Докторска дисертација 1 Универзитет у Крагујевцу Природно-математички факултет Мр Мирјана Р. Цвијовић, дипломирани физикохемичар Испитивање реакција хидролизе и комплексирања у растворима алуминијум(III)-јона и неких флуорохинолона методом електроспреј–тандем масене спектрометрије Докторска дисертација Крагујевац 2013. Mр Mирјана Р. Цвијовић 2 Сваки човек је понекад ентузијаста. Код неког ентузијазам траје пола сата, код неког месец дана. Успешни су они који су ентузијасти целог живота, јер такав ентузијазам је по старим Грцима божији дар. Докторска дисертација 3 МОЈИМ РОДИТЕЉИМА и мојим пријатељима Лазаревићима За сво стрпљење и огромну подршку у току израде дисертације Велику захвалност дугујем професорима: Др Предрагу Ђурђевићу, Др Срећку Трифуновићу, Др Милени Јеликић Станков, Др Ратомиру Јелићу. Др Предрагу Ђурђевићу се захваљујем за свесрдну помоћ у изради дисертације. Захвалност дугујем Др Весни Килибарди, Др Тањи Васиљевић, Др Пиетру Тралдију, Др Тањи Анђелковић у чијим лабораторијијама су узорци припремани и снимани. Захвалност дугујем и асистентима Андрији Ћирићу, Ивану Јаковљевићу и доценту Др Љубинки Јоксовић за помоћ при изради дисертације. Захвалност дугујем Милоју Лазаревићу, за техничку обраду овог документа. Mр Mирјана Р. Цвијовић 4 Индефикациона страница докторске дисертације I. Аутор Име и презиме: Мирјана Р. Цвијовић Датум и место рођења: 10. 06.1 970. Ужице Садашње запослење: Ваљаоница бакра а.д. Севојно II. Докторска дисертација Наслов: Испитивање реакција хидролизе и комплексирања у растворима Al(III)-јона и некох флурохинолона методом електроспереј–тандем масене спектрометрије Број страница: 194 Број слика: 131 Број табела: 30 Број схема: 5 Број слика прилога: 6 Број табела прилога: 24 Број библиографских података: 161 Установа и место где је рад израђен: VMA–Београд; CNR–Падова; ПМФ -Крагујевац Научна област (УДК): Неорганска хемија, 54. Ментор: професор др Предраг Ђурђевић III. Оцена и одбрана Датум пријаве теме: 28. 12. 2011. године Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: Одлука Наставно-научног већа ПМФ-а у Крагујевцу бр. 1050/XII-1 од 28. 12. 2011. године – Одлука Стручног већа за Природно математичке науке, Универзитета у Крагујевцу бр. 234/4, oд 9. 5. 2012. године. Комисија за оцену подобности теме и кандидата: (Одлука бр. 1051/10 од 6. 7. 2011. године) 1. Др Предраг Ђурђевић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, ужа научна област аналитичка и неорганска хемија, ментор 2. Др Срећко Трифуновић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, ужа научна област неорганска хемија, члан 3. Др Милена Јеликић Станков, редовни професор Фармацеутског факултета у Београду, ужа научна област хемија, члан Комисија за оцену и одбрану докторске дисертације: (Одлука бр. 510/XV-1 од 26.6. 2013.године) 1. Др Предраг Ђурђевић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, ужа научна област аналитичка и неорганска хемија, ментор 2. Др Срећко Трифуновић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, ужа научна област неорганска хемија, члан 3. Др Милена Јеликић Станков, редовни професор Фармацеутског факултета у Београду, ужа научна област хемија,члан 4. Др Ратомир Јелић, ванредни професор Факултета медицинских наука у Крагујевцу, ужа научна област фармацеутска хемија, члан Датум одбране дисертације: . .2013. године Докторска дисертација 5 СПИСАК ОЗНАКА И СИМБОЛА HQ0 флуорохинолон, неутрални облик Q–=L- анјонски облик хинолона H2Q±=LH2+ диполарни јон HQ+=LH+ катјонски облик хинолона +HV потенцијал капиларе k11, k12, k21, k22 микорконстанте K1 и K2 макроконстанте дисоцијације флуорохинолона ЕΘ/V (Al3+/Al) редокс потенцијал Ec јачина елекричног поља у простору око врха капиларе Vc потенцијал rc спољни радијус капиларе d удаљеност између електрода Ep потенцијална енергија V разлика потенцијала (напон) z наелектрисање јона Ek кинетичка енергија m маса јона v брзина јона L дужина путање, дужине прелета јона у цеви t врема прелета јона k константа пропорционалности зависна од карактеристика инструмента Φ основни потенцијал λ, σ и γ тежински фактори r0 бројчана константна Φ0 примењено електрично поље (комбинација RF и DC) ν примењена фреквенца у херцима Ecoll колизиона енергија mp+ прекурсор (родитељ) јон md+ продукт (ћерка) јон mn један или више неутралних врста (неутрални губитак) AB+ јон који се судара са неутралним врстама М и раскида везу hν фотон М неутрални молекул m/z однос масе и наелектрисања М+• радикал јон А хетеро атом X водоник или халогени елемент V запремина додате базе Fc функција циља zr жељена (мерена, експериментално добијена) вредност излаза yr вредност излаза (оutpuт) r-тог излазног неурона добјена помоћу ANN рачунски X матрица-вектор улазних варијабли Y матрица-вектор излазних варијабли Wih матрица тежинских коефицијената у гранама између улазног и скривеног слоја Mр Mирјана Р. Цвијовић 6 who матрица тежинских коефицијената у гранама између скривеног слоја и излаза αj укупан улаз у неурон j у скривеном слоју xi i-та улазна варијабла wij тежински коефицијент везе између неурона i и j Ni број улазних неурона Nh број неурона у скривеном слоју g(x) трансфер функција rj r-ти излаз из неуронске мреже P број улазно/излазних парова за обучавање δr вектор грешке излазних неурона ycalc r вредности излаза израчунате преко АNN yr means мерене вредности (вредности добијене експериментално) h ознака за скривени слој q индекс који означава неки од неурона скривеног слоја m број излазних неурона δq вектор грешке скривених неурона xq(h) излаз сваког скривеног неурона q wij (t) тежински коефицијент у итерацији t између неурона i и j wij (t+1) тежински коефицијент у итерацији t+1 између неурона i и j η брзина учења (брзина конвергенције ка глобалном минимуму) δj грешка процесног елемента ј xi вредност output-a процесног елемента i μ момент, који помаже мрежи да превазиђе локални минимум wij (t −1) тежински фактор две итерације RES-MS релативни интензитети јона у ESI MS спектрима iAlL и iAlL2 интензитети свих јона који потичу од AlL и AlL2 јонаiL интензитет лиганда у свим врстама REQIL молски удели компонената на основу потенциометрије ß константа стабилности комплекса Z средњи протонски број RF напон на прстенастој електроди ⇒ стрелица за премештање електронског пара → једнострука стрелица за пренос појединачних електрона АPI јонизација при атмсферском притиску CID сударом индукована дисоцијација CAD сударом активирана дисоцијација ECD дисоцијација заробљавањем електрона ETD електрон трансфер дисоцијација NETD дисоцијација негативним електронским преносом MALDI јонизација потпомогнута ласерском десорпцијом (отпаравањем) из матрикса Nd: YAG неодијум - итријум алуминијум гарент ESI електроспреј јонизација TOF време прелета (time of fl ight) TLF време кашњења фокусирања (time-lag focusing) Докторска дисертација 7 MS/MS тандем масена спектрометрија (масена спектрометрија/масена спектрометрија) MSn ознака за масену спектрометрију n-тог степена ESI Q MS електроспреј квадрупол масени спектрометар LC/MSD течно масена спектрометрија Cipro ципрофлоксацин Moxi моксифлоксацин Flero флероксацин AAN вештачка неуронска мрежа (Artifi cial Neural Network) MSEE средња квадратна грешка (mean summed squared error) SIM мониторинг селектованог јона (secleted ion monitoring) SIR снимање селектованог јона (secleted ion recording) TIC укупна јонска струја, сума интензитета свих детектованих јона, (Total Ion Current) ECM енергија центра масе Pattern Схема (шаблон) маса пикова у спектру, која је последица изотопске расподеле елемената према релативној природној изотопској заступљености елемената Parent ion јон који у реакцији, CID-ом, једномолекуларним разлагањем или променом укупног наелектрисања даје продукт јоне; по својој природи сврстава се у прекурсор јоне Charge state реципрочна вредност Δm/z издвојеног јона у изотопској расподели јона у еnvelop-и. Phenylium ion јон на m/z 77 који настаје у масеним спектрима једињења са фенил групом Isotopic envelope изотопска овојница која обухвата више пикова тј изотопска дистрибуција, експериментално добијених пикова, где је први пик моноизотопски пик, а пик у средини envelope одговара пику са “average” масом Plume брз, експлозиван фазни прелаз из чврстог у гасно стање проузрокован дејством ласерског зрака на подлогу у MALDI MS Mр Mирјана Р. Цвијовић 8 СПИСАК СЛИКА И СХEМА Слика 1. Пут јона у масеном спектрометру .................................................................................. 23 Слика 2. Основни делови масеног спектрометра ........................................................................ 24 Слика 3. Принцип ESI MS спектрометрије ................................................................................... 25 Слика 4. Механизам електроспреја ................................................................................................ 27 Слика 5. ESI MS спектар воденог раствора Na, K, Rb, и Cs ....................................................... 29 Слика 6. Схематски приказ MALDI TOF инструмент ................................................................ 30 Слика 7. Аблација кристала и формирање агрегата састављених од матрице и аналита ..... 34 Слика 8. Путања јона у трапу и заробљавање јона ..................................................................... 34 Слика 9. Путања јона у ТОF анализатору ..................................................................................... 35 Слика 10. Путања јона у квадруполу ................................................................................................. 35 Слика 11. Принцип тандем (MS/MS) спектрометрије ................................................................. 37 Слика 12. Изглед масеног спектра ..................................................................................................... 39 Слика 13. Општа структура хинолона ............................................................................................. 43 Слика 14. Нумерација атома у хинолонском прстену .................................................................. 44 Слика 15. Структурна формула флероксацина ............................................................................. 46 Слика 16. Структурна формула моксифлоксацина ...................................................................... 47 Слика 17. Структурна формула ципрофлоксацина ...................................................................... 48 Слика 18. ESI MS спектри, раствора AlCl3 концетрације. 5x10-4 mol/dm3, pH=4,20, разичити напони на конусу а) 10 V, b) 50 V и c) 100 V ............................................... 65 Слика 19. ESI MS спектар 2,7x10-5 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=4,814 ...................................... 66 Слика 20. ESI MS спектар 2,7x10-5 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=3,594 .................................... 66 Слика 21. ESI MS спектар 2,7x10-5 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=3,192 .................................... 67 Слика 22. ESI MS спектар 1,0x10-4 mol/dm3, раствора AlCl3 ,pH=4,35 ........................................ 67 Слика 23. ESI MS спектар 5x10-4 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=4,23 .......................................... 68 Слика 24. ESI MS спектар 1x10-3 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=4,18 .......................................... 68 Слика 25. ESI MS спектар раствора AlCl3 , CАl3+=5,0x10-3 mol/dm3, CCl-=150x10-3 mol/dm3, pH=4,05 .......................................................................................... 69 Слика 26. ESI MS спектар 0,1x10-3 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=3,30, након 30 дана .............. 69 Слика 27. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,16, tube lens 15 V .................................... 70 Слика 28. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,16, tube lens-20 V .............................. 71 Слика 29. ESI MS спектар флероксацина, молекулски јон m/z 370, pH=4,26, позитиван мод ..................................................................................................................... 72 Слика 30. ESI MS спектар раствора флероксацина, 368 m/z, pH=4,26, негативни мод ............ 72 Слика 31. MS/MS јона 368, Ecoll=20% ................................................................................................. 73 Слика 32. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=4,03, позитивни мод ........................... 74 Слика 33. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=4,03,негативни мод ............................. 74 Слика 34. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=5,29 позитивни мод ............................. 75 Слика 35. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=5,29, негативни мод ............................ 75 Слика 36. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3 pH=6,20 позитивни мод ............................. 76 Слика 37. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=6,20 негативни мод ............................. 76 Слика 38. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1,5, pH=3,50 позитивни мод ......................... 77 Слика 39. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1,5, pH=4,14 позитивни мод ......................... 77 Слика 40. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1,5, pH=5,64 позитивни мод ........................ 78 Слика 41. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1 pH=3,05, позитивни мод ............................ 78 Слика 42. Gauss-oв приказ спектра раствора CAl:CFlero=2:1, pH=3,05 ........................................ 79 Докторска дисертација 9 Слика 43. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,06, позитивни мод ........................... 79 Слика 44. Gauss-oв приказ спектра раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,06 ........................................ 80 Слика 45. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=5,06, позитивни мод ............................ 81 Слика 46. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1, pH=5,02, позитивни мод ............................ 81 Слика 47. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=5,04, позитивни мод ............................ 82 Слика 48. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:2, pH=5,03, позитивни мод ........................... 82 Слика 49. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,96, позитивни мод ........................... 83 Слика 50. Модел синапси у људском мозгу и структура вештачког неурона ......................... 84 Слика 51. Структура неуронске мреже са три улаза и пет излаза ............................................. 86 Слика 52. Дијаграм грешки учења и грешки тестирања за комплекс m/z 719 ........................ 87 Слика 53. Дијаграм грешки учења и грешки тестирања за комплекс m/z 763 ....................... 87 Слика 54. Дијаграм рачунских и експерименталних вреднсоти после 4000 циклуса учења за комплекс m/z 719 ..................................................................... 88 Слика 55. Дијаграм рачунских и експерименталних вреднсоти после 2100 циклуса учења за комплекс m/z 763 .................................................................... 88 Слика 56. Zoom scan jона 255, Δ=0,3, (255,06, 255,36, 255,71) ..................................................... 89 Слика 57. Zoom scan јона 382, Δ=0,5 (382,13, 382,64, 383,11) ...................................................... 90 Слика 58. Zoom scan јона 763, Δ=1, (763,30, 764,29, 765,28) ........................................................ 90 Слика 59. Zoom scan јона 360, Δ=0,5, (360,14, 360,65, 361,15) ..................................................... 91 Слика 60. Изотопски pattern протонованог јона флероксацина m/z 370 и јона комплекса m/z 382 ............................................................................................................ 91 Слика 61. Zoom scan јона 215, Δ=0,5, (215,47, 216,00, 216,47) ...................................................... 92 Слика 62. Zoom scan јона 719, Δ=1,0 (719,33, 720,30, 721,30) ....................................................... 92 Слика 63. МS/МS спектар parent јона 255, Ecoll =25 % .................................................................... 93 Слика 64. MS/MS спектар parent јона 255, Ecoll=30 % ..................................................................... 94 Слика 65. MS/MS/MS спектар јона 255, Ecoll=25%, јона 246, Ecoll=30% ....................................... 94 Слика 66. MS/MS спектар parent јона 429,90, Ecoll=78 % ................................................................ 95 Слика 67. MS/MS parent јона 215,50, Ecoll=55 % ............................................................................... 95 Слика 68. MS/MS јона 763, Ecoll=30 % ................................................................................................ 96 Слика 69. MS/MS parent јонa 763, Ecoll=35 % ..................................................................................... 96 Слика 70. MS/MS спектар parent јонa 382, Ecoll=30 % ..................................................................... 96 Слика 71. maLDI спектар подлоге ..................................................................................................... 97 Слика 72. maLDI спектар флероксацина у смеши вода:метанол =30:70, pH=4,90 ................ 98 Слика 73. maLDI спектри: а) флероксацин у смеши вода: метанол, pH=4,90 и b) флероксацин у води ........................................................................................................ 98 Слика 74. maLDI спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=3,85 .......................................................... 99 Слика 75. maLDI спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=4,50 ........................................................ 100 Слика 76. maLDI спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=5,42, димер .......................................... 100 Слика 77. ESI и MS/MS спектри моксифлоксацина .................................................................... 101 Слика 78. ESI MS спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,60, CAl=2,7x10-5 mol/dm3 ............... 102 Слика 79. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:1, pH=4,40 ........................................................ 103 Слика 80. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:1, pH=5,90 ........................................................ 104 Слика 81. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,10 ........................................................ 104 Слика 82. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,10 ........................................................ 105 Слика 83. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,59 ........................................................ 105 Слика 84. MS/MS спектар јона 332, Ecoll=40% ................................................................................ 106 Mр Mирјана Р. Цвијовић 10 Слика 85. ESI MS спектар раствора CAl:CCipro=1:3, pH=5,26 ....................................................... 106 Слика 86. Zoom scan јона 1056 ......................................................................................................... 107 Слика 87. Zoom scan јона 231 ........................................................................................................... 107 Слика 88. MS/MS спектар parent jона 346, Ecoll=35,0% ................................................................ 108 Слика 89. MS/MS спектар parent jона 687, Ecoll=30,0% ................................................................ 108 Слика 90. MS/MS спектар parent јона 687, Ecoll=35,0% ................................................................ 109 Слика 91. MS/MS спектар parent jона 687, Ecoll=40,0% ................................................................ 109 Слика 92. MS/MS спектар parent jона 716, Ecoll=35,0 % ............................................................... 110 Слика 93. MS/MS спектар parent jона 993, Ecoll=30,0% ................................................................ 110 Слика 94. MS/MS спектар parent jона 1057, Ecoll=35,0% .............................................................. 111 Слика 95. MS/MS/MS спектар parent jона 687 Ecoll=30,0% .......................................................... 111 Слика 96. MS/MS спектар parent jона 688, Ecoll=40,0 % ............................................................... 112 Слика 97. MS/MS/MS спектар 688 јона Ecoll=40,0%; јона 660 Ecoll=80,0% ................................. 112 Слика 98. MS/MS/MS спектар 688 јона Ecoll=40,0%; јона 660 Ecoll=100,0 % .............................. 113 Слика 99. MS/MS спектар parent јона 700, Ecoll=30,0% ................................................................ 113 Слика 100. MS/MS/MS спектар 700 јона Ecoll=30,0% и јона 630, Ecoll=45% .............................. 114 Слика 101. maLDI спектари раствора CAl:CCipro=1:3, различито pH ........................................ 115 Слика 102. maLDI спектар раствора CAl:CCipro=1:3, pH=5,10, различите концентрације компонената .................................................................... 115 Слика 103. maLDI спектар раствора CAl:CCipro=1:3, pH=4,10, димер ........................................ 116 Слика 104. SIM мод за доказ циљаног јона m/z 96 и јона m/z 132 ........................................... 119 Слика 105. Изотопски pattern јона m/z 132, SIM мод ................................................................. 120 Слика 106. Изотопски pattern јона m/z 132, добијен коришћењем soft wera Xcalibur ......... 120 Слика 107. 27Al NMR спектри раствора AlCl3, на различитим pH, CAl=50mmol/dm3 .......... 123 Слика 108. Tитрационе криве раствора AlCl3, добијене на основу две различите титрационе процедуре .................................................................................................. 124 Слика 109. Изотопски pattern флероксацина ............................................................................... 127 Слика 110. Могућа структура комплекса типа AlL2 у систему Al-флероксацин. ................ 128 Слика 111. Изотопски pattern јонске врсте AlL2, m/z 763 ........................................................... 130 Слика 112. Хистограм релативних интезитета јона различитих m/z вредности vs концентрациони односи Al (III)јон-флероксацин ....................... 135 Слика 113. 3D површ релативне заступљености комплекса m/z 719 у функцији од pH и концентрације ................................................................................................... 135 Слика 114. 3D површ релативне заступљености комплекса m/z 763 у функцији од pH и концентрације .................................................................................................. 136 Слика 115. Изотопски pattern моксифлоксацина ......................................................................... 137 Слика 116. Могућа структура комплекса типа AlL2 у систему Al-моксифлоксацин ........................................................................................................ 138 Слика 117. Изотопски pattern јонске врсте AlL2, m/z 827 ........................................................... 139 Слика 118. Изотопски еnvelope у систему алуминијум моксифлоксацин ............................... 140 Слика 119. Изотопски pattern ципрофлоксацина ........................................................................ 141 Слика 120. Могућа структура комплекса AlL2 у систему Al-ципрофлоксацин ................... 142 Слика 121. Изотопски pattern јонске врсте AlL2, m/z 687 .......................................................... 142 Слика 122. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Cfl ero=1:3 ..................... 145 Слика 123. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Cfl ero=1:1,5 .................. 146 Слика 124. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Cfl ero=2:1 ..................... 146 Слика 125. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:CCipro=1:3, концентрација компонената 10-5 mol/dm3 ................................................................ 147 Докторска дисертација 11 Слика 126. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:CCipro=1:3, концентрација компонената 10-4 mol/dm3 ................................................................ 147 Слика 127. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:CМoxi=1:3, концентрација компонената 10-5 mol/dm3 ................................................................ 148 Слика 128. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:CМoxi =1:3, концетрација компонената 10-4 mol/dm3 .................................................................... 148 Слика 129. Дистрибуциони дијаграм за моксифлоксацин ........................................................ 149 Слика 130. Дистрибуциони дијаграм за ципрофлоксацин ....................................................... 149 Слика 131. Дистрибуциони дијаграм за флероксацин ............................................................... 150 Схема 1: Реакциона путања у МАLDI MS ........................................................................ 31 Схема 2: Равнотеже у раствору флуорохинолона ....................................................... 125 Схема 3: Фрагметациона путања (m/z 255) Al-флероксацин комплекса у MS2 и MS3 експерименту .................................................................................. 131 Схема 4: Фрагметациона путања (m/z 763) Al-флероксацин комплекса у MS2 експерименту .............................................................................................. 132 Схема 5: Фрагментациони путања (m/z 687) Аl-ципрофлоксацин комплекса у МS2 и МS3 експерименту .................................................................................. 143 СПИСАК СЛИКА ПРИЛОГА Слика 1 П: ESI MS спектри 2,7x10-5 mol/dm3 AlCl3 раствор, pH=3,594; 50 V; утицај мобилне фазе ..................................................................................................... 162 Слика 2 П: ТIC хроматограм АlCl3 раствора ............................................................................. 163 Слика 3 П: ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1,3:1, pH=4,88, позитивни мод централна тачка ............................................................................................................. 163 Слика 4 П: ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1,3:1, pH=4,88, негативан мод, централна тачка ............................................................................................................. 164 Слика 5 П: MALDI спектри: а) комплекс где је метал у великом вишку CAl:CFlero = 10 :1, б) спектар подлоге .............................................................. 164 Слика 6 П: MALDI спектар CAl:CCipro = 1:3, pH = 5,10 ............................................................... 164 СПИСАК ТАБЕЛА Табела 1: Јони одабраних класа аналита, формирани примарном и секундарном јонизацијом .................................................................................................. 32 Табела 2: Природни изотопи, њихова заступљеност и масе ...................................................... 43 Табела 3: Растворљивост флуорохинолона .................................................................................... 44 Табела 4: pK вредности флуорохинолона ....................................................................................... 45 Табела 5: Енергија јонизације, коефицијент електронегативности и редокс потенцијал алуминијума ..................................................................................... 49 Табела 6: Најзаступљеније хемијске врсте у раствору AlCl3, ESI MS; позитиван мод ......... 54 Табела 7: MS подаци за Al(III)-јон-понцирин комплексе типа [Al(III)(флавоноид –H)2]+ ..... 55 Табела 8: Инструментални параметри у ESI извору при испитивању хидролизе ................. 61 Табела 9: Инструментални параметри у ESI извору при испитивању комплексирања ....... 61 Табела 10: Инструментални параметри при снимању MALDI спектара ................................... 61 Табела 11: Састави раствора при изучавању хидролизе ................................................................. 73 Табела 12. Састави раствора и pH вредности за ЕSI МS спектре .................................................. 99 Табела 13: Састави раствора Аl(III)-јона и флероксацина за различите pH вредности ...................................................................................................................... 99 Табела 14: Састави раствора Аl(III)-јона и моксифлоксацина за различите pH вредности . . 103 Табела 15: Састави раствора Al (III)-јона и ципрофлоксацина за различите pH вредности ..... 114 Mр Mирјана Р. Цвијовић 12 Табела16: Идентификоване врсте у основном спектру, раствор моксифлоксацина, CL=2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,60 ................................................... 117 Табела 17: Идентификоване врсте у растворима AlCl3, концентрације 0,1-1,0x10-3 mol/dm3, pH=4,20 ......................................................... 118 Табела 18: Подаци из базе података за хидролитичке комплексе алуминијума ................ 124 Табела 19: Идентификоване врсте у раствору флероксацина, CL= 2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,26, позитиван мод ........................... 126 Табела 20: Идентификоване врсте у раствору флероксацина, CL=2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,26, негативан мод ............................ 127 Табела 21: Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и флероксацина, CAl=2,7×10-5mol/dm3, ESI MS спектрометријом ......................... 129 Табела 22: Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и флероксацина, CAl:CFlero= 1:3, концетрација 10-4 mol/dm3, pH 3,85-5,50, maLDI спектрометријом .............................................................................................. 130 Табела 23: Поређењење релативних интезитета АlL и АlL2 комплекса добијених ЕSI МS и потенциометријским мерењима ................................................ 134 Табела 24: Идентификоване врсте у основном спектру, раствор моксифлоксацина CL=2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,60 ...................................................... 137 Табела 25: Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и моксифлоксацина, CAl=2,7×10-5 mol/dm3, ESI MS спектрометријом ................... 138 Tabela 26: Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и моксифлоксацина, CAl:CMoxi од 1:1 до 1:3, концетрацијe 10-4 mol/dm3, maLDI спектрометријом ....... 139 Табела 27: Идентификоване врсте у раствору ципрофлоксацина, CL=2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,60 ......................................................................................... 141 Табела 28: Идентификоване врсте у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина, ESI MS спектрометријом ................................................................................................ 142 Табела 29: Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и ципрофлоксацина, CAl:CCipro =1:3, концетрацијe 10-4mol/dm3, maLDI спектрометријом ...................... 144 Табела 30: Констате стабилности коришћене у прорачуну специјације (преузете из литературe) ............................................................................................... 145 СПИСАК ТАБЕЛА ПРИЛОГА Табела 1П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Ccipro=1:3, pH=4,99, CAl=2,7×10-4 mol/dm3 у смеши вода и метанол ................. 165 Табела 2П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Ccipro = 1:3, CAl=10-5 mol/dm3, pH =5,26 ................................................................................................. 165 Табела 3П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Cfl ero=2:1, CAl = 2,7×10-5 mol/dm3, pH=4,26 .............................................. 166 Табела 4П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Cfl ero=2:1, CAl = 2,7×10-5 mol/dm3, pH = 5,06 .............................................................. 166 Табела 5П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Cfl ero=1:1, CAl = 2,7×10-5 mol/dm3, pH = 5,06 ............................................................. 166 Табела 6П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,192, 50V ...................... 167 Табела 7П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,594, 50V ...................... 168 Табела 8П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,594, 50V ...................... 169 Табела 9П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,1mM, pH= 4,35, 50V ............................ 170 Табела 10П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,5mM, pH= 4,203 50V ......................... 172 Табела 11П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=1,0 mM, pH= 4,184 50V ....................... 172 Табела 12П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 4,814, 50V ................... 173 Докторска дисертација 13 Табела 13П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,594, 50V ................... 174 Табела 14П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,192, 10V ................... 175 Табела 15П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,192, 100V .................. 176 Табела 16П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,594, 10V ................... 177 Табела 17П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 3,594, 100V ................. 178 Табела 18П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 4,814, 100V ................. 179 Табела 19П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,027mM, pH= 4,814, 10V .................... 180 Табела 20П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=1,0mM, pH= 4,184, 50V ....................... 181 Табела 21П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,5mM, pH= 4,203, 100V ..................... 182 Табела 22П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,1mM, pH= 4,35, 10V ......................... 183 Табела 23П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=0,1mM, pH= 4,35, 100V ....................... 184 Табела 24П. Хидролиза алуминијум(III)-јона, CAl=1,0 mM, pH= 4,184, 10V ...................... 185 Mр Mирјана Р. Цвијовић 14 САДРЖАЈ Списак ознака и симбола Списак слика и схема Списак табела ИЗВОД .................................................................................................................................................... 17 SUMMARY ............................................................................................................................................. 19 УВОД ....................................................................................................................................................... 21 1. ОПШТИ ДЕО ................................................................................................................................... 23 1.1. Масена спектрометрија ........................................................................................................ 23 1.1.1. Основни делови инструмента ...................................................................................... 23 1.1.2. Типови јонизације ........................................................................................................... 26 1.1.3. Настајање наелектрисаних капљица на врху капиларе у ESI извору ................. 27 1.1.4. Смањење наелектрисаних капљица насталих електроспрејом ............................ 27 1.1.5. Гасно фазне реакције ...................................................................................................... 28 1.1.6. Утицај интерференција на интензитет сигнала ....................................................... 28 1.1.7. Параметри у ESI битни за анализу .............................................................................. 29 1.1.8. Извор јонизације – MALDI ........................................................................................... 29 1.1.9. Анализатори у масеној спектрометрији .................................................................... 32 1.1.9.1. Јон трап анализатор ............................................................................................. 33 1.1.9.2. TOF анализатор .................................................................................................... 34 1.1.9.3. Квадрупол анализатор ........................................................................................ 35 1.1.10. Детектори у масеној спектрометарији ..................................................................... 36 1.1.10.1. Детектори у MALDI TOF масеној спектрометрији .................................... 36 1.1.11.Тандем масена спектрометрија .................................................................................... 37 1.1.11.1. Фрагментација у тандем масеној спектрометрији ..................................... 38 1.1.12. Масени спектар .............................................................................................................. 39 1.1.13. Конституенти масеног спектра .................................................................................. 39 1.1.14. Интерпретација масених спектара ........................................................................... 40 1.1.14.1. Типични јони ............................................................................................................ 40 1.1.14.2. Присуство молекулског јона ................................................................................ 41 1.1.14.3. Типични неутрални „губици“ ............................................................................. 41 1.1.14.4. Интерпретација масеног спектра непознатог једињења .............................. 41 1.1.14.5. Одређивање наелектрисања ................................................................................ 42 1.1.15. Изотопна супституција у масеној спектрометрији ............................................... 42 1.2. Хинолони .................................................................................................................................. 43 1.2.1. Флуоровани хинолони ................................................................................................... 44 1.2.1.1. Физичко-хемијске особине флуорохинолона ............................................... 45 1.2.2. Флероксацин–опште особине ...................................................................................... 46 1.2.3. Моксифлоксацин–опште особине ............................................................................... 47 1.2.4. Ципрофлоксацин–опште особине .............................................................................. 47 1.3. Алуминијум .............................................................................................................................. 48 1.3.1. Физичка и хемијска својства алуминијума(III)-јона .............................................. 49 1.3.2. Типичне реакције алуминијум(III)-јона: хидролиза и комплексирање ............. 49 1.3.3. Токсичне особине алуминијума ................................................................................... 51 1.4. Литературни преглед ............................................................................................................. 53 Докторска дисертација 15 1.4.1. Изучавање хидролизе Al(III)-јона ESI MS техником .............................................. 53 1.4.2. Изучавање комплексирања флуорохинолона, хинолона, флавоноида са Al(III)-јоном ESI MS техником .................................................................................... 54 1.4.3. Изучавање комплексирања флуорохинолона, флавоноида и других једињења са металним јонима MALDI техником ................................................... 56 2. ЦИЉ И ЗАДАТАК РАДА .............................................................................................................. 58 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО ....................................................................................................... 59 3.1. Реагенси и раствори ............................................................................................................... 59 3.1.1. Реагенси .............................................................................................................................. 59 3.1.2. Основни раствори ........................................................................................................... 59 3.1.3. Радни раствори ............................................................................................................... 60 3.2. Инструменти ............................................................................................................................. 60 3.3 Експериментални поступак .................................................................................................. 62 3.4. Експериментални резултати ............................................................................................... 64 3.4.1. ESI MS спектри хидролитичких врста Аl(III)-јона .................................................. 64 3.4.2. Параметри који утичу на ESI MS спектре при изучавању хидролизе ................ 64 3.4.3. ЕSI МS спектри раствора Аl(III)-јона и флуорохинолона ...................................... 70 3.4.4. Утицај инструменталних параметара при снимању ESI MS спектара ............... 70 3.4.5. Утицај експерименталних услова при снимању ESI MS спектара ....................... 71 3.4.6. ESI MS спектри флероксацина у позитивном и негативном моду ...................... 72 3.4.7. ESI MS спектри раствора Аl(III)-јона и флероксацина позитивни и негативни мод ......................................................................................... 73 3.4.7.1. Основне карактеристке спектрaлних линија-Gauss-ова расподела ............ 80 3.4.8. Примена неуронских мрежа на комплексирање алуминијума и флуорохинолона .............................................................................................................. 83 3.4.9. Zoom Scan јона у систему алуминијум флероксацин ............................................. 88 3.4.10. Тандем масена спектрометрија ........................................................................................ 92 3.4.11. MS/MS експеримент јона у раствору флероксацина и Аl(III)-јона ................... 95 3.4.12. maLDI спектри ............................................................................................................... 97 3.4.13. maLDI спектри подлоге и флероксацина ................................................................. 97 3.4.14. maLDI спектри комплекса Аl(III)-јона и флероксацина ...................................... 99 3.4.15. ESI MS спектри раствора моксифлоксацина ........................................................ 101 3.4.16. ESI MS спектри раствора Аl(III)-јона и моксифлоксацина ............................... 102 3.4.17. maLDI спектри раствора Аl(III)-јона и моксифлоксацина ............................... 103 3.4.18. ESI MS спектри раствора ципрофлоксацина ........................................................ 106 3.4.19. ESI MS спектри раствора Аl(III)-јона и ципрофлоксацина .............................. 106 3.4.20. Zoom scan јона у систему алуминијум-ципрофлоксацин ................................. 107 3.4.21. Тандем масена спектрометрија јона у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина (10-5 mol/dm3) ...... ...................................................................... 108 3.4.22. MS/MS/MS експеримент јона у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина ... 111 3.4.23. Тандем масена спектрометрија јона у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина, (10-4 mol/dm3) ........................................................................... 112 3.4.24. maLDI спектри Аl(III)-јона и ципрофлоксацина ................................................. 114 4. ДИСКУСИЈА РЕЗУЛТАТА ......................................................................................................... 117 4.1. Проучавање хидролизе Al(III)-јона масеном спектрометријом ................................. 117 4.2. Проучавање комплексирања Al(III)-јона и флуорохинолона масеном спектрометријом .................................................................................................................... 125 Mр Mирјана Р. Цвијовић 16 4.2.1. Систем алуминијум-флероксацин ............................................................................ 126 4.2.1.1. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и флероксацина ESI MS спектрометријом .......................................................... 127 4.2.1.2. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и флероксацина mаLDI спектрометријом .......................................................... 129 4.2.1.3. Квантитативна специјација у растворима Аl(III)-јона и флероксацина ..... 133 4.2.1.4. Примена модела вештачких неуронских мрежа на проучавање комплексирања Аl(III)-јона и флероксацина .............................. 135 4.2.2. Систем алуминијум-моксифлоксацин ..................................................................... 136 4.2.2.1. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и моксифлоксацина ESI MS спектрометријом ........................................................ 137 4.2.2.2. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и моксифлоксацина mаLDI спектрометријом .......................................................... 139 4.2.3. Систем алуминијум-ципрофлоксацин ..................................................................... 141 4.2.3.1. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и ципрофлоксацина ESI MS спектрометријом .......................................................... 141 4.2.3.2. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и ципрофлоксацина mаLDI спектрометријом ........................................................ 144 4.3. Дистрибуциони дијаграми ................................................................................................ 144 5. ЗАКЉУЧАК ................................................................................................................................... 151 6. РЕФЕРЕНЦЕ ................................................................................................................................... 154 7. ПРИЛОГ .......................................................................................................................................... 162 8. БИОГРАФИЈА ................................................................................................................................. 186 9. СПИСАК РАДОВА ....................................................................................................................... 187 10. РАДОВИ ПРОИСТЕКЛИ ИЗ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ ...................................... 193 Докторска дисертација 17 ИЗВОД Предмет ове дисертације је проучавање реакција хидролизе алуминијум(III)-јона и реакција комплексирања алуминијум(III)-јона и флуорохинолона (HQ) (флероксацина, ципрофлоксацина и моксифлоксацина). У оквиру дисертације одређена је специјација у растворима алуминијум(III)-јона и растворима алуминијум(III)-јона и флуорохинолона (HQ) са циљем бољег разумевања фармако и токсикокинетике флуорохинолонских антибиотика у присуству лекова на бази алуминијума (антациди, вакцине, дијализатни раствори). Проучавања су вршена електроспреј масеном спектрометријом, (ESI MS), тандем масеном спектрометријом (MS/MS) и масеном спектрометријом, где је јонизација потпомогнута ласерском десорпцијом из матрикса (MALDI МS). Проучавањем наведних система, поменутим експерименталним техникама и компјутерском обрадом података, коришћењем програма Hyss 2006 и модела вештачких неуронских мрежа (AAN) добијени су следећи резултати: При проучавању хидролизе алуминијума врсте идентификоване у растворима алуминијум(III)-јона, концетрације 0,03 дo 5,0 mmol/dm3, су врсте са наелектрисањем +1, +2 и +3, формиране у опсегу pH од 3-6. Мономерне и димерне врсте су доминантне до pH 3,8. ЕSI МS спектри указују на формирање малих полимерних врста (Аl3–Аl5) на pH 4,8. Са повећањем pH и концетрације алуминијум(III)-јона идентификују се средњи полимери (Аl6–Аl10). Даљим повећањем pH и концентрације алуминијум(III)-јона настају виши полимери (Аl11–Аl13). Виши полимери су привремене врсте које постоје релативно кратко време након припреме раствора. На pH око 6,4 почиње формирање талога. Резултати добијени ЕSI масеном спектрометријом су у сагласности са резултатима добијеним 27 Al NMR спектроскопијом и потенциометријом. Изглед масених спектрара зависи од инструменталних параметара као што су брзина протока мобилне фазе, температура јонског извора, напон на капилари и конусу. Највише утицаја на изглед масеног спектра има напон на конусу. При напону на конусу до 50 V добијено је најбоље слагање врста идентификованих потенциометријски и врста добијених масеном спектрометријом. Изучавани су и утицаји експерименталних услова на хидролитичке процесе: pH раствора, старење раствора, утицај мобилне фазе, утицај концентрације алуминијум(III)-јона, утицај контра јона. Са старењем раствора број врста у спектру се знатно смањује. Идентификује се само неколико сигнала у спектру који потичу од врста: [Al(OH)2]+, [Al6(OH)13]5+, [Al4(OH)9]3+ и [Al5(OH)12]3+. ESI MS спектри Al(III)-јона и HQ раствора су снимани у позитивном моду у опсегу од m/z 50 до 2000. Сем калибрације инструмент је фино подешен раствором једне компоненте (лиганда), са циљем оптимизације инструменталних параметара. У ESI MS спектрима као доминантне врсте за концентрационе односе (метал: лиганд) од 2:1 дo 1:3, у pH опсегу од 3,0 до 6,0 идентификоване су мононуклеарне врсте: AlL2+, AlL2+ и AlL30. Доминантне врсте ESI MS спектрометријом идентификоване у растворима Al(III)-јона и флероксацина су на следећим m/z: 193,52; 255,20; 719,62; 763,23; у растворима Al(III)-јона и моксифлоксацина на m/z 216,81; 414,22; 827,31; 1266,88; у растворима Al(III)-јона и ципрофлоксацина на m/z 249,05; 687,75; 1040,33; 1056,15. Мешовити протоновани и хидроксо комплекси су идентификовани и при нижим и при вишим pH вредностима, али полимерне врсте нису нађене у ESI MS спектрима. Тандем масена спектрометрија, MSn је коришћена да би се добио увид у структуру Al(III)-јон-HQ комплекса, тј. да би се утврдила највероватнија везивна места алуминијума у комплексима. У МSn експериментима су на parent јоне примењиване високе колизионе енергије (80-100% од максималног rf voltage) што указује да су комплекси Al(III)-joн- флуорохинолони веома стабилни. На стабилност ових комплекса указује и чињеница да у току фрагментације региструју само губици малих неутралних молекула, нема кидања везе алуминијум-лиганд. Mр Mирјана Р. Цвијовић 18 На основу maLDI спектара су идентификоване врсте која су потврда мононуклеарних врста идентификованих у ESI MS спектрима, што указује да ове врсте заиста постоје у раствору и да нису последица гасно-фазних реакција. У maLDI спектрима идентификоване су и полимерне врсте, означене као [2Al3++5L-]+. Ове врсте највероватније потичу од димерног језгра Al2L2, које се формира у раствору, а кластери са више депротонованих лиганда се формирају у гасној фази. Врста означена као [2Al3++5L-]+ се идентификује у систему флероксацина и Al(III)-joнa на m/z 1894,77, у систему моксифлоксацина и Al(III)- јона на m/z 2054,36 и у систему ципрофлоксацина и Al(III)-јона, на m/z 1703,88. У maLDI спектрима се индетификује и AlL3 врста, која је најчешће адукт са јоном натријума или калијума. Квантитативном специјацијом дошло се до закључка да је заступљеност молских удела комплексних врста, у систему Al(III)-joн-флероксацин, i763/i719 слична као код слободних лиганда i370/i326. Релативни интензитети за најзаступљеније врсте AlL2+ и AlL2+ добијени на основу ESI MS спектара са променом pH и релативни интензитети добијени на основу потенциометријских мерења су у прилично доброј сагласноти. Разилажења која постоје између ових података су последица ESI пертурбација у раствору. Идентификација ових пертурбација је веома важна јер се на основу њих процењује колико ESI MS спектри реално одсликавају стање равнотеже у раствору. Докторска дисертација 19 SUMMARY (Abstract) Th is dissertation comprises investigation of hydrolysis aluminum(III)-ion and aluminum(III)- ion and fl uoroquinolones (FQLs) family members (fl eroxacin, ciprofl oxacin and moxifl oxacin) complexation reactions. Within present study it is determined speciation in solutions of aluminum(III)-ion and in solutions of aluminum(III)-ions and fl uoroquinolones (FQLs) in aim to better understand pharmacotherapy and toxicokinetics of fl uoroquinolones antibiotics in the presence of aluminum-based drugs (antacids, vaccines, solutions for dialysis). So the solutions were investigated by electrospray mass spectrometry (ESI MS), tandem mass spectrometry (MS/ MS) and mass spectrometry with matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI MS). Investigation or these systems, using the above mentioned experimental techniques and computer processing data by using Hyss 2006 soft ware and artifi cial neural network (AAN) model gave the following results: Th e hydrolysis of aluminum(III)-ion have been investigated in the solutions of concentration level 0,03 to 5,0 mmol/dm3, in the pH range 3 to 6. Th e species with electric charge +1, +2 and +3, formed in this conditions. Monomeric and dimeric species were dominant until the pH value of 3,8. ESI MS spectra indicate the formation of small polymeric species (Al3-Al5) at pH 4,8 value. With the increase pH and concentrations values of aluminum(III)-ion, it was identifi ed intermediate polymers (Al6-Al10). With further increase in pH and the concentration of aluminum(III)-ion, higher polymers (Al11-Al13) were generated. Higher polymers are species that are relatively short period of time existing. At a pH of about 6,4 the sludge formed. Th e results obtained by ESI MS spectra are in good agreement with the results obtained by 27Al NMR spectroscopy and by potentiometry. Th e mass spectra generally depend on the instrumental parameters such as: fl ow rate of mobile phase, ion source temperature, capillary voltage and cone voltage. Th e most infl uence on the appearance of the mass spectrum is the cone voltage. If the cone voltage is 50 V it obtained the best agreement between the potentiometric species and species obtained by mass spectrometry. Тhe eff ects of experimental conditions on hydrolytic processes were also studied: infl uence of pH changes, aging solution, the infl uence of mobile phase, the infl uence of the aluminum(III)-ion concentration, the infl uence of counter ions. With increasing age the number of species in the solution spectrum is signifi cantly reduced. Only a few signals derived from species [Al(OH)2]+, [Al6(OH)13]5+, [Al4(OH)9]3+ and [Al5(OH)12]3 were identify in the spectrum. ESI MS spectra of Al(III)-ion and (FQLs) solutions were recorded in the positive mode in the range of 50 to 2000 m/z. Except calibration of instrument, is was tuned with solution of one component to optimize the instrumental parameters. In the pH range 3,0 to 6,0 and metal to ligand concentration ratio 2:1 to 1:3 were identifi ed mononuclear species: AlL2+, AlL2+ и AlL30, by ESI MS spectrometry.Th ese species identifi ed (by ESI MS spectrometry) in Al(III)-ion and fl eroxacin solutions at m/z: 193,52; 255,20; 719,62; 763,23; in Al(III)-ion and moxifl oxacin solutions at m/z 216,81; 414,22; 827,31; 1266,88; in Al(III)-ion and ciprofl oxacin solutions at m/z 249,05; 687,75; 1040,33; 1056,15. Protonated and mixed hydroxo complexes were identifi ed at all pH values, but the polymeric species are not found in the ESI MS spectra. Tandem mass spectrometry, MSn was used to gain insight into the structure of Al(III) ion- (FQLs) complexes, i.e. to determine the most probable binding sites of aluminum complexes. In the MSn experiments high collision energies (80-100 % of the maximum rf voltage) are applied to the parent ions. High collision energies indicates that the complexes of Al(III)-ion-fl uoroquinolones are very stable. Th e stability of these complexes indicates that during the fragmentation register only loss of small neutral molecules. MALDI measurements without the matrix confi rmed the existence of mononuclear complexes found by ESI MS. Th is fact indicates that these species are really formed in the solution but not the result of gas phase reactions. Polymer species, designated as [2Al3++5L-]+were identifi ed Mр Mирјана Р. Цвијовић 20 in the MALDI spectra. Th ese species probably descended from Al2L2 dimeric core, which is formed in solution and than the clusters are formed in the gas phase. Th e species identifi es as [2Al3++5L-]+ in the system fl eroxacin and Al(III)-ion appear at m/z 1894,77, in the system of moxifl oxacin and Al(III)-ion at m/z 2054,36 and the in system of ciprofl oxacin and Al(III)-ion at m/z 1703,88. AlL3 species also identify in the MALDI spectrum, which is usually sodium or potassium adduct ion. Th e mole fractions of complex species in the system Al(III)ion- fl eroxacin, i763/i719 is similar to that of the free ligand i370/i326. Th eir presence was concluded by quantitative speciation. Relative intensities for the most abundant species of AlL2+ and AlL2+ obtained by ESI MS with the change of pH and relative intensities obtained from the potentiometric measurements are in fairly good agreement. Th e diff erences between these data are the result of ESI perturbations in the solution. Identifi cation of these perturbations is very important because based on them estimate how ESI MS spectra refl ect the real state of equilibrium in solution. Докторска дисертација 21 УВОД Хинолони су синтетички антибиотици широког спектра дејства. Према антибакте- ријском спектру дејства хинолони се деле у четири генерације (I; II; III; IV и генерацију у развоју). Амфотерна су једињења која граде соли и са киселинама и са базама. У воденим растворима, у зависности од pH вредности могу постојати као катјони, анјони, диполарни јони и неутрални молекули. Хинолони су врло слабо растворни у води, а лако се растварају у киселинама и базама. Увођењем атома флуора у основно језгро хинолона настају флуоро- хинолони. Флуоровани хинолони (HQ) су једињења која у структури садрже осим нафтириди- нског и хинолонског прстена и атом флуора у позицији 6, а често и пиперазински прстен у позицији 7 хинолон-3 карбоксилног језгра. Најефикаснији супституент јесте пиперазинил чијим увођењем се повећава активност ових једињења против грам-позитивних и грам-не- гативних бактерија. Флуорохинолони су антибиотици широког спектра дејства уведени осамдесетих го- дина прошлог века да би се превазишао проблем резистенције многих бактерија на дотада примењиване антибитиоке. Најчешће коришћени флуорохинолони су: ципрофлоксацин, моксифлоксацин, флероксацин, левофлоксацин, офлоксацин, норфлоксацин, пефлоксацин. Примењују се код уринарних, бубрежних, респираторних инфекција, инфекција меких тки- ва, костију и у гинекологији [1]. Ови антибиотици инхибирају ензиме микробног нуклеуса (једра) топоизомеразу II и топоизомеразу IV (ДНК гиразу), ензиме који производе нега- тивни супернамотај ДНК. Замена карбоксилне групе неком другом киселом групом доводи до смањења антибактеријске активности. Изражене комплексирајуће особине флуорохи- нолона чине их инкомпатибилним са антацидима и препаратима који садрже минерале са двовалентним или тровалентним металима. Стехиометрија формираних комплекса зависи од више фактора као што су: концентрација хелатног агенса и металног јона, валенца (нае- лектрисање) металног јона и pH вредности раствора. Алуминијум као тровалентни катјон спада у тврде Lewis-oвe киселине и као такав по- казује велики афинитет за везивање са тврдим базама као што су хидроксиди, флуориди. Алуминијум (III)-јон је веома подложан хидролизи због великог афинитета ка негативно на- електрисаном кисеонику [2]. У зависности од услова хидролизе гради велики број хидроли- тичких комплекса од којих су најважнији мононуклеарни комплекси при ниским укупним концентрацијама алуминијума: ([Al(OH)]2+, [Al(OH)2]+ и Al(OH)30), односно полинуклеарни при вишим концентрацијама алуминијума. Најважнији полинуклеарни хидролитички ком- плекси су: [Al2(OH)2]4+, [Al3(OH)4]5+ и [Al13O4(OH)24]7+ . Алуминијум је нерастворан је у опсегу pH 6,0-8,0. При pH вредностима мањим од 6,0 и већим од 8,0, као и у присуству неорганских и органских лиганада, растворљивост алуми- нијума расте. Алуминијум не учествује у физиолошким процесима у организму. Међутим, велика примена овог метала у производњи и чувању хране, третману пијаће воде, у козме- тичким препаратима, велика заступљеност овог елемента у земљиној кори и појава киселих киша које га ослобађају из земљишта и уносе у ланац исхране, чине га веома штетним. У нормалним околностима када се мале количине алуминијум уносе храном и леко- вима, бубрежни механизам је довољан да уклони сав унети алуминијум. Међутим у стањи- ма када је поремећена функција бубрега или код пацијената на терапији лековима на бази алуминијума, нарочито оних са бубрежном инсуфицијенцијом (дијализатни раствори) или чиром на желудцу (антациди), болестима при којима се подразумева примање високих доза овог метала у дужем периоду или примање вакцина може доћи до накупљања Al(III)-јона у организму [3]. Токсично дејство Al(III)-јона се тумачи чињеницом да Al(III)-јон ступа у интеракције са многим биомолекулима, а посебно са протеинима(албумин и трансферин) и полипептидима.