УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ Докторска дисертација СИНТЕЗА, КАРАКТЕРИСАЊЕ И ПОТЕНЦИЈАЛНА АНТИМИКРОБНА АКТИВНОСТ КОМПЛЕКСА НЕКИХ ПРЕЛАЗНИХ МЕТАЛА СА ЛИГАНДИМА ЕДДА-ТИПА    Mр Драгослав Р. Илић          Крагујевац, 2014.  1. Аутор  Име и презиме: Мр Драгослав Р. Илић  Датум и место рођења: 20. 07. 1961. Миоковићи, Лепосавић  Садашње запослење: Висока медицинска школа, Ћуприја  2. Докторска дисертација  Наслов: СИНТЕЗА, КАРАКТЕРИСАЊЕ И ПОТЕНЦИЈАЛНА АНТИМИКРОБНА АКТИВНОСТ КОМПЛЕКСА НЕКИХ ПРЕЛАЗНИХ МЕТАЛА СА ЛИГАНДИМА ЕДДА-ТИПА Број страница: 103 + 6  Број библиографских јединица: 115  Установа и место где је рад израђен: Природно‐математички факултет, Крагујевац  Научна област (УКД): Хемија (54) – Неорганска хемија (546)  Ментор: Проф. Др Срећко Р. Трифуновић  3. Оцена и одбрана  Датум пријаве тезе:  Комисија за оцену теме и подобности кандидата:   1. Др Срећко Трифуновић, ред. проф. Природно‐математички факултет Крагујевац,   Неорганска хемија   2. Др Тибор Сабо, ред. проф. Хемијски факултет  Београд,  Неорганска хемија    3. Др Миорад  M. Васојевић,  доцент, Природно‐математички факултет  Крагујевац,   Настава хемије  Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације:   Комисија за преглед, оцену и одбрану дисертације:   1. Др Срећко Трифуновић, ред. проф. Природно‐математички факултет Крагујевац,   Неорганска хемија   2. Др Тибор Сабо, ред. проф. Хемијски факултет  Београд,  Неорганска хемија    3. Др Миорад  M. Васојевић,  доцент, Природно‐математички факултет  Крагујевац,   Настава хемије  4. Др Љиљана Чомић, ред. проф. Природно‐математички факултет Крагујевац,  Микробиологија   5. Др Зоран Матовић, ред. проф. Природно‐математички факултет Крагујевац,  Неорганска  хемија     Датум одбране дисертације:      С а д р ж а ј    ИЗВОД..............................................................................................  1  SUMMARY ......................................................................................  3  УВОД‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐   5  1. О П Ш Т И   Д Е О.............................................................................................  7  1.1. СТРУКТУРА ОКТАЕДАРСКИХ M(III)‐КОМПЛЕКСА КОЈИ САДРЖЕ  КВАДРИЕНТАТНЕ ЛИГАНДЕ EDDA‐ТИПА...........................................................    7  1.1.1. СТЕРЕОХЕМИЈА КОМПЛЕКСА...................................................................................  7  1.1.1.1. ГЕОМЕТРИЈСКА ИЗОМЕРИЈА.................................................................................  8  1.1.2. НУКЛЕАРНО‐МАГНЕТНО‐РЕЗОНАНЦИОНИ              (NMR) СПЕКТРИ.........................................................................................................    13  1.1.3. ИНФРА‐ЦРВЕНИ (IR) СПЕКТРИ...............................................................................  18  1.1.4. ЕЛЕКТРОНСКИ АПСОРПЦИОНИ СПЕКТРИ............................................................  19  1.1.5. ОПТИЧКА АКТИВНОСТ И АПСОЛУТНЕ КОНФИГУРАЦИЈЕ                 КОМПЛЕКСА............................................................................................................  1.2. ЗАДАТАК ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ ………………….……………….      26  37  2.  E  K  С  П  Е  Р  И  М  Е  Н  Т  А  Л  Н  И      Д  Е  О..............  38  2.1. Синтезе лиганада и комплекса паладијум(II) јона...............................................  38  2.1.1. Синтеза (S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐(4‐метил)‐пентанске               киселине, H2eddl.....................................................................................................    38  2.1.2. Синтезе диалкил естара (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4- метил)-пентанске киселине (S,S)-R2eddl (L1-L4).............................................   39  2.1.3. Синтеза комплекса паладијума(II) са диалкил естрима (S,S)- етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине 1-4.........................   40  2.1.4. In vitro антимикробни тест паладијум(II)‐комплекса.........................................  2.1.4.1. Тестиране супстанце.........................................................................................  42  42  2.1.4.2. Тестирани микроорганизми .........................................................................................  42  2.1.4.3. Припрема суспензија ........................................................................................... 43  2.1.4.4. Микродилуциона метода ................................................................................... 43  2.1.4.5. Статистичка анализа .................................................................................................  44  2.1.5. Синтеза 3‐(1‐(2‐хидроксиетиламино)етилиден)хроман‐2,4‐ диона................  44    2.1.6. Синтеза хлоридо‐3‐(1‐(2‐хидроксиетиламино)етилиден)хроман‐             2,4‐дион‐паладијум(II) комплекса .......................................................................      45  2.1.7. Кристална структура хлоридо‐3‐(1‐(2‐хидроксиетиламино)‐             етилиден)хроман‐2,4‐дион‐паладијум(II) комплекса ........................................    46  2.1.8. Испитивање антитуморске активности паладијум(II) комплекса …………………..  2.1.8.1. Ћелије и реагенси.................................................................................................  48  48  2.1.8.2. Одређивање виталности ћелија...................................................................................  48  2.1.8.3. ДНК Фрагментација и анализа апоптоза/некрозе ....................................................  49  2.1.8.4. Активација каспасе ........................................................................................................  49  2.1.8.5. Мерење митохондријског ћелијског потенцијала  ...................................................  49  2.1.8.6.Одређивање реактивних врста кисеоника (ROS)( Reactive oxygen species)..............  50  2.1.8.7. Статистичка анализа ..................................................................................................  50  2.2. Синтезе лиганада и комплекса хром(III)‐јона .............................................. 2.2.1. Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, H2-(S,S)-eddv.2HCl ..................................................................... 50    50  2.2.2. Синтеза s‐cis‐оксалато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐(3‐метил)‐бутаноато‐            хромат(III)‐дихидрата, s‐cis‐К[Cr(S,S‐eddv)(ox)].2H2O ........................................................    51  2.2.3. Синтеза s‐cis‐малонато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐(3‐метил)‐бутаноато‐            хромат(III)‐дихидрата, s‐cis‐К[Cr(S,S‐eddv)(маl)].2H2O ......................................................    51  2.2.4. In vitro антимикробни тест хром(III)‐комплекса...............................................................  52  2.3. Синтезе лиганада и комплекса кобалт(III)‐јона ....................................................  2.3.1. Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропанске киселине, H2-(S,S)-eddp (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропанска киселина, (H2-S,S-eddp) је синтатисана према већ раније описаном поступку [2]........................................ 53      53  2.3.2..Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, H2-(S,S)-eddv.2HCl ..................................................................... 2.3.3. Синтеза s‐cis‐оксалато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐пропаноато‐кобалтат(III)‐              семихидрата, s‐cis‐К[Cо(S,S‐eddp)(ox)].0,5H2O..................................................................    53    53  2.3.4. Синтеза  s‐cis‐малонато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐пропаноато‐кобалтат(III)‐             тетрахидрата, s‐cis‐K[Co(S,S‐eddp)(mal)]∙4H2O...................................................................    54  2.3.5. Синтеза  s‐cis‐оксалато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐(3‐метил)‐бутаноато‐            кобалтат(III)‐трихидрата, s‐cis‐К[Cо(S,S‐eddv)(ox)].3H2O....................................................    55  2.3.6. Синтеза  s‐cis‐малонато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐(3‐метил)‐бутаноато‐            хромат(III)‐ тетрахидрата, s‐cis‐К[Cо(S,S‐eddv)(mal)].4H2O.................................................    55  2.3.7. Кристална структура s‐cis‐оксалато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐пропаноато‐            кобалтат(III)‐семихидрата, s‐cis‐К[Cо(S,S‐eddp)(ox)].0,5H2O..............................................    56  2.3.8. In vitro антимикробни тест кобалт(III)‐комплекса............................................................  57  2.4. Мерења....................................................................................................  2.4.1. 1H и 13C нуклеарно‐магнетно‐резонанциони спектри...................................................  2.4.2. Електронски апсорпциони и циркуларно дихроични спектри ...................................  2.4.3. Инфрацрвена спектроскопија......................................................................................  2.4.4. Микроанализа ....................................................................................................................  58  58  58  58  58    3.  Р Е З У Л Т А Т И  И  Д И С К У С И Ј А...................................        59  3.1. Синтеза и карактеризација и антимикробна активност диалкил естара (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске, киселине (S,S)-R2eddl (L1-L4) и одговарајућих комплекса паладијум(II)-јона 1-4............................     59  3.1.1 Инфрацрвени спектри..................................................................................................  59  3.1.2. Електронски апсорпциони спектри комплекса  ...........................................................  60  3.1.3. In vitro испитивање антимикробне активности ...............................................................  61  3.2. Синтеза, карактеризација и антитумосрска активност  3‐(1‐(2‐хидроксиетил‐          амино)етилиден)хроман‐2,4‐диона и  одговарајућег комплекса            паладијума(II)...........................................................................................................  3.2.1. Синтеза 3‐(1‐(2‐хидроксиетиламино)етилиден)хроман‐2,4‐диона и одговарајућег             комплекса паладијума(II) ..................................................................................................  3.2.2. Карактеризација хлоридо‐3‐(1‐(2‐хидроксиетиламино)етилиден)хроман‐2,4‐дион‐            ‐паладијум(II) комплекса.....................................................................................................      65    65    65  3.2.3. Кристална структура хлоридо‐3‐(1‐(2‐хидроксиетиламино)‐етилиден)хроман‐            ‐2,4‐дион‐паладијум(II) комплекса.....................................................................................    66  3.2.3. In vitro цитотоксичност комплекса паладијума(II) према неким ћелијским              линијама рака......................................................................................................................    68  3.3. Синтезa, карактеризација и антимикробна активност лиганада и комплекса           хром(III)‐јона .........................................................................................................................    73  3.3.1. Инфра‐црвени спектри .....................................................................................................  73  3.3.2. Електронски апсорпциони, циркуларно‐дихроични (CD) спектри и             апсолутне конфигурације ...................................................................................................    75  3.3.2. In vitro испитивање антимикробне активности...............................................................  3.4. Синтезa, карактеризација и антимикробна активност лиганада и           комплекса кобалт(III)‐јона........................................................................................  3.4.1. Инфра‐црвени спектри  .....................................................................................................  3.4.2. Електронски апсорпциони, циркуларно‐дихроични (CD) спектри и апсолутне             конфигурације комплекса .................................................................................................  3.4.3. Кристална структура s‐cis‐оксалато‐(S,S)‐етилендиамин‐N,N’‐ди‐2‐пропаноато‐            ‐кобалтат(III)‐семихидрата, s‐cis‐К[Cо(S,S‐eddp)(ox)].0,5H2O ...........................................  3.4.4. In vitro испитивање антимикробне активности ..............................................................  4. ЗАКЉУЧАК........................................................................................................  78    81  82    83    86  91  93  5. ЛИТЕРАТУРА...................................................................................................  95  СПИСАК РАДОВА ПРОИСТЕКЛИХ ИЗ РЕЗУЛТАТА ОВЕ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ.....    НАУЧНО‐ИСТРАЖИВАЧКИ РАД........................................................................................       БИОГРАФИЈА ...................................................................................    100  101  102  ПРИЛОГ............................................................................................ 103                 Ова докторска дисертација рађена је у Институту за хемијске науке  Природно‐математичког факултета Универзитета у Крагујевцу.  Тему дисертације предложио  је и директно руководио израдом рада  проф. Др Срећко Р. Трифуновић, на чаму му изражавам посебну захвалност.    Захваљујем се и члановима комисије проф. др Тибору Сабоу и доценту  др Миораду М. Васојевићу на корисним саветима током писања ове тезе.     Посебну  захвалност  дугујем  колегама  из  лабораторије  на  великој  помоћи приликом израде експерименталног  дела ове дисертације.    На крају,  захваљујем се својој породици на стрпљењу и безграничној  подршци.  Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 1 И З В О Д СИНТЕЗА, КАРАКТЕРИСАЊЕ И ПОТЕНЦИЈАЛНА АНТИМИКРОБНА АКТИВНОСТ КОМПЛЕКСА НЕКИХ ПРЕЛАЗНИХ МЕТАЛА СА ЛИГАНДИМА ЕДДА-ТИПА У првом делу ове Докторске дисертације описана је синтеза и карактеризација паладијум(II)-комплекса опште формуле [PdCl2(R2-S,S-eddl)] на бази инфрацрвене и електронске апсорпционе спектроскопије. Извршено је in vitro тестирање антимикробне активности синтетисаних лиганада и одговарајућих комплекса против 15 врста бактерија и гљивица. Такође, синтетисан је и нови комплекс паладијум(II)-јона са дериватом кумарина 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-дионом који је карак- терисан на бази микроанализе, инфрацрвене и нуклеарне магнетне спектроскопије. Предложена структура комплекса је потврђена на основу резултата рентгенске структурне анализе. Синтетисани комплекс је тестиран in vitro на ћелијама рака, Л929 фибросарком миша, У251 људски глиом и Б16 меланом миша У другом делу ове Докторске дисертације описана је синтеза комплекса хром(III)-јона и кобалт(III)-јона. Прво је описана синтеза s-cis-[Cr(S,S-eddv)L]-- комплекса (S,S-eddv = (S,S)-етилендиамин-N,N′-ди-2-(3-метил)бутаноато јон; L = оксалато или малонато јон). Комплекси су пречишћени јоноизмењивачком хроматографијом. Геометрија комплекса је претпостављена на основу инфрацрвених и електронских апсорпционих спектара, а апсолутне конфигурације изолованих комплекса су претпостављене на основу њихових циркуларно-дихроичних спектара. Такође, испитивана је антимикробна активност синтетисаних комплекса против 28 врста микроорганизама. Синтетисани су и октаедарски комплекси кобалта(III) са (S,S)-етилендиамин- N,N'-ди-2-пропионскoм киселином (S,S-eddp) и (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(3- метил)бутернoм киселином (S,S-eddv) који садрже и окалато и малонато лиганде, као додатне бидентатне лиганде. Комплекси су пречишћени јоноизмењивачком хроматографијом. Геометрија комплекса је претпостављена на основу инфрацрвених и електронских апсорпционих спектара, а апсолутне конфигурације изолованих Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 2 комплекса су претпостављене на бази њихових циркуларно-дихроичних спектара које су потврђене резултатима рентгенске структурне анализе у случају s-cis-K[Co(S,S- eddp)(ox)]·0,5H2O. Такође, испитивана је антимикробна активност синтетисаних комплекса на 13 врста микроорганизама (пет сојева патогених бактерија, пет врста патогених гљива и три врсте пробиотика). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 3 SUMMARY SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND POTENTIAL ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THE COMPLEXES OF SOME TRANSITION METAL COMPLEXES WITH EDDA-TYPE LIGANDS In the first part of the Doctoral thesis the synthesis and characterization of a palladium(II) complexes of general formula [PdCl2 (R2-S,S-eddl)] on the basis of infrared absorption spectroscopy is described. In vitro testing of the antimicrobial activity of the synthesized ligands and the corresponding complexes against 15 species of bacteria and fungi is carried out. Also, a new palladium(II) complex with a coumarine derivative, 3-(1-(2- hydroxyethylamino)ethylidene)chroman-2,4-dione is synthesized and characterized on the basis of microanalysis, the infrared and nuclear magnetic spectroscopy. The proposed structure of the complex was confirmed from the results of X-ray structural analysis. Prepared complex was tested in vitro on cancer cells, L929 mouse fibrosarcoma, human U251 glioma, and mouse melanoma B16. In the second part оf this PhD thesis, the synthesis of chromium(III) and cobalt(III)- complex еs is described. Firstly, the synthesis of s-cis-[Cr(S,S -eddv)L]--complexes (S,S-eddv = (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)butanoate ion, L = oxalato or malonato ion is described. The complexes are purified by ion exchange chromatography. The geometry of the complex is proposed on the basis of infrared and elektronic absorption spectra, and the absolute configuration sof the complexes are predicted based on their circular-dichroiism spectra. Also, the antimicrobial activity of the synthesized complexes against 28 species of microorganisms was investigated. The octahedral cobalt(III) complexes with (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propionic (S,S-eddp) and (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)butanoic (S,S-eddv) acids and oxalato and malonato ligands, as additional bidentate ligands, were prepared and characterized. The complexes were purified by ion-exchange chromatography. The geometry of the complexes has been supposed on the basis of the infrared, electronic absorption and Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 4 NMR spectra. The absolute configurations of the isolated complexes have been predicted on the basis of their circular dichroism (CD) spectra. Antimicrobial activity of ligand and cobalt(III)-complexes was evaluated in relation to 13 species of microorganisms (five strains of pathogenic bacteria, five species pathogenic fungi and three species of probiotic). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 5 У В О Д Комплекси прелазних метала са тетрадентатним лигандима едда-типа (едда = анјон етилендиамин-N,N'-дисирћетне киселине) и њихових деривата предмет су изучавања многих истраживача већ дуги низ годинa, пре свега ради изучавања спектралних особина награђених комплекса. Најзначајнији радови у овој области координационе хемије посвећени су изучавању фактора који утичу на оптичке карактеристике хиралних комплекса са овим типом лиганада. Многобројни научни радови посвећени овом типу комплексних једињења сумарно су приказани у неколико прегледних радова, што само по себи говори о интересу истраживача за ово научно поље. Шездесетих година прошлог века испитивина је и медицинска примена лиганада овог типа у циљу елиминације јона тешких метала приликом оралног тровања једињењима наведених метала. Иако се ови лиганди, пре свега сам едда као и едта (едта = анјон етилендиамин-тетрасирћетне киселине) чији је едда лиганд фрагмент, примењују у медицини у наведену сврху ипак имају ограничену примену с обзиром да обављају неселективну елиминацију јона метала. Поред елиминације јона метала из организма који су изазвали тровање, излучују се и јони метала који су неопходни за нормално функционисање организма. Појачан интерес за комплексе пралазних метала са лигандима овог типа и њиховим дериватима јавио се у прошлој деценији када је утврђено да ова једињења имају хидролитичко дејство на молекуле нуклеинских киселина и већу антитуморску активност, а мање нежељене ефекте, односно токсичност на поједине органе, у односу на цисплатину која се примењује у медицини као цитостатик, као и значајну антимикробну активност. Значај резултата ове Дисертације огледаће се у резултатима који треба да допринесу бољем разумевању хемије неких прелазних метала са лигандима наведеног типа а посебно треба да буду актуелни резултати испитивања антибактеријске и антифугалне активности синтетисаних комплекса и лиганада. Сами резултати могу указати и на евентуалну примену ових комплекса као антимикробних реагенаса. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 6 Досадашња истраживања комплекса пралазних метала са лигандима у већини случајева имају већу антитуморску активност, а мање нежељене ефекте, односно токсичност на поједине органе, у односу на цисплатину која се примењује у медицини као цитостатик, као и значајну антимикробну активност. Резултати ове Дисертације ће бити део и само логичан наставак започетих истраживања у овој области. Лиганди и комплекси који су предвиђени у задацима ове Дисертације биће синтетисани употребом различитих синтетичких метода. Њихова струтура биће претпоставњена на бази различитих спектроскопских метода (инфрацрвена, нуклеарна магнетна резонанца, УВ-ВИС), а у случају погодних кристала биће потврђена и дифракцијом X-зрака. Састав комплекса и лиганада биће одређен елементалном микроанализом. Антимикробна активност синтетисаних лиганада и комплекса биће одређивана верификованим методама и употребом стандардизованих бактеријских и гљивичних линија. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 7 1. О П Ш Т И Д Е О 1.1. СТРУКТУРА ОКТАЕДАРСКИХ M(III)-КОМПЛЕКСА КОЈИ САДРЖЕ КВАДРИДЕНТАТНЕ ЛИГАНДЕ EDDA-ТИПА 1.1.1. СТЕРЕОХЕМИЈА КОМПЛЕКСА Анјон етилендиамин-N,N′-дисирћетне киселине (edda) поседује два донорска аминска азота и два донорска кисеоника карбоксилних група и у случају потпуног координовања фунгира као квадридентатни лиганд. Овај лиганд практично представља фрагмент хексадентатног етилендиамин-тетраацетато (edta) лиганда (Слика 1), па се њихови октаедарски M(III)-комплекси, посебно N2O4 типа, директно повезују. - H2COOC OOC H2C- N CH2 CH2 N CH2 COO- CH2 COO- edta OOC H2C- N CH2 CH2 N CH2 COO- edda H H Слика 1. Структура етилендиамин-тетраацетато (edta) и етилендиамин-N,N′- -диацетато (edda) лиганда Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 8 Остали лиганди edda-типа (Табела 1) представљају N- или C-супституисане деривате edda лиганда или хомологе овог лиганда који садрже продужене ланце (диамински у случају триметилен-диамин-N,N′-диацетато (tmdda) и карбоксилатне у случају етилендиамин-N,N′-ди-3-пропионато (eddp) лиганда). 1.1.1.1. ГЕОМЕТРИЈСКА ИЗОМЕРИЈА При координовању са централним јоном метала edda лиганд формира три хелатна прстена и то један диамински (петочлани) и два глицинска (такође петочлани) прстена. За октаедарске комплексе опште формуле [M(edda-tip)(L)]n (M = Co(III) или Cr(III); L = два монодентатна или један бидентатни лиганд) се очекује геометријска изомерија приказана на слици 2. У случају октаедарских ди(монодентатних) M(III)-комплекса овог типа могу се теоријски очекивати три геометријска изомера: s-cis (I), uns-cis (uns-cis1 или uns-cis2) (II) и trans (III) (Слика 2а). За одговарајуће бидентатне M(III)-комплексе (L = симетрични бидентатни лиганд) очекују се два геометријска изомера: s-cis (IV) и uns-cis (V) (Слика 2b). Ова изомерија се нешто проширује за случај L = несиметрични бидентатни лиганд, када се теоријски могу очекивати три геометријска изомера: s-cis (VI), uns-cis1 (VII) и uns-cis2 (VIII) (Слика 2c). Означавања геометријских изомера приказаних на слици 2 су у скаду са номенклатуром која је предложена за овај систем [1]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 9 Табела 1. Квадридентатни лиганди edda-типа ЛИГАНД СКРАЋЕНIЦА етилендиамин-N,N′-диацетат edda (- OOCCH2)NHCH2CH2NH(CH2COO –) N,N′-диметил-етилендиамин-N,N′-диацетат dmedda (- OOCCH2)N(CH3)CH2CH2(CH3)N(CH2COO –) N,N′-диетил-етилендиамин-N,N′-диацетат deedda (- OOCCH2)N(C2H5)CH2CH2(C2H5)N(CH2COO –) N,N′-дибензил-етилендиамин-N,N′-диацетат dbedda (- OOCCH2)N(C6H5CH2)CH2CH2(C6H5CH2)N(CH2COO –) 1-стилбен-диамин-N,N′-диацетат 1-sdda (- OOCCH2)NHCH(C6H5)CH(C6H5)NH(CH2COO –) етилендиамин-N,N′-ди-S-α-пропинат SS-eddp -OOC(CH3)CHNHCH2CH2NHCH(CH3)COO – 1,3-пропан-диамин-N,N′-диацетат 1,3-pdda (- OOCCH2)NHCH2CH2CH2NH(CH2COO –) етилендиамин-N,N′-ди-3-пропинат eddp (- OOCCH2CH2)NHCH2CH2NH(CH2CH2COO –) Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 10 (a) (c) (Y) (Y) (Y)X X(Y) X s-cis uns-cis trans N N X X O O N N O X O N N O O I II III (uns1-cis) ili (uns2-cis) s-cis uns-cis O N N X X O N N O X O X IV V (b) s-cis uns1-cis uns2-cis Y X N N Y X O O N N O X O N N O Y O VI VII VIII Слика 2. Могући геометријски изомери октаедарских edda-М(III)-комплекса који садрже као додатне лиганде: (а) два монодентата, (b) симетрични бидентат и (c) несиметрични бидентат Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 11 N N X X O O s-cis N N X O O X uns-cis O O O O Ha Hb Ha Ha Ha Hb Hb Hb Hb HH H H H H HH N N O O O O O O Ha Ha Hb Hb H H H H O Hb Ha OHa G G G RR R R R EE Ea) b) Слика 3. Ознаке хелатних прстенова у комплексима Co(III) који садрже: (а) edta и (b) edda лиганд Weakliem и Hoard [2] су први увели номенклатуру помоћу које су означили хелатне прстенове у хексадентатном етилендиамин-тетраацетато-Co(III)-комплексу (Слика 3а). Иста номенклатура је касније употребљена и за означавање хелатних прстенова у октаедарским edda-M(III)-комплексима (Слика 3b). С обзиром на ову номенклатуру, етилендиамински прстен означен је као E прстен. Два глицинска прстена, која леже у октаедарској равни са диаминским прстеном, означени су као G прстенови, за разлику од друга два глицинска прстена која леже ван октаедарске равни (R прстенови) (Слика 3а). Rезултати рентгенске структурне анализе за хексадентатне комплексе Co(III) [2,3] су показали да су G глицински прстенови ових система под Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 12 нешто већим напоном од R глицинских прстенова. Исто тако, структурни подаци за uns-cis-[Co(edda)(R-pn)]+ јон [4] указују да edda лиганд при свом координовању формира глицинске прстенове различитог напона (G глицинске прстенове са нешто израженијим напоном у односу на одговарајуће R прстенове). Ово је омогућило да се у октаедарским edda комплексима и структурно сличним системима може на тој основи испитивати геометријска изомерија. Edda-Co(III)-комплекси [4-19] су изоловани у облику оба геометријска изомера, s-cis и uns-cis. При томе је показано да је s-cis геометрија ових комплекса фаворизована у највећем броју синтетичких реакција, било у комплексима Co(III) [10,18], било у комплексима Cr(III) [20,21]. С обзиром на ове резултате претпостављено је да је више изражен напон G прстенова [4] у комплемсима uns-cis конфигурације представља одлучујући фактор у дистрибуцији геометријских изомера edda лиганда. Поред тога, на бази разматрања модела молекула, Legg и сарадници [6,7] су показили да је фаворизовање s-cis конфигурације edda лиганда базирано на чињеници да су стерне интеракције између координованих додатних лиганада и edda лиганда знатно израженије у случају uns-cis конфигурације што се посебно манифестује на примерима аминских комплекса. Код комплекса edda-типа, који као додатне лиганде садрже диаква, дихлоро, карбонато, оксалато или малонато лиганде [5,9-11,19], изолована су (с обзиром на одсуство стерних интеракција) оба (s-cis и uns-cis) геометријска изомера ових комплекса. Изомери s-cis и uns-cis геомертије диаква-edda-Co(III)-комплекса су одвојени техником јоноизмењивачке хроматографије [19]. При томе је утврђено да се uns-cis изомер овог комлекса релативно лако изомеризује у више стабилан s-cis изомер. Ова изомеризација, како су показала кинетичка испитивања [22], зависи од температуре области и pH вредности воденог раствора. Исто тако, кинетичке студије s-cis-диаква- edda-Co(III)-комплекса у присуству оксалато лиганда указују да мање кисели водени раствори фаворизују uns-cis, а више кисели s-cis изомере оксалато комплекса [23]. 1,3-пропандиамин-N,N′-диацетато (1,3-pdda) и етилендиамин-N,N′-ди-3-пропи- онато (eddp) лиганди (Табела 1) су такође лиганди O-N-N-O типа као и edda лиганд, изузев што оба ова лиганда при свом координовању граде, поред петочланих и шесточлане хелатне прстенове (диамински у случају 1,3-pdda лиганда и карбоксилатне у случају eddp лиганда). Октаедарски комплекси ових хомолога edda лиганда су изоловани само као uns-cis геометријски изомери било у случају Co(III) [24-28] (изузев у случају етилен-диаминског комплекса [26], где је поред фаворизованог uns-cis Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 13 изомера, добивен и s-cis изомер), било у случају Cr(III) [29]. При томе је закључено да конформације шесточланих хелатних прстенова имају пресудну улогу на дистрибуцију геометријских изомера M(III)-комплекса ових лиганада. 1.1.2. НУКЛЕАРНО-МАГНЕТНО-РЕЗОНАНЦИОНИ (NMR) СПЕКТРИ За означавање геометријских изомера октаедарских компленкса Co(III) који садрже лиганде edda-типа успешно су примењени 1H NMR (PMR) [6,7,9,10,19] и 13C NMR [26] спектри. PMR спектри s-cis и uns-cis геометријских изомера интерпретирани су на бази резултата раније добивених за аминополикарбоксилатне Co(III)-комплексе [30], за које је нађено да се константа купловања (J) AB пара може поделити у две категорије: (а) J = 16Hz за глицинске прстенове који леже у октаедарској равни (G прстенови) и (b) J = 18 Hz за глицинске прстенове који леже ван октаедарске равни (R прстенови). Поред тога, на везу између различитог хемијског померања А и Б протона и оријентације координованих глицинских група код аминополикарбоксилних Co(III)- комплекса указано је по први пут од стране Legg-a и сарадника [10]. На бази ових резултата, извршено је разликовање геометријских изомера и означавање PMR спектара већег броја Co(III)-комплекса edda-типа. s-cis изомери edda-Co(III)-комплекса, с обзиром да имају два еквивалентна R глицинска прстена и C2 молекулску симетрију (Слика 2), показују сигнале (AB квартет) само за један AB пар. Одговарајући uns-cis изомери ових комплекса са два нееквивалентна (R и G) глицинска прстена и C1 молекулском симетријом, поседују знатно сложеније PMR спектре с обзиром да се очекују сигнали за два AB пара. На слици 4, примера ради, приказани су PMR спектри за оба, s-cis и uns-cis изомера edda- Co(III)-комплекса који садрже као додатне диаква и малонато (mal) лиганде. У табели 2 дати су подаци за хемијско померање метиленских протона глицинских прстенова s-cis и uns-cis изомера [Co(edda)(L)]n комплекса који садрже различите додатне лиганде (L = 2H2O, CO32-, ox, mal, en) [10,19]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 14 Слика 4. PMR спектри s-cis и uns-cis изомера edda-Co(III)-комплекса који садрже додатне: (а) диаква и (b) малонато лиганде Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 15 Сигнали AB квартета за s-cis изомере (Табела 2) леже на вишем пољу у односу на HOD пик, а одговарајући сигнали симетричних AA′BB′ парова E прстена налазе се на још вишем пољу. PMR спектри [Co(edda)(H2O)2]+ комплекса (Слика 4, Табела 2) представљају типичне спектре s-cis и uns-cis изомере овог комплекса . HA и HB сигнли означени су од стране Legg-а и Cooke-а [6], а исто означавање касније је потврдјено од стране Sudмeier-а и Occupati-а [31]. Константа купловања која износи 18,0 ± 0,5 Hz је типично за метиленске протоне R глицинских прстенова [6,7,9,10]. У случају uns-cis- [Co(edda)(H2O)2]+ комплекса, AB квартет на 4,37, 4,07, 3,44, 3,14 ppм (Слика 4) одговара протонима R прстена, а квартет другог AB пара (3,74, 3,48, 3,40, и 3,14 ppм), на нешто вишем пољу, се приписује протонима G прстена. Константа купловања за протоне G прстена је у складу са очекиваним вредностима (J = 16,0 + 0,5 Hz) за аминополикарбоксилатне Co(III)-комплексе [30]. На основи ових резултата извршена је интерпретација PMR спектара s-cis и uns-cis изомера за остале Co(III)-комплексе који садрже лиганде edda-типа. Нешто простији PMR спектри s-cis изомера у односу на спектре uns-cis изомера ових комплекса у складу су са њиховим одговарајућим молекулским симетријама (вишом C2 за s-cis и нижом C1 за uns-cis изомере). Означавање геометријских изомера [Co(eddа-тип)(L)]n комплекса извршено је и на бази нуклеарно-магнетно-резонанционих спектара угљеника C-13 (13C NMR) [26]. Применом технике селективног декупловања и технике деутеризације извршено је означавање резонанција појединачних угљеникових атома за већи број s-cis и uns-cis геометријских изомера edada и tмdda-Co(III)-комплекса (Слика 5). s-cis изомери edda комплекса (Слика 5) показују две резонанције у метиленској области, од којих једна потиче од два еквивалентна угљеника етилендиаминског (E) леђног прстена. Као што се и очекује за s-cis изомере, добивена је само једна резонанција у карбонилној области. У случају uns-cis изомера edda комплекса са два нееквивалентна (R и G) глицинска прстена, у складу са овом геометријом, добивене су четири резонанције у метиленској области и две очекиване резонанције у карбонилној области. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 16 Табела 2. Хемијско померање (δ) метиленских протона глицинских прстенова s-cis и uns-cis изомера [Co(edda)(L)]n комплекса (L = 2H2O, CO32-, ox, мal, en)а ___________________________________________________________________________ R Прстенови G Прстенови КОМПЛEКС δHA δA-δB δHB δHA δA-δB δHB s-cis-[Co(eddа)(H2O)2]+ 4,07 (0,88) 3,19 uns-cis-[Co(eddа)(H2O)2]+ 4,20 (0,88) 3,32 3,55 (0,22) 3,33 s-cis-[Co(eddа)(CO3)]- 4,18 (0,88) 3,30 uns-cis-[Co(eddа)(CO3)]- 3,93 (0,90) 3,03 3,57 (0,13) 3,44 s-cis-[Co(eddа)(ox)]- 4,28 (0,95) 3,33 uns-cis-[Co(eddа)(ox)]- 3,92 (0,83) 3,09 3,56 s-cis-[Co(eddа)(маl)]- 4,20 (0,95) 3,25 uns-cis-[Co(eddа)(маl)]- 3,99 (0,90) 3,09 3,48 s-cis-[Co(eddа)(en)]+ 4,22 (0,84) 3,38 uns-cis-[Co(eddа)(en)]+ 4,02 (0,87) 3,15 3,71 аВредности су дате у ppм у односу на ТМС, а снимање спектара вршено је у D2O10,19. s-cis изомери 1,3-pdda комплекса (Слика 5) показују три резонанције у метиленској области: једна потиче од два терминална угљеника триметилен- диаминског (E) леђног прстена. Поред тога, s-cis изомери ових комплекса показују, као што се и очекује, само једну резонанцију у карбонилној области. Одговарајући uns-cis изомери tмdda комплекса показују пет резонанција у метиленској области, што је у складу са два нееквивалентна глицинска (R и G) прстена и нижом симетријом ових комплекса. Овим је уједно демонстрирана и могућност примене 13C NMR спектроскопије за испитивање стереохемије октаедарских Co(III)-компlекса који садрже лиганде edda-типа. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 17 Слика 5. 13C НМR спектри геометријских изомера [Co(eddа-тип)(L)]n комплекса Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 18 1.1.3. ИНФРА-ЦРВЕНИ (IR) СПЕКТРИ Анализа ових спектара врши се на два принципијелно различита начина: a) емпиријски, корелацијом положаја карактеристичних вибрација структурних јединица (група) у различитим молекулима b) теоријски, израчунавањем појединих фреквенција нормалних вибрација које одговарају одређеним фреквенцијама дужине везе и валенционих углова посматраног система. Eмпиријско тумачење своди се на чињеницу да се одређене карактеристичне вибрације јављају увек у одређеној области без обзира на природу осталих група у молекулу. Тако на пример, положај апсорпционих трака N-H валенционих вибрација координованих аминских, аминокиселинских и аминополикиселинских лиганада утиче низ фактора. Грађењем везе M-N електронска густина се помера од азота ка јону метала због чега слаби веза N-H. Овим се смањује број фреквенција, а повећава интензитет N-H валенционих вибрација ("ефекат координације") [32,33]. Промена централног јона доводи до промене степена ковалентног карактера везе метал-лиганд и постоји извесна правилност у померању фреквенција карактеристичних вибрација лиганада. Тако се на пример, у случају аминокиселинских и аминополикиселинских М(III)-комплекса, са порастом степена ковалентног крактера везе M-N, валенционе N-H и валенционе симетричне COO- и деформационе NH2 вибрације ка вишим фреквенцијама у односу на положаје одговарајућих трака у спектрима слободних лиганада [34]. Очекује се да cis изомери ниже симетрије показују нешто комплексније IR спектре од trans изомера више симетрије, па се на овим основама заснива могућност разликовања геометријских изомера октаедарских М(III)-комплекса. За испитивање геометријске изомерије аминополикиселинских M(III)-комплекса примењена је, са више или мање успеха, карбоксилатна област. У циљу разликовања координованих од некоординованих карбоксилних група коришћен је критеријум Busch-а и сарадника [34-36]. На основу овог критеријума фреквенције асиметричних валенционих вибрација за протоноване карбоксилне групе би се очекивале у области 1700-1750 cм-1, док се одговарајуће фреквенције координованих карбоксилних група (за петочлане прстенове) налазе у области 1600-1650 cм-1. Поред ове чињенице нађено је да Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 19 се асиметричне валенционе вибрације координованих карбоксилних група петочланих прстенова налазе на нижој енергији [33] од одговарајућих вибрација за координоване шесточлане прстенове [37], што је и потврђено на примерима октаедарских М(III)- комплекса који садрже хексадентатне аминополикарбоксилатне лиганде са мешовитим (петочланим и шесточланим) карбоксилатним ланцима [38,39]. Карбоксилатна област успешно jе примењена и за разликовање геометријских изомера октаедарских М(III)-комплекса који садрже лиганде edda-типа [11,12,19,20, 28,29]. Изомери s-cis геометрије ових комплекса [11,12,19,20] показују јаку апсорпцију у очекиваној области (на око 1650 cм-1) карактеристичну за валенционе асиметричне вибрације координованих карбоксилних група петочланих прстенова [34]. Само једна трака нађена у овој области очекивана је за изомере C2 молекулске симетрије који поседују два еквивалентна R глицинска прстена. У истој области, uns-cis изомери [М(edda-тип)(L)]n комплекса показују нешто сложеније IR спектре који указују nа присуство две апсорпциоnе траке. Ово је у складу са C1 молекулском симетријом uns-cis изомера и чињеницом да ови поседују два нееквивалентна (R и G) глицинска прстена [28,29]. Изомери испитиваних [Co(edda-тип)(L)]n комплекса, који поседују додатне оксалато лиганде, показују очекивану апсорпцију на око 1720 cм-1 сагласно потпуној координацији оксалато лиганда [40], с обзиром да се одговарајућа фреквенција за оксалато монодентат налази на 1757 cм-1 [41]. 1.1.4. ЕЛЕКТРОНСКИ АПСОРПЦИОНИ СПЕКТРИ Електронски апсорпциони спектри у видљивој и блиској ултра-љубичастој области најчешће су примењивани за разликовање геометријских изомера октаедарских М(III)-комплекса који садрже лиганде edda-типа. Ови комплекси припадају углавном [M(N)4(O)2], [M(N)3(O)3] или [M(N)2(O)4]-типу комплекса и највећи део ових комплекса односи се на комплексе Co(III). [Co(N)4(O)2]-тип комплекса садржи, поред edda-типа лиганда, као додатне, аминске лиганде (два монодентата или један бидентат), од којих су од посебног значаја комплекси који садрже: 2NH3 [6,12], en [6,7,12,18] i R-pn [18] лиганде (еn = етилендиамин, R-pn = R-1,2-пропан-диамин). Комплекси [Co(N)3(O)3]-типа [12,18,27] су мање испитивани. У случају комплекса [M(N)2(O)4]-типа посебно су студирани: диаква [5,11,19,20], карбонато [9,19,25,28], оксалато и малонато [9-11,19,20,25,28] комплекси. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 20 У случају октаедарских комплекса [Co(N)4(O)2]-типа, s-cis изомери припадају trans(O)-[Co(N)4(O)2]-типу, а uns-cis изомери cis(O)-[Co(N)4(O)2]-типу комплекса. Теоријски је предвиђено [42], а и експериментално утврђено да trans(O) изомери поменутог типа комплекса показују разлагање прве апсорпционе траке док су одговарајуће траке cis(O) изомера готово симетричне и јачег интензитета. На слици 6 (Табела 3) приказани су електронски апсорпциони спектри s-cis и uns-cis изомера аминских edda-Co(III)-комплекса. Tabela 3. Нумерички подаци за електронске апсорпционе спектре аминских edda-Co(III)-комплекса Комплекс Трака Ia ν (cm-1) ε Трака Ib ν (cm-1) ε Трака II ν (cm-1) ε Dt' (cm-1) Dq (ac.) s-cis-[Co(edda)(NH3)2]+ 1866 92,6 2169 pa 2747 118 301 1993 uns-cis-[Co(edda)(NH3)2]+ 2000 153,2 2793 159 s-cis-[ Co(edda)(en)]+ 1890 87,3 2232 p 2762 113 287 2027 uns-cis-[ Co(edda)(en)]+] 1805 p 2020 16 9 2778 168 276 2047 pa - превој Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 21 Слика 6. Електронски апсорпциони спектри s-cis и uns-cis изомера аминских edda-Co(III)-комплекса Ballhausen и сарадници [43,44] и Yaмatera [45] су теоријски предвидели померање и разлагање апсорпционих трака за [Co(N)4(O)2]-тип комплекса, као што је приказано на слици 7. Са приказане схеме (Слика 7) се јасно види да се за комплексе овог типа тетрагоналног лигандног поља очекује разлагање прве и друге апсорпционе траке знатно лакше за trans(O) (s-cis изомери) него за cis(O) изомере (uns-cis изомери). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 22 IaIa IIb IIb 1A1 1A11A1 1A1 1A2 1E 1E 1B2 16B 10Dq-C δ1 12δ1δ 2δ3δ2-δ3 2δ3δ2-δ32( ) 1T1 1T2 1A2 1B2, 1B2 1A2, 1B1 Тетрагонално Кубно Тетрагонално (uns-cis) (s-cis) Слика 7. Схема очекиваних померања и разлагања апсорпционих трака тетрагоналних Co(III)-комплекса Ова предвиђања су у сагласности и са спектрима добивеним за аминске комплексе овога типа (Слика 6) [6]. Као што се види траке Ia s-cis изомера леже на нижој енергији, а траке Ib истих изомера су нижег интензитета (превој) и леже на вишој енергији. У случају uns-cis изомера ових комплекса траке Ib су нешто шире и већег интензитета, што се и очекује на бази теорије кристалног поља [46]. Оба изомера ових комплекса са етилендиамином имају прве апсорпционе максимуме на вишој енергији у односу на одговарајуће изомере [Co(edda)(NH3)2]+ комплекса, што је последица хелатног ефекта додатног (еn) лиганда. Ради тумачења ових спектара Wentworth и Piper [47] су дали израз за израчунавање Dt′ параметра (Dt′ = апроксимативни параметар Dt) према једначини: Dt′ = 4/35 · [(10Dq – C) - W] где W представља еnергију интензивног пика траке I у комплексима trans(O)- [Co(N)4(O)2]-типа.