УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ Гордана П. Радић СИНТЕЗА И КАРАКТЕРИЗАЦИЈА НЕКИХ КОМПЛЕКСА ПАЛАДИЈУМА(II) И ЊИХОВА ПОТЕНЦИЈАЛНА БИОЛОШКА АКТИВНОСТ Докторска дисертација Крагујевац, 2012.  I. Аутор Име и презиме: Гордана П. Радић Датум и место рођења: 30. 09. 1980. Крагујевац Садашње запослење: Природно-математички факултет, Крагујевац II. Докторска дисертација Наслов: Синтеза и карактеризација неких комплекса паладијума(II) и њихова потенцијална биолошка активност Број страница: 155+13 Број слика: 43 Број библиографских јединица: 156 Установа и место где је рад израђен: Природно-математички факултет, Крагујевац Научна област (УКД): Хемија (54) - Неорганска хемија (546) Ментор: Проф. др Срећко Р. Трифуновић III. Оцена и одбрана Датум пријаве тезе: Комисија за оцену теме и подобности кандидата: 1. Др Срећко Р. Трифуновић, ред. професор ПМФ-а у Крагујевцу, Неорганска хемија 2. Др Тибор Ј. Сабо, ред. професор Хемијског факултета у Београду, Неорганска хемија 3. Др Небојша Н. Арсенијевић, ред. професор Mедицинског факултета у Крагујевцу, Микробиологија и имунологија; Онкологија 4. Др Љиљана Р. Чомић, ред. професор ПМФ-а у Крагујевцу, Микробиологија 5. Др Биљана В. Петровић, доцент ПМФ-а у Крагујевцу, Неорганска хемија Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: Комисија за преглед, оцену и одбрану дисертације: 1. Др Срећко Р. Трифуновић, ред. професор ПМФ-а у Крагујевцу, Неорганска хемија 2. Др Тибор Ј. Сабо, ред. професор Хемијског факултета у Београду, Неорганска хемија 3. Др Небојша Н. Арсенијевић, ред. професор Mедицинског факултета у Крагујевцу, Микробиологија и имунологија; Онкологија 4. Др Љиљана Р. Чомић, ред. професор ПМФ-а у Крагујевцу, Микробиологија 5. Др Биљана В. Петровић, доцент ПМФ-а у Крагујевцу, Неорганска хемија Датум одбране дисертације:  Тему ове докторске дисертације предложио је прoфесор др Срећко Р. Трифуновић, редовни професор Природно-математичког факултета у Крагујевцу, који је руководио овим радом и све време ми указивао свестрену помоћ на чему му искрено захваљујем. Члановима Комисије професорима др Тибору Сабоу, др Небојши Арсенијевићу, др Љиљани Чомић и др Биљани Петровић захваљујем на уложеном напору за побољшавање квалитета ове дисертације корисним саветима и сугестијама. Пријатељима из лабораторије, посебно Верици В. Глођовић захваљујем на несебичној помоћи, подршци и заједничком раду. И на крају, породици хвала на љубави, као и на томе што су, као и увек, веровали у мене. САДРЖАЈ ИЗВОД........................................................................................................................ 1 SUMMARY................................................................................................................. 5 1. УВОД................................................................................................................... 9 2. ОПШТИ ДЕО.................................................................................................... 13 2.1. Структура квадратно-планарних комплекса паладијума(II) који садрже бидентатне лиганде......................................................... 15 2.1.1. Бидентатни лиганди S,O-типа................................................... 18 2.2. Комплекси паладијума(II) са О,О'-диалкил естрима edda типа лиганада................................................................................................... 19 2.3. Биолошка активност комплекса неких прелазних метала............ 23 2.3.1. Антитуморска активност комплекса платине.......................... 23 2.3.2. Механизам дејства цисплатине................................................. 26 2.3.3. Развој нових антитуморских лекова......................................... 28 2.3.4. Антимикробна активност комплекса паладијума(II).............. 31 2.3.5. Механизми дејства антимикробних једињења........................ 33 2.3.6. Развој нових антимикробних једињења................................... 36 2.4. Методе за одређивање структуре комплекса метала са лигандима edda типа............................................................................. 40 2.4.1. Нуклеарно-магнетно-резонанциона спектроскопија.............. 40 2.4.2. Инфрацрвена спектроскопија.................................................... 41 2.5. Циљ и задатак докторске дисертације............................................... 41 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО......................................................................... 45 3.1. Синтезе лиганада.................................................................................... 47 3.1.1. Синтеза етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине, H2-(S,S)-еddp................................................................................ 47 3.1.2. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)- -2-пропанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddp·2HCl.. 47 3.1.3. Синтеза етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине, H2-(S,S)-еddv.............................................................. 49 3.1.4. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)- -2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl...................................................................... 50 3.1.5. Синтеза S-алкил деривата тиосалицилне киселине................ 53 3.1.6. Синтеза meso -1,2-дифенил-етилендиамин, 1,2-dphen............ 55 3.1.7. Синтеза meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N'-ди-3- -пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O.......................................................... 55 3.2. Синтезе комплекса................................................................................. 57 3.2.1. Синтеза дихлоридо-O,O′-дипропил-етилендиамин-N,N′-ди- -(S,S)-2-пропаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl2(dpr-(S,S)-eddp)]............................................................... 57 3.2.2. Синтеза дихлоридо-O,O′-дибутил-етилендиамин-N,N′-ди- -(S,S)-2-пропаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)].............................................................. 58 3.2.3. Синтеза дихлоридо-O,O'-дипентил-етилендиамин-N,N’- -ди-(S,S)-2-пропаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl2(dpe-(S,S)eddp)]................................................................ 59 3.2.4. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-етил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]............................................... 60 3.2.5. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-пропил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(pr-(S,S)-eddv)].............................................. 61 3.2.6. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-бутил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(bu-(S,S)-eddv)].............................................. 62 3.2.7. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-пентил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(pe-(S,S)-eddv)].......................................... 63 3.2.8. Синтеза bis-(S-бензил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiosal)2]................................................... 64 3.2.9. Синтеза bis-(S-метил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-met-thiosal)2]................................................ 64 3.2.10. Синтеза bis-(S-етил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-et-thiosal)2]................................................... 65 3.2.11. Синтеза bis-(S-пропил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-pr-thiosal)2].................................................. 66 3.2.12. Синтеза bis-(S-бутил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bu-thiоsal)2]................................................... 66 3.2.13. Синтеза cis-дихлоридо(meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропаноато)паладијум(II) комплекса, cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)]............................................................ 67 3.2.14. Синтеза s-cis-дихлоридо(meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N′-ди-3-пропаноато)платина(IV) комплекса, s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)]...................................... 68 3.3. Мерења..................................................................................................... 69 3.3.1. Елементална микроанализа анализа......................................... 69 3.3.2. 1H и 13C нуклеарно-магнетно-резонанциона спектроскопија 69 3.3.3. Инфрацрвена спектроскопија.................................................... 69 3.3.4. Рендгенска структурна анализа................................................. 70 3.3.4.1. Рендгенска структурна анализа meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O........................................... 70 3.3.4.2. Рендгенска структурна анализа хлоридо((S,S)- -етилендиамин-N-(O-етил-2-(3-метил)-бутаноат)- -N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)].................................................... 71 3.3.4.3. Рендгенска структурна анализа bis-(S-бензил- -тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiоsal)2]........................................................ 73 3.4. Биолошка мерења.................................................................................. 74 3.4.1. In vitro антимикробни тест......................................................... 74 3.4.1.1. Тестирани микроорганизми....................................... 74 3.4.1.2. Микродилуциона метода............................................ 75 3.4.2. In vitro антитуморска активност................................................ 77 3.4.2.1. Испитиване ћелијске линије...................................... 77 3.4.2.2. МТТ колориметријски тест........................................ 78 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА....................................................................... 81 4.1. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -пропанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddp·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II), [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)]. 83 4.1.1. Синтезе лиганада и комплекса.................................................. 83 4.1.2. Инфрацрвени спектри O,O′-диалкил естара етилендиамин- -N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II).................................. 85 4.1.3. Нуклеарно-магнетно-резонанциони (1H и 13C) спектри O,O′- -диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II).............................................................................. 86 4.1.4. Микробиолошка активност O,O′-диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II).... 88 4.2. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II), [PdCl(R-(S,S)-eddv)]................................................................................ 90 4.2.1. Синтеза лиганада и комплекса.................................................. 90 4.2.2. Инфрацрвени спектри О,О'-диалкил естара етилендиамин- -N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II).... 94 4.2.3. Нуклеарно-магнетно-резонанциони (1H и 13C) спектри О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3- -метил)-бутанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II)........................................................... 95 4.2.4. Микробиолошка активност О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II).... 96 4.2.5. Кристална структура хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O- -етил-2-(3-метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноато паладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]........................ 99 4.3. Синтеза и карактеризација S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II)..................... 103 4.3.1. Синтеза лиганада и комплекса.................................................. 103 4.3.2. Инфрацрвени спектри S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II).............. 104 4.3.3. Нуклеарно-магнетно-резонанциони (1H и 13C) спектри S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II)....................................................... 105 4.3.4. Кристална структура bis-(S-бензил-тиосалицилато) паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiosal)2]............................ 106 4.3.5. Микробиолошка активност S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II).............. 108 4.4. Паладијум(II) и платина(IV) комплекси са meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанском киселином.......................... 112 4.4.1. Синтеза лиганда и комплекса.................................................. 112 4.4.2. Инфрацрвени спектри meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропанске киселине и одговарајућих комплекса палaдијума(II) и платине(IV)..................................................... 114 4.4.3. Кристална структура meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O.................................. 116 4.4.4. Микробиолошка активност meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) и платине(IV)..................................................... 120 4.4.5. In vitro антитуморска активност комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)]............... 122 5. ЗАКЉУЧАК....................................................................................................... 125 6. ЛИТЕРАТУРА................................................................................................... 131 БИОГРАФИЈА.................................................................................................. 143 РАДОВИ У КОЈИМА СУ ШТАМПАНИ РЕЗУЛТАТИ ОВЕ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ...................................................................... 145 НАУЧНО-ИСТРАЖИВАЧКИ РАД.............................................................. 147 ПРИЛОГ............................................................................................................. 155 СПИСАК СЛИКА Слика 1. Структура етилендиамин-N,N'-диацетато лиганда......................... 15 Слика 2. Diamond презентација комплекса паладијума(II) са тетраетил (I) и тетраметил(II) естрима edta........................................................... 21 Слика 3. Могући изомери [PtCln(R2-edda-типа)], (n = 2, 4) и [PdCl2(R2-edda-типа)] комплекса...................................................... 22 Слика 4. Израчунате структуре [PtCln(еt2-edda)] (a, b: n = 4; c, d: n = 2)...... 22 Слика 5. Структура cis-диаминдихлоридоплатина(II) комплекса, познатијег као цисплатина, cis-DDP................................................. 23 Слика 6. Структура диамин[1,1-циклобутандикарбоксилато(2)]-О,О'- -платина(II) комплекса, карбоплатина............................................. 25 Слика 7. Структура (I) cis-диаминциклохексаноксалатоплатина(II), оксалиплатин и (II) cis-диамин(гликолато-О,О')платина(II), недаплатин.......................................................................................... 25 Слика 8. Структура (I) cis-диаминдихлоридопаладијум(II), cis-[PdCl2(NH3)2]; (II) cis-1,2-диаминциклохександихлоридопаладијум(II), cis-[PdCl2(DACH)].............................................................................. 29 Слика 9. Комплекс паладијума(II) са дериватом кумарина, активнији приближно 7800 пута од карбоплатине........................................... 30 Слика 10. Адаптациони механизам за заштиту ћелије од токсичних ефеката липофилних једињења: (I) реструктуирање фосфолипидног двослоја променом конформације фосфолипида из cis у trans, или променом масних киселина у засићену форму; (II) Модификација липополисахарида у спољашњем омотачу Грам-негативних бактерија; (III) повећање повезаности конституената ћелијског зида и/или промене у његовој хидрофилности; (IV) повећање хидрофилности S-слоја; (V) активна екскреција из ћелије............................................................. 32 Слика 11. Потенцијална места на бактеријској ћелији за дејство антимикробних супстанци................................................................. 33 Слика 12. Грађа омотача Грам-негативних и Грам-позитивних бактерија 34 Слика 13. Паладијум(II)-јон координован за антибиотике из групе тетрациклина....................................................................................... 37 Слика 14. Паладијум(II) комплекс са флуорохинолином као лигандом........ 38 Слика 15. Структура деривата тиосалицилне киселине................................. 39 Слика 16. Могући дијастереоизомери комплекса [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)], R = pr-, bu- и pe-.................................................................................. 87 Слика 17. ORTEP слика [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] комплекса................................ 100 Слика 18. Начин паковања комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]............................ 102 Слика 19. Структура комплекса [Pd(S-bz-thiosal)2].......................................... 106 Слика 20. Два молекула комплекса са интермолекулским интеракцијама.... 108 Слика 21. Теоријски могући геометријски изомери октаедарских комплекса са тетрадентатним лигандима edda типа и два монодентатна лиганда........................................................................ 113 Слика 22. Кристална структура молекула meso-1,2-дифенил-етилендиами- -N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O.................................................................. 117 Слика 23. Начин паковања молекула H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O.................... 119 Слика 24. In vitro антитуморска активност комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)]. А) 4T1, Б) B16F1 ћелијске линије су инкубиране 72 сата са различитим концентрацијама комплекса.............................................................. 122 Слика 25. IC50 вредности cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] .................................................................. 123 СПИСАК ШЕМА Шема 1. Општа шема синтезе edda-типа лиганда по Берсворту.................... 17 Шема 2. Методе синтеза О,О'-диалкил естра H2-edda типа лиганда............ 17 Шема 3. Метода синтезе S-алкил етра тиосалицилне киселине.................... 18 Шема 4. Синтеза комплекса паладијума(II) са тетраметил и тетраетил естрима edta ......................................................................................... 20 Шема 5. Пут лека................................................................................................ 26 Шема 6. Хидролиза и грађење ДНК-цисплатина адукта................................ 27 Шема 7. Синтеза етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине, (H2-(S,S)-eddp)...................................................................................... 83 Шема 8. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -пропанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddp·2HCl.............. 84 Шема 9. Синтеза комплекса [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)]........................................ 85 Шема 10. Синтеза етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине, H2-(S,S)-eddv....................................................................... 91 Шема 11. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl............................................................................... 92 Шема 12. Синтеза комплекса [PdCl(R-(S,S)-eddv)]............................................ 93 Шема 13. Синтеза комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]........................................... 99 Шема 14. Синтеза S-алкил деривата тиосалицилне киселине.......................... 103 Шема 15. Синтеза комплекса паладијума(II) са S-алкил-дериватима тиосалицилне киселине....................................................................... 104 Шема 16. Синтеза лиганда H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O..................................... 112 Шема 17. Синтеза комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)]..................................... 113 Шема 18. Синтеза комплекса s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)]................................... 114 СПИСАК ТАБЕЛА Табела 1. Неки тетрадентатни лиганди edda-типа............................................ 16 Табела 2. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре за H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O................. 71 Табела 3. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]............. 72 Табела 4. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре комплекса [Pd(S-bz-thiоsal)2]................. 73 Табела 5. Списак тестираних микроорганизама............................................... 75 Табела 6. Важније траке у инфрацрвеним спектрима R2-(S,S)-eddp·2HCl лиганада и одговарајућих паладијум(II) комплекса......................... 86 Табела 7. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада R2-(S,S)-eddp·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса..................................................................... 89 Табела 8. Најважније траке у инфрацрвеним спектрима R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II)..................................... 94 Табела 9. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса..................................................................... 98 Табела 10. Дужине веза (Å) и углови веза (°) у молекулу [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]............................................................................. 101 Табела 11. Дужине веза (Å) и углови веза (°) у молекулу [Pd(S-bz-thiosal)2].. 107 Табела 12. Дужине (Å), углови (°) као и диедарски углови интермолекулских и интрамолекулских водоничних веза у молекулу [Pd(S-bz-thiosal)2]................................................................ 107 Табела 13. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада S-аликил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих паладијума(II) комплекса...................... 110 Табела 14. Најважније апсорпционе траке у инфрацрвеним спектрима неких комплексних једињења са линеарним O-N-N-O лигандима............................................................................................. 116 Табела 15. Дужине веза (Å) и углови веза (°) у H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O..... 118 Табела 16. Дужине (Å) и углови (°) водоничних веза у молекулу H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O................................................................... 119 Табела 17. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности испитиваног лиганда H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O и одговарајућих комплекса паладијума(II) и платине(IV)........................................... 121 1   И З В О Д СИНТЕЗА И КАРАКТЕРИЗАЦИЈА НЕКИХ КОМПЛЕКСА ПАЛАДИЈУМА(II) И ЊИХОВА ПОТЕНЦИЈАЛНА БИОЛОШКА АКТИВНОСТ Откриће антитуморских особина cis-диаминдихлоридоплатина(II) комплекса, познатијег под именом цисплатина (cis-DDP) и сличних комплекса платине повећало је интересовање за добијање још ефикаснијих комплекса других метала и лиганада. Међу првим комплексима коришћеним у клиничким испитивањима против тумора били су паладијум(II) аналози цисплатине. Иако првобитни резултати нису били охрабрујући, комплекси паладијума(II) су много шире проучавани. Паладијум(II) комплекси су скоро увек показивали мању антитуморску активност у односу на одговарајуће комплексе платине због њихове велике лабилности. Да би се ови проблеми превазишли, многа истраживања су била усмерена ка употреби хелатних лиганада који би умањили реактивност паладијум(II) комплекса. До сада је синтетисан мали број комплексних једињења паладијума(II) са О,О'-диалкил естрима лиганада edda-типа као бидентатним лигандима, као и са S-алкил дериватима тиосалицилне киселине. Стога је у оквиру ове Докторске дисертације описана синтеза и карактеризација неких лиганада edda-типа, њихових естара, као и S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II). У овој Докторској дисертацији описана је синтеза и карактеризација већег броја лиганада и одговарајућих комплекса паладијума(II). Прво је описана синтеза 2   и карактеризација О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине (H2-(S,S)-eddp). Ова једињења су добијена директном реакцијом између тетрадентатног лиганда и одговарајућег апсолутног алкохола (етанол, 1-пропанол, 1-бутанол, 1-пентанол) у молском односу 1:2, уз увођење гасовитог хлороводоника. На претходно описан начин синтетисани су и О,О'-диалкил естри етилендиамин- N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине (H2-(S,S)-eddv). Такође, приказана је и синтеза S-алкил деривата тиосалицилне киселине. Поменути бидентатни S,О донорски лиганди добијени су директном реакцијом између натријумове соли тиосалицилне киселине и одговарајућих алкил халогенида (метил-, етил-, пропил-, бутил- и бензил) у молском односу 1:1. На крају приказана је и синтеза тетрадентатног лиганда meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанске киселине. Структуре и састав изолованих лиганада претпостављене су применом елементалне микроанализе, инфрацрвене, 1H и 13C NMR спектроскопије, a потврђене на бази резултата рендгенске структурне анализе у случају: meso-1,2- -дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, (H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O). Добијени лиганди су употребљени за синтезу одговарајућих комплекса паладијума(II). Састав добијених квадратно-планарних комплекса паладијума(II) потврђен је елементалном микроанализом. Структура изолованих комплекса претпостављена је на основу инфрацрвене, 1H и 13C NMR спектроскопије, а потврђена је на бази рендгенске структурне анализе у случају хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-етил-2-(3-метил)-бутаноат)-N'-2-(3- -метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] и bis-(S-бензил- -тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiоsal)2]. In vitro антимикробна активност синтетисаних лиганада и одговарајућих комплекса паладијума(II) тестирана је микродилуционом методом. Том приликом одређене су минималне инхибиторне (МИК) и минималне микробицидне концентрације (ММК) награђених једињења. Поједини комплекси су показали 3   значајну антифунгалну активност на патогеним гљивама Aspergillus flavus и Aspergillus fumigatus. Међутим, синтетисани паладијум(II) комплекси су показали умерену антибактеријску активност. In vitro антитуморска активност комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] као и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)], испитивана је на ћелијама тумора 4Т1 и B16F1, а број ћелија одређиван након је 72 сата коришћењем МТТ технике. Испитивањем је утврђено да оба једињења показују нижу антитуморску активност у поређењу са цисплатином. Кључне речи: R2-(S,S)-eddp лиганди, R2-(S,S)-eddv лиганди, S-алкил деривати тиосалицилне киселине, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O, паладијум(II) комплекси, инфрацрвена и NMR спектроскопија, рендгенска структурна анализа, антибактеријска активност, антитуморска активност.  5   SUMMARY SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF SOME PALLADIUM(II) COMPLEXES AND THEIR POTENTIAL BIOLOGICAL ACTIVITY The discovery of anticancer activity of cis-diammindichloridoplatinum(II) complexes, better known as cisplatin (cis-DDP) and related platinum complexes has stimuled the interest for obtaining more efficient complexes of other metals and ligands. Some the first complexes used in clinical treatments against tumors were palladium(II) complexes as analogues of cisplatin. Although the first results were not encouraging, palladium complexes have been studied to longer extent. Palladium(II) complexes show less antitumor activity than corresponding platinum complexes due to their high instability. In order to overcome these problems, many studies have been directed toward the use of chelating ligands which would reduce the reactivity of palladium(II) complexes. So far a small number of complex compounds of palladium(II) have been synthesized with O,O'-dialkyl esters edda-type ligands as bidentate ligands, as well as S-alkyl derivatives of thiosalicylic acid. Therefore, this dissertation describes the synthesis and characterization of some edda-type ligands, their esters, S-alkyl derivatives of thiosalicylic acid and corresponding palladium(II) complexes with obtained ligands. The synthesis and characterization of some ligands and corresponding palladium(II) complexes are described in this PhD thesis. Firstly, the synthesis and characterization of O,O'-dialkyl esters of ethylenediamine-N,N'-di-(S,S)-2-propanoic acid H2-(S,S)-eddp is described. These compounds were obtained by direct reaction between 6   tetradentate ligand and the corresponding absolute alcohol (ethanol, 1-propanol, 1-butanol, 1-pentanol) in a molar ratio 1:2 with the addition of gaseous hydrogen chloride. As described above, O,O'-dialkyl esters of ethylenediamine-N,N'-di-(S,S)- -2-(3-methyl)-butanoic acid, H2-(S,S)-eddv were synthesized was also done. The synthesis of S-alkyl derivatives of thiosalicylic acid. Bidentate S,O donor ligands were obtained by direct reaction between the sodium salt of thiosalicylic acid and corresponding alkyl halides (methyl, ethyl, propyl, butyl, benzyl) in a molar ratio 1:1. The synthesis of the tetradentate ligand meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoic acid is shown at the end of this dissertation. Structure and composition of the isolated ligands were assumed using by elemental microanalysis, IR, 1H and 13C NMR spectroscopy, and confirmed by X-ray diffraction analysis in the case of meso-1,2- -diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid monohydrate dicholorohydrate, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O. The obtained ligands were used for synthesis of the corresponding palladium(II) complexes. The composition of obtained square-planar palladium(II) complexes was confirmed by elemental microanalysis. The structure of isolated complexes is assumed on basis of infrared, 1H and 13C NMR spectroscopy and confirmed on basis of X-ray diffraction analysis in the case of chlorido(S,S)-ethylenediamine-N- -(O-ethyl-2-(3-methyl)butanoate)-N'-2-(3-methyl)-butanoate-palladium(II) complex, [PdCl(et-(S,S)-eddv)] and bis-(S-benzyl-thiosalycilato)palladium(II) complex, [Pd(S-bz-thiosal)2]. Antimicrobial activity of synthesized ligands and corresponding palladium(II) complexes was tested by microdilution method. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum microbicidal concetration (MMC) were determined in this process. Some complexes showed significant antifungal activity on pathogenic fungi Aspergillus flavus and Aspergillus fumingatus. However, synthesized palladium(II) complexes showed limited antibacterial activity. In vitro antitumor activity of the complexes cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] and s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] was determined on the tumor cells of the 4T1 and B16F1, and 7   the number of cells was determined after 72 hours by using MTT technique. The study found that both compounds showed lower antitumor activity compared to cisplatin. Keywords: R2-(S,S)-eddp ligands, R2-(S,S)-eddv ligands, S-alkyl derivatives of thiosalicylic acid, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O, palladium(II) complexes, infrared and NMR spectroscopy, X-ray structural analysis, antimicrobial activity, antitumor activity.   