Токсично дејство алуминијума је „ублажено“ чињеницом да је већина њего- вих једињења слабо растворна. Код здравих људи ретко се јавља акутна токсичност орално унетим алуминијумом. Mр Mирјана Р. Цвијовић 22 При комплексирању Al(III)-јона са флуорохинолонима смањује се биорасположивост алуминијума, а самим тим и његова токсичност. Литературни преглед указује да нема радова који обухватају изучавање комплекси- рања алуминијума и флуорохинолона масеном спектрометријом, али постоје радови у који- ма је публикована фрагментација флуорохинолона као и интеракције двовалентних метала са норфлоксацином и левоксацином. Значај изучавања комплексирања алуминијум(III)-јона и флуорохинолона је велики, пре свега за разумевање фундаменталних биолошких процеса на нивоу ћелије. Ова дисе- ртација треба да разјасни питања природе и стабилности комплекса који се граде у раство- рима алуминијум(III)-јона и флуорохинолона, њихову концентрациону расподелу у услови- ма блиским физиолошким. Један од циљева ове дисертације јесте и разјашњавање начина везивања алуминијум(III)-јона за молекуле флуорохинолона. Да би се реализовали постављени циљеви примењена је масена спектрометрија и то ESI MS (за одређивање специјације у растворима алуминијума и растворима алуминијума и флуорохинолона), MALDI MS (за изучавање полимеризације у растворима алуминијума и флуорохинолона, као и за потврду специјације у овим растворима идентификовану приме- ном ESI MS технике), тандем масена спектрометрија за одређивање путева фрагментације и потенцијалне структуре молекула. Масена спектрометрија има предности у односу на оста- ле технике, јер њеним коришћењем се детектују формиране комплексне врсте присутне у микроконцентрацијама, баш као што могу настати у људском организму. Одређивање спе- цијације у растворима је извршено недвосмисленом асигнацијом сигнала у МS спектрима на основу односа масе и наелектрисања, изотопске дистрибуције и расподеле наелектрисања. Примењен је концепт вештачких неуронских мрежа (ANN) за анализу податакa до- бијених експериментално из ESI MS спектара. Добијено је добро слагање теоријских прора- чуна и експерименталних података. Докторска дисертација 23 1. ОПШТИ ДЕО 1.1. Масена спектрометрија Масена спектометрија је техника која се често примењује како за рутинске тако и у истраживачке сврхе. Најважнија примена ове технике је за тачно одређивање молекулске масе узорка [4]. Користи се у фармацији, изучавању нових лекова, проучавању метаболизма лекова, фармакокинетици, клиничком дијагностификовању присутности дрога, стероида у људском организму, анализи хемоглобина, квалитета воде и хране, за проучавање понашања јона у вакууму, анализи протеина, пептида, полимера, масе јона [5]. Масена спектрометрија се примењује у изучавању комплексних врста у раствору. Једина је техника која даје експерименталну потврду броја и идентификацију врста у раствору (специјациона анализа). Инфрацрвена и раманска спектроскопија дају податке о функционалним групама везаним за комплексе. NMR даје податке о координацији комплекса, (да ли је алуминијум(III)-јон 4– или 6– координован) као и податке о координационим стањима окружења анализираног атома-језгра [4, 6]. У овој дисертацији масена спектрометрија је коришћена за одређивање специјације у растворима алуминијум хлорида и растворима алуминијума и флуорохинолона и детекцију места (структурних јединица) унутар молекула, на којима је највећа вероватноћа да дође до фрагментације и одређивање потенцијалне структуре молекула. Масена спектрометрија се заснива на томе да се анализирани узорак (органско или неорганско једињење) преводи у стање јонизованог гаса (термалном методом, применом електричног поља или бомбардовањем убрзаним е-, јонима или фотонима при чему настаје сноп једнаких енергија), различитог односа масе и наелектрисања. Кретањем наелектрисаних честица тј. јона у електричном или магнетном пољу полазни сноп јона се разлаже на основу разлике количника масе и наелектрисања јона m/z (Слика 1). Формирани јони могу бити једноструко јонизовани атоми, кластери, молекули или њихови фрагменти. Настали јони се проводе кроз анализатор, који раздваја јоне у простору и/или времену. Из анализатора, јони иду на детектор где формирају електрични сигнал који се региструје на рачунару. Квалитативна и квантитативна анализа врше се на основу вредности m/z и релативне заступљености врста [4]. Слика 1. Пут јона у масеном спектрометру 1.1.1. Основни делови масеног спектрометра Да би једињење било анализирано у масеном спектрометру мора бити наелектрисано [7]. Међутим, већина органских молекула је неутрална па их је потребно јонизовати у извору. Mр Mирјана Р. Цвијовић 24 Основни део масеног спектрометра је јонизациони извор који обезбеђује наелектрисане честице тј. јоне, убрзава их и шаље у следећи део који обезбеђује наелектрисане честице, јоне, анализатор. Анализатор врши селекцију, тј. раздвајање јона у зависности од њиховог односа масе и наелектрисања m/z. Раздвојени јони се детектују и сигнал се бележи у бази података ради даље анализе. Важан део спектрометра је систем за одражавање ниског притиска 10-2–10-5 Ра тј. систем за високи вакуум. Високи вакуум обезбеђује минималну вероватноћу молекуске реакције јона тј. омогућава јонима да са једног краја инструмента дођу на други крај, а да не дође до судара тих јона са другим молекулима и до њихове неутрализације, расејања, или реакције фрагментације. Основне функције масеног спектрометра су: јонизација репрезентативног дела молекула из узорка, раздвајање јона према њиховој маси или према односу масе и наелектрисања m/z и мерење релативне заступљeности [7] (принос јона у % на одређеној маси, тј. на m/z). Масени спектрометар се састоји од следећих делова (Слика 2): 1. систем за увођење узорка (inlet) 2. јонски извор – производи јонски сноп из испитиваног узорка 3. јонска оптика – спроводи јоне до масеног анализатора 4. масени анализатор – разлаже јоне према њиховом односу маса и наелектрисања 5. вакуум систем – обезбеђује високи вакуум; 6. детекциони систем – детектује разложене јоне и мери њихов интензитет (електронски мултипликатори) 7. рачунар–за аквизицију и обраду података Слика 2. Основни делови масеног спектрометра Извор јонизације (Јонизатор): Основна намена јонског извора је да произведе јоне из атома или молекула узорка, формира и убрза јонски сноп ка масеном анализатору. Процес јонизације подразумева довођење енергије молекулу, при чему се избацује један или више електрона. При том може доћи и до фрагментације молекула у два или више фрагмената. Фрагментација је често пожељна, јер појава фрагмената у спектру указује на то од којих је компонената састављен испитивани молекул. Дешифровањем појединих фрагмената може се добити структура молекула. Најчешће се молекул фрагментише на различите начине, док један део остане цео и у спектру даје сигнал с највећом вредности масе. Тај јон се зове молекулски јон и он показује масу молекула (молску масу). Постоји више начина јонизације, који се разликују по количини енергије која се предаје молекулу. У зависности од начина јонизације неутралне честице, развијени су различити типови јонских извора. Докторска дисертација 25 ESI извор се примењује за анализу узорака из раствора. Растварач мора бити [4] поларни, лако испарљив. Узорак се најчешће припрема у одговарајућој концентрацији у смеши воде и органског растварача метанола, ацетонитрила или изопропанола. Одговарајућа количина сирћетне киселине често се додаје да поспеши процес протоновања молекула аналита за снимање у позитивном моду јонизације. За снимање у негативном моду јонизације додаје се амонијачни раствор или испарљиви амини да поспеше депротоновање молекула аналита. Раствор може бити и елуент из течно хроматографске колоне [8]. Избор позитивног или негативног мода снимања (ESI+ или ESI-) условљен је основним наелектрисањем врсте у раствору са циљем добијања најбољих резултата. Раствор се ињектује у област високог позитивног или негативног потенцијала. Највећи део растварача мора бити уклоњен без губитка узорка. Ако се растварач не уклони, онда испарава и „обара“ вакуум инструмента што доводи до повећања притиска и гашења инструмента. Постоји неколико начина раздвајања носећег растварача и испитиваног раствора. Један од бољих начина је примена ESI MS технике. Раствор пролази кроз челичну капилару (кратке дужине) до краја на коме се примењује високи позитиван или негативан електрични потенцијал (HV), обично 3-5 kV. Када раствор стигне до краја капиларе, јако електрично поље проузрокује тренутно испаравање (небулизацију) у млаз спреја веома малих наелектрисаних капи раствора у пари растварача. Јони се формирају на атмосферском притиску (API) и пролазе кроз конус у средњи вакуум регион, а одатле кроз мали отвор (апертуру) у област високог вакуума, [7, 9] масеног анализатора (Слика 3). Слика 3. Принцип ESI MS спектрометрије Основне карактеристике ESI-MS спектрометрије у изучавању метал-лиганд равнотежа су: • Примена за одређивање стехиометрије новосинтетисаних комплекса • Број идентификованих врста одговара броју пикова • Стехиометрија присутних врста се може директно одредити из m/z вредности (изотопски однос, MS спектари високе резолуције) • Релативна концентрација врста је пропорционална интензитету пикова Ако из MS спектра не добије довољно информација за идентификацију врста, примењују се снимање спектара високе резолуције MS/MS спектара и анализа изотопских шема пикова која даје потпуну идентификацију присутних врста. Mр Mирјана Р. Цвијовић 26 1.1.2. Типови јонизације Масени анализатор „ради“ само са наелектрисаним врстама, тј. јонима који настају из атома или молекула, ређе из радикала, zwitter јона или кластера [10]. Задатак јонског извора је да изведе одлучујући корак превођењa неутралних молекула или атома у наелектрисане честице. Постоји велики број јонзациних метода којима се ово остварује за разне врсте аналита [4]. Већина техника јонизације побуђује неутралне молекуле аналита који при том остају без електрона и долази до стварања катјон радикала M+ ·. Друге технике укључују стварање јона MH+ који настаје реакцијом између јона и неутралног молекула. Јони се загревају десорпцијом и десолватацијом и преводе у гасну фазу. Избор јонског извора зависи од природе узорка као и од врсте информација које треба добити. Оно о чему треба водити рачуна при избору јонског извора је енергија јонизације аналита, јер она контролише количину фрагментисаних јона. Најчешће јонизационе технике су: • електронска јонизација (EI) • хемијска јонизациуја (CI) • десорпција пољем (FD) • бомбардовање брзим атомима (FAB) • електроспреј јонизација (ESI) • јонизација потпомогнута ласерском десорпцијом (отпаравањем) из матрикса енг. (matrix assisted laser desorption /ionisation-MALDI) Електронска јонизација (EI) користи сноп брзих електрона, којима се бомбардују молекули у гасној фази. Електронски сноп се производи помоћу филамента (катоде) загрејаног до високе температуре провођењем струје кроз њега. Електрони који се избију са филамента, убрзавају се према позитивно наелектрисаној аноди. Варирањем потенцијала између катоде и аноде, варира се и енергија електрона, а тиме и учинак фрагментације. Обично се користе енергије од 70 eV. Електронска јонизација обично јако фрагментише молекуле аналита. Електроспреј јонизација (ESI; Electro Spray Ionization) [11, 12] јонизује аналит у облику раствора. Као растварач, обично се користи нека супстанца која је испарљивија од аналита. Узорак растворен у поларном, испарљивом растварачу у струји азота се распршује кроз челичну капилару на коју се при атмосферском притиску примењује јако електрично поље под чијим утицајем долази до одвајања позитивног и негативног наелектрисања у раствору. Када је капилара прикључена на позитиван крај извора напона, позитивно наелектрисани јони путују према катоди и акумулирају се на површини течности. При критичној јачини поља настаје тзв. Tејлоров конус у коме се континуално производе капљице „обогаћене“ позитивно наелектрисаним јонима које под утицајем градијента потенцијала и притиска путују према анализатору масеног спектрометра. Мењањем поларитета могуће је произвести негативно наелектрисане капљице. Будући да се електроспрејом континуално производи струја, како би се избегла акумулација наелектрисања на капилари и супротној електроди одвија се редокс процес. Значај електроспреја и њен велики допринос развоју модерне масене спектрометрије је што је то благи начин јонизације који омогућава пренос јона из раствора у гасну фазу. Јединствено својство електроспреја је и у настајању вишеструко наелектрисаних јона. Овај тип јонизације омогућава детекцију супстанци великих молекулских маса, поред малих молекула. Процес електроспреја може се поделити у три фазе: а)настајање капљица, б)смањење капљица ц)настајање јона у гасној фази (Слика 4). Докторска дисертација 27 Слика 4. Механизам електроспреја 1.1.3. Настајање наелектрисаних капљица на врху капиларе у ESI извору Напон од 2-3 kV примењује се на металну капилару, спољног пречника 0,2 mm, унутрашњег пречника 0,1 mm, удаљености 1-3 cm од веће, планарне „супротне“ електроде [7]. Јачина елекричног поља Ec у простору око врха капиларе при одређеном потенцијалу Vc може се представити једначином: (1) где је : rc спољни радијус капиларе и d удаљеност између електрода. Другим речима, електроспреј је специјална врста електролитичке ћелије у којој се транспорт дела наелектрисања не одвија кроз раствор већ кроз гасну фазу, најпре преко наелектрисаних капљица, а онда преко јона у гасној фази. 1.1.4. Смањење наелектрисаних капљица насталих електроспрејом Почетна величина наелектрисаних капљица насталих електроспрејом зависи од неколико параметара од којих су брзина протока раствора и својства растварача најбитнији [8]. При брзини протока од 5 dm3/min и укупној концентрацији електролита не већој од 10-3 mol/dm3 постижу се најбољи услови за висок принос јона у гасној фази. Тако настају капљице малог пречника па се могу сматрати монодисперзним (Слика 4). Како растварач при грејању испарава, смањује се величина капљица, али наелектрисање остаје константно. Долази до несиметричног дељења капљице, односно капљица „претка“ емитује неколико мањих капљица, слично процесу који се одвија на врху Tејлоровог конуса. Високи напон (1–4 kV) доводи до стварања Tејлоровог конуса који је „обогаћен“ позитивним или негативним јонима на врху. Спреј наелектрисаних капљица се избацује из Tејлоровог конуса под утицајем електричног поља. Капљице се сакупљају испаравањем, уз помоћ топле „струје“ гаса азота, пролазећи фронт јонизационог извора. Настале капљице су приближно монодисперзне, а њихов радијус износи око једне десетине радијуса капљице „претка“. Таквим несиметричним цепањем, у новије време названим распадом млаза (jet fi ssion), настају две врсте капљица, велике, које у себи носе нежељене спарене јоне електролита и мале, из којих настају јони у гасној фази. Mр Mирјана Р. Цвијовић 28 1.1.5. Гасно фазне реакције Финални продукти формирања јона у ESI комори јесу и јони у гасној фази, који пре доласка до анализатора и детектора, могу учествовати у различитим реакцијама и тиме мењати свој број или хемијски састав на често непредвидљив начин. Обим гасно фазних реакција зависи од напона на конусу ESI извора [13] при чему су гасне реакције мање заступљене при нижим вредностима овог напона (cone voltage). Ове реакције у одређеној мери могу довести до модификације дистрибуције присутних врста у самом анализатору, у односу на услове који претходе ињектирању раствора. Гасно фазне реакције се могу предвидети са мање сигурности него пертурбације у раствору, с обзиром да се понашање датих врста у гасној фази може потпуно разликовати од оног у течној фази. Када се растварач удаљава у гасно фазном процесу, може се догодити да се поједина врста иначе стабилна у раствору, услед недостатка солватације дестабилише у гасну фазу (или обрнуто). Постоје случајеви за које не важи претпоставка да уколико одређена врста захтева високу енергију фрагментације у MS/MS експерименту, егзистира у раствору као стабилна (то јест, не сматра се да је накнадно формирана у гасној фази). Механизам гасно-фазних реакција ни до данас није у потпуности разјашњен, али су два модела којима се објашњава настајање јона у гасној фази најприхватљивија: 1. модел остатка наелектрисања (Dole, 1968.): према моделу остатка [14, 15] наелектрисања ствара се изузетно мала капљица, радијуса приближно 1 nm, која садржи само један јон. Испаравањем последњег молекула растварача настаје јон у гасној фази. Данас се сматра да велики молекули, масе преко 3300 Dа, настају тим процесом. 2. модел испаравања јона (Iribarne и Th omson, 1976.): према овом моделу, из капљица радијуса приближно 8 nm, са вишком од приближно 70 елементарних наелектрисања, долази [6, 8] до испаравања јона пре него што капљица достигне Рејлијеву границу и започне дељење. Сматра се да мали јони у гасној фази претежно настају овим механизмом. Неки аутори примењују анализу интензитета пикова при смањивању концентрације метала, на истој pH вредности и при истом односу метал/лиганд [13, 15]. У случају гасно фазних реакција, очекује се да интензитети пикова буду у корелацији са концентрацијом метала и у складу са познатим подацима о равнотежи. Овај приступ изискује претходно познавање равнотежних односа у раствору који се испитује. Брзина гасно фазних реакција се повећава са порастом Т и ове се реакције дешавају у близини „угрејаног“ улаза у капилару. 1.1.6. Утицај интерференција на интензитет сигнала Раствор који је подвргнут електроспреју уз аналит садржи и производе електрохемијских реакција, нечистоће које могу потицати из различитих извора (растварачи обично садрже око 10-5 mol/dm3 Na+), често и електролит који се додаје узорку како би се побољшала десорпција одређене врсте [8, 16]. Киселина се додаје за повећање приноса јона M+H+, а базе за повећање приноса јона M-H+. Присутност електролита у великим количинама као и присутност површински активних супстанци може „маскирати“ сигнал аналита, што је један од главних недостатака електроспреја као начина јонизације у масеној спектрометрији. Мали и стабилни јони алкалних метала (Li+,Na+,K+, Rb+, Cs+) преводе се у гасну фазу без промена. На Слици 5. приказан је ESI MS спектар воденог раствора натријумовог, калијумовог, рубидијумовог и цезијумовог хлорида. Осим сигнала једноструко наелектрисаних јона алкалних метала може се уочити и сигнал при 18 m/z, који потиче од онечишћења, јона NH4+. Такође се могу уочити сигнали слабијег интензитета који одговарају хидратисаним јонима алкалних метала [M+H2O]+. Докторска дисертација 29 Слика 5. ESI MS спектар воденог раствора Na, K, Rb, и Cs 1.1.7. Параметри у ESI битни за анализу За ESI испитивање узорак се раствара у поларом испарљивом растварачу и пумпа кроз уску, челичну капилару [4]. На врх капиларе се примењује напон [8]. Капилара је смештена у јонизационом извору. Јако електрично поље тера узорак да изађе на врх диспергујући се у аеросол високо наелектрисаних капљица. Захваљујући испаравању растварача његова количина се смањује. Стога се густина неравнотежног наелектрисања повећава на површини капљице. Одбојне силе међу наелектрисањима расту проузрокујући низ експлозија све док јони аналита испаравају из капљице. У току процеса јонизације у ESI извору одигравају се неке од реакција у спољној сфери у току испаравања, које могу да промене почетно наелектрисање солватисаних врста. Код ESI технике вишеструко наелектрисани јони могу се добити нарочито у воденим растворима, јер вода има високу поларност (диелектрична константа 78,54). Овај параметар стабилише високо наелектрисање у раствору. Четири различита напона су битна да би се све врсте детектовале: • капиларни напон (3,5-4 kV), (capillary voltage) • мањи напон на конусу (sample cone voltage) (40-70 V), • екстракциони напон на конусу (5 V) (extraction cone voltage) и • напон оптике (200 V) (RF lens voltage). Капиларни и екстракциони напон имају врло мали утицај на спектре. Шум се углавном повећава при високим напонима, а најмањи сигнали ишчезавају када су напони врло ниски. Параметар који има највећи ефекат је „sample cone voltage“. Овај напон много утиче на изглед спектра; чак базни сигнал може ишчезнути, а нови ће се појавити и расти када се овај параметар мења. При вишим вредностима напона, број сигнала се повећава, а неки од сигнала достижу 100 % интензитет. Снижавањем напона смањује се вредност укупне јонске струје (total ion current) на врло низак ниво. Подешавањем напона оптике (RF lens voltagе) одабира се број врста [8]. 1.1.8. Извор јонизације MALDI MALDI је техника која директно јонизује и преводи јоне аналита из течне фазе у гасну. Ова техника се доста користи за термолабилне, неиспариве, велике органске молекуле као што су протеини, пептиди, синтетички и природни полимери, олигонуклеотиди, олигосахариди, лекови [16, 17]. MALDI техника се заснива на бомбардовању узорка ласерским снопом тако да сноп изазива и јонизацију и десорпцију (отпаравање, прелази из течности у гас) молекула узорка без хемијске деградације (Слика 7). Узорак се прво припреми тако што се меша са основом (матриксом) и та смеша се стављају на мету, подлогу (plate). Матрикс служи као „растварач“ за молекуле аналита [18]. Матрикс је најчешће нека органска компонента која Mр Mирјана Р. Цвијовић 30 има особину да јако апсорбује (UV) зрачење на таласној дужини ласера. Избор матрикса зависи од молекула који се анализира. Матрикс са узорком се остави док растварач испари. Најчешће коришћена метода је метода осушене капи (dried droplet) где се на тако припремљен узорак примени снажан ласерски пулс у трајању 3 до 5 ns. [11, 18, 19]. Енергију ласера апсорбују молекули основе и трансформишу енергију ласера у ексцитациону вибрациону енергију узорка што изазива избацивање јона аналита и матрикса са површине на коју је нанета ова смеша. Овакав трансфер енергије је ефикасан а молекули аналита нису изложени директној јонизацији при којој може доћи до њихове декомпозиције. У првој фази ласер десорбује високо енергетске честице из матрикса (што је олакшано применом вакуума и електричног поља), а у другој фази ласер јонизује аналит протоновањем или катјонизацијом и депротоновањем. MALDI јонизација је веома блага јонизациона техника чији типични масени спектар садржи: молекулски јон, мало вишеструко наелектрисаних јона, неколико фрагмената Дешава се да се фрагменти уопште не појаве па се овакав спектар може релативно лако интерпретирати. Ретко се јављају вишеструко наелектрисани јони. Основни делови MALDI ТОF инструмента (Слика 6) су: – Извор јонизације –ласер – Подлога – где се наноси узорак са одговарајућим матриксом – Анализатор – где се раздвајају јонизовани молекули на основу односа m/z, што се постиже мерењем времна прелета јона (ТОF анализатор) – Детектори – линеарни или рефлексиони. Детектори су повезани са рефлекторима, уређајима за повећање резолуције. Рефлектори се састоји од више електрода већег потенцијала, истог поларитета и напона убрзања. Ако су електроде укључене снима се рефлексионом методом, а ако су искључене линеарном методом детекције. Слика 6. Схематски приказ MALDI TOF инструмента Механизам MALDI се може сажети у три фазе: • Формирање „чврстог раствора“: Битно је обезбедити да матрикс буде у вишку чиме се омогућава да молекули аналита буду међусобно потпуно изоловани. Овако се формира хомогени „чврсти раствор“ чиме се обезбеђује стабилна десорпција аналита. Eвентуална нехомогеност нанете смеше изазвала би велико варирање резултата (варијације у интензитету и резолуцији пикова, тачности израчунатих маса) [17, 20]. • Ексцитација матрикса: Ласерски зрак се фокусира на површину матрикс-aнaлит чврстог раствора. Када је фреквенција ласера као фреквенција хромофоре матрикса Докторска дисертација 31 долази до брзе ексцитације, појаве вибрација што води до локализованог распадања чврстог раствора (Слика 7). Кластери емитовани са површине састоје се од молекула аналита окружени матриксом и јонима соли [21, 22]. Молекули матрикса испаравају из кластера и остављају слободни аналит у гасној фази. • Јонизација аналита: Фотоексцитирани молекули матрикса се стабилишу кроз трансфер протона. Везивање катјона за аналит је поспешено овим процесом. На овај начин се формирају карактеристични јони аналита [M+X]+ (X=H, Na, K). Ова јонизациона реакција се одвија у десорбованом матрикс-aнaлиту изнад површине. Јони се затим екстрахују у масени спектрометар за анализу. При снимању у позитивном моду код MALDI технике присутни су радикалски катјони, [23] протоновани псеудо-молекулски јони и катјони псеудо-молекулских јона у облику адуката металног јона. Слика 7. Аблација кристала и формирање агрегата састављених од матрице и аналита Формирање јона у ESI извору води преко микро капљица, док формирање јона код MALDI технике преко аблације материјала изазване дејством ласера (најчешће CO2 ласера за IR област или UV ласера) и формирања „plume“ [18, 22, 23]. MALDI plume је веома брз чак експлозиван фазни прелаз из чврстог у гасно стање. „Plume“ процес доприноси фрагментацији. Механизам формирања јона код MALDI технике састоји се из примарне и секундарне јонизације. Примарном јонизацијом добија се прва генерација јона из неутралних молекула узорка. Ови јони су најчешће врсте настале из матрикса (тзв. јонизациони корак). Секундарном јонизацијом настају јони који нису директни продукти примарне јонизације. Најчешће су то јони аналита. Схема 1. Реакциона путања у MALDI MS предложена од стране Karas-a i Hilenkamp-a Ова реакциона путања обухвата: фотоексцитациону путању (А формирање енергетских резерви, „energy pooling“), B (секвенцијалнy двофотонскy екситацијy) [24], С (симултану Mр Mирјана Р. Цвијовић 32 двофотонску екситацију), што све води до високо ексцитираних интермедијера из којих се ослобађају електрони у првом кораку јонизације. „Еnergy pooling“ је појава у којој се електронска ексцитациона енергија два суседна молекула прерасподељује, што се дешава кроз елементарни корак ексититације . У фази секундарне јонизације осим појединачних молекула избацују се и кластери и агрегати матрикса (нарочито карактеристично када се користе IR ласери). У реакцији фотојонизације између фотоелектрона и неутралних молекула настају високо реактивни радикал молекулскик јони [М-·]. Ови јони реагују са депротонованим, молекулским јонима [М- H]-, реакцијам преноса водоника. Запажају се и реакције вишеструке адиције водоника [М+2H]+· и [М +3H]+ које се на сличан начин могу објаснити. Код ESI МS технике постоје солватисани вишеструко наелектрисани јони, а код MALDI МS вишеструко наелектрисани агрегати. У фази примарне јонизације радикали фотојонизваног матрикса су кључни јони у односу на остале MALDI јоне што јеприказано на Схеми 1. У Табели 1 су сумирани највжнији јонски продукити који потичу од различитих класа аналита добијених разлитим путевима јонизације [24]. Табела 1: Јони одабраних класа аналита, формирани примарном и секундарном јонизацијом Класа аналита Десорпција претходно формираних јона Гасно-фазни трансфер протона Гасно-фазна катјонизација, анјонска адиција Трансфер електрона Елиминација наелектрисања Пептиди, протеини Изотопски обележен А+ (А+H)+ (А-H)- (А+C) + (А+C(II) –H)+ Металопротеини (А+C) + (А+H) + (А-H)- (А+C) + (А+C(II) –H)+ Јонофоре, метал комплекс лиганди (А+C) + (А+H)+ (А-H)- (А+C) + (А+C(II) –H)+ Олигонуклеотиди (А+H) + (А-H)- (А+Na/K) + Олигосахариди (А-H)- (А+C)+ (А+Na/K)+ (А+C –nH) - Поларни полимери (А+H) + (А-H)- (А+Na)+ (А+K)+ (А+C)+ (А+C(II) –H)+ Неполарни полимери (А+C) + (А+Ag)+ (А+C(II) –H) + Фулерени, деривати фулерена (А+H)+ (А-H)- (А+C) + A+· A+· Једињења са ниским јониз. потенцијалом (Фероцени, металоцикли) (А+X)- A +· A-· Јако кисели аналити (сулфонат Боје) (А-H) - (А-H)- где је А-аналит, C-метал катјон (понекад специфициран као Na, K, Ag...), X је контра јон 1.1.9 Анализатори у масеној спектрометрији Масени анализатор је основни део масеног спектрометра, помоћу кога се остварује примарна функција масене анализе–раздвајање јона (насталих неком од јонизационих техника) по њиховој маси и/или наелектрисању из јонизованог узорка и омогућава мерење Докторска дисертација 33 њихове релативне заступљености (обилности). Масени анализатор након раздвајања јона масе m од јона блиске масе m+m фокусира издвојени сноп јона Постоји више начина за раздвајање јона па се стога анализатори деле на континуалне и пулсне [23]. Континуални пропуштају само једну врсту јона тј. јоне одређеног m/z који долазе до детектора. Код таквих анализатора је потребно мењати јачину магнетног поља да би сви јони били детектовани. Такви анализатори су квадруполни, магнетни сектори. Магнетни сектори се састоје од магнета између чијих полова пролазе јони под дејством Lorenz-oве силе на наелектрисање у кретању. Квадруполни се састоје од четири ваљкасте паралелне електроде између којих се пропуштају јони. Пулсни са друге стране детектују цео спектар из једног пулса јона. Такви анализатори су јон трап анализатор, TOF анализатор са јон циклотронском резонанцом. Јон трап анализатор је кутијица са неколико електрода са наизменичним и једносмерним напоном којима се контролишу јони. ТОF анализатор убрзава јоне из јонизатора помоћу хомогеног електричног поља. Анализатор са јон циклотронском резонанцом (Fourier Transform Mass Spectrometry) je техника анализе јона по масама. Овај анализатор садржи велики магнет у коме је низ електрода помоћу којих се контролише положај јона. 1.1.9.1 Јон трап анализатор Јон трап је уређај који ограничава и чува у добро дефинисаној области простора јоне од интереса који ће се анализирати. Сем што се широко примењује као масени анализатор овај уређај се користи и као масени спектрометар захваљујући ниској цени коштања и ултра високим перформансама [25, 26]. Јон трап анализатори се класификују у четири групе: 1. Тродимензиони (3D) квадруполи и јон трап уређаји високог поља (high fi eld order) 2. Линеарни јон трап 3. Јон –циклотрон резонантни FT MS уређај 4. Орбитрап Овде ће бити описан принцип рада тродимензионог (3D) квадруполног јон трапа, тзв. Paulov-oг трапа. Инструмент са овим анализатором је брз и има високу резолуцију (моћ раздвајања). Тродимензиони (3D) квадруполи јон трап (QIT) фунционише тако да се раздвајање јона по масама постиже чувањем јона у простору заробљавања (trapping space), управљањем њиховим кретањем у времену а не у простору [5]. Принцип овог јон трапа је чување јона у уређају који је састоје од три електроде: прстенаста и две тањирасте електроде. Јони се стабилишу у трапу применом RF напона на прстенасту електроду. Да би се постигла максимална ефикасност, јони се морају усмерити ка центру где је поље заробљавања (trapping) најближе идеалном и најмање изобличено, што обезбеђује максималну резолуцију и осетљивост. Ово се постиже увођењем гаса за пригушење у трап (99,98 % хелијум) који смањује сударе ињектованих јона, пригушујући њихове осцилације док се не стабилизују и ограничава их на центар трапа. Повећањем RF напона или применом додатног напона на тањирасте електроде или комбиновањем оба могуће је: дестабилизовати јоне и прогресивно их избацивати из трапа, чувајући при том само један јон одређене m/z вредности у трапу и онда га избацити са циљем анализирања или чувања само једног јона у трапу и његовим фрагменисањем индукованим вибрацијама и посматрати настале фрагменате (принцип МS/МS). С обзиром да се све дешава на истом месту, али у различито време овај поступак се зове МS/МS „у времену“ при чему aкo се последња операција понавља неколико пута да би се прогресивно фрагментисали јони то је МSn. Тродимензионо поље се формира применом потенцијала Φ=U–V·cos(ω·t) (2) Mр Mирјана Р. Цвијовић 34 на прстенасту електроду и одржавањем тањирастих електрода на основном потенцијалу. U и V су амплитуде DC и RF потенцијала респективно, а ω је ангуларна фреквенца. На слици 8. је приказана конструкција јон трапа са три електроде једном прстенастом и две тањирасте. Слика 8. Путања јона у трапу и заробљавање јона 1.1.9.2 TOF анализатор TOF анализатор је један од најједноставнијих уређаја за анализу маса. Овај анализатор је доста брз, али има мању моћ раздвајања од електричног или масеног сектора (мању од 500). Предности TOF-а су: висок трансмисиони ефекат, неограничен опсег m/z, ниска граница детекције и велика брзина скенирања [27]. Принцип рада овог анализатора заснива на раздвајању јона (формираних у извору) на основу различитог времена (t) потребног да различити јони пређу познато растојање до детектора након убрзања у електричном пољу. На почетку процеса сви јони имају исту енергију и њихове брзине су пропорционалне односу m/z. У извору ТОF инструмента сви јони настају истовремено брзом експлозијом са филамента. Овај метод се зове пулсна јонизација. Потом се убрзавају изван јонског извора коришћењем електричног потенцијала од 2–2,5 kV. Са становишта физике потенцијална енергија сваког јона који напушта извор је пропорционална zV (наелектрисању јона). Кроз цев прелета (евакуисана цев без присуства електричног поља) дужине око 100 cm, путују јони и сва енергија се у току кретања јона претвара у кинетичку енергију. (3) Масивнији јони путују спорије. Потенцијална енергија сваког јона који напушта јонски извор мора бити једнака кинетичкој енергији којом стиже до детектора тако да је: (4) Брзина јона у току путовања кроз цев је једнака дужини цеви подељеној временом које је потребно да јон пређе ово растојање тако да је: (5) Решавањем једначине (5) по m/z добија се основана једначина TOF масене спектрометрије (6) У једначини (6) L је одређено дизајном инструмента, а V се одржава константним тако да је L/(2V)1/2 константа. Следи да је m/z пропорционално квадратном корену времена путовања (прелета) t јона кроз цев. Докторска дисертација 35 Масени спектар се добија акумулацијом излазног сигнала са детектора као функиција времена, а затим се та вредност конвертује у m/z вредност. Јони који се разликују по времену прелета за најмање 1 ns могу се детековати. Када се најспорији јони детектују (највишeг m/z) следећи сет јона се формира и убрзава електричним пољем изван извора ка детектору. Опсег m/z који ће бити подвргнути аквизицији мора се пажљиво бирати јер јони са већим m/z од задатог опсега могу наставити да се крећу ка детектору иако је пулс нових јона формиран и убрзан [6, 11]. Слика 9. Путања јона у ТОF анализатору Тандем TOF/TOF је спектрометар где се истовремено користе два TOF инструмента. TOF/TOF може да ради у МS моду када бележи цео спектар (full spectrum) детектујући све јоне или у тандем МS/МS моду када детектује само јоне преостале након редукције првобитног броја јона. Први TOF МS (обично је цев за прелет јона на чијим се крајевима врши одабир јона по времену) изолује прекурсор јоне на основу филтера брзина. Други TOF МS (обухвата „пост“ акцелератор, цев за прелет јона, јонско огледало (ion mirror) и јон- детектор који анализира фрагментне јоне. 1.1.9.3 Квадрупол анализатор Квадруполни анализатор је најчешће коришћени анализатор, због погодних димензија, велике брзине снимања спектра, високе ефикасности трансмисије (број јона који стигне до детектора), добре линеарности, умереног вакуума (p≈10-4 mbar) и ниске цене [25]. Квадруполни анализатор се састоји од два пара међусобно паралелних електрода (Слика 10). Две су на позитивном електричном потенцијалу истог интезитета, а две су на негативном електричном потенцијалу истог интезитета. Хиперболичног су или цилиндричног облика, усмерене дуж z осе. Монтиране су у квадратну конфигурацију. На електроде се доводи електрично поље које је комбинација RF и DC напона, дефинисано једначином: (7) где је Φ– електрично поље, U–једносмерни потенцијал, V–амплитуда наизменичног потенцијала, Ω –фреквенција наизменичног потенцијала, t–време [6, 10]. Слика 10. Путања јона у квадруполу Mр Mирјана Р. Цвијовић 36 Док пролазе кроз анализатор, јони се филтрирају електричним пољем на основу m/z вредности, тако да само поједини бивају пропуштени, јер имају стабилну путању, док су остали разелектрисани на електродама. Вредност m/z јона који ће проћи кроз анализатор, зависи од U, V и Ω вредности. Радио-фреквентни потенцијал одбија или преноси јоне на основу m/z вредности, фокусирајући их наизменично у различитим равнима. За време прве половине радиофреквентног циклуса, горња и доња електрода су позитивно, а лева и десна негативно наелектрисане. Овакав распоред наелектрисања потискује позитивне јоне у хоризонталну раван. У другој половини циклуса поларизованост је обрнута, па се јони фокусирају у вертикалној равни. Електрично поље квадруполног анализатора наставља да се мења на исти начин па настаје тродимензионални талас кретања јона. Да би стигли на колектор, амплитуда дуж две осе треба да буде таква, да онемогући привлачење јона од стране електроде. Одабиром одговарајућег RF потенцијала, анализатор ће пропуштати јоне већег m/z односа до детектора, а јони мањег m/z односа биће привучени ка електродама. Једносмерни напон, такође има утицаја на кретање јона. Утицај је већи на „теже“ јоне, јер се спорије рефокусирају под дејством радио-фреквентног поља, него „лаки“ јони. Због тога се они полако усмеравају даље од центра квадрупола, а при крају анализатора привлаче их електроде [25]. 1.1.10. Детектори у масеној спектрометарији Када се јонске врсте раздвоје у масеном анализатору потребно их је квалитативно и квантитативно одредити. Детекција се најчешће изводи електричним путем, тако што се мери релативна заступљеност (укупна јонска струја). Када су вредности релативних заступљености (relative abundance) ниске, тј. јонске струје мале јачине (10-9–10-6А), користе се разни једносмерни електрични појачавачи (DC-појачивачи), фотомултипликатори, електрон мултипликатори и динамички кондезатори (вибрациони – цевасти електрометри) [4]. Принцип рада електрон мултипликатора заснива се на употреби више узастопних „Фарадејевих шоља“, динода са растућим потенцијалом. Јонски сноп из масеног анализатора пада на електроду мултипликатора и избија електроне, обично један до два електрона по јону. Они бивају убрзани на путу ка следећој „Фарадејевој шољи“ која има виши потенцијал него предходна, па се емитује још већи број електрона и тако редом 8 до 20 пута. На тај начин улазни сигнал се појачава се 10 до 12 пута због чега има високу осетљивост. Највећа осетљивост постиже се при напону од око 3000 V, али овако висок напон скраћује век трајања детектора. Код фотомултипликатора јони излазе из масеног анализатора, преводе се у фотоне и као такви детектују. Овај уређај има мању осетљивост, али знатно дужи век трајања. Снимање масеног спектра изводи се променом једносмерне и наизменичне компоненте напона, при чему је њихов однос константан. 1.1.10.1. Детектори у MALDI TOF масеној спектрометрији Детекција убрзаних јона (трећи ступањ MALDI TOF масене спектрометрије) се може извршити коришћењем линеарне и рефлексионе методе. На крају цеви за прелет јона је код већине MALDI TOF инструмената смештен уређај за повећање резолуције, тзв. рефлектор [20]. Овај уређај се састоји од серије електрода, које имају нешто већи потенцијал и исти поларитет као напон убрзавања. Рефлектор је повезан са додатним детектором, постављеним насупрот обичног детектора. Када су електроде искључене спектар се снима линеарном методом, а када су укључене рефлексионом методом. Јони који имају одређени однос m/z и брзину лета продиру у поље рефлектора у различитом опсегу. Брзи јони продиру дубље у поље, па је самим тим за њих потребно дуже време за рефлексију. Истовремено, дуже време лета повећава резолуцију. Са друге стране, код линеарне методе детекције фрагменти молекула који се распадају након зоне убрзавања и даље се крећу приближно истом брзином као и почетни (нераспаднути) молекули и доводе до настајања сигнала дефинисаних истим временом прелета, истовремено проузрокују и благо ширење пика. Ово својство линеране методе је нарочито важно за детекцију молекула великих моларних маса. Докторска дисертација 37 Обе методе детекције имају својих предности и недостатака, па их треба користитити у зависности од жељених информација. Линеарна метода детекције показује већу осетљивост за веће молекуле, док је код рефлексионе методе резолуција већа. Зато се линеарна метода користи приликом одређивања расподеле моларних маса полимера, нарочито када је M>10000 g/mol [17] Са друге стране, рефлексиона метода се углавном користи приликом одређивања тачне моларне масе индивидуалних ланаца полимера, што је неопходно приликом идентификације крајњих група и детекције споредних производа. 1.1.11. Тандем масена спектрометрија (Масена спектрометрија/масена спектрометрија или MS/MS спектрометрија) Основна конфигурација инструмента [28, 29] за MS/MS експерименте је комбинација два масена анализатора са реакционим простором између њих (слика 11). Велики број конфигурација може бити употребљен за MS спектрометрију, а основни концепт укључује мерење m/z јона пре и после реакције у масеном спектрометру. Реакција подразумева промену у маси и може бити приказана на следећи начин: mp+→md+ + mn (8) где je mp+ прекурсор (родитељ) јон, md+ je продукт (ћерка) јон a mn представља један или више неутралних врста (неутрални губитак). Са становишта маса важи: mp=md+mn (9) У основи MS/MS експеримента је селекција прекурсор јона у првој фази анализе, и анализа маса продукт јона у другој фази анализе (енгл. product ion scan). Фрагментација прекурсор јона зависи од активационе енергије реакције. Енергија за савлађивање ове баријере потиче од вишка енергије акумулиране у прекурсор јону у току јонизације. Метастабилни јон који у току јонизације добија довољно унутрашње енергије за фрагментацију и опстаје довољно дуго до екстракције из јонског извора, може дисосовати спонтано у току „лета“ (путање) од јонског извора до детектора. Двоструко фокусирајући сектор инструмента може се користити да детектује метастабилне јоне. MS/MS има аналитичку примену у комбинацији са благим (soft ) јонизационим техникама где би без MS/MS добили само информацију о „недирнутом“ (целовитом) молекулу и не би се могла посматрати фрагментација. Слика 11. Принцип тандем (MS/MS) спектрометрије Информације добијене карактеристичним путевима фрагментације су важне и сударом индукована дисоцијација (CID) је идеално решење. Први корак у CID-у је актуелни судар између јона који се брзо крећу и непокретних неутралних мета, што резултује повећањем унутрашње енергије јона. Други спорији корак обухвата спонтану фрагментацију [30] екцитираног јона при чему се добија продукт јон и неутрални фрагменти. Постоје два режима за CID: нискоенергетски (примењују се десетине електрон волти-eV) и високо енергетски (примењују се хиљаде електрон волти). У пракси ниско енергетски CID се изводи тако што се сноп убрзаних електрона усмерава да пређе запремину запоседнуту молекулима гаса или атомима као метом. У MS/MS инструментима масени анализатори су раздвојени у простору, као код tripl quada (QqQ). Простор који „затвара“ ову запремину зове Mр Mирјана Р. Цвијовић 38 се колизиона ћелија. У колиозионој ћелији се дешава велики број судара чији је допринос (проценат фрагментисаних јона који долазе до детектора) веома висок. Нискоенергетски CID спектри су веома осетљиви на мале промене у колизионој енергији, промене притиска колизионог гаса и масу неутралне мете. Поред продукт јон скан мода већина MS/МS инструмената ради и у другим скан модовима. Примена различитих модова је корисна не само за тумачење фрагментационе схеме одређеног једињења, већ и за скрининг серија структурно повезаних једињења у комплексном узорку. У продукт јон скан моду први масени анализатор селектује одређене прекурсор јоне, док се продукт јони добијени CID-ом анализирају у другом масеном анализатору. У прекурсор јон скан моду овај процес је виртуелно „реверзан“. 1.1.11.1. Фрагментација у тандем масеној спектрометрији Фрагментација јона у гасној фази је основ тандем масене спектрометрије између различитих фаза масено спектрометријске анализе [30, 31]. Постоји много метода које се користе за фрагментацију јона и тако се добијају различите информације о структури и саставу молекула. Фрагментација у извору (распад јона у самом извору за јонизацију) Често се дешава да је процес јонизације јак да оставља продукт јоне са довољном унутрашњом енергијом да се фрагментишу у масеном спектрометру. Ако продукт јони постоје у неравнотежном стању умерено дуго пре него што започне процес дисоцијације овај процес се зове метастабилна фрагментација [32]. Nozzle-skimer фрагментација (фрагментација која се дешава у области између испуста, отвора (nozzle) и прскалице (skimer) се односи на циљану индуковану фрагментацију у извору повећањем потенцијала на скимеру ЕSI инструмента. Мада фрагментација у извору омогућава фрагментациону анализу то технички није тандем масена спектрометрија све док се метастабилни јони анализирају масеном спектрометријом или се одабирају пре аутодисоцијације. Други корак анализе се изводи на резултујућим фрагментима. Фрагментација у извору се често користи као додатак тандем масеној спектрометрији са фрагментацијом ван извора која омогућава два корака фрагментације у псеудо МS3 експериментима. Фрагментација ван извора се најчешће користи у тандем масено спектрометријским експериментима. Енергија се такође може додати јонима који су већ вибрационо ексцитирани кроз сударе ван извора са неутралним атомима или молекулима, апсорцијом зрачења или тансфером или заробљавањем електрона вишеструко наелектрисаним јоном. Сударом индукована дисоцијација (CID) која се другачије зове и сударом активирана дисоцијација (CАD) подразумева сударе јона се неутралним атомом или молекулом у гасној фази и следећем кораку дисоцијацију јона [33, 34]. На пример ако размотримо AB+ +M→A+B++M (10) где је АB+ јон који се судара са неутралним врстама М и касније раскида везу. Ово се детаљније описује колизионом теоријом. Ако се електрон придружи вишеструко наелектрисаном позитивном јону, ослобађа се Кулонова енергија. „Придруживање” слободног електрона се зове ЕCD–дисоцијација заробљавањем електрона [35, 36] и приказује се једначином: [M+nH]n+ +e- →[M+(n-1)H( n-1 ) +]*→ фрагменти (11) За вишеструко протноване молекуле М присаједињавање електрона кроз јeдначином реакције зове се електрон трансфер дисоцијација-ЕТD и приказује се једначином: Докторска дисертација 39 [M+nH]n+ +A- →[M+(n-1)H( n-1) +]*+A→ фрагменти (12) Оваква фрагментација се такође дешава са депротонованим врстама у којима је електрон који се преноси са дате врсте на катјонски реагенс у току дисоцијације са негативним електронским преносом -NETD: [M-nH]n- +A+ →[M- nH( n+1)-]* +A→ фрагменти (13) Енергија неопходна за дисоцијацију може се обезбедити апсорпцијом фотона што резултује фотодисоцијацијом и представља се једначином: AB+ +hν→A+B+, (14) где је hν фотон абсорбован од стране јона [37-39]. 1.1.12. Масени спектар Масени спектар је аналитички приказ резултата [38] масено-спектрометријског мерења, који представља функционалну зависност интензитета појединих јона од количника масе и наелектрисања m/z (Слика 12). Добија се у графичком облику на одговарајућем регистратору, који се затим нормализацијом (прерачунавањем релативних интензитета свих пикова у односу на најинтензивнији пик) преводи у спектар у линијском облику. • Апсциса: m/z • Ордината: релативна заступљеност (abundance), релативан интензитет Слика 12. Изглед масеног спектра 1.1.13. Конституенти масеног спектра При судару молекула узорка с електронским снопом у јонском извору спектрометра долази до јонизације и фрагментације молекула [39]. Стварају се врсте јона различитог карактера и интензитета, који се одражавају у сложеном масеном спектру. Први корак у прикупљању информација из масеног спектра представља класификацију јона који одговарају појединим линијама (пиковима) у спектру. На масеном спектру (Слика 12) су означени : 1. Основни јон, јон са највећим интензитетом у спектру, 2. Метастабилни јон (М+), јон који се налази на нецелобројним вредностима маса, 3. Вишеструко наелектрисани јони, 4. Преуређени јони, 5. Фрагментациони јони (M+, M++, F+), 6. Изотопски јони, 7. Негативни јони 8. Јони настали у јонско-молекулским реакцијама Основни јон је увек најинтензивнији јон у спектру без обзира на то, да ли је он молекулски или фрагментациони јон, његов се интензитет процењује на 100%. Остали јони се у спектру обрачунавају у односу на основни јон. Mр Mирјана Р. Цвијовић 40 Молекулски јон М+ је јон чија је маса једнака молекулској маси једињења [3]. Молекулски јони, или јони основног молекула, настају откидањем једног електрона из молекула узорка, односно, формира се елиминацијом једног електрона из неутралног молекула, спаривањем електрона из молекула са једним електроном велике енергије. M+e-→M++2e- (15) Значај молекулског јона који се налази на маси m/z и која одговара молекулској маси једињења је у томе што он најтачније и најпоузданије одређује молекулску масу испитиваног молекула. Различите групе органских једињења имају различити релативни интензитет молекулског јона. Тако у спектрима алкохола, амина, карбонских киселина молекулски јон (М+) је слабог интензитета (5-25%) у неким случајевима може и да изостане. За разлику од ових, код ароматичних једињења молекулски јон (М+) је један од најинтензивнијих ако не и најинтензивнији, односно основни јон. Ако једињење садржи елемент са више природних изотопа онда су они садржани у јонима М++1, М++2, М++3, у зависности од природе и броја природних изотопа. Интензитет молекулског јона, односно релативна обилност молекулског јона у односу на фрагментационе јоне у масеном спектру може се повећати смањивањем енергије електрона до близу вредности потенцијала јонизације молекула, при стандардним условима снимања. 1.1.14. Интерпретација масених спектара Стандардна процедура интерпретације спектара обухвата [3] прикуплање следећих информација: молекулску масу, елементарни састав, број прстенова и двоструких веза (незасићеност), „подструктуре“, корелацију између „подструктуре“ и фрагментације, итд. Претпостављени могући молекул упоређује се са подацима из базе података (Mc Laff erty база садржи 220,000 различитих једињења), [41]. При интерпретацији масених спектара осовне информације се добијају на основу вредности m/z. Вредност m/z мора бити прецизно измерена (±0,5 масених јединица). Да би се проверила поузданост одређивања m/z треба прво снимити интерни стандард (перфлуороалкана, CnF2n+2). Већина пикова су целобрајне масе, међутим вишеструко наелектрисани јони јављају се у виду масе чија је вредност разломак. Базична информација за идентификацију једињења је молекулска формула, број елемената конституената. Када су у спектру присутни изотопи, изотоп најниже масе је увек најзаступљенији у спектру за сваки елемент. Бројне јонизационе технике дају радикал катјоне или радикал анјоне, протоноване или депротоноване молекуле и различите адукте. Ови јони дају фрагменте са парним бројем електрона (попуњене љуске) или са непарним бројем електрона (непопуњене љуске). 1.1.14.1. Типични јони Неки јони су типични за одређене структуре. На пример једињења која садрже угљоводоничне ланце дају серије јона са међусобном разликом од 14 Dа (-CH2). Масе на којима се они појављују зависе од група које су са њима везане. Потпуно засићени угљоводонични јони јављају се на масама 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99 Da . Молекули са бензенским језгром често дају фенилијум јон на m/z 77, којима се придружују фрагменти који одговарају губитку ацетилена на m/z 51. Ако је за алкил ланац везано језгро бензена, добијају се јони на m/z 91, који су комбинација бензилијум и тропилијум структуре, која даје фрагмент на m/z 65 при губитку ацетилена. Докторска дисертација 41 1.1.14.2. Присуство молекулског јона Код електронског судара молекулски јони су слабо видљиви у случају линераних засићених угљоводоника. Гранање обично проузрокује ишчезавање пика молекулског јона. Међутим, код незасићених, нарочито код оних са ароматичним прстеном, пик молекулског јона је интензивнији. Присуство електронегативних хетероатома (кисеоника, флуора) спречава појаву молекулског јона. Интензитет зависи од група које су присутне. Стога алифатични естри дају слаб или одсуство молекулског јона, док ароматични дају интензиван пик молекулског јона. Употребом благе јонизационе технике (ЕSI) у позитивном моду (М-H)+ се најчешће детектује код засићених једињења и (М+H)+ у случају незасићених једињења или једињења која садрже хетероатоме. Међутим халогена једињења или једињења која садрже sp3 кисеоник често спречавају могућност посматрања молекулског јона. Стога је тешко формирати молекулски јон или псеудомолекулски јон ацетала или ортоестара. 