Сличне формуле су предвиђене од стране Yaмatere [45] и за cis(O)- [Co(N)4(O)2]-тип комплекса у којима вредност 8/35 замењује вредност 4/35. Wentworth и Piper [47] су показали да је C вредност у датом изразу приближно константна за већи број Cо(III)-комплекса и да се ова вредност, која приближно износи 3800 cм-1, може користити у рачунању преко израза 10Dq – C и за комплексе другог типа. Вредности Dq′ изражене су преко Dq вредности амина и ацетата, користећи следећи израз: Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 23 Dt′ = 4/7 (Dq(амиn) – Dq(аcet.)) Полазећи од познате вредности Dq(aмin) за [Co(en)3]3+-јон израчунато је да вредност Dq(acet.) износи 2000 cм-1 што је у складу са надјеним вредностима од стране Piper-а и Carlina-а [48] за [Co(ox)3]3-јон. Електронски апсорпциони спектри аминских 1,3-pdda-Co(III)-комплекса су интерпретирани употребом D4h модела [24,26] при чему је показано да tмdda лиганд у комплексима [Co(N)4(O)2]-типа фаворизује uns-cis геометрију. Апсорпциони максимуми uns-cis комплекса 1,3-pdda лиганда леже у очекиваној области и показују знатно нижу моларну апсорптивност у односу на одговарајуће uns-cis изомере edda лиганда. Као што је предпостављено [24,25] нижа моларна апсорптивност ових комплекса условљена је крутом конформацијом шесточланог триметилен-диаминског ледјног прстена. Мешовити аминокиселински комплекси опште формуле [Co(edda-tip)(aм)] (aм = аминокиселина) су релативно мало испитивани [18,27]. Изомери s-cis геометрије [Co(N)3(O)3]-типа комплекса егзистирају у меридионалном облику, као и uns1-cis изомер (Слика 2ц) и њихово разликовање се не може вршити на бази електронске апсорпционе спектроскопије. Меdjутим, uns2-cis изомери (фацијални изомери) поседују кубну симетрију лигандног поља за разлику од ромбичне симетрије лигандног поља uns1-cis изомера, па је разликовање ових геометријских изомера извршено на бази њихових електронских апсорпционих спектара. Очекује се да ово опадање симетрије лигандног поља (од кубне ка ромбичној) буде довољан разлог за разлагање прве апсорпционе траке, као што је то и експериментално показано на комплексима овог типа [18,27]. Изомери [M(edda-tip)(L)]n комплекса (L = диаква, хидроксо, CO32-, ox или мal) припадају [M(N)2(O)4]-типу комплекса. Електронски апсорпциони спектри N2O4-типа комплекса Co(III) [5,9-11,19,28] и Cr(III) [20,21,29] нису имали већи значај за разликовање s-cis и uns-cis геометријских изомера, с обзиром да поседују готово симетричне обе апсорпционе траке и да се не уочава тенденција разлагања првих апсорпционих трака ових комплекса. Из тих разлога електронски апсорпциони спектри комплекса [M(N)2(O)4]-типа су углавном интерпретирани применом псеудооктаедарске (Oh) симетрије. Међутим, како s-cis изомери овог типа комплекса поседују вишу (C2) молекулску симетрију од uns-cis изомера (C1 молекулске симетрије са максимално несиметричним пољем око M(III) јона) то се очекује да ће апсорпционе траке s-cis Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 24 изомера бити нижег интензитета од одговарајућих трака uns-cis изомера, као што је и експериментално нађено [9-11,19,20,28,29]. Поред тога, нађено је да прве апсорпционе траке s-cis изомера [M(N)2(O)4]-типа комплекса edda-типа лиганда леже на нижој енергији од одговарајућих трака uns-cis изомера било у случају комплекса Co(III) [9,10,19] било Cr(III) [20,29]. Апсорпциони максимуми uns-cis изомера 1,3-pdda-Co(III)-комплекса [25] леже у очекиваној области и показују нешто ниже моларне апсорптивности у односу на одговарајуће вредности uns-cis изомера edda-Co(III)-комплекса [10,19], што је у складу са слабијим лигандним пољем и крутом конформацијом леђног лиганда триметил- диаминског прстена 1,3-pdda лиганда. Поред поменутих Cr(III)-комплекса који садрже лиганде edda-типа описан је већи број комплекса који садрже различите лиганде, а такође припадају N2O4-типу комплекса. Значајни резултати постигнути су при испитивању комплекса cis(N) и trans(N) конфигурације који садрже ida (ida = иминодиацетатни јон) или N-алкил супституисане деривате овог лиганда [49,50]. У свим комплексима Cr(III) поменуте хромофоре, прве апсорпционе траке спински дозвољених 4A2g→ 4T2g електронских прелаза у октаедарском пољу су готово симетричне и интензивније од друге апсорпционе траке 4A2g→ 4T1g електронског прелаза. За [Cr(ida)2]- "модел" комплекс теоријски се очекују три геометријска изомера: cis(N), trans(N) (фацијални) и trans(N) (меридионални) (Слика 8). O O N N Cr O O N O N O Cr O O N O N O Cr O O cis(N) trаns(N) (фацијални) trаns(N) (меридионални) Слика 8. Могући геометријски изомери [Cr(ida)2]--комплекса Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 25 Изомери ових комплекса поседују тетрагонално поље. Међутим, trans(N) изомери [Cr(ida)2]- комплекса имају D4h, а одговарајући cis(N) изомери C2v молекулску симетрију. Испитивања су показала да N-алкил деривати овог лиганда фаворизују грађење trans(N) изомера [50] док [Cr(ida)2]- комплекс има cis(N) конфигурацију [50]. На следећој слици (Слика 9) приказана је схема енергетских нивоа [Cr(N)2(O)4]-типа комплекса добивена на бази теорије лигандног поља или модела ангуларног преклапања [51]. Као што се види, разлагање првог спински дозвољеног нивоа је веће за trans(N) него за cis(N) изомере ових комплекса. С друге стране, компоненте већег интензитета прве апсорпционе траке биће лоциране на стани краћих таласних дужина (с обзиром на њену дегенерацију), док ће друге компоненте мањег интензитета остати на позицијама октаедарске хромофоре [Cr(O)6] што се добро слаже са одговарајућим прелазом (1759 cм-1) код [Cr(ox)3]3- [52]. Изомери ових комплекса cis(N) геометрије поседују центар инверзије па ће се прелази електричног дипола по Laporte-у бити забрањени. Из тих разлога траке trans(N) изомера биће нижег интензитета од одговарајућих трака cis(N) изомера. Разлагање 4T2g нивоа у лигандном пољу D4h симетрије је дато у функцији параметра Dt: E(Eg) – E(B2g) = 35/4 Dt Ако се узму у разматрање дијагонални елементи [53,54] Dt параметар се може изразити и преко Dq параметра октаедарског поља: Dt = - 4/7 (DqO - DqN) у ком случају ово разлагање зависи од параметара DqO и DqN. На основу овог израза нађено је да параметар DqN износи у алкил-ida-Cr(III)-комплексима 2280–2500 cм-1. Одговарајући DqN параметар у [Cr(en)3]3+ комплексу износи 2190 cм-1 52. За cis(N) изомере овог типа комплекса Dt износи +2/7, из чега се закључује да је разлагање 4T2g нивоа мање за фактор два у односу на одговарајуће trans(N) изомере, полазећи од претпоставке да посматрани комплекси поседују исте дужине веза метал-лиганд. С обзиром на ове податке, разлагање cis(N)-ida-Cr(III)-комплекса се не очекује (Слика 9) под нормалним експерименталним условима [50]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 26 Δ1 Δ2 4Eg 4B2g 4A1 4A2, 4B2 4A2g 4B1g 4B1 4T2g 10 Dqo CrO6 trаns-CrN2O4 cis-CrN2O4 Oh D4h C2v Слика 9. Схема разлагања терма најнижих спински дозвољених прелаза за различите симетрије ( Δ1 = 5(DqN – DqO), Δ2 = -Δ1/2) 1.1.5. ОПТИЧКА АКТИВНОСТ И АПСОЛУТНЕ КОНФИГУРАЦИЈЕ КОМПЛЕКСА Оптичка активност s-cis и uns-cis изомера [Co(edda-tipa)(L)]n комплекса такође је интензивно испитивана [7-9,14-17,24,25,27,55,56]. Два структурна фактора, за које се сматра да имају доминантне ефекте на релативне интензитете CD компонената ових система, су: (a) "конфигурациони ефекат" условљен распоредом хелатних прстенова око централног јона и (b) "вицинални ефекат" који потиче од асиметричних азотових атома координованих лиганада edda-типа Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 27 Геометријски s-cis изомери edda комплекса поседују три пара хелатних прстенова истог хиралитета [57,58]. За s-cis изомере ових комплекса приказане на слици 10 (изомер I) ови парови хелатних прстенова се означавају као ΛΛΛ [57] (нето Λ) [58]. У случају uns-cis комплекса, изомери се означавају са четири пара хелатних прстенова од којих су три пара истог хиралитета, а четврти пар супротног хиралитета. За оптичке изомере приказане на слици 10 (изомери II и III) ови парови хелатних прстенова се означавају као ΛΛΛΔ [57] (нето Λ) [58]. Према томе, uns-cis изомери edda комплекса имају мањи нето хиралитет (два пара хелатних прстенова истог хиралитета) од нето хиралитета s-cis изомера (три пара хелатних прстенова истог хиралитета) па се може очекивати и мањи конфигурациони допринос ротационој моћи uns-cis изомера у односу на s-cis изомере ових комплекса као што је то и експериментално нађено [17] . N N O O 2 1 H N N O 2 1 H N N O I II III Λ-SS-s-cis Λ-RS-uns-cis Λ-RR-uns-cis Слика 10. Λ-изомери s-cis и uns-cis-[Co(edda)(L)]n комплекса (L = бидентатни лиганд) Знак вициналног доприноса за CD компоненте најниже енергије је позитиван у случају SS конфигурације азотових атома (Λ-SS-s-cis изомери) а негативан у случају RR конфигурације азотових атома (Λ-RR-uns-cis изомери) (Слика 10). "Ангуларни" азот uns-cis комплекса (атом N2) је у стереохемијском смислу исти са N атомима s-cis комплекса и њихов хиралитет је условљен датим распоредом хелатних прстенова. "Планарни" азот uns-cis комплекса (N1) се разликује од азота N2 по томе што у истој равни са азотовим атомима поседује ацетатну групу. Ипак, имајући у виду да је непосредна стереохемијска околина N1 азота слична околини N2 азота, постоји могућност да се знак вициналног ефекта и не мења. С обзиром на то, супротно азоту N2, азот N1 се може означити било са R било са S конфигурацијом. У том случају очекују се два геометријски различита uns-cis изомера за исту (Λ) апсолутну конфигурацију edda Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 28 комплекса (Слика 10, изомери II и III). Полазећи од претпоставке да uns-cis изомери имају сличан вицинални ефекат као и s-cis изомери, доминантни CD пик uns-cis изомера би у случају RR конфигурације азотових атома био мањег интензитета (негативан вицинални, позитиван конфигурациони ефекат) од истог CD пика uns-cis изомера RS конфигурације азотових атома у ком случају би се вицинални ефекат практично поништавао. Међутим, uns-cis изомери (било RR или RS конфигурације азотових атома), с обзиром на хиралне доприносе (конфигурациони и вицинални) ротационој моћи треба да показују доминантне CD траке нижег интензитета у односу на одговарајуће CD траке s-cis изомера исте апсолутне конфигурације, што је и нађено [17]. CD спектри s-cis-[Co(edda)(L)]n комплекса су практично неосетљиви на природу додатних лиганада L (L = аминокиселина, ам [7], CO32-, оx, мal [9], 2NH3, en, tn [15]). Примера ради, такви спектри приказани су на слици 11 а за случај различитих аминских edda-Co(III) комплекса [15]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 29 Слика 11. CD спектри Λ-s-cis изомера: (а) [Co(edda)(L)]+ комплекса (L = 2NH3, en, tn) (b) [Co(edda)(en)]+ и одговарајућих комплекса edda лиганда (dмedda и deedda) Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 30 Високи CD интензитети s-cis edda комплекса су условљени крутом конформацијом леђног прстена edda лиганада и израженим вициналним доприносом асиметричних азотових атома. Када је бидентатни додатни лиганд L остао непромењен (L = en) а у синтези употребљени N-супституисани деривати edda лиганда (N,N'-диетил- етилендиамин-N,N'-диацетат, dmedda, и N,N'-диетил-етилендиамин-N,N'-диацетат, deedda) показано је да интензитети доминантних CD трака опадају са порастом величине N-супституената [14] (Слика 11b). Овим је уједно и демонстриран значајан вицинални допринос асиметричних N атома у комплексима Co(III) s-cis конфигурације. Велики бензил супституенти на N атомима edda лиганда (dbedda лиганд) (dbedda = N,N'-дибензил-етилендиамин-N,N'- диацетато јон) доводе до значајних измена у интензитетима CD трака у односу на N-метил супституенте (Слика 12а) и вицинални доприноси -CH2C6H5 и –H супституената утичу на измену знакова CD компонената у области I апсорпционе траке (Слика 12b) [16]. У циљу испитивања вициналног доприноса асиметричних угљеникових атома 1-стилбен-диамина [56]. награђен је s-cis-[Co(edda)(1-stien)]+ (1-stien = 1-стилбен- диамин). Додатни 1-stien лиганд има SS конфигурацију [59] и у датом комплексу координује се стереоспецифично градећи фаворизовани изомер са доминантним CD пиком негативног знака у приносу од око 70% (Слика 13а). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 31 Слика 12. (а) CD спектри Λ-s-cis-[Co(edda)(en)]+ и одговарајућих комплекса деривата edda лиганда (dмeddа и dbedda) и (b) разлика CD спектара: Δε[Co(eddа)(en)]+ - Δε[Co(dмeddа)(en)]+ Δε[Co(dbeddа)(en)]+ - Δε[Co(dмeddа)(en)]+ Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 32 . Слика 13. CD спектри оптичких изомера: (а) Λ,Δ-s-cis-[Co(edda)(1-stien)]+ и (b) Δ-s-cis-[Co(1-sdda)(en)]+ комплекса Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 33 Овај изомер означен је као Δ изомер у складу са закључцима добивеним на бази поређења CD спектара и разматрања стерних интеракција у моделу молекула фаворизоване конфигурације [56]. Доприноси SS-стилбен-диамина CD кривој Δ-s-cis- [Co(edda)(1-stien)]+ комплекса су негативни у видљивој области у којој доминира допринос edda лиганда. Други, s-cis-[Co(1-sdda)(en)]+ комплекс (1-sdda = 1-стилбен- диамин-N,N'-диацетат) поседује леђни 1-стилбен-диамински прстен и сваки од азотових атома овога лиганда има за супституенте: -CH2COO -, -H и –CHC6H5 групе. Специфичност s-cis-[Co(1-sdda)(en)]+ комплекса није изненађујућа с обзиром да фаворизована δ-конформација 1-sdda захтева да се два велика фенил супституента налазе у екваторијалном положају. s-cis-[Co(1-sdda)(en)]+ комплекс (Слика 13b) поседује доминантан CD пик позитивног знака и у поређењу са CD спектром (+)-s- -cis-[Co(1-sdda)(en)]+ комплекса требало би да му се припише Λ-конфигурација. Међутим, Λ-s-cis конфигурација овог комплекса би захтевала да леђни 1-стилбел- диамински прстен има λ-конформацију која доводи велике супституенте у нефаворизовани аксијални положај. Фаворизована δ-конформација диаминског прстена са екваторијалним положајем великих супституената је очекивана само за s-cis-[Co(1- sdda)(en)]+ комплекс Δ-апсолутне конфигурације са врло израженим позитивним доприносом асиметричних N атома ротационој моћи за Е прелаз. Супституенти на азотовим атомима s-cis-[Co(1-sdda)(en)]+ комплекса су много више међусобно различити у случају одговарајућих супституената edda, dмedda, deedda или dbedda комплекса што условљава да су вицинални доприноси у поменутом комплексу значајно велики. Апсолутне конфигурације N атома су (RR) за случај s-cis изомера Δ-[Co(edda)(en)]+ комплекса а (SS) за комплексе Δ-[Co(dbedda)(en)]+ и Δ-[Co(1- sdda)(en)]+. Разлика у конфигурацији азотових атома за поменуте комплексе исте апсолутне конфигурације резултира из измене приоритета супституената на азотовом атому. Пара супституисани аналози dbedda лиганда етилен-диаминског комплекса (пара метил, хлоро и нитро деривати) [56] не утичу на положај CD максимума Е компонената (ниже енергије), а незнатно утичу на промене у интензитету CD спектара. CD спектри tмdda комплекса Co(III) су такође испитивани [24,25,27]. Овај лиганд, као што је већ поменуто, с обзиром на присуство круте конформације шесточланог диаминског прстена, фаворизује грађење комплекса uns-cis конфигурације. CD спектри uns-cis-[Co(tмdda)(L)]+ комплекса [24] (L = 2NH3, en или tn) (Слика 14а) су интерпретирани у складу са D4h моделом. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 34 Слика 14. CD спектри Λ-uns-cis-[Co(tмdda)(L)]n комплекса: (а) L = 2NH3, en, tn (b) L = CO32-, ox, мal За комплексе L = 2NH3 или tn уочене су две добро разложене CD компоненте у области прве апсорпционе траке. Ова два CD пика (-,+) су означена као компонента А2 (ниже енергије) и Е (више енергије) које су у обрнутом распореду у односу на одговарајуће компоненте s-cis-[Co(edda)(aмin)]+ комплекса [7]. А2 компонента ових комплекса се редукује идући од L = 2NH3 ка L = tn да би исчезла код етилен- Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 35 диаминског комплекса (Слика 14а). Нето ротациона моћ комплекса опада датим редом: en > tn > 2NH3. Комплекси uns-cis-[Co(tмdda)(L)]- (L = CO32-, ox, мal) су такође у складу са D4h моделом, а супротно аминским комплексима A2 (D4h) компонента је више енергије од компоненте E (D4h) (ниже енергије). CD спектар малонато комплекса (Слика 14b) показује три CD траке у области ниже енергије указујући на нижу симетрију овог молекула. У истој области, одговарајући карбонато и оксалато комплекси поседују само једну CD траку. Доминантне CD траке ових комплекса (или укупне ротационе моћи) опадају датим редом: CO32- > ox > мal са повећањем величине дикарбоксилатног прстена. Најзад, комплекси опште формуле uns-cis-[Co(1,3-pdda)(S-aм)] (S-aм = S-alanin (S-ala), S-valin (S-val), S-prolin (S-pro), S-H-asparaginat (S-aspH) ili S-H-glutaмat (S-gluH)) су такође испитивани у светлости њихове оптичке активности [27]. uns-cis изомери ових комплекса су добивени из H[Co(1,3-pdda)Cl2]+·1/2H2O комплекса дејством S-амино-киселина при pH ≈ 8, а њихово одвајање извршено је хроматографски: pH = 8 (65ºC) H[Co(1,3-pddа)Cl2]+· 1/2 H2O + вишак S-ам + NаOH активnи угаљ хроматографско Δ, Λ-uns-cis-мer [Co(1,3-pddа)(S-ам)] + одвајање Δ, Λ-uns-cis-fаc На тај начин изоловано је четрнаест изомера: Δ,Λ-uns-cis-мer у случају S-аланина, S-валина, S-пролина; Δ,Λ-uns-cis-fac у случају S-аспарагинске и S-глутаминске киселине. С обзиром на изражену стереоселективност, у реакцијама су доминирали uns- cis-мer изомери. Конфигурациони ефекат ових система је одвојен од C-вициналног ефекта додатних лиганда и CD спектри су дискутовани у складу са конфигурацијом добивених изомера. Спектрална означавања изомера [Co(edda-типа)(L)]n комплекса извршена су применом ефективне тетрагоналне симетрије, а њихове апсолутне конфигурације изведене су углавном употребом C2 (или D4h) молекулске симетрије. Полазећи од претпоставке да су конфигурациони ефекти ових комплекса доминантни, означавање апсолутних конфигурација извршено је на бази модела предложеног од стране Mason-а и сарадника [60]. Овим моделом врши се повезивање CD спектара cis-CoA4B2 хелата са Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 36 CD спектром [Co(en)3]3+ комплекса познате апсолутне конфигурације [61]. Применом ове методе [Co(edda-типа)(L)]n комплекси, који поседују доминантан CD пик позитивног знака означени су са ΛΛΛ (у случају s-cis) односно ΛΛΛΔ (у случају uns- cis) изомера ових комплекса [57] (нето Λ) [58]. Означавање edda и 1,3-pdda комплекса на бази корелација CD спектара [60] су такође потвђена означавањем апсолутне конфигурације Δ-s-cis[Co(S,S-eddp)(en)]+ комплекса (позитивног доминантног CD пика) (SS-eddp = анјон етилендиамин-N,N'-ди-S-α-пропионске киселине) помоћу PMR спектара [55]. Ова истраживања укључују такође и Δ-uns-cis-[Co(SS-eddp)(en)]+ комплекс (негативног доминантног CD пика). Иста означавања изомера [Co(edda- тип)(L)]n комплекса резултирају такође на основу укупног знака ротационе моћи у области T1g (Oh), како је то дато од стране Richardson-a [16,62]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 37 1.2. ЗАДАТАК ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ У оквиру ове докторске дисертације, предвиђени су следећи задаци: „ Синтетисати тетрадентатни лиганд (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-пропионску киселину (H2-S,S-eddp), „ Синтетисати одговарајуће комплексе овог лиганда са јонима хрома(III) и кобалта(III), „ Синтетисати тетрадентатни лиганд (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанску киселину (H2-S,S-eddv), „ Синтетисати неке O,O'-диалкил естре тетрадентатног лиганда (S,S)-етилендиамин-N,N'- ди-2-(4-метил)-пентанске киселине (H2-S,S-eddv), „ Синтетисати одговарајуће паладијум(II) комплексе са O,O'-диалкил естрима H2-S,S-eddv лиганда, „ Састав лиганда и комплекса утврдити на бази резултата елементалне микроанализе. „ Структуру лиганда и награђених комплекса предвидети на бази њихових инфрацрвених, електронских апсорпционих и нуклеарно-магнетних спектара, где год је то могуће. „ Структуру лиганда и награђених комплекса потврдити на бази рентгенске структурне анализе, где год је то могуће. „ Испитати антимикробну активност награђених комплекса метала са наведеним лигандима. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 38 2. E K С П Е Р И М Е Н Т А Л Н И Д Е О 2.1. Синтезе лиганада и комплекса паладијум(II) јона 2.1.1. Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине, H2eddl (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(4-метил)-пентанска киселина је синтатисана према већ раније описаном поступку [64]. У раствор добијен растварањем 10 g (0,25 mol) NaOH у 40 cm3 воде дода се 32,78 g (0,25 mol) S-леуцина. Раствор се рефлуктује за време од три сата уз постепено додавање 23,48 g (0,125 mol) 1,2-дибром-етана и 13,14 g (0,125 molova) Na2CO3. Хлађењем и подешавањем pH вредности на 5 помоћу раствора HCl (1:1) издваја се бели талог (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине који се испере са водом и осуши на ваздуху. Принос 42,5 g (89,63%). Добијена (S,S)-етилендиамин-N,N’- ди-2-(4-метил)-пентанска киселина се прекристалисава растварањем у врелој води уз додатак концентроване HCl (pH > 1) и дужим стајањем на собнојтемператури. Анализа: израчунато за (S,S)-H2eddl·2HCl·H2O = C14H32N2O5Cl2Cl2: C, 44,33; H, 8,50; N, 7,38%. Нађено: C, 44,69; H, 8,10; N, 7,49%. IR (cm-1): 3451, 3083, 2957, 2871, 1579, 1470, 1396, 1063, 798, 673, 540. 1H NMR (200 MHz, D2O, ppm): 0,94 (d, 12H, C6,7H3), 1,65 (m, 4H, C4H2), 1,72 (m, 2H, C5H), 3,18 (m, 4H, C1H2), 3,75 (t, 2H, C2H). 13C NMR (200 MHz, D2O, ppm): 23,79 (C6,7H3), 24,93 (C5H), 27,04 (C4H2), 42,66 (C1H2), 56,29 (C2H), 178,39 (COO-). 