УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ Ненад Вуковић ХЕМИЈСКА СИНТЕЗА И БИОХЕМИЈСКА АКТИВНОСТ НОВИХ ДЕРИВАТА 4-ХИДРОКСИ КУМАРИНА Докторска дисертација Крагујевац, 2010. ИНДЕТИФИКАЦИОНА СТРАНИЦА ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ I. Аутор Име и презиме: Ненад Вуковић Датум и место рођења: 30. 05. 1976. године, Пријепоље Садашње запослење: Природно-математички факултет у Крагујевцу II. Докторска дисертација Наслов: Хемијска синтеза и биохемијска активност нових деривата 4-хидрокси кумарина Број страница: 143 Број слика: 52; број табела 40 Број библиографских података: 86 Установа и место где је рад израђен: ПМФ Крагујевац Научна област (УДК): Хемија Ментор: др Слободан Сукдолак III. Оцена и обрана Датум пријаве теме: 22. 04. 2009. године (одлука бр. 270/V-1) Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: Комисија за оцену подобности теме и кандидата: 1. Др Слободан Сукдолак, в. професор Природно-математички факултет, Крагујевац Научна област: Биохемија 2. Др Славица Солујић, в. професор Природно-математички факултет, Крагујевац Научна-област: Биохемија 3. Др Влатка Вајс, научни саветник Центар за хемију, Институт за хемију, технологију и металургију, Београд Научна област: Хемија природних производа, Биохемија Комисија за оцену подобности теме и кандидата: Комисија за оцену докторске дисертације: 1. Др Слободан Сукдолак, в. професор Природно-математички факултет, Крагујевац Научна област: Биохемија 2. Др Славица Солујић, в. професор Природно-математички факултет, Крагујевац Научна-област: Биохемија 3. Др Влатка Вајс, научни саветник Центар за хемију, Институт за хемију, технологију и металургију, Београд Научна област: Хемија природних производа, Биохемија Комисија за одбрану докторске дисертације: 1. Др Слободан Сукдолак, в. професор Природно-математички факултет, Крагујевац Научна област: Биохемија 2. Др Славица Солујић, в. професор Природно-математички факултет, Крагујевац Научна-област: Биохемија 3. Др Влатка Вајс, научни саветник Центар за хемију, Институт за хемију, технологију и металургију, Београд Научна област: Хемија природних производа, Биохемија Датум одбране дисертације: Посвећено оцу Лазару и мајци Славци Захваљујем се професору др Слободану Сукдолаку на сугестијама током израде докторске дисертације Захваљујем се професору др Славици Солујић на корисним сугестијама током писања докторске дисертације Захваљујем се Марији Рвовић на неизмерној подршци да истрајем ИЗВОД Садржај докторске дисертације обухвата две научне целине: први део обухвата хемијске синтезе деривата 4-хидроксикумарина, идентификацију хемијске структуре и хемијске модификације уведених фармакофора. Друга научна целина иза за циљ да одговори како промена функционалних група на основном молекулу 4-хидроксикумарина утиче на неке облике биохемијске активности као што су антиоксидативна активност, антимикробна активност и антикоагулативна активност. У том смислу, у првом делу докторске дисертације приказани су поступци хемијске синтезе, односно, функционализације положаја С-3 у полазном молекулу 4-хидроксикумарина, у сврху добијања једанаест 2-аминотиазолинских деривата, осам имино и осам амино деривата 4-хидроксикумарина. Увођење тиазолинске фармакофоре у молекул 4-хидроксикумаринана изведено je Hantzsch-овом реакцијом еквимоларних количина одговарајућег тиоуреа деривата и 3-(2-бромацетил)-4-хидроксикумарина, у кључалом етанолу. Тиазолонски деривати 4-хидроксикумарина добивени су у високом приносу. Увођење имино фармакофоре у молекул 4-хидроксикумарина изведено је на два начина: a) конвенционалном методом кондензације еквимоларних количина одговарајућег амина и 3-ацетил-4-хидроксикумарина, b) методом под дејством микроталасног зрачења. Ова метода је потврдила битне експерименталне предности које се огледају у мањем времену потребном за одвијање реакције као и повећању приноса једињења која се синтетишу. Имино деривати 4-хидроксикумарина су, као полазни супстрати, употребљени за реакцију редукције у циљу добијања одговарајућих амино деривата 4-хироксикумарина. Хемијска структура свих 27 синтетисаних деривата 4-хидроксикумарина је идентификована и потврђена на основу резултата спектралних анализа (IC, 1H NMR, 13 C NMR, MS) и елементарне анализе. Хемијским путем синтетисани и структурно окарактерисани деривати 4- хидроксикумарина (укупно 27 деривата) даље су укључени у испитивање биохемијске активности и то: антиоксидативне активности, антимикробне активности и антикоагулативне активности. У том смислу, одређивана је антиоксидативна активност једињења применом пет различитих метода, у циљу дефинисања видова антиоксидативне активности (укупна антиоксидативна активност, антирадикалска активност методом са DPPH, редуктивна активност, инхибиција липидне пероксидације у присуству линолеинске киселине и OH aнтирадикалска активност). Констатовано је да су амино деривати 4-хидроксикумарина (61c-68c) јачи антиоксиданси од полазних имино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b), при томе, дериват 65с, са p-нитрофениламино групом је најјачи антиоксиданс. Исти тренд испитивана једињења показују и према DPPH реагенсу. Наведени резултати су у потпуној сагласности са обимом редуктивне активности испитиваних једињења за коју су имино деривати 4- хидроксикумарина бољи супстрати од амино деривата 4-хидроксикумарина. При томе, једињење 67с, са бензиламино фармакофором је најјачи редуктант. Обим липидне пероксидације испитиваних деривата кумарина је приметно већи у поређењу са аскорбинском киселином, тј. ови деривати кумарина су јачи антиоксиданси. Највећа активност у односу на стандардни антиоксиданс BHT је измерена код деривата кумарина са p-толилимино фармакофором (62b) при концетрацији од 1000 M. Сви тестирани кумарини су се показали као јачи инхибитори формирања хидроксил радикала од аскорбинске киселине, при чему је као и према DPPH реагенсу, већа активност забележена код супстрата са амино групом (61c-68c), док је једињење са p-нитрофенил фармакофором (65c) најјачи антиоксиданс. Антимикробна активности испитиваних деривата кумарина је одређивана код бактерија и гљива применом две методе: макродилуционе и микродилуционе методе. Добијени резултати су показали зависност антимикробне активности од природе фармакофоре везане на положај 3 молекуле 4-хидроксикумарина. У серији кумарина са тиазолинском фармакофором једино супстрат са m- нитрофенил фармакофором (58c) према бактерији S. aureus показује активност комплементарну стрептомицину, док је антифунгална активност једнака кетоконазолу уочена само код једињења са метил (50c), m-толил (54c) и m- нитрофенил (58c) фармакофорама према гљиви M. mucedo. Амино деривати 4-хидроксикумарина су се показали као јачи антибактеријски супстрати од полазних имино деривата, при чему једињења са фенил, толил и p- нитрофенил фармакофорама (61c-65c) показују четири пута већу активност према E. coli у односу на примењени стандард. У серији имина највећу антибактеријску активност су показала једињења са бензил (67b) и -(CH2)4COOH (68b) фармакофором. Једињења 61b-68b поседују већу антифунгалну активност у односу на једињења 61c-68c, при чему ни један од тестираних кумарина нема активност једнаку кетоканазолу. Антикоагулантна активност испитиваних деривата кумарина је одређена модификованом методом по Квику, а добијени резултати су показали да највећу активност има имино дериват са фармакофором типа -(CH2)4COOH (68b) и у поређењу са варфарином и аценокумаролом је ефикаснији антикоагулант. SUMMARY This dissertation includes two scientific wholes. The first whole includes chemical syntheses of 4-hydroxy coumarin derivatives, identification of the chemical structure and chemical modifications of the introduced pharmacophores. The second scientific whole aims to explain how replacement of functional groups on a 4-hydroxy coumarin starting compound affects some of the biochemical activities, such as antioxidative, antimicrobial and anticoagulative activities. Accordingly, the first part of this dissertation shows procedures of chemical syntheses, i.e. functionalization of C-3 in 4-hydroxy coumarin starting compound in order to obtain eleven 2-aminothiazoline derivatives, eight imino derivatives of 4- hydroxy coumarin and eight amino derivatives of 4- hydroxy coumarin. Introduction of thiazoline pharmacophore into 4-hydroxy coumarin compound was performed using Hantzsch reaction of equimolar amounts of the appropriate thiourea derivative and 3-(2-bromoacetyl)-4-hydroxy coumarine in boiling ethanol. Thiazoline derivatives of 4-hydroxy coumarin were obtained in high yield. Introduction of imino pharmacophores into 4-hydroxy coumarin compound was performed in two ways: a) conventional method of condensation of equimolar amounts of the appropriate amine and 3-acetyl-4-hydroxy coumarin and b) microwave assisted method. This method confirmed significant experimental advantages in terms of decreased time of reaction and increased yields of the synthesized compounds. Imino derivatives of 4-hydroxy coumarins were used as starting substrates in reduction reaction to obtain the corresponding amino derivatives of 4-hydroxy coumarins. Chemical structures of all twenty-seven synthesized 4-hydroxy coumarin derivatives were identified and confirmed by spectral analyses data (IC, 1H NMR, 13C NMR, MS) and elemental analysis. Chemically synthesized and structurally characterized 4-hydroxy coumarin derivatives (twenty-seven derivatives in total) were then involved in examination of their biochemical activity, i.e. antioxidative activity, antimicrobial activity and anticoagulative activity. Accordingly, antioxidative activity of the compounds was determined using five different methods, in order to define specific kinds of antioxidative activity (total antioxidative activity, antiradical activity by DPPH method, reductive activity, inhibition of lipid peroxidation in linoleic acid and OH antiradical activity). It was determined that amino derivatives of 4-hydroxy coumarins (61c-68c) were stronger antioxidants than the starting imino derivatives of 4-hydroxy coumarins (61b- 68b), derivative 65c with p-nitrophenylamino group being the strongest antioxidant. Examined compounds show the same trend with DPPH reagent. These results are completely in accordance with the range of the examined compounds reductive activity for which imino derivatives of 4-hydroxy coumarine are better substrates than amino derivatives of 4-hydroxy coumarine. In addition, compound 67c, containing benzylamino pharmacophore, is the strongest reducing agent. The range of lipid peroxidation of the examined coumarine derivatives is markedly bigger than the range of ascorbic acid, i.e. these coumarine derivatives are stronger antioxidants. The strongest activity, in comparison to a standard antioxidant BHT, was measured at the coumarine derivative with p-tolylimino pharmacophore (62b), at a concentration of 1000 M. All examined coumarins proved to be stronger inhibitors of hydroxyl radicals forming than the ascorbic acid, where, similarly as with DPPH reagent, substrates with amino group (61c-68c) show stronger activity, and the compound with p-nitrophenyl pharmacophore (65c) is the strongest antioxidant. Antimicrobial activity of the examined coumarine derivatives was being determined against the fungi and the bacteria, using two methods- macrodilution and microdilution methods. Obtained results show that antimicrobial activity depends on the kind of the pharmacophore bonded at the 3-position of a 4-hydroxy coumarin compound. In the series of coumarins with thiazoline pharmacophore, only a substrate with m- nitrophenyl pharmacophore (58c) showed the activity against bacteria S. aureus complementary to that of streptomycin, while the antifungal activity equal to that of ketoconazole could be seen only with compounds with methyl (50c), m-tolyl (54c) and m-nitrophenyl (58c) pharmacophores against fungi M. mucedo. Amino derivatives of 4-hydroxy coumarine proved to be stronger antibacterial substrates than the starting imino derivatives, where the compounds with phenyl, tolyl and p-nitrophenyl pharmacophores (61c-65c) showed the activity against E. coli four times stronger than the activity of the applied standard. In the series of imines, compounds with benzyl (67b) and -(CH2)4COOH (68b) pharmacophores showed the strongest antibacterial activity. Compounds 61b-68b showed stronger antifungal activity than compounds 61c-68c, where none of the examined coumarins showed activity equal to that of ketoconazole. Anticoagulative activity of the examined coumarin derivatives was determined using a modified Quick’s method, and the obtained results show that the imino derivative with -(CH2)4COOH pharmacophore (68b) possesses the strongest activity and is a more efficient anticoagulant than warfarin and acenocoumarol. Докторска дисертација Садржај мр Ненад Вуковић САДРЖАЈ 1. ОПШТИ ДЕО 1 1.1. Хемија кумарина 2 1.2. Биохемија кумарина 6 1.2.1. Деривати кумарина са антиоксидативним дејством 7 1.2.2. Деривати кумарина са антимикробним дејством 9 1.2.3. Деривати кумарина са антикоагулантним дејством 16 1.2.4. Остали видови биохемијског дејства кумаринских деривата 20 1.2.4.1. Кумарински деривати са фитоалексинским дејством 20 1.2.4.2. Кумарински деривати са антиинфламаторним дејством 20 1.2.4.3. Кумарински деривати са антиартеросклеротичним дејством 21 1.2.4.4. Кумарински деривати са вазодилататорским дејством 21 1.2.4.5. Кумарински деривати са естрогеним дејством 22 1.2.4.6. Кумарински деривати као стимулатори активности централног 23 нервног система 1.2.4.7. Афлатоксини 24 1.2.4.8. Кумарински деривати са анти- HIV активошћу 25 1.2.4.9. Кумарински деривати са антипаразитским дејством 25 1.2.4.10. Кумарински деривати са антиканцерогеним дејством 26 2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 28 2.1. Поступци за добијање нових деривата 4-хидроксикумарина 29 2.1.1. Општа процедура добијања тиоуреа деривата 29 2.1.2. Општа процедура добијања 2-аминотиазолинских деривата 29 4-хидроксикумарина 2.1.3. Општа процедура добијања имино деривата 4-хидроксикумарина 31 2.1.3.1. Конвенционална метода 31 2.1.3.2. Метода под дејством микроталасног зрачења 31 2.1.4. Општа процедура добијања амино деривата 4-хидроксикумарина 31 2.2. Физички и спектроскопски подаци синтетизованих кумаринских деривата 34 2.2.1. Тиоуреа деривати 34 2.2.2. 2-Аминотиазолински деривати 4-хидроксикумарина 35 2.2.3. Имнио деривати 4-хидроксикумарина 39 2.2.4. Амнио деривати 4-хидроксикумарина 43 2.3. Поступци за одређивање антиоксидативне активности 48 2.3.1. Одређивање укупног антиоксидативног капацитета фосфомолибденском 48 методом 2.3.2. Одређивање антиоксидативне активности DPPH методом 51 2.3.3. Одређивање редуктивне способности 57 2.3.4. Одређивање инхибиције липидне пероксидације амонијум 61 тиоцијанатном методом Докторска дисертација Садржај мр Ненад Вуковић 2.3.5. Одређивање способности хватања хидроксил радикала 66 2.4. Поступци за одређивање антимикробне активности 70 2.4.1. Припремни поступци за одређивање антимикробне активности 70 2.4.2. Одређивање антимикробне активности супстрата 4-хидроксикумарина у 74 in vitro условима 2.4.2.1. Одређивање антимикробне активности 2-аминотиазолинских деривата 74 4-хидроксикумарина применом макродилуционе методе 2.4.2.2. Одређивање антимикробне активности имино и амино деривата 4- 77 хидроксикумарина применом микродилуционе методе 2.5. Прелиминарно одређивање антикоагулантне активности у in vitro 83 условима 3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 85 3.1. Синтеза и структурна карактеризација добијених 4-хидроксикумаринских 87 деривата 3.1.1. Аминотиазолински деривати 4-хидрокси кумарина (64c-74c) 87 3.1.2. Имино и амино деривати 4-хидрокси кумарина (77b-84b, 77c-84c) 91 3.2. Антиоксидативна активност имино-4-хидроксикумарина (77b-84b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (77c-84c) 3.2.1. Укупна антиоксидативна активност деривата имино-4- хидроксикумарина (77b-84b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (77c- 84c) 3.2.2. Антирадикалска активност деривата имино-4-хидроксикумарина (77b-84b) и деривата амино 4-хидроксикумарина (77c-84c) методом са DPPH 3.2.3. Редуктивна активност деривата имино-4-хидроксикумарина (77b-84b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (77c-84c) 96 96 98 106 3.2.4. Инхибиција липидне пероксидације у присуству линолеинске киселине 112 3.2.5. Способност везивања OH радикала 116 3.3. Антимикробна активност нових деривата 4-хидроксикумарина 121 3.3.1. Антибактеријска активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина (64c-74c) у in vitro условима 3.3.2. Антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина (64c-74c) у in vitro условима 3.3.3. Антибактеријска активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (77b-84b, 77c-84c) у in vitro условима 3.3.4. Антифунгална активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (77b-84b, 77c-84c) у in vitro условима 3.4. In vitro антикоагулантна активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (77b-84b, 77c-84c) 4. ЛИТЕРАТУРА 121 124 127 131 135 139 Докторска дисертација Табеле мр Ненад Вуковић Табеле Табела 1. Потребна концентрација за 50 % инхибицију раста различитих фунгалних врста 13 Табела 2. Инхибиција protein kinaze при концентрацији кумаринских деривата од 200 μM 27 Табела 3. Синтетисани тиоуреа деривати и 2-аминотиазолински деривати 4-хидроксикумарина 30 Табела 4. Синтетисани имино и амино деривати 4-хидроксикумарина 33 Табела 5. Апсорбанце раствора имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 50 Табела 6. Укупни антиоксидативни капацитет имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 50 Табела 7. Aпсорбанце и проценат инхибиције DPPH радикала серије разблажења имино и амино деривата 4-хидроксикумарина по истеку 30 минута 54 Табела 8. Aпсорбанце и проценат инхибиције DPPH радикала серије разблажења имино и амино деривата 4-хидроксикумарина по истеку 60 минута 55 Табела 9. DPPH антирадикалска активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 56 Табела 10. Редуктивна способност RP серије разблажења имино и амино деривата 4- хидроксикумарина 59 Табела 11. Редуктивна активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина представљена као RP50 вредност 59 Табела 12. Апсорбанце контролног узорка и серије разблажења имино и амино деривата у функцији концетрације и времена 63 Табела 13. Проценти инхибиције процеса липидне пероксидације у емулзионом систему линолеинске киселине раствора имино деривата 4-хидроксикумарина 64 Табела 14. Проценти инхибиције процеса липидне пероксидације у емулзионом систему линолеинске киселине раствора амино деривата 4- хидроксикумарина 65 Табела 15. Проценти инхибиције хидроксил радикала насталих у Фентоновој реакцији у функцији концетрације имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 68 Табела 16. Концетрације у g/mL имино и амино деривата 4-хидроксикумарина потребне за инхибицију 50 % хидроксил радикала насталих у Фентоновој реакцији 68 Табела 17. Оптичка густина у функцији густине инокулума 73 Табела 18. Антибактеријска активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина 76 Табела 19. Антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина 76 Докторска дисертација Табеле мр Ненад Вуковић Табела 20. Антибактеријска активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 81 Табела 21. Антифунгална активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 82 Табела 22. In vitro антикоагулантна активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 84 Табела 23. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци тиоуреа деривата (66b, 68b, 70b-72b) 89 Табела 24. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци 2-аминотиазолинских деривата (64c-74c) 89 Табела 25. Приноси и време реакције добијања имино деривата (77b-84b) 92 Табела 26. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци имино деривата (77b-84b) 93 Табела 27. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци амино деривата (77c-84c) 93 Табела 28. Укупна антиоксидативна активност деривата имино-4-хидроксикумарина (77b-84b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (77c-84c) 96 Табела 29. Антирадикалска активност ( M) деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина методом са DPPH у току 30 и 60 минута 99 Табела 30. Резултати линеарне регресионе анализе за DPPH методу 101 Табела 31. Редуктивна активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина 107 Табела 32. Резултати линеарне регресионе анализе за методу одређивања редуктивне активности 109 Табела 33. Инхибиција липидне пероксидације под утицајем деривата имино-4- хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина 113 Табела 34. Инхибиција формирања хидроксил радикала у присуству деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина 117 Табела 35. Резултати линеарне регресионе анализе за OH антирадикалску методу 118 Табела 36. Антибактеријска активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина 122 Табела 37. Антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина 125 Табела 38. Антибактеријска активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина 128 Табела 39. Антифунгална активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина 132 Табела 40. In vitro антикоагулантна активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина 136 Докторска дисертација Слике мр Ненад Вуковић Слике Слика 1. Кумарин и хромон 2 Слика 2. Део резонанционих структура бензопиранског језгра 2 Слика 3. Приказ електронакцепторског дејства карбонилне групе 3 Слика 4. Приказ реакција напада електрофилног агенса на кумарински прстен: а) блажи реакциони услови; б) енергичнији реакциони услови 3 Слика 5. Реакција кумарина са натријум бисулфитом 4 Слика 6. Реакције кумарина са јаким нуклеофилним реагенсима 4 Слика 7. Реакције хидрирања кумарина 5 Слика 8. 7-хидроксикумарин 6 Слика 9. Биотрансформација кумарина до сулфата и глукуронида 6 Слика 10. 7,8-Дихидрокси-4-метилкумарин и 4-метилкумарин 8 Слика 11. 4-хидрокси супституисани кумарини 8 Слика 12. Ангуларни и линеарни тетрахидро супституисани кумарин 4-карбоксилати 9 Слика 13. Бергаптен 9 Слика 14. Новобиоцин 10 Слика 15. 4-Хидрокси кумарински деривати као антибактеријски агенси 10 Слика 16. Аморезинол и острутин 10 Слика 17. Антифунгални ефекат лиофилизираног екстракта Ruta graveolens 11 Слика 18. Ефекат 8-MOP (A) и 5-MOP (B) (четири различите концентрације) на степен раста F. solani, P. lycopersici и T. viride 12 Слика 19. 5-Метоксипсорален и 8-метоксипсорален 13 Слика 20. Новобиоцин: R1=Me, R2=NH2 16; хлоробиоцин: R1=Cl, R2=2-metilpirol 23 14 Слика 21. Приказ утицаја 5',5'-диметил групе новиозе на активност кумаринских антибиотика 14 Слика 22. Интеракција између 24 kDa N-терминалног протеинског фрагмента giraze B из E. coli са хлоробиоцином и новобиоцином 16 Слика 23. Дикумарол 16 Слика 24. Приказ структурне аналогије витамина K и 4-хидроксикумаринског система 17 Слика 25. Приказ ензимске -карбоксилације остатка глутаминске киселине уз редукцију дихидровитамина K до витамин K 2,3-епоксида 17 Слика 26. Механистички модел редукције витамин K 2,3-епокисда и инхибиције са варфарином 18 Слика 27. Циклокумарол 18 Слика 28. Aценокумарол и 4-метил-3-фенил-пирано[3,2-c]-хромен-2,5-дион 19 Слика 29. Mаркумар и варфарин 19 Слика 30. Скополетин и умбелиферон 20 Докторска дисертација Слике мр Ненад Вуковић Слика 31. 4-(Арилоксиметил)кумарински деривати као антиинфламаторни супстрати 21 Слика 32. Карбохромен 21 Слика 33. Виснадин и самидин 22 Слика 34. Естрадиол и кумарински деривати са естрогеним дејством 22 Слика 35. 7-Хидрокси-4-метил-8-пиперидин-1-илметил-хромен-2-он 23 Слика 36. Eсупрон и LU53439 24 Слика 37. Aфлатоксини M1 и M2 24 Слика 38. (+)-Каланолид A и (-)-каланолид B 25 Слика 39. Калепин 26 Слика 40. Антиканцерогени агенс на Sarcom W256 26 Слика 41. Дафнетин 27 Слика 42. Графички приказ функционалне зависности различитих концентрација раствора аскорбинске киселине у односу на апсорбанце раствора са параметрима једначине линеарне регресионе анализе 49 Слика 43. Графичка зависност % инхибиције DPPH радикала након 30 минута у односу на концентрацију супстрата 65c са параметрима линеарне регресионе анализе (прве четири тачке су изузете) 53 Слика 44. Графичка зависност % инхибиције DPPH радикала након 60 минута у односу на концентрацију супстрата 65c са параметрима линеарне регресионе анализе (прве четири тачке су изузете) 53 Слика 45. Графички приказ зависности редуктивне способности у односу на концентрацију супстрата 67c са параметрима линеарне регресионе анализе 60 Слика 46. Графички приказ зависности редуктивне способности у односу на концентрацију супстрата 61b са параметрима линеарне регресионе анализе (без задње четири тачке) 60 Слика 47. Графички приказ зависности OH антирадикалске активности у односу на концентрацију супстрата 61c са параметрима линеарне регресионе анализе 69 Слика 48. Графички приказ зависности OH антирадикалске активности у односу на концентрацију супстрата 65c са параметрима линеарне регресионе анализе 69 Слика 49. Приказ промене боје као последица редукције ресоруфина од стране микроорганизама 78 Слика 50. Приказ микродилуционе плоче са различито обојеним растоврима у јамицама 79 Слика 51. Структуре нових 2-аминотиазолинских деривата (49c-59c) 90 Слика 52. Структуре нових деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) 95 Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 1 1. ОПШТИ ДЕО Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 2 1.1. Хемија кумарина Молекули α- i γ- пирона кондензовани са бензенским прстеном називају се кумарини (1) и хромони (2) (Слика 1). O O O O 1 2 Слика 1. Кумарин и хромон Кумарини и хромони, као и њихови различити деривати, су веома распрострањени у природи, нарочито у биљном свету. Деривати кумарина су нађени у производима метаболизма микроорганизама и животиња 1-3. Производи кумарина поседују хемијске особине условљене присуством лактонске структуре, двоструке везе α-пирона и ароматичног прстена. Кумарини се у неким случајевима понашају као ароматска једињења, ступајући при том у реакције електрофилне супституције (нитровање, сулфоновање, диазотовање) одупирући се дејству оксиданата, при чему се електрофилни агенси везују за бензенски прстен а не на лактонски део молекула. Тако, при нитровању кумарина долази до образовања 6- нитрокумарина у високом приносу. Објашњавање ових реакција се изводи помоћу резонанционих структура из којих се јасно може видети да се електрофилна супституција успешно може изводити у положајима 6 и 8 бензенског прстена (Слика 2) 4 . O O O O O O O O O O Слика 2. Део резонанционих структура бензопиранског језгра Двострука веза 3-4 пиронског прстена коњугована са карбонилном групом, чини јединствени систем. Електронакцепторски карактер карбонилне групе доприноси Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 3 смањењу електронске густине на C4 угљениковом атому и њеном померању у смеру карбонилне групе (Слика 3) 4. C H CH C O O C4 C3 C2 O H  O Слика 3. Приказ електронакцепторског дејства карбонилне групе Очито је да угљеник C4 постаје електрофилни центар пиронског прстена док је C3 угљеник нуклеофилни центар. Из тог разлога се нитровањем кумарина при загревању добија мала количина 3,6-динитро-кумарина. O O 6 3 El O O 6 3 El a) b) O O 6 3 O O 6 3 R R-NO2, SO3H R R R-NO2, SO3H Слика 4. Приказ реакција напада електрофилног агенса на кумарински прстен: а) блажи реакциони услови; б) енергичнији реакциони услови Као што се може видети, у реакцијама електрофилне супституције (нитровање или сулфоновање) напад електрофилног агенса се дешава на C6 угљеников атом, односно на ароматски део молекуле кумарина. При енергичнијим условима и C3 угљеник постаје нуклеофилни центар, тако да реакција при загревању иде уз формирање 3,6-дисупституисаног производа (Слика 4) 4. Кумарини учествују и у нуклеофилним реакцијама. У општем случају слабији нуклеофили, нпр. бисулфит се везују за положај 4 (3). Аналогно ће тећи реакције са CN - i MeO - (Слика 5) 4. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 4 O O NaHSO 3 O O SO3Na 3 Слика 5. Реакција кумарина са натријум бисулфитом Јачи нуклеофили ће нападати положај 2. Пример овога је базна хидролиза. Након везивања нуклеофила за положај 2 долази до отварања хетероцикличног прстена на лактонском делу, уз образовање дианјона 3-(2-хидрокси-фенил)-акрилне киселине (4, 5). Формирана двострука веза има cis конфигурацију (овај продукт се назива кумаринска киселина) (4). Треба нагласити да је trans изомер (5) стабилнији, а добија се загревањем кумарина у присуству натријум етоксида. Хидроксиламин се, везујући за положаје 2 и 4, преводи у једињење N-хидрокси-3-хидроксиамино-3-(2-хидрокси- фенил)-пропионамид (6) (Слика 6) 4. O O OH O COO 4 O COO 5 NH2OH OH NHOH NHOH O 6 Слика 6. Реакције кумарина са јаким нуклеофилним реагенсима Реакција хидрирања са LiAlH4 не налази употребну вредност из разлога не селективности, тј. формирања смеше производа. Реакција хидрирања са водоником уз присуство катализатора или пак реакција са амалгамисаним натријумом се дешава лагано и води добијању 3,4-дихидро производа (7) (Слика 7) 4. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 5 O O O O O O Li Al H 4 H2/kat. OH COOH 7 4 7 ili Na/Hg Слика 7. Реакције хидрирања кумарина 4-Хидроксикумарин се разликује по хемијским особинама како од самог кумарина, тако и од других хидроксикумарина. Разлог томе је присуство високо енолизованог β-кетоестарског система који знатно стабилизује кумарински прстен повећавајући му ароматичност. Бензенски прстен 4-хидроксикумарина мање је реактиван од обичног бензенског прстена или деривата бензена, док α-пиронски прстен под врло благим условима ступа у реакције супституције при чему настају 3- супституисани деривати 4-хидроксикумарина. 