medicinal Plants of Africa. Med. Plant Research in Africa. 2013; 479-555. 102. Tomczyk M, Pleszczyńska M, Wiater A. Variation in Total Polyphenolics Contents of Aerial Parts of Potentilla Species and Their Anticariogenic Activity. Molecules 2010; 15: 4639-51. 103. Katalinic V, Milos M, Modun D, Music I, Boban M. Antioxidant effectiveness of selected wines in comparison with (+)-catechin. Food Chem. 2004; 86: 593–600. 104. Suzuki T, Someya S, Hu F, Tanokura M. Comparative study of catechin compositions in five Japanese persimmons (Diospyros kaki). Food Chem. 2005; 93: 149–52. 105. Tsanova-Savova S, Ribarova F, Gerova M. (+)-Catechin and (-)-epicatechin in Bulgarian fruits. J Food Compost Anal. 2005; 18: 691-8. Литература 86 106. Cuvelier ME, Hubert R, Berset C. Comparison of the Antioxidative Activity of Some Acid-phenols: Structure-Activity Relationship. Biosci. Biotech. Biochem. 1992; 56 (2): 324-5. 107. Rice-Evans CA, Miller NJ, Pagagna G. Structure-Antioxidant Activity Relationships of Flavonoids and Phenolic Acids. Free Radic Biol Med. 1996; 20(7): 933-56. 108. Aslan M, Cort A, Yucel I. Oxidative and nitrative stress markers in glaucoma. Free Radic Biol Med. 2008; 45: 367–76. 109. Halliwell B. Establishing the significance and optimal intake of dietary antioxidants: the biomarker concept. Nutr Re. 1999; 57(4): 104-13. 110. Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol. Ther. 2002; 96: 67–202. 111. Gülçin I. Antioxidant activity of caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid). Toxicology 2006; 217 (2-3): 213-20. 112. Sun C, Fu J, Chen J, Jiang L, Pan Y. On-line HPLC method for screening of antioxidants against superoxide anion radical from complex mixtures. J Sep Sci. 2010; 33(8): 1018-23. 113. Ivanov S, Nomura K, Malfanov IL, Sklyar IV, Ptitsyn LR. Isolation of a novel catechin from Bergenia rhizomes that has pronounced lipase-inhibiting and antioxidative properties. Fitoterapia 2011; 82: 212–8. 114. Miliauskas G. Venskutonis PR. van Beek TA. Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chem. 2004; 85: 231–7. 115. Hatano T, Edamatsu R, Hiramatsu M, et al. Effects of the interaction of tannins with co-existing substances.VI.: Effects of tannins and related polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Chem Pharm Bull. 1989; 37: 2016–21. 116. Cheel J, Theoduloz C, RodriÄguez J, Schmeda-Hirschmann GJ. Free Radical Scavengers and Antioxidants from Lemongrass (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf.). J Agric Food Chem. 2005; 53: 2511-7. 117. Tadic VM, Dobric S, Markovic GM et al. Anti-inflammatory, Gastroprotective, Free-Radical-Scavenging, and Antimicrobial Activities of Hawthorn Berries Ethanol Extract. J. Agric. Food Chem. 2008; 56(17): 7700–9. Литература 87 118. Santos-Buelga C, Scalbert A. Proantocyanidins and tannin-like compounds-nature, occurrence dietary intake and effects on nutrition and health. J Sci Food Agric. 2000; 80: 1094–117. 119. Alder V, Yin Z, Tew KD, Ronai Z. Role of redox potential and reactive oxygen species in stress signaling. Oncogene 1999; 18: 6104–11. 120. Keane MP, Strieter RM. The importance of balance pro- inflammatory and anti- inflammatory mechanisms in diffuse lung disease. Respir. Res. 2002; 3: 5. 121. Luger TA, Schwarz T. Evidence for an epidermal cytokine network. J. InVest. Dermatol. 1990; 95: S100–4. 122. Murray AR, Kisin E, Castranova V, Kommineni C, Gunther MR, Shvedova AA. Phenol-induced in vivo oxidative stress in skin: evidence for enhanced free radical generation, thiol oxidation, and antioxidant depletion. Chem Res Toxicol. 2007; 20:1769–77. 123. Rogerio AP, Kanashiro A, Fontanari C et al. Antiinflammatory activity of quercetin and isoquercitrin in experimental murine allergic asthma. Inflammation Res. 2007; 56: 402–8. 