УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ Мр Тања С. Милошевић-Ифантис ХЕМИЈСКИ САСТАВ И АНТИМИКРОБНА АКТИВНОСТ НЕКИХ СЕКУНДАРНИХ МЕТАБОЛИТА БИЉАКА Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai (Asteraceae) И Origanum scabrum Boiss. & Heldr. (Lamiaceae) Докторска дисертација Крагујевац, 2013. године ИДЕНТИФИКАЦИОНА СТРАНИЦА ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ I.Аутор Име и презиме: Тања С. Милошевић-Ифантис Датум и место рођења: 25.07.1979. Крагујевац Садашње запослење: Фармацеутски факултет, Универзитет у Атини II. Докторска дисертација Наслов: Хемијски састав и антимикробна активност неких секундарних метаболита биљака Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai (Asteraceae) и Origanum scabrum Boiss. & Heldr. (Lamiaceae) Број страница: 273 Број слика: 140, Број схема: 11, Број табела: 61 Број библиографских јединица: 364 Установа и место где је израђен: Природно-математички факултет, Крагујевац; Фармацеутски факулет, Атина Научна област: (УДК): 577.1, Хемија-Биохемија Ментор: др Хелен Скалтса III. Оцена и одбрана Датум пријаве теме: 1050/IХ-2, 17.11.2010 Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: Комисија за оцену подобности теме и кандидата: 930/V-3, 20.10.2010; 03-1050/3-1, 10.11.2010. 1. Др Славица Солујић, редовни професор Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу Научна област: Биохемија и хемија природних производа 2. Др Хелен Скалтса, редовни професор Фармацеутски факултет, Универзитет у Атини Научна област: Фармакогнозија и хемија природних производа (ментор) 3. Др Љиљана Чомић, ванредни професор Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу Научна област: Микробиологија Комисија за преглед, оцену и одбрану докторске дисертације: 350/VII-1, 15.05.2013 1. Др Хелен Скалтса, редовни професор Фармацеутски факултет, Универзитет у Атини Научна област: Фармакогнозија и хемија природних производа (ментор) 2. Др Славица Солујић, редовни професор Природно-математички факултет, Универзитет у Крагујевцу Научна област: Биохемија и хемија природних производа 3. Др Мирослав М. Врвић, редовни професор Хемијски факултет, Универзитет у Београду Научна област: Биохемија 4. Др Влатка Вајс, научни саветник Катедра за органску хемију Хемијског факултета Универзитета у Београду и ИХТМ-у Научна област: Хемија природних производа и органска хемија Датум одбране дисертације: Експериментални део ове докторске дисертације урађен је на Фармацеутском факултету, Универзитета у Атини и у Институту за хемију Природно-математичког факултета Универзитета у Крагујевцу и део су програма пројеката, који финансира Министарство просвете и науке Републике Србије и Грчке државне фондације за стипендије IKY. Тему за докторску дисертацију предложили су проф. др Хелен Скалтса и проф. др Славица Солујић. Изражавам посебну захвалност др Хелен Скалтса, редовном професору Фармацеутског факултета, Универзитета у Атини, ментору рада и др Славици Солујић редовном професору Природно-математичког факултета Универзитета у Крагујевцу на стручној помоћи и драгоценим сугестијама које су омогућиле несметани ток и завршетак овог рада. Посебно се захваљујем др Хелен Скалтса, на отворености и помоћи током израде овог рада. Захваљујем се проф. др Мирославу Врвићу и др. Влатки Вајс са Хемијског факултета, Универзитета у Београду на корисним саветима и сугестијама у току писања дисертације, као и за учешће у комисији за оцену и одбрану докторске дисертације. Захвалност дугујем проф. др Ј. Хеилману (Jorg Heilmann) и његовим сарадницима са Хемијског и Фармацеутског факултета, Универзитета у Регенсбургу, Немачка (Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie Naturwissenschaftliche, Fak- ultat IV – Chemie und Pharmazie, Universitat Regensburg) који су снимили масене спектре (HREIMS) супстанци и значајно допринели интерпретацији резултата који се односе на структуру ново изолованих супстанци. Хвала др Т. Константинидису (Theophanis Constantinidis) са Биолошког факултета, Универзитета у Атини, проф. др Драгани Павловић-Муратспахић са Природно-математичког факултета Универзитета у Крагујевцу на стручној помоћи и уложеном напору око сакупљања, проналажења литературе и фотографија описаних врста биљака, и др К. Кукулица (Catherine Koukoulitsa) са Хемијског факултета, Универзитета у Атини на помоћи око формирања 3D структуре супстанци. Искрену захвалност изражавам свим сарадницима из лабораторије проф. Х. Скалтса и проф. С. Солујић за корисне дискусије и пријатне часове дружења током израде ове докторске дисертације. Захваљујем се свим колегама који су ми на било који начин помогли у изради овог рада, а нарочито другарици и колегиници Јелени Степановић, лабораторија за Аналитичку хемију, на несебечној помоћи око техничког дела израде докторске дисертације и др Марији Живковић на несебичним саветима и подршци у току израде дисертације. Највећу захвалност дугујем мојим родитељима, оцу Слободану, мајци Мири, супругу Христосу и пријатељима на разумевању и стрпљењу које су ми пружали током израде ове докторске дисертације. ИЗВОД ИЗВОД Предмет докторске дисертације је изоловање и идентификација секундарних метаболита из екстраката надземних делова биљака Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai (Asteraceae) и Origanum scabrum Boiss. & Heldr. (Lamiacea), као и испитивање обима њихове антимикробне активности и хемотаксономски значај. Такође, предмет испитивања је хемијски састав етарског уља Centaurea pannonica и антимикробна активност. Применом хроматографских метода изоловања једињења и спектроскопских метода идентификације структура, из неполарног екстракта биљке Centaurea pannonica са подручја Србије, изоловано је и идентификовано 25 једињења: 14 сесквитерпенских лактона, 7 флавоноида, 3 лигнана и 1 фенилпропаноид глукозид. Наведена једињења по први пут су изолована из наведене биљке док су гермакранолид 2α-хидрокси 8- дехидрокси-15-Ο-метакрилат салонитенолид и гвајанолиди: 2α,8α-дихидрокси дехидрокостунолид лактон и панонин нови природни производи, први пут изоловани из природног ресурса. Испитивањем есенцијалног уља наведене биљке, идентификовано је укупно 45 једињења, што је 82,2% укупног састава есенцијаног уља. Квантитативно најзаступљеније групе једињења чине вишемасне киселине са 43,7% и кисеонични деривати сесквитерпенa 18,7%. Из поларног екстракта биљке Origanum scabrum која је ендемска врста Грчке, изоловано је и идентификовано 8 једињења: 3 фенолне киселине из групе депсида, 2 монотерпенска гликозида, 2 алициклична деривата и 1 лигнан. Сва једињења су по први пут изолована из биљке, док су дериват рузмаринске киселине, 3-O-метил рузмаринска киселина и неолигнан, глочидиобозид први пут изоловани из рода Origanum. Резултати антимикробне активности применом микродилуционе методе потврђују да сва изолована једињења показују антимикробну активност. Испитивани грам (+) сојеви осетљивији су у односу на грам (–). Код биљке C. pannonica најбољу активност показују сесквитерпенски лактони са кисеоничним групама док су код биљке O. scabrum најактивнији метил дериват рузмаринске киселине и неолигнан. Од тестираних ИЗВОД микроорганизама, најосетљивији сој је грам (–) бактерија A. baumannii, а најотпорнији стандардни сој квасца C. albicans на свим испитаним узорцима. Резултати антимикробне активности есенцијалног уља биљке C. pannonica указују да уље показује значајну активност. Уље изоловано из C. pannonica показује јаку бактерицидну активност на метил-резистентан сој S. aureus (MBC је 0,63 µL/mL). Екстракти и фракције биљака показале су израженију антимикробну активност од појединачних супстанци, док су у поређењу са комерцијалним антибиотицима, сви испитивани узорци показали слабију антимикробну активност. Поред антимикробне активности испитиван је хемотаксономски значај изолованих једињења обе биљке унутар фамилија Asteraceae и Lamiaceae. Заправо, изоловани метаболити из биљке C. pannonica, која припада „Centaurea jacea” групи, упоређивани су са метаболитима изолованим из Centaurea врста које припадају истој групи у циљу доказивања филогенетичке релације унутар групе. С друге стране, O. scabrum припада потфамилији Nepetoideae и ово је једина врста која припада секцији Anatolicon Bentham, рода Origanum, која је испитивана до сада. Због тога, извршено је упоређивање изолованих метаболита из биљке O. scabrum са метаболитима осталих врста које припадају роду Origanum тј. потфамилији Nepetoideae у циљу откривања потенцијалног хемотаксономског маркера. Резултати изоловања и идентификације секундарних метаболита из биљака C. pannonica и O. scabrum и испитивање њихове антимикробне активности тј. хемотаксономског значаја до сада су први публиковани научни резултати. Кључне речи: Centaurea pannonica, Origanum scabrum, сесквитерпенски лактони, флавоноиди, лигнани, неолигнани, фенолне киселине-депсиди, монотерпениски гликозиди, алициклични деривати, антимикробна активност SUMMARY SUMMARY Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai (Asteraceae) and Origanum scabrum Boiss. & Heldr. (Lamiaceae) and their antimicrobial activities In the present thesis, the secondary metabolites of two different plant species, namely Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai (Asteraceae) growing wild in Serbia and Origanum scabrum Boiss. & Heldr. (Lamiaceae) growing wild in Greece, were isolated and identified. Moreover, the antimicrobial activities of the total plant extracts and the isolates were evaluated. In addition, the chemical composition and the antimicrobial activity of the essential oil of C. pannonica were investigated. The chemical composition of the plant extracts was investigated by means of standard chromatographic (VLC, MPLC, HPLC, CC, TLC) and spectroscopic methods (UV, IR, HREIMS and 1D & 2D NMR). The lipophilic extract of C. pannonica afforded twenty-five compounds including fourteen sesquiterpene lactones, seven flavonoids, three lignans and one phenylpropanoid glycoside. All compounds were isolated for the first time from C. pannonica. Among them, one germacranolide, 2α-hydroxy, 8-dehydroxy 15-Ο-methacrylate salonitenolide and two guaianolides, i.e. 2α, 8α-dihydroxy-dehydrocostus lactone and pannonin are new natural products. Forty-five compounds were identified, representing 82.2% of the total C. pannonica essential oil. Unsaturated and aliphatic acids (43.7%) and oxygenated sesquiterpenes (18.7%) are the major groups of components. The polar extract of Origanum scabrum yielded eight compounds, namely three depsides, two monoterpene glucosides, two alicyclic derivatives and one neolignan. Аll compounds were found in O. scabrum for the first time, while 3-O-methyl rosmarinic acid and the neolignan glochidioboside were isolated from the first time from the genus Origanum L. The in vitro antimicrobial activities of all obtained extracts and isolated compounds were evaluated using the microdilution method. The extracts of both plants showed better antimicrobial activity than the isolated compounds, which exhibited moderate antimicrobial SUMMARY activity. Sesquiterpene lactones bearing oxygenated functions were the most active compounds of C. pannonica, while the most active substances of O. scabrum were 3-O-methyl rosmarinic acid and glochidioboside. Gram-positive bacteria were proved more sensitive than Gram- negative; among all tested microorganisms, A. baumannii was the most sensitive strain, while C. albicans proved the most resistant strain against all isolated compounds. The essential oil of C. pannonica exhibited significant activity against all tested strains. Moreover, it was found that the oil has strong bactericidal effects against methicillin-resistant S. aureus (MBC of 0.63 µL/mL). The antibacterial potential of all samples was lower than the commercial antibiotics. Furthermore, the chemical profile of C. pannonica, which belongs to the “Centaurea jacea” group, was compared to previously studied taxa of the same group and used to assess the phylogenetic relationships in the group. O. scabrum belongs to the subfamily Nepetoideae within Lamiaceae family and this is the only taxon from section Anatolicon Bentham of the genus Origanum studied so far; its chemical profile was compared to other taxa belonging to the subfamily Nepetoideae. This is the first investigation concerning the isolation and the identification of the secondary metabolites from the aerial parts of C. pannonica and O. scabrum and their antimicrobial activities, as well as their chemotaxonomic significance. Key words: Centaurea pannonica, Origanum scabrum, sesquiterpene lactones, flavonoids, lignans, neolignans, phenolic acids, monoterpene glucosides, alicyclic derivatives, antimicrobial activity САДРЖАЈ САДРЖАЈ 1 ОПШТИ ДЕО 1.1 Значај и употреба активних метаболита добијених из лековитог биља 1 1.2 Преглед хемијских структура и биосинтетичких путева неких секундарних метаболита биљака 3 1.2.1 Терпеноиди 4 1.2.1.1 Сесквитерпенски лактони и биосинтезa 7 1.2.2 Фенолна једињења 10 1.2.2.1 Фенолне киселине. Биосинтеза рузмаринске киселине 13 1.2.2.2 Флавоноиди 16 1.2.2.3 Лигнани. Биосинтеза лигнана 19 1.3 Антибиотички ефекат секундарних метаболита биљака 21 1.4 Хемотаксономски значај секундарних метаболита биљака 35 1.5 Основне карактеристике испитиваних биљних врста 36 1.5.1 Фамилија Asteraceae (Compositae) – главочикe 36 1.5.2 Фамилија Lamiaceae (Labiatae) – уснатице 59 ЦИЉ ИСТРАЖИВАЊА 73 2 ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 2.1 Методе изоловања и идентификације активних супстанци из биљног материјала 74 2.1.1 Методе екстракције 74 2.1.2 Хроматографске методе 76 2.1.3 Спектроскопске методе 79 2.2 Хроматографско раздвајање екстракта 81 2.2.1 C. pannonica 81 2.2.2 O. scabrum 94 2.3 Испитивање антимикробне активности 101 2.3.1 Тестирани микроорганизми 101 2.3.2 Одређивање антимикробне активности методом микродилуције 103 САДРЖАЈ 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 3.1 Сесквитерпенски лактони 106 3.2 Лигнани 166 3.3 Флавоноиди 181 3.4 Есенцијално уље C. pannonica 205 3.5 Фенолне киселине 208 3.6 Неолигнан 219 3.7 Алициклични деривати 224 3.8 Монотерпенски гликозиди 229 3.9 Антимикробна активност 236 3.9.1 Антимикробна активност екстраката, фракција и чистих једињења биљке Centaurea pannonica 236 3.9.2 Антимикробна активност екстраката, фракција и чистих једињења биљке О. scabrum 241 3.10 Хемотаксономски значај изолованих метаболита 245 4 ЗАКЉУЧАК 249 ЛИТЕРАТУРА 252 БИОГРАФИЈА ПРИЛОГ Табеле Табела 1.1 Неке групе природних једињења са механизмом деловања 24 Табела 1.2 Ботаничка карта Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai 40 Табела 1.3 Гвајанолиди рода Centaurea 42 Табела 1.4 Структуре гвајанолида изолованих из рода Centaurea 46 Табела 1.5 Флавоноиди изоловани из секције Jacea, род Centaurea 54 Табела 1.6 Структуре флавоноида изолованих из биљних врста секције Jacea, род Centaurea 55 Табела 1.7 Лигнани изоловани из биљних врста рода Centaurea 56 Табела 1.8 Ботаничка карта Origanum scabrum Boiss. & Heldr. in Boiss. 62 Табела 1.9 Секундарни метаболити изоловани из рода Origanum 64 Табела 1.10 Структуре флавона и флавонола изолованих из биљних врста рода Origanum 71 Табела 1.11 Структуре дихидрофлавона и дихидрофлавонола изолованих из биљних врста рода Origanum 72 Табела 2.1 Фракције добијене раздвајањем неполарног екстракта биљке C. pannonica VLC методом 82 Табела 2.2 Фракције добијене раздвајањем неполарног екстракта биљке O. scabrum VLC методом 94 Табела 3.1 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 1 (CDCl3; 400,0 MHz) 107 Табела 3.2 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 2 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 113 Табела 3.3 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 3 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 118 Табела 3.4 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 4 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 121 Табела 3.5 1H-NMR и13C-NMR супстанце 5 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 125 Табела 3.6 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 6 (CDCl3; 400,0 MHz) 128 Табела 3.7 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 7 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 131 Табела 3.8 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 8 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 135 Табела 3.9 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 9 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 140 Табела 3.10 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 10 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 146 Табела 3.11 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 11 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 150 Табела 3.12 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 12 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 154 Табела 3.13 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 13 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 158 Табела 3.14 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 14 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 161 Табела 3.15 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 15 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 167 Табела 3.16 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 16 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 171 Табела 3.17 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 17 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) 174 Табела 3.18 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 18 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) 179 Табела 3.19 UV-Vis спектар супстанце 19 (λmax у nm) 182 Табела 3.20 1Η-NMR супстанце 19 (CD3OD; 400,0 MHz) 182 Табела 3.21 UV-Vis спектар супстанце 20 (λmax у nm) 183 Табела 3.22 1Η-NMR супстанце 20 (CD3OD; 400,0 MHz) 185 Табела 3.23 UV-Vis спектар супстанце 21 (λmax у nm) 187 Табела 3.24 1H-NMR супстанце 21 (CD3OD; 400,0 MHz) 188 Табела 3.25 UV-Vis спектар супстанце 22 (λmax у nm) 189 Табела 3.26 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 22 (CD3OD; 400,0 MHz) 191 Табела 3.27 UV-Vis спектар супстанце 23 (λmax у nm) 193 Табела 3.28 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 23 (CD3OD; 400,0 MHz) 195 Табела 3.29 UV-Vis спактар супстанце 24 (λmax у nm) 197 Табела 3.30 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 24 (CD3OD; 400,0 MHz) 199 Табела 3.31 UV-Vis спектар супстанце 25 (λmax у nm) 201 Табела 3.32 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 25 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) 203 Табела 3.33 Хемијски састав (изражено у %) есенцијалног уља изолованог из биљке C. pannonica 207 Табела 3.34 UV-Vis спектар метанолног раствора супстанце 26 209 Табела 3.35 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 26 (CD3OD; 400,0 MHz; 50,3 MHz) 211 Табела 3.36 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 27 (CD3OD; 400,0 MHz; 50,3 MHz) 214 Табела 3.37 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 28 (CD3OD; 400,0 MHz; 50,3 MHz) 217 Табела 3.38 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 29 (CD3OD; 400,0 MHz) 220 Табела 3.39 1H-NMR супстанце 30 (CD3OD; 400,0 MHz) 225 Табела 3.40 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 31 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) 227 Табела 3.41 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 32 (CD3OD; 400,0 MHz) 230 Табела 3.42 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 33 (CD3OD; 400,0 MHz) 233 Табела 3.43 Антимикробна активност сесквитерпенских лактона (1-14) изолованих из биљке C. pannonica (MIC и MBC µg/mL) 238 Табела 3.44 Антимикробна активност лигнана (15-18), флавоноида (19-25) екстракта и фракције биљке C. pannonica (MIC и MBC µg/mL) 239 Табела 3.45 Антимикробна активност есенцијалног уља биљке C. pannonica (MIC и MBC µL/mL) 240 Табела 3.46 Антимикробна активност секундарних метаболита изолованих из биљке О. scabrum (MIC и MBC µg/mL) 242 Табела 3.47 Антимикробна активност антибиотика на G(–) сојеве бактерија (MIC µg/mL) 243 Табела 3.48 Антимикробна активност антибиотика на G(+) сојеве бактерија (MIC µg/mL) 244 Схеме Схема 1.1 Интрацелуларна локација IPP/DMAPP у биљци, два биосинтетичка пута у којима учествују као и потенцијално место повезаности метаболичких путева (означено стрелицама) 5 Схема 1.2 Формирање (+)-костунолида 9 Схема 1.3 Предложени метаболички пут формирања еудасманолида и гвајанолида од костунолида код биљке водопија 10 Схема 1.4 Биосинтеза фенолних једињења путем шикимске киселине 12 Схема 1.5 Биосинтеза рузмаринске киселине 15 Схема 1.6 Биосинтетички пут флавоноида 18 Схема 1.7 Биосинтеза лигнана 20 Схема 2.1 Екстракција биљке C. pannonica 75 Схема 2.2 Реакција Натустроф реагенс-флавоноид 79 Схема 2.3 Хроматографско раздвајање неполарног екстракта биљке C. pannonica 93 Схема 2.4 Хроматографско раздвајање поларног екстракта биљке O. scabrum 100 Слике Слика 1.1 Основне групе секундарних метаболита и проценат њихове заступљености 3 Слика 1.2 Основне структуре флавоноидних представника 16 Слика 1.3 Механизам дејства есенцијалног уља и компоненти које улазе у његов састав на ћелију бактерије (a-f) 23 Слика 1.4 Структуре терпеноида: (1) ксанторхизол; (2) цинамодин; (3) ент-каур-16(17)- енска киселина; (4) олеанска киселина; (5) урсулна киселина 27 Слика 1.5 Структуре сесквитерпенских лактона: (6) хеленалин; (7) бис(хеленалил)малонат; (8) артемисин 28 Слика 1.6 Структуре сесквитерпенских лактона: (9) кницин; (10) 4'-ацетил кницин (11) центаурепенсина; (12) хлоројанерина; (13) 13-ацетил солститиалина А 29 Слика 1.7 Различити механизми дејства лактона артемисина, партенолида и тхапсигаргина на ћелије тумора 30 Слика 1.8 Структуре фенолних једињења: (14-18) псоракорифоле А-Е 32 Слика 1.9 Структура лабуртенин 33 Слика 1.10 Структуре лигнана: (19) (+)-лионирезинол-3α-O-β-D-глукопиранозид; (20) хејнеанол A 35 Слика 1.11 Распрострањеност рода Centaurea 38 Слика 1.12 Распрострањеност врсте C. pannonica 40 Слика 1.13 Опште структуре гвајанолида 53 Слика 1.14 Општа структура флавоноида 55 Слика 1.15 Структуре дибензилбутиролактонске групе лигнана 57 Слика 1.16 Структуре фурофуранска група лигнана 58 Слика 1.17 Распрострањеност рода Origanum:...........; подручје свих секција изузев секције Origanum:---------. 60 Слика 1.18 Распрострањеност врсте O. scabrum 62 Слика 1.19 Основне структуре монотерпена и монотерпенских гликозида 67 Слика 1.20 Основне структуре тритерпена 67 Слика 1.21 Основне структуре стерола 68 Слика 1.22 Основне структуре алицикличних деривата 68 Слика 1.23 Основне структуре фенолних једињења/ фенолни гликозиди 68 Слика 1.24 Основне структуре фенолних једињења/ фенолне киселине 69 Слика 1.25 Структура хинона/тимохинона 70 Слика 1.26 Структура дихидробензодиокан дериват/оригалигнанола 70 Слика 1.27 Основне структуре флавоноида/ флавони и флавоноли 70 Слика 1.28 Основне структуре флавоноида/ дихидрофлавони и дихидрофлавоноли 72 Слика 1.29 Основне структуре алкалоида 72 Слика 2.1 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-DCH 84 Слика 2.2 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-DCK 85 Слика 2.3 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-EN 87 Слика 2.4 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-EV 87 Слика 2.5 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-F 88 Слика 2.6 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-G 89 Слика 2.7 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-IB 90 Слика 2.8 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-IK 91 Слика 2.9 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CEJ 96 Слика 2.10 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CEI 97 Слика 2.11 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CFDF 98 Слика 2.12 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CFDI 99 Слика 3.1 1. Бабилин А 106 Слика 3.2 1H-NMR спектар супстанце 1 (CDCl3; 400,0 MHz) 107 Слика 3.3 1H-1H COSY, HSQC, HMBC и NOESY спектри супстанце 1 111 Слика 3.4 2. Хлорохисопифолин Ц 112 Слика 3.5 1H-NMR спектар супстанце 2 (CDCl3; 400,0 MHz) 114 Слика 3.6 1H-1H COSY, HMBC и 13C-NMR спектри супстанце 2 116 Слика 3.7 3. Репин 117 Слика 3.8 1H-NMR спектри супстанце 2 (црвени) 2 и 3 (плави) (CDCl3; 400,0 MHz) 118 Слика 3.9 13C-NMR спектар смеше супстанце 2 и 3 119 Слика 3.10 4. Јанерин 120 Слика 3.11 1H-NMR спектар супстанце 4 (CDCl3; 400,0 MHz) 121 Слика 3.12 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 4 123 Слика 3.13 5. 19-Деоксијанерин 124 Слика 3.14 1H-NMR спектар супстанце 5 (CDCl3; 400,0 MHz) 126 Слика 3.15 1H-1H COSY, HSQC и 13C-NMR спектри супстанце 5 126 Слика 3.16 6. Бабилин Б 127 Слика 3.17 1H-NMR спектар супстанце 6 (CDCl3; 400,0 MHz) 128 Слика 3.18 HMBC, HSQC и COSY спектри супстанце 6 129 Слика 3.19 7. Цебелин Ј 130 Слика 3.20 1H-NMR спектар супстанце 7 (CDCl3; 400,0 MHz) 131 Слика 3.21 1H-1H COSY, NOESY и 13C-NMR спектри супстанце 7 132 Слика 3.22 8. Рхапосерин 134 Слика 3.23 1H-NMR спектар супстанце 8 (CDCl3; 400,0 MHz) 135 Слика 3.24 HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, 13C-NMR спектри супстанце 8 137 Слика 3.25 9. 2α,8α-Дихидрокси дехидрокостунолид 139 Слика 3.26 Масени спектар супстанце 9 139 Слика 3.27 1H-NMR спектар супстанце 9 (CDCl3; 400,0 MHz) 140 Слика 3.28 HSQC, HMBC, 13C-NMR/DEPT, 1H-1H COSY и NOESY спектри супстанце 9 142 Слика 3.29 10. Хлорорепдиолид 145 Слика 3.30 1H-NMR спектар супстанце 10 (CDCl3; 400,0 MHz) 146 Слика 3.31 COSYи HMBC спектар супстанце 10 148 Слика 3.32 11. Панонин 149 Слика 3.33 Масени спектар супстанце 11 149 Слика 3.34 1H-NMR спектар супстанце 11 (CDCl3; 400,0 MHz) 151 Слика 3.35 HSQC, HMBC,13C-NMR, 1H-1H COSY и NOESY спектри супстанце 11 152 Слика 3.36 12. Епоксирепдиолид 153 Слика 3.37 1H-NMR спектар супстанце 12 (CDCl3; 400,0 MHz) 155 Слика 3.38 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 12 155 Слика 3.39 13. Репдиолид 156 Слика 3.40 1H-NMR спектар супстанце 13 (CDCl3; 400,0 MHz) 158 Слика 3.41 HSQC, COSY и 13C-NMR спектри супстанце 13 159 Слика 3.42 14. 2α-Хидрокси 8-дехидрокси 15-Ο-метакрилат салонитенолид 160 Слика 3.43 Масени спектар супстанце 14 160 Слика 3.44 1H-NMR спектар супстанце 14 (CDCl3; 400,0 MHz) 162 Слика 3.45 HSQC, HMBC, 13C-NMR/DEPT, 1H-1H COSY и NOESY спектри супстанце 14 164 Слика 3.46 15. Матересинол 166 Слика 3.47 1H-NMR спектар супстанце 15 (CDCl3; 400,0 MHz) 168 Слика 3.48 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 15 169 Слика 3.49 16. Арктигенин 170 Слика 3.50 1H-NMR спектар супстанце 16 171 Слика 3.51 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 16 172 Слика 3.52 17. Арктин 173 Слика 3.53 1H-NMR спектар супстанце 17 (CDCl3; 400,0 MHz) 175 Слика 3.54 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 17 176 Слика 3.55 18. Сирингин 177 Слика 3.56 1H-NMR спектар супстанце 18 (CD3OD; 400,0 MHz) 179 Слика 3.57 1H-1H COSY, HSQC и 13C-NMR спектри супстанце 18 180 Слика 3.58 19. Апигенин 181 Слика 3.59 1Η-NMR спектар супстанце 19 (CD3OD; 400,0 MHz) 182 Слика 3.60 20. Диосметин 183 Слика 3.61 1Η-NMR спектар супстанце 20 (CD3OD; 400,0 MHz) 185 Слика 3.62 21. Хиспидулин 186 Слика 3.63 1Η-NMR спектар супстанце 21 (CD3OD; 400,0 MHz) 188 Слика 3.64 22. Непетин 189 Слика 3.65 Хипохромно померање (око 30-50 nm) траке I на спектру AlCl3 након додатка раствора HCl 190 Слика 3.66 1H-NMR спектар супстанце 22 (CD3OD; 400,0 MHz) 192 Слика 3.67 HSQC и HMBC спектри супстанце 22 192 Слика 3.68 23. Хиспидулин-7-O--D глукопиранозид 193 Слика 3.69 1H-NMR спектар супстанце 23 (CD3OD; 400,0 MHz) 195 Слика 3.70 HSQC, HMBC, 13C-NMR и ROESY спектари супстанце 23 196 Слика 3.71 24. Непетин-7-O-β-D-глукопиранозид 197 Слика 3.72 1H-NMR спектар супстанце 24 (CD3OD; 400,0 MHz) 200 Слика 3.73 HSQC и ROESY спектри супстанце 24 200 Слика 3.74 25. 6-Метоксикаемферол 201 Слика 3.75 1H-NMR спектар супстанце 25 (CD3OD; 400,0 MHz) 203 Слика 3.76 13C-NMR спектар супстанце 25 (CD3OD; 50,3 MHz) 204 Слика 3.77 Графички приказ основних група хемијских једињења изолованих из есенциајлног уља биљке C. pannonica 206 Слика 3.78 26. Рузмаринска киселина 209 Слика 3.79 1H-NMR спектар супстанце 26 (CD3OD; 400,0 MHz) 211 Слика 3.80 13C-NMR и HSQC спектар супстанце 26 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) 212 Слика 3.81 27. Метилестар рузмаринске киселине 213 Слика 3.82 1H-NMR спектар супстанце 27 (CD3OD; 400,0 MHz) 214 Слика 3.83 HMBC и 13C-NMR спектри супстанце 27 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) 215 Слика 3.84 28. 3-O-Метил рузмаринска киселина 216 Слика 3.85 1H-NMR спектар супстанце 28 (CD3OD; 400,0 MHz) 218 Слика 3.86 HSQC и 13C-NMR спектари супстанце 28 218 Слика 3.87 29. Глочидиобозид 219 Слика 3.88 1H-NMR спектар супстанце 29 (CD3OD; 400,0 MHz) 221 Слика 3.89 HMBC, COSY и HSQC спектри супстанце 29 223 Слика 3.90 30. 12-O-Хидрокси јасмонична киселина 224 Слика 3.91 1H-NMR спектар супстанце 30 (CD3OD; 400,0 MHz) 225 Слика 3.92 31. 12-O-Хидрокси јасмонична киселина 12-O-β-глукопиранозид 226 Слика 3.93 1H-NMR и 13C-NMR спектри супстанце 31 (CD3OD; 400,0; 50,3MHz) 228 Слика 3.94 32. Тимохинол-5-O--глукопиранозид 229 Слика 3.95 1H-NMR спектар супстанце 32 (CD3OD; 400,0 MHz) 230 Слика 3.96 HMBC, HSQC и ROESY спектри супстанце 32 232 Слика 3.97 33. Тимохинол-2-O--глукопиранозид 232 Слика 3.98 1H-NMR спектар супстанце 33 (CD3OD; 400,0 MHz) 234 Слика 3.99 HSQC и HMBC спектри супстанце 33 235 1. ОПШТИ ДЕО ОПШТИ ДЕO 1 1.1 Значај и употреба активних метаболита добијених из лековитог биља Употреба лековитог биља документована је кроз историју свих цивилизација. Пре проналаска и употребе синтетичких дрога, људски род је потпуно зависио од употребе медицинског биља. Биљке су коришћене за лечење и превенцију различитих обољења, затим као зачини у исхрани, а због пријатног, специфичног мириса ароматичне биљке су употребљаване и у козметици. Биљке су коришћене у сировој форми, као прах или екстракт. Сматра се да је више од 20000 биљних врста коришћено кроз историју у традиционалној медицини (Hamamouchi, 2002). Древно знање о употреби биљака, пре свега у лечењу различитих обољења, омогућилo је у модерном времену откривање активних супстанци код којих је потврђено да су заслужне за лековито дејство биља. Заправо, вишевековним истраживањима која су и данас актуелна, а употребом различитих хемијских техника, данас је познато да се у биљној ћелији одвијају два међусобно повезана метаболитичка пута. Примарни метаболитички пут односи се на добијање примарних биомолекула (угљенихидрати, масти, протеини, витамини и минералне материје), док секундарни метаболички пут синтетише секундарне метаболите различите хемијске структуре у оквиру којих је велики број физиолошки активних једињења (феноли, танини, кумарини, флавоноиди, алкалоиди, Mann, 1987). Почетком деветнаестог века научници изолују и идентификују прве секундарне метаболите из биљака, да би се током двадесетог века открило да су управо секундарни метаболити (или природни производи) активне супстанце одговорне за лековита и токсична дејства биљака. Заправо, утврђено је да ове супстанце показују значајну биолошку активност и да су потенцијални извори за нове фармацеутске лекове (антибиотици, цитостатици, антиинфламатици итд). Током двадесетог века изражена је потреба модерне медицине за добијањем лекова са дефинисаним и циљним дејством. Употреба биљака и ОПШТИ ДЕO 2 њихових активних компоненти у лечењу потпуно је замењена хемијском синтезом у развијеним земљама. Међутим, недавне публикације базиране на клиничким испитивањима екстраката биљака и изолованих секундарних метаболита потврђују њихово лековито дејство и предлажу интезивнију употребу у модерној медицини (Butler, 2008; Harvey, 2008). Данас се више од 30% свих познатих лековитих и ароматичних биљака користи у медицинске сврхе, а њихова употреба и даље расте. Од када је светска здравствена организација (WHO) објавила да 80% социјално угрожене популације у развијеним земљама зависи од биљака и/или од алтеранативне медицине и затражила од земаља чланица да истражују безбедне домаће лекове за њихову националну здравствену заштиту, раст примене биља у модерној медицини је у сталном порасту. Тако, у сагласности са овом чињеницом забележено је да 1984. године, најмање 25% лекова произведених у западним земљама базирано је на природним производима (издато у Америци и Канади). Најновија истраживања показују да су 28% лекова произведено и међународно признато у периоду 01. 1981. – 06. 2006. природни производи или њихови деривати и да је чак 50-80% антибактеријских и антиканцерогених медикамената заправо базирано на природним производима (Newman & Cragg, 2007, 2010). Биљни и природни производи данас су у широкој употреби пре свега због мање штетности на људско здравље и околину у односу на синтетичке дроге, а притом су и јефтинији и доступнији. На тржишту, биљке су присутне у облику сирове дроге, тинктуре или екстракта, док се неки секундарни метаболити могу наћи у облику пилула. Поред биљaка, нови фармаколошки препарати испитују се у микробима, инсектима, лишајевима, морском биљном и животињском свету, због чега су истраживања ових природних ресурса у сталном развоју. ОПШТИ ДЕO 3 Terpeni 55% Fenoli 18% Alkaloidi 27% 1.2 Преглед хемијских структура и биосинтетичких путева неких секундарних метаболита биљака До сада је идентификовано и изоловано више хиљада различитих секундарних метаболита биљака. Секундарни метаболити су мали молекули, обично присутни у ограниченим количинама у биљној ћелији. При том, за разлику од примарних метаболита, немају хранљиве карактеристике али имају значајну функцију за биљку, као биљни хормони, у заштити биљке од пестицида, патогена, хербивора. Такође, задужени су за боју и мирис биљке (Rosenthal & Berenbaum, 1991, Schafer & Wink, 2009). Свака фамилија, род и врста продукује карактеристичну смешу ових једињења (Walton & Brown, 1999). Секундарни метаболити биљака могу се сврстати на основу:  хемијске структуре (садрже прстен, шећер…),  састава (садрже хетеро атом),  растворљивости у различитим растварачима,  на основу биосинтетичког метаболичког пута. На основу биосинтетичког пута, најпростија класификација укључује три основне групе секундарних метаболита као природних производа:  Терпени и терпеноиди (биосинтетички прекурсор је мевалонска киселина и 1-деокси- D-ксилулозо-5-фосфат). Молекули су изграђени од угљеника, водоника и кисеоника, и идентификовано је око 30000 различитих једињења ове групе.  Фенолна једињења (биосинтетички прекусор су једноставни шећери и аминокиселина фенил- аланин). Молекул ових једињења садржи бар један бензенов прстен, а елементарна анализа указује на присуство водоника и кисеоника. Из ове групе идентификовано је око 8000 различитих једињења.  Једињења која садрже азот (биосинтетички прекурсор су амино- киселине, различити молекули који могу да садрже и сумпор). До сада, из ове групе природних производа изоловано је око 12000 једињења (Croteau et al., 2000). Слика 1.1 Основне групе секундарних метаболита и проценат њихове заступљености ОПШТИ ДЕO 4 Предмет овог рада је испитивање секундарних метаболита одређених биљних врста из прве две наведене групе, стога ће њихова биосинтеза и биолошка активност, посебно антимикробна, бити детаљно описана. 1.2.1 Терпеноиди Терпени (терпеноиди) су структурно различита и широко распрострањена група природних производа која садржи око 30000 дефинисаних једињења изолованих из биљних и животињских извора (Davis & Croteau, 2000). Велики број терпеноида је изолован из биљака и откривено је да имају више значајних улога пре свега везано за примарни метаболизам (неколико биљних хормона као и најзаступљенији биљни терпеноид, фитол, који је бочни ланац фотосинтетичког пигмента хлорофила), затим у еколошким интеракцијама (као хемијски заштитници од хербивора и патогена, опрашивачи, алелопатски агенси, итд.). Многи терпени имају економски значај, укључујући есенцијална уља, каротеноидне пигменте и природну гуму. Основна градивна јединица молекула терпена је изопрен, угљоводоник са 5С атома. Изопренске јединице могу се везивати на различите начине и због тога су терпени, међу природним производима, најраспрострањенија и структурно најразноврснија група једињења. Изопрен је најједноставнији терпен познат као хемитерпен. Повезан са другим изопреном даје терпенску јединицу, монотерпен (C10). Сесквитерпени садрже три изопренске јединице (C15), дитерпени (C20) и тритерпени (C30) садрже четири, односно шест изопренских јединица. Тетратерпени садрже четири терпенске јединице док политерпени више од четири терпенске јединице или више од осам изопренских јединица (Davis & Croteau, 2000; Drew et al., 2009). Бисинтетички прекусор свих терпена су активне изопренске јединице изопентил-дифосфат (IPP) и диметилалил-пирофосфат (DMAPP) (Схема 1). Биосинтеза терпена у биљној ћелији може се посматрати на више нивоа. Први ниво је биосинтеза горе наведених активних изопренских јединица. Следећи корак је њихова кондезација при чему се добија геранил-дифосфат (GDP). Кондезацијом још једног молекула изопентил-дифосфата са геранил- ОПШТИ ДЕO 5 дифосфатом добија се фарнезил дифосфат (FPP), који везивањем још једног молекула (IPP) даје велики изопреноидни прекурсор. Схема 1.1 Интрацелуларна локација IPP/DMAPP у биљци, два биосинтетичка пута у којима учествују као и потенцијално место повезаности метаболичких путева (означено стрелицама) ОПШТИ ДЕO 6 Биосинтетички пут преко мевалонске киселине (MVA) Биосинтеза IPP и DMAPP започиње у цитосолу у присуству NADPH као енергетског извора. Механизмом Клајзенове, а затим и алдолне кондензације, једине се три молекула ацетил-CoA, и дају β-хидрокси-β-метилглутарил-CoA (HMG-CoA) (Berg et al., 2007; Drew et al., 2009). Наведена реакција катализована је ензимима ацетоацетил-CoA синтетазом и β-хидрокси-β-метилглутарил-CoA синтетазом. Значајно је напоменути да је код неких биљака откривено да поседују ензиме који катализују добијање HMG-CoA директно из ацетил-CoA, без претходног добијања ацетоацтил-CoA као интермедијера. Затим се HMG- CoA редукцијом са NADPH+H+ претвара у мевалонску киселину, прекурсор изопреноида у цитосолу. Помоћу ATP мевалонска киселина се активира у пирофосфат мевалонску киселину а затим се декарбоксилацијом, елиминацијом и изомеризацијом добијају примарни прекусори у биосинтези терпеноида: IPP/DMAPP (Схема 1.1). Биосинтетички пут преко 1-деокси-D-ксилулозо-5-фосфата (DXP пут) Овај биосинтетички пут откривен је крајем XX века и за сада је нађен у свега неколико биљака и микроорганизама. Финални продукти су IPP/DMAPP, али интермедијер није мевалонска киселина (Rohmer et al., 1993). На основу биосинтетичких интермедијера 1-деокси-D-ксилозе-5-фосфата и 2-метил-D- еритритол-4-фосфата пут је познат као DXP или MEP пут. Поред разлике у интермедијерима, најважнија разлика ових путева биосинтезе је различита локација ензима у ћелији. Откривено је да се DXP пут одвија у пластициду ћелије (хлоропласт, леукопласт, итд.) и да се овим путем формирају каротеноиди, хлорофил, дитерпени и токофероли за разлику од MVA пута који се одвија у цитосолу и продукује IPP/DMAPP за добијање сесквитерпена, стерола и убихинона (Okada et al., 2008). DXP пут започиње помоћу TPP који иницира декарбоксилацију пирогрожђане киселине и кондензацију са D-глицералдехид-3-фосфатом у 1-деокси-D-ксилозо-5-фосфат (Схема 1.1). У молекулу се одвија премештање типа-пинакола, праћено редукцијом уз формирање 2-метил-D-еритритол-4-фосфат (MEP), који активиран помоћу CTP ОПШТИ ДЕO 7 и ATP даје неколико интермедијера који се одједном конвертују у IPP/DMAPP (Withers and Keasling, 2007). Када су у питању биљке код којих се одвијају оба метаболичка пута, методом изотопног обележавања атома, потврђен је индиректан прелаз активног протона са пластицида у цитоплазму на оба прекурсора, IMP и DMAPF. Верује се да је ово можда разлог због чега је DXP пут дуго година био непознат (Bick & Lange 2003). Ензими који катализују стварање фарнезил дифосфата и већих терпена IMP и DMAPF су прекусори зa све групе терпеноида, а даље реакције транформације су катализоване различитим пренил-синтетазама (трансферазама). Наведене трансферазе, према степену специфичности и везивању броја изопреноидних јединица (Barton Sir et al., 1999), сврстане су у четири групе. Група I: кратко ланчани ензим пренил-дифосфат синтетаза која учествује у формирању изопреноидних јединица до 20 угљеникових атома у молекулу. Ензим је активан у присуству Mg2+ или Mn2+ као кофактора (Barton Sir et al., 1999). Групе II и IV: средњи и дуго-ланчани ензими пренил-дифосфат синтетазе који учествују у синтези терпеноида са 20 и више угљеникових атома. Група III: пренил трансфераза која учествује у изградњи FPP, прекусора свих сесквитерпена. Ензим FPP синтетаза је обимно проучавана (Barton Sir et al., 1999), а резултати су показали да добијање различитих производа зависи од врсте ћелије (прокариота или еукариота), као и да активни део ензима, специфична фенил група амино киселина, одређује величину створеног пренил- дифосфата. 1.2.1.1 Сесквитерпенски лактони и биосинтеза Сесквитерпенски лактони (Sls) припадају групи терпеноида који садрже три изопренске јединице и чија је молекулска формула C15H24. До сада је изоловано и идентификовано више од 5000 супстанци које припадају овој групи (Fraga, 1992-2012). Сесквитерпенски лактони изоловани су из различитих ОПШТИ ДЕO 8 фамилија биљака Acanthaceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Euphorbiaceae, Lauraceae, Magnoliaceae, Menispermaceae, Rutaceae, Winteraceae, Hepatideae, итд. али највећи број сесквитерпенских лактона пронађен је у фамилији Asteraceae (Compositae). На основу C-скелета лактони су подељени на псеудогвајанолиде, гвајанолиде, гермакранолиде, еудесманолиде, хелианголиде и хиптокретенолиде. Гермакранолиди, гвајанолиди и еудасманолиди су најзаступљенији у природи. Суфикс "олид" означава да је лактонски прстен везан за сесквитерпен. Представник сесквитерпенских лактона је гермакранолид костунолид чији је биосинтетички прекусор сесквитерпен гермакрон који садржи карбоциклични прстен са десет угљеникових атома. Лактони се у највећој количини налазе у лишћу и цвету биљке. Испитивањем биосинтезе сесквитерпена утврђено је да FPP, прекусор сесквитерпена, учествује у више различитих реакција циклизације, што за последицу има откривање више од 300 различитих цикличних сесквитерпенских структура. Циклизација, изомеризација а затим јонизација trans- FPP омогућавају добијање различитих циклохексаноида, циклодеканоида, циклодеканида или бициклохесаноидних структура. Добијени циклични молекули су активни тако да даље лако подлежу многим хемијским реакцијама: Wagner-Meerwein премештању, миграцији група, адицији на двоструке везе (Bohlmann et al., 1998). Од свих сесквитерпенских лактона изолованих до сада, највише испитиван па самим тим и најбоље окарактерисан је гермакранолидни лактон костунолид. Овај сесквитерпенски лактон изолован је из биљне фамилије Asteraceae и на њему су вршена и прва испитивања биосинтезе лактона. Утврђено је да почетни корак у биосинтези костунолида јесте циклизација FPP у (+)-гермакрен A. Добијање гермакрена А је катализовано помоћу ензима гермакрен А синтетазе (I), која садржи Mg2+ као кофактор. Због присуства двоструких веза у структури FPP, две (E)-оријентисане двоструке везе су инкорпориране у добијеном десеточланом прстену. Оксидацијом изопренилног бочног ланца у примарни алкохол у присуству ензима (+)- гермакрен А-хидроксилазе, а затим даљом оксидацијом помоћу NAD(P)+- зависне дехидрогеназе (II) добија се гермакренска киселина (III). ОПШТИ ДЕO 9 Хидроксилацијом на положају C-6 (IV), а затим лактонизацијом, добија се као крајњи производ лактон (+)-костунолид (Схема 1.2) (De Kraker et al., 2001). Схема 1.2 Формирање (+)-костунолида Велики број стереоспецифичних трансформација гермакранолида и њихових деривата у еудезманолиде и гвајанолиде истражено је и публиковано. Међутим, у периоду 1998. – 2002. године, Бујмастер (Bouwmeester) и његови сарадници издали су серију публикација у којима су презентовали резултате истраживања ензима који учествују у реакцији биосинтезе костунолида и његових деривата код биљке водопија (Asteraceae). На основу ових истраживања, гвајанолидни скелет настаје епоксидацијом или хидроксилацијом костунолида. Заправо, ензимска епоксидација костунолида на положају C-4/C-5 директно даје партенолид (De Kraker et al., 2002; Drew et al., 2009) од кога се trans-ануларном циклизацијом извијеног прстена добија интермедијер (1). Елиминацијом молекула воде са интермедијера (1) добија се директно гвајанолидни скелет. Међутим, ензими који учествују у последњој реакцији формирања гвајанолида код фамилије Asteraceae до данас нису изоловани и идентификовани (Схема 1.3). ОПШТИ ДЕO 10 Схема 1.3 Предложени метаболички пут формирања еудесманолида и гвајанолида од костунолида код биљке водопија У наставку предложеног биосинтетичког пута описаног на схеми 1.3, наведен је и алтернативни пут: ензимска хидроксилација на положају C-3 (+)- костунолида при чему се добија интермедијер (2), који након дехидрогенизације и циклизације, даје скелет гвајанолида (De Kraker et al., 1998, 2002). 1.2.2 Фенолна једињења Фенолна једињења представљају велику и значајну групу секундарних метаболита. До сада, изоловано је и идентификовано више од 8000 фенолних једињења која су претeжно лоцирана у вакуолама биљке. Изолована су у слободној форми или као супституисани деривати при чему су најчешћи ОПШТИ ДЕO 11 супституенти шећери: глукоза, галактоза, рамноза, маноза, рутиноза и други. Једноставна фенолна једињења врло су ретка у природи. Подељена су у више група (приказ ниже) у зависности од броја угљеникових атома који чине основни фенолни скелет (Pietta, 2000):  Основни феноли, бензохинони (C6),  Хидробензенске киселине (C6-C1),  Ацетофенони, фенилсирћетне киселине (C6-C2),  Хидроксициметна киселина, кумарини, фенилпропани, хромони (C6-C3),  Нафтохинони (C6-C4),  Ксантони (C6-C1-C6),  Стилбени, антрахинони (C6-C2-C6),  Флавоноиди (флавоноли, флавони, флаванони, изофлавони и антоцианини) (C6-C3-C6),  Лигнани, неолигнани (C6-C3)2,  Бифлавоноиди (C6-C3-C6)2,  Лигнини (C6-C3)n,  Катехол меланини (C6)n,  Кондезовани танини (C6-C3-C6)n. Ова једињења имају веома важну улогу у метаболизму биљака и битна су за раст и репродукцију биљних врста. Сматра се да ове супстанце имају улогу заштите биљака од природних (патогени и предатори) и хемијских (UV- радијације, суше, итд.) агенаса (Parr & Bolwell, 2000). Фенолна једињења одређују карактеристичну боју и мирис код различитих биљних врста (Alasalvar et al., 2001). Феноли или полифеноли могу бити уопштено дефинисани као једињења која у свом саставу садрже ароматични прстен са хидроксилном групом (феноли) или више њих (полифеноли), при чему у структуру могу бити укључене и различите функционалне групе (естри, метил етри, гликозиди, итд.). Прецизнија дефиниција међутим, дефинише феноле и полифеноле као секундарнe метаболитe који се биосинтетички добијају тзв. шикимско- фенилпропаноидно-флавоноидним путем (пут шикимске киселине). Они се углавном добијају из циметне киселине, која се формира из фениланина, у присуству l-фенилаланин амонијум-лиазе (PAL). Овај биосинтетички пут у току нормалног развоја биљке, обезбеђује јој око 20% угљеника (Схема 1.4). ОПШТИ ДЕO 12 Схема 1.4 Биосинтеза фенолних једињења путем шикимске киселине (Parr & Bolwell, 2000; Dicko, et al., 2006) Фенилаланин се деаминује помоћу фенилаланин амониум лиазе при чему се добија циметна киселина која се хидроксилује помоћу цимет 4-хидроксилазе ОПШТИ ДЕO 13 (C4H) у p-кумаринску киселину. Помоћу 4-кумарат-CoA лигазе (4CL) p-кумаринску киселину активира се у p-кумарил-CоA. Ово једињење је прекурсор у синтези флавоноида, стилбена и осталих фенилпропаноида као и монолигнола p-кумарил алкохола. Даља хидроксилација на положају 3 помоћу кумарат-3-хидроксилазе (C3H) даје кофеинску киселину или кофеил-CоA. Додата хидроксилна група може бити метилована помоћу O-метилтрансферазе (OMT) при чему се добија ферулна киселина или ферулил-CоA. Кофеинска и ферулна киселина могу се накнадно активирати у одговарајаћи CоA тиоестар помоћу 4-кумарат-CoA лигазе; ферулил-CоA је прекусор за синтезу кониферил алкохола монолигнола. Такође, ферулат може бити хидроксилован у присуству ферулат 5-хидроксилазе (F5H) у 5-хидроксиферулат који је субстарт за 4CL. Хидроксилна група на положају 5 код 5-хидроксиферулата може се накнадно метиловати помоћу OMT и дати синапате; одговарајуће метиловање 5- хидроксиферулил-CоA у синапил-CоA је потврђено и највероватније се дешава у присуству ензима кофеил-CоA 3-O-метилтрансферзе (CCoA-OMT). Директна активација синапата у синапоил-CоA је теоретски могућа, али није потврђена. Експериментално је доказано да редукција CоA до одговарајућих алдехида и алкохола као коначних производа катализована је одговарајућом алдехид-CоA редуктазом (ACR) и алкохол дехидрогеназом (ADН). 1.2.2.1 Фенолне киселине. Биосинтеза рузмаринске киселине Фенолне киселине се код биљака могу добити преко шикимске киселине, фенилпропаноидним путем (Схема 1.4) или као продукти разлагања лигнина или полифенола који су акумулирани у ћелијском зиду васкуларног биља (Carpita & McCann, 2000; Croteau et al., 2000; Harborne, 1980). Фенолне киселине добијене на овај начин су једноставне хемијске структуре C6-C3 (фенилпропаноидног типа) и обавезни су секундарни метаболити, нарочито код ароматичног биља. Међу многобројним фенолним киселинама акумулираним у биљној ћелији, рузмаринска киселина привлачи посебну пажњу научника и припада групи молекула од посебног интереса. Заправо, поједине биљке је акумулирају у количини много већој од саме биљке (до 36% од суве масе ћелије), па се из тог разлога предлаже биотехнолошка производња рузмаринске ОПШТИ ДЕO 14 киселине из култивисаних биљних ћелија. По хемијском саставу рузмаринска киселина је естар кофеинске и 3,4-дихидроксифениллактонске киселине. Обично се налази у биљкама фамилије Boraginaceae и Lamiaceae (ограничено на субфамилију Nepetoideae), али је изолована и из многи других фамилија. До сада су изоловани и многи деривати рузмаринске киселине. Аминокиселине L- фенилаланин и L-тирозин су прекусори у биосинтези рузмаринске киселине. Свих осам ензима који катализују реакцију биосинтезе су изоловани и идентификовани као и cDNA која је одговорна за кодирање тј. синтезу наведених ензима (Petersen and Simmonds, 2003). Ензими су изоловани из ћелијских суспензија биљних врста Anchusa officinalis (Boraginaceae) и Coleus blumei (Lamiaceae). Фенилаланин се трансформише на начин описан код биосинтезе фенолних једињења (Схема 1.5). Први метаболички корак код L-тирозина је трансаминација са 2-оксоглутаратом при чему се добија 4-хидроксифенилпируват и глутамат. Ензим који катализује ову реакцију је пиродоксалфосфат зависна трансаминаза или тирозин аминотрансфераза (ТЕТ). Ензим као и ген cDNA помођу ког се синтетизује ензим су изоловани из биљке Coleus blumei. Како 4-хидрокси-фенилпируват није идентификован као интермедијер приликом биосинтезе аминокиселина, представљени пут из тирозина је логичан. 4-Хидрокси-фенилпируват се затим редукује до 4-хидроксифениллактата помоћу хидроксифенилпируватне редуктазе (HPPR) (Petersen et al., 1993). Ензим је NADH и NADPH зависан и није специфичан с обзиром да редукује и 3,4-дихидроксифенилпируват са смањеном активношћу. Цео ланац cDNA од HPPR је изолован из Coleus blumei. Као крајњи производ добија се хидроксифениллактат R (+)-стереоизомер, једини могући изомер у реакцији коју катализује хидроксифениллактат хидроксиманил тренсферазе (синтетаза рузмаринске киселине, RAS). У присуству овог ензима одвија се реакција естерификације 4-кумаринске киселине и хидроксилне групе 4-хидроксифениллактата уз формирање 4-кумарил-4'-хидроксифениллактата који може накнадно бити хидроксилизован на положају 3 и 3' помоћу цитохром P450 монооксигеназе. Ензим, као и ген помоћу ког се синтетизује, изоловани су из Lithospermum erythrorhizon (Схема 1.5). ОПШТИ ДЕO 15 Схема 1.5 Биосинтеза рузмаринске киселине ОПШТИ ДЕO 16 1.2.2.2 Флавоноиди Флавоноиди припадају групи природних једињења са различитим фенолним структурама, широко распрострањени у биљном свету. Изоловани су из воћа, поврћа, житарица. Налазе се у кори, корену, стаблу и цвету биљака (Nijveldt et al., 2001). Више од 4000 различитих флавоноида је изоловано до сада од којих су многи одговорни за боју цвета, плода и листа биљке. Подељени су у више група, према основној хемијској структури (Слика 1.2). O O A B C2 3 45 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' Flavoni O O 2 3 45 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' Flavonoli OH O O 2 3 45 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' Izoflavoni O O 2 3 45 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' Flavanoni O O 2 3 45 6 7 8 2' 3' 4' 5' 6' Dihidrof lavonoli OH O CH O 4 7 6 5 2' 3' 4' 5'6' Auroni O 2 3 4 56 2' 3' 4' 5' 6' Halkoni Слика 1.2 Структуре флавоноидних представника Флавоноиди се у природи налазе у облику агликона, гликозида и метилованих деривата. Флавоноид агликон садржи бензенски прстен (A) који је кондезован ОПШТИ ДЕO 17 за шесточлани прстен (C), који на позицији C-2 садржи фенил групу (B) као супституент (Слика 1.2). Шесточлани прстен кондезован са бензенским прстеном је или α-пирон (флаваноли и флаванони) или његов дихидродериват (дихидрофлавонол и дихидрофлавонон). Позиција фенилне групе раздваја флавоноиде у две основне групе: флавоноиди (позиција C-2) и изофлавоноиди (позиција C-3). Флавоноли се разликују од флавонона по хидроксилној групи на положају C-3 и двострукој вези на положају C-2/C-3. Аурони садрже бензофурански елемент који је повезан са фенолном групом на позицији C-2. Код аурона, халкон група је затворена у облику петочланог прстена у односу на шесточлане прстенове који су типични за флавоноиде. Флавоноиди су често хидроксиловани на положајима 3,5,7,2',3',4',5'. Метиловање и ацетиловање алкохолних група је такође често код флавоноида изолованих из биљака. Шећери су најчешће лоцирани на позицији C-3 или C-7 и од шећера су до сада идентификовани L-рамноза, D-глокоза, галактоза и арабиноза (Raj Narayana et al., 2001). Халкон је ароматични кетон са енонском групом у централном делу молекула и они су најчешће интермедијери у биосинтези флавоноида. Биосинтеза флавоноида почиње кондезацијом једног молекула 4-кумарил-CoA са три молекула малонил-CoA дајући нарингенин халкон. Ова реакција се одвија у присуству ензима халкон синтетазе (CHS). Два непосредна прекусора халкона су директни или индиректни продукти два различита биосинтетичка пута примарног метаболизма:  Кумарил-CoA је синтетизован од аминокиселине фенилаланина (Схема 1.4).  Малонил-CoA је добијен карбоксилацијом ацетил-CoA, који је централни интермедијер у Кребсовом циклусу. Добијени халкон затим, реакцијом изомеризације, у присуству ензима халкон флаванон изомеразе (CHI) даје флаванон - централни интермедијер од кога се метаболички пут грана, дајући горе наведене класе флавоноида (Схема 1.6). ОПШТИ ДЕO 18 Схема 1.6 Биосинтетички пут флавоноида (Ензими: фенил амониум-лиаза (PAL); цимет 4-хидроксилазе (C4H); 4-кумурил-коензим А лигазе (4CL); халкон синтаза (CHS); халкон флаванон изомераза (CHI); флаванон-3F-хидроксилазе (F3H); дихидрофлавонол 4-редуктазе (DFR); флавонол синтетазе (FLS); изофлавоноид синтетазе (IFS); антоцианин синтетазе (AS); флавоноид 3-0-глукозилтрансферазе (F3ГТ); UDP глукозе (UDP- Glc) ОПШТИ ДЕO 19 1.2.2.3 Лигнани. Биосинтеза лигнана Лигнани и неолигнани су група природних производа добијених купловањем два молекула C6-C3. Израз лигнан користи се код оних једињења код којих су две јединице C6-C3 повезане β,β'-везом за разлику од неолигнана када су две јединице купловане на други начин (m,m'; γ,γ'; β,m', итд.). Концепт да су лигнани деривати добијени полимеризацијом кониферил алкохола датира још с краја ХIX и почетком XX века (Freudenberg, 1965). Потврда оваквог метаболичког пута, да су кониферил алкохол и остали монолигноли прекурсори, добијена је пре око тридесет година (Freudenberg, 1965; Freudenberg and Neish, 1968; Higuchi & Brown, 1963). Међутим, још увек није потпуно разјашњено на који начин је фаворизован одређени биосинтетички пут у ћелији код различитих биљака или у различитим ћелијама исте биљне врсте. Три монолигнола, који се разликују по остатку на ароматичном прстену, могу бити полимеризовани у лигнан (Схема 1.7). Релативна количина различитих монолигнола у лигнану зависи од биљне врсте као и од тоталног садржаја лигнана. Механизам који контролише ове варијације није у потпуности познат. Такође, механизам као и ензими који катализују реакције биосинтезе лигнана још увек нису познати (Dean and Eriksson, 1994; O'Malley et al., 1993; Savidge et al., 1994, Whettena & Sederoffa, 1995). Недавно истраживање (DeMartino, 2005) указало је на учешће неколико стереоспецифичних ензима у процесу биосинтезе. Претпоставља се да купловање фенилпропаноидних јединица може бити започето у присуству пероксидаза, при чему настају слободни радикали који се димеризују слободно- радикалским механизмом дајући рецемску смешу куплованих производа. Иако прихватљиво, ово истраживање ипак нема одговор на добијање енантиомерних смеша директним купловањем и/или добијање даљих деривата, изолованих из биљака (Схема 1.7). ОПШТИ ДЕO 20 Схема 1.7 Биосинтеза лигнана ОПШТИ ДЕO 21 Како се у биљним ћелијамa одвијају различити метаболички процеси истовремено, јасно је да једна биљка може произвести више секундарних метаболита, као и да различите биљне врсте имају карактеристичне метаболичке путеве као и специфичне метаболите. Секундарни метаболити међусобно се разликују по хемијском саставу, садрже различите функционалне групе, имају врло значајне функције у биљци и показују изражену биолошку активност. 