1.1.14.3. Типични неутрални „губици“ Губитак водониковог атома код електронског судара се дешава код алдехида, у случају хетероцикла који садрже кисеоник или азот [10, 39] или када је више водоникових атома везано за α угљеник, за азот или атом кисеоника . Губитак молекула водоника се посматра код сваке јонске врсте (позитивне или негативне, валентне–непопуњене или попуњене љуске) и сваки пут доприноси коњугацији или ароматичности. То је заједничко за циклична једињења . Губитак од 15 Dа типичан је за метил групу и засићени прстен. МS спектар циклохексана са Мr=84 Dа, показује фрагмент на m/z 69 са релативним интензитетом 25 %. Овај јон је присутан и у ЕSI спектру тетралина. Губитак од 16 Dа одговара губитку метана или N оксида или сулфоксида што указује на губитак кисеоника. Фрагментација чији је резултат губитак воде се „види“ као губитак од 18 Dа. Ово је честа појава када је хидроксилна група присутна и за различите врсте јона. Молекули који садрже карбонилну групу обично не губе воду, изузев из њихових коњугованих киселина. У случају неароматских прстенова губитак од 18 Dа одговара обично (H2+CH4). Губитак од 19 или 20 Dа је типичан за флуор чија је атомска маса 19 Dа. У случају узастопних губитака, вода и водоник могу дати губитак од 20 Dа. Неки неутрални губици су карактеристични за нарочите структуре и показују велику аналитичку корист. На пример естри масних киселина губе 3 C атома до карбоксиметила и атоме водоника специфичним преуређивањем. Губитак од 44 Dа је типичан за неутрални молекул CO2. 1.1.14.4. Интерпретација масеног спектра непознатог једињења обухвата: 1. Претраживање библотеке спектара [6] 2. Прикупљање података о хемијској историји узорка 3. Могућност идентификације M+• (позитивно наелектрисан молекулски јон) или проверавања да ли је присутан у спектру 4. Проверавање да ли се номинална молекуларна маса јавља на параној или непарној m/z вредности Узимање у обзир правила азота 5. Одређивање када је то могуће, елементарног састава за јоне коришћењем интензитета изотопског пика • Одређивање номиналне масе јона • Нормализовање интензитета пикова • Потрага за A+2 pattern-ом елемената (осим О) Mр Mирјана Р. Цвијовић 42 • Коришћење X+1 интензитета пика за одређивање броја и врсте А+1 елемената. • Израчунавање броја О атома из X+2 интензитета пика (X, X+1, су пикови са m/z вредношћу већом или мањом од пикова у спектру са одређеним бројем јединица). • Процењивање масе преосталих А елемената 6. Анализирање на шта општи изглед спектра указује 7. Потрага за серијама јона мањих маса (може их бити више од једне) 8. Ређање првих „губитка“ од М+• и покушај да се прикаже њихова схема 9. Проналажење интензитета непарних-електрон јона у спектру 10. „Сабирање” свих ових информација и претпостављање структуре. Израчунавање укупног броја прстнова и двоструких веза у М+• опште формуле CxXyNzOn, где X може бити водоник или халогенени елемент или комбинација оба: Укупан број прстенова и двоструких веза , где сеједна половина односи на паран број електрона. 1.1.14.5. Одређивање наелектрисања Постоји више начина да се одреди наелектрисање које одговара пику у спектру, па према томе и маса. Први начин је на основу изотопских пикова [6, 40, 41]. За скуп изотопских пикова разлика у масама од 1 a.m.u одговара једноструко наелектрисаном јону. Разлика од 0,5 a.m.u одговара двоструко наелектрисаном јону. На овај начин наелектрисање се може одредити ако је присутан само један пик или скуп изотопских пикова. У спектрима често се појаве адуктни јони H+2, Na+ или NH4+ на основу чега се може одредити наелектрисање. Натријумов адукт једноструко наелектрисане честице биће на плус 22 a.m.u даље од MH+пика. Ако је јон двоструко наелектрисан адукт јавиће се на +11 a.m.u oд MH+ пика. Следећи начин одређивања је на основу претпосатављеног наелектрисања. У ЕSI извору формирање димера и тримера компликује интерпретацију спектара. То се обично отклања смањивањем концетрације аналита или променом јонизујућих параметара (напона). Ако је претпостављено наелектрисање +1 додаје се протон вредности m/z посматраног јона и дели се са један. Ако тако израчунато m/z даје сигнал у спектру на тој m/z вредности претпосавка о +1 наелектрисању је тачна. Ако израчунато m/z не даје у спектру дату m/z вредност треба претпоставити другачије наелектрисање. За узастопна наелектрисања треба израчунати m/z и видети да ли постоје сигнали при тим m/z. Ако имамо једињења масе 1000 и 2000 вишеструко наелектрисана стања ће се разликовати за ова два једињења. За једињење 2000 појавиће се пикови на 2001 (z=1), 1001 (z=2), 667 (z=3) и 501 (z=4) уз претпоставку да m није било наелектрисано. За једињење масе 1000 појавиће се пикови 1001 (z=1), 501 (z=2) 334 (z=3) и 251 (z=4). 1.1.15. Изотопна супституција у масеној спектрометрији Присуство елемената са више стабилних природних изотопа има за последицу појаву јона на маси m/z M++1, M++2, M++3, M++4, што зависи од врсте и количине присутног изотопа [3]. Многи елементи садрже два или више природних изотопа (Табела 2) .Тако, бром садржи два изотопа Br79 и Br81 и даје два молекулска јона M+-Br79 и M+-Br81 чији су интензитети приближно у односу 49,5: 50,5. Код спектара метана је молекулски јон састављен из два јона и то јона m/z 16 који потиче од C12H4+ и јон m/z 17 који потиче од C13H4+ који је мањег интензитета и јони који се налазе на m/z 18, који су занемарљиво мали, а потичу од C13H3 H2+ i C12H4H2+. Докторска дисертација 43 Табела 2. Природни изотопи, њихова заступљеност и масе [4] Изотоп Егзактнамаса Проценат заступљености Хемијска маса 1H 1,00782510 99,9852% 1,00794 2H (D) 2,01410222 0,0148% 12C 12,0(0) 98,892% 12,01100 13C 13,0033544 1,108% 14N 14,00307439 99,635% 14,00674 15N 15,0001077 0,365% 16O 15,99491502 99,759% 15,99940 17O 16,9991329 0,037% 18O 17,99916002 0,204% 26Al 25,986892 27Al 26,98153863 100% 26,98154 35Cl 34,96885268 75,78% 35,45279 37Cl 36,96590259 24,22% 19F 18,99840322 100% 18,99840 У интерпретацији масених спектара користе се подаци о међусобним интензитетима сигнала и релативној заступљености да би се лакше дешифровао изотопски pattern [29, 41]. Анализа изотопског pattern-а уз анализу m/z је основ идентификације у масеној спектрометрији. 1.2. Хинолони Хинолони су синтетички антибиотици широког спектра дејства. Произашли су из налидиксинска киселине. Хинолонима припадају и деривати нафтиридина, пиридопиримидина и хинолина, који садрже додатне атоме азота у једном или другом спојеном прстену [42, 43]. Краћи назив 4-хинолони је усвојен као генеричко име за све антибактеријске агенсе ове групе једињења. Сви 4-хинолони су деривати 1,4-дихидро-4-оксо-пиридин-3-карбонске киселине. Увођењем супституената у положаје 1-, 2-, 5-, 7 и 8 настају различите структуре хинолона. Као протон акцептор ових једињења појављује се секундарна амино група из пиперазинског, пиролидинског, пиперидинског прстена која може да прими протон и пређе у амонијум групу. Протон донор је карбоксилна група везана за хинолонско језгро. Општа структура хинолона приказана је на Слици 13. Према антибактеријском спектру дејства хинолони се деле у различите генерације (I, II; III; IV и генерација у развоју). Слика 13. Општа структура хинолона Увођењем атома флуора у основно језгро настају флуорохинолони. Атом флуора везан је за централни прстен а типичне позиције су C6 и C7 (Слика 14) . Mр Mирјана Р. Цвијовић 44 Слика 14. Нумерација атома у хинолонском прстену Растворљивост молекула хинолона у телесним течностима утиче на њихову биорасположивост као и на њихову апсорпцију, дистрибуцију и елиминацију. Сви имају висок степен расподеле што указује на њихову добру дифузију у ткива, органе и телесне течности. 1.2.1. Флуоровани хинолони Флуорохинолони су класа антимикробних агенаса који су уведени осамдесетих година да би се превазишао проблем резистенције многих бактерија на досада примењиване антибиотике. Флуорохинолони прве групе су активни против многих грам позитивних и грам негативних бакерија али су опет донекле ограничени појавом резистенције.Друга генерација флуорохинолона има шири спектар дејства и овде није присутан проблем резистентности. Флуорохинолони су хетероцикличне амино киселине. Ова једињења су диполарни (zwitter) јони и различите су растворљивости у зависности од pH. Слабо се растварају у води. Лако се растварају у киселинама и базама [45, 58]. Раствори у базама су стабилни до pH =12. При вишим pH вредностима долази до хидролизе и разлагања молекула флуорохинолона. Већина ових једињења се раствара у хлороформу и метиленхлориду. Растворљивост у етанолу, метанолу, ацетону и етру је мала. Захваљујући присуству ароматичних дeлокализоиваних пи електрона и електронегативних хетеро атома, посматрани флуорохинолони су високо поларизабилни и стога подложни мноштву специфичних интеракција са поларним растварачем: протоновање, специфична солватација итд. С обзиром да су ови молекули конформацијски флексибилни, то утиче на њихову реактивност и солватацију. У Табели 3. су приказани подаци о растворљивости флурохинолона који су коришћени као лиганди од интереса у овој дисертацији (флероксацин, моксифлоксан и ципрофлоксацин). Табела 3. Растворљивост флурохинолона (mg/cm3) на 250C Растварач Моксифлоксацин Ципрофлоксацин Флероксацин Вода 24 35 0,450 Метанол 26 0,300 Етанол 2,5 0,100 Пропиленгликол 0,150 Диетилетар <0,001 Ацетон 0,072 0,500 Хлороформ 4 n-хексан <0,001 Глацијална CH3COOH 300 Ацетонитрил 0,27 Дихлорометан 0,068 N,N- диметилформамид 7,6 Растворљивост ципрофлокстацина у етанолу и 2-пропранолу је за 2 до 3 реда нижа него његова растворљивост у води а у случају моксифлоксацина за један ред величине је нижа. И Докторска дисертација 45 ципрофлоксацин×HCl и моксифлоксацин×HCl показују исти тренд растворљивости у датим растварачима. Ово је последица чињенице да су сличне структуре оба флуорохинолона и показују високу растворљивост у води најмање за један ред величине већу него у другим растварачима. Ова чињеница је последица присуства хидрохлорне групе која у води постаји (Cl- )водећи до формирања јонских врста и повећавајући растворљивост ципрофлоксацина у води. Растворљивост ципрофлоксацина показује већу температурску зависност него растворљивост мохсифлоксацина. Флуорохинолони су мали молекули молекулске масе између 300 и 500 Dа. Показују афинитет ка хелатирању са металним јонима као што су: Cu, Pb, Zn и Mg [43, 46, 47]. Флуорохинолони су осетљиви на светлост. При дуготрајном чувању, да не би изгубили активност, морају бити заштићена од светлости. Примењуjу се у третману уринарних, респираторних инфекција, у терапији мешовитих инфекција костију, меких ткива, у гинекологији. Неки се користе и као хемиотерапеутици [42]. Флуорохинолони друге генерације (ципрофлоксацин, флероксацин ломефлоксацин, норфлоксацин, грепафлоксацин, офлоксацин) имају побољшну активност (око 1000 пута већу) према аеробним грам-негативним бактеријама, а показују активност и према аеробним грам-позитивним бактеријама. Флуорохинолони четврте генерације (моксифлоксацин, тровафлоксацин) имају значајну активност према анаеробним бактеријама, а задржавају активност и према аеробним грам-негативним бактеријама. Клиничка испитивања су показала да истовремена примена флуорохинолона [42, 43] и антацида на бази алуминијума води до смањене биолошке доступности антибиотика и до 40 %. Присуство флуорохинолона може утицати на апсорпцију алуминијума преко формирања Аl(III)-јон- HQ комплекса који могу бити стабилни толико да доведу до смањења концентрације слободних Al(III)-joна. 1.2.1.1. Физичко-хемијске особине флуорохинолона Физичко-хемијске особине као што су константе дисоцијације, растворљивост, партициони коефицијенти значајне су за разумевање адсорпције, транспорта, метаболизма и екскреције ових молекула. Макроконстанте дисоцијације показују алкалитет самих молекула као целине, док микорконстанте описују способност везивања појединих функционалних група [48, 49, 50, 51]. Људски организам је састављан од 70–75 % воде. Како је просечна молекулска маса лека 400 g/mol, доза од 400 mg даје концентрацију oд 2×10-5 mol/dm3 лека у организму. Дакле, у организму су присутни као разблажени раствори. Кисело-базне особине лека директно утичу на апсорпцију, екскрецију и компатибилност са другим лековима. Tипичне вредности макро (pKi) и микро константи (pkij) дисоцијације испитиваних флуорохинолона дате су у Табели 4. Табела 4: pK вредности флуорохинолона Флуорохинолон pK1 pK2 pk22 pk11 pk21 pk12 pI Ципрофлоксацин 6,11 8,50 6,19 7,04 8,72 6,19 7,46 Флероксацин 5,50 8,00 6,86 Моксифлоксацин 6,25 9,29 7,46 6,29 8,08 9,25 7,77 Mр Mирјана Р. Цвијовић 46 1.2.2. Флероксацин–опште особине Флероксацин (6,8-дифлуоро-1-(2-флуороетил)-1,4-дихидро-7-(4’-метил-1’-пиперазинил) -4-оксо-3-хинолин карбоксилна киселина) припада II генерацији флуорохинолона. Има три атома флуора: два су директно везана за хинолонски прстен, а један је у бочном низу (Слика 15). Слика 15.Структурна формула флероксацина Општа формула флероксацина је C17H18F3N3O3. Релативна молекулска маса је 369,34 g/mol. Први пут је описан раних 80-тих година, а синтетисан је у лабораторији Hoff man-La Roche и Kyorin 1985. године. Флероксацин је бео, нехигроскопан, кристални прашак без укуса и мириса. Врло је осетљив на светлост и сва испитивања се морају вршити заштићено од светлости. Више од 99,5 % честица има пречник већи од 50 μm. Партициони коефицијент флероксацина је 1,08 (октанол/вода). Флероксацин је слабо хидросолубилан и умерено липосолубилан [45, 51]. Испитивање растворљивости флероксацина у различитим растварачима показују да се флероксацин најбоље раствара у неполарним растварачима (хлороформ), киселинама и базама. У растворима јаких база флероксацин је нестабилан и брзо подлеже хидролизи и разлагању при pH вредностима изнад 10. Од поларних растварача најбоље га растварају они који могу са њим да награде водоничну везу и који се понашају као акцептори протона (диметилсулфоксид). Пошто је по хемијском саставу хетероциклична амино киселина у воденим растворима, може постојати у облику протонованог катјона, диполарног јона, неутралног молекула и анјона. Константе дисоцијације флероксацина у воденом раствору на 298 K и при јонској јачини 0,1 mol/dm3 износе pK1= 6,97, pK2=8,21. Прва константа дисоцијације се односи на дисоцијацију протона карбоксилне групе катјона флероксацина, а друга на дисоцијацију протона са протонованог азота пиперазинског прстена. Физичкохемијска и фармакокинетичка својства флероксацина при другим експерименталним условима показују друге вредности константи дисоцијације pK1= 5,5, pK2=8,0. Електронски апсорпциони спектар флероксацина има два максимума: први на 280 nm који потиче од апсорпције делокализованог π-електронског система хинолонског језгра. Други максимум се налази на 320 nm и потиче од апсорпције пиперазинског супституента [51, 52, 53]. Флероксацин показује природну флуоресценцију. У воденом раствору, ексцитациони максимум се налази на 280 nm, а емисиони на 450 nm. Гради хелатне комплексе са металним јонима прелазних метала као што су бакар, олово, цинк и магнезијум. Наведени комплекси су мање хидросолубилни и због тога имају мању антибактеријску активност. Није запажено разлагање флероксацина ни после месец дана на 65 0C, било у сувој атмосфери било при 85 % релативној влажности. Нема хиралних центара и синтезом се не добијају оптички изомери. Докторска дисертација 47 1.2.3. Моксифлоксацин–опште особине Моксифлоксацин је новија, IV генерација антибиотика која делује против широког спектра патогена, укључујући и Streptococcus pneumonie, резистентну на многе друге антибиотике. Заштићени назив регистрованог препарата моксифлоксацина је „Avelox“. Моксифлоксацин (1-циклопропил-7 [(s,s)-2’,8’-диазабицикло [4,3,0]нон-8’-ил]-6-флуоро- 8-метокси-1,4-дихидро-4-оксо-3-хинолин карбоксилна киселина) је кристална супстанца светло жуте боје, горког укуса [51, 54]. Општа формула моксифлоксацина је C21H24FN3O4. Релативна молекулска маса 401,43 (Слика 16). Моксифлоксацин хидрохлорид нема дефинисану тачку топљења, али на температурама изнад 250 °C долази до његове разградње. Специфична ротација раствора моксифлоксацина концентрације 10 mg/cm3 у 50 % ацетонитрилу је [α]0–1310. Слика 16. Структурна формула моксифлоксацина Инфрацрвени спектар моксифлоксацина показује карактеристичне траке на следећим таласним бројевима (cm-1): 3528–3470, 3068–2830, 2796–2083, 1709–1623 и 1515–1352. Најизраженије траке су у области 1515–1352 cm-1. Потичу од истежућих вибрација C=C ароматичног језгра и савијајућих вибрација N–H, C-H i C-N-C прстена. Такође су изражене и истежуће вибрације C=О карбонилне групе у области 1709–1623 cm-1 [59]. Електронски апсорпциони спектар моксифлоксацина је врло сличан спектру осталих флуорованих хинолона тј. има два максимума: први максимум је на 294 nm и потиче од апсорпције делокализованог π електронског система хинолонског језгра. Други максимум се налази на 330 nm и потиче од апсорпције пиперидинског и пиролидинског супституента. Моксифлоксацин има 2 pKa вредности. Прва pK1 износи 6,25 и потиче од дисоцијације протона карбоксилне групе, а друга pK2 износи 9,29 и потиче од дисоцијације протона са азота на C7 супституенту [55]. Моксифлоксацин је чист S,S-енантиомер са два асиметрична центра. Одговарајућа стереохемијска конфигурација је осигурана полазним материјалом S,S-пироло- пиперидином, па није потребна стерео-селективна синтеза нити сепарација рацемата. 1.2.4. Ципрофлоксацин–опште особине Ципрофлоксацин је синтетички хемотерапеутски антибиотик флуорохинолонског типа комерцијално познат под називом „Ciprinol“. Припада II генерацији флуорохинолонеских антибиотика [56, 57, 58, 60]. Ципрофлоксацин:1,4-дихидро-1-циклопропил-6-флуоро-4-оксо-7-(1-пиперазинил)- 3-хинолон карбоксилна киселина има општу формулу: C17H18FN3O3. Релативна молекулска маса: 331,34 (Слика 17). Хинолони имају два типа прстенова у структури, нафтиридински са азотним атомомом у положају 1 и 8, језгро са само једним азотом у положају 1 које се зове уствари хинолонски прстен (језгро). Они садрже кето кисеоник у С-4 положају и карбксилни ланац у С-3 Mр Mирјана Р. Цвијовић 48 положају. Моксифлоксацин и ципрофлоксацин садрже пиперазилску групу у С-7 положају. Присуство карбоксилне и амино групе има утицај на кисело базна својства ових лекова чини да на својства ових лекова утицај имају физичкохемијска својства растварача [64]. Слика 17. Структурна формула ципрофлоксацина Електронски апсорпциони спектар ципрофоксацина има два максимума: први на 275 nm који потиче од апсорпције делокализованог -електронског система хинолонског језгра. Други максимум се налази на 330 nm. На нижим таласним дужинама налази се симетрична трака јаког интензитета, док се на вишим таласним дужинама налази асиметрична трака знатно мањег интензитета. Инфрацрвени спектар ципрофлоксацина показује карактеристичне траке на следећим таласним бројевима (cm-1): 3442–2701, 1731–1518, 1468–1194 и 761-561. Најизраженије траке су у области 2701–1731 cm-1 и оне потичу од N-H асиметричних истезања и C=О истежућих вибрација карбонилне групе. Карактеристичне су и јаке траке на 1264 cm-1 које потичу од CH савијања у равни, као и на 1194 cm-1 од CH савијања и CH увијања и C-О истезања [59, 62]. NMR спектри ципрофлоксацина 1H и 13C карактеришу се мултиплетима и померајима карактеристичних сигнала. У 1Н спектрима ципрофлоксацин x HCl карактеристични су помераји H-2 (9,14s), H-5 (8,14d), H-8 (7,71d) уз супституенте циклопропил групе (CH2 1,26- 1,52 m, CH 3,89 m) и пиперазинску групу (H-3’ 3,53 m, H-2’ 3,75 m) [61, 62, 63]. У 13C спектрима карактеристични је група хемијских помераја испод 60 ppm, који одговарају супституентима везаним за језгро хинолона, а помераји изнад 100 ppm одговарају C атомима који чине само језгро. За сигнале изнад 110 ppm карактеристична су преклапања сигнала која потичу од C3, C5 и C8 угљеникових атома.13C помераји ципрофлокацина [62] у DCl (147,5, 109,5, 167,2, 168,1, 113,(113,2) 150,1 (155,2), 145,1 (145,4), 104,5, 138,8, 119,2. 1.3. Алуминијум Према распрострањености у земљиној кори [65] (масени удео 8 %) алуминијум је трећи елемент, одмах после кисеоника и силицијума. Уобичајени опсег алуминијума у земљишту креће се од 1-30 %. У природи се не налази у елементарном стању, већ је у облику руда. Најважнија руда алуминијума је боксит. Велике количине алуминијума се налазе у облику минерала на бази алумино-силикатних комплекса као што су: глине и фелдспат. Анхидровани алуминијум-оксид (Al2O3) се јавља у природи као корунд. Различито обојени корунд служи као драго камење. Ако је корунд онечишћен траговима кобалта обојен је модро и зове се сафир; онечишћен траговима хрома обојен је црвено и зове се рубин. Зелено обојени корунд назива се смарагдом, љубичасти аметистом и жути топазом. Докторска дисертација 49 1.3.1. Физичко-хемијске особине алуминијума Алуминијум је мек, попут сребра бео метал [65]. Спада у групу лаких метала (густина 2,79 g/cm3). Добар је проводник електричне струје и топлотне енергије. Његове физичке особине еластичност, лака топивост, могућност лаке обраде ваљањем, сечењем и извлачењем учиниле су да се алуминијум доста користи у индустрији. Постојан је на корозију, рефлектор је светлости, не ствара магнетно поље. Пошто је чист алуминијум превише мек, даље се прерађује у облику легура (најчешће се легира са Mg, Ti, Si, Ni...). Легуре алуминијума имају знатно боља механичка својства од чистог алуминијума. Најпознатије легуре су: дуралуминијум, силумин, мангалијум. Алуминијум се налази у III а групи Периодног система елемената са редним бројем 13. Атомска маса алуминијума је 27,0. Има мали атомски радијус који омогућава стабилност његових једињења. Ковалантени радијус алуминијума је 0,125 nm, а јонски радијус је 0,045 nm. Оксидациона стања +3, +1 (веома ретко). У основном стању атом алуминијума има конфигурацију 1s2 2s2 2p6 3s2 3p1. Конфигурација задњег нивоа се може представити схематски: ↓↑ ↑ 3s 3p Неке од карактеристика овог елемента [65] дате су у Табели 5. Табела 5: Енергија јонизције, коефицијент електронегативности и редокс потенцијал алуминијума Симбол елемента Енергија јонизације [еV] Коефицијент електронегативности Редокс потенцијал ЕΘ/V(Al3+/Al)I II III Al 5,98 19,0 28,44 1,5 -1,66 Вредност редокс потенцијала указује да алуминијум релативно лако прелази из елементарног стања у 3+ јон. Стабилно тровалентно стање Al(III)-јона се објашњава великом енергијом хидратације (4180 kJ/mol). Енергија хидратације је функција наелектрисања и величине јона. Са малим јонским радијусом (0,045 nm) и великим наелектрисањем Аl(III)-јон има велики јонски потенцијал и у воденим растворима лако хидролизује у одсуству других лиганада. С обзиром да коефицијент електронегативности има малу вредност, не могу се очекивати једињења са негативним степеном оксидације. У воденим растворима алуминијум се најчешће налази у стању +3. Са овим оксидационим бројем гради велики број једињења јонског и ковалентног карактера. Најчешћа координација алуминијума је 4 и 6. Координацији 4 одговара хибридизација sp3 са тетраедарском структуром, док координацији 6 одговара sp3d2 хибридизација са октаедарском структуром. Алуминијум је „најтврђи“ метални јон (међу 3+ јонима). Формира комплексе повећане стабилности са лигандима са тврдим донорским групама. Најефективнији лиганди су они који садрже јако базне, негативно наелектрисане кисеоничне атоме: фенолати, карбоксилати, фосфати, алкоксиди и атом азота који су геометријски тако распоређени унутар молекула лиганда да се формирају петочлани или шесточлани металоцикли [67, 68, 69]. 1.3.2. Типичне реакције алуминијум(III)-јона: хидролиза и комплексирање Хидролиза алуминијум(III)-јона Хидролиза је реакција разлагања воде у присуству јона или неутралних молекула. Када су у питању јони, разлажу се молекули воде координовани за дати јон. Хидролиза јона заједно са неутрализацијом и дисоцијацијом спада у протолитичке реакције [66, 70]. Постоје два типа хидролизе: самохидролиза (self) хидролиза која се јавља у изразито киселим растворима Mр Mирјана Р. Цвијовић 50 и одвија се сама по себи (када хидратисани катјон алуминијума елиминише протон без додатка икаквих реагенаса) и принудна (forced) хидролиза, где се одвајање протона са хидратисаног катјона врши додатком регенаса који реагују са њим (прима протон). Услови хидролизе (тј. састав раствора и брзина којом се врсте комбинују, старење, температура, pH средине, природа анјона основног електролита, врста јонске средине) [66] одређују природу и квалитет прелазних полимерних врста, колоидних честица или формиране аморфне чврсте фазе. Главни проблем у изучавању хидролизе проистиче из чињенице да је то веома спор процес, при чему изгледа да ови системи никада не достижу праву равнотежу. Као високо наелектрисан мали катјон Аl(III)-јон лако хидролизује у воденим растворима у одсуству комплексирајућих лиганада. У растворима киселијим од pH~4 Аl(III)-јон остаје нехидролизован. Са порастом pH раствора Аl(III)-јон хидролизује и даје различите мононуклеарне и полинуклеарне хидролитичке комплексе. У киселим срединама pH<3, алуминијум постоји у облику Al(H2O)63+ јонa [66]. Са порастом pH (pH>4), дешава се брзо и реверзибилно депротоновање солватисаног молекула воде што доводи до формирања следећих врста: [Al(OH)(H2O)5]2+, [Al(OH)2(H2O)4]+, [Al(OH)3(H2O)3] и [Al(OH)4(H2O)2], при ниским укупним концентрацијама алуминијума (CAl <1 mmol/dm3). Мале полинуклеарне врсте формирају се спорије и то су: [Al2(OH)2(H2O)8]4+, [Al3(OH)4(H2O)10]5+, а још много спорије стварају се велики полимерни јони [Al13O4(OH)24(H2O)12]7+. Полинуклеарне врсте се формирају, ако је концентрација Аl(III)-јона довољно висока (CАl веће од 10 mmol/dm3). Неутрални раствори дају талог Аl(ОH)3, који се поново раствара при повећању pH (pH>6), што за последицу има формирање Al(OH)4-. Ако у раствору нема других лиганада који су способни да задрже Аl(III)-јон у раствору, равнотеже растварања за Al(OH)3 и растворне хидроксо комплексе Аl(III)-јона, морају се узети у разматрање са циљем да се опише стање Аl(III)-јона у раствору. Комплексирање алуминијум(III)-јона Везивање хидроксидног и других лиганада за алуминијум јон одређено је термодинамичким и кинетичким факторима. Са термодинамичке тачке гледишта, однос високог наелектрисања према радијусу алуминијумовог јона предвиђа његову већу склоност ка електростатичком, него ковалентном везивању. Стога алуминијум формира стабилне комплексе са лигандима који садрже негативно наелектрисане органске функционалне групе, нарочито јако базичне кисеоничне атоме. И величина прстена може утицати на стабилност комплекса када су N атоми геометријски тако распоређени да се формирају петочлани или шесточлани металоцикли (EDTA, DTPA) [69, 71, 73]. Кинетички Аl(III)-јон се разматра као лабилан метални јон са релативно брзом изменом воде и лиганда. Хидратисан алуминијумов јон је „најтврђи“ од свих тровалентних металних јона и има ефективни јонски радијус 0,50 Å. Зато што је Аl(III)-јон веома „тврд“ метални јон, он има велики афинитет ка „тврдим“ анјонима. Међу „најтврђим“ донорима је кисеонични јон који се налази у полимерним Аl(III) врстама; обично је координован са два или више Аl(III)-јона. Мада су OH- и F- изоелектрични, ОH- има много већи афинитет за Аl(III)-јон због делимично ковалентне природе Аl-О координационе везе и због чињенице да је веза између Аl3+ и F- скоро потпуно јонска. Аl(III)-јон формира најстабилније комплексе са мултидентантним лигандима са негативним кисеоничним донором, а афинитет ових лиганада ка Аl(III)-јону се повећава са базношћу лигандних донорских група [67, 68, 69]. Монодентантни негативни кисеонични донори који се често налазе у мултидентантним лиганднима, ефикасни су за Аl(III)-јоне. Докторска дисертација 51 Константе протоновања ових донора указују да њихов афинитет за Аl(III)-јоном варира са базношћу која се у воденим растворима мери константом протоновања. Стога се базност донорских атома лиганда мора узети у разматрање при изучавању равнотежа Аl(III)-лиганд у воденим растворима. Донорске групе могу бити комбиноване на различите начине међусобно, као и са другим органским групама да би дале бидентантне или полидентантне лиганде различите базности. Афинитет ових донора за Аl(III)-јон одговара константама протоновања.[74] За мултидентантне лиганде са више од две донорске групе, веома су важни и други фактори, као што је промена конформације лиганда. Код мултидентантних лиганада са негативним кисеоничним донорима, афинитет расте са бројем донорских група и са базношћу донорских група. Координациони број је шест, код већине ових комплекса. Групе са најизраженијом базношћу, као што су алифатични и ароматични хидроксилни донори генерално су протоноване при ниским pH, чак и са присутним Аl(III)-јоном, а много су доступније за везивање и ефективније на вишим pH. Донори мање базности, као што је карбоксилатни анјон су, у општем случају, доступнији при нижим pH, али их Аl(III)-јон везује слабије. Са аспекта склоности лиганада ка грађењу хелатних прстенова, различите величине са различитим металним јонима, с обзиром да је геометрија хелатног прстена таква да се петочлани хелатни прстенови граде са већим металним јонима, док се шесточлани хелатни прстенови граде са малим металним јонима. Примери хелатних прстенова који се граде по овом принципу могу се наћи у структурама цитратних комплекса. Тридетантне координације цитрата са металним јоном могу довести до формирања два шесточлана хелатна прстена или једног петочланог и једног шесточланог прстена у зависности од радијуса металног јона [70, 71]. Амини не везују Аl(III)-јон јако, изузев као део мултидентатног лигандног система као што је нитрилотриацетат NTA и EDTA. Азотне базе DNA и RNA не везују Аl(III)-јон. Флуориди везују Аl(III)-јон јако и на нивоу од 1 ppm, у коме се додају у закишељену пијаћу воду (појављују се као АlF2+ и неутрални AlF3 ). Од значајнијих лиганада у билошким системима треба споменути десфериоксамин (DFО) који је ефикасан комплексирајући агенс за Аl(III)-јон. Може се користити као хелатирајући агенс у третирању прекорачења концентрације алуминијума и гвожђа у људском организму. Цитрат је молекул мале масе који се најјаче веже за алуминијум. Због његове улоге у метаболизму алуминијума, цитрат је лиганд чије су интеракције са алуминијумом највише изучаване. Цитрат углавном постоји у облику трикарбоксилног анјона на pH>6 и 0,1 mM у крвној плазми. Пошто цитрат може да хелатира трагове алуминијума у храни не препоручује се унос цитрата заједно са антацидима на бази алуминијума. Цитрат такође ослобађа Аl(III)- јон и из нерастворног Al(OH)3 и из AlPO4. Од представника молекула велике молекулске масе који се често јавља као лиганд у комплексирању са Аl(III)-јоном треба споменути трансферин. Трансферин је главни протеин плазме који учествује у везивању алуминијума. Од физиолошке важности такође је комплексирање алуминијума са фосфатним лигандима. Ови лиганди имају високу константу стабилности, али су ипак мање проучавани, него комплекси алуминијума са цитратом 1.3.3. Токсичне особине алуминијума Токсично дејство Аl(III)-јона објашњава се чињеницом да овај јон ступа у интеракције са многим биомолекулима, посебно са протеинима и полипептидима. Тоскично дејство алуминијума се ублажава чињеницом да је већина његових једињења слабо растворна. Mр Mирјана Р. Цвијовић 52 Најчешће манифестације токсичности алуминијума су: неуротоксичност (Alchajmero-ова болест, амиотрофична латерална склероза), скелетна токсичност (остеомалација, патолошке фрактуре), хематотоксичност (анемије: хипохромна, нормохромна) [72, 73, 75-77]. Код здравих људи (упркос широкој изложености једињењима алуминијума преко хране, пијаће воде и антацида) ретко се јавља акутна токсичност орално унетим алуминијумом [74]. До повећања концентрације алуминијума код уремијских пацијената долази као последица уношења велике дозе орално примљеног алуминијума (овим пацијентима се дају фосфат- везујући гелови на бази алуминијума чија је улога да регулишу ниво серумског фосфата) или parentрално датог алуминијума (парентерални алуминијума потиче од присуства Аl(III)- јона у дијализујућем флуиду). Ефекти експозиције људског организама алуминијума могу се поделити на локалне ефекте (на месту уласка алуминијума у организам) и системске. Локални ефекти су углавном локализовани у гастроинтестиналном тракту и плућном ткиву. Алуминијум делујући локално у гастроинтестиналном тракту смањује апсорпцију гвожђа, фосфора, флуорида, калцијума и повећава апсорпцију калцијума. Такође алуминијум смањује мотилитет дигестивног тракта, па се веома често као компликација код примене лекова који садрже у себи знатне количине алуминијума (најчешће антацида) јавља опстипација. Везивање фосфата у гастроинтестиналном тракту може довести до смањења садржаја фосфата и остеомалације. Најпознатија манифестација локалног дејства алуминијума на плућно ткиво је плућна фиброза, позната као Shavers-ова болест. И појава астме код радника запослених у производњи алуминијума сврстава се у локалне ефекте експозиције алуминијумом и његовим једињењима (флуоридима, сулфатима и др). Системски ефекти алуминијума се испољавају углавном у ткивима у којима долази до његовог накупљања. Проучавање системских ефеката алуминијума веома је компликовано јер су ретки случајеви у којима се могу in vivo проучавати изоловани ефекти алуминијума. Углавном се системски ефекти алуминијума сусрећу код пацијената на дијализи (који су изложени алуминијуму из дијализатних раствора) или код пацијената на дуготрајној парентералној исхрани (због присуства цревних обољења пацијенти добијају сваког дана неколико mg алуминијума који је присутан као контаминант у интравенозно датом протеинском хидролизату). Остали извори парентерално датог алуминијума су албумински раствори који могу бити контаминирани алуминијумом у току чувања или код пацијената са екстензивним опекотинама. Алуминијум је присутан у бројним растворима који се примењују за опекотине и може изазвати скидање коже и повећање укупне концентрације овог елемента у организму). При експозицији алуминијуму, долази до промена на централном и периферном нервном систему, миокарду, костима, паратиреоидној жлезди. Најчешћа манифестација неуротоксичности је Alchajmer-oва болест. Аlchajmer-ова болест је облик сенилне деменције која се карактерише тиме да региони у мозгу постају хаотично дезорганизовани. Сматра се да за развој Alchajmer-ова болести посебан значај има појава амилоида у церебралном кортексу. Појава амилоида доводи до поремећаја у функцији крвно-мождане баријере која постаје пропустљивија. због чега долази до накупљања у можданом ткиву алуминијума, гвожђа и других метала који истискују цинк из металоензимских комплекса. Скелетна токсичност се манифестује као бол у костима, миопатија и патолошке фрактуре. Коштане промене које настају као последица дејства алуминијума доводе до смањене продукције коштане масе и утиче на продужено време минерализације костију. Докторска дисертација 53 1.4. Литературни преглед 1.4.1. Изучавање хидролизе Аl(III)-јона ЕSI МS техником Алуминијум(III)-јон лако подлеже хидролизи у воденим растворима [78, 79, 80]. Најобухватнију ЕSI МS студију о хидролизи алуминијума публиковала је Sarapola са сарадницама. Они су пронашли више различитих анјонских и катјонских Аl(III)-комплекса од мономера до полимера (Al30) у хлоридном, сулфатном и мешовитом хлоридно- сулфатном медијуму. Ефекат анјона на специјација је такође изучаван. Применом ESI MS–TOF технике, пронашли су три различита pH опсега у којима се специјација алуминијума разликује међусобно. На pH око 3 доминантни облици су димери [Al2O(OH)2Cl (H2O)0-3]+ и тримери [Al3O(OH)4Cl2(H2O)0-3]+ док на pH око 5 доминантни су већи полимери са Аl13 језгром. Наелектрисање ових комплексаје је у опсегу од -2 до +3, а разилажење са +7 Kegginovim полимерима је објашњено присуством терминалних хлоро атома. На неутралном pH формирање колоида и талога прузрокује губитка свих сигнала из спектара. Највећи алуминијумов катјон који је индефикована Sarapola са сардницима, је Аl30 кластер [Al30O35 (OH) 17]3+. У новијим радовима, резултати добијени ESI MS TOF техником су поново експериментално проверени помоћу тандем масене спектрометрије на трипл-квадрупол инструменту. Добијени су катјонски сигнали. Сигнали мономерних комплексa [Al(OH)2]+ и [Al(OH)2(H2O)n]+ (n=1,2,3) доминирају целом облашћу скенирања спектра. При вишим колизоним енергијама две хидроксо групе формирају мостне оксо лиганде, губитком једног молекула воде. Хлоро лиганди нису били присутни као „мостни“ јони, јер се и на ниским колизоним енергијама елиминишу као HCl. Нађено је да су чак и мали димерни и тримерни комплекси у стању да „заробе“ аква лиганде. Фрагментни јони се померају ка вишим m/z вредностима у спектрима. Urabe и сарадници [80, 81] су изучавали специјацију у АlCl3 растворима јер је уочено да су неки Sarapol-ини резултати изучавања хидролизе били контрадикторни. Urabe и сарадници су за проучавање хидролитичких комплекса у растворима алуминијум хлорида користили ESI Q MS, ESI Q MS/MS и ESI TOF MS технике. Хидролизу нису катализовали додавањем базе, односно проучавана је без pH подешавања, у концентрационом опсегу алуминијума од 0,02 до 100 mmol/dm3. Нађене алуминијумске врсте у раствору углавном су позитивно наелектрисани мономерни алуминијумски хидроксиди са неколико молекула воде. Поред мономера идентификовани су и неки полимери (Аl2, Аl3, Аl4, Аl5) са +1 наелектрисањем. У позитивном моду није идентификовано комплексирање са хлоридним јоном. Urabe и сарадници, су у делимично неутралним AlCl3 растворима (CAl=1 mmol/dm3, Z=1,5) идентификовали троструко и двоструко наелектрисан тридекамер Аl132+ при m/z 279- 309 и m/z 409+9n (n=0-7) респективно. Тридекамерне врсте се разликују по броју молекула воде у кластеру. При снимању у позитивном моду идентификовали су мономерне врсте, димере, тримере, тетрамере и један пентамер (Табела 6). Резултаи снимања у негативном моду су дали много већи број сигнала у спектру и много већи број анјонских врста је идентификован: мономери, димери, тримери и тетрамери. Евидентно је добро слагање резултата добијеним ESI Q MS техником и термодинамичких прорачуна које су извршили Botero и сарадници [82]. Доступни литературни подаци указују да су главни проблеми који се јавља у ЕSI МS проучавању хидролизе алуминијума манифестују као разлика између равнотежног стања у раствору и врста присутних у ЕSI извору (гасно фазане реакције). Генерално, класичне методе (потенциометрија, NМR спектроскопија) идентификују знатно мање врста него ЕSI МS указујћи да је већина врста идентификованих у МS пре карактеристика гасно фазних реакција него ли реалног стања у раствору. Mр Mирјана Р. Цвијовић 54 Оптимално подешавање МS инструмента треба обавити тако да се постигне максимално слагање између спектроскопских и потенциометријских резултата. Утврђено је [81] дa примена ESI Q MS техника боље одражава стање у растворима јона алуминијума него ли примена ESI TOF MS технике. Табела 6. Најзаступљеније хемијске врсте у раствору АlCl3, позитиван мод Тип m/z из спектра Идентификоване врсте Мономер 79 [Al(OH)2(H2O)]+ 97 [Al(OH)2(H2O)2]+ 115 [Al(OH)2(H2O)3]+ 133 [Al(OH)2(H2O)4]+ Димер 157 [Al2H7O6]+ 175 [Al2H9O7]+ Тример 217 [Al3H8O8]+ 235 [Al3H10O9]+ Тетрамер 277 [Al4H9O10]+ 295 [Al4H11O11]+ Пентамер 337 [Al5 H10O12]+ Urabe [81] је наставио истраживања хидролизе у АlCl3 растворима. Дошао је до закључка да само у раствору ове соли се формира алуминијум тридекамер (Аl13) и потврдио његово постојање коришћењем неколико техника. Коришћењем ЕSI МS детектовани су двовалентни и тровалентни јони. С обзиром да ЕSI МS појединачно региструје сваку врсту алуминијума у раствору на основу њеног m/z за очекивати је да ова техника даје додатне информације из хемије раствора алуминијумовог јона. Извршили су детаљно испитивање алуминијумових врста коришћењем потенциометрије и 27Al NMR спектроскопије и поређење ових резултата са резултатима масеноспектрометријских испитивања. Zhаo и сарданици [83] су се детаљно бавили изучавањем хидролизе у веома разблаженим растворима алуминијума масеном спектрометријом. Констатовали су да се хидролитичке врсте могу поделити у четири групе: на pH=4,8 мономерне и димерне алуминијумске врсте хидролизују и полимеризују градећи мале полимерне алуминијумске врсте (Аl3-Аl5). Мале полимерне алуминијумске врсте полимеризују у средње полимерне врсте (Аl6-Аl10 врсте) на pH 5,0. На сличан начин мале и средње полимерне врсте алуминијума стварају агрегате великих полимерних врста (Аl11-Аl21). На pH изнад 5,8 метастаблне средње и велике полимерне „врсте“ се распадају на мале врсте алуминијума и тако се агрегати разграђу на димерне врсте. Са порастом pH до 6,4 већина алуминијумових врста гради Al(OH)3 аморфне талоге. 1.4.2. Изучавање комплекса флуорохинолона, хинолона, флаваноида са Аl(III)-јоном ЕSI МS техником Мали број радова постоји везаних за изучавања комплексирања метала са хинолонима ESI-MS спектрометријом, а нема публикованих радова из области комплексирања Аl(III)-јона са флуорохинолонима ESI MS спектрометријом. Agostino и сарадници су изучавали флуорохинолонске антибиотике: норфлоксацин, еноксацин, ципрофлоксацин и оксофлоксацин ESI MS техником [84]. Приказане су врсте које Докторска дисертација 55 настају при дисоцијацији ових антибиотика као и фрагментационе путање карактеристичне за ове флуорохинолоне. Код норфлоксацина на 150 V прво се губи CО2 из карбоксилне киселине, а потом C2H5N из пиперазилне групе и C2H4 из етил групе на N1. Приказана је и алтернативна путања код норфлоксацина на 150 V по којој се на почетку губи C2H4 из етил групе на N1, а потом C2H5N из пиперазилне групе и H2О из карбоксилне групе. На овај начин је извршена идентификација фрагмената испитиваних флуорохинолона што је корисно при структурним разњашњењима метаболита. Zhang и сарадници [85] су изучавали комплексирање Аl(III)-јона и флавоноида ESI MS спектрометријом. У свом раду су показали утицај растварача на заступљеност комплекса Аl(III)-рутин, као и других флавоноида у раствору. Констатовали су да испитивани раствор не сме имати велику јонску јачину (основни електролит) и да се мора додати органски растварач пре почетка ESI MS анализе. Молекули растварача се уклањају или везују за метал у процесу јонизације. Као најбољи растварач се показао метанол. Структурну карактеризацију и диференцијацију изомера дигликозида урадили су применом тандем масене спектрометрије (МS/MS). Захваљујући дешифрованој фрагментационој путањи разјашњени су путеви гликолизе, врсте сахарида и тип везе између C-2 и C-3 атома. Алуминијум гради комплексе са флавоноидма за различите концентрационе односе Аl(III)-јона и лиганда: 2:1, 1:1, 1:2. Најзаступљенији комплекси су 1:2 типа [Al(III)-јон (флавоноид–H)2]+ где је Аl(III)-јон чврсто везан са флаваноидима. Начин фрагментације за овај систем је дат у Табели 7. Везивање је преко 4-кето и суседних хидроксилних група 5-, 7-ОH или обе групе. Табела 7. МS подаци за Аl(III)-јон-понцирин комплексе типа [Аl(III)-(флавоноид–H)2]+ Флавоноид Путања Фрагмент Неутрални губитак Релативна заступљеност Понцирин 1213-1067 947 120 11 921 146 20 905 162 47 759 308 100 597 407 19 V. Di Marco и сарадници [86] су ЕSI МS применили за изучавање равнотежа у растворима Аl(III)-јона и лиганда: 3-хидроксо- 4- пиридин карбоксилна киселина (3H4P) и 4-хидроксо- 3- пиридин карбоксилна киселина (4H3P). Поређењем ових резултата са резултатима класичних метода за испитивање равнотрежа у растворима добили су добро слагање упркос појави пертурбација и гасно-фазних реакција карактеристичних за ЕSI МS. На основу тога су дошли до закључка да се ЕSI МS може користити за изучавање равнотежа у растворима: за идентификовање формираних врста и њиховог стехиометријског састава, али и за одређивање квантитатнивног састава врста у раствору [13] (са циљем да се израчунају концентрације различитих комплекса формираних у раствору и њихових константи стабилности). Ross и Riley су користили „брзо атомско бомбардовање“ (FAB МS) за изучавање комплексирања Аl3+, Мg2+, Ca2+, Bi3+ и Fе3+ са ломефлоксацином [87]. Изучавали су концентрационе односе ломефлоксацин: метал од 3:1 до 2:1. Урађена је специјациона анализа у овим растворима. ESI MS као техника значајна у квалитативним одређивањима примењена је и на изучавање полимеризација самог лиганда и дала слагање резултата са (FAB МS) техником. ESI MS указује на присуство врста високе нуклеарнолсти тј. тримера и тетрамера који не могу бити детектовани другим техникама. Ако се упореде потенциометријски и Mр Mирјана Р. Цвијовић 56 спектрофотометријски подаци види се да они указују на модел базиран на мононоклуеарним и динуклеарним врстама. Док резултати ESI MS испитивања на истим системима указују да су димерне врсте много више заступљене него мономерне. Alvaerez и сарадници [88] су изучавали реакције комплексирања метала (Ni+, Cu+, Co+) и хинолонских антибиотика (еноксацин, оксолинска киселина, флумеквин, пиромидинска киселина и налидинска киселина) ЕSI и LDI техником. За ове процесе комплексирања каракетиристична је елиминација CO уз формирање цикличних структура које се стабилишу водоничним везама. CAD pattern-и Ni+ комплекса су информатиовнији од фрагментационих pattern-а протонованих хинолона. Такође су изучаване гасно фазне јон молекулске реакције између хинолона и ласер десорбованих монопозитивних јона прелазних метала. У другој фази експеримената испитиване су серије метанолских раствора антибиотика и соли јона прелазних метала и лиганда електроспреј јонизацијом уз кориошћење јон трапа као анализатора. Губитак водоника је врло каракетиристичан у току CAD експеримената прелазних метала у гасној фази. Пошто је коришћен јон трап у коме је увек мало воде присутно потврђено је везивање воде за никал и бакар. Формирање комплекса између хинолона и јона прелазних метала је ефектно када антибиотик изгуби кисели протон из карбоксилне киселине и формира се ковалентна везу са металним јоном. Код Cu комплексе са помрнутим хинолонима регистрован је губитак CО2, CO или HF. Поређењем експеримнената LDI и ЕSI констатовано је да су сигнали металних комплекса формирани у електроспреју за један ред величине већи од сигнала добијених у случају када се користи LDI техника. LDI спектри садрже неколико пикова који одговарају фрагментним јонима из родитељских комплекса. Ово није карактеристично за ЕSI MS спектре који се карактеришу нетакнутим родитељским комплексима. Уочена је различита природа металних комплекса насталих LDI и ЕSI техником која се објашњава чињеницом да монопозитивни метални јони имају различиту електронску конфигурацију у односу на двоструко наелектрисане јоне који су присутни у току ЕSI процеса. 1.4.3. Изучавање комплекса метала и флуорохинолона, флавоноидаи других једињења MALDI техником У литератури не постоје подаци који се односе на карактеризацију равнотежа које се успостављају у растворима флуорохинолона и алуминијум(III)-јона MАLDI техником. Приличан број радова је обљављен са резултатима примене MALDI технике у анализи флуорохинолона. Иако се ради о малим молекулима MALDI се показао врло корисним у овим испитивањима: за одређивање концентрације ових антибиотика у метаболитима, за одређивање најефикаснијих концентрација ових лекова при лечењу гонореје, пнеумоније и сличних инфекција [42]. Пошто у литератури нема радова у којима су изучавани комплекси алуминијум(III)-јона MАLDI техником приказни су комплекси других метала са одговјућим лигандима изучавани MАLDI техником. Ruttink и сарадници су публиковали резултате изучавања гасно фазних реакција које се јављају при примени MALDI технике у изучавању комплекса Cu+ и Cu2+, као и за изучавање тернарних комплекса (смеша CuCl2 и FeCl3). За ову смешу су након снимања основног спектра урађени и ТOF/ТOF експерименти за поузданију анализу кластера [21]. March и сарадници су изучавали флавоноиде ЕSI МS спектрометријом и MALDI МS спектрометриијом [89]. Јони детектовани у масеним спектрима у серији од девет протонованих флавоноида анализарни су електроспреј јонизацијом у комбинацији са квадрупол/ТОF анализатором (ЕSI-Q-ТОF), и MALDI јонизацијом у комбинацији са Докторска дисертација 57 квадруполе јон трапом (MALDI QIT) као и тандем масеном спектрометријом или ТОF тандем масеном спектрометријом (MALDI TOF ReTOF). Испитивана једињења су: 3,6-, 3,2´ и 3,3'-дихидроксифлавон, апигенин (5,7,4'-трихидроxифлавон), лутеолин (5,7,3',4'-тетрахид роксифлавон), апигенин-7-О-глузид хесперидин (5,7,3' -трихидрокси-4' -метоксифлаванон), даидзен (7,4' -дихидроxисофлавон), и рутин (кверцитин-3-О-рутинозид) где је кверцитин 3,5,7,3', 4' -пентахидроксифлавон. За примену MALDI технике на испитивање интеракција метала и флавоноида пример су испитивања натријума са рутином (цитрусним флавоноидом). Енергије центара масе (ECM) у ЕSI QTOF и MALDI QIT су биле (1-4 еV) а њихови продукт јони у масеним спектрима су виртуелно идентични. У MALDI TOF ReTOF инструменту, опсег центра маса енергије је од 126-309 еV од рутина са натријумом до протонованих дихидроксифлавона, респективно. Захваљујући високим енергијама центара масе доступним на MALDI TOF ReTOF инструменту, добијене су корисне структурне информације. Али са повећањем прекусорског односа маса/наелектрисање, продукт јон у масеном спектру постаје упрошћен те су тако ограничени и структурни подаци. У овом раду електронска ексцитација протонованих врста (или адуката са натријумом) гликозида даје објашњење за продукте јона дбијене овом техником. Масени спектари негликозидних флавоноида проучавани MALDI TOF ReTOF на високим енергијама центара масе и не показује компетитивну фрагментацију, која се уочава за ниске енергије (1-4 еV) центара масе. Идентификација продукт јона у опсегу m/z 100-160 је отежана као последица слабе резолуције масе при којој су ови јони посматрани није било могуће једнозначно одређивање хемијског састава. Са порастом масе јона прекурсора, уз истовремену редукцију ECM до 261 eV, масени спектри јона продуката изучавани MALDI TOF ReTOF постају доста једоставнији показујући два или три доминантна продукт јона. За протоновани хесперидин, два главна продукт јона су радикалиске врсте настале попречним цепањем (cleveage) молекула. За протоновани лутеолин, два главна продукт јона одговарају врстама са протонованим апигенином. Ови резултати су неочекивани јер нема једноставне заједничке фрагментације за протоновани лутеолин и апигенин. Brindel и сарадници су MALDI TOF [90] техником изучавали комплексе рутенијума (и то цис и транс изомере) са олигонуклеотидима. MALDI TOF анализа је показала да се и цис и транс комплекси координују са олигонуклеотидима. Адукти настали у овим реакцијама су слабо везани са DMSO, Cl и H2O лигандима. Ови лиганди се лако губе у процесу десорпције/јонизације. На основу ових истраживања аутори су закључили да је MALDI TOF веома корисна за детекцију металних адукта са олигонуклеотидима и за изучавање изомера рутенијума у циљу боље примене у терапеутске сврхе, упркос чињеници да су олоигонуклеотиди у високо наелектрисаним стањима. Petković и сарадници су публиковали резултате примене флавоноида (кверцетина и рутина) као најефикаснијих матрица у примени MALDI спектрометрије на изучавање неорганских комплекса платине и паладијума. Када се ови флавоноиди примене као матрице, тада неоргански комплекси платине и паладијума остају непромењени и идентификују се у спектрима као адукти Nа+ и K+. Ове матрице су веома погодне при изучавању амино киселина и фосфолипида [91, 92]. Mр Mирјана Р. Цвијовић 58 2. ЦИЉ И ЗАДАТАК РАДА Истраживања која су предмет наведене докторске дисертације треба да омогуће утврђивање поуздане специјације алуминијум(III)-јона у присуству флуорохинолона: флероксацина, ципрофлоксацина и моксифлоксацина. На основу тако утврђене специјације треба размотрити утицај флуорохинолона на биодистрибуцију алуминијума и његову токсикокинетику у хуманом организму при паралелној терапији флуорохинолонским антибиотицима и лековима на бази алуминијума (антацидима, вакцинама, парентералним нутриенсима итд). Осим тога подаци масене спектрометрије треба да укажу на структуру доминантног комплекса у раствору као и на јачину везе алуминијум-О2 у комплексима. Комплексирање алуминијума са флуорохинолонским антибиотицима испитивано је техникама ESI MS, ESI MSn и MALDI спектрометрије при чему је примењена MALDI техника без подлоге. Уз MALDI јонизацију коршћен је TOF анализатор. Уз ESI јонизацију коришћени су анализатори: квадрупол и јон трап. Резултати хидролизе алуминијума су поново испитивани ESI MS спектометријом због чињенице да су у литератури постојала два контрадикторна модела (модел Sarapol-e и модел Urabe-a) који дају различите специјације у растворима алуминијума у истим pH интервалима. Очекивани резултати ове дисертације могу се сумирати у неколико тачака: 1) Састав и структура хидролитичких комплекса алуминијума који се формирају у раствору 2) Утицај различитих експерименталих фактора (старење, температура, јонска јачина) на састав хидролитичких комплекса алуминијума 3) Утврђивање оптималних експерименталних и инструменталних параметара за изучавање комплексирања алуминијума са наведеним флуорохинолонима 4) Утврђивање састава комплекса у раствору и састава фрагментационих продуката 5) Утицај услова ESI јонизације на појаву пертурбација у извору и њихов утицај на равнотеже у раствору 6) Одређивање полимерних врста које се формирају при комплексирању применом MALDI технике 7) Специјациона анализа у растворима алуминијума иу растворима флуорохинолона и алуминијума урађена је компјутерском симулацијом, коришћењем програма Hyss 2006 и Neuro 2013 sofwera заснованог на моделу вештачких неуронских мрежа. Докторска дисертација 59 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 3.1. Раствори и реагенси 3.1.1. Реагенси – Алуминијумова трака, Al-wire, 99,99 %, (Merck) – Трифлуоросирћетна киселина, TFA, C2HF3O2, p.a., ампула, чистоће >99 % (Fluka) – Триетиламин, TEA, C6H15N, p.a, (чистоће >99,5 %) (Merck) – Хлороводонична киселина, Suprapure HCl, 30 %, (Merck) – Натријум-хидроксид, NaOH, p.a., у гранулама, (Merck) – Флероксацин, C17H18F3N3O3, 99,9 % (Riedel–de Haen), Sigma–Aldrich – Моксифлоксацин хидрохлорид, C21H24FN3O4xHCl; 99,9 %; (Bayer Pharma AG) – Ципрофлоксацин хидрохлорид, C17H18FN3O3xHCl; 99,9 % (Bayer Leverkusen) – Сирћетна киселина, CH3COOH, 99,8 % (Lachema) – Метанол, CH3OH, HPLC граде чистоће, Baker (Bio-Analyzed Reagent) – Пуфери: pH 4.00 (фталат), pH 7.00 (фосфат), pH 9.00 (борат); чистоћа пуфера у складу са NISТ стандардима, (J. T. Baker) – Мilli Q вода, (Millipore USA) За ЕSI МS снимања коришћен је компримовани азот (N2) чистоће 99,99 %, Messer, и компримовани хелијум (Hе) као колизиони гас, чистоће 99,9999 % Messer. 3.1.2. Основни раствори Алуминијум-хлорид (0,1 mol/dm3): Основни раствор алуминијума је припремљен од Аl траке која је исецкана на ситне комадиће. Измерено је 0,53974 g траке, а затим је додато 5 cm3 „Suprapure HCl“ и 1-2 cm3 редестиловане воде. Раствор је лагано загреван на пешчаном купатилу неколико сати до потпуног растварања. Узорак је допуњен до црте редестилованом водом. Концентрација алуминијума у овом раствору је проверена гравиметријском методом таложењем са амонијум хидроксидом [25]. Талог је жарен на 1200°C и мерен као алуминијум (III)-оксид. Одређена концентрација алуминијума је CAl = 0,1020 mol/dm3. Истовремено је садржај алуминијума у овом раствору проверен и ICP-OES техником (CAl = 0,100 mol/dm3). Добијено је добро слагање ове две методе. Концентрација додате хлороводоничне киселине одређена је потенциометријском титрацијом стандардним раствором натријум-хидроксида, применом Гранове методе и износила је C = 0,152 mol/dm3 HCl. Флероксацин (0,812 mmol/dm3): Одмеравањем 0,0150 g флероксацина p.а. и допуњавањем редестилованом водом до 50 cm3 направљен је раствор концентрације 0,812 mmol/dm3. Да би се флероксацин потпуно растворио неопходно је овај узорак ставити на ултразвучно купатило 20-так минута. Моксифлоксацин (3 mmol/dm3): Одмеравањем 0,0654g моксифлоксацин хидрохлорида p.а. и допуњавањем редестилованом водом до 50 cm3 направљен је раствор концентрације 3 mmol/dm3. Ципрофлоксацин (2 mmol/dm3): Одмеравањем 0,03678 g ципрофлоксацин хидрохлорида p.а. и допуњавањем редести- лованом водом до 50 cm3 направљен је раствор концентрације 2 mmol/dm3 Mр Mирјана Р. Цвијовић 60 Раствор трифлуоросирћетне киселине, ТEА (0,1 mmol/dm3): Пипетирањем 386 μl чисте киселине и допуњавањем редестилованом водом до 50 cm3 направљен је раствор концентрације 0,1 mmol/dm3. Раствор триетиламина, ТЕА (0,1 mmol/dm3): За припремање полазног раствора триетиламина коришћен је TEA. Пипетирањем 699,5 cm3 чисте базе ТЕА и допуњавањем редестилованом водом до 50 cm3 направљен је раствор концентрације 0,1 mmol/dm3. pH свих раствора је подешен додатком стандардних раствора TFA или ТЕА. pH–метар је калибрисан са J. T. Baker pH 4,00, 7,00 и 9,00 пуферима. 