2.1.2. Синтезе диалкил естара (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)- пентанске киселине (S,S)-R2eddl (L1-L4) Диалкил естри (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине, добијени су у облику дихидрохлорида: L1: O,O'-диетил-(S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2- (4-метил)-пентаноат, (S,S)-Et2eddl, L2: O,O'-дипропил-(S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4- метил)-пентаноат, (S,S)-Pr2eddl, L3: O,O'-дибутил-(S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4- Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 39 метил)-пентаноат, (S,S)-Bu2eddl и L4: O,O'-дипентил-(S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4- метил)-пентаноат, (S,S)-Pe2eddl, a синтетисани су по доле наведеној општој методи. У балон од 150 cm3 који садржи 50 cm3 одговарајућег апсолутног алкохола (етанол, n-пропанол, n-бутанол, n-пентанол) охлађенoг на 0°C у леденом купатилу лагано се укапава тионил-хлорид (4,0 cm3, 55 mmol) током једног сата. Након тога у балон се дода 2,00 g (5,54 mmol) (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине дихидрохлорида, (S,S)-H2eddl.2HCl, и суспензија се рефлуктује 16 сати на температури кључања одговарајућег алкохола. Смеша се процеди, филтрат остави у фрижидеру неколико дана. Добијени бели производ се процеди, испере одговарајућим алкохолом и осуши на ваздуху. Нумерација атома је дата на слици 15. L1·2HCl·H2O: Принос 1,120 g, 48,78%. Анализа: израчунато за (S,S)- Et2eddl = C18H38N2O4Cl2·H2O: C, 49,65; H, 9,25; N, 6,43%. Нађено: C, 49,73; H, 8,79; N, 6,44%. IR (cm–1): 3457, 2975, 2719, 2622, 2527, 2403, 1737, 1546, 1476, 1216, 1066, 1015, 803 1H NMR* (200 MHz, D2O, δ ppm ): 0,96 (d, 12H, 3ЈH,H =5,68, C6,7H3), 1,33 (t, 4H, C9H3), 1,79 (m, 4H, C4H2), 1,92 (m, 2H, C5H), 3,49 (s, 4H, C1H2), 4,17 (m, 2H, C2H), 4,35 (q, 4H, C8H2). 13C NMR* (50 MHz, D2O, δ ppm): 16,1 (C9H3), 23,7 и 24,9 (C6,7H3), 27,1 (C5H), 41,2 (C4H2), 45,3 (C1H2), 62,2 (C2H), 66,8 (C8H2), 173,02 (COOR). L2·2HCl·0.5H2O: Принос 0,980 g, 40,90%. Анализа: израчунато за (S,S)-Pr2eddl = C20H42N2O4Cl2·0.5H2O: C, 52,86; H, 9,54; N, 6,16%. Нађено: C, 52,74; H, 9,21; N, 6,36%. IR (cm–1): 3453, 2966, 2721, 2621, 2528, 2407, 1735, 1547, 1472, 1210, 1065, 927, 802. 1H NMR* (200 MHz, D2O, δ ppm ): 0,93 (t, 6H, C10H3), 0,95 (d, 12H, 3ЈH,H =6,10, C6,7H3), 1,60-2,00 (m, 6H, C4H2, C5H), 1,76 (m, 4H, C9H2), 3,51 (s, 4H, C1H2), 4,15 (m, 2H, C2H), 4,25 (t, 4H, 3ЈH,H = 6.48 C8H2). 13C NMR* (50 MHz, D2O, δ ppm): 14,0 (C10H3), 25,1 (C9H2), 25,6 и 28,4 (C6,7H3), 28,7 (C5H), 42,6 (C4H2), 46,6 (C1H2), 63,7 (C2H), 73,6 (C8H2), 174,3 (COOR). L3·2HCl·H2O: Принос 1,020 g, 39,38%. Анализа: израчунато за (S,S)-Bu2eddl = C22H46N2O4Cl2·H2O: C, 53,75; H, 9,84; N, 5,69%. Нађено: C, 53,29; H, 9,48; N, 5,78%. IR (cm–1): 3455, 2963, 2716, 2619, 2526, 2405, 1736, 1546, 1470, 1209, 1062, 925, 803. 1H NMR* (200 MHz, D2O, δ ppm ): 0,91 (t, 16H, C11H3), 0,95 (d, 12H, 3ЈH,H =5,04, C6,7H3), 1,38 (m, 4H, C10H2), 1,60-2,00 (m, 6H, C4H2, C5H), 1,69 (m, 4H, C9H2), 3,47 (s, 4H, C1H2), 4,15 (m, 2H, C2H), 4,30 (t, 4H, C8H2). 13C NMR* (50 MHz, D2O, δ ppm): 15,8 (C11H3), 21,5 (C10H2), 23,7 и 25,0 (C6,7H3), 27,2 (C9H), 32,7 (C5H2), 41,3 (C4H2), 45,4 (C1H2), 62,2 (C2H), 70,4 (C8H2), 173,3 (COOR). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 40 L4·2HCl·H2O: Принос 0,960 g, 35,05%. Анализа: израчунато за (S,S)- Pe2eddl = C24H50N2O4Cl2.H2O: C, 55,47; H, 10,08; N, 5,39%. Нађено: C, 55,32; H, 9,83; N, 5,14%. IR (cm–1): 3452, 2960, 2726, 2623, 2525, 2401, 1736, 1543, 1470, 1211, 1066, 956, 798. 1H NMR* (200 MHz, D2O, δ ppm ): 0,91 (t, 6H, 3ЈH,H = 7,20, C12H3), 0,99 (d, 12H, 3ЈH,H = 5,40, C6,7H3), 1,36 (m, 8H, C10,11H2), 1,60-2,00 (m, 6H, C4H2, C5H), 1,74 (m, 4H, C9H2), 3,53 (s, 4H, C1H2), 4,22 (m, 2H, C2H), 4,32 (t, 4H, C8H2). 13C NMR* (50 MHz, D2O, δ ppm): 16,15 (C12H3), 23,25 (C11H3), 26,94 (C10H2), 30,27 (C9H2), 24,51 (C6,7H3), 24,99 (C5H), 41.,37 (C4H2), 45,40 (C1H2), 62,24 (C2H), 70,62 (C8H2), 173,36 (COOR). Слика 15. Нумерација атома коришћених у означавању сигнала у NMR спектрима 2.1.3. Синтеза комплекса паладијума(II) са диалкил естрима (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине 1-4 Комплекси паладијума(II) са диалкил естрима (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4- метил)-пентанске киселине су добијени мешањем 10 cm3 воденог раствора K2[PdCl4] (0,200 g, 0,610 mmol) и одговарајућих лиганада ((S,S)-Et2eddl·2HCl·H2O: 0,267g, 0,610 mmol; (S,S)-Pr2eddl·2HCl·H2O: 0,277g, 0,61mmol; (S,S)-Bu2eddl·2HCl·H2O: 0,301 g, 0,610 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 41 mmol; (S,S)-Pe2eddl·2HCl·H2O: 0,318g, 0,610mmol). Током мешања oд 2 сата, у реакциону смешу се укапава 10 cm3 воденог раствора LiOH (0,0293 g, 1,220 mmol). Након укапавања добијени су жути талози комплекса, који се процеде, исперу са мало ледене воде и осуше на ваздуху. [PdCl2L1]·0,5H2O (1): Принос 0,260 g, 80,00%. Aнализа: израчунато за [PdCl2{(S,S)-Et2eddl}] = C18H36N2O4Cl2Pd·0,5H2O: C, 40,73; H, 7,02; N, 5,27%. Нађено: C, 40,83; H, 6,93; N, 5,44%. IR (cm–1): 3088, 2960, 2872, 1739, 1468, 1370, 1239, 1194, 1143, 1024, 934, 849, 774. 1H NMR* (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,94 (d, 12H, 3ЈH,H =3,66, C6,7H3), 1,28 (t, 6H, 3ЈH,H = 7,10, C9H3), 1,60-2,10 (m, 6H, C4H2, C5H), 2,52 (m, 4H, C1H2), 3,48 (q, 2H, C2H), 4,33 (m, 4H, C8H2), 6,30-6,50 (s, 2H, NH). 13C NMR* (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 14,1 (C9H3), 21,7 (C6,7H3), 24,6 (C5H), 37,7 (C4H2), 48,9 (C1H2), 59,6 (C2H), 61,6 (C8H2), 169,6 (COOR). [PdCl2L2] (2): Принос 0,300 g, 89,45%. Aнализа: израчунато за [PdCl2{(S,S)- Pr2eddl}] = C20H40N2O4Cl2Pd: C, 43,68; H, 7,33; N, 5,09%. Нађено: C, 43,33; H, 7,12; N, 5,03%. IR (cm–1): 3143, 2961, 2875, 1739, 1468, 1389, 1241, 1195, 1144, 1057, 946, 845, 775. 1H NMR* (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,92 (d, 12H, 3ЈH,H = 3,74, C6,7H3), 1,07 (t, 6H, 3ЈH,H = 6,82, C10H3), 1,60-2,10 (m, 6H, C4H2, C5H), 1,70 (m, 4H, C9H2), 2,54 (m, 4H, C1H2), 3,48 (q, 2H, C2H), 4,25 (m, 4H, C8H2), 6,30-6,50 (s, 2H, NH). 13C NMR* (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 10,4 (C10H3), 21,9 (C6,7H3), 22,7 (C9H2), 26,0 (C5H), 37,8 (C4H2), 49,3 (C1H2), 60,3 (C2H), 67,2 (C8H2), 171,5 (COOR). [PdCl2L3] (3): Принос 0.330 g, 93.19%. Aнализа: израчунато за [PdCl2{(S,S)- Bu2eddl}] = C22H44N2O4Cl2Pd: C, 45,72; H, 7,67; N, 4,84%. Нађено: C, 45,49; H, 7,78; N, 4,77%. IR (cm–1): 3133, 2960, 2872, 1740, 1466, 1369, 1241, 1197, 1143, 1089, 938, 844, 736. 1H NMR* (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,93 (d, 12H, 3ЈH,H = 6,60, C6,7H3), 1,08 (t, 6H, 3ЈH,H = 7,40, C11H3), 1,40 (sex, 4H, C10H2), 1,60-2,10 (m, 6H, C4H2, C5H), 1,70 (m, 4H, C9H2), 2,55 (m, 4H, C1H2), 3,20 (m, 2H, C2H), 4,28 (t, 4H, C8H2) 6,20-6,60 (m, 2H, NH). 13C NMR* (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13,6 (C11H3), 19,1 (C6,7H3), 21,6 (C10H2), 25,9 (C5H), 30,4 (C9H2), 38,9 (C4H2), 48,9 (C1H2), 60,3 (C2H), 65,5 (C8H2), 171,5 (COOR). [PdCl2L4]·2,5H2O (4): Принос 0,290 g, 72,72%. Aнализа: израчунато за [PdCl2{(S,S)-Pe2eddl}] = C24H48N2O4Cl2Pd·2.5H2O: C, 44,27; H, 8,20; N, 4,30%. Нађено: C,43,79; H, 8,01; N, 4,57%. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 42 IR (cm–1): 3139, 2959, 2870, 1741, 1466, 1369, 1229, 1197, 1129, 1070, 971, 730. 1H NMR* (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,91 (t, 6H, 3ЈH,H = 6,60 C12H3), 1,03 (d, 12H, 3ЈH,H = 6,60 C6,7H3),1,33 (m, 8H, C10,11H2), 1,60-2,20 (m, 6H, C4H2, C5H), 1,66 (m, 2H, C9H), 3,20 (m, 4H, C1H2), 3,84 (m, 2H, C2H), 4,19 (t, 4H, C8H2). 5,90-6,10 (s, 2H, NH). 13C NMR* (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13,8 (C12H3), 22,1 (C6,7H3), 2,7 (C11H2), 24,9 (C10H2), 27,9 (C9H2), 28,0 (C5H2), 40,9 (C4H2), 42,8 (C1H2), 55,4 (C2H), 66,0 (C8H2), 172,3 (COOR). 2.1.4. In vitro антимикробни тест паладијум(II)-комплекса 2.1.4.1. Тестиране супстанце Тестирана једињења су растворена у DMSO и потом разређени течним хранљивим медијумом до концентрације DMSO од 10%. Антибиотик доксициклин (Галеника А.Д., Београд) растворен је у течном хранљивом медијуму Милер- Хинтоновог бујона (Торлак, Београд), док је антимикотик флуконазол (Pfizer Inc., USA) растворен у Сабурад декстрозном бујону (Торлак, Београд). 2.1.4.2. Тестирани микроорганизми Антимикробна активност припремљених једињења тестирана је на 15 микроорганизама. Експеримент укључује 5 сојева патогених бактерија: Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabilis (клинички изолат) and Escherichia coli (клинички изолат); 6 врста патогених гљива: Aspergillus fumigatus PMFKG-F23, Aspergillus flavus PMFKG-F24, Aspergillus restrictus PMFKG-25, Aspergillus niger PMFKG-26 and Aspergillus niger ATCC 16404, једну врсту квасца Candida albicans (клинички изолат); четири врсте пробиотика: Lactobacillus plantarum PMFKG-P31, Bacillus subtilis IP 5832 PMFKG-P32, Bifidobacterium animalis subsp. lactis PMFKG-P33 and Saccharomyces boulardii Сви клинички изолати великодушан су поклон Института за Јавно Здравље, Крагујевац. Остали микроорганизми обезбеђени су из колекције Лабораторије за Микробиологију, Природно-математички факултет, Универзитета у Крагујевцу. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 43 2.1.4.3. Припрема суспензија Суспензије бактерија и гљива припремљене су методом директних колонија. Колоније су изоловане директно са плоче и суспендоване у 5 cm3 стерилног раствора 0,85% кухињске соли. Замућеност иницијалне суспензије подешена је поређењем са 0,5 МекФарландовог стандарда (0,5 cm3 1,17% w/v BaCl2·2H2O + 99,5 cm3 1% w/v H2SO4) [65]. Након подешавања замућености 0,5 МекФарландовим стандардом бактеријална суспензија садржи око 108 јединица способних за формирање колонија (CFU) cm–3, док суспензија квасца садржи око 106 CFU cm–3. Разблажење од 1:100 иницијалне суспензије посебно је припремљено у стерилном раствору 0,85% кухињске соли. Суспензије гљивичних спора припремљене су лаганим скидањем спора са растуће филаментозне гљиве. Резултирајућа суспензија је била разблажена 1:1000 у стерилном раствору 0,85% кухињске соли. 2.1.4.4. Микродилуциона метода Антимикробна активност је тестирана одређивањем минималне инхибиторне концентрације (МИК) и минималне микробицидне концентрације (ММК) методом микродилуције са резофурином [66]. Микротитер плоча са 96 бунарића третиране су са по 100 μL хранљивог бујона по бунарићу, Милер-Хинтоновим бујоном за бактерије и Сабуроа декстрозним бујоном за гљиве и квасце. Додано је 100 μL основног раствора тестиране супстанце (концентрације 2 000 μg cm–3) у први ред плоче. Потом је изведено двоструко серијско разблажење вишеканалном пипетом. Добијена концентрација је у распону од 1000 до 7,81 μg cm–3. 10 μL разблажене суспензије бактерија, квасца и спора додано је у сваки бунарић дајући коначну концентрацију од 5·105 CFU cm–3 за бактерије и and 5·103 CFU cm–3 за квасце и гљиве. Коначно, 10 μL раствора резофурина додано је у сваки бунарић третиран бактеријама и квасцима. Резофурин је оксидоредукциони индикатор коришћен за евалуацију микробног раста. То је плава нефлуоресцентна боја која прелази у флуоресцентну розе када је у свом редукованом стању резофурина, настала деловањем оксидоредуктаза унутар живих ћелија. Третиране плоче инкубиране су на 37°C 24 сата код бактерија, 28°C 48 сата код квасаца и 28°C за 72 сата код гљива. МИК дефинисана је као најнижа концентрација тестиране супстанце при којој не долази до промене боје ресазурина из плаве у розе. Код гљива, МИК вредности Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 44 тестираних супстанци одређиване су као најнижа концентрација која видљиво инхибира раст мицелија. Доксициклин и флуконазол коришћени су као позитивна контрола. Контрола растварача изведена је проучавањем ефекта 10% ДМСО на раст микроорганизама. Такође, треба напоменути да је током експеримента концентрација ДМСО додатно смањивана због двоструког серијског разблаживања (радна концентрација је 5% и мање). Сваки тест укључивао је и контролу раста и контролу стерилности. Сви тестови рађени су у дупликату и МИК вредности су константне. Минимална бактерицидна и фунгицидна концентрација одређивана је пребацивањем 10 μL узорка на хранљиви агарни медијум из бунарића где није примећена промена боје индикатора. На крају инкубационог периода најнижа концентрација где нема раста (нема колонија) дефинисана је као минимална микробицидна концентрација. 2.1.4.5. Статистичка анализа Све статистичке анализе су извршене коришћењем СПСС пакета. Резултати за су приказани као средња вредност ± СД. Студентски упарени т-тест је био коришћен за поређење концентрације између лиганада и паладијум(II)-комплекса. Разлике између група (једињења, микроорганизми) су анализирани коришћењем 1-фактор АНОВА. У свим случајевима P вредности <0.05 су сматране статистички значајним. 2.1.5. Синтеза 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-диона Смеша 3-aцeтил 4-хидроксикумарина (0,4 g, 0,002 mol) и 2-aминоетанола (0,12 g, 0,002 mol) у метанолу (50 cm3) се рефлуктује један сат. Ток реакције се прати TLC хроматографијом (толуен : aцетон = 7 : 3). Запремина реакционе смеше се смањи на четвртину од почетне. Стајањем на собној температури издвајају се бели кристали 3-(1- (2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-диона који се процеде, осуше и прекристалишу из етанола. Принос: 0,48 g (97 %). Т.Т: 181-183 ºC.. Анализа: Израчунато за C13H13NO4 (Mр: 247,25): C, 63,15; H, 5,30; N, 5,67. Нађено: C, 62,78; H, 5,10; N, 5,87. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 45 IR (KBr, у cm-1) 3412 (NH), 3300 (OH), 3050 (=CH), 2948, 2894 (CH), 1661 (C=O од 2,4- диоксохроманског дела), 1615, 1592, 1573 и 1487 (C=C)ar cm-1; 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 2,19 (br s, 1H, OH), 2,77 (s, 3H, CH3-C-1'), 3,73 (t, 2H, CH2- C-2'', 3J = 5,8 Hz), 4,12 (t, 2H, CH2- C-1'', 3J = 5,8 Hz), 7,18 (2H, m, C-H-6, C-H- 7), 7,55 (1H, dd, 3JH-8, H-7=8,10 Hz, 4JH-8, H-6=2,11 Hz, C-H-8), 8,05 (1H, dd, 3JH-5, H-6=7,99 Hz, 4JH-5, H-7=1,90 Hz, C-H-5), 14,62 (br s, 1H, NH); 13C NMR (200 MHz, DMSO) δ ppm: 18,9 (C-1'-CH3), 46,2 (C-1''), 60,5 (C-2''), 97,4 (C-3), 116,6 (C-8), 120,6 (C-6), 123,6 (C-5), 126,0 (C-10), 133,8 (C-7), 152,2 (C-9), 153,7 (C-2), 177,1 (C-1'), 181,3 (C-4). MS m/z (%): 247 (M+, 100), 216 (8), 204 (72), 187 (63), 175 (12), 147 (19), 121 (52), 92 (34), 67 (27). 2.1.6. Синтеза хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман- -2,4-дион-паладијум(II) комплекса Раствору K2PdCl4 (0,0652 g, 0,2 mmol) у 10,0 cm3 воде се дода еквомоларна количина 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-диона (0,0495 g, 0,2 mmol), раствореног у метанолу (12,0 cm3). Смеша се загрева на воденом купатилу за време од 48 сати. За то време се издваја жути талог хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)- етилиден)хроман-2,4-дион-паладијум(II) комплекса који се процеди и прекристалисава из метанола. Принос: 0,051 g (65.7%). Анализа. Израчунато за C13H12ClNO4Pd (Mr = 388,106 g/mol) (%): C, 41.23; H, 3.12; N, 3.61. Нађено: C, 41.32; H, 3.47; N, 3.88. IR (KBr, n in cm-1) 3425 (OH), 3067 and 3035 (=CH), 2922, 2898, 2852 and 2818 (CH), 1675 (C=O), 1605 (C=N), 1601, 1570 and 1482 (C=C)ar, 524 (Pd-O), 459 (Pd-N); 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 2.50 (s, 3H, CH3-C-1'), 3.40 (br s, 1H, OH), 3.68 (t, 2H, CH2- C-2'', 3J = 5.3 Hz), 3.99 (t, 2H, CH2- C-1'', 3J = 5.3 Hz), 7.27 (2H, m, C-H-6, C-H- 7), 7.59 (1H, dd, 3JH-8, H-7=8.10 Hz, 4JH-8, H-6=2.11 Hz, C-H-8), 7.93 (1H, dd, 3JH-5, H-6=7.99 Hz, 4JH-5, H-7=1.90 Hz, C-H-5); 13C NMR (200 MHz, DMSO) δ ppm: 19.6 (C-1'-CH3), 46.6 (C-1''), 59.0 (C-2''), 96.2 (C-3), 116.2 (C-8), 120.4 (C-6), 123.7 (C-5), 125.7 (C-10), 133.6 (C-7), 152.6 (C-9), 153.1 (C-2), 176.3 (C-1'), 179.5 (C-4). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 46 2.1.7. Кристална структура хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)- етилиден)хроман-2,4-дион-паладијум(II) комплекса Кристали погодни за ренденску структурну анализу су добијени из матичног раствора стајањем неколико дана на собној температури. Дифракциони подаци су сакупљени помоћу Oxford Diffraction Gemini S four-circle гониометрм са Sapphire CCD detector коришћењем CuKα (λ = 1.5418 Å) зрака. Прикупљени подаци су обрађени коришћењем програма CrysAlisPRO [67]. Кориговани су и Лоренцови и поларизациони ефекти а примењена је и нумеричка апсорпциона корекција [67]. Структура је решена директном методом Sir 97 програма [68] а побољшана са full-matrix least-squares применом на F2 коришћењем SHELXL-97 програма [69] као примењеног програма у WinGX програму [70]. Не-водонични атоми су утачњени анизотропски. Положаји водоникових атома су дефинисани испитивањем разлика у Fourier мапама. H атоми из метил група и ароманичног прстена у позиционирани геометријски (C−H = 0.96 Å ѕа метил и C−H = 0.93 Å код ароматичног прстена,) и редефинисани коришћењем изотропних параметара. Кристалографски подаци и параметри решавања структуре су дати у Табели 4. Слике које представљају молекулску структуру изведене су коришћењем ORTEP-3 [71] и PLATON [72] програма. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 47 Табела 4. Основни експерименатлни подаци везани за решавање структуре хлоридо-3- (1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-дион-паладијум(II) комплекса Кристалографски подаци Формула C13H12ClNO4Pd Mr 388.09 Критални систем, просторна група Орторомбичан, Pbca Температура (K) 293 a, b, c (Å) 18.373 (5), 7.324 (5), 21.280 (5) V (Å3) 2864 (2) Z 8 F(000) 1536 Тип зрачења Cu Kα θ опсег (°) 4.8–72.0 μ (mm-1) 12.29 Величина кристала (mm) 0.39 × 0.15 × 0.09 Прикупњање података Дифрактометар Xcalibur-Gemini S diffractometer Извор зрачења Enhance (Cu) X-ray Source Абсорпциона корекција Gaussian CrysAlis PRO, Agilent Technologies, Version 1.171.36.24 (release 03-12-2012 CrysAlis171 .NET). Нумеричка корекција апсорпције је заснована на gaussian инрегралу Tmin, Tmax 0.119, 0.417 Број мерених, независних и обрађених [I > 2σ(I)] рефлексија 5983, 2553, 2191 Rint 0.029 θ values (°) θmax = 67.0, θmin = 4.2 Опсег за h, k, l h = -10→21, k = -8→4, l = -24→25 Решавање R[F2 > 2s(F2)], wR(F2), S 0.031, 0.088, 1.09 No. рефлексија 2553 No. параметара 203 Одређивање положаја H- атома Положаји H атома су одређени коришћењем и независног и ограниченог уташњавања (Δ/σ)max 0.001 Δρmax, Δρmin (e Å-3) 0.54, -0.43 Computer programs: CrysAlis PRO, Agilent Technologies, Version 1.171.36.24 (release 03- 12-2012 CrysAlis171 .NET) (compiled Dec 3 2012,18:21:49), SHELXL97 (Sheldrick, 1997). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 48 2.1.8. Испитивање антитуморске активности паладијум(II) комплекса 2.1.8.1. Ћелије и реагенси Сви реагенси су набављени од Sigma (St. Louis, MO), уколико није другачије наведено. Хумана глиом ћелијска линија U251 је поклон од Dr. Pedro Tranque (Universidad de Castilla-La Mancha, Albacete, Spain), док су мишје B16 меланом ћелијска линија и мишја линија фибросаркомских ћелије L929 добијене од European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury, UK). Линије туморске ћелије су држане на 37°C у влажној атмосфери са 5%CO2, у RPMI медијуму ћелијске културе (PAA Laboratories, Pasching, Austria) допуњен са 5% феталним говеђим серумом (FCS) и пеницилин/стрептомицин. Ћелије су припремљене за експерименте користећи конвенционални трипсински поступак са трипсин/ЕДТА и инкубирана у плочама са равним дном и 96 лежишта (1 x 104 ћелија/бунарчић) за процену одрживости ћелија, или са плочама са 24 лежишта (5 × 104 ћелија/бунарчић) за анализу проточне цитотоксисичности. Ћелије су реласиране 24 сата, а затим су третиране са комплексом или лигандом, као што је описано у делу Резултати и у тексти испод графика који се односе на ова испитивања. 2.1.8.2. Одређивање виталности ћелија МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолијум бромид] и лактат дехидрогеназе (LDH) тестови су коришћени за процену митохондријалне дехидрогеназне активност као и интегритета ћелијске мембране. Тестови су као што је претходно описано [73]. Резултати су представљени као% од контроле одрживости (МТТ) подешен на 100%, или као% цитотоксичности (LDH), користећи Тритон Кс-100-лизиране нетретиране ћелије као позитивну контролу. IC50 вредности су израчунате коришћењем GraphPad Prism софтвера. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 49 2.1.8.3. ДНК Фрагментација и анализа апоптоза/некрозе ДНК фрагментација је анализирана проточном цитометријом помоћу ДНК- везујуће боје пропидијум-јодид (PI) као што је претходно описано [73] Апоптотичко/некротична ћелијска смрт анализирана је проточном цитометријом пратећи двострукост бојења са анексин V-FITC и PI, у којој анексин V се везује за апоптотске ћелија видљиве са фосфатидилсерином, док PI означава некротичне ћелије са оштећењем у мембрани. Бојење је вршено према упутствима од стране произвођача (BD Pharmingen, San Diego, CA).Зелено/црвено (FL1/FL2) флуоросценција аннекин/PI и PI-обојених ћелија је анализирана са FACSCalibur течном (BD, Heidelberg, Germany). Број рано апоптотичних (annexin−/PI−) и касно апоптотичих (annexin+/PI−) ћелија, као и однос хиподиплоид, апоптотичних ћелија са фрагментисане ДНК (sub-G простор) одређен је коришћењем Cell Quest Pro BD) софтвера. 2.1.8.4. Активација каспасе Активација каспазе мерена је проточном цитометријом након означавања ћелија са ћелијски пропустљивим FIT-conjugated pan-caspase инхибитором (ApoStat; R&D Systems, Minneapolis, MN) у складу са упутствима произвођача. Повећање зелене флуоресцентности (FL1), као мере активности каспазе, одређена је коришћењем FACSCalibur проточног цитометру. 