1.3 Антибиотички ефекат секундарних метаболита биљака У прошлом веку доказано је да су за медицинска својства многих биљних врста заслужни секундарни метаболити, и да показују разноврсну биолошку активност: антиоксидативну, антиинфламаторну, антимутагену, антиканцерогену као и антимикробну активност (Aaby et al., 2004; Luo et al., 2004). Током последње деценије постало је очигледно да антибиотици који су у широкој употреби, губе ефикасност као последица резистентности патогених микроорганизама на њихову активност. Бактерије могу стећи отпорност на више различитих начина, при чему неке постају и потпуно резистентне на дејство антибиотика, попут тзв. метицилин резистентне Staphylococcus aureus (MRSA). Решавање питања резистентности микрорганизама тј. повећање активности анибитотика или проналазак нове супстанце која показује ефикасније дејство, мање штетно за човека, стално је актуелно. Многа испитивања данас усмерена су ка добијању нових ефикаснијих антибиотика широког спектра дејства (Amabile-Cuevas, 2010, Newman & Cragg, 2010). У сагласности са наведеним, истраживања базирана на антимикробној активности секундарних метаболита (природних производа), који су широко доступни, а притом структурно и хемијски врло различити, је фундаментално. Заправо, у циљу добијања супстанци које ће имати потенцијал за добијање ефикаснијег, а по људско здравље мање токсичног антибиотика, истраживања природних једињења нагло се развијају. Тако је у периоду 2000. – 2008. године за више од 300 секундарних метаболита изолованих из биљака доказана ОПШТИ ДЕO 22 активност на испитиване микроорганизме, при чему готово половина показује активност бољу или једнаку актуелном антибиотику који је коришћен као стандард у испитивању. У прошлости, основни извор антибиотика били су микроорганизми и очекује се да ће они заједно са биљкама бити основни антибиотички извор у будућности (Behal 2001; Saleem et al., 2009). Механизам антимикробне активности природних једињења Сматра се да постоји пет основних механизма дејства природног производа на ћелију микроорганизма:  дезинтеграција мембране цитоплазме,  дестабилизација проласка протона кроз мембрану ћелије (PMF),  проток електрона,  активни транспорт и  коагулација ћелијског садржаја. Најчешћи механизам дејства је нарушавање ћелијског зида микроорганизма, при чему се сâм механизам може одвијати на више различитих начина и на више нивоа, у зависности од хемијске природе супстанце. Хидрофобне супстанце изазивају таложење липида ћелијске мембране, нарушавају организацију ћелијске мембране бактерије која постаје знатно пермеабилнија. Са друге стране, неке супстанце везују се за протеине ћелијске мембране (најчешћа реакција је интеракција липофилних једињења са хидрофобним деловима протеина). Одређене супстанце могу директно нарушити липид- протеинску интеракцију ћелијског зида или реагују са ензимима који се налазе унутар цитоплазматичне мембране и на тај начин нарушавају њену стабилност тј. потпуно деградирају ћелијски зид. Познато је, такође, да неки циклични угљоводоници делују на ATP-азе, ензиме лоциране унутар цитоплазматичне мембране окружене липидним молекулима и на тај начин нарушавају енергентски биланс ћелије као и структуру ћелије микроорганизма (Sikkema, 1995). Механизам есенцијалних уља одвија се каскадно. Због своје хидрофобности, у додиру са ћелијском мембраном микроорганизма есенцијална уља нарушавају липидну структуру, при чему ћелијски зид постаје пермеабилнији. Одређене компоненте есенцијалног уља дифундују кроз ОПШТИ ДЕO 23 нарушену структуру мембране и реагују са основним ћелијским компонентама при чему каскадно долази до заустављања осталих виталних биохемијских процеса у ћелији: попут нарушавања енергетског баланса битног за регенерацијске процесе ћелије (утицај на ATP); нарушавање синтезе структурних молекула или прекид секреције витално важних ензима (Faleiro, 2011; Raybaudi-Massilia et al., 2009). Механизам дејства есенцијалног уља приказан је на слици 1.3. Слика 1.3 Механизам дејства есенцијалног уља и компоненти које улазе у његов састав на ћелију бактерије (a-f). Илустрован је механизам дејства унутар мембране (Burt 2004a) Са друге стране, код одређених бактеријских сојева, као у случају бактерије Helicobacter pylori, активност једињења или њихове смеше (биљни екстракти или есенцијална уља) могу се повезати са механизмом антиинфламативне активности. Наведена бактерија развија се у слузавом слоју желуца и сматра се основним изазивачем хроничног гастритиса, једне од болести савременег доба као и полазном основом за добијање канцера желуца. Истраживања су показала да H. pylori у контакту са епителним ћелијама изазива стварање високе концентрације неутрофил-везаног хемокина, интерлеукина (IL)-8 преко активације нуклеарног фактора (NF)- κB (Lamb et al., 2009). Према томе, смањење концентрације тј. прекид пораста нивоа цитокина представља ОПШТИ ДЕO 24 место за интервенцију активне супстанце и евентуално спречавање H. pylori инфламације. Природна једињења сматрају се потенцијалним инхибиторима транскрипционог фактора NF-κB, супротно од широко употребљаваних синтетичких антибиотика који су инхибитори упумпавања протона тј. смањења киселости у желуцу (Bork et al., 1997). Због тога су испитивања активности разних секундарних метаболита на H. pylori у последњој декади XXI века врло актуелна и стално се интезивирају (Chun et al., 2005; Fukai et al., 2002; Keenan et al., 2012; Toyoda et al., 2007). Табела 1.1 Неке групе природних једињења са механизмом деловања Група Подгрупа Једињење Механизам Феноли Обични феноли Катехоол Смањење субстрата Епикатехин Нарушавање мембране Фенолне киселине Цинаминска киселина ? Хинони Хиперицин Комплекс са ћелијском мембраном, инактивација ензима Флавоноиди Хрисин Адхезионо везивање Флавони - Ћелијск мембрански комплекс Абисинон Инактивација ензима Реверзна инхибиција HIV транскриптазе Флавоноли Тотарол ? Танини Елагитанин Везивање за протеине Везивање за адхесин Инхибиција ензима Смањење субстрата Комплекс са ћелијом мембране Нерушавање ћелије мембране Метал-јон комплекс Кумарини Варфарин Интеракција са еукаротском DNA (антивирална активност) Терпеноиди Есенцијална уља - Капсаицин Нерушавање ћелије мембране Алкалоиди - Берберин Интеракција са ћелијским зидом и/или DNA Пиперин Лектини и полипептиди - Манозе- специфични аглутинин Блокирање вирусне футије или адсорпције фалксатин Формирање дисулфидних веза ОПШТИ ДЕO 25 Како се крајем прошлог и почетком овог века интезивно истраживала антимикробна активност различитих група природних једињења, у овом раду издвојићемо само најактивније и најпознатије представнике групе терпеноида и флавоноида. Терпеноиди. Терпени су многобројна група једињења, потпуно различита међу собом по хемијској и физичкој активности, па је самим тим врло тешко извршити категоризацију њихове разноврсне биолошке активности, изузев за групу сесквитерпенских лактона, за које је доказано да су цитотоксични природни производи. Међу биоактивним дитерпенима познати су: гинколиди - PAF инхибитори, гиберлини - биљни хормони раста као и антиканцероген дитерпен паклитаксел. Од тритерпена издваја се биолошка активност бетулинске киселине. Заправо, откривено је да ова киселина инхибира развој вирус HIV-а и да је актива на злоћудном тумору-меланому. Затим, босвелинска киселина показује антиинфламаторно дејство као и потенцијална заштита од артритиса док је брусатол познат у превенцији од канцера (Tolstikov et al., 2005). Антимикробно дејство есенцијалних уља која представљају смешу монотерпена и сесквитерпена познато је од античког доба. Последњих деценија, њихово антимикробно дејство, које је синергично дејство више компоненти, научно је доказано и данас се сматра да 60% хемијских деривата присутних у есенцијалним уљима показују антифунгално дејство док 30% показује антибактеријско. И поред наведеног, пронађено је да су есенцијална уља изолована из појединих биљака као што је бели тимус, лимун и цимет врло активна на неколико сојева MRSA, Streptococcus и Candida и сматрају се потенцијалним заменама за познате антибиотике (Warnke et al., 2009). Такође, запажа се да показују израженију активност на грам (+) бактерије, што се објашњава чињеницом да је код грам (–) бактерија ћелијски зид састављен од хидрофилних липополисахарида (LPS), што представља баријеру за макромолекуле и хидрофобна једињења. Наведена генерална претпоставка мора се узети са резервом јер као што је претходно описано (стр. 23), механизам дејства есенцијалних уља одвија се на више начина и тешко је предвидети осетљивост испитиваног микроорганизма (Hyldgaard et al., 2012). ОПШТИ ДЕO 26 Од појединачних супстанци из групе терпена издвајају се (Слика 1.4):  Сесквитерпен ксанторхизол (1) изолован из етанолног екстракта Curcuma xanthorrhiza, показује MIC од 8,0 – 16,0 µg/mL на следеће сојеве Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, и Vibrio parahaemolyticus (Lee et al., 2008).  Дитерпен цинамодин (2) показује изражену антифунгалну активност на: Alternaria alternata (MFC 3,9 µg/mL), Candida albicans D10 и Wangiella dermatitidis (MFC 15,6 µg/mL) као и кауран дитерпен, ент-каур-16(17)- енска киселина (3) показује потенцијалну активност на оралне патогене Streptococcus sobrinus, S. mutans, S. mitis, S. sanguinis i Lactobacillus casei.са MIC 10,0 µg/mL (Amiguet et al., 2006; Ghisalberti, 1997; Slimestad, 1997). С обзиром на то да врло мали број природних производа показује значајну активност на оралне патогене изазиваче зубног каријеса ово је врло значајан податак који указује на примену каурана за производњу лекова који спречавају кариjес.  Значајну антимикробну активност показали су и пентациклични терпени од којих се издвајају олеинска (4) и урсoлна киселина (5), изоловани из различитих биљних фамилија. Хориучи (Horiuchi) и сарадници су у свом рад тврде да наведени тритерпени показују значајну активност на ванкомицин резистентни сој Enterococcus са минималном инхибиторном концентрацијом (MIC) 8,0 и 4,0 µg/mL, појединачно; такође су оба терпена показала активност на Streptococcus pneumoniae и MRSA, са MIC 16,0 и 8,0 µg/mL. Наведене супстанце већ се дуги низ година налазе у слободној продаји у Кини као лекови за обољења јетре са врло малом дозом токсичности. У сагласности са овом чињеницом верује се да су корисна једињења у лечењу инфекција изазваних ванкомицин резистентним сојем Enterococcus (Horiuchi et al., 2007; Liu, 1995). ОПШТИ ДЕO 27 Слика 1.4 Структуре терпеноида: (1) ксанторхизол; (2) цинамодин; (3) ент-каур-16(17)-енска киселина; (4) олеанска киселина; (5) урсулна киселина Механизам деловања терпена није у потпуности разјашњен али сматра се да утичу на разградњу ћелијског зида, нарочито липофилни терпени. Мендоза (Mendoza) је нашао да повећање броја хидроксилних група код каурен дитерпеноида значајно смањују њихову активност (Mendoza et al., 1997). Сесквитерпенски лактони-група терпеноида која су и поред тога што показују различите биолошке активности пре свега познати по својој израженој цитотоксичној и антиинфламатарној активности (Мuhammad et al., 2003; Bruno et al., 2005; Ren et al., 2012). Поред многобројних испитивања антиканцерогене активности издваја се in vitro и in vivo активност на P388 ћелије леукемије где су нарочиту активност показали хеленалин (6) и дериват бис(хеленалил)малонат (7), који инхибирају DNA и протеинске синтетазе малигних ћелија, инхибирајући синтезу пурина (Hall et al., 1987; Williams et al., 1988). Такође, по биолошкој активности међу сесквитерпенским лактонима издвајају се артемисин (8) и његови деривати који се налазе на листи Светске здравствене организације за лечење маларије (Слика 1.5). Овај лактон са врло карактеристичним пероксидним прстеном понаша се као инхибитор соја P. falciparum, изазивача маларије вероватно реакцијом са атомима азота ОПШТИ ДЕO 28 протеина. Лактон је активан у наномоловима на P. falciparum сојеве и није штетан за људско здравље, па је незаменљив лек више од деценије (Chaturvedi, 2011). Будући да је врло активна супстанца и лако реагује са другим лековима а како се недавно појавио сој P. falciparum на Тајланду и Камбоџи, отпоран на артемисин, ради се на његовој дериватизацији, да би се добио пре свега стабилнији производ подједнако или више активан од артемисина (O'Brien et al., 2011, Amaratunga et al., 2012). O HO H H OO O OH H O O O O H H O O OO O O O O O H 11 1312 6 7 8 Слика 1.5 Структуре сесквитерпенских лактона: (6) хеленалин; (7) бис(хеленалил)малонат; (8) артемисин Поред појединих секвитерпенских лактона који се користе у медицинске сврхе и корисни су за људско здравље, постоје и они који су штетни, врло токсични изазивачи алергија. Тако се сматра да гвајанолид репин изолован из биљке C. repens изазива неуролошке поремећаје код животиња нарочито код коња, сличне Паркинсоновој болести при чему долази до грчење мишића па и до потпуне парализе мишићног система животиње (Hamburger, 1993). С обзиром на изражену биолошку активност, у литаратури постоји велики број резултата истраживања лактона као антибиотичких једињења. Откривено је да ова група једињења показује средње јаку активност код бактерија као и да су много осетљивији грам (+) сојеви у односу на грам (–). Такође, доказано је да сесквитерпенски лактони показују јаку антифунгалну активност (Vajs et al., 1999, Barero et al., 2000, Karioti et al., 2002; Saroglu et al., 2005; Djeddi et al., 2007; Cartagena et al., 2008, Ćirić, 2009; Duraipandiyan et al. 2012). ОПШТИ ДЕO 29 Из групе гермакранолида (Ćirić, 2009) кницин (9) и дериват 4'-ацетил кницин (10) показали су најбоље антимикробно дејство на широк спектар испитиваних бактерија и гљива. Минимална инхибиторна концентрација је у опсегу 13,2 – 52,8 µmol/mL код бактерија и 6,6 – 52,8 µmol/mL код гљива. На основу наведеног рада показано је да најбоље антифунгално дејство имају гермакранолиди, елеманолиди па гвајанолиди (Слика 1.6). Од гвајанолида недавно је урађено испитивање антимикробне активности центаурепенсина (11), хлоројанерина (12) и 13-ацетил солститиалина А (13) изолованих из Centaurea solstitialis L. ssp. solstitialis (Слика 1.6). Наведени гвајанолиди показали су јаку активност на сој Staphilococcus aureus са минималном инхибиторном активношћу 16 µg/mL, на друге испитиване сојеве активност је била знатно слабија, укључујући и квасац Candida albicans код којег је одређена минимална инхибиторна концентрациjа 64 µg/mL (Özçelik et al., 2009). За разлику од слабе антибактеријске активности на грам (+) и грам (–) бактерије многи сесквитерпенски лактони изоловани из различитих биљака показују значајну активност на Helicobacter pylori in vitro и in vivo ( Konstantinopoulou et al., 2003). Између осталих, испитивана је активност неполарног екстракта наведене Centaurea solstitialis L. ssp. solstitialis као и изолованих фракција које садрже наведене гвајанолиде на Helicobacter pylori, и забележена je значајна активност (Yesilada et al., 2004). O O O Cl OH O HO HO Cl O O O OH O HO HO Cl O O HO O CH3 O OH OHO O O OH OHO OHO O O OAC OHO (9) (10) (11) (12) (13) Слика 1.6 Структуре сесквитерпенских лактона: (9) кницин; (10) 4'-ацетил кницин (11) центаурепенсин; (12) хлоројанерин; (13) 13-ацетил солститиалин А ОПШТИ ДЕO 30 Испитивањем механизма деловања сесквитерпенских лактона који као група једињења показују различите биолошке активности, изводи се закључак да следеће структурне карактеристике утичу на активност: (1) Присуство егзоцикличне метиленске групе која је коњугована са γ- лактоном. (2) Присуство разних функционалних група у молекулу, епоксид, хидроксил, хлорхидрин, незасићени кетон или О-ацил група који могу појачати активност α-метилен-γ-лактонског прстена према биолошким нуклеофилима (Rodrigeuz et al., 1976; Hoffmann & Rabe 1985). Изразита цитотоксична активност сесквитепенских лактона објашњава се управо присуством α-метилен-γ-лактонског прстена који селективно алкилује тиолне групе у протеинима и ензимима типом Michael адиције и то једним од механизама приказаних на Слици 1.7. Слика 1.7 Различити механизми дејства лактона артемисина, партенолида и тхапсигаргина на ћелије тумора (Ghantous et al., 2010) Michael адиција α-метилен-γ-лактонског прстена на тиолне групе цитокина и разних упалних ензима могу се применити као објашњење и за активност сесквитерпенских лактона на Helicobacter pylori. Сматра се да сесквитерпенски лактони показују значајну активност на ову бактерију која изазива упални ОПШТИ ДЕO 31 процес и повећава концентрацију упалних медијатора цитокина. Секвитерпенски лактони с друге стране, као изразито антиинфламаторне супстанце, директно утичу на смањење концентрације упалних медијатора као и на ефикасност ензима који активирају упални процес и заустављају везивање транскрипционог фактора NF-κB за DNA, самим тим спречавају развијање Helicobacter pylori (Al-Saghir et al., 2009; Rüngeler et al., 1998; Tornhamre et al., 2001). Када је у питању антимикробна активност, не постоји много информација о вези између структуре сесквитерпенских лактона и активности. Претпоставља се да, слично као код цитотоксичности, долази до реакције егзоцикличне двоструке везе лактонског прстена са тиолним групама ензимских протеина који чине ћелијски зид бактерија (Picman & Towers, 1983). Међутим, због разноврсности резултата добијених испитивањем антимикробне активности као и структура сесквитерпенских лактона, претпоставља се да је сам механизам скуп више хемијских реакција које утичу на резултате активности. Као потврда горе наведеног, Монслав (Monslave) и сарадници су објавили да је гермакранолид кницин јак иреверсни инхибитор који делује на систем бактеријских ензима Мур А (MurA), одговорних за биосинтезу пептидогликана у цитоплазми, и од виталног су значаја за даљи метаболизам бактерије (Monslave et. al., 2009). Са друге стране, код антифунгалне активности, претпоставља се да активност појединих сесквитерпенских лактона, пре свега гермакранолида потиче од њихове високе липофилности што им омогућава лакшу и бржу пенетрацију кроз ћелијски зид гљива (Barreroa et al., 2000; Ćirić, 2009). Све наведено указује да су даља истраживања у овој области неопходна. Фенолна једињења. Слично терпенима, фенолна једињења показују широк спектар биолошких дејстава. Једна од основних је антиоксидативна активност (везивање слободних радикала) због које се фенолна једињења сматрају супстанцама које могу утицати превентивно и у знатној мери редуковати различите болести: канцер, атеросклерозу, остеопорозу, Алцхајмерову болест, итд. (Fukai et al., 2002; Shi et аl., 2001). По антиоксидативној активности нарочито се издваја група полифенола који су заступљени у воћу, многим зачинским биљкама, вину, маслиновом уљу (Wojdyło et al., 2007). ОПШТИ ДЕO 32 Антимикробна активност биљних фенола је такође интензивно истраживана, с обзиром на то да су ова једињења заслужна за контролу ширења и раста биљних патогена. Интезивна истраживања активности фенола на хумане патогене има за циљ добијање нових здравих хранљивих супстанци, медицинских супстанци и лекова, пре свега сигурних за људско здравље. До данас постоји много литературних података о антимикробној активности фенола и полифенола на патогене Staphylococcus aureus, сојеве Streptococcus-а, Enterobacter, Proteus, Bacillus са врло интезивном активношћу МIC 0,78 – 6,25 µg/mL (Cueva et al. 2010; Jayaprakasha et al., 2003; Özkan et al., 2004). Нађено је да обични феноли као што су катехол (две хидроксилне групе) и пирогалол (три хидроксилне групе) показују антимикробну активност, при чему је показано да присуство више хидроксилних група повећава активност према микроорганизмима. Фенолне киселине показују значајну антимикробну активност, па је испитивањем активности протокатехинске, кофеинске, ферулне и кумаринске киселине откривено да оне инхибирају раст следећих бактеријских сојева Lactobacillus spp. Escherichia coli, Bacillus subtilis при концентрацији од 0,04 – 3,75 g/L. Од многих активних фенолних једињења (Saleem et al., 2010) нарочито су значајни псоракорифоле А-Е (14-18) изоловане из семена Кинеске биљке Psoralea corylifolia (Слика 1.8). Свих пет супстанци показало је значајну инхибиторну активност на два соја Helicobacter pylori (SS1 и ATCC 43504) са минималном инхибиторном концентрацијом 12,5 – 25,0 µg/mL што је пет/десет пута активније од стандардног лека метродиназола. HO O HOH O H O HO O H O HO H O HO H O HO (14) (15) (16) (17) (18) Слика 1.8 Структуре фенолних једињења: (14-18) псоракорифоле А-Е. ОПШТИ ДЕO 33 Флавоноиди су једна од највећих група секундарних метаболита који су изоловани из различитих биљних врста. Налазе се у воћу, поврћу, орасима, семену, стаблу, прополису и меду. Због разноликости хемијске структуре вршена су многа испитивања њихове биолошке активности и утврђено је да су јаки антиоксиданти али да поседују средње јаку биолошку активност. Сматрају се и потенцијалим антимикробним агенсима (Cushnie & Lamb, 2005). Међу многобројним биљним флавоноидима који инхибирају раст микроорганизма издвојићемо неколико најзначајниих:  Апигенин, показује запажену активност 3,9 – 15,6 µg/mL на 20 различитих сојева Staphylococcus aureus. Други широко заступљени биљни флавоноид каемферол инхибира раст две G(–) и четри G(+) бактерије са минималном инхибиторном активношћу 2,6 µg/mL а показује и запажену активност на квасац Candida glabrata 4,8 – 9,7 µg/mL. Флавон гликозид је такође потенцијални антимикробни агенс, показујући активност на гљиве Trichophyton mentagrophytes и C. neoformans (MIC на обе 6,25 µg/mL), у поређењу са стандардом антигљивичним антибиотиком флуконазолом (MIC 2,0 µg/mL).  Лабуртенин (Слика 1.9), изолован из метанолоног екстракта Ficus chlamydocarpa, показује потенцијалну антимикробну активност на Mycobacterium smegmatis и M. tuberculosis, са MIC 0,61 и 4,88 µg/mL (Kuete et al., 2007, 2008; Sato et al., 2000; Sathiamoorthy et al., 2007). Слика 1.9 Структура лабуртенин Битно је напоменути да се у литературним изворима јавља велика разлика у антимикробној активности појединих флавоноида, што се објашњава пре свега различитим условима приликом извођења експеримента (Cushnie & Lamb, 2005). ОПШТИ ДЕO 34 Иначе, претпоставља се да флавоноиди делују на ћелијски зид микрооганизма тј. блокирају наелектрисање аминокиселина које су лоциране у порaма ћелијског зида патогена. Као доказ ове претпоставке, нађено је да флавоноиди (као и феноли) са више хидроксилних група, показују израженију антимикробну активност, при чему су нарочито активни флавоноиди који садрже хидроксилне групе на положајима C-5 и C-7 прстена А. Такође је могуће да флавоноиди стварају комплексе са екстрацелуларним и растворним протеинима, а затим се, као комплекс, везују за ћелијски зид микроорганизма; као и да липофилнији флавоноиди могу нарушити мембрану микрорганизма (Cushnie & Lamb, 2005). Досадашња испитивања показала су врло ограничену активност флавоноида на Helicobacter pylori (Fukai et al., 2002). Лигнани као фенолна једињења имају широк спектар биолошке активности. Међутим, у литертури се истичу антиоксидативна активност и лечење и превенција од рака као најзначајније и најосновније биолошке активности (Pan et al., 2009; Saleem et al., 2005; Yousefzadi et al., 2010). Иако се у многим радовима где је испитивана антимикробна активност лигнана наводи не тако изражена активност, неколико лигнана је показало врло ниске инхибиторне концентрације. Такође, поједини семисинтетички деривати показали су значајну микробиолошку активност. Због свега наведеног, ова група једињења се сматра потенцијалним новим антимикробним агенсима (Silva et al., 2007, 2009). Од лигнана изолованих из биљака, лигнан (+)-лионирезинол-3α-O-β-D- глукопиранозид (19), изолован из корена биљке Lycium chinense је један од најактивнијих. Забележено је да показује антимикробну активност на сој Staphylococcus aureus при MIC 2,5 – 5,0 µg/mL, као и антифунгалну активност на три патогене гљиве Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae и Trichosporon beigelii при MFC 5,0, 5,0 и 10,0 µg/mL (Lee et al., 2005). За лигнан хејнеанол A (20), изолованог из екстракта корена биљке Vitis sp. (винова лоза), нађено је да поседује изражену антимикробну активност на грам (+) патогене. Употребом диск-дифузионе методе, нађено је да спречава раст MRSA на 2,0 µg/mL, док при концентацији од 2,0 – 4,0 µg/mL спречава развој Enterococcus faecium, S. aureus, Streptococcus agalactiae и Streptococcus pyogenes (Peng et al., 2008). ОПШТИ ДЕO 35 OHMeO HO OMe MeO OH OMe O O HO HO OHOH O R HO OH OH OH HOOHHO R= (19) (20) Слика 1.10 Структуре лигнана: (19) (+)-лионирезинол-3α-O-β-D- глукопиранозид; (20) хејнеанол A Тачан механизам активности лигнана на ћелију микроорганизма још увек није познат. Претпоставља се да инактивириају ензиме микробне ћелије или ћелијске транспортне протеине везивањем помоћу неспецифичних веза као што су водоничне везе. На антимикробну активност лигнана, нарочито бутирлактонског типа знатно утиче стереохемија тј. просторни положај ароматичних прстенова везаних за лактонски прстен лигнана (Kawaguchi et al., 2009). 1.4 Хемотаксономски значај секундарних метаболита биљака Поред изражене примене у медицинске сврхе, секундарни метаболити користе се у хемотаксономији која врши систематику биљних врста према броју, врсти и количини секундарних метаболита. Велики број истраживања показао је заправо да различите биљне врсте које припадају једном роду- фамилији најчешће биосинтетишу исту групу хемијских једињења (Marin, 2003). Ова чињеница користи се за поређење хемијског састава једне биљке са осталим врстама које припадају роду (фамилији), да се одреди карактеристична хемијска група за те врсте и потврди њена ботаничка припадност групи као и за ОПШТИ ДЕO 36 евентуално одређивање хемотаксономског маркера тј. једињења које је заступљено у већини биљних врста истог рода (фамилији). 1.5 Основне карактеристике испитиваних биљних врста 1.5.1 Фамилија Asteraceae (Compositae) – главочике Asteraceae (Compositae) је једна од најбројнијих фамилија, која садржи 1600 родова са око 24000 биљних врста, са различитим животним формама и широким распрострањењем. Најчешћи представници фамилије су зељасте једногодишње и двогодишње биљке, мада су познати и вишегодишњи представници. Главна карактеристика врста ове фамилије је да су цветови организовани у главичасте цвасти. Цветну главицу (capitulum) чини проширена осовина цвасти која носи већи број цветова и налази се на врху дршке цвасти (skapus). Цвасти су обавијене заштитним листовима (involucrum) који штите цваст током развоја цветова. Цвасти могу бити појединачне или организоване у сложене цвасти различитог типа. У главицама се најчешће налазе различити типови цветова. Тако, неке главице поседују цевасте цветове, друге по ободу имају језичасте (или двоуснате) цветове који су обично женски или стерилни, а у центру се налазе цевасти. Постоје и такве главице које садрже само језичасте (или двоуснате) цветове. Изданци су негранати или гранати, а код појединих родова у виду скапуса (безлисна стабла са приземном лисном розетом). Листови су спирално, наспрамно или чешће пршљенасто (наизменично) распоређени (Dostál, 1976). Цветови су петочлани, двополни (хермафродитни), једнополни или стерилни. Многе врсте фамилије Asteraceae користе се у исхрани, као и лековите биљке. Фамилија има веома важан економски значај, јер се поједине врсте већ дуго користе и прерађују у индустрији хране, затим у фармацеутској и козметичкој индустрији, као и у медицини. Многе врсте, такође користе се као баштанско украсно биље. Група Cardueae (Carduoideae) је једна од највећих у фамилији Asteraceae. У њу је уврштено 73 рода и 2400 врста (Funk et al., 2009). Подељена је у четири ОПШТИ ДЕO 37 подгрупе: Carlininae, Echinopsinae, Carduinae и Centaureinae. Подгрупа Centaureinae садржи један од највећих, таксономски врло захтевних родова Centaurea (Garcia-Jacas, 2001). Род Centaurea укључује око 250 различитих врста, које су углавном заступљене на подручју Медитерана и Западне Азије (Mabberlay, 1997; Susanna & Garcia- Jacas, 2007). Три неформалне групе су дефинисане унутар рода (Acrocentron, Cyanus, Jacea). Род чине најчешће једногодишње, двогодишње или вишегодишње зељасте биљке, ређе мали жбунови са бодљикавим изданцима или велики зелени жбунови. Таксономија рода је врло компликована и ова комплексност потиче од широке разноликости таксономских карактера (Garcia- Jacas, 2001, 2006). Традиција употребе врста које припадају роду Centaurea протеже се далеко у прошлост. Заправо, први пут се помиње у античкој Грчкој митологији када је Ахилов учитељ мудрости Хирон Кенатура (Chiron the Centaur) (пола човек-пола коњ) рањен Херкуловом отровном стрелом а затим излечен биљком са љубичасто-плавим цветом чудноватог лековитог дејства. И данас, врсте овог рода су у широкој употреби у народној медицини нарочито на Средњем Истоку где су и најзаступљеније Традиционално, Centaurea cyanus и C. scabiosa се користе против прехладе, за отпорност јетре, отклањање свраба као и за лечење офтамолошких обољења; C. calcitrapa, C. solstitialis и C. melitensis имају хипогликемијски док Centaurea calcitrapa, Centaurea iberica антипируетски ефект (Talhouk et al., 2008). Са друге стране, познато је да су поједине врсте овог рода као Centaurea solstitialis L. (жута бодља) и C. repens L. (syn. Acroptilion repens) поред доказане јаке цитотоксичности, заправо врло токсичне (Hamburger et al., 1993). Оне могу изазвати тровање стоке, а нарочито је опасна по коње јер изазива бесповратно оштећење мозга код ових животиња тј. болест познату као „болест жвакања” (equine nigropallidal encephalomalacia). Такође, обе врсте су познате као опасне коровске биљке у Америци. Заправо, на природним стаништима у Малој Азији, Средњем Истоку, Северно-Централној Европи и Русији ове врсте расту у балансираним еколошким условима, тј. њихов раст и распрострањеност су контролисани присуством многих природних биљних штеточина, инсеката и другим биљкама које расту у близини. Без овог природног еколошког баланса ОПШТИ ДЕO 38 наведене биљне врсте неконтролисано расту и представљају штетне коровске биљке. У Србији врсте рода Centaurea познате су под називом „различак”. На простору Србије расте 32 врстe од којих су C. kosaninii Hayek и C. derventana Vis et. Panč. ендемске врсте (Јosifović, 1975). Слика 1.11 Распрострањеност рода Centaurea (извор: http://www.discoverlife.org) Секција Jacea - Lepteranthus. [Секција Jacea (Mill.) DC. (укључена секција Lepteranthus DC.) (Garcia-Jacas et al., 2006)]. Врсте које припадају секцији су вишегодишње зељасте биљке, са гранатим врховима изданака, са по неколико главичастих цвасти средње величине. Листови су цели или умерено усечени, овалног или кружног облика. Цветови су розе-љубичасти, стабло је најчешће средње величине а код неких врста веома редуковано. Поједине врсте се могу наћи у облику малог жбуна. Секција садржи 24 врсте (26 са подврстама) (Dostál, 1976). Међутим, секцију карактеришу бројни хибриди. Хибридизација међу врстама је један од основних узрока врло компликоване таксономије, па самим тим и класификације биљака унутар секције Jacea. Тринаест хибрида рода Centaurea у Централној Европи утврђено је у оквиру секције Jacea, од којих су два троструки хибриди. Нађено је да врсте из ове секције често подлежу хибридизацији са врстама других секција као што је Acrolophus (Koutecký, 2008). ОПШТИ ДЕO 39 Врсте које припадају секцији користе се у народној медицини као дируетици, против високе температуре, за заштиту обољења јетре и бубрега, за лечење запаљења очију. Centaurea jacea L. је представник по коме секција носи назив и најпознатија је лековита биљка унутар секције. Користи се код главобоље, стомачних тегоба и против високе температуре, као и код дерматолошких проблема (Forgo at al., 2012; Kumarasamy et al., 2003). Врсте рода Centaurea које припадају секцији Jacea-Lepteranthus су: C. haynaldii Borbás ex Vuk; C. bracteata Scop.; C. weldeniana Reichenb.; C. rocheliana (Heuff.) Dostál; C. pannonica (Heuff.) Simonk.; C. vinyalsii Sennen; C. dracunculifolia Dufour; C. jacea L.; C. debeauxii Gren. & Godron; C. nigra L.; C. phrygia L.; C. stenoleppis A. Kerner; C. idurata Janka; C. uniflora Turra; C. kernerana Janka; C. pectinara L., C. antennata Dufour; C. trichocephala Bieb. ex Willd., C. janeri Graells, C. linifolia L., C. hyssopifolia Vahl; C. parilica Stoj. & Stefanov, C. procumbens Balbis; C. rhaetica Mortizi (Dostál, 1976). Група Garcia-Jacas et al., је 2006 године, на основу упоредних анализа DNA секвенци у секцију укључила и врсте: C. exarata Boiss. ex. Coss; C. inexpectata Wagenits; C. patula Boiss. Врста : Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai Базионим: Centaurea amara var. angustifolia DC. Хомотипски синоним: Centaurea angustifolia Schrank [non Mill. 1768] Centaurea amara var. angustifolia DC. Хетеротипски синоним: Centaurea duboisii Boreau Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. Jacea pannonica (Heuff.) Soják Centaurea jacea subsp. pannonica (Heuff.) Hayek Centaurea amara var. pannonica Heuff. Погрешна употреба имена: "Centaurea amara" sec. Bouchard, J. - Flore pratique de la Corse, Ed. 3 Bastia 1978. "Centaurea amara" sec. Boissier, E. - Flora orientalis 3 Genève, Basel & Lyon 1875. "Centaurea jacea subsp. amara" sec. Rothmaler, W. - Exkursionsflora von Deutschland, 4. Gefäßpflanzen: Kritischer Band, Ed. 8 Jena, Stuttgart 1994. Извор: The Euro+Med PlantBase (биљне врсте са подручја Европско-Медитеранске регије). ОПШТИ ДЕO 40 Вишегодишња је биљка са једним усправним изданком, висине 30 – 100 cm, који је интензивно гранат у првој трећини (Табела 1.2). Ахенија 3 mm дугачка, гола или фино длакава, белосива до светлосмеђа слабо избраздана, јако сјајна. Листови прекривени сивим длакама. Главице појединачне (ретко 2 – 3 заједно) на врху изданака. Инволукрум јајаст или јајасто лоптаст док су наставци листића инволукрума широко округласти или јајасти, недељени или само спољни неправилно исцепкани. Цветови пурпурни. Природна станишта су сунчана, каменита или делимично каменита подручја као и ливаде са сланим земљиштем (Јosifović, 1975, Bojňanský & Fargašová, 2007). Биљка је распрострањена у Централној и Јужној Европи (Dostál, 1976) (Слика 1.12). Медоносна је и лековита биљка (Bojňanský& Fargašová , 2007). Табела 1.2 Ботаничка карта Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai Царство: Plantae Подела: Spermatophyta Подподела: Angiosperms Раздео: Magnoliophyta Класа: Magnolopsida Ред: Asterales Фамилија: Asteraceae Подфамилија: Cardueae Cass. Подгрупа: Centaureinae Род: Centaurea L. Сeкција Jacea Слика 1.12 Распрострањеност врсте C. pannonica (Извор: Dostál, 1976) ОПШТИ ДЕO 41 Хемотаксономија рода Centaurea. Род Centaurea (Asteraceae), групе Cardueae, који садржи велики број врста више од 40 година изазива пажњу научника, како са биолошког, тако и са хемијског аспекта. Велики број истраживања урађен је а многа су и данас у току (Garcia-Jacas, 2000, 2001, 2006, Susanna & Garcia-Jacas, 2007). Изоловање хемијских једињења из биљака има два основна циља: да се објасни лековито и/или токсично дејство појединих врста са једне стране и пронађе спона између једињења и сложене таксономије рода, са друге стране. Многи секундарни метаболити су до данас изоловани и идентификовани из биљних врста, рода Centaurea: полиацетилени, сесквитерпени, кумарини, индоли, алкалоиди, фенолне киселина, индол алкалоиди, антоцианини, флавоноиди и њихови гликозиди (Cooper et al., 2002; Fernandez et al., 1989; Flamini et al., 2002a,b; Formisano et al., 2012; Janackovic et al., 2004; Kaij-a Kamb et al., 1992; Tešević et al., 1997; Vajs et al., 1999). Међу њима, основни (најчешће изоловани) секундарни метаблити су: сесквитерпенски лактони, флавоноиди и полиацетилени (Bruno et al., 2005; Djeddi et al., 2008; Gousiadou and Skaltsa, 2003; Karioti et al., 2002; Koukoulitsa et al., 2005; Nowak, 1992; Panagouleas et al., 2003; Saroglou et al., 2005; Ćirić et al., 2012). С обзиром на обилну литературу везану за секундарне метаболите изоловане из биљних врста рода Centaurea у овом раду смо се ограничили на литературу везану за сесквитерпенске лактоне-групе гвајанолиди, на лигнане изоловане из врста рода Centaurea, као и на флавоноиде који су изоловани из врста које припадају секцији Jacea- Lepteranthus (Табеле 1.3 - 1.7). ОПШТИ ДЕO 42 Табела 1.3 Гвајанолиди рода Centaurea Име врсте Сесквитерпенски лактони Литература C. americana Nutt. Цинаропицрин Ohno et al., 1973 C. adjarica Alb. син. C. koenigii Sosn. Акроптилин, Дезоксирепин, Јанерин, Репдиолид, Репин, Центаурепенсин, Цинаропицрин, Хлоројанерин, Цебелин Д, Е, Ф, И, Ј Nowak, 1992; Nowak et al., 1989 C. aegyptica L. 8-Деацилрепин, 8-Деацилсауприн, 19-Дезоксихлоројанерин, 11α,13-Дихидросаупирин, Епоксирепдиолид, Јанерин, Репинхлорохисопифолин A, Б, Е, Хлоројанерин, Саупирин, 17,18-Епокси-19-десоксихлоројанерин El Dahmy et al., 1985; Sarg et al., 1987 C. arguta Nees Агуерин Б, Цинаропицрин Gadeschi et al., 1989 C. acaulis L. Залузанин Д, Кандаванолид 14-хлоро-10β- хидрокси-10(14)- дихидрозалузалин D, Bentamène et al., 2005 C. babylonica (L.) L. Бабилин A, Бабилин Б, Јанерин, Репин, Хлорохисопифолин Ц, Цебелин Ј Bruno et al., 2005 C. bella Trautv. Акроптилин, 8-Деацилокси-8α- [2-метилакрилоксил]-сублутеолид, 19-Дезоксихлоројанерин, 15-Деоксирепин, 17,18-Епокси-10- дезоксихлоројанерин, Јанерин, Репдиолид, 8α,4'-(хидроксил)тиглинате-8- деацетилсублутеолиде, Хлоројанерин, Цебелин A, Б, Г, Д, E [=Хлорорепдиолид], И, J, K, Л, Н, O, Ф Х, Центаурепенсин, Цинаропицрин, Daniewski & Nowak 1993; Nowak, 1992; Nowak 1993 C. behen L. Агуерин Б, Гросхемин, 4β,15-Дихидро-3-дехидро солститиалин A, 4β,15-Дихидро-3-дехидро солститиалин A-13 ацетат, Десацилцинароциприн, Цинаропицрин Rustaiyan et al., 1981a; Öksüz et al., 1982 C. canariensis Brouss (var. subexpinnata Burch). Агуерин A, Агуерин Б, Деацилцинаропицрин, 3-Десоксицинаропицрин, 11,13- Дихдродеацилцинаропицрин, 3-Епи-11,13-дихидродеацилцинароциприн, 8α-Метакрилокси дехидрокостунолид, 8α- Хидрокси-11β,13H-дехидрокостус лактон, Субексипинатин, Субексипинатин Ц, Цинаропицрин, Bohlmann & Gupta, 1981; González et al., 1978a; Gonzalez et al., 1982 Collado Gonzalez et al., 1985 C. clementei Boiss. еx DC Деацил-цинаропицрин, Клементин, Клементин Б,Ц, Цинаропицрин Massanet et al., 1983; Collado Gonzalez et al., 1986 C. chilensis Hook |& Arn 8α-Ацетоксидехидрокостунолид, Дехидрокостунолид, 11H-11,13-Дихидродесацил- цинаропицрин-8--D-глукозид, 8α-Хидроксидехидрокостус лактон, Negrete et al., 1984, 1988a,b C. collina L. Десацилцинаропицрин, 11β,13-Дихидродеацилцинаропицрин, 3β-Хидрокси-8α-епоксиметил акрилилокси-4(15),10( 14),11( 13)-триен-(lαH), (5αH)-гвајан-6,12-олид и његов 11β,13- Дихидродериват Fernandez et al., 1989 ОПШТИ ДЕO 43 C. confera L. Хлоројанерин, Хлорохисопифолин A, 17-Епи хлорохисопифолин A, смеша Сублутеолид и Репин, Јанерин, смеша Бабилин Б и Бабилин Б C 17-епимер, 15-Десхлоро 15-хидроксихлоројанерин Nowak et al., 1989 Bruno et al., 1998 C. deflexa Wagenitz Агуерин Б, 8-Деацилцинароциприн, 15-Нор-гвајанолид, Цинаропицрин Chicca et al., 2011 C. glastifolia L. Агуерин Б, Акроптилин, 15-Дехлоро-15-хидроксиеписолстиолид, 19-Дезоксипикролид A, 17,18-дезоксирепин, 15-Дехлоро-15-хидропероксихлоројанерин, 19-Дезокси-15-хлоројанерин, Епицебелин J, Еписолстиолид, Епицентаурепенсин, Јанрин, Репин, Репдиолид триол, Хлоројанерин, Цебелин Д, J, Ф, Центауропенсин, Цинаропицрин Nowak, 1992; Oksuz & Topcu 1994 C. hermanii F. Herm. 15-Дехлоро-15-хиропероксихлоројанерин, 15-Дехлоро-15-хидроперокси- хлорохисопифолин Б, 15-Дехлоро-3β-ацетил- 15-хидроксихлоројанерин,15-Дехлоро- 15-ацетоксихлоројанерин, 19-Дезоксихлоројанерин, 15-Дехлоро-15-ацетоксихлоројанерин, Јанерин, Хлоројанерин, Цинаропицрин Öksüz et al., 1994 C. hyssopifolia Vahl Акроптилин, Јанерин, Репин Хлорохисопифолин A, Б, Ц, Д, Центаурепенсин Gonzáles et al., 1974, 1972a; Geppert et al., 1983 C. hyrcanica Bornm. Акроптилин, Јанерин, Репин Evstratova et al., 1969; Geppert et al., 1983 C. imperialis Hauffk. ex Bornm. 3-Дезоксисолститиалин A, 15-Дехлоро- 15-Хидрокси-8-десацетилцентауререпин-8-O- (4-хидрокси)тиглинат, 8-Десацетилцентаурепенсин-8-O-(4-хидрокси)- тиглинат, Солститиалин А, Солститиалин A-ацетат, Центаурепенсин, Rustaiyan et al., 1984 C. incana Desf Акроптилин, Акроптилин-4,15-региоизомер [=Солститиолид], Дезоксирепин, Јанерин, Репин, Репдиолид триол Massiot et al., 1986 C. isaurica Hub. Mor. Јанерин Flamini et al., 2004 C. janeri Graells Хлорохисопифолин Ц, Јанерин, Хлоројанерин González et al., 1977; Geppert et al., 1983 C. kandavanensis Rechinger Кандаванолид, 9β-Хидрокси-кандаванолид [=Салогравиолид А] Rustaiyan & Ardebili 1984 C. kotschyi Boiss. Десацилцинаропицрин, Дериват линихлорина B, Линихлорин Б, Цинаропицрин Öksüz & Putun 1983 C. linifolia L. Агуерин Б, Акроптилин, Линихлорин A, B, C, Јанерин, Репин, Хлорохисопифолин A, Б, Ц Д, E, Центаурепенсин, Цинаропицрин Gonzáles et al., 1978; Geppert et al., 1983 C. marchaliana Spreng. Акроптилин, Јанерин, Хлоројанерин, Цебелин Д, Nowak, 1992 Nowak et al., 1989 ОПШТИ ДЕO 44 C. musimonum Maire Агуерин Б, 4, 15-Дихидро-3- дехидросолститиалин А моноацетат, 4, 15-Дихидро-3-дехидросолститиалин А, Линихлорин Б, Центаурепенсин, Центаурепенсин C-17 епимер, Хлоројанерин, Цинаратриол, 17, 18-дезоксирепин, 19-Дезокси- 15-хлоројанерин, Цинаропицрин, 3-Оксо-4α- ацетокси-15-хидрокси-1αH, 5αH, 6βH, 7αH, 11βH-гваи-10(14)-ен-6,12-олид, 3-оксо-4α- хидрокси-15-хидрокси-1α H, 5αH, 6βH, 7αH, 11βH-гваи-10(14)-ен-6,12-олид, репин González-Platas et al., 1999; Medjroubi et al., 1997; Medjroubi et al, 2003 ; Medjroubi et al.,2005; López-Rodríguez et al., 2009 C. nigra L. Хлорохисопифолин A Kaïj-a-Kamb et al., 1992 C. nicolai Bald. 9-O-Ацетилсалвогравиолид A, 3-Деацетил-9-O-ацетилсалогравиолид A, Кандаванолид, Салогравиолид A, Б Vajs et al., 1999 C. ornata Will. Гросхемин α,β-дихидроксиизобутират, 3α-Дихидро-4(15)-дехидрогросхемин α,β- дихидроксиизобутарат Navarro et al., 1990 C. pabotii Wagenitz Агуерин A, 11,13-Дихидродеацилцинаропицрин, деацилцинаропицрин-8-O-[(S)-3-хидрокси-2- метилпропионат] Marco et al., 1992 C. ptosimopappa Hayek Деацилцинаропицрин, 11α,13-Дихидро деацилцинаропицрин, 11β,13-Дихидро-деацилцинаропицрин, 4β,15- Дихидро-3-дехидро-солститиалин А, Залузанин Д, Ц, Јанерин, Хлоројанерин, Цинаропицрин, Çelik et al., 2006 C. ptosimopappoides Wagenitz Цинаропицрин, 11,13-Дихидро- десацетилцинаропицрин Oksuz & Serin 1997 C. phaeopappoides Bordz Јанерин, Хлоројанерин, Цинаропицрин Nowak et al., 1989 C. repens L. (Acrptilon repens DC.) Акрорепдиолид, Агуерин Б, 2,3-Дихидрокси- 8α-метакрилоилоксихидрокостуслакрон, Епоксирепдиолид, Јанерин, Репдиолид, Репин, Репенсолид, Хлорорепдиолид, Хлорохисопифолин A, Ц, Цинаропицрин Evstratova et al., 1967; Jakupović et al., 1986; Rustaiyan et al.,1981b; Stevens & Wong, 1986 Stevens, 1982 C. salonitana Vis. Агуерин A, Кандаванолид, Салигравиолид A, Б, Ц Daniewski et al., 1992; Daniewski et al., 1993 C. sinaica DC. Амбербоин, Синаицин, Хлорохисопифолин А, Хлорорепдиолид [=Цебелин Е] Al-Easa et al., 1990; Sarg et al., 1988 C. solstitialis L. Акроптилин, 8-Дезацетилцентаурепенсин-8-О- (4-хидрокси)тиглате, 19-Дезоксихлоројанерин, 11β,13-Дихидро-деацилцинаропицрин, 17-Епи- центаурепенсин, Еписолститиолид јанерин, Солститиалин A, Солститиалин A 13-ацетат, Центаурепенсин, Репин, Солститиолид, Сублутеолид, Цинаропицрин Merrill & Stevens, 1985; Jakupovic et al., 1986; Tešević et al., 1998 C. solstitialis L. subsp. Schouwii (DC.) Dostál (DC.) Dostál Агуерин Б, 4β,15-Дихидро-3-дехидро солститиалин A ацетат, Цинаропицрин Bruno et al., 1991 ОПШТИ ДЕO 45 C. scoparia Sieb. (1S,3S,5R,6R,7R,8S)-8-ангелилокси-3- хидроксигваи-3(15),10(14),11(13)-триен- 6,12-олид, 8-Десацетилцентаурепенсин-8-0- (4-хидрокситиглинат), 8-Десацилрепин, Десацилцинаропицрин, Диаин, Јанерин, Линихлорин А, 3-Хидрокси-8α-(3,4- диметоксибезоилокси)-11,13-дихидро- 1αH,5αH,6H,7αH-гваи-4(15),10(14)-диен-6,12- олид, 8α,4'- (хидрокситиглинате)-8 десацилоксисублутеолид, 8α-Хидрокси-11α,13- дихидрозалузанин, Хлорохисопифолин A, Б, C, Хлороскопарин, (1R,3S, 4S,5S,6S,7R,8S)-4- (хлорометил)-3,4α-дихидрокси-8α-(3-формил- 2-метил-пропеноилокси)-1αH,5αH,6H,7αH- гваи-10(14),11(13)-диен-6,12-олид, (1R,3S,4S, 5S,6S,7R,8S)-4-(хлорометил)-3,4α- дихидрокси-8α-(сараценоилокси)- 1αH,5αH,6H,7αH-гваи-10(14),11(13)-диен- 6,12-олид, 8α-Хидрокси-3-(бензолилокси)- 1αH,5αH,6H,7αH-гваи-4(15),10(14),11(13)- триен-6,12-олид, цебелин F, цинаропицрин Helal et al., 1997; Youssef & Frahm, 1994a,b; Youssef 1998 C. thracica (Janka) Hayek Јанерин, Хлоројанерин, Цинаропицрин Nowak, 1992; Nowak et al., 1989 C. tagananensis Svent. Деацилцинаропицрин, Цинаропицрин González et al., 1984 C. uniflora Turra subsp.nervosa (Willd.) Јанерин, 8α-Тиглоилокси-2α ,3-дихидрокси-4α -епоксидехидрокостуслактон Appendino et al., 1986 C. webbiana Sch. Bip. Дихидроестафионе I González, 1972b ОПШТИ ДЕO 46 Табела 1.4 Структуре гвајанолида изолованих из рода Centaurea Сесквитерпенски лактон Хемијска структура Структура Супституција R1 R2 R3 R4 Акроптилин (Хлоро- хисопифолин Ц) I H OH O C O C CH3 OH CH2Cl O CH2 Акропитилин-4,15- региоизомер I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2Cl HO Агуерин A III H H C CH O CH3 CH3 H Агуерин Б III H H H Амбербоин VI H H CH3 - (1S,3S,5R,6R,7R, 8S)-8-Ангелилокси- 3-хидроксигваи- 3(15),10(14),11(13)- триен-6,12-олид III H H C O H Бабилин A I H OH O C O C CH3 CH2OH OH O CH2 Бабилин Б I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2OH HO Гросхемин V H H _ _ Гросхемин α,-дихидрокси изобутират V H O C O C CH3 CH2OH OH _ _ Деацил- цинаропицрин III H H H H Деацил цинаропицрин 8-O- [(S)-3-хидрокси-2- метилпропионат) III H H OH O H 3-Деацил- 9-O-ацетил салогравиолид A III H H H 8-Деацилокси-8α-[2- метил акрилокси]- сублутеолид II H H O CH2 C O C CH2 CH3 ОПШТИ ДЕO 47 15-Деоксирепин III H H C C O H2 C O CH3 H 8-Десацетил центаурепенсин- 8-O-(4-хидрокси тиглинат) I H OH C C O OH CH2Cl HO 8-Деацилрепин I H OH OH O CH2 15-Дехлоро-15- хидроперокси хлоројанерин I H OH O C O C CH2 CH2OH CH2OOH HO 15-Дехлоро- 15-хидрокси еписолстиолид I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2OH HO 15-Дехлоро- 15-хидроперокси хлорохисопифолин Б I H OH OH CH2OOH HO 15-Дехлоро- 15-ацетокси хлоројанерин I H OH O C O C CH2 CH2OH CH2OAc HO 15-Дехлоро- 3β-ацетил- 15-хидрокси хлоројанерин I H OAc O C O C CH2 CH2OH CH2OH HO 15-Дехлоро- 15-хидрокси-8- десацетилцентаурепен син-8-O-(4- хидрокси)тиглинат I H OH C C O OH CH2OH HO 19-Дезокси хлоројанерин I H OH O C O C CH2 CH3 CH2Cl HO 3-Дезокси цинароциприн I H H O C C O CH2OH CH2 CH2 19-Дезокси пикролид A I H OH OH O O OH 17, 18-Дезокси репин I H OH O C O CH2 CH3 O CH2 Диаин IX OH H H3C CH3 O C C O CH2OH CH2 11α, 13-Дихидро- деацил цинаропицрин IX -OH H α-CH3 OH 11, 13-Дихидро- деацил цинаропицрин IX -OH H -CH3 OH 3-епи 11,13- Дихидродеацил- цинаропицрин IX α-OH H α-CH3 OH ОПШТИ ДЕO 48 11H 11, 13- Дихидродесацилцина ропицрин- 8--D-глукозид IX OH H α-CH3 O H OH OH HOH H CH2OH H Дехидро костунолид I H H H CH2 11,13-Дихидро-8α- епоксиметил акрилоилокси- 4(15),10 (14),11(13)-триен- (lαH), (5αH)- гваи-6,12-олид IX OH H CH3 O C C O H2 C O CH3 Дихидро естафиетон I X CH3 H OH OH 11,13- Дихидросаупирин IX OH H CH3 C C O CH2OH CH2 3α-Дихидро- 4(15)дехидро гросхимин-α.- дихидрокси изобутарат III H H O C O C CH3 CH2OH OH H 15-Дехлоро- 15-хидрокси-8- десацетилцентаурепен син-8-O-(4- хидрокси)тиглинат I H OH C C O OH CH2OH HO 19-Дезоксихлоро јанерин I H OH O C O C CH2 CH3 CH2Cl HO 3-Дезокси цинароциприн I H H O C C O CH2OH CH2 CH2 Еписолститиолид I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2Cl HO Епицебелин I H OH O C O C CH3 OH CH2Cl CH2OH HO Епи- центауреапенсин (=17-епихлоро хисопифолин A) I H OH O C O C CH3 OH CH2Cl CH2Cl HO 17,18-Епокси- 19-дезокси хлоројанерин I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2Cl HO Еписолститиолид I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2Cl HO Залузанин Ц I H OH H CH2 Залузанин Д I H OAc H CH2 ОПШТИ ДЕO 49 Јанерин II H H O CH2 C C O CH2OH CH2 Кандаванолид III H H H Клементин IX OH H CH2 CH O CH3 Линихлорин A I H OH CH2Cl HO Линихлорин B III H H C C O CH2Cl OH CH3 H Дериват линихлорин Б III H H C C O CH2OH OH CH3 H Линихлорин Ц I H O C CH3 O C C O CH2Cl OH CH3 CH2OH HO 8α-Мета- крилоилоксид хидрокостуснолид I H H O C O CH CH2 CH2 15-Нор-гвајанолид X H OH - - 3-Оксо- 4α-хидрокси- 15-хидрокси- 1αH,5αH,6H,7αH, 11H-гваи-10(14)-ен- 6,12- олид VIII H H CH3 H 3-Оксо- 4 α-ацетокси- 15-хидрокси- 1αH,5αH,6H,7αH, 11H-гваи-10(14)-ене- 6,12-олид VIII H CH3 H Репдиолид III OH H H Репдиолид триол I H OH CH2OH HO 4,15-Епокси- репдиолид II OH H O CH2 Репин (сублутеолид) II H H O CH2 C C O H2 C O CH3 Репин монохлорхидрин II H H CH2ClHO ОПШТИ ДЕO 50 Репенсолид I H OH CH2Cl HO Салогравиолид А (=9β-хидрокси- кандаванолид) III H H OH Салогравиолид A-9- O-ацетил III H H Салогравиолид Б* (*10 4-епокси) III H H H Салогравиолид Ц III H H O C C O H2 C O CH3 H Сауприн III H OH C C O CH2OH CH2 H Солститиалин A IX OH H H Солститиалин A 13- ацетил IX OH H H 4β,15-Дихидро-3- дехидро солститиалин A VII H H - - Солститиолид I H OH O C C O H2 C O CH3 CH2Cl HO Субекспинатин I H H O C C O CH2OH CH2 CH2 Субекспинатин Б IX H H Субекспинатин Ц IX H H OH 8α-Тиглоилокси- 2α, 3-дихидрокси- 4α-епоксидехидро костуслактон I OH OH O C O CH2OH O CH2 8α-Хидроксиде- хидрокостуслактон I H H OH CH2 8α-Хидрокси-1113H- дехидроксикостус лактон (синаицин) IX H H α-CH3 OH 8α,4'-(Хидрокси тиглинат)-8- десацилокси сублутеолид I H OH O C C O OH O CH2 8α-Хидрокси- 11α,13-дихидро залузанин Ц IX OH H CH3 OH 3-Хидрокси- 8α-епоксиметил акрилоилокси- 4(15),10(14),11(13)- триен-(lαH), (5αH)- гвајан-6,12-олид III H H O C C O H2 C O CH3 H ОПШТИ ДЕO 51 8α-Хидрокси-3- (бензолилокси)- 1αH,5αH,6H,7αH- гваи-4(15),10(14), 11(13)-триен-6,12- олид III H O OH H 3-Хидрокси-8α-(3,4- диметокси бензоиллокси)- 11,13-дихидро- 1αH,5αH,6H,7αH- гваи-4(15),10(14)- диен-6,12-олид IX OH H CH3 OCH3 OCH3 O O 9β-Хидрокси- кандаванолид III H H OH 8α-Хидрокси- дехидрокостус лактон I H H OH CH2 Хлорохисопифолин Б I H OH OH CH2Cl HO Хлорохиспифолин Д I H OH O C O C CH3 CH2Cl O CH2CH3 CH2Cl HO Хлорохисопифолин Е I H OH O C O C CH3 CH2OH OH CH2Cl HO Хлоројанерин I H OH O C C O CH2OH CH2 CH2Cl HO Хлороскопарин I H OH O C C O OAc CH2Cl HO Хлорорепдиолид III OH H C O C CH2 CH3 H 14-Хлоро- 10-хидрокси- 10(14)-дихидро залузалин Д IV OAc H CH2 CH2Cl HO (1R,3S,4S, 5S,6S,7R,8S)- 4-(Хлорометил)- 3,4α-дихидрокси-8α- (3-формил- 2-метил- пропенолиокси)- 1αH,5αH,6H,7αH- гваи-10(14),11(13)- диен-6,12-окид I H OH O C C O H O CH2Cl HO ОПШТИ ДЕO 52 (1R,3S,4S, 5S,6S,7R,8S)- 4-(Хлорометил)- 3,4α-дихидрокси-8α- (саракеноилокси)- 1αH,5αH,6H,7αH- гваи-10(14),11(13)- диен-6,12-олид I H OH O C C O CH3 OH CH2Cl HO Цебелин A III OH H C O CH2 CH CH2CH3 CH3 H Цебелин B III OH H C O CH2 CH CH3 CH3 H Цебелин D I H OH C O CH2 CH CH2OH CH3 O CH2Cl HO Цебелин E I OH OH O C O C CH2 CH3 CH2Cl HO Цебелин Ф III H H C C O OH H Цебелин Г I H OH O C C O CH2OH CH2 CH2OAc HO Цебелин Х I H OH O C HC O CH2OH CH3 CH2OAc HO Цебелин И *1-αOH I* H OH O C O C CH2 CH3 O CH2 Цебелин J I H OH O C O C CH3 OH CH2Cl CH2OH HO Цебелин K I O C O CH2 CH CH2CH3 CH3 H OH CH2 Цебелин Л I O C O CH2 CH CH2CH3 CH3 OH H CH2 Цебелин Н I O C O CH2 CH CH3 CH3 H OH CH2 Цебелин О I O C O CH2 CH CH3 CH3 OH H CH2 ОПШТИ ДЕO 53 O R1 R2 R4 R3 CH2 O H2C H H 123 4 5 6 7 8 910 11 12 13 O R1 OR2 CH2 O H2C H H O O R1 R2O OR3 CH2 O H2C H HH2C R4 14 O R1 R4 R3 O H2C H HH2C R2 O O O H2C H H OR1 OR2 O O O H2C O O H2C R3 R1 R2O OR4 CH2 I II III IV V X O R1 OR2 O H2C H H O R3 O O O H2C VIII OR3OR2 OR1 R4 IX O R1 R2 CH2 O R4 H HR3 VII VI R2 R1 Слика 1.13 Опште структуре гвајанолида. Центаурепенсин (хлоро хиспофолин A) I H OH O C O C CH3 OH CH2Cl CH2Cl HO Цинаропицрин III H H C C O CH2OH CH2 H ОПШТИ ДЕO 54 Табела 1.5 Флавоноиди изоловани из секције Jacea, род Centaurea Биљна врста Флавоноиди Литература C. jacea L. Центауреидин, Центауреин, Јацеин, Јацеозид, Јацеозидин, 4',5,7-Трихидрокси 3,6- диметоксифлавон, 4',5-Дихидрокси-3,6-диметокси-7- O-глукозилфлавон, 3',4',5,7-Тетрахидрокси- 3-метоксифлавон,7-Рутинозил-3- O-метилкаемферол, Апигенин, Цирсилиол, Хиспидулин, Еупаторин, Изокаемферид, Аксиларин, 3, 6-Диметоксикаемферол Wagner et al., 1969 Rosler et al., 1971 Forgo et al., 2011 C. nigra L. Апигенин, Центауреин, Јацеин Kaij-a-Kamb et al., 1992 C. phyrgia L. Деметокси-центауреидин Kaij-a-Kamb et al., 1992 C. phyrgia ssp. pseudophrya Кварциметрин (=кварцетин 7-O-β- D-глукопиранозид), Деметоксицентауридин Formisano et al., 2012 C. hyssopifolia Vahl Јацеидин (=5,7,4'-трихидрокси- 3,6,3'-триметоксифлавон), Јацеин (=5,7,4'-трихидрокси-3,6,3'- триметоксифлавон-7-β-D- глукозид), Formisano et al., 2012 C. pannonica Heuff. Simonk. Скутеларин (=скутелареин 7-β-D-глукуронид), Цинарозид (=лутеолин-7-O-β-D- глукопиранозид), Ксиперозид (кварцетин 3-O-β-галактозид), Центауроцианин (=3-O-(6''-O- суцинил-β-D-глукозил)-5-O-(β-D- глукозил)цианидин) Formisano et al., 2012 C. pannonica Heuff. Simonk. ssp. semifrimbiata Центауроцианин (=3-O-(6''-O- суцинил-β-D-глукозил)-5-O-(β-D- глукозил)цианидин) Formisano et al., 2012 ОПШТИ ДЕO 55 O R4 O R6 R5 OH R1 R2 R3 5 10 9 6 7 8 2 34 1' 2' 3' 4' 5' 6' Слика 1.14 Општа структура флавоноида Табела 1.6 Структуре флавоноида изолованих из биљних врста секције Jacea, род Centaurea R1 R2 R3 R4 R5 R6 Апигенин Η ΟΗ Η H Η ΟΗ Аксиларин ΟCH3 ΟΗ Η ΟCH3 OΗ OH Центауреидин ΟCH3 ΟΗ H ΟCH3 OH ΟCH3 Центауреин ΟCH3 O-Glu H ΟCH3 OH ΟCH3 Цирсилиол ΟCH3 ΟCH3 Η H OH OH Деметокси-центауреидин Η OH Η Η OH Η 3,6-Диметоксикаемферол OCH3 OH H ΟCH3 H OH 4',5-Дихидрокси-3,6- диметокси-7-O- глукозилфлавон ΟCH3 O-Glu H ΟCH3 H OH Еупаторин ΟCH3 ΟCH3 H H ΟH ΟCH3 Хиспидулин ΟCH3 OH H H H OH Изокамферид H OH H ΟCH3 H OH Јацеин ΟCH3 O-Glc H ΟCH3 H ΟCH3 Јацеидин OCH3 OH H OCH3 OCH3 OH Јацеозид OCH3 O-Glc H H OH OH Јацеозидин OCH3 OH H H ΟCH3 OH Кварциметрин H O-Glc H OH OH OH Скутеларин OH O-Glu H H H OH 4',5,7-Трихидрокси 3,6- димеоксифлавон OH ΟCH3 H ΟCH3 H OH 3',4',5,7-Тетрахидрокси,3- метоксифлавон H OH H ΟCH3 OH OH 7-Рутинозил-3-O- метилкаемферол H O-Rut H ΟCH3 OH OH Хиперозид H OH H О-Gal OH OH Цинарозид H O-Glc H H OH OH ОПШТИ ДЕO 56 Табела 1.7 Лигнани изоловани из биљних врста рода Centaurea Биљна врста Лигнани Литература C. affinis Friv. Артигенин, Матеренизол Janаckovic et al., 2004 C. americana Nutt. Американин, Арктин, Артигенин, Матеренизол, Матерезинозид, Лапаол А Shoeb et al., 2006 C. americana Nutt. Матерезинозид, Арктин Cooper et al., 2002 C. calcitrapa L. Артигенин, Матеренизол, Пинорезинол, 7’(S)-Хидроксиарктигенин Dawidar et al., 1989 Marco et al., 1992 C. cuneifolia Sm. (-)-Арктигенин Aslan & Öksüz, 1999 C. dealbata Willd. Арктигенин Christensen & Lam,1991b C. deflexa Wagenitz Арктигенин, Арктин Chicca et al., 2011 C. dimorpha Viv. Арктин Damak et al., 2000 C. glomerata Valh. Арктин Zaghloul et al., 1990 C. iberica Лигнан гликозидни димер Nisar Khan et al., 2011 C. macrocephala Muss. Puschk. ex Willd. Арктигенин Ribeiro et al., 2002 C. macrocephala Muss- Puschk ex Willd Арктин, Лапаол A, Матерезинол, Матерезинозид Shoeb et al., 2004 C. melitensis L. Арктин Negrete et al., 1989 C. montana L. Арктигенин Christensen et al., 1991b C. napifolia L. Лапаол A, ИзолапаолA Bruno et al., 1995 C. nervosa Willd. Арктигенин Christensen & Lam,1991a C. nicaensis All. Fl. Pedem. Лапаол A, Изолапаол A Bruno et al., 1996 C. nigra L. Арктигенин, Арктин, Матерезинол, Матерезинозид, Тујапликатин метил етар Middleton et al., 2003 C. orphanidea Heldr. Диметилматерезинол, Пинорезол Gousiadou & Skaltsa, 2003 C. paui Loscos ex Willk. Арктигенин, Пинорезинол Cardona et al., 1997 C. persica Boiss. Матерезинол Sanz et al., 1990 C. phrygia L. Арктигенин, Матерезинол, Пинорезинол, 7’(S)-Хидроксиарктигенин Christensen & Lam,, 1991a C. raphanina Sm. ssp. mixta (DC.) Runemark (-)-Матерезинол Panagouleas et al., 2003 C. regia Boiss. Арктигенин Ulubelen et al., 1988 C. scoparia Sieber ex DC. (-)-Матерезинол, Арктигенин Youssef & Frahm, 1995 C. solstitialis L. Арктигенин, Лириорезинол Б Τesevic et al., 1998b C. solstitialis L. ssp. schouwii Арктигенин, Матерезинол Bruno et al., 1991 C. sphaerocephala L. ssp. polyacantha (-)-Арктигенин, Матерезинол (-)-Арктин, Лапаол А, Изолапаол А Bastos et al., 1990 C. tweediei Hook.EtArn. Арктигенин, Матерезинол Fortuna et al., 2001 ОПШТИ ДЕO 57 O O H H H3CO RO OR' OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9' 7' 1' 2' 3'4' 5' 6' 8' R'' O O H H OCH3 OCH3 7' H3CO OH HO R=H; R'=H;R''=H Матерезинол R=CH3; R'=CH3;R''=CH3 Диметилматерезинол 7’(S)-Хидроксиарктигенин R=CH3; R'=H; R''=H Арктигенин R=H; R'=Glu; R''=H Матерезинозид R= CH3; R'=Glu; R''=H Арктин R= H; R'=H; R''=OCH3 Тујапликатин метил етар O O OCH3 H3CO OCH3 O O OH HO O O HO HOOH OH O H3CO O OCH3 OCH3 O1 2 3 4 5 6 7 89 9' 7' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 4''6'' Лигнан гликозидни димер: (3R,4R)-4-(3,4-диметоксибензил)-3-(4-{[5-{[6-(4-{[(3R,4R)-4-(3,4- диметоксибензил)-2-оксотетарто-3-фуранил]метил}-2-метоксифенокси)-4,5-дихидрокси-2- (хидрокси-метил)тетрахидро-2H-пиран-3ил]окси}-3,4-дихидрокси-6-(хидроксиметил)тетрахидро- 2H-пиран-2-ил]окси}-3-метоксибензил)дихидро-2-(3H)-фуранон O O H H H3CO HO H3CO O H OH OCH3 OH H C A B O O H H OH OCH3 OC B A OCH3 HO OH Лапаол A Изолапаол A Слика 1.15 Структуре дибензилбутиролактонске групе лигнана ОПШТИ ДЕO 58 O O OCH3 HO HH OH OH O O OCH3 HO HH OCH3 OH H3CO OCH3 Пинорезинол Лириорезинол Β Слика 1.16 Структуре фурофуранске група лигнана Поред разноврсних неиспарљивих компонента, врсте које припадају роду Centaurea такође су богате испарљивим компонентама тј. есенцијалним уљима. Сесквитерпени и њихови оксидовани деривати као и вишемасне киселине су основни састојци есенцијалних уља изолованих из врста рода Centaurea. Међутим, испитивањем хемијског састава нађено је да присутност поједних компоненти зависи од географског подручја на коме је биљка сакупљана. Тако је нпр. гермакрен Д, основна испарљива компонента есенцијалног уља врста са подручја Турске, док није идентификован (или у врло малом проценту) код врста рода Centaurea са подручја Грчке (Flamini et al., 2002; Dural et al., 2003; Karamenderes et al., 2008). Кариофилен оксид је основна компонента врста са овог подручја (Lazari et al., 1999, 2000) док је из из есенцијалних уља добијених из врста Centaurea са подручја Бугарске β-еудесмол и спатуленол (Roselli et al., 2008). Интересантно је напоменути да је код свих врста нађен значајан проценат вишемасних засићених киселина за које се пак сматра да нису прави конституенти есенцијалних уља већ да су типични конституенти епикутикуларног воска (Lazari et al., 2000). ОПШТИ ДЕO 59 1.5.2 Фамилија Lamiaceae (Labiatae) – уснатице Фамилија Lamiaceae (Labiatae) садржи од 233 до 263 рода и 6900 – 7200 врста. Родови са највише врста су: Salvia, Scutellaria, Stachys, Plectranthus, Hyptis, Teucrium, Vitex, Thymus, и Nepeta (Harley et al., 2004). Биљке су једногодишње и вишегодишње, жбунасте или полужбунасте. Стабло и изданци обично су четвороугаони. Листови су наспрамни а ређе пршљенасти или наизменични, са усеченим или целим ободом, без залистака (Fernades & Heywood, 1972). Фамилија Lamiaceae је позната и као „фамилија мента”, с обзиром на то да фамилију чине биљне врсте које су у широкој употреби у кулинарству: босиљак, нана, рузмарин, жалфија, планински чај, мајорам, оригано, мајчина душица, лаванда. Од античког доба ове биљке су познате као ароматичне, богате есенцијалним уљима па су због тога током векова коришћене као зачини и природни конзерванси, али и за производњу парфема. Наведене врсте су такође познате лековите биљке. Због пријатног мириса и етеричних компоненти есенцијална уља биља користе се пре свега за опуштање приликом нервне напетости, док се чајеви користе за опуштање, затим за стомачна обољења и разне инфекције. Данас се биљке из породице Lamiaceae употребљавају у индустрији хране, фармацеутској индустрији и козметици и имају велики економски значај. Род Origanum. На основу морфолошких карактеристика врста род Origanum је диференциран на 3 групе, 10 секција, 38 врста, 6 подврста и 17 хибрида. Врсте су обично распрострањене дужином Медитеранске регије, док је 75% нађено на источном Медитерану (Ietswaart, 1980). Биљке су једногодишње, двогодишње и вишегодишње. Најчешће су патуљасти жбунови, са цветовима (један или више) привидно груписаним у класове тј. удружени у компактне округласте цвасти. Чашица звонаста, са 13 нерава, ждрело чашице чекињаво, чашичних зубаца 5. Крунична цев нешто дужа од чашице, прашника 4, од којих су два дужа а два краћа, вире из круничне цеви, плодићи су јајасте глатке орашице. Листови неназубљени или умерено назубљени, већином јајасти. Врсте рода Origanum претежно насељавају сува станишта као што су стеновите литице планинских и брдских масива. У погледу животне форме, најчешће су патуљасти жбунови ОПШТИ ДЕO 60 висине 20 – 80 cm са бројним црвено љубичастим цветовима организованим у збијене цвасти. Цветају током пролећа и лета (Diklić, 1974; Fernades & Heywood, 1972). Реч „origanum” потиче од грчких речи „oros” што значи планина и „ganos” радост. Тако да, у буквалном преводу, биљке представљају радост планине. Роду Оriganum припадају најзначајније кулинарске биљке као што