4-Хидроксикумарин реагује, како са електрофилним, тако и са нуклеофилним реагенсима. У реакцији са електрофилним реагенсима најреактивнији је положај 3. Ацетиловањем, нитровањем и бромовањем се добијају одговарајући 3-супституисани деривати 4-хидроксикумарина 4. У реакцијама нуклеофилних супституција најреактивнији је положај 4, што и потврђују експериментални подаци 5. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 6 1.2. Биохемија кумарина Деривати кумарина, односно 2H-1-бензопиран-2-она, су широко распрострањени у природи, а нарочито у биљном свету 6. До сада је изоловано око 1300 различитих кумаринских деривата, и то углавном из породица биљака Rutaceae, Apiaceae, Fabaceae и Asteraceae 7. Најчешће је за карбоциклични фрагмент молекуле кумарина везан кисеоник, и то у положају 7, а ређе у положајима 5, 6 и 8. Типични примери су 7-хидроксикумарин (8) (Слика 8) и његов β-гликозид скимин 4. O OHO 8 Слика 8. 7-хидроксикумарин Катаболизам кумарина се врши под утицајем ензима kumarin-7-hidroksilaze, при чему се кумарини специфично хидроксилују до 7-хидрокси деривата, који се потом у форми сулфата или глукуронида (насталих уз учешће ензима sulfotransferaze и uridin difosfat glukuronil transferaze) излучују преко урина (Слика 9) 8, 4. O O NADPH CYT P450 O OHO sulfotransf eraza O OOS O O HO O COOH OH OH OH O O O uridin dif osf at glukuronil transf eraza Слика 9. Биотрансформација кумарина до сулфата и глукуронида За многе кумаринске деривате као секундарне метаболите, утврђено је да поседују интересантна биолошка својства 4. Па ипак узимајући у обзир чињеницу да је њихов садржај у биљкама веома мали, као и да изоловање захтева софистицирану опрему и велики утрошак времена, развијен је велики број синтетичких путева њиховог добијања. Увођењем нових фармакофора на бензофурански прстен Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 7 синтетисан је велики број кумаринских деривата, од којих значајан број има и клиничку примену. Супституција на једном и/или свих шест доступних места на основном молекулу кумарина води ка супстратима који се, осим по значајној разлици у структури, разликују и по биолошкој активности коју испољавају. Управо ова структурна разноликост кумаринским дериватима омогућује различите биолошке особине, чинећи их интересантном основом за развој нових супстрата који ће благотворно деловати у различитим патофизиолошким стањима организма или пак умањивати ризик од различитих обољења 9. 1.2.1. Деривати кумарина са антиоксидативним дејством За велики број кумаринских деривата је утврђено да инхибирају формирање и подстичу хватање реактивних кисеоничних и реактивних азотних врста 4. Литературни подаци показују да је за антиоксидативну активност одговорна структурна аналогија са флавонодима и бензофенонима уз констатацију да тачан молекулски механизам дејства, на заштиту ткива и ћелија од штетног дејства оскидативног стреса, још није разјашњен 9-12. Важност истраживања њиховог антиоксидативног дејства лежи и у чињеници да су многи кумарински деривати присутни у намирницама (у форми адитива за храну или природних компоненти), вину и другим алкохолним пићима, дуванским производима, цитрусном воћу, зеленом поврћу, пекарским производима и житарицама 13, 14. По утврђивању корелације између реактивних кисеоничних врста и њиховог учешћа у патогенези разних обољења, као и тога да се са екстерном администрацијом са антиоксидантима може утицати на успоравање развоја болести, кумаринским супстратима се придаје велика важност у борби против оксидативног стреса. Одређивање антиоксидативне активности употребом стабилног DPPH радикала представља једну од најчешће коришћених метода. Добијени резултати показују на способност тестираног супстрата да хватају слободне радикале, односно да донирају водонични радикал. Будући да се DPPH радикали сматрају као слаби акцептори Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 8 водоника, резултати се могу разматрати и са нивоа способности тестираних супстрата да хватају пероксил (RCOO) радикале 9. Велики број тестираних кумарина показује добру DPPH антирадикалску активност. Пример су супституисани 4- метилкумарини 9, који у зависности од типа супституције и природе супституената показују активност у опсегу IC50 вредности од 1,21 x 10 -5 mol/L за 7,8-дихидрокси супституисани дериват (9) до 9,72 x 10-2 mol/L за 4-метилкумарин (10) (Слика 10). O O CH 3 9 HO HO O O CH 3 10 Слика 10. 7,8-Дихидрокси-4-метилкумарин и 4-метилкумарин Јасно се може констатовати да је значајно већа антирадикалска активност 7,8- дихидрокси деривата последица присуства хидроксилних група на бензеноидном делу молекуле. Утврђено је да значајну DPPH антирадикалску активност поседују кумарински супстрати који на положају 4 имају хидроксилну групу. При IC50 вредности ~150 M 7,8-спиро супституисани 4-хидроксикумарин (11) показује комплементарну активност 4-хидроксикумарину (IC50 124 M) и неупоредиво бољу активност у односу на 7-хидрокси супституисани кумарин (IC50 >400 M) (Слика 11) 15 . O O OH 11 O O O OH 12 O O HO 8 Слика 11. 4-хидрокси супституисани кумарини Из групе реактивних кисеоничних врста, а због своје високе реактивности, хидроксил радикали (OH) се сматрају једном од најтоксичнијих радикалских честица, значајно доприносећи оштећењу ћелијских макромолекула протеина, липида и DNA 16 . Кумарин 4-карбоксилатни деривати супституисани са 6,7,8,9-тетрахидро (13) и Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 9 7,8,9,10- тетрахидро (14) групама при концентрацији од 0,1mM при вредностима од 77 % и 53 % елиминишу хидроксил радикале настале у систему Fe3+/аскорбинска киселина/EDTA, што је приближно активности идентичне концетрације стандардног једињења тролокса (Слика 12) 17. O O CO2Me 13 O O CO2Me 14 Слика 12. Ангуларни и линеарни тетрахидро супституисани кумарин 4-карбоксилати Праћењем инхибиције насталих пероксил радикала у емулзионом систему - каротен-линолеинска киселина, кумарински дериват бергаптен (15) при концетрацији од 10 M показује антиоксидативну активност (на нивоу ћелијске мембране) у вредности од 9 %, што је комплементарно инхибиторној активности флавоноида апигенина (Слика 13) 18. O OO OCH3 15 Слика 13. Бергаптен 1.2.2. Деривати кумарина са антимикробним дејством Новобиоцин (16) (Слика 14) показује антибиотску активност према грaм негативним бактеријама 4, 6, 19. То откриће је уједно и било и разлог испитивања антибиотског ефекта и других кумаринских деривата. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 10 O O OH NHCO OH OO MeO OCONH2 16 Слика 14. Новобиоцин Констатовано је да 3-ацетил-4-хидроксикумарин (17) показује антибактеријску активност на неколико врста бактерија, нпр. Staphylococcus aureus и Mycobacterium tuberculosis 20. Утврђено је да антибактеријску активност показују и једињења сличне структуре (18) (Слика 15). O O OH CH3 O 17 O O OH R O 18 Слика 15. 4-Хидрокси кумарински деривати као антибактеријски агенси Аморезинол (19) и острутин (20) (Слика 16) делују на широки спектар бактерија: Staphylococcus aureus, Micrococcus lutena, Micrococcus lisodeicticus и Bacillus megathermium 21 . O O OH CH3 HO 19 O OHO CH3 H 2 20 2 Слика 16. Аморезинол и острутин Иако екстензивна употреба хербицидних и фунгицидних средстава обезбеђује значајне приносе у пољопривреди, треба напоменути и њихову штетност у погледу загађења животне средине и опасности по људско здравље. Ове чињенице дају подстицаја истраживачима у проучавању агенаса изолованих из неких виших биљака, чија ће ефикасност не само бити већа, већ и неће дејствовати штетно на Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 11 животну средину и људско здравље. Једно истраживање је било посвећено праћењу антифунгалне активности екстракта Ruta graveolens, као и алелохемикалија 8- метоксипсоралена (8-MOP) (21), 5-метоксипсоралена (5-MOP) (22) и 4- хидроксикумарина изолованих из ове биљке 22. На слици 17 је дата антифунгална активност различитих концентрација лиофилизираног екстракта рутвице према неким патогеним гљивама. Највећу активност екстракт показује према P. lycopersici (за концетрације од 20 g/L и 40 g/L). При концентрацији од 5 g/L екстракт подстиче раст Penicillium sp.. Слика 17. Антифунгални ефекат лиофилизираног екстракта Ruta graveolens Што се тиче изолованих алелохемикалија, констатовано је да антифунгалну активност 4-хидроксикумарин не поседује, док са друге стране, 8-MOP и 5-MOP показују значајну активност (Слика 18 и 19) (Табела 1). У опсегу концетрација од 27,6 mg/L до 39,9 mg/L (за 8-MOP), односно 6,33 mg/L до 27,0 mg/L (за 5-MOP) хидроксипсоралени показују антифунгалну активност. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 12 Слика 18. Ефекат 8-MOP (A) и 5-MOP (B) (четири различите концентрације) на степен раста F. solani, P. lycopersici и T. viride Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 13 Табела 1. Потребна концентрација за 50 % инхибицију раста различитих фунгалних врста IC50 гљива лиофилизирани екстракт (g/L) 8-MOP (mg/L) 5-MOP (mg/L) F. solani 8,25 ± 1,45 27,7 ± 3,5 6,77 ± 0,5 P. lycopersici 4,16 ± 0,07 39,9 ± 2,3 27,0 ± 0,3 T. basicola 8,43 ± 0,07 T .viride 15,17 ± 0,04 27,6 ± 1,3 6,33 ± 0,1 T. dahliae 6,50 ± 0,10 Penicillium sp. 9,04 ± 0,03 O OO O OO OMe OMe 22 21 Слика 19. 5-Метоксипсорален и 8-метоксипсорален DNA giraza (ензим из класе topoizomeraza) је бактеријски ензим одговоран за процес превођења DNA у нативну форму 23-25. Ради се о ензиму који је виталан за бактерије и нема директног представника у сисарима, те је самим тим изузетно атрактивна антибактеријска мета. Структурна одређивања су показала да се ради о ензиму који садржи две субјединице (A и B). Констатовано је да функционише као A2B2 тетрамер у којој је A субјединица одговорна за везивање и раскидање веза, као и рекомбинацију DNA. С друге стране, B субјединица је одговорна за енергију путем контролисања хидролизе ATP. Две класе органских једињења су познате до сада као клинички ефективни антибиотици DNA giraze. То су хинолони и кумарини. Дејство хинолона се заснива на њиховом везивању за A субјединицу уз формирање стабилног тернарног комплекса који узрокује смрт ћелије. Што се тиче кумарина, њихово дејство се огледа у везивању за B субјединицу (нпр. новобиоцин) и инхибирању дејства ATP-aze. Један од кумаринских деривата, новобиоцин, има успешну клиничку употребу (углавном се то односи на грам-позитивне бактерије) али треба имати у виду његову токсичност као и брзо развијање резистенције. Што се тиче кумеромицина A1 и хлоробиоцина, треба нагласити њихове недостатке који се односе на њихове физичко-хемијске карактеристике (Слика 20). Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 14 Чињеница да giraza B као субјединица бактеријске DNA giraze лако може постати резистентна дала је подстицаја истрживачима у погледу структурног модификовања досадашњих кумаринских деривата који дејствују као антибиотици. Истраживања су показала значајан утицај 5',5'-диметил групе новиозе на антибактеријско дејство кумаринских антибиотика 24. O O OH NHCO OH OO MeO OCOR2 novioza R1 3' 5' 4 Слика 20. Новобиоцин: R1=Me, R2=NH2 16; хлоробиоцин: R1=Cl, R2=2-metilpirol 23 Поређењем аминокиселинских секвенци из дванаест грам позитивних врста констатовано је да активност ентерококалне и стрептококалне giraze B у приличној мери је под утицајем новиозе, у поређењу са girazom B изолованом из E. coli (Слика 21), пошто њихови хидрофобни џепови садрже Val-94 и Phe-95, и у извесној мери су већи у односу са girazоm B изоловане из E. coli 24. OO MeO OCOR2 novioza 3' 5' kumarin hidrofobni dzep Слика 21. Приказ утицаја 5',5'-диметил групе новиозе на активност кумаринских антибиотика У покушају синтезе ефикаснијих антибактеријских агенаса који у свом саставу садрже кумарински прстен (кумарин карбонских киселина које су по структури сличне новобиоцину) констатовано је да везивањем L-рамнозил остатка као шећерне компоненте, тј. заменом новиозе са рамнозом у значајној мери се може повећати инхибиторна активност 24. Такође је утврђено да се увођењем алкил остатка на C5 угљеников атом кумаринског језгра повећава антибактеријско својство кумаринских Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 15 деривата у in vitro условима. Заменом 5'-аксијалне метил групе у молекулу новиозе са водоником у рамнози резултоваће у петоструком умањењу инхибиторног дејства ензима DNA giraze. Ово није изненађујуће узимајући у обзир чињеницу да је 5',5'- диметил група новиозе у комплексу са girazom B окружена хидрофобним аминокиселинама као и да супституција метил групе са водоником резултује у парцијалном губитку ових хидрофобних интеракција. И поред тога кумарински супстрат који као шећерну компоненту садржи рамнозу задржава сличну инхибиторску активност према DNA girazi као и новобиоцин. Чланови групе кумеромицин антибиотика 24 продукованих од стране врста Streptomyces се међусобно разликују по присуству 5-метилпирол-2-карбоксилатног или пирол-2-карбоксилатног дела у молекулу. Упоредне студије антибактеријске активности ове групе кумаринских деривата показују да је за изражени антибактеријски профил кумеромицина A1 одговорна 5-метил група из 5- метилпирол-2-карбоксилатног дела. Хлоробиоцин показује два пута већу антибактеријску активност у односу на новобиоцин, док кумеромицин показује десетоструко већу инхибиторску активност према ензиму DNA girazi у односу на новобиоцин. Оваква потенција кумеромицина се може приписати већој хидрофобности 5-метилпирол-2-карбоксилатног дела, а самим тим, и већој пермеабилности мембране. Констатовано је да пиролни део хлоробиоцина у комплексу са girazom B је окружен хидрофобним аминокиселинским остацима Val-43, Val-71, Val-120, Val-167 и Ile-78 (хидрофобни џеп) (Слика 22). Осим хидрофобних контаката утврђено је да стабилности комплекса доприносе и интеракције путем водоничне везе формиране између NH-групе пирола и дела ензима, тј. аминокиселинског остатка Aps-73, односно водоничних веза које настају између карбонилне групе пирол-2-естра и воде са аминокиселинским остацима Thr-165 и Gly-77 24. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 16 N H O hlorobiocin H O H Asp-73 Thr-165 Gly-77 N O novobiocin O Hb Ha Asp-73 Thr-165 Gly-77 H O H hidrofobni dzep Слика 22. Интеракција између 24 kDa N-терминалног протеинског фрагмента giraze B из E. coli са хлоробиоцином и новобиоцином 1.2.3. Деривати кумарина са антикоагулантним дејством Након открића да употреба буђавог сена слатке детелине у исхрани крупне стоке инхибира синтезу витамина K1 у јетри и стварање протромбина (доказано је присуство дикумарола (24) (Слика 23)) 26, 27, започела су интензивна истраживања на синтези једињења дикумаролског типа који имају ефекат антикоагуланата. O O O OHOH O 24 Слика 23. Дикумарол Антикоагулантно дејство 4-хидроксикумаринских деривата се заснива на структурној аналогији са витамином K (коагулациони витамин) као нафтахинонским дериватом који у положају 2 поседује изопреноидни остатак, а у положају 3 метил групу 27 (Слика 24). Витамин K је кофактор посттранслационале карбоксилације остатка глутаминске киселине до -карбоксиглутамата на N-терминалном делу витамин K-зависних протеина 28, 29. Да би фактори коагулације (фактор II - протромбин и фактори коагулације VII, IX и X) поседовали биолошку активност Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 17 неопходна је -карбоксилација и везивање Ca2+ јона преко две карбоксилне групе у - карбоксиглутамат остатку 28. O O O OH O O O OH 3 Слика 24. Приказ структурне аналогије витамина K и 4-хидроксикумаринског система Карбоксилација витамин K-зависних коагулационих фактора је катализована дејством karboksilaze, уз присуство редуковане форме витамина K (дихидровитамин K или KH2) као коензима, молекулског кисеоника и угљен диоксида. Током овог процеса коензим karboksilaze, дихидровитамин K (KH2) се оксидује до витамин K 2,3- епоксида. Надаље, регенерација дихидровитамина K се изводи дејством ензима vitamin K 2,3-epoksid reduktaze на витамин K-2,3-епокисд 30, 31. Управо 4- хидроксикумрински деривати као антагонисти витамина K своју антикоагулантну активност показују преко инхибиције ензима vitamin K 2,3-epoksid reduktaze, спречавајући превођење инактивне у активну форму витамина K, а тиме и ограничавајући процес-карбоксилације коагулационих протеина (Слика 25) 30. OH OH R CH3 O O R CH3 O CH CO HN CH2 CH2 COOH CH CO HN CH2 CH HOOC COOH    karboksilaza O2 CO2 Слика 25. Приказ ензимске -карбоксилације остатка глутаминске киселине уз редукцију дихидровитамина K до витамин K 2,3-епоксида Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 18 У сагласности са механизмом представљеним од стране Fasco-a 32, депротоновани 4-хидроксикумарински супстрат се везује за оксидовану дисулфидну форму vitamin K 2,3-epoksid reduktaze. На тај начин кореспондира процесу елиминације воде из 2-хидроксивитамина K, под дејством дисулфидне форме ензима vitamin K 2,3-epoksid reduktaze. Односно, то значи да се 4-хидроксикумарински молекул везујe за активни центар на сличан начин као и 1,4-нафтахинонски молекул витамина K, при чему супституент у положају 3 опонаша изопреноидни остатак у положају 2 2-хидроксивитамина K (Слика 26). O O CH3 R O O CH3 R O B H B H S HS S S O O CH3 R OH B H B H O O CH3 R OH S S H B B H S S B H B H2O W Слика 26. Механистички модел редукције витамин K 2,3-епокисда и инхибиције са варфарином Приликом тестирања више од сто синтетисаних деривата кумарина као потенцијалних антикоагуланата констатовано је да је циклокумарол (25) (Слика 27) најактивнији и показује 60 % активности природног производа дикумарола 33. O O O H3C OMe C6H5 25 Слика 27. Циклокумарол Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 19 Примена циклокумарола у минималним дозама код здравих људи, зечева и паса изазива продужену и интензивну хипопротромбинемију. Значајну антикоагулантну активност показује и аценокумарол (26), као и једињење 4-метил-3-фенил-пирано[3,2-c]-хромен-2,5-дион (27) (Слика 28) 34. O O OH CH3 O 26 O O O CH3 O Ph 27 Слика 28. Aценокумарол и 4-метил-3-фенил-пирано[3,2-c]-хромен-2,5-дион J. Chmielewska и сарадници 35 закључују да дикумаролска структура није неопходан предуслов за антикоагулантно деловање, што се може видети из структуре маркумара (28) и варфарина (29) (Слика 29) 36. O O OH COOCH3 Et O O OH COOCH3 28 29 Слика 29. Mаркумар и варфарин Увођењем халогена у ароматични прстен 4-хидроксикумарина повећава се антикоагулационо дејство, док замена кисеониковог атома у прстену са сумпором утиче на смањење активности 37. Варфарин се скоро увек дозира орално, премда се дозира и парентерално. Клиничка испитивања су забележила брзу ресорпцију варфарина. Као доказ тога даје се чињеница да се након 90 минута од узимања јавља максималан ниво у крви. Транспорт путем крви се врши стабилним везивањем за серумски протеин албумин. Екскреција преко хидроксиловане инактивне форме путем урина започиње акумулирањем и метаболисањем у јетри и излучивањем преко жучи у танко црево Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 20 (ентерохепатични пут). Варфарин се као рацемска смеша два енантиомера (S-изомер и R-изомер) у ћелијама хепатоцита катаболише путем citohrom P450 изоензима. 1.2.4. Остали видови биохемијског дејства кумаринских деривата 1.2.4.1. Кумарински деривати са фитоалексинским дејством Биљке су у стању да се одбране од неких патогених микроорганизама индуковањем одбрамбеног одговора 38. Гљивично обољење изазвано нападом Ceratocystis fimбriata F. platani је значајан предмет проучавања истраживача из разлога високе опасности по опстанак дрвећа. Ове патогене гљиве улазе у биљку кроз оштећене делове корена, стабла и лишћа изазивајући сушење лишћа. Чак и већа и отпорнија стабла могу бити уништена за око 4-7 година, иако је забележена значајна акумулација два хидроксикумарин фитоалексина скополетина (30) и умбелиферона (8) (Слика 30). Треба нагласити да је констатовани одбрамбени одговор биљке недовољан за заштиту. O O O HO 30 O OHO 8 Слика 30. Скополетин и умбелиферон 1.2.4.2. Кумарински деривати са антиинфламаторним дејством Испитивања на експерименталним животињама су показала да супстрати са арилоксиметиленском групом на положају 4 кумаринског језгра поседују антиинфламаторно дејство 39, 40, и да је оно последица формирања (функционалне трансформације) карбоксилне групе у биолошким системима 40. Премда поуздан молекулски механизам дејства није разјашњен, 4-(арилоксиметил)кумарини (31) и Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 21 кумарини са ванилинским остатком (32) поседују значајну антиинфламаторну активност (Слика 31). O O H 2 C O CHO R 31 O O R CH2 O MeO CHO 32 MeO Слика 31. 4-(Арилоксиметил)кумарински деривати као антиинфламаторни супстрати 1.2.4.3. Кумарински деривати са антиартеросклеротичним дејством 4-Метилкумарински дериват са диетиламино-етил групом у положају 3 и оксиацетатном групом у положају 7 се годинама у клиничкој пракси под називом интенсаин, хромонар или карбохромен (33) употребљава за профилаксу напада ангине пекторис, односно као антиартеросклеротични агенс (Слика 32) 41. O O CH3 N Et Et OH2C EtOOC HCl 33 Слика 32. Карбохромен 1.2.4.4. Кумарински деривати са вазодилататорским дејством Из породице биљака Apiaceae изоловани су различити кумарини са вазодилататорским деловањем. Међу њима треба истаћи виснадин (34) и самидин (35) као супстрате биогенетски изведене из умбелиферона (8) који се међусобно Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 22 структурно разликују по присуству 2,3-метилбутеноатне, односно метилбутаноатне групе везане за положај 4 тетрахидро-пиранског дела молекуле (Слика 33) 42, 43. O OO H3C H3C OCOCH3 OCOR R= C CH3 C CH3 H 34 R= H 2 C C H CH 3 CH3 35 Слика 33. Виснадин и самидин 1.2.4.5. Кумарински деривати са естрогеним дејством Куместрол (36) 44, 45 изолован из детелине Alfaalfa и других махуна је потенцијални естроген. Естрогена активност куместрола је последица структурне аналогије са природним хормоном естрадиолом (37) 46. Такође 3-супституисани кумарински дериват 4-етил-7-хидрокси-3-(4-хидрокси-фенил)-хромен-2-он (38) поседује естрогену активност (Слика 34). O O OH HO 38 OH HO 37 O OHO O OH 36 Слика 34. Естрадиол и кумарински деривати са естрогеним дејством Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 23 1.2.4.6. Кумарински деривати као стимулатори активности централног нервног система За неке од кумаринских деривата је утврђено да делују на централни нервни систем, као стимулатори његове активности. Међу њима 4-метил-7-хидрокси супстрат са пиперидинским делом везаним преко метиленске групе у положају 8 поседује највећу активност (39) (Слика 35) 47. OH3C O OH H2 C N 39 Слика 35. 7-Хидрокси-4-метил-8-пиперидин-1-илметил-хромен-2-он Monoaminooksidaze (MAO, EC 1. 4. 3. 4) су FAD зависни ензими. Катализују оксидативну деаминацију моноамина из ендогених и егзогених извора утичући на тај начин на концентрацију неуротрансмитерских моноамина (биогени амини) 48, 49. Извесни синтетички кумарински деривати 47, 49 показали су се као MAO инхибитори, те на тај начин представљају могуће терапеутске агенсе, примера ради у сврху третмана Паркинсонове болести (констатовано је да је MAO одговоран за биотрансформацију 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридина у 1-метил-4- фенилпиридин, тј. продукт Паркинсонове болести неуротоксин 50, 51). Утврђено је да су есупрон (40) и LU53439 (41) реверзибилни MAO инхибитори (Слика 36) 49. Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 24 O OEtSO3 O OO N N S 40 41 Слика 36. Eсупрон и LU53439 1.2.4.7. Афлатоксини Испитивањем хране која је била узрочник помора животиња, констатовано је да је у њој била извесна количина афлатоксина као продуката метаболизма буђи сена слатке детелине 52-54. За афлатоксине је утврђено да су узрочници канцера јетре и да своје токсично дејство испољавају и у врло малим количинама. Из млека животиња третираних са афлатоксинима изоловани су афлатоксини M1 и M2 (42, 43) (Слика 37) за које је доказано да су производи метаболизма Aspergillus flavus 54. O O O OMe O O OH O O O OMe O O OH H 42 43 Слика 37. Aфлатоксини M1 и M2 Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 25 1.2.4.8. Кумарински деривати са анти- HIV активошћу Извесни кумарински деривати су се показали као потенцијални анти-HIV агенси 55. Ради се о кумаринима (+)-каланолиду A (44) и (-)-каланолиду B (костатолид) (45) (Слика 38) изолованим из биљака Calophyllum cerasiferum Vesque и Calophyllum inophyllum Linn из породице Clusiaceae. Механизам дејства ових кумаринских деривата се заснива на инхибицији ензима HIV reverzne transkriptaze односно RNA- зависне DNA-polimeraze, чиме се спречава реверзна транскрипција вирусне RNA и њена интеграција у геном ћелије. На овај начин је онемогућено да RNA-polimeraze хуманих ћелија учествују у синтези за овај ретро-вирус специфичних mRNA (кодирају специфичне протеине вируса), чиме се зауставља њихова даља репликација56. O O O O OH O O O O OH 44 45 Слика 38. (+)-Каланолид A и (-)-каланолид B 1.2.4.9. Кумарински деривати са антипаразитским дејством Кумарински дериват калепин (46) (Слика 39) изолован из биљака рода Rutaceae делотворно делује против Changa's-ове болести (прилично је заступљена у централној и јужној Америци, премда има доста забележених случајева и у Северној Америци) 57. Утврђено је да је узрочник ове болести паразит Trypanosoma cruzi. Антипаразитско дејство калепина се испољава инхибирањем ензима gliceraldehid 3- fosfat dehidrogenaze (GAPDH) присутног у гликозомима овог паразита, заустављајући Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 26 процес гликолизе на нивоу формирања 3-фосфоглицерол-1-фосфата. Како интрацелуларне амастиготе паразита енергију добијају процесом гликолизе произилази да би инхибирање ензима GAPDH са супстратима типа калепина условило уништење овог паразита 56, 57. O O O HO 46 Слика 39. Калепин 1.2.4.10. Кумарински деривати са антиканцерогеним дејством Деривати кумарина показују и антиканцерогено дејство. Недавно је објављено истраживање да и сам кумарин поседује цитостатичко дејство 58. Констатовано је и да маркумар, кумарински дериват са антикоагулативном активношћу, инхибира спонтано метастазирање тумора, док кумарински дериват са метилсулфонил групама у положајима 4 и 7 (47) дејствује антиканцерогено на Sarcom W256 (Слика 40) 59-61 . O O OSO2CH3 H 3 COSO 2 47 Слика 40. Антиканцерогени агенс на Sarcom W256 Protein kinaze играју веома важну улогу у контроли размножавања ћелија, диференцијације и метаболизма 62. Рецептор фактора раста, tirozin kinaza, се активира путем везивања његових специфичних лиганада. Прекомерна израженост рецептора неких фактора раста је утврђена у случају људског канцера, као што је рак дојке и јетре 63-65. Инхибитори protein kinaze могу представљати потенцијално важну класу Докторска дисертација Општи део мр Ненад Вуковић 27 терапеутских агенаса за неке врсте канцера насталих као последица прекомерне активности protein kinaze (ензими protein kinaza и protein fosfataza одговорни су за битне процесе фосфорилације и дефосфорилације који регулишу функцију ћелије). Неки кумарински деривати, дафнетин, есцулин, 3-хидроксикумарин, 4- хидроксикумарин и 7-хидроксикумарин били су предмет истраживања као потенцијални инхибитори ензима protein kinaze 66. Одређен је ефекат дејства на активност EGF рецептора tirozin kinaze, PKA (cAMP zavisna protein kinaza) и PKC (protein kinaza C). PKA су Ser/Thr specifične protein kinaze које су значајне са аспекта регулације ћелијског метаболизма, развоја и диференцијације. Табела 2. Инхибиција protein kinaze при концентрацији кумаринских деривата од 200 μM % инхибиције супстрат EGFR-PTKa PKC PKA кумарин - - 35,28 дафнетин 99,65 99,19 98,67 ескулин - - 30,35 3-ОH-кумарин - - 26,72 4-ОH-кумарин - 12,37 29,47 7-ОH-кумарин - 10,54 40,71 a EGFR-PTK фактор епидермалног раста рецептора protein tirozin kinaze O O OH HO 48 Слика 41. Дафнетин На основу приказане табеле 2, дафнетин (48) (Слика 41) као 7,8-дихидрокси супституисани кумарин ефикасно инхибира активност protein Tyr-kinaze (катализује фосфорилацију егзогених супстрата), PKA и PKC. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 28 2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 29 2.1. Поступци за добијање нових деривата 4-хидроксикумарина 2.1.1. Општа процедура добијања тиоуреа деривата У 40 mL воде се раствори амонијум тиоцијанат (0,012 mol, 1 g). По додатку 1 mL 36 % хлороводоничне киселине и 0,012 molova одговарајућег амина (49a, 50а, 51a- 53а) смеша се загрева на температури од 80-90 ˚C у периоду од 3-4 сата. Ток реакције се прати хроматографијом на танком слоју (TLC Kieselgel G nach Stahl; елуент бензен:ацетон=8:2; средство за изазивање мрља-паре јода). На крају реакције, вода се упари на ротационом упаривачу а добијени талог третира са етил ацетатом. Настали амонијум хлорид у реакцији, као нерастворан у етил ацетату, се одвоји цеђењем под сниженим притиском. Преостали раствор се концентрује на ротационом упаривачу, при чему се добијају одговарајући тиоуреа деривати. Изузев 5-тиоуреидо-пентанске киселине (51b) и 1,1-диетил-тиоурее (52b), који се добијају као уљане супстанце, сви остали тиоуреа деривати се добијају као кристалне супстанце које кристалишу из метанола. Пречишћавање свих тиоуреа деривата се врши применом хроматографије на колони силика гела (силика гел 230-400 mesh ASTM; смеша за елуирање бензен:метанол=9:1). 