2.1.8.5. Мерење митохондријског ћелијског потенцијала Потенцијал митохондријалне мембране је процењен коришћењем DePsipher (R&D Systems, Minneapolis, MN), који је липофилни катјон и има својство везивања за мембране након поларизације уз формирање наранџасто-црвеног флуоресцентног једињења. Уколико је потенцијал митохондријске мембране нарушен, боја не може да уђе у трансмебрански простор и остаје иста или се враћа у зелени мономерни облик. Ћелије које су су обојене са DePsipher реагенсом, као и зелени мономери и наранџасто- црвени агрегати су одређиване проточном цитометријом. као што је описано од стране произвођача. Смањење наранџатсо/зеленог флуоресцентног односа (FL2/FL1) одражава митохондријску деполаризацију. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 50 2.1.8.6. Одређивање реактивних врста кисеоника (ROS)( Reactive oxygen species) Интрацелуларна производња реактивних врста кисеоника (ROS) је одређена мерењем интензитета емитоване зелене флуоресценције од редокс-осетљиве боје 2',7'- дицхлорофлуоресцеин-диацетата (DCFDA), док је супероксид емисија мерена коришћењем дихидроетхидиума (DHE) (оба од Life Technologies, Carlsbad, CA), према упутствима произвођача. Интензитет зелене (FL1-DCFDA) или црвене (FL2-DHE) флуоресценције, који одговара укупној количини ROS или количини емисије супероксидне врсте, одређена је коришћењем FACSCalibur проточном цитометру. 2.1.8.7. Статистичка анализа Статистички значајна разлика између третмана је процењена коришћењем Т- теста или one-way ANOVA уз праћење са Student–Neuman–Keuls тестом за вишеструко поређење. Вредност p <0,05 је сматрана значајаном. 2.2. Синтезе лиганада и комплекса хром(III)-јона 2.2.1. Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, H2-(S,S)-eddv.2HCl (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(2-метил)-бутанска киселина је синтатисана према већ раније описаном поступку [64]. У раствор добијен растварањем 20 g (0,5 mol) NaOH у 40 cm3 воде дода се 58,5 g (0,5 mol) S-валина. Раствор се рефлуктује за време од три сата уз постепено додавање 47 g (0,25 mol) 1,2-дибром-етана и 26,28 g (0,25 molova) Na2CO3. Хлађењем и подешавањем pH вредности на 5 помоћу раствора HCl (1:1) издваја се бели талог (S,S)- етилендиамин-N,N’-ди-2-(2-метил)-бутанске киселине који се испере са водом и осуши на ваздуху. Принос 7,1 g (10,92%). Добијена (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(4-метил)- пентанска киселина се прекристалисава растварањем у врелој води уз додатак концентроване HCl (pH > 1) и дужим стајањем на собној температури. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 51 Анализа: Израчунато за H2-(S,S)-eddv·2HCl = C12H36N2O4Cl2 (Mr = 333,254 g/mol): C, 43,21; H, 7,86; N, 8,41 %. Нађено: C, 43,82; H, 8,09; N, 8,29 %. 2.2.2. Синтеза s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато- хромат(III)-дихидрата, s-cis-К[Cr(S,S-eddv)(ox)].2H2O У 10 cm3 воде раствори се 1,33 g (0,005 моl) CrCl3·6H2O и у овај раствор дода 1,67 g (0,005 mola) H2eddv.2HCl растворених у 10 cm3 воде и неутралисаних са раствором NaOH (0,2 g у 5 cm3 H2O, 0,005 mol) уз мешање на 40-50oC. Добијени раствор се меша уз загревање на наведној темпаратури још 2 сата при чему раствор мења боју до црвено-љубичасте. У настали раствор се дода 1,01 g (0,0075 mol) натријум-оксалата и настави мешање на истој темпаратури још пола сата уз подешавање pH вредности на око 6 помоћу раствора NaOH (0,1 mol/dm3). Добијени раствор се упари на малу запремину, процеди и нанесе на колону (2 x 30 cm) напуњену јоноизмењивачком смолом Dowex 1-X4 (200-400 mesh) у Cl- облику. Колона се испере дестилованом водом и елуира са 0,1 M раствором KCl. Добијена је једна трака црвено-љубичасте боје која потиче од s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато-хроматa(III). Раствор комплекса се упари на малу запремину и обесоли на колони (2,5 x 32 cm) напуњеном са Sephadex-ом G-10. Добијени елуат се упари до сува. Принос: 0,72 g (30,4%). Водени раствор (0,1%) даје [α]589 = −912° ([M]589 =−4154°). Анализа: Израчунато за s-cis-K[Cr(S,S- eddv)(ox)]·2H2O = C14H26CrKN2O10 (Mr =473,458g/mol) (%): C, 35.51; H, 5.54; N, 5.92. Нађено: C, 35,30; H, 5,57; N, 5,83. IR (cm−1): 3453, 3217, 2969, 1649, 1466 1398, 1332, 1254, 1093, 1035, 917, 806, 646, 547, 485. 2.2.3. Синтеза s-cis-малонато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато- хромат(III)-дихидрата, s-cis-К[Cr(S,S-eddv)(маl)].2H2O У 10 cm3 воде раствори се 1,33 g (0,005 моl) CrCl3·6H2O и у овај раствор дода 1,67 g (0,005 mola) H2eddv.2HCl растворених у 10 cm3 воде и неутралисаних са раствором NaOH (0,2 g у 5 cm3 H2O, 0,005 mol) уз мешање на 40-50oC. Добијени раствор се меша уз загревање на наведној темпаратури још 2 сата при чему раствор мења боју до црвено-љубичасте. У настали раствор се дода 0,78 g (0,0075 mol) малонске Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 52 киселине и настави мешање на истој темпаратури још пола сата уз подешавање pH вредности на око 6 помоћу раствора NaOH (0,1 mol/dm3). Добијени раствор се упари на малу запремину, процеди и нанесе на колону (2 x 30 cm) напуњену јоноизмењивачком смолом Dowex 1-X4 (200-400 mesh) у Cl- облику. Колона се испере дестилованом водом и елуира са 0,1 M раствором KCl. Добијена је једна трака црвено-љубичасте боје која потиче од s-cis-малонато-(S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато-хроматa(III). Раствор комплекса се упари на малу запремину и обесоли на колони (2,5 x 32 cm) напуњеном са Sephadex-ом G-10 Добијени елуат се упари до сува. Принос: 0,55 g (22,6%). Водени раствор (0,1%) даје [α]589 = −628° ([M]589 = −3288°). Анализа: Израчунато за s-cis-K[Cr(S,S- eddv)(mal)]·2H2O = C15H28CrKN2O10 (Mr = 487,484 g/mol) (%): C, 36,96; H, 5,79; N, 5,75. Нађено (%): C, 37,12; H, 5,87; N, 5,73. IR (cm−1): 3436, 3225, 2968, 1638, 1466, 1379, 1336, 1083, 1036, 999, 971, 943, 918, 891, 867, 847, 805, 736, 646, 592, 540, 483, 466. 2.2.4. In vitro антимикробни тест хром(III)-комплекса In vitro антимикробни тест хром(III)-комплекса извршен је на начин како је то описану у Експерименталном делу под 2.1.4. Међутим, антимикробна активност припремљених хром(III)-комплекса тестирана је на 28 микроорганизама. Експеримент укључује 16 сојева патогених бактерија, укључујући шест стандардних сојева (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabilis ATCC 12453, Staphylococcus aureus ATCC 25923; Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus pumilus NCTC 8241) и десет клиничких изолата (Escherichia coli; Enterococcus faecalis; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus; Sarcina lutea; Bacillus subtilis; Bacillus cereus; Proteus mirabilis; Salmonella enterica; Salmonella typhymirium). Такође, пет врсти патогених гљива (Aspergillus fumigatus PMFKG-F23; Aspergillus flavus PMFKG-F24; Aspergillus restrictus PMFKG-F25; Aspergillus niger PMFKG-F26 and standard strain A. niger ATCC 16404); две врсте квасца (Candida albicans (клинички изолат) and C.albicans ATCC 10231) и пет врсти пробиотика (Lactobacillus plantarum PMFKG-P31, Bacillus subtilis IP 5832 PMFKG-P32, Bifidobacterium animalis subsp. lactis PMFKGP33; Saccharomyces boulardii PMFKG-P34 and Lactobacillus rhamnosus PMFKG-P35) су тестирани. Сви клинички изолати великодушан су поклон Института за Јавно Здравље, Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 53 Крагујевац. Остали микроорганизми обезбеђени су из колекције Лабораторије за Микробиологију, Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу. 2.3. Синтезе лиганада и комплекса кобалт(III)-јона 2.3.1. Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропанске киселине, H2-(S,S)-eddp (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропанска киселина, (H2-S,S-eddp) је синтатисана према већ раније описаном поступку [55] У раствор који садржи 20,00 g (0,50 mol) натријум-хидроксида лагано се, у малим порцијама додаје 44,40 g (0,50 mol) S-аланина. Раствор се рефлуктује уз укапавање 47,00 g (0,25 mol) 1,2-диброметана и истовремено додавање 26,00 g (0,25 mol) безводног натријум-карбоната. Раствор се рефлуктује још три сата. Након хлађена реакционе смеше и подешавања pH на 5 помоћу раствора HCl (1:1) издваја се чврст, бели производ, етилендиамин-N,N′-ди-S,S-2-пропанска киселина, који се процеди, добро испере водом и осуши на ваздуху. Принос: 5,90 g (11,60%). Анализа. Израчунато за H2-S,S-eddp = C8H16N2O4 (Мr = 204,246 g/mol) (%): C, 47,04; N,13,72; H, 7,90. Нађено: C, 47,01; N, 13,84; H, 7,81. 2.3.2.. Синтеза (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, H2-(S,S)-eddv.2HCl (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(2-метил)-бутанска киселина је синтатисана према описаном поступку у 2.3.1. 2.3.3. Синтеза s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропаноато-кобалтат(III)- семихидрата, s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O У 10 cm3 воде раствори се 1,19 g (0,005 моl) CoCl2·6H2O и у овај раствор дода 1,02 g (0,005 mola) H2-(S,S)-eddp. растворених у 10 cm3 воде и неутралисаних са раствором NaOH (0,2 g у 5 cm3 H2O, 0,005 mol) уз мешање на 40-50oC. Добијени раствор се меша уз загревање на наведној темпаратури још 2 сата уз лагано додавање 1,5 cm3 30% H2O2, при чему раствор мења боју до црвено-љубичасте. У настали раствор Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 54 се дода 0,94 g (0,0075 mol) оксалне киселине дихидрата и настави мешање на истој темпаратури још пола сата уз подешавање pH вредности на око 6 помоћу раствора NaOH (0,1 mol/dm3). Добијени раствор се упари на малу запремину, процеди и нанесе на колону (2 x 30 cm) напуњену јоноизмењивачком смолом Dowex 1-X4 (200-400 mesh) у Cl- облику. Колона се испере дестилованом водом и елуира са 0,1 M раствором KCl. Добијена је једна трака црвено-љубичасте боје која потиче од s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2-пропаноато-кобалтата(III). Раствор комплекса се упари на малу запремину и обесоли на колони (2,5 x 32 cm) напуњеном са Sephadex-ом G-10. Добијени елуат се упари до сува. Принос: 0,55 g (24,9%). Водени раствор (0,1%) даје [α]589 = -13320 ([M] = -52920). Анализа: Израчунато за s-cis-K[Cо(S,S- eddp)(ox)]·0,5H2O C10H15CoKN2O8,5 (Mr = 397,27 g/mol) (%): C, 30,23; H, 3,81; N, 7,05. Нађено: C, 30,30; H, 3,57; N, 6,83. 2.3.4. Синтеза s-cis-малонато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропаноато-кобалтат(III)- тетрахидрата, s-cis-K[Co(S,S-eddp)(mal)]·4H2O У 10 cm3 воде раствори се 1,19 g (0,005 моl) CoCl2·6H2O и у овај раствор дода 1,02 g (0,005 mola) H2-(S,S)-eddp. растворених у 10 cm3 воде и неутралисаних са раствором NaOH (0,2 g у 5 cm3 H2O, 0,005 mol) уз мешање на 40-50oC. Добијени раствор се меша уз загревање на наведној темпаратури још 2 сата уз лагано додавање 1,5 cm3 30% H2O2, при чему раствор мења боју до црвено-љубичасте. У настали раствор се дода 0,78 g (0,0075 mol) малонске киселине и настави мешање на истој темпаратури још пола сата уз подешавање pH вредности на око 6 помоћу раствора NaOH (0,1 mol/dm3). Добијени раствор се упари на малу запремину, процеди и нанесе на колону (2 x 30 cm) напуњену јоноизмењивачком смолом Dowex 1-X4 (200-400 mesh) у Cl- облику. Колона се испере дестилованом водом и елуира са 0,1 M раствором KCl. Добијена је једна трака црвено-љубичасте боје која потиче од s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2 пропаноато-кобалтата(III). Раствор комплекса се упари на малу запремину и обесоли на колони (2,5 x 32 cm) напуњеном са Sephadex-ом G-10. Добијени елуат се упари до сува. Принос: 0,53 g (22,36%). Водени раствор (0,1%) даје [α]589 = -7400 ([M] = -35100). Анализа: Израчунато за s-cis-K[Co(S,S- Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 55 eddp)(mal)]·4H2O = C15H28CoKN2O8 (Mr = 474,35 g/mol) (%) C, 27,85; H, 5,10; N, 5,90. Нађено (%): C, 28,25; H, 5,30; N, 5,91. 2.3.5. Синтеза s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато- кобалтат(III)-трихидрата, s-cis-К[Cо(S,S-eddv)(ox)].3H2O У 10 cm3 воде раствори се 1,19 g (0,005 моl) CoCl2·6H2O и у овај раствор дода 1,67 g (0,005 mola) H2-(S,S)-eddv.2HCl. растворених у 10 cm3 воде и неутралисаних са раствором NaOH (0,2 g у 5 cm3 H2O, 0,005 mol) уз мешање на 40-50oC. Добијени раствор се меша уз загревање на наведној темпаратури још 2 сата уз лагано додавање 1,5 cm3 30% H2O2, при чему раствор мења боју до црвено-љубичасте. У настали раствор се дода 0,94 g (0,0075 mol) оксалне киселине дихидрата и настави мешање на истој темпаратури још пола сата уз подешавање pH вредности на око 6 помоћу раствора NaOH (0,1 mol/dm3). Добијени раствор се упари на малу запремину, процеди и нанесе на колону (2 x 30 cm) напуњену јоноизмењивачком смолом Dowex 1-X4 (200-400 mesh) у Cl- облику. Колона се испере дестилованом водом и елуира са 0,1 M раствором KCl. Добијена је једна трака црвено-љубичасте боје која потиче од s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато-кобалтата(III). Раствор комплекса се упари на малу запремину и обесоли на колони (2,5 x 32 cm) напуњеном са Sephadex-ом G-10. Добијени елуат се упари до сува. Принос: 0,40 g (16,06%). Водени раствор (0,1%) даје [α]589 = +3650 ([M] = +18190). Анализа: Израчунато за s-cis-K[Co(eddv)(ox)]·3H2O = C19H36CoKN2O8 (Mr = 498,41g/mol) (%):C, 33,96; H, 6,08; N, 5,28. Found(%): C, 34,30; H, 6,17; N, 5,30. 2.3.6. Синтеза s-cis-малонато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутаноато- хромат(III)- тетрахидрата, s-cis-К[Cо(S,S-eddv)(mal)].4H2O У 10 cm3 воде раствори се 1,19 g (0,005 моl) CoCl2·6H2O и у овај раствор дода 1,02 g (0,005 mola) H2-(S,S)-eddv.2HCl. растворених у 10 cm3 воде и неутралисаних са раствором NaOH (0,2 g у 5 cm3 H2O, 0,005 mol) уз мешање на 40-50oC. Добијени раствор се меша уз загревање на наведној темпаратури још 2 сата уз лагано додавање 1,5 cm3 30% H2O2, при чему раствор мења боју до црвено-љубичасте. У настали раствор Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 56 се дода 0,78 g (0,0075 mol) малонске киселине и настави мешање на истој темпаратури још пола сата уз подешавање pH вредности на око 6 помоћу раствора NaOH (0,1 mol/dm3). Добијени раствор се упари на малу запремину, процеди и нанесе на колону (2 x 30 cm) напуњену јоноизмењивачком смолом Dowex 1-X4 (200-400 mesh) у Cl- облику. Колона се испере дестилованом водом и елуира са 0,1 M раствором KCl. Добијена је једна трака црвено-љубичасте боје која потиче од s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2 пропаноато-кобалтата(III). Раствор комплекса се упари на малу запремину и обесоли на колони (2,5 x 32 cm) напуњеном са Sephadex-ом G-10. Добијени елуат се упари до сува. Принос: 0,35 g (13.67 %). Водени раствор (0,1%) даје [α]589 = +500 ([M] = +2650). Анализа: Израчунато за s-cis- K[Co(edval)(mal)]·4H2O = C19H36CoKN2O8 (Mr = 530,46 g/mol) (%): C, 33,96; H, 6,08; N, 5,28. Нађено (%): C, 34,30; H, 6,17; N, 5,30. 2.3.7. Кристална структура s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропаноато- кобалтат(III)-семихидрата, s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O Подаци дифракције X-зрака прикупљени су дифракцијом на монокристалу s-cis- K[Co(S,S-eddp)(ox)]·0,5H2O на собној температури на Agilent Gemini S дифрактометру са МоКα зрацима (λ = 71073 А). Обрада података и емпиријске корекције су извршене користећи CrysAlisPro [75]. Кристална структура је решена директном методом, користећи SIR2002 програм [76] и утачњавање je извршено помоћу SHELXL програма [77]. Атоми водоника су постављени у геометријски идеализоване позиције са С-Н растојањима до 0,98, 0,97 и 0,96 Å из метин, метилен и метил C (sp3) атоме N-H растојањима на 0,91 Å. Одговарајући изотропни параметри померања атома водоника су једнаки 1,2 Ueq и 1,5 Ueq од порекла C и N атома. Атоми водоника везани за молекул воде у кристалној решетки је лоциран на бази Fourier-ове мапе. Координате ових Н аtома су фиксирани на бази ралзила у овим мапама е, док њена Uiso је слободно решена. Кристалографски подаци су наведени у табели 5. PARST [78] и PLATON [79]] програми су коришћени за геометријски обрачун и програм ORTEP [80] је коришћен за молекуларну графику. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 57 Табела 5. Основни експерименатлни подаци везани за решавање структуре s-cis- -оксалато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропаноато-кобалтат(III)- -семихидрата, s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O Емпиријска формула C10 H16 Co K N2 O9 Молекулска маса 397.27 Боја, облик тристала Љубичаста, призматичан Величина кристала (mm3) 0.34 x 0.29 x 0.25 Темпаратура (K) 293(2) Таласна дужина(Å) 0.71073 Кристални систем Орторомбичанc Просторна група P21212 Димензије ћелије a (Å) 8.2067(5) b (Å) 26.3185(13) c (Å) 6.6034(4) V (Å 3 ) 1426.26(14) Z 4 Dcalc (Mg/m3) 1.850 μ (mm-1) 1.542 θ опсег прикупљања података (°) 3.10 to 28.95 Број рефлексија 9656 Број независних рефлексија, Rint 3289, 0.0533 Completeness (%) to θ = 26° 99.8 Метода решавања структуре Full-matrix least-squares on F2 Подаци/ ограничења/ параметри 3289/ 0 / 207 Апсолутни структурни параметар 0.09(4) Утачњеност F2 1.228 Финални R1/wR2 за [I >2σ(I)] 0.0690/ 0.1696 2.3.8. In vitro антимикробни тест кобалт(III)-комплекса In vitro антимикробни тест кобалт(III)-комплекса извршен је на начин како је то описану у Експерименталном делу под 2.1.4. Међутим, антимикробни тест кобалт(III)- комплекса извршен је на 13 микроорганизама. Експеримент је укључио 5 стандардних патогених бактерија (Escherichia coli (клинички изолат), Proteus mirabilis (клинички изолат); Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Enterococcus faecalis ATCC 29212); пет врста патогених гљива (Candida albicans (клинички изолат), Aspergillus fumigatus PMFKG-F23; Aspergillus flavus PMFKG-F24; Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 58 Aspergillus restrictus PMFKG-F25 и Aspergillus niger PMFKG-F26) и три врсте пробиотика (Lactobacillus plantarum PMFKG-P31, B. subtilis IP 5832 PMFKG-P32, и Saccharomyces boulardii PMFKG-P34). Сви клинички изолати великодушан су поклон Института за Јавно Здравље, Крагујевац. Остали микроорганизми обезбеђени су из колекције Лабораторије за Микробиологију, Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу. 2.4. Мерења 2.4.1. 1H и 13C нуклеарно-магнетно-резонанциони спектри Снимање ових спектара вршено је помоћу спектрофотометра Varian Gemini-200 NMR користећи D2O као растварач. Хемијска померања су дата у односу на TMS (триметилсилан), употребом DDS као инертног стандарда. 2.4.2. Електронски апсорпциони и циркуларно дихроични спектри Електронски апсорпциони спектри снимљени су помоћу Perkin-Elmer Lambda 35 double-beam UV-VIS спектрофотометра. За снимање спектара употребљени су водени раствори концентрације 1·10-3 mol/dm3 у кивети дужине 1 cm. Циркуларно дихроични спектри снимљени су помоћу JASCO-815 Spectropolarimeter апарата. За снимање спектара употребљени су водени раствори концентрације 0,1%. 2.4.3. Инфрацрвена спектроскопија Инфрацрвени спектри снимљени су помоћу спектрофотометра Perkin- -Elmer FTIR 31725X (KBr-техника). 2.4.4. Микроанализа Елементална анализа за C, H and N урађена је помоћу апарата Vario EL III C, H, N, S Elemental Analyzer. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 59 3. Р Е З У Л Т А Т И И Д И С К У С И Ј А 3.1. Синтеза и карактеризација и антимикробна активност диалкил естара (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске киселине (S,S)-R2eddl (L1-L4) и одговарајућих комплекса паладијум(II)-јона 1-4 Сви естри (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(4-метил)-пентанске, киселине и одговарајући комплекси паладијум(II)-јона C1-C4 синтетисани су модификованом методом која је раније описана [64,81–83] (Шема 1). Шема 1. Синтеза естара L1·2HCl–L4·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса 1–4. Естри нису растворни у хлороформу, али су нешто боље растворни у води, метанолу, диметил-сулфоксиду, као и у алкохолу у индивидуално употребљеним за појединачне естерификације. Комплекси су растворни у хлороформу и диметил- сулфоксиду, али не у води. 3.1.1 Инфрацрвени спектри Инфрацрвени спектри изолованих лиганада спектри лиганада и одговарајућих комплекса су слични одговарајућим спектрима структурно личних лиганада и комплекса који су претходно објављени [84,85]. Апсорпционе траке за секундарне Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 60 амино групе у комплексима 1-4 су нађене на 3088, 3143, 3133 и 3139 cm–1, што указује координацију лиганада за централни јон метала. Исте траке у инфрацрвеним спектрима лиганада L1·2HCl–L4·2HCl су нађене на 3457, 3453, 3455 and 3452 cm–1. Све друге специфичне траке у спектрима су нађене на сличним положајима и за лигандеа и за одговарајуће комплексе, што указује да нема других атома из лиганада координинованих са паладијум(II)-јон (види Експериментални део). 