је мајорам и оригано, незаобилазни зачини за рибу и месо у Медитеранској кухињи (Aligiannis et al., 2001). Врсте рода Origanum богате су етеричним уљима па се користе и као лековите биљке. Origanum vulgare L. је најраспрострањенија биљка овога рода и налази се у Европи, Западној и Централној Азији све до Тајвана. Најбољи европски оригано производи се у Грчкој, где се сакупља у дивљини или се гаји под специјалним условима, користи се као зачин, у козметици и производњи вермута и битера (Fleishera and Sneer, 1982). Слика 1.17 Распрострањеност рода Origanum:...........; подручје свих секција изузев секције Origanum:------- - -(извор Ietswaart, 1980) ОПШТИ ДЕO 61 Надземни делови врста ове секције су умерено гранати са изданцима првог, веома ретко другог реда. Цветови су организовани у оборене класолике цвасти средње величине. Листови су овални, умерено длакави, наспрамно постављени, преклопљени, са зеленом до љубичастом кутикулом, глатке површине. Цветови средње величине, обично двополни по два заједно, вертикално оријентисани. Чашични листићи међусобно делимично срасли чинећи двосунату чашицу. Крунични листићи, такође, међусобно срасли у круницу која је диференцирана на горњу и доњу усну. Прашнички конци неравномерне дужине. Секцију сачињава осам врста: O. akhdarense Ietswaart et Boulos (Либија); O. cyrenaicum Béguinot et Vaccari (Либија); O. hypericifolium Schwarz et Davis (Турска), O. libanoticum Boissier (Либан); O. scabrum Boiss & Heldr. in Boiss (Грчка); O. siplyeum Linnaeus (Грчка,Турска); O. vetteri Briquet and Barbey (Грчка), O. pampaninii (Brullo et Furnari) Ietswaart, O. sipyleum L. (Либија) (Ietswaart, 1980). Међу наведеним врстама надземни делови биљке O. siplyeum L. се користе као чај за стомачне проблеме и природни адитиви у храни (Oluk et al., 2009). Врста: Origanum scabrum Boiss & Heldr. in Boiss. Извор информација: сајт The Euro+Med PlantBase за Европско-Медитеранску биљну распростањеност. Вишегодишња жбунаста биљка са двополним цветовима, понекад само женским. Стабло до 45 cm дужине, усправљено, глатко, на горњој површини разгранато. Корен пречника до 1,5 cm (Табела 1.8). Величина листа 11 – 30 x 11 – 20 mm, јајсти-полујајасти најчешће глатки. Листићи величина 8 – 10 x Хомотипски синоним: Amaracus scaber (Boiss. & Heldr.) Briq. Хетеротипскисиноним: Amaracus pulcher (Boiss. & Heldr.) Briq. Origanum pulchrum Boiss. & Heldr. Origanum scabrum subsp. pulchrum (Boiss. & Heldr.) P. H. Davis ОПШТИ ДЕO 62 7 – 8 mm, упадљиви, јајасти, јајасто елиптични, пурпурни. Цвет је љубичаст, дупло већи од чашице (Ietswaart, 1980). O. scabrum је ендемска биљка Грчке, налази се на планинама Тајгетос и Малево на Пелопонезу као и на планинама Кандилион и Делфи на острву Евиа. Обично се налази на надморској висини 1000 – 1800 m. Цвета од јануара до септембра. O. scabrum формира хибрид са врстом O. vulgare ssp. hirtum, који је познат под називом O. lirium (Ietswaart, 1980; Fernandes and Heywood, 1972). За сада не постоје литературни подаци о употреби биљке Origanum scabrum. Табела 1.8 Ботаничка карта Origanum scabrum Boiss. & Heldr. in Boiss. Царство: Plantae Подела: Spermatophyta Подподела: Angiospermae Класа: Dicotyledones Ред: Lamiales Породица: Lamiaceae Lindl. Род: Origanum L. Секција: Anatolicon Bentham Слика 1.18 Распрострањеност врсте O. scabrum (Извор: Ietswaart,1980) ОПШТИ ДЕO 63 Хемотаксономија рода Origanum. Биљне врсте рода Origanum богате су есенцијалним уљима која се користе више хиљада година. Хемијски састав различитих Origanum врста испитиван је до сада (Bendahou et al. 2008; Karioti et al., 2006; Şahin et al., 2004). Утврђено је да састав уља умногоме зависи од географског подручја са кога потиче наведена врста, али карактеристична хемијска група за род су поједини монотерпени: карвакрол, тимол, линалоол, терпинен-4-ол, γ-терпинен и сабинен (Deans & Svoboda, 1990; Russo et al., 1998). Карвакрол и тимол су основна једињења идентификована у есенцијалним уљима готово свих врста Origanum испитиваних до сада (Kokkini, 1997). Због тога су врсте рода Origanum подељене у две хемотипске групе: 1. тимол и 2. карвакол група (Russo et al., 1998). За групу карвакрол се знало још у античко доба. Заправо, назив hyssop (грчка форма од јеврјске речи ‘ezov’), позната и као ‘za’atar’ у арапском свету и origanum на латинском, први пут се помиње у Библији (Друга књига Мојсијева 12: 22 опис Ускршњег ритауала) (Fleisher and Fleisher, 1988). Упоредна студија о традиционалној употреби oregano-у исхрани Медитеранских народа доказује да је библијски hyssop, карвакрол биљке Majorana syriaca (L.) Feinbr. (синоним: Origanum maru L., Origanum syriacum L.) (Fleisher and Fleisher, 1988). Због лековитог дејства и карактеристичног укуса, поред есенцијалних уља годинама се испитује и хемијски састав екстраката биљака Origanum. Међу различитим хемијским групама идентификованим до сада, најзаступљенији су терпени и фенолни деривати (Табела 1.9). Међу терпенима највише има монотерпена док су из групе фенолних једињења нарочито заступљене фенолне киселине, (рузмаринска киселина и деривати) као и флавоноиди. ОПШТИ ДЕO 64 Биљна врста Географско порекло врсте Изоловане супстанце Литература O. compactum Benth. Мароко β-Амирин, Бетулин, Бетулинска киселинаid, 21-α-Хидрокси олеанолинска киселина, 21-α-Хидроксиурсолна киселина, Аромадендрин, Тимохидрохинон Bellankhdar et al., 1988 O. dictamnus L. Грчка Апигенин, Ериодиктиол, Кварцетин, Лутеолин Harvala & Skaltsa, 1986 Грчка Апигенин-7-O-глукозид, Ериодиктиол-7-O-глукозид, Лутеолин-7-O-глукозид, Витексин, Изовитексин, Изоориентин, Ориентин, Рузмаринска киселина, Метил естар рузмаринске киселине, Салвианолинска киселина P Skaltsa & Harvala, 1987 Грчка Тимохинон, Тимохинол-2-O-β-глукопиранозид, Оресбиусин A, E-кафеинска киселина, Апигенин, Каемферол, Кварцетин, Ериодиктиол, Таксифолин, Нарингенин, 12-Хидроксијасмонична киселина, 12-Хидроксијасмонична киселина 12-O-β-D-глукопиранозид Chatzopoulou et al., 2010 O. dubium Boiss. Грчка Апигенин-4′-метилетер, Каемферол-3,6,7-триметилетар, Кварцетин-3,6-диметилетар, Кварцетин-3,6, 7-триметилетар Souleles et al., 1990 O. intercedens Rech. Крит Грчка Кафеинске киселина, Рузмаринска киселина, Карвакрол Pizzale et al., 2002 O. x intercedens Rech. (=O. onites x vulgare ssp. hirtum) Грчка Технолошко- образовани институт Солун Тимусин, 5,6,4'-Трихидрокси-7,3'-диметоксифлавоне, Тимонин, Кирсимаритин, Генкванин Bosabalidis et al.,1998 O. majorana L. Египат Арбутин, Метиларбутин, Хидрохинон, Хидрохинон-монометил етар Assaf et al., 1987 - Апигенин, Каемферол, Лутеолин Yadav et al., 2000 Јапан Локални маркет 6-Хидроксиапигенин, 6-Хидроксиапигенин-7-O-β-D-глукопиранозид, 6-Хидроксилутеолин-7-O-β-D-глукопиранозид, 6-Хидроксиапигенин-7-O-(6''-O- ферулоил)- β-D-глукопиранозид, 6-Хидроксилутеолин-7-O-(6''-O-ферулоил)- β-D-gглукопиранозид Kawabata et al., 2003 O. majoricum Camb. (=O. majorana x vulgare ssp. virens) Шпанија Апигенин, Лутеолин, Нарингин, Рутин, Хризоериол Palomino et al., 1997 O. onites L. Крит Грчка Кафеинска киселина, Рузмаринска киселина, Карвакрол Pizzale et al., 2002 Табела 1.9 Секундарни меатаболити изоловани из рода Origanum* ОПШТИ ДЕO 65 O. syriacum L. Египат Тимохинол-2-O-β-глукопиранозид, Тимохинол-5-O-β-глукопиранозид, Тимохинол-2,5-O-β-дигликопиранозид, Карвакрол-2-O-β-гликопиранозил-(1→2)-β гликопиранозид, p-мент-1-ен-3,4-диол-4-O- β-глукопиранозид Kamel et al., 2001 O. tyttanthum Gontsch. Узбекистан 4-O-β-D-Гликопиранозил-3'-хидроксил- -4'-метоксибензоат, Тимол, Карвакрол тимол-β-D-глукопиранозид, Нарингенин, Ериодиктиол, 4-O-β-D-глукопиранозилбензил-3',4'-дихидроксибензоат, Тимохинол-5-O-β-глукопиранозид, Тимохинол-2-O-β-глукопиранозид, Ацацетин-7-O-β-D-метилглукуронат, Рузмаринска киселина, 4-O-β-D-глукопиранозилбензил-4'- хидрокси бензоат, 4-O-β-D-Глукопиранозилбензил-4'- хидрокси-3'-метокси-бензоат Takeda et al., 2008 O. vulgare L. Руска провинција Новосибирск Космосид, Лутеолин-7-O-β-D-глукопиранозид Peshkova & Mirovich, 1984 Јапан Ботаничка башта 4-[(3,4)-Дихидроксибензоилокси)метил]фенил- β-глукопиранозид Natakani & Kikuzaki, 1987 Japan Ботаничка башта E-Кафеинска киселина, Рузмаринска киселина, Протокатехинска киселина Kikuzaki & Natakani, 1989 Русија Ванилна киселина, E-Кафеинска киселина, Циметна киселина, Прокатехинска киселина, Сиригинска киселина, p-Хидроксибензоева киселина, Хлорогенична киселина Mirovich et al., 1989 - Апигенин, Лутеолин Segiet-Kujawa & Michalowsa, 1990 - 5-Хидрокси-7-метокси-6-O-[α-L-рамнопиранозил(1→2)-β-D- фукопиранозил]флавон, 5,6-Дихидрокси-7-метоксифлавон, 5-Хидрокси-6,7-диметоксифлавон, Изосакуранетин 7-O-β-D-неохесперидозид, 3',4',5'-Триметокси-фуранофлавон Zheng et al., 1997 Пољска E-кофеинска киселина, Рузмаринска киселина Zgórka et al., 1997 - Прокатехинска киселина, Урсолна киселина, Олеанолинска киселина, Сагитатозид A, β-Ситостерол, Стигмастерол, Тилианин Wu et al., 2000 БФР Македонија Апигенин, Диосметин, Лутеолин, Хрисоериол Kulevanova et al., 2001 Русија Аристолохична киселина I, Аристолохична киселина II, D-(+)-рафинозе, Урсолна киселина Goun et al., 2002 Јапан Ботаничка башта 4'-O-β-D-Глукопиранозил-3',4'-дихидроксибензилпрокатехиат, 4'-O-β-D-Глукопиранозил-3',4'-дихидроксибензил, 4-O- метилпрокатехинат Matsuura et al., 2003 ОПШТИ ДЕO 66 *Аутори биљака су наведени на основу рефернце Ietswaart, 1980. Таиван Салвианолична киселина A, Салвианолична киселина Ц Литосперминска киселина, Рузмаринска киселина, Прокатехинска киселина, Кофеинска кислина, Апигенин-7-O- β-D-глукуронид, Апигенин-7-O-β-D-(6-метил) глукуронид, Лутеолин, Лутеолин-7-O-β-D-глукопиранозид, Лутеолин-7-O- β-D-глукуронид, Лутеолин-7-O-β-D-ксилопиранозид, 4-Хидроксибензил алкохол-4-O-β-D-глукопиранозид, 4-(3,4-дихироксибензилоксиметил), фенил-O-β-D- глукопиранозид, Оригалигнанол Lin et al., 2003 Литванија Ботаничка башта Рузмаринска киселина, Хлорогенична киселина, Кофеинска киселина, Хиперозид, Нарингин+Рутин, Лутеолин, Астрагалин, Витексин, Изовитексин, Ериодиктол, Кверцетин, Нарингенин, Диосметин Radušienė et al., 2008 Кина Апотека Метилестар рузмаринске киселине Ding et al., 2010 Египат Апигенин, Лутеолин, Салвагенин, Кирсимартин, Диосметин, Десметоксицентауридин, 5-Хидрокси-6,7,3,4-тетраметокси апигенин, Апигенин-7-O-глукопиранозид, Лутеолин 7-O- глукопиранозид, Лутеолин-7-O-глукозид-6-метилестар, Лутеолин-7-O-α-L-рамнозид-4--D-глукопиранозид, Кверцетин-3-O--D-глукозид-4-O-α-L-рамнозид Hawas et al., 2008 Индија Ориганол A, Ориганол B, Урсулна киселина, Олеанолинска киселина, β-ситостерол, Триаконтанол Venkateswara Rao et al., 2011 O. vulgare L. ssp. hirtum (Link) Ietswaart Грчка Апигенин, Лутеолин, Хризоериол, Диосметин, Кверцетин, Ериодиктиол, Космозид, Виценин-2, Кафеинска киселина, p-мент-3-ене-1,2-диол 1-O-β-D-глукопиранозид, Тимохонол-2-O-β-гликопиранозидтим, Тимохинол-5-O-β-гликопиранозид, Тимохинол-2,5-O-β-дигликопиранозид, 12-O-Хидроксијасмонична киселина, 12-O-Хидроксијасмонична киселина 12-O-β-глукопиранозид, Литоспермична киселина B, рузмаринска киселина, 10-epi- Литоспермична киселина, epi-литоспермична киселина B Koukoulitsa et al., 2006 ОПШТИ ДЕO 67 OH OR Карвакрол R=H Тимол R=Glu Тимол-β-D-глукопиранозид OR1 R2O 2 5 R1 = Η R2 = Η Тимохидрохинон R1 = Glu R2 = H Тимохинол-2-O-β- D-глукопиранозид R1 = H R2 = Glu Тимохинол-5-O- β-D-глукопиранозид R1 = Glu R2 = Glu Тимохинол-2,5-O-β-D-диглукопиранозид O Glu Glu 2 2 OH OGlu 2 3 3 4 HO Ha Hb GluO Карвакрол-2-O-β-глукопиранозил- (1→2)-β-глукопиранозид p-Мент-1-ен-3,4-диол-4-O-β- D-глукопиранозид p-Мент-3-ен-1,2-диол 1-O-β-D-глукопиранозид Слика 1.19 Основне структуре монотерпена и монотерпенских гликозида HO H H H HO H H H H OH HO H H H COOH H β-Амирин Бетулин Бетулинска киселина Слика 1.20 Основне структуре тритерпена HO H H H COOH R HO H H H COOH R R=H Олеанолинска киселина R=H Урсолна киселина R=OH 21-α-Хидрокси оланолинска киселина R=OH 21-α-Хидрокси урсолна киселина ОПШТИ ДЕO 68 RO H H H HO H H H β-Ситостерол Стигмастеролl Слика 1.21 Основне структуре стерола O OH COOH 1 234 5 6 7 8 9 10 11 12 O O COOH 1 234 5 6 7 8 9 10 11 12 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' O OH OH OH HO 12-O-Хидроксијасмонична киселина 12-O-Хидроксијасмонична киселина 12-O-β-глукопиранозид Слика 1.22 Основне структуре алицикличних деривата OR1 OR2 R1 = Η R2 = Glu Арбутин R1 = CΗ3 R2 = Glu Метиларбутин R1 = H R2 = H Хидрохинон R1 = CΗ3 R2 = H Хидрохинон-монометил етар O O R1 O O OH HO HO OH R3 OR2 R1 = ΟΗ R2 = H R3 = OH 4'-O-β-D-Глукопиранозил-3',4'-дихидроксибензил прокатехинат R1 = ΟΗ R2 = CΗ3 R3 = OH 4'-O-β-D-Глукопиранозил-3',4'-дихидроксибензил, 4-O-метилкатехин ат R1 = H R2 = H R3 = OH 4'-[(3,4)-Дихидроксибензилокси)метил]фенил-3'-β-D-глукопиранозид, 4-O-β-D-Глукопиранозилбензил-3',4'-дихидроксибензоат R1 = H R2 = CΗ3 R3 = OH 4-O-β-D-Глукопиранозилбензил-3'-хидроксил-4'-метоксибензоат R1 = H R2 = H R3 = H 4-O-β-D-Глукопиранозилбензил-4'-хидроксибензоат R1 = H R2 = H R3 = OCH3 4-O-β-D-Глукопиранозилбензил-4'-хидрокси-3'-метоксибензоат Слика 1.23 Основне структуре фенолних једињења/фенолни гликозиди ОПШТИ ДЕO 69 OH COOH OH COOH OCH3 OH COOH OCH3H3CO OH COOH OH p-Хидробанзоева киселина Ванилинса киселина Сиригинска киселина Протокатехинска киселина COOH COOH HO HO OH OH O O CO2HHO HO OH E-Циметна киселина E-Кофеинска киселина Хлорогенска кислеина HO HO OH OCH3 O Оресбиусин A O O OH OH HO HO COOH O O OH OH HO HO C O OCH3 Рузмаринска киселина Метил естар рузмаринске киселине O O OH OH HO COOH O COOH OH HO O O OH OH HO H O COOH OH HO COOH Литоспермична киселина 10-epi-Литоспермична киселина O O OH OH HO COOH O OH HO O OH OH H COOHO O O OH OH HO COOH O OH HO O OH OH H COOHO Литоспермична киселина B epi-Литоспермична киселина B O O OH OH HO COOHHO OH HO O O OH OH HO COOH O OH HO Салвианолинска киселина A Салвианолинска киселина C O O OH OH COOH O O O HO OH HO Салвианолинска киселина P Слика 1.24 Основне структуре фенолних једињења/фенолне киселине ОПШТИ ДЕO 70 O O Слика 1.25 Структура хинона/тимохинона O O O O O O CH3 OH OH O O OH OH HO HO Слика 1.26 Структура дихидробензодиокан деривата/оригалигнанола O R4 O R6 R5 OH R1 R2 R3 5 10 9 6 7 8 2 34 1' 2' 3' 4' 5' 6' Слика 1.27 Основне структуре флавоноида/флавони и флавоноли ОПШТИ ДЕO 71 Табела 1.10 Структуре флавона и флавонола изолованих из биљних врста рода Origanum R1 R2 R3 R4 R5 R6 Апигенин Η ΟΗ Η H Η ΟΗ Апигенин-4′-метилетер Η ΟΗ Η H Η ΟCH3 6-Хидроксиапигенин OH OH H H H OH 6-Хидроксиапигенин-7-O-β-D- глукопиранозид OH O-Glu H H H OH 6-Хидроксиапигенин-7-O-(6'''-O- feruloyl)-β-D-глукопиранозид ΟH O-Glu-(6- ферулилl) H H H OH Апигенин-7-O-β-D-глукопиранозид H O-Glc H H H H Апигенин-7-O-β-D-(6-метил) глукуронид H O-Glc метил естер H H H H Апигенин-7-O-β-D-глукуронид H O-Glc H H H H 5-хидрокси-6,7,3,4- тетраметокси-апигенин OCH3 OCH3 H H OCH3 OCH3 Ахриосериол H OH H H ΟCH3 OH Витексин Η ΟΗ C-Glu H Η ΟΗ Диосметин Η ΟΗ Η Η ΟΗ ΟCH3 Изовитексин C-Glu ΟΗ Η H Η ΟΗ Изоориентин C-Glu ΟΗ Η H ΟΗ ΟΗ Каемферол Η ΟΗ Η ΟH Η ΟΗ Каемферол-3,6,7-триметилетер ΟCH3 ΟCH3 Η ΟCH3 Η ΟΗ Кверцетин Η ΟΗ Η ΟΗ ΟΗ ΟΗ Кверцетин-3,6-диметилетар ΟCH3 ΟΗ Η ΟCH3 ΟΗ ΟΗ Кверцетин-3,6,7-триметилетар ΟCH3 ΟCH3 Η ΟCH3 ΟΗ ΟΗ Кверцетин 3-O--D-глукозид-4-O- α-L-рамнозид H OH H O-Glu OH a-L-Rha Космосид H O-Glu H H H OH Лутеолин Η ΟΗ Η H ΟΗ ΟΗ Лутеолин 7-O-β-D-глукопиранозид Η O-Glu Η Η ΟΗ ΟΗ Лутеолин-7-O-β-D-глукопиранозид Η O-Glc Η Η ΟΗ ΟΗ Лутеолин-7-O-β-D-ксилопиранозид Η a-D-Xy H H ΟΗ OΗ Лутеолин-7-O-α-L-рамнозид-4--D- глукозид H a-L-Rha H H OH O-Glu Лутеолин-7-O-глукозид- 6-метилестер H O-Glc метил естер H H OH OH 6-Хидроксилутеолин-7-O-β-D- глукопиранозид OH O-Glu H H OH OH 6-Хидроксилутеолин-7-O-(6''-O- ферулоил)-β-D-глукопиранозид OH O-Glu-(6- ферулолил) H H OH OH 5-Хидрокси-7-метокси-6-O-[α-L- рамнопиранозил(1→2)-β-D- фукопиранозил]флавон α-L-rha (1→2)-β-D- fuco ΟCH3 H H Ph H Ориентин Η ΟΗ C-Glu H ΟΗ ΟΗ Рутин Η ΟΗ Η Glu (1→6) rha ΟΗ ΟΗ Тилианин H O-Glu H H H ΟCH3 Хрисоериол Η ΟΗ Η H ΟCH3 ΟΗ Тимонин OH ΟCH3 ΟCH3 H OH ΟCH3 Цирисмаритин ΟCH3 ΟCH3 H H OH H 5,6,4'-Трихидрокси-7,3'- диметоксифлавон OH ΟCH3 H H ΟCH3 OH Генкванин H ΟCH3 H H H OH Хиперозид H OH H O-Glu OH OH Астрагалин H OH H O-Glu H OH Виценин-2 C-Glu OH C-Glu H H OH Акацетин-7-O-β-D- метилглукуронат H O-GlcA Метил естер H H H ΟCH3 ОПШТИ ДЕO 72 O R4 O R6 R5 OH R1 R2 R3 5 10 9 6 7 8 2 3 4 1' 2' 3' 4' 5' 6' Слика 1.28 Основне структуре флавоноида/дихидрофлавони и дихидрофлавоноли Табела 1.11 Структуре дихидрофлавона и дихидрофлавонола изолованих из биљних врста рода Origanum H NO2 COOHO O OCH3 NO2 COOHO O Аристолохична киселина I Аристолохична киселина II Слика 1.29 Основне структуре алкалоида R1 R2 R3 R4 R5 R6 Аромадендрин Η ΟΗ Η ΟH Η ΟΗ Ериодиктиол H OΗ H H ΟH OH Ериодиктиол-7-O- глукопиранозид H O-Glu H H ΟH ΟΗ Нарингенин Η Glu (1→2) rha Η Η Η ΟH Сагитатозид A H OH Glu (1→2) rha H ΟCΗ3 Таксифолин H OH H OH OH OH ОПШТИ ДЕO 73 ЦИЉ ИСТРАЖИВАЊА Увидом у научну литертуру може се закључити да су биљни ресурси предмет испитивања у неколико праваца: 1. испитивање биосинтезе секундарних метаболита, 2. помоћу хемијског састава биљке у њеној прецизној класификацији тј. хемотаксономији, 3. примена биљака као извора биолошки активних једињења или као извор структура за модификацију у циљу профилисања и повећања активности. Имајући у виду горе наведено ова докторска дисертација конципирана је као прилог општих принципа изучавања биљака са циљем да се испита:  Хемијски састав есенцијалног уља и неполарног екстракта надземног дела биљке Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai са подручја Србије.  Хемијски састав поларног екстракта надземних делова биљке Origanum scabrum Boiss. & Heldr. in Boiss. са подручја Грчке.  Испитивање антимикробне активости екстраката испитиваних биљака и компарација са активношћу чистих једињења.  Класификација биљака унутар рода Centaurea и Origanum на основу изолованих једињења. 2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 74 МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ 2.1 Методе изоловања и идентификације активних супстанци из биљног материјала 2.1.1 Методе екстракције C. pannonica (Heuffel) Simonkai Биљни материјал: Надземни делови биљке сакупљени су током цветног периода (Септембар, 2008.) у Дивостину (Шумарице, Крагујевац, Централна Србија), 200 – 250 m надморске висине. Ваучер врсте налази се у хербаријуму Института за ботанику, Биолошког факултета, Универзитета Београд. Број ваучера: 16387 (C. pannonica). Идентификацију биљног материјала извршила је професор Драгана Муратспахић-Павловић (Природно-математички факултет, Институт за Биологију, Крагујевац, Србија). Осушени надземни делови (0,61 kg) екстраховани су следећом смешом растварача: циклохексан:етил-етар:метанол 1:1:1; метанол:вода 5:1, сукцесивно, на собној температури. Неполарни екстракт је екстахован засићеним раствором NaCl; а затим је водена фаза ре-екстрахована са етил-ацетатом (EtOAc). Органска фаза (Схема 2.1) подвргнута је даљим испитивањима. Екстракција есенцијалног уља: За добијање есенцијалнпог уља коришћена је модификована Claevenongel-ова апаратура. 500 mL H2O додато је у претходно иситњене надземне делове биљке (70,0 g), есенцијално уље је добијено хидро-дестилацијом након 2 h (Hellenic Pharmacopeia, 2002). Уље је сакупљено у 2 mL n-хептана аналитичке чистоће и осушено помоћу безводног натријум-сулфата. Чувано је у фрижидеру на - 4°C до анализе на гасном хроматограму и гасном хроматограму-масеном спектрометру. Принос је изражен као запремина уља добијена од релативне тежине биљног материјала. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 75 Centaurea pannonica (610.0 g) I-EKSTRAKCIJA Cikloheksan:Et2O:MeOH (1:1:1) II-EKSTRAKCIJA MeOH:H2O (5:1) organska faza A vodena f aza zasiceni rastvor NaCl tecna-tecna ekstrakcija sa EtOAc organska faza B (8,8 g) vodena f aza VLC CCHPLC Seskviterpenski laktoni LignaniFlavonoidiFenil propanoidni derivati Схема 2.1 Екстракција биљке C. pannonica Origanum scabrum Boiss. & Heldr. Биљни материјал: Надземни делови биљке сакупљани су на планини Дирфис (острво Евиа, Грчка) током цветног периода, јун 2007. године. Ваучер Origanum scabrum са истог локалитета налази се у хербаријуму, Универзитета Патра. (Phitos 3938, UPA). Осушени надземни делови биљке (0,240 kg) екстраховани су користећи сукцесивну хладну екстракцију помоћу следећих растварача: дихлорметан, метанол, и смеша растварача метанол:вода 5:1. Добијени су следећи екстракти:  Дихлорметан (5,7 g): ORI_A  Метанол (9,1 g): ORI_B ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 76  Метанол-вода 5:1 (6,8 g): ORI_C Последњи екстракт је изабран за даљу анализу на основу 1H-NMR спектра и TLC анализе свих наведених екстраката. Сви екстракти и фракције добијени током процеса изоловања су упаравани на ниским температурама (40οC) на ротационом вакуум упаривачу и чувани у ексикатору који садржи дифосфор-пентоксид, високе чистоће (P2O5, Merck, Art. 540). 2.1.2 Хроматографске методе Танкослојна хроматографија За микро-аналитичку танкослојну хроматографију коришћене су:  алуминијумске плоче прекривене танким слојем силика гела са флуоресцентним индикатором, 20  20 cm, дебљине абсорбенса (стационарне фазе) 0,1 mm (Kieselgel F254, Merck, Art. 5554),  алуминијумске плоче прекривене танким слојем целулозе без флуоресцентног индикатора, 20  20 cm, дебљине абсорбенса (Merck, Art. 5552). За препаративну танкослојну хроматографију коришћене су:  стаклене плоче прекривене силика гелом са флуоресцентним индикатором, 20  20 cm, дебљине абсорбенса 0,25 mm (Kieselgel F254, Merck, Art. 5715),  стаклене плоче са силика гелом без флуоресцентног индикатора, 20  20 cm, дебљине абсорбенса 0,25 mm (Kieselgel F254, Merck, Art. 5721). Код препаративне танкослојне хроматографије након развијања хроматограма одговарајућом мобилном фазом (смеша растварача), на стакленој плочи, уочава се више трака које представљају различите супстанце. Често је за уочавање трака потребна употреба UV-лампе или прскање једног краја плоче одговарајућим реагенсом. Након обележавања трака оне се стружу са плоча и пребацују у одговарајуће лабораторијске судове. Додатком растварача, најчешће метанола, супстанца се одваја од абсорбенса. Након 24 часа, филтрирањем се уклони абсорбенс (силика гел, целулоза) а растварач са супстанцом пренесе у претходно измерен балон. Упаравањем до сува се уклони растварач, а затим се понови мерење да би се утврдила тачна маса супстанце, пре NMR анализе. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 77 Хроматографија на колони За хроматографију на колони коришћени су следећи абсорбенси:  силика гел 60H (Kieselgel 60Η, Merck, Art.7736); с обизиром на малу величину пора силика гела, за бржи проток елуента је коришћен вакуум,  силика гел 60, 230 – 400 мрежа ASTM, за хроматографију на колони (Kieselgel 60H, Merck, Art. 9385),  сефадекс LH-20 (Sephadex LH-20-хидроксипропилен декстран; величина пора 25 – 100 μm) (Pharmacia Fine Chemicals). Припрема и паковање колоне: Sephadex LH-20 се испоручује као суви прах и пре употребе потребно је активирање. За активирање сефадекс се сједини са елуентом 24 часа пре коришћења. Треба избегавати мешање, магнетном мешалицом јер може доћи до оштећења. Течна хроматографија под средње јаким притиском (Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC) Раздвајање фракција течном хроматографијом под средње јаким притиском извођено је на апарату Büchi који се састоји од пумпе модел C-605 капацитета 250 mL/min и максималног притиска 50 bara. Експеримент је извршен на Büchi стакленој колони 230 x 25 mm, која је пуњена силика гелом 60-реверзна (Merck, Art. 10167) Течна хроматографија под високим притиском (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) Ова техника користи се за изоловање чистих супстанци, или за њихово прећишћавање. За хроматографију под високим притиском коришћен је апарат JASCO-HPLC који се састоји од следећих компоненти: - течна хроматографска пумпа: PU-2080 plus, са колоном Kromasil RP-18 (реверзна фаза, 250 × 10 mm, 10 µm) - рефрактив индекс детектор: RID-10A, Shimadzu. Софтверски програм Clarity. Проток растварача: 1,5 – 2,0 mL/min. Концентрација узорка: 5,0 mg/mL; 7,0 mg/mL. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 78 Биљка C. pannonica Као мобилна фаза код течне хроматографије под високим притиском коришћена је смеша растварача метанол:вода (MeOH:H2O) у различитим пропорцијама. Свакој сакупљеној фракцији додата је иста запремина засићеног раствора NaCl, а затим је вршена екстракција са дихлорметаном (CH2Cl2). Добијена органска фаза филтрирана је преко безводног Na2SO4 а затим концентрована до сувоте. Биљка O. scabrum Као мобилна фаза код течне хроматографије под високим притиском коришћена је смеша: 5 – 15% сирћетна киселина:метанол (AcOH:MeOH) у различитим пропорцијама. Сакупљене фракције директно су упараване до сува под вакумом на умереној температури. Гасна хроматографија Анализе су вршене на Perkin Elmer 8500 гасном хроматограму са FID детектором (FID detector), опремљеном са Supelcowax-10 капиларном колоном (топљени силика, 30 m x 0,32 mm I.D.; дебљина слоја: 0,25 μm). Температура колоне је програмирана у опсегу 75 – 250°C са порастом од 2,5°C/min. Температура ињектора и детектора је програмирана на 230°C и 300°C, појединачно. Запремина узорка је 2 µL. Реагенси коришћени за идентификацију код танкослојне хроматографије 1. Ванилин Раствор I: 4% ванилин у метанолу Раствор II: 4% H2SO4 у мeтанолу Реагенс се припрема мешањем исте запремине свеже припремљених раствора. Плоче се након прскања загревају неколио минута на температури од 105°C за визуелизацију мрља (тачака). 2. p-Анизалдехид/сумпорнe киселина Свеже припремити 0.5 mL p-анисалдехид у 50 mL глацијалне сирћетне киселине и 1 mL концентроване сумпорне киселине. Загревати на 105°C до визуелизације мрља. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 79 3. Натустроф реагенс (Neu’s Reagent) 2-аминоетил естер дифенилборне киселине, 1% раствор у метанолу (Neu, 1957). Плоче испрскане спрејом анализирају се под UV лампом на 366 nm и 254 nm. Различите флуоресцентне боје уочавају се услед формирања комплекса између хидроксилне групе/група флавоноида и реагенса по следећој реакцији: Схема 2.2 Реакција Натустроф реагенс-флавоноид  Деривати апигенина: жута флуоресценција; на дневном светлу након 24 часа добија се браон-црвена боја,  Деривати лутеоилна: жута флуоресценција,  Деривати каемферола: жуто-зелена флуоресценција,  Деривати кварцетина: из жуте у светло оранџ флуоресценцију. 2.1.3 Спектроскопске методе Инфрацрвена спектроскопија (IC) За инфрацрвену спектроскопију коришћен је Perkin-Elmer FT-IR спектрометар Paragon 500; CHCl3 лабораторијски код A3505E (Lab-Scan Code no. A3505E). Нуклеарна магнетна резонанца (NMR) За нуклеарну магнетну спектроскопију коришћени су:  Спектрометар Bruker AC 200 (200,13 MHz за 1H-NMR и 50,3 MHz за 13C-ΝMR). ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 80  Спектрометар Bruker Advance 400 (399,95 MHz за 1H-NMR и 100,58 MHz за 13C-ΝMR). За снимање спектара коришћени су следећи растварачи:  CDCl3 (7,24 ppm за 1H-NMR и 77,0 ppm за 13C-NMR).  CD3OD (3,31 ppm за 1H-NMR и 49,0 ppm за 13C-NMR). Хемијска померања су изражена у δ (ppm) а константа купловања (J) у херцима (Hz). Следеће 2D технике су коришћене:  DEPT (Distorsionless Enhancement by Polaritation Transfer),  COSY (Correlation Spectroscopy),  HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence),  HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation),  NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy),  ROESY (Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy). Гасна хроматографија-масена спектроскопија Анализа састава есенцијалних уља вршена је гасном хроматографијом- масеном спектроскопијом. У раду је коришћен апарат Hewlett-Packard 5973 – 6890 са електројонизатором (70 eV) који се састоји од сплит/сплитлес ињектор (220°C), сплит проток 1/10. Две капиларне колоне су коришћене: неполарна HP-5 MS (30 m x 0,25 mm, дебљина филма: 0,25 μm); и поларна HP-Innowax (30 m x 0.25 mm, дебљина филма: 0,50 μm). Температура колоне HP-5 MS је програмирана у опсегу од 60°C (5 min) до 280°C са скоком од 4°C/min док је температурни опсег за HP-Innowax колону од 60°C до 260°C са скоком од 3°C/min. Као носећи гас је коришћен хелијум са протоком 1,0 mL/min. Запремина узорка 2 μL. Идентифкација супстанци: Ретенциони индекс за све супстанце је одређен у сагласности са Van den Dool методом (Van den Dool et al., 1963), употребом n- алкана (C9-C24) као стандарда. Идентификација супстанци је утврђена упоређивањем њихових масених спектара са спектрима у Wiley Library (Massada, 1976) и оним доступним у литератури (Davies, 1990; Adams, 2007). ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 81 Ултраљубичаста-видљива спектрофотометрија (UV-Vis) Спектри су снимани на Shimadzu UV-160 A спектрофотометру. UV-Vis спектри су снимани пре свега у циљу утврђивања структуре флавоноида. Додатком различитих реагенаса а на основу UV-Vis спектара могуће је у потпуности одредити групе и предвидети степен супституције код флавоноида (Mabry et al., 1970). Масена спектроскопија Масени спектри снимљени су на апарату Agilent Q-TOF 6540 UHD. Оптичка ротација Вредност [] 20 D је одређена на 20ºC; =589 nm у n-хептану или CHCl3 (g/100 mL) [Lab-Scan Code no. A3505E) употребом Perkin-Elmer 341 полариметра. Запремина кивете: 1 mL; дужина кивете: 10 cm. Растварачи Сви растварачи су дестиловани пре употребе изузев етил-етра (Lab-Scan Code no. A3509E) и метанола (Reag. Ph. Eur, PA-ACS-ISO, 131091.0716). За RP18 HPLC су коришћени следећи растварачи: HPLC високо пречишћени метанол ([Lab-Scan Code no. C2517]; Scharlau ref. 11-23/25), дејонизована и бидестилована вода и сирћетна киселина. Пре употребе раставарачи су филтрирани помоћу регенерисаног целулозног филтра (Agilent 3150-0576; величина пора 0,45 m). 2.2 Хроматографско раздвајање екстракта 2.2.1 C. pannonica За сепарацију неполарног екстракта биљке C. pannonica (8,53 g) коришћена је вакуум течна хроматографија (VLC., 10,0 cm x 8,0 cm). Као стационарна фаза коришћен је силика гел (Merck, Art. 7736), док је као еулент коришћена смеша растварача циклохексан, етил-ацетат, ацетон (Me2CO), метанол и вода. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 82 Табела 2.1 Фракције добијене раздвајањем неполарног екстракта биљке C. pannonica VLC методом 1. PAV-Α (0,09 g) циклохексан 100% 2. PAV-Β (0,37 g) циклохексан: EtOAc 75:25 3. PAV-C (0,56 g) циклохексан: EtOAc 50:50 4. PAV-D (1,24 g) циклохексан: EtOAc 25:75 5. PAV-E (0,99 g) EtOAc 100% 6. PAV-F (0,59 g) EtOAc: Me2CO 90:10 7. PAV-G (0,11 g) EtOAc: Me2CO 75: 25 8. PAV-H (0,29 g) Me2CO 100% 9. PAV-I (1,74 g) Me2CO:MeOH 50:50 10. PAV-J (0,48 g) MeOH 100% 11. PAV-K (0,23g) MeOH:H2O 50:50 Добијено је једанаест фракција (Табела 2.1). Урађена је танкослојна хроматографија на силика гелу (Merck, Art. 5554), за визуелизацију мрља коришћен је p-анизалдехид:сумпорна киселина реагенс. На основу TLC анализе у комбинацији са 1H-NMR спектрима фракција, следеће фракције су изабране за даљу анализу: PAV-C, PAV-D, PAV-E, PAV-F, PAV-G, PAV-I, PAV-J, PAV-K. Протон спектри фракција PAV-A, PAV-B и PAV-C су показали да не садрже супстанце од значаја за даље истраживање, док је 1H-NMR спектар фракције PAV-H био готово идентичан фракцији PAV-G, због тога није даље вршено испитивање. Фракција PAV-D (1.24 g) Фракција је раздвојена вакуум течном хроматографијом (VLC, 10,0 cm x 8,0 cm), а као стационарна фаза коришћен је силика гел (Merck, Art. 7736), док је као елуент коришћена смеша растварача дихлорметан:метанол:вода уз пораст поларности. Добијено је осам фракција: PAV-DA (1; 16,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 100:0:0-95:5:0,5}, PAV-DB (2; 19,1 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 90:10:1}, PAV-DC (3; 1009,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 85:15:1,5}, PAV-DD (4; 21,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2}, PAV-DE (5; 20,5 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3}, PAV-DF (6; 11,7 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5}, PAV-DG (7; 10,3 mg), {CH2Cl2:MeOH:H2O 30:70:7}, PAV-DH (8; 8,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 83 0:100:0}. Након аналитичке TLC фракције PAV-DD и PAV-DE су сједињене у PAV-DD' (37,6 mg). Суб-фракција PAV-DD' (37,6 mg) је аплицирана у облику танких линија на плоче препаративне TLC са силика гелом (Merck, Art. 5721); као елуент коришћена је смеша растварача CH2Cl2:Me2CO:HCOOH 9:2:1. Фракције су истругане са плоче при чему је сакупљено пет фракција. PAV-DD'A (10,7 mg); PAV-DD'B (6,1 mg); PAV-DD'C (9,3 mg); PAV-DD'D (3,7 mg); PAV-DD'E (2,4 mg). Фракција PAV-DD'C је идентификована као супстанца 21 (хиспидулин). Вакуум течна хроматографија (VLC, 10,0 cm x 8,0 cm) на силика гелу (Merck, Art. 7736) је коришћена за раздвајање суб-фракције PAV-DC (1009,6 mg). Фракција је елуирана CH2Cl2:MeOH смешом са порастом поларности. Четрнаест фракција је сакупљено: PAV-DCA (1; 11,2 mg) {циклохексан 100%}, PAV-DCB (2; 3,7 mg) {CH2Cl2 100%}, PAV-DCC (3; 9,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 99:1}, PAV- DCD (4; 6,1 mg) {CH2Cl2:MeOH 98:2}, PAV-DCE (5; 6,6 mg) {CH2Cl2:MeOH 97:3}, PAV-DCF (6; 7,0 mg) {CH2Cl2:MeOH 96:4}, PAV-DCG (7; 29,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 95:5}, PAV-DCH (8; 101,9 mg) {CH2Cl2:MeOH 93:7}, PAV-DCI (9; 670,7 mg) {CH2Cl2:MeOH 90:10}, PAV-DCJ (10; 143,6 mg) {CH2Cl2:MeOH 87:13}, PAV-DCK (11; 35,9 mg) {CH2Cl2:MeOH 84:16}, PAV-DCL (12; 16,0 mg) {CH2Cl2:MeOH 80:20}, PAV-DCM (13; 12,9 mg) {CH2Cl2:MeOH 50:50}, PAV- DCN (14; 27,4 mg) {MeOH 100%}. Након ТЛС анализе фракције PAV-DCH, PAV-DCI, PAV-DCK су подвргнуте даљем истраживаљу. Суб-фракција PAV-DCH (101,9 mg) је раздвојена течном хроматографијом под високим притиском (RP18-HPLC). Смеша MeOH:Η2Ο 2:1 (PAV-H5) је коришћена као елуент; проток 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Следеће супстанце су изоловане: 15 (метересинол) (Rt=11,1 min, 2,3 mg), 25 (6- метоксикаемферол) (Rt=12,7 min, 2,1 mg), (2 и 3) (хлорохисопифолин Ц и репин) (Rt=12,8 min, 13,8 mg), 16 (арктигенин) (Rt=14,2 min, 16,3 mg), 14 (2α-хидрокси, 8-дехидрокси 15-Ο-метакрилат салонитенолид) (Rt=15,6 min, 3,1 mg), 20 (диосметин) (Rt=20,6 min, 3,3 mg), 5 (19-деоксијанерин) (Rt=24,7 min, 1,5 mg). ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 84 Слика 2.1 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-DCH Суб-фракција PAV-DCI (670,7 mg) је раздвојена помоћу хроматографије на колони CC (12,0 cm x 3,5 cm). Коришћен је силика гел (Merck, Art. 9385) као стационарна фаза док је смеша растварача циклохексан:дихлорметан:метанол растуће поларности коришћена као елуент. Добијене су 42 фракције, и оне су регруписане након TLC анализе: PAV- DCIA (1→13; 6,7 mg) {циклохексан 100% -CH2Cl2:MeOH 95:5}, PAV-DCIB (14→19; 480,8 mg) {CH2Cl2:MeOH 94,5:5,5} PAV-DCIC (20→23; 123,8 mg) {CH2Cl2:MeOH 94,5:5,5}, PAV-DCID (24→26; 13,1 mg) {CH2Cl2:MeOH 94,5:5,5}, PAV-DCIE (27→28; 11,2 mg) {CH2Cl2:MeOH 94:6}, PAV-DCIF (29; 3,1 mg) {CH2Cl2:MeOH 94:6}, PAV-DCIG (30→35; 7,0 mg) {CH2Cl2:MeOH 90:10}, PAV-DCIH (36→41; 2,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 80:20}, PAV-DCIO (42; 6,6 mg) {MeOH 100%}. Хроматографијом на колони CC (9,0 cm x 2,5 cm) је раздвојена и суб-фракција PAV-DCIB (480,8 mg). Силика гел (Merck, Art. 9385) је коришћен као стационарна фаза, док је као елуент коришћена смеша растварача циклохексан:дихлорметан:етил-ацетат:метанол растуће поларности. Сакупљено је 60 фракција и након ТLC анализе регруписано у следеће суб-фракције: PAV- DCIBA (1→7; 5,2 mg) {циклохексан 100%-CH2Cl2:EtOAc 99:1}, PAV-DCIBB (8→9; 5,6 mg) {CH2Cl2:EtOAc 99:1}, PAV-DCIBC (10; 11,4 mg) {CH2Cl2:EtOAc 99:1}, PAV-DCIBD (11→15; 14,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 99:1-98:2}, PAV-DCIBE ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 85 (16→17; 10,8 mg) {CH2Cl2:EtOAc 98:2-97:3}, PAV-DCIBF (18→33; 25,1 mg) {CH2Cl2:EtOAc 97:3-90-10}, PAV-DCIBG (34; 6,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 90:10}, PAV-DCIBH (35→39; 60,6 mg) {CH2Cl2:EtOAc 80:20} PAV-DCIBI (40; 14,1 mg) {CH2Cl2:EtOAc 70:30} PAV-DCIBJ (41→43; 129,3 mg) {CH2Cl2:EtOAc 70:30}, PAV-DCIBK (44; 17,8 mg) {CH2Cl2:EtOAc 60:40}, PAV-DCIBL (45; 18,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 60:40}, PAV-DCIBM (46→51; 25,1 mg) {CH2Cl2:EtOAc 60:40- 40:60}, PAV-DCIBN (52→60; 2,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 20:80-EtOAc-MeOH 50:50}. Фракција PAV-DCIBK је идентификована као супстанца 2 (хлорохисопифолин Ц). Суб-фракција PAV-DCIC (123,7 mg) је раздвојена хроматографијом на колони CC (20,0 cm x 2,5 cm) Sephadex LH-20 као стационарном фазом. Као елуент је коришћена смеша MeOH:CH2Cl2 80:20. Добијено је 26 фракција. На основу аналитичке TLC анализе, фракције 22-24 су спојене (PAV-DCIIK', 1,7 mg) и идентификоване као супстанца 19 (апигенин). За раздвајање суб-фракције PAV_DCK (33,6 mg) коришћена је течна хроматографија под високим притиском са колоном обрнутих фаза (RP18- HPLC). Као елуент је коришћена смеша MeOH:Η2Ο 4:3 (PAV-H4); проток 1,5 mL/min; концентрација узорка 5,0 mg/mL. Добијене су супстанце: 7 (цебелин Ј) (Rt=14,2 min, 1,5 mg) и 21 (хиспидулин) (Rt=53,3 min, 2,3 mg). Слика 2.2 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-DCK ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 86 Фракција PAV-E (995,3 mg) Фракција је раздвојена хроматографијом на колони CC (15,0 cm x 3,0 cm) са силика гелом као стационарном фазом (Merck, Art. 9385). Као мобилна фаза коришћена је смеша растварача циклохескан:дихлорметан:етил-ацетат:метанол са порастом поларности. 137 фракција запремине од 10-30 mL је сакупљено и регруписано у сагласности са TLC резултатима: PAV-EA (1; 35,9 mg) {циклохексан 100%}, PAV-EB (2→5; 4,7 mg) {CH2Cl2:EtOAc 100:0-99:1}, PAV- EC (6→13; 1,3 mg) {CH2Cl2:EtOAc 97:3-95:5}, PAV-ED (14→15; 0,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 95:5}, PAV-EE (16→18; 1,1 mg) {CH2Cl2:EtOAc 95:5-90:10}, PAV-EF (19→24; 1,7 mg) {CH2Cl2:EtOAc 90:10}, PAV-EG (25→36; 4,3 mg), {CH2Cl2:EtOAc 80:20-70:30}, PAV-EH (37→44; 17,7 mg) (CH2Cl2:EtOAc 70:30- 60:40}, PAV-EI (45→47; 8,2 mg){CH2Cl2:EtOAc 60:40}, PAV-EJ (48→54; 44,9 mg) {CH2Cl2:EtOAc 60:40-50:50}, PAV-EK (55→58; 39,6 mg) {CH2Cl2:EtOAc 50:50}, PAV-EL (59→62; 70,4 mg) {CH2Cl2:EtOAc 50:50}, PAV-EM (63→66; 108,1 mg) {CH2Cl2:EtOAc 40:60}, PAV-EN (67→69; 95,2 mg) {CH2Cl2:EtOAc 40:60}, PAV-EO (70→72; 69,9 mg) {CH2Cl2:EtOAc 40:60}, PAV-EP (73; 11,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 30:70}, PAV-EQ (74-75; 28,8 mg) {CH2Cl2:EtOAc 30:70}, PAV- ER (75-82; 75,3 mg) {CH2Cl2:EtOAc 30:70-20:80}, PAV-ES (83; 5,5 mg) {CH2Cl2:EtOAc 20:80}, PAV-ET (84-85; 17,0 mg) {CH2Cl2:EtOAc 20:80}, PAV- EU (86-91; 53,3 mg){CH2Cl2:EtOAc 20:80}, PAV-EV (92-99; 80,0 mg) {CH2Cl2:EtOAc 0:100}, PAV-EW (100; 9,0 mg) {EtOAc:MeOH 90:10}, PAV-EX (101-103; 9,6 mg){EtOAc:MeOH 90:10}, PAV-EY (104-106; 7,4 mg) {EtOAc:MeOH 90:10}, PAV-EZ (107-109; 17,5 mg) {EtOAc:MeOH 90:10-80:20}, PAV-EZ1 (110-111; 30,1 mg) {EtOAc:MeOH 80:20}, PAV-EZ2 (112-116; 8 mg) {EtOAc:MeOH 80:20}, PAV-EZ3 (117-123; 5,8 mg) {EtOAc:MeOH 70:30}, PAV- EZ4 (124-137; 40,5 mg) {EtOAc:MeOH 70:30-0:100}. Суб-фракција PAV-ES (5,5 mg) је идентификована као супстанца 4 (јанерин). Суб-фракција PAV-EN (95,2 mg) раздвојена је течном хроматографијом под високим притиском. Елуент MeOH:Η2Ο 2:1 (PAV-H2); проток 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Следеће супстанце су изоловане: 8 (рапосерин) (Rt=12,1 min, 1,2 mg), 2 (хлорохисопифолин Ц) (Rt=5,2 min, 2.9 mg), 10 (хлорорептиолид) (Rt=16,8 min, 30,5 mg). ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 87 Слика 2.3 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-EN Суб-фракција PAV-EV (80,0 mg) је такође раздвојена HPLC обрнутих фаза. Као елуент коришћен је MeOH:Η2Ο 3:2 (PAV-H6); проток 2,0 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Изоловане су следеће супстанце: 1 (бабилин А) (Rt=9,4 min, 5.4 mg), 9 (2α, 8α-дихидрокси-дехидрокостус лактон) (Rt= 10,6 min, 1,1 mg), 12 (епоксирепдиолид) (Rt=16,9 min, 18,7 mg), 13 (репдиолид) (Rt=26,3 min, 6,3 mg). Слика 2.4 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-EV ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 88 Фракција PAV-F (594,4 mg) Део фракције (100,5 mg) раздвојен је течном хроматографијом под високим притиском. Као елуент коришћена је смеша MeOH:Η2Ο 3:2 (PAV-H1); проток елеунта 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Шест супстанци је изоловано и идентификовано: 1 (бабилин A) (Rt=10,3 min, 9,0 mg); 9 (2α, 8α- дихидрокси-дехидрокостус лактон) (Rt=11,4 min, 2,6 mg); 7 (цебелин J) (Rt=12,8 min, 0,9 mg); 12 (епоксирепдиолид) (Rt=18,2 min, 15,6 mg), 22 (непетин) (Rt=26,5 min, 2,1 mg), 13 (репдиолид) (Rt=28,9 min, 1,9 mg). Слика 2.5 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-F Фракција PAV-G (109, 5 mg) Течна хроматографија под високим притиском је коришћена за раздвајање фракције. Смеша MeOH:Η2Ο 9:11 је коришћена као елуент (PAV-H3); проток растварача је 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Следеће супстанце су изоловане: 7 (цебелин J) (Rt=13,8 min, 6,2 mg), 11 (панонин) (Rt= 20,2 min, 4,3 mg), 6 (бабилин Б) (Rt=25,2 min, 1,2 mg). ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 89 Слика 2.6 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-G Фракција PAV-I (1,7483 g) За раздвајање фракције коришћена је вакуум течна хроматографија (VLC, 10,0 cm x 8,0 cm) на силика гелу (Merck, Art. 7736). Смеша CH2Cl2:MeOH са порастом поларности коришћена је као елуент. 12 фракција је сакупњено и оне су помоћу TLC регруписане на следећи начин: PAV-IA (1; 11,1 mg) {циклохексан 100% - CH2Cl2:MeOH 99:1}, PAV-IB (2; 52,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 97:3-90:10}, PAV-IC (3; 142,3 mg) {CH2Cl2:MeOH 85:15}, PAV-ID (4; 497,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 80:20-70-30}, PAV-IE (5; 486,7 mg) {CH2Cl2:MeOH 50:50-MeOH 100%}, PAV-IF (6; 159,3 mg) {MeOH:H2O 50:50}. Суб-фракција PAV-IB (52,5 mg) је раздвојена помоћу RP18-HPLC са смешом MeOH:Η2Ο 3:2 (PAV-H9) као елуентом; проток растварача 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Супстанца 17 (арктин) (Rt=10,3 min, 9,0 mg) је изолована и идентификована. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 90 Слика 2.7 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-IB Фракција PAV-J (233,9 mg) Фракција је раздвојена на колони CC (15,0 cm x 2,5 cm). Силика гел је коришћен као стационарна фаза (Merck, Art. 9385), док је као елуент коришћена смеша растварача растуће поларности. Сакупњено је 92 фракције, које су на основу аналитичке TLC регруписане: PAV-JA (1→8; 5,4 mg) {циклохексан 100%-CH2Cl2:MeOH 95:5}, PAV-JB (9→12; 7,2 mg) {CH2Cl2:MeOH 95:5-93:7}, PAV-JC (13→15; 2,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 97:3}, PAV-JD (16→18; 7,7 mg) {CH2Cl2:MeOH 97:3}, PAV-JE (19→22; 4,3 mg) {CH2Cl2:MeOH 90:10}, PAV-JF (23→25; 23,5 mg) {CH2Cl2:MeOH 90:10}, PAV-JG (26→27; 12,6 mg) {CH2Cl2: MeOH 90:10}, PAV-JH (28→30; 7,5 mg) {CH2Cl2: MeOH 87:13}, PAV-JI (31; 2,3 mg) {CH2Cl2: MeOH 87:13}, PAV-JJ (32; 9,0 mg) {CH2Cl2: MeOH 87:13}, PAV- JK (33→38; 56,3 mg) {CH2Cl2: MeOH 87:13-85:15}, PAV-JL (39→55; 150,9 mg) {CH2Cl2: MeOH 85:15-70:30}, PAV-JM (56→59; 18,9 mg) {CH2Cl2: MeOH 70:30}, PAV-JN (60→63; 61,2 mg) {CH2Cl2: MeOH 60:40}, PAV-JO (64→67; 33,2 mg) {CH2Cl2: MeOH 50:50}, PAV-JP (68; 1,7 mg) {CH2Cl2: MeOH 50:50}, PAV- JQ (69; 2,2 mg) {CH2Cl2: MeOH 50:50}, PAV-JR (70→77; 11,9 mg) {CH2Cl2: MeOH 30:70}, PAV-JS (78→81; 7,2 mg) {CH2Cl2: MeOH 30:70-20:80}, PAV-JT (82→90; 6,3 mg) {CH2Cl2: MeOH 20:80-10:90}, PAV-JU (91→92; 56,2 mg) {MeOH 100%-MeOH:H2O 50:50}. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 91 Суб-фракције PAV-JP, PAV-JQ, PAV-JR су груписане у PAV-JP (13,5 mg), која је идентификована као супстанца 24 (непетин-7-O-β-D- глукопиранозид), док је PAV-JD идентификована као 22 (непетин). Суб-фракција PAV-JK (56,3 mg) раздвојена је употребом течне хроматографије под високим притиском RP18-HPLC. MeOH:Η2Ο у односу 1:1 (PAV-H8) коришћен је као растварач; проток растварача 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Супстанце 18 (сирингин) (Rt=7,4 min, 1,2 mg) и 23 (хиспидулин 7- O--D-глукопираноѕид) (Rt=22,7 min, 11,8 mg) изоловане су и идентификоване. Слика 2.8 HPLC хроматограм суб-фракције PAV-IK Фракција PAV-K (233,9 mg) За раздвајање фракције коришћена је хроматографија на колони CC (15,0 cm x 3,0 cm) са силика гелом (Merck, Art. 9385) као стационарном фазом и смешом растварача растуће поларности. 112 фракција је сакупљено, запремине 10-30 мил, које су на основу аналитичке TLC анализе регруписане: PAV-KA (1; 0,4 mg) {циклохексан 100%}, PAV-KB (2→4; 1,1 mg) {CH2Cl2 100%}, PAV-KC (5→12; 2,0 mg) {CH2Cl2:MeOH 97:3}, PAV-KD (13→14; 1,4 mg) {CH2Cl2:MeOH 97:3}, PAV-KE (15→19; 1,8 mg) {CH2Cl2:MeOH 95:5}, PAV-KF (20→21; 1,3 mg) {CH2Cl2:MeOH 95:5}, PAV-KG (22→30; 4,4 mg) {CH2Cl2: MeOH 95:5-90:10}, PAV-KH (31→32; 2,1 mg) {CH2Cl2: MeOH 95:5}, PAV-KI (33→34; 3 mg) {CH2Cl2: MeOH 90:10}, PAV-KJ (35→40; 15,6 mg) {CH2Cl2: MeOH 90:10}, PAV- KK (41→42; 3,0 mg) {CH2Cl2: MeOH 95:5}, PAV-KL (43→44; 3,6 mg) ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 92 {CH2Cl2:MeOH 85:15}, PAV-KM (45→46; 5,8 mg) {CH2Cl2:MeOH 85:15}, PAV- KN (47→51; 9,7 mg) {CH2Cl2: MeOH 85:15}, PAV-KN' (52→54; 4,4 mg) {CH2Cl2:MeOH 85:15}, PAV-KO (55→57; 3,4 mg) {CH2Cl2:MeOH 85:15-80:20}, PAV-KP (58→69; 8,1 mg) {CH2Cl2:MeOH 80:20}, PAV-KQ (70→76; 8,3 mg) {CH2Cl2:MeOH 70:30}, PAV-KR (77→83; 4,3 mg) {CH2Cl2:MeOH 70:30-50:50}, PAV-KS (84→88; 5,7 mg) {CH2Cl2:MeOH 50:50}, PAV-KT (89→103; 10,0 mg) {CH2Cl2:MeOH 50:50-30:70}, PAV-KU (104→103-6; 4,7 mg) {CH2Cl2:MeOH 30:70-20:80}, PAV-KV (107-109; 3,0 mg) {CH2Cl2:MeOH 20:80}, PAV-KW (110; 0,6 mg) {CH2Cl2:MeOH 20:80}, PAV-KX (111; 0,7 mg) {CH2Cl2:MeOH 20:80}, PAV-KY (112; 10,1 mg) {MeOH 100% }. PAV-KR (5,5 mg) је идентификована као супстанца 24 (непетин-7-O-β-D- глукопиранозид). За раздвајање суб-фракција PAV-KP (8,1 mg) коришћена је препаративна ТLC хроматографија на танком слоју целулозе (Merck, Art. 5716). Екстракт је нанесен као танка линија на ТLC плоче а као елуент је коришћен 30% раствор сирћетне киселине. Добијене линије су истругане са плоча и четири фракције је сакупљено: PAV-KPA (3,2 mg); PAV-KPB (1,0 mg); PAV-KPC (1,1 mg); PAV- KPD (0,8 mg). PAV-KPA је идентификована као супстанца 24 (непетин-7-O-β-D -глукопиранозид). На основу аналитичке TLC, суб-фракције PAV-KL и PAV-KM су груписане као PAV-KL' (37,6 mg), која је аплицирана на плоче препаративне TLC које садрже целулозу као стационарну фазу (Merck, Art. 5716) под условима већ описаним у претходном пасусу. Четири линије је истругано са плоча: PAV-KL'A (10,7 mg); PAV-KL'B (6,1 mg); PAV-KL'C (9,3 mg); PAV-KL'D (3,7 mg). Линија PAV-KL'B је идентификована као супстанца 23 (хиспидулин 7-O--D-глукопиранозид). 93 Схема 2.3 Хроматографско раздвајање неполарног екстракта биљке C. pannonica ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 94 2.2.2 O. scabrum Поларни осушени екстракт (MeOH:H2O 5:1; ORI-C) биљке O. scabrum (6,8 g) је раздвојен вакуум течном хроматографијом (VLC, 10,0 cm x 8,0 cm) на силика гелу (Merck, Art. 7736). Као елуент коришћена је следећа смеша раставарача: дихлорметан, метанол и вода. Табела 2.2 Фракције добијене раздвајањем неполарног екстракта биљке O. scabrum VLC методом 1. ORI-CΑ (0,04 g) CH2Cl2:MeOH:H2O 97:3:0.3 2. ORI-CB (0,05 g) CH2Cl2:MeOH:H2O 95:5:0.5 3. ORI-CC (0,16 g) CH2Cl2:MeOH:H2O 90:10:1.0 4. ORI-CD (0,07 g) CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2.0 5. ORI-CE (0,63 g) CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3.0 6. ORI-CF (1,50 g) CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5.0 7. ORI-CG (2,29 g) MeOH 100% 8. ORI-CH (1,01 g) MeOH: H2O 80:20 9. ORI-CI (0,35 g) MeOH: H2O 50:50 10. ORI-CJ (0,17 g) MeOH: H2O 20:80 У Табели 2.2 приказане су раздвојене фракције које су груписане након аналитичке танкослојне хроматографије на силика гелу (Merck, Art. 5554), употребом ванилина као реагенса за визуелизацију мрља. На основу добијених резултата следеће фракције су изабране за даљу анализу: ORI-CB, ORI-CC, ORI- CD, ORI-CE, ORI-CF, при чему су фракције ORI-CB, ORI-CC уједињене као ORI- CB'. Фракција ORI-CB' (213,6 mg) За раздвајање фракције је коришћена хроматографија на колони CC (20,0 cm x 2,5 cm) употребом Sephadex LH-20. Као елуент је коришћена смеша MeOH:CH2Cl2 90:10. 41 суб-фракција од 30 mL је сакупљено и на основу аналитичке ТLC, фракције су рекомбиноване у основних девет суб-фракција: ORI- ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 95 CB'A-ORI-CB'K. Суб-фракције ORI-CB'G (1,6 mg) и ORI-CB'H (1,5 mg) су идентификоване као супстанца 26 (рузмаринска киселина). Фракција ORI-CE (631,3 mg) Хроматографијом на колони CC (10,0 cm x 3,0 cm) раздвојена је фракција ORI-CE (631,3 mg). Силика гел (Merck, Art. 9385) је коришћен као стационарна фаза док је као елуент коришћена смеша растварача CH2Cl2:MeO:H2O растуће поларности. 109 фракција је сакупљено, и оне су на основу аналитичке TLC регруписане: ORI-CEA (1→4; 1,6 mg) {циклохексан 100%-CH2Cl2 100%}, ORI-CEB (5→8; 0,5 mg) {CH2Cl2 100%-CH2Cl2:MeOH:H2O 98:2:0,2}, ORI-CEC (9→18; 0,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 98:2:0,2-95:5:0,5}, ORI-CED (19→29; 5,1 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 95:5:0.5-90:10:1,0}, ORI-CEE (30→35; 3,8 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 85:15:1,5}, ORI-CEF (36→45; 22,5 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 85:15:1.5-80:20:2,0}, ORI-CEG (46→47; 16,4 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2,0}, ORI-CEH (48→52; 173,6 mg){CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2,0}, ORI-CEI (53→60; 82,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3,0}, ORI-CEJ (61→67; 84,5 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3,0-60:40:4,0}, ORI-CEK (68→73; 40,8 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 60:40:4,0}, ORI-CEL (74→76; 40,5 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 60:40:4,0-50:50:5,0}, ORI-CEM (77→78; 0,9 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 40:60:6,0}, ORI-CEN (79→109; 5,2 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 40:60:6,0-MeOH 100%}. Суб-фракција ORI-CEJ (84,5 mg) је раздвојена течном хроматографијом под високим притиском обрнутих фаза RP18-HPLC. Као елуент је коришћена смеша MeOH:AcOH (5%) 35:65 (ORI-H3); проток растварача 1,5 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/ml. Следеће супстанце су изоловане: 30 (12-O-хидрокси јасмонична киселина) (Rt=11,2 min, 2,5 mg), 31 (12-O-хидроксијасмонична киселина 12-O-β- глукопиранозид) (Rt=14,5 min, 4,3 mg), 33 (тимохинол-2-O--глукопиранозид) (Rt=26,1 min, 1,1 mg), и 26 (рузмаринска киселина) (Rt=61,2 min, 8,5 mg). ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 96 Слика 2.9 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CEJ Суб-фракција ORI-CEI (82,6 mg) је раздвојена помоћу RP18-HPLC. Као елуент је коришћена смеша MeOH:AcOH (5%) 35:65 (ORI-H5); проток растварача 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Супстанце 31 (12-O- хидроксијасмонична киселина 12-O-β-гликопиранозид) (Rt=13,9 min, 10,1 mg), 32 (тимохинол-5-O--глукопиранозид) (Rt=15,2 min, 9,2 mg), и лигнан 29 (глочидиобозид) (Rt=26,6 min, 2,8 mg), су изоловане. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 97 Слика 2.10 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CEI Фракција ORI-CF (1504, 8 mg) Фракција је раздвојена употребом вакуум течне хроматографије (VLC, 10,0 cm x 8,0 cm) са силика гелом (Merck, Art. 7736) као стационарном фазом. Смеша CH2Cl2:MeO:H2O са растућом поларношћу коришћена је као елуент и 9 фракција је сакупљено: ORI-CFA (1; 5,2 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 97:3:0,3}, ORI- CFB (2; 1,4 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 95:5:0,5}, ORI-CFC (3; 6,8 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 90:10:1,0}, ORI-CFD (4; 128,6 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 85:15:1,5}, ORI-CFE (5; 52,7 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2,0}, ORI-CFF (6; 142,3 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3,0}, ORI-CG (7; 88,4 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5,0}, ORI-CH (8; 50,2 mg) {MeOH 100%}, ORI-CI (9; 70,9 mg) {MeOH:H2O 50:50}. Након аналитичке танкослојне хроматографије на силика гелу (Merck, Art. 5554), суб-фракције ORI-CFD, ORI-CFE, ORI-CFF груписане су као ORI-CFD (323,6 mg). За раздвајање суб-фракције ORI-CFD (323,6 mg) коришћена је хроматографија на колони CC (15,0 cm x 3,0 cm) на силика гелу (Merck, Art. 9385). За елуирање је коришћена смеша растварача растуће поларности. 31 фракција је сакупљена и ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 98 регруписана након аналитичке TLC (Merck, Art. 5554) на следећи начин: ORI- CFDA (1→4; 0,7 mg) {циклохексан 100%-CH2Cl2:MeOH:H2O 97:3:0,3}, ORI-CFDB (5→7; 0,7 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 97:3:0,3}, ORI-CFDC (8→9; 0,5 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 95:5:0,5}, ORI-CFDD (10→1; 0,9 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 95:5:0.5-90:10:1,0}, ORI-CFDE (15→18; 3,2 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 90:10:1,0- 80:20:2,0}, ORI-CFDF (19→21; 99,1 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2,0}, ORI- CFDG (22→23; 101,8 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2,0-70:30:3,0}, ORI-CFDH (24→25; 54,7 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3,0}, ORI-CFDI (26→28; 42,7 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3,0}, ORI-CFDJ (29; 3,3 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5,0}, ORI-CFDK (30; 2,1 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5,0}, ORI-CFDL (31; 1,3 mg) {CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5,0}. Суб-фракција ORI-CFDF (99,1 mg) је раздвојена RP18-HPLC. Као елуент коришћена је смеша MeOH:AcOH (5%) 50:50 (ORI-H4); проток растварача 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Следеће супстанце су изоловане и идентификоване: 32 (тимохинол-5-O--глукопиранозид) (Rt=9,4 min, 20,1 mg), 28 (3-O-метил рузмаринска киселина) (Rt=20,6 min, 3,6 mg) и 27 (метилестaр- рузмаринске киселине) (Rt=25,2 min, 2,7 mg). Слика 2.11 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CFDF ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 99 Суб-фракција ORI-CFDG (101,8 mg) је раздвојена течном хроматографијом умереног притиска и обрнутих фаза RP18-MPLC. Као елуент коришћена је смеша H2O:MeOH опадајуће поларности. 20 фракција је сакупљено и регруписано у 9 основних фракција у сагласности са резултатима аналитичке TLC: ORI_CFDGA (1; 3,9 mg) {H2O:MeOH 100,0:0,0}, ORI_CFDGB (2; 5,6 mg) {H2O:MeOH 95,0:5,0}, ORI_CFDGC (3; 4,6 mg) {H2O:MeOH 90,0:10,0}, ORI_CFDGD (4; 10,6 mg) {H2O:MeOH 85,0:15,0}, ORI_CFDGE (5; 20,6 mg) {H2O:MeOH 80,0:20,0}, ORI_CFDGF (6; 12,5 mg) {H2O:MeOH 75,0:25,0}, ORI_CFDGG (7; 15,6 mg) {H2O:MeOH 70,0:30,0}, ORI_CFDGH (8; 3,8 mg) {H2O:MeOH 60,0:40,0}, ORI_CFDGI (9; 6,5 mg) {H2O:MeOH 50,0:50,0}, ORI_CFDGJ (10; 2,4 mg) {MeOH 100%}. Суб-фракција ORI_CFDGE (20,6 mg) је идентификована као смеша две супстанце 30 (12-O-хидрокси јасмонична киселина) и 33 (тимохинол-2-O-- глукопиранозид). Течном хроматографијом под високим притиском RP18-HPLC раздвојена је фракција ORI-CFDI (42,7 mg). Као елуент коришћен је MeOH:AcOH (5%) 35:65 (ORI-H2); проток растварача 1,8 mL/min; концентрација узорка 7,0 mg/mL. Пикови на Rt=11,1 min; 21,9 min; 50,9 min су сакупљени као основни и идентификовани као супстанце: 30 (12-O-хидрокси јасмонична киселина) (3,5 mg), 33 (тимохинол-2- O--глукопиранозид) (3,8 mg) и 26 (рузмаринска киселина (28,7 mg). Слика 2.12 HPLC хроматограм суб-фракције ORI-CFDI 100 Схема 2.4 Хроматографско раздвајање неполарног екстракта биљке O. scabrum ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 101 2.3 Испитивање антимикробне активности 2.3.1 Тестирани микроорганизми У раду је коришћено укупно 20 микроорганизама. Испитивања су вршена на микроорганизмима који се налазе у микотекама лабораторије за Биохемију, Природно-математичког факултета, Универзитета у Крагујевцу и микробиолошким лабораторијама, болницама Патисион и Света Олга у Атини (GENIKO NOSOKOMEIO PATHSION и AGIA OLGA).  Из лабораторије Природно-математичког факултета, Универзитета у Крагујевцу тестиране су следеће врсте микроорганизама: грам-негативне бактерије, G(–): стандардни сој Escherichia coli (ATCC 25922), два клиничка изолата Klebsiella pneumoniae (FSB 26), и Pseudomonas aeruginosa (FSB 37), грам-позитивне бактерије, G(+): Micrococcus lysodeikticus (ATCC 4698), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), и Staphylococcus aureus (ATCC 25923), квасац Candida albicans (ATCC 10259). Клинички изолати појединих бактеријских сојева потичу из Института за јавно здравље у Крагујевцу.  Из микробиолошке лабораторије болнице Патисион у Атини тестиране су следеће врсте бактерија: грам-негативне бактерије: стандардни сојеви − Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853); клинички изолати- Escherichia coli (2020/09), Klebsiella pneumoniae (2645/09), Pseudomonas aeruginosa (2503/09), Acinetobacter baumannii (53/10), Citrobacter amalonaticus (6168/13), грам-позитивне бактерије: стандардни сој − Enterococcus faecalis (ATCC 29212); клинички изолати Enterococcus faecalis (2049/13), Staphylococcus aureus (0801/13), ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 102 стандардни сој квасца Candida albicans (ATCC 164279) узет је из микробиолошке лабораторије болнице Света Олга у Атини. Припрема тест микроорганизама за испитивање подразумева њихово пресејавање на хранљиве подлоге, при чему су бактеријске културе пресејане на коси хранљиви агар (HA); Candida albicans пресејана је на Sabouraud декстрозни агар (SDA). Пресејани микроорганизми инкубирани су на 37°C током 24 h. Након тога, ћелије испитиваних микроорганизама суспендоване су у стерилном физиолошком раствору (0,9% NaCl), при чему је фотоколориметријском методом број ћелија микроорганизама стандардизован на 0,5 јединица на McFarland скали. Коначна концентрација бактеријског инокулума и инокулума за C. albicans износила је 5,6 × 106 CFU/mL (Сolony Forming Unit). За постизање 0,5 јединица на McFarland скали, апсорбанција суспензија мерена је или помоћу фотоколориметра Iskra MA 9507 на 550 nm (зелени филтeр) мерењем оптичке густине припремљене суспензије, уз додавање стерилног физиолошког раствора у циљу постизања оптичке густине О.D.550 nm = 0,045 за бактерије и C. albicans, и 0,03, или је McFarland коефицијент директно одређен на аутоматском фотоколориметру. Антибиотици: Као стандарди код антибактеријске активности коришћена је серија антибитоика из групе пеницилина (инхибиција ћелијског зида); тетрациклина (инхибиција синтезе протеина), антибиотици који инхибирају синтезу нуклеинских киселина и метаболизма (Табела 3.47 – 3.48). Хранљиве подлоге Подлоге за гајење бактерија: Mueller-Hinton подлога -Mueller-Hinton агар 38 g -дестилована вода 1000 mL Готова Mueller-Hinton подлога (Torlak, Beograd, Srbija) сипа се у хладну дестиловану воду и кува до потпуног растварања. Стерилише се на температури од 121ºC, 15 min. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 103 Подлога за гајење Candida albicans: Sabouraud-Dekstroza-агар (SDA) -глукоза 40 g -пептон 10 g -агар 18 g -дестилована вода 1000 mL У 1000 mL хладне дестиловане воде додају се: глукоза, пептон и агар. Кува се до потпуног растварања и стерилише на температури од 121ºC, 25 min. pH = 5.6 се регулише уз помоћ 1M NaOH. За одређивање MBC коришћена је Mueller-Hinton подлога са 7% крвног агара за Staphylococcus aureus, Sabouraud-Dekstroza-агар за Candida albicans и Mac Conkey No2 за остале микроорганизме. 2.3.2 Одређивање антимикробне активности методом микродилуције Одређивање минималне инхибиторне концентрације (MIC) вршено је микродилуционом методом у бујону (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), 1999). Ова метода је модификација дилуционе методе, уместо епрувета користе се микротитарске плоче са 96 конусних удубљења запремине 200 μL. Испитивани екстракати и једињења претходно су растворени у 5-10% физиолошком раствору DMSO, помоћу течног бујона је добија серија двоструких разблажења; а након тога је додаван инокулум одређене концентрације. Микроплоче су затим инкубиране на 37C у трајању од 24 часа. Најмања концентрација на којој није било раста микроорганизма узимана је за MIC тј. MIF. Минималне бактерицидне концентрације (MBC) и минималне фунгицидне концетрације (MFC) одређиване су пипетирањем 10 L суспензије MIC или оних концентрација на којима се запажа да нема раста, а затим су наношене на чврсте подлоге са индикатором у Петри кутије. Уколико није било развоја микроорганизма у наредних 24 часа те концентрације су узимане за MBC или MFC. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 104 Минимална инхибиторна концентрација антибиотика одређена је микродилуционом методом у микротитарским плочама са индикатором Panel за Грам (+) PBC29 и Panel за Грам (–) NBC42. Резултати су читани помоћу микротитрационог читача MicroScan auto Scan4 (Pade Behring) на 450 и 650 nm таласне дужине. 3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 105 У овом поглављу докторске дисертације приказани су и дискутовани експериментални резултати: 1. Хемијске анализе биљних врста C. pannonica и O. scabrum. 2. Антимикробне активности екстраката, изолованих једињења наведених биљака, као и есенцијалног уља биљке C. pannonica. 3. Хемотаксономски значај изолованих једињења. Поступком екстракције неполарног екстракта биљке C. pannonica изоловано је 25 једињења из следећих група секундарних метаболита: сесквитерпенски лактони (14), флавоноиди (7), лигнани (3) и фенилпропаноид глукозид (1). Сва наведена једињења по први пут су изолована из биљке, док су три сесквитерпенска лактона нови природни производи. Такође, по први пут је изоловано и окарактерисано по хемијском саставу есенцијално уље биљке C. pannonica. Из поларног екстракта биљке O. scabrum изоловано је укупно 8 једињења из групе фенолних киселина (3), алицикличних деривата (2), неолигнана (1) и монотерпенских гликозида (2). Сва једињења су новоизолована из биљке O. scabrum. Њихове структуре су одређене применом спектроскопских метода попут UV/VIS, IC, 1 и 2D NMR (1H-NMR, 13C-NMR/DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY, ROESY,), GC/GC-MS и MS. Антимикробна активност на једанаест различитих микроорганизама одређивана је микродилуционом методом на екстрактима (2), појединим фракцијама екстракције (1) и чистим компонентама изолованим из екстраката биљака (33). Такође, испитана је и антимикробна активност етарског уља биљке C. pannonica. Изоловани и идентификовани секундарни метаболити биљака C. pannonica и O. scabrum разматрани су као потенцијални хемотаксономски маркери рода Centaurea, група „Centaurea јacea“ (секција Jacea), и рода Origanum. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 106 3.1 Сесквитерпенски лактони 1. Бабилин А Супстанца је по први пут изолован из биљке Centaurea babylonica (Bruno et al., 2005). У нашем експерименталном раду супстанца је изолована као жуто уље из неполарног екстракта биљке C. pannonica и одређена јој је хемијска структура приказана на слици 3.1. O O O O OH OH HO O 123 4 5 6 7 8 910 11 12 16 17* 18 19 15 H H 13 14 Слика 3.1 1. Бабилин А Хлороформски раствор супстанце 1 има вредност оптичке ротације: [] 20 D + 75,5 (c=1,06; CHCl3). У IR (CaF2) спектру запажају се следеће траке: νmax 3445 cm-1 (OH), 1765 cm-1 (γ-лактон), 1745 cm-1 (естaрска група), 1665 и 1635 cm-1 (двострука веза), 1240 cm-1 (естарска група), 1150 cm-1 трака фрагмента -O−C=O). На основу сигнала који се уочавају на 1H-NMR спектру (Табела 3.1; Слика 3.2) изводи се закључак да супстанца 1 припада групи сесквитерпенских лактона-типа гвајанолида: РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 107 Табела 3.1 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 1 (CDCl3; 400,0 MHz) *Вредности су одређене коришћењем HSQC и HMBC података. Слика 3.2 1H-NMR спектар супстанце 1 (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 45,9 Η-1 3,36 t (J=9,5) 1 C-2 CH2 37,6 Η-2a 2,46 ddd (J=14,7; 9,5; 7,0) 2 H-2b 1,77 ddt (J=14,7; 10,1; 3,9) C-3 CH 76,2 H-3 3,95 dd (J=7,0; 3.9) 1 C-4 C 67,7 - - - - C-5 CH 53,6 H-5 1,99 dd (J=11,2; 9,5) 1 C-6 CH 76,1 H-6 4,67 dd (J=11,2; 9,3) 1 C-7 CH 47,3 H-7 3,08 tt (J=9,3; 3,2) 1 C-8 CH 75,5 H-8 5,17 ddd (J=9,3; 5,1; 3,2) 1 C-9 CH2 35,1 H-9a 2,68 dd (J=15,0; 5,1) 2 H-9b 2,46 dd (J=15,0; 3,2) C-10 C 140,4 - - - - C-11 C 137,1 - - - - C-12 C=O 170,3 - - - - C-13 CH2 122,1 H-13a 6,20 d (J=3,4) 2 H-13b 5,57 d (J=3,2) C-14 CH2 118,9 H-14a 5,17 brs 2 H-14b 5,09 brs C-15 CH2 48,3 H-15a 3,31 d (J=4,2) 2 H-15b 3,04 d (J=4,2) C-16 C=O 174,6 - - - - C-17 C 75,4 - - - - C-18 CH2 68,3 H-18a 3,85 d (J=11,6) 2 H-18a 3,61 d (J=11,6) C-19 CH3 21,2 CH3-19 1,38 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 108  Триплет на δ 3,36 (J=9,5 Hz) и двоструки дублет са хемијским померањем на δ 1,99 (J=11,2; 9,5 Hz) као два метинска протона у алифатичној регији спектра карактеристични су за протоне H-1 и H-5 гвајанолида.  Двоструки дублет на δ 4,67 (J=11,2; 9,5 Hz) је карактеристичан за протон H-6. Налази се у делу спектра оксидованих метинских група, јер је везан за кисеоников атом α-метилен γ-лактонског прстена.  Троструки дублет са хемијским померањем од δ 5,15 (J=9,3; 5,1; 3,2 Hz) је сигнал карактеристичан за протон H-8, гвајанолида. Протон H-8 припада групи оксидованих метинских протона као и H-6, па би се сходно томе очекивало да се налазе један поред другог. Овде, због естерификације бочног ланца, протон на позицији C-8 има више хемијско померање (налази се у области олефинских протона) у односу на протон H-6. Сигнали карактеристични за α-метилен γ-лактонски прстен:  Два дублета на δH 6,20 (J=3,4 Hz) и δH 5,57 (J=3,2 Hz) (Δ11(13)) карактери- стични за протоне егзометиленске двоструке везе лактонског прстена, H-13a и H-13b.  Двоструки триплет на δH 3,08 (J=9,3; 3,2 Hz) је карактеристичан за протон H-7 (Слика 3.2). У алифатичној регији 1H-NMR спектра су идентификоване две метиленске групе:  Два двострука дублета на позицијама δH 2,68 (J=15,1; 5,1 Hz) и δH 2,46 (J=15,0; 3,2 Hz) који одговарају геминалним протонима H-9a и H-9b.  Троструки дублет на δH 2,46 (J=14,7; 9,5, 7,0 Hz) и дублет дублет триплета на δ 1,77 (J=14,5; 10,1; 3,9 Hz) карактеристични су за геминалне протоне H-2a и H-2b. Двоструки дублет на позицији δH 3,95 (J=7,0; 3,9 Hz) карактеристичан је за протон H-3. Хемијско померање ка вишим вредностима овог метинског протона који се налази на петочланом прстену гвајанолида објашњава се присуством хидроксилне групе на позицији C-3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 109 Два јасна синглета у области олефинских протона δH 5,17 и δH 5,09, карактеристични су за протоне егзо-метиленске двоструке везе H-14a и H-14b, (Δ10(14)). Типичан AB систем, два дублета на δH 3,85 и δH 3,61 са константом спрезања од J=11,0 Hz, као и синглет на δH 1,38 који интеграцијом даје три протона, карактеристичан за метил групу, указују на присуство бочног ланца у молекулу. Наведени сигнали су карактеристични за 2-метил-2-хидроксил пропаноилокси [= метакрилат] бочни ланац који је естарски везан за C-8 (Слика 3.2). Поред свега наведеног, на 1H-NMR спектру се уочавају и два дублета δH 3,31 (J=4,4 Hz) и δH 3,04 (J=4,2 Hz) који, у сагласности са литературним подацима, одговарају геминалним протонима H-15a и H-15b епоксидног прстена који се налази на позицији C-4 (Bruno et al., 2005). Основна структура гвајанолида 1 потврђена је помоћу COSY спектра (Слика 3.3): Спин систем A: H-7/H-13a,b Спин систем Б: H-1/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9a,b Спин систем Ц: H-1/H-2a,b/H-3. На основу HSQC (корелација угљеник-протон) спектара дефинисани су следећи угљеникови атоми супстанце 1 (Слика 3.3):  три метинска угљеника C-1, C-5 и C-7 (δC 45,9; δC 53,6; δC 47,3),  три оксиметинска угљеника C-3, C-6 и C-8 (δC 76,2; δC 76,1 и δC 75,5),  два алифатична метиленска угљеника C-2 и C-9 (δC 37,6 и δC 35,1),  два олефинска угљеника карактеристична за егзо-метиленску двоструку везу C-14 и C-13 (δC 118,9 и δC 122,1),  један метиленски угљеник епоксидног прстена C-15 на δC 48,3,  један метиленски угљеник бочног ланца C-18 на δC 68,3,  један угљеник метил групе бочног ланца C-19 на δC 21,2. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 110 Помоћу спектра 1H-13C корелације HMBC, који омогућава дефинисање положаја удаљених атома (нпр. атома угљеника који је за три или четри везе удаљен од протона), одређена су хемијска померања следећих кватернерних угљеникових атома (Слика 3.3):  C-12 (δC 170,3) на основу повезаности сигнала H-13a,b/C-12,  C-16 (δC 174,6) - H-18b, CH3-19/C-16,  C-10 (δC 140,4) - H-1/C-10,  C-4 (δC 67,7) - H-5/C-4,  C-11 (δC 137,1) - H-7/C-11,  C-17 (δC 75,4) - H-18b, CH3-19/C-17. Релативна конформација сесквитерпенског лактона 1 добијена је упоређивањем константи купловања вициналних протона са публикованим вредностима, за одговарајуће гвајанолиде (Bruno et al., 2005). Поред тога, помоћу хомонуклеарног 1H-1H NOESY спектра одређени су сви хирални центри супстанце 1. Јака nOe повезаност између H-1 и H-5 потврђује cis полажај петочланог и седмочланог прстена гвајанолида; trans- диаксијална расподела протона на позицијама C-5 (α), C-6 (β) и C-7 (α) карактеристична за α-метилен γ-лактонски прстен гвајанолида изолованих из биљака фамилије Astereacea утврђена је nOe корелацијом између H-5 и H-7, као H-6 са H-8. Интезиван, јасно уочљив nOe сигнал између H-8 са H-6 и H-9b потврђује α-оријентацију естарског бочног ланца на позицији C-8, док nOe сигнал између H-7 и H-3 потвђују β–орјентацију хидроксилне групе на положају C-3. Одсуство nOe сигнала између метиленских протона на позицији C-15 и H-5, указује на њихову β–оријентацију на положају C-4 (Слика 3.3). Стереохемија група на угљенику C-17 обележена је R* у случају да се ради о супротној стереохемији на угљениковом атому. У сагласности са литературним подацима уколико је протон H-13b на нижим вредностима хемијских померања, што је и овде случај, сматра се да су групе на угљенику распоређене у простору на начин приказан код супстанце 1 (Bruno et al., 2005; Merril and Stevens, 1985). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 111 O O O O CH3 OH OH HO O 12 3 4 5 6 7 8 910 11 12 16 17* 18 19 15 H H 13 14 O O H13b H13a H2b H1 H2a HO H6 H9a H8 H9b O H14a H14b H5 O O OH OH H7 H3 17 15 CH3 Слика 3.3 1H-1H COSY, HSQC, HMBC и NOESY спектри супстанце 1 (CDCl3; 400,0 MHz); Корелације добијене на основу HMBC спектра (црвене стрелице од 1H ка 13C) и 1H-1H COSY корелација (плаве линије); Предложена конформација супстанце 1 добијена на основу 1H-NMR и 1H-1H NOESY спектара РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 112 2. Хлорохисопифолин Ц (акроптилин) Супстанца је по први пут изолована 1967. године из биљке Acroptilon repens (Centaurea repens), (Evstratova et al., 1967). Касније је супстанца изолована и из других биљних врста, пре свега из врста рода Centaurea (Табела 1.5). Супстанца је још изолована из рода Rhaponticum врсте R. сerratuloides (Berdin et al., 1999). Поред биљне фамилије Asteraceae изолована је и из фамилије Jurinea: J. suffruticosa Rgl. (Zakirov et al., 1982). У нашем раду, супстанца је изолована у облику белих кристала и помоћу спектроскопских метода одређена је следећа хемијска структура приказана на слици 3.4. O O O O OH Cl HO O 123 4 5 6 7 8 910 11 12 16 17* 18 19 15 H H 13 14 Слика 3.4 2. Хлорохисопифолин Ц Измерена оптичка ротација хлороформског раствора супстанце је: [] 20 D + 79,0 (c=1,00; CHCl3). Резултати IR (CaF2) спектра указују на присуство следећих функционалних група: νmax 3470 cm-1 (OH група) и 1743 cm-1 (C=O, карбонилна група), и слабе траке на 1665 и 1630 cm-1(C=C, двоструке групе). Као што је приказано у Табели 3.2 и на Слици 3.5, хемијска померања сигнала протона на 1H-NMR спектру супстанце 2 готово су идентична као код претходно описане супстанце бабилин А (1), са изузетком сигнала карактеристичног за H-8 (δH 5,22 vs 5,17) и метил групе бочног ланца CH3-19 (δH 1,53 vs 1,38). На основу ових промена може се закључити да се две супстанце мађусобно разликују по хемијском саставу бочног ланца. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 113 У сагласности са литературним подацима, два дублета на δH 3,86 и δH 3,63, H-18a,b и оштар, јасан синглет који интеграцијом даје три протона на δH 1,53 CH3-19 а који се уочавају на 1H-NMR спектру супстанце 2, указују да је естарски везана 2-хлорометил-2-хидрокси пропионатна група као бочни ланац који се налази на позицији C-8 супстанце 2 (Bruno et al., 2005). Табела 3.2 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 2 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Вредности су одређене коришћењем 13C-NMR и HMBC података. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 46,1 Η-1 3,36 t (J=9,6) 1 C-2 CH2 37,8 Η-2a 2,49 ddd (J=14,4, 9,6; 7,2) 2 H-2b 1,77 ddt (J=14,4; 9,8; 3.7) C-3 CH 76,2 H-3 3,97 dd (J=7,2; 3,7) 1 C-4 C 68,1 - - - - C-5 CH 53,7 H-5 1,99 dd (J=11,3; 8,7) 1 C-6 CH 76,4 H-6 4,66 dd (J=11,7; 9,4) 1 C-7 CH 47,7 H-7 3,07 td (J=9,7; 3,3) 1 C-8 CH 75,8 H-8 5,22 m 1 C-9 CH2 35,5 H-9a 2,68 dd (J=15,3; 4,9) 2 H-9b 2,47 dd (J=14,8, 2,3) C-10 C 140,9 - - - - C-11 C 137,3 - - - - C-12 C=O 168,7 - - - - C-13 CH2 122,4 H-13a 6,21 d (J=3,5) 2 H-13b 5,54 d (J=3,2) C-14 CH2 119,3 H-14a 5,18 brs 2 H-14b 5,02 brs C-15 CH2 48,6 H-15a 3,34 d (J=4,4) 2 H-15b 3,04 d (J=4,4) C-16 C=O 173,2 - - - - C-17 C 74,7 - - - - C-18 CH2 51,2 H-18a 3,86 d (J=10,8) 2 H-18a 3,63 d (J=10,8) C-19 CH3 23,5 CH3-19 1,53 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 114 Слика 3.5 1H-NMR спектар супстанце 2 (CDCl3; 400,0 MHz) Потврда присуства наведеног бочног ланца који у свом саставу садржи халоген добијена је помоћу HMBC спектра на коме се уочава укрштање сигнала метил групе CH3-19 са угљениковим атомима на следећим хемијским померањима δC 173,2 (C-16), δC 74,7 (C-17) и δC 51,2 (C-18) (Слика 3.6). Наведена хемијска померања угљеникових атома су у сагласности са литературним подацима бочног ланца који садржи атом хлора (Fernandez et al., 1995). У случају када се у бочном ланцу уместо хлора налази хидроксилна група, сигнал C-18 се налази на δC 68,3 (бабилин A, стр. 107). Основна структура гвајанолида 2 потврђена је помоћу COSY спектра (Слика 3.6): Спин систем A: H-7/H-13a,b Спин систем B: H-1/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9a,b Спин систем C: H-1/H-2a,b/H-3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 115 На основу 13C-NMR спектра одређени су положаји следећих сигнала (Табела 3.2; Слика 3.6):  у регији карбоксилних угљеникових атома уочавају се два пика: C-16 (δC 173,2; бочни ланац), C-12 (δC 168,7; лактонски прстен),  у регији олефинских угљеникових атома присутна су четири различита сигнала: - два кватернерна угљеникова атома на позицијама: C-10 (δC 140,9); C-11 (δC 137,3), - два угљеникова атома егзоцикличних двоструких веза: C-13 (δC 122,4); C-14 (δC 119,3),  у регији угљеника везаних за кисеоников атом уочава се укупно пет сигнала: C-3 (δC 76,2); C-6 (δC 76,4); C-8 (δC 75,8); C-17 (δC 74,7); C-4 (δ 68,1),  у регији алифатичних угљеника налазе се следећи сигнали: C-1 (δC 46,1); C-2 (δC 37,1); C-5 (δC 53,7); C-7 (δC 47,7); C-9 (δC 35,5); C-15 (δC 48,5) и метил C-19 (δC 23,5). Позиције кватернерних угљеникових атома су потврђене помоћу HMBC спектра (Слика 3.6). Релатива стереохемија супстанце 2 потвђена је упоређивањем вредности константи купловања као и хемијским померањима угљеникових атома са већ публикованим вредностима за, по хемијском саставу, сличне гвајанолиде (Merrill and Stevens, 1985, Bruno et al., 2005). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 116 O O O O CH3 OH Cl HO O 12 3 4 5 6 7 8 910 11 12 16 17* 18 19 15 H H 13 14 Слика 3.6 1H-1H COSY, HMBC и 13C-NMR спектри супстанце супстанце 2 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Најважније укрштања добијена помоћу HMBC спектра (црвене стрелице од 1H ка 13C) и1H-1H COSY корелације (означене плавим болд линијама) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 117 3. Репин Изолована је први пут из биљке Acroptilon repens L. (Evstratova, 1969). Супстанца је изолована и из других биљних врста из рода Centaurea (Табела 1.5). Из испитиваног екстракта супстанца је изолована у облику беле кристалне супстанце и одређена је следећа хемијска структура приказана на слици 3.7. O HO H H O O O O O 12 3 4 5 6 7 8 910 14 13 11 12 16 17 18 19 15 Слика 3.7 3. Репин Супстанца 3 изолована је у смеши, заједно са хлорохисопифолином С (2) у односу 1:3, што је одређено помоћу 1H-NMR спектра (Табела 3.3; Слика 3.8). Упоређујући 1H и 13C-NMR спектре са спектрима чисте супстанце 2 уочава се присуство још једне супстанце. На основу спектроскопских података, закључено је да су централни скелети гвајанолида идентични и да се две супстанце разликују једино по структури бочног ланца. На 1H-NMR спектру поред карактеристичних пикова за хлорохисопифолин С, присуство два дублета на δH 3,14 (J=5,8 Hz) и δH 2,80 (J=5,8 Hz), као и једног синглета на δH 1,59 који интегрисањем даје укупно три протона тј. метил групе CH3-19 указује на присуство епоксидног прстена у бочном ланцу (Bruno et al., 2005). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 118 Табела 3.3 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 3 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) Слика 3.8 1H-NMR спектри супстанце 2 (црвени) 2 и 3 (плави) (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 45,7 Η-1 3,36 t (J=9,6) 1 C-2 CH2 37,5 Η-2a 2,49 ddd (J=14,4; 9,6; 7.2) 2 H-2b 1,77 ddt (J=14,4; 9,8; 3,9) C-3 CH 75,5 H-3 3,97 dd (J=7,2; 3,9) 1 C-4 C 68,2 - - - - C-5 CH 53,7 H-5 1,99 dd (J=11,3; 8,7) 1 C-6 CH 76,7 H-6 4,64 dd (J=11,7; 9,4) 1 C-7 CH 48,0 H-7 3,07 td (J=9,7; 3,3) 1 C-8 CH 75,5 H-8 5,12 m 1 C-9 CH2 36,3 H-9a 2,72 dd (J=15,3; 4,9) 2 H-9b 2,47 dd (J=14,8; 2,3) C-10 C 140,9 - - - - C-11 C 137,3 - - - - C-12 C=O 168,7 - - - - C-13 CH2 122,4 H-13a 6,21 d (J=3,5) 2 H-13b 5,54 d (J=3,2) C-14 CH2 119,3 H-14a 5,18 brs 2 H-14b 5,02 brs C-15 CH2 48,5 H-15a 3,34 d (J=4,4) 2 H-15b 3,04 d (J=4,4) C-16 C=O 173,2 - - - - C-17 C 53,2 - - - - C-18 CH2 52,8 H-18a 3,14 d (J=5,8) 2 H-18a 2,80 d (J=5,8) C-19 CH3 17,5 CH3-19 1,59 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 119 Присуство следећих угљеникових атома на 13C-NMR спектру: C-17 (δC 53,2), C-18 (δC 52,8) и C-19 (δC 17,5) потврђује горе наведену претпоставку да се епоксидни прстен налази у бочном ланцу (Слика 3.9). Слика 3.9 13C-NMR спектар смеше супстанце 2 и 3 (CDCl3; 50,3 MHz); детаљ 13C-NMR спектра смеше супстанце 2 и 3 Стереохемија супстанце 3 добијена је упоређивањем константи купловања и вредности хемијских померања пикова са претходно публикованим подацима за сесквитерпенске аналоге. Узет је у обзир и потенцијални биосинтетички пут гвајанолида изолованих из фамилије Astereacea, рода Centaurea. Репин је сесквитерпенски лактон изолован из C. solstitialis и C. repens, биљака које изазивају коњску нигропалидалну енцефаломацију или болест жвакања (equine nigropallidal encephalomalacia-ENE), фаталну неуродегеративну болест коња, сличну Паркинсоновој болести. Активност сесквитерпенског РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 120 лактона репина објашњава се присуством метиленбутирлактонске и епоксидне групе које су јаки елeкрофили и могу реаговати са различитим биолошким нуклеофилима, као што су протеини, DNK , и глутатион (GSH). Откривено је да репин изазива промене нивоа глутатиона GSH у функцији митохондрија што за последицу има смањење концентрације допамина у ћелији. Како се зна да Перкинсонова болест зависи од концентрације допамина у ћелијама организма, претпоставља се да је репин неуротоксичан гвајанолид одговоран за ENE код коња (Tukov et al., 2004; Robles et al., 1998). Такође је откривено да репин изазива хипотермију код пацова. С обзиром на то да ниједан познати медикамент као што су атропин сулфат, атропин метилбромид, пропранолол, метерголин, кетансерин, дифенхидрамин и апоморфин не умањују хипотермички ефекат репина, механизам изазивања хипотермије у присуству репина се и даље истражује (Akbar et al., 1995). 4. Јанерин Први пут супстанца је изолована из Centaurea janeri (Gonzales et al., 1977). До сада је изолована из различитих врста које припадају роду Centaurea (Табела 1.5). Супстанца је изолована и из других родова биљака: Rhaponticum: R. pulchrum (Cis et al., 2006), Pleiotaxis: P. rugosa (Zdero & Bohlmann, 1989) и Centaurothamnus: C. maximus (Muhammad et al., 2003). Наведено једињење изоловано је у облику жуте аморфне супстанце и на основу спектроскопске анализе одређена је следећа хемијска структура приказана на слици 3.10. O HO H H O O O O 12 3 4 5 6 7 8 910 14 13 11 12 16 17 18 19 OH 15 Слика 3.10 4. Јанерин РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 121 Вредност измерене оптичке ротације је: [] 20 D + 42,0 (c=1,00; CHCl3). На основу 1H-NMR спектра, закључује се да супстанца 4 припада истој подгрупи гвајанолида као и претходно описане супстанце са епоксидним прстеном на C-4 (Табела 3.4; Слика 3.11). Табела 3.4 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 4 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) Слика 3.11 1H-NMR спектар супстанце 4 (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 48,2 Η-1 3,34 t (J=10,4) 1 C-2 CH2 37,8 Η-2a 2,45 dd (J=14,7; 7.0) 2 H-2b 1,83 ddt (J=14,7; 10,4; 4.3) C-3 CH 76,7 H-3 3,98 t (J=7,0) 1 C-4 C 68,3 - - - - C-5 CH 53,2 H-5 2,06 t (J=10,4) 1 C-6 CH 77,2 H-6 4,61 dd (J=10,4; 9,2) 1 C-7 CH 45,9 H-7 3,10 t (J=9,2) 1 C-8 CH 74,3 H-8 5,13 m 1 C-9 CH2 36,6 H-9a 2,73 dd (J=15,1; 5,5) 2 H-9b 2,41 dd (J=15,1; 3,3) C-10 C 141,5 - - - - C-11 C 137,1 - - - - C-12 C=O 165,3 - - - - C-13 CH2 122,8 H-13a 6,20 d (J=3,0) 2 H-13b 5,60 d (J=2,8) C-14 CH2 118,8 H-14a 5,17 brs 2 H-14b 4,94 brs C-15 CH2 48,6 H-15a 3,32 d (J=3,3) 2 H-15b 3,05 d (J=3,3) C-16 C=O 168,8 - - - - C-17 C 139,4 - - - - C-18 CH2 126,9 H-18a 6,32 d (J=10,8) 2 H-18a 5,94 d (J=10,8) C-19 CH3 62,5 CH3-19 4,32 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 122 Сви сигнали за гвајанолидни тип скелета су очигледни на протонском спектру као и два дублета на δH 3,32 и δH 3,05 са константом спрезања J=3,5 Hz која одговарају геминалним протонима епоксидног прстена, H-15a and H-15b. Са 1H-NMR спектра евидентно је да је једина разлика између супстанце 4 и претходно описаних гвајанолида у хемијској природи бочног ланца. На 1H- NMR спектру два широка синглета на δH 6,32 и δH 5,94 као и синглет на вишим померањима (δH 4,32), који интеграцијом даје два протона, одговарају бочном низу 4-хидроксиметакрилату, естарски везаном за C-8. Даља потврда предложне структуре добијена је помоћу COSY и 13C-NMR спектара (Слика 3.12). Као и код претходних гвајанолида централни скелет супстанце 4 потврђен је помоћу COSY спектра док су хемијска померања свих угљеникових атома супстанце 4 добијена анализом 13C-NMR спектра. Релативна стереохемија супстанце 4 добијена је упоређивањем константи спрезања између вициналних протона и хемијским померањима угљеника са одговарајућим гвајанолидима чија структура је утврђена анализом X-зрака (Mattern et al., 1996). Константа спрезања H-6 (J=10,4; 8,5 Hz) са H-5 и H-7 указује на trans-диаксијалну расподелу протона на C-5 (α), C-6 (β) и C-7 (α) лактонског прстена што је најчешћа карактеристика сесквитерпенских лактона. Константа спрезања H-1 од 10,4 Hz са H-5 потврђује да су два прстена (петочлани и седмочлани) гвајанолида, који чине основну структуру, међусобно cis-повезани. Константа спрезања од 9,3 Hz између H-7 и H-8 потврђује њихову супротну оријентацију као и β оријентацију протона H-8. Прелиминарна истраживања цитотоксичне активности јанерина показују његову активност на ћелије рака SKMEL, KB, BT-549 и SK-OV-3 (Muhammad et al., 2003). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 123 Слика 3.12 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 4 (CDCl3, 400,0; 50,3 MHz); најважније корелације добијене COSY спектром (обележене плавом и зеленом болд линијом) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 124 5. 19-Деоксијанерин; деоксирепин Болман и Зајце (Bohlmann & Ziesche) су први пут изоловали супстанцу из биљне врсте Ptilostemon chamaepeuce 1980. године (Bohlmann & Ziesche, 1981). До данас, супстанца је изолована из неколико биљних врста које припадају фамилији Asteraceae: Ptilostemmon gnaphaloide (Menichini et al., 1996), Rhaponticum pulchrum (Cis et al., 2006), Cousinia canescens (Alberto Marco et al., 1993), Pleiotaxis cf. rugosa Hoffm. (Bohlmann & Zdero, 1982b). Из рода Centaurea, идентификована је код C. bella (Daniewski & Nowak, 1993) и C. incana (Massiot et al., 1986). Супстанца је изолована у облику наранџастог уља, а предложена хемијска структура приказана је на слици 3.13. O HO H H O O O O 12 3 4 5 6 7 8 910 14 13 11 12 16 17 18 19 15 Слика 3.13 5. 19-Деоксијанерин Оптичка ротација хлороформског раствора супстанце је: [] 20 D + 19,2 (c=1,30; CHCl3) Упоређивањем 1 и 2D NMR спектралних података супстанце 5 (Табела 3.5; Слике 3.14 – 3.15) са спектрима супстанце 4 (стр.121), уочава се да две супстанце имају идентичан скелет-гвајанолида и да је једина разлика у структури бочног низа који се налази на положају C-8 (Слика 3.10). Два дублета на δH 6,15 и δH 5,63 са константом спрезања 1,8 Hz одговарају геминалним протонима H-18a и H-18b, бочног ланца. Наведени дублети заједно са метил групом која се у облику синглета уочава на δH 1,95 одговарају метил метакрилатној групи. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 125 Сигнал на δH 5,08 као двоструки триплет (J7,8=8,8; J8.9a =4,7; J8,9b =3,5 Hz) одговара H-8. Слично осталим гвајанолидима сматра се да бочни ланац заузима α-положај на C-8, на основу хемијског померања и вредности константи спрезања. Табела 3.5 1H-NMR и13C-NMR супстанце 5 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Преклопљен сигнал са H-15a. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 45,5 Η-1 3,32 * 1 C-2 CH2 37,1 Η-2a 2,50 m 2 H-2b 1,82 m C-3 CH 76,0 H-3 3,89 dd (J=6,2; 3,8) 1 C-4 C 62,3 - - - - C-5 CH 52,9 H-5 2,05 dd (J=10,8; 9,2) 1 C-6 CH 76,8 H-6 4,64 t (J=9,2) 1 C-7 CH 47,1 H-7 3,10 tt (J=9,0; 3,5) 1 C-8 CH 73,8 H-8 5,08 tt (J=9,0; 5,0; 3,5) 1 C-9 CH2 36,3 H-9a 2,73 dd (J=15,0; 4,7) 2 H-9b 2,41 dd (J=15,0; 3,5) C-10 C 137,5 - - - - C-11 C 137,3 - - - - C-12 C=O 165,2 - - - - C-13 CH2 123,1 H-13ª 6,17 d (J=3,6) 2 H-13b 5,56 d (J=3,3) C-14 CH2 119,3 H-14a 5,14 brs 2 H-14b 4,92 brs C-15 CH2 48,6 H-15a 3,31 d (J=3,9) 2 H-15b 3,02 d (J=3,9) C-16 C=O 174,1 - - - - C-17 C 133,9 - - - - C-18 CH2 126,5 H-18a 6,15 d (J=1,8) 2 H-18a 5,63 d (J=1,8) C-19 CH3 18,1 CH3-19 1,95 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 126 Слика 3.14 1H-NMR спектар супстанце 5 (CDCl3; 400,0 MHz) Слика 3.15 1H-1H COSY, HSQC и 13C-NMR спектри супстанце 5 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); 1H-1H COSY корелација (означено плавом и зеленом болд линијом) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 127 6. Бабилин Б До сада, супстанца је изолована из две врсте рода Centaurea: C. conifera L. (Bruno et al., 1998) и C. babylonica L. (Bruno et al., 2005). Супстанца је изолована у облику наранџастог уља и спектроскопском анализом је одређена следећа структура приказана на слици 3.16. O HO HO H H O O O O 123 4 5 6 7 8 910 14 13 11 1215 16 17 18 HO 19 Слика 3.16 6. Бабилин Б Оптичка ротација супстанце је: [] 20 D + 32,7 (c=1,10; CHCl3). На основу хемијских померања сигнала на 1H-NMR спектру супстанце закључује се да је супстанца 6 изомер бабилина A (стр.106). Упоређујући 1H-NMR спектралне податке (Табела 3.6; Слика 3.17) супстанце 6 и бабилина A, уочава се разлика у природи бочног ланца код супстанце 6 и бабилина A. Заправо два дублета на δH 3,15 (J=5,8 Hz) и δH 2,81 (J=5,8 Hz) и једна метил група CH3-19 која се као синглет јавља на δH 1,59 одговарају епоксидном прстену у бочном ланцу као што је случај код репина (стр.118). Међутим, поред наведене разлике за бочни ланац, код супстанце 6 уочава се одсуство епоксидног прстена на позицији C-4, а који се јавља и описан је код бабилина А и репина. Заправо синглет на δH 3,97 (H-15a,b) који интеграцијом даје два протона као и триплет померен ка вишим вредностима хемијских померања δH 2,30 (H-5; J=9,8) и двоструки дублет на δH 4,15 (H-3; J=6,0; 4,8) указују на присуство диолне групе на позицији C-4 (Öküz and Topcu, 1994). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 128 Табела 3.6 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 6 (CDCl3, 400,0 MHz) * Вредности су добијене на основу вредности добијених на HSQC и HMBC спектру. * Преклопљени сигнали: H-2b/ H-9b; H-2b/H-5; ‡ литературни податак (Bruno et al. 2005). Слика 3.17 1H-NMR спектар супстанце 6 (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 43,9 Η-1 3,34 q (J=9,4) 1 C-2 CH2 37,8 Η-2a 2,43 ddd (J=14,2; 10,2; 6,6) 2 H-2b 1,63 ddd (J=14,2; 8,8; 4,8)* C-3 CH 78,2 H-3 4,15 dd (J=6,0; 4,8) 1 C-4 C 84,5 - - - - C-5 CH 55,1 H-5 2,30 t (J=9,4) 1 C-6 CH 76,9 H-6 4,54 dd (J=11,6; 9,4) 1 C-7 CH 47,1 H-7 3,12 tt (J=9,6; 3,5)* 1 C-8 CH 75,3 H-8 5,06 m 1 C-9 CH2 37,5 H-9a 2,70 dd (J=14,8; 5,2) 2 H-9b 2,27 dd (J=14,8; 3,7)* C-10 C 141,5‡ - - - - C-11 C 137,5 - - - - C-12 C=O 168,2 - - - - C-13 CH2 123,1 H-13a 6,23 d (J=3,6) 2 H-13b 5,51 d (J=3,3) C-14 CH2 117,6 H-14a 5,15 brs 2 H-14b 4,98 brs C-15 CH2 64,2 H-15a,b 3,97 brs 2 C-16 C=O 172,5 - - - - C-17 C 53,3 - - - - C-18 CH2 52,6 H-18a 3,15 d (J=5,8) 2 H-18a 2,81 d (J=5,8) C-19 CH3 17,0 CH3-19 1,59 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 129 Даља потврда структуре добијена је помоћу 2D-NMR спектара (Слика 3.18). Основна структура гвајанолида 6 утврђена је помоћу COSY спектра, док је помоћу HSQC спектра утврђен положај протонованих угљеникових атома супстанце 6. На HMBC спектру корелација између синглета који одговара метил групи CH3-19 са угљениковим атомима на δC 172,5 (C-16), δC 53,3 (C-17) и δC 52,6 (C-18), недвосмислено потврђује присуство епоксидног прстена у бочном низу (Bruno et al., 2005). O HO HO H H O O O O HO Слика 3.18 HMBC, HSQC и COSY спектри супстанце 6 (CDCl3; 400,0 MHz); Корелације добијене на основу HMBC спектра (црвене стрелице) и 1H-1H COSY корелеције (плаве болд линије) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 130 Такође, корелација између H-15a,b са угљеником на δC 84,5 (C-4) потврђује присуство метил хидроксилне групе на C-4. Хемијско померање C-4 (> 80 ppm) је карактеристично за присуство још једне хидроксилне групе за исти угљеников атом (диол) (Bruno et al., 2005). Релативна стереохемија супстанце 6 потврђена је упоређивањем вредности константи спрезања вициналних протона и хемијских померања пикова угљеникових атома са претходно публикованим резултатима (Öküz & Topcu, 1994, Bruno et al., 2005). 7. Цебелин J До сада је супстанца изолована из неколико врсти рода Centaurea: C. bella Trautv., (Nowak et al.; 1989, Nowak, 1993); C. glastifolia L., (Öküz & Topçu, 1994); C. babylonica L., (Bruno et al., 2005). Супстанца је изолована у облику жуто-наранџастог уља и одређена јој је следећа структура приказана на слици 3.19. O HO H H O O OH O Cl HO HO 12 3 4 5 6 7 8 910 16 17 18 19 15 14 12 1311 Слика 3.19 7. Цебелин Ј Оптичка ротација супстанце је: [] 20 D + 60,7 (c=1,00; CHCl3). Супстанца 7 је диастероизомер Бабилина Б. Упоређивањем 1H-NMR спектара уочава се сличност у структури две наведене супстанце (Табела 3.7; Слика 3.20). Једина разлика је присуство структурно другачијег бочног ланца на позицији C-8 код супстанце 7. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 131 Табела 3.7 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 7 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) Слика 3.20 1H-NMR спектар супстанце 7 (CDCl3, 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 45,2 Η-1 3,44 q 1 C-2 CH2 37,8 Η-2a 2,47 ddd (J=14,3; 10,2; 6,5) 2 H-2b 1,61 ddd (J=14,3; 9,2; 3,4) C-3 CH 77,2 H-3 4,14 dd (J=6,5; 3,4) 1 C-4 C 84,3 - - - - C-5 CH 56,0 H-5 2,28 t (J=9,4) 1 C-6 CH 77,9 H-6 4,64 dd (J=11,4; 9,4) 1 C-7 CH 47,1 H-7 3,10 ttt (J=10,8; 9,4; 3,3) 1 C-8 CH 75,9 H-8 5,18 dd (5,3; 3,3) 1 C-9 CH2 36,6 H-9a 2,70 dd (J=15,0; 4,8) 2 H-9b 2,40 dd (J=15,0; 3,5) C-10 C 141,8 - - - - C-11 C 136,8 - - - - C-12 C=O 166,2 - - - - C-13 CH2 122,9 H-13a 6,22 d (J=3,5) 2 H-13b 5,60 d (J=3,3) C-14 CH2 118,1 H-14a 5,15 brs 2 H-14b 5,03 brs C-15 CH2 63,4 H-15a,b 3,99 brs 1 C-16 C=O 173,1 - - - - C-17 C 74,8 - - - - C-18 CH2 51,2 H-18a 3,86 d (J=11,3) 2 H-18a 3,63 d (J=11,3) C-19 CH3 23,5 CH3-19 1,55 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 132 Уместо епоксидног прстена који се налази у бочном ланцу бабилина Б, присуство два дублета на δH 3,86 и δH 3,63 (H-18a,b) и једног оштарог синглета на δH 1,53 (CH3-19) са хемијским померањима угљеникових атоми на δH 51,2 (C-18) и δH 23,5 (C-19) добијених са 13C-NMR спектра (Слика 3.21), указују на присуство 2-хлорметил-2-хидрокси пропионата као бочног низа на C-8, који је такође идентификован код хлорохисопифолина С (стр.112). O HO H H O O OH O Cl HO HO O O H13b H13a H2a H1 H2b HO H6 H9b H8 H9a H14a H14b H5 H7 H3 HO HO O O CH3 OH Cl Слика 3.21 1H-1H COSY, NOESY и 13C-NMR спектри супстанце 7 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Шематски приказ 1H-1H COSY корелација (плава болд линија); Конформација супстанце 7 на основу 1H-NMR и 1H 1H-NMR и NOESY спектра РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 133 Што се тиче супституције на позицији C-4, присуство широког синглета на δH 3,99, триплета на δH 2.38 (J=9,5 Hz; H-5), као и двоструког дублета на δ 4,14 (J=3,5; 6,2 Hz; H-3) указују на присуство једне метил хидроксилне и једне хидроксилне групе (диол) на C-4 као код бабилина Б (стр. 128) (Öküz and Topcu, 1994). Такође, на основу 13C-NMR спектра хемијска померања за: C-4 на δC 84,3 и C-15 на δC 63,4 потврђују ову чињеницу. Структура основног скелета гвајанолида 7 потврђена је помоћу COSY спектра (Слика 3.21): Спин систем A: H-7/H-13a,b Спин систем Б: H-1/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9a,b Спин систем Ц: H-1/H-2a,b/H-3. Релативна конформација свих хиралних центара супстанце 7 добијена је на основу 1H-1H NOESY спектра. nOe корелација између H-1 и H-5 потвђује cis везивање између петочланог и седмочланог прстена гвајанолида trans- диаксијална орјентација протона C-5 (α), C-6 (β) и C-7 (α) добијена је на основу nOe крос пикова између H-5 и H-7, као и H-6 са H-8. nOe корелација између H-8 са H-6 и H-9b потврђује α-оријентацију естарског бочног ланца на положају C-8, док nOe крос-пик између H-7 и H-3 потврђују β-позицију хидроксилне групе на C-3. Одсуство nOe крос-пика између метиленеских протона на C-15 и H-5, указује на могућу β-орјентацији метил хидроксилне групе на положају C-4 (Слика 3.21). Релативна стереохемија C-18 (бочног низа), потврђена је на основу хемијских померања протона: H-13a,b; (δH 6,22 и δH 5,60); H-14a,b (δH 5,15 и δH 5,03), као и присуства протона H-8 на δH 5,18. У случају C-18 епимера, хемијска померања H-13a,b су много ближа док су пикови H-14a,b одвојени (Öküz and Topçu, 1994, Merrill and Stevens, 1985). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 134 8. Рхапосерин До сада, супстанца је изолована из биљних врста Rhaponticum serratuloides (Berdin et al., 1999) (род Rhaponticum Hill; син. Stemmacantha Cass.). Супстанца је сада први пут изолована из врсте рода Centaurea, што је у сагласности са досада публикованим једињењима из ове биљне врсте. Супстанца је изолована у облику белих кристала и на основу спектроскопских података одређена је следећа структура прикатана на слици 3.22. O O O O OH Cl HO HO 123 4 5 6 7 8 910 11 12 16 17 18 19 15 O C O CH3 20 21 13 14 H H Слика 3.22 8. Рхапосерин Оптичка ротација хлороформског раствора овог једињења има вредност: [] 20 D + 75,0 (c=1,20; CHCl3). У IR (CaF2) спектру идентификоване су следеће функционалне групе: 3540 cm-1 (OH), 3095 cm-1, 1640 cm-1 (C=CH2), 1765 cm-1 (γ-лактон), 1715 cm-1 (C=O), 1215 cm-1, 1140 cm-1, 1060 cm-1 (C-O). На 1H-NMR спектру супстанце 8 снимљеном у CDCl3 уочавају се следећи карактеристични пикови (Табела 3.8; Слика 3.23): два метинска протона: H-1 као двоструки триплет на δH 3,54 и H-5 као триплет на δH 2,28 (J=10,4 Hz), три оксиметинска протона H-3 као триплет на δH 3,75 (J=7,2), H-6 као двоструки дублет на δH 4,83 (J=10,4; 9,2 Hz) и H-8 као двоструки дублет на δH 5,20 (J=10,2; 5,0 Hz). У алифатичном делу спектра налазе се сигнали који одговарају протонима H-2a, H-2b на (δH 2,46 и δH 1,77) као и H-9a, H-9b на (δH 2,66 и δH 2,43). Наведени сигнали су део скелета гвајанолида. Поред наведених, на 1H-NMR спектру се уочавају егзоциклични метиленски протони H-13a и H-13b у облику два дублета на δH 6,20 (J=3,0 Hz) и δH 5,57 (J=2,8 Hz) као РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 135 и протон H-7 у облику триплета на δH 3,10 (J=9,2 Hz) потврђујући присуство α-метилен γ-лактонског прстена. Табела 3.8 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 8 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Вредности су добијене на основу HSQC и HMBC спектара. Слика 3.23 1H-NMR спектар супстанце 8 (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 45,7 Η-1 3,52 dt (J=9,2; 7,2) 1 C-2 CH2 37,0 Η-2a 2,46 ddd (J=14,9; 9,9; 6,3) 2 H-2b 1,62 dd (J=14,9; 7,2) C-3 CH 76,1 H-3 3,75 t (J=7,2) 1 C-4 C 84,0 - - - - C-5 CH 56,5 H-5 2,28 t (J=10,4) 1 C-6 CH 76,4 H-6 4,83 dd (J=10,4; 9,2) 1 C-7 CH 46,3 H-7 3,10 t (J=9,2) 1 C-8 CH 75,7 H-8 5,20 dd (J=10,2; 5,0) 1 C-9 CH2 35,0 H-9a 2,67 dt (J=15,4; 5.0) 2 H-9b 2,43 dd (J=15,4; 3,5) C-10 C 141,6 - - - - C-11 C 137,0 - - - - C-12 C=O 168,2 - - - - C-13 CH2 122,5 H-13a 6,20 d (J=3,0) 2 H-13b 5,57 d (J=2,8) C-14 CH2 118,0 H-14a 5,17 brs 2 H-14b 5,09 brs C-15 CH2 66,0 H-15a 4,98 d (J=12,6) 2 H-15b 4,20 d (J=12,6) C-16 C=O 172,6 - - - - C-17 C 74,2 - - - - C-18 CH2 51,5 H-18a 3,85 d (J=11,8) 2 H-18a 3,61 d (J=11,8) C-19 CH3 23,1 CH3-19 1,54 s 3 C-20 OCO(CH3) 172,2 - - - - C-21 OCO(CH3) 20,9 CH3-21 2,16 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 136 Основна структура представљеног гвајанолида је потврђена помоћу COSY спектра, односно следећих корелација које се на спектру запажају: H- 13/H-7; H-7/H-6; H-6/H-5; H-5/H-1; H-1/H-2a/H2b; H-2a/H2b/H-3; H-7/H-8; и H- 8/H-9a/H-9b (Слика 3.24). На 1H-NMR спектру се такође уочавају сигнали за метил групе. Један од синглета се налази на δH 1,54 који са два дублета на δH 3,85 и 3,61 (J=11,8 Hz) указује на присуство метиленхлорида у бочном ланцу естарски везаном за положај C-8 (Слика 3.23). Други сигнал карактеристичан за метил групу уочава се у облику оштрог синглета на δH 2,16. Наведено хемијско померање је карактеристично за метилацетокси групу, везану за угљеников атом C-15 (HMBC спектар, Слика 3.24). Геминални протони H-15a,b уочавају се у облику два дублета на δH 5,02 и δH 4,20 а њихово померање ка вишим вредностима поља у односу на померања које се запажају када је присутна хидроксилна група на истој положају (супстанца 6 на позицији δH 3,95; стр. 128) се објашњава електрофилним каректером ацетокси групе. Два типична дублета на δH 5,17 и δH 5,09 су карактеристична за егзоцикличне протоне двоструке везе H-14a,b. На основу HSQC спектра одређена су померања угљеникових атома централног скелета гвајанолида (Слика 3.24): три метинска угљеникова атома: два одговарају суседним атомима угљеника C-1 и C-5 (δC 45,7; δ 56,6), а један угљенику C-7 α-метилен γ-лактонског прстена који се уочава на δC 46,3. Три оксиметинска угљеника C-3 петочланог прстена на δC 76,1; C-6 α-метилен γ- лактонског прстена на δC 76,4 и естерификовани C-8 на δC 75,7. Два алифатична метиленска угљеника: C-2 и C-9 на δC 37,0 и δC 35,0. У олефинском делу спектра два пика који одговарају егзоцикличним метиленским угљениковим атомима C- 13 и C-14 на δC 122,5 и δC 118,0. Угљеников атом бочног низа који одговара хлорованом метиленском угљенику C-18 налази се на δC 51,5, као и C-19 метил група на δC 23,1. Како је за C-15 угљеников атом везана ацетокси група наведени угљеников атом налази се на δC 66,0, док се метил угљеников атом ацетокси групе (C-21) уочава на δC 20,9. На основу HMBC спектра потврђено је позиција ацетокси групе, с обзиром да се уочава укрштање пикова између H-15a,b/C-20 (OCO(CH3)) и CH3- 21/C-20. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 137 O O O O OH Cl HO HO O C O CH3 H H Слика 3.24 HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, 13C-NMR спектри супстанце 8 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Укрштања на HMBC спектру (представљено црвеним стрелицама од 1H према13C) и 1H-1H COSY корелација (плава болд линија) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 138 Помоћу HMBC и 13C-NMR спектара идентификовани су кватернерни угљеникови атоми молекула:  C-4 помоћу унакрсног пика између H-15, H-5/C-4,  C-11 помоћу корелације између H-13, H-7/C-11,  C-17 бочног ланца помоћу укрштања пикова између CH3-19/C-17,  C-10 корелација између H-2/C-10, као и карбонилне групе α-метилен γ-лактонског прстена (C-12 на δC 168,2) и бочног ланца (C-16 на δC 172,6) (Слика 3.24). Релативна стереохемија супстанце 8 добијена је упоређивањем константи спрезања добијеног за сваки протон са вредностима публикованим у литертури за сличне гвајанолиде (Berdin et al., 1999). Константа спрезања од J5,6=10,4 и J6,7=9,5 потврђује присуство trans α-метилен γ-лактонског прстена. Констана купловања од J7,8=10,2 одговара β-оријентацији H-8. У сагласности са 13C-NMR публикованим подацима, конфигурација асиметричног центра C-17 угљениковог атома бочног ланца је идентична бочном ланцу код центаурепенсина и акроптилина (Merrill and Stevens 1985), чија је структура претходно одређена помоћу кристалографске методе X-зрачења (Stevens and Wong 1982). На основу представљених спектралних података тачна конфигурација 4,15-O-ацетокси групе није могла бити одређена. Међутим, посматрајући претходно изоловане и описане гвајанолиде код којих је C-4 хидроксилна група α оријентисана и с обзиром на то да је утврђено да сви слични гвајанолиди изоловани из рода Centaurea садрже α-орјентисану C-4 функционалну групу са кисеоником (Stevens and Wong, 1986), закључено је да у сагласности са биосинтетичким путем биљке, и на основу горе наведених литеретурних података, супстанца 8 садржи α-орјентисану хидроксилну групу на положају C-4 (Слика 3.24). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 139 9. 2α,8α-Дихидрокси дехидрокостунолид; 3α8α-дихидрокси-1αH,5αH,6βH,7αH-гвајан-4(15),10(14),11(13)- триен-6,12-олид Супстанца 9 је нови природни производ, изолована је у облику жутог уља и одређена је следећа структура приказана на слици 3.25. O O OH HO H H 12 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 Слика 3.25 9. 2α,8α-Дихидрокси дехидрокостунолид Супстанца је претходно идентификована као синтетички дериват саурина (Kushnir & Kuzovkov, 1968), али до сада никада није изолована из природног ресурса. Вредност оптичке ротације хлороформског растора супстанце 9 је: [] 20 D + 55,56 (c=0,54; CHCl3,). На масеном спектру супстанце 9 уочава се јон пик на m/z 263,1275 (израчунато 263,1283 за [M+H]+), што одговара молекулској формули C15H18O4 (Слика 3.26). Слика 3.26 Масени спектар супстанце 9 {EIMS (проба) 120 eV, m/z (рел. итезитет.) 547,2297 [2M+Na]+ (49,98), 525,2477 [2M+H]+ (62,17), 280,154 [M+NH4]+ (52,84), 263,1275 [M+H]+ (100), 245,117 [(M+H)-H2O]+(27,93)} РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 140 На IR (CaF2) спектру уочава се широк пик карактеристичан за хидроксилну групу на (3600 cm-1), γ-лактон (1700-1 cm-1) и метиленску групу (1665-1 cm-1). 1 и 2D-NMR подаци указују да супстанца 9 припада групи 2-хидрокси гвајанолида (Табела 3.9; Слика 3.27; 3.28). Табела 3.9 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 9 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) # Иако су пикови делимично преклопљени J је јасно одређен на основу 1H-NMR спектра. * Вредности су утврђене на основу HSQC и HMBC података. ‡ Нејасно уочљива вредност спрезања. Слика 3.27 1H-NMR спектар супстанце 9 (CDCl3, 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 57,5 Η-1 2,80 dd (J=9,6; 7,8)# 1 C-2 CH 71,5 H-2 3,94 ddd (J=7,8; 5,6; 3,5) 1 C-3 CH2 41,5 H-3ª 2,60 dd (J=14,2; 5,6) 2 H-3b 2,32 dd (J=14,2; 3,5) C-4 C 141,1 - - - - C-5 CH 50,9 H-5 2,99 dd (J=10,4; 9,6) 1 C-6 CH 78,6 H-6 3,98 dd (J=10,4; 9,0) 1 C-7 CH 50,3 H-7 2,78 dddd (J=9,0; 8,2; 3,2; 2,8)# 1 C-8 CH 73,2 H-8 4,15 ddd (J=8,2;‡;3,3) 1 C-9 CH2 41,1 H-9a 2,85 qd (J=14.0, 3.3) 1 H-9b 2,39 qt (J=14.0, 5.6) 1 C-10 C 145,8 - - - - C-11 C 137,3 - - - - C-12 C=O 169,2 - - - - C-13 CH2 123,4 H-13a 6,28 dd (J=3.2, 0.7) 2 H-13b 6,14 dd (J=2.8, 0.7) C-14 CH2 118,8 H-14a 5,08 d (J=1.4) 2 H-14b 5,06 d (J=1.4) C-15 CH2 112,8 H-15a 5,37 d (J=2.2) 2 H-15b 5.12 d (J=2.2) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 141 На основу 13C NMR и DEPT/13C NMR спектралних података супстанце 9 закључује се да супстанца садржи једну карбонилну групу; шест олефинских угљеникових атома и пет алифатичних угљеникових атома. Расподела протонских и угљеникових сигнала омогућила нам је да закључимо да супстанца 9 саржи пет кватернерних угљеникових атома, три sp2 олефинска угљеникова атома, три оксиметинска угљеника, три алифатичне метинске групе и две алифатичне метиленске групе (Слика 3.28). На основу 1H-NMR спектра било је евидентно одсуство сигнала бочног ланца. Помоћу 1H-1H COSY спектра утврђени су пикови протона који чине α- метилен γ-лактонски прстен: два двострука дублета на δH 6,28 (J=3,2; 0,7 Hz) и δH 6,14 (J=2,8; 0,7 Hz) карактеристични за егзоцикличне протоне лактонског прстена. H-13a,b су у корелацији са дублет дублет дублет дублетом на δH 2,78 (J=9,0; 8,2; 3,2; 2,8) карактеристичан за протон H-7. Даље, корелација наведеног сигнала H-7 са двоструким дублетом на δH 3,98 (J=10,4; 9,0 Hz) као и квартетом на δH 4,15 (J=8,2 Hz), омогућила је идентификацију оксиметинских протона H-6 и H-8 (Слика 3.27; 3.28). Одсуство сигнала који одговарају бочном ланцу у молекулу као и померање два наведена сигнала оксиметинских протона (H-6, H-8) ка нижим хемијским померањима (више вредности поља) у односу на претходно описане гвајанолиде, наводе да се код супстанце 9 на положају C-8 налази слободна -OH група. На основу 1H-1H COSY спектра, утврђени су положаји и осталих протона у молекулу. Сигнал протона H-6 је у корелацији са дублет дублетом δH 2,99 (J=10,4; 9,6 Hz) који одговара протону H-5, а који је у корелацији са двоструким дублетом на δH 2,80 (J=9,6; 7,8 Hz), сигналом карактеристичним за протон H-1. Сигнал карактеристичан за протон H-1 је у корелацији са троструким дублетом на δH 3,94 (J=7,8; 5,6; 3,5 Hz) који одговара протону H-2. Померање сигнала протона H-2 ка вишим хемијским померањима указује на присуство хидроксилне групе на позицији C-2. Јасна корелација између сигнала протона H-2 са дублет дублет дублетом дублетом на δH 2,60 (J=14,2; 5,6; 3,5 Hz) и дублет дублетом на δH 2,32 (J=14,5; 3,5), који су међусобно у корелацији указује на присуство метиленске групе на позицији C-3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 142 O O OH HO H H O O H13b H13a OH H1 H2a H3a H6 H9a H8 H9b H14a H14b H5 OH H7 H3b H15a H15b Слика 3.28 HSQC, HMBC, 13C-NMR/DEPT, 1H-1H COSY и NOESY спектри супстанце 9 (CDCl3, 400,0; 50,3 MHz); Корелације добијене на основу HMBC спектра (означене црвеним стрелицама 13C to 1H) и 1H-1H COSY корелација (плава болд линија); Предложена конформација 9 добијена на основу 1H-NMR и 1H-1H NOESY спектара. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 143 Са друге стране, сигнал протона H-8 је у корелацији са геминалним протонима (H-9a,b), који се уочавају као квартет дублета на δH 2,85 (J=14,0; 3,3 Hz) и квартет триплета на δH 2,39 (J=14,0; 5,6 Hz). Потврда основне конфигурације гвајанолида добијена је на основу HSQC и HMBC спектралних података (Слика 3.28). HSQC спектар супстанце 9 омогућио је евиденцију:  Три метинска угљеника C-1, C-5 и C-7 (δC 57,5; δC 50,9; δC 50,3),  Tри оксиметинска угљеника C-6, C-8 и C-2 (δC 78,3; δC 73,2 и δC 71,5),  Два алифатична метиленска угљеника C-3 и C-9 (δC 41,5 и δC 41,1),  Три sp2 метиленска угљеника C-13, C-14 и C-15 (δC 123,4, δC 118,8 и δC 112,8). Хетеронуклерана вишеструка кохеренција 1H-13C (HMBC) омогућила је одређивање положаја кватернерних угљеникових атома:  C-12 (δC 169,2) на основу укрштања H-13a,b/C-12,  C-11 (δC 137,3) на основу укрштања H-13a, H-6/C-11,  C-4 (δC 141,1) на основу корелације H-3/C-4. С обзиром на то да на HMBC спектру није уочено укрштање које би дало вредност кватернерног угљениковог атома на положају C-10, хемијско померање сигнала од δ 145,8 утврђено је на основу 13C NMR спектра. Релативна стереохемија супстанце 9 добијена је на основу хомонуклераног 1H-1H NOESY спектра, као и поређењем хемијских померања и константи спрезања сигнала вициналних протона и угљеника са вредностима публикованим до сада (Bohlman and Gupta, 1982; Daniewski and Nowak, 1993, Stevens and Wong, 1986). Корелација nOe између H-8, H-6 и H-2 са H-3a и H-9a указује да три наведена протона имају исту оријентацију. Такође, одсуство nOe корелације између H-6 и H-7, H-5, као и вредности констани спрезања J5,6=10,4 Hz и J6,7=9,0 Hz потврђују trans-диаксијалну расподелу протона лактонског прстена C-5 (α), C-6 (β) и C-7 (α). На основу наведеног закључује се да су H-8 и H-2 β- оријенстисани. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 144 Доле наведени литературни подаци омогућили су утврђивање β- оријентације протона H-8:  Велика спин-спин константа спрезања између H-7 и H-8 од 8,2 Hz указује на њихов trans-положај. Важно је напоменути да код 2-хидрокси гвајанолида, константа спрезања између H-7 и H-8 је обично око 2,0 Hz у случају cis- орјентације (Bohlman & Gupta, 1982c).  Сваки од H-13 протона уочава се у облику двоструких дублета што се објашњава одговарајућим експерименталним спин утицајима и резултат је геминалног купловања H-13a,b протона, као и алилног купловања између H- 13a,b и 8β-H; поред тога H-13b сигнал је померен ка вишим вредностима, што је директан утицај 8α-OH групе (Yoshioka & Mabry, 1971), док H-6 није под овим утицајем. У случају 8β-OH, сигнал H-6 је померен ка вишим хемијским померањима (нижим вредностима поља) због утицаја 8β- хидроксилне групе, док се код сигнала H-13b не уочавају промене пошто није под утицајем хидроксилне групе (Bohlman & Gupta, 1982). Анализа X-зрацима неких 2-хидрокси гвајанолида претходно изолованих из врста рода Centaurea потврђује да се седмочлани прстен налази у облику twist chair конформације, док је петочлани прстен у суштини планаран. Како је петочлани прстен у равни, константа купловања између trans-оријентисаних протона H-1 и H-2 није исувише велика, већ око 6-9 Hz (Stevens and Wong, 1986). У сагласности са овим податком добијена константа спрезања J1,2=7,8 Hz потврђује trans-расподелу H-1 и H-2 (Слика 3.28). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 145 10. Хлорорепдиолид До сада, супстанца је изолована из две врсте рода Centaurea: C. repens L. (Stevens and Wong, 1986); C. bella Trautv. (Nowak et al., 1989; Nowak et al., 1993), као и из биљке Leuzea carthamoides (Nowak et al., 1988). Супстанца је изолована у облику светло-жутих кристала и спектроскопском анализом је одређена следећа структура приказана на слици 3.29. O HO H H O O 18 O 12 3 4 5 6 7 8 910 14 13 11 12 16 17 19 Cl OH 15 HO Слика 3.29 10. Хлорорепдиолид Оптичка ротација супстанце 10 у хлорофорском раствору је: [] 20 D + 85,00 (c=1,00; CHCl3). На 1H-NMR спектру супстанце 10 уочавају се сигнали карактеристични за гвајанолидни тип скелета (Табела 3.10; Слика 3.30):  Два алифатична метин протона: H-1 у облику триплета на δH 3,23 (J=7,5 Hz) и H-5 у облику двоструког дублета на δH 2,55 (J=10,8 Hz), (COSY корелација, Слика 3.31).  Два карактеристична оксиметинска протона: H-6 у облику двоструког дублета на δH 4,66 (J=10,8; 9,8 Hz), и H-8 као триплет на δH 5,03 (J=9,2; 4,3 Hz), значајно померен ка вишим вредносима хемијских померања услед присуства бочног ланца. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 146 Табела 3.10 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 10 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) Слика 3.30 1H-NMR спектар супстанце 10 (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 55,3 Η-1 3,23 t (J=7,5) 1 C-2 CH 82,5 Η-2,3 4,03 d (J=7,5) 1 C-3 CH 81,0 C-4 C 82,3 - - - - C-5 CH 56,7 H-5 2,55 t (J=10,8) 1 C-6 CH 76,7 H-6 4,66 dd (J=10,8; 9,4) 1 C-7 CH 47,2 H-7 3,08 t (J=9,4) 1 C-8 CH 73,7 H-8 5,03 tt (J=9,4; 4,3) 1 C-9 CH2 37,8 H-9a 2,60 dd (J=14,8; 4,3) 1 H-9b 2,35 dd (J=14,8; 2,8) 1 C-10 C 139,6 - - - - C-11 C 136,5 - - - - C-12 C=O 169,3 - - - - C-13 CH2 123,4 H-13a 6,17 d (J=3,3) 2 H-13b 5,61 d (J=2,8) C-14 CH2 118,9 H-14a 5,20 brs 2 H-14b 4,96 brs C-15 CH2 47,8 H-15a 4,11 d (J=12,0) 2 H-15b 3,83 d (J=12,0) C-16 C=O 166,5 - - - - C-17 C 135,9 - - - - C-18 CH2 126,9 H-18a 6,15 brs 2 H-18a 5,65 brs C-19 CH3 18,3 CH3-19 1,96 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 147 Такође, на 1H-NMR спектру уочавају се два широка синглета у олефинском делу спектра на δH 5,17 и δH 5,09 карактеристичних за геминалне егзометиленске протоне H-14a и H-14b на позицији C-10 основног скелета молекула; два дублета на δH 4,11 и δH 3,83 (J=12,0 Hz), одговарају геминалним протонима H-15a и H-15b карактеристичним за 4,15-епихлорхидрин групу (Stevens and Wong, 1986); два широка синглета на δH 6,15 и δH 5,65 (H-18a и H- 18b), и један оштар синглет на δH 1,96 (CH3-19; интеграцијом даје три протона) који указују на присуство метиларилатне групе као бочног ланца на позицији C-8. На 13C-NMR спектру, сигнал на δC 47,8 (C-15) потврђује присуство епихлорхидрина (хлорметиленске групе) на позицији C-4. У случају метил хидроксилне групе, C-15 се налази на око δC 62,0 ppm (погледај Бабилин Б, стр. 128). Карактеристични пикови за α-метилен γ-лактонски прстен су:  Егзоциклични метиленски протони H-13a и H-13b, који се јављају као два дублета на δH 6,17 (J=3,3 Hz) и δH 5,61 (J=2,8 Hz).  H-7 као триплет на δH 3,08 (J=9,4 Hz). Вредност констане спрезања указује на trans-диаксијалани положај H-7 у односу на H-6 и H-8. Основна разлика представљеног гвајанолида и претходно описаних је у томе што:  у алифатичном делу спектра запажају се два геминална протона H-9a и H-9b, који се у облику два двострука дублета јављају на δH 2,60 (J=14,8; 4,5 Hz) и δH 2,35 (J=14,8; 2.8 Hz),  два метинска протона H-2 и H-3, која се налазе заједно у облику дублета на δH 4,03 (J=7,5), померени су ка нижим вредностима хемијских померања с обзиром на то да угљеникови атоми на којим се налазе садрже још и хидроксилну групу. Као што је приказано на слици 3.31, HMBC спектар даје евиденцију о хемијским померањима следећих сигнала угљеникових атома: РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 148  Укрштање H-2, H-3 са угљениковим атомима на δC 56,7 (C-5), δC 82,5 (C-3) и δC 81,0 (C-2) потврђује присуство хидроксилних грипа на C-2 и C-3 (Stevens and Wong, 1986).  Корелација CH3-19 са угљениковим атомима на δC 166,5 (C-16), δC 135,9 (C-17) и δC 126,9 (C-18), потврђује присуство двоструке везе у бочном ланцу (Stevens and Wong, 1986).  Корелација H-15a и H-15b са угљеником на δC 82,3 (C-4). O HO H H O O O Cl OH HO Слика 3.31 COSYи HMBC спектар супстанце 10 (CDCl3; 400,0 MHz); Корелације добијене помоћу HMBC спектра (означене црвеним стрелицама од 1H ка13C) и 1H-1H COSY корелације (плава и зелена болд линија) Релативна стереохемија супстанце 10 добијена је упоређивањем вредности константи спрезања вициналних протона као и хемијским померањима угљеника са вредностима добијеним за претходно описане сличне гвајанолиде чија је структура испитана анализом X-зрака (Stevens and Wong, 1986). Такође, и биосинтетички пут указује да вициналне хидроксилне групе на позицијама C-2 и C-3 су trans-оријентисане, као и код свих претходних 2 хидрокси гвајанолида, изолованих из рода Centaurea (Stevens and Wong, 1986). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 149 11. Панонин; [2α3β4α-трихидрокси-4β-(ацетоксиметил)-8α(4-метакрилат)-1αH,5αH,6βH,7αH- гвајан-10(14),11(13)-диен-6,12-олид] Супстанца 11 је нови природни производ описан први пут. Супстанца је изолована у облику жуто-црвеног уља и одређена јој је следећа структура приказана на слици 3.32. O O HO HO HO O O H H 1 5 2 3 4 6 7 8 910 14 16 17 18 19 O C O CH3 11 12 13 20 21 Слика 3.32 11. Панонин Оптичка ротација хлороформског раствора супстанце је: [] 20 D + 17.20 (c=1,05; CHCl3,). На масеном спектару супстанце 11 уочава се јон пик на m/z 440,1916 [M+NH4]+ (израчунато: 440,1920 за [M+NH4]+), што одговара молекулској формули супстанце C21H26O9 (Слика 3.33). Слика 3.33 Масени спектар супстанце 11; {EIMS (проба) 120 eV, m/z (рел. интезитет) 867,3046 [2M+Na]+ (12,59), 440,1916 [M+NH4]+ (100), 423,1648 [M+H]+ (39,18), 405,1541 [(M+H)-H2O]+(16,32)} РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 150 1H-NMR спектроскопски подаци супстанце 11 приближно су исти онима описаним за хлорорепдиолид (стр. 146), са изузетком сигнала на позицији C-15 (Табела 3.11; Слика 3.34). Табела 3.11 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 11 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Вредности су добијене на основу HSQC и HMBC података. Заправо, на 1H-NMR спектару супстанце 11 уочавају се два дублета на вишим хемијским померањима δH 4,74 and 4,22 (Jgem=12,4 Hz) карактеристична за AB система и један оштар синглет на δH 2,14 који интеграцијом даје три протона. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 55,1 Η-1 3,17 dd (J=10,8; 6,2) 1 C-2 CH 79,8 Η-2 4,04 dd (J=6,4; 4,6) 1 C-3 CH 81,3 H-3 3,80 brd (J=4,6) 1 C-4 C 82,0 - - - - C-5 CH 56,5 H-5 2,58 t (J=10,8) 1 C-6 CH 75,9 H-6 4,59 dd (J=10,8; 9,6) 1 C-7 CH 47,8 H-7 3,10 ddt (J=9,6; 3,5; 3,3) 1 C-8 CH 72,9 H-8 5,05 dd (J=9,6; 4,7) 1 C-9 CH2 38,9 H-9a 2,67 dd (J=14,0; 4,7) 1 H-9a 2,36 dd (J=14,0; 4.7) 1 C-10 C 139,6 - - - - C-11 C 136,5 - - - - C-12 C=O 168,5 - - - - C-13 CH2 123,0 H-13a 6,20 d (J=3,5) 2 H-13b 5,62 d (J=3,3) C-14 CH2 118,0 H-14a 5,22 brs 2 H-14b 5,02 brs C-15 CH2 64,7 H-15a 4,74 d (J=12,4) 2 H-15b 4,22 d (J=12,4) C-16 C=O 166,2 - - - - C-17 C 135,8 - - - - C-18 CH2 126,9 H-18a 6,17 brs 2 H-18a 5,66 brs C-19 CH3 18,0 CH3-19 1,97 s 3 C-20 CH3COO 172,3 - - - - C-21 CH3COO 21,3 CH3-20 2,14 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 151 Слика 3.34 1H-NMR спектар супстанце 11 (CDCl3; 400,0 MHz) COSY корелација између H-7/H-13a,b; H-1/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9 и H-1/H- 2/H-3 указује на основну структуру гвајанолида (Слика 3.35). У складу са 1H-NMR подацима, 13C-NMR спектроскопски подаци супстанце 11, који су сортирани уз помоћ HSQC спектра, указују да молекул садржи четири угљеника са кисеоничном функцијом на δC 81,3 (C-3), 79,8 (C-2), 75,2 (C-6), 72,9 (C-8), три егзоцикличне двоструке везе на δC 123,0 (C-13), 136,5 (C-11), 118,0 (C-14), 139,6 (C-10), 126,9 (C-18), 135,8 (C-17), два метил угљеника атома на δC 18,0 (C-19) и 21,3 (CH3COO-). Остали сигнали угљеникових атома који се уочавају на 13C NMR спектру су: два метиленска угљеника, један од њих са кисеоничном групом, два метинска угљеника, један засићени кватернерни угљеников атом и две кето групе. Даља карактеризација структуре супстанце утврђена је помоћу HMBC спектра. Снажна и чиста корелација између два дублета на δH 4,74 и 4,22 (H-15a,b), као и синглета на δH 2,14 (CH3- 21) са карбоксилном групом на δC 172,3 (C-20) потврђују присуство ацетокси групе на позицији C-15. Кључне HMBC корелације: H-13a,b/ C-12 (δC 168,5); H- 18, CH3-19/ C-16 (δC 166,2); H-13a/ C-11 (δC 137,3); H-1, H-9b/ C-10 (δC 137,3); H- 15b/ C-4 (δC 82,0) омогућиле су утврђивање свих кватернерних угљеникових атома у молекулу (Слика 3.35). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 152 O O HO HO HO O O O C O CH3 O O H13b H13a OH H1 H2a HO H6 H9a H8 H9b H14a H14b H5 O O H7 H3 17 HO O C CH3 O H18a H18b Слика 3.35 HSQC, HMBC,13C-NMR, 1H-1H COSY и NOESY спектри супстанце 11 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Корелације са HMBC спектра (црвене стрелице од 1H ка 13C) и 1H-1H COSY корелација (плава линија); Предложена конформација 11 добијена на основу 1H-NMR и 1H-1H NOESY спектара РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 153 Релативна конфигурација супстанце 11 добијена је на основу NOESY NMR експеримента. Добијена nOe корелација H-8/H-6/H-2 са H-9a указује на њихову идентичну конфигурацију. Хемијска померања и константе спрезања ових протонских сигнала потпуно су у сагласности са оним описаним код хлорорепдиолида. У односу на најраспрострањенију α-конформацију протона H-7, велика константа купловања од J6,7=10,8 и J7,8=9,6 потврђује њихову trans орјентацију и β-конфигурацију H-6/H-8 (Слика 3.35). На основу приложеног, изводи се закључак да је H-2 такође β-оријентисан, што је у сагласности са литературним подацима и биосинтетичким путемем 2-хидрокси гвајанолида претходно изолованих из рода Centaurea (Daniewski and Nowak, 1993; Stevens and Wong, 1986). 12. Епоксирепдиолид Супстанца је претходно изолована из биљке Centaurea repens L. (Stevens, 1982). Супстанца је изолована у облику белих кристала и одређена је следећа структура приказана на слици 3.36. O HO H H O O O 123 4 5 6 7 8 910 14 13 11 12 16 17 15 HO 18 19 O Слика 3.36 12. Епоксирепдиолид Вредност оптичке ротације супстанце је: [] 20 D + 115,00 (c=1,10; CHCl3). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 154 1H-NMR спектар супстанце 12 је сличан спектру хлорорепдиолида (стр. 146), изузев сигнала метиленске групе на δC 48,4 који се уочава на 13C-NMR спектру и два дублета на δH 3,37 (J=4,8) и δH 3,05 (J=4,8) на 1H-NMR спектру (Табела 3.12; Слика 3.37). Наведени сигнали указују на то да је присутан епоксидни прстен у молекулу који је везан за положај C-4 претходно описан код бабилина А (стр.106). Основна стуктура гвајанолида потврђена је помоћу COSY спектра (Слика 3.38). Релативна конфигурација хиралних центара супстанце 12 добијена је упоређивањем вредности констани спрезања међу вициналним протонима и хемијским померањима угљеникових атома са сличним гвајанолидима описаним у литертури (Stevens and Wong, 1986). На основу наших сазнања, ово је први пут да су објављене вредности хемијских померања угљеникових атома добијених помоћу 13C-NMR спектра. Табела 3.12 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 12 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Вредности су добијене на основу HSQC и HMBC података. * Преклопљено са сигналом H-14. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 51,5 Η-1 2,99 t (J=10,6) 1 C-2 CH 76,8 Η-2,3 4,00 t (J=7,5) 2 C-3 CH 77,3 C-4 C 65,3 - - - - C-5 CH 47,2 H-5 2,50 t (J=10,6) 1 C-6 CH 78,6 H-6 4,33 dd (J=11,0; 9,2) 1 C-7 CH 47,7 H-7 3,11 ttt (J=11,0; 9,4; 3,3) 1 C-8 CH 73,6 H-8 5,07 dd (J=9,4; 4,2)* 1 C-9 CH2 35,3 H-9a, 2,62 dd (J=15,0; 4,8) 1 H-9b 2,43 dd (J=15,0; 3,3) 1 C-10 C 138,5 - - - - C-11 C 136,3 - - - - C-12 C=O 168,9 - - - - C-13 CH2 123,3 H-13a 6,19 d (J=3,3) 2 H-13b 5,60 d (J=3,0) C-14 CH2 120,7 H-14a 5,22 brs 2 H-14b 5,05 brs C-15 CH2 48,4 H-15a 3,37 d (J=4,8) 2 H-15b 3,05 d (J=4,8) C-16 C=O 166,4 - - - - C-17 C 135,8 - - - - C-18 CH2 127,0 H-18a 6,17 brs 2 H-18a 5,68 brs C-19 CH3 18,0 CH3-19 1,96 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 155 Слика 3.37 1H-NMR спектар супстанце 12 (CDCl3; 400,0 MHz) O HO H H O O O HO O Слика 3.38 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 12 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); 1H-1H COSY корелација (плаве и зелене болд линије) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 156 13. Репдиолид До сада, супстанца је изолована из неколико врсти рода Centaurea: C. repens L., (Stevens, 1982), C. bella Trautv., (Nowak et al., 1989; Nowak et al., 1993). Такође, изолована је из рода Rhaponticum Hill: R. serratuloides (Berdin et al., 2001); R. pulchrum Fisch. et Mey. (Cis et al., 2006). Супстанца 13 изолована је у облику жутог уља и одређена јој је следећа структура приказана на слици 3.39. O HO H H O O O 123 4 5 6 7 8 910 14 13 11 12 16 17 15 HO 18 19 Слика 3.39 13. Репдиолид Вредност оптичке ротације хлороформског растовора супатанце је: [] 20 D + 86,85 (c=1,50; CHCl3). Проучавањем 1H-NMR спектроскопских података уочава се да је супстанца 13 структурно веома слична претходно описаном хлорорепдиолиду (стр.146). Једина разлика уочава се у положају геминалних протона на позицији C-15 (Табела 3.13; Слике 3.40 – 3.41). Заправо, на основу 1H-/ 13C-NMR и HSQC спектара супстанце 13 запажа се да поред карактеристичних сигнала гвајанског скелета постоје сигнали који одговарају присуству четири егзометиленске двоструке везе у молекулу (Слика 3.41):  Карактеристични егзоциклични метиленски протони коњуговани са γ- лактонским прстеном, H-13a,b који се уочавају у облику два дублета на δH 6,20 (J=3,2 Hz) и δH 5,59 (J=3,4 Hz), и чији се угљеников атом налази на δC 122,6 (C-13) на основу HSQC спектра. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 157  Егзоциклични метиленски протони H-14a,b карактристични за гвајански седмочлани прстен налазе се у облику два широка дублета на δH 5,18 и δH 4,99, чији се угљеников атом налази на δC 120,3 (C-14).  Коњуговани егзометиленски протони бочног низа са карбонилном групом уочавају се у облику два широка дублета на δH 6,17 и δH 5,67 (H-18a,b), и њихов угљеников атом налази се на δC 126,7 (C-18).  Поред наведених на спектру уочавају се два триплета на δH 5,62 и δH 5,37 (J=2,4 Hz) који указују на присуство егзометиленских протона H-15a,b на положају C-4 гвајанског петочланог прстена. Мала константа купловања триплета јавља се услед алилног утицаја протона H-3 на сваки од геминалних протона H-15a,b. Корелација између H-15a,b са угљеником на δC 114,0 (C-15) на основу HSQC спектра, као и присуство још једног сигнала угљеника у незасићеном делу 13C-NMR спектра на δC 147,2, непобитно доказују присуство двоструке везе на C-4/C-15 (Слика 3.41). Помоћу COSY спектра потврђена je основна структура молекула. Релативна стерохемија супстанце 13 објашњена је на основу упоређивања добијених вредности константи спрезања са оним, објављеним за сличне гвајанолиде (Stevens and Wong, 1986). Претпостављајући да је H-7 α-оријенстисан, што је случај код свих гвајанолида описаних до сада а изолованих из рода Centaurea, узимајући у обзир вредности констане спрезања између H-5/H-6 и H-6/H-7 (око 9-11 Hz), потврђује се њихова trans стереохемија при чему је протон H-6 β-оријентисан. Такође, вредност констане спрезања J7,8=9.6 указује на β-оријентацију H-8, што је у доброј сагласности са литературним подацима (Bruno et al., 2005). Константа спрезања (J1,5=10,3 Hz) између H-1/H-5 потврђује cis-везивање два гвајанска прстена. У сагласности са литературним подацима (Stevens and Wong, 1986), оба протона H-1 и H-5 су α-оријентисани. Константа спрезања (J1,2=10,5 Hz) између H-1/H-2 потврђује њихов trans положај као и то да хидроксилна група на позицији C-2 има α- оријентацију. Са друге стране, константа спрезања између H-2 и H-3 (J2,3=8,3 Hz) потврђује β –оријентацију OH групе на C-3, што је у доброј сагласности са литературним подацима (Stevens and Wong, 1986). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 158 Табела 3.13 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 13 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) Слика 3.40 1H-NMR спектар супстанце 13 (CDCl3; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 51,3 Η-1 2,77 t (J=10,3) 1 C-2 CH 77,2 Η-2 3,78 dd (J=10,3; 8,3) 1 C-3 CH 78,1 H-3 4,29 tt (J=8,3; 2,4) 1 C-4 C 147,2 - - - - C-5 CH 47,8 H-5 2,97 t (J=10,3) 1 C-6 CH 78,9 H-6 4,20 dd (J=10,6; 9,2) 1 C-7 CH 46,5 H-7 3,17 ttt (J=10,6; 9,3; 3,3) 1 C-8 CH 73,4 H-8 5,09 tt (J=9,3, 3,0) 1 C-9 CH2 35,3 H-9a,b 2,47 m 2 C-10 C 139,3 - - - - C-11 C 137,0 - - - - C-12 C=O 168,8 - - - - C-13 CH2 122,6 H-13a 6,20 d (J=3,4) 2 H-13b 5,59 d (J=3,2) C-14 CH2 120,3 H-14a 5,18 brs 2 H-14b 4,99 brs C-15 CH2 114,0 H-15a 5,62 t (J=2,2) 2 H-15b 5,37 t (J=2,2) C-16 C=O 166,5 - - - - C-17 C 135,9 - - - - C-18 CH2 126,7 H-18a 6,17 brs 2 H-18a 5,67 brs C-19 CH3 18,0 CH3-19 1,96 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 159 O HO O O O HO Слика3.41 HSQC, COSY и 13C-NMR спектри супстанце 13 (CDCl3; 400,0; 50,3MHz); 1H-1H COSY корелација (плаве и зелене болд линије) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 160 14. 2α-Хидрокси 8-дехидрокси-15-Ο-метакрилат салонитенолид Супстанца 14 изолована је у облику жутог аморфног праха и одређена јој је следећа хемијска структура приказана на слици 3.42. O O HO O O 11 13 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 1617 18 19 14 Слика 3.42 14. 2α-Хидрокси 8-дехидрокси 15-Ο-метакрилат салонитенолид Супстнаца 14 је нови природни производ. Оптичка ротација хлороформског раствора супстанце је: [] 20 D + 15,71 (c=0,70; CHCl3). На масеном спектру супстанце 14 уочава се јон пик на m/z 350,1961 [M+NH4]+ (израчунато 350,1967 за [M+NH4]+), што одговара молекулској формули супстанце C19H24O5 (Слика 3.43). Слика 3.43 Масени спектар супстанце 14 {EIMS (проба) 120 eV, m/z (рел. интез.) 687,3137 [2M+Na]+ (24,33), 355,1513[M+Na]+ (6,58), 350,1961 [M+ NH4]+ (100), 333,1696 [M+ H]+ (8,28)} РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 161 1H-NMR спектар 14 указује на присуство сигнала карактеристичних за основну структуру гермакранолида (Табела 3.14; Слика 3.44):  Два олефинска метинска протона H-1 и H-5 као два дублета на δH 5,02 (J=9,8 Hz) и δH 5,15 (J=10,2).  H-6 се јавља облику двоструког дублета на δH 4,67 (J=9,1; 10,2), у области кисеоничних метина, с обзиром на то да је везан за угљеник α-метилен γ- лактонског прстена.  Егзоциклични метиленски протони H-13a и H-13b, који се у облику два дублета уочавају се у олефинском делу спектра на δH 6,26 (J=3,5) и δH 5,52 (J=3,3).  H-7 као мултиплет на δH 2,58. Табела 3.14 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 14 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Вредности су добијене на основу HSQC и HMBC података. * Преклопљени сигнали. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 CH 129,8 Η-1 5,02 d (J=9,8) 1 C-2 CH 69,7 H-2 4,63 tt (J=10,0; 5,8) 1 C-3 CH2 44,5 H-3ª 2,87 dd (J=11,2; 5,6) 2 H-3b 2,09 t (J=10,8)* C-4 C 139,2 - - - - C-5 CH 132,6 H-5 5,15 d (J=10,2) 1 C-6 CH 79,7 H-6 4,54 dd (J=10,2; 9,1) 1 C-7 CH 50,8 H-7 2,58 m 1 C-8 CH2 27,5 H-8a 2,16 m * 1 H-8b 1,63 m C-9 CH2 40,6 H-9a 2,45 dd (J=15,0; 5,1) 1 H-9b 2,14 dd (J=15,0; 2,3)* 1 C-10 C 137,6 - - - - C-11 C 139,1 - - - - C-12 C=O 169,8 - - - - C-13 CH2 120,1 H-13a 6,26 d (J=3,5) 2 H-13b 5,52 d (J=3,3) C-14 CH3 16,9 1,41 s 3 C-15 CH2 62,2 H-15a,b 4,66 s 2 C-16 C=O 166,7 - - - - C-17 C 135,5 - - - - C-18 CH2 126,4 H-18a 6,12 t (J=1,2) 1 H-18b 5,59 t (J=1,2) 1 C-19 CH3 18,2 1,96 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 162 Слика 3.44 1H NMR спектар супстанце 14 (CDCl3; 400,0 MHz) У алифатичном делу 1H-NMR спектра уочавају се сигнали карактеристични за три различите метиленске групе:  Геминални протони H-9a и H-9b, као два двострука дублета на δH 2,45 (J=5,1; 15,0) и δH 2,14 (J=2,3; 15,0).  COSY спектар показује да су оба протона CH2-9 у корелацији са геминалним протонима H-8a и H-8b, који се уочавају на спектру као два мултиплета на δH 2,16 и δH 1,63, при чему су сигнали H-9b и H-8a делимично преклопљени (Слика 3.45).  Геминални протони H-3a and H-3b уочавају се као двоструки дублет на δH 2,87 (J=5,6; 11,2) и триплет на δH 2,09 (J=10,8), оба су померена ка вишим вредностима хемијских померања, с обзиром на то да су окружени хидроксиметинском групом (CH-OH), који се налази у облику тростуког триплета на δH 4,63 (J=5,8; 10,0), и протонима бочног низа који је естарски везан за метил групу на C-15. Присуство два триплета на δH 6,12 и δH 5,59 (H-18a и H-18b), једног оштрог синглета на δH 1,96 (CH3-19), који интеграцијом даје три протона, указује на присуство метакрилатне групе као бочног низа. Сигнал на HMBC спектру између синглета CH2-15 (на δH 4,66, интеграцијом даје два протона) и карбонилне групе C-16 потврђује положај бочног низа C-15, чији се угљеников атом налази на δC 62,2, на основу HSQC спектра. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 163 Битно је нагласити да у случајевима када хидроксиметиленска група на C-15 није супституисана, геминални протони (CH2-15) уочавају се као одвојени дублети на око 4,30 ppm, један, и други на око 4,0 ppm, са великом константом спрезања (Jgem= око 10,0 Hz) (Слика 3.45). 13C-NMR и DEPT/13C-NMR спектар указују на присуство 19 угљеникових атома: шест кватернерних, шест метиленских (засићених и незасићених) и седам CH3/CH (Слика 3.45). На основу HSQC спектра идентификовани су следећи угљеникови атоми у молекулу:  Пет метинских угљеника C-1, C-2, C-5, C-6 и C-7 (δC 129,8; 69,7; 132,6; 79,7; 50,8),  Три алифатична метиленска и један кисеонични метиленски угљеник C-3, C-8, C-9 и C-15 (δC 44,5; 27,5; 40,6; 62,2), као и два олефинска егзоциклична метиленска угљенка C-13 и C-18 (δC 120,1; 126,4),  Два метил угљеникова атома C-14 и C-19 на δC 16,9; 18,2. 1H-13C (HMBC) спектрални подаци дају следеће податке везане за структуру молекула (Слика 3.45):  C-12 (δC 169,8) на основу корелације H-13a,b/C-12,  C-16 (δC 166,7) - H-18b, CH3-19/C-16,  C-10 (δC 137,6) - CH3-14/C-10,  C-4 (δC 139,2) - H-5/C-4,  C-11 (δC 139,1) - H-7/C-11,  C-17 (δC 135,5) - H-18b, CH3-19/C-17. У олефинском делу 13C-NMR спектра, присутно је 8 угљеникових атома, што указује на присуство четири двоструке везе: 129,8 (CH); 137,6 (C); 139,2 (C); 132,6 (CH); 139,1 (C); 120,1 (CH2); 126,4 (CH2); 135,5 (C). Присуство две двоструке везе Δ4,5 и Δ1,10 може се закључити на основу сигнала (δC 129,8 и 132,6) типичних за метинске незасићене групе (HSQC) и на основу 2D COSY спектра (Marco et al., 1997). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 164 O O HO O O Слика 3.45 HSQC, HMBC, 13C-NMR/DEPT, 1H-1H COSY и NOESY спектри супстанце 14 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Најважније корелације на основу HMBC спектра (црвене стрелице од 1H ка13C) и COSY корелација (плаве болд линије); 3D представљена конформација на основу nOe корелација РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 165 Релативна стереохемија супстанце 14 потврђена је упоређивањем константи купловања вициналних протона са оним вредностима које су публиковане за сличне гермакранолиде (Karioti et al, 2002). Вредности константи спрезања за вициналне протоне H-1, H-2 и H-5; H-5, H-6 и H-7 у потпуној су сагласности са - стереохемијом протона H-1 и trans-оријентацијом протона H-5/H-6 и H-6/H-7 (Rustaiyan et al., 1986). Присуство групе са кисеоником на циклодекадиенском прстену потврђено је постојањем угљениковог атома са хемијским померањем δC 69,7, које је у корелацији са протоном H-2 на основу 1H-1H COSY, HSQC спектара. Велика вредност констане купловања (J1,2=10,0 Hz) у сагласности је са - орјентацијом хидроксилне групе на положају C-2 (Bohlmann et al., 1982a; Vasquez et al., 1990). У случају -оријентације H-2 констана спрезања би имала знатно нижу вредност (J1,2=6,0 Hz) (Marco et al., 1997). Такође, хомонуклеарни 1H-1H NOESY спектар нам је омогућио да утврдимо положај свих хиралних центара супстанце 14 (Слика 3.45). nOe корелација између H-1 и H-5, H-5 и H-7, као и H-6 са H-8a указују на trans- диаксијални распоред протона C-5 (α), C-6 (β) и C-7 (α). Такође, велика вредност константе спрезања између H-6 и H-7 (J6,7=9,1 Hz), заједно са алилном константом спрезања између H-7 и H-13 (J7,13=3,5 Hz), потврђује trans везу - метилен-γ-лактонског прстена са циклодекадиенским прстеном (Bohlmann et al., 1982a). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 166 3.2 Лигнани 15. Матересинол Супстанца 15 до сада је изолована из различитих врста рода Centaurea (Табела 1.7). Mатересинол је изолован као жута уљана супстанца, а анализом спектралних података предложена је хемијска структура приказана на слици 3.46. O O H H H3CO HO OH OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9'7' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 8' Слика 3.46 15. Матересинол На основу резултата 1H-NMR, 13C-NMR и COSY спектара (Табела 3.15; Слика 3.47) и корелацијом са публикованим литературним подацима, закључује се да супстанца припада групи лигнана, подгрупи диарилбутиролактона, чији молекул садржи две фенил пропанил групе, које су преко C8-C8' угљениковог моста везани са лактонским прстеном. Вредност оптичке ротације износи: [] 20 D - 22,9 (c=0,10; CH3OH). На 1H-NMR спектру се запажају шест сигнала карактеристичних за ароматичне протоне: РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 167  Два дублета на δH 6,94 (J=8,1 Hz) и δH 6,74 (J=8,2 Hz), карактеристична за ароматичне протоне H-5' и H-5; који су у orto- положају у односу на протоне H-6' и H-6.  Два двострука дублета на δH 6,58 (J=8,1; 1,4 Hz) и δH 6,53 (J=8,2; 1,9 Hz) карактеристична за протоне H-6' и H-6, који су у meta-положају са протонима H-2' и H-2, и у orto-положају са протонима H-5' и H-5.  Два дублета на δH 6,65 и 6,47 (J=2,0 и 1,8 Hz) карактеристични за протоне H- 2' и H-2. Табела 3.15 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 15 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Позиција Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Бензилски прстен C-1 C 129,7 - - - - C-1 C 129,5 - - - - C-2 CH 110,9 H-2 6,38 d (J=1,8) 1 C-2 CH 111,5 H-2' 6,59 d (J=2,0) 1 C-3 C 146,7 - - - - C-3 C 146,6 - - - - C-4 C 144,5 - - - - C-4 C 144,4 - - - - C-5 CH 114,1 H-5 6,77 d (J=7,8) 1 C-5 CH 114,4 H-5 6,80 d (J=8,2) 1 C-6 CH 121,3 H-6 6,48 dd (J=7,8; 1,8) 1 C-6 CH 122,1 H-6 6,57 dd (J=8,6; 2,0) 1 C-7 CH2 34,6 H-7ª 2,55 t (J=6,8) 1 H-7b 2,44 t (J=7,2) 1 C-7 CH2 38,3 H-7'a 2,93 dd (J=14,2; 5,4) 1 H-7'b 2,85 dd (J=14,2: 7,0) 1 Лактонски прстен C-8 CH 41,0 H-8 2,46 dt (J=12,8; 6,8) 1 C-8' CH 46,6 H-8' 2,54 dt (Ј=12,8; 7,2) 1 C-9 CH2 71,3 H-9a 4,13 dd (J=9,0; 7,0) 1 H-9b 3,87 dd (J=9,0; 7,0) 1 C-9 C=O 178,7 - - - - Метокси група OCH3 CH3 55,8 C-3/CH3 3,80 s 3 OCH3 CH3 C-3/CH3 3,79 s 3 Хидроксилна група OH - - C-4/OH 5,51 brs 1 OH - - C-4/OH 5,48 brs 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 168 H-5 H-5' H-2' H-6' H-6 H-2 H-9aH-9b OCH3 H-7'a H-7'b H-8' H-7a H-8 H-7b OH Слика 3.47 1H-NMR спектар супстанце 15 (CDCl3; 400,0 MHz) Поред сигнала који су описани, а карактеришу два ароматична ABX система на 1H-NMR спектру, уочавају се два синглета са хемијским померањима на δH 3,79 и 3,80, који указују на присуство две метокси групе и два карактеристична хидроксилна синглета на δH 5,51 и 5,48, што указује на присуство два 1,3,4 трисупституисана ароматична прстена (Слика 3.47). На основу 1H-NMR/COSY спектра (Слика 3.48) потврђено је присуство лактонског прстена и молекулу. Бензил протони H-7a,b, који се облику два триплета уочавају на δH 2,55 и 2,44 (J=6,8; J=7,5 Hz) и H-7'a,b као два двострука дублета на δH 2,93 и 2,85 (J=14,2; 5,4 и J=14,2; 7,0) су у COSY корелацији са два двострука триплета на δH 2,46 и δH 2,54 (J=12,8; 6,8, Hz; Ј=12,8; 7,2,) који су означени као протони H-8, H-8'. Даље, COSY корелација H-8/H-9a,b указује на положај геминалних протона лактонског прстена H-9a,b, која се уочавају као два двострука дублета на δH 4,13 (J=9,0; 7,0) и δH 3,87 (J=9,2; 7,0 Hz) (Слика 3.47). На основу свега наведеног, закључује се да молекул садржи два иста 4- хидрокси-3-метокси супституисана ароматична прстена, што се потврђује и помоћу 13C-NMR спектра (Слика 3.48), који садржи дванаест ароматичних угљеникових атома са готово идентичнијм хемијским померањима. Поред угљеникових атома ароматичних прстенова на 13C-NMR спектру се уочавају РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 169 сигнали који одговарају присуству два метиленска угљеникова атома C-7, C-7 (δC 34,6; 38,3), један оксиметиленски угљеников атом C-9 (δC 71,3), два метинска угљеникова атома C-8, C-8 (δC 41,0; 46,5), два метокси угљеникова атома на δC 55,8 и један лактон карбонилни угљеников атом (δC 174,8) (Слика 3.48). Хемијска померања за угљеникове атоме C-7, C-8, C-9, C-7', C-8' и C-9' карактеристична су и потврђују trans-везани петочлани лактонски прстен у молекулу (Ayres & Loike, 1990). Слика 3.48 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 15 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Најбитније корелације (плаве болд линије) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 170 16. Арктигенин До сада, арктигенин је изолован из неколико различитих врста рода Centaurea (Табела 1.7). Супстанца 16 изолована је у облику жутог уља и на основу резултата спектралне анализе предложена је хемијска структура приказана на слици 3.49. H3CO H3CO O O OCH3 OH H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9'7' 1' 6' 5' 4' 3' 2' 8' Слика 3.49 16. Арктигенин Вредност оптичке ротације метанолског раствора супстанце износи: []20D - 41,4 (c=0,13; CH3OH). На основу 1H-NMR спектра супстанце 16 (Табела 3.16; Слика 3.50 – 3.51) уочава се да су хемијска померања сигнала готово аналогна матересинолу (једињење 15). Једину разлику представљају три сигнала у ароматичном делу спектра H-6 (δH 6,52 vs 6,48); H-5 (δH 6,77 vs 6,72); H-2 (δH 6,43 vs 6,38), као и само један широки синглет на δH 5,54 од фенолне OH. Интеграцијом два синглета на δH 3,79 и δH 3,83 која се уочавају на спектру, добија се укупно девет протона, за разлику од шест протона, колико се добија интеграцијом два синглета код матересинола. Ови спектрални подаци указују на то да молекул садржи три метокси групе, од којих су две еквивалентне. Такође, једна хидроксилна група ароматичних прстенова матересинола супституисана је метил групом код супстанце 16 (Слика 3.50). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 171 Табела 3.16 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 16 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) H-5' H-5H-2' H-6 H-2 H-6' OH H-9a H-9b -OCH3 2xOCH3 H-7'a H-7'b H-8' H-7a H-8 H-7b Слика 3.50 1H-NMR спектар супстанце 16 Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Позиција Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Бензил прстен C-1 C 130,5 - - - - C-1 C 129,6 - - - - C-2 CH 111,5 H-2 6,43 d (J=1,8) 1 C-2 CH 111,8 H-2' 6,61 d (J=2,0) 1 C-3 C 149,1 - - - - C-3 C 147,1 - - - - C-4 C 146,7 - - - - C-4 C 144,6 - - - - C-5 CH 111,4 H-5 6,72 d (J=8,1) 1 C-5 CH 114,1 H-5 6,80 d (J=8,1) 1 C-6 CH 120,6 H-6 6,52 dd (J=1,8; 8,0) 1 C-6 CH 122,1 H-6 6,58 dd (J=2,0; 8,0) 1 C-7 CH2 34,5 H-7a 2,60 t (J=7,4) 1 H-7b 2,40 t (J=7,4) 1 C-7 CH2 38,2 H-7'a 2,93 dd (J=5,5; 14,1) 1 H-7'b 2,87 dd (J=6,6; 14,1) 1 Лактонски прстен C-8 CH 40,9 H-8 2,50 dt (J=5,9; 12,8) 1 C-8' CH 46,6 H-8' 2,61 dt (Ј=5,9; 12,8) 1 C-9 CH2 71,3 H-9a 4,11 dd (J=7,2; 9,0) 1 H-9b 3,86 dd (J=7,2; 9,0) 1 C-9 C=O 178,8 - - - - Метокси група OCH3 CH3 55,8 - 3,83 s 3 2xOCH3 CH3 - 3,79 s 6 Хидроксилна група OH - - C-4/OH 5,54 brs 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 172 Слика 3.51 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 16 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Најважније корелације COSY спектра (плаве болд везе) Помоћу 13C-NMR спектра (Слика 3.51) одређена је позиција треће метокси групе. Поређењем 13C-NMR спектра супстанце 16 са спектром матересинола (15), уочавају се одређене разлике код хемијских померања појединих угљеникових атома једног ароматичног прстена: C-1 (δC 130,5 vs 129,7), C-2 (δC 111,5 vs 110,9), C-3 (δC 149,5 vs 146,7), C-4 (δC 146,7 vs 144,5), C-5 (δC 111,4 vs 114,1) и C-6 (δC 120,6 vs 121,3). Како се основне разлике уочавају на угљениковим атомима C-4, C-3, C-5 и једна метокси група се налази на положају C-3 матересинола, изводи се закључак да је трећа метокси група везана за положај C-4. Наведени спектрални подаци су у сагласности са литературним подацима (Nishibe et al., 1984). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 173 Основна структура диарилбутирлактонског лигнана 16 потврђена је помоћу COSY спектра (Слика 3.51): Спин систем A: CH2-7/H-8/H-8'/CH2-7'; Спин систем B: CH2-9/H-8; Спин систем C: H-5/H-6; Спин систем D: H-5'/H-6'. 17. Арктин Арктин је присутан у многим врстама фамилије Asteraceae, а изолован је из многих врста рода Centaurea (Табела 1.7). Супстанца 17 изолована је као уљаста супстанца наранџасте боје. Анализом спектралних података за наведено једињење предложена је следећа хемијска структура приказана на слици 3.52. O O H H OCH3 H3CO H3CO OOOH HO HO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9'8'7' 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5''6'' Слика 3.52 17. Арктин Вредност оптичке ротације метанолског раствора једињења је: []20D - 34,6 (c=0,09; CH3OH). Сигнали који се уочавају на 1H-NMR спектру (Табела 3.17; Слика 3.53) потврђују да супстанца припада бутирлактонској групи лигнана, са два бензил метиленска протона CH2-7 који се уочавају као триплети на δH 2,64 и δH 2,52 са идентичним константама спрезања (J=6,8 Hz), и CH2-7' као дублети на δH 2,86 (J=5,7), два метинска протона CH-8 као триплет на δH 2,47 (J=7,2) и CH-8 као двоструки триплет на δH 2,56 (Ј=13,4; 5,7). Метиленски протони CH2-9 уочавају РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 174 се као двоструки дублет на δH 4,13 (J=8,9; 7,4) и на δH 3,85 (преклопљени сигналима шећерне компоненте). Остали сигнали у спектру указују на присуство шест ароматичних протона, три метокси групе и једне шећерне компоненте. Поред сигнала карактеристичних за бутирлактонски лигнан, дублет на δH 4,75 (J=6,7 Hz), одговара аномерном протону H-1 шећерне компоненте. Табела 3.17 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 17 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz) * Сигнали су преклопљени сигналима протона глукозе. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Позиција Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Бензил прстен C-1 C 130,4 - - - - C-1 C 133,9 - - - - C-2 CH 112,0 H-2 6,47 d (J=2,0) 1 C-2 CH 113,2 H-2' 6,65 d (J=1,8) 1 C-3 C 149,2 - - - - C-3 C 148,2 - - - - C-4 C 145,3 - - - - C-4 C 144,9 - - - - C-5 CH 111,5 H-5 6,74 d (J=8,2) 1 C-5 CH 115,8 H-5 6,94 d (J=8,1) 1 C-6 CH 120,6 H-6 6,53 dd (J=8,2; 1,9) 1 C-6 CH 121,8 H-6 6,58 dd (J=8,1; 1,4) 1 C-7 CH2 34,5 H-7a 2,64 t (J=6,8) 1 H-7b 2,52 t (J=6,8) 1 C-7 CH2 38,1 H-7'a 2,86 d (J=5,7) 2 H-7'b Лактонски прстен C-8 CH 46,5 H-8 2,47 t (J=7,2) 1 C-8' CH 48,9 H-8' 2,56 dt (Ј=13,4; 5,7) 1 C-9 CH2 71,2 H-9a 4,13 dd (J=8,9; 7,4) 1 H-9b 3,85 m* 1 C-9 C=O 178,4 - - - - Глукоза C-1 CH 102,2 H-1 4,75 d (J=6,7) 1 C-2 CH 73,5 H-2 3,66 m 1 C-3 CH 76,5 H-3'', H-5'' 3,43 m 2 C-4 CH 69,4 C-5 CH 75,6 H-4'', H-6''a, H-6''b 3,85 m 3 C-6 CH2 60,7 Метокси група OCH3 CH3 55,9 - 3,82 s 3 OCH3 CH3 55,8 - 3,78 s 3 OCH3 CH3 55,8 - 3,73 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 175 -OCH3 -OCH3 -OCH3 H-5 H-5' H-2' H-2 H-6' H-6 H-1'' H-9a H-3'',H-5'' H-2'' H-8',H-7b H-4'',H-6''a,H-6''bH-9b H-7'a,H-7'b H-7a H-8 Слика 3.53 1H-NMR спектар супстанце 17 (CDCl3; 400,0 MHz) Помоћу COSY спектра (Слика 3.54) одређен је тачан положај свих протона шећера, поред протонских сигнала лактонског прстена. 13C-NMR спектар потврђује присуство глукозе као шећерне компоненте. Упоређујући хемијска померања сигнала на 13C-NMR спектру арктигенина (стр. 171) и једињења 16, уочавају се две основне разлике у хемијским померањима угљеникових атома централног скелета молекула:  Ароматични угљеник C-l уочава се на нижим вредностима поља од δC 129,6 на 133,9,  C-3 од δC 147,1 на 148,2. Разлика од δC 4,3 и 1,1 ppm, је већином у сагласности са литературним подацима групе Нишибе (Nishibe) група је публиковала да је разлика од + 3,0 и + 1,4 ppm за C-l и C-3, карактеристична за постојање гликозидне везе на положају C-4 прстенастог система типа гвајакола Nishibe et al. (1984) Хемијска померања свих угљеникових атома шећерне компоненте добијена су на основу 13C-NMR спектра (Слика 3.54): C-1 (δC 102,2); C-2(δC 73,5); C-3(δC 76,5); C-4(δC 69,4); C-5(δC 75,6); C-6(δC 60,7). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 176 Слика 3.54 1H-1H COSY и 13C-NMR спектри супстанце 17 (CDCl3; 400,0; 50,3 MHz); Најважније корелације (плаве болд везе) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 177 18. Сирингин; Синапил алкохол -4-O--D-глукопиранозид Први пут супстанцу је изоловао Милет (Meillet) из биљке Syringa vulgaris L., 1841 године. До сада, супстанца је изолована из различитих биљних врста, нарочито из фамилије Asteraceae, и предложена је као хемотаксономски маркер унутар наведене фамилије (Cis et al., 2003). Из рода Centaurea изолована је из следећих врста: C. repens (Acroptilon repens (L.) DC.); C. bella Trautv; C. crocodylium L, (Cis et al., 2003); C. cineraria L, (Senatore et al., 2003), C. jacea L, (Forgo et al., 2012), C. ptosimopappoides (Flamini et al., 2006). Супстанца 18 изолована је у облику кристала жуте боје, а анализом спектралних података одређена је хемијска структура једињења приказана на слици 3.55. OH 9 8 7 H3CO OCH3 O 1 6 5 4 3 2 OOH HO HO OH 1' 2' 3' 4' 5' 6' Слика 3.55 18. Сирингин Вредност оптичке ротације метанолског раствора испитиваног једињења је: [] 20 D - 27,5 (c=0,12; CH3OH). 1/2D NMR (Табела 3.18; Слика 3.56) спектри указују на присуство ароматичног глукозидног деривата. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 178 На 1H-NMR спектру се уочавају два синглета типична за симетрично тетра-супституисани ароматични прстен, један који интеграцијом даје два протона налази се на δH 6,75 (H-2', H-6); и други на δH 3,86 који интеграцијом даје шест протона, карактеристичних за две метокси групе. Дублет на δH 6,55 (J=15,6, H-7) и троструки триплет на δH 6,33 (J=5,6; 15,6, H-8) указују на присуство trans двоструке везе директно везане за хидрокси-метиленску групу (CH2-9), Корелација између хидрокси-метиленске групе и двоструке везе потврђена је помоћу COSY спектра (Слике 3.56 – 3.57). Хемијска померања протона и угљеникових атома добијена су на основу COSY и HSQC спектара, као и на основу 13C-NMR спектра. На основу литературних података циметна киселина и алкохоли (добијени редукцијом циметне киселине помоћу коензим A естра и алдехида) учествују у биохемијској синтези осталих метаболита који у свом саставу садрже C6-C3 структурни фрагмент. Биљке гимносперми полимеризују углавном кониферил алкохол, дикотелодини, кониферил и синапил алкохол, док монокотиледони користе сва три алокохола (Dewick, 2001). На основу ових чињеница, може се констатовати да је сирингин један од прекурсора у биосинтези изолованих лигнана, с обзиром на то да је синапил алкохол потврђени интермедијер у биосинтези једињења типа лигнана. Супстанца је добар антиалергент и хипотенсив, показује анти- инфламатору активност, као цитотоксичну активност на неколико ћелија рака (Cis, 2003). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 179 Табела 3.18 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 18 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) * Преклопљено сигналима растварача. Слика 3.56 1H-NMR спектар супстанце 18 (CD3OD; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Позиција Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Синапил остатак C-1 C 131,9 - - - - C-2, C-6 CH 105,1 H-2', H-6 6,75 brs 2 C-3 C 154,8 - - - - C-4 C 135,8 - - - - C-5 C 154,8 - - - - C-7 CH2 63,4 H-1 4,22 d (J=5,6) 2 C-8 CH 129,7 H-2 6,33 tt (J=15,6; 5,6) 1 C-9 CH 130,6 H-3 6,55 d (J=15,6) 1 Глукоза C-1 CH 104,7 H-1 4,88 * 1 C-2 CH 75,2 H-2, H-3,H-4 3,49-3,42 m 3 C-3 CH 78,9 C-4 CH 71,8 C-5 CH 77,5 H-5 3,20 m 1 C-6 CH2 62,2 H-6a 3,78 dd (J=12,0; 1,4) 1 H-6b 3,67 dd (J=12,0; 5,3) 1 Метокси група OCH3 CH3 56,7 CH3 3,86 s 6 Хидроксил група OH 4,70 s 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 180 OH 1 2 3 H3CO OCH3 O 1' 6' 5' 4' 3' 2' OOH HO HO OH 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' Слика 3.57 1H-1H COSY, HSQC и 13C-NMR спектри супстанце 18 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz); Најважније корелације (плаве болд везе) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 181 3.3 Флавоноиди 19. Апигенин; 5,7,4-Трихидроксифлавон До данас, апигенин је изолован из многих врста рода Centaurea : C. jacea L. (Forgo et al., 2012), C. alexanderina (Kubacey et al., 2012), C. urvillei DC. subsp. urvillei (Gülcemal et al., 2010), C. nicaeensis all. var. walliana M. (Hammoud et al., 2012) и C. sadleriana JANKA (Csupor et al., 2012) итд. Апигенин је један од најзаступљенијих флавона у биљном свету Изолован је у облику аморфног жутог праха а његова хемијска структура (приказана на слици 3.58) потврђена је анализом спектралних података и њиховом корелацијом са до сада, публикованим резултатима (Agrawal, 1989). O O OH HO OH 4' 3 5 6 7 8 Слика 3.58 19. Апигенин РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 182 Резултати UV-Vis спектралне анализе приказани су у Табели 3.19. Табела 3.19 UV-Vis спектар супстанце 19 (λmax у nm) Трака ΙΙ Трака Ι Δλ (Ιa) ΙIb Iia Ιb Ia MeOH 270,0 334,0 MeONa 276,0 320,5 391,0↑ +57,0 AlCl3 276,0 301,5(sh) 350,0 378,0 +44,0 AlCl3/HCl 276,0 301,5(sh) 349,0 379,0 +45,0 NaOAc 276,0 Δλ (ΙΙ) +6,0 309,0 325,0 383,5 +49,5 NaOAc/H3BO3 270,0 337,5 +3,5 Табела 3.20 1Η-NMR супстанце 19 (CD3OD; 400,0 MHz) Хемијско померање δ (ppm) Бр. Η Хемијско спрезање J (Hz) Позиција 7,85 2 d (J=8,6) H-2', H-6' 6,93 2 d (J=8,6) H-3', H-5' 6,60 1 brs H-3 6,46 1 d (J=2,0) H-8 6,21 1 d (J=2,0) H-6 Слика 3.59 1Η-NMR спектар супстанце 19 (CD3OD; 400,0 MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 183 20. Диосметин; 3',4',5,7-тетрахидроксифлавон 4'-метил етар; лутеолин-4-метил етар Супстанца 20 изолована је као жути прах и на основу резултата спектроскопских анализа одређена је хемијска структура приказана на слици 3.60. O O OCH3 HO OH 4' 3 5 6 7 8 OH Слика 3.60 20. Диосметин Ово једињење флавоноидне структуре је први пут изоловано из рода Centaurea. Резултати UV-Vis спектралне анализе приказани су у Табели 3.21. Табела 3.21 UV-Vis спектар супстанце 20 (λmax у nm) трака ΙΙ трака Ι Δλ (Ιa) Ιib IIa Ιb Ia MeOH 261,0 273,0 338,0 MeONa 273,0 305,5(sh) 374,0 +36,0 AlCl3 261,0 271,0 296,0(sh) 361,0 383,0 (sh) +45,0 AlCl3/HCl 258,0 273,0 300,5(sh) 354,0 385,0 (sh) +47,0 NaOAc 277,0 Δλ (ΙΙ) +7,0 317,0(sh) 360,5 +22,5 NaOAc/H3BO3 268,0 341,5 +3,5 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 184 Апсорпциони максимум траке I (λmax=338 nm) у метанолском раствору указује, као и претходном случају, да супстанца 20 припада групи флавона. Два апсорпциона пика траке II (λmax=261, 273 nm) јављају се на спектру када молекул садржи 3',4' функционалне групе са кисеоником на Б-прстену (Табела 3.21). Батохромно померање траке I од +36 nm након додавања NaOMe иницијалном метанолском раствору, индикује одсуство 4'-OH групе у Б-прстену. Уз то, криве спектра су стабилне неколико минута након додатка NaOMe што потврђује да супстанца 20 не припада флавонолима. Одсуство хипохромног ефекта Траке I, након додатка HCl у раствор AlCl3, указује да Б-прстен супстанце 20 не садржи orto-дихидроксилне групе. Батохромно померање сва четири апсорпциона пика у односу на метанолни раствор супстанце, која се уочавају на спектру по додатку AlCl3/HCl, карактеристични су за 5-хидроксифлавоне. Такође, батохромно померање Траке II (Δλ= + 7,0) приликом снимања спектра у раствору NaOAc указује на слободну 7-хидроксилну групу, док батохромно померање мање од 5,0 nm Траке I (Δλ= + 3,5 nm) након додатка H3BO3 потврђује одсуство orto-дихидроксилних група на прстеновима A, B у молекулу. На 1H-NMR спектару супстанце (Табела 3.22, Слика 3.61), уочавају се пикови у ароматичном делу спектра карактеристични за ABX систем. Два дублета на δH 7,48 (J=2,0) и δH 6,93 (J=8,4), као и двоструки дублет на δH 7,50 (J=8,0; 1,8) указују на 3',4' ди-супституисани Б-прстен флавона. Наведени пикови одговарају протонима H-2', H-5', H-6', наведеног прстена. У ароматичној регији спектра се такође налазе и три пика карактеристична за протоне који потичу са A-прстена молекула. Два дублета на δH 6,44 и δH 6,20 са малом константом купловања (ca. 2,0 Hz) одговарају протонима H-8 и H-6, док широки синглет на δH 6,60 протону H-3 (Слика 3.61). Оштар синглет на δH 3,80, који интеграцијом даје три протона, карактеристичан је за метокси групу која се, у сагласности са подацима добијеним на основу UV-Vis спектара, налази на положају C-4'. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 185 Табела 3.22 1Η-NMR супстанце 20 (CD3OD; 400,0 MHz) Хемијско померање δ (ppm) Бр. Η Константа спрезања J (Hz) Позиција 7,50 1 dd (J=8,0;1,8) H-6' 7,48 1 d (J=2,0) H-2' 6,93 1 d (J=8,4) H-5' 6,60 1 brs H-3 6,44 1 d (J=2,0) H-8 6,20 1 d (J=2,0) H-6 3,80 3 s OCH3 Слика 3.61 1Η-NMR спектар супстанце 20 (CD3OD; 400,0 MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 186 21. Хиспидулин; 5,6,7,4'-тетрахидроксифлавон 6-метил етар; 6-метоксиапигенин; 6-метилскутеларин Према литературним изворима ово једињење изоловано је из следећих врста рода Centaurea: C. jacea L. (Forgo et al., 2012), C. sadleriana JANKA (Csupor et al., 2012), C. melitensis L. (Negrete et al., 1989), Centaurea phyllocephala Boiss. (Twaij et al., 1983), C. bracteata Scop. (Flamini et al., 2001), C. napifolia L. (Akkal et al., 2003), C. collina L. subsp. collina (Fernandez et al., 1989), C. aspera L. var. subinermis DC. (Cardona et al., 1991). Супстанца 21 жуте је боје и уљастог изгледа. Према доле приказаним резултатима спектралне анализе одређена јој је следећа хемијска структура приказана на слици 3.62. OHO OH O OH H3CO Слика 3.62 21. Хиспидулин Спектроскопском анализом супстанце 21 (UV-Vis, Табела 3.23) добијене су карактеристичне криве са наведеним вредностима таласних дужина. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 187 Табела 3.23 UV-Vis спектар супстанце 21 (λmax у nm) Трака II Трака I Δλ (Ι) MeOH 273,0 334,0 MeONa 274,5 303,0 (sh) 378,5 +44,0 AlCl3 279,0 302,0(sh) 360,5 +26,5 AlCl3/HCl 278,0 302,5 354,0 +20,0 NaOAc 276,0 Δλ (ΙΙ) +3,0 305,0(sh) 366,0 +32,0 NaOAc/H3BO3 278,0 300,0 338,0 +4,0 Вредност апсорбанце траке I од λmax 334,0 nm у раствору метанола супстанце 21 класификује је у подгрупу флавона. Апсорпиони пик траке II (λmax 273 nm) у раствору метанола као и батохромни и хипсохромни ефекат апсорпционог максимума траке I по додатку MeONa указује на присуство слободне 4'- хидроксилне групе Б-прстена (Табела 3.23). Стабилност спектра након додатка NaOMe потврђује одсуство хидроксилне групе на положају C-3. Батохромни ефекат траке I од Δλ + 20 nm додатком AlCl3/HCl, у односу на почетни метанолски раствор је карактеристичан за флавоне који садрже 5- хидрокси-4-кето-систем, као и присуство метокси или хидрокси групе на положају C-6, али не и на положају C-8 (Mears & Mabry, 1972, Sakakibara & Mabry, 1977). Батохромни ефекат траке II од Δλ= + 3, чији је апсорпциони пик стабилан неколико минута након додавања NaOAc, потврђује присуство кисеоничне функције на позицији C-6 као и хидроксилних група на позицији C- 7 и C-5. Батохромно померање траке I од + 4 nm у присуству NaOAc/H3BO3 потврђује да A и Б прстенови не садрже orto-дихидроксилни систем. Структура супстанце 21 потврђена је помоћу 1H-NMR спектра (Табела 3.24; Слика 3.63). Два дублета у ароматичној регији спектра од δH 7,84 (J=8,4; H-2', H-6') и δH 6,92 (J=8,8; H-3', H-5') потврђују para-супституисани Б прстен. Два широка синглета, на δH 6,53 и δH 6,58 која интеграцијом дају по један протон, карактеристични су за H-3 и H-8, док је синглет на δH 3,88 који интеграцијом даје три протона карактеристичан за метокси групу. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 188 Табела 3.24 1H-NMR супстанце 21 (CD3OD; 400,0 MHz) Хемијско померање δ (ppm) Бр. Η Константа спрезања J (Hz) Позиција 7,84 2 d (J=8,4) H-2', H-6' 6,92 2 d (J=8,8) H-3', H-5' 6,58 1 brs H-8 6,53 1 brs H-3 3,88 3 s -OCH3 Слика 3.63 1Η-NMR спектар супстанце 21 (CD3OD; 400,0 MHz) 22. Непетин; 5,6,7,3,4-Пентахидроксифлавон 6-метил етар; Еупафолин До сада, супстанца је изолована из различитих врста рода Centaurea: C. sulphurea Willd. (Kabouche et al., 2011); C. bracteata (Flamini et al., 2001); C. virgata Lam., C. inermis Velen. (Öksüz, et al. 1983); C. phyllocephala Boiss. (Twaij et al., 1983), C. collina L. subsp. collina (Fernandez et al., 1989), C. aspera L. var. subinermis DC. (Cardona et al., 1991). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 189 Супстанца 22 изолована је у облику жутих кристалних иглица. Структура (приказана на слици 3.64) је потврђена анализом спектралних података и њиховом корелацијом са до сада публикованим резултатима (Agrawal, 1989). O O OH HO OH 4' 3 5 6 7 8 OH 3' H3CO Слика 3.64 22. Непетин Спектроскопском анализом супстанце 22 (UV-Vis, Табела 3.25) добијене су карактеристичне криве са наведеним вредностима таласних дужина. Табела 3.25 UV-Vis спектар супстанце 22 (λmax у nm) Трака ΙΙ Трака Ι Δλ (Ιa) ΙIb IIa Ιb Ia MeOH 254,0 271,0 347,0 MeONa 270,0 335,5(sh) 394,0 +47,0 AlCl3 274,0 297,0(sh) 332,0(sh) 418,0 +71,0 AlCl3/HCl 260,0 281,0 294,0(sh) 365,0 +18,0 NaOAc 273,0 Δλ (ΙΙ) +2,0 305,0(sh) 330,0(sh) 362,5 +15,5 NaOAc/H3BO3 264,0 300,0 377,0 +30,0 UV-Vis спектрални подаци (Табела 3.25) добијени у метанолском раствору супстанце 22 указују да супстанца припада подгрупи флавона са 3,4 хидроксилним групама на Б прстену: апсорпциони максимум Траке I на λmax=347,0 nm; као и дељење траке II (IIb/λmax=254,0 nm; IIa/λmax=271,0 nm). Такође, како је апсорпциони максимум траке IIa (λmax=271,0 nm) у метанолском раствору испод 279 nm, супстанца не садржи никакву кисеоничну групу на C-8 (Voirin, 1983). У сагласности са литературним подацима (Voirin, РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 190 1983), супституција на C-8 узрокује раздвајање траке I на две траке (Трака Ia и Трака Ib) са интезитетом Траке Ib од око λ 305 nm. трака ΙΙ се такође раздваја при чему долази до већег батохромног померања трака ΙΙ код 8-OH/-OCH3 деривата у односу на супстанце без супституције на позицији C-8. Коначно, вредност односа апсорпционих максимума траке Ιa и траке ΙΙ је критеријум за одређивање положаја супституента (C-6 или C-8). У случају супституције на C- 8, однос је мањи, док је у случају супституције на C-6 однос знатно већи. Велики батохроми и хиохромни ефекат траке I од +47 nm у раствору NaOMe у односу на метанолни раствор потврђује присуство слободне 4- хидроксилне групе. С обзиром на то да је спектар стабилан након неколико минута закључује се да нема слободне хидроксилне групе на C-3. Хипсохромно померање λmax [AlCl3- AlCl3/HCl] + 53 nm траке I које се запажа на спектру након додатка HCl у раствор AlCl3 супстанце, указује на разлагање комплекса насталог између AlCl3 са orto-дихидроксилном групом на Б-прстену. Батохромни ефекат траке I од λmax + 18.0 nm у раствору AlCl3/HCl у односу на метанолски раствор потврђује присуство слободне 5-хидроксилне групе у молекулу као и присуство метокси групе на C-6 (Mears & Mabry, 1972, Sakakibara & Mabry, 1977), док батохромни ефекат од λmax + 2 nm Траке II на спектру по додатку NaOAc указује на слободну хидроксилну групу на C-7. Ово се објашњава тиме да је NaOAc слаб алкални реагенс, а како је киселост хидроксилне групе на положају 7-OH смањена присуством метокси групе на C-6, није могућа потпуна јонизација, тако да се запажа померање мање од + 5 nm. Батохромно померање од λmax + 30 nm траке I у присуству NaOAc/H3BO3 потврђује присуство orto-дихидроксилне групе на Б прстену. OHO O OH OH OHO O O O Al Cl AlCl3 aqu HCl OH O Al Cl Cl OHO O OH OH O Al Cl Cl Слика 3.65 Хипохромно померање (око 30-50 nm) траке I на спектру AlCl3 након додатка раствора HCl РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 191 На 1H-NMR спектру супстанце 22 (Табела 3.26; Слика 3.66 – 3.67) уочавају се сигнали карактеристични за ABX систем Б-прстена. Два дублета на δH 7,39 (J=2,0 Hz) и δH 6,92 (J=8,4 Hz) као и двоструки дублет на δH 7,40 (J=8,4; 2,0 Hz) одговарају ароматичним протонима H-2, H-5 и H-6. На спектру се такође уочава један широки синглет на δH 6,56 који интеграцијом даје два протона. С обзиром на то да се на основу UV-Vis спектара закључује да на положајима C-3 и C-8 нема супституената, наведени пик одговара протонима H- 3 и H-8. С друге стране, синглет на δH 3,88 одговара метокси групи на положају C-6. Потврда предложене структуре добијена је помоћу HSQC и HMBC спектара: на HSQC спектру, широки синглет на δH 6,56 даје два сигнала δC 103,1 (C-3; HMBC) и δC 95,1 (C-8; HMBC) што потврђује две метинске групе које се налазе на истом положају у 1H-NMR спектру (Слика 3.66 – 3.67); вредности су у сагласности са литературним подацима (Flamini et al., 2001). На основу HMBC корелације метокси групе на δH 3,88 са угљеником на δC 132,6 потврђује да се наведена група налази на положају C-6 (Agrawal, 1989). Табела 3.26 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 22 (CD3OD; 400,0 MHz) * 13C-NMR хемијска померања добијена су на основу HSQC и HMBC експеримента. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Ring A C-1 - - - - - - C-2 C 166,0 - - - - C-3 CH 103,1 H-3 6,56 s 1 C-4 C=O 183,9 - - - - C-5 C n.o. - - - - C-6 C 132,6 - - - - C-7 C 154,8 - - - - C-8 CH 95,1 H-8 6,56 s 1 C-9 C 154,8 - - - - C-10 C 105,2 - - - - Ring B C-1 C 122,8 - - - - C-2 CH 113,8 H-2 7,39 d (J=2,0) 1 C-3 C 146,2 - - - - C-4 C 151,0 - - - - C-5 CH 116,5 H-5 6,92 d (J=8,4) 1 C-6 CH 119,9 H-6 7,40 dd (J=8,4, 2,0) 1 OCH3 CH3 60,2 CH3 3,88 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 192 Слика 3.66 1H-NMR спектар супстанце 22 (CD3OD; 400,0 MHz) O O OH HO OH 4' 3 5 6 7 8 OH 3' H3CO Слика 3.67 HSQC и HMBC спектри супстанце 22(CD3OD; 400,0 MHz); Најважније корелације добијене помоћу HMBC спектра РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 193 23. Хиспидулин 7-O--D-глукопиранозид; 5,6,7,4 тетрахидроксифлавон 6-метил етар 7-O--D-глукопиранозид Гликозид је већ изолован из следећих врста рода Centaurea: C. microcarpa (Louaar et al., 2011), C. bracteata (Flamini et al., 2001); C. urvillei DC. subsp. urvillei (Gülcemal et al., 2010). Супстанца 23 је излована из екстракта биљке као аморфан прах жуте боје и спектроскопском анализом одређена му је хемијска структура приказана на слици 3.68. O O OH O OH 4' 3 5 6 7 8 H3CO O HO HO OH OH 1'' 6'' Слика 3.68 23. Хиспидулин 7-O--D-глукопиранозид UV-Vis спектар супстанце 23 (Табела 3.27) је идентичан спектру описаном за агликон тј. хиспидулин (21). Табела 3.27 UV-Vis спектар супстанце 23 (λmax у nm) Трака ΙΙ Трака Ι Δλ (Ιa) MeOH 276,0 333,0 MeONa 276,5 296,0 (sh) 375,0 +42,0 AlCl3 283,0 300,0(sh) 354,0 +22,5 AlCl3/HCl 278,0 303,0 350,0 +17,0 NaOAc 272,0 Δλ (ΙΙ) -4,0 297,0(sh) 368,0 +33,0 NaOAc/H3BO3 278,0 300,0 338,0 +5,0 Потпуна структура супстанце добијена је на основу 1/2D NMR спектара. На 1H-NMR спектару (Табела 3.28; Слика 3.69) уочава се да је спин систем агликонског дела супстанце 23 карактеристичан за хиспидулин. Два дублета у РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 194 ароматичном делу спектра на H 7,88 (J=8,4; H-2', H-6') и H 6,92 (J=8,8; H-3', H- 5') потврђују para-супституисани B прстен. Синглет на H 6,68 као и широки синглет на H 6,98, који интеграцијом дају укупно два протона, окарактерисани су као протони H-3 и H-8. Хемијско померање H-8 на вишим вредностима објашњава се присуством 7-O супституента, с обзиром на то да су у случају присуства слободне –OH групе на C-7, хемијска померања протона H-6 и H-8 око H 6,2 - 6,5 (Μabrаy, 1970). Дублет на H 5,13 са константом спрезања J=7,2 Hz одговара аномерном протону (H-1) шећерне компоненте у молекулу. Вредност константе спрезања указује на присуство β-глукопиранозе (Markham, 1989) (Слика 3.69). На основу HSQC спектра, корелација протона са хемијским померањима на H 6,68 и H 6,98 са угљениковим атомима на H 103,4 и H 93,7 потврђује њихов положај на C-3 и C-8. Помоћу овог спектра идентификована су хемијска померања свих угљеникових атома шећерне компоненте: C-1'' (C 101,6), C-2'' (C 74,0), C-3'' (C 78,0), C-4'' (C 70,4) C-5''(C 77,4) and C-6''a,b (C 62,2). На основу HMBC спектра и корелације удаљених атома, корелација између протонског сигнала на H 6,98 и угљеникових атома C-7 (C 157,8), и C-9 (C 153,7) потпуно потвђује да наведени сигнал одговара протону H-8. Корелација са угљениковим атомом C-7 са хемијским померањем на C 157,8 уочава се и за сигнал аномерног протона шећера H-1на H 5,13, што потврђује позицију шећера, одређену и помоћу ROESY спектра, на коме се уочава корелација H-1са H-8 (H 6,98) (Слика 3.70). 13C-NMR спектар садржи двадесет три сигнала различитих угљеникових атома, чија су хемијска померања потпуно одређена на основу HSQC и HMBC спектара (Слика 3.70). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 195 Табела 3.28 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 23 (CD3OD; 400,0 MHz) *13C NMR хемијска померања су одређена на основу HSQC и HMBC експеримента **н.о. положај сигнала није одређен. Слика 3.69 1H-NMR спектар супстанце 23 (CD3OD; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Агликонски део A-прстен C-1 - - - - - - C-2 C 166,7 - - - - C-3 CH 103,4 H-3 6,67 s 1 C-4 C=O 183,7 - - - - C-5 C н.o. - - - - C-6 C 133,9 - - - - C-7 C 157,8 - - - - C-8 CH 93,7 H-8 6,98 br s 1 C-9 C 153,7 - - - - C-10 C 107,2 - - - - OCH3 CH3 61,2 CH3 3,90 s 3 B-Ring C-1 C 122,7 - - - - C-2 CH 129,5 H-2, H-6 7,88 d (J=8,2) 2 C-3 CH 115,4 - - - - C-4 C 162,6 - - - - C-5 CH 115,4 H-3, H-5 6,93 d (J=8,2) 2 C-6 CH 129,5 - - - - Шећерни део C-1 CH 101,6 H-1 5,13 d (J=7,2) 1 C-2 CH 74,0 H-2 3,57 m 2 C-3 CH 78,0 H-3 3,58 C-4 CH 70,4 H-4 3,41 t (J=8,8) 1 C-5 CH 77,4 H-5 3,52 t (J=8,4) 1 C-6a CH2 62,2 H-6a 3,95 d (J=10,6) 1 C-6b H-6b 3,72 dd (J=10,2; 4,6) 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 196 O O OH O OH H3CO O HO HO OH OH Слика 3.70 HSQC, HMBC, 13C-NMR и ROESY спектари супстанце 23 (CD3OD; 400,0 ; 50,3 MHz); најважније корелације добијене помоћу HMBC (црвене стрелице) и ROESY (зелене стрелице) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 197 24. Непетин-7-O-β-D-глукопиранозид; 5,6,7,3′,4′-Пентахидроксифлавон 6-метилетар 7-O-β-D-глукозид; Непитрин Претходно је супстанца изолована из Centaurea bracteata Scop. (Flamini et al., 2001). Супстанца 24 изолована је у облику жуто-зеленог праха и спекроскопском анализом одређена јој је следећа структура приказана на слици 3.71. O O OH O OH 4' 3 5 6 7 8 H3CO O HO HO OH OH OH 1'' 6'' Слика 3.71 24. Непетин-7-O-β-D-глукопиранозид UV-Vis спектроскопском анализом супстанце 24 добијене су карактеристичне траке са следећим вредностима апсорпционих максимума (Табела 3.29). Табела 3.29 UV-Vis спактар супстанце 24 (λmax у nm) Band ΙΙ Band Ι Δλ (Ιa) Ιib IIa Ιb Ia MeOH 254,0 273,0 342,0 MeONa 271,0 300,0 (sh) 342,0(sh) 395,0 +53,0 AlCl3 275,0 295,0(sh) 417,0 +75,0 AlCl3/HCl 262,0(sh) 279,0 295,0(sh) 342,0(sh) 362,0 +20,0 NaOAc 269.5 Δλ (ΙΙ) -3.5 341,0(sh) 396,0 +54,0 NaOAc/H3BO3 263,0 343,0(sh) 368,0 +26,0 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 198 UV-Vis спектар метанолског раствора супстанце 24 је типичан за флавоне који на позицији 3',4'-Б прстена садрже функционалне групе са кисеоником (Табела 3.29). У присуству MeONa, батохромно померање траке I од λmax= + 53 nm (у односу на спектар добијен у иницијалном раствору метанола), као и благо повећање апсорпционог максимума указује на присуство слободне C-4'-хидроксилне групе. Раздвајање траке I на спектру добијеном у раствору AlCl3/HCl, као и хипсохромно померање од [λmax= - 55 nm] у односу на спектар снимљен у раствору AlCl3 потврђује присуство orto-дихидроксилног система на Б-прстену, као и слободну хидроксилну групу на положају C-5. Такође, присуство дихидроксилног система на Б-прстену потврђено је и батохромним померањем траке I у раствору NaOAc/H3BO3 [λmax= + 26 nm]. С друге стране, батохромно померање од [λmax= + 20 nm у односу на спектар добијен у метанолском раствору] које се уочава на спектру добијеном у AlCl3/HCl раствору супстанце указује на присуство групе са кисеоником на положају C-6 (Sakakibara & Mabry, 1977). Хипсохромно померање[λmax= - 3,5 nm у односу на основни раствор] траке II на спектру снимљеном у NaOAc раствору супстанце потврђује присуство групе са кисеоником на положају C-6 као и одсуство слободне 7-OH. На 1H-NMR спектру (Табела 3.30; Слика 3.72) се уочавају три пика у ароматичном делу, карактеристични за ABX систем:  два дублета на H 7,42 (J=2,4) и H 6,91 (J=8,5) одговарају протонима H-2' и H-5' и  један двоструки дублет на H 7,44 (J=8,5; 2,4 Hz) карактеристичан за протон H-6'. Као и код супстанце 23 (стр. 195), два синглета на H 6,67 и H 6,98 указују на присуство H-3 и H-8. Слично, аномерни протон шећерне компоненте (H-1) уочава се у облику дублета на H 5,13 (J=7,2 Hz) што указује на присуство β-глукопиранозе (Markham, 1989). На основу HSQC спектра (Слика 3.73) утврђени су положаји свих протонованих угљеникових атома. Добијени подаци, у комбинацији са COSY спектром, омогућили су одређивање хемијских померања свих протона и угљеникових атома шећерне компоненте. Корелација протона на хемијским РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 199 померањима H 6,67 и H 6,98 и угљеникових атома на C 102,2 (C3) и C 94,1 (C8) потврђују њихову позицију (Agrawal, 1989). Позиција шећерне компоненте на угљениковом атому C-7 утвђена је помоћу rOe сигнала између H-1'' и H-8 (Слика 3.73). Табела 3.30 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 24 (CD3OD; 400,0 MHz) *Положаји су утврђени на основу HSQC спектра. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η Агликонски део A-прстен C-1 - - - - - - C-2 C - - - - - C-3 CH 102,2 H-3 6,67 s 1 C-4 C=O - - - - - C-5 C - - - - - C-6 C - - - - - C-7 C - - - - - C-8 CH 94,1 H-8 6,98 s 1 C-9 C - - - - - C-10 C - - - - - OCH3 CH3 61,2 CH3 3,90 s 3 Б-прстен C-1 C - - - - - C-2 CH 112,7 H-2 7,42 d (J=2,4) 1 C-3 C - - - - - C-4 C - - - - - C-5 CH 115,3 H-5 6,91 d (J=8,5) 1 C-6 CH 119,0 H-6 7,44 dd (J=8,5; 2,4) 1 Шећерна компонента Глукозна компонента C-1 CH 101,6 H-1 5,13 d (J=7,2) 1 C-2 CH 74,0 H-2 3,57 m 2 C-3 CH 78,0 H-3 3,58 C-4 CH 70,4 H-4 3,41 t (J=8,8) 1 C-5 CH 77,4 H-5 3,52 t (J=8,4) 1 C-6a CH2 62,2 H-6a 3,95 d (J=10,6) 1 C-6b H-6b 3,72 dd (J=10,2; 4,6) 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 200 Слика 3.72 1H-NMR спектар супстанце 24 (CD3OD; 400,0 MHz) O O OH O OH H3CO O HO HO OH OH OH Слика 3.73 HSQC и ROESY спектри супстанце 24 (CD3OD; 400,0 MHz) и најважније корелације са ROESY спектра РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 201 25. 6-Метоксикаемферол; 3,5,6,7,4-Пентахидроксифлавон 6-метил етар; 5,6,7,4-Тетрахидрокси флавонол 6-метил етар. Метокси дериват каемферола изолован је из следећих врста рода Centaurea sp.; C. senegalensis DC (Aqil et.al, 1998) и C. ruthenica (Mishio et al., 2006). Супстанца 25 изолована је у облику жутих кристалних иглица, а предложена хемијска структура, приказана на слици 3.74, потврђена је анализом добијених спектралних података. O O OH HO OH 4' 3 5 6 7 8 H3CO OH Слика 3.74 25. 6-Метоксикаемферол UV-Vis спектрална анализа супстанце 25 приказана је у Табели 3.31. Табела 3.31 UV-Vis спектар супстанце 25 (λmax у nm) Трака ΙΙ Трака Ι Δλ (Ιa) ΙIb IIa Ιb Ia MeOH 270,0 365,0 MeONa 272,0 423,0 +58,0 AlCl3 274,0 303,0(sh) 372,0(sh) 428,0 +63,0 AlCl3/HCl 273,0 295,0(sh) 368,0 422,0 +57,0 NaOAc 273,0 (sh) 288,0 Δλ (ΙΙ) +18 312,0(sh) 378,0 +13,0 NaOAc/H3BO3 271,0 344,0(sh) 366,0 +1,0 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 202 На UV-Vis спектру метанолског раствора супстанце уочавају се два апсорпциона пика на таласним дужинама λmax=269 и 367 nm. Наведени подаци одговарају подгрупи флавонола који не садрже orto-дихидроксилну групу на Б- прстену. Батохромно померање траке I од Δλ= + 58 nm (у односу на метанолски раствор) у раствору MeONa указује на присуство слободне 4-OH групе на Б- прстену док батохромно померање од Δλ= + 63 nm и Δλ= + 57 nm у AlCl3 и AlCl3/HCl растворима супстанце, указују на присуство 3-OH и 5-OH. Такође, додатком NaOAc у основни метанолски раствор, батохромно померање траке II од Δλ= + 18 nm је карактеристично за слободне 7-OH и 3-OH групе, нарочито за 3-OH групу. Стабилност пика након неколико минута на спектру добијеном снимањем у раствору NaOAc супстанце, потврђује групу са кисеоником на позицији C-6 и хидроксилну групу на положајима C-7 и C-5. Додатком борне киселине у раствор NaOAc, не запажају се веће разлике у односу на спектар снимљен у метанолском раствору, што потврђује одсуство orto-хидроксилних група у молекулу (Табела 3.31). На 1H-NMR спектру (Табела 3.32) уочавају се карактеристични пикови за p-супституисани Б-прстен (AA'BB' систем). Два дублета на H 7,86 и H 6,93 са константом спрезања од J=8,4 Hz одговарају протонима H-2', H-6' и H-3', H-5'. У истој ароматичној регији спектра уочава се један синглет на H 6,56 који одговара протону на прстену A (Слика 3.75). Даља потврда структуре супстанце добијена је помоћу 13C-NMR спектра (Слика 3.76). Спектар садржи шеснаест угљеникових атома, од којих петнаест одговарају основној структури флавоноида и један, са хемијским померањем на C 60,0, угљениковом атому метокси групе. 13C-NMR спектар потврђује флавонолну структуру скелета молекула с обзиром на разлике у хемијским померањима угљеникових атома C-4 [C 183,9 (стр. 191) на C 180,5] и C-2 [C 166,0 (стр. 191) C 156.1] ка нижим вредностима (вишим вредностима поља) у поређењу на флавонима. Такође, и угљеникови атоми који се уочавају на C 94,4 и C 134,7 су у сагласности са претпоставком о одсуству супституента на позицији C-8 као и на присуство хидроксилне групе на позицији C-3 (Слика 3.76). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 203 Табела 3.32 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 25 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) Слика 3.75 1H-NMR спектар супстанце 25 (CD3OD; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η A-прстен C-1 - - - - - - C-2 C 156,1 - - - - C-3 C 134,7 - - - - C-4 C=O 180,5 - - - - C-5 C 153,2 - - - - C-6 C 131,6 - - - - C-7 C 157,9 - - - - C-8 CH 94,4 H-8 6,56 s 1 C-9 C 153,1 - - - - C-10 C 103,5 - - - - OCH3 CH3 60,0 CH3 3,87 s 3 Б-прстен C-1 C 122,3 - - - - C-2 CH 128,4 H-2, H-6 7,86 d (J=8,4) 2 C-3 C 116,5 - - - - C-4 C 157,8 - - - - C-5 CH 116,5 H-3, H-5 6,93 d (J=8,4) 2 C-6 CH 128,4 - - - - РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 204 Слика 3.76 13C-NMR спектар супстанце 25 (CD3OD; 50,3 MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 205 3.4 Есенцијално уље C. pannonica Осушени делови биљке (цвет, лист и стабло) C. pannonica сакупљени у септембру 2009. године, подвргнути су поступку дестилације воденом паром, применом модификоване Clovenagel-ove апаратуре. Добијено је 0,043% есенцијалног уља (v/w, запремина уља у односу на суву масу биљке). Уље је анализирано применом GS/MS методе, а резултати добијеног спектра потврдили су присуство 45 једињења, што чини укупно 82,2% есенцијалног уља. Квантитативно (Табела 3.33) најзаступљенија група једињења су вишемасне киселине са уделом од 43,7%, при чему 9-октадеканске киселине има 34,0% а (Z,Z)-9,12-октадекадиенске киселине 8,6%. Једињења из групе сесквитерпена који садрже функционалне групе са кисеоником присутна су у количини од 18,7% . Основне супстанце ове групе су кариофилен оксид (8,0%) и спатуленол (6,0%) као и алдехид n-нонанал који је присутан у количини 3,2%. Добијени резултати су у доброј корелацији са до сада публикованим резултатима хемијског састава етарског уља биљне врсте C. pannonica (Слика 3.77). Иако се сматра да врсте које припадају роду Centaurea нису богате испаривим компонентама у поређењу са етарским уљем ароматичних биљака, ипак су биле предмет опсежних испитивања због њихове примене у медицинске сврхе. Испитиване су врсте са различитих географских подручја, али пре свега врсте Турске, где се налази и највећи број ендемитета, затим Грчке, Бугарске и Италије (Dural et al., 2003; Lazari et al., 1999, 2000; Rosselli et al., 2008; Senatore et al 2003; Yayli et al., 2005). Сесквитерпенски алкохоли, кетони, алдехиди, са једне стране, и вишемасне киселине, са друге стране, хемијски дефинишу карактер есенцијалних уља врста Centaurea. Кариофилен оксид и спатуленол идентификовани су у свим есенцијалним уљима (у различитом проценту), независно од порекла испитиване биљке. На основу литературних података, гермакрен Д се појављује у есенцијалним уљима биљака са подручја Турске РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 206 (Flamini et al., 2002, Karamenderes, 2008), али је у малом проценту присутан или га нема у уљима добијеним из биљака са подручја Грчке. Међу вишемасним киселинама идентификованим у есенцијалном уљу врста са различитих подручја, углавном преовлађују засићене масне киселине (Karamenderes, 2008). Вишемасне киселине су идентификоване у значајном проценту и у есенцијалним уљима добијеним из других врста секције Jacea: C. jacea са подручја Србије, C. bracteata и C. pannonica var. pannonica са подручја Хрватске (Milošević et al., 2010, Formisano et al., 2010). Друга карактеристика наведених врста секције Jacea јесте врло мали проценат алифатичних и кисеоничних деривата монотерпена, баш као у случају C. pannonica. Hemijski sastav esencijalno ulja izolovanog iz C. Pannonica (grupe hemijskih jedinjenja) 2,2%2,2% 6,8% 0,9% 43,7% 3,5% 18,7%1,3%2,9% Alkani, Alkeni Alkoholi Aldehidi Ketoni Višemasne kiseline i alifatični estri Seskviterpenski hidrougljenici Oksigovani seskviterpeni Raznovrsna jed. Jedinjenja sa 13 ugljenika Слика 3.77 Графички приказ основних група хемијских једињења изолованих из есенциајлног уља биљке C. рannonica РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 207 Табела 3.33 Хемијски састав (изражено у %) есенцијалног уља изолованог из биљке C. pannonica aRI, ретенциони индекс израчунат је на основу C9-C24 n-алкана на снимљених на HP-5MS колони (1) и HP- Innowax (2) капиларној колони, појединачно. Супстанца RI1a RI2a (%) (E)-2-Хексанал 851 1210 0,2 2-Пентил-фуран 990 1231 0,5 n-Октанал 996 1289 0,1 (E,E)-2,4-Хептадиенал 1010 1443 0,3 Бензил алкохол 1033 1,1 n-Нонанал 1102 1392 3,2 (E)-2-Ноненал 1163 1528 0,2 n-Деканал 1199 1500 1,3 (Ε)-2-Деканал 1265 1639 0,4 Дихидроедулан II 1288 1485 0,4 Дихидроедулан I 1291 1512 0,2 Теапиран A 1296 0,3 Теапиран B 1312 0,3 (E,E)-2,4-Декадиенал 1310 1812 0,5 E-β-Демаскенон 1378 1765 0,4 β-Елемен 1391 1572 0,4 β-Кариофилен 1417 1580 1,2 Видрен 1448 1598 0,3 α-Хумулен 1455 1660 0,3 Геранил ацетон 1458 1863 0,7 Гермакрен Д 1482 1701 1,0 β-Јонон 1486 1950 0,6 -Селинен 1492 1717 0,3 Тридеканал 1507 1817 0,3 1,5-Епоксисалвиал-4(14)-ен 1562 1924 - Спатуленол 1580 2120 6,0 Кариофилен оксид 1585 1987 8,0 Салвиал-4-(14)-ен-1-он 1595 2010 0,7 Нор-копанон 1610 2156 0,5 Вулгарол B 1615 2345 0,6 1,5,5,8-Тетраметил-12- оксибицикло[9.1.0]додека-3,7- диен 1626 1,3 Фоненол 1635 0,8 β-Еудесмол 1652 2238 1,6 Хептадекан 1700 1700 0,2 Октадекан 1800 1800 0,2 1,15-Пентадекандиол 1812 0,2 Хексадеканал 1815 2108 0,3 6,10,14-Триметил-2- пентадеканон 1842 2131 0,9 Хексадеканол 1872 2384 0,9 Етил линолеат 1894 0,2 (E,E)-Фарназил ацетон 1920 2386 - Хексадеканска киселина 1965 2911 0,7 11,14,17-Метил естар икосантриноичне киселина 2054 0,2 (Z,Z)-9,12-Октадекадиенска киселина 2130 3150 8,6 9- Октадеканска киселина 2140 3154 34,0 Пентакозан 2500 2500 1,0 Хептакозан 2700 2700 0,8 Укупно 82,2 [] 20 D =-0,98 (c=2,56; hep) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 208 3.5 Фенолне киселине 26. Рузмаринска киселина; 3,4-дихидроксициметна киселина (R)-9-карбокси-8-(3,4- дихидроксифенил) етил естар Рузмаринска киселина (и по хемијском саставу сличне супстанце) позната је под називом „Labiatengerbstoff”, чак и пре него што је њена хемијска структура била позната (Hermann, 1960). Сматра се да је рузмаринска киселина дериват танина, мада се данас све чешће описује као депсид кофеинске киселине. По први пут је изолована и идентификована у рузмарину (Rosmarinus officinalis L.) (структура је одређена као естер рузмаринске киселине и 3-(3,4- дихидроксидифенил) лактонске киселине (Scarpati & Oriente, 1958). Супстанца је изолована из неколико таксономски различитих биљних фамилија (Holzmanova, 1996; Petersen & Simmonds, 2003). Фамилије Αpiaceae, Borraginaceae и Lamiaceae садрже велику количину рузмаринске киселине, више од 3%. Што се тиче фамилије Lamiaceae, најчешће је изолована из биљака под- фамилије Nepetoideae (Litvinenko et al., 1975), којој припадају и врсте рода Origanum (стр. 64). Велику пажњу научника привлачи од када је откривено да рузмаринска киселина изолована из матичњака показује антивиралну активност на Herpes simplex вирус и да спречава његово ширење. Због наведене, али и због многих других биолошких активности сматра се природном супстанцом од посебног значаја (Vogt et al., 1991; Borkowski 1996). Супстанца 26 изолована је у облику тамно-црвеног уља и спектроскопским методама је одређена хемијска структура приказана на слици 3.78. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 209 O O COOH H HO HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' Слика 3.78 26. Рузмаринска киселина Метанолни раствор супстанце 26 показао је следећу вредност оптичке ротације: [] 20 D + 3, 44 (c=0,8; MeOH). Спектроскопском анализом (UV-Vis спектар) супстанце 26 добијене су карактеристичне криве са вредностима апсорпционих максимума приказаним у Табела 3.34. Табела 3.34 UV-Vis спектар метанолног раствора супстанце 26 Трака ΙI Трака Ι Ιb Ιa Δλ (Ιa) MeOH 290 328 MeONa 289,5 346 +18 NaOAc 289,5 345,5 +17,5 NaOAc/ H3BO3 293 347 +19 UV-Vis спектар метанолног раствора супстанце садржи два апсорпциона пика на λmax 290 (Трака II) и 328,0 nm (Трака I) карактеристична за фенолне киселина (Табела 3.34). Додавањем MeONa у основни раствор долази до батохромног померања траке I од + 18 nm, због брзе јонизације фенолних хидроксилних група. Батохромно померање траке I од само + 17,5 nm након додавања NaOAc указује да је дошло до супституције на карбоксилној групи. Присуство οrto-ΟΗ групе потврђено је батохромним померањем траке I од + 19 nm, након додатка NaOAc/ H3BO3. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 210 У ароматичној регији 1H-NMR спектра супстанце 26 (Табела 3.35; Слика 3.79; 3.80) уочавају се сигнали карактеристични за два ароматична ABX система:  Два дублета на H 7,04 (J=1,8 Hz) и H 6,78 (J=8,2 Hz), као и двоструки дублет на H 6,95 (J=8,2 Hz; 1,8 Hz) одговарају протонима H-2, H-5 и H-6 ароматичног прстена. Такође, уочавају се два дублета на H 7,54 и H 6,27 са константом спрезања J=16,0 Hz. Ови сигнали су карактеристични за два вицинална метинска протона trans-двоструке везе када се налази између ароматичног прстена са једне, и карбоксилне групе са друге стране. Представљени подаци омогућили су нам да окарактеришемо један ABX систем као 3,4-дихидроксициметна киселина (кофеинска киселина).  Дублети са нижим вредностима померања на H 6,75 (J=1,8 Hz) и H 6,69 (J=8,0 Hz), као и двоструки дублет на H 6,61 (J=8,0; 1,8 Hz) означени су као протони H-2, H-5 и H-6 другог ABX система. На спектру се још уочавају три сигнала:  у алифатичној регији спектра уочавају се два двострука дублета H 3,10 (J=14,0; 7,3 Hz) и H 3,00 (J=14,0; 3,8 Hz) који одговарају метиленским протонима на позицији H-7a,b, и  мултиплет са хемијским померањем на H 5,17 који одговара окси-метин протону (H-8). На основу свега горе наведеног, други ABX систем је идентификован као 3,4-дихидроксифенил-етил естер кофеинске киселине. Коначно 13C-NMR спектар садржи осамнаест угљеникових атома: девет метинских, један метиленски, шест квартернерних угљеникових атома и две карбонилне групе (HSQC). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 211 Табела 3.35 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 26 (CD3OD; 400,0 MHz; 50,3 MHz) Слика 3.79 1H-NMR спектар супстанце 26 (CD3OD; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C 127,8 - - - - C-2 CH 114,8 H-2 7,04 d (J=1,8) 1 C-3 C 147,5 - - - - C-4 C 149,7 - - - - C-5 CH 116,4 H-5 6,78 d (J=8,2) 1 C-6 CH 123,1 H-6 6,95 dd (J=8,2; 1,8) 1 C-7 CH 146,8 H-7 7,54 d (J=16,0) 1 C-8 CH 115,3 H-8 6,27 d (J=16,0) 1 C-9 C=O 168,6 - - - - C-1 C 129,9 - - - - C-2 CH 116,5 H-2 6,75 d (J=1,8) 1 C-3 C 146,1 - - - - C-4 C 145,1 - - - - C-5 CH 117,6 H-5 6,69 d (J=8,0) 1 C-6 CH 121,8 H-6 6,61 dd (J=8,0; 1,8) 1 C-7 CH2 38,2 H-7a 3,10 dd (J=14,0; 7,3) 1 H-7b 3,00 dd (J=14,0; 3,8) 1 C-8 CH 74,3 H-8 5,17 m 1 C-9 C=O 173,1 - - - - РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 212 Слика 3.80 13C-NMR и HSQC спектар супстанце 26 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 213 27. Метилестар рузмаринске киселине Метилестар рузмаринске киселине по први пут је изолован 1989. из биљке Salvia miltiorrhiza (Kohda et al., 1989). До данас, супстанца је изолована из различитих биљних врста, али само из две врсте рода Origanum: O. dictamnus (Chatzopoulou et al., 2010) са подручја Грчке, и O. vulgare (Ding et al., 2010) и из Јапана. Супстанца 27 изолована је као наранџаста уљана супстанца и спектроскопским методама је одређена структура приказана на слици 3.81. HO HO O O O HO OH 1 3 4 5 6 2 7 8 9 1' 2' 3'4' 5' 6' 7' 8' 9' OCH3 Слика 3.81 27. Метилестар рузмаринске киселине Метанолски раствор супстанце 27 показао је следећу вредност оптичке ротације: [] 20 D + 2,14 (c=1,08; MeOH). Анализом 1H-NMR спектра (Табела 3.36; Слика 3.82) супстанце 27 запажа се да је готово идентичан протонском спектру рузмаринске киселине (супстанца 26). Једино се разликује синглет на δH 3,70, који интеграцијом даје три протона што је директна индикација за постојање метил групе у молекулу. На основу осталих сигнала идентификована су два ABX система:  два дублета на δH 7,05 (J=2,0 Hz) и δH 6,78 (J=8,2 Hz), као и двоструки дублет на δH 6,95 (J=8,2; 2,0 Hz) одговарају протонима H-2; H-5 и H-6,  два дублета на δH 6,73 (J=1,8 Hz) и δH 6,69 (J=8,2 Hz), као и двоструки дублет на δH 6,58 (J=8,2; 1,8 Hz) одговарају протонима H-2'; H-5' и H-6'. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 214 Два AB дублета који одговарају trans-олефинским протонима на H 7,55 (J=16,0 Hz) и H 6,26 (J=16,0 Hz) представљају протоне H-7 и H-8 у молекулу. Један мултиплет на H 5,18 одговара окси-метинском протону H-8', док два двострука дублета на H 3,08 (J=14,0; 7,3) и H 3,00 (J=14,0; 4,2) представљају метиленске протоне H-7'a,b. Табела 3.36 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 27 (CD3OD; 400,0 MHz; 50,3 MHz) Слика 3.82 1H-NMR спектар супстанце 27 (CD3OD; 400,0 MHz) Положај Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C 127,6 - - - - C-2 CH 114,6 H-2 7,05 d (J=2,0) 1 C-3 C 147,8 - - - - C-4 C 149,7 - - - - C-5 CH 116,4 H-5 6,78 d (J=8,2) 1 C-6 CH 123,2 H-6 6,95 dd (J=8.2, 2.0) 1 C-7 CH 146,8 H-7 7,55 d (J=16,0) 1 C-8 CH 115,3 H-8 6,26 d (J=16,0) 1 C-9 C=O 168,3 - - - - C-1 C 128,9 - - - - C-2 CH 117,2 H-2 6,73 d (J=2,0) 1 C-3 C 146,2 - - - - C-4 C 145,3 - - - - C-5 CH 117,6 H-5 6,69 d (J=8,2) 1 C-6 CH 121,8 H-6 6,58 dd (J=8,2, 2,0) 1 C-7 CH2 38,1 H-7a 3,08 dd (J=14,0; 7,3) 1 H-7b 3,00 dd (J=14,0; 4,2) 1 C-8 CH 74,8 H-8 5,18 m 1 C-9 C=O 172,3 - - - - OCH3 CH3 52,7 CH3 3,70 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 215 13C-NMR спектар садржи деветнаест сигнала: један метил, један метилен, девет метинских и осам кватернерних угљеникових атома којима припадају и два карбоксилна угљеникова атома. Сигнали на вишим вредностима хемијских померања (нижим вредностима поља) C 149,7; 147,8; 146,2; 145,3 одговарају ароматичним угљениковим атомима за које је везан јак електрофил, тј. кисеоников атом (хидрокслине групе). Угљеников атом са померањем на C 52,7, означен је као метил група, естарски везана за карбоксилну групу (-COOCH3). Померање ка вишим вредностима хемијског померања сигнала који одговара угљенику карбоксилне групе C-9' (C 173,7 у односу на 172,3 супстанца 26) указује на 9'-O-метил естерификацију, што је у сагласности са литературним подацима (Parejo et al., 2004). Поред тога, на HMBC уочава се повезаност сигнала метил групе са сигналом за угљеник C-9', што је директан доказ горе наведене претпоставке о позицији метил групе (Слика 3.83). Супстанца показује антиоксидативну активност и депигментацију па се претпоставља да се може користити у индустрији хране као адитив или у козметици за контролу пигментације коже (Ding et al., 2010). Слика 3.83 HMBC и 13C-NMR спектри супстанце 27 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 216 28. 3-O-Метил рузмаринска киселина Први пут супстанца 28 је изолована из крви и урина мишева као продукт метаболизма након оралне употребе рузмаринске киселине (Baba et al., 2004). Ово је први пут да је супстнца изолована из рода Origanum, а други пут из биљног материјала. Први пут је изолована и идентификована из екстракта биљке са јапанског подручја, под називом Кеiskea japonica (Murata et al., 2012). Супстанца 28 изолована је као црвено-жута аморфна супстанца и одређена је следећа структура приказана на слици 3.84. O O COOH H H3CO HO OH OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' Слика 3.84 28. 3-O-Метил рузмаринска киселина Оптичка ротација метанолног раствора супстанце 28 одређена је и износи [] 20 D + 2,51 (c=0,7; MeOH). Анализом 1H-NMR спектра супстанце 28 (Табела 3.37; Слика 3.85) запажа се сличност са протонским спектром рузмаринске киселине (супстанца 26), уз присуство још једног синглета на H 3,90, који интеграцијом даје три протона, што је директна индикација присуства метокси групе у молекулу. С обзиром на то да су сигнали који одговарају ароматичним протонима једног ABX система померени ка вишим вредностима хемијских померања, у односу на сигнале ароматичних протона истог система код рузмаринске киселине H 7,20 у односу на H 7,04 (d, J=2,0 Hz; H-2), H 6,82 vs H 6,78 (d, J=8,2 Hz; H-5) и H 7,05 vs 6,95 (dd, J=8,2; 2,0 Hz; H-6), претпоставља се да је метокси група везана за један ароматични прстен. Хемијска померања сигнала на 13C-NMR спектру супстанце 28 готово су идентична сигналима на 13C-NMR спектру РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 217 супстанце 26. Једино се разликују сигнали који одговарају угљениковим атомима ароматичног прстена који садржи метокси групу као супституент: C 127,4 vs 127,8 (C-1), 111,4 vs 114,2 (C-2), 149,2 vs 147,5 (C-3), 149,5 vs 149,7 (C- 4), 116,2 vs 116,4 (C-5) и 124,5 vs 123,1 (C-6). Како долази до значајне промене померања ка вишим вредностима код угљеника C-3, сматра се да је до супституције дошло на овом угљениковом атому (Слика 3.86). Наведене вредности су у сагласности са литературним подацима за 3-O- метил рузмаринску киселину (Baba et al., 2004). Битно је такође напоменути да, упоређујући спектроскопске податке супстанце 28 и 27, примећује се битна разлика хемијских померања протона метил групе: H 3,90 (супст. 28) vs 3,70 (супст. 27); C 56,5 (супст. 28) vs 52,7 (супст. 27). Табела 3.37 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 28 (CD3OD; 400,0 MHz; 50,3 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C 127,4 - - - - C-2 CH 111,4 H-2 7,20 d (J=2,0) 1 C-3 C 149,2 - - - - C-4 C 149,5 - - - - C-5 CH 116,2 H-5 6,82 d (J=8,2) 1 C-6 CH 124,5 H-6 7,05 dd (J=8,2; 2,0) 1 C-7 CH 146,6 H-7 7,52 d (J=16,0) 1 C-8 CH 115,5 H-8 6,36 d (J=16,0) 1 C-9 C=O 168,8 - - - - C-1 C 129,4 - - - - C-2 CH 117,4 H-2 6,74 d (J=2,0) 1 C-3 C 145,5 - - - - C-4 C 144,3 - - - - C-5 CH 117,3 H-5 6,72 d (J=8,2) 1 C-6 CH 122,1 H-6 6,64 dd (J=8,2; 1,8) 1 C-7 CH2 38,3 H-7a 3,10 m 1 H-7b 3,05 m 1 C-8 CH 74,6 H-8 5,08 m 1 C-9 C=O 173,4 - - - - OCH3 CH3 56,5 CH3 3,90 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 218 Слика 3.85 1H-NMR спектар супстанце 28 (CD3OD; 400,0 MHz) Слика 3.86 HSQC и 13C-NMR спектри супстанце 28 (CD3OD; 400,0; 50,3 MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 219 3.6 Неолигнан 29. Глочидиобозид; (7S, 8R)-дихидро дехидро дикониферил алкохол-9'-O-β-D-глукопиранозид (7S, 8R)-7,8-дихидро-8-хидроксиметил-5'-метокси-2-(4-хидрокси-3-метоксифенил)- 1'-бензофуран-пропанол 9'-O-β-D-глукопиранозид Takeda et al. по први пут су супстанцу 29 изоловали 1998. године из биљке Glochidion obovatum и комплетно хемијски окарактерисали. До сада је супстанца изолована из многих биљних врста. Међутим, карактеристично је да већина биљака из којих је супстанца изолована потиче са кинеског подручја: (Glochidion zeylanicum (Gaertn) A. Juss (Otsuka et al., 2000), Bridelia glauca Bl. f. balansae (Tucht.) Hatusima, (Sueyoshi et al., 2007), Osmanthus heterophyllus (Machida et al., 2009), Chloranthus japonicus Sieb. (Kuang et al., 2009), Litsea glutinosa (Lour.) C. B. Rob (Yu Pan et al., 2010). Ово је први пут да је супстанца 29 изолована из рода Origanum. Супстанца 29 изолована је као наранџаста аморфна супстанца и одређена јој је следећа структура приказана на слици 3.87. O HO OCH3 OCH3 O OH 1 2 34 5 6 7 8 9 3' 4' 2' 5' 6' 1' 7' 8' 9' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' O OH OH OH HO Слика 3.87 29. Глочидиобозид РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 220 Оптичка ротација метанолског раствора супстанце 29 је одређена и износи [] 20 D – 31,6 (c=0,68; MeOH). На 1H-NMR спектру уочавају се четири сигнала у регији ароматичних протона. Два дублета на H 6,95 (J=1,4) и H 6,77 (J=8,2), као и двоструки дублет на H 6,82 (J=8,2; 1,4) чине један ABX систем и наводе на претпоставку да супстанца 29 у свом саставу садржи један-три супституисани ароматични прстен (Табела 3.38; Слика 3.88). У овој регији уочава се и један широки синглет на H 6,76 који интеграцијом даје два протона, карактеристичним за молекуле који садрже ароматични прстен са четири супституента. Табела 3.38 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 29 (CD3OD; 400,0 MHz) * вредности су утврђене на основу HSQC и HMBC спектара. ** Преклапање са сигналом OCH3. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C 133,7 - - - - C-2 CH 110,1 H-2 6,95 d (J=1,4) 1 C-3 C 149,0 - - - - C-4 C 146,7 - - - - C-5 CH 115,8 H-5 6,77 d (J=8,0) 1 C-6 CH 119,3 H-6 6,82 dd (J=8,0; 1,4) 1 C-7 CH 87,8 H-7 5,50 d (J= 6,3) 1 C-8 CH 55,7 H-8 3,47 m 1 C-9 CH2 64,7 H-9ª 3,84 ** 1 H-9b 3,75 dd (J=10,5; 7,6) 1 C-1 C 136,7 - - - - C-2 CH 113,8 H-2 6,76 brs 1 C-3 C 144,9 - - - - C-4 C 147,0 - - - - C-5 CH 146,5 - - - - C-6 CH 117,7 H-6 6,76 brs 1 C-7 CH 32,7 H-7 2,68 t (J=7,5) 2 C-8 CH 32,9 H-8 1,90 m 2 C-9 CH2 69,8 H-9a 3,93 m 1 H-9b 3,54 m 1 C-1 CH 104,1 H-1 4,24 d (J=7,7) 1 C-2 CH 74,8 H-2 3,20 t (J=8,0) 1 C-3 CH 77,8 H-3 3,36 m 1 C-4 CH 71,4 H-4 3,24 m 1 C-5 CH 77,4 H-5 3,24 m 1 C-6 CH2 62,5 H-6a 3,83 ** 1 H-6b 3,65 dd (J=11,9; 5,4) 1 3-OCH3 CH3 56,2 CH3 3,82 s 3 5-OCH3 CH3 56,5 CH3 3,86 s 3 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 221 Слика 3.88 1H-NMR спектар супстанце 29 (CD3OD; 400,0 MHz) На 1H-NMR спектру уочавају се још два синглета H 3,86 и H 3,82, карактеристична за метокси групе као и дублет на H 4,24 (J=7,7 Hz) сигнал карактеристичан за аномерни протон C-1 шећера, што сугерише и присуство β- D-глукопиранозне јединице у молекулу. COSY спектар даје три спин ситема:  Спин A: један оксиметин протон који се у облику дублета уочава на H 5,50 (J=6,3 Hz) куплован је са вициналним метин протоном који се у облику мултиплета налази на H 3,47. Вицинални метин протон се додатно куплује са два геминална хидроксиметил протона чија се померања налазе на H 3,84 (сигнал је делимично прекривен сигналом за метокси групу) и на H 3,75 у облику двоструког дублета (dd, J=10,5; 7,6 Hz). Описан систем као и хемијска померања сигнала одговарају хидроксиметил фурановом прстену.  Спин B: корелација између триплета на H 2.68 (J=7,5) и мултиплета на H 1,90, који је са друге стране у корелацији са мултиплетима на H 3,93 и H 3,54 указују на присуство хидрокси пропил групе у молекулу.  Спин C: корелација између протона шећера што потврђује присуство β-D- глукопиранозидне јединице. Коначна структура супстанце као и позиција шећерне компоненте добијена је на основу HSQC и HMBC спектара (Слика 3.89). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 222 Хемијско померање угљеника C-9' од δC 69,8 код супстанце 29 знатно је више у односу на супстанце које садрже слободну хидроксилну групу на позицији C-9' (δC 64,0) и указују на место везивања шећера (Takeda et al., 1998). Да је шећерна компонента везана за угљеник C-9' потврђено је помоћу HMBC спектра где се јасно уочава корелација између дублета на δC 4,24 (J=7,7 Hz; H-1'') сигнала карактеристичног за аномерни протон глукозе и угљеника C-9'. Такође, купловање између H-9a/C-7, H-2/C-7 и H-6/C-7, које се уочава на HMBC спектру, потврђује да је трисупституисани ароматични прстен везан за угљеник C-7 бензофуранског дела молекула. Помоћу HMBC спектра утврђене су и позиције метокси група у молекулу: једна метокси група се налази на C-3 трисупституисаног ароматичног прстена, док се друга метокси група налази на позицији C-5' бензофуранског прстена. Хетеронуклеарно HMBC купловање између 2H-7'/C-1', 2H-7'/C-2', 2H- 7'/C-6', 2H-7'/C-8' и 2H-7'/C-9' указује да је бочни низ везан за позицију C-1' бензофуранског прстена. Стереохемија супстанце 29 потврђена је упоређивањем хемијских померања и константи спрезања са вредностима датим у летаратури (Matsuda et al., 1996). Константа спрезања између 7-арил и 8-хидроксиметил протона од J=6,3 Hz указује на њихову trans конфигурацију. Апсолутна конфигурација супстанце 7S, 8R одређена је упоређивањем вредности хемијских померања за угљеникове атоме C-7 и C-8 на 13C-NMR са вредностима из литературе, који одговарају различитим диастереоизомерима. На основу литературних података хемијско померање C-7 и C-8 од δC 86,5–87,5 и 55,0–56,5, појединачно, одговара 7S,8R-конфигурацији; док су за 7R, 8S-конфигурацију супстанце одређена следећа хемијска померања δC 88,5–89,5 и 52,5–53,5 за угљеникове атоме C-8 и C-7, појединачно (Zheng et al., 2008). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 223 Слика 3.89 HMBC, COSY и HSQC спектри супстанце 29 (CD3OD; 400,0 MHz) и структурно приказане најважније корелације уочене на HMBC (црвене стрелице) и COSY спектру РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 224 3.7 Алициклични деривати 30. 12-O-Хидрокси јасмонична киселина Први пут супстанца 30 је изолована из гљиве B. theobromae (Miersch et al., 1991). Касније, супстанца је изолована из различитих биљних врста: Perilla frutescens (Fujita et al., 1996), Salvia officinalis (Wang et al., 2000), Thymus vulgaris (Kitajima et al., 2004). Из рода Origanum изолована је и идентификована у оквиру три врсте са подручја Грчке: O. vulgare L. ssp hirtum (Koukoulitsa et al., 2006), O. dubium Boiss. (Pachopos, 2007) and O. dictamnus (Chatzopoulou et al., 2010). Супстанца 30 изолована је у облику безбојног уља и одређена јој је следећа хемијска структура приказана на слици 3.90. O OH COOH 1 234 5 6 7 8 9 10 11 12 Слика 3.90 30. 12-O-Хидрокси јасмонична киселина Вредност оптичке ротације метанолног раствора супстанце 30 износи [] 20 D – 13,44 (c=0,8; MeOH). У 1Η-NMR делу спектра (Табела 3.39; Слика 3.91) карактеристичном за олефинске протоне, налазе се два двострука дублет триплета на δH 5,49 (J=11,8; 7,4; 1,0) и δH 5,42 (J=11,8; 7,4; 1,0) што одговара вициналним cis-метин протонима H-9, H-10. У сагласности са литературним подацима (Miersch et al., 1991), хемијска померања на δH 5,7-5,2 карактеристична су за природно добијене деривате јасмоничне киселине које у свом саставу имају бочни ланац са cis двоструком везом. На основу вредности константи спрезања и литературних података, триплет на δH 2,38 (J=5,9) одговара протонима H-8a,b, РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 225 док квартет на δH 2,31 (J=6,8) протонима на позицији H-11a,b. Такође, триплет на δH 3,55 одговара геминалним протонима на позицији Η-12a,b, док сигнали на нижим вредностима спектра одговарају алифатичним протонима молекула. Протонски спектар је идентичан спектрима за јасмоничну киселину претходно изоловану из врста рода Origanum (Chatzopoulou et al. 2010; Koukoulitsa et al., 2006; Pachopos, 2007). Табела 3.39 1H-NMR супстанце 30 (CD3OD; 400,0 MHz) Слика 3.91 1H-NMR спектар супстанце 30 (CD3OD; 400,0 MHz) Позиција Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η - - - - H-2а 2,67 dd (J=18,6; 13,9) 1 H-2b, H-3, H-4b,H-5b,H-7 2,25-2,09 m 4 H-4а 1,53 m 1 H-5а 2,00 ddd (J=18,6;10,2;8,3) 1 - - - - H-8a,b 2,38 t (J=5,9) 2 H-9 5,42 ddt (J=11,8; 7,4; 1,0) 1 H-10 5,49 ddt (J=11,8; 7,4; 1,0) 1 H-11a,b 2,31 q (J=6,8) 2 H-12a,b 3,55 t (J=6,8) 2 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 226 31. 12-O-Хидрокси јасмонична киселина 12-O-β-глукопиранозид Поред наведеног природног материјала и биљних врста из којих је изолована супстанца 30, супстанца 31 је идентификована и из S. tuberosum (Šimko, 1996). Супстанца 31 изолована је као безбојно уље и помоћу спектроскопских метода одређена је следећа структура приказана на слици 3.92. O O COOH 1 234 5 6 7 8 9 10 11 12 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' O OH OH OH HO Слика 3.92 31. 12-O-Хидрокси јасмонична киселина 12-O-β-глукопиранозид Вредност оптичке ротације метанолног раствора супстанце 31 износи [] 20 D – 9,24 (c=0,7; MeOH). Анализом 1H NMR спектра добијеног за супстанцу 31 уочава се сличност са протонским спектром 12-O-јасмоничне киселине (30), уз присуство и сигнала карактеристичних за β-глукопиранозу (Табела 3.40; Слика 3.93). Дублет на δ 4,27 (J=7,8 Hz), који је карактеристичан сигнал за аномерни протон H-1' шећера, у корелацији је са вициналним протоном H-2' на основу COSY спектра. Сигнал наведеног протона уочава се као двоструки дублет са померањем на δH 3,17 и константом спрезања J=9,0; 7,8 Hz. Вредности константи спрезања ова два протона карактеристични су за глукозу. Супротно 1H-NMR спектру супстанце 30, где се геминални протони H-12a,b налазе на δH 3,55 у облику триплета са константом J=6,9 Hz, овде су наведени протони два одвојена сигнала двоструки триплет на δH 3,88 (J=7,4; 9,6 Hz) и квартет на δ 3,56 (J=9,6 Hz) што указује да је глукоза као шећерна компонента везана за C-12. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 227 На 13C-NMR спектру супстанце 31 уочава се укупно осамнаест сигнала: шест сигнала глукозе и дванаест сигнала основног скелета. Међу њима, два сигнала карактеристична за карбоксилну групу на δC 222,7 (C-6) и δC 177,0 (C- 1), као и угљеник не δC 104,8 карактеристичан за угљеник C-1' шећера. Презенотовани подаци су у сагласности са литературним подацима (Fujita et al., 1996; Koukoulitsa et al., 2006; Pachopos, 2007; Chatzopoulou et al., 2010). Табела 3.40 1H-NMR и 13C-NMR супстанце 31 (CD3OD; 400,0; 50.3 MHz) * Сигнал делимично преклопљен са сигналом протона H-12а. ** Преклопљени сигнали. Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C=O 177,0 - - - - C-2 CH2 42,6 H-2a 2,69 dd (J=13,6; 18,4) 1 C-3 CH 39,7 H-3 2,25 m 1 C-4 CH2 29,4 H-4b 1,53 m 1 H-2b,H-4a,H-5b 2,15-2,04 m 3 C-5 CH2 39,2 H-5a 2,41** m 1 C-6 C=O 222,7 - - - - C-7 CH 55,6 H-7 1,98 m 1 C-8 CH2 27,4 H-8 3,47 m 1 C-9 CH 129,4 H-9 5,41 dt (J=7,2; 10,6) 1 C-10 CH 129,5 H-10 5,51 dt (J=7,0; 10,8) 1 C-11 CH2 29,8 H-11a,b 2,41** m 2 C-12 CH2 72,2 H-12a 3,88 dt (J=7,4; 9,6) 1 H-12b 3,56 q (J=9,6) 1 C-1 CH 104,8 H-1 4,27 d (J=7,8) 1 C-2 CH 75,6 H-2 3,17 dd (J=7,8; 9,0) 1 C-3 CH 78,6 H-3', H-4', H-5' 3,38-3,27 m 3 C-4 CH 70,7 C-5 CH 78,4 C-6 CH2 63,3 H-6a 3,85 * 1 H-6b 3,66 dd (J=5,3; 11,8) 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 228 Слика 3.93 1H-NMR и 13C-NMR спектри супстанце 31 (CD3OD; 400,0; 50,3MHz) РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 229 3.8 Монотерпенски гликозиди 32. Тимохинол-5-O--глукопиранозид Први пут супстанца је изолована из биљке Schisandra chinensis (Yahara et al., 1993), док је у оквиру фамилије Lamicaeae први пут изолована и хемијски окарактерисана из Origanum syriacum (Καmel et al. 2001). До данас је изолована још из две врсте рода Origanum: O. vulgare L. ssp hirtum (Koukoulitsa et al., 2006) и O. dubium Boiss. (Pachopos, 2007). Супстанца 32 је безбојно уље хемијске структуре приказано на слици OH CH3 O H3C CH3 O OH HO HO OH 1 2 3 45 6 7 8 9 10 1'2'3' 4' 5' 6' Слика 3.94 32. Тимохинол-5-O--глукопиранозид Вредност оптичке ротације метанолског раствора супстанце 32 износи [] 20 D – 24,3 (c = 0,37; MeOH). На 1H-NMR спектру супстанце 32 (Табела 3.41; Слика 3.95 – 3.96), уочавају се два синглета на δH 6,62 и δH 6,93 који одговарају протонима H-3 и H- 6, појединачно (Yahara et al., 1993). Мултиплет на δH 3,47 заједно са двоструким дублетом на δH 1,15 (J=6,8; 1,8 Hz), који интеграцијом даје укупно шест протона, указују на присуство изопропил групе као бочног ланца у молекулу (H-8, CH3-9 и CH3-10, појединачно). Са друге стране, синглет на δH 2,13 који интеграцијом даје три протона карактеристичан је за метил групу CH3-7 (Yahara et al., 1993). У области од δH 3,30 до δH 4,70, 1H-NMR спектра уочава се неколико сигнала који интеграцијом дају укупно седам протона РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 230 карактеристичних за молекул глукозе. Како је сигнал аномерног протона глукозе идентификован на δH 4,70 у облику дублета са константом спрезања J=7,5 Hz, утврђена је β-конфигурација глукопиранозидне јединице. Табела 3.41 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 32 (CD3OD; 400,0 MHz) * Вредности су добијене на основу HSQC и HMBC спектара. Слика 3.95 1H-NMR спектар супстанце 32 (CD3OD; 400,0 MHz) Позиција Тип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C 123,1 - - - - C-2 C 152,2 - - - - C-3 CH 112,2 H-3 6,62 s 1 C-4 C 138,2 - - - - C-5 C 149,2 - - - - C-6 CH 119,8 H-6 6,93 s 1 C-7 CH3 15,8 H-7 2,13 s 3 C-8 CH 26,8 H-8 3,47 m 1 C-9 CH3 23,5 H-9,H-10 1,15 dd (J=1,8; 6.8) 6 C-10 CH3 23,4 C-1 CH 103,9 H-1 4,70 d (J=7,5) 1 C-2 CH 74,1 H-2,H-3 H-4,H-5 3,49-3,33 m 4 C-3 CH 76,9 C-4 CH 70,5 C-5 CH 77,4 C-6 CH2 61,9 H-6a 3,88 dd (J=1,5; 12.0) 1 H-6b 3,70 dd (J=5,1; 12,0) 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 231 Помоћу ROESY спектра утврђена је конформација молекула као и положај шећерне компоненте. Дублет на δH 4,70 који одговара аномерном протону глукозе H-1 даје rOe сигнал са синглетом на вишим вредностима померања δH 6,93 (H-6), што указује на то да је глукоза везана за угљеников атом C-5. Такође, rOe сигнал синглета на δH 1,15 (CH3-7) и горе наведеног синглета на δH 6,93 (H-6) потврђује да је метил група супституент на позицији C-1 док rOe сигнал између H-3 и CH3-9/ CH3-10 потврђује претпоставку да се изопропил група налази на C-4 (Слика 3.96). Са HSQC и HMBS спектара утврђено је да молекул укупно садржи шест угљеникових атома несупституисаног шећера са померањима на: δC 103,9 (C-1'); 74,1 (C-2'); 76,9 (C-3'); 70,5 (C-4'); 77,4 (C-5') и 62,4 (C-6') заједно са 10 угљеникових сигнала агликона који одговарају следећим хемијским групама: три метил групе (δC 15,8; 23,4 и 23,5), три метин групе (δC 26,8; 112,2; 119,8) и четири кватернерна угљеникова атома (δC 152,2; 149,2; 138,2 и123,1). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 232 OH CH3 O H3C CH3 O OH HO HO OH Слика 3.96 HMBC, HSQC и ROESY спектри супстанце 32 (CD3OD; 400,0 MHz); Структурно представљене корелације уочене на HMBC (црвене стрелице) и ROESY спектрима 33. Тимохинол-2-O--глукопиранозид Први пут супстанца 33 идентификована је у биљци Sphaeranthus bullatus (Jakupovic et al., 1990). Поред наведених биљних врста рода Origanum из којих је изолована претходно описана супстанца 32, супстанца 33 је изолована и идентификована и из врсте O. dictamnus (Chatzopoulou et al., 2010). Супстанца 33 изолована је као жуто уље и одређена јој је структура приказана на слици 3.97. O CH3 HO O OH H3C CH3 OH OH HO 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7 1 6 2 35 4 89 10 Слика 3.97 33. Тимохинол-2-O--глукопиранозид РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 233 Вредност оптичке ротације метанолног раствора супстанце 33 износи [] 20 D – 37,8 (c=0,7; MeOH). 1H-NMR спектар супстанце 33 (Табела 3.42; Слика 3.98 – 3.99) је веома сличан протонском спектру тимохинол-5-O--глукопиранозида (32), са следећим разликама:  синглет у ароматичном делу спектра је померен ка вишим вредностима фреквенције [Δδ=- 0,10 ppm], од δH 6,52 на 6,62,  мултиплет који одговара H-8 је такође померен ка вишим вредностима [Δδ=- 0,27 ppm] (δH 3,20 vs 3,47). Ове разлике указују да је шећерна компонента везана у para- положају у молеку 33 у односу на 32. Табела 3.42 1H-NMR и 13C-NMR* супстанце 33 (CD3OD; 400,0 MHz) * Вредности су добијене на основу HSQC и HMBC спектара. Позиција Tип C атома Хемијско померање δ (ppm) Хемијско померање δ (ppm) Константа спрезања J (Hz) Бр. Η C-1 C 126,9 - - - - C-2 C 150,5 - - - - C-3 CH 115,3 H-3 6,98 s 1 C-4 C 133,4 - - - - C-5 C 150,1 - - - - C-6 CH 117,6 H-6 6,52 s 1 C-7 CH3 15,6 H-7 2,18 s 3 C-8 CH 27,8 H-8 3,20 m 1 C-9 CH3 22,6 H-9,H-10 1,19 dd (J=1,4; 6,9) 6 C-10 CH3 22,4 C-1 CH 104,1 H-1 4,67 d (J=7,5) 1 C-2 CH 75,0 H-2,H-3 H-4,H-5 3,49-3,33 m 4 C-3 CH 77,6 C-4 CH 70,9 C-5 CH 77,9 C-6 CH2 62,5 H-6a 3,88 dd (J=2,2; 12,0) 1 H-6b 3,70 dd (J=5,2; 12,0) 1 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 234 Слика 3.98 1H-NMR спектар супстанце 33 (CD3OD; 400,0 MHz) Такође, на основу HMBC спектра супстанце 33, C-2 на δC 150,5 је у корелацији са метил групом на δ 2,18 (H-7) и ароматичним синглетом на δH 6,52 (H-6), који је у овом случају померен ка нижим вредностима, у односу на вредности код супстанце 32 код које је на HMBC спектру уочено да је C-2 на δC 152,2 у корелацији са метил групом на δH 2,13 (H-7) као и ароматичним синглетом на δH 6,93 (H-6). На основу свега наведеног, изводи се закључак да синглет на нижим вредностима одговара протону H-6, док синглет на вишим вредностима фреквенције одговара протону H-3, што је супротно положају сигнала код супстанце 32 (δH 6,93 vs 6,62). На основу ових запажања, као и промена које су уочене код хемијских померања угљеника C-2 (δC 150,5 vs 152,2) и C-5 (δC 150,1 vs 149,2) упоређивањем спектроскопских података супстанци 32 и 33 потврђује се претпоставка да се шећерна компонента налази на C-2 угљениковом атому код супстанце 33, што је у сагласности са литературним подацима (Jakupovic et al., 1990). Положај свих угљеникових атома утврђен је на основу HSQC и HMBC спектара (Слика 3.99). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 235 O CH3 HO O OH H3C CH3 OH OH HO Слика 3.99 HSQC и HMBC спектри супстанце 33 (CD3OD; 400,0 MHz); Структурно приказане најбитније корелације добијене на основу HMBC спектра РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 236 3.9 Антимикробна активност 3.9.1 Антимикробна активност екстраката, фракција и чистих једињења биљке Centaurea pannonica Применом микродилуционе методе на 11 бактерија и квасац Candida albicans одређена је антимикробна активност неполарног екстракта биљке C. pannonica која се креће у опсегу од 31,25 – 125,0 µg/mL, при чему је екстракт најактивнији на E. faecalis (31,25 µg/mL). Фракција означена PAV_F је најактивнија према културама E. faecalis (15,62 – 31,25 µg/mL) и A. baumannii 31,25 µg/mL. Од свих тестираних једињења, супстанце 8, 12, 13 су показале најбољу антибактеријску активност и код њих је измерена минимална инхибиторна концентрација (MIC) 31,25 – 125,0 µg/mL и минимална бактерицидна концентрација (MBC) 62,5 – 250,0 µg/mL. Неполарни екстракт биљке као и фракција F која садржи сесквитерпенске лактоне 1, 9, 10, 13, показују израженију антимикробну активност у односу на појединачне супстанце. Такође, супстанца 3, која чини смешу супстанце 2 и 3 у односу 3:1 показује благо појачану активност у односу на остала изолована једињења. Проучавајући резултате антимикробне активности сесквитерпенских лактона датих у табели 3.43 запажа се да су све супстанце показале приближно исту, умерену, антимикробну активност. Од свих 14 тестираних сесквитерпенских лактона изолованих из C. pannonica гвајанолиди 8, 10, 11, 12, 13 и гермакранолид 14 показали су најјаче дејство на испитиване микроорганизме MIC 31,25 – 125,0 µg/mL док се активност свих осталих лактона кретала у опсегу MIC 125,0 – 500,0 µg/mL. Према резултатима микродилуционе методе изоловани флавоноиди показали су знатно слабију активност у односу на Sls (Табела 3.44). Супстанца 21 је инхибирала раст свих тестираних микроорганизама у концентрацијама 62,5 – 500,0 µg/mL. Остали флавоноиди показали су врло слабу активност или потпуну неактивност на микроорганизме S. aureus и C. albicans. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 237 Од наведених група једињења изолованих из биљке C. pannonica, лигнани су показали најслабију активност од MIC 125,0 – >500 µg/mL (Табела 3.44), са изузетком арктина који је показао нешто већу активност. Резултати антимикробне активности есенцијалног уља биљке C. pannonica указују да уље показује значајну активност (Табела 3.45). Слично као код супстанци и екстракта, грам (+) бактерије су осетљивије на дејство етеричног уља у односу на грам (–) сојеве, што је у сагласности са претходним испитивањима (Yayli et al., 2005). Нађено је да уље изоловано из C. pannonica показује јаку бактерицидну активност на метил-резистентан сој S. aureus (MBC је 0,63 µL/mL), средње јаку активност на сојеве E. faecalis, M. lysodeikticns, K. pneumoniae и C. albicans (MBC је 0,63 – 5,00 µL/mL) и потпуну неактивност на бактерије E. coli и P. aeruginosa MIC, MBC >5,00 µL/mL. Добијена антимикробна активност уља може се објаснити садржајем основних идентификованих метаболита есенцијалног уља: 9-октадеканоинска киселина и (Z,Z)-9,12-октадекадиенска киселина, кариофилен-оксида и спатуленола. Све наведене супстанце појединачно, показале су значајну антимикробну активност у досадашњим испитивањима на поједине сојеве бактерија и гљива. У овом случају, међутим, не сме се занемарити присуство појединих компоненти у уљу у мањим количинама и њихов евентуални синергистички ефекат са основним метаболитима (Bougatsos et al., 2004; Lanciotti et al., 2003; Marino et al., 2001; Zheng et al., 2005). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 238 Табела 3.43 Антимикробна активност сесквитерпенских лактона (1-14) изолованих из биљке C. pannonica (MIC и MBC µg/mL) * Смеша две супстанце (2 и 3). Супстанцa Грам (–) бактерије Грам (+) бактерије Квасац Стандарни сој Клинички изолати Стандардни сој Клинички изолати Стандардни сој Escherichia coli 25922 Pseudomonas aeruginosa 27853 Escherichia coli 2020 Pseudomonas aeruginosa 2503 Klebsiella pneumoniae 2645 Acinetobacter baumannii 5310 Citrobacter amalonaticus 6168 Enterococcus faecalis 29212 Enterococcus faecalis 2049 Staphylococcus aureus 0801 Candida albicans 164279 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC 1 125,0 250,0 125,0 250,0 250,0 500,0 125,0 125,0 125,0 250,0 62,5 125,0 250,0 250,0 62,5 62,5 125,0 125,0 62,5 250,0 500,0 - 2 125,0 500,0 62,5 250,0 250,0 - 125,0 125,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 125,0 62,5 62,5 125,0 125,0 62,5 250,0 500,0 - 3* 125,0 250,0 62,5 125,0 125,0 250,0 31,25 62,5 62,5 250,0 62,5 62,5 125,0 250,0 31,25 62,5 62,5 125,0 62,5 125,0 125,0 250,0 4 250,0 500,0 62,5 250,0 250,0 500,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 125,0 250,0 250,0 62,5 125,0 125,0 125,0 500,0 - 500,0 - 5 250,0 500,0 125,0 250,0 250,0 250,0 250,0 250,0 125,0 250,0 62,5 125,0 250,0 500,0 125,0 125,0 125,0 250,0 125,0 250,0 500,0 - 6 250,0 250,0 125,0 250,0 500,0 - 250,0 250,0 125,0 250,0 62,5 125,0 125,0 125,0 62,5 62,5 250,0 250,0 125,0 250,0 500,0 500,0 7 250,0 250,0 125,0 250,0 250,0 250,0 125,0 250,0 250,0 250,0 125,0 250,0 250,0 250,0 125,0 125,0 250,0 250,0 250,0 500,0 500,0 - 8 125,0 250,0 125,0 125,0 125,0 250,0 62,5 125,0 62,5 125,0 62,5 62,5 125,0 125,0 62,5 62,5 62,5 125,0 250,0 250,0 500,0 - 9 250,0 250,0 62,5 125,0 250,0 500,0 125,0 250,0 250,0 500,0 62,5 125,0 250,0 250,0 62,5 62,5 62,5 125,0 250,0 250,0 500,0 500,0 10 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 500,0 62,5 250,0 125,0 125,0 125,0 125,0 250,0 250,0 62,5 125,0 62,5 125,0 125,0 125,0 125,0 250,0 11 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 125,0 62,5 125,0 125,0 125,0 31,25 62,5 31,25 62,5 62,5 125,0 125,0 500,0 12 125,0 250,0 62,5 250,0 250,0 500,0 62,5 125,0 125,0 250,0 62,5 125,0 125,0 125,0 31,25 62,5 31,25 62,5 125,0 125,0 250,0 500,0 13 125,0 250,0 62,5 250,0 125,0 250,0 62,5 125,0 125,0 125,0 62,5 125,0 125,0 250,0 31,25 62,5 31,25 62,5 125,0 125,0 125,0 250,0 14 125,0 125,0 62,5 125,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 62,5 125,0 250,0 250,0 31,25 62,5 62,5 62,5 62,5 125,0 250,0 500,0 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 239 Табела 3.44 Антимикробна активност лигнана (15-18), флавоноида (19-25) екстракта и фракције биљке C. pannonica (MIC и MBC µg/mL) Супстанцa Грам (–) бактерије Грам (+) бактерије Квасац Стандарни сој Клинички изолати Стандардни сој Клинички изолати Стандардни сој Escherichia coli 25922 Pseudomonas aeruginosa 27853 Escherichia coli 2020 Pseudomonas aeruginosa 2503 Klebsiella pneumoniae 2645 Acinetobacter baumannii 5310 Citrobacter amalonaticus 6168 Enterococcus faecalis 29212 Enterococcus faecalis 2049 Staphylococcus aureus 0801 Candida albicans 164279 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MFC 15 250,0 250,0 250,0 250,0 125,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 125,0 500,0 250,0 250,0 125,0 125,0 125,0 500,0 >500,0 - н.а. - 16 250,0 250,0 250,0 250,0 125,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 125,0 500,0 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 500,0 >500,0 - н.а. - 17 250,0 500,0 250,0 250,0 125,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 125,0 500,0 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 500,0 >500,0 - 500,0 500,0 18 250,0 250,0 250,0 250,0 125,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 125,0 500,0 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 500,0 >500,0 - н.а. - 19 125,0 250,0 125,0 250,0 250,0 500,0 62,5 250,0 125,0 500,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 125,0 62,5 125,0 250,0 500,0 н.а. - 20 125,0 250,0 125,0 250,0 250,0 500,0 62,5 250,0 250,0 500,0 125,0 125,0 250,0 250,0 125,0 125,0 62,5 125,0 250,0 500,0 н.а. - 21 250,0 125,0 125,0 125,0 125,0 500,0 125,0 250,0 125,0 500,0 62,5 250,0 125,0 250,0 62,5 125,0 62,5 125,0 >500,0 - 500,0 - 22 250,0 125,0 125,0 250,0 125,0 500,0 125,0 250,0 125,0 500,0 62,5 500,0 125,0 250,0 62,5 125,0 62,5 125,0 >500,0 - н.а. - 23 250,0 500,0 250,0 250,0 250,0 500,0 250,0 500,0 250,0 500,0 62,5 500,0 250,0 250,0 250,0 500,0 125,0 250,0 125,0 250,0 н.а. - 24 250,0 500,0 250,0 250,0 250,0 500,0 250,0 500,0 125,0 500,0 62,5 500,0 250,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 >500,0 - н.а. - 25 125,0 125,0 125,0 125,0 250,0 500,0 62,5 250,0 250,0 500,0 125,0 125,0 250,0 500,0 125,0 250,0 62,5 62,5 250,0 250,0 н.а. - Eкст. PAV 125,0 125,0 62,5 125,0 62,5 125,0 62,5 125,0 62,5 125,0 31,25 62,5 62,5 125,0 31,25 62,5 31,25 62,5 125,0 250,0 125,0 125,0 Фрак. F 125,0 125,0 62,5 62,5 62,5 125,0 62,5 125,0 62,5 250,0 31,25 62,5 62,5 125,0 15,62 62,5 31,25 62,5 62,5 250,0 125,0 250,0 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 240 Табела 3.45 Антимикробна активност есенцијалног уља биљке C. pannonica (MIC и MBC µL/mL) а Стандардни антибиотици коришћени у раду: тетрациклин за бектерије и нистатин за C. albicans изражени у µg/mL. Микроорганизми Есенцијално уље C. pannonica Стандард MIC MBC MICа MBCа Бактерије Грам (+) бактерије E. faecalis 0,63 0,63 0,31 0,31 M. lysodeikticus 2,50 5,00 0,62 1,25 S. aureus 0,31 0,63 0,62 1,25 Грам (–) бактерије E. coli >5,00 >5,00 0,31 0,62 K. pneumoniae 1,25 1,25 0,31 0,31 P. aeruginosa >5,00 >5,00 >2,50 >2,50 Квасац C. albicans 2,50 5,00 0,31 0,31 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 241 3.9.2 Антимикробна активност екстраката, фракција и чистих једињења биљке О. scabrum Супстанце изоловане из поларног екстракта О. scabrum показале су умерену активност на тестиране микроорганизме. Најосетљивија бактерија је изолат A. baumannii са измереном MIC 62,5 – 125,0 µg/mL, док je најотпронији микроорганизам Citrobacter amalonaticus са MIC 125,0 – 500,0 µg/mL. Испитивани екстракт је показао нешто израженију антимикробну активност у односу на испитиване супстанце. Дериват рузмаринске киселине, супстанца 28 и неолигн 29 са MIC 62,5 – 250,0 µg/mL јесу супстанце са најизраженијом активношћу, док су монотерепенски гликозиди са MIC 250,0 – >500 µg/mL показали најслабију активност на испитиване микроорганизме (Табела 3.46). Значајну активност у односу на све остале испитане супстанце на сој S. aureus показује супстанца 26 са MIC 62,5 µg/mL, као и супстанца 30 на C. albicans са истом вредношћу минималне инхибиторне концентрације. Екстракти обе биљке имају знатно бољу активност од појединачних једињења, њихове вредности минималне инхибиторне концентрације су приближне фосфомицину MIC 32 µg/mL код појединих испитиваних сојева бактерија. Такође, сва једињења су показала знатно бољу активност на грам (+) сојеве и чак знатно јачу код соја E. faecalis од антибиотика Гентамицин Синерги MIC 500 µg/mL и Стрептомицин Синерг. <=1000,0 µg/mL (Табелe 3.47 – 3.48). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 242 Табела 3.46 Антимикробна активност секундарних метаболита изолованих из биљке О. scabrum (MIC и MBC µg/mL) Супстанцa Грам (–) бактерије Грам (+) бактерије Квасац Стандарни сој Клинички изолати Стандардни сој Клинички изолати Стандардни сој Escherichia coli 25922 Pseudomonas aeruginosa 27853 Escherichia coli 2020 Pseudomonas aeruginosa 2503 Klebsiella pneumoniae 2645 Acinetobacter baumannii 5310 Citrobacter amalonaticus 6168 Enterococcus faecalis 29212 Enterococcus faecalis 2049 Staphylococcus aureus 0801 Candida albicans 164279 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC 26 250,0 250,0 250,0 500,0 500,0 500,0 125,0 250,0 250,0 500,0 125,0 250,0 500,0 500,0 125,0 125,0 125,0 500,0 62,5 250,0 250,0 250,0 27 250,0 500,0 250,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 250,0 250,0 125,0 250,0 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 500,0 125,0 500,0 250,0 250,0 28 250,0 500,0 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 125,0 62,5 250,0 125,0 125,0 125,0 250,0 125,0 500,0 125,0 500,0 250,0 500,0 29 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 125,0 125,0 250,0 62,5 125,0 250,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 250,0 500,0 125,0 125,0 30 250,0 500,0 250,0 500,0 250,0 500,0 250,0 500,0 250,0 250,0 125,0 250,0 250,0 250,0 125,0 125,0 250,0 500,0 250,0 500,0 62,5 125,0 31 125,0 125,0 125,0 500,0 500,0 500,0 125,0 250,0 250,0 500,0 125,0 250,0 250,0 500,0 125,0 125,0 125,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 32 250,0 500,0 250,0 500,0 250,0 250,0 250,0 500,0 500,0 500,0 125,0 250,0 500,0 250,0 250,0 250,0 250,0 500,0 500,0 - 125,0 250,0 33 250,0 250,0 250,0 500,0 250,0 250,0 250,0 500,0 250,0 500,0 125,0 250,0 250,0 250,0 250,0 250,0 250,0 500,0 250,0 250,0 125,0 125,0 Eкст. ORI 125,0 250,0 125,0 125,0 250,0 125,0 125,0 125,0 250,0 250,0 62,5 62,5 250,0 250,0 125,0 125,0 125,0 250,0 125,0 250,0 125,0 250,0 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 243 Табела 3.47 Антимикробна активност антибиотика на G(–) сојеве бактерија (MIC µg/mL) Антибиотик Грам (–) бактерије Стандарни сој Клинички изолати Escherichia coli 25922 Pseudomonas aeruginosa 27853 Escherichia coli 2020 Pseudomonas aeruginosa 2503 Klebsiella pneumoniae 2645 Acinetobacter baumannii 5310 Citrobacter amalonaticus 6168 MIC MIC MIC MIC MIC MIC MIC Амикацин <=16 <=16 <=16 >32 32 >32 <=16 Амо/К Clav >8/4 >16/8 16/8 >16/8 >16/8 >16/8 <=8/4 Aмпицилин <=8 >16 >16 >16 >16 >16 <=8 Цефазолин <=8 >16 >16 >16 >16 >16 <=8 Цефепим <=8 16 <=8 >16 >32 >16 <=8 Цефотаксим <=2 8 <=2 >32 >8 >32 <=2 Цефокситин <=8 >8 <=8 >8 >16 >8 <=8 Цефтазидим <=1 8 <=1 >16 >16 >16 <=1 Цефуроксим <=4 >16 >16 >16 >16 >16 8 Цолистин <=2 4 <=2 <=2 >4 <=2 <=2 Ертапенем <=2 >4 <=2 >4 >4 >4 <=2 Фосфомицин <=32 <=32 <=32 <=32 <=32 >32 <=32 Гентамицин <=4 <=4 <=4 8 <=4 <=4 <=4 Имипенем <=4 8 <=4 >8 >8 >8 <=4 Левофлоксацин <=2 <=2 >4 >4 >4 4 <=2 Меропенем <=1 <=1 <=1 8 >8 >8 <=1 Мезлоцилин <=16 <=16 64 >64 >64 >64 <=16 Нитрофурантоин <=32 >64 <=32 >64 >64 >64 <=32 Норфлоксацин <=4 <=4 <=8 >8 >8 >8 <=4 Пиперацилин <=16 <=16 64 64 >64 >64 <=16 Тетрациклин <=4 >8 >8 >8 <=4 >8 <=4 Тобрамицин <=4 <=4 >8 >8 >8 8 <=4 Триметоприм <=8 >8 >8 >8 >8 >8 <=8 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 244 Табела 3.48 Антимикробна активност антибиотика на G(+) сојеве бактерија (MIC µg/mL) Антибиотик Грам (+) бактерије Стандардни сој Клинички изолати Enterococcus faecalis 29212 Enterococcus faecalis 2049 Staphylococcus aureus 0801 MIC MIC MIC Амо/К Clav <=4/2 <=4/2 <=4/2 Aмпицилин 8 <=0,25 >8 Цефалотин 16 16 <=8 Хлорамфеникол <=8 <=8 <=8 Ципрофлоксацин <=1 <=1 <=1 Клиндамицин >2 >2 0,5 Даптомицин 4 4 <=1 Еритромицин 4 <=0,5 <=0,5 Фосфомицин <=32 >32 <=32 Фусидна киселина <=2 <=2 16 Гент. Синерги <=500,0 <=500,0 - Гентамицин 8 8 <=4 Левофлоксацин <=1 <=1 <=1 Линезолид <=2 <=2 <=2 Моксифлоксацин <=0,5 <=0,5 <=0,5 Нетилмицин <=8 <=8 <=8 Нитрофурантои <=32 <=32 <=32 Норфлоксацин <=4 <=4 <=4 Оксацилин >2 >2 >2 Пеницилин 8 8 >8 Рифампин <=1 <=1 <=1 Стреп. Синерги <=1000,0 <=1000,0 - Синерицид >2 2 <=1 Тикопланин <=1 <=1 <=1 Тетрациклин >8 >8 <=2 Триметх/Сулф <=2/38 <=2/38 <=2/38 Ванцомицин 4 4 2 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 245 3.10 Хемотаксономски значај изолованих метаболита Род Centaurea L. сматра се таксономски веома компликованим због различите морфологије и поленске разноврсности врста (Susanna and Garcia- Jacas, 2007). Таксономско сређивање рода је и данас изазов за ботаничаре. На основу најновијих истраживања на молекуларном нивоу три монофилетске групе су дефинисане унутар рода (Acrocentron, Cyanus и Jacea). Чак више, предлаже се да се одређене секције уједињују унутар група. Centaurea pannonica припада секцији Jacea-Lepteranthus унутар групе „Centaurea jacea” (Jacea). Група је највећа унутар рода и садржи укупно 29 секција. Карактер групе је специфичан Centaurea jacea тип полена (Garcia-Jacas et al., 2000). Хемијском анализом врста из групе су изоловани различити секундарни метаболити при чему основне групе једињења чине сесквитерпенски лактони, флавоноиди и лигнани. Гвајанолиди су изоловани из 54 врсте рода Centaurea L., при чему 23 припадају групи Jacea (Milošević-Ifantis et al., 2013). Јако оксидовани и халогеновани гвајанолиди су предоминантна подгрупа гвајанолида унутар групе, са цинароциприном и јанерином (супстанца 5) као основним конституентима, док су гвајанолиди који садрже хлоров атом основни конституенти врста које припадају двема груписаним секцијама Jacea- Lepteranthus. Хлорохисопфолин Ц (супстанца 2) и деривати су идентификовани у свим врстама секције Lepteranthus, тако да се може сматрати евентуалним хемотаксономским маркером наведене групе секција. Готово да нема хемотаксономске разлике између ове две секције; ово запажање везано за хемијски састав унутар две секције је у потпуној сагласности са предлогом о груписању ове две секције базираном на DNA анализи (Garcia-Jacas et al., 2006). Од осталих гвајанолида изолованих из биљке C. pannonica бабилин A (супстанца 1) је изолован из C. babylonica (секција Microlophus), бабилин Б (супстанца 6) и цебелин J (супстанца 7) из C. glastifolia L. (Cheirolepis- Pseudoseridia-Pteracantha-Plumosipappus комплекс). У сагласности са референцом научне групе Гарциа-Јакас (Garcia-Jacas), C. thracica (Janka) Hayek је премештена из секције Microlophus у групу секција Cheirolepis-Pseudoseridia- РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 246 Pteracantha-Plumosipappus, чак више њихов предлог да Cheirolepis и Microlophus секције треба редефинисати у потпуности је у сагласности са нашим подацима (Garcia-Jacas et al., 2006). Хлорорепдиолид (супстанца 10), епоксирепдиолид (супстанца 12), репдиолид (супстанца 13) и репин (супстанца 3) изоловани из C. pannonica су идентификоване у биљци C. repens, бившој врсти рода Centaurea L., која је регруписана у род Rhaponticum Vaill.; такође, рхапосерин (супстанца 8) је изолована први пут из биљке Rhaponticum seratuloides (Georgi) Bobrov., врсти која такође припада роду Rhaponticum. Овај податак као и присуство гвајанолида (Cis et al., 2006) у недавно редефинисаном роду Rhaponticum Vaill. подржавају претпоставку да врсте из групе Jacea имају јаку хемотакономску повезаност са наведеним родом. Интересанто је да из врсте C. jacea од које је Jacea група добила назив, није изолован ни један гвајанолид већ два гермакранолида, кницин и ацетиловани дериват 4'-ацетилкницин (Forgo et al., 2012), потенцијални хемотаксономски меркер секције Acrolophus (Nowak, 1992; Gousiadou and Skaltsa, 2003; Janaćković, 2004a,b). Узимајући у обзир да су гермакранолиди кницин, салонитенолид и њихови деривати идентификовани заједно са гвајанолидима у неким врстама рода Centaurea L. које припадају осталим секцијама унутар Jacea групе, ова чињеница може објаснити хемијски профил C. jacea L. Чак више у сагласности са Janaćković (2004a) присуство кницина у неким врстама подрода Jacea је повезано са присуством салонитенолида, такође је важно напоменути да све претходно испитане врсте било које секције садрже салонитенолид деривате са бочним ланцем на позицији C-8, док се код супстанце 3 бочни ланац налази на позицији C-15. Међу лигнанима, диарилбутиролактони арктигенин, матересинол и арктин (супстанаца 15-17) идентификовано у 90% да сада испитаних Centaurea врсте. Присуство фенилпропаноид гликозида сирингина (супстанца 18) као дериват синапил алкохола, активног интермедијера биосинтетичког пута лигнана је очекиван (Dewick, 2001). РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 247 Метиловани флавоноиди и њихови гликозиди су дефинисани као основна подгрупа унутар Centaurea L. (Formisano et al., 2012). Чак више, флавоноиди са метокси групом на позицији C-6, као и шећерном компонентом на C-7 могу се сматрати важним хемотаксономским маркером не само за секцију Jacea-Lepteranthus, већ и за целу Jacea групу. Презентовани флавоноиди (19-25) изоловани из биљке C. pannonica су у комплетној сагласности са недавном публикацијом научне групе Formisano et al., (2012), која је у ревијалном раду презентовала све до сада изоловане флавоноиде из група Cardueae, фамилије Asteraceae. Анализом есенцијалног уља добијено је укупно 45 једињења што чини 82,2% укупне количине уља. Квантитативно најзаступљеније групе једињења су вишемасне киселине и оксидовани сесквитерпенски деривати. Како су из секције Jacea-Lepteranthus испитане четри Centaurea врсте и у свима је нађено да су најзаступљеније групе вишемасне киселине и оксидовани сесквитерпени, ове групе једињења се могу сматрати евентуалним хемотаксономским маркером секције у даљим истраживањима (Milošević et al., 2010). Origanum scabrum припада потфамилији Nepetoideae унутар фамилије Lamiaceae и ово је једина врста из секције Anatolicon Bentham рода Origanum (Ietswaart, 1980) која је испитана до данас. Из биљке је изоловано и идентификовано 8 супстанци које припадају следећим групама: фенолне киселине типа депсида (супстанце 26-28), неолигнан (29), алициклични деривати (30-31) и монотерпенски гликозиди (32-33). Основно једињење изоловано из биљке је рузмаринска киселина, која је изолована из многих врста фамилије Lamiaceae и сматра се потенцијалним хемотаксономским маркером потфамилије Nepetoideae (Zgorka and G1owniak, 2001; Grayer and de Kok, 1998). Рузмаринска киселина и њени деривати су карактеристични секундарни метаболити рода Origanum, с обзиром да је рузмаринска киселина идентификована у готово свим врстама рода Origanum испитиваним до сада. Такође, како су врсте рода Origanum богате есенцијалним уљима, па самим тим моно/сескви-терпенима, присуство монотерпенских гликозида је очекивано. Ова група једињења укључује тимихинол-5-О-β-глукопиранозид (супстанца 32) и тимохинол-2-О-β-глукопиранозид (супстанца 33) који су по први пут изоловани РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА 248 из Origanum syriacum (Kamel et al., 2001) а затим и из врста са Грчког подручја O. dictamnus (Chatzopoulou et al., 2010) и O. vulgare ssp. hirtum (Koukoulitsa et al., 2006), као и из врсте Origanum tyttanthum из Узбекистана (Takeda et al., 2008). Интересантно је напоменути да су алициклични деривати до сада изоловани само из предходно наведених врста са Грчког подручја и да нису до сада изоловани ни из једне биљне врсте из потфамилије Nepetoideae. Неолигнан глочидиобизид је први пут изолован из рода Origanum и може бити интересантан маркер потфамилије Nepetoideae у будућим истраживањима (Milošević-Ifantis et al., 2012). 4. ЗАКЉУЧАК ЗАКЉУЧАК 249 На основу добијених резултата можемо извести следеће закључке: 1. Хемијска анализа биљака Centaurea pannonica  Из врсте Centaurea pannonica (Heuffel) Simonkai хроматографским и спектроскопским методама изоловано је 25 супстанци (супсатанца 1-25) од којих је 14 сесквитерпенских лактона, 7 флавоноида, 3 лигнана и 1 фенилпропаноид глукозид.  Међу наведеним једињењима изоловане су и идентификоване 3 нове супстанце из групе сесквитерпенских лактона, први пут изоловане из природног материјала:  Гермакранолид - 2α-Хидрокси 8-дехидрокси-15-Ο-метакрилат салонитенолид (Супстанца 14)  Гвајанолиди - 2α,8α-Дихидрокси дехидрокостунолид лактон (Супстанца 9) - Панонин (Супстанца 11).  Сесквитерпенски лактон рхапосерин (Супстанца 8) и флавоноид диосметин (Супстанца 20) су по први пут изоловани из врсте рода Centaurea.  Применом GC/MS анализирано је есенцијално уље биљке C. pannonica. Идентификовано је 45 супстанци што чини 82,2% укупног састава есенцијланог уља. Квантитативно најзаступљеније групе једињења су вишемасне киселине са 43,7% и оксиговани сесквитерпени 18,7%. Origanum scabrum  Из врсте Origanum scabrum Boiss. & Heldr. изоловано је и идентификовано 8 супстанци (супсатанца 26-33) од којих су 3 фенолне киселине из групе депсида, 2 гликозидна монотерпена, 2 алициклична деривата и 1 неолигнан. ЗАКЉУЧАК 250  Све наведене супстанце су по први пут изоловане из биљке, док су дериват рузмаринске киселине 3-O-метил рузмаринска киселина (супстанца 28) и неолигнан глочидиобозид (супстанца 29) први пут изоловани из рода Origanum. 