1. УВОД Увод    11   Чињеница је да се многа комплексна једињења сама или у комбинацији са другим једињењима већ дужи низ година користе у медицини за лечење различитих обољења. Откриће антитуморске активности цисплатине условило је повећано интересовање за синтезу и карактеризацију нових комплекса, али и за испитивање њихове биолошке активности. На основу тога расте реална могућност да се открије ново једињење које ће имати ширу примену у медицини. Комплекси паладијума(II) поседују хемијске особине сличне комплексима платине(II) (имају d8 електронски систем и граде квадратно-планарне комплексе) због чега је било интересантно синтетисати нове комплексе са бидентатним лигандима, О,О'-диалкил естрима тетрадентатних лиганада етилендиамин-N,N'-ди- -(S,S)-2-пропанске киселине (R2-(S,S)-eddp) и етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3- -метил)-бутанске киселине (R2-(S,S)-eddv), као и алкил-дериватима тиосалицилне киселине, утврдити њихову геометрију, in vitro испитати њихову антибактеријску, антифунгалну и антитуморску активност.     2. ОПШТИ ДЕО Општи део    15   2.1. СТРУКТУРА КВАДРАТНО-ПЛАНАРНИХ КОМПЛЕКСА ПАЛАДИЈУМА(II) КОЈИ САДРЖЕ БИДЕНТАТНЕ ЛИГАНДЕ Етилендиамин-N,N'-дисирћетна киселина (edda) поседује два донорска атома азота и два донорска атома кисеоника из карбоксилних група (Слика 1). У случају потпуног координовања понаша се као тетрадентатни лиганд. Заједно са лигандима етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанском киселином (eddp), 1,3- -пропандиамин-N,N'-дисирћетном киселином (1,3-pdda) и сличним спада у групу киселина које су класификоване као edda-тип лиганада [1а,1b]. edda Слика 1. Структура етилендиамин-N,N'-диацетато лиганда Лиганди edda-типа представљају N- или C- супституисане деривате edda лиганда или његове хомологе који садрже продужене ланце и то, на пример, диамински у случају 1,3-пропандиамин-N,N'-дисирћетне киселине и карбоксилатни у случају етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанске киселине. У Табели 1 су приказани неки лиганди edda-типа. Општи део    16   Табела 1. Неки тетрадентатни лиганди edda-типа Назив и формула лиганада Скраћеница етилендиамин-N,N'-диацетат -OOCCH2NHCH2CH2NHCH2COO- edda N,N'-диметил-етилендиамин-N,N'-диацетат -OOCCH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)CH2COO- dmedda N,N'-диетил-етилендиамин-N,N'-диацетат -OOCCH2N(C2H5)CH2CH2N(C2H5)CH2COO- deedda етилендиамин-N,N'-ди-3-пропаноат -OOCCH2CH2NHCH2CH2NHCH2CH2COO- eddp етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропаноат -OOC(CH3)CHNHCH2CH2NHCH(CH3)COO- (S,S)-eddp етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутаноат -OOC(C3H7)CHNHCH2CH2NHCH(C3H7)COO- (S,S)-eddv 1,3-пропандиамин-N,N'-диацетат -OOCCH2NHCH2CH2CH2NHCH2COO- 1,3-pdda (tmdda) N,N'-bis-(2-аминоетил)глицинат (H2NCH2CH2)2NCH2COO- i-dtma N,N'-дибензил-етилендиамин-N,N'-диацетат -OOCCH2N(CH2C6H5)CH2CH2N(CH2C6H5)CH2COO- dbedda meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропаноат -OOCCH2CH2NHCH(C6H5)CH(C6H5)NHCH2CH2COO- 1,2-dpheddp Наведени лиганди се могу синтетисати на основу методе описане патентом који су представили Берсворт (Bersworth) и сарадници (Шема 1) [2], а најчешће се координују тетрадентатно за централни метални јон. Општи део    17     Шема 1. Општа шема синтезе edda-типа лиганда по Берсворту Лиганди еdda-типа се могу врло лако естерификовати користећи уобичајене методе што је приказано на Шеми 2 [3]. Шема 2. Методе синтеза O,O'-диалкил естра H2-edda типа лиганда Приликом потпуног координовања естри edda-типа лиганда се углавном понашају као бидентатни лиганди. Формирање координативно ковалентне везе остварује се преко два донорска атома азота тј. κ2N,N′-тип координовања. У неким случајевима долази до хидролизе једне или обе естарске групе, па се лиганди понашају тридентатно или бидентатно. Општи део    18   2.1.1. Бидентатни лиганди S,O-типа Тиосалицилна киселина и њени S-аликил деривати имају разноврсну примену и то као реагенси за одређивање метала [4,5], модификатори графитних електрода [6] и као фотоиницијатори за слободно-радикалске полимеризације, [7] али имају примену и у козметичке сврхе и то у третману за раст косе [8]. Користе се при лечењу разних специфичних запаљенских и алергијских процеса респираторног низа [9] као и за инхибицију раста туморских ћелија [10]. Кето деривати тиосалицилне киселине, такође, имају велику примену и као инхибитори транспорта жучне киселине [11]. S-алкил деривати тиосалицилне киселине (алкил = бензил-, метил-, етил-, пропил- и бутил-) се могу синтетисати на основу претходно описаног поступка [12-15] чију шему добијања можемо срести у раду Смита (Smith) и сарадника, а може се приказати на следећи начин (Шема 3). OHO SH + R-X + 2NaOH C2H5OH/H2O ONaO S R H+ OHO S R   Шема 3. Метода синтезе S-алкил етра тиосалицилне киселине Општи део    19   2.2. КОМПЛЕКСИ ПАЛАДИЈУМА(II) СА O,O'-ДИАЛКИЛ ЕСТРИМА EDDA ТИПА ЛИГАНАДА Интеракције комплекса платина(II), платина(IV) као и паладијум(II) јона са сумпор- и азот-донорским лигандима су веома важне са хемијског, биолошког и медицинског аспекта. Познато је да комплекси платине(II), а у новије време и комплекси платине(IV) имају широку примену у медицини, а потенцијалну примену у медицини у будућности могу имати и комплекси паладијума(II). Антитуморска активност комплекса ових метала описује се њиховом интеракцијом са молекулима ДНК. Међутим, ови комплекси врло често реагују и са другим биомолекулима у организму (пептидима, протеинима и ензимима). Такође је познато да јони платине(II) имају веома велики афинитет према атому сумпора. Због тога уколико се платина(II)-јон координује преко атома сумпора из S-цистеина и S-метионина гради врло стабилне комплексе. Све нежељене последице које се јављају током хемиотерапије (нефротоксичност, ототоксичност, неуротоксичност, резистенција и друге) описане су заправо интеракцијом комплекса платине са биомолекулима који садрже сумпор-донорске атоме. Интензивна испитивања интеракција различитих комплекса платине(II) са сумпор-донорским биомолекулима показују да су једињења платине(II) са тиолима (S-цистеин, S-глутатион) јако стабилна, нереактивна и токсична, док су једињења платине(II) са тиоетрима (S-метионин, S-метил-глутатион) мање стабилна и могу се сматрати интермедијерима у процесу интеракције комплекса са ДНК. Паладијум је прелазни метал који припада платинској групи метала. Најчешће се у једињењима јавља са оксидационим стањем +2. У природи га има у јако малим количинама и то у комбинацији са другим елементима платинске групе. Паладијум има широку примену у петрохемији као катализатор, а изнад свега у аутомобилској индустрији. Такође велику примену паладијум је нашао и у стоматологији за прављење круница и мостова за зубе. Општи део    20   Као и јони осталих прелазних метала и паладијум(II) јон гради комплексна једињења. Комплекси платине и паладијума поседују велику примену у медицини и индустрији. Због тога се ова једињења интензивно изучавају већ дужи низ година. Платина се у комплексима јавља у оксидационим стањима +2 и +4, док се паладијум најчешће јавља у оксидационом стању +2. Ретко се јавља у оксидационом стању +4, јер су једињења са овим оксидационим стањем паладијума врло нестабилна. Хемијске особине платине(II) и паладијума(II) су јако сличне, првенствено због њихове d8 електронске конфигурације. Због тога они граде и слична комплексна једињења. Комплекси паладијума(II) су квадратно-планарне структуре и дијамагнетични су. За разлику од веома инертних комплекса платине, комплекси паладијума су знатно реактивнији и реагују скоро 105 пута брже. Паладијум спада у групу меких Луисових (Lewis) киселина. Има врло изражену тежњу да гради стабилне комплексе са меким Луисовим базама, као што су лиганди са сумпором као донорским атомом. Синтетисан је и окарактерисан велики број комплексних једињења паладијума(II) са лигандима који садрже азот и кисеоник као донорске атоме. Синтетисани су на пример комплекси паладијума(II) са етилендиамин-тетраацетато лигандом (edta) [16-18], етилендиамином [19,20], као и са аминокиселинама [21-23]. Синтеза комплекса паладијума(II) са тетраметил и тетраетил естрима edta приказана је на Шеми 4. N N OR OOR O OR O RO O PdCl2/HCl 5h Pd N ClN Cl OR OR O O OR OR O O R = CH3-, CH3CH2- Шема 4. Синтеза комплекса паладијума(II) са тетраметил и тетраетил естрима edta Општи део    21   У новије време објављене су и кристалне структуре ових комплекса (Слика 2) [24]. Дужине и углови веза су у сагласности са литературним подацима [16-23].   (I) (II) Слика 2. Diamond презентација комплекса паладијума(II) са тетраетил (I) и тетраметил(II) естрима edta Петочлани прстенови које формира етилендиамински део R4-edta са паладијум(II) јоном [24] заузима конформацију полустолице нађену и код других сличних комплекса [25-27]. Торзиони углови N-C-C-O су између synperiplanarnih и goš конформација [24]. Координовањем R2edda зa паладијум(II)-јон азотови атоми постају асиметрични што теоријски даје могућност за настајање три изомера: два енантиомера [(R,R) и (S,S)] и један диjастереоизомер (R,S) конфигурације (Слика 3). Приликом синтезе платина(IV) комплекса са et2-edda [28] добијени су само енантиомери ((R,R), (S,S) и рацемска смеша) у чврстом стању, као и у раствору, што je потврђено рендгенском структурном анализом и NMR спектроскопијом. Да би се објаснио разлог стереоселективности, рађени су DFT прорачуни за R,R (anti) и R,S (syn) изомере коришћењем функционала MPW1PW91 [28] (Слика 4). Општи део    22   У случају anti изомера утврђено је да је N–H···Cl електростатичка интеракција нешто јача, што може бити довољан разлог за стереоселективност [28]. (S) (S) (S) (S,S)(R,R) (R,S) N N R R MCln (R) (R) H H C2 M = Pt(IV), Pt(II), Pd(II) N N R R MCln H H C2 N N R R MCln (R) H H   Слика 3. Могући изомери [PtCln(R2-edda-типа)], (n = 2, 4) и [PdCl2(R2-edda-типа)] комплекса   Слика 4. Израчунате структуре [PtCln(еt2-edda)] (a, b: n = 4; c, d: n = 2). Општи део    23   2.3. БИОЛОШКА АКТИВНОСТ КОМПЛЕКСА НЕКИХ ПРЕЛАЗНИХ МЕТАЛА 2.3.1. Антитуморска активност комплекса платине Иако се цисплатина први пут помиње у раду Пирона (Peyrone) из 1845. године [29], антитуморска активност остаје непримећена до 1965. године када су Розенберг (Rosenberg) и сарадници открили антипролиферативну активност индуковану на култури Escherichia coli услед дејства електричног поља изазваним платинским електродама. Експериментално је потврђено да су том приликом настали неки комплекси платине услед редокс реакција платинских електрода са електролитом. Од награђених комплекса платине цисплатина се сматрала одговорном за ову врсту активности. Цисплатина (Слика 5) је заустављала деобу ћелије блокирајући репликацију ДНК. Даљим испитивањем Розенберг и сарадници показали су да овај лек делује на туморе миша, попут саркома 180 и леукемије 1210 [30,31]. Слика 5. Структура cis-диаминдихлоридоплатина(II) комплекса, познатијег као цисплатина, cis-DDP Општи део    24   Интересантно је да одговарајући trans геометријски изомер trans- -диаминдихлоридоплатина(II) (трансплатина) није показао антитуморску активност на поменутим туморима миша [32,33]. Од тада се цисплатина широко користи у терапији разних тумора. Цисплатина је посебно ефикасна у терапији тумора тестиса и јајника, а такође се широко примењује у лечењу тумора бешике, грлића материце, карцинома бронхија, тумора једњака и малигних болести крви [34-43]. Упркос великом успеху приликом лечења неких тумора, цисплатина показује и нежељене ефекте попут високе неуротоксичности, нефротоксичности и повраћања. Нажалост, оваква споредна дејства ограничавају количину дозирања цисплатине код пацијената (100 mg/дан до највише пет узастопних дана терапије). Иако се цисплатина клинички широко користи, њена примена је ипак ограничена на релативно мали број тумора. Неки тумори поседују природну резистенцију према цисплатини, а неки је стичу после одређеног времена терапијске примене. Цисплатина је релативно слабо растворна у води и примењује се интравенски, што условљава њену примену само при хоспитализацији пацијената [44-55]. Након открића антитуморске активности цисплатине, синтетисан је велики број комплекса платине за које се сматрало да су потенцијални антитуморски агенси. Велики број њих је ушао у клиничка испитивања, али је само диамин[1,1- -циклобутандикарбоксилато(2)]-О,О'-платина(II) комплекс познатији под именом карбоплатина (Слика 6) добио одобрење за рутинску клиничку примену. Карбоплатина је мање токсична од цисплатине и може се пацијентима давати у много већим дозама у односу на цисплатину, али је мање активна [49,50]. Карбоплатина делује у истом спектру тумора као и цисплатина, а примењује се такође интравенски. Општи део    25     Слика 6. Структура диамин[1,1-циклобутандикарбоксилато(2)]-О,О'-платина(II) комплекса, карбоплатина Последњих година су још два комплекса платине(II) cis-L-диаминциклохексан)оксалатоплатина(II), оксалиплатин и cis-диамин (гликолато-О,О')платина(II), недаплатин (Слика 7) добила ограничено одобрење за коришћење приликом поновног лечења метастатских тумора дебелог црева [52]. Међутим, ни један од ова два комплекса није показао предност у односу на цисплатину и карбоплатину. Због тога су истраживања настављена у правцу синтезе нових комплекса платине и других јона метала који ће показати мању токсичност, шири спектар дејства у односу на цисплатину и могућност оралне примене. (I) (II) Слика 7. Структура (I) cis-диаминциклохексаноксалатоплатина(II), оксалиплатин и (II) cis-диамин(гликолато-О,О')платина(II), недаплатин Општи део    26   2.3.2. Механизам дејства цисплатине Цисплатина испољава антитуморску активност везујући се за ДНК и заустављајући транскрипцију, односно репликацију ДНК [56-61]. Ови поремећаји активирају процес цитотоксичности и доводе до смрти ћелије тумора кроз апоптозу, односно програмирану смрт ћелије. Апоптоза изостаје тј. настаје резистенција ако долази до повећања поправке ДНК-адукта и способности толеранције оштећења ДНК (Шема 5).   Шема 5. Пут лека Након интравенског дозирања цисплатине на путу до оболеле ћелије она може да реагује са бројним биомолекулима. Висока концентрација хлоридо јона у крви (100 mM) спречава хидролизу полазног комплекса. Према томе, цисплатина доспева до туморских ћелија као Општи део    27   неутралан комплекс. Када доспе у ћелију, где је концентрација хлоридо јона приближно 4 mM, долази до замене хлоридо лиганда молекулима воде (Шема 6). Најважнија врста која настаје је [PtCl(H2O)(NH3)2]+ катјон [62-64]. Овај катјон је врло реактиван због тога што је вода у односу на хлоридо лиганд боља одлазећа група [65]. Шема 6. Хидролиза и грађење ДНК-цисплатина адукта Пре него што уђе у ћелију, цисплатина се може везати за фосфолипиде и фосфатидилсерин из ћелијске мембране. Такође, у организму су присутни многи макробиомолекули који могу бити потенцијална места за везивање платине, укључујући РНА, бројне протеине и пептиде који садрже сумпор [44-48]. Процењено је да се мање од 1% молекула цисплатине који уђу у ћелију везују за ДНК из једра, док се остала количина везује за протеине и друге биомолекуле ћелије [66,67]. Општи део    28   Иако се зна да се већи број молекула цисплатине везује за протеине постоје и експериментални докази да ове врсте интеракција имају важну улогу при покретању апоптозе (програмиране смрти ћелије). Осим тога некроза (случајна смрт ћелије), која настаје услед главног неуспеха самог функционисања ћелије, такође је допринела објашњавању механизма којим цисплатина уништава туморске ћелије. 2.3.3. Развој нових антитуморских лекова Од великог броја синтетисаних комплекса платине, којима је испитана антитуморска активност, знатан број је испитан у односу зависности активности од структуре комплекса. Показано је да комплекси платине(II) који показују антитуморску активност морају имати cis геометрију са општом формулом [Pt(am)2X2], где је am инертни амински лиганд са најмање једном NH групом а X је лако одлазећа група. Одлазећа група мора бити анјон са умерено јаком координацијом за платину, као и да поседује слаби trans ефекат да би се избегла лабилизација аминског лиганда. Али и комплекси са релативно добро одлазећим групама, као што су перхлоратни или нитратни анјон, су изразито токсични, док су комплекси са инертним одлазећим групама углавном неактивни. Откриће антитуморских особина поменутих комплекса платине повећало је интересовање ка добијању евентуално ефикаснијих комплекса других метала и лиганада. Међу првим комплексима коришћеним у клиничким испитивањима против тумора били су комплекси паладијума(II) и то аналози цисплатине, cis-диаминдихлоридопаладијум(II), cis-[PdCl2(NH3)2] и cis-1,2-диаминциклохександихлоридопаладијум(II), cis-[PdCl2(DACH)] комплекси (Слика 8) [68]. Општи део    29   (I) (II) Слика 8. Структура (I) cis-диаминдихлоридопаладијум(II), cis-[PdCl2(NH3)2]; (II) cis-1,2-диамнинциклохександихлоридопаладијум(II), cis-[PdCl2(DACH)] Познато је да су комплекси платине(II) термодинамички и кинетички стабилнији од паладијум(II) аналога. Паладијум(II) комплекси подлежу хидролизи и измени лиганада чак 105 пута брже него одговарајући комплекси платине(II), што условљава нижу антитуморску активност комплекса паладијума и већу токсичност [60,68,69]. Иако први резултати нису показали значајну антитуморску активност комплекса паладијума(II), ови комплекси су ипак много шире проучавани. Углавном су комплекси паладијума(II) због велике реактивности показивали нижу антитуморску активност од цисплатине [60,69]. Сматра се да је нижа активност ових комплекса последица јако брзе измене лиганада и немогућности комплекса да непромењене стуктуре стигне до биолошке мете, чиме је повећан ризик од неповољних ефеката на биохемијске процесе у ћелији. У циљу превазилажења оваквих проблема многи аутори [70] су предлагали да се паладијум(II) јон координује за хелатне лиганде, чиме би се смањила реактивност паладијумовог центра повећавајући стабилност награђеног комплекса. Антитуморска активност комплекса, односно успех лека, зависи и од коришћеног лиганда за координовање јер од лиганда зависи реактивност и липофилност, као и стабилизовање одређених оксидационих стања метала или могућност супституције [71,72]. До сада је једина примена паладијума у медицини у лечењу брзорастућег канцера простате и то користећи радиоактивни изотоп 103Pd [73,74]. Општи део    30   Постоје и комплекси паладијума(II) који показују активност сличну цисплатини или карбоплатини. Комплекс паладијума са лигандом који је дериват кумарина (Слика 9) показује приближно 7800 пута већу активност у односу на карбоплатину на ћелијама А549, HeLa i K562 [75,76]. Тиме је потврђена претпоставка да са волуминознијим лигандима комплекси показују бољу антитуморску активност. Такође је испитиван велики број паладијум(II) комплекса са неутралним лигандима, као што су деривати пиридина [77,78], фосфатни деривати хинолина [89,80] или деривати пиразола [81] и тиме је доказана њихова значајна антитуморкса активност. Слика 9. Комплекс паладијума(II) са дериватом кумарина, активнији приближно 7800 пута од карбоплатине У тежњи да се синтетише једињење са већом антитуморском активношћу и мањим нежељеним последицама, вршена су испитивања комплекса других метала који не припадају платинској групи. Међу таквим једињењима су били комплекси рутенијума, злата и сребра [82,83], титанијума [84,85] и калаја [86,87]. Дејсон (Dayson) и сарадници [98-90] су објавили значајне резултате радећи на фероценил-пиридин-арен рутенијум комплексима и на ефекту Општи део    31   циклопентадиенил прстена на цитотоксичност рутенијумових једињења. Кеплер (Keppler) и сарадници [82,83,90] су објавили одличне резултате радећи са рутенијумским и паладијумским комплексима. Комплекси злата су такође испитивани, обзиром да је злато(III) изоелектронско и изоструктурно са Pt(II) комплексима. Комплекси злата су лабилнији, али су неки показали велику цитотоксичност [91,92]. Чак и комплексе злата(I) и сребра(I) [93] треба поменути као могуће будуће лекове за лечење тумора. 2.3.4. Антимикробна активност комплекса паладијума(II) Микроорганизми су хетерогена група организама. Својим комплексним физиолошким и биохемијским потенцијалима представљају неодвојиви део сваког екосистема и од великог су значаја за хуману популацију. Носиоци су бројних процеса значајних за развој савременог друштва. Процењује се да су се први пут појавили на Земљи пре око 3,5 милијарди година и то као Archebacteria. За микроорганизме се везују и најзначајније промене у еволуцији: прелаз с прокариота на еукариоте и прелаз из једноћелијских у вишећелијске организме. Ова група организама је произвела и прве молекуле кисеоника на Земљи и утицала на промену хемијског састава атмосфере, хидросфере и литосфере. Данас постоји велики број различитих врста микроорганизама које се међусобно разликују према морфолошким, физиолошким и биохемијским карактеристикама. При томе поред корисних микроорганизама које употребљавамо у различите сврхе, почев од прехрамбене преко медицинске до биотехнолошке употребе, веома значајну групу чине патогени микроорганизми. То је посебна група микроорганизама која изазива обољења код људи. Између људи и патогених бактерија постоји дугогодишња борба. У античко време најпре су биљке коришћене за контролу и лечење хуманих болести изазваних микроорганизмима. Касније, открићем антибиотика напредовала је борба против патогених бактерија и Општи део    32   до тада неизлечиве болести су постале излечиве. Међутим, све већом употребом антибиотика јављала се пропорционална резистентност патогених микроорганизама. Резистентност представља одбрамбени механизам микроорганизама на дејство антимикробних супстанци. Сикема (Sikkema) и сарадници (1995. године) су навели широк спектар адаптивних механизама на присуство липофилних једињења. Механизми деловања се могу заснивати на адаптацији ћелијског омотача у погледу његовог састава или функције. Адаптације на нивоу ћелијског зида дешавају се у виду промене (повећања/смањења) његове хидрофилности, што омогућава додатну баријеру за одређене супстанце (Слика 10) [94]. Слика 10. Адаптациони механизам за заштиту ћелије од токсичних ефеката липофилних једињења: (I) реструктуирање фосфолипидног двослоја променом конформације фосфолипида из cis у trans, или променом масних киселина у засићену форму; (II) Модификација липополисахарида у спољашњем омотачу Грам- -негативних бактерија; (III) повећање повезаности конституената ћелијског зида и/или промене у његовој хидрофилности; (IV) повећање хидрофилности S-слоја; (V) активна екскреција из ћелије. Општи део    33   2.3.5. Механизми дејства антимикробних једињења Антибактеријско дејство може бити усмерено на више структура у бактеријској ћелији. Дејство може бити усмерено на ћелијски зид, цитоплазматичну мембрану, као и на унутрашњост ћелије (метаболичке процесе ћелије, тј. синтезу нуклеинских киселина и протеина) (Слика 11) [95]. Слика 11. Потенцијална места на бактеријској ћелији за дејство антимикробних супстанци Механизам антибактеријског дејства зависи од карактеристика циљних микроорганизама, а суштинска разлика је у различитости грађе ћелијског омотача која постоји између Грам-негативних и Грам-позитивних бактерија као што је приказано на Слици 12. Општи део    34     Слика 12. Грађа омотача Грам-негативних и Грам-позитивних бактерија Грам-позитивне бактерије имају дебео ћелијски зид који је углавном изграђен од пептидогликана, што представља спољашњи слој око ћелије. Такође, у састав ћелијског зида Грам-позитивних бактерија улази и тејхојна киселине. Тејхојна киселина се састоји од фосфата и алкохола: глицерола и рибитола. Због присуства тејхојне киселине наелектрисање на површини ћелијског зида је негативно. Сложена структура ћелијског зида Грам-позитивних бактерија ипак не представља значајну баријеру [96]. Ћелијски зид Грам-негативних бактерија осим слоја пептидогликана, који је код ових бактерија много тањи, састављен је из једног или више слојева, а садржи и спољашњи слој. Спољашњи слој ћелијског зида, који се налази изнад пептидогликанског слоја, а који се састоји се од фосфолипидног двослоја, липопротеина и липополисахарида. Функције овог слоја су вишеструке: његово негативно наелектрисање спречава деловање одбрамбеног система домаћина (фагоцитоза), као и антимикробних супстанци (пеницилин), лизозима, детерџената, тешких метала и одређених боја [97]. Полупропустљива је и функционише као препрека за молекуле веће од 600 Da. Хидрофобни макромолекули не могу проћи баријеру спољашњег слоја ћелијског зида Грам- негативних бактерија. Општи део    35   Липополисахариди, који се налазе на спољашњем делу фосфолипидног слоја хидрофилни су и наелектрисани, па стога представљају додатну баријеру за хидрофобне супстанце [94,96]. Због сложеније структуре, Грам-негативне бактерије поседују генерално већу отпорност на дејство различитих антимикробних супстанци у односу на Грам- -позитивне бактерије [98]. Циљна места интеракције бактеријске ћелије су и ћелијска мембрана и цитоплазма ћелије. 1. Ћелијска мембрана. Интеракцијом липофилних једињења са фосфолипидним делом условљава промене у структури и функцији ћелијске мембране. Уколико дође до акумулације ових једињења долази до губитка интегритета ћелијске мембране, као и разних промена активности ензима мембране [94]. 2. Дејство на унутарћелијске процесе. Дејство антимикробних супстанци може утицати и на унутарћелијске процесе у које спадају ометање или потпуни прекид репликације и коагулације унутар ћелијског садржаја [99]. У неким случајевима може доћи до процеса самоуништења ћелија, који је последица метаболичког дисбаланса. Аутоцидни процеси настају као последица два механизма дејства: акумулације слободних радикала и поремећаја јонске хомеостазе [95]. Гљиве су еукариотски организми, по грађи сложенији од бактерија. Велика група гљива, укључујући и гљиве из рода Aspergillus, су вишећелијски организми чије је вегетативно тело (мицелија) изграђено од гранатих нити (хифа), док једна мања група представља једноћелијске организме, овалног облика којој припадају квасци. Ћелијски зид гљива је углавном изграђен од аминополисахарида хитина који је у ћелијском зиду квасаца присутан у нешто мањем проценту. Општи део    36   Будући да су гљиве еукариотски организми, механизми антифунгалног деловања су самим тим и комплекснији. Врло често, због велике сличности између еукариотске ћелије гљива и анималне или хумане ћелије, антифунгални агенси токсично делују и на њих, па је и то један од разлога за откривањем нових, безбедних антифунгалних агенаса. Механизам њиховог деловања се огледа у: - нарушавању интегритета ћелијске мембране повећавајући њену пропустљивост - инхибицији синтезе ћелијског зида - инхибицији синтезе нуклеинских киселина - инхибицији ћелијске деобе (митозе) [100]. Микроорганизми, који могу изазвати болести, спадају у групу патогених микроорганизама, а квантитативна мера те способности зове се вируленција [101]. Карактеристике којима се патогени микроорганизми разликују у односу на непатогене јесу поседовање једног или више фактора вируленције у које спадају: способност микроорганизма да продре у домаћина, способност адхеренције и колонизације (инвазивност), способност избегавања имуног одговора домаћина и способност продукције токсина [102]. 2.3.6. Развој нових антимикробних једињења Микроорганизми су развили бројне одбрамбене механизме на дејство разних антимикробних супстанци. То је довело до пораста инфекција изазваних резистентним или мање осетљивим бактеријама. Такође, инфекције изазване патогеним бактеријама Candida albicans и Aspergillus sp. су у све већем порасту. То је навело многе научнике на проналажење нових антимикробних агенаса који се могу ефикасно применити у борби против инфекција. Најпре су извор разних истраживања била природна једињења, а касније се радило на синтези нових једињења која би показала бољу антимикробну активност. Значајно антибактеријско и антифунгално дејство такође су показали и многи комплекси прелазних метала. Бројни синтетисани комплекси паладијума(II) су показали Општи део    37   значајну антибактеријску активност, као и утицај на раст и метаболизам различитих група микроорганизама. Гуера (Guerra) и сарадници су приказали синтезу три комплекса паладијума(II) (Слика 13) са антибиотицима из групе тетрациклина и испитивали њихов утицај на тетрациклин осетљиве и резистентне бактеријске сојеве [103]. Слика 13. Паладијум(II)-јон координован за антибиотике из групе тетрациклина Општи део    38   Том приликом је показано да комплекс паладијума(II) са тетрациклином показује 16 пута бољу активност на резистентни сој Echerichia coli HB101/pBR322 у поређењу са тетрациклином. Виера (Viera) и сарадници су 2009. године приказали синтезу и антимикробну активност комплекса паладијума(II) са биолошки активним лигандом флоурохинолином (Слика 14), при чему је забележена значајна активност комплекса на бактерију Mycobacterium tuberculosis вирулентни сој [104]. Флурохинолин и други биолошки активни молекули коришћени су као лиганди за координовање и за друге металне јоне, који су такође условљавали већу антимикробну активност. У литератури постоје бројни радови са синтетисаним комплексима паладијума(II) који су показали значајну активност на различите врсте бактерија и гљива [105-110] Слика 14. Паладијум(II) комплекс са флуорохинолином као лигандом Општи део    39   Многа ранија истраживања су показала да ароматична и хетероциклична група тиоетра игра значајну улогу у антимикробној активности. Бројна једињења овог типа су синтетисана и испитана је њихова антибактеријска и антифунгална активност [111-114]. Њихова активност забележена је на бактеријама Escherichia coli и Staphylococcus aureus. Многи научници инспирисани оваквим резултатима испитивали су антимикробну активност S-алкил деривата тиосалицилне киселине [115] (Слика 15). Њихова антибактеријска и антифунгална активност испитана је микродилуционом методом на различитим бактеријским сојевима Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas аeruginosa и Escherichia coli, док је in vitro антифунгална активност испитивана на Candida albicans и Candida krusei. Слика 15. Структура деривата тиосалицилне киселине Општи део    40   2.4. МЕТОДЕ ЗА ОДРЕЂИВАЊЕ СТРУКТУРЕ КОМПЛЕКСА МЕТАЛА СА ЛИГАНДИМА EDDA-ТИПА Одређивање структуре комплекса који садрже бидентатне лиганде О,О'-диалкил естре edda-типа и S-алкил деривате тиосалицилне киселине вршена је употребом спектроскопских метода: нуклеарно-магнетно-резонанционе (NMR) и инфрацрвене спектоскопије (IR) као и рендгенске структурне анализе. 