2.1.2. Општа процедура добијања 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина У 60 mL апсолутног етанола раствори се 3-(2-бромацетил)-4-хидрокси-хромен-2- она (60) (3,5 mmol, 1 g) и еквимоларна количина одговарајућег тиоуреа деривата (49b-59b). Смеша се загрева и рефлуктује у току 30-45 минута. По хлађењу реакционе смеше добијени талог одговарајућег 2-аминотиазолинског деривата (49c-59c) одвоји се од раствора цеђењем под сниженим притиском и рекристалише из 96 % етанола. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 30 Табела 3. Синтетисани тиоуреа деривати и 2-аминотиазолински деривати 4-хидроксикумарина R1 R2 Тиоуреа деривати H -NH2 тиоуреа 49b * H -NHCH3 1-метилтиоуреа 50b * H C6H3(OH)COOH 2-хидрокси-4-тиоуреидо-бензојева киселина 51b H p-NO2-C6H4- (4-нитро-фенил)-тиоуреа 52b * H p-C6H4SO3H 4-тиоуреидо-бензенсулфонска киселина 53b H m-CH3-C6H4- m-толил-тиоуреа 54b * H -CH2(CH2)3COOH 5-тиоуреидо-пентанска киселина 55b Et Et 1,1-диетил-тиоуреа 56b H o-CH3-C6H4- o-толил-тиоуреа 57b H m-NO2-C6H4- (3-нитро-фенил)-тиоуреа 58b * H C10H8 1-(нафтален-1-ил)тиоуреа 59b * R1 R2 2-Амино тиазолински деривати H -NH2 3-(2-амино-тиазол-4-ил)-4-хидрокси-хромен-2-он 49c H -NHCH3 4-хидрокси-3-(2-метиламинотиазол-4-ил)хромен-2-он 50c H C6H3(OH)COOH 2-хидрокси-4-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]-бензојева киселина 51c H p-NO2-C6H4- 4-хидрокси-3-[2-(4-нитро-фениламино)-тиазол-4-ил]-хромен-2-он 52c H p-C6H4SO3H 4-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]-бензенсулфонска киселина 53c H m-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(2-m-толиламино-тиазол-4-ил)-хромен-2-он 54c H -CH2(CH2)3COOH 5-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]-пентанска киселина 55c Et Et 3-(2-диетиламино-тиазол-4-ил)-4-хидрокси-хромен-2-он 56c H o-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(2-o-толиламино-тиазол-4-ил)-хромен-2-он 57c H m-NO2-C6H4- 4-хидрокси-3-[2-(3-нитро-фениламино)-тиазол-4-yl]-хромен-2-он 58c H C10H8- 4-хидрокси-3-(2-(нафтален-1-иламино)тиазол-4-ил)-2H-хромен-2-он 59c *Претходно синтетисани тиоуреа деривати H2N N S R2 R 1 NH4CNS NH2 R2 R1 H2O 80-90 C° 51a, 53a, 55a-57a 51b, 53b, 55b-57b O OH O O Br EtOH ref lux. O OH O S N N R1 R2 49c-59c60 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 31 2.1.3. Општа процедура добијања имино деривата 4-хидроксикумарина 2.1.3.1. Конвенционална метода У 50 mL анхидрованог толуена раствори се 3-ацетил-4-хидроксикумарин (17) (0,01 mol) и еквимоларна количина одговарајућег амина (61a-68a). По додатку каталитичке количине p-толуен сулфонске киселине врши се загревање, уз азеотропно уклањање воде применом Dean-Stark-овог наставка, у току 10-12 сати. Ток реакције се прати хроматографијом на танком слоју (TLC Kieselgel G nach Stahl; елуент толуен:ацетон=7:3; средство за изазивање мрља-паре јода). По завршетку реакције растварач се упари до четвртине запремине, а након хлађења, остатак раствора одвоји од талога цеђењем под сниженим притиском. Пречишћавање имина (61b-68b) се врши хроматографијом на колони силика гела (силика гел 230-400 mesh ASTM; смеша за елуирање бензен:ацетон=8:2). 2.1.3.2. Метода под дејством микроталасног зрачења Смеша 3-ацетил-4-хидроксикумарина (17) (0,01 mol), одговарајућег амина (61a- 68a) (0,01 mol) и каталитичке количине p-толуен сулфонске киселине у 50 mL анхидрованог толуена се подвргава микроталасном зрачењу снаге 500 W у току 3 минута. По хлађењу, растварач се упари на ротационом упаривачу, а добијени одговарајући имини (61b-68b) рекристалишу из метанола. 2.1.4. Општа процедура добијања амино деривата 4-хидроксикумарина Раствору 0,0034 mola одговарајућег имина (61b-68b) у 50 mL смеше метанол:тетрахидрофуран=8:2, полако и у порцијама, уз стално мешање, додаје се натријум борхидрид (0,0034 mol, 0,129 g). Након додатка целокупне количине натријум борхидрида наставља се интензивно мешање реакционе смеше на собној температури и у току 4 сата. Ток реакције прати се хроматографијом на танком слоју (TLC Kieselgel G nach Stahl; елуент толуен:ацетон=7:3; средство за изазивање мрља- паре јода). По завршетку реакције, реакциона смеша се пажљиво упари при Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 32 сниженом притиску, а сирови производ закисели са раствором хлороводоничне киселине (10 %) и меша на собној температури у току 30-60 минута. Затим се изврши неутрализација киселине са засићеним воденим раствором натријум бикарбоната, а добијени одговарајући амин екстрахује са метилен хлоридом (3 x 50 mL). Метилен хлоридни екстракти се помешају и суше преко анхидрованог натријум сулфата. По одвајању натријум сулфата цеђењем при сниженом притиску, и упаравања метилен хлорида добија се талог одговарајућег амина (61c-68c) који се пречишћава хроматографијом на колони силика гела (230-400 mesh ASTM; смеша за елуирање бензен:ацетон=8:2). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 33 Табела 4. Синтетисани имино и амино деривати 4-хидроксикумарина R3 Имино деривати C6H5- 4-хидрокси-3-(1-(фенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 61b p-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(p-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 62b m-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(m-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 63b o-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(o-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 64b p-NO2-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(4-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 65b m-NO2-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(3-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 66b C6H5CH2- 3-(1-(бензилимино)етил)-4-хидрокси-2H-хромен-2-он 67b -CH2(CH2)3COOH 5-(1-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)етилиденамино)пентанска киселина 68b R3 Aмино деривати C6H5- 4-хидрокси-3-(1-(фениламино)етил)-2H-хромен-2-он 61c p-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(p-толиламино)етил)-2H-хромен-2-он 62c m-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(m-толиламино)етил)-2H-хромен-2-он 63c o-CH3-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(o-толиламино)етил)-2H-хромен-2-он 64c p-NO2-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(4-нитрофениламино)етил)-2H-хромен-2-он 65c m-NO2-C6H4- 4-хидрокси-3-(1-(3-нитрофениламино)етил)-2H-хромен-2-он 66c C6H5CH2- 3-(1-(бензиламино)етил)-4-хидрокси-2H-хромен-2-он 67c -CH2(CH2)3COOH 5-(1-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)етиламино)пентанска киселина 68c O O OH R3-NH2 O O OH N R3 O 17 61b-68b O O OH N H R 61c-68c THF/MeOH NaBH4 10 % HCl NaHCO3 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 34 2.2. Физички и спектроскопски подаци синтетизованих кумаринских деривата 2.2.1. Тиоуреа деривати 2-Хидрокси-4-тиоуреидо-бензојева киселина (51b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3360, 3295, 3184, 3028, 1637, 1599, 1525, 1506, 1468, 1390, 1304, 1259, 1228, 1179, 1152, 1141, 1073, 905, 775. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 6,08 (d, 1H, J5,6=8,5 Hz, 5-H), 6,14 (s, 1H, 3-H), 7,62 (d, 1H, J5,6=8,5 Hz, 6-H), 9,5 (s, 2H, NH2), 10,1 (широк синглет, 1H, OH), 11,9 (широк синглет, 1H, NH), 12,5 (широк синглет, 1H, OH из COOH). Бруто формула једињења: C8H8N2O3S; (Mw 212,23); Израчунато %: C, 45,28; H, 3,80; N, 13,20; Нађено %: C, 45,30; H, 3,67; N, 13,62; Т.т. 76-78 ºC; Принос 56 % 4-Тиоуреидо-бензенсулфонска киселина (53b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3461, 3220, 3063, 2912, 1631, 1600, 1548, 1493, 1280, 1171, 1124, 819. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 7,19 (d, 2H, 3-H, 5-H, J3,2=J5,6=9 Hz), 8,03 (d, 2H, 2-H, 6-H, J2,3=J6,5=9 Hz), 9,4 (широк синглет, 2H, NH2), 11,82 (широк синглет, 1H, NH). Бруто формула једињења: C7H8N2O3S; (Mw 232,28); Израчунато %: C, 36,20; H, 3,47; N, 12,06; Нађено %: C, 35,97; H, 3,61; N, 11,92; Т.т. 84-87 ºC; Принос 53 %. 5-Тиоуреидо-пентанска киселина (55b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3138, 2926, 1754, 1420, 1400, 1100. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 1,55-1,6 (m, 4H, 3-H, 4-H), 2,2 (t, 2H, 2- H, J2,3=7 Hz), 2,65 (t, 2H, 5-H, J5,4=7,1 Hz), 9,0 (широк синглет,1H, NH), 9,56 (широк синглет, 2H, NH2), 11,8 (широк синглет, 1H, OH из COOH). Бруто формула једињења: C6H12N2O2S; (Mw 176,24); Израчунато %: C, 40,89; H, 6,86; N, 15,90; Нађено %: C, 40,84; H, 6,82; N, 15,93; Уље; Принос 39 %. 1,1-Диетил-тиоуреа (56b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3399, 2994, 2981, 1611, 1140, 823 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 1,0 (t, 6H, CH3, J=8,5 Hz), 2,65 (q, 4H, CH2, J=8,5 Hz), 9,53 (широк синглет, 2H, NH2). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 35 Бруто формула једињења: C5H12N2S; (Mw 132,23); Израчунато %: C, 45,42; H, 9,15; N, 21,19. Нађено %: C, 45,39; H, 9,18; N, 21,13; Уље; Принос 61 %. o-Толил-тиоуреа (57b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3447, 3284, 3169, 2986, 1611, 1552, 1533, 1289, 1067, 795, 741. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 6,5-6,7 (m, 2H, 4-H, 5-H), 6,8 (d, 1H, J6,5=7,5 Hz, 6-H), 9,5 (широк синглет, 2H, NH2), 12,4 (широк синглет, 1H, NH). Бруто формула једињења: C8H10N2S; (Mw 166,24); Израчунато %: C, 57,80; H, 6,06; N, 16,85; Нађено %: C, 56,73; H, 6,01; N, 16,91; Т.т. 44-46 ºC; Принос 44 %. 2.2.2. 2-Амино тиазолински деривати 4-хидроксикумарина 3-(2-Амино-тиазол-4-ил)-4-хидрокси-хромен-2-он (49c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3433, 3381, 3241, 3122, 1698, 1609, 1524, 1405, 1328, 1294, 1165, 1072, 950. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 7,29-7,37 (m, 2H, 6-H, 8-H, J6,8=1,16 Hz, J6,5=7,90 Hz, J6,7=7,35 Hz, J8,7=8,35 Hz), 7,21 (s, 1H, 5'-H), 7,44 (ddd, 1H, 7-H, J6,7=7,35 Hz, J7,5=1,63 Hz, J8,7=8,35 Hz), 8,58 (широк синглет, 1H, NH2, спора измена са D2O), 15,87 (s, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 165,452 (C-2'), 140,67 (C-4'), 108,56 (C- 5'), 154,28 (C-2), 93,86 (C-3), 163,09 (C-4), 123,76 (C-5), 124,06 (C-6), 132,11 (C-7), 116,34 (C-8), 120,23 (C-9), 152,05 (C-10). Бруто формула једињења: C12H8N2O3S; (Mw 260,27); Израчунато %: C, 55,37; H, 3,10; N, 10,76; Нађено %: C, 55,12; H, 2,98; N, 10,38; Т.т. 255-257 ºC; Принос 60 %. 4-Хидрокси-3-(2-метиламинотиазол-4-ил)хромен-2-он (50c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3433, 3381, 3155, 3116, 1698, 1630, 1513, 1409, 1340, 1299, 1185, 1092, 960. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 2,98 (s, 3H, CH3), 7,29-7,82 (m, 4H, 6-H, 7-H, 5-H, 8-H, J7,5=1,63 Hz, J6,8=1,18 Hz, J6,5=7,89 Hz, J6,7=7,37 Hz), 7,36 (s, 1H, 5-H), 11,01 (широк синглет, 1H, NH), 16,36 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 36 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 159,42 (C-2'), 109,46 (C-5'), 141,67 (C- 4'), 156,32 (C-2), 168,39 (C-4), 32,34 (CH3). Бруто формула једињења: C13H10N2O3S; (Mw 274,30); Израчунато %: C, 56,92; H, 3,67; N, 10,26; Нађено %: C, 56,62; H, 23,98; N, 10,28; Т.т. 218-220 ºC; Принос 67 %. 2-Хидрокси-4-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]- бензојева киселина (51c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3413,3295, 3184, 3028, 1637, 1599, 1525, 1506, 1468, 1450, 1390, 1304, 1259, 1228, 1179, 1152, 1141, 1073, 905, 775. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 6,21 (s, 1H, 3"-H), 6,23 (d, 1H, 5"-H, J5",6"=8,5 Hz), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7.4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7.6 (dd, 1H, 5- H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 7,73 (d, 1H, 6"-H, J6",5"=8,5 Hz), 7,83 (s, 1H, 5'-H), 10,1 (bs, 2"-OH), 12,11 (s, 1H, 2'-NH), 12,52 (широк синглет, 1H, OH из COOH), 13,27 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C19H12N2O6S; (Mw 396,37); Израчунато %: C, 57,57; H, 3,05; N, 7,07; Нађено %: C, 56,90; H, 3,01; N, 7,14; Т.т. 282-284 ºC; Принос 79 %. 4-Хидрокси-3-[2-(4-нитро-фениламино)-тиазол-4-ил]-хромен-2-он (52c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3414, 3134, 1682, 1636, 1608, 1519, 1465, 1425, 1369, 1261, 1213, 1098, 783, 764. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,35 (d, 2H, J3",2"=J5,6=8.2 Hz, 3"-H, 5"-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7.6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7.8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 8,03 (d, 2H, J2",3"=J6",5"=8,2 Hz, 2"-H, 6"-H), 8,10 (s, 1H, 5'-H), 10,22 (s, 1H, 2'-NH), 13,25 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C18H11N3O5S; (Mw 381,36); Израчунато %: C, 56,69; H, 2,91; N, 11,02; Нађено %: C, 57,05; H, 2,93; N, 10,95; Т.т. 227-230 ºC; Принос 82 %. 4-[4-(4-Хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]-бензенсулфонска киселина (53c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3436, 3180, 3061, 2910, 1694, 1611, 1551, 1493, 1216, 1188, 1164, 1127, 1099, 1037, 1012, 820, 751. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 37 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 7,0 (d, 2H, 3"-H, 5"-H, J3",2"=J5",6"=9 Hz), 7.3 (m, 1H, 6-H), 7.4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1.1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7.7 (m, 1H, 7-H), 7,78 (s, 1H, 5'-H), 8,03 (d, 2H, J2",3"=J6",5"=9 Hz, 2"-H, 6-H), 10,31 (s, 1H, S-OH), 10,94 (s, 1H, 2'-NH), 13,24 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C18H12N2O6S2; (Mw 416,43); Израчунато %: C, 51,92; H, 2,90; N, 6,73; Нађено %: C, 51,90; H, 2,87; N, 6,75; Т.т. 247-249 ºC; Принос 72 %. 4-Хидрокси-3-(2-m-толиламино-тиазол-4-ил)-хромен-2-он (54c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3412, 3067, 2974, 2938, 1681, 1607, 1585, 1518, 1465, 1369, 1261, 1098, 967, 791, 755. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 2.20 (s, 3H, CH3), 6,6 (d, 1H, J6",5"=7,5 Hz, 6"-H), 7,2 (m, 1H, 5"-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,44 (d, 1H, J4",5"=8,5 Hz, 4"-H), 7,5 (s, 1H, 2"-H), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 8,08 (s, 1H, 5'-H), 9,60 (s, 1H, 2'-NH), 15,30 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C19H14N2O3S; (Mw 350,39); Израчунато %: C, 65,13; H, 4,03; N, 7,99; Нађено %: C, 65,10; H, 3,99; N, 8,03; Т.т. 270-273 ºC; Принос 84 %. 5-[4-(4-Хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]-пентанска киселина (55c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3416, 3114, 3084, 2926, 2853, 1690, 1614, 1549, 1496, 1270, 1200, 1106, 1033, 1000, 890, 759. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 1,5-1,6 (m, 4H, 2"-H, 3"-H), 2,2 (t, 2H, J=7 Hz), 3,1 (t, 2H, J=7,1 Hz, 1"-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 7,9 (s, 1H, 5'-H), 8,87 (s, 1H, 2'-NH), 9,26 (s, 1H, 5''-OH), 14,98 (s, 1H, 4-OH). Бруто формула једињења: C17H16N2O5S; (Mw 360,38); Израчунато %: C, 56,66; H, 4,47; N, 7,77; Нађено %: C, 57,01; H, 4,23; N, 7,58; Т.т. 224-225 ºC; Принос 71 %. 3-(2-Диетиламино-тиазол-4-ил)-4-хидрокси-хромен-2-он (56c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3413, 3067, 3054, 1693, 1621, 1578, 1544, 1413, 1348, 1274, 791, 754. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 38 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 1,04 (t, 6H, 2''-H, J=8,5 Hz), 3,11 (q, 4H, J=8,5 Hz, 1''-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,64 (s, 1H, 5'-H), 7,7 (m, 1H, 7-H), 14,89 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C16H16N2O3S; (Mw 316,37); Израчунато %: C, 60,74; H, 5,10; N, 8,85; Нађено %: C, 60,70; H, 5,15; N, 8,82; Т.т. 245-247 ºC; Принос 63 %. 4-Хидрокси-3-(2-o-толиламино-тиазол-4-ил)-хромен-2-он (57c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3414, 3301, 3040, 2982, 1690, 1605, 1577, 1521, 1412, 1293, 1270, 1182, 1111, 1035, 949, 753, 738. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 2,10 (s, 3H, CH3), 6,4 (d, 1H, J3",4"=8 Hz, 3"-H), 6,5 (m, 1H, 5"-H), 6,8 (d, 1H, J6,5=7,5 Hz), 6,83 (m, 1H, 4"-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8.3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7.6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7.7 (m, 1H, 7-H), 7,85 (s, 1H, 5'-H), 9,20 (s, 1H, 2'-NH), 14,80 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C19H14N2O3S; (Mw 350,39); Израчунато %: C, 65,13; H, 4,03; N, 7,99; Нађено %: C, 65,09; H, 3,97; N, 8,05; Т.т. 236-238 ºC; Принос 54 %. 4-Хидрокси-3-[2-(3-нитро-фениламино)-тиазол-4-yl]-хромен-2-он (58c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3415, 3279, 3083, 1675, 1615, 1552, 1527, 1492, 1413, 1353, 1269, 1157, 1118, 760. 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 6,91 (d, 1H, J4",5"=8,5 Hz, 4"-H), 7,2 (m, 1H, 5"-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7.4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7.43 (s, 1H, 2"-H), 7,5 (d, 1H, J6",5"=8 Hz, 6"-H), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7.7 (m, 1H, 7-H), 7,91 (s, 1H, 5'-H), 8,74 (s, 1H, 2'-NH), 14,15 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C18H11N3O5S; (Mw 381,36); Израчунато %: C, 56,69; H, 2,91; N, 11,02; Нађено %: C, 57,07; H, 2,85; N, 10,98; Т.т. >300 ºC; Принос 67 %. 4-Хидрокси-3-(2-(нафтален-1-иламино)тиазол-4-ил)-2H-хромен-2-он (59c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3413, 3287, 3054, 1693, 1621, 1578, 1544, 1413, 1348, 1274, 791, 754. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 39 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6); δ (ppm), J (Hz): 6,5 (d, 1H, J2",3"=8,2 Hz, 2"-H), 7,15 (m, 2H, 3"-H, 4"-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,45-7,52 (m, 2H, 6"-H, 7-H), 7,56 (m, 2H, 5"-H, 6"-H), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7.7 (m, 1H, 7-H), 7,87 (s, 1H, 5'-H), 8,57 (s, 1H, 2'-NH), 15,54 (широк синглет, 1H, 4- OH, брза измена са D2O). Бруто формула једињења: C22H14N2O3S; (Mw 386,42); Израчунато %: C, 68,38; H, 3,65; N, 7,25; Нађено %: C, 68,29; H, 3,72; N, 7,29; Т.т. 278-280 ºC; Принос 82 %. 2.2.3. Имнио деривати 4-хидроксикумарина 4-Хидрокси-3-(1-(фенилимино)етил)-2H-хромен-2-он (61b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3415, 3073, 3037, 2929, 2853, 1704, 1609, 1592, 1561, 1480. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,72 (s, 3H, CH3-C=N), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 6,9-7,21 (m, 5H, фенил), 16,15 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,9 (CH3-C=N), 97,4 (C3), 116,2 (C10), 116,8 (C8), 119,1 (C5), 119,8 (C2’’, C6’’), 125,9 (C6), 126,9 (C4’’), 129,4 (C7), 131,5 (C3’’, C5’’), 138,1 (C1’’), 152,4 (C9 C2), 180,3 (C1’), 180,5 (C4). MS: m/z (%)=279 (M + , 64), 278 (100), 264 (17), 262 (10), 188 (19), 187 (28), 158 (12), 144 (4), 131 (9), 130 (14), 121 (19), 118 (10). Бруто формула једињења: C17H13NO3 (Mw 279,29); Израчунато %: C, 73,11; H, 4,69; N, 5,02; Нађено %: C, 73,09; H, 4,71; N, 4,97; Т.т. 169-171 ºC; Принос 95 %. 4-Хидрокси-3-(1-(p-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он (62b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3421, 3073, 2985, 2922, 2852, 1709, 1611, 1597, 1569, 1513, 1483. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,41 (s, 3H, CH3-C4’’), 2,69 (s, 3H, CH3- C=N), 7,09-7,65 (ABq, 4H, 2",3",5",6"-H, J=8,43 Hz), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 16,07 (широк синглет, 1H, C4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 40 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,6 (CH3-C4’’), 20,8 (CH3-C=N), 97,3 (C3), 116,6 (C10), 116,8 (C8), 119,3 (C5), 119,9 (C2’’, C6’’), 125,9 (C6), 129,3 (C7), 129,9 (C4’’), 131,7 (C3’’,C5’’), 138,4 (C1’’ C2), 152,4 (C9), 180,4 (C4), 180,5 (C1’). MS: m/z (%)=293 (M + , 91), 292 (100), 278 (32), 276 (20), 188 (21), 187 (12), 172 (9), 144 (12), 132 (10), 121 (23), 107 (12), 106 (11), 91 (23). Бруто формула једињења: C18H15NO3 (Mw 293,32); Израчунато %: C, 73,71; H, 5,15; N, 4,78; Нађено %: C, 73,72; H, 5,12; N, 4,79; Т.т. 147-149 ºC; Принос 97 %. 4-Хидрокси-3-(1-(m-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он (63b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3417, 3067, 2982, 2929, 2853, 1697, 1606, 1600, 1566, 1484. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,42 (s, 3H, CH3-C3’’), 2,70 (s, 3H, CH3- C=N), 7,01 (dd, 1H, 4''-H, J4’’,5’’=7,58 Hz, J4’’,6’’=1,14 Hz), 7,04 (dd, 1H, 6''-H, J6’’,5’’=8,12 Hz, J6’’,4’’=1,14 Hz), 7,12 (s, 1H, 2''-H), 7,25 (m, 1H, 5''-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 15,9 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,9 (CH3-C=N), 21,0 (CH3-C3’’), 97,2 (C3), 116,7 (C8), 116,9 (C10), 118,9 (C6’’), 119,3 (C5), 121,9 (C2’’), 124,0 (C4’’), 125,9 (C6), 129,3 (C7), 130,7 (C5’’), 139,1 (C1’’), 139,1 (C3’’ C2), 152,1 (C9), 180,3 (C1’), 180,6 (C4). MS: m/z (%)=293 (M + , 81), 292 (100), 278 (30), 276 (12), 188 (14), 187 (27), 172 (11), 158 (7), 145 (13), 144 (12), 132 (10), 121 (19), 107 (12), 91 (20). Бруто формула једињења: C18H15NO3 (Mw 293,32); Израчунато %: C, 73,71; H, 5,15; N, 4,78; Нађено %: C, 73,72; H, 5,14; N, 4,79; Т.т. 109-110 ºC; Принос 94 %. 4-Хидрокси-3-(1-(o-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он (64b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3467, 3072, 2935, 2856, 1712, 1611, 1594, 1563, 1486. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,30 (s, 3H, CH3-C1’’), 2,81 (s, 3H, CH3- C=N), 7,13 (m, 1H, 4''-H), 7,23 (dd, 1H, 6''-H, J6’’,5’’=8,01 Hz, J6’’,4’’=1,12 Hz), 7,28 (dd, 1H, 3''-H, J3’’,4’’=7,62 Hz, J3’’,5’’=1,11 Hz), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,37 (m, 1H, 5''-H), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7- H), 15,8 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 41 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,2 (CH3-C=N), 20,9 (CH3-C2’’), 97,8 (C3), 116,1 (C10), 116,8 (C8), 118,9 (C6’’), 119,3 (C5), 122,7 (C2’’), 124,1 (C4’’), 125,8 (C6), 129,1 (C7), 129,8 (C5’’), 138,9 (C1’’), 139,1 (C3’’ C2), 152,5 (C9), 179,6 (C1’), 180,4 (C4). MS: m/z (%)=293 (M + , 42), 292 (34), 278 (100), 188 (7), 187 (11), 172 (8), 158 (15), 145 (4), 144 (9), 132 (9), 121 (16), 107 (2), 106 (3), 91 (17). Бруто формула једињења: C18H15NO3 (Mw 293,32); Израчунато %: C, 73,71; H, 5,15; N, 4,78; Нађено %: C, 73,75; H, 5,21; N, 4,73; Т.т. 138-139 ºC; Принос 94 %. 4-Хидрокси-3-(1-(4-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он (65b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3414, 3081, 3046, 2992, 2947, 2849, 1707, 1608, 1580, 1519, 1483, 1557, 1340. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,76 (s, 3H, CH3-C=N), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,43 (d, 2H, 3'',5''-H, J3’’,5’’=8,9 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 8,39 (d, 2H, 2'',6''-H, J2’’,3’’, 6’’,5’’=8,9 Hz), 15,95 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,8 (CH3-C=N), 97,9 (C3), 116,4 (C8), 116,9 (C10), 119,6 (C5), 123,2 (C2’’, C6’’), 125,3 (C6), 129,1 (C7), 133,2 (C3’’, C5’’), 136,1 (C1’’), 145,3 (C4’’), 152,4 (C9 C2), 177,5 (C1’), 180,7 (C4). MS: m/z (%)=324 (M + , 60), 323 (100), 309 (8), 307 (10), 294 (14), 277 (18), 263 (8), 188 (26), 187 (47), 121 (48), 117 (12), 108 (7). Бруто формула једињења: C17H12N2O5 (Mw 324,29); Израчунато %: C, 62,96; H, 3,73; N, 8,64; Нађено %: C, 62,97; H, 3,77; N, 8,69; Т.т. 212-215 ºC; Принос 92 %. 4-Хидрокси-3-(1-(3-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он (66b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3416, 3089, 3062, 2980, 2936, 2853, 1705, 1609, 1590, 1538, 1491, 1562, 1353. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,61 (s, 3H, CH3-C=N), 7,26 (dd, 1H, 6''- H, J=8,02 Hz, J=1,12 Hz), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,34 (s, 1H, 2''-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,54 (m, 1H, 5''-H), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 8,09 (dd, 1H, 4''-H, J4’’,5’’=8,5 Hz, J4’’,6’’=1,12 Hz), 16,02 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 42 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 19,2 (CH3-C=N), 97,9 (C3), 116,4 (C8), 116,5 (C10), 117,8 (C2’’), 119,4 (C5), 121,4 (C4’’), 125,5 (C6), 127,3 (C6’’), 129,3 (C7), 131,5 (C5’’), 141,9 (C1’’ C2), 148,2 (C3’’), 152,1 (C9), 177,4 (C1’), 180,1 (C4). MS: m/z (%)=324 (M + 69), 323 (83), 307 (100), 294 (14), 263 (61), 188 (26), 187 (67), 163 (15), 157 (12), 121 (78), 117 (19), 103 (9). Бруто формула једињења: C17H12N2O5 (Mw 324,29); Израчунато %: C, 62,96; H, 3,73; N, 8,64; Нађено %: C, 62,96; H, 3,73; N, 8,64; Т.т. 209-210 ºC; Принос 97 %. 3-(1-(Бензилимино)етил)-4-хидрокси-2H-хромен-2-он (67b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3406, 3032, 3012, 2930, 1698, 1612, 1586, 1572, 1485. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 2,64 (s, 3H, CH3-C=N), 3,25 (s, 2H, CH2- N=C), 7,29 (m, 2H, 3'',5''-H), 7,26 (m, 1H, 4''-H), 7,39 (dd, 2H, 2'',6''-H, J2’’,3’’, 6’’,5’’= 7,7 Hz, J2’’,4’’, 6’’,4’’=1,1 Hz), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 16,01 (широк синглет, 1H, 4- OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 17,9 (CH3-C=N), 57,4 (C=N-CH2), 97,7 (C3), 116,7 (C10), 116,8 (C8), 119,3 (C5), 125,9 (C6), 126,7 (C4’’), 127,0 (C2’’, C6’’), 128,3 (C3’’, C5’’), 129,3 (C7), 138,7 (C1’’ C2), 167,1 (C1’), 152,5 (C9), 180,3 (C4). MS: m/z (%)=293 (M + , 100), 292 (14), 276 (15), 202 (66), 173 (10), 156 (19), 144 (14), 121 (16), 107 (12), 106 (6). Бруто формула једињења: C18H15NO3 (Mw 293,32); Израчунато %: C, 73,71; H, 5,15; N, 4,78; Нађено %: C, 73,73; H, 5,13; N, 4,73; Т.т. 151-152 ºC; Принос 97 %. 5-(1-(4-Хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)етилиденамино)пентанска киселина (68b) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3418, 3602-2811, 2947, 2930, 2875, 1721, 1703, 1614, 1600, 1560, 1487. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,82 (m, 4H, 2'',3''-H), 2,46 (t, 2H, 4''-H, J4’’,3’’=7,07 Hz), 2,70 (s, 3H, CH3-C=N), 3,60 (t, 2H, 1''-H, J1’’,2’’=7,1 Hz), 7,3 (m, 1H, 6- H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 11,3 (широк синглет, 1H, OH из COOH), 16,11 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 43 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 18,9 (CH3-C=N), 22,9 (C3’’), 30,4 (C2’’), 33,5 (C4’’), 53,9 (C1’’), 98,1 (C3), 116,5 (C8), 116,7 (C10), 119,3 (C5), 125,4 (C6), 129,2 (C7), 152,5 (C9), C2), 169,0 (C1’), 178,5 (C5’’), 180,4 (C4). MS: m/z (%)=303 (M + ). Бруто формула једињења: C16H17NO5 (Mw 303,11); Израчунато %: C, 63,36; H, 5,65; N, 4,62; Нађено %: C, 63,27; H, 5,68; N, 4,63; Т.т. 169-171 ºC; Принос 87 %. 2.2.4. Амнио деривати 4-хидроксикумарина 4-Хидрокси-3-(1-(фениламино)етил)-2H-хромен-2-он (61c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3429, 3183, 3072, 2970, 2933, 1669, 1614, 1602, 1567, 1497. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,34 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,68 Hz), 3,91 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,68 Hz), 3,96 (шири синглет, 1H, NH), 7,3 (m, 1H, 6-H), 6,87-7,23 (m, 5H, фенил), 7,29 (m, 1H, 7-H), 7,64 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,4 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,84 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,67 Hz), 17,05 (широк синглет, 1H, C4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,3 (C2’), 45,4 (C1’), 91,8 (C3), 117,3 (C8), 117,4 (C10), 117,6 (C2’’, C6’’), 121,8 (C4’’), 123,7 (C5), 124,1 (C6), 129,4 (C3’’, C5’’), 131,4 (C7), 145,6 (C1’’), 152,8 (C9 C2), 163,8 (C4). MS: m/z (%)=281 (M + , 4), 280 (15), 266 (11), 204 (100), 190 (91), 175 (74), 162 (12), 147 (34), 121 (89), 120 (61), 92 (44). Бруто формула једињења: C17H15NO3 (Mw 281,31); Израчунато %: C, 72,58; H, 5,37; N, 4,98; Нађено %: C, 72,64; H, 5,51; N, 5,03; Т.т. 189-190 ºC; Принос 89 %. 4-Хидрокси-3-(1-(p-толиламино)етил)-2H-хромен-2-он (62c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3466, 3191, 3071, 2989, 2966, 1671, 1612, 1601, 1566, 1499. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,33 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,69 Hz), 2,26 (s, 3H, C4’’-CH3), 3,93 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,69 Hz), 4,09 (шири синглет, 1H, NH), 6,73- 7,11 (ABq, 4H, 2'',3'',5'',6''-H, J=8,43 Hz), 7,29 (m, 1H, 6-H), 7,63 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,11 Hz), 7,29 (m, 1H, 7-H), 7,84 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,81 Hz, J5,7=1,69 Hz), 17,09 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 44 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,8 (C2’), 21,2 (CH3-C4’’), 45,3 (C1’), 91,9 (C3), 113,6 (C2’’, C6’’), 117,3 (C10), 117,4 (C8), 123,7 (C5), 124,1 (C6), 129,4 (C4’’), 129,8 (C3’’, C5’’), 131,3 (C7), 145,2 (C1’’), 152,9 (C9 C2), 163,8 (C4). MS: m/z (%)=295 (M + , 6), 294 (11), 280 (32), 256 (9), 204 (100), 190 (74), 175 (87), 121 (91), 92 (42). Бруто формула једињења: C18H17NO3 (Mw 295,33); Израчунато %: C, 73,20; H, 5,80; N, 4,74; Нађено %: C, 73,12; H, 5,67; N, 4,77; Т.т. 167-169 ºC; Принос 86 %. 4-Хидрокси-3-(1-(m-толиламино)етил)-2H-хромен-2-он (63c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3455, 3179, 3069, 2970, 2932, 2870, 1670, 1615, 1601, 1567, 1497. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,33 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,69 Hz), 2,21 (s, 3H, C3’’-CH3), 3,87 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,69 Hz), 3,94 (шири синглет, 1H, NH), 6,77 (dd, 1H, 6''-H, J6’’,5’’=7,99 Hz, J6’’,4’’=1,12 Hz), 6,71 (s, 1H, 2''-H), 7,01 (dd, 1H, 4''-H, J4’’,5’’=7,58 Hz, J4’’,6’’=1,12 Hz), 7,19 (m, 1H, 5''-H), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,28 (m, 1H, 7-H), 7,63 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,11 Hz), 7,86 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 17,09 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,8 (C2’), 21,1 (CH3-C3’’), 45,2 (C1’), 91,4 (C3), 110,4 (C6’’), 113,9 (C2’’), 117,2 (C10), 117,3 (C8), 118,4 (C4’’), 123,6 (C5), 124,3 (C6), 129,1 (C5’’), 131,2 (C7), 138,7 (C3’’), 146,2 (C1’’), 152,7 (C9 C2), 163,7 (C4). MS: m/z (%)=295 (M + , 9), 294 (14), 280 (6), 256 (7), 227 (15), 204 (100), 199 (23), 190 (64), 175 (72), 162 (16), 147 (18), 121 (93), 120 (49), 92 (44). Бруто формула једињења: C18H17NO3 (Mw 295,33); Израчунато %: C, 73,20; H, 5,80; N, 4,74; Нађено %: C, 73,18; H, 5,66; N, 4,78; Т.т. 119-121 ºC; Принос 91 %. 4-Хидрокси-3-(1-(o-толиламино)етил)-2H-хромен-2-он (64c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3433, 3193, 3066, 2985, 2970, 2932, 1670, 1615, 1602, 1568, 1499. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,31 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,67 Hz), 2,19 (s, 3H, C3’’-CH3), 3,82 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,67 Hz), 3,87 (шири синглет, 1H, NH), 6,91 (dd, 1H, 6''-H, J6’’,5’’=8 Hz, J6’’,4’’=1,11 Hz), 6,99 (m, 1H, 4''-H), 7,11 (m, 1H, 5''-H), 7,21 (dd, 1H, 3''-H, J3’’,4’’=7,62 Hz, J3’’,5’’=1,11 Hz), 7,27 (m, 1H, 7-H), 7,29 (m, 1H, 6-H), 7,65 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,29 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,86 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 17,08 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 45 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 17,7 (CH3-C2’’), 19,5 (C2’), 44,1 (C1’), 91,9 (C3), 111,3 (C6’’), 117,4 (C8), 117,5 (C10), 121,1 (C4’’), 122,5 (C2’’), 123,3 (C5), 124,2 (C6), 126,1 (C5’’), 128,6 (C3’’), 131,4 (C7), 144,5 (C1’’), 152,7 (C9 C2), 163,9 (C4). MS: m/z (%)=295 (M + , 3), 294 (18), 280 (42), 256 (19), 204 (100), 190 (87), 175 (93), 121 (91), 92 (25). Бруто формула једињења: C18H17NO3 (Mw 295,33); Израчунато %: C, 73,20; H, 5,80; N, 4,74; Нађено %: C, 73,28; H, 5,76; N, 4,79; Т.т. 147-149 ºC; Принос 82 %. 4-Хидрокси-3-(1-(4-нитрофениламино)етил)-2H-хромен-2-он (65c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3433, 3184, 3076, 2971, 2931, 1673, 1613, 1601, 1567, 1497, 1528, 1344. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,33 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,68 Hz), 3,78 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,68 Hz), 4,14 (шири синглет, 1H, NH), 7,3 (m, 1H, 6-H), 7,4 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 6,81-8,13 (ABq, 4H, 2'',3'',5'',6''-H, J=8,9 Hz), 7,6 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,79 Hz, J5,7=1,71 Hz), 7,7 (m, 1H, 7-H), 17,1 (широк синглет, 1H, C4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,1 (C2’), 43,5 (C1’), 91,5 (C3), 113,4 (C2’’, C6’’), 117,1 (C8), 117,6 (C10), 123,8 (C5), 124,1 (C6), 127,2 (C3’’, C5’’), 131,3 (C7), 136,3 (C4’’), 151,1 (C1’’), 152,3 (C9 C2), 163,9 (C4). MS: m/z (%)=326 (M + , 1), 325 (14), 311 (8), 307 (10), 204 (100), 189 (48), 162 (25), 121 (44), 120 (47), 92 (12). Бруто формула једињења: C17H14N2O5 (Mw 326,30); Израчунато %: C, 62,57; H, 4,32; N, 8,59; Нађено %: C, 62,67; H, 3,97; N, 8,61; Т.т. 222-223 ºC; Принос 74 %. 4-Хидрокси-3-(1-(3-нитрофениламино)етил)-2H-хромен-2-он (66c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3431, 3181, 3069, 2970, 2931, 1671, 1615, 1601, 1569, 1524, 1499, 1357. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,35 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,67 Hz), 3,75 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,67 Hz), 3,91 (шири синглет, 1H, NH), 7,16 (dd, 1H, 6''-H, J6’’,5’’=8 Hz, J6’’,4’’=1,1 Hz), 7,27 (m, 1H, 7-H), 7,44 (m, 1H, 5''-H), 7,5 (m, 1H, 6-H), 7,49 (s, 1H, 2''-H), 7,61 (dd, 1H, 4''-H, J4’’,5’’=8,45 Hz, J4’’,6’’=1,1 Hz), 7,65 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 46 J8,6=1,1 Hz), 7,86 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 17,07 (широк синглет, 1H, 4- OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 19,8 (C2’), 44,9 (C1’), 91,5 (C3), 108,4 (C2’’), 113,3 (C4’’), 117,3 (C8), 117,6 (C10), 118,3 (C6’’), 123,4 (C5), 124,3 (C6), 130,1 (C5’’), 131,5 (C7), 146,7 (C3’’), 148,7 (C1’’), 152,5 (C9 C2), 163,4 (C4). MS: m/z (%)=326 (M + , 1), 325 (11), 311 (9), 307 (19), 204 (100), 189 (38), 162 (41), 121 (34), 120 (49), 92 (15). Бруто формула једињења: C17H14N2O5 (Mw 326,30); Израчунато %: C, 62,57; H, 4,32; N, 8,59; Нађено %: C, 62,62; H, 3,99; N, 8,60; Т.т. 215-217 ºC; Принос 76 %. 3-(1-(Бензиламино)етил)-4-хидрокси-2H-хромен-2-он (67c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3445, 3190, 3069, 2978, 2966, 1679, 1664, 1621, 1603, 1567, 1496. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,29 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,7 Hz), 3,45 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,7 Hz), 3,67-3,81 (ABq, 2H, N-CH2-фенил, J=12 Hz), 3,96 (шири синглет, 1H, NH), 7,22 (m, 2H, 3'',5''-H), 7,24 (m, 1H, 4''-H), 7,26 (dd, 2H, 2'',6''-H, J2’’,3’’, 6’’,5’’= 7,75 Hz, J=1,12 Hz), 7,28 (m, 1H, 7-H), 7,53 (m, 1H, 6-H), 7,64 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 7,85 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 16,55 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,2 (C2’), 42,4 (C1’), 52,2 (C-N-CH2), 91,8 (C3), 117,3 (C10), 117,5 (C8), 123,8 (C5), 124,2 (C6), 126,6 (C4’’), 128,1 (C2’’, C6’’), 128,4 (C3’’, C5’’), 131,4 (C7), 140,1 (C1’’), 152,5 (C9 C2), 163,7 (C4). MS: m/z (%)=295 (M + , 16), 294 (8), 280 (22), 256 (7), 204 (100), 190 (76), 175 (67), 162 (11), 147 (26), 121 (90), 120 (75), 92 (29). Бруто формула једињења: C18H17NO3 (Mw 295,33); Израчунато %: C, 73,20; H, 5,80; N, 4,74; Нађено %: C, 73,21; H, 5,76; N, 4,73; Т.т. 171-173 ºC; Принос 91 %. 5-(1-(4-Хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)етиламино)пентанска киселина (68c) IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3611-2590, 3433, 3189, 3067, 2993, 2987, 2974, 1710, 1672, 1615, 1600, 1497. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3); δ (ppm), J (Hz): 1,25 (d, 3H, C1’-CH3, J2’,1’=6,65 Hz), 1,82 (m, 4H, 2'',3''-H), 2,46 (t, 2H, 4''-H, J4’’,3’’=7,08 Hz), 3,44 (q, 1H, C2’-CH, J1’,2’=6,65 Hz), 3,60 (t, 2H, 1''-H, J1’’,2’’=7,05 Hz), 4,02 (шири синглет, 1H, NH), 7,27 (m, 1H, 7-H), 7,54 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 47 (m, 1H, 6-H), 7,56 (dd, 1H, 5-H, J5,6=7,8 Hz, J5,7=1,7 Hz), 7,64 (dd, 1H, 8-H, J8,7=8,3 Hz, J8,6=1,1 Hz), 11,8 (широк синглет, 1H, OH из COOH), 17,19 (широк синглет, 1H, 4-OH, брза измена са D2O). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3 (ppm): 20,1 (C2’), 21,9 (C3’’), 29,9 (C2’’), 34,7 (C4’’), 42,3 (C1’), 54,5 (C1’’), 91,8 (C3), 117,1 (C8), 117,4 (C10), 124,0 (C6), 123,8 (C5), 131,4 (C7), 152,3 (C9 C2), 163,9 (C4), 178,1 (C5’’). MS: m/z (%)=303 (M + ). Бруто формула једињења: C16H17NO5 (Mw 305,33); Израчунато %: C, 62,94; H, 6,27; N, 4,59; Нађено %: C, 63,01; H, 6,26; N, 4,61; Т.т. 231-233 ºC; Принос 68 %. Инструментација: Тачке топљења су урађене на инструменту Kofler-hot stage. Елемантарна анализа је урађена на инструменту Carlo Erba 1106. Инфрацрвени (IR) спектри су снимљени на инструментима Perkin-Elmer Grating спектроскопима, модели 137 и 337. 1H NMR (200 MHz) и 13C NMR (50 MHz) спектри су снимљени на Varian Gemini 200 спектроскопу уз коришћење растварача DMSO-d6 и CDCl3. Гасно хроматографска/масено спектрометријска анализа (GC/MS) је урађена на Agilent 6890N/5975B гасном хроматографу/масеном спектрометру. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 48 2.3. Поступци за одређивање антиоксидативне активности 2.3.1. Одређивање укупног антиоксидативног капацитета фосфомолибденском методом 67 Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Нормални суд од 50 mL Нормални судови од 25 mL Пипете градуисане на 1 mL Микропипета са полистиренским наставцма Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете Термометар UV/VIS спектрофотометар подешен на 695 nm Сет полистиренских кивета оптичке дужине 1 cm Штоперица Полазни раствори аскорбинске киселине и тестираних имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c-68c) концетрације 500 g/mL се припремају растварањем 25 mg супстрата у 50 mL етанола. У пет епрувета се одмерава по 1 mL етанола, а потом у прву епрувету дода 1 mL полазног раствора тестираног супстрата, односно аскорбинске киселине, претходно наведене концетрације. Потом се употребом пипете узима 1 mL раствора из прве епрувете и преноси у другу. Надаље, сукцесивним разблаживањем до последње епрувете, односно двоструким разблаживањем се добија серија раствора тестираних једињења, односно аскорбинске киселине, концентрација 250, 125, 62,5, 31,25 и 15,63 g/mL. Раствори тестираних кумаринских деривата (100 L), односно аскорбинске киселине, различитих концентрација, одмере се у епрувете, и комбинују са 1 mL раствора реагенса који садржи 0,6 М сумпорну киселину, 28 mМ натријум фосфата и 4 mМ амонијум молибдата. Потом се раствори инкубирају на температури од 95 ºC у Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 49 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 50 100 150 200 250 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska ------------------------------------------ A 3,84 4,73 B 370,56 13,92 ------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------ 0,99 7,14 5 1,16E-4 ------------------------------------------ g /m L A s c A току 90 минута. Исти поступак је коришћен за бланко раствор, који уместо 100 L раствора тестираног једињења садржи 100 L етанола. По извршеној инкубацији и хлађењу раствора, се мери апсорбанца на 695 nm. Резултати укупног антиоксидативног капацитета се изражавају као број еквивалената аскорбинске киселине. Користећи статистички софтвер OriginPro 6.1 графички је представљена функицонална зависност концетрације аскорбинске киселине у односу на апсорбанцу инкубираних раствора. Применом линеарне регресионе анализе дата је једначина која дефинише праву функционалне зависности концетрације аскорбинске киселине у односу на апсорбанцу инкубираних раствора. Yi=A+BXi Y-концентрација раствора аскорбинске киселине; А- тачка пресека праве на Y оси; B- нагиб праве; X-апсорбанце инкубираних раствора аскорбинске киселине Уносом измерених вредности апсорбанци инкубираних раствора тестираних супстрата у једначину линеарне регресионе анализе, израчунава се укупни антиоксидантни капацитет као број грам еквивалената аскорбинске киселине. Слика 42. Графички приказ функционалне зависности различитих концентрација раствора аскорбинске киселине у односу на апсорбанце раствора са параметрима једначине линеарне регресионе анализе C ( g/mL) Апсорбанца Asc 250,00 0,6538 125,00 0,3533 62,50 0,1413 31,25 0,0712 15,60 0,0356 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 50 Табела 5. Апсорбанце раствора имино и амино деривата 4-хидроксикумарина C ( g/mL) Апсорбанца 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b 250 0,0221 0,0212 0,0215 0,0212 0,0236 0,0229 0,0223 0,0225 125 0,0129 0,0146 0,0152 0,0149 0,0135 0,0134 0,0144 0,0145 62,5 0,0039 0,0062 0,0058 0,0036 0,0025 0,0023 0,0056 0,0064 31,25 -0,0018 -0,0019 -0,0011 -0,0025 -0,0018 -0,0016 0,0007 -0,0003 15,6 -0,0042 -0,0025 -0,0045 -0,0052 -0,0031 -0,0057 -0,0051 -0,0019 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 250 0,1124 0,1164 0,1167 0,1179 0,1369 0,1135 0,1223 0,1228 125 0,0444 0,0521 0,046 0,0453 0,0632 0,0551 0,0532 0,0404 62,5 0,0111 0,0241 0,0197 0,0114 0,0216 0,0201 0,0209 0,0192 31,25 0,0011 0,0025 0,0019 -0,0009 0,0102 0,0138 0,0038 0,0021 15,6 -0,0089 -0,0056 -0,0078 -0,0081 0,0022 0,0042 -0,0009 -0,0004 Из једначине: Yi=3,84409+370,56208Xi за Xi као вредности апсорбанци инкубираних раствора различитих концентрација имино и амино деривата 4-хидроксикумарина добијају се вредности Yi као вредности грам еквивалената аскорбинске киселине. Табела 6. Укупни антиоксидативни капацитет имино и амино деривата 4-хидроксикумарина C ( g/mL) Укупни антиоксидативни капацитет* 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b 250 12,03 11,7 11,83 11,71 12,58 12,33 12,11 12,18 125 8,64 9,25 9,47 9,37 8,84 8,82 9,18 9,22 62,5 5,29 6,14 5,99 5,18 4,77 4,68 5,92 6,22 31,25 3,18 3,96 3,44 2,92 3,18 3,25 4,1 3,73 15,6 2,29 2,92 2,18 1,92 2,7 1,73 1,95 3,14 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 250 45,5 46,98 47,09 47,53 54,57 45,9 49,16 49,35 125 20,3 23,15 20,89 20,63 27,26 24,26 23,56 18,81 62,5 7,96 12,77 11,14 8,07 11,83 11,29 11,59 10,94 31,25 4,25 4,77 4,55 3,51 7,63 8,96 5,25 4,62 *вредности су изражене као грам еквиваленати аскорбинске киселине- g/mL аскорбинске киселине Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 51 2.3.2. Одређивање антиоксидативне активности DPPH методом Поступак којим је извршено испитивање могућности хватања стабилног DPPH радикала је модификована метода Takao-а, Watanabe-а, Yagi-а и Sakata 68. Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Нормални суд од 100 mL Нормални суд од 50 mL Нормални судови од 25 mL Пипете градуисане на 1 mL Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете UV/VIS спектрофотометар подешен на 517 nm Сет полистиренских кивета оптичке дужине 1 cm Штоперица Полазни раствори имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c- 68c), односно стандардних једињења бутил хидроксил толуена и аскорбинске киселине, концентрације 500 g/mL се припремају растварањем 25 mg супстрата у 50 mL метанола. Пре извођења експеримента (користи се свеж раствор) припреми се раствор 1,1- дифенил-2-пикрил-хидразила (DPPH) концетрације 80 g/mL, растврањем 8 mg реагенса у 100 mL метанола. Потом се нормални суд обложи са алуминијумском фолијом и остави у фрижидер до тренутка коришћења раствора. У десет епрувета се одмерава по 2 mL метанола, а потом у прву епрувету дода 2 mL полазног раствора тестираног супстрата, односно стандардног једињења претходно наведене концетрације. Потом се употребом пипете узима 2 mL раствора из прве епрувете и преноси у другу. Надаље, сукцесивним разблаживањем до последње епрувете, односно двоструким разблаживањем се добија серија раствора тестираних, односно стандардних једињења концентрација 250, 125, 62,5, 31,25, 15,63, 7,8, 3,9, 1,95, 0,98 и 0,49 g/mL. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 52 Затим, у сваки од разблажених раствора запремина 2 mL додати по 2 mL раствра DPPH, и након 30 минута и 60 минута мерити умањење апсорбанце на таласној дужини од 517 nm у односу на бланко растварач метанол. Вредности апсорбанци серије раствора тестираних супстрата и стандардних једињења након 30 минута и 60 минута унети табеларно у Microsoft Office Еxcel 2007 програм, и помоћу њега а на основу доње формулације израчунати проценат хватања DPPH радикала након 30 минута и 60 минута. % = (Аконтрола-Аузорак) / Аконтрола x 100 Вредности IC50 у g/mL, односно mol/mL се израчунавају применом линеарне регресионе анализе уз коришћење статистичког софтвера OriginPro 6.1. Као независна варијабла се узимају вредности процената хватања стабилног DPPH радикала (Xi вредности), а као зависна варијабла су концетрације супстрата за дати проценат инхибиције (Yi вредности). Из једначине: Yi=A+BXi а на основу статистички израчунатих вредности A (тачка пресека праве на Y оси) и B (нагиб праве) за проценат инхибиције од 50 % (вредност X) се израчунавају вредности IC50 (вредност Y; као концетрације које условљавају умањење инхибиције за 50 %). Да би линеарна регресиона анализа дала што прецизније резултате вредност R као корелациони коефицијент линеарне регресије треба да буде већа, односно приближнија вредности 1, и у том смислу тачке које значајно одступају од праве треба елиминисати. Због репродуктивности резултата експеримент се изводи три пута, а добијене вредности представљају средњу вредност три мерења. Због могуће реакције примеса из метанола са DPPH радикалом неопходно је користити свеже предестиловани метанол, а метанолски раствор DPPH одмах након спремања треба употребити за експеримент. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 53 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska ------------------------------------------------ A -3,47 1,97 B 0,24 0,048 ------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------ 0,93 2,39 6 0,00745 ------------------------------------------------ g /m L % inhibicije Слика 43. Графичка зависност % инхибиције DPPH радикала након 30 минута у односу на концентрацију супстрата 65c са параметрима линеарне регресионе анализе (прве четири тачке су изузете) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska ------------------------------------------------- A -3,67 1,70 B 0,23 0,04 ------------------------------------------------- R SD N P ------------------------------------------------- 0,95 2,06 6 0,004 ------------------------------------------------- g /m L % inhibicije Слика 44. Графичка зависност % инхибиције DPPH радикала након 60 минута у односу на концентрацију супстрата 65c са параметрима линеарне регресионе анализе (прве четири тачке су изузете) Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 54 Табела 7. Aпсорбанце и проценат инхибиције DPPH радикала серије разблажења имино и амино деривата 4-хидроксикумарина по истеку 30 минута Метанол 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b C ( g/mL) Aконтрола Aузорак % Aузорак % Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб инхб инхб 250 1,615 0,5941 63,21 0,61 62,23 0,5553 65,62 0,603 62,66 0,6889 57,34 0,6764 58,12 0,6112 62,15 0,5869 63,66 125 1,615 0,7314 54,71 0,8216 49,13 0,8326 48,45 0,7111 55,97 0,7566 53,15 0,845 47,68 0,7287 54,88 0,7216 55,32 62,5 1,615 0,9351 42,1 1,107 31,46 1,068 33,87 0,887 45,08 0,836 48,24 1,058 34,49 0,831 48,54 0,899 44,33 31,25 1,615 1,044 35,36 1,305 19,2 1,227 24,02 1,024 36,59 1,003 37,89 1,189 26,38 1,1157 30,92 1,009 37,52 15,6 1,615 1,145 29,1 1,375 14,86 1,26 21,98 1,121 30,59 1,13 30,03 1,26 21,98 1,212 24,95 1,117 30,84 7,8 1,615 1,201 25,63 1,401 13,25 1,29 20,12 1,215 24,77 1,227 24,02 1,363 15,6 1,283 20,56 1,2173 24,63 3,9 1,615 1,295 19,81 1,443 10,65 1,381 14,49 1,311 18,82 1,341 16,97 1,401 13,25 1,331 17,59 1,311 18,82 1,95 1,615 1,327 17,83 1,45 10,22 1,401 13,25 1,398 13,44 1,375 14,86 1,421 12,01 1,375 14,86 1,363 15,6 0,98 1,615 1,357 15,98 1,464 9,35 1,445 10,53 1,411 12,63 1,47 8,98 1,435 11,15 1,488 7,86 1,401 13,25 0,49 1,615 1,551 3,96 1,465 9,29 1,463 9,41 1,515 6,19 1,56 3,41 1,5112 6,43 1,556 3,65 1,562 3,28 Метанол 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c C ( g/mL) Aконтрола Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб 250 0,2044 87,34 0,1077 93,33 0,2143 86,73 0,178 88,98 0,1276 92,1 0,1308 91,9 0,2393 85,18 0,2112 86,92 125 1,615 0,2293 85,8 0,2191 86,43 0,3095 80,84 0,2828 82,49 0,1931 88,04 0,1424 91,18 0,2571 84,08 0,2225 86,22 62,5 1,615 0,3312 79,49 0,3884 75,95 0,3895 75,88 0,2957 81,69 0,2428 84,97 0,1623 89,95 0,3415 78,85 0,3642 77,45 31,25 1,615 0,4576 71,67 0,6359 60,63 0,5322 67,05 0,4014 75,15 0,3462 78,56 0,3329 79,39 0,4925 69,5 0,51 68,42 15,6 1,615 0,6429 60,19 0,8321 48,48 0,8899 44,9 0,6484 59,85 0,5304 67,16 0,5972 63,02 0,8077 49,99 0,8321 48,48 7,8 1,615 0,841 47,93 0,9942 38,44 1,107 31,46 0,8679 46,26 0,7287 54,88 0,8679 46,26 1,131 29,97 1,121 30,59 3,9 1,615 1,021 36,78 1,333 17,46 1,197 25,88 1,2145 24,8 0,9437 41,57 1,149 28,85 1,236 23,47 1,32 18,27 1,95 1,615 1,135 29,72 1,359 15,85 1,223 24,27 1,3139 18,64 1,205 25,39 1,159 28,24 1,301 19,44 1,35 16,41 0,98 1,615 1,466 9,23 1,47 8,98 1,354 16,16 1,341 16,97 1,322 18,14 1,264 21,73 1,411 12,63 1,451 10,15 0,49 1,615 1,515 6,19 1,512 6,38 1,515 6,19 1,523 5,7 1,473 8,79 1,473 8,79 1,55 4,02 1,503 6,93 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 55 Табела 8. Aпсорбанце и проценат инхибиције DPPH радикала серије разблажења имино и амино деривата 4-хидроксикумарина по истеку 60 минута 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b C ( g/mL) Aузорак % Aузорак % Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб инхб инхб 250 0,49 69,66 0,5385 66,66 0,4958 69,3 0,6564 59,36 0,6072 62,4 0,6079 62,36 0,4546 71,85 0,4853 69,95 125 0,6323 60,85 0,731 54,74 0,63 60,99 0,6979 56,79 0,7419 54,06 0,815 49,54 0,7159 55,67 0,7144 55,76 62,5 0,9501 41,17 0,845 47,68 0,794 50,84 0,847 47,55 0,7754 51,99 1,001 38,02 0,8291 48,66 0,891 44,83 31,25 1,018 36,97 1,0113 37,38 0,9891 38,76 0,957 40,74 0,956 40,8 1,11 31,27 1,1124 31,12 0,987 38,89 15,6 1,113 31,08 1,1397 29,43 1,1236 30,43 1,0192 36,89 1,1281 30,15 1,15 28,79 1,176 27,18 1,1141 31,02 7,8 1,205 25,39 1,249 22,66 1,255 22,29 1,114 31,02 1,223 24,27 1,325 17,96 1,275 21,05 1,198 25,82 3,9 1,269 21,42 1,325 17,96 1,343 16,84 1,232 23,72 1,289 20,19 1,394 13,68 1,325 17,96 1,2813 20,66 1,95 1,305 19,2 1,387 14,12 1,395 13,62 1,325 17,96 1,36 15,79 1,398 13,44 1,3651 15,47 1,301 19,44 0,98 1,416 12,32 1,45 10,22 1,455 9,91 1,405 13 1,4045 13,03 1,423 11,89 1,389 13,99 1,35 16,41 0,49 1,5023 6,98 1,557 3,59 1,551 3,96 1,491 7,68 1,4879 7,87 1,47 8,98 1,451 10,15 1,49 7,74 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c C ( g/mL) Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб Aузорак % инхб 250 0,1435 91,11 0,0862 94,66 0,1472 90,89 0,1398 91,34 0,1251 92,25 0,1233 92,37 0,2082 87,11 0,1423 91,19 125 0,1457 90,98 0,1662 89,71 0,2293 85,8 0,213 86,81 0,1439 91,09 0,1344 91,68 0,2091 87,05 0,21 87 62,5 0,2591 83,96 0,3854 76,14 0,3015 81,33 0,2147 86,71 0,1997 87,63 0,14 91,33 0,2698 83,29 0,3254 79,85 31,25 0,3594 77,75 0,5765 64,3 0,4128 74,44 0,3211 80,12 0,3026 81,26 0,2803 82,64 0,4177 74,14 0,45 72,14 15,6 0,6196 61,63 0,698 56,78 0,806 50,09 0,5716 64,61 0,4599 71,52 0,5179 67,93 0,7187 55,5 0,7847 51,41 7,8 0,8224 49,08 0,945 41,49 1,062 34,24 0,8469 47,56 0,7401 54,17 0,7927 50,92 1,1 31,89 1,11 31,27 3,9 0,9942 38,44 1,316 18,51 1,146 29,04 1,117 30,84 0,9431 41,6 1,131 29,97 1,232 23,72 1,24 23,22 1,95 1,127 30,22 1,34 17,03 1,189 26,38 1,229 23,9 1,165 27,86 1,143 29,23 1,279 20,8 1,29 20,12 0,98 1,455 9,91 1,453 10,03 1,267 21,55 1,345 16,72 1,321 18,2 1,263 21,8 1,373 14,98 1,385 14,24 0,49 1,49 7,74 1,468 9,1 1,438 10,96 1,457 9,78 1,457 9,78 1,466 9,23 1,446 10,46 1,443 10,65 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 56 Табела 9. DPPH антирадикалска активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина Време мерења DPPH антирадикалска активност IC50 ( g/mL) Имино деривати Стандарди 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc 30 мин 124,81 138,08 152,04 120,67 120,49 161,72 124,64 119,48 5,60 7,48 60 мин 78,61 78,19 49,89 69,74 49,34 143,17 118,16 114,40 2,82 4,79 Амино деривати 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 30 мин 9,61 27,73 38,93 21,35 8,46 13,34 18,49 19,34 60 мин 9,31 17,36 16,54 13,28 8,15 12,14 16,81 17,83 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 57 2.3.3. Одређивање редуктивне способности Редуктивна способност структурно модификованих супстрата 4- хидроксикумарина се одређује по методи Oyaizu-а 69. Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Нормални суд од 100 mL Нормални суд од 50 mL Нормални судови од 25 mL Пипете градуисане на 1 mL Микропипета са полистиренским наставцима Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете Термометар UV/VIS спектрофотометар подешен на 700 nm Сет полистиренских кивета оптичке дужине 1 cm Штоперица Полазни раствори имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c- 68c), односно стандардних једињења бутил хидроксил толуена и аскорбинске киселине, концентрације 500 g/mL се припремају растварањем 25 mg супстрата у 50 mL метанола. У десет епрувета се одмерава по 1 mL метанола, а потом се у прву епрувету дода 1 mL полазног раствора тестираног супстрата, односно стандардног једињења, претходно наведене концентрације. Пипетом се узима 1 mL раствора из прве епрувете и преноси у другу. Надаље, сукцесивним разблаживањем до последње епрувете, односно двоструким разблаживањем, добија се серија раствора тестираних, односно стандардних једињења концентрација 250, 125, 62,5, 31,25, 15,63, 7,8, 3,9, 1,95, 0,98 и 0,49 g/mL. У епруветама запремине 10 mL помешати 300 L сваког од раствора испитиваних супстрата са 300 L фосфатног пуфера концетрације 0,2 М и pH=6,6 и Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 58 300 L 1 % раствора калијум ферицијанида. Потом се смеша инкубира у току 20 минута, на температури од 50 °C. По хлађењу, у сваку епрувету додати по 300 L 10 % раствора трихлорсирћетне киселине и затим извршити центрифугирање на 3000 rpm, у току 10 минута. Потом се из сваке епрувете узима 0,6 mL горњег слоја раствора и меша са 0,6 mL дестиловане воде и 120 mL 0,1 % раствора фери хлорида и мери апсорбанца раствора на 700 nm. Бланко узорак се припрема тако што се помеша 300 L дестиловане воде, 300 L фосфатног пуфера, 300 L 1 % раствора калијум фероцијанида и 300 L 10 % трихлорсирћетне киселине. Редуктивна способност се израчунава по формули: RP = Абланко - Аузорак Редуктивна способност изражена у % се рачуна по следећој формули: RP % = (Абланко - Аузорак) x 100 Вредности RP50 у g/mL, односно mol/mL се израчунавају применом линеарне регресионе анализе уз коришћење статистичког софтвера OriginPro 6.1. Као независна варијабла се узимају вредности редуктивне способности (Xi вредности), а као зависна варијабла су концетрације супстрата за дату вредност RP (Yi вредности). Из једначине: Yi=A+BXi а на основу статистички израчунатих вредности A (тачка пресека праве на Y оси) и B (нагиб праве) за проценат редуктивне активности од 50 % (вредност X) се израчунавају вредности RP50 (вредност Y; као концетрације које условљавају умањење редуктивне способности за 50 %). Да би линеарна регресиона анализа дала што прецизније резултате вредност R као корелациони коефицијент линеарне регресије треба да буде што је могуће већа, односно приближнија вредности 1, и у том смислу тачке које значајно одступају од праве, треба елиминисати. Да би добијени резултати били репродуктивни експеримент се изводи три пута, а резултати се представљају као средња вредност три мерења. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 59 Табела 10. Редуктивна способност RP серије разблажења имино и амино деривата 4-хидроксикумарина C ( g/mL) Редуктивна способност RP 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc Абланко - Аузорак 250 0,713 0,7643 1,143 0,7225 0,711 0,7999 1,15 1,014 3,22 3,22 125 0,6907 0,5623 1,107 0,4419 0,5523 0,7011 1,012 0,9989 3,22 3,22 62,5 0,2958 0,2816 0,8437 0,2777 0,2771 0,2871 0,4732 0,5641 2,618 3,22 31,25 0,2806 0,2089 0,3067 0,0957 0,1999 0,207 0,2274 0,2374 1,203 3,22 15,6 0,1532 0,1026 0,0739 0,0986 0,1011 0,1231 0,1154 0,1264 0,8155 2,375 7,8 0,052 0,0801 0,0324 0,0932 0,074 0,043 0,0896 0,0901 0,4524 1,414 3,9 0,0346 0,0229 0,0249 0,0892 0,021 0,031 0,0794 0,0786 0,2734 0,7193 1,95 0,0336 0,0213 0,0235 0,0605 0,019 0,024 0,0548 0,0603 0,1536 0,3764 0,98 0,0268 0,0124 0,006 0,0405 0,0104 0,0171 0,0458 0,0422 0,0779 0,2177 0,49 0,0222 0,0026 0,0051 0,0301 0,0031 0,0076 0,0429 0,0329 0,0391 0,1231 C ( g/mL) 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c Абланко - Аузорак 250 0,713 0,7643 1,143 0,7225 0,711 0,7999 1,15 1,014 125 0,6907 0,5623 1,107 0,4419 0,5523 0,7011 1,012 0,9989 62,5 0,2958 0,2816 0,8437 0,2777 0,2771 0,2871 0,4732 0,5641 31,25 0,2806 0,2089 0,3067 0,0957 0,1999 0,207 0,2274 0,2374 15,6 0,1532 0,1026 0,0739 0,0986 0,1011 0,1231 0,1154 0,1264 7,8 0,052 0,0801 0,0324 0,0932 0,074 0,043 0,0896 0,0901 3,9 0,0346 0,0229 0,0249 0,0892 0,021 0,031 0,0794 0,0786 1,95 0,0336 0,0213 0,0235 0,0605 0,019 0,024 0,0548 0,0603 0,98 0,0268 0,0124 0,006 0,0405 0,0104 0,0171 0,0458 0,0422 0,49 0,0222 0,0026 0,0051 0,0301 0,0031 0,0076 0,0429 0,0329 Табела 11. Редуктивна активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина представљена као RP50 вредност Редуктивна способност RP50 ( g/mL) Имино деривати Стандарди 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc 79,69 102,76 82,06 108,88 99,65 96,00 95,15 84,50 98,51 25,06 Амино деривати 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 122,56 107,84 126,44 86,64 110,34 101,30 75,50 85,33 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 60 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0 50 100 150 200 250 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska -------------------------------------------- A -14,40 18,29 B 61,66 12,16 -------------------------------------------- R SD N P -------------------------------------------- 0,87 41,62 10 9,65E-4 -------------------------------------------- g /m L RP vrednost Слика 45. Графички приказ зависности редуктивне способности у односу на концентрацију супстрата 67c са параметрима линеарне регресионе анализе 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 50 100 150 200 250 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska -------------------------------------------------- A -28,01 32,22 B 302,13 72,73 -------------------------------------------------- R SD N P -------------------------------------------------- 0,90 44,95 6 0,01421 -------------------------------------------------- g /m L RP vrednost Слика 46. Графички приказ зависности редуктивне способности у односу на концентрацију супстрата 61b са параметрима линеарне регресионе анализе (без задње четири тачке) Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 61 2.3.4. Одређивање инхибиције липидне пероксидације амонијум тиоцијанатном методом 70 Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Нормални суд од 50 mL Нормални судови од 25 mL Пипете градуисане на 1 mL Микропипета са полистиренским наставцима Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете Сушница адаптирана за инкубацију у мраку на температури од 37 °C UV/VIS спектрофотометар подешен на 500 nm Сет полистиренских кивета оптичке дужине 1 cm Штоперица Полазни раствори имино и амино деривата 4-хидрокси кумарина (61b-68b, 61c- 68c), односно стандардних једињења бутил хидроксил толуена, аскорбинске киселине и -токоферола, концентрације 2000 се припремају растварањем одговарајуће масе супстрата у 25 mL етанола. Емулзија линолеинске киселине се припрема мешањем 0,2804 g линолеинске киселине, 0,2804 g Tween 20 и 50 mL фосфатног пуфера концентрације 0,2 М и pH=7. Хомогенизација се изводи интензивним мућкањем смеше. Нормални суд са припремљеном емулзијом линолеинске киселине обложи се алуминијумском фолијом и до коришћења остави у фрижидеру на 4 °C. У четири епрувете одмерава се по 1 mL етанола, а потом у прву епрувету дода 1 mL полазног раствора тестираног супстрата, односно стандардног једињења претходно наведене концетрације. Пипетом се узима 1 mL раствора из прве епрувете и преноси у другу. Надаље, сукцесивним разблаживањем до последње епрувете, односно двоструким разблаживањем, добија се серија раствора тестираних, односно стандардних једињења концентрација 1000, 500, 250 и 125 g/mL. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 62 Одмеравају запремине од 0,5 mL етанолског раствора различитих концентрација тестираних супстрата, односно аскорбинске киселине и -токоферола као стандардних једињења, и мешају са емулзијом линолеинске киселине (2,5 mL, 0,02 М, pH=7) и фосфатним пуфером (2 mL, 0,2 М, pH=7), а затим врши инкубирање на температури од 37 °C у мраку да би се убрзао процес пероксидације. Током процеса инкубације у различитим временским периодима (24, 48, 72 и 96 сати) се узимају аликвоти од 100 L и степен оксидације одређује додавањем 4,7 mL 75 % раствора етанола, 100 L 30 % раствора амонијум тиоцијаната и 100 L 0,02 М раствора фери хлорида у 3,5 % раствору хлороводоничне киселине. Након 3 минута, мерењем апсорбанце раствора на 500 nm одређује се степен инхибиције процеса пероксидације линолеинске киселине. Апсорбанца контролног узорка се одређује по истом поступку, осим што раствори не садрже тестирана једињења, односно стандардне супстанце. По формули: % = (Аконтрола-Аузорак)/Аконтрола x 100 се одређује проценат инхибиције липидне пероксидације и изражава у односу на стандардне супстанце, у функцији времена инкубирања. Због репродуктивности, експеримент се понавља три пута, а резултати приказују као средња вредност три мерења. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 63 Табела 12. Апсорбанце контролног узорка и серије разблажења имино и амино деривата у функцији концетрације и времена C Aконтрола Аузорак ( M) 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc Време инкубирања 24 сата 1000 1,709 0,7859 0,677 0,9361 1,035 1,01 1,12 0,9874 1,32 0,5878 1,3227 500 1,709 1,156 0,8374 1,04 1,187 1,12 1,24 1,29 1,56 0,6648 1,4047 250 1,709 1,55 1,171 1,45 1,54 1,36 1,37 1,35 1,65 0,6887 1,5108 125 1,709 1,7 1,347 1,65 1,56 1,45 1,64 1,701 1,702 0,7502 1,5842 Време инкубирања 48 сати 1000 2,176 0,7009 0,5079 0,507 0,5376 0,4687 0,5562 0,8235 0,8562 0,3548 1,261 500 2,176 1,188 0,6348 0,6865 0,8149 0,6215 0,7451 1,114 1,2544 0,4246 1,425 250 2,176 1,786 1,075 1,447 1,649 1,074 1,3541 1,485 1,5014 0,4278 1,738 125 2,176 2,104 1,331 1,837 2,041 1,32 1,9854 1,712 2,065 0,4517 1,999 Време инкубирања 72 сата 1000 2,626 0,79 0,3239 0,4722 0,6305 0,5121 0,6455 0,98 1,012 0,2474 1,846 500 2,626 1,389 0,6305 0,6789 0,9802 0,7213 0,7321 1,298 1,354 0,2586 1,999 250 2,626 1,684 1,131 1,48 1,8031 1,24 1,384 1,65 1,699 0,2649 2,022 125 2,626 1,736 1,255 1,912 2,012 1,54 2,012 1,864 2,298 0,2735 2,381 Време инкубирања 96 сати 1000 2,735 1,337 0,4968 0,834 0,9897 0,7812 0,99 1,21 1,54 0,4349 2,0731 500 2,735 1,559 0,95 1,599 1,278 0,98 1,56 1,957 1,689 0,4513 2,1907 250 2,735 1,668 1,957 1,798 2,011 1,59 1,98 2,12 2,045 0,5142 2,2236 125 2,735 2,309 1,981 2,258 2,434 2,23 2,458 2,513 2,601 0,5470 2,4861 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c -Toc Време инкубирања 24 сата 1000 1,709 1,35 1,31 1,25 1,03 1,12 1,16 1,11 1,34 1,0391 500 1,709 1,48 1,39 1,27 1,21 1,21 1,35 1,25 1,39 1,116 250 1,709 1,602 1,49 1,48 1,56 1,59 1,47 1,36 1,65 1,1416 125 1,709 1,65 1,56 1,66 1,63 1,65 1,66 1,69 1,6642 1,2322 Време инкубирања 48 сати 1000 2,176 1,1625 1,1892 1,1951 1,172 0,9892 1,16 1,12 1,15 0,8442 500 2,176 1,6541 1,875 1,9958 1,712 1,5625 1,64 1,32 1,41 0,9073 250 2,176 1,8741 1,962 2,012 1,9561 1,7196 1,85 1,939 2,01 0,9879 125 2,176 2,0951 2,1111 2,1561 2,157 2,13 2,14 2,168 2,1591 1,0205 Време инкубирања 72 сата 1000 2,626 1,254 1,312 1,21 1,213 0,9892 1,25 1,21 1,32 0,8088 500 2,626 1,787 1,687 1,99 1,84 1,4561 1,87 1,41 1,59 0,8587 250 2,626 1,98 1,875 2,12 1,99 1,89 1,96 1,99 2,11 0,9558 125 2,626 2,21 2,121 2,25 2,32 2,2314 2,33 2,25 2,23 1,0451 Време инкубирања 96 сати 1000 2,735 1,49 1,598 1,56 1,56 1,34 1,56 1,49 1,98 1,1678 500 2,735 2,011 1,989 2,21 2,12 1,89 2,21 1,98 2,012 1,2444 250 2,735 2,32 2,12 2,45 2,45 2,32 2,356 2,34 2,36 1,3292 125 2,735 2,689 2,465 2,64 2,67 2,59 2,67 2,59 2,59 1,3729 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 64 Табела 13. Проценти инхибиције процеса липидне пероксидације у емулзионом систему линолеинске киселине раствора имино деривата 4-хидроксикумарина C ( M) % = (Аконтрола-Аузорак)/Аконтрола x 100 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc -Toc Време инкубирања 24 сата 1000 54,0 60,4 45,2 39,4 40,9 34,5 42,2 22,8 65,6 22,6 39,2 500 32,4 51,0 39,2 30,5 34,5 27,4 24,5 8,7 61,1 17,8 34,7 250 9,3 31,5 15,2 9,9 20,4 19,8 21,0 3,5 59,7 11,6 33,2 125 0,5 21,2 3,5 8,7 15,2 4,0 0,5 0,4 56,1 7,3 27,9 Време инкубирања 48 сати 1000 67,8 76,7 76,7 75,3 78,5 74,4 62,2 60,7 83,7 42,1 61,2 500 45,4 70,8 68,5 62,6 71,4 65,8 48,8 42,4 80,5 34,5 58,3 250 17,9 50,6 33,5 24,2 50,6 37,8 31,8 31,0 80,3 20,1 54,6 125 3,3 38,8 15,6 6,2 39,3 8,8 21,3 5,1 79,2 8,1 53,1 Време инкубирања 72 сата 1000 74,5 94,4 88,6 78,5 81,3 76,4 63,2 62,6 90,6 29,7 69,2 500 50,5 77,4 75,4 66,5 73,4 72,8 52,9 51,8 90,2 23,9 67,3 250 38,5 60,4 46,2 35,9 55,8 49,2 39,3 39,0 89,9 23,0 63,6 125 36,6 53,9 29,9 25,4 43,6 31,8 30,8 15,8 89,6 9,3 60,2 Време инкубирања 96 сати 1000 51,1 81,8 69,5 63,8 71,4 63,8 55,8 43,7 84,1 24,2 57,3 500 43,0 65,3 41,5 53,3 64,2 43,0 28,5 38,2 83,5 19,9 54,5 250 39,0 28,5 34,3 26,5 41,9 27,6 22,5 25,2 81,2 18,7 51,4 125 15,6 27,6 17,4 11,0 18,5 10,1 8,1 4,9 80,0 9,1 49,8 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 65 Табела 14. Проценти инхибиције процеса липидне пероксидације у емулзионом систему линолеинске киселине раствора амино деривата 4-хидроксикумарина C ( M) % = (Аконтрола-Аузорак)/Аконтрола x 100 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c Време инкубирања 24 сата 1000 21,0 23,4 26,9 39,7 34,5 32,1 35,1 21,6 500 13,4 18,7 25,7 29,2 29,2 21,0 26,9 18,7 250 6,3 12,8 13,4 8,6 6,5 14,0 20,4 3,5 125 3,5 8,7 2,9 4,6 3,2 2,4 1,0 2,6 Време инкубирања 48 сати 1000 46,6 45,4 45,1 46,1 54,5 46,7 48,5 47,2 500 24,0 13,8 8,3 21,3 28,2 24,6 39,3 35,2 250 13,9 9,8 7,5 10,1 21,0 15,0 10,9 7,6 125 3,7 3,0 0,9 0,9 2,1 1,7 0,4 0,8 Време инкубирања 72 сата 1000 57,6 57,7 59,4 58,9 67,8 58,3 60,3 52,9 500 34,9 37,6 31,5 35,6 47,5 37,8 48,7 41,7 250 25,6 29,5 21,5 27,6 29,7 27,6 27,2 22,8 125 17,9 22,4 15,9 15,0 20,9 15,6 18,1 16,8 Време инкубирања 96 сати 1000 45,5 41,6 43,0 43,0 51,0 43,0 45,5 27,6 500 26,5 27,3 19,2 22,5 30,9 19,2 27,6 26,4 250 15,2 22,5 10,4 10,4 15,2 13,9 14,4 13,7 125 1,7 9,9 3,5 2,4 5,3 2,4 5,3 5,3 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 66 2.3.5. Одређивање способности хватања хидроксил радикала Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Нормални суд од 100 mL Нормални суд од 50 mL Нормални судови од 10 mL Пипете градуисане на 1 mL Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете Термометар UV/VIS спектрофотометар подешен на 532 nm Сет полистиренских кивета оптичке дужине 1 cm Штоперица По методи Halliwell-а, Gutteridge-а и Auroma-а је одређена способност кумаринских деривата као супстрата погодних за хватање хидроксил радикала насталих у Фентоновој реакцији 71. Полазни раствори имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c- 68c), односно стандардних једињења бутил хидроксил толуена и аскорбинске киселине, концентрације 1000 g/mL припремају се растварањем 50 mg супстрата у 50 mL метанола. У осам епрувета се одмерава по 1 mL метанола, а потом у прву епрувету дода 1 mL полазног раствора тестираног супстрата, односно стандардног једињења претходно наведене концетрације. Пипетом се узима 1 mL раствора из прве епрувете и преноси у другу. Сукцесивним разблаживањем до последње епрувете, односно двоструким разблаживањем се добија серија раствора тестираних, односно стандардних једињења концентрација 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,63, 7,8 и 3,9 g/mL. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 67 Реакција се изводи у 10 mМ фосфатном пуферу при pH=7,4, 2,8 mМ раствору дезоксирибозе, 2,8 mМ водоник пероксиду, 12,5 М раствору фери хлорида, 100 mМ раствору EDTA уз присуство тестираног једињења, односно стандардног једињења. Реакција започиње додатком аскорбинске киселине до концентрације 200 mМ. Потом се реакциона смеша инкубира у периоду од 60 минута на температури од 37 ºC. По хлађењу раствора додаје се 1 mL 1 % раствора тиобарбитурне киселине у 0,05 М натријум хидроксиду, а затим и 1 mL 2,8 % раствора трихлорсирћетне киселине. Затим се сви раствори у епруветама инкубирају у периоду од 20 минута на температури од 100 ºC. По хлађењу реакционих смеша, проценат деградације дезоксирибозе се одређује мерењем апсорбанце на 532 nm у односу на бланко раствор (садржи све претходно наведене компоненте осим тестираних једињења, односно стандардног једињења) по формули: % = (Абланко-Аузорак) / Абланко x 100 a резултати се представљају и као IC50 вредности, у односу на резултате активности стандардог једињења према хидроксил радикалима. Вредности апсорбанци серије раствора тестираних супстрата и стандардних једињења након завршеног процеса инкубирања унети табеларно у Microsoft Office Еxcel 2007 програм, и помоћу њега, а према наведеној формули, израчунава се проценат деградације дезоксирибозе. Вредности IC50 у g/mL, односно mol/mL се израчунавају применом линеарне регресионе анализе уз коришћење статистичког софтвера OriginPro 6.1. Као независна варијабла се узимају вредности процената деградације дезоксирибозе (Xi вредности), а као зависна варијабла су концетрације супстрата за дати проценат инхибиције (Yi вредности). Из једначине: Yi=A+BXi а на основу статистички израчунатих вредности A (тачка пресека праве на Y оси) и B (нагиб праве) за проценат инхибиције од 50 % (вредност X) се израчунавају вредности IC50 (вредност Y; као концетрације које условљавају умањење инхибиције Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 68 за 50 %). Да би линеарна регресиона анализа дала што прецизније резултате вредност R као корелациони коефицијент линеарне регресије треба да буде већа, односно приближнија вредности 1, и у том смислу тачке које значајно одступају од праве треба елиминисати. Због репродуктивности резултата експеримент се изводи три пута, а добијене вредности представљају средњу вредност три мерења. Табела 15. Проценти инхибиције хидроксил радикала насталих у Фентоновој реакцији у функцији концетрације имино и амино деривата 4-хидроксикумарина C ( g/mL) % = (Абланко-Аузорак) / Абланко x 100 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b 62,5 80,23 84,23 81,25 83,21 85,12 84,11 79,11 79,56 31,25 66,36 67,59 67,23 67,11 68,23 67,89 65,55 64,56 15,6 62,44 63,98 63,55 63,87 62,55 63,02 62,11 63,11 7,8 58,91 59,11 59,01 59,03 58,87 58,98 58,29 56,23 3,9 54,88 55,06 54,98 54,99 55,64 55,01 54,48 54,01 1,95 47,87 47,98 47,95 47,91 47,86 47,99 47,12 47,02 0,98 39,47 39,44 39,65 39,33 39,45 39,58 39,46 39,21 C ( g/mL) 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 62,5 87,89 84,12 81,26 82,56 89,12 87,59 86,58 84,15 31,25 71,12 70,45 72,15 73,15 75,69 75,11 73,26 71,25 15,6 67,18 67,6 67,98 67,12 69,86 68,16 68,02 66,59 7,8 62,23 60,11 61,28 61,11 62,12 63,05 63,12 65,12 3,9 55,12 54,26 54,22 55,01 55,89 55,15 53,99 57,45 1,95 48,18 48,11 48,35 48,34 48,69 48,51 48,02 49,01 0,98 41,59 41,57 40,23 40,34 40,89 40,33 41,66 38,87 Табела 16. Концетрације у g/mL имино и амино деривата 4-хидроксикумарина потребне за инхибицију 50 % хидроксил радикала насталих у Фентоновој реакцији OH aнтирадикалска активност IC50 ( g/mL) Имино деривати Стандард 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 61b Asc 4,44 3,95 4,02 4,14 3,98 3,96 5,08 5,72 4,02 Амино деривати 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 1,75 2,30 2,86 2,52 1,35 1,87 1,77 2,39 4,02 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 69 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska ---------------------------------- A -65,28 15,58 B 1,34 0,24 ---------------------------------- R SD N P ---------------------------------- 0,93 9,29 7 0,00278 ----------------------------------g /m L % inhibicije Слика 47. Графички приказ зависности OH антирадикалске активности у односу на концентрацију супстрата 61c са параметрима линеарне регресионе анализе 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 Y = A + B * X Parametar Vrednost Greska -------------------------------------- A -60,71 15,94 B 1,24 0,25 -------------------------------------- R SD N P -------------------------------------- 0,91 9,92 7 0,0039 --------------------------------------g /m L % inhibicije Слика 48. Графички приказ зависности OH антирадикалске активности у односу на концентрацију супстрата 65c са параметрима линеарне регресионе анализе Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 70 2.4. Поступци за одређивање антимикробне активности 2.4.1. Припремни поступци за одређивање антимикробне активности Стерилизација потребног лабораторијског посуђа. Стерилизација је процес при којем се убијају сви живи организми и све споре без обзира на врсту. Судови се најпре потопе у Ешку смешу (метанолски раствор натријумовог и калијумовог карбоната), исперу са водом, потом исперу са дејонизованом водом. Ако су у судовима гајени патогени микроорганизми, најпре се изврши дезинфекција са алкохолом, а потом приступа прању. Након прања, судови се осуше, исперу са мало метанола и приступи се процесу стерилизације у сушници (стерилизатору). Постоје разне физичке методе које се користе за стерилизацију (влажна топлота, пара под притиском, стерилизација UV зрацима). Овде је коришћена метода стерилизације сувом топлотом, тако што се судови ставе у сушницу у периоду од 1 h на температури од 100 ºC. Ови услови омогућавају уништење свих микроорганизама након чега се посуђе може употребити 72. Хранљиве подлоге. Као подлоге у овом истраживању коришћени су: хранљиви агар у праху (за бактерије) и кромпир-глукозни агар (за гљиве)- за засејавање; Милер- Хинтеов бујон (за бактерије) и сабора течна подлога (за гљиве) (Института за имунологију и вирусологију, Торлак, Београд)- за макродилуциону и микродилуциону методу. Припрема хранљивог агара. Суспендује се 41,3 g праха (састав: пептон-1 ’’Торлак’’ - 15,0 g; месни екстракт ’’Торлак’’ - 3 g; натријум хлорид - 5 g; калијум фосфат - 0,3 g; агар - 18,0 g; pH=7,3) у 1000 mL хладне воде и остави да одстоји 15 мин. Потом се раствор пажљиво загрева до кључања уз стално мешање стакленим штапићем да би се прах у потпуности растворио. Оставити да раствор кључа 15 минута, уз интензивно мешање. Овако припремљен агар се разлије у епрувете и стерилише у аутоклаву у периоду од 15 минута на 121 ºC. Након стерилизације подлога у епруветама се охлади у укошеном положају. Потребна опрема: Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 71 Вага тачнности 0,0001 g Мензура од 500 mL Чаша од 1 L Стаклени штапић за мешање Грејно тело (решо) Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете Аутоклав за стерилизацију Припрема Милер-Хинтоновог бујона (П29)-течна подлога. Измери се одговарајућа количина супстанци (казеин хидролизат - 17,5 g; месни екстракт - 3 g; скроб -1,5 g) и раствори у 1000 mL дестиловане воде. Да би се компоненте потпуно раствориле, подлога се загрева до кључања, уз мешање а затим пребаци у одговарајући суд и стерилише 15-20 минута на температури од 120 ºC 73. Користи се Торлакова подлога следећег састава, g/L Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Мензура од 500 mL Чаша од 600 mL Стаклени шташић за мешање Грејно тело (решо) Ерленмајери запремине 250 mL Стерилизатор Припрема кромпир-глукозног агара. Исече се 250 g очишћеног кромпира и дода 1 L воде. Затим се кромпир кува, процеди се и дода воде до 1 L (односно она количина која је у међувремену испарила током кључања). Затим се додаје 17 g агара (15-20 %), и када се агар отопи, дода се 20 g глукозе. Кориговати pH до 6,5. Потом се врши стерилизација у трајању од 15-20 минута на температури од 120 ºC и притиску од 1,5 бара. После тога се врши разливање подлоге у одговарајуће судове. Потребна опрема: Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 72 Вага тачности 0,0001 g Нож Чаша од 1 L Мензура од 500 mL Газа за цеђење Епрувете запремине 10 mL Метални сталци за епрувете Стерилизатор Припрема Сабора (Saboraud) течне подлоге. 30 g праха (Saboraud течна подлога, Торлак, Београд; састав: пептон - 10,0 g; декстроза - 20,0 g) се дода у 1000 mL дестиловане воде и пажљиво загрева до кључања, да се потпуно раствори. По пребацивању у одговарајући суд врши се стерилизација у аутоклаву 15 минута на 121 ºC. Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Мензура од 500 mL Чаша од 600 mL Стаклени шташић за мешање Грејно тело (решо) Ерленмајери запремине 250 mL Стерилизатор Засејавање подлога. Од припремљене подлоге (хранљиви агар за бактерије и кромпир глукозни агар за гљиве) формира се коси агар у епруветама и на њему се врши засејавање одговарајуће културе. Код течних подлога помоћу стерилисане пипете се унесе суспензија спора културе у одређену запремину претходно стерилисане подлоге. Засејавање значи преношење микроорганизама из њихове природне средине на хранљиву подлогу, или из једне хранљиве подлоге на другу. Основни предуслов је потпуна стерилност, што се постиже у стерилној комори или у другим експерименталним условима који обезбеђују потребну стерилност. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 73 Потребна опрема: Стерилна комора са UV лампом за стерилизацију Бутан боца са Бунзеновим пламеником Езе за засејавање Суд са апсолутним етанолом Стерилизатор Припремање суспензије (инокулума) спора одређене концетрације. Густина инокулума је један од важнијих параметара. Препоручено је да она изнонси 1x104 – 1x10 6 CFU/mL за бактерије и 1x103 –1x104 CFU/mL за гљиве (CFU- енг. Colony forming unit). Већом густином се скраћује лаг фаза, односно фаза развића, док превише брз раст знатно смањује зоне инхибиције 73. Један од путева за одређивање густине тест супспензије је коришћење нефелометрије или спектрофотометрије. У епрувету у којој се налази култура одређене старости (24 h за бактерије и 72 h за гљиве), додаје се стерилисана, дестилована вода. 1 mL концетроване суспензије се одпипетира у чисту епрувету и дода се 5 mL стерилисане воде. Спектрофотометријски се мери оптичка густина на 550 nm, при чему се врши додавање стерилисане воде или микроорганизма у циљу добијања A550 nm= 0,045 за бактерије и A550 nm= 0.03 за гљиве (Табела 17). Табела 17. Оптичка густина у функцији густине инокулума Стандард Густина инокулума x 106 CFU/mL Оптичка густина на 550 nm (E) 0.5 150 0,125 1 300 0,250 2 600 0,500 3 900 0,750 4 1200 1,000 5 1500 1,250 Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 74 2.4.2. Одређивање антимикробне активности супстрата 4-хидроксикумарина у in vitro условима 2.4.2.1. Одређивање антимикробне активности 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина применом макродилуционе методе 74, 75 Потребна опрема: Стерилизатор Нормални судови запремине 25 mL за полазне растворе тестираних супстрата Вага тачности 0,0001 g Епрувете запремине 10 mL Сталци за епрувете Пипете градуисане на 1 mL Пипете градуисане на 0,1 mL Стерилна комора У експеримент су укључене следеће културе: Бактерије: Грам позитивне: Bacillus mycoides (FAB B1), Bacillus subtilis (FAB B2), Staphilococcus aureus (ATCC 25923) и Грам негативне: Agrobacterium tumefaciens (FAB 231), Enterobacter cloaceae (FAB 22), Erwinia carotovora (FAB 73), Escerichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (FAB 26), Pseudomonas fluorescens (FAB 097) и Pseudomonas glycinea (FAB 111). Гљиве: Ampelomyces quisqualis (DBFS 90), Aspergillus flavus (ATCC 9170), Aspergillus fumigatus (DBFS 310), Botrytis cinerea (DBFS 133), Candida albicans (ATCC 10259), Fusarium oxysporum (DBFS 292), Fusarium solani (DBFS 112), Mucor mucedo (ATCC 52568), Paecilomyces variotii (ATCC 22319), Penicillium perpurescens (DBFS 418), Penicillium verrucosum (DBFS 262) и Trichoderma harzianum (DBFS 379). Најпре се направе полазни раствори тестираних тиазолинских деривата 4- хидроксикумарина (49c-59c) у концентрацији од 1000 g/mL употребом 5 % раствора Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 75 диметил сулфоксида (DMSO). У десет епрувета се одмерава по 1 mL течне подлоге, а затим у прву епрувету дода 1 mL раствора тестираног супстрата, односно стандардног једињења одређене концетрације. Употребом стерилне пипете узима се 1 mL добијеног раствора из прве епрувете и преноси у другу епрувету. Сукцесивним разблаживањем до последње епрувете, односно двоструким разблаживањем полазног раствора, добија се серија раствора тестираног једињења, односно стандардних једињења од 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 15,6, 7,8, 3,9, 1,95 и 0,98 g/mL. Затим се у све епрувете додаје по 0,1 mL суспензије спора чија је густина инокулума дефинисана 0.5 Mc Farland стандардом (106 CFU/mL за бактерије и 104 CFU/mL за гљиве). По истеку 24 сата за бактерије, и 48 сати за гљиве, вредности минималних инхибиторних концентрација се одређују визуелно (на основу замућености) као најниже концетрације које инхибирају раст микроорганизама. Стандардна једињења, односно стандардни лекови коришћени у експерименту су стрептомицин за бактерије и кетоконазол за гљиве. При извођењу експеримента су потребне три контроле: Контрола 1-медијум Контрола 2-медијум + 0,1 mL стандардизоване суспензије микроорганизма Контрола 3-медијум + 0,1 mL стандардизоване суспензије микроорганизма + 5 % DMSO. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 76 Табела 18. Антибактеријска активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) Бактерија 49c 50c 51c 52c 53c 54c 55c 56c 57c 58c 59c S* Грам + B. mycoides 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 7,81 B. subtilis 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 7,81 S. aureus 125 62,5 125 125 62,5 62,5 250 250 250 31,25 125 31,25 Грам - A. tumefaciens 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 250 31,25 62,5 7,81 E. cloaceae 125 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 1,95 E. carotovora 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 250 31,25 62,5 7,81 E. coli 125 125 500 62,5 62,5 125 125 125 250 62,5 125 31,25 K. pneumoniae 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 1,95 P. fluorescens 62,5 62,5 62,5 125 62,5 31,25 62,5 62,5 31,25 125 62,5 7,81 P. glycinea 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 7,81 * S Стрептомицин Табела 19. Антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) Гљива 49c 50c 51c 52c 53c 54c 55c 56c 57c 58c 59c K* A. quisquialis 62,5 31,25 125 125 62,5 62,5 125 62,5 125 31,25 62,5 3,9 A. flavus 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 3,9 A. fumigatus 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 3,9 B. cinerea 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 1,95 C. albicans 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 125 31,25 62,5 1,95 F. oxysporum 62,5 31,25 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 3,9 F. solani 62,5 62,5 125 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 3,9 M. mucedo 62,5 31,25 125 125 62,5 31,25 125 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 P. variotii 62,5 31,25 62,5 125 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 62,5 1,95 P.purpurescens 62,5 31,25 125 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 31,25 62,5 3,9 P. verrucosum 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 3,9 T. harsianum 62,5 31,25 62,5 125 62,5 62,5 125 62,5 62,5 31,25 62,5 7,8 * K Кетоконазол Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 77 2.4.2.2. Одређивање антимикробне активности имино и амино деривата 4-хидроксикумарина применом микродилуционе методе 76 Дозирање течне подлоге, раствора тестираних супстрата, ресазурин индикаторског раствора као и суспензије спора тест микроорганизама врши се, применом микропипете са стерилним наставцима, у јамице (200 L) на стерилним полистиренским микродилуционим плочама. Потребна опрема: Стерилизатор Нормални судови запремине 25 mL за полазне растворе тестираних супстрата Нормални суд од 5 mL за ресазурин индикаторски раствор Вага тачности 0,0001 g Микропипета Стерилни полистиренски наставци за микропипету Стерилне полистиренске микродилуционе плоче са јамицама (U или V дно) запремине 200 L Стерилна комора У експеримент су укључене следеће културе микроорганизама: Грам позитивне бактерије: Bacillus mycoides (FSB 1), Bacillus subtilis (FSB 2), Micrococcus lysodeikticus (ATCC 4698), Staphilococcus aureus (ATCC 25923) и Staphilococcus aureus (FSB 30). Грам негативне бактерије: Azotobacter chroococcum (FSB 14), Enterobacter cloaceae (FSB 22), Erwinia carotovora (FSB 31), Escerichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (FSB 26), Pseudomonas fluorescens (FSB 28), Pseudomonas glycinea (FSB 40) и Pseudomonas phaseolicola (FSB 29). Гљиве: Aspergillus glaucus (FSB 32), Aspergillus niger (FSB 31), Candida albicans (ATCC 10259), Fusarium oxysporum (FSB 91), Penicillium verrucosum (FSB 21), Trichoderma longibrachiatum (FSB 13), Trichoderma harzianum (FSB 12) и Trichoderma viride (FSB 11). Суспензије спора се припремају по поступку који је идентичан макродилуционој методи одређивања минималне инхибиторне концетрације. Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 78 Ресазурин, односно 7-хидрокси-3H-феноксазин-3-он 10-oксид је плави пигмент које се углавном користи као оксидо-редукциони индикатор у ресазурин тесту за бактерије (Слика 49 и 50). Открио га је Weselsky, а Pesch и Simmert су га 1929. године први пут искористили за квантификацију бактеријског садржаја у млеку, након чега се екстензивно употребљава у Великој Британији у бројним тестовима хигјенске исправности млека. Осим што се користи за регистровање и квантификацију бактеријских култура, широку примену је нашао и у експериментима на културама хуманих ћелија а у циљу њиховог бојења. У присуству живих ћелија дешава се редукција у две фазе: ресазурин (плаво обојен) се преводи иреверзибилно у ресоруфин (љубичасто обојен), при чему даља редукција иде реверзибилно до дихидроресоруфина. Реоксидација дихидроресоруфина праћена појавом љубичасте боје је нашла примену у анаеробној микробиологији, а у циљу констатовања контаминације са кисеоником. O N HO O O O N HO O O N HO OH H NADH/H+ NAD+, H2O + 2H+ + 2e- resazurin resoruf in dihidroresoruf in Слика 49. Приказ промене боје као последица редукције ресоруфина од стране микроорганизама Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 79 Слика 50. Приказ микродилуционе плоче са различито обојеним растоврима у јамицама Поступак за одређивање антибактеријске активности. Направе се полазни раствори тестираних имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c- 68c), односно стандардног лека стрептомицина у концентрацији од 1000 g/mL у апсолутном етанолу. Ресазурин индикаторски раствор се припрема непосредно пре самог експеримента, растварањем 270 mg ресазурина у 40 mL претходно стерилисане дестиловане воде. Најпре се у сваку од 96 јамица на микродилуционој плочи микропипетом сипа 50 L течне подлоге, па се у сваку од дванаест првих јамица у линији дода по 50 L почетног раствора имино или амино деривата 4- хидроксикумарина, односно стандардног лека стрептомицина. Двоструко разблажење у свакој од линија се изводи тако што се микропипетом изима 50 L добијеног раствора из прве јамице и пренесе у другу, а потом се идентичан поступак изводи до крајње, односно осме јамице у линији. На овај начин се постиже опсег тестираних концентрација од 500 g/ L до 0,244 g/ L. Потом се у сваку од јамица сипа 10 L раствора ресазурина, 30 L течне подлоге и на крају по 10 L суспензије спора бактерија. Како је додата суспензија спора бактерија дефинисана концетрацијом од 106 CFU/ L, коначна концентрација спора у свакој од јамица је 106 CFU/ L. Пажљиво се затвори микродилуциона плоча и остави у инкубатор на 37 °C. Након 24 h се одређује минимална инхибиторна концентрација супстрата праћењем промене боје раствора из плаве до љубичасте, односно црвене. За вредност Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 80 минималне инхибиторне концетрације се узима најнижа концентрација супстрата (у једној линији јамица) при којој не долази до промене боје. При извођењу експеримента за сваку употребљену микродилуциону плочу су потребне три контроле: Контрола 1 - медијум + ресазурин; Контрола 2 - медијум + ресазурин + 0,1 mL стандардизоване суспензије бактерија; Контрола 3 - медијум + ресазурин + 0,1 mL стандардизоване суспензије бактерија + етанол Поступак за одређивање антифунгалне активности. Направе се полазни раствори тестираних имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c-68c), односно стандардног лека кетоконазола у концентрацији од 1000 g/mL у апсолутном етанолу. У сваку од 96 јамица на микродилуционој плочи микропипетом се сипа 50 L течне подлоге, па се у сваку од дванаест првих јамица у линији дода по 50 L почетног раствора имино или амино деривата 4-хидроксикумарина, односно стандардног лека кетоконазола. Двоструко разблажење у свакој од линија се изводи тако што се микропипетом извуче 50 L добијеног раствора из прве јамице и пренесе у другу, а потом се идентичан поступак изводи до крајње, односно осме јамице у линији. На овај начин се постиже опсег тестираних концентрација од 500 g/mL до 0,244 g/mL. Потом се у сваку јамицу сипа 40 L течне подлоге и на крају по 10 L суспензије спора гљива. Како је додата суспензија спора гљива дефинисана концетрацијом од 104 CFU/ L, коначна концентрација спора у свакој од јамица је 103 CFU/ L. Пажљиво се затвори микродилуциона плоча и остави у инкубатор на 37 °C. Након 48 h се одређује минимална инхибиторна концентрација супстрата праћењем појаве замућења у свакој од дванаест линија. Као минимална инхибиторна концентрација се узима најнижа концентрација супстрата (у једној линији јамица) при којој не долази до појаве замућења. При извођењу експеримента за сваку употребљену микродилуциону плочу су потребне три контроле: Контрола 1- медијум; Контрола 2- медијум + 0,1 mL стандардизоване суспензије гљива; Контрола 3 - медијум + 0,1 mL стандардизоване суспензије гљива + етанол Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 81 Табела 20. Антибактеријска активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) бактерија Грам + Грам - B.m. B.s. M.l. S.a. S.a.