3.1.3. Радни раствори Раствори лиганада су припремани, најпре у смеши растварача вода/метанол = v/v 50:50, 30:70. Присуство 50 %, 70 % метанола у растварачу имало је за циљ да олакша десолватациони процес у електроспреју и обезбеди бољи јонски принос. У току експеримената је констатовано да су и спектри раствора у дејонизованој води одговарајућег квалитета те су надаље узорци припремани у дејонизованој води. Раствори алуминијум(III)-хлорида и одговарајућег флурохинолонског лиганда су припремани у различитим концентрационим односима: од 0,5:1 до 3:1. Вредности pH раствора подешаване су од 3,0 до 7,0 додатком раствора 0,01-0,1 М ТFА или 0,01-0,1 M TEA. Концентрације лиганада и алуминијума су биле реда величине 10-5 до 10-4 mol/dm3. Тачне вредности концентрација алуминијума и лиганада у анализираним растворима и pH вредности су наведене у табелама у овом поглављу Експериментални резултати. Раствори комплекса остављени су да стоје један дан пре почетка снимања од мешања компоненти, како би било довољно времена за хемијску реакцију. Након овог периода поново је проверена pH вредност раствора. Мерење pH вршено је на сваких сат времена док нису добијена стабилна очитавања са грешком ± 0,02 pH јединице. У почетку је као проточни растварач коришћена смеша растварача вода/метанол у запреминском односу 30:70 са протоком 0,3 cm3/min, а затим само вода. Сви припремљени раствори су чувани на хладном (+ 4 °C) и без присутва светла, јер су лиганди подложни фотодеградацији. Узорци раствора су филтрирани од механичких нечистоћа (кроз μm стаклени филтер), како би се избегла адсорпција аналита на површини филтра или десорпција нечистоћа са површине филтарских пора у испитивани раствор (нарочито површински адсорбованог NH3 из атмосфере и Nа+ из материјала филтра). При испитиваним концентрацијама аналита, реда величине 10–5 mol/dm3, интерференце са филтером могу значајно да промене равнотежне услове у посматраном систему. После завршеног рада са једним раствором или једном врстом лиганда, обавезно је вршено испирање ЕSI МS инструмента у трајању од 5–20 минута, метанолом или смешом метанол/вода, до стабилизације инструмента, то јест до потпуног губитка сигнала који потичу од претходно испитиваног аналита или других нечистоћа. 3.2. Инструменти 1) Масени спектрометри Масени спектри раствора АlCl3 (при испитивању хидролизе алуминијума), су снимани на LC/МCD масеном спектрометру, Waters 2695-2996 са Micromass ZQ 2000 single quadrupol анализатором и MassLynx 4,0 soft ver-ом. Спектри су снимљени у позитивном моду. Најпре су одређени најоптималнији инструментални параметари. Услови снимања су дати у Табели 8: Докторска дисертација 61 Табела 8. Инструментални параметри у ЕSI извору при испитивању хидролизе Параметар, јединица Вредност Напон на капилари, kV 3,5 Температура извора, °C 125 Десолватациона температура, °C 200 Брзина протока десолватационог гаса, L/h 450 Напон на конусу, kV 50 Напон екстрактора, V 3 Потенцијал јонске оптике (R.f.lens),V 5 Брзина протока гаса на конусу, L/h 50 Опсег маса, m/z 40-1000 Резолуција 2000 За снимање масених спектара раствора лиганда (HQ) и раствора алуминијума и лиганда коришћен је масени спектрометар Th ermo Finnigan LCQ Deca Termo Quest (USA) са квадрупол јон трап анализатором. Оперативни систем на инструменту је Finningan Xcalibur. Услови снимања су дати у Табели 9: Табела 9. Инструментални параметри у ЕSI извору при испитивању комплексирања Параметар, јединица Вредност Напон „спреја“, kV 4,7 Температура капиларе, °C 220 Брзина протока десолватационог гаса, аrb јединице 74 Напон на капилари, kV 6 Потенцијал јонске оптике (Tube lens off set), V 15 Подешене вредности АPI извора Директно увођење узорка Проток, μl/mim 10 Динамички опсег, m/z 50-1200 Мобилна фаза у једној серији 50:50 метанол /вода; у осталим без мобилне фазе МALIDI МS спектри су снимљени на Bruker Ultrafl extreme TOF/TOF инструменту са Nd Yаg, неодијум-итријум алуминијум гарнет ласером. Опретаивни систем је Bruker Daltonics fl exyAnalysis, version 2,0. Спектри су снимљени у рефлексионом позитивном моду. Инструментални услови су дати у Табели 10. Запремина од 0,5 μL ових раствора је стављена на (sample plate) челичну подлогу. Након што се узорак осушио на ваздуху подлога је стављена у инструмент где је узорак изложен ласерском зрачењу. Табела 10. Инструментални параметри при снимању МАLDI спектара Параметри, јединица Вредности IS1, kV 25,0 IS2, kV 22,3 Сочива, kV 7,70 Рефлектор 1, kV 26,45 Рефлектор 2, kV 13,45 Пулсна јонска екстракција, ns 80,0 2) pH-метри За подешавање pH коришћен је Mettler Toledo DL 50 титратор са комбинованом стакленом електродом. Калибрација је вршена са J.T. Baker pH=4,00, 7,00 и 9,00 пуферима. Очитавања су вршена са прецизношу од ± 0,001 pH јединице. Сва мерења су вршена уз стално мешање магнетном мешалицом при додатку киселине или базе. Mр Mирјана Р. Цвијовић 62 3.3. Експериментални поступак Прелиминарно испитивање сваког од система је започињано анализом чистог раствора лиганда C=2,7x10-5 mol/dm3, у циљу утврђивања општих јонизационих карактеристика једињења, присуства поједних јонских врста у ESI МS спектру, равномерности одзива сигнала итд. Прво снимање је вршено при подразумеваним вредностима параметара инструмента (default factory tunning), у поларитету ESI извора који је одабран према природи испитиваног лиганда. Негативни мод (ESI -) је адекватнији за кисела једињења подложна депротонизацији, а позитивни мод извора (ESI +) за базна једињења изражене нуклефилности. Затим је у датом моду, одабран сигнал m/z молекулског јона [M+H]+, или [M-H]-, тј. јона одређеног као карактеристичног за даља испитивања (тзв. мониторинг јон). Коришћењем Hamilton шприца V=500 μL, id=3,26 mm, одржаван је у fl ow injection режиму проток од 10 μL/min. Вршене су пробе и са мањим и већим протоцима. У наредној фази су вршена подешавања инструмента тј. оптимизација радних услова инструмента (manual tunning): брзина протока sheath–aux гаса (N2), температура и напон капиларе, tube lens off set, температура вапоризатора, док су подешавања јонске оптике вршена аутоматском оптимизационим по процедури Tune Plus ver. 1,3 Th ermo Finnigan Xcalibur soft ware-a [93]. Оптимизацијом је постигнута стабилност одзива, као и појачање релативног интензитета сигнала одабраног мониторинг јона, а низ вредности оптимизованих параметара је и даље коришћено у раду са датим раствором (LCQ Tune Instrumental Method). Аутоматска варијација параметара у току снимања није примењивана. Како на изглед спектра највећи утицај има напон на фрагментатору и проток растварача ове су величине даље вариране у наведеним опсезима док није добијена максимална резолуција спектара. Пре снимања ЕSI МS спектара дефинисан је опсег скенирања (scan range) oд m/z 50 дo 800. Затим је опсег снимања проширен до m/z 1000. Опсег скенирања је биран тако да са сигурношћу обухвати молекулски јон, као и адуктне јоне веће масе који су евентуално присутни у испитиваном раствору. Изабрано је време аквизиције (acquire time): Scans 20, кao и Scan Time–Number of Microscans: 3. Сви спектри су добијени и приказани у нормализованом моду (Y-axis normalization mode), који даје најјачи m/z сигнал приказан са 100 % релативног интензитета. Калибрација инструмента је урађена према екстерном стандарду. Масена прецизност је подешена на 2 децимале. За „baseline noise“ толеранција је била 10 %. Снимања узорака вршена су на класичан начин МS експеримента и у високој резолуцији МS/МS експерименти, као и у Zoom scan моду. Снимање ЕSI МS спектра супротног поларитета: После добијеног спектра у ЕSI+ моду, под одговарајућим оптимизованим условима, и за остале испитиване лиганде вршено је снимање МS спектра у ЕSI– моду. При томе су коришћени претходно подешени параметри апарата, али са супротним поларитетима капиларе и јонске оптике. Накнадна оптимизација најчешће није вршена, осим подешавања основних параметара, у оним случајевима када је спектар садржао препознатљиве сигнале аналита. Констатовано је да спектри снимљени у негативном моду имају много већи шум, да су много мање репрезентативни од спектара снимљених у позитивном моду. Снимање ESI MS/MS спектара: Снимани су и ESI MS/MS и ESI MS/MS/MS (MS3) спектри у циљу добијања информација о структури посматраног почетног parent (родитељског) јона, за који је биран првенствено молекулски јон, а у одређеним случајевима испитивани су и други parent јони, односно сигнали из примарног ESI MS спектра. MS/MS спектри су снимани у позитивном моду ЕSI извора који (више одговара лиганду и награђеним комплексима), такође у „fl ow injection“ режиму са протоком 5–20 μmol/dm3. Затим је биран Докторска дисертација 63 молекулски јон за МS/МS фрагментацију, са isolation width: ±1,0 m/z. Вредност колизионе енергије је повећавана на 30–70 % све док се није добила уочљива фрагментација на мањим вредностима m/z, а да се parent јон још увек уочава у спектру. На крају подешавања, колизиона енергија Ecoll је обично износила 50–60 % зависно од лиганда (LCQ програм изражава Ecoll у релативним јединицама, %). Као колизиони гас у масеном анализатору је коришћен хелијум (He). При снимању узорака најпре су снимани TIC хроматограми сваког раствора. TIC хроматограми репрезентују суму интензитета у читавом опсегу маса детектованих у свакој тачки у току анализе. Регион хроматографског пика је одређен временском X-осом (time) у минутима и релативним интензитетом сигнала (relative abundance)-Y оса. Време трајања анализе било је 40 секунди при чему је од значаја било да хроматографски пик буде потпуно обухваћен временом анализе. Код снимања TIC –хоматограма одабран је Full Scan mode у опсегу m/z 50– m/z 1000, уместо SIM мода (Single Ion Monitoring), јер SIM метод у претходним испитивањима није показао уочљиве предности у погледу осетљивости и стабилности сигнала. SIM мод омогућава јонима, са специфичном вредношћу m/z, да пређу до анализатора док се остали јони одбацују. SIM омогућава повећање сензитивности за детектовање ниских концентрација једињења у узорцима. У SIM mod-у се одабира неколико јона (нпр. три) која су заступљена и карактеристична за структуру једињења [93]. Ако је концентрација једињења врло ниска при детекцији у Full scan-у на квадропол масеном спектрометру, SIM мод може спустити детектциони лимит и до 1000 пута. У овом моду су снимљени одређени „циљани“ јони. Zoom scan мод: Пошто у ЕSI спектрима могу бити присутни и вишеструко наелектрисани јони било је важно одредити да ли је дати јон +3,+2 или +1 наелектрисан тако да постоји разлика Δ=0,3; Δ=0,5; Δ=1 у спектру између блиских линија у односу на централну масу. За јоне за које је наелектрисање било очигледно Zoom scan је био потврда наелектрисања. На овај начин је олакшана интерпртетација добијених спектара. Примењивани су исти ЕSI услови и при снимању раствора лиганда, да би се сачувао што приближнији релативни однос интензитета сигнала и омогућило касније поређење. Mр Mирјана Р. Цвијовић 64 3.4. Експериментални резултати 3.4.1. ESI MS спектри хидролитичких врста алуминијум (III)-јона Алуминијум(III)-јон је веома подложан хидролизи због великог афинитета ка нега- тивно наелектрисаном кисеонику. Степен хидролизе, „састав“ и стабилност хидролитичких врста формираних у раствору зависе од много фактора: природе и концентрације јонског медијума, pH раствора, природе и концентрације базе која се користи да поспеши хидролизу, времена старења и присуства других супстанци које могу интераговати са алуминијум (III)- јоном и/или молекулима воде [94]. За изучавање хидролизе Аl(III)-јона припремани су раствори концентрација у опсегу 2,7 × 10-5 do 5 × 10–3 mol/dm3. Испитивани pH интервал је био од 3–6. Састави и pH вредности испитиваних раствора дати су у Табели 11. Раствори су били бистри и стабилни до pH 5,00 два дана (није било замућења ни таложења). На вишим pH вредностима, раствори остају бистри 2-3 h након додатка базе, а затим се развија замућење. Табела 11. Састав раствора при изучавању хидролизе Nº узорка pH Kонцентрација Al [mol/dm3] 1. 3,192 2.7×10–52. 3,594 3. 4,814 4. 4,350 1×10–4 5. 4,203 0.5x10–4 6. 4,184 1×10–3 7. 4,050 5×10–3, (CCl =150×10–3) Резултати масене спектрометрије зависе од инструменталних параметара. Услови снимања (Т у јонском извору, напон на конусу, напон на капилари, брзина протока мобилне фазе) су варирани док нису добијени репродуктивни спектри. Од инструменталних параметара најјачи утицај на спектре има напон на конусу те је посебно изучаван утицај овог параметра на спектре. 3.4.2. Параметри који утичу на ESI MS спектри хидролизе Ефекат различитих напона на конусу На квалитет масених спектара утичу напони на капилари (needle elektrospray voltage), напон оптике (rf lens), напон на конусу и екстракциони напон на конусу. На основу литературних података, [81, 94] „битни“ напони су подешени у следећим опсезима: напон на капилари 2-4, 5 kV, напон на конусу 0-200 V и напон оптике (rf lens) 0-20 V. На сличан начин извршено је варирање ових напона за раствор АlCl3. Након оптимизације инструмента за даље експерименте су прихваћене вредности напона на капилари од 3,5 kV, напона оптике (rf lens) од 5 V. На квалитет спектра значајније утиче напон на конусу у односу на остале напоне. Стога су и експерименти приказани у овој тези вршени тако да су коришћени параметри добијени финим подешавањем инструмента (тјунирање), а вариран је напон на конусу. Репрезентативни спектри су приказани на Слици 18. Докторска дисертација 65 Слика 18. ЕSI МS спектри 5x10-4 mol/dm3 раствора AlCl3, pH = 4,20, разичити напони на конусу a) 10 V, b) 50 V и c) 100 V На Слици 18. су приказани спектри раствора исте концентрације и истог pH, снимљени при различитим напонима на конусу. Најинтензивнији сигнали су у области од m/z 50 до m/z 230. У области од m/z 230 до m/z 400 су сигнали који су доста нижег интензитета. Најоптималнији је напон од 50 V јер је при овом напону најчистија базна линија, сигнали интензитета < 5% могу се лако детектовати, нема преклапања сигнала. Спектри на 10 V и 100 V показују већи позадински шум. На 100 V област виших интензитета се помера до m/z 240. Повећање напона на конусу доводи до повећања броја сигнала у спектру јер повећање енергије пренете молекулу проузрокује фрагментацију. Промена напона на конусу је метода која се често користи са циљем фрагментације на основу које се добијају структурне информације о испитиваним врстама [94]. На 10 V сем шума и перклапање сигнала је израженије. Стога су сви остали узорци снимани на напону од 50 V. Велики утицај је уочен на интензитет сигнала на m/z 60,50. При напону на конусу од 50 V релативни интензитет овог сигнала је 100 %. Mр Mирјана Р. Цвијовић 66 Ефекат различитих pH вредности Од експерименталних услова испитивани су: утицај различитих pH вредности за фиксну концентрацију алуминијума, утицај различитих концентрација алуминиујма на стварање хидролитичких врста, ефекат старења раствора, утицај мобилне фазе. Сходно чињеници да на разноврсност хиролитичких врста утиче pH средине, у овом одељку су приказани резултати испитивања утицаја pH на хидролизу алуминијума. Серија ЕSI МS спектара је снимљена за концентрацију алуминијума 2.7x10-5 mol/dm3 при оптимизованим инструменталним условима, на различитим pH вредностима (3,192; 3,594; 4,814). Репрезентативни спектри су приказани на сликама 19, 20, 21. Слика 19. ESI MS спектар 2,7x10-5 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=4,814 На Слици 19. је приказан спектар у коме је уочљива неправилна дистрибуције сигнала по интензитетима. Интензивнији сигнали су у области m/z 60-140, док су у области већој од m/z 140 груписани сигнали нижег интензитета, што не значи да су то сигнали који репрезентују хемијски мање битне врсте. Као најобилнији издвајају се сигнали на m/z 57,35 (релативни интензитет 60 %), m/z 60,53 (релативни интензитет 40 %), m/z 76,64 (релативни интензитет 100 %), m/z 96,30 (релативни интензитет 20 %). Сигнали нижег интензитета су: m/z 276,85; и m/z 365,80 и највероватније потичу од полинуклеарних врста. У овом спектру се уочава правилна Gauss-ова расподела [96, 97] у однос на јон m/z 60,52. Слика 20. ESI MS спектар 2,7x10-5 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=3,594 И при нижим pH (Слика 20) се запажа да је расподела сигнала правилна Gauss-ова у односу сигнале: m/z 60,52 и m/z 76,64. Најинтензивни сигнали су у области m/z 50–140. Докторска дисертација 67 Највиши релативни интензитет (100 %) има сигнал на m/z 60,52. Поређењем овог спектра са спектром раствора при вишој pH вредности (Слика 19.) уочава се пораст интензитета сигнала на m/z 364,80, а смањује се релативни интензитет сигнала m/z 76,64. Са аспекта утицаја pH вредности на формирање хидролитичких врста овај спектар се може сматрати репрезентативним. Слика 21. ESI MS спектар 2,7x10-5 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=3,192 На Слици 21. је приказан спектар при најнижој pH вредности у овој серији раствора. Најобилнији сигнал је m/z 69,50 (релатини интензитет 88 %). Интензитети осталих сигнала су још увек високи m/z 76,74 (релативни интензитет 78 %), m/z 60,52 (релативни интензитет је 100 %). Релативни интензитети сигнала m/z 364,80, m/z 120,74 и m/z 76,74 расту у односу на растворе виших pH вредности. Ефекат различитих концентрација алуминијума Ефекат различитих концентрација Аl(III)-јона на хидролизу испитиван је на pH = 4,20, за концентрације Аl(III)-јона у опсегу 0,1–1,0x10-3mol/dm3. Репрезентативни спектри су на Сликама 22, 23, 24. Слика 22. ESI MS спектар 1,0x10-4 mol/dm3, раствора AlCl3 ,pH=4,35 При концентрацији Аl(III)-јона 1,0x10-4 mol/dm3 (Слици 22) највећи број сигнала је смештен у области од m/z 50-150. Сигнали у области од 150–330 су доста нижег интензитета. Најинтензивнији је сигнал на m/z 78,40. Молекулски јон на 96,35 m/z је релативног интензи- тета 70 %. Пошто је сигнал на m/z 132,86 тешко видљив у основном спектру коришћен је SIM мод за потврду овог „циљаног“ јона. (Слика 104 у Дискусији) Када су хлоридни Mр Mирјана Р. Цвијовић 68 јони координовани за Аl(III)-јон, хлор изотопна дистрибуција се може користити за идентификацију ових врста (на основу % обилности изотопа и међусобног односа релативних интензитета). Слика 23. ESI MS спектар 5x10-4 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=4,23 При већој концентрацији алуминијума, Слика 23, најобилнији су сигнали на m/z 60,52; 78,59 и 96,66. Сигналима m/z 78,59, 96,66 опада релативни интензитет у односу на спектре при нижим концентрацијама алуминијума. Релативни интензитет сигнала на m/z 212,79 расте. У овом спектру се јављају и нови сигнали на m/z 366,69; 398,69 који вероватно потичу од полинуклеарних врста. Слика 24. ESI MS спектар 1x10-3 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=4,18 Спектар (на Слици 24) и претходни (на Слици 23) су врло слични, с тим што се под условима где је виша концентрација алуминијума, јављају и нови сигнали на m/z 434,57 и 494,50. У серији спектара где је изучаван ефекат промене концетрације АlCl3 овај спектар се може сматрати репрезентативним. Испитивани су и спектри раствора у којима је укупна концентрација алуминијум јона била 5,0x10-3 mol/dm3 на pH 4,05 са повишеном концентрацијом хлоридног јона (укупна концентрација хлорида=150x10-3 mol/dm3) У овом спектру се уочава правилна Gauss-ова расподела [96-98] у однос на јон m/z 96,65 Докторска дисертација 69 Слика 25. ESI MS спектар CАl3+=5,0x10-3 mol/dm3, CCl-=150x10-3 mol/dm3, раствора AlCl3 pH=4,05 У спектру на Слици 25. интензитетска дистрибуција је правилна, а највиши сигнали су смештени на вишим m/z вредностима. Повишена концентрација хлоридног јона доводи до померања сигнала ка вишим вредностима у области од m/z 300 до 600. До m/z 300 сигнали ређи. На спектру се уочава Gauss-ова расподела у односу на јоне m/z 352,4 и 464,5. Највишег интензитета је сигнал на m/z 317,2 (100 %). Знатног интензитета су и сигнали на m/z 352,4; 464,5; 536,2; 622,1. Утицај повишене концентрације хлоридног јона помера сигнале ка вишим m/z, јер највероватније проузрокује формирање полинуклеарних хлоридних врста.У киселим растворима алуминијум је веома хидролизован и не веже се лако са хлоридним јоном, па су врло ретки негативно наелектрисани јони. Сходно литератури [80] ефекат контра јона (хлоридног) се може уочити при снимању спектара у негативном моду Ефекат старења раствора Кинетички ефекти водених раствора алуминијума се традиционално изучавају потенциометријом и NMR спектрометријом. Сем у изучавању брзих реакција где се формирају врсте са мањим бројем алуминијумових језгра масена спектрометрија је врло примењива и у изучавању споријих реакција полимеризације [94]. Како на хидролизу утиче и старење раствора и овај ефекат је изучаван, тако што су припремљени раствори старили 4 сата, 7, 15 и 30 дана. У току периода старења ових раствора проверавано је pH повремено и констатовано је да су вредности стабилне до 0,01 pH јединице. Добијени резултати приказани су на Слици 26. Слика 26. ESI MS спектар 0,1x10-3 mol/dm3, раствора AlCl3, pH=3,30, након 30 дана Mр Mирјана Р. Цвијовић 70 Спектар на Слици 26. има много мање сигнала у односу на све до сада приказане спектре, што је последица старења раствора (30 дана). Сви сигнали су сконцентрисани у области од m/z 40-110. Само неколико сигнала у спектру на: m/z 83,64; 64,79; 76,79 су вишег интензитета. У спектару исте концентрације снимљеном одмах по припреми као доминантни сигнали уочавају се сигнали m/z 78,40, 96,35. Спектар на Слици 26. карактерише пад интензитета следећих сигнала m/z 46,02 опада до 10 % у односу на исти сигнал у спектру на Слици 22. (снимљеном одмах по припреми, чији релативни интензитет износи 40 %). Интензитет сигнала на m/z 60,52 опада са старењем раствора до 3 %. Сигнал на m/z 42,74 је са релативним интензитетом 100 %. Изучавани су утицаји мобилне фазе па су у том циљу снимани спектри са и без протока мобилне фазе (спектри дати у Прилогу). У зависности од тога да ли се као мобилна фаза користи ацетонитрил или метанол сигнали у спектру се знатно разликују (Слика 1П, Прилог). 3.4.3. ЕSI МS спектри раствора Аl(III) јона и флуорохинолона При снимању ESI MS спектара коришћени су следећи модови снимања: Full scan mod (TIC), SIM mod, MSn и Zoom Scan mod. За доказивање циљаног јона коришћен је SIM (single monitiring ion) мод. MSn је мод снимања у више корака са циљем испитивања структуре јона. Zoom Scan је mod високе резолуције, где се цео опсег скенира да би се разрешио изотопски pattern [6] који се користи за одређивање наелектрисања или за одређивање јонизационог стања испитиваног једињења. Прелиминарно испитивање је указало да позитиван мод даје сигнификантније спектре, за разлику од негативног мода који даје спектре са више шума. 3.4.4. Утицај инструменталних параметара при снимању ЕSI МS спектара ESI MS спектри су зависни од инструменталних параметара извора и јонске оптике који се примењују у току снимања, напона спреја, температуре капиларе, напона капиларе, потенцијала јонске оптике (tube lens off set) и напона конуса. Њиховом изменом се могу добити битно другачији резултати за дати систем. На Сликама 27 и 28 приказани су ESI MS спектри снимљени при различитим RF lens напонима. Слика 27. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,16, Докторска дисертација 71 (Nº 1, табела 12), rf tube lens 15 V Састав и pH вредност раствора, чији је ESI MS спектар приказан на Слици 27 дат је у Табели 12. (раствор 1). Напон оптике је подешен на 15 V, проток гаса који потпомаже формирање и десолватацију капљица 74, брзина протока раствора 10 μL/min, ињектирана запремина 69 μL. У спектрима на Сликама 27 и 28 су осим различитих напона оптике (tube lens voltage), различити протоци десолватационог гаса и брзине протока раствора у односу на све остале спектре. Констатовано је да брзина протока раствора мање утиче на изглед спектара од осталих инструменталних параметара. Интезитети сигнала у спектру на Слици 27 показују правилну Gauss-ову расподелу. (за јоне m/z 202,40, 370,13, 382,20 и 429,90). Карактеристична је изотопска дистрибуција за јоне m/z 382,13 и 215,47. Под овим условима у спектру се запажа доста шума. Сигнали највишег интензитета се идентификују у интервалу од m/z 190 до m/z 500. При условима када је напон оптике 15 V релативни интензитет јона m/z 215,47 износи 58 %, јона 429,90 износи 100 %, јона 255,20 износи 12 %, јона 202,40 износи 44 %, јона 236,40 износи 12 %. Слика 28. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,16, (Nº 1, табела 12), tube lens-20 V Спектар на Слици 28 је снимљен при другим инструменталним условима у односу на претходни са циљем испитивања утицаја различитих напона на оптици (tube lens voltage). Састав раствора и pH вредност раствора су исти као и у спектра на Слици 27. Напон оптике је у овом случају износио –20 V. (Остали параметри су били исти као при снимању претходног спектра: проток гаса који потпомаже формирање и десолватацију капљица 74, брзина протока раствора10 μL/мин, ињектирана запремина 69 μL). Највећи утицај промене вредности напона оптике (tube lens) се запажа на јоне m/z 215,47, 429,93, 255,13. У случају када је напон оптике подешен на –20 V релативни интензитет јона m/z 215,47 износи 100 %, јона 429,93 износи 63 %, јона 255,13 износи 20%, јона 202,47 износи 28 %, јона 236,33 износи 24 %. У односу на претходни спектар интензитети неких сигнала расту, а интензитети других сигнала опадају. 3.4.5. Утицај експерименталних услова при снимању ЕSI МS спектара Реакције комплексирања зависе од: концентрације метала, лиганда, концетрационог односа метала и лиганда, pH вредности у раствору. У циљу снимања ESI MS спектара раствора алуминијум(III)-јона и флуорохинолонских лиганада припремљено је неколико серија раствора чији су састави и pH вредности дати у Табели 12. Прелиминарна испитивања су показала да лиганди и комплекси лиганда са алуминијумом који поседују базне Mр Mирјана Р. Цвијовић 72 функционалне групе, лакше подлежу протоновању у киселој средини и фаворизују стварање позитивних јона, тако да су спектри лиганда и комплекса лиганда са алуминијумом најпре снимани у позитивном моду. Једна серија узорака је снимљена и у негативном моду. Пре снимања комплекса снимљени су спектри самог лиганда у позитивном и негативном моду. 3.4.6. ESI МS спектри флероксацина у позитивном и негативном моду У спектру на Слици 29 приказан је спектар раствора флероксацина, концентрације Cl=2,7x10-5mol/dm3, pH=4,26. Слика 29. ESI MS спектар флероксацина, молекулски јон m/z 370, pH=4,26, позитиван мод Као најинтензивнији сигнал (релелативни интензитет 100 %) уочава се сигнал на m/z 370,07, који потиче од протонованог молекулског јона, док је m/z 326,27 релативног интензитета 24 %. Остали сигнали имају мале интензитете (релативних интензитета <15 %). Оптимизација радних услова инструмента (ЕSI извора и јонске оптике) је извршена према молекулском јону m/z 370,07 који је одабран као мониторинг јон. Идентификоване врсте приказане су у Табели 12 у Дискусији. Слика 30. ESI MS спектар флероксацина, молекулски јон m/z 368, pH=4,26, негативни мод У спектру на Слици 30 приказан је спектар раствора исте концентрације и pH вредности, снимљен у негативном моду. Уочава се базни пик флероксацина на m/z 367,93 који потиче од Докторска дисертација 73 депротонованог молекулског јона (релативни интензитет 28 %), док је m/z 234,93 релативног интензитета 100 %, чија је разлика у маси 133 у односу на молекулски јон. Остале јонске врсте значајнијег интензитета су: m/z 143,07; 150,93; 202,87 и 427,80. Мониторинг јон у овом случају је молекулски јон m/z 368,0. Слика 31. MS/MS joна 368,00 Ecoll=20% Ако се примени колизиона енергија од 20 % (Слика 31) још увек је врло интензиван молекулски јон 368,00 (релативни интензитет 100 %). Иако је ниска колизиона енергија, ипак је дошло до фрагментације молекулског јона флероксацина. Главни продукт јони из МS2 експеримента су: m/z 278,20; 304,20; 324,07; 348,07. 3.4.7. ESI спектри раствора алуминијума и флероксацина позитивни и негативни мод За изучавање комплексирања алуминијума и флероксацина ЕSI МS припремани су раствори различитих концентрација, концентрационих односа и различитих pH вредности, чији су састави дати у Табели 12. Ове серије узорака су снимљене при следећим инструменталним условима: напон оптике 15 V, проток гаса који потпомаже формирање и десолватацију капљица 19, проток раствора 5 μL/min, ињектирана запремина 30 μL. Табела 12. Састави и pH вредности раствора за ЕSI МS спектре Nº узорка pH Концентрација Аl [mol/dm3] Концентрација лиганда [mol/dm3] Концентрациони однос Аl:L 1. 4,16 5,4×10–5 2,7×10–5 2:1 2. 4,03 2,7×10–5 8,1×10–5 1:3 3. 5,29 4. 6,20 5. 3,50 2,7×10–5 4,05×10–5 1:1,5 6. 4,14 7. 5,64 8. 3,05 5,4×10–5 2,7×10–5 2:1 9. 4,06 10. 5,06 11. 5,02 2,7×10–5 2,7×10–5 1:1 12. 5,03 2,7×10–5 5,4×10–5 1:2 13. 5,04 2,7×10–5 8,1×10–5 1:3 14. 4,96 5,4×10–5 2,7×10–5 2:1 Mр Mирјана Р. Цвијовић 74 1. Спектри раствора алуминијума и флероксацина, 1:3 концентрациони однос, позитивни и негативни мод У Табели 12 дати су састави и pH вредности (4,03, 5,29, 6,20) раствора за концентрациони однос CAl:CFlero=1:3. Ови спектри приказани су на Сликама 32-37. За растворе флероксацина и алуминијума извршено је снимање ЕSI МS спектра под истим условима, тј. примењени су исти оптимизовани параметри као и при снимању раствора самог флероксацина. Иако ЕSI спада у „благе“ јонизационе технике са малим степеном деградације аналита, ипак се запажа одређен степен фрагментација и у примарним ЕSI МS спектрима. Слика 32. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3 (Nº 2, табела 12), позитивни мод На Слици 32 приказан је спектар раствора у коме је pH=4,03. Спектар се може поделити на две области: прва област m/z од 90 до m/z 400 са вишим интензитетима сигнала и друга област за веће од m/z 400 коју карактеришу сигнали знатно нижег интензитета. У спектру се запажају „нови“ сигнали знатног интензитета: m/z 214,00, 236,33, 276,80, 697,27, 739,27, што највероватније указује на формирање нових комплексних јона позитивног наелектрисања. Неки од „нових“ сигнала нису приметни за исти концентрациони однос и више вредности pH, јер у овом случају се поред комплексирања дешава и хидролиза алуминијума с обзиром да pH=4,03 погодује и хидролитичким реакцијама. Овај спектар је недовољно репрезентативан, јер га карактерише веома изражен шум, као и преклапања сигнала, највероватније последица појаве хидролитичких сигнала. Слика 33. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=4,03, негативни мод Докторска дисертација 75 На Слици 33 приказан је спектар истог раствора као на претходној само снимљен у негативном моду (напон на капилари=-15 V, tube lens off set=-5). У Xcalibur програму је креирана и оптимизована нова инструментална метода за рад у негативном моду. У спектру је присутно много више шума него у истом снимљеном у позитивном моду. Сигнале знатног интензитета, у овом спектру су: m/z 143,13; 233,13; 311,07; 346,80; 407,07. Спектар се карактерише великим присуством шума и преклапањем сигнала што отежава идентификацију врста присутних у раствору. Сигнали у овом спектру који се уочавају као нови и највероватније припадају хидролитичким врстама су: најинтензивнији сигнал на m/z 96,93(релативног интензитета 72 %), 311,07 (релативни интезитет 100%), 346,80 (релативног интензитета 28 %), 286,93 (релативног интензитета 16 %), 251,07 (релативни интензитета 26 %). Слика 34. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3 (Nº3, табела 12), позитивни мод Спектар на Слици 34 карактерише „чиста“ базна линија, јасни сигнали. Интензитетска расподела је правилна Gauss-ова расподела. У исечку „А“ на Слици 34 приказана је Gauss-ова расподела у односу на јон 763,27. На сличан начин се може илустровати Gauss-ова расподела у односу на остале јоне у изучаваним спектрима. Највероватније је комплексирање доминантно при овим условима, pH=5,29, лиганд у вишку. Сигнал на m/z 763,27 расте (релативног интензитет 20 %). Сигнал на m/z 719,27 је ниског релативног интензитета 6 %. Сигнал 382,20 је са релативног интензитетом 24 %. Сигнал на m/z 223,67, са релативним интензитетом 20 %. Сигнал 203,60 је релативног интензитета 6 %. Овај спектар се може сматрати репрезентативним за овај концентрациони однос. Слика 35. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=5,29, негативни мод Mр Mирјана Р. Цвијовић 76 На Слици 35 приказан је спектар истог раствора само снимљен у негативном моду. Спектар је снимљен у опсегу m/z 50-1000. Сигнали вишег интензитета су у области до m/z 500. Ову област карактерише велики шум и преклапање сигнала. Сигнали вишег интензитета су : 91,93; 96,93; 165,00; 395,80; 416,07 510,07, 772,60. У области m/z > 500 запажа се мање шума и сигнали нижег интензитета. Сигнали уочени у спектру на Слици 32 на pH 4,03 овде нису уочљиви (а највероватније припадају хидролитичким врстама ) што је највероватније последица чињеце да при овом pH доминира комплексирање у односу на хидролизу. Слика 36. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3 (Nº4, табела 12), позитивни мод При истом концентрационом односу, а са повећањем pH=6,20 добија се спектар на Слици 36. Вредност pH=6,20 мање погодује комплексирању тако да су релативни интензитети сигнала који највероватније указују на формирање комплексних јона снижени. Јону m/z 763,27 се релативни интензитет са 20 % смањује на 12 %. Јон m/z 719,33 показује незнатан пораст интензитета. Јон m/z 382,20 показује велики пад релативног интензитета на 5 %. Сигнали слободног лиганда m/z 326,20 и 269,27 показују пораст у интензитету што указује да на овом pH заостаје све више неизреагованог лиганада (релативни интензитет молекуског јона флероксацина у позитивном моду m/z 370,13 је 100 %). Слика 37. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=6,20, негативни мод На Слици 37 приказан је спектар истог раствора као на претходној pH=6,20, снимљен у негативном моду, у опсегу m/z 50-1000. У спектру је присутно више шума и спектралног Докторска дисертација 77 преклапања него у истом снимљеном у позитивном моду. Сигнали знатног интензитета су: 304,27 (релативни интензитет 100 %), потиче од слободног лиганда, молекулски јон флероксацина у негативном моду 368,00 (рел.интензитета 78 %); 278,33 (релатиног интензитета 35 %); такође потиче од слободног лиганда. Ови сигнали указују да на овом pH заостаје више неизреагованог лиганада, што је у потпуности у складу са закључком када је исти раствор снимљен у позитивном моду. 2. Спектри раствора алуминијума и флероксацина, CAl:CFlero=1:1,5 концентрациони однос Спектри концентарционог односа CAl:CFlero=1:1,5, за различите pH вредности (3,50, 4,14, 5,64), чији су састави дати у Табели 12, приказани су на сликама 38-40. И у овој серији спектара, која је снимљена при благој јонизацији у ЕSI извору, јавља се и у основним МS1 спектрима приметна фрагментација. Добијени ЕSI МS спектри испитиваних комплекса добро одсликавају њихову молекулску структуру и могу се корелисати са њиховим карактеристикама, што је основни предуслов за коришћење ЕSI МS технике за потребе ових експеримената. Слика 38. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1,5 (Nº5, табела 12), позитивни мод Спектар на Слици 38. има мало сигнала, што највероватније значи да је комплексирање мало изражено, при pH = 3,50. Релативни интензитети сигнала, који најверватније указују на комплексирање су ниски. Базна линија је чиста, без шума. Сигнали 763,27 и 719,33 су релативних интензитета m/z < 5 %. Двоструко наелектрисани јони 382,20; 222,13 су релативног интензитета 6 %. Интензитет протонованог молекулског јона 370,13 је 100 %, а јон 326,20 има релетивни интензитет 12 %. Слика 39. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1,5 (Nº6, табела 12), позитивни мод Mр Mирјана Р. Цвијовић 78 Спектар на Слици 39 се односи на раствор истог концетрационог односа и више pH вредности (pH = 4,14) и карактерише се израженим преклапањем сигнала. До су 450 m/z су сигнали виших релативних интензитета, са доста шума. При m/z већим од 500 једини већи сигнали су од јона 763,27 и 719,20. Под овим концентрационим и pH условима је изражено комплексирање при чему су релативни интензитети формираних сигнала доста виши. Уочавају се и нови сигнали у односу на претходни спектар. Један од нових сигнала је на m/z 255,20. Интензивнији сигнали су и 236,40 и 223,60. Сигнал на m/z 763,27 је са релативним интензитеом већим од 20 %, сигнал 382,20 је са релативним интензитетом 45 %. Слика 40. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1,5 (Nº7, табела 12), позитивни мод При истом концетрационом односу а при pH = 5,64 интензитети „главних“ сигнала почињу да опадају (Слика 40). Сигнал на m/z 763,27 је релативног интезитета мањег од 20 %, сигнал 382,20 је релативног интезитета 25 %. Сигнал јона 255,27 је релативног интензитета 20 %. При овој pH вредности комплексирање је интензивније него ли при pH вредностими 3,50 и истом концентрационом односу. Из дате серије овај спектар се може сматрати репрезентативним, јер се у овом спектру уочавају сигнали без много шума и преклапања. 3. Спектри раствора где је метал у вишку, а различите pH вредности Спектри за концентарциони однос CAl:CFlero=2:1 за различите pH вредности (3,05, 4,06, 5,06) су приказани на Сликама 41-43. За ову серију је карактеристична појава већег броја сигнала у области од m/z 190 до 250. Слика 41. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1(Nº 8, табела 12), позитивни мод Докторска дисертација 79 Спектар на Слици 41 је снимљен у опсегу од m/z 100 до 1000. У спектру се запажају две области: m/z до 500 са сигналима виших интензитета, већим преклапањем и област већом од m/z 500 са сигналима нижег интензитета. Запажа се јачи шум у овом спектру. Сигнал на m/z 763,27 је релативног интезитета 7 %. Молекуски јон флероксацина је мањи од 100 %. Сигнал на m/z 382,20 је релативног интезитета 18 %. У поређењу са спектрима где је лиганд у вишку, спектри где је метал у вишку су са много више сигнала што највероватније потиче од хидролитичких процеса који су у овом случају комкурентни процесима комплексирања. Слика 42. Gauss-ов приказ спектра раствора CAl:CFlero=2:1, pH=3,05 На Слици 42 је приказан интервал од m/z. 200 до 280 На овом приказу се види да је расподела интензитета сигнала правилна, која се не уочава лако у основном спектру на Слици 41, због много шума у том спектру. Слика 43. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1(Nº 9, табела 12), позитивни мод. При истом концетрационом одосу алуминијума и флероксацина а са повећањем pH за једну једницу добија се спектар на Слици 43. Спектар карактерише доста шума, највероватније последица фаворизованих хидролитичких процеса под овим експерименталним условима. Релативни интензитет јона 763,27 расте до 12 %, док релативни интензитет молекулског јона лиганда на m/z 370,07 опада на 40 %. Сигналу 382,20 расте релативни интензитет до 35 %. Релативни интензитет „новог“ сигнала на m/z 215,47 је 100 %. У овом спектру су интензивни и сигнали: 193,47; 202,40, док су једва приметни у растворима када је лиганд у вишку (последица комплексирања). Mр Mирјана Р. Цвијовић 80 3.4.7.1. Основне карактеристике спектралних линија Gauss-oва расподела Основна карактеристика профила линије је његова полуширина на половини висине максималног интензитета Δλ1/2 тј. ширина спектралне линије је у складу са нормалном расподелом. Најзначајније особине спектралних линија јесу интензитет линије и облик профила линије. Спектрална линија увек има одређен профил тј. некакву расподелу интензитета зрачења у одређеном интервалу фреквенција [96, 97, 98]. Профил не мора обавезно бити симетричан. Облик профила и ширина снимљене спектралне линије зависе од врсте атома емитера, физичких услова присутних у извору, као и од карактеристика спектралног уређаја. При анализи спектралних линија значајне су и друге карактеристике профила, као што су: форма крила линије, асиметрија профила или померај спектралне линије. Померај представља растојање за које је максимум испитиване спектралне линије померен у односу на максимум линије коју би емитовали изоловани и непокретни атоми. Све ове карактеристике профила линије говоре о посебним физичким условима у којима се налазе емитери приликом емисије фотона. Ти посебни физички услови су последица истовременог присуства интензивног термичког кретања честица извора и интеракције међу њима. Механизми који доводе до ширења спектралних линија, које емитују неутрални атоми или јони из извора, могу се поделити у три групе: природно ширење, које је последица коначности средњег времена живота атома у побуђеном стању Doppler-oвo ширење, које се јавља услед кретања атома-емитера у односу на оптички систем помоћу којег се зрачење посматра ширење услед притиска, узроковано интеракцијом атома-емитера са околним неутралним и наелектрисаним честицама (пертурберима). Наведени механизми делују истовремено, али је њихов утицај различит и зависи од услова који владају у извору. Осим поменутих механизама ширења постоји и додатно инструментално ширење спектралних линија које уноси сам спектрални уређај. Слика 44. Gauss-ов приказ спектра раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,06 На Слици 44 је приказан интервал од m/z 170 до 270. На овом приказу се види да је расподела интензитета сигнала Gauss-oва, која се не уочава у основном спектру на Слици 43 због много шума у овој области. Полуширине линија на слици су у складу са нормалном расподелом. Профил линија у интервалу од m/z 190 до 250 је симетричан. Већину линија карактерише појава крила што је најверобатније последица недовољне резолуције инструмента Докторска дисертација 81 Слика 45. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1 (Nº10, табела 12), позитивни мод. Повећањем pH само једну јединицу (pH = 5,06) добија се за спектар на Слици 45 кога карактерише доста шума у целом опсегу m/z. Интензитетска расподела сигнала је правилна, Gauss-ова. Релативни интензитет јона на m/z 763,27 расте и износи 24 %, а јон 719,47 је релативни интезитет 12%. Релативни интензитет молекулског јона 370,20 расте до 100%. Општи изглед овог спектра све више се ближи спектрима који настају када су лиганди у раствор додати у вишку. Сигнал јона на m/z 382,27 расте до 50 %. У знатном проценту су заступљени јони 255,20 и 223,67 (више од 50 %). Из ове серије, где је метал у вишку, а хидролитички процеси конкурентски са процесима комплексирања, спектар на Слици 45, се може сматрати репрезентативним. 4. Спектри раствора где је иста pH вредност, а различити концентрациони односи На основу резултата снимљених спектара где је мењана pH вредност, при константним концетрациони односима закључено је да је pH вредност 5,0 оптимална Стога у овом пасусу су резултати снимања серије спектара где је pH подешено на 5,00, а мењан је међусобни однос метала и лиганда како би се добили најоптималнији спектри. Појединачне концентрације су биле реда 10-5 mol/dm3, као у људском организму. Инструментални услови снимања су исти као и у претходним серијама спектара. Спектри ове серије су приказани на Сликама 46-50. Мало шума у спектрима је карактеристично за целу серију. Слика 46. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:1(Nº 11, табела 12), позитивни мод Mр Mирјана Р. Цвијовић 82 При концентрационом односу CAl:CFlero=1:1, (Слика 46) уочава се правилна Gauss- ова расподела по интензитетима. Релативни интензитет сигнала на m/z 763,27 је 18 %, а јона 719,33 релативни интензитет је 6 %. Релативни интензитет молекулског јона лиганда m/z 370,07 је 100 %. Сигнал на m/z 382,20 има релативни интензитет 12 %. Релативни интензитет сигнала на m/z 222,20 је 5 %. Релативни интензитети сигнала у овом спектру су прилично ниски што указује да при овом концентрационом односу највероватније долази до комплексирања метала и лиганда, али је принос формираних врста низак у поређењу са интензитетом молекулског јона лиганда, 370,13. Слика 47. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=2:1, pH=4,96 (Nº 14, табела 12) позитивни мод При двоструко већој концентрацији метала у односу на концентрацију лиганда у раствору, (Слика 47) уочава се да су релативни интензитети сигнала, који указују да највероватније долази до комплексирања, већи него у претходном спектру. Релативни интензитет сигнала на m/z 763,27 достиже вредност од 25 %. Релативни интензитет сигнала протонованог лиганда m/z 370,07 је 100 %. Релативни интензитет сигнала на 382,20 расте до 27 %. Релативни интензитет сигнала на m/z 223,60 је 12 %. Овај спектар указује да ако је метал у вишку мали пораст pH преко 4,96 доводи до појаве шума и преклапања сигнала у знатној мери, јер хидролиза постаје све интензивнија. Из два различита експеримента, за две врло блиске pH вредности, исти концентрациони однос (CAl:CFlero=2:1) добија се добра поновљивост сигнала, једино се међусобно разликују по шуму и преклапању сигнала (Слика 43 спектар pH = 5,06) Слика 48. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:2 (Nº 13, табела 12), позитивни мод Докторска дисертација 83 Када је у раствору је лиганд присутан у двоструко већој концетрацији од метала запажа се мало више шума него на осталим спектрима из ове серије (Слика 48). У овим условима релативни интензитети следећих сигнала расту: m/z 763,27 расте до 45%, 382,27 расте до 64 %, а релативни интензитет сигнала 255,20 износи 68 %. Релативни интензитет протонованог лиганда m/z 370,07 је 100 %, док сигнал лиганда m/z на 326,33 опада на 10 %. У исечку „Б“ на Слици 48 приказана је пртавилна Gauss-ова расподела у односу на јон m/z 763,33. Слика 49. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1:3 (Nº 13, табела 12), позитивни мод При троструко већој концетрацији лиганда од метала, а истом pH (Слика 49) релативни интензитет јона m/z 763,27 расте до 56 %, док сигнал на 719,33 достиже вредност релативног интензитета од 8 %. Сигнал на m/z 382,20 има релативни интензитет 58 %. Релативни интензитет сигнала на m/z 255,20 опада до 42 %. Релативни интезитети сигнала слободног лиганда m/z 370,13 и 326,27 остају исти као у претходном спектру. Овај спектар указује на добру репродуктивност спектара, јер из два различита експеримента, а за две блиске pH вредности (pH=5,00 и pH=5,29 за концетрациони однос CAl:CFlero= 1:3, добија се добра поновљивост сигнала (Слика 34 спектар при pH = 5,29) с том разликом што су код спектра на pH=5,29 релативни интензитети сигнала који највероватније потичу од комплексних врста знатно нижи. При испитивању прве серије раствора са порастом pH за лиганд у три пута већој концентрацији у односу на алуминијумов јон интезитети комплексних врста опадају. Ако се као критеријум квалитета спектра узме интензитет сигнала који указује на формирање одређене комплексне врсте и одсуство шума у спектру онда се из I серије репрезентативним спектром сматра спектар за концетрациони однос метала и лиганда 1:3, pH = 5,29, за концентрациони однос 1:1,5 и pH = 4,14 (II серија), а из III серије спектар за концентрациони однос 2:1 и pH=5,06. 3.4.8. Примена неуронских мрежа на комплексирање алуминијума и флуорохинолона Неуронска мрежа је упрошћени математички модел аналоган биолошким неуронским мрежама (Слика 50). Сваки неурон је специјализована ћелија способна да пренесе електрохемијски сигнал. Ћелија се састоји од тела (some) које има језгро (nukleus) у центру, разгранату улазну структуру (dendrons) и излазну грану (akson). Аксон једне ћелије повезан је са дендроном друге ћелије. Синапсе су функционални међумембрански контакти аксона једног неурона и дендрона другог неурона. Један од најпознатијих истраживача у домену неуронских система Donald Hebb поставио је постулат да се учење састоји у мењању (фином подешавању-тјунирању) јачине синаптичких веза. Mр Mирјана Р. Цвијовић 84 Слика 50. Модел синапси у људском мозгу и структура вештачког неурона Неурон прима улазне сигнале по аналогији са електрохемијским сигналом и даје ouput-е који одговарају outoput-има биолошких неурона. У вештачком неурону (процесни елеменат) сигнали се могу мењати као што се мењају синапсе у биолошким системима. Неурони (чворови) су међусобно повезани тежинским везама (везама са тежинским коефицијентима). Неурони (процесни елементи) су груписани по нивоима [99]. Вештачка неуронска мрежа (Artifi cial Neural Network/ANN) има један УЛАЗНИ слој, један ИЗЛАЗНИ слој и један или више скривених слојева (hiden layers). Број мрежних структура је веома велики, јер примена ове технике вештачке интелигенције прожима сва поља научног истраживања и има огромну примену у пракси. Све мреже (неуронске структуре) могу се категорисати у две класе: Feed–forward и Feed-back мреже. Feed–forward мреже (мреже са простирањем унапред) омогућавају кретање сигнала у једном правцу од input-а до output-a. За сваку од ових група разликујемо мреже које уче под надзором (надгледано учење) и мреже које уче без надгледања. За мреже које уче са надгледањем ИЗЛАЗИ су познати па се разлика између жељених и израчунатих вредности користи за корекцију тежинских фактора неуронских мрежа. Важно питање које се односи на овај тип учења је проблем конвергенције грешака – минимизирање разлике између добијених и жељених вредности излазних варијабли [99]. Циљ је да се подесе тежински фактори на вредности за које ће грешке бити минималне. У ту сврху најбољи метод је метод најмањих квадрата. Ова група мрежа укључује следеће класе неуронских мрежа класификоване по критеријуму Feed– forward и Feed-back. Типови мрежа са надгледањем: 1. Feed-forward networks: Backpropagation (BP), Backpercolation (Perc), Perceptron, Cauchy Machine (CM), General Regression, Neural Network (GRNN); 2. Feed-back networks: Fuzzy Congitive Map (FCM), Mean Field Annealing (MFT), Real- time recurrent learning (RTRL), Backpropagation through time (BPTT), Recurrent Cascade Correlation (RCC): Један од најбољих алгоритама учења за неуронске мреже је BackPropagation (Метод учења са простирањем уназад). Полазећи од слоја output-a, разлике (грешке) између жељеног (zr) и актуелног оutput-а (yr) се рачунају са циљем да побољшају тежинске факторе у претходном нивоу. Сложеност мреже одређена је бројем нивоа и бројем неурона. Тежински фактори (тежине у гранама–коефицијенти у гранама) се подешавају кроз процес учења (learning) на бази примера (скуп емпиријиских, мерених парова улаз/излаз) и процес тестирања (testing). Први изазов када се дизајнира неуронска мрежа је одређивање одговарајуће архитектуре, нарочито број слојева и број скривених неурона. Ако је овај број сувише мали онда ANN нема довољно степени слободе за представљање података (underfi ting). Ако је исувише велики дешава се overfi tting. Докторска дисертација 85 У софтверу, који је коришћен за анализу у овом раду, а који је базиран на теореми Kolomogorov-a користе се мреже са једним скривеним слојем. Основни параметри у структури такве мреже (Слика 50) су: X- матрица-вектор улазних варијабли; Y- излазни вектор (који репрезентује површ функције реаговања–излазне или моделиране функције); wih– матрица тежинских коефицијената у гранама између улазног и скривеног слоја; who - матрица тежинских коефицијената у гранама између скривеног слоја и излаза [100]. Учење се изводи у итеративним циклусима. Сваки циклус садржи две фазе: корак напред и корак назад. Корак напред обухвата прорачун вредности излаза мреже ycalc за дате улазе. Почиње се од првог слоја који не извршава никакво процесирање вредности Улаза (x1, x2, x3 и x4) већ само повезује неуроне из првог слоја са свим неуронима у скривеном слоју. Један неурон са вредношћу 1 се додаје (bias) у улаз и скривене слојеве. Тежински коефицијенти се иницијализирају случајно у интервалу (-0,5-0,5). Укупни улаз jα у неурон j у скривеном слоју је тежинска сума свих улаза xi, (15) где је wij тежински коефицијент везе између неурона i и j, Ni је број улазних неурона, а Nh је број неурона у скривеном слоју. Излази из процесног елемента ј у скривеном слоју се добијају користећи одговарајућу трансфер функцију g(x). У софтверу који је коришћен у анализи употребљена је биполарна сигмоидна трансфер функција, дефинисана једначином (16). У складу са претходним излаз неурона ј у скривеном слоју биће: (16) Коначно, имамо output из процесног елемента р који је излаз из неуронске мреже: (17) Потом се рачуна MSEE (Mean Summed Squared Error) излазног вектора на бази разлике мерених вредности и вредности добијених моделом: (18) где је t = 1,2 ,..., P, a P је број улазно / излазних парова за обучавање. Са циљем да изведемо корекцију треба да одредимо вектор грешке успешно за сваки ниво и све неуроне. Према детаљним описима датим у референци [101, 102], грешка у излазном слоју ће бити: (19) где је δr вектор грешке излазних неурона, yrcalc су вредности излаза израчунате преко АNN и yrmeans су мерене вредности (вредности добијене експериментално). Извод сложене функције даје грешке у скривеном слоју (у даљем тексту h је ознака за скривени слој): (20) где q индекс означава неки од неурона скривеног слоја, m је број излазних неурона, δq je вектор грешке скривених неурона, xq(h) је излаз сваког скривеног неурона, δr је вектор Mр Mирјана Р. Цвијовић 86 грешке излазног слоја и wqr(t) тежински вектор излазног слоја који се узима из претходне итерације у складу са (102). Корекција тежинских фактора се изводи из ширења грешке из output-а у ниво input-а. Корекција тежинских фактора wij за процесне елементе i и j између два слоја у итерацији t+1 се приказује на следећи начин: (21) где је wij(t ) тежина пре модификације, a wij (t+1) је тежина после модификације. η је брзина учења (брзина конвергенције измђу датог решења и глобалног минимума). δ j је грешка за процесни елемент ј, а xi је вредност output-a процесног елемента i, μ је момент који помаже мрежи да превазиђе локални минимум и wij (t −1) је тежински фактор две итерације пре и текуће итерације. На брзину конвергенције не може се знатно утицати повећањем брзине учења η, јер то води до изостављања минимума грешака и осцилација система. У овом софтверу препоручено је да стартна вредност брзине учења η има вредност 0,8 док је момент μ константа и има вредност 0,9. Сви input-и и output-и су нормализовани у интервалу (-1,1) линеарним скалирањем. Процес тежинских корекција се изводи у серији сукцесивних циклуса учења. Процес увежбавања може бити завршен било којим од критеријума: укупно време учења, укупан број циклуса учења или критеријума који дефинишу грешку учења итд. На крају процеса учења знање неуронске мреже се енкодира у тежинске коефицијенте. BP алгоритам и метод учења су базирани на примени софтвера за моделирање неуронских мрежа Неуро 2013. На основу резултата за процес формирања комплекса између алуминијума и флероксацина у физиолошким условiма, за моделирање је употребљена мрежа са 3 улаза и 5 излаза, (слика 51). Слика 51. Структура неуронске мреже са три улаза и пет излаза Као улазни фактори коришћени су: • pH [] – pH вредност • c [mol/dm3] – концентрација • v [ml] – запремина додате базе ТЕА Излазни фактори су награђени комплекси: • Комплекс 223 [%] – релативна заступљеност комплекса m/z 223 у раствору • Комплекс 255 [%] – релативна заступљеност комплекса m/z 255 у раствору • Комплекс 382 [%] – релативна заступљеност комплекса m/z 382 у раствору • Комплекс 719 [%] – релативна заступљеност комплекса m/z 719 у раствору • Комплекс 763 [%] – релативна заступљеност комплекса m/z 763 у раствору Коришћењем модела ANN са датим улизима и излазима најпре су за све комплексе и различите експерименталне услове (запремина додате базе) обучаване а затим тестиране мреже и најповољнији резултати ових процеса прказани на Сликама 52 и 53. Докторска дисертација 87 Слика. 52. Дијаграм грешки учења и грешки тестирања за комплекс m/z 719 Слике 52 и 53 дају приказ дијаграма грешака за процес обучавања (за Learning DataSet) и процес тестирања (за Testing Dataset) мреже. На основу дијаграма за m/z 719 се види да процес учења конвергира (грешке учења су све мање), али после око 4000 циклуса грешка тестирања почиње нагло да расте. У теорији ANN ово је граница за коју се препоручује прекид учења да би се избегао overlearning. Другiм речима икао је могуће постићи још бољу тачност у процесу учења, укупни ефекат (над оба скупа) је бољи ако се са учењем престане у зони у којој грешка тестирања почиње да расте. Ово је битно за практичну примену ANN мрежа. Ако је број примера за обучавање већи онда се добијају мање грешке обучавања/ учења, а грешка тестирања почиње да расте много касније, дакле у суми имамо тачнији систем који показује добре перфорамнсе и за нове примере (мерења) која нису учествовала у обучавању мреже. Слична је ситуација код дијаграма за m/z 763 стим што је овај циклус тестиран за 2100 и 3000 циклуса. Уочено је да је боље да се прекид врши после 2100 циклуса. Слика. 53. Дијаграм грешки учења и грешки тестирања за комплекс m/z 763 Mр Mирјана Р. Цвијовић 88 Слика 54. Дијаграм рачунских и експерименталних вреднсти после 4000 циклуса учења за комплекс m/z 719 На следећим дијаграмима (Слика 54 и 55) дат је приказ релативног учешћа комплекса m/z 719 и m/z 763 добијен мерењем на основу података ESI MS технике (плави маркери) и ANN моделом (црвени маркери). За комплекс m/z 763 после 3000, односно 2100 циклуса учења. За комплекс m/z 719 после 4000, односно 8500 циклуса учења Формирани су и дијаграми грешака после 3000 и 2100 за m/z 763 односно дијаграми грешака за m/z 719 после 4000 и 8500 циклуса обучавања. На дијаграму грешака за комплекс m/z 719 уочава се да после 5000 циклуса учења, овај процес иако генерално конвергира поприма и дозу нестабилности. Програм током процеса учења бележи сва стања грешака и на крају меморише најбоље стање (минимум грешке учења), што је у овом случају 6300 циклуса. Када се користи 4000 циклуса за учење мреже види се да постоји доста добро слагање за већину мерених тачака са експериментално добијеним, а одступања која се јављају су углавном задовољавајућа изузев за примере обучавања у 2, 10 и 12 мерењу. Слика 55. Дијаграм рачунских и експерименталних вреднсти после 2100 циклуса учења за комплекс m/z 763 Са дијаграма 54 и 55 види се да постоји прихвтљиво одступање неких тачака добијених прорачуном ANN моделом у односу на експериментално добијене резутате добијене ESI MS технике. 