УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ Андрија Ћирић ОПТИМИЗАЦИЈА И ВАЛИДАЦИЈА ТЕЧНО- ХРОМАТОГРАФСКЕ МЕТОДЕ ЗА ОДРЕЂИВАЊЕ ФЛАВАНОНА И ЊИХОВИХ ДЕРИВАТА У ФАРМАЦЕУТСКИМ ФОРМУЛАЦИЈАМА И ХРАНИ Докторска дисертација Крагујевац, 2014. I. Аутор Име и презиме: Андрија Ћирић Датум и место рођења: 20.07.1981. године, Краљево Садашње запослење: Aсистент Природно-математичког факултета, Крагујевац II. Докторска дисертација Наслов: Оптимизација и валидација течно-хроматографске методе за одређивање флаванона и њихових деривата у фармацеутским формулацијама и храни Број страница: 261 Број слика: 128 Број библиографских података: 353 Установа и место где је рад израђен: 1. Институт за хемију, Природно-математичког факултета, Универзитета у Крагујевцу, Србија 2. Катедра за аналитичку хемију, Факултета за хемију и хемијску технологију, Универзитета у Љубљани, Словенија Научна област (УДК): Аналитичка хемија (54) Ментор: проф. др Предраг Ђурђевић, Н.О. Аналитичка и неорганска хемија III. Оцена и одбрана Датум пријаве теме: 08.09.2010. године, Одлуком број 790/XII-3 Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације:1877/6, 10.11.2010. године Комисија за оцену подобности теме и кандидата: 1. Др Предраг Ђурђевић, ред. проф. Природно-математичког факултета у Крагујевцу 2. Др Милена Јеликић-Станков, ред. проф. Фармацеутског факултета у Београду 3. Др Радмила Џудовић, ванред. проф. Природно-математичког факултета у Крагујевцу Комисија за оцену докторске дисертације: 1. Др Предраг Ђурђевић, ред. проф. Природно-математичког факултета у Крагујевцу 2. Др Душанка Милојковић-Опсеница, ред. проф. Хемијског факултета у Београду 3. Др Милена Јеликић-Станков, ред. проф. Фармацеутског факултета у Београду 4. Др Татјана Анђелковић, ванред. проф. Природно-математичког факултета у Нишу Комисија за одбрану докторске дисертације: 1. Др Предраг Ђурђевић, ред. проф. Природно-математичког факултета у Крагујевцу 2. Др Душанка Милојковић-Опсеница, ред. проф. Хемијског факултета у Београду 3. Др Милена Јеликић-Станков, ред. проф. Фармацеутског факултета у Београду 4. Др Татјана Анђелковић, ванред. проф. Природно-математичког факултета у Нишу Датум одбране дисертације: 2014. Дуњи и Михајлу Ова дисертација је плод доприноса многих људи који су посредно или непосредно учествовали у њеном обликовању и изради. Рађена је у Институту за хемију, Природно-математичког факултета у Крагујевцу и Факултету за хемију и хемијску технологију, Универзитета у Љубљани. Словенија, под руководством др Предрага Ђурђевића, редовног професора. Захваљујем се др Предрагу Ђурђевићу, који је предложио тему дисертације, руководио њеном израдом и указао ми помоћ током израде и писања. Неизмерну захвалност дугујем др Хелени Просен, ванредном професору Факултета за хемију и хемијску технологију у Љубљани, која је руководила израдом једног дела дисертација и пружила ми несебичну помоћ приликом писања докторске дисертације. Др Милени Јеликић-Станков, редовном професору Фармацеутског факултета у Београду, др Александри Ђурђевић, начелнику инструменталне лабораторије Агенције за лекове и медицинска средства Србије, Београд и др Љубинки Јоксовић, доценту Природно-математичког факултета у Крагујевцу, захваљујем на корисним саветима и сугестијама током израде и прегледа рукописа докторске дисертације.Такође се захваљујем и колегама са Института за хемију Природно-математичког факутета у Крагујевацу на помоћи и подршци приликом израде и писања дисетрације. Посебну захвалност дугујем породици на подршци и разумевању. Списак скраћеница  – Површински напон – Стандарднa девијација одступања поновљених мерења ̅ – Средња вредност мерења 1D – Једноимензионална мапа резолуције 2D – Дводимензионална мапа резолуције 2 – Константа која је приближно једнака 1 3GT – Флаванон 3-глукозид трансфераза 4CL – 4-Кумарил-CoA лигаза 6,8DF –1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8- дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина 6,8DM –1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8- диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина 6F8E – 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-етокси-6- флуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина 6M8F – 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-флуоро-6- метокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина Aext – Екстраполисана вредност апсорбанције Amax – Измерена максимална апсобранција ANS – Антоцианидин синтетаза br – Развучен C4H – Цинамат-4-хидроксилаза CEC – Капиларна електро хроматографија CE–MS – Капиларна електрофореза – масена спектрометрија CHI – Халкон изомераза CHR – Халкон редуктаза CHS – Халкон синтетаза CID – Дисоцијација изазвана сударом CL – Концентрација лиганда CM – Концентрација јона метала CoA – Коензим А CV – Коефицијент варијације CZE – Капиларна зонска електрофореза d – Дублет dd – Дублет дублета DFT – Дихидрофлаванон редуктаза Dm – Дифузиони коефицијент аналита у мобилну фазу DMSO – Диметил-сулфоксид dp – Просечна величина честица пуњења E – Диелектрична константа растварача EI – Удар електрона ESI-MS – Електроспреј јонизациони масени спектрометар FAB-MS – Брзо бомбардовање атома масени спектрометри FHT – Флаванон хидрокситрансфераза FID – Пламени јонизациони детектор FLD – Флуориметријски детектор FLS – Флавонол синтетаза FSI – Флаванон синтетаза GC–MS – Гасна хроматографија – масена спектрометрија HETP – Висина еквивалентна теоретском поду HILIC – Течна хроматографија хидрофилних интеракција HSCCC – Хроматографија брзе измене струје HTLC – Високо-температурна течна фроматографија ICH – Међународна Конференција о Хармонизацији Техничких Захтева за Регистрацију Лекова IFS – Изофлаванон синтетаза IR – Инфрацрвена област електромагнетног зрачења k – Ретенциони фактор Ka – Константа дисоцијације K е – Молекуларни параметар растварача L – Лиганд LAR – Леукоантоцианидин редуктаза LC×LC – Дводимензионална течна хроматографија LC-MS/MS – Течна хроматографија-масена спектрометрија LOD – Граница детекције LOQ – Граница квантификације m – Мултиплет MAE – Микроталасна екстракција MALDI–MS – Масена спектрометрија са ласерском десорпционом јонизацијом потпомогнутом матриксом MEKC – Мицеларна електрокинетичка хроматографија MOX – Моксифлоксацин хидрохлорид N – Број теоретских подова NMR – Нуклеарна магнетна резонанца PAL/TAL – Фенилаланин-тирозин амонијум лаза PDA – Фотодиодни детектор PLE – Течна екстракција при повишеном притиску Pо – Атмосферски притисак R – Универзална гасна константа RP-C18 – Реверзно-фазне C18 колоне RP-HPLC – Реверзно-фазна високо-ефикасна течна хтоматографија Rs – Резолуција између два суседна пика RSD – Релативна стандардна девијација s – Синглет S – Растворак sb – Стандардна девијација SEL – Селективност/специфичност SFE – Суперкритична флуид екстракција SIM – Мониторинг изабраног јона THF – Тетрахидрофуран tr – Ретенционо време UHPLC – Ултра високо-ефикасна течна хроматографија UV – Ултраљубичасто електроматнетно зрачење Vis – Видљива област електромагнетног зрачења W – Ширина пика у основи Нр – Висину еквивалентна теоријском поду који зависи од брзине протока мобилне фазе G0 – Промена стандардне слободне енергије H0 – Промена стандардне енталпије S0 – Промена стандардне ентропије  – Брзина протока мобилне фазе – Коефицијент одређен величином пора, обликом и величином честица Садржај Извод .................................................................................................................................................. 1 Summary .......................................................................................................................................... 4 Увод .................................................................................................................................................... 7 1. ОПШТИ ДЕО ............................................................................................................................ 10 1.1. Флавоноиди ............................................................................................................................11 1.1.1. Историјат флавоноида .......................................................................................... 11 1.1.2. Номенклатура флавоноида ................................................................................... 12 1.1.3. Распрострањеност и улога флавоноида у природним производима ................ 14 1.1.4. Биосинтеза флавоноида ........................................................................................ 16 1.1.5 Физичко-хемијске особине флавоноида .............................................................. 17 1.1.5.1. Липофилност биофлавоноида ...................................................................... 17 1.1.5.2. Киселинско-базне особине флавоноида ...................................................... 18 1.1.5.3. UV/Vis aпсорпциони спектри флавоноида ................................................. 20 1.1.5.4. Флуоресцентни спектри флавоноида .......................................................... 21 1.1.5.5. IR спектри флавоноида ................................................................................. 22 1.1.5.6. NMR спектри флавоноида ............................................................................ 24 1.1.5.7. Масени спектри флавоноида ........................................................................ 27 1.1.6. Комплекси флавоноида са јонима метала ......................................................... 29 1.1.6.1. Карактеризација комплекса флавоноида и метала применом IR спектроскопије .............................................................................................. 35 1.1.6.2. Карактеризација комплекса флавоноида са јонима метала применом масене спектрометрије ................................................................................. 36 1.1.7. Екстракција полифенолних једињења из биљних узорака ............................... 37 1.1.8. Одређивање фенолних једињења ....................................................................... 38 1.1.8.1. Течна хроматографија (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) ........................................................................................................................ 38 1.1.8.2. Гасна хроматографија (GC) .......................................................................... 40 1.1.8.3 Спектрофотометријске методе ...................................................................... 41 1.1.8.4. Друге методе за одвајање и квантификацију фенолних једињења ........... 41 1.1.9. Антиоксидативна активност флавоноида .......................................................... 42 1.1.9.1. Механизам и кинетика антиоксидативне активности флавоноида .......... 44 1.1.9.2. Веза између структуре и антиоксидативне активности флавоноида (QSAR студија) ............................................................................................. 48 1.1.10. Значај флавоноида и њихова фармаколошка активност ................................. 49 1.2. Хинолони .................................................................................................................................50 1.2.1. Природни извор хинолона и њихових деривата ............................................... 51 1.2.2. Биосинтеза хинолона и њихових деривата ......................................................... 51 1.2.3. Методе за синтезу 2-арил-4-хинолонских деривата .......................................... 52 1.2.4. Номенклатура флуорохинолона ......................................................................... 52 1.2.5. Моксифлоксацин .................................................................................................. 53 1.2.5.1. Синтеза моксифлоксацина ........................................................................... 54 1.2.5.2. Физичко-хемијске карактеристике моксифлоксацина .............................. 57 1.2.5.3. Стабилност моксифлоксацина .................................................................... 61 1.2.5.4. Литературни преглед метода за одређивање моксифлоксацина и његових деградационих призвода ............................................................................. 62 1.3. Припрема узорка за анализу ....................................................................................... 63 1.3.1. Прикупљање биљног материјала ........................................................................ 63 1.3.2. Обрада прикупљене сировине ............................................................................ 63 1.3.3. Сушење ................................................................................................................... 64 1.3.4. Узорковање ........................................................................................................... 64 1.3.5. Припрема узорка таблете за анализу .................................................................. 65 1.3.6. Екстракција ........................................................................................................... 65 1.3.6.1. Екстракција на чврстој фази (Solid-phase extraction, SPE) ....................... 67 1.4. Инструменталне методе анализе .............................................................................. 70 1.4.1. Високо-ефикасна течна хроматографија (HPLC) .............................................. 70 1.4.1.1. Теорија хроматографије ............................................................................... 71 1.4.1.2. Термодинамика ретенције ........................................................................... 73 1.4.1.3. HPLC систем .................................................................................................. 75 1.4.1.4. HPLC колоне .................................................................................................. 76 1.4.1.5. Хроматографски параметри ......................................................................... 78 1.4.1.6. Утицај pH на сепарацију аналита ................................................................. 79 1.4.1.7. Развој и оптимизација HPLC методе .......................................................... 81 1.5. Mасенa спектрометријa .................................................................................................. 82 1.5.1. Проблем састава мобилних фаза ........................................................................ 84 1.5.2. Јонски извори ....................................................................................................... 85 1.5.3. Електроспреј јонизација ...................................................................................... 86 1.5.4. Хемија јонизације ................................................................................................. 87 1.5.5. Анализатори маса ................................................................................................. 87 1.5.5.1. Квадрупол ...................................................................................................... 88 1.5.5.2. Јонска замка .................................................................................................. 88 1.6. Утицај матричног ефекта на одређивање аналита применом MS ............89 1.7. UV/Vis спектрофотометријске методе ....................................................................91 1.8. Оптимизација инструменталних метода ...............................................................94 1.8.1. Експериментални дизајн ...................................................................................... 94 1.8.2. Класични експериментални дизајн ..................................................................... 94 1.8.3. Израчунавање ефеката ......................................................................................... 98 1.8.4. Оптимизациони дизајни ...................................................................................... 98 1.8.5. Факторски и централно композитни дизајн ...................................................... 99 1.9. Валидација модела (анализа варијанси, ANOVA) ........................................ 101 1.10. Компјутерска симулација коришћењем програма Dry Lab и LC- Simulator ........................................................................................................................ 103 1.11. Валидација аналитичке методе ............................................................................. 105 1.11.1. Линеарност и опсег .......................................................................................... 105 1.11.2. Селективности/специфичност ......................................................................... 105 1.11.3. Осетљивост ....................................................................................................... 106 1.11.4. Тачност .............................................................................................................. 106 1.11.5. Прецизност ........................................................................................................ 106 1.11.6. Граница детекције ............................................................................................ 107 1.11.7. Граница квантификације ................................................................................. 107 1.11.8. Робусност .......................................................................................................... 107 1.12. Циљ и задатак рада ............................................................................................. 108 2. Експериментални део .................................................................................................109 2.1. Реагенси ............................................................................................................................... 110 2.1.1. Стандарди биофлавоноида ................................................................................ 110 2.1.2. Стандарди хинолона .......................................................................................... 111 2.1.3. Узорци таблета и инфузија ................................................................................ 112 2.1.4. Општи реагенси .................................................................................................. 112 2.2. Раствори ................................................................................................................................113 2.2.1. Основни раствори стандарда биофлавоноида .................................................. 113 2.2.2. Основни раствори стандарда флуорохинолона ................................................ 115 2.2.3. Основни раствори општих реагенаса ................................................................ 116 2.2.4. Радни раствори .................................................................................................... 117 2.3. Припрема узоракa за анализу биофлавоноида .................................................119 2.3.1. Поступак екстракције биофлавоноида из различитих узорака хране ........... 120 2.3.2. Екстракција по Сокслету ................................................................................... 120 2.3.3. Ултразвучна екстракција ................................................................................... 120 2.3.4. Екстракција мацерацијом .................................................................................. 121 2.3.5. Екстракција водом ............................................................................................... 121 2.4. Припрема узорка таблете и инфузије .................................................................... 121 2.5. Метода стандардног додатка...................................................................................... 122 2.6. Апаратура и инструменти ............................................................................................ 124 2.6.1. Уситњавање, хомогенизација и течно-чврста екстракција ............................ 124 2.6.2. Хроматографски системи .................................................................................. 126 2.6.3. LC-MS/MS систем .............................................................................................. 127 2.6.4. UV/Vis спектрофотометар .................................................................................. 127 3. Експериментални резултати ................................................................................ 129 3.1. Екстракција биофлавоноида из узорака хране биљног порекла ............ 131 3.1.1. Течно-чврста екстракција биофлавоноида из екстраката коре поморанџе, црвеног лука и меда ................................................................................................... 133 3.1.2. Оптимизација LC-MS/MS методе за одређивање биофлавоноида ................. 135 3.1.3. Испитивање утицаја матричног ефекта на одређивање биофлавоноида у екстрактима хране ..................................................................................................... 142 3.1.4. Одређивање биофлавоноида у узорцима црвеног лука, коре поморанџе и меда ........................................................................................................................................ 148 3.2. Оптимизација HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica .......................................................................................................... 153 3.2.1. Прелиминарна испитивања ...................................................................................... 153 3.2.2. Оптимизација RP-HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica ..................................................................................................... 154 3.2.3. Одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica ............................ 159 3.2.4. Одређивање антиоксидативне активности екстраката фамилије Brassica .... 161 3.3. Оптимизација HPLC методе за одређивање моксифлоксацина и сродних супстанци у таблетама и инфузији ..................................................... 166 3.3.1. Прелиминарна испитивања ...................................................................................... 166 3.3.2. Развој HPLC методе за одвајање моксифлоксацина и сродних једињења .... 170 3.3.3. Одређивање сродних једињења моксифлоксацина ............................................ 183 3.3.4. Одређивање нечистоћа у фармацеутским формулацијама “Avelox-a” .......... 187 3.3.5. Одређивање производа присилне деградације моксифлоксацина .................. 188 3.4. Спектрофотометријско одређивање моксифлоксацина у серуму ....... 192 3.4.1. Прелиминарна испитивања ...................................................................................... 192 3.4.2. Оптимизација спектрофотометријских услова мерења ..................................... 193 4. Дискусија резултата ................................................................................................... 206 4.1. Екстракција биофлавоноида из узорака хране ................................................. 207 4.1.1. Течно-чврста екстракција биофлавоноида из екстраката хране ...................... 211 4.2. Процена матричног ефекта на LC-MS одређивање биофлавоноида у узорцима хране ............................................................................................................... 213 4.3. Oдређивање биофлавоноида у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда применом LC-MS/MS методе ................................................................... 217 4.4. Одређивање испитиваних биофлавоноида у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда применом LC-MS/MS методе ...................................... 220 4.5. Поређење наше методе за одређивање биофлавонида у узорцима хране са литературним подацима ........................................................................................ 220 4.5.1. Одређивање биофлавоноида у узорцима коре поморанџе ................................ 220 4.5.2. Одређивање биофлавоноида у узорцима црвеног лука ..................................... 221 4.5.3. Одређивање биофлавоноида у узорцима меда .................................................... 222 4.6. HPLC-DAD анализа биофлавоноида узорака фамилије Brassica ........... 223 4.6.1. Оптимизација хроматографских услова коришћењем програма ACD/LC Simulator ...................................................................................................................... 223 4.6.2. Oдређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica ............................ 226 4.6.3. Поређење наше методе са литературним подацима одређивања биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica .................................................. 227 4.7. Aнтиоксидативнa активност екстраката фамилије Brassica .................... 228 4.8. HPLC-DAD анализа сродних једињења и нечистоћа моксифлоксацина (аналога флавоноида) .................................................................................................. 232 4.8.1. Оптимизација хроматографских услова коришћењем DryLab® програма .... 232 4.8.2. Одређивање сродних једињења и нечистоћа моксифлоксацина у Avelox® таблетама и инфузији ............................................................................................... 236 4.8.3. Поређење наше методе за одређивање нечистоћа и деградационих производа са литературним подацима ..................................................................................... 237 4.9. Спектрофотометријско одређивање моксифлоксацина у хуманом серуму ................................................................................................................................... 238 4.9.1. Поређење наше методе одређивања моксифлоксацина са литературним подацима ..................................................................................................................... 239 5. Закључак .............................................................................................................................. 241 6. Литература ......................................................................................................................... 244 7. Биографија ......................................................................................................................... 256 8. Научни радови .................................................................................................................. 258 Списак слика и шема Слика 1. Основне структуре скелета флавоноидних агликона ........................................................12 Слика 2. Хемијске структуре неких природних флавоноида и њихови извори. А) флавони, B) флавоноли, C) катехини, D) флаваноли, E) флаванони и F) изофлавони ................... 14,15 Шема 1. Детаљна шема биосинтезе флаванона и различитих класа флавоноида ..........................16 Шема 2. Поступна дисоцијација каемпферола ..................................................................................19 Слика 3. Дистрибуциони дијаграм различитих врста каемпферола у функцији од рН .................20 Слика 4. UV/Vis спектри флавоноида ................................................................................................21 Слика 5. Флуоресцентни ексцитациони (ex) и емисиони (em) спектар оноина у ацетонитрилу и води ........................................................................................................................................22 Слика 6. IR спектар кверцетина ..........................................................................................................23 Слика 7. 1H NMR спектар даидзеина снимљен у DMSO ..................................................................24 Слика 8. 13C NMR спектар катехина ...................................................................................................25 Слика 9. Масени спектар кверцетин3-О-галактозида у 70 % етанолу ............................................28 Слика 10. Потенцијална места координовања метала за флавоноид ..............................................29 Слика 11. Потенциометријске титрационе криве за HClО4, HClО4 + нарингенин, HClО4 + нарингенин + Al(III), HClО4 + нарингенин + Fe(II) у NaClО4 јонској средини ..............30 Слика 12. Крива формирања за нарингенин ......................................................................................30 Слика 13. Крива формирања комплекса Al(III) + нарингенин .........................................................31 Слика 14. UV/Vis спектри нарингинина (плава линија) и нарингинин-бакар комплекса (црвена линија) ....................................................................................................................................32 Слика 15. Job-ова крива за каемпферол-бакар комплекс..................................................................32 Слика 16. Емисиони флуоресцентни спектар кверцетина и кверцетин метал комплекса у метанолу на собној температури .........................................................................................33 Слика 17. IR спектар (а) морина и (b) морин-Cr(III) комплекса ......................................................36 Слика 18. Структурни критеријуми за антиоксидативну активност флавоноида ..........................43 Слика 19. Механизам антиоксидативне активности 3`,4`-дихидрокси флавоноида ......................45 Слика 20. Механизам антиоксидативне активности 3-хидроксифлавона.......................................45 Слика 21. Апсорпциони спектар метанолског раствора DPPH........................................................46 Слика 22. Шема антиоксидативне активности DPPH у реакцији са полифенолима .....................47 Слика 23. Кинетика радикалске реакције екстракта кумина праћена DPPH методом .................47 Слика 24. Општа структура хинолона ................................................................................................50 Слика 25. Структуре хинолин-4(1Н)-она (а) и ароматични хинолонски дериват (б) ....................50 Слика 26. Хемијске структуре гравеолина (а), едулеина (б) ............................................................51 Слика 27. Синтеза гравеолина .............................................................................................................51 Слика 28. Основне структуре хинолонских прстенa ........................................................................52 Слика 29. Структура моксифлоксацина .............................................................................................54 Шема 3. Први корак синтезе моксифлоксацина ................................................................................54 Шема 4. Други ступањ синтезе моксифлоксацина ............................................................................55 Шема 5. Пречишћавање моксифлоксацина за инфузију ..................................................................55 Слика 30. UV спектар моксифлоксацина у метанолу на рН = 7,4 ...................................................58 Слика 31. IR спектар моксифлоксацина снимљен KBr техником ...................................................59 Слика 32. 1H-NMR спектар моксифлоксацина снимљен теҳником Fourije-ове трансформације .59 Слика 33. 13C-NMR спектар моксифлоксацина снимљен теҳником Fourije-ове трансформације 60 Слика 34. Масени спектар моксифлоксацина ...................................................................................60 Слика 35. Ток припреме узорка за анализу ........................................................................................63 Слика 36. Van Deemter-ова крива .......................................................................................................73 Слика 37. Van Hoff-ове криве за два различита дистрибуциона система .......................................75 Слика 38. Систем за HPLC анализу ....................................................................................................76 Слика 39. Интеракције које се одвијају на површини силика-гела ................................................77 Слика 40. Хроматограм добијен раздвајањем двокомпонентне смеше (1) и (2) ............................78 Слика 41. Утицај рН на ретенцију базног аналита у хроматографији ............................................79 Слика 42. Различити типови јонизације под атмосферским притиском .........................................86 Слика 43. Електроспреј ........................................................................................................................86 Слика 44. Квадрупол ............................................................................................................................88 Слика 45. Јонска замка .........................................................................................................................88 Слика 46. Повезаност фактора и карактериситка процеса ...............................................................94 Слика 47. Ток експерименталног дизајна ..........................................................................................97 Слика 48. Централни композитни дизајн за два и три фактора. Сиви кругови образују коцку - број ранова 22 и 23. Црни кругови образују облик звезде .............................................100 Слика 49. Изглед криве за методу стандардног додатка ................................................................123 Слика 50. Хомогенизатор Silent Crusher M Homogenizer ...............................................................124 Слика 51. Апаратура за екстракцију по Сокслету ...........................................................................125 Слика 52. Ултразвучно купатило Sonorex DT 52 H ........................................................................125 Слика 53. SPE манифолд Agilent ......................................................................................................126 Слика 54. HPLC Agilent 1100 Series ..................................................................................................126 Слика 55. HPLC систем Shimadzu .....................................................................................................127 Слика 56. LC-MS/MS систем Perkin-Elmer / Applied Biosystems ...................................................127 Слика 57. UV/Vis спектрофотометар Perkin Elmer Lambda 35 ......................................................128 Слика 58. Ефикасност екстракције биофлавоноида добијена ултразвучном екстракцијом из коре поморанџе и црвеног лука у поређењу са екстракцијом по Сокслету (ефикасност екстракције = 100 %)...........................................................................................................133 Слика 59. Изглед радног прозора програма Analyst .......................................................................136 Слика 60. Масени спектар кверцетина .............................................................................................138 Слика 61. Масени спектар рутина ....................................................................................................138 Слика 62. Масени спектар хесперетина ...........................................................................................138 Слика 63. Масени спектар хесперидина ..........................................................................................138 Слика 64. Масени спектар каемпферола ..........................................................................................138 Слика 65. Фрагментације рутина, кверцетина, каемпферола, хесперидина и хеспетерина ........139 Слика 66. HPLC-DAD хроматограм смеше стандарда биофлавоноида снимљен под оптималним условима .............................................................................................................................141 Слика 67. TIC (total ion chromatogram) смеше стандарда биофлавонида .....................................141 Слика 68. HPLC-UV хроматограм редоследа елуирања полифенолних киселина и биофлавоноида ....................................................................................................................147 Слика 69. HPLC-UV хроматограм екстракта црвеног лука добијен ултразвучном екстракцијом на 280 nm ............................................................................................................................149 Слика 70. TIC екстракта црвеног лука ............................................................................................149 Слика 71. HPLC-UV хроматограм екстракта коре поморанџе добијен ултразвучном екстракцијом на 280 nm ......................................................................................................149 Слика 72. TIC екстракта коре поморанџе ........................................................................................150 Слика 73. HPLC-UV хроматограм екстракта меда добијен ултразвучном екстракцијом на 280 nm .........................................................................................................................................150 Слика 74. TIC екстракта меда ...........................................................................................................150 Слика 75. Калибрациона крива и крива за методу стандардног додатка за хесперетин ...........151 Слика 76. 1D мапа резолуције добијена у tG/% ацетнитрила оптимизацији са 2 % сирћетном киселином и на температури од 30 oC ..............................................................................155 Слика 77. 2D мапа резолуције добијена рачунарском симулацијом применом програма LC- Simulator ...............................................................................................................................157 Слика 78. Хроматограм биофлавоноида добијен компјутерском симулацијом коришћењем програма LC-Simulator .......................................................................................................157 Слика 79. Хроматограм стандарда биофлавоноида под оптималним условима ..........................158 Слика 80. Хроматограм екстракта свежег броколија ......................................................................159 Слика 81. Одређивање кверцетина у узорку свежег карфиола методом стандардног додатка ..159 Слика 82. Калибрациона крива DPPH у метанолу за одређивање концентрације у растворима екстраката ............................................................................................................................162 Слика 83. Кинетика антиоксидативне активности свежег екстракта карфиола ...........................163 Слика 84. Кинетика антиоксидативне активности екстракта замрзнутог карфиола ...................163 Слика 85. Кинетика антиоксидативне активности екстракта свежег броколија ..........................164 Слика 86. Кинетика антиоксидативне активности екстракта замрзнутог броколија ...................164 Слика 87. Кинетика антиоксидативне активности екстракта прокеља .........................................164 Слика 88. Потенциометријска титрација 1,07 mmol/L моксифлоксацина у 0,1 mol/L LiCl средини на 25оC у и без присуства SDS-a .........................................................................167 Слика 89. Мртва запремина HPLC система .....................................................................................170 Слика 90. 1D мапа резолуције добијена оптимизацијом tG/%ACN при pH= 5,5 и T = 30оC ......172 Слика 91. 2D мапа резолуције за оптимизацију tG/температуре при pH = 6,12 ...........................172 Шема 6. Експериментални дизајн за оптимизацију LC- tG/pH ......................................................173 Слика 92. Сет хроматограма за оптимизацију у LC-RP Gradient/pH. Т = 30 оС, tG = 30 min ......173 Слика 93. Сет хроматограма за оптимизацију у LC-RP Gradient/pH. Т = 30 оС, tG = 60 min ......174 Слика 94. 2D робусна мапа резолуције добијена коришћењем програма DryLab .......................175 Слика 95. Израчунати (симулирани) хроматограм добијен у програму DryLab ..........................175 Слика 96. Површина одговора израчуната на основу дизајна .......................................................181 Слика 97. Хроматограм смеше стандарда моксифлоксацина (200 ng/mL), сродних једињења (1 ng/mL), и офлоксацина (1 ng/mL) при утврђеним експерименталним условима ........183 Слика 98. Радна калибрациона права за одређивање 6F8E у воденој фази. P6F8Е/PO – oднос површина 6F8E и офлоксацина (ИС), C6F8Е/CO – однос концентрација 6F8E и офлоксацина (ИС) ..............................................................................................................184 Слика 99. Радна калибрациона права за одређивање 6M8F у воденој фази. P6M8F/PO – oднос површина моксифлоксацина и офлоксацина (ИС), C6M8F/CO – однос концентрација 6M8F и офлоксацина (ИС) ................................................................................................185 Слика 100. Радна калибрациона права за одређивање 6,8DM у воденој фази. P6,8DM/PO – oднос површина 6,8DM и офлоксацина (ИС), C6,8DM/CO – однос концентрација 6,8DM и офлоксацина (ИС) ...............................................................................................................186 Слика 101. Радна калибрациона праваљ за одређивање 6,8DF у воденој фази. P6,8DF/PO – oднос површина 6,8DF и офлоксацина (ИС), C6,8DF/CO – однос концентрација 6,8DF и офлоксацина (ИС) ..............................................................................................................187 Слика 102. Хроматограм таблете “Avelox” (активна компонента моксифлоксацин) у присуству интерног стандарда офлоксацина (1 g/mL) ....................................................................188 Слика 103. Хроматоргам производа деградације инфузије моксифлоксацина у киселој средини у присуству интерног стандарда офлоксацина ...............................................................189 Слика 104. Хроматоргам производа деградације инфузије моксифлоксацина у базној средини у присуству интерног стандарда офлоксацина ..................................................................189 Слика 105. Хроматоргам производа деградације таблете моксифлоксацина у киселој средини у присуству интерног стандарда офлоксацина ..................................................................190 Слика 106. Хроматоргам производа деградације таблете моксифлоксацина у базној средини у присуству интерног стандарда офлоксацина ..................................................................190 Слика 107. Спектри моксифлоксацина различитих концентрација у присуству 0,1 mol/L LiCl, у pH опсегу од 5 – 6 ..............................................................................................................194 Слика 108. Апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L при различитим pH вредностима у 0,1 mol/L раствору LiCl ..................................................194 Слика 109. Издвојени апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у интервалу pH од 1,80 до 8,84 у 0,1 mol/L раствору LiCl ................................................195 Слика 110. Апсорпциони спектар моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS у 0,1 mol/L раствору LiCl ........................................................................195 Слика 111. Апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS у 0,1 mol/L раствору LiCl где је pH подешавано јаком киселином и/или јаком базом .........................................................................................................................196 Слика 112. Апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у пуферима различитих pH вредности у 0,1 mol/L раствору LiCl ......................................................197 Слика 113. Издвојени апсорпциони спектри мокисфлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у пуферима од pH 5 до 7,2 у 0,1 mol/L раствору LiCl ........................................................197 Слика 114. Издвојени апсорпциони спектри мокисфлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у пуферима од pH 7,2 до 9,0 у 0,1 mol/L раствору LiCl .....................................................198 Слика 115. Апсорпциони спектри мокисфлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS пуферима у 0,1 mol/L раствору LiCl ......................................................198 Слика 116. Апсорпциони спектри серума без и у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl ...........................................................................................................................199 Слика 117. Апсорпциони спектри серума без и у присуству моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини .....................................................................199 Слика 118. Апсорпциони спектри серума и моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mmol/L без и у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини ................200 Слика 119. Апсорпциони спектри различитих концентрација моксифлоксацина у серуму за калибрациону криву у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини ...............................................................................................................................201 Слика 120. Други извод апсорпционих спектара различитих концентрација моксифлоксацина у серуму за калибрациону криву у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини .......................................................................................................................201 Слика 121. Калибрациона права за одређивање моксифлоксацина у плазми .............................202 Слика 122. Апсорпциони спектри различитих концентрација моксифлоксацина у серуму у присуству 12 mmol/L SDS na pH = 7,2 .............................................................................203 Слика 123. Други извод апсорпционих спектара различитих концентрација моксифлоксацина у серуму у присуству 12 mmol/L SDS na pH = 7,2 .............................................................203 Слика 124. UV спектар плазме пацијента без и у присуству SDS-а .............................................204 Слика 125. Хроматограм плазме пацијента узет 1 сат након примене „Avelox“ таблете (400 mg) ..............................................................................................................................................205 Слика 126. Ефикасност SPE екстракције биофлавоноида на различитим кертриџима ...............212 Слика 127. Процена матричног ефекта (%) приликом коришћења различитих растварача .......214 Слика 128. Процењен матрични ефекат (%) приликом одређивања биофлавоноида у узорцима хране .....................................................................................................................................215 Списак табела Табела 1. Подела флавоноида на подгрупе ........................................................................................13 Табела 2. Вредност logPexp за флавоноиде .........................................................................................18 Табела 3. Вредности сукцесивних константи дисоцијације флавоноида ......................................20 Табела 4. Таласне дужине (nm) максимума апсорпције неких флавоноида у метанолу ...............21 Табела 5. Прелази у IR спектрима флавоноида и њихова асигнација ............................................23 Табела 6. 1Н NMR померања појединих атома водоника у одређеним флавоноидима ................25 Табела 7. 13C NMR спектри флавоноида ...........................................................................................26 Табела 8. Масени спектри неких флавоноида ..................................................................................28 Табела 9. Mетоде одређивања, врсте и константе стабилности комплекса флавоноида и метала ................................................................................................................................................35 Табела 10. Апсорпционе траке у IR спектроскопији слободних флавоноида и одговарајућих комплекса .............................................................................................................................36 Табела 11. Номиналне вредности m/z јона који се јављају у позитивном моду ESI-MS спектра комплекса нарингинина и бакра .........................................................................................37 Табела 12. Вредности константе брзине реакције DPPH радикала са флавоноидима ...................48 Табела 13. Предвиђене и експерименталне вредности антиоксидативне активности флавоноида ................................................................................................................................................49 Табела 14. Класификација хинолона по генерацијама и индикације ..............................................53 Табела 15. Структуре и називи сродних и деградационих производа моксифлоксацина .............56 Табела 16. Растворљивост (g/L) моксифлоксацина у различитим растварачима на 25оС .............57 Табела 17. Таласне дужине маскималне апсорпције моксифлоксацина у различитим растварачима .........................................................................................................................58 Табела 18. Табеларни приказ фрагментације моксифлоксацина. ..................................................60 Табела 19. Хроматографски параметри, формуле за израчунавање и оптималне вредности .......79 Табела 20. Матрица дизајна за 23 факторијални експеримент ........................................................95 Табела 21. Нивои кодираних вредности за централно композитни дизајн за двофакторске и трофакторске системе .........................................................................................................100 Табела 22. Анализа варијанси за најмање квадрате линеарног модела са параметрима .............102 Табела 23. Концетрације биофлавоноида (кверцетин, рутин, хесперетин, хесперидин и каемпферол) (у g/mL): .....................................................................................................117 Табела 24. Концетрације биофлавоноида (кверцетин, каемпферол, апигенин, лутеолин, катехин и епикатехин) (у g/mL). ...................................................................................................118 Табела 25. Концентрације једињења сродних моксифлоксацину (у g/mL). ..............................118 Табела 26. Карактеристике испитиваних Supelco кертриџа. ..........................................................134 Табела 27. Вредности ефикасности SPE екстракције ± SD (%) флавоноида добијених применом различитих врста SPE кертриџа и растварача коришћених за елуирање ......................135 Табела 28. Оптимални услови SPE екстракције биофлавоноида ...................................................135 Табела 29. Оптимални инструментални услови за анализу у ESI-MS/MS. .................................137 Табела 30. Јони у MS/MS спектру биофлавоноида .........................................................................138 Табела 31. Регресиони параметри за калибрационе криве (Y=a+bX; Y = интензитет сигнала, X = концентрација аналита, g/mL) за калибрационе криве за најинтензивније SRM прелазе .................................................................................................................................142 Табела 32. Процењени матрични ефекат приликом одређивања биофлавоноида екстрахованих водом из узорака хране коришћењем методе пост-екстракције .....................................144 Табела 33. Ефекат матрикса (%) на одређивање биофлаоноида у узорцима хране методом стандардног додатка у различитим екстрактима .............................................................145 Табела 34. Садржај биофлавоноида у узорцима хране и поређење са литературним подацима 152 Табела 35. Експериментани услови и одговарајући подаци добијени из хроматограма који су коришћени за оптимизацију методе ..................................................................................156 Табела 36. Оптимални услови за сепарацију и одређивање биофлавоноида у узорцима хране утврђени компјутерском симулацијом .............................................................................158 Табела 37. Садржај биофлавоноида (mg/100g свеже масе) за различите врсте Brassica.............160 Табела 38. Антиоксидативна активност (% преосталог DPPH ± SD) за различите врсте купуса добијене DPPH методом .....................................................................................................165 Табела 39. Експериментални услови за оптимизацију изократског извођења анализе ...............171 Табела 40. Поређење симулираних и експерименталних ретенционих података за оптимизовано одвајање модела једињења (10 % ацетонитрила; pH = 6,10) ..........................................176 Табела 41. Експеримантални подаци за факторски дизајн .............................................................177 Табела 42. ANOVA анализа израчунавања факторског дизајна ....................................................177 Табела 43. Хроматографски фактори и њихове кодиране вредности ...........................................178 Табела 44. Експериментални дизајн. Укупни одговор фактора, RX = R1,2+R2,3+R3,4+R4,5 ............179 Табела 45. ANOVA анализа квадратног хроматографског модела ...............................................179 Табела 46. Израчунати коефицијенти за квадратни модел хроматографског раздвајања ...........181 Табела 47. Оптимални услови за раздвајање и одрђивање моксифлоксацина и сродних једињења у фармацеутским формулацијама утврђени експерименталним дизајном .182 Табела 48. Основне хроматографске карактеристике раздвајања моксифлоксацина и четири сродне нечистоће раздвојене на XTerra колони при оптималним условима ...............182 Табела 49. Валидациони параметри за одређивање 6F8E у води ..................................................184 Табела 50. Валидациони параметри за одређивање 6M8F у води .................................................185 Табела 51. Валидациони параметри за одређивање 6,8DM у води................................................186 Табела 52. Валидациони параметри за одређивање 6,8DF у води .................................................187 Табела 53. Услови и подаци присилне деградације стандарда, таблете и инфузије моксифлоксацина ................................................................................................................191 Табела 54. Вредности за конструкцију калибрационе криве за одређивање концентрације моксифлоксацина у серуму ................................................................................................202 Табела 55. Резултати погодности методе за одређивања моксифлоксацина у серуму ................204 Табела 56. Физичко-хемијске карактеристике растварача који се најчешће користе за екстракцију биофлавоноида ...............................................................................................209 Табела 57. Хроматографски параметри добијени на Phenomenex Gemini C18 колони под оптималним условима ........................................................................................................218 Табела 58. Параметри валидације методе за LC-MS/MS анализу биофлавоноида у храни ........219 Табела 59. Хроматографски параметри добијени на Hypersil GOLD aQ колони под оптималним условима ..............................................................................................................................225 Табела 60. Валидациони параметри хроматографске методе за одређивање биофлавоноида у узорима фамилије Brassica.................................................................................................226 Табела 61. Вредности константе брзине реакције ± стандардна грешка (×10-2) реакције DPPH радикала са екстрактима фамилије Brassicа ....................................................................230 Табела 62. Подаци за испитивање прецизности методе за смешу стандарда сродних једињења моксифлоксацина ................................................................................................................235 Андрија Ћирић Докторска дисертација 1 Извод У овом раду развијене су LC-MS/MS и HPLC-UV/DAD методe за истовремено одређивање биофлавоноида: рутина, кверцетина, хесперидина, хесперетина, каемпферола, апигенина, лутеолина, катехина и епикатехина у неким узорцима хране (кора поморанџе, црвени лук, мед, карфиол, броколи и прокељ). Такође, развијене су и HPLC-DAD и спектрофотометријске методе за одређивање моксифлоксацина (аналога флавоноида) и његових сродних једињења и деградационих производа у фармацеутским формулацијама и хуманој крвној плазми. Процењен је матрични ефекат приликом одређивања рутина, кверцетина, хесперетина, хесперидина и каемпферола у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда. Утицај матрикса процењен је коришћењем методе пост-екстракције при чему се добијене негативне вредности у опсегу од -44 до -0,5 %, што указује на јонску супресију. Матрични ефекат јако зависи од концентрације испитиваних биофлавоноида. Јонска супресија се може објаснити присуством коелуираних фенолних киселинa, које због својих киселинско-базних и хидрофилних карактеристика утичу на јонизацију биофлавоноида у гасној плазми. Екстракти узорака хране су добијени применом различитих начина екстракције (екстракција по Сокслету, ултразвучна ектракција, екстракција мацерацијом и екстракција кључалом водом). За пречишћавање и преконцентрисавање добијених екстраката аналита коришћена је екстракција на чврстој фази применом Supelco кертриџа. Ефикасност екстракције изражена преко искоришћења креће се од 88 до 96 %, што указује на веома добро изоловање аналита из узорака. Екстракти узорака хране добијени екстракцијом по Сокслету и ултразвучном екстракцијом су анализирани на садржај биофлавоноида праћењем реакција њихове фрагментације LC-MS/MS методом уз троструки квадрупол као детектор. Раздвајање испитиваних аналита постигнуто је применом Phenomenex Gemini C18 колоне при градијентном начину елуирања мобилне фазе састављене од фазе A: 2 % сирћетна киселина у води и фазе B: ацетонитрила. Вредности резолуције (Rs) између два суседна пика су се кретале у опсегу од 1,3 до 3,2, указујући на добру селективност методе. Метода стандардног додатка, као најпогоднија, је коришћена за квантитативно одређивање аналита за овај тип узорака. Добијени резултати квантификације биофлавоноида (mg/100 g свеже масе) су: за рутин Андрија Ћирић Докторска дисертација 2 0,16; за кверцетин у опсегу 0,65 – 56; за хесперидин 0,016 – 24; за хесперетин 0,0068 – 36,4 и за каемпферол 0,14 – 1,63 и у доброј су сагласности са литературним подацима. Ниске вредности границе детекције (0,039 – 0,076 mg/mL) су добијене са прихватљивом тачношћу (86 – 114 %). Укупно време анализе је мање од 40 min, тако да предложена метода представља значајно побољшање постојећих метода. Такође, оптимизована је RP-HPLC метода са UV (DAD) детекцијом за истовремено одређивање биофлавоноида: кверцетин, апигенин, катехин, епикатехин, каемпферол и лутеолин у узорцима хране фамилије Brassica (карфиол, броколи, прокељ) применом програма LC-Simulator (ACD Labs suite). Оптимални услови за раздвајање и квантификацију биофлавоноида су постигнути применом Hypersil GOLD aQ колоне са изократским елуирањем мобилном фазом A: 2 % сирћетна киселина у води и B: ацетонитрил у односу 91 : 9 (v/v %). Добијене вредности резолуције између пикова су биле у опсегу од 1,3 до 3,1, указујући на добру селективност методе. Добијени резултати квантификације биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica показују добро слагање са литературним подацима. Добијене су ниске вредности граница детекције (0,02 – 0,055 μg/mL) са прихватљивом тачношћу (90 - 109 %). Укупно време анализе је мање од 11 min, стога развијена метода представља унапређење већ постојећих метода. Екстрактима узорака фамилије Brassica, добијеним различитим начинима екстракције, одређена је способност да неутралишу кисеоничне слободне радикале. Антиоксидативна активност екстраката фамилије Brassica испитивана је спектрофотометријском методом праћењем смањења концентрације DPPH радикала. Реакција између DPPH радикала и екстраката фамилије Brassica одвија се према кинетици псеудо првог реда. Вредности брзине ове реакције крећу се у опсегу од 7,1×10-2 до 17,9×10-2 L mol-1 s-1. Различите вредности брзине указују на присуство полимеризованих и/или мање активних врста антиоксиданата са различитим механизмом неутрализације. Развијена је и RP-HPLC метода за раздвајање и одређивање сродних једињења моксифлоксацина (аналога флавонима), као и производа деградације моксифлоксацина применом програма DryLab® и хемометријског (површина одговора) приступа. Ове методе су валидиране при оптималним условима раздвајања, а након тога коришћене за одређивање сродних једињења моксифлоксацина у фармацеутским формулацијама. Андрија Ћирић Докторска дисертација 3 Раздвајање четири синтетичка сродна једињења је постигнуто применом Waters C18 XTerra колоне термостатиране на 45 оС, проток мобилне фазе састављене од (вода + триетиламин (2 %, v/v)) : ацетонитрил = 90 : 10 (v/v %) је био 1,5 mL/min, а pH вредност водене фазе је подешена коришћењем разблажене фосфорне киселине на 6,0. Резолуција између два најмање раздвојена пика била је већа од 1,5. Параметри валидације методе указују на линеараност у концентрационом опсегу од 0,2 до 2,0 g/mL, са границом квантификације (LOQ) од 0,20 g/mL и границом детекције (LOD) од 0,05 g/mL за све аналите. Развијена метода је примењена за одређивање моксифлоксацина и сродних једињења у таблетама и инфузији (Avelox®, Bayer AG) и за производе деградације моксифлоксацина приликом испитивања његове стабилности. Садржај сродних једињења моксифлоксацина у таблетама и инфузији био је 0,1 % од укупног моксифлоксацина. Два производа деградације су уочена при хидролитичким условима. Развијена је једноставна, брза и прецизна спектрофотометријска метода за одређивање моксифлоксацина у хуманој крвној плазми. Одређивање је вршено у цитрат – фосфатном пуферу (pH = 7,2), у присуству натријум додецилсулфата (12,0 mmol/L). За квантификацију коришћен је други извод спектра моксифлоксацина. Линеарни опсег концентрација био је у опсегу од 0,25 до 10 μg/mL, са тачношћу од 95 до 102 % и границом детекције од 0,03 μg/mL. Тачност методе је била између Метода је успешно примењена за анализу моксифлоксацина у хуманој крвној плазми здравих волонтера. Развијена је и HPLC метода као референтна метода, за валидацију и потврду спектрофотометријских резултата. Методе развијене у овој дисертацији одговарају сврси и могу се користити за контролу квалитета хране, као и у фармацеутским и клиничким испитивањима. Андрија Ћирић Докторска дисертација 4 Summary In the present work the LC-MS/MS and HPLC-UV/DAD methods with solid phase extraction for simultaneous determination of bioflavonoids rutin, quercetin, hesperidin, hesperetin, kaempferol, apigenin, luteolin, catehin and epicatehin in some food samples (red onion, orange peel, honey, cauliflower, broccoli and Brussel sprouts) were developed. Also, HPLC-UV/DAD and spectrophotometric methods for determination moxifloxacin (flavonoids analog) and their related substances and degradation products in pharmaceutical forms and human plasma were developed. The matrix effect accompanying determination rutin, quercetin, hesperidin, hesperetin and kaempferol in orange peel, red onion and honey was quantified. The matrix effect evaluated using postextraction addition method was found to be negative in the range -44 – -0,5 %, indicating ionization suppression and strongly depended on bioflavonoid concentration. Ion suppresion was explained taking into account the co-elution of phenolic acids, in terms of their acid-base and hydrophilic properties, which affected ionisation of bioflavonoids in gas phase. Extracts of food samples were obtained by different methods of extraction. Purification and preconcentration of extracts, on the solid phase using the Supelco cartridges was performed. The efficacy of extraction expressed as the absolute recoveries of flavonoids were 88 – 96 %, indicating very good efficiency of extraction. The extracts of food samples obtained either by Soxhlet or ultrasonic extraction were analyzed for bioflavonoid content by LC- MS/MS method in selected reaction monitoring mode using triple quadrupole detector and standard addition method, which was found to be the most suitable calibration approach for these samples. The optimized separation was achieved on Phenomenex Gemini C18 column with gradient elution and mobile phase composition A: 2% acetic acid in water and B: acetonitrile. Rs values were in the range from 1,3 to 3,1 indicating good selectivity of the method. The obtained results (mg/100 g fresh weight) for different bioflavonids were for rutin 0,16, for quercetin in the range 0,65 – 56, for hesperidin 0,016 – 24, for hesperetin 0,0068 – 36,4 and for kaempferol 0,14 – 1,63 and generally show good agreement with published data. Low detection limits (0,039 – 0,079 mg/mL) were obtained with acceptable recoveries (86 – 114 %). Total time of analysis was less than 40 min, so that the proposed method represents significant improvement over existing methods. Андрија Ћирић Докторска дисертација 5 Also the rapid RP-HPLC method with UV (DAD) detection for simultaneous quantification of bioflavonoids: quercetin, apigenin, catechin, epicatechin, kaempferol and luteolin in some food samples (cauliflower, broccoli and Brussels sprouts, Brassica oleracea species) was developed with the aid of LC-Simulator (ACD Labs  suite) software. The optimal conditions for separation and quantification were established after 9 scouting runs entered to LC-Simulator software. The optimized separation was achieved on Hypersil GOLD aQ column with isocratic elution and mobile phase composition A: 2 % acetic acid in water and B: acetonitrile in 91 : 9 (v/v%) ratio. The Rs values were in the range from 1,3 to 3,1, indicating good selectivity of the method. The obtained results generally show good agreement with published data. Low detection limits (0,02 – 0,055 μg/mL) were obtained with acceptable recoveries (90 - 109 %). Total time of analysis was less than 11 min, therefore the proposed method represents significant improvement over existing methods. Sample extracts the Brassica family, obtained by the various methods of extraction have been tested for their radical scavenging effects. The antioxidant activity of extracts of Brassica family was investigated by monitoring the spectrophotometric method of reducing the concentration of DPPH radicals. The reaction between the DPPH radicals, and the Brassica family extracts is carried out under pseudo-first order kinetics. The values of the reaction rate are in the range of 7.1×10-2 to 17.9×10-2 L mol-1 s-1. Different kinetics suggested the presence of polymerized and/or less active antioxidants with different scavenging mechanisms for particular polyphenolic compounds. A RP-HPLC method for the separation and determination of synthetic impurities of moxifloxacin, in its pharmaceutical forms as well as moxifloxacin degradation products, was developed with the aid of DryLab ® software and chemometric (response surface) approach. Both methods were validated under optimal conditions and then used for the determination of related substances of moxifloxacin in pharmaceutical formulations. The separation of four synthesis - related impurities was achieved on a Waters C18 XTerra column using a mobile phase with the composition (water + triethylamine (2 %, v/v)) : acetonitrile = 90 : 10 (v/v %); the pH of water phase being adjusted with dil. phosphoric acid to 6.0. Flow rate of the mobile phase was 1,5 ml/min and UV detection at 290 nm was employed. The column was thermostated at 45 o C. The resolution between two the least resolved impurity peaks was in average, Rs,min > 1.5. Method validation parameters indicate linear dynamic range 0,2 – 2,0 g/ml with LOQ ca. 0,20 g/ml and LOD ca. 0,05 g/ml for all analytes. Андрија Ћирић Докторска дисертација 6 The method was applied for the impurities determination in drug tablets and infusion (Avelox ® , Bayer AG) and for degradation products of moxifloxacin determination in a stability indicating study of moxifloxacin. The impurity content in the tablets and infusion was quantified as 0,1 % of total drug. Two degradation products were noted under hydrolytic conditions. The simple yet rapid and accurate spectrophotometric method for the determination of fluoroquinolone family member, moxifloxacin in human plasma was developed. The determination was carried out in a citrate – phosphate buffer (pH = 7,2) in the presence of sodium dodecylsulfate (12,0 mmol/L). Second order derivative spectra were employed for the quantitation of moxifloxacin by measuring peak – to – peak amplitude in a wavelength range 335 – 345 nm. Linear dynamic range was 0,25 – 10 μg/mL with a limit of detection 0,03 μg/mL. Recovery was between 95 – 102 %. The method was successfully applied for the analysis of plasma of healthy volunteers. A HPLC method was also developed as a reference method, to validate and confirm spectrophotometric results. Methods are appropriate for the purpose and can be used for quality control of food , as well as in the pharmaceutical and clinical practice. Андрија Ћирић Докторска дисертација 7 Увод Феноли и полифенолна једињења су широко распрострањени у природи, првенствено у биљном свету. Биљке које се користе у људској исхрани садрже велики број једињења која су по саставу полифеноли или супституисани феноли. Почетком овог века откривено је да једињења из ове групе имају веома важне биолошке функције у људском огранизму. То се пре свега односи на деривате фенола: флаваноне и флавоноиде. По свом хемијском саставу ове две групе садрже бензо--пиронско језгро и у природи су углавном гликолизовани тј. конјуговани са различитим врстама шећера. У слободном облику ретко се срећу. Биљке их производе као секундарне метаболите па су стога распрострањени готово у свим деловима биљака (семену, корену, зеленим деловима и плодовима) где се акумулирају у највећој мери. Испитивања ових класа једињења привукло је последњих година велику пажњу због њихове антиоксидативне активности, односно способности да делују као хватачи кисеоничних слободних радикала. Утврђена је и корелација између антиоксидативне способности појединих врста биљне хране и садржаја биофлавоноида у њима. Имајући у виду повољан ефекат антиоксидативне активности природних флавоноида на људско здравље развијене су методе синтетичке органске хемије за синтезу једињења аналогних по структури природним флаванонима и флавоноидима. Једна класа тих једињења, под називом хинолони, привукла је велику пажњу имајући у виду њихов снажни антибактеријски ефекат. Наведене особине биофлавоноида и хинолона довеле су до потребе за развојем аналитичких метода за њихово одређивање у различитим типовима узорака (тј. матрицама). При томе биофлавоноиди се најчешће одређују у различитим деловима биљака, док се хинолони, као синтетички производи, одређују у фармацеутским дозираним облицима. Одређивање у хуманој крвној плазми представља посебан изазов имајући у виду сложеност матрикса и ниске нивое концентрација које ове супстанце достижу у крви. Развој методе за одређивање биофлавоноида, у биљном материјалу, мора да обухвати све фазе анализе од начина прикупљања биљака, чувања, одабира делова за анализу, сушења узорака, екстракције аналита и избора инструменталне методе за квантификацију. Посебан проблем код анализе биолошких узорака представља матрични ефекат, односно утицај других компоненти узорка на сигнал аналита. Метода избора за квантификацију биофлавоноида, а такође и за њихову квалитативну Андрија Ћирић Докторска дисертација 8 идентификацију је HPLC са масеном и/или UV детекцијом. У литератури је описан велики број примена HPLC методе за одређивање биофлавоноида при чему су хроматографски параметри готово увек били оптимизовани. Међутим, испитивању утицаја матричног ефекта посвећено је релативно мање пажње, стога је било потребно проучити матрични ефекат у HPLC анализи биофлавоноида и на основу тога оптимизовати ову методу за одређивање биофлавонида у различитим узорцима биљне хране. Осим матричног ефекта, на квантификацију биофлавоноида утиче велики број променљивих од којих се неке могу контролисати, а неке не могу. Велики проблем представља узорковање. Узорци су природно варијабилни у погледу количине биофлавоноида, на пример, због различитог садржаја воде (конституционе и као влаге), температуре околине, састава земљишта, итд. Осим тога, садржај биофлавоноида варира у поједниним деловима биљке па је потребно водити рачуна о томе који се део анализира. Начин чувања узорка је такође извор варијабилитета тј. садржај биофлавоноида зависи од тога да ли је узорак замрзнут или свеж, сушен на ваздуху или у сушници (сушари) и слично. Хомогенизовање узорка за анализу је значајан извор варијабилитета нарочито у погледу величине честица до којих се узорак мрви, као и присуства нежељеног чврстог материјала (нпр. делова стабљике при анализи листова). Наведени узроци варијабилитета тешко се могу контролисати, мада је у овом раду велика пажња посвећена хомогенизацији узорка, а материјал за анализу био је комерцијалног порекла. Следећи проблем је екстракција биофлавоноида где су извори варијабилитета били избор:  начина екстракције,  одговарајућег растварача,  величина додирне површине између узорка и растварача  температуре на којој се врши екстракција,  времена трајања екстракције,  количине употребљеног растварача. Стога је било потребно обратити посебну пажњу и оптимизовати процес екстракције аналита из узорака. Ради обезбеђивања пожељне репродуктивности резултата оптимизован је начин екстракције, тип (врста) растварача, температура и Андрија Ћирић Докторска дисертација 9 време трајања екстракције. Екстракти су подгврнути HPLC анализи, при чему је посебна пажња посвећена оптимизацији резолуције сигнала аналита. Квантификација садржаја аналита вршена је методом стандардног додатка и статистичком обрадом резултата мерења. Знатно мањи проблем у погледу узорковања и екстракције представља анализа хинолона и њихових деградационих производа у фармацеутским формулацијама. Практично, ту је била потребна само оптимизација резолуције сигнала, што је урађено одговрајућим статистичким методама и компјутерском симулацијом. Овај рад треба да представља допринос разради HPLC методе за одређивање биофлавонида и њихових аналога у различитим типовима узорака. Андрија Ћирић Докторска дисертација 10 1. Општи део Андрија Ћирић Докторска дисертација 11 1.1. Флавоноиди Флавоноиди (или биофлавоноиди) представљају највећу групу биљних полифенола. Они су биљни пигменти и назив им потиче од латинске речи flavus, што значи жут. До сада је изоловано преко 8000 једињења која припадају овој групи. Већина флавоноида се налази у воћу, поврћу као и напицима (чај, кафа, пиво, вино итд.) који се добијају од воћа и поврћа. Широко су распрострањени, како у вишим биљкама (Betulaceae – бреза, Sambucaceae – зова, Tiliaceae – липа, Rosaceae – глог, Ginkgoaceae – гинко) [1], тако и у нижим, као што су маховине и лишајеви [2]. Биљке их користе у различите сврхе као што су заштита од сунчеве светлости, као унутрашње регулаторе и као одбрану од инсеката. Неки флавоноиди (антицианидини) су јако обојени и од њих потиче црвена, плава или љубичаста боја цвета и плода биљака. Иако су флавоноиди широко распрострањени у биљном свету, свака биљна врста синтетизује флавоноиде карактеристичне само за ту врсту [3]. Корелација између специјације биљака и флавоноида од изузетне је важности у биљној хемотаксономији (класификација врста заснована на хемијском саставу) [4]. 1.1.1. Историјат флавоноида Проучавање флавоноида почело је, као и код већине природних производа, од потребе за добијањем нових једињења са корисним физиолошким функцијама. Најстарији документ у којем се помињу флавоноиди је дело „Experiments and Considerations Touching Colours“ Robert-а Boyle-а из 1664. године [5], у којем се описује утицај киселина и база на боју екстракта цвета и других ткива биљака. Хемијски састав флавоноида, посебно плавог пигмента цвета кукуруза и црвеног пигмента из вина, описани су средином деветнаестог века и укључивали су изоловање и одређивање елементарног састава, (тј. односа и садржаја угљеника, водоника и кисеоника) [6, 7]. Касније су проучаване и безбојне супстанце повезане са антоцианидним пигментима [8,9]. Интензивније проучавање флавоноида почело је 1936. године, када је мађарски научник Albert Szent-Gyorgi са сарадницима [10] установио да флавоноиди изоловани из паприке (Capsicum annuum) и коре поморанџе (Citrus limon) помажу у опоравку заморчића оболелих од скорбута када у њиховој исхрани није био присутан витамин Ц. Као објашњење својих истраживања Szent-Gyorgi и сарадници су закључили да флавоноиди битно утичу на интегритет малих крвних судова, и на тај начин могу заменити витамин Ц код особа оболелих од скорбута. Они су ову групу једињења сврстали у класу витамина и назвали их витамин П (Р – permeability – пропустљивост) [11]. H. Scarborough и A.L. Bacharach [12] су 1949. године објавили прегледни рад у којем су сумирали радове између 1935. и 1949. године и при томе одбацили тврдњу да витамин П може заменити витамин Ц. Међутим, они су истакли утицај биофлавоноида на пропустљивост крвних судова. Андрија Ћирић Докторска дисертација 12 Опште мишљење до 1950. године било је да су флавоноиди физиолошки значајни и да је њихов главни утицај (издржљивост капилара) независан од витамина Ц. На основу тога, Уједињени Комитет Биохемијске Номенклатуре (Joint Committee on Biochemical Nomenclature) Сједињених Држава је предложио да се термин „витамин П“ замени термином „биофлавоноиди“, а 1980. године Комитет за Додатак храни и Одбор за исхрану (Committee on Dietary Allowances of the Food and Nutrition Board, COMA) Велике Британије су указали да биофлавоноиде треба сматрати фармаколошким супстанцама. У протеклом периоду главни интерес у проучавању биофлавоноида био је њихов однос са витамином Ц и њихова улога као антиоксиданаса. Крајем двадесетог и почетком двадесет првог века проучавање биофлавоноида се интензивира јер је потврђено њихово антивирусно, антиалергијско, антиинфламаторно, антитуморно и антиоксидативно дејство. Коришћење биофлавоноида као додатка исхрани побољшава апсорпцију витамина Ц из гастроинтестиналног тракта, а вероватно и његово задржавање у ткивима [13]. 1.1.2. Номенклатура флавоноида Појам „флавоноид“ се обично користи да се опише велика група природних производа који у свом саставу садрже -пирон (пиранон-4), бензо--пирон (хромон) и 2-фенил-бензо-γ-пирон (флавон) чије су структуре приказане на Слици 1. O O O O O O A B C –пирон бензо--пирон 2-фенил-бензо-γ-пирон (флавон) Слика 1. Основне структуре скелета флавоноидних агликона Структуру флавоноида карактерише флавонско језгро састављено од два бензенска прстена (A и B) повезана преко хетероцикличног прстена (C), односно, C6- C3-C6 угљенични скелет [14 - 19]. У биљкама се могу наћи у облику агликона, али у већини случајева су везани за шећерну компоненту. Флавоноиди се разликују по броју и распореду хидрокси, метокси и гликозидних супституената [16]. На основу броја двоструких веза и степена оксидације угљеникових атома присутних у хетероцикличном С-прстену флавоноиди Андрија Ћирић Докторска дисертација 13 се могу поделити у поткласе [18]. Према њиховој молекулској структури подељени су на 9 група (Табела 1). Табела 1. Подела флавоноида на подгрупе. Флавони Флавоноли Флаванони 9 10 8 5 7 6 O 1 2 4 3 1' 2' 6' 3' 5' 4' O 9 10 8 5 7 6 O 1 2 4 3 1' 2' 6' 3' 5' 4' O OH 9 10 8 5 7 6 O 1 2 4 3 1' 2' 6' 3' 5' 4' O Халкони Антоцианидини Дихидрофлавоноли O O + O O OH Изофлавони Катехини Аурони O O O OH O O У биљкама су често присутни као О- или С-гликозиди. Код О-гликозида шећерна компонента је везана за хидроксилну групу агликона, обично у положају 3 или 7, док је код С-гликозида шећер везан за угљеников атом агликона обично у положају 6 или 8 [19]. Нађено је неколико различитих и изомерних моносахарида који у природи граде гликозиде са флавоноидима. Шећер који је најчешће везан за биофлавоноиде је глукоза, али се често сусрећу и галактоза, рамноза, арабиноза и ксилоза. Маноза, фруктоза, алоза, глукуронска и галактоуронска киселина се такође сусрећу, али веома ретко [20]. Флавоноид-дигликозиди су такође често присутни. Два најчешћа дисахарида су 1→6 глукозорамнозид, у неохесперидози и 1→2 глукозорамнозид. Шећерне компоненте су често супституисане ацил остацима као што је малонил или ацетил [21]. Андрија Ћирић Докторска дисертација 14 1.1.3. Распрострањеност и улога флавоноида у природним производима Флавоноли, флавони и антоцианидини су широко распрострањени у биљном свету [22], док су остале класе знатно мање присутне. Нађени су у чајевима, вину, поврћу, воћу и деловима биљака (семењу, стабљици, цвету и корену), што представља намирнице које се користе у свакодневној исхрани [23 – 25]. Флаванони су карактеристични за породицу цитруса. Катехини се налазе у неколико специфичних биљака као што је на пример кокос. Највећа разноврсност флавоноидних хетерозида налази се у скривеносеменицама; тако је у врстама фамилије Asteraceae идентификовано преко тридесет различитих типова флавоноида. Хетерозиди су растворни у води и налазе се у ћелијском соку, вакуолама епидермалних ћелија мезофила. Одговорни су за боју цветова, плодова и листова биљака. Халкони, аурони и неки флавоноиди су жуте боје, док црвена, плава и разне нијансе љубичасте боје потичу од антоцијана. Агликони флавоноида се налазе на површини листова и цветова. Сматра се да оваква локализација штити биљку од штетних ефеката ултраљубичастог зрачења. Заштитна улога флавоноида огледа се и у њиховој антимикробној активности, а за биљку у којој настају су значајни и као саставни делови ензимских система, неопходних за обављање метаболичких процеса. На Слици 2 представљени су различити флавоноиди биљака заступљених у свакодневној људској исхрани [26, 27]. А) Флавони OOH OH O OH Апигенин Першун OOH OH O OCH3 OH Доизметин Лимун OOH OH O OH OCH3 OCH3 Кризин Исусов венац OH3CO OCH3 O OCH3 H3CO OCH3 Тангеретин Кора поморанџе B) Флавоноли OOH OH O OH Галангин Ђумбир OOH O OH OH OH Физетин Јагода OOH OH O OH OH Каемпферол Броколи OOH OH O OH OH OH Кверцетин Јабука Андрија Ћирић Докторска дисертација 15 C) Катехини OOH OH OH OH OH (-)-Епикатехин Акација OOH OH OH OH OH (-)-Катехин Зелени чај OOH OH OH OH OH O OH O OH OH OH Теафлавин Црни чај OOH OH O O OH OH OH OH OH OH (-)-Епигалокатехин галат Чај D) Флаваноли OOH OH OH CH2 O O OH OH OCH3 Силибинин Плава детелина OOH OH OCH3 OH O Хесперетин Кора поморанџе Е) Флаванони OOH OH O OH Генистеин Псоралеа OOH OH O OCH3 OH Пратенсеин Црвена детелина OOH O OH H3CO Глицитеин Соја OOH O OH Даидзеин Kwao krua F) Изофлавони O + OH OH OH OH OH Цианидин Трешња O + OH OH OH OH OH OH Делфинидин Вишња O + OH OH OH OCH3 OH OCH3 Малвидин Грожђе O + OH OH OH OH Пеларгонидин Купина Слика 2. Хемијске структуре неких природних флавоноида и њихови извори. А) флавони, B) флавоноли, C) катехини, D) флаваноли, E) флаванони и F) изофлавони [26, 27] Андрија Ћирић Докторска дисертација 16 1.1.4. Биосинтеза флавоноида Биосинтеза полифенола се одвија у цветовима и плодовима биљака. Најважнији конституенти ових супстанци су флавоноиди, међу којима су флаванони (као прекурсори свих осталих једињења) најзаступљенији. Флаванони се синтетизују од аминокиселина фенилаланина или тирозина. Начин биосинтезе флавоноида приказан је на Шеми 1. Шема 1. Детаљна шема биосинтезе флаванона и различитих класа флавоноида (ознаке у шеми: DFR – дихидрофлаванон редуктаза, LAR – леукоантоцианидин редуктаза, ANS – антоцианидин синтетаза, 3GT уридо – флаванон 3-глукозид трансфераза, FSI – флаванон синтетаза, CHR – халкон редуктаза, IFS – изофлаванон синтетаза, FHT – флаванон хидрокситрансфераза, FLS – флавонол синтетаза) [28] Тирозин р-Кумарна киселина Фенилаланин Циметна киселина Кафеинска киселина Малонил-СоА Комплекс СоА Халкони Антоцианидини Флаванони Изофлавони Флавони Флавоноли Антоцианин 3-О-глукозид Андрија Ћирић Докторска дисертација 17 Процес биосинтезе флавоноида почиње ензимом фенилаланин-тирозин амонијум лазом (PAL/TAL), који преводи наведене амино киселине у фенилпропионску киселину. Биосинтетички пут укључује ензиме цитохром-Р450 и цинамат-4- хидроксилазу (C4H), који додају хидроксилну групу у положају 4 ароматичног прстена фенилаланина. Након тога се синтетизују естри коензима А (CoA) из фенилпропионске киселине деловањем фенилпропионил-CoA лигазе, као што је 4-кумарил-CoA лигаза (4CL). Тип III поликетид синтетазе - халкон синтетаза (CHS) катализује секвенционалну кондензацију три дела малонил-CoA са једним делом CoA-естра образујући халконе. Ово је први корак у биосинтези флавоноида. Крајње структуре флаванона се синтетизују само када се халкони стереоспецифично изомеризују у (2S)- флаваноне у присуству халкон изомеразе (CHI), што се одвија спонтано у алкалној средини. Након синтезе флаванона, мноштво ензима делује на функционализацију и/или измену конформација тропрстенасте фенилпропаноидне основе дајући преко 8000 различитих хемијских структура. Функционализација се може остварити хидроксилацијом, редукцијом, алкиловањем, оксидацијом и гликозилацијом појединачно или у комбинацији. 