3.1.2. Електронски апсорпциони спектри комплекса Електронсски апсорпциони спектри испитиваних паладијум(II)-комплекса 1–4 су међусобно веома слични по изгледу и апсорпциони максимуми су дати у Табели 6. Табелa 6. Електронсски апсорпциони спектри испитиваних паладијум(II)- -комплекса Комплекс λ(nm) ε(M-1cm-1) Литература [PdCl2L1]·0,5H2O (1) 393 161,1 Овај рад [PdCl2L2]·(2) 399 156,1 Овај рад [PdCl2L3]·(3) 399 143,9 Овај рад [PdCl2L4]·(4) 399 146,2 Овај рад PdCl4]2– 474 161 21 [Pd(H2O)4]2+ 378 83 21 На основу изгледа и положаја апсорпционих максимума изолованих комплекса (1–4) паладијум(II) јон поседује квадратно-панарну геометрију. За паладијум(II) комплексе са D4h молекулском геометријом очекивани су електронски d-d прелази (1A1g → 1A2g) у области 350–500 nm [86,87]. У раствору сви изоловани комплекси 1-4 су врло сличне жуто-оранж боје. Скоро исти положај апсорпционих максимума у UV/Vis спектрима комплекса сугерише квадратно-пlанарну околину око паладијум(II)-јона. Померање положаја d-d електронских прелаза за Pd(II)-јон од 474 nm за [PdCl4]2- [86] до ≈400 nm за комплексе 1–4 може се објаснити изменом Cl– лиганда са L1–L4 лигандима. Смањење моларног екстинционог коефицијента код изолованих комплекса (Табела 5) са повећањем броја Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 61 C атома у алил групама лиганада је очекивано и може се објаснити смањењем јачине лигандног поља око паладијум(II)-јона. 3.1.3. In vitro испитивање антимикробне активности Резултати in vitro испитивања антибактеријске и антифунгалне активноти изолованих паладијум(II)-комплекса 1-4 и одговарајућих лиганада L1–L4 приказани су у Табелама 7 и 8. Ради поређења, у истим табелама дате су и MИК и MMК вредности за доксоциклин и флуконазол. Изоловани комплекси и лиганди показују различит ниво антимикрробне активности у односу на тестиране врсте микроорганизама. Интензитет антимиктодног деловања варира зависно и од групе микроорганизама и од типа једињења. Антимикробна активност тестираних једињења је процењена на основу одрећивања MIC и MMC вредности за 15 врста микроорганизама. МИК вредности су у опсегу 4,9 до > 5000 μg cm–3 до су ММК вредности од 78 to > 5000 μg cm–3. Из Табела 7 и 8 може се уочити да паладијум(II) комплекси показују већу антимикробну активност у односу на одговарајуће лиганде (p < 0.0005 за MИК и MMК). Поређењем активности лиганада и одговарајућих комплекса оучљиво је да су комплекси 1 и 4 значајно активнији у односу на одговарајуче лиганде L1 и L4 (p = 0.004 за MИК и p = 0.005 и MMК за 1 и L1 ; односно p = 0.001 за MIИК и p < 0.0005 заr MMк за 4 и L4). Такође, из наведених табела се може уочити да ипитивани лиганди L1–L4 не показују битну разлику у антимикробној активности. Насупрот томе, комплекси показују значајне разлике у активности: комплекси 1 и 4 су активнији у односу на комплексе 2 и 3. Комплекс 4 је показао највећу активност од свих испитиваних једињења (p < 0.05). MИК за комплекс 4 је од 39,1 до 1250 μgcm–3 и MMК је од 39,1 до > 2500 μg cm–3. Виша антимикробна активност комплекса у односу на активноsт одговарајућих лиганада може се објаснити на бази хелатне теорије. По овој теорији опадање поларизабилности паладијум(II)-јон може побољшати липофилност код комплекса [88]. Према различитим групама микроорганизама, паладијум(II) комплекси су показали значајнији инхибиторни ефекат у односу на лиганде на раст патогених бактерија, пробиотици и плесни (п <0.05) како је то већ раније показано за сличне комплексе [89]. У поређењу са позитивном контролом, паладијум(II) комплекси су показали умерену до ниске антибактеријске активност према тестираном стандарду и клиничким сојевима бактерија. Као најосетљивија показало се да је грам-позитивна бактерија Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 62 Enterobacter faecalis ATCC 29212 са МИК од 156,3 μg cm–3 за L3 и L4. Ова чињеница је у складу са раније потврђеном чињеницом да су грам-позитивне бактерије осетљивије на антимикробне агенсе од грам-негативних бактерија [90]. Основни разлог за то је хемијски састав њиховог ћелијског зида и присуство спољашње мембране код грам- негативних бактерија који је ефикасна баријера [90]. Proteus mirabilis је највише отпоран. Тестирана једињења нису показала никакве ефекте и при вишим концентрацијама на раст ове бактерије. Пробиотици Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis IP 5832 су показали највећу осетљивост на тестирана једињења. Најбољу активност су показали комплекси 1-3 са МИК вредностима између 4,9 до 78 μg cm–3. Међу њима ипак најосетљивији је Lactobacillus plantarum (МИК је 4,9 μg cm–3) што је у сагласности са резултатима испитивања антимикробне активности за сличне комплексе [89]. Активност од комплекса 2-4 против тестираних плесни је боља од активности лиганада и позитивном контролом флуцоназола (p <0,05). Добијенe концентрације паладијум(II)-комплексa који инхибирају раст плесни су од 39.1 до 625 μg cm–3. Најосетљивији је Aspergillus fumigatus. Иако активност ових комплекса против плесни значајанија о односу на флуцоназол, ипак је активност ових комплекса нижа у поређењу са сличним комплексима [89] на истим микроорганизама које сузнатно боље и иду до вредности 0,49 μg cm–3. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 63 Табела 7. Антимикробна активност лиганада L1l–L4l и одговарајућих комплекса паладијум(II)-јона 1-4 (µg/cm3) Species L 1 C 1 L 2 C 2 L 3 C 3 L 4 C 4 Doxycycline MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC Escherichia coli ATCC 25922 2500 2500 1250 1250 2500 5000 2500 2500 1250 2500 1250 2500 5000 5000 312.5 312.5 25 25 Enter. faecalis ATCC 29212 1250 1250 1250 1250 2500 >5000 625 >5000 156.3 >625 625 >5000 1250 5000 156.3 1250 50 50 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 5000 5000 1250 1250 2500 5000 1250 2500 2500 2500 2500 5000 5000 >5000 312.5 1250 12,5 50 Proteus mirabilis 5000 5000 1250 1250 >5000 >5000 2500 >5000 >5000 >5000 2500 >5000 5000 5000 1250 2500 50 >50 Escherichia coli 625 >5000 625 1250 312.5 >2500 1250 >5000 1250 >5000 2500 >5000 625 >5000 312.5 >2500 12,5 12,5 Bifidobact. animalis subsp. lactis 78 > 625 78 >625 >5000 >5000 1250 2500 5000 5000 2500 5000 5000 >5000 625 2500 0,024 >0,19 Lactobacill. plantarum 9.8 78 4.9 >39.1 78 >625 78 2500 2500 >5000 78 5000 1250 >5000 312.5 >2500 0,012 >0,098 Bacillus subtilis IP 5832 78 > 625 39.1 >312.5 625 >5000 78 >5000 2500 >5000 78 >5000 1250 >5000 312.5 >2500 0,003 0,024 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 64 Табела 8. Антифунгална активност лиганада L1–L4ڄодговарајућих комплекса паладијум(II)-јона 1-4 (µg/cm3) Species L1 C1 L2 C2 L3 C3 L4 C4 Fluconazole MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC Sacchar. boulardii 5000 5000 1250 1250 625 625 625 625 312.5 1250 625 625 625 1250 312.5 312.5 6.25 > 50 Candida albicans 5000 >5000 2500 2500 1250 2500 1250 1250 1250 1250 625 1250 2500 2500 625 625 3.125 > 50 Aspergillus fumigatus 1250 >5000 2500 >5000 156.3 625 312.5 625 39.1 78 39.1 78 39.1 78 39.1 39.1 >500 >500 Aspergillus flavus >500 0 >5000 625 1250 312.5 2500 312.5 625 1250 1250 156.3 312.5 2500 2500 312.5 312.5 >500 >500 Aspergillus restrictus >500 0 >5000 312.5 625 156.3 625 156.3 312.5 1250 1250 312.5 625 1250 2500 39.1 39.1 >500 >500 Aspergillus niger >500 0 >5000 1250 >5000 625 1250 312.5 625 625 1250 312.5 312.5 1250 2500 312.5 625 >500 >500 Aspergillus niger ATCC16404 >500 0 >5000 1250 >5000 1250 2500 625 625 156.3 156.3 156.3 156.3 312.5 312.5 156.3 312.5 >500 >500 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 65 3.2. Синтеза, карактеризација и антитумосрска активност 3-(1-(2-хидроксиетил-амино)етилиден)хроман-2,4-диона и одговарајућег комплекса паладијума(II) 3.2.1. Синтеза 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-диона и одговарајућег комплекса паладијума(II) Реакцијом 3-ацетил-4-хидрокси-кумарина [91] 1 са еквимоларном количином 2-аминоетанола 2 у метанолу добијен производ 3 у приносу од 96% (Шема 2). Ово једињење је већ познато [92] а спектрални подаци синтетисаног 3-(1-(2-хидрокси- етиламино)-етилиден)хроман-2,4-дион 3 су у складу са подацима из литературе [92]. Структура синтетисаног комплекса 4 је одређена спектроскопски (IR, 1H NMR и 13C NMR) и елементалном анализом, а потврђена рендгенском структурном анализом монокристала. O OH O O H2N OH O O O HN OH 1 2 3 O O O N O Pd Cl H 4 Шема 2. Синтеза лиганда 3 и одговарајућег паладијум(II) комплекса 4 3.2.2. Карактеризација хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-дион- -паладијум(II) комплекса У односу на лиганд 3, добијени паладијум(II)-комплекс 4 је показао значајне разлике у IR спектру. IR спектар паладијум(II)-комплекса комплекс 4 показао присуство Pd-О и Pd-N траке (524 cm-1 и 459 cm-1). Трака 1605 cm-1 припада апсорпцији имино групе (C=N), а трака на 1675 cm-1 одговара апсопрцији која потиче од Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 66 кумаринске лактонске C=О групе. Ови резултати указују да је током реакције формирања паладијум(II)-комплекса енамински резонантни облик лиганда формира имински резонантни облик уз координацију иминског азота за паладијум(II)-јон. Такође, занимљиво је да IR спектри комплекса 4 показаje ширoку траку која потиче од ОН групе на 3300 cm-1. Ипак ово нам не може потврдити да ли је ова трака OH групу кумарина од хидрокси-етил групе лиганда (табела 9). Табела 9. Најважније траке у IR спектримаи њихови таласни бројеви Jeдињење ν(cm-1) NH OH C=O C=N Pd-O Pd-N 3 3412 3380 1661 / / / 4 / 3300 1675 1605 524 459 У 1H NMR спектру паладијум(II)-комплекса 4, широки сигнал на 3,40 ppm потврђује присуство OH групе из хидрокси-етил групе лиганда. Широки синглет 14,62 ppm потиче од протона из NH групе из енаминског облика лиганда 2 није нађена спектру одговарајућeг паладијум(II)-комплекса 4. Такође, сигнал за изменљив протон из OH групе везане за прстен кумарина није присутан. Протони из CH3-C-1' се налазе на 2,50 ppm, што је за 0,27 ppm нижи пложај о односи на исте сигнале у лиганду 3. Слична је ситуација и у случају метиленских протона из етил групе (CH2- C-2'' на 3,68 ppm и CH2- C-1'' на 3.99 ppm) (Табела 10). 13C NMR спектри су показали сигнал CH3-C-1' угљеников на вишој фреквенцији у односу на лиганд 3 (19,6 ppm), као и сигнал угљеника од C-1'' (46,6 ppm). С друге стране, атоми угљеника С-2'' и С-4 су нађени на нижој фреквенцији него ког лиганда 3 (59,0 ppm и 179,5 ppm). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 67 Taбела 10. Разлике у хемијским померањима протона из карактеристичних група лиганда 3 и паладијум(II)-комплекса 4 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ ppm Δ δ ppm Једињење 3 4 2,19 (br s, 1H, OH) 3,40 (br s, 1H, OH) 1,21 2,77 (s, 3H, CH3-C-1') 2,50 (s, 3H, CH3-C-1') 0,27 3,73 (t, 2H, CH2- C-2'') 3,68 (t, 2H, CH2- C-2'') 0,05 4,12 (t, 2H, CH2- C-1'') 3,99 (t, 2H, CH2- C-1'') 0,13 14,62 (br s, 1H, NH) / / br-широка; s-синглет; t-триплет; Ови подаци нас наводе на закључак да је при формирању комплекса 4 дошло до координације лиганда 3 преко азотовог атома из имино групе, кисеониковог атома кумарина везаног у положају С-4", као и кисеониковог атома из хидроксилне групе од хидрокси-етил дела лиганда 3. 3.2.3. Кристална структура хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)-етилиден)хроман- -2,4-дион-паладијум(II) комплекса Молекулска структура 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-дион- паладијум(II) комплекса (4) претпоставњена на бази инфрацрвене и нуклеарне магнетне рецонационe спетроскопије потврђена је на бази рентгенске структурне анализе. Молекулска структурa 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-дион- паладијум(II) комплекса (4) је приказана на слици 16. На слици 17 представљен је начин паковања једињења 4 у кристалу. Паладијум(II)-јон у комплексу 4 има уобичајену квадратно-планарну геометрију, везаним са по једаним N, једним Cl и два О атома (Слика 16). Главни геометријски параметри PdNO2Cl дела у комплексу 4 су дати у Табели 10. Овај део молекула је мало искривљен, али је ипак скоро савршено планаран са максималним одступањем код веза (O1/N1/O2/CI1) за 0,0151 (3) Å. Сви остали параметри (Табела 11) су у опсегу описаним у литератури [93]. Паковање молекула комплекса 4 у кристалу је контролисано O2- Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 68 H2...O4 међумолекулским интермолекулским водоничним везама (геометријски детаљи су дати у Табели 12). Настајање "глава- репа" водоничних веза се представњено је дуж а осе (Слика 17). Слика 16. Структура хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)-етилиден)хроман-2,4-дион- -паладијум(II) комплекса 4 са нумерисаним не-Н атомима Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 69 Слика 17. Паковање молекула комплекса 4. Интермолекуске водоничне везе O2-H2....O4 приказане су испрекиданом линијом. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 70 Tabела 11. Одабрани геометријски параметри за хлоридо-3-(1-(2-хидроксиетиламино)- етилиден)хроман-2,4-дион-паладијум(II) комплекс 4. Дужине веза [Å] Pd—O1 1.950 (3) Pd—N1 1.974 (3) Pd—O2 2.018 (3) Pd—Cl1 2.3069 (11) Углови веза [°] O1—Pd—N1 93.30 (13) O1—Pd—O2 176.33 (12) N1—Pd—O2 83.17 (13) O1—Pd—Cl1 90.00 (9) N1—Pd—Cl1 176.61 (10) O2—Pd—Cl1 93.52 (9) C2’’—O2—Pd 106.2 (2) C4—O1—Pd 124.7 (3) C1’—N1—Pd 126.6 (3) C1’’—N1—Pd 111.3 (2) Торзиони углови [°] Pd—O1—C4—C3 1.5 (6) Pd—O1—C4—C10 -179.1 (3) Pd—N1—C1''—C2'' -18.0 (5) Pd—N1—C1'—C3 7.3 (6) Pd—N1—C1'—C2' -177.3 (3) Pd—O2—C2''—C1'' -50.4 (4) Taбела 12. Гометријски параметри за водоничне везе у комплексу 4 D-H....A D-H (Å) H....A (Å) D ⋅⋅⋅⋅⋅A (Å) θ (°) O2-H2....O4a 0.74(6) 1.84(5) 2.575(5) 171(6) a-1/2+x,y,1/2-z Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 71 3.2.3. In vitro цитотоксичност комплекса паладијума(II) према неким ћелијским линијама рака У циљу in vitro испитивања антиканцерогеног деловања деривата кумарина, 3-(1-(2-хидроксиетиламино)етилиден)хроман-2,4-диона и одговарајућег паладијум(II)- комплекса, на ћелије тумора фибросарком Л929 миша, људски глиом У251 и меланом Б16 миша, наведене ћелије су инкубиране у присуству различитих концентрација и лиганда и комплекса. Третман са комплексом 4 за 24 сата смањила број живих ћелија све три туморске ћелијске линије на дозно-зависан начин, као што је показано мерењем активност митохондријалне дехидрогеназе као и оштећења ћелијске мембране са MTT и LDH тестовима, (Слика 18А, B). С друге стране, лиганд 3 незнатно смањује активност митохондријалне дехидрогеназе у L929 aи B16 ћелијама (Слика 18А) , а није уочено повећано ослобађање LDH од свих ћелијских линија тумора које су тестиране тестиране (Слика 18B). На крају и микроскопски преглед ћелија је показао да комплекс 4, изазва јаку вакуолизацију туморских ћелија (Слика 18C). Наведени резултати показују да је паладијум(II)-комплекс 4 токсичан за L929, U251 и B16 ћелије рака . Паладијум(II)-комплекс 4 индукује апоптозу повезану са оксидативним стресом, деполаризацијом митохондрија и активацијом цаспасе У наставну истраживања испитиван је интрацелуларни механизам одговоран за цитотоксични ефекат комплекса 4 према ћелијама У251 глиома. Анализа на бази проточне цитометрије ћелијског циклуса је показала да комплекс 4 је повећао број апоптозе ћелија са фрагментисаном ДНК (sub-G0/G1) (Слика 19А). Сходно томе, анализа ћелија обојених са анексином V-FITC и пропидијум-јодидом је показала да комплекс 4 индукује значајно повећање у броју и ранo апоптотских ћелија са нетакнутом ћелијском мембраном (annexin+/PI−), и касно апоптотских ћелија са оштећеним ћелијским мембранама (annexin+/PI+) (Слика 19B). Апоптозу индуковану дејством паладијум(II)-комплекса је повезана са активацијом ензима каспазе (Слика 19C). Третман са комплексом 4 проузроковао губитак потенцијала митохондријалне мембране, што је показано повећањем односа зелене/црвене (FL1/FL2) флуоресценције у У251 ћелијама обојеним са митохондрија- везивном бојом DePsipher (Слика 19D). Користећи редокс-осетљив флуорохром DCFDA, утврђено је да комплекс 4 изазвао генерисање реактивних врста кисеоника (ROS) (Слика 19Е), што се може делимично приписати присуством супероксида, као што је показано појавом боје од са супероксид-селективне флуоресцентне боје DHE Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 72 (Слика 19F). Ови подаци показују да паладијум(II)-комплекс 4 индукује апоптозу канцерогених ћелија кроз активацију ензима цаспасе, деполаризацију митохондрија и кроз оксидативни стрес. Слика 18. Комплекс 4 је токсичан за L929, U251 и B16 ћелије рака. (А, B), L929, U251 и B16 ћелије су инкубиране током 24 сата са комплексом 4 или лигандом 3. Ћелијско преживљавање је одређена МТТ (А) или LDH тестом (B). Подаци су средња вредност ± SD вредност за три независна експеримента (*p <0,05 у односу на нетретирану Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 73 контролу). (С) Морфологија нетретираних ћелија или ћелија третираних са 6,25 μM раствром комплекса 4 је процењена коришћењем оптичке микроскопије (С). Слика 19. Комплекс 4 индукује апоптозу повезану са оксидативним стресом, деполаризацијом митохондрија и активацијом ензима каспасе. U251 ћелије су инкубиране у одсуству или у присуству 6,25 μ М (A-C, E- F) или различитих концентрација комплекса 4 (D). После 24 сата, ћелије су обојене са PI (А) или annexin- FITC/PI (В), а извршена анализа ДНК фрагментације проточном цитометријом (А) или фосфатидилсерин екстерном анализом (В). Алтернативно, ћелије су обојене ApoStat (С), DePsipher (D), DHE (E) или DCFDA (F) а активација каспазе (С), деполаризација митохондрија (D), продукција супероксида (Е) или укупна РОС продукција (F) је испитаna проточном цитометријом након 16 сати инкубације. Репрезентативне тачке и хистограми из најмање три експеримента су приказани у (A-C, E-F), док су подаци у (D) су средње + SD вредности из три независна експеримента (p<0,05* у односу на нетретирану контролу). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 74 3.3. Синтезa, карактеризација и антимикробна активност лиганада и комплекса хром(III)-јона (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-(3-метил)-бутанска киселина, H2-S,S-eddv, (Слика 20а) је синтетисна према већ раније описаном поступку [1]. При свом потпуном координовању за централни јон метала, као тетрадентатни лиганд теоријски, у присуству симетричног бидентатног лиганда, теоријски може да гради два геометријска изомера (s-cis и uns-cis) (Слика 20b), при чему задржава S апсолутну конфигурацију на оба угљеникова атома. 3.3.1. Инфра-црвени спектри У циљу одређивања начина координације S,S-eddv за хром(III)-јон симљени су инфрацрвени спектри изолованих [Cr(S,S-eddv)(ox)]-.и [Cr(S,S-eddv)(mal)]-.комплекса. Kао критеријум за координовање узима се положај трака у инфрацрвеним спектрима асиметричних валенционих фреквенција карбоксилних група. Ове траке се налазе у области од 1700-1750 cm−1, уколико су протоноване и некоординоване, односно у области од 1600-1650 cm−1 уколико су координоване за метални јон [29,34]. Такође, ова област у инфрацрвеном спектру је коришћена за разликовање s-cis и uns-cis изомера у комплексима аминополикарбоксилатних киселина [29,38,39,94-96]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 75 Slika 20. (a) Конфигурација H2-S,S-eddv молекулa, (b) четири могућа дијастереомера [Cr(S,S-eddv)L]− комплекса (R = CH(CH3)2; L= оксалато или малонато јон). Комплекси s-cis-К[Cr(S,S-eddv)(ox)].2Н2О и s-cis-К[Cr(S,S-eddv)(mal)].2Н2О показују јаке широке траке у области асиметричних валенционих вибрација за координоване карбоксилне групе S,S-eddv лиганда на 1649 и 1638 cm−1. Наведене траке за оба изолована комплекса указују на C2 молекуласку симетрију комплекса и s-cis координацију S,S-eddv лиганда [34]. Недостатак апсорпционих трака између 1700 и 1750 cm−1 показује да су обе карбоксилне групе S,S-eddv лиганда координоване за хром(III)-јон и не налазе се као као слободна киселина (ова трака за слободну СООН групу лиганда се налази на 1728 cm−1). Такође, јака и оштра трака која потиче од симетричних асиметричних валенционих вибрација координованих карбоксилних група S,S-eddv лиганда леже у очекиваној области (око 1400 cm−1) [34], за s-cis-К[Cr(S,S- eddv)(ox)].на 1398 cm−1и s-cis-К[Cr(S,S-eddv)(mal)].2Н2О на 1379 cm−1. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 76 3.3.2. Електронски апсорпциони, циркуларно-дихроични (CD) спектри и апсолутне конфигурације Елекронски апсорпциони и CDспектри за s-cis-[Cr(S,S-eddp)L]−- (L = оксaлато или малонато лиганди) (1 и 2) су приказани на слици 21 и одговарајући максимуми су дати у Табели 13. Одговарајући подаци за сличнe [Cr(edda-tip)L]− комплексе су дати ради поређења. Слика 21. Електронски апсорпциони (доле) и CD спектри (горе) изолованих Cr(III) комплекса: 1. s-cis-[Cr(S,S-eddv)(ox)]− (–), 2. s-cis-[Cr(S,S-eddv)(mal)]− (---). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 77 Taбела 13. Електронски апсорпциони и CD спектри неких Cr(III) комплекса са оксалтним и малонатним лигандима Комплекс Апсопрциони CD Лит. νa ε νa Δε Δ-(–)589-s-cis-[Cr(S,S-eddv)(ox)]- 18.48 76.5 25.06 64.8 18.25 -1.37 25.06 +0.20 27.70 -0.12 30.96 -0.02 35.71 -0.20 Овај рад Δ-(–)589-s-cis-[Cr(S,S- eddv)(mal)]- 18.45 74.2 24.63 62.0 18.35 -0.93 24.69 +0.13 27.71 -0.02 30.77 -0.06 35.71 +.01 Овај рад Δ-(–)589-s-cis-[Cr(S,S-eddp)(ox)]- 18.93 132.7 25.51 118.3 17.98 -2.08 21.11 +0.15 23.98 -0.03 26.38 +0.37 27.93 +0.01 98 Δ-(–)589-s-cis-[Cr(S,S- eddp)(mal)]- 18.66 106.1 25.13 80.5 18.55 -1.57 21.76 +0.10 23.26 -0.02 25.28 +0.15 27.93 -0.09 98 Δ-(–)589-s-cis-[Cr(edda)(ox)]-b 18.72 88 25.44 74 - (dominant)d + - - 97 Δ-(–)589-s-cis-[Cr(edda)(mal)]-b 18.53 69 25.06 53 18.48 -1.05c 21.27 +0.35c 23.86 -0.03c 25.51 +0.05c 27.85 -0.09c 97 a у cm-1 x 10-3 b делимично разлагање c вредности су приближне збoг делимичног разлагања узете из литературе [97] У јаком лигандном пољу октаедарске симетрије за хром(III)-јон очекују два спински дозвољена d-d електронска прелаза: 4A2g →4T2g на нижој енергији и 4A2g → 4T1g на вишој енергији. Хром(III)-edda-тип комплекси са s-cis геометријом имају молекулску симетрију не већу од С2. Дакле, чак шест електронских апсорпционих трака (спински-дозвољеног порекла) може се очекивати од 4T2g(Oh) and 4T2g(Oh) електронских прелаза [1]. За s-cis-Cr(III)-edda-тип комплекса се не очекује цепање траке ниже енергије под нормалним експерименталним условима. Међутим, електронски апсорпциони спектри [Cr(edda-type)L]-- комплекса могу да се користе за разликовање Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 78 s-cis од uns-cis изомера. Експериментално је утврђено да апсорпциони спектри s-cis изомера имају максимумe првe апсорпционе траке на дужим таласним дужинaма од одговарајућих uns-cis изомера [1,10,19,97]. Изглед апсорпционих спектара s-cis-[Cr(S,S-eddp)L]−-комплекса са две симетричне апсорпционе траке, указује да изоловани комплекси имају псеудо- октаедарску симетрију (Слика. 