3.4.9. Zoom Scan јона у систему алуминијум флероксацин Zoom scan је тип скенирања који даје резултате веће резолуције. Овај мод се користи за одређивање наелектрисања посматраног пика (charge state). Све до 10 односа m/z јони могу бити одређени у Zoom scan моду. Ако су изотопски пикови раздвојени за 0,33 јединице јон има наелектрисанје +/- 3. Докторска дисертација 89 Zoom scan је scan високе резолуције, full range, намењен да дешифрује изотопски „envelope“ [103] који се често користи за одређивање пептида и одређиванје јонизационог стања органометала. Zoom scan мод омогућава да раздвојимо изотопске врсте вишеструко наелектрисаних јона добијених у електроспреј масеним спектрима. Дешифровање изотопског кластера открива једну четвртину m/z разлике између угљеничних изотопа, чија разлика у маси износи 1 далтон, а потиче од разлике 12С/13С. Стога наелектрисање овог јона износи +4. Спектри високе резолуције (Zoom scan) ако су са на пример двоструко и четвороструко наелектрисани кластери имају такве изтотопске pattern-е у спектрима који се добро слажу са израчунатом изотопском дистрибуцијом. Добра калибрација инструмента се захтева да би се избегао charge space ефекат. Такође је важно одржавати стаблном укупну јонску струју и без флуктуација. Ово је један од разлога зашто се фаворизује микроспреј у односу на ESI јер је добро познато да микро спреј даје континуалан и стабилан спреј. Zoom scan спректри са резолуцијом између 6 000 и 8 000 се користе за идентификацију различитих charge state али не и за спаривање (усаглашавање пикова). Посматрани помераји у Zoom scan су често 0, 3; 0,2; 1,0 Dа. Charge state пептидног јона се обрачунава из m/z разлике изеђу његових изотопских пикова. На пример: ако је m/z разлика између изотопских пикова 0,25 и ако је разлика у маси 1 a.m.u следи да је charge state + 4 [104, 105]. Ако се користе анализатори мање резолуције као што је јон трап у поређењу са анализаторима високе резолуције као што је орбитрап то чини одређиванје charge state много тежим. Ово се дешава зато што изотопски пикови улазе једни у друге када се користе анализатори мање резолуције, тј. недовољно су раздвојени пикови. Највећа предност познаванја charge state у масеном спектру је када покушавамо да анализирамо пептиде и сходно чињеници да пептиди захваљујући њиховим основним амино крају и тежњи основне амино киселине да више стабилизаује позитивно наелекетрисање него друге сличне молекуле као што су полимери. Када користимо ESI ово значи да су јони пептида најзаступљенији у +2 и +3 charge state, док су полимери и други слични молекули обично у +1 charge state. Zoom scan модом је потврђено и наелектрисање двоструко наелектрисаних јона комплекса: 223,60, 382,20, једноструко наелектрисаних јона комплекса 763,27 и једноструко наелектрисаног лигандног јона 326,27. Слика 56. Zoom scan joна 255, Δ=0,3, (255,06, 255,36, 255,71) Mр Mирјана Р. Цвијовић 90 Применом zoom scan moda на јон 255 (Слика 56) уочава се разлика између пикова од 0,3 јединице, из чега следи да је овај јон троструко наелектрисан. Слика 57. Zoom scan joна 382, Δ=0,5 (382,13, 382,64, 382,11) Применом zoom scan мода на јон 382 (Слика 57) уочава се разлика од 0,5 јединица, што је потврда двоструког наелектрисања овог јона. Слика 58. Zoom scan јона 763, Δ=1, (763,30, 764,29, 765,28) Применом zoom scan мода на јон 763 (Слика 58) уочава се разлика између пикова од 1 јединице, из чега следи да је овај јон једноструко наелектрисан. Докторска дисертација 91 Слика 59. Zoom scan јона 360, Δ=0,5, (360,14, 360,65, 361,15) Применом zoom scan мода на јон 360 (Слика 59) уочава се разлика између пикова од 0,5 јединица, из чега следи да је то двоструко наелектрисани јон. Слика 60. Изотопски pattern протонованог јона флероксацина m/z 370 и јона комплекса m/z 382 На слици 60 су приказани истовремено јон самог лиганда (протоновани флероксацин m/z 370) и јон награђеног комплекса између алуминијума и флероксацина m/z 382. Занимљиво је уочити да је наелектрисање првог јона износи +1, што се закључује на основу разлика између узастопних пикова у patternu која износи 1, а наелектрисање другог јона m/z 382 је +2, јер разлика између узастопних пикова у pattern-у износи 0,5. Mр Mирјана Р. Цвијовић 92 Слика 61. Zoom scan јона 215, Δ=0,5, (215,47, 216,00, 216,47) Применом zoom scan мода на јон 215 (Слика 61) уочава се разлика између пикова од 0,5 јединица, из чега следи да је то двоструко наелектрисани јон. Слика 62. Zoom scan јона 719, Δ=1, (719,33, 720,30, 721,30) Применом zoom scan мода на јон 719 (Слика 62) уочава се разлика између пикова од 1 јединице, из чега следи да је овај јон једноструко наелектрисан. 3.4.10. Тандем масена спектрометрија Снимање МS/МS спектара је процедура за испитивање појединачних јона у раствору (смеши). Јон од интереса се изолује на основу његове карактеристичне m/z вредности и након активације тог јона сударом (применом CID, сударом изазвана дисоцијација), долази до његове дисоцијације и настајања продукт јона. Ова дисоцијације се дешава у присуству Докторска дисертација 93 колизионог гаса хелијума (Hе), применом одговарјућег rf напона при скенирању MSn. Резултујући продукт јони, настали од parent јона, се испитују у другом кораку мерења. Применом тандем масене спектрометрије се елиминише или максимално редукује сигнал који потиче од других компонената или инструмент background-a (хемијског шума) [30]. Тандем масена, MSn је коришћена у овој тези да би се добио увид у могућу структуру Al(III)-јон -HQ комплекса, тј. да би се утврдила највероватнија везивна места алуминијума у комплексима. Стога су одабрани јони који дају сигнале на карактеристичним m/z уведени у јон трап и подвргнути сударима са колизионим гасом при различитим енергијама судара. За parent јон је биран првенствено молекулски јон, а у одређеним случајевима испитивани су и други parent јони, тј. сигнали из примарног ЕSI МS спектра. МS/МS спектри су снимани у позитивном моду ЕSI извора (више одговара киселој средини), у fl ow injection режиму са протоком 10 μmol/dm3. Затим су бирани молекулски јони за MS/MS/MS фрагментацију, са isolation width: m/z ± 1,0. Вредност колизионе енергије је повећавана од 30–80 % све док се не добије уочљива фрагментација при датим вредностима m/z, а да се parent јон још увек види у спектру. LCQ програм изражава Ecoll у релативним јединицама, процентима (%). На крају МS/МS експеримената, колизиона енергија Ecoll је обично износила 50–60 % зависно од лиганда везаног са алуминијумом. 3.4.11. MS/MS експеримент јона у раствору флероксацина и Аl(III)-јона Слика 63. МS/МS спектар parent јона 255, Ecoll =25 % Спектар на Слици 63 је спектар parent јона 255 који је одабран из основног спектра раствора алуминијума и флероксацина, концентрације компонената 10-5 mol/dm3, концетрационог односа CAl:Cfl ero=2:1, pH=5,06. Овај јон је троструко наелектрисан, што је доказано Zoom scanom, слика 63. Накнадно примењени повећани rf напони, на parent јон 255 су 25% од максималне вредности. Најзначајнији продукт јони су: 246,20 (релативног интезитета 100 %), 237,53 (релативног интезитета 7 %), и 231,60 (релативног интезитета 4 %). У спектру је још увек присутан parent јон са релативним интензитетом 15 %, из чега следи да је примењена енергија била оптимална: изазвала је фрагментацију parent јона, али га није потпуно разбила. Mр Mирјана Р. Цвијовић 94 Слика 64. MS/MS спектар parent јона 255, Ecoll=30 % При повећању колизионе енергије на 30 % смањује се релативни интензитет parent јона 255 на 4 %, Слика 64. Релативни интензитет јона 246,13 остаје исти (100 %), а релативни интензитет јона 237,53 расте до 11 % и 231,60 (релативни интензитет 3 %). Са повећањем колизионе енергије за 5 % нема нових фрагмената, већ само релативни интензитети претходно добијених јона расту. Слика 65. MS/MS/MS спектар јона 255, Ecoll=25 %, јона 246, Ecoll=30 % Након што је јон 255 фрагментисан, даље је требало проузроковати фрагментацију највећег продукт јона 246 у МS3 експерименту, Слика 65. Сада је 246 јон постао parent јон, једини јон преостали у јон трапу, на кога је примењена колизиона енергија од 30 %. Под овим условима parent јон је још увек присутан у спектру са релативним интензитетом 4%. Његови продукт јони су: 240,48 (релативног интезитета100 %), јони 215,46 (релативног интезитета 60 %), 202,36 (релативног интезитета 34 %), и 193,51 (релативног интезитета 8 %). Докторска дисертација 95 Слика 66. MS/MS спектар parent јона 429,90, Ecoll=78 % Спектар на Слици 66. је спектар parent јона 429,90 који је одабран из основног спектра раствора алуминијума и флероксацина, концентрације компонената 10-5mol/dm3, концентрационог односа CAl:Cfl ero=2:1, pH=4,26, tube lens off set=15 V. Приказан је интервал од m/z 150–600. Примењена је велика колизиона енергија од 78 % на parent јон. Међутим ова комплексна врста је толико стабилна да је и поред високе колизионе енергије parent јон са релативним интензитетом 100 %. Настали продукт јони су: 403,60 (релативног интензитета 28 %) и јони нижег интензитета 385,67 и 341,33. Слика 67. MS/MS parent јона 215,50, Ecoll=55 % Спектар на Слици 67 је спектар parent јона 215,50. И у овом случају је примењена велика колизиона енергија од 55 %, а parent јон је само делимично фрагметисан (релативног интензитетa 88 %). Настали продукт јони су: 202,29 (релативног интензитета 100 %), 193,44 (релативног интензитета 6 %). Mр Mирјана Р. Цвијовић 96 Слика 68. MS/MS јона 763, Ecoll=30 % Parent јон m/z 763,00 је одабран из основног раствора CAl:CFlero=1:1, pH=5,0. При колизној енергији од 30 % parent јон је још увек нефрагментисан ( релативног интензитета 100 %). Настаје само један продукт јон 719,27 (релативног интензитета 10 %), (Слика 68). Слика 69. MS/MS parent јонa 763, Ecoll=35 % На исти јон је примењена већа колизиона енергија од 35 % (Слика 69.) и сада је parent јон фрагментисан. Релативни интензитет parent јона m/z 763 износи 38 %. Настали продукт јони су: 743,22 (релативни интензитет 100 %), 719,27(релативни интензитет 70 %) и јони 690,20, 687,27 нижег интензитета. Слика 70. MS/MS спектар parent јонa 382, Ecoll=30 % Докторска дисертација 97 При колизионој енергији од 30 % parent јон 382 се фрагментише (Слика 70.) и још увек постоји у спектру (релативног интезитета 12 %). Настали продукт јони у МS/МS експерименту су: 372,13 (релативног интезитета 84 %), 368,80 (релативног интезитета 100 %), 358,87 (релативног интезитета 20 %) и 348,87 (релативног интезитета 8 %). 3.4.12. maLDI спектри Ласер десорпциона јонизација (LDI) подразумева стварање гасних јона у току интерације фотона из ласера са чврстим или течним узорком. Карактеристика LDI процеса је настајање великог броја јона за сваки ласер хитац (shot) [106]. LDI се примењује само на једињења која имају масу испод 1000 Da и на мале поларне молекуле. LDI спектри много зависе од примењеног ласера и од присуства нечистоћа. Коректан LDI спектар једињења зависи од услова који су примењени да би се формирали јони аналита. Кључни допринос у LDI експериментима је посматрање десорпционе ефикасности молекула (нпр. амино киселина и пептида) који апсорбују ласерски зрак више од оних једињења без хромофора. Сви они настају по једноставној шеми формирања протонованих или депротонованих квазимолекуларних јона удружених са неколико фрагментних јона насталих губитком малих стабилних молекула као што су CO2 или мравља киселина. Формирају се из високо интензитетских (позитивних) радикал молекулских јона или водоничних адуката као што су [M+2H]+• ,[M+3H]+• или депротоване врсте ([M-H]+•) као и појава фотоадуката који настају од хемијских једињења која превазилазе масу матрикс молекула[18, 24, 107]. Циљ примене maLDI спектрометрије је био да се специјација у растворима алуминијума и флуорохинолона употпуни. Наиме како ЕSI МS спектрометријом није могуће детектовати продукте полимеризације примењена је maLDI спектрометрија да би се из тих спектара идентификовале полимерне (димерне врсте) које се могу формирати у реакцијама комплексирања алуминијума и лиганда. Извршена оптимизација инструменталних параметара на МАLDI ТОF спектрометру, а потом је снимљена сама подлога и сваки лиганд појединачно. Након тога су снимани раствори свих лиганда са алуминијумом под истим условима 3.4.13. maLDI спектри подлоге и флероксацина Чиста подлога од челика је стављена у инструмент и снимљен је њен спектар да би се овако елиминисале могуће недоумице при интерпретацији спектара комплекса алуминијума и лиганада. Слика 71: maLDI спектар подлоге Mр Mирјана Р. Цвијовић 98 У maLDI спектру подлоге (Слика 71) се уочавају два јака сигнала на m/z 268,45 и 628,90. Спектар чисте подлоге садржи кластер јоне који настају при излагању челичне подлоге дејству ласера у МАLDI ТOF инструменту. Слика 72. maLDI спектар флероксацина у смеши вода: метанол=30:70, pH=4,90 У спектру флероксацина (Слика 72) запажа се сигнал који потиче од протонованог лиганда 370,41, нижег интензитета у односу на остале сигнале. Остали сигнали (268,45 и 628,90) потичу од подлоге. Највиша је релативна заступљеност јона подлоге m/z 268,44 (интензитет 2000 а. u.). Слика 73. maLDI спектри: а) флероксацин у смеши вода:метанол, pH=4,90 и б) спектар флероксацин у води На Слици 73 приказани су зумирани делови спектара а) флероксацина у смеши вода:метанол 30:70 и б) флероксацина у води у интервалу m/z 340 до 430. У спектрима Докторска дисертација 99 флероксацина раствореног у води и флероксацина раствореног у смеши вода метанол констатује се мања разлика у интензитету појединих сигнала, а не јављају се нови сигнали. Овај резултат је у складу са очекивањима да утицај растварача нема битнијег значаја у maLDI спектрима. 3.4.14. maLDI спектри комплекса Аl(III)-јона и флероксацина За изучавање комплексирања алуминијума и флероксацина maLDI спектрометријом припремљени су раствори различитих концентрација, концентрационих односа метала и лиганда и различитих pH вредности. Састави и pH вредности одабраних (приказаних) спектара дати су у Табели 13. Осим раствора где су концентрације метала и лиганда биле реда величине 10-5 mol/dm3 снимљени су и раствори где су концентрације метала и лиганда биле 10-4 mol/dm3. Табела 13: Састави за различите pH вредности раствора Аl(III)-јона и флероксацина Број узорка pH Концентрација Аl [mol/dm3] Концентрација флероксацина [mol/dm3] 1. 3,85 2,7 x10-4 8,1x10-42. 4,50 3. 5,42 Спектри су снимљени у позитивном рефлексионом моду. Слика 74. maLDI спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=3,85 Спектар на Слици 74 је снимљен у опсегу од m/z 700 до 1200 да би се избегао утицај сигнала од подлоге чији су сигнали уочљиви до m/z 650. У спектру се уочавају две карактеристичне групе сигнала и то у области око 700 и у области m/z 1100. Најинтезивнији сигнал из прве групе је на 763,51 а из друге серије на m/z 1170,59. LDI спектри се карактеришу сигналима нетакнутих молекулских јона, фрагментиним јонима насталим губитком малих неутралних молекула H2O, NH3 и HCOOH из протонованих врста које су обично ниског интензитета. Mр Mирјана Р. Цвијовић 100 Пикови квазимолекуларног јона се удружују са сателит пиковима на већим масама који потичу од молекула матрикса. Из молекулске масе добијају се важни подаци за карактеризаију молекула. Сваки пик карактерише envelope изотопске дистрибуције. Зато је важна резолуција да би се могли раздвојити појединачно пикови. Оштри пикови рефлектују изотопску дистрибуцију родитељског јона (ширина пика 10 Da) и ови спектри често показују допринос малих неутралних губитака нарочито ако зрачење није у потпуности контролисано и ако је блиско детекционом лимиту. TOF/ТОF масеном спектрометријом флуорохинолона и алуминијума добијају се envelope изотопске дистрибуције аналита који су значајни за структурно тумачњеових насталих комплекса. Слика 75. maLDI спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=4,50 Спектар на Слици 75 је снимљен у опсегу од m/z 300 до 3000. У спектру снимљеном при истом концeтрационом односу, али pH вишем се уочавају две карактеристичне групе сигнала и то у области око 700 и у области око m/z 1100. Сигнал на m/z 763,50 има највиши интензитет. Сигнал на 1154,61 представља по интензитету значајну врсту у овом систему. Слика 76. maLDI спектар раствора CAl:CFlero=1:3, pH=5,42, димер Докторска дисертација 101 Спектар на Слици 76 је снимљен у опсегу од m/z 600 до 2000 и још вишој pH вредности у односу на претходне спектре. На овом спектру запажају се 3 интензивнија изотопска кластера. Сигнал на m/z 1894,77 је из најниже групе сигнала. Као и на претходним pH тако и при овој pH вредности најинтензивнији је сигнал на m/z 763,20. Интензитет овог сигнала је врло висок па је и са аспекта заступљености значајан. Сигнал на m/z 1170,50 је окружен сигналима који највероватније потичу од метастабилних јона. 3.4.15. ЕSI МS и МS/МS спектри раствора моксифлоксацина Оптимизација радних услова ЕSI извора и јонске оптике је извршена према молекулском јону моксифлоксацина m/z 402, који је одабран као мониторинг јон. Снимање је извршено у позитивном моду. Слика 77. ESI и MS/MS спектри моксифлоксацина а) MS спектар моксифлоксацина; б) MS2 јон m/z 402,0, CID=0; ц) MS2 јон m/z 402,0, CID=40; д) MS4 јона m/z 402,0, CID=40; m/z358,0, CID=40; m/z 338,0, CID=0; е) MS4 јонa m/z 402, CID=40; m/z 358,0,CID=40; m/z 338,0,CID=40; Иако је ЕSI блага јонизациона техника ипак се у примарном МS1 спектру, на Слици 77 а) примећује фрагментација (губитак CО2, губитак C6H13N). У овом спектру најинтензи- внији (релативног интезитета 100 %) је сигнал m/z моксифлоксацина на 402,24 који потиче Mр Mирјана Р. Цвијовић 102 од протонованог молекулског јона. Остале јонске врсте имају мали интензитет сигнала (ре- лативног интезитет <15 %). б) Ово је спектар МS2 јона m/z 402,16, с тим што је колизиона енергија CID=0 ц) Спектар МS2 parent јона m/z 402,16, уз примену CID=40 % се фрагментише (декарбоксила- цијом) дајући тако потомак јон m/z 338,24, а даљим губитком HF настаје јон 338,24 и остали мање заступљени јони. У овом спектру је још увек присутан јон 402,16 ниског релати-вног интензитета, из чега следи да је примењена CID адекватна д) Спектар МS4 јона m/z 402,0, CID = 40; m/z 358,0, CID =40; m/z 338,0, CID =0; има само један сигнал и то од јона 338,19 чији је релативног интезитета 100% е) Спектар МS4 јона 402,16 CID =40; m/z 358,0, CID =40; m/z 338,0, CID =40; се фрагментише дајући тако потомак јон m/z 323,16 (релативног интезитета 100 %) и остале мање заступљене јоне: 282,21 (релативног интезитета 30 %) и јона 269,29. У овом спектру је још увек присутан јон 338,36 ниског релативног интензитета, из чега следи да је примењена CID адекватна. 3.4.16. ЕSI МS спектри раствора Аl(III)-јона и моксифлоксацина За изучавање комплексирања алуминијума и моксифлоксацина ЕSI МS техником припремани су раствори различитих концентрација, концентрационих односа и раствори различитих pH вредности. Овде је приказан само најрепрезентативнији спектар, снимљен у позитивном моду и на основу оптимизације инструмента за протоновани јон моксифлоксацина m/z 402,30. Слика 78. ESI MS спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,60, CAl=2,7x10-5 mol/dm3 ЕSI МS спектар на Слици 78 је снимљен у опсегу од m/z 50 до 1300. Расподела интензитета је правилна, Gauss-ова у односу на сигнале 402,20, 827,31, 1266,88. Базна линија је чиста без много шума. Сигнал на m/z 827,31 је релативни интезитет 24 %. Сигнали на m/z 414,22, је релативни интензитет 28 % и 424,28 је релативног интензитета 10 %. Сигнал 216,81 је са релативним интензитетом 4 %. Сигнал на 1266,88 је релелативно интензитета 6 %, али хемијски није мање битан од осталих. У спектру је најинтензивнији сигнал од слободног лиганда на 402,20 (релативног интензитета 100%). Сигнал на m/z 358,27 је знатно нижи (релативни интензитет 8 %). Овај спектар се може сматрати репрезентативним за овај концентрациони однос и ову pH вредност. Докторска дисертација 103 3.4.17. maLDI спектри раствора Аl(III)-јона и моксифлоксацина Најпре су снимљени maLDI спектри самог моксифлоксацина, исте концетрације и pH вредности као у растворима алуминијума и моксифлоксацина. За изучавање комплексирања алуминијума и моксифлоксацина maLDI МS техником припремани су раствори различитих концентрационих односа и различитих pH вредности. Састави и pH вредности одабраних спектара су у Табели 14 а остали спектри су дати у Прилогу ове тезе. Табела 14. Састави и pH вредности раствора Аl(III)-јона и моксифлоксацина Број узорка pH Конц. однос Концентрација Аl [mol/dm3] Конц. моксифлоксацина [mol/dm3] 1 4,40 1:1 2,7x10-4 2,7x10 -4 8,1x10-4 2 5,90 1:1 3 5,10 1:3 4 5,90 1:3 Слика 79. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:1, pH=4,40 Спектр на Слици 79 се односи на концетрациони однос алуминијума и моксифлоксацтина 1:1 и pH 4,40. Издвајају две групе сигнала. Осим сигнала од подлоге до m/z 600, уочавају се и нижи сигнали у другој групи од m/z 700 до 900 који највероватније припадају комплексим врстама. Ови су јони ниске релативне заступљености, јер ови експериментални услови не погодују комплексирању. Уочава се и сигнал на m/z 827,50, који се при свим концетрационим односима и свим pH вредностима јавља. Mр Mирјана Р. Цвијовић 104 Слика 80. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:1, pH=5,90, према спектру подлоге При истом концентрационом односу а са порастом pH за једну јединицу добија се спектар на Слици 80. Слика приказује два спектра: а) спектар који потиче од подлоге и б) спектар који потиче од раствора алуминијума и моксифлоксацина. Када се „одбије“ утицај подлоге остају пикови (465,61, 827,58, 1077,45, нижег интензитета). На спектру који потиче од подлоге сви сигнали су сконцентрисани до m/z 630, док у спектру раствора алуминијума и моксифлоксацина сигнали се појављују до m/z 1100. Слика 81. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,10 Спектар на Слици 81 се односи на раствор концетрационог одноаса алуминијума и моксифлоксцина = 1:3 и pH = 5,10. Снимљен је у опсегу од m/z 300 до 2800. Сигнал на m/z 827,50 има овом случају релативни интензитет 100 %. Овај сигнал се уочава у претходним спектрима али је много мањег интезитета. Испред овог сигнала налази се више нижих сигнала који потичу од метастабилних јона и са аспекта релативне заступљености представљају минорне врсте. Сигнал на m/z 1250,62 у овим условима је трећи по својој релативној заступљености. Сигнал на m/z 1266,59 се не види у овом спектру па је зато зумирана област на исечку „А“. Докторска дисертација 105 Слика 82. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,10 На Слици 82 приказан је спектар концентрационog односa 1:3, истог pH са циљем боље анализе подручја до m/z. 900 У спектру се издвајају три групе сигнала. Осим сигнала од подлоге до m/z 500, уочавају се и сигнали у другој групи од m/z 600 до 750 који потичу највероватније од метастабилних јона и то су минорне врсте (ниска релативна заступљеност). У трећој групи сигнала на овом спектру највишег интензитета је сигнал на m/z 827,50. Слика 83. maLDI спектар раствора CAl:CMoxi=1:3, pH=5,90. Спектар на Слици 83 се односи на раствор истог концентрационог односа 1:3 као и спектар на Слици 81 с тим што је pH вредност виша. Пораст pH доводи до појаве новог сигнала на 2054,36. Сигнал на m/z 1250,62 је други по интензитету у овом спектру. На m/z 827,50 у овом maLDI спектру је сигнал највеће релативне заступљености, што није случај при концентрационо односу алуминијума и моксифлоксацина=1:1, истом pH (Слика 80). Сигнал на m/z 2054,36 је доста нижег интензитета. Овај спектар се може сматрати најрепрезентативнијим међу свим maLDI спектрима алуминијума и моксифлоксацина. Mр Mирјана Р. Цвијовић 106 3.4.18. ЕSI MS спектри раствора ципрофлоксацина Оптимизација радних услова ЕSI извора и јонске оптике је извршена према молекулском јону ципрофлоксацина m/z 332, који је одабран као мониторинг јон. Снимање је извршено у позитивном моду. Слика 84. MS/MS спектар joна 332, Ecoll=40 % ESI је блага јонизациона техника, али се и у примарном МS1 спектру примећује блага фрагментација. Спектар на Слици 84 је MS/MS спектар где је на parent јон 332 примењена колизиона енергија од 40 %. При овој колизионој енергији је дошло до фрагментације parent јона, али је овај јон још увек високог интензитета, што указује да је колизиона енергија требало да буде још већа. Настали продукт јони су: m/z 288,17; 268,23; 231,17. 3.4.19. ЕSI МS спектри раствора и Аl(III)-јона ципрофлоксацина За изучавање комплексирања алуминијума и ципрофлоксацина ЕSI МS техником припремани су раствори различитих концентрационих односа метала и лиганда, различитих концентрација компонената (реда величине 10-5 mol/dm3 и реда величине 10-4 mol/dm3) и различитих pH вредности. Снимани су и спектри раствора где је вода растварач и раствора где је смеша воде и метанола коришћена као растварач и констатовано је да нема већих разлика у ЕSI МS спектрима у овим растварачима. Приказан је само најрепрезентативнији спектар, снимљен у позитивном моду и на основу оптимизације инструмента за протоновани јон ципрофлоксацина m/z 332,01. Слика 85: ESI MS спектар раствора CAl:CCipro=1:3, pH=5,26 Докторска дисертација 107 Спектар приказан на Слици 85 је снимљен у опсегу од m/z 70 до 1200 и може се сматрати репрезентативним за овај концентрациони однос и ову pH вредност. Ово је спектар раствора где је концентрација алуминијума CAl=2,7x10-5 mol/dm3, а ципрофлоксацина три пута већа у односу на концентрацију алуминијума (растварач смеша воде и метанола). Прва група сигнала највероватније потиче од слободног лиганда: 332.01(релативни интезитет 100 %) и 231,20 (релативни интезитет 4 %). Другу групу сигнала представљају сигнали на: m/z 249,05 (релативни интезитет 8 %), 667,79 и 687,75 (релативни интезитет 24 %). Трећу групу сигнала представљају сигнали на: m/z 1040,33 (релативни интезитет 4 %), 1057,15 (релативни интезитет 6 %). 3.4.20. Zoom scan јона у систему алуминијум-ципрофлоксацин Zoom scan мод је коришћен са циљем провере наелектрисања појединих врста. Zoom scan даје већу резолуцију од осталих модова. Слика 86. Zoom scan јона 1056 Јон 1056 (Слика 86) је изабран из МS1 спектра раствора алуминијума и ципрофлоксацина приказаног на Слици 85 Интервал снимања је од m/z 1052-1061. Изотопски пикови јона 1056 су међусобно одвојени за Δ=1,0 јединицу, из чега следи да је јон m/z 1056 једноструко наелектрисан. Слика 87. Zoom scan јона 231 Mр Mирјана Р. Цвијовић 108 Јон 231 (Слика 84) је изабран из основног МS1 спектра раствора ципрофлоксацина и алуминијума (Слика 81). Јон је једноструко наелектрисан, јер разлика „суседних” пикова износи Δ=1,0 3.4.21. Тандем масена спектрометрија јона у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина (10-5 mol/dm3) За тандем масену спектрометрију одабрани су parent јони из спектара раствора ципрофлоксацина и алуминијума, где су као растварачи коришћени вода и смеша воде и метанола. Концентрације компоненти биле су реда величине 10-4 и 10-5 mol/dm3, концетрациони однос ципрофлоксацина и алуминијума 3:1, pH=4,99-5,26. Слика 88. MS/MS спектар parent јона 346, Ecoll=35,0 % Спектар на Слици 88 је спектар parent јона 346 који је одабран из основног спектра раствора ципрофлоксацина и алуминијума, концентрације компонената 10-5 mol/dm3, концетрационог односа 3:1, pH=5,26 (Слика 85). На parent joн 346,00 је примењена колизиона енергија од 35 % и као продукт јони су добијени 332,04, (најинтензивнији је у спектру); 314,11 (релативни интензитет 18 %) и 302,10 (релативни интензитет 4 %). У овом спектру је још увек видљив родитељски јон 346,00 чији релативни интензитет износи 7 %, што указује да је добро одабрана вредност колизионе енергије (дошло је до адекватне фрагментације, а родитељски јон још постоји у спектру). Слика 89. MS/MS спектар parent јона 687 (AlL2vrsta), Ecoll=30,0 % Докторска дисертација 109 Спектар на Слици 89 је спектар parent јона 687,00 који је одабран из основног спектра раствора ципрофлоксацина и алуминијума, Слика 85. Снимљен у интервалу од m/z 335- 1100. На parent јон 687,00 је примењена колизиона енергија од 30 %. Ова енергија није била довољна да изазове фрагментацију јона 687,00 па је релативни интензитет овог јона још увек 100 %. Настао је један минорни фрагмент на m/z 667,09 врло ниског интензитета. Слика 90. MS/MS спектар 687 јона, Ecoll=35,0 % Применом колизионе енергије од 35 % (Слика 90) запажа се да је интензивнија фрагментација parent јона и као продукт јони настају: 660,51 (релативни интезитет 45 %), 667,09 (релативни интезитет 24 %) и 604,11 врло ниског интензитета. Још увек је присутан parent јон 687,00 са релативни интезитет 100 %, што указује да је највероватније настала комплексна врста у којој су метал и лиганди чврсто везани и да колизиона енергија од 35 % не може раскинути везу између њих. Слика 91. MS/MS спектар parent јона 687, Ecoll=40,0 % Mр Mирјана Р. Цвијовић 110 Применом више колизионе енергије од 40,0 % фрагментација постаје интензивнија (Слика 91). Присутан је parent јон 687,00 са интензитетом 12 %, што указује да је примење- на енергија оптимална. Најважнији продукт јони су 660,52 (релативни интензитет 100 %), 667,17 (релативни интензитет 36 %) и 604,25 нижег интензитета. Слика 92. MS/MS спектар parent јона 716, Ecoll=35,0 % Спектар на Слици 88 је спектар parent јона 716,65 који је одабран из основног спектра (Слика 92) раствора ципрофлоксацина и алуминијума, концетрационог односа CAl:Ccipro = 1:3, pH =5,26. Снимљен у интервалу од 335–1100. На parent јон 716,00 је примењена колизиона енергија од 35 %. У овом спектру се запажа да parent јон више не постоји, што указује да је колизиона енегија требала бити нижа. Најзначајнији продукт јони су: 703,03 (релативни интензитет 22 %), 689,07 (релативни интезитета 67 %), 672,00 (релативни интезитета 100 %), 628,05 (релативни интензитет 12 %) и 605,05 врло ниског интензитета. Слика 93. MS/MS спектар parent јона 993, Ecoll=30,0 % Докторска дисертација 111 Из основног спектра (Слика 85) је одабран и јон 993,54 и применом колизионе енергије од 30 % су добијени продукт јони 976,02, 860,41, 828,69, 821,05, 677,29 и јон 661,77 са релативним интензитетом од 100 %. Интензитет parent јона 993,54 износи 4 %. Слика 94. MS/MS спектар parent јона 1056.55 (врста AlL3K), Ecoll=35,0 % Из основног спектра (Слика 85). oдабран је и јон 1056.55, примењена је колизиона енергија од 35 % и добијен спектар на Слици 94. Фрагментацијом овог јона се добијају следећи продукт јони: 1013,02 (релативни интезитет 100 %), 725,41 (релативни интезитет 24%) и јон 686,98 (релативни интезитет 30 %). Parent јона нема у овом спектру што указује да је примењена колизиона енергија превисока. 3.4.22. MS/MS/MS експеримент јона у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина У јонском трапу потпуна фрагментација се постиже тек у МS3 експерименту, за разлику од квадрупола, где је довољан и МS2 експеримент за детекцију свих фрагмената. Слика 95. MS/MS/MS спектар parent јона 687 Ecoll =30,0 % Спектар на Слици 95 је спектар parent јона 687,00, одабран из основног спектра (Слика 85) раствора ципрофлоксацина и алуминијума, концентрације компонената 10-5 mol/dm3, конц. односа 3:1, pH=5,26. Снимљен у интервалу од m/z 200-1200. На parent јон 687,00 је примењена колизиона енергија од 30%. Mр Mирјана Р. Цвијовић 112 Најзначајнији продукт јони су: 549,98 са релативним интензитетом од 100 % и јон на m/z 1005,54 настао као последица присаједињавања parent јона са неком врстом у раствору. Присаједињавање је ређа појава у односу на фрагментацију parent јона при примени одређене колизионе енергије. 3.4.23. Тандем масена спектрометрија јона у раствору Аl(III)-јона и ципрофлоксацина, концентрација компонената 10-4 mol/dm3 Изузетно тешко се у МS/МS експерименту разбијају parent јони из спектара раствора где су концетрације полазних компонената 10-4 mol/dm3..Потребна је велика колизиона енергија, а у неким случајевима неки јони се не могу потпуно разбити што указује да су формирани комплекси врло стабилни при вишим концентрацијама лиганда и метала. Слика 96. MS/MS спектар parent јона 688, Ecoll=40,0 % Спектар на Слици 96 је спектар parent јона 688 који је одабран из основног спектра раствора ципрофлоксацина и алуминијума, концентрације компонената 10-4 mol/dm3, концтрационог односа 3:1, pH=4,99. Снимљен у интервалу од m/z 185-1300. На parent јон 688,00 је примењена колизиона енергија од 40 %. У спектру је још увек присутан parent јон са релативним интензитетом 14 %. Када је концентрација компонената десет пута нижа овај јон у спектру више не постоји. Најзначајнији продукт јони су: 660,64 (релативни интезитет 100 %), 641,14 (релативни интезитет 7 %), 562,67 (релативни интезитет 4%). Слика 97. MS/MS/MS спектар 688 јона Ecoll=40,0 % и јона 660 Ecoll=80,0 % Докторска дисертација 113 За даљу фрагментацију изабран је као parent јон 660 (Слика 97) на кога је примењена енергија од 80,0 %. Дошло је до фрагментације овог јона, али још увек јон 660 постоји у спектру са релативним интензитетом 100 %, из чега следи да је енергија примењена у МS3 експерименту недовољна да би фрагментисала насталу комплексну врсту. Продукт јони настали у МS3 експерименту су: 643,10 (релативни интезитет 42 %), 635,18 (релативни интезитет 35 %) и 365,31 (релативни интезитет 15 %). Слика 98. MS/MS/MS спектар 688 јона Ecoll=40,0 %; јона 660 Ecoll=100,0 % На Слици 98 је приказан MS3 спектар јона 688 јона фрагментисаног са колизионом енергијом 40,0 % и јона 660 са колизионом енергијом 100,0 %. Пошто је у претходном случају на јон 660 примењена енергија од 80 %, била недовољна да фрагментише овај јон, у MS3 експерименту примењена је већа колизиона енергија. Међутим јон 660 је још увек са релативним интензитетом од 100 %. Ово указује да је дата комплексна врста (у када су концетрације компонети реда величине 10-4 mol/dm3) врло стабилна и да је тешко прекинути везу метал-лиганд. Настали продукт јони при енергији 100 % су: 643,10 (релативни интезитет 32 %) и 365, 31 (релативни интензитет 15 %). Слика 99. MS/MS спектар 700,80 јона, Ecoll=30,0 % Из основног спектра одабран је као parent јон на m/z 700,80 и фрагментисан је колизионом енергијом од 30 %. (Слика 99). Добијен је велики број продукт јона, а parent јон је са релативним интензитетом 3 %. Међу продукт јонима је и јон 688,28, (релативни Mр Mирјана Р. Цвијовић 114 интензитет 4 %), 657,09 (релативни интензитет 32 %), 630,80 (релативни интензитет 100 %), 612,95 (релативни интензитет 10 %) и низ фрагмената у области од m/z 330 до 480, што је дато у табели у Прилогу. Слика 100. MS/MS/MS спектар јона m/z 700,80 јона Ecoll=30,0 %, јона 630,90, Ecoll=45 % У претходном МS2 експерименту као продукт јон настао је јон 630,90. У МS3 експерименту (Слика 100) на јон 630,90 примењена колизиона енергија од 45 %. Међутим ни то није била довољна енергија да се јон 630,90 фрагментише (још увек са релативни интензитетом од 100 %). Ово указује да је дата комплексна врста (када су концентрације компонети реда величине 10-4 mol/dm3) врло стабилна и да је тешко прекинути везу метал- лиганд. Остали продукт јони су: 613,00 (релативни интензитет 32 %), 592,77 (релативни интензитет 5 %) и јони нижег интензитета 363,27 и 380,78. 3.4.24. maLDI спектри Аl(III)-јона и ципрофлоксацина Најпре су снимљени спектри самог ципрофлоксацина исте концетрације и pH вредности као у растворима метала и ципрофлоксацина. За изучавање комплексирања алуминијума и ципрофлоксацина maLDI MS техником припремани су раствори различитих концентрационих односа и раствори различитих pH вредности. У Табели 15. су приказани раствори за концентрациони однос 1:3 и различите pH вредности. Приказани су најрепрезентативнији спектри у овом поглављу, а остали су дати у Прилогу. Табела 15. Састави и pH вредности раствора Аl(III)-јона и ципрофлоксацина Број узорка pH Концетрациони однос Концентрација Аl(III)-јона [mol/ dm3] Концентрација ципрофлоксацина [mol/dm3] 1 3,50 1:3 2,7x10-4 8,1x10-42 4,10 1:33 5,10 1:3 4 6,10 1:3 Докторска дисертација 115 Слика 101. maLDI спектари раствора CAl:CCipro=1:3, различито pH Сигнал на m/z 687,49 се јавља на свим pH вредностима и највишег је интензитета. На pH 3,50–5,50 јавља се сигнал на m/z 1040,61. На pH 4,0 јавља се и сигнал на m/z 1703,88 који је нижег интензитета. На pH=5,10 до 5,50 јавља се сигнал на m/z 1056,57, а сигнал 1703,88 више није видљив (Слика 101). Исечак на слици Б представља зумирану област m/z 1025 до 1075 и показује да јон на m/z 1040,52 постоји на свим pH вредностиама само је нижег интензитета. Слика 102. maLDI спектар раствора CAl:CCipro=1:3, pH=5,10, различите концетрације компонената На Слици 102 приказани су maLDI спектри ципрофлоксацина и алуминијума чије се концентрације компонената међусобно разликују за по 10 пута. Запажа се да при концентрацији компонеата 10-6 mol/dm3 релативни интензитети врста 687,44 (0,5x 104 а.u.) и 1050,50 (0,10x104 а.u.), што је знатно ниже од ових врста формираних при концентрацијама Mр Mирјана Р. Цвијовић 116 компоненти 10-5 и 10-4 mol/dm3. Више концентрације воде до формирања комплексних врста са јачим везама метал-лиганд и веће релативне заступљености. Слика 103. maLDI спектари раствора CAl:CCipro=1:3, pH=4,10, димер На Слици 103 је приказан maLDI спектар на коме се запажа један интензиван кластер, са центром масе на m/z 687,49. Пошто овај сигнал постоји и у ЕSI спектру сматра се да је његова појава у maLDI спектрима егзактна потврда његовог постојања у раствору ципрофлоксацина и алуминијума. Сигнали на m/z 1040,81 и 1703,88 су нижег релативног интензитета. Докторска дисертација 117 4. ДИСКУСИЈА РЕЗУЛТАТА Проучавање равнотежa у растворима Аl(III)-јона и флуорохинолона је отежано услед појаве хидролизе Аl(III)-јона. Хидролиза знатно отежава карактеризацију појединих врста насталих у току комплексирања. Стога је хидролиза алуминијума проучавана у истим експерименталним условима као и реакције комплексирања. У оквиру ове дисертације извршена су испитивања хидролизе Аl(III)-јона применом ЕSI МS спектрометрије, као и параметара који утичу на хидролизу алуминијума. Испитивање су спроведена са циљем да се нађе што реалнији модел процеса хидролизе, јер се по литератури срећу два контрадикторна модела [81, 113, 108-110]. У том циљу су варирани инструментални параметри код ЕSI МS технике и услови експеримента да би се што боље процениле реалне врсте у хидролизованом раствору. Затим је испитивано комплексирања у системима Аl(III)-јон-флероксацин, Аl(III)-јон- моксифлоксацин и Аl(III)-јон-ципрофлоксацин ЕSI МS спектрометријом, у циљу специја- ционе анализе. Фрагментациони продукти су одређени тандем масеном спектрометријом (испитивање интеракције алуминијума са HQ лигандима). Реакције полимеризације при комплексирању алуминијума и флуорохинолонских лиганда су изучаване maLDI спектрометријом. Проучавани су и утицаји услова јонизације на пертурбације равнотежа у раствору. Пертурбације у растворима су равнотежни помераји у капљицама и јављају се услед промена pH вредности, концентрације, температуре, промене јонске јачине у капљицама у току испаравања. Пертурбације се могу јавити осим у раствору, на граници течно-гас и у гасној фази. У литератури постоје подаци да се варирањем инструменталних параметара могу оптимизовати пертурбације.[12, 111] Стога се експериментални услови морају тако изабрати да процеси небулизације и десолватације не поремете равнотежне услове. Добијени масени спектри су тумачени на основу m/z вредности и изотопских pattern-a. 4.1. Проучавање хидролизе Аl(III)-јона масеном спектрометријом За изучавање хидролизе AlCl3 масеном спектрометријом припремљена је серија раствори у опсегу pH 3,0-5,0 различитих концентрација алуминијумовог јона. Добијени спектри су приказани у Експерименталном делу Слике 18-26. Табела 16: Идентификоване врсте у раствору АlCl3, концентрације , 2,7x10-5 mol/dm3, при различитим pH вредностима: 3,192; 3,594; 4,814 Из спектра m/z Теоријски m/z Идентификоване врсте pH Значај 57,35 57,02 [Al(H2O)8]3+ 3,594–4,814 60,52 60,98 [Al(OH)2]+ 3,192–4,814 69,84 69,97 [Al2(OH)3Cl]2+ 3,192–4,814 хлоро врсте 78,58 78,95 [Al(OH)Cl]+ 3,192–4,814 хлоро врсте 96,65 96,91 [AlCl2]+ 3,192–4,814 102,93 102,95 [Al2O2(OH)]+ 3,594 120,78 120,96 [Al2O2(OH)(H2O)]+ 3,192–4,814 122,69 122,98 [Al2(OH)3(H2O)]+ 3,192–4,814 132,86 132,88 [AlCl3 +H+]+ 3,192–4,814 молекулски пик 156,83 156,94 [Al2(OH)4Cl]+ 3,192–4,814 хлоро врсте 174,83 174,99 [Al2H9O7]+ 3,192–3,594 216,81 216,87 Al3 O2(OH)2Cl2 3,594–4,814 Олигомер хлоро врсте 234,88 234,97 [Al3O4(H2O)5]+ 3,594 (251,99) 252,83 252,89 [Al3(OH)6Cl2] + 3,192–4,814 Полинуклеарне хлоро врсте 276,80 276,85 [Al4O3(OH)3Cl2]+ 3,594–4,814 Полинуклеарне хлоро врсте (364,87) 366,85 366,82 [Al4(OH)7Cl4] + 3,594–4,814 Полинуклеарне хлоро врсте У Табели 16 су приказане идентификоване врсте формиране у растворима у којима су Mр Mирјана Р. Цвијовић 118 вариране pH вредности (3,192; 3,594; 4,814) за фиксну концентрацију алуминијума 2,7x10- 5mol/dm3..Идентификоване су мономерне врсте: m/z 57,35 асигнирана као [Al(OH2)8]3+, m/z 60,52 асигнирана као дихидроксо комплексна [Al(OH)2]+ врста. Осим мономера индентификоване су и мање полимерне врсте: димери, тримери, тетрамери (Аl2, Аl3 и Аl4). Пошто је Аl3+ aква јон присутан у свим растворима, до формирања мононуклеарних Аl-ОH врста може доћи у гасној фази, процесом редукције наелектрисања у току дехидратације: [Al(H2O)6]3+→ [Al(OH)n (H2O)6-n](3-n)++nH3O+ Идентификоване су и хлоро врсте: m/z 78,58; асигнирана као [Al(OH)Cl]+; m/z 96,65 асигнирана као [AlCl2]+и полинуклеарне хлоро врсте: за m/z 276,80 означена као [Al4O3(OH)3Cl2]+; 364,87 означена као [Al4(OH)7Cl4]+, чија је заступљеност знатно нижа. Преовладавају једноструко наелектрисане врсте. Врло интензивни сигнали су у области m/z 60–100. Потичу од мононуклеарних хидроксо комплекса, [Al(OH)]2+ и [Al(OH)2]+. Ови комплекси су карактеристични за хидролизоване растворе алуминијума ниских концентрација. Формирају се брзо и реверзибилно. На pH 3,594 доминантна је дихидроксо врста [Al(OH)2]+ m/z 60,52. На pH 3,192 најзаступљенија је хлоро врста [Al2(OH)3Cl]2+ m/z 69,84. Са порастом pH расте однос ОH/Аl, што доводи појаве полимеризације. До pH 4,8 мономерне и димерне врсте алуминијума хидролизују у мање полимерне врсте (Аl3-Аl5). Табела 17: Идентификоване врсте у растворима алуминијума, где су концентрације 0,1-1,0x10-3 mol/dm3 AlCl3, на pH=4,20 Из спектра m/z Теоријски m/z Врсте Концентрације раствора (mol/dm3) 60,52 60,98 [Al(OH)2]+ 1x10-4-1x10-3 69,97 69,97 [Al2(OH)3Cl]2+ 1x10-4; 1x10-3 78,59 78,95 [Al(OH)Cl]+,[Al(OH)2(H2O)]+ 1x10-4 –1x10-3 96,65 97,00 [AlCl2]+ 1x10-4-1x10-3 132,78 132,88 [AlCl3+H+]+ 1x10-4–1x10-3 174,83 174,99 [Al2H9O7]+ 1x10-4 –1x10-3 192,47 192,92 [Al7O9(OH)(H2O)2]2+ 1x10-4 196,13 195,89 [Al8O11]2+ 1x10-4–1x10-3 212,79 212,88 [Al13O18]3+ 1x10-4–1x10-3 246,89 246,87 [Al5O7]+ 5x10-4 252,83 252,89 [Al3(OH)6Cl2]+ 5x10-4 328,83 328,83 [Al13O18(OH)]2+ 5x10-4 330,70 330,89 [Al11O11(OH)9(H2O)2]2+ 1x10-4; 1x10-3 366,71 366,82 [Al4(OH)7Cl4]+ 5x10-4; 1x10-3 494,52 492,73 [Al7O6(OH)5Cl3(H2O)]+ 5x10-4; 1x10-3 Следећа серија испитиваних узорака је припремљена за фиксну pH вредност 4,20, а концентрација алуминиујма је варирана од 0,1–1,0 x10-3 mol/dm3. Идентификоване врсте су приказане у Табели 17. У серији где се повећава концетрација АlCl3 уочавају се средњи полимери (Аl6–Аl10) и већи полимери (Аl11–Аl13). Под овим условима идентификовани су и тридекамери, Аl133+ на m/z 212,8, а Аl132+ на око m/z 328,3 што је у складу са резултатима које је Sarapola публиковала [95, 112, 113] Аll33+ садржи молекуле воде. Сигнал на m/z 328,83 указује на двовалентну врсту Аl132+ и потиче од делимично неутралисаног раствора AlCl3. Докторска дисертација 119 При концентрацији 1x10-4 mol/dm3 присутна је врста [Al(OH)2(H2O)]+ на m/z 78,59. Молекулски јон се асигнира као [АlCl2]+ на m/z 96,65. Ова врста као и [AlCl3+H+]+ на m/z 132,86 нису карактеристичне за раствор и највероватније се формирају у току процеса небулизације. Пошто су ове врсте ниског интензитета у „основном“ спектру, снимљеном у Full scan моду, коришћен је SIM мод за доказ циљаног јона (Слика 104). Када су хлоридни јони координовани за алуминијум, онда се хлор изотопна дистрибуција може користити за идентификацију тих врста, што је приказано на Слици 106. Термодинамичка равнотежа укључује сложене смеше комплекса који имају различит број терминалних OH- и Cl- лиганда. Замена једног или више молекула H2О или ОH- групе резултује у идентичним m/z вредностима, али различитим дистрибуционим pattern- има. Неправилна (измењена) хлоро изотопска дистрибуција (35Cl и 37Cl) се запажа [114]. Изотопски pattern се мења сходно количини хлорида. Облик изотопског pattern-а указује да ли је сигнал део серије врста у којима су координовани молекули воде или је производ хидроксид хлоридне компетиције. Серија врста у којима су координовани молекули воде показује симетричну дистрибуцију (облика звона). ТIC хроматограми хидролитичких раствора дати су у Прилогу ове тезе. Слика 104. SIM мод за доказ циљаног јона m/z 96 и јона m/z 132 Mр Mирјана Р. Цвијовић 120 Слика 105. Изотопски pattern јона m/z 132, SIM мод За јон m/z 132,60 јона детектован је изотопски pattern у спектру (Слика 105) Исти pattern се и теоријски може потврдити коришћењем изотопског калкулатора у soft weru „Xcalibur“ (Слика 106). Слика 106. Изотопски pattern јона m/z 132, добијен коришћењем soft wera Xcalibur Присуство атома хлора доводи до појаве М+2 пика у спектру. Присуство два атома хлора доводи до појаве М+4 пика. Молекулски јон пика М+ и М+2 може садржати атоме Докторска дисертација 121 хлора с тим што атоми хлора могу бити у облику изотопа 35 Cl и 37 Cl. Линије у спектру у области молекулског јона у случају алуминијум хлорида јављају се на различитим m/z вредностима 132, 134, 136, 138, (Слика 105) јер су могуће различите комбинације изотопа хлора. Алуминијум има један изотоп релативне заступљености 100 % чија је маса 27. Могуће комбинације у АlCl3 једињењу чији изотопски pattern тумачимо су: 27+ 35+35+35 = 132 27+ 35+35+37 = 134 27+ 35+37+37 = 136 27+ 37+37+37 = 138 Висине пикова хлора су у међусобном односу 3:1 што значи да хлор садржи три пута више 35 Cl изотопа него 37 Cl изотопа. Ово указује да три пута има више молекула који садрже лакши изотоп него тежи изотоп хлора. У овом случају у области молекулског јона постоје четири линије (М+, М+2, М+4, М+6) са размаком од m/z 2 и једињење садржи три атома хлора који стоје у међусобном односу 1:6:9. При концентрацији 5x10-4 mol/dm3 најзаступљеније су олигомерне врсте на m/z 60,52; 78,59. Полимерна врста m/z 212,79 је асигнирана као [Al13O18]3+. Полимерне врсте са језгрима од Аl8 до Аl13 су вишеструко наелектрисане +2,+3. При концентрацији 5x10-4 и 1x10-3 mol/ dm3 идентификујe се полинуклеарна хлоро врста на m/z 366,71. Хлоро комплекси могу да формирају метастабилне јонске парове од позитивно наелектрисаних врста Аl-ОH и хлоридног анјона у току ЕSI небулизације. При концентрацији алуминијума 10x10-4 mol/dm3 у спектру доминирају врсте: m/z 60,52 асигнирана као [Al(OH)2]+ и врста m/z 78,58 асигнирана као хлоро врста [Al(OH)Cl]+. Врста на m/z 494,50 је полинуклеарна хлоро врста асигнирана као [Al7O6(OH)5Cl3(H2O)]+. Полимерне врсте се јављају као хидратисане или хлоро врсте [115]. Са старењем раствора број врста у спектру се знатно смањује [116]. На спектру раствора 0,1x10-3 mol/dm3 АlCl3 на pH=3,30, након месец дана старења (Слика 26) види се само неколико врста у спектру које потичу од: [Al(OH)2]+, [Al6(OH)13]5+ и [Al4(OH)9]3+. Различите хидролитичке шеме се срећу у литератури код изучавања старења раствора алуминијума. Најинтензивнији пик је пик аква јона алуминијума, јер се ради о релативно ниском pH. Остале интензивније врсте припадају тетрамеру и хексамеру и индиција су да и при средње киселим вредностима pH долази до полимеризације у знатној мери. Испитивани су и ефекти контра јона (хлоридног) те су снимљени спектри раствора у којима је укупна концентрација алуминијум јона 5,0x10-3 mol/dm3, pH=4,05 са повишеном концентрацијом хлоридног јона (укупни хлорид=150 x10-3 mol/dm3), Слика 25. Утицај контра јона у киселим растворима није много уочљив јер је алуминијум јако хидролизован. Утицај контра јона се испитује у негативном моду. Цео процес испитивања хидролизе ESI MS спектрометријом се састоји од две фазе. У првој фази лакше наелектрисане честице стижу у детектор. У другој фази настају теже честице, већи полимери настали у форми кластера од олигомера с натријумом и хлоридним јоном или молекулима воде. Пренос кластера у гасну фазу је неефикасан тако да се уочавају сигнали ниског интензитета у спектру. Већина комплекса садржи хлоридни јон или као координовани јон или као јонски пар [117].Једноструко наелектрисане врсте на вишим pH вредностима (>4,8) су преовладавајуће. Најинтензивнији сигнали у целом pH опсегу могу се приписати Аl2–Аl6 језгрима. Главни проблем при интерпретацији ESI MS спектара је појава је пертурбација. Три врсте пертурбација се могу јавити у ESI извору: у раствору, на граници фаза течно-гас и у Mр Mирјана Р. Цвијовић 122 гасној фази [111]. Ове пертурбације могу бити повезане са формирањем хидролитичких полимера у капљици, различитом ефикасношћу преноса из капљице у гасну фазу за различите комплексе (у зависности од односа њиховог радијуса и површинске активности) и парцијално термалног разлагања полимера. Пертурбације у раствору се дешавају у капљици [12, 119] у току њеног испаравања. Испаравање капљице мења концентрацију растворене врсте и сходно томе проузрокује равнотежне помераје у зависности од pH, концентрације, Т и промена јонске јачине. Пертурбације на граници течно-гас зависе од радијуса капљица и површинске активности јона. Ови параметри утичу на ефикасност којом се различите врсте претварају из капљица у гасну фазу и тако мењају њихову концентрацију. Пертурбације у гасној фази су реакције фрагментације или друге термално проузроковане реакције које се дешавају после трансфера јона у гасну фазу и пре њихове детекције. Формирање полимерних хидролитичких комплекса може бити последица перту- рбација у капљицама када се раствор Al(III)-јона распршује електроспрејом. Било да су полимерне хидролитичке врсте резултат праве равнотеже у раствору или пертурбација у ESI MS извору, могу се проценити поређењем резултата добијених различитим методама и финим подешавањем инструменталних параметара. Коришћени су ниски напони, а анализатор је био квадруполни у експериментима при проучавању хидролизе ESI MS спектрометријом. У ESI MS извору сигнал алуминијум хлорида се детектује на m/z 132,78. Овај сигнал ишчезава из раствора на pH вишим од 4,5. Резултат је у складу са резултатима 27 Al NMR спектроскопије. 27 Al NMR спектри су прикази на Слици 107. Сигнал аква алуминијум јона је на 0 ppm. Мали пик на 0,34 ppm се уочава у pH опсегу од 3 до 5 и приписује се моно хидролизованим врстама Al(OH)(H2O)52+ формираним у првој фази хидролизе, док се широки пик нижег интензитета јавља на 4,5 ppm, за pH>4,0 и приписује се врстама мале молекулске масе Al2(OH)2(H2O)84+ и Al3(OH)4(H2O)95+. Сходно литературиним подацима [120-125] могуће је наћи мономере до 9 ppm. У овим експериментима нису нађени сигнали за однос S/N већи од 3, где је S/N однос сигнала и шума (signal to noise). Виши хидролитички полимери дају веома широке пикове, у области од 10 до 40 ppm при вишим pH вредностима. Тридекамери или полимерне врсте које садрже Аl13, AlO4Al12(OH)24(H2O)127+ идентифико- ване су на 62,5 ppm. Овај полимер почиње да се јавља на pH око 4,0 и максималан интензитет достиже на pH=5,5. Са порастом pH овај сигнал нестаје и на pH 6,0 нема евидентног NMR сигнала који би указао на формирање лакших полимера. После краћег периода старења уочава се замућење и флокулација. Међутим, ЕSI МS указује на формирање Аl3–Аl8 полимера у овом pH опсегу. То говори да се Keggin-oви полимери [126-130] прво трансформишу у лакше полимере пре таложења. Тридекамер садржи тетраедарски алуминијум окружен са 12 октаедарских алуминијума, где су сви везани преко кисеоника. Тетредарски алуминијум има јасан оштар пик на 62,5 ppm у односу на мономерни Al(H2O)63+. Других 12 алуминијума у тридекамеру као и доста аморфних полимерних врста алуминијума даје веома широк пик на око 40 ppm. Докторска дисертација 123 Слика 107. 27Al NMR спектри раствора АlCl3, на различитим pH вредностима, CAl=50 mmol/dm3 Хидролитичке врсте су одређене и потенциометријским титрацијама. Потенциоме- трјске титрације су изведене по две различите процедуре додавања базе. У једном титраци- оном низу нове порције базе су додаване након 2 минута по стабилизацији потенцијала, брзином од 0,05 cm3/s, док је за други титрациони низ база додавана након 20 минута од стабилизације потенцијала, истом брзином [131-136]. Остали титрациони низови су изведени тако да је за одређене вредности pH додавана база све док очитавања потенцијала нису постала стабилна за дужи временски период, уз релативну стандардну девијацију до 3 %. Титрационе криве показују хистерезис у области у којој се титрациони параметар „а“ креће у интервалу између 1,0 и 1,5 (Слика 108). Пуна линија симулира титрацију чији су подаци за логоритам константи стабилности (log β) хидролитичких врста приказани у Табели 18. Све до близу вредности 0,2 титрационог параметра раствори остају бистри у дужем временском периоду. Титрационе криве добијене под различитим кинетичким условима поклапају се по вредности „а“ до близу 0,2. При вишим вредностима титрационог параметра „а“, релативно брз додатак базе не даје видљиве промене у раствору и потенцијал остаје стабилан. Међутим, ако се ти раствори оставе сат или више без додатка базе потенцијал постаје нестабилан (релативна стандардна девијација очитавања потенцијала већа од 5 %) са благим замућењем раствора. Даље повећање титрационог параметра води до стварања микро-колоидних талога и када је параметар „а“ око 1 долази до појаве сталног таложења. Широки опсег титрационих кривих обухвата плато и „скок“ pH вредности (Слика 108) што одговара метастабилном стању са главним „скоком“ који указује на формирање растворног Al(OH)3. Mр Mирјана Р. Цвијовић 124 Слика 108. Титрационе криве раствора AlCl3 добијене на основу две различите титрационе процедуре Ове врсте касније формирају презасићене растворе и када број центара нуклеуса достигне критичну вредност почиње кондензација формирањем полимера и таложењем. При фитовању ових калибрационих кривих са низом комплекса узетих из базе података (Табела 18.) добија се одличан резултат фитовања за Z (однос хидроксида и алуминијума) до близу 1. При вишим вредностима Z (средњи протонски број) израчунате криве се приближавају експериментално добијеним са спорим додатком базе. Разлике између ESI MS и потенциометријске специјације се уочавају за врсте које се детектују у ESI MS са различитим бројем киселих протона тј. различитим наелектрисањем. Подаци из литературе [111, 137-140] указују на кључну улогу радијуса капљице при одређивању релативног интензитета ESI MS. Радијус може утицати директно на ефективност којом се јони преносе у гасну фазу. Пертурбације у раствору се повећавају са повећањем капљице. С обзиром да прелаз јона у гасну фазу касни, реакције у капљицама се више пута дешавају. У исто време већа вредност радијуса повећава гасно фазну концентрацију површински активних комплекса и смањује површински неактивне комплексе. Поређењем резултата ESI MS, NМR и потенциометријских мерења закључује се да се најбоље слагање [112, 121, 132] добија код хидролитичких врста мале молекулске масе, што је последица чињенице да густина и вискозност у растворима полимеризованог алуминијума расту, што за последицу има пораст површинског напрезања капљице. Зато су више енергије потребне за одвајање врста више молекулске масе из капљице. Табела 18: Подаци из базе података за хидролитичке комплексе алуминијума Врста log β AlH-1 -5,5AlH-2 -11,3AlH-3(aq) -16,3AlH-4 -26,96AlH-5 -43,1Al2H-2 -7,7Al3H-4 -13,9Al3H-11 -63,0Al6H-15 -60,7Al8H-22 -93.0Al13H-22 -106,1AlH-3(s) -10,3 Докторска дисертација 125 Резултати испитивања хидролизе, који су приказани у Табелама 16 и 17 су у складу са литературним подацима [110-112]. Ови резултати указују да је добро слагање са моделом из литературе који су дали Urabe и сарадници [80, 81] примењујући масену спектрометрију на изучавање разблажених алуминијум-хлоридних раствора и нашли су мономере, полимерне позитивно наелектрисане врсте. Други модели који су добијени применом масене спектрометрије на проучавање хидролизе алуминијума (Sarapola и сарадници [112, 113]) указују на врсте које нису у складу са врстама које су нашли Urabe и сарадници. Sarapola [79] је нашла димере, тримере, полимере са наелектрисањима од –2 до +3. Резултати приказани у овој тези показују највећу заступљеност хидролитичких врста при pH=4,0, мономерних и димерних врста, док су тримери и терамери заступљени у нешто мањем проценту. 