124. Utsunomiya I, Nagai S, Oh-ishi S. Differential effects of indomethacin and dexamethasone on cytokine production in carrageenin-induced rat pleurisy. Eur J Pharmacol. 1994; 252: 213-8. 125. Tang LQ, Wei W, Wang XY. Effects and mechanisms of catechin for adjuvant arthritis in rats. Adv Ther. 2007; 24(3): 679-90. 126. Guardia T, Rotelli AE, Juarez AO, Pelzer LE. Anti-inflammatory properties of plant flavonoids. Effects of rutin, quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat. Il Farmaco 2001; 56: 683–7. 127. Zeng H, Wang Y, Kong J, Nie C, Yuan Y. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of rutin from Chinese medicinal plants. Talanta 83 (2010) 582–590 128. Unnati S, Ripal S, Sanjeev A, Niyati A. Novel anticancer agents from plant sources. Chin J Nat Med. 2013; 11(1): 0016−23. 129. Siriwatanametanon N, Fiebich BL, Efferth T, Prieto JM, Heinrich M. Traditionally used Thai medicinal plants: In vitro anti-inflammatory, anticancer and antioxidant activities: J. Ethnopharmacol. 2010; 130: 196 – 207. 130. McMillan BBS, Riggs DRBA, Jackson BJBA, Cunningham C, McFadden DWMD. Dietary Influence on Pancreatic Cancer Growth by Catechin and Inositol Hexaphosphate. J Surg Res. 2007; 141: 115–9. Литература 88 131. Scheck AC, Perry K, Hank NC, Clark WD. Аnticancer activity of extracts derived from the mature roots of Scutellaria baicalensis on human malignant brain tumor cells. BMC Complement Altern Med. 2006; 6: 27. 132. Kanadaswami C, Lee LT, Lee PPH, et al. The Antitumor Activities of Flavonoids. In vivo 2005; 19: 895-910. 133. Neagu E, Paun G, Constantin D, Radu G.L . Arabian Journal of Chemistry Cytostatic activity of Geranium robertianum L. extracts processed by membrane procedures. Arabian Journal of Chemistry (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.arabjc.2013.09.028 134. Tucakov J. Lecenje biljem. Beograd: Rad; 2006. 135. Јанковић СМ, Простран М, Тодоровић З. Фармакологија и токсикологија. Крагујевц, Београд: медицински факултет у Крагујевцу; 2007. 136. Harish MS, Nagur M, Badami S. Antihistaminic and mast cell stabilizing activity of Striga orobanchioides J Ethnopharmacol. 2001; 76: 197–200. 137. Middleton EJ, Kandaswami C. Effects of flavonoids on immune and inflammatory cell functions. Biochem Pharmacol. 1992; 43(6):1167-79. 138. Sunita P, Jha S, Pattanayak SP. Bronchodilatory and mast cell stabilising activity of Cressa cretica L. Evaluation through in vivo and in vitro experimental models. Asian Pac J Trop Med. 2012; 180-6. 139. Manthey JA. Biological properties of flavonoids pertaining to inflammation. Microcirculation 2000; 7: 29–34. 140. Kimata M, Shichijo M, Miura T, Serizawa I, Inagaki N, Nagai H. Effects оf luteolin, quercetin and baicalein on immunoglobulin E-mediated mediator release from human cultured mast cells. Clin Exp Allergy. 2000; 30: 501–8. 141. Breschi MC, Martinotti E, Apostoliti F, Nieri P. Protective effect of silymarin in antigen challenge- and histamineinduced bronchoconstriction in in vivo guinea pigs. Eur J Pharmacol. 2002; 437: 91–5. 142. Ko WC, Wang HL, Lei CB, Shih CH, Chung MI, Lin CN. Mechanisms of relaxant action of 3-O-methylquercetin in isolated guinea pig trachea. Planta Med. 2002; 68: 30–5. 143. Qin HD, Shi YQ, Liu ZH, et al. Effect of Chlorogenic acid on mast cell-dependent anaphylactic reaction. Int Immunopharmacol. 2010; 10: 1135–41. Литература 89 144. Venkatesh P, Mukherjee PK, Kumar NS, et al. Anti-allergic activity of standardized extract of Albizia lebbeck with reference to catechin as a phytomarker. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2010; 32(2): 272-6. 