2. Антимикробна активност Centaurea pannonica  На основу добијених резултата истраживања антимикробне активности, коришћењем микродилуционе методе, евиденто је да сви тестирани узорци поседују антимикробну активност.  Од три групе једињења изолованих из биљке, сесквитерпенски лактони, показали су најизраженију активност, при чему су од 14 испитиних Sls, најачу активност показали гвајанолиди са више кисеоничних група 8, 10, 11, 12, 13 као и гермакранолид 14.  Флавоноиди и лигнани су показали знатно слабију активност на испитане сојеве.  Резултати антимикробне активности есенцијалног уља биљке C. pannonica указују да уље показује значајну активност, нађено ја да уље изоловано из C. pannonica показује јаку бактерицидну активност на метил-резистентан сој S. аureus. Origanum scabrum  Супстанце изоловане из поларног екстракта О. scabrum показале су умерену активност на тестиране микроорганизме.  Дериват рузмаринске киселине, супстанца 28 и неолигнан 29 су супстанце са најизраженијом активношћу док су монотерепенски гликозиди показали најслабију активност на испитиване микроорганизме.  Испитивани екстракти и изоловане фракције биљака показали су јачу антимикробну активност у односу на појединачне супстанце.  У поређењу са комерцијалним антибиотицима тестирани узорци су у већини случајева показали слабију антимикробну активност. ЗАКЉУЧАК 251 3. Хемотаксономски значај Centaurea pannonica  Основни секундарни метаболити изоловани из биљке C. pannonica секција Jacea-Lepteranthus, група Jacea су сесквитерпенски лактони, група гвајанолида.  Од укупно 40 врста рода Centaurea из којих су изоловани и идентификовани гвајанолиди, двадесет врста припада групи Jacea.  У групи су нарочито заступљени оксиговани гвајанолиди тако да се могу сматрати евентуалним хемотаксономским маркером групе.  Унутар секције Jacea-Lepteranthus испитано је укупно 8 врста.  Нарочито заступљени су хлоровани деривати гвајанолида, који су врло ретко заступљени у природи. Како је наведена група једињења идентификована у готово свим испитиваним врстама може се сматрати потенцијалним хемотаксономским маркером секције. Origanum scabrum  Рузмаринска киселина и њени деривати су основна група једињења изолована из врсте O. scabrum.  Како је наведена киселина изолована из готово свих врста рода Origanum, може се сматрати потенцијалним хемотаксономским маркером.  Неолигнан глочидиобозид је изолован по први пут из рода Origanum и интересантан је хемијски маркер за даља истраживања унутар наведеног рода. ЛИТЕРАТУРА 252 ЛИТЕРАТУРА 1. Aaby, K., Hvattum, E., Skrede, G., 2004. Analysis of flavonoids and other phenolic compounds using high-performance liquid chromatography with coulometric array detection: Relationship to antioxidant activity. J. Agric. Food Chem. 52, 4595–4603. 2. Adams, R.P., 2007. Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectroscopy (4th ed.) Carol Stream, IL: Allured Publishing Co., Illinois. 3. Agrawal, P.K., 1989. Carbon-13 NMR of flavonoids. Central Institute of Medicinal and Aromatic plants, Luknow, India, Elseiver, Amsterdam, Oxford, New York, Tokio. 4. Akbar, S., Fries, D.S., Malone M.H., 1995. Effect of various pretreatments on the hypothermic activity of repin in naive rats. J. Ethnopham. 49, 91–99. 5. Akkal, S., Benayache, F., Bentamene, A., Medjroubi, K., Seguin, E., Tillequin, F. 2003 Flavonoid aglycones from Centaurea napifolia. Chem.Nat. Comp. 39, 219-220. 6. Alasalvar, C., Grigor, J.M., Zhang, D., Quantick, P.C., Shahidi, F., 2001. Comparison of volatiles, phenolics, sugars, antioxidant vitamins, and sensory quality of different colored carrot varieties. J. Agric. Food Chem. 49 1410–1416 7. Alberto Marco, J., Sanz, F.J., Albiach, R., Rustaiyan, A., Habibi, Z., 1993. Bisabolene derivatives and sesquiterpene lactones from Cousinia species. Phytochemistry 32, 395-400. 8. Al-Easa, H.S., Mann, J., Rizk, A.F., 1990. Guaianolides from Centaurea sinaica. Phytochemistry 29, 1324-1325. 9. Aligiannis, N., Kalpotzakis, E., Mitaku, S., Chinou, I.B., 2001. Composition and antimicrobial activity of the essential oils of two Origanum species. J. Agric. Food Chem. 40, 4168–4170. 10. Al-Saghir, J.; Al-Ashi, R.; Salloum, R.; Saliba, NA.; Talhouk, RS., Homaidan FR., 2009. Anti-inflammatory properties of Salograviolide A purified from Lebanese plant Centaurea ainetensis. BMC Complement. Altern. Med. 9, 36. 11. Amábile-Cuevas, C.F., 2010. Global perspectives of the resistance problem. In Sosa AJ, Byarugada DK, Amábile-Cuevas CF, Okeke I, Kariuki S, Hsueh PR, editors. Antimicrobial resistance in developing countries. New York: Springer. 3-13. 12. Amaratunga, C., Sreng, S., Suon, S., Phelps, E.S., Stepniewska, K., et al. 2012. Artemisinin-resistant Plasmodium falciparum in Pursat province, western Cambodia: a parasite clearance rate study. Lancet. Infect. Dis. 12, 851–858. 13. Amiguet, V.T., Petit, P., Ta, C.A., Nuñez, R., Sánchez-Vindas, P., Alvarez, L.P., Smith, M.L., Arnason, J.T., Durst, T., 2006. Phytochemistry and antifungal properties of the newly discovered tree pleodendron costaricense. J. Nat. Prod., 69, 1005–1009. ЛИТЕРАТУРА 253 14. Appendino, G., Gariboldi, P., Belliardo, F., 1986. Sesquiterpene lactones from Centaurea uniflora ssp. nervosa. Phytochemistry 25, 2163-2165.Öksüz, S., Serin, S., Topçu, G., 1994. Sesquiterpene lactones from Centaurea hermanii. Phytochemistry 35, 435–438. 15. Aqil, M., Khan, I.Z., Diamari, G.A. 1998. Flavonoids from Centaurea senegalensis DC (Compositae) .Bull. Chem. Soc. Ethiop. 12, 177-180. 16. Aslan, Ü., Öksüz, S., 1999. Chemical constituents of Centaurea cuneifolia. Turk J Chem, 23, 15–20. 17. Assaf, M.H., Ali, A.A., Makboul, M.A., Beck, J.P., Anton, R., 1987. Preliminary study of phenolic glycosides from Origanum majorana; quantitative estimation of arbutin; cytotoxic activity of hydroquinone. Planta Med. 53, 343– 345. 18. Ayres, D.C., Loike J.D. 1990. Lignans-Chemical, biological and clinical propertis, Cambridge University Press, Cambridge, New York. p.198. 19. Baba, S. Osakabe N., Natsume, M., Terao, J., 2004. Orally administered rosmarinic acid is present as the conjugated and/or methylated forms in plasma, and is degraded and metabolized to conjugated forms of caffeic acid, ferulic acid and m-coumaric acid. Life Sci. 75, 165–178. 20. Barreroa, A.F., Oltraa, J.E. Álvareza, M., Raslanb, S.D., Saúdec, A.D., Akssirad, M., 2000. New sources and antifungal activity of sesquiterpene lactones. Fitoterapia 71, 60–64. 21. Barton Sir, D., Nakanishi, K., Meth-Cohn, O., 1999. Comprehensive natural products chemistry. Elsevier Science Ltd, London. 22. Bastos, M.M., Kijjoa, A. S.M.,, Cardoso Jose M., Gutierrez Alicia B., Herz W., 1990. Constituents of Centaurea sphaerocephala ssp. polyacantha, Planta Med. 56, 403–405. 23. Bellakhdar, J., Passannanti, S., Paternostro, M.P., Piozzi, F., 1988. Constituents of Origanum compactum. Planta Med., 54, 94–94. 24. Bendahou, M., Muselli, M., Grignon-Dubois, M., Benyoucef, M., Desjobert, J.M., Bernardini, A.F., 2008. Antimicrobial activity and chemical composition of Origanum glandulosum Desf. essential oil and extract obtained by microwave extraction: Comparison with hydrodistillation. Food Chem. 106, 132-139. 25. Bentamène, A., Benayache, S., Creche, J., Petit, G., Bermejo-Barrera, J., Leon, F., Benayache, F., 2005. A new guaianolide and other sesquiterpene lactones from Centaurea acaulis L. (Asteraceae). Biochem. Syst. Ecol. 33, 1061–1065. 26. Berdin, A.G., Adekenov, S.M., Raldugin, V.A., Shakirov, M.M., Druganov, A.G., Kulyyasov, A.T. Tolstikov, G.A., 1999. Rhaposerine and rhaserolide, new sesquiterpene lactones from Rhaponticum serratuloides. Russ. Chem. Bull. 48, 1987–1991. 27. Berdin, G.A., Raldugin, A.V., Shakirov, M.M., Bagryanskaya, Yu.I., Gatilov, V.Yu., Druganov, G.A., Kulyyasov, T.A., Adekenov, M.S., Habdolda, G., Tolstikov, A.G., 2001. 15-O-Deacetylrhaposerin and rhaserin-new components of a lactone mixture from Rhaponticum serratuloides. Russ. Chem. Bull. 50, 537–542. 28. Behal, V., 2001. Nontraditional microbial bioactive metabolites. Fol. Microbiol. 46, 363–370. 29. Berg, J.M., Tymoczkom, J.L,, Stryer, L., 2007. Biochemistry. W.H. Freeman and company, New York. ЛИТЕРАТУРА 254 30. Bick J.A., Lange B.M., 2003 Metabolic cross talk between cytosolic and plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis: unidirectional transport of intermediates across the chloroplast envelope membrane. Arch. Biochem. Biophys. 415, 146–154. 31. Bohlmann, F., Ziesche, J., 1980. Neue Guajanolide und Acetylenverbindungen aus Ptilostemon-Arten. Phytochemistry 19, 692–696. 32. Bohlmann, F., Gupta, R.K., 1981. Guaianolides from Centaurea canariensis. Phytochemistry 20, 2773–2775. 33. Bohlmann, F., Adler, A., King, R.K., Robinson, H., 1982a. Germacranolides from Mikania grazielae. Phytochemistry 21, 1169–1170. 34. Bohlmann, F., Zdero, C., 1982b. Chemotaxonomy of the genus Pleiotaxis. Phytochemistry 21, 1434–1435. 35. Bohlmann, F., Gupta, R.K., 1982c. 8β-hydroxy dehydrozaluzanin C from Andryala pinnatifida. Phytochemistry 21, 1799–1800. 36. Bohlmann, J, Meyer-Gauen, G., Croteau, R., 1998. Plant terpenoid synthases: molecular biology and phylogenetic analysis. Proc Natl Acad Sci USA 95(8):4126–4133. 37. Bojňanský, V., Fargašová, A., 2007. Atlas of Seeds and Fruits of Central and East-European Flora: The Carpathian Mountains region. Springer. Berlin, Heidelberg. 38. Bork, P.M.,Schmitz, M.L., Kuhnt, M.,Escher, C., Heinrich, M., 1997. Sesquiterpene lactone containing Mexican Indian medicinal plants and pure sesquiterpene lactones as potent inhibitors of transcription factor NF-kappaB. FEBS Lett. 402, 85–90. 39. Borkowski, B., Biesiadecka, A., 1996. Comparison of virusostatic activity of caffeic, chlorogenic and rosmarinic acid (in Polish), Herba Pol. 317–321. 40. Bosabalidis, A., Gabrieli, C., Niopas, I., 1998. Flavone aglycones in glandular hairs of Origanum x intercedens. Phytochemistry 49, 1549–1553. 41. Bougatsos C, Ngassapa O, Runyoro KBD, Ioanna BC. 2004. Chemical composition and in vitro antimicrobial activity of the essential oils of two Helichrysum species from Tanzania. Zeit. Naturf. C. 59, 368–372. 42. Bruno, M., Diaz, G.J., Herz, W., 1991. Guaianolides and lignans from C. solstitialis subsp. schouwii. Phytochemistry 30, 4165–4166. 43. Bruno, M., Fazio, C., Paternostro, M.P., Diaz, J.G., Herz, W., 1995. Sesquiterpene lactones and other constituents of Centaurea napifolia. Planta Med. 61, 374–375. 44. Bruno, M., Paternostro, M.P., Gedris, T.E., Herz, W., 1996. Sesquiterpene lactones and other constituents of Centaurea nicaensis, Phytochemistry 41, 335– 336. 45. Bruno, M., Vasallo, N., Fazio, C., Gedris, E.T., Herz, W., 1998. Sesquiterpene lactones of two Centaurea species from Sicily. Biochem. Syst. Ecol. 26, 801– 803. 46. Bruno, M., Rosselli, S., Maggio, A., Raccuglia, A.R., Arnold A.N., 2005. Guaianolides from Centaurea babylonica. Biochem. Syst. Ecol. 33, 817–825. 47. Bruno, M., Rosselli, S., Maggio, A., Raccuglia, A.R., Bastow, F.K., Lee, H-K., 2005. Cytotoxic activity of some natural and synthetic guaianolides. J. Nat. Prod. 68, 1042–1046. 48. Burt, S., 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods:a review. Int J Food Microbiol 94:223–253. ЛИТЕРАТУРА 255 49. Butler, M.S., 2008. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Nat. Prod. Rep. 25, 475–516. 50. Cardona, M.L., Fernandez, I., Pedro, J.R., Perez, B., 1991. Sesquiterpene lactones and Flavonoids From Centaure aspera. Phytochemistry 30, 2331-2333. 51. Cardona M. L., Garcia B., Munoz M. C., Navarro F. I., Pedro J. R., 1997. New sesquiterpenes and other constituents from Centaurea paui. Liebigs Ann./Recl., 3, 527-532. CA 126: 314852. 52. Carpita, N., McCann, M., 2000. The cell wall. In Biochemistry and Molecular Biology of Plants, B.B. Buchanan, G. Wilhelm, and R.L. Jones, eds Rockville, IL: American Society of Plant Physiologists, 52–108. 53. Cartagena, E., Montanaro, S., Bardón, A., 2008. Improvement of the antibacterial activity of sesquiterpene lactones. Rev. Latinoamer. Quím. 36/2, 43-51. 54. Çelik, S., Rosselli, S., Maggio, A.M., Raccuglia, A.R., Uysal, I., Kisiel, W., Michalska, K., Bruno, M., 2006. Guaianolides and lignans from the aerial parts of Centaurea ptosimopappa. Biochem. Syst. Ecol. 34, 349–352. 55. Chaturvedi, D., 2011. 10. Sesquiterpene lactones: Structural diversity and their biological activities Opportunity, Challenge and Scope of Natural Products in Medicinal Chemistry, 313-334. ISBN: 978-81-308-0448-4 56. Chatzopoulou, A., Karioti, A., Gousiadou, C., Lax Vivancos, V., Panagiotis K., Golegou, S., Skaltsa, H., 2010. Depsides and Other Polar Constituents from Origanum dictamnus L. and Their in Vitro Antimicrobial Activity in Clinical Strains. J. Agric. Food Chem. 58, 6064–6068. 57. Chicca, A., Tebano, M., Adinolfi, B., Ertugrul, K., Flamini, G., Nieri, P., 2011. Anti-proliferative activity of aguerin B and a new rare nor-guaianolide lactone isolated from the aerial parts of Centaurea deflexa. Eur. J. Med. Chem. 46, 3066–3070. 58. Christensen, L.P., Lam, J., 1991a. Flavones and other constituents from Centaurea species, Phytochemistry 30, 2663–2665. 59. Christensen, L.P., Lam, J., 1991b. Acetylenes and other constituents from Centaurea species Phytochemistry 30, 3289–3292. 60. Chun, S.-S., Vattem, D.A., Lin, Y.-T.. Shetty, K., 2005. Phenolic antioxidants from clonal oregano (Origanum vulgare) with antimicrobial activity against Helicobacter pylori. Process Biochem. 40, 809–816. 61. Cis, J., Nowak, G., Kisiel, W., 2006. Antifeedant properties and chemotaxonomic implications of sesquiterpene lactones and syringin from Rhaponticum pulchrum Biochem. Syst. Ecol. 34, 862–867. 62. Collado González, I., Macías, F.A., Massanet, M.G., R-Luis F., 1985. Guaianolides from Centaurea canariensis*. Phytochemistry 24, 2107–2109. 63. Collado González, I., Macías, F.A., Massanet, M.G., R-Luis F., 1985. Guaianolides from Centaurea canariensis*. Phytochemistry 24, 2107–2109. 64. Collado González, I., Macías, F.A., Massanet, M.G., R-Luis F., 1986. Structure, chemistry and stereochemistry of clementeins. Sesquiterpene lactones from Centaurea clementei. Tetrahedron 42, 3611–3622. 65. Cooper, G., Laird, A., Nahar, L., Sarker, S.D., 2002. Lignan glucosides from the seeds of Centaurea americana (Compositae). Biochem. Syst. Ecol. 30, 65–67. ЛИТЕРАТУРА 256 66. Croteau, R., Kutchan, T.M., Lewis, N.G., Natural products (secondary metabolites). In Buchanan et al.(eds.) Biochemistry and molecular biology of plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville MD 2000; 1250- 1318. 67. Csupor, D. , Widowitz, U., Blazsó, G., Laczkó-Zöld, E., Tatsimo, S. N. J. Balogh, Á. Boros, K., Dankó, B., Bauer, R. Hohmann, J., 2012. Anti- inflammatory activities of eleven Centaurea species occurring in the Carpathian. Basin Phytother. Res. DOI: 10.1002/ptr.4754 68. Cueva, C., Moreno-Arribas M.V., Martín-Álvarez, P.J., Vicente, M.F., Bills, G., Basilio, A., López Rivas, C., Requena, T., Rodrígueze, M.J., Bartoloméa, B., 2010. Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria. Res. Microbiol. 161, 372–382. 69. Cushnie, T.P.T., Lamb, A.J., 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Ag. 26, 343–356. 70. Ćirić, A., 2009. Antimikrobna aktivnost sekundarnih metabolita izolovanih iz vrsta Centaurea spruneri Boiss & Heldr i Centaurea zuccariniana DC. Doktorska disertacija. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. 71. Ćirić, A., Karioti, A., Koukoulitsa, C., Soković, M., Skaltsa, H., 2012. Sesquiterpene lactones from Centaurea zuccariniana and their antimicrobial activity. Chem Biodivers.9, 2843-2853. 72. Daniewski, W.M., Nowak, G., Routsi, E., 1992. Salograviolide A, a sesquiterpene from Centaurea salonitana. Phytochemistry, 31, 2891–2893. 73. Daniewski, M.W., Nowak, G., 1993. Further sesquiterpene lactones of Centaurea bella. Phytochemistry 32, 204–205. 74. Daniewski, M.W., Nowak, G., Pankowska, E., Georgiadis, T., Routsi, E., Rychlewska, U., Szczepanska, B., 1993. Sesquiterpene Lactones of Centaurea salonitana. Phytochemistry 34, 445–447. 75. Damak, N., Ghorbel, H., Bahroun, A., Damak, M., Mc Killop, A., Simmonds, M., 2000. Contribution to structural investigation of Centaurea dimorpha compounds. J. Soc. Chim.Tunis 4, 653-658. 76. Davies, N.W., 1990. Gas chromatographic retention indices of monoterpenes on methyl silicone and Carbowax 20 M phases. J. Chromatogr. A. 503, 1–24. 77. Davis, E.M., Croteau, R., 2000. Cyclization Enzymes in the Biosynthesis of Monoterpenes, Sesquiterpenes, and Diterpenes. Topics in Current Chemistry, Vol. 209, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 53–95. 78. Dawidar A.M., Metwally M.A., Abou-Elzahab M., Abdel-Mogib M., 1989. Chemical constituents of two Centaurea species, Pharmazie 44, 735–736. 79. Deans, S.G., Svoboda, K.P., 1990. The antimicrobial properties of marjoram (Origanum majorana L.) Volatile Oil Flavour Frag. J. 5, 187-190. 80. De Kraker, J.W., Franssen, M.C.R., de Groot, A., Konig, W.A., Bouwmeester, H.J. 1998. (?)-Germacrene A biosynthesis—The committed step in the biosynthesis of bitter sesquiterpene lactones in chicory. Plant Physiol. 117, 1381–1392. 81. De Kraker, J.W., Franssen, M.C.R., Dalm, M.C.F., De Groot, A., Bouwmeester, H.J., 2001. Biosynthesis of germacrene A carboxylic acid in chicory roots. demonstration of a cytochrome P450 (1)-germacrene A hydroxylase and NADP+-dependent sesquiterpenoid dehydrogenase(s) involved in sesquiterpene lactone biosynthesis. Plant Physiol. 125, 1930–1940. ЛИТЕРАТУРА 257 82. De Kraker, J.W., Franssen, M.C.R., Joerink, M., de Groot, A., Bouwmeester, H.J., 2002. Biosynthesis of costunolide, dihydrocostunolide, and leucodin. Demonstration of cytochrome P450-catalyzed formation of the lactone ring present in sesquiterpene lactones of chicory. Plant Physiol. 129, 257–268. 83. DeMartino, 2005. Lignan Natural Products. Baran Group Meeting. 84. Dewick, M.P., 2001. Medical Natural Products, second ed. John Wiley and Sons Ltd., Baffins Lane, Chichester. 85. Dey, P.M., Harborne, J.B. 1999. Plant biochemistr. Academic Press, London. 86. Djeddi, S., Karioti, A., Sokovic, M., Stojkovic, D., Seridi, R., Skaltsa, H., 2007. Minor sesquiterpene lactones from Centaurea pullata and their antimicrobial activity. J. Nat. Prod. 70, 1796-1799. 87. Djeddi, S., Karioti, A., Sokovic, M., Koukoulitsa, C., Skaltsa, H., 2008. A novel sesquiterpene lactone from Centaurea pullata: structure elucidation, antimicrobial activity, and prediction of pharmacokinetic properties. Bioorg. Med. Chem. 16, 3725-3731. 88. Dicko, M.H., Gruppen, H., Traoré, S.A., Voragen A.,G.J., van Berkel, W.J.H., 2006. Phenolic compounds and related enzymes as determinants of sorghum for food use. BMBR. 1, 21–38. 89. Diklić, N., 1974. Origanum L. [In: Diklić, N., Janković, M. M. Lamiaceae Lindley]. In: Josifović, M. (ed.): Flora SR Srbije 6: Srpska Akademija Nauka i Umetnosti, Beograd. 474-475. 90. Ding, H.Y., Chou, T.H., Liang, C.H., 2010. Antioxidant and antimelanogenic properties of rosmarinic acid methyl ester from Origanum vulgare. Food Chem. 123, 254–262. 91. Drew, D.P., Krichau, N. Reichwald, K., Simonsen, H.T., 2009. Guaianolides in apiaceae: perspectives on pharmacology and biosynthesis. Phytochem. Rev. 8, 581–599. 92. Dostál, J., 1976. In Flora Europea; Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burgess, N.A., Moore, D.M., Valentine, D.H., Walters, S.M., Webb, D.A., (Eds.) Cambridge University Press. Cambridge, Vol. 4, p. 290. 93. Duraipandiyan, V., Abdullah Al-Harbi, N., Ignacimuthu, S.,, Muthukumar, C., 2012. Antimicrobial activity of sesquiterpene lactones isolated from traditional medicinal plant, Costus speciosus (Koen ex.Retz.) Sm. BMC Complement Altern Med. 12, 1–6. 94. Dural, H., Bagci, Y., Ertugrul, K., Demırelma, H., Flamini, G., Luıgı Cioni, P., Morelli, I., 2003. Essential oil composition of two endemic Centaurea species from Turkey, Centaurea mucronifera and Centaurea chrysantha, collected in the same habitat. Biochem. Syst. Ecol. 31, 1417-1425. 95. El-Dahmy, S., Bohlmann, F., Sarg, T. M., Ateya, A., Farrag, N., 1985. New guaianolides from Centaurea aegyptiaca. Planta Med. 176–177. 96. Evstratova, I.R., Rybalko, S.K., Rzazade, Ya.R., 1967. Acroptilin-a new sesquiterpene lacrone from Acroptilon repens. Chem. Nat. Compd. 3, 284. 97. Evstratova, I.R., Mukhametzhanov, M.N., Sheichenko, V.I., Shreter A.I., Pakaln, D., 1969. Isolation of repin from Centaurea hyrcanica. Chem. Nat. Compd. 5, 186. 98. Faleiro, M.L., 2011. The mode of antibacterial action of essential oils. Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Méndez-Vilas, A. (Ed.). ©FORMATEX 1143–1156. ЛИТЕРАТУРА 258 99. Fernández, I., García, B., Grancha, J.F., Pedro, J.R., 1989. Sesquiterpene lactones, flavonoids and coumarins from Centaurea collina. Phytochemistry 28, 2405–2407. 100. Fernández, I., Pedro, J.R., Polo, E., 1995. Sesquiterpene lactones from Centaurea alba and C. conifera. Phytochemistry 38, 655–657. 101. Fernandes, R., Heywood, V.H., 1972. OriganumL. In: Flora Europaea, Tutin TG, Heywood, V.H, Burges, N.A., Moore, D.M., Valentine, D.H., Walters, S.M,, Webb, D.A. (eds.) III, London, New York, Cambridge Univ. Press. 171. 102. Flamini, G., Antognoli, E., Morelli, I., 2001. Two flavonoids and other compounds from the aerial parts of Centaurea bracteata from Italy. Phytochemistry 57, 559–564. 103. Flamini, G., Ertugrul, K., Cioni, P.L., Morelli, I., Dural, H., Bagci, Y., 2002. Volatile constituents of two endemic Centaurea species from Turkey: C. pseudoscabiosa subsp. pseudoscabiosa and C. hadimensis. Biochem. Syst. Ecol. 30, 953-959. 104. Flamini, G., Bulleri, C., Morelli, I., 2002a. Secondary constituents from Centaurea horrida and their evolutionary meaning. Biochem. Sys. Ecol. 30, 1051–1054. 105. Flamini, G., Pardini, M., Morelli, I., Ertugrul, K., Dural, H., Bagci, Y., Kargioglu, M., 2002b. Flavonoid glycosides from Centaurea pseudoscabiosa subsp. pseudoscabiosa from Turkey. Phytochemistry 61, 433–437. 106. Flamini, G., Stoppelli, G., Morelli, I., Ertugrul, K., Dural, H., Tugay, O., Demirelma, H., 2004. Secondary metabolites from Centaurea isaurica from Turkey and their chemotaxonomical significance. Biochem. Syst. Ecol. 32, 553– 557. 107. Flamini, G., Tebano, M., Cioni, P. L., Bagci, Y., Dural, H., Ertugrul, K. Uysal, T.and Savran, A., 2006. A multivariate statistical approach to Centaurea classification using essential oil composition data of some species from Turkey. Pl. Syst. Evol. 261, 217–228. 108. Fleisher, A., Fleisher, Z., 1988. Identification of Biblical Hyssop and origin of the traditional use of oregano-group herbs in the mediterranean region. Econ.Bot. 42, 232–241. 109. Fleisher, A., Sneer, N., 1982. Oregano spices and Origanum chemotypes. J. Sci. Food Agric. 33, 441–446. 110. Forgo, P., Zupkó, I., Molnár, J., Vasas, A., Dombi, G., Hohmann, J., 2012. Bioactivity-guided isolation of antiproliferative compounds from Centaurea jacea L. Fitoterapia 83, 921–925. 111. Formisano, C., Senatore, F., Bancheva, S., Bruno, M., Maggio, A., Rosselli, S., 2010. Volatile components of Centaurea bracteata and C. pannonica subsp. pannonica growing wild in Croatia. Nat. Prod. Commun. 5, 1649-1654. 112. Formisano, C., Rigano, D., Senatore, F., Bancheva, S., Maggio, A., Rosselli, S., Bruno, M., 2012. Flavonoids in the subtribe Centaureinae (Cass.) Dumort. (Tribe Cardueae, Asteraceae): Distribution and 13C-NMR spectral data. Chem. Biodiv. 9, 2096–2158. 113. Fortuna, A.M., de Riscala, E.C., Catalan C.A.N., Gedris T.E., Herz W., 2001. Sesquiterpene lactones from Centaurea tweediei. Biochem. Syst. Ecol. 29, 967- 971. ЛИТЕРАТУРА 259 114. Fraga, B.M., 1992; 1993; 1994; 1995; 1996; 1997; 1998; 1999; 2000; 2001; 2002; 2003; 2004; 2005; 2006; 2007; 2008; 2009; 2010; 2011; 2012 Natural Sesquiterpenoids. Natural Products Reports 9, 217-241 and 557-580; 10, 397- 419; 11, 533-554; 12, 303-320; 13, 307-326; 14, 145-162; 15, 73-92; 16, 21-38; 16, 711-730; 17, 483-504; 18, 650-673; 19, 650-672; 20, 392-413; 21, 669-693; 22, 465-486; 23, 943-972; 24, 1350-1381; 25, 1180-1209; 26, 1125-1155; 27, 1681-1708; 28, 1580–1610; 29, 1334–1366. 115. Freudenberg, K., 1965. Lignin: Its constitution and formation from p- hydroxycinnamyl alcohols. Science 148, 595–600. 116. Freudenberg, K., Nelsh, A.C., 1968. Constitution and Biosynthesis of Lignin: Molecuiar Biology, Biochemistry and Biophysics, Vol. 2, A. Kleinzeller, G.F. Springer, and H.G. Wittman, eds (New York: Springer-Verlag). 117. Fujita T., Terato K., Nalayama M., 1996. Two jasmonoid glucosides and a phenylvaleric acid glucosides from Perilla frutescens”, Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 732–735. 118. Fukai, T., Marumo A., Kaitou K., Kanda T., Terada S., Nomura T., 2002. Anti- Helicobacter pylori flavonoids from licorice extract. Life Scien. 71, 1449–1463. 119. Funk V.A., Susanna A., Stuessy T.F. & Bayer R.J. (eds.) 2009. Systematics, evolution and biogeography of Compositae. IAPT, Vienna, Austria. 120. Gadeschi, E., Jorge, Z.D., Massanet, G.M., Lurs, F.R., 1989. Two derivatives of costic acid from Centaurea arguta. Phytochemistry 28, 2204–2206. 121. Garcia-Jacas, N., Susana, A., Mozaffarian, V., Ilarslan, R., 2000. The natural delimitation of Centaurea (Asteraceae: Cardueae): ITS sequence analysis of the Centaurea jacea group. Plant Syst. Evol. 223, 185–199. 122. Garcia-Jacas, N., Susana, A., Garnatje, T., Vilatersana, R., 2001. Generic delimination and phylogeny of the subtribe Centaurinae (Asteraceae): A combined nuclear and chloroplast DNA analysis. Ann. Bot. 87, 503–515. 123. Garcia-Jacas, N., Uysal, T., Romaschenko, K., Suarez-Santiago, V.N., Ertugrul, K., Susana, A., 2006. Centaurea revisited: A molecular survey of the Jacea group. Ann. Bot. 98, 741–753. 124. Geppert, B., Drozdz, B., Kiełczewski, M., Holub, M., 1983. Sesquiterpene lactones. XXIII. Isolation of sesquiterpene lactones from Centaurea L. species. Acta Soc. Bot. Pol. 52, 23–34. 125. Ghantous, A., Gali-Muhtasib, H., Vuorela, H., Saliba N.A., Darwiche, N., 2010. What made sesquiterpene lactones reach cancer clinical trials. Drug. Discov. Today 15, 668-678. 126. Ghisalberti, E.L., 1997. The biological activity of naturally occurring kaurane diterpenes. Fitoterapia 68, 303–325. 127. González, G.A., Bermejo, J., Rincones Rodríguez, M., 1972b. Dihidroestafiatona aislada de la Centaurea webbiana. Sch. Bip. An. Quim. 68, 333–334. 128. González, G.A., Bermejo, J., Bretón, L.J., Massanet M.G., Triana, J., 1974. Chlorohyssopifolin C, D, E and vahlenin, four new sesquiterpene lactones from Centaurea hyssopifolia. Phytochemistry 13, 1193–1197. 129. González, G.A., Bermejo, J., Massanet M.G., 1977. Aportation al estudio quimiotaxonomico del genera Centaurea. Rev. Latinoamer. Quim. 8, 176–181. 130. González G.A., Bermejo J., Cabrera I., Massanet M.G., Mansilla H., Galindo, A., 1978a. Two sesquiterpene lactones from Centaurea canariensis. Phytochemistry 17, 955–956. ЛИТЕРАТУРА 260 131. González, G.A., Bermejo, J., Amaro, M.J., Massanet, M.G., Galindo, A., Cabrera, I., 1978b. Sesquiterpene lactones from Centaurea linifolia Vahl. Cem. J. Chem. 56, 491–494. 132. González, G.A., de la Rosa, D.A., Massanet, M.G., 1982. Subexpinnatin, a new Guaianolide from Centaurea canariensis. Phytochemistry 21, 2363–2368. 133. González, A.G., Barrera, J.B., García, T.Z., Rosas, F.E., 1984. Sesquiterpene lactones from Centaurea species. Phytochemistry 23, 2071–2072. 134. González-Platas, J., Pérez-Ruiz, C., González, G.A., Bermejo, J., Medjroubi, K., 1999. 4,15-Dihydro-3-dehydrosolstitialin A. Acta Cryst. C55, 1837–1839. 135. Goun, E., Cunningham, G., Solodnikov, S., Krasnykch, O., Miles, H., 2002. Antithrombin activity of some constituents from Origanum vulgare. Fitoterapia 73, 692–694. 136. Gousiadou, C., Skaltsa, H., 2003. Secondary metabolites from Centaurea orphanidea Biochem. Syst. Ecol. 31, 389–396. 137. Grayer, R.J., de Kok P.J. R. 1998. Flavonoids and verbascoside as chemotaxonomic characters in the genera Oxera and Faradaya (Labiatae) Biochem. Syst. Ecol. 26, 729-741. 138. Gülcema,l D., Alankuş-Calışkan, O.C., Karaalp, A., Uygar Örs, Ballar, P., Bedir, E., 2010. Phenolic Glycosides with antiproteasomal activity from Centaurea urvillei DC. subsp. urvillei. Carbohydr. Res. 345, 2529–2533. 139. Hall, I.H., Grippo, A.A., Lee, K.H., Chaney, S.G., Holbrook, D.J., 1987. Effect of helenalin and bis(helenalinyl)malonate on nucleic acid and protein synthesis in human KB carcinoma cells. Pharm. Res. 4, 509–514. 140. Hamamouchi, M., 2002. Medicinal plants in Morocco: traditional use, marketing, andstrategies for conservation and increasing value. Esperance Medicale 9, 454–458. 141. Hamburger, M., Wolfender, J.-L., Hostettmann K. 1993. Search for chlorinated sesquiterpene lactones in the neurotoxic thistle Centaurea solstitialis by liquid chromatography-mass spectrometry, and model studies on their possible artifactual formation. Natural Toxins 1, 315–327. 142. Hammoud, L. Seghiri, R. Benayache, S. Mosset, P. Lobstein, A. Chaabi, M. León, F. Brouard, I. Bermejo, J. Benayache F., 2012. A new flavonoid and other constituents from Centaurea nicaeensis аll. var. walliana M. Natural product research. 26, 203-208. 143. Harborne J.B., 1980. Plant phenolics. In: Bell EA, Charlwood BV (eds) Encyclopedia of Plant Physiology, volume 8 Secondary Plant Products, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 329–395. 144. Harley, R.M., Atkins, S., Budantsev, A.L., Cantino, P.D., Conn, B.J., Grayer, Renée J.; Harley, M.M., de Kok, Rogier P.J. et al. 2004. "Labiatae". In Kubitzki, Klaus; Kadereit, Joachim W. The Families and Genera of Vascular Plants VII. Berlin; Heidelberg, Germany: Springer-Verlag, 167–275. 145. Harvala, C., Skaltsa, H., 1986. Chemical study on Origanum dictamnus L., Part 1. Plant Med. Phytother. 20, 300–304. 146. Harvey, A.L., 2008 Natural products in drug discovery. Drug Discovery Today, 13, 19/20, 894–901. 147. Hawas, U.W., El-Desoky, S.K., Kawashty, S.A., Sharaf, M. 2008. Two new flavonoids from Origanum vulgare. Nat. Prod. Res. 22, 1540–1543. ЛИТЕРАТУРА 261 148. Helal, M.A., Nakamura, N., Meselhy, R. M., El-Fishawy, M.A., Hattori, M., Mahran H.G., 1997. Guaianolides from Centaurea scoparia. Phytochemistry 45, 551–554. 149. Hellenic Pharmacopeia. 2002. 5th ed, EOF, Athens, Chapter 2.8.12. 150. Hermann, K., 1960. Über Den „Gerbstoff“ Der Labiatenblätter. Arch. Pharm. (Weinheim) 293, 1043–1048. 151. Higuchi, T., Brown, S.A. 1963. Studies of lignin biosynthesis using isotopic carbon. XIII. The phenylpropanoid system in lignification. Can. J. Biochem. Physiol. 41, 621–628. 152. Holzmanova, V., 1996. Rosmarinic аcid аnd its biological activity (In Czech). Chem. Listy 90, 486–496. 153. Hoffmann, H.M.R., Rabe, J., 1985. Synthesis and Biological Activity of α- Methylene-γ-butyrolactones. Angewandte Chemie. 24, 94–110. 154. Horiuchi, K., Shiota, S., Hatano, T., Yoshida, T., Kuroda, T., Tsuchiya, T., 2007. Antimicrobial activity of oleanolic acid from Salvia officinalis and related compounds on vancomycin-resistant enterococci (VRE). Biol. Pharm. Bull., 30, 1147–1149. 155. Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R.L., 2012. Essential Oils in Food Preservation: Mode of Action, Synergies, and Interactions with Food Matrix Components. Front Microbiol. 3, 1–24. 156. Ietswaart, J. M., 1980. A taxonomic revision of genus Origanum. Leiden University Press: Leiden. 157. Ifantis Milošević , T., Solujić, S., Skaltsa, H., 2011. Secondary metabolites from the aerial parts of Origanum scabrum Boiss. & Heldr. Biochem. Syst. Ecol. 44, 289-294. 158. Ifantis Milošević, T., Solujić S., Pavlović-Muratspahić D., Skaltsa, H., 2013. Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. from Serbia and their chemotaxonomic importance. Phytochemistry DOI:10.1016/j.phytochem.2013.05.014 159. Jakupovic, J., Grenz, M., Bohlmann, F., Mungai, G.M., 1990. Carvotacetone derivatives and eudesman-12,6β-olides from Sphaeranthus species. Phytochemistry 29, 1213–1217. 160. Jakupović, J., Jia, Y., Pathak, V.P., Bohlmann, F., King, R.M., 1986. Bisabolen derivatives and sesquiterpene lactones from Centaurea species. Planta med. 5, 399–401. 161. Janaćković, P., 2004a. Fitochemical and chemotaxonomic research of some Centaurea L. (Asteraceae) species from the Central Balkan Peninsula. Ph.D. [In Serbian]. 162. Janaćković, P., Tešević, V., Milosavljevic, S., Vajs, V., Marin, P.D., 2004b. Sesquiterpene lactones, lignans and flavones of Centaurea affinis. Biochem. Syst. Ecol. 32, 355–357. 163. Jayaprakasha, G.K., Selvi, T., Sakariah, K.K. 2003. Antibacterial and antioxidant activities of grape (Vitis vinifera) seed extracts. Food Res. Int. 36, 117–122. 164. Josifović, M., 1975. Flora SR Srbije (VII). Josifović, M., Stjepanović, L., Kojić, M., Nikolić, V. (eds.), SANU, Beograd, стр. 256. 165. Kabouche, A., Kabouche, Z., Touzani, R., Bruneau, C., 2011. Flavonoids from Centaurea sulphurea. Chem. Nat. Comp. 46, 966-967. ЛИТЕРАТУРА 262 166. Kaij-a-Kamb, M., Amoros, M., Girre, L., 1992. Chimie et activités biologiques du genre Centaurea. Pharm. Acta Helv. 67, 178, and references therein. 167. Kamel M.S., Assaf M.H., Hasanean H.A., Ohtani, K., Kasai, R., Yamasaki, K., 2001. Monoterpene glucosides from Origanum syriacum. Phytochemistry 58, 1149–1152. 168. Karamenderes, C., Demirci, B., Baser, K.H.C., 2008. Composition of essential oils of ten Centaurea L. taxa from Turkey. J. Essent. Oil Res. 20, 342-349. 169. Karioti, A., Skaltsa, H., Lazari, D., Sokovic, M., Garcia, B., Harvala, C., 2002. Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea deusta. Antifungal and antibacterial activities. Zeit. Naturf. C. 57c, 75–80. 170. Karioti, A., Vrahimi-Hadjilouca, T., Droushiotis, D., Rancic, A., Hadjipavlou- Litina, D., Skaltsa, H., 2006. Analysis of the essential oil of Origanum dubium growing wild in Cyprus. Investigation of its antioxidant capacity and antimicrobial activity. Planta Med. 72, 1330-1334. 171. Kawabata, J., Mizuhata, K., Sato, E., Nishioka, T., Aoyama, Y., Kasai, T., 2003. 6-hydroxyflavonoids as α-glucosidase inhibitors from marjoram (Origanum majorana) leaves. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 445–447. 172. Kawaghuchi, Y., Yamauchi, S., Masuda, K., Nishiwaki, H., Akiyama, K., Maruyama, M., Sugahara, T., Kishida, T., Koba, Y., 2009. Antimicrobial activity of stereoisomers of butane-type lignans. Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 1806–1810. 173. Keenan, J.I., Salm, N., Wallace, A.J.. Hampton, M.B., 2012. Using food to reduce H. pylori associated inflammation. Phytother. Res. 26, 1620–1625. 174. Kikuzaki, H., Nakatani, N., 1989. Structure of a new antioxidative phenolic acid from oregano (Origanum vulgare L.) Agric. Biol. Chem. 53, 519–524. 175. Kitajima J., Ishikawa T., Urabe A., 2004. A new hydroxyjasmone glucoside and its related compounds from the leaf of thyme. Chem. Pharm. Bull. 52, 1013– 1014. 176. Kohda, H., Takeda, O., Tanaka, S., Yamasaki, K., Yamashita, A., Kurokawa, T., Ishibashi, S., 1989. Isolation of Inhibitors of adenylate cyclase from Dan-shen, the root of Salvia miltiorrhiza. Chem. Pharm. Bull. 37 (5) 1287–1290. 177. Kokkini, F., 1997. Taxonomy, diversity and distribution of Origanum species. In Proceedings of the IPGRI International Workshop on Oregano; Padulosi Ed. Valenzano, Italy, 2-12. 178. Konstantinopoulou, M., Karioti, A. Skaltsa, H., 2003. Sesquiterpene lactones from Anthemis altissima and their anti-Helicobacter pylori activity. J. Nat. Prod. 5, 699-702. 179. Koutecký, P., 2008. Taxonomic study of Central European taxa of Centaurea sect. Jacea, Summary of Ph.D. Thesis, Czech Republik. 180. Koukoulitsa, C., Geromichalos, G.D., Skaltsa, H., 2005. VolSurf analysis of pharmacokinetic properties for several antifungal sesquiterpene lactones isolated from Greek Centaurea sp. J.Comput.-Aid. Mol. Des. 19, 617–623. 181. Koukoulitsa, C., Karioti A., Bergonzi, C. M., Pescitelli, G., Di Bari, L. Skaltsa, H., 2006. Polar constituents from the aerial parts of Origanum vulgare L. ssp. hirtum growing wild in Greece. J. Agric. Food Chem. 54, 5388–5392. 182. Kuang, X.H., Xia, G.Y., Yang, B.Y., Wang, H.Q., Lü, W.S., 2009. Lignan constituents from Chloranthus japonicus. Sieb. Arch. Pharm. Res. 32, 3, 329– 334. ЛИТЕРАТУРА 263 183. Kubacey, M. T., Haggag, G. E., El-Toumy, A. S., , Ahmed, A. A., El-Ashmawy, M. I., Youns, M.M., 2012. Biological activity and flavonoids from Centaurea alexanderina leaf extract. J. Pharm. Res. 5, 3352-3361. 184. Kuete, V., Nguemeving, J.R., Beng, V.P., Azebaze, A.G., Etoa, F.X., Meyer, M., Bodo, B., Nkengfack, A.E., 2007. Antimicrobial activity of the methanolic extract, fractions and four flavonoids from the twigs of Dorstenia angusticornis Engl. (Moraceae). J. Ethnopharmacol. 109, 372–379. 185. Kuete, V., Eyong, K.O., Folefoc, G.N., Beng, V.P., Hussain, H., Krohn K., Nkengfack, A.E. 2008. Antimicrobial activity of the methanolic extract and of the chemical constituents isolated from Newbouldia laevis. Pharmazie 62, 552– 556. 186. Kulevanova, S., Stefova, M., Stefkov, G., Stafilov, T., 2001. Identification, isolation, and determination of flavones in Origanum vulgare from Macedonian flora. J. Liq. Chromatogr. Related Technol. 24, 589–600. 187. Kumarasamy, Y., Middleton, M., Reid, R., Nahar, L., Sarker, S., 2003. Biological activity of serotonin conjugates from the seeds of Centaurea nigra. Fitoterapia 74, 609–612. 188. Kushnir, L.E., Kuzovkov, A.D., 1968. Problem concerning structure of saurine. A sesquitepene lactone from Sausserea pulchella. Fisch. Khimiko- Farmatsevticheskii Zhurnal 12. 21–29. 189. Lamb, A.,Yang, X.D.,Tsang, Y.H., Li, J.D., Higashi, H., Hatakeyama, M., Peek, R.M., Blanke, S.R., Chen L.F., 2009. Helicobacter pylori CagA activates NF- kappaB by targeting TAK1 for TRAF6-mediated Lys 63 ubiquitination. EMBO Rep. 10, 1242–1249. 190. Lanciotti, R., Belletti, N., Patrignani, F., Gianotti, A., Gardini, F., Guerzoni, E.M., 2003. Application of hexanal, (E)-2-hexenal, and hexyl acetate to improve the safety of fresh-sliced apples. J. Agric. Food Chem. 51, 2958–2963. 191. Lazari, D.M., Skaltsa, H.D., Conrstantinidis, T. 1999. Volatile constituents of Centaurea raphanina Sm. Subsp. Mixta (DC.) Runemark and C. spruneri Boiss. and Heldr. (Asteracea), growing wild in Greece. Flav. Fragr. J. 14, 415–418. 192. Lazari, D.M., Skaltsa, H.D. T. Conrstantinidis 2000. Volatile constituents of Centaurea pelia DC., C. thessala Hausskn. subsp. drakiensis (Freyn & Sint) Georg. and C. zuccariniana DC. from Greece. Flav. Fragr. J. 15, 7–11. 193. Lee, D.G., Jung H.J., Woo, E.R., 2005. Antimicrobial property of (+)- lyoniresinol-3alpha-O-beta-D-glucopyranoside isolated from the root bark of Lycium chinense Miller against human pathogenic microorganisms. Arch. Pharmacal. Res., 28, 1031–1036. 194. Lee, L.Y., Shim, J.S., Rukayadi, Y., Hwang, J.K., 2008. Antibacterial activity of xanthorrhizol isolated from Curcuma xanthorrhiza Roxb. against foodborne pathogens. J. Food Prot. 71, 1926–1930. 195. Lin, Y.L., Wang, C.N., Shiao, Y.J., Liu, T.Y., Wang, W.Y., 2003. Benzolignanoid and polyphenols from Origanum vulgare. J. Chin. Chem. Soc. 50, 1079–1083. 196. Litvinenko, V.I., Popova, T.P., Simonjan, A.V., Zoz, I.G., Sokolov,V.S., 1975. ‘‘Gerbstoffe’’ und Oxyzimtsäureabkömmlinge in Labiaten. Planta Med. 27, 372–380. 197. Liu, J., 1995. Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid. J. Ethnopharmacol. 49, 57–68. ЛИТЕРАТУРА 264 198. López-Rodríguez, M., García, V.P., Zater, H., Benayache, S., Benayache, F., 2009. Cynaratriol, a sesquiterpene lactone from Centaurea musimomum. Acta Cryst. E65, 1867–1868. 199. Louaar, S., Achouri, A., Lefahal, M., Laouer, H., Medjroubi, K., Duddeck, H., Akkal, S. 2011. Flavonoids from Algerian endemic Centaurea microcarpa and their chemotaxonomical significance. Nat. Prod. Commun. 6, 1603-1604. 200. Luo, Y., Cai, Q., Sun, M., Corke, H., 2004. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life Science 74, 2157–2184 201. Mabberley, D.J., 1997. The Plant Book, second ed., Cambridge University, Press, Cambridge. 138 202. Mabry, T.J., Markham, K.R., Thomas, M.B., 1970. The Systematic Identification of Flavonoids. Springer-Verlag, New York, Heidlberg, Berlin. 203. Machida, K., Sakamoto, S., Kikuchi, M., 2009. Two new neolignan glycosides from leaves of Osmanthus heterophyllus. J. Nat. Med. 63, 227–231. 204. Mann, J. (1987) Secondary methabolites. Oxford chemistry series. 205. Marco, J.A., Sanz, J.F., Sancenon, F., Susanna, A., Rustaiyan, A., Saberi, M., 1992. Sesquiterpene lactones and lignans from Centaurea species Phytochemistry 31, 3527–3530. 206. Marco, J.A., Sanz-Cervera, J.S., Garcia Liso, V., Batlle, N., 1997. Sesquiterpene lactones from Artemisia lucentica. Phytochemistry 45, 755–763. 207. Marin, D.P., 2003.Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. Beograd 208. Marino M, Bersani C, Comi G. 2001. Impedance measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. Inter. J. of Food Microb. 67, 187–195. 209. Markham, K.R., 1989. In “Methods in Plant Biochemistry”, Plant Phenolics (Dey, P.M. and Harborne, J.B., Ed.), vol. 1, Academic Press, London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto. 197-235. 210. Massada, Y., 1976. Analysis of essential oil by gas chromatography and spectrometry. John Wiley & Sons, New York. 211. Massanet, G.M., Collado, L.G., Macias, F.A., 1983. Structural determination of clementin, a new guaianolide isolated from Centaurea clementei. Tetrahedron Lett. 24, 1641–1642. 212. Massiot, G., Morfaux, A.M., Le Men-Olivier, L., Bouqouant, J., Madaci, A., Mahamoud, A., Chopova, M., Aclinou, P., 1986. Guaianolides from leaves of Centaurea incana. Phytochemistry 25, 258–261. 213. Matsuda, N.; Sato, H.; Yaoita, Y.; Kikuchi, M., 1996. Isolation and absolute structures of the neolignan glycosides with the enantiomeric aglycones from leaves of Viburnum awabuki K. Koch. Chem. Pharm. Bull. 44, 1122–1123. 214. Matsuura, H., Chiji H., Asakawa, C., Amano, M., Yoshihara, T., Mizutani, J., 2003. DPPH radical scavengers from dried leaves of oregano (Origanum vulgare). Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 2311–2316. 215. Mattern, G., Weckert, E., Youssef, D., Frahm, W.A., 1996. Absolute configuration of chlorojanerin, a chlorine-containing guaianolide from Centaurea scoparia. Acta Cryst. C52, 1791–1793. 216. Medjroubi, K., Benayache, F., Benayache, S., Akkal, S., Khalfallah, N., Aclinou, P., 1997. Guaianolides from Centaurea musimonum. Phytochemistry 45, 1449–1451. ЛИТЕРАТУРА 265 217. Medjroubi, K., Benayache, F., León, F. & Bermejo, J., 2003. Complete assignment of the 13C and 1H NMR spectra of two known guaianolides isolated from Centaurea musimonum. Rev. Colombiana Quim. 32, 17–25. 218. Medjroubi, K., Benayache, F., Bermejo, J., 2005. Sesquiterpene lactones from Centaurea musimonum. Antiplasmodial and cytotoxic activities. Fitoterapia 76, 744–746. 219. Menichini, F., di Benedetto, R., Delle Monache, F., 1996. A triterpene and guaianolide from Ptilostemmon gnaphaloides. Phytochemistry 41, 1377-1379. 220. Merrill B.G., Stevens L.H.K., 1985. Sesquiterpene lactones from Centaurea solstitialis. Phytochemistry 24, 2013–2018. 221. Middleton, M., Cox, J. P., Jaspars, M., Kumarasamy, Y., Nahar, L., Reid, R., Sarker D.S., 2003. Dibenzylbutyrolactone lignans and indole alkaloids from the seeds of Centaurea nigra (Asteraceae). Biochem. Syst. Ecol. 31, 653–656. 222. Miersch, O., Schneider G., Sembdner G., 1991. Hydroxylated jasmonic acid and related compounds from Βοtryodiplodia theobromae. Phytochemistry 30, 4049– 4051. 223. Milosević, T., Argyropoulou C., Solujić, S., MuratSpahić, D., Skaltsa, H., 2010. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from Centaurea pannonica and C. jacea. Nat. Prod. Commun. 5, 1663-1668. 224. Mirovich, V.M., Peshkova, V.A., Shatokhina, R.K., 1989. Phenolic acids of Origanum vulgare. Khim. Prir. Soedin. 6, 850–850. CA 112:115824. 225. Mishio, T., Honma, T., Iwashina, T., 2006. Yellow flavonoids in Centaurea ruthenica as flower pigments. Biochem. Syst. Ecol. 34, 180-184. 226. Monsalve, L.N., Rosselli, S., Bruno, M., Baldessaria, A. 2009. Lipase-catalysed preparation of acyl derivatives of the germacranolide cnicin. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57, 40–47. 227. Muhammad, I., Takamatsu, S., Mossa, S.J., El-Feraly, S.F., Walker, A.L., Clark M.A., 2003. Cytotoxic Sesquiterpene Lactones from Centaurothamnus maximus and Vicoa pentanema. Phytotherapy Res. 17, 168–173. 228. Murata, T., Miyase, T., Yoshizaki, F., 2012. Hyaluronidase inhibitors from Keiskea japonica. Chem. Pharm. Bull. 60, 121-128. 229. Natakani, N., Kikuzaki H., 1987. A new antioxidative glucoside isolated from oregano (Origanum vulgare L.). Agric. Biol. Chem. 51, 2727–2732. 230. Navarro, J.J., Caballero, C.M., Moran, R.J., Medarde, M., Grande, M., Anaya, J., 1990. Guaianolides and eudesmanolides from Centaurea ornata. J. Nat. Prod. 53, 573–578. 231. NCCLS (1999) Performance standard for antimicrobial activity susceptibility test ninth international supplement. Document M100-S-, Wayne, PA. 232. Negrete, E.R., Backhouse, N., Avendaño, S., San Martín, A., 1984. Dehydrocostus lactone et 8α-hydroxydehydrocostus lactone de Centaurea chilensis Hooker et Amold. Plant. Méd. Phytothér. 4, 226–232. 233. Negrete, E. R., Latorre, L., Backhouse, N., Peña, R., Delporte, C., 1988a. Etudes anatomiques et phytochimiques: Flavonoides et lactone de Centaurea chilensis Hooker et Amold. Plant. Méd. Phytothér. 22, 1–10. 234. Negrete, E.R., Backhouse, N. San-Martín, A., Cassels, K.B., Hartmann, R., Breitmaier, E., 1988b. Guaianolides from Centaurea chilensis and Centaurea f1occosa. Chem. Ztg. 112, 144–146. ЛИТЕРАТУРА 266 235. Negrete R.E., Backhouse N., Prieto P., Mejias H., Camargo R.C., Cassels B.K., Breitmaier E., Hartmann R., 1989. Steroids, a lignan and a flavonoid from Centaurea melitensis L, Plant Med. Phytother. 23, 293–304. 236. Neu, R., 1957. Chelate von Diarylborsäuren mit aliphatischen Oxyalkylaminen als reagenzien für den Nachweis von oxyphenyl-benzo--pyronen, die Naturwissen-schaften. 44, 181–183. 237. Newman J.D., Cragg, G.M., 2007. Natural products as source of new drugs over the last 25 years. J. Nat. Prod. 70, 461–477. 238. Newman J.D., Cragg, G.M., 2010. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J. Nat. Prod. 75, 311–335. 239. Nijveldt, R.J., van Nood, E., van Hoorn, E.C.D., Boelens, P.G., van Norren, K., van Leeuwen P.A.M., Flavonoids 2001. A review of probable mechanisms of action and potential applications. Am. J. Clin. Nutr. 74, 418–425. 240. Nisar Khan, A., Fatima, I., Abdul Khaliq, U., Malik, A., AbbasMiana, G., Qureshi, Z.R., Rasheed, H., 2011. Potent anti-platelet constituents from Centaurea iberica. Molecules 16, 2053–2064. 241. Nishibe, S., Tsukamoto, H., Hisada, S., 1984. Effects of O-methylation and O- glucosylation on carbon-13 nuclear magnetic resonance chemical shifts of matairesinol, (+)-pinoresinol and (+)-epipinoresinol Chem. Pharm. Bull. 32, 4653–4657. 242. Nowak, G., Holub, M., Buuděšínsky, M. 1988. Sesquiterpene lactones. XXXIV. Guaianolides in the genus Leuzea DC. Acta Soc. Bot. Pol. 57, 157-163. 243. Nowak, G., Holub, M., Buuděšínsky, M., 1989. Sesquiterpene lactones. XXXVI. Sesquiterpene lactones in several subgenera of the genus Centaurea L. Acta Soc. Bot. Pol. 58, 95–102. 244. Nowak, G., 1992. A chemotaxonomic study of sesquiterpene lactones from subtribe Centaureinae of the Compositae. Phytochemistry 31, 2363-2368. 245. Nowak, G., 1993. Chromatography of twenty six sesquiterpene lactones from Centaurea bella. Chromatographia 35, 325–328. 246. Ohno, N., Hirai, H., Yoshioka, H., Domínguez, A.X., Mabry J.T., 1973. Cynaropicrin: A sesquiterpene lactone from Centaurea americana. Phytochemistry 12, 221–222. 247. Okada, K., Kasahara, H., Yamaguchi, S., Kawaide, H., Kamiya, Y., Nojiri, H., Yamane, H., 2008. Genetic evidence for the role of isopentenyl diphosphate isomerases in the mevalonate pathway and plant development in arabidopsis. Plant Cell Physiol. 49, 604–616. 248. Öksüz, S., Ulubelen, A., Aynechi, Y., Wagner, H., 1982. A guaianolide from Centaurea behen. Phytochemistry 21, 2747–2749. 249. Öksüz, S., Ayyildiz, H., Johhansson C., 1983. 6-methoxylated and C-glycosyl flavonoids from Centaurea species. J. Nat. Prod. 47, 902-903. 250. Öksüz, S., Putun, E., 1983. Guaianolides from Centaurea kotschyi. Phytochemistry 22, 2615–2616. 251. Öksüz, S., Topçu, G., 1994. Guaianolides from Centaurea glastifolia. Phytochemistry 37, 487–490. 252. Oksuz, S., Serin, S., 1997. Triterpenes of Centaurea ptosimopappoides. Phytochemistry 46, 545. 253. Oluk, E.A., Çakır, A., 2009. Micropropagation of Origanum sipyleum L., an endemic medicinal herb of Turkey. Afr. J. Biotechnol. 8, 5769-5772. ЛИТЕРАТУРА 267 254. Özkan, G., Sagdic, O., Baydar, N.G., Baydar, H., 2004. Antioxidant and antibacterial activities of Rosa damascena flower extracts. Food Sci. Technol. Int. 10, 277-281. 255. O'Brien, C., Henrich, P.P., Passi, N., D.A., 2011. Recent clinical and molecular insights into emerging artemisinin resistance in Plasmodium falciparum. Curr Opin. Infect. Dis. 24, 570–577. 256. O'Malley, D.M., Whetten, R., Bao, W., Chen, C.-L., Sederoff, R. 1993. The role of laccase in lignification. Plant J. 4, 751–757. 257. Otsuka, H., Hirata, E., Shinzato, T., Takeda Y. 2000. Isolation of lignan glucosides and neolignan sulfate from the leaves of Glochidion zeylanicum (Gaertn) A. Juss Chem. Pharm. Bull. 48, 1084–1086. 258. Ӧzçelik, B., Gürbüz, I., Karaoglu, T., Yeşilada, E., 2009. Antiviral and antimicrobial activities of three sesquiterpene lactones from Centaurea solstitialis L. ssp. solstitialis. Microbiol. Res. 164, 545–552. 259. Pachopos, Ν. 2007. Chemical analysis of the polar constituents of the plant Origanum dubium Boiss. (Lamiaceae) M.Sc., Athens. 260. Palomino, O.M., Gomez-Serranillos, P., Carretero, E., Cases, A., 1997. Variation in the flavonoid content of Origanum X majoricum in different plant stages by HPLC. Planta Med. 63, 584–584. 261. Pan, J.Y.; Chen, S.L., Yang, M.H., Wu, J., Sinkkonen, J., Zou, K., 2009. An update on lignans: natural products and synthesis. Nat. Prod. Rep. 26, 1251- 1292, 1460-4752. 262. Panagouleas, C., Skaltsa, H., Lazari, D., Skaltsοunis, A.L., Sokovic, M., 2003. Antifungal activity of secondary metabolites of Centaurea raphanina ssp. mixta growing wild in Greece. Pharm. Βiol. 41, 266–270. 263. Parejo, I., Caprai, E., Bastisa, J., Vidalomat, F., Jáuregui O., Codina C., 2004. Investigation of Lepechinia graveolens for its antioxidant activity and phenolic composition. J. Ethnoparm. 94, 175–184. 264. Parr, A.J., Bolwell, G.P., 2000. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. 80: 985–1012. 265. Peng, S.C., Cheng, C.Y., Sheu F., Su, C.H., 2008. The antimicrobial activity of heyneanol A extracted from the root of taiwanese wild grape. J. Appl. Microbiol. 105, 485–491. 266. Peshkova, V.A., Mirovich, V.M., 1984. Flavonoids of Origanum vulgare. Khim. Prir. Soedin. 4, 522–522. 267. Petersen, M., Haüsler, E., Karwatzki, B., Meinhard, J., 1993. Proposed biosynthetic pathway for rosmarinic acid in cell cultures of Coleus blumei Benth. Planta 189, 10–14. 268. Petersen, M., Simmonds, M.S.J., 2003. Molecules of interest-Rosmarinic acid. Phytochemistry 62, 121–125. 269. Picman, A.K., Towers, G.H.N., 1983. Antibacterial activity of sesquiterpene lactones. Biochem. Syst. Ecol. 11, 321-327. 270. Pietta, P.G., 2000. Flavonoids as antioxidants. J. Nat. Prod. 63, 1035-1042. 271. Pizzale, L., Bortolomeazzi, R., Vichi, S., Überegger, E., Conte, L.S., 2002. Antioxidant activity of sage (Salvia officinalis and S. fruticosa) and oregano (Origanum onites and O. indercedens) extracts related to their phenolic compound content. J. Sci. Food Agric. 82, 1645–1651. ЛИТЕРАТУРА 268 272. Radušienė, J., Ivanauskas, L., Janulis, V., Jakštas, V., 2008. Composition and variability of phenolic compounds in Origanum vulgare from Lithuania, Biologija 54, 45–49. 273. Raj Narayana, K., Sripal Reddy, M., Chaluvadi, M.R., Krishna, D.R., 2001. Bioflavonoids classification, pharmacological, biochemical effects and therapeutic potential. Ind. J. Pharm. 33, 2–16. 274. Raybaudi-Massilia, R.M., Mosqueda-Melgar, J., Soliva-Fortuny, R., Martín- Belloso, O. 2009. Pathogenic and spoilage microorganisms in fresh-cut fruits and fruit juices by traditional and alternative natural antimicrobials. Compr. Rev. Food Sci. Food Safety. 8, 157–180. 275. Ren Y., Acuña U.M., Jiménez, F., Garcia, R., Mejía, M., Chai, H., Gallucci, J.C., Farnsworth, N.R., Soejarto, D.D., Carcache de Blanco, E.J., Kinghorn, A.D., 2012. Cytotoxic and NF-κB inhibitory sesquiterpene lactones from Piptocoma rufescens. Tetrahedron 68, 2671–2678. 276. Ribeiro, N.L., Nahar, L., Kumarasamy, Y., Mir-Babayev, N., Sarker, S.D., 2002. Flavonoid C-glucosides and a lignan from Centaurea macrocephala (Compositae). Biochem. Syst. Ecol. 30, 1097–1100. 277. Robles, M., Choi, BH., Han, B., Santa Cruz, K., Kim, RC., 1998. Repin-induced neurotoxicity in rodents. Exp. Neurol. 152, 129–136. 278. Rodriguez, E., Towers, G.H.N., Mitchell, J.C., 1976. Biological activities of sesquiterpene lactones. Phytochemistry 15, 1573-1580. 279. Rohmer, M., Knani, M., Simonin, P., Sutter, B., Sahm, H., 1993. Isoprenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate. Biochem. J. 295, 517–524. 280. Rosenthal, G.A., Berenbaum M.R., 1992. Herbivores: Their interaction with secondary plant metabolites, Vol II Ecological and evolutionary processes, 2nd edition academic press, San Diego. 281. Rosselli, S., Bruno, M., Maggio, A., R.A. Bancheva, S., Senatore, F., Formisano, C., 2009. Essential oils from the aerial parts of Centaurea cuneifolia Sibth. & Sm. and C. euxina Velen., two species growing wild in Bulgaria. Biochem. Syst. Ecol. 37, 426–431. 282. Rosler, H., Star, A.E., Mabry, T.J., 1971. New 6-methoxyflavonols from Centaurea jacea. Phytochemistry 10, 450–451. 283. Rustaiyan, A., Niknejad, A., Zdero, C., Bohlmann, F., 1981a. A guaianolide from Centaurea behen. Phytochemistry 10, 2427–2429. 284. Rustaiyan, A., Nazarians, L., Bohlmann, F., 1981b. Guaianolides from Acroptilon repens. Phytochemistry 20, 1152–1153. 285. Rustaiyan, A., Ardebili, S., 1984. New guaianolides from C. kandavanensis. Planta Med. 4, 363–364. 286. Rustaiyan, A., Sharif, Z., Tajarodi, A., Ziesche, J., Bohlmann, F., 1984. Neue guajanolide aus Centaurea imperialis. Planta Med. 50, 193–194. 287. Rustaiyan, A., Ahmadi, B., Jaкupovic, J., Bohlmann, F., 1986. Sesquiterpene lactones and eudesmane derivatives from Onopordon carmanicum. Phytochemistry 25, 1659–1662. 288. Russo, M., Galletti, G.C., Bocchini, P., Carnacini, A., 1998. Essential Oil Chemical Composition of wild populations of Italian Oregano spice (Origanum vulgare ssp. hirtum (Link) Ietswaart): A preliminary evaluation of their use in chemotaxonomy by cluster analysis. 1. Inflorescences. J. Agric. Food Chem. 46, 3741-3746. ЛИТЕРАТУРА 269 289. Rüngeler, P., Lyv, G., Castro, V., Mora, G., Pahl, H.L., Merfort, I., 1998. Study of three sesquiterpene lactones from Tithonia diversifolia on their anti- inflammatory activity using the transcription factor NF-αB and enzymes of the arachidonic acid pathway as targets. Planta Med. 64, 588-593. 290. Sakakibara, A., Mabry, T.J., 1977. A UV procedure for distinguishing 5- hydroxyl-6-methoxyl from 5,6-dihydroxyl systems in flavones and 3-O- substituted flavonols. Rev. Latinoam. Quim. 8, 99. 291. Saleem, M., Nazir, M., Ali S.M., Hussain, H., Lee Y.S., Riaza, N., Jabbar, A., 2010. Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates. Nat. Prod. Rep. 27, 238–254. 292. Saleem, M., Kim, H.J. Ali, M.S., Lee, Y.S., 2005. An update on bioactive plant lignans. Nat. Prod. Rep. 22, 696-716. 293. Şahin, F., Gulluce, M., Daferera, D., Sokmen, A., Sokmen, M., Polissiou, M., Agar, G., Ozer, H., 2004. Biological activities of the essential oils and methanol extract of Origanum vulgare ssp. vulgare in the Eastern Anatolia region of Turkey. Food Control 15, 549–557. 294. Sanz, J.F., Marco, J.A., Rustaiyan, A., 1990. Chemical constituents of Centaurea persica and Senecio coronopifolius. Pharmazie 45, 381. 295. Sarg, T.M., El-Domiaty, M., El-Dahmy, S., 1987. Further guaianolides from Centaurea aegyptiaca. Sci. Pharm. 55, 107–110. 296. Sarg, T., El-Dahmy, S, El-Domaity, M., Ateya, A., 1988. Guaianolides and other constituents from Centaurea sinaica. Acta Pharm. Hung. 58, 129. 297. Saroglou, V.; Karioti, A.; Demetzos, C.; Dimas, K.; Skaltsa, H., 2005. Sesquiterpene lactones from Centaurea spinosa and their antibacterial and cytotoxic activities. J. Nat. Prod. 68, 1404-1407. 298. Sathiamoorthy, B., Gupta, P., Kumar, M., Chaturvedi, A.K., Shukla P.K., Maurya, R., New antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17, 239–242. 299. Sato, Y., Suzaki, S., Nishikawa, T., Kihara, M., Shibata H., Higuti, T., 2000. Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata and antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Ethnopharmacol. 72, 483–488. 300. Savidge, R.A., Udagama-Randenaya, P.V., and Lelnhos, V., 1994. Properties of two enzymes of lignification in conifers. In Proceedings of the Second lnternational Symposium on the Applications of Biotechnology to Tree Culture, Protection and Utilization, C.H. Michler, M.R. Becwar, D. Cullen, W.L. Nance, R.R. Sederoff, and J.M. Slavicek, eds (St. Paul, MN: U.S. Department of Agriculture, Forest Service), p. 10. 301. Scarpati, M.L., Oriente, G., 1958. Isolamento e costituzione dell’acido rosmarinico (dal rosmarinus off.). Ric. Sci. 28, 2329–2333. 302. Schafer, H., Wink, M., 2009. Medicinally important secondary metabolites in recombinant microorganisms or plants: progress in alkaloid biosynthesis. Biotech. J. 4, 1684–1703. 303. Segiet-Kujawa, E., Michalowska, A., 1990. Determination of flavonoids in Hb. Origani. Herba Pol. 36, 79-82. CA 116:136343 304. Senatore, F., Rigano, D. De Fusco, R., Bruno M., 2003. Volatile components of Centaurea cineraria L. subsp. umbrosa (Lacaita) Pign. and Centaurea napifolia L. (Asteraceae), two species growing wild in Sicily. Flavour Fragr. J. 18, 248– 251. ЛИТЕРАТУРА 270 305. Shoeb, M., MacManus, S.M., Kumarasamy, Y., Jaspars, M., Nahar, L., Thoo- Lin, P.K., Nazemiyeh, H., Sarker, S.D., 2006. Americanin, a bioactive dibenzylbutyrolactone lignan, from the seeds of C. americana. Phytochemistry 67, 2370–2375. 306. Shoeb, M., Rahman, M. M., Nahar, L., Delazar, A., Jaspars, M., Macmanus, S.M. Sarker, S.D. 2004. Bioactive lignans from the seeds of Centaurea macrocephala. DARU 12, 87–93. 307. Shi, H., Noguchi, N., Niki, E., 2001. Flavonoids and other polyphenols. Methods Enzymol. 335, 157-166. 308. Skaltsa, H., Harvala, C., 1987. Chemical study of Origanum dictamnus L. Part 2. Leaf glucosides. Plant Med. Phytother. 21, 56–62. 309. Slimestad, R., Marston, A., Mavi, S. Hostettmann, K., 1995. Larvicidal constituents of Melantheria albinervia. Planta Med. 61, 562–563. 