1.1.5 Физичко-хемијске особине флавоноида Биолошка активност неке супстанце зависи од њених структурних, физичких и хемијских особина. Агликони флавоноида су кристалне супстанце жуте боје са тачком топљења која се креће у опсегу од 230 до 320 оС, док су гликозиди флавоноида светло жуте или беле боје са нижом тачком топљења која се налази у опсегу од 150 до 200 оС. Уопштено, агликони су липофилни и у већини случаја растворни у поларним органским растварачима: метанолу, етанолу, диетил-етру, ацетону, а готово су нерастворни у води, док су гликозиди ових једињења растворни у врућој води, алкохолима и поларним растварачима. Када имају најмање једну слободну фенолну групу, растварају се у растворима алкалних хидроксида. 1.1.5.1. Липофилност биофлавоноида Једна од битнијих особина која утиче на биолошку активност супстанци, њихову ресорпцију, расподелу, метаболизам и елиминацију је липофилност. Липофилност представља тенденцију једињења да се расподели између липофилне органске фазе (која се не меша се водом) и поларне водене фазе. Липофилност се изражава преко логаритма партиционог коефицијента P (logP) између ове две фазе. Супстанце са великом липофилношћу лако пролазе кроз ћелијску мембрану, најчешће обичном дифузијом. Обично се користе два параметра за објашњење липофилности и то: партициони коефицијент (Р) и хидрофобна супституциона константа (). Први параметар је везан за молекул као целину, док је други везан за супституенте [29, 30]. Андрија Ћирић Докторска дисертација 18 Равнотежни однос концентрација активне супстанце у липидној и воденој фази назива се партициони коефицијент и у систему органска средина/водена фаза природна је мера способности супстанце да прође кроз мембрану. Она представља допринос који даје одређена група партиционом коефицијенту и дефинисана је од стране Hansch-а и сарадника једначином: где су PRH и PRX партициони коефицијенти стандардног једињења и његовог моносупституисаног деривата. Међутим, кад је присутно неколико супституената, вредност  за дато једињење представља суму  вредности за сваки супституент посебно. Вредност партиционог коефицијента за флавоноиде представљена је у Табели 2. Табела 2. Вредност logPexp за флавоноиде [31] Једињење logPexp. Једињење logPexp. Катехин 0,51 Диозметин 3,10 Кверцетин 1,82 Апигенин 2,92 Каемпферол 3,11 Лутеолин 2,53 Кверцетин-3-О-глукозид 0,76 Хризин 3,52 Рутин -0,64 5-Хидроксифлавон 4,30 Хесперетин 2,60 7-Хидроксифлавон 3,62 Фустин 0,87 5,3`,4`-Трихидроксифлавон 3,31 Таксифолин 0,95 Даидзеин 2,51 Нарингенин 2,60 Генистеин 3,04 Нарингин -0,44 Глицитеин 1,97 Диозмин 0,14 Генистин 0,97 На основу Табеле 2 може се закључити да присуство хидроксилних група које донирају атом водоника, и при томе граде водоничне везе, повећавају растворљивост тих молекула у води, а у исто време смањују липофилност полифенола. Утицај броја хидроксилних група на липофилност, нарочито је изражена код флаванона. Најмању вредност липофилности има нарингин (logP = -0,44). 1.1.5.2. Киселинско-базне особине флавоноида Како су флавоноиди полифенолна једињења, понашају се као слабе полипротичне киселине. Вредности рКа веома зависе од природе и положаја супституената у суседним положајима и обично се налазе у опсегу од 8 до 10,5. Ова група једињења поседује од три до пет хидроксилних група које могу дисосовати са рКа вредностима релативно блиским једна другој. На Шеми 2 приказана је ступњевита дисоцијација каемпферола као и одговарајуће константе дисоцијације Ка1, Ка2, Ка2 и Ка4 приказане једначинама (2 – 5). Андрија Ћирић Докторска дисертација 19 O OH OOH OH OH O OH OOH -O OHKa1 H4Fln H3Fln - H + [ ][ ] [ ] (2) O O- OOH -O OH O OH OOH -O OH Ka2 H3Fln - H2Fln 2- H + [ ][ ] [ ] (3) O O- OOH -O OH O O- OOH -O O- Ka3 H2Fln 2- HFln3- H + [ ][ ] [ ] (4) O O- OO- -O O- O O- OOH -O O- Ka4 HFln3- Fln4- H + [ ][ ] [ ] (5) Шема 2. Поступна дисоцијација каемпферола Као што се може видети са Шеме 2, најкиселиjе хидроксилне групе су на положају 7 и 4`. Преостале две константе дисоцијације су везане за положаје 3-ОН и 5- ОН. Хидроксилна група везана за С5 битно се разликује по својим особинама од 7- и 4`- хидроксилних група јер је она у пери-позицији у односу на протон-акцепторску карбонилну групу способну да гради интрамолекулске водоничне везе [32]. Хидроксилна група везана за С3 атом угљеника такође гради интрамолекулску водоничну везу са карбонилном групом, али ова веза је значајно слабија него она која се формира са хидроксилном групом на С5 атому. Склоност ка дисоцијацији сваке хидроксилне групе није константна код свих врста флавоноида и у значајној мери варира у зависности од природе супституената присутних у скелету флавоноида. Каемпферол постоји у неутралном облику при рН вредностима мањим од 8,0 (тетрапротонована киселина) и као протоновани анјон; као трипротонован између рН 8 и 9,5, дипротонован између 9,5 и 10,5; монопротонован између 10,5 и 12,5 и у депротонованом облику при рН већим од 13. Дистрибуциони дијаграм различитих врста каемпферола у воденом раствору је представљен на Слици 3. Андрија Ћирић Докторска дисертација 20 Слика 3. Дистрибуциони дијаграм различитих врста каемпферола у функцији од рН [33] У Табели 3 су приказане литературне вредности константи дисоцијација неких флавоноида. Табела 3. Вредности сукцесивних константи дисоцијације флавоноида Супстанца рК1 рК2 рК3 рК4 рК5 Услови Реф. Катехин 8,77 9,97 11,99  = 0,10 mol/L NaNO3, T = 25 o C 34 Епикатехин 9,00 10,20 12,20  = 0,10 mol/L NaNO3, T = 25 o C 34 Каемпферол 8,2 9,5 10,5 12,5  = 0,10 mol/L NaNO3, T = 25 o C 34 Фисетин 8,405 9,965 11,773 11,906  = 0,10 mol/L КCl, T = 25 oC 35 Морин 5,702 8,860 10,555 11,642 11,851  = 0,10 mol/L КCl, T = 25 oC 35 Кверцетин 8,331 9,667 11,211 11,948 12,378  = 0,10 mol/L КCl, T = 25 oC 35 Нарингин 8,238 10,034 11,324  = 0,10 mol/L КCl, T = 25 oC 35 Галангин 8,232 10,684 11,694  = 0,10 mol/L КCl, T = 25 oC 35 Кризин 7,983 11,406  = 0,10 mol/L КCl, T = 25 oC 35 На основу вредности за рКа флавоноида изводи се закључак да су њихове хидроксилне групе мале киселости. 1.1.5.3. UV/Vis aпсорпциони спектри флавоноида Степен јонизације фенолних група флавоноида у великој мери утиче на апсорпцију светлости (боја) и флуоресцентне спектре ових једињења, што представља битне услове за квалитативну и квантитативну анализу [36]. Као пигменти одговорни су за боју листова и латица биљака, зато што флавоноиди показују интензивну апсорпцију у блиској ултраљубичастој (UV) области спектра. Хетерозиди и агликони имају специфичан апсорпциони спектар, најчешће са две апсорпционе траке: прва између 300 и 400 nm која потиче од прелаза у прстену В, односно циметног система и друга између 240 и 280 nm која потиче од  → * прелаза у прстену А. Kaempf erol 6 8 10 12 14 pH 0 40 80 % f o rm a ti o n r e la ti v e t o K a m Kam KamH KamH2 KamH3 KamH4 Каемпферол % з ас ту п љ ен о ст и р аз л и ч и ти х о б л и к а к ае м п ф ер о л а Андрија Ћирић Докторска дисертација 21 Слика 4. UV/Vis спектри флавоноида [19] На Слици 4 су приказани UV/Vis спектри неких флавоноида и може се уочити да се прва трака за флавоне налази у опсегу таласних дужина од 310 до 350 nm, док је за флавоноле та трака између 350 и 385 nm. Друга трака се налази у опсегу од 250 до 290 nm и иста је за све групе флавонoида. Код флаванона и дихидрофлавонола, прва трака је померена ка мањим таласним дужинама у опсегу од 300 до 330 nm, док се друга трака налази у области од 277 до 295 nm и представља главни пик. На основу тога, ове две подгрупе не могу се окарактерисати једноставном UV/Vis анализом. Флаваноли показују максималну апсорпцију на неспецифичној таласној дужини између 270 и 290 nm, на којоj већина фенола апсорбује, што не дозвољава њихову селективну детекцију. У Табели 4 приказане су таласне дужине максимума апсорпције неких флавоноида. Табела 4. Таласне дужине (nm) максимума апсорпције неких флавоноида у метанолу [37]. Једињење Прва трака Друга трака Једињење Прва трака Друга трака Кверцетин 372 256 Кризин 314 268 Физетин 362 248 Ериодиктиол 336 288 Каемпферол 366 267 Хесперетин 336 288 Флавонол 344 240 Таксифолин 340 288 Лутеолин 350 254 (+)-Катехин - 280 Апигенин 336 269 (-)-Епикатехин - 280 1.1.5.4. Флуоресцентни спектри флавоноида Флавоноиди ретко имају природну флуоресценцију при дневном осветљењу, али под ултраљубичастом светлошћу флуоресцирају. Интензитет флуоресценцеије и боја се мењају у присуству алкалија или металних комплексирајућих агенаса. За доказивање Хесперетин Лутеолин Кверцетин Генистеин Андрија Ћирић Докторска дисертација 22 присуства флавоноида може бити искоришћена специфична флуоресценција комплекса ових једињења са оксалном и борном киселином. У класе флавоноида које показују природну флуоресценцију убрајају се изофлавони, флавоноиди са ОН групом у положају 3, као и метиловани флавони. Природа и број функционалних група одређују да ли одређени флавоноид показује флуоресценцију или не. Само они изофлавоноиди који немају ОН групу у положају 5 показују јаку природну флуоресценцију. Ова једињења показују велика Stoks-ova померања, због промене структуре молекула од непланарне у Ѕ0 стању до планарне у Ѕ1 стању, праћене променом електричног диполног момента. Ова велика померања стварају велику селективност у односу на нечистоће из матрикса, пошто оне омогућују коришћење дужих емисионих таласних дужина. Флуоресцентна ексцитација, па стога и емисиони спектри, показују зависност од рН. На рН вредностима које су блиске рКа вредности аналита јавља се додатна трака на 340 nm. При вишим вредностима рН, супстанца је претежно у анјонском облику. Померање у емисионом спектру је мање изражено: од 495 nm код неутралних молекула до 470 nm за анјоне. Код гликозида овакав ефекат се не јавља јер супституент спречава јонизацију. Такође, 3-ОН група у побуђеном стању је укључена у интрамолекулски пренос протона, што доводи до појаве две траке чији однос зависи од састава растварача. На Слици 5 приказан је флуоресцентни спектар оноина. Слика 5. Флуоресцентни ексцитациони (екс) и емисиони (ем) спектар оноина у ацетонитрилу и води [38] 1.1.5.5. IR спектри флавоноида IR и Raman спектроскопске методе се користе за добијање структурне информације о геометрији флавоноида. Главна примена ових метода је за проучавање места и природе супституената (хидроксилних и метокси група) у молекулској структури, укључујући испитивање диедарског угла између фенилног прстена и хромонског дела молекула. На Слици 6 је приказан IR спектар кверцетина. екс вода ем вода екц ацетонитрил ем ацетонитрил Таласни број (cm-1) И н те н зи те т ф л у о р ес ц ен ц и је Андрија Ћирић Докторска дисертација 23 Слика 6. IR спектар кверцетина [39] Вибрациони спектри једноставних флавоноида у чврстом стању су упоређивани са спектрима добијеним у раствору. Разлике између спектара добијених у чврстом стању и раствору су објашњене могућношћу грађења интрамолекулске водоничне везе код чврстих супстанци, а под специфичним условима и у раствору, или грађењем интермолекулске водоничне везе са растварачем (СН3ОН). Раманска спектрометрија се чешће користи код ових проучавања јер је она мање компликована него IR спектрометрија. На основу броја и места хидроксилних група у пиронском и бензеновом прстену могу се анализирати померања валенционих вибрација карбонилне групе флавоноида. Такође треба разматрати канонске структуре флавоноида и проценити стабилност петочланих и шеcточланих прстенова који се формирају грађењем интермолекулске водоничне везе. Карактеристичне траке које се јављају у IR спектрима неких флавоноида дате су у Табели 5. Табела 5. Прелази у IR спектрима флавоноида и њихова асигнација [40] Супстанца Валенциона веза С=О Аромарично језгро -С-ОН деформационе вибрације -С-ОН валенционе вибрације Флавон (2-фенил-- бензопирон) 1648s 1604s, 1568s, 1496s, 1465s, 1448s, 1377s 1313w, 1283w, 1260w,1224m, 1128s, 1079w, 1044, 1028m Фисетин 1636, 1620s 1603s 1560s, 1516, 1507s, 1464m, 1447 1304, 1285m, 1252w, 1193m 1020 Мирицетин 1640s 1596s, 1560s, 1520s, 1465s, 1447s 1333, 1326, 1228, 1202, 1186 1110, 1029s Кверцетин 1664s 1612s, 1564s, 1523s, 1458, 1429 1317, 1296, 1245, 1211 1015m Морин 1655s 1608s, 1572s, 1508s, 1452s 1320m, 1264m, 1244, 1216w, 1200 1092w Хесперетин 1652s 1612s, 1584, 1516, 1504, 1472, 1444m 1284, 1264, 1240, 1204, 1188 1092, 1068 s - јака трака, m – трака средње јачине, w – трака слабе јачине. Таласни број (cm-1) Т р ан см и та н ц а Андрија Ћирић Докторска дисертација 24 У Табели нису дате вредности таласних бројева веће од 2000 cm-1 где се јавља веома широка трака од вибрација хидроксилне групе која прекрива друге траке. 1.1.5.6. NMR спектри флавоноида NMR спектроскопија је важна аналитичка метода за одређивање структуре флавоноида [41 – 44], али њена употреба је ограничена због мале осетљивости и потешкоћа које се јављају приликом анализе смеше. Међутим, развој NMR спектроскопије омогућава најкомплетније објашњење структуре флавоноида. Могуће је урадити комплетну асигнацију свих сигнала који потичу од протона или угљеника код свих флавоноида изолованих у малим количинама. Ове асигнације се заснивају на хемијском померању () и константама купловања (Ј) у 1D 1H и 13C NMR спектрима. Друге методе, као што је 17O NMR спектроскопија, користе се за проучавање само неких класа флавоноида. На Слици 7 је приказан типичан 1H NMR спектар флавоноида. Слика 7. 1H NMR спектар даидзеина снимљен у DMSO [45] Сигнали који су карактеристични за све класе флавоноида у 1H NMR су сигнали атома водоника у бензенском прстену и то на С2` око 8 ppm, С5` око 7 ppm и С6` око 8 ppm. Остали сигнали који се јављају у 1H NMR су карактеристични за поједине класе флавоноида. Тако, на пример, за флавоне је карактеристичан сигнал на 6,8 ppm који потиче од водоника везаног за С3 угљеников атом, док се за изофлавоноиде и флаваноне овај сигнал јавља на 5 ppm. У Табелама 6 и 7 приказане су вредности 1H и 13C померања за одговарајуће флавоноиде. Андрија Ћирић Докторска дисертација 25 Табела 6. 1Н NMR померања појединих атома водоника у одређеним флавоноидима Флавони 3 5 6 7 8 2` 3` 4` 5` 6` Реф. Лутеолин 6,76s 12,7s 6,94s 7,44 3,88s 7,11d 8,7 7,54d 8,6 46 Апигенин 6,87s 6,19d 6,51d 7,98 d 9,0 7,15d 9,0 7,15d 9,0 7,84d 9,0 47 Изоорнитин 6,55s 6,91s 7,56 s 3,90s ОМе 6,88d 7,2 7,57 d 8,6 48 Флавоноли 3 5 6 7 8 2` 3` 4` 5` 6` Каемпферол 6,14d 1,9 6,34d 1,9 8,01d 8,8 6,89 d 8,8 6,89d 8,8 8,01d 8,8 49 Кверцетин 6,27 6,47 7,82 6,97 7,72 50 Изорамнетин 6,28 6,48 8,04 4,04 ОМе 7,00 7,72 51 Мирицетин 6,17d 2,0 6,35d 2,0 7,23d 7,23d 52 Аурони  4 5 6 7 2` 3` 4` 5` 6` Маесопсин 3,06s 5,76d 1,5 5,73d 1,5 7,00d 8,4 6,57d 8,4 6,57d 8,4 7,00d 8,4 53 Ликоагроаурон 7,46d 8,5 6,83 d 8,5 7,61 d 2,5 6,96 d 8,5 7,42d d 8,5 54 Изофлавоноиди 2 4 5 6 8 2` 3` 4` 5` 6` Јудаицин 4,88s 6,60s 7,05d 8,2 6,59d d 8,2 6,50d 2,1 3,74s ОМе 6,82s 7,5 8,8 6,90s 55 Јунипегнин 7,89s 4,04s ОМе 6,53s 7,1d 2,0 3,93s ОМе 3,92s ОМе 6,94d 8,3 7,03d d 8,3 56 Флаванони 2 3eq 3ax 5 6 7 8 2` 3` 4` Хесперетин 5,45m 2,78d 10,5 3,15m 12s OH 6,15d 2,0 6,17d 2,0 6,8m 9,15br s OH 3,75s Ome 57 Нарингенин 5,46d 2,9 13 2,83d 2,9 17,3 3,25d 13,0 17,3 6,30d 2,2 6,27d 2,2 7,40d 8,6 6,90d 8,6 58 s – синглет, d – дублет, dd – дублет дублета, br – развучен и m – мултиплет За све класе флавоноида у 13C NMR карактеристични су сигнали који се јављају у области од 110 – 150 ppm који потичу од угљеникових атома бензенског прстена. Једини карактеристични сигнали за класу флаванона за С2 и С3 атоме јављају се на око 80, односно 45 ppm. На Слици 8 приказан је 13C NMR спектар катехина. Слика 8. 13C NMR спектар катехина Андрија Ћирић Докторска дисертација 26 Табела 7. 13C NMR спектри флавоноида Р еф . 4 6 4 7 4 8 4 9 Р еф . 4 9 5 0 5 1 5 2 Р еф . 5 9 6 0 Р еф . 5 5 5 6 5 6 Р еф . 5 7 5 8 О М е 5 6 5 6 5 6 О М е О М е О С Н 2 О 1 0 1 О М е 6 ` 1 1 9 1 2 9 1 2 0 6 ` 1 3 1 1 2 2 1 2 4 1 1 0 6 ` 1 3 3 1 2 6 6 ` 1 0 8 1 0 9 1 2 3 6 ` 1 1 8 1 3 0 5 ` 1 1 2 1 1 8 1 1 6 1 1 6 5 ` 1 1 5 1 1 6 1 1 6 1 4 7 5 `/ 5 `` 1 1 6 1 1 7 2 6 5 ` 1 4 1 1 4 6 1 1 1 5 ` 1 1 2 4 ` 1 5 1 1 6 1 1 5 1 1 6 1 4 ` 1 6 0 1 4 6 1 4 9 1 3 8 4 `/ 4 `` 1 5 7 1 4 8 1 8 4 ` 1 4 8 1 4 4 1 4 9 4 ` 1 4 7 3 ` 1 4 7 1 1 8 1 4 8 1 1 6 3 ` 1 1 5 1 4 9 1 5 1 1 4 7 3 `/ 3 `` 1 1 6 1 4 6 1 3 3 3 ` 9 6 1 4 7 1 4 9 3 ` 1 4 9 2 ` 1 1 3 1 2 9 1 1 0 1 2 8 2 ` 1 3 1 1 1 6 1 1 5 1 1 0 2 `/ 2 `` 1 3 3 1 1 9 1 2 2 2 ` 1 5 3 1 4 9 1 1 2 2 ` 1 1 4 1 ` 1 2 3 1 2 6 1 2 1 1 2 1 1 ` 1 2 1 1 2 4 1 2 3 1 2 2 1 `/ 1 `` 1 2 6 1 2 5 2 3 1 ` 1 1 9 1 1 9 1 2 1 1 ` 1 3 1 1 0 1 0 6 1 0 5 1 0 3 1 0 4 1 0 1 0 3 1 0 4 1 0 6 1 0 6 a 4 2 ,1 1 1 2 8 а /9 1 5 4 1 5 4 1 5 3 1 0 1 0 3 1 0 5 9 1 4 9 1 5 9 1 5 6 1 5 7 9 1 5 6 1 5 8 1 5 9 1 5 8 9 1 0 3 1 1 5 8 1 0 3 9 3 ,9 9 3 ,2 9 1 6 3 1 6 5 8 9 3 ,8 9 5 ,1 9 3 ,6 9 0 ,2 8 9 3 ,7 9 4 ,4 9 5 ,4 9 4 ,5 8 1 6 0 1 6 4 7 1 5 7 1 5 5 1 5 5 8 9 5 ,7 9 7 ,9 7 1 5 1 1 6 6 1 6 3 1 6 4 7 1 6 5 1 6 5 1 6 3 1 6 6 7 9 6 ,8 1 1 3 6 1 0 9 1 3 0 1 3 0 7 1 6 5 1 1 6 7 6 1 3 1 1 0 0 1 0 9 1 0 9 6 9 8 ,9 9 9 ,3 1 0 1 9 9 ,7 6 1 7 2 1 6 8 5 1 2 7 1 5 5 1 5 4 6 9 6 ,5 9 6 ,9 5 1 4 7 1 6 3 1 6 1 1 6 0 5 1 6 1 1 6 2 1 6 3 1 6 3 5 9 1 ,1 1 1 3 4 а 1 1 8 1 0 7 1 0 6 5 1 6 3 1 5 9 4 1 8 2 1 8 4 1 8 2 1 8 2 4 1 7 7 1 7 7 1 7 9 1 7 9 4 1 7 4 1 2 3 4 1 2 1 1 8 1 1 8 1 4 1 9 7 1 9 8 3 1 0 3 1 0 4 1 0 3 1 0 2 3 1 3 3 1 3 7 1 3 6 1 3 5 3 1 9 7 1 8 3 3 1 2 9 1 2 0 1 2 1 3 4 2 ,1 4 4 ,1 2 1 6 4 1 6 6 1 6 3 1 6 4 2 1 5 6 1 4 8 1 5 9 1 5 8 2 1 0 7 1 4 7 2 6 7 ,6 1 5 3 1 5 2 2 7 8 ,5 8 0 ,6 Ф л а в о н и Л у те о л и н А п и ге н и н И зо о р и ен ти н С п и н о зи н Ф л а в о н о л и К ае м п р еф о л К ве р ц ет и н И зо р ам н ет и н М и р и ц ет и н А у р о н и М ае со п си н Л и к о аф р о ау р о н И зо ф л а в о н о и д и Ју д аи ц и н И р и сј ап о н и н Ју н и п ег ен и н Ф л а в а н о н и Х ес п ер и ти н Н ар и н ге н и н Андрија Ћирић Докторска дисертација 27 1.1.5.7. Масени спектри флавоноида Већина гликозида флавоноида су термолабилна једињења и немогуће је испаравање таквих једињења, без разлагања, чак и у јонским изворима где је високи вакуум. У овом случају неопходне су методе “soft” јонизације при чему се молекули аналита јонизују без испаравања у високом вакууму (FAB, LSIMS или MALDI) или при атмосферском притиску (ESI, APCI). Из масеног спектра могу се добити информације о молекулској маси целог коњугата, величини шећерне компоненте везене за агликонски део као и молекулској маси самог агликона. Флавоноид-О-гликозиди дају у позитивном моду масене спектре са интензивним [М+Н]+ јоном као и фрагментне јоне настале након раскидања гликозидних веза између флавоноида и шећера. Нешто другачија ситуација се јавља у масеном спектру добијеном у негативном моду где се јавља много мања фрагментација депротонованог молекулског јона [М-Н]-. Код О-гликозил-гликозида, долази до премештања шећера током процеса фрагментације, тако да секвенца губљења шећера не одговара редоследу везивања шећера у молекулу. Другачији путеви фрагментације се јављају код С-гликозида, код којих долази до раскидања прстена шећера и стварања интензивног јона [М+Н-120]+. Раскидање шећерног дела примећено је код свих типова С-гликозида приликом позитивног и негативног мода рада. Структурне информације добијене из масених спектара могу се побољшати када се примењују технике тандемске масене спектрометрије. Могуће је повећати степен фрагментације коришћењем CID MS/MS технологије, међутим код LC/MS инструмената са јонизацијом на атмосферском притиску (APCI или ESI) повећање потенцијала између улазног прореза на анализатору и скимера такође доводи до фрагментације молекулског јона, нарочито у позитивном моду. Највећа предност “soft” техника јонизацијe је могућност купловања MS са различитим хроматографским техникама као што су гасна хроматографија (GC–MS), капиларна електрофореза (CE–MS) и течна хроматографија (LC–MS). Могућност одређивања тачне молекулске масе јона и начина фрагментације омогућава: a) структурне информације о природи агликона и супституената (шећера, ацил група, итд), b) интергликозидно повезивање и место супституције на агликону, c) стереохемијске информације На Слици 9 приказан је типичан масени спектар флавоноида, као и пут фрагментације кверцетин-3-О-галактозида у 70 % етанолу. Андрија Ћирић Докторска дисертација 28 Слика 9. Масени спектар кверцетин-3-О-галактозида у 70 % етанолу [61] У Табели 8 дати су карактеристични фрагменти у масеном спектру неких флавоноида као и њихова релативна заступљеност. Табела 8. Масени спектри неких флавоноида Једињење Матични јон Фрагменти Реф. Катехин 289 (40 %) М-Н- 245 (100 %) 62 Епикатехин 289 (40 %) М-Н- 245 (100 %) 62 Кверцетин 301 (60 %) М-Н- 151 (100 %) 62 Лутеолин 285 (100 %) М-Н- 199 (20 %) 62 175 (20 %) 62 151 (85 %) 62 133 (50 %) 62 Нарингенин 271 (25 %) М-Н- 177 (20 %) 62 151 (100 %) 62 119 (75 %) 62 107 (35 %) 62 Апигенин 269 (60 %) М-Н- 151 (100 %) 62 Каемпферол 285 (100 %) М-Н- 217 (40 %) 62 151 (85 %) 62 133 (75 %) 62 Изорамнетин 315 (60 %) М-Н- 300 (100 %) 62 151 (10 %) 62 Лутеолин 6-С-гликозид (изоориентин) 447 (65 %) М-Н- 429 (65 %) 62 357 (100 %) 62 327 (100 %) 62 Лутеолин 8-С-глукозид (ориентин) 447 (30 %) М-Н- 375 (70 %) 62 327 (100 %) 62 Апигенин 8-С-глукозид (витексин) 431 (35 %) М-Н- 341 (30 %) 62 311 (100 %) 62 Апигенин 6-С-глукозид (изовитексин) 431 (15 %) М-Н- 341 (40 %) 62 311 (100 %) 62 Андрија Ћирић Докторска дисертација 29 1.1.6. Комплекси флавоноида са јонима метала Како у свом молекулу флавоноиди садрже одређен број хидроксилних (најчешће две на B прстену и две на положају С3 и С5 на прстену С) односно кето групу (4- карбонил група на C прстену), постоји могућност грађења комплекса са јонима метала. Метали су есенцијални за многе физиолошке функције, као конституенти хемопротеина и кофактори различитих ензима, који су укључени у антиоксидативну одбрану (гвожђе у каталази, бакар у церулоплазмину, и бакар и цинк у супероксид дисмутази). У зависности од структуре флавоноида постоје три потенцијална места за координовање са јонима метала [63] и то: a) између 5-хидроксилне и 4-карбонилне групе, b) између 3-хидроксилне и 4-карбонилне групе, c) између 3`,4`-хидроксилних група у В прстену (Слика 10). O O M O M O O MO Слика 10. Потенцијална места координовања метала за флавоноид Према литературним подацима, максимални број молекула флавоноида у комплексима са металима не прелази два. За одређивање састава и стабилности комплекса флавоноида са јонима метала најчешће се користе инструменталне методе: спектофотометрија [64] и потенциометрија [65], а све ширу примену налазе NMR [66] и масена спектрометрија [67]. Јони метала који показују висок афинитет ка кисеоничним донорима (фенокси, карбокси, карбонил) су најчешће “hard” Pеаrson-ове киселине. Тој групи припадају јони прелазних метала (Cr, Ln, Y, Zr, Al, Sn, Si, Sb) као и јони лантанида. Од s и p метала“hard” Pеаrson-ове киселине су Al, Be. Комплексирање биофлавоноида са наведеним јонима метала је интензивно проучавано током протекле деценије. Јони метала и флавоноида најчешће показују стехиометрију 1 : 1, ређе 1 : 2 док полинуклеарни комплекси нису нађени. Потенциометријским методама утврђен је састав и стабилност великог броја комплекса метала и флавоноида. При томе се углавном користи техника потенциометријских рН метријских титрација, будући да су флавоноиди слабе киселине у којима јон метала приликом комплексирања истискује водонични јон. Андрија Ћирић Докторска дисертација 30 Пример потенциометријског одређивања састава и стабилности комплекса нарингенина и алуминијума и гвожђа приказан је на Слици 11. Слика 11. Потенциометријске титрационе криве за HClО4, HClО4 + нарингенин, HClО4 + нарингенин + Al(III), HClО4 + нарингенин + Fe(II) у NaClО4 јонској средини [68] Према Irving-Rossotti-јевој методи изводе се три титрације (1) јаке киселине (HClО4) јаком базом, (2) смеше јаке (HClО4) и слабе киселине (нарингенин) и (3) јаке киселине (HClО4), слабе кисеине (лиганд) и металног јона. На основу титрационих кривих (1) и (2) израчунава се средњи протонски број, ̅ , по формули: ̅ где је почетна запремина, концентрација NaOH, почетна концентрација лиганда, почетна концентрација јаке киселине, а представља број протона присутних у лиганду који могу дисосовати. Константе протоновања се одређују са графика зависности ̅ од рН, где рН вредности ̅ на 0,5 и 1,5, криве формирања, одговарају вредностима logK1 односно logK2, што је представљено на Слици 12. Слика 12. Крива формирања за нарингенин Андрија Ћирић Докторска дисертација 31 За одређивање константи стабилности користи се крива (3), при чему се рачуна средњи лигандни број, ̅ , на основу формуле: ̅ ( ̅ ) ̅ где су све ознаке исте као код претходне једначине, осим која представља концентрацију метала помоћу које се израчунавају вредности pL, коришћењем формуле: ( [ ] [ ] [ ] ̅ ) Константе стабилности се одређују на основу графика зависности ̅ од pL (Слика 13), где вредности pL на ̅ једнако 0,5 и 1,5 одговарају константама стабилности. Слика 13. Крива формирања комплекса Al(III) + нарингенин Будући да су флавоноиди обојени спектрофотометрија је метода избора за проучавање комплексирања при чему се прати померање карактеристичног апсорпционог пика флавоноида. На Слици 14 је приказана промена у спектру приликом комплексирања нарингина са бакром(II). ?̅?𝐿 Андрија Ћирић Докторска дисертација 32 Слика 14. UV/Vis спектри нарингина (плава линија) и нарингин-бакар комплекса (црвена линија) [69] Може се уочити да метанолски раствор слободног нарингина показује апсорпциони максимум на 282 nm, што одговара  → * електронским прелазима који се одвијају у А прстену и слабу траку на 326 nm, што одговара електронским прелазима у В прстену. Приликом комплексирања са јоном бакра апсорпциони максимум је померен на 304 nm, а слаба трака је померена на 379 nm у односу на слободни флавоноид, на основу чега се може закључити да постоји интеракција јона бакра са кондензованим прстеновима флавоноида на позицијама 4 и 5 [69]. Каемпферол даје једноставан спектар у области таласних дужина од 300 до 450 nm са једном асиметричном траком са максимумом апсорпције на 365 nm, док се у присуству бакра ова трака дели на две, и то једну са хипсохромним и другу са батохромним померањем. Батохромна трака (max = 413 nm) је карактеристична за комплекс и користи се за одређивање састава и константе стабилности комплекса. Применом методе континуалних варијација и методе молских односа на спектралне податке може се закључити да се комплекс између бакра и каемпферола гради у стехиометријском односу 1 : 1 (Слика 15). Слика 15. Job-ова крива за каемпферол-бакар комплекс [33] 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 A xL Amax Aext Нарингин Комплекс Андрија Ћирић Докторска дисертација 33 Константа стабилности комплекса, се рачуна коришћењем формуле: [ ] [ ][ ] * + * + где је Aext екстраполисана вредност апсорбанције, Amax измерена максимална апсобранција, CM концентрација јона метала, CL концентрација лиганда и Cx концентрација метала и лиганда при максималној апсорбанцији. Сами флавоноиди показују природну флуоресценцију, а у присуству јона метала повећава се природна флуоресценција, па се промена интензитета флуоресценције може искористи за праћење комплексирања. На Слици 16 приказани су флуоресцентни спектри кверцетина и кверцетин металних комплекса [70]. Слика 16. Емисиони флуоресцентни спектар кверцетина и кверцетин метал комплекса у метанолу на собној температури [70] Повећање интензитета флуоресценције комплекса повезано је са координовањем лиганда са малим, али високо наелектрисаним јонима Al(III) и Zn(II), који ефикасно повећавају ригидност структуре самог лиганда, због чега долази до смањене вероватноће расипања енергије. Друго могуће порекло повећања флуоресценције настаје због везивања за дијамагнетичне метале што је повезано са смањењем интрамолекулског преноса електрона између побуђених стања хидроксилне и кето групе C прстена. Кверцетин И н те н зи те т Андрија Ћирић Докторска дисертација 34 Емисионе таласне дужине свих комплекса су померене ка нижим таласним дужинама у односу на слободни флавоноид, што сугерише да електронско поље јона метала смањује разлику између вишеенергетских попуњених и нискоенергетских слободних молекулских орбитала флавоноида. Комплекси вишег координационог броја се градe у благо киселом или неутралном раствору, а ретко у базној средини. Оптимална рН вредност за образовање комплекса је око 6, што зависи и од карактеристика јона метала. Стварање комплекса на рН вредностима мањим од 3,0 је отежано, јер се флавоноиди налазе у недисосованом облику. Иако високе вредности рН фаворизују депротоновање флавоноида и могућност стварања више комплексних врста, при вишим вредностима рН јони метала учествују у споредним реакцијама (хидролизе) и образовања хидроксо комплекса. Комплексирање са флавоноидима као монодентатним или бидентатним лигандима, доводи до образовања комплекса који садрже протон, јон метала и лиганд (протоновани комплекси) који тежи дисоцијацији при вишим вредностима рН. Стога се може јавити батохромно померање у апсорпционом спектру комплекса метал- флавоноид на вишим рН вредностима, које се може приписати дисоцијацији протонованог комплекса, пре него стварању комплекса различитог стехиометријског састава. У Табели 9 су приказани комплекси неких флавоноида са металима као и вредности константи стабилности, одређених различитим методама, где су одговарајуће константе стабилности дефинисане следећим реакцијама и изразима: [ ] [ ][ ] [ ] [ ][ ] где је М метал, а флавоноид. Андрија Ћирић Докторска дисертација 35 Табела 9. Mетоде одређивања, врсте и константе стабилности комплекса флавоноида и метала Флавоноид Метал Метода одређивања Однос М/Фла Константа стабилност log Реф. Рутин Cu(II) Job, MW 1 : 2 10,76 71 Zn(II) MW, B-F 1 : 1 4,68 72 Pb(II) MW, Nach, Job 1 : 2 13,81 73 Ni(II) MW, Nach, Job 1 : 2 8,95 74 Co(II) MW, Nach 1 : 1 6,04 75 MoO4 2- B-F, Job, MW 1 : 1 8,01 76 WO4 2- MW 1 : 2 13,44 77 Eu(III) Job, MW 1 : 2 10,59 78 UO2(II) Job, MW 1 : 1 6,57 79 Pd(II) Job 1 : 2 10,15 80 TiO(C2O4)2 2- Job, MW 1 : 2 10,80 81 Кверцетин Ni(II) MW, Nach 1 : 1 5,57 82 Co(II) MW, Nach 1 : 1 4,87 83 Pd(II) Job, MW 1 : 1 6,05 84 TiO(C2O4)2 2- Job, MW 1 : 2 11,84 85 Морин Cu(II) Job, MW 1 : 2 4,94 86 Zn(II) Job, MW, Nach 1 : 2 6,74 87 WO4 2- Job 1 : 2 11,6 88 Pd(II) Job 1 : 1 4,55 89 TiO(C2O4)2 2- Job, MW 1 : 2 7,35 90 Ba(II) MW, B-F 1 : 1 4,55 91 3-Хидроксифлавон Zn(II) Job 1 : 1 8,51 92 Pb(II) Job, MW, Nach 1 : 1 7,74 93 Ni(II) Job, MW 1 : 1 7,63 94 Co(II) Job 1 : 1 10,87 95 MoO4 2- Job, MW 1 : 2 15,13 96 WO4 2- Job 1 : 2 16,45 7 Eu(III) Job 1 : 2 13,47 98 UO2(II) Job, MW, B-F 1 : 1 8,68 99 TiO(C2O4)2 2- Job, MW 1 : 2 16,65 100 Mn(II) Job, MW 1 : 1 5,43 101 Хесперидин Cu(II) Job, MW 1 : 2 5,78 102 UO2(II) Job, MW 1 : 2 7,00 103 Al(III) Job, MW 1 : 1 4,54 104 Нарингенин Al(III) Irving Rossotti 1 : 1 15,39 68 Irving Rossotti 1 : 2 7,12 68 Irving Rossotti 1 : 3 6,47 68 Fe(III) Irving Rossotti 1 : 1 10,11 68 Irving Rossotti 1 : 2 6,40 68 Irving Rossotti 1 : 3 6,11 68 1.1.6.1. Карактеризација комплекса флавоноида и метала применом IR спектроскопије Да би се добила информација о структури комплекса који се гради између флавоноида и јона метала, неопходно је упоредити апсорпционе траке добијене применом IR спектроскопије за слободан флавоноид и одговарајуће комплексе. На Слици 17 су приказани IR спектри морина и комплекса морина са хромом(III). Андрија Ћирић Докторска дисертација 36 Слика 17. IR спектар (а) морина и (b) морин-Cr(III) комплекса [105] У Табели 10 су приказане одговарајуће траке у IR спектру за неке флавоноиде и њихове комплексе са јонима метала. Табела 10. Апсорпционе траке у IR спектрима слободних флавоноида и одговарајућих комплекса. Једињење  (O-M)  (C=O)  (C=C)  (C-O-C)  (C-OH)  (O-H) Реф. Кверцетин - 1666,4 1611,0 1262,6 1319,1 3408,1 106 Кверцетин-Sn(II) 424,8 1642,9 1341,9 3384,8 Рутин - 1655 1599 1296 3600-3000 107 Рутин-Cu(II) 623 1630 1600 1286 3600-2800 Морин - 1651 1608 1315 1348 3296 108 Морин-Cu(II) 576 1622 1560 1247 1248 3439 Морин 1662 1613 1310 3000-3400 105 Морин-Cr(III) 466 1623 1594 1320 Рутин 1655 1505 1362 - 109 Рутин-Fe(III) 1632 1504 1357 3856 Приликом комплексирања флавоноида са јонима метала највеће промене у IR спектру дешавају се у вибрацијама између карбонилне групе (4C=O) и хидроксилне групе у положају 5. Стога се може закључити да се гради веза између метала и кисеоника карбонилне групе и да је кисеоник везан за атом угљеника у положају 5. 1.1.6.2. Карактеризација комплекса флавоноида са јонима метала применом масене спектрометрије У позитивном моду ESI-MS спектра комплекс између нарингина и бакра, у присуству метанола, показује карактеристичне јоне који су представљени у Табели 11 и који су подвргнути дисоцијацији изазваној колизијом, како би се добила њихова структура. Таласни број (cm-1) Таласни број (cm-1) Т р ан см и та н ц а (% ) Т р ан см и та н ц а (% ) Андрија Ћирић Докторска дисертација 37 Табела 11. Номиналне вредности m/z јона који се јављају у позитивном моду ESI-MS спектра комплекса нарингинина и бакра [69] Номиналне вредности m/z Структура 581 Нарингин + Н+ 603 Нарингин + Na+ 619 Нарингин + K+ 641 Нарингин-H+ + 63Cu2+ 643 Нарингин-H+ + 65Cu2+ 673 Нарингин-H+ + 63Cu2+ + CH3OH 675 Нарингин-H+ + 65Cu2+ + CH3OH 705 Нарингин-H+ + 63Cu2+ + 2CH3OH 707 Нарингин-H+ + 65Cu2+ + 2CH3OH 933 Двоструко наелектрисан: 3Нарингин-2H+ + 263Cu2+ 1183 2Нарингин + Na+ 1222 Двоструко наелектрисан: 4Нарингин-2H+ + 63Cu2+ + Na+ + K+ Ови резултати показују да један молекул нарингина интерагује са једним атомом бакра и при томе губи атом водоника, координујући се са два молекула метанола као контра јонима (губи се приликом јонизације) на m/z 705 и 707. У току јонизације адукти метанола се губе дајући при томе јоне на m/z 641, 643, 673 и 675. Адукти нарингина са јонима натријума и калијума су такође присутни и јављају се на m/z 603 и 619. Присутни су у малој количини али се такође јонизују у позитивном моду. Кластери који садрже два или више молекула нарингина су такође присутни у раствору и јављају се на m/z 933, 1183 и 1222 [69]. 1.1.7. Екстракција полифенолних једињења из биљних узорака За анализу флавоноида и њихових коњугата могу се применити различите методе екстраховања које зависе од порекла биолошког материјала из којег се аналит екстрахује. Код изоловања полифенолних једињења, важно је утврдити циљ, идентификовати појединачне компоненте присутних у узорку или одредити укупни садржај полифенолних једињења. Присуство угљених хидрата и/или липида могу утицати на садржај и врсту флавоноида и њихових деривата у екстракту. Коришћење сувих узорака биљака за екстракцију може довести до смањења приноса коњугата флавоноида. Ациловани гликозиди флавоноида су нестабилни приликом повећања температуре и обично се термички деградирају током припреме узорка. Стога је приликом екстракције коњугата и ацилованих гликозида флавоноида потребно очувати њихову структуру јер су ови облици одговорни за њихову физиолошку и биохемијску улогу у биљкама. Слободни агликони флавоноида могу се изоловати из биљног ткива (листа или корена) коришћењем неполарних растварача као што су метилен хлорид, етил-етар или етил-ацетат. Међутим, поларнији гликозидни коњугати растварају се у поларним растварачима (метанол и етанол) и обично се екстрахују по Сокслету. Смеша алкохола и воде у различитим односима се примењује за екстракцију флавоноида и њихових коњугата из чврстог биолошког материјала (биљна или животињска ткива). Ефикасност екстракције флавоноида се може побољшати употребом ултразвучне [110, 111] или Андрија Ћирић Докторска дисертација 38 течне екстракције при повишеном притиску на температурама од 60 до 200 оС. Суперкритична течна екстракција угљеник(IV)-оксидом се такође користи, али се мора водити рачуна о могућој термалној деградацији флавоноида. У већини случаја неопходно је даље пречишћавање и/или преконцентровање аналита. За ову сврху најчешће се користи течно-течна екстракција или екстракција на чврстој фази. За процену приноса екстракције потребно је у биолошки материјал додати одговарајући интерни стандард. Као интерни стандард најпогоднија су једињења структурно слична испитиваним једињењима, али која нису присутна у узорку. Једињења са стабилним изотопима (2Н и 13С) су корисна када се примењује масено спектрометријска детекција. Приликом изоловања флавоноида из биолошког материјала, додају се различите класе фенолних једињења. Са друге стране, приликом квантитативне анализе смеше флавоноида потребно је додати референтни стандард у циљу тачне квантификације. Избор начина екстракције флавоноида из биолошког материјала је важан и зависи од циља истраживања. Количина биолошког материјала из кога се врши екстракција флавоноида може бити веома мала и тада се користи техника микроекстракције. У многим случајевима потребно је избећи хемијску и/или ензимску деградацију. Ово је важно приликом одређивања гликозида флавоноида у истраживањима која су везана за функционисање биљака или током физиолошких или биохемијских студија где је потребно познавати све класе флавоноида које су присутне, чак и термално нестабилне ациловане деривате флавоноида. Са друге стране, у фитохемијској анализи биљних врста или фитофармацеутским испитивањима биљног материјала, важније је изоловање свих биолошки активних агликона флавоноида у добром приносу. У том циљу примењују се драстичнији услови изоловања. 1.1.8. Одређивање фенолних једињења HPLC и гасна хроматографија (GC), и њихова комбинација са масеном спектрометријом су две најчешће примењeне методе за квантификацију фенолних једињења. Друге релевантне технике се заснивају на спектрофотометрији. 1.1.8.1. Течна хроматографија (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) Високо-ефикасна течна хроматографија је техника која се најчешће користи за одвајање и квантификацију фенолних једињења [112]. Неколико фактора утиче на HPLC анализу фенола: чистоћа узорка, састав мобилне фазе, тип колоне и врста детектора [113]. Уопштено, пречишћени узорци фенола се инјектују у HPLC инструмент са реверзно-фазном C18 колоном (RP-C18) и фотодиодним детектором (PDA) и елуирају поларним закишељеним органским растварачем [114]. Постоји неколико радова који описују примену HPLC технике за квантификацију фенолних једињења [115 – 118]. Уопштено, осетљивост HPLC методе Андрија Ћирић Докторска дисертација 39 се повећава пречишћавањем фенолних једињења и њиховим преконцентровањем из сложеног матрикса сировог биљног материјала. Ацетонитрил и метанол, или њихови водени раствори, се најчешће користе као мобилне фазе приликом HPLC квантификације биофлавоноида [119, 120]. У неким случајевима се користе етанол, тетрахидрофуран (THF) и 2-пропанол [121 – 123]. pH мобилне фазе би требало да буде у опсегу од 2 – 4 како би се избегла јонизација фенолних једињења током њихове идентификације. Стога се користе закишељени водени раствори мобилних фаза са сирћетном, мрављом, фосфорном киселином или пуфери на бази амонијум ацетата [124, 125]. Најчешће се користи градијентни начин елуирања, мада се може користити и изократски у зависности од сложености матрикса [115]. Избор одговарајуће колоне је најважнији фактор при идентификацији фенолних једињења. На основу поларности, различите класе фенолних једињења могу бити раздвојене коришћењем нормално-фазних или реверзно-фазних колона дужине од 10 до 30 cm, унутрашњег пречника 3,9 - 4,6 mm и величине честица од 3 до 10 m [126]. Нови типови колона (монолитне и површинско-порозне) дужине од 3 до 25 cm, унутрашњег пречника од 1 до 4,6 mm и величине честица од 1,7 до 10 m су у употреби за одређивање фенолних једињења применом савремених HPLC техника као што je UHPLC (ultra-high performance liquid chromatography) и HTLC (high temperature liquid chromatography) као и дводимензионалне течне хроматографије (LC×LC) [127, 128]. Већина HPLC анализа фенолних једињења се изводи на собној температури. Међутим, у новије време и високе температуре се препоручују приликом примене нових колона и инструмената [129]. Врема трајања HPLC анализе је још један фактор који утиче на раздвајање фенолних једињења и може бити у опсегу од 10 до 150 min. Roggero и сарадници [130] наводе да велика репродуктивност резултата, када је дуго време анализе, захтева константну температуру, да би резултати били репродуктивни. Фенолна једињења се најчешће идентификују коришћењем UV-VIS и PDA детектора на таласним дужинама од 190 до 380 nm [131]. Међутим, флуорометријски (FLD) [132], колориметријски [133], PDA купловани са флуоресцентним детектором [134] и технике детекције на основу хемијске реакције се такође користе. Масено спектрометријски (MS) детектори везани за течне хроматографе (HPLC–MS) [135, 136], као што су електроспреј јонизациони масени спектрометри (ESI-MS) [137], масена спектрометрија са ласерском десорпционом јонизацијом потпомогнутом матриксом (MALDI–MS) [138, 139], масени спектрометри са брзим бомбардовањем атома (FAB- MS) [140] и удар електрона-масена спектрометрија [140], се такође користе за структурну карактеризацију и потврду различитих класа фенолних једињења. HPLC метода куплована са MS детекторима је веома осетљива и има могућност за постизање велике специфичности на основу избора масе која се детектује [141]. HPLC–NMR и UHPLC су нове технике за идентификацију биоактивних једињења у узорцима биљног порекла [142 – 144]. Андрија Ћирић Докторска дисертација 40 Нови трендови у анализи фенолних једињења су течна хроматографија хидрофилних интеракција (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) као и дводимензионална течна хроматографија (2-dimensional liquid chromatography, 2D LC). У новије време HILIC техника је све популарнија због велике компатибилности мобилне фазе која се користи када се повеже за MS, чиме се повећава прецизност приликом анализе поларних једињења у сложеним матрицама [145]. 2D LC је релативно нова савремена техника у хроматографији која омогућава одвајање и идентификацију структурно сличних или трагова једињења из сложених матрикса, повећавајући капацитативност пика и селективност [146]. Комбинација 2D LC×HILIC и 2D LC×RP-LC, показује велики потенцијал за одвајање компоненти различите поларности из сложеног матрикса, што није могуће применом једнодимензионалне RP- LC [147]. 1.1.8.2. Гасна хроматографија (GC) Гасна хроматографија је техника која се користи за одвајање, идентификацију и квантификацију фенолних једињења као што су фенолне киселине [148], кондензовани танини [149] и флавоноиди [150]. Главна препрека приликом GC анализе, које нема код HPLC технике, су дериватизација и испарљивост фенолних једињења. Квантификација фенола гасном хроматографијом из узорака хране укључује фазе пречишћавања, као што је уклањање липида из екстракта, ослобађање фенола од гликозида и раскидање естарске везе у присуству ензима [151], алкалној [152] и киселој средини [153] и хемијска модификација, као што је превођење у лако испарљиве деривате [154]. Неколико типова реагенаса се користи за модификацију и стварање лако испарљивих деривата. Етил и метил хлороформиат, диазометан и диметил сулфоксид у комбинацији са метил јодатом се користе за синтезу метил или етил естара фенола. Друга врста реагенаса који имају предности у стварању испарљивих једињења су триметилсилил једињења као што су трифлуороацетамид, N-(terc-бутилдиметилсилил)- N-метилтрифлуороацетамид и триметилсилил деривати [155]. Реакција силилације је једноставна, ослобођена нежељених нуспроизвода и ствара веома испарљиве производе. Силил дериватизација је веома добар начин за идентификацију фенолних једињења. Капиларе пуњене збијеним силикагелом дужине 30 m, унутрашњег пречника 25 – 32 μm и величином честица стационарне фазе од 0,25 μm су најчешће колоне које се користе за квантификацију фенола коришћењем GC технике [155]. Употреба пламеног јонизационог детектора (flame ionization detector, FID) је најчешћа метода за детекцију фенола, али њен примат полако преузима масена спектрометрија (MS). Гасна хроматографија је постала осетљивија и селективнија метода када се комбинује са масеном спектрометријом. Андрија Ћирић Докторска дисертација 41 1.1.8.3 Спектрофотометријске методе Спектрофотометрија је релативно једноставна техника за квантификацију фенола. Примена Folin-Denis и Folin-Ciocalteu реагенаса су две широко распрострањене спектрофотометријске методе које се користе за мерење укупних фенола у биљном материјалу [156, 157]. Обе методе се заснивају на хемијској редукцији која укључује реагенсе који садрже волфрам и молидбен [113]. Производи ових редукција, у присуству фенолних једињења, су плаве боје са широким апсорпционим максимумом на 760 nm. Оба реагенса нису специфична само за феноле, већ реагују и са осталим супстанцама као што су аскорбинска киселина, амини и шећери [158]. Квантификација укупних фенола, укупних флавоноида, проантоцијанидина и хидролизабилних танина може се извршити колориметријским методама. Метанолски или етанолски екстракти биљних фенола се мешају са AlCl3 и мери апсорбанција у опсегу од 410 до 423 nm [159, 160]. Ванилин и диметиламиноциметалдехид се користе за одређивање проантоцијанидина [28]. Ове методе дају информације о степену полимеризације и путу хидроксилације као и стереохемији подгрупа флаван-3-ола [161, 162]. Смеша бутанола и HCl се користи за одређивање проантоцијанидина. У реакцији између проантоцијанидина са бутанолом у присуству вруће HCl долази до аутооксидације и настајања антоцианидина црвене боје који показује маскимум апсорбанције на око 550 nm [163]. Третирањем узорка албумином таложи се нерастворни танин-протеин комплекс. Танин-протеин комплекс се раствара у натријум-додецил сулфату и триетаноламину и реагује са гвожђе(III)-хлоридом, стварајући љубичасти комплекс са максимумом апсорпције на 510 nm [164]. Хидролизабилни танини се могу одредити коришћењем калијум-јодатне методе, тиоцијанатне методе или натријум нитритне методе. Калијум јодат се најчешће користи за испитивање узорака на садржај танина. Црвена боја са максимумом апсорпције између 500 и 550 nm, настаје као последица реакције између метил галата и калијум јодата [162]. Спектрофотометријска метода за квантификацију флавонона и дихидрофлавонола се заснива на њиховој интеракцији са киселим раствором 2,4-динитрофенилхидразина [126]. Пиноцембрин је стандард који се користи за ова мерења и апсорбанција се мери на 486 nm [165]. 1.1.8.4. Друге методе за одвајање и квантификацију фенолних једињења Хроматографија на хартији (paper chromatography, PC) и танкослојна хроматографија (thin-layer chromatography, TLC) су две адсорпционе технике које се користе за одвајање фенолних једињења из узорака хране [157]. Хроматографија на хартији је једноставна метода, али се мање користи у поређењу са HPLC и GC. Користи Андрија Ћирић Докторска дисертација 42 се за одвајање и идентификацију фенолних једињења из листа чаја коришћењем мобилне фазе састава бунанол/сирћетна киселина/вода [166]. Танкослојна хроматографија је применљивија метода од хроматографије на хартији за анализу фенолних једињења, нарочито код сирових биљних екстраката. Ова метода је јефтина и омогућава детекцију више једињења на истој плочи, при кратком времену извођења анализе [114]. Хроматографија брзе измене струје (high-speed counter current chromatography, HSCCC) је двофазна течно-течна партициона метода која се користи за изоловање и одвајање смеше компонената [112]. Ова јединствена техника се широко примењује за пречишћавање и одвајање различитих полифенолних једињења [167 – 170]. Одвајање једињења помоћу HSCCC методе заснива се на њиховим партиционим коефицијентима између две течне фазе, који су одређени њиховом хидрофобношћу [171]. Метода не користи чврсту подлогу која омогућава трајно адсорбовање једињења из узорка [172]. Применом ове методе полифенолна једињења се могу раздвојити из сирових екстраката без претходне припреме узорака (изоловање и пречишћавање). Капиларна електрофореза (сapillary electrophoresis, CE) је погодна техника за идентификацију наелектрисаних једињења малих и средњих молекулских маса. Сама метода је брза и ефикасна са високом резолуцијом и не захтева велике количине узорка и реагенаса [173]. Постоји неколико ревија које се баве проучавањем примене капиларне електрофорезе за одвајање и идентификацију фенолних једињења у биљном материјалу [174 – 178]. Мицеларна електрокинетичка хроматографија (micellar electrokinetic chromatography, MEKC), капиларна електро хроматографија (capillary electro chromatography, CEC) и капиларна зонска електрофореза (capillary zone electrophoresis, CZE) купловане са UV, електрохемијском или масеном детекцијом су најраспрострањеније технике капиларне електрофорезе [179 – 181]. 1.1.9. Антиоксидативна активност флавоноида Слободни радикали се константно стварају у људском организму у специфичним метаболичким процесима. Примери кисеоничних слободних радикала укључују слободни кисеоник (1О2), супероксид (О2 •-), алкил пероксил (ROO•), алкоксил (RO•) и хидроксил (HO•) радикал. Поред осталих функција, слободни радикали су укључени у стварање енергије и регулисање раста ћелије. Међутим, када се јави неравнотежа између стварања слободних радикала и одбрамбених механизама у организму, долази до реакције између слободних радикала са липидима ћелијске мембране, протеинима ткива и ДНК, при чему долази до оксидације која изазива оштећење мембране, модификацију протеина и оштећење ДНК. Сматра се да ова оксидативна оштећења играју узрочну улогу код неких болести као што су рак, болести срца и превремено старење тела. Човек поседује широк спектар физиолошких антиоксидативних механизама за неутралисање слободних радикала, везивање металних јона укључених у њихово формирање и смањење оштећења. Храна богата полифенолима свакако доприноси овој одбрани. Многа фенолна једињења, као што су флавоноиди, показују Андрија Ћирић Докторска дисертација 43 антиоксидативну активност, која је много јача него она коју показују витамини Ц и Е [182]. Особина која најбоље описује антиоксидативну активност флавоноида је њихов велики капацитет да дају водоничне јоне [183 - 187]. Интензитет антиоксидативне активности флавоноида у великој мери зависи од њихове хемијске структуре. Постоје велике несугласице између структуре и антиоксидативне активности флавоноида [188, 189]. Прихваћено је да на антиоксидативну активност флавоноида утиче број и место хидроксилних група везаних за В и А прстен, као и продужена коњугација између В и С прстенова [190 – 199]. За ефективно уклањање радикала и/или антиоксидативни потенцијал флавоноида потребно је да су испуњена три основна Борова структурна критеријума: 1) о-дихидрокси (3`,4`-дихидрокси, нпр. катехол) структура у В прстену, даје већу стабилност феноксил радикала флавоноида, преко водоничне везе или преко продужене делокализације електрона; 2) Двострука веза између С2-С3 (могућа коњугација са 4-оксо групом), која одређује копланарност хетеропрстена и учествује у стабилизацији радикала делокализацијом електрона преко сва три прстена; 3) Присуство 3-ОН и 5-ОН група повећава капацитет неутралисања слободних радикала и највећу апсорпцију радикала. Поред ових критеријума може се додати још један четврти услов: 4) У осдуству о-дихидрокси структуре у В прстену, хидроксил супституенти у структури катехола на А прстену могу се компензовати и утицати на антирадикалску антивност флавоноида [200 – 209]. Према van Acker et al. [193], основна структура флавоноида није од великог значаја за антиоксидативну активност. Она постаје значајна само када катехолна група није присутна. Гликолизација флавоноида у већини случајева смањује њихову антиоксидативну активност. Блокирањем хидроксилне групе на С3 положају или померањем 3-ОН смањује се антиоксидативна способност флавоноида. На Слици 18 су сумирани структурни критеријуми који утичу на антиоксидативну активност флавоноида. Слика 18. Структурни критеријуми за антиоксидативну активност флавоноида Андрија Ћирић Докторска дисертација 44 1.1.9.1. Механизам и кинетика антиоксидативне активности флавоноида Према Halliwell-у и Gutteridge-у механизам антиоксидативне активности укључује: (1) Смањење настајања реактивних кисеоничних врста, било инхибицијом ензима или везивањем трагова метала који су укључени у производњу слободних радикала; (2) Удаљавање реактивних кисеоничних врста и (3) Регулисање или заштиту антиоксидативних бранилаца. Механизми антиоксидативне активности флавоноида укључују директно везивање и неутралисање реактивних слбодних радикала, везивање трагова јона метала који учествују у формирању слодобних радикала, инхибицију ензима укључених у настајање слободних радикала и регенерацију антиоксиданата везаних за мембрану [210, 211]. Антиоксидативна активност флавоноида се јавља из директног уклањања реактивних кисеоничних врста. Уопштено се може рећи да је основни механизам уклањања радикала флавоноидима донирање атома водоника. Они се такође могу понашати и као преносиоци електрона [212]. Структурни захтеви за донирање атома водоника за антиоксидативну активност укључују орто-дихидрокси супституцију у В- прстену, С2-С3 двоструку везу, и С4 карбонилну групу на С прстену [213, 214]. Реактивне кисеоничне врсте реагују са флавоноидима (антиоксидант) стварајући неактивне врсте (фенокси радикал) и коњуговану базу хидроген-пероксид. Долази до прерасподеле електрона и фенокси радикал је стабилизован резонанцијом. Међутим, коњугована база хидроген-пероксид није стабилна и реагује са флавоноидима, везујући протон, дајући релативно стабилан хидроген-пероксид. Предложени механизам интеракције између супероксидног анјонског радикала са флавоноидима се заснива на преносу атома водоника и овај механизам се може описати једначинама: [ ] Код механизма преноса атома водоника, хидроксилна група даје водоник радикалу, стабилизујући га и дајући релативно стабилан фенокси радикал флавоноида (Слика 19). Фенокси радикал флавоноида може реаговати са другим алкоксид радикалом (RO•), формирајући хинон стабилне структуре: Андрија Ћирић Докторска дисертација 45 Слика 19. Механизам антиоксидативне активности 3`,4`-дихидрокси флавоноида Прстен В флавоноида је укључен у реакцију флавоноида и радикала. Хидроксилна група поседује копланарну Ar-O везу у којој  орбитале ароматичног прстена теже преклапању са слободним електронским паром кисеоника из хидроксилне групе, доводећи до делокализације невезивних електрона кисеоника и јачања Ar-O везе. Као резултат наведеног долази до повећања густине електрона код арил угљеничног прстена у орто и пара хидроксил групама. Стога, присуство С2 и С3 двоструке везе и супституената на позицији 3 у С прстену са кето групом ће стабилизовати радикал резонанцијом унутар молекула. Коњугација је важан фактор за антиоксидативну активност. Прихваћено је да торзиони угао В-прстена утиче на способност везивања за слободне радикале. Механизам где се даје електрон је валидан само за монохидрокси флавоне, где не постоји могућност да се атом водоника измењује са других група. Код 3-ОН и/или 5- ОН хидроксифлавона, јака водонична веза између ОН група са атомом кисеоника везаним за С4 карбонилну групу спречава, не само његово ефикасно депротоновање, већ и његову активност за везивање радикала, у смислу донирања атома водоника. Предложени механизам антиоксидативне активности 3-ОН и 5-ОН хидроксифлавона је приказан на Слици 20. Слика 20. Механизам антиоксидативне активности 3-хидроксифлавона Водонична веза стабилизује феноксил радикал флавоноида Стабила хинонска структура Андрија Ћирић Докторска дисертација 46 Структура А је основни неутрални молекул 3-хидроксифлавона, В је почетни радикалски катјон (добијен отпуштањем електрона из неутралног молекула) и С је његов стабилнији таутомерни облик. Таутомерни облик С флавоноида је такође антиоксидант који ихнибира ензиме пероксидазе. Овај механизам је одговоран за њихове ефекте in vivo. Флавоноиди показују антиоксидативну активност и везивањем са јонима прелазних метала у првом реду са Fe(II), Fe(III) и Cu(II). Ови јони учествују у реакцијама стварања слободних радикала [215]. Комплекси метала и флавоноида у значајној мери елиминишу слободне радикалске врсте и играју важну улогу у заштити од оксидативног стреса. Флавоноиди могу изоловати металне јоне комплексирањем и на тај начин спречавају стварање метал-прелазног стања приликом настајања слободних радикала штитећи потенцијалне биолошке молекуле од оксидације. Антиоксидативна активност се не може директно измерити, већ се мери ефекат антиоксиданта у контролисаном процесу оксидације. Постоји више метода за мерење антиоксидативне активности. Као што и методе одређивања антиоксидативне активности варирају, тако варирају и методе изражавања резултата. У спектрофотометријском одређивању антиоксидативне активности, уобичајени начин изражавања антиоксидативне активности је преко релативне антиоксидативне активности (РАА) која је дата изразом: где су АА1 и ААреф апсорбанције испитиване и референтне антиоксидативне супстанце при истој моларној концентрацији, на истој таласној дужини. Једноставан метод који је развијен за одређивање антиоксидативне способности намирница користи стабилан 2,2 дифенил-1-пирилхидразил (DPPH) радикал, чији је апсорпциони спектар приказан на Слици 21. Слика 21. Апсорпциони спектар метанолског раствора DPPH 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 300 400 500 600 700 A  (nm)  max = 517 nm  Андрија Ћирић Докторска дисертација 47 Присуство неспареног електрона у слободном радикалу DPPH доводи до апсорпционог максимума на 517 nm и љубичасте боје раствора. Боја се мења од љубичасте ка жутој како се моларна апсорпција DPPH радикала смањује (са 9660 на 1640), када је неспарени електрон упарен са водоником из слободних радикала дејонизованог антиоксиданта. Том приликом се формира редукован DPPH-H. Резултујућа деколоризација је стехиометријска у односу на број уклоњених електрона. На Слици 22 је приказана шема реакције између флавоноида и DPPH. N N NO2O2N NO2 + O OH O OH CH3 OH OH NO2O2N NO2 N NH + O OH O OH CH3 OH O Слика 22. Шема антиоксидативне активности DPPH у реакцији са полифенолима [216] Слика 23. Кинетика радикалске реакције екстракта кумина праћена DPPH методом [216] Слика 23 представља кинетику реакције DPPH радикала у присуству полифенола (кумина) у току 15 минута. Реакција између DPPH радикала и полифенола може се поделити у два сегмента, први део „брзе“ реакције који траје до 5 минута и други „спори“ део који почиње након 5 минута и траје до краја реакције. Спор реакциони период у реакцији полифенола и DPPH може се објаснити формирањем производа који споро реагују са DPPH радикалом или интрамолекулским преуређењем у молекулу антиоксиданса [216]. Реакција флавоноида са DPPH радикалом има брзину другог реда, са одговарајућом константом брзине, kf. П р ео ст ал и D P P H ( % ) Време (min) DPPH Метанол Етанол Дихлоро метан Ацетон Хексан Етил-ацетат Андрија Ћирић Докторска дисертација 48 [ ] [ ] [ ][ ] Табличне вредности константе брзине за неке флавоноиде дате су у Табели 12. Табела 12. Вредности константе брзине реакције DPPH радикала са флавоноидима [208] Флавоноид kf (L mol -1 s -1 ) Флавоноид kf (L mol -1 s -1 ) Каемпферол 2,38×103 Баицалеин 6,3×102 Кверцетин 4,76×102 Лутеолин 2,29×103 Робинетин 1,14×102 Нарингенин 4,0 Кверцетагетин 4,4×103 Дихидрокверцетин 2,2×102 Мирицетин 7,55×101 (+)-Катехин 5,3×102 Апигенин 0,1 (-)-Епикатехин 4,89×102 Кинетика антиоксидативне активности различитих врста екстраката који садрже полифеноле показује да она зависи од ефикасности уклањања слободних радикала и садржаја полифенола. Међутим, како је одређивање антиоксидативне активности смеше полифенола компликованије него одређивање антиоксидативне активности појединачних полифенола, тешко је објаснити механизам антиоксидативне активности, али се претпоставља да се одигравају сличне реакције. 1.1.9.2. Веза између структуре и антиоксидативне активности флавоноида (QSAR студија) Проучавање везе између структуре и антиоксидативне активности флавоноида врши се квантно-механичким методама. Како постоји велики број флавоноида, тако се и њихове антиоксидативне активности разликују. Стога се често користи QSAR анализа за проналажење корелације између биолошке актиности и физичко-хемијских особина флавонида. Антиоксидативна активност флавоноида веома зависи од броја и места везивања хидроксилних група у молекулу. Дихидроксиловани В-прстен (катехолна структура), присуство незасићења и кето групе у С-прстену се претпоставља да повећавају антиоксидативни капацитет [16, 192]. Lien и сарадници [218] су применили израчунате параметре као што су топлота формирања, енергија високо-спинских попуњених и ниско-спинских непопуњених молекулских орбитала, и број хидроксилних група за описивање антирадикалске активности флавоноида и других полифенолних једињења. Амић и сарадници [219] су дефинисали индикаторске променљиве као збир бројева и положаја хидроксилних група присутних у флавоноидима. Farkas-а и сарадници [220] су направили квантитативни модел за дескрипторе и предвиђање антиоксидативне активности за флавоноиде и класификовали их на основу њихове биолошке активности и структурног шифровања. Предвиђене и Андрија Ћирић Докторска дисертација 49 експерименталне вредности антиоксидативне активности флавоноида дате су у Табели 13. Табела 13. Предвиђене и експерименталне вредности антиоксидативне активности флавоноида [220] Једињење Експериментално Предвиђено 3,5,7,3`,4`,5`-Хексаметокси флавон 2,6 22,7 3,5,7,3`,4`-Пентаметокси флавон 1,1 8,1 3-Хидрокси флавон 59,4 6,1 5-Хидрокси флавон -4,9 -26,7 7-Хидрокси флавон 0,0 65,8 Галангин 64,9 59,8 Каемпферол 65,3 8,1 Кверцетин 63,6 61,8 Кверцетин 3-О-глукозид-7-О-рамнозид -6,2 -7,8 Ларицитин 28,5 61,8 Мирицетин 18,4 22,7 Морин 63,5 65,8 Нарингин 47,4 48,1 Рутин -10,2 -7,4 Фисетин 61,6 57,7 Фустин -23,4 61,1 Хесперитин 4,7 -5,9 1.1.10. Значај флавоноида и њихова фармаколошка активност Флавоноиди показују широк спектар биолошке активности. Они имају антиинфламаторно, антибактеријско, антивирално, антиалергијско [22, 23], цитотоксично, антитуморско дејство [18, 221, 222]. Флавоноиди су такође познати као инхибитори липидне пероксидазе, агрегатори тромбоцита, капиларне пермеабилности и фрагилности, утичу на активност цикло-оксигеназе и липооксигеназе. Понашају се као антиоксиданти, хватачи слободних радикала, хелатори метала [222, 223]. Такође, показало се да инхибирају различите ензиме као што су хидролазе, хијалуронидазе, алкалне фосфатазе, арилсулфатазе, липазе, α-глукозидазе, киназе [224]. Андрија Ћирић Докторска дисертација 50 1.2. Хинолони Хинолони су структурни аналози флаванона и тиафлаванона за које је карактеристичан коњугован ароматичан прстен А и фенил супституент В на позицији 2 хетероцикличног прстена С, опште структуре приказане на Слици 24. 4a 8a 5 8 6 7 4 3 X 1 2 1' 2' 6' 3' 5' 4' O B R' CR A Слика 24. Општа структура хинолона Флаванони имају у хетероцикличном прстену Х = О [225, 226], док хинолони имају аза везу (Х = NR, R = Н, ацетил и сулфонил) [227, 228] и тиафлаванони имају тиоетарску везу (Х = S) [229]. Хинолони (3) и флаванони [230, 231] су распрострањени у биљкама, али могу бити и синтетисани у лабораторији коришћењем различитих метода. Прстен С хинолона садржи неколико реактивних центара (позиције 1, 3 и 4) и такође дозвољавају различит степен незасићености хетероцикличног прстена, као што се може уочити код хинолин-4(1Н)-она и код ароматичних хинолонских деривата приказаних на Слици 25 [232 – 235]. N O Ar R N Y Ar (а) R = H, алкил, ацетил или сулфонил (б) Y = алкокси, амино Слика 25. Структуре хинолин-4(1Н)-она (а) и ароматични хинолонски дериват (б) Прстен А у општој структури (R = Cl, Br) се може модификовати нуклеофилном супституцијом било на позицији 6 или 8 [236, 237]. Андрија Ћирић Докторска дисертација 51 1.2.1. Природни извор хинолона и њихових деривата Већина 2-фенилхинолона и њихових алкалоида су широко распрострањени у биљкама фамилије Rutacea [238 – 240]. Гравеолин (R = R` = Н) (Слика 26а), на пример, је први изолован из Ruta graveolens, као и његови супституисани деривати, 3’- метоксигравеолин (R = H, R` = OMe) и 3’,8-диметоксигравеолин (R = R` = OMe) такође су изоловани из корена бразилске биљке Esenbeckia grandiflora [241]. Едулеин (Слика 26б), дериват 2-фенил-4-хинолона, изолован је из коре мексичког дрвета Casimiroa edulis и листова Lunasia amara [242, 243]. N O O O CH3R R' N O CH3 H3CO (а) (б) Слика 26. Хемијске структуре гравеолина (а), едулеина (б) 1.2.2. Биосинтеза хинолона и њихових деривата Биосинтеза 2-алкилхинолона, 2-арилхинолона и алкалоида 2-арилхинолона укључује кондензацију антранилне киселине и фенилаланина [244 – 247] или ацетата као прекурсора. Гравеолин (Слика 26а), на пример, је производ кондензације -кето естра (1) и антранилне киселине (2) преко интермедијера 3-карбокси хинолона (3) чија је синтеза приказана на Слици 27. N O R'' R R' N O R'' R R' COOH PhCH2CH(NH2)CO2H R R'CO H2C CO2R COOH NH2 1 2 3 Слика 27. Синтеза гравеолина Андрија Ћирић Докторска дисертација 52 1.2.3. Методе за синтезу 2-арил-4-хинолонских деривата Већина ових једињења је изолована у малим количинама из велике количине биљног материјала и ово у неким случајевима доводи до интензивне жетве и/или изумирања неких биљних врста. Стога се алтернативне методе стално развијају у лабораторијама за синтезу медицински важних деривата хинолона и њихових аналога. У литератури је описано неколико путева синтезе деривата 2-арил-4-хинолона. Лабораторијска припрема деривата 2-арил-4-хинолона углавном укључује реакције комерцијално доступних реагенаса, као што је анилин [248, 249] или деривата аминоацетофенона [250] са карбонилним једињењима. 1.2.4. Номенклатура флуорохинолона Иако читава група ових антибиотика носи назив 4-хинолони, технички, нису сви припадници ове групе деривати хинолона. Наиме, овој групи припадају и деривати нафтиридина, пиридопиримидина и цинолина, који садрже додатне атоме азота у једном или другом коњугованом прстену. Оно што је заједничко за сва ова једињења је да имају 4-оксо-1,4-дихидрохинолинско језгро (Слика 28a). Краћи израз 4-хинолони је предложен као генеричко име за све ове антибактеријске агенсе. Оваква номенклатура даје тачан опис веза у пиридинском прстену. Тако су на овај начин, деривати нафтиридина означени као 8-аза-4-хинолони (Слика 28b), једињења са пиридопиримидинским прстеном су 6,8-диаза-4-хинолони (Слика 28c), а једињења са цинолинским системом 2-аза-4-хинолони (Слика 28d) [251]. N O COOH CH3 N N O COOH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 N N N O COOH CH3 CH3 CH3 N N O COOH CH3 CH3 a) b) c) d) Слика 28. Основне структуре хинолонских прстенa Андрија Ћирић Докторска дисертација 53 До данас не постоји стандардна класификација хинолона по генерацијама или групама [252]. Најчешће се класификација врши према спектру дејства и према индикацијама, тако да се хинолони могу поделити у четири генерације при чему свака следећа генерација има проширен спектар дејства (Tабела 14). Табела 14. Класификација хинолона по генерацијама и индикације. Генерација хинолона Припадници Индикације Прва генерација Налидиксинска киселина Некомпликоване инфекције уринарног тракта Оксолинска киселина Циноксацин Пиромидинска киселина Пипемидинска киселина Флумекин Друга генерација Норфлоксацин Компликоване инфекције уринарног тракта, сексуално преносиве болести Ципорфлоксацин Еноксацин Флероксацин Ломефлоксацин Офлоксацин Левофлоксацин Руфлоксацин Трећа генерација Спарфлоксацин Пнеумонија у болничким условима Тосуфлоксацин Гатифлоксацин Пазуфлоксацин Грапафлоксацин Четврта генерација Тровафлоксацин Интра-абдоминалне инфекције Клинафлоксацин Ситафлоксацин Моксифлоксацин Гемифлоксацин 1.2.5. Моксифлоксацин Моксифлоксацин хидрохлорид, (1-циклопропил-7[S,S]-2`,8`-диазабицикло [4,3,0]нон-8-ил-6-флуоро-8-метокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина хидрохлорид, MOX) је синтетички антибактеријски агенс активан на Грам- негативне и неке Грам-позитивне бактерије. Састоји се од бицикличног ароматичног језгра са атомом флуора на положају С6, метокси групом на положају С8, на N1 циклопропил групом и азобицикло групом на положају С7 (Слика 29). Андрија Ћирић Докторска дисертација 54 10 9 5 8 6 7 4 3 N 1 2 13 1415 N 8' 9' 7' 1' 6' N H 2' 3' 5' 4' H H F O 11 O OH O CH3 12 Слика 29. Структура моксифлоксацина Моксифлоксацин је први синтетисао и описао Petersen средином 90-тих година двадесетог века [253]. Молекулска формула: Молекулска маса Хидрохлорид C21H21FN3O4 × HCl 437,90 База C21H24FN3O4 401,44 Препоручена доза је 400 mg моксифлоксацина, а фармацеутске фромулације које садрже ову количину лека су таблете од 400 mg и раствор инфузије који садржи 400 mg/ 250 mL. У фармацеутским формулацијама се јавља у облику таблета и инфузија (Avelox ® , Avalox ® , Tovan ® , Bayer AG). Синтетизује се различитим процедурама које обухватају две фазе: (a) синтеза хинолонског језгра и (b) увођење разиличитих супституената [254, 255]. Произвођач Bayer AG (Леверкузен, Немачка) патентирао је неколико синтетичких поступака [256]. 1.2.5.1. Синтеза моксифлоксацина Синтеза моксифлоксацин-хидрохлорида се одвија у два ступња: У првом ступњу реагују трифлуорохинолонска киселина (I) и S,S-пиролидопиперидин (II) (Шема 3). Реакција се одвија у присуству терцијарног амина N,N-диизопропилетиламина да би се неутралисала киселина која настаје у току реакције. Као систем растварача користи се смеша N-метил-2-пиролидинона и метанола. Смеша се рефлуктује 3 сата на температури од 70 °C. После хлађења суспензија се филтрира, испира метанолом и суши у вакууму. Као производ ове реакције добија се Bay Z 7906 (III), који је интермедијер у синтези моксифлоксацина. N O F F F O OH + N H NH H H NN N H H H O OH F F O I II III Bay z 7906 Шема 3. Први корак синтезе моксифлоксацина MeOH N,N-Диизопропил- етиламин Андрија Ћирић Докторска дисертација 55 У другом ступњу Bay z 7906 се преводи у моксифлоксацин-хидрохлорид (IV), заменом атома флуора метокси групом на положају 8 (Шема 4). Ово се постиже реакцијом Bay z 7906 и калијум-terc-бутоксида у присуству тетрахидрофурана и метанола. Смеша се рефлуктује 2,5 сата на 70 °C. После хлађења, раствор се пребацује у други суд који садржи разблажену хлороводоничну киселину. Раствор се хлади и меша све док се не заврши преципитација. Преципитат се издваја и испира водом и етанолом. NN N H H H O OH F F O NN N H H H O OH F O O CH3 x HCl 1. KOtBu, MeOH, THF 2. HCl III Bay z 7906 IV Моксифлоксацин HCl Шема 4. Други ступањ синтезе моксифлоксацина Уколико се моксифлоксацин хидрохлорид користи за производњу инфузионих раствора онда постоји још један степен пречишћавања: преципитат добијен у другом ступњу се раствори у прочишћеној води и рефлуктује. Кристали који се формирају након хлађења се скупљају филтрирањем и испирају етанолом. Кристали који су настали после ове прве кристализације се поново растварају у смеши воде и етанола (70 : 30, v/v) и рефлуктују. Раствор се третира активним угљем и филтрира. Кристали који настану после хлађења се скупљају филтрирањем, испирају етанолом и суше док производ не достигне температуру од 43 °C. Овако добијен моксифлоксацин има минималан садржај нечистоћа. NN N H H H O OH F O O CH3 x HCl NN N H H H O OH F O O CH3 x HCl EtOH/H 2 O Моксфлоксацин HCl Моксифлоксацин HCl IV Шема 5. Пречишћавање моксифлоксацина за инфузију Током синтезе развијене од стране Bayer AG, могу се јавити не само неизрегована дифлуорована једињења већ и сродни аналози: 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8-дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6,8DF], 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8- диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6,8DM], 1- Активни угаљ Андрија Ћирић Докторска дисертација 56 циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-флуоро-6-метокси-1,4- дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6M8F] и 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-етокси-6-флуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6F8E], који су присутни у малим количинама у производима моксифлоксацина [253, 257]. Хемијске структуре сродних једињења и деградационих производа моксифлоксацина приказани су у Табели 15. Табела 15. Структуре и називи сродних и деградационих производа моксифлоксацина NN N H O O OH F F H H Bay z 7906 (нуспроизвод синтезе) NN N H O F OCH3 H H Декарбокси једињење (деградациони производ) NN N + O O OH F OCH3 H H Cl - N-метил једињење (потенцијални нуспродукт синтезе) NN N H O O OH F OCH3 H H Моксифлоксацин HCl диастереоизомер (потенцијални производ синтезе) NN N H O O OH H3CO OCH3 H H 6,8-диметокси једињење (нуспроизвод синтезе) NN N H O O OH F OC2H5 H H 8-етокси једињење (прекурсор синтезе) NN N H O O OH H3CO F H H 6-метокси-8-флуоро једињење (нуспроизвод синтезе) NN N H O O OH F OH H H 8-хидрокси једињење (нуспроизвод синтезе) Сваки лек може садржавати нечистоће или деградационе производе који настају приликом производње или тестирања стабилности, приликом присилне деградације или при условима складиштења. Дозвољена максимална количина за сваку нечистоћу је установљена према правилнику Међународне Конференције о Хармонизацији Техничких Захтева за Регистрацију Лекова, ICH (The International Conference on Андрија Ћирић Докторска дисертација 57 Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) [258], која уједињује стручњаке из регулаторног подручја и фармацеутске индустрије из три регије (Европа, Сједињене Америчке Државе и Јапан) који се са научног и технолошког аспекта договарају о регистрацији лека и уколико превазилазе одређене границе, нечистоће се морају идентификовати и квантификовати [259, 260]. 1.2.5.2. Физичко-хемијске карактеристике моксифлоксацина Моксифлоксацин-хидрохлорид је кристална супстанца светложуте боје, горког укуса. Хигроскопан је и може да веже до једног мола воде, што зависи од температуре и релативне влажности. На повишеној температури може да изгуби везану воду. Моксифлоксацин-хидрохлорид нема изражену тачку топљења, али на температурама изнад 250 оС долази до његове разградње. Специфична ротација раствора моксифлоксацина концентрације 10 mg/mL у 50 % ацетонитрилу износи []D о – 131о. Растворљивост моксифлоксацин-хидрохлорида у води износи 24 g/L. Растворљивост се смањује у присуству хлоридног јона. Испитивања растворљивости на различитим рН вредностима на 25 оС, показала су да нема промене растворљивости у опсегу рН од 3 до 5 и она износи 27 g/L. На рН = 1 (0,1 mol/L HCl) растворљивост опада на 4,7 g/L, због присуства хлоридних јона. Са повећањем рН вредности растворљивост незнатно расте, да би на рН = 7 била 38 g/L. Растворљивост моксифлоксацина у различитим растварачима дата је у Табели 16. Табела 16. Растворљивост (g/L) моксифлоксацина у различитим растварачима на 25 оС Растварач Растворљивост Растварач Растворљивост Вода 24 0,1 mol/L НCl 4,7 Вода + 0,1 mol/L NaCl 5,1 0,1 mol/L NaОН 67 Вода + 0,5 mol/L NaCl 0,85 Метанол 26 Вода + 1,0 mol/L NaCl 0,40 N,N-Диметилформамид 7,6 Вода + 2,0 mol/L NaCl 0,18 Етанол 2,5 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 3 27 2-Пропанол 0,24 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 4 27 Ацетонитрил 0,27 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 5 27 Дихлорметан 0,068 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 6 29 Ацетон 0,072 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 7 38 Етил-ацетат 0,00085 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 8 45 Толуен 0,00015 0,15 mol/L фосфатни пуфер рН = 9 46 n-Хептан <0,0001 Андрија Ћирић Докторска дисертација 58 Пошто је моксифлоксацин у облику хидрохлорида, рН вредност воденог раствора мокисфлоксацина концентрације 10 mg/mL износи 4,4. Моксифлоксацин има две pKa вредности. Прва pKa износи 6,38 и потиче од карбоксилне групе, а друга pKa износи 9,53 и потиче од азота у С-7 супституенту. Ове константе су одређене потенциометријски коришћењем воденог раствора моксифлоксацина концентрације 1 mg/mL. Партициони коефицијенти моксифлоксацина имају вредност log Po/w= -1,87 за октанол/воду и log Po/w= - 0,61 за октанол/фосфатни пуфер. Мокисфлоксацин је чист S,S-енантиомер са два стереогена центра. Одговарајућа стереохемијска конфигурација је одређена полазним материјалом S,S- пиролидопиперидином, па није потребна стерео-селективна синтеза нити раздвајање рацемата. UV спектар моксифлокацина је врло сличан спектру осталих флуорованих хинолона тј. има два максимума: први максимум је на 294 nm и потиче од апсорпције делокализованог  електронског система хинолонског језгра. Други максимум се налази на 330 nm и потиче од апсорције пиперидинског супституента и електрона карбонила и пиперидинског прстена. Специфичан коефицијент апсорпције Am је 1122, а моларни апсорпциони коефицијент max је 4,9126×10 4 L mol -1 cm -1 . UV спектар моксифлоксацина у метанолу приказан је на Слици 30. Слика 30. UV спектар моксифлоксацина у метанолу на рН = 7,4 Изглед и карактеристике спектра моксифлоксацина јако зависе од рН вредности растварача. У Табели 17 су приказани положаји најизраженијих максимума у спектру за различите средине. Табела 17. Таласне дужине маскималне апсорпције моксифлоксацина у различитим срединама. Растварач 0,1 mol/L HCl Пуфер рН = 7 0,1 mol/L NaOH Максимум 1 295 nm 288 nm 291 nm Максимум 2 327 nm 338 nm 339 nm 0 0,5 1 1,5 2 2,5 220 270 320 370 420 A  (nm) Андрија Ћирић Докторска дисертација 59 IR спектар моксифлоксацина показује карактеристичне траке на следећим таласним бројевима (cm-1): 3528 – 3470, 3068 – 2830, 2796 – 2083, 1709 – 1623 i 1515 – 1352. Најизраженије траке су у области 1515 – 1352 cm-1 и оне потичу од вибрација истезања C=C ароматичног језгра и вибрација савијања N–H, C-H i C-N-C прстена. Такође су изражене и вибрације истезања карбонилне групе у области 1709–1623 cm-1. IR спектар моксифлоксацина снимљен KBr техником приказан је на Слици 31. Слика 31. IR спектар моксифлоксацина снимљен KBr техником [261] 1 H-NMR спектар моксифлоксацина (Слика 32) снимљен је теҳником Fourije-ове трансформације на радној фреквенцији од 300,135 MHz. Као растварач коришћен је диметилсулфоксид, а као интерни стандард тетраметилсилан. Спектрална ширина је била 20,07 ppm, а дигитална резолуција 0,368 Hz/Pt (Слика 32) [257]. Слика 32. 1H-NMR спектар моксифлоксацина снимљен теҳником Fourije-ове трансформације [257] Андрија Ћирић Докторска дисертација 60 13 C-NMR спектар моксифлоксацина (Слика 33) снимљен је теҳником Fourije-ове трансформације на радној фреквенцији од 75,48 MHz. Као растварач коришћен је диметилсулфоксид, а као интерни стандард тетраметилсилан. Спектрална ширина је била 301,1 ppm, а дигитална резолуција 0,694 Hz/Pt. Брзина аквизиције је била 1,442 секунде, а дужина пулса 7,4 msec, 90° угао пулса. Број слободно индукованиҳ распада био је 3200 [257]. Слика 33. 