145. Maeda-Yamamoto M, Ema K, Monobe M, Tokuda Y, Tachibana H. Epicatechin-3- O-(3″-O-methyl)-gallate content in various tea cultivars (Camellia sinensis L.) and its in vitro inhibitory effect on histamine release. J Agric Food Chem. 2012; 60(9): 2165- 70. 146. Tosun A, Bahadir Ö, Altanlar N. Antimicrobial activity of some plants used in folk medicine in Turkey. Turk J Pharm Sci. 2006; 3(3): 167-76. 147. Tomczyk M, Leszczyńska K, Jakoniuk P. Antimicrobial activity of Potentilla species. Fitoterapia 2008; 79: 592–4. 148. Ghassempour A, Mollayi S, Farzaneh M, Sharifi-Tehrani A, Aboul-Enein HY. Variation of Catechin, epicatechin and their enantiomers concentrations before and after wheat cultivar-Puccinia triticina infection. Food Chem. 2011; 125: 1287–90. 149. Saito H, Tamura M, Imai K, Ishigami T, Ochiai K. Catechin inhibits Candida albicans dimorphism by disrupting Cek1 phosphorylation and cAMP synthesis. Microb Pathog. 2013; 56: 16-20. 150. Chunmeia D, Jiabob W, Weijuna K, Chengc P, Xiaoheb X. Investigation of anti- microbial activity of catechin on Escherichia coli growth by microcalorimetry. Environ Toxicol Pharmacol. 2010; 30: 284–8. 151. Xia D, Wu X, Shi J, Yang Q, Zhang Y. Phenolic compounds from the edible seeds extract of Chinese Mei (Prunus mume Sieb. et Zucc) and their antimicrobial activity. Food Sci and Technol- LEB 2011; 44: 347-9. 152. Cowan MM. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev. 1999; 12: 564–82. Прилог 90 ПРИЛОГ 8.1 КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАТИКА УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ФАКУЛТЕТ МЕДИЦИНСКИХ НАУКА Редни број: РБ Идентификациони број: ИБР Тип документације: ТД Монографска публикација Тип записа: ТЗ Текстуални штампани материјал Врста рада: ВР Докторска дисертација Аутор: АУ Марина Т. Томовић Ментор: МН доц. др Снежана Цупара Наслов рада: НР Испитивање антимикробног, антиинфламаторног и антихистаминског дејства екстракта Potentilla reptans L. Језик публикације: ЈП Српски (ћирилица) Језик извода: ЈИ Српски / Енглески Земља публиковања: ЗП Србија Уже географско подручје: УГП Србија Година: ГО 2014. Издавач: ИЗ Ауторски репринт Прилог 91 Место и адреса: МС Светозара Марковића 69, 34 000 Крагујевац Физичи опис рада: ФО Дисертација има 89 страна, 7 поглавља, 20 слика, 11 табела и 152 референце Научна област: НО Медицина Научна дисциплина: ДИ Клиничка и експериментална фармакологија Предметна одредница / Potentilla reptans L, анти- кључне речи: ПО инфламаторно, антихистаминско, антимикробно деловање екстраката, фитохемијска анализа УДК Чува се: ЧУ У библиотеци Факултета медицинских наука у Крагујевцу, Светозара Марковића 69, 34 000 Крагујевац Важна напомена: ВН Извод: ИД Potentilla reptans L. је коровска биљка доста распрострањена у Европи и Азији. Користи се у традиционалној медицини, у терапији различитих обољења сама или у комбинацији са другим биљкама. Циљ овог истраживања је одређивање хемијског профила ове биљке као и утврђивање биолошке активности и фармаколошких ефеката водених екстраката ризома и хербе P. reptans. До сада нису забележени подаци о хемијском саставу ризома P. reptans, док је у херби идентификовано осам једињења. Фармаколошка испитивања су се односила на одређивање антиоксидантног и антиулцерогеног ефекта. За предвиђене анализе припремљени су водени екстракти хербе и ризома P. reptans. Применом референтне методологије одређен је садржај укупних фенола, флавоноида и процијанидина, као и идентификација фенолних једињења из помоћ 45 стандардних супстанци. У in vitro условима применом DPPH теста одређена је антиоксидантна Прилог 92 активност екстраката. Испитивање фармаколошких ефеката спроведено је применом одговарајућих методологија при чему је одређивана антиинфламаторна, антихистаминска, антимикробна и цитотоксична