2.4.1. Нуклеарно-магнетно-резонанциона спектроскопија Претпостављена координација лиганада прекурсора потврђена је применом протонске нуклеарно-магнетно-резонанционе спектроскопије. За одговарајуће паладијум(II) комплексе у 1H NMR спектрима сигнали за метиленске протоне етилендиаминског дела молекула из edda-типа лиганда су померени ка вишем магнетном пољу у односу на спектре одговарајућих лиганада R2-edda (на 0,1-0,9 ppm) што указује на координацију азотових атома за централни метални јон. Присуство по два сета сигнала у спектрима комплекса паладијума(II) указује на постојање диjастереоизомера што је очекивано према DFT прорачунима рађеним за слична једињења [28]. У 13C NMR спектрима комплекса сигнали за естарске угљеникове атоме налазе се на приближно истим вредностима као у спектрима одговарајућих лиганада, што потврђује да није дошло до координације кисеоникових атома за централни метални јон. Међутим у неким случајевима уочава се значајна разлика у положајима сигнала за естарски угљеников атом и карбоксилни угљеников атом, што указује на тридентатно координовање неких алкил естара edda-типа лиганада. Општи део    41   2.4.2. Инфрацрвена спектроскопија У инфрацрвеним спектрима изолованих естара уочене су важне апсорпционе траке: за секундарне амонијумове соли ν(R2NH2+), за алкил групе ν(CH2), естарске групе ν(C=O) и ν(C-O). Приликом координовања за централни метални јон долази до формирања секундарне амино групе. Као критеријуми за разликовање координованих од некоординованих карбоксилних група у инфрацрвеним спектрима користи се положај фреквенција асиметричних валенционих вибрација ових група [116-118]. Асиметричне валенционе вибрације протонованих карбоксилних група налазе се у области од 1750 до 1700 cm-1, а у случају координовања померају се ка нижим фреквенцијама, односно налазе се у области 1650-1600 cm-1. N-H валенционе вибрације у комплексима са координованим лигандима edda-типа се налазе у области 3460-3200 cm-1. 2.5. ЦИЉ И ЗАДАТАК ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ Комплекси прелазних метала са тетрадентатним и бидентатним лигандима еdda-типа (edda = анјон етилендиамин-N,N′-дисирћетне киселине) и њихових деривата предмет су изучавања многих истраживача већ дужи низ година, пре свега ради изучавања спектралних особина награђених комплекса. Шездесетих година прошлог века испитивана је медицинска примена лиганада овог типа у циљу елиминације јона тешких метала приликом оралног тровања. Иако се лиганди, пре свега сам edda као и edta (edta = анјон етилендиаминтетрасирћетне киселина), чији је edda лиганд фрагмент, примењују у медицини у наведену сврху, имају ограничену примену с обзиром да обављају неселективну елиминацију јона метала. Поред елиминације јона метала који су Општи део    42   изазвали тровање, из организма се излучују и јони метала који су неопходни за нормално функционисање организма. Откриће антитуморских особина цисплатине и сличних комплекса платине је повећало интересовање за добијање још ефикаснијих комплекса других метала и лиганада. Међу првим комплексима коришћеним у клиничким испитивањима против тумора били су паладијум(II) аналози цисплатине. Иако првобитни резултати нису били охрабрујући, комплекси паладијума су много шире проучавани. Паладијум(II) комплекси су скоро увек показивали мању антитуморску активност од цисплатине због своје велике лабилности. Да би се ови проблеми превазишли, многа истраживања су била усмерена ка употреби хелатних лиганада који би умањили реактивност паладијум(II) комплекса. До сада је синтетисан мали број комплексних једињења паладијума(II) са диалкил естрима edda-типа као бидентатним лигандима, као и S-алкил дериватима тиосалицилне киселина. Стога је у оквиру ове Докторске дисертације предвиђена синтеза и карактеризација неких лиганада edda-типа, њихових О,О'-диалкил-естара као и S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II). У том циљу у оквиру ове Докторске дисертације предвиђени су следећи задаци: • Синтетисати тетрадентатни лиганд етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанску киселину, (H2-(S,S)-eddp) • Синтетисати неке О,О′-диалкил естре тетрадентатног лиганда -етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине, (R2-(S,S)-eddp) • Синтетисати одговарајуће паладијум(II) комплексе са О,О′-диалкил естрима (H2-(S,S)-eddp) лиганда • Синтетисати тетрадентатни лиганд етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)- -бутанску киселину, (H2-(S,S)-eddv) • Синтетисати неке О,О′-диалкил естре тетрадентатног лиганда -етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине, (R2-(S,S)-eddv) Општи део    43   • Синтетисати одговарајуће паладијум(II) комплексе са О,О′-диалкил естрима H2-(S,S)-eddv лиганда • Синтетисати S-алкил деривате тиосалицилне киселине • Синтетисати одговарајуће паладијум(II) комплексе са наведеним S-алкил дериватима тиосалицилне киселине • Синтетисати тетрадентатни лиганд meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′- -ди-3-пропанску киселину • Синтетисати одговарајуће паладијум(II) и платина(IV) комплексе са наведеним тетрадентатним лигандом meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′- -ди-3-пропанском киселином • Састав добијених лиганада и комплекса утврдити на основу резултата елементалне микроанализе • Структуру лиганада и награђених комплекса предвидети на основу њихових инфрацрвених и нуклеарно-магнетно-резонанционих спектара, где год је то могуће • Структуру лиганада и награђених комплекса потврдити на основу рендгенске структурне анализе, где год је то могуће • Испитати антимикробну и антитуморску активност награђених лиганада и одговарајућих комплекса  3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО Експериментални део    47   3.1. СИНТЕЗЕ ЛИГАНАДА 3.1.1. Синтеза етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине, H2-(S,S)-еddp Тетрадентатни лиганд, H2-(S,S)-еddp, је синтетисан на основу претходно описаног поступка [119]. У раствор који је добијен растварањем 20,00 g (0,50 mol) натријум-хидроксида лагано се, у малим порцијама, додаје 44,40 g (0,50 mol) S-аланина. Реакциона смеша се меша уз рефлуктовање и укапавање 47,00 g (0,25 mol) 1,2-дибром-етана и истовремено додавање 26,00 g (0,25 mol) анхидрованог натријум-карбоната. Раствор се рефлуктује још три сата. Након хлађења реакционе смеше и подешавања pH вредности на 5 помоћу раствора HCl (1:1) издваја се бели талог етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине. Добијени талог се процеди, добро испере водом и суши на ваздуху. Принос: 5,90 g (11,60 %). Резултати елементалне микроанализе за H2-(S,S)-еddp, М(C8H16N2O4) = 204,25 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 47,04 13,72 7,90 Нађено: 47,01 13,84 7,81 3.1.2. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -пропанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddp·2HCl O,O'-диалкил естри етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине синтетисани су на основу претходно описаног поступка [3]. У 50,00 mL Експериментални део    48   одговарајућег апсолутног алкохола (1-пропанол, 1-бутанол и 1-пентанол) уводи се гасовити хлороводоник, а потом додаje тетрадентатни лиганд, H2-(S,S)-еddp, 1,53 g (7,5 mmol). Реакциона смеша се рефлуктује 12 сати. Након тога добијени бели талог О,О′-диалкил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине у облику дихлорхидрата се одвоји цеђењем, испере водом, етанолом, етром и суши на ваздуху. За О,О'-дипропил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрат трихидрат, dpr-(S,S)-eddp·2HCl·3H2O (L1). Принос: 1,62 g (51,92 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 3,51 (s, 4H), 3,55 (q, 2H), 1,51 (d, 6H), 4,24 (t, 4H), 1,65 (m, 4H), 0,92 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 44,75 (CH2), 59,07 (CH), 17,18 (CH3), 173,34 (COO-pr), 72,04 (CH2-pr), 21,17 (CH2-pr), 12,45 (CH3-pr). Резултати елементалне микроанализе за dpr-(S,S)-eddp·2HCl, М(C14H36Cl2N2O7) = 415,35 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 40,48 6,75 8,74 Нађено: 40,06 6,71 8,34 За О,О'-дибутил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрат трихидрат, dbu-(S,S)-eddp·2HCl·3H2O (L2). Принос: 1,84 g (55,26 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 3,34 (s, 4H), 4,26 (q, 2H), 1,35 (d, 6H), 4,32 (t, 4H), 1,67 (m, 4H), 1,47 (m, 4H), 0,92 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 44,59 (CH2), 59,10 (CH), 17,05 (CH3), 173,01 (COO-bu), 70,40 (CH2-bu), 32,62 (CH2-bu), 21,35 (CH2-bu), 15,62 (CH3-bu). Експериментални део    49   Резултати елементалне микроанализе за dbu-(S,S)-eddp·2HCl·3H2O, М(C16H40Cl2N2O7) = 443,40 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 43,34 6,32 9,09 Нађено: 43,18 6,38 8,54 За О,О'-дипентил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрат дихидрат, dpe-(S,S)-eddp·2HCl·2H2O (L3). Принос: 1,87 g (55,00 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 3,42 (s, 4H), 4,14 (q, 2H), 1,34 (d, 6H), 4,28 (t, 4H), 1,72 (m, 4H), 0,93 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 45,14 (CH2), 58,99 (CH), 17,49 (CH3), 173,98 (COO-pe), 70,50 (CH2-pe), 30,28 (CH2-pe), 30,19 (CH2-pe), 24,55 (CH2-pe), 16,16 (CH3-pe). Резултати елементалне микроанализе за dpe-(S,S)-eddp·2HCl·2H2O, М(C18H42Cl2N2O6) = 453,44 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 47,68 6,18 9,34 Нађено: 46,91 6,12 9,46 3.1.3. Синтеза етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине, H2-(S,S)-еddv Етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанскa киселина, H2-(S,S)-еddv, је синтетисана на начин описан у одељку 3.1.1. У раствор који је добијен растварањем 20,00 g (0,50 mol) натријум-хидроксида лагано се, у малим порцијама додаје 58,57 g (0,50 mol) S-валина. Реакциона смеша се меша уз рефлуктовање и укапавање 47,00 g (0,25 mol) 1,2-дибром-етана и истовремено додавање 26,00 g (0,25 mol) натријум-карбоната. Раствор се рефлуктује још три сата. Након хлађења реакционе Експериментални део    50   смеше и подешавања pH вредности на 5 помоћу раствора HCl (1:1) издваја се бели талог етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине. Добијени талог се процеди, добро испере водом и суши на ваздуху. Принос: 8,15 g (12,52 %). Резултати елементалне микроанализе за H2-(S,S)-еddv, М(C12H24N2O4) = 260,33 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 55,36 10,76 9,29 Нађено: 55,21 10,84 9,41 3.1.4. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl Диалкил естри етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине синтетисани су на начин описа у одељку 3.1.2. У 50,00 mL одговарајућег апсолутног алкохола (етанол, 1-пропанол, 1-бутанол и 1-пентанол) уводи се гасовити хлороводоник, а потом додаје H2-(S,S)-еddv, 2,50 g (7,50 mmol). Реакциона смеша се рефлуктује 12 сати. Након тога добијени бели талог О,О'- -диалкил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине се одвоји цеђењем, испере водом, етанолом и етром и суши на ваздуху. За О,О'-диетил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат, det-(S,S)-eddv·2HCl (L4). Принос: 1,72 g (59,11 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 1,1 (m, 12H, C5,6H3), 1,35 (t, 6H, C8H3), 2,41 (m, 4H, C1H2), 3,62 (m, 2H, C4H), 3,69 (d, 2H, C2H), 4,34 (q, 4H, C7H2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 16,25 (C8H3), 20,93 (C5H3), 21,07 (C6H3), 32,58 (C4H), 46,20 (C1H2), 68,64 (C2H), 70,30 (C7H2), 173,77 (C3OO-еt). Експериментални део    51   Резултати елементалне микроанализе за det-(S,S)-eddv·2HCl, М(C16H34Cl2N2O4) = 389,35 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 49,35 7,20 8,80 Нађено: 48,84 7,37 8,41 За О,О'-дипропил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат, dpr-(S,S)-eddv·2HCl (L5). Принос: 1,72 (55,00 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 0,91 (t, 6H, C9H3), 1,21 (m, 12H, C5,6H3), 1,74 (m, 4H, C8H2), 2,37 (m, 4H, C1H2), 3,52 (m, 2H, C4H), 4,11 (d, 2H, C2H), 4,27 (q, 4H, C7H2). 13C NMR (50 MHz, D2O, δ ppm): 12,63 (C8H3), 19,47 (C5H3), 20,15 (C6H3), 24,22 (C8H2), 32,48 (C4H), 46,48 (C1H2), 69,35 (C2H), 72,21 (C7H2), 171,6 (C3OO-pr). 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,86 (t, 6H, C9H3), 1,18 (m, 12H, C5,6H3), 1,58 (m, 4H, C8H2), 2,26 (m, 4H, C1H2), 3,46 (m, 2H, C4H), 4,07 (d, 2H, C2H), 4,37 (q, 4H, C7H2), 4,63 (2H, NH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 12,48 (C8H3), 18,96 (C5H3), 20,17 (C6H3), 24,89 (C8H2), 33,03 (C4H), 46,41 (C1H2), 68,97 (C2H), 72,06 (C7H2), 170,9 (C3OO-pr). Резултати елементалне микроанализе за dpr-(S,S)-eddv·2HCl, М(C18H38Cl2N2O4) = 417,40 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 51,79 6,71 9,18 Нађено: 51,92 6,73 9,06 За О,О'-дибутил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат, dbu-(S,S)-eddv·2HCl (L6). Принос: 1,74 g (52,00 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 0,91 (t, 6H, C10H3), 1,13 (m, 12H, C5,6H3), 1,37 (m, 4H, C9H2), 1,70 (m, 4H, C8H2), 2,41 (m, 4H, C1H2), 3,56 (m, 2H, C4H), 3,87 (d, 2H, C2H), 4,34 (q, 4H, C7H2). 13C NMR (50 MHz, D2O, δ ppm): 15,80 (C10H3), 19,43 (C5H3), Експериментални део    52   19,76 (C6H3), 21,51 (C9H2), 32,60 (C4H), 36,38 (C8H2), 46,19 (C1H2), 64,50 (C2H), 70,49 (C7H2), 171,56 (C3OO-bu). 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,87 (t, 6H, C10H3), 1,17 (m, 12H, C5,6H3), 1,39 (m, 4H, C9H2), 1,66 (m, 4H, C8H2), 2,28 (m, 4H, C1H2), 3,48 (m, 2H, C4H), 3,79 (d, 2H, C2H), 4,26 (q, 4H, C7H2), 4,58 (2H, NH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 14,99 (C10H3), 19,37 (C5H3), 19,58 (C6H3), 21,43 (C9H2), 32,54 (C4H), 36,26 (C8H2), 46,03 (C1H2), 64,57 (C2H), 70,48 (C7H2), 171,51(C3OO-bu). Резултати елементалне микроанализе за dbu-(S,S)-eddv·2HCl, М(C20H42Cl2N2O4) = 445,46 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 53,92 6,29 9,50 Нађено: 53,48 9,54 6,48 За О,О'-дипентил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат, dpe-(S,S)-eddv·2HCl (L7). Принос: 1,82 g (51,00 %). 1H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 0,90 (t, 6H, C11H3), 1,10 (m, 12H, C5,6H3), 1,37 (m, 8H, C9,10H2), 1,72 (m, 4H, C8H2), 2,40 (m, 4H, C1H2), 3,62 (m, 2H, C4H), 4,09 (d, 2H, C2H), 4,39 (q, 4H, C7H2). 13C NMR (50 MHz, D2O, δ ppm): 16,13 (C11H3), 19,48 (C5H3), 20,69 (C6H3), 24,52 (C10H2), 30,31 (C9H2), 32,66 (C8H2), 33,92 (C4H), 46,29 (C1H2), 64,83 (C2H), 70,74 (C7H2), 171,84 (C3OO-pe). 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,90 (t, 6H, C11H3), 1,12 (m, 12H, C5,6H3), 1,36 (m, 8H, C9,10H2), 1,68 (m, 4H, C8H2), 2,33 (m, 4H, C1H2), 3,64 (m, 2H, C4H), 4,02 (d, 2H, C2H), 4,21 (q, 4H, C7H2), 4,76 (2H, NH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 16,06 (C11H3), 19,43 (C5H3), 20,32 (C6H3), 24,45 (C10H2), 30,29 (C9H2), 32,69 (C8H2), 33,88 (C4H), 46,07 (C1H2), 64,12 (C2H), 70,76 (C7H2), 171,34 (C3OO-pe). Експериментални део    53   Резултати елементалне микроанализе за dpe-(S,S)-eddv·2HCl, М(C22H46Cl2N2O4) = 473,51 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 55,80 5,92 9,79 Нађено: 55,68 6,02 9,76 3.1.5. Синтеза S-алкил деривата тиосалицилне киселине S-алкил деривати тиосалицилне киселине добијени су реакцијом алкиловања тиосалицилне киселине одговарајућим алкил-халогенидима у базној средини и смеши вода-етанол као растварачу. У раствор добијен растварањем (1 mmol) тиосалицилне киселине у 50,00 mL 30% етанола додаје се раствор натријум-хидроксида (2,00 mmol у 5,00 mL дестиловане воде). Одговарајући алкил- -халогенид (бензил-(L8), метил-(L9), етил-(L10), пропил-(L11), бутил-(L12)) (2,00 mmol) се раствори у 5,00 mL етанола и постепено додаје у малим порцијама у претходно припремљену бистру реакциону смешу. Тако добијена реакциона смеша остави се током ноћи на 60ºC. Након тога раствор се пренесе у кристализациону шољу и упари на воденом купатилу ради удаљавања етанола. У добијени водени раствор додаје се (2,00 mM) раствор хлороводоничне киселине услед чега се ствара бели талог одговарајућег S-алкил деривата тиосалицилне киселине. Тако добијени производ се одвоји цеђењем, испере великом количином дестиловане воде и суши преко ноћи на вакууму. S-алкил деривати тиосалицилне киселине су добијени у приносу 85-95 %. S-бензил тиосалицилна киселина (L8): IR (KBr, cm–1): 3414, 3061, 2920, 2648, 2559, 1674, 1584, 1562, 1463, 1412, 1317, 1272, 1255, 1154, 1062, 1046, 897, 743, 711, 652, 551. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 4,17 (s, 2H, CH2), 7,21-8,14 (m, 9H, Ar и bz). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 35,9 (CH2), 124,1; 125,9; Експериментални део    54   126,7; 127,3; 127,9; 128,3; 128,6; 129,3; 131,0; 132,4; 136,8; 141,3 (Ar и bz), 167,5 (COOH). S-метил тиосалицилна киселина (L9): IR (KBr, cm–1): 3446, 3068, 2916, 2652, 2560, 1674, 1586, 1561, 1466, 1412, 1308, 1291, 1270, 1255, 1151, 1062, 1048, 892, 743, 699, 652, 556. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,48 (s, 3H, CH3), 7,16-8,18 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 15,6 (CH3), 123,5; 124,4; 125,4; 132,5; 133,6; 144,4 (Ar), 171,6 (COOH). S-етил тиосалицилна киселина (L10): IR (KBr, cm–1): 3435, 3066, 2972, 2652, 2562, 1682, 1588, 1563, 1466, 1414, 1315, 1275, 1252, 1152, 1063, 1049, 884, 740, 704, 690, 651, 550. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 1,42 (t, 3H, CH3), 2,97 (q, 2H, CH2), 7,16-8,17 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13,1 (CH3), 26,2 (CH2), 124,0; 125,9; 126,4; 132,6; 133,2; 142,9 (Ar), 171,4 (COOH). S-пропил тиосалицилна киселина (L11): IR (KBr, cm–1): 3414, 3056, 2979, 2641, 2555, 1678, 1588, 1562, 1462, 1405, 1310, 1271, 1257, 1150, 1062, 1053, 811, 740, 704, 691, 653, 554. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 1,1 (t, 3H, CH3), 1,74 (m, 2H, CH2), 2,92 (t, 2H, CH2), 7,15-8,15 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13,8 (CH3), 21,6 (CH2), 34,1 (CH2), 123,8; 125,6; 126,2; 132,5; 133,1; 143,1 (Ar), 171,6 (COOH). S-бутил тиосалицилна киселина (L12): IR (KBr, cm–1): 3420, 2955, 2869, 2641, 2556, 1674, 1586, 1560, 1462, 1408, 1320, 1270, 1250, 1153, 1060, 1048, 924, 810, 738, 704, 651, 553. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,96 (t, 3H, CH3), 1,46 (m, 2H, CH2), 1,78 (m, 2H, CH2), 2,94 (t, 2H, CH2), 7,15-8,16 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13,7 (CH3), 22,3 (CH2), 30,2 (CH2), 31,9 (CH2), 123,8; 125,7; 126,3; 132,5; 133,1; 143,1 (Ar), 171,4 (COOH). Експериментални део    55   3.1.6. Синтеза meso-1,2-дифенил-етилендиамин, 1,2-dphen Meso-1,2-дифенил-етилендиамин је синтетисан на основу претходно описаног поступка [120]. Раствор припремљен растврањем амонијум-ацетата (60,00 g) у бензалдехиду (30,00 g) рефлуктује се 3 сата. Након тога реакциона смеша се охлади, а добијени талог се одвоји цеђењем, испере етанолом и суши на ваздуху. Прекристалисавањем из бутанола добијен је N-бензоил-N-бензилиден- -meso-1,2-дифенил-етилендиамин. Хидролизом овог једињења помоћу 70 % воденог раствора сумпорне киселине, уз рефлуктовање добија се meso-1,2- дифенил-етилендиамин. 3.1.7. Синтеза meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N'-ди-3- -пропанске киселине дихлорхидрат монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Раствор добијен растварањем 4,34 g (0,04 mol) 3-хлор-пропанске киселине у 5,00 mL воде охлади се у леденом купатилу и пажљиво неутралише помоћу 5,00 mL хладног раствора NaOH (1,60 g, 0,04 mol) пазећи при томе да температура не пређе 20ºC. Добијеном раствору се потом додаје потребна количина meso-1,2- -дифенил-етилендиамина (4,24 g, 0,02 mol). Реакциона смеша се постепено загрева до температуре од 90ºC уз мешање и лагано укапавање раствора 5,00 mL натријум- -хидроксида (1,60 g, 0,04 mol) при чему се одржава pH вредност у смеши на 7 током периода загревања од 3 сата. Након хлађења реакциона смеша се неутралише помоћу 5,60 mL 6,00 mol/L хлороводоничне киселине и упари до запремине од 7,00 mL. Тако добијеном раствору се додаје 6,00 mL концентроване хлороводоничне киселине, уз мешање, при чему се издваја већа количина натријум-хлорида који се одвоји цеђењем. Филтрату се затим додаје 6 mL концентроване хлороводоничне киселине, 6,00 mL етанола и 6,00 mL етра и остави Експериментални део    56   се у фрижидеру преко ноћи. Издвојени бео талог, meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропанска киселина дихлорхидрат (L13), се одвоји цеђењем. Тако добијени производ се прекристалише из смеше вода-етанол у односу (1:2). На тај начин је добијен кристал погодан за рендгенску структурну анализу. Принос: 4,00 g (44,69 %). Резултати елементалне микроанализе за H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O, М(C20H28Cl2N2O5) = 447,34 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 53,69 6,26 6,31 Нађено: 53,88 6,08 6,70 Експериментални део    57   3.2. СИНТЕЗЕ КОМПЛЕКСА 3.2.1. Синтеза дихлоридо-O,O′-дипропил-етилендиамин-N,N′-ди- -(S,S)-2-пропаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl2(dpr-(S,S)-eddp)] Раствору добијеном растварањем 0,20 g (0,61 mmol) калијум- -тетрахлоридопаладата(II) у 10,00 mL дестиловане воде лагано се додаje (0,25 g, 0,61 mmol) О,О'-дипропил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата трихидрата (dpr-(S,S)-eddp·2HCl·3H2O). Реакциона смеша се загрева на воденом купатилу уз мешање 2 сата. Током овог периода у малим порцијама се додаје раствор LiOH (0,03 g, 1,23 mmol у 10,00 mL дестиловане воде). Настали жути талог комплекса, [PdCl2(dpr-(S,S)-eddp)] (C1), се одвоји цеђењем, испере дестилованом водом и суши на ваздуху. Принос: 0,19 g (66,60 %). Изомер A: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,83 (s, 4H), 3,63 (q, 2H), 2,04 (d, J = 7,37 Hz, 6H), 4,14 (t, 4H), 1,69 (m, 4H), 0,95 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 48,62 (CH2), 57,26 (CH), 14,63 (CH3), 170,14 (COO-pr), 67,48 (CH2-pr), 21,76 (CH2-pr), 10,24 (CH3-pr). Изомер B: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,85 (s, 4H), 3,21 (q, 2H), 2,47 (d, J = 7,37 Hz, 6H), 4,53 (t, 4H), 1,76 (m, 4H), 0,92 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 51,68 (CH2), 58,69 (CH), 15,93 (CH3), 171,46 (COO-pr), 67,14 (CH2-pr), 21,70 (CH2-pr), 10,24 (CH3-pr). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl2(dpr-(S,S)-eddp)], М(C14H28Cl2N2O4Pd) = 465,68 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 36,11 6,02 6,06 Нађено: 35,81 5,82 6,01 Експериментални део    58   3.2.2. Синтеза дихлоридо-O,O′-дибутил-етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)- -2-пропаноатoпаладијум(II) комплекса, [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)] Полазећи од 0,20 g (0,61 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,27 g (0,61 mmol) О,О'-дибутил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата трихидрата, dbu-(S,S)-eddp·2HCl·3H2O на начин описан у одељку 3.2.1. синтетисан је [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)] (C2), комплекс жуте боје. Принос: 0,18 g (59,50 %). Изомер A: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,83 (s, 4H), 3,62 (q, 2H), 1,29 (d, J = 6,81 Hz, 6H), 4,15 (t, 4H), 1,56 (m, 4H), 1,36 (m, 4H), 0,90 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 48,63 (CH2), 57,25 (CH), 14,64 (CH3), 170,16 (COO-bu), 65,43 (CH2-bu), 33,32 (CH2-bu), 18,97 (CH2-bu), 13,50 (CH3-bu). Изомер B: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,49 (s, 4H), 3,20 (q, 2H), 1,37 (d, J = 6,81 Hz, 6H), 4,21 (t, 4H), 1,70 (m, 4H), 1,39 (m, 4H), 0,97 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 51,64 (CH2), 58,69 (CH), 16,95 (CH3), 171,45 (COO-bu), 65,77 (CH2-bu), 30,37 (CH2-bu), 19,00 (CH2-bu), 13,55 (CH3-bu). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)], М (C16H32Cl2N2O4Pd) = 493,74 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 38,92 5,68 6,53 Нађено: 38,74 5,57 6,66 Експериментални део    59   3.2.3. Синтеза дихлоридо-O,O′-дипентил-етилендиамин-N,N′-ди- -(S,S)-2-пропаноатoпаладијум(II) комплекса, [PdCl2(dpe-(S,S)-eddp)] Полазећи од 0,20 g (0,61 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,28 g (0,61 mmol) О,О'-дипентил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата трихидрата (dpe-(S,S)-eddp·2HCl·2H2O) на начин описан у одељку 3.2.1. синтетисан је [PdCl2(dpe-(S,S)-eddp)] (C3), комплекс жуте боје. Принос: 0,19 g (59,65 %). Изомер A: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,82 (s, 4H), 3,64 (q, 2H), 1,24 (d, J = 7,17 Hz, 6H), 4,14 (t, 4H), 1,85 (m, 4H), 1,31 (m, 4H), 1,39 (m, 4H), 0,90 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 48,64 (CH2), 57,27 (CH), 14,67 (CH3), 170,18 (COO-pe), 65,72 (CH2-pe), 48,64 (CH2-pe), 27,85 (CH2-pe), 22,14 (CH2-pe), 13,79 (CH3-pe). Изомер B: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 2,50 (s, 4H), 3,21 (q, 2H), 1,26 (d, J = 7,17 Hz, 6H), 4,11 (t, 4H), 1,69 (m, 4H), 1,42 (m, 4H), 1,59 (m, 4H), 0,94 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 51,62 (CH2), 58,67 (CH), 15,97 (CH3), 171,45 (COO-pe), 66,04 (CH2-pe), 51,62 (CH2-pe), 28,24 (CH2-pe), 22,10 (CH2-pe), 13,87 (CH3-pe). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl2(dpe-(S,S)-eddp)], М(C18H36Cl2N2O4Pd) = 521,79 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 41,43 5,37 6,95 Нађено: 40,92 5,33 7,11 Експериментални део    60   3.2.4. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-етил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] Полазећи од 0,20 g (0,61 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,25 g (0,61 mmol) О,О'-диетил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)- -бутанске киселине дихлорхидрата (det-(S,S)-eddv·2HCl) на начин описан у одељку 3.2.1. синтетисан је [PdCl(et-(S,S)-eddv)] (C4), комплекс жуте боје. Кристали погодни за рендгенску структурну анализу добијени су прекристалисавањем комплекса из система диметилсулфоксид-вода. Принос: 0,15 g (61,02 %). 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,95 (d, 6H, C6,7H3), 1,02 (d, 6H, C11,12H3), 1,25 (t, 3H, C15H3), 2,23 (m, 4H, C1,2H2), 2,45 (q, 1H, C3H), 2,87 (q, 1H, C10H), 3,91 (d, 1H, C9H), 4,16 (d, 1H, C5H), 4,45 (q, 2H, C14H3). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 14,23 (C15H3), 17,93 (C6,7H3), 19,34 (C11,12H3), 28,41 (C10H), 30,58 (C3H), 46,95 (C1H2), 49,76 (C2H2), 50,52 (C5H), 61,88 (C9H), 68,01 (C14H3), 169,25 (C4OO-), 171,93 (C13OO-et). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl(еt-(S,S)-eddv)], М(C14H27ClN2O4Pd) = 429,25 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 39,17 6,53 6,34 Нађено: 39,34 6,38 6,41 Експериментални део    61   3.2.5. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-пропил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(pr-(S,S)-eddv)] Полазећи од 0,20 g (0,61 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,26 g (0,61 mmol) О,О'-дипропил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, (dpr-(S,S)-eddv·2HCl) на начин описан у одељку 3.2.1. синтетисан је [PdCl(pr-(S,S)-eddv)] (C5), комплекс жуте боје. Принос: 0,23 g (72,00 %). 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,94 (t, 3H, C15H3), 1,11 (d, 6H, C6,7H3), 1,21 (d, 6H, C10,11H3), 1,61 (m, 2H, C14H2), 1,94 (m, 4H, C1,2H2), 2,24 (m, 1H, C5H), 2,48 (m, 1H, C9H), 3,71 (d, 1H, C3H), 4,10 (d, 1H, C8H), 4,28 (t, 2H, C13H2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 10,68 (C15H3), 19,25 (C6H3), 19,34 (C7H3), 21,15 (C10H3), 22,15 (C11H3), 30,58 (C14H2), 46,83 (C5H), 49,70 (C9H), 50,56 (C1H2), 56,61 (C2H2), 65,29 (C8H), 68,75 (C3H), 72,99 (C13H2), 171,73 (C12), 178,74 (C4). 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,92 (t, 3H, C15H3), 1,03 (d, 6H, C6,7H3), 1,23 (d, 6H, C10,11H3), 1,58 (m, 2H, C14H2), 1,89 (m, 4H, C1,2H2), 2,13 (m, 1H, C5H), 2,45 (m, 1H, C9H), 3,59 (d, 1H, C3H), 4,02 (d, 1H, C8H), 4,29 (t, 2H, C13H2), 5,83 (2H, NH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 11,12 (C15H3), 18,87 (C6H3), 19,36 (C7H3), 21,07 (C10H3), 22,17 (C11H3), 30,53 (C14H2), 46,74 (C5H), 49,72 (C9H), 50,55 (C1H2), 56,16 (C2H2), 65,39 (C8H), 68,74 (C3H), 72,87 (C13H2), 171,56 (C12), 178,28 (C4). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl(pr-(S,S)-eddv)], М(C15H29ClN2O4Pd) = 443,27 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 40,64 6,32 6,59 Нађено: 41,00 6,43 6,57 Експериментални део    62   3.2.6. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-бутил-2-(3-метил)- -бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(bu-(S,S)-eddv)] Полазећи од 0,20 g (0,61 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,27 g (0,61 mmol) О,О'-дибутил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат, (dbu-(S,S)-eddv·2HCl) на начин описан у одељку 3.2.1. синтетисан је [PdCl(bu-(S,S)-eddv)] (C6), комплекс жуте боје. Принос: 0,19 g (71,00 %). 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,91 (t, 3H, C16H3), 0,99 (d, 6H, C6,7H3), 1,17 (d, 6H, C10,11H3), 1,35 (m, 2H, C15H2), 1,59 (m, 2H, C14H2), 2,19 (m, 4H, C1,2H2), 2,56 (m, 1H, C5H), 2,84 (m, 1H, C9H), 3,50 (d, 1H, C3H), 4,08 (d, 1H, C8H), 4,29 (t, 2H, C13H2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13,64 (C16H3), 17,99 (C6H3), 18,17 (C7H3), 19,24 (C10H3), 19,44 (C11H3), 21,58 (C15H2), 28,34 (C5H), 29,68 (C9H), 30,55 (C14H2), 38,68 (C1H2), 41,52 (C2H2), 59,40 (C8H), 61,40 (C3H), 67,21 (C13H2), 170,81 (C12), 177,84 (C4). 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,88 (t, 3H, C16H3), 0,93 (d, 6H, C6,7H3), 0,98 (d, 6H, C10,11H3), 1,23 (m, 2H, C15H2), 1,46 (m, 2H, C14H2), 2,06 (m, 4H, C1,2H2), 2,51 (m, 1H, C5H), 2,79 (m, 1H, C9H), 3,39 (d, 1H, C3H), 3,56 (d, 1H, C8H), 4,12 (t, 2H, C13H2), 5,85 (2H, NH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 13,53 (C16H3), 17,85 (C6H3), 18,79 (C7H3), 19,70 (C10H3), 19,87 (C11H3), 21,79 (C15H2), 21,99 (C5H), 27,83 (C9H), 30,44 (C14H2), 49,93 (C1H2), 53,96 (C2H2), 64,36 (C8H), 64,64 (C3H), 71,23 (C13H2), 171,37 (C12), 179,20 (C4). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl(bu-(S,S)-eddv)], М(C16H31ClN2O4Pd) = 457,29 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 42,02 6,13 6,83 Нађено: 42,23 5,99 7,10 Експериментални део    63   3.2.7. Синтеза хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-пентил-2-(3- -метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(pe-(S,S)-eddv)] Полазећи од 0,20 g (0,61 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,29 g (0,61 mmol) О,О'-дипентил естра етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат (dpe-(S,S)-eddv·2HCl) на начин описан у одељку 3.2.1. синтетисан је [PdCl(pe-(S,S)-eddv)] (C7), комплекс жуте боје. Принос: 0,19 g (70,53 %). 1H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0,93 (t, 3H, C17H3), 0,99 (d, 6H, C6,7H3), 1,11 (d, 6H, C10,11H3), 1,32 (m, 2H, C15H2), 1,45 (m, 2H, C16H2), 1,60 (m, 2H, C14H2), 2,09 (m, 4H, C1,2H2), 2,46 (m, 1H, C5H), 2,79 (m, 1H, C9H), 3,51 (d, 1H, C3H), 3,63 (d, 1H, C8H), 4,07 (t, 2H, C13H2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 17,92 (C17H3), 18,43 (C6H3), 19,98 (C7H3), 21,87 (C10H3), 22,09 (C11H3), 27,79 (C16H2), 27,94 (C15H2), 30,14 (C14H2), 36,72 (C5H), 37,28 (C9H), 41,55 (C1H2), 49,90 (C2H2), 54,07 (C8H), 64,50 (C3H), 71,20 (C13H2), 171,62 (C12), 179,46 (C4). 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,91 (t, 3H, C17H3), 1,02 (d, 6H, C6,7H3), 1,13 (d, 6H, C10,11H3), 1,41 (m, 2H, C15H2), 1,58 (m, 2H, C16H2), 1,74 (m, 2H, C14H2), 2,18 (m, 4H, C1,2H2), 2,58 (m, 1H, C5H), 2,92 (m, 1H, C9H), 3,50 (d, 1H, C3H), 3,69 (d, 1H, C8H), 4,33 (t, 2H, C13H2), 6,05 (2H, NH). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 18,60 (C17H3), 19,08 (C6H3), 19,92 (C7H3), 21,94 (C10H3), 22,87 (C11H3), 28,81 (C16H2), 29,35 (C15H2), 32,34 (C14H2), 38,74 (C5H), 39,93 (C9H), 45,56 (C1H2), 51,18 (C2H2), 55,46 (C8H), 67,53 (C3H), 74,74 (C13H2), 171,38 (C12), 178,92 (C4). Резултати елементалне микроанализе за [PdCl(pe-(S,S)-eddv)], М(C17H33ClN2O4Pd) = 471,32 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 43,32 5,94 7,06 Нађено: 43,43 5,89 6,98 Експериментални део    64   3.2.8. Синтеза bis-(S-бензил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiosal)2] Раствору добијеном растварањем 0,10 g (0,31 mmol) калијум- -тетрахлоридопаладата(II) у 10,00 mL дестиловане воде лагано се додаје (0,15 g, 0,61 mmol) S-бензил етар тиосалицилне киселине. Реакциона смеша се загрева на воденом купатилу уз мешање 2 сата. Током овог периода у малим порцијама се додаје раствор литијум-хидроксида (0,03 g, 0,61 mmol у 10,00 mL дестиловане воде). Настали жути талог комплекса, [Pd(S-bz-thiosal)2] (C8), одвоји се цеђењем, испере дестилованом и суши на ваздуху. Кристали погодни за рендгенску структурну анализу добијени су прекристалисавањем из система диметилсулфоксид-вода. Принос: 0,11 g (58,70 %). IR (KBr, cm-1): 3420, 3057, 1634, 1616, 1562, 1327, 1146, 753, 708, 698. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 4,05 (s, 4H, CH2), 7,08-8,10 (m, 9H, Ar и bz). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 25,9 (CH2), 124,1; 125,6; 125,7; 126,2; 126,3; 126,8; 127,3; 127,8; 129,5; 133,2; 136,2; 139,7 (Ar и bz), 171,5 (COO-). Резултати елементалне микроанализе за [Pd(S-bz-thiosal)2], М(C28H22O4S2Pd) = 592,98 g·mol-1 C (%) S(%) H (%) Израчунато: 56,71 10,82 3,74 Нађено: 56,43 10,75 3,85 3.2.9. Синтеза bis-(S-метил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-met-thiosal)2] Полазећи од 0,10 g (0,31 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,10 g (0,61 mmol) S-метил етра тиосалицилне киселине на начин описан у одељку Експериментални део    65   3.2.8. синтетисан је [Pd(S-met-thiosal)2] (C9), комплекс жуте боје. Принос: 0,08 g (59,80 %). IR (KBr, cm-1): 3419, 1619, 1597, 1399, 1385, 1332, 1306, 1142, 960, 865, 741, 693, 654. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 2,35 (s, 6H, CH3), 7,19-8,08 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 14,6 (CH3), 123,6; 125,1; 125,2; 129,0; 132,7; 135,7 (Ar), 171,8 (COO-). Резултати елементалне микроанализе за [Pd(S-met-thiosal)2], М(C16H14O4S2Pd) = 440,67 g·mol-1 C (%) S(%) H (%) Израчунато: 43,61 14,52 3,20 Нађено: 43,41 14,21 3,39 3.2.10. Синтеза bis-(S-етил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-et-thiosal)2] Полазећи од 0,10 g (0,31 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,11 g (0,61 mmol) S-етил етра тиосалицилне киселине на начин описан у одељку 3.2.8. синтетисан је [Pd(S-et-thiosal)2] (C10), комплекс жуте боје. Принос: 0,08 g (57,90 %). IR (KBr, cm-1): 3436, 1587, 1518, 1393, 752. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 1,27 (t, 6H, CH3), 2,83 (q, 4H, CH2), 7,11–8,08 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 14,4 (CH3), 13,8 (CH2), 124,8; 125,3; 126,1; 128,7; 133,2; 135,9 (Ar), 172,0 (COO-). Резултати елементалне микроанализе за [Pd(S-et-thiosal)2], М(C18H18O4S2Pd) = 468,86 g·mol-1 C (%) S(%) H (%) Израчунато: 46,11 13,68 3,87 Нађено: 45,97 13,54 3,93 Експериментални део    66   3.2.11. Синтеза bis-(S-пропил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-pr-thiosal)2] Полазећи од 0,10 g (0,31 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,12 g (0,61 mmol) S-пропил етра тиосалицилне киселине на начин описан у одељку 3.2.8. синтетисан је [Pd(S-pr-thiosal)2] (C11), комплекс жуте боје. Принос: 0,0889 g (58,40 %). IR (KBr, cm-1): 3421, 1589, 1541, 1520, 1397, 752. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,98 (t, 6H, CH3), 1,76 (m, 4H, CH2), 2,84 (t, 4H, CH2), 7,20-8,25 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 13,2 (CH3), 22,0 (CH2), 27,6 (CH2), 125,1; 126,6; 126,7; 130,5; 134,2; 137,2 (Ar); 172,5 (COO-). Резултати елементалне микроанализе за [Pd(S-pr-thiosal)2], М(C20H22O4S2Pd) = 496,91 g·mol-1 C (%) S(%) H (%) Израчунато: 48,34 12,91 4,46 Нађено: 48,52 12,73 4,11 3.2.12. Синтеза bis-(S-бутил-тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bu-thiоsal)2] Полазећи од 0,10 g (0,31 mmol) калијум-тетрахлоридопаладата(II) и 0,13 g (0,61 mmol) S-бутил етра тиосалицилне киселине на начин описан у одељку 3.2.8. синтетисан је [Pd(S-bu-thiosal)2] (C12), комплекс жуте боје. Принос: 0,09 g (58,43 %). IR (KBr, cm-1): 3420, 1634, 1616, 1561, 1327, 1146, 753, 698.1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0,95 (t, 6H, CH3), 1,33 (m, 4H, CH2), 1,62 (m, 4H, CH2), 2,79 (t, 4H, CH2), 7,24-8,19 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 13,4 (CH3), 20,5 (CH2), 21,6 (CH2), 33,7 (CH2), 123,8; 124,4; 126,3; 130,2; 131,9; 135,9 (Ar), 171,9 (COO-). Експериментални део    67   Резултати елементалне микроанализе за [Pd(S-bu-thiоsal)2], М(C22H26O4S2Pd) = 524,96 g·mol-1 C (%) S(%) H (%) Израчунато: 50,33 12,22 4,99 Нађено: 50,52 12,56 4,51 3.2.13. Синтеза cis-дихлоридо(meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропаноато)паладијум(II) комплекса, cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] У раствор добијен растварањем 0,20 g (0,61 mmol) калијум- -тетрахлоридопаладата(II) у 10,00 mL воде додаје се 0,27 g (0,61 mmol) meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата. Реакциона смеша се загрева 2 сата уз мешање на 60°C. Током тог периода у малим порцијама додаје се раствор литијум- -хидроксида (0,06 g, 2,45 mmol у 10,00 mL воде). Настали жути талог комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] (C13) одвоји се цеђењем, испере дестилованом водом и суши на ваздуху. Принос: 0,25 g (76,43 %). Резултати елементалне микроанализе за комплекс cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)], М(C20H24Cl2O4N2Pd) = 533,73 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 45,00 5,25 4,53 Нађено: 45,64 5,31 4,87 Експериментални део    68   3.2.14. Синтеза s-cis-дихлоридо(meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропаноато)платина(IV) комплекса, s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] У раствор добијен растварањем 0,20 g (0,41 mmol) калијум- -хексахлоридоплатината(IV) у 10,00 mL воде додаје се 0,18 g (0,41 mmol) meso-1,2- -дифенил-етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата. Реакциона смеша се загрева 12 сати уз мешање на 60°C. Током тог периода у малим порцијама додаје се раствор литијум-хидроксида (0,04 g, 1,65 mmol у 10,00 mL воде). Настали жути талог комплекса s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] (C14) одвоји се цеђењем, испере дестилованом водом и суши на ваздуху. Принос: 0,09 g (37,25 %). Резултати елементалне микроанализе за комплекс s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)], М(C20H26Cl2N2O4Pt) = 620,39 g·mol-1 C (%) N (%) H (%) Израчунато: 38,72 4,52 3,57 Нађено: 38,38 4,61 3,81 Експериментални део    69   3.3. МЕРЕЊА 3.3.1. Елементална микроанализа Елементалне анализе (C, H, N, S) су урађене на апарату Vario III C, H, N, S Elemental Analyzer. 3.3.2. 1H и 13C нуклеарно-магнетно-резонанциона спектроскопија Снимање нуклеарно-магнетно-резонанционих спектара синтетисаних једињења вршена су помоћу спектрофотометра Varian Gemini-200 NMR користећи D2O (за синтетисане лиганде) и CDCl3 и DMSO-d6 (за одговарајуће комплексе паладијума(II)) као раствараче. Хемијска померања су дата у односу на триметилсилан (TMS), употребом DDS као инертног стандарда. 3.3.3. Инфрацрвена спектроскопија Инфрацрвени спектри снимљени су помоћу спектрофотометра Perkin Elmer FTIR 31725X (KBr техника). Експериментални део    70   3.3.4. РЕНДГЕНСКА СТРУКТУРНА АНАЛИЗА 3.3.4.1. Рендгенска структурна анализа meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N'-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Монокристали meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата (H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O) погодни за рендгенску структурну анализу добијени су прекристалисавањем из смеше етанол- -вода у односу 1:2. Дифракциони подаци сакупљени су на собној температури помоћу дифрактометра Oxford Diffraction Xcalibur Gemini S опремљен CuKα зрачењем на таласној дужини λ = 1,54184 Å (Табела 2). Подаци су обрађени помоћу CrysAlis софтвера [121], а кориговани су аналитичком нумеричком методом [122]. Кристална структура је решена применом директне методе, Sir2002 [123], a утачњена коришћењем програма SHEXL [124]. Геометријска израчунавања су извршена помоћу PARTS97 [125], а слика молекула применом ORTEP-3 [126]. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре за H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O приказани су у Табели 2. Експериментални део    71   Табела 2. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре за H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Формула C20H28Cl2N2O5 F(000) 476 М 445,33 Z 2 Кристални систем Триклиничан Dc (g·mL) 1,4195 Просторна група P1 λ (Å) 1,54184 Величина кристала (mm) 0,12 x 0,07 x 0,04 μ (mm-1) 3,047 a (Å) 8,6989(18) Температура (K) 293(2) b (Å) 10,086(2) Θ (º) 3,40-27,10 c (Å) 13,461(3) Сакупљене рефлексије 4136 α (°) 104,143(17) Независне рефлексије 4136 β (°) 105,795(17) Посматране рефлексије 3775 γ (°) 100,754(18) I>2σ(I) R1=0,1762 V (Å3) 1060,7(4) wR2 0,3267 3.3.4.2. Рендгенска структурна анализа хлоридо((S,S)- -етилендиамин-N-(O-етил-2-(3-метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)- бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] Претходно синтетисани комплекс хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O- -етил-2(3-метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекс, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)], кристалисао је из система диметилсулфоксид-вода тако што је добијени талог комплекса растворен у малој количини диметилсулфоксида. Добијен раствор је заједно са чашом остављен у већој чаши са дестилованом водом. Већа чаша је затворена парафилмом и остављена на тамном месту. Након неколико дана добијени су жуто-наранџасти кристали који су били погодни за рендгенску структурну анализу. Експериментални део    72   Кристалографски подаци су сакупљени на 294 К помоћу Bruker-Nonius Kappa CCD дифрактометра користећи MoKα (λ = 0,71073 Å) зрачење монохроматизовано графитним монохроматором. Лоренцови и поларизациони ефекти су кориговани, а примењена је и нумеричка апсорпциона корекција [127]. Структура је решена применом директних метода и побољшана коришћењем full- -matrix, least-square процедура [128]. Кристалографски подаци као и подаци у вези са решавањем структуре комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] приказани су у Табели 3. Табела 3. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] Формула C14H27ClN2O4Pd F(000) 880 М 429,23 Z 4 Кристални систем Орторомбичан Dc (g·mL) 1,523 Просторна група P212121 λ (Å) 0,71073 Величина кристала (mm) 0,55 x 0,35 x0,18 μ (mm-1) 1,150 a (Å) 6,1062(2) Температура (K) 294(2) b (Å) 10,5325(4) Θ (º) 3,40-27,10 c (Å) 29,1149(11) Сакупљене рефлeксије 4136 α (°) 90 Независне рефлексије 4136 β (°) 90 Посматране рефлексије 3775 γ (°) 90 I>2σ(I) R1=0,0583,wR2=0,1402 V (Å3) 1872,5(2) R R1=0,0636,wR2=0,1429 Експериментални део    73   3.3.4.3. Рендгенска структурна анализа bis-(S-бензил- -тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiоsal)2] Одговарајући кристали комплекса bis-(S-бензил-тиосалицилато) паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiоsal)2], за рендгенску кристалну анализу добијени су прекристализацијом из система диметилсулфоксид-вода на начин описан у одељку 3.3.3.2. Резултати су сакупљени на 123 К коришћењем Bruker- -Nonius Kappa CCD дифрактометра са APEXII детектором користећи MoKα (λ = 0,71073 Å) монохроматизовано зрачење графитног монохроматора. Структура награђеног комплекса је решена применом директних метода SIR-2004 [129] и SHELXL-97 [124]. Лоренцови и поларизациони ефекти су кориговани, а примењена је и нумеричка апсорпциона корекција [130]. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре комплекса дате су у Табели 4. Табела 4. Основни кристалографски подаци и подаци у вези са решавањем и утачњавањем структуре комплекса [Pd(S-bz-thiоsal)2] Формула C28H22O4S2Pd F(000) 1200 М 592,98 Z 4 Кристални систем Моноклиничан Dc (g·mL) 1,640 Просторна група P21/c λ (Å) 0,71073 Величина кристала (mm) 0,16 x 0,04 x 0,02 μ (mm-1) 0,981 a (Å) 12,0280(5) Температура (K) 123(2) b (Å) 21,0330(8) Θ (º) 2,96-25,02 c (Å) 9,5049(4) Сакупљене рефлексије 13559 α (°) 90 Независне рефлексије 4212 β (°) 92,578(2) Посматране рефлексије 3775 γ (°) 90 I>2σ(I) R1=0,0624,wR2=0,1034 V (Å3) 2402,16(17) R R1=0,1215,wR2=0,1179 Експериментални део    74   3.4. БИОЛОШКА МЕРЕЊА 3.4.1. In vitro антимикробни тест 3.4.1.1. Тестирани микроорганизми Антимикробна активност бидентатних лиганада диалкилестара edda-типа лиганда, деривата тиосалицилне киселине и њихових одговарајућих комплекса је одређена тестирањем на 26 врста микроорганизама. Експерименти су извођени на 14 врста патогених бактерија, укључујући 7 стандардних врста и 9 клиничких изолата; 4 врсте пробиотских бактерија и 9 врста гљива укључујући 5 врста буђи и 4 врсте квасца. Сви тестирани микроорганизми приказани су у Табели 5. Сви клинички изолати патогених бактерија добијени су на поклон од Института за јавно здравље, Крагујевац. Остале врсте микроорганизама су из колекције микроорганизама Лабораторије за микробиологију, Природно-математичког факултета, Универзитета у Крагујевцу. Бактеријске суспензије и суспензије квасца су припремљене тако што су колоније узимане директно са подлоге и суспендоване у 5 mL стерилног физиолошког раствора. Густина почетне суспензије је подешавана упоређивањем са 0,5 Mc Farland стандардом (0,50 mL 1,17% w/v BaCl2 ·2H2O + 99,50 mL 1% w/v H2SO4) [131]. Густина стандарда 0,5 Mc Farland одговара бактеријској суспензији која садржи око 108 CFU/mL и суспензији квасца од 106 CFU/mL. Почетне суспензије бактерија и квасаца су разблажене у односу 1:1000 стерилним 0,85% физиолошким раствором. Суспензија спора гљива је припремљена пажљивим скидањем спора са мицелије. Таква суспензија је потом разблажена у односу 1:1000 стерилним физиолошким раствором. Експериментални део    75   Табела 5. Списак тестираних микроорганизама Бактерије Гљиве Грам-позитивне бактерије Квасци Bacillus subtilis ATCC 6633 Candida albicans ATCC 10231 Bacillus subtilis Candida albicans Enterococcus faecalis ATCC 29212 Rhodotorula sp. Enterococcus faecalis Saccharomyces boulardii Sarcina lutea ATCC 9341 Sarcina lutea Гљиве изазивачи буђи Staphylococcus aureus ATCC 25923 Aspergillus niger ATCC 16404 Staphylococcus aureus Aspergillus niger Aspergillus restrictus Грам-негативне бактерије Aspergillus fumigatus Escherichia coli ATCC 25922 Aspergillus flavus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis ATCC 12453 Proteus mirabilis Salmonella enterica Salmonella typhymurium Пробиотици Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bacillus subtilis IP 5832 Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus plantarum 3.4.1.2. Микродилуциона метода Ова метода омогућава испитивање антимикробне активности одређивањем минималне инхибиторне концентрације (MIК) и минималне микробицидне концентрације (MMК) употребом микротитрационих плоча уз помоћ ресазурина Експериментални део    76   [132]. Коришћена је плоча са 96 бунарића у која су стављена по 100 μL хранљиве подлоге, Mueller-Hinton бујон за бактерије и Sabouraud dextrose бујон за гљиве и квасце. По 100 μL раствора испитиваних једињења почетне концентрације 1000 μg/mL је додато у први ред микротитрационе плоче. Двоструким разблажењем користећи мултиканaлну пипету добијени су раствори концентрација у области од 500 до 0,24 μg/mL. Затим је додавано по 10 μL суспензија бактерија, квасца или спора. Тестирана једињења су испитана на концентрацији бактерија од 105 CFU/mL, и концентрацији квасца и спора гљива од 103 CFU/mL. Коначно, у сваки бунарић додат је ресазурин. Ресазурин је индикатор ћелијског раста. У периоду инкубације, ресазурин плаво-љубичасте боје под утицајем оксидоредуктаза живе ћелије прелази у резоруфин розе флуоросцентне боје [133]. Тако припремљене плоче су инкубиране на 37°C 24 сата за бактерије, на 28°C 48 сати и на 28°C 72 сата за гљиве. MIК је дефинисана као најнижа концентрација испитиваних супстанци на којој није дошло до промене боје ресазурина из плаве у ружичасту. Код гљива MIК представља најнижу концентрацију испитиваних једињења која спречава раст мицелије. Резултати су очитавани визуелно. Минимална микробицидна концентрација је одређена пресејавањем 10 μL узорка из бунарића у којима није уочен раст на плочаст агар. Концентрација на којој после периода инкубације није уочен раст дефинисана је као минимална микробицидна концентрација. Доксицилин и флуконазол су коришћени као позитивна контрола. Такође праћен је и утицај растварача етанола и диметилсулфоксида (10%) на раст микроорганизама. Установљено је експериментално да поменуте концентрације растварача не делују на раст микроорганизама. Експериментални део    77   3.4.2. In vitro антитуморска активност 3.4.2.1. Испитиване ћелијске линије Цитотоксичност комплекса паладијума(II) и платине(IV) је испитивана на ћелијским линијама мишјег тумора дојке (American Type Culture Collection, Manassas, ATCC VA, USA; CRL-2539) и мишјег малигног меланома (American Type Culture Collection CRL-6323, ATCC, USA). Туморске ћелије су култивисане у комплетном DMEM медијуму (Dulbecco`s Modified Eagles Medium) који садржи: 4,5 g/L глукозе, 10% феталног бовиног серума (FBS), 2 mmol/L S-глутамина, 1 mmol/L натријум пирувата, 10 mmol/L HEPЕS-а, 100 U/mL пеницилина, 100 μg/mL стрептомицина и 1 mmol/L мешаних неесенцијалних аминокиселина (Sigma, USA). Ћелије су култивисане у фласковима-Т25(BD Falcon) у стерилним условима у инкубатору са стандардним условима (температура 37°C и процентуални удео угљен-диоксида, CO2, у ваздуху 5%). Једнослојне субконфлуенте ћелијске културе су пасажиране сваког трећег дана. Укратко, ћелије су након прања у PBS (енгл. Phosphate Buffered Saline-Сони фосфатни пуфер, PAA Laboratories GmbH) прикупљене из фласка третирањем трипсином (0,25% трипсин са хелатором 0,02% EDTA који су растворени у PBS) 2 до 5 минута у инкубатору, како би се одлепиле. Ћелије су после одлепљивања покупљене и пребачене у епрувету која садржи 14 mL комплетног медијума, затим су ресуспендоване и пребачене у 3 нова Т25 фласка (по 5 mL у сваки). Експериментални део    78   3.4.2.2. МТТ колориметријски тест Ефекат испитиване супстанце одређује се поређењем интензитета боје који дају ћелије излагане само медијуму и интензитета који дају ћелије излагане испитиваној супстанци. Продуковани формазан се раствара у органским рстварачима и интензитет боје се одређује спектрофотометријски на таласној дужини од 570 nm. Цитотоксичност комплекса је одређивана МТТ тестом [134]. Ћелије у експоненцијалној фази раста прикупљене су из фласка на претходно описани начин. Број ћелија је одређен коришћењем Neubauer-ове коморе уз искључење мртвих ћелија тј. ћелија обојених трипан плавим. Трипан плаво је боја која може да прође само кроз оштећену ћелијску мембрану невијабилних ћелија и боји цитоплазму, док је код вијабилних ћелија ова могућност искључена. Ћелије су разблажене до густине 3 х 104 ћелија/mL. У микротитар плоче са 96 отвора је сипано 100 μL (3.000 ћелија) суспензије по отвору. У посебне отворе је сипан медијум без ћелија како би се одредила оптичка густина самог медијума, бленк. Плоча се преко ноћи инкубирала на температури од 37оС и у присуству 5% CO2. За 24 сата су се ћелије полепиле па је медијум одливен и замењен са 100 μL комплекса раствореног у комплетном медијуму у концентрацијама 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 7,8; 3,9 μmol/L. Тестирана једињења су растварана у диметилсулфоксиду. За свако разблажење рађен је трипликат. У контролне отворе је поново сипан чист медијум. Плоча је инкубирана 72 сата под истим условима. По истеку 72 сата, из свих бунарчића је уклоњена течност и додато је по 100 μL чистог DMEM-а са 15 % МТТ раствора (5 mg/mL у PBS, Phosphate buffer saline- -сони фосфатни пуфер). Плоче су инкубиране још 2 до 4 сата. По истеку инкубације медијум је одливен и у сваки отвор је сипано по 150 μL Експериментални део    79   диметилсулфоксида (Sigma Aldrich, Немачка) и 20 μL глицинског пуфера (рН-10,5). Плоче су вортексоване до растварања кристала формазана и оптичка густина узорака је мерена мултифункционалним читачем микротитар плоча, Zenyth 3100. Проценат мртвих ћелија је израчунат на основу формуле: % цитотоксичности = 100-((Е−Б)/(К−Б) × 100); Е-означава отвор са испитиваним супстанцама; Б-бленк; К-отвор са нетретираним ћелијама. 4. РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА Резултати и дискусија    83   4.1. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -пропанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddp·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II), [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] 4.1.1. Синтезе лиганада и комплекса Тетрадентатни лиганд етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-пропанска киселина (H2-(S,S)-eddp) је добијен у реакцији натријумове соли S-аланина и 1,2-дибром-етана у молском односу 1:1 (Шема 7). Подешавањем pH вредности на 5 добијен је наведени лиганд у облику унутрашње соли (zwitter јона). CH2 CH2 + CH3 CH NH2 C O ONa 2 C O O CH CH3 N H H CH2 CH2 N H H CH Br Br CH3 C O O + 2NaBr pH=5 Шема 7. Синтеза етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине, (H2-(S,S)-eddp), Добијена H2-(S,S)-eddp киселина је естерификована при чему су добијени пропил-, бутил- и пентил- естри етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине (Шема 8). Резултати и дискусија    84   CH2 CH2 NH NH HC CH CH3 CH3 HO C C HO O O + 2ROH HCl CH2 CH2 NH NH CH CH CH3 CH3 RO C C RO O O R = pr-(L1), bu-(L2), pe-(L3) 2HCl Шема 8. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -пропанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddp·2HCl Синтетисани естри нису добро растворни у води и неким органским растварачима. Реакцијом између добијених естара R2-(S,S)-edpp и калијум- -тетрахлоридопаладата(II) у молском односу 1:1 и уз додатак литијум-хидроксида синтетисани су одговарајући квадратно-планарни комплекси [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] (Шема 9). Синтетисани комплекси су растворни у метилхлориду, метиленхлориду, хлороформу, угљентетрахлориду, метанолу и етанолу, али нису растворни у води. Резултати елементалне микроанализе за награђене лиганде и комплексе су у сагласности са израчунатим вредностима (експериментални део 3.1.2. за лиганде и 3.2.1.-3.2.3. за комплексе). Резултати и дискусија    85   CH2 CH2 NH NH CH CH CH3 CH3 RO C C RO O O R = pr-(C1), bu-(C2), pe-(C3) K2PdCl4 + CH2 CH2 N N CH CH CH3 CH3 RO C C RO O O Pd Cl Cl H H LiOH 2HCl Шема 9. Синтеза комплекса [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] 4.1.2. Инфрацрвени спектри O,O′-диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) У Табели 6 дате су најважније траке у инфрацрвеним спектрима изолованих бидентатних лиганада (L1, L2, L3) и одговарајућих паладијум(II) комплекса (C1, C2, C3). Инфрацрвени спектри наведених комплекса потврђују бидентатно координовање R2-(S,S)-eddp лиганада преко два азотова атома за паладијум(II)-јон. Претпоставка да су R2-(S,S)-eddp лиганди координовани преко два азотова атома може се потврдити присуством трака које припадају валенционим вибрацијама секундарне амино групе на 3130 cm-1 за комплекс (C1); Резултати и дискусија    86   3120 cm-1 (C2) и 3118 cm-1 за комплекс (C3). Такође, наведени комплекси [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] немају апсорпциону траку протоноване амино групе која је уочена у спектрима диалкил-естра R2-(S,S)-eddp и то на 3461 cm-1 за лиганд (L1), на 3461 cm-1 за (L2) и на 3462 cm-1 за лиганд (L3). Остале апсорпционе траке нађене су у истим областима у комплексима, али и у полазним лигандима, што нам указује да координација није извршена преко кисеоникових атома карбоксилних група. Табела 6. Важније траке у инфрацрвеним спектрима R2-(S,S)-eddp·2HCl лиганада и одговарајућих паладијум(II) комплекса ν(C=O) ν(C-O) ν(CH3) ν(R-NH2+) ν(R-NH) dpr-(S,S)-eddp·2HCl (L1) 1745 1231 2968 3461 - dbu-(S,S)-eddp·2HCl (L2) 1745 1223 2976 3461 - dpe-(S,S)-eddp·2HCl (L3) 1746 1231 2977 3462 - [PdCl2(dpr-(S,S)-eddp)] (C1) 1735 1215 2971 - 3130 [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)](C2) 1740 1241 2960 - 3120 [PdCl2(dpe-(S,S)-eddp)](C3) 1741 1229 2958 - 3118 4.1.3. Нуклеарно-магнетно-резонанциони (1H и 13C) спектри O,O′-диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) NMR спектроскопски подаци за сва три паладијум(II) комплекса потврђују претпоставку да је координација лиганада за паладијум(II)-јон извршена преко два азотова атома из O,O′-диалкил естра етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине (R2-(S,S)-eddp) (одељак 3.1.2. за лиганде и 3.2.1.-3.2.3. за комплексе). Поређењем хемијских померања за водоникове атоме -CH2- групе из етилендиаминског дела лиганда са хемијским померањем истих Резултати и дискусија    87   водоникових атома у одговарајућем комплексу (у области око 0,9 ppm) потврђује се координовање преко два азотова атома. Такође, хемијска померања водоникових атома са угљеникових атома из R-остатака алкохола налазе се у очекиваним областима [135-137]. Број сигнала у 13C NMR спектрима изолованих комплекса [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] потврђују координовање O,O′-диалкил естра етилендиамин- -N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине (R2-(S,S)-eddp) за паладијума(II)-јон (одељак 3.1.2. за лиганде и 3.2.1.-3.2.3. за комплексе). Координовањем лиганада (R2-(S,S)- eddp) за паладијум(II)-јон оба асиметрична угљеникова атома из eddp остатка задржали су S апсолутну конфигурацију. Истовремено, координовањем азотови атоми из етилендиаминског прстена постају асиметрични. Због тога је могуће очекивати три диастереоизомера комплекса [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] као што је приказано на Слици 16 [(R,R), (R,S≡S,R) и (S,S)]. За (R,R) и (S,S) енантиомере, због присутне C2 симетрије молекула у 13C NMR спектрима, можемо очекивати само један сигнал услед идентичног положаја естарских остатака. Појава по два сета сигнала различитих интензитета у 13C NMR спектрима [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] комплекса указује на присуство (R,S) дијастереоизомера, као што је и публиковано раније [137-139] за паладијум(II) комплексе са истим типом лиганада (Слика 16).   Слика 16. Могући дијастереоизомери комплекса [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)], R = pr-, bu- и pe- Резултати и дискусија    88   4.1.4. Микробиолошка активност O,O′-диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) У Табели 7 приказани су резултати in vitro испитивања антибактеријске и антифунгалне активности за три нова бидентатна лиганда и три комплекса паладијума(II). У истој табели су такође приказане и вредности за MИК и MMK доксицилина и флуконазола због поређења. Растварач 10% етанол није успоравао раст тестираних микроорганизама. Испитивани комплекси паладијума(II) су показивали различите степене антимикробне активности на различите тестиране врсте. Заправо, интензитети антимикробне активности зависе од групе микроорганизама (бактерије или гљиве) као и од концентрације испитиваног комплекса. Експериментално је показано да сва три комплекса показују сличну активност у односу на стандардне и клинички изоловане сојеве бактерија. У односу на позитивну контролу ови комплекси показују умерену антибактеријску активност. Као што се може видети у Табели 7, MИК вредности су у распону од 31,25 до 125 μg/mL, а MMK вредности од 125 до 500 μg/mL у зависности од соја бактерије. Најбољу активност показао је комплекс [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)] (C2) на Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и Escherichia coli и имао вредност MИК 31,25 μg/mL. Пробиотици су показали осетљивост сличну осталим бактеријама осим на комплекс [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)] (C2). Раст Lactobacillus plantarum, Bacillus subtilis IP 5832, Bifidobacterium animalis subsp. lactis је био успорен дејством комплекса [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)] (C2) концентрације 15,6 μg/mL. Треба нагласити да су испитивани комплекси показали значајну антифунгалну активност. Сва три комплекса су успоравала раст Aspergillus flavus при конценрацији од 0,49 μg/mL, док је [PdCl2(dpe-(S,S)-eddp)] (C3) утицао на раст Резултати и дискусија    89   Aspergillus fumigatus и на нижим концентрацијама (МИК = 7,8 μg/mL). МИК вредности за квасце Candida albicans су биле 125 μg/mL за сва три комплекса, док су вредности за ММК биле 250 μg/mL за све комплексе осим за [PdCl2(dbu-(S,S)-eddp)] где је износила 500 μg/mL. Упоређивањем вредности закључено је да је у највећем броју случајева активност сва три лиганда била мања од активности одговарајућих комплекса паладијума (II) (Табела 7). Табела 7. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада R2-(S,S)-eddp·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса (L1) (C1) (L2) (C2) MИК MMK MИK MMK MИK MMK MИK MMK E. coli ATCC 25922 >500 >500 125 250 125 >500 125 125 E. faecalis ATCC 29212 >500 >500 125 250 125 >500 62,5 250 P. aeruginosa ATCC27853 >500 >500 125 250 >500 >500 31,25 125 P.mirabilis >500 >500 62,5 500 >500 >500 125 >500 E. coli 125 >500 62,5 125 31,25 >500 31,25 >250 B. animalis subsp. lactis 125 >500 62,5 125 7,8 >500 15,6 125 L. plantarum 125 >500 62,5 125 15,6 125 15,6 125 B. subtilis IP 5832 125 >500 62,5 125 62,5 >500 15,6 125 S. boulardii >500 >500 125 250 500 >500 125 250 C. albicans >500 >500 125 250 >500 >500 125 500 A. fumingatus >500 >500 31,25 31,25 >500 >500 31,25 31,25 A. flavus >500 >500 0,49 0,49 >500 >500 0,49 0,49 Резултати и дискусија    90   Табела 7. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада R2-(S,S)-eddp·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса (наставак) (L3) (C3) доксицилин флуконазол MИК MMК MИК MMК MИК MMК E. coli ATCC 25922 125 >500 62,5 250 25/25 / E. faecalis ATCC 29212 >500 >500 62,5 250 50/50 / P. aeruginosa ATCC27853 >250 >500 125 125 12,5/50 / P.mirabilis >250 >500 125 125 50/>50 / E. coli >250 >500 125 >500 12,5/12,5 / B. animalis subsp. lactis 0,98 >31,25 125 >500 0,024/>0,19 / L. plantarum 1,95 >62,5 125 >500 0,012/>0,098 / B. subtilis IP 5832 62,5 >500 62,5 >500 0,003/0,024 / S. boulardii 62,5 125 125 125 / 6,25/>50 C. albicans 500 500 125 125 / 3,125/>50 A. fumingatus 62,5 125 7,8 7,8 / >500 A. flavus 62,5 125 0,49 0,49 / >500 MИК-минимална инхибиторна концентрација (μg/mL); ММК- минимална микробицидна концентрација (μg/mL). "/" – није испитивана; Антибиотик-доксицилин; Антимикотик-флуконазол 4.2. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II), [PdCl(R-(S,S)-eddv)] 4.2.1. Синтеза лиганада и комплекса Етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанска киселина, H2-(S,S)-eddv добијена је на начин описан у одељку 4.1. У реакцији натријумове соли S-валина и 1,2-диброметана у молском односу 1:1 и подешавањем pH вредности на 5 добија се етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанска киселина која се издвајала у облику унутрашње соли (zwitter јона) (Шема 10). Резултати и дискусија    91   CH2 CH2 + CH CH NH2 C O ONa 2 C O O CH CH N H H CH2 CH2 N H H CH Br Br CH C O O + CH3 CH3 H3C CH3H3C CH3 2NaBr pH=5 Шема 10. Синтеза етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине, H2-(S,S)-eddv Након сушења добијени производ коришћен је за реакцију естерификације. У закишељен апсолутни алкохол (етанол, 1-пропанол, 1-бутанол, 1-пентанол) додат је тетрадентатни лиганд етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанска киселина. Након рефлуктовања од 12 сати добијен је О,О'-диалкил естар етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрат, R2-(S,S)-eddv·2HCl (Шема 11). Резултати и дискусија    92   CH2 CH2 NH NH HC CH CH CH HO C C HO O O + 2 ROH HCl CH2 CH2 NH NH CH CH CH CH RO C C RO O O R = et-(L4), pr-(L5), bu-(L6), pe-(L7) CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 2HCl   Шема 11. Синтеза О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2- -(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl Добијени естри (L4-L7) су слабо растворни у хлороформу, али се боље растварају у води, метанолу, диметилсулфоксиду и одговарајућим алкохолима који су коришћени у реакцијама естерификације. Одговарајући комплекси паладијума(II) (C4-C7) добијени су директном реакцијом калијум-тетрахлоридопаладата(II) и лиганда у молском односу 1:1, уз додатак воденог раствора литијум-хидроксида који је коришћен због депротовања амино група (Шема 12). Тако добијени комплекси нису растворни у води, али су веома добро растворни у хлороформу и диметилсулфоксиду. Мада смо очекивали бидентатну координацију синтетисаних диестара (S,S)-eddv лиганада као и у случају одговарајућих естара (S,S)-eddp лиганда. Резултати елементалне микроанализе, инфрацрвене и нуклеарно-магнетно-резонанционе спектроскопије (NMR 1H и 13C) сугеришу да је дошло до делимичне хидролизе диестра, а потом до Резултати и дискусија    93   тридентатне координације за паладијум(II)-јон што је и потврђено рендгенском структурном анализом за комплекс [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]. Ова чињеница се може објаснити померањем хемијске равнотеже између реакције естерификација и реакције хидролизе у правцу хидролизе таложењем нерастворних паладијум(II) комплекса. Ово се није десило у случају [PdCl2(R2-(S,S)-eddp)] комплекса јер су наведени комплекси довољно растворни у води. Састав комплекса и лиганада потврђен је елементалном микроанализом чији су резултати у сагласности са израчунатим вредностима за угљеник, водоник и азот (експериментални део 3.1.4 за лиганде и 3.2.4.–3.2.7. за комплексе). NH NH RO CH CH O O 2HCl LiOH R = et-(C4), pr-(C5), bu-(C6), pe-(C7) N N RO CH O Pd O Cl H K2PdCl4 + RO CH O H Шема 12. Синтеза комплекса [PdCl(R-(S,S)-eddv)] Резултати и дискусија    94   4.2.2. Инфрацрвени спектри О,О'-диалкил естара етилендиамин- -N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) У Табели 8 дате су најважније траке у инфрацрвеним спектрима О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II). Табела 8. Најважније траке у инфрацрвеним спектрима R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих комплекса паладијума(II) ν(C=O) ν(C-O) ν(CH3) ν(R-NH2+) ν(R-NH) det-(S,S)-eddv·2HCl (L4) 1733 1228 2977 3415 - dpr-(S,S)-eddv·2HCl (L5) 1734 1202 2973 3437 - dbu-(S,S)-eddv·2HCl (L6) 1737 1215 2967 3428 - dpe-(S,S)-eddv·2HCl (L7) 1736 1230 2964 3439 - [PdCl(et-(S,S)-eddv)] (C4) 1735, 1640 1267 2970 - 3178 [PdCl(pr-(S,S)-eddv)] (C5) 1731, 1652 1267 2970 - 3181 [PdCl(bu-(S,S)-eddv)](C6) 1716, 1640 1267 2966 - 3180 [PdCl(pe-(S,S)-eddv] (C7) 1716, 1642 1267 2969 - 3180 У спектрима лиганада уочене су апсорпционе траке секундарне амино групе R-NH2+ и то на 3415 cm-1 за (L4), 3437 cm-1 за (L5), 3428 cm-1 за (L6), 3439 cm-1 за (L7) (Табела 8), што указује на протоновану форму азотових атома у наведеним естрима. Резултати и дискусија    95   У инфрацрвеним спектрима комплекса паладијума(II) (C4-C7) нађене су апсорпционе траке секундарне амино групе и то на 3178 cm-1, 3181 cm-1, 3180 cm-1 и 3180 cm-1 што указује на координацију преко азотових атома R2-(S,S)-eddv лиганада за паладијум(II)-јон. Такође, постоји једна апсорпциона трака у области око 1730 cm-1 карактеристична за естарску групу. Међутим, у IR спектрима свих комплекса постоје две апсорпционе траке валенционих асиметричних вибрација C=O група, које указују на постојање две различите C=O групе (Табела 8). Трака у области око 1650 cm-1 може се приписати депротонованој, односно деестерификованој карбоксилној групи R2-(S,S)-eddv лиганада, док је трака у области 1700-1750 cm-1 (Табела 8) на готово истим положајима као и код одговарајућег естра. На бази ових резултата може се претпоставити да је дошло до хидролизе једне алкил групе из R2-(S,S)-eddv лиганда (Шема 12). Све остале апсорпционе траке нађене су у очекиваним областима за све лиганде и њихове одговарајуће комплексе. 4.2.3. Нуклеарно-магнетно-резонанциони (1H и 13C) спектри О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)- -бутанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) Положаји сигнала за протоне у NMR спектрима добијених лиганада и комплекса паладијума(II) нађени су у очекиваним областима. Сигнал за протоне -CH2- група из диаминског дела лиганда на око 0,9 ppm потврђују претпостављену координацију лиганда преко азотових донорских атома за паладијум(II)-јон. (експериментални део одељак 3.2.4.-3.2.7.). Хемијска померања за протоне са свих метил група нађена су у области од 0,9-1,21 ppm. N,N координацију лиганада потврђује и померање NH сигнала (4,5 ppm за лиганде и 5,8 ppm за комплексе). Резултати и дискусија    96   Положаји сигнала за угљеникове атоме у 13C NMR спектрима R2-(S,S)-eddv лиганада и одговарајућих паладијум(II) комплекса јављају се у очекиваним облатима. Уочена је појава два сигнала за угљеникове атоме из карбоксилних група на око 170 ppm за све синтетисане комплексе. То потврђује претпоставку изведену на бази IR спектара комплекса да је једна естарска група лиганда хидролизована и да је координација тако добијених лиганада извршена преко кисеониковог атома деестерификоване карбоксилне групе (сигнал на вишој вредности, експериментални део одељак 3.2.4.–3.2.7). 4.2.4. Микробиолошка активност О,О'-диалкил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) У Табели 9 приказани су резултати in vitro антибактеријске и антифунгалне активности за четири нова комплекса паладијума(II) и одговарајућих лиганада. Такође, приказане су вредности МИК и MMК доксицилина и флуконазола ради поређења. Експериментално је потврђено да раствaрач (10% диметилсулфоксид) не успорава раст испитиваних микроорганизама. Интензитет антимикробне активности варира у зависности од врсте микроорганизама, као и од типа и концентрације испитиваног једињења. Углавном, испитивани лиганди (L4-L7), са малим изузецима, показују веома малу антимикробну активност, док паладијум(II) комплекси (C4-C7) показују селективну и умерену активност (Табела 9). Статистички значајна разлика антимикробне активности између лиганада и њихових одговарајућих комплекса је изражена на нивоу MИК вредности (p < 0,05). Није забележена различита активност ниједног од тестираних једнињења у зависности од групе микроорганизама. Резултати и дискусија    97   Добијени резултати показују да координациона једињења показују већу активност од одговарајућих лиганада. Повећана активност комплекса може се разумети само са аспекта хелатне теорије. Према овој теорији опадање поларизабилности металног јона повећава липофилност комплексног једињења, а тиме и антимикробну активност [140]. Сва испитивана једињења показују селективну и умерену антимикробну активност у односу на тестиране стандардне и клиничке сојеве бактерија. У поређењу са позитивном контролом ова једињења су показала нижу антимикробну активност. Занимљиво је истаћи да лиганди (L6), (L7) и комплекси (C6), (C7) показују значајну активност на Echerichia coli (клинички изолат). MИК су у области од 7,813 μg/mL до 31,25 μg/mL. Пробиотске бактерије су показале већу резистентност на дејство испитиваних једињења. МИК вредности су биле у области између 125 μg/mL и 1000 μg/mL, MMК вредности у области између 500 μg/mL и 1000 μg/mL. Највећу осетљивост је показала Lactobacillus plantarum на (C6) и (C7) (MИК је мања од 7,813 μg/mL). Тестирани лиганди и одговарајући паладијум(II) комплекси су показали нижу антифунгалну активност. MИК вредноси су биле од 125 μg/mL до 1000 μg/mL, док су MMК вредности између 500 μg/mL и 1000 μg/mL. Испитивана једињења не показују утицај на раст квасца или је њихова активност веома ниска (MИК/MMК вредности су биле од 1000 μg/mL и веће од 1000 μg/mL). Резултати и дискусија    98   Табела 9. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса (L4) (C4) (L5) (C5) (L6) MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК E. coli ATCC 25922 1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 P. aerugin. ATCC 27853 1000 1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 E. faecalis ATCC 29212 500 500 500 1000 >1000 >1000 500 >1000 1000 >1000 E. coli 500 1000 125 500 125 1000 125 500 15.63 500 P. mirabilis 1000 1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 B. an. subsp. lactis 250 500 125 1000 500 >1000 250 >1000 62.5 1000 L.plantarum 250 >1000 250 >1000 500 >1000 250 >1000 62.5 250 B. subtilis IP 5832 125 500 15.63 >1000 62.5 >1000 7.813 1000 250 >1000 S. boulardii 1000 1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 C.albicans >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 A.niger >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 500 >1000 >1000 >1000 A. niger ATCC 16404 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 A. flavus 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 A.fumigatus 1000 >1000 250 500 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 A. restrictus 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 Табела 9. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада R2-(S,S)-eddv·2HCl и одговарајућих паладијум(II) комплекса (наставак) (C6) (L7) (C7) доксицилин / флуконазол MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК E. coli ATCC 25922 1000 1000 >1000 >1000 500 1000 7.81 15.63 P.aeruginosa ATCC 27853 500 1000 500 >1000 500 1000 62.5 125 E. faecalis ATCC 29212 500 1000 1000 >1000 500 1000 7.81 62.5 E.coli 31.25 500 15.63 125 <7.813 125 7.81 15.63 P. mirabilis 1000 1000 >1000 >1000 500 1000 250 > 250 Bifidobac.an. subsp. lactis 62.5 1000 62.5 500 125 >1000 31.3 62.5 L.plantarum <7.813 125 62.5 250 <7.813 62.5 0.45 7.81 B. subtilis IP 5832 500 1000 1000 >1000 500 <1000 1.95 15.63 S. boulardii 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 31.3 1000 C.albicans 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 62.5 1000 A.niger 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 500 1000 A. niger ATCC 16404 250 500 >1000 >1000 500 1000 62.5 62.5 A. flavus 250 500 >1000 >1000 1000 1000 1000 1000 A.fumigatus 500 500 >1000 >1000 125 500 500 1000 A. restrictus 500 500 500 1000 250 500 500 2000 MИК-минимална инхибиторна концентрација (μg/mL); ММК- минимална микробицидна концентрација (μg/mL). "/" – није испитивана; Антибиотик-доксицилин; Антимикотик-флуконазол Резултати и дискусија    99   4.2.5. Кристална структура хлоридо((S,S)-етилендиамин-N-(O-етил- -2-(3-метил)-бутаноат)-N'-2-(3-метил)-бутаноатопаладијум(II) комплекса, [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] Реакцијом воденог раствора лиганда (еt)2-(S,S)-(eddv)·2HCl и раствора калијум-тетрахлоридопаладата(II) уз додатак литијум-хидроксида у молском односу 1:1:2, као што је приказано на Шеми 13, добијен је комплекс [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] (C4). Као што је већ речено (4.2.2. и 4.2.3.) анализа IR и NMR спектара указала је на делимичну хидролизу естарских група R2-(S,S)-(eddv)·2HCl лиганада и тридентатну координацију насталих полуестара (S,S)-eddv. Ова претпоставка је потврђена рендгенском структурном анализом [PdCl(еt-(S,S)-eddv)], односно, паладијум(II)-јон је наградио квадратно планарни комплекс са полухидролизованим естром координовањем преко кисеониковог атома и два азотова атома, док хлоридо лиганд заузима четврто координационо место (Шема 13). Шема 13. Синтеза комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] Резултати и дискусија    100   Изоловани комплекс кристалише у орторомбичном кристалном систему просторнe групe P212121 (Слика 17). Слика 17. ORTEP слика [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] комплекса У Табели 10 приказане су одговарајуће дужине и углови веза изолованог комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)]. Дужине Pd-N веза (2,028(7) и 2,043(7)Å) незнатно одступају од одговарајућих веза нађених у комплексу [PdCl{(S,S)-(ipr)eddip}] (1,995(5)-2,047(6)Å) [138] и у комплексу паладијума(II) са етилендиамином (2,03-2,09 Å) [19,141]. С друге стране, Pd-N везе су краће него у комплексима паладијума(II) са тетраалкил лигандима edta-типа (2,098(4)-2,106(7) Å) [24, 16-18]. Pd-O веза у изолованом комплексу је (1,990(6) Å) и нешто је краћа од исте везе у комплексу [PdCl{(S,S)-(ipr)eddip}] (2,019(5) Å), али је у очекиваној области за петочлане и шесточлане прстенове који садрже Pd-O везу (1,999(6)- -2,105(3) Å) [142,143]. Такође, веза Pd-Cl у добијеном комплексу (2,308(2) Å) је Резултати и дискусија    101   нешто краћа него у комплексима [PdCl{(S,S)-(iPr)eddip}] (2,325(1) Å), [PdCl2(R4edta)] и [PdCl2(edta)]·xH2O (R = Me, Et; x = 5,6; 2,287(2)-2,298(2) и 2,30(1) Å [17,18,24]. Табела 10. Дужине веза (Å) и углови веза (°) у молекулу [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] (R,R)-2c (R,S)-2c (S,R)-2c (S,S)-2c Pd-N(2) 2,028(7) 2,051 2,054 2,075 2,055 Pd-O(1) 1,990(6) 1,990 1,991 2,011 2,007 Pd-N(1) 2,043(7) 2,079 2,095 2,120 2,099 Pd-Cl(1) 2,308(2) 2,345 2,342 2,345 2,343 C(4)-O(1) 1,30(1) 1,332 1,332 1,349 1,338 C(4)-O(2) 1,21(1) 1,243 1,243 1,259 1,243 C(13)-O(3) 1,18(2) 1,234 1,231 1,274 1,232 C(13)-O(4) 1,345(2) 1,378 1,370 1,464 1,367 C(14)-O(4) 1,49(2) 1,480 1,480 1,488 1,481 C(2)-N(2) 1,486(9) 1,498 1,493 1,522 1,496 C(1)-N(1) 1,51(1) 1,499 1,506 1,529 1,508 N(2)-Pd-N(1) 87,4(3) 87,2 87,6 85,8 84,9 N(2)-Pd-Cl(1) 176,5(2) 177,0 176,0 179,1 175,7 O(1)-Pd-N(1) 169,9(3) 169,9 170,0 165,1 161,0 O(1)-Pd-Cl(1) 93,2(2) 97,4 95,4 98,6 95,9 O(1)-Pd-N(2) 83,3(3) 83,1 82,5 81,2 84,4 N(1)-Pd-Cl(1) 96,1(2) 92,0 94.,5 94,3 93,6 N(2)-C(2)-C(1) 109,2(7) 108,3 108,6 110,8 106,6 N(1)-C(1)-C(2) 108,4(7) 109,8 112,2 107,6 111,9 Pd-N(1)-C(1) 104,8(5) 105,2 104,2 100,3 105,1 Pd-N(1)-C(9) 122(1) 116,7 122,1 118,2 123,8 Pd-N(2)-C(2) 103,1(5) 103,4 104,4 107,0 99,0 Pd-N(2)-C(3) 106,5(5) 107,5 107,6 102,2 108,9 Резултати и дискусија    102   У молекулу добијеног комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] уочене су две интрамолекулске водоничне везе N(1)-H···O(2) дужине 3,002(9) Å, као и интермолекулска водонична веза N(2)-H(2)···Cl(1) дужине 3,263(7) Å. Такође, уочено је и неколико необичних интрамолекулских водоничних веза C-H···A (C(1)···O(3) = 3,07(1) Å, C(6)···O(2) = 2,99(2) Å, C(9)···Cl(1) = 3,36(1) Å, C(14)···O(3) = 2,78(3) Å), као и интермолекулска водонична веза C-H···O (C(2)···O(1) = 3,26(1) Å) [144]. На основу резултата рендгенске структурне анализе може се закључити да су наведене водоничне везе одговорне за начин паковања изолованог комплексног једињења [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] што се може видети на Слици 18. Слика 18. Начин паковања комплекса [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] Резултати и дискусија    103   4.3. Синтеза и карактеризација S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II) 4.3.1. Синтеза лиганада и комплекса S-аликил деривати тиосалицилне киселине добијени су директном реакцијом тиосалицилне киселине и одговарајућих алкил халогенида у базној средини. Као растварач коришћена је смеша етанол-вода (Шема 14). R = бензил-(L8), метил-(L9), етил-(L10), пропил-(L11), бутил-(L12) Шема 14. Синтеза S-алкил деривата тиосалицилне киселине Одговарајући комплекси паладијума(II) [Pd(S-R-thiosal)2] добијени су реакцијом калијум-тетрахлоридопаладата(II) и S-алкил деривата тиосалицилне киселине у молском односу 1:2 уз додатак воденог раствора литијум-хидроксида (Шема 15). Приноси реакција били су преко 50%. Резултати и дискусија    104   R = бензил-(C8), метил-(C9), етил-(C10), пропил-(C11), бутил-(C12) Шема 15. Синтеза комплекса паладијума(II) са S-алкил-дериватима тиосалицилне киселине 4.3.2. Инфрацрвени спектри S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II) Бидентатна координација (S-O) лиганада (L8-L12) за паладијум(II)-јон је очекивана. Недостатак S-H валенционих вибрација у спектрима комплекса (C8-C12) у области 2600-2550 cm-1 [145] (2559 cm-1 за (L8), 2560 cm-1 за (L9), 2562 cm-1 за (L10), 2555 cm-1 за (L11) и 2556 cm-1 за (L12)) указује на чињеницу да се депротонована -SH група координује за паладијум(II)-јон (одељак 3.1.5. за лиганде и 3.2.8.–3.2.12. за комплексе). Асиметричне валенционе вибрације карбоксилних група изолованих лиганада (1674 cm-1 за (L8) и (L9), 1682 cm-1 за (L10), 1678 cm-1 за (L11) и 1674 cm-1 за (L12)) су уочене на нижим вредностима од очекиваних (1700-1750 cm-1) [145,146] што би се могло објаснити присуством велике R-S групе у orto положају. Положаји ових трака у одговарајућим комплексима (C8-C12) налазе се у очекиваној области (1600-1650 cm-1) [111] (1633 Резултати и дискусија    105   и 1616 cm-1 за (C8), 1619 cm-1 за (C9), 1587 cm-1 за (C10), 1589 cm-1 за (C11) и 1633 и 1615 cm-1 за (C12)) што потврђује њихово депротоновање и координовање за метал. Присуство по две апсорпционе траке за COO- групе у инфрацрвеним спектрима комплекса (C8) и (C12) указује на мале разлике у енергијама, које су последица присутних великих алкил група (бензил- и бутил-) и њихов стерни утицај на фенил групе из тиосалицилне киселине. 4.3.3. Нуклеарно-магнетно-резонанциони (1H и 13C) спектри S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II) Хемијска померања водоникових и угљеникових атома добијених S-алкил деривата тиосалицилне киселине, као и одговарајућих комплекса паладијума(II), нађена су на очекиваним и скоро истим хемијским померањима. Уочене су само незнатне разлике у хемијским померањима угљеникових атома карбоксилних група S-аликил деривата тиосалицилне киселине (за S-бензил 167,5; за S-метил 171,6; S-етил 171,4; S-пропил 171,6; S-бутил 171,4 ppm) и одговарајућих комплекса паладијума(II) (171,5; 171,8; 172,0; 172,5; 171,9 ppm). Овакве разлике у хемијским померањима карбоксилне групе могу се објаснити координовањем лиганада преко кисеониковог атома из карбоксилне група за паладијум(II)-јон (одељак 3.1.5. за лиганде и 3.2.8.-3.2.12. за комплексе). На основу инфрацрвених и нуклеарно-магнетно резонанционих спектара добијених алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II) може се закључити да је дошло до бидентатног координовања S-алкил деривата за метални јон. На овај начин није се могла предвидети геометрија награђених паладијум(II) комплекса. Резултати и дискусија    106   4.3.4. Кристална структура bis-(S-бензил- -тиосалицилато)паладијум(II) комплекса, [Pd(S-bz-thiosal)2] Рендгенска структурна анализа комплекса [Pd(S-bz-thiosal)2] (C8), потврђује квадратно-планарну геометрију комплекса као што је приказано на Слици 19. Слика 19. Структура комплекса [Pd(S-bz-thiosal)2] Као што се са Слике 19 може видети два молекула S-бензил дериватa тиосалицилне киселине координована су бидентатно за паладијум(II) јон преко сумпора и кисеоника као донорских атома. Рендгенска структурна анализа указује да они поседују cis-S-cis-O геометрију [147]. Одабране дужине и углови веза у [Pd(S-bz-thiosal)2] комплексу дати су у Табели 11. Резултати и дискусија    107   Табела 11. Дужине веза (Å) и углови веза (°) у молекулу [Pd(S-bz-thiosal)2] дужине веза углови веза Pd(1)-O(2) 2,024(4) O(2)-Pd(1)-O(4) 88,4(2) Pd(1)-O(4) 2,034(4) O(2)-Pd(1)-S(1) 89,84(14) Pd(1)-S(1) 2,246(2) O(4)-Pd(1)-S(1) 172,52(15) Pd(1)-S(2) 2,254(2) O(2)-Pd(1)-S(2) 172,77(14) S(1)-C(3) 1,778(7) O(4)-Pd(1)-S(2) 89,70(14) S(1)-C(8) 1,829(7) S(1)-Pd(1)-S(2) 92,94(7) S(2)-C(17) 1,787(7) C(3)-S(1)-C(8) 105,9(3) S(2)-C(22) 1,830(7) C(3)-S(1)-Pd(1) 100,0(2) O(2)-C(1) 1,278(8) C(8)-S(1)-Pd(1) 104,4(2) O(4)-C(15) 1,279(8) C(17)-S(2)-C(22) 105,9(3) O(1)-C(1) 1,229(8) C(17)-S(2)-Pd(1) 99,1(2) O(3)-C(15) 1,235(8) C(22)-S(2)-Pd(1) 105,7(2) C(16)-C(15) 1,516(10) C(1)-O(2)-Pd(1) 128,5(4) C(2)-C(1) 1,518(9) C(15)-O(4)-Pd(1) 127,5(5) C(22)-C(23) 1,493(9) C(9)-C(8) 1,506(10) У Табели 12 дате су дужине и углови водоничних веза које стабилизују систем и утичу на начин паковања комплексних јединица у кристалу. Табела 12. Дужине (Å), углови (°) као и диедарски углови интермолекулских и интрамолекулских водоничних веза у молекулу [Pd(S-bz-thiosal)2] H···A (Å) D···A(Å) (°) (°) C(6)-H(6)···O(4)a 3,318(9) 125 Pd(1)-S(2)-C(22)-C(23) -69,1(5) C(11)-H(11)···O(2)b 3,414(9) 155 Pd(1)-S(1)-C(8)-C(9) -52,0(5) C(14)-H(14)···O(3)c 3,293(9) 156 Pd(1)-S(1)-C(3)-C(2) -42,3(6) C(20)-H(20)···O(1)b 3,305(9) 127 Pd(1)-S(2)-C(17)-C(16) -40,5(6) C(22)-H(22b)···O(3)d 3,380(9) 134 C(3)-C(2)-C(1)-O(2) 29,2(11) C(24)-H(24)···O(3)d 3,471(9) 144 C(17)-C(16)-C(15)-O(4) 34,2(10) C(25)-H(25)···O(1)e 3,388(9) 168 C(27)-H(27)···O(1)a 3,223(10) 127 C(4)-H(4)···πd,g 2,71 3,653(10) 174 C(18)-H(18)··· πd,g 2,71 3,617(10) 159 C(22)-H(22a)··· πf,h 2,87 3,778(10) 153 π····πd,h 3,308(10) Симетријске операције за положаје одговарајућих атома: а –x, -y+1, -z. b –x+1, -y+1, -z. c x, y,z+1. d x,-y+1/2, z+1/2. e –x,y-1/2, -z+1/2. f x,-y+1/2,z-1/2. g растојање најближих C атома h растојање од C до најближег C атома Резултати и дискусија    108   Шесточлани прстенови укључујући паладијум(II)-јон заузимају полустоличасту конформацију. Такође, бензил и фенил групе нису паралелно оријентисане што условљава да молекул у целини није симетричан. Просторна оријентација бензил група није идентична, што се може закључити и на основу вредности диедарских углова, Pd(1)-S(1)-C(8)-C(9) и Pd(1)-S(2)-C(22)-C(23) ( -52.0(5) и -69,1(5)) Табели 12. Као што се може видети из Табеле 12 уочене су слабе C-H···O интеракције и три C-H···π интеракције (Слика 20). Слика 20. Два молекула комплекса са интермолекулским интеракцијама 4.3.5. Микробиолошка активност S-алкил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих комплекса паладијума(II) Резултати in vitro испитивања антимикробне активности за пет нових бидентатних лиганада (L8-L12) и одговарајућих паладијум(II) комплекса (C8-C12) Резултати и дискусија    109   приказани су у Табели 13. За извођење експеримената коришћен је растварач 10% диметилсулфоксид за који је најпре утврђено да не успорава раст испитиваних микроорганизама. Интензитет антимикробне активности варира у зависности од врсте микроорганизма и типа испитиваног једињења. Активност комплексних једињења била је знатно виша у односу на одговарајуће лиганде (p < 0,05). MИК и MMК вредности за лиганде су биле у области од 15,68 до 1000 μg/mL, а за комплексе од 7,8 до 1000 μg/mL. Најбољу активност су показали (L10) и (L11) од лиганада и (C10) и (C11) од комплекса (p < 0,05). Паладијум(II) комплекси су показали значајну антифунгалну активност. Најосетљивије врсте су биле Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus и Aspergillus restrictus. Активност комплекса је била боља од позитивне контроле флуконазола (p < 0,5). Концентрација паладијумових комплекса која успорава раст гљива из рода Aspergillus је од 7,8 до 500 μg/mL. Стандардни и клинички сој Aspergillus niger не показује уобичајену осетљивост, као што је претпостављено, а MИК вредности су биле од 250 до 1000 μg/mL (Табела 13). Испитивана једињења нису показала утицај на раст квасца или је њихова активност била веома ниска. MИК и MMК вредности за квасце су биле од 500 до 1000 μg/mL, осим за комплексе (C10) и (C11) испитиване на Rhodotorula sp. где је MИК била од 250 до 1000 μg/mL. Сва испитивана једињења су показала слабу антибактеријску активност. Грам-позитивне бактерије су показале значајнију осетљивост у односу на Грам- негативне бактерије и то на испитиване комплексе. Највећу осетљивост показала је Staphylococcus aureus са врдностима MИК 125 μg/mL за комплекс (C12). MИК вредности Грам-негативних бактерија биле су од 500 до 1000 μg/mL. Тестирани комплекси (C9) и (C10) су показали значајно већу антибактеријску активност на Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (MИК = 250 μg/mL). Резултати и дискусија    110   Пробиотици су показали сличну осетљивост. MИК вредности су биле од 250 до 1000 μg/mL, док су MMК вредности биле од 500 до 1000 μg/mL. Табела 13. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада S-аликил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих паладијума(II) комплекса (L8) (C8) (L9) (C9) (L10) MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК B. anim. subsp. lactis 500 500 500 1000 500 500 1000 1000 1000 1000 B. subtilis IP5832 500 500 500 500 500 500 500 500 1000 >1000 L. plantarum 500 1000 250 500 500 500 500 500 500 >1000 L. rhamnosus >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 1000 1000 1000 S. lutea 500 1000 250 500 1000 1000 500 500 500 >1000 E. faecalis 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 E. faecalis ATCC29212 1000 1000 500 500 1000 1000 500 1000 500 1000 B. subtilis 500 500 250 500 125 500 500 500 1000 >1000 B. subtilis ATCC6633 500 500 250 500 1000 1000 500 500 >1000 >1000 S. aureus 250 500 250 500 500 >1000 500 500 1000 >1000 S. aureus ATCC 25923 500 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 E. coli >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 E. coli ATCC25922 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 P. aaeruginosa 1000 >1000 1000 1000 500 >1000 500 1000 1000 >1000 P. aeruginosa ATCC 27853 500 >1000 500 1000 500 >1000 250 500 500 >1000 P. mirabilis 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 S. enterica 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 S. Typhimurium 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 1000 1000 1000 C. albicans >1000 >1000 500 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Rhodotorula sp. >1000 >1000 500 1000 500 1000 500 1000 500 1000 S. boulardii 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 1000 1000 1000 1000 A. niger >1000 >1000 500 1000 500 500 500 1000 500 1000 A. niger ATCC16404 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 A. restrictus 500 >1000 125 250 500 1000 500 1000 500 1000 A. fumigatus 62,5 62,5 62,5 62,5 62,5 250 <7,8 16,68 15,68 15,68 A. flavus 31,25 250 <7,8 <7,8 1000 1000 15,7 15,68 125 125 Резултати и дискусија    111   Табела 13. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности бидентатних лиганада S-аликил деривата тиосалицилне киселине и одговарајућих паладијума(II) комплекса (наставак) (C10) (L11) (C11) (L12) (C12) доксицилин /флуконазол MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК MMК B. anim. subsp. lactis 500 500 500 1000 250 500 1000 1000 500 1000 31,25 62,5 B. subtilis IP5832 250 500 500 500 250 250 1000 >1000 250 500 1,953 15,63 L. plantarum 250 500 250 >1000 250 500 1000 >1000 500 500 0,448 7,81 L. rhamnosus 500 500 1000 >1000 500 >1000 >1000 >1000 1000 1000 7,81 31,25 S. lutea 250 250 500 >1000 250 250 1000 >1000 250 500 <0,448 3,75 E. faecalis 500 500 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 1000 1000 7,81 62,5 E. faecalis ATCC29212 250 500 500 1000 250 500 1000 1000 500 1000 7,81 62,5 B. subtilis 250 250 500 1000 250 250 1000 >1000 250 500 0,112 1,953 B. subtilis ATCC6633 250 250 1000 >1000 250 250 1000 >1000 250 500 1,953 31,25 S. aureus 250 250 250 1000 250 250 1000 >1000 125 500 0,448 7,81 S. aureus ATCC 25923 500 500 500 1000 500 500 >1000 >1000 500 500 0,224 3,75 E.coli 500 500 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 1000 1000 7,81 15,63 E.coli ATCC25922 500 500 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 1000 1000 15,625 31,25 P. aeruginosa 500 500 500 >1000 500 1000 1000 >1000 1000 1000 250 >250 P. aeruginosa ATCC 27853 250 500 500 >1000 500 1000 500 >1000 500 1000 62,5 125 P. mirabilis 500 500 1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 250 >250 S. enterica 500 500 1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 15,625 31,25 S. Typhimurium 500 500 1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 15,625 125 C. albicans 500 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 62,5 1000 Rhodotorula sp. 250 500 1000 1000 250 500 500 1000 500 1000 62,5 1000 S. boulardii 500 1000 1000 1000 500 1000 500 1000 500 1000 31,25 1000 A. niger 500 1000 500 1000 250 500 1000 >1000 250 500 500 1000 A. niger ATCC16404 500 1000 500 1000 500 500 1000 1000 500 1000 62,5 62,5 A. restrictus 125 250 500 1000 31,3 125 250 250 31,3 250 500 2000 A. fumigatus <7,8 <7,8 15,68 125 <7,8 <7,8 62,5 62,5 31,3 31,25 500 1000 A. flavus 62,5 500 125 500 62,5 62,5 125 1000 125 250 1000 1000 MИК-минимална инхибиторна концентрација (μg/mL); ММК- минимална микробицидна концентрација (μg/mL). Антибиотик-доксицилин; Антимикотик-флуконазол Резултати и дискусија    112   4.4. Паладијум(II) и платина(IV) комплекси са meso-1,2- -дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанском киселином 4.4.1. Синтеза лиганда и комплекса Тетрадентни лиганд edda типа, meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3- -пропанска киселина (L13) добијен је директном реакцијом између meso-1,2- -дифенил-етилендиамина и 3-хлор-пропанске киселине у молском односу 1:2 као што се може видети на Шеми 16. Шема 16. Синтеза лиганда H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Резултати и дискусија    113   Код комплекса платине(IV) са тетрадентатним лигандима edda типа и два монодентатна лиганда могућа су три геометријска изомера: s-cis, uns-cis и trans (Слика 21). X X X s-cis uns-cis trans N N X X O O N N O X O N N O O Слика 21. Теоријски могући геометријски изомери октаедарских комплекса са тетрадентатним лигандима edda типа и два монодентатна лиганда Наведени лиганд meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанска киселина употребљен је и за синтезу одговарајућег паладијум(II) комплекса, као што је приказано на Шеми 17 и то директном реакцијом калијум- -тетрахлоридопаладата(II) и meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанске киселине у молском односу 1:1 у присуству воденог раствора литијум-хидроксида. Синтетисан је квадратно-планарни cis-дихлоридо-(meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N′-ди-пропаноато)паладијум(II) комплекс (C13) (Шема 17). NH NH Pd Cl Cl OH OH O O HN N H O OHO HO K2PdCl4 LiOH Шема 17. Синтеза комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] Резултати и дискусија    114   У овом раду s-cis-дихлоридо-(meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3- -пропаноато)платина(IV) комплекс (C14) добијен је директном реакцијом калијум- -хексахлоридоплатината(IV) и meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3- -пропанске киселине у молском односу 1:1 уз додатак воденог раствора литијум- хидроксида. Наведена реакција може се приказати следећом реакционом Шемом 18. HN N H O OHO HO K2PtCl6 LiOH NH NH Pt O O O O Cl Cl Шема 18. Синтеза комплекса s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] Добијени комплекси паладијума(II) и платине(IV) показали су врло слабу растворљивост у води и у већини органских растварача. 