13C-NMR спектар моксифлоксацина снимљен теҳником Fourije-ове трансформације [257] Масени спектри нам помажу код одређивања молекулског јона, као и фрагмената који из њега настају. На Слици 34 је приказан масени спектар моксифлоксацина, а у Табели 18 молекулски јон и фрагменти моксифлоксацина. Слика 34. Масени спектар моксифлоксацина [262] Табела 18. Табеларни приказ фрагментације моксифлоксацина. Моксифлоксацин (MW = 401,4 g/mol) 402,6 [M+H]+ 358,5 [M-CO2+H] + 384,5 [M-HF+H] + 261,4 [M-C6H13N-CO2+H] + Андрија Ћирић Докторска дисертација 61 1.2.5.3. Стабилност моксифлоксацина Да би се утврдила термална стабилност моксифлоксацин-хидрохлорида испитивани су узорци који су чувани на 25 °C и 60 % релативне влажности и на 40 °C и 75 % релативне влажности. У анализираним узорцима није примећена никаква деградација, односно, узорци су имали непромењен изглед, бистрину и боју раствора, садржај воде и органске нечистоће. Ово такође значи да се не дешава ни изомеризација на хиралним центрима, јер би то довело до пораста садржаја диастереомера моксифлоксацина. На основу тих података закључено је да је моксифлоксацин- хидрохлорид стабилан на температурама до 25 °C. Испитивања фотостабилности су изведена, како на чврстој супстанци, тако и на 10 -3 mol/L раствору у 25 %-тном метанолу. Узорци су били изложени светлости коју је емитовала ксенонова лампа. Анализом озрачених узорака утврђено је да је супстанца мало осетљива на светлост, док је раствор осетљивији и због тога је растворе потребно заштитити од светлости. Хемијска стабилност је испитана анализирањем узорака 0,1 %-тног раствора моксифлоксацин-хидрохлорида који су чувани у 0,1 mol/L NaOH и у води током 24 сата на температури од 90 °C. Мала деградација је запажена у 0,1 %-тном раствору који је чуван под истим условима у фосфатном пуферу pH = 7 и у 0,1 mol/L HCl. После једне недеље чувања на 90 °C добијени су исти разултати као и после једног дана. Испитивање оксидационе стабилности обављено је на узорцима 0,1 %-тног растора у присуству 3 % H2О2 у води и у фосфатном пуферу pH = 7, на собној температури, током 24 сата и током 7 дана. Када је чуван у води на 25 °C, моксифлоксацин-хидрохлорид показује само трагове деградације после 24 сата, док се око 5% деградационих производа награди после 7 дана на 40 °C. Када је чуван у пуферу на pH = 7, запажена је већа деградација чак и после 24 сата на 25 °C (око 8 %), док се после 7 дана чувања на 40°C у истом пуферу награди 80 % деградационих производа. 1.2.5.4. Литературни преглед метода за одређивање моксифлоксацина и његових деградационих призвода Због широке употребе моксифлоксацина у клиничкој пракси јавила се потреба за увођењем брзе и поуздане методе за његово одређивање у фармацутским формулацијама и биофлуидима. Међутим, само неколико HPLC метода је развијено за одређивање моксифлоксацина у биолошким формулацијама и узорцима [263 – 265] али ниједна за испитивање стабилности. Изоловање и идентификација деградационих производа објављена је до сада у свега неколико радова. Kumar и сарадници [266] изоловали су и структурно окарактерисали четири нечистоће у формулацији мокисфлоксацина: 1-циклопропил-6-флуоро-1,4-дихидро- 8-метокси-7-[(S,S)-N-метил-2,8-диазабицикло(4,3,0)нон-8ил]-4-оксо-3-хинолин карбоксилну киселину, метил-1-циклопропил-6-флуоро-1,4-дихидро-8-метокси-7- [(S,S)-2,8-диазабицикло(4,3,0)нон-8-л]-4-оксо-3-хинолински карбоксилат, 1-цикло- Андрија Ћирић Докторска дисертација 62 пропил-6-флуоро-1,4-дихидро-8-хидрокси-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло(4,3,0)нон-8- ил]-4-оксо-3-хинолин карбоксилну киселину и 1-циклопропил-6,7-дифлуоро-8- хидрокси-4-оксо-1,4-дихидро-3-хинолин карбоксилну киселину. Motwani и сарадници [267] су идентификовали три деградациона производа користећи HPTLC методу. Активну супстанцу су такође подвргли киселој и базној хидролизи, оксидацији, сувом и мокром третману као и фотодеградацији. Значајна деградација је примећена под хидролитичким условима (седам производа), док под осталим условима деградација је умерена (три производа). Salem и сарадници [268] су применили две методе, дензитометријску TLC и деривативну спектрофотометрију за одређивање ломефлоксацина, моксифлоксацина и спарфлоксацина, у присуству њихових киселих деградационих производа. Главно једињење деградације је декарбоксилован производ одвојен применом TLC. Wei и сарадници [269] окарактерисали су неке нечистоће моксифлоксацина коришћењем спектрофотометријске методе. Андрија Ћирић Докторска дисертација 63 1.3. Припрема узорка за анализу Припрема узорка је најбитнији део прe хроматографске или спектроскопске анализе. Овим поступком потребно је припремити репрезентативни, поновљиви и хомогени раствор који је погодан за анализу. Операције које је потребно урадити обухватају: прикупљање узорка, складиштење и конзервирање, транспорт, прелиминарну обраду и лабораторијско узорковање, мерење и растварање (Слика 35). Слика 35. Ток припреме узорка за анализу 1.3.1. Прикупљање биљног материјала Опште је правило да се брање биљака обавља по лепом и сунчаном времену. Правило је да се увек бере само једна врста да не би дошло до замене и мешања материјала. У зависности од тога који се део биљке користи, али и од хемијске природе физиолошки активних састојака, сакупљање се одвија у различитим фазама развоја биљке. 1.3.2. Обрада прикупљеног материјала После скупљања, биљни материјал мора да се пречисти. Одвајају се сви делови биљке који се не користе, друге биљке, земља и камење. Затим се одстрањују оштећени, оболели или трули делови. Подземни делови се перу у води, да би се очистили од земље и песка. Најчешће се, пре сушења, биљни делови секу на начин и до величине која је уобичајена за дату сировину. Сакупљање узорка/узорковање Транспорт узорка Припрема узорка Анализа узорка Обрада података Архивирање Информације кориснику Подношење извештаја Андрија Ћирић Докторска дисертација 64 1.3.3. Сушење Сушење је најбржи и најједноставнији начин конзервирања сирове биљне масе; овај процес представља максимално смањење влаге у ћелијама. Сушењем долази до умањења масе активне компоненте у односу на сирово биљно ткиво. Биљна ћелија садржи 60 – 95 % слободне воде и њено присуство је главни узрок кварења. Због неправилног или неадекватног паковања и складиштења, активне компоненте могу накнадно да поприме атмосферску влагу. Технологија сушења је веома значајна јер се њоме обезбеђује добар изглед и клавитет активне компоненте. Неправилним сушењем се добија сировина слабијег квалитета са аспекта активних састојака. Процес сушења се може обављати природним и вештачким путем. Природним путем се сировине суше у танком растреситом слоју на одговарајућим подлогама на сеновитом и промајном месту или директно изложене сунчевој светлости. Дужина процеса зависи од структуре ткива, али и од временских услова. Данас се много чешће примењују вештачке методе сушења. Опште је правило да сировина мора бити удаљена најмање 15 cm од загрејаних површина и да у унутрашњости сушара мора бити обезбеђена циркулација топлог ваздуха и одвођење водене паре. Сировине које садрже лако испарљиве састојке, суше се на 35 – 40 оС, док је за сушење грубљих делова неопходна температура од 50 – 60 оС. Све више се за сушење сировог материјала и екстраката користи процес лиофилизације. Замрзнуто ткиво се ставља у специјалне коморе у којима се успоставља вакуум, тако да долази до постепене сублимације замрзнуте воде, а ткиво постаје суво и порозно. 1.3.4. Узорковање Сви чврсти узорци су хетерогеног састава, стога се мора добити репрезентативни узорак у циљу одређивања његовог стварног састава. Током смањења количине узорка све величине узорка морају бити узете у обзир у зависности од њихове заступљености. Пожељно је чврст узорак свести на ситне честице због: - Спрашен узорак је хомоген и омогућава репрезентативно подузорковање са већом тачношћу и прецизношћу; - Спрашен узорак се брже раствара и лакше екстрахује због веће додирне површине. Основне методе за уситњавање узорака су сецкање, дробљење, сечење, млевење, хомогенизација, мацерација, пресовање, пулверизација [270]. Избор начина уситњавања узорка зависи од: - Врсте узорка, односно његове чврстине, - Почетне величине честица узорка, - Крајње величине честица које је потребно добити, - Количине узорка или потребне количине за анализу, - Нечистоћа које могу интераговати са испитиваним аналитом. Андрија Ћирић Докторска дисертација 65 Компаније које производе уређаје за сечење, дробљење, млевење, хомогенизацију, мацерацију, пресовање и пулверизацију су Retsch Technology (Haan, Немачка), Spex SamplePrep (Metuchen, САД), Fritsch (Idar-Oberstein, Немачка) и Buehler (Lake Bluff, САД). Када је узорак уситњен и компактан наставља се са даљом обрадом. Иако је величина честица униформна потребно је узети само мали део целокупне количине за припрему лабораторијског узрока. У ту сврху примењује се метода четвртања све док се не добије потребна количина узорка. Након добијања потребне количине лабораторијског узорка потребно је класификовати честице на основу њихове величине; у ту сврху користе се сита различитих промера отвора, односно броја окаца [271]. Што је већи број окаца то се добија мања величина честица односно прах. За аналитичка испитивања употребљавају се сита чији промер окца није већи од 5 m. Након тога се примењују различити растварачи или смеше растварача за превођење узорка у растворан облик. 1.3.5. Припрема узорка таблете за анализу Када се анализирају узорци таблета или прашка, узорковање мора осигурати добијање репрезентативног узорка који се даље користи за испитивања. Приликом анализе таблета потребно је узети 20 таблета или капсула, након чега следи хомогенизација и растварање целокупног узорка у одговарајућој мобилној фази уз коришћење ултразвука у периоду од 15 минута. 1.3.6. Екстракција Екстракција представља процес којим се из неке чврсте супстанце или течности врши изоловање неке компоненете помоћу погодног растварача. Циљ екстракције је да се жељена компонента која се налази у узорку помоћу погодног растварача изолује, а након тога, ако је потребно, одстрањивањем растварача добије у чистом облику. Екстракција супстанци из чврстог материјала назива се ослобађање и заснива се на дифузији жељене компоненте из унутрашњости носеће материје у растварач који је у сталном додиру са узорком и одабран према жељеној компоненти. Дифузија траје све док постоји разлика у концентрацији жељене компоненте у узорку и растварачу. На брзину екстракције утиче: 1. Величина додирне површине растварача и узорка, 2. Поларност растварача, 3. Време трајања екстракције и 4. Температура система. Повећање додирне површине између растварача и узорка се постиже уситњавањем узорка. У зависности од поларности жељене компоненте која се изолује врши се и избор растварача који се користи. Растварачи који се користе за екстракцију требало би да буду селективни, да имају ниску температуру кључања, малу топлоту Андрија Ћирић Докторска дисертација 66 испаравања, да су једнородни и чисти, да нису отровни и да нису агресивни према апаратури која се користи за екстракцију. Као растварачи се углавном употребљавају: вода, метанол, етанол, ацетон и течни угљоводоници. Дужим временом трајања екстракције, као и вишом температуром повећава се и ефикасност екстракције, али треба водити рачуна да при тим условима екстракције не дође до деградације испитиване компоненете. Брзина екстракције се може дефинисати као количник масе изоловане жељене компоненте (m) у јединици времена (t) и дата је изразом: ( ) где је t коефицијент преноса жељене компоненте кроз гранични слој и пропорционалан је температури, A површина додира, xg концентрација компоненте у узорку и x концентрација компоненте у растварачу. Поступак екстракције се изводи у три фазе: 1. Узорак који подлеже екстракцији доводи се у контакт са растварачем, 2. Врши се одвајање насталих фаза 3. Уклањање и регенерација растварача Један од услова који утичу на екстракцију је растворљивост супстанце у различитим растварачима који се дефинише коефицијентом расподеле, KD. [ ] [ ] где [A1] и [A2] представљају равнотежне концентрације супстанце А у различитим растварачима. Коефицијент расподеле говори о расподели неке супстанце између две фазе, али не и о томе колико ће се супстанце екстраховати при датим условима. Ефикасност екстракције дефинише се као проценат екстракције и дат је изразом: Проценат екстракције зависи од коефицијента расподеле и релативног односа запремина две фазе и дат је изразом: где су V1 и V2 запремине фаза. Ако у условима екстракције проценат екстракције није 100 %, што се често дешава, њена ефикасност се може побољшати вишеструком екстракцијом са малим запреминама органске фазе. Још боља ефикасност екстракције се постиже континуалном екстракцијом. Андрија Ћирић Докторска дисертација 67 1.3.6.1. Екстракција на чврстој фази (Solid-phase extraction, SPE) Претходна припрема узорака за анализу модерним инструменталним методама анализе (HPLC, GC, UV) захтева два услова, а то су пречишћавање и преконцентровање. Пречишћавање узорка је потребно извршити када су присутне нечистоће у матриксу узорка које интерагују са испитиваним аналитом. Нечистоће које могу скратити живот HPLC и GC колона морају се елиминисати пре инјектовања узорка на колону. Преконцентровање аналита је важно када је раствор превише разблажен за директно мерење. Изоловање аналита из узорка најчешће се врши течно-течно екстракцијом. Традиционална течно-течна екстракције се изводи у левковима за одвајање што ову методу чини заморном, дуготрајном и скупом. Ова метода не само што захтева неколико корака, већ се јављају и други проблеми приликом анализе, као што су мешање растварача, велика запремина растварача, нечисти и мокри узорци, као и немогућност квантитативне и репродуктивне екстракције. Друге класичне технике припреме узорка укључују центрифугирање, филтрирање, дестилацију, таложење и лиофилизацију. Средином 70-их година двадесетог века уводи се једноставнији алтернативни метод, екстракција на чврстој фази (solid phase extraction, SPE) [272, 273]. Слично течној хроматографији при ниском притиску, садржи мале колоне за једнократну употребу пуњене различитим сорбентима. Ове полипропиленске колоне су пуњене са 100, 200, 500, 1000 или 2000 mg сорбента између полиетиленских фритова. Запремина колона је 1, 3 или 6 mL. Велике запремине узорка (неколико литара) се пропуштају кроз колону при чему се аналити сорбују. Велики број колона сличних конфигурација могу се наћи на тржишту. Колоне се прво кондиционирају одговарајућим растварачем (метанол, хексан или хлороформ) како би се солватисале функционалне групе сорбента. Након што је сорбент кондициониран матриксом узорка, раствор узорка се наноси на сорбент аспирирањем или применом притиска. Колона задржава испитивани аналит који се након тога испира одговарајућим растварачем који селективно елуира нечистоће, али оставља аналит на колони. Пречишћени аналит се на крају елуира растварачем довољно «јаким» да десорбује аналит са сорбента. Механизми који се одвијају приликом екстркције на чврстој фази укључују:  Интермолекулске силе,  Факторе који утичу на јоно-измењивачку селективност. Механизми одвајања који се заснивају на интермолекулским интеракцијама између аналита и функционалних група сорбента укључују следеће силе:  Јонске,  Водоничну везу,  Дипол-дипол привлачење,  Дипол-индуковани дипол,  Дисперзионе силе. Андрија Ћирић Докторска дисертација 68 Водоничне везе се граде између молекула код којих је атом водоника ковалентно везан за јако електронегативан елемент као што је кисеоник, азот или флуор. Јачина водоничне везе је око 8,5 – 42 kJ/mol, односно око 10 % јачине ковалентне везе. На релативну јачину водоничне везе утиче електронегативност и величина везујућег елемента. Тако на пример, азот и хлор имају једнаку електронегативност, али мањи атом азота има већи афинитет за водоничну везу. Дипол-дипол привлачење се јавља између диполних молекула који поседују спољашње електрично поље, које је много слабије од електричног поља јона. Молекул има диполни моменат само када се средишта негативног и позитивног наелектрисање молекула не поклапају. Дипол-дипол интеракције између молекула су слабијег интензитета од водоничне везе. Дисперзионе силе (van der Walls-ове или London-ове силе) су слабе међумолекулске силе, које потичу из квантно индуковане тренутне поларизације мултипола у молекулима. Ако је симетричан молекул унет у електрично поље, електронски облак молекула може бити благо померен, стварајући индуковани диполни моменат. Дисперзионе силе могу бити привлачне или одбојне, у зависности од интермолекулског растојања и слабијег су интензитета од водоничне везе и дипол- дипол интеракција. Дисперзионе силе, иако појединачно слабе, су значајне код молекула састављених од великог броја атома. Јонске интеракције су примарне силе укључене код јоно-измењивачке екстракције. Интеракције се јављају између ковалентно везане наелектрисане групе јоно-измењивача и раствора јона супротног наелектрисања. Ово је електростатичко, реверзибилно привлачење. Фактори који утичу на јоно-измењивачку селективност су:  Поларност органског растварача,  рН растварача којим се врши елуирање,  Величина контра јона са којим се врши измена,  Јонска јачина раствора којим се врши елуирање,  Проток. Ретенција једињења на чврстој фази постигнута је њиховом јонизацијом. Оптимално рН за јонске аналите зависи од њихове рКа вредности. Киселина ће бити у одговарајућем облику за ретенцију на анјон изменљивој колони ако се рН подеси за две рН јединице веће од њене рКа вредности, када се кисели облик преводи у нејонизовану форму. Насупрот томе, базе се најефикасније екстрахују на катјон изменљивој колони из раствора који је за две рН јединице испод њене рКа вредности. Селективност контра јона ових везивних фаза је важна за ретенцију. За SAX сорбенте, контра јони као што су Li+, H+, Na+ и NH4 +, се најлакше замењују катјонском групом аналита. Контра јони, Cu2+, Ca2+ или Ba2+ , се теже замењују. Код SAX измењивача OH-, F- и C2H3O2 -, контра јони се најлакше замењују, док H2PO4 - и HCO3 - се умерено лако замењују. Контра јони као што су HSO4 - , NO3 - , CN - , Cl - се умерено тешко замењују. Лоши резултати екстракције се јављају када су цитрати, јодиди или бензен сулфонат контра јони у матриксу узорка. Андрија Ћирић Докторска дисертација 69 Јонска јачина је мера укупне концентрације јонских врста у матриксу која утиче на ретенцију јонских аналита. Велика концентрација страних катјона у матриксу узорка ће утицати на везивање катјонских аналита за слободна кисела места јоноизмењивача. Ниска јонска јачина фаворизује ретенцију, док велика јонска јачина тежи лакшем елуирању. У неким случајевима растворљивост неутралног облика киселине или базе је много мања у води у поређењу са јонским обликом. Као последица тога аналит може постати нерастворан када је растварач за елуирање такав да аналит преводи у неутралан облик. Органски растварачи који се мешају са водом морају се додати у растварач за елуирање како би се ефикасно елуирале такве компоненте. Проток растварача мањи од 5 mL/min препоручује се за растворе узорка, пошто се јоно-измењивачке интеракције одвијају у мањем обиму неко поларне или неполарне интеракције. Андрија Ћирић Докторска дисертација 70 1.4. Инструменталне методе анализе 1.4.1. Високо-ефикасна течна хроматографија (HPLC) Хроматографска метода је дефинисана од стране Интернационалне уније за чисту и примењену хемију [274] као: „Хроматографија је физичка метода раздвајања у којој се компоненте смеше које треба раздвојити расподељују између две фазе, од којих је једна непокретна (стационарна фаза) и друге која се креће кроз или дуж стационарне фазе у дефинисаном правцу (мобилна фаза). Мобилна фаза може да буде течност, гас или суперкритични флуид, док стационарна фаза може бити чврста, гел или течност, која је распоређена на чврстој основи која може, али не мора да учествује у процесу раздвајања“. Хроматографске методе се деле према физичком стању фаза, према физичко хемијским реакцијама које се дешавају приликом раздвајања компоненти или механизму раздвајања. Подела према физичком стању фаза 1. Течна хроматографија  Адсорпциона (течно/чврсто), TLC, HPLC  Јонска  Ексклузиона 2. Гасна хроматографија  Гас/течно  Гас/чврсто 3. Суперкритична флуидна хроматографија Подела према облику система 1. Колонска хроматографија 2. Планарна хроматографија Подела према механизму раздвајања 1. Адсорпциона хроматографија 2. Партициона (подеона) хроматографија 3. Јоноизмењивачка (јонска) хроматографија 4. Ексклузиона хроматографија Течна хроматографија, нарочито високо-ефикасна течна хроматографија (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) је најважнија и најчешће примењивана метода хроматографије [275]. Овом методом могу се анализирати готово сви узорци, лекови, храна, индустријске хемикалије, козметички производи, узорци из животне средине и многи други. Андрија Ћирић Докторска дисертација 71 1.4.1.1. Теорија хроматографије Постоје две теорије којима се могу описати хроматографски процеси и то теорија подова [276] и кинетичка теорија [277]. Према теорији подова, хроматографска колона се посматра као велики број хоризонталних слојева, који се називају теоријски подови. Приликом кретања мобилне фазе и узорка, на подовима се успоставља равнотежна расподела аналита између стационарне и мобилне фазе. Равнотежа се описује равнотежном константом, К, која се назива партициони коефицијент, и представља однос моларне концентрације аналита у стационарној и мобилној фази: На колони се могу раздвојити супстанце које имају различите партиционе коефицијенте. Што је партициони коефицијент већи, супстанца ће се спорије кретати кроз колону. Теоретски подови служе и као мера ефикасности колоне, било да се она изражава преко броја теоретских подова N, или преко висине еквивалентне теоретском поду. Број теоретских подова (N) се израчунава са хроматограма према следећој једначини: ( ) где је: tr – ретенционо време, W – ширина пика у основи Теорија теоретских подова претпоставља да се равнотежа успоставља великом брзином, што није тачно, јер се у стварности равнотежа никад не може достићи због сталног кретања мобилне фазе. Кинетичка теорија објашњава да ширење пика потиче од три фактора и то: 1. Вишеструкe путањe аналита кроз паковањe колоне, 2. Дифузије молекула, 3. Трансферa масе између фаза. Van Deemter је 1956. године развио теорију брзине хроматографског процеса која се темељи на наведеним факторима. Своју теорију Van Deemter је представио у облику једначине која даје зависност висине еквивалентне теоријском поду (HETP) од линеарне брзине мобилне фазе. Ова теорија се у почетку односила на гасну хроматографију, али се касније показало да се исти физички процеси одигравају и код високо-ефикасне течне хроматографије. Брзина мобилне фазе кроз колону може зависити од величине унутрашњег пречника колоне, од облика честица пуњења, порозности као и од структуре честица. Сви ови фактори који доводе до ширења пика могу се описати једначином: Андрија Ћирић Докторска дисертација 72 где Нр представља висину еквивалентну теоријском поду која зависи од брзине протока мобилне фазе, dp је просечна величина честица пуњења и 2 је константа која је приближно једнака 1. Ова једначина показује да се Нр може смањити (повећава ефикасност) ако се смањи величина честица (долази до повећања повратног притиска) тј. коефицијент зависи од облика и величине честица. Уколико честице нису сферног облика и неједнаке величине добијају се мање вредности  Познато је да расподела молекула, или њихово мешање, долази услед дифузије. Лонгитудинална дифузија (кроз колону) доводи до ширења пика. Висина еквивалентна теоријском поду зависна од дифузије, Hd, може се представити изразом: где је Dm дифузиони коефицијент аналита у мобилној фази, је фактор који је повезан са спречавањем дифузије од стране паковања колоне и  брзина протока мобилне фазе. На основу једначине 24 очигледно је да веће брзине мобилне фазе доводе до мањег дифузионог ефекта на ширење пика. Дифузија молекула у течну фазу је за пет редова величине нижа него код гасне фазе, стога је овај ефекат занемарљив при уобичајеним протоцима код течне хроматографије. Трансфер масе је најмање испитиван параметар. За савремене типове паковања колоне долази до комбиновања два ефекта: адсорпциона кинетика и трансфер масе унутар честица. Адсорпциона кинетика је занемарљив члан у односу на дифузију унутар честица, и простирање пика може се дифинисати једначином: где Hm представља висину еквивалентну теоријском поду која зависи од трансфера масе, dp је пречник честица, Dm дифузиони коефицијент аналита у мобилној фази, коефицијент који зависи од величине пора, облика и величине честица,  брзина протока. Једначина 25 описује линеарну зависност висине еквивалентне теоријском поду од протока мобилне фазе. Мање брзине и молекули аналита уједначене величине могу прoћи унутар честица паковања, и на тај начин могу утицати на ефикасност раздвајања аналита. Сви фактори претходно разматрани утичу на укупно ширење пика, стога њихов збир даје укупну висину подова колоне: Андрија Ћирић Докторска дисертација 73 Односно заменом једначина 23, 24 и 25 у једначину 26 добија се Van Deemter-ова једначина је хиперболична функција која показује оптималну брзину при којој је ефикасност колоне максимална и дата је на Слици 36. Слика 36. Van Deemter-ова крива 1.4.1.2. Термодинамика ретенције Ретенција аналита у хроматографском систему је одређена вредношћу дистрибуционог коефицијента између две фазе и количином стационарне фазе која је доступна за интеракције. Како је коефицијент дистрибуције у хроматографији равнотежна константа, може се разматрати са термодинамичке тачке гледишта [278]. Класична термодинамика омогућава описивање промене слободне енергије растворене супстанце, када се она преноси из једне у другу фазу, као функција константе равнотеже (дистрибуционог коефицијента) и дата је изразом: где је R – универзална гасна константа, T – апсолутна температура , G0 – промена стандардне слободне енергије. Пошто је: Проток мобилне фазе (mL/min) В и си н а те о р и јс к о г п о д а (m m ) Оптимални проток мобилне фазе Андрија Ћирић Докторска дисертација 74 где је H0 – промена стандардне енталпије, S0 – промена стандардне ентропије одакле следи: ( ) односно, [ ] На основу једначина 30 и 31 може се видети да ако се промене стандардне ентропије и енталпије могу израчунати, онда се може предвидети и коефицијент дистрибуције супстанце између две фазе, односно ретенциона запремина. Нажалост, ове две величине је тешко проценити, стога је немогуће израчунати коефицијент дистрибуције на овај начин. Међутим, када се изаберу мобилна и стационарна фаза и окарактеришу довољним бројем експерименталних података, може се извести емпиријска једначина за оптимизацију датог дистрибуционог система за специфично раздвајање. Рачунарски програми, који се заснивају на овој релацији, могу извести овакве оптимизације за смешу растварача за раздвајање три или више супстанци. Одговарајућа стационарна фаза се бира на основу типа интеракција које је потребно искористити за раздвајање компоненти. Преуређењем једначине 30 или 31 добија се: и имајући у виду да је: добија се једначина: Мерењем ретенционе запремине растворене супстанце у испитиваном опсегу температура на основу једначине 34 може се идентификовати тип ретенционог механизма на коме се заснива раздвајање компоненти. Конструисањем графика зависности log V’ од 1/T добија се права линија, чији је нагиб пропорционалан стандардној енталпији а одсечак стандардној ентропији. Ова крива се назива Van`t Hoff-ова крива и приказана је на Слици 37. Андрија Ћирић Докторска дисертација 75 Слика 37. Van`t Hoff-ове криве за два различита дистрибуциона система На основу Слике 37 може се уочити да систем А има велику вредност енталпије и малу вредност ентропије, што значи да је расподела контролисана молекулским силама. Растворена супстанца се распоређује у стационарној фази као резултат њене јаче интеракције са стационарном фазом него са мобилном фазом. Насупрот томе, систем Б поседује малу вредност енталпије и велику вредност ентропије. Стога расподела растворене супстанце није контролисана молекулским силама. Негативна вредност промене ентропије показује да растворена супстанца у мањој мери реагује са стационарном фазом. 1.4.1.3. HPLC систем Систем за високо-ефикасну течну хроматографију се састоји од пумпе која обезбеђује константан проток, инјектора који служи за уношење узорка у систем, термостатског дела који одржава температуру колоне константном, колоне на којој се врши раздвајање компоненти, детектора и система за аквизицију података. Хроматограм представља графички приказ раздвајања који се десио на колони и који служи за квалитативну хемијску анализу и за квантитативно одређивање аналита [278]. Изглед типичног HPLC система је приказана на Слици 38. Систем А Систем Б Б Б Андрија Ћирић Докторска дисертација 76 Слика 38. Систем за HPLC анализу 1.4.1.4. HPLC колоне Стационарна фаза (HPLC колона), поред мобилне фазе, активно учествује у процесу раздвајања. Због тога је избор HPLC колоне од кључног значаја за постизање раздвајања. Избор стационарне фазе зависи пре свега од компонената које треба раздвојити, односно од типа хроматографије. Приликом избора HPLC колоне треба водити рачуна о врсти стационарне фазе, величини честица и величини пора, као и о димензијама колоне. Већина хроматографских раздвајања се изводи на стационарним фазама чије су aпсорпционе особине модификоване ковалентним везивањем различитих функционалних група за површину силика-гела. Површина носача може да се модификује и превлачењем површине хемијски стабилним апсорпционим или адсорпционим слојем. Хемијски стабилне везе између носача и лиганда могуће су само на силика гелу и полимерним носачима и оне су одговорне за ретенцију и селективност. Површина силика гела се може лако дериватизовати процесом силанизације. Најчешће Резервоар мобилне фазе Улазни филтер Пумпа Инјектор Предколона Колона Детектор Рачунар Регулатор повратног притиска Резервоар отпада Предколонски филтер Андрија Ћирић Докторска дисертација 77 коришћене HPLC стационарне фазе се добијају дериватизацијом површине силицијум диоксида алифатичним силанским реагенсима дугог ланца. Уколико су колоне пуњене силика-гелом које су хемијски модификоване октадецилсилил групама такве колоне се називају ODS или C18 колоне. Ове врсте колона примењују се у великој мери због брзог кондиционирања и великог броја теоријских подова. Приликом кондиционирања колоне, односно њене еквилибрације, мора се водити рачуна о адсорпционим силама које делују на површину силика-гела. Међутим, увођењем октадецилсилил група које су волуминозне и нереактивне, већи број силанолних група преостаје неизреагован. Слика 39. Интеракције које се одвијају на површини силика-гела Хидрофобне интеракције се јављају између једињења мале поларности и алифатичних октадецил остатака. Силе задржавања које се при томе јављају одговорне су за реверзно-фазну хроматографију. Неизреаговале силанолне групе на површини силика гела код којих долази до делимичног привлачења електрона од стране кисеоника и стварања делимичног позитивног наелектрисања на водонику, могу да граде водоничне везе. Честице паковања могу бити сферне или неправилног облика. Већина колона данас се пуни сферним честицама. Такве колоне се одликују добром стабилношћу, малим позадинским притиском и добром репродуктивношћу. Честице неправилног облика се добијају млевењем великих честица. Колоне пуњене овим честицама су мање стабилне од оних које су пуњене сферним честицама. Величина сферичних честица се креће од 3 – 20 m. Најчешће се користе честице од 5 m, али постоји тренд смањења величине честица чиме се добија краће време анализе. Тако се данас врло често користе честице од 3 m, а све чешће и од 1,7 m. Хидрофобна интеракција Водонична веза Јонска веза Андрија Ћирић Докторска дисертација 78 1.4.1.5. Хроматографски параметри Хроматографко раздвајање компонената узорка може се постићи оптимизацијом хроматографских услова: састава мобилне фазе, протока, начина елуирања, температуре, врсте и димензија колоне. Квалитет раздвајања и ефикасност колоне процењује се преко хроматографских параметара [279]: • ретенциони фактор • сепарациони фактор • број теоретских подова • висина еквивалентна теоретском поду • симетрија пика • резолуција Сви ови параметри се могу израчунати са хроматограма: Слика 40. Хроматограм добијен раздвајањем двокомпонентне смеше (1) и (2) Формуле за израчунавање хроматографских параметара и њихове оптималне вредности дати су у Табели 19. Андрија Ћирић Докторска дисертација 79 Табела 19. Хроматографски параметри, формуле за израчунавање и оптималне вредности Параметар Формула Оптималне вредности Ретенциони фактор 2 – 10 Сепарациони фактор ≥ 1 Ефикасност, теоретски број подова ( ) ≥ 2000 Ефикасност, HEТР Симетрија пика 1 Резолуција ≥ 1 Ретенциони фактор (k) представља меру задржавања аналита на хроматографској колони. Велике вредности ретенционог фактора показује јаку интеракцију аналита са стационарном фазом. Сепарациони фактор () представља способност хроматографског система да хемијски раздвоји два једињења. Ефикасност, теоријски број подова (N) је мера расподеле пика аналита на хроматографској колони, указујући на перформансе колоне. Ефикасност, ефикасна висина теоријских подова (HETP) Симетрија пика (As) говори о изгледу пика и представља утицај мртве запремине инструмента, утицај адсорпције стационарне фазе и квалитет паковања колоне. У идеалном случају симетрија је 1. Вредности веће од 1 указују на предуго задржавање компонената на колони, а мање од 1 указују на пресићеност колоне. Резолуција (Rs) представља способност хроматографског система да раздвоји аналите на базној линији. 1.4.1.6. Утицај pH на раздвајање аналита Зависност ретенције јонизујућих аналита од pH вредности мобилне фазе за базне компоненте може се објаснити на основу Слике 41. Слика 41. Утицај рН на ретенцију базног аналита у хроматографији Андрија Ћирић Докторска дисертација 80 Са Слике 41 се јасно види да постоје три одвојене области:  Област А – аналит је потпуно протонован (налази се у облику катјона) и има слабу ретенцију. Налази се у свом најхидрофилнијем облику и интеракције са хидрофобном стационарном фазом су потпуно потиснуте.  Област B – ово је област делимичног протоновања. Овде се аналит налази у два облика, протонованом и депротонованом, и због тога се добија лош изглед пика. Пошто аналит у неутралном облику има много већу ретенцију, молекули дуже остају у стационарној фази. Због тога долази да померања равнотеже у мобилној фази према формирању депротонованих молекула и даљег повећавања ретенције. У овој области мала промена pH вредности мобилне фазе доводи до великог померања ретенционих времена.  Област C – аналит је у неутралном облику (највише хидрофобном) и има највећу ретенцију. Исти облик ретенциона крива има и за киселе компоненте, али би та крива била као одраз у огледалу криве за базне компоненте. Ови ретенциони профили би се могли описати следећим једначинама, као функција pH вредности мобилне фазе и pKa вредности аналита: [ ] [ ] или [ ] [ ] где је: k1 – ретенциони фактор јонизованог облика (протонованог облика за базе и анјонског облика за киселине) k0 – ретенциони фактор неутралних облика за киселине и базе k – ретенциони фактор на датој pH вредности Ka – јонизациона константа аналита Генерални приступ у раздвајању компонената смеше која садржи јонизујуће компоненте јесте супресија њихове јонизације. Супресија јонизације смањује снагу молекулске солватације чиме се хидрофобни (органски) део молекула излаже површинским интеракцијама. Супресија јонизације се обично постиже додавањем пуфера у растварач, чиме се постиже одређена pH вредност. У одсуству пуфера, лако јонизујуће компоненте се елуирају са колоне као веома широки пикови јер је према Le Chatelier-овом принципу, растворена јонизујућа компонента у раствору присутна као смеша јона и нејонизованих молекула. Хроматографско понашање јона и неутралних молекула је различито. Ако претпоставимо да ће неутрални молекули бити задржани, а да ће се јони кроз колону кретати брже, значи да ће у првом тренутку те две врсте бити раздвојене. Међутим, из Андрија Ћирић Докторска дисертација 81 наведене равнотеже следи да ће у одсуству неутралних молекула, јони тежити да формирају нове неутралне молекуле који ће такође бити задржани. Тај процес се понавља и доводи до развлачења аналита дуж колоне и појаве широких пикова. Уколико се равнотежа помери додатком пуфера чија је pH вредност најмање 2 јединице различита од pK компоненте, то се не дешава [280]. 1.4.1.7. Развој и оптимизација HPLC методе Пре почетка експеримента потребно је знати све информације о узорку. Такође je потребно дефинисати циљеве хроматографског раздвајања. Најважније информације које треба знати су број присутних аналита, хемијску структуру аналита, молекулске масе, pKa вредности, UV спектре, опсег концентрација аналита и растворљивост. Уколико је познат хемијски састав узорка могуће је изабрати најбоље почетне услове за HPLC раздвајање. У зависности од тога како ће се користити те информације, два различита приступа у развоју HPLC методе су могућа. Први приступ је теоријски, и у том случају се проба да се хемијска природа узорка уклопи са условима за HPLC раздвајање. При томе је пресудно искуство аналитичара, као и додатне информације (нпр. подаци из литературе). Други приступ је емпиријски и ту се не поклања превише пажње природи узорка већ се емпиријски одаберу неки почетни услови раздвајања. И теоријски и емпиријски приступ у развоју HPLC методе могу бити успешни, а најчешће је најбоља комбинација оба приступа. При развоју HPLC методе, без обзира да ли се то ради мануелно или коришћењем софтвера за развој метода, увек се до жељеног раздвајања долази на исти начин, односно истим поступком. Најпре, треба добити прихватљива ретенциона времена са изабраном мобилном фазом и колоном. Након тога треба подесити селективност, променом мобилне фазе или додавањем неког реагенса у мобилну фазу. Након што је постигнута задовољавајућа селективност, следи фино подешавање протока, величине честица и димензија колоне, чиме се даље побољшава метода. Резолуција између пикова зависи од три фактора: ефикасности колоне, селективности и ретенције. Са јонизованим аналитима, киселинама и базама, сви ови фактори зависе и јако се мењају са pH. Променом pH вредности мобилне фазе такође се може побољшати ефикасност колоне, јер се могу мењати јонизација аналита и остатака силанолних група, чиме се смањују секундарне интеракције између аналита и површине силика гела. Постизање оптималне резолуције такође захтева промену pH мобилне фазе у току елуирања. При развоју HPLC методе, у случају малих молекула, најбоље је почети са пуферисаном мобилном фазом на ниским pH вредностима, pH 2 – 3. Коришћењем мобилних фаза са ниским pH вредностима, добијају се оштри пикови за базне компоненте на колонама испуњеним силика гелом, јер су на ниским pH вредностима, силанолне групе на силика гелу потпуно протоноване, тако да позитивно наелектрисана, протонована базна једињења не интерагују. Већина једињења са киселим особинама нису наелектрисана, због чега при ниским pH вредностима имају Андрија Ћирић Докторска дисертација 82 максималну ретенцију. Ово су најважније предности развоја методе при ниским pH вредностима. Зато развој методе обично почиње са мобилном фазом која садржи ацетонитрил као органски модификатор и 25 – 50 mmol/L фосфатни пуфер (pH 2 – 3), као водени део фазе. Овим се обезбеђује добра контрола pH вредности која је потребна за репродуктивне анализе јонизованих једињења. За почетак се узима C18 колона, евентуално C8 колона. Уколико се под овим почетним условима не добије задовољавајуће раздвајање, ацетонитрил се може заметнити метанолом или тетрахидрофураном, или се може променити колона. Неке компоненте се не могу раздвојити на ниским pH вредностима јер имају бољу растворљивост и стабилност у средишњој области pH. У тој области, базна једињења (нпр. амини) још увек могу имати позитивно наелектрисање, а површина силика гела може бити негативно наелектрисана. Због тога, што је више силанолних група депротоновано, то је бољи изглед пика. Треба водити рачуна да се pH мобилне фазе разликује за најмање једну pH јединицу од pKa вредности аналита да би се смањила могућност промене ретенционих времена са променом pH. Најбољи избор за мобилну фазу на pH 7 је фосфатни пуфер, јер је његов пуферски опсег у области pH 6,1 - 8,1. Други избор је ацетатни пуфер (опсег рН 3,8 - 5,8). Нека базна једињења на ниским или средњим вредностима pH немају довољну ретенцију. За таква једињења раздвајање се врши на високим pH вредностима, јер су у тој области базна једињења у облику слободне базе. Колоне произведене по новим технологијама су заштићене од растварања силика гела, тако да се могу користити и на високим pH вредностима. Зато се као мобилне фазе могу користити органски пуфери, као што је триетиламин. 1.5. Mасенa спектрометријa Према дефиницији „основни принцип масене спектрометрије (MS) је стварање јона било из неорганских или органских једињења погодном методом, одвајање насталих јона на основу односа масе и наелектрисања (m/z), њихова квалитатина детекција и квантитативо одређивање на основу заступљености. Аналит се може јонизовати термалним путем, применом електричног поља или сударом са електронима, јонима или фотонима. Јони могу бити једном јонизовани атоми, кластери, молекули или њихови фрагменти или асоцијати. Одвајање јона врши се статичким или динамички деловањем електричног или магнетног поља“. Иако ова дефиниција масене спектрометрије датира од 1968. године када је органска масена спектрометрија била на почетку [281], треба додати и две новине. Прва, поред електрона, јона или фотона, енергетски неутрални атоми и кластери тешких метала се могу користити за ефективну јонизацију аналита. Друго, одвајање јона по односу m/z, може се извести у области без утицаја електричног или магнетног поља, уколико јони поседују дефинисану кинетичку енергију на уласку у путању лета. Андрија Ћирић Докторска дисертација 83 У последњих 20 година комбинација течне хроматографије и масене спектрометрије се развила у широко примењивану и рутински коришћену детекцију у течно хроматографским анализама. При комбиновању ове две аналитичке технике јављају се три основна проблема:  Протоци нису компатибилни, јер елуирање са конвенционалне HPLC колоне се обично врши при протоку од 1 mL/min, а тај елуент треба да уђе у подручје високог вакуума које влада у масеном спектрометру.  Мобилне фазе које се користе у течној хроматографији често нису компатибилне са масеним спектрометром, јер се користе неиспарљиви пуфери.  Јонизација неиспарљивих и/или термолабилних једињења. Јонизација je нарочито представљала проблем у самом почетку развоја LC-MS технике, када су се за јонизацију органских једињења користиле само технике удара електрона (electron impact - EI), хемијска јонизација (chemical ionization - CI) и десорпција/јонизација у пољу (field desorption/ionization - FD). FD се не може применити у комбинацији са течном хроматографијом. За јонизације EI и CI, узорак мора бити у гасовитом стању, док је LC-MS посебно значајна за анализу неиспарљивих аналита. У међувремену су развијене технике меке јонизације, као што су бомбардовање брзим електронима (fast-atom bombardment - FAB), термоспреј, електроспреј и MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization), чиме је превазиђен проблем јонизације елуента. При директном увођењу течности (direct liqud introduction inteface) небулизација елуента се постиже формирањем млаза на малој дијафрагми и даљом дезинтеграцијом до малих капљица. Небулизација се одиграва у десолватационој комори у којој влада снижени притисак, а која је повезана са CI јонским извором. Десолватација капљица обезбеђује се превођење неиспарљивих и термолабилних једињења из течног у гасовито стање. Хемијска јонизација десолватизованог аналита се постиже коришћењем реверзно-фазних растварача као реактивног гаса. Овај интерфејс је врло брзо замењен другим, пре свега због протока који је ограничен на 100 L/min и због честог запушавања дијафрагме чији је пречник свега 4 m. Код термоспреј интерфејса млаз паре и малих капљица се формира на излазу загрејане цеви за испаравање. Распршивање се дешава због ширења паре која настаје на зиду цеви приликом испаравања течности. Пре него што започне испаравање у цеви део топлоте се преноси на растварач. Ова топлота касније потпомаже десолватацију капљица у области сниженог притиска. Применом јаких и ефикасних механичких пумпи које се вежу директно на јонски извор, у вакуумски систем масеног детектора се може увести до 2 mL/min воденог растварача. До јонизације аналита долази услед хемијске јонизације помоћу растварача, а затим се дешава процес испаравања јона. Реактивни гас који је потребан за хемијску јонизацију може да се добије коришћењем енергетских електрона из ужареног влакна или електроде, или процесом термојонизације, где се користи испарљиви пуфер који је растворен у елуенту. Иако је термоспреј годинама био највише коришћен, данас је скоро у потпуности замењен другим интерфејсима. Андрија Ћирић Докторска дисертација 84 Код интерфејса са константним протоком или динамичким бомбардовањем брзим атомима (continuous-flow or dynamic fast atom bombardment – CF-FAB) мала струја течности, обично 5 – 15 L/min, која је помешана са огдоварајућим FAB матрикс растварачем, протиче кроз узану капилару према фриту од нерђајућег челика или златној FAB плочици. На фрити или плочици успоставља се равнотежа између испаравања растварача и стварања униформног филма течности. Јони се стварају бомбардовањем тог филма течности брзим атомима или јонима. Динамичка природа овог процеса даје динамичком FAB неколико предности над статичким FAB. Обнављање површинског слоја у CF-FAB је динамичнији процес, који није одређен само дифузијом аналита. Због тога је разлика у одговорима хидрофобних и хидрофилних аналита у смеши, која је примећена код статичког FAB, овде знатно мања. Поред тога, позадински сигнал који потиче од јона из матрикса је у великој мери смањен, тако да су побољшани апсолутни лимити детекције. Коришћење CF-FAB је смањено од када су уведени електроспреј интерфејси. Код интерфејса са зраком честица (particle-beam) елуент се распршује или пнеуматски или термоспреј јонизацијом, у десолватационој комори која је на скоро атмосферском притиску, а која је повезана са моментним сепаратором, у коjeм се аналити велике молекулске масе преносе у јонски извор масеног детектора, а молекули растварача који имају мање масе се одводе пумпама из сепаратора. Молекули аналита су у јонском извору у облику малих честица и ту се дезинтегришу при судару са загрејаним зидовима извора. Настали гасовити молекули се могу јонизовати у судару са електронима или хемијском реакцијом. Могућност да се добију електроспреј масени спектри је највећа предност овог интерфејса. Два различита приступа за увођење узорка се користе код уређаја са јонизацијом на атмосферском притиску. Они се првенствено разликују у принципу распршивања и у подручју примене. Код загрејаног распршивача, елуент се пнеуматски распршује у загрејаној цеви, где растварач скоро потпуно испари. Хемијска јонизација под атмосферским притиском (atmospheric pressure chemical ionization – APCI), која започиње електронима из корона игле, се дешава у тој истој области. Затим се ти јони уводе у област високог вакуума, који влада у масеном детектору, у анализатор маса. Код електроспреј интерфејса, елуент се распршује на атмосферском притиску, а као резултат деловања јаког електричног поља ствара се услед разлике потенцијала од 3 kV који влада између узане спреј капиларе и супротно наелектрисане електроде. Растварач који излази из капиларе је у облику млаза који се даље дезинтегрише у мале капљице. 1.5.1. Проблем састава мобилних фаза За већину једињења масени спектрометар је осетљивији и специфичнији у односу на друге детекторе који се користе у течној хроматографији. Коришћењем масеног детектора могу се анализирати и једињења која немају хромофоре. Такође, могу се идентификовати компоненте које нису хроматографски раздвојене, чиме се умањује потреба за идеалном хроматографијом. Андрија Ћирић Докторска дисертација 85 Подаци који се добију са масеног детектора употпуњују податке добијене са других детектора. Два једињења могу имати сличне UV спектре или сличне масене спектре, али је врло ретко да имају слична оба спектра. Два ортогонална сета података су врло корисна за потврду идентитета, као и за квантификацију. Неки масени спектрометри имају могућност да изводе масену спектрометрију једног узорка у више корака. Могу да снимају масени спектар, да одвоје специфичан јон из тог спектра, фрагментишу јон и генеришу други масени спектар; тај циклус се може понављати много пута. Такви спектрометри могу да врше разлагање молекула део по део, док се не утврди његова структура. Масени спектрометри раде на принципу јонизације молекула, а затим се јони разврставају и идентификују према односу масе и наелектрисања (m/z). Два кључна дела масеног спектрометра су јонски извор, где настају јони и анализатор маса, који разврстава јоне. Неколико различитих типова јонских извора се користи у LC-MS анализи. Сваки од њих је погодан за различите класе једињења. Такође се користи неколико врста анализатора маса. Сваки од њих има своје предности и мане, у зависности од тога која је врста информација потребна. 1.5.2. Јонски извори Највећи напредак у развоју LC-MS последњих година је постигнут у развоју јонских извора и техника којима се јонизују молекули аналита и добијени јони раздвајају од мобилне фазе. Ранији LC-MS системи су имали јонске изворе који нису могли да раздвоје молекуле мобилне фазе од молекула аналита (директни течни улаз, термоспреј) или су то радили пре јонизације (зрак честица). Молекули аналита су били јонизовани у масеном спектрометру у вакууму, често традиционалном јонизацијом, електронима. Увођењем техника јонизације под атмосферским притиском, знатно је проширило број једињења која се могу анализирати LC-MS. Код оваквог начина јонизације, молекули аналита се најпре јонизују на атмосферском притиску, а затим се ти јони механички или екелтростатички одвајају од неутралног молекула. Уобичајене технике јонизације под атмосферским притиском су:  Електроспреј јонизација (EI)  Хемијска јонизација под атмосферским притиском (APCI)  Фотојонизација под атмосферсиким притиском (APPI) Примена различитих типова јонизације под атмосферским притиском приказана је на Слици 42. Андрија Ћирић Докторска дисертација 86 Слика 42. Различити типови јонизације под атмосферским притиском 1.5.3. Електроспреј јонизација Код електроспреј јонизације (Слика 43) јони аналита се генеришу у раствору пре него што аналит доспе у масени спектрометар. Елуент из течног хроматографа се распршује у комору на атмосферском притиску у присуству јаког електростатичког поља и загрејаног гаса за сушење. У електростатичком пољу долази до даље дисоцијације молекула аналита, а загрејани гас за сушење доводи до испаравања растварача из капљица. Како се капљице смањују, тако расте концентрација наелектрисања у њима. На крају, одбојна сила између јона са истим наелектрисањем премашује кохезионе силе и јони бивају избачени у гасну фазу. Ти јони бивају привучени због електростатичког привлачења електростатичких огледала и пролазе кроз капилару у анализатор маса. У гасној фази се могу десити и неке друге реакције, углавном трансфер протона и размена наелектрисања, и то у тренутку када су јони избачени из капљица , а пре него што дођу до анализатора маса. Велики молекули често имају више од једног наелектрисања. Захваљујући вишетруком наелектрисавању, елекроспреј се може користити и за анализу великих молекула (до 150000 u), иако је опсег маса за типичне LC-MS инструменте око 3000 m/z. Да би се тачно одредила молекулска маса вишеструко наелектрисаних великих молекула, често се користи математички процес који се назива деконволуција. Слика 43. Електроспреј Поларност Поларно Неполарно М о л ек у л ск а те ж и н а Јони Горивни гас Спреј растварача Диелектрични капиларни улаз Гас за сушење – загрејани азот Андрија Ћирић Докторска дисертација 87 1.5.4. Хемија јонизације Пошто је формирање јона аналита од пресудне важности за добијање добрих резултата, посебна пажња се мора посветити припреми мобилне фазе. Зато је за електроспреј важно:  Да се изаберу испарљиви пуфери да би се избегло нагомилавање соли у јонском извору,  Подешавање pH раствора према поларности жељених јона,  Коришћење растварача који имају мале топлоте испаравања и мале површинске напоне да би се побољшала десорпција јона,  Обезбедити да реакције у гасној фази не доведу до неутрализације јона. Ако подешена pH вредност не одговара хроматографији, треба модификовати растварач после колоне. На тај начин се може побољшати МS одговор без угрожавања хроматографије. Припрема мобилне фазе је мање критична за рад APCI, јер се јонизација ту дешава у гасној, а не течној фази. Ипак избор растварача може имати значајан ефекат на одговор аналита. Зато је овде важно:  Изабрати испарљиве раствараче,  Изабрати раствараче који се теже јонизују од аналита,  За позитивну јонизацију изабрати протичне раствараче који су бољи од непротичних,  За негативну јонизацију изабрати раствараче који имају велики афинитет за електроне,  Избегавати соли амонијака у мобилној фази, јер могу довести до формирања адуката,  Температура испаривача такође мора да се подеси тако да испари растварач, али да не изазове термалну деградацију молекула аналита. 1.5.5. Анализатори маса Иако се теоретски сви типови анализатора маса могу користити за LC-MS, најчешће се користе следећи: • Квадрупол, • Време прелета (Time of flight), • Јонска замка (Ion trap), • Циклотрон резонанција Fourier-трансформисаних јона (CT-ICR или FT-MS). Андрија Ћирић Докторска дисертација 88 1.5.5.1. Квадрупол Овај анализатор маса састоји се од четири паралелне шипке које су поређане у облику квадрата. Јони аналита су усмерени у центар квадрата. Напон који се примењује на шипке ствара електромагнетно поље. Ово поље одређује однос масе и наелектрисања јона који могу да прођу кроз филтер у датом тренутку. Квадруполи су најједноставнији и најјефтинији анализатори. Квадруполи могу да раде на два начна: • Скенирање (scan mode), • Мониторинг изабраног јона (selected ion monitoring – SIM). Код скенирања, прате се сви јони у одређеном опсегу масе и наелектрисања. Код SIM начина, анализира се само неколико јона са изабраним односом масе и наелектрисања. SIM начин рада је много осетљивији од скенирања, али даје информације о малом броју јона. Користи се за праћење и квантификацију тачно одређеног једињења. Скенирање се користи за квалитативне анализе, или за квантификацију, када су масе аналита унапред познате. Изглед квадрупола је дат на Слици 44. Слика 44. Квадрупол 1.5.5.2. Јонска замка Овај анализатор се састоји од електоде у облику кружног прстена и две електроде – улазне и излазне, што заједно чини комору. Јони који уђу у комору бивају задржани електромагнетним пољем. Поље другачије јачине се може применити да би се јони селективно избацивали из коморе. Предност јонске замке је у томе што се може изводити вишефазна масена спектрометрија, без додатних анализатора. Изглед јонске замке је дат на Слици 45. Слика 45. Јонска замка Акумулација Избацивање Филтер квадрупола Пред филтер Андрија Ћирић Докторска дисертација 89 Технике јонизације под атмосферским притиском су релативно меке технике јонизације. Код меких јонизација обично настају: • Молекулски јони М+ или М-, • Протоновани молекули [М+H]+, • Једноставни адукти јона [М + Na]+, • Јони настали губитком неког дела молекула нпр. губитком воде [М+H – H2О] + . Информација која се добија је молекулска маса, али су често потребне и додатне структурне информације. Да би се те информације добиле, јони аналита се фрагментишу у сударима са неутралним молекулима у процесу који се назива дисоцијација изазвана сударом (collision induced dissociation – CID). Додатни напон се примењује на јоне аналита да би им се додала енергија за сударе и да би се фрагментисали. CID се примењује и код обичне масене спектрометрије и код тандем масене спектрометрије. У првом случају, CID се дешава у јонском извору. Јони аналита се убрзавају и сударају са неутралним молекулима и дају фрагменте. Овај начин је прилично једноставан и релативно јефтин. Недостатак је што се фрагментишу сви присутни јони, јер не постоји начин да се изаберу одређени јони. Добијени спектри зато поред пикова аналита од интреса, садрже и пикове од позадинских јона. Код тандем масене спектрометрије CID се дешава између појединачних анализатора. Тако нпр. код троструког квадрупола први квадрупол служи да се изабере јон који ће се фрагментисати. CID се дешава у следећем квадруполу који се назива колизиона ћелија. Трећи квадрупол тада даје спектар јона насталих фрагментацијом. Модерни LC-MS системи могу да издрже протоке до 2 mL/min. Са малим модификацијама, исти инструменти могу да дају одличне резултате и са микролитарским или нанолитарским протоцима. Јонски извори са ортогоналним распршивачима боље подносе неиспарљиве пуфере. Измене LC метода које захтевају модерни LC-MS системи обично обухватају измене у припреми узорака: • Подешавање одговарајућих концентрација аналита, • Избор одговарајућих растварача и пуфера да би се обезбедила максимална јонизација, • Смањивање присуства других једињења која могу да јонизују или могу да врше супресију сигнала реакцијама у гасној фази. 1.6. Утицај матричног ефекта на одређивање аналита применом MS Високо осетљива тандемска масена спектрометрија, са успешним одвајањем маса, доводи до малог утицаја интерференција, чак иако је њихово присуство велико, које су се истовремено екстраховале и елуирале са испитиваним једињењима. Како HPLC-ESI-MS/MS техника има карактеристике високе селективности, осетљивости, није изненађујуће што се ова техника све чешће користи у клиничким Андрија Ћирић Докторска дисертација 90 лабораторијама. Једини проблем који се мора разматрати приликом развоја методе, валидације и рутинске употребе, је матрични ефекат. Матрични ефекат је измена јонизације у присуству супстанци које су се заједно елуирале. Матрични ефекат се јавља када се молекули коелуирају са једињењем од интереса, при чему врше промену јонизационе ефикасности електроспреј извора. Овај феномен први су описали Kebarle и Tang [282] и показали да се одговор електроспреја органских база смањује када концентрација осталих органских база расте. Тачан механизам матричног ефекта је непознат, али вероватно потиче од компетиције између аналита и коелуираних, недетектованих аналита матрикса. King са сарадницима [283] је показао, преко серије експеримената, да је матрични ефекат резултат компетиције између неиспарљивих компоненти матрикса и јона аналита за долазак на површину капљице која се преноси у гасну фазу. У зависности од средине у којој се јонизација и испаравање врши, ова компетиција може смањити (позната као супресија) или повећати (ion enhancment) ефикасност формирања жељеног јона аналита пристуног у истој концентрацији на интерфејсу. Ефикасност формирања јона аналита веома зависи од уношења матрикса у извор електроспреј јонизације. Матрични ефекат такође зависи од једињења која се анализирају. Bonfiglio са сарадницима [284] је навео да хемијска природа једињења има значајан утицај на степен матричног ефекта. Они су проучавали четири једињења различите поларности под истом условима. За најполарније једињење је нађено да има највеће смањење јонизације, а за најнеполарније има мали утицај. Утицај матричног ефекта на поузданост HPLC-ESI-MS/MS у погледу прецизности и тачности [285], осетљивости и лимита квантификације методе може неповољно утицати на одређиваље аналита [286]. На основу тога приликом развоја поуздане HPLC-ESI-MS/MS методе, треба изводити експерименте који разјашњавају утицај матричног ефекта на одређивање аналита. Две главне технике које се користе за одређивање матричног ефекта приликом HPLC-ESI-MS/MS анализе су постекстракциони додатак супстанце или постколонска инфузија. Техника постекстракционог додатка захтева екстракте узорка са аналитом од интереса, додатог после екстракције и упоређивање са стандардним растворима припремљених у мобилној фази која садржи еквивалентну количину аналита од интереса [287 – 291]. Разлика у одговору између постекстрахованог узорка и стандардног раствора подељена са одговором стандардног раствора даје степен матричног ефекта који се јавља приликом одређивања аналита у испитиваном раствору, под одређеним хроматографским условима. Техника постекстракционог додатка се сматра статичном техником која даје само информације о матричном ефекту на аналит од интереса. Динамичнија техника за утврђивање матричног ефекта је постколонска инфузија [292]. Пумпа се користи за испоруку константног протока аналита у HPLC систем, у тренутку после хроматографске колоне, а пре масеног извора јонизације. Узорак екстракта (без додатог аналита) се убризгава под жељеним хроматографским условима. Постинфузиона техника омогућава одређивање утицаја матрикса на одговор аналита током целог Андрија Ћирић Докторска дисертација 91 времена хроматографисања. Резултати постколонске инфузије омогућавају да се процени утицај матричног ефекта на одређивање аналита изолованог из узорка различитим техникама. Да би се добила робусна HPLC-ESI-MS/MS метода, потребно је да се уклони или минимизира матрични ефекат (присуство коелуираних супстанци). Утицај матрикса на одређивање испитиваних компоненти мора бити узет у обзир. До сметњи може доћи од узорка који се убризгава, или нагомилавања и преоптерећења аналитичке колоне [293]. Два приступа су могућа да би се уклонили или минимизирали ефекти матрикса. То су модификација методологије екстракције узорка и побољшано хроматографско одвајање [294]. Ова два параметра су међусобно повезана у развоју квантитативне HPLC-ESI- MS/MS методе. 1.7. UV/Vis спектрофотометријске методе Апсорпциона спектрофотометрија је метода спектралне анализе заснована на физичком феномену апсорпције светлости. Апсорпција светлости је процес у којем нека хемијска врста у транспарентној средини смањује интензитет електромагнетног зрачења које кроз ту средину пролази. Зависност апсорбанције од таласне дужине упадног зрачења представља апсорпциони спектар. Апсорпциони спектар даје информације о квалитативном и квантитативном саставу апсорбујуће супстанце. Зависност интензитета пропуштене светлости од концентрације раствора дата је Lambert-Beer-овим законом апсорпције: односно, где је А апсорбанција, интензитет пропуштеног зрачења, а интензитет упадног зрачења, дебљина апсорпционог слоја, моларна концентрација, моларни апсорпциони коефицијент који не зависи од концентрације, већ је функција таласне дужине и природе супстанце. Квантитативна анализа се заснива на Lambert-Beer-овом закону. Како је код спекрофотометара b једнако дебљини кивете и константно, то апсорбанција зависи само од концентрације и моларног коефицијента апсорптивитета. За квантитативну анализу је битно да се очитавање апсорбанције врши са највећом могућом тачношћу и осетљивошћу. Да би се то постигло битан је избор таласне дужине на којој се врши мерење. Она мора да испуни неколико услова: 1. да се мерењем постиже максимална осетљивост, 2. да мала промена таласне дужине не утиче на репродуктивност, 3. да важи Lambert-Beer-ов закон апсорпције. Андрија Ћирић Докторска дисертација 92 На основу ових захтева, а у зависности од услова, очитавање апсорбанције се врши: a) на таласној дужини максималне апсорпције, max, ако у посматраној области спектра апсорбује само анализирана супстанца, јер је онда осетљивост мерења највећа. Да би се постигла добра репродуктивност потребно је да max лежи на равни максимумуа у апсорпционом спектру. Код оштрих, уских максимума, мала промена у таласној дужини доводи до грешке и погоршава репродуктивност одређивања. b) на таласној дужини оптималне апсорпције, opt, ако у испитиваној области поред анализиране супстанце апсорбује и нека компонента или додати реагенс, и представља таласну дужину где је највећа разлика у апсорбанцији апсорбујућих супстанци. c) на таласној дужини изобестичке тачке, izob, ако испитивана супстанца постоји у раствору у два облика који имају различите максимуме апсорпције и представља таласну дужину на којој оба равнотежна облика имају исту апсорбанцију. Уколико је познат број аналита у смеши и ако сви апсорбују светлост у UV/Vis области спектра могу се квантификовати користећи спектрофотометријску мултикомоненту анализу. Код мултикомпонентне анализе, вредност апсорбанције при одређеној таласној дужини, једнака је збиру апсорбанције свих компоненти на тој таласној дужини, што се може представити једначином: где је А апсорбанција на таласној дужини, К константа у коју улазе моларни апсорптивитет и ширина кивете и С концентрација. Уколико се мери апсорбанција на i таласних дужина, n компонената може се написати следећи систем једначина: : : (40) : или у облику матрице: [ ] [ ] [ ] Андрија Ћирић Докторска дисертација 93 или у облику: А = К С (42) где А, К и С представљају матрице апсорбанција, коефицијената и концентрације. Након одређивања коефицијента матрице, непознате концентрације појединачних једињења се израчунавају из измерене апсорбанције и инверзне матрице (К-1). Сn = Аi К -1 (43) Андрија Ћирић Докторска дисертација 94 1.8. Оптимизација инструменталних метода 1.8.1. Експериментални дизајн Већина експеримената обухвата више фактора (независних променљивих) и изводи се или у циљу оптимизације процеса, или ради испитивања повезаности фактора и карактеристика самог процеса (Слика 46) [295]. Температура, pH, концентрација, катализатор Синтеза, хемијска реакција, инд. процес Принос, чистоћа, биолошка активност Слика 46. Повезаност фактора и карактериситка процеса Основна идеја се састоји у томе да се обави мали број експеримената у којима се сви релевантни фактори мењају систематски. Обично није потребно извршити више од 10-20 експеримената. Статистичка анализа експерименталних резултата треба да омогући успостављање оптималних услова, идентификацију фактора који имају највећи утицај на резултате и оних који немају, постојање интеракција и синергизма између фактора [295]. Експериментални дизајн почиње јасном формулацијом проблема који треба да да одговор на питање шта је сврха и циљ истраживања, који фактори утичу на посматрани процес и колики је распон њихове промене, као и на који начин треба извршити експеримент. У другом ступњу врши се скрининг фактора, при чему се утврђује који су фактори релевантни, а који нису. 1.8.2. Класични експериментални дизајн Као основни пример примене експерименталног дизајна, претпоставља се да је могуће идентификовати само две вредности, или нивоа, сваког од улазних фактора. Не постоји универзални рецепт за то како поставити те нивое, али требало би их подесити да буду по природи “супротни”, али не толико да то буде неприродно. Ако има k улазних фактора, онда постоји 2k различитих комбинација улазних фактора, од којих сваки дефинише различиту конфигурацију модела; то се зове 2k факторски дизајн. Обележавајући два нивоа сваког фактора као “-” и “+” ниво, може се формирати матрица дизајна која тачно описује шта је свака од 2k различите конфигурације модела, изражена у нивоима својих улазних фактора. На пример, ако постоји k = 3 фактора, ФАКТОРИ СИСТЕМ ИЛИ ПРОЦЕС ОДГОВОР Андрија Ћирић Докторска дисертација 95 било би 23 = 8 конфигурација, а матрица дизајна би била као што је приказано у Табели 20, где Ri означава одзив из i-те конфигурације. Табела 20. Матрица дизајна за 23 факторијални експеримент Пролаз (i) Фактор 1 Фактор 2 Фактор 3 Одзив 1 - - - R1 2 + - - R2 3 - + - R3 4 + + - R4 5 - - + R5 6 + - + R6 7 - + + R7 8 + + + R8 Поред тога, може се испитивати да ли би ефекат једног фактора на неки начин могао да зависи од нивоа једног или више других фактора, што се назива интеракцијом између фактора. Ако постоји интеракција између два фактора, онда главни ефекат тих фактора не може да се интерпретира изоловано. Друга тешкоћа са потпуним факторијалним дизајном је то што ако број фактора постане чак и умерено велики, број експеримената је огроман (експоненцијално расте са бројем фактора). Начин да се ово заобиђе је да се користи фракционално - факторијални дизајн, где се извршава само мали део свих могућих комбинација фактора. Међутим, мора се водити рачуна о пажљивом избору подскупа експеримената. Лоша страна извршавања само дела експеримената је што није могуће проценити неке од могућих интеракција, јер што је мањи број пролаза, мањи је и број интеракција које се могу проценити [295]. У раним фазама извођења експеримената битно је идентификовати који фактори су важни, а који нису. Безначајне факторе треба фиксирати на неке разумне вредности и изоставити их из разматрања, а даље истраживање се може извршити са значајним факторима. У најширој примени су потпуни факторски, фракционо факторски, Placket- Burman-ов, Taguchi-јев, Box-Behnken-ов дизајн који се називају још скрининг дизајни на два нивоа. Ако се пође од чињенице да одабрани дизајн мора да задовољи услов статистичке интерпретације ефеката фактора на експериментални одговор, онда одабрани дизајн није увек онај са најмањим бројем експеримената, због тога што се одређени број степени слободе мора проценити да би се израчунала вредност експерименталних грешка (извори варијабилности). Наведени дизајни дозвољавају само интерпретацију главних ефеката фактора, док су факторске интеракције укључене у главни ефекат. Најчешће се користи Placket-Burman-ов дизајн у којем могу да се процене интеракције два фактора у скренинг дизајну [296]. Осим експеримената предвиђених дизајном изводи се више поновљених мерења при номиналном нивоу. Ови реплицирани номинални експерименти служе за контролу одговора уколико се одговори на номиналном нивоу мењају током времена. Уколико је то случај, одговори Андрија Ћирић Докторска дисертација 96 експерименталног дизајна морају се кориговати. У скрининг дизајну експерименти се најчешће изводе у случајној секвенци. Међутим, понекад се експерименти изводе тако што се групишу према вредностима одређеног фактора тј. прво се изведу сви експерименти при једном нивоу одређеног фактора, затим при другом нивоу тог фактора, итд. Овакво извођење експеримената представља сортирано извођење или извођење у блоковима. Унутар блока експерименти се изводе у случајном распореду. Ово је груписање по факторима, оно није повезано са груписањем у односу на екстерне факторе који се не тестирају у дизајну, на пример, када се експерименти изводе током више дана. На основу изведених експеримената дефинише се одговор дизајна тј. експериментални резултат. Одговори могу бити квантитативни, као што је на пример количина аналита, површина пика, висина пика у хроматогрфским методама. Експериментални одговори могу бити квалитативни и у хроматографији они описују квалитет раздвајања или анализе: резолуција, релативна ретенција, ретенциони фактор и фактор асиметрије. Треба напоменути да се у статистичком дизајну квантитативни и квалитативни фактори другачије дефинишу. Квантитативни фактори су они који се у одређним границама могу мењати континуално и то су сви горе поменути фактори. Квалитативни фактори могу имати само дискретне нивое и то су, на пример, произвођач колоне или стационарне фазе и слично. Општа шема експерименталног дизајна у хроматографији дата је на Слици 47 [297]. Андрија Ћирић Докторска дисертација 97 Дефинисање проблема Избор методе Дефинисање експерименталних фактора Дефинисање нивоа фактора и њиховог кодирања „screening“ дизајн Избор дизајна Избор фактора и екстремних фактора нивоа Одређивање значајних фактора Специјални дизајн Факторски дизајн Унос одговора Коректура одговора Израчунавање коректуре Израчунавање ефеката фактора Статистичка интерпретација ефеката фактора Графички приказ ефеката Проширење дизајна Крај да да да да не не не не Слика 47. Ток експерименталног дизајна Андрија Ћирић Докторска дисертација 98 1.8.3. Израчунавање ефеката Ефекти фактора на одзив експеримента се израчунавају из измерених одговора. Када се фактори испитују на два нивоа за сваки фактор одговарајући ефекат се израчунава по једначини: ∑ ⁄ ∑ ⁄ где X представља факторе, интеракције фактора или празну вредност у Plackett- Burmanovom дизајну. EX је ефекат X на одговор Y; ∑Y(+1) и ∑Y(-1) су суме одговора где је фактор X на нивоу +1 и -1, а N је број експеримената у дизајну. Средња вредност квадрата сваке варијабле се рачуна према формули: ∑ ∑ Експериментална грешка мерења се рачуна као однос средње вредности квадрата и броја споредних фактора по формули: ∑ Фактори који показују велики утицај се проналазе коришћењем F-теста. где је R експериментална грешка, Vxd средња вредност квадрата споредних фактора, Vxi средња вредност квадрата фактора и n број споредних фактора. Критични ефекат Ftab се израчунава при нивоу сигнификантности 0,05 и 0,01. 1.8.4. Оптимизациони дизајни За одређивање површина одговора (response surface) користи се оптимизациони дизајни користе се потпуни или делимични факторски дизајн, централно композитни, Box-Behnke-ов дизајн, Doehlert-ов и дизајн смеше. Потпуни или делимични факторски дизајни најчешће се користе као скрининг дизајни. Међутим, они се могу користити и као први корак у мултиваријантном испитивању, где је површина одговора линеарна. У двофакторском случају површина одговора дата је линеарним моделом. Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b12X1×X2 (48) Андрија Ћирић Докторска дисертација 99 Ако је интеракциони члан мали, површина одговора је планарна; што је већи интеракциони члан површина одговора је све више извијена. Ако линеарни модел није довољан за адекватно представљање експерименталних података онда се мора извести више експеримената него што предвиђа факторски дизајн. У том случају се користи централно композитни дизајн да би се дефинисала квадратна површина. Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b11X12 + b22X22 + b12X1×X2 (49) Површина одговора се користи за предвиђање оних нивоа фактора који дају максимални или минимални одговор. Box-Benkhet-ов и Doehler-тов дизајн такође се користе за добијање површине одговора и оптимизацију хроматографских фактора као што су температура, карактеристике колоне и проток. Дизајн смеше се користи за оптимизовање састава мобилне фазе. Овај дизајн оптимизује укупну количину материјала коришћеног у експерименту. Мултиваријантна оптимизација хроматографског система врши се према следећој преоцедури: а) изабрати статистички дизајн за испитивање експерименталне области фактора б) извести експеримент случајним хронолошким редом в) извршити анализу варијансе (ANOVA) регресионих резултата тако да се потврди адекватност модела без појаве значајне вредности “lack of fit” [298]. 1.8.5. Факторски и централно композитни дизајн Централно композитни дизајн (CCD) комбинује потпуни и делимични факторски дизајн са два нивоа са додатним аксијалним или звездасто постављеним тачкама и барем једном тачком у центру дизајна. Овај дизајн дозвољава израчунавање и линераног и квадратног модела. CCD за k фактора (X1, ..., Xk) састоји се из три дела. 1) факторски или кубни дизајн који садржи nfact тачака са координатама Xi = -1 или Xi = +1 за i = 1, ..., k, 2) аксијални или звезда део који се формира од nax = 2k тачака чије су све координате једнаке нули осим једне која је једнака α (или -α), 3) укупно nc тачака које се формирају у центру дизајна и где су све координате једнаке нули. Кодирање вредности фактора врши се по следећој формули: Кодирање измерених вредности тј. превођење реалних вредности у кодне, омогућава ефикасније рачунање са матрицама дизајна. Андрија Ћирић Докторска дисертација 100 За CCD се мора знати колико се кубних тачака користи и која је вредност за α и колико ће се експеримената извести у централној тачки. Дизајн је представљен у Табели 21 и на Слици 48. Табела 21. Нивои кодираних вредности за централно композитни дизајн за двофакторске и трофакторске системе. Два фактора Три фактора x1 x2 x1 x2 x3 -1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 0 0 -1 -1 1 0 0 1 1 1 0 0 -1 1 1 -1,414 0 1 1 1 1,414 0 0 0 0 0 -1,414 0 0 0 0 1,414 0 0 0 -1,683 0 0 1,683 0 0 0 -1,683 0 0 1,683 0 0 0 -1,683 0 0 1,683 Слика 48. Централни композитни дизајн за два и три фактора. Сиви кругови образују коцку - број ранова 22 и 23. Црни кругови образују облик звезде Андрија Ћирић Докторска дисертација 101 Двофакторски CCD (лево у Табели 21) састоји се из четири експеримента који чине кубни део, три поновљена експеримента у централној тачки и четири експеримента у дизајну звезде. Трофакторски експеримент има 8 кубних тачака, 4 централне и 6 аксијалних тачака са  = 1,683. Укупан број тачака у CCD је 22 + 2×k + c0, где је c0 број централних тачака. Потпуни квадратни модел за k фактора садржи ((k+1)×(k+2))/2 параметара, што за двофакторски модел даје 6 фактора. Вредност α обично се креће од 1 до √ . Када је α једнак √ и кубне и аксијалне тачке се налазе на површини сфере, па се дизајн назива сферични. То је случај са двофакторским дизајном у Табели 19, где се све периферне тачке налазе на кружници. Ако је α једнак 1, тачке се налазе у центру стране површи кубног дела дизајна. Да би се одредила вредност α, Box-Hunter су предложили да се користи тзв. концепт ротабилности као критеријум за избор вредности α. 1.9. Валидација модела (анализа варијанси, ANOVA) Метода за упоређивање средњих вредности више популација врши се анализом варијанси познатој као ANOVA. Ова метода користи један тест како би се одредило да ли постоји или не, разлика између средњих вредности популација. Уколико ANOVA покаже постојање разлике, користи се процедура вишеструког упоређивања како би се идентификовала популација која се разликује од осталих [299]. Тестира се нулта хипотеза да су средње вредности популација једнаке, што се може представити у облику: као и алтернативна хипотеза На, код које је потребно да се макар две средње вредности разликују. Осим познавања средњих вредности свих популација и њихових варијанси, потребно је знати и укупну средњу вредност за цео низ мерења, која се може израчунати по формули: ̿ ( ) ̅ ( ) ̅ ( ) ̅ ( ) ̅ где је N1 број мерења у групи 1, N2 број мерења у групи 2 и тако даље. Да би се утврдила истинитост нулте хипотезе израчуната вредност за F тест се упоређује са табличном при одређеном степену сигнификантности, а нулта хипотеза се одбацује ако је израчуната вредност F теста већа од критичне (табличне) вредности. ANOVA табела за валидацију модела иста је за све експерименталне дизајне и представљена је у Табели 22. Андрија Ћирић Докторска дисертација 102 Табела 22. Анализа варијанси за најмање квадрате линеарног модела са параметрима Извор варијација Сума квадрата Број степени слободе Средњи квадрати Регресија ∑∑ ̅ p - 1 Резидуал ∑∑( ) n - p Lack of fit ∑∑ ̅ m - p Pure error ∑∑( ) n - m Укупно ∑∑( ) n - 1 Укупна варијанса дели се на два главна доприноса, варијансу која потиче од грешке модела тј. варијансу објашњену регресијом SSR и варијансу која потиче од резидуала експеримента тј. варијансу од суме квадрата резидуала SSr. Обе суме се израчунавају преко свих нивоа експерименталног дизајна и свих репликација извршених на тим нивоима. Ако је број коефицијената у моделу p, онда је SSR сума квадрата разлика вредности одговора предвиђених регресионим моделом и укупне средње вредности свих одговора и има p - 1 степени слободе. SSr је сума квадрата резидуала, који представљају разлику између одговора добијеног експериментом и одговора предвиђеног моделом. Ова сума има n- p степени слободе, где је n укупан број експерименталних тачака. Ако модел тачно описује експерименталне податке онда је SSR велико, а SSr мало. Сума ове две величине је SST, укупна сума квадрата разлика између експерименталих података и укупне средње вредности свих одговора. Однос SSR/SST представља објашњену варијансу и означава се са R 2 где је R коефицијент корелације. Квалитет модела одређује се на основу вредности SSr. Ова вредност представља се у облику два сабирка: lack of fit, SSlof и pure error, SSpe. Pure error је сума квадрата разлике појединачне експерименталне вредности и средње вредноти на истом факторском нивоу. Док је lack of fit једнакa суми квадрата између предвиђене вредности и средње експерименталне вредности на истом факторском нивоу. Модел се тестира на следећи начин: F-тест, F = SSlof/SSpe, се пореди са табличном вредношћу за n- p и n - m степена слободе при нивоу поверења 95%. Ако је Fcalc веће од Ftable модел се одбацује, у супротном модел је прихваћен. Сигнификантност регресије се одређује поређењем F дистрибуције, F = SSR/SSr са табличном за p - 1 и n – p степена слободе. Регресија је сигнификантна ако је Fcalc веће од Ftable. Андрија Ћирић Докторска дисертација 103 1.10. Компјутерска симулација коришћењем програма Dry Lab и LC-Simulator Код HPLC одређивања параметри који се најчешће оптимизују су: састав и pH мобилне фазе, концентрација органског модификатора у мобилној фази, брзина протока мобилне фазе и други. Истовремена оптимизација овако великог броја параметара захтева рачунски оријентисан, хемометријски поступак како би се поједноставио. Термодинамички приступ је реализован у облику рачунарског програма DryLab, који је првобитно био развијен од стране фирме LC Resources и њиховог истраживачког тима J. Dolan, J.R. Snyder, Cs. Horvath. Касније је програм битно дограђен, и додате су две нове функције „Chrom Merge“ и „Peak Tracking“, а диструбуцију и развој даље је наставио Молнаров институт у Берлину, под руководством Imre Molnar-a [300 – 302]. Приликом употребе програма DryLab за оптимизацију неопходни су пробни хроматограми. Најчешће се полази од градијентног елуирања, али постоји могућност да се калибрација програма изврши и преко изократског начина рада. Улазни подаци за DryLab се могу поделити у три групе: а) подаци о колони, б) подаци о мобилној фази и ц) хроматографски подаци. Подаци о колони обухватају: дужину колоне, унутрашњи пречник колоне, величину честица, притисак на колони, температуру и тип колоне. Програм израчунава број теоријских подова колоне. За оба начина елуирања (изократски и градијентни), у програм је потребно да се унесе податак о мртвој запремини (dwell volume). Подаци о мобилној фази обухватају: састав растварача А (водени део мобилне фазе), састав растварача В (органски део фазе), концентрацију пуфера и концентрацију модификатора воденог дела мобилне фазе. У градијентном моду потребно је задати време и нагиб градијента. Хроматографски подаци се уносе за сваки пик и обухватају: ретенционо време, површину и ширину пика. Уношење ових података у сложенијим случајевима захтева идентификацију пикова хроматограма. Идентификацију пикова DryLab може да ради аутоматски укључивањем опције „Peak Tracking“. Са улазним пробним хроматограмима програм израчунава критичну резолуцију Rs, као функцију једног или два хроматографска параметра за сваки пар пикова. Графички, представљањем критичне мапе резолуције у функцији једног или два параметра, добија се мапа критичне резолуције из које се идентификују оптимални услови и робусне области хроматографске методе. Техника критичне мапе резолуције, коју је увео Molnar, је ефективна за проналажење оптималних услова раздвајања и заснована је на једначини изведеној из термодинамичког разматрања хроматографског процеса: ⁄ ⁄ Андрија Ћирић Докторска дисертација 104 где је: k – ретенциони фактор, А – електростатичка сила, B×D – van der Walls-ove силе, V – моларна запремина растварача, Kе – молекуларни параметар растварача, Pо – атмосферски притисак,  – површински напон, T – температура, N – број подова, E – диелектрична константа растварача, S – растворак и L – стационарна фаза (C18). Једначина 53 описује утицај састава елуента на ретенцију на основу површинског напона, који је пропорционалан %А, температури, молекуларним својствима узорка и хемијски везаног лиганда, ΔА и електростатичким својствима, као што је концентрација пуфера. Програм DryLab омогућава симултану оптимизацију једног или два хроматографска параметра на основу улазних података (ретенционо време, површина и ширина пика) под дефинисаним хроматографским условима (врста колоне, температура, начин елуирања). Програм омогућава визуелизацију померања пикова што је нопходно за процену робусности методе. Једноимензионална мапа резолуције (1D) представља дводимензионални дијаграм зависности критичне резолуције од одабраног хроматографског параметра. Дводимензионална мапа резолуције (2D) је тродимензионални контурни дијаграм, где је критична резолуција као трећа димензија означена различитим бојама. У 2D оптимизацији на дијаграму се види маркер чијим померањем у области максималне критичне резолуције се идентификују оптималне вредности хроматографских параметара. За оптимално хроматографско раздвајање се захтева да минимална критична вредност резолуције буде већа од 1,5. На сличном принципу на коме ради DryLab ради и LC-Simulator. Компјутерски потпомогнут развој хроматографске методе је неопходан за праћење померања пикова како се мењају услови одвајања. Прираштај пика се користи за прављење математичког модела помоћу којег се минимизира број експеримената потребних за оптимизацију. Програм LC-Simulator изводи оптимизацију методе на основу експерименталних хроматограма и прави модел који се заснива на експерименталним варијаблама (% елуента, концентрација пуфера, температура итд.) са ретенционим фактором [303]. Резултати оптимизације се приказују као мапа резолуције дајући резолуцију критичног пара пикова. Мапа резолуције показује промене у методи које утичу на одвајање аналита. Концентрациони профил се добија применом средњих вредности најмањих квадрата мултиваријантне анализе. Програм омогућава истовремену оптимизацију једне или две променљиве где се као подаци уносе: ретенционо време, површина пика аналита и ширина пика при одређеним хроматографским условима (врста и карактеристике колоне, температура, проток, градијентни или изократски начин елуирања) и праћење померања пика које је битно за разумевање робусности HPLC методе. Померањем курсора облика дијаманта у области максималне критичне резолуције, могу се оптимизовати вредности параметара и идентификовати најбољи експериментални услови при чему се добија симулирани хроматограм. Андрија Ћирић Докторска дисертација 105 1.11. Валидација аналитичке методе Валидација аналитичке методе је поступак којим се, лабораторијским испитивањем, утврђује да ли је метода поуздана за предвиђена аналитичка одређивања и дефинише се као „процес којим се документује да је метода одговарајућа за дату намену“ [280]. Парамтери валидације зависе од предвиђене намене методе. Према упутствима ICH [258], валидација методе подразумева дефинисање параметара као што су: селективност/специфичност, линеарност и опсег, тачност, прецизност, граница детекције, граница квантификације, робусност за одговарајући систем. 