21 и Табела 13). Такође, на основу поређења положаја максимума апсорпциионих трака и моларног апсопционог коефицијента неколико [Cr(edda-type)L]-- комплекса (Табела 13) може се закључити да изоловани [Cr(S,S- eddv)(ox)]- и [Cr(S,S-eddv)(mal)]--комплекси поседују s-cis геометрију. Очекивано, CD спектри изолованих [Cr(S,S-eddv)(ox)]- и [Cr(S,S-eddv)(mal)]- (1,2, Слика 21) комплекси показују веће разлагање апсорпциионих трака од одговарајућих електронских апсорпционих спектара. Комплекси [Cr(edda-tip)L] са s-cis геометријом имају три пара хелатних прстенова који дају енантиомере са ΛΛΛ или ΔΔΔ апсолутним конфигурацијама [57]. Апсолутна конфигурација [Cr(edda-type)L]--комплекса је претпостављена на основу спектралних сличности хрома(III) комплекса са d3 електронском конфигурацијом и кобалт(III)-комплекса са d6 ниско-спинском електронском конфигурацијом [99-101]. Доминантан CD пик у оквиру прве апсорпционе траке одређује укупан CD знак нижег енергетског прелаза Oh порекла. Са позитивним доминантним или укупним CD пиком изолованим s-cis-[Cr(edda-type)L]-комплексимa приписана је Λ апсолутна конфигурација [97,98]. Овакво означавање апсолутних конфигурација изолованих Cr(III)-комплекса на основу облика и знака CD спектара, је у сагласности са чињеницом да стереоспецифични лиганди са S конфигурацијом око атома угљеника граде комплексне јонe са ΔΔΔ (нето Δ ) апсолутном конфигурацијом [10]. Ова чињеница потврђена је резултатима ренгенске структурне анализе комплекса Δ-(–)-s-cis-K[Cr(S,S-eddp)(ox)]x0.5H2O ((S,S-eddp = (S,S)-етилендиамин-N,N'- ди-2-пропионато јон) [98]. Како су S,S-eddp and S,S-eddv лиганди структурно слични може се претпоставити да формирају комплексе са истим геометријским конфигурацијама и конформацијама за сва три петочлана хелатна прстена а поређење њихових CD спектара Cr(III) комплекса може да отвори могућност за израчунавање С- вициналног ефекта на ротациону јачину. Нажалост, енантиомери s-cis-Cr-edda комплекса са додатним оксалатним и малонатним лигандима нису стабилни [97] и ово поређење није могуће. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 79 Изоловани (–)589-s-cis-[Cr(S,S-eddp)(L)]- [14] и (–)589-s-cis-[Cr(S,S-eddv)(L)]- - комплекси (L = оксалатo или малонатo) не показују тенденцију рацемизације у воденом раствору. У CD спектрима види се смањење CD интензитета (Табела 13) од оксалато до малонато комплекса. Ово смањење се може повезати са повећањем величине дикарбоксилатног хелатног прстена и већом флексибилношћу малонатног у односу на оксалатни прстен. Иако се очекује C-вицинални ефекат будe мали, из Табеле 13. може се видети да повећање величине алкил групе на хиралном атому угљеника постоји прилично смањењује интензитет CD пикова. Ипак да ови примери нису још увек довољни да се са сигурношћу изведе општи закључак о величини вициналног ефекта. 3.3.3. In vitro испитивање антимикробне активности Резултати иn vitro испитивања антибактеријске и антифунгалне активности четири хром(III) комплекса 1-4 су приказани у Табели 14 и 15. Ради поређења, МИК и ММК наведени вредности активности и за доксициклин и флуконазол у Табели 14 и 15. Сви тестирани хром(III) комплекса 1-4 су показали ниско антимикробно дејство. МИК и ММК су од 250 до >1000 μg cm-3. Није било разлике у активностима између комплекса и између групе микроорганизма (бактерија, квасца, гљива). На ове комплексе, мало осетљивије су Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bacillus cereus и Aspergillus restrictus (MИК 250-500 μg cm-3). Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 80 Табела 14. Антибактеријска активност изолованих хром(III) комплекса Врста K[Cr(S,S- eddp)ox] (3) 1 K[Cr(S,S- eddp)mal] (4) 2 Doxycycline MICa MMb MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC Sarcina lutea 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 <0.44 8 7.81 Enterococcus faecalis >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 7.81 62.5 Bacillus subtilis 1000 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 0.112 1.953 B. subtilis ATCC 6633 1000 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 1.953 31.25 Staphylococcus aureus >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 0.224 3.75 S. aureus ATCC 25923 1000 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 0.224 3.75 Escherichia coli >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 7.81 15.62 5 E. coli ATCC 25922 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 15.625 31.25 Pseudomonas aeruginosa 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 250 >250 P. aeruginosa ATC C 27853 1000 >100 0 1000 >100 0 1000 >100 0 1000 >100 0 62.5 125 Proteus mirabilis >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 250 >250 P. mirabilis ATCC 12453 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 15.625 62.5 Salmonella enterica >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 15.625 31.25 Salmonella typhymirium >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 15.625 125 Bacillus cereus 500 1000 >100 0 >100 0 500 >100 0 500 >100 0 0.977 7.81 B. pumilus NCTC 8241 1000 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 0.112 7.81 Lactobacillus rhamnosus >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 7.81 31.25 Lactobacillus plantarum >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 0.448 7.81 Bifidobacterium animalissubsp. lactis 250 250 500 >100 0 500 500 500 1000 31.25 62.5 Bacillus subtilis IP 5832 1000 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 >100 0 1.953 15.62 5 aMIC values (μg/cm3) means inhibitory activity. bMMC values (μg/cm3) means microbicidal activity. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 81 Табела 15. Aнтифунгална активност испитиваних хром(III) комплекса Врста K[Cr(S,S- eddp)ox] (3) 1 K[Cr(S,S- eddp)mal] (4) 2 Fluconazole MICa MMCb MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC Candida albicans 500 >1000 500 1000 >1000 >1000 >1000 >1000 62.5 1000 C. albicans ATCC 10231 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 31.25 1000 Saccharomyces boulardii >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 31.25 1000 Aspergillus niger >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 500 1000 A. niger ATCC 16404 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 62.5 62.5 Aspergillus restrictus 1000 1000 250 >1000 500 >1000 >1000 >1000 500 2000 Aspergillus fumigatus >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 500 1000 Aspergillus flavus 1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 1000 1000 a MIC values (μg/cm3) means inhibitory activity. b MMC values (μg/cm3) means microbicidal activity. 3.4. Синтезa, карактеризација и антимикробна активност лиганада и комплекса кобалт(III)-јона Kao што је то већ речено (поглавље 3.3 Дискусије резултата) (S,S)-етилендиамин- N,N’-ди-2-(3-метил)-бутанска киселина, H2-S,S-eddv, као и (S,S)-етилендиамин-N,N’-ди- 2-3-пропанска киселина, H2-S,S-eddp, (Слика 22а) је синтетиснa према већ раније описаном поступку [74]. При свом потпуном координовању за централни јон метала, као тетрадентатни лиганд теоријски, у присуству симетричног бидентатног лиганда, теоријски могу да граде два геометријска изомера (s-cis и uns-cis) (Слика 22b), при чему задржавају S апсолутну конфигурацију на оба угљеникова атома. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 82 NH2 CH2 CH2 NH2 CHHC CH3CH3 CC O HO O OCl а) N N O O Co O OH H CH3 H CH3 O O N N Co O O H CH3 H CH3 s-cis N N O O Co O O H CH3 H CH3 O O N N Co O O H CH3 H CH3 b) uns-cis Слика. 22. (a) Конфигурација H2-S,S-eddp молекулa, (b) четири могућа дијастереомера [Co(S,S-eddv)L]− комплекса; L= оксалато или малонато јон 3.4.1. Инфра-црвени спектри Инфрацрвени спектри изолованих комплекса су снимљени ради одређивања начина координације S,S-eddp и S,S-eddv лиганада. Област асиметричних валенционих вибрација карбоксилних група је успешно коришћена за разликовање координованих (1700-1750 cm-1) од некоординованих (1600-1650 cm-1) карбоксилних група за јоне метала [39, 102, 103]. Такође, ова област у инфрацрвеном спектру је коришћена за Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 83 разликовање s-cis и uns-cis геометријских изомера аминополи-карбоксилатних комплекса [38, 95, 97, 103]. Најважнијe траке у инфрацрвеним спектрима испитиваних комплекса су приказане у Табели 16. Као што се види, сви S,S-eddp иS,S-eddv Co(III) комплекси показују једну јаку и широку траку у очекиваној области асиметричних валенционих вибрација координованих карбоксилних група [34,102]. Постојање једне траке у овој области у инфрацрвеним спектрима изолованих комплекса сугерише C2 молекулску симетрију комплекса као и s-cis координацију S,S-eddp и S,S-eddv лиганада [34,38,102] за централни Co(III)-јон. Недостатак апсорпционих трака између 1700-1750 цм-1 (Табела 16) указује да су обе карбоксилне групе S,S-eddp и S,S-eddv лиганада координоване за Co(III)-јон и нису присутне као слободне киселине. Taбела 16. Најважнијe траке у инфрацрвеним спектрима испитиваних комплекса (cm-1) Комплекс υasym (COOM) υsym (COOM) s-cis-K[Co(S,S-eddp)(ox)]·0,5H2O 1654 1410 s-cis-K[Co(S,S-eddp)(mal)]·4H2O 1627 1385 s-cis-K[Co(S,S-eddv)(ox)]·3H2O 1646 1400 s-cis-K[Co(S,S-eddv)(mal)]·4H2O 1633 1400 Такође, јаке и оштре траке које потичу од симетричних валенционих вибрација координованих карбоксилних група S,S-eddp и S,S-eddv лиганада леже у очекиваној области (око 1400 cm-1) [34] (Табела 16). 3.4.2. Електронски апсорпциони, циркуларно-дихроични (CD) спектри и апсолутне конфигурације комплекса Елекронски апсорпциони и циркуларно-дихроични (CD) спектри за s-cis-[Cо(S,S-eddp)L]- и s-cis-[Co(S,S-eddv)L]- комплексе (L = оксaлато или малонато лиганди) су приказани на слици 23а одговарајући максимуми су дати у Табели 17. Одговарајући подаци за сличне [Cо(edda-тип)L]− комплексе су дати ради поређења. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 84 Табела17. Електронски апсорпциони и CD спектри неких Cо(III) комплекса са оксалтним и малонатним лигандима Комплекс Апсопрциони CD Лит. λ (nm) ε λ (nm) Δε Δ-(–)589-s-cis-[Co(S,S-eddp)(ox)]- 535 136.2 384 153.9 577 -7.44 488 +3.51 403 -0.89 365 -0.87 280 +2.68 Овај рад Δ-(–)589-s-cis-[Co(S,S- eddp)(mal)]- 528 171.2 384 152.4 596 -0.94 533 +1.10 378 -0.66 339 0.00 296 -0.27 Овај рад Δ-(–)589-s-cis-[Co(S,S-eddv)(ox)]- 535 136.1 383 139.3 592 -2.32 518 +1.85 384 -1.36 335 -0.20 300 -1.61 Овај рад Δ-(–)589-s-cis-[Co(S,S- eddv)(mal)]- 528 171.2 385 152.5 625 -0.70 619 +3.49 398 -2.08 336 -0.03 302 -1.96 Овај рад Δ-(–)589-s-cis-[Co(edda)(ox)]- a 558 128 384 139 560 -5.20 485 -1.60 397 -0.50 1, 9,17, 19 Δ-(–)589-s-cis-[Co(edda)(mal)]- a 560 134 385 110 566 -4.70 495 -2.10 377 +0.40 1, 9,17, 19 Δ-(–)-s-cis-[Co(dmedda)(ox)]- a,b 569 110 390 150 558 -2.72 479 +0.20 434 -0.10 1, 16 Δ-(–)-s-cis-[Co(deedda)(mal)]- a,c 565 98 389 140 564 -2.42 434 +0.10 400 -0.20 366 +0.20 1, 16 aСве вредности су приближне јер су очитане са спектара и узете су из лит. [2] b dmedda = N,N'-диметил-eтилендиамин-N,N'-диацетато јон c deedda = N,N'-диетил-етилендиамин-N,N'-диацетато јон Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 85 Слика 23. Електронски апсорпциони и циркуларно-дихроични (CD) спектри изолованих кобалт(III)-комплекса За кобалт(III)-јон, у јаком лигандном пољу октаедарске симетрије, очекују се два спински дозвољена d-d електронска прелаза: 1A1g→1T1g ниже енергије и 1A1g→1T2g више енергије. Са опадањем молекулске симетријe комплекса од октаедарске до C2 код кобалт(III)-edda-типа комплекса s-cis-геометрије, може се очекивати шест електронских апсорпционих тракa (спински дозвољеног порекла) од 1T1g(Oh) и 1T1g(Oh) електронских прелаза [1]. Досадашња испитивања су показала да разлагање апсорпционих трака код кобалт(III)-edda-типа комплекса s-cis-геометрије се не очекује [1, 104, 105]. Као критеријум за разликовање s-cis од uns-cis геометријских изомера [Co(edda-тип)L]- комплекса користи се положај првог максимума прве апсорпционе траке [1, 104, 105] знајући да ће s-cis изомери имати први максимум на дужим таласним дужинама (нижим енергијама) од одговарајућих uns-cis изомера. Апсорпциони спектри изолованих Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 86 [Cо(edda-тип)L]− комплекса (Слика 23 и Табела 17) показују две широке и симетричне апсорпционе траке код свих комплекса, што сугерише псеудо-октаедарску симетрију комплекса. Поређењем положаја максимума апсорпционих трака и коефицијената моларне апсорптивности неколико [Cо(edda-тип)L]− комплекса (Tабела 17) указују на закључак, са великом сигурношћу, да изоловани [Cо(S,S-eddp)L]- и s-[Co(S,S-eddv)L]- комплекси поседују s-cis геометрију. Очекује се веће разлагање апсорпционих трака у CD спектрима изолованих [Cо(S,S-eddp)L]- и [Co(S,S-eddv)L]- комплекса (Слика 23 и Табела 17) него код одговарајућих електронских апсорпционих спектара. Енантиомери [Co(едда-тип)L]- комплекса са s-cis геометријом имају три пара хелатних прстенова са ΛΛΛ или ΔΔΔ хиралитетом [57]. Претходне студије су показале да када је доминантан или укупан CD пик позитиван код s-cis-[Co(edda-тип)L]- приписана им је Λ апсолутна конфигурација [9, 16, 17, 19, 39]. На основу облика и знака CD спектара изолованих кобалт(III)- комплекса можемо приписати ΔΔΔ (нето Δ) апсолутне конфигурације. Ово је у складу са чињеницом да стереоспецифични лиганди са S апсолутном конфигурацијом угљеника граде хелатне комплексне јоне са ΔΔΔ (нето Δ) апсолутном конфигурацијом [10, 106]. 3.4.3. Кристална структура s-cis-оксалато-(S,S)-етилендиамин-N,N’-ди-2-пропаноато- -кобалтат(III)-семихидрата, s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O Молекулска структура s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса са одгова- рајућим нумерисањем атома приказана је на слици 24, док су одабрани геометријски параметри дати у Табели 18. Co(III) јон је смештен у дисторгованом октаедарском окружењу које образује два карбоксилатна кисеоника и два атома азота из депротонованог S,S-eddp лиганда и два кисеоникова атома из депротонованог оксалатног лиганда. Комплекс поседује s-cis геометријску конфигурацију која је доминантна међу комплексима метала са edda-типом лиганaдa и формирају петочлане хелатне прстенове. У овој геометрији карбоксилатни атоми кисеоника О1 и О3 од тетрадентатног eddp лиганда заузимају аксијалне позиције са углом О1-Со1-О3 од 176,8(2)°. Екваторијалне координационе положаје заузимају парови азотових донаторских атома из eddp лиганда и кисеоникових донорских атома из оксалатног лиганада (Слика 24). Комплекс показује значајно угаоно одступање од идеалне октаедарске геометрије, са угловима у опсегу 86,1(2) до 87,9(3)°. Со-О и Со-N дужине Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 87 веза (Табела 18) су упоредиве са онима које су нађене у сличним комплексима укључујући edda-тип лиганада. У Табели 19 дате су дужине и углови веза комплекса кобалта са лигандима edda-типа у свим претходно објављеним стуктурама октаедарских Со(III)-комплекса депонованих у бази структурних података у Кембриџу (CSD) [7]. У комплексима са s-cis геометријом дужине Со-О и Со-N веза су у опсегу 1,87 до 1,91 Å односно 1,94 до 2,00 Å. Сличне вредности дужине веза су нађене у четири комплекса исте геометрије, док код одговарајућих комплекса ниже uns-cis геометрије дужине Со-О и Со-N веза су у опсегу 1,89 до 1,91Å односно 1,90 до 1,95Å, (Табела 19). Со-N везе су у просеку нешто краће за комплексе uns-cis геометрије него код комплекса са s-cis геометријом. У s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплексу екваторијални етилендиамински прстен (Co1/N1/C4/C5/N2) jе у увијеној конформацији са торзиионим углом N1–C4– C5–N2 од 51,9(8)°. Као што је претходно нађено за edda-тип комплексе са s-cis геометријом два аксијална петочлана прстена (Co/N/C/C/O) су више у планарној конформацији, мада је један ипак са приметном разликом у N1–C2–C1–O1 и N2–C6– C8–O3 торзионим угловима који имају вредности од -6.0(9)о одноано -19.7(9)°. Оксалатни прстен скоро планаран са O5–C9–C10–O7 торзионим углом од -4.5(9)°. У циљу процене напона прстенова, који је прихваћен као главни разлог дистрибуције геометријских изомера код комплекса edda-типа, битно је испитати збир углова веза у хелатним прстеновима као што су сугерисали Weakliem иHoard [2].У случају s-cis- К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса збир углова веза у екваторијалном Co/N1/C4/C5/N2 прстену је 517,8° што указује на значајнији напон с обзиром на идеалну израчунату вредност од 527,9°. С друге стране, збир углова веза код аксијалних Co/N1/C2/C1/O1 и Co/N2/C6/C8/O3 прстенова је 537,80 односно 535,1°, што је више у складу са идеалном вредношћуод 538,4° нађене за планарне петочлане ацетатне хелатне прстенове [2]. Важно је напоменути да по саставу сличан комплекс са мање фаворизованом геометријом, uns-cis-K[Co(edda)ox].H2O [108] има одговарајући етилендиамински прстен под нешто мањим напоном (518,9°) него у изолованом s-cis- К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплексу. Као што се очекивало, знатно виши напон прстенова постоји код два ацетатна прстена у uns-cis-K[Co(edda)ox].H2O комплексу, са сумом углова од 528,7 и 527,4°. Задња вредност одговара прстену G са највећим напоном (смештен у равни са етилендиаминским прстеном) [2], док су сви углови веза Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 88 код Co1/O1/C1/C2/N1 прстену изолованом s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса мањи у просеку за 2,1°. Слика 24. Молекулска структура s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса Табела18. Одабране дужине (Å) и углови веза (°) за s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса Co1–O1 1.894(5) O1–Co1–N1 86.4(2) Co1–O3 1.876(5) O3–Co1–N2 86.1(2) Co1–N1 1.936(6) N1–Co1–N2 87.9(3) Co1–N2 1.948(5) O5–Co1–O7 86.3(2) Co1–O5 1.893(5) O1–Co1–O3 176.8(2) Co1–O7 1.900(5) N1–Co1–O5 176.5(2) C1–O1 1.275(9) N2–Co1–O7 175.3(2) C1–O2 1.234(9) Co1–O1–C1 115.4(5) C8–O3 1.294(10) Co1–O3–C8 116.3(5) C8–O4 1.217(10) C2–C1–O2 118.5(7) C9–O5 1.283(9) C6–C8–O4 121.1(8) C10–O7 1.285(8) C2–N1–C4 112.4(5) C2–N1 1.480(8) C5–N2–C6 111.7(6) C6–N2 1.496(8) Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 89 Табела 19. Дужине и углови веза у раније синтетисаним Co(III)-edda-тип комплекса узете из Cambridge Structural Database [107]. CSD refcode Co–O1 Co–N1 Co–O2 Co–N2 O1–Co–N1 N1–Co–N2 N2–Co–O2 O1–Co–O2 s-cis CEWTUT(+) 1.90 1.97 1.88 1.96 85.3 86.4 86.1 177.3 JATMOG(+) 1.89 1.97 1.88 2.00 86.1 87.6 86.1 177.4 WARRUC (+) 1.91 1.98 1.87 1.94 86.5 87.4 87.2 178.4 WEWYUS(+) 1.89 1.99 1.89 1.96 87.1 86.3 86.7 176.5 WEWZAZ (+) 1.91 1.97 1.90 1.97 85.7 86.7 85.9 175.4 YEFDAO (+) 1.90 1.98 1.90 1.98 86.3 86.0 85.5 176.7 EKIFOT (0) 1.88 1.94 1.88 1.95 86.5 86.9 86.3 178.2 NODZIP (0) 1.88 1.96 1.88 1.98 86.7 86.1 87.2 178.2 SOMGAC (0) 1.91 1.95 1.89 1.95 86.9 87.3 86.5 177.2 JIRKEB (0) 1.90 1.94 1.89 1.94 86.3 87.5 87.4 178.6 NANNOF (–) 1.89 1.94 1.88 1.92 86.4 88.3 87.1 178.5 NANPAT (–) 1.90 1.96 1.90 1.94 87.0 88.0 87.0 176.3 VAQBUK (–) 1.90 1.98 1.88 1.97 86.4 86.2 86.0 176.8 VAQCAR (–) 1.90 1.98 1.89 1.96 86.0 87.0 86.2 176.4 VAQCEV (–) 1.90 1.96 1.87 1.96 85.6 86.5 85.6 176.7 WARROW (–) 1.89 1.98 1.88 1.98 86.5 86.7 85.3 176.1 uns-cis * EACPCO (+) 1.91 1.94 1.90 1.94 84.7 87.7 84.9 90.2 JITPUX (0) 1.91 1.92 1.88 1.95 85.1 87.4 86.2 90.3 NANUL (–) 1.90 1.90 1.90 1.93 84.4 88.7 85.0 92.2 ZENBOJ (–) 1.90 1.91 1.91 1.91 85.4 88.3 85.0 93.1 *у uns-cis комплексима O1 атом је посматран да припадаокаедарској равни (G прстен). У паковању кристала комплексни анјони су директно повезани са две N−H…O водоничне везе које укључују оба етиленедиамин N−H доноре N1−H1 = 0.91, N1…O6 = 2.925(8), H1…O6 = 2.02 Å, N1−H1…O6i = 172°, (i) x, y, z−1 и N2−H2 = 0.91, N2…O2 = 2.886(8), H2…O2 = 2.08 Å, N2−H2…O2ii = 146°, (ii) x+1/2, −y+3/2, −z+2]. N1−H1…O6 интеракција са кисеоником оксалата као акцептором повезује молекуле у ланац дуж c осе. Додатна N2−H2...O2 интеракција, која укључује као акцептор О2 из карбоксилне групе пропионата, повезује ове ланце дуж a осе доводи до дводимензионалне структуре која је паралелно 101 кристалографској равни.Молекули воде у кристалној решетки служи као везе од суседних молекула преко пара симетрично везаних O9−H9…O8 водоничних веза[O9−H9 = 0.86, O9…O8 = 2.869(8), H9…O8 = 2.05 Å, O9−H9…O8iii 159°, (iii) x+1, y, z−1]. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 90 Слика 25. Водоничне везе у кристалној структури s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса (калијумови јони су изостављени ради јасноће) Слика 25 приказује фрагмент тродимензионалне кристалне структуре изолованог s-cis-К[Cо(S,S-eddp)(ox)].0,5H2O комплекса са главним водоничниим везама. Атоми кисеоника О4 и О3 другог пропионат прстена, као и О9 из воде остају без одговарајућег донора атома водоника лепљењем и стога ови атоми формирају прилично кратке контакте са катјоном калијумoм са K…O растојањем од 2,742(5), 2,678(7) и 3,007(8) Å. Два најкраћа контакта припадају пропионато карбоксилној групи која је део Co/N2/C6/C8/O3 хелатног прстена. Утицај ових електростатичких контаката може бити у вези са горе поменутим разликама у N–C–C–O торзионим угловима два аксијална хелатна прстена који показују повећано савијање Co/N2/C6/C8/O3 у односу на Co/N1/C2/C1/O1 хелатни прстен. Слична разлика у планарности аксијалних хелатних прстенова је примећенa код изостукрурног комплекса s-cis-K[Cr(S,S-eddp)(ox)]·0,5H2O [98], где први аксијални пропионато прстен (торзиони угао N–C–C–O = -25,4° ) образује два К...