4.4.2. Инфрацрвени спектри meso-1,2- -дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанске киселине и одговарајућих комплекса палaдијума(II) и платине(IV) Као што је описано у ранијим радовима где је централни метални јон везан за аминокиселину [148,149] асиметричне валенционе вибрације карбоксилних Резултати и дискусија    115   група петочланих прстенова [148] леже на вишим енергијама од одговарајућих фреквенција шесточланих хелатних прстенова [149]. Касније су Нил и Рос (Neal и Rose) [150] и Даглас и сарадници [151,152], који су синтетисали комплекс са хексадентатним лигандима и смешом петочланих и шесточланих прстенова као што су trans-(O5)-[M(S,S)-edds)]- (M = Co(III) или Cr(III); (S,S)-edds = (S,S)- -етилендиамин-N,N′-дићилибарна киселина) [150-152], показали да постоје две веома јаке и добро раздвојене траке у области асиметричних валенционих вибрација карбоксилних група. Ове траке COO група припадају карбонилним валенционим вибрацијама у оквиру петочланог прстена на вишим енергијама, док су за шесточлани прстен на нижим енергијама. Изоловани комплекси платине(IV) и паладијума(II) показују асиметричне валенционе вибрације C=O групе у области (1618 cm-1 и 1610 cm-1 за комплекс платине(IV) и на 1643 cm-1 и 1580 cm-1 у комплексу паладијума(II) као што је приказано у Табели 14). Поменути дублети леже на нешто нижим енергијама од одговарајућих трака петочланих хелатних прстенова [149,151]. Одсуство апсорпционе траке између 1700-1750 cm-1 указује на то да је координовање H2-1,2-dpheddp лиганда извршено преко обе карбоксилне групе за платина(IV)-јон. Добијени лиганд, meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанска киселина у инфарцрвеном спектру показује апсорпционе траке асиметричних валенционих вибрација C=O групе у области између 1700-1750 cm-1 (1754 cm-1 и 1732 cm-1, Табела 14). Две вредности апсорпционих трака указују на мале разлике у енергијама присутних карбоксилних група. Резултати и дискусија    116   Табела 14. Најважније апсорпционе траке у инфрацрвеним спектрима неких комплексних једињења са линеарним O-N-N-O лигандима једињење νas(COOH) νas(COO-) референца trans-[PtCl2(H2-edta)] 1775; 1764 1691; 1678 [153] uns-cis-[PtCl2(H2-edta)] 1758; 1742 1692; 1685 [153] cis-[PtCl2(H2-edta)] 1753; 1741 1725; 1716 [153] trans-[PtCl2(eddp)]·H2O - 1637; 1630 [154] trans-[PtCl2(1,3-pdda)]·H2O - 1696; 1660 [155] trans-[PtBr2(pdda)]·H2O - 1684; 1648 [156] s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] - 1618; 1610 овај рад H2-1,2-dpheddp 1754; 1732 - овај рад cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] - 1643; 1580 овај рад 4.4.3. Кристална структура meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′- -ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Резултати рендгенске структурне анализе потврђују да је изоловано једињење meso-1,2-дифенил-етилендиами-N,N′-ди-3-пропанска киселина кристалисало у претпостављеној meso оријентацији фенил група као дихлорхидрат монохидрат. Као што се може видети на Слици 22, кристална јединица се састоји од два независна молекула са делимично различитим конформацијама. Резултати и дискусија    117   Слика 22. Кристална структура молекула meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Неке дужине и углови веза у лиганду H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O дати су у Табели 15. Резултати и дискусија    118   Табела 15. Дужине веза (Å) и углови веза (°) у H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O дужине веза углови веза O(1)-C(1) 1,207(12) O(1)-C(1)-C(2) 122.8(9) O(2a)-C(1) 1,307(17) O(2а)-C(1)-O(1) 125(3) O(2b)-C(1) 1,306(17) O(2а)-C(1)-C(2) 112(2) O(3)-C(11) 1,234(8) O(2b)-C(1)-O(1) 118(2) O(4)-C(11) 1,270(8) O(2b)-C(1)-C(2) 119(3) N(1)-C(4) 1,498(8) O(3)-C(11)-C(12) 120,0(6) N(1)-C(3) 1,472(9) O(3)-C(11)-O(4) 124,2(6) N(2)-C(13) 1,494(11) O(4)-C(11)-C(12) 115,8(6) N(2)-C(14) 1,507(9) N(1)-C(3)-C(2) 110,6(6) C(1)-C(2) 1,482(12) N(1)-C(4)-C(5) 110,5(5) C(2)-C(3) 1,506(11) N(2)-C(14)-C(15) 112,3(6) C(4)-C(5) 1,499(10) N(2)-C(13)-C(12) 114,6(6) C(5)-C(6) 1,368(10) C(4)-N(1)-C(3) 115,2(5) C(5)-C(10) 1,397(10) C(14)-N(2)-C(13) 110,0(6) C(6)-C(7) 1,391(11) C(1)-C(2)-C(3) 114,4(7) C(8)-C(7) 1,372(13) C(4)-C(5)-C(6) 121,6(6) C(8)-C(9) 1,332(13) C(4)-C(5)-C(10) 119,3(6) C(9)-C(10) 1,401(12) C(5)-C(6)-C(7) 120,2(7) C(11)-C(12) 1,498(10) C(5)-C(10)-C(9) 119,7(8) C(12)-C(13) 1,510(10) C(6)-C(7)-C(8) 119,7(8) C(14)-C(15) 1,510(11) C(8)-C(8)-C(9) 121,4(8) C(15)-C(16) 1,380(11) C(8)-C(9)-C(10) 120,0(8) C(15)-C(20) 1,396(11) C(6)-C(5)-C(10) 119,1(7) C(16)-C(17) 1,377(12) C(11)-C(12)-C(13) 114,6(6) C(17)-C(18) 1,368(14) C(14)-C(15)-C(16) 118,3(7) C(18)-C(19) 1,377(15) C(14)-C(15)-C(20) 119,0(7) C(19)-C(20) 1,352(12) C(15)-C(20)-C(19) 120,3(8) C(15)-C(16)-C(17) 119,7(8) C(16)-C(17)-C(18) 120,9(9) C(16)-C(15)-C(20) 119,0(7) C(17)-C(18)-C(19) 119,2(8) C(18)-C(19)-C(20) 120,9(9) Резултати и дискусија    119   У Табели 16 дате су дужине и углови водоничних веза које су одговорне за конформације молекула и начин паковања молекула. Табела 16. Дужине (Å) и углови (°) водоничних веза у молекулу H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O D-H···A (Å) D-H H···A D···A D-H···A N(2)-H(2b)···O(3)i 0,90 2,16 2,750(8) 122 N(1)-H(1a)···O(3)i 0,90 2,00 2,786(8) 145 C(2)-H(22a)···O(3)i 0,97 2,52 3,176(10) 125 N(1)-H(1a)···O(4)ii 0,90 2,56 3,111(9) 120 C(13)-H(13b)···O(1)iii 0,97 2,46 3,076(11) 121 C(13)-H(13a)···O(5)i 0,97 2,45 3,415(16) 174 O(2a)-H(2c)···O(5)iv 0,82 2,06 2,72(3) 137 O(2b)-H(2d)···C1(2)i 0,82 2,24 3,05(5) 168 N(1)-H(1b)···C1(2)i 0,90 2,20 3,089(7) 169 N(2)-H(2a)···C1(2)i 0,90 2,33 3,137(8) 148 C(20)-H(20)···Cl(1)i 0,93 2,73 3,651(10) 169 C(2)-H(22a)···Cl(2)i 0,97 2,75 3,324(9) 118 Симетричне операције за положаје одговарајућих атома: (i) x, y, z; (ii) -x+1, -y+2, -z+2; (iii) x, +y+1, +z; (iv) x, +y-1, +z. На Слици 23 приказан је начин паковања H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O.     Слика 23. Начин паковања молекула H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O Резултати и дискусија    120   4.4.4. Микробиолошка активност meso-1,2-дифенил-етилендиамин- -N,N′-ди-3-пропанске киселине дихлорхидрата монохидрата и одговарајућих комплекса паладијума(II) и платине(IV) Резултати in vitro испитивања антибактеријског и антифунгалног дејства лиганда H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O и одговарајућих комплекса паладијума(II) и платине(IV) као и MИК и MMК вредности доксицилина и флуконазола ради поређења приказани су у Табели 17. Као и у претходним резултатима и у овом сличају интензитет активности испитиваних једињења је зависио од врсте микроорганизама, и од типа испитиваног једињења. Углавном је активност комплекса била виша у односу на лиганд, а посебно је примећена висока активност паладијум(II) комплекса. Такође, комплекси платине(IV) и паладијума(II) показују знатно већи утицај на успоравање раста бактерија него раста гљива. Паладијум(II) комплекс показује знатно вишу антибактеријску активност (Табела 16) што се може видети на основу вредности MИК, која је била у опсегу од 15,63 до 500 μg/mL, док је MMК вредност била од 125 до 1000 μg/mL у зависности од врсте испитиване бактерије. Грам-позитивне бактерије су показале знатно већу осетљивост од Грам-негативних бактерија са вредностима MИК у опсегу од 31,25 до 62,5 μg/mL. Занимљиво је да испитивани комплекси поседују велику антибактеријску активност на Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (MИК = 15,63 μg/mL). Комплекс паладијума(II) показује веома слабу антифунгалну активност осим на Aspergillus niger (MИК = 31,25 μg/mL). Тестирани лиганд H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O и одговарајући комплекси паладијума(II) и платине(IV) су показали слабу антимикробну активност. MИК вредности су биле у опсегу од 125 до 1000 μg/mL, док су вредности MMК биле у опсегу од 500 до 1000 μg/mL. Коришћене концентрације испитиваних једињења нису показале утицај на раст клиничких изолата: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Candida albicans и Aspergillus flavus. Резултати и дискусија    121   Табела 17. Резултати антибактеријске и антифунгалне активности испитиваног лиганда H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O и одговарајућих комплекса паладијума(II) и платине(IV) (L13) паладијум(II) комплекс платина(IV) комплекс доксицилин флуконазол MИК MMК MИК MMК MИК MMК MИК/MMК MИК/MMК E. coli ATCC 25922 >1000 >1000 500 1000 500 1000 7,81/15,625 / P.aeruginosa ATCC 27853 250 >1000 15.63 500 125 500 62,5/125 / S. aureus ATCC 25923 500 >1000 31.25 500 250 500 0,224/3,75 / Sarcina lutea ATCC 9341 500 >1000 62.5 500 125 500 < 0,448/7,81 / B. subtilis ATCC 6633 500 >1000 62.5 500 250 500 1,953/31,25 / Enter. faecalis ATCC 29212 500 >1000 31.25 500 250 500 7,81/62,5 / B. pumilus NCTC 8241 >1000 >1000 62.5 500 250 500 0,112/7,81 / E. coli >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 7,81/15,625 / P. aeruginosa 500 >1000 500 1000 500 1000 250/>250 / S. aureus >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 0,448/7,81 / Sarcina lutea 500 >1000 62.5 500 250 500 < 0,448/3,75 / B. subtilis 500 >1000 31.25 500 250 >1000 0,112/1,953 / E. faecalis >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 7,81/62,5 / Proteus mirabilis >1000 >1000 500 500 >1000 >1000 250/>250 / S. enterica >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 15,625/31,25 / B. animalis subsp. lactis >1000 >1000 31.25 125 250 500 31,25/62,5 / L. plantarum 500 >1000 125 500 250 500 0,448/7,81 / B. subtilis IP 5832 500 >1000 250 500 250 500 1,953/15,625 / S. boulardii >1000 >1000 >1000 >1000 1000 1000 / 31,25/1000 C. albicans >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 / 62,5/1000 R. sp. 1000 1000 500 1000 1000 1000 / 62,5/1000 A. niger 125 >1000 31.25 1000 125 >1000 / 500/1000 A. restrictus 250 250 500 500 1000 1000 / 500/2000 A. fumigatus 1000 1000 1000 1000 500 1000 / 500/1000 A. flavus >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 / 1000/1000 MИК-минимална инхибиторна концентрација (μg/mL); ММК- минимална микробицидна концентрација (μg/mL). Антибиотик-доксицилин; Антимикотик-флуконазол Резултати и дискусија    122   4.4.5. In vitro антитуморска активност комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] In vitro антитуморска активност комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] испитивана је на ћелијским линијама мишијег тумора дојке (4T1) и мишијег малигног меланома (B16F1). Цитотоксичност комплекса је одређиван MTT тестом. На Слици 24 приказана је антитуморска активност комплекса у поређењу са цисплатином. Као што се може са слике видети комплекс паладијума(II) показује вишу антитуморску активност на обе ћелијске линије у односу на активност комплекса платине(IV). Међутим, у поређењу са антитуморском активношћу цисплатине оба испитивана једињења показују нижу активност, осим комплекса паладијума(II) при концентрацијама вишим од 62,5 μΜ и то на ћелијама B16F1. А) 0 20 40 60 80 100 120 0 3.9 7.8 15.625 31.25 62.5 125 250 cy to to xi ci ty [ % ] c [µM] 4T1 Pt Pd cisplatin Б)  0 20 40 60 80 100 120 0 3.9 7.8 15.625 31.25 62.5 125 250 500 cy to to xi ci ty % c [μM] B16F1 Pt Pd cisplatin Слика 24. In vitro антитуморска активност комплекса cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)]. А) 4T1, Б) B16F1 ћелијске линије су инкубиране 72 сата са различитим концентрацијама комплекса. Резултати и дискусија    123   Стандардне девијације IC50 вредности испитиваних једињења за B16F1 ћелијск у линију износе за комплекс cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] 157,51 ± 14,09; за s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] 223,38 ± 25,12 и за цисплатину 186,63 ± 55,3 (Слика 25). Комплекс паладијума(II) показује значајно вишу активност на ћелијама 4T1 (IC50= 17,34 ± 2,25) у поређењу са комплексом платине(IV) (IC50= 144,69 ± 55,3). 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 Pt Pd cisplatin IC 50 [μ M ] 4T1    0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 Pt Pd cisplatin IC 50 [μ M ] B16F1 Слика 25. IC50 вредности cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] и s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)]   5. ЗАКЉУЧАК Закључак    127   У овој Докторској дисертацији описане су синтезе: • Етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине, (H2-(S,S)-eddp), • О,О′-диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине дихлорхидрата, (R2-(S,S)-eddp·2HCl), (R = пропил-, бутил-, пентил-) • Одговарајућих паладијум(II) комплекса са наведеним О,О′-диалкил естрима (H2-(S,S)-eddp) киселине • Етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине, (H2-(S,S)-eddv) • О,О′-диалкил естара етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине дихлорхидрата, (R2-(S,S)-eddv·2HCl) (R = етил-, пропил-, бутил-, пентил-) • Одговарајућих паладијум(II) комплекса са наведеним О,О′-диалкил естрима H2-(S,S)-eddv киселине • S-алкил деривата тиосалицилне киселине (алкил = бензил-, метил-, етил-, пропил-, бутил-) • Одговарајућих паладијум(II) комплекса са наведеним S-алкил дериватима тиосалицилне киселине • meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанске киселине • Одговарајућих паладијум(II) и платина(IV) комплекса са наведеним тетрадентатним лигандом meso-1,2-дифенил-етилендиамин-N,N′-ди-3- -пропанском киселином Награђени лиганди и комплекси окарактерисани су елементалном микроанализом, инфрацрвеном и нуклеарно-магнетно-резонанционом спектроскопијом. Рендгенском структурном анализом су потврђене претпостављене структуре. Резултати елементалних микроанализа су у сагласности са претпостављеним саставом лиганада и комплекса. Закључак    128   Анализом IR спектара утврђено је да се О,О′-диалкил естри етилендиамин- -N,N′-ди-(S,S)-2-пропанске киселине (R2-(S,S)-eddp) координују за паладијум(II)-јон бидентатно преко два азотова атома из диаминског ланца лиганада, док се О,О′- -диалкил естри етилендиамин-N,N′-ди-(S,S)-2-(3-метил)-бутанске киселине R2-(S,S)-eddv координују тридентатно, преко азотових атома диаминског ланца и преко једног кисеониковог атома из хидролизовале естарске групе. Координација бидентатних лиганада S-алкил деривата тиосалицилне киселине извршена је преко донорских атома сумпора из тиолне групе и преко атома кисеоника из карбоксилатног дела. • Број, положај и изглед сигнала у 1H и 13C NMR спектрима потврђују структуру полазних лиганада и добијених одговарајућих паладијум(II) комплекса. • Рендгенске структурне анализе потврђују да је лиганд meso-1,2-дифенил- -етилендиамин-N,N′-ди-3-пропанска киселина кристалисао као дихлорхидрат монохидрат, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O. Такође, рендгенска структурна анализа [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] комплекса је потврдила претпостављену структуру на бази анализе инфрацрвених и NMR спектара, односно да је комплекс [PdCl(еt-(S,S)-eddv)] награђен тридентатним координовањем О,О'-диетил естара етилендиамин-N,N'-ди-(S,S)-2-(3-метил)- -бутанске киселине. Исто тако рендгенска структурна анализа комплекса [Pd(S-bz-thiosal)2] је потврдила бидентатно координовање S-бензил- -тиосалицилне киселине преко атома сумпора и атома кисеоника. • Испитивањем антимикробне активности свих награђених лиганада и одговарајућих комплекса паладијума(II) уврђено је да су комплекси показивали знатно вишу активност у односу на одговарајуће лиганде. • Испитивањем антитуморске активности комплекса паладијума(II) и платине(IV) са тетрадентатним лигандом meso-1,2-дифенил-етилендиамин- Закључак    129   -N,N′-ди-3-пропанском киселином на ћелијама 4T1 и B16F1 закључено је да комплекс паладијума(II) показује вишу антитуморску активност у поређењу са комплексом платине(IV) на обе ћелијске линије. Међутим, такође потврђено је да је антитуморска активност на наведеним ћелијским линијама тумора знатно нижа у односу на антитуморску активност цисплатине. Резултати ове Докторске дисертације су верификовани објављивањем резултата испитивања у три научна рада у часописима са SCI листе, једне монографске студије/поглавље у књизи, три научна рада послатих на рецензију и већег броја саопштења на домаћим и међународним конференцијама.    6. ЛИТЕРАТУРА Литература    133   [1а] T. J. Sabo, S. R.Grgurić-Šipka, S. R. Trifunović, Synth. React. Inorg. Met.-org. Chem. 32 (2002) 1661 [1b] D. Ј. Radanović, Coord. Chem. Rev. 54 (1984) 159 [2] F. C. Bersworth, British Patent 723, 316 (1955) [3] D. B. Haydock, T. P. C. Mulholland, J. Chem. Soc. C (197) 2389 [4] A. Kumar Chhakkar, L. Rai Kakkar, Fresenius, J. Anal. Chem. 347 (1993) 483 [5] G. R. E. C. Gregory, P. G. Jeffery, Analyst. 92 (1967) 293 [6] M. J. Gismera, J. R. Procopio, M. Teresa-Sevilla, L. Hernandez, Electroanalysis 15 (2003) 126 [7] M. Aydin, N. Arsu, Y. Yagci, Macromol, Rapid. Commun. 24 (2003) 718 [8] D. Shander, G. Ahluwalia, D. Grosso, US Patent 5411991 [9] H. Jacobelli, US Patent 20050267095 [10] J. Halaschek-Wiener, Y. Kloog, V. Wacheck, B. Jansen, J. Invest. Dermat. 120 (2003) 109 [11] I. Sadao, S. Fujio, M. Eiichi, K. Keita, Kokai Tokkyo Koho, 2000, pp. 127 [12] J. D. Smith, J. Org. Chem. 76 (6) (2011) 1513 [13] H. V. Huynh, Organometallic 29 (6) (2010) 1479 [14] J. Nakayama, T. Fujita, M. Hoshino, Chem. Lett. 11 (1982) 1777 [15] J. J. Donleavy, J. English Jr, J. Am. Chem. Soc. 62 (1940) 220 [16] M. Kalpun, M. Sandström, D. Boström, A. Shchukarev. P. Peresson, Inorg. Chim. Acta 358 (2005) 527 [17] D. J. Robinson, C. H. L. Kennard, J. Chem. Soc. A (1970) 1008 [18] X.-M. Luo, X.-H. Chen, S. Shanmuga Sundara Raj, H.-K. Fun, L.-G. Zhu, Acta Crystallogr. Sect. C: Cryst. Struct. Commun. 55 (1999) 1220 [19] S. Baggio, L. M. Amzel, L. N. Becka, Acta Crystallogr., Sect. B: Struct. Crystallogr. Cryst. Chem. 26 (1970) 1968 [20] J. R. Wiesner, E. C. Lingafelter, Inorg. Chem. 5 (1966) 1770 Литература    134   [21] I. A. Baidina, N. V. Podberezskaya, V. V. Bakakin, E. V. Golubovskaya, N. A. Shestakova, G. D. Malchikov, J. Struct. Vhem. 20 (1979) 463 [22] I. A. Baidina, N. V. Podberezskaya, S. V. Borisov, J. Struct. Chem. 21 (1980) 659 [23] V. Z. Pletnev, Yu. A. Zolotarev, N. M. Galitskii, A. I. Verenich, J. Struct. Chem. 33 (1992) 98 [24] G. N. Kaluđerović, H. Schmidt, Ch. Wagner, K. Merzweiler, D. Steinborn, Collect. Czech. Chem. Commun. 72 (2007) 560 [25] A. L. Spek, J. Appl. Crystallogr. 36 (2003) 7 [26] D. Cremer, J. A. Pople, J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 1354 [27] D. Cremer: Acta Crystallogr. Sect. B: Struct. Crystallogr. Cryst. Chem. 40 (1984) 498 [28] G. N. Kaluđerović, H. Schmidt, S. Schwieger, Ch. Wagner, R. Paschke, A. Dietrich, T. Mueller, D. Steinborn, Inorg. Chim. Acta. 361 (2008) 1395 [29] M. Peyrone, Ann. Chem. Pharm. 51 (1845) 1 [30] B. Rosenberg, L. Van Camp, T. Krigas, Nature 205 (1965) 698 [31] B. Rosenberg, L. Van Camp, J. E. Trosko, V. H. Mansour, Nature 222 (1969) 385 [32] M. Tucker, C. Colvin, D. Martin, Jr. Inorg. Chem. 3 (1964) 1373 [33] B. Rosenberg, D. Tucket, Cancer Res. 42 (1982) 3565 [34] I. Piel, D. Meyer, C. Perlia, V. Wolf, Cancer Chemother. Rep. pt 1. 58 (1974) 871 [35] F. Cavelli, R. Sonntag, H. Ryssel, L. Tschopp, K Brunner, Schweiz. Med. Wochenschr. 106 (1976) 754 [36] C. Merrin, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17 (1976) 243 [37] H. Brucker, C. Cohen, R. Wallach, B. Kabakow, G. Deppe, E. Greenspan, S. Gusberg, J. Holland, Cancer Treat. Rep. 62 (1978) 555 [38] K. Briscoe, M. Pasmanteir, J. Brown, B. Kennedy, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 19 (1978) 378 [39] R. Yong, B. Chabner, S. Hubbard, R. Fischer, R. Bender, T. Anderson, V. De Vita, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 19 (1978) 393 [40] J. Hill, E. Loeb, A. MacLellan, N. Hill, A. Khan, Cancer Chemother. Rep. 59 (1975) 647 Литература    135   [41] W. Hong, S. Shapshay, R. Bhutani, M. Craft, V. Alptekin, K. Yamaguchi, C. Vaughan, M. Strong, Cancer Res. 44 (1979) 26 [42] M. Soloway, J. De Kernion, D. Rose, l. Persky, Surg. Forum. 13 (1973) 542 [43] L. Kvols, R. Eagan, E. Creagan, R. Dalton, Proc. Am. Assoc. Cancer. Res. 19 (1978) 82 [44] J. Reedijk, Inorg. Chim. Acta 198-200 (1992) 873 [45] M. J. Bloemink, J. Reedijk in Metal ions in biological systems, ed. H. Sigel and A. Sigel, M. Dekker, New York, (1996) vol. 32, pp. 641-685 [46] J. Reedijk, Chem. Comm. (1996) 801 [47] T. W. Hambley, Coord. Che. Rev. 166 (1997) 181 [48] T. G. Appleton, Coord. Che. Rev. 166 (1997) 313 [49] B. K. Keppler, In: Metal Complexes in Cancer Chemoterapy, Ed. B. K. Keppler, VCH, Weinheim, Germany, 1993, p. 3. [50] M. Hartman, B. K. Keppler, Comments Inorg. Chem. 16 (1995) 339 [51] M. H. Heim, In: Metal Complexesin Cancer Chermotherapy, Ed. B. K. Keppler, VCH, Wienheim, Germany, 1993, p. 16 [52a] C. P. Saris, P. J. M. Van de Vaart, F. A. Blommert, R. Rietbroek, A. C. Begg, Proceedings of 7th International Symposium on Platinum and other metal coordination componds in Cancer Chermotheraphy (ISPCC), Amsterdam, The netherlands, 1995, 042; [52b] F. Levi, D. Machover, M. Marty, E. Diaz-Rubio, A. De Gramont, C. Garufi, M. Itzhaki, E. Cvitkovic, S. Brienza, ibid., 044. [53a] N. Farrell, Transition Metal Complexes as Drugs and Chemotherapeutic Agents, Kluwe Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands 1989, p. 57; [53b] N. Farrell, S. G. De Almeida, K. A. Skov, J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 5018 [54] K. Kamisango, T. Matsumoto, K. Akamatsu, K. Morikawa, T. Tashiro, K. Koizumi, Jap. J. Cancer. Res. 83 (1992) 304 [55] T. Matsumoto, K. Endoh, K. Akamatsu, K. Morikawa, T. Tashiro, K. Koizumi, K. Morikawa, M. Koizumi, T. Matsuno, Br. J. Cancer 64 (1991) 41 Литература    136   [56] D. Lebwohl, R. Canetta, Eur. J. Cancer 33 (1998) 1522 [57] D. P. Gately, S. B. Howell, Br. J. Cancer 67 (1993) 1171 [58] G. Chu, J. Biol. Chem. 269 (1994) 787 [59] K. Wang, J. Lu, R. Li, Coord. Chem. Rev. 151 (1996) 53 [60] E. R. Jamieson, S. J. Lippard, Chem. Rev. 99 (1999) 2467 [61] P. Jordan, M. Carmo-Fonseca, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1299 [62] S. E. Miller, D. A. House, Inorg. Chim. Acta 166 (1989) 189 [63] T. G. Appleton, J. R. Hall, S. F. Ralph, C. S. M. Thompson, Inorg. Chem. 28 (1989) 1989 [64] S. J. Berners-Price, T. A. Frenkiel. U. Frey, J. D. Ranford, P. J. Sadler, J. Chem. Soc.-Chem. Commun. (1992) 789 [65] S. E. Miller, D. A. House, Inorg. Chim. Acta 187 (1991) 125 [66] R. P. Pérez, Eur. J. Cancer 34 (1998) 1535 [67] E. L. M. Lempers. J. Reedijk, Adv. Inorg. Chem. 37 (1991) 175 [68] J. L. Butour, S. Wimmer, F. Wimmer, P. Castan, Chem. Biol. Inter. 104 (1997) 165 [69] J. Ruiz, J. Lorenzo, L. Sanglas, N. Cutillas, C. Vicente, M. D. Villa, F. X. Avilés, G. López, V. Moreno, J. Pérez, D. Bautista, Inorg. Chem. 45 (2006) 6347 [70] C. Navarro-Ranninger, J. M. Pérez, F. Zamora, V. M. González, J. R. Masaguer, C. Alonso, J. Inorg. Biochem. 52 (1993) 37 [71] S. Ray, R. Mohan, J. K. Singh, M.K. Samantaray, M.M. Shaikh, D. Panda, P. Ghosh, J. Am. Chem. Soc. 129 (2007) 15042 [72] T. Storr, K. H. Thompson, C. Orvig, Chem. Soc. Rev. 35 (2006) 534 [73] N. N. Stone, P. G. Stock, Eur. Urol. 41 (2002) 427 [74] L. Potters, Y. Cao, E. Calugaru, T. Torre, P. Fearn, X. H. Wang, Int. J. Radiart. Oncol. Biol. Phys. 50 (2001) 605 [75] E. Budzisz, B. K. Keppler, G. Giester, M. Woźniczka, A. Kufelnicki, B. Nawrot, Eur. J. Inorg. Chem. (2004) 4412 [76] E. Budzisz, U. Krajewska, M. Rozalski, Pol. J. Pharmacol. 56 (2004) 473 Литература    137   [77] G. Zhao, H. Lin, P. Yu, H. Sun, S. Zhu, X. Su, Y. Chen, J. Inorg. Biochem. 73 (1999) 145-149 [78] F. Huq, H. Tayyem, P. Beale, J. Q. Yu, J. Inorg. Biochem. 101 (2007) 30-35 [79] L. Tušek-Božić, J. Matijašić, G. Bocelli, P. Sgarbotto, A. Furlani, V. Scarcia, A. Papaioannou, Inorg. Chim. Acta 185 (1991) 229 [80] L. Tušek-Božić, J. Matijašić, G. Bocelli, G. Calestani, A. Furlani, V. Scarcia, A. Papaioannou, J. Chem. Soc., Dalton Trans. (1991) 195 [81] T. A. K. Al-Allaf, L. J. Rashan, Boll. Chim. Farm. 140 (2001) 205 [82] S. Grgurić-Šipka, M. A. A. M. Alshtewi, D. Jeremić, G. N. Kaluđerović, S. Gómez-Ruiz, Ž. Žižak, Z. Juranić, T. J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 73 (2008) 619 [83] S. Grguric-Šipka, C. R. Kowol, S. Valiahdi, R. Eichinger, M. A. Jakupec, A. Roller, S. Shova, V. B. Arion, B. K. Keppler, Eur. J. Inorg. Chem. (2007) 2870 [84] S. Gómez-Ruiz, G. N. Kaluđerović, S. Prashar, D. Polo-Cerón, M. Fajardo, Ž. Žižak, T. J. Sabo, Z. D. Juranić, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 1558 [85] S. Gómez-Ruiz, G. N. Kaluđerović, D. Polo-Cerón, S. Prashar, M. Fajardo, Ž. Žižak, Z. D. Juranić, T. J. Sabo, Inorg. Chem. Comm. 10 (2007) 748 [86] S. Gómez-Ruiz, G. N. Kaluđerović, S. Prashar, E. Hey-Hawkins, A. Erić, Ž. Žižak, Z. D. Juranić, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 2087 [87] M. Gielen, E. R. T. Tiekink, in: M. Gielen, E. R. T. Tiekink (Eds.), Metallotherapeutic drugs and metal-based diagnostic agents: the use of metals in medicine, John Wiley & Sons Ltd. (2005) 421 [88] M. Auzias, B. Therrien, G. Suss-Fink, P. Štĕpnička, W. Han Ang, P. J. Dyson, Inorg. Chem. 47 (2008) 578 [89] B. Dutta, C. Scolaro, R. Scopelliti, P. J. Dyson, K. Severin, Organometallics 27 (2008) 1355 [90] E. Budzisz, M. Malecka, B. K. Keppler, V. B. Arion, G. Andrijewski, U. Krajewska, M. Rozalski, Eur. J. Inorg. Chem. (2007) 3728 [91] A. Casini, Ch. Hartinger, Ch. Gabbiani, E. Mini, P. J. Dyson, B. K. Keppler, L. Messori, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 564 Литература    138   [92] S. Y. Ho, E. R. T. Tiekink, in: M. Gielen, E. R. T. Tiekink (Eds.), Metallotherapeutic drugs and metal-based diagnostic agents: the use of metals in medicine, John Wiley & Sons Ltd. (2005) 507 [93] J. J. Liu, P. Galettis, A. Farr, L. Maharaj, H. Samarasinha, A. C. McGechan, B. C. Baguley, R. J. Bowen, S. J. Berners-Price, M. J. McKeage, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 303 [94] J. Sikkema, J.A.M. de Bont, B. Poolman, Microbiology Reviews 59(2) (1995) 201 [95] S. P. Denyer, G. S. A. B. Stewart, International Biodeterioration and Biodegradation 41(3) (1998) 261 [96] M. Cristani, M. D’Arrigo, G. Mandalari, F. Castelli, M.G. Sarpietro, D. Micieli, V. Venuti, G. Bisignano, A. Saija, D Trombetta, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55(5) (2007) 6300 [97] G. J. Tortora, B. R. Funke, C. L. Case. Microbiology: an introduction. 7th ed. Pearson Education, San Francisco, CA 2002 [98] M. Nevas, A. Korhonen, M. Lindstrom, P. Turkki, H. Korkeala, Journal of Food Protection 67(1) (2004) 199 [99] S. A. Burt, R. D. Reinders, Letters in Applied Microbiology 36(3) (2004) 162 [100] M. Madigan, J. Martinko, P. Dunlap, D. Clark 2009. Brock Biology of Microorganisms 12 ed., Pearson Education Inc., San Francisco, USA [101] W. E. Levinson, E. Jawetz. Medical microbiology and immunology. Examination & Board Review. Second Edition, Prentice Hall, London (1992) [102] P. R. Murray, G. S. Kobayashi, M. A. Pfaller, K. S. Rosenthal, Medical Microbiology 2nd ed. St. Louis: Mosby Year Book (1994). [103] W. Guerra, E. De Andrade Azevedo, A. R. de Souza Monteiro, M. Becciarelli- Rodriguz, E. Chartone-Souza, A.M. Amaral Nascimento, A.P. Soares Fontes, I. Le. Moyes, E.C. Pereira-Maia, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 2348 [104] L. M. M. Vieira, M. V. de Almeida, M. C. S. Lourenco, F. A. F. M. Bezerra, A. P. S. Fontes, European Journal of Medicinal Chemistry 44 (2009) 4107 [105] D. Kovala-Demertzi, m.A Demertzis, J. R. Miller, C. Papadopoulou, C. Dodorou, G. Filousis, J. Inorg. Biochem. 86 (2001) 555 Литература    139   [106] R. R. Coombs, M. K. Ringer, J. M. Blacquire, J. C. Smith, J. S. Neilsen, Y.-S. Uh, J. B. Gilbert, L. J. Leger, H. Zhang, A. M. Irving, S. L. Wheaton, C. M. Vogels, S. A Westoctt, Transition Metal Chem. 30 (2005) 411 [107] M. Ali, M. Aminul, R. Butcher, C. Karen, Transition Met. Chem. 31 (2006) 79 [108] I. Kizilcikli, Y. D. Kurt, B. Akkurt, A.Y. Genel, S. Birteksöz, G. Ötük, B. Ülküseven, Folia Mikrobiol. 52 (2007) 15 [109] N. M. Aghatabay, M. Somer, M. Senel, B. Dulger, F. Gucin, Eur. J. Med. Chem. 42 (2007) 1069 [110] M. K. Biyala, K. Sharma, S. Swami, N. Fahmi, R. Vir Singh, Tran. Met. Chem. 33 (2008) 377 [111] V. Climesova, J. Koci, M. Pour, J. J. Stachel, K. Waisser, J. Kaustova, Eur. J. Pharm. Chem. 37 (2002) 409 [112] J. Valdez. R. Cedillo, A. Hernandez/Campos, L. Yepey, F. Hernandey-Luis, G. Navarrete-Vazquez, A. Tapia, R. Cortes, M. Hernandez, R. Castillo, Bioorganic and Medicinal Chem. Letters 12 (2002) 2221 [113] T. C. Kühler, M. Swanson, B. Christenson, C.A. Klintenberg, B. Lamm, J. Fagerhag, G. Roberto, M. Ölwegard-Halvarsson, V. Shcherbuchin, T. Elebring, E. Sjöström, J. Med. Chem. 45 (2002) 4282 [114] M. Andrzejewska, L. Yepez-mulia, A. Tapia, R. Cedillo-Rivera, A.E. Laudy, B.J. Starsciak, Z. Kazimierczuk, Eur.J. Pharm. Chem. 21 (2004) 323 [115] M. Gökç, S. Utku, E. Berçin, B. Özçelik, T. Karaoğlu, N. Noyanalpan, Turk. J. Chem. 29 (2005) 207 [116] K. Nakamoto, Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordiantion Compounds, New York (1986) [117] D. H. Busch, J. C. Bailar, J. Am. Chem. Soc. 75 (1953) 4574 [118] M. L. Morris, D. H. Busch, J. Am. Chem. Soc. 78 (1956) 5178 [119] V. V. Glođović, G. P. Radić, S. M. Stanić, F. W. Heinemann and S. R. Trifunović, J. Serb. Chem. Soc. 76 (2001) 995 [120] Tri Pett, S. J. Chem. Soc. (1957) 4407 Литература    140   [121] Oxford Diffraction, CrysAlis CCD and CrysAlis RED Versions 1.171.32.24. Oxford Diffraction Ltd., Abington, England, 2008 [122] R. C. Clark and J. S. Reid, Acta Cryst. A51 (1995) 887 [123] SIR2002 - M.C. Burla, M. Camalli, B. Carrozzini, G.L. Cascarano, C. Giacovazzo, G. Polidori and R. Spagna. J. Appl. Cryst. 36 (2003) 1103 [124] G. M. Sheldrick, Acta Cryst. A64 (2008) 112 [125] M. Nardelli. Comput. Chem. 7 (1983) 95 [126] L. J. Farrugia. J. Appl. Cryst. 30 (1997) 565 [127] SADABS 2.06, Bruker Axs. Ins. (2002), Madison, Wi, USA [128] SHELXTL NT 6.12, Bruker-Axs INC (2002) Madison, Wi, USA [129] M. C. Burla, M. Camalii, B. Carrozzini, G. L. Cascarano, C. Giacovazzo, G. Polidori, R. Spagna. J. Appl. Crystallog. 38 (2005) 381 [130] G. M. Sheldrick, SADABS, University of Gottingen, Germany (1996) [131] J. M. Andrews, J. Antimicrob Chemother. 56 (2005) 60 [132] S. D. Sarker, L. Naher, Y. Kumarasamy, Methods 42 (2007) 321 [133] E. Banfi, G. Scialino, C. Monti-Bragadin, J. Antimicrob. Chemother 52 (2003) 796 [134] T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65(1,2) (1983) 55 [135] B. B. Krajčinović, G. N. Kaluđerović, D. Steinborn, H. Schmidt, Ch. Wagner, Z. Žižak, Z. D. Juranić, S. R. Trifunović, T. J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 892 [136] G. N. Kaluđerović, V. M. Đinović, Z. D. Juranić, T. P. Stanojkovic, T. J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 488 [137] G. N. Kaluđerović, H. Schmidt, S. Schwieger, Ch. Wagner, R. Paschke, A. Dietrich, T. Mueller, D. Steinborn, Inorg. Chim. Acta 361 (2008) 1395 [138] B. B. Krajčinović, G. N. Kaluđerović, D. Steinborn, H. Schmidt, Ch. Wagner, K. Merzweiler, S. R. Trifunović, T. J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 74 (2009) 389 [139] B. B. Zmejkovski, G.N. Kaluđerović, S. Gómez-Ruiz, Z. Žižak, D. Steinborn, H. Schmidt. R. Paschke, Z. Juranić, T. Sabo, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 3452 Литература    141   [140] R. S. Srivastava, Inorg. Chim. Acta 56 (1981) 65 [141] J. R. Wiesner, E. C. Lingafelter Inorg. Chem. 5 (1966) 1770 [142] A. K. Singh, J. Sooriyakumar, S. Husebye, K. W. Tornroos J. Organomet. Chem. (2000) 612 [143] D. R. Billodeaux, F. R. Fronczek, A. Yoneda, G. R. Newkome Acta. Cryst. 