1.11.1. Линеарност и опсег У једнокомпонентној анализи резултат је калибрациона права, код које је одговор инструмента, y, функција концентрације аналита, с, што се може изразити као: y = a c+b + e (56) при чему је a нагиб, b одсечак, c концентрација, а e стохастична грешка сигнала. Зависно од процеса мерења, та грешка у мерењу сигнала може бити нормално расподељена случајна променљива са аритметичком средином једнаком 0 и са варијансом 2. Линеарност подразумева резултате који су директно пропорционални концентрацији аналита у датом опсегу. Како се у пракси обавља ограничени број мерења, могућа одступања од идеалне линеарности израчунавају се регресионом анализом. Линеарна зависност може се потврдити визуелно, статистичком провером (коефицијентом корелације) или F-тестом, при чему се упоређују варијансе тачке која одступа од правца и укупне варијансе свих тачака. Према упутствима ICH, потребно је најмање пет концентрационих нивоа у датом опсегу. За одређивање садржаја минималан опсег је 80 – 120 % од циљане концентрације [280]. 1.11.2. Селективности/специфичност Метода је селективна уколико аналит од интереса може тачно да се одреди у присуству других компоненти које се могу очекивати у матриксу, а специфична уколико одговор детектора потиче само од компоненте од интереса. Селективност се изражава као однос дела сигнала који недвосмислено потиче од аналита (r*) и укупног сигнала (r). То је бездимензиона величина и има вредности од 0 до 1, а приказује се као: Андрија Ћирић Докторска дисертација 106 1.11.3. Осетљивост Осетљивост је промена одзива инструмента (r) са променом концентрације аналита (c), односно нагиб регресионог правца a, и изражава се као: 1.11.4. Тачност Тачност је мера слагања између тачне или референтне вредности и нађене вредности. За одређивање тачности анализира се синтетичка смеша у коју је додата позната количина аналита. Према упутствима ICH, препоручено је најмање десет одређивања за најмање три концентрације у датом опсегу. Добијени подаци се приказују као повратни принос, односно однос додате и нађене количине или као разлика између средње и тачне вредности са интервалима поузданости [280]. 1.11.5. Прецизност Прецизност је мера степена поновљивости аналитичке методе под оптималним хроматографским условима и обично се изражава као релативна стандардна девијација за статистички значајан број узорака. Према упутствима ICH, прецизност треба одредити на три различита нивоа концентрација аналита: 1. Поновљивост – односи се на резултате добијене у кратком временском интервалу под истим условима. Препоручено је да се уради најмање девет одређивања на три концентрациона нивоа или шест одређивања на циљаној концентрацији. 2. Интермедијарна прецизност – односи се на резултате добијене у истој лабораторији, али у току различитих дана, или када анализу раде различити аналитичари на различитој опреми. Да би се пратили ефекти појединачних променљивих, треба користити експериментални дизајн. 3. Репродуктивност – односи се на резултате добијене у различитим лабораторијама. Прецизност се изражава као релативна стандардна девијација или коефицијент варијације: ̅ где је стандарднa девијација одступања поновљених мерења, а ̅ средња вредност мерења. Прихватљиве вредности за прeцизност зависе од врсте анализе. За анализу дозираних облика, релативна срандардна девијација може да има вредност мању од 1 %, а при анализи биолошких узорака релативна срандардна девијација може бити 16 % на граничним вредностима концентрације и 10 % на осталим концентрацијама. Андрија Ћирић Докторска дисертација 107 1.11.6. Граница детекције Граница детекције (limit of detection – LOD) се дефинише као најмања концентрација аналита у узорку која се може детектовати, али не и квантификовати [280]. Граница детекције се изражава као концентрација и може се израчунати преко односа сигнал/шум. Лимит детекције се може израчунати преко стандардне девијације одговора (sb) и нагиба калибрационе праве (a) на нивоима блиским лимиту, по формули: Стандардна девијација одговора се може одредити на основу стандардне девијације слепе пробе, стандардне девијације резидуала регресионе праве, или стандардне девијације одсечка регресионе праве. 1.11.7. Граница квантификације Граница квантификације (limit of quantification - LOQ) се дефинише као најмања концентрација аналита у узорку која се може квантификовати са прихватљивом прецизношћу и тачношћу, под условима који су наведени у методи. Граница детекције се изражава као концентрација и може се израчунати преко односа сигнал/шум. Лимит детекције се може израчунати преко стандардне девијације одговора (sb) и нагиба калибрационе праве (a) на нивоима блиским лимиту, по формули: 1.11.8. Робусност Робусност методе је њен капацитет да остане непромењена при малим, али намерним променама параметара методе. Робусност методе се процењује варирањем параметара као што су промена pH вредности, јонске јачине раствора, температуре и других, и утврђивање ефекта тих параметара на резултате методе [280]. Ефекат ових фактора може се проценити појединачно или као део факторског експеримента. Андрија Ћирић Докторска дисертација 108 1.12. Циљ и задатак рада Циљ истраживања ове докторске дисертације био је развијање аналитичких (спектрофотометријских, HPLC и LC-MS) метода за одређивање биофлавоноида и сродних једињења у храни, крвној плазми и фармацеутским формулацијама. Резултате добијене применом развијених метода требало је поредити са подацима описаним у литератури. На основу изложеног, задатак овог рада је: 1. Избор оптималног поступка за течно-чврсту екстракцију биофлавоноида из узорака хране. 2. Процена утицаја матричног ефекта на одређивање биофлавоноида у узорцима хране. 3. Предходно испитивање услова и оптимизација LC-MS методе за одређивање хесперетина, хесперидина, кверцетина, рутина и каемпферола у узорцима хране. 4. Предходно испитивање услова и оптимизација HPLC методе за одређивање кверцетина, каемпферола, лутеолина, апигенина, катехина и епикатехина у узорцима хране. 5. Предходно испитивање услова и оптимизација HPLC методе за одређивање једињења моксифлоксацина и једињења сродних њему у фармацеутским формулацијама. (Оптимизација обухвата симулацију хроматографских експеримената употребом програма DryLab, као и статистичку оптимизацију коришћењем методе експерименталног дизајна). 6. Валидација методе и одређивање валидационих параметара. 7. Валидираним методама извршити одређивање биофлавоноида у узорцима хране, активне супстанце моксифлоксацина у серуму и сродних супстанци у таблетама и инфузији. Андрија Ћирић Докторска дисертација 109 2. Експериментални део Андрија Ћирић Докторска дисертација 110 2.1. Реагенси 2.1.1. Стандарди биофлавоноида Кверцетин (C15H10O7), (2-(3,4-дихидроксифенил)-3,5,7-трихидрокси-4H-хромен-4- он): коришћен је стандард кверцетина (MW = 302,236 g/mol), чистоће > 99 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Рутин хидрат (C27H30O16×H2O), (2-(3,4-дихидроксифенил)-5,7-дихидрокси-3-[α-L- рамнопиранозил-(1→6)-β-D-глукопиранозил]-4H-хромен-4-он: коришћен је стандард рутин хидрата (MW = 628,52), чистоће > 94 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Хесперетин (C16H14O6), ((S)-2,3-дихидро-5,7-дихидрокси-2-(3-хидрокси-4- метоксифенил)-4H-1-бензопиран-4-он): коришћен је стандард хесперетина (MW = 302,27 g/mol), чистоће > 95 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Хесперидин (C28H34O15) (2S)-5-хидрокси-2-(3-хидрокси-4-метоксифенил)-7- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-ттрихидрокси-6-[[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-трихидрокси-6- метилоксан-2-ил]оксиметил]оксан-2-ил]окси-2,3-дихидрохромен-4-он): коришћен је стандард хесперидина (MW = 610,56 g/mol), чистоће 80 %, производ фирме Sigma- Aldrich (Беч, Аустрија). Каемпферол (C15H10O6), (3,5,7-трихидрокси-2-(4-хидроксифенил)-4H-хромен-4- он): коришћен је стандард каемпферола (MW = 286,23 g/mol), чистоће > 95 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Катехин (C15H14O6), ((2R,3S)-2-(3,4-дихидроксифенил)-3,4-дихидро-2H-хромен- 3,5,7-триол) коришћен је стандард катехина (MW = 290,27 g/mol), чистоће > 98 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Епикатехин (C15H14O6), ((2R,3R)-2-(3,4-дихидроксифенил)-3,4-дихидро-1(2H)- бензопиран-3,5,7-триол) коришћен је стандард епикатехина (MW = 290,27 g/mol), чистоће > 90 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Апигенин (C15H10O5), (5,7-дихидрокси-2-(4-хидроксифенил)-4H-1-бензопиран-4- он) коришћен је стандард апигенина (MW = 290,27 g/mol), чистоће > 95 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Андрија Ћирић Докторска дисертација 111 Лутеолин (C15H10O6), (2-(3,4-дихидроксифенил)-5,7-дихидрокси-4-хроменон) коришћен је стандард лутеолина (MW = 286,24 g/mol), чистоће > 94 %, производ фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). 2.1.2. Стандарди хинолона Моксифлоксацин хидрохлорид (C21H24FN3О4×HCl), (1-циклопропил-7-[(1S,6S)- 2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6-флуоро-8-метокси-4-оксо-хинолин-3-карбоксилна киселина хидрохлорид [MOX]: коришћен је стандард моксифлоксацин хидрохлорида (MW = 437,9 g/mol), чистоће веће од 99,9 % производ фирме BayerPharma AG (Леверкузен, Немачка). Синтетичка нечистоћа 1: 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8- ил]-6,8-дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6,8DF] коришћен је стандард (MW = 413 g/mol), чистоће веће од 99,9 %, производ фирме BayerPharma AG (Леверкузен, Немачка). Синтетичка нечистоћа 2: 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8- ил]-6,8-диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6,8DM] коришћен је стандард (MW = 413,5 g/mol), чистоће веће од 99,9 %, производ фирме BayerPharma AG (Леверкузен, Немачка). Синтетичка нечистоћа 3: 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8- ил]-8-флуоро-6-метокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6M8F] коришћен је стандард (MW = 401,4 g/mol), чистоће веће од 99,9 %, производ фирме BayerPharma AG (Леверкузен, Немачка). Синтетичка нечистоћа 4: 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8- ил]-8-етокси-6-флоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина [6F8E] коришћен је стандард (MW = 415,5 g/mol), чистоће веће од 99,9 %, производ фирме BayerPharma AG (Леверкузен, Немачка). Офлоксацин (C18H20FN3O4), ((RS)-7-флуоро-2-метил-6-(4-метилпиперазин-1-ил)- 10-оксо-4-окса-1-азатрицикло[7.3.1.0]тридека-5(13),6,8,11-тетраен-11-карбоксилна киселина [OFLO]: коришћен је стандард офлоксацина (MW = 361,368 g/mol), чистоће 100% производ фирме Rhone Poulenc Rorer (Париз, Француска). Андрија Ћирић Докторска дисертација 112 2.1.3. Узорци таблета и инфузија Avelox таблете: Анализиран је узорак „Avelox” таблета номиналне масе 400 mg произвођача Bayer Pharma AG (Леверкузен, Немачка). Avelox инфузија: Анализиран је узорак „Avelox” инфузије номиналне концентрације 400 mg/250 mL произвођача BayerPharma AG (Леверкузен, Немачка). 2.1.4. Општи реагенси Folin-Ciocalteu реагенс фирме Merck (Дармстад, Немачка). Бутиловани хидрксилтолуен, BHT (С15Н24О24) (2,6-бис(1,1-диметилетил)-4- метилфенол) (MW = 220,35 g/mol) фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). -токоферол, (С29Н50О2) ((2R)-2,5,7,8-тетраматил-2-[(4R,8R)-(4,8,12- триметилтридецил)]-6-хроманол) MW = 430,71 g/mol) фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). DPPH (C18H12N5O6) (дефенил-(2,4,6-тринитрофенил)иминоазаниум) (MW = 394,32 g/mol) фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). Ацетонитрил (CH3CN) (MW = 41,05 g/mol) хроматографског степена чистоће без даљег пречишћавања произвођача J.T. Baker (Девентер, Холандија). Метанол (CH3OH) (MW = 32,04 g/mol) хроматографског степена чистоће без даљег пречишћавања произвођача J.T. Baker (Девентер, Холандија). Сирћетна киселина (CH3COOH) (MW = 60,05 g/mol), чистоће 99,5 %, д.д. „Зорка Фарма“, (Шабац, Србија). Литијум-хлорид (LiCl) p.a. чистоће произвођача Merck (Дармштад, Немачка). Натријум-додецил-сулфат (SDS) (C12H25OSO3)Na, (MW = 288,38 g/mol) p.a. чистоће произвођача Merck (Дармштад, Немачка). Хлороводонична киселина (HCl); Коришћена је хлороводонична киселина p.a. стандардне концентрације 12 mol/L “Suprapure”, Merck (Дармштад, Немачка). Натријум-хидроксид (NaOH): Стандардни, ампулирани 0,1 mol/L раствор натријум-хидроксида, p.a. чистоће је коришћен за припремање раствора радне концентрације 0,01 mol/L, Merck (Дармштад, Немачка). Андрија Ћирић Докторска дисертација 113 Лимунска киселина (C6H8О7×H2O) чистоће 99,5 % (MW = 210,14 g/mol), д.д. „Зорка Фарма“, (Шабац, Србија). Фосфорна киселина (H3PO4): За подешавање pH вредности мобилне фазе коришћена је концентрована фосфорна киселина p.a. концентрације 83% Merck (Дармштад, Немачка), Динатријум-хидрогенфосфат (Na2HPO4) p.a., (MW = 141,958 g/mol). произвођача Merck (Дармштад, Немачка). Натријум-тетраборат декахидрат (Na2B4О7×10H2O), (MW = 381,37 g/mol) p.a. чистоће “Зорка” (Шабац Србија). Триетиламин (N(CH2CH3)3), (MW = 101,19 g/mol) (99,5 %, v/v) од Fluka (Busce, Швајцерска). Серум: Узорци хуманог серума „pool“ добијени су из Института за трансфузију крви Србије (Београд). Узорци су чувани у фрижидеру на -10 0C до употребе. Вода за хроматографију: Вода за мобилну фазу добијена је дејонизацијом воде помоћу апарата „Easy-Pure“. Измерена је проводљивост од 18,3 MΩcm-1. 2.2. Раствори 2.2.1.Основни раствори стандарда биофлавоноида Кверцетин. Одмерена маса кверцетина (0,025789 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,0316 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора кверцетина. Рутин. Одмерена маса рутина (0,026250 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,05 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора рутина. Хесперетин. Одмерена маса хесперитина (0,026173 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,047 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора хесперетина. Андрија Ћирић Докторска дисертација 114 Хесперидин. Одмерена маса хесперидина (0,035731 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,1433 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора хесперидина. Каемпферол. Одмерена маса каемпферола (0,025447 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,0179 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора каемпферола. Катехин. Одмерена маса катехина (0,025447 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,0179 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора катехина. Епикатехин. Одмерена маса епикатехина (0,025447 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,0179 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора епикатехина. Апигенин. Одмерена маса апигенина (0,025447 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,0179 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора апигенина. Лутеолин. Одмерена маса лутеолина (0,025447 g) је разблажена метанолом у нормалном суду од 25 mL до црте. Концентрација тако добијеног раствора је износила 1,0179 mg/mL. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора лутеолина. Андрија Ћирић Докторска дисертација 115 2.2.2. Основни раствор стандарда флуорохинолона Моксифлоксацин-хидрохлорид Основни раствор стандарда моксифлоксацина концентрације 10,01 mg/mL припремљен је директним одмеравањем 0,5005 g и растварањем стандардне супстанце у нормалном суду од 50 mL са 0,1 v/v % фосфорне киселине. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора. Синтетичка нечистоћа 1 Основни раствор стандарда 6M8F концентрације 55,0 μg/mL припремљен је директним одмеравањем 0,0055 g и растварањем стандардне супстанце у нормалном суду од 100 mL са 0,1 v/v % фосфорне киселине. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора. Синтетичка нечистоћа 2 Основни раствор стандарда 6F8E концентрације 51,0 μg/mL припремљен је директним одмеравањем 0,0051 g и растварањем стандардне супстанце у нормалном суду од 100 mL са 0,1 v/v % фосфорне киселине. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора. Синтетичка нечистоћа 3 Основни раствор стандарда 6,8DM концентрације 51,0 μg/mL припремљен је директним одмеравањем 0,0051 g и растварањем стандардне супстанце у нормалном суду од 100 mL са 0,1 v/v % фосфорне киселине. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора. Синтетичка нечистоћа 4 Основни раствор стандарда 6,8DF концентрације 52,0 μg/mL припремљен је директним одмеравањем 0,0052 g и растварањем стандардне супстанце у нормалном суду од 100 mL са 0,1 v/v % фосфорне киселине. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора. Андрија Ћирић Докторска дисертација 116 Офлоксацин Основни раствор стандарда офлоксацина концентрације 53,0 μg/mL припремљен је директним одмеравањем 0,0053 g и растварањем стандардне супстанце у нормалном суду од 100 mL са 0,1 v/v % фосфорне киселине. Раствори других концентрација су добијени разблаживањем основног раствора. 2.2.3. Основни раствори општих реагенаса DPPH Раствор је припремљен одмеравањем 0,0059 g 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил радикала и његовим растварањем у нормалном суду од 10 mL у метанолу. Концентрација тог раствора је била 1,5 mmol/L. LiCl Раствор је припремљен одмеравањем 1,8772 g литијум-хлорида и његовим растварањем у нормалном суду од 50 mL у бидестилованој води. Концентрација тог раствора је била 0,8846 mol/L. Литијум-хлорид се додаје у испитиване растворе због константности јонске силе. SDS За добијање 0,1 mol/L раствора SDS потребно је на аналитичкој ваги одмерити 14,4190 g чисте супстанце и пренети у нормални суд од 500 mL и разблажити до црте. Динатријум-хидрогенфосфат За добијање раствора концентрације 0,2 mol/L потребно је одмерити 11,8968 g Na2HPO4 и разблажити бидестилованом водом до 500 mL у нормалном суду. Лимунске киселина Концентрација полазног раствора лимунске киселине износила је 0,1 mol/L. Добијен је растварањем 10,507 g кристалне супстанце у нормалном суду од 500 mL. Андрија Ћирић Докторска дисертација 117 Натријум-тетраборат декахидрат За припремање полазног раствора треба измерити 4,7671 g чисте супстанце и разблажити бидестилованом водом до 500 mL. Концентрација тако добијеног раствора је износила 0,025 mol/L. 2.2.4. Радни раствори Хлороводонична киселина Радни раствор HCl концентрације 0,1 mol/L добијен је одмеравањем 4,17 mL раствора „Suprapure“ киселина и његовим разблаживањем до 500 mL у нормалном суду до црте. Стандардизован је потенциометријском методом са 0,1 mol/L раствором NaOH. Раствори пуфера Цитратни пуфер припреман је одмеравањем одређене запремине 0,1 mol/L раствора лимунске киселине и 0,2 mol/L раствора динатријум-хидрогенфосфата. Боратни пуфер је припреман одмеравањем одређене запремине 0,025 mol/L Na2B4О7×10H2O и X mL 0,1 mol/L HCl. Радни раствори стандарда биофлавоноида за калибрациону криву Серија раствора за конструисање калибрационе криве припремљена је разблаживањем аликвота основног раствора биофлавоноида. Табела 23. Концетрације биофлавоноида (кверцетин, рутин, хесперетин, хесперидин и каемпферол) (у g/mL): Ниво калибрације 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Кверцетин 0,053 0,106 0,212 0,532 1,06 2,12 5,32 10,6 21,2 Рутин 0,052 0,105 0,263 0,525 1,05 2,63 5,25 10,5 21,0 Хесперетин 0,052 0,104 0,262 0,523 1,05 2,62 5,23 10,5 20,9 Хесперидин 0,057 0,114 0,286 0,572 1,14 2,86 5,72 11,4 22,9 Каемпферол 0,051 0,102 0,204 0,511 1,02 2,04 5,11 10,2 20,4 Калибрациона крива представља зависност површине пикa биофлавоноида у функцији од концентрације биофлавоноида. За сваку концентрацију раствори су инјектовани по три пута и узете су средње вредности површине пикова. Андрија Ћирић Докторска дисертација 118 Радни раствори стандарда биофлавоноида за калибрациону криву Серија раствора за конструисање калибрационе криве припремљена је разблаживањем аликвота основног раствора биофлавоноида. Табела 24. Концетрације биофлавоноида (кверцетин, каемпферол, апигенин, лутеолин, катехин и епикатехин) (у g/mL). Ниво калибрације 1 2 3 4 Кверцетин 0,512 1,024 2,048 5,12 Каемпферол 0,525 1,05 2,1 5,25 Апигенин 0,528 1,056 2,112 5,28 Лутеолин 0,582 1,164 2,328 5,82 Катехин 0,571 1,034 2,068 5,17 Епикатехин 0,546 1,092 2,184 5,46 Калибрациона крива представља зависност површине пикa биофлавоноида у функцији од концентрације биофлавоноида. За сваку концентрацију су иницирани по три пута и узете су средње вредности површине пикова. Радни раствори стандарда сродних начистоћа моксифлоксацина за калибрациону криву Серија раствора за конструисање калибрационе криве припремљена је разблаживањем аликвота основног раствора стандарда нечистоће коме је додата одговарајућа запремина основног раствора офлоксацина. Табела 25. Концентрације једињења сродних моксифлоксацину (у mg/mL). Ниво калибрације 1 2 3 4 5 6 7 6F8E 0,4856 0,6799 0,9714 1,1653 1,4570 1,6513 1,9427 6,8DF 0,5179 0,7251 1,0358 1,2430 1,5538 1,7609 2,0717 6M8F 0,5060 0,7084 1,0120 1,2144 1,5180 1,7204 2,0240 6,8DM 0,4922 0,6890 0,9843 1,1812 1,4765 1,6733 1,9686 Калибрациона крива представља зависност односа површине пикова сродних супстанци моксифлоксацину и офлоксацина у функцији од односа концентрација Андрија Ћирић Докторска дисертација 119 сродних супстанци и офлоксацина. За сваку концентрацију раствори су инјектовани три пута и узете су средње вредности површине пикова. Радни раствори стандарда DPPH за калибрациону криву Серија раствора за конструисање калибрационе криве припремљена је разблаживањем аликвота основног раствора стандарда DPPH. Концетрације нечистоће сродне моксифлоксацину (у mol/L) су следеће: Ниво калибрације 1 2 3 4 5 Концентрација DPPH (mol/L) 10 25 50 75 100 Калибрациона крива представља зависност односа површине пикова сродних супстанци моксифлоксацину и офлоксацина у функцији од односа концентрација сродних супстанци и офлоксацина. За сваку концентрацију раствори су инјектовани по три пута и узете су средње вредности површине пикова. 2.3. Припрема узоракa за анализу биофлавоноида Шест узорака хране је изабрано за анализу биофлавоноида и то: црвени лук, кора поморанџе, цветни мед, карфиол, броколи и прокељ као различити облици матрикса. Храна је купљена у продавници и одмах након куповине вршена је припрема узорка за екстракцију. Пре почетка припреме узорци црвеног лука и поморанџе су опрани под млазом воде како би се уклонила прљавштина. Прикупљено је око 1 kg узорка и кухињским ножем су уситњени на ситније комаде погодне за даље уситњавање у блендеру. У блендеру се величина узорка свела на малу величину (0,5 mm) који су даље хомогенизовани употребом Silent Crusher хомогенизатора (Heidolph, Schwabach, Немачка). Хомогенизација је вршена 5 минута док величина честица није била уједначена и мања од 5 m. Узорак меда је хомогенизован у присуству одговарајућег растварача (метанол, вода). Андрија Ћирић Докторска дисертација 120 2.3.1. Поступак екстракције биофлавоноида из различитих узорака хране Процес екстракције је рађен по узору на Vacek-а и сараднике [304]. Одмерена је одређена маса уситњених узорака хране и додата одговарајућа средства за екстракцију. За екстракцију флавоноида из испитиваних узорака коришћени су раствори метанола, ацетонитрила и воде. Узорак меда је енергично мешан док се није добро хомогенизовао. У случају меда није била могућа екстракција ацетонитрилом јер се стварала нерастворна вискозна маса. 2.3.2. Екстракција по Сокслету Уситњен узорак масе 5 g унет је у папирну капсулу и додато 50 mL метанола. Екстракција је вршена 120 min на температури од 60 oC [305]. После завршене екстракције екстракт је одвојен од заосталог узорка којем је додато нових 50 mL метанола и екстракција настављена још 60 min до завршетка екстракције. Екстракти су сједињени и упарени на вакуум упаривачу до запремине од 5 mL након чега је екстракт пропуштен кроз 0,45 m мембрански филтер, и разблежен метанолом до црте у нормалном суду запремине 10 mL. Све екстракције су поновљене три пута. Како би се установило да преостали узорак не садржи фенолна једињења урађен је квалитативни тест, тј. реакције са Fe(III) [306] и Folin-Ciocalteu-овим реагенсом [307]. Реакције су биле негативне, односно показале су да у заосталом екстракту нису присутна фенолна једињења. 2.3.3. Ултразвучна екстракција Уситњеном узорку масе 2,5 g, у чаши, додато је 50 mL растварача и чаша обложена парафилмом ради смањења губитка растварача. Чаша је смештена у ултразвучно купатило, фреквенције 35 kHz и снаге 150 W, 30 min на температури од 40 o C. Након 30 min екстракт је одвојен од заосталог узорка којем је додато нових 50 mL растварача и екстракција настављена још 15 min до завршетка екстракције. Екстракти су сједињени и упарени на вакуум упаривачу до запремина од 5 mL након чега је пропуштен кроз 0,45 m мембрански филтер, и разблежен метанолом до црте у Андрија Ћирић Докторска дисертација 121 нормалном суду запремине 10 mL. Све ектракције су поновљене три пута ради статистичке анализе. 2.3.4. Екстракција мацерацијом Уситњеном узорку масе 2,5 g, у авану, додато је 25 mL 70 % метанола. Даља процедура је била иста као код екстракције по Сокслету. 2.3.5. Екстракција водом Уситњеном узорку масе 2,5 g ,у чаши, додато је 100 mL воде. Даља процедура је била иста као код екстракције по Сокслету. 2.4. Припрема узорка таблете и инфузије Прецизно је измерена маса три таблете (како би се добила просечна маса једне таблете) након чега су фино спрашене и 273,2 mg хомогенизованог праха пренето у нормални суд запремине 25 mL. У нормални суд додато је око 20 mL растварача и раствор смештен у ултразвучно купатило на 15 min, након чега је нормални суд допуњен до црте растварачем. Тако добијен раствор је профилтриран кроз најлон филтер промера 0,22 mm. Одмерено је тачно 175 μL филтрата што је еквивалентно концентрацији моксифлоксацина од 200 μg/mL, у два нормална суда од 5 mL. Раствор у два нормална суда је разблажен до црте растварачем и један је коришћен за анализу нечистоћа, док је други употребљен за испитивање деградационих производа. Одмерена је запремина од 0,625 mL инфузије која је пренета у нормални суд од 5 mL и разблажена растварачем до ознаке. Овај раствор је коришћен за одређивање нечистоћа. Андрија Ћирић Докторска дисертација 122 2.5. Метода стандардног додатка Због комплексности испитиваних узорака у којима су одређивани биофлавоноиди и због њихове мале концентрације као метода избора намеће се метода стандардног додатка. У свим литературним техникама које се користе у аналитичкој хемији, метода стандардног додатка се користи за одређивање аналита у сложеним узорцима где није могуће уклонити ометајуће супстанце. Иако савремени инструменти који се користе имају велику осетљивост и одличну линеарност, апсолутна вредност сигнала може варирати из дана у дан и од анализе до анализе. Корисно је стога упоредити непознати узорак са познатим. Многе процедуре дају лажан утисак да је најбољи прилаз поређење непознатог узорка са стандардним или поређење једног непознатог са калибрационом кривом. Ова друга процедура је валидна само ако су сви узорци идентични. Уколико се стандардне супстанце и непознати узорак разликују по pH, јонској јачини, температури, вискозности или врсти нечистоћа или интерферирајућих супстанци, метода калибрационе криве не може се применити. У сваком случају одговарајућа метода стандардног додатка може дати најбоље резултате за непознати узорак смањујући наведене грешке али често има и предност, јер се може проценити и грешка приликом одређивања. Линеарни инструменти су они чији је сигнал, S, директно пропорционалан концентрацији, c, дат у облику S = k c, где је k константа пропорционалности. Многи инструменти, као што су спетрофотометри, поларографи, раде на овом принципу. Обично, корекција за бланк и основну линију су неопходни за дирекну пропорционалност. Припрема се серија раствора који имају константну запремину, Vx, раствора непознате концентрације, cx, и NVs јединица стандарда, cs, где N, представља целе јединице (N = 0, 1, 2, ...), константне запремине, Vs. Сваки раствор се даље разблажује до константне запремине, Vt. Линеарни одговор, Rn, добија се за сваки раствор при чему се добија: [ ] при чему је Андрија Ћирић Докторска дисертација 123 ⁄⁄ након чега се добија Као што је приказано на Слици 49, једначина 2, је права линија ако се Rn црта у функцији од N. Нагиб, m, је дат изразом, kfscs, а одсечак, b, дат изразом, kfxcx. Непозната концентрација, cx, може се добити из нагиба, m, и одсечка, b. Слика 49. Изглед криве за методу стандардног додатка Анализом праве линије методе најмањих квадрата, може се добити стандардна девијација нагиба, dm, и одсечка, db. Коришћењем једначина (3), грешка за, cx, dcx, може се апроксимирати једначином: *( ) ( ) + ⁄ где су db и dm грешке одговора инструмента, а не припреме раствора. На исти начин грешка за k, dk, може се изразити као: Андрија Ћирић Докторска дисертација 124 Метода стандардног додатка је изведена додавањем 125 L стандардних раствора у одређену запремину раствора екстракта у нормалом суду од 5 mL и разблажено до црте метанолом. Непозната концентрација је очитана као x – одсечак на графику. Несигурност одсечка је израчуната коришћењем формуле: | | √ ̅ ∑ ̅ где је sy стандардна девијација у очитавању y, a је нагиб, n број тачака, x је концентрација и y хроматографски одговор. Интервал поверења је израчунат као t × SDx, где је t Студентов t параметар за n – 2 степени слободе. 2.6. Апаратура и инструменти 2.6.1. Уситњавање, хомогенизација и течно-чврста екстракција За уситњавање и хомогенизацију узорака хране био је коришћен хомогенизатор Silent Crusher M Homogenizer (Heidolph, Немачка) приказан на Слици 50. Слика 50. Хомогенизатор Silent Crusher M Homogenizer За екстракцију по Сокслету коришћена је апаратура састављена од грејног тела, балона са округлим дном, Сокслетовим наставком, папирне капсуле, спиралног концензатора, приказана на Слици 51. Андрија Ћирић Докторска дисертација 125 Слика 51. Апаратура за екстракцију по Сокслету Ултразвучна екстракција је извођена у ултразвучном купатилу Sonorex DT 52 H, снаге 150 W и фреквенције 35 kHz произвођача Bandelin (Берлин, Немачка). Слика 52. Ултразвучно купатило Sonorex DT 52 H За течно-чврсту екстракцију аналита из екстрактата хране коришћен је SPE манифолд произвођача Agilent (Санта Клара, САД) приказан на Слици 53. Андрија Ћирић Докторска дисертација 126 Слика 53. SPE манифолд Agilent 2.6.2. Хроматографски системи Хроматографски систем (Слика 54) је модуларни HPLC систем Agilent 1100 који се састоји од дегазера, бинарне пумпе, аутосемплера, термостата колоне, UV/Vis детектора. Аквизиција и обрада података је вршена помоћу софтвера ChemStation (Agilent, Санта Клара, САД). Слика 54. HPLC Agilent 1100 Series Други хроматографски систем који је коришћен је Shimadzu (Кјото, Јапан) састављен од дегазера DGU-20As, кватернерне пумпе LC-20AT, мануелног инјектора 7125, термостара за колону, DAD детектора SPD-M20A и контролора CBM-20A (Слика Андрија Ћирић Докторска дисертација 127 55). Прикупљање и обрада података је вршена помоћу софтвера LC Solution (Shimadzu, Кјото, Јапан). Слика 55. HPLC систем Shimadzu 2.6.3. LC-MS/MS систем Хроматографски систем који је био спрегнут са масеним детектором се састојао од пдегазера, бинарне пумпе, аутосемплера, термостара за колону и UV/Vis детектора, произвођача Perkin-Elmer. Масени детектор који је коришћен, је Q-Trap, произвођача Applied Biosystems (Луцерн, Швајцерска) (Слика 56). Слика 56. LC-MS/MS систем Perkin-Elmer / Applied Biosystems (Луцерн, Швајцерска) 2.6.4. UV/Vis спектрофотометар Спектрофотометријска мерења су вршена помоћу UV/Vis спектрофотометра модел Lambda 35 (Слика 57), фирме Perkin-Elmer (Валтман. САД). Спектрофотометар има радни опсег таласних дужина од 200 – 1000 nm, а спектри су снимани при ширини Андрија Ћирић Докторска дисертација 128 разреза од 1 nm и брзини скенирања од 50 nm/min. За обраду података коришћен је програм UV WinLab (Perkin-Elmer, Валтман, САД). Слика 57. UV/Vis спектрофотометар Perkin Elmer Lambda 35 За мерење рН коришћен је систем састављен од pH-метра Beckman (Бреа, САД), стакленог балона (титрациони суд) са двоструким зидовима и комбиноване електроде. Калибрација pH-метра је вршена пуферима pH 4,00 и 7,00. Андрија Ћирић Докторска дисертација 129 3. Експериментални резултати Андрија Ћирић Докторска дисертација 130 Експериментални резултати у овој дисертацији сврстани су у две целине: У првој целини описује се одређивање биофлавоноида у храни (црвени лук, мед, кора поморанџе, карфиол, прокељ и броколи) и то:  Екстракција аналита a) Екстракција по Сокслету и ултразвучна екстракција биофлавоноида из узорака црног лука и коре поморанџе. b) Течно-чврста екстракција биофлавоноида из екстраката истих узорака. c) Екстракција по Сокслету, ултразвучна, мацерација и екстракција кључалом водом биофлавоноида из узорака различитих врста фамилије Brassica.  Оптимизација методе a) Оптимизација LC-MS/MS методе за одређивање биофлавоноида у црном луки, кори поморанџе и меду. b) Оптимизација HPLC-DAD методе за одређивање биофлавоноида у екстрактима фамилије Brassica.  Испитивање утицаја матричног ефекта на одређивање биофлавоноида у екстрактима црвеног лука, меда и коре поморанџе  Одређивање биофлавоноида у црвеном луку, меду, кори поморанџе, карфиолу, прокељу и броколију. a) Одређивање биофлавоноида у узорцима меда, црвеног лука и коре поморанџе. b) Одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica.  Одређивање антиоксидативне активности екстраката фамилије Brassica. У другој целини приказује се одређивање моксифлоксацина и сродних једињења у фармацеутским формулацијама и хуманом крвном серуму и то.  Оптимизација методе a) Оптимизација HPLC методе за одређивање моксифлоксацина и сродних супстанци у таблетама и инфузији. b) Оптимизација спектофотометријских услова за одређивање моксифлоксацина у хуманом крвном серуму.  Одређивање сродних једињења моксифлоксацинa у таблетама и инфузији.  Одређивање деградационих производа моксифлоксацина у таблетама и инфузији.  Спектрофотометријско одређивање моксифлоксацина у хуманом крвном серуму. Андрија Ћирић Докторска дисертација 131 3.1. Екстракција биофлавоноида из узорака хране биљног порекла Избор начина екстракције жељених флавоноида из биолошког материјала је веома важан и зависи од циља истраживања. До сада примењивани начини екстракције за изоловање и одређивање активних полифенолних киселина у биљном ткиву и храни су описани у прегледним радовима [335, 336]. Најчешће примењивани начини екстракције у аналитици биљног материјала су: - Екстракција по Сокслету, - Ултразвучна екстракција, - Суперкритична флуид екстракција (Supercritical fluid extraction, SFE), - Микроталасна екстракција (Microwave-assisted extraction, MAE), - Течна екстракција при повишеном притиску (Pressurized liquid extraction, PLE), Екстракција по Сокслету је потпуна јер се одвија при континуалној циркулацији растварача којим се екстрахују испитивани аналити. Међутим, заједно са жељеним аналитима се екстрахују и друге, нежељене супстанце, које могу сметати приликом одређивања аналита. Још једна мана екстракције по Сокслету је висока температура која се мора одржавати, а која није погодна за екстракцију аналита који су термолабилни. Други недостатак је и дуго одвијање екстракције које може трајати и сатима. У циљу отклањања ових недостатака развијају се други начини екстракције којима ће се екстраховати испитивани аналити, при нижим температурама и у краћем временском периоду. Како би се установила ефикасност екстракције аналита било којим начином екстракције врши се упоређивање концентрација аналита добијених неком методом са Сокслетовом методом и ефикасност се рачуна по формули: Биљна ткива имају веома танак омотач који се може разорити деловањем ултразвука који представља још један начин за изоловање аналита. Ултразвук такође изазива бубрење и хидратацију биљног материјала што доводи до ширења пора пуцања ћелијског зида. Суперкритична течна екстракција, SFE, се користи за екстракцију испарљивих једињења, као што су есенцијална уља и ароматична једињења из биљног материјала. Андрија Ћирић Докторска дисертација 132 Предност SFE је кратко време извођења екстракције за мање од 30 минута, приликом чега се смањује употреба отровних растварача и коришћење гаса или течности за елуирање. Главна предност SFE је да се овим начином екстракције избегава деградација једињења која се јавља као резултат излагања узорка повишеној температури и атмосферском кисеонику. Микроталасна екстракција користи енергију микроталаса за загревање раствора при чему долази до знатног скраћења времена екстракције. МАЕ такође омогућава знатно смањење употребе органских растварача (мање од 40 mL) у поређењу са Сокслетовом екстракцијом. Екстракција при повишеном притиску је брза и ефикасна метода за екстракцију аналита из чврстих узорака као што је биљни материјал. Температура екстракције је важан експериментални фактор чијим повећањем долази до значајног повећања капацитета растварача, односа транспорта масе између течне и чврсте фазе, ефикасности квашења узорка и продирања у матрикс, при чему долази до побољшања екстракције и десорпције аналита са површине и активних места на чврстом узорку. Међутим, да би се постигле ове карактеристике потребно је повећавати притисак како би растварач и даље био у течном стању на повишеној температури. У циљу испитивања ефикасности екстракције биофлавоноида из узорака коре поморанџе и црвеног лука применом ултразвучне екстракције вршено је упоређивање концентрација испитиваних биофлавоноида добијених ултразвучном и Сокслетовом екстракцијом. Одређивање концентрација испитиваних аналита вршено је применом методе стандардног додатка на добијене екстракте. Добијени раствори су хроматографисани развијеном LC-MS/MS методом (колона Phenomenex 150×4,6 mm, 3 m, мобилна фаза А: 2 % сирћетна киселина и В: ацетонитрил у градијентном начину елуирања, при пртоку мобилне фазе 0,7 mL/min и собној температури). Ефикасност ултразвучне екстракције биофлавоноида из узорака коре поморанџе и црвеног лука представљен је на Слици 58. За ефикасност екстракције по Сокслету узето је да је 100 %. Андрија Ћирић Докторска дисертација 133 Слика 58. Ефикасност екстракције биофлавоноида добијена ултразвучном екстракцијом из коре поморанџе и црвеног лука у поређењу са екстракцијом по Сокслету (ефикасност екстракције = 100 %) Анализа резултата приказаних на Слици 58 применом једнофакторског ANOVA теста, показује да не постоји значајна разлика у ефикасности екстракције између Сокслетове и ултразвучне екстракције за оба узорка јер је Fcrit = 5,14 мање од Ftab = 23,84. Због једноставности и брзине извођења ултразвучна екстракција је изабрана за даљи рад. 3.1.1. Течно-чврста екстракција биофлавоноида из екстраката коре поморанџе, црвеног лука и меда Екстракција на чврстој фази је оптимизована у циљу избора одговарајућег кертриџа, запремине испитиваног аналита и врсте растварача за елуирање. За развој најефикасније SPE методе коришћено је пет разиличитих кертриџа (LC-18, ENVI-18, DSC-18, LC-C8 и DSC-SAX) од истог произвођача (Supelco, САД). Карактеристике наведених кертриџа дате су у Табели 26. 82 84 86 88 90 92 94 96 Хесперетин Хесперидин Кверцетин Рутин Каемпферол Еф и ка сн о ст е кс тр ак ц и је ( % ) Кора поморанче Црвени лук Андрија Ћирић Докторска дисертација 134 Табела 26. Карактеристике испитиваних Supelco кертриџа. DSC-18  Полимерно везани октадецил остаци.  Више од 18 % угљеника за повећање капацитета везивања.  Мање осетљива фаза: задржава већину органских аналита из водене средине.  Погодна за екстракцију великог броја аналита различите структуре из истог узорка. DSC-SAX  Полимерно везан кветернерни амин који остаје наелектрисан на свим рН вредностима  Обично се користи за екстракцију слабих катјона (нпр. карбоксилне киселине) које се не везују довољно јако за слабији анјонски измењивач  Селективност се може модификовати мењањем контра јона са одговарајућим пуфером током кондиционирања ENVI-18  Полимерно везани октадецил остаци  Одлична за пречишћавање, екстракцију и концентровање аналита за водених раствора узорка  Више од 17 % угљеника, чиме се повећава капацитет везивања и добије веће искоришћење LC-18  Мономерно везани октадецил остаци  Више од 10 % угљеника  За реверзно-фазну екстракцију неполарних до умерено поларних једињења LC-C8  Мономерно везани октил остаци  Више од 7 % угљеника Према препоруци произвођача кертриџи су предкондиционирани са 5 mL метанола након чега је додато 5 mL дејонизоване воде. Припремљен је раствор смеше стандардних супстанци у води, у нормалном суду од 10 mL, након чега је овако добијен раствор пропуштени кроз кертриџ при протоку од 1 mL/min. После наношења аналита, SPE кертриџ је испран са 5 mL воде и остављен да се суши уз примену вакуума. На овај начин уклоњена је заостала вода са кертриџа. Аналити су елуирани са 5 mL растварача (метанол, ацетонитрил). Екстракти добијени на овај начин су хроматографисани и ефикасност SPE методе је рачуната по формули: Добијене вредности ефикасности SPE екстракције (± стандардна девијација, SD) за екстракцију флавоноида применом различитих врста кертриџа приказане су у Табели 27. Андрија Ћирић Докторска дисертација 135 Табела 27. Вредности ефикасности SPE екстракције ± SD (%) флавоноида добијених применом различитих врста SPE кертриџа и растварача коришћених за елуирање. Биофлавоноиди Ефикасност SPE екстракције (%) ± SD LC-С18 ENVI-18 DSC-18 LC-С8 DSC-SAX МеОН ACN МеОН ACN МеОН ACN МеОН ACN МеОН AСN Кверцетин 97 ± 2 56 ± 2 77 ± 2 59 ± 3 54 ± 1 42 ± 2 70 ± 2 56 ± 2 74 ± 1 67 ± 2 Рутин 95 ± 1 43 ± 1 66 ± 2 53 ± 2 48 ± 2 40 ± 1 72 ± 2 49 ± 3 68 ± 2 63 ± 2 Хесперетин 96 ± 2 50 ± 2 86 ± 2 52 ± 3 54 ± 2 46 ± 2 64 ± 2 64 ± 3 65 ± 1 64 ± 3 Хесперидин 96 ± 1 48 ± 3 95 ± 1 51 ± 1 42 ± 1 47 ± 3 61 ± 2 60 ± 4 58 ± 2 59 ± 4 Каемпферол 93 ± 4 57 ± 3 95 ± 1 53 ± 2 48 ± 2 42 ± 1 67 ± 2 61 ± 2 61 ± 2 58 ± 2 На основу изложеног оптимални услови SPE екстракције за све испитиване биофлавоноиде сумирани су у Табели 28. Табела 28. Оптимални услови SPE екстракције биофлавоноида. Врста кертриџа Supelco LC-18 Kондиционирање 5 mL метанола 5 mL воде Запремина узорка 10 mL Проток 1 mL/min Испирање 5 mL воде Сушење 10 min под вакуумом Елуент 5 mL метанол Најбоља вредност ефикасности SPE екстракције за све испитиване аналитe добијена је применом Supelco LC-18 кетриџа и метанола као елуента, па је у даљем раду коришћен овај кертриџ и растварач. 3.1.2. Оптимизација LC-MS/MS методе за одређивање биофлавоноида Да би се повећала осетљивост квантитативне LC-ESI-MS/MS анализе изабран је негативни мод јонизације јер су флавоноиди, због депротоновања, негативно наелектрисани. Оптимални ЕSI услови су установљени тако што су појединачно инјектовани стандардни раствори рутина, кверцетина, хесперидина, хесперетина и каемпферола. Изабрани су потенцијали фокусирања који су дали максимум резолуције и интензитета сигнала, чист спектар, као и минималну позадинску емисију. Мерења су вршена при темпаратури од 500 oC и напону спреја од - 4500 V. Задатак се заснивао на Андрија Ћирић Докторска дисертација 136 праћењу [M–H]- јона аналита у првом квадруполу и њиховог одговарајућег продукт јона у трећем квадруполу са временом задржавања од 50 ms. Подаци су прикупљени и обрађени коришћењем софтвера Analyst. Приказ радног прозора дат је на Слици 59. Слика 59. Изглед радног прозора програма Analyst Радни параметри и други инструментални параметри су мануелно подешавани како би се добиле што боље перформансе инструмента за анализу. Мануелно подешавање инструмента се састоји у оптимизацији резолуције, сензитивности и калибрацији скале масе. Калибрација скале масе је урађена коришћењем калибрационог стандарда кафеина концентрације 100 µg/mL. Након калибрације скале масе појединачни раствори аналита у метанолу концентрације 100 g/mL директно су инјектовани помоћу шприца, при протоку од 10 L/min. Оптимални експериментални параметри ESI интерфејса за максималну јонизацију испитиваних биофлавоноида дати су у Табели 29. Андрија Ћирић Докторска дисертација 137 Табела 29. Оптимални инструментални услови за анализу у ESI-MS/MS. Хесперетин Хесперидин Рутин Кверцетин Каемпферол Гас за распршивање, GS1 (mL/min) 20 Помоћни гас, GS2 (mL/min) 60 Температура, TEM (оС) 500 Застор гаса, CUR 10 Напон јонског спреја (V) -4500 Напон разлагања , DP (V) -40 -57 -86 -21 -22 Напон на улазу, ЕP (V) -5 -5 -8 -8 -3 Енергија судара, CE (еV) -25 -34 -56 -31 -45 Напон на излазу из колизионе ћелије, CXP (V) -6 -9 -4 -12 -6 У свим аналитима јон прекурсор био је [M–H]- где је M молекулска маса одређеног аналита, из кога као резултат губитка протона настаје негативно наелектрисани молекулски јон. Вредности молекулског јона m/z и његова релативна заступљеност за кверцетин је m/z 301 (100 %), рутин m/z = 609 (100 %), хесперетин m/z 301 (100 %), хесперидин m/z 609 (100 %), и за каемпферол m/z 285 (100 %). Како су вредности m/z исте за рутин и хесперидин и за кверцетин и хесперетин рађена је даља фрагментација (MS/MS мод) за њихову идентификацију и квантификацију. Прекурсор и главни јони и њихова релативна заступљеност у процентима је праћена у изабраном реакционом моду (selected reaction mode, SRM). Фрагментација молекулског јона кверцетина (m/z 301) дала је следеће јоне 179 (63 %), 151 (95 %), 107 (31 %), 97 (36 %), рутина m/z 609: 301 (12 %), 273 (44 %), 257 (24 %), 179 (31 %), хесперетина (m/z 301): 286 (37 %), 244 (25 %), 179 (34 %), 151 (63 %), хесперидина (m/z 609): 343 (45 %), 325 (30 %), 174 (37 %), 151 (24 %) и каемпферола (m/z 285): 256 (43 %), 243 (29 %), 228 (86 %), 125 (61 %). Ови MS/MS фрагменти су изабрани јер су најинтензивнији у MS спектру молекулског јона. Масени спектри испитиваних једињења дати су на Сликама 60, 61, 62, 63 и 64. Андрија Ћирић Докторска дисертација 138 Слика 60. Масени спектар кверцетина Слика 61. Масени спектар рутина Слика 62. Масени спектар хесперетина Слика 63. Масени спектар хесперидина Слика 64. Масени спектар каемпферола Избор јона у MS/MS спектру који су коришћени за идентификацију и квантификацију биофлавоноида дати су у Табели 30. Табела 30. Јони у MS/MS спектру биофлавоноида Биофлавоноид m/z Кверцетин 301/179 301/151 301/107 301/97 Рутин 609/301 609/273 609/257 609/179 Хесперетин 301/286 301/244 301/179 301/151 Хесперидин 601/343 609/325 609/174 609/151 Каемпферол 285/256 285/243 285/228 285/125 0 20 40 60 80 100 50 100 150 200 250 300 350 % m/z 0 20 40 60 80 100 100 200 300 400 500 600 % m/z 0 20 40 60 80 100 50 150 250 350 % m/z 0 20 40 60 80 100 100 200 300 400 500 600 % m/z 0 20 40 60 80 100 50 100 150 200 250 300 % m/z Андрија Ћирић Докторска дисертација 139 На основу могуће фрагментације јона аналита одређене су врсте фрагмената који могу настати. На Слици 65 приказан је литературни пут фрагментације биофлавоноида [308, 309]. OH O OH OH O OH OH OH O OH OH OH OH m/z 273 m/z 257 m/z 301 m/z 609 OH OH OH OH OH - CO -CO 2 O OH OCH3 O O OH O m/z 609 m/z 343 m/z 325 O OH OCH3 O OH OH OH OH O O m/z 151 m/z 301 RDA OH OH O O m/z 244 m/z 286 m/z 179 [M-H rutinoze] - [M-H glycoside] - O OH OCH3 O O OH CH -H 2 O O OH O OH OH O OH OH O O m/z 179 OOH OH O OH OH O OH O OH OH O CO . OH OH OH O O OH OH OH OH OH OH OH OH O O m/z 151 OH OH m/z 107 m/z 285 m/z 256 m/z 243 m/z 125 -CH 3 . -CO -H -H -H-H-H -H -H O- O-O- O- O- O- O- -H O- -H O- -H O- -H O- - CO . -H O- -H O--H O- -H O- -H O- -H O- - CO CH OOH OH OH -H O- m/z 228 a) b) c) Слика 65. Фрагментације рутина, кверцетина, каемпферола, хесперидина и хеспетерина [308, 309] Кверцетин Рутин Каемпферол Хесперидин Хесперетин ретроциклизација Андрија Ћирић Докторска дисертација 140 Након оптимизације услова за масену идентификацију и квантификацију испитиваних аналита приступило се изналажењу оптималних хроматографских услова за њихово одвајање. На основу литературних података уочено је да се користи градијентно елуирање. Mобилнa фазa се састоји од смеше метанола и воде или ацетонитрила и воде. Као органски адитив користи се мравља или сирћетна киселина. На почетку оптимизације хроматографских услова испитивана је мобилна фаза састављена од метанола и воде у којој је концентрација мравље киселина била 5 % v/v при линеарној промени градијента у току 60 минута од 5 – 90 % метанола. При овим условима испитивани аналити су елуирани сувише брзо и долазило је до преклапања пикова кверцетина и каемпферола. У следећем кораку метанол је замењен ацетонитрилом и снимљени су појединачни хроматограми стандардних супстанци при истој концентрацији мравље киселине и истом градијенту. Применом ових услова дошло је до споријег елуирања аналита са колоне, али се јављало развлачење пикова свих аналита. Да би се поправио изглед пикова мравља киселина је замењена сирћетном киселином и снимљени су појединачни спектри стандардних супстанци. Изглед пика је био значајно бољи, па је даље настављено са мобилном фазом састављеном од ацетонитрила и воде којој је додата сирћетна киселина у концентрацији од 5 % v/v. У следећем кораку је мењана концентрација сирћетне киселине од 1 – 5 % како би се смањила њена потрошња. Концентрација сирћетне киселине при којој је и даље био добар изглед пика износила је 2 % v/v. У циљу скраћења времена извођења анализе мењан је почетни однос мобилних фаза стим да се водило рачуна да се аналити не елуирају сувише брзо како би се избегло њихово заједничко елуирање са фенолним киселинама. Почетни однос мобилних фаза који је испунио задате услове износио је 15 % ацетонитрила и 85 % воде у којој је концентрација сирћетне износила 2 % v/v. На основу претходних разматрања као оптимални услови за хроматографско раздвајање коришћена је мобилна фаза састављена од A: 2% сирћентне киселине у води и B: ацетонитрила. Растварачи су мешани у линеарном градијенту: 0 min – 85 % A и 15 % B, 5 min – 85 % A и 15 % B, 25 min – 10 % A и 90 % B, 30 min – 10 % A и 90 % B, 35 min – 85 % A и 15 % B, 40 min – 85 % A и 15 % B при протоку мобилне фазе од 0,7 mL/min на собној температури, а инјектована запремина износила је 20 µL. Андрија Ћирић Докторска дисертација 141 При наведеним хроматографским условима снимљен је хроматограм смеше биофлавонида концентрације 0,1 g/mL као и њихов ТIC (total ion chromatogram) који су приказани на Сликама 66 и 67. Слика 66. HPLC-DAD хроматограм смеше стандарда биофлавоноида снимљен под оптималним условима Слика 67. TIC (total ion chromatogram) смеше стандарда биофлавонида Са Слика 66 и 67 може се видети да су испитивани флавоноиди добро раздвојени са резлуцијама Rs1,2 = 1,3 за рутин и хесперидин, Rs2,3 = 3,2 за хесперидин и кверцетин, Rs3,4 = 2,1 за кверцетин и каемпферол и Rs4,5 = 1,3 за каемпферол и хесперетин. Пикови су раздвојени на основној линији тако да су услови за добру хроматографију испуњени. Асигнација пикова у хроматограмима екстракта хране (кора поморанџе, црвени лук и Андрија Ћирић Докторска дисертација 142 мед) је урађена на основу ретенционих времена и масених спектара одговарајућих максимума пикова упоређивањем са стандардним једињењима. Да би се испитала поузданост HPLC-MS/MS методе за анализу на садржај биофлавоноида проверене су перформансе ове методе анализирањем стандардних раствора аналита припремљених у метанолу. Калибрационе криве за сваки аналит су конструисане наношењем зависности површине пика аналита од одговарајуће концентрације. Калибрационе криве су линеарне у области концентрација од 0,05 до 10,00 g/mL и одговарајући регресиони параметри дати су у Табели 31. Табела 31. Регресиони параметри за калибрационе криве (Y=a+bX; Y = интензитет сигнала, X = концентрација аналита, g/mL) за калибрационе криве за најинтензивније SRM прелазе. Једињење Хесперетин Хесперидин Кверцетин Рутин Каемпферол SRM прелаз 301/286 301/244 609/325 609/174 301/179 301/151 609/301 609/273 285/256 285/243 Број тачака (N) 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 Нагиб (a) (×105) 3,1±0,8 1,8±0,1 4,8±0,1 9,6±0,1 3,0±0,1 1,8±0,1 4,6±0,1 1,4±0,1 7,6±0,1 3,6±0,1 Опсег (g/mL) 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 0,05-10 Одсечак (b) (×104) 4,4±0,3 2,6±0,2 1,3±0,3 1,9±0,1 1,6±0,1 3,1±0,3 0,7±0,1 0,7±0,1 3,7±0,1 2,3±0,1 Стандардна грешка (×104) 7,9 4,8 0,4 8,6 2,6 4,8 6,7 1,9 5,6 3,7 Коефицијент детерминације (r2) 0,9948 0,9945 0,9995 0,9994 0,9987 0,9937 0,9984 0,9986 0,9941 0,9976 LOD (g/mL) 0,055 0,046 0,045 0,049 0,043 0,041 0,076 0,062 0,039 0,041 LOQ (g/mL) 0,167 0,139 0,136 0,148 0,130 0,124 0,229 0,189 0,118 0,121 На основу вредности података приказаних у Tабели 31 може се закључити да је развијена прецизна, тачна, осетљива и специфична LC-MS/MS метода за одређивање испитиваних биофлавоноида у узорцима хране (кора поморанџе, црвени лук и мед). 3.1.3. Испитивање утицаја матричног ефекта на одређивање биофлавоноида у екстрактима хране Електроспреј јонизација (ESI) и хемијска јонизација при атмосферском притиску (APCI) су најчешће примењиване технике јонизације. Упркос чињеници да се Андрија Ћирић Докторска дисертација 143 јонизација код њих заснива на различитим механизмима формирања јона, оба начина се сматрају „soft“ методама јонизације, који пре свега воде ка стварању депротонованог или протонованог молекула без фрагментације. Међутим, приликом анализе комплексних узорака долази до појачања или смањења интензитета MS сигнала који се назива матрични ефекат. Овај нежељени феномен је непоновљив и нерепродуктибилан између различитих анализа истог узорка, стога може утицати на квантитативно одређивање аналита. Предложени су различити механизми који објашњавају матрични ефекат код ESI јонизације, али је прихваћено да је он резултат компетиције приликом јонизације између различитих врста које се заједно елуирају са колоне. Стога је потребно проценити матрични ефекат приликом развоја LC-ESI-MS/MS методе. Квантификован је матрични ефекат приликом истовременог одређивања кверцетина, рутина, хесперидина, хесперетина и каемпфеола у узорцима екстракта хране (кора поморанџе, црвени лук и мед) користећи LC-ESI-MS/MS методу. Матрични ефекат у току развоја аналитичке методе може се проценити поређењем MS/MS одговора (површина пика и одговарајућа висина) аналита додатог у екстракт узорка са MS/MS одговором истог аналита присутног у мобилној фази, на неколико нивоа концентрација. Релативни ефекат матрикса, ME (%), се дефинише као однос између разлике површина MS/MS одговора стандардног раствора додатог у изоловани матрикса и одговора истог стандардног раствора раствореног у мобилној фази или растварачу и површине одговора стандардног раствора у мобилној фази или растварачу и дат је изразом: Да би се испитао утицај матричног ефекта на одређивање биофлавоноида методом пост-екстракције, у изоловани матрикс додате су одговарајуће запремине познатих концентрација (од 0,5 до 5,0 g/mL) стандардних раствора аналита (четири нивоа концентрација). Водени екстракти узорака хране су припремљени, након чега су екстракти пропуштени кроз SPE кертриџе на којима су се апсорбовали биофлавоноиди. Ефикасно пречишћавање аналита из екстракта узорака је постигнуто коришћењем Supelco LC-18 кертриџа при чему су добијени екстракти ослобођени одређених супстанци и ендогених интерферирајућих супстанци. У преостали изоловани матрикс су након тога додате одређене запремине раствора познате концентрације биофлавоноида и израчунат ефекат матрикса користећи једначину 71. Добијени резултати приказани су у Табели 32. Андрија Ћирић Докторска дисертација 144 Табела 32. Процењени матрични ефекат приликом одређивања биофлавоноида екстрахованих водом из узорака хране коришћењем методе пост-екстракције. Conc. (g/mL) 0,5 1,0 2,5 5,0 SRM прелаз (ME ± SD) (%) (ME ± SD) (%) (ME ± SD) (%) (ME ± SD) (%) К о р а п о м о р ан џ е Х ес п ер ет и н 301/286 -33 ± 8 -30 ± 2 -28 ± 1 -24,45 ± 0,03 301/244 -41 ± 2 -40 ± 2 -38 ± 1 -30,8 ± 0,7 301/179 -41 ± 6 -39 ± 2 -39 ± 2 -30,2 ± 0,9 301/151 -36 ± 3 -35 ± 3 -34 ± 1 -29 ± 2 Х ес п ер и д и н 609/343 -40,3 ± 0,2 -36,84 ± 0,06 -30,1 ± 0,5 -21,9 ± 0,4 609/325 -43,4 ± 0,2 -36,00 ± 0,09 -32,8 ± 0,1 -23,9 ± 0,1 609/174 -43 ± 1 -38,3 ± 0,7 -34 ± 1 -23,5 ± 0,5 609/151 -39,4 ± 0,2 -35,4 ± 0,2 -29,9 ± 0,6 -23 ± 2 К ве р ц ет и н 301/179 -27 ± 2 -22 ± 5 -18 ± 3 -16 ± 2 301/151 -26 ± 2 -23 ± 4 -17 ± 2 -14 ± 1 301/107 -29 ± 3 -24 ± 3 -17 ± 2 -15 ± 2 301/97 -29 ± 3 -25 ± 4 -18 ± 3 -15 ± 2 М ед Х ес п ер ет и н 301/286 -10 ± 1 -8 ± 1 -6 ± 2 -5 ± 2 301/244 -13 ± 2 -11 ± 3 -9 ± 1 -6 ± 4 301/179 -12 ± 3 -7 ± 2 -6 ± 2 -6 ± 1 301/151 -4 ± 3 -3 ± 2 -3 ± 2 -0,6 ± 0,3 Х ес п ер и д и н 609/343 -15 ± 5 -8 ± 3 -6 ± 2 -3 ± 1 609/325 -23 ± 2 -16 ± 2 -8 ± 3 -8 ± 2 609/174 -15 ± 2 -10 ± 5 -5 ± 2 -4 ± 2 609/151 -25 ± 2 -20 ± 2 -9 ± 4 -5 ± 3 К ве р ц ет и н 301/179 -16 ± 4 -10 ± 2 -6 ± 3 -4 ± 1 301/151 -16 ± 3 -11 ± 2 -7 ± 2 -4 ± 2 301/107 -16 ± 2 -11 ± 2 -7 ± 3 -3 ± 1 301/97 -16 ± 3 -10 ± 2 -7 ± 3 -4 ± 2 К ае м п ф ер о л 285/256 -11 ± 2 -8 ± 3 -6 ± 1 -3 ± 2 285/243 -11 ± 2 -8 ± 3 -6 ± 1 -2 ± 2 285/228 -13 ± 2 -8 ± 3 -6 ± 2 -3 ± 3 285/125 -11 ± 2 -8 ± 4 -5 ± 1 -3 ± 3 Ц р ве н и л у к Х ес п ер ет и н 301/286 -9,3 ± 0,4 -7,4 ± 0,7 -5 ± 2 -1 ± 5 301/242 -11 ± 1 -10 ± 1 -8 ± 1 -3,0 ± 0,4 301/174 -13 ± 4 -12,2 ± 0,6 -10 ± 1 -6 ± 6 301/150 -6 ± 2 -3 ± 2 -2 ± 2 -1,0 ± 0,8 Х ес п ер и д и н 609/343 -14 ± 2 -8 ± 4 -5,66 ± 0,05 -5 ± 3 609/325 -23 ± 7 -16,10 ± 0,03 -8,1 ± 0,9 -7,8 ± 0,2 609/174 -48 ± 7 -10 ± 2 -9 ± 2 -5 ± 1 609/151 -21 ± 5 -16 ± 7 -7 ± 3 -5 ± 1 К ве р ц ет и н 301/179 -22 ± 2 -17 ± 2 -11 ± 3 -5 ± 4 301/151 -23 ± 5 -16 ± 5 -12 ± 4 -5 ± 3 301/107 -22 ± 6 -15 ± 4 -12 ± 4 -5 ± 4 301/97 -23 ± 4 -14 ± 4 -11 ± 2 -5 ± 2 Р у ти н 609/300 -17,2 ± 0,6 -15 ± 4 -10 ± 3 -6,4 ± 0,3 609/271 -15 ± 2 -12,6 ± 0,5 -6,8 ± 0,2 -5 ± 1 609/255 -48 ± 1 -20 ± 7 -14 ± 1 -9 ± 5 609/179 -14 ± 4 -12 ± 4 -9 ± 1 -3 ± 2 К ае м п ф ер о л 285/256 -20 ± 4 -16 ± 3 -12 ± 2 -4 ± 2 285/243 -19 ± 5 -15 ± 7 -11 ± 4 -5 ± 2 285/228 -19 ± 5 -14 ± 3 -10 ± 4 -5 ± 1 285/125 -18 ± 3 -15 ± 4 -10 ± 3 -5 ± 2 Андрија Ћирић Докторска дисертација 145 Као што се може приметити из Tабеле 32 у свим анализираним узорцима јавља се негативан матрични ефекат. Негативни матрични ефекат представља губитак аналитичког сигнала (јонска супресија) и за то је одговорна промена ефикасности јонизације. Матрични ефекат се смањује са повећањем концентрације аналита, а повећава са повећањем концентрације хесперидина. Ефекат матрикса је уопштено много мањи код узорка меда него код осталих узорака хране. Такође, на најинтензивније пикове у MS/MS спектру биофлавоноида утицај матрикса је најмањи. Покушана је оптимизација настајања продуктних јона повећањем енергије колизије у трећем квадруполу (Q3), међутим, добијен је велики број фрагмената без побољшања осетљивости анализе. Да би се испитао утицај растварача на количину супстанци које се елуирају заједно са испитиваним једињењима из реалних узорака као и на интензитет MS сигнала, стандардни раствор флавоноида концентрације 0,5 mg/mL додат је у екстракт узорка добијеног применом различитих растварача (метанол, ацетонитрил и вода). Ефекат матрикса је израчунат коришћењем једначине 72. Резултати испитивања дати су у Табели 33. Табела 33. Ефекат матрикса (%) на одређивање биофлаоноида у узорцима хране методом стандардног додатка у различитим екстрактима. Узорак Једињење SRM прелаз MeOH H2O ACN Средња вредност ME (%) ± SD (%) Средња вредност ME (%) ± SD (%) Средња вредност ME (%) ± SD (%) К о р а п о м о р ан џ е Хесперетин 301/286 -110 ± 1 -102 ± 1 -112 ± 1 301/244 -110 ± 1 -103 ± 1 -110 ± 1 301/179 -108 ± 1 -103± 1 -110 ± 1 301/151 -127 ± 1 -102± 1 -111 ± 1 Хесперидин 609/343 -151 ± 2 -109 ± 7 609/325 -103 ± 3 -108 ± 1 609/174 -101 ± 3 609/151 -98 ± 4 -96 ± 2 Кверцетин 301/179 -87 ± 2 -77 ± 3 -95 ± 3 301/151 -85 ± 3 -74 ± 4 -93 ± 3 301/107 -85 ± 3 -76 ± 5 301/97 -85 ± 2 -76 ± 4 Андрија Ћирић Докторска дисертација 146 М ед Хесперетин 301/286 -89 ± 2 -5 ± 6 301/244 -80 ± 2 -5 ± 7 301/179 -85 ± 1 -6 ± 5 301/151 -84 ± 2 -4 ± 5 Хесперидин 609/343 -15 ± 4 -46 ± 8 609/325 -19 ± 4 -42 ± 5 609/174 -15 ± 3 -48 ± 4 609/151 -12 ± 3 -44 ± 2 Кверцетин 301/179 -76 ± 5 -8 ± 4 301/151 -74 ± 4 -8 ± 4 301/107 -76 ± 5 -8 ± 4 301/97 -75 ± 5 -7 ± 4 Каемпферол 285/256 -63 ± 3 -13 ± 6 285/243 -63 ± 2 -14 ± 7 285/228 -63 ± 4 -12 ± 7 285/125 -62 ± 4 -12 ± 8 Ц р ве н и л у к Хесперетин 301/286 -72 ± 2 -94 ± 1 -87 ± 1 301/244 -74 ± 1 -96 ± 1 -85 ± 1 301/179 -75 ± 1 -95 ± 2 301/151 -76 ± 2 -87 ± 1 Хесперидин 609/343 -64 ± 3 -63 ± 4 609/325 -64 ± 2 -69 ± 1 609/174 -64 ± 5 609/151 -68 ± 6 Кверцетин 301/179 -71 ± 3 -52 ± 5 -32 ± 3 301/151 -71 ± 4 -53 ± 4 301/107 -71 ± 3 -52 ± 5 -31 ± 3 301/97 -71 ± 4 -51 ± 5 Рутин 609/301 -37 ± 1 -96 ± 4 -63 ± 2 609/273 -65 ± 2 609/257 -30 ± 6 -99 ± 5 -66 ± 9 609/179 -34 ± 6 Каемпферол 285/256 -64 ± 4 -38 ± 6 -49 ± 2 285/243 -64 ± 5 -38 ± 6 285/228 -61 ± 4 -39 ± 6 -47 ± 1 285/125 -65 ± 4 Андрија Ћирић Докторска дисертација 147 Повећање јонске супресије примећено је у метанолу као растварачу у поређењу са водом, за узорак меда, док је код узорка коре поморанџе и црвеног лука матрични ефекат скоро исти за све употребљене раствараче. Јонска супресија је много мање изражена код методе пост-екстракције него код методе стандардног додатка (поређење са Табелом 32). Метода пост-екстракције као калибрациони приступ, је изводљива само са матриксом који има састав сличан саставу екстракта (који не садржи аналит). Стога је одлучено да се ослонимо на методу стандардног додатка као калибрациону методу, која је препоручена као најпоузданија метода за анализу узорака који садрже доста интерферирајућих супстанци [53]. Примењена метода за припрему и пречишћавање узорака, не даје чист екстракт. Недостатак методе је у недовољном отклањању ендогених супстанци као што су фенолне киселине и фосфолипиди из аналита. У нашем случају фенолне киселине се елуирају пре флавоноида, што је приказано на Слици 68. Слика 68. HPLC-UV хроматограм полифенолних киселина и биофлавоноида Приказан хроматограм показује да супстанце које се заједно елуирају изазивају једнаку супресију због смањења ефикасности јонизације. Други биомакромолекули (липиди, масне киселине) заостају на SPE кертриџима. Главне сметње приликом електроспреј јонизације и хроматографског раздвајања биофлавоноида долазе од фенолних киселина, тако да развој LC методе укључује одвајање фенолних киселина од аналита. Фенолне киселине Биофлавоноиди Андрија Ћирић Докторска дисертација 148 3.1.4. Одређивање биофлавоноида у узорцима црвеног лука, коре поморанџе и меда Начин побољшања тачности квантификоване методе и елиминисање интерференција треба разматрати приликом одређивања количине биофлавоноида у узорцима хране. Комплетно уклањање супстанци које се заједно елуирају приликом пречишћавања узорка није могуће постићи у случају наших узорака. Матрице су сложене и разликују се по саставу од узорка до узорка. Као последица тога чак и код истих поступака екстракције истих узорака, раствор екстракта може варирати између узорака. Ово значи да степен супресије сигнала изазваног од коелуираних супстанци такође варира од узорка до узорка. Може се закључити да је тешко и непрактично потпуно уклањање коелуираних супстанци које утичу на супресију сигнала. На основу тога, метода избора у нашем случају је метода стандардног додатка. У анализирани раствор екстракта се додаје позната количина стандардог раствора, а за израчунавање количине флавоноида се користи формула: ( ) где је Xi количина биофлавоноида у раствору екстракта; Sf је количина биофлавоноида додатог у раствор екстракта; Ix је интензитет сигнала биофлавоноида у раствору екстракта и Is+x је интензитет сигнала биофлавоноида у оптерећеном раствору. Репрезентативни HPLC-UV и укупни хроматограми јона (TIC) метанолских екстраката коре поморанџе, црвеног лука и меда, приказани су на Сликама 69, 70, 71, 72, 73 и 74. Андрија Ћирић Докторска дисертација 149 Слика 69. HPLC-UV хроматограм екстракта црвеног лука добијеног ултразвучном екстракцијом на 280 nm Слика 70. TIC екстракта црвеног лука Слика 71. HPLC-UV хроматограм екстракта коре поморанџе добијеног ултразвучном екстракцијом на 280 nm Андрија Ћирић Докторска дисертација 150 Слика 72. TIC екстракта коре поморанџе Слика 73. HPLC-UV хроматограм екстракта меда добијеног ултразвучном екстракцијом на 280 nm Слика 74. TIC екстракта меда Андрија Ћирић Докторска дисертација 151 Након развоја процедуре за одређивање испитиваних једињења, извршена су специфична масено спектрометријска мерења за растворе анализираних узорака. Процес идентификације и квантификације се заснива само на сигналу циљаних аналита и може бити веома критичан у случају јонске супресије. Узорци коре поморанџе, црвеног лука и меда су анализирани на садржај кверцетина, рутина, хесперетина, хесперидина и каемпферола коришћењем методе стандардног додатка. На Слици 75 је приказана калибрациона крива за хесперетин у метанолу и крива за методу стандардног додатка за одређивање хесперетина у кори поморанџе. Слика 75. Калибрациона крива и крива за методу стандардног додатка за хесперетин Велика разлика у положајима кривих показује јак утицај матричног ефекта. Линеарна крива за методу стандардног додатка је добијена у концентрационом опсегу за додати стандардни раствор биофлавоноида од 0,05 – 0,5 g/mL (четири нивоа концентрација). Линеарност је потврђена вредностима регресионог коефицијената већим од 0,98 и Cohran-овим тестом хомосхедастичности (Gmax = s 2 max/si 2) који је поређен са табеларним вредностима. Нулта хипотеза је једнакост појединих тачака стандардне девијације, прихватљива ако је Gmax < Gtable, показујући хомогену дистрибуцију стандардне девијације. На основу методе стандардног додатка, за сваки узорак, одређена је количина испитиваних биофлавоноида. Резултати одређивања биофлавоноида у изабраним узорцима приказани су у Табели 34. y = (9,26 ± 0,03)×105 Х + 1,33 ± 0,04)×105 R² = 0,9917 y = (2,98 ± 0,02)×106 Х - (9,31 ± 0,02)×103 R² = 0,9983 -2,00E+05 0,00E+00 2,00E+05 4,00E+05 6,00E+05 8,00E+05 1,00E+06 1,20E+06 1,40E+06 1,60E+06 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 П о вр ш и н а Конц. (g/mL) Standard addition Pure standardСтандардни раствор Стандардни додатак Андрија Ћирић Докторска дисертација 152 Табела 34. Садржај биофлавоноида у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда и поређење са литературним подацима. Храна Једињење Садржај (mg/100 g fw) CV (%) Искоришћење (%) Вредност одсечка ± SDx t-тест Садржај (mg/100 g fw) литературна Кора поморанџе Хесперетин 36,4 5,87 91,5 0,14±0,08 0,2535 31 – 41,4 [29,30] Хесперидин 24,3 3,42 103,5 0,06±0,01 0,1205 18 – 66,5 [29,30] Кверцетин 0,65 2,56 93,47 0,10±0,11 0,1758 0,00 – 2,20 [31,32] Црвени лук Хесперетин 0,0068 2,36 108,7 0,19±0,01 0,2402 0,0064– 0,0076 [33-35] Хесперидин 0,016 3,59 87,6 0,04±0,04 0,0932 0,001 – 0,03 [33-35] Кверцетин 56,3 3,68 99,37 0,24±0,02 0,2873 0,00 –191,7 [35-41] Рутин 0,16 4,73 93,4 0,62±0,11 0,2663 0,17 – 0,27 [41] Каемпферол 1,63 5,61 92,4 0,41±0,11 0,1873 0,00 – 4,5 [42-44] Мед Хесперетин 0,072 3,38 105,6 0,63±0,23 0,2617 0,028 – 0,084 [45,46] Хесперидин 14 6,48 106,4 0,13±0,02 0,2822 12 – 26 [46] Кверцетин 0,67 3,56 91,4 0,19±0,02 0,3014 0,02 – 1,3 [45-50] Каемпферол 0,14 4,1 87,65 0,38±0,06 0,1489 0,05 – 0,17 [45-50] fw – свеж тежина, CV- коефицијент варијације, SDx – стандардна девијација одсечка Наши резултати у поређењу са литературним подацима [29 - 50] за садржај биофлавоноида у храни (Табела 34), показује одговајајуће слагање. Андрија Ћирић Докторска дисертација 153 3.2. Оптимизација HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica У циљу оптимизације HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica извршена су:  Прелиминарна испитивања,  Избор одговарајуће HPLC колоне за одвајање аналита,  Избор одговарајуће мобилне фазе,  Избор температуре,  Избор погодне таласне дужине детекције,  Рачунарски потпомогнута оптимизација RP-HPLC методе,  Примена оптимизоване RP-HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica 3.2.1. Прелиминарна испитивања Прелиминарна испитивања хроматографских услова за одвајање биофлавоноида (кверцетина, каемпферола, апигенина, лутеолина, катехина и епикатехина) вршенa су коришћењем стандардних супстанци фирме Sigma-Aldrich (Беч, Аустрија). На основу испитивања физичко-хемијских особина биофлавоноида изводи се закључак да су они слабе хетероцикличне киселине које имају константе дисоцијације (рКа) у области од 6 – 12. Највише пажње, током прелиминарних испитивања, било је посвећено избору органског растварача мобилне фазе као и одговарајућег пуфера којим је подешавано рН мобилне фазе (мравља и сирћетна киселина). Како су биофлавоноиди умерено поларна једињења најбоља растворљивост се постиже у мобилној фази умерене поларности, а то изискује примену реверзно-фазне хроматографије. Током прелиминарних испитивања коришћена је само Thermo Science Hypersil GOLD aQ (150×4,6 mm, 5 m) колона, која је намењена за одређивање аналита из комплексног узорка, уз малу потрошњу мобилне фазе. Колона је пуњена силика-гелом са октадецил остацима који су хемијски везани за порозни силика-гел. Сферне хибридне честице садрже и неорганске (силика-гел) и органске (органосилоксан) компоненте хемијски модификоване на површини са трифункционалним Андрија Ћирић Докторска дисертација 154 октадецилсилил групама. На тај начин се смањује интеракција октадецилцилил група са базним једињењима. У прелиминатним испитивањима је био циљ да се употребе до сада описани поступци у литератури. Како је одвајање биофлавоноида на реверзно-фазним колонама тешко, јавља се проблем око ширења пика и брзог проласка кроз колону (проценат ацетонитрила већи од 15) са малом ефикасношћу раздвајања, стога је потребно оптимизовати хроматографске услове за њихово одвајање. 3.2.2. Оптимизација RP-HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica Циљ оптимизације RP-HPLC методе, за одређивање биофлавоноида, био је да се избегне градијентно елуирање и на тај начин скрати време извођења анализе, али да су при томе задовољени сви хроматографски параметри добре хроматографије, као и да због примене DAD детекције метода буде селективна, прецизна, тачна и поуздана. У ту сврху било је потребно наћи оптимални удео органске фазе као и процентни садржај органског адитива (сирћетне киселине) у мобилној фази. Развој хроматографске методе за ову класу једињења представља изазов имајући у виду сличност њихових структура, а самим тим и физичко-хемијских карактеристика. Услови за развој методе су изабрани на основу поларности аналита и мобилне фазе. Развој методе почео је коришћењем Hypersil GOLD aQ колоне (150×4,6 mm, 5 m величина честице). Колона садржи хибридни органско/неоргански материјал. Коришћене су различите мобилне фазе како би се добили хроматограми са задовољавајућом резолуцијом између пикова аналита, у прихватљивом временском интервалу. Састав мобилне фазе је изабран након неколико покушаја са метанолом, ацетонитрилом и водом у различитим односима и при различитим рН вредностима, при градијентном начину елуирања. Да би се побољшао облик пика сирћетна киселина је додата у мобилну фазу како би се спречила дисоцијација хидроксилних група биофлавоноида [310 – 312]. Промене рН вредности мобилне фазе такође утичу на резолуцију пикова. Према Michalkiewicz-у и сарадницима [313], повећање рН мобилне фазе смањује ретенцију биофлавоноида. Уколико се примени градијентни начин елуирања са мобилном фазом у којој преовлађује вода и у коју је додата киселина и постепено повећава удео метанола, одвајање биофлавоноида се врши у дугом Андрија Ћирић Докторска дисертација 155 временском интервалу и са лошом резолуцијом пикова. Ако се уместо метанола примени ацетонитрил, одвајање биофлавоноида се побољшава и скраћује се време анализе. Из нашег претходног рада [314] нађено је да оптимална температура колоне износи 30 оС. Оптимизација одвајања аналита је почела са две линеарне градијентне анализе: tG = 30 min и tG = 60 min; % ацетонитрила се мењао од 15 – 85 % и са 2 % сирћетне киселине у циљу проналажења оптималног процента ацетонитрила и минималног броја експеримената за извођење изократских анализа. Таласне дужине на којима се вршило мерење износиле су 260 и 280 nm, а изабране су на основу апсорпционих максимума испитиваних аналита. Идентификација пикова је потврђена инјектовањем појединачних раствора стандарда. Подаци потребни за анализу (ретенциона времена, површина и ширина пикова) из добијених хроматограма су ручно унети у програм LC-Simulator. Добијена 1D мапа резолуције приказана је на Слици 76. Слика 76. 1D мапа резолуције добијена у tG/% ацетонитрила оптимизацији са 2 % сирћетном киселином и на температури од 30 oC Погодни услови за раздвајање испитиваних биофлавоноида изражени су преко различитих боја: зелена за прихватљиве услове, а црвена за неприхватљиве услове раздвајања биофлавоноида. У следећој фази истовремено су оптимизовани концентрација сирћетне киселине и удео ацетонитрила за изократско извођење анализа. На основу експериментаног дизајна изведено је девет изократских анализа у току tI = 20 min. Експериментални Андрија Ћирић Докторска дисертација 156 подаци и добијени резултати за компјутерску оптимизацију експерименталних услова дати су у Табели 35. Табела 35. Експериментани услови и одговарајући подаци добијени са хроматограма који су коришћени за оптимизацију методе. Колона Hypersil GOLD aQ (150×4,6 mm, 5 m), таласна дужина 260 nm, температура 30 oC, проток 1 mL/min Услови 95 : 5; 1% сирћетна киселина : ацетонитрил 90 : 10; 1% сирћетна киселина : ацетонитрил 85 : 15; 1% сирћетна киселина : ацетонитрил Једињење tr Површина Ширина tr Површина Ширина tr Површина Ширина Кверцетин 3,149 78324 0,284 3,564 32648 0,193 3,077 10452 0,204 Каемпферол 9,865 53837 0,357 3,568 12364 0,387 3,659 14756 0,208 Катехин 8,756 57658 0,272 5,359 18651 0,268 3,454 14698 0,256 Лутеолин 18,07 73159 0,348 6,385 13684 0,268 8,696 10479 0,326 Апигенин 16,52 76825 0,239 7,326 23265 0,365 6,879 17856 0,172 Епикатехин 14,49 47689 0,342 11,326 10946 0,462 3,785 10752 0,136 Услови 95 : 5; 2% сирћетна киселина : ацетонитрил 90 : 10; 2% сирћетна киселина : ацетонитрил 85 : 15; 2% сирћетна киселина : ацетонитрил Једињење tr Површина Ширина tr Површина Ширина tr Површина Ширина Кверцетин 2,146 54492 0,200 2,074 37282 0.090 2,077 10092 0,204 Каемпферол 5,949 28749 0,308 2,525 15740 0.260 2,458 10088 0,208 Катехин 6,670 15524 0,292 4,163 17251 0.230 1,454 15566 0,182 Лутеолин 16,06 10398 0,348 4,482 12994 0.190 7,696 10059 0,326 Апигенин 13,63 20808 0,332 6,448 21418 0.320 4,879 18448 0,172 Епикатехин 12,52 20846 0,310 9,613 10157 0.320 1,785 10702 0,136 Услови 95 : 5; 3% сирћетна киселина : ацетонитрил 90 : 5; 3% сирћетна киселина : ацетонитрил 85 : 15; 3% сирћетна киселина : ацетонитрил Једињење tr Површина Ширина tr Површина Ширина tr Површина Ширина Кверцетин 2,949 28749 0,308 0,895 15740 0,260 1,358 40088 0,208 Каемпферол 3,470 15524 0,292 1,163 17251 0,230 0,875 35566 0,182 Катехин 1,146 33544 0,200 2,074 37282 0,090 1,237 10092 0,204 Лутеолин 10,43 40846 0,310 4,613 10157 0,320 1,255 10702 0,136 Апигенин 11,24 20808 0,332 6,448 21418 0,320 2,879 18448 0,172 Епикатехин 14,05 10398 0,348 7,482 12994 0,190 5,496 10059 0,326 Хроматографски параметри (ретенционо време, површина и ширина пика) су ручно унети у програм при датим експерименталним условима. Андрија Ћирић Докторска дисертација 157 Програм LC-Simulator је дао мапу резолуције приказану на Слици 77. Слика 77. 2D мапа резолуције добијена рачунарском симулацијом применом програма LC-Simulator Мапа резолуције је представљена као тродимензионални график, при чему се два фактора (концентрација сирћетне киселине и проценат ацетонитрила) који се налазе на осама координативног система, а трећа димензија (укупна резолуција) је приказана различитим бојама. На Слици 78 је представљен симулирани хроматограм добијен при оптималним условима. Слика 78. Хроматограм биофлавоноида добијен компјутерском симулацијом коришћењем програма LC-Simulator 10.510.09.59.08.58.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.5 Time, min 20 40 60 80 100 120 K a t e h i n A p i g e n in E p i k a t e h in L u te o l in K v e r c e t in K a e m f e r o l A280 Андрија Ћирић Докторска дисертација 158 На основу тога оптимални услови за одвајање испитиваних биофлавонида су дати у Табели 36. Табела 36. Оптимални услови за сепарацију и одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica утврђени компјутерском симулацијом. Параметар Опимални услови Колона Hypersil GOLD aQ (150×4,6 mm, 5 m) Проток 1 mL/min Температура 30 оС Детекција UV 260 nm Запремина инјектовања 20 L % ацетонитрила 9 % pH вредности мобилне фазе 4,0 % сирћетне киселине 2 % При нађеним оптималним хроматографским условима снимљен је хроматограм смеше стандарда биофлавоноида. Добијени хроматограм смеше биофлавоноида под оптималним условима дат је на Слици 79. Слика 79. Хроматограм стандарда биофлавоноида под оптималним условима Са Слика 78 и 79 уочава се веома добро слагање између симулираног и експерименталног хроматограма добијеног под оптималним условима са просечном грешком од 1 до 5 % за ретенциона времена и резолуцију. Пре саме анализе узорака купуса, проверене су перформансе хроматографске методе анализирањем раствора стандардних супстанци у метанолу. 