активност водених екстраката хербе и ризома P. reptans. Резултати истраживања су показали доминантно присуство флавоноида у херби P. reptans, док у ризому доминира катехин. Испитивани екстракти показују антиоксидантни ефекат, где је уочено да нешто јачи антиоксидантни ефекат испољава ризом у односу на хербу. Антиинфламаторна активност је посматрана код оба екстракта применом неколико растућих концентрација. Позитиван резултат је уочен применом највеће концентрације воденог екстракта ризома P. reptans. Оба екстракта показују цитотоксичну активност, при чему је већа активност уочена код воденог екстракта ризома. Антихистаминска активност је уочена код воденог екстракта хербе P. reptans док ризом није показао ову врсту активности. Испитивањем ефикасности екстраката на грам позитивне, грам негативне бактерије и гљивицу Candida albicans уочена је ефикасност обе врсте екстраката. Антимикробно деловање је било најизраженије при највећим примењеним концентрацијама, изузетак је бактерија Klebsiella pneumoniae где ни једна од примењених концентрација није довела до значајног ефекта. Датум прихватања теме од стране ННВ: ДП Датум одбране: ДО Чланови комисије: КО Доц. др Наташа Ђорђевић- председнк Факултет медицинских наука у Крагујевцу Проф. др Викторија Драгојевић Симић - члан Медицински факултет ВМА Универзитета одбране у Београду Проф. др Слободан Јанковић-члан Факултет медицинских наука у Крагујевцу Прилог 93 8.2 КЕY WORDS DOCUMENTATION UNIVERSITY OF KRAGUJEVAC FACULTY OF MEDICINE KRAGUJEVAC Accession number: ANO Identification number: INO Documentation type: DT Monographic publication Type of record: TR Textual material, printed Contents code: CC Ph.D. Thesis Author: AU Marina T. Tomovic Menthor: MN doc. dr Snezana Cupara Title: TI Examination of the Antimicrobial, Antiinflammatory and Antihistaminic effects of the extracts Potentilla reptans L. Language of text: LT Serbian Language of abstract: Serbian / English Country of publication: CP Serbia Locality of publication: LP Serbia Publication year: PY 2014. Publisher: PU Reprint by author Publication place: PP Svetozara Markovica 69, 34 000 Kragujevac Physical description: PD Thesis contains 89 pages, 7 chapters, 20 images, 11 tables and 152 literature references Прилог 94 Scientific field: SF Medicine Scientific discipline: SD Clinical and experimental pharmacology Subject/key words: SKW Potentilla reptans L., antiinflammatory, antimicrobial, antihistaminic, chemical analysis UDC Holding data: Library of Faculty of Medical Sciences, University of Kragujevac, Serbia Note: N Abstract: AB Potentilla reptans L . is a weedy plant widespread throughout Europe and Asia. It has been used in traditional medicine to treat various diseases, alone or in combination with other plants. The aim of this research is to determine the chemical profile of this plant as well as to assess the biological activity and pharmacological effects of an aqueous extract of P. reptans rhizome and aerial parts. Until now, no data has been found for chemical composition of P. reptans rhizome, while eight compounds have been identified in the aerial part. Pharmacological researches were intended to determine an anti-oxidant and anti-ulcer effect. The aqueous extracts of both rhizome and aerial parts of P. reptans were provided for proposed analysis. Using reference methodology, it was determined the total content of phenols, flavonoids and procyanidins, and phenolic compounds were identified using 45 standard substances. In vitro, anti-oxidant activity was determined by using DPPH test. The research of pharmacological effects was carried out using appropriate methodologies where anti-inflammatory, anti-histamic, antimicrobial and cytotoxic activity of aqueous