54 (1998) 1439 [144] T. H. Steiner Cryst. Rev. 6 (1996) 1 [145] R. M. Silverstein, C. G. Bassler, T. C. Morril, Spectrometric Identification of Organic Compounds third ed. Wiley International Edition 1974 p. 113 [146] K. Nakamoto, Infrared Spectra of Inorganic and Coordination Compounds (1963) p. 206 (Wiley, New York) [147] D. A. Langs, C. R. Hare, R. G. Little, Chem. Commun. (London) (1967) 1080 [148] K. Nakamoto , Y. Morimoto, A. E. Martell, J. Am. Chem. Soc. 83 (1961) 4528. [149] M. B. Ćelap, S. R. Niketić, T. J. Janjić,V. N. Nikolić, Inorg. Chem. 6 (1967) 2063 [150] J. A. Neal, N. J. Rose, Inorg. Chem. 7 (1968) 2405; 12 (1973) 1226 [151] D. J. Radanović, B. E. Douglas, J. Coord. Chem. 4 (1975) 191 [152] K. D. Gailey, D. J. Radanović, M. I. Đuran, B. E. Douglas, J. Coord. Chem, 8 (1978) 161 [153] T. G. Appleton, J. R. Hall, M. A. Williams, Inorg. Chim. Acta 61 (1982) 51 [154] G. N. Kaluđerović, G. A. Bogdanović, T. J. Sabo, J. Coord. Chem. 55 (2002) 817 [155] V. M. Ðinović, G. A. Bogdanović, S. Novaković, T. J. Sabo, J. Coord. Chem. 8 (2004) 535 [156] V. M. Đinović, L. Mančić, G. Bogdanović, P. Vulić, G. Del Rosario, T. J. Sabo, O. B. Milošević, J. Mater. Res. 20 (2005) 102 Биографија      14 БИОГРАФИЈА Гордана П. Радић (девојачко Васић) је рођена 30. 09. 1980. године у Крагујевцу. Основну школу и Другу крагујевачку гимназију, општег смера, завршила је са одличним успехом. Студије хемије, смер за истраживање и развој, на Природно-математичком факултету у Крагујевцу уписала је 1999. године, где је и дипломирала 2004. године са просечном оценом 9,14. Магистарске студије, смер Неорганска хемија, уписала је школске 2004/2005 године, а након ступања на снагу новог Закона о високом образовању уписала се на Докторске студије, смер Неорганска хемија, у Институту за хемијске науке Природно-математичког факултета у Крагујевцу. Након дипломирања од 01. 01. 2005. године ангажована је на Пројекту број 142008 под насловом „Синтеза нових комплексних јона прелазних метала и механизам њихових реакција са биолошки значајним лигандима” у периоду од 2006/2010. године код Министарства просвете и науке Републике Србије. Од 01. 01. 2011. године ангажована је на Пројекту број 172016 под насловом „Синтеза, моделовање, физичко-хемијске и биолошке особине неорганских једињења и одговарајућих комплекса метала” у периоду од 2011/2014. године код Министарства просвете и науке Републике Србије. Такође активно учествује у реализацији пројектних задатака програма научне и технолошке сарадње између Републике Србије и Републике Белорусије „Развој нових фармацеутских препарата за комбиновану хемотерапију инфекција” и ТЕМПУС пројекта под називом ʺModernisation of Post Graduate Studies in Chemistry and Chemistry Related Programmesʺ (511044-TEMPUS-1-2010-1-UK-TEMPUS-JPCR). Изабрана је у звање истраживач-приправник на Природно-математичком факултету у Крагујевцу 24. 05. 2006. године (одлука број 170/IX-2), а у звање истраживач-сарадник 13. 05. 2009. године (одлука број 310/VII-1). У периоду 3 Биографија      144 април-мај 2009. године боравила је у Солуну (Грчка) по CPCTAS пројекту (Centre for Pre-Clinical Testing of Active Substances). Откада је уписала последипломске студије Гордана П. Радић активно учествује у раду са студентима изводећи вежбе из предмета: АО5 Лекови 1: Хемија и дизајн лекова, БО4 Медицинска хемија и дизајн лекова 1. Од 2007. године активно учествује у раду Центра за таленте радећи са талентованим ученицима основних и средњих школа. У оквиру свог истраживачког рада на Природно-математичком факултету Гордана П. Радић је до сада објавила 7 научних радова у водећим часописима са SCI листе, коаутор је једне монографске студије/поглавље у књизи, 10 саопштења на међународним и 7 саопштења на домаћим научним скуповима.     145 РАДОВИ У КОЈИМА СУ ШТАМПАНИ РЕЗУЛТАТИ ОВЕ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ 1. G. P. Vasić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, V. M. Đinović and S. R. Trifunović, Stereospecific ligand and their complexes. V. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-propanoic acid, Inorg. Chim. Acta 363 (2010) 3606-3610; ISSN: 0020-1693; DOI: 10.1016/j.ica.2010.05.046; M22 2. G. P. Radić, V. V. Glođović, G. N. Kaluđerović, F. W. Heinemann and S. R. Trifunović, Palladium(II) complexes with R2edda derived ligands. Part V. Reaction of O,O′- -diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)butanoate with K2[PdCl4], Trans. Met. Chem. 36 (2011) 331-336 ISSN: 0340-4285; DOI: 10.1007/s11243-011-9473-3; M23 3. G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, Z. R. Ratković, A. Valkonen, K. Rissanen and S. R. Trifunović, Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl derivates of thiosalicylic acids. Crystal structure of bis(S-benzil- -thiosalicylate)-palladium(II) complex, [Pd(S-bz-thiosal)2], Polyhedron, 31 (2012) 69-76: DOI: 10.1016/j.poly. 2011.08.042; M21   146 4. I. D. Radojević, V. V. Glođović, G. P. Radić, J. M. Vujić, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić and S. R. Trifunović, From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes, Chapter in ″Antibacterial Agents/Book1″ ISBN: 979-953-307-281-3; М14 5. G. P. Radić, V.V. Glođović, Z. R. Ratković, S. B. Novaković, S. G. Granda, L. Roces, L. M. Taboada, I. D. Radojević, O. D. Radojević. Lj. R. Čomić and S. R. Trifunović, Synthesis, characterization and antimicrobial activity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with 1,2-diphenyl-ethilenediamine-N,N′-di-3-propanoic acid. Crystal structure of H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O, submitted (J. Mol. Struct.) 6. G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, V. M. Đinović and S. R. Trifunović Stereospecific ligands and their complexes. X. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoic acid, submitted (Inorg. Chim. Acta) 7. G. P. Radić, V. V. Glođović, Z. R. Ratković, M. Milovanović, V. Volarević, N. Arsenijević and S. R. Trifunović, Synthesis, characterization and cytotoxicity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di-3- -propanoic acid, submitted (Polyhedron)     147 НАУЧНО-ИСТРАЖИВАЧКИ РАД 1. Списак радова 1.1. V. M. Đinović, V. V. Glođović, G. P. Vasić, V. Trajković, O. Klisurić, S. Stanković, T. J. Sabo and S. R. Trifunović, Stereospecific ligand and their complexes. IV. Synthesis, characterization and cytotoxicity of novel platinum(IV) complexes with ethylenediamine-N,N′-di-S,S-2- propanoic acid and halogenido ligands: Crystal structure of s-cis-[Pt(S,S-eddp)Cl2]·4H2O and uns-cis-[Pt(S,S-eddp)Br2], Polyhedron 29 (2010) 1933-1938; ISSN: 0277-5387; DOI:10.1016/j.poly.2010.03.004; M21 1.2. G. P. Vasić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, V. M. Đinović and S. R. Trifunović, Stereospecific ligand and their complexes. V. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-propanoic acid, Inorganica Chimica Acta 363 (2010) 3606-3610; ISSN: 0020-1693; DOI:10.1016/j.iva.2010.05.046; M22 1.3. S. R. Trifunović, D. D. Dimitrijević, G. P. Vasić, N. Radulović, M. Vukićević, F. W. Heinemann, R. D. Vukićević, New Simple Synthesis of N-Substitutde 1,3-Oxazinan-2-ones, Synthesis-Stuttgart 6 (2010) 0943-0946; ISSN: 0039-7881; DOI: 10.1055/s-0029-1218642; ID:T20509SS M22   148 1.4. G. P. Radić, V. V. Glođović, G. N. Kaluđerović, F. W. Heinemann and S. R. Trifunović, Palladium(II) complexes with R2edda derived ligands. Part V. Reaction of O,O′- -diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)butanoate with K2[PdCl4], Trans. Met. Chem. 36 (2011) 331-336 ISSN: 0340-4285; DOI: 10.1007/s11243-011-9473-3; M23 1.5. V. V. Glođović, G. P. Radić, S. M. Stanić, F. W. Heinemann and S. R. Trifunović, Stereospecific ligands and their complexes. VI. The crystal structure of (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-propanoic acid hydrochloride, (S,S)-H2-eddp·HCl, J. Serb. Chem. Soc. 76 (7) (2011)995-1001; ISSN: 0352-5139; DOI: 10.2298/JSC101025088G M23 1.6. M. Z. Stanković, G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, O. R. Klisurić, V. M. Đinović and S. R. Trifunović, Stereospecific ligands and their complexes. IX: Synthesis, characterization and antimicrobial activity of ethyl esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2- -propanoic and (S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoic acids and corresponding platinum(IV) complexes: Crystal structure of tetrachlorido-(O,O′- -diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-propanoato)platinum(IV), [PtCl4(det-S,S-eddp)], Polyhedron 30 (2011) 2203-2209; ISSN:0020-1693; DOI: 10.1016/j.poly.2011.05.034; M21 1.7. G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, Z. R. Ratković, A. Valkonen, K. Rissanen and S. R. Trifunović Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl derivates of thiosalicylic acids. Crystal structure of bis(S-benzyl-   149 -thiosalicylate)-palladium(II) complex, [Pd(S-bz-thiosal)2], Polyhedron 31 (2012) 69-76: DOI: 10.1016/j.poly. 2011.08.042; M21 1.8. G. P. Radić, V.V. Glođović, Z. R. Ratković, S. B. Novaković, S. G. Granda, L. Roces, L. M. Taboada, I. D. Radojević, O. D. Radojević. Lj. R. Čomić and S. R. Trifunović, Synthesis, characterization and antimicrobial activity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with 1,2-diphenyl-ethilenediamine-N,N′-di-3-propanoic acid. Crystal structure of H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O, submitted (J. Mol. Struct.) 1.9. G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, V. M. Đinović and S. R. Trifunović Stereospecific ligands and their complexes. X. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoic acid, submitted (Inorg. Chim. Acta) 1.10. G. P. Radić, V. V. Glođović, Z. R. Ratković, M. Milovanović, V. Volarević, N. Arsenijević and S. R. Trifunović, Synthesis, characterization and cytotoxicity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di-3- -propanoic acid, submitted (Polyhedron) 1.11. I. D. Radojević, V. V. Glođović, G. P. Radić, J. M. Vujić, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić and S. R. Trifunović, From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes, Chapter in ″Antibacterial Agents/Book1″ ISBN: 979-953-307-281-3; М14   150 2. Списак саопштења на међународним научним конференцијама који су штампани у изводу 2.1. V. V. Glođović, G. P. Vasić, S. R. Trifunović and V. M. Đinović, Synthesis and characterization of the ruthenium(III) complex with ethylenediamine-N,N′-di-S,S-2-propionate ligand, 37thInternational Conference of COOrdination Chemistry, Cape Town, South Africa2006, p. 592; M34 2.2. V. V. Glođović, G. Vasić, S. R. Trifunović and V. M. Đinović, Synthesis and characterization of the platinum(IV) complex with ethylenediamine- -N,N′-di-S,S-2-propionate ligand, 5th International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Ohrid 2006, ICH-13, p. 313; M34 2.3. V. V. Glođović, G. Vasić, S. R. Trifunović and V. M. Đinović, Synthesis and characterization of the platinum(IV) complex with (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-(4,4-dimethyl -2,2-di-pentaoate ligand, 5th International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Ohrid 2006, OCH-64, p. 488; M34 2.4. V. V. Glođović, G. Vasić, S. R. Trifunović, V. M. Đinović and T. J. Sabo, Novel complex of platinum(IV) with ethyl ester of ethylenedimine –N,N′-di S,S-2- -propanoic acid, 6th International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Sofia 2008, 3-P25, 166; M34   151 2.5. G. P. Vasić, V. V. Glođović, S. R. Trifunović and Z. Ratković, Synthesis and characterization of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di-3- -propanoic acid and corresponding platinum(IV) complex, 6th International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Sofia 2008, 3-P42, 183; M34 2.6. G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, V. M. Đinović and S. R. Trifunović, Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)-etylenediamine-N,N′-di-2-propanoic acid, 10th European Biological Inorganic Chemistry Conference, Thessaloniki 2010, PO-085; M34 2.7. G. P. Radić, V. V. Glođović, Z. Ratković, M. Milovanović, V. Volarević, N. Arsenijević and S. R. Trifunović, Antitumor activity of platinum(IV) and palladium(II) complexes with tetradentate ligand 1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di-3-propanoic acid, 10th European Biological Inorganic Chemistry Conference, Thessaloniki 2010, PO-207; M34 2.8. M. Z. Stanković, G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić and S. R. Trifunović, Antimicrobial activity of ethyl esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2- -propanoic and (S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoic acids and corresponding platinum(IV) complexes, Preclinical Testing of Active Substances and Cancer Research with International   152 Symposium on Anti-cancer Agents, Cardiotoxicity and Neurotoxicity Kragujevac, 2011; M34 2.9. I. D. Radojević, O. D. Stefanović, G. P. Radić, V. V. Glođović, Lj. R. Čomić and S. R. Trifunović, Antimicrobial activity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with 1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di-3-propanoic acid, Preclinical Testing of Active Substances and Cancer Research with International Symposium on Anti-cancer Agents, Cardiotoxicity and Neurotoxicity Kragujevac, 2011; M34 2.10. D. S. Đačić, S. D. Marković, V. V. Glođović, G. P. Radić and S. R. Trifunović. The antiproliferative effects of cisplatin and buthyl and pentyl esters of (S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-propanoic acid and corresponding platinum(IV) complexes, Preclinical Testing of Active Substances and Cancer Research with International Symposium on Anti-cancer Agents, Cardiotoxicity and Neurotoxicity Kragujevac, 2011; M34 3. Списак саопштења на домаћим научним конференцијама који су штампани у изводу 3.1. S. Trifunović, M. Stanković, Z. Matović, G. Vasić, A. Meetsma, P. J. Van Koningsburggen, The Crystal structure of complex [Ni(S,S-eddp)]·2H2O XIII Conference of the Serbian Crystallographic Society, Novi Sad 2006, 26; M64   153 3.2. S. R. Trifunović, V. V. Glođović, G. P. Vasić, V. M. Đinović, T. J. Sabo, O. Klisurić and S. Stanković Cryustal structure of uns-cis-dibromo(ethylenediamine-N,N′-di-S,S-2- -propionato)platinum(IV) complex, uns-cis-[Pt(S,S-eddp)Br2], XV Conference of the Serbian Crystallographic Society, Donji Milanovac 2008, 24; M64 3.3. G. P. Vasić, S. R. Trifunović V. V. Glođović, V. M. Đinović, T. J. Sabo, O. Klisurić and S. Stanković, The crystal structure of the s-cis-dichloro-(ethylenediamine-N,N′-di-S,S-2- -propionato)-platinum(IV) complex, s-cis-[Pt(S,S-eddp)Cl2], XV Conference of the Serbian Crystallographic Society, Donji Milanovac 2008, 28; M64 3.4. G. P. Radić, V. V. Glođović, S. G. Granda, L. M. Taboada, Z. Ratković and S. R. Trifunović Crystal structure of 1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di-3-propanoic acid dihydrochloride, XVII Conference of the Serbian Crystallographic Society, Ivanjica 2010, 36; M64 3.5. G. P. Radić, V. V. Glođović, F. W. Heinemann and S. R. Trifunović, Synthesis and crystal structure of palladium(II) complex with O,O′-diethyl-(S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)butanoate, XVII Conference of the Serbian Crystallographic Society, Ivanjica 2010, 60; M64   154 3.6. M. Z. Stanković, G. P. Radić, V. V. Glođović, O. R. Klisurić, S. R. Trifunović Synthesis and crystal structure of tetrachlorido-(O,O′-diethyl-(S,S)- -ethylenediamine-N,N′-di-2-propanoato)-platinum(IV) XVIII Conference of the Serbian Crystallographic Society, Andrevlje, Fruška Gora, 2011, 42; M64 3.7. D. P. Dimitrijević, G. P. Radić, V. V. Glođović, I. D. Radojević, O. D. Stefanović, Lj. R. Čomić, Z. R. Ratković, A. Valkonen, K. Rissanen, S. R. Trifunović, Crystal structure of bis-(benzyl-thiosalicylate)-palladium(II) complex, [Pd(S-bz-thiosal)2], XVIII Conference of the Serbian Crystallographic Society, Andrevlje, Fruška Gora, 2011, 42; M64   ПРИЛОГ   s I) no do 12, man Received 26 November 2009 pyl, n-butyl and n-pentyl) have been synthesized and characterized by microanalysis, infrared and 1H and 13C NMR spectroscopy. Antimicrobial activity of these ligands and complexes was tested by microdilution method and both minimal inhibitory and microbicidal concentration were determined. These tested gen or sulfur donors (soft bases) than oxygen donors (hard bases). In general, Pt(II) complexes are thermodynamically and kinetically more stable than those of Pd(II). Pd(II) complexes undergo aqua- cline itself against resistant strain. Vieira et al. [6] prepared new palladium(II) and platinum(II) complexes with fluoroquinolones which showed activity to Mycobacterium tuberculosis. There are other papers in the literature showing different intensity of palla- dium complexes activity on various species of bacteria and fungi [7–12]. Pd(II) complexes with R2-S,S-eddp ligands (R = iPr [13a], iBu [13b], cPe [14] and Cy [14] were synthesized and characterized. The authors concluded from NMR spectra that the mixture of q For Part IV see V.M. Djinovic´, V.V. Glodjovic´, G.P. Vasic´, V. Trajkovic´, O. Klisuric´, S. Stankovic´, T.J. Sabo, S.R. Trifunovic´, Polyhedron (2010), doi:10.1016/j.poly.2010. 03.004 * Corresponding author. Tel.: +381 34 300263; fax: +381 34 335040. Inorganica Chimica Acta 363 (2010) 3606–3610 Contents lists availab Inorganica Ch w.eE-mail address: srecko@kg.ac.rs (S.R. Trifunovic´).1. Introduction Microorganisms have developed numerous defensive mecha- nisms against antimicrobial factors. That led to the increase of infection number caused by resistant or less susceptible bacteria. Besides, opportunistic infections caused by pathogen Candida albi- cans or mold infections caused by Aspergillus sp. are increasing. Faced with this problem, the search for new antimicrobial agents has been intensified in the last decade. The main aim of many research groups is to find medicines that could be efficient in the infection treatment. The natural occurring compounds or synthesized compounds are great source of inspiration for the future researches. Pd(II) has a very similar chemistry to Pt(II) forming square pla- nar complexes and less frequently trigonal bipyramidal. Both Pd(II) and Pt(II) are soft Lewis acids and form stronger bonds with nitro- tion and ligand exchange reactions 10 time faster than corre- sponding Pt(II) complexes. The synthesis and evaluation of the biological activity of the new metal-based compounds is the field of growing interest. Numerous complexes based on palladium(II) ion have been syn- thesized and their different biological activities have been docu- mented [1–3]. The impact of different palladium complexes on the growth and metabolism of various groups of microorganisms has been studied. Garoufis et al. [4] reviewed numerous scientific papers on anti-viral, antibacterial and antifungal activity of palla- dium(II) complexes with different types of ligands (sulfur and nitrogen donor ligands, Schiff base ligands and drugs as ligands). Guerra et al. [5] synthesized three palladium complexes with anti- biotics of the tetracycline family and they tested their effects on tetracycline sensitive and resistant bacterial strains. The palladium complex with tetracycline was 16 times stronger than the tetracy-Received in revised form 30 March 2010 Accepted 21 May 2010 Available online 1 June 2010 Keywords: Palladium(II) complexes (S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propanoic acid Antimicrobial activity0020-1693/$ - see front matter  2010 Published by doi:10.1016/j.ica.2010.05.046complexes demonstrated the significant antifungal activity against pathogenic fungi Aspergillus flavus and Aspergillus fumigatus. On the other hand, these complexes demonstrated moderate antibacterial activity.  2010 Published by Elsevier B.V. 5Article history: Three new ligands and their palladium(II) complexes of general formula [PdCl2(R2-S,S-eddp)] (R = n-pro-Note Stereospecific ligands and their complexe and antimicrobial activity of palladium(I of (S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propa Gordana P. Vasic´ a, Verica V. Glodjovic´ a, Ivana D. Ra Vesna M. Djinovic´ c, Srec´ko R. Trifunovic´ a,* aDepartment of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Domanovic´a bDepartment of Biology and Ecology, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Do c Faculty of Chemistry, University of Belgrade, Studentski trg 16, 11000 Belgrade, Serbia a r t i c l e i n f o a b s t r a c t journal homepage: wwElsevier B.V.. V. Synthesis, characterization complexes with some alkyl esters ic acidq jevic´ b, Olgica D. Stefanovic´ b, Ljiljana R. Cˇomic´ b, 34000 Kragujevac, Serbia ovic´a 12, 34000 Kragujevac, Serbia le at ScienceDirect imica Acta l sevier .com/locate / ica (55.00%). Anal. Calc. for C18H42Cl2N2O6 (Mr = 453.436): C, 47.68; H, imic9.34; N, 6.18. Found: C, 46.91; H, 9.46; N, 6.12%. 1H NMR (200 MHz, D2O, d ppm): 3.42 (s, 4H), 4.14 (q, 2H), 1.34 (d, 6H), 4,28 (t, 4H), 1.72 (m, 4H), 0.93 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, D2O, d ppm): 45.14 (CH2), 58.99 (CH), 17.49 (CH3), 173,98 (COO-n-Pe), 70.50 (CH2-n- Pe), 30.28 (CH2-n-Pe), 30.19 (CH2-n-Pe), 24.55 (CH2-n-Pe), 16.16 (CH3-n-Pe). 2.1.3. Preparation of dichloro-(O,O0-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2—propanoate)-palladium(II), [PdCl2(dpr-S,S-eddp)]diastereoisomers of the [PdCl2(R2-eddip)] complexes was obtained. The antitumoral investigations of these complexes were performed [14]. The aim of this paper is to synthesize new palladium complexes and in vitro research of their antibacterial and antifungal activities. The second objective is to evaluate the impact of newly synthe- sized palladium complexes on probiotics. Probiotics are used as supplements and they play significant role in protecting and main- taining the balance of intestinal microflora in antibiotic therapy. 2. Experimental 2.1. Chemistry 2.1.1. Reagents and instruments All chemicals were obtained commercially and used without further purification. For infrared spectra a Perkin–Elmer Spectrum One FT-IR spectrometer was employed. 1H and 13C spectra were re- corded on a Varian Gemini-2000 (200 MHz) NMR spectrometer using TMS in CDCl3 for complexes and TMS in D2O for ligands. Ele- mental microanalysis for C, H and N were performed by standard methods on a Vario III CHNS Elemental Analyzer, Elemental Anal- ysensysteme GmbH. (S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propanoic acid (H2-S,S-eddp) was prepared using a previously described pro- cedure [15]. 2.1.2. Preparation of O,O0-dialkyl esters of the (S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-propanoic acid dihydrochloride, R2-S,S-eddp2HCl In 50 mL of dry alcohol (1-propanol, 1-butanol or 1-pentanol), saturated with gas HCl, 1.53 g (7.5 mmol) of H2-S,S-eddp was added and the mixture was refluxed for 12 h. The mixture was fil- tered and left in the refrigerator over night. The obtained white powder was filtered and air-dried. O,O0-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propanoate dihy- drochloride trihydrate, dpr-S,S-eddp2HCl3H2O (L1) Yield: 1.62 g (51.92%). Anal. Calc. for C14H36Cl2N2O7 (Mr = 415.348): C, 40.48; H, 8.74; N, 6.75. Found: C, 40.06; H, 8.34; N, 6.71%. 1H NMR (200 MHz, D2O, d ppm): 3.51 (s, 4H), 3.55 (q, 2H), 1.51 (d, 6H), 4.24 (t, 4H), 1.65 (m, 4H), 0.92 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, D2O, d ppm): 44.75 (CH2), 59.07 (CH), 17.18 (CH3), 173.34 (COO-n-Pr), 72.04 (CH2-n-Pr), 21.17 (CH2-n-Pr), 12.45 (CH3-n-Pr). O,O0-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propanoate dihy- drochloride trihydrate, dbu-S,S-eddp2HCl3H2O (L2) Yield: 1.84 g (55.26%). Anal. Calc. for C16H40Cl2N2O7 (Mr = 443.4): C, 43.34; H, 9.09; N, 6.32. Found: C, 43.18; H, 8.54; N, 6.38%. 1H NMR (200 MHz, D2O, d ppm): 3.34 (s, 4H), 4.26 (q, 2H), 1.35 (d, 6H), 4,32 (t, 4H), 1.67 (m, 4H), 1.47 (m, 4H), 0.92 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, D2O, d ppm): 44.59 (CH2), 59.10 (CH), 17.05 (CH3), 173.01 (COO-n-Bu), 70.40 (CH2-n-Bu), 32.62 (CH2-n-Bu), 21.35 (CH2-n-Bu), 15.62 (CH3-n-Bu). O,O0-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propanoate dihy- drochloride dihydrate, dpe-S,S-eddp2HCl2H2O (L3) Yield: 1.87 g G.P. Vasic´ et al. / Inorganica ChK2[PdCl4] (0.200 g, 0.613 mmol) was dissolved in 10 mL of water on a steam bath and O,O0-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-propanoate dihydrochloride trihydrate, dpr-S,S-eddp2HCl3H2O, (0.2546 g, 0.613 mmol) was added. The mixture was stirred for 2 h and during this period water solution of LiOH (0.0294 g, 1.226 mmol in 10 mL of water) was introduced. The complex, [PdCl2(dpr-S,S-eddp)] (C1) as a yellow precipitate, was filtered, washed with water and air-dried. Yield: 0.19 g (66.60%). Anal. Calc. for C14H28Cl2N2O4Pd (Mr = 465.68): C, 36.11; H, 6.06; N, 6.02. Found: C, 35.81; H, 6.01; N, 5.82%. Isomer A: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.83 (s, 4H), 3.63 (q, 2H), 2.04 (d, J = 7.37 Hz, 6H), 4.14 (t, 4H), 1.69 (m, 4H), 0.95 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 48.62 (CH2), 57.26 (CH), 14.63 (CH3), 170.14 (COO-n-Pr), 67.48 (CH2-n-Pr), 21.76 (CH2-n-Pr), 10.24 (CH3-n-Pr). Isomer B: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.85 (s, 4H), 3.21 (q, 2H), 2.47 (d, J = 7.37 Hz, 6H), 4.53 (t, 4H), 1.76 (m, 4H), 0.92 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 51.68 (CH2), 58.69 (CH), 15.93 (CH3), 171.46 (COO-n-Pr), 67.14 (CH2-n-Pr), 21.70 (CH2-n-Pr), 10.24 (CH3-n-Pr). 2.1.4. Preparation of dichloro-(O,O0-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-propanoate)-palladium(II), [PdCl2(dbu-S,S-eddp)] The complex, [PdCl2(dbu-S,S-eddp)], (C2) was prepared as de- scribed in Section 2.1.3, using O,O0-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-propanoate dihydrochloride trihydrate, dbu-S,S-eddp 2HCl3H2O, (0.2718 g, 0.613 mmol) instead of dpr-S,S-eddp 2HCl3H2O. Yield: 0.18 g (59.50%). Anal. Calc. for C16H32Cl2N2O4Pd (Mr = 493.74): C, 38.92; H, 6.53; N, 5.68. Found: C, 38.74; H, 6.66; N, 5.57%. Isomer A: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.83 (s, 4H), 3.62 (q, 2H), 1.29 (d, J = 6.81 Hz, 6H), 4.15 (t, 4H), 1.56 (m, 4H), 1.36 (m, 4H), 0.90 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 48.63 (CH2), 57.25 (CH), 14.64 (CH3), 170.16 (COO-n-Bu), 65.43 (CH2-n-Bu), 33.32 (CH2-n-Bu), 18.97 (CH2-n-Bu), 13.50 (CH3-n-Bu). Isomer B: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.49 (s, 4H), 3.20 (q, 2H), 1.37 (d, J = 6.81 Hz, 6H), 4.21 (t, 4H), 1.70 (m, 4H), 1.39 (m, 4H), 0.97 (t, 6H), 13C NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 51.64 (CH2), 58.69 (CH), 16.95 (CH3), 171.45 (COO-n-Bu), 65.77 (CH2-n-Bu), 30.37 (CH2-n-Bu), 19.00 (CH2-n-Bu), 13.55 (CH3-n-Bu). 2.1.5. Preparation of dichloro-(O,O0-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-propanoate)-palladium(II), [PdCl2(dpe-S,S-eddp)] The complex, [PdCl2(dpe-S,S-eddp)], (C3) was prepared as de- scribed in Section 2.1.3, using O,O0-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-propanoate dihydrochloride dihydrate, dpe-S,S-eddp 2HCl2H2O, (0.2780 g, 0.613 mmol) instead of dpr-S,S-eddp 2HCl3H2O. Yield: 0.19 g (59.65%). Anal. Calc. for C18H36Cl2N2O4Pd (Mr = 521.79): C, 41.43; H, 6.95; N, 5.37. Found: C, 40.92; H, 7.11; N, 5.33%. Isomer A: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.82 (s, 4H), 3.64 (q, 2H), 1.24 (d, J = 7.17 Hz, 6H), 4.14 (t, 4H), 1.85 (m, 4H), 1.31 (m, 4H), 1.39 (m, 4H), 0.90 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 48.64 (CH2), 57.27 (CH), 14.67 (CH3), 170.18 (COO-n-Pe), 65.72 (CH2-n-Pe), 48.64 (CH2-n-Pe), 27.85 (CH2-n- Pe), 22.14 (CH2-n-Pe), 13.79 (CH3-n-Pe). Isomer B: 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.50 (s, 4H), 3.21 (q, 2H), 1.26 (d, J = 7.17 Hz, 6H), 4.11 (t, 4H), 1.69 (m, 4H), 1.42 (m, 4H), 1.59 (m, 4H), 0.94 (t, 6H). 13C NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 51.62 (CH2), 58.67 (CH), 15.97 (CH3), 171.45 (COO-n-Pe), 66.04 (CH2-n-Pe), 51.62 (CH2-n-Pe), 28.24 (CH2-n-Pe), 22.10 (CH2-n-Pe), 13.87 (CH3-n-Pe). 2.2. In vitro antimicrobial assay 2.2.1. Test substances The tested compounds were dissolved in ethanol and then a Acta 363 (2010) 3606–3610 3607diluted into nutrient liquid medium to achieve a concentration of 10%. An antibiotic, doxycycline (Galenika A.D., Belgrade), was dissolved in nutrient liquid medium, a Mueller–Hinton broth concentration was 5% and lower). Each test included growth con- trol and sterility control. All tests were performed in duplicate and MICs were constant. Minimum bactericidal and fungicidal concentration was deter- mined by plating 10 lL of samples from wells, where no indicator color change was recorded, on nutrient agar medium. At the end of the incubation period the lowest concentration with no growth (no colony) was defined as minimum microbicidal concentration. 3. Results and discussion 3.1. Synthesis and characterization The synthesis of the propyl, butyl and pentyl esters of the (S,S)-ethylenediamine-N,N0-di-2-propanoic acid (H2-S,S-eddp) as a dihydrochoride, can be presented by the next reaction scheme (Scheme 1). The esters are slightly soluble in water and in common organic solvents. The [PdCl2(R2-S,S-eddp)] complexes were synthesized by mixing aqueous solution of the K2[PdCl4] and corresponding esters (Scheme 2). The resulting complexes are soluble in chloromethane, dichloromethane, threechloromethane and tetrachloromethane, methanol and ethanol, but not in water and other common organic solvents. The results of microanalysis confirmed the predicted con- tent of the isolated complexes. The most important bands in the infrared spectra of the isolated dialkyl esters (L1, L2 and L3) of the S,S-eddp ligand and corre- sponding palladium(II) complexes (C1, C2 and C3) are given in Table 1. The infrared spectra of the listed complexes confirm the expected N–N coordination of the R2-S,S-eddp ligands to the palla- RO 3 RO 3 imica Acta 363 (2010) 3606–3610(Torlak, Beograd), while an antimycotic, fluconazole (Pfizer Inc., USA) was dissolved in Sabouraud dextrose broth (Torlak, Belgrade). 2.2.2. Test microorganisms Antimicrobial activity of three palladium complexes was tested for 12 microorganisms including five strains of pathogenic bacteria (standard and clinical strains): Escherichia coli ATCC 25922, Entero- coccus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabilis (clinical isolate) and E. coli (clinical isolate); two species of pathogenic fungi Aspergillus fumigatus PMFKG-F23 and Aspergillus flavus PMFKG-F24 and one yeast speciesC. albicans; four species of probiotics: Lactobacillus plantarium PMFKG-P31, Bacillus subtilis IP 5832 PMFKG-P32, Bifidobacterium animalis subsp. Lactis PMFKG-P33 and Saccharomyces boulardii PMFKG-P34. All clinical isolates were a generous gift from the Institute of Public Health, Kragujevac. The other microorganisms were provided from a col- lection held by the Microbiology Laboratory Faculty of Science, University of Kragujevac. 