0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 m A U min К ве р ц ет и н К ае м п ф ер о л К ат ех и н А п и ге н и н Еп и ка те хи н Л ут ео л и н Андрија Ћирић Докторска дисертација 159 3.2.3. Одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica Због сложености матрикса као метода избора за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica намеће се метода стандардног додатка, тј. у анализиране растворе екстракта запремине 3 mL су додате одређене запремине (100, 200, 300 и 400 L) смеше стандарда тачно познате концентрације и разблажене метанолом у нормалном суду од 5 mL. Тако припремљени раствори фамилије Brassica су хроматографисани. Репрезентативни хроматограм екстракта свежег броколија приказан је на Слици 80. Слика 80. Хроматограм екстракта свежег броколија Анализом добијених хроматограма конструисане су криве за методу стандардног додатка помоћу којих је одређен садржај биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica. На Слици 81 је представљен график за одређивање кверцетина у екстракту карфиола добијеном ултразвучном екстракцијом. Слика 81. Одређивање кверцетина у узорку свежег карфиола методом стандардног додатка 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 m A U min К ве р ц ет и н ае м п ф ер о л К ат ех и н А п и ге н и н Еп и ка те хи н Л ут ео л и н y = 1E+06x + 3275,5 R² = 0,999 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 -0,004 -0,002 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 П о вр ш и н а п и ка conc. (mg /mL) Андрија Ћирић Докторска дисертација 160 Непознате концентрације флавоноида су одређене из конструисаних кривих за сваки аналит као зависност површине пика аналита од концентрације додатог стандарда. Непозната концентрација је очитана као одсечак на х-оси, а несигурност одсечка је израчуната по формули: | | √ ̅ ̅ где је sy стандардна девијација у очитавању сигнала, a нагиб, n број испитиваних тачака, x концентрација аналита и y површина пика. Интервал поверења је рачунат као производ између t и SDx, где је t вредност Student-овог параметра за n-2 степена слободе. Применом описане методе одређен је садржај биофлавоноида у екстрактима карфиола, броколија и прокеља (свежег и смрзнутог) (Табела 37). Табела 37. Садржај биофлавоноида (mg/100g свеже масе) за различите врсте Brassica. Карфиол Једињење Сокслетова екстракција Ултразвучна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракцијан водом Литературна вредност Реф Свеж Кверцетин 0,94 ± 0,05 0,9 ± 0,1 0,75 ± 0,09 0,64 ± 0,10 0,83 315 Каемпферол 0,14 ± 0,08 0,11 ± 0,09 0,09 ± 0,08 0,1 ± 0,05 0,25 315 Катехин 0,52 ± 0,07 0,48 ± 0,06 0,42 ± 0,08 0,31 ± 0,03 Лутеолин 0,07 ± 0,04 0,06 ± 0,07 0,05 ± 0,05 0,03 ± 0,09 0,07 315, 316, 317 Апигенин 0,025 ± 0,05 0,022 ± 0,08 0,015 ± 0,1 0,01 ± 0,07 0,03 315, 316, 317 Епикатехин 0,52 ± 0,06 0,41 ± 0,09 0,30 ± 0,06 0,25 ± 0,06 Смрзнут Кверцетин 0,73 ± 0,04 0,75 ± 0,09 0,61 ± 0,09 0,56 ± 0,08 Каемпферол 0,22 ± 0,06 0,21 ± 0,08 0,19 ± 0,08 0,12 ± 0,05 0,25 318 Катехин 0,88 ± 0,08 0,87 ± 0,08 0,77 ± 0,08 0,54 ± 0,03 0,83 318 Лутеолин 0,32 ± 0,09 0,35 ± 0,04 0,28 ± 0,05 0,18 ± 0,08 Апигенин 0,12 ± 0,06 0,12 ± 0,1 0,09 ± 0,1 0,03 ± 0,09 Епикатехин 0,26 ± 0,05 0,29 ± 0,08 0,24 ± 0,06 0,18 ± 0,06 Броколи Једињење Сокслетова екстракција Ултразвучна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција водом Литературна вредност Реф Свеж Кверцетин 2,78 ± 0,05 2,71 ± 0,1 2,65 ± 0,09 2,54 ± 0,10 2,51 319, 320 Каемпферол 3,71 ± 0,08 3,60 ± 0,09 3,52 ± 0,08 3,52 ± 0,05 4,01 319, 320 Катехин 0,60 ± 0,07 0,58 ± 0,06 0,32 ± 0,08 0,28 ± 0,03 Лутеолин 0,81 ± 0,04 0,77 ± 0,07 0,55 ± 0,05 0,36 ± 0,09 0,86 316, 319 Апигенин 0,32 ± 0,05 0,27 ± 0,08 0,12 ± 0,1 0,11 ± 0,07 Епикатехин 0,38 ± 0,06 0,31 ± 0,09 0,40 ± 0,06 0,15 ± 0,06 Смрзнут Кверцетин 2,33 ± 0,04 2,25 ± 0,09 2,11 ± 0,09 1,46 ± 0,08 2,40 318 Каемпферол 2,32 ± 0,06 2,28 ± 0,08 1,78 ± 0,08 1,41 ± 0,05 2,49 318 Катехин 0,47 ± 0,08 0,35 ± 0,08 0,36 ± 0,08 0,34 ± 0,03 Лутеолин 0,36 ± 0,09 0,32 ± 0,04 0,26 ± 0,05 0,19 ± 0,08 Апигенин 0,22 ± 0,06 0,15 ± 0,1 0,19 ± 0,1 0,13 ± 0,09 Епикатехин 0,27 ± 0,05 0,23 ± ,08 0,22 ± 0,06 0,16 ± 0,06 Прокељ Једињење Сокслетова екстракција Ултразвучна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција водом Литературна вредност Реф Свеж Кверцетин 0,34 ± 0,05 0,29 ± 0,1 0,15 ± 0,09 0,10 ± 0,10 0.3 315, 317 Каемпферол 0,65 ± 0,08 0,50 ± 0,09 0,62 ± 0,08 0,52 ± 0,05 0.95 315, 317 Катехин 0,42 ± 0,07 0,41 ± 0,06 0,52 ± 0,08 0,35 ± 0,03 Лутеолин 0,28 ± 0,04 0,23 ± 0,07 0,15 ± 0,05 0,11 ± 0,09 0.34 315, 317 Апигенин 0,32 ± 0,05 0,27 ± 0,08 0,25 ± 0,1 0,08 ± 0,07 Епикатехин 0,35 ± 0,06 0,31 ± 0,09 0,20 ± 0,06 0,15 ± 0,06 Смрзнут Кверцетин 0,23 ± 0,04 0,21 ± 0,09 0,21 ± 0,09 0,16 ± 0,08 Каемпферол 0,52 ± 0,06 0,52 ± 0,08 0,47 ± 0,08 0,39 ± 0,05 Катехин 0,48 ± 0,08 0,37 ± 0,08 0,37 ± 0,08 0,24 ± 0,03 Лутеолин 0,22 ± 0,09 0,20 ± 0,04 0,18 ± 0,05 0,11 ± 0,08 Апигенин 0,12 ± 0,06 0,12 ± 0,1 0,09 ± 0,02 0,03 ± 0,01 Епикатехин 0,26 ± 0,05 0,29 ± 0,08 0,24 ± 0,06 0,18 ± 0,06 Андрија Ћирић Докторска дисертација 161 Као што се може уочити из Tабеле 37 садржај биофлавоноида код свих врста купуса је већи код свежих него код замрзнутих узорака. То се може објаснити начином припреме замрзнутих узорака као и дужином времена у којем су били замрзнути. Још једна разлика се јавља у садржају биофлавоноида, а то је у начину њихове екстракције из узорка и највећи је применом екстракције по Сокслету. Ова разлика се може објаснити разликом у температури и времену трајања екстракције као и од врсте растварача који је употребљен за екстракције. 3.2.4. Одређивање антиоксидативне активности екстраката фамилије Brassica Настајања слободних радикала, или реактивних кисеоничних врста, током метаболизма биолошких система одговорни су за оксидативни стрес који доводи до болести срца, неуродегенеративних поремећаја, рака и старења. Антиоксиданси су супстанце које су присутне у малој концентрацији и реагују са слободним радикалима, при чему спречавају њихову активност, односно спречавају деструкцију ћелијске мембране. Познато је да хемијски састав и структура молекула који улазе у састав биљака утичу на пут радикалске реакције. Између различитих природних једињења која показују антиоксидативну активност, флавоноиди су међу најзначајнијима. Број и распоред хидроксилних група и места гликолизације одређују антиоксидативну активност полифенолних једињења. Гликолизација на позицији 7 значајно смањује антиоксидативну активност биофлавоноида у поређењу са њиховим слободним агликонским делом. Међутим, и други фактори као што су рН и особине растварача утичу на антиоксидативну активност. Методе за испитивање антиоксидативне активности најчешће се заснивају на спектрофотометријском мерењу промене апсорбанције током одвијања реакције између слободних радикала и антиоксиданса. Од метода које се најчешће користе за in vitro испитивања су: ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), TRAP (Total Radical- Trapping Antioxidant Parameter), TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), DPPH (2,2`-дифенил-1-пикрилхидразил радикала), TOSC (Total Oxiradical Scavengin Capacity), PSC (Peroxyl Radical Scavenging), FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). DPPH тест је најстарија индиректна метода за одређивање антиоксидативне активности, која се заснива на способности стабилног слободног радикала DPPH да Андрија Ћирић Докторска дисертација 162 реагује са донорима водоника укључујући феноле [321, 322]. Стабилни DPPH радикал се користи за процену способности антиоксиданса да реагују са радикалима [316, 323] и за боље разумевање њиховог антиоксидативног механизма. Антиоксидативни капацитет екстраката врсте Brassica су анализирани коришћењем DPPH методе. Припремљен основни раствор DPPH у метанолу (1,5 mmol/L) је додат у 3 mL свеже припремљених екстраката фамилије Brassica добијених различитим методама екстракције и мерена је апсорбанција тако добијених раствора на 517 nm (DPPH показује максимум апсорпције). Праћено је смањење концентрације у различитим временским интервалима и то одмах након додатка DPPH, а након тога на сваких 5 минута. Преостала концентрација DPPH у реакционој смеши је израчуната на основу калибрационе криве за DPPH приказана на Слици 82. Слика 82. Калибрациона крива DPPH у метанолу за одређивање концентрације у растворима екстраката Како би се одредио утицај начина припреме, чувања и различитости врста испитиваних узорака фамилије Brassica на антиоксидативну активност, израчунате су вредности процента преосталог DPPH у раствору на основу формуле: [ ] [ ] где је t временски интервал у којем је вршено мерење. y = 0,0086x + 0,0147 R² = 0,9986 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A концентрација DPPH (mol/L) Андрија Ћирић Докторска дисертација 163 Графици зависности процента преосталог DPPH у раствору у функцији времена за различите врсте фамилије Brassica, начине екстракције и чувања приказани су на Сликама 83, 84, 85, 86 и 87. Слика 83. Кинетика антиоксидативне активности свежег екстракта карфиола Слика 84. Кинетика антиоксидативне активности екстракта замрзнутог карфиола 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 % п р е о ст ал о г D P P H Време (min) Екстракција по Сокслету Ултразвушна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција кљушалом водом 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 % п р е о ст ал о г D P P H Време (min) Екстракција по Сокслету Ултразвушна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција кљушалом водом Андрија Ћирић Докторска дисертација 164 Слика 85. Кинетика антиоксидативне активности екстракта свежег броколија Слика 86. Кинетика антиоксидативне активности екстракта замрзнутог броколија Слика 87. Кинетика антиоксидативне активности екстракта прокеља 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 % п р е о ст ал о г D P P H Време (min) Екстракција по Сокслету Ултразвушна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција кљушалом водом 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 % п р е о ст ал о г D P P H Време (min) Екстракција по Сокслету Ултразвушна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција кљушалом водом 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 % п р е о ст ал о г D P P H Време (min) Ултразвушна екстракција свежег Ултразвушна екстракција замрзнутог Андрија Ћирић Докторска дисертација 165 Сумирани резултати испитиване антиоксидативне активности су приказани у Табели 38. Табела 38. Антиоксидативна активност (% преосталог DPPH ± SD) за различите врсте купуса добијене DPPH методом. Узорак Време (min) Екстракција по Сокслету Ултразвучна екстракција Екстракција мацерацијом Екстракција кључалом водом Свеж Смрзнут Свеж Смрзнут Свеж Смрзнут Свеж Смрзнут Карфиол 0 100 ± 2 100 ± 7 100 ± 5 100 ± 3 100 ± 5 100 ± 1 100 ± 4 100 ± 9 5 61 ± 5 73 ± 3 58 ± 6 70 ± 5 65 ± 3 77 ± 2 68 ± 6 80 ± 7 10 29 ± 6 40 ± 4 24 ± 4 37 ± 7 34 ± 2 47 ± 3 40 ± 7 55 ± 6 15 17 ± 4 28 ± 6 14 ± 2 24 ± 9 21 ± 3 34 ± 2 25 ± 5 40 ± 4 20 13 ± 3 18 ± 5 12 ±1 14 ± 2 18 ± 4 20 ± 4 20 ± 3 27 ± 8 25 13 ± 4 18 ± 4 11 ±1 14 ± 6 18 ± 5 20 ± 5 20 ± 4 27 ± 2 30 13 ± 6 18 ± 6 11 ±1 14 ± 7 18 ± 6 20 ± 8 20 ± 2 27 ±5 Броколи 0 100 ± 4 100 ± 4 100 ± 5 100 ± 3 100 ± 2 100 ± 5 100 ± 4 100 ± 5 5 47 ± 7 64 ± 7 45 ± 6 60 ± 4 55 ± 5 68 ± 2 60 ± 6 72 ± 6 10 34 ± 6 48 ± 6 30 ± 7 42 ± 6 40 ± 8 58 ± 2 45 ± 5 63 ± 8 15 25 ± 5 35 ± 7 20 ± 2 30 ± 7 30 ± 3 40 ± 2 35 ± 7 45 ± 4 20 15 ± 4 24 ± 5 14 ± 7 17 ± 2 22 ± 5 29 ± 2 26 ± 5 33 ± 6 25 14 ± 3 23 ± 3 12 ± 6 17 ± 6 20 ± 2 26 ± 2 25 ± 7 30 ± 5 30 14 ± 9 22 ± 4 12 ± 7 17 ± 5 20 ± 5 24 ± 8 25 ± 4 29 ± 3 Прокељ 0 100 ± 100 ± 6 5 45 ± 7 60 ± 3 10 30 ± 6 40 ± 5 15 20 ± 4 30 ± 7 20 13 ± 3 20 ± 4 25 10 ± 7 20 ± 5 30 10 ± 4 20 ± 4 Смањење апсорбанције DPPH радикала је последица реакције између молекула антиоксиданса и радикала, при чему долази до неутралисања радикала који прима атом водоника. Као што је приказано у Табели 38 уочено је значајно смањење концентрације DPPH у току реакције са екстрактима купуса на основу чега се може закључити да су екстракти богати антиоксидансима. Проучавање кинетике реакције између DPPH и екстраката врши се у циљу одређивања реда и величине брзине хемијске реакције. На почетку реакција се одвија према кинетици другог реда и веома је брза. Ово се може објаснити реакцијом између молекула антиоксиданаса мале молекулске масе (фенолне киселине), док се други део одиграва по кинетици псеудо првог реда и за њу су одговорни молекули велике молекулске масе (полимери фенолних киселина). Добијени резултати показују значајну разлику у антиоксидативној активности између различитих врста купуса као и између свежих и замрзнутих узорака. Највећу антиоксидативну активност показује узорак свежег броколија. Андрија Ћирић Докторска дисертација 166 3.3. Оптимизација HPLC методе за одређивање моксифлоксацина и сродних супстанци у таблетама и инфузији У циљу развоја HPLC методе за одређивање моксифлоксацина и сродних супстанци извршена је оптимизација методе која је обухватала: - Прелиминарна испитивања - Избор хроматографске колоне - Оптимизацију интерног стандарда - Оптимизацију мобилне фазе - Избор начина елуирања - Оптимизацију температуре одређивања - Оптимизацију pH вредности мобилне фазе - Избор начина детекције - Оптимизацију „displacing“ реагенса - Статистичку обраду експериманталног дизајна 3.3.1. Прелиминарна испитивања Хроматографско раздвајање јонизујућих компоненти – киселина и база, јако зависи од pH вредности мобилне фазе. Ретенција на неполарним колонама се може побољшати мењањем pH вредности мобилне фазе, тако што се једињења преведу у свој нејонизовани облик. Такође, интеракције између поларних силанолних група на носачу колоне и аналита, које доводе до развлачења пикова, могу се смањити правилним избором састава и pH вредности мобилне фазе. Да би се нашла оптимална мобилна фаза за раздвајање моксифлоксацина и сродних супстанци из таблета и инфузије, треба имати на уму да су они слабе хетероцикличне амино киселине са два места за јонизацију: једно одговара протоновању 3'-N секундарне амино пиперазинил групе, а друго депротоновању карбоксилне групе. Према томе, мокисфлоксацин и сродне супстанце у раствору могу постојати у облику катјона, анјона, цвитерјона и у неутралном облику. Релативна заступљеност ових облика зависи од pH вредности раствора. Пошто се на стационарној фази најдуже задржавају неутрални облици и цвитерјон, треба одредити интервал pH вредности у коме су они највише заступљени. Такође, треба одредити изоелектричну Андрија Ћирић Докторска дисертација 167 тачку мокисфлоксацина и сродних супстанци, што значи да треба одредити обе константе дисоцијације у одређеном растварачу. У циљу одређивања константи дисоцијације моксифлоксацина извршена је потенциометријска титрација раствора моксифлоксацина концентрације 1,07 mmol/L у и без присуства 12 mmol/L SDS-а у 0,1 mol/L LiCl јонској средини на 298 К. Титрација је вршена стандардним раствором NaOH концентрације 0,1 mol dm-3. Праћена је зависност pH раствора од запремине додате базе. На Слици 88 је приказана титрациона крива у облику зависности pH од титрационог параметра, a. Титрациони параметар једнак је односу концентрација додате јаке базе, [BOH], у раствору и укупне концентрације слабе киселине, CA, и рачунат је по формули: [ ] Са Слике 88 се види да на титрационој кривој постоје два превоја, један у слабо киселој, а други у базној средини. Оба превоја су јако изражена и показују да протоновани моксифлоксацин, при дисоцијацији, ступњевито оптушта два протона, при чему су pH вредности при којима долази до дисоцијације јасно раздвојене. Слика 88. Потенциометријска титрација 1,07 mmol/L моксифлоксацина у 0,1 mol/L LiCl средини на 25оC у и без присуства SDS-a На основу испитивања физичко-хемијских карактеристика, може се извести закључак да се у воденим растворима моксифлоксацин понаша као амфотерна амино 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 a pH 1.07 mM Mox + 12 mM SDS 1.07 mM Mox Андрија Ћирић Докторска дисертација 168 киселина са изоелектричном тачком pI = 7,44. Дистрибуциони дијаграм различитих јонизованих и нејонизованих облика моксифлоксацина одређен је на основу измерених константи дисоцијације моксифлоксацина што указује да моксифлоксацин постоји у катјонском облику при pH мањем од 5 (у облику катјона H2(MOX) +) и при pH већем од 8,0 (као анjон (MOX)-). Највише прелиминарних испитивања је урађено у циљу проналажења оптималне мобилне фазе. За регулисање pH вредности мобилне фазе коришћени су различити пуфери. Посто су ово поларни облици моксифлоксацина најбоља растворљивост постиже се у мобилној фази повишене поларности, а то изискује употребу реверзно-фазне хроматографије. Прелиминарна испитивања хроматографских услова за раздвајање моксифлоксацина од осталих сродних нечистоћа вршена су употребом стандардних раствора моксифлоксацина и сродних нечистоћа фирме Bayer. Током прелиминарних испитивања коришћена је само ABZ колона. ABZ колона је пуњена сферним честицама силика-гела на чијој површини се као активне групе налазе остаци алкиламида. Колона има јединствену деактивациону технологију која омогућава одличне реверзно-фазне перформансе како за базна и кисела, тако и за поларна и неполарна једињења. Раздвајање аналита на силанолним површинама јавља се као последица њихове интеракције са алкиламинима, тако да за добијање доброг изгледа пика нису потребне велике јонске силе и екстрамна подешавања рН мобилне фазе. Применом ове колоне могу се анализирати веома комплексни узорци, без предходног пречишћавања узорка, чиме се избегавају могући губици аналита. Међутим, у прелиминарним испитивањима циљ је био да се упореди поступак на овој колони са стандардним поступцима описаним до сада у литератури. За одређивање моксифлоксацина и хинолона уопште, у литератури се најчешће помињу RP-HPLC методе на ODS колони. Због тога прелиминарна су испитивања обухватила и хроматографисање на XTerra C18 колони, под сличним експерименталиним условима као и на ABZ колони. Пунилац XTerra C18 колона је прва генерација хибридних (неорганско/органских) честица. Колона комбинује најбоље карактеристике силика гела и полимера код које је свака трећа силанолна група замењена метил групом. Ова хидрофобност је распоређена кроз целу структуру честица, дајући на тај начин чврсте хидридне честице, на којима се може радити при вишим протоцима, вишим температурама и вишим рН вредностима. Приликом прелиминарних испитивања, као начин детекције изабрана је UV/Vis детекција. Андрија Ћирић Докторска дисертација 169 Прелиминарна испитивања су рађена на собној темпераури (25 оС) и на 40 оС. Пошто рад при повишеним температурама не доводи до значајног побољшања хроматографсих параметара, одлучено је да радна температура буде собна, јер у том случају нема потребе за коришћењем термостата за колону. Прелиминарна испитивања показују да је интензитет апсорпције анјонског облика већи од катјонског, из чега произилази да би се већа осетљивост одређивања постигла при вишим pH вредностима. Међутим, хроматографски параметри, стабилност колоне и ретенциона времена за све колоне веома су неповољни при повишеним pH вредностима. Стога је оптимизација вршена у области pH вредности од 2 – 6. За одржавање константне pH вредности коришћени су различити пуфери и пуферске смеше (фосфати, PIPES, HEPES). На основу физичко-хемијских карактериситка мокисфлоксацина и сродних супстанци и прелиминарних испитивања састав мобилне фазе треба да обухвати ацетонитрил као органски модификатор у проценту не већем од 20 % v/v (%В) и воду као поларну компоненту (%А). Наиме, због присуства ексципијената у узорку, мобилна фаза мора да буде таква да не долази до њиховог таложења. То значи да мобилна фаза не сме да садржи више од 20 % органског растварача. У циљу проналажења најбољег интерног стандарда за одређивање моксифлоксацина у таблетама и инфузији, током прелиминарних испитивања, као могући интерни стандарди анализирани су офлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, флероксацин и еноксацин. На основу извршених прелиминарних испитивања квалитета раздвајања може се закључити да при изократском начину елуирања на квалитет раздвајања утиче проценат ацетонитрила у мобилној фази, pH вредност воденог дела мобилне фазе и температура Андрија Ћирић Докторска дисертација 170 3.3.2. Развој HPLC методе за одвајање моксифлоксацина и сродних једињења Пре почетка анализе одређена је мртва запремина HPLC система. Мртва запремина HPLC система представља запремину која се налази од миксера мобилних фаза до изласка из инјектора (Слика 89). Слика 89. Мртва запремина HPLC система Потребно је одретити мртву запремину како би се развијена метода пренела са једног на други HPLC систем. Приликом одређивања мртве запремина уклоњена је HPLC колона, а инјектор и детектор су повезани што краћим цревом. Урађене су градијентне анализе приликом чега је коришћен ацетонитрил као растварач А и 0,1 % раствор ацетона у ацетонитрилу као растварач B. Примењен је линеарни градијент у трајању од 10 минута са променом мобилне фазе од 0 – 100 % B и проток од 2 mL/min. На основу добијеног графика зависности %B од tG и ретенционог времена на средишњој тачки градијента израчуната је мртва запремина [300]. За Agilent систем мртва запремина износила је 1,7 mL а за Shimadzu систем 2,7 mL. Ови подаци су унети у програм који повезује ретенције узорака и градијентни састав мобилне фазе. Развој методе почео је са ABZ колоном, а мобилну фазу је чинила вода (A) (фосфатни пуфер pH = 6,0 + 2 % TEA) - тетрахидрофуран, THF (B) и смеша вода (A) (фосфатни пуфер pH = 6,0 + 2 % TEA) - метанол, MeOH (B) са линеарним градијентом од 0 до 50 % B за 20 и 40 минута. Није примећено раздвајање пикова приликом употребе THF, док применом MeOH није постигнута боља резолуција од Rs = 1,1 између критичних парова пикова. У следећем кораку мобилна фаза је замењена са Пумпе Миксер Инјектор Колона Мртва запремина Андрија Ћирић Докторска дисертација 171 смешом вода (A) – ацетонитрил, ACN (B). Оптимизација раздвајања аналита почела је са две линеарне градијентне анализе: tG = 30 минута и tG = 60 минута; % ацетонитрила се мењао од 5 до 50% (одвајање у LC-Gradient моду). Температура је била подешена на 30 о C, а pH водене фазе износио је 5,5. Сви експериментални подаци: ретенциона времена, површина пикова и ширина пикова једињења, температура колоне и подаци о колони и инструменту су коришћени за компјутерску симулацију у програму DryLab®. Да би се добила 2D мапа резолуције разматране су три комбинације параметара: tG/удео органског растварача, tG (градијентно време)/температура колоне и удео органског растварача/pH. Друге могуће комбинације нису разматране. Експериментални услови за градијентно извођење анализа и резултати дати су у Табели 39. Табела 39. Експериментални услови за оптимизацију изократског извођења анализе Градијент B (ацетнитрил) pH T (K) Критични пар Rs (min) 0` - 0% B, 30` - 50% B 5,5 303 6,8DM, 6M8F 0,53 0` - 0% B, 60` - 50% B 5,5 303 6,8DM, 6M8F 0,94 0` - 5% B, 30` - 20% B 2,5 303 6,8DF, mox 0,97 4,5 303 6,8DF, mox 0,87 6,5 303 6,8DM, 6M8F 0,81 0` - 5% B, 60` - 20% B 2,5 303 6,8DF, mox 0,87 2,5 333 6,8DM, 6M8F 0,54 4,5 303 6,8DF, mox 0,86 4,5 333 6,8DM, 6M8F 0,46 6,5 303 6,8DM, 6M8F 0,76 6,5 333 6,8DM, 6M8F 1,79 0` - 5% B, 30` - 30% B 2,5 303 6,8DM, 6M8F 0,92 0` - 5% B, 60` - 30% B 2,5 303 6,8DF, mox 0,95 Андрија Ћирић Докторска дисертација 172 Добијена 1D мапа резолуције приказана је на Слици 90. Слика 90. 1D мапа резолуције добијена оптимизацијом tG/%ACN при pH= 5,5 и T = 30 о C Оптималан удео ацетонитрила за изократско раздвајање испитиваних једињења, како се може уочити са Слике 90, налази се у области од 10 до 13 % ACN. Након тога, приступило се оптимизацији температуре колоне при чему су изведене четири градијентне анализе у току tG = 30 min и 60 min, при чему је удео ацетонитрила мењан од 5 до 20 %, а температура износила 30 оС и 60 оC (начин одвајања LC-RP Gradient/Temperature). На основу добијених хроматограма при испитиваним условима добијена је 2D мапа резолуције приказана на Слици 91. Слика 91. 2D мапа резолуције за оптимизацију tG/температуре при pH = 6,12 50 100 150tG 50 °C 0.00 0.83 1.66 2.50 3.33 4.16 4.99 5.82 6.65 Андрија Ћирић Докторска дисертација 173 Са 2D мапе резолуције приказане на Слици 91 оптималан опсег температуре колоне налази се у интервалу од 45 оС до 47 оC. Имајући у виду да су све испитиване супстанце амфотерне може се очекивати јак утицај pH вредности на одвајање. Експериментални дизајн за оптимизацију pH представљен је на Шеми 6. 30 60tG(min) pH 2.5 4.5 6.5 30 60tG(min) pH 5.56 6.12 T=300C 1% TEA T=450C 2% TEA 4.65 Шема 6. Експериментални дизајн за оптимизацију LC- tG/pH Да би се нашло оптимално pH прво је урађено шест градијентних анализа за tG = 30 и 60 min, а удео ацетонитрила мењао се од 5 до 20 % и pH вредности су износиле 2,5, 4,5 и 6,5 (начин одвајања LC-RP Gradient/pH). Сет хроматограма урађених при овим условима представљен је на Сликама 92 и 93. Слика 92. Сет хроматограма за оптимизацију у LC-RP Gradient/pH, Т = 30 оС, tG = 30 min Андрија Ћирић Докторска дисертација 174 Слика 93. Сет хроматограма за оптимизацију у LC-RP Gradient/pH, Т = 30 оС, tG = 60 min Испитивања промене pH мобилне фазе вршена су при вредности садржаја ацетонитрила који је близак оптималном. Са слика се види да приликом повећања pH вредности долази до смањења интензитета пикова и смањења резолуције. Избор оптималне pH вредности у овом случају диктирају техничке карактеристике колоне, јер се на XTerra колони не сме радити на pH вредностима мањим од 2,5, јер на нижим pH вредностима долази до растварања хидрофобног дела колоне. Имајући у виду квалитет раздвајања, оптимални опсег pH вредности је између 4 и 6. Ове анализе показују да се оптимална област pH налази на вредностима већим од 4,0. Задовољавајуће вредности Rs могу се добити и на нижим pH вредностима (2,5) али при тим условима време анализе је дуго и услови за раздвајање нису робусни. На основу тога, додатних шест градијентних анализа је урађено при pH = 4,65, 5,56 и 6,12, под истим градијентним условима како је претходно наведено. На овај начин препорука [300] да се не мења pH за више од једне јединице у близини pKa је била испоштована. Константе дисоцијације моксифлоксацина су претходно одређене [263] и износе pKa,1 = 6,16 и pKa,2 = 8,72. Изабран интервал pH се налази у близини прве константе дисоцијације. Температура колоне је подешена на 45 оC и проток мобилне фазе на 1,5 mL/min. При Андрија Ћирић Докторска дисертација 175 овим условима снимљени су хроматограми, а подаци добијени из њих искоришћени за истовремено одређивање оптималног рН мобилне фазе као и удела ацетонитрила. Добијена 2D мапа резолуције приказана је на Слици 94. Слика 94. 2D робусна мапа резолуције добијена коришћењем програма DryLab Мењањем услова у изократском начину елуирања, са 2D мапе резолуције нађени су оптимални услови: pH = 6,0 и удео ацетонитрила од 9,8 %. Применом оптималних може се добити израчунати (симулирани) хроматограм раздвајања испитиваних компоненти (Слика 95). Слика 95. Израчунати (симулирани) хроматограм добијен у програму DryLab Критична мапа резолуције показује да ретенција расте да порастом pH вредности и са смањењем процента ацетонитрила. При нижим процентима ацетонитрила у мобилној фази ретенциона времена су неприхватљиво висока (са 20 % ацетонитрила и pH = 8, ретенционо време је 20 min). Оптимална ретенциона времена су добијена са 10 0 10 20 30 40 50%B 4.5 5.0 5.5 pH 0.00 0.32 0.65 0.97 1.30 1.62 1.94 2.27 2.59 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 [1 ] 6 ,8 D F [2 ] M O X [3 ] 6 ,8 D M [4 ] 6 M 8 F [5 ] 6 F 8 E Андрија Ћирић Докторска дисертација 176 % ацетонитрила, али је резолуција између пикова 6,8DM и 6М8F смањена на pH вредностима вишим од 8,0 и нижим од 3,0. Зато су као оптимални услови за раздвајање ових једињења 10 % ацетонитрила и pH вредност 6,0. Симулирана изократска анализа је упоређена са експериментално добијеним хроматограмом под оптималним условима нађеним применом DryLab® програма, и добијени резултати су дати у Табели 40. Табела 40. Поређење симулираних и експерименталних ретенционих података за оптимизовано одвајање модела једињења (10 % ацетонитрила; pH = 6,10) Пик Ретенционо време Резолуција DryLab Експериментално DryLab Експериментално 6,8DF 3,16 3,20 5,55 5,50 MOX 4,65 5,00 4,09 4,00 6,8DM 6,16 6,20 2,36 2,41 6M8F 7,24 7,14 3,66 3,00 6F8E 9,34 9,08 n/a n/a Просечна стандардна грешка 0,10 0,20 Подаци у Табели 40 показују да програм DryLab® прецизно предвиђа ретенцију аналита. Оптимални услови одговарају левом делу критичне резолуционе мапе. Ова област је боља јер је робуснија и није осетљива на мале промене процента органског дела фазе и pH вредности. Хроматографски параметри се мењају за 1 – 3 %, при промени процента ацетонитрила од 8 – 12 % и при промени pH вредности од 4,0 – 8,0. Најосетљивија компонента је 6M8F, али су и њени хроматографски параметри у прихватљивим границама. Из DryLab симулације је евидентно да проценат ацетонитрила и pH јако утичу на ретенцију аналита. Да би се утврдио комбиновани ефекат процента органског модификатора и pH вредности мобилне фазе на истовремено одређивање моксифлоксацина и сродних једињења коришћена је методологија одговора површине. Ови фактори су варирани и то од 8 – 12 % ацетонитрила и pH од 4,0 – 8,0. Одговор који је мерен је релативна ретенција (α). Релативна ретенција је боља мера раздвајања него разлика у ретенционим временима јер не зависи од ефикасности колоне. Релативна ретенција се добија када се већи фактор капацитета подели са мањим фактором. Експериментални подаци коришћени за факторски дизајн приказани су у Табели 41. Израчунавања су вршена коришћењем програма Ststistica v. 6.0. Андрија Ћирић Докторска дисертација 177 Табела 41. Експеримантални подаци за факторски дизајн. No. Exp pH %ACN T (K) %TEA sum R No. Exp pH %ACN T (K) %TEA sum R 1 4 8 313 2 1,48 19 6 10 318 2 8,10 2 4 10 313 2 5,18 20 6 9 318 2 8,99 3 4 12 313 2 5,67 21 6 11 318 2 9,35 4 4,5 10 298 1 3,18 22 6 11 318 2 9,44 5 4,5 10 318 2 2,54 23 6,5 10 298 1 6,79 6 5 8 318 2 1,40 24 6,5 12 298 1 5,47 7 5 12 318 2 3,45 25 6,5 10 298 1 7,73 8 5,5 10 318 1 8,40 26 6,5 10 318 1 6,53 9 6 10 318 2 9,23 27 6,5 8 318 1 6,34 10 6 9 318 1 7,41 28 7 12 298 1 6,80 11 6 10 318 1 7,47 29 7 10 298 1 5,78 12 6 9 323 1 7,13 30 7 10 318 1 4,45 13 6 9 318 2 9,26 31 7,5 8 313 2 2,65 14 6 9 323 1 7,12 32 7,5 10 313 2 3,50 15 6 9 318 1 7,35 33 7,5 12 313 2 5,52 16 6 12 298 1 5,78 34 8 8 318 2 4,42 17 6 10 318 1 8,04 35 8 12 318 2 2,38 18 6 10 318 2 9,27 Почетна ANOVA израчунавања показују 13 коефицијената у квадратном моделу од којих су четири линеарна, четири су квадратна и пет су интеракције и дат је изразом: z = ao + a1 pH +a2 %ACN - a3 T(K) + a4 %TEA -a5 pH 2 -a6 %ACN 2 - a7 T(K) 2 - a8 %TEA 2 + a9pH T(K) + a10 pH %TEA - a11 %ACN T(K) + a12 %ACN %TEA + a13 T(K) %TEA (77) Резултати израчунатих коефицијента приказани су у Табели 42. Табела 42. ANOVA анализа израчунавања факторског дизајна. Коефицијент Вредност ± стандардна грешка Значајност ao 8,33 ± 1,11 Не a1 0,52 ± 0,81 Да a2 0,62 ± 0,33 Да a3 -0,10 ± 1,62 Не a4 0,58 ± 1,19 Да a5 -4,24 ± 1,47 Да a6 -0,57 ± 0,25 Да a7 -0,12 ± 2,07 Не a8 -0,38 ± 0,37 Не a9 0,30 ± 1,94 Не a10 0,04 ± 1,14 Не a11 -0,18 ± 0,81 Не a12 0,50 ± 0,43 Не a13 0,10 ± 1,84 Не Андрија Ћирић Докторска дисертација 178 Из DryLab® симулације евидентно је да удео ацетонитрила, pH и температура колоне, показују јак утицај на ретенцију и одвајање аналита. Приближно оптимални услови захтевају pH око 6, удео ацетонитрила око 10 % и температуру колоне већу од 40 o C. Мада је резолуција критичног пара под овим условима задовољавајућа, примећено је развлачење пикова за моксифлоксацин и 6F8E аналите. Због тога је ABZ колона замењена XTerra колоном којом се добијају симетрични пикови. Даља оптимизација је извођења на XTerra колони коришћењем факторске анализе и методологије одговора површине са почетним вредностима фактора добијених DryLab® анализом. Није постојала значајна разлика у оптималним хроматографским параметрима после примене ове две колоне. Методологија одговора површине омогућава статистичко моделовање и квантификацију ефекта фактора у хроматографским процесима. Испитивани су следећи фактори: pH (X1), %ACN (X2), %TEA (X3). Нивои ових фактора заједно са одговарајућим кодираним вредностима за изабрани централни композитни дизајн су сумирани у Табели 43. Табела 43. Хроматографски фактори и њихове кодиране вредности. pH (X1) 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 Кодирана вредност -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 %ACN (X2) 8 9 10 11 12 Кодирана вредност -2 -1 0 1 2 %TEA (X3) 1 2 3 Кодирана вредност -1 0 1 Кодирање фактора је урађено применом формуле: Xкодирано = (Xстварна – Xпросек)/(опсег/2) Xпросек = (Xmax + Xmin)/2 Опсег = Xmax - Xmin У сваком експерименту укупна резолуција представља збир свих појединачних резолуција између парова пикова. Између два пика резолуција RS1,2 је израчуната коришћењем фомуле [324]: ( )√ ( ) где је Np број теоретских подова аналита, k1 ретенциони фактор пика 1, а k2 за пик 2. Експеримент је дизајниран као подешен централни композитни дизајн са Андрија Ћирић Докторска дисертација 179 понављањима. У циљу смањења броја експеримената температура је подешена на 45 o C, као оптимална вредност одређена DryLab® симулацијом. Потпуни кодирани дизајн дат је у Табели 44. Табела 44. Експериментални дизајн. Oдговор система, ∑ No. pH %ACN %TEA RX No. pH %ACN %TEA RX 1 0 0 0 9,27 20 1,5 2 0 5,52 2 0 0 0 9,23 21 1,5 -2 0 2,65 3 0 0 0 9,37 22 1 0 -1 4,45 4 0 0 1 8,1 23 1 0 -1 5,78 5 0 0 1 8,15 24 1 2 -1 6,8 6 0 0 -1 7,47 25 0,5 0 -1 6,53 7 0 0 -1 8,04 26 0,5 0 -1 7,73 8 0 1 0 8,35 27 0,5 0 -1 6,79 9 0 1 0 8,25 28 0,5 2 -1 5,47 10 0 -1 0 8,99 29 0,5 -2 -1 6,34 11 0 -1 0 9,26 30 -0,5 0 -1 8,4 12 0 -1 -1 7,35 31 -1 2 0 3,45 13 0 -1 -1 7,41 32 -1 -2 0 1,4 14 0 2 -1 5,78 33 -1,5 0 0 2,54 15 0 -1 -1 7,13 34 -1,5 0 -1 3,18 16 0 -1 -1 7,12 35 -2 0 0 5,18 17 2 2 0 2,38 36 -2 2 0 5,67 18 2 -2 0 4,42 37 -2 -2 0 1,48 19 1,5 0 0 3,5 Дизајн се састоји од 37 анализа са неким фракционим фактроијелима и централним тачкама са три понављања и неким поновљеним тачкама, тако да се може проценити pure error. Анализом података наведених у Табели 44 добијају се резултати приказани у Табели 45. Табела 45. ANOVA анализа квадратног хроматографског модела. Коефицијенти SS df MS F p b1 0,737 1 0,737 4,508 0,055211 b11 58,553 1 58,553 357,772 0,000000 b2 4,912 1 4,912 30,014 0,000141 b22 10,207 1 10,207 62,369 0,000004 b3 0,857 1 0,857 5,239 0,041011 b33 0,852 1 0,852 5,205 0,041571 b12 4,062 1 4,062 24,820 0,000319 b23 0,812 1 0,812 4,961 0,045832 Lack of Fit 70,481 16 4,405 26,916 0,000001 Pure Error 1,964 12 0,164 Total SS 198,330 36 Андрија Ћирић Докторска дисертација 180 где је SS – сума квадрата, df – степен слободе, MS – средња вредност суме квадрата, F – Фишерова статистика, p – статистички параметар повезан за значајношћу коефицијената. Како је израчуната вредност p статистичког параметра већа од 0,05 за X1X3 интеракциони коефицијент, у другом циклусу прорачуна овај коефицијент је изостављен и укључен у lack of fit. ANOVA анализа (Табела 45) даје средњу вредност lack of fit од 4,4 која показује примену квадратног модела. За сва четири аналита F-тест између варијанси за „lack of fit“ (loss функција) и за „pure error“ (репликације) даје F вредности много веће од табеларних (критичних) вредности на нивоу поузданости од 0,05, Fкрит. = 4,07. Према томе, анализом површина одговора могуће је утврдити поуздане оптималне услове за раздвајање мокисфлоксацина и сродних једињења. Састав мобилне фазе при коме је могуће добити прихватљиву резолуцију аналита (Rs > 2) и кратко трајање анализе (мање од 10 минута) је 10 % ацетонитрила и 90 % воде, уз додатак 2 % триетиламина и при pH вредности 6,0 (подешено фосфорном киселином). Да би се установио појединачан утицај хроматографских фактора на резолуцију пикова коришћена је метода одговора површине. Укупна резолуција, Rx, се дефинише као збир свих појединачних резолуција између пикова и узета је као функција независних варијабли, % ацетонитрила, рН, температуре и % TEA. Стога укупна резолуција ће се повећавати како се побољшавају аналитичке перформансе. Област блиска максимуму на графику одговора површине се може описати користећи полином другог реда: ∑ ∑ ∑ где је f димензија фактора и грешка које се односи на одговор Rx, и за коју се претпоставља да је нормално распоређена. У Табели 45 су коефицијенти за једначину 79 израчунати заједно са стандардним грешкама. Андрија Ћирић Докторска дисертација 181 Табела 46. Израчунати коефицијенти за квадратни модел хроматографског раздвајања. Коефицијенти Ефекат Стандардна грешка (Pure Err) t(12) р b0 8,23 0,144 56,9798 0,000000 b1 0,58 0,272 2,1233 0,055211 b11 -8,90 0,470 -18,9149 0,000000 b2 1,48 0,270 5,4785 0,000141 b22 -2,80 0,355 -7,8974 0,000004 b3 0,70 0,306 2,2889 0,041011 b33 -0,91 0,400 -2,2814 0,041571 b12 -1,68 0,337 -4,9819 0,000319 b23 1,03 0,465 2,2273 0,045832 Израчунати p статистички параметри показују да је осам коефицијената значајно, а најзначајнији је квадратни pH терм. Такође, интеракција између pH и % ацетонитрила је важна у моделу, мада промене pH и органског модификатора мобилне фазе појединачно утичу на резолуцију. Потребно је пажљиво подешавање оба параметра у циљу постизања квалитетног раздвајања. Количина TEA и његова интеракција са ACN је мање важна. Израчуната површина одговора приказан је на Слици 96. Слика 96. Површина одговора израчуната на основу дизајна Како се може уочити са Слике 96 површина одговора показује релативно широк максимум показујући робусност методе. Резултати су показали да се ретенционо понашање моксифлоксацина може апроскимирати површином другог степена. Оптимизацијом резолуције добијена је површина одговора која има релативно широк максимум између 8 – 12 % ацетонитрила у опсегу pH вредности 4 – 8. Андрија Ћирић Докторска дисертација 182 Оптималне вредности су нађене коришћењем методе нелинеарних најмањих квадрата. Оптимални услови експерименталним дизајном дати су у Табели 47. Табела 47. Оптимални услови за раздвајање и одрђивање моксифлоксацина и сродних једињења у фармацеутским формулацијама утврђени експерименталним дизајном. Параметар Опимални услови Колона XTerra (50×4,6 mm, 5 m) Проток 1,5 mL/min Температура 45 оС Детекција UV 290 nm Запремина инјектовања 20 L % Aцетонитрила 10 % pH вредности мобилне фазе 6,0 % Tриетиламина 2 % При експерименталним условима наведеним у Табели 47 добијена су прихватљива ретенциона времена, при максималном раздвајању моксифлоксацина, сродних једињења моксифлоксацина и офлоксацина и у блиској су сагласности са резултатима добијеним DryLab симулацијом. Оптимизација релативне ретенције дала је врло сличне резултате. Такође, при овим условима су добијени и најбољи резултати за релативну стандардну девијацију површина пикова. На различитим системина за HPLC (под истим хроматографским условима) не постоји значајна разлика у израчунатим концентрацијама, а нађени хроматографски параметри су приказани у Табели 48. Табела 48. Основне хроматографске карактеристике раздвајања моксифлоксацина и четири сродне нечистоће раздвојене на XTerra колони при оптималним условима. Параметар Инструмент 6,8DF MOX 6,8DM 6M8F 6F8E Релативно ретенционо време Shimadzu 0,714 1,00 1,434 1,549 1,710 Agilent 0,758 1,00 1,540 1,600 1,674 Релативни фактор одговора Shimadzu 0,991 1,00 0,415 0,404 0,529 Agilent 1,190 1,00 0,430 0,460 0,589 Резолуција Shimadzu 5,239 2,757 2,779 1,553 1,410 Agilent 5,460 2,900 2,910 1,600 1,420 Tailing Shimadzu 1,189 0,980 1,160 0,976 1,072 Agilent 1,010 1,000 0,890 0,970 0,984 Андрија Ћирић Докторска дисертација 183 3.3.3. Одређивање сродних једињења моксифлоксацина Циљ одређивања сродних једињења моксифлоксацина у воденој фази је провера погодности методе, хроматографског система, стабилности параматара за њихово одређивање у дозираним облицима. У процесу оптимизације методе за одређивање сродних једињења моксифлоксацина (6F8Е - 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8- етокси-6-флоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина, 6M8F - 1- циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-флуоро-6-метокси-1,4- дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина), 6,8DM - 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8-диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина), 6,8DF - 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8- ил]-6,8-дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) у воденој фази, утврђени оптимални услови приказани су у Табели 47. Под приказаним условима добијен је хроматограм смеше стандарда моксифлоксацина (200 g/mL), сродних једињења (1 g/mL), и офлоксацина (1 g/mL), као интерног стандарда приказан је на Слици 97. Слика 97. Хроматограм смеше стандарда моксифлоксацина (200 g/mL), сродних једињења (1 g/mL), и офлоксацина (1 g/mL) при утврђеним експерименталним условима За одређивање садржаја појединих једињења конструисане су радне калибрационе праве где је концентрацијa интерног стандарда (ИС) (офлоксацина) износила 1 g/mL. Андрија Ћирић Докторска дисертација 184 Радна калибрациона права за одређивање 6F8Е (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-етокси-6-флоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) у воденој фази приказана је на Слици 98, а одговарајући валидациони параметри у Табели 49. Слика 98. Радна калибрациона права за одређивање 6F8E у воденој фази. P6F8Е/PO – oднос површина 6F8E и офлоксацина (ИС), C6F8Е/CO – однос концентрација 6F8E и офлоксацина (ИС) Табела 49. Валидациони параметри за одређивање 6F8E у води Валидациони параметар Резултат Линеарни опсег концентрација (N = 12, n = 3) 0,4857 – 1,9427 mg/L Регресиона једначина за калибрациону праву Y = (0,99 ± 0,02)X – (0,12 ± 0,02) Коефицијент корелације 0,9986 Граница квантификације 0,21 mg/L Граница детекције 0,061 mg/L Радна калибрациона права за одређивање 6M8F (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-флуоро-6-метокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) у воденој фази приказана је на Слици 99, а одговарајући валидациони параметри у Табели 50. y = 0,9914x - 0,1156 R² = 0,9986 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 0,5 1 1,5 2 P6F8E/PO C6F8E/CO Андрија Ћирић Докторска дисертација 185 Слика 99. Радна калибрациона права за одређивање 6M8F у воденој фази. P6M8F/PO – oднос површина моксифлоксацина и офлоксацина (ИС), C6M8F/CO – однос концентрација 6M8F и офлоксацина (ИС) Табела 50. Валидациони параметри за одређивање 6M8F у води Валидациони параметар Резултат Линеарни опсег концентрација (N = 12, n = 3) 0,506 – 2,024 mg/L Регресиона једначина за калибрациону праву Y = (0,86 ± 0,01)X – (0,14 ± 0,02) Коефицијент корелације 0,9990 Граница квантификације 0,1824 mg/L Граница детекције 0,0547 mg/L Радна калибрациона права за одређивање 6,8DM (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8-диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) у воденој фази приказана је на Слици 100, а одговарајући валидациони параметри у Табели 51. y = 0,8562x - 0,1399 R² = 0,9990 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 0,5 1 1,5 2 2,5 P6M8F/PO C6M8F/CO Андрија Ћирић Докторска дисертација 186 Слика 100. Радна калибрациона права за одређивање 6,8DM у воденој фази. P6,8DM/PO – oднос површина 6,8DM и офлоксацина (ИС), C6,8DM/CO – однос концентрација 6,8DM и офлоксацина (ИС) Табела 51. Валидациони параметри за одређивање 6,8DM у води Валидациони параметар Резултат Линеарни опсег концентрација (N= 12, n = 3) 0,4922 – 1,9686 mg/L Регресиона једначина за калибрациону праву Y = (0,75 ± 0,01)X – (0,14 ± 0,01) Коефицијент корелације 0,9994 Граница квантификације 0,14 mg/L Граница детекције 0,041 mg/L Радна калибрациона права за одређивање 6,8DF (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8-дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) у воденој фази приказана је на Слици 101, а одговарајући валидациони параметри у Табели 52. y = 0,7543x - 0,1449 R² = 0,9994 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 0,5 1 1,5 2 2,5 P6,8DM/PO C6,8DM/CO Андрија Ћирић Докторска дисертација 187 Слика 101. Радна калибрациона праваљ за одређивање 6,8DF у воденој фази. P6,8DF/PO – oднос површина 6,8DF и офлоксацина (ИС), C6,8DF/CO – однос концентрација 6,8DF и офлоксацина (ИС) Табела 52. Валидациони параметри за одређивање 6,8DF у води Валидациони параметар Резултат Линеарни опсег концентрација (N = 12, n = 3) 0,5179 – 2,0717 mg/L Регресиона једначина за калибрациону праву Y = (1,06 ± 0,02)X – (0,04 ± 0,02) Коефицијент корелације 0,9989 Граница квантификације 0,20 mg/L Граница детекције 0,06 mg/L 3.3.4. Одређивање нечистоћа у фармацеутским формулацијама “Avelox-a” Приликом испитивања присуства нечистоћа припремљен је раствор таблета и инфузије тако да концентрација моксифлоксацина износи 200 g/mL и додат интерни стандард офлоксацина тако да његова крајња концентрација износи 1 g/mL. Снимљен је хроматограм овако припремљених раствора за испитивање присуства нечистоћа који је приказан на Слици 102. y = 1,0644x - 0,0427 R² = 0,9989 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 P6,8DF/PO C6,8DF/CO Андрија Ћирић Докторска дисертација 188 Слика 102. Хроматограм таблете “Avelox” (активна компонента моксифлоксацин) у присуству интерног стандарда офлоксацина (1 g/mL) Пик нечистоће на tR = 8,015 min је забележен у растворима таблета и инфузије. Тај пик је веома добро раздвојен од стандарда моксифлоксацина (релативно ретенционо време, RRT = 1,52). Квантификација нечистоће у односу на референтни стандард моксифлоксацина даје удео од 0,11 %. Поређењем вредности RRT и DAD спектра познатих синтетичких нечистоћа показује да је нечистоћа вероватно 6-метокси-8- флуоро (6M8F) једињење. 3.3.5. Одређивање производа присилне деградације моксифлоксацина Деградација стандарда моксифлоксацина, као и његових дозираних облика (инфузије и таблета “Avelox”) изведена је при хидролитичким условима у киселој (0,1 mol/L HCl), неутралној (водена средина) и базној (0,1 mol/L NaOH) средини, при чему су раствори загревани на температури од 50 оС у трајању од 3 сата. Оксидациони стрес је изведен у присуству 3 % раствора Н2О2, при чему је раствор остављен 6 сати на собној температури пре анализе, док је фотолитички стрес изведен у светлосној комори са две UV лампе, где је коришћено укупно зрачење од 840 Wh/m2 у трајању од 3 сата. Пре анализе, у све растворе додата је иста количина интерног стандарда (офлоксацина) тако да његова крајња концентрација износи 1 μg/mL. Приликом деградације таблета и инфузија уочено је да не постоји интеракција између моксифлоксацина и ексципијената. На Сликама 103 и 104 су представљени Андрија Ћирић Докторска дисертација 189 хроматограми производа деградације инфузије моксифлоксацина у киселој и базној средини, а на Сликама 105 и 106 деградација “Avelox” табелете. Слика 103. Хроматоргам производа деградације инфузије моксифлоксацина у киселој средини у присуству интерног стандарда офлоксацина Слика 104. Хроматоргам производа деградације инфузије моксифлоксацина у базној средини у присуству интерног стандарда офлоксацина Андрија Ћирић Докторска дисертација 190 Слика 105. Хроматоргам производа деградације таблете моксифлоксацина у киселој средини у присуству интерног стандарда офлоксацина Слика 106. Хроматоргам производа деградације таблете моксифлоксацина у базној средини у присуству интерног стандарда офлоксацина Приликом хидролтичке деградације инфузије и таблете “Avelox-a” примећена су два деградациона производа на tR = 7,049 и 6,728 min (кисела хидролиза) и tR = 8,088 и 6,059 min (базна хидролиза). Укупни хидролитички производи деградације су око 0,3 %. Сумирани подаци присилне деградације стандарда, таблете и инфузије моксифлоксацина при различитим условима приказани су у Табели 53. Андрија Ћирић Докторска дисертација 191 Табела 53. Услови и резултати присилне деградације стандарда, таблете и инфузије моксифлоксацина Деградациони услови Стандард Таблета Инфузија % деградације RRT % деградације RRT % деградације RRT 0,1 M HCl; 90 0 C, 3 h 0,2 1,380 0,1 1,381 0,2 1,390 0,28 1,570 0,24 1,575 0,31 1,580 0,1 M NaOH; 90 0 C, 3h 0,28 1,400 0,21 1,420 0,30 1,410 0,20 1,570 0,17 1,562 0,21 1,575 H2O2 (20% v/v) 3h - - - - - - Загревање (1200C); 24 h < 0,1 1,60 < 0,1 1,58 - - Фотостабилност - дневна светлост, 72 h - - - - - - UV (310 nm), 24 h - - - - - - Приликом хидролитичке деградације стандарда моксифлоксацина као и његових дозираних облика јављају се два деградациона производа на ретенционим временима tR= 5,90 и 6,73 min (киселна хидролиза) и tR= 6,05 и 6,67 min (базна хидролиза). Укупни садржај деградационих производа приликом хидролитичке деградације је око 0,3 %. Приликом фотолитичких или оксидативних услова деградације нису нађени други пикови осим моксифлоксацина, на основу чега се може закључити да је лек стабилан приликом оксидативне и фото деградације. Андрија Ћирић Докторска дисертација 192 3.4. Спектрофотометријско одређивање моксифлоксацина у серуму Моксифлоксацин је одређиван у хуманом серуму спектрофотометријском методом. У циљу развоја спектрофотометријске методе извршена је оптимизација методе која је обухватала: - Прелиминарна испитивања, - Потенциометријска мерења, - Оптимизацију спектрофотометријских услова, - Конструкцију калибрационе праве за одређивање моксифлоксацина у серуму - Валидацију развијене спектрофотометријске методе и - Примену спектрофотометријске методе за одређивање моксифлоксацина на хуманим волонтерима. 3.4.1. Прелиминарна испитивања Моксифлоксацин је слаба хетероциклична амино киселина, која може постојати у раствору у катјонском, неутралном, диполарном и анјонском облику. Релативна концентрација ових облика веома зависи од pH вредности раствора. Стога је неопходна строга контрола pH приликом одређивања моксифлоксацина коришћењем спектрофотометријске методе. Спектар моксифлоксацина се састоји од две главне траке са максимумом на 290 nm за прву и 340 nm за другу траку. Високоенергетска трака потиче превасходно од  → * прелаза у ароматичном прстену. Нискоенергетска трака потиче од n → * прелаза у диазабицикло-супституенту на позицији 7 и садржи два подпика. Ови подпикови такође представљају утицај слободног електронског пара на атому азота на позицији 1 и изазван је интермолекулским водоничним везама између моксифлоксацина и воде као и интрамолекулских водоничних веза између 4-кето и 3-карбоксилне групе [325, 326]. Приликом повећања pH од 4 до 9, високоенергетска трака показује само мале промене таласне дужине и интензитета сигнала (хипохромно померање). Трака ниже енергије показује приметне разлике у облику, вредности таласне дужине (батохромно померање) и интензитету. При pH вредностима мањим од 7, ова трака је приближно симетрична са максимумом на 350 nm, али на pH вредностима већим од 7 на спектру се уочавају два одвојена маскимума на 335 nm и 355 nm. Интензитет траке се повећава сa повећањем Андрија Ћирић Докторска дисертација 193 pH до 8, а након тога опада. На основу тога оптимална вредност pH за одређивање је 7,2. Испитивањем спектра моксифлоксацина у воденој фази, чије је pH подешавано додатком јаке киселине или базе и мерено потенциометријски, и њиховим поређењем са спектрима код којих је pH подешавано пуферима, уочава се занемарљив утицај пуфера на апсорпцију моксифлоксацина. Додатком SDS повећава се интензитет апсорпционих пикова за око 5% и апсорпционе траке постају симетричније. Присуство SDS такође утиче на померање изоелектричне тачке моксифлоксацина са 7,44 на 8,21, при чему се растворљивост задржава на прихватљивом нивоу. Стога је пик са максимумом на таласној дужини од 340 nm изабран за анализу моксифлоксацина у узорку. 3.4.2. Оптимизација спектрофотометријских услова мерења За спектрофотометријска мерења коришћен је радни раствор моксифлоксацина концентрације 2×10-4 mol/L. Мерења су вршена на собној темератури (298 ± 0,1 K) и у области таласних дужина од 310 до 440 nm. Због немогућности коришћења основног спектра који се углавном састоји од широких некарактеристичних трака, чији изглед пружа мало корисних инфирмација, за конструкцију калибрационе криве потребно је урадити други извод апсорпционог спектра тј. тражи се промена апсорбанције са променом таласне дужине у зависности од таласне дужине. На Слици 107 приказани су спектри водених раствора моксифлоксацина различитих концентрација у присуству 0,1 mol/L LiCl у области таласних дужина од 310 до 440 nm. Као референтни раствор коришћена је само бидестилована вода. pH вредност испитиваног раствора кретала се између 5 и 6, што је одређено помоћу универзалног индикаторског папира. Андрија Ћирић Докторска дисертација 194 Слика 107. Спектри моксифлоксацина различитих концентрација у присуству 0,1 mol/L LiCl, у pH опсегу од 5 – 6 Моксифлоксацин показује максимум апсорпције на таласној дужини око 340 nm. Као што се очекује са повећањем концентрације моксифлоксацина долази до пораста апсорбанције. На Слици 108 дати су UV/Vis спектри раствора моксифлоксацина чија концентрација износи 5,35×10-5 mol/L у области pH вредности од 1,8 до 11,9. pH је подешено додатком јаке киселине и/или јаке базе. Као слепа проба коришћен је 0,1 mol/L раствор LiCl, а pH је мерено потенциометријски. Слика 108. Апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L при различитим pH вредностима у 0,1 mol/L раствору LiCl 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 310 330 350 370 390 410 430 A  (nm) 1.003×10-5 M 2.006×10-5 M 3.009×10-5 M 5.012×10-5 M 8.025×10-5 M 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 320 340 360 380 400 420 440 A (nm) 1,8 3,666 4,817 5,688 6,022 6,311 7,033 7,87 8,323 8,835 9,4 10,284 11,87 Андрија Ћирић Докторска дисертација 195 Види се да интензитет и положај апсорпционих трака зависи од pH. Слика 109. Издвојени апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у интервалу pH од 1,80 до 8,84 у 0,1 mol/L раствору LiCl Слика 109 представља издвојене спактре раствора моксифлоксацина у којима се pH креће у границама од 1,80 до 8,84. Као што се може приметити апсорпциони максимуми расту са порастом pH вредности. Међутим, ово није случај и са спектром који је снимљен на pH = 8,84, чији се апсрпциони максимум налази на мањој вредности него што би се то могло претпоставити. Узрoк томе је појава да се моксифлоксацин на високим вредностима pH хемијски модификује. На Слици 110 је приказан утицај SDS на апсорпциони спектар моксифлоксацина. Слика 110. Апсорпциони спектар моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS у 0,1 mol/L раствору LiCl 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 320 340 360 380 400 420 440 A (nm) 1,800 3,666 4,817 5,688 6,022 6,311 7,033 7,870 8,323 8,835 0 0,5 1 1,5 2 2,5 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A  (nm) са SDS без SDS Андрија Ћирић Докторска дисертација 196 Као што се може видети са Слике 110 приликом додатка SDS-а у водени раствор моксифлоксацина долази до смањења интензитета нискоенергетске траке као и до дељења тог максимума на два мања пика. На Слици 111 приказани су спектри моксифлоксацина у присуству SDS-а где је pH подешавано додатком јаке базе и јаке киселине и мерено потенциометријски. Као растварач коришћена је бидестилована вода. За слепу пробу узет је раствор који садржи 12 mmol/L SDS у 0,1 mol/L раствору LiCl. Слика 111. Апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS у 0,1 mol/L раствору LiCl где је pH подешавано јаком киселином и/или јаком базом Са слике 111 види се утицај тензида SDS-а на спектре раствора моксифлоксацина. Његовим додавањем јавља се смањење у интензитету апсорбанције раствора. Спектри се ређају према порасту pH. На Слици 112 су приказани спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS у 0,1 mol/L раствору LiCl где је pH подешавано додатком пуфера. 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 310 330 350 370 390 410 430 A  (nm) 4,396 4,909 5,658 6,359 6,552 6,981 7,463 7,759 8,013 8,612 Андрија Ћирић Докторска дисертација 197 Слика 112. Апсорпциони спектри моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у пуферима различитих pH вредности у 0,1 mol/L раствору LiCl За pH вредности од 5 до 8 коришћен је цитратни пуфер, а за pH у области од 8,5 до 9,0, коришћен је боратни пуфер. Као референтни раствор коришћен је раствор пуфера чије је pH = 7,2. Као и на Слици 108 где је pH мерено потенциометријски и овде се уочава да у киселој и неутралној средини апсорпциони максимуми расту са порастом pH, али у слабо базној средини опет долази до опадања интензитета максимума апсорпције. Ово се боље уочава на Сликама 113, 114 и 115. Слика 113. Издвојени апсорпциони спектри мокисфлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у пуферима од pH 5 до 7,2 у 0,1 mol/L раствору LiCl 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 310 330 350 370 390 410 430 A  (nm) 5 5,6 6 6,6 7,2 8 8,5 8,8 9 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 310 330 350 370 390 410 430 A  (nm) 5 5,6 6 6,6 7,2 Андрија Ћирић Докторска дисертација 198 Слика 114. Издвојени апсорпциони спектри мокисфлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у пуферима од pH 7,2 до 9,0 у 0,1 mol/L раствору LiCl Слика 115. Апсорпциони спектри мокисфлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству 12 mmol/L SDS пуферима у 0,1 mol/L раствору LiCl Као што се примећује на Слици 115 максимум апсорбанције раствора код којег је pH = 7,2 је мањи од раствора код којег је pH = 6,6. Ово је последица разлагања моксифлоксацина са порастом рН раствора. Максимум апсорбанције на свим рН вредностима је на блиским таласним дужинама. 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 1,000 310 330 350 370 390 410 430 A  (nm) 7,2 8 8,5 8,8 9 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 320 340 360 380 400 420 440 A (nm) 5 5,6 6 6,6 7,2 8 8,5 8,8 9 Андрија Ћирић Докторска дисертација 199 Ради одређивања моксифлоксацина у серуму у присуству SDS-а било је неопходно испитати утицај SDS-а на спектар серума. У ту сврху снимљени су спектри серума без и у присуства SDS-а. Протеини плазме апсорбују на таласној дужини од 280 nm (Слика 116) Слика 116. Апсорпциони спектри серума без и у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl Као што се може видети са Слике 116 присуство SDS-а не утиче на апсорпциони спектар серума, односно не постоји никаква интеракција између серума и SDS-а. Следећи корак је био испитивање утицаја серума на апсорпциони спектар моксифлоксацина. Збор тога је снимљен апсорпциони спектар моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mol/L у присуству серума у 0,1 mol/L раствору LiCl (Слика 117). Слика 117. Апсорпциони спектри серума без и у присуству моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 220 260 300 340 380 420 460 500 A  (nm) Serum Serum+SDS 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 220 260 300 340 380 420 460 500 A  (nm) Serum Serum+MOX Серум Серум + SDS Серум Серум + MOX Андрија Ћирић Докторска дисертација 200 Са Слике 117 се може видети да присуство серума утиче на високоенергетски апсорпциони максимум моксифлоксацина јер се налази на приближно истој таласној дужини као апсорпциони максимум самог серума, док овај утицај изостаје код нискоенергетског максимума моксифлоксацина. Да би могла да се искористи деривативна спектрофотометријска метода за одређивање моксифлоксацина било је неопходно снимити спектре моксифлоксацина у присуству серума са и без присуства SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини. Добијени спектри приказани су на Слици 118. Слика 118. Апсорпциони спектри серума и моксифлоксацина концентрације 5,35×10-5 mmol/L без и у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини Како се може видети са Слике 118, у присуству SDS-а, долази до смањења интензитета нискоенергетске траке моксифлоксацина у серуму и његове поделе на два мања пика, што је искоришћено за одређивање моксифлоксацина у серуму. За одређивање концентрације моксифлоксацина у серуму снимљени су апсорпциони спектри стандардних раствора моксифлоксацина и нађени су њихови други изводи. На основу амплитуде између два суседна пика у другом изводу и концентрације коришћених раствора конструисана је калибрациона крива која је коришћена за одређивање непознате концентрације моксифлоксацина у серуму. Оптимални услови за одређивање моксифлоксацина у плазми и дозираним облицима су: таласна дужина максималне апсорпције 340 nm и pH вредност од 7,2. На 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 220 260 300 340 380 420 460 500 A  (nm) Serum+MOX Serum+MOX+SDS Серум + MOX Серум + MOX + SDS Андрија Ћирић Докторска дисертација 201 Слици 119 представљен је спектар моксифлоксацина у присуству серума, а на Слици 120 његов други извод. Слика 119. Апсорпциони спектри различитих концентрација моксифлоксацина у серуму за калибрациону криву у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини 325 330 335 340 345 350 355 -0.0150 -0.012 -0.010 -0.008 -0.006 -0.004 -0.002 0.000 0.002  nm D2 Слика 120. Други извод апсорпционих спектара различитих концентрација моксифлоксацина у серуму за калибрациону криву у присуству SDS концентрације 12 mmol/L у 0,1 mol/L LiCl средини 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 300 320 340 360 380 400 420 A  (nm) 0,4025 0,6762 0,805 1,2558 2,3 2,99 5,75 Андрија Ћирић Докторска дисертација 202 Калибрациони график за деривативно спектрофотометријско одређивање конструисан је наношењем зависности амплитуде пик – пик, из другог извода спектра, у функцији од концентрације моксифлоксацина. Амплитуде су мерене у интервалу таласних дужина од 334 – 348 nm. Подаци коришћени за калибрациону криву су представљени у Табели 54, а добијен калибрациони график за одређивање моксифлоксацина у плазми приказан је на Слици 121. Табела 54. Вредности за конструкцију калибрационе криве за одређивање концентрације моксифлоксацина у серуму. Конц. (g/mL)  nm  2 A/2 0,40 0,0136 – 0,0116 334 – 348 0,0006578 0,68 0,0234 – 0,0200 334 – 348 0,0014154 0,81 0,0284 – 0,0238 334 – 348 0,0020310 1,26 0,0426 – 0,0358 334 – 348 0,0031683 2,30 0,0732 – 0,0616 334 – 348 0,0058829 2,99 0,0879 – 0,0743 334 – 348 0,0073916 5,75 0,1644 – 0,1391 334 – 348 0,0136322 Слика 121. Калибрациона права за одређивање моксифлоксацина у хуманој серуму y = 0,0024x + 1E-07 R² = 0,997 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014 0,016 0 1 2 3 4 5 6 7 2A 2 конц. (mg/mL) Андрија Ћирић Докторска дисертација 203 Да би се испитала исправност методе у серум су додате три различите концентрације моксифлоксацина (0,575, 2,07 и 4,025 g/mL) и снимељени су апсорпциони спектри тих раствора који су приказани на Слици 122. Слика 122. Апсорпциони спектри различитих концентрација моксифлоксацина у серуму у присуству 12 mmol/L SDS na pH = 7,2 Како пик на таласној дужини 340 nm није добро раздвојен од пика на 355 nm коришћен је други извод спектра који су приказани на Слици 123. На овај начин апсорпција позадине серума је минимизована. 325 330 340 350 355 -0.0150 -0.014 -0.012 -0.010 -0.008 -0.006 -0.004 -0.002 0.000 0.002  nm D2 Слика 123. Други извод апсорпционих спектара различитих концентрација моксифлоксацина у серуму у присуству 12 mmol/L SDS na pH = 7,2 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 300 320 340 360 380 400 420 440 A  nm I 4.025 II 4.025 III 4.025 IV 4.025 I 2.07 II 2.07 III 2.07 IV 2.07 I 0.575 II 0.575 III 0.575 IV 0.575 Андрија Ћирић Докторска дисертација 204 На основу другог извода апсорпционог спектра моксифлоксацина и калибрационе криве, одређене су концентрације моксифлоксацина у серуму и добијени подаци анализе приказани су у Табели 55. Табела 55. Резултати погодности методе за одређивања моксифлоксацина у серуму Узета концентрација (g/mL) 0,575 2,070 4,025 Нађена концентрација (g/mL) 0,676 1,941 4,196 0,586 1,805 4,235 0,575 1,985 4,211 0,599 1,915 4,192 Средња концентрација (g/mL) 0,609 1,912 4,209 Средња вредност квадрата 0,372 3,658 17,712 Дисперзија 0,002 0,004 0,000 Стандардна девијација 0,040 0,066 0,017 Релативна стандардна девијација 6,503 3,473 0,401 Процена грешке мерења 0,073 3,473 0,031 Апсолутна грешка 0,034 0,159 0,184 Релативна грешка 0,056 0,083 0,044 Метода је примењена за анализу моксифлоксацина у плазми код два здрава волонтера који су узели таблету „Avelox-а“. Узети су узорци крви (1 mL) из вене један сат након узимања лека. Крв је остављена да се згрушава на собној температури и након тога центрифугирана 30 минута при 1500 rpm. Одређивање садржаја моксифлоксацина у тако добијеном серуму извршено је по већ описаној методи. Основни UV спектар плазме једног од пацијената приказан је на Слици 124. Слика 124. UV спектар плазме пацијента без и у присуству SDS-а Андрија Ћирић Докторска дисертација 205 Резултати анализе након пет понављања су за први узорак: 3,56 ± 0,15 g/mL и за други узорак 3,89 ± 0,10 g/mL моксифлоксацина. Како би се упоредила и валидовала спектрофотометријска метода примењена је модификована HPLC метода из литературе [263]. Приликом развоја методе тежило се да pH вредност буде неутрална као што је урађено код спектрофотометријске методе. На коришћеној колони није дозвољено да pH вредност буде већа од 7, стога је варирањем експерименталних параметара pH подешено на 6,5, док је у исто време проценат ацетонитрила повећан али тако да су задовољени хроматографски параметри. Оптерећени узорак плазме је директно инјектиран на колону. Добијени хроматограм узорка плазме пацијента приказан је на Слици 125. Слика 125. Хроматограм плазме пацијента узет 1 сат након примене „Avelox“ таблете (400 mg) Калибрациона права је конструисана наношењем зависности односа површина пикова за моксифлоксацин и офлоксацин у зависности од односа концентрација моксифлоксацина и офлоксацина. Концентрација офлоксацина била је 0,5 g/mL. Метода је валидирана и добијени су следећи валидациони параметри: опсег линеарности 50 - 1500 ng/mL, коефицијент корелације 0,9983, „recovery” 98,5%, лимит квантификације 12,0 ng/mL и лимит детекције 5,0 ng/mL. Концентрација моксифлоксацина у серуму пацијента је одређена на основу калибрационе праве и износила је 4,05 ± 0,08 g/mL. Релативна грешка у односу на спектрофотометријска мерења је 4,1 %, што значи да је тачност и прецизност предложене спектрофотометријске методе задовољавајућа. Андрија Ћирић Докторска дисертација 206 4. Дискусија резултата Андрија Ћирић Докторска дисертација 207 У циљу изналажења оптималних услова за раздвајање и одређивање флавоноида и њихових аналога у храни и фармацеутским формулацијам извршена је: 1. Екстракција биофлавоноида из узорака црвеног лука, коре поморанџе и меда. 2. Течно-чврста екстракција биофлавоноида из екстраката црвеног лука, коре поморанџе и меда. 3. Процена матричног ефекта приликом одређивања биофлавоноида у црвеном луку, кори поморанџе и меду. 4. Оптимизација услова за одређивање биофлавоноида: хесперетина, хесперидина, кверцетина, рутина и каемпферола и њихово одређивање у узорцима црвеног лука, коре поморанџе и меда применом LC-MS/MS методе. 5. Оптимизација RP-HPLC методе за одређивање биофлавоноида: кверцетина, каемпферола, апигенина, лутеолина, катехина и епикатехина у узорцима фамилије Brassica. 6. Мерење антиоксидативне активности екстраката узорака из фамилије Brassica. 7. Оптимизација услова и одређивање сродних и деградационих производа мокисфлоксацина (аналога флавоноида) применом RP-HPLC методе у фармацеутским формулацијама. 8. Оптимизација услова за одређивање моксифлоксацина у узорцима хуманог серума применом спектрофотометријске методе. 4.1. Екстракција биофлавоноида из узорака хране Постоје три главне врсте матрица у којима се одређују флавоноиди: биљке, храна и течни узорци као што су биолошке течности и пића. Све методе за одређивање биофлавоноида у овим узорцима заснивају се на претходној екстракцији аналита. До сада је развијено више метода за екстракцију биофлавоноида из узорака хране биљног порекла, при чему је главни циљ био постићи што већу селективност и ефикасност екстракције. На основу литературних података за екстракцију биофлавоноида из узорака хране најчешће се користе методе екстракције по Сокслету, микроталасна екстракција, ултразвучна екстракција, екстракција мацерацијом, суперкритична флуид екстракција, екстракција кључалом водом и др. Андрија Ћирић Докторска дисертација 208 Од поменутих метода у овој докторској дисертацији примењене су и упоређене следеће методе за екстракцију биофлавоноида из узорака хране:  Екстракција по Сокслету  Ултразвучна екстракција Циљ овог упоређивања био је да се развије једноставна и брза метода екстракције биофлавоноида из различитих узорака хране, при чему је било потребно да се: a) постигне што већа специфичност екстракције за испитиване аналите, b) постигне што већа ефикасност екстракције испитиваних аналита, c) користе нетоксични растварачи, d) употребе мале количине растварача, e) екстракција врши у што краћем временском периоду, f) екстракција врши на што нижој температури. У циљу развоја методе која испуњава горе наведене услове, израчуната је ефикасност екстракције поређењем количине аналита добијене применом ултразвучне екстракције са количином аналита добијене екстракцијом по Сокслету. За ефикасност екстракције по Сокслету узето је да износи 100%. Ефикасност екстракције биофлавоноида из узорака хране (изражена у %) је добијена коришћењем формуле: На ефикасност екстракције утиче природа растварача. Обично се растварачи бирају на основу њихове тачке кључања, диелектричне константе и фактора расипања. За екстракцију биофлавоноида као растварачи најчешће се користе: вода, ацетон, алкохоли (метанол, етанол и пропанол) као и њихове смеше. Физичко-хемијске особине одабраних растварача приказане су у Табели 56. Андрија Ћирић Докторска дисертација 209 Табела 56. Физичко-хемијске карактеристике растварача који се најчешће користе за екстракцију биофлавоноида. Растварач Диелектрична константа (`) Фактор расипања (tan ) Тачка кључања ( оС) Вискозност (сР) Ацетон 20,7 5555 56 0,30 Ацетонитрил 37,5 620 82 Етанол 24,3 2500 78 0,69 Хексан 1,89 69 0,30 Метанол 32,6 6400 65 0,54 2-Пропанол 19,9 6700 82 0,30 Вода 78,3 1570 100 0,89 Етил ацетат 6,02 5316 77 0,43 Током екстракције долази до преноса енергије на узорак конвекцијом, кондукцијом и радијацијом са површине расторене супстанце приликом загревања. Најзначајнија карактеристика растварача је диелектрична константа и фактор расипања који су дефинисани једначинама: √ и где представља стварни део диелектричне константе, а имагинарни део, или “loss factor”. Диелектрична константа одређује колико ће случајне енергије деловати на површину ваздух-узорак и колико се пренети унутар узорка. Ефикасност адсорбоване енергије која се преводи у топлоту одређује вредност “loss factor”. Фактор расипања (tan ) је важна карактеристика растварача који показује способност матрикса да адсорбује енергију и пренети енергију на околне молекуле и одговоран је за ефикасност екстракције. Мање поларни флавоноиди (изофлавони, флаванони, метиловани флавони и флавоноли) се екстрахују хлороформом, дихлорометаном, диетил етром или етил ацетатом, док се гликозиди флавоноида и поларнији агликони екстрахују алкохолом или смешом алкохола и воде. Пошто гликозиди имају већу растворљивост у води, за њихову екстракцију се употребљава смеша неког алкохола и воде. У сврху одабира најпогоднијег растварачa испитани су различити растварачи (метанол, ацетон, и вода) као и њихове смеше. Ацетон и вода како појединачно тако и у смеши, екстрахују мале количине биофлавоноида из испитиваних узорака, док смеша Андрија Ћирић Докторска дисертација 210 метанола и воде даје знатно већи принос биофлавоноида. Коришћење чистог метанола дало је највећи принос екстрахованих биофлавоноида, па је у даљем раду коришћен екстракцију. Осим избора одговарајућег растварача на ефикасност екстракције биофлавоноида, из узорака хране, могу утицати температура и време трајања екстракције. Повишене температуре и дуже време екстракције, доводе до боље екстракције аналита. Утицај температуре на ефикасност екстракције испитан је у интервалу од 40 – 80 оС. Показало се да је бољи принос екстракције биофлавоноида добијен при температури од 40 оС, јер се биофлавоноиди у биљкама, при вишим температурама разлажу или подлежу нежељеним реакцијама, као што је ензимска оксидација. У циљу што потпуније екстракције биофлавоноида из узорака, процес екстракције је поновљан три пута са чистим растварачем. На Слици 58 је приказана ефикасност екстракције биофлавоноида (кверцетин, рутин, хесперетин, хесперидин и каемпферол) из узорака црвеног лука и коре поморанџе применом ултразвучне екстракције. Мање вредности ефикасности екстракције биофлавоноида из узорака црвеног лука и коре поморанџе добијају се применом ултразвучне екстракције у односу на екстракцију по Сокслету. То се објашњава нижом температуром на којој се изводи ултразвучна екстракција. При тим условима не долази до деградације гликозидних облика флавоноида и може се добити реалан увид у састав флавоноида у испитиваним узорцима. Добијене вредности ефикасности екстракције применом ултразвучне екстракције за хесперетин налазе се у опсегу од 92 до 96 %, за хесперинин од 89 до 90 %, за кверцетин 90 – 95 %, рутин 87 % и каемпферол 90 % у зависности од испитиваног узорка. Према томе може се сматрати да је екстракција биофлавоноида применом ултразвучне екстракције задовољавајућа. Уочава се да постоји разлика у ефикасности екстракције одређених аналита (хесперетин, хесперидин и кверцетин) између узорака коре поморанџе и црвеног лука. Ова разлика у ефикасности екстракције између различитих типова узорака може се објаснити просторном расподелом испитиваних једињења у биљном ткиву. Такође, већа ефикасност екстракције биофлавоноида из црвеног лука се може објаснити већим садржајем воде у ткиву лука, јер применом ултразвучних таласа долази до лакшег бубрења ткива и пуцања ћелијског зида и ослобађања биофлавоноида. Андрија Ћирић Докторска дисертација 211 На основу наведених фактора који утичу на ефикасност екстракције може се закључити да се испитивани биофлавоноиди: хесперетин, хесперидин, кверцетин, рутин и каемпферол најбоље екстрахују из свежих узорака коришћењем метанола као поларног растварача. Температура која се користи за екстракцију не прелази 40 оС и при тој температури не долази до деградације гликозида флавоноида у току 30 min при чему је ефикасност екстракције за све испитиване биофлавоноиде већа од 87 %, што се може сматрати задовољавајућом екстракцијом аналита. Оваквим начином екстракције не добијају се потпуно чисти екстракти јер се истовремено могу екстраховати нежељене супстанце као што су угљени хидрати и липофилне супстанце. Оне могу утицати на квантитативни састав флавоноида и њихових деривата у добијеном екстракту. Да би се уклониле ометајуће супстанце, које могу утицати на садржај биофлавоноида, неопходно је развити методу за пречишћавање добијених екстраката. У ту сврху развијена је метода течно-чврсте (SPE) екстракције биофлавоноида из екстраката хране. 4.1.1. Течно-чврста екстракција биофлавоноида из екстраката хране Додатно пречишћавање екстраката добијених из узорака коре поморанџе и црвеног лука неопходно је због тога што се употребом поларних растварача ко- екстрахују и друге супстанце растворне у њима, а не само аналити. Додатно пречишћавање екстракта може се постићи различитим методама као што су:  Упаравање екстраката до сува, а затим његова реконституција у одговарајућем растварачу или мoбилној фази,  Течно-течна екстракција,  Течно-чврста екстракција (SPE). Одабрана је течно-чврста екстракција коришћењем SPE кертриџа. Извршено је поређење више кертриџа различитог типа пуњења и различитих елуената у циљу проналажења оптималних услова при којима би ефикасност SPE екстракције биофлавоноида била што већа. Ефикасност екстракције рачуната је према формули: Андрија Ћирић Докторска дисертација 212 Испитано је пет врста кертриџа и то: LC-18, ENVI-18, DSC-18, LC-8 и DSC-SAX и два растварача за елуирање, метанол и ацетонитрил. Природа чврсте фазе у овим кертриџима представљена је у Табели 26. На Слици 126 и Табели 27 приказана је ефикасност SPE екстракције биофлавоноида на различитим врстама кертриџа применом метанола и ацетонитрила за елуирање. Слика 126. Ефикасност SPE екстракције биофлавоноида на различитим кертриџима Оно што је карактеристично за све врсте кертриџа је да се мање вредности ефикасности екстракције добијају применом ацетонитрила као елуента. Највеће вредности ефикасности SPE екстракције за све испитиване аналите се добијају употребом LC-18 кертриџа и крећу се у опсегу од 93 – 97 %. Боље перформансе С18 кертриџа могу се приписати адсорпцији биофлавоноида преко  – интеракција. Хидроксилне групе аналита доводе до грађења водоничне везе и нелокализованих електростатичких интеракција између хидроксилних група. За елуирање адсорбованих аналита са кертриџа коришћени су метанол, односно ацетонитрил. На основу добијених резултата представљених у Табели 27 може се уочити да се за све врсте кертриџа, употребом метанола, добијају веће вредности ефикасности екстракције у односу на ацетонитрил. Добијене вредности за метанол 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 МеОН ACN МеОН ACN МеОН ACN МеОН ACN МеОН ACN LC-С18 ENVI-18 DSC-18 LC-С8 DSC-SAX Еф и ка сн о ст S P E е кс тр ак ц и је ( % ) Кверцетин Рутин Хесперетин Хеспердин Каемпферол Андрија Ћирић Докторска дисертација 213 крећу се у опсегу од 42 до 97 %, док се вредности за ацетонитрил крећу у опсегу од 40 до 95 %. Већа ефикасност SPE екстракције биофлавоноида, употребом метанола, може се објаснити њиховом већом растворљивошћу у метанолу. 4.2. Процена матричног ефекта на LC-MS одређивање биофлавоноида у узорцима хране Матрични ефекат у MS се дефинише као утицај супстанци које се заједно елуирају са аналитом на његову ефикасност јонизације. Стога је смањење или повећање интензитета сигнала који потиче од аналита праћено смањењем прецизности и тачности мерења. Утицај матрикса стога ограничава примену LC-MS технике за квантитативну анализу. Већа тачност и прецизност одређивања постиже се применом SRM, односно MS/ MS методе за одређивање аналита. Имајући у виду валидацију методе као први корак током развоја LC-MS/MS методе мора се проценити утицај матрикса. На основу литературних података до сада је процена матричног ефекта вршена при одређивању активних супстанци из фармацеутских формулација у серуму, плазми и урину. Веома мало радова се бави проценом матричног ефекта при одређивању биофлавоноида у узорцима хране што је и био један од циљева ове докторске дисертације. За процену утицаја матрикса у овом раду коришћене су методе постекстракционог додатка аналита као и метода стандардног додатка. На основу података из Табеле 33, на Слици 127 су приказане вредности матричног ефекта на одређивање биофлавоноида екстрахованих из узорака црвеног лука, коре поморанџе и меда коришћењем различитих растварача (метанол, вода и ацетонитрил) применом методе стандардног додатка. Андрија Ћирић Докторска дисертација 214 Слика 127. Процена матричног ефекта (%) приликом коришћења различитих растварача Приликом употребе ацетонитрила као растварача (Слика 127), долази до губитка неких сигнала аналита код свих узорака што се може објаснити ступањем фенола у реакцију са ацетонитрилом при чему се граде ацетофенони (Hoesch-ова реакција). Може се уочити да се приликом коришћења метанола као растварача код већине узорака јавља константан негативан матрични ефекат при одређивању биофлавоноида применом калибрационе криве и креће се у опсегу од 60 до 80 % у односу на вредности добијене методом стандардног додатка. За све испитиване аналите израчунат матрични ефекат постекстракционом методом дат је у Табели 32 и на Слици 128. -130 -110 -90 -70 -50 -30 -10 10 3 0 1 /2 8 6 3 0 1 /2 4 4 3 0 1 /1 7 9 3 0 1 /1 5 1 6 0 9 /3 4 3 6 0 9 /3 2 5 6 0 9 /1 7 4 6 0 9 /1 5 1 3 0 1 /1 7 9 3 0 1 /1 5 1 3 0 1 /1 0 7 3 0 1 /9 7 3 0 1 /2 8 6 3 0 1 /2 4 4 3 0 1 /1 7 9 3 0 1 /1 5 1 6 0 9 /3 4 3 6 0 9 /3 2 5 6 0 9 /1 7 4 6 0 9 /1 5 1 3 0 1 /1 7 9 3 0 1 /1 5 1 3 0 1 /1 0 7 3 0 1 /9 7 2 8 5 /2 5 6 2 8 5 /2 4 3 2 8 5 /2 2 8 2 8 5 /1 2 5 3 0 1 /2 8 6 3 0 1 /2 4 4 3 0 1 /1 7 9 3 0 1 /1 5 1 6 0 9 /3 4 3 6 0 9 /3 2 5 6 0 9 /1 7 4 6 0 9 /1 5 1 3 0 1 /1 7 9 3 0 1 /1 5 1 3 0 1 /1 0 7 3 0 1 /9 7 6 0 9 /3 0 1 6 0 9 /2 7 3 6 0 9 /2 5 7 6 0 9 /1 7 9 2 8 5 /2 5 6 2 8 5 /2 4 3 2 8 5 /2 2 8 2 8 5 /1 2 5 Хесперетин Хесперидин Кверцетин Хесперетин Хесперидин Кверцетин Каемпферол Хесперетин Хесперидин Кверцетин Рутин Каемпферол Кора поморанче Мед Црвени лук Метанол Вода Ацетонитрил Андрија Ћирић Докторска дисертација 215 Слика 128. Процењен матрични ефекат (%) приликом одређивања биофлавоноида у узорцима хране -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 301/286301/244301/179301/151609/343609/325609/174609/151301/179301/151301/107 301/97 Хесперетин Хесперидин Кверцетин М ат р и чн и е ф е ка т (% ) Кора поморанџе 0,5 mg/L 1 mg/L 2,5 mg/L 5 mg/L -25 -20 -15 -10 -5 0 3 0 1/ 2 8 6 3 0 1/ 2 4 4 3 0 1/ 1 7 9 3 0 1/ 1 5 1 6 0 9/ 3 4 3 6 0 9/ 3 2 5 6 0 9/ 1 7 4 6 0 9/ 1 5 1 3 0 1/ 1 7 9 3 0 1/ 1 5 1 3 0 1/ 1 0 7 3 0 1/ 9 7 2 8 5/ 2 5 6 2 8 5/ 2 4 3 2 8 5/ 2 2 8 2 8 5/ 1 2 5 Хесперетин Хесперидин Кверцетин Каемпферол М ат р и чн и е ф е ка т (% ) Мед 0,5 mg/L 1 mg/L 2,5 mg/L 5 mg/L -25 -20 -15 -10 -5 0 3 0 1/ 2 8 6 3 0 1/ 2 4 2 3 0 1/ 1 7 4 3 0 1/ 1 5 0 6 0 9/ 3 4 3 6 0 9/ 3 2 5 6 0 9/ 1 7 4 6 0 9/ 1 5 1 3 0 1/ 1 7 9 3 0 1/ 1 5 1 3 0 1/ 1 0 7 3 0 1/ 9 7 6 0 9/ 3 0 0 6 0 9/ 2 7 1 6 0 9/ 2 5 5 6 0 9/ 1 7 9 2 8 5/ 2 5 6 2 8 5/ 2 4 3 2 8 5/ 2 2 8 2 8 5/ 1 2 5 Хесперетин Хесперидин Кверцетин Рутин Каемпферол М ат р и чн и е ф е ка т (% ) Црвени лук 0,5 mg/L 1 mg/L 2,5 mg/L 5 mg/L Андрија Ћирић Докторска дисертација 216 На основу података приказаних у Табели 32 и Слици 128 може се уочити да се код свих узорака јавља негативан матрични ефекат, што указује да се он мора узети у обзир приликом одређивања биофлавоноида. Негативан матрични ефекат је последица смањења ефикасности јонизације биофлавоноида. До смањења ефикасности јонизације долази због присутних фенолних киселина које ослобађају протон на нижим енергијама него биофлавоноиди, што води некомплетној дисоцијацији хидроксилних група биофлавоноида. Такође, формирање водоничне везе између карбоксилне групе фенолних киселина и хидроксилне групе флавоноида може допринети матричном ефекту. Други процес везан за смањење интензитета сигнала је повећање вискозности и површинског напона капљица које се добијају у електроспреј интерфејсу. То је последица хидрофилне природе фенолних киселина и присуства површински активних супстанци у реалним узорцима. Може се уочити да се добијају мање вредности матричног ефекта приликом повећања додате концентрације аналита јер долази до боље јонизације. Ово се може објаснити тиме да више молекула бива јонизовано, пре него што неке друге компоненте матрикса дођу до јонског извора. Такође уочава се и разлика у вредности матричног ефекта и између узорака на основу чега се може говорити о комплексности самих узорка. Највећи матричи ефекат на одређивање биофлавоноида се јавља код узорка коре поморанџе због њеног сложеног састава. Заједничко елуирање ендогених супстанци са супстанцама од интереса је главни извор матричног ефекта. Истовремено елуирање је неизбежно имајући у виду да је ретенција органских аналита (полифенолних киселина, биофлавоноида и биомакромолекула) из узорака на материјалу чврсте фазе одређена хидрофобним интеракцијама између неполарних група биомолекула који се налазе у екстракту и угловодоничног низа из ланца са површине силика гела. На основу тога, хидрофобност молекула присутних у екстракту, има важну улогу у њиховој ретенцији на чврстој фази пуњења кертриџа. Како површина силика гела садржи слободне хидроксилне групе, водоничне везе између јонизованих хидроксилних група материјала чврсте фазе и карбоксилних група присутних у фенолним киселинама и вишим масним киселинама или другим киселинским групама из биомакромолекула такође доприносе ретенцији. Материјал чврсте фазе ће адсорбовати и задржати не само молекуле аналита већ и друге молекуле сличних карактеристика. Елуирање једињења са материјала чврсте фазе са поларним растварачима је слично као код RP-LC, хидрофилнија једињења (фенолне киселине) се елуирају прва, а затим супстанце веће хидрофобности. Андрија Ћирић Докторска дисертација 217 У циљу уклањања интерференција и смањења матричног ефекта требало је: 1. Оптимизовати хроматографске параметре – што се постиже добрим одабиром колоне, градијентним начином елуирања погодном мобилном фазом, променом протока мобилне фазе, продужењем времена трајања анализе, коришћењем различитих растварача за реконструкцију узорка, променом протока и поларности мобилне фазе. 2. Променити начин јонизације уколико се постиже боља квантификација – ако постоји могућност одабира између ESI и APCI јонизације. 