4.2. Проучавање комплексирања масеном спектрометријом Предмет испитивања ове дисертације је биодистрибуције HQ у присуству лекова на бази алуминијума (антациди, вакцине, дијализатни раствори) у људском организму. Алуминијум се лако везује са HQ in vitro као и in vivo. Захваљујући чињеници да постоје различити облици флуорохинолона (катјонски, zwitter-јонски, неутрални, анјонски) при различитим pH вредностима разни облици комплекса могу настати. Анјонски облик испитиваних флуорохинолона (флероксацина, ципрофлоксацина, моксифлоксацина) означава се са Q–, диполни јон са HQ±, а катјонски са H2Q+. Равнотеже у воденим растворима флуорохинолона се представљају схематски (Схема 2). Схема 2: Равнотеже у воденим растворима флуорохинолона где су k11, k12, k21, k22 микорконстанте, а К1 и К2 макроконстанте [48, 49] дисоцијације флуорованих хинолона, чије су вредности приказане у Tабели 4. Код свих хинолона киселе особине амонијум групе мање су изражене него киселе особине карбоксилне групе. То је последица стабилизације –COO–групе +R ефектом. Анализа експерименталних података показује да на нижим pH вредностима доминантни комплекс у Al(III)-хинолонским растворима је протонована врста Al(HQ)3+. Узимајући у обзир pH интервал у коме се он формира, може се претпоставити да се његово настајање одвија према реакцији: Mр Mирјана Р. Цвијовић 126 Al(OH)2+ + H2Q+ → Al(HQ)3+ + H2O Изоелектрична тачка флуорохинолона је на pH око 7,5 тако да на pH вредностима нижим од 5 флуорохинолони егзистирају у катјонској форми. Реактивна алуминијумова врста на pH између 3,0 и 3,6 je монохидроксо комплекс Al(OH)2+ тако да је горња реакција много вероватнија од оне у којој аква-алуминијум реагује са неутралним флуорохинолоном: Al3+ + HQ → Al(HQ)3+ Са порастом pH, Al(HQ) комплекс почиње да хидролизује до Al(Q) комплекса који са наредним повећањем pH подлеже даљем сукцесивном депротоновању. У Al(Q) комплексу 3-карбоксилна и 4-карбонилна група су укључене у координацију као последица високог афинитета алуминијума према кисеонику. У сврху реализације постављених циљева снимано је више серија раствора у којима су вариране pH вредности и концентрациони односи алуминијума и флуорохинолона масено- спектрометријским техникама. Карактеристике комплекса метал лиганд и специјација зависе од pH, [141] јер комплекси мењају своје стање протоновања и наелектрисања са променом pH (показују или кисела или базна својства). Одређивање специјације у растворима извршено је недвосмисленом асигнацијом сигнала у ЕSI МS спектрима на основу односа масе и наелектрисања, изотопске дистрибуције и расподеле наелектрисања. Тандем масена спектрометрија (МS/МS спектри) омогућила је одређивање структуре формираних комплекса преко фрагментационих путања. МАLDI спектрометрија је омогућила разматрање полимеризације (детектовани димерни комплекси). 4.2.1. Систем алуминијум-флероксацин Најпре су снимљени и анализирани ЕSI МS спектри раствора: флероксацина у позитивном и негативном моду, након тога раствора алуминијума и флероксацина. Затим је примењена МАLDI спектрометрија и коначно тандем масена спектрометрија са циљем дешифровања путева фрагментације. У Табели 19. су приказане врсте идентификоване у раствору флероксацина снимљеног у позитивном моду. Молекулска формула флероксацина је C17H18F3N3O3, a Mr=369,34 Табела 19. Идентификоване врсте у раствору флероксацина, CL= 2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,26, позитиван мод m/z из спектра m/z теоријски Идентификовани јони 370,07 370,20 [L-+2H+]+ 326,27 326,30 [L-+2H+-CO2]+ 269,13 269,28 [L-+2H+-C5H11N2 ]+ Протоновањем флероксацина настаје молекулски јон на m/z 370,07. Друге две врсте веће заступљености настају: декарбоксилацијом (врста на m/z 326,27) и губитком пиперазил групе (врста на m/z 269,13). Докторска дисертација 127 Слика 109. Изотопски pattern флероксацина На Слици 109 приказан је изотопски pattern молекула флероксацина, добијен коришћењем soft wera Xcalibur. На исечку „А“ приказан је изотопски pattern протонованог флероксацина, експерментално добијен. Оба изотопска pattern-а су у доброј сагласности као и релативне заступљености јона који чине област молекулског јона (370, 371, 372 и 373). У Табели 20 су приказане врсте идентификоване у раствору флероксацина снимљеног у негативном моду. Табела 20. Идентификоване врсте у раствору флероксацина, CL=2,7x10-5 mol/dm3 pH=4,26, негативан мод m/z из спектра m/z теоријски Идентификовани јони 368,00 368,09 [L-]- 348,07 348,12 [L--HF]- 324,07 324,19 [L--CO2]- 304,20 304,29 [L--CO2-HF]- 278,20 278,10 [L--CO2-HF-C2H2]- У негативном моду се детектује више врста, него у позитивном. Молекулски јон је на m/z 368,00. Врста на m/z 348,12 настаје губитком флуороводоника. Остале врсте (324,07, 304,20) настају губитком угљен-диоксида или губитком и флуороводоника и угљен-диоксида, док врста на m/z 278,20 у току фрагментације губи још и етин. 4.2.1.1. Проучавање комплексирања алуминијума и флероксацина ЕSI МS спектрометријом Идентификација јонских врста које потичу од најинтензивнијих сигнала урађена је на основу њихових m/z вредности и изотопских pattern-a. Zoom scanom је потврђено charge state сваког јона посебно. Најзаступљенији јони су једноструко, двоструко или троструко наелектрисани. И у основним спектрима се детектује фрагментација, иако су спектри снимани при ниским напонима на конусу. Фрагментација и анализа продукт јона врло су важни за индефикацију јона у спектру. У Табели 21 су приказане најзаступљеније врсте из спектара. Најчешћи је губитак CО2, губитак HF [88]. Губитак CО2 је врло каратеристичан у фрагметакционим путањама базираним на подацима из ЕSI МS и MALDI металних комплекса са малим молекулима. Губитци H2О се не региструју, већ напротив имамо везивање Mр Mирјана Р. Цвијовић 128 молекула H2О са датим јонима што је у потпуности у складу са литературним подацима при проучавању сродних система. [88, 143, 147]. Ово је последица присуства малих количина воде у јон трапу које је тешко уклонити. Губитак CО2 проузрокује цепање везе између Аl(III)-јона и карбоксилног кисеоника из лиганда. Губитак CО2 из координованог молекула флероксацина је иреверзибилан процес, док је губитак молекула H2О реверзибилан процес под одређеним експерименталним условима. Експериментални резултати показују да се у испитиваним растворима и ЕSI МS и МАLDI MS техником идентификују бинарни комплекси у молском односу алуминијум :ципрофлоксацин од 2:1 дo 3:1, алуминијум: моксифлоксацин од 2:1 дo 3:1, алуминијум: флероксацин од 2:1 дo 3:1, што је у складу са литературним подацима добијеним на сродним системима [144, 146, 149]. Проучавањем интеракција између норфлоксацина и јона Al, Mg и Ca нађено је да норфлоксацин и алуминијум формирају бинарне комплексе у молском односу алуминијум: норфлоксацин од 2:1 до 3:1. И резултати Riley и Ross [61], кojи су проучавали комплексирање јона Аl, Mg и Fe са ломефлоксацином FAB MS техником су у складу са резултатима добијеним у овој дисертацији. Ови аутори су нашли да се комплекси формираjу при молском односу лиганд:метал од 2:1 и 3:1. Комплекси ципрофлоксацина [56, 60], са јонима Cа, Cо, Ni, Cu, Zn, Аl и Fе су проучавани у раствору потенциометријским и спектроскопским техникама при чему су нађени различити протоновани комплекси. Јони гвожђа и алуминијума формирају комплексе при молском односу лиганд:метал од 3:1. Интеракције норфлоксацина са дивалентним и тривалентним катјонима су испитиване потенциометријским титрацијама [144]. Порастом pH са 2,5 на 4,5 појава нових пикова указује на стварање нових комплекса, хидролитичких. Додатак Al(III)-јона у раствор флуорохинолона индукује велике промене у МS спектрима. Сигнал слободног лиганда још увек је присутан. Јављају се нови сигнали како се pH и концентрација Al(III)-јона повећавају. Комплексирање је најуочљивије на спектрима када је лиганд у вишку или ако је метал у вишку и то за pH=4,96. Доминати комплекс је m/z 763, коме одговара структура AlL2+. Сличне структуре је и комплекс m/z 719. Међусобни однос релативне заступљености (релативни интезитет) i763/i719 је сличан односу i370/i326, што указује на сличне константе комплексирања за L и L-CO2 врсте [111, 119]. Бинарни комплекс детектован на m/z 763 је врста доминантна у растворима у широком опсегу pH и за широк концетрациони опсег CAl:CFlero. Врста АlL2 настаје координацијом једног металног јона са два јона лиганда, Слика 110. Слика 110. Могућа структура комплекса типа АlL2 у систему Аl-флероксацин У масеним спектрима се детектује као најзаступленија врста. С обзиром на зависност интензитета сигнала од pH овај комплекс се формира у раствору највероватније према следећој реакцији: АlL2++L-=АlL2+. Врста на m/z 719,27 такође настаје координацијом једног металног јона са два јона лиганда и губитком CО2 молекула. Врста на m/z 382,20 је двоструко наелектрисани Докторска дисертација 129 јон где је један метални јон координован са два лиганда, а врста на m/z 255,20 настаје везивањем два лиганда за један метални јон и троструко је наелектрисана. Врсте на m/z (255,20 и 382,27) показују у Zoom scan-у разлике Δ=0,3 и Δ=0,5 респективно, из чега следи да им је наелектрисање +3 и +2, (Слике 52 и 53) у Експерименталном делу. Ове врсте се могу представити као [Al(HL)L]2+ и [Al(HL)]3+. Са порастом pH вредности врста [Al(HL)]3+ реагује са депротонованим обликом лиганда градећи [Al(HL) L]2+ Протоновани комплекс је нађен и потенциометријски у растворима алуминијума и флероксацина, из чега следи да ова врста заиста постоји у раствору. Врста на m/z 203,60 настаје везивањем једног лиганда за метални јон, три молекула воде и губитком једног CО2 молекула. Табела 21. Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и флероксацина, CAl=2,7×10-5 mol/ dm3, ESI MS спектрометријом m/z теоријски m/z експериментално Идентификовани јони Врсте у равнотежи које највероватније дају ЕSI-МS јоне ZООМ scan 193,56 193,52 [Al3++ L-+2H2O-CO2]2+ AlL2+ 202,67 203,53 [Al3++ L-+3H2O-CO2]2+ AlL2+ 255,20 255,20 [Al3++ 2L-+2H+]3+ AlL23+ наелектрисање +3 326,10 326,27 [L-+ 2H+ -CO2]+ Слободан лиганд наелектрисање +1 370,32 370,20 [L-+ 2H+]+ Слободан лиганд 382,30 382,27 [Al3++2L-+H+]2+ AlL2+ наелектрисање +2 719,62 719,33 [Al3++ 2L- -CO2]+ AlL2+ 763,23 763,27 [Al3++2L-]+ AlL2+ наелектрисање +1 На Слици 33 је спектар раствора концетрационог односа CAl:CFlero=1:3, pH= 4,03, снимљен у негативнома моду где се идентификују хидролитичке врсте m/z 311,07 [Al4H8O10Cl]- тетрамерна хидролитичка врста и 346,80 [Al4H12O12Cl]- тетрамерна врста, 286,93 [Al3H11O10Cl]- тримерна хидролитичка врста и 251,07 која потиче oд [Al3(OH)10]- врсте. Ове врсте врсте су карактеристичне и за остале остале спектре снимљене у негативном моду, што указује да паралелно са комплексирањем при ови експерименталним условима се дешава и хидролиза. 4.2.1.2. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и флероксацина maLDI спектрометријом Сви maLDI спектри су снимљени на подлози без коришћења матрице како би се избегле могуће интерфернце алита са матрицом. Генерално говорећи maLDI спектри су врло једнозначни и једноставни за тумачење. Изузев периодичне појаве метастабилних јона сви остали јони су јони који указују на формирање комплексних врста. Ови спектри дају податак колико има % које врсте на основу њихових релативних интензитета (заступљености). Прва група врста која се идентификују при нижим m/z у maLDI спектрима је идентична, са онима добијеним у ЕSI MS спектрима (m/z 763,50). То је егзактна потврда постојања тих комплексних врста у испитиваним растворима. Другу групу врста чине врсте за m/z преко 1000, полинуклеарне комплексне врсте, којима су „пришли“ јони Nа+и К+. Врста на 1170,59 је адуктни јон који се формира између К+ јона и АlL3 комплекса. Врста на 1154,61 је адуктни јон који се формира између Nа+ јона и АlL3 комплекса. Врста на m/z 1894,77 је највероватније кластер који потиче од два Аl(III)-јона и пет депротонованих лиганда, што је у складу са резутатма публиковним од стране V. Di Marco и сардника, али применом ЕSI јонизације [111]. Појава ове врсте у maLDI спектру се објашњава формирањем кластера дејством ласера на подлогу са узорком. Са аспекта координационе хемије мало је вероватно да се два алуминијума вежу са 5 лиганада. Ова врста највероватније настаје тако што димено језгро Аl2L2 формира у раствору, а кластери са више депротнованих лиганада настају у гасној фази Mр Mирјана Р. Цвијовић 130 Сходно „кластер“ моделу предложеном од стране Караса и сарданика [17, 18] кластери садрже јоне произведене у чврстом стању. При испаравању из кластера се ослобађају јони. Протоноване врсте се лако стварају ласерским зрачењем. У Tабели 22 приказане су најобилније врсте идентификоване у maLDI спектрима, при различитим концентрацијама и pH вредностима. Табела 22: Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и флероксацина = 1:3, концетрација 10-4 mol/dm3, pH 3,85–5,50, maLDI спектрометријом maLDI m/z из спектра 1:3, pH=3,85 maLDI m/z из спектра 1:3, pH =4,50 maLDI m/z из спектра 1:3, pH =5,50 врсте maLDI- флероксацин, 30:70 метанол: вода подлога 268,458 врло јак Слободни лиганад 370,421 365,643 686,94 763,232 763,501 763,508 AlL2+ 1154,610 1154,620 1154,618 AlL3Na+ 1170,593 1170,582 1170,582 AlL3K+ 1190,591 н.и. 1894,777 Al2L5 н.и. - није индификовано Коришћењем soft wera Xcalibur добијен је изотопски pattern флероксацина и неких врста формираних у растворима алуминијума и флероксацина, што је значајно за идентификацију врста. Линије у области молекулског јона се јављају на различитим вредностима m/z (за лиганд 370, 371, 372, 373) за комплекс (763, 764, 765, 766). Карактеристично је да се код лиганда и комплекса јавља М+1 пик који потиче од C атома. Ови пикови се међусобно разликују за по 1 m/z јединицу и јављају се надесно од молекуслког пика. М+1 пик може потицати од 13 C изотопа или од 12 C изотопа [4] чија је релативна заступљеност 98 % па је међусобни однос ових изотопа 2:98. Остали атоми који улазе у састав атома лиганда или комплекса су изотопи ниске релативне заступљености или стабилни изотопи. Слика 111. Изотопски pattern јонске врсте АlL2 (m/z 763) Докторска дисертација 131 На Слици 111 приказан је изотопски pattern комплекса АlL2+, добијен коришћењем soft wera Xcalibur. На исечку „А“ приказан је изотопски pattern комплекса АlL2+, експерментално добијен. Оба изотопска pattern-а су у доброј сагласности као и релативне заступљености јона који чине област молекулског јона (763, 764, 765 и 766). На Схемама 3 и 4 су приказане фрагментационе путање добијена на основу MS/MS и MS/MS/MS експеримента. Схема 3: Фрагментациона путања јона 255 m/z Аl(LH)3+ из МS2 и МS3 експеримента У првој фази, након примене више колизионе енергије [147-153], на јон 255, 25 (комплекс у коме је један алуминијум везан са два молекула флероксацина) губи се цијановодонична киселина и тако настаје продукт јон на m/z 246,20. Из продукт јона m/z Mр Mирјана Р. Цвијовић 132 246,0 у МS2 експерименту настају продукт јони m/z 202,36 и то губитком 2 молекула CH2=CHF (етилен-флуорида) и 2 молекула флуороводоничне киселине HF и продукт јон на m/z 215,46, губитком 2 молекула CH2=CHF (етилен-флуорида). У МS3 експерименту из јона m/z 246,20 настају продукт јони: m/z 237,53 губитком цијановодоничне киселине, продукт јон на m/z 240,48 губитком метана (CH4) и јон на m/z 193,51 који настаје губитком 2 молекула CH2=CHF (етилен-флуорида), 2 молекула флуороводоничне киселине и једног молекула цијановодоничне киселине HCN. При губитку малих молекула структура комплекса остаје сачувана, тј. у току МS2 и МS3 експеримента нема кидања Аl-L веза. Стога се фрагментациона схема може тумачити уз претпоставку да Al(III)-јон остаје хелатиран са оба лиганда. Схема 4: Фрагментациони путања јона m/z 763, врста АlL2+ Докторска дисертација 133 Применом колизионе Е од 35 % од максималне вредности rf напона на parent јон (m/z 763) долази до фрагментације. Од комплекса у коме је један алуминијум везан са два депротонована молекула флероксацина у МS2 експерименту настају следећи продукт јони: губитком флуороводоничне киселине (HF) настаје продукт јон на m/z, 743 губитком цијановодоничне киселине (HCN) настаје продукт јон m/z 736, губитком 2 -азопропена (C2H5N) настаје продукт јон на m/z 719, губитком етил диметил-амина(C4H11N) настаје продукт јон на m/z 690 и губитком флуороводоничне киселине (HF) и етена (C2H4) настаје продукт јон на m/z 715. И у овом случају се ради о стабилној врсти, јер није дошло до раскидања везе алуминијума са лигандима. Gauss-oвa расподела спектралних линија На спектрима (Слике 42, 44) дати су Gauss-oви прикази ЕSI МS спектарa где се уочава правилнa расподела облика звона у интервалу m/z 220-250,односно у интервалу m/z 190-240. Профили спектралних линија (полуширине на половини висине максималног интензитета) су симетрични у већини спектара. Код датих спектралних линија и друге карактеристике профила линије су анализиране: форма крила линије, појава асиметрије профила и померај спектралне линије. Мањи помераји линија (који се запажају су последица чињенице да максимуми испитиваних спектралних линија померају највероватније због различитих услова (pH, концентрација) у сниманим растворима у односу на максимум линије коју би емитовали изоловани и непокретни атоми или јони. Појава крила спектралних линија је последица чињенице да је као анализатор у свим експериментима коришћен јон трап па многe од линија нису у потпуности раздвојене. Уочава се и присуство веома комплексних профила спектралних линија који се састоје из више компоненти које се међусобно преклапajу [96, 98]. Што се тиче Gauss-oве расподеле у односу на дати јон, приказане на Сликама 34, 48, у поглављу које илуструје комплексирање у Аl(III)-јон-HQ растворима, издвојен је јон m/z 763,27; односно 763,33 којим се илуструје и симетрична расподела интензитета облика звона и померај спектралне линије узрокован чињеницом да дати јон није изолован, већ у различитим окружењима у раствору. На Сликама 19 и 23 којима се илуструју хидролиза у растворима Аl(III)-јона приказана је Gauss-oва расподела интензитета у односу на јоне m/z 60,52, односно 96,65 облика звона. На сличан начин се може илустровати Gauss-oва расподела у односу на остале јоне у овим спектрима. 4.2.1.3. Квантитативна специјација у растворима алуминијум(III)–jона и флероксацина Већина сигнала у ЕSI МS спектрима je зависни од концентрације и pH вредности. Изучаване су варијације спектара са променом pH вредности за Аl/L однос, обрачуном релативих интензитиета сигнала слободног лиганда, Аl:L=1:1 и Аl:L=1:2 и награђених комплекса. У ту сврху је израчунат интензитет јона сваког пика у спектру [118, 119]. Нађена је сума свих интензитета јона у датом спектру и извршено је дељење јона који се односе на исти тип комплекса сумом свих јона. Релативни интензитет је обележен са RES-MS. и дефинише се једначинама 22 и 23. (22) (23) При чему је R дефинисано једначином [24]: (24) Mр Mирјана Р. Цвијовић 134 (25) где су: iL-интензитет лиганда у свим врстама iAlL и iAlL2 -интензитети свих јона који потичу од АlL и АlL2 јона, респективно Важно је истаћи да су релативни интезитети комплексних врста i763/i719 слични као код слободних лиганда i370/i326, што указује на сличне константе комплексирања за L и [L–CО2] врсте што је у складу са литературним подацима [111, 119]. Бинарни bis–комплекс детектован на m/z 763 је доминантна врста у раствору за релативно широк опсег pH и релативно широк концентрациони опсег CAl:Cfl ero. Имајући у виду pH зависност од интензитета сигнала, највероватније је да се овај комплекс формира у раствору ступњевито по реакцији: АlL2++L- =АlL2+ Истовремено је са рачунањем релативних интензитета добијених на основу ЕSI МS спектара са променом pH, исти обрачун је спроведен за податке добијене потенциометријским мерењима. Подаци за прорачуне расподеле су узети из литературно публикованих података [154-157]. У Табели 23 се са REQUIL обележава сума свих молских удела формираних комплекса на датом pH/укупна концентрација алуминијума. Подаци потенциометрије и ESI MS су корелисани Hyss 2006. програмом, приказани су у Табели 29. Сходно литератури [119] у идеалним условима REQUIl=RESI-MS. Разлике које се јављају су последица ЕSI пертурбација у раствору (разлика у саставу растварача и јонске јачине) Пертурбације се могу десити осим у раствору, на граници фаза течно-гас и у гасној фази. Пертурбације у раствору су последица равнотежног помераја у капљици и утицаја pH, концентрације,Т, јонске јачине које се дешавају док капљице испаравају [12]. Пертурбације које се дешавају на граници фаза течно-гас су последица ефективности којом различите врсте прелазе из капљице у гасну фазу. Пертурбације у гасној фази су последица фрагментације или других реакција које се дешавају након преласка јона у гасну фазу, а пре њихове детекције унутар или у близини улазне капиларе. Идентификација пертурбација је од великог значаја да би се што реалније тумачили резултати ESI MS специјације [111]. Расподела различитих комплекса у раствору је приказана на дистрибуционим дијаграмима. Генерално говорећи постоји слагање података добијених масеном спектрометријом и потенциометријом што указује да већина комплекса детектованих у ESI MS спектрима добро одсликава равнотежно стање у растворима Аl(III)-јона и флуорохинолона. Разлике које се јављају између ESI MS и потенциометријске специјације су за оне врсте које се у ESI MS спектрима детектују са различитим бројем киселих протона, тј. различитим наелектрисањима (charge state). Са порастом pH и за CAl:C fl ero=1:3, кoд AlL врсте ове вредности се све више међусобно приближавају. За врсту AlL2 приближно је исто разилажење ових вредности за оба концентрациона односа (Табела 23). Ова чињеница је у потпуној сагласности са литературним подацима на другим системима Аl(III)-јон- лиганд изучаваним ESI MS спектрометријом и објашњава се чињеницом да се различитом ефикасношћу јони различитих наелектрисања преносе из раствора у гасну фазу[111]. Табела 23. Поређењење релативних молских удела АlL и АlL2 комплекса добијених ЕSI МS и потенциометријским (равнотежним) мерењима [Аl(III)]-јон (mol/dm3) [флероксацин] (mol/dm3) pH REQUIL1 врсте АlL RES-MS1 врсте АlL REQUIL2 врсте АlL2 RES-MS2 врсте АlL2 2,7×10–5 8,1×10–5 4,03 0,768 0,491 0,402 0,420 5,29 0,320 0,304 0,697 0,805 6,20 0,254 0,243 0,616 0,774 2,7×10–5 4,05×10–5 3,50 0,748 0,324 0,207 0,385 4,14 0,551 0,214 0,782 0,837 5,64 0,478 0,196 0,320 0,532 Докторска дисертација 135 4.2.1.4. Примена модела вештачких неуронских мрежа на проучавање комплексирања Аl(III)-јона и флероксацина Слика 112. Хистограм релативних интезитета (заступљености) јона различитих m/z вредности vs концентрационим односима Аl(III)-јон-флероксацин На Слици 112 је приказана графичка расподела најобилнијх комплексних врста у фукнцији од концентрационих односа. Релативна заступљеност врста m/z 223 и 719 је најнижа. Врсте m/z 255 и 763 су са највишом релативном заступљеношћу за све концентрационе односе, а посебно за концентрационе односе CAl:Cfl ero=1:2 и CAl:Cfl ero=1:3. Врста m/z 382 има више релативне заступљености за концентрационе односе CAl:Cfl ero=1:2 и CAl:Cfl ero=1:3. Затим је коришћењем концепта ААN појединачно анализирана релативана заступљеност за најобилније комплексе типа АlL2 (m/z 719 и 763), што је графички представљено 3D површима. Слика 113. 3D површ релативне заступљености комплекса m/z 719 у функцији од pH и концентрационих однаса Mр Mирјана Р. Цвијовић 136 Како релативна заступљеност врста у раствору зависи од pH раствора и концентрационог односа метал - лиганд, pH раствора алуминијум(III)-јон–флероксацин је пажљиво додатком базе TEA. На основу модела неуронских вештачких мрежа израчунате су 3D површи реаговања (response surface) излазних величина на помену вредности улазних величина. Response surface показује за m/z 719 врсту типа AlL2 максимална застипљеност у pH интервал 3,77 до 4,80 и концентрационој области до 0,30 до 1,10, као и за pH интервал од 5,5 до 6,10 и концентрациони однос 1,10 до 1,37. При налажању оптималног pH интервала за формирање врсте AlL2 треба узтеи у обзир да је по хемијском саставу флероксацин хетероциклична амино киселина која у воденим растворима, може постојати у облику протонованог катјона, диполарног јона, неутралног молекула и анјона. Релативна заступљеност ових облика флероксацина у раствору је зависна од pH раствора. Стога се у разматрање мора узети дисоцијациона констата у датом растварачу. Константе дисоцијације флероксацина у воденом раствору на 298 K и при јонској јачини 0,1 mol/dm3 износе pK1=6,97, pK2=8,21. Прва константа дисоцијације се односи на дисоцијацију протона карбоксилне групе катјона флероксацина, а друга на дисоцијацију протона са протонованог азота пиперазинског прстена. На депротонована места може се лако везати метални јон и очекивало би се да се то дешава у базној средини где је флероксацин депртонован да се ради о раствору самог флероксацина. Међутим 3D површ показује да се максимална заступљеност ове врсте детектује у киселој средини. То се објашњава чињеницом да у присуству металног јона алуминијума у киселим растворима овај јон проузрокује депротоновање карбоксилне група (уз додатак базе у одређеним порцијама у овом случају по 0,3ml на 30 sec). И на тим местима, на депротонованој карбоксилној групи се сада дешава везивања Аl3+ јона и 2 депротонована јона флероксацина тако да настаје врста AlL2+ Слика 114. 3D површ релативне заступљености комплекса m/z 763 у функцији од pH и концентрационих однаса На 3D површи се уочава да је подручје максималне заступљености комплекса m/z 763 за pH 4,20-4,95 и концетрационе односе од 0,25-1,25 . 4.2.2. Систем алуминијум-моксифлоксацин Прво су снимљени и анализирани ЕSI МS спектри раствора моксифлоксацина, а затим раствора алуминијума и моксифлоксацина. У Табели 24. су приказане идентификоване врсте у спектру самог моксифлоксацина. Примењена је тандем масена спектрометрија са циљем дешифровања путева фрагментације и коначно maLDI спектрометрија. Докторска дисертација 137 Табела 24. Идентификоване врсте у основном спектру МS1, раствор моксифлоксацина, CL=2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,60 m/z из спектра m/z теоријски Идентификовани јони у ЕSI МS извору 261,40 261,09 [L--C6H13N-CO2+2H+]+ 338,02 338,30 [L--CO2-HF+2H+]+ 358,53 358,20 [L--CO2+2H+]+ 402,33 402,21 [L-+2H+]+ Молекулски јон моксифлоксацина се идентификује на m/z 402,33. Врста на 358,53 настаје декарбоксилацијом лиганда, што је у складу са литературним подацима. Међутим врста на m/z 384,40 која се у литературе помиње [147, 158, 159], а настаје губитком воде је мање вероватна јер у извору воде има у вишку и најчешће се јавља присаједињавање воде. Овај сигнал се у нашим експериментима не региструје. Врста на m/z 338,02 настаје губитком CО2 и HF. МS2 спектри прекурсор јона 402,00 (протонованог моксифлоксацина) указују да лиганд прво губи CО2 из 3-карбоксилне групе. Даљим повећањем колизионе енергије до 45 % од максималне rf вредности долази до губитка HF из хинолонског језгра. Продукт јон 338,02 је даље одабран за фрагментацију у МS3 експерименту. Његови продукт јони су 282,04 и 323,32. Следи да је моксифлоксацин „отпоран“ на фрагментацију (хинолонско језгро је тешко „разбити“), јер се запажа само губитак супституената. Слика 115. Изотопски pattern моксифлоксацина На Слици 115 приказан је изотопски pattern молекула моксифлоксацина, добијен kоришћењем soft wera Xcalibur. Изотопски pattern протонованог моксифлоксацина, експерментално добијен jе у доброј сагласности са теоретски изарачунатим као и релативне заступљености јона. Област молекулског јона чине: 401, 402, 403 и 404, М+1 јони. 4.2.2.1. Проучавање комплексирања Аl(III)-јона и моксифлоксацина ЕSI МS спектрометријом Моксифлоксацин се у структури разликује од флероксацина по присуству „велике“ групе у позицији-7 хинолонског језгра. Сем псеудо-молекулског јона моксифлоксацина и неколико фрагментацијом насталих сигнала слободног (некомплексираног) моксифлоксацина у Mр Mирјана Р. Цвијовић 138 ESI MS спектрима се идентификују следеће комплексне врсте AlL 2+, AlL 2+ и AlL 30. Остали релативно слаби сигнали се асигнирају као фрагментациони продукти настали губитком CО2, HF и ређе губитком CО [88, 158,159]. Структура молекула је сачувана у гасној фази. Губитак CО потиче (у складу са литературом од карбонилне групе једног од везаних лиганда у комплекс и указују да се лакше раскида веза са металним јоном, него са друга два лиганда. Губитци H2О се не региструју, већ се региструје присаједињавање молекула H2О са датим јонима што је у потпуности у складу са литературним подацима [147,153]. То је последица присуства малих количина воде у јон трапу које је тешко уклонити. У врстама AlL 2+, AlL 2+ вода је чврсто везана за алуминијум и пораст pH вредности води до појаве хидроксо врста. Потенциометрија не разликује врсте у којима је координована вода депротонована од врста у којима је лиганд депротонован. Предност масене спектрометрије је у томе што разликује ове врсте [13]. Врста на m/z 827,31 настаје координацијом једног металног јона са два јона лиганда. Слика 116. Могућа структура комплекса АlL2 у систему Аl-моксифлоксацин Врсте на m/z 414,22 и 424,28 настају координацијом једног металног јона са два јона лиганда од којих је један у облику L- а други LH. Врста на m/z 216,81 настаје координацијом једног металног јона и једног лиганда. Врста на m/z 1266,88 настаје координацијом три лиганда са металним јоном и К+ јоном. Уочавају се и врсте које припадају слободном лиганду на m/z 402,20 и 358,27 настала декарбоксилацијом протонованог лиганда (Табела 25). Табела 25. Идентификоване. врсте у растворима Аl(III)-јона и моксифлоксацина, CAl=2,7×10-5 mol/dm3, ESI MS спектрометријом m/z теоријски m/z експериментално Идентификовани јони Врсте у равнотежи које највероватније дају ЕSI-МS јоне 216,58 216,81 [Al3++L-+3H2O-CO-HF]2+ AlL2+ 358,43 358,27 [L-+2H+ -CO2]+ Слободни L 402,20 402,20 [L- +2H+]+ Слободни L 414,43 414,22 [Al3++2L-+H+]2+ AlL22 + 423,80 424,28 [Al3++2L-+H2O+H+]2+ AlL22 + 827,32 827,31 [Al3++2L-]+ AlL2 + 1266,45 1266,88 [Al3++3L- +K+]+ AlL3K+ Докторска дисертација 139 Слика 117. Изотопски pattern јонске врсте АlL+2 на m/z 827 На Слици 117 приказан је изотопски pattern комплекса АlL2+, добијен коришћењем soft wera Xcalibur. Изотопски pattern комплекса АlL2+, експерментално добијен, је у доброј сагласности са теоретски израчунатим. Област молекулског јона чине 827, 828, 829 и 830 јони. 4.2.2.2. Проучавање комплексирања алуминијум (III)-joна и моксифлоксацина mаLDI спектрометријом Врсте из maLDI спектара потврђују специјацију добијену на основу ЕSI МS спектара[153]. У maLDI спектрима се уочавају следећи јони: 827,505 који репрезентује врсту АlL2 насталу координацијом једног јона метала са два јона депротонованог лиганда. При нижим вредностима m/z у овом спектру запажа се више врста које потичу од метастабилних јона. Врста на m/z 1250,62 је адуктна АlL3 врста са Nа+ јоном, врста на m/z 1266,45 је адуктна АlL3 врсту са К+ јоном. Врста на m/z 2054,36 би се могла приписати [Аl2L5]+, међутим како се ова врста недетектује у раствору, њена појава се објашњава формирањем кластер јона дејством ласера. [21, 22, 111]. Са аспекта координационе хемије мало је вероватно да се два алуминијума вежу са 5 лиганада. Највероватније је да ова врста потиче од димерног језгра Al2L2, које се формира у раствору, а кластер са више депротонованих лиганда се формира у гасној фази, тј. у plume створеном ласерским зраком. Табела 26. Идентификоване. врсте у растворима Аl(III)-јона и моксифлоксацина, од 1:1 до 1:3, концетрација 10-4 mol/dm3, maLDI спектрометријом mаLDI m/z из спектра 1:1, pH=4,40 mаLDI m/z из спектра 1:1, pH =5,90 mаLDI m/z из спектра 1:3, pH =5,10 Врсте моксифл-оксацин подлога 268,458 јак пик 365,643 402,447 402,408 Слободнилиганд 686,94 827,574 827,517 827,505 AlL2+ 1250,627 1250,627 1250,627 AlL3Na+ 1266,599 1266,599 1266,599 AlL3K+ 2054,366 Al2L5+ Mр Mирјана Р. Цвијовић 140 Слика 118. Изотопски еnvelope у систему алуминијум моксифлоксацин maLDI спектри дају исте врсте као и ЕSI MS спектри, што је потврда да те врсте заиста постоје у раствору. Јони у maLDI спектрима настају по једноставној схеми формирања протонованих или депротонованих квазимолекуларних јона удружених са неколико фрагментних јона насталих губитком малих стабилних молекула [18, 88] као што је CO2. Јони се формирају се из високо интензитетских радикал молекулских јона или водоничних адуката као што су [M+2H]+, [M+3H]+ или депротоване врсте [M-H]_. И молекулски и фрагментациони карактерише изотопски envelope [160]. Из молекулске масе и међусобних растојања пикова у изотопски envelope добијају се важни подаци за карактеризаију молекула. Пик на m/z 827,505 карактерише изотопски envelope аналита (Слика 118), који је значајан за структурно тумачње насталог комплекса у систему алуминијум-моксифлоксацина типа AlL2+ Зато је важна резолуција инструмента да би се могли довољно раздвојити пикови у изотопски envelope. TOF/ТОF масеном спектрометријом флуорохинолона и алуминијума добијају се добро раздвојени пикови . Мада стимулисана фрагментација није коришћена, уочава се ограничена метастабилна фрагментација молекулског јона (дешава се након што јони напусте област акцелерације- убрзања). maLDI ТОF МS састоји се из три ступња: први ступањ представља превођење молекула аналита у гасну фазу и њихову јонизацију, други ступањ представља раздвајање јонизованих молекула на основу односа масе и наелектрисања (m/z) и на крају трећи ступањ је детекција јона. Предност maLDI TOF масене спектрометрије над другим методама карактеризације испитиваних молекула лежи у чињеници да се овом методом мери однос масе и наелектрисања јона чиме је олакшано испитивање појединачних молекула. Из тог разлога су резултати добијени карактеризацијом једнозначни. Изотопски еnvelope служи за: –једнозначну интерпрентацију јер нема интерференције између јона, –за потврђиванје структуре познатог и одређивање могуће структуре непознатог хетероатома – за процену броја С атома у непознатом молекулу на основу интензитета А+1 јона –за експериментално одредиђивање charge state јона, базирано на односу Δm/z између јона у envelopе . Charge state је реципрочна вредност Δm/z издвојеног јона у изотопском envelopе. Charge state = 1/Δm/z Докторска дисертација 141 4.2.3. Систем алуминијум(III)-јон ципрофлоксацин Снимљени су и анализирани ЕSI МS спектри раствора ципрофлоксацина и раствора алуминијума и ципрофлоксацина са циљем одређивања специјације. Тандем масена спектрометрија је примењена са циљем дешифровања путева фрагментације. mаLDI спектрометрија је коришћења ради детектовања полимера. У Табели 27 су приказане идентификоване врсте у раствору ципрофлоксацина. Табела 27. Идентификоване врсте у раствору ципрофлоксацина, CL=2,7x10-5 mol/dm3, pH=4,60 m/z теоријски m/z из спектра Идентификовани јони у ЕSI МS извору 332,10 332,04 [L-+2H+]+ 288,25 288,17 [L--CO2+2H+]+ 268,62 268,23 [L--CO2-HF+2H+]+ 245,45 245,50 [L--C2H5N-CO2+2H+]+ Врста на 332,04 је молекулски јон ципрофлоксацина настао протоновањем овог лиганда. Врсте (245,50, 288,17) су у складу са литературно публикованим подацима [152, 161]. Настају губитком молекула угљен-диоксида и 2-азопропена. Нису идентификоване врсте на m/z 314, 249, 231, 205 који се у литератури помињу. Врста на m/z 268,23 настаје још и губитком флуороводоника. Слика 119. Изотопски pattern ципрофлоксацина На Слици 119. приказан је изотопски pattern молекула ципрофлоксацина, добијен коришћењем soft wera Xcalibur. Изотопски pattern протонованог ципрофлоксацина, експерментално добијен, jе у доброј сагласности са теоретски изарачунати као и релативне заступљености јона. Област молекулског јона чине 331, 332, 333 и 334 врсте. 4.2.3.1. Проучавање комплексирања алуминијума(III)-joна и ципрофлоксацина ЕSI МS спектрометријом ЕSI МS спектри ципрофлоксацина и алуминијума су слични спектрима претходних система. Сем сигнала слободног ципрофлоксацина који је протонован, у спектрима се уочавају сигнали комплекса АlLn (n=1,2,3). Доминантни комплекси су бинарни бис и трис комплекси, који могу бити протоновани, депротоновани. Mр Mирјана Р. Цвијовић 142 Табела 28. Идентификоване врсте у растворима Аl(III)-јона и ципрофлоксацина, CAl=2,7 ×10-5 mol/dm3, ESI MS спектрометријом m/z теоријски m/z експериментално Идентификовани јони Врсте у равнотежи које највероватније дају ЕSI МS јоне 231,32 231,20 [L-+2H+-C3H4-C2H5N-H2O]+ Слободни лиганд 249,30 249,05 [Al3++ L--2CO2-2HF+H2O]2+ AlL2+ 332,14 332,01 [L-+2H+]+ Слободни лиганд 334,11 334,12 [Al3++2L-+H+-HF]2+ AlL22+ 667,23 667,79 [Al3++2L--HF]+ AlL2+ 687,23 687,75 [Al3++2L-]+ AlL2+ 1040,34 1040,33 [Al3++3L3-+Na+]+ AlL3Na+ 1056,52 1056,15 [Al3++3L3-+K+]+ AlL3K+ Прва група врста потиче од слободног лиганда: 332,01 и 231,20. Другу групу врста чине АlL2 врсте: 249,05, 667,79 и 687,75 (Слика 119). Слика 120. Могућа структура комплекса АlL2 у систему Аl-ципрофлоксацин Трећа група су АlL3 адуктне врсте са Nа+ и К+ јоном. Врста на m/z 1040,33 је адукт са Nа+ јоном, а врста на m/z 1056,15 је врста којој је пришао јон К+. Фрагментација није много јака и укључује губитк HF, CО2, ређе долази до губитка етил-амина. Слика 121. Изотопски pattern јонске врсте АlL2 на 687 m/z Докторска дисертација 143 На Слици 121 приказан је изотопски pattern комплекса АlL2+, добијен коришћењем soft wera Xcalibur. Изотопски pattern комплекса АlL2+, експерментално добијен је у доброј сагласности са теоретски израчунатим. Област молекулског јона чине 687, 688, 689 и 690. На Схеми 5 је приказана фрагментациона путања добијена на основу МS/МS и МS/ МS / МS експеримента у систему Аl- ципрофлоксацин. Схема 5: Фрагментациона путања Аl-ципрофлоксацин комплекса из МS2 и МS3 експеримента МS2 експеримент јона 687 тек при 40 % од максималне ексцитационе енергије показује да прекурсор јон губи HF, HCN или циклопропен C3H4+C2H5N молекуле. У МS3 експерименту из јона 660 губитком C3H4; C2H5N и C2H4 настаје врста на m/z 549,98. Mр Mирјана Р. Цвијовић 144 У првој фази од комплекса у коме је један алуминијум везан са два молекула ципрофлоксацина губи се флуороводонична киселина HF и то тако што F одлази са оксо- хинолонског прстена, а водоник из пиперазинске групе [152, 161]. Тако настаје потомак на m/z 667,64. Губитком циклопропена (C3H4) и 2-азопропена (C2H5N) од полазног молекула настаје фрагмент на m/z 604,52. Трећи потомак који настаје од полазног молекула губитком цијановодоничне киселине (HCN) је продукт јон на m/z 660,60. У МS3 експерименту из овог продукт јона губитком циклопропена (C3H4), 2-азопропена (C2H5N) и етена (C2H4), настаје продукт јон на m/z 549,98. Тандем масена спектрометрија указује да су потребне врло високе колизионе енергије за фрагментацију ових комплекса (нарочито када су концентрације полазних компоненти 10-4 mol/dm3, Еcoll су 80 до 100% од максималне вредности RF voltage) из чега следи да је висока стабилност ових комплекса. То узрокује веома ниску концентрацију слободног алуминијума. Стога, реакције комплексирања in vivo између алуминијум јона и флуорохинолона одвија се као серија реакција лигандне измене. На стварање комплекса утичу кинетички ефекти, гастритична стања, компетиција са другим лигандима и металним јонима и системски кинетички транспорт флуорохинолона. Најважније компетитивне врсте у плазми су лиганди мале молекулске масе, протеини и јон калцијума. 4.2.3.2. Проучавање комплексирања алуминијума(III)-јона и ципрофлоксацина mаLDI спектрометријом Већина врста из maLDI спектара су нађене и у ЕSI МS спектрима. Из овога следи да идентификоване врсте потичу из раствора, а не из гасне фазе. Најзаступљеније врсте су приказане у Табели 29. Табела 29. Индефиковане врсте у растворима Аl(III)-јона и ципрофлоксацина = 1:3, концентрација 10-4 mol/dm3, maLDI спектрометријом m/z mаLDI из спектра 1:3, pH=3,5 m/z mаLDI из спектра 1:3, pH =4,00 m/z mаLDI из спектра 1:3, pH =5,10 m/z mаLDI из спектра 1:3, pH =6,10 врсте Plate(подлога) 268,458 jaк пик 687,498 687,497 687,495 687,495 AlL2+ 686,946 1016,609 1016,597 1016,603 н.и. 1040,605 1040,611 1040,62 AlL3Na+ 1056,576 1056,574 AlL3K+ 1703,900 1703,888 Al2L5+ н.и. - није идефиковано Врста на m/z 1703,88 би се могла приписати Аl2L5+, међутим како се ова врста не детектује у раствору, појава ове врсте у LDI спектру се објашњава најпре формирањем димерног језгра Al2L2 у раствору, а затим настаје кластер Al2L5+ као последица гасно-фазних реакција. Врста АlL3 на m/z 1040,61 је последица формирња адукта са Nа+, а врста на 1056,34 је последица формирња адукта са К+јоном. Врста на m/z 1016,60 је врста настала коордиацијом три лиганда за алуминијум. Врста на m/z 687,45 настаје координацијом два депротонована лиганда за алуминијум. 4.3. Дистрибуциони дијаграми На основу дистрибуционих дијаграма израчунатих програмом Hyss 2006 за дати коцентрациони однос метала и лиганда ЕSI МS спектри се много лакше интерпретирају. Дистрибуциони дијаграми за различите концентрационе односе Аl(III)-јона и флуорохинолона су израчунати на основу вредности константи стабилности комплекса Докторска дисертација 145 Аl(III) јона и флуорохинолна приказаних у табели 30. Константе стабилности су преузете из литературе [154-157]. Табела 30. Констате стабилности које су коришћене у прорачуну специјације. Константе су преузете из литературних података. Врсте -logß Врсте -logß Врсте -logß H2(Moxi)0 15,67 H2(Flero) 13,73 H2(Cipro) 14,71 H(Moxi) 9,32 H(Flero) 8,06 H(Cipro) 8,54 Al(HMoxi)3+ 16,59 Al(HFlero) 14,02 Al(HCipro) 16,27 Al(Moxi)2+ 11,66 Al(Flero) 11,14 Al(H2Cipro) 18,87 Al(H-1Moxi) 5,28 Al(H-1Flero) 5,2 Al(HCipro)2 23,73 Al(H-2Moxi) -2,92 Al(H-2Flero) -1,61 Al(H2Cipro)2 29,33 AlFlero(HFlero) 24,87 Al(Cipro)3 19,56 Al(HCipro)3 27,78 Al(H2Cipro)3 35,8 Al(H3Cipro)3 43,26 Al(Cipro) 11,21 Al(Cipro)2 15,92 Al(H-1Cipro) 4,96 На основу вредности константи стабилности комплекса Аl(III)-јона и флероксацина израчунати су дистрибуциони дијаграми алуминијума и флероксацин за различите концентрационе односе . Анализом дистрибуционих дијаграма види се да су комплекси Аl(Flero) и Аl(H-1Flero) присутни при свим концентрационим односима метал:лиганд. Слика 122. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Cfl ero =1:3 За концентрациони однос CAl:Cfl ero =1:3 најзаступљенија врста је типа Аl(Flero). Комплекс Аl(Flero) настаје у области pH од 3-7 са максималном концентрацијом на pH 4,5. Комплекс Аl(H-1 Flero) се јавља у области pH од 5-8 са максималном концентрацијом на pH 6,5 8 (Слика 122). Комплекс Аl(H-2 Flero) се јавља у pH интервалу од pH 6 до 10, са максимумом на pH 8. Дистрибуциони дијаграми одсликавају равнотежно стање у раствору. Mр Mирјана Р. Цвијовић 146 Слика 123. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Cfl ero =1:1,5 За концентрациони однос CAl:Cfl ero =1:1,5 у раствору је врло слична ситуација по основу награђених врста у функцији од pH, као у претходном случају (Слика 123). Слика 124. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Cfl ero =2:1 За концентрациони однос CAl:Cfl ero =2:1, где је метал у вишку, заступљене су и чисто хидролитичке и комплексне и мешовите врсте. У области pH 5,5-6,5 доминантан је хидролитички комплекс типа АlH-2. Аl-флеро је доминатна врста у области pH 4,0–5,5. При pH вешим од 7 доминантна је хидролитичка врста АlH-3. Докторска дисертација 147 Слика 125. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Ccipro =1:3, концентрација компонената 10-5 mol/dm3 Са Слике 125 се уочава да je за концентрациони однос CAl:Ccipro = 2,7x10-5:8,1x10-5 mol/dm3 доминантна врста АlHL, у систему алуминијум ципрофлоксацин максимална у интервалу pH 3 до 5. У области од pH 5 до 7 доминантна врста је АlL. При pH већим од 7 доминантна врста је АlH-1L. При pH већим од 8 доминантна је хидролитичка врста је АlH-3 (s). Слика 126. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:Ccipro = 1:3, концентрација компонената 10-4 mol/dm3 Пошто су у овом случају концентрације компонената 10 пута више у односу на претходну а концентрациони однос исти, уочава се формирање већег броја врста. У области pH 2-6 настаје врста АlH L, са максимумом на pH 3,8. У области pH 4-7 настаје врста АlH3L3, са максимумом на pH 6. Ове врсте има знатно више него у случају када су концентрације реда величине 10-5 mol/dm3. Заступљеност врсте АlH-1L знатно је нижа у овом случају. Настају нове врсте АlH2L2 и АlH L2. Mр Mирјана Р. Цвијовић 148 Слика 127. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:CМoxi=1:3, концетрација компонената 10-5 mol/dm3 Дистрибуциони дијаграм на Слици 127. одсликава равнотежно стање у раствору алуминијума и моксифлоксацина за концентрациони однос CAl:Cmoxi = 2,7x10-5:8,1x10-5 mol/ dm3. За овај концентрациони однос у области pH 3-5 најзаступљенија врста је типа АlHL. У области pH 5-6 доминантна врста је АlL. Изнад pH 7 долази до стварања Аl(OH)3 (s). Слика 128. Дистрибуциони дијаграм за концентрациони однос CAl:CМoxi =1:3, концетрација компонената 10-4 mol/dm3 У овом случају, Слика 128 су концентрације компонената 10 пута више а концентрациони однос исти (2,7x10-4:8,1x10-4mol/dm3) као у претходном примеру и уочава се слична расподела врста по pH. У области pH 3-5 доминантна врста је АlHL. Проценат заступљености износи 90 % што је знатно више него у случају када су концентрације реда Докторска дисертација 149 величине 10-5 mol/dm3 (када заступљеност износи 70 %). У области pH 5-6 доминантна врста је АlL. Изнад pH 7 доминира таложење алуминијума АlH-3. На дијаграмима који следе приказана је дистрибуција самих лиганада добијена применом програма Hyss 2006, а на основу литературних података [154-157] датих у Табели 30. Слика 129. Дистрибуциони дијаграм за моксифлоксацин Дистрибуциони дијаграм моксифлоксацина (Слика 129) израчунат је на основу константи протоновања анјона моксифлоксатина у области pH од 3-12. У воденим растворима моксифлоксацин се реагује као амфотерна амино киселина са изоелектричном тачком pI=7,4. На основу дистрибуционог дијаграма следи да моксифлоксацин постоји у катјонском облику при pH нижим од 8. При pH вишим од 8 је у анјонском облику. Слика 130. Дистрибуциони дијаграм за ципрофлоксацин Дистрибуциони дијаграм ципрофлоксацина израчунат је на основу константи протоновања анјона ципрофлоксацина у области pH од 3–12 (Слика 130). На основу Mр Mирјана Р. Цвијовић 150 дистрибуционог дијаграма следи да ципрофлоксацин постоји у катјонском облику при pH вредностима нижим од 8. При pH вишим од 8 је у анјонском. На pH 7,4 је у zwitter јонском облику. Слика 131. Дистрибуциони дијаграм за флероксацин Из дистрибуционог дијаграма (Слика 131) следи да флероксацин постоји у катјонском облику при pH вредностима нижим од 8. При pH вишим од 8 је у анјонском. На pH 6,9 је у zwitter јонском облику. Докторска дисертација 151 5. ЗАКЉУЧАК У оквиру ове дисертације испитане су хидролитичке равнотеже и специјација у растворима алуминијум(III)-јона применом ЕSI МS спектрометрије и равнотеже и специјација у растворима алуминијум(III)-јона и флуорохинолона (HQ) применом ЕSI МS спектрометрије, maLDI MS и тандем масене спектрометрије. Сходно добијеним експерименталним резултатима урађена је недвосмислена асигнација на основу односа масе и наелектрисања, изотопских pattern-а и расподеле наелектрисања. Циљ свих ових испитивања био је да се проучи утицај одабраних HQ: флероксацина, моксифлоксацина и ципрофлоксацина на биодистрибуцију алуминијум(III)-јона у људском организму, као и међусобне интеракције флуорохинолонских антибиотика и лекова на бази алуминијума (антацида, вакцина, дијализатних течности). Детаљним разматрањем добијених експерименталних резултата, њиховом математичком обрадом, коришћењем модела вештачких неуронских мрежа (АNN) и поређењем са литературним резултатима дошло се до следећих закључака: 1. При проучавању хидролизе у растворима алуминијум(III)-јона, концетрације 0,03 дo 5,0 mmol/dm3, индетификована су врсте са наелектрисањем +1, +2 и +3, формиране у опсегу pH од 3-6. Мономерне и димерне врсте су доминантне до pH 3,8 вредности. ЕSI МS спектри указују на формирање малих полимерних врста (Аl3–Аl5) на pH 4,8. Са повећањем pH и концетрације алуминијум(III)-јона идентификују се средњи полимери (Аl6–Аl10). Даљим повећањем pH и концентрације алуминијум(III)-јона настају виши полимери (Аl11–Аl13). Виши полимери су привремене врсте које постоје релативно кратко време након припреме раствора. На pH око 6,4 почиње формирање талога, што указује да се Keggin-ови полимери прво трансформишу у мање полимере, а затим почиње таложење. Идентификоване полимерне врсте садрже координоване јоне хлора и молекуле воде. Идентификоване врсте у овим експериментима су у складу са описаним врстама у литератури од стране Urabe и сарадника [81]. 2. Ефекти хидролизе алуминијум(III)-јона, „идентитет“ и стабилност хидролитичких врста формираних у раствору зависе од експерименталних фактора: природе и концентрације јонског медијума, pH раствора, природе и концентрације базе која се користи да поспеши хидролизу, времена старења и присуства других супстанци (контра јона) које могу интераговати са алуминијум(III)-јоном и/или молекулима воде, концентрације алуминијум(III)-јона. Са старењем раствора број врста у спектру се знатно смањује. Идентификује се само неколико сигнала у спектру који потичу од врста: [Al(OH)2]+, [Al6(OH)13]5+, [Al4(OH)9]3+ и [Al5(OH)12]3+. Старење раствора на pH до 6 у трајању од 7, 15 и 30 дана није дало полимере веће од Al13. 3. Ефекти хидролизе алуминијум(III)-јона, проучавани ЕSI МS спектрометријом, зависе од инструменталних параметара: брзина протока растварача, темепературa јонског извора и напон на конусу и на капилари. При тјунирању сви ови параметри су подешавани. Највећи утицај је имао напон на конусу. Најбоље слагање резултата ЕSI МS са резултатима потенциометрије и 27Al NMR спектроскопијом се добија при напону на конусу до 50V. 4. Врсте које се идетификају на m/z 132,86 [AlCl3+H+]+ и m/z 96,65 [АlCl2]+ нису карактеристичне за раствор, највероватније настају у току процеса небулизације у ЕSI извору. 5. При проучавању комплексирања у растворима алуминијум(III)-јона и одабраним HQ (флероксацин, моксифлоксацин и ципрофлоксацин) идентификоване су ESI MS Mр Mирјана Р. Цвијовић 152 спектрима за концентрационе односе (метал: лиганд) од 2:1 дo 1:3 и у pH опсегу од 3,0 до 6,0 мононуклеарне врсте: AlL2+, AlL2+ и AlL30. Мешовити протоновани и хидроксо комплекси су идентификовани и при нижим и при вишим pH вредностима, али полимерне врсте нису нађене у ESI MS спектрима. Идентификоване врсте у ESI MS спектрима су у сагласности са врстама индефикованих у maLDI MS и литературно публикованим резултатима на сличним системима [91, 111]. 6. Квантитативном специјацијом дошло се до закључка да је заступљеност молских удела комплексних врста i763/i719 слична као код слободних лиганда i370/i326 што указује на сличне константе комплексирања за L и [L-CO2], што је у складу са литературним подацима. Истовремено са рачунањем релативних интензитета добијених на основу ЕSI МS спектара са променом pH, исти обрачун је спроведен за податке добијене потенциометријским мерењима. Сходно литератури у идеалним условима REQUIl=RESI-MS. Разлике које се јављају су последица ЕSI пертурбација у раствору. Пертурбације у раствору су последица равнотежног помераја у капљици и утицаја pH, концентрације,Т, јонске јачине које се дешавају док капљице испаравају. Идентификација пертурбација је од великог значаја да би се што реалније тумачили резултати ESI MS специјације. У овом случају је прилично добро слагање података добијених масеном спектрометријом и потенциометријом што указује да већина комплекса детектованих у ESI MS спектрима добро одсликава равнотежно стање у растворима Аl(III)-јона и флуорохинолона. 7. Спектралне линије које илуструју комплексирање алуминијум(III)-јона и HQ и хидролизу алуминијум(III)-јона карактерише правилна Gauss-ова расподела. Профили линија (полуширина спектралних линија на половини висине максималног интензитета) су у већини спектара симетрични. Појава крила спектралних линија је последица чињенице да је као анализатор у свим експериментима коришћен јон трап па многе од линија нису могле бити у потпуности раздвојене. Појава помераја максимума спектралних линија (нпр. m/z 763,27 односно 763,33) је последица чињенице да се ови јони налазе у различитом окружењима у раствору, тј. нису посматрани максимуми изолованих или непокретних атома (јона). 8. 3D добијене на основу примене модела неуронских мрежа јасно показују при којим условима експеримента (концентрационе интервале, интервале pH и запремину додате базе) при којима је релативна заступљеност врсте типа АlL2 максимална. Дијаграми учења и тестирања мрежа су у доброј сагласности са експерметалнима подацима из чега следи да је овај математички soft wer моћно оруђе за индификацију скривених релација између промењљивих као и предикцију и тумачење резултата експеримента. 9. На основу maLDI спектара су идентификоване врсте која су потврда мононуклеарних врста идентификованих у ESI MS спектрима, што указује да ове врсте заиста постоје у раствору и да нису последица гасно-фазних реакција. У maLDI спектрима идентификоване су и полимерне врсте, означене као [2Al3++5L-]+. Ове врсте највероватније потичу од димерног језгра Al2L2, које се формира у раствору, а кластери са више депротонованих лиганда се формирају у гасној фази, тј. у plume створеном ласерским зраком. Врста означена као [2Al3++5L-]+ се идентификује у систему флероксацина и Al(III)-joнa на m/z 1894,77, у систему моксифлоксацина и Al(III)-јона на m/z 2054,36 и у систему ципрофлоксацина и Al(III)-јона, на m/z 1703,88. У maLDI спектрима се индетификује и AlL3 врста, која је најчешће адукт са јоном натријума или калијума. 10. Резултати тандем масене спектрометрије, MSn су послужили, након дешифровања фрагментационих pattern-a, за разјашњење структуре комплекса формираних између Al(III)-joна и HQ и места везивања. Докторска дисертација 153 11. У МSn експериментима су на parent јоне примењиване високе колизионе енергије што указује да су комплекси Al(III)-joн-флуорохинолони веома стабилни. На стабилност ових комплекса указује и чињеница да у току фрагментације региструју само губици малих неутралних молекула, тј нема кидања везе алуминијум-лиганд. На фрагментационим pattern-има за врсту типа AlL2 уочава се да Al(III)-joн остаје везан са оба лиганда упркос високим примењеним колизионим енергијама које се крећу и до 80, па и 100 % од максималног rf voltage нарочито када су концентрације компонената у растворима биле реда величине 10-4 mol/dm3. 12. Постепено формирање Аl(III)–флуорохинолонских комплекса и њихова релативно велика заступљеност у поређењу са слободним лигандом, указује да је значајан удео лиганда везан за јон метала, преко карбонилне и карбоксилне групе. 13 Резултати ових експеримената су значајни за се расветљавање процеса у гастроинтестиналном тракту када се HQ антибиотици дозирају заједно са лековима на бази алуминијума(антацида, вакцина, дијализатних течности). 14 Формирање комплекса између Аl(III)–јона и HQ може за последицу имати мању биорасположивост HQ, због смањења интестиналне пропустљивости пошто наелектрисани HQ-метал комплекси тешко продиру кроз интестиналну мукозну мембрану. Са друге стране неутрални комплекси могу продрети кроз мембрану и повећати токсичност алуминијума при дисоцијацији комплекса у крвотоку. Mр Mирјана Р. Цвијовић 154 6. РЕФЕРЕНЦЕ 1) A. R. Roland, D. E. Low, Fluoroquinolone Antibiotics, Birkhauser Verlag Basel, (2003). 2) H. Zhao, H. Liu, J. Qu, J. Colloid Interface Sci. 330, 105, “Eff ect of pH on the Aluminum Salts Hydrolysis During Coagulation Process: Formation and Decomposition of Polymeric Aluminum Species” (2009) 3) G. Berthon, Coord. Chem. Rev. 228,2, 319, Aluminium speciation in relation to aluminium bioavailability, metabolism and toxicity (2002) 4) J. H. Gross, Mass Spectrometry, A Textbook, Springer, (2004) 5) W. L. Budde, Analytical Mass Spectromery, ACS and Oxford University Press, Washington, D. C. and Oxford, (2001) 6) R. M. Smith, Understanding Mass Spectra: A Basic Approach–2nd ed. Wiley Interscience, New Yersey, (2004) 7) E. Alison Ashcroft , “An Introduction to Mass Spectrometry”, Th e University of Leeds (2010) 8) N. Gali: “Elektrospršenje – jonizacija u masenoj spektrometriji“, Kem. Ind. 53 (3) 117, (2004) 9) S. J. Gaskell, J. Mass Spectrom. 32, 677, „Electrospray: Principles and Practice”, (1997) 10) E. de Hoff mann, V. Stroobant, J. Charette, “Mass Spectrometry Principles and Applications”, John Wiley&Sons Ltd, Chichester, (2007) 11) R. Cole, “Electrospray and MALDI Mass Spectrometry, Fundamentals, Instrumentation, Practicalities and Biologiacal Applications”, Wiley Publication, (2010). 12) S. Crotti, R. Seraglia, P. Traldi, Eur. J. Mass Spectrom. 17, 85, “Review: Some Th oughts on Electrospray Ionization Mechanisms” (2011) 13) V. B. Di Marco, G. G. Bombi, P. Traldi, “Electrospray Mass Spectrometry (ESI-MS) in the Study of Metal-Ligand Solution Equilibria”, Mass Spectrom. Review 25, 347, (2006) 14) M. Dole, L. L. Mack, R. L. Hines, R. C. Mobley, L. D. Ferguson, M. B. Alice, Gas Phase Macroions. J. Chem. Phys. 49, 2240, (1968) 15) A. Matsumoto, T. Fukumoto, H. Adachi, H. Watarai “Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Metal Complexes. Gas Phase Formation of a Binuclear Copper(II) 5-Br PADAP Complex“. Anal. Chim. Acta 390,193, (1999) 16) M. C. McMaster LC&MS, A Practical User’s Guide, A John Wiley & Sons, Inc. Publication, (2005) 17) F. Hilenkap, J. P. Katalić, MALDI MS, A Pratcical Guide to Instrumentation, Methods and Applications, Wiley-VCH Verlag GmnH, Co.KGaA, Weinheim, (2007). 18) M. Karas, U. Bahr, Mass Spectrometry Reviews, 10, 335, „Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Mass Spectrometry”, (1991) 19) W. Henderson, J. S. McIndoe, Mass Spectrometry of Inorganic, Coordination and Organometallic Compounds: Tools–Techniques–Tips, John Wiley & Sons, (2005) 20) J. Vuković, S. Jovanović, M. D. Lechner, Hem. Ind. 61(6) 333 „Karakterizacija Alifatskih Hiper Razgranatih Poliestara MALDI-TOF Masenom Spektrometrijom“, (2007) 21) P. J. A. Ruttink, J. K. Terlouw, T. M. Luider, P. C. Burgers, J. Mass. Spectrom. 46, 223, “Structure and Dissociation Characteristics of Metal Chloride Anion Clusters Containing Redox-Active Metal Ions Studied by Laser Desorption and Electrospray Ionization Mass Spectrometry and AB Initio Calculations”, (2011) 22) L. Molin, R. Seraglia, F. R. Dani, G. Moneti, P.Traldi; Rapid Commun. Mass Spectrom. 