(i) A.c. En.cl. Er.ca. Es.co. K.p. P.fl. P.gl. P.ph. 61b 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 125 62,5 125 62,5 15,6 62,5 62,5 62,5 62b 125 125 125 125 62,5 62,5 62,5 125 62,5 31,25 62,5 31,25 62,5 63b 31,25 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 64b 62,5 31,25 62,5 62,5 125 62,5 125 62,5 62,5 15,6 62,5 31,25 62,5 65b 62,5 15,6 125 62,5 31,25 31,25 62,5 31,25 125 15,6 62,5 31,25 125 66b 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 125 7,8 125 31,25 125 67b 62,5 31,25 62,5 125 31,25 125 125 31,25 31,25 15,6 62,5 15,6 31,25 68b 31,25 31,25 31,25 125 62,5 31,25 125 62,5 31,25 31,25 62,5 62,5 31,25 61c 15,6 7,8 3,9 3,9 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 3,9 7,8 62,5 62c 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 3,9 7,8 31,25 63c 15,6 15,6 3,9 7,8 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 3,9 7,8 31,25 64c 62,5 62,5 3,9 15,6 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 15,6 3,9 7,8 62,5 65c 15,6 31,25 3,9 15,6 15,6 3,9 7,8 7,8 7,8 7,8 3,9 7,8 15,6 66c 15,6 7,8 3,9 31,25 15,6 3,9 7,8 7,8 15,6 15,6 7,8 15,6 7,8 67c 15,6 31,25 3,9 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 31,25 7,8 3,9 7,8 15,6 68c 7,8 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 15,6 7,8 3,9 7,8 7,8 S * 7,8 7,8 1,95 15,6 7,8 7,8 1,95 7,8 31,25 1,95 7,8 7,8 3,9 * S Стрептомицин; B.m.-Bacillus mycoides (FSB 1); B.s.-Bacillus subtilis (FSB 2); M.l.-Micrococcus lysodeikticus (ATCC 4698); S.a.-Staphilococcus aureus (ATCC 25923); S.a.(i)-Staphilococcus aureus (FSB 30); A.c.-Azotobacter chroococcum (FSB 14); En.cl- Enterobacter cloaceae (FSB 22); Er.ca-Erwinia carotovora (FSB 31); Es-co-Escerichia coli (ATCC 25922); K.p.-Klebsiella pneumoniae (FSB 26); P.fl.-Pseudomonas fluorescens (FSB 28); P.gl-Pseudomonas glycinea (FSB 40); P.ph.-Pseudomonas phaseolicola (FSB 29). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 82 Табела 21. Антифунгална активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) гљива A.gl. A.n. C.a. F.o. P.ve. T.l. T.h. T.v. 61b 62,5 125 31,25 31,25 62,5 31,25 31,25 31,25 62b 62,5 125 31,25 62,5 62,5 31,25 125 125 63b 62,5 125 31,25 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 64b 125 31,25 31,25 125 31,25 31,25 31,25 31,25 65b 31,25 31,25 125 125 62,5 62,5 62,5 62,5 66b 62,5 31,25 125 125 31,25 62,5 62,5 31,25 67b 31,25 125 31,25 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 68b 31,25 62,5 31,25 62,5 62,5 31,25 125 125 61c 62,5 125 125 125 125 62,5 62,5 125 62c 125 125 125 62,5 125 62,5 62,5 125 63c 62,5 125 125 62,5 125 62,5 62,5 62,5 64c 125 250 250 125 125 62,5 62,5 62,5 65c 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 125 125 62,5 66c 62,5 125 62,5 125 125 125 125 125 67c 62,5 250 62,5 125 62,5 250 125 62,5 68c 62,5 250 125 250 125 250 125 62,5 K * 7,8 7,8 1,95 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 K * Кетоконазол; A.gl-Aspergillus glaucus (FSB 32); A.n-Aspergillus niger (FSB 31); C.a.- Candida albicans (ATCC 10259); F.o.-Fusarium oxysporum (FSB 91); P.ve-Penicillium verrucosum (FSB 21); T.l.-Trichoderma longibrachiatum (FSB 13); Trichoderma harzianum (FSB 12); T.v.-Trichoderma viride (FSB 11). Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 83 2.5. Прелиминарно одређивање антикоагулантне активности у in vitro условима Један од начина да се утврди да ли нови имино и амино деривати 4- хидроксикумарина поседују антикоагулантну активност јесте одређивање протромбинског времена по додатку ензима trombokinazе, односно ткивног тромбопластина и јона калцијума у плазму. Одређивањем времена коагулације се одређује активност протромбина и фактора коагулације крви V, VII, X, и фибриноген). Протромбинско време плазме здравих људи се креће у интервалу од 11- 15 секунди. Поступак одређивања протромбинског времена PT модификованом методом по Квику 77 Потребна опрема: Вага тачности 0,0001 g Нормални судови од 10 mL Епрувете запремине 10 mL Микропипета са полистиренским наставцима Полистиренски штапићи са О петљом Водено купатило Термометар Штоперица Потребни раствори: 20 % етанол 1 % NaCl w/v 60 % глицерол 10 % NaH2PO4/Na2HPO4 Потребни биолошки супстрати: Хумана плазма Thromborel® S реагенс (тромбопластин са јонима калцијума; trombokinaza) Докторска дисертација Експериментални део мр Ненад Вуковић 84 Thromborel® S реагенс (Dade Behring) је по саставу хумани плацентални тробопластин са калцијум хлоридом са ISI вредности од 1,0 до 1,1. Показује добру осетљивост ка редукцији фактора II, V, VII и X. Направе се раствори имино и амино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c- 68c), односно стандардних једињења варфарина и аценокумарола, концетрације 10 mg/mL, растварањем 10 mg супстрата у 10 mL смеше (20 % етанол:1 % NaCl w/v:10 % NaH2PO4/Na2HPO4=1:1:1). Потом се врши активирање ензма trombokinaze тако што се у бочицу Thromborel® S реагенса одмери 2 mL дестиловане воде, пренесе се на водено купатило и остави на температури од 37 ºC у периоду од 30 минута. У епрувете запремина 10 mL одмери се микорпипетом 100 L хумане плазме и 100 L раствора имино, односно амино деривата 4-хидроксикумарина предходно наведене концетрације. По додатку 200 L раствора активираног ензима trombokinazе штоперицом се одређује време појаве коагулације. Као крајња тачка времена узима се оно време при коме на О петљи полистиренског штапића настаје стабилна опна. Табела 22. In vitro антикоагулантна активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина Протромбинско време (PT) имино деривата 4-хидроксикумарина у секундама * 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b W Ac C 20±0,3 21±0,2 22±0,3 18±0,4 22±0,3 18±0,1 16±0,1 27±0,3 18±0,3 26±0,1 12±0,2 Протромбинско време (PT) амино деривата 4-хидроксикумарина у секундама * 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c W Ac C 21±0,4 20±0,2 22±0,2 23±0,2 23±0,3 20±0,1 23±0,2 20±0,1 18±0,4 26±0,1 12±0,2 +резултати су средња вредност три експеримента W-варфарин Ac-аценокумарол C-без стандардног једињења односно кумаринског супстрата Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 85 3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 86 Прегледом обимних литературних извора 9, 15, 18, 19, 20, 26, 27, 38, 40- 43, 46 констатовали смо да супстрати кумаринске структуре показују различите видове биохемијске активности која је у функцији хемијске структуре испитиваног деривата кумарина. На катедри за биохемију Природно-математичког факултета Универзитета у Крагујевцу, дуги низ година ради истраживачка група која се бави добијањем биолошки активних деривата кумарина, процесима тоталне и парцијалне хемијске синтезе. Два горе наведена разлога била су основни, и довољан повод, за планирање и реализацију ове докторске дисертације чији задатак је подразумевао модификацију хемијске структуре полазног 4-хидроксикумарина увођењем различитих фармакофора на положај С-3 кумаринског молекула. На тај начин синтетисана је и структурно окарактерисана серија 2-аминотиазолин-4-хидроксикумарина, серија имино-4-хидроксикумарина и серија амино-4-хидроксикумарина што чини садржај првог дела експерименталног рада. У другом делу рада приказани су резултати испитивања биохемијске активности деривата 4-хидроксикумарина као потенцијалних антиоксидативних једињења, као антимикробних једињења и као антикоагулантних једињења. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 87 3.1. Синтеза и структурна карактеризација добијених 4- хидроксикумаринских деривата 3.1.1. Аминотиазолински деривати 4-хидрокси кумарина (64c-74c) Нови тиоуреа деривати (51b, 53b, 55b-57b) су добијени реакцијама полазних амина (51a, 53а, 55a-57а) (0,012 mol) у облику хидрохлорида и воденог раствора амонијум тиоцијаната (0,012 mol) загревањем у току 3-4 сата, на температури од 80-, а због промене у приносу реакције максимална температура реакционе смесе је до 90 ˚С. Реакција се прати ТLC хроматографијом а на крају реакције, након концентровања реакционе смеше, заостали сирови тиоуреа дериват се третира етил ацетатом и пречишћава хроматографијом на колони силика гела. Осим 5-тиоуреидо- пентанске киселине (55а) и 1,1-диетил-тиоурее (56а), који се добијају као уљане супстанце, сви остали тиоуреа деривати се добијају као кристална једињења. Hantzsch-ова реакција добијања тиазолинског прстена 78 се изводи у кључалом апсолутном етанолу, између еквимоларних количина 3-(2-бромацетил)-4-хидрокси- хромен-2-она (60) и одговарајућег тиоуреа деривата (49b-59b) у току 30-45 минута. Настали 2-аминотиазолински деривати 4-хидроксикумарина (49c-59c) су слабо растворни у етанолу и већини других растварача (осим у диметил сулфоксиду), тако да се по завршетку реакције и хлађења реакционе смеше добијени талог одвоји цеђењем. Добијени производи пречишћавају се кристализацијом из 96 % етанола, а сви 2-аминотиазолински деривати су кристална једињења нерастворна у метанолу, етанолу, толуену, бензену, а растворна у диметил сулфоксиду. Идентификација хемијске структуре синтетисаних тиоуреа и 2- аминотиазолинских деривата извршена је на основу одређивања тачке топљења, и анализом резултата IC и 1H NMR спектара. Сумарни преглед спектралних података синтетисаних деривата приказан је у табелама 23 и 24. На основу табеле 23 се може видети да су тиоуреа деривати 5-тиоуреидо- пентанскa киселинa (55а) и 1,1-диетил-тиоуреa (56а) вискозне супстанце. Увођење тиоуреидо групе је потврђено присуством карактеристичних апсорпционих трака од - Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 88 NH и -NH2 група у инфрацрвеном спектру и широких синглета -NH и -NH2 група у 1 H NMR спектру. Увођење аминотиазолинске групе констатовано је карактеристичном апсорпционом траком -NH групе и сигналима у виду синглета који потичу од протона са C-5’ угљеника тиазолинског прстена и протона са амино групе (Табела 24). Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 89 Табела 23. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци тиоуреа деривата (51b, 53b, 55b-57b) Тиоуреа деривати Карактеристичне апсорпције у IC и 1H NMR спектру т.т. (NH) cm -1 δ (ppm) ˚C од NH и NH2 групе од NH2 групе од NH групе 51b 2-хидрокси-4-тиоуреидо-бензојева киселина 3360, 3295 и 3184 9,5 11,9 76-78 53b 4-тиоуреидо-бензенсулфонска киселина 3461 и 3220 9,4 11,82 84-87 55b 5-тиоуреидо-пентанска киселина 3138 9,56 9,0 уље 56b 1,1-диетил-тиоуреа 3399 9,53 - уље 57b o-толил-тиоуреа 3447, 3284 и 3169 9,5 12,4 44 Табела 24. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци 2-аминотиазолинских деривата (49c-59c) 2-Амино тиазолински деривати Карактеристичне апсорпције у IC и 1H NMR спектру т.т. (NH) cm -1 δ (ppm) ˚C од NH групе 2’-NH H-C-5’ 49c 3-(2-амино-тиазол-4-ил)-4-хидрокси-хромен-2-он 3433 и 3241 8,58 7,21 255-257 50c 4-хидрокси-3-(2-метиламинотиазол-4-ил)хромен-2-он 3433 11,01 7,36 216-218 51c 2-хидрокси-4-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2- иламино]-бензојева киселина 3413 12,11 7,83 282-284 52c 4-хидрокси-3-[2-(4-нитро-фениламино)-тиазол-4-ил]-хромен-2-он 3414 10,22 8,10 227-230 53c 4-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]- бензенсулфонска киселина 3436 10,94 7,78 247-249 54c 4-хидрокси-3-(2-m-толиламино-тиазол-4-ил)-хромен-2-он 3412 9,60 8,08 270-273 55c 5-[4-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3-ил)-тиазол-2-иламино]- пентанска киселина 3416 8,87 7,9 224-225 56c 3-(2-диетиламино-тиазол-4-ил)-4-хидрокси-хромен-2-он - - 7,64 245-247 57c 4-хидрокси-3-(2-o-толиламино-тиазол-4-ил)-хромен-2-он 3414 9,20 7,85 236-238 58c 4-хидрокси-3-[2-(3-нитро-фениламино)-тиазол-4-yl]-хромен-2-он 3415 8,74 7,91 >300 59c 4-хидрокси-3-(2-(нафтален-1-иламино)тиазол-4-ил)-2H-хромен-2-он 3413 8,57 7,87 278-280 Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 90 O OH O S N NH2 O OH O S N HN 49c 50c C12H8N2O3S Mr 260,26 C 13 H 10 N 2 O 3 S Mr 274,29 O OH O S N HN COOH 51c C19H12N2O6S Mr 396,37 OH O OH O S N HN NO2 52c C18H11N3O5S Mr 381,36 O OH O S N HN SO 3 H 53c C18H12N2O6S2 Mr 416,43 O OH O S N HN 54c C19H14N2O3S Mr 350,39 O OH O S N HN (CH2)4COOH 55c C 17 H 16 N 2 O 5 S Mr 360,38 O OH O S N NEt2 56c C 16 H 16 N 2 O 3 S Mr 316,3748 O OH O S N HN 57c C19H14N2O3S Mr 350,3911 O OH O S N HN NO 2 58c C18H11N3O5S Mr 381,36 O OH O S N HN 59c C 22 H 14 N 2 O 3 S Mr 386,4232 Слика 51. Структуре нових 2-аминотиазолинских деривата (49c-59c) Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 91 3.1.2. Имино и амино деривати 4-хидрокси кумарина (61b-68b, 61c-68c) Имино деривати 4-хидроксикумарина (61b-68b) су синтетисани кондензацијом уз азеотропно издвајање воде 79 и процесом загревања реакционе смеше дејством микроталасног зрачења. Конвенционална метода добијања имино деривата 4-хидроксикумарина. Синтеза имино деривата 4-хидроксикумарина (61b-68b) остварена је модификованим процесом по Layer-у 79. Еквимоларне количине полазних једињења 3-ацетил-4-хидроксикумарина (17) и амина (61a-68a) у анхидрованом толуену као растварачу, се по додатку каталитичке количине p-толуен сулфонске киселине загревају, уз азеотропно издвајање воде, у току 10-12 сати. Крај реакције се одређује ТLC хроматографијом, реакциона смеша се хлади и концентрује до четвртине запремине. Сирови производи реакције се пречишћавају хроматографијом на колони силика гела. Чисти имино деривати (61b- 68b) су кристалне супстанце слабо растворне у метанолу и толуену, а добро растворни у етанолу и тетрахидрофурану. Метода под дејством микроталасног зрачења. Извођење реакција под дејством микроталасног зрачења данас добија све више на значају. Разлог томе је скраћивање времена реакције и њихово извођење под много блажим реакционим условима 80. Врло је важно истаћи да се под оваквим реакционим условима скоро у потпуности елиминише настајање нуспродуката, односно да су приноси жељених једињења високи, тако да се њихово пречишћавање изводи само рекристализацијом из погодног растварача, чиме се знатно штеди, не само на времену потребном за пречишћавање хроматографијом, већ и на растварачима потребним за елуирање 80. Еквимоларне количине 3-ацетил-4-хидроксикумарина (17) и амина (61a-68a) у анхидрованом толуену као растварачу, се по додатку каталитичке количине p-толуен сулфонске киселине, подвргавају микроталасном зрачењу снаге 500 W у периоду од 3 минута. По хлађењу, реакциона смеша се концентрује а талог добијених имина се прекристалише из метанола (61b-68b). У табели 25 компаративно су приказани Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 92 реакциони услови конвенционалне методе синтезе и микроталасне методе синтезе имино деривата која потврђује предност примене микроталасне методе у смислу краћег реакционог времена, већег приноса реакције и добијања чистијих производа реакције. Табела 25. Приноси и време реакције добијања имино деривата (61b-68b) Конвенционална метода Микроталасна метода имини Време синтезе (h) Принос % Време синтезе (h) Принос % 61b 9 75 9 95 62b 9,5 73 9,5 97 63b 9 84 9 94 64b 9,5 73 9,5 94 65b 13,5 51 13,5 92 66b 12,5 62 12,5 97 67b 10 75 10 97 68b 10 42 10 87 Деривати амино-4-хидроксикумарина Редукција имина до одговарајућих амина 4-хидроксикумарина (61c-68c) се изводи у смеши растварача метанол:тетрахидрофуран=8:2 са натријум борхидридом. Да би реакција текла једнозначно, на собној температури и уз интензивно мешање раствора имина, средство за редукцију се додаје поступно, у порцијама. По додатку целокупне количине натријум борхидрида, реакциона смеша наставља да се меша у периоду од 4 сата. Крај реакције се контролише TLC хроматографијом. Реакциона смеша се концентрује а затим третира са 10 % хлороводоничном киселином и интензивно меша на собној температури у периоду од 30-60 минута. Након неутрализације, амини се екстрахују са метилен хлоридом а после сушења и концентровања растварача сирови производи се пречишћавају хроматографијом на колони. Амини су кристална једињења светло жуте боје и добро су растворни у метанолу, етанолу, тетрахидрофурану и метилен хлориду. Идентификација структуре синтетисаних имино и амино деривата 4- хидроксикумарина је извршено на основу резултата IC, 1H NMR и масених спектара (Табеле 26 и 27) као и тачке топљења. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 93 Табела 26. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци имино деривата (61b-68b) Табела 27. Тачке топљења и карактеристични спектрални подаци амино деривата (61c-68c) Aмино деривати Карактеристичне апсорпције у IC и 1H NMR спектру MS т.т. (NH) cm -1 δ (ppm) m/z (%) ˚C од NH групе NH C1’-CH3 M + M + -1 M + -15 61c 4-хидрокси-3-(1-(фенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 3183 3,96 1,34 281 (4) 280 (15) 266 (11) 189-190 62c 4-хидрокси-3-(1-(p-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 3191 4,09 1,33 295 (6) 294 (11) 280 (32) 167-169 63c 4-хидрокси-3-(1-(m-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 3179 3,94 1,33 295 (9) 294 (14) 280 (6) 119-121 64c 4-хидрокси-3-(1-(o-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 3193 3,87 1,31 295 (3) 294 (18) 280 (42) 147-149 65c 4-хидрокси-3-(1-(4-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 3184 4,14 1,33 326 (1) 325 (14) 311 (15) 222-223 66c 4-хидрокси-3-(1-(3-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 3181 3,91 1,35 326 (1) 325 (11) 311 (9) 215-217 67c 3-(1-(бензилимино)етил)-4-хидрокси-2H-хромен-2-он 3190 3,96 1,29 295 (16) 294 (8) 280 (22) 171-173 68c 5-(1-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3- ил)етилиденамино)пентанска киселина 3189 4,02 1,25 305 (2) 304 (5) 290 (7) 231-233 Имино деривати Карактеристичне апсорпције у IC и 1H NMR спектру MS т.т. (C=N) cm -1 δ (ppm) m/z (%) ˚C од C=N групе CH3-C=N M + M + -1 M + -15 61b 4-хидрокси-3-(1-(фенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 1609 2,72 279 (64) 278 (100) 264 (17) 169-171 62b 4-хидрокси-3-(1-(p-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 1611 2,69 293 (91) 292 (100) 278 (32) 147-149 63b 4-хидрокси-3-(1-(m-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 1606 2,70 293 (81) 292 (100) 278 (30) 109-110 64b 4-хидрокси-3-(1-(o-толилимино)етил)-2H-хромен-2-он 1611 2,81 293 (42) 292 (34) 278 (100) 138-139 65b 4-хидрокси-3-(1-(4-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 1608 2,76 324 (60) 323 (100) 309 (9) 212-215 66b 4-хидрокси-3-(1-(3-нитрофенилимино)етил)-2H-хромен-2-он 1609 2,61 324 (69) 323 (100) 309 (4) 209-210 67b 3-(1-(бензилимино)етил)-4-хидрокси-2H-хромен-2-он 1612 2,64 293 (100) 292 (100) 278 (5) 151-152 68b 5-(1-(4-хидрокси-2-оксо-2H-хромен-3- ил)етилиденамино)пентанска киселина 1614 2,70 303 (12) 302 (41) 288 (11) 169-171 Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 94 Увођење имино групе је потврђено на основу карактеристичне апсорпционе траке од C=N валенционе вибрације, сигнала у облику синглета који потиче од метил групе везане за имино угљеник, као и вредности m/z и интензитета молекулског јона, односно М+-1 и М+-15 фрагментационих јона. Редукција имино групе до амино групе се констатује у IC спектру појавом шире траке од валенционе вибрације -NH групе, док се у 1H NMR спектру региструје шири синглет -NH групе и дублет протона са C1’-CH3 групе. Бензофурански фрагмент свих синтетисаних кумаринских једињења (Слика 51 и 52) спектрално одговара полазним једињењима 3-(2-бромацетил)-4- хидроксикумарину (60) и 3-ацетил-4-хидроксикумарину (17) 81. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 95 O O OH N 61b C17H13NO3 Mr 279,29 O O OH N C18H15NO 3 Mr 293,32 62b O O OH N 63b C18H15NO3 Mr 293,32 O O OH N 64b C18H15NO 3 Mr 293,32 O O OH N 65b N + O – O C17H12N2O5 Mr 324,2876 O O OH N 66b C17H12N2O5 Mr 324,2876 N + O – O O O OH N 67 b C18H15NO3 Mr 293,3166 (CH 2)4COOH O O OH N 68b C16H17NO5 Mr 303,31 O O OH HN 61c C17H15NO3 Mr 281,31 O O OH HN 62c C18H17NO3 Mr 295,3325 O O OH HN 63c C18H17NO3 Mr 295,3325 O O OH HN 64c C18H17NO3 Mr 295,3325 O O OH N 65c N + O – O C17H12N2O5 Mr 324,29 O O OH HN 66c N + O – O C17H12N2O5 Mr 324,29 O O OH HN 67c C18H17NO3 Mr 295,3325 (CH2)4COOH O O OH HN 68c C16H19NO5 Mr 305,33 Слика 52. Структуре нових деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 96 3.2. Антиоксидативна активност имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) 3.2.1. Укупна антиоксидативна активност деривата имино-4- хидроксикумарина (61b-68b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) Укупна антиоксидативна активност две групе новосинтетисаних деривата имино- 4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина, као и аскорбинске киселине као стандарда, одређена је као њихова способност да редукују Mo(VI) до Mo(V) при чему се формира зелено обојени комплекс Mo(V) са максимумом апсорпције на 695 nm 67. Сумаран преглед експерименталних вредности укупне антиоксидативне активности испитиваних деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина приказан је у табели 28. Табела 28. Укупна антиоксидативна активност деривата имино-4- хидроксикумарина (61b-68b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) Еквиваленти аскорбинске киселине ( g/mL)* 250 g/mL 125 g/mL 62,50 g/mL 31,25 g/mL 15,60 g/mL 61b 12,03±0,25 8,64±0,29 5,29±0,31 3,18±0,27 2,29±0,17 62b 11,70±0,54 9,25±0,32 6,14±0,32 3,96±0,35 2,92±0,19 63b 11,83±0,13 9,47±0,38 5,99±0,58 3,44±0,47 2,18±0,45 64b 11,71±0,24 9,37±0,27 5,18±0,24 2,92±0,44 1,92±0,11 65b 12,58±0,29 8,84±0,41 4,77±0,22 3,18±0,41 2,70±0,26 66b 12,33±0,27 8,82±0,47 4,68±0,35 3,25±0,38 1,73±0,11 67b 12,11±0,57 9,18±0,39 5,92±0,41 4,10±0,33 1,95±0,38 68b 12,18±0,65 9,22±0,36 6,22±0,11 3,73±0,35 3,14±0,24 61c 45,50±0,68 20,30±0,34 7,96±0,14 4,25±0,51 0,55±0,25 62c 46,98±0,29 23,15±0,37 12,77±0,25 4,77±0,23 1,77±0,28 63c 47,09±0,35 20,89±0,38 11,14±0,31 4,55±0,21 0,95±0,21 64c 47,53±0,31 20,63±0,25 8,07±0,24 3,51±0,18 0,84±0,17 65c 54,57±0,13 27,26±0,27 11,83±0,36 7,63±0,25 4,66±0,29 66c 45,90±0,11 24,26±0,28 11,29±0,38 8,96±0,38 5,40±0,33 67c 49,16±0,25 23,56±0,21 11,59±0,13 5,25±0,24 3,51±0,39 68c 49,35±0,12 18,81±0,51 10,94±0,17 4,62±0,35 3,70±0,34 *представљене вредности су средња вредност три експеримента Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 97 Основна констатација која следи на основу резултата приказаних у табели 28 је да све испитиване концентрације деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) показују већу антиоксидативну активност у поређењу са активношћу деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b). Концентрације деривата амино-4-хидроксикумарина од g/mL показују активност на нивоу од 45,50 g/mL до 54,57 g/mL аскорбинске киселине, односно 18,81 g/mL до 27,26 g/mL аскорбинске киселине. Исте концентрације деривата имино-4-хидроксикумарина показују слабију активност која се налази у опсегу од 11,70 g/mL до 12,58 g/mL аскорбинске киселине, односно 8,64 g/mL до 9,47 g/mL аскорбинске киселине. Може се закључити да промена имино групе у амино групу доводи до повећања обима антиоксидативне активности синтетисаних деривата кумарина. Концентрација од 250 g/mL показује високе вредности укупне антиоксидативне активности, (одговара 12,58 g/mL и 12,33 g/mL аскорбинске киселине) код деривата имино-4-хидроксикумарина са p-нитрофенил (65b) и m-нитрофенил (66b) фармакофорама. Супротно, при истој концентрацији, једињења са толил фармакофорама (62b-64b) показују најслабију активност која се креће у опсегу од 11,70 g/mL до 11,83 g/mL аскорбинске киселине. Дериват амино-4-хидроксикумарина са p-нитрофенил фармакофором (65c) показује висок степен антиоксидативне активности која при тестираној концентрацији од 250 g/mL износи 54,57 g/mL аскорбинске киселине. Такође, може се констатовати, да висок степен антиоксидативне активности показују деривати амино-4-хидроксикумарина са бензил (67c) и -(CH2)4COOH (68c) фармакофором на амино азоту. Потпуно супротан ефекат, тј. слабу антиоксидативну активност показују једињења са фенил (61c) и o-толил (64c) групама. Фосфомолибденска метода је опште примењена метода за одређивање антиоксидативне активности али овде приказани резултати представљају прве публиковане резултате антиоксидативне активности имино-4-хидроксикумарина као и амино-4-хидроксикумарина. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 98 3.2.2. Антирадикалска активност деривата имино-4-хидроксикумарина (61b- 68b) и деривата амино 4-хидроксикумарина (61c-68c) методом са DPPH Способност синтетисаних деривата кумарина да се понашају као једињења која везују стабилне DPPH радикале одређује се реакцијом са DPPH реагенсом. Интезитет љубичасте боје метанолског раствора је у функцији концентрације DPPH радикала, што је основа спектрофотометријског мерења обима антирадикалске активности, променом апсорбанце на 517 nm. Обим антирадкалске активности изражава се као IC50 вредност, односно као концентрација супстрата потребна да се за 50 % умањи почетна концентрација DPPH радикала 68. Сумарни приказ експерименталних резултата антиоксидативне активности испитиваних деривата имино-4-хидроксикумарина и амино-4-хидроксикумарина приказан је у табели 29. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 99 Табела 29. Антирадикалска активност ( M) деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина методом са DPPH у току 30 и 60 минута Време мерења DPPH антирадикалска активност IC50 ( M) * Имино деривати Стандарди 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc 30 мин 446,9±12,1 352,6±22,2 334,6±21,9 304,1±13,2 371,6±12,7 498,7±13,2 424,9±14,3 394,2±21,8 25,4±22,7 42,4±22,7 60 мин 281,5±9,1 266,6±12,2 170,1±8,7 237,8±18,3 152,1±17,4 441,5±7,6 402,8±11,2 377,4±24,6 12,78±7,6 27,22±14,3 Амино деривати 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 30 мин 34,1±13,4 93,9±13,3 131,8±21,6 72,3±13,4 25,9±11,8 40,9±13,9 62,6±14,2 63,4±12,7 60 мин 33,1±11,3 58,8±11,5 56,0±15,3 45,0±19,8 25,0±14,6 37,2±7,7 56,9±21,2 58,4±14,5 * IC50 су средња вредност три експеримента BHT - бутил хидроксил толуен Asc - аскорбинска киселина Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 100 У светлу резултата приказаних у табели 29 који дају обим антирадикалске активности испитиваних деривата 4-хидроксикумарина као IC50 вредности, може се констатовати да деривати амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) показују значајно већу DPPH антирадикалску активност у поређењу са обимом активности деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b). Резултати указују да обим антирадикалске активности зависи од хемијске структуре супституента на положају С-3 у молекулу 4-хидроксикумарина као и од дужине одвијања реакције. Способност антирадикалске активности применом DPPH реагенса код деривата имино-4-хидроксикумарина је у опсегу од 304,1 М до 498,7 М после 30 минута реакције, односно 152,1 М до 441,5 М после 60 минута реакције. DPPH антирадикалска активност деривата амино-4-хидроксикумарина је у опсегу од 25,9 М до 131,8 М мерена после реакције од 30 минута, односно 25,0 М до 58,8 М при мерењу после 60 минута. Све експерименталне вредности које се односе на обим антирадикалске активности деривата имино-4-хидроксикумарина и амино-4-хидроксикумарина укључене су у линеарну регресиону анализу, а сумарни резултати приказани су у табели 30. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 101 Табела 30. Резултати линеарне регресионе анализе за DPPH методу За експеримент мерења апсорбанци по истеку 30 минута једначина грешка Коефицијент корелације Вреоватноћа Стандардна девијација Број узетих тачака Изузете тачке Yi = A + B Xi A B R P SD N 61b Yi = -69,04 + 3,89 Xi 25,36 0,72 0,88 6,26 x 10 -4 39,49 10 0 62b Yi = -46,04 + 4,18 Xi 10,31 0,36 0,97 < 0,0001 19,96 10 0 63b Yi = -62,20 + 4,28 Xi 11,66 0,37 0,97 < 0,0001 20,35 10 0 64b Yi = -62,30 + 3,66 Xi 26,09 0,73 0,87 0,00105 42,06 10 0 65b Yi = -51,48 + 3,44 Xi 30,15 0,87 0,81 0,00427 49,78 10 0 66b Yi = -59,25 + 4,42 Xi 16,72 0,56 0,94 < 0,0001 29,06 10 0 67b Yi = -49,84 + 3,49 Xi 23,64 0,69 0,87 9,54 x 10 -4 41,56 10 0 68b Yi = -60,89 + 3,61 Xi 26,03 0,73 0,87 0,0011 42,29 10 0 61c Yi = -2,63 + 0,24 Xi 2,19 0,06 0,90 0,01445 2,82 6 прве четири 62c Yi = -10,36 + 0,76 Xi 5,82 0,14 0,91 0,00157 9,55 8 прве две 63c Yi = -26,28 + 1,30 Xi 14,82 0,30 0,85 0,00363 23,42 9 прва 64c Yi = -11,30 + 0,65 Xi 7,46 0,15 0,87 0,0051 11,56 8 прве две 65c Yi = -3,47 + 0,24 Xi 1,97 0,05 0,93 0,00745 2,39 6 прве четири 66c Yi = -7,97 + 0,43 Xi 3,05 0,07 0,94 0,0014 4,06 7 прве три 67c Yi = -5,44 + 0,48 Xi 1,96 0,05 0,97 2,99 x 10 -4 2,99 7 прве три 68c Yi = -5,01 + 0,49 Xi 1,53 0,04 0,98 < 0,0001 2,39 7 прве три Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 102 наставак табеле 30 За експеримент мерења апсорбанци по истеку 60 минута једначина грешка Коефицијент корелације Вреоватноћа Стандардна девијација Број узетих тачака Изузете тачке Yi = A + B Xi * A B R P SD N 61b Yi = -39,06 + 2,35 Xi 11,68 0,36 0,93 3,31 x 10 -4 16,79 9 прва 62b Yi = -28,83 + 2,14 Xi 12,91 0,42 0,89 0,00132 20,37 9 прва 63b Yi = -14,47 + 1,29 Xi 5,34 0,19 0,94 5,59 x 10 -4 8,07 8 прве две 64b Yi = -38,53 + 2,17 Xi 17,19 0,50 0,85 0,00349 23,29 9 прва 65b Yi = -19,63 + 1,38 Xi 5,44 0,19 0,95 3,22 x 10 -4 7,37 8 прве две 66b Yi = -64,85 + 4,16 Xi 19,41 0,59 0,93 1,18 x 10 -4 32,21 10 0 67b Yi = -64,32 + 3,65 Xi 17,98 0,49 0,94 < 0.0001 30,16 10 0 68b Yi = -75,76 + 3,80 Xi 22,74 0,60 0,91 2,27 x 10 -4 34,89 10 0 61c Yi = -2,89 + 0,24 Xi 2,22 0,06 0,90 0,01382 2,78 6 прве четири 62c Yi = -5,07 + 0,45 Xi 3,24 0,09 0,92 0,00346 4,84 7 прве три 63c Yi = -9,51 + 0,52 Xi 1,99 0,05 0,98 1,32 x 10 -4 2,54 7 прве три 64c Yi = -7,00 + 0,41 Xi 2,94 0,06 0,94 0,00144 4,08 7 прве три 65c Yi = -3,67 + 0,23 Xi 1,70 0,04 0,95 0,004 2,06 6 прве четири 66c Yi = -7,61 + 0,39 Xi 3,30 0,07 0,93 0,00217 4,42 7 прве три 67c Yi = -6,68 + 0,47 Xi 1,73 0,04 0,98 1,22 x 10 -4 2,50 7 прве три 68c Yi = -6,93 + 0,49 Xi 1,46 0,04 0,98 < 0.0001 2,10 7 прве три Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 103 У серији деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) једињење са o-толил фармакофором (64b, IC50 304,1 М) показује највећу активност. Најслабију антирадикалску активност показује једињење са m-нитрофенил фармакофором (66b, IC50 498,7 М). Јаку DPPH антирадикалску активност показују деривати имино-4- хидроксикумарина са p-толил (62b), m-толил (63b) и p-нитрофенил (65b) фармакофорама (IC50 вредности су: 352,6 М, 334,6 М и 371,6 М). Једињења са фенил (77b), бензил (83b) и -(CH2)4COOH (84b) функционалним групама показују средњи ниво антирадикалске активност са IC50 вредностима од 446,9 М, 424,9 М и 394,2 М. Уколико се реакција одвија у току 60 минута највећу антирадикалску активност показују једињења са p-нитрофенил (65b) и m-толил (63b) фармакофорама (IC50 вредности су 152,1 М и 170,1 М), насупрот кумаринима са m-нитрофенил (66b), бензил (67b) и -(CH2)4COOH (68b) групама који показују слабу активност (IC50 вредности су: 441,5 М, 402,8 М и 377,4 М). Остали деривати имино-4- хидроксикумарина показују средњи ниво антирадикалске активности са IC50 вредностима од 237,8 М до 281,5 М. У серији деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) највећу антирадикалску активност је показало једињење са p-нитрофенил фармакофором (65c) (IC50 вредност 25,9 М), док је најмања активност измерена код једињења са m-толил групом (63c) и износи 131,8 М. Јаку антиоксидативну активност показују једињења са фениламино (61c) и бензиламино (67c) фармакофорама које имају IC50 вредности од 34,1 М и 40,9 М. Остали деривати амино-4-хидроксикумарина показују умерену антирадикалску активност са IC50 вредностима од 62,6 М до 93,9 М. Антирадикалска активност мерена после реакције од 60 минута је била интензивна код једињења са p-нитрофениламино фармакофором (65c) што је тренд уочен и код реакције од 30 минута са IC50 вредношћу од 25,0 М. Умерен ниво активности је констатован код једињења 61c и 66c са IC50 вредностима од 33,1 М и Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 104 37,2 М, док је минорна антирадикалска активност измерена код преосталих деривата амино-4-хидроксикумарина. Деривати имино-4-хидроксикумарина показују слабију активност у поређењу са активношћу стандардних антиоксиданаса типа бутил хидроксил толуена (BHT) и аскорбинске киселине, док у серији деривата амино-4-хидроксикумарина једињење са p-нитрофенил фармакофором (65c) показује активност са IC50 вредност 25,9 М скоро еквивалентну антирадикалској активности BHT-а (IC50 25,4 М). Са друге стране, једињења 61c, 65c и 66c показују већу антирадикалску активност (IC50 вредности су 34,1 М, 25,9 М и 40,9 М) у поређењу са активношћу аскорбинске киселине (IC50 42,4 М). Антирадикалска активност после 60 минута показује да сви деривати амино-4- хидроксикумарина имају ниво активности мањи од BHT, само једињење 65c показује већу антирадикалску активност (IC50 25 М) у поређењу са активношћу аскорбинске киселине (IC50 27,22 М). У светлу резултата приказаних у табели 29 може се закључити да хемијска структура уведене фармакофоре битно утиче на DPPH антирадикалску активност. Увођењем метил групе на бензенски прстен (толилимино деривати) доприноси повећању у антирадикалске активности. Према врстама фармакофора може се констатовати следећи редослед раста активности: фенил < p-толил < m-толил < o- толил. Увођењем нитро групе на пара положај фенил групе у једињењу 65b (IC50 371,6 М), значајно увећава активност у односу на активност деривата са фенилимино фармакофором (61b) (IC50 446,9 М). Нитро група у мета положају бензенског прстена делује супротно, условљавајући да супстрат са m-нитрофенил фармакофором (66b) показује слабију активност (IC50 498,7 М) у поређењу са активношћу свог структурног изомера (65b), као и у односу на активност фенилимино деривата (61b). У серији фенил супституисаних деривата (61c-64c) редослед активности расте следећим редом: m-толил < p-толил < o-толил < фенил, односно дериват са фениламино фармакофором (61c) показује најбољу антирадикалску активност (IC50 Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 105 34,1 М), док дериват са m-толиламино фармакофором (66c) показује најслабију активност (IC50 131,8 М). Слично правилностима уоченим код имино-4-хидроксикумарина, код нитрофениламино деривата, супстрат са m-нитрофенил фармакофором (66c, IC50 40,9 М) показује слабију активност у односу на p-нитрофенил структурни изомер (65c, IC50 25,9 М). Увођење бензил (67c), односно -(CH2)4COOH фармакофоре (68c) на амино азот не доприноси повећању антирадикалске активности и таква једињења се одликују малим способностима за везивање радикала што се потврђује IC50 вредностима које износе 62,6 М, односно 63,4 М. Представљени експериментални резултати антирадикалске активности синтетисаних деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4- хидроксикумарина потпуно су у сагласности са публикованим литературним резултатима 9 који се односе на структурно слична једињења из групе флавоноида и бензофенона. Основни структурни услов за антирадикалску активност испитиваних једињења је присуство функционалних група које су донори водоникових атома 82. У случају испитиваних деривата кумарина сва једињења имају OH групу на положају С-4 која је предуслов антирадикалске активности. Присуство ароматичног прстена такође има значајан ефекат који се огледа у стабилизацији путем делокализације неспареног електрона 82. Такође, увођење још једне функционалне групе која је ефикасан донор водоника, као што је амино група, ствара предуслов за повећану антирадикалску активност деривата амино-4-хидроксикумарина која се огледа у реакцији DPPH са супстратом 83, односно чињеници да је број доступних водоника за редукцију DPPH радикала два пута већи код амина, у односу на имине. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 106 3.2.3. Редуктивна активност деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) и деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) Способност природних и синтетичких једињења да редукују Fe3+ јоне до Fe2+ јона представља заначајну потврду антиоксидативне природе испитиваних једињења. Током редукције долази до промене боје раствора из жуте до различитих нијанси зелене, односно плаве боје, у зависности од редуктивне способности супстрата. Заправо, присуство редуктанта у раствору условљава редукцију Fe3+/цијанидног једињења до феро облика, а количина насталог Fe2+ јона одређује се спектрофотометријски на 700 nm 69. Резултати се дају као концентрација супстрата (RP50) која за 50 % умањује полазну концентрацију Fe 3+ јона. У табели 31 сумарно су приказани резултати RP50 вредности испитиваних деривата кумарина. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 107 Табела 31. Редуктивна активност имино и амино деривата 4-хидроксикумарина Редуктивна способност RP50 ( М) * Имино деривати Стандарди 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b BHT Asc 285,3±2,3 350,3±3,3 279,7±2,1 371,2±4,4 307,3±3,5 296,0±4,3 324,4±3,2 278,8±2,6 447,1±4,4 142,3±4,5 Амино деривати 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 435,7±4,7 365,1±2,3 428,1±3,3 293,4±4,3 338,2±4,4 310,5±3,3 255,6±3,3 279,5±2,2 * RP50 су средња вредност три експеримента BHT - бутил хидроксил толуен Asc - аскорбинска киселина Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 108 У светлу резултата приказаних у табели 31 може се констатовати да деривати имино-4-хидроксикумарина поседују већу редуктивну активност у односу на активност деривата амино-4-хидроксикумарина. Може се приметити да овај вид биохемијске активности битно зависи од хемијске структуре супституента на положају С-3 у молекулу 4-хидроксикумарина. Редуктивна активност деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) се налази у опсегу од 278,8 М до 350,3 М. Редуктивна активност деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) се налази у опсегу од 255,6 М до 435,7 М. Једначине линеарне регресионе анализе из којих су изведене бројне вредности редуктивне активности сумарно су приказане у табели 32. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 109 Табела 32. Резултати линеарне регресионе анализе за методу одређивања редуктивне активности једначина грешка Коефицијент корелације Вреоватноћа Стандардна девијација Број узетих тачака Изузете тачке Yi = A + B Xi A B R P SD N 61b Yi = -28,01 + 302,13 Xi 32,22 72,73 0,90 0,01421 44,95 6 прве четири 62b Yi = -11,76 + 299,67 Xi 7,87 24,39 0,97 < 0,0001 19,17 10 0 63b Yi = -3,34 + 149,43 Xi 15,61 26,98 0,89 5,49 x 10 -4 38,86 10 0 64b Yi = -19,17 + 354,46 Xi 5,03 17,39 0,99 < 0.0001 11,75 10 0 65b Yi = -11,75 + 313,34 Xi 8,94 29,11 0,97 < 0.0001 21,71 10 0 66b Yi = -8,74 + 261,89 Xi 10,49 29,38 0,95 < 0.0001 25,84 10 0 67b Yi = -10,53 + 183,79 Xi 10,49 20,34 0,95 < 0.0001 25,52 10 0 68b Yi = -11,49 + 189,34 Xi 13,88 28,12 0,92 1,47 x 10 -4 33,08 10 0 61c Yi = 4,06 + 111,91 Xi 2,97 3,74 0,99 < 0.0001 8,05 10 0 62c Yi = -10,59 + 73,62 Xi 5,97 4,55 0,98 < 0.0001 14,71 10 0 63c Yi = 0,41 + 78,86 Xi 1,93 1,67 0,99 < 0.0001 5,11 10 0 64c Yi = -14,17 + 62,67 Xi 13,50 8,85 0,93 1,04 x 10 -4 31,69 10 0 65c Yi = -7,78 + 75,94 Xi 5,64 4,51 0,99 < 0.0001 14,16 10 0 66c Yi = -11,53 + 75,23 Xi 9,05 7,08 0,98 < 0.0001 21,99 10 0 67c Yi = -14,40 + 61,66 Xi 18,29 12,16 0,87 9,65 x 10 -4 41,62 10 0 68c Yi = -14,25 + 69,94 Xi 13,58 9,93 0,93 1,08 x 10 -4 31,84 10 0 Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 110 У групи деривата имино-4-хидроксикумарина једињење са -(CH2)4COOH фармакофором (68b) показује најјачу редуктивну активност (RP50 278,8 М). Такође, једињења са фенил (61b), m-толил (63b), p-нитрофенил (65b) и m-нитрофенил (66b) фармакофорама показују јаку редуктивну активност са RP50 вредностима од 285,3 М, 279,7 М, 307,3 М и 296,0 М. Умерену редуктивну активност са RP50 од 324,4 М има једињење са бензилимино фармакофором (67b), док малу редуктивну активност показују једињења са p-толилимино (65b) и o-толилимино (64b) фармакофорама чије RP50 вредности износе 350,3 М и 371,2 М. Код деривата амино-4-хидроксикумарина најјачу редуктивну активност показује једињење са бензиламино фармакофором (67c, RP50 255,6 М). Једињења са фениламино (61c) и m-толиламино (66c) фармакофорама показују слабу редуктивну способност и RP50 вредности од 435,7 М и 428,1 М. Остали деривати амино-4- хидроксикумарина показују умерену редуктивну активност са RP50 вредностима у опсегу од 279,5 М до 365,1 М. Може се закључити да испитивани деривати кумарина показују мању редуктивну активност у односу на аскорбинску киселину (RP50 142,3 М), али су активнији у поређењу са нивоом редуктивне активности бутил хидроксил толуена чија RP50 је 447,1 М. Анализом резултата приказаних у табели 31 може се закључити да редуктивна активност испитиваних кумаринских деривата зависи и од природа супституената који су везани за имино, односно амино азот. У серији фенил и толил супституисаних имина (61b-64b) активност опада следећим редом: m-толил > фенил > p-толил > o- толил, односно увођење метил супституента на пара и орто положај бензенског прстена води ка слабљењу редуктивне активности. Слично, положај нитро групе на бензенском прстену условљава слабију активност p-нитрофенил изомера у односу на активност m-нитрофенил структурног изомера. У серији фениламино и толиламино деривата (61c-64c) уочен је супротан ефекат супституције са метил групом у односу исти ефекат на одговарајуће имине (61b-64b). Редуктивна способност опада следећим редом: o-толил > p-толил > m-толил > фенил. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 111 У случају синтетисаних кумарина са нитрофениламино фармакофором, m- нитрофениламино дериват (66c) показује већу активност у поређењу са активношћу p-нитрофениламино деривата (65c). Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 112 3.2.4. Инхибиција липидне пероксидације у присуству линолеинске киселине Одређивањем инхибиције липидне пероксидације у емулзионом систему линолеинске киселине дефинише се антиоксидативна активност супстрата на нивоу ћелијске мембране. Пероксил радикали формирани у процесу липидне пероксидације оксидују Fe2+ јоне до Fe3+ јона, који са тиоцијанатним анјонима формирају комплексно једињење које даје максимумом апсорпције на 500 nm 70. Дакле, инхибиција липидне пероксидације мери се непосредно преко количине фери јона у систему. Већа вредност апсорбанце, односно нижа вредност % инхибиције индикатор је високе концентрације пероксида насталих у периоду инкубације емулзије линолеинске киселине. Вредности апсорбанце на 500 nm у одређеном временском интервалу, како код испитиваних једињења, тако и у случају стандарда, расту до максималне вредности у току 72 сата од почетка инкубације, а да затим до 96 сати вредности апсорбанце опадају (Табела 12). Разлог ових резултата је у чињеници да су настали хидропероксиди линолеинске киселине нестабилни и да временом прелазе у стабилније облике чиме се процес пероксидације прекида. Преглед резултата инхибиције липидне пероксидације испитиваних деривата кумарина сумарно је приказан у табели 33. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 113 Табела 33. Инхибиција липидне пероксидације под утицајем деривата имино-4- хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина* % Инхибиције липидне пероксидације* после 72 сата 1000 M 500 M 250 M 125 M 61b 74,5±1,1 50,5±1,8 38,5±2,1 36,6±2,3 62b 94,4±1,3 77,4±1,6 60,4±2,3 53,9±2,1 63b 88,6±2,1 75,4±1,4 46,2±2,1 29,9±2,4 64b 78,5±1,9 66,5±1,2 35,9±2,9 25,4±2,5 65b 81,3±1,5 73,4±1,1 55,8±3,5 43,6±2,5 66b 76,4±1,6 72,8±1,4 49,2±1,1 31,8±2,7 67b 63,2±1,4 52,9±1,5 39,3±1,4 30,8±3,5 68b 62,6±2,4 51,8±1,7 39,0±1,8 15,8±3,1 61c 57,6±2,2 34,9±1,7 25,6±2,7 17,9±1,5 62c 57,7±2,0 37,6±1,8 29,5±2,4 22,4±2,7 63c 59,4±2,5 31,5±1,5 21,5±2,3 15,9±2,4 64c 58,9±1,6 35,6±1,9 27,6±2,1 15,0±2,6 65c 67,8±1,7 47,5±2,1 29,7±1,5 20,9±1,7 66c 58,3±1,1 37,8±2,2 27,6±1,5 15,6±1,8 67c 60,3±1,1 48,7±2,0 27,2±1,3 18,1±2,0 68c 52,9±1,4 41,7±2,3 22,8±1,2 16,8±1,7 BHT 90,5±1,3 90,1±2,1 89,7±1,1 89,6±1,3 Asc 27,8±1,4 20,5±2,5 16,0±1,7 8,8±1,5 -Toc 69,2±1,9 67,3±2,9 63,6±1,8 60,2±2,1 *средња вредност три експеримента BHT - бутил хидроксил толуен; Asc - аскорбинска киселина; -Toc - -токоферол Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 114 На основу резултата приказаних у табели 33 може се закључити да испитивана једињења кумаринске структуре, у опсегу свих тестираних концентрација, инхибирају формирање пероксил радикала. Деривати имино-4-хироксикумарина (61b-68b) показују већу инхибиторску активност у односу на активност одговарајућих деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c). У групи деривата имино-4-хидроксикумарина највећу инхибиторску активност показује једињење са p-толилимино фармакофором (62b) при свим тестираним концетрацијама и за 1000 М износи 94,4 %. Јаку активност показују и једињења са m-толил (63b) и p-нитрофенил (65b) фармакофорама која износи 88,6 %, односно 81,3 % (за 1000 М). Слабу инхибиторну активност показују једињења са бензил (83b) и -(CH2)4COOH (68b) фармакофорама која је 63,2 %, односно 62,6 % (за 1000 М ), док остала испитивана једињења имају степен инхибиције који се може окарактерисати као ниво средње активности. Код деривата амино-4-хидроксикумарина само једињење са p-нитрофенил фармакофором (65c) при концентрацији од 1000 М показује занчајнију инхибиторску активност формирања пероксил радикала која износи 67,8 %. Остала једињења из ове групе, при тестираним концетрацијеама, показују слабу активност. Сви тестирани деривати имино-4-хидроксикумарина показују већу инхибицију липидне пероксидације у поређењу са активношћу аскорбинске киселине. При концентрацијама од 1000 М и 500 М синтетисани кумарински деривати (62b-66b) показују већу инхибицију липидне пероксидације у односу на -токоферол. Преостала два имина, 67b и 68b показују слабију инхибиторску активност у односу на -токоферол. Једињење са p-толил фармакофором (62b), при концентрацији од 1000 М, показује већу активност (94,4 %) у поређењу са активношћу бутил хидроксил толуена (90,5 %). У осталим испитиваним узорцима деривата кумарина бутил хидроксил толуен показује већу активност. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 115 У серији деривата амино-4-хидроксикумарина само једињење са p-нитрофенил фармакофором (65c) при концентрацији од 1000 М показује инхибиторску активност приближно једнаку активности -токоферола и износи 67,8 %. Многи аутори повезују обим DPPH антирадикалске активности са предвиђањем обима инхибиције липидне пероксидације код природних и синтетичких једињења различите хемијске структуре 84, 85. Наши експериментални резултати нису у сагласности са овом констатацијом јер деривати имино-4-хидроксикумарина показују јачу активност у односу на деривате амино-4-хидроксикумарина. Амино деривати, мада имају два лако доступна водоника за терминацију насталих пероксил радикала су слабији супстрати у елиминацији насталих радикалских врста. Разлог томе је што су радикалске честице настале при липидној пероксидацији значајно реактивније 85 у односу на DPPH радикале и у том смислу се врши везивање водоника са киселе OH групе бензопиранског језгра. Такође, како се одређивање инхибиције липидне пероксидације изводи у емулзионом систему линолеинске киселине, насупрот DPPH активности, која се прати у метанолско раствору, сасвим је очекивано да ће и већа липофилност имино деривата у односу на амино деривате диктирати њихову израженију активност. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 116 3.2.5. Способност везивања OH радикала Хидроксил радикали се због своје високе реактивности сматрају једном од најтоксичнијих радикалских честица из групе реактивних кисеоничних врста. Одговорни су за оштећење ћелијских макромолекула као што су протеини, DNA и липиди 16. Истраживања су утврдила везу између концентрације хидроксил радикала са количином других реактивних кисеоничних врста, односно констатовано је да настају из њих (примера ради Фентон-ова реакција) уз учешће металних јона као што су Fe2+ и Cu+. Висока реактивност хидроксил радикала условљава врло кратко полувреме живота (свега 10-9 s), чиме се њихово дејство ограничава на врло мали простор у односу на место где су настали. Како је формирање ових високо реактивних врста везано за јоне метала, то ће и њихова локација одређивати места слободно радикалског оштећења ћелије. Принцип методе одређивања антиоксидативне активности према хидроксил радикалима се заснива на компетицији дезоксирибозе и тестираног супстрата према хидроксил радикалима насталим у Фентоновој реакцији, односно систему Fe 3+/аскорбинска киселина/EDTA. У зависности од концентрације и способности антиоксиданта да елиминише хидроксил радикале, врши се превођење дезоксирибозе на мање фрагменте, који при ниској pH вредности и при загревању на воденом купатилу, реагују са тиобарбитурном киселином, формирајући једињења љубичасте боје са максимумом апсорпције на 532 nm 71. Експериментални резултати се представљају као проценат инхибиције деградације дезоксирибозе или као IC50 вредности у односу на аскорбинску киселину као стандард. У табели 34 сумарно су приказани резултати који указују на способност тестираних деривата имино-4- хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина да везују реактивне хидроксил радикале. Добивени експериментални резултати укључени су у линеарну реагресиону анализу а бројне вредности сумарно су приказане у табели 35. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 117 Табела 34. Инхибиција формирања хидроксил радикала у присуству деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина OH aнтирадикалска активност IC50 ( М) * Имино деривати Стандард 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b Asc 15,9±1,3 13,5±1,5 13,7±1,7 14,1±1,3 12,3±1,6 12,2±2,4 17,3±2,1 18,9±1,8 19,0±2,3 Амино деривати 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c 6,2±2,1 7,8±1,3 9,7±1,9 8,5±1,2 4,1±1,9 5,7±2,2 6,0±1,8 7,8±1,5 * IC50 је средња вредност три мерења Asc - аскорбинска киселина Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 118 Табела 35. Резултати линеарне регресионе анализе за OH антирадикалску методу једначина грешка Коефицијент корелације Вреоватноћа Стандардна девијација Број узетих тачака Изузете тачке Yi = A + B Xi A B R P SD N 61b Yi = -72,80 + 1,54 Xi 19,21 0,32 0,91 0,00483 10,34 7 0 62b Yi = -67,54 + 1,43 Xi 16,41 0,27 0,92 0,00313 9,50 7 0 63b Yi = -71,33 + 1,51 Xi 18,64 0,31 0,91 0,00455 10,22 7 0 64b Yi = -68,43 + 1,45 Xi 17,21 0,28 0,92 0,00369 9,81 7 0 65b Yi = -67,01 + 1,42 Xi 15,26 0,25 0,93 0,00233 8,97 7 0 66b Yi = -68,34 + 1,45 Xi 15,93 0,26 0,93 0,00264 9,19 7 0 67b Yi = -73,71 + 1,57 Xi 19,57 0,33 0,91 0,00502 10,42 7 0 68b Yi = -72,44 + 1,56 Xi 18,47 0,31 0,91 0,00415 10,04 7 0 61c Yi = -65,28 + 1,34 Xi 15,58 0,24 0,93 0,00278 9,29 7 0 62c Yi = -68,48 + 1,42 Xi 17,44 0,28 0,98 0,0039 9,92 7 0 63c Yi = -66,01 + 1,38 Xi 20,99 0,34 0,87 0,00952 11,79 7 0 64c Yi = -65,99 + 1,37 Xi 19,55 0,31 0,89 0,00712 11,15 7 0 65c Yi = -60,71 + 1,24 Xi 15,94 0,25 0,91 0,0039 9,92 7 0 66c Yi = -61,18 + 1,26 Xi 16,70 0,26 0,91 0,00465 10,26 7 0 67c Yi = -64,15 + 1,32 Xi 16,87 0,26 0,91 0,00417 10,05 7 0 68c Yi = -62,64 + 1,30 Xi 21,38 0,34 0,86 0,01199 12,32 7 0 Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 119 На основу резултата приказаних у табели 34 констатује се да деривати амино-4- хидроксикумарина (61c-68c) представљају јаче инхибиторе формирања OH радикала у односу на деривате имино-4-хидроксикумарина (61b-68b). IC50 вредности за серију деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) су у интервалу од 12,2 М до 18,9 М. Концентрације деривата амино-4-хидрокикумарина (61c-68c) потребне за 50 % инхибицију OH радикала налазе се у интервалу од 4,1 М до 9,7 М. У серији деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) највећу активност показује једињење са m-нитрофенил (66b) и p-нитрофенил (65b) фармакофорама чије IC50 вредности су 12,2 М и 12,3 М. Јака OH антирадикалска активност је уочена и код сва три толилимино супстрата (62b-64b) са IC50 вредностима од 13,5 М, 13,7 М и 14,1 М. Једињење са фенилимино фармакофором (61b) при IC50 вредности од 15,9 М показује средњу активност, док једињење са бензил (67b) и -(CH2)4COOH (68b) фармакофорама показују слабу активност чије IC50 вредности су 17,3 М и 18,9 М. У серији деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) једињење са p- нитрофенил фармакофором (65c) показује највећу антиоксидантну активност чија IC50 износи 4,1 М. Средњи ниво активности је забележен код једињења са фенил (61c), m-нитрофенил (66c) и бензил (67c) фармакофорама чије IC50 вредности су: 6,2 М, 5,7 М и 6,0 М. Остала једињења имају IC50 вредности у опсегу од 7,8 М до 9,7 М што указује на слабу активност. У компарацији са аскорбинском киселином као стандардом чија IC50 износи 19,0 М сви тестирани кумарини поседују већу активност. Увођење метил групе на бензенски прстен води повећању активности, с тим што антиоксидативна активност зависи и од типа супституције и природе супституента на бензенском прстену. У групи фенил и толилимино деривата (61b-64b) активност опада следећим редом: p > m > o > фенил. У групи фенил и толиламино деривата (61c-64c) увођење метил супституента на бензенски прстен условљава слабљење активности и она опада следећим редом: фенил > o > p > m. Везивање нитро групе на Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 120 бензенски прстен за резултат има повећање активности и за имино и за амино деривате. Презентовани резултати показују да промена имино групе у амино групу доприноси добијању супстрата са већом OH антирадикалском активношћу, што је у сагласности са чињеницом да се добијају једињења која имају један водоников атом више расположив за реакцију са хидроксил радикалом. Такође, хидроксил радикали су значајно реактивинији (брзина реакције је ограничена процесом дифузије) у односу на DPPH радикале, односно хидропероксил радикале настале при процесу липидне пероксидације, те је очекивано да су концентрације потребне за елиминацију 50 % хидроксил радикала насталих у Фентоновој реакцији ниже и не могу се компарирати са резултатима ова два експеримента. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 121 3.3. Антимикробна активност нових деривата 4-хидроксикумарина 3.3.1. Антибактеријска активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина (49c-59c) у in vitro условима Антибактеријска активност (MIC у g/mL) синтетисаних 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина је одређена макродилуционом методом уз визуелну детекцију бактеријских спора на основу замућења. У експерименту је испитивана антибактеријска активност на десет бактерија (грам позитивне: Bacillus mycoides (FAB B1), Bacillus subtilis (FAB B2) и Staphilococcus aureus (ATCC 25923); грам негативне: Agrobacterium tumefaciens (FAB 231), Enterobacter cloaceae (FAB 22), Erwinia carotovora (FAB 73), Escerichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (FAB 26), Pseudomonas fluorescens (FAB 097) и Pseudomonas glycinea (FAB 111)). Резултати антибактеријске активности испитиваних деривата кумарина у односу на стандард стрептомицин приказани су у табели 36 и показују да испитивана једињења показују мањи ниво активности у односу на стандард. Антибактеријска активност тестираних кумаринских супстрата је у опсегу MIC вредности од 31,25 g/mL до 500 g/mL. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 122 Табела 36. Антибактеријска активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) Бактерија 49c 50c 51c 52c 53c 54c 55c 56c 57c 58c 59c S* Грам + B. mycoides 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 7,81 B. subtilis 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 7,81 S. aureus 125 62,5 125 125 62,5 62,5 250 250 250 31,25 125 31,25 Грам - A. tumefaciens 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 250 31,25 62,5 7,81 E. cloaceae 125 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 1,95 E. carotovora 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 250 31,25 62,5 7,81 E. coli 125 125 500 62,5 62,5 125 125 125 250 62,5 125 31,25 K. pneumoniae 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 1,95 P. fluorescens 62,5 62,5 62,5 125 62,5 31,25 62,5 62,5 31,25 125 62,5 7,81 P. glycinea 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 7,81 * S Стрептомицин Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 123 Највећа активност је констатована код једињења са m-нитрофенил фармакофором (58c) при концентрацији од 31,25 g/mL према бактерији S. aureus, која је на нивоу активности стрептомицина исте концентрације. Једињења са метил (50c), -C6H4SO3H (53c) и m-толил (54c) фармакофорама су активна на S. аureus у присуству дупло веће концентрације. Јака активност је уочена и код једињења са -C6H4SO3H (53c) и m-нитрофенил (58c) фармакофорама (MIC 62,5 g/mL) према бактерији E. coli, показујући за 50 % слабију активност у поређењу са активношћу стрептомицина. Према осталим дериватима кумарина испитиване бактерије су резистентне. У светлу резултата датих у табели 36 констатује се да антибактеријска активност синтетисаних кумарина зависи од природе супституента везаног за аминотиазолински део молекула. Највећа активност се постиже увођењем m-нитрофенил фармакофоре. При концетрацији од 31,25 g/mL једињење 73c инхибира раст бактерија B. mycoides, B. subtilis, S. aureus, A. tumefaciens, E. carotovora и K. pneumoniae. При истој MIC вредности супстрати са m-толил (69c) и o-толил (72c) фармакофорама инхибирају раст бактерија P. fluorescens и P. glycinea. Најслабија активност (MIC 500 g/mL) је забележена у случају деривата 4-хидрокси бензојеве киселине (51c) према бактерији E. coli. Такође, једињења 55c, 56c и 57c као деривати n-пентанске киселине, о-толил амина и диетил амина показују слабу активност према бактерији S. aureus (MIC вредности су 250 g/mL). При истој концетрацији, једињење са о-толил фармакофором (57c) инхибира раст бактерија S. aureus, A. tumefaciens, E. carotovora и E. coli. Вредности MIC од 62,5 g/mL су доминантне за преостала испитивана једињења са различитим функционалним групама. Нема литературних података који би указивали на молекулски ниво антибактеријске активности синтетисаних 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 124 3.3.2. Антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина (49c-59c) у in vitro условима Антифунгална активност синтетисаних 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина је одређена применом макродилуционе методе уз визуелно праћење појаве замућења (након 72 часа) као констатације присуства фунгалних спора. Антифунгална активност је одређена на једанаест врста гљива (Ampelomyces quisqualis (DBFS 90), Aspergillus flavus (ATCC 9170), Aspergillus fumigatus (DBFS 310), Botrytis cinerea (DBFS 133), Candida albicans (ATCC 10259), Fusarium oxysporum (DBFS 292), Fusarium solani (DBFS 112), Mucor mucedo (ATCC 52568), Paecilomyces variotii (ATCC 22319), Penicillium perpurescens (DBFS 418), Penicillium verrucosum (DBFS 262) и Trichoderma harzianum (DBFS 379)), а резултати су представљени у табели 37. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 125 Табела 37. Антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) Гљива 49c 50c 51c 52c 53c 54c 55c 56c 57c 58c 59c K* A. quisquialis 62,5 31,25 125 125 62,5 62,5 125 62,5 125 31,25 62,5 3,9 A. flavus 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 3,9 A. fumigatus 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 3,9 B. cinerea 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 1,95 C. albicans 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 125 31,25 62,5 1,95 F. oxysporum 62,5 31,25 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 3,9 F. solani 62,5 62,5 125 125 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 3,9 M. mucedo 62,5 31,25 125 125 62,5 31,25 125 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 P. variotii 62,5 31,25 62,5 125 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 62,5 1,95 P.purpurescens 62,5 31,25 125 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 31,25 62,5 3,9 P. verrucosum 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 3,9 T. harsianum 62,5 31,25 62,5 125 62,5 62,5 125 62,5 62,5 31,25 62,5 7,8 * K Кетоконазол Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 126 Антифунгална активност испитиваних деривата кумарина је у опсегу концетрација од 31,25 g/mL до 125 g/mL. Као и у случају антибактеријске активности, и антифунгална активност 2-аминотиазолинских деривата је нижа у односу на стандард кетоконазол. Висок ниво антифунгалне активности, еквивалентан стандарду, измерен је код једињења са метил (50c), m-толил (54c) и m-нитрофенил (58c) фармакофорама према гљиви M. mucedo и MIC вредности су 31,25 g/mL, док су све испитиване гљиве резистентне према осталим дериватима кумарина као потенцијалним антифунгалним једињењима. Саглано наведеним резултатима (Табела 37) може се констатовати да хемијска структура функционалне групе на аминотиазолинском делу молекула је одговорна за ниво антифунгалне активности тестираних деривата кумарина. Увођењем метил, односно m-нитрофенил фармакофоре добијају се супстрати 50c и 58c који показују висок ниво активности. При концетрацији од 31,25 g/mL једињење 50c инхибира раст гљива: A. quisquialis, C. albicans, F. oxysporum, M. mucedo, P. variotii, P. purpurescens, P. verrucosum и T. harsianum. При истој MIC вредности једињење 58c инхибира раст гљива B. cinerea, C. albicans, F. oxysporum, M. mucedo, P. variotii, P. purpurescens, P. verrucosum и T. harsianum. Једињење са m-толил фармакофором (54c) при концетрацјији од 31,25 g/mL инхибира раст гљива: B. cinerea, C. albicans и M. mucedo. Низак ниво активности констатован је у случају једињења са p-нитрофенил фармакофором (52c) које при MIC вредности од 125 g/mL инхибира раст гљива A. quisquialis, F. solani, M. mucedo, P. variotii и T. harsianum. Вредности MIC од 62,5 g/mL су доминантне за преостала испитивана једињења са различитим функционалним групама. Нема литературних података који би указивали на молекулски ниво антифунгалне активности синтетисаних 2-аминотиазолинских деривата 4-хидроксикумарина. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 127 3.3.3. Антибактеријска активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c-68c) у in vitro условима Антибактеријска активност (MIC у g/mL) имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина је одређена применом микродилуционе методе, уз визуелну детекцију бактеријских спора употребом ресазурина као индикатора и промене боје из плаве у љубичасту, односно црвену. У експеримент је укључено 13 врста бактерија, од којих су пет грам позитивне (Bacillus mycoides (FSB 1), Bacillus subtilis (FSB 2), Micrococcus lysodeikticus (ATCC 4698), Staphilococcus aureus (ATCC 25923) и Staphilococcus aureus (FSB 30)), а преосталих осам грам негативне (Azotobacter chroococcum (FSB 14), Enterobacter cloaceae (FSB 22), Erwinia carotovora (FSB 31), Escerichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (FSB 26), Pseudomonas fluorescens (FSB 28), Pseudomonas glycinea (FSB 40) и Pseudomonas phaseolicola (FSB 29)). Резултати антимикробне активности испитиваних деривата кумарина сумарно су приказани у табели 38 и показују да сва тестирана једињења показују антибактеријску активност. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 128 Табела 38. Антибактеријска активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) бактерија Грам + Грам - B.m. B.s. M.l. S.a. S.a.(i) A.c. En.cl. Er.ca. Es.co. K.p. P.fl. P.gl. P.ph. 61b 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 125 62,5 125 62,5 15,6 62,5 62,5 62,5 62b 125 125 125 125 62,5 62,5 62,5 125 62,5 31,25 62,5 31,25 62,5 63b 31,25 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 31,25 62,5 62,5 62,5 64b 62,5 31,25 62,5 62,5 125 62,5 125 62,5 62,5 15,6 62,5 31,25 62,5 65b 62,5 15,6 125 62,5 31,25 31,25 62,5 31,25 125 15,6 62,5 31,25 125 66b 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 62,5 62,5 125 7,8 125 31,25 125 67b 62,5 31,25 62,5 125 31,25 125 125 31,25 31,25 15,6 62,5 15,6 31,25 68b 31,25 31,25 31,25 125 62,5 31,25 125 62,5 31,25 31,25 62,5 62,5 31,25 61c 15,6 7,8 3,9 3,9 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 3,9 7,8 62,5 62c 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 3,9 7,8 31,25 63c 15,6 15,6 3,9 7,8 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 3,9 7,8 31,25 64c 62,5 62,5 3,9 15,6 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 15,6 3,9 7,8 62,5 65c 15,6 31,25 3,9 15,6 15,6 3,9 7,8 7,8 7,8 7,8 3,9 7,8 15,6 66c 15,6 7,8 3,9 31,25 15,6 3,9 7,8 7,8 15,6 15,6 7,8 15,6 7,8 67c 15,6 31,25 3,9 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 31,25 7,8 3,9 7,8 15,6 68c 7,8 7,8 7,8 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 15,6 7,8 3,9 7,8 7,8 S * 7,8 7,8 1,95 15,6 7,8 7,8 1,95 7,8 31,25 1,95 7,8 7,8 3,9 * S Стрептомицин; B.m.-Bacillus mycoides (FSB 1); B.s.-Bacillus subtilis (FSB 2); M.l.-Micrococcus lysodeikticus (ATCC 4698); S.a.- Staphilococcus aureus (ATCC 25923); S.a.(i)-Staphilococcus aureus (FSB 30); A.c.-Azotobacter chroococcum (FSB 14); En.cl- Enterobacter cloaceae (FSB 22); Er.ca-Erwinia carotovora (FSB 31); Es-co-Escerichia coli (ATCC 25922); K.p.-Klebsiella pneumoniae (FSB 26); P.fl.-Pseudomonas fluorescens (FSB 28); P.gl-Pseudomonas glycinea (FSB 40); P.ph.-Pseudomonas phaseolicola (FSB 29). Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 129 MIC вредности деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) се налазе у опсегу од 7,8 g/mL до 125 g/mL. MIC вредности деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) се налазе у опсегу од 3,9 g/mL до 62,5 g/mL. Деривати амино-4-хидроксикумарина показују већи ниво антибактеријске активности у поређењу са дериватима имино-4-хидроксикумарина. У серији имина највећу антибактеријску активност показују једињења са бензил (67b) и -(CH2)4COOH (68b) фармакофором. При MIC вредности која истовремено одговара стандарду, од 31,25 g/mL, активна су према E. coli. Такође, висок ниво активности (50 % вредности стандарда) према E. coli показују и једињења са фенил и толил фармакофорама (61b-64b). Испитиване бактерије су у доброј мери резистентне на присуство осталих испитиваних деривата имино-4-хидроксикумарина. Из серије деривата амино-4-хидроксикумарина највећу активност показује једињење са фенил, толил и p-нитрофенил фармакофорама (61c-65c) и са MIC вредности од 7,8 g/mL је четири пута активнији према E. coli у односу на примењени стандард. Такође, при концетрацији од 3,9 g/mL једињења са фенил (61c), p-толил (62c), бензил (67c) и -(CH2)4COOH (68c) фармакофорама делују антибактеријски на S. aureus (ATCC 25923), показујући четири пута већу активност у поређењу са активношћу стрептомицина (MIC 15,6 g/mL). Једињење са о-толил фармакофором (64c) чија MIC износи 62,5 g/mL показује слабу антибактеријску активост према B. mycoides, B. subtilis, K. pneumoniae и P. phaseolicola. Вредности MIC испитиваних деривата кумарина према тест бактеријама варирају у зависности од природе супституента на имино, односно амино азоту. Јаку инхибицију бактеријског раста показује једињење са бензил фармакофором (67b). При концетрацији једињења 67b од 15,6 g/mL инхибира се раст K. pneumoniae и P. glycinea, а при MIC од 31,25 g/mL инхибира се раст B. subtilis, S. aureus (FSB 30), E. carotovora, E. coli и P. phaseolicola. Такође, јака активност је уочена и код Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 130 једињења са -(CH2)4COOH фармакофором (68b), које при MIC од 31,25 g/mL делује антибактеријски на B. mycoides, B. subtilis, M. lysodeikticus, A. chroococcum, E. coli, K. pneumoniae и P. phaseolicola. Код преосталих испитиваних деривата кумарина са различитим функционалним групама на азоту имино групе констатован је низак ниво активности. Трансформација имино групе у амино групу за резултат има значајно увећање антибактеријске активности. Изузетак је констатован само у случају једињења са m-толил (63c) и о-толил (64c) фармакофорама према B. mycoides, будући да одговарајући имини имају већу активност. Једињења са m-толил (62c) и -(CH2)4COOH (68c) фармакофором поседују највећу активност. Изузев према P. phaseolicola (за супстрат 62c), односно према E. coli (за супстрат 68c), MIC вредност код осталих бактерија је у опсегу од 3,9 g/mL до 7,8 g/mL. Најслабија активност је забележена у случају једињења са о-толил фармакофором (64c), јер се тек при концетрацији од 62,5 g/mL инхибира раст бактерија B. mycoides, B. subtilis и P. phaseolicola. Нема литературних података који би указивали на молекулски ниво антибактеријске активности деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино- 4-хидроксикумарина. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 131 3.3.4. Антифунгална активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c-68c) у in vitro условима Антифунгална активност (MIC у g/mL) деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c-68c) је одређена применом микродилуционе методе уз визуелну детекцију фунгалног раста степеном замућења у линији јамица. У експерименту је праћена антифунгална активност кумаринских једињења на осам врста гљива (Aspergillus glaucus (FSB 32), Aspergillus niger (FSB 31), Candida albicans (ATCC 10259), Fusarium oxysporum (FSB 91), Penicillium verrucosum (FSB 21), Trichoderma longibrachiatum (FSB 13), Trichoderma harzianum (FSB 12) и Trichoderma viride (FSB 11)). Резултати антифунгалне активности деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина сумарно су приказани у табели 39 и показују да сва тестирана једињења показују антифунгалну активност. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 132 Табела 39. Антифунгална активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина MIC вредности тестираних једињења ( g/mL) гљива A.gl. A.n. C.a. F.o. P.ve. T.l. T.h. T.v. 61b 62,5 125 31,25 31,25 62,5 31,25 31,25 31,25 62b 62,5 125 31,25 62,5 62,5 31,25 125 125 63b 62,5 125 31,25 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 64b 125 31,25 31,25 125 31,25 31,25 31,25 31,25 65b 31,25 31,25 125 125 62,5 62,5 62,5 62,5 66b 62,5 31,25 125 125 31,25 62,5 62,5 31,25 67b 31,25 125 31,25 62,5 62,5 31,25 62,5 31,25 68b 31,25 62,5 31,25 62,5 62,5 31,25 125 125 61c 62,5 125 125 125 125 62,5 62,5 125 62c 125 125 125 62,5 125 62,5 62,5 125 63c 62,5 125 125 62,5 125 62,5 62,5 62,5 64c 125 250 250 125 125 62,5 62,5 62,5 65c 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 125 125 62,5 66c 62,5 125 62,5 125 125 125 125 125 67c 62,5 250 62,5 125 62,5 250 125 62,5 68c 62,5 250 125 250 125 250 125 62,5 K * 7,8 7,8 1,95 3,9 3,9 7,8 7,8 7,8 K * Кетоконазол; A.gl-Aspergillus glaucus (FSB 32); A.n-Aspergillus niger (FSB 31); C.a.- Candida albicans (ATCC 10259); F.o.-Fusarium oxysporum (FSB 91); P.ve-Penicillium verrucosum (FSB 21); T.l.-Trichoderma longibrachiatum (FSB 13); Trichoderma harzianum (FSB 12); T.v.-Trichoderma viride (FSB 11). Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 133 MIC вредности за деривате имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) се налазе у опсегу од 31,25 g/mL до 125 g/mL. MIC вредности за деривате амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) се налазе у опсегу од 62,5 g/mL до 250 g/mL. Генерално гледано, једињења 61b-68b показују већу активност у поређењу са активношћу једињења 61c-68c, уз констатацију да ни један од тестираних кумарина не поседује активност на нивоу активности стандарда за упоређивање. Према вредностима MIC тестираних једињења укључених у испитивање антифунгалне активности може се констатовами да тај вид активности првенствено зависи од хемијске структуре супституента на имино, односно амино азоту. Највећу активност показује једињење са o-толил фармакофором (64b). При концетрацији од 31,25 g/mL инхибира раст шест од осам гљива, односно A. niger, C. albicans, P. verrucosum, T. longibrachiatum, T. harzianum и T. viride. Увођењем фенил групе на имино азот, једињење 61b, са MIC вредности од 31,25 g/mL инхибира раст C. albicans, T. longibrachiatum, T. harzianum и T. viride. Такође, при истој концетрацији једињење са бензил фармакофором (67b) инхибира раст гљива A. glaucus, C. albicans, T. longibrachiatum и T. viride. Најслабију активност показује једињење са p-толил фармакофором (62b) које инхибира развој гљива A. niger, T. harzianum и T. viride при концетрацији од 125 g/mL. Антифунгална активност деривата амино-4-хидроксикумарина (61c-68c) према тест гљивама је прилично слаба и неупоредива са активношћу кетоконазола. Једињење са p-нитрофенил фармакофором (65c) показује највећу активност. При концентрацији од 62,5 g/mL делује антифунгално на шест од осам тест гљива. У поређењу са активношћу кетоконазола (MIC 7,8 g/mL), једињење 65c показује осам пута слабију активност (MIC 62,5 g/mL) према гљивама A. glaucus, A. niger и T. viride, а према F. oxysporum и P. verrucosum показује шеснаест пута слабију активност (MIC 62,5 g/mL), у поређењу са активношћу кетоконазола (MIC 3,9 g/mL). Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 134 Најслабију активност и вредност MIC од 250 g/mL показује једињење са -(CH2)4COOH фармакофором (68c) према гљивама A. niger, F. oxysporum и T. longibrachiatum. Нема литературних података који би указивали на молекулски ниво антифунгалне активности синтетисаних деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 135 3.4. In vitro антикоагулантна активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина (61b-68b, 61c-68c) Протромбинско време тестираних кумаринских једињења је одређено модификованом методом по Квику 77. У систем хумана плазма-кумарински дериват одређене концентрације, додају се јони калцијума и претходно активирани ензим trombokinaza. За протромбинско време се узима време од момента додатка ензима до тренутка визуелне детекције формирања коагулума. У табели 40 су приказани резултати коагулације хумане плазме у присуству испитиваних кумаринских деривата, оралних кумаринских антикоагуланата варфарина и аценокумарола као стандарда и хумане плазме без додатка антикоагулатна. Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 136 Табела 40. In vitro антикоагулантна активност деривата имино-4-хидроксикумарина и деривата амино-4-хидроксикумарина Протромбинско време (PT) имино деривата 4-хидроксикумарина у секундама * 61b 62b 63b 64b 65b 66b 67b 68b W Ac C 20±0,3 21±0,2 22±0,3 18±0,4 22±0,3 18±0,1 16±0,1 27±0,3 18±0,3 26±0,1 12±0,2 Протромбинско време (PT) амино деривата 4-хидроксикумарина у секундама * 61c 62c 63c 64c 65c 66c 67c 68c W Ac C 21±0,4 20±0,2 22±0,2 23±0,2 23±0,3 20±0,1 23±0,2 20±0,1 18±0,4 26±0,1 12±0,2 +резултати су средња вредност три експеримента W-варфарин Ac-аценокумарол C-без стандардног једињења односно кумаринског супстрата Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 137 Експериментални резултати показују да сва тестирана једињења показују антикоагулантну активност. На основу табеларно презентованих резултата може се видети да стандардна хумана плазма има време коагулације од 12 секунди, док системи хумане плазме и тестираног кумаринског једињења показују знатно дуже време формирања фибрина, које се налази у интервалу од 16 секунди до 27 секунди за деривате имино-4- хидроксикумарина (61b-68b) и 20 секунди до 23 секунде за деривате амино-4- хидроксикумарина (61c-68c). Време коагулације варфарина је 18 секунди, а аценокумарола 26 секунди. У серији деривата имино-4-хидроксикумарина (61b-68b) највећу активност показује једињење које има фармакофору типа -(CH2)4COOH (68b) са протромбинским временом од 27 секунди, и у поређењу са варфарином и аценокумаролом је ефикаснији антикоагулант. Средњу антикоагулантну активност (PT вредности су у опсегу од 20 секунди до 22 секунде) су показала једињења са фенил (61b), p-толил (62b), m-толил (63b) и p-нитрофенил (65b) фармакофором у поређењу са активношћу аценокумарола, али знатно јачу активност у односу на варфарин. Слабу активност у односу на активност аценокумарола показују једињења са бензилимино (67b) (PT 16 секунди) и m-нитрофенилимино (66b) (PT 18 секунди) фармакофорама. За једињење са m-нитрофенилимино фармакофором (66b) уочена је активност еквивалентна активности варфарина. Деривати амино-4-хидроксикумарина показују слабију антикоагулативну активност у односу на активност аценокумарола. Највећа активност је констатована код једињења са о-толил (64c), p-нитрофенил (65c) и бензил (67c) фармакофорама, који при PT вредности од 23 секунде показују јачу антикоагулантну активност у односу на активност варфарина (PT 18 секунди). Такође, при PT вредностима које су у опсегу од 20 секунди до 22 секунде и остали тестирани супстрати показују јачу активност у поређењу са активношћу варфарина. Антикоагулативна активност деривата 4-хидроксикумарина заснива се на инхибицији ензима vitamin K 2,3-epoksid reduktaze 86 који се налази у мембрани Докторска дисертација Резултати и дискусија мр Ненад Вуковић 138 ендоплазматичног ретикулума. Каталитички центар ензима чине два остатка цистеина на положајима 132 и 135. Примарну структуру активног центра чине остаци амино киселина 130-140 Ala-Phe-Cys-Ile-Val-Cys-Ile-Thr-Tyr-Ala из α-хеликса, при чему се сматра да хидрофобни остатак Thr(138)-Tyr(139)-Ala(140) представља место везивања 4-хидроксикумаринских супстрата 30, 31. Хидрофобне карактериситике -C=N-(CH2)4COOH фармакофоре на положају С-3 у молекулу 4-хидроксикумарина омогућавају јаку интеракцију са хидрофобним активним центром (Thr(138)-Tyr(139)-Ala(140)), а самим тим и јаку инхибицију ензима vitamin K 2,3-epoksid reduktaze од стране једињења 68b. Са друге стране, трансформација имино групе у амино групу за последицу има добијање фармакофоре (-C-NH-(CH2)4COOH) чије су хидрофобне карактеристикаме мање, условљавајући слабију активност једињења 84c. Амино деривати са фенил, о-толил, p-нитрофенил, m-нитрофенил и бензил фармакофорама (61c, 64c-67c) показују незнатно јачу антикоагулантну активност у односу на одговарајуће имино деривате, док једињење са m-толил групом (63c) задржава активност имина из ког је изведен. У овим случајевима умањење хидрофобних карактеристика фармакофоре везане за положај С-3 не условљава слабију активност. Заправо, у иминима не постоји могућност слободне ротације хидрофобне фармакофоре око C=N групе, што за резултат има њен отежан прилаз хидрофобном џепу, а самим тим и слабију интеракцију лиганд-рецептор, што ће се одражавати на њихову слабију активност. Докторска дисертација Литература мр Ненад Вуковић 139 4. ЛИТЕРАТУРА 1. F. M. Dean, Naturally Occuring Oxigen Ring Compounds, Butterworth, London, 1963. 2. T. Asao, G. Buchi, M. M. Abdel-Kader, S. B. Chang, E. L. Wick, G. N. Wogan, J. Am. Chem. Soc., 85, 1706 (1963) . 3. B. P. Moore, Nature, 195, 1101 (1962). 4. С. Сукдолак, С. Солујић, Н. Вуковић, Хемија и биохемија кумарина, ПМФ Крагујевац, 2007. 5. Х. А. Кузнецова, Природние Кумарини и Фурокумарини, Наука, Ленинград, 1967. 6. F. M. Dean, Naturally Occuring Oxigen Ring Compounds, Butterworth, London, 1963. 7. R. D. H. Murray, Nat. Prod. Rep., 8, 591-624 (1989). 8. O. Pelkonen, H. Raunio, A. Rautio, J. Mäenpää, M. A. Lang, J. Irsh. Coll. Phys. Surg., 22, 24 (1993). 9. S. Cavar, F. Kovac, M. Maksimovic, Food Chemistry, 117, 1, 135-142 (2009). 10. P. Bermejo, E. Pinero, A. M. Villar, Food Chemistry, 110, 436–445 (2008). 11. S. Surveswaran, Y. Z. Cai, H. Corke, M. Sun, Food Chemistry, 102, 938–953 (2007). 12. C. R. Wu, M. Y. Huang, Y. T. Lin, H. Y. Ju, H. Ching, Food Chemistry, 104, 1464– 1471 (2007). 13. B. G. Lake, Food and Chemical Toxicology, 37, 423–453 (1999). 14. C. Sproll, W. Ruge, C. Andlauer, R. Godelmann, D. W. Lachenmeier, Food Chemistry, 109, 462–469 (2008). 15. V. Panteleon, I. K. Kostakis, P. Marakos, N. Pouli, I. Andreadou, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 18, 5781-5784 (2008). 16. S. X. Chen, P. Schopfer, Eur. J. Biochem., 260, 726-735 (1999). 17. T. Symeonidis, K. C. Fylaktakidou, D. J. Hadjipavlou-Litina, K. E. Litinas, Food Chemistry, 44, 5012–5017 (2009). 18. J. Yu et all, J. Agric. Food Chem., 53, 2009-2014 (2005). Докторска дисертација Литература мр Ненад Вуковић 140 19. H. C. Lin et all, Biochem. Pharmacol., 75, 1416 (2008). 20. T. Uhita, D. Mizuno, T. Taumra, T. Yamahawa, S. Nojima, J. Pharm. Soc. Japan, 71, 234 (1951). 21. M. A. Al-Haiza, M. S. Mostafa, M. Y. El-Kady, Molecules, 8, 275-286 (2003). 22. А. Oliva, E. Lahoz, R. Contillo, G. Aliotta, J. Chem. Ecology, vol 25, No 3, 519 (1999). 23. D. Ferroud, J. Collard, M. Klich, C. D. Hamelin, P. Mauvais, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 9, 2881-2886 (1999). 24. Anne-Marie Periers et all, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 10, 161-165 (2000). 25. B. Musicki et all, Tetrahedron Lett., 44, 9259-9262 (2003). 26. C. D. Marple, M. J. McIntyre, The Am. J. of Nursing, 56, 7 875-879 (1956). 27. F. W. Deckret, Souther Medical Journal, 67, 10 1191-1202 (1974). 28. M. J. Fasco, L. M. Principe, W. A. Walsh, P. A. Friedman, Biochemistry, 22, 5655- 5660 (1983). 29. I. Mukharji, R. B. Silverman, Biochemistry, 82, 2713-2717 (1985). 30. R. Wallin, S. M. Hutson, Trends in Molecular Medicine, 10, 7, 299-302 (2004). 31. L. Goodstadt, C. P. Ponting, Trends in Molecular Medicine, 29, 6, 289-292 (2004) 32. M. J. Fasco, L. M. Principe, J. Biol. Chem., 10, 4894-4901 (1982). 33. J. M. Neilson, A. W. Mollison, Brit. Med. J., 1214-1217 (1957). 34. R. B. Arora, C. N. Mathur, Brit. J. Pharmacol., 20, 29-35 (1963). 35. I. Chmielewska, J. Cieslak, Tetrahedron, 4, 135 (1958). 36. E. J. Valente, E. C. Lingafelter, W. R. Poter, K. F. Trager, J. Med. Chem., 20, 11, 1489 (1977). 37. P. Meunier, C. Mentzer, J. Lajudie, Bull. Soc. Chim. Biol., 29, 977 (1947). 38. I. Alami, S. Mari, A. Clérivet, Phytochemostry, 48, 5, 771-776 (1998). 39. S. S. Hanmantgad, V. N. Biradar, S. Nanjappa, Arch. Pharm., 314, 435-439 (1981). 40. M. Ghate, D. Manohar, V. Kulkarni, R. Shobha, S. Y. Kattimani, Eur. J. Med. Chem., 38, 297-302 (2003). 41. M. C. Toimil et all, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 12, 783-786 (2002). Докторска дисертација Литература мр Ненад Вуковић 141 42. J. Duarte, I. Vallejo, F. P. Vizcaino, R. Jimenez, A. Zarzuelo, J. Tamargo, Planta Med., 63, 3, 233-236 (1997). 43. E. Smith, N. Hosansky, W. G. Bywater, E. E. van Tamelen, J. Am. Chem. Soc., 79, 13, 3534–3540 (1957). 44. M. Monquin, C. Macre, Presse Med., 68, 257 (1960). 45. E. M. Bickoff, J. Anim. Sci., 19, 4 (1960). 46. R. Bakhchinian, F. Terrier, S. Kirkiacharian, M. R. Rigon, F. Bouchoux, E. Cerede, Il Farmaco, 58, 1201-1207 (2003). 47. V. N. Gupta, B. R. Sharima, R. B. Avora, J. of Sci. & Indust. Res., 20B, 300, (1961) 48. J. W. Greenawalt, C. Schnaitman, J. Cell Biol., 46, 173-179 (1970). 49. F. Chimenti, D. Secci, A. Bolasco, P. Chimenti, A. Granese, O. Befani, P. Turini, S. Alcaro, F. Ortuso, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 14, 14, 3697-3703 (2002). 50. A. J. Trevor, N. Castagnoli, P. Caldera, R. R. Ramsay, T. P. Singer, Life Sci., 40, 8, 713-719 (1987). 51. A. J. Trevor, N. Castagnoli, T. P. Singer, Toxicology, 49, 513-519 (1988). 52. F. A. Hodges, J. R. Zust, H. R. Smith, A. A. Nelson, B. H. Armbrecht, A. D. Compbell, Science, 145, 1439 (1964). 53. R. D. Hartley, B. E. Nesbitt, J. O. Kelly, Nature, 198, 1057 (1963). 54. M. S. Masari, R. E. Lundin, Y. R. Page, V. C. Garcia, Nature, 215, 753 (1967). 55. C. Spino, M. Dodier, S. Sotheeswaran, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 8, 3475-3478 (1998). 56. P. Karlson, Biokemija, Školska knjiga, Zagreb, 1993. 57. A. Leitao et all, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 14, 2199-2204 (2004). 58. L. W. Wattenberg, L. K. T. Low, A. V. Fladmoe, Cancer Res., 39, 1651 (1979). 59. B. Hagmar, Pathol. Europ., 3, 620 (1968). 60. B. Hagmar, B. Boeryd, Pathol. Europ., 3, 509 (1968). 61. A. B. Smith, P. J. Jerris, Tetrahedron Lett., 21, 711 (1980). 62. M. H. Von Woert, S. H. Palmer, Cancer Res., 29, 1952 (1969). 63. W. G. Cance, E. T. Liu, Breast Canc. Res. Treat., 35, 105-114 (1995). 64. E. B. Yang, D. F. Wang, L. Y. Cheng, P. Mack, Cancer J., 10, 319-324 (1997). Докторска дисертација Литература мр Ненад Вуковић 142 65. Z. M. Nofal, M. I. El-Zahar, S. S. Abd El-Karim, Molecules, 5, 99-113 (2000). 66. E. B. Yang, D. F. Wang, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 260, 682–685 (1999). 67. P. Prieto, M. Pineda, M. Aguilar, Analytical Biochemistry, 269, 337–341 (1999). 68. T. Takao, N. Watanabe, I. Yagi, K. Sakata, Biosci. Biotech. and Biochem., 58, 1780- 1783 (1994). 69. M. Oyaizu, Jap. J. of Nutrit., 44, 307-315 (1986). 70. T. Masude, D. Isibe, A. Jitoe, N. Naramati, Phytochemistry, 33, 3645–3647 (1992). 71. B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge, O. I. Aruoma, Anal. Biochem., 165, 215–219 (1987). 72. С. Солујић, Практикум из биохемије, 2003, ПМФ Крагујевац. 73. М. М. Врвић, Г. Цвијовић-Гојгић, Практикум за микробиолшку хемију, 2003, Хемијски факултет, Београд. 74. Clinical and Laboratory Standards Institute, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Fifteenth Informational Supplement, CLSI Document M100- S15, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 2005. 75. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Approved Standards. NCCLS Document M27-A, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA, 1997. 76. S. A. Sarker, L. Nahar, Y. Kumarasamy, Methods, 42, 321-324 (2007). 77. A. J. Quick, J. Biol. Chem., 109, 73-74 (1935). 78. C. Y. Qian, Z. T. Jin, B. Z. Yin, J. Heterocyclic Chem., 26, 601-604 (1989). 79. R. W. Layer, Chem. Rev., 63 (5), 489–510 (1963). 80. C. O. Kappe and A. Stadtler, Microwaves in Organic and Medicinal Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2005. 81. S. Sukdolak, N. Vuković, S. Solujić, N. Manojlović, Lj. Krstić, J. Heterocycl. Chem. 41, 593-596 (2004). 82. M. Okawa, J. Kinjo, T. Nohara, M. Ono, Biol. Pharm. Bull., 24, 10, 1202-1205 (2001). 83. P. Molyneux, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26, 2, 211-219 (2004). Докторска дисертација Литература мр Ненад Вуковић 143 84. O. I. Aruoma, Free radicals and food additives, London, Taylor and Francis Ltd., pp.17–35, 1991. 85. G. Ozkan, H. Kuleaoan, S. Celik, R. S. Gokturk, O. Unal, Food Control, 18, 509-512 (2007). 86. M. Gebauer, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 15, 2414-2420 (2007). Биографија Ненад Вуковић је рођен 30. 05. 1976. године у Пријепољу, општина Пријепоље, Република Србија. Основну школу и Гимназију је завршио у Пријепољу, а студије хемије на Катедри за хемију, Природно-математичког факултета у Крагујевцу. Последипломске магистарске студије, смер хемија, биохемија је завршио 2003. године на Катедри за хемију, Природно-математичког факултета у Крагујевцу. Запослен је у звању асистента за ужу научну област Биохемија и изводи практичну наставу на предметима Инструменталне структурне методе, Основи органске и биохемијске спектроскопије и Методе анализа токсичних супстанци. Оператер је на гасном хроматографу/масеном спектрометру Agilent 6890N/5975B. Предмет научног истраживања су изоловање и структурна модификација секундарних метаболита биљака и одређивање њихове биохемијске активности. e-mail: nvukovic@kg.ac.rs