3. Одабрати методу за екстракцију – једноставно таложење протеина органским растварачима, течно-течна ектракција и екстракција на чврстој фази осигуравају да избор растварача који се користе за екстракцију буде у складу са природом аналита. 4.3. Oдређивање биофлавоноида у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда применом LC-MS/MS методе Сепарација фенолних киселина и флавоноида се изводи на реверзно фазним HPLC колонама, у којима се налазе сферне честице силика-гела везане октадецил (С18) ланцима [23, 251]. HPLC колоне паковане монолитским носачима омогућавају релативно брзо извођење анализа. Градијентно елуирање се користи због сложености узорка који се анализира. Користи се велики број мобилних фаза и бинарних система који су састављени од воде и мање поларног органског растварача (ацетонитрил или метанол). Киселине (мравља, сирћетна и фосфорна) се најчешће користе како би се подесило одговарајуће pH током извођења анализе. Редослед излажења аналита је следећи: бензенске киселине, циметне киселине, гликозидни флаванони праћени флавонолима и гликозидним флавонима и на крају слободним агликонима. У циљу тестирања погодности хроматографске методе за одвајање биофлавоноида: рутина, хесперидина, кверцетина, каемпферола и хесперетина потребно је оптимизовати хроматографске параметре: фактор капацитета (k), фактор селективности (), резолуцију (R), развлачење пика (T) и теоријски број подова колоне (N). Оптималне вредности ових фактора су: ретенциони фактор (k > 2), сепарациони фактор (), резолуција између пикова (R > 1,4), развлачење пика (T ≤ 2) и теоријски број подова (N > 2000). Тестирање погодности методе извршено је пропуштањем Андрија Ћирић Докторска дисертација 218 синтетичке смеше биофлавоноида при оптималним хроматографским условима. Хроматограм добијен при оптималним условима за раздвајање испитиваних биофлавоноида представљен је на Слици 66. У Табели 57 дати су хроматографски параметри за методу. Табела 57. Хроматографски параметри добијени на Phenomenex Gemini C18 колони под оптималним условима. Једињење Рутин Хесперидин Кверцетин Каемпферол Хесперетин Х р о м ат о гр аф ск и п ар ам ет р и Ретенционо време (min) 12,6 13,9 16,3 17,5 18,6 Резолуција 0,00 1,3 (1,2) 3,2 (2,3) 2,1 (3,4) 1,3 (4,5) Ретенциони фактор 20 22 26 28 30 Сепарациони фактор 1,10 1,18 1,07 1,06 Број теоретских подова 10161 15266 11808 14566 15376 На основу добијених хроматографских параметара датих у Табели 57 може се уочити да све вредности хроматографских параметара одговарају оптималним. Стога се предложена метода за раздвајање биофлавоноида: рутина, хесперидина, кверцетина, каемпферола и хесперетина може применити за њихово одређивање у реалним узорцима. Оптимизована LC-MS/MS метода за одређивање биофлавонида у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда је валидирана у односу на специфичност, линеарност, тачност, прецизност, робусност, границу детекције и границу квантификације. Добијени валидациони параметри дати су у Табели 31. За развијену методу може су уочити веома широк опсег концентрације од 0,05 до 10 g/mL, тако да се метода може применити за одређивање биофлавоноида у различитим узорцима, а постоји и добра корелација између концентрације и сигнала испитиваних аналита што закључујемо на основу вредности коефицијента детерминације који се креће у опсегу од 0,9937 – 0,9995. Вредности за LOD и LOQ које се крећу у опсегу од 0,039 до 0,076 g/mL, односно 0,118 – 0,229 g/mL указују да је метода осетљива и могу се одредити мале количине биофлавонода. Добијени резултати валидације приказани су у Табели 58. Андрија Ћирић Докторска дисертација 219 Табела 58. Параметри валидације методе за LC-MS/MS анализу биофлавоноида у храни. Додата конц. (g/mL) 0,05 0,10 0,25 0,50 1,00 2,50 5,00 10,00 Х ес п ер ет и н m/z 301/286 0,044 0,087 0,253 0,518 1,014 2,338 4,987 9,953 Искоришћење (%) 88,0 87,0 101,2 103,6 101,4 93,5 99,7 99,5 RSD (%) (n = 3) 4,76 3,02 2,11 2,54 1,23 1,45 1,31 0,87 m/z 301/244 0,049 0,107 0,270 0,516 0,925 2,399 5,018 9,930 Искоришћење (%) 98,0 107,0 108,0 103,2 92,5 95,96 100,4 99,3 RSD (%) (n = 3) 5,04 3,64 2,35 2,78 1,67 1,34 1,55 0,93 Х ес п ер и д и н m/z 609/325 0,047 0,075 0,226 0,477 1,009 2,517 5,174 9,909 Искоришћење (%) 94,0 95,0 90,4 95,4 100,9 100,7 103,5 99,1 RSD (%) (n = 3) 4,56 4,59 2,23 2,28 0,14 1,72 5,05 0,29 m/z 609/179 0,063 0,091 0,238 0,468 0,986 2,445 5,209 9,913 Искоришћење (%) 112,0 91,0 95,2 93,6 98,6 97,8 104,2 99,1 RSD (%) (n = 3) 4,98 3,59 0,88 2,74 0,81 1,19 0,98 0,74 К в ер ц ет и н m/z 301/179 0,0505 0,101 0,2525 0,505 1,01 2,626 5,02 10,3 Искоришћење (%) 101,0 101,3 98,6 97,3 102,6 103,3 100,2 103,2 RSD (%) (n = 3) 3,87 4,62 4,03 2,69 3,98 4,67 2,36 2,47 m/z 301/151 0,0491 0,102 0,2613 0,523 1,136 2,587 5,13 10,35 Искоришћење (%) 98,2 102,0 104,5 104,6 113,6 103,5 102,6 103,5 RSD (%) (n = 3) 3,64 4,25 3,81 3,97 5,79 2,38 4,67 2,64 Р у ти н m/z 609/301 0,049 0,093 0,245 0,483 0,965 2,621 5,218 10,025 Искоришћење (%) 98,0 93,0 98,0 96,6 96,5 104,8 104,4 100,3 RSD (%) (n = 3) 4,61 2,57 0,98 3,07 1,49 1,14 1,12 0,46 m/z 609/273 0,048 0,092 0,241 0,481 0,955 2,615 5,206 10,033 Искоришћење (%) 96,0 92,0 96,4 96,2 95,5 104,6 104,1 100,3 RSD (%) (n = 3) 8,24 3,71 0,88 1,94 1,03 0,39 0,38 1,23 К ае м п ф ер о л m/z 285/256 0,057 0,114 0,285 0,57 1,14 2,964 5,31 11,4 Искоришћење (%) 114,0 112,4 111,2 110,9 109,8 108,6 109,6 106,2 RSD (%) (n = 3) 3,56 4,67 4,59 4,37 3,28 3,67 2,89 2,57 m/z 285/243 0,056 0,124 0,264 0,567 1,15 2,56 5,31 10,6 Искоришћење (%) 112,0 106,3 102,6 103,4 105,6 107,3 108,3 101,3 RSD (%) (n = 3) 4,57 4,69 4,78 3,85 3,67 2,94 2,68 2,47 Андрија Ћирић Докторска дисертација 220 Резултати валидације методе указују да се вредности за искоришћење (88 – 114 %) и релативне стандардне девијације (0,46 – 8,24 %) налазе у оптималном опсегу, а ниске вредности лимита детекције и лимита квантификације показују да су перформансе методе задовољавајуће за одређивање изабраних биофлавоноида у реалним узорцима хране. Такође, нема потребе за преконцентровањем или дериватизацијом аналита јер се обухвата велики опсег концентрација биофлавоноида. 4.4. Одређивање испитиваних биофлавоноида у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда применом LC-MS/MS методе Оптимизована и валидирана LC-MS/MS метода је примењена за одређивање биофлавоноида у реалним узорцима (црвени лук, мед и кора поморанџе). Добијен садржај испитиваних биофлавоноида у реалним узорцима представљен је у Табели 34. Добијене вредности коефицијента варијације које се крећу у опсегу од 2,36 до 6,48 % и искоришћење од 87,65 до 108,7 % указују да је одређивање садржаја биофлавоноида поуздано. 4.5. Поређење наше методе за одређивање биофлавонида у узорцима хране са литературним подацима 4.5.1. Одређивање биофлавоноида у узорцима коре поморанџе Justesen и сарадници [319] су развили HPLC методу за одређивање неких биофлавоноида у узорцима броколија, коре поморанџе, коре јабуке, луку и чају. За раздвајање испитиваних аналита користили су Phenomenex RP C18 колону (250×4,6 mm, 5 m). Као мобилну фазу су користили смешу метанол-вода (30 : 70 v/v) у којој је садржај мравље киселине био 1 % , као фазу А и чист метанол као фазу В. Мобилна фаза је мешана у градијентном односу од 25 до 86 %, у току 50 min, при протоку од 1 mL/min. У кори поморанџе одредили су да је садржај хесперетина износио 21 mg/100 g свеже масе. Rouseff и сарадници [327] су користили Zorbax ODS (C-18) колону (250×4,6 mm, 5 m) за раздвајање нарирутина, нарингенина, хесперидина и неохесперидина у кори поморанџе. Као мобилну фазу су користили 79,5 % воде, 20 % ацетонитрила и 0,5 % Андрија Ћирић Докторска дисертација 221 главијалне сирћетне киселине, при протоку од 1 mL/min. Они су нашли да се садржај хесперидина налазио у концентрационом опсегу од 122 до 254 ppm. Mattila и сарадници [328] су развили HPLC методу за одређивање неких биофлавоноида, које су раздвојили на Inertsil ODS-3 колони (150×4,0 mm, 3 m). За раздвајање аналита су користили градијентни начин елуирања мобилном фазом која се састојала од 50 mmol/L H3PO4 (рН 2,5) и ацетонитрила у односу 95 : 5 (v/v %), при чему је укупно време анализе износило 67 min, при протоку од 0,7 mL/min. Они су нашли да је садржај хесперетина у кори поморанџе 41,5, а кверцетина у црвеном луку 30,7 mg/100 g свеже масе. У нашем раду применом развијене LC-MS/MS нађено је да је садржај хесперетина 36,4, хесперидина 24,3 и кверцетина 0,65 mg/ 100 g свеже масе. 4.5.2. Одређивање биофлавоноида у узорцима црвеног лука Franke и сарадници [329] су одређивали мирецетин, кверцетин, каемпферол, лутеолин и апигенин у различитим узорцима хране. У ту сврху развијена је HPLC метода за њихово раздвајање на NovaPak C18 (300×3,9 mm, 4 m) колони. Елуирање је вршено при протоку од 0,6 mL/min, користећи линеарни градијент мобилне фазе састава 10 % воденог раствора сирћенте киселине (А) и метанола : ацетонитрила : дихлорометана (10 : 5 : 1 v/v/v) у току 60 min. Нађена вредност за кверцетин износила је 136, а за каемпферол 4 mg/kg. Arabbi и сарадници [330] су развили HPLC методу за раздвајање кверцетина, каемпферола, лутеолина, апигенина и цианидина на Prodigy 5 ODS 3 (250×4,6 mm), користећи мобилну фазу састављену од воде/тетрахидрофурана/трифлуоросирћетне киселине (98 : 2 : 0,1) као једне фазе и ацетонитрила као друге фазе. Они су одређивали садржај наведених биофлавоноида у другој половини 2001. и првој половини 2002. У оба случаја нису детектовали каемпферол, а количина кверцетина се кретала од 38,3 до 93,6 mg/100 g свежег узорка. Crozier и сарадници [331] су одређивали каемпферол, кверцетин, мирицетин, апигенин, лутеолин и изорамнетин у воћу и поврћу које се свакодневно користи у Великој Британији. У ту сврху развили су реверзно фазну хроматографску методу за одвајање ових флавоноида користећи Symmetry С18 (150×3,9 mm, 5 m) колону. Као мобилну фазу користили су воду закишељену са трифлуоросирћетном киселином чије Андрија Ћирић Докторска дисертација 222 је рН било 2,5 и ацетонитрил у градијентном начину елуирања од 15 до 35 % у току 20 min, и протоку од 1 mL/min. Међутим, при овим условима није дошло до раздвајања лутеолина и кверцетина. Они су одредили да је садржај кверцетина у црвеном луку 201 g/g свежег узорка. Patil и сарадници [332] су у свом раду посматрали утицај температуре на садржај кверцетина у различитим узорцима лука. За та испитивања су развили хроматографску методу код које је раздвајање вршено на Bondapak C-18 (250×4,6 mm, 10 m) колони. У градијентном начину елуирања мобилну фазу је чинила 0,5 % фосфорна киселина у води и 0,5 % фосфорна киселина у метанолу, при протоку од 1 mL/min. Садржај кверцетина у црвеном луке се кретао од 0,16 до 0,30 mg/kg свеже масе. Marotti и сарадници [333] су развили методу за раздвајање и квантификацију кверцетина, кверцетин моногликозида, кверцетин дигликозида, рутина, изорамнетина, изорамнетин моногликозида на реверзно фазној Bondclone 10 C18 (300×3,9 mm, 10 m) колони коришћењем мобилне фазе састављене од воде и мравље киселине (95 : 5, v/v) и метанола, користећи линеарни градијент у току 30 min, при протоку од 1,5 mL/min. Они су нашли да се садржај кверцетина креће у опсегу 57,5 – 557,8 mg/kg, а рутина 1,7 – 2,7 mg/kg свеже масе. Price и сарадници [334] су у свом раду испитивали утицај времена складиштења на садржај кверцетина и његових гликозида. У ту сврху развили су хроматографску методу где се као мобилна фаза користила смеша воде/тетрахидрофуранa/трифлуоросирћетне киселине у односу 98 : 2 : 0,1 и ацетонитрил у укупном времену трајања анализе 40 min. Коришћена је Dynamax ODS (250×4,6 mm) колона. Нашли су да је садржај кверцетина у црвеном луку 17 g/g свеже масе, и да његова количина опада након 84 дана. У нашем раду применом развијене LC-MS/MS нађено је да је садржај хесперетина 0,0068, хесперидина 0,016, кверцетина 56,3, рутина 0,16 и каемпферола 1,63 mg/ 100 g свеже масе. 4.5.3. Одређивање биофлавоноида у узорцима меда Gil и сарадници [335] су испитивали садржај флавоноида у узорцима меда од руже. Развили су хроматографску методу користећи Lichrochart RP-18 (120×4,0 mm, 5 m) колону, а као мобилну фазу користили су водени раствор мравље киселине (19 : 1 Андрија Ћирић Докторска дисертација 223 v/v) и метанол у градијентном начину елуирања у току 60 min. Нашли су да се садржај кверцетина креће у опсегу од 0,11 до 0,28 g/g, а каемпферола од 0,44 до 0,85 g/g. Bonvehı и сарадници [336] су развили HPLC за одређивање флавоноида и фенолних киселина у узорцима меда из различитих делова Шпаније. У ту сврху користили су Nucleosil C18 (250×4,6 mm, 10 m) колону, а као мобилну фазу бидестиловану воду закишељену фосфорном киселином чија је рН 2,6 и метанол чији се однос мењао у линеарном градијенту од 0 – 100 % метанола у току 33 min. Утврдили су да се садржај рутина у 11 узорака креће од 18,35 до 44,45 mg/ 100 g узорка, кверцетина 4,69 – 9,75 mg/ 100 g узорка, а каемпферола 0,71 – 1,68 mg/ 100 g узорка. У нашем раду применом развијене LC-MS/MS нађено је да је садржај хесперетина 0,072, хесперидина 14, кверцетина 0,67 и каемпферола 0,14 mg/ 100 g свеже масе. Постоји слагање између наших резултата у поређењу са литературним подацима за садржај биофлавоноида у храни. Предност наше методе у односу на приказане из литературе је:  краће време трајања анализе,  мањи проток мобилне фазе,  мања потрошња штетних растварача,  једноставан састав мобилне фазе,  једноставан линеарни градијент. 4.6. HPLC-DAD анализа биофлавоноида узорака фамилије Brassica 4.6.1. Оптимизација хроматографских услова коришћењем програма ACD/LC Simulator Оптимизација хроматографске методе укључује избор експерименталних услова којима се могу одвојити аналити у прихватљивом времену са задовољавајућим факторима одвајања. Процес оптимизације може бити мануелан (метода пробе и грешке), статистички и рачунарски потпомогнут. За развој ефикасне методе за раздвајање аналита неопходно је коришћење специјализованих рачунарских програма. Највећи изазов приликом развоја хроматографске методе је праћење померања пикова при промени хроматографских услова одвајања. Померање пикова се користи за Андрија Ћирић Докторска дисертација 224 конструкцију математичког модела помоћу којег се смањује број потребних експеримената приликом оптимизације. Коришћењем технике пик инкримента гради се математички модел којим се број експеримената у оптимизационом циклусу своди на минимум. Оптимизација методе за смеше непознатог састава је још комплокованија јер не постоје a priori подаци о особинама компонената и ретенционим временима. Другим речима директна асигнација сигнала није могућа. Да би се постигла успешна идентификација или квантификација мора се постићи максимално одвајање сигнала као најважнији фактор. У овом случају оптимизација метода се заснива на сигналу пикова исте компоненте при чему пикови потичу од различитих експериментата. Другим речима захтева се узајамно поклапање пикова између HPLC експеримената. Нова метода за узајамно слагање пикова у серији HPLC анализа исте непознате смеше, при различитим условима одвајања, је примењена код рачунарске оптимизације коришћењем програма ACD LC Simulator. Приступ који се назива аутоматско слагање пикова (МАР) не захтева предходно познавање састава смеше. Алгоритам се заснива на примени апстрактне факторске анализе (АФА) и итеративне факторске анализе (ИФА) на проширену матрицу хроматографских података. Математички алгоритам израчунава број компонената у смеши и ретенционо време сваке компоненте за сваки од улазних података. У циљу проналажења оптималних хроматографских услова за одвајање биофлавоноида: кверцетина, каемпферола, катехина, лутеолина, апигенина и епикатехина извршена је рачунарска опзимизација услова за њихово одвајање. Услови који подлежу оптимизацији били су: састав мобилне фазе (% ACN) за изократско елуирање, њена јонска јачина и рН вредности. Како би се пронашао оптимални удео ацетонитрила за одвајање изабраних биофлавоноида снимљени су хроматограми појединачних стандарда биофлавоноида при градијентном начину елуирања и на температури колоне од 30 оС. Коришћењем добијених података помоћу ACD/LC Simulator-а добијена је 1D мапа резолуције представљена на Слици 76. Уочава се само једна област са погодним условима за одвајање при максималној резолуцији. Област са оптималним уделом ацетонитрила за изократско извођење анализе налази се у концентрационом опсегу од 8,0 – 12,0 % ацетонитрила. При нижим вредностима ацетонитрила од 8 % долази до смањења резолуције између пикова и Андрија Ћирић Докторска дисертација 225 дужег трајања анализе, док при вишим вредностима ацетонитрила од 12 % долази до прелкапања пикова. У следећем кораку је било потребно установити оптимални садржај сирћетне киселине у мобилној фази. У ту сврху снимљени су хроматограми при условима датим у Табели 35, а подаци искоришћени за добијање 2D мапе резолуције приказане на Слици 77. На 2D мапи резолуције уочава се неколико области са максималном резолуцијом. Највеће вредности резолуције се добијају при нижим концентрацијама сирћетне киселине (концентрација сирћетне киселине при максималној резолуцији не прелази 3 %) и малом уделу ацетонитрила. Међутим, при овим условима, време анализе је сувише дуго (22 min). Друга област високе резолуције је при уделу ацетонитрила од 20 % и ниској концентрацији сирћетне киселине. При овим условима време анализе се значајно скраћује (12 min) али се аналити елуирају сувише брзо и потрошња ацетонитрила је сувише висока, па стога при овим условима нису задовољени задати критеријуми. Трећа област високе резолуције која испуњава задате критеријуме налази се у централној области графика. Иако резолуција није максимална, она је још увек у прихватљивом опсегу. Оптимизовани хроматографски услови дати су Табели 36. Развијена и оптимизована хроматографска метода је валидирана, а хроматографски параметри приказани су у Табели 59. Табела 59. Хроматографски параметри добијени на Hypersil GOLD aQ колони под оптималним условима. Једињење Кверцетин Каемпферол Катехин Лутеолин Апигенин Епикатехин Ретенционо време (min) 3,05 3,73 4,51 5,55 7,24 10,03 Резолуција 0,00 2,60 3,56 4,67 6,80 8,00 Фактор капацитета 5,35 6,71 8,38 10,56 14,1 19,94 Фактор селективности 0,00 1,25 1,25 1,26 1,34 1,41 Број теоретских подова 1653 5476 5184 12321 9344 10100 Вредности свих хроматографских параметара (Табела 59) указују да задовољавају услове добре хроматографије. Андрија Ћирић Докторска дисертација 226 Лимит детекције и лимит квантификације за кверцетин, каемпферол, катехин, апигенин, лутеолин и епикатехин у узорцима хране су одређени из калибрационих кривих за методу стандардног додатка. Параметри валидације хроматографске методе за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica дати су у Табели 60. Табела 60. Валидациони параметри HPLC методе за одређивање биофлавоноида у узорима фамилије Brassica. Једињење Кверцетин Каемпферол Катехин Лутеолин Апигенин Епикатехин Опсег (g/mL) 0,1 - 10 0,1 - 10 0,1 - 10 0,1 - 10 0,1 - 10 0,1 – 10 Број тачака (N) 8 8 8 8 8 8 Нагиб (a) (×103) 9,96±0,05 10,71±0,01 9,10±0,01 9,88±0,06 12,93±0,04 10,89±0,03 Одсечак (b) (×102) 2,9±0,4 1,0±0,5 2,7±0,6 3,3±0,3 5,8±0,7 2,7±0,2 Стандардна грешка (×102) 4,9 12,0 12,9 6,2 4,1 3,7 Коефицијент детерминације (r2) 0,9998 0,9992 0,9988 0,9997 0,9938 0,9929 LOD (g/mL) 0,055 0,032 0,025 0,020 0,030 0,04 LOQ (g/mL) 0,167 0,096 0,075 0,060 0,090 0,120 Лимит детекције је у опсегу од 0,02 – 0,055 g/mL што показује да метода поседује задовољавајуће перформансе за одређивање изабраних биофлавоноида у узорцима хране фамилије Brassica. Различите врсте купуса су анализиране на садржај биофлавоноида у линеарном опсегу концентрација од 0,02 до 0,4 g/mL (пет нивоа концентрација). Линеарност је потврђена вредностима коефицијента регресије већим од 0,98 и Cohran-овим тестом хомосхедастичности (Gmax = s 2 max/si 2 је поређена са табличном вредношћу, нулта хипотеза говори о једнакости појединачних стандардних девијација и прихватљива је ако је Gmax < Gtable) показујући хомогену расподелу стандардних девијација. 4.6.2. Oдређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica У циљу одређивања садржаја биофлавоноида кверцетина, каемпферола, катехина, лутеолина, апигенина и епикатехина у свежим и замрзнутим узорцима фамилије Brassica извршена је екстракција различитим методама. Методе које су коришћене за Андрија Ћирић Докторска дисертација 227 екстракцију биофлавоноида биле су екстракција по Сокслету, ултразвучна екстракција, екстракција мацерацијом и екстракција кључалом водом. Добијени резултати одређивања биофлавоноида кверцетина, каемпферола, катехина, лутеолина, апигенина и епикатехина приказани су у Табели 37. Садржај кверцетина се налази у опсегу од 0,10 до 2,78, каемпферола од 0,09 до 3,71, катехина од 0,12 до 0,88, лутеолина 0,03 до 0,81, апигенина 0,01 до 0,32 и епикатехина од 0,15 до 0,52 mg/ 100 g узорка. Како се може уочити постоји разлика у садржају биофлавоноида између свежих и замрзнутих узорака фамилије Brassica. Разлика у садржају биофлавоноида између свежих и замрзнутих узорака купуса може се објаснити: хидролизом гликана, оксидацијом липида и денатурацијом протеина. Различити фактори, као што су температура замрзавања, степен замрзавања, вакуумско паковање или врста материјала у коме се пакује могу утицати на квалитет и садржај биофлавоноида у залеђеним узорцима. Стога вероватно долази до деградације аналита које се догађа приликом технолошке обраде и замрзавања узорака. Такође, постоји и разлика у садржају биофлавоноида између различитих начина екстракције што се може објаснити применом различитих растварача и температура које се користе за екстракцију. 4.6.3. Поређење наше методе са литературним подацима одређивања биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica Неколико HPLC метода је описано за одређивање биофлавоноида у узорцима фамилије Brassica. Hertog и сарадници [315] су одређивали садржај кверцетина и каемпферола у карфиолу, броколију и прокељу. Нашли су да је садржај ових биофлавоноида мањи од 1 mg/kg свежег јестивог дела у карфиолу и прокељу, док броколи садржи 30 mg/kg кверцетина и 70 mg/kg каемпферола. Vallejo и сарадници [337] су изоловали и структурно окарактерисали флавоноиде из броколија користећи LC/UV-DAD/ESI-MS методу. Нашли су велики број естара хидроксициметне киселине, каемпферола и глукозида кверцетина. Структуре глукозида флавоноида су одређене након алкалне хидролизе и идентификовани су 3- софорозид/софоротриозид-7-глукозид/софорозид каемпферола, кверцетина и изорамнетина. Међутим, није извршена квантификација наведених флавоноида. Андрија Ћирић Докторска дисертација 228 Price и сарадници [338] су нашли два главна гликозида флавонола у броколију и идентификовали су их као кверцетин-3-О-софорозид и каемпферол-3-О-софорозид. Детектовали су и три глукозида кверцетина и каемпферола и то, изокверцетин, каемпферол-3-О-глукозид и каемпферол-диглукозид. Софорозиди кверцетина и каемпферола су присутни у свежем узорку броколија у количини од 65 mg/kg односно 166 mg/kg. Укупне количине гликозида кверцетина и каемпферола изражене као слободни агликони износе 43 и 94 g/g свежег узорка. Justesen и сарадници [319] су користили HPLC методу са PDA и MS начином детекције за одређивање и квантификацију флавонола, флавона и флаванона у воћу, поврћу и пићима. Квантификовали су кверцетин и каемпферол у количини од 3,7 mg/100g и 6,0 mg/100g броколија и 0,6 mg/100g и 0,9 mg/100g у прокељу. Sikora и сарадници [320] су применили различите начине припреме кеља, броколија, прокеља, белог и зеленог карфиола. Идентификовали су деривате хидроксициметне киселине (кафеинску киселину, р-кумарну киселину, синапинску киселину) и флавоноле – каемпферол (у мањој количини) и кверцетин. Највећи садржај наведених једињења нашли су у кељу (укупно 94,4 mg/100 g свежег узорка), док је најмања колична нађена у белом и зеленом карфиолу (3,6 mg/100g и 3,03mg/100g). Наше вредности садржаја испитиваних биофлавоноида у поређењу са литературним показују добро слагање. 4.7. Aнтиоксидативнa активност екстраката фамилије Brassica Антиоксидативна активност представља способност једињења да ступе у реакцију са слободним радикалима и на тај начин их неутралишу. Разлика у антиоксидативној активности може варирати због присуства различитих компонената које се могу понашати као хватачи слободних радикала (у води растворан витамин С, фенолне киселине, као и витамин Е и каротеноиди) [339]. Оне могу бити у испитиваним узорцима пошто се заједно коелуирају са С18 кетриџа приликом SPE екстракције. Неколико студија показују да постоје битне и значајне разлике између фитохемијских антиоксиданаса, унутар саме врсте фамилије Brassica али и између њих. Антиоксидативна активност екстраката фамилије Brassica испитана је спектрофотометријски коришћењем DPPH (2,2`-дифенил-1-пикрилхидразин) теста. Андрија Ћирић Докторска дисертација 229 Као резултат реакције између DPPH и антиоксиданаса долази до смањења апсорбанције услед промене боје DPPH из љубичасте у жуту. Графици представљени на Сликама 83, 84, 85, 86 и 87 добијени су коришћењем програма Microcal Origin (v. 8) и представљају зависност преостале концентрације DPPH у функцији од времена. Са протеклим временом долази до смањења концентрације DPPH услед његове реакције са антиоксидативним врстама из екстраката свежих и замрзнутих узорака фамилије Brassica. Испитивани биофлавоноиди доприносе само 4 – 6 % од укупне антиоксидативне активности, што је одређено мерењем антиоксидативне активности смеше стандарда у концентрацији добијеној Сокслетовом екстракцијом за сваку врсту купуса. Максимална разлика у преосталој количини (%) DPPH радикала у реакцији са екстрактима је уочена након 10 min од почетка реакције. Вредности преостале количине (%) DPPH након 10 min од почетка реакције износе: 29, 24, 34, 40 за свеж карфиол; 40, 37, 47, 55 за замрзнути карфиол; 34, 30, 40, 45 за свеж броколи; 48, 42, 58, 63 за замрзнути броколи и 30 за свеж прокељ, а 40 за замрзнути прокељ за различите начине екстракције. Највећи проценат изреагованог DPPH радикала добијен је у реакцији са екстрактом добијеним ултразвучном екстракцијом за све врсте узорака, следећи је за екстракте добијене Сокслетовом екстракцијом, док је најмањи добијен за екстракте добијене екстракцијом са кључалом водом. Разлика у антиоксидативној активности између узорака може се објаснити употребом различитих растварача за екстракцију и присуством других антиоксидативних једињења у екстрактима. Константе брзине реакције DPPH са екстрактима су одређене у циљу одређивања капацитета уклањања слободних радикала екстрактима фамилије Brassica добијених различитим методама екстракције. Већина реакција флавоноида са DPPH код наших анализа је потпуна након 10 минута, а мерења након тог времена не показују значајну промену у садржају DPPH. Вредности брзине реакција DPPH радикала са екстрактима купуса су израчунати на основу зависности процента преосталог DPPH у функцији од времена за сваку врсту купуса као и начин чувања узорака. На почетку реакција се одвија према кинетици другог реда, након тога према кинетици псеудо првог реда. Антиоксидативна активност екстраката фамилије Brassica Андрија Ћирић Докторска дисертација 230 је одређена на основу реакције псеудо-првог реда, при чему је [DPPH•]0 >> [BE]0 на основу једначине: [ ] [ ] [ ] [ ] где је [BE] концентрација екстракта фамилије Brassica, [BE]0 почетна концентрација екстракта, k константа брзине псеудо-првог реда и t време. Израчунате константе брзине реакције DPPH са екстрактима поврћа из фамилије Brassica, добијеним на различите начине, приказане су у Табели 61. Табела 61. Вредности константе брзине реакције ± стандардна грешка (×10-2) реакције DPPH радикала са екстрактима фамилије Brassica. Начин екстракције Карфиол Броколи Прокељ Бутил хидроксил толуен -токоферол Сокслетова екстракција свеж 13,8 ± 0,2 16,4 ± 0,3 6,25 ± 0,4 787 ± 0,2 смрзнут 9,7 ± 0,3 10,7 ± 0,4 Ултразвучна екстракција свеж 14,8 ± 0,5 16,6 ± 0,2 17,9 ± 0,2 смрзнут 10,5 ± 0,3 11,5 ± 0,3 13,0 ± 0,3 Екстракција мацерацијом свеж 11,7 ± 0,3 14,5 ± 0,2 смрзнут 8,5 ± 0,2 9,6 ± 0,3 Екстракција кључалом водом свеж 11,8 ± 0,5 13,4± 0,2 смрзнут 7,1 ± 0,5 8,9 ± 0,4 Ове константе брзине су повезане са присуством антиоксиданата у екстрактима поврћа. Веће вредности константе брзине одговарају бољој антиоксидативној активности. Антиоксидативни капацитет поврћа је поређен са синтетичким (бутил хидроксил толуен, BHT) и природним (-токоферол) антиоксидантима. Сви екстракти имају веће вредности константе брзине у односу на синтетички антиоксиданс (BHT), али далеко мање у односу на природни, -токоферол. Такође, се долази до закључка да су све константе брзине хемијске реакције између DPPH и екстракта фамилије Brassica веће код екстракта свежих узорака на основу чега се може закључити да је садржај антирадикалских супстанци далеко већи у свежим узорцима. Различите кинетике указују на различите механизме уклањања радикала од стане полифенолних једињења; у реакционој смеши су присутни мали молекули активних флавоноида и велики полимерни производи. Кинетички параметри реакције између DPPH радикала и екстраката купуса дају додатне податке о антиоксидативној Андрија Ћирић Докторска дисертација 231 активности. Реакција DPPH са флавноидима је веома брза због присуства великог броја хидроксилних група које лако ступају у реакције. Спори део реакције може се објаснити присуством малих молекула антиокдидатаса (полифенолних киселине) или полимеризацијом као и стерним сметњама (неповољан положај између DPPH радикала и хидроксилен група малих молекула). Особине растварача који се користе за екстракцију битно утичу на ефикасност екстракције биофлавоноида а самим тим и на антиоксидативну активност. Растварачи коришћени за екстракцију полифенола из узорака карфиола, броколија и прокеља имају значајан утицај на антиоксидативни капацитет екстраката. На основу изведених експеримената метанолски раствори екстраката купуса показују већу антиоксидативну активност јер су флавоноиди и полифенолне киселине главни антиоксиданти у овим врстама купуса и растворљивији су у метанолу него у води. На основу тога вода није погодан растварач за екстракцију биофлавоноида из купуса. Промена у поларности растварача доводи до промене у њиховој способности да растворе одабрану групу једињења и тако утичу на процену антиоксидативне активности самих једињења [340]. Свеже воће и поврће поготово карфиол садржи више витамина С неко они узорци који су замрзнути, стога замрзнути узорци показују постепено смањење садржаја аскорбинске киселине како се температура снижава а период чувања продужава. Губитак се повећава продужавањем времена чувања, повећањем температуре, ниске релативне влажности, физичким оштећењем [341]. Ови фактори могу утицати на варијабилност добијених резултата за антиоксидативну активност за свеже и замрзнуте узорке фамилије Brassica. Већа антиоксидатина активност екстраката указује на присуство других активних једињења. Антиоксидативна активност биљака потиче од присуства многих активних фитохемикалија као што су витамини, флавоноиди, терпени, каротеноиди, кумарини, куркумарини, лигнини, сапонини, биљни стероли итд. Разлике у антиоксидативној активности између врста фамилије Brassica условљава више фактора и то: сама врста купуса, време брања, услови узгајања, врста земљишта и услови обраде као и складиштења након брања. Такође, индустријски начини обраде као што су бланширање, конзервирање, стерилизација, замрзавање као и само кување могу утицати на састав и садржај биофлавоноида, а самим тим и на антиоксидативну активност. Током обраде узорка долази до његове деградације која условљава убрзан контакт супстрата и ензима и на тај начин може се смањити антиоксидативна активност екстраката хране. Андрија Ћирић Докторска дисертација 232 4.8. HPLC-DAD анализа сродних једињења и нечистоћа моксифлоксацина (аналога флавоноида) У раду је развијена и HPLC-DAD метода за одређивање сродних једињења и нечистоћа моксифлоксацина, који је структурно сличан са флавоноидима. 4.8.1. Оптимизација хроматографских услова коришћењем DryLab® програма Циљ је био да постигнемо изократско одређивање моксифлоксацина и сродних супстанци са резолуцијом (у односу на интерни стандард, офлоксацин) већом од 1,4 и вредностима за ретенциони фактор између 1 и 10. Да би се постигли ови услови, приликом избора органског модификатора мобилне фазе (ACN, МеОH, ТHF), показало се да у присуству МеОН и ТHF, наведени хроматографски захтеви не могу бити постигнути. Стога је у даљем раду мобилна фаза оптимизована у присуству ACN. Како су прелиминарна испитивања показала, резолуција и ретенција углавном зависе од процента ACN у мобилној фази, рН и температуре. Рачунарски потпомогнутом оптимизацијом, употребом DryLab програма, добијена је 1D мапа резолуције приказана на Слици 90 за градијентно елуирање за раздвајање моксифлоксацина и његових сродних једињења. Најбоља резолуција се постиже приликом удела ацетонитрила од 10 – 13 %, при чему су сви пикови раздвојени на основној линији. На Слици 91 приказана је 2D мапа резолуције која је коришћена за оптимизацију температуре за раздвајање моксифлоксацина и његових сродних једињења. Уочено је да се оптимална температура креће у опсегу 45 – 47 оС. На Сликама 92 и 93 је приказан утицај рН на раздвајање моксифлоксацина и сродних једињења при градијентном начину елуирања. При нижим pH вредностима одвајање између 6,8DM (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8- диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) и 6M8F (1- циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-флуоро-6-метокси-1,4- дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) је задовољавајуће, али резолуција између MOX (моксифлоксацина) и 6,8DF (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8-дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина) је неприхватљива. Повећањем pH вредности побољшава се резолуција и Андрија Ћирић Докторска дисертација 233 раздвајање између MOX и 6,8DF. Зато је фино подешавање између удела ацетонитрила и pH неопходно како би се побољшала резолуција између критичног пара 6,8DM и 6M8F. 2D робусна мапа резолуције представљена на Слици 94 приказује зависност резолуције, у облику обојениҳ површи, од pH (y-оса) и процента ACN (х-оса). Може се видети да је оптимална вредност pH у области од 5,8 до 6,1. На основу ове мапе такође се може видети да је ∆tR много мања од 25 % градијентног времена, тако да је изократски начин раздвајања потврђен. Критична мапа резолуције показује да ретенција расте са порастом pH вредности и са смањењем процента ацетонитрила. При нижим процентима ацетонитрила у мобилној фази ретенциона времена су неприхватљиво висока (са 5 % ACN и pH = 2,5 ретенционо време 6F8E је око 20 минута). Оптимална ретенциона времена (вредност ретенционог фактора око 3) су добијена са 20 % ацетонитрила, али је резолуција између пикова 6,8DF мања од 1,5 на pH вредностима нижим од 4,5. Зато су, као оптимални услови за раздвајање моксифлоксацина и његових сродних једињења 10 % ацетонитрила, pH = 6,0 и температура од 45 оС. Оптимални услови који су добијени повлачењем кончанице у леви део 2D критичне мапе резолуциије су робустни, што се види из малиҳ промена резолуције приликом промене pH и процента ACN. Ҳроматографски параметри се мењају за 1 – 3 % при промени процента ацетонитрила од 8 до 12 % и промени pH вредности од 5,0 до 7,0. Из DryLab симулације је евидентно да проценат ацетонитрила и pH јако утичу на ретенцију аналита. Да би се утврдио комбиновани ефекат процента органског модификатора, pH вредности воденог дела мобилне фазе и температуре на истовремено одређивање моксифлоксацина и његових сродних једињења, коришћена је методологија површине одговора. Експериментално нађене вредности зависности резолуције пикова моксифлоксацина, сродних једињења моксифлоксацина и интерног стандарда од процента ацетонитрила, удела рН вредности мобилне фазе, температуре колоне и удела TEA су подвргнуте факторском дизајну (Табела 42). Израчунавања су вршена применом програма Statistica. Три врсте израчунавања су примењена:  мултиваријантни линеарни модел без интеракција,  мултиваријантни линеарни модел са интеракцијом фактора,  квадратни модел. Андрија Ћирић Докторска дисертација 234 Погодност модела и сигнификантност коефицијената тестирани су на основу вредности "lack of fit" и F-теста у ANOVA анализи (Табели 43). Поређењем вредности из ANOVA табеле, линеарни модели се могу одмаҳ одбацити, јер је "lack of fit" вредност много висока. За све аналите F-тест односа варијанси за "lack of fit" ("loss" функција) и за "pure error" (репликације) дају F вредност много веће од табеларниҳ критичниҳ вредности на нивоу поузданости од 0,05, Fтаб. = 4,07. Према томе, анализом површина одговора могуће је утврдити поуздане оптималне услове за раздвајање моксифлоксацина и његових сродних једињења. Тестирани квадратни модел обуҳвата шест коефицијената, од тога три линеарна и два квадратна и један интеракциони. Квадратни модел примењен је на моксифлоксацин и сродна једињења, при чему је укупна резолуција рачуната у односу на интерни стандард. За потпуни факторски дизајн, за три фактора на пет нивоа, изведено је 37 експеримената, а да би се извела анализа грешака експеримент под оптималним условима поновљен је три пута. Варијанса сваког регресионог коефицијента b, s2(b), је израчуната из дијагоналниҳ елемената матрице варијанса-коваријанса. Значајност коефицијената је тестирана Студентовим тестом, t = b/s2(b). Коефицијент је значајан ако је t вредност већа од критичне табеларне вредности tkrit(N-m,p) за N-m степени слободе на датом нивоу поузданости (p = 0,05). У нашем случају N = 37 и m = 6, тако да је tkrit = 2,306. Израчунате вредности коефицијената из једначине 79 представљене су у Табели 44, а површина одговора је дата на Слици 96. Израчуната површина одговора показује релативно широк максимум за сродна једињења моксифлоксацина при уделу ацетонитрила од 10 % и pH око 6,1 – 6,4. Мале промене овиҳ фактора не доводе до значајне промене одговора. Дефинисани оптимални услови за раздвајање моксифлоксацина и његових сродних једињења су 11 % ацетонитрила, pH = 6,0 (подешено фосфорном киселином), удео ТЕА 2 % и температура 45 оС. Под експерименталним условима наведеним у Табели 47 добијена су прихватљива ретенциона времена, са максималним раздвајањем моксифлоксацина од његових сродних једињења и интерног стандарда. При овим условима су добијене и најбоље вредности за релативну стандардну девијацију површине пикова. Програм DryLab се показао веома корисним приликом развоја и оптимизације изократских хроматографских услова раздвајања аналога моксифлоксацина и његових сродних једињења, као и деградационих производа. Резултати добијени након неколико Андрија Ћирић Докторска дисертација 235 анализа су искоришћени за проналажење оптималних услова раздвајања аналита у што краћем времену. Оптимизована HPLC-RP метода је валидирана. Валидација методе обухватила је одређивање специфичности, опсега концентрација, линеарности, прецизности, границе детекције и границе квантификације. Одговор аналита био је линеаран у опсегу конценртација од 0,5 до 2,0 mg/L, а израчунати статистички параметри показују да калибрационе криве показују добро поклапање са моделом и да су линеарне упркос релативно великој концентрацији моксифлоксацина у испитиваном раствору (200 μg/mL). Одређене су и вредности LOD и LOQ за нечистоће које показују да се нечистоће могу поуздано идентификовати и квантификовати у фармацеутским формулацијама моксифлоксацина. Нађено је да је %RSD површине пика при концентрацији на LOQ мања од 5%, показујући задовољавајућу осетљивост квантификације компоненти. Након конструкција калибрационих правих приступило се испитивању прецизности методе при чему су припремљени раствори стандарда сродних једињења и моксифлоксацина одређених концентрација у присуству офлоксацина као интерног стандарда. Добијени резултати анализе сродних једињења моксифлоксацина приказани су у Табели 62. Табела 62. Подаци за испитивање прецизности методе за смешу стандарда сродних једињења моксифлоксацина. Једињење Додато (g/mL) Нађено ± S.D. (g/mL) Recovery (%) 6,8DF* 0,80 0,81 ± 0,02 101,25 0,98 1,00 ± 0,10 102,0 1,51 1,53 ± 0,05 101,3 6,8DM* 0,82 0,84 ± 0,03 102,4 1,02 0,99 ± 0,03 97,1 1,53 1,57 ± 0,08 102,6 6M8F* 0,77 0,78 ± 0,01 101,3 0,96 0,97 ± 0,03 101,04 1,44 1,48 ± 0,06 102,8 6F8E* 0,79 0,78 ± 0,02 98,7 0,97 0,96 ± 0,02 99,0 1,49 1,47 ± 0,02 97,3 *6,8DF-1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-6,8-диметокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина, 6M8F (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-флуоро-6-метокси-1,4- дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина, 6,8DF (1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8-диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]- 6,8-дифлуоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина, 6F8E 1-циклопропил-7-[(S,S)-2,8- диазабицикло[4.3.0]нон-8-ил]-8-етокси-6-флоро-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолон карбоксилна киселина. Андрија Ћирић Докторска дисертација 236 Задовољавајуће вредности „recoverу“ испитиваних супстанци (97,3 – 102,8 %) са % RSD мањом од 4 % су добијене претпостављајући да метода може прецизно квантификовати нечистоће у оба испитивана узорка, таблетама и инфузији. Мале промене различитих параметара (pH, % B, температуре итд.) не резултују у великој промени укупне резолуције, што показује да је метода робусна. Смањење pH вредности захтева знатно дуже време анализе како би се задовољила прихватљива резолуција између пикова. У свим експериментима изведеним под оптималним условима, критична резолуција није била мања од 1,4. Развлачење пикова неких нечистоћа одступа од идеалних, али хроматограми су репродуктивни (два инструмента) и поновљиви. Промене у концентрацији доводе до линеарног одговора у површини пикова и омогућавају прецизно одређивање. Хроматографски пик офлоксацина, као интерног стандарда налази се на нижем ретенционом времену од пика мокисфлоксацина и сродних једињења, па је погодан за употребу као интерни стандард у одређивању. Вишеструко поновљена мерења сродних супстанци у фармацеутским формулацијама показују да је релативна стандардна девијација мерења мања од 4 %. Осим тога, хроматографске карактеристике пикова сродних једињења као и моксифлоксацина (симетрија, полуширина итд.) налазе се у препорученим границама. 4.8.2. Одређивање сродних једињења и нечистоћа моксифлоксацина у Avelox® таблетама и инфузији Декларисани ексципијенти Avelox таблета обуҳватају магнезијум стеарат, микрокристалну целулозу и натријум-скроб гликолат. Ҳроматограм смеше ексципијената не показује пикове у области ретенциониҳ времена пикова интерног стандарда и активниҳ компоненти Avelox таблета, што значи да ексципијенти не ометају одређивање активниҳ компоненти. Овим се показује да је HPLC метода специфична за одвајање и одређивање нечистоћа које настају у процесу производње таблета које садрже моксифлоксацин. Пик нечистоће на tr = 8,02 min је примећен код анлизе табелета и раствора инфузије. Он је добро одвојен од стандарда моксифлоксацина (релативно ретенционо време, 1,54 min). Квантификацијa у поређењу са референтним стандардом моксифлоксацина показује да је заступљено 0,11 % нечистоће. Поређењем вредности релативног ретенционог времена и спектра добијеног употребом DAD детектора са Андрија Ћирић Докторска дисертација 237 познатим синтетичким нечистоћама дошло се до закључка да је присутна нечистоћа 6- метокси-8-флуоро једињење (6M8F). Вишеструко поновљено хроматографско раздвајање активниҳ компоненти указују на репродуктивност ретенциониҳ времена, при чему је (средња) релативна стандардна девијација мерења мања од 5 %. Ово указује да је развијена HPLC метода погодна за анализу Avelox таблета и инфузија у складу са ICH упутствима. Динамички опсег концентрација (0,5 – 2,0 mg/L) линеарног одговора указује на погодност примењене методе и при великим разблажењима узорака чиме се ефекат матрикса губи, а уједно повећава прецизност одређивања. LOD се креће у опсегу 0,041 – 0,061 g/mL, a LOQ 0,14 – 0,21 g/mL и у приҳватљивим су границама што указују да је одређивање могуће и при великим разблажењима, што поједностављује одржавање колоне. Добијене вредности за искоришћење које се налазе у опсегу од 97,3 до 102,8 %, указују да је метода тачна и прецизна. На основу свега изложеног може се закључити да је HPLC метода погодна за одређивање сродних једињења и деградационих производа у таблетама и инфузијама које као активну компоненту садрже мокисфлоксацин и да задовољава препоруке ICH. 4.8.3. Поређење наше методе за одређивање нечистоћа и деградационих производа са литературним подацима Kumar и сарадници [266] су користећи препаративну HPLC анализу и градијентно елуирање одвојили четири сродне нечистоће из лека моксифлоксацина. Њихове структуре су потврђене и идентичне су са онима синтетисаним у лабораторији. Нечистоћа нађена у нашем раду се разликује од оних које су нашли Kumar и сарадници. Разлика се може објаснити узимајући у обзир чињеницу да су у оба случаја нечистоће везане за процес производње. У нашем раду коришћен је узорак од Bayer AG, док су Kumar и сарадници користили узорак из Dr. Reddy’s Laboratories Ltd. Индија. Процес синтезе и пречишћавања код ова два произвођача се разликују, стога се јавља и разлика у нађеним нечистоћама. Salem и сарадници [268] су користећи TLC методу у свом раду нашли декарбоксиловани моксифлоксацин (производ киселинске деградације), који су идентификовали користећи IR спектроскопију. Motwani и сарадници [267] су идентификовали седам производа хидролитичке деградације користећи HPTLC методу. Разлика у деградацији моксифлоксацина у нашем раду и раду Motwani и сарадника може се приписати драстичнијим условима Андрија Ћирић Докторска дисертација 238 деградације у њиховом раду (1 mol/L концентрација HCl или NaOH, 30 % H2O2, при рефлуксу од 3 h). 4.9. Спектрофотометријско одређивање моксифлоксацина у хуманом серуму Циљ развоја спектрофотометријске методе за одређивање моксифлоксацина у хуманом серуму био је проналажење оптималних услова за раздвајање моксифлоксацина и протеина из хуманог серума. Треба имати у виду да је моксифлоксацин хетероциклична амино киселина са два места за протолизу: једно одговара везивању протона на 2`-N секундарној амино пиперазинил групи, а друго отпуштању протона са карбоксилне групе. Према томе, моксифлоксацин у раствору може постојати у облику катјона, анјона диполарног (“zwitter) јона и у неутралном облику. Релативна заступљеност ових облика зависи од рН вредности раствора. Како највећи интензитет апсорпције показује неутрални молекул, треба одредити рН вредност у које је неутрални облик највише заступљен. Такође, треба одредити изоелектричну тачку моксифлоксацина, што значи да је потребно одредити константе дисоцијације моксифлоксацина у раствору. Валидација методе обуҳватила је одређивање погодности, линеарности, тачности, прецизности, границе детекције и границе квантификације. Валидациони параметри погодности методе за одређивање моксифлоксацина у плазми дати су у Табели 55. Параметри погодности методе указују да серумски протеини показују максималну апсорбанцију на истој таласној дужини на којој моксифлоксацин максимално апсорбује. Из тог разлога је за одређивање искоришћена друга трака на већој таласној дужини где компоненте серума не показују апсорбанцију. Према томе, утицај матрикса на сигнал аналита је занемарљив. Вишеструко поновљена мерења моксифлоксацина у плазми (у облику оптерећене плазме) показују да је релативна стандардна девијација мерења мања од 2 %. На основу изложеног може се закључити да је метода погодна, према ICH смерницама, за одређивање моксифлоксацина у плазми. Опсег линеарности одговора и одређене границе квантификације и границе детекције показују да је метода погодна, не само за једнократно одређивање моксифлоксацина, већ и за фармакокинетичка мерења, тј за одређивање моксифлоксацина у одређеном временском интервалу, на почетку дозирања, при максималној концентрацији у плазми, као и при почетку елиминације. При томе, нема Андрија Ћирић Докторска дисертација 239 потребе за преконцентровањем, екстракцијом или дериватизацијом аналита, већ се мерењем може обуҳватити велики динамички опсег концентрација моксифлокацина у плазми. Променом pH вредности мобилне фазе постиже се оптимално време за брзо извођење анализе и релативно мала потрошња супстанци. Ова чињеница је од значаја у клиничким анализама, када је потребно анализирати велики број узорака у кратком времену. Предност методе је и то што је једноставна за извођење. Добијена "recоvery" вредност од 92,5 % је у приҳватљивим границама за ову врсту мерења и указује да је постигнута тачност методе у складу са смерницама за валидацију биоаналитичкиҳ метода. Прецизност мерења изражена је преко релативне грешке и њена вредност је око 5 % и мања, што указује на занемарљив утицај протеина плазме. Клиничка испитивања су показала да се моксифлоксацина брзо и потпуно апсорбује након оралног начина узимања. Максимална концентрација моксифлоксацина у плазми (око 4,5 g/mL) се постиже 1 до 3 сата након узимања једне дозе од 400 mg. Биорасположивост је приближно 90 % на основу чега се може закључити да је утицај ензима јетре занемарљив. Моксифлоксацин поседује дуго време полу живота у плазми (12 сати) и у већем делу се излучује било као непромењено једињење или као сулфат или глукозидни метаболит. Како се моксифлоксацин споро метаболише у плазми, могуће је његово тачно одређивање чак и након 10 сати после узимања лека. Резултати анализе након пет понављања су 3,56 ± 0,15 g/mL и 3,89 ± 0,10 g/mL моксифлоксацина. Стога, предложена спектрофотометријска метода за одређивање моксифлоксацина у плазми, која је једноставна и брза, може се применити за фармакокинетичка мерења и рутинске клиничке анализе. 4.9.1. Поређење наше методе одређивања моксифлоксацина са литературним подацима За одређивање моксилофлоксацина у биофлуидима најчешће се користи HPLC метода [342 – 345], затим флуориметрија [346], капиларна електрофореза [347], диференцијална пулсна поларографија [348], диференцијална пулсна волтаметрија [349] и спектрофотометрија [350]. HPLC метода је метода избора у анализи флуорохинолона у биолошким матрицама. Она нуди широк линеарни опсег од 5 ng/mL до 3 g/mL са лимитом Андрија Ћирић Докторска дисертација 240 детекције од 2 ng/mL. Међутим, за извођење ове технике потребно је доста времена и захтева стручно лице. Стога, алтернативна метода за рутинске клиничке анализе може бити спектрофотометрија. До сада je само један рад објављен за одређивање мокисфлоксацина користећи основне спектре. У раду Motwani и сарадника [350] моксифлоксацин је одређиван на таласној дужини од 296 nm у 0,1 mol/L хлороводоничној киселини (pH = 1,2) и на 289 nm у фосфатном пуферу (pH = 7,4). За конструкцију калибрационе криве користили су опсег линеарности од 1 – 12 g/mL (r2 = 0,9999) у хлороводоничној киселини и 1 – 14 g/mL (r 2 = 0,9998) у фосфатном пуферу. Вредности за лимит детекције и лимит квантификације износе 0,0402 и 0,1214 g/mL у хлороводоничној киселини и 0,0384 и 0,1163 g/mL у фосфатном пуферу. Релативна стандардна девијација за одређивање моксифлоксацина применом ове методе у фармацеутским формулацијама (таблетама, инфузији и капима за очи) износи мање од 2 %. Tarkase и [351] су развили UV спектрофотометријску методу користећи први извод спектра за одређивање моксифлоксацина у фармацеутским формулацијама. Таласна дужина максималне апсорпције износи 293 nm, опсег концентрација 1 – 20 g/mL. За одређивање моксифлоксацина коришћена је амплитуда између таласних дужина од 282 nm до 302 nm. Приликом одређивања моксифлоксацина у таблетама стандардна девијација је мања од 2, вредности „recovery“ се крећу у опсегу од 98 до 101 %. Dhumal и сарадници [352] су користили основни и први извод спектра моксифлоксацина за његово одређивање у офтамолошком раствору. Линеарност је била у опсегу концентрација 1 – 12 g/mL (r2 > 0,99), а вредности искоришћења се крећу у опсегу од 99 до 100 %. Резултати одређивања моксифлоксацина код пацијената који су узели таблете “Avelox” су у доброј сагласности са литературним подацима [353]. У поређењу са литературним подацима спектрофотометријског одређивања моксифлоксацина опсег концентрација код наше методе је знатно мањи, на основу чега се може закључити да је наша метода осетљивија и има нижу вредност лимита детекције. За разлику од осталих метода које се користе за одређивање моксифлоксацина у фармацеутским формулацијама једино наша метода се бави одређивањем моксифлоксацина у серуму. Андрија Ћирић Докторска дисертација 241 5. Закључак Свестраним разматрањем резултата приказаних у овој докторској дисертацији могу се извести следећи закључци: 1. Разрађене су нове HPLC методе за квантификацију биофлавоноида: кверцетина, рутина, хесперидина, хесеретина, хесперидина, апигенина, лутеолина, катехина и епикатехина у узорцима биљне хране (кора поморанџе, црвени лук, мед, броколи, карфиол и прокељ). 2. Развијена је спектрофотометријска и HPLC метода за квантификацију структурно сличног једињења (аналога флавона) моксифлоксацина у различитим матрицама: фармацеутским облицима и хуманом крвном серуму. 3. Да би се обезбедила репродуктивности анализе потребно је да се комерцијални узорци хране хомогенизују до величине честица од 5 m. 4. Оптимизацијом процеса екстракције биофлавоноида утврђено је да течно- чврста екстракција уз примену Supelco LC-18 кертриџа са метанолом као елуентом даје најбољи принос екстракције који се налази у опсегу од 93 – 97 %. 5. Проучавање матричног ефекта на масене сигнале аналита показало је да матрикс узорка врши супресију сигнала свих испитиваних биофлавоноида. Могући узроци супресије су присуство фенолних киселина и неких липофилних супстанци у екстрактима. 6. Матрични ефекат који се јавља приликом одређивања биофлавоноида коришћењем методе пост-екстракције креће се у опсегу од - 44 до -0,5 %, док се применом методе стандардног додатка налази у опсегу од -151 до -7 %. 7. Сузбијање ефикасности јонизације која се јавља од присутних коелуираних супстанци које изазивају промене у одговору LC-ESI-MS система је превазиђено коришћењем методе стандардног додатка. Коришћење методе стандардног додатка за квантификацију биофлавоноида може послужити као обећавајући и практични приступ за превазилажење матричног ефекта и има велики потенцијал за примену на друге врсте матрица где се користи LC-ESI- MS/MS техника. Андрија Ћирић Докторска дисертација 242 8. Добијени резултати указују да је садржај биофлавоноида одређен у овом раду у доброј сагласности са литературним подацима. 9. Параметри валидације методе за одређивање рутина, кверцетина, хесперидина, хесперетина и каемпферола у узорцима коре поморанџе, црвеног лука и меда указују да се тачност налази у опсегу од 88 – 114 %, прецизност у опсегу од 0,46 – 8,24 %, LOD 0,039 – 0,076 g/mL, a LOQ 0,118 – 0,229 g/mL. За одређивање кверцетина, каемпферола, катехина, лутеолина, апигенина и епикатехина у узорцима фамилије Brassica добијени су следећи валидациони параметри: тачност: 85 – 109 %, прецизност: 1,23 – 4,58 %, LOD 0,02 – 0,055 g/mL, a LOQ 0,06 – 0,17 g/mL. 10. Испитана је антиоксидатина активност екстраката узорака фамилије Brassica и одређене су константе брзине реакције псеудо првог реда између DPPH и екстраката узорака фамилије Brassica. Вредности константи брзина реакције између DPPH и екстраката узорака фамилије Brassica крећу се у опсегу од 7,1×10-2 – 16,4×10-2 L mol-1 s-1. 11. Развијена је RP-HPLC метода помоћу компјутерске симулације DryLab и статистичке методологије одговора површине за одвајање моксифлоксацина од синтетичких нечистоћа и деградационих производа моксифлоксацина (аналога биофлавоноида) хемометријским приступом у кратком временском периоду са прихватљивим хроматографским параметрима. Валидациони параметри развијене хроматографске методе дати су преко тачности која се креће у опсегу од 97,3 до 102,8 %, док је прецизност за све аналите мања од 4 %, LOD се креће у опсегу од 0,041 до 0,061 g/mL, a LOQ од 0,14 до 0,21 g/mL. Садржај производа деградације налази се у опсегу 0,1 – 0,3 % од укупне количине моксифлоксацина приликом киселе и базне деградације стандарда, узорака таблета и инфузије моксифлоксацина. 12. Развијена је једноставна спектрофотометријска метода за одређивање моксифлоксацина у серуму, без претходне припреме узорка. Тачност развијене спектрофотометријске методе креће се у опсегу од 95,1 до 102,1 %, а прецизност је мања од 5 %. Андрија Ћирић Докторска дисертација 243 Научни допринос ове докторске дисертације огледа су у разради HPLC методе са MS/MS и UV/DAD детекцијом за квантификацију биофлавонида, у биљном материјалу (храни) као и структурно сличног једињења моксифлоксацина у фармацеутским облицима и хуманом крвном серуму. Разрада HPLC методе потпомогнута је рачунарском, статистичком и термодинамичком оптимизацијом процеса. Ефикасност оваквог приступа (претходне симулације HPLC процеса) огледа се у скраћењу времена анализе, смањењу потрошње растварача и могућношћу поуздане квантификације великог броја структурно сличних аналита. Развијене методе су унапређене у односу на литературне у погледу свеобухватности оптимизације сваког корака анализе: узорковања, хомогенизације узорка, екстракције, пречишћавања екстракта и саме интрументалне анализе. То је довело до високе поузданости и репродуктивности предложених метода и могућности њихове примене у анализи животних намирница и лабораторијама за контролу квалитета. Андрија Ћирић Докторска дисертација 244 6. Литература 1. N.G. Bisset, “Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals”, Medpharm, Stutgart, 1994. 2. J.B. Harborne, H. Baxter, “The Handbook of Natural Flavonoids”, John Wiley & Sons, Chichester, 1999. 3. J.B Harborne, B.L Turner, “Plant Chemosystematics”, Academic Press, London. 1984. 4. S. Asker, S. Frost, Hereditas, 66 (1970) 49. 5. R. Boyle, “Experiments and Considerations Touching Colours”, London, 1664. 6. F.S. Morot, Ann. Sci. Nat., (1849) 160. 7. A. Glenard, Ann. Chim. Phys., (1858) 366. 8. E. Filhol, Acad. Sci., 39 (1854) 194. 9. A. Wigand, Bot. Ztg., 20 (1862)121. 10. A.B. Rusznyak, A. Szent-Györgyi, Nature, 138 (1936) 798. 11. M.T. Murray, Nutrition 1998 12. H. Scarborough, A.L. Bacharach, Vitam.Horm., 7 (1949) 1. 13. A. Hassig, W.X. Liang, H. Schwabl, K. Stampfli, Med. Hypoth., 52 (1999) 479. 14. J.B. Harborne, Phytochemistry, 3 (1964) 151. 15. J.B. Harborne, “Comparative Biochemistry of the Flavonoids”. Academic Press, New York, 1967. 16. K.E. Heim, A.R. Tagliaferro, D.J. Bobliya, J. Nutr. Biochem., 13 (2002) 572. 17. J. Peterson, M.S. Dwyer, Nutr. Res., 18 (1998) 1995. 18. H Tsuchiya, Food Chem., 120 (2010) 1089. 19. E.D. Rijke, P. Out, W.M. Niessen, F. Ariese, C. Goojer, U.A. Brinkman, J. Chromatogr. A, 1112 (2006) 31. 20. P.K. Stumpf, E. Conn, “The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise”, Vol. 7: Secondary plant products, Academic Press, New York, 1981. 21. P. K. Stumpf and E. Conn (Eds.), “The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise”, Vol. 8: Secondary plant products, Academic Press, New York, NY, USA, 1981 22. T.P.T. Cushnie, A.J. Lamb, Int. J. Antimicrob. Ag., 26 (2005) 343. 23. N.C. Cook, S. Samman, Nutr. Biochem., 7 (1996) 66. 24. S.C Sahu, G.C. Gray, Cancer Lett., 104 (1996) 193. 25. J.O. Prey, J. Brown, J. Fleming, P.R. Harrison, Biochem. Pharmacol., 66 (2003) 2075. 26. P.C.H. Hollman, M.B. Katan, Food Chem. Toxicol., 37 (1999) 937. 27. W. Ren, Z. Qiao, H. Wang, L. Zhu, L. Zhang, Med. Res. Rev., 23 (2003) 519. 28. B.S.J. Winkel, The Biosynthesis of Flavonoids, “The Science of Flavonoids” Edited by Erich Grotewold, Springer, 2006. 29. G. Thomas, “Fundamentals of Medicinal Chemistry”, J. Wiley & Sons, Chichester, UK, 2003. 30. D. Cairns, “Essentials of Pharmaceutical Chemistry”, 2nd edition, Pharmaceutical Press, London, UK, 2003. 31. V. Rastija, S. Nikolic, V.H. Masand, Acta Chim. Slov., 60 (2013) 781. Андрија Ћирић Докторска дисертација 245 32. I.D. Sadekov, V.I. Minkin, A.E. Lutskii, Usp. Khim., 39 (1970) 380. 33. A. Ciric, I. Jakovljevic, M. Cvijovic, M. Jelikic-Stankov, P. Djurdjevic, “Metal Complexes of Kaempferol and Their Speciation in Human Plasma”, 187 – 202. у књизи „Kaempferol Chemistry, Natural Occurrences and Health Benefits“, Editors G. Villers and Y. Fougere, Nova Science Publishers, Inc, New York, 2013. 34. N.P. Slabbert, Tetrahedron Lett., 33 (1977) 821. 35. S.V. Jovanovic, S. Steenken, M. Tosic, B. Marjanovic, M.G. Simic, J. Am. Chem. Soc., 116 (1994) 4846. 36. Ј. Peinado, Ј. Florinda, Analyst, 113 (1988) 555. 37. D. Tsimogiannis, M. Samiotaki, G. Panayotou, V. Oreopoulou, Molecules, 12 (2007) 593. 38. G. Zgorka, J. AOAC Int., 94 (2011) 22. 39. A. Сhourasiya, A. Upadhayay, R.N. Shukla., J. Pharm. Biomed. Sci. 25 (2012) 179. 40. M. Heneczkowski, M. Kopacz, D. Nowak, A. Kuzniar, Acta Pol. Pharm., 58 (2001) 415. 41. K.R. Markham, V.M. Chari, “Carbon-13 NMR Spectroscopy of Flavonoids”, in “The Flavonoids: Advances in Research”, Harborne, J.B. and Mabry, T.J., Eds., Chapman & Hall, London, 19,1982. 42. K.R. Markham, H. Geiger, “1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Flavonoids and Their Glycosides in Hexadeuterodimethylsulfoxide”, in “The Flavonoids: Advances in Research” Harborne, J.B. and Mabry, T.J., Eds., Chapman & Hall, London, 19,1982. 43. J.B. Harborne, Chapman & Hall, London, 441, 1993. 44. P.K. Agrawal, “Carbon-13 NMR of Flavonoids”, Elsevier, Amsterdam, 1989. 45. Y. Yuan, Y. Song, W. Jing, Y. Wang, X. Yang, D. Liu, Anal. Methods, 6 (2014) 907. 46. D.C. Albach, Phytochemistry, 64 (2003) 1295. 47. A. Stochmal, Phytochemistry, 57 (2001) 1223. 48. G.T. Maatooq, Phytochemistry, 44 (1997) 187. 49. C. Xie, Phytochemistry, 65 (2004) 3041. 50. T. Fossen, A.T. Pedersen, O.M. Andersen, Phytochemistry, 47 (1998) 281. 51. R. Slimestad, Phytochemistry, 40 (1995) 1537. 52. K.M. Davies, Plant J., 13 (1998) 259. 53. X.C. Li, L. Cai, C.D. Wu, Phytochemistry, 46 (1997) 97. 54. R.W.D. Welford, Chem. Commun., 1828 (2001). 55. P.C. Stevenson, N.C. Veitch, Phytochemistry, 43 (1996) 695. 56. H. Minami, Phytochemistry, 41 (1996) 1219. 57. V.P. Singh, B. Yadav,V.B. Pandey, Phytochemistry, 51 (1999) 587. 58. Y. Shimada, FEBS Lett., 461 (1999) 241. 59. R.M. Seabra, Phytochemistry, 40 (1995) 1579. 60. C. Rosati, Мol. Breed., 12 (2003) 197. 61. X.Q. Li, X.H. Sun, S. Cai, X.X. Ying, F.M. Li, Yao Xue Xue Bao, 44 (2009) 895. 62. F. Sanchez-Rabaneda, J. Mass. Spectrom, 38 (2003) 35. Андрија Ћирић Докторска дисертација 246 63. D.D. Perin, R.P. Agarwal, “Metal Ions in Biological Systems”, H. Sigel, Marcel Dekker, New York, 1973. 64. G.H. Nancollas, M. B. Tomson, Pure & Appl.Chem. 54 (12) 2675. 65. D.D. Perrin, “Stability Constants of Metal-Ion Complexes Part B, Organic Ligands”, IUPAC Chemical Data Series No. 22, Pergamon Press, Oxford, 1979. 66. P.K. Glasoe, F.A. Long, J. Phys. Chem., 64 (1960) 188. 67. J. Petit, V. Geertsen, C. Beaucair, M. Stamouli, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 4113. 68. R. Karadag, G. Erdogan, M. Bayar, E. Dolen, Rev. Anal. Chem., 26 (2007) 169. 69. R.M.S. Pereira, N.E.D. Andrades, N. Paulino, A.C.H.F. Sawaya, M.N. Eberlin, M.C. Marcucci, G.M. Favero, E.M. Novak, S.P. Bydlowski, Molecules, 12 (2007) 1352. 70. F.V. Rubens de Souza, W.F. de Giovani, Spectrochim. Acta Part A, 61 (2005) 1985. 71. Z. Radoviс, D. Malešev, Pharmazie, 39 (1984) 870. 72. D. Malešev, Z. Radovic, Pharmazie, 40 (1985) 133. 73. Z. Radovic, D. Malešev, Mikrochim. Acta, 2 (1985) 247. 74. Z. Radovic, D. Malešev, Acta Pol.. Pharm. XLIV, 5 (1987) 433. 75. D. Malešev, Z. Radovic, M. Jelikic–Stankov, M. Bogavac, Anal. Lett., 24 (1991) 1159. 76. D. Malešev, Z. Radovic, M. Jelikic–Stankov, Pharmazie, 46 (1991) 534. 77. D. Malešev, Z. Radovic, M. Jelikic–Stankov, Spectrosc. Lett., 26 (1993)1985. 78. V.S. Kuntiс, D.L. Malešev, Z.V. Radovic, M.M. Kosanic, U.B. Mioc, V.B.Vukojevic, J. Agric. Food Chem., 46 (1998) 5139. 79. V. Kuntic, M. Kosanic, D. Malešev, Z. Radovic, Pharmazie, 53 (1998) 724. 80. V. Kuntic, M. Kosanic, D. Malešev, Z. Radovic, U. Mioc, J. Serb. Chem. Soc., 63 (1998) 565. 81. V. Kuntic, D. Malešev, Z. Radovic, V. Vukojevic, Monaths. Chem., 131 (2000) 769. 82. Z. Radovic, D. Malešev, Arch. Pharm., 320 (1987) 188. 83. D. Malešev, Z. Radovic, Pharmazie, 42 (1987) 59. 84. V. Kuntic, S. Blagojevic, D. Malešev, Z. Radovic, M. Bogavac, Monatsh. Chem., 129 (1998) 41. 85. N. Pejiс, V. Kuntiс, D. Malešev, Pharmazie, 57 (2002) 216. 86. Z. Radoviс, D. Malešev, Arh. Farm., 5 (1983) 221. 87. D. Malešev, Z. Radovic, Bull. Soc. Chim., 48 (1983) 745. 88. D. Malešev, Z. Radovic, M. Jelikic–Stankov, J. Serb.Chem. Soc., 58 (1993) 557. 89. S. Blagojeviс, D. Malešev, Z. Radovic, Arh. Farm. 5–6 (1999) 287. 90. S. Blagojeviс, M. Aleksic, D. Malešev, Z. Radovic, Arh. Farm., 5 (2003) 17. 91. Z. Radoviс, D. Malešev, Pharmazie, 43 (1988) 135. 92. Z. Radoviс, D. Malešev, Arh. Farm., 4 (1983) 147. 93. D. Malešev, Z. Radovic, M. Jelikic–Stankov, Arh. Farm., 46 (1991) 223. 94. Z. Radovic, D. Malešev, Arh. Farm., 42 (1992) 27. 95. D. Malešev, Z. Radoviс, Pharmazie, 44 (1989) 496. 96. D. Malešev, Z. Radoviс, M. Jelikiс–Stankov, Monatsh. Chem., 122 (1991) 429. 97. D. Malešev, Z. Radoviс, M. Jelikiс-Stankov, Spectrosc. Lett., 25 (1992) 1089. 98. D. Malešev, Z. Radoviс, M. Jelikiс–Stankov, Arh. Farm., 42 (1992) 163. Андрија Ћирић Докторска дисертација 247 99. D. Malešev, Z. Radoviс, M. Jelikiс–Stankov, Monatsh. Chem., 121 (1990) 455. 100. M. Aleksiс, S. Blagojeviс, D. Malešev, Z. Radoviс, J. Serb. Chem. Soc., 65 (2000) 631. 101. D. Malešev, Z. Radoviс, M. Jelikiс-Stankov, Pharmazie, 44 (1989) 863. 102. V. Kuntiс, S. Blagojeviс, D. Malešev, Z. Radoviс, Pharmazie, 54 (1999) 548. 103. V. Kuntiс, M. Kosaniс, D. Malešev, Z. Radoviс, U. Mioс, J. Serb. Chem. Soc., 63 (1998) 565. 104. D. Malešev, Z. Radoviс, V. Kuntiс, M. Kosaniс, Anal. Lett., 30 (1997) 917. 105. Q.K. Panhwar, S.Memon, Sci. World J., 55 (2014) 8. 106. G. Dehghan, Z. Khoshkam, „Chelation of Toxic Tin(II) by Quercetin: A Spectroscopic Study“, International Conference on Life Science and Technology, IPCBEE vol.3 (2011). 107. M. Medvidovic-Kosanovic, M. Samardžic, N. Malatesti, M. Sak-Bosnar, Int. J. Electrochem. Sci., 6 (2011) 1075. 108. S. Ahmed Fahran, Int. J. Chem. Sci., 11(3) (2013) 1247. 109. S. Selvaraj, S. Krishnaswamy, V. Devashya, S. Sethuraman, U.M. Krishnan, RSC Adv., 2 (2012) 2797. 110. M.A. Rostagno, M. Palma, C.G. Barroso, J. Chromatogr. A., 1012 (2003) 119. 111. M. Herrero, J.A. Mendiola, A. Cifuentes, E. Ibanez, J. Chromatogr. A., 1217 (2010) 2495. 112. M. Naczk, F. Shahidi, J. Chromatogr. A, 1054 (2004) 95. 113. C.D. Stalikas, C.D. J. Sep. Sci., 30 (2007) 3268. 114. I. Ignat, I. Volf, V.I Popa, Food Chem., 126 (2011) 1821. 115. R.J. Robbins, J. Agric. Food Chem., 51 (2003) 2866. 116. K.M. Kalili, A. de Villiers, J. Sep. Sci., 34 (2011) 854. 117. R. Flamini, Mass Spectrom. Rev., 22 (2003) 218. 118. H.M. Merken, G.R. Beecher, J. Agric. Food Chem., 48 (2000) 577. 119. A.S. Zarena, K.J. Udaya Sankar, Food Biochem., 36 (2011) 627. 120. C. Qin, Y. Li, W. Niu, Y. Ding, R. Zhang, X. Shang, Czech J. Food Sci., 28 (2010) 117. 121. K.V. Reichelt, R. Peter, S. Paetz, M. Roloff, J.P. Ley, G.E. Krammer, K.H. Engel, J. Agric. Food Chem., 58 (2010) 458. 122. K.A. Cooper, E. Campos-Gimenez, D. Jimenez-Alvarez, K. Nagy, J.L. Donovan, G. Williamson, J. Agric. Food Chem., 55 (2007) 2841. 123. Y. Takenaka, N. Morimoto, N. Hamada, T. Tanahashi, Phytochemistry, 72 (2011) 1431. 124. J. Lee, C. Rennaker, R.E. Wrolstad, Food Chem., 110 (2008) 782. 125. C.A. Diagone, R. Colombo, F.M. Lancas, J.H. Yariwake, Chromatogr. Res. Int. 2012. 126. D. Lopes-Lutz, J. Dettmann, C. Nimalaratne, A. Schieber, Molecules, 15 (2010) 8543. 127. B. Klejdus, J. Vacek, L. Benesova, J. Kopecky, O. Lapcik, V. Kuban, Anal. Bioanal. Chem. 389 (2007) 2277. 128. M.I. Churchwell, N.C. Twaddle, L.R. Meeker, D.R. Doerge, J. Chromatogr. B, 825 (2005) 134. 129. C. Cavaliere, P. Foglia, R. Gubbiotti,P. Sacchetti, R. Samperi, Rapid Commun. Mass Spectrom., 22 (2008) 3089. 130. J.P. Roggero, P. Archier, S. Coen, “Chromatography of Phenolics in Wine. In Wine: Nutritional and Therapeutic Benefits”; American Chemical Society: Washington, DC, USA, 1997. Андрија Ћирић Докторска дисертација 248 131. A. de Villiers, K.M. Kalili, M. Malan, J. Roodman, LCGC Eur., 23 (2010) 466. 132. E. Cicchetti, A. Chaintreau, J. Sep. Sci., 32 (2009) 3043. 133. T. Kraushofer, G. Sontag, Eur. Food Res. Technol., 215 (2002) 529. 134. M.A. Rostagno, M.D. Arrigo, J.A. Martínez, TrAC-Trend. Anal. Chem., 29 (2010) 553. 135. Y.S Oh, J.H. Lee, S.H. Yoon, C.H. Oh, D.S. Choi, E. Choe, M.Y. Jung, J. Food Sci., 73 (2008) 378. 136. S. Moze, T. Polak, L. Gasperlin, D. Koron, A. Vanzo, N. Poklar Ulrih, V. Abram, J. Agric. Food Chem., 59 (2011) 6998. 137. F.P. do Amaral, A. Napolitano, M. Masullo, L.C. dos Santos, M. Festa, W. Vilegas, C. Pizza Piacente, J. Nat. Prod., 75 (2012) 547. 138. L. Zhang, J. Chen , Y. Wang, D. Wu, M. Xu, Molecules, 15 (2010) 3567. 139. S.D Wei, H.C. Zhou, Y.M. Lin, M.M. Liao, W.M. Chai, Molecules, 15 (2010) 4369. 140. R. Edenharder, G. Keller, K.L Platt, K.K. Unger, J. Agric. Food Chem., 49 (2001) 2767. 141. A. Bianco, F. Buiarclli, G. Cartoni, F. Coccioli, I. Muzzalupo, A. Polidor, N. Uccella, Anal. Lett., 34 (2001) 1033. 142. F. Chinnici, N. Natall, U. Spinabelli, C. Riponi, LWT-Food Sci. Technol., 40 (2007) 1587. 143. F.N. Muanda, R. Soulimani, A. Dicko, J. Nat. Prod., 4 (2011) 100. 144. A.M. Pawlowska, W. Oleszek, A. Braca, J. Agric. Food Chem., 56 (2008) 3377. 145. P. Jandera, J. Sep Sci., 31 (2008) 1421. 146. J. Zeng, X. Zhang, Z. Guo, J. Feng, J. Zeng, X. Xue, X. Liang, J. Chromatogr. A, 1220 (2012) 50. 147. Z. Liang, K. Li, X. Wang, Y. Ke, Y. Jin, X. Liang, J. Chromatogr. A, 1224 (2012) 61. 148. J.G.P. Martin, E. Porto, C.B. Correa, S.M. De Alencar, E.M. Da Gloria, I.S.R. Cabral, L.M. De Aquino, J. Nat. Prod., 5 (2012) 27. 149. F. Shadkami, S. Estevez, R. Helleur, J. Anal. Appl. Pyrolysis., 85 (2009) 54. 150. C. Proestos, I.S. Boziaris, G.J.E. Nychas, M. Komaitis, Food Chem., 95 (2006) 664. 151. J. Liggins, L.J.C. Bluck, A. Coward, S.A. Bingham, Anal. Biochem., 264 (1998) 1. 152. M.H. Siess, A.M. Le Bon, M.C. Canivenc-Lavier, M.J. Amiot, S. Sabatier, S.Y. Aubert, M. Suschetet, J. Agric. Food Chem., 44 (1996) 2297. 153. L.F. Wang, D.M. Kim, C.Y. Lee, J. Agric. Food Chem., 48 (2000) 4227. 154. Q. Liu, W. Cai, X. Shao, Talanta, 77 (2008) 679. 155. R. Zadernowski, S. Czaplicki, M. Naczk, Food Chem., 112 (2009) 685. 156. B. Lapornik, M. Prosek, W.A. Golc, J. Food Eng., 71 (2005) 214. 157. M. Naczk, F. Shahidi, J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 41 (2006) 1523. 158. J.D. Box, Water Res., 17 (1983) 511. 159. W. Huang, A. Xue, H. Niu, Z. Jia, J. Wang, Food Chem., 114 (2009) 1147. 160. A.J.D. Fernandes, M.R.A. Ferreira, K.P. Randau, T.P. De Souza, L.A.L. Soares, Sci. World J., 2012 (2012) 1. 161. S.W. Abeynayake, S. Panter, A. Mouradov, G. Spangenberg, Plant Method., 7 (2011) 1. 162. P.W. Hartzfeld, R. Forkner, M.D. Hunter, A.E. Hagerman, J. Agric. Food Chem., 50 (2002) 1785. Андрија Ћирић Докторска дисертација 249 163. L.J. Porter, L.N. Hrstich, B.G. Chan, Phytochemistry, 25 (1986) 223. 164. A.E. Hagerman, L.G. Butler, J. Agric. Food Chem., 26 (1978) 809. 165. L.A. Marghtas, C.M. Mihai, F. Chirila, D.S. Dezmirean, N. Fit, Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj., 38 (2010) 40. 166. E.A.H. Roberts, D.J. Wood, Biochem. J., 49 (1951) 414. 167. X. Cao, C. Wang, H. Pei, B. Sun, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 4268. 168. Y. Yang, D. Gu, H. Wu, H. Aisa, T. Zhang, Y. Ito, J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 31 (2008) 3012. 169. Y. Ito, J. Chromatogr. A, 1065 (2005) 145. 170. H.T. Lu, Y. Jiang, F. Chen, J. Chromatogr. A, 1026 (2004) 185. 171. A. Yanagida, A. Shoji, Y. Shibusawa, H. Shindo, M. Tagashira, M. Ikeda, Y. Ito, J. Chromatogr. A, 1112 (2006) 195. 172. J. Wang, H. Gao, J. Zhao, Q. Wang, L. Zhou, J. Han, Z. Yu, F. Yang, Molecules, 15 (2010) 5998. 173. D. Caridi, V.C. Trenerry, S. Rochfort, S. Duong, D. Laugher, R. Jones, Food Chem., 105 (2007) 691. 174. S.C. Wang, Z. Zhang, L.C. He, H. Li, Anal. Lett., 43 (2010) 1534. 175. E.H. Liu, L.W. Qi, J. Cao, P. Li, C.Y. Li, Y.B. Peng, Molecules, 13 (2008) 2521. 176. F.N. Fonseca, M.F.M. Tavares, J. Chromatogr. A, 1154 (2007) 390. 177. X.J. Chen, H. Ji, Y.T. Wang, S.P. Li, J. Sep. Sci., 31 (2008) 881. 178. R.H.F. Cheung, P.J. Marriott, D.M. Small, Electrophoresis, 28 (2007) 3390. 179. A. Rybarczyk, R.B. Pegg, R.Z. Amarowic, Pol. J. Food Nutr. Sci., 58 (2008) 263. 180. T. Wu, Y,Q. Quan, J.N. Ye, Food Chem., 100 (2007) 1573. 181. S. Zhang, S.Q. Dong, L.Z. Chi, Talanta, 76 (2008) 780. 182. R.L. Prior, G.J. Cao, AOAC Int., 83 (2000) 950. 183. C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga, Trends Plant Sci., 2 (1997) 152. 184. C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, “Flavonoids in Health and Disease”; Rice-Evans, C.A.; Packer, L., Eds.; Marcel Dekker: New York, 1998, pp 192-198. 185. K.E. Heim, A.R. Tagliaferro, D.J. Bobilya, J. Nutr. Biochem., 13 (2002) 572. 186. S.A.B.E. van Acker, M.J. de Groot, D.J. van den Berg, M.N.J.L. Tromp, G.D. den Kelder, W.J.F. van der Vijgh, A. Bast, Chem. Res. Toxicol., 9 (1996) 1305. 187. C.A. Rice-Evans, Curr. Med. Chem., 8 (2001) 797. 188. S.A.B.E. van Acker, A. Bast, W.J.F. van der Vijgh, “Flavonoids in Health and Disease”; Rice-Evans, C.A.; Packer, L., Eds.; Marcel Dekker: New York, 1998, pp. 221-251. 189. M.M. Silva, M.R. Santos, G. Caroco, R. Rocha, G. Justino, L. Mira, Free Radic. Res., 36 (2002) 1219. 190. G. Sichel, C. Corsaro, M. Scalia, A.J. Di Bilio, R.P. Bonomo, Free Radic. Biol. Med., 11 (1991) 1. 191. Z.Y. Chen, P.T. Chan, K.Y. Ho, K.P Fung, J. Chem. Phys. Lipids, 79 (1996) 157. 192. C.A. Rice-Evans, N.J. Miller, G. Paganga, Free Radic. Biol. Med., 20 (1996) 933. Андрија Ћирић Докторска дисертација 250 193. S.A.B.E. van Acker, D.J. van den Berg, M.N.J.L. Tromp, D.H. Griffioen, W.P van Bennekom, W.J.F van der Vijgh, A. Bast, Free Radic. Biol. Med., 20 (1996) 331. 194. G. Cao, E. Sofic, R.L. Prior, Free Radic. Biol. Med., 22 (1997) 749. 195. M. Okawa, J. Kinjo, T. Nohara, M. Ono, Biol. Pharm. Bull., 24 (2001) 1202. 196. T. Yokozawa, C.P. Chen, E. Dong, T. Tanaka, G.I. Nonaka, I. Nishioka, Biochem. Pharmacol., 56 (1998) 213. 197. D.B. McPhail, R.C. Hartley, P.T. Gardner, G.G. Duthie, J. Agric. Food Chem., 51 (2003) 1684. 198. O.L. Woodman, W.F. Meeker, M.J. Boujaoude, Cardiovasc. Pharmacol., 46 (2005) 302. 199. G.R.M.M. Haenen, M.J.T.J Arts, A. Bast, M.D. Coleman, Environ. Toxicol. Phar., 21 (2006) 191. 200. W. Bors, C. Michel, N.Y. Ann. Acad. Sci., 957 (2002) 57. 201. C.G.M. Heijnen, G.R.M.M. Haenen, F.A.A. van Acker, W.J.F. van der Vijgh, A. Bast, Toxicol. In Vitro, 15 (2001) 3. 202. M.A. Soobrattee, V.S. Neergheen, A. Luximon-Ramma, O.I. Arouma, T. Bahorun, Mutat. Res., 579 (2005) 200. 203. A. Arora, M.G. Nair, G.M. Strasburg, Free Radic. Biol. Med., 24 (1998) 1355. 204. M. Foti, M. Piattelli, M.T. Baratta, G. Ruberto, J. Agric. Food. Chem., 44 (1996) 497. 205. K. Lemanska, H. Szymusiak, B. Tyrakowska, R. Zielinski, A.E.M.F. Soffers, I.M.C.M. Rietjens, Free Radic. Biol. Med., 31 (2001) 869. 206. Y.Z. Cai, M. Sun, J. Xing, Q. Luo, H. Corke, Life Sci., 78 (2006) 2872. 207. J.W. Chen, Z.Q. Zhu, T.X. Hu, D.Y. Zhu, Acta Pharmacol. Sin., 23 (2002) 667. 208. V. Butkovic, L. Klasinc, W. Bors, J. Agric. Food Chem., 52 (2004) 2816. 209. M. Furusawa, T. Tanaka, T. Ito, A. Nishikawa, N. Yamazaki, K.I. Nakaya, N. Matsuura, H. Tsuchiya, M. Nagayama, M. Iinuma, J. Health Sci., 51 (2005) 376. 210. R.J. Nijveldt, E. van Nood, D.E.C. van Hoorn, P.G. Boelens, K. van Norren, P.A.M. van Leeuwen, Am. J. Clin. Nutr., 74 (2001) 418. 211. Z.Z. Sroka, Naturforsch., 60 (2005) 833. 212. P. Trouillas, P. Marsal, D. Siri, R. Lazzaroni, J.L. Duroux, Food Chem., 97 (2006) 679. 213. W. Bors, W. Heller, C. Michel, M. Saran, “Methods in Enzymology”; Packer, L.; Glazer, A.N. Eds.; Academic Press: San Diego, CA, 1990; Vol. 186, pp. 343-355. 214. C.A. Rice-Evans, Why do we Expect Flavonoids to Function as Antioxidants in vivo? 2002 215. P.G. Pietta, J. Nat. Prod., 63 (2000) 1035. 216. A. Seyoum, K. Asres, K. El-Fiky, Phytochemistry, 67 (2006) 2058. 217. V. Butkovica, L. Klasnic, W. Bors, J. Agric. Food Chem., 52 (2004) 2816. 218. E.J. Lien, S.J. Ren, H.Y. Bui, R.B. Wang, Free. Rad. Biol. Med., 26 (1999) 285. 219. D. Amić, D. Davidovic-Amić, D. Bešlo, N. Trinajstić, Croat. Chem. Act., 76 (2003) 55. 220. O. Farkas, J. Jakus, K. Héberger, Molecules, 9 (2004) 1079. 221. R.J. Williams, J.P.E. Spencer, C. Rice-Evans, C. Free Radi. Biol. Medic., 36 (2004) 838. Андрија Ћирић Докторска дисертација 251 222. L. Chebil, C. Humeau, A. Falcimaigne, J. Engasser,M. Ghoul, Process Biochem., 41 (2006) 2237. 223. E.J.R. Middleton, C. Kandaswami, T.C. Theoharides, Pharmacol. Rev., 52 (2000) 673. 224. K.R. Narayana, S.R. Reddy, M.R. Chaluvadi, D.R. Krishna, Indian J Pharmacol., 33 (2001) 2. 225. L. Farkas, M. Gabor, F. Kallay, “Topics in Flavonoid Chemistry and Biochemistry”, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, 1973, pp. 24. 226. J.D. Bulock, “The Biosynthesis of Natural Products”, McGraw-Hill Publishing Company Limited, New York, 1965, pp. 90. 227. M.J. Mphahlele, M.R.C. Mabusela, S. Afr. J. Chem., 52 (1999) 157. 228. P.T. Kaye, M.J. Mphahlele, S. Afr. J. Chem., 47 (1994) 21. 229. P.T. Kaye, M.J. Mphahlele, Synth. Commun., 25 (1995) 1495. 230. Y. Noda, M. Watanabe, Helv. Chem. Acta, 85 (2002) 3473. 231. B.M. Choudary, K.V.S. Ranganath, J. Yavad, M.L. Kantam, Tetrahedron Lett., 46 (2005) 1369. 232. H. Mohamed, M. Anne-Marie, B. Ahcene, Chem. Pharm. Bull., 49 (2001) 1352. 233. R.S. Varma, D. Kumar, Tetrahedron Lett., 39 (1998) 9114. 234. M.J. Mphahlele, F.K. Mogamisi, M. Tsanwani, S.M. Hlatshwayo, R.M. Mampa, J. Chem. Res., (1999) 706. 235. M.J. Mphahlele, S.M. Hlatshwayo, S.M. Ndlovu, M.A. Fernandes, S. Afr. J. Chem., 54 (2001) 60. 236. Y. Xia, Z.Y. Yang, P. Xia, T. Hackl, E. Hamel, A. Mauger, J.H. Wu, K.H. Lee, J. Med. Chem., 44 (2001) 3932. 237. M. Majewski, N.M. Irvine, G.W. Bantle, J. Org. Chem., 59 (1994) 6697. 238. G.M. Coppola, J. Heterocyclic Chem., (1982) 727. 239. J.K. Oyama, I.T. Oyokumi, K.T. Agahara, Chem. Pharm. Bull., 47 (1999) 1038. 240. J.P. Michael, J. Nat. Prod. Rep., 14 (1997) 605. 241. F.M. Oliveira, A.E.G. Santana, L.M. Conserva, J.G.S. Maia, G.M.P. Guilhon, Phytochem., 41 (1996) 647. 242. F. Sondheimer, A. Meisels, J. Org. Chem., 23 (1958) 762. 243. S. Goodwin, A.F. Smith, A.A. Velasquez, E.C. Horning, J. Am. Chem. Soc, 81 (1959) 6209. 244. R.H.F. Manske, R.G.A. Rodrigo, “The Alkaloids, Chemistry and Physiology”, Academic Press, London, 1979, pp. 188-189. 245. A.Brossi, “The Alkaloids, Chemistry and Physiology”, Academic Press, Ins., London, 1988, pp. 342. 246. V.I. Dene, G. Ciurdaru, Chem. Commun., (1969) 621. 247. R.H. Prager, H.M. Thredgold, Aust. J. Chem., 22 (1969) 2627. 248. B. Chantal, H. Mohamed, M. Anne-Marie, B. Ahcene, Tetrahedron Lett., 41 (2000) 7037. 249. L.J. Huang, M.C. Hsieh, C.M. Teng, K.H. Lee, S.C. Kuo, Bioorg. Med. Chem., 6 (1998) 1657. Андрија Ћирић Докторска дисертација 252 250. M.J. Mphahlele, A.M. El-Nahas, J. Mol. Struct., 688 (2004) 129. 251. V. T. Andrile, “The Quinolones”, 3rd edition, Academic Press, London, 2000 252. J. Turinidge, Drugs, Suppl. 2 (1999) 29. 253. U. Petersen, “Quinolone Antibiotics: The Development of Moxifloxacin”, in J. Fischer and C. Robin Ganellin (Eds), “Analogue – based Drug Discovery”, Wiley – VCH Verlag, Weinheim, 2006. 254. A. Kleemann, J. Engel, B. Kutscher, D. Reichert, “Pharmaceutical Substances, Synthesis, Patents, Applications”, 4th Edition, Thieme Medical Publ., Stuttgart, 2001. pp. 1372-1374., 255. Matrix Laboratories Ltd. India, PCT WO 2005/012285 A1; Cipla Ltd. India, WO 2008/059223. 256. Bayer AG, European patent office, EP 0350733 B1, EP 550903, EP 657448. 257. Bayer AG, Business Group Pharma, Data on file. Moxifloxacin HCl. Nov. 2000. 258. J. P. Boehlert, “Regulatory Aspects: ICH and Pharmacopoeial Perspectives”, in S. Görög, “Identification and Determination of Impurities in Drugs, Series: Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis”, vol. 4, Elsevier, 2000. 259. S. Görög, “The Role of Impurity Profiling in Drug Research, Development and Production”, in S. Görög, “Identification and Determination of Impurities in Drugs, Series: Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis”, vol. 4, Elsevier, 2000. 260. R. J. Smith and M. L. Webb, “Analysis of Drug Impurities”, Blackwell Publishing, Oxford, 2007. 261. M.S. Reddy, S. Eswaraiah, V.V. Raju, R.R. Kumar, N. Srinivasreddy, V. Ravindra, Indian Patent Application No. 308/MAS/2003, Apr. 9, 2003. 