310. Sikkema, J., de Bont, J.A., Poolman, B., 1995. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 59, 201–222. 311. Silva, M.L.A.,Coímbra, H.S., Pereira, A.C., Almeida, V.A.,Lima, T.C., Costa, E.S., Vinhólis, A. H.C., Royo, V.A., Silva, R., Da Silva Filho, A.A., Cunha, W.R., Furtado, N.A.J.C., Martins, C. H.G., Carvalho, T.C., Bastos, J.K., 2007. Evaluation of Piper cubeba extract, (-)-cubebin and its semi-synthetic derivatives against oral pathogens. Phytother. Res. 21, 420 – 422. 312. Silva, M.L.A., Martinsa, C.H.G., Lucarinia, R., Satob, D.N., Pavanb, F.R., Freitasa, N.H.A., Andradeb L.N., Pereiraa, A.C., Biancoa, T.N.C., Vinholisa, A.H.C., Cunhaa, W.R., Bastosc, J.K. Silvaa, R., da Silva Filhoa, A.A. 2009. Antimycobacterial activity of natural and semi-synthetic lignans. Z. Naturforsch. 64 c, 779 – 784. 313. Souleles, C., 1990. Flavonoids of Origanum dubium. Plant Med. Phytother. 24, 175–178. 314. Stevens L.K., Wong Y.R., 1986. Structure of chlororepdiolide, a new sesquiterpene lactone from C. repens. J. Nat. Prod. 49, 833–837. 315. Stevens, L.K., 1982. Sesquiterpene lactones from C. repens. Phytochemistry 21, 1093–1098. 316. Sueyoshi, E., Liu, H., Matsunami, K., Otsuka, H., Shinzato, T., Aramoto, M., Takeda, Y., 2007. Bridelioside, a new lignan glycoside from Bridelia glauca Bl. f. balansae (Tucht.) Hatusima. J. Nat. Med. 61, 468–471. 317. Susanna, A., Garcia-Jacas, N., 2007. “The tribe Cardueae”, in “Flowering Plants.Eudicots. Asterales”, in Kadereit, J., Jeffrey, C. (Eds.) “The Families and Genera of Vascular Plants”, Ed. K. Kubitzki, Springer, Berlin, Heidelberg. 8, pp. 123–146. 318. Šimko, I., Omer, E.A., Ewing, E.E., Daviesa, P.J., McMurrya, S., Koch, J.L., 1996. Tuberonic (12-OH-jasmonic) acid glucoside and its methyl ester in potato. Phytochemistry 43, 727-730. 319. Talhouk, R.S., El-Jouni, W., Baalbaki, R., Gali-Muhtasib, H., Kogan, J., Talhouk, S.N. 2008. Anti-inflammatory bio-activities in water extract of Centaurea ainetensis. J. Med. Plants Res. 2, 024-033. 320. Takeda, Y., Mima, C., Masuda, T., Hirata, E., Takushi, A., Otsuka, H., 1998. Glochidioboside, a glucoside of (7S, 8R)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol from leaves of Glochidion obovatum. Phytochemistry 49, 2137–2139. ЛИТЕРАТУРА 271 321. Takeda, Y., Tomonari, M., Arimoto, S., Masuda, T., Otsuka, H., Matsunami, K., Honda, G., Ito, M., Takaishi, Y., Kiuchi, F., Khodzhimatov, O. K., Ashurmetov O. A. 2008. A new phenolic glucoside from Uzbek medicinal plant Origanum tyttanthum. J. Nat. Med. 62, 71–74. 322. Tešević, V., Vajs, V., Todorović, N., Djoković, D. Marin, P., Milosavljević, S., 1998. Sesquiterpene lactones from plant species Centaurea solstitialis L.J. Serb. Chem. Soc. 63, 131–135. 323. Tolstikov, G.A., Flekhter, O.B., Shultz, E.E., Baltina, L.A., Tolstikov, A.G., 2005. Betulin and Its Derivatives. Chemistry and Biological Activity. Chem. Sust. Dev. 13, 1-29. 324. Tornhamre, S., Schmidt, T.J., Näsman-Glaser, B., Ericsson, I., Lindgren, JA., 2001. Inhibitory effects of helenalin and related compounds on 5-lipoxygenase and leukotriene C(4) synthase in human blood cells. Biochem Pharmacol. 62, 903-911. 325. Toyoda, T., Tsukamoto, T., Mizoshita, T., Nishibe, S., Deyama, T., Takenaka, Y., Hirano, N., Tanaka, H., Takasu, S., Ban, H., Kumagai, T., Inada, K., 2007. Utsunomiya, H., Tatematsu, M., Inhibitory effect of nordihydroguaiaretic acid, a plant lignan, on Helicobacter pylori-associated gastric carcinogenesis in Mongolian gerbils. Cancer Sci. 98, 1689–1695. 326. Tukov, F.F, Rimoldi, J.M, Matthews, J.C., 2004. Characterization of the role of glutathione in repin-induced mitochondrial dysfunction, oxidative stress and dopaminergic neurotoxicity in rat pheochromocytoma (PC12) cells. Neurotoxicology 25, 989–999. 327. Twaij, H.A., Kery, A., Al-Khazraji, N.K., 1983. Some pharmacological, toxicological and phytochemical investigations on Centaurea phyllocephala. J. Ethnopharmacol. 9, 299-314. 328. Ulubelen, A., Öksüz, S., Meriçli, A.H., 1988. Palmitic acid ester of sitosteryl 3β- glucoside From Centaurea regia. Phytochemistry 27, 3964–3965. 329. Vajs, V., Todorović, N., Ristić, M., Tešević, V., Todorović, B., Janaćković, P., Marin, P., Milosavljević, S., 1999. Guaianolides from Centaurea nicolai: antifungal activity. Phytochemistry 52, 383–386. 330. Van Den Dool, H., Kratz, P.D., 1963. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas—liquid partition chromatography. Journal of Chromatography A, 11, 463–467. 331. Vasquez, M., Quijano, L., Fronczek, R.F., Macias, A.F., Urbatsch, E.L., Coxf B.P., Fischer, N.H., 1990. Sesquiterpene lactones and lignanes from Rudbeckia species. Phytochemistry 29, 561–565. 332. Venkateswara Rao, G., Mukhopadhyay, T., Annamalai, T., Radhakrishnan, N., Sahoo M.R., 2011. Chemical constituent and biological studies of Origanum vulgare Linn. Pharmacognosy Res. 3, 143–145. 333. Voirin, B., 1983. UV spectral differentiation of 5-hydroxy- and 5-hydroxy-3- methoxy flavones with mono-(4'), di-(3',4') or tri-(3',4',5')-substituted B rings. Phytochemistry 22, 2107-2145. 334. Vogt, H.J., Tausch, I., Wölbling, R.H., Kaiser, P.M., 1991. Melissenextrakt bei Herpes simplex (eine Plazebo-kontrollierte Doppelblind-Studie). Allgemeinarzt 13, 832–841. 335. Vajs, V., Todorovic, N., Ristic, M., Tesević, V., Todorović, B., Janaćković, P., Marin, P., Milosavljević, S. 1999. Guaianolides from Centaurea nicolai: antifungal activity. Phytochemistry 52, 383–386. ЛИТЕРАТУРА 272 336. Wagner, H., Hoerhammer, L., Hoer, R., Murakami, T., Farkas, L., 1969. Untersuchungenüber die Glykoside von Centaurea jacea L. III. Isolierung, Struktur und Synthese von 4,5,7-Trihydroxy-3,6-dimetoxy-flavon-7-mono-β-D- glucopyranoside. Tetrahedron Lett. 39, 3411–3414. 337. Walton, N.J., Brown, D.E., 1999. Chemicals from Plants: Perspectives on Plant Secondary Products. Chapter 1: Harborne, J.B. Classes and functions of secondary products from plants. Imperial college press and World Scientific Publishing Co.Pte. Ltd. 338. Wang M., Kikuzaki H., Zhu N., Sang S., Nakatani N., Ho C.-T., 2000. Isolation and structural elucidation of two new glucosides from Sage (Salvia officinalis L.). J. Agric. Food Chem. 48, 235–238. 339. Warnke, P.H., Becker, S.T., Podschun, R.,Sivananthan, S.,Springer, I.N., Russo, P.A.,Wiltfang, J, Fickenscher, H., Sherry, E., 2009. The battle against multi- resistant strains: Renaissance of antimicrobial essential oils as a promising force to fight hospital-acquired infections. J. Craniomaxillofac Surg. 37, 392–397. 340. Whettena, R., Sederoffa, R., 1995. Lignin Biosynthesis. The Plant Cell 7, 1001– 1013. 341. Williams, WL.Jr., Hall, I.H., Grippo, A.A., Oswald, C.B., Lee, K.H., Holbrook, D.J., Chaney, S.G., 1988. Inhibition of nucleic acid synthesis in P-388 lymphocytic leukemia tumor cells by helenalin and bis(helenalinyl)malonate in vivo. J. Pharm. Sci. 77, 178–184. 342. Withers S.T., Keasling J.D., 2007. Biosynthesis and engineering of isoprenoid small molecules. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 980–990. 343. Wojdyłoa, A., Oszmiański, J., Czemerys, R., 2007. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chem. 105, 940–949. 344. Wu, R., Ye, Q., Chen, N., Zhang, G., 2000. Chemical constituents of Origanum vulgare L. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 12, 13-16. CA 135:2915. 345. Yadav, S.B., Vyasji, T., 2000. Flavonoids from Origanum majorana. Indian Drugs 37, 508-508. CA 135:105009. 346. Υahara, S., Sakamoto, C., Nohara, T., Niiho, Y., Nakajima, Y., Ito, H., 1993. Thymoquinol glucosides from Schisandrae fructus. Shoykugaku Zasshi 47, 420–422. CA 121:65387. 347. Yayli, Ν., Yaşar, Α., Güleç, C., Usta, A., Kolayli, S., Coşkunçelebi, K., Karaoğlu, S., 2005. Composition and antimicrobial activity of essential oils from Centaurea sessilis and Centaurea armena. Phytochemistry 66, 1741-1745. 348. Yesiladaa, E., Gürbüza, I., Bedirb, E., Tatlic, I., Khanb, I.A., 2004. Isolation of anti-ulcerogenic sesquiterpene lactones from Centaurea solstitialis L. ssp.solstitialis through bioassay-guided fractionation procedures in rats. J. Ethnopharmcol. 95, 213–219. 349. Yoshioka, H., Mabry, T.J., 1971. The geminal coupling and paramagnetic shift of exomethylen protons in the α, β'-unsaturated γ-lactone group of sesquiterpene lactones containing C8-α-hydroxyl groups. Tetrahedron 27, 3317–3322. 350. Youssef, D., Frahm A.W., 1995. Constituents of the Egyptian Centaurea scoparia; III. Phenolic constituents of the aerial parts. Planta Med. 61, 570–573. 351. Youssef, D., Frahm, W., 1994a. Constituents of the Egyptian Centaurea scoparia; Chlorinated guaianolides of the aerial parts. Planta Med. 60, 267–271. 352. Youssef, D., Frahm, W., 1994b. Constituents of the Egyptian Centaurea scoparia; II. Guaianolides of the aerial parts. Planta Med. 60, 572–575. ЛИТЕРАТУРА 273 353. Youssef, A.T.D., 1998. Sesquiterpene lactones of Centaurea scoparia. Phytochemistry 49, 1733–1737. 354. Yousefzadi, M., Sharifi, M., Behmanesh, M., Moyano, E., Bonfill, M., Cusido, R.M., Palazon, J., 2010. Podophyllotoxin: Current approaches to its biotechnological production and future challenges. Eng. Life Sci. 10, 281-292. 355. Yu Pan, J., Zhang, S., Wu, J., Xin Li, Q., Hui Xiao, Z., 2010. Litseaglutinan A and lignans from Litsea glutinosa. Helv. Chim. Acta. 93, 951–957. 356. Yayli, Ν., Yaşar, Α., Güleç, C., Usta, A., Kolayli, S., Coşkunçelebi, K., Karaoğlu, S., 2005. Composition and antimicrobial activity of essential oils from Centaurea sessilis and Centaurea armena. Phytochemistry 66, 1741–1745. 357. Zaghloul, A.M., Salama, O.M. Halim, A.F., Mansoura, 1990. Chemical investigation of Centaurea glomerata Vahl. J. Pharm. Sci. 6, 61-68. 358. Zakirov, Kh.S., Kasymov, Z.Sh., Sidyakin, P.G., 1982. Sesquiterpene lactones of Jurinea suffruticosa. Khim. Prirod. Soed. 3, 399. 359. Zdero, C., Bohlmann, F., 1989. Sesquiterpene lactones from Oldenburgia arbuscula and Pleiotaxis rugosa. Phytochemistry 28, 3345–3346. 360. Zgórka, G., Lutostanska, E., Głowniak, K., 1997. Seasonal variations of phenolic acids in Origanum vulgare leaves. Pharm. Pharmacol. Lett. 7, 187– 190. 361. Zgórka, G, Głowniak, K., 2001.Variation of free phenolic acids in medicinal plants belonging to the Lamiaceae family. J. Pharm. Biomed. Anal. 26, 79-87. 362. Zheng, S., Wang, X., Gao, L., Shen, X., Liu, Z., 1997. Studies on the flavonoid compounds of Origanum vulgare L. Indian J. Chem., Sect. B: Org. Chem. Incl. Med. Chem. 36 B, 104-106. CA 127: 92675. 363. Zheng, X.K., Li, K.K., Wang, Y.Z., 2008. Chin. Chem. Lett. 19, 19. 364. Zheng, J.C., Yoo, S.J., Lee, G.T., Cho, Y.H., Kim, H.Y., Kim, G.W., 2005. Fatty acid synthesis is a target for antibacterial activity of unsaturated fatty acids. FEBS Letters, 579, 5157–5162. БИОГРАФИЈА БИОГРАФИЈА Тања С. Милошевић-Ифантис рођена је 25.07.1979. године у Крагујевцу. Основну школу и Прву техничку школу завршила је у Крагујевцу. На Природно-математички факултет у Крагујевцу, група Хемија, смер истраживање и развој, уписала се школске 1998/99. године, где је и дипломирала, децембра 2004. године, са просечном оценом 9,10. На последипломске студије на Природно-математичком факултету у Крагујевцу (смер Биохемија) уписала се 2004. године, а магистарску тезу под насловом „Aнтимикробна активност екстраката биљке Hypericum perforatum L.” одбранила је 2007. године, под менторством професорке др Славице Солујић. Након дипломирања 2005. године ангажована је као истраживач приправник, а од 2009. године као истраживач сарадник на пројектима које финансира Министарство просвете и науке Републике Србије. [пројекати бр. 1740 (2005. године), 142025 (2006. – 2010. године) и III 43004 (2011. године)]. Од тог периода бави се научно − истраживачким радом из области статичке и динамичке биохемије биљака и микроорганизама и хемије природних производа. У току ангажовања на пројектима успешно је водила експерименталну наставу на Природно-математичком факултету у Крагујевцу на предметима Биохемија и Хемија природних производа као и на предмету Биофармација, Фармацеутског факултета у Крагујевцу. У току докторских студија, октобра 2008. године, као стипендиста грчке државне фондације IKY, боравила је годину дана на Фармацеутском факултету, Универзитета у Атини, када је започела експериментални део докторске дисертације у лабораторији професорке др Хелен Скалтса. Од 2011. године живи у Грчкој и ради у својству истраживача сарадника на пројекту Грчко-турске билатералне сарадње на Фармацеутском факултету, Универзитета у Атини. ПРИЛОГ СПИСАК НАУЧНИХ РАДОВА СПИСАК НАУЧНИХ РАДОВА Резултати истраживања, приказани у оквиру ове докторске дисертације, објављени су као следећи радови у наведеним међународним часописима: 1. T. Milošević, C. Argyropoulou, S. Solujić, D. Muratspahić, H. Skaltsa Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from Centaurea pannonica and C. jacea Nat. Prod. Commun. 5 (2010) 1663-1668. 2. T. Milošević Ifantis, S. Solujić, H. Skaltsa Secondary metabolites from the aerial parts of Origanum scabrum Boiss. & Heldr. Biochem. Syst. Ecol. 44 (2012) 289-294. 3. T. Milošević Ifantis, S. Solujić., D. Pavlović-Muratspahić, H. Skaltsa Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. from Serbia and their chemotaxonomic importance Phytochemistry (2013) DOI:10.1016/j.phytochem.2013.05.014 Secondary metabolites from the aerial parts of Origanum scabrum Boiss. & Heldr. Tanja Milosevic Ifantis a,b, Slavica Solujic b, Helen Skaltsa a,* aDepartment of Pharmacognosy & Chemistry of Natural Products, School of Pharmacy, University of Athens, Panepistimiopolis, Zografou, 157 71 Athens, Greece bDepartment of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, Radoja Domanovica 12, 34000 Kragujevac, Serbia a r t i c l e i n f o Article history: Received 6 February 2012 Accepted 3 June 2012 Available online 4 July 2012 Keywords: Origanum scabrum Boiss. & Heldr. Lamiaceae Phenolic acid Neolignan Chemotaxonomy 1. Subject and source The genus Origanum (Lamiaceae) comprises approximately 40 species (Ietswaart, 1980). Most of them have a very local distribution around the Mediterranean. In particular, nine are restricted to Greece, South Balkans and Asia Minor (six are local Greek endemics) (Kokkini, 1996). Systematics and taxonomy of the genus are difficult due to hybridization between species and large variation of almost all morphological characters within the genus (Skoula and Harborne, 2002). Origanum scabrum Boiss. & Heldr. is an endemic species distributed at the mountains of South Greece. It is rhizo- matous perennial herb with the erect, light or dark brown stems up to 45 cm long. The leaves are sessile, heart-shaped or roundish up to 12 pairs per stem while bracts are conspicuous, ovate to ovate-elliptica. Corolla is pink and it flowers from June to September (Ietswaart, 1980; Fernandes and Heywood, 1972). The aerial parts of O. scabrum Boiss. & Heldr. were collected from mountain Dirphys (island of Evia) during flowering period in June 2007. A voucher of the species from the same locality, on which our collection was based, is kept in the University of Patras Herbarium (Phitos 3938, UPA). The plants are well known as medicinal and culinary herbs (Dorman and Deans, 2000; Burt, 2004; Milos et al., 2000) and also as garden plants. Among them Origanum vulgare L. plays a primary role among culinary herbs inworld trade (Prieto et al., 2007). As far as we know, there are no data about uses of O. scabrum. * Corresponding author. Tel./fax: þ30 2107274593. E-mail address: skaltsa@pharm.uoa.gr (H. Skaltsa). Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Biochemical Systematics and Ecology journal homepage: www.elsevier .com/locate/biochemsyseco 0305-1978/$ – see front matter  2012 Published by Elsevier Ltd. http://dx.doi.org/10.1016/j.bse.2012.06.014 Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 289–294 Table 1 Secondary metabolites isolated from Origanum spp.a Species Origin of species Compound References O. compactum Benth. Morocco b-Amyrin, betulin, betulinic acid, 21-a-hydroxy oleanolic acid, 21-a-hydroxy ursolic acid, aromadendrin, thymohydroquinone Bellakhdar et al., 1988 O. dictamnus L. Greece Apigenin, eriodictyol, quercetin, luteolin Harvala and Skaltsa, 1986 Greece Apigenin-7-O-glucoside, eriodictyol-7-O-glucoside, luteolin-7-O-glucoside, vitexin, isovitexin, isoorientin, orientin Skaltsa and Harvala, 1987 Greece Salvianolic acid P, rosmarinic acid, rosmarinic acid methyl ester, thymoquinone, thymoquinol-2-O- b-glucopyranoside, oresbiusin A, E-caffeic acid, apigenin, kaempferol, quercetin, eriodictyol, taxifolin, naringenin, 12-hydroxyjasmonic acid, 12-hydroxyjasmonic acid 12-O-b-D-glucopyranoside Chatzopoulou et al., 2010 O. dubium Boiss. Greece Apigenin-40-methylether, kaempferol-3, 6,7-trimethylether, quercetin-3, 6-dimethylether, quercetin-3,6, 7trimethylether Souleles, 1990 O. intercedens Rech. Crete Greece Caffeic acid, rosmarinic acid, carvacrol Pizzale et al., 2002 O.  intercedens Rech. (¼O. onites  vulgare ssp. hirtum) Greece Technological Educational Institution Thessaloniki Thymosin, 5,6,40-trihydroxy-7, 30-dimethoxyflavone, thymonin, cirsimaritin, genkwanin Bosabalidis et al., 1998 O. majorana L. Egypt Arbutin, methylarbutin, hydroquinone, hydroquinone-monomethyl ether Assaf et al., 1987 – Apigenin, kaempferol, luteolin Yadav and Tripathi, 2000 Japan, Local market 6-hydroxyapigenin, 6-hydroxyapigenin- 7-O-b-D-glucopyranoside, 6-hydroxyluteolin-7-O-b-D-glucopyranoside, 6-hydroxyapigenin-7-O-(6-O-feruloyl)-b-D- glucopyranoside, 6-hydroxyluteolin-7-O- (6-O-feruloyl)-b-D-glucopyranoside Kawabata et al., 2003 O. majoricum Camb. (¼O. majorana  vulgare ssp. virens) Spain Apigenin, luteolin, naringin, rutoside, chrysoeriol Palomino et al., 1997 O. onites L. Crete Greece Caffeic acid, rosmarinic acid, carvacrol Pizzale et al., 2002 O. syriacum L. Egypt Thymoquinol-2-O-b-glucopyranoside, thymoquinol-5-O-b-glucopyranoside, thymoquinol-2,5-O-b-diglucopyranoside, carvacrol-2-O-b-glucopyranosyl-(1/2)-b glucopyranoside, p-menth-1-ene-3,4-diol 4-O-b-glucopyranoside Kamel et al., 2001 O. tyttanthum Gontsch. Uzbekistan 4-O-b-D-glucopyranosylbenzyl-30-hydroxyl-40- methoxybenzoate, thymol, carvacrol, thymol-b-D-glucoside, naringenin, eryodictiol, 4-O-b-D-glucopyranosylbenzyl-30 , 40-dihydroxybenzoate, thymoquinol-5-O-b-glucopyranoside, thymoquinol-2-O-b-glucopyranoside, acacetin-7-O-b-D-methylglucuronate, rosmarinic acid, 4-O-b-D-glucopyranosylbenzyl-40- hydroxy benzoate, 4-O-b-D-glucopyranosylbenzyl-40- hydroxy-30-methoxy-benzoate Takeda et al., 2008 O. vulgare L. Novosibirsk province Russia Cosmoside, luteoline-7-O-b-D-glucopyranoside Peshkova and Mirovich, 1984 Japan Botanical garden 4-[(3,4)-dihydroxybenzoyloxy)methyl]phenyl-b - glucopyranoside Nakatani and Kikuzaki, 1987 Japan Botanical garden E-caffeic acid, rosmarinic acid, protocatechuic acid Kikuzaki and Nakatani, 1989 Russia Vanillic acid, E-caffeic acid, cinnamic acid, protocatechuic acid, syringic acid, p-hydroxybenzoic acid, chloregenic acid Mirovich et al., 1989 – Apigenin, luteolin Segiet-Kujawa and Michalowska, 1990 T.M. Ifantis et al. / Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 289–294290 2. Previous work The genus Origanum is known to contain a diversity of compounds (Table 1). Previous study of O. scabrum focused on volatile secondary metabolites which was found to contain carvacrol, p-cymene, g-terpinene and thymol (Aligiannis et al., 2001). There are limited data about the non volatile secondary metabolites of O. scabrum Boiss. & Heldr. (Tomás-Barberán et al., 1988). This study deals with the isolation and structural elucidation of polar constituents from O. scabrum. 3. Present study The air-dried powdered aerial parts of O. scabrum (0.24 kg) were successively extracted at room temperature with CH2Cl2 (5.7 g), MeOH (9.1 g) and MeOH:H2O 5:1 (6.8 g) and evaporated to dryness in vacuo. The latter extract was chosen for further analysis based on the 1H NMR spectra of all extracts. Fractionation was carried out by VLC over silica gel (10  8 cm) using as eluent mixtures of CH2Cl2:MeOH:H2O of increasing polarity (97:3:0.3–0:20:80) to yield 10 fractions (A–J). According to TLC analysis on silica gel (CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3) fractions E and F were selected for further research. Fraction E (eluted with CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3; 0.63 g) was further applied to CC on silica gel using a step-wise gradient of CH2Cl2:MeOH:H2O (98:2:0.2–20:80:8) and afforded 14 fractions (EA–EN). The fraction EI (CH2Cl2:MeOH:H2O 70:30:3; 82.6 mg) was subjected to Table 1 (continued ) Species Origin of species Compound References – 5-hydroxy-7-methoxy-6-O-[a-L-ramnopyranosyl (1/2)-b-D-fucopyranosyl]flavon, 5,6-dihydroxy-7- methoxyflavone, 5-hydroxy-6,7-dimethoxyflavone, isosakuranetin 7-O-b-D-neohesperidoside, 30 ,40 , 50-trimethoxy-furanoflavone Zheng et al., 1997 Poland E-caffeic acid, rosmarinic acid Zgórka et al., 1997 – Protocatechuic acid, ursolic acid, oleanolic acid, sagitatoside A, b-sitosterol, stigmasterol, tilianin Wu et al., 2000 FYROM Apigenin, diosmetin, luteolin, chrysoeriol Kulevanova et al., 2001 Russia Aristolochic acid I, aristolochic acid II, D-(þ)-raffinose, ursolic acid Goun et al., 2002 Japan Botanical garden 40-O-b-D-glucopyranosyl-30 ,40-dihydroxybenzyl protocatechuate, 40-O-b-D-glucopyranosyl-30 , 40-dihydroxybenzyl, 4-O-methylprotocatechuate Matsuura et al., 2003 Taiwan Salvianolic acid A, salvianolic acid C, lithospermic acid, rosmarinic acid, protocatechuic acid, caffeic acid, apigenin-7-O-b-D-glucuronide, apigenin-7-O-b-D- (60-methyl) glucuronide, luteolin, luteolin-7-O-b-D- glucopyranoside, luteolin-7-O-b-D-glucuronide, luteolin-7-O-b-D-xylopyranoside, 4-hydoxybenzyl alcohol-4-O-b-D-glucopyranoside, 4-(3,4-dihydroxybenzoyloxymethyl) phenyl-O-b-D-glucopyranoside Lin et al., 2003 Lithuania Botanical garden Rosmarinic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, hyperozide, naringin þ rutin, luteolin, astragalin, vitexin, isovitexin, eriodictol, quercetin, naringenin, diosmetin Radusien _e et al., 2008 China Drug store Rosmarinic acid methyl ester Ding et al., 2010 Egypt Apigenin, luteolin, salvagenin, cirsimartin, diosmetin, desmetoxycentauridin, 5-hydroxy-6,7,30 ,40-tetramethoxy-apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin 7-O-glucoside, luteolin-7-O-glucoside-600-methylester, luteolin-7-O-a-L-rhamnoside-40-b-D-glucoside, quercetin 3-O-b-D-glucoside-40-O-a-L-rhamnoside Hawas et al., 2008 India Origanol A, origanol B, ursolic acid, oleanolic acid, b-sitosterol, triacontanol Venkateswara Rao et al., 2011 O. vulgare L. ssp. hirtum (Link) Ietswaart Greece Apigenin, luteolin, chrysoeriol, diosmetin, quercetin, eriodictyol, cosmoside, vicenin-2, caffeic acid, p-menth-3-ene-1,2-diol 1-O-b-glucopyranoside, thymoquinol-2-O-b-glucopyranoside, thymoquinol-5-O-b-glucopyranoside, thymoquinol-2,5-O-b-diglucopyranoside, 12-O-hydroxyjasmonic acid, 12-O-hydroxyjasmonic acid 12-O-b-glucopyranoside, lithospermic acid B, rosmarinic acid, 10-epi-lithospermic acid, epi-lithospermic acid B. Koukoulitsa et al., 2006 a The authorities of the species have been recorded according to Ietswaart (1980). T.M. Ifantis et al. / Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 289–294 291 RP-HPLC (MeOH:AcOH 5% 35:65) and allowed the isolation of compounds 7 (10.1 mg; tR 13.6 min), 4 (9.2 mg; tR 15.2 min), 8 (2.8 mg; tR 26.6 min). Fraction EJ (84.3 mg eluted with CH2Cl2:MeOH:H2O 60:40:4) also was further purified by RP-HPLC (MeOH:AcOH 5% 35:65) and yielded 6 (2.8 mg; tR 11.3 min). Fraction F (eluted with CH2Cl2:MeOH:H2O 50:50:5; 1.5 g) was further applied to VLC over silica gel using CH2Cl2:MeOH:H2Omixtures of increasing polarity (97:3:0.3–0:50:50) and yielded nine fractions (FA–FI). Combined fractions FD, FE and FF (FD; 0.32 g) were submitted to CC on silica gel (CH2Cl2:MeOH:H2O 97:3:0.3–50:50:5) and yielded twelve fractions (FD 0 A–FD 0 L). Fraction FD 0 F (eluted with CH2Cl2:MeOH:H2O 80:20:2; 99.1 mg) was further subjected to RP-HPLC (MeOH:AcOH 5% 35:65) and finally yielded compounds 4 (20.1 mg; tR 9.5 min), 5 (7.2 mg; tR 10.3 min), 2 (3.6 mg; tR 14.7 min), 3 (2.7 mg; tR 17.5 min). Fraction FD 0 I (eluted with CH2Cl2:MeOH: H2O 70:30:3; 42.7 mg) was similarly purified by RP-HPLC (MeOH:AcOH 5% 35:65) and allowed the isolation of compounds 6 (5.5 mg; tR 10.8min) and 1 (28.7mg; tR 50.5min). Vacuum-liquid chromatography (VLC) was carried out on silica gel 60H (Merck, Art. 7736). Column chromatography (CC) was carried out on silica gel 60 (Merck, Art. 9385). TLC: Merck silica gel 60 F254 (Merck, Art. 5554); detection, UV light R'O HO O O O RO HO OH 1 R=R'=H 3 R=CH3; R'=H 2 R=H; R'=CH3 O CH3 HO O OH OH HO HO H3C CH3 OH CH3 O H3C CH3 O OH COOH O O COOH O HO OH OH HO 6 7 4 5 O HO OCH3 OCH3 O O HO OH OH OH 8 HO O OH HO HO OH Fig. 1. Secondary metabolites isolated from O. scabrum. T.M. Ifantis et al. / Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 289–294292 (absorbance: l 254 and l 365 nm); spray reagents, vanillin-H2SO4 on silica gel. Semi-preparative HPLC was carried on a JASCO liquid chromatograph with pump (PU-2080 Plus), refractive index detector (RID-10A, Shimadzu), Kromasil RP-18 column (250  10 mm, 10 mm) and software program Clarity. The structure of isolated compounds (Fig. 1) was elucidated by combination of spectroscopic (UV, 1H/13C NMR and 2D NMR) and literature data. They were identified as: rosmarinic acid (1) (Kohda et al., 1989; Sawabe et al., 2006), 3-O-methyl rosmarinic acid (2) (Baba et al., 2004), methyl ester of rosmarinic acid (3) (Kohda et al., 1989; Sawabe et al., 2006), thymo- quinol-5-O-b-glucopyranoside (4) (Kamel et al., 2001), thymoquinol-2-O-b-glucopyranoside (5) (Kamel et al., 2001), 12-O- hydroxyjasmonic acid (6) (Fujita et al., 1996) and its 12-O-b-glucoside (7) (Fujita et al., 1996), glochidioboside (8) (Takeda et al., 1998; Kuang et al., 2009). 4. Chemotaxonomic significance O. scabrum belongs to the subfamily Nepetoideae within Lamiaceae family and this is the only taxon from section Ana- tolicon Bentham of the genusOriganum (Ietswaart, 1980) studied so far. The isolated compounds fromO. scabrum (Fig.1) were assigned as phenolic acids, namely as depsides (1–3), monoterpene glucosides (4, 5), two alicyclic derivatives (6, 7) and one neolignan (8). To the best of our knowledge, all compounds were found for the first time in O. scabrum. Substances 2 and 8 are reported for the first time in the genus. The major compound present in O. scabrum is rosmarinic acid (1). So far, it has been isolated frommany species belonging to the Lamiaceae family and it was noted as potentially chemotaxonomic marker of the sub-family Nepetoideae (Zgorka and G1owniak, 2001; Grayer and de Kok, 1998). As shown in Table 1, rosmarinic acid and its derivatives are characteristic secondary metabolites of the genus Origanum, since rosmarinic acid is identified in almost any Origanum species studied, so far. Themethyl ester of rosmarinic acid (3) was previously isolated from the Origanum dictamnus (Chatzopoulou et al., 2010), and O. vulgare (Ding et al., 2010), while 3-O-methyl rosmarinic acid (2) has never previously been reported into Origanum spp. From the other hand, species from the genus Origanum are renowned for their essential oils (Skoula et al., 1999). Although the plants are rich in mono- and sesqui-/terpenoids, monoterpene glucosides have been isolated from few species. This group of compounds including thymoquinol-5-O-b-glucopyranoside (4) and thymoquinol-2- O-b-glucopyranoside (5) have been firstly isolated fromOriganum syriacum (Kamel et al., 2001). Later, they have been found in two Greek taxa, namely O. dictamnus (Chatzopoulou et al., 2010) andO. vulgare ssp. hirtum (Koukoulitsa et al., 2006), as well as in Origanum tyttanthum from Uzbekistan (Takeda et al., 2008). It is noteworthy that the alicyclic derivatives (6, 7), found only in the aforementioned Greek Origanum spp. (Chatzopoulou et al., 2010; Koukoulitsa et al., 2006), have not been isolated so far from any other species belonging to the sub-family Nepetoideae. Furthermore, this is the first report of the presence of the neolignan glochidioboside (8) in the genus Origanum. On the basis of the present study and according to previous researches, it could be concluded that rosmarinic acid and its derivatives have important role in the genus Origanum and they could be considered as useful chemotaxonomic markers not only for Origanum genus, but potentially for all taxa of the Nepetoideae subfamily. In addition, the neolignan, glochidioboside, could be interesting marker for the Nepetoideae subfamily. Acknowledgements The authors are grateful to Ass. Prof. Theophanis Constantinidis (Department of Ecology & Systematics, Faculty of Biology, University of Athens) for the collection and identification of the plant material. Refernces Aligiannis, N., Kalpoutzakis, E., Mitaku, S., Chinou, I.B., 2001. J. Agric. Food Chem. 49, 4168. Assaf, M.H., Ali, A.A., Makboul, M.A., Beck, J.P., Anton, R., 1987. Planta Med. 53, 343. Baba, S., Osakabe, N., Natsume, M., Terao, J., 2004. Life Sci. 75, 165. Bellakhdar, J., Passannanti, S., Paternostro, M.P., Piozzi, F., 1988. Planta Med. 54, 94. Bosabalidis, A., Gabrieli, C., Niopas, I., 1998. Phytochemistry 49, 1549. Burt, S., 2004. Int. J. Food Microbiol. 94, 223. Chatzopoulou, A., Karioti, A., Gousiadou, C., Lax Vivancos, V., Panagiotis, K., Golegou, S., Skaltsa, H., 2010. J. Agric. Food Chem. 58, 6064. Ding, H.Y., Chou, T.H., Liang, C.H., 2010. Food Chem. 123, 254. Dorman, H.J., Deans, S.G., 2000. J. Appl. Microbiol. 88, 308. Fernandes, R., Heywood, V.H., 1972. In: Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burgess, N.A., Moore, D.M., Valentine, D.H., Walters, S.M., Webb, D.A. (Eds.), Flora Europea. Cambridge University Press, Cambridge, U.K, pp. 171–172. Fujita, T., Terato, K., Nakayama, M., 1996. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 732. Goun, E., Cunningham, G., Solodnikov, S., Krasnykch, O., Miles, H., 2002. Fitoterapia 73, 692. Grayer, R.J., de Kok, R.P.J., 1998. Biochem. Syst. Ecol. 26, 729. Harvala, C., Skaltsa, H., 1986. Plant Med. Phytother. 20, 300. Hawas, U.W., El-Desoky, S.K., Kawashty, S.A., Sharaf, M., 2008. Nat. Prod. Res. 22, 1540. Ietswaart, J.H., 1980. A Taxonomic Revision of the Genus Origanum (Labiatae). Leiden University, The Hague. Kamel, M.S., Assaf, M.H., Hasanean, H.A., Ohtani, K., Kasai, R., Yamasaki, K., 2001. Phytochemistry 58, 1149. Kawabata, J., Mizuhata, K., Sato, E., Nishioka, T., Aoyama, Y., Kasai, T., 2003. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 445. Kikuzaki, H., Nakatani, N., 1989. Agric. Biol. Chem. 53, 519. Kohda, H., Takeda, O., Tanaka, S., Yamasaki, K., Yamashita, A., 1989. Chem. Pharm. Bull. 37, 1287. Kokkini, S., 1996. Proceedings of the IPGRI International Workshop on Oregano. 8–12 May 1996 CIHEAM, Valenzano, Bari, Italy. Koukoulitsa, C., Karioti, A., Bergonzi, C.M., Pescitelli, G., Di Bari, L., Skaltsa, H., 2006. J. Agric. Food Chem. 54, 5388. T.M. Ifantis et al. / Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 289–294 293 Kuang, H., Xia, Y., Yang, B., Wang, Q., Lü, S., 2009. Arch. Pharm. Res. 32, 329. Kulevanova, S., Stefova, M., Stefkov, G., Stafilov, T., 2001. J. Liq. Chromatograph. Relat. Technol. 24, 589. Lin, Y.L., Wang, C.N., Shiao, Y.J., Liu, T.Y., Wang, W.Y., 2003. J. Chin. Chem. Soc. 50, 1079. Matsuura, H., Chiji, H., Asakawa, C., Amano, M., Yoshihara, T., Mizutani, J., 2003. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67, 2311. Milos, M., Mastelic, J., Jerkovic, I., 2000. Food Chem. 71, 79. Mirovich, V.M., Peshkova, V.A., Shatokhina, R.K., 1989. Khim. Prir. Soedin. 6, 850. Nakatani, N., Kikuzaki, H., 1987. Agric. Biol. Chem. 51, 2727. Palomino, O.M., Gómez-Serranillos, P., Carretero, E., Cases, A., 1997. Planta Med. 63, 584. Peshkova, V.A., Mirovich, V.M., 1984. Khim. Prir. Soedin. 4, 522. Pizzale, L., Bortolomeazzi, R., Vichi, S., Überegger, E., Conte, L.S., 2002. J. Sci. Food Agric. 82, 1645. Prieto, J.M., Iacopini, P., Cioni, P., Chericoni, S., 2007. Food Chem. 104, 889. Radusien _e, J., Ivanauskas, L., Janulis, V., Jakstas, V., 2008. Biologija 54, 45. Sawabe, A., Satake, T., Aizawa, R., Sakatani, K., Nishimoto, K., Ozeki, C., Hamada, Y., Komemushi, S., 2006. J. Oleo Sci. 55, 413. Segiet-Kujawa, E., Michalowska, A., 1990. Herba Pol. 36, 79. Skaltsa, H., Harvala, C., 1987. Plant Med. Phytother. 21, 56. Skoula, M., Harborne, J.B., 2002. The taxonomy and chemistry of Origanum V. In: Kintzios, S.E. (Ed.), Oregano. Taylor & Frances, London in New York, p. 277. Skoula, M., Gotsiou, P., Naxakis, G., Johnson, C.B., 1999. Phytochemistry 52, 649. Souleles, C., 1990. Plant Med. Phytother. 24, 175. Takeda, Y., Mima, C., Masuda, T., Hirata, E., Takushi, A., Otsuka, H., 1998. Phytochemistry 49, 2137. Takeda, Y., Tomonari, M., Arimoto, S., Masuda, T., Otsuka, H., Matsunami, K., Honda, G., Ito, M., Takaishi, Y., Kiuchi, F., Khodzhimatov, O.K., Ashurmetov, O.A., 2008. J. Nat. Med. 62, 71. Tomás-Barberán, F.A., Grayer-Barkmeijer, R.J., Gil, I.M., Harborne, B.J., 1988. Phytochemistry 27, 2631. Venkateswara Rao, G., Mukhopadhyay, T., Annamalai, T., Radhakrishnan, N., Sahoo, M.R., 2011. Pharm. Res. 3, 143. Wu, R., Ye, Q., Chen, N., Zhang, G., 2000. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 12, 13. Yadav, S.B., Tripathi, V., 2000. Indian Drugs 37, 508. Zgorka, G., G1owniak, K., 2001. J. Pharm. Biomed. Anal. 26, 79. Zgórka, G., Lutostanska, E., Glowniak, K., 1997. Pharm. Pharmacol. Lett. 7, 187. Zheng, S., Wang, X., Gao, L., Shen, X., Liu, Z., 1997. Indian J. Chem. Sect. B: Org. Chem. Incl. Med. Chem. 36 B, 104. T.M. Ifantis et al. / Biochemical Systematics and Ecology 44 (2012) 289–294294 Graphical abstract pp xxx–xxxSecondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. from Serbia and their chemotaxonomic importance Tanja Miloševic´ Ifantis, Slavica Solujic´, Dragana Pavlovic´-Muratspahic´, Helen Skaltsa * Structure of sesquiterpene lactones (1–3) isolated from the C. pannonica non polar extract. Highlights  Phytochemical study of C. pannonica (Heuff.) Simonk.  Chemotaxonomy study of ‘‘Centaurea jacea” group.  One new germacranolide, two new and eleven known guaianolides were identified.  Moreover, seven flavonoids, three lignans and one phenolic glucoside were isolated. O O HO O O O O OH HO H H O O HO HO HO O O H H O C O CH3 1 PHYTO 10621 No. of Pages 1, Model 5G 19 June 2013 Table 4 Guaianolides isolated from taxa of ‘‘Centaurea Jacea’’ group.a Section-clade/plant species Origin of species Sesquiterpene lactones References Calcitrapa C. sinaica DC. Egypt Amberboin, chlorohyssopifolin A [= centaurepensin], chlororeptiolide [= cebellin E] sinaicin Al-Easa et al. (1990), Sarg et al. (1988) Cheirolepis–Pseudoseridia–Pteracantha–Plumosipappus C. deflexa Wagenitz Turkey Aguerin B, cynaropicrin, 8-desacylcynaropicrin, (=3S,3aR,4S,6aR,6aS,6bR)- 4-hydroxy-3-methyl-6-methyleneoctahydroazulenol[4,5-b]furan- 2,8(3H,9bH)-dione [=15-nor-guainolides] Chicca et al. (2011) C. glastifolia L. Turkey Acroptilin, aguerin B, centaurepensin, cynaropicrin, chlorojanerin, cebellin D, cebellin F, cebellin J, 19-desoxypicrolide A, 15-deschloro-15- hydroxyepisolstiolide, 15-deschloro-15-hydroperoxychlorojanerin, 19- desoxy-15-chlorojanerin, 17,18-desoxyrepin, epicebellin J, episolstiolide, epicentaurepensin, janerin, repdiolide trio1, repin [=subluteolide] Nowak (1992), Öksüz and Topçu (1994) C. hermanii F. Herm. Turkey Cynaropicrin, chlorojanerin 15-deschloro-15-hydroperoxychlorojanerin [=hermanoid 1], 15-deschloro-15-hydroperoxychlorohyssopifolin B [=hermanoid 2], 15-deschloro-3b-acetoxy-15-hydroxychlorojanerin 15- deschloro-15-acetoxychlorojanerin, janerin, 19-desoxychlorojanerin [= linichlorin A] Öksüz et al. (1994) C. isaurica Hub. Mor. Turkey Janerin Flamini et al. (2004) C. kotschyi Boiss. Turkey Desacylcynaropicrin, cynaropicrin, linichlorin B, linichlorin B derivative Öksüz and Putun (1983) C. thracica (Janka) Hayek Bulgaria Chlorojanerin, cynaropicrin, janerin Nowak (1992), Nowak et al. (1989) Corethropsis C. scoparia Sieb. Egypt (1S,3S,5R,6R,7R,8S)-8-angelyloxy-3-hydroxyguai-3(15), 10(14) 11(13)- trien-6,12-olide, cebellin F, chlorohyssopifolin A, chlorohyssopifolin B, chlorojanerin, chloroscoparin [=19 acetate cebellin D], (1R,3S,4S,5S,6S,7R,8S)-4b-(chloromethyl)-3b,4a-dihydroxy-8a-(3-formyl- 2-methyl-propenoyloxy)-1aH,5aH,6bH,7aH-guai-10(14),11(13)-dien- 6,12-olide, (1R,3S,4S, 5S,6S,7R,8S)-4b-(chloromethyl)-3b,4a-dihydroxy-8a- (sarracenoyloxy)-1aH,5aH,6bH,7aH-guai-10(14),11(13)-dien-6,12-olide, cynaropicrin, desacylcynaropicrin, 3b,8a-O-di(4-hydroxy-tigloyl)- 1aH,5aH,6bH,7aH-guai-4(15),10(14),11(13)-trien-6,12-olide, 8a,40- (hydroxytiglinate)-8-desacyloxysubluteolide, 8-desacylrepin, 8- desacetylcentaurepensin-8-O-(4-hydroxytiglinate) [= cebellin D], diain, janerin,8a-hydroxy-11a,13-dihydrozaluzanin C, 8a-hydroxy-3b- (benzolyloxy)-1aH,5aH,6bH,7aH-guai-4(15),10(14),11(13)-trien-6,12- olide, 3b-hydroxy-8a-(3,4-dimethoxybenzolyloxy)-11b,13-dihydro- 1aH,5aH,6bH,7aH-guai-4(15),10(14)-dien-6,12-olide, linichlorin A Dawidar et al. (1989), Youssef and Frahm (1994a,b), Helal et al. (1997), Youssef (1998) Cynaroides–Paraphysis C. imperialis Hauffk. ex Bornm. Teheran Centaurepensin, 3-desoxysolstitialin A, 8-desacetyl-centaurepensin-8-O- (4-hydroxytiglinate), 15-deschloro-15-hydroxy-8-desacylcentaurepensin- 8-O-(4-hydroxy)tiglinate, solstitialin A-acetate, solstitialin A Rustaiyan et al. (1984) Jacea–Lepteranthus C. debeauxii Gren. & Gordon subsp. thuillieri Dostál Department of medical plants in Poznan Poland Cynaropicrin Geppert et al. (1983) C. exarata Boiss. ex Cosson. – Cynaropicrin Nowak et al. (1986a) C. hyrcanica Bornm. Russia Chlorohyssopifolin C [= acroptilin], janerin, repin Evstratova et al. (1969), Geppert et al. (1983) C. hyssopifolia Vahl Spain Chlorohyssopifolin A, chlorohyssopifolin B, chlorohyssopifolin C, chlorohyssopifolin D, chlorohyssopifolin E, janerin, repin González et al. (1972a, 1974), Geppert et al. (1983) C. janeri Graells – Chlorohyssopifolin C, chlorojanerin, janerin González et al. (1977), Geppert et al. 1983) C. linifolia L. Spain Aguerin B, chlorohyssopifolin A, chlorohyssopifolin B, chlorohyssopifolin C, chlorohyssopifolin D, chlorohyssopifolin E, cynaropicrin linichlorin A, linichlorin B, linichlorin C; janerin, repin González et al. (1978b), Geppert et al. (1983) C. nigra L. – Chlorohyssopifolin A Kaij-a-Kamb et al. (1992) C. uniflora Turra ssp. nervosa (Willd.) Bonnier et Layens Italy Janerin, 8-tigloyloxy 2,3b-dihydroxy 4-epoxy dehydro costus lactone, 8a- methacryloyloxy-8-desacyloxysubluteolide Appendino et al. (1986) Mesocentron C. solstitialis L. California, Argentina Acroptilin, centaurepensin, cynaropicrin, 8-desacyloxy-8a-[2- methylacryloyloxy]-11b,13-dihydro-subluteolide, 8- desacylcentaurepensin-8-O-(4-hydroxy)tiglate,19-desoxyclorojanerin, 11b,13-dihydro-deacylcynaropicrin, 17-epi centaurepensin, episolstitiolide, janerin, linichlorin B, 13-O-acetyl solstitialin A, repin, solstitialin A, subluteolide, solstitiolide Merrill and Stevens (1985), Jakupovic´ et al. (1986), Teševic´ et al. (1998a,b) C. solstitialis L. subsp. schouwii (DC.) Dostál Sicily Aguerin B, cynaropicrin, 4b,15-dihydro-3-dehydro solstitialin A acetate Bruno et al. (1991) Microlophus C. babylonica (L.) L. Lebanon Babylin A, babylin B, cebellin J, chlorohyssopifolin C, janerin, repin Bruno et al. (2005) C. behen L. Iran Aguerin B, cynaropicrin, desacylcynaropicrin, grosshemin, 4b,15-dihydro- 3-dehydro solstitialin A 4b,15-dihydro-3-dehydro solstitialin A 13-acetate Rustaiyan et al. (1981a), Öksüz et al. (1982) Ptosimopappus 6 T.M. Ifantis et al. / Phytochemistry xxx (2013) xxx–xxx PHYTO 10621 No. of Pages 13, Model 5G 19 June 2013 Please cite this article in press as: Ifantis, T.M., et al. Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. from Serbia and their chemotaxonomic importance. Phytochemistry (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2013.05.014 592 Daniewski, M.W., Nowak, G., Pankowska, E., Georgiadis, T., Routsi, E., Rychlewska, 593 U., Szczepanska, B., 1993. Sesquiterpene Lactones of Centaurea salonitana. 594 Phytochemistry 34, 445–447. 595 Dawidar, A.M., Metwally, M.A., Abou-Elzahab, M., Abdel-Mogib, M., 1989. Chemical 596 constituents of two Centaurea species. Pharmazie 44, 735. 597 Dewick, M.P., 2001. Medical Natural Products, second ed. John Wiley and Sons Ltd., 598 Baffins Lane, Chichester. 599 Dittrich, M., 1968. Morphologische Untersuchungen an den Fruchten der Subtribus 600 Cardueae–Centaureinae (Compositae). Willdenowia 5, 67–107. 601 Dostál, J., 1976. In: Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burgess, N.A., Moore, D.M., Valentine, 602 D.H., Walters, S.M., Webb, D.A. (Eds.), Flora Europea, vol. 4. Cambridge 603 University Press, Cambridge, p. 290. 604 El-Dahmy, S., Bohlmann, F., Sarg, T.M., Ateya, A., Farrag, N., 1985. New guaianolides 605 from Centaurea aegyptiaca. Planta Med., 176–177. 606 Evstratova, I.R., Rybalko, S.K., Rzazade, Ya.R., 1967. Acroptilin-a new sesquiterpene 607 lacrone from Acroptilon repens. Chem. Nat. Compd. 3, 284. 608 Evstratova, I.R., Mukhametzhanov, M.N., Sheichenko, V.I., Shreter, A.I., Pakaln, D.A., 609 1969. Isolation of repin from Centaurea hyrcanica. Chem. Nat. Compd. 5, 186. 610 Fernández, I., García, B., Grancha, J.F., Pedro, R.J., 1987. Two guaianolides from 611 Centaurea collina. Phytochemistry 26, 2403–2405. 612 Fernández, I., García, B., Grancha, J.F., Pedro, J.R., 1989. Sesquiterpene lactones, 613 flavonoids and coumarins from Centaurea collina. Phytochemistry 28, 2405– 614 2407. 615 Fernández, I., Pedro, J.R., Polo, E., 1995. Sesquiterpene lactones from Centaurea alba 616 and C. conifera. Phytochemistry 38, 655–657. 617 Flamini, G., Bulleri, C., Morelli, I., 2002a. Secondary constituents from Centaurea 618 horrida and their evolutionary meaning. Biochem. Syst. Ecol. 30, 1051–1054. 619 Flamini, G., Pardini, M., Morelli, I., Ertugrul, K., Dural, H., Bagci, Y., Kargioglu, M., 620 2002b. Flavonoid glycosides from Centaurea pseudoscabiosa subsp. 621 pseudoscabiosa from Turkey. Phytochemistry 61, 433–437. 622 Flamini, G., Stoppelli, G., Morelli, I., Ertugrul, K., Dural, H., Tugay, O., Demirelma, H., 623 2004. Secondary metabolites from Centaurea isaurica from Turkey and their 624 chemotaxonomical significance. Biochem. Syst. Ecol. 32, 553–557. 625 Forgo, P., Zupkó, I., Molnár, J., Vasas, A., Dombi, G., Hohmann, J., 2012. Bioactivity- 626 guided isolation of antiproliferative compounds from Centaurea jacea L.. 627 Fitoterapia 83, 921–925. 628 Formisano, C., Rigano, D., Senatore, F., Bancheva, S., Maggio, A., Rosselli, S., Bruno, 629 M., 2012. Flavonoids in the subtribe Centaureinae (Cass.) Dumort. (Tribe 630 Cardueae, Asteraceae): distribution and 13C-NMR spectral data. Chem. 631 Biodivers. 9, 2096–2158. 632 Fortuna, M.A., de Riscala, C.E., Catalan, A.C., Gedris, E.T., Herz, W., 2001. 633 Sesquiterpene lactones from Centaurea tweediei. Biochem. Syst. Ecol. 29, 967– 634 971. 635 Fraga, B.M., 1992; 1993; 1994; 1995; 1996; 1997; 1998; 1999; 2000; 2001; 2002; 636 2003; 2004; 2005; 2006; 2007; 2008; 2009; 2010; 2011; 2012. Natural 637 sesquiterpenoids. Nat. Prod. Rep. 9, 217–241 and 557–580; 10, 397–419; 11, 638 533–554; 12, 303–320; 13, 307–326; 14, 145–162; 15, 73–92; 16, 21–38; 16, 639 711–730; 17, 483–504; 18, 650–673; 19, 650–672; 20, 392–413; 21, 669–693; 640 22, 465–486; 23, 943–972; 24, 1350–1381; 25, 1180–1209; 26, 1125–1155; 27, 641 1681–1708; 28, 1580–1610; 29, 1334–1366. 642 Gabrielyan, E., 1995. On the generic status of certain groups of Centaureinae 643 (Compositae). In: Hind, D.J.N., Jeffrey, C., Pope, G.V. (Eds.), Advances in 644 Compositae Systematics. Royal Botanic Gardens, Kew, pp. 145–152. 645 Gadeschi, E., Jorge, Z.D., Massanet, G.M., Lurs, F.R., 1989. Two derivatives of costic 646 acid from Centaurea arguta. Phytochemistry 28, 2204–2206. 647 Garcia-Jacas, N., Susanna, A., Mozaffarian, V., Ilarslan, R., 2000. The natural 648 delimitation of Centaurea (Asteraceae: Cardueae): ITS sequence analysis of the 649 Centaurea jacea group. Plant Syst. Evol. 223, 185–199. 650 Garcia-Jacas, N., Susanna, A., Garnatje, T., Vilatersana, R., 2001. Generic delimination 651 and phylogeny of the subtribe Centaurinae (Asteraceae): a combined nuclear 652 and chloroplast DNA analysis. Ann. Bot. 87, 503–515. 653 Garcia-Jacas, N., Uysal, T., Romaschenko, K., Suárez-Santiago, V.N., Ertugrul, K., 654 Susanna, A., 2006. Centaurea revisited: a molecular survey of the Jacea group. 655 Ann. Bot. 98, 741–753. 656 Geppert, B., Drozdz, B., Kiełczewski, M., Holub, M., 1983. Sesquiterpene lactones. 657 XXIII. Isolation of sesquiterpene lactones from Centaurea L. species. Acta Soc. 658 Bot. Pol. 52, 23–34. 659 González, G.A., Bermejo, J., Bretón, L.J., Triana, J., 1972a. Constituents of Compositae. 660 XV. Chlorohyssopifolin A and B, two new sesquiterpene lactones from Centaurea 661 hyssopifolia Vahl. Tetrahedron Lett. 20, 2017–2020. 662 González, G.A., Bermejo, J., Rincones Rodríguez, M., 1972b. Dihidroestafiatona 663 aislada de la Centaurea webbiana. Sch. Bip. An. Quim. 68, 333–334. 664 González, G.A., Bermejo, J., Bretón, L.J., Massanet, M.G., Triana, J., 1974. 665 Chlorohyssopifolin C, D, E and vahlenin, four new sesquiterpene lactones 666 from Centaurea hyssopifolia. Phytochemistry 13, 1193–1197. 667 González, G.A., Bermejo, J., Massanet, M.G., 1977. Aportation al estudio 668 quimiotaxonomico del genera Centaurea. Rev. Latinoam. Quim. 8, 176–181. 669 González, G.A., Bermejo, J., Cabrera, I., Massanet, M.G., Mansilla, H., Galindo, A., 670 1978a. Two sesquiterpene lactones from Centaurea canariensis. Phytochemistry 671 17, 955–956. 672 González, G.A., Bermejo, J., Amaro, M.J., Massanet, M.G., Galindo, A., Cabrera, I., 673 1978b. Sesquiterpene lactones from Centaurea linifolia Vahl. Cem. J. Chem. 56, 674 491–494. 675 González, G.A., de la Rosa, D.A., Massanet, M.G., 1982. Subexpinnatin, a new 676 Guaianolide from Centaurea canariensis. Phytochemistry 21, 2363–2368. 677González, A.G., Barrera, J.B., García, T.Z., Rosas, F.E., 1984. Sesquiterpene lactones 678from Centaurea species. Phytochemistry 23, 2071–2072. 679González-Platas, J., Ruiz-Pérez, C., González, G.A., Bermejo, J., Medjroubi, K., 1999. 6804,15-Dihydro-3-dehydrosolstitialin A. Acta Crystallogr. C55, 6811837–1839. 682Gousiadou, Ch., Skaltsa, H., 2003. Secondary metabolites from Centaurea orphanidea. 683Biochem. Syst. Ecol. 31, 389–396. 684Harborne, J.B., 1994. The Flavonoids: Advances in Research Since 1986. Chapman & 685Hall, London. 686Helal, M.A., Nakamura, N., Meselhy, R.M., El-Fishawy, M.A., Hattori, M., Mahran, 687H.G., 1997. Guaianolides from Centaurea scoparia. Phytochemistry 45, 688551–554. 689Jakupovic´, J., Jia, Y., Pathak, V.P., Bohlmann, F., King, R.M., 1986. Bisabolen 690derivatives and sesquiterpene lactones from Centaurea species. Planta Med. 5, 691399–401. 692Janac´kovic´, P., 2004a. Fitochemical and chemotaxonomic research of some 693Centaurea L. (Asteraceae) species from the Central Balkan Peninsula. Ph.D. [In 694Serbian]. 695Janac´kovic´, P., Teševic´, V., Milosavljevic, S., Vajs, V., Marin, P.D., 2004. Sesquiterpene 696lactones, lignans and flavones of Centaurea affinis. Biochem. Syst. Ecol. 32, 355– 697357. 698Josifovic´, M., 1975. Flora SR Srbije (VII). In: Josifovic´, M., Stjepanovic´, L., Kojic´, M., 699Nikolic´, V. (Eds.), SANU, Beograd. p. 256 [In Serbian]. 700Kaij-a-Kamb, M., Amoros, M., Girre, L., 1992. Chimie et activités biologiques du 701genre Centaurea. Pharm. Acta Helv. 67, 178, and references therein. 702Karioti, A., Skaltsa, H., Lazari, D., Sokovic, M., Garcia, B., Harvala, C., 2002. Secondary 703metabolites from the aerial parts of Centaurea deusta. Antifungal and 704antibacterial activities. Z. Naturforsch. C. 57c, 75–80. 705López-Rodríguez, M., García, V.P., Zater, H., Benayache, S., Benayache, F., 2009. 706Cynaratriol, a sesquiterpene lactone from Centaurea musimomum. Acta 707Crystallogr. E65, 1867–1868. 708Mabberley, D.J., 1997. The Plant Book, second ed. Cambridge University Press, 709Cambridge, p. 138. 710Mabry, J.T., Markham, R.K., Thomas, B.M., 1970. The Systemtic Identification of 711Flavonoids. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. 712Marco, J.A., Sanz-Cervera, J.F., Sancenon, F., Susanna, A., Rustaiyan, A., Saberi, M., 7131992. Sesquiterpene lactones and lignans from Centaurea species. 714Phytochemistry 31, 3527–3530. 715Marco, J.A., Sanz-Cervera, J.S., García Liso, V., Batlle, N., 1997. Sesquiterpene lactones 716from Artemisia lucentica. Phytochemistry 45, 755–763. 717Martín Villodre, J., Garcia-Jacas, N., 2000. Pollen studies in subtribe Centaureinae 718(Asteraceae): the Jacea group analysed with electron microscopy. Bot. J. Linn. 719Soc. 133, 473–484. 720Massanet, G.M., Collado, L.G., Macías, F.A., 1983. Structural determination of 721clementin, a new guaianolide isolated from Centaurea clemente. Tetrahedron 722Lett. 24, 1641–1642. 723Massiot, G., Morfaux, A.M., Le Men-Olivier, L., Bouqouant, J., Madaci, A., Mahamoud, 724A., Chopova, M., Aclinou, P., 1986. Guaianolides from leaves of Centaurea incana. 725Phytochemistry 25, 258–261. 726Medjroubi, K., Benayache, F., Benayache, S., Akkal, S., Khalfallah, N., Aclinou, P., 7271997. Guaianolides from Centaurea musimonum. Phytochemistry 45, 1449– 7281451. 729Medjroubi, K., Benayache, F., León, F., Bermejo, J., 2003. Complete assignment of the 73013C and 1H NMR spectra of two known guaianolides isolated from Centaurea 731musimonum. Rev. Colomb. Quim. 32, 17–25. 732Medjroubi, K., Benayache, F., Bermejo, J., 2005. Sesquiterpene lactones from 733Centaurea musimonum. Antiplasmodial and cytotoxic activities. Fitoterapia 76, 734744–746. 735Merrill, B.G., Stevens, L.H.K., 1985. Sesquiterpene lactones from Centaurea solstitialis. 736Phytochemistry 24, 2013–2018. 737Middleton, M., Cox, P.J., Jaspars, M., Kumarasamy, Y., Nahar, L., Reid, R., Sarker, D.S., 7382003. Dibenzylbutyrolactone lignans and indole alkaloids from the seeds of 739Centaurea nigra (Asteraceae). Biochem. Syst. Ecol. 31, 653–656. 740Miloševic´, T., Argyropoulou, C., Solujic´, S., Muratspahic´, D., Skaltsa, H., 2010. 741Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from 742pannonica and C. jacea. Nat. Prod. Commun. 5, 1663–1668. 743Navarro, J.J., Caballero, C.M., Moran, R.J., Medarde, M., Grande, M., Anaya, J., 1990. 744Guaianolides and eudesmanolides from Centaurea ornata. J. Nat. Prod. 53, 573– 745578. 746Neu, R., 1957. Chelate von Diarylborsäuren mit aliphatischen Oxyalkylaminen 747alsreagenzien für den Nachweis von oxyphenyl-benzo-c-pyronen. die 748Naturwissen-schaften. 44, 181–183. 749Negrete, E.R., Backhouse, N., Avendaño, S., San Martín, A., 1984. Dehydrocostus 750lactone et 8a-hydroxydehydrocostus lactone de Centaurea chilensis Hooker et 751Arnold. Plant. Méd. Phytothér. 4, 226–232. 752Negrete, E.R., Latorre, L., Backhouse, N., Peña, R., Delporte, C., 1988a. Etudes 753anatomiques et phytochimiques: flavonoides et lactone de Centaurea chilensis 754Hooker et Arnold. Plant. Méd. Phytothér. 22, 1–10. 755Negrete, E.R., Backhouse, N., San-Martín, A., Cassels, K.B., Hartmann, R., Breitmaier, 756E., 1988b. Guaianolides from Centaurea chilensis and Centaurea f1occosa. Chem. 757Ztg 112, 144–146. 758Nishibe, S., Fujimoto, T., Nose, M., Takeda, T., Ogihara, Y., Xu, G., 1993. Lignans from 759Trachelospermum axillare. Phytochemistry 32, 1579–1581. 760Nowak, G., Dzordz, B., Kroszczyensky, W., Holub, M., 1986a. Sesquiterpene lactones. 761XXIX. Cynaropicrin in species of the subtribe Centaureinae. Acta Soc. Bot. Pol. 76255, 17–22. Q2 T.M. Ifantis et al. / Phytochemistry xxx (2013) xxx–xxx 11 PHYTO 10621 No. of Pages 13, Model 5G 19 June 2013 Please cite this article in press as: Ifantis, T.M., et al. Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. from Serbia and their chemotaxonomic importance. Phytochemistry (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2013.05.014 763 Nowak, G., Drozdz, B., Holub, M., Lagodzinska, A., 1986b. Sesquiterpene lactones 764 XXXIII. Guaianolides in the subgenus Psephellus Cass. Schmalh. genus 765 Centaurea. Acta Soc. Bot. Pol. 55, 629–638. 766 Nowak, G., Holub, M., Budeˇšínsky, M., 1989. Sesquiterpene lactones. XXXVI. 767 Sesquiterpene lactones in several subgenera of the genus Centaurea L.. Acta 768 Soc. Bot. Pol. 58, 95–102. 769 Nowak, G., 1992. A chemotaxonomic study of sesquiterpene lactones from subtribe 770 Centaureinae of the Compositae. Phytochemistry 31, 2363–2368. 771 Nowak, G., 1993. Chromatography of twenty six sesquiterpene lactones from 772 Centaurea bella. Chromatographia 35, 325–328. 773 Ohno, N., Hirai, H., Yoshioka, H., Domínguez, A.X., Mabry, J.T., 1973. Cynaropicrin: A 774 sesquiterpene lactone from Centaurea americana. Phytochemistry 12, 221–222. 775 Öksüz, S., Ulubelen, A., Aynechi, Y., Wagner, H., 1982. A guaianolide from Centaurea 776 behen. Phytochemistry 21, 2747–2749. 777 Öksüz, S., Putun, E., 1983. Guaianolides from Centaurea kotschyi. Phytochemistry 22, 778 2615–2616. 779 Öksüz, S., Serin, S., Topçu, G., 1994. Sesquiterpene lactones from Centaurea hermanii. 780 Phytochemistry 35, 435–438. 781 Öksüz, S., Topçu, G., 1994. Guaianolides from Centaurea glastifolia. Phytochemistry 782 37, 487–490. 783 Öksüz, S., Serin, S., 1997. Triterpenes of Centaurea ptosimopappoides. 784 Phytochemistry 46, 545. 785 Rahman, M.M.A., Dewick, P.M., Jackson, D.E., Lucas, J.A., 1990. Lignans of Forsythia 786 intermedia. Phytochemistry 29, 1971. 787 Ribeiro, N.L., Nahar, L., Kumarasamy, Y., Mir-Babayev, N., Sarker, S.D., 2002. 788 Flavonoid C-glucosides and a lignans from Centaurea macrocephala 789 (Compositae). Biochem. Syst. Ecol. 30, 1097–1100. 790 Rustaiyan, A., Niknejad, A., Zdero, C., Bohlmann, F., 1981a. A guaianolide from 791 Centaurea behen. Phytochemistry 10, 2427–2429. 792 Rustaiyan, A., Nazarians, L., Bohlmann, F., 1981b. Guaianolides from Acroptilon 793 repens. Phytochemistry 20, 1152–1153. 794 Rustaiyan, A., Ardebili, S., 1984. New guaianolides from C. kandavanensis. Planta 795 Med. 4, 363–364. 796 Rustaiyan, A., Sharif, Z., Tajarodi, A., Ziesche, J., Bohlmann, F., 1984. Neue 797 guajanolide aus Centaurea imperialis. Planta Med. 50, 193–194. 798 Rustaiyan, A., Ahmadi, B., Jakupovic, J., Bohlmann, F., 1986. Sesquiterpene lactones 799 and eudesmane derivatives from Onopordon carmanicum. Phytochemistry 25, 800 1659–1662. 801 Saliba, N.A., Dakdouki, S., Homeidan, F.R., Kogan, J., Bouhadir, K., Talhouk, S., 802 Talhouk, R., 2009. Bio-guided identification of an anti-inflammatory guaianolide 803 from Centaurea ainetensis. Pharm. Biol. 47, 701–707. 804 Sarker, D.S., Laird, A., Nahar, L., Kumarasamy, Y., Jaspars, M., 2001. Indole alkaloids 805 from the seeds of Centaurea cyanus (Asteraceae). Phytochemistry 57, 1273– 806 1276. 807 Sarg, T.M., El-Domiaty, M., El-Dahmy, S., 1987. Further guaianolides from Centaurea 808 aegyptiaca. Sci. Pharm. 55, 107–110. 809 Sarg, T., El-Dahmy, S., El-Domaity, M., Ateya, A., 1988. Guaianolides and other 810 constituents from Centaurea sinaica. Acta Pharm. Hung. 58, 129. 811 Shoeb, M., Rahman, M.M., Nahar, L., Delazar, A., Jaspars, M., Macmanus, M.S., 812 Satyajit, S., 2004. Bioactive lignans from the seeds of Centaurea macrocephala. 813 DARU 12, 87–93. 814Shoeb, M., MacManus, M.S., Kumarasamy, Y., Jaspars, M., Nahar, L., Kong Thoo-Lin, 815P., Nazemiyeh, H., Sarker, S.D., 2006. Americanin, a bioactive 816dibenzylbutyrolactone lignan, from the seeds of Centaurea americana. 817Phytochemistry 67, 2370–2375. 818Stevens, L.K., 1982. Sesquiterpene lactones from C. repens. Phytochemistry 21, 8191093–1098. 820Stevens, L.K., Wong, Y.R., 1986. Structure of chlororepdiolide, a new sesquiterpene 821lactone from C. repens. J. Nat. Prod. 49, 833–837. 822Sugiyama, M., Nagayama, E., Kikuchi, M., 1993. Lignan and phenylpropanoid 823glycosides Osmanthus asiaticus. Phytochemistry 33, 1215–1219. 824Sulyok, G., Laszlo-Bencsik, Á., 1985. Cyanidin 3-(6-succinyl glucoside)-5-glucoside 825from flowers of seven Centaurea species. Phytochemistry 5, 1121–1122. 826Susanna, A., Garcia-Jacas, N., Soltis, D.E., Soltis, P.S., 1995. Phylogenetic relationships 827in tribe Cardueae (Asteraceae) based on ITS sequences. Am. J. Bot. 82, 1056– 8281068. 829Susanna, A., Garcia-Jacas, N., 2007. ‘‘The tribe Cardueae’’, in ‘‘Flowering 830Plants.Eudicots. Asterales’’. In: Kadereit, J., Jeffrey, C. (Eds.), The Families and 831Genera of Vascular Plants, vol. 8. Kubitzki, K. (Eds.), Springer, Berlin, Heidelberg. 832pp. 123–146. 833Suzuki, H., Lee, K.H., Mitsumasa, H., Toshiyuki, I., Kazuo, I., Huang, H.C., 1982. (+)- 834Arctigenin, a lignan from Wikstroemia indica. Phytochemistry 21, 1824–3825. 835Teševic´, V., Vajs, V., Janac´kovic´, P., Todorovic´, N., Djokovic´, D., Marin, P., 836Milosavljevic´, S., 1998a. Sesquiterpene lactones from Centaurea species: C. 837derventana and C. kosaninii. Planta Med. 64, 488. 838Teševic´, V., Vajs, V., Todorovic´, N., Djokovic´, D., Marin, P., Milosavljevic´, S., 1998b. 839Sesquiterpene lactones from plant species Centaurea solstitialis L.. J. Serb. Chem. 840Soc. 63, 131–135. 841Vajs, V., Todorovic´, N., Ristic´, M., Teševic´, V., Todorovic´, B., Janac´kovic´, P., Marin, P., 842Milosavljevic´, S., 1999. Guaianolides from Centaurea nicolai: antifungal activity. 843Phytochemistry 52, 383–386. 844Vasquez, M., Quijano, L., Fronczek, F.R., Macias, F.A., Urbatsch, L.E., Cox, P.B., Fischer, 845N.H., 1990. Sesquiterpene lactones and lignans from Rudbeckia species. 846Phytochemistry 29, 561–565. 847Vilatersana, R., Martín Villodre, J., Susanna, A., Garcia-Jacasm, N., Garnatje, T., 2001. 848Pollen studies in subtribe Centaureinae (Asteraceae): the Carthamus complex 849and the genus Aegialophila analyzed with electron microscopy. Plant Biol. 3, 850607–615. 851Wagenitz, G., 1955. Pollenmorphologie und Systematik in der Gattung Centaurea L. 852s.1. Flora 142, 213–279. 853Wagenitz, G., Hellwig, F.H., 1996. Evolution of characters and phylogeny of the 854Centaureinae. In: Hind, D.J.N., Beentje, H.G. (Eds.) Compositae: Systematics. 855Proceedings of the International Compositae Conference, Kew, 1994. Royal 856Botanical Gardens, Kew. pp. 491–510. 857Youssef, D., Frahm, W., 1994a. Constituents of the egyptian Centaurea scoparia; 858Chlorinated guaianolides of the aerial parts. Planta Med. 60, 267–271. 859Youssef, D., Frahm, W., 1994b. Constituents of the Egyptian Centaurea scoparia; II. 860Guaianolides of the aerial parts. Planta Med. 60, 572–575. 861Youssef, A.T.D., 1998. Sesquiterpene lactones of Centaurea scoparia. Phytochemistry 86249, 1733–1737. 863 12 T.M. Ifantis et al. / Phytochemistry xxx (2013) xxx–xxx PHYTO 10621 No. of Pages 13, Model 5G 19 June 2013 Please cite this article in press as: Ifantis, T.M., et al. Secondary metabolites from the aerial parts of Centaurea pannonica (Heuff.) Simonk. from Serbia and their chemotaxonomic importance. Phytochemistry (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2013.05.014