25,3091, “Th e Double Nature of 1,5-Diaminonaphtalene as Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Matrix: Some Experimental Evidence of the Protonation and Reduction Mechanisms“ (2011) Докторска дисертација 155 23) P. Traldi, R. Flamini, Mass Spectrometry In Grape And Wine Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. Publication, (2010) 24) R. Zenobi, R. Knochenmuss, Mass Spectrometry Reviews 17;337 by John Wiley and Sons, “Ion Formation in MALDI Mass Spectrometry”, (1998) 25) C. Dass, Fundametals of Contemprorary Mass Spectrometry, John Wiley and Sons Inc. Publication, New Yersey, (2007) 26) D. J. Douglas, A. J. Frank, D. Mao „Linear Ion Traps in Mass Spectrometry“. Mass Spectrom. Reviews 24,1, (2005) 27) M. B. Christopher, D. C. Duckworth, D. H. Smith, Inorganic Mass Spectrometry, Fundamentals and Applications, Vol 23 National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee, by Marcel Dekker Inc. (K. L. Sutton, K. L. Ackley, J. A. Caruso) Elemental Speciation By Inorganic Mass Spectrometry, 373, Inorganic TOF MS, 447, (2000) 28) Mc Laff erty FW(ed) Tandem Mass Spectrometry: John Wiley Sons, (1983) 29) Base Peak-Glossary of Terms in Mass Spectrometry, publ. by Wiley, http://www.wiley.com/ legacy/wileychi/ms/news/glossary.html, (2011) 30) J. C. Lindon, G. E. Tranter, J. L. Holmes, Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry, vol (1-3), Academic Press (2000); WMA Niessen, Hyphen Mass Spec Consultancy, Leiden, Th e Netherland, 1404, “Mass Spectrometry, MS-MS and MSn“,(1999) 31) E. de Hoff man, J. Mass Spectrometry, Vol 31, 129, “Tandem Mass Spectrometry: A Primer“ (1996) 32) J. C. Lindon, G. E. Tranter, J. L. Holmes, Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry, vol (1-3), Academic Press (2000); H-F Grutzmacher, Mass Spectrometry, Fragmentation in Mass Spectrometry, 637, Universitat Bielefeld, Germany, (1999) 33) J. M. Wells, S.A. McLuckey „Collision-Induced Dissociation (CID) of Peptides and Proteins“. Meth. Enzymol. 402, 148, (2005) 34) H. J. Cooper, K. Hakansson, A. G. Marshall, „Th e Role of Electron Capture Dissociation in Biomolecular Analysis“, Mass Spectrom. Rev. 24, 201, (2005) 35) IUPAC gold book defi nition of metastable ion (in mass spectrometry) 36) IUPAC gold book defi nition of transient (chemical) species 37) L. Sleno, D. A. Volmer, „Ion Activation Methods for Tandem Mass Spectrometry“. J. Mass Spectrom. 39 ,10,1091, (2004) 38) K.K. Murray, J. Chromatogr. A 1217, 3922, Glossary of Terms for Separations Coupled to Mass Spectrometry, (2010) 39) A. Mallet, S.Down, Dictionary of Mass Spectrometry, John Wiley &Sons,Chicester, (2009) 40) F. W. McLaff erty, F. Tureček, Interpretation of Mass Spectra, University of Science Books, Sausalito, California, (1992) 41) N.C. Contino, E. E. Pierson, D. Z. Keifer, M. F. Jarrold, “Charge Detection Mass Spectrometry with Resolved Charge States”, J.Am.Soc.Mass Spectrom. 24 ,101, (2013) 42) V. T. Andriole, Th e Quinolones, 3rd edition, Academic Press, London, (2000) 43) L. J. Ming, “Structure and Function of Metalloantibiotics”, Med. Res. Rev. 6,697, (2003) 44) Y. Kawai, K Matsubayashi, H. Hakusui, “Interaction of Quinolones with Metal Cations in Aqueous Solution”, Chem. Pharm. Bull. 44, 1425, (1996) 45) D. L. Ross, C. M. Riley, „Aqueous Solubilities of Some Various Substituted Quinolone Antimicrobials“, Intern.J. Pharm. 63, 237, (1990) 46) S. Lecomte, M. H. Barton, M. T. Chenon, C. Coupry, N. J. Moreau, „Eff ect of Magnesium Complexation by Fluoroquinolones on Th eir Antibacterial Properties“, Animicrob. Agents Chemother. 38, 2810, (1994) Mр Mирјана Р. Цвијовић 156 47) G. Palu, S. Valisena, G. Ciarrocchi, B. Gatto, M.Palumbo, „Quinolone Binding to DNA is Mediated by Magnesium Ions“, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9671, (1992). 48) J. H. Borrell, M. T. Montero, „Calculating Microspecies Concentration of Zwitterion Amphoteric Compounds: Ciprofl oxacin as Example“, J. Chem. Educ. 74, 11, 1311, (1997) 49) K. T. Novak, B. Noszal, I. Hermecz, G. Kereszturi, B. Podanyi, G. Szasz, „Protonation Equilibria of Quinolone Antibacterials“, J. Pharm. Sci. 79, 11, 1023, (1990) 50) Z. Qiang, C. Adams, „Potentiometric Determination of Acid Dissociation Constants (pKa) for Human and Veterinaty Antibiotics“, Waters Research, 38, 2874, (2004) 51) H. R. Park, T. H. Kim, K. M. Bark, „Physicochemical properties of Quinolone Antibiotics in Various Environments“, Eur. J. Med. Chem. 37, 443, (2002). 52) P. Т. Đurđević, М. Ј. Stankov, D. Stankov „Fluorescence Reaction and Complexation Equilibria Between Norfl oxacin and Aluminium(III)-Ion in Chloride Medium“, Anal. Chim. Acta 300, 253, (1995) 53) G. Popović, LJ. Milovanović, V. Kapetanović, „Study od Acido-Base Equilibria of Fleroxacin“, J. Pharm. Biomed. Anal. 18, 859, (1998) 54) Moxifl oksacine Bayer, AG, Busness, GROUP Pharma, Marketing Authorization Application, Data on File, November (2000) 55) M. H. Langlois, M. Montagut, J. P. Dubost, J. Grellet, M. C. Saux, „Protonation Equilibrium and Lipophilicity of Moxifl oxacin“, J. Pharm. Biomed. Anal. 37, 389, (2005) 56) D. A. Allemandi, F. Alovero, R. H. Manzo, „Formulation of a Neutral Solution of Ciprofl oxacin upon Complexation with Aluminum“, Il Farmaco 54, 758, (1999) 57) P. G. Higgins, A. C. Fluit, F-J. Schmitz, “Fluoroquinolones: Structure and Target Sites”, Current Drug Targets, 4, 181, (2003) 58) M. J. P. Melo, F. R. Varanda, R. Dohrn, I. M. Marrucho, “Solubility of Ciprofl oxacin and Moxfi loxacin in Diff erent Solvents: Th e Eff ect of the HCl Group”, 2nd Mercosur Congress on Chemical Engineering, 4th Mercosur Congress on Process Systems Engineering, Enpromer,14th–18th August, Brasil, 1-5 59) Y. Wang, K. Yu, S. Wang, „Vibrational Spectra Study on Quinolones Antibiotics“, Spectrochim. Acta Part A, 65, 159, (2006) 60) P.Т. Đurđević, М. Ј. Stankov, Ј. Оdović, „Study of Solution Equilibria Iron(III) Ion and Ciprofl oxacin in Pure Nitrate Ionic Medium and Micellar Medium“, Polyhedron 19, 1085, (2000) 61) C. M. Riley, D. L. Ross, D. Vander Velde, F. Takusagawa, “Characterization of the Complexation of Fluoroquinolone Antimicrobials with Metal Ions by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy”, J. Pharm. Biomed. Anal.11, 49, (1993) 62) A. K. Chattah, Y. G. Linck, G. A. Monti, P. R. Levstein, S. R. Breda, R. H. Manzo, M. E. Olivera, “NMR and IR Characterization of the Aluminum Complexes of Norfl oxacin and Ciprofl oxacin Fluoroquinolones”, Magnetic Res. Chem. 45, 850, (2007) 63) M. Sakai, A. Hara, S. Anjo, M. Nakamura, “Comparison of the Complexation of Fluoroquinolone Antimicrobials with Metal Ions by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy”, J. Pharm. Biomed. Anal. 18,1057, (1999) 64) T.J.Yoshikawa, S. Rajagopalan, Antibiotic Th erapy for Geriatric Patients; T.J. Marrie and S. Fryters,” Quinolones”, 167, Taylor & Francis Group,(2006) 65) I. Filipović, S. Lipanović, Opća i anorganska kemija, I i II dio, Školska knjiga, Zagreb, (1985) 66) J.M.Elders,PHD thesis ,Th e University of Leeds, “NMR Studies of the Polymeric Cations Produced by the Hydrolysis of Aqueous Aluminium (III) Salt Solutions”(1986) 67) G. Berthon (Ed.), Handbook of Metal-Ligand Interactions in Biological Fluids. Bioinorganic Chemistry. Vols. I and II. Marcell Dekker, N.Y. (1995) Докторска дисертација 157 68) A. Martell, R. D. Hancock, R. M. Smith, R. J. Motekaitis. Coord. Chem. Rev. 149, 311, ”Coordination of Al (III) in the Environment and in Biological Systems“ (1996) 69) A. E. Martell, R. J. Motekaitis, R. M. Smith. Polyhedron, 9, 171 “Aluminium complexes of hydroxyaliphatic and hydroxyaromatic ligands in aqueous systems—some problems and solutions” (1990) 70) R. J. P. Williams, Coord. Chem. Rev. 149, 1, ”Aluminium and Biological Systems: An Introduction” (1966) 71) T. Kiss, T. Jakusch, M. Kilyen, E. Kiss, A. Lakatos, Polyhedron, 19, 2389, “Solution Speciation of Bioactive Al(III) and VO(IV) Complexes” (2000) 72) Aluminum Compounds, Review of Toxicological Literature, Integrated Laboratory Systems, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, North Carolina (2000). 73) S. Dayde, D. Champmartin, P. Rubini, G. Berthon. Inorg. Chim. Acta, 339, 513,”Aluminium Speciation Studies in Biological Fluids. Part 8. A Quantitative Investigation of Al(III)–Amino Acid Complex Equilibria and Assessment of Th eir Potential Implications for Aluminium Metabolism and Toxicity” (2002) 74) F. J. C. Rossotti, H. Rossotti. Th e Determination of Stability Constants, McGraw Hill Inc. New York, 58, (1961) 75) Th e Merck Manual of Diagnosis and Th erapy, 19th Edition, Merck & Co. New Jersey, (2003) 76) P. Bulat. „Uticaj metala na metabolizam glutationa u eritrocitima pri profesionalnom ekspoziciji“, Doktorska disertacija, Medicinski fakultet Beograd, (1994) 77) S. Dayde, V. Brumas, D. Champmartin, P. Rubini, G. Berthon. J. Inorg. Biochem ,97,1, 104, Aluminum Speciation Studies in Biological Fluids: Part 9. A Quantitative Investigation of Aluminum(III)–Glutamate Complex Equilibria and Th eir Potential Implications for Aluminum Metabolism and Toxicity (2003) 78) P. L. Hayden, A. J. Rubin, In Aqueous Environmental Chemistry of Metals, 317. ed. A. J. Rubin, Ann Arbor Science Publishers: Ann Arbor, MI, (1976),Chemistry of Metals, 317. ed. A. J. Rubin, Ann Arbor Science Publishers: Ann Arbor, MI, (1976) 79) A. Sarpola, Th e Hydrolysis of Aluminum, a Mass Spetrometric Study, PhD Th esis, University of Oulu, Finland, Acta Univ. Oul. C 279, 1, (2007) 80) T. Urabe, T. Tsugoshi, M. Tanaka, J. Mol. Liq. 143, 70, “Electrospray Ionization Mass Spectrometry Investigation of the Blocking Eff ect of Sulfate on the Formation of Aluminum Tridecamer”,(2008) 81) T. Urabe, M.Tanaka, S. Kumakura, T. Tsugoshi, J. Mass. Spectrom. 42, 591, “Study on chemical speciation in aluminum chloride solution by ESI-Q-MS“ (2007) 82) J. Y. Bottero, J. M. Cases, F. Fiessinger, J. E. Poirier, J. Phys. Chem. 84, 2933, “Studies of Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions. 1. Nature of Aluminum Species and Composition of Aqueous Solutions”(1980) 83) H. Zhao, H.Liu, J. Qu, J. Coll. Intef. Sci. 330, 105, “Eff ect of pH on the aluminium salt hydrolysis during coagulation process: Formation and decomposition of polymeric aluminum species” (2009) 84) P. A. D’Agostino, J. R. Hancock, L. R. Provost, Rapid Commun.Mass Spectrom. 9, 1038, “Electrospray Mass Spectrometric Characterization of Fluoroquinolone Antibiotics: Norfl oxacin, Enoxacin, Ciprofl oxacin and Ofl oxacin“, (1995) 85) J. Zhang, J. Wang, J. S. Brodbelt, J. Mass Spectrom. 40,350, “Characterization of Flavonoids by Aluminium Complexation and Collisionally Activated Dissociation”, (2005) 86) V. B. Di Marco, G. G. Bombi, M. Tubaro, P. Traldi, “Electrospray Mass Spectrometry in the Studies of Aluminium(III)-ligand Solution Equilibria”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 17,2039, (2003) Mр Mирјана Р. Цвијовић 158 87) D. L. Ross, C. M. Riley, Intern. J. Pharm. 87, 203, “Physicochemical Properties of Fluoroquinolone Antimicrobals III. Compexation of Lomefl oxacin with Various Metal Ions and the Eff ect of Metal Ion Complexation on Aqueous Solubility” (1992) 88) E. J. Alvarez, V. H. Vartanian, J. S. Brodbelt, Anal. Chem. 69, 1147, “Metal Complexation Reaction of Quinolone Antibiotics in Quadrupole Ion Trap”, (1997) 89) R. E. March, H. Li, O. Belgacem, D. Papanstasion, Internat. J. Mass Spectrom. 262, 51, “High Energy and Low Energy Collision Induced Dissociation of Protonated Flavonoids Generated by MALDI and by ESI”, (2007) 90) M. Brindell, S.K.C. Elmorth, G.Stochel, Journ. Inorg. Biochem. 98, 1367,„Mechanism of Information of the Reaction of Cis and Trans [RuCl2(DMSO)4] with d(T2GGT2) derived from MALDI TOF and HPLC studies“, (2004) 91) M. Petković, A. Vujačić, J. Schiller, Ž. Bugarčić, J. Savić, V. Vasić, Rapid Commun. Mass Spectrom. 23:1467, “Application of Flavonoids-Quercetin and Rutin-as New Matrices for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometric Analysis of Pt(II) and Pd(II) Complexes”, (2009) 92) M. Petković, B. Petrović, J. Savić, Ž.D. Bugarčić, J. Dimitrić-Marković, T. Momić, V. Vasić, Internat.J. Mass Spectrom. 290, 39, “Flavonoids as Matrices for MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Transition Metal Complexes” (2010) 93) Xcalibur version 2.0.7,Th ermo Scientifi c, (2008) 94) C. F. Baes, R. E. Mesmer; Th e Hydrolysis of Cations, John Wiley & Sons, New York, (1976) 95) A. Sarpola, V. Hietapelto, J. Jalonen, J. Jokela, R. S. Laitinen, J. Mass Spectrom. 39, 423, “Identifi cation of the hydrolysis products of AlCl3·6H2O by electrospray ionization mass spectrometry” (2004) 96) M.Ćirišan, Određivanje Štarkovih parametara spektralnih linija Xe II u plazmi impulsnog luka, Magistarski rad, Univerzitet u Novom Sadu, (2006) 97) J. K Patel, C. B. Read,. Handbook of the Normal Distribution. New York: Dekker, (1982) 98) M. Dimitrijević, Analiza Štarkovih linija argona, Magistarski rad, Univerzitet u Beogradu, Fizički fakultet (1976) 99) http://www.mathworks.com/product/neural-network/ 100) M. Milivojević, S. Stopić, B. Friedrich, B. Stojanović, D. Drndarević, “Computer Modeling of High Pressure Leaching Process of Nickel Laterite by Design of Experiments and Neural Networks”, Inter. J. Min. Matall. Mater. 19, 7, 584, (2012) 101) D. Drndarević, “Modelovanje i optimizacija procesa metalurgije praha pomoću neuronskih mreža”, Doktorski rad, Mašinski fakultet, Beograd, (1996) 102) M. Milivojević , D. Drndarević, S. Stopić, V.Simić, B. Stojanović, Modeling stell annealing process based on BP Neural Network, 3-ći. SED 2010, Uzice, (2010) 103) Veysey, K. Harrata, Finnigan LCQ Advantage-Training Manual, Iowa State University (2006) 104) www.lamondlab.com/.../MassSpectrometry/charge state... 105) Y.-H. Tseng, C. Uetrecht, A. J. R. Heck, W.-P. Peng, Anal. Chem. 83 (6), 1960,” “Interpreting the Charge State Assignment in Electrospray Mass Spectra of Bioparticles” (2011) 106) M. Rainer, M. N. Qureshi, G. K. Bonn, Anal. Bioanal. Chem. 400, 2281, ”Matrix Free and Material Enhanced Laser Desorption/Ionization mass Spectrometry for the Analysis of Low Molecular Weight Compounds”, (2011) 107) J. W. Morgan, J. M. Hettick, D. H. Russell „Peptide Sequencing by MALDI 193-nm Photodissociation TOF MS“, Meth. Enzymol. 402, 186, (2005) 108) V. A. Nazarenko, V. P. Antonovich, E. M. Nevskaya,” Gidroliz Ionov Metallov v Razbavlennykh Rastvorakh”, Atomizdat, Moscow, (1979) Докторска дисертација 159 109) P. L. Hayden, A. J. Rubin,”Systematic Investigation of the Hydrolysis and Precipitation of Aluminum (III)-ion”, In Aqueous Environmental Chemistry of Metals, Ann Arbor Science Publishers: An Arbor, MI, (1974) 110) C. Orvig, “Th e Aqueous Coordination Chemistry of Aluminum”, In Coordination Chemistry of Aluminum, 85, Ed. G. H. Robinson, VCH Publishers, New York, (1993) 111) V. B. Di Marco, L. Ravenue, A. Dean, P. Traldi, “Perturbations Produced by Electrospray Ionization Mass Spectrometry in Speciation of Aluminium (III) 1,6 dimethyl -4-hydroxy- 3-pyridinecarboxylate Aqueous Solutions”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 24,868, (2010) 112) A. Sarpola, V. Hietapelto, J. Jalonen, J. Jokela, R. S. Laitinen, J. Rämö, J. Mass. Spectrom. 39, 1209, “Identifi cation and Fragmentation of Hydrolyzed Aluminum Species by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry “(2004) 113) A. Sarpola, H. Hellman, V. Hietapelto, J. Jalonen, J. Jokela, J. Rämö, J. Saukkoriipi, Polyhedron, 26, 2851, “Hydrolysis products of water treatment chemical aluminium sulfate octadecahydrate by electrospray ionization mass spectrometry “, (2007) 114) http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/mplus2 115) P. M. Bertsch, D. R. Parker, “Aqueous Polynuclear Aluminum Species”, In Th e Environmental Chemistry of Aluminum, 117, ed. G. Sposito, CRC Press, Inc. Lewis Publishers, Boca Raton, FL, (1996) 116) G. Fu, L. F. Nazar, A. D. Bain, Chem. Mater. 3, 602, Aging processes of alumina sol-gels: Characterization of New Aluminum Polyoxycations by Aluminum-27NMR spectroscopy (1991) 117) W. H. Casey, J. R. Rustad, Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 21, “Reaction dynamics, molecular clusters, and aqueous geochemistry”. (2007) 118) D. K. Nordstrom, H. M. May, “Aqueous Equilibrium Data for Mononuclear Aluminum Species”, In Th e Environmental Chemistry of Aluminum, 39. ed: G. Sposito, CRC Press, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (1996) 119) V. B. Di Marco, G. G. Bombi, S. Zambon, P.Traldi, J. Mass Spectrom. 44, 120, “Metal- Ligand Solution Equilibria Studied by Electrospray Ionisation Mass Spectrometry –Eff ect on Instrumental Parameters”,(2009) 120) J. W. Akitt, J. M. Elders, Bull. Soc. Chim. Fr. 10, (1986) 121) J. W. Akitt, J. M. Elders, J. Chem. Soc. Dalton. Trans. 1347, Multinuclear magnetic resonance studies of the hydrolysis of aluminium(III). Part 8. Base hydrolysis monitored at very high magnetic fi eld (1988) 122) J. W. Akitt, A. Farthing, J. Chem. Soc. Dalton. Trans., 1606, “Aluminium-27 nuclear magnetic resonance studies of the hydrolysis of aluminium(III). Part 5. Slow hydrolysis using aluminium metal” (1981) 123) J. W. Akitt, Progr. Nucl. Magn. Res. Spectrosc. 21, 1,(1989) 124) J. W. Akitt, N. N. Greenwood, B. L. Khandelwal, G. D. Lester , J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1972, 604, 27Al nuclear magnetic resonance studies of the hydrolysis and polymerisation of the hexa-aquo-aluminium(III) cation (1972) 125) J. A.Tossell, J. Magn. Reson. 135, 203, Th e Eff ects of Hydrolysis and Oligomerization upon the NMR Shieldings of Be+2and Al+3Species in Aqueous Solution (1998) 126) J. F. Keggin, Proc. R. Soc. Lond. 144, 75. “Structure and formula of 12-phosphotungstic acid” (1934) 127) J. F. Keggin, Nature, 131, 908, “Structure of the molecule of 12-phosphotungstic acid” (1933) 128) S. Bi, C. Wang, Q. Cao, C. Zhang, Coord. Chem. Rev. 248, 441, Studies on the mechanism of hydrolysis and polymerization of aluminum salts in aqueous solution: correlations between the “Core-links” model and “Cage-like” Keggin-Al13 model (2004) Mр Mирјана Р. Цвијовић 160 129) B. Shi, G. Li, D. Wang, H. Tang, Sep. Purif. Technol. 54, 88, Separation of Al13 from polyaluminum chloride by sulfate precipitation and nitrate metathesis. (2007) 130) J.Y Bottero, M. Axelos, D. Tchoubar, J. M Cases, J. J. Fripiat, F. Fiessinger, J. Colloid Inter. Science, 117, 47, Mechanism of formation of aluminum trihydroxide from keggin Al13 polymers, (1987) 131) D. J. Wesolowski, D. A. Palmer, Geochim. Cosmochim. Acta 58, 2947, Aluminum speciation and equilibria in aqueous solution: V. Gibbsite solubility at 50°C and pH 3–9 in 0.1 molal NaCl solutions (a general model for aluminum speciation; analytical methods) (1994) 132) D. A. Palmer, D. J. Wesolowski, Geochim. Cosmochim. Acta 57, 2929, Aluminum speciation and equilibria in aqueous solution: III. Potentiometric determination of the fi rst hydrolysis constant of aluminum(III) in sodium chloride solutions to 125°C (1993) 133) W. Stumm, J. J. Morgan, Aquatic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, (1981) 134) R. C. Turner, Can. J. Chem. 54, 1910, A second species of polynuclear hydroxyaluminum cation, its formation and some of its properties, (1976) 135) P. L. Brown, R. N. Sylva, G. E. Batley, J. Ellis, J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1967, Th e hydrolysis of metal ions. Part 8. Aluminium (III), (1985) 136) P. L. Hayden, A. J. Rubin, In Aqueous-Environmental Chemistry of Metals; Rubin, A. J. ed.; Ann Arbor Science Publishers: Ann Arbor, MI, 317(1976) 137) L.-O Öhman, S. Sjöberg, Coord. Chem. Rev. 149, 33, “Th e experimental determination of thermodynamic properties for aqueous aluminium complexes”(1996) 138) N. B. Milić, Ž. D. Bugarčić, P. T. Djurdjević, Canad. J.Chem. 69, 28, Hydrolysis of aluminum(III) ion in sodium nitrate medium (1991) 139) P. Cañizares, F. Martínez, C. Jiménez , J. Lobato , M. A. Rodrigo Ind. Eng. Chem. Res., 45 , 8749, Comparison of the Aluminum Speciation in Chemical and Electrochemical Dosing Processes ,(2006) 140) W. O. Parker, R. Millini, I. Kiricsi, Inorg. Chem. 36, 571, Metal Substitution in Keggin-Type Tridecameric Aluminum−Oxo−Hydroxy Clusters (1997) 141) V. B. Di Marco, G. G. Bombi, M. Ranaldo, P. Traldi, ”Metal-ligand Solution Equlibria Studied by Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Correlation between Ion Intensity and Acid-base Equilibria in Solution”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 21,3825,(2007) G. Johansson, Acta Chem. Scand. 14, 771, Th e Crystal structure of some basic aluminum salts (1960) 142) V. Hopfgartner, E. Varesio, V. Tschappat, C. Grivet, E. Bourgogne, L. A. Leuthold, J. Mass Spectrom. 39, “Triple Quadrupole Linear Ion Trap Mass Spectrometer for the Analysis of Small Molecules and Macrolmolecules”, (2004) 143) B. Urbaniak, Y. Mrestani, Z. J. Kokot, R. H. Neubert, “Investigation of Interaction of Fluoroquinolones with Aluminum, Iron and Magnesium Using Capillary Zone Electrophoresis”, Chromatographia 65, 489, (2007) 144) S. C. Wallis, B. G. Charles, L. R. Gahan, L. J. Filippich, M. G. Bredhauer, P. A. Duckworth, “Interaction of Norfl oxacin with Divalent and Trivalent Pharmaceutical Cations. In vitro Complexation and in vivo Pharmacokinetic Studies in the Dog”, J. Pharm. Sci. 85, 803, (2000) 145) Z. F. Chen, R. G. Xiong, J. L. Zuo, Z. Guo, X. G. You, H. K. Fun, “X-ray Crystal Structure of Mg2+ and Ca2+ Dimmers of the Antibacterial Drug Norfl oxacin”, J. Chem. Soc. Dalton Trans. 4013, (2000) 146) I. Turel, “Th e Interactions of Metal Ions with Quinolone Antibacterial Agents”, Coord. Chem. Rev. 232, 27, (2002) 147) P. Neta, B. Godugu, Y Liang, Y. Smanso, X. Zang, S. E. Stein, ”Electrospray Tandem Quadrupole Fragmentation of Quinolone Drugs and Related Ions. On the Reversibility of Water Loss from Protonated Molecules”, Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3271, (2010) Докторска дисертација 161 148) A Serafi n, A Stanczak Th e Complexes of Metal Ions with Fluoroquinolones, Russ. J. Coord. Chem. 35: 81-95. (2009) 149) P. Т. Đurđević, LJ. Joksović, R. Jelić, A. Đurđević М. Ј. Stankov, Chem. Pharm. Bull. 55,1689, “Solution Equilibria between Aluminium(III) ion and Some Fluroquinolone Family Members (2007) 150) B. Urbaniak, Z. J. Kokot, Analytica Chimica Acta 647, 54, ”Analysis of the Signifi cantly Infl uence the Stability of Fluoroquinolone–Metal Complexes,(2009) 151) P. Т. Đurđević, М. Ј. Stankov, „Study of Solution Equilibria Between Aluminum(III)-ion and Ofl oxacin“, J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 501, (1999) 152) P. Calza, C. Medana, F. Carbone, V. Giancotti, C. Baiocchi, Rapid Commun. Mass Spectrom, 22, 1533, Characterization of intermediate compounds formed upon photoinduced degradation of quinolones by high-performance liquid chromatography/high-resolution multiple-stage mass spectrometry, (2008) 153) T. LeRiche, J. Osterodot, D. A. Volner, Rapd Commun. Mass Spectrom. 15:6 08-614, “An Experimental Comparison of Electrospray Ion Trap and Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization Post –Source Decay Mass Spectra for the Characterization of Small Drug Molecules“, (2001) 153) K. Vishwanathan, M. G. Bartlett, J. T. Stewart, J. Pharm. Biomed. Anal. 30, 961 „Determination of Moxifl oxacin in Human Plasma by Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry“, (2002) 154) L. Pettit, J. K. Powell, Stability Constant Database and Mini-SCDatabase, Version 5.8, IUPAC and Academic Soft ware, Otley, UK, (2003) 155) R. M. Smith, A. E. Martell, R. J. Motekaitis, NIST Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes Database, Version 8.0. for Windows U.S. National Institute of Standards and Technology: Gaithersburg, MD, (2004) 156) D. J. Leggett (ed), Computational Methods for the Determination of Formation Constants 157) SC-database (IUPAC stability constants database) IUPAC and Academic Soft ware, Leeds, UK, (2004) 158) K. Vishwanathan, M. G. Bartlett, J. T. Stewart, J. Pharm. Biomed. Anal. 30, 961 „Determination of Moxifl oxacin in Human Plasma by Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry“, (2002) 159) M. F. Tuutunji, H. M. Ibrahim, M. H. Khabbas, L. T. Tutunji, J. Chromatogr. B, 877, 1689, Simultaneous determination of bisoprolol and hydrochlorothiazide in human plasma by HPLC coupled with tandem mass spectrometry (2009) 160) R.K. Boyd, C. Basic, R.A. Bethem, Trace Quantitative Analysis By Mass Spectrometry, John Wiley and Sons, New York, New York, April 2008. 161) E. M. Golet, A. C. Alder, A. Hartmann, T. A. Ternes, W. Giger, Anal.Chem.73, 3632, Trace determination of fl uoroquinolone antibacterial agents in urban wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography with fl uorescence detection (2001) Mр Mирјана Р. Цвијовић 162 7. ПРИЛОГ Снимљени су ESI MS спектри са различитoм мобилном фазом: ацетонитрилу и метанолу. Слика 1П: ЕSI МS спектри 2,7 x 10-5 mol/dm3 АlCl3 раствор, pH=3,594, 50 V Са Слике 1П се уочава да спектар на а) снимљен са ацетонитрилом има много већи број линија неголи б) спектар исте концентрације истог pH снимљен са метанолом. Докторска дисертација 163 Слика 2 П: ТIC хроматограм АlCl3 раствора чији су ЕSI MS спектри дати у поглављу Експериментални део. На Слици 2П уочава се да површине испод пикова у приказаним хроматограмима расту са порастом напона на конусу. ESI MS СПЕКТРИ Слика 3П. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1,3:1, pH=4,88,+esi, централна тачка Mр Mирјана Р. Цвијовић 164 Слика 4П. ESI MS спектар раствора CAl:CFlero=1,3:1, pH=4,88, -esi mod, централна тачка. На Слици 4П је спектар раствора концентрационог односа CAl:CFlero=1:1,3, pH= 4,88, снимљен у негативнома моду идентификују се хидролитичке врсте: 311.07 [Al4H8O10Cl]- тетрамерна хидролитичка врста, 286,93 [Al3H11O10Cl]- тримерна, 262,87 потиче од [Al2O2H2Cl5]- врсте. MALDI СПЕКТРИ Слика 5П: MALDI спектри: а) комплекс где је метал у великом вишку 10 Аl:1fl ero б) спектар подлоге Када је метал у великом вишку у односу на лиганд формира се само једна значајна врста m/z 763, чији интезитет износи 0,2х105 a. u. Слика 6П: MALDI спектар 1Аl:3cipro, pH =5,10 На Слици 6П уочава се да je нajзатупљенија врста AlL2 на m/z 687. Докторска дисертација 165 Табела 1.П. Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Ccipro=1:3, pH=4.99, CAl3+=2.7×10-4 mol/dm3 у смеши вода и метанол CID (еV) МS (abudance %) МS2 (abudance %) Разлика МS-МS2 МS 3 (abudance %) Разлика МS2-МS3 врсте 40 688,00 660,14 (100%) 641,14 562,67 363,87 28=CO или C2H4 47↕=19 126↕=79 (78) C6H6 325↕=199 660,86(100%) 643,14↕=17,72 17 =OH AlL2 + 80 688,00 660,60 (100%) 27,4 ≈CO или C2H4 674,50↕=14 660,67(100%)↕17=OH 643,10↕=8 635,18↕=270 365,31 17,5↕7,92 25,42 295,3 AlL2+ 100 688,00 660,60 (100%) 27,4 ≈CO или C2H4 660,63 643,36=17,27 356,66 =303,94 28=CO или C2H4 44,64=CO2 332,34 AlL2+ 30→45 за MS3 опсег 190-1300 700,00 688,28 657,09 630,80 (100) 612,95 483,57 380,83 331,98 230,81 12↕=31 43↕=27 70 88↕=18=H2O 217↕=129 320↕=103 369↕=49 470↕=101 630,86(100%) 613,00↕=17,86=H2O 592,77↕=21 380,78↕=212 363,27↕=17=OH 313,25↕=50 17,8=H2O 38,13 250,12 267,63 317,65 30 993,00 976,02 860,41 828,69 821,05 677,29 661,77 17=OH 133 165 172 316 332 636,76 348,29 332,04 287,04 AlL3+ 35 1057,22 1029,69 1013,02(100%) 725,41 686,98 28=CO2↕16,7 44=CO2 332 370↕38 AlL3+ Табела 2П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Ccipro =1:3, концентација CAl3+=10-5 mol/dm3, pH =5,26 CID (еV) МS (%) (abudance) МS2 (abudance %) Разлика МS-МS2 МS 3 (abudance %) Разлика МS2-МS3 pH/ species 35 346,00 332,04 314,11 302,10 14↕18= H2O 32↕12 44=CO2 AlL22+ 30 687,00 667,09 20 AlL2+ 35 687,00 660,51604,11 27↕56 83 AlL2 + 40 687,00 667,17 660,52 (100%) 604,25 20 27 83↕56 549,98 (100%) 110,52 AlL2+ 35 716,00 703,03 689,07 672,00 628,05 605,05 13 27 44=CO2 88 111↕23 Mр Mирјана Р. Цвијовић 166 Табела 3П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Cfl ero=2:1, pH=4.26, CAl3+ = 2,7×10-5 mol/dm3 CID (еV) МS (abudance %) МS2 (abudance %) Разлика МS-МS2 МS3 (abudance %) Разлика МS2-МS3 55 215,50 202,29193,44 13,21 22,06↕9 30 382,00 372,13 368,80 358,87 348,87 10,13 13,2 23,13 33,13 78 429,90 422 403,60 397,80 385,67 26,0↕ 18=H2O 32,1 44,23 Табела 4П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Cfl ero=2:1, pH=5,06, CAl3+ = 2,7×10-5 mol/dm3 CID (еV) МS (%) (abudance) МS2 (abudance %) Разлика МS-МS2 МS3 (abudance %) 100323-10 Разлика МS2-МS3 30 255.20 246,20 (100%)237,53 9 17,7=H2O 240,48 (100%) 237,61 215,46 202,36 193,51 184,66 5,65 8,59 30,74 43,84 52,69 61,54 30 430.00 421,87 412,00 404,00 8,13 18=H2O 26,0 Табела 5П: Тандем масена спектрометрија раствора CAl:Cfl ero=1:1, pH = 5,06, CAl3+ = 2,7×10-5 mol/dm3 CID (еV) МS (abudance %) МS2 (abudance %) Разлика МS-МS2 МS3 (abudance %) Разлика МS2-МS3 pH /врсте 35 763,02 (100) 743,22 (100) 736,70 719,27 715,28 690,13 687,40 675,36 627,20 19,78 26,3 43,73=CO2 47,72 72,87 75,6 87,64 135,8 45 763,25 (100) Докторска дисертација 167 ЕSI MS спектри хидролизе алуминијум(III)-јона Taбела 6 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,192, 50V HIDROLIZA-3PH=3,192+50 10 (0.352) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.1933 4.05e6 10.74 0.81 2: 41.6177 3.51e7 92.87 6.98 3: 42.7831 2.76e7 73.07 5.49 4. 43.8190 1.3e7 30.02 2.26 5. 44.8549 6.94e6 18.39 1.38 6: 45.9556 1.22e6 3.24 0.24 7: 50.5526 1.20e6 3.18 0.24 8: 52.6246 1.09e7 28.82 2.17 9: 54.6965 7.87e6 20.85 1.57 10: 56.5742 2.33e7 61.73 4.64 11: 58.3872 2.20e7 58.38 4.39 12: 60.5239 3.25e7 21.58 6.47 13: 62.5312 8.14e6 7.52 1.62 14: 64.6032 2.84e6 1.52 0.56 15: 66.0925 5.74e5 7.29 0.11 16: 66.7400 2.84e6 99.99 0.55 17: 68.6178 5.74e5 6.08 7.51 18: 69.9129 2.75e6 17.25 0.46 19: 71.5964 3.77e7 17.33 1.30 20: 72.1792 2.29e6 7.33 0.55 21: 72.4382 2.17e6 5.76 0.43 22: 72.7620 15.0e6 3.96 0.30 23: 72.8915 2.17e6 2.02 0.15 24: 73.6685 1.50e6 9.89 0.74 25: 74.8989 7.63e5 1.15 0.09 26: 76.6472 3.73e6 73.34 5.51 27: 78.4604 4.98e6 13.21 0.99 28: 79.1727 1.15e6 3.05 0.23 29: 80.5373 5.21e6 13.79 1.04 30: 82.6694 5.56e6 14.73 1.11 31: 83.7703 5.48e5 1.45 0.11 32: 84.4179 4.33e6 11.47 0.86 33: 85.8425 5.67e5 1.50 0.11 34: 86.4253 1.97e6 5.21 0.39 35: 88.6271 2.85e6 7.55 0.57 36: 90.6346 1.82e6 4.83 0.36 37: 92.6421 3.41e6 9.03 0.68 38: 93.2896 4.88e5 1.29 0.10 39: 94.7143 2.98e6 7.91 0.59 40: 96.6571 2.53e6 6.69 0.50 41: 98.6647 З.З8е6 8.95 0.67 42: 100.6722 1.62e6 4.30 0.32 43: 101.5141 1.24e6 3.29 0.25 44: 101.7084 1.53e6 4.06 0.31 45: 102.6151 5.36e6 14.21 1.07 46: 104.6874 2.60e6 6.90 0.52 47: 105.7884 4.24e5 1.12 0.08 48: 106.7598 1.48e6 3.93 0.30 49: 108.7027 1.48e6 3.92 0.29 50: 110.9046 1.48e6 3.93 0.30 51: 112.1998 3.82e5 1.01 0.08 52: 112.6532 1.64e6 4.36 0.33 53: 114.6609 1.64e6 4.34 0.33 54: 116.6685 2.48e6 6.56 0.49 55: 117.8343 4.36e5 1.16 0.09 56: 118.8058 1.40e6 3.71 0.28 57: 120.7487 5.36e6 14.20 1.07 59: 122.7565 2.43e6 6.44 0.48 59: 123.7927 3.97e5 1.05 0.08 60: 124.8290 8.87e5 2.35 0.18 61: 126.7720 5.26e5 1.39 0.10 62: 128.7797 1.12e6 2.98 0.22 63: 64: 130.7875 6.50e5 1.72 0.13 131.6943 4.22e5 1.12 0.08 65: 132.7953 1.41e6 3.74 0.28 66: 134.8031 2.46e6 6.52 0.49 67: 136.8757 1.16e6 3.07 0.23 68: 138.7540 1.71e6 4.52 0.34 69: 140.8267 4.15e6 11.00 0.83 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 142.8993 7.05e5 1.87 0.14 71: 144.7777 4.36e5 1.16 0.09 72: 146.9151 5.68e5 1.51 0.11 73: 148.9230 7.29e6 19.32 1.45 74: 149.9594 6.00e5 1.59 0.12 75: 150.9310 5.67e5 1.50 0.11 76: 152.8741 8.69e5 2.30 0.17 77: 155.0116 6.54e5 1.73 0.13 78: 156.9548 7.11e5 1.88 0.14 79: 158.8333 1.70e6 4.50 0.34 80: 160.8413 5.28e5 1.40 0.11 81: 162.9788 5.36e5 1.42 0.11 82: 164.7277 8.40e5 2.23 .0.17 83: 166.8653 5.35e5 1.42 0.11 84: 168.9381 3.98e5 1.05 0.08 85: 170.8167 4.81e5 1.27 0.10 86: 174.8328 9.01e5 2.39 0.18 87: 176.9057 4.07e5 1.08 0.08 88: 177.9421 3.78e5 1.00 0.08 89: 178.9786 5.13e5 1.36 0.10 90: 180.9867 4.01e5 1.06 0.08 91: 182.8653 4.68e5 1.24 0.09 92: 184.7439 5.44e5 1.44 0.11 93: 187.0111 4.98e5 1.32 0.10 94: 190.8331 1.29e6 3.40 0.26 95: 192.8413 6.18e5 1.64 0.12 96: 194.7848 4.00e5 1.06 0.08 97: 195.8213 4.08e5 1.08 0.08 98: 196.9873 4.29e5 1.14 0.09 99: 198.0238 4.58e5 1.21 0.09 100: 198.9956 8.03e5 2.13 0.16 101: 200.7447 6.63e5 1.76 0.13 102: 203.0121 5.19e5 1.37 0.10 103: 206.8343 4.96e5 1.31 0.10 104: 208.9721 4.38e5 1.16 0.09 105: 210.9804 3.97e5 1.05 0.08 106: 212.9239 3.95e5 1.05 0.08 107: 216.8110 4.88e5 1.29 0.10 108: 218.9489 5.40e5 1.43 0.11 109: 220.8277 3.81e5 1.01 0.08 110: 222.8361 4.07e5 1.08 0.08 111: 226.9176 3.94e5 1.04 0.08 112: 230.8697 8.28e5 2.19 0.16 113: 232.8133 5.26e5 1.39 0.10 114: 234.8865 5.12e5 1.36 0.10 115: 236.8302 4.21e5 1.12 0.08 116: 238.9034 3.80e5 1.01 0.08 117: 251.9910 4.52e5 1.20 0.09 118: 257.1095 4.01e5 1.06 0.08 119: 276.8067 4.46e5 1.18 0.09 120: 308.7518 3.81e5 1.01 0.08 121: 324.6927 7.31e5 1.94 0.15 122: 364.8710 1.82e6 4.83 0.36 123: 380.8135 4.20e5 1.11 0.08 Mр Mирјана Р. Цвијовић 168 Taбела 7 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,594, 50V HIDROLIZA-2-PH=3,594+50 11 (0.387) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.193 31.48e6 3.66 0.49 2: 41.6427 2.29e7 56.67 7.66 3: 43.4305 1.90e7 47.08 6.36 4: 45.1787 3.56e6 8.82 1.19 5: 45.5671 2.17e6 5.37 0.73 6: 45.7614 1.85e6 4.57 0.62 7: 50.5526 1.01e6 2.51 0.34 8: 52.5598 6.73e6 16.65 2.25 9: 54.5670 2.30e6 5.69 0.77 10: 56.5742 8.51e6 21.07 2.85 11: 57.3512 2.91 e6 7.20 0.97 12: 57.8692 9.91 е6 24.53 3.31 13: 58.7757 1.88e6 4.66 0.63 14: 60.5239 4.04e7 100.00 13.51 15: 62.5312 5.86е6 14.50 1.96 16: 62.9844 1.09e6 2.70 0.37 17: 64.6032 8.61е5 2.13 0.29 18: 66.0925 5.52е5 1.37 0.18 19: 66.8695 7.37е5 1.83 0.25 20: 68.7473 4.81 е6 11.92 1.61 21: 69.8481 1.75е6 4.32 0.58 22: 71.5964 3.17е6 7.85 1.06 23: 71.9850 1.32е6 3.27 0.44 24: 72.3087 1.28е6 3.16 0.43 25: 73.6685 3.99е6 9.88 1.34 26: 76.6472 1.78е7 44.09 5.96 27: 78.1366 1.54е6 3.80 0.51 28: 78.5899 8.41 е6 20.81 2.81 29: 80.5976 3.11е6 7.69 1.04 30: 82.6694 2.60е6 6.43 0.87 31: 83.8998 8.96е5 2.22 0.30 32: 84.7416 7.47е5 1.85 0.25 33: 86.3606 1.03е6 2.56 0.35 34: 88.6271 1.35е6 3.35 0.45 35: 90.4403 5.06е5 1.25 0.17 36: 92.7716 1.70е6 4.20 0.57 37: 94.7143 2.23е6 5.51 0.75 38: 96.5924 1.88е6 4.66 0.63 39: 98.5999 1.25е6 3.09 0.42 40: 100.5427 8.56е5 2.12 0.29 41: 101.8379 2.85е6 7.05 0.95 42: 102.9389 4.14е5 1.03 0.14 43: 104.7522 1.74е6 4.30 0.58 44: 106.6303 9.77е5 2.42 0.33 45: 108.8322 5.09е5 1.26 0.17 46: 112.5884 5.51е5 1.36 0.18 47: 114.7256 1.28е6 3.16 0.43 48: 116.6685 1.36е6 3.38 0.46 49: 118.6762 6.14е5 1.52 0.21 50: 120.7487 4.31e6 10.66 1.44 51: 122.6917 2.11е6 5.21 0.70 52: 124.6994 4.94е5 1.22 0.17 53: 128.9093 4.15е5 1.03 0.14 54; 132.8601 1.10е6 2.71 0.37 55: 134.8031 1.43e6 3.54 0.48 56: 138.7540 2.59е6 6.42 0.87 57: 140.8267 3.18е6 7.86 1.06 58: 142.8345 4.27е5 1.06 0.14 59: 148.8583 1.26е6 3.12 0.42 60: 156.8901 1.32е6 3.26 0.44 61: 158.8333 1.37е6 3.40 0.46 62: 164.7277 7.08е5 1.75 0.24 63: 174.7680 5.32е5 1.32 0.18 64: 176.9705 4.86е5 1.20 0.16 65: 182.7357 5.12е5 1.27 0.17 66: 192.7766 4.35е5 1.08 0.15 67: 198.7364 1.87е6 4.62 0.62 68: 200.8094 6.48е5 1.60 0.22 69: 216.6815 7.16е5 1.77 0.24 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 218.7546 5.32e5 1.32 0.18 71: 234.7570 6.95e5 1.72 0.23 72: 364.8062 7.87e5 1.95 0.26 Докторска дисертација 169 HIDROLIZA-2-PH=3,594+50 11 (0.387) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.1933 3.69е6 10.81 1.38 2: 41.5529 3.41е7 100.00 12.73 3: 42.8478 2.78е6 8.16 1.04 4: 43.5600 9.10е6 26.66 3.39 5: 44.5960 7.32е5 2.15 0.27 6: 44.9844 2.96е6 8.66 1.10 7: 45.8261 1.42е6 4.17 0.53 8: 50.2289 4.50е5 1.32 0.17 9: 50.6174 8.62е5 2.53 0.32 10: 52.6246 6.04е6 17.71 2.25 11: 54.6317 2.69е6 7.87 1.00 12: 56.5095 1.97e7 57.87 7.37 13: 57.8692 3.84е6 11.25 1.43 14: 58.8404 5.09е5 1.49 0.19 15: 60.5239 1.69е7 49.49 6.30 16: 62.5312 8.49е6 24.87 3.17 17: 64.7975 7.69е5 2.25 0.29 18: 65.7687 4.38е5 1.28 0.16 19: 65.8982 5.47е5 1.60 0.20 20: 66.2220 6.77е5 1.99 0.25 21: 66.7400 1.19е6 3.48 0.44 22: 67.5170 4.66е5 1.36 0.17 23: 67.9703 1.21е6 3.55 0.45 24: 68.2941 1.47е6 4.32 0.55 25: 68.8768 7.15е5 2.10 0.27 26: 69.0711 4.86е5 1.43 0.18 27: 69.6539 2.89е6 8.46 1.08 28: 70.9489 6.1 Зе5 1.80 0.23 29: 71.7907 3.47е6 10.17 1.29 30: 73.6685 3.58е6 10.49 1.33 31: 76.5825 1.55е7 45.36 5.77 32: 78.5251 6.60е6 19.35 2.46 33: 80.5325 2.94е6 8.62 1.10 34: 81.2448 9.84е5 2.89 0.37 35: 81.5038 4.01е5 1.17 0.15 36: 82.6694 3.65е6 10.71 1.36 37: 83.6408 4.67е5 1.37 0.17 38: 84.4179 1.48е6 4.35 0.55 39: 85.6482 4.73е5 1.39 0.18 40: 86.4901 5.52е5 1.62 0.21 41: 86.8786 3.52е5 1.03 0.13 42: 88.1738 3.74е5 1.10 0.14 43: 88.6271 1.72е6 5.04 0.64 44: 90.7641 1.19е6 3.48 0.44 45: 92.7068 1.79е6 5.24 0.67 46: 94.7143 1.80е6 5.29 0.67 47: 96.5924 1.34e6 3.93 0.50 48: 98.4704 1.43е6 4.19 0.55 49 98.9237 4.56е5 1.34 0.17 50: 100.6075 8.72е5 2.56 0.33 51: 101.8379 2.26е6 6.61 0.84 52: 104.6874 1.62е6 4.75 0.60 53: 105.3998 3.94е5 1.16 0.15 54: 106.6303 1.64е6 4.82 0.61 55: 109.4798 5.20е5 1.52 0.19 56: 110.5160 7.79е5 2.28 0.29 57: 112.6532 1.23е6 3.59 0.46 58: 114.7256 9.27е5 2.72 0.35 59: 116.6685 2.99е6 8.76 1.12 60: 118.8058 5.96е5 1.75 0.22 61: 120.7487 2.78е6 8.16 1.04 62: 122Ј565 3.24е6 9.51 1.21 63: 124.1813 3.88е5 1.14. 0.14 64: 124.6347 6.76е5 1.98 0.25 65: 132.9249 4.99е5 1.46 0.19 66: 134.7384 1.ЗОе6 3.82 0.49 67: 138.8188 1.34е6 3.92 0.50 68: 140.7619 3.59е6 10.53 1.34 69: 142.8993 3.94е5 1.15 0.15 Taбела 8 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,594, 50V No Mass Inten %BPI %TIC 70: 148.9878 7.59e5 2.22 0.28 71: 150.6719 4.11e5 1.20 0.15 72; 156.8901 6.36e5 1.86 0.24 73: 158.8980 1.11e6 3.25 0.41 74: 160.8413 4.18e5 1.23 0.16 75: 164.7925 4.13e5 1.21 0.15 76: 176,9057 3.98e5 1.17 0.15 77: 194.8495 3.72e5 1.09 0.14 78: 198.8012 1.12e6 3.28 0.42 79: 200.8094 1.51 e6 4.43 0.56 80: 203.0121 3.75e5 1.10 0.14 81: 216.9406 4.53e5 1.33 0.17 82: 218.9489 6.27e5 1.84 0.23 83: 276.8716 3.61 e5 1.06 0.13 84: 364.8710 8.01e5 2.35 0.30 85: 380.8783 4.20e5 1.23 0.16 Mр Mирјана Р. Цвијовић 170 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 166.8005 1.06e5 1.08 0.12 71: 175.0271 2.32e5 2.36 0.25 72: 176.5818 1.28e5 1.30 0.14 73: 178.6547 2.06e5 2.10 0.23 74: 184.6143 1.62e5 1.65 0.18 75: 194.8495 3.39e5 3.45 0.37 76: 198.0238 3.37e5 3.43 0.37 77: 199.0603 1.82e5 1.86 0.20 78: 204.8260 1.87e5 1.91 0.21 79: 208.8425 9.98e4 1.02 0.11 80: 212.7944 2.34e5 2.38 0.26 81: 214.1548 1.16e5 1.18 0.13 82: 214.9971 1.04e5 1.06 0.11 83: 222.7713 3.76e5 3.83 0.41 84: 230.9993 1.46e5 1.49 0.16 85: 244.7993 1.09e5 1.11 0.12 86: 328.7104 1.26e5 1.28 0.14 Taбела 9 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,1mM, pH= 4,35, 50V HIDROLIZA-6-PH=4,35+50 13 (0.457) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.2580 6.89e5 7.02 0.76 2: 41.5529 4.42e6 45.02 4.86 3: 42.7831 4.31e5 4.39 0.47 4; 42.9773 8.39e5 8.54 0.92 5: 43.4953 3.99e5 4.06 0.44 6: 43.8838 1.50e6 15.30 1.65 7: 44.9197 3.12e5 3.18 0.34 8: 45.6966 1.06e6 10.75 1.16 9: 50.5526 1.36e5 1.38 0.15 10: 52.5598 3.27e6 33.27 3.60 11: 54.1138 2.56e5 2.61 0.28 12: 54.5670 7.92e5 8.07 0.87 13: 56.5095 1.47e6 15.01 1.62 14: 57.4807 2.32e6 23.68 2.56 15: 58.7109 1.21e5 1.23 0.13 16: 58.9052 3.10e5 3.16 0.34 17: 60.5239 3.21e6 32.72 3.54 18: 62.4664 4.85e5 4.94 0.53 19: 62.9197 1.20e5 1.22 0.13 20: 64.8622 2.31 e5 2.36 0.25 21: 65.5097 1.04e5 1.06 0.11 22: 66.3515 1.20e5 1.22 0.13 23: 68.6178 4.33e6 44.16 4.77 24: 70.0424 3.43e5 3.50 0.38 25: 71.0137 1.16e5 1.18 0.13 26: 71.2727 2.71e5 2.76 0.30 27: 71.9202 1.27e6 12.93 1.40 28: 72.8915 1.44e5 1.47 0.16 29: 73.0210 3.42e5 3.48 0.38 30: 73.6038 1.21e6 12.32 1.33 31: 74.8341 1.21e5 1.23 0.13 32: 76.5825 9.82e6 100.00 10.81 33: 78.5899 3.26e6 33.24 3.59 34: 80.5325 7.70e5 7.84 0.85 35: 82.6694 4.39e5 4.48 0.48 36: 83.0580 1.65e5 1.68 0.18 37: 84.4826 1.15e6 11.76 1.27 38: 85.7130 1.48e5 1.51 0.16 39: 86.8139 1.12e5 1.14 0.12 40: 88.3680 2.23e5 2.27 0.25 41: 88.8861 1.72e5 1.76 0.19 42: 90.5050 1.34e5 1.36 0.15 43: 92.6421 5.84e5 5.95 0.64 44: 94.7143 6.54e6 66.67 7.20 45: 96.5276 2.33e6 23.70 2.56 46: 98.5999 3.39e5 3.45 0.37 47: 98.9237 1.74e5 1.78 0.19 48: 101.7084 8.13e5 8.28 0.89 49: 104.8169 4.59e5 4.68 0.51 50: 106.5655 4.61e5 4.69 0.51 51: 108.7674 1.49e5 1.51 0.16 52: 112.7179 6.81e5 6.94 0.75 53: 114.5961 3.47e5 3.53 0.38 54: 116.7333 3.99e5 4.07 0.44 55: 117.8343 1.22e6 12.39 1.34 56: 119.7125 6.89e5 7.02 0.76 57: 120.8783 3.97e5 4.04 0.44 58: 124.7642 1.95e5 1.99 0.21 59: 129.7513 3.21e5 3.27 0.35 60: 132.7306 1.51e5 1.54 0.17 61: 140.8267 2.47e6 25.16 2.72 62: 142.0573 1.84e5 1.88 0.20 63: 142.7698 1.90e5 1.94 0.21 64: 148.5992 2.86e5 2.91 0.31 65: 148.9230 8.21e5 8.36 0.90 66: 150.8662 1.44e5 1.47 0.16 67: 156.7605 1.98e5 2.01 0.22 68: 157.9912 3.57e5 3.64 0.39 69: 160.7765 2.03e5 2.07 0.22 Докторска дисертација 171 HIDROLIZA-5-PH=4,203+50 12 (0.422) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.3228 7.57e5 6.27 0.36 2: 41.5529 1.03e7 85.01 4.90 3: 42.8478 1.22e6 10.13 0.58 4: 43.1068 1.24e6 10.25 0.59 5: 43.6248 3.05e6 25.28 1.46 6: 44.3370 6.69e5 5.54 0.32 7: 44.5960 2.17e6 17.98 1.04 8: 45.2434 2.99e5 2.47 0.14 9: 45.6319 1.74e6 14.40 0.83 10: 50.8764 1.39e5 1.15 0.07 11: 52.5598 3.54e6 29.35 1.69 12: 53.7253 1.32e5 1.09 0.06 13: 54.6317 1.07e6 8.89 0.51 14: 55.0850 3.54e5 2.93 0.17 15: 55.9267 3.80e5 3.15 0.18 16: 56.3800 1.22e6 10.09 0.58 17: 56.5742 1.11e6 9.17 0.53 18: 56.8980 1.53e6 12.63 0.73 19: 57.5454 4.71e6 39.01 2.25 20: 59.0347 4.56e5 3.78 0.22 21: 59.2289 2.31e5 1.91 0.11 22: 60.5239 1.21e7 100.00 5.77 23: 62.4664 1.58e6 13.12 0.76 24: 64.5385 3.78e5 3.13 0.18 25: 65.5097 2.19e5 1.82 0.10 26: 66.5458 2.44e5 2.02 0.12 27: 66.9343 1.33e5 1.10 0.06 28: 68.6178 4.16e6 34.45 1.99 29: 70.0424 4.96e5 4.11 0.24 30: 70.1719 3.20e5 2.65 0.15 31: 71.2079 1.57e6 13.00 0.75 32: 71.5317 6.64e5 5.50 0.32 33: 71.7259 2.14e5 1.77 0.10 34: 72.3087 1.35e6 11.19 0.65 35: 73.0210 1.08e6 8.97 0.52 36: 73.2800 3.24e5 2.68 0.15 37: 73.4095 2.80e5 2.32 0.13 38: 73.7980 1.65e6 13.65 0.79 39: 76.5825 1.12e7 92.95 5.36 40: 78.5899 9.59e6 79.41 4.58 41: 80.5325 1.67e6 13.87 0.80 42: 82.2809 3.97e5 3.29 0.19 43: 82.9932 2.26e5 1.87 0.11 44: 83.5113 2.26e5 1.87 0.11 45: 84.6769 1.23e6 10.22 0.59 46: 85.9073 5.35e5 4.43 0.26 47: 88.5623 1.10e6 9.12 0.53 48: 89.0804 2.64e5 2.19 0.13 49: 89.3394 1.52e5 1.26 0.07 50: 90.5698 3.28e5 2.72 0.16 51: 91.4764 2.09e5 1.73 0.10 52: 92.5773 1.10e6 9.07 0.52 53: 93.2249 2.06e5 1.71 0.10 54; 94.7143 6.00еб 49.65 2.86 55: 96.6571 6.68e6 55.34 3.19 56: 98.7294 5.51 e5 4.56 0.26 57: 101.7084 2.52e6 20.84 1.20 58: 104.3636 1.95e5 1.62 0.09 59: 104.8169 5.56e5 4.60 0.27 60: 106.6303 1.01e6 8.36 0.48 61: 108.8969 4.30e5 3.56 0.21 62: 109.3503 2.25e5 1.87 0.11 63: 109.6093 1.59e5 1.32 0.08 64: 110.6455 2.92e5 2.42 0.14 65: 111.6170 1.24e5 1.02 0.06 66: 112.7827 5.67e5 4.70 0.27 67: 113.7542 1.50e5 1.24 0.07 68: 114.4666 5.77e5 4.78 0.28 69: 115.6323 1.43e5 1.18 0.07 Taбела 10 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,5mM, pH= 4,203 50V No Mass Inten %BPI %TIC 70: 116.7333 7.82e5 6.48 0.37 71: 117.8991 1.01e6 8.37 0.48 72: 119.7772 2.79e6 23.07 1.33 73: 120.7487 1.04e6 8.65 0.50 74: 122.1088 1.57e5 1.30 0.07 75: 122.8212 1.37e5 1.14 0.07 76: 124.7642 4.97e5 4.12 0.24 77: 128.7150 1.71e5 1.41 0.08 78 129.8160 5.74e5 4.75 0.27 79: 132.7953 4.67e5 3.86 0.22 80: 134.7384 2.32e5 1.93 0.11 81: 137.8473 1.47e5 1.22 0.07 82: 138:7540 4.39e5 3.64 0.21 83: 140.8267 2.20e6 18.26 1.05 84: 141.9926 2.14e5 1.77 0.10 85: 142.8345 3.80e5 3.14 0.18 86: 147.7572 2.04e5 1.69 0.10 87: 148.8583 2.02e6 16.71 0.96 88: 150.6719 5.65e5 4.68 0.27 89: 154.0400 1.54e5 1.28 0.07 90: 154.9469 1.24e5 1.03 0.06 91: 156.8253 3.26e5 2.70 0.16 92: 157.9264 4.92e5 4.07 0.23 93: 159.0924 1.26e5 1.04 0.06 94: 160.7765 8.37e5 6.93 0.40 95: 162.8493 1.60e5 1.33 0.08 96: 166.9301 4.04e5 3.34 0.19 97: 168.7438 2.59e5 2.15 0.12 98: 171.0110 1.67e5 1.38 0.08 99: 173.0191 1.26e5 1.05 0.06 100: 174.8976 4.23e5 3.50 0.20 101: 176.9705 4.14e5 3.43 0.20 102: 178.9138 1.09e6 9.06 0.52 103: 180.7924 1.71e5 1.41 0.08 104: 184.8086 7.15e5 5.92 0.34 105: 186.8168 4.56e5 3.78 0.22 106: 190.7684 1.26e5 1.05 0.06 107: 192.7118 1.21e5 1.00 0.06 108: 194.8495 1.39e6 11.47 0.66 109: 196.9225 4.69e5 3.88 0.22 110: 198.0238 5.49e5 4.55 0.26 111: 198.9956 1.33e5 1.10 0.06 112: 202.8177 3.54e5 2.93 0.17 113: 204.8908 1.01e6 8.36 0.48 114: 206.8343 1.42e5 1.18 0.07 115: 208.9721 1.34e5 1.11 0.06 116: 212.7944 1.70e6 14.10 0.81 117: 214.8027 7.31e5 6.05 0.35 118: 216.8758 1.87e5 1.55 0.09 119: 220.8277 1.57e5 1.30 0.07 120: 222.8361 1.36e6 11.28 0.65 121: 223.2896 1.93e5 1.60 0.09 122: 226.5937 2.35e5 1.94 0.11 123: 230.6753 3!6e5 2.61 0.15 124: 232.6837 2.73e5 2.26 0.13 125: 234.6274 2.24e5 1.86 0.11 126: 240.9119 2.19e5 1.81 0.10 127: 244.7345 2.89e5 2.39 0.14 128: 248.5571 1.58e5 1.31 0.08 129: 2503248 1.56e5 1.29 0.07 130: 252.833 1.60е5 1.32 0.08 131: 253.8699 1.24e5 1.03 0.06 132: 254.7122 1.43e5 1.18 0.07 133: 257.0447 1.21e5 1.00 0.06 134: 263.0704 2.12e5 1.76 0.10 135: 264.8199 1.50e5 1.24 0.07 136: 266.7636 1.70e5 1.41 0.08 137: 272.7247 3.10e5 2.57 0.15 138: 274.7981 1.78e5 1.47 0.08 Scan ES+ No Mass Inten %BPI %TIC 139: 280.8240 1.23e5 1.02 0. 140: 282.4439 1.41e5 1.17 0. 141: 282.7679 3.75e5 3.11 0. 142: 284.2582 1.34e5 1.11 0. 143: 285.1006 1.27e5 1.05 0. 144: 290.7379 2.84e5 2.35 0. 145: 292.8762 4.83e5 4.00 0. 146: 294.4313 1.46e5 1.21 0. 147: 300.7167 4.07e5 3.37 0. 148: 302.7255 2.14e5 1.77 0. 149: 304.7342 1.21e5 1.00 0. 150: 310.7606 4.59e5 3.80 0. 151: 318.7310 3.36e5 2.78 0. 152: 320.6750 2.48e5 2.05 0. 153: 322.8782 1.82e5 1.50 0. 154: 324.6927 3.08e5 2.55 0. 155: 328.7104 4.85e5 4.01 0. 156: 330.6544 2.97e5 2.46 0. 157: 332.7281 1.25e5 1.03 0. 158: 334.6722 1.71e5 1.42 0. 159: 336.6811 1.95e5 1.62 0. 160: 338.7548 2.69e5 2.22 0. 161: 340.5692 2.73e5 2.26 0. 162: 342.9022 2.03e5 1.68 0. 163: 346.6608 2.19e5 1.82 0. 164: 348.7345 1.52e5 1.25 0. 165: 350.5490 1.75e5 1.45 0. 166: 352.8172 1.80e5 1.49 0. 167: 354.6965 1.26e5 1.04 0. 168: 356.7055 2.53e5 2.10 0. 169: 358.7145 2.44e5 2.02 0. 170: 360.9179 1.29e5 1.07 0. 171: 364.611 81.28e5 1.06 0. 172: 366.8152 4.93e5 4.08 0. 173: 370.5092 2.36e5 1.96 0. 174: 378.6100 1.89e5 1.57 0. 175: 380.6190 3.55e5 2.94 0. 176: 382.7577 1.45e5 1.20 0. 177: 384.7020 2.26e5 1.87 0. 178: 388.7849 2.06e5 1.70 0. 179: 392.6086 1.40e5 1.16 0. 180: 398.5710 2.31e5 1.91 0. 181: 402.7188 1.89e5 1.57 0. 182: 404.5983 1.21e5 1.00 0. 183: 406.6722 1.80e5 1.49 0. 184: 408.5517 2.11e5 1.75 0. 185: 412.6348 2.18e5 1.81 0. 186: 414.7087 1.49e5 1.23 0. 187: 416.6530 3!4e5 2.60 0. 188: 418.6622 1.48e5 1.23 0. 189: 420.6713 1.86e5 1.54 0. 190: 426.8932 1.96e5 1.62 0. 191: 430.6523 1.86e5 1.54 0. 192: 434.6059 4.10e5 3.39 0. 193: 436.4206 2.00e5 1.66 0. 194: 438.4298 1.62e5 1.35 0. 195: 442.4482 1.59e5 1.32 0. 196: 444.5870 2.09e5 1.73 0. 197: 446.5962 1.27e5 1.05 0. 198: 448.3462 2.43e5 2.01 0. 199: 450.6146 1.34e5 1.11 0. 200: 452.6239 1.38e5 1.14 0. 201: 454.6979 2.20e5 1.83 0. 202: 458.6516 2.20e5 1.83 0. 203: 460.6608 1.60e5 1.32 0. 204: 462.6700 1.35e5 1.12 0. 205: 468.6978 1.24e5 1.02 0. 206: 470.7070 1.53e5 1.26 0. 207: 476.6052 1.65e5 1.37 0. Mр Mирјана Р. Цвијовић 172 Taбела 11 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=1,0 mM, pH= 4,184 50V HIDROLIZA-7-PH=4,184+5012 (0.422) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.2580 3.74e5 2.08 0.15 2: 41.6177 9.15e6 50.74 3.69 3: 42.6536 3.10e5 1.72 0.13 4: 42.8478 7.52e5 4.17 0.30 5: 43.1068 1.05e6 5.84 0.42 6: 43.8190 2.59e6 14.36 1.04 7: 44.3370 4.81e5 2.67 0.19 8: 44.7255 1.70e6 9.41 0.68 9: 45.8261 4.95e5 2.74 0.20 10: 52.5598 2.51e6 13.94 1.01 11: 54.3080 4.41e5 2.45 0.18 12: 54.9555 5.94e5 3.30 0.24 13: 56.3800 5.57e5 3.09 0.22 14: 57.3512 1.81e6 10.04 0.73 15: 57.8692 6.50e5 3.60 0.26 16: 58.6462 3.86e5 2.14 0.16 17: 58.9052 3.46e5 1.92 0.14 18: 59.0347 2.81e5 1.56 0.11 19: 60.5239 1.80e7 100.00 7.27 20: 62.5312 2.64e6 14.64 1.06 21: 64.4737 3.45e5 1.91 0.14 22: 68.6178 2.53e6 14.05 1.02 23: 70.6251 2.26e6 12.54 0.91 24: 71.0784 8.44e5 4.68 0.34 25: 71.4669 2.73e5 1.51 0.11 26: 72.5677 3.21e6 17.78 1.29 27: 73.9923 5.12e5 2.84 0.21 28: 76.6472 9.36e6 51.92 3.78 29: 78.5899 1.47e7 81.69 5.94 30: 80.5973 1.17e6 6.49 0.47 31: 82.4104 2.46e5 1.36 0.10 32: 83.1875 2.96e5 1.64 0.12 33: 84.4179 3.03e5 1.68 0.12 34: 85.3245 1.93e5 1.07 0.08 35: 86.0368 3.67e5 2.03 0.15 36: 87.5910 4.23e5 2.35 0.17 37: 88.6918 1.26e6 6.97 0.51 38: 92.6421 6.64e5 3.68 0.27 39: 93.0954 2.01e5 1.12 0.08 40: 94.7143 ,449e6 24.89 1.81 41: 96.6571 8.49e6 47.10 3.43 42: 98.7294 3.56e5 1.98 0.14 43: 100.0246 1.87e5 1.04 0.08 44: 101.7732 2.44e6 13.56 0.99 45: 104.6874 7.01 e5 3.89 0.28 46: 106.7598 1.61e6 8.92 0.65 47: 108.7674 1.85e5 1.02 0.07 48: 110.3865 2.39e5 1.33 0.10 49: 113.6894 3.74e5 2.07 0.15 50: 114.9199 4.86e5 2.70 0.20 51: 116.7333 1.33e6 7.36 0.54 52: 117.7695 8.48e5 4.71 0.34 53: 118.2229 2.83e5 1.57 0.11 54: 119.7772 4.14e6 22.95 1.67 55: 120.8783 6.08e5 3.37 0.25 56: 123.0155 2.35e5 1.31 0.09 57: 124.7642 5.77e5 3.20 0.23 58: 129.7513 4.90e5 2.72 0.20 59: 132.7953 7.98e5 4.43 0.32 60: 134.9327 1.99e5 1.10 0.08 61: 138.8188 5.82e5 3.23 0.24 62: 140.8267 1.98e6 10.97 0.80 63: 142.8345 7.28e5 4.04 0.29 64: 148.8583 1.83e6 10.15 0.74 65: 150.8014 9.52e5 5.28 0.38 66: 152.8741 2.88e5 1.60 0.12 67: 153.9105 1.85e5 1.03 0.07 68: 156.8253 6.26e5 3.47 0.25 69: 157.8616 4.04e5 2.24 0.16 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 160.8413 1.07e6 5.94 0.43 71: 166.8005 8.90e5 4.94 0.36 72: 168.8086 4.49e5 2.49 0.18 73: 170.8167 1.89e5 1.05 0.08 74: 174.8328 4.65e5 2.58 0.19 75: 176.9057 9.60e5 5.33 0.39 76: 178.8490 2.09e6 11.61 0.84 77: 184.8086 1.24e6 6.91 0.50 78: 186.7520 6.49e5 3.60 0.26 79: 194.8495 2.51e6 13.91 1.01 80: 196.7930 5.85e5 3.25 0.24 81: 197.9591 3.89e5 2.16 0.16 82: 202.8177 8.46e5 4.69 0.34 83: 204.8260 1.55e6 8.60 0.63 84: 212.7944 З.ОЗеб 16.82 1.22 85: 214.8027 1.09e6 6.02 0.44 86: 220.7629 1.86e5 1.03 0.08 87: 222.8361 1.81e6 10.05 0.73 88: 230.8697 8.33e5 4.62 0.34 89: 232.8133 3.17e5 1.76 0.13 90: 234.5626 2.21 e5 1.22 0.09 91: 236.9597 3.02e5 1.68 0.12 92: 237.3485 1.92e5 1.07 0.08 93: 240.7823 2.59e5 1.44 0.10 94: 244.7993 4.04e5 2.24 0.16 95: 254.7770 3.48e5 1.93 0.14 96: 256.4616 2.91e5 1.61 0.12 97: 262.8112 2.36e5 1.31 0.10 98: 264.7551 4.29e5 2.38 0.17 99: 272.7895 4.83e5 2.68 0.19 100: 282.7679 8.62e5 4.78 0.35 101: 284.8414 3.74e5 2.08 0.15 102: 286.7205 1.96e5 1.09 0.08 103: 290.8027 5.11e5 2.83 0.21 104: 292.6818 1.07e6 5.92 0.43 105: 294.7553 2.01e5 1.11 0.08 106: 300.7167 8.74e5 4.85 0.35 107: 302.7255 3.19e5 1.77 0.13 108: 308.6870 2.78e5 1.54 0.11 109: 310.7606 9.09e5 5.04 0.37 110: 318.7310 8.65e5 4.80 0.35 111: 320.8694 5.25e5 2.91 0.21 112: 324.4983 2.99e5 1.66 0.12 113: 328.7104 9.01e5 5.00 0.36 114: 330.6544 3.71e5 2.06 0.15 115: 332.5985 3.46e5 1.92 0.14 116: 336.8107 2.87e5 1.59 0.12 117: 338.6900 7.15e5 3.97 0.29 118: 340.5692 3.87e5 2.15 0.16 119: 340.8932 1.98e5 1.10 0.08 120: 342.5133 3.60e5 2.00 0.15 121: 346.7256 6.31 e5 3.50 0.25 122: 348.6697 3.66e5 2.03 0.15 123: 350.7435 2.62e5 1.45 0.11 124: 352.6228 2.00e5 1.11 0.08 125: 356.6407 4.12e5 2.29 0.17 126: 358.8441 2.14e5 1.19 0.09 127: 360.7883 2.68e5 1.49 0.11 128: З64.7414 1.98e5 1.10 0.08 128 366.7504 8.01e5 4.44 0.32 130: 37075740 6.12e5 3.40 0.25 131: 370.9628 2.49e5 1.38 0.10 132: 372.5830 2.05e5 1.14 0.08 133: 374.6568 2.85e5 1.58 0.12 134: 378.6748 З.ООе6 1.66 0.12 135: 380.6190 6.00e5 3.33 0.24 136: 384.5724 3.27e5 1.82 0.13 137: 388.7849 3.49e5 1.94 0.14 138: 390.5347 2.01e5 1.12 0.08 Scan ES+ No Mass Inten %BP1 %TIC 139: 396.5619 31.5e5 1.75 0. 140: 398.6358 4.67e5 2.59 0. 141: 402.6540 2.51e5 1.39 0. 142: 406.6074 5.39e5 2.99 0. 143: 408.6165 3.93e5 2.18 0. 144: 410.8849 2.41 e5 1.34 0. 145: 412.6348 1.92e5 1.06 0. 146: 416.5234 5.49e5 3.05 0. 147: 418.5974 2.83e5 1.57 0. 148: 420.7361 2.10e5 1.17 0. 149: 424.6248 3.94e5 2.19 0. 150: 426.6340 4.90e5 2.72 0. 151: 428.5135 2.30e5 1.27 0. 152: 434.6059 7.87e5 4.36 0. 153: 436.2262 1.99e5 1.10 0. 154: 436.5502 4.31e5 2.39 0. 155: 438.3650 2.81e5 1.56 0. 156: 442.3834 2.05e5 1.14 0. 157: 444.5222 4.09e5 2.27 0. 158: 448.4110 2.92e5 1.62 0. 159: 450.5498 2.45e5 1.36 0. 160: 452.6887 2.34e5 1.30 0. 161: 454.7627 3.12e5 1.73 0. 162: 456.6423 2.42e5 1.34 0. 163: 458.5219 4.61e5 2.56 0. 164: 460.5312 2.02e5 1.12 0. 165: 462.4756 1.95e5 1.08 0. 166: 466.4941 2.40e5 1.33 0. 167: 468.5033 3.43e5 1.90 0. 168: 470.6422 2.13e5 1.18 0. 169: 474.6607 1.89e5 1.05 0. 170: 476.5404 3.47e5 1.92 0. 171: 478.7441 2.85e5 1.58 0. 172: 484.5127 2.09e5 1.16 0. 173: 490.4757 2.12e5 1.17 0. 174: 494.2998 2.00e5 1.11 0. 175: 494.6239” 3.99e5 2.21 0. 176: 496.4388 2.91 e5 1.62 0. 177: 498.5777 2.39e5 1.33 0. 178: 504.6057 2.99e5 1.66 0. 179: 508.4298 2.57e5 1.42 0. 180: 514.3282 3.30e5 1.83 0. 181: 516.3375 2.67e5 1.48 0. 182: 518.5413 3.07e5 1.70 0. 183: 522.1063 2.11e5 1.17 0. 184: 522.4951 5.84e5 3.24 0. 185: 524.6989 2.56e5 1.42 0. 186: 526.3194 2.19e5 1.21 0. 187: 528.5232 2.00e5 1.11 0. 188: 532.5419 5.40e5 3.00 0. 189: 534.4216 3!4e5 1.74 0. 190: 536.5606 2.70e5 1.50 0. 191: 538.8292 1.89e5 1.05 0. 192: 542.5238 3.31e5 1.84 0. 193: 546.5425 2.20e5 1.22 0. 194: 592.4992 1.91e5 1.06 0. 195: 594.3142 2.05e5 1.14 0. 196: 600.4072 2.34e5 1.30 0. 197: 602.5463 2.81 e5 1.56 0. 198: 610.4542 2.99e5 1.66 0. 199: 620.3069 2.48e5 1.37 0. 200: 630.4188 2.23e5 1.24 0. 201: 674.9502 1.97e5 1.09 0. 202: 689.3402 1.83e5 1.01 0. 