262. Moxifloxacin Hydrochloride Summary Validation Report 263. A. Laban-Djurdjevic, M.J. Stankov, P. Djurdjevic, J. Chromatogr. B, 844 (2006) 104. 264. H. Stass, A. Dalhoff, J. Chromatogr. B, 702 (1997) 163. 265. S. Tatar Ulu, J. Pharm. Biomed. Anal., 43 (2007) 320. 266. Y. Ravindra-Kumar, V.V.N.K.V. Prasad Raju, R. Rajes Kumar, S. Eswaraiah, K. Mukkanti, M.V. Suryanarayanna, M. Satyanarayana Reddy, J. Pharm. Biomed. Anal. 34 (2004) 1125. 267. S.K. Motwani, R.K. Khar, F.J. Ahmad, S. Chopra, K. Kohli, S. Talegaonkar, Anal. Chim. Acta, 582 (2007) 75. 268. M. Yacoub Salem, N.M. El-Guindi, H.K. Mikael, L. El-Sayed abd-el-Fattah, Chem. Pharm. Bull., 54 (2006) 1625. 269. L. Wei, H.C. Qin, H.T. Jun, West China J. Pharm. Sci., 2 (2006) 270. 270. M. Rhodes, ”Introduction to Particle Technology”, 2nd Ed., John Wiley and Son, Chichester, U.K., 2008. 271. B. Bhatt, S.S. Agramal, “Size Reduction and Size Separation, Pharmaceutical Engineering”, NISCAIR National Science Digital Library, 2008. 272. M.C. Hennion, J. Chromatogr. A, 856 (1999) 3. 273. A. Zwir-Ferenc, M. Biziuk, Polish J. Environ. Stud., 15 (2006) 677. Андрија Ћирић Докторска дисертација 253 274. Recommendations on Nomenclature for Chromatography, Pure Appl Chem. 65 (1993) 819. 275. D.H. Shewiy, E. Kale, P.G. Risha, B. Dejaegher, J.S.Verbeke, Y.V. Heyden, J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 6 (2012) 1. 276. A.J. P. Martin and R. L. M. Synge, Biochem. J., 35 (1941) 1358. 277. J. J. van Deemter, F. J. Zuideweg and A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci., 5 (1956) 271. 278. L.R. Snyder, J.J. Kirkland, “Introduction to Мodern Liquid Chromatography”, 2nd edition, Wiley-Interscience, New York 1979. 279. A. Braithwaite, F.J. Smith, “Chromatograpic Methods” Kluwer Academic Publication, Dordrecht, 1999. 280. S. Ahuja, H. Rasmussen, “HPLC Method Development for Pharmaceuticals”, Elsevier, Academic Press, London, 2007. 281. R.A. Hites, K.A. Biemann, Mass Spectrometers. Anal. Chem., 39 (1967) 965. 282. P. Kebarle, L. Tang, Anal. Chem., 65 (1993) 972. 283. R. King, R. Bonfiglio, C. Fernandez-Metzler, C. Miller-Stein, T. Olah, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 11 (2000) 942. 284. R. Bonfiglio, R. King, T. Olah, K. Merkle, Rapid Commun. Mass Spectrom., 13 (1999) 1175. 285. R.E. Majors, LCGC, 24 (2006) 118. 286. N. Lindegardh, A. Annerberg, N. White, N. Day, J. Chromatogr. B, 862 (2008) 227. 287. T.M. Annesley, Clin. Chem., 49 (2003) 1041. 288. B.K. Matuszewski, M.L. Constanzer, C.M. Chavez-Eng, Anal. Chem., 75 (2003) 3019. 289. B.K. Matuszewski, M.L. Constanzer,C.M. Chavez-Eng, Anal. Chem., 70 (1998) 882. 290. D. Buhrman, P. Price, P. Rudewicz, J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 7 (1996) 1099. 291. I. Fu, E.J. Woolf, B.K. Matuszewski, J. Pharm. Biomed. Anal., 18 (1998) 347. 292. R. King, R. Bonfiglio, C. Fernandez-Metzler, C. Miller-Stein, T. Olah, J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 11 (2000) 942. 293. F.M. Lagerwerf, W.D. van Dongen, R.J.J.M. Steenvoorden, M. Honing, J.H.G. Jonkman, TrAC, Trends Anal. Chem., 19 (2000) 418. 294. P.J. Taylor, A.G. Johnson, J Chromatogr. B, 718 (1998) 251. 295. D.C. Montgomery, “Design and Analysis of Experiments”, 5th Edition, John Wiley & Sons, N.Y., 2001. 296. R.L. Plackett, J.P. Burman, Biometrika, 33 (1946) 305. 297. J. Antony, “Design of Experiment for Engineers and Scientists”, Elsevier science and technology books, London, 2003. 298. S.L.C. Ferreira, R.E. Bruns, E.G.P. Silva, W.N.L. Santos, C.M. Quintella, J.M. David, J.B. Andrade, M.C. Breitkreitz, I.C.S.F. Jardim, B.B. Neto, J. Chromatogr. A, 1158 (2007) 2. 299. R.A. Fisher, W.A. Mackenzie, J. Agr. Sci., 13 (3) (1923) 311. 300. DryLab User Manual, LC Resources Ltd., Walnut Creek, 2000. 301. DryLab Chromatographic Reference Guide, LC Resources Ltd., Walnut Creek, 2000. Андрија Ћирић Докторска дисертација 254 302. Robust HPLC Methods, Course on CD, Molnar Institut fur angewandte chromatographie, Berlin, 2002. 303. A. Bogomolov, M. McBrien, Anal. Chim. Acta, 490 (2003) 41. 304. J. Vacek, B. Klejdus, L. Lojkov, V. Kub, J. Sep. Sci. 31 (2008) 2054. 305. A. Escarpa, M.C. Gonzalez, J. Chromatogr., 51 (2000) 37. 306. L. Mira, M.T. Fernandez, M. Santos, R. Rocha, M.H. Florencio, K.R. Jennings, Free Radical. Res., 36 (2002) 1199. 307. V.L. Singleton, J.A. Rossi, Amer. J. Enol. Viticult., 16 (1965) 144. 308. F. Xu, Y Liu, Z. Zhang, C. Yang, Y. Tian, Chinese Med., 4 (2009) 15. 309. N Fabre, I. Rustan, E. de Hoffmann, J. Quetin-Leclercq, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 12 (2001) 707. 310. G. Chunsriimyatav, I. Hoza, P. Valašek, S. Skrovanková, D. Banzragch, N. Esevegsuren, Czech J. Food Sci., 27 (2009) 259. 311. Y. Jin, H. Liu, K. Yuan, J. Medic. Plant Res., 5 (2003) 5630. 312. Y. Zu, C. Li, Y. Fu, C. Zhao, J. Pharm. Biomed. Anal., 41 (2006) 714. 313. A. Michalkiewicz, M. Biesaga, and K. Pyrzynska, J. Chromatogr. A, 1187 (2008) 18. 314. A. Ciric, H. Prosen, M. Jelikic-Stankov, P. Djurdjevic, Talanta, 99 (2012) 780. 315. M.G.L. Hertog, P.C.H. Hollman, M.B. Katan, J. Agric. Food Chem. 40 (2002) 2379. 316. T. Bahroun, A. Luximon-Ramma, A. Crozier, O.J. Arouma, J. Sci. Food Agr. 84 (2004) 1553. 317. A. Lugasi, J. Hovari, Acta Aliment. Hung., 29 (2000) 345. 318. R. Puupponen-Pimia, S.T. Häkkinen, M. Aarni, T. Suortti, A.M. Lampi, M Eurola, V. Hiironen, A.M. Nuutila, K.M. Oksman-Caldentey, J. Sci. Food Agr., 83 (2003) 1389. 319. U. Justesen, P. Knuthsen, and T. Leth, J. Chromatogr. A, 799 (1998) 101. 320. E. Sikora, E. Cieslik, A.F. Florkiewicz, and T. Leszczyńska, Acta Sci. Pol. Technol. Aliment., 11 (2012) 45. 321. V. Roginsky, E.A. Lissi, Food Chem., 92 (2005) 235. 322. W. Brand-Williams, M.E. Cuvelier and C. Berset, Lebensm. Wiss Technol., 28 (1995) 25. 323. C.J. Hong, H. Chi-Tang, J. Agric. Food Chem., 45 (1997) 2357. 324. Y. Vander Heyden, C. Hartmann, D.L. Massart, L. Michel, P. Kiechle, F. Erni, Anal. Chim. Acta, 316 (1995) 15. 325. U. Neugebauer, A. Szeghalmi, M. Schmitt, W. Kiefer, J. Popp, U. Holzgrabe, Spectrochim. Acta Part A, 61 (2005) 1505. 326. R.H. Park, Y.K. Chung, C.K. Lee, K.J. Lee, M.K. Bark, Bull. Kor. Chem. Soc., 21 (2000) 849. 327. R.L. Rouseff, S.F. Martin, C. Youtsey, J. Agric. Food Chem., 35 (1987) 1027. 328. P. Mattila, J. Astola, J. Kumpulainen, J. Agric. Food Chem., 48 (2000) 5834. 329. Adrian A. Franke, Laurie J. Custer, Christi Arakaki, Suzanne P. Murphy, J. Food Compos. Anal., 17 (2004) 1. 330. P.R. Arabbi, M.I. Genovese, F.M. Lajolo, J. Agric. Food Chem., 52 (2004) 1124. Андрија Ћирић Докторска дисертација 255 331. A. Crozier, M.E.J. Lean, M.S. McDonald, C. Black, J. Agric. Food Chem., 45 (1997) 590. 332. B.S. Patil, L.M. Pike, K.S. Yoo, J. Amer. Soc. Hort. Sci., 120 (1995) 909. 333. M. Marotti, R. Piccaglia, J. Food Science, 67 (2002) 1229. 334. K.R. Price, J.R. Bacon, M.J.C. Rhodes, J. Agric. Food Chem., 45 (1997) 938. 335. M.I. Gil, F. Ferreres, A. Ortiz, E. Subra, F.A. Tomas-Barberhn, J. Agric. Food Chem., 43 (1995) 2833. 336. J.S. Bonvehi, M.S. Torrento, E.C. Lorente, J. Agric. Food Chem., 49 (2001) 1848. 337. F. Vallejo, F.A. Tomás-Barberán, F. Ferreres, J. Chromatogr. A, 1054 (2004) 181. 338. K.R. Price, F. Casuscelli, I.J. Colquhoun, M.J.C. Rhodes, J. Sci. Food Agr. 77, 468 (1998). 339. A. Podsеdek, Food Sci. Technol., 40 (2007) 1. 340. K. Zhou, L. Yu, Lebensm. Wiss. Technol., 37 (2004) 717. 341. S.K. Lee, A.A. Kader, Postharvest Biol. Tec., 20, (2000) 207. 342. A. Dalhoff, H. Stass, Drugs, 58 (1999) 239. 343. T. Radhakrishna, D.S. Rao, K. Vyas, G.O. Reddy, J. Pharm. Biomed. Anal., 22 (2000) 691. 344. T. Lemoine, D. Breilh, D. Ducint, J. Dubrez, J. Jougon, J.F. Velly, M.C. Saux, J. Chromatogr. B, 742 (2000) 247. 345. K. Vishwanathan, M.G. Bartlett, J.T. Stewart, J. Pharm. Biomed. Anal., 30 (2002) 961. 346. J.A. Ocana Gonzales, F.J. Barragan, C. Manuel, Analyst, 125 (2000) 2322. 347. J.G. Möller, H. Stass, R. Heinig, G. Blaschke, J. Chromatogr. B, 716 (1998) 325. 348. R. Inam R, H. Mercan, E. Ylmaz, B. Uslu, Anal. Lett., 40 (2007) 529. 349. N. Erk, Anal. Bioanal. Chem., 378 (2004) 1351. 350. S.K. Motwani, S. Chopra, F.J. Ahmed, R.K. Khar, Spectrochim. Acta A, 68 (2007) 250. 351. K.N. Tarkase, S.S. Admane, N.G. Sonkhede, S.R. Shejwal, Der Pharma Chem., 4 (2012) 1180. 352. D.M. Dhumal, A.A. Shirkhedkar, S.J. Surana, Der Pharmacia Lettr., 3 (2011) 453. 353. A. Speciale, R. Musumeci, G. Blandino G, I. Milazzo, F. Caccamo, G. Nicoletti, Int. J. Antimicrob. Ag., 19 (2002) 111. Андрија Ћирић Докторска дисертација 256 7. Биографија Андрија Ћирић је рођен у Краљеву, 20. јула 1981. године. Основну школу и Гимназију завршио је у Краљеву. На Природно-математичком факултету, група хемија, смер истраживање и развој, Универзетета у Крагујевцу, дипломирао је 2006. године. По завршетку основних студија уписао је докторске студије на Природно- математичком факултету у Крагујевцу на групи Хемија, смер Аналитичка хемија, 2006/2007. године и положио све испите предвиђене наставним планом и програмом. Након завршетка основних студија био је ангажован као истраживач-приправник, у Институту за хемију, Природно-математичког факултета у Крагујевцу. Боравио је на стручном усавршавању од 01.10.2009 – 31.08.2010. године на Факултету за хемију и хемијску технологију Универзитета у Љубљани, Словенија код проф. др Хелене Просен. За асистента на Природно-математичком факултету у Крагујевцу, у Институту за хемију изабран је јуна 2013. године. Био је ангажован на вежбама из предмета: Квалитативна хемијска анализа, Квантитативна хемијска анализа, Аналитичка хемија 1, Аналитичка хемија 2, Аналитичка хемија 3, Аналитичка хемија за екологе, Инструментална аналитичка хемија 1, Инструментална аналитичка хемија 2 и Равнотеже у аналитичкој хемији. Ангажован је на домаћем пројекту „Синтеза, моделовање, физичко-хемијске и биолошке особине органских једињења и одговарајућих комплекса“ број 172016 код Министарства просвете, науке и технолошког развоја под руководством проф. др Срећка Трифуновића. Такође, био је ангажован и на два међународна пројекта „ТЕМПУС – Modernisation of Post-Graduate Studies in Chemistry and Chemistry Related Programmes“ финансиран од стране Европске уније и „Билатерална сарадња са Словенијом“ финансиран од стране Министарства на просвету, науку и технолошки развој Републике Србије и Министарства за науку Републике Словеније. Курсеви, усавршавања и семинари: 1. Летња школа течне хроматографије, 15 – 19. септембр 2008, Београд, Србија. 2. Друга летња школа масене спектрометрије, 6 – 10. јул 2009, Ниш, Србија. Андрија Ћирић Докторска дисертација 257 3. 6th Slovenian-Croatian Waters Users Meeting, 11 – 13. новембар 2009, Мокрице, Словенија. 4. Triki in nasveti – povečajte učinkovitost LC analiz, 30. март 2010, Љубљана, Словенија. 5. Школа течне хроматографије-масене спектрометрије, 7 – 8. октобар 2010, Београд, Србија. 6. Седма школа масене спектрометрије, 30. мај – 1. јун 2011, Ниш, Србија. 7. Ремедијација, 26 – 27. септембар 2012, Крагујевац, Србија. Андрија Ћирић Докторска дисертација 258 8. Научни радови Научни радови: 1. Andrija Ćirić, Ratomir Jelić, Ljubinka Joksović, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Djurdjević, ”Determination of moxifloxacin in human plasma by derivative UV spectrophotometry in a micellar medium”, Can. J. Anal. Sci. Spec., 52 (6) (2007) 344– 352. ISSN: 1205-6685, IF = 0,422, M23. 2. Predrag Djurdjevic, Andrija Ciric, Aleksandra Djurdjevic, Milena Jelikic-Stankov, ”Optimization of separation and determination of synthesis-related impurities of moxifloxacin by RP-HPLC”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50 (2) (2009) 117–126. ISSN: 0731-7085, IF = 2,524, doi:10.1019/ј.јpba.2009.03.029, M22. 3. Leposava Pavun, Daniela Ðikanović, Predrag Ður|ević, Milena Jelikić Stankov, Dušan Malešev and Andrija Ćirić, “Spectrofluorimetric and HPLC Determination of Morin in Human Serum”, Acta Chim. Slov., 56 (2009) 967-972. ISSN: 1318-0207, IF = 1,066, M23. 4. Andrija Ćirić, Helena Prosen, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Đurđević, “Evaluation of matrix effect in determination of some bioflavonoids in food samples by LC–MS/MS method”, Talanta, 99 (2012) 780–790. ISSN: 0039-9140, IF = 3,733, http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2012.07.025, M21. 5. Pavun Leposava A,. Dimitrić-Marković Jasmina M., Đurđević Predrag T., Jelikić- Stankov Milena D., Đikanović Daniela B., Ćirić Andrija R., Malešev Dušan L., “Development and validation of spectrofluorimetric and LC-MS/MS method for the determination of hesperidin in human plasma and pharmaceutical forms” J. Serb. Chem. Soc., 77 (11), (2012) 1625–1640. ISSN 0352-5139, IF = 0,879, doi: 10.2298/JSC111005060P, М23. 6. Jelena Zirojevic, Zarko Jovic, Aleksandra Djurdjevic, Andrija Ciric, Predrag Djurdjevic, “Chemometric assisted determination of some bisphosphonates and their related substances in pharmaceutical forms by ion chromatography with inverse UV detection”, Acta Chromatographia, in press. ISSN: 1233-2356, IF = 0,485, DOI: 10.1556/AChrom.27.2015.2.2, M22. Андрија Ћирић Докторска дисертација 259 7. Andrija R. Ciric, Nevena Ivanovic, Milica S. Cvijovic, Milena Jelikic-Stankov, Ljubinka Joksovic, Predrag T. Djurdjevic, “Chemometric assisted optimization of RP- HPLC method for determination of some bioflavonoids in Brassica oleracea species and their antioxidative activity”, Food Anal. Method, 7 (2014) 1387-1399. ISSN: 1936-9751, IF = 1,893, DOI: 10.1007/s12161-013-9761-y, M22. 8. Leposava Pavun, Predrag Djurdjevic, Milena Jelikic-Stankov, Daniela Djikanovic, Andrija Ciric and Snezana Uskokovic-Markovic, „Spectrofluorimetric determination of quercetin in pharmaceutical dosage forms“ Maced. J. Chem. Chem. En. in press. ISSN: 1857-5552, IF = 0,318, M23. Поглавље у монографији: 1. Andrija Ciric, Ivan Jakovljevic, Milica Cvijovic, Milena Jelikic-Stankov, Predrag Djurdjevic, “Metal Complexes of Kaempferol and Their Speciation in Human Plasma”, 187 – 202. у књизи „Kaempferol Chemistry, Natural Occurrences and Health Benefits“, Editors G. Villers and Y. Fougere, Nova Science Publishers, Inc, New York, 2013. ISBN: 978-1-62618-516-6, M14. Научна саопштења: 1. Andrija Ciric, Aleksandra Djurdjevic, Milena Jelikic-Stankov, Predrag Djurdjevic, ”Optimization of hplc determination of degradation products of moxifloxacin in its pharmaceutical formulations”, 19th International Symposium on Phamaceutical and Biomedical Analysis, 8 – 12. јун 2008., Гдањск, Пољска. 2. Andrija Ćirić, Ivan Lazarević, Ratomir Jelić, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Đurđević, „Speciation on aluminium(III)-fluoroquionolone family members solutions”, XV Congerss of Analytical Chemistry, P015-B2, 6 – 10. септембар 2009., Инсбрук, Аустрија. 3. Andrija Ciric, Predrag Djurdjevic, Helena Prosen, “Matrix effect on determination some flavonoids in real samples by LC-MS/MS method”, 17th Young Investigators Seminar on Analytical Chemistry, 29. јун – 2. јул 2010., Венеција, Италија. 4. И. Ж. Јаковљевић, И. Лазаревић, Љ. Јоксовић, А. Ћирић, Р. Јелић, П. Ђурђевић, “Равнотеже комплексирања Gd(III)-јона са неким флуорохинолонима”, 49. Саветовање Српског хемијског друштва, AH04-O, 29-32, 13-14. мај 2011., Крагујевац, Србија. Андрија Ћирић Докторска дисертација 260 5. И. Т. Лазаревић, И. Јаковљевић, А. Ћирић, М. Јеликић-Станков, Р. Јелић П. Ђурђевић, “Рачунарско моделирање хумане плазме“, 49. Саветовање Српског хемијског друштва, AH10-P, 46-49, 13-14. мај 2011., Крагујевац, Србија, 6. Andrija Ćirić, Helena Prosen, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Đurđević, “Determination of bioflavanons u food samples using liquid-chromatography methods”, XI Euroanalysis, 11 – 15. септембар 2011., Београд, Србија. 7. Nevena Ivanovic, Milica Cvijovic, Andrija Ciric, Predrag Djurdjevic, “Computer assisted optimization of ultrasound extraction of total phenolics from citrus peel”, 7th Central European Congress on Food – CEFood, 21 – 24. мaj 2014., Oхрид, Македонија, Научни радови проистекли из докторске дисертације 1. Andrija Ćirić, Ratomir Jelić, Ljubinka Joksović, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Djurdjević, ”Determination of moxifloxacin in human plasma by derivative UV spectrophotometry in a micellar medium”, Can. J. Anal. Sci. Spec., 52 (6) (2007) 344– 352. ISSN: 1205-6685, IF = 0,422, M23. 2. Predrag Djurdjevic, Andrija Ciric, Aleksandra Djurdjevic, Milena Jelikic-Stankov, ”Optimization of separation and determination of synthesis-related impurities of moxifloxacin by RP-HPLC”, J. Pharm. Biomed. Anal., 50 (2) (2009) 117–126. ISSN: 0731-7085, IF = 2,524, doi:10.1019/ј.јpba.2009.03.029, M22. 3. Andrija Ćirić, Helena Prosen, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Đurđević, “Evaluation of matrix effect in determination of some bioflavonoids in food samples by LC–MS/MS method”, Talanta, 99 (2012) 780–790. ISSN: 0039-9140, IF = 3,733, http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2012.07.025, M21. 4. Andrija R. Ciric, Nevena Ivanovic, Milica S. Cvijovic, Milena Jelikic-Stankov, Ljubinka Joksovic, Predrag T. Djurdjevic, “Chemometric assisted optimization of RP- HPLC method for determination of some bioflavonoids in Brassica oleracea species and their antioxidative activity”, Food Anal. Method, 7 (2014) 1387-1399. ISSN: 1936-9751, IF = , DOI: 10.1007/s12161-013-9761-y, M22. Научна саопштења проистекла из докторске дисертације: 1. Andrija Ciric, Aleksandra Djurdjevic, Milena Jelikic-Stankov, Predrag Djurdjevic, ”Optimization of hplc determination of degradation products of moxifloxacin in its Андрија Ћирић Докторска дисертација 261 pharmaceutical formulations”, 19th International Symposium on Phamaceutical and Biomedical Analysis, 8 – 12. јун 2008., Гдањск, Пољска. 2. Andrija Ćirić, Ivan Lazarević, Ratomir Jelić, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Đurđević, „Speciation on aluminium(III)-fluoroquionolone family members solutions”, XV Congerss of Analytical Chemistry, P015-B2, 6 – 10. септембар 2009., Инсбрук, Аустрија. 3. Andrija Ciric, Predrag Djurdjevic, Helena Prosen, “Matrix effect on determination some flavonoids in real samples by LC-MS/MS method”, 17th Young Investigators Seminar on Analytical Chemistry, 29. јун – 2. јул 2010., Венеција, Италија. 4. Andrija Ćirić, Helena Prosen, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Đurđević, “Determination of bioflavanons u food samples using liquid-chromatography methods”, XI Euroanalysis, 11 – 15. септембар 2011., Београд, Србија. 5. Nevena Ivanovic, Milica Cvijovic, Andrija Ciric, Predrag Djurdjevic, “Computer assisted optimization of ultrasound extraction of total phenolics from citrus peel”, 7th Central European Congress on Food – CEFood, 21 – 24. мaj 2014., Oхрид, Македонија, Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy Determination of moxifloxacin in human plasma by derivative UV spectrophotometry in a micellar medium Andrija Cirića, Ratomir Jelića, Ljubinka Joksovića, Milena Jelikić- Stankovb, Predrag Djurdjevića,* Abstract The simple yet rapid and accurate spectrophotometric method for the determination of fluoroquinolone family member, moxifloxacin in human plasma was developed. The determination was carried out in a citrate – phosphate buffer (pH = 7.2) in the presence of sodium dodecylsulfate (12.0 mmol L-1). Second order derivative spectra were employed for the quantitation of moxifloxacin by measuring peak – to – peak amplitude in a wavelength range 335 – 345 nm. Linear dynamic range was 0.25 – 10 μg mL-1 with a limit of detection 0.03 μg mL-1. Recovery was between 95 – 102%. Addition of surface active substance improved the sensitivity of the method. The method was successfully applied for the analysis of plasma of healthy volunteers. A HPLC method was also developed as a reference method, to validate and confirm spectrophotometric results. Keywords: Moxifloxacin; Antibiotic; Plasma; Deriva- tive spectrophotometry; Sodium dodecylsulfate (SDS) Résumé N o u s a v o n s d é v e l o p p é u n e m é t h o d e spectrophotométrique simple mais rapide et exacte pour la détermination d’un membre de la famille fluoroquinolone, la moxifloxacine, dans le plasma humain. La détermination a été effectuée dans un tampon citrate – phosphate (pH = 7.2), en présence de *Author to whom correspondence should be addressed: e-mail: preki@kg.ac.yu (Predrag Djurdjevic) a Faculty of Science, Chemistry Department, P.O. Box 60, 34000 Kragujevac, Serbia b Faculty of Pharmacy, Institute of Analytical Chemistry, Vojvode Stepe 450, 11000 Belgrade, Serbia Received: May 7, 2007 Accepted (in revised form): September 19, 2007 dodécylsulfate de sodium (12.0 mmol L-1). Les spectres dérivés du second ordre ont servi à la quantification de la moxifloxacine en mesurant l’amplitude de pic à pic dans la gamme de longueur d’onde 335 – 345 nm. La gamme de linéarité dynamique était de 0.25 à 10 μg mL-1, avec une limite de détection de 0.03 μg mL-1. Les recouvrements se situaient entre 95 et 102%. L’addition d’une substance à surface active a amélioré la sensitivité de la méthode. La méthode a été appliquée avec succès à l’analyse du plasma de volontaires en santé. Une méthode HPLC a aussi été développé à titre de référence, afin de valider et de confirmer les résultats spectrophotométriques. Introduction Moxifloxacin (1-cyclopropyl-7-(S,S)-2,8-diazabicy- clo(4.3.0)-non-8-yl-6-fluoro-8-methoxy-1,4-dihydro-4- oxo-3-quinoline carboxylic acid hydrochloride), Fig. 1, is a new fourth generation 8-methoxy fluoroquinolone developed primarily for the treatment of community acquired pneumonia and upper respiratory tract infec- tions. It is active against Gram negative pathogens, Gram positive cocci, aerobic intracellular bacteria, atypical organisms and anaerobic bacteria [1, 2]. Widespread use of moxifloxacin requires develop- ment of number of analytical methods for its determina- tion in various matrices. However, not many methods have been developed for moxifloxacin determination in biological fluids and dosage forms. Moxifloxacin has been determined in biofluids by HPLC methods [3 – 11], fluorometry [12], capillary elec- trophoresis [13], differential pulse polarography [14], dif- 344 Andrija Cirić, Ratomir Jelić, Ljubinka Joksović, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Djurdjević Volume 52, No. 6, 2007 ferential pulse voltammetry [15] and spectrophotometry [16]. The HPLC based procedures are methods of choice in the analysis of fluoroquinolones in biological matrices. They offer wide dynamic linear range of determination from about 5 ng/mL up to 3 μg/mL with a limit of de- tection as low as 2 ng/mL. These techniques however, are time consuming and require expertise. Therefore, alternative methods for routine clinical analysis are desir- able. Very suitable may be spectrophotometric methods. So far only two papers dealt with spectrophotometric determination of moxifloxacin [14,16] using zero order UV spectra. No methods have been reported which use derivative spectrophotometric determination of moxifloxacin in human plasma. In clinical practice frequent determination of moxi- floxacin levels in plasma is often required to follow success in therapy or to evaluate the efficacy of moxi- floxacin and possible emergence of ressistance. Such determinations are time consuming because of the need to examine a large number of samples. Therefore, rapid analytical methods are required for labor saving. So, the aim of the present investigation was to develop a fast, sensitive, accurate and simple procedure for determina- tion of moxifloxacin in biofluids, without prior, tedious, extraction procedures. In continuation of our previous determination of fluoroquinolones [17] in the present paper, second-order derivative UV spectrophotometry in a micellar medium was used for the direct assay of moxifloxacin in human plasma. Experimental Reagents and standard solution Moxifloxacin hydrochloride standard (declared purity > 99%), yellow powder, Mr = 437.9, was obtained from BayerPharma AG (Germany). Tablets “Avelox“ (400 mg) were products BayerPharma AG. Standard solutions of NaOH and HCl (0.1 mol L-1) were prepared by diluting from concentrated ampoule solution Merck (Darmstadt, Germany). Citrate buffers (pH = 4 – 8) were prepared by mixing appropriate volumes of 0.1 mol L-1 citric acid and 0.2 mol L-1 sodium-monohidrogenphosphate. Borate buffers (pH = 8.5 – 9) were prepared by mixing appropri- ate volumes of 0.025 mol L-1 sodium borate and 0.1 mol L-1 HCl. All buffer solutions were prepared according to Perrin and Dempsey [18]. Solution of sodium dodecy- lsulfate, SDS, (0.1 mol L-1) was prepared from purified sodium dodecylsulphate (Merck) by direct weighing and subsequent dissolution in doubly distilled water. Human plasma samples were separated from human pool whole – blood obtained from the Department of transfusion of clinical hospital “Dr Dragisa Misovic”, Belgrade. Apparatus Spectrophotometric measurments were performed on a Perkin-Elmer (USA), Model Lambda 35, and GBC (Australia) Cintra Model 40, UV-Vis, double-beam spec- trophotometers, interfaced to an IBM PC computer. De- rivative spectra were obtained with the software supplied by the manufacturer. Quartz cuvettes of 1 cm pathlength were used. Optimized working settings were: slit width 0.5 nm, scan speed 120 nm min-1, time response 0.1 ms and Δλ = 1 or 2 nm [19]. HPLC measurements were performed on an Agilent (Waldbronn, FRG) Series 1100 chromatograph equipped with binary pump and fluores- cence detector. The analysis was carried out on Supelco (USA) direct injection shielded hydrohobic phase col- umn, 150 mm × 4.6 mm i.d., 5.0 μm particle size, with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.25 mol dm-3 Na3PO4 (pH = 6.5, adjusted with phosphoric acid) mixed in a volume ratio 15:85, respectively. Isocratic elution with flow rate 1.0 μL min-1 and fluorescence detection with λex = 290 nm and λem = 500 nm was used. Structural analog of moxifloxacin, ofloxacin, was used as an internal standard. The data were processed with HP ChemStation software. Optimization procedure Stock solution of moxifloxacin hydrochloride (50.0 μg mL-1 of moxifloxacin) was prepared by dissolving moxifloxacin standard in doubly distilled water. For the purpose of preliminary optimization of measure- ment conditions, different volumes, 0.02 – 2.00 mL, of the stock solution were transferred to 5 mL volumetric flasks using Eppendorf pipettes, and diluted with either water, water + SDS, buffer or buffer + SDS to the mark and shaken well. The concentration of SDS in solu- Fig. 1. Chemical structure of moxifloxacin (neutral form). 345 Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy Determination of moxifloxacin in human plasma by derivative UV spectrophotometry in a micellar medium tions was 12 mmol L-1. In water solutions the pH was adjusted by the addition of either HCl or NaOH and measured potentiometrically (pH from 3.0 to 9.0). The concentration range of moxifloxacin thus covered, was 0.2 – 20.0 μg mL-1. The zero order spectra were recorded in a wavelength interval 200 – 450 nm while second- order derivative spectra were recorded in 320 – 400 nm wavelength range against appropiate reagent blank. For the construction of the calibration graph the standard solutions of moxifloxacin prepared in citrate buffer (pH = 7.2) with the addition of SDS (12 mmol L-1) were used. Peak to peak amplitude was measured in second order derivative spectra in the wavelength range 335 – 345 nm and ploted against concentration. Calibration graph and procedure for plasma samples A human pool plasma (1.0 mL) was mixed with dif- ferent volumes of standard solution of moxifloxacin to give the final drug concentration of 0.25 – 10.0 μg mL-1. According to literature data moxifloxacin in plasma is bound to plasma proteins (43%). To coagulate proteins and prevent moxifloxacin binding to proteins (mainly albumin) sodium-dodecylsulphate was added so that its final concentration was 12 mmol L-1. SDS also creates hydrophobic enviroment which enhances the solubility of moxifloxacin. The plasma samples were then centri- fuged at 6000 rpm for 15 min. Supernatant was separated and after filtration through a Minisart plus syringe filter (0.2 μm pore size, Supelco, USA) was transferred into a volumetric flask. The flask was filled with citrate buf- fer (pH = 7.2) to the mark. Zero and second order UV derivative spectra of the prepared solutions were taken in the 200 – 450 and 320 – 400 nm wavelength range, respectively, against the plasma blank, prepared as de- scribed above but without the addition of the drug. Peak – to – peak amplitude in second order derivative spectra were measured in the wavelength range 335 – 345 nm. The same procedure for sample preparation was used for chromatographic measurements with the difference that the concentration range of moxifloxacin was 0.05 to 1.5 μg/mL and supernatant was filled in a volumetric flask with phosphate buffer (0.25 mol/L Na3PO4 + H3PO4, pH = 6.5) to the mark. Analytical recovery Five different concentration of moxifloxacin were added to human plasma in order to get concentrations 0.25 – 5.0 μg mL-1. These plasma samples were treated in the same way as for the calibration graph [20]. Results and Discussion Moxifloxacin is a weak heterocyclic amino acid which may exist in solution in cationic, neutral, dipolar and anionic forms. Relative concentrations of these forms strongly depend on pH of the solution. Thus, the strict control of the pH of the solution is necessary for the determination of moxifloxacin by spectrophotometric method. Examination of the spectra of moxifloxacin in aque- ous phase, which was pH adjusted with the addition of strong acid or strong base, were measured potentio- metrically, and their comparison with the spectra where the pH was adjusted by buffer shows only negligible influence of buffers on moxifloxacin absorption. Addition of SDS enhances the intensity of absorption peaks for about ca. 5% and affects the shape of absorption bands which become more symmetrical (Fig. 2). SDS also shifts isoelectric point of moxifloxacin from 7.44 to 8.21 [17] thus keeping the solubility at the acceptable level. The UV spectrum of moxifloxacin consists of two ma- jor bands with the maximum at 290 nm for the first band and 340 nm for the second band. The high energy band is mainly due to the π → π* transition in the aromatic ring. The low energy band is due to n → π* transition in diazabicyclo substituent at position 7, and consists of two subpeaks. These subpeaks also reflect the participation of non-bonding electron pair on nitrogen at position 1 and are caused by an intermolecular hydrogen bond equilib- rium between moxifloxacin and water as well as intramo- lecular hydrogen bond between 4-keto and 3-carboxylic groups [21,22]. Upon increasing the pH from ca. 4 to 9 higher energy band shows only small changes in position and maximum intensity (hypochromic shift). The lower energy band exhibits however, significant changes in a shape, position and intensity (bathochromic shift). At pH values lower than 7, this band is fairly symmetrical with a shoulder at 350 nm, but at pH values higher than 7, two separated absorption maxima at 335 and 355 nm are obtained. Intensity of the band increases upon increasing the pH up to ca 8 and then decreases. Thus, the optimal pH value for analysis was set to 7.2. The absorption of plasma proteins interferes with the band at 290 nm but becomes negligible at 300 nm. (Fig. 3). Therefore, the peak centered at 340 nm was chosen for analysis. Since this peak is not well separated from the peak at 355nm the second-order derivative spectrum was used. In this way the background absorption of the plasma was also minimized. Thus the optimal conditions for the determination 346 Andrija Cirić, Ratomir Jelić, Ljubinka Joksović, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Djurdjević Volume 52, No. 6, 2007 Fig. 2. The effect of sodium dodecylsulfate (SDS) on moxifloxacin spectra. Concentration of SDS is 12 mmol/L and that of moxifloxacin 10 mg/mL. Varying pH of solutions are given in the legend. of moxifloxacin in plasma and in dosage forms were: wavelength at maximum absorption, 340 nm and pH of solution, 7.2. In Fig. 4, the zero (a) and second-order derivative spectra (b), for the different concentration of moxifloxacin in plasma at pH = 7.2 are shown. The calibration graph for the derivative spectropho- tometry was constructed by plotting the peak-to-peak amplitude, in the second derivative spectrum, versus drug concentration. The amplitude was measured in 335 - 345 nm wavelength interval. The equation obtained through regresion analysis of the data for standard solution of plasma was: Y = (2.41 ± 0.06)10-3 X + (3.0 ± 0.2)10-4 (n = 7, r = 0.997 , Sx = 2.7 × 10 -5) where Y is the peak-to-peak amplitude in second order derivative spectra, in absorbance units, X is the concen- tration of moxifloxacin in μg mL-1 and Sx is the standard error of estimation. The limit of detection, DL, defined as [20]: where sb is standard deviation of intercept and a is a slope of the calibration curve was found to be 0.030 μg mL-1. Table 1 shows the results obtained in the analysis of plasma samples. The accuracy of measurements, expressed in terms of relative error (R.E.) was about 5% or even less, thus in- dicating negligible influence of plasma proteins. Clinical investigations have shown that moxifloxacin is rapidly and completely absorbed after oral administration. Peak plasma concentration (approximately 4.5 μg mL-1) is reached about 1 to 3 hours after administration of single dose of 400 mg. The bioavailability is approximately 90% and together with large AUC area indicate that effect of the first liver pass is negligible. Moxifloxacin has a long plasma half-life (12 h) and is predominantly excreted as either unchanged drug or sulfate and glucuro- nide matabolites. In this way moxifloxacin metabolizes very slowly in plasma, allowing accurate determination even more than 10 h after administration. Thus, the pro- posed method for the assay of moxifloxacin in plasma, being simple and rapid, can be applied for the purpose of pharmacokinetic measurements and routine clinical analysis. The method was applied to the analysis of moxi- floxacin in plasma of two healthy volunteers to whom an “Avelox” tablet (400 mg) was administered after overnight fastning. The blood samples (1 mL) were taken by cubital vein puncture at 1 h after administration. The blood was allowed to clot at room temperature and after- 347 Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy Determination of moxifloxacin in human plasma by derivative UV spectrophotometry in a micellar medium Fig. 3. The UV spectra of blank plasma, plasma with the addition of moxifloxacin and plasma with the addition of moxifloxacin and sodium dodecylsulfate. Table 1. Results obtained in determination of moxifloxacin in plasma samplesa Sample Added (µg mL-1) Found (µg mL-1) R.E. (%) Recovery (%) ± R.S.D. 1 0.250 0.238 ± 0.01 4.8 95.2 ± 4.3 2 0.575 0.547 ± 0.02 4.9 95.1 ± 3.7 3 2.070 2.001 ± 0.03 3.3 96.7 ± 1.5 4 4.025 4.109 ± 0.07 2.1 102.1 ± 1.7 5 5.010 4.987 ± 0.02 0.5 99.5 ± 0.4 a Mean, standard deviation, relative error (R.E.) and relative standard deviation (R.S.D.) in five determination 348 Andrija Cirić, Ratomir Jelić, Ljubinka Joksović, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Djurdjević Volume 52, No. 6, 2007 Fig. 4b. Second order derivative spectra for moxifloxacin determination in plasma. Fig. 4a. Zeroth spectra for moxifloxacin determination in plasma. Concentrations of moxifloxacin are in μg/mL. 349 Canadian Journal of Analytical Sciences and Spectroscopy Determination of moxifloxacin in human plasma by derivative UV spectrophotometry in a micellar medium wards centrifuged at 1500 rpm for 30 min. The superna- tant (0.5 mL) was subjected to the same procedure as for plasma calibration graph. The zero order UV spectrum of one patient plasma specimen is shown in Fig. 5. The results of analysis after five repeated measure- ments were: for sample 1; 3.56 ± 0.15 μg mL-1 and for sample 2; 3.89 ± 0.10 μg mL-1. These results are in good agreement with the literature data [23]. An HPLC method was developed to compare the validity of the spectrophotometric method. In the de- velopment of the method we aimed to achieve the pH values near to neutral as this proved to be optimal for spectrophotometry. However, the column used does not allow higher pH values than 7 so we varied experimental parameters in such a way that pH was set to 6.5 while at the same time the percentage of acetonitrile was raised in comparison with that used in our previous work [17] so that chromatographic parameters were acceptable. Spiked plasma samples were directly injected onto the column. The calibration line was constructed by ploting the peak areas ratio of moxifloxacin to ofloxacin versus moxifloxacin concentration. The concentration of ofloxa- cin was 0.5 μg mL-1. The method was fully validated and validation parameters were: linearity range 50 – 1500 ng mL-1, correlation coefficient, 0.9983, mean recovery, 98.5%, limit of quantification, 12.0 ng mL-1 and limit of detection, 5.0 ng mL-1. The chromatogram of patient plasma sample is shown in Fig. 6. The concentration of moxifloxacin in patient plasma read from the calibration curve was 4.05 ± 0.08 μg mL-1 for sample 2. Relative error related to spectrophotometric result is 4.1%, which means that the accuracy and precis- Fig. 6. Chromatogram of patient plasma specimen taken 1 hr after administration of an Avelox tablet (400 mg). Fig. 5. UV spectra of patient plasma specimen in the presence and without SDS. 350 Andrija Cirić, Ratomir Jelić, Ljubinka Joksović, Milena Jelikić-Stankov, Predrag Djurdjević Volume 52, No. 6, 2007 sion of the proposed method is satisfactory. Conclusions The proposed method is fast and accurate with minimal sample pre-treatment. Plasma proteins do not interfere and addition of sodium dodecylsulfate enhances sensitivity of determination. The method could be reli- ably used in the analysis of the large number of samples in a short time e.g. in clinical and pharmacological analysis. Acknowledgements The authors thank the Ministry of Science of Serbia for the financial support through the project 142013. References 1. J.A. Barman Balfour, L.R. Wiseman, Drugs, 57, 363 (1999). 2. H. Stass, A. Dalhoff, D. Kubitza, U. Schühly, Antimicrob. Agents Ch. 42, 2060 (1998). 3. A. Dalhoff, H. Stass, Drugs, 58, 239 (1999) 4. T. Radhakrishna, D.S. Rao, K. Vyas, G.O. Reddy, J. Pharm. Biomed. Anal., 22, 691 (2000) 5. T. Lemoine, D. Breilh, D. Ducint, J. Dubrez, J. Jougon, J.F. Velly, M.C. Saux, J. Chromatogr. B, 742, 247 (2000). 6. K. Vishwanathan, M.G. Bartlett, J.T. Stewart, J. Pharm. Biomed. Anal., 30, 961 (2002). 7. B.B. Ba, R. Etienne, D. Ducint, C. Quentin, M.C. Saux, J. Chromatogr. B, 754, 107 (2001). 8. H. Stass, A. Dalhoff, J. Chromatogr. B, 702, 163 (1997). 9. J.A. Ocaña Gonzáles, M. Callejón Mochón, F.J. Barragán de la Rosa, Microchim. Acta, 151, 39 (2005). 10. T.S. Ulu, J. Pharm. Biomed. Anal., 43, 320 (2007). 11. S. Schulte, T. Ackermann, N. Bertram N, T. Sau- erbruch, D.W. Paar, J. Chromatogr. Sci., 44, 205 (2006). 12. J.A. Ocaña Gonzáles, F.J. Barragán, C. Manuel, Analyst, 125, 2322 (2000). 13. J.G. Möller, H. Stass, R. Heinig, G. Blaschke, J. Chromatogr. B, 716, 325 (1998). 14. R. Inam R, H. Mercan, E. Ylmaz, B. Uslu, Anal. Lett., 40, 529 (2007). 15. N. Erk, Anal. Bioanal. Chem., 378, 1351 (2004). 16. S.K. Motwani, S. Chopra, F.J. Ahmed, R.K. Khar, Spectrochim. Acta A, 68, 250 (2007). 17. A.L. Djurdjevic, M.S. Jelikic, P. Djurdjevic, J Chromatogr. B, 844, 104 (2006). 18. D.D. Perrin, B. Dempsey (1974) Buffer for pH and Metal Ion Control. Chapman and Hall, Lon- don, pp. 148, 153. 19. M.A. Gillespie (1994) Manual of spectrofluoro- metric and spectrophotometric derivative experi- ments. CRC Press, Boca Raton, pp. 29 – 33. 20. M. Thompson, S.L.R. Ellison, R. Wood, Pure Appl. Chem., 74, 835 (2002). 21. U. Neugebauer, A. Szeghalmi, M. Schmitt, W. Kiefer, J. Popp, U. Holzgrabe, Spectrochim. Acta Part A, 61, 1505 (2005). 22. R.H. Park, Y.K. Chung, C.K. Lee, K.J. Lee, M.K. Bark, Bull. Korean Chem. Soc., 21, 849 (2000). 23. A. Speciale, R. Musumeci, G. Blandino G, I. Milazzo, F. Caccamo, G. Nicoletti, Int. J. Antimi- crob. Ag., 19, 111 (2002). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 Contents lists available at ScienceDirect Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis journa l homepage: www.e lsev ier .com/ locate / jpba Optimization of separation and determination of moxifloxacin and its related substances by RP-HPLC Predrag Djurdjevica,∗, Andrija Cirica, Aleksandra Djurdjevicb, Milena Jelikic Stankovc a Chemistry Department, Faculty of Science, 34000 Kragujevac, P.O. Box 60, Serbia b Medicines and Medical Devices Agency of Serbia, 11000 Belgrade, Serbia c Analytical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, 11000 Belgrade, Serbia a r t i c l e i n f o Article history: Received 10 December 2008 Received in revised form 20 March 2009 Accepted 25 March 2009 Available online 5 April 2009 Keywords: Moxifloxacin Impurities Degradation RP-HPLC Chemometry a b s t r a c t A RP-HPLC method for the separation and determination of impurities of moxifloxacin, in its pharmaceu- tical forms aswell asmoxifloxacin degradation products, was developedwith the aid of DryLab® software and chemometric (response surface) approach. The separation of four synthesis-related impurities was achieved on a Waters C18 XTerra column using a mobile phase of (water + triethylamine (2%, v/v)): ace- tonitrile = 90:10 (v/v%); the pH of water phase being adjusted with phosphoric acid to 6.0. Flow rate of the mobile phase was 1.5ml/min and UV detection at 290nm was employed. The column was thermostated at 45 ◦C. The resolution between the two least resolved impurity peakswas in average, Rs,min > 1.5.Method validation parameters indicate linear dynamic range 0.2–2.0g/ml with LOQ ca. 0.20g/ml and LOD ca. 0.05g/ml for all analytes. The method was applied for the impurities determination in drug tablets and infusion (Avelox®, Bayer AG) and for degradation products determination in a stability study ofmoxifloxacin. The impurity content in the tablets and infusionwasquantifiedas0.1%of totaldrug. Twodegradationproductswerenotedunder hydrolytic conditions. The method can also be used for rapid and accurate quantification of moxifloxacin hydrochloride in its tablets during stability testing. © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Moxifloxacin, [1-cyclopropyl-7[S,S]-2,8-diazabicyclo[4.3.0]non- 8-yl-6-fluoro-8-methoxy-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolone carbo- xylic acid hydrochloride] (MOX) is a synthetic antibacterial agent active against Gram-negative and some Gram-positive bacteria. Its pharmaceutical formulations involve tablets and infusions (Avelox®, Avalox®, Tovan®, Bayer AG). It is synthesized by vari- ous procedures which commonly involve two main phases: (a) synthesis of quinolone nucleus and (b) introduction of various substituents [1,2]. Bayer AG (Leverkusen, Germany) has patented several synthetic processes [3], the main one being outlined in Scheme 1 [3,4]. During the synthesisdevelopedbyBayerAG,notonlyun-reacted difluoro compoundbut also its related analogues: (i) 1-cyclopropyl- 7-[(S,S)-2,8-diazabicyclo[4.3.0]non-8-yl]-6,8-difluoro-1,4-dihyd- ro-4-oxo-3-quinolone carboxylic acid [6,8DF], (ii) 1-cyclopropyl- 7-[(S,S)-2,8-diazabicyclo[4.3.0] non-8-yl]-6,8-dimethoxy-1,4-  Presented in part in XIX International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Gdansk (Poland), 2008. ∗ Corresponding author. Fax: +381 34 335 040. E-mail address: preki@kg.ac.yu (P. Djurdjevic). dihydro-4-oxo-3-quinolone carboxylic acid [6,8DM], (iii) 1-cyclo- propyl-7-[(S,S)-2,8-diazabicyclo[4.3.0]non-8-yl]-8-fluoro-6-meth- oxy-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolone carboxylic acid [6M8F], and (iv) 1-cyclopropyl-7-[(S,S)-2,8-diazabicyclo[4.3.0]non-8-yl]-8- ethoxy-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolone carboxylic acid [6F8E] (Scheme 2) are usually carried over in small quantities into bulk MOX [4,5]. Hence, the drug may contain impurities or to degrade during formulation process and stability testing under accelerated and long term storage conditions. Identification limits must be established for each impurity in accordance to ICH guidelines [6] and if the limit level is exceeded the impurity must be identified and quantified [7,8]. Several HPLC methods have been reported for moxifloxacin determination in its pharmaceutical forms and biological matrices [9–11]; no one was stability indicating. Isolation and identification of synthesis-related impurities was dealt with in some papers. Kumar et al. [12], isolated and structurally characterized four impu- rities in bulk moxifloxacin: 1-cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-8- methoxy-7-[(S,S)-N-methyl-2,8-diazabicyclo(4,3,0)non-8yl]-4-oxo -3-quinoline carboxylic acid, methyl-1-cyclopropyl-6-fluoro- 1,4-dihydro-8-methoxy-7-[(S,S)-2,8-diazabicyclo(4,3,0)non-8-yl]- 4-oxo-3-quinoline carboxylate, 1-cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dih- ydro-8-hydroxy-7-[(S,S)-2,8-diazobicyclo(4,3,0)non-8-yl]-4-oxo- 3-quinoline carboxylic acid, and 1-cyclopropyl-6,7-difluoro- 0731-7085/$ – see front matter © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.jpba.2009.03.029 118 P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 Scheme 1. Synthetic route of moxifloxacin HCl [3]. 8-hydroxy-4-oxo-1,4-dihydro-3-quinoline carboxylic acid. The different structures of impurities found by Kumar et al. and those stated by Bayer AG could be attributed to different sythetic routes [2,3]. Motwani et al. [13], found three synthesis-related impurities by HPTLC method. The drug was also subjected to acid and alkali hydrolysis, oxidation, dry and wet heat treatment and photo degradation. Significant degradation was observed under hydrolytic conditions (seven products) while under other conditions degradation was milder (three products). Salem et al. [14] applied two stability-indicating methods, densitometric TLC and derivative spectrophotometry for the determination of lome- floxacin,moxifloxacin, and sparfloxacin in thepresence of their acid degradates. The main degradant, a decarboxylated product was separated by TLC. Wei et al. [15] characterized some moxifloxacin impurities by spectrophotometric method. To our knowledge, no method for separation and determination of synthetic impurities of moxifloxacin based on chemometric approach was described in literature. Themain goal of the present investigationwas to obtain optimal separationof components ina reasonableanalysis timebyadjusting acceptable chromatographic factors. The methods achieving this goal arebasedon theoptimizationof themobilephasecomposition, pH, additive concentration, flow rate, type of chromatographic col- umn, temperature and buffer selection. Simultaneous optimization of that many parameters requires computer oriented chemometric approach in order to simplify and accelerate the optimization pro- cess. In the present study a computer simulation software DryLab® was used in developing and optimizing a reverse-phase HPLC separation of moxifloxacin and its related impurities and degrada- tion products of moxifloxacin [16–18]. Scouting analytical runs are required for DryLab® calculations since they train (“calibrate”) the software. With the input data of training runs the software evalu- ates the resolution, Rs as a function of one or two chromatographic parameters for each peak pair. A “critical resolution map” is pro- duced by plotting smallest value of resolution of any two critical peaks as a function of one or two varied experimental parame- P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 119 Scheme 2. Structure of moxifloxacin and related impurities with abbreviations. ters revealing not only the optimum chromatographic conditions but also the robust regions of an HPLC method [16]. The predictive power of DryLab® software is based on Eq. (1) derived from the thermodynamic considerations of chromatographic process [19]: ln k = A + B · D + C · A + D(Ke − 1)V2/3 + E + ln(RT/P0V) (1) This equation involves six energetic contributions—electrostatic forces, van der Waals forces, cavity term, correction term for non-planar surfaces, dielectric constant term and entropy of con- densation term. The meaning of individual terms in Eq. (1) is: k: capacity factor A: experimental accessible constant A= (AS +AL −ASL) solvophobic contact surface area in solute (S)–ligand (L) complex BD: electrostatic term (D approx. = 1) V: molar volume of the solvent Ke: molecular parameter of the solute P0: atmospheric pressure : surface tension T: temperature R: gas constant CA (=NA/RT): cavity reduction term N: Avogadro’s number E: van der Waals term Eq. (1) describes the influence of the composition of eluent on retention based on the surface tension,  , which is propor- tional to (100−%B=%A), the amount of water in the mobile phase, the temperature T, molecular properties of sample and chemically bonded ligand, the contact surface area between ligand and solute A and electrostatic properties such as buffer concentration. The DryLab® software allows for simultaneous optimization of one or two variables with input parameters, retention time, peak area and peak-width under chosen chromatographic conditions (col- umn, temperature, gradient or isocratic elution) and is visualizing peak movements, which are essential to understand robustness of anHPLCmethod. The resolutionmapof one-dimensional optimiza- tion (1D) is two-dimensional graph whereas the resolution map of a two-dimensional optimization (2D) is a three-dimensional con- tourplot inwhich thecritical resolutionasa thirddimension is color coded. Sliding a cross-hairmarker to the regionofmaximumcritical resolution one is able to optimize values of parameters and sim- ulated chromatogram can be obtained, so that best experimental conditions can be easily identified. To study the individual contribution of chromatographic factors to resolution of the peaks the response surface method was used [20]. The overall experimental response, Rx, is taken as a function of independent variables, %B, pH, T and %TEA (factors). The response, overall resolution, Rx is defined as a sum of individual resolutions between pairs of critical peaks [21]. Hence, the Rx will increase as analytical performance improves. Plot of Rx on factor space is the response surface. The region close to the extremum, a “nearly sta- tionary region” can be suitably described by using second order polynomial: Rx = b0 + f∑ i=1 bixi + f∑ i=1,j>1 bi,jxixj + f∑ i=1 biix 2 i + ε (2) where f is the dimension of the factor space and ε is the error asso- ciated to the Rx, which is assumed to be normally distributed. We determined the factors corresponding to optimumresponse (nearly stationary space) employing the softwareStatSoft Statisticav.6 [22]. 2. Materials and methods 2.1. Reagents All reagentswereHPLC reagent grade purity unless stated other- wise. Moxifloxacin hydrochloride and its synthetic impurities and 120 P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 ofloxacin as internal standard (IS) were used as certified reference compounds (Bayer AG, Germany) for quantitative analysis. Avelox® tablets (400mg) and infusion (400mg/250ml) were products of Bayer Health Care, Leverkusen, Germany. Acetonitrile was obtained from J.T. Baker (Deventer, The Netherlands) while ortho-phosphoric acid, sodium hydroxide and hydrochloric acid were products of Merck (Darmstadt, Germany). Triethylamine (99.5%, v/v)wasobtained fromFluka (Buchs, Switzer- land). HPLC grade water was produced by using Milli-Q water purification system (Millipore, Milford, USA) and was used for preparation of all solutions and reagents. 2.2. Apparatus A HPLC system (Shimadzu, Kyoto, Japan) consisted of degasser DGU-20A3, analytical pumps LC-20AT, 7125 injector andSPD-M20A diode array detector and CBM-20A system controller as well as Agilent 1100 series HPLC system (Agilent, CA, USA) comprising qua- ternary pump, injector, degasser and diode array UV detector were used for analysis. A reversed-phase Supelco (Bellefonte, PA, United States) ABZ C18 (50mm×4.6mm, particle size 5m) and XTerra C18 (Waters, Milford, USA) column (50mm×4.6mm, particle size 5m) were used for separation. The chromatographic data were processed using LC Solution computer software (Shimadzu) and ChemStation software (Agilent). For the disintegration of the Avelox tablets and acceleration of dissolution, an ultrasonic bath (Bandelin Sonorex Super, Model RK 512H) was used. 2.3. Chromatographic conditions The chromatographic separations were performed using either Supelco ABZ or Waters XTerra column using a mobile phase, water (+2% triethylamine): acetonitrile 90:10 (v/v%), the pH of the aque- ous phase being adjusted to 6.0with phosphoric acid, with the flow rate of mobile phase of 1.5ml/min at 45 ◦C. The samples were mon- itored at 290nm. 20l volume of sample was injected into HPLC system. 2.4. Analytical procedure 2.4.1. Stock solutions For the preparation of stock solutions of moxifloxacin, ofloxacin and five impurities 0.1% phosphoric acid was used as solvent and diluent. The concentration of moxifloxacin was 10.01mg/ml, ofloxacin was 0.206mg/ml, 6M8F was 55.0g/ml, 6F8E was 51.0g/ml, 6,8DM was 51.0g/ml, 6,8DF was 52.0g/ml. 2.4.2. Standard solutions Working standard solutionswere prepared by dilution of appro- priate volumes of stock solutions to 10ml. For DryLab® simulations the mix solution contained moxifloxacin and its related impurities at the sameconcentration level, 10g/ml. Theworking solutions for optimization study contained 200g/ml ofmoxifloxacin, 1.0g/ml of ofloxacin as internal standard (IS) and 1.0g/ml of all impurities. 2.4.3. Sample preparation Three tablets were accurately weighed (to obtain the aver- age mass of one tablet) then finely powdered and 273.2mg of homogenized powder was transferred to 25ml volumetric flask. Approximately 20ml of the diluentwas added and themixturewas sonicated for 15min. The mixture was then diluted to volume with thediluent. The solutionwasfiltered througha0.22mmnylonfilter. Exactly 175l of filtrate, equivalent to 200g/ml of moxifloxacin, was pipetted using an Eppendorf pipette into a 5ml volumetric flask. Solutions in two flasks were diluted to the mark with dilu- ent and one flask was used for analysis of the impurities while the other was used for degradation studies. Degradation was carried out under hydrolytic conditions in acid (0.1M HCl), neutral (water medium) and base (0.1M NaOH) medium. Solutions were left at 50 ◦C for 3h. Oxidation stress was performed in 3% H2O2 solution; the solution was left for 6h at room temperature, while photolytic stress was done in light chamber equipped with lamp bank with two Osram UV lamps. Total 840Wh/m2 of irradiation for 3h, was used. 0.625ml of infusion was transferred to a 5ml volumetric flask and diluted with the diluent to mark. This solution was used for impurity determination. The degradation of bulkmoxifloxacinwas carried out in parallel, in the same way as described above. Before analysis to all solutions the same quantity of internal standard (ofloxacin) was added so that its final concentration was 1g/ml. 2.5. Method development Themethoddevelopment startedwithABZcolumnandbuffered (pH 6.0 adjusted with H3PO4 +2%TEA in water phase) water (A)-tetrahydrofuran, THF (B) and water (A)–methanol, MeOH (B) mixture as the mobile phases with linear gradient from 0 to 50% B in 20 and 40min. No separation of peaks was noted with THF, while with MeOH no better resolution than Rs = 1.1 between criti- cal pairs of peaks could be achieved. In further set of experiments the mobile phases were exchanged to water (A)–acetonitrile, ACN (B) mixture. All experimental data: retention times, peak areas and widths, temperature, column information and instrumental data, were entered into DryLab® software. To obtain 2D resolution map three combinations of parameters were considered: tG vs. eluent composition (ACN:H2O), tG (gradient time) vs. column tempera- ture; and eluent composition vs. pH. Other possible combinations were not considered. Optimization was started with gradient runs. Then, retention data from gradient runs were used to predict iso- cratic separation. Before starting analytical runs the dwell volume of HPLC systems was determined. The dwell volume must be deter- mined to be able to make method transfer from one to another HPLC system. First, HPLC column was removed and injector and detector were short connected by piece of tube. Gradient run was made with acetonitrile as solvent A and 0.1% acetone solution in acetonitrile as solvent B. Linear 10min gradient with 0–100%B was used with flow rate of 2ml/min. A plot of %B vs. tG was made and from the retention time at midpoint of the gradient the dwell vol- ume was calculated [18]. For Agilent system the dwell volume was 1.7ml and for Shimadzu system, 2.7ml. These data were entered into a program to relate sample retention to gradient composition at the column. The optimization of analytes separation was started with two linear gradient runs: tG=30min and tG=60min; %B run from 5 to 50% in the DryLab® mode LC-Gradient. Temperature was 30 ◦C and pH of water phase was 5.5. Along with retention times and peak areas the baseline peak-widths were also entered into the program. The resulting 1D resolution map is shown in Fig. 1. Identification of peaks (peak tracking) was ensured by co- injecting the standards. FromFig. 1 theoptimal%B for isocraticwork can be easily identified to be in the range 10–13% ACN. Further, the column temperature was optimized by four linear gradient runs with tG=30 and 60min, %B from 5 to 20% and temperatures 30 and 60 ◦C (DryLab® mode LC-RP Gradient/Temperature). From 2D reso- lution map presented in Fig. 2 the optimal temperature range was identified at 45–47 ◦C. Bearing in mind that all analytes are ionizable amphoteric sub- stances one may expect the strong influence of pH on separation. Experimental design for pH optimization is presented in Scheme 3. P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 121 Fig. 1. 1D resolution map obtained in tG/%B optimization at pH 5.5 and T=30 ◦C. Fig. 2. 2D resolution map in tG/temperature optimization at pH 6.12. Scheme 3. Experimental design for LC-tG/pH optimization. To find optimal pH first, six screening gradient runs were carried out with tG=30 and 60min, %B varying from 5 to 20% and pH val- ues at 2.5, 4.5 and 6.5 (DryLab® mode LC-RP Gradient/pH). The training (scouting) set of screening chromatograms is presented in Fig. 3. These runs indicated that the optimal area of pH is above 4.0. Table 1 A comparison of predicted and experimental retention data for the optimized sep- aration of model compounds (11% B; pH 6.10). Peak I.D. Retention time (min) Resolution DryLab Experimental DryLab Experimental 6,8DF 3.16 3.20 5.55 5.50 MOX 4.65 5.00 4.09 4.00 6,8DM 6.16 6.20 2.36 2.41 6M8F 7.24 7.14 3.66 3.00 6F8E 9.34 9.08 n/a n/a Average standard error 0.10 0.20 Though satisfactory values of Rs can be obtained at lower pH values (2.5), analysis time is too long and conditions are not robust. Thus, additional six gradient runs were made at pH 4.65, 5.56 and 6.12 under the same gradient conditions. In this way the recommendation [18] not to change the pH for more than one unit near pKa was followed. The dissociation con- stants of moxifloxacin are pKa,1 = 6.25 and pKa,2 = 9.29 [23]. Thus, the chosen pH interval adequately brackets the area near the first dissociation of moxifloxacin. The temperature was set at 45 ◦C and flow rate at 1.5ml/min. Inspecting the chromatograms one may see that at lower pH values the separationbetween6,8DMand6M8F is adequatebut res- olution between MOX and 6,8DF is unacceptable. Increasing the pH generally improves the resolution and MOX and 6,8DF adequately separate, but fine tuning between %B and pH is needed to improve resolution between critical pair 6,8DM and 6M8F. From 2D robust resolution map it can be seen that optimal pH is in the range 5.8–6.1. From this map it can also be seen that tR is much lower than25%of tG so that isocraticmodemight be possible. Changing DryLab® conditions from 2D resolution map to isocratic mode, from 2D resolution map optimal conditions are identified at pH 6.0 and %B=9.8%. The isocratic resolution map and calculated (simulated) chromatogram are shown in Fig. 4. A simulated isocratic run is compared with experimentally obtained isocratic chromatogram under optimal conditions found in DryLab® simulations, and results are presented in Table 1. Data in Table 1 show that DryLab® accurately predicts retention of analytes. The calculated number of plates for moxifloxacin was 9654. From DryLab® simulations it is evident that %B, pH and tem- perature show strong influence on retention and separation of the analytes.Nearly optimumcondition requiredpHaround6, %B about 10%, and temperature higher than 40 ◦C. Though the resolutions of critical pairs under these conditions are satisfactory, significant tail- ing was obtained for moxifloxacin and 6-fluoro-8-ethoxy analytes. Therefore we exchanged ABZ column for XTerra which provides more symmetrical peaks. There was no significant difference in optimal chromatographic parameters between these two columns. DryLab® simulation is based on thermodynamic consideration of chromatographicprocess and it isdesirable to seehowphenomeno- logical, i.e. statistical approach compares with thermodynamical. Further optimization was performed on XTerra column using fac- tor analysis and response surface methodology with initial values of factors taken from DryLab® analysis. Response surface method- ologywould enable statisticalmodeling andquantification of factor effects on the chromatographic process. The following factors were examined: pH (X1), %B (X2), temperature, %TEA (X3). Levels of these factors together with their coded values for customized central composite design are summarized in Table 2. Coding of factors was performed according to formulae: Xcoded = (Xreal − Xaverage) (range/2) 122 P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 Table 2 Chromatographic factors and their coded values. pH (X1) 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 Coded values −2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2 %ACN (X2) 8 9 10 11 12 Coded values −2 −1 0 1 2 %TEA (X3) 1 2 3 Coded values −1 0 1 Xaverage = (Xmax + Xmin)2 range = Xmax − Xmin In each experiment overall resolution, i.e. the sum of all resolu- tion of individual resolutions between pairs of peaks was used as response. Between two peak resolution Rs1,2 was calculated using the formula [24]: Rs1,2 = 1 4 ( k′2 k′1 − 1 )√ Np ( k′1 k′1 + 1 ) (3) where Np is number of theoretical plates for the drug, k1 is a capacity factor for peak 1 and k2 for peak 2. The experiment was designed as customized central composite face centered design with replications. In order to reduce the number of experiments the temperaturewas set to 45 ◦C, as optimal value determined from DryLab® simulation. The complete coded design is given in Table 3. The factors are designated as X1 =pH, X2 =%ACN, X3 =%TEA. The design consists of 37 runs with some fractional factorial and star points with three replicates at central point and some other replicate points, so that pure error can be estimated. The calcula- tions were performed by using a program Statistica v. 6. Initial ANOVA calculation indicated 11 coefficients in a quadratic model of which four are linear, three are quadratic and three are interactions. Since, calculated p-statistics was higher than 0.05 for X1X3 interaction coefficient, in a second calculation cycle this coef- ficient was omitted and included in the lack-of-fit. ANOVA analysis (Table 4) gave mean lack of fit of 4.4 which suggest applicability of quadratic model. In Table 5 coefficients from Eq. (2) are presented together with standard error. The calculated p-statistics indicate that eight coefficients are important, the most important being quadratic pH term. Also, pH and %ACN interaction is important in the model, thus, changes in both pH and organicmodifier ofmobile phase simultaneously exert effect on resolution. Careful regulation of both is needed in order to achieve good separation. Quantity of TEA and its interaction with ACN is less important. Calculated response surface is shown in Fig. 5. It has relatively broad maximum indicating favorable robustness of the method. The optimal values were searched using non-linear least square method. The optimal calculated values were: pH 6.0, %ACN=10%, Fig. 3. Training set of chromatograms for screening LC-gradient tG/pH optimization. T=30 ◦C. (a) tG=30min; (b) tG=60min. P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 123 Fig. 3. (Continued.) Fig. 4. Isocratic 2D resolution map (a) obtained from gradient data for pH optimiza- tion and corresponding chromatogram (b). Fig. 5. Response surface calculated from the design data given in Table 3. 124 P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 Table 3 Experimental design. The overall response factor, Rx was measured by summing the individual resolutions between pairs of peaks. No. pH %ACN %TEA Rx 1 0 0 0 9.27 2 0 0 0 9.23 3 0 0 0 9.37 4 0 0 1 8.1 5 0 0 1 8.15 6 0 0 −1 7.47 7 0 0 −1 8.04 8 0 1 0 8.35 9 0 1 0 8.25 10 0 −1 0 8.99 11 0 −1 0 9.26 12 0 −1 −1 7.35 13 0 −1 −1 7.41 14 0 2 −1 5.78 15 0 −1 −1 7.13 16 0 −1 −1 7.12 17 2 2 0 2.38 18 2 −2 0 4.42 19 1.5 0 0 3.5 20 1.5 2 0 5.52 21 1.5 −2 0 2.65 22 1 0 −1 4.45 23 1 0 −1 5.78 24 1 2 −1 6.8 25 0.5 0 −1 6.53 26 0.5 0 −1 7.73 27 0.5 0 −1 6.79 28 0.5 2 −1 5.47 29 0.5 −2 −1 6.34 30 −0.5 0 −1 8.4 31 −1 2 0 3.45 32 −1 −2 0 1.4 33 −1.5 0 0 2.54 34 −1.5 0 −1 3.18 35 −2 0 0 5.18 36 −2 2 0 5.67 37 −2 −2 0 1.48 Table 4 ANOVA analysis of quadratic chromatographic model. Coefficients SS df MS F p b1 0.737 1 0.737 4.508 0.055211 b11 58.553 1 58.553 357.772 0.000000 b2 4.912 1 4.912 30.014 0.000141 b22 10.207 1 10.207 62.369 0.000004 b3 0.857 1 0.857 5.239 0.041011 b33 0.852 1 0.852 5.205 0.041571 b12 4.062 1 4.062 24.820 0.000319 b23 0.812 1 0.812 4.961 0.045832 Lack of fit 70.481 16 4.405 26.916 0.000001 Pure error 1.964 12 0.164 Total SS 198.330 36 SS: sum of squares, df: degree of freedom, MS: mean sum of squares, F: Fisher statistics, p: statistical parameter related to significance of coefficients. Table 5 Calculated coefficients in a quadratic model of chromatographic separation. Coefficients Effect Std. err. pure err. t(12) p b0 8.23 0.144 56.9798 0.000000 b1 0.58 0.272 2.1233 0.055211 b11 −8.90 0.470 −18.9149 0.000000 b2 1.48 0.270 5.4785 0.000141 b22 −2.80 0.355 −7.8974 0.000004 b3 0.70 0.306 2.2889 0.041011 b33 −0.91 0.400 −2.2814 0.041571 b12 −1.68 0.337 −4.9819 0.000319 b23 1.03 0.465 2.2273 0.045832 T=45 ◦C, %TEA=2% in close agreement obtained by DryLab® simu- lation. 2.6. Method validation [25,26] The optimized chromatographic conditions were validated by evaluating specificity, linearity, precision, accuracy, limit of detec- tion (LOD), limit of quantification (LOQ), robustness and system suitability in accordance with ICH guidelines Q2A. 2.6.1. Linearity Standard stock solution of the drug and impurities were diluted to prepare linearity standard solutions of impurities in the concentration range 0.2–2.0g/ml. Each test solution contained moxifloxacin (200g/ml), ofloxacin (1 (g/ml) and one particu- lar impurity standard. Different volumes of stock solutions were transferred into 5ml volumetric flasks and diluted to mark with the diluent to yield 0.2–2.0g/ml concentration range for each impurity. Seven solutions were prepared. The calibration line was obtained by plotting the analyte to IS peak area ratio against cor- responding concentration ratio. Three sets of such solutions were prepared and each set was analyzed to plot a calibration curves. The linear coefficients, standard deviation of slope and intercept, correlation coefficient, standard error of the fit, residual sum and standard error in residuals were calculated using the program Sta- tistica v. 6 [22]. 2.6.2. Precision, limit of detection, and limit of quantitation The precision of the HPLC procedure was assessed by analyzing 10 solutions containing known quantities of analytes. The precision was calculated as: %RSD = SD × 100 x¯ The detection limit was determined from calibration curves plot- ted by using sufficiently low concentrations (0.10, 0.25, 0.35, 0.45, 0.5 and 0.60g/ml) of analytes. The limit of detection (LOD) was calculated using the formula: LOD = 3.3 sb a where sb is the standard deviation of y-intercept of the calibration line and a is the slope of the calibration line. Limit of quantitation (LOQ) was calculated using the equation: LOQ = 10 sb a The test solutions at LOD and LOQ concentrations were injected six times and %RSD of peak area of replicate injections was calculated. 2.6.3. Accuracy Standard mixtures containing MOX, OFLO and four impurities were prepared and analyzed by HPLC using optimal separation conditions. The accuracy of the method was checked for three different impurity concentration levels (relating to nominal one): 80%, 100% and 150%, by standard addition technique. A known amount of impurities was added to the sample containing all components: moxifloxacin, 200.0g/ml and ofloxacin as internal standard, 1.0g/ml and ratio of peak area (analyte to internal stan- dard) was recorded against added quantity of analyte. All analyses were repeated six times and standard deviations (SD), recoveries and %RSD, were calculated. 2.6.4. Specificity To demonstrate the specificity of the method the solution of moxifloxacin standard was spiked with known quantities of poten- tial impurities. All the impurities were clearly separated and are P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 125 Fig. 6. Chromatogramof ofloxacin (1g/ml),moxifloxacin (200g/ml) and four synthesis-related impurities (ca. 1g/ml) under optimal conditions: pH 6.0; T=313K;mobile phase composition (water +2% triethylamine):acetonitrile = 90:10 (v/v%); flow rate: 1.5ml/min; =290nm. Table 6 Linear regression data for moxifloxacin related impurities. Compound Linear regression Y= aX+ba Correlation coefficient (R2) LOD (g/ml) LOQ (g/ml) Standard error Sum of residuals 6,8DF Y= (1.06±0.02)X− (0.04±0.02) 0.9988 0.060 0.20 0.02 2×10−15 6,8DM Y= (0.75±0.01)X− (0.14±0.01) 0.9994 0.041 0.14 0.01 −7×10−16 6M8F Y= (0.86±0.01)X− (0.14±0.02) 0.9990 0.054 0.18 0.02 −6×10−16 6F8E Y= (0.99±0.02)X− (0.12±0.02) 0.9986 0.061 0.21 0.02 4×10−16 Concentration range 0.200–2.000g/ml. No. of experimental points 7. Internal standard ofloxacin, 1.0g/ml. a Y=peak area ratio between analyte and internal standard; X= concentration ratio of analyte and internal standard. not interfering with the retention times of either moxifloxacin or ofloxacin. A stock solution of placebo was made by dissolving excipients mix (microcrystalline cellulose 136mg, croscarmelose sodium 32mg, lactose monohydrate 68mg, magnesium stearate 6mg, hypermelosa 10mg, makrogol 4000 3mg) in diluent in a 100ml volumetric flask with sonication and ultrafiltration. Test solutions were made from reference standards and placebo solu- tion. 2.6.5. Robustness To demonstrate the robustness of the method deliberate small changes of pH and acetonitrile content were made around the optimal values. The pH was varied between 5.8 and 6.2 while ace- tonitrile content was varied between 9.8 and 11%. No significant changes (relative error less than 5%) of relative retention time (rel- ative to internal standard, ofloxacin) was seen. 2.6.6. System suitability The system suitability parameters were defined with respect to theoretical plates, tailing factor, repeatability and resolution of the moxifloxacin peak using reference and test solutions. 3. Results and discussion 3.1. Method validation It was found that the excipients do not interfere with either moxifloxacin or any impurity component. This indicates that the method is specific for the separation and determination of process impurities in moxifloxacin tablets. A typical chromatogram of a synthetic mixture containing MOX and four impurities: 6,8DF, 6,8DM, 6M8F and 6F8E is shown in Fig. 6. Reproducible peak shapeswere obtained under the optimum conditions. The validation data for calibration lines of four impurities are summarized in Table 6. The response of analytes was linear in the concentration range 0.2–2.0g/ml. Calculated statistical param- eters indicate that the calibration lines are fitting well into the model and that are significantly linear despite relatively large con- centration of moxifloxacin in the test solutions (200g/ml). The determined LOD and LOQ values for the impurities indicate their reliable identification and quantification in moxifloxacin pharma- ceutical forms. The %RSD of peak area at LOQ concentration was found to be less than 5% indicating satisfactory sensitivity of com- ponents quantification. Using a different HPLC instrument (under the same chro- matographic conditions) no significant variation in calculated concentrations, and chromatographic parameters were found (Table 7). Satisfactory recoveries of the test substances (97.3–102.8%)with %RSD less than 4% were obtained suggesting that method can accurately quantify impurities in both tablets and infusion. Small variations of different parameters (pH, %B) do not result in large change of overall resolution as seen from response surface (Fig. 5) indicating the robustness of themethod. To develop amethod capa- ble to resolve the drug and its four synthetic impurities in one isocratic run it was necessary to set a minimal base resolution of critical peak pair which should be achieved. We set this value at Rs = 1.4. FromDryLab® simulations itwas evident that this value can bemet ina relativelybroad rangeofACNpercentage ineluent (9–12, v/v%)butapHrange isnarrower, between5.8and6.2. LoweringapH requiresmuch longer analysis time tokeepacceptable resolution. In all experiments conducted under optimal conditions, critical reso- Table 7 Chromatographic characteristics of moxifloxacin and four impurities resolved on a XTerra column under optimal conditions. Parameter Compound Instrument 6,8DF MOX 6,8DM 6M8F 6F8E RRT S 0.714 1.00 1.434 1.549 1.710 A 0.758 1.00 1.540 1.600 1.674 RRF S 0.991 1.00 0.415 0.404 0.529 A 1.190 1.00 0.430 0.460 0.589 Rs S 5.239 2.757 2.779 1.553 1.410 A 5.460 2.900 2.910 1.600 1.420 Tailing S 1.189 0.980 1.160 0.976 1.072 A 1.010 1.000 0.890 0.970 0.984 RRT: relative retention time, RRF: relative response factor, Rs: resolution, calculated relative to ofloxacin as an internal standard, S: Shimadzu, A: Agilent apparatus. 126 P. Djurdjevic et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50 (2009) 117–126 lution was not less than 1.4. Thus, two regions of %B and pH overlap at Rs values ranging from minimal 1.4 to as high as 5.5 indicating favorable robustness and suitability of themethod.However, tailing of some peaks of impurities deviates from ideal, but nonetheless, chromatogramsare reproducible (two instruments) andrepeatable. Change in concentration leads to a linear response in peak areas and allows for precise determination. Thus, the experimental tailing is acceptable. 3.2. Impurity determination An impurity peak at tR =8.02min was noted in tablets and infu- sion solution. It was well resolved from the standard moxifloxacin (RRT=1.54). Quantification against moxifloxacin reference stan- dard gives 0.11% of the drug. Comparison of RRT values and DAD spectra with known synthetic impurities indicate that the impu- rity is 6-methoxy-8-fluoro (6M8F) product. Kumar et al. [12] using preparative gradient HPLC elution separated four process-related impurities from bulk moxifloxacin. The impurity found in our work is different from those found by Kumar et al. The difference can be explained taking into account the fact that in both cases impuri- ties are process related, and we used the samples from Bayer AG while Kumar et al., used the samples from Dr. Reddy’s Laborato- ries Ltd., India. The synthesis andpurification procedures employed by these two manufacturers are different, thus, different process- related impurities result. 3.3. Forced degradation products determination The similar degradation behavior of the drug in bulk, tablets and infusion indicated that there was no interaction between moxifloxacin and excipients. Under hydrolytic conditions two degradation products at tR =5.90 and 6.73min (acid hydrolysis) and tR =6.05 and 6.67min (base hydrolysis) are seen. Total hydrolytic degradation is ca. 0.3%. No peaks of degradants were seen under photolytic or oxidative conditions. Salem et al. [14] found one acid degradant of moxifloxacin by densitometric TLC which was identi- fied by IR spectroscopy as decarboxylatedmoxifloxacin.Motwani et al. [13] identified by densitometric HPTLC method seven hydrolytic degradates. The difference in degradation behavior of moxifloxacin in our work and that of Motwani et al., can be attributed to much more drastic conditions used for degradation in their work (1M concentration of HCl or NaOH, 30% H2O2, with reflux for 3h). 4. Conclusion In the present work a RP-HPLC method for the separation of moxifloxacin impurities was developed with the aid of chemomet- ric approach, validated and used for their determination in tablets and infusion. Optimization based on DryLab® computer simula- tions and on statistical response surface methodology led to the practically same optimal conditions for separation. The proposed method separates the drug from its process-related impurities and degradants formed during stability testing in a reasonable analysis time and with acceptable chromatographic parameters. Acknowledgement Authors gratefully acknowledge financial support from theMin- istry of Science and Technology, Serbia, under the project 142013. References [1] A. Kleemann, J. Engel, B. Kutscher, D. Reichert, Pharmaceutical Substances, Syn- thesis, Patents, Applications, 4th Edition, ThiemeMedical Publ., Stuttgart, 2001, pp. 1372–1374. [2] Matrix Laboratories Ltd., India, PCT WO 2005/012285 A1; Cipla Ltd. India, WO 2008/059223. [3] Bayer AG, European Patent Office, EP 0350733 B1, EP 550903, EP 657448. [4] Bayer AG, Business Group Pharma, Data on file, Moxifloxacin HCl, November 2000. [5] Uwe Petersen, Quinolone antibiotics: the development of moxifloxacin, in: J. Fischer, C. Robin Ganellin (Eds.), Analogue-based Drug Discovery, Wiley–VCH Verlag, Weinheim, 2006. [6] J.P. Boehlert, Regulatory aspects: ICH and pharmacopoeial perspectives, in: S. Görög (Ed.), Identification and Determination of Impurities in Drugs, Series: Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol. 4, Elsevier, 2000. [7] S. Görög, The role of impurity profiling in drug research, development and pro- duction, in: S. Görög (Ed.), Identification and Determination of Impurities in Drugs, Elsevier, Amsterdam, 2000. [8] R.J. Smith, M.L. Webb (Eds.), Analysis of Drug Impurities, Blackwell Publishing, Oxford, 2007. [9] A. Laban-Djurdjevic´, M.J. Stankov, P. Djurdjevic´, J. Chromatogr. B 844 (2006) 104–111. [10] H. Stass, A. Dalhoff, J. Chromatogr. B 702 (1997) 163–174. [11] S. Tatar Ulu, J. Pharm. Biomed. Anal. 43 (2007) 320–324. [12] Y. Ravindra-Kumar, V.V.N.K.V. Prasad Raju, R. Rajes Kumar, S. Eswaraiah, K. Mukkanti, M.V. Suryanarayanna, M. Satyanarayana Reddy, J. Pharm. Biomed. Anal. 34 (2004) 1125–1129. [13] S.K. Motwani, R.K. Khar, F.J. Ahmad, S. Chopra, K. Kohli, S. Talegaonkar, Anal. Chim. Acta 582 (2007) 75–82. [14] M. Yacoub Salem, N.M. El-Guindi, H.K. Mikael, L. El-Sayed abd-el-Fattah, Chem. Pharm. Bull. 54 (2006) 1625–1632. [15] L. Wei, H.C. Qin, H.T. Jun, West China J. Pharm. Sci. 2 (2006) 270–272. [16] I. Molnár, J. Chromatogr. A 965 (2002) 175–194. [17] L.R. Snyder, L. Wrisley, Computer facilitated HPLC method development using DryLab® Software, in: S. Kromidas (Ed.), HPLC Made to Measure: A Practical Handbook for Optimization, Wiley–VCH Verlag, Weinheim, 2006. [18] DryLab Users Manual, LC Resources, Walnut Creek, CA, USA, 2000. [19] C. Horváth, W. Melander, I. Molnár, J. Chromatogr. A 125 (1976) 129–156. [20] D.C. Montgomery, Design and Analysis of Experiments, 5th Edition, John Wiley & Sons, N.Y., 2001. [21] C. Burgess, Valid Analytical Methods and Procedures, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2000, pp. 27–39. [22] Statistica v. 6, StatSoft, Tulsa, USA, 2001. [23] M.-H. Langlois,M.Montagut, J.