О контакта са 2,63 и 2,71Å за разлику од другог (торзиони угао N–C–C–O = 9,0°) где су карбоксилатни кисеоникови атоми укључени у грађење водоничних веза. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 91 3.4.4. In vitro испитивање антимикробне активности Резултати in vitro испитивања антибактеријске и антифунгалне активности Н2-S,S-eddp лиганда и одговарајућих s-cis-[Cо(S,S-eddp)(ox)]-.и s-cis-[Cо(S,S-eddp)(маl)]- комплекса су приказани у Табели 20. Ради поређења, МИК и ММК наведени вредности активности и за доксициклин и флуконазол у Табели 20. Уопште, Н2-S,S-eddp лиганд и одговарајућих s-cis-[Cо(S,S-eddp)(ox)]-.и s-cis- [Cо(S,S-eddp)(маl)]-.комплекси да имају широк спектар активности, од благе до умерене активности ка већини сојева [110,111,114]. Испитивана једињења су мање ефикасна од комерцијалних антибиотика против бактерија и гљивица [109-111]. Иако су неки комплeкси кобалта(III), у поређењу са позитивном контролом, показали већи ефекат инхибиције против свих патогена [113]. Taбела 20. In vitro антимикробна активност Н2-S,S-eddp лиганда и одговарајућих s-cis-[Cо(S,S-eddp)(ox)]-.и s-cis-[Cо(S,S-eddp)(mal)]-.комплекса Врсте Н2-S,S-eddp [Cо(S,Seddp)(ox)] - [Cо(S,S-eddp)(маl)]-. Доксици' клин Флуко- назолl MIC* MMC** MIC MMC MIC MMC MIC/MMC MIC/MMC Escherichia coli 1000 >1000 1000 >1000 1000 >1000 7.81/15.63 - Escherichia coli ATCC 25922 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 15.63/31.25 - Pseud. aeruginosa ATCC 27853 1000 >1000 1000 >1000 1000 >1000 62.5/125 - Enter. faecalis ATCC 29212 125 >1000 31.25 >1000 125 >1000 7.81/62.5 - Proteus mirabilis 15.63 >1000 1000 >1000 1000 >1000 250/> 250 - Lactobacillus plantarum 7.81 500 500 >1000 7.81 62.5 0.45/7.81 - Bacillus subtilis IP 5832 500 >1000 250 500 250 >1000 1.95/15.63 - Saccharomyces boulardii 500 >1000 500 >1000 500 >1000 - 31.25/1000 Candida albicans 500 >1000 500 >1000 500 >1000 - 62.5/1000 Aspergillus restrictus 1000 1000 1000 1000 1000 1000 - 500/2000 Aspergillus niger >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 - 500/1000 Aspergillus flavus 1000 1000 1000 1000 >1000 >1000 - 1000/1000 Aspergillus fumigatus >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 - 500/1000 - MIC* μg/ml, MMC**μg/ml, - није тестиран; Свa тестиранa једињења показала селективну антибактеријску активност у односу на тестиранe врстe. МИK и ММK вредности за лиганд и комплексe биле у опсегу 7,81 до > 1000 μg/mL. Није било разлике у активностима између лиганда и одговарајућих комплекса. Неки радови о антимикробним особинама кобалт(III)-комплекса често наглашавају повећану ефикасност кобалт јона након координације на одређени лиганд у односу на сам лиганд [115], што у овом раду није случај. Испитивани комплекси показују известан инхибиције раста неких микроорганизама [109]. Enterococcus faecalis ATCC 29212 су биле осетљивије од Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 92 осталих бактерија, што је у складу са радовима [113]. МИК вредности су у распону од 31,25 до 125 μg/mL, али ММК вредности су> 1000 μg/mL. Тестирана једињења не утичу на раст клиничких изолата и стандардних сојева грам-негативних бактерија или њихове активности су врло ниске (МИК и ММК у распону од 1000 до> 1000 μg/mL). Proteus mirabilis (клинички изолат) је посебно осетљив на лиганд (МИK је 15,63μg/mL, али ММК је > 1000 μg/mL). И пробиотици су показали већу осетљивост слично као тестирана једињења према другим микроорганизмима. МИК вредности биле су у распону од 7,81 до 500 μg/mL, ММК вредности су од 62,5 до > 1000 μg/mL. Најосетљивији се показао Lactobacillus plantarum према Н2-S,S-eddp лиганду и одговарајућем s-cis-[Cо(S,S-eddp)(ox)]-- комплексу (МИК је 7,81 μg/mL). Тестирани Н2-S,S-eddp лиганд и одговарајући кобалт(III) комплекси су показали ниску антигљивичну активност. МИК су од 500 до> 1000 7,81 μg/mL, док ММК су од 1000 до> 1000 7,81 μg/mL. Имајући у виду ниску антимикробну активност Н2-S,S-eddp лиганда и одговарајућих кобалт(III) комплекса, сматрали смо да испитивање антимикробне активности Н2-S,S-eddv лиганда и одговарајућих кобалт(III) комплекса није вредно труда. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 93 4. ЗАКЉУЧАК У првом делу ове Докторске дисертације описана је синтеза и карактеризација паладијум(II)-комплекса, прво са N,N бидентатним лигандима едда-типа опште формуле [PdCl2(R2-S,S-eddl)]- а потом и са дериватом кумарина, 3-(1-(2-хидрокси- етиламино)етилиден)хроман-2,4-дионом. [PdCl2(R2-S,S-eddl)]- комплекси су окарактерисани микроанализом, инфрацрвеном и електронском апсорпционом спектроскопијом. Извершено је in vitro тестирање антимикробне активности синтетисаних лиганада и одговарајућих [PdCl2(R2-S,S-eddl)]- комплекса против 15 врста бактерија и гљивица. Паладијум(II) комплекси имају статистички значајно већу активност него одговарајући лиганди. Паладијум(II)-комплекс са 3-(1-(2-хидрокси-етиламино)етилиден)хроман-2,4- дионом окарактерисани микроанализом, инфрацрвеном и електронском апсорпционом 1H и13C NMR спектроскопијом. Предложена структура комплекса је потврђена на основу резултата рентгенске структурне анализе. Синтетисани комплекс је тестиран in vitro на ћелијама рака, Л929 фибросарком миша, У251 људски глиом и Б16 меланом миша. Резултати испитиваља указују да синтетизовани паладијум(II)-комплекс показује веома значајну антитуморску активност према наведеним ћелијама рака и да може бити потенцијални кандидат за антиканцерогену терапију. У овом раду извршена је синтеза хрома(III)-комплекса са (S,S)-етилендиамин- N,N′-ди-2-(3-метил)бутаноато јон оксалато и малонато лигандима као додатним лигандима. Карактеризација је извршена на бази резултата микроанализе, инфрацрвене и електронске апсорпционе спектроскопије. ΔΔΔ (нето Δ) апсолутна конфигурација изолованих хром(III)-комплекса је предвиђена на основу облика и знака CD спектара и то је у сагласности са чињеницом да стереоспецифични лиганди са S конфигурацијом атома угљеника формирају комплексне јоне са поменутом Δ апсолутном конфигурацијом. Иако се очекује да C вицинални ефекат да буде мали, из овде приказаних резултата може се видети да повећање величине алкил група на хиралном атому угљеника прилично смањује CD интензитете. Али ови примери још увек не увек дозвољавају да са сигурношћу изведемо општи закључак о величини вициалног ефекта. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 94 Резултати су показали да антимикробне активности тестираних хром(III)-комплекса генерално показују ниску антибактеријску и антифунгалну активност. Синтетисани су и октаедарски комплекси кобалта(III) са (S,S)-етилендиамин- N,N'-ди-2-пропионскoм киселином (S,S-eddp) и (S,S)-етилендиамин-N,N'-ди-2-(3- метил)бутернoм киселином (S,S-eddv) који садрже и окалато и малонато лиганде, као додатне бидентатне лиганде. Геометрија комплекса је претпостављена на основу инфрацрвених и електронских апсорпционих спектара,. ΔΔΔ (нето Δ) апсолутна конфигурација изолованих кобалт(III)-комплекса је предвиђена на основу облика и знака CD спектара и то је у сагласности са чињеницом да стереоспецифични лиганди са S конфигурацијом атома угљеника формирају комплексне јоне са поменутом Δ апсолутном конфигурацијом што је потврђено резултатима рентгенске структурне анализе у случају s-cis-K[Co(S,S-eddp)(ox)]·0,5H2O. Резултати испитивања антимикробне активности су показали да тестирани лиганд и кобалт(III) комплекси немају различит степен антимикробне активности према тестираним врстама микроорганизама. Није било разлике у активностима лиганда и комплекса. У принципу, тестирани лиганд и комплекси, показују ниско или умерено антимикробно дејство. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 95 5. Л И Т Е Р А Т У Р А 1. D. J. Radanović, Coord. Chem. Rev. 54 (1984) 159 2. H.A. Weakliem, J. L. Hoard, J. Am. Chem. Soc. 81 (1959) 549 3. R. Nagao, F. Marumo, Y. Saito, Acta Cryst. Sect. B 28 (1972) 1852 4. L. J. Halloran, R. E. Caputo, R. D. Willett, L. I. Legg, Inorg. Chem. 14 (1975) 1762 5. M. Mori, M. Shibata, E. Kyuno, F. Maruyama, Bull. Chem. Soc. Jpn. 35 (19629 75 6. J. I. Legg, D. W. Cooke, Inorg. Chem. 4 (1965) 1576 7. J. I. Legg, D. W. Cooke, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 6 (1967) 700 8. J. I. Legg, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 7 (1968) 1452 9. C. W. Van Saun, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 8 (1969) 115 10. P. F. Coleman, J. I. Legg, J. Steele, Inorg. Chem. 9 (1970) 937 11. K. Kuroda, K. Watanabe, Bull. Chem. Soc. Jpn. 44 (1971) 1034; ibid. 44 (1971) 2550 12. K. Kuroda, Bull. Chem. Soc. Jpn. 45 (1972) 2176 13. K. Kuroda, Chem. Lett. (1972) 197; ibid. (1974) 17 14. C. W. Maricondi, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 11 (1972) 688 15. W. T. Jordan, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 12 (1973) 403 16. C. W. Maricondi, C. Maricondi, Inorg. Chem. 12 (1973) 1524 17. W. T. Jordan, J. I. Legg, Inorg. Chem. 13 (1974) 955 18. L. J. Halloran, J. I. Legg, Inorg. Chem. 13 (1974) 2193 19. P. J. Garnett, D. W. Watts, Inorg. Chim. Acta 8 (1974) 293; P. J. Garnett, D. W. Watts, J. I. Legg, Inorg. Chem. 8 (1969) 2534 20. D. J. Radanović, D. S. Veselinović, S. A. Grujić, Bull. Soc. Chim. Beograd 44 (1979) 503 21. G. Srdanov, R. Herak, D. J. Radanović, D. S. Veselinović, Inorg. Chim. Acta 38 (1980) 37 22. J. A. Weyh, Inorg. Chem. 16 (1977) 2968 23. J. A. Weyh, A. K. Newlun, T. J. Baker, T. K. Shioyama, Inorg. Chem. 12 (1973) 2374; J. A. Weyh, R. B. Maynard, T. J. Baker, Inorg. Chem. 15 (1976) 2298 24. K. Igi, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 13 (1974) 425 25. K. Igi, B. E. Douglas, Inorg. Chim. Acta 10 (1974) 109 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 96 26. K. D. Gailey, K. Igi, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 14 (1975) 2956 27. M. Okabayashi, K. Igi, J. Hidaka, Bull. Chem. Soc. Jpn. 52 (1979) 753 28. D. J. Radanović, M. I. Djuran, V. D. Miletić, R. R. Parijez, J. Serb. Chem. Soc. Beograd 2 (1985) 29. D. J. Radanović, M. I. Djuran, D. Č. Stamenović, S. A. Grujić, Bull. soc. Chim. Beograd 6 (1984) 315 30. J. L. Sudmeier, A. J. Senzel, G. L. Blackmer, Inorg. Chem. 10 (1971) 90 31. J. L. Sudmeier, G. Occupati, Inorg. Chem. 7 (1968) 2524 32. J. Fujita, K. Nakamoto, M. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc. 78 (1956) 3295 33. K. Nakamoto, Y. Morimoto, A. E. Martell, J. Am. Chem. Soc. 83 (1961) 4528 34. K. Nakamoto, "Infrared Spectra of Inorganic and Coordination Compounds", John Wiley & Sons , New York, 1963, p. 238 35. D. H. Busch, J. C. Bailar, Jr., J. Am. Chem. Soc. 75 (1953) 4574 36. M. L. Morris, D. H. Busch, J. Am. Chem. Soc. 78 (1956) 5178 37. M. B. Ćelap, S. R. Niketić, T. J. Janjić, V. N. Nikolić, Inorg. Chem. 6 (1967) 2063 38. J. A. Neal, N. J. Rose, Inorg. Chem. 7(1968) 2405; ibid. 12 (1973) 1226 39. D. J. Radanović, B. E. Douglas, J. Coord. Chem. 4 (1975) 191 40. J. A. Broomhead, M. Dwyer, N. Kane-Maquire, Inorg. Chem. 7 (1968) 1388 41. K. Nakamoto, J. Fujita, S. Tanaka, M. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc. 79 (1957) 4904 42. M. Linhard, M. Weigel, Z. Anorg. Allg. Chem. 264 (1951) 321 43. C. J. Ballhausen, C. K. Jørgensen, K. Dan. Vidensk. Selsk. Mat. Phys. Medd. 29 No 14 (1955) 44. W. J. Moffit, C. J. Ballhausen, J. Inorg. Nucl. Chem. 3 (1956) 178 45. H. Yamatera, Bull. Chem. Soc. Jpn. 31 (1958) 95 46. S. Yamada, R. Tsuchida, Bull. Chem. Soc. Jpn. 26 (1953) 15 47. R. A. D. Wentworth, T. S. Piper, Inorg. Chem. 4 (1965) 709 48. T. S. Piper, R. L. Carlin, J. Chem. Phys. 35 (1961) 1809 49. J. A. Weyh, R. E. Hamm, Inorg. Chem. 7 (1968) 2431 50. R. Wernicke, H. H. Schmidtke, P. E. Hoggard, Inorg. Chim. Acta 24 (1977) 145 and references there in 51. C. M. Schafer, C. K. Jørgensen, K. Dan. Vidensk. Selsk. Mat. Phys. Medd. 34 No 13 (1965) 52. C. K. Jørgensen, Adv. Chem. Phys. 5 (1963) 33 53. J. R. Perumareddi, J. Phys. Chem. 71 (1967) 3144 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 97 54. R. Krishnamurthy, W. B. Schaap, J. R. Perumareddi, Inorg. Chem. 6 (19679 1338 55. L. N. Schoenberg, D. W. Cooke, C. F. Liu, Inorg. Chem.7 (1968) 2368 56. G. G. Hawn, C. Maricondi, B. E. Douglas, Inorg. Chem. 18 (19799 2542 57. 1970 IUPAC rules, Pure Appl. Chem. 28 1971) 1; Inorg. Chem. 9 (1970) 1 58. J. I. Legg, B. E. Douglas, J. Am. Chem. Soc. 88 (1966) 2697 59. R. Kuroda, S. F. Mason, J. Chem. Soc. Dalton. Trans. (1977) 1016 60. A. J. McCaffery, S. F. Mason, B. J. Norman, J. Chem. Soc. (1965) 5094 61. Y. Saito, K. Nakatsu, M. Shiro, H. Kuroya, Acta Cryst. 8 (1955) 729 62. F. S. Richardson, Inorg. Chem. 11 (1972) 2366 63. B. N. Figgis, "Introduction to Ligand Fields" Interscience Division, John Wiley & Sons, New York 1966, p. 242. 64. J.M. Vujić, M. Cvijović, G.N. Kaludjerović, M. Milovanović, B.B. Zmejkovski, V. Volarević, N. Arsenijević, T. J. Sabo, S. R. Trifunović, Eur. J. Med. Chem., 45 (2010) 3601–3606. 65. J.M. Andrews, J. Antimicrob. Chemother., 56 (2005) 60–76. 66. S.D. Sarker, L. Nahar, Y. Kumarasamy, Methods, 42 (2007) 321–324. 67. Agilent, CrysAlis PRO, Agilent Technologies, Yarnton, Oxfordshire, England (2010). 68. (a) A. Altomare, M.C. Burla, M. Cavalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Gagliardi, A.G. Moliterni, G. Polidori, R. Spagna, Sir97, CNR, Bari (1997); b) A. Altomare, M.C. Burla, M. Cavalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Gagliardi, G.G. Moliterni, G. Polidori, R. Spagna, J. Appl. Cryst. 32 (1999) 115. 69. G.M. Sheldrick, SHELXS-97 and SHELXL-97, Acta Crystallogr. A64 (2008) 112. 70. L.J. Farrugia, WinGX, University of Glasgow, Scotland, 1998; J. Appl. Cryst. 32 (1999) 837. 71. L.J. Farrugia, ORTEP-3 for Windows, University of Glasgow, Scotland, 1997; J. Appl. Cryst. 30 (1997) 565. 72. A.L. Spek, Acta Crystallogr. D65 (2009) 148. 73. G. N. Kaludjerović, D. Miljković, M. Momcilović, V. M. Djinović, M. Mostarica- Stojković, T. J. Sabo, V. Trajković, Int. J. Cancer., 2005, 116, 479-486. 74. L.N. Schoenberg, D.W. Cooke, C.F. Liu, Inorg. Chem., 7 (1968), p. 2386 75. Agilent (2013). CrysAlis PRO., Agilent Technologies, Yarnton, Oxfordshire, England. 76. M. C. Burla, M. Camalli, B. Carrozzini, G. L. Cascarano, C. Giacovazzo, G. Polidori, R. Spagna, J. Appl. Crystallogr., 36 (2003) 1103. 77. G. M. Sheldrick, Acta Crystallogr., A64 (2008) 112–122. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 98 78. M. Nardelli, J. Appl. Crystallogr., 28 (1995) 659. 79. A. L. Spek, J. Appl. Crystallogr., 36 (2003) 7–13. 80. L. J. Farrugia, J. Appl. Crystallogr., 45 (2012) 849–854. 81. T.J. Sabo, G.N. Kaluđerović, S.R. Grgurić-Šipka, F.W. Heinemann, S.R. Trifunović, Inorg. Chem. Commun., 7 (2004) 241–244. 82. G.N. Kaluđerović, V.M. Đinović, Z.D. Juranić, T.P. Stanojković, T.J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 488–496. 83. B.B. Krajčinović, G.N. Kaluđerović, D. Steinborn, H. Schmidt, Ch. Wagner, Ž. Žižak, Z.D. Juranić, S.R. Trifunović, T.J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 892–900. 84. B.B. Krajčinović, G.N. Kaluđerović, D. Steinborn, Ch. Wagner, K. Merzweiler, S.R. Trifunović, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc., 74 (2009) 389–400. 85. B .B. Zmejkovski, G. N. Kaluđerović, S. Gómez-Ruiz, T. J. Sabo, J. Serb. Chem.,Soc., 11 (2009) 1249–1258. 86. L.I. Elding, L.F. Olsson, J. Phys. Chem., 82 (1978) 69–74. 87. L. I. Elding, Inorg. Chim. Acta, 6 (1972) 647–651. 88. S.O. Podunavac-Kuzmanović, V.M. Leovac, N.U. Perišić-Janjić, J. Rogan, G. Balaš, J. Serb. Chem. Soc., 64 (1999) 381–388. 89. G.P. Vasić, V.V. Glodjović, I.D. Radojević, O.D. Stefanović, Lj.R. Čomić, V.M. Djinović, S.R. Trifunović, Inorg. Chim. Acta, 363 (2010) 3606–3610. 90. B. Karakašević, Microbiology and Parasitology, Medicinska knjiga, Beograd-Zagreb, 1987. 91. S. Sukdolak, N. Vuković, S. Solujić, N. Manojlović, Lj., J. Heterocyclic Chem., 41 (2004) 593-596. 92. E. Budzisz, E. Brzezinska, U. Krajewska, M. Rozalski, E. J. Med. Chem., 38 (2003) 597-603. 93. F.H. Allen, O. Kennard, D.G. Watson, L. Brammer, A.G. Orpen, J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 94. D.J. Radanović, S.R. Trifunović, S.A. Grujić, C. Maricondi, M. Parvez, B.E. Douglas, Inorg. Chim. Acta, 157 (1989), p. 33 95. D.J. Radanović, D.S. Veselinović, S.A. Grujić, J. Serb. Chem. Soc., 44 (1979), p. 503 96. V.V. Glođović, M.D. Joksović, S.R. Trifunović, J. Serb. Chem. Soc., 70 (2005), p. 1 97. D.J. Radanović, S.R. Trifunović, S.A. Grujić, C. Maricondi, M. Parvez, B.E. Douglas, Inorg. Chim. Acta, 157 (1989), p. 33 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 99 98. V.V. Glođović, F.W. Heinemann, S.R. Trifunović, J. Chem. Crystallogr., 38 (2008), p. 883 99. P.G. Bedoe, S.F. Mason, Inorg. Nucl. Chem. Lett., 4 (1968), p. 433 100 K.R. Butler, M.R. Snow, Chem. Commun. (1971), p. 550 101.а) S. Kaizaki, J. Hidaka, Y. Shimura, Bull. Chem. Soc. Jpn., 42 (1969), p. 988, b) S. Kaizaki, J. Hidaka, Y. Shimura, Bull. Chem. Soc. Jpn., 43 (1970), p. 1100 102. K. Swaminathan, D. H. Busch, J. Inorg. Nucl. Chem., 20 (1961) 159 103. D. J. Radanović, M.I. Djuran, D. C. Stamenović, S.A. Grujić, J. Serb. Chem. Soc., 6 (1984) 315 104. Brubaker GR, Schaefer DP, Worrell JH, J.I.Legg., (Coord. Chem. Rev., 7, (1971)161 105. Sabo TJ, Grgurić, SR, Trifunović SR Synth React Inorg Met Org Chem (Rev), 32 (2002) 1661 106. M.J. Jun, Y.B. Park, S.R. Choi, Polyhedron 8 (1989) 120 107. F. H. Allen, Acta Cryst. B58 (2002) 380–388. CSD release 5.34, May 2013. 108. I. Bernal, J. Cai, W. T. Jordan, J. Coord. Chem. 37 (1996) 283-298 109. E. Canpolat, M. Kaya, Turk. J. Chem. 28 (2004) 235. 110. A.Mishra, N.K. Kaushik, A.K. Verma, R. Gupta, European J Med Chem 43 (2008) 2189. 111. S. Martin, A. Dayalan, Indian J. Sci. Technology. 2:9 (2009) 59. 112. S. Srinivasan, J. Annaraj, P.R. Athappan, J. Inorganic Biochem 99 (2005) 876. 113. K. Sasikala, S. Arunachalam, Chem Sci Trans. 2(S1) (2013) S157. 114. R.S Kumar, Arunachalam S, Periasamy VS, Preethy CP, Riyasdeen A, Akbarsha MA, J Inorg Biochem., 103(2009) 117-127. 115. E.L. Chang, C. Simmers, D. A. Knight, Pharmaceuticals. 3 (2010) 1711. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 100 СПИСАК РАДОВА ПРОИСТЕКЛИХ ИЗ РЕЗУЛТАТА ОВЕ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ 1. Dragoslav R. Ilić, Jelena M. Vujić, Ivana D. Radojević, Olgica D.Stefanović, Ljiljana R. Čomić, Dragić D. Banković, Srećko R. Trifunović, Stereospecific ligands and their complexes, Part VIII: Antimicrobial activity of Palla dium(II) complexes with O,O'-dialkyl esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N'- di-2-(4-methyl)-pentanoic acid Hem. Ind. 66 (3) 349–355 (2012) DOI:10.2298/HEMIND110928096I M23 2. D. R. Ilić, V. V. Jevtić, I. D. Radojević, S. M. Vasić, O. S. Stefanović, Lj. R. Čomić, M. M. Vasojević, M. Z. Jelić, T. V. Koval'chuk, N. V. Loginova, S. R. Trifunović, Stereospecific ligands and their complexes. Part XIX. Synthesis, characterization, circular dichroism and antimicrobial activity of oxalato and malonato-(S,S)- ethylenediamine-N,N'-di-2-(3--methyl)butanoato-chromate(III) complexes, J. Mol. Struct., 1050 (2013) 133-139. doi.org/10.1016/j.molstruc.2013.07.022; ISSN 0022-2860; M23 3. D. R. Ilić, V. V. Jevtić, G. P. Radić, K. Arsikin, B. Ristić, Lj Harhaji-Trajković, N. Vuković, S. Sukdolak , Olivera Klisurić, V. Trajković, S. R. Trifunović Synthesis, characterization and cytotoxicity of a new palladium(II) complex with a coumarine-derived ligand Eur. J. Med. Chem., 74 (2014) 502-508 doi.org/10.1016/j.ejmech.2013.12.051 M21 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 101 НАУЧНО-ИСТРАЖИВАЧКИ РАД НАУЧНИ РАДОВИ ОБЈАВЉЕНИ У ПРОТЕКЛОМ ПЕРИОДУ 1. Živadin D. Bugarčić, Dragoslav Ilić and Miloš I. Djuran, Kinetic Study of the Interactions of Palladium(II) Complexes with Thiols in Acidic Aqueous Solution, Austr. J. Chem.,2001, 54, p. 237-240; ISSN 004-9425; DOI:10.1071/CH01031 M21 Саопштења на домаћим научним конференцијама: 1. D. Ilić, S. Milinković, B. V. Đorđević, Ž . D. Bugarčić, M. I. Đuran Helatni kompleksi nekih prelaznih elemenata kao novi aditivi za stočnu hranu XXXIX Savеtovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd,1999, str. 170. M64 2. D. Ilić, LJ. Milosavjević, Z. Minić Župahrom CM u službi ekologije Savetovanje Vodni resursi sliva Velike Morave i njihovo korišćenje, Kruševac, 1988 M64 3. D. Ilić, M. Perišić Unapređenje tehnološkog prečišćavanja vode za piće i zaštite vodnih resursa XXXI Konferencija o aktuelnim problemima korišćenja i zaštita voda, Jugoslovensko društvo za zaštitu voda, Vrnjačka Banja, 2002, str. 421 M64 Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 102 БИОГРАФИЈА Мр Драгослав Р. Илић је рођен 20.VII 1961. у Миоковићу, општина Лепосавић. Основну и средњу школу завршио је у Лепосавићу са одличним успехом. На Природно- математчки факултет у Крагујевцу, студијска група Хемија, уписао се 1981. године, где је и дипломирао 1985. године са просечном оценом 7,65. Након дипломирања запослио се у Хемијској индустрији Жупа у Крушевцу као стручни сарадник, а касније је постављен на радно место директора сектора Развој и инвестиције. Тренутно ради као предавач на Високој медицинској школи у Ћуприји. Последипломске студије, смер Неорганска хемија, на Природно- -математичком факултету у Крагујевцу уписао је 1998. године где је и одбранио магистарску тезу 2001. године под насловом Механизам супституционих реакција комплекса паладијума(II) са тиолима. На докторске студије, смер Неорганска хемија, на Природно-математичком факултету у Крагујевцу уписао се 2007. године. Драгослав Р. Илић Докторска дисертација Крагујевац, 2014. 103 П Р И Л О Г