203: 718.5092 2.12e5 1.18 0. Докторска дисертација 173 HIDROLIZA-1-PH=4,814+50-SAMF 13 No Mass Inten %ВРI %ТIС 1: 40.1286 2.56e5 3.70 0.39 2: 40.3228 5.06e5 7.31 0.76 3: 41.4235 4.53e6 65.57 6.86 4: 41.9414 1.24e6 17.99 1.88 5: 42.1356 8.97e5 12.97 1.36 6: 42.6536 3.41 e5 4.94 0.52 7: 42.8478 8.04e5 11.62 1.22 8: 43.4953 2.18e6 31.58 3.30 9: 44.9197 2.31e5 3.34 0.35 10: 45.1787 4.75e5 6.87 0.72 11: 45.5671 1.32e6 19.02 1.99 12: 46.6678 7.43e4 1.07 0.11 13: 50.4879 1.62e5 2.34 0.24 14: 52.6246 2.21e6 32.00 3.35 15: 54.5670 6.14e5 8.88 0.93 16: 55.0850 1.21e5 1.75 0.18 17: 56.4447 1.12e6 16.26 1.70 18: 57.6102 3.16e6 45.67 4.78 19: 58.0634 5.69e5 8.22 0.86 20: 59.0994 9.26e4 1.34 0.14 21: 59.1642 1.24e5 1.80 0.19 22: 59.9412 2.26e5 3.27 0.34 23: 60.7182 2.73e5 3.94 0.41 24: 64.4737 1.49e5 2.15 0.23 25: 66.0925 1.96e5 2.83 0.30 26: 67.1285 7.33e4 1.06 0.11 27: 68.6178 5.92e6 85.66 8.96 28: 69.9776 2.39e5 3.45 0.36 29: 70.1719 1.65e5 2.39 0.25 30: 71.6612 1.18e6 17.13 1.79 31: 73.1505 4.29e5 6.20 0.65 32: 73.6685 1.70e6 24.59 2.57 33: 74.8989 1.07e5 1.54 0.16 34: 76.6472 6.91 e6 100.00 10.46 35: 77.8776 4.60e5 6.66 0.70 36: 78.7841 2.62e5 3.78 0.40 37: 79.1079 7.21e4 1.04 0.11 38: 79.5612 1.48e5 2.14 0.22 39: 79.6907 7.10e4 1.03 0.11 40: 80.6620 6.05e5 8.75 0.92 41: 82.4752 2.73e5 3.95 0.41 42: 83.3818 1.86e5 2.69 0.28 43: 84.2236 3.90e5 5.64 0.59 44; 84.5474 1.01e6 14.66 1.53 45: 85.0007 4.49e5 6.50 0.68 46: 85.4540 1.34e5 1.94 0.20 47: 86.0368 8.68e4 1.26 0.13 48: 88.8861 1.54e5 2.23 0.23 49: 92.5773 5.55e5 8.03 0.84 50: 94.7143 4.12e6 59.52 6.23 51: 96.5276 5.21 e5 7.53 0.79 52: 98.1466 2.21 e5 3.20 0.34 53: 98.7294 1.12e5 1.62 0.17 54: 98.9237 8.09e4 1.17 0.12 55: 101.3846 1.18e5 1.71 0.18 56: 101.9027 1.11e6 16.00 1.67 57: 102.9389 1.01e5 1.47 0.15 58: 104.8817 3.68e5 5.32 0.56 59: 106.1122 8.33e4 1.20 0.13 60: 106.9541 9.07e4 1.31 0.14 61: 108.7674 1.53e5 2.21 0.23 62: 110.9046 9.85e4 1.42 0.15 63: 112.4589 3.41e5 4.93 0.52 64: 112.9122 7.60e4 1.10 0.12 65: 113.7542 7.49e4 1.08 0.11 66: 114.6609 1.53e5 2.21 0.23 67: 116.7981 2.40e5 3.47 0.36 68: 117.7048 6.77e5 9.79 1.02 69: 118.0934 1.62e5 2.35 0.25 Taбела 12 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 4,814, 50V No Mass Inten %BPI %TIC 70: 119.0001 9.25e4 1.34 0.14 71: 119.7772 1.89e5 2.73 0.29 72: 120.6840 3.62e5 5.24 0.55 73: 122.5622 1.32e5 1.91 0.20 74: 129.8160 2.41e5 3.48 0.36 75: 131.9534 8.11e4 1.17 0.12 76: 132.7953 8.60e4 1.24 0.13 77: 134.8679 1.08e5 1.56 0.16 78: 138.9484 8.32e4 1.20 0.13 79: 140.8914 1.67e6 24.19 2.53 80: 141.9278 1.34e5 1.93 0.20 81: 148.8583 3.72e5 5.38 0.56 82: 157.9264 2.43e5 3.51 0.37 83: 198.1534 2.22e5 3.22 0.34 84: 199.3195 7.23e4 1.05 0.11 85: 251.8614 1.06e5 1.54 0.16 Mр Mирјана Р. Цвијовић 174 Taбела 13 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,594, 50V HIDROLIZA-2-PH=3,594+50-SAMF 30 (1.055) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.0638 1.54e4 1.33 0.16 2: 40.5818 3.97e4 3.43 0.40 3: 40.6465 5.29e4 4.56 0.54 4: 40.9702 1.41e5 12.20 1.44 5: 41.6177 3.06e5 26.39 3.11 6: 41.8767 1.28e5 11.06 1.30 7: 42.2004 2.72e4 2.35 0.28 8: 43.1068 1.68e4 1.45 0.17 9: 44.3370 1.47e4 1.27 0.15 10: 45.6319 1.47e4 1.27 0.15 11: 50.2936 1.52e4 1.31 0.15 12: 51.5886 1.23e4 1.06 0.12 13: 52.5598 3.88e5 33.49 3.95 14: 54.0490 3.80e4 3.28 0.39 15: 54.5670 1.84e4 1.59 0.19 16: 55.1497 3.79e4 3.27 0.39 17: 55.3440 1.60e4 1.38 0.16 18: 56.1210 3.51e4 3.02 0.36 19: 56.4447 2.83e4 2.44 0.29 20: 56.8980 5.39e4 4.65 0.55 21: 57.6102 2.07e4 1.79 0.21 22: 64.9917 2.04e4 1.76 0.21 23: 68.1646 3.62e4 3.12 0.37 24: 68.3588 1.42e5 12.20 1.44 25: 68.6826 3.68e5 31.70 3.74 26: 70.3014 1.32e4 1.14 0.13 27: 70.8194 1.44e4 1.24 0.15 28: 71.0137 3.61e4 3.11 0.37 29: 71.4669 7.44e4 6.42 0.76 30: 71.8554 1.35e4 1.16 0.14 31: 73.3448 4.35e4 3.75 0.44 32: 73.6685 1.08e5 9.33 1.10 33: 74.0571 2.62e4 2.26 0.27 34: 74.8989 1.86e4 1.60 0.19 35: 76.6472 1.16e6 100.00 11.79 36: 78.1366 8.78e4 7.57 0.89 37: 78.9784 1.84e4 1.59 0.19 38: 80.7268 8.24e4 7.10 0.84 39: 81.1153 2.39e4 2.06 0.24 40: 82.1514 3.48e4 3.00 0.35 41: 82.7990 2.23e4 1.92 0.23 42: 90.3108 3.26e4 2.81 0.33 43: 94.7143 7.89e5 68.06 8.03 44: 96.0095 7.10e4 6.13 0.72 45: 96.3333 2.39e4 2.06 0.24 46: 97.4990 3.59e4 3.09 0.36 47: 99.8303 1.98e4 1.70 0.20 48: 104.6226 5.42e4 4.67 0.55 49: 105.5941 1.88e4 1.62 0.19 50: 107.1484 1.69e4 1.46 0.17 51: 108.5084 3.00e4 2.59 0.30 52: 109.2855 1.17e4 1.01 0.12 53: 111.3579 3.64e4 3.14 0.37 54: 112.9122 3.66e4 3.16 0.37 55: 113.9485 1.75e4 1.51 0.18 56: 117.7048 3.76e5 32.43 3.82 57: 118.1581 7.03e4 6.06 0.71 58: 119.0648 2.21 e4 1.91 0.22 59: 119.8420 1.42e4 1.22 0.14 60: 120.7487 2.58e4 2.23 0.26 61: 127.8730 1.19e4 1.02 0.12 62: 140.8267 7.19e5 61.96 7.31 63: 141.8630 1.96e4 1.69 0.20 64: 142.1221 6.73e4 5.81 0.68 65: 143.3527 1.44e4 1.24 0.15 66: 149.2469 1.70e4 1.46 0.17 67: 152.9389 2.18e4 1.88 0.22 68: 157.9264 1.37e5 11.82 1.39 69: 158.8980 1.32e4 1.14 0.13 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 159.0924 2.99e4 2.58 0.30 71: 166.8653 2.48e4 2.14 0.25 72: 170.2984 1.22e4 1.05 0.12 73: 195.8860 1.27e4 1.10 0.13 74: 197.9591 7.59e4 6.55 0.77 75: 199.2547 2.47e4 2.13 0.25 76: 204.6964 1.54e4 1.32 0.16 77: 213.7661 1.20e4 1.04 0.12 78: 251.8614 2.29e4 1.97 0.23 79: 260.2196 1.53e4 1.32 0.16 80: 273.5022 1.66e4 1.43 0.17 81: 320.1566 1.41e4 1.22 0.14 82: 335.9682 1.23e4 1.06 0.13 83: 342.9022 1.17e4 1.01 0.12 Докторска дисертација 175 Taбела 14 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,192, 10V HIDROLIZA-3-PH=3,192+ 9 (0.316) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.3875 7.78e6 22.48 2.41 2: 40.7113 9.36e6 27.04 2.90 3: 41.0350 9.07e6 26.20 2.81 4: 41.4882 1.62e7 46.82 5.02 5: 45.3082 8.18e6 23.64 2.53 6: 46.0204 3.46e7 99.99 10.72 7: 46.7973 9.48e6 27.39 2.94 8: 47.9628 7.69e5 2.22 0.24 9: 48.8692 7.32e5 2.12 0.23 10: 51.5886 7.78e5 2.25 0.24 11: 54.2433 1.87e6 5.40 0.58 12: 55.5382 1.69e7 48.85 5.24 13: 56.8332 2.72e6 7.85 0.84 14: 58.1929 1.91e6 5.51 0.59 15: 59.2937 4.06e6 11.73 1.26 16: 59.8764 2.88e6 8.32 0.89 17: 60.4592 1.01e7 29.09 3.12 18: 63.1787 1.42e6 4.09 0.44 19: 64.1500 1.77e6 5.10 0.55 20: 64.5385 4.12e6 11.90 1.28 21: 67.2580 9.88e5 2.85 0.31 22: 68.5531 1.22e7 35.10 3.76 23: 69.9129 7.85e5 2.27 0.24 24: 72.2440 6.17e5 1.78 0.19 25: 73.6685 4.75e6 13.73 1.47 26: 74.8341 4.56e5 1.32 0.14 27: 75.5464 4.23e5 1.22 0.13 28: 76.3235 9.78e5 2.82 0.30 29: 77.1653 3.56e5 1.03 0.11 30: 78.0071 9.83e5 2.84 0.30 31: 78.5251 1.92e6 5.55 0.60 32: 82.6694 1.06e6 3.07 0.33 33: 85.7130 1.13e6 3.27 0.35 34: 86.3606 3.47e5 1.00 0.11 35: 87.9147 6.23e5 1.80 0.19 36: 89.7927 1.45e6 4.18 0.45 37: 90.1812 4.65e5 1.34 0.14 38: 90.8936 5.11e5 1.48 0.16 39: 92.3830 6.64e5 1.92 0.21 40: 94.8438 7.97e5 2.30 0.25 41: 96.6571 7.47e6 21.58 2.31 42: 98.6647 3.28e6 9.46 1.01 43: 101.9027 5.53e6 15.98 1.71 44: 102.8741 1.16e6 3.36 0.36 45: 103.7807 8.11e5 2.34 0.25 46: 105.7236 8.37e5 2.42 0.26 47: 106.7598 8.06e5 2.33 0.25 48: 107.6665 1.28e6 3.71 0.40 49: 108.2493 4.61e5 1.33 0.14 50: 112.7827 8.49e5 2.45 0.26 51: 113.6246 4.05e5 1.17 0.13 52: 114.7904 4.75e5 1.37 0.15 53: 116.2152 3.98e5 1.15 0.12 54: 116.5390 5.86e5 1.69 0.18 55: 117.6400 3.92e5 1.13 0.12 56: 118.7410 2.67e6 7.71 0.83 57: 120.6840 1.94e6 5.61 0.60 58: 121.7850 3.97e5 1.15 0.12 59: 124.8290 9.92e5 2.86 0.31 60: 126.6424 3.87e5 1.12 0.12 61: 128.7797 5.40e5 1.56 0.17 62: 130.0103 5.42e5 1.57 0.17 63: 131.7590 6.1 e5 1.88 0.20 64: 133.4430 3.8765 1.12 0.12 65: 134.9327 8.18e5 2.36 0.25 66: 135.8394 4.757e5 1.32 0.14 67: 138.8836 6.68e5 1.93 0.21 68: 140.9562 2.66e6 7.69 0.82 69: 143.0936 3.75e5 1.08 0.12 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 144.6481 3.60e5 1.04 0.11 71: 146.8503 4.50e5 1.30 0.14 72: 150.8662 4.44e5 1.28 0.14 73: 151.9673 3.98e5 1.15 0.12 74: 153.1980 3.59e5 1.04 0.11 75: 156.8253 5.07e5 1.46 0.16 76: 161.9424 9.49e6 27.40 2.94 77: 163.0436 10.00e5 2.89 0.31 78: 163.9504 9.36e5 2.70 0.29 79: 170.9462 7.34e5 2.12 0.23 80: 174.8976 8.18e5 2.36 0.25 81: 176.9057 9.11e5 2.63 0.28 82: 179.8855 4.03e5 1.16 0.12 83: 184.8734 3.60e5 1.04 0.11 84: 188.8897 2.06e6 5.95 0.64 85: 189.9262 4.16e5 1.20 0.13 86: 190.7684 3.62e5 1.04 0.11 87: 192.7118 4.58e5 1.32 0.14 88: 194.9143 6.72e5 1.94 0.21 89: 198.0238 5.62e5 1.62 0.17 90: 202.6881 4.51e5 1.30 0.14 91: 203.9190 4.76e5 1.38 0.15 92: 205.9273 7.16e5 2.07 0.22 93: 206.8343 9.37e5 2.71 0.29 94: 213.9605 5.70e6 16.46 1.76 95: 215.1266 5.89e5 1.70 0.18 96: 216.0336 3.57e5 1.03 0.11 97: 216.9406 5.20e5 1.50 0.16 98: 220.8277 4.51e5 1.30 0.14 99: 222.9009 2.58e6 7.45 0.80 100: 226.9824 4.36e5 1.26 0.13 101: 230.9993 1.77e6 5.10 0.55 102: 232.8781 3.52e5 1.02 0.11 103: 235.9231 6.77e5 1.96 0.21 104: 248.8163 4.73e5 1.36 0.15 105: 251.8614 5.06e5 1.46 0.16 106: 258.9237 3.95e5 1.14 0.12 107: 260.8027 4.91e5 1.42 0.15 108: 266.6341 3.74e5 1.08 0.12 109: 268.0595 8.39e5 2.42 0.26 110: 284.5822 3.91e5 1.13 0.12 111: 288.8588 6.77e5 1.96 0.21 112: 306.9374 3.70e5 1.07 0.11 Mр Mирјана Р. Цвијовић 176 HIDROLIZA-3-PH=3,192+100 9 (0.316) No Mass Inten %BPI %TCI 1: 40.8407 5.38e6 47.50 2.61 2: 41.7472 5.19e6 45.85 2.52 3: 43.5600 8.84e6 78.06 4.30 4: 45.0492 4.81 e6 42.47 2.34 5: 45.6966 2.07e6 18.24 1.00 6: 45.8261 1.63e6 14.39 0.79 7: 46.7326 1.66e5 1.46 0.08 8: 47.7038 1.72e5 1.52 0.08 9: 48.9987 7.05e5 6.22 0.34 10: 49.7757 1.13e7 100.00 5.50 11: 50.6821 7.00e6 61.84 3.40 12: 51.7828 1.36e5 1.20 0.07 13: 52.4951 1.34e6 11.80 0.65 14: 53.4663 1.20e5 1.06 0.06 15: 54.3080 1.10e6 9.70 0.53 16: 54.6965 2.18e6 19.28 1.06 17: 55.2145 5.68e5 5.02 0.28 18: 56.5095 9.41e6 83.10 4.57 19: 58.5167 1.08e7 95.69 5.27 20: 60.5239 4.71e6 41.56 2.29 21: 62.5959 З.З6е6 29.63 1.63 22: 64.6032 2.69e6 23.77 1.31 23: 66.8048 8.41е5 7.43 0.41 24: 68.0998 3.67е5 3.24 0.18 25: 68.6178 1.26е6 11.14 0.61 26: 69.8481 3.13е5 2.77 0.15 27: 70.1071 2.14е5 1.89 0.10 28: 71.5317 1.06е6 9.34 0.51 29: 71.9850 4.51е5 3.98 0.22 30: 72.2440 2.03е5 1.79 0.10 31: 72.7620 2.33е5 2.06 0.11 32: 73.0210 4.15е5 3.67 0.20 33: 73.2800 5.46е5 4.82 0.27 34: 73.7333 1.86е5 1.64 0.09 35: 74.3808 1.41е6 12.46 0.69 36: 74.8341 4.81 е5 4.25 0.23 37: 76.5825 1.50е6 13.28 0.73 38: 78.5899 1.37е6 12.07 0.66 39: 79.1727 2.21е5 1.95 0.11 40: 80.5973 2.30е6 20.28 1.12 41: 82.5399 1.56е6 13.78 0.76 42: 83.1875 3.24е5 2.86 0.16 43: 83.7056 1.39е5 1.23 0.07 44: 83.8998 2.93е5 2.59 0.14 45: 84.2884 7.08е5 6.25 0.34 46: 84.8712 3.18е5 2.81 0.15 47: 85.1302 2.28е5 2.01 0.11 48: 85.2597 2.55е5 2.26 0.12 49: 86.4253 2.54е5 2.25 0.12 50: 88.5623 7.17е5 6.34 0.35 51: 90.6993 1.11е6 9.80 0.54 52: 92.5773 3.84е5 3.39 0.19 53: 93.4839 1.54е5 1.36 0.07 54: 94.1315 1.83е5 1.61 0.09 55: 94.4553 2.71е5 2.39 0.13 56: 94.7791 4.75е5 4.19 0.23 57: 96.1390 3.30е5 2.91 0.16 58: 96.5924 2.26е6 19.96 1.10 59: 98.6647 1.32е6 11.69 0.64 60: 100.3484 2.14е5 1.89 0.10 61: 101.1903 1.28е5 1.13 0.06 62: 102.8093 5.20е5 4.59 0.25 63: 104.7522 6.90е5 6.09 0.34 64: 105.2055 1.89е5 1.67 0.09 65: 105.9826 1.75е5 1.54 0.08 66: 106.7598 5.33е5 4.71 0.26 67: 107.6017 2.50е5 2.21 0.12 68: 108.7674 З.ЗЗе6 2.94 0.16 69: 109.8684 1.49е5 1.31 0.07 Taбела 15 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,192, 100V No Mass Inten %BPI %TIC 70: 110.5808 6.76e5 5.97 0.33 71: 111.0341 2.42e5 2.14 0.12 72: 112.5884 1.89e6 16.67 0.92 73: 114.6609 2.04e6 18.04 0.99 74: 116.6685 9.39e5 8.29 0.46 75: 118.7410 6.26e5 5.53 0.30 76: 120.7487 1.58e6 13.94 0.77 77: 122.7565 5.79e5 5.11 0.28 78: 124.7642 4.97e5 4.39 0.24 79: 126.7072 3.94e5 3.48 0.19 80: 127.8082 2.53e5 2.23 0.12 81: 128.7797 1.92e5 1.69 0.09 82: 129.8160 1.74e5 1.53 0.08 83: 130.7228 2.61e5 2.31 0.13 84: 131.5647 1.20e5 1.06 0.06 85: 132.3420 1.51e5 1.34 0.07 86: 132.7953 3.80e5 3.35 0.18 87: 134.2202 1.95e5 1.72 0.09 88: 134.7384 5.40e5 4.77 0.26 89: 136.8110 1.35e6 11.93 0.66 90: 137.8473 1.17e5 1.03 0.06 91: 138.8836 5.39e5 4.76 0.26 92: 139.8551 2.29e5 2.02 0.11 93: 140.8267 4.89e5 4.32 0.24 94: 142.8345 4.73e5 4.18 0.23 95: 144.8424 2.19e5 1.93 0.11 96: 146.7208 2.24e5 1.98 0.11 97: 148.9230 1.82e5 1.60 0.09 98: 149.8298 1.47e5 1.30 0.07 99: 150.9310 2.37e5 2.09 0.12 100: 151.9026 1.26e5 1.12 0.06 101: 152.9389 5.01e5 4.43 0.24 102: 154.8821 1.68e5 1.48 0.08 103: 156.6957 2.96e5 2.61 0.14 104: 158.8333 1.03e6 9.13 0.50 105: 160.8413 1.40e5 1.23 0.07 106: 162.9140 2.21e5 1.95 0.11 107: 164.9221 2.09e5 1.85 0.10 108: 166.8653 1.78e5 1.57 0.09 109: 167.8369 1.89e5 1.67 0.09 110: 169.9098 1.72e5 1.52 0.08 111: 172.7599 2.56e5 2.26 0.12 112: 174.8328 8.49e5 7.50 0.41 113: 175.2862 1.34e5 1.18 0.07 114: 176.7761 3.13e5 2.76 0.15 115: 178.7195 4.70e5 4.15 0.23 116: 180.8571 6.16e5 5.44 0.30 117: 182.8653 3.13e5 2.76 0.15 118: 184.9382 3.28e5 2.90 0.16 119: 186.8168 1.87e5 1.65 0.09 120: 188.9545 2.11e5 1.87 0.10 121: 190.8331 8.62e5 7.62 0.42 122: 192.8413 4.31e5 3.81 0.21 123: 194.7848 4.03e5 3.56 0.20 124: 195.8213 1.24e5 1.10 0.06 125: 196.8578 3.36e5 2.96 0.16 126: 198.8012 5.11e5 4.52 0.25 127: 200.7447 2.68e5 2.36 0.13 128: 202.8825 3.32e5 2.93 0.16 129: 204.8260 3.06e5 2.70 0.15 130: 206.8990 1.17e5 1.03 0.06 131: 207.7412 1.21e5 1.07 0.06 132: 208.7130 3.25e5 2.87 0.16 133: 210.8508 2.08e5 1.84 0.10 134: 212.9239 1.77e5 1.56 0.09 135: 214.8027 2.53e5 2.23 0.12 136: 216.7462 2.38e5 2.11 0.12 137: 218.8842 2.71e5 2.39 0.13 138: 220.8925 2.42e5 2.13 0.12 139: 222.7713 1.58e5 1.39 0. No Mass Inten %BPI %TIC 140: 224.8445 2.46e5 2.18 0. 141: 227.0472 2.18e5 1.92 0. 142: 228.8613 2.15e5 1.90 0. 143: 230.6753 3.23e5 2.85 0. 144: 232.8133 1.53e5 1.35 0. 145: 235.0809 1.18e5 1.04 0. 146: 236.7654 2.94e5 2.59 0. 147: 238.8386 2.92e5 2.57 0. 148: 240.3288 1.43e5 1.26 0. 149: 240.6527 2.81e5 2.48 0. 150: 242.5316 1.30e5 1.15 0. 151: 242.7908 2.95e5 2.61 0. 152: 244.7993 1.73e5 1.53 0. 153: 246.8077 1.61e5 1.42 0. 154: 248.3627 2.35e5 2.08 0. 155: 252.8333 1.78e5 1.57 0. 156: 254.8418 2.36e5 2.08 0. 157: 256.7856 2.06e5 1.82 0. 158: 258.7941 1.81e5 1.59 0. 159: 260.6731 2.37e5 2.09 0. 160: 262.6817 1.59e5 1.40 0. 161: 264.9494 1.26e5 1.11 0. 162: 268.7722 2.07e5 1.83 0. 163: 270.6512 1.88e5 1.66 0. 164: 272.9839 2.20e5 1.95 0. 165: 274.6685 1.95e5 1.72 0. 166: 276.7419 1.48e5 1.31 0. 167: 278.6210 1.59e5 1.41 0. 168: 280.6944 1.35e5 1.19 0. 169: 282.7679 2.19e5 1.93 0. 170: 284.7766 1.59e5 1.40 0. 171: 286.8501 2.41e5 2.13 0. 172: 288.6644 1.19e5 1.05 0. 173: 292.6818 2.32e5 2.05 0. 174: 294.6905 1.48e5 1.31 0. 175: 296.8288 1.67e5 1.47 0. 176: 298.2544 149e5 1.32 0. 177: 298.6432 3.32e5 2.93 0. 178: 300.7815 2.21e5 1.95 0. 179: 302.7255 1.52e5 1.34 0. 180: 305.0582 1.85e5 1.64 0. 181: 306.6134 1.21e5 1.07 0. 182: 308.5573 1.80e5 1.59 0. 183: 310.8902 1.24e5 1.09 0. 184: 314.7133 1.83e5 1.61 0. 185: 316.7221 1.80e5 1.59 0. 186: 318.6662 1.78e5 1.58 0. 187: 322.7486 1.36e5 1.20 0. 188: 326.8959 1.14e5 1.00 0. 189: 330.3304 1.15e5 1.02 0. 190: 332.7929 1.26e5 1.11 0. 191: 335.0610 1.69e5 1.49 0. 192: 336.6162 1.65e5 1.46 0. 193: 345.0407 1.21e5 1.07 0. 194: 346.8552 1.73e5 1.53 0. 195: 350.6139 1.19e5 1.05 0. 196: 352.8820 1.55e5 1.37 0. 197: 354.9558 1.79e5 1.58 0. 198: 364.9358 9.35e5 8.26 0. 199: 366.8152. 1.20e5 1.06 0. 200: 370.2499 1.47e5 1.30 0. 201: 372.8422 1.36e5 1.20 0. 202: 374.3976 1.16e5 1.02 0. 203: 376.7306 1.74e5 1.54 0. 204: 378.6748 1.28e5 1.13 0. 205: 380.8135 2.42e5 2.13 0. 206: 382.8225 1.45e5 1.28 0. 207: 390.5995 1.62e5 1.43 0. Докторска дисертација 177 HIDROLIZA-2-PH=3,594+10 11 (0.387) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.2580 9.07e6 18.41 3.48 2: 41.3587 4.92e7 100.00 18.90 3: 46.5383 1.43e7 28.96 5.48 4: 47.8980 5.85e5 1.19 0.22 5: 48.6102 6.12e5 1.24 0.23 6: 51.4591 1.03e6 2.09 0.40 7: 54.5023 6.04e6 12.27 2.32 8: 54.8260 1.79e6 3.63 0.69 9: 55.0850 1.90e6 3.86 0.73 10: 55.7325 7.16e6 14.53 2.75 11: 56.1857 З.ООе6 6.09 1.15 12: 56.7037 2.52e6 5.13 0.97 13: 58.3872 2.11e6 4.28 0.81 14: 59.2937 3.51e6 7.13 1.35 15: 60.3944 1.93е7 39.17 7.40 16: 62.5312 6.04е5 1.23 0.23 17: 63.5024 2.21 е6 4.49 0.85 18: 64.4090 1.59е6 3.23 0.61 19: 67.1933 8.78е5 1.78 0.34 20: 68.6178 4.13е6 8.39 1.59 21: 68.9416 1.86е6 3.78 0.71 22: 73.6038 1.40е6 2.84 0.54 23: 74.2513 7.95е5 1.61 0.31 24: 75.2226 5.22е5 1.06 0.20 25: 75.8054 1.75е6 3.55 0.67 26: 77.3595 7.93е5 1.61 0.30 27: 78.5251 1.47е6 2.98 0.56 28: 82.6047 2.01 еб 4.07 0.77 29: 85.4540 1.08е6 2.20 0.42 30: 89.4689 5.75е5 1.17 0.22 31: 89.6632 7.67е5 1.56 0.29 32: 90.6346 1.62е6 3.30 0.62 33: 94.5201 6.27е5 1.27 0.24 34: 96.6571 8.45е6 17.16 3.24 35: 98.6647 4.68е6 9.51 1.80 36: 101.8379 8.29е6 16.84 3.18 37: 103.2627 7.30е5 1.48 0.28 38: 105.7236 9.37е5 1.90 0.36 39: 106.6303 7.06е5 1.43 0.27 40: 108.3141 1.23е6 2.50 0.47 41: 108.7674 5.25е5 1.07 0.20 42: 112.7179 3.55е6 7.21 1.36 43: 114.6609 7.05е5 1.43 0.27 44: 115.8266 5.15е5 1.05 0.20 45: 116.6685 5.50е5 1.12 0.21 46: 118.8058 2.10е6 4.27 0.81 47: 120.6192 7.77е5 1.58 0.30 48: 124.7642 5.74е5 1.17 0.22 49: 126.7072 5.25е5 1.07 0.20 50: 128.7150 7.69е5 1.56 0.30 51: 131.7590 5.07е5 1.03 0.19 52: 134.8679 6.30е5 1.28 0.24 53: 138.9484 6.82е5 1.39 0.26 54: 140.8914 6.44е5 1.31 0.25 55: 150.9310 1.07е6 2.17 0.41 56: 162.0072 1.56е6 3.17 0.60 57: 162.9788 5.70е5 1.16 0.22 58: 174.8976 6.65е5 1.35 0.26 59: 176.8409 6.52е5 1.32 0.25 60: 188.8250 7.80е5 1.58 0.30 61: 213.9605 6.04е6 12.27 2.32 62: 215.0618 5.96е5 1.21 0.23 63: 223.0305 5.44е5 1.10 0.21 64: 230.9993 6.37е5 1.29 0.24 65: 288.7940 5.47е5 1.11 0.21 Taбела 16 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,594, 10V Mр Mирјана Р. Цвијовић 178 Taбела 17 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 3,594, 100V HIDROLIZA-2-PH=3,594+100 11 (0.352) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.7760 3.98e6 37.15 2.76 2: 41.2292 1.84e6 17.18 1.28 3: 41.4235 6.99e5 6.53 0.49 4: 41.8119 2.23e6 20.87 1.55 5: 43.5600 1.06e7 98.96 7.36 6: 44.9844 3.70e6 34.59 2.57 7: 45.4377 8.33e5 7.78 0.58 8: 45.7614 1.66e6 15.52 1.15 9: 46.7973 2.03e5 1.90 0.14 10: 48.3512 1.17e5 1.09 0.08 11: 49.3224 3.52e6 32.89 2.45 12: 49.5167 5.63e6 52.54 3.91 13: 49.9699 1.78e6 16.61 1.24 14: 50.5526 6.87e6 64.13 4.77 15: 51.7828 2.15e5 2.01 0.15 16: 52.3656 2.70e5 2.52 0.19 17: 52.6893 9.09e5 8.49 0.63 18: 53.5310 1.24e5 1.16 0.09 19: 53.6605 2.51e5 2.35 0.17 20: 53.9843 4.75e5 4.43 0.33 21: 54.3728 5.07e5 4.73 0.35 22: 54.9555 1.19e6 11.10 0.83 23: 55.4087 2.64e5 2.47 0.18 24: 55.9267 9.70e5 9.06 0.67 25: 56.5095 3.59e6 33.56 2.50 26: 58.5167 З.О6е6 28.57 2.13 27: 60.5239 1.07e7 100.00 7.44 28: 62.5312 4.02e6 37.59 2.80 29: 64.2147 5.65e5 5.28 0.39 30: 64.6032 1.74e6 16.21 1.21 31: 66.4810 1.24e5 1.16 0.09 32: 67.2580 2.55e5 2.38 0.18 33: 68.2941 1.99e5 1.86 0.14 34: 68.8768 1.50e5 1.40 0.10 35: 69.4596 6.00e5 5.61 0.42 36: 70.3014 1.22e5 1.14 0.09 37: 71.1432 1.79e5 1.67 0.12 38: 71.7259 1.84e5 1.72 0.13 39: 71.9850 3.53e5 3.30 0.25 40: 72.6972 2.54e5 2.38 0.18 41: 72.9563 3.90e5 3.64 0.27 42: 73.6038 2.57e5 2.40 0.18 43: 74.1218 8.74e5 8.17 0.61 44: 74.9636 1.85e5 1.72 0.13 45: 76.5825 1.04e6 9.71 0.72 46: 78.5899 1.92e6 17.95 1.34 47: 80.5325 9.39e5 8.77 0.65 48: 82.0867 1.57e5 1.47 0.11 49: 82.2162 1.90e5 1.78 0.13 50: 82.7342 4.58e5 4.28 0.32 51: 83.8998 1.71e5 1.60 0.12 52: 85.3892 1.51e5 1.41 0.11 53: 88.5623 6.29e5 5.87 0.44 54: 88.9509 1.66e5 1.55 0.12 55: 90.5698 8.96e5 8.37 0.62 56: 92.6421 3.37e5 3.14 0.23 57: 94.7791 2.33e5 2.18 0.16 58: 96.5276 8.22e5 7.68 0.57 59: 97.1104 1.29e5 1.21 0.09 60: 98.4704 3.39e5 3.16 0.24 61: 100.0246 1.18e5 1.11 0.08 62: 102.6798 2.97e5 2.78 0.21 63: 104.6226 5.40e5 5.04 0.38 64: 104.8817 2.41e5 2.25 0.17 65: 106.6950 2.96e5 2.76 0.21 66: 108.6379 1.15e5 1.08 0.08 67: 110.7751 1.88e5 1.75 0.13 68: 112.6532 9.04e5 8.45 0.63 69: 114.5961 8.62e5 8.05 0.60 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 114.9847 2.79e5 2.60 0.19 71: 115.1790 1.45e5 1.35 0.10 72: 116.7333 3.93e5 3.67 0.27 73: 118.8705 2.60e5 2.43 0.18 74: 120.6840 2.86e6 26.73 1.99 75: 122.7565 8.52e5 7.96 0.59 76: 124.7642 3.74e5 3.50 0.26 77: 126.7072 1.66e5 1.55 0.12 78. 127.8082 1.26e5 1.18 0.09 79: 132.8601 2.93e5 2.73 0.20 80: 134.6736 1.82e5 1.70 0.13 81: 136.8110 1.39e5 1.29 0.10 82: 138.7540 1.08e6 10.08 0.75 83: 140.8267 3.67e5 3.42 0.25 84: 142.7050 2.54e5 2.38 0.18 85: 144.9720 1.73e5 1.62 0.12 86: 146.8503 1.40e5 1.31 0.10 87: 148.9230 1.24e5 1.16 0.09 88: 150.8014 1.77e5 1.65 0.12 89: 152.8741 1.47e5 1.37 0.10 90: 156.8253 4.02e5 3.75 0.28 91: 158.8333 2.87e5 2.68 0.20 92: 160.9060 1.21e5 1.13 0.08 93: 164.9221 1.60e5 1.50 0.11 94: 166.8005 1.61e5 1.51 0.11 95: 174.8328 2.25e5 2.10 0.16 96: 176.8409 1.54e5 1.43 0.11 97: 178.8490 1.45e5 1.35 0.10 98: 180.7924 5.70e5 5.33 0.40 99: 182.2175 1.29e5 1.20 0.09 100: 182.6062 3.27e5 3.06 0.23 101: 184.8734 4.03e5 3.76 0.28 102: 186.6872 1.96e5 1.83 0.14 103: 190.7036 1.99e5 1.86 0.14 104: 192.9709 1.44e5 1.35 0.10 105: 196.8578 2.38e5 2.22 0.17 106: 197.1817 1.17e5 1.09 0.08 107: 198.8012 3.22e5 3.01 0.22 108: 200.7447 2.71e5 2.53 0.19 109: 202.8825 2.04e5 1.90 0.14 110: 208.7130 2.05e5 1.91 0.14 111: 211.0452 2.00e5 1.87 0.14 112: 214.8675 1.19e5 1.11 0.08 113: 216.8110 1.99e5 1.86 0.14 114: 218.8842 1.61e5 1.50 0.11 115: 220.7629 1.33e5 1.24 0.09 116: 222.7713 1.90e5 1.77 0.13 117: 224.7149 1.30e5 1.21 0.09 118: 234.8865 1.32e5 1.23 0.09 119: 238.7738 3.65e5 3.41 0.25 120: 240.6527 4.51e5 4.21 0.31 121: 242.8556 2.42e5 2.26 0.17 122: 244.8640 2.60e5 2.43 0.18 123: 248.6867 1.15e5 1.07 0.08 124: 256.9152 1.59e5 1.49 0.11 125: 258.6646 2.44e5 2.28 0.17 126: 260.8027 1.88e5 1.75 0.13 127: 262.9409 2.29e5 2.13 0.16 128: 266.5693 1.32e5 1.24 0.09 129: 268.7722 1.79e5 1.67 0.12 130: 270.5217 1.66e5 1.55 0.12 131: 272.8543 1.23e5 1.15 0.09 132: 274.8629 1.65e5 1.54 0.11 133: 276.7419 1.80e5 1.68 0.12 134: 278.7506 1.43e5 1.34 0.10 135: 280.7592 1.38e5 1.29 0.10 136: 282.8327 1.08e5 1.01 0.08 137: 284.7766 1.35e5 1.26 0.09 138: 296.6344 2.37e5 2.22 0.16 Scan ES+ No Mass Inten %BPI %TIC 139: 298.7727 1.17e5 1.10 0. 140: 300.5871 2.03e5 1.90 0. 141: 302.7903 1.79e5 1.67 0. 142: 304.6694 1.77e5 1.65 0. 143: 306.6134 1.10e5 1.03 0. 144: 308.8814 1.11e5 1.04 0. 145: 314.6486 1.15e5 1.07 0. 146: 318.7310 1.58e5 1.47 0. 147: 320.5454 1.14e5 1.07 0. 148: 322.6190 1.24e5 1.16 0. 149: 324.8223 1.44e5 1.34 0. 150: 344.7815 1.71e5 1.60 0. 151: 358.7145 1.09e5 1.02 0. 152: 360.7883 1.68e5 1.57 0. 153: 364.8710 3.91e5 3.65 0. 154: 366.7504 1.44e5 1.35 0. 155: 378.5452 1.36e5 1.27 0. 156: 380.8783 1.52e5 1.42 0. 157: 386.6462 1.07e5 1.00 0. 158: 496.4388 1.22e5 1.14 0. Докторска дисертација 179 Taбела 18 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 4,814, 100V HIDROLIZA-1-PH=4,814+100 10 (0.352) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.7760 2.80e6 33.20 2.85 2: 41.7472 1.81e6 21.50 1.85 3: 42.9126 8.09e5 9.58 0.82 4: 43.2363 1.90e6 22.49 1.93 5: 43.6895 4.41 e6 52.28 4.49 6: 44.2075 2.37e6 28.12 2.41 7: 44.5312 1.62e6 19.15 1.64 8: 44.7255 9.37e5 11.10 0.95 9: 45.5024 2.94e6 34.81 2.99 10: 46.8621 1.49e5 1.76 0.15 11: 47.5743 1.06e5 1.26 0.11 12: 48.2217 1.07e5 1.27 0.11 13: 49.7109 8.44e6 100.00 8.59 14: 50.1642 2.25e6 26.67 2.29 15: 50.6821 4.80e6 56.85 4.88 16: 52.1066 5.06e5 6.00 0.52 17: 52.7541 1.47e5 1.74 0.15 18: 53.5310 3.30e5 3.91 0.34 19: 54.3728 2.83e5 3.35 0.29 20: 5.5.0850 2.60e5 3.09 0.26 21: 56.5095 5.61е6 66.49 5.71 22: 58.5167 6.63e5 7.86 0.67 23: 60.5239 5.67e6 67.12 5.76 24: 62.5312 3.32e6 39.35 3.38 25: 63.6320 1.72e5 2.04 0.17 26: 63.8262 3.43e5 4.06 0.35 27: 64.1500 5.39e5 6.38 0.55 28: 64.6680 1.08e6 12.75 1.09 29: 65.7687 1.22e5 1.44 0.12 30: 66.2868 1.21e5 1.44 0.12 31: 66.7400 8.46e4 1.00 0.09 32: 67.5170 3.34e5 3.95 0.34 33: 68.6178 2.52e5 2.98 0.26 34: 68.8768 9.97e4 1.18 0.10 35: 69.7186 1.46e5 1.72 0.15 36: 70.9489 1.28e5 1.52 0.13 37: 71.7259 1.78e5 2.11 0.18 38: 72.6325 1.46e5 1.73 0.15 39: 73.2153 1.45e5 1.72 0.15 40: 73.7333 5.91 e5 7.00 0.60 41: 74.7046 2.43e5 2.88 0.25 42: 76.5177 3.52e5 4.17 0.36 43: 77.4890 1.00e5 1.19 0.10 44: 78.5899 1.40e6 16.55 1.42 45: 79.9497 1.30e5 1.53 0.13 46: 80.0792 2.21 e5 2.62 0.22 47: 80.5325 5.49e5 6.51 0.56 48: 82.4104 1.42e5 1.68 0.14 49: 82.7342 2.99e5 3.54 0.30 50: 84.6769 1.02e5 1.21 0.10 51: 88.4328 2.15e5 2.55 0.22 52: 90.6993 4.06e5 4.81 0.41 53: 91.2821 9.38e4 1.11 0.10 54: 92.4478 1.19e5 1.42 0.12 55: 94.1963 1.53e5 1.82 0.16 56: 94.9734 1.32e5 1.57 0.13 57: 96.2686 2.84e5 3.36 0.29 58: 96.5924 7.14e5 8.45 0.73 59: 98.5351 2.47e5 2.93 0.25 60: 101.0608 8.45e4 1.00 0.09 61: 102.4855 1.32e5 1.57 0.13 62: 104.1693 1.13e5 1.34 0.11 63: 104.9465 1.04e5 1.23 0.11 64: 106.6303 1.91e5 2.26 0.19 65: 109.8036 9.22e4 1.09 0.09 66: 112.5237 1.14e6 13.51 1.16 67: 114.6609 5.03e5 5.96 0.51 68: 116.7333 4.65e5 5.50 0.47 69: 118.7410 2.96e5 3.51 0.30 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 119.0648 1.25e5 1.48 0.13 71: 120.7487 1.12e6 13.31 1.14 72: 122.6917 1.20e6 14.26 1.22 73: 124.6347 1.06e5 1.26 0.11 74: 130.2694 1.04e5 1.24 0.11 75: 132.7306 1.68e5 1.98 0.17 76: 132.9896 8.75e4 1.04 0.09 77: 134.8031 1.32e5 1.57 0.13 78: 138.7540 4.25e5 5.04 0.43 79: 140.8267 3.17e5 3.75 0.32 80: 142.8993 1.03e5 1.22 0.10 81: 146.8503 1.01e5 1.19 0.10 82: 155.0764 8.68e4 1.03 0.09 83: 156.7605 1.92e5 2.27 0.19 84: 158.7685 2.58e5 3.06 0.26 85: 174.8976 1.20e5 1.42 0.12 86: 176.8409 1.42e5 1.69 0.14 87: 180.7924 2.93e5 3.47 0.30 88: 182.8005 2.70e5 3.20 0.27 89: 190.7036 1.15e5 1.36 0.12 90: 198.8660 1.66e5 1.96 0.17 91: 208.7778 1.15e5 1.36 0.12 92: 218.7546 1.36e5 1.61 0.14 93: 234.7570 9.79e4 1.16 0.10 94: 236.7654 2.04e5 2.42 0.21 95: 238.7738 2.79e5 3.31 0.28 96: 240.7175 3.10e5 3.67 0.32 97: 242.7260 2.16e5 2.56 0.22 98: 243.1147 9.03e4 1.07 0.09 99: 244.7993 1.09e5 1.29 0.11 100: 256.5264 1.05e5 1.25 0.11 101: 258.7941 9.89e4 1.17 0.10 102: 260.8675 1.16e5 1.37 0.12 103: 269.1610 1.24e5 1.46 0.13 104: 272.5951 1.43e5 1.70 0.15 105: 278.7506 1.03e5 1.22 0.11 106: 280.6944 8.59e4 1.02 0.09 107: 289.0532 1.03e5 1.22 0.10 108: 296.7640 2.70e5 3.20 0.28 109: 298.5784 1.07e5 1.27 0.11 110: 318.6013 1.35e5 1.60 0.14 111: 364.8062 3.00e5 3.55 0.30 Mр Mирјана Р. Цвијовић 180 Taбела 19 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,027mM, pH= 4,814, 10V HIDROLIZA-1-PH=4,814+10 8 (0,281) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.2580 1 33e7 34.12 5.45 2: 40.8407 3.89e7 100.00 15.99 3: 41.6824 1.62e7 41.71 6.67 4: 42.8478 4.86e5 1.25 0.20 5: 46.5383 1.91e7 49.00 7.83 6: 47.8980 8.65e5 2.22 0.36 7: 48.6750 6.31 e5 1.62 0.26 8: 51.0706 6.11e5 1.57 0.25 9: 51.6533 8.08e5 2.08 0.33 10: 54.3080 2.36e6 6.07 0.97 11: 54.5670 3.37e6 8.66 1.38 12: 54.8907 5.18e6 13.32 2.13 13: 55.7972 6.69e6 17.21 2.75 14: 56.6390 4.62e6 11.88 1.90 15: 58.3224 2.32e6 5.98 0.96 16: 59.2937 З.З6е6 8.64 1.38 17: 59.5527 3.74e6 9.62 1.54 18: 60.3944 8.65e6 22.25 3.56 19: 63.5024 1.67e6 4.28 0.68 20: 64.2147 1.12е6 2.87 0.46 21: 64.7327 6.11е5 1.57 0.25 22: 67.0638 4.66е5 1.20 0.19 23: 67.3228 4.49е5 1.16 0.18 24: 68.4883 2.90е6 7.45 1.19 25: 73.7333 1.49е6 3.82 0.61 26: 76.5825 1.74е6 4.49 0.72 27: 77.6185 8.49е5 2.18 0.35 28: 77.8776 4.64е5 1.19 0.19 29: 79.1079 5.16е5 1.33 0.21 30: 82.6047 3.97е6 10.21 1.63 31: 84.9359 1.33е6 3.43 0.55 32: 85.1949 3.94е5 1.01 0.16 33: 85.7778 1.39е6 3.59 0.57 34: 89.4689 4.08е5 1.05 0.17 35: 90.3108 8.54е5 2.20 0.35 36: 90.6993 5.50е5 1.41 0.23 37: 90.9583 4.50е5 1.16 0.18 38: 94.7143 8.54е5 2.20 0.35 39: 95.2324 4.27е5 1.10 0.18 40: 96.7219 1.56е6 4.00 0.64 41: 98.7294 5.86е6 15.06 2.41 2: 100.6075 1.07е6 2.75 0.44 43: 101.8379 6.12е6 15.73 2.52 44: 103.1331 4.25е5 1.09 0.17 45: 105.8531 7.36е5 1.89 0.30 46: 106.8245 4.80е5 1.23 0.20 47: 107.7312 7.60е5 1.95 0.31 48: 112.7179 3.73е6 9.59 1.53 49: 114.7904 8.08е5 2.08 0.33 50: 115.8914 4.53е5 1.17 0.19 51: 116.6685 5.42е5 1.39 0.22 52: 118.6762 2.60е6 6.70 1.07 53: 120.8783 1.70е6 4.37 0.70 54: 124.8290 4.40е5 1.13 0.18 55: 126.8367 4.01е5 1.03 0.16 56: 128.7797 7.70е5 1.98 0.32 57: 130.1399 4.27е5 1.10 0.18 58: 131.9534 4.62e5 1.19 0.19 59: 132.9896 4.46е5 1.15 0.18 60: 134.9975 6.47е5 1.66 0.27 61: 138.8188 8.06е5 2.07 0.33 62: 142.8993 7.34е5 1.89 0.30 63: 146.9151 4.44е5 1.14 0.18 64: 155.8537 4.74е5 1.22 0.19 65: 160.8413 4.62е5 1.19 0.19 66: 162.9140 4.33е5 1.11 0.18 67: 163.8209 6.32е5 1.63 0.26 68: 172.9543 4.12е5 1.06 0.17 69: 176.8409 1.13е6 2.90 0.46 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 214.0253 4.76e6 12.24 1.96 71: 215.1266 4.28e5 1.10 0.18 72: 230.9345 6.58e5 1.69 0.27 73: 235.9879 1.15e6 2.95 0.47 74: 236.4415 4.31e5 1.11 0.18 75: 251.9262 5.16e5 1.33 0.21 Докторска дисертација 181 HIDROLIZA-7-PH=4,184+100 11 (0.387) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.0638 6.68e5 5.55 0.38 2: 41.5529 1.20e7 100.00 6.81 3: 43.4953 5.24e6 43.57 2.97 4: 45.8261 1.37e5 1.14 0.08 5: 49.5814 4.35e6 36.15 2.46 6: 50.6174 4.52e6 37.59 2.56 7: 52.1066 3.70e5 3.08 0.21 8: 53.7900 1.48e5 1.23 0.08 9: 54.8260 3.20e5 2.66 0.18 10: 56.1210 2.91e5 2.42 0.16 11: 56.8332 1.64e5 1.37 0.09 12: 58.3872 5.47e5 4.54 0.31 13: 58.9699 2.09e5 1.74 0.12 14: 60.5239 3.28e6 27.28 1.86 15: 62.2722 1.20e5 1.00 0.07 16: 62.5312 2.30e5 1.91 0.13 17: 63.5024 2.20e5 1.82 0.12 18: 64.2795 1.85e5 1.53 0.10 19: 65.1212 2.32e5 1.93 0.13 20: 68.7473 2.68e5 2.23 0.15 21: 70.1719 7.45e5 6.19 0.42 22: 70.5604 1.63e6 13.54 0.92 23: 72.6325 4.85e5 4.03 0.27 24: 73.7980 3.74e5 3.11 0.21 25: 74.5751 2.17e5 1.80 0.12 26: 75.5464 2.57e5 2.13 0.15 27: 76.3882 3.10e5 2.58 0.18 28: 76.7120 1.21e5 1.01 0.07 29: 77.1005 3.10e5 2.58 0.18 30: 78.5899 1.97e6 16.36 1.11 31: 80.5325 8.53e5 7.09 0.48 32: 80.8563 2.76e5 2.30 0.16 33: 82.4752 3.67e5 3.05 0.21 34: 82.7990 1.25e5 1.04 0.07 35: 84.5474 3.03e5 2.52 0.17 36: 86.4901 3.66e5 3.04 0.21 37: 88.5623 6.47e5 5.37 0.37 38: 90.7641 3.47e5 2.88 0.20 39: 96.6571 9.99e5 8.30 0.56 40: 101.7084 3.16e5 2.62 0.18 41: 102.5503 3.33e5 2.77 0.19 42: 102.9389 1.28e5 1.07 0.07 43: 103.5217 1.69e5 1.41 0.10 44: 104.6874 5.42e5 4.51 0.31 45: 109.0265 1.21e5 1.00 0.07 46: 114.4666 3.35e5 2.78 0.19 47: 114.9199 1.67e5 1.38 0.09 48: 115.0494 1.22e5 1.01 0.07 49: 116.6685 4.04e5 3.36 0.23 50: 119.5182 2.13e5 1.77 0.12 51: 120.6192 1.30e6 10.84 0.74 52: 122.6269 3.15e5 2.62 0.18 53: 124.6994 1.26e5 1.05 0.07 54: 127.5492 1.59e5 1.32 0.09 65 130.7228 3.10e5 2.58 0.18 56: 132.7306 2.24e5 1.86 0.13 57: 134.8031 1.69e5 1.41 0.10 58: 138.8188 1.29e6 10.75 0.73 59: 140.8267 3.55e5 2.95 0.20 60: 146.9799 4.39e5 3.65 0.25 61: 148.7287 2.02e5 1.68 0.11 62: 150.8662 4.40e5 3.65 0.25 63: 153.9105 1.44e5 1.19 0.08 64: 156.8253 1.45e6 12.01 0.82 65: 158.8333 2.44e5 2.03 0.14 66: 160.9708 1.83e5 1.52 0.10 67: 162.7845 6.51e5 5.41 0.37 68: 164.7925 6.20e5 5.15 0.35 69: 166.8005 4.49e5 3.73 0.25 Taбела 20 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=1,0mM, pH= 4,184, 50V No Mass Inten %BPI %TIC 70: 171.0110 1.30e5 1.08 0.07 71: 171.8531 1.77e5 1.47 0.10 72: 174.8328 1.05e6 8.73 0.59 73: 176.4522 1.77e5 1.47 0.10 74: 176.8409 5.56e5 4.62 0.31 75: 178.8490 3.35e5 2.79 0.19 76: 179.8207 2.40e5 1.99 0.14 77: 180.7924 1.60e6 13.25 0.90 78: 182.8005 1.32e6 10.98 0.75 79: 184.8734 2.80e5 2.33 0.16 80: 186.8168 1.25e5 1.04 0.07 81: 190.8331 1.40e5 1.16 0.08 82: 192.7766 4.39e5 3.65 0.25 83: 194.8495 2.40e5 2.00 0.14 84: 197.7647 1.47e5 1.22 0.08 85: 198.8012 2.22e6 18.45 1.26 86: 199.8377 1.40e5 1.17 0.08 87: 200.8094 1.11e6 9.23 0.63 88: 202.8177 2.45e5 2.03 0.14 89: 204.8908 5.59e5 4.65 0.32 90: 208.7778 2.74e5 2.28 0.15 91: 210.8508 3.79e5 3.15 0.21 92: 212.7944 1.81e5 1.51 0.10 93: 216.8110 2.77e6 23.01 1.57 94: 218.6898 9.20e5 7.64 0.52 95: 220.8925 1.52e5 1.26 0.09 96: 222.7713 6.46e5 5.37 0.37 97: 224.7149 2.30e5 1.91 0.13 98: 226.7233 3.57e5 2.96 0.20 99: 228.6669 1.98e5 1.65 0.11 100: 234.7570 1.56e6 13.00 0.88 101: 236.8302 7.48e5 6.22 0.42 102: 238.6443 3.60e5 2.99 0.20 103: 240.7823 4.46e5 3.70 0.25 104: 242.7260 6.39e5 5.31 0.36 105: 244.7345 2.78e5 2.31 0.16 106: 246.8725 1.42e5 1.18 0.08 107: 248.8163 2.07e5 1.72 0.12 108: 252.7037 8.52e5 7.08 0.48 109: 254.7770 7.08e5 5.88 0.40 110: 256.9152 2.23e5 1.85 0.13 111: 258.5998 4.19e5 3.48 0.24 112: 260.6731 5.89e5 4.89 0.33 113: 262.8112 5.29e5 4.39 0.30 114: 264.8846 1.68e5 1.40 0.10 115: 266.7636 2.10e5 1.74 0.12 116: 268.6426 1.64e5 1.37 0.09 117: 270.7809 3.95e5 3.28 0.22 118: 272.8543 2.71e5 2.25 0.15 119: 274.7981 1.51e5 1.25 0.09 120: 276.7419 5.34e5 4.44 0.30 121: 278.7506 7.01e5 5.82 0.40 122: 280.7592 3.39e5 2.82 0.19 123: 282.7031 1.34e5 1.11 0.08 124: 284.7766 2.50e5 2.08 0.14 125: 286.7853 2.83e5 2.35 0.16 126: 288.7940 3.33e5 2.76 0.19 127: 290.6731 2.41e5 2.00 0.14 128: 292.7466 3.05e5 2.54 0.17 129: 294.6905 6.03e5 5.01 0.34 130: 295.0793 1.55e5 1.28 0.09 131: 296.6992 9.68e5 8.04 0.55 132: 298.6432 5.17e5 4.29 0.29 133: 300.7167 2.59e5 2.15 0.15 134: 302.2719 1.24e5 1.03 0.07 135: 304.6694 2.38e5 1.98 0.13 136: 306.6782 6.58e5 5.47 0.37 137: 308.8814 1.96e5 1.63 0.11 138: 310.6310 2.71e5 2.25 0.15 Scan ES+ No Mass Inten %BPI %TIC 139: 312.6397 5.86e5 4.87 0. 140: 314.7133 4.40e5 3.66 0. 141: 316.7221 4.55e5 3.78 0. 142: 318.8606 3.20e5 2.66 0. 143: 320.8046 2.30e5 1.91 0. 144: 322.6838 3.07e5 2.55 0. 145: 324.7575 3.20e5 2.66 0. 146: 328.6456 2.68e5 2.23 0. 147: 330.7192 2.77e5 2.30 0. 148: 332.5985 4.74e5 3.93 0. 149: 334.3481 2.33e5 1.94 0. 150: 336.8107 2.16e5 1.80 0. 151: 338.7548 2.65e5 2.20 0. 152: 340.7636 4.61 e5 3.83 0. 153: 342.6429 6.00e5 4.99 0. 154: 344.7167 1.37e5 1.14 0. 155: 346.5960 2.96e5 2.46 0. 156: 348.6049 2.23e5 1.85 0. 157: 350.6786 5.48e5 4.56 0. 158: 352.5580 1.62e5 1.34 0. 159: 354.7614 1.49e5 1.24 0. 160: 356.6407 3.45e5 2.87 0. 161: 358.7793 2.80e5 2.32 0. 162: 360.7234 3.45e5 2.86 0. 163: 362.6676 1.73e5 1.43 0. 164: 364.7414 2.21e5 1.83 0. 165: 366.6208 3.07e5 2.55 0. 166: 368.7594 2.91 e5 2.42 0. 167: 370.8332 1.39e5 1.16 0. 168: 372.7126 1.56e5 1.29 0. 169: 374.5920 7.00e5 5.81 0. 170: 376.6010 4.05e5 3.37 0. 171: 378.7397 2.82e5 2.35 0. 172: 380.5543 3.79e5 3.15 0. 173: 382.6281 1.90e5 1.58 0. 174: 384.7020 6.27e5 5.21 0. 175: 386.5814 3.24e5 2.69 0. 176: 388.6552 3.07e5 2.55 0. 177: 392.6734 2.31 e5 1.92 0. 178: 394.6825 7.08e5 5.88 0. 179: 396.6916 2.46e5 2.04 0. 180: 398.7655 1.40e5 1.17 0. 181: 400.5153 2.12e5 1.76 0. 182: 402.5892 2.80e5 2.33 0. 183: 404.5983 2.05e5 1.70 0. 184: 406.5426 2.07e5 1.72 0. 185: 408.6165 3.36e5 2.79 0. 186: 410.3016 1.52e5 1.26 0. 187: 410.6256 3.15e5 2.62 0. 188: 412.6348 3.59e5 2.98 0. 189: 414.5791 1.27e5 1.06 0. 190: 416.6530 1.94e5 1.61 0. 191: 418.3381 1.92e5 1.60 0. 192: 420.6065 3.60e5 2.99 0. 193: 421.0602 1.46e5 1.22 0. 194: 422.4861 2.00e5 1.66 0. 195: 424.9489 1.77e5 1.47 0. 196: 426.5692 4.60e5 3.82 0. 197: 428.6431 2.99e5 2.48 0. 198: 428.9672 1.49e5 1.24 0. 199: 430.7819 4.09e5 3.40 0. 200: 432.5967 1.74e5 1.44 0. 201: 434.6059 2.67e5 2.22 0. 202: 436.4206 3.21 e5 2.66 0. 203: 438.5594 2.94e5 2.45 0. 204: 440.6982 2.01 e5 1.67 0. 205: 442.5778 1.70e5 1.42 0. 206: 444.2629 1.30e5 1.08 0. 207: 444.6518 5.69e5 4.73 0. Mр Mирјана Р. Цвијовић 182 Taбела 21П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,5mM, pH= 4,203, 100V HIDROLIZA-5-PH=4,203+100 13 (0.457) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 40.0638 1.20e6 7.16 0.93 2: 41.5529 1.68e7 100.00 13.03 3: 43.4953 4.68e6 27.81 3.62 4: 44.8549 3.26e5 1.94 0.25 5: 46.5383 1.70e5 1.01 0.13 6: 49.2577 2.13e6 12.64 1.65 7: 49.3872 З.06е6 18.21 2.37 8: 49.7757 4.88e6 29.04 3.78 9: 50.5526 4.85e6 28.85 3.76 10: 50.8116 2.84e6 16.87 2.20 11: 51.7828 3.71е5 2.21 0.29 12: 54.1138 2.29е5 1.36 0.18 13: 55.1497 4.09е5 2.43 0.32 14: 56.3800 7.33е5 4.36 0.57 15: 57.0275 2.31е5 1.37 0.18 16: 58.7109 2.58е5 1.53 0.20 17: 60.5239 2.41е6 14.35 1.87 18: 62.0779 1.69е5 1.00 0.13 19: 64.2147 4.59е5 2.73 0.36 20: 64.9270 3.66е5 2.18 0.28 21: 66.8048 2.68е5 1.59 0.21 22: 68.4236 1.80е5 1.07 0.14 23: 70.6899 5.37е5 3.19 0.42 24: 71.0784 2.59е5 1.54 0.20 25: 73.1505 1.79е5 1.06 0.14 26: 73.3448 3.11е5 1.85 0.24 27: 74.1866 3.17е5 1.88 0.25 28: 74.7694 4.67е5 2.77 0.36 29: 76.7767 7.17е5 4.26 0.56 30: 78.5899 1.60е6 9.53 1.24 31: 79.0431 2.39е5 1.42 0.19 32: 80.0145 2.97е5 1.76 0.23 33: 80.5325 9.13е5 5.43 0.71 34: 82.1514 2.55е5 1.52 0.20 35: 82.6047 5.49е5 3.26 0.42 36: 84.6769 5.23е5 3.11 0.41 37: 86.5548 2.81е5 1.67 0.22 38: 88.8213 4.73е5 2.81 0.37 39: 90.7641 4.49е5 2.67 0.35 40: 94.6496 2.90е5 1.72 0.22 41: 96.5924 1.27е6 7.54 0.98 42: 98.5351 3.08е5 1.83 0.24 43: 101.7732 2.11е5 1.25 0.16 44: 102.7446 1.87е5 1.11 0.14 45: 103.8455 2.07е5 1.23 0.16 46: 104.6226 3.16е5 1.88 0.24 47: 106.1122 1.85е5 1.10 0.14 48: 112.6532 5.24е5 3.11 0.41 49: 114.0780 1.86е5 1.11 0.14 50: 114.5961 3.17е5 1.88 0.25 51: 116.6685 3.27е5 1.94 0.25 52: 116.9924 1.71е5 1.01 0.13 53: 119.6477 3.45е5 2.05 0.27 54: 120.7487 7.71е5 4.58 0.60 55: 122.7565 2.33е5 1.38 0.18 6: 130.6580 2.10е5 1.25 0.16 57: 132.8601 1.87е5 1.11 0.14 58: 138.7540 8.93е5 5.31 0.69 59: 140.8914 2.67е5 1.59 0.21 60: 150.8014 1.84е5 1.09 0.14 61: 156.9548 1.07е6 6.35 0.83 62: 158.7037 2.43е5 1.45 0.19 63: 162.8493 3.31е5 1.97 0.26 64: 164.7925 3.06е5 1.82 0.24 65: 166.8005 4.57е5 2.72 0.35 66: 174.8328 4.39е5 2.61 0.34 67: 176.8409 3.04е5 1.81 0.24 68: 178.7842 1.84е5 1.09 0.14 69: 179.9502 2.31е5 1.38 0.18 No Mass Inten %BPI %TIC 70: 180.8571 5.38e5 3.20 0.42 71: 182.9300 6.99e5 4.16 0.54 72: 184.9382 2.90e5 1.72 0.22 73: 194.8495 1.91e5 1.13 0.15 74: 197.8295 2.90e5 1.73 0.22 75: 198.8660 9.62e5 5.72 0.74 76: 200.8094 5.21e5 3.10 0.40 77: 202.7529 1.70e5 1.01 0.13 78: 205.0203 2.50e5 1.49 0.19 79: 208.8425 1.81e5 1.07 0.14 80: 210.9156 2.51e5 1.49 0.19 81: 216.8110 1.20e6 7.13 0.93 82: 218.6898 4.82e5 2.87 0.37 83: 222.7713 3.97e5 2.36 0.31 84: 226.7881 2.47e5 1.47 0.19 85: 234.8217 5.50e5 3.27 0.43 86: 236.7654 3.61e5 2.15 0.28 87: 238.9034 2.98e5 1.77 0.23 88: 240.7175 3.09e5 1.84 0.24 89: 242.5964 2.21e5 1.31 0.17 90: 244.7345 2.02e5 1.20 0.16 91: 248.7514 2.02e5 1.20 0.16 92: 252.7685 3.92e5 2.33 0.30 93: 254.7122 2.51e5 1.49 0.19 94: 258.9885 2.41e5 1.43 0.19 95: 260.7379 2.73e5 1.62 0.21 96: 262.8112 2.68e5 1.59 0.21 97: 266.6341 1.97e5 1.17 0.15 98: 270.7809 1.79e5 1.06 0.14 99: 274.7981 1.70e5 1.01 0.13 100: 276.6771 2.61e5 1.55 0.20 101: 278.8154 4.13e5 2.46 0.32 102: 280.5648 1.98e5 1.18 0.15 103: 282.5735 2.10e5 1.25 0.16 104: 290.7379 1.89e5 1.13 0.15 105: 294.8849 2.69e5 1.60 0.21 106: 296.7640 3.98e5 2.37 0.31 107: 306.7430 3.81 e5 2.26 0.29 108: 312.6397 2.31e5 1.37 0.18 109: 314.5837 2.16e5 1.28 0.17 110: 324.6927 2.36e5 1.40 0.18 111: 328.7752 1.95e5 1.16 0.15 112: 342.7726 2.28e5 1.35 0.18 113: 350.6786 2.28e5 1.36 0.18 114: 360.6587 2.41 e5 1.43 0.19 115: 364.6118 2.30e5 1.37 0.18 116: 372.7126 1.70e5 1.01 0.13 117: 374.6568 2.00e5 1.19 0.15 118: 380.5543 1.99e5 1.18 0.15 119: 384.6371 2.43e5 1.44 0.19 120: 394.6825 2.52e5 1.50 0.20 121: 396.7564 1.90e5 1.13 0.15 122: 426.5044 2.07e5 1.23 0.16 123: 438.6242 1.85e5 1.10 0.14 124: 444.6518 2.46e5 1.46 0.19 125: 482.5034 2.14e5 1.27 0.17 Докторска дисертација 183 HIDROLIZA-6-PH=4,35+10 12 (0.422) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 58.6462 1.23e8 100.00 74.66 2: 59.9412 1.93e6 1.57 1.18 3: 63.6320 3.64e6 2.97 2.22 4: 68.6826 1.31e6 1.07 0.80 5: 79.5612 2.32e6 1.89 1.41 6: 82.5399 1.38e6 1.12 0.84 7: 101.8379 1.86e6 1.52 1.13 8: 213.8957 1.59e6 1.30 0.97 9: 230.9345 2.33e6 1.90 1.42 Taбела 22 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,1mM, pH= 4,35, 10V Mр Mирјана Р. Цвијовић 184 Taбела 23 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=0,1mM, pH= 4,35, 100V HIDROLIZA-6-PH=4,35+100 11 (0.387) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 41.5529 1.71e7 100.00 33.80 2: 42.6536 1.81e5 1.06 0.36 3: 43.1068 8.90e5 5.20 1.76 4: 43.8190 7.42e5 4.34 1.47 5: 49.6462 5.49e6 32.07 10.84 6: 50.6821 4.12e6 24.09 8.14 7: 51.9771 2.35e5 1.37 0.46 8: 55.7972 1.95e5 1.14 0.38 9: 55.9915 2.62e5 1.53 0.52 10: 56.6390 3.18e5 1.86 0.63 11: 60.2649 2.46e5 1.44 0.49 12: 60.5239 5.59e5 3.27 1.11 13: 64.7327 2.94e5 1.72 0.58 14: 66.6105 2.01e5 1.17 0.40 15: 73.2800 2.13e5 1.25 0.42 16: 73.7333 4.82e5 2.82 0.95 17: 74.7046 3.85e5 2.25 0.76 18: 76.4530 2.29e5 1.34 0.45 19: 77.0358 2.80e5 1.64 0.55 20: 78.6546 4.55e5 2.66 0.90 21: 82.5399 1.98e5 1.16 0.39 22: 90.7641 2.86e5 1.67 0.57 23: 112.5237 3.13e5 1.83 0.62 24: 214.0253 3.24e5 1.89 0.64 Докторска дисертација 185 Taбела 24 П. Хидролиза алуминијум(III)-јона CAl=1,0 mM, pH= 4,184, 10V HIDROLIZA-7-PH=4,184+10 11 (0.387) No Mass Inten %BPI %TIC 1: 41.6177 1.92e6 1.72 1.09 2: 58.5814 1.12e8 100.00 63.47 3: 59.9412 1.79e6 1.60 1.01 4: 63.5672 2.44e6 2.19 1.39 5: 82.6694 1.43e6 1.28 0.81 6: 101.8379 1.72e6 1.54 0.98 7: 118.8705 1.22e6 1.09 0.69 8: 123.7279 1.35e6 1.20 0.76 9: 157.8616 1.40e6 1.25 0.80 10: 214.0253 1.60e6 1.43 0.91 11: 230.9993 1.86e6 1.66 1.05 Mр Mирјана Р. Цвијовић 186 8. БИОГРАФИЈА Мирјана Цвијовић је рођена 10. 06. 1970. године у Ужицу, где је завршила основну школу и гимназију. На Факултету за физичку хемију у Београду дипломирала је 1996. године са просечном оценом 8,00 и стекла звање дипломирани физико-хемичар. Магистрирала је из области неорганске хемије на ПМФ-у у Крагујевцу 2006. године када је одбранила тезу под називом „Спектроскопска испитивања равнотежа у растворима алуминијум(III)-јона и L-хистидина“. 2008. године уписала је докторске студије на ПМФ-у у Крагујевцу. Просечна оцена на постдипломским студијама је 9,50. На Универзитету у Дебрецину (Мађарска), Те- хнолошки факултет, на Одсеку за неорганску хемију, усавршавала се код професора I. Banyai у току 2003. године. 2008. године усавршавала се на Техничком факултету – Одсек за неорганску и индустријску хемију „Gh. Asachi“, Iasi (Румунија), код професора I. Cretescu и у Институту „Petro Poni“ у Iasi. 2010. и 2011. године усавршавала се у Италији код професора P. Traldija у Научно-истраживачком институту „CNR“ у Падови. На „International Exibition of Inventions, Research and Technological Transfer 2008“. го- дине добила је златну медаљу за свој рад. У току 2006. била стипендиста Bena Carslberg из Данске из области Еколошких испитивања. Запослена је у Ваљаоници бакра Севојно у хемијској лабораторији од 1996. године. Активно познаје енглески језика-положен испит ESOL. Рад на PC: Windows Offi ce, Курс за PC сервисера, Gaussian, Xcalibur. Члан: DFH, SHD, FECS, KOMIM, Комисија за стандарде –KC026. Завршила више школа Масене спектрометрије у организацији Универзитета Пјер Ма- рија Кири – Париз и ПМФ–Ниш, јула 2009. године до 2012 и Школа масене на ТМФ – Бео- град 2010. Положила је више екстерних курсева: QMC1-техике за побољшање квалитета, са акцентом на статистичку обраду податаке, обука за мерну несигурност, SMQ обуке за про- вериваче, положила је испит за саветнике за хемикалије. Водила послове акредитације лабо- раторије и била координатор израде студије процене опасности од хемијског удеса. Познаје већи број инструменталних техника. Докторска дисертација 187 9. СПИСАК РАДОВА 9.1 Списак радова и саопштења Мирјане Цвијовић М22 – Рад у истакнутом међународном часопису 1. П. Ђурђевић, Р. Јелић, Љ. Јоксовић, М. Цвијовић, „Potentiometric and Multinuclear Magnetic Resonance Study of the Solution Equilibria Between Aluminium(III) Ion and L-Aspartic Acid“, Monatsheft e fur Chemie, 137 (6), 717-735 (2006), ISSN: 0026-9247 2. М. Цвијовић, В. Килибарда, М. Ј. Станков, И. Лазаревић, И. Јаковљевић, Љ. Јоксовић, П. Ђурђевић „ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminium Chloride solutions“, Journal of the Brazilian Chemical Society,“ Vol 23, No 6, 1087-1097, (2012), ISSN 0103-5053, 3. A. Dean, M. G. Ferlin, M. Цвијовић, П. Ђурђевић, F. Dotto, D. Badocco, P. Pastore, A. Venzo, V. Di Marco, „Evaluation of 1,2-dimethyl-3-hydroxy-4-pyridinecarboxylic Acid and of Other 3-hydroxy-4-pyridinecarboxylic Acid Derivatives for Possible Application in Iron and Aluminium Chelation Th erapy“, Polyhedron, october, (2013), In Press М23 – Рад у међународном часопису 4. M. Цвијовић, V. Di Marco, P. Traldi, M. J. Stankov, P. Đurđević „Mass Spectrometric Study of Speciation in Aluminium–Fluoroquinolone Solutions, „European Journal of Mass Spectrometry„ Vol 18, Nº3, 313-322 (2012), ISSN 1469-0667, doi:10.1255/1183 5. П. Ђурђевић, М. Цвијовић, В. Павелкић, J. Zakrzewska, „Spectrophotometric and 27Al NMR Characterization of Aluminum (III) Complexes with L-Histidine“, Spectroscopy Letters, 38, 617-634 (2005), ISSN: 0038-7010 6 П. Ђурђевић, М. Цвијовић, J. Zakrzewska, „Aluminium(III) Complexes of S-Histidine: Synthesis, Characterization, Potentiometric and Spectroscopic Study of Solution Equilibria“, Journal of Coordination Chemistry, 58 (17) 1615-1629 (2005), ISSN: 0095-8972. 7. П. Ђурђевић, Р. Јелић, Д. Џајевић, М. Цвијовић, „Solution Equilibria between Aluminium (III) ion and L-Histidine or L-Tyrosine“, Metal Based Drugs, 8 (5), 235-248 (2002), ISSN 0793-0291 8. М. Цвијовић, Д. Голобочанин, С. Трифуновић, Н. Миљевић, „Alum-treated Drinking Water in Western Serbia“, Journal of Environmental Protection and Ecology, 10 (3) 649-656 (2009), ISSN: 1311-5065. 9. Н. Миљевић, М. Марковић, Д. Тодоровић, М. Цвијовић, М. Орлић, Д. Веселиновић, Д. Голобочанин, „Uranium Content From Bomb Craters“, Journal of Environmental Protection and Ecology, 2 (3), 642-648 (2001), ISSN: 1311-5065. 10. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, С. Цветковић, I. Cretescu, „A Case Study of Industrial Water Polluted with Chromium (VI) and its Impact to River Recipient in Western Serbia“, Environmental Engineering and Management Journal, 9 (1) 45-49 (2010), ISSN: 1582-9596 М41 – Поглавље у монографији националног значаја (7) 1. М. Орлић, М. Цвијовић, М. Марковић, Р. Биочанин, Н. Миљевић, Д. Тодоровић, Д. Веселиновић, Д. Голобочанин, „Uranium Content in Soil Aft er Bombing Fry“, Environmental Recovery of Yugoslavia, Monograph, edited by Dragoljub P. Antić and Jasmina Lj. Vujić, VINČA Institute of Nuclear Sciences, Belgrade, 311-318 (2002), ISBN 86- 7306-054-0. М51 – Рад у водећем националном часопису (2) 1. Н. Миљевић, М. Марковић, Д. Тодоровић, М. Цвијовић, М. Орлић, Д. Веселиновић, Д. Голобочанин, „Uranium Content in the Soil of the Fedral Republic of Yugoslavia aft er NATO Intervention“, Archive of Oncology, 9 (4) 245-249 (2001), ISSN: 0354-7310 Mр Mирјана Р. Цвијовић 188 М33 ‒ Рад саопштен на скупу међународног значаја штампан у целости (1) 1. В. Бојовић, М. Цвијовић, Д. Веселиновић, Р. Биочанин, Н. Миљевић, „Th e Determination of Uranium Amounts on Some Areas Bombing by NATO Aviation“, Fift h International Conference on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 27-29. September 2000, Belgrade, 526-528, ISBN: 86-82475-03-0. 2. М. Цвијовић, В. Павелкић, Н. Миљевић, Д. Станисављев, П. Ђурђевић, „Spectrophotometric Study of Solution Equilibria Between Al3+ Ion and L-Histidine“, Physical Chemistry 2004, 21- 23. September 2004, Belgrade, 805-807, ISBN: 86-82457-14-9. 3. М. Цвијовић, М. Кићановић, Д. Веселиновић, П. Ђурђевић, „Th ermal Analysis of Aluminium–Histidine Complex“, Physical Chemistry 2004, 21-23. September 2004, Belgrade, 796-798, ISBN: 86-82457-14-9. 4. М. Цвијовић, З. Трмчић, М. Милаковић, „Infl uence of the Termomechanical Treatment on Dispersion of Pb in Brass CuZn39Pb3 Products and the Ways of Chemical Determination of Pb Aft er Th at Treatment“, 4th Balkan Conference on Metallurgy-Scientifi c Achievements and Perspectives of Metals Industry in South-East Europe, September 27-29. 2006, Zlatibor, 585-588, ISBN: 86 904393-4-X. 5. М. Цвијовић, М. Бокоров, М. Ђурић, „SEM-EDX Identifi cation of Implements in Th e Copper Tube Production and ICP-OES Analysis“, 3rd International Symposium Light Metals and Composite Materials, 12-14. Septembеr 2008, Begrade, 143-149. 6. М. Цвијовић, Д. Веселиновић, Д. Тодоровић, З. Босиљчић, З. Трмчић, Р. Биочанин, „Садржај урана у земљишту са бомбардованих локалитета одређиван ICP/ОЕS спектрометријом и односа 236U/238U γ-спектрометријом“, IV Југословенски симпозијум са међународним учешћем, Хемија и заштита животне средине, 23-26. Септембар 2001, Зрењанин, 490-492, ЦИП у публикацији Народне библиотеке Србије, каталогизација 504.05/06(048), ID 93949452. 7. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Јеликић-Станков, Т. Анђелковић, Љ. Свилар, J. C. Tabet, „Electrospray Mass Spectrometry of Aluminium Fleroxacin Complexes“, Physical Chemistry 2010, 21-24. September 2010, Belgrade, 10th International Conferences on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry 81-83, ISBN: 978-86-82475-170. 8. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, В. Килибарда, Д. Стојшић, М. Јеликић-Станков, „Electrospray Mass Spectrometric Investigation of Aluminium Hydrolysis in Chloride Medium“, Physical Chemistry 2010, 21-24. September 2010, Belgrade, 10th International Conferences on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry 515-517, ISBN: 978-86-82475-170 9. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, P. Traldi, Б. Настасијевић, Ј. Звездановић, „Maldi Tof of Aluminium Fluoroquinolone Complexes“, Physical Chemistry 2012, 24-28 Septembеr 2012, Belgrade,11th International Conferences on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 692-694, ISBN: 978-86-82475-27-9. M63 – Рад саопштен на скупу националног значаја штампан у целини (0.5) 1. З. Трмчић, М. Цвијовић, Ђ. Тимотијевић, Ћ. Абази, „Шема међулабораторијског испитивања легуре бакра MIM-Cu 9/07“, 13. Саветовање комитета за међулаборатори- јска испитивања материјала, Септембар 2007, Тара, 8-15. 2. П. Ђурђевић, М. Цвијовић, А. Лабан, „Електроспреј-јонизациона масена спектрометрија комплекса алуминијум(III) јона и L-Хистидина“, 43. Саветовање СХД, 24-25. Јануар 2005, Београд, Књига радова, 145-148, ISBN: 86-7132-023-5; Кратки изводи радова, 25, ISBN: 86-7132-021-9 3. М. Цвијовић, С. Трифуновић, Н. Миљевић, П. Ђурђевић, Н. Беговић, „Експериментално и теоријско проучавање синтетисаних молекулских врста у систему алуминијум- хистидин“, XLV Саветовање СХД, 25-26. јануар 2007, Нови Сад, Књига радова, 166- 169, ISBN: 978-86-7132-032-0; Кратки изводи радова, 85, ISBN: 978-86-7132-031-3. Докторска дисертација 189 4. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Бокоров „Развој методе за анализу пукотина у CuZn28 шипци“, 47. Саветовање СХД, 21. Март 2009, Београд, Књига радова, 112-115, ISBN: 978-86-7132-039-9; Кратки изводи радова, 52, ISBN: 978-86-7132-038-2. 5. М. Цвијовић, М. Милојевић, В. Драгутиновић, Н. Милосављевић, „Појава пукотина и ломова у месинганим откивцима“, XVI Саветовање KOMIM, 22-24. Септембра 2010, Ужице, 54-61, ISBN: 978-86-911831-2-7. 6. М. Цвијовић, З. Трмчић, З. Босиљчић, „Примена ICP/OES и IR спектроскопије за анализу хемијских параметара воде реке Лужнице“, XI Саветовање о међулабораторијским испитивањима материјала, Унија хемијских друштава Југославије, KOMIM, 14-16. Септембар 2005, Чачак, 53-55. 7. С. Јовановић, Р. Ћитић, М. Цвијовић, „Утицај примеса на повишење температуре рекристализације бакра“, XI Саветовање о међулабораторијским испитивањима материјала, Унија хемијских друштава Југославије, KOMIM, 14-16. Септембар 2005, Чачак, 31-34. 8. М. Цвијовић, З. Трмчић, Д. Бацотић, М. Милаковић, „Аналитичке методе за одређивање олова у CuZn39Pb3 производима и утицај дисперзије олова на анализу олова ових производа“, XII саветовање комитета за међулабораторијска испитивања материјала, Септембар 2006, Јагодина, 61-63. М34 – Рад саопштен на скупу међународног значаја штампан у изводу (0.5) 1. Д. Веселиновић, М. Цвијовић, М. Миловановић, Р. Биочанин, Н. Миљевић, „Determination of Uranium in Soil by Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spetrometry“, Second International Conference of the Chemical Societies of the South– Eastern European Countries on Chemical Sciences for Sustainable Development, Book of Adstract, Vol. I, 6-9. June 2000, Halkidiki, Greece, 125. 2. Д. Голобочанин, М. Цвијовић, М. Марковић, Р. Биочанин, Н. Миљевић, М. Орлић, Д. Тодоровић, Д. Веселиновић, „Uranium Content from Bomb Craters“, First International Conference on Eniveronmental Recovery of Yugoslavia, 27-30. September 2001, Belgrade, 109, ISSN: 1450-5525. 3. П. Ђурђевић, Д. Веселиновић, М. Цвијовић, Н. Миљевић, „Th e Toxicity of Aluminium“, Fift h International Conference of Balkan Environmental Association on Transboundary Pollution“, 7-10. November 2002, Belgrade, 6, ISSN: 13311-5065. 4. М. Цвијовић, J. Zakrzewska, П. Ђурђевић, „Investigation of Solution Equilibria Between Al(III)-ion and L-Histidine by 27Al, 13C and 1H NMR Spectroscopy“, 28th International Conference on Solution Chemistry, 23-28. August 2003, Debrecen, Hungary, 190. 5. М. Цвијовић, З. Томић, М. Митровић, П. Ђурђевић, „Powder X-Ray and Scanning Electron Microscopy Study of Aluminium–Histidine Complex“, II International Symposium Light Metals and Composite Materials, 19-20. May 2004, Belgrade, 113-114, ISBN: 86-904393-1-5. 6. М. Цвијовић, J. Zakrzewska, З. Недић, П. Ђурђевић, „Spectroscopic Study of Equlibria Between Aluminium (III)-Ion and L-Histidine in Aqueous Solutions“, 9th International Conference on Solution Chemistry, 21-25. August 2005, Portorož, Slovenija, 176, ISBN: 961- 6286-63-3. 7. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, З. Томић, „Th e Synthesis of Aluminium(III)-Ion and Histidine Complexes“, First South-East European Congress of Chemical Engineering, 25-28. September 2005, Belgrade, 208, ISBN: 86-905111-0-5. 8. М. Цвијовић, Н. Миљевић, С. Трифуновић, „Water Pollution with Diff erent State of Chromium Form in the Process of Surface Refuge“, International Conference Management and Sustainable Marine Development, (B.E.N.A.) 15-18. May 2008, Mamaia, Romania, 20. Mр Mирјана Р. Цвијовић 190 9. М. Цвијовић, З. Недић, П. Ђурђевић, Н. Беговић, „Spectroscopic Characterisation of Al (HHis)HisCl2 complexes“, 19th IUPAC Conference on Physical Organic Chemistry, 13-18. July 2008, Santiago de Compostela, Spain, 84. 10. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, Д. Веселиновић, J. Zakrzewska, „Th e Complexes Aluminium and Histidine and its Role in the Toxicity of Aluminium“, II Regional Simposium Chemistry and the Environment, 18-22. June 2003, Kruševac, 89-90, ISBN: 86-7132-015-4. 11. М. Цвијовић, „Chemical Painting of Copper and Brass Products Used for Interior Decorations“, International Exibition of Inventions, Research and Technological Transfer, 14-24. May 2008, Iasi, Romania, 749, ISBN: 978-973-730-491-9. 12. М. Цвијовић, Н. Миљевић, С. Трифуновић, „Aluminium in Drinking Water Technology and its Intake in Human Body that Cause Diff erent Kind of Intoxicity“, International Conference on Quality of Life and Environment in the Frame of E. U. Sustainability, 15-17. November 2007, Belgrade, 14-15, (B.E.N.A.), ISBN: 978-86-82121-46-6, CIP–katalogizacija u publikaciji Narodne biblioteke Srbije, Cobsis. sr-id. 144741388. 13. М. Цвијовић, З. Недић, З. Томић, П. Ђурђевић, „Synthesis and Characterization of Al Histidine Complexes“, Forth International Conference of the Chem. Soc. of the South- Eastern Europen Countr. on Chem. Sciences in Changing Times: Visions, Challenges and Solution, 18-21. July 2004, Belgrade, Book of Abstract, Vol. I, 185, ISBN: 86-7132018-9. 14. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, С. Цветковић, I. Cretescu, „Case Study of Industrial Water Polluted with Chromium VI and its Impact to River Recipient in Western Serbia“, Fift h International Conferences of Environmental Engineering and Management, 15-19. Septembar 2009, Book of Abstract, 47, Tulcea, Delta Danube, Romania, ISBN 978-973-7645-66. 15. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Јеликић Станков, P. Traldi „Maldi Mass Spectrometry Of Aluminium–Fluoroquinolone Complexes“, Euroanalysis 11-15. September 2011. Belgrade , Book of Abstract, 144, MS04 16. М. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Јеликић Станков P. Traldi „Tandem Mass Spectrometry Of Aluminum – Fluroquinolone Complexes“, Euroanalysis 11-15. September, Belgrade 2011,Book of Abstract, 145, MS05 17. M. Цвијовић, П. Ђурђевић, P. Traldi, Maldi Mass Spectrometry Of Aluminium Fluoroqinolone Complexes, 31st IMMS 2013, Palermo, Italy, 153-154, 2013, ISBN 978-88- 907388-2-1 М64 – Рад саопштен на скупу националног значаја штампан у изводу (0.2) 1. М. Цвијовић, Б. Мајкић, З. Босиљчић, Д. Веселиновић, З. Трмчић, „Одређивање концентрације урана у земљишту после НАТО агресије на Југославију“, V Саветовање металурга Југославије, 24-25. Мај 2001, Нови Сад, 168, СИМЈ. 2. М. Цвијовић, З. Трмчић, Н. Лазић, В. Инђић, „Резултати испитивања легуре алуминијума AlCu4MglMn добијени рендгенско-флуоросцентном спектрометријом, Хемијско бојење бакра и месинга са циљем примене у грађевинарству и за ентеријер“, VIII Саветовање о међулаборатојским испитивањима материјала, 4-6. Октобар 2002, Младеновац, 27-28. 3 М. Цвијовић, П. Ђурђевић, Д. Веселиновић, „Комплекси Al-хистидин и њихова улога у повећању токсичности алуминијума“, VI Саветовање металурга Србије и Црне Горе, 12-13. Јун 2003, Аранђеловац, 61, ISBN: 86-904393-0-7. 4. М. Цвијовић, Ј. Zakrzewska, П. Ђурђевић, Д. Веселиновић, „Th e Investigation of Interaction Between Al(III) ion and L-Histidine in Water Solution by 27Al and 13C NMR spectroscopy“, XLII Саветовање СХД, 22-23. Јануар 2004, Нови Сад, 249, ISBN: 86-7132-016-217. 5. М. Цвијовић, З. Трмчић, Б. Мајкић, „Квалитет воде реке Лужнице са аспекта анализе хемијских параметара и њихов утицај на живи свет ове реке“, Конференција о Докторска дисертација 191 коришћењу и заштити вода, Вода 2004, 8-11. Јун 2004, Борско језеро, 135-136, ISBN: 86-904241-1-3. 6. М. Цвијовић, З. Босиљчић, З. Трмчић, „Утицај отпадних вода из прехрамбене индустрије на квалитет воде реципијената“, Воде Србије –наслеђе и перспективе, 23- 24. Септембар 2004, Сомбор, абстр.0345. 7. М. Цвијовић, З. Трмчић, З. Босиљчић, „Утицај отпадних вода из текстилне индустрије на реку Моравицу“, 34-та конференција о актуелним проблемима коришћења и заштите вода, Вода 2005, 7-10. Јун 2005, Копаоник, 407-408, ISBN 86-904241-2-1. 8. М. Цвијовић, В. Инђић, Н. Лазић, З. Трмчиић, „Хемијско бојење бакра и месинга са циљем примене у грађевинарству и за ентеријер“, Симпозијум деформација и структура метала и легура са међународним учешћем, 26-27. Јун 2002, Београд, 197-198 9. М. Цвијовић, З. Трмичић, С. Јовановић, Ј. Јанковић, М. Милојевић, „Утицај концентрације Fe и P као примеса на хомогеност структуре легуре CuZn30 и одређивање мерне несигурности концентрације P“, 13. саветовање комитета за међулабораторијска испитивања материјала, Септембар 2007, Тара, 52. 10. М. Цвијовић, С. Цветковић, М. Милаковић, М. Бокоров, „Појава укључака у производњи бакарних цеви“, XV саветовање KOMIM, 30.9.-.2.10. 2009, Врњачка Бања, 73-74, ISBN 978-86-911831-1-0. 9.2. Списак радова проистеклих из докторске дисертације Научни радови: 1 М. Цвијовић, В. Килибарда, М. Ј. Станков, И. Лазаревић, И. Јаковљевић, Љ. Јоксовић П. Ђурђевић „ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminium Chloride solutions“, Journal of the Brazilian Chemical Society, Vol 23, No 6, 1087-1097, (2012), ISSN 0103-5053, 2. M. Цвијовић, V. Di Marco, P. Traldi, M.J. Станков, П. Ђурђевић „Mass Spectrometric Study of Speciation in Aluminium–Fluoroquinolone Solutions, „European Journal of Mass Spectrometry“ Vol. 18, Nº3, 313-322 (2012), ISSN 1469-0667, doi:10.1255/1183 3. A. Dean, M. G. Ferlin, M. Цвијовић, П. Ђурђевић, F. Dotto, D. Badocco, P. Pastore, A. Venzo and V. Di Marco, Evaluation of 1,2-dimethyl-3-hydroxy-4-pyridinecarboxylic Acid and Other 3-hydroxy-4-pyridinecarboxylic Acid Derivatives for Possible Application in Iron and Aluminium Chelation Th erapy, Polyhedron, october, (2013), In Press Саопштења: 1 М. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Јеликић-Станков, Т. Анђелковић, Љ. Свилар, J. C. Tabet, „Electrospray Mass Spectrometry of Aluminium Fleroxacin Complexes“, Physical Chemistry 2010, 21-24. September 2010, Belgrade, 10th International Conferences on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry 81-83, ISBN: 978-86-82475-170. 2. M. Цвијовић, П. Ђурђевић, В. Килибарда, Д. Стојшић, М. Јеликић-Станков, „Electrospray Mass Spectrometric Investigation of Aluminium Hydrolysis in Chloride Medium“, Physical Chemistry 2010, 21-24. September 2010, Belgrade, 10th International Conferences on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 515-517, ISBN: 978-86-82475-170. 3. M. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Јеликић Станков, P. Traldi „Maldi Mass Spectrometry Of Aluminium–Fluoroquinolone Complexes“, Euroanalysis 11-15. Септембар 2011. Belgrade, Book of Abstract, 144, MS04 4. M. Цвијовић, П. Ђурђевић, М. Јеликић Станков P.Traldi „Tandem Mass Spectrometry Of Aluminum–Fluroquinolone Complexes“, Euroanalysis 11-15. September, Belgrade 2011, Book of Abstract, 145, MS05 Mр Mирјана Р. Цвијовић 192 5. M. Цвијовић, П. Ђурђевић, P. Traldi, Б. Настасијевић, Ј. Звездановић, „Maldi Tof of Aluminium Fluoroquinolone Complexes“, Physical Chemistry 2012, 24-28 Septembar 2012, Belgrade,11th International Conferences on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 692-694, ISBN: 978-86-82475-27-9. 6. M. Цвијовић, П. Ђурђевић, P. Traldi, „Maldi Mass Spectrometry of Aluminium Fluoroqinolone Complexes“, 31st IMMS 2013, Palermo, Italy 153-154, 2013, ISBN 978-88- 907388-2-1 Докторска дисертација 193 10. РАДОВИ ПРОИСТЕКЛИ ИЗ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ Mр Mирјана Р. Цвијовић 194