-P. Dubost, J. Grellet,M.C. Saux, J. Pharm. Biomed. Anal. 37 (2005) 389–393. [24] Y. Vander Heyden, C. Hartmann, D.L. Massart, L. Michel, P. Kiechle, F. Erni, Anal. Chim. Acta 316 (1995) 15–26. [25] D.M. Bliesner, Validating Chromatographic Methods. A Practical Guide, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2006. [26] J. Ermer, J.H.McB,Miller,MethodValidation in Pharmaceutical Analysis AGuide to Best Practice, Wiley–VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005. Evaluation of matrix effect in determination of some bioflavonoids in food samples by LC–MS/MS method Andrija C´iric´ a, Helena Prosen b, Milena Jelikic´-Stankov c, Predrag urXevic´ a,n a University of Kragujevac, Faculty of Science, P.O. Box 60, 34000 Kragujevac, Serbia b University of Ljubljana, Faculty of Chemistry and Chemical Technology, Asˇkercˇeva 5, SI-1000 Ljubljana, Slovenia c University of Belgrade, Faculty of Pharmacy, V. Stepe 450, 11000 Belgrade, Serbia a r t i c l e i n f o Article history: Received 14 February 2012 Received in revised form 5 July 2012 Accepted 8 July 2012 Available online 20 July 2012 Keywords: Bioflavonoid Food LC–MS/MS determination Matrix effect Standard addition a b s t r a c t In the present work the LC–MS/MS method with solid phase extraction for simultaneous determination of bioflavonoids rutin, quercetin, hesperidin, hesperetin and kaempferol in some food samples (red onion, orange peel and honey) was developed and the matrix effect accompanying this determination was quantified. The matrix effect evaluated using a postextraction addition method was found to be negative in the range 44 to 0.5%, indicating ionization suppression and strongly depended on bioflavonoid concentration. The observed matrix effect was explained taking into account the co-elution of phenolic acids, in terms of their acid–base and hydrophilic properties. The efficacy of extraction expressed as the absolute recoveries of flavonoids were 88–96%, indicating very good efficiency of extraction. The extracts of food samples obtained either by Soxhlet or ultrasonic extraction were analyzed for bioflavonoid content by the LC–MS/MS method in selected reaction monitoring mode using a triple quadrupole detector and standard addition method, which was found to be the most suitable calibration approach for these samples. The optimized separation was achieved on a Phenomenex Gemini C18 column with gradient elution and mobile phase composition A: 2% acetic acid in water and B: acetonitrile. Rs values were in the range from 1.3 to 3.1, indicating good selectivity of the method. The obtained results (mg/100 g fresh weight) for different bioflavonids were for rutin 0.16, for quercetin in the range 0.65–56, for hesperidin 0.016–24, for hesperetin 0.0068–36.4 and for kaempferol 0.14–1.63 and generally show good agreement with published data. Low detection limits (0.014–0.063 mg/mL) were obtained with acceptable recoveries (86–114%). Total time of analysis was less than 40 min, therefore the proposed method represents significant improvement over existing methods. & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Flavonoids are a large class of phenolic compounds which are subclassified as flavones, flavonols, isoflavones, flavanones and catechins, chalcones and anthocyanidins depending on phenyl substituent in the C2 or C3 position in benzo-g-pyrone nucleus. Interest in the bioflavonoids is related to their diversity, biological significance as secondary plant metabolites and ecological role [1], use as chemotaxonomic markers [2], impact on fruit quality [3], physiological effects [4–6] and industrial applications [7]. The flavonoids are potent antioxidants, free radical scavengers [8] and metal chelators; they inhibit lipid peroxidation [9] and exhibit various physiological activities [10–15], including anti-inflammatory [16], anti-allergic, anti-carcinogenic, antihypertensive and anti- arthritic activities [17]. Various methods have been developed for the determination of bioflavonoids and reviewed: capillary electrophoresis [18], thin-layer chromatography [19], gas-chromatography [20], high- performance liquid chromatography with UV/visible, fluorescence detection [21,22], and electrochemical detection modes [23]. HPLC techniques are now the most widely used both for separation and quantitation of phenolic compounds [24]. LC–MS and in particular LC–MS/MS methods have been recognized [25] as the best tool to analyze samples of biological origin due to their selectivity, sensitivity and speed of analysis. Red onion and honey are food samples which are rich with bioflavonoids and constitute common part of the everyday diet [26,27]. Orange peel is not used for food but it is recommended as a flavoring agent to improve taste because it is rich in bioflavo- noids [28]. Bioflavonoids narirutin, hesperidin, didymin, diosmin, sinense- tin, nobiletin, tangeretin, quercetin, kaempferol, myricetin, luteolin, apigenin quercetin 3-glucoside, quercetin 7,4’-diglucoside, querce- tin 3,7,4’-triglucoside, isorhamnetin 4’-glucoside and isorhamnetin Contents lists available at SciVerse ScienceDirect journal homepage: www.elsevier.com/locate/talanta Talanta 0039-9140/$ - see front matter & 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2012.07.025 n Corresponding author. Tel.: þ381 34 300261; fax: þ381 34 335040. E-mail address: preki@kg.ac.rs (P. urXevic´). Talanta 99 (2012) 780–790 3,4’-diglucoside were analyzed in orange peel [29–32], red onion [33–44] and honey [45–50] employing HPLC–MS/MS techniques. The content of bioflavonoids (in mg/100 g fresh weight) in orange peel for hesperetin, hesperidin and quercetin were in the range 2.2–67 with LOD 0.03–0.4 mg/mL [28–32], for hesperetin, hesper- idin, quercetin, rutin and kaempferol were in the range 0.001–192 with LOD 0.0004–5 mg/mL in red onion [26,33–44] and finally, for hesperetin, hesperidin, quercetin and kaempferol in honey were in the range 0.02–26 with LOD 0.01–3 mg/mL [27,45–50]. Main problems encountered in the analysis of these samples are ioniza- tion suppression or enhancement depending on ‘‘visible’’ and ‘‘invisible’’ matrix interferences. It was supposed that the matrix effect was eliminated by sample extraction and clean-up using SPE. The matrix effect can be a serious problem as it could severely compromise quantitative analysis of the compounds at trace levels as well as method reproducibility [51]. Little is known about the matrix effect due to co-eluting substances in red onion, orange peel and honey sample extracts. The matrix effect in determination of bioflavonids in food samples was not studied to the best of our knowledge. Knowing the source and level of the matrix effect possibly false results in determination of bioflavonoids content in food samples could be eliminated. Matrix effects in LC–MS analysis occur when molecules co- eluting with the compound/s of interest (analytes) alter the ionization efficiency of the electrospray interface. A matrix effect is defined as a change in the analytical signal caused by anything else in the sample other than analyte. The influence of matrix effect on the reliability of LC–ESI–MS/MS method was investi- gated in terms of trueness and precision of determination and it has been shown that when ionization suppression occurs, the sensitivity and limit of quantification of the method may be adversely affected [52]. The most effective way to eliminate matrix effect affecting trueness and precision of the analytical method is to use the standard addition technique [53]. Standard addition is especially appropriate when the sample composition is unknown or com- plex and affects the analytical signal. If small volume of concen- trated standard is added to the unknown the concentration of the matrix will not be significantly changed. The assumption in standard addition method is that the matrix has the same effect on added analyte as it has on the original analyte in the unknown. The aim of this study was to develop an optimized HPLC method in terms of resolution (RsZ1.5), analysis time and selectivity which could be used in food quality control labora- tories and nutritional and pharmaceutical research. As a part of the method development, the matrix effect was studied to establish the dependence of MS/MS response on type of sample and solvent used for extraction. In addition the purpose of this work was to evaluate the degree of the signal suppression by co- eluting substances in food samples extracts to correct matrix effect by appropriate adjustment of LC–MS/MS parameters. The data presented in this paper clearly demonstrate that the study of matrix effect should constitute an integral and important part of quantitative determination of bioflavonoids in food samples. First the matrix effect on LC–ESI–MS/MS determination of bioflavonoids (rutin, hesperidin hesperetin, quercetin and kaemp- ferol) in some food samples (red onion, orange peel and honey) was recorded. Since the main source of matrix effect arises from extraction procedure we paid special attention to the extraction of analytes [54]. The extraction methodology for flavonoids generally includes extraction by solvents such as methanol, ethanol, acetone or mixture of solvent with water, cleaning-up and further fractiona- tion by liquid–liquid extraction, column chromatography and solid-phase extraction. According to the literature [55–57], an ultrasonic bath at room temperature is a suitable extraction method for flavonoids. The ultrasonic and Soxhlet extraction were compared since it is widely accepted that Soxhlet extraction of flavonoids yields 100% recovery [55,56]. For evaluation of the extent of matrix effect the postextraction addition method was used. In an attempt to optimize a method for a simultaneous determination of five flavonoids, we developed a clean-up of analytes from food sample matrix prior to LC–MS/MS analysis. Bearing in mind the polar nature of the analytes a commercially available Supelco LC-18 end-capped SPE cartridge was used for clean-up of bioflavonoids from the food matrix. The use of reversed-phase cartridge effectively eliminated the interfering material with efficient extraction of flavonoids. Analytes from the extract were separated by HPLC using C18 column and gradient elution with ESI–MS/MS detection. Quantification was performed using the standard addition method. Bearing in mind important beneficial effects of bioflavonoids on human health, the results obtained in the present study may be of interest not only to analytical chemists but also to food chemists and nutritionists. 2. Experimental 2.1. Materials and solutions Rutin hydrate (495%), hesperidin (485%), hesperetin (480%), quercetin (499%), kaempferol (495%) and caffeine (499%) were from Sigma-Aldrich (Vienna, Austria), acetic acid, acetonitrile and methanol (HPLC grade purity) were from JT Baker (Deventer, Holland). Water was obtained from a Millipore Milli-Q system (Watford, UK). 2.2. Preparation of stock and sample solutions 1.00 mg/mL rutin, hesperidin, hesperetin, quercetin and kaempferol standards in methanol were prepared. Working cali- brators (0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 and 10.0) mg/mL were prepared by appropriate dilution of these standard stock solutions with methanol. For standard addition method five solutions containing (10.0, 20.0, 40.0, 100.0 or 200.0) mg/mL of each flavonoid in methanol were prepared. Extracted samples were spiked with each of these solutions. Three food matrices were selected for the bioflavonoids analysis—red onion, orange peel and honey. Samples were purchased from an organic firm grocery. For sample treatment, the procedure of Vacek et al. [57] was followed. Samples were cut into small pieces and chopped. Water, methanol and acetonitrile extracts were prepared by extracting 10 g of the material with corresponding pure solvents. Honey was thoroughly mixed until a homogeneous sample was obtained. 10 g of sample was quantitatively transferred to beaker with water. Extraction with acetonitrile could not be performed due to formation of insoluble viscous material. 2.3. Soxhlet extraction The ground powder of sample (5 g) and 50 mL of methanol were placed into the capsule. The extraction was performed for 120 min at 60 1C. After 120 min the extract was separated from the remaining material to which a new portion of 50 mL of methanol was added and extraction was continued for 60 min until completeness. The combined extract was evaporated in rotary vacuum evaporator to the volume of 5 mL and passed through a 0.45 mm microporus membrane filter; the filtrate was diluted with methanol in 10 mL normal flask to the mark and used for HPLC analysis. All extraction procedures were performed in triplicates for statistical analysis. A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790 781 2.4. Ultrasonic extraction The ground powder of sample (2.5 g) and 50 mL of methanol as solvent was first loaded into a 250 ml beaker and sealed by plastic film to avoid loss of solvent. The sample beakers were immersed into the ultrasonic cleaning bath for ultrasonication. After 30 min of extraction the extract was separated from the rest of the solid material on which was added a new portion of 50 mL of methanol and extraction was continued for 15 min. The combined extract was evaporated in rotary vacuum evaporator to the volume of 5 mL and passed through a 0.45 mm microporus membrane filter; the filtrate was diluted with methanol in 10 mL normal flask to the mark and used for HPLC analysis. All extrac- tion procedures were performed in triplicates for statistical analysis. The results shown in Fig. 1 indicate that no significant difference is found in extraction efficiency between Soxhlet and ultrasonic bath extraction method. Owing to its simplicity and rapidity, the ultrasonic bath extraction was chosen as the pre- ferred method. 2.5. Development of the solid phase extraction procedure The solid phase extraction was optimized in terms of cartridge and eluting solvent. To develop the most efficient SPE method five different cartridges (LC-C8, LC-SAX, LC-18, LC-NH2 and DSC-NH2) of different loading polarity, from the same manufacturer (Supelco, USA) were tested. The cartridges were pre-conditioned with 5 mL of tested solvent (methanol, acetonitrile or water) followed by 5 mL of deionized water. The standard solution of analyte mixture (0.1–0.3 mL) was diluted with water to 10 mL and this solution was forced through the cartridge at a flow rate of 1 mL/min. After loading, the SPE cartridge was washed with 5 mL of water and subsequently dried by vacuum drying at room temperature for 10 min. In this way excessive and residual water was removed from the cartridge. Finally, the analytes were eluted with 5 mL of tested solvents. The optimal extraction conditions in terms of efficacy and elution time was obtained with methanol as eluting solvent. The extracts obtained in this way were chroma- tographed and the efficiency of the method was calculated as ratio between peak areas of the standard solution before and after solid phase extraction multiplied by 100. The obtained recoveries (7standard deviation, SD) for extraction of flavonoids with different types of cartridges are presented in Table 1. It may be seen from Table 1 that the best recoveries were obtained with Supelco LC-18 cartridge, so for further SPE we used this cartridge. 2.6. Instruments The separation was carried out using an HPLC system Perkin Elmer PE200 (Norwalk, CT, USA), composed of binary pump, autosampler and UV/VIS DAD detector. The mass spectrometer was 3200 QTRAP MS/MS (Applied Biosystems/MDS Sciex, USA) with electrospray ionization (ESI). The data were processed using an Analyst (PE Sciex) software. HPLC column was Phenomenex Gemini C18 (1504.6 mm, 3 mm particle size), Phenomenex, Torrance, USA. Solid phase extraction (SPE) was carried out with a Supelco (Bellefonte, PA, USA) vacuum tank on Supelco LC-18 cartridges. Ultrasonic extraction experiments were carried out in ultra- sonic cleaning baths produced by Elma Hans Schmidbaner GmgH and Co. KG Singen, Germany, which can work at 20 kHz, 60 kHz, and 100 kHz frequencies with a variable power output, and have a digital timer to set up time and a temperature controller.. 2.7. LC–MS/MS conditions All MS and MS/MS data were collected in negative ion ESI mode. Both quadrupoles (Q1 and Q3) were operated at unit resolution. To establish the optimum ESI conditions infusion of individual rutin, quercetin, hesperidin, hesperetin and kaempferol standard solutions was performed. Potentials were chosen to obtain the maximum resolution and intensity of the signals, clean spectral area as well as minimal background emission. The measurements were made at a 500 1C source temperature, 4500 V ion spray voltage, 300 V focus- ing potential. The assay is based on monitoring the [M–H] ions for the analytes in the first quadrupole and their corresponding product ions in the third quadrupole with a dwell time of 50 ms. Selected reaction monitoring data were collected using a Sciex Analyst soft- ware. Working parameters and other instrumental parameters were manually adjusted to get the best performance from the instrument. Identification of precursor and product ions and MS/MS optimization were established by direct infusion of 100 mg/mL solutions of single analyte in methanol. Infusion was made by a syringe pump. Typically, flow rate was 10 mL/min. The manual tuning of the instrument comprised the optimization of resolution, sensitivity and calibrating mass scale. Mass scale calibration was accomplished by 100 mg/mL of caffeine solution as calibration standard. Optimal experimental con- ditions are listed in Table 2. For the LC separation the mobile phase composed of A: 2 wt% of acetic acid in water and B: acetonitrile was used. The solvents were mixed in a linear gradient: 0 min–85% A and 15% B, 5 min– 85% A and 15% B, 25 min–10% A and 90% B, 30 min–10% A and 90% B, 35 min–85% A and 15% B, 40 min–85% A and 15% B; flow rate of the mobile phase was 0.7 mL/min, injected volume 20 mL. 3. Results and discussion For quantitative LC-ESI-MS/MS the negative ionization mode was selected because of improved sensitivity due to the presence Fig. 1. Extraction yield of bioflavonoids from orange peel and red onion compared (normalized) to Soxhlet extraction. Table 1 Recoveries7SD (%) of flavonoids obtained with different SPE cartridges. Bioflavonoids Supelco cartridges LC-18 ENVI-18 DSC-18 SepPak Plus C18 DSC-SAX Quercetin 9772 7772 5471 7072 7471 Rutin 9571 6672 4872 7272 6872 Hesperetin 9672 8672 5472 6472 6571 Hesperidin 9671 9571 4271 6172 5872 Kaempferol 9374 9571 4872 6772 6172 A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790782 of hydroxyl groups which are easily deprotonated. Representative total ion chromatograms of methanol solution containing mixture of analytes and that of orange peel, red onion and honey extracts are shown in Fig. 2. From Fig. 2a it can be seen that the investigated flavonoids are separated with resolutions Rs1,2¼1.3 for the rutin and hesperidin, Rs2,3¼3.2 for hesperidin and quercetin, Rs3,4¼2.1 for quercetin and kaempferol and Rs4,5¼1.3 for kaempferol and hesperetin. Peaks are resolved at a baseline so that conditions for good chromatography are fulfilled. The assignment of peaks in chro- matograms of food samples was done on the basis of retention times and mass spectra corresponding to peak maxima by comparison with corresponding standards. The matrix effect on simultaneous determination of quercetin, rutin, hesperetin, hesperidin, and kaempferol in food samples extracts (orange peel, red onion and honey) by the LC–ESI–MS/MS method was quantified. The efficient clean-up of analytes from the samples extracts was achieved by Supelco LC18 cartridges yielding the extracts free of particulate matter and endogenous interfering material. 3.1. Mass spectra and total ion chromatograms In all analytes the precursor ion [M–H] where M is the molecular mass of the respective analyte, is formed as a result of the loss of a proton to form a negatively charged molecular ion. The base peak and relative abundance in percents is for quercetin m/z 301 (100%), rutin m/z 609 (100%), hesperetin m/z 301 (100%), hesperidin m/z 609 (100%), and kaempferol m/z 285 (100%). Since the values of m/z are the same for rutin and hesperidin and for hesperetin and quercetin, further fragmentation (i.e. MS/MS mode) were employed for their identification and quantitation. The precursor and major product ions and relative abundance in percents of the analytes were monitored in selected reaction mode (SRM) as follows: quercetin 301-179 (63%), 301-151 (95%), 301-107 (31%), 301-97 (36%), rutin: 609-301 (12%), 609-273 (44%), 609-257 (24%), 609-179 (31%), hesperetin: 301-286 (37%), 301-244 (25%), 301-179 (34%), 301-151 (63%), hesperidin: 609-343 (45%), 609-325 (30%), 609-174 (37%), 609-151 (24%) and kaempferol: 285-256 (43%), 285- 243 (29%), 285-228 (86%), 285-125 (61%). These MS/MS frag- ments were chosen because they the most intensive peaks in the product ion MS spectra. Possible fragmentation scheme for some analytes is given in Fig. 3. 3.2. Matrix effect evaluation The matrix effect during the development of the analytical method may be examined by comparing MS/MS response (peak areas and heights) of an analyte in spiked sample extract with the MS/MS response of the same analyte present in the ‘‘neat’’ mobile phase, at several concentration levels. The relative matrix effect, ME%, is defined as the difference between the MS/MS response of an analyte present in the real sample extract and response from the same analyte present in the ‘‘neat’’ mobile phase or a solvent, but without the compounds extracted from a real sample MEð%Þ ¼ peak area of post extractionpeak area of pure solution peak area of pure solution  100 ð1Þ To investigate the influence of matrix effect on the determina- tion of some bioflavonoids by post-extraction method, spiking of matrix with suitable concentrations (0.5 to 5.0 mg/mL) of analytes was employed (four concentration levels). First, water extract of food sample was prepared, then extracts were passed over the SPE cartridge, resulting in almost complete adsorption of bio- flavonoids. Remaining isolated matrix was then spiked with known concentrations of bioflavonoids and resulting matrix effect, calculated using Eq. (1). The obtained results are given in Table 3. The negative matrix effect represents a loss of the analytical signal (ion suppression) due to alterations in ionization efficiency. By inspecting the Table 3 it may be concluded that process efficiency is sufficiently high so that trueness and LOD may be obtained with satisfactory degree. The matrix effect decreases with increasing concentration of hesperetin and increases with increasing concentration of hesperidin. The matrix effect was generally much lower in honey than in other food samples. It is also less pronounced for the most intensive peaks in MS/MS spectra for all bioflavonoids. We tried to increase collision energy to optimize the formation of product ions. However, only a large number of fragments was obtained without improvement in the sensitivity of the assay. To investigate the influence of solvents on the amount of co- eluting substances originating from the real sample extracts and on the MS responses, the standard solution of flavonoids was spiked into the extract of samples obtained with different solvents (methanol, acetonitrile and water). Matrix effect was calculated from Eq. (2) MEð%Þ ¼ peak area from standard additionpeak area from calibration curve peak area from calibration curve : ð2Þ The results are given in Table 4. Increased ionization suppression was seen with methanol as compared to water for honey samples while in orange and onion the matrix effect was almost the same for different solvents. The ionization suppression was much less pronounced in the post- extraction addition than in the standard addition method (com- pare with Table 3). Postextraction addition as a calibration approach, however, is feasible only with closely matrix-matched extract without the analytes, which could be difficult to obtain. It was therefore decided to rely on standard addition procedure as a calibration method, which, although time-consuming, is Table 2 Optimal instrumental conditions for the analytes in ESI–MS/MS. Hesperetin Hesperidin Rutin Quercetin Kaempferol GS1 (gas 1) the nebulizer gas (mL/min) 20 GS2 (gas 2) the auxiliary gas (mL/min) 60 TEM (temperature) (1C) 500 CUR (curtain gas) 10 Ion spray voltage (V) 4500 DP (declustering potential) (V) 40 57 86 21 22 EP (entrance potential) (V) 5 5 8 8 3 CE (collision energy) (eV) 25 34 56 31 45 CXP (collision cell exit potential) (V) 6 9 4 12 6 A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790 783 Fig. 2. (a) HPLC/UV chromatograms for bioflavonoid standards, (b) TIC (total ion chromatogram) of standards, (c) HPLC/UV chromatogram of red onion extract, (d) TIC red onion extract, (e) HPLC/UV chromatogram of orange peel extract, (f) TIC of orange peel extract and (g) HPLC/UV chromatogram of honey extract and (h) TIC of honey extract. A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790784 recommended as the most reliable in the analysis of samples with many interfering compounds [53]. Our method for preparation and clean-up of samples, did not result in a scrupulously clean extract. The method failed to sufficiently remove endogenous compounds such as polyphenolic acids and phospholipids from analytes. It is a result of the effort to achive acompromise between high recovery of the analytes and low co-extraction of endogenous substances. Coelution of these compounds with the compounds of interest is the main source of matrix effect. Coelution is unavoidable bearing in mind that retention of organic analytes (polyphenolic acids, bioflavonoids and bioma- cromolecules) from samples onto the SP material is determined primarily by hydrophobic interactions between nonpolar parts of biomolecules contained in extracts and hydrocarbon C18 chain from silica surface. Thus, hydrophobicity of molecules present in extract will play dominant role in their retention onto the SP cartridge material. Since, silica surface of C18 sorbent also con- tains some remaining OH groups, hydrogen bonding between ionized hydroxyl groups of SP material and carboxyl groups m/z 273 m/z 257 m/z 301 Quercetin - Rutinose unit retrocyclization m/z 151 m/z 301 RDA m/z 244 m/z 286 m/z 179 [M-H rutinoze] m/z 609 Rutin - [M-H glycoside] m/z 609 -H2O m/z 179 m/z 151 m/z 107 m/z 285 Kaempferol m/z 256 m/z 243 m/z 125 retrocyclisation -Glycoside - CO m/z 228 Hesperidin Hesperetin Fig. 3. Proposed fragmentation pathway for (a) rutin and quercetin (b) kaempferol and (c) hesperidin and hesperetin. A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790 785 present in phenolic acids and higher fatty acids or other acidic groups from biomacromolecules also contributes to retention. Thus, SP material will adsorb and retain not only analyte mole- cules but also other nonpolar molecules. Compound elution from SP material with polar solvent is similar to that of RP-LC i.e. more hydrophilic compounds (e.g. phenolic acid) elute first followed by those with increasing hydrophobicity. In our case elution order is phenolic acids before flavonoids. Other biomacromolecules (lipids, fatty acids) are retained by SPE. From the above discussion it may be concluded that the main interferences for ES ionization and chromatographic separation of bioflavanoids would arise from polyphenolic acids, so the devel- opment of the LC method should involve separation of phenolic acids from analytes. The result presented in Fig. 4 shows that co-eluting substances cause equal suppression because of the degradation of ionization efficiency. Degradation of ionization efficiency may be linked to the pronounced tendency of phenolic acids to release proton at lower energies than bioflavonoids leading to incomplete dissociation of phenolic OH group of bioflavonoids. Also, hydro- gen bond formation between carboxyl group from phenolic acids and OH from flavonoids may contribute to the effect. A second process is linked to the increased viscosity and surface tension of the droplets produced in electrospray interface due to hydrophilic nature of phenolic acids. This could reduce capability of the analytes to be emitted in the ionized form from droplets (ion evaporation model of small ion formation in ESI) and to enrich gas phase. 3.3. Determination of bioflavonoids in food samples The method to improve accuracy of the quantitation methods and eliminate interferences should be considered in the quantita- tion of bioflavonoids in food matrices. Complete removal of co- eluting substances by sample clean-up could not be achieved since in the case of our samples, the matrices are complex and different in composition from sample to sample. Consequently, even if the same extraction procedure is used for each sample, the Table 3 Matrix effect on determination of bioflavonoids extracted in H2O by postextraction method in food samples. Conc. (mg/mL) SRM transition 0.5 1.0 2.5 5.0 (ME7SD) (%) (ME7SD) (%) (ME7SD) (%) (ME7SD) (%) Orange peel Hesperetin 301/286 3378 3072 2871 24.4570.03 301/244 4172 4072 3871 30.870.7 301/179 4176 3972 3972 30.270.9 301/151 3673 3573 3471 2972 Hesperidin 609/343 40.370.2 36.8470.06 30.170.5 21.970.4 609/325 43.470.2 36.0070.09 32.870.1 23.970.1 609/174 4371 38.370.7 3471 23.570.5 609/151 39.470.2 35.470.2 29.970.6 2372 Quercetin 301/179 2772 2275 1873 1672 301/151 2672 2374 1772 1471 301/107 2973 2473 1772 1572 301/97 2973 2574 1873 1572 Honey Hesperetin 301/286 1071 871 672 572 301/244 13 2 1173 971 674 301/179 1273 772 672 671 301/151 473 372 372 0.670.3 Hesperidin 609/343 1575 873 672 371 609/325 2372 1672 873 872 609/174 1572 1075 572 472 609/151 2572 2072 974 573 Quercetin 301/179 1674 1072 673 471 301/151 1673 1172 772 472 301/107 1672 1172 773 371 301/97 1673 1072 773 472 Kaempferol 285/256 1172 873 671 372 285/243 1172 873 671 272 285/228 1372 873 672 373 285/125 1172 874 571 373 Red onion Hesperetin 301/286 9.370.4 7.470.7 572 175 301/242 1171 1071 871 3.070.4 301/174 1374 12.270.6 1071 676 301/150 672 372 272 1.070.8 Hesperidin 609/343 1472 874 5.6670.05 573 609/325 2377 16.1070.03 8.170.9 7.870.2 609/174 4877 1072 972 571 609/151 2175 1677 773 571 Quercetin 301/179 2272 1772 1173 574 301/151 2375 1675 1274 573 301/107 2276 1574 1274 574 301/97 2374 1474 1172 572 Rutin 609/300 17.270.6 1574 1073 6.470.3 609/271 1572 12.670.5 6.870.2 571 609/255 4871 2077 1471 975 609/179 1474 1274 971 372 Kaempferol 285/256 2074 1673 1272 472 285/243 1975 1577 1174 572 285/228 1975 1473 1074 571 285/125 1873 1574 1073 572 A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790786 extract solution may vary between samples. This means that the degree of signal suppressions by coeluting substances also varies from sample to sample. It is concluded that it will be difficult and impractical to remove co-eluting substances completely for the reduction of the signal suppression. Thus, as the method of choice in our case is standard addition method, that is, analyzing extract solution with added known quantity of standard solution; the calculation procedure is as follows: Xi ¼ Ix Isþ x ðSf þXf Þ where Xi is the amount of bioflavonoids in the extract solution; Sf is the amount of bioflavonoids spiked into the extract solution; Ix is the signal intensity of bioflavonoids in the extract solution and Isþx is the signal intensity of bioflavonoids in the spiked solution. This method requires at least two LC–MS runs per analysis—the run of the extract sample and the run of the extract samples spiked with a known quantity of bioflavonoids. 3.3.1. Method performance and validation After having developed a purification procedure for a given compound, a specific mass spectrometric measurement for a standard solution submitted to the procedure is expected to produce a satisfying signal, indicating a good recovery of the analyte. An identification and quantification processes based only on the target analyte signal can be very critical in case of ion suppression, but a systematic use of spiked extracted samples for calibration curves instead of standard solutions is clearly preferable. The food samples were analyzed for bioflavonoids content by applying the method of standard addition. Prior to analysis, the performance of the method was checked by analyzing standard solutions of analytes prepared in methanol as solvent. Calibration curves for each analyte were constructed by plotting the peak area of the analyte against corresponding concentration. The curves were linear in the concentration range 0.05–10 mg/mL with regression parameters given in Table 5. The trueness expressed as recovery (¼Cfound/Cadded100) and precision, expressed as relative standard deviation ð ¼ SD 100=xÞ were calculated by analyzing 8 solutions with known concentration of analytes. Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were estimated from the calibration curves for sufficiently low concentration of analytes (0.05–1.00 mg/mL) using the formula k ðSb=aÞ where k is 3.3 for LOD and 10 for LOQ. Sb is the calculated standard deviation in intercept of calibration curve and a is its gradient. The obtained results are given in Table 6. The standard addition method was performed by adding the unknown solution to 125 mL of standard solution, in a 5 mL volumetric flask, to the mark. Thus, no dilution with solvent was employed. The unknown concentration was assayed by plotting the corrected signal against the added concentration of the analytes. The unknown concentration was read as the x- intercept of the graph. The uncertainty of the intercept was calculated as SDx ¼ sy aj j ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 1 n þ y 2 a2 P ðxixÞ2 s ð3Þ where sy is standard deviation in y—readings, a is the slope of least—squares line, n is a number of data points, x is concentra- tion and y chromatographic response. The confidence interval was calculated as t x SDx where t is a Student t for n2 degrees of freedom. The detection limits of rutin, hesperetin, hesperidin, quercetin and kaempferol in food samples were determined from the standard addition curves based on the definition of the concen- tration of analyte yielding a signal equivalent to three times the standard deviation of the non-spiked sample (n¼5). The limit of detection was in the range 0.014–0.063 mg/mL indicating that the method has satisfactory performance for the determination of chosen bioflavonoids in real food samples. The orange peel, red onion and honey samples were analyzed for quercetin, rutin, hesperetin, hesperidin and kaempferol con- tent by using the standard addition method to the sample extracts. In Fig. 5, standard addition curve was plotted together with calibration curve obtained in methanol for hesperetin determination in orange peel. Large difference indicates a strong matrix effect. The linear standard addition curves were obtained in the concentration range of the added standard solutions of bioflavonoids 0.5–5.0 mg/mL (four concentration levels). Linearity Table 4 Matrix effect (%) on bioflavonoids in food samples by standard addition method in different solvents. Food sample Compound SRM transition MeOH H2O ACN Mean ME (%)7SD (%) Mean ME (%)7SD (%) Mean ME (%)7SD (%) Orange peel Hesperetin 301/286 11071 10271 11271 301/244 11071 10371 11071 301/179 10871 10371 11071 301/151 12771 10271 11171 Hesperidin 609/343 15172 10977 609/325 10373 10871 609/174 10173 609/151 9874 9672 Quercetin 301/179 8772 7773 9573 301/151 8573 7474 9373 301/107 8573 7675 301/97 8572 7674 Honey Hesperetin 301/286 8972 576 301/244 8072 577 301/179 8571 675 301/151 8472 475 Hesperidin 609/343 1574 4678 609/325 1974 4275 609/174 1573 4874 609/151 1273 4472 Quercetin 301/179 7675 874 301/151 7474 874 301/107 7675 874 301/97 7575 774 Kaempferol 285/256 6373 1376 285/243 6372 1477 285/228 6374 1277 285/125 6274 1278 Red onion Hesperetin 301/286 7272 9471 8771 301/244 7471 9671 8571 301/179 7571 9572 301/151 7672 8771 Hesperidin 609/343 6473 6374 609/325 6472 6971 609/174 6475 609/151 6876 Quercetin 301/179 7173 5275 3273 301/151 7174 5374 301/107 7173 5275 3173 301/97 7174 5175 Rutin 609/301 3771 9674 6372 609/273 6572 609/257 3076 9975 6679 609/179 3476 Kaempferol 285/256 6474 3876 4972 285/243 6475 3876 285/228 6174 3976 4771 285/125 6574 A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790 787 Fig. 4. HPLC/UV chromatograms of red onion extract after SPE. Table 5 Regression equation (Y¼aþbX; Y¼area of the signal, X¼concentration of analyte, mg/mL) for calibration curves at most intensive SRM transition. Compound SRM transition Number of points, (N) Slope (b) (105) Intercept (a) (104) Standard error (104) Correlation coefficient (r2) Hesperetin 301/286 8 3.0770.08 4.470.3 7.9 0.9948 301/244 8 1.8270.05 2.670.2 4.8 0.9945 Hesperidin 609/325 8 4.8370.04 0.2470.02 0.4 0.9995 609/174 8 9.6470.09 1.370.3 8.6 0.9994 Quercetin 301/179 8 2.9670.09 1.9370.08 2.6 0.9987 301/151 8 1.8470.06 1.6470.09 4.8 0.9931 Rutin 609/301 8 4.6170.07 3.170.3 6.7 0.9984 609/273 8 1.3770.02 0.7370.08 1.9 0.9986 Kaempferol 285/256 8 7.6470.08 3.6570.05 5.6 0.9941 285/243 8 3.6470.09 2.3170.02 3.7 0.9976 Table 6 Statistical parametars of method validation for the LC–MS/MS analysis of bioflavonoids in food. Conc added (mg/mL) 0.05 0.10 0.25 0.50 1.00 2.50 5.00 10.00 LOD LOQ Hesperetin 301/286 0.044 0.087 0.253 0.518 1.014 2.338 4.987 9.953 0.055 0.167 Recovery (%) 88.0 87.0 101.2 103.6 101.4 93.5 99.7 99.5 RSD (%) 4.76 3.02 2.11 2.54 1.23 1.45 1.31 0.87 301/244 0.049 0.107 0.270 0.516 0.925 2.399 5.018 9.930 0.046 0.139 Recovery (%) 98.0 107.0 108.0 103.2 92.5 95.96 100.4 99.3 RSD (%) 5.04 3.64 2.35 2.78 1.67 1.34 1.55 0.93 Hesperidin 609/325 0.047 0.075 0.226 0.477 1.009 2.517 5.174 9.909 0.045 0.136 Recovery (%) 94.0 95.0 90.4 95.4 100.9 100.7 103.5 99.1 RSD (%) 4.56 4.59 2.23 2.28 0.14 1.72 5.05 0.29 609/179 0.063 0.091 0.238 0.468 0.986 2.445 5.209 9.913 0.049 0.148 Recovery (%) 112.0 91.0 95.2 93.6 98.6 97.8 104.2 99.1 RSD (%) 4.98 3.59 0.88 2.74 0.81 1.19 0.98 0.74 Quercetin 301/179 0.0505 0.101 0.2525 0.505 1.01 2.626 5.02 10.3 0.043 0.130 Recovery (%) 101.0 101.3 98.6 97.3 102.6 103.3 100.2 103.2 RSD (%) 3.87 4.62 4.03 2.69 3.98 4.67 2.36 2.47 301/151 0.0491 0.102 0.2613 0.523 1.136 2.587 5.13 10.35 0.041 0.124 Recovery (%) 98.2 102.0 104.5 104.6 113.6 103.5 102.6 103.5 RSD (%) 3.64 4.25 3.81 3.97 5.79 2.38 4.67 2.64 Rutin 609/301 0.049 0.093 0.245 0.483 0.965 2.621 5.218 10.025 0.076 0.229 Recovery (%) 98.0 93.0 98.0 96.6 96.5 104.8 104.4 100.3 RSD (%) 4.61 2.57 0.98 3.07 1.49 1.14 1.12 0.46 609/273 0.048 0.092 0.241 0.481 0.955 2.615 5.206 10.033 0.062 0.189 Recovery (%) 96.0 92.0 96.4 96.2 95.5 104.6 104.1 100.3 RSD (%) 8.24 3.71 0.88 1.94 1.03 0.39 0.38 1.23 Kaempferol 285/256 0.057 0.114 0.285 0.57 1.14 2.964 5.31 11.4 0.039 0.118 Recovery (%) 114.0 112.4 111.2 110.9 109.8 108.6 109.6 106.2 RSD (%) 3.56 4.67 4.59 4.37 3.28 3.67 2.89 2.57 285/243 0.056 0.124 0.264 0.567 1.15 2.56 5.31 10.6 0.04 0.121 Recovery (%) 112.0 106.3 102.6 103.4 105.6 107.3 108.3 101.3 RSD (%) 4.57 4.69 4.78 3.85 3.67 2.94 2.68 2.47 A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790788 was confirmed by the values of the regression coefficient higher than 0.98 and Cohran’s test for homoscedasticity (Gmax¼s2max/Ssi2 was compared with tabulated value, null hypothesis about equality of individual point standard deviation, accepted if GmaxoGtable) indicated homogenous distribution of standard deviations. The results of bioflavonoids determination in the chosen samples are given in Table 7. Our values were compared with literature data for the bioflavo- noid contents in food (see Table 7). Reasonably good agreement was obtained with published data using other detection modes. 4. Conclusion A new LC–MS/MS procedure for the determination of bioflavo- noids in food samples using the ultrasonic extraction method was developed to avoid hydrolysis of their glycosides and to have an insight into the real composition of the food. Excellent selectivity and sensitivity in determination of bioflavonoids were achieved by ESI ionization technique in SRM detection mode. During the method development the matrix effect accompanying the determi- nation was evaluated. SPE and LC–ESI–MS/MS provide a novel method to determine levels of bioflavonoids in food. The advantage of the described method is quantitative extraction without the need for excessive sample clean-up steps. LC–ESI–MS/MS in addition to being fast and specific provides sensitivity in the low mg/mL range. Thus, the main advantage of the method is the rapid separation and specific detection. The standard addition method to quantify the bioflavonoids by calibration with the standard bioflavonoids solu- tion added in the extract solution can serve as a very promising and practical approach to overcome matrix effects and has a great potential to be applicable to other matrices where the LC–ESI–MS/ MS technique is used. Thus, the suppression of the ionization efficiency which occurs due to co-eluting substances and causes variation in LC–MS responses was overcame by the successful use of standard addition method. Acknowledgment Financial support from the Ministry of Education and Science of Republic of Serbia under the project 172016 is gratefully acknowl- edged. A.C´. is grateful for scholarship from BASILEUS program (European Union under the auspices of University of Ghent). H.P. would like to acknowledge the financial support from the Slovenian Research Agency through P1-0153 research program. References [1] J.B. Harborne, Acta Hortic. 381 (1994) 36–43. [2] S. Kamiya, S. Esaki, G. Konishi, Agric. Biol. Chem. 43 (1979) 1529–1536. y = 92607x + 13304 R2 = 0.9917 y = 298864x - 931.08 R2 = 0.9983 -2.00E+05 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 1.20E+06 1.40E+06 1.60E+06 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 A re a Conc (µg/mL) Standard addition Pure standard Fig. 5. Calibration curve for hesperetin in methanol and standard addition curve for hesperetin in orange peel extract. Table 7 Flavonoid content in food samples, compared to other studies. Food Compound Contents (mg/100 g fw) this study CV (%) Recovery (%) x-intercept7SDx t-test Contents (mg/100 g fw) other study Orange peel Hesperetin 36.4 5.87 91.5 0.1470.08 0.2535 31–41.4 [29,30] Hesperidin 24.3 3.42 103.5 0.0670.01 0.1205 18–66.5 [29,30] Quercetin 0.65 2.56 93.47 0.1070.11 0.1758 0.00–2.20 [31,32] Red onion Hesperetin 0.0068 2.36 108.7 0.1970.01 0.2402 0.0064–0.0076 [33–35] Hesperidin 0.016 3.59 87.6 0.0470.04 0.0932 0.001–0.03 [33–35] Quercetin 56.3 3.68 99.37 0.2470.02 0.2873 0.00–191.7 [35–41] Rutin 0.16 4.73 93.4 0.6270.11 0.2663 0.17–0.27 [41] Kaempferol 1.63 5.61 92.4 0.4170.11 0.1873 0.00–4.5 [42–44] Honey Hesperetin 0.072 3.38 105.6 0.6370.23 0.2617 0.028–0.084 [45,46] Hesperidin 14 6.48 106.4 0.1370.02 0.2822 12–26 [46] Quercetin 0.67 3.56 91.4 0.1970.02 0.3014 0.02–1.3 [45–50] Kaempferol 0.14 4.1 87.65 0.3870.06 0.1489 0.05–0.17 [45–50] Fw-fresh weigth, CV-coefficient of variation, SDx-standard deviation of intercept. A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790 789 [3] R.L. Rouseff, ACS Symp. Ser. 143 (1980) 83–86. [4] G. Forkmann, The 16th International Conference of Groupe Polyphenols, Lisbon, 1992, vol. 16, pp. 19–27. [5] K. Herrmann, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensmittel 12 (1970) 161–167. [6] V. Cody, E Middleton, J.B. Harborne, A. Beretz, Plant Flavonoids in Biology and Medicine II: Biochemical, Cellular and Medicinal Properties, Alan R. Liss, New York, 1988, pp. 107–121. [7] A. Ortuno, D. Garcia-Puig, M.D. Fuster, M.L. Perez, F. Sabater, I. Porras, A. Garcia-Lidon, J.A. Del Rio, J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 1–5. [8] M. Sato, N. Ramarathnam, Y. Suzuki, T. Ohkubo, M. Takeuchi, H. Ochi, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 37–41. [9] N.C. Cook, S. Samman, J. Nutr. Biochem. 7 (1996) 66–76. [10] E. Middleton, Chem. Abstr. 84 (1976) 426–435. [11] B.E. Leibovitz, J.A. Mueller, J. Opt. Nutr. 2 (1993) 17–35. [12] F.D. Dakora, Aust. J. Plant Physiol. 22 (1995) 87–99. [13] K. Raghavan, J.K. Buolamwini, M.R. Fesen, Y. Pommier, K.W. Kohn, J.N. Weinstein, J. Med. Chem. 38 (1995) 890–897. [14] A. Das, J.H. Wang, E.J. Lien, Prog. Drug Res. 42 (1994) 133–166. [15] L.U. Thompson, Food Res. Int. 26 (1993) 131–149. [16] M.A. Read, Am. J. Pathol. 147 (1995) 235–237. [17] R. Ficarra, P. Ficarra, S. Tommasini, M.L. Calabro, S. Ragusa, R. Barbera, A. Rapisarda, Farmaco 50 (1995) 245–256. [18] L. Suntornsuk, J. Pharm. Biomed. Anal. 27 (2002) 679–698. [19] E. Ragazzi, G. Veronese, J. Chromatogr. 77 (1973) 369–375. [20] P. Stremple, J. High Resolution Chromatogr. 19 (1996) 581–584. [21] M.A. Rodriguez-Delgado, S. Malovana, J.P. Perez, T. Borges, F.J. Garcia Mon- telongo, J. Chromatogr. A 912 (2001) 249–257. [22] P.C.H Hollman, J.M.P van Trijp, M.N.C.P. Buysman, Anal. Chem. 68 (1996) 3511–3515. [23] P. Jandera, V. Skerikova, L. Rehova, T. Hajek, L. Baldrianova, G. Skopova, V. Kellner, A. Horna, J. Sep. Sci. 28 (2005) 1005–1022. [24] H.M. Merken, G.R. Beecher, J. Chromatogr. 897 (2000) 177–184. [25] R.A. Weintraub, B. Ameer, J.V. Johnson, R.A. Yost, J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 1966–1968. [26] M. Soltoft, J.H. Christensen, J. Nielsen, P. Knuthsen, Talanta 80 (2009) 269–278. [27] K. Pyrzynsk, M. Biesaga, Trends Anal. Chem. 28 (2009) 893–902. [28] M.S. Sawalha, D.E. Arra´ez-Roma´n, A. Segura-Carretero, A. Ferna´ndez-Gutie´r- rez, Food Chem. 116 (2009) 567–574. [29] U. Justesen, P. Knuthsen, T. Leth, J. Chromatogr. A 799 (1998) 101–110. [30] P. Mattila, J. Astola, J. Kumpulainen, J. Agric. Food Chem. 48 (2000) 5834–5841. [31] R.L. Rouseff, S.F. Martin, C.O. Youtsey, J. Agric. Food Chem. 35 (1987) 1027–1030. [32] A. Lugasi, J. Hovari, Acta Aliment. 31 (2002) 63–71. [33] A.A. Franke, L.J. Custer, C. Arakaki, S.P. Murphy, J. Food Compos. Anal. 17 (2004) 1–35. [34] P.R. Arabbi, M.I. Genovese, F.M. Lajolo, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 1124–1131. [35] M. Marotti, R. Piccaglia, J. Food Sci. 67 (2002) 1229–1232. [36] B.S. Patil, L.M. Pike, J. Hortic. Sci. Biotechnol. 70 (1995) 643–650. [37] B.S. Patil, L.M. Pike, S.Y. Kil, J. Am. Soc. Hortic. Sci. 120 (1995) 909–913. [38] A. Crozier, M.E.J. Lean, M.S. McDonald, C. Black, J. Agric. Food Chem. 45 (1997) 590–595. [39] K.R. Price, J.R. Bacon, M.J.C. Rhodes, J. Agric. Food Chem. 45 (1997) 938–942. [40] K.R. Price, M.J.C. Rhodes, J. Sci. Food Agric. 74 (1997) 331–339. [41] J. Kiviranta, K. Huovinen, R. Hiltunen, Acta Pharm. Fenn. 97 (1988) 67–72. [42] T. Bahroun, A. Luximon-Ramma, A. Crozier, O. Arouma, J. Sci. Food Agric. 84 (2004) 1553–1561. [43] A. Bilyk, P.L. Cooper, G.M. Sapers, J. Agric. Food Chem. 32 (1984) 274–276. [44] A. Lugasi, J. Hovari, Acta Aliment. 29 (2000) 345–352. [45] L. Yao, Y. Jiang, B. D’Arcy, R. Singanusong, N. Datta, N. Caffin, K. Raymont, J. Agric. Food Chem. 52 (2004) 210–214. [46] L. Yao, Y. Jiang, R. Singanusong, B. D’Arcy, N. Datta, N. Caffin, K. Raymont, Food Res. Int. 37 (2004) 166–174. [47] M.I. Gil, F. Ferreres, A. Ortiz, E. Subra, F.A. Toma´s-Barbera´n, J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 2833–2838. [48] F. Ferreres, J.M. Giner, F.A. Toma´s-Barbera´n, J. Sci. Food Agric. 65 (1994) 371–372. [49] P. Truchado, F. Ferreres, F.A. Tomas-Barberan, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 7241–7248. [50] J.S. Bonvehi, M.S. Torrento, E.C. Lorente, J. Agric. Food Chem. 49 (2001) 1848–1853. [51] I. Erlund, Nutr. Res. 24 (2004) 851–874. [52] B.K. Matuszewski, M.L. Constanzer, C.M. Chavez-Eng, Anal. Chem. 70 (1998) 882–889. [53] M. Stuber, T. Reemtsma, J. Anal. Bioanal. Chem. 378 (2004) 910–916. [54] H. Merken, G.R. Beecher, J. Agric. Food Chem. 48 (2000) 577–599. [55] M. Ye, Y. Li, Y.N. Yan, H.W. Liu, X.H. Ji, J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 621–628. [56] A. Escarpa, M.C. Gonzalez, Chromatography 51 (2000) 37–44. [57] J. Vacek, B. Klejdus, L. Lojkov, V. Kub, J. Sep. Sci. 31 (2008) 2054–2067. A. C´iric´ et al. / Talanta 99 (2012) 780–790790 Chemometric-Assisted Optimization of RP-HPLC Method for Determination of Some Bioflavonoids in Brassica oleracea Species and Their Antioxidative Activity Andrija R. Ciric & Nevena Ivanovic & Milica S. Cvijovic & Milena Jelikic-Stankov & Ljubinka Joksovic & Predrag T. Djurdjevic Received: 25 May 2013 /Accepted: 14 November 2013 /Published online: 28 November 2013 # Springer Science+Business Media New York 2013 Abstract In the present work, the rapid RP-HPLC method with UV (DAD) detection for simultaneous quantification of bioflavonoids: quercetin, apigenin, catechin, epicatechin, kaempferol, and luteolin in Brassica oleracea species sam- ples (cauliflower, broccoli, and Brussels sprouts) was devel- oped with the aid of LC-Simulator (ACD Labs® suite) soft- ware. A series of extracts obtained with different extraction method were evaluated for antioxidant activity. The optimal conditions for separation and quantification were established after nine scouting runs entered to LC-Simulator software. The optimized separation was achieved on Hypersil GOLD aQ column with isocratic elution and mobile phase composi- tion A:2 % acetic acid in water and B:acetonitrile in 91:9 (v /v %) ratio. The R s values were in the range from 2.6 to 8.00, indicating good selectivity of the method. The obtained results generally show good agreement with published data. Low detection limits (0.02–0.055 μg/mL) were obtained with acceptable recoveries (90–109 %). Total time of analysis was less than 11 min; therefore, the proposed method represents significant improvement over existing methods. Extracts from Brassica vegetables, obtained using different extraction pro- cedures, were studied for their radical scavenging effects. Scavenging of DPPH showed different kinetics at the beginning of the assay period and after 15 min from the initialization of reaction. Different kinetics suggested the pres- ence of polymerized and/or less active antioxidants with dif- ferent scavenging mechanisms for particular polyphenolic compounds. Keywords Computer optimization . Bioflavonoid . Brassica vegetables . Standard addition . Antioxidative activity Introduction Flavonoids are a large class of phenolic compounds which are subclassified as flavones, flavonols, isoflavones, flavanones and catechins, chalcones, and anthocyanidins depending on phenyl substituent in the C2 or C3 position in benzo-γ-pyrone nucleus. Interest in the bioflavonoids is related to their diversity, biolog- ical significance as secondary plant metabolites and ecological role (Harborne 1994), use as chemotaxonomicmarkers (Kamiya et al. 1979), impact on fruit quality (Rouseff 1980), physiolog- ical effects (Forkmann et al. 1992; Herrmann 1970; Cody et al. 1988), and industrial applications (Ortuno et al. 1995). The flavonoids are potent antioxidants, free radical scav- engers (Sato et al. 1996), and metal chelators; they inhibit lipid peroxidation (Cook and Samman 1996) and exhibit various physiological activities (Middleton 1976; Leibovitz and Mueller 1993; Dakora 1995; Raghavan et al. 1995; Das et al. 1994), including anti-inflammatory (Thompson 1993), anti-allergic, anticarcinogenic, antihypertensive, and antiar- thritic activities (Read 1995). Structures of investigated bioflavonoids are presented in Fig. 1. In the present paper, we aimed to develop the method for simultaneous determination of several bioflavonoids in spe- cies Cruciferae brassica. Brassica vegetables have been found to be a significant host of antioxidant phytochemicals A. R. Ciric :N. Ivanovic : L. Joksovic : P. T. Djurdjevic (*) Faculty of Science, University of Kragujevac, P.O. Box 60, 34000 Kragujevac, Serbia e-mail: preki@kg.ac.rs M. S. Cvijovic Faculty of Agronomy, University of Kragujevac, 32000 Čačak, Serbia M. Jelikic-Stankov Faculty of Pharmacy, University of Belgrade, Vojvode Stepe 452, 11000 Belgrade, Serbia Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 DOI 10.1007/s12161-013-9761-y (polyphenols, flavonoids, flavanols, and anthocyanins), glu- cosinolates, and plant proteins (Weintraub et al. 1995). The major contributor to Brassica vegetables antioxidant activity are their polyphenolic compounds content. Thus, food sam- ples were assayed for their antioxidative activity. Various methods have been developed for the determina- tion of bioflavonoids in plants and reviewed capillary electro- phoresis (Ficarra et al. 1995), thin-layer chromatography (Suntornsuk 2002), gas chromatography (Ragazzi and Veronese 1973), high-performance liquid chromatography with UV/visible, fluorescence detection (Stremple 1996; Rodriguez-Delgado et al. 2001), and electrochemical detec- tion modes (Hollman et al. 1996). HPLC techniques are now the most widely used both for separation and quantitation of phenolic compounds (Jandera et al. 2005). LC-MS and in particular LC-MS/MS methods have been recognized (Merken and Beecher 2000) as the best tool to analyze samples of biological origin due to their selectivity, sensitivity, and speed of analysis. Several HPLC methods have been reported for bioflavonoids determination in Brassica vegetables. Hertog et al. (1992) determined quercetin and kaempferol in Brassica vegetables. Content of quercetin and kaempferol in cauliflow- er and Brussels sprout was less than 1 mg/kg fresh edible parts, while in broccoli was 30 mg/kg of quercetin and 70 mg/kg kaempferol. Vallejo et al. (2004) isolated and struc- turally characterized the flavonoids from broccoli inflores- cences by LC/UV-DAD/ESI-MS method. A large number of hydroxycinnamic acid esters of kaempferol and quercetin glucosides have been characterized. The structures of the flavonoid glycosides were analyzed after alkaline hydrolysis and were identified as 3-sophoroside/sophorotrioside- 7-glucoside/sophoroside of kaempferol, quercetin, and isorhamnetin, but their quantification was not performed. Price et al. (1998a) found two main flavonol glycosides in broccoli florets identified as quercetin 3-O-sophoroside and kaempferol 3-O -sophoroside. Three minor glucosides of quercetin and kaempferol were also detected, namely isoquercitrin, kaempferol 3-O -glucoside, and a kaempferol diglucoside. The sophorosides of quercetin and kaempferol were present in raw florets at a level of 65 and 166mg/kg fresh weight, respectively. The total content of quercetin and kaempferol glycosides expressed as aglycone was 43 and 94μg/g fresh weights, respectively. Justesen et al. (1998) used high-performance liquid chromatographic (HPLC) separation method with photo-diode array and mass spectrometric (MS) detection for determination and quantification flavonols, fla- vones, and flavanones in fruits, vegetables, and beverages. They quantified quercetin and kaempferol in amount of 3.7 mg/100 g and 6.0 mg/100 g in broccoli and 0.6 mg/100 g and 0.9 mg/100 g in Brussels sprout, respectively. Sikora et al. (2012) applied different preparation method on kale, broccoli, Brussels sprouts, and white and green cauliflower. They iden- tified derivatives of hydroxycinnamic acid (caffeic acid, p -coumaric acid, and sinapic acid) and flavonols– kaempferol and in smaller amounts, quercetin. The high content of above components was found in kale (total 94.4 mg/100 g of fresh matter), whereas the smallest amounts were found in white and green cauliflower, 3.6 mg/100 g and 3.03 mg/100 g, respectively. Main problems encountered in the analysis of these samples are “visible” and “invisible” matrix interferences. The matrix effect can be a serious problem as it could severely compromise quantitative analysis of the compounds at trace levels as well as method reproducibility (Erlund 2004). The most effective way to eliminate matrix effect affecting trueness and precision of the analytical method is to use the standard addition technique (Stuber and Reemtsma 2004). Standard addition is especially appropriate when the sample composition is unknown or com- plex and affects the analytical signal. By reviewing the above literature data, it can be con- cluded that separation and quantification of a large num- ber of flavonoids potentially present in Brassica species were not performed. OOH OH OH OH OH catechin OOH OH OH OH OH epicatechin O O OH OH OH apigenin OH OH O O OH OH kaempferol OOH OH OH O OH OH quercetin OH OH O O OH OH luteolin Fig. 1 Structure of investigated bioflavonoids 1388 Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 The main goal of the present investigation was to develop and validate precise, accurate, rugged, and reliable method for separation of bioflavonoids in food samples in a reasonable analysis time by adjusting acceptable chromatographic fac- tors. This method would be suitable for routine use in food quality control with regards to the wide range of flavonoid concentration in food samples and large number of samples needed to be analyzed in a short time. To achieve this goal, optimization of chromatographic parameters, the mobile phase composition, pH, flow rate, type of chromatographic column, and temperature is required. Simultaneous optimiza- tion of that many parameters requires computer oriented che- mometric approach in order to simplify and accelerate the optimization process. In the present study, a computer simu- lation software LC-Simulator (ACD Labs, Toronto, Ontario, Canada) was used in developing and optimizing a reverse- phase HPLC separation of bioflavonoids. There are three varieties of Brassica and each has its own use. Information on the antioxidative capacities of phenolics and flavonoids in all varieties of Brassica species are very controversial. Therefore, the other part of the present research was aimed to evaluate the antioxidant activities in different extracts of three varieties of Brassica species. Materials and Solutions Catechin, (2R ,3S )-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H- chromene-3,5,7-triol (C15H14O6) (>98 %); epicatechin, (2R ,3R )-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-1(2H )- benzopyran-3,5,7-triol (C15H14O6) (>90 %); apigenin, 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H -1-benzopyran-4-one (C15H10O5) (>95 %); kaempferol, 3,5,7-trihydroxy- 2-(4-hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one (C15H10O6) (>98 %); quercetin, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chro- men-4-one (C15H10O7) (>99 %); and luteolin, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-chromenone (C15H10O6) (>94 %) were all from Sigma-Aldrich (Vienna, Austria); acetic acid was from HEMO (Serbia), Folin– Ciocalteu phenol reagent from Merck (Darmstadt, Germany), acetonitrile was from J.T. Baker (Deventer, Holland), and meth- anol (HPLC grade purity) was from Sigma-Aldrich (Vienna, Austria); DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium) was from Sigma-Aldrich (Vienna, Austria). Water was obtained from a Millipore Milli-Q system (Watford, UK). Fresh and frozen samples of cauliflower, broccoli, and Brussels sprout were purchased from a local store. Sample Preparation Three food matrices were selected for the bioflavonoid anal- ysis—cauliflower, broccoli, and Brussels sprouts. Samples were cut into small pieces and chopped. Frozen sample were first thawed and air-dried. Comminution and homogenization of samples were performed using food processor (Hamilton Beach/Proctor-Silex Inc., Southern Pines, NC, USA) and homogenizer (Silent Crusher, Heidolph, Schwabach, Germany), respectively. Homogenization was carried out for 5 min until particle size was uniform and less than 5 μm. Preparation of Stock and Sample Solutions Stock solutions of catechin, epicatechin, apigenine, kaempferol, quercetin, and luteolin standards concentration of 1.00 mg/mL in methanol were prepared. For standard addition method, five solutions containing 0.1 μg/mL querce- tin, 0.1 μg/mL kaempferol, 0.05μg/mL apigenin, 0.03μg/mL catechin, 0.03 μg/mL epicatechin, and 0.02 μg/mL luteolin in methanol were prepared. Extracted samples were spiked with each of these solutions. Water and methanol extracts were prepared by extracting 2 g of the material with corresponding pure solvents. Methods of Extraction According to the literature data (Ye et al. 2002a; Escarpa and Gonzalez 2000a; Olsen et al. 2009; Brusotti et al. 2010; Price et al. 1998b), several extraction methods were investigated in the present paper: Soxhlet, ultrasonic, boiling with water, and extraction by maceration. The solvent, extraction time, and temperature were chosen on the basis of the literature data (Ye et al. 2002a; Escarpa and Gonzalez 2000a; Olsen et al. 2009; Brusotti et al. 2010; Price et al. 1998b). To find the most effective method, various ways of extraction were tested. Soxhlet Extraction The ground powder of sample (2 g) and 50 mL of methanol were placed into the capsule. The extraction was performed for 120 min at 60 °C (Escarpa and Gonzalez 2000a). After 120 min, the extract was separated from the remaining mate- rial to which a new portion of 50 mL of methanol was added and extraction was continued for 60 min until completeness. The combined extract was evaporated in rotary vacuum evap- orator to the volume of 5 mL and passed through a membrane filter; the filtrate was diluted with methanol in 25 mL normal flask to the mark and used for HPLC analysis. To ascertain that the remaining sample does not contain bioflavonoids, qualitative tests on bioflavonoids were made. Reaction with Fe(III) (Mira et al. 2002) and Folin–Ciocalteu phenol reagent (Singleton and Rossi 1965) was performed. The reactions were negative and did not show presence of bioflavonoids, so the extraction of bioflavonoids was com- plete with 100 % efficiency. Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 1389 Ultrasonic Extraction The ground powder of sample (2 g) and 50 mL of methanol as solvent was first loaded into a 250-mL beaker and sealed by plastic film to avoid loss of solvent. The beakers were im- mersed into the ultrasonic bath for ultrasonication at 35 kHz frequency and 150 W power. After 30 min of extraction at 40 °C, the extract was separated from the rest of the solid material on which was added a new portion of 50 mL of methanol and extraction was continued for 15 min. Further procedure is the same as in the case of Soxhlet extraction. Extraction by Maceration The ground powder of sample (2 g) is measured, and extrac- tion was performed with 25 mL of 70 % methanol as solvent in the mortar. Further procedure is the same as in the case of Soxhlet extraction. Water Extraction The ground powder of sample (2 g) is measured, and extrac- tion was performed with 100 mL of boiled water. Further procedure is the same as in the case of Soxhlet extraction. Instruments A HPLC system (Shimadzu, Kyoto, Japan) consisted of degasser DGU-20A3, analytical pumps LC-20AT, manual injector 7125 and SPD-M20A diode array detector, and CBM-20A system controller. A reversed-phase Hypersil GOLD aQ (150×4.6 mm, particle size 5 μm) column (Bellefonte, PA, USA) was used for separation. The chro- matographic data were processed using LC Solution computer software (Shimadzu). UV spectrophotometer was Lambda 45 (Perkin-Elmer, USA) with operating software WinLab. Ultrasonic extraction experiments were carried out in ultra- sonic bath (Bandelin Sonorex Super) Model RK 512H. Free Radical Scavenging Activity Free radical scavenging capacity of the Brassica species was determined according to the previously reported procedure using the stable 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH) (Ali et al. 2001; Marina et al. 1998). Freshly prepared DPPH solution 0.2 mL (1 mg/mL) in methanol was added to 3 ml of diluted each Brassica extracts to start the radical antioxidant reaction. The decrease in absorbance was mea- sured at different time intervals, i.e., 0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, and 30.0 min at 517 nm. The remaining concentration of DPPH in the reaction mixture was calculated using equation: % of DPPH remaining ¼ DPPH½ t= DPPH½ t¼0  100 where t is the current time. The absorbance measured at 10 min of the antioxidant– DPPH radical reaction was used to compare the DPPH radical scavenging capacity of each Brassica vegetable extract. Results and Discussion Method Development Bearing in mind that all analytes are ionizable substances, one may expect the strong influence of pH on separation. Developing of a chromatographic assay for this class of com- pound is challenging owing to the similar structure and phys- icochemical properties. The aim of the method was the direct measurement of the bioflavonoids in food samples based on the use of single column chromatography with UV detection. The conditions for method development were chosen on the basis of polarity of analytes and polarity of the mobile phase. Method development started with Hypersil GOLD aQ column (150×4.6 mm, 5 μm particle size) with hybrid organic/inorganic packing material. Different mobile phase compositions were evaluated to obtain chromatograms with good resolution of the eluting species within an acceptable time of analysis. The mobile phase was chosen after several trials with methanol, acetonitrile, and water in various propor- tions at different pH values under different gradient elution schemes. To improve the peak shape, acetic acid (Chunsriimyatav et al. 2009; Li et al. 2007; Jin et al. 2003; Zu et al. 2006; Irakli et al. 2012) was added as a mobile phase modifier to inhibit dissociation of the phenolic hydroxyl group of phenolic compounds (Lui et al. 2008). Changes in the pH value of the mobile phase also had a significant effect on the resolution of compounds. According to Michalkiewicz et al. (2008), the increase in pH of the mobile phase dramatically reduces the retention of bioflavonoids. When the gradient elution system starts with acidified water followed by gradient increase of methanol, separation of bioflavonoids can be achieved under a long run time due to low resolution. Starting the elution with acidified water and acetonitrile, sep- aration of bioflavonoids was improved and the analysis run time decreased. Wavelengths at 260 and 280 nm were chosen as monitoring wavelengths according to absorption maxima of the analytes. Optimization RP-HPLC Conditions Because of similar structure and properties of bioflavonoids, it is very difficult to separate them in short run time, low mobile phase consumption, and low content of organic modifier in the mobile phase. Bioflavonoids are weak heterocyclic acid (Perron and Brumaghim 2009) with three to five dissociation sites: first corresponding to proton loss from hydroxyl group 1390 Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 in position 7 (pKa∼8), second corresponding to proton loss from position 4′-OH group (pKa∼9.5), and other two con- stants are due to the 3-OH (pKa∼8 10.5) and 5-OH (pKa∼ 12.5) groups. Thus, bioflavonoids may exist in solution in neutral, and three to five anionic forms (−1 to −5 charge). Relative percentages of these forms in solution depend upon the pH of the solution. Since the stationary phase best retains the neutral or low charged anionic forms of bioflavonoids, the pH interval for their maximum formation should be known and fixed. Hence, their separation on reverse-phase column is difficult. The problems involve broad tailing peaks (Zhang and Xiang 2002), too early elution (acetonitrile >15 %) with low efficiency of separation. So, to achieve quality separation of bioflavonoids, a RP-C18 Hypersil GOLD aQ column was used. According to the manufacturer's recommendations, the column can be used over a pH range 2–10 and content of organic modifier in mobile phase should be less than 15 %. In order to keep capacity factors to be neither too low (bad resolution) nor too high (lack of sensitivity and long analysis time), the mobile phase composition and the pHmust be optimized. The composition of mobile phase used for chromatography may have a strong UV absorbance gradient chromatography may have a sloping baseline, which could obscure analyte peaks. Optimization usually involves simul- taneous adjustment of both the composition and pH of the mobile phase. Thus, the optimization of mobile phase com- position for isocratic elution was conducted using LC- Simulator software. The computer-assisted chromatographic method develop- ment is the necessity for tracking the movement of the peaks as separation conditions are changed. Peak increments are than used to build a mathematical model capable of minimiz- ing the number of experiments in an optimization runs. LC- Simulator software can perform optimization analysis of ex- perimental chromatograms and build predictionmodels which relate the experimental variables (%B, buffer concentration, temperature, etc.) with retention factor (Bogomolov and McBrien 2003). Results are displayed as resolution maps illustrating resolution of critical pair. Resolution maps show how changes in the method affect the separation. Concentration profiles are obtained by means of least-square multivariate curve analysis. The software allows simultaneous optimization of one or two variables with input parameters, such as retention time, peak area, and peak–width under chosen chromatographic conditions (column, temperature, and gradient or isocratic elution) and its visualizing peak movements, which are essen- tial to understand robustness of an HPLC method. The reso- lution map of one-dimensional optimization (1D) is two- dimensional graph whereas the resolution map of a two- dimensional optimization (2D) is a three-dimensional contour plot in which the critical resolutions as a third dimension is color coded. Sliding a diamond-shaped cursor to the region of maximum critical resolution, one is able to optimize values of parameters and simulated chromatogram can be obtained so that best experimental conditions can be easily identified. From our previous work (Ciric et al. 2012), the column temperature at 30 °C was found to be optimal. The optimiza- tion of analytes separation was started with two linear gradient runs: tG=30 min and tG=60 min; %B run from 5 to 90 % in the LC-Simulator mode gradient and with 2 % acetic acid in order to find optimal percent of acetonitrile and to find min- imal number of runs for isocratic analysis. These two chro- matograms were manually input into the LC-Simulator soft- ware, i.e., retention times, peak areas, and the baseline peak– widths were entered into the program. The resulting 1D reso- lution map is shown in Fig. 2. Identification of peaks was ensured by coinjecting the standards. The suitability bar along the X-axis displayed the degree to which the optimized conditions match those speci- fied as suitable options. The suitability is expressed through colors: red for outside the admissible interval and green inside Fig. 2 1D resolution map obtained in tI/%B optimization at 2 % acetic acid and T=30 °C Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 1391 desired interval. So, the critical zone covers only the completely unsuitable resolution map regions. From Fig. 2, only one area with maximum resolution could be identified. That area for the optimal %B for isocratic work can be easily identified to be in the range 8.0–12.0 % B. In the next stage, concentration of acetic acid and percent quantity of acetonitrile for isocratic elution were optimized simultaneously. Based on the experimental design, nine isocratic runs with tI=20 min were performed. The experimental data and the obtained data set for computer optimization of the experi- mental conditions pertaining to these runs are given in Table 1. The chromatographic parameters (retention time, peak ar- ea, and width) were input manually into the software at all the given conditions. Table 1 Experimental conditions and corresponding data obtained from chromatograms used for method optimization Column Hypersil GOLD aQ (150×4,6 mm, 5 μm), wavelength 260 nm, temperature 30 °C, flow rate 1 mL/min Conditions 95:5; 1 % acetic acid/acetonitrile 90:10; 1 % acetic acid/acetonitrile 85:15; 1 % acetic acid/acetonitrile Substance t r Area Width t r Area Width t r Area Width Quercetin 3.149 78,324 0.284 3.564 32,648 0.193 3.077 10,452 0.204 Kaempferol 9.865 53,837 0.357 3.568 12,364 0.387 3.659 14,756 0.208 Catechin 8.756 57,658 0.272 5.359 18,651 0.268 3.454 14,698 0.256 Luteolin 18.074 73,159 0.348 6.385 13,684 0.268 8.696 10,479 0.326 Apigenin 16.522 76,825 0.239 7.326 23,265 0.365 6.879 17,856 0.172 Epicatechin 14.489 47,689 0.342 11.326 10,946 0.462 3.785 10,752 0.136 Conditions 95:5; 2 % acetic acid/acetonitrile 90:10; 2 % acetic acid/acetonitrile 85:15; 2 % acetic acid/acetonitrile Substance t r Area Width t r Area Width t r Area Width Quercetin 2.146 54,492 0.200 2.074 37,282 0.090 2.077 10,092 0.204 Kaempferol 5.949 28,749 0.308 2.525 15,740 0.260 2.458 10,088 0.208 Catechin 6.670 15,524 0.292 4.163 17,251 0.230 1.454 15,566 0.182 Luteolin 16.064 10,398 0.348 4.482 12,994 0.190 7.696 10,059 0.326 Apigenin 13.626 20,808 0.332 6.448 21,418 0.320 4.879 18,448 0.172 Epicatechin 12.520 20,846 0.310 9.613 10,157 0.320 1.785 10,702 0.136 Conditions 95:5; 3 % acetic acid/acetonitrile 90:5; 3 % acetic acid/acetonitrile 85:15; 3 % acetic acid/acetonitrile Substance t r Area Width t r Area Width t r Area Width Quercetin 2.949 28,749 0.308 0.895 15,740 0.260 1.358 40,088 0.208 Kaempferol 3.470 15,524 0.292 1.163 17,251 0.230 0.875 35,566 0.182 Luteolin 1.146 33,544 0.200 2.074 37,282 0.090 1.237 10,092 0.204 Apigenin 10.426 40,846 0.310 4.613 10,157 0.320 1.255 10,702 0.136 Catechin 11.236 20,808 0.332 6.448 21,418 0.320 2.879 18,448 0.172 Epicatechin 14.048 10,398 0.348 7.482 12,994 0.190 5.496 10,059 0.326 Fig. 3 3D resolution map obtained by simulation for maximal resolution 1392 Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 LC-Simulator produces map of resolutions which is pre- sented at Fig. 3. The resolution map is displayed as a color bar under map resolution is presented as a palette of colors as a function two experimental parameters which are simultaneous changed. From 2D resolution map presented in Fig. 3, few areas with maximum resolution could be found. As it could be seen from Fig. 3, concentration of acetic acid at maximal resolution does not exceed 3 %. The highest value of resolution is obtained at low concentrations of acetic acid and a small proportion of acetonitrile. However, at these conditions, run time is too long (22 min) and does not meet the above criteria. The second area with high resolution is at 20 % acetonitrile and low concen- tration of acetic acid. At these conditions, time of analysis is significantly reduced (12 min), but analytes elute too quickly and acetonitrile consumption is high; therefore, these condi- tions do not comply with suitability criteria. The third area is in the central part of the graph and adequately fulfills suitabil- ity criteria. Although the resolution is not maximal, it is still within the acceptable range, so it was decided to take these conditions as the optimal ones. Thus, the optimal conditions for separation of bioflavonoids were Hypersil GOLD aQ column, 2 % concen- tration of acetic acid with acetonitrile in ratio 91:9 (v /v %), temperature of 30 °C with detection at 260 nm, and flow rate 1 mL/min. The chromatogram obtained by computer simula- tion is presented in Fig. 4a. In the next step, the chromatogram of analyte mixture was taken. The chromatogram obtained under optimal conditions is presented in Fig. 4b. From Fig. 4a, b, it could be seen that a very good agreement between simulated and experimental chromatogram obtained under optimal conditions with average errors from 1 to 5% for retention time and resolution, respectively. In Table 2, chro- matographic parameters obtained from chromatograms re- corded under optimal conditions are presented. The trueness expressed as recovery (=Cfound/Cadded×100) and precision and expressed as relative standard deviation a b 10.510.09.59.08.58.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.5 Time, min 20 40 60 80 100 120 Ka te hi n Ap ig en in Ep ika te hi n Lu te ol in Kv er ce tin Ka em fe ro l A280 0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 m AU min Qu er ce tin Ka em pf er ol Ca te ch in Ap ig en in Ep ica te ch in Lu te ol in Fig. 4 a Chromatogram obtained computer simulation using program LC-Simulation. b Chromatogram of standard bioflavonoids under optimal conditions Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 1393 (¼ SD 100=x ) were calculated by analyzing five solutions with known concentration of analytes. Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) were estimated from the calibration curves for sufficiently low concentration of analytes (0.1–1.0 μg/mL) using the formula k×(Sb/a) where k is 3.3 for LOD and 10 for LOQ. Sb is the calculated standard deviation in intercept of calibration curve and a is its gradient. Extraction efficiency Several parameters may influence the yield of phenolics, including extraction time, temperature, matrix type, particle size, solvent-to-sample ration, the number of repeat extraction of the sample, as well as the solvent type. All types of extraction were compared with Soxhlet extraction since it is widely accepted that Soxhlet extraction of flavonoids yields 100 % recovery (Ye et al. 2002b; Escarpa and Gonzalez 2000b). Extraction efficiency was determined using analyte standards. The data are presented in Table 3. It can be seen that there is no significant difference in efficiency between Soxhlet and ultrasonic bath extraction method. The extraction efficacy was slightly lower for the frozen samples. It could be attrib- uted to matrix effects and possible hydrolysis. Owing to its simplicity and rapidity, the ultrasonic bath extraction was chosen as the preferred method. Determination of Bioflavonoids in Food Samples The method to improve accuracy of the quantitation methods and eliminate interferences should be considered in the quan- titation of bioflavonoids in food matrices. Complete removal of co-eluting substances by sample cleanup could not be achieved since in the case of our samples, the matrices are complex and different in composition from sample to sample. Thus, as the method of choice in our case is standard addition method, that is analyzing extract solution with added known quantity of standard solution; the calculation procedure is as follows: X i ¼ Ix I sþx S f þ X f   Where Xi is the amount of bioflavonoids in the extract solution, Sf is the amount of bioflavonoids spiked into the extract solution, I x is the signal intensity of bioflavonoids in the extract solution, and I s+x is the signal intensity of bioflavonoids in the spiked solution. This method requires at least two HPLC runs per analysis—the run of the extract Table 2 Chromatographic parameters obtained onHypersil GOLD aQ column under 2% concentration of acetic acid with acetonitrile in ration 91:9 (v / v %), temperature of 30 °C at 260 nm, and flow rate 1 mL/min Substances Retention time (min) Resolution Capacity factor Selectivity factor Number of theoretical plates LOD (μg/mL) LOQ (μg/mL) Quercetin 3.05 0.00 5.35 0.00 1,653 0.055 0.167 Kaempferol 3.73 2.60 6.71 1.25 5,476 0.032 0.096 Catechin 4.51 3.56 8.38 1.25 5,184 0.025 0.075 Luteolin 5.55 4.67 10.56 1.26 12,321 0.02 0.06 Apigenin 7.24 6.80 14.1 1.34 9,344 0.030 0.090 Epicatechin 10.03 8.00 19.94 1.41 10,100 0.04 0.12 Table 3 Extraction yield (%±SD) of bioflavonoids from fresh Brassica oleracea species compared (normalized) to Soxhlet extraction Quercetin Kaempferol Catechin Luteolin Apigenin Epicatechin Cauliflower Extraction with water 68±8 74±8 60±9 55±8 50±5 48±4 Maceration 80±6 86±6 81±5 74±5 83±7 58±3 Ultrasound extraction 94±5 93±5 92±7 91±5 94±6 92±8 Broccoli Extraction with water 69±7 73±7 72±7 51±6 63±3 69±4 Maceration 83±4 77±4 81±5 69±7 79±7 75±6 Ultrasound extraction 91±7 89±8 97±6 90±9 93±5 92±5 Brussels sprouts Extraction with water 73±6 80±2 73±4 71±5 69±8 70±6 Maceration 84±3 85±8 79 ±7 79±7 78±6 79±4 Ultrasound extraction 92±5 92±5 93±6 87±7 91±7 93±7 1394 Food Anal. Methods (2014) 7:1387–1399 sample and the run of the extract samples spiked with a known quantity of bioflavonoids. Method Performance and Validation Prior to analysis, the performance of the method was checked by analyzing standard solutions of analytes prepared in meth- anol as solvent. Calibration curves for each analyte were constructed by plotting the peak area of the analyte against corresponding concentration. The standard addition method was performed by adding the unknown solution to 100, 200, 300, and 400 μL of standard solution in a 5-mL volumetric flask to the mark. Thus, no dilution with solvent was employed. The unknown concentration was assayed by plotting the corrected signal against the added concentration of the analytes. The unknown concentration was read as the x -intercept of the graph. The uncertainty of the intercept was calculated as: SD ¼ sy aj j ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 1 n þ y 2 a2  xi−x  2 vuuut Where sy is standard deviation in y -readings, a is the slope of least–squares line, n is a number of data points, x is the concentration, and y chromatographic response. The confi- dence interval was calculated as t×SDx where t is a Student t for n−2° of freedom. The detection limits of quercetin, kaempferol, catechin, apigenin, luteolin, and epicatechin in food samples were de- termined from the standard addition curves based on the definition of the concentration of analyte yielding a signal equivalent to three times the standard deviation of the non- spiked sample. The limit of detection was in the range 0.02–0.055 μg/mL indicating that the method has satisfactory performance for the determination of chosen bioflavonoids in real food samples. The Brassica vegetable samples were analyzed for quercetin, kaempferol, catechin, apigenin, luteolin, and epicatechin content by using the standard addi- tion method to the sample extracts. The linear standard addi- tion curves were obtained in the concentration range of the added standard solutions of bioflavonoids 0.02–0.4 μg/mL (five concentration levels). Linearity was confirmed by the values of the regression coefficient higher than 0.98 and Cohran's test for homoscedasticity (Gmax=s 2 max/Σsi 2 was com- pared with tabulated value, null hypothesis about equality of individual point standard deviation, accepted if Gmax