extracts of P. reptans rhizome and aerial parts was determined. Research results showed dominant presence of flavonoids in P. reptans aerial parts, while catechin is dominant in rhizome. Examined extracts showed anti-oxidant effect, and it is detected that the rhizome showed a stronger anti-oxidant effect than the areal parts. Anti- inflammatory activity was observed in both extracts using several growing concentrations. Positive result occurred when the highest concentration of the aqueous extract of P. reptans rhizome was used. Both extracts showed cytotoxic activity, but stronger activity was detected Прилог 95 in the aqueous extract of rhizome. Anti-histamic activity was detected in the aqueous extract of P. reptans areal parts while the rhizome did not show this kind of activity. An examination of the extract effectiveness against gram-positive and gram-negative bacteria and fungus Candida albicans showed the effectiveness of both extracts. Antimicrobial activity was the most significant at the highest concentrations, the exception is Klebsiella pneumonia bacteria, where the used concentrations did not show any significant effect. Accepted by the Scientic Board on: ASB Defended on: DE Thesis defended board (Degree/name/surname/title/faculty): DB Doc. dr Natasa Djordjevic - Chairmen Faculty of Medical Sciences, Kragujevac Prof. dr Viktorija dragojevic Simic - member Medical faculty of Military Academy, Belgrade Prof. dr Slobodan Jankovic - member Faculty of Medical Sciences, Kragujevac Прилог 96 8.3. Биографски подаци аутора Дипл. фарм. Марина Т. Томовић рођена је 14.11.1975. године у Крагујевцу, где је завршила основну школу и Гимназију, природно-математички смер. Фармацеутски факултет, смер дипломирани фармацеут Универзитета у Београду уписала је 1994/95. године а 20. 06. 2001. године дипломирала. Дипломски испит је положила са оценом 10 пред члановима Завода за медицинску биохемију. Удата, мајка два детета. Од августа 2001 до октобра 2008. год. запослена у Апотеци Крагујевац на месту дипломираног фармацеута. Од 2005. год. обавља функцију начелника апотеке „Палилула“ а од 2006. год. и функцију руководиоца централне набавке Апотеке Крагујевац. Од септембра 2001. год. до децембра 2002. год. обавља послове професора козметологије у Медицинској школи у Крагујевцу. Од октобра 2008. год. запослена је на Факултету медицинских наука Универзитета у Крагујевцу, у звању сарадника у настави за ужу научну област Фармацеутска технологија. Од октобра 2009. год. прелази у звање асистента за ужу научну област Фармацеутска технологија. Учествовала је у два истраживачка пројекта: на „Јуниор“ пројекту Факултета медицинских наука у Крагујевцу и на међународном пројекту: „SEEERANET PLUS 088 -Indigenous Traditional Plants for Preparing Added Value New Products with Different Appllication“. До сада је објавила више научних радова од којих су пет у часописима на СЦИ листи. Ко-аутор је приручника за предмет „Практични аспекти издавања лекова и ручна производња лековитих препарата“. Током 2013. год. је учествовала два пута на курсу континуиране медицинске едукације под називом „Безбедно управљање хемикалијама и биоцидним производима“ као предавач. Докторске академске студије на Факултету медицинских наука у Крагујевцу одсек молекулска медицина (клиничка и експериментална фармкологија) уписала је 2008/2009 године. Усмени докторски испит положила је у јуну 2010 године са оценом 10. Докторску дисертацију на тему „Испитивање антимикробног, антиинфламаторног и антихистаминског дејства екстракта Potentillae reptans L.“ Пријавила је 20.12.2010. године. Стручно веће за медицинске науке Универзитета у Крагујевцу дало је сагласност на тему докторске дисертације на седници одржаној 24.01.2011. године. Комисија за оцену и одбрану завршене докторске дисертације у саставу: доц. др Наташа Ђорђевић (председник), проф. др Викторија Драгојевић Симић (члан), проф. др Прилог 97 Слободан Јанковић (члан) именована је на седници Наставно – научног већа Факултета медицинских наука 30.10.2013. године. 8.4. Списак објављених радова Радови у часописима националног и међународног значаја 1. Popovic-Milenkovic TM, Tomovic TM, Brankovic RS, Ljujic TB, Jankovic MS. Antioxidant and anxiolytic activities of Crataegus nigra Wald. et Kit berries. Acta Pol Pharm. 2014; 71(2): pp. xxx. 2. Kostic M, Jovanovic S, Tomovic M, Popovic Milenkovic M, Jankovic S. Cost – effectiveness analysis of tracilizumab in combination with methotrexate for rheumatoid arthritis: a Markov model based on data from a Balkan country in socio – economic transition. Vojnosanit Pregl. 2014; 71(2): pp. xxx. 3. Radovanovic MA, Cupara MS, Popovic LjS, Tomovic TM, Slavkovska NV, Jankovic МS. Cytotoxic effect of Potentilla reptans L. rhizome and aerial part extracts. Acta Pol Pharm. 2013; 70(5): 851-4. 4. Dostić PM, Tomović TM, Popović-Milenković TM, Stefanović MS, Janković MS. Risk factors for intraoperative arrhythmias in general surgery patients operated under general anesthesia. Med Glas. 2012; 9(2): 204-10. 5. Radovanovic A, Cupara S, Tomovic M, Tamas V, Ivopol G, Simion D, Gaidau C, Jankovic S. Comparative analysis of the chemical composition of heliantus tuberosus L. growing in Serbia and Romania. Ser J Exp Clin Res. 2013; 14(1): 9-12. 6. Popovic ТM. Pharmacological and phytochemical properties of some species of the genus Potentilla. Racionalna terapija 2009; I(2): 1-5. 7. Tomovic МТ, Cupara SМ, Popovic-Milenkovic MT, Ljujic BT, Kostic MJ, Jankovic SM. Antioxidant and anti-inflammatory activity of Potentilla reptans L. Acta Pol Pharm. 2015; (1) pp. xxx Прилог 98 Радови саопштени на скупу националног и међународног значаја у форми апстракта 1. Popović M. Farmakološke osobine nekih vrsta roda Rotentilla. Други национални конгрес рационалне терапије у медицини. Рационална терапија. Књига сажетака 2009; 1(2): 66. 2. Popović – Milenković M, Tomović M. Prirodni preparati i moguće interakcije sa lekovima. Трећи национални конгрес рационалне терапије у медицини. Рационална терапија. Књига сажетака 2011; 3(1): 62. Прилог 99 8.5 ИДЕНТИФИКАЦИОНА СТРАНИЦА ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ I. Аутор Име и презиме: Марина Томовић Датум и место рођења: 14.11.1975, Крагујевац Садашње запослење: Асистент на Одсеку за фармацију, Факултета медицинских наука у Крагујевцу II. Докторска дисертација Наслов: Испитивање антимикробног, антиинфламаторног и антихистаминског дејства екстракта Potentillae reptans L. Број страница: 89 (без Прилога) Број слика: 20 Број библиографских података: 152 Установа и место где је рад израђен: факултет Медицинских Наука у Крагујевцу, Природно математички факултет - Нови Сад. Научна област (УДК): Медицина (Клиничка и експериментална фармакологија) Ментор: Доц. др. Снежана Цупара III. Оцена и обрана Датум пријаве теме: 20.12.2010 Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: 24.01.2011 Комисија за оцену подобности теме и кандидата: Проф. др Слободан Јанковић Проф. др Викторија Драгојевић-Симић Доц. др Наташа Ђорђевић Комисија за оцену подобности теме и кандидата: Проф. др Слободан Јанковић Проф. др Викторија Драгојевић-Симић Доц. др Наташа Ђорђевић Комисија за оцену докторске дисертације: Доц. др Наташа Ђорђевић Проф. др Викторија Драгојевић Симић Проф. др Слободан Јанковић Комисија за одбрану докторске дисертације: 1.1 Доц. др Наташа Ђорђевић 1.2 Проф. др Викторија Драгојевић Симић Проф. др Слободан Јанковић Датум одбране дисертације: Образац 100 Образац 101 Образац 102