2.2.3. Suspension preparation Bacterial suspensions and yeast suspension were prepared by the direct colony method. The colonies were taken directly from the plate and were suspended in 5 mL of sterile 0.85% saline. The turbidity of initial suspension was adjusted by comparing with 0.5 McFarland’s standard (0.5 mL 1.17% w/v BaCl22H2O + 99.5 mL 1% w/v H2SO4) [16]. When adjusted to the turbidity of the 0.5 McFarland’s standard, bacteria suspension contains about 108 col- ony forming unites (CFU)/mL and suspension of yeast contains 106 CFU/mL. Ten-hold dilutions of initial suspension were addi- tionally prepared into sterile 0.85% saline. The suspensions of fun- gal spores were prepared by gentle stripping of spore from slopes with growing aspergilli. The resulting suspensions were 1:1000 di- luted in sterile 0.85% saline to obtain inoculum of approximately 104 CFU/mL. 2.2.4. Microdilution method Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal or fungi- cidal concentration (MBC/MFC) by using microdilution plate meth- od [17]. The 96-well plates were prepared by dispensing 100 lL of nutrient broth, Mueller–Hinton broth for bacteria and Sabouraud dextrose broth for fungi and yeasts, into each well. A 100 lL from the stock solution of tested compound (concentration of 1000 lg/ mL) was added into the first row of the plate. Then, twofold, serial dilutions were performed by using a multichannel pipette. The ob- tained concentration range was from 500 to 0.24 lg/mL. A 10 lL of diluted bacterial, yeast suspension and suspension of spores was added to each well to give a final concentration of 5  105 CFU/ mL for bacteria and 5  103 CFU/mL for fungi and yeast. Finally, 10 lL resazurin solution was added to each well inoculated with bacteria and yeast. Resazurin is an oxidation–reduction indicator used for the evaluation of microbial growth. It is a blue non-fluo- rescent dye that becomes pink and fluorescent when reduced to resorufin by oxidoreductases within viable cells [18]. The inocu- lated plates were incubated at 37 C for 24 h for bacteria, 28 C for 48 h for the yeast and 28 C for 72 h for fungi. MIC was defined as the lowest concentration of tested substance that prevented res- azurin color change from blue to pink. For fungi, MIC values of the tested substance were determined as the lowest concentration that visibly inhibited mycelia growth. Doxycycline and fluconazole were used as a positive control. Solvent control test was performed to study an effect of 10% etha- nol on the growth of microorganism. It was observed that 10% eth- 3608 G.P. Vasic´ et al. / Inorganica Chanol did not inhibit the growth of microorganism. Also, in the experiment, the concentration of ethanol was additionally de- creased because of the twofold serial dilution assay (the workingNH NH RO O CH3 N N RO O CH3 Pd Cl Cl H H LiOHK2PdCl4 + 2HCldium(II) ion. Indication of the R2-S,S-eddp coordination via nitro- gen ligand atoms can be proved by the presence of the bands for NH NH HO HO O O CH3 CH3 + ROH NH NH RO RO O O CH3 CH3 2HClHCl R = n-Pr(L1), n-Bu(L2), n-Pe(L3) Scheme 1. The preparation of the propyl, butyl and pentyl esters of H2-S,S-eddp. O CH O CHR = n-Pr(C1), n-Bu(C2), n-Pe(C3) Scheme 2. The preparation of the [PdCl2(R2-S,S-eddp)]. secondary amino groups [3130 cm1 (C1); 3120 cm1 (C2) and 3118 cm1 (C3)] and none of the [PdCl2(R2-S,S-eddp)] show the absorption band for the protonated secondary ammonium group, as it was found in spectra of R2-S,S-eddp precursors [3461 cm1 (L1); 3461 cm1 (L2); 3462 cm1 (L3)] (Table 1). All other absorp- tion bands are found at almost the same positions as in the corre- sponding spectra of the free ligands, indicating that oxygen atoms from carboxylic groups are not coordinated. NMR spectroscopic data for all three complexes give proofs for their structures and N–N coordination R2-S,S-eddp esters to the palladium(II) ion. Chemical shifts arising from the carbon and hydrogen atoms of this type of esters are found at the expected positions [14,19,20]. Comparison of chemical shifts of methylene hydrogen atoms from ethylenediamine part of esters with chemical shifts of the same hydrogen atoms in the complexes (up to 0.9 ppm) indicates that the coordination of the R2-S,S-eddp esters performed via nitro- gen ester atoms. The number of the signals in 13C NMR spectra of the isolated [PdCl2(R2-S,S-eddp)] complexes confirm the coordination of the R2-S,S-eddp esters to the palladium(II) ion. By the coordination of the R2-S,S-eddp esters to the palladium(II) the both asymmetric carbon atoms from the eddp part of the molecule retain S absolute configurations. But, in the same time the nitrogen atoms from the diammine ring of the eddp ligand become asymmetric. Thus three diastereoisomers can be expected for [PdCl2(R2-S,S-eddp)] com- plexes [(R,R), (R,S „S,R) and (S,S), Fig. 1]. The (R,R) and (S,S) enan- tiomers, due to C2 symmetry, should give rise to one signal in NMR spectra, each for their ester branches. The last (R,S) diastereoisomer will give rise to two sets of NMR signals because the ester branches are not equivalent. The presence of two sets of signals in NMR spectra of the isolated complexes with different intensities sug- gests the mixture of the diastereoisomers, as it was concluded in previously published results [13a,20,21] for Pd(II) complexes with the same type of ligands. 3.2. Microbiology The results of in vitro testing antibacterial and antifungal activ- ities of the three new palladium complexes are shown in Table 2. For comparison, MIC and MBC/MFC values of doxycycline and fluconazole are also listed in Table 2. The solvent (10% ethanol) did not inhibit the growth of the tested microorganisms. The tested palladium(II) complexes showed different degrees of antimicrobial activity in relation to the tested species. The intensity of antimicro- bial action varied depending on the groups of microorganisms Table 1 The most important IR absorption bands of ligands and [PdCl2(R2-S,S-eddp)] complexes (cm1). Compound m(C@O) m(C–O) m(CH3) mðR—NH2þÞ m(R–NH) dpr-S,S-eddp.2HCl (L1) 1745 1231 2968 3461 – dbu-S,S-eddp.2HCl (L2) 1745 1223 2976 3461 – dpe-S,S-eddp.2HCl (L3) 1746 1231 2977 3462 – [PdCl2(dpr-S,S-eddp)] (C1) 1735 1215 2971 – 3130 [PdCl2(dbu-S,S-eddp)] (C2) 1740 1241 2960 – 3120 [PdCl2(dpe-S,S-eddp)] (C3) 1741 1229 2958 – 3118 Pd O C2 S,S) (R,S) R2-S G.P. Vasic´ et al. / Inorganica Chimica Acta 363 (2010) 3606–3610 3609Pd ClCl NN H H RO OR O O C2 (R) (R) (S) (S) Cl N H RO O (S) (S) (R,R) ( Fig. 1. Diastereoisomers of [PdCl2( Table 2 Antibacterial and antifungal activity of the tested [PdCl2(R2-S,S-eddp)] complexes and cor Species L1 C1 L2 MIC MMC MIC MMC MIC MM Escherichia coli ATCC 25922 >500 >500 125 250 125 >50 Enterococcus faecalis ATCC 29212 >500 >500 125 250 125 >50 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 >500 >500 125 250 >500 >50 Proteus mirabilis >500 >500 62.5 500 >500 >50 Escherichia coli 125 >500 62.5 125 31.25 >50 Bifidobacterium animalis subsp. lactis 125 >500 62.5 125 7.8 >50 Lactobacillus plantarum 125 >500 62.5 125 15.6 125 Bacillus subtilis IP 5832 125 >500 62.5 125 62.5 >50 Saccharomyces boulardii >500 >500 125 250 500 >50 Candida albicans >500 >500 125 250 >500 >50 Aspergillus fumigatus >500 >500 31.25 31.25 >500 >50 Aspergillus flavus >500 >500 0.49 0.49 >500 >50 MIC, minimum inhibitory concentration (lg/mL). MMC, minimum microbiocidal concentration (lg/mL). /, not tested.,S-eddp)], R = n-Pr, n-Bu and n-Pe. responding ligands. C2 L3 C3 Doxycycline /fluconazol C MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC/MMC MIC/MMC 0 125 125 125 >500 62.5 250 25/25 / 0 62.5 250 >500 >500 62.5 250 50/50 / 0 31.25 125 >250 >500 125 125 12.5/50 / 0 125 >500 >250 >500 125 125 50/>50 / 0 31.25 >250 >250 >500 125 >500 12.5/12.5 / 0 15.6 125 0.98 >31.25 125 >500 0.024/>0.19 / 15.6 125 1.95 >62.5 125 >500 0.012/>0.098 / 0 15.6 125 62.5 >500 62.5 >500 0.003/0.024 / 0 125 250 62.5 125 125 125 / 6.25/>50 0 125 500 500 500 125 125 / 3.125/>50 0 31.25 31.25 62.5 125 7.8 7.8 / >500 0 0.49 0.49 62.5 125 0.49 0.49 / >500Cl N H OR (S) (S) Pd ClCl NN H H RO OR O O (S) (R) (S) (S) (bacteria or fungi) and on the type and concentration of the complex. All three complexes demonstrated approximately similar activ- ity in relation to the tested standard and clinical strains of bacteria. Being compared to positive control, these complexes showed mod- erate antibacterial activity. MIC values were in range from 31.25 to 125 lg/mL, and MBC values from 125 to 500 lg/mL depending on the species of bacteria. The best activity was shown by [PdCl2(dbu- S,S-eddp)] to P. aeruginosa ATCC 27853 and E. coli (MIC was 31.25 lg/mL). The probiotics showed sensitivity similar to the sensitivity of the other bacteria to the tested complexes, except in the case of [PdCl2(dbu-S,S-eddp)]. The growth of Lactobacillus plantarum, B. subtilis IP 5832, B. animalis subsp. lactis was inhibited at concen- tration of 15.6 lg/mL [PdCl2(dbu-S,S-eddp)]. Compared to the tested fungi, the complexes showed significant antifungal activity. All three complexes inhibited the growth of A. flavus at concentration of 0.49 lg/mL while [PdCl2(dpe-S,S-eddp)] affected A. fumigatus at low concentration (MIC was 7.8 lg/mL). MIC values for yeast C. albicans were 125 lg/mL for all three com- plexes, while MFC was 250 lg/mL except for [PdCl2(dbu-S,S-eddp)] where it was 500 lg/mL. In most cases the activity of free ligands was lower than that of Acknowledgements The authors are grateful for financial support to the Ministry of Science and Technological Development (Project No. 142008) and EC under FP7 research potential program (GA No. 206809). References [1] B.T. Khan, J. Bhatt, K. Najmoddin, S. Shamsuddin, K. Annapoorna, J. Inorg. Biochem. 44 (1991) 55. [2] C. Navarro-Eanninger, J.M. Peréz, F. Zamora, V.M. Gonzáles, J.M. Masaguer, C. Alonso, J. Inorg. Biochem. 52 (1993) 37. [3] I. Brudzinska, Y. Mikata, M. Obata, C. Ohtsuki, S. Yano, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 2533. [4] A. Garoufis, S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis, Coord. Chem. Rev. 253 (2009) 1384. [5] W. Guerra, E. de Andrade Azevedo, A.R. de Souza Monteiro, M. Bucciarelli- Rodriguez, E. Chartone-Souza, A.M. Amaral Nascimento, A.P. Soares Fontes, L. Le Moyec, E.C. Pereira-Maia, J. Inorg. Biochem 99 (2005) 2348. [6] L.M.M. Vieira, M.V. de Almeida, M.C.S. Lourenço, F.A.F.M. Bezerra, A.P.S. Fontes, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 4107. [7] D. Kovala-Demertzi, M.A. Demertzis, J.R. Miller, C. Papadopoulou, C. Dodorou, G. Filousis, J. Inorg. Biochem. 86 (2001) 555. [8] R.R. Coombs, M.K. Ringer, J.M. Blacquiere, J.C. Smith, J.S. Neilsen, Y.-S. Uh, J.B. Gilbert, L.J. Leger, H. Zhang, A.M. Irving, S.L. Wheaton, C.M. Vogels, S.A. Westcott, A. Decken, F.J. Baerlocher, Transition Met. Chem. 30 (2005) 411. [9] M.A. Ali, A.H. Mirza, R.J. Butcher, K.A. Crouse, Transition Met. Chem. 31 (2006) 3610 G.P. Vasic´ et al. / Inorganica Chimica Acta 363 (2010) 3606–3610the complexes (Table 2). 4. Conclusion R2-S,S-eddp-type esters and the corresponding Pd(II) complexes were synthesized and characterized by IR, 1H and 13C NMR spec- troscopies and elemental analysis. From NMR spectra we can ob- serve the presence of the mixture of diastereoisomeric forms. The results of antimicrobial activity show that [PdCl2(R2-S,S- eddp)] complexes have significantly higher activity than corre- sponding ligands. The antimicrobial activities of complexes vary depending on the group of microorganisms and the type of com- plexes. Pd(II)-complexes showed limited activity to strains of path- ogenic bacteria (standard and clinical strains), probiotics and yeast. Fungi Aspergillus sp.were extremely sensitive to the reported com- plexes, so these complexes could be evaluated as potential phar- maceutical agents.79. [10] I. Kizilcikli, Y.D. Kurt, B. Akkurt, A.Y. Genel, S. Birteksöz, G. Ötük, B. Ülküseven, Folia Microbiol. 52 (2007) 15. [11] N.M. Aghatabay, M. Somer, M. Senel, B. Dulger, F. Gucin, Eur. J. Med. Chem. 42 (2007) 1069. [12] M.K. Biyala, K. Sharma, M. Swami, N. Fahmi, R. Vir Singh, Transition Met. Chem. 33 (2008) 377. [13] (a) B.B. Krajcˇinovic´, G.N. Kaludjerovic´, D. Steinborn, Ch. Wagner, K. Merzweiler, S.R. Trifunovic´, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 74 (2009) 389; (b) B.B. Zmejkovski, G.N. Kaludjerovic´, S. Gómez-Ruiz, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 74 (2009) 1249. [14] B.B. Krajcˇinovic´, G.N. Kaludjerovic´, D. Steinborn, H. Schmidt, Ch. Wagner, Z. Zˇizˇak, Z.D. Juranic´, S.R. Trifunovic´, T.J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 892. [15] L.N. Schoenberg, D.W. Cooke, C.F. Liu, Inorg. Chem. 7 (1968) 2386. [16] J.M. Andrews, J. Antimicrob. Chemother. 56 (2005) 60. [17] S.D. Sarker, L. Nahar, Y. Kumarasamy, Methods 42 (2007) 321. [18] E. Banfi, G. Scialino, C. Monti-Bragadin, J. Antimicrob. Chemother. 52 (2003) 796. [19] G.N. Kaludjerovic´, V.M. Djinovic´, Z.D. Juranic´, T.P. Stanojkovic, T.J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 488. [20] G.N. Kaludjerovic´, H. Schmidt, S. Schwieger, Ch. Wagner, R. Paschke, A. Dietrich, T. Mueller, D. Steinborn, Inorg. Chim. Acta 361 (2008) 1395. [21] B.B. Zmejkovski, G.N. Kaludjerovic´, S. Gómez-Ruiz, Z. Zizak, D. Steinborn, H. Schmidt, R. Paschke, Z. Juranic´, T. Sabo, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 3452. Palladium(II) complexes with R2edda-derived ligands. Part V. Reaction of O,O0-diethyl-(S,S)-ethylenediamine- N,N0-di-2-(3-methyl)butanoate with K2[PdCl4] Gordana P. Radic´ • Verica V. Glod¯ovic´ • Goran N. Kalud¯erovic´ • Frank W. Heinemann • Srec´ko R. Trifunovic´ Received: 27 December 2010 / Accepted: 18 February 2011 / Published online: 18 March 2011  Springer Science+Business Media B.V. 2011 Abstract The reaction of K2[PdCl4] with [(S,S)-H2(Et)2- eddv]Cl2 diester (O,O 0-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N0-di- 2-(3-methyl)butanoate) (1) resulted in [PdCl2{(S,S)-(Et)eddv- j2N,N0,jO}] (2) complex with one hydrolyzed ester group. The compound was characterized by spectroscopic meth- ods and it was found that the reaction is diastereoselective (1H and 13C NMR; one diastereoisomer of four possible). In addition, the structure of 2 was confirmed by X-ray diffraction analysis, indicating that the product is the (R,R)–N,N0-configured isomer. DFT calculations support the formation of one diastereoisomer of 2. Introduction The reactions between [H2(R)2eddp]Cl2 ligand precursors (R2eddp = esters of ethylenediamine-N,N 0-di-3-propanoic acid; R = Me, Et, nPr, nBu, nPe) and potassium hexa- chloroplatinate(IV) have been recently investigated. Depending on the R moiety, the reaction gave different products (Fig. 1a, b) [1, 2]. For R shorter than nBu, these reactions proceeded with the hydrolysis of the ester groups yielding trans-[PtCl2(eddp-j 2N,N0,j2O,O0)] (Fig. 1a), which was confirmed by X-ray structural analysis. On the other hand, when R was nBu or nPe, the isolated platinum(IV) complexes were [PtCl4(R2eddp-j 2N,N0)] with intact ester functions of the ligand (Fig. 1b) [1]. In contrast, sodium hexachloroplatinate(IV) reacted with homologous acetato [H2(R)2edda]Cl2 ligand precursors (esters of ethylenedia- mine-N,N0-diacetic acid; R = Me, Et, nPr) yielding only [PtCl4(R2edda-j 2N,N0)] complexes (Fig. 1c), without hydro- lysis of the ester function [2]. Chiral branched-chain [(S,S)-H2(R)2eddip]Cl2 esters [(S,S)- R2eddip = (S,S)-ethylenediamine-N,N 0-di-2-propanoic acid; R = Et, nPr, nBu, nPe, iPr, iBu] were also used in the synthesis of corresponding platinum(II/IV) complexes, [PtCln{(S,S)-R2eddip}] (n = 2, 4; Fig. 1d) [3]. The reaction of [(S,S)-H2(R)2eddip]Cl2 and hexachloroplatinate(IV) affords complexes in which the ligands have retained their ester functional groups without hydrolyzing. This class of platinum(II/IV) complexes is also interesting regarding antitumoral activity. In some cases, platinum(IV) complexes with R2edda-derived ligands showed higher cytotoxicity than cisplatin, and the kinetics of the tumor cell death process induced by these complexes is considerably faster in com- parison with that induced by cisplatin [4, 5]. Because of the similar coordination modes and chemical properties of palladium(II) and platinum(II) compounds (besides the fact that palladium(II) complexes are kineti- cally less stable than platinum(II) complexes [6, 7]), syn- thesis and characterization of palladium(II) complexes with edta tetraalkyl esters and ethylenediammonium-N,N0-di-3- propanoic acid were performed [8, 9]. Nevertheless, some G. P. Radic´  V. V. Glod¯ovic´  S. R. Trifunovic´ (&) Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Domanovic´a 12, 34000 Kragujevac, Serbia e-mail: srecko@kg.ac.rs G. N. Kalud¯erovic´ (&) Institut fu¨r Chemie, Martin-Luther-Universita¨t Halle- Wittenberg, Kurt-Mothes-Strabe 2, 06120 Halle, Germany e-mail: goran.kaluderovic@chemie.uni-halle.de G. N. Kalud¯erovic´ Biozentrum, Martin-Luther-Universita¨t Halle-Wittenberg, Weinbergweg 22, 06120 Halle, Germany F. W. Heinemann Department of Chemistry and Pharmacy, Inorganic Chemistry, Universita¨t Erlangen-Nu¨rnberg, Egerlandstrasse 1, 91058 Erlangen, Germany 123 Transition Met Chem (2011) 36:331–336 DOI 10.1007/s11243-011-9473-3 palladium(II) complexes with R2edda-derived ligands exhibited very high antiproliferative activity [10–13]. Fur- thermore, the diisopropyl ester of (S,S)-eddip reacts with K2[PdCl4] and yields two complexes [PdCl2{(S,S)-(iPr)2ed- dip}] and [PdCl{(S,S)-(iPr)eddip}] (Fig. 1e, f), with intact and with partly hydrolyzed ester ligand, respectively. The reactivity of K2[PdCl4] with [(S,S)-H2(Et)2eddv]Cl2 diester ligand precursor is reported further in this paper. The obtained compound 2 was characterized by IR, 1H and 13C NMR spectroscopy, elemental analysis, and X-ray crystallography. In addition, DFT calculations were per- formed for four possible diastereoisomers of the complex. Experimental All chemicals were obtained commercially and used without further purification. For infrared spectra, a Perkin- Elmer Spectrum One FT-IR spectrometer was employed. 1H and 13C NMR spectra were recorded on a Varian ‘‘Gemini 2000’’ (200 MHz) NMR spectrometer in CDCl3 using tetramethylsilane as internal standard for the com- plex and in D2O using tetramethylsilane as internal stan- dard for the ligand precursor. Elemental analyses for C, H, and N were done on a Vario III C, H, N, S Elemental Analyzer, Elemental Analysensystem GmbH. Synthesis of O,O0-diethyl ester of the (S,S)- ethylenediamine-N,N0-di-2-(3-methyl)butanoic acid dihydrochloride, [(S,S)-H2(Et)2eddv]Cl2 1 [(S,S)-H2(Et)2eddv]Cl2, 1, (Fig. 2) was prepared using an esterification reaction as previously described [14]. To 50 mL of dry ethanol, saturated with HCl gas, 2 g (6 mmol) of [(S,S)-H4eddv]Cl2 was added and the mixture was refluxed for 12 h. The mixture was filtered and left in the refrigerator overnight. The obtained white powder was fil- tered and air-dried. Yield: 1.21 g (51.71%). Found: C, 49.84; H, 8.41; N, 7.37 (%). Anal. Calcd. for 1, C16H34Cl2N2O4: C, 49.35; H, 8.80; N, 7.20. IR (cm-1): 3,414.93, 2,977.11, 2,759.11, 2,533.10, 1,733.29, 1,469, 1,227.63, 1,047, 850.93, 563.48. 1H NMR (200 MHz, D2O, d, ppm): 1.1 (m, 12H, C5,6H3), 1.35 (t, 6H, C 8H3), 2.41 (m, 4H, C 1H2), 3.62 (m, 2H, C4H), 3.69 (d, 2H, C2H), 4.34 (q, 4H, C7H2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, d, ppm): 16.25 (C 8), 20.93 (C5), 21.07 (C6), 32.58 (C4), 46.20 (C1), 68.64 (C2), 70.30 (C7), 173.77 (C3). Synthesis of {PdCl[(S,S)-(Et)eddv)]}, 2 K2[PdCl4] (0.200 g, 0.613 mmol) was dissolved in water (10 mL) on a steam bath and 1 (0.2546 g, 0.613 mmol) was added. The mixture was stirred for 2 h, and during this period, a solution of LiOH (0.0294 g, 1.226 mmol in 10 mL of water) was introduced. The complex, {PdCl[(S,S)-(Et)- eddv)]}, 2 (Fig. 2) as a yellow precipitate, was filtered off, washed with water, and air-dried. The compound was crystalized from DMSO–water. Yield: 0.1473 g (61.02%). Found: C, 39.34; H, 6.41; N, 6.38 (%). Anal. Calcd. for 2, C14H27ClN2O4Pd: C, 39.17; H, 6.34; N, 6.53. IR (cm -1): 3,435.93, 3,177.78, 3,108.09, 2,970.05, 1,735.14, 1,640.49, 1,394.11, 1,266.68, 1,197.50, 1,022.50, 865.20, 591.67, 463.46. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d, ppm): 0.95 (d, 6H, C6,7H3), 1.02 (d, 6H, C 11,12H3), 1.25 (t, 3H, C 15H3), 2.23 (m, 4H, C1,2H2), 2.45 (q, 1H, C 3H), 2.87 (q, 1H, C10H), 3.91 (d, 1H, C9H), 4.16 (d, 1H, C5H), 4.45 (q, 2H, C14H2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, d, ppm): 14.23 (C 15), 17.93 (C6,7), 19.34 (C11,12), 28.41 (C10), 30.58 (C3), 46.95 (C1), 49.76 (C2), 50.52 (C5), 61.88 (C9), 68.01 (C14), 169.25 (C4), 171.93 (C13). X-ray crystallographic data collection and refinement A single crystal of the complex suitable for X-ray data collection was mounted on a Bruker-Nonius Kappa CCD Fig. 2 Numbering of compounds used for NMR data Fig. 1 Platinum(II/IV) and palladium(II) complexes containing R2edda-derived ligands 332 Transition Met Chem (2011) 36:331–336 123 diffractometer equipped with graphite-monochromated MoKa (k = 0.71073 A˚) radiation. The diffraction inten- sities were corrected for Lorentz and polarization effects. The absorption effects were corrected on semiempirical basis using multiple scan (SADABS) [15]. The structure was solved by direct methods and refined by full-matrix, least-square calculations against F2 [16]. All non-hydro- gen atoms were refined with anisotropic displacement parameters. The positions of all hydrogen atoms were derived from a difference Fourier synthesis, and all hydrogen atoms were refined with individual isotropic displacement parameters. Disorder was observed for the atoms O3, O4, and C9–C15, where two different orien- tations were refined, resulting in site occupancy factors of 64(1) % for the major fraction and 36(1) % for the minor fraction (O3A, O4A, C9A–C15A). SAME restraints were applied in the refinement of the disordered structure part (atoms O3–C15 and O3A–C15A). SIMU restraints were used for the refinement of the atoms O4, O4A, C14, and C14A, and ISOR restraints for the atoms C9A, C12, C15, and C15A. The distances N1–C9 and N1–C9A were restricted to be of approximately the same length using an SADI restraint. Empirical formula, C14H27ClN2O4Pd; formula weight, 429.23; crystal system, orthorhombic; space group, P212121; a (A˚), 6.1062(2); b (A˚), 10.5325(4); c (A˚), 29.115(1); a = b = c (), 90; volume (A˚3), 1,872.5(1); Z, 4; Dcalcd (g cm -3), 1.523; l Mo-Ka (mm-1), 1.150; F(000), 880; hranged (), 3.40–27.10; refln. collected, 4,136; refln. observed [I [ 2r(I)], 3,775; refln. independent, 4,136; data/restrains/parameters, 4136/60/289; goodness of fit (F2), 1.031; R1 [I [ 2r(I)], 0.0574; wR2, 01376; R1 (all data), 0.0627; wR2, 0.1400; Dq (e/A˚3), 1.53/–2.36. CCDC 795802 contains the supplementary crystallo- graphic data for this paper. These data can be obtained free of charge from The Cambridge Crystallographic Data Centre via www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif. Computational details Geometry optimizations were performed by the Gaussian 03 package [17]. All the structures were optimized using the MPW1PW91 functional [18]. The SDD basis set for all atoms was employed in the calculations [19, 20]. The appropriateness of the chosen functional and basis set for palladium has been stated elsewhere [21]. All sys- tems were optimized without symmetry restrictions. The resulting geometries were characterized as equilibrium structures by the analysis of the force constants of normal vibrations. Supplementary data associated with quantum chemical calculations can be obtained from the authors upon request. Results and discussion The reaction of an aqueous solution containing ligand precursor [(S,S)-H2(Et)2eddv]Cl2 with the solution of a K2[PdCl4] followed by the addition of a stoichiometric amount of base (molar ratio 1:1:2) results in the formation of 2 (Scheme 1). The j2N,N0,jO coordination mode of [(S,S)- (Et)eddv]- ligand in 2 arises from the hydrolysis of one of the two ester groups of the original [(S,S)-(Et)2eddv] ligand. Spectroscopic properties The IR spectrum of compound 2 shows specific absorption bands m(C=O) at 1,735 cm-1 (strong) (typical absorption for aliphatic esters), m(C–O) at 1,230 cm-1 (strong), m(CH3) at 2,970 cm-1 (medium) (for comparison 1: 1,733, 1,228, and 2,977 cm-1, respectively [3]). For 2, there are two absorption bands for m(C=O) at 1,735 and 1,640 cm-1, which indicates two different C=O groups, being in correspondence with hydrolysis of one of the ethyl groups, and coordination of the residual oxygen atom. The m(N–H) absorption bands at 3,215 (for 1) and 3,177 cm-1 (2) (both typical absorptions for secondary amino groups) may indicate that coordination occurred via nitrogen atoms [1–3]. The constitution of complex 2 has been proved by NMR spectroscopic measurements. In the 1H NMR spectrum, the signals of methylene hydrogen atoms from ethylenedia- mine moiety show shifts up to 0.9 ppm, which indicate that the coordination occurred via nitrogen atoms. Chemical shifts for carbon atoms belonging to the COO moiety were found in the same area but at very different shift values in the 13C NMR spectrum. From comparison of the 13C NMR spectra of 1 and previously reported [PdCl{(S,S)-(iPr)ed- dip}] complex with 2, it can be concluded that the signal at 169.2 ppm belongs to the ester carbon atom, and the signal at 171.9 ppm belongs to the carbon atom of the carboxyl group that participates in coordination with its oxygen atom. The coordination of the N atoms gives rise to the formation of chiral centers, thus in principle four diaste- reoisomers are possible: (R,R)-, (S,S)-, (S,R)-, and (R,S)-2 (vide infra Quantum Chemical Calculations), but only one set of signals was found in both 1H and 13C NMR spectra. Scheme 1 Reaction of K2[PdCl4] with [(S,S)-H2(Et)2eddv]Cl2 Transition Met Chem (2011) 36:331–336 333 123 Solid-state structure of 2 The complex [PdCl{(S,S)-(Et)eddv}] is found to crystallize in orthorhombic crystal system in the chiral space group P212121. The molecular structure is shown in Fig. 3, and selected bond lengths and angles are listed in Table 1. The Pd atom is in a square–planar coordination geometry with one tridentate [(S,S)-(Et)eddv]- ligand coordinated through one carboxylic oxygen and two nitrogen atoms (j2N,N0,jO coordination mode). The chloro ligand occupies the fourth coordination site. A five-membered ring is formed by the coordination of the [(S,S)-(Et)eddv]- ligand to Pd(II), and ethylenediamine and aminocarboxylato are in envelope conformation on C2 and N2, respectively. The X-ray structural analysis showed that the isolated compound is the (R,R)–N,N0-configured isomer. The Pd–N bond lengths (2.028(7) and 2.043(7) A˚) are comparable with those found in [PdCl{(S,S)-(iPr)eddip}] complex (1.995(5)–2.047(6) A˚) [22] and in Pd(II) com- plexes with ethylenediamine ligands (2.03–2.09 A˚) [23, 24]. On the other hand, the Pd–N bond lengths are shorter than those found in palladium complexes with edta tetra- alkyl ester ligands (2.098(4)–2.106(7) A˚) [8, 25–27]. The Pd–O bond length in 2 (1.990(6) A˚) is shorter than that in [PdCl{(S,S)-(iPr)eddip}] (2.019(5) A˚) but within the range of values for five- and six-membered chelates containing Pd–O bonds (1.999(6)–2.105(3) A˚) [28, 29]. Also, the Pd– Cl bond length (2.308(2) A˚) is shorter than in [PdCl{(S,S)- (iPr)eddip}] (2.325(1) A˚) and comparable with those found in [PdCl2(R4edta)] and [PdCl2(edta)]xH2O complexes (R = Me, Et; x = 5, 6; 2.287(2)–2.298(2) and 2.30(1) A˚, respectively) [8, 26, 27]. Intramolecular N1–HO2 (N1O2 = 2.838(9) A˚) and intermolecular N1–HO3 (N1O3 = 2.997(8) A˚) hydro- gen bonds were observed in the structure of [PdCl{(S,S)- (iPr)eddip}], while in the structure of 2, two intermolecular hydrogen bonds are found (N1–H1O2 = 3.002(9) A˚ and N2–H2Cl1 = 3.263(7) A˚). Apart from this, some non- classical intramolecular C–HA (C1O3 = 3.07(1) A˚, C6O2 = 2.99(2) A˚, C9Cl1 = 3.36(1) A˚, C14O3 = 2.78(3) A˚) and intermolecular C–HO interactions (C2O1 = 3.26(1) A˚) were located [30]. Quantum chemical calculations In order to investigate the selectivity of formation of only one of the four possible isomers of 2, quantum chemical Fig. 3 Molecular structure of [PdCl{(S,S)-(Et)eddv}] (2) (50% probability ellipsoids, hydrogen atoms drawn at arbitrary size, disorder not shown for clarity) Table 1 Selected experimentally found bond lengths (A˚) and angles () in molecular structure of 2 and calculated values (2c) for diaste- reoisomers of 2 Compound 2 (R,R)-2c (R,S)-2c (S,R)-2c (S,S)-2c A˚,  Pd–N2 2.028(7) 2.051 2.054 2.075 2.055 Pd–O1 1.990(6) 1.990 1.991 2.011 2.007 Pd–N1 2.043(7) 2.079 2.095 2.120 2.099 Pd–Cl1 2.308(2) 2.345 2.342 2.345 2.343 C4–O1 1.30 (1) 1.332 1.332 1.349 1.338 C4–O2 1.21(1) 1.243 1.243 1.259 1.243 C13–O3 1.18(2) 1.234 1.231 1.274 1.232 C13–O4 1.345(2) 1.378 1.370 1.464 1.367 C14–O4 1.49(2) 1.480 1.480 1.488 1.481 C2–N2 1.486(9) 1.498 1.493 1.522 1.496 C1–N1 1.51(1) 1.499 1.505 1.529 1.508 N2–Pd–N1 87.4(3) 87.2 87.6 85.8 84.9 N2–Pd–Cl1 176.5(2) 177.0 176.0 179.1 175.7 O1–Pd–N1 169.9(3) 169.6 170.0 165.1 161.0 O1–Pd–Cl1 93.2(2) 97.4 95.4 98.6 95.9 O1–Pd–N2 83.3(3) 83.1 82.5 81.2 84.4 N1–Pd–Cl1 96.1(2) 92.0 94.5 94.3 93.6 N2–C2–C1 109.2(7) 108.3 108.6 110.8 106.6 N1–C1–C2 108.4(7) 109.8 112.2 107.6 111.9 Pd–N1–C1 104.8(5) 105.2 104.2 100.3 105.1 Pd–N1–C9 122(1) 116.7 122.1 118.2 123.8 Pd–N2–C2 103.1(5) 103.4 104.4 107.0 99.0 Pd–N2–C3 106.5(5) 107.5 107.6 102.2 108.9 334 Transition Met Chem (2011) 36:331–336 123 calculations were employed. DFT calculations were con- ducted for the isomers resulting from the coordination of [(S,S)-(Et)eddv]- to the chloropalladium(II) moiety. The structures were fully optimized without any symmetry constraints and were found to represent equilibrium struc- tures. Optimized structures of the [PdCl{(S,S)-(Et)eddv}] complex (2c) were represented in Fig. 4. From the quantum chemical calculations, it is obvious that three of the four isomers of 2c have more strain, and they are higher in energy than (R,R)-2c by 4.4–59.8 kcal/ mol (Fig. 4). Therefore, this indicates that the (R,R)-2c isomer is thermodynamically more stable than the other isomers and that the energy differences correlate well with the results from X-ray crystallography and NMR spectro- scopic investigations. As can be seen from comparison of calculated and experimental bond lengths and angles shown in Table 1, the calculated values for (R,R)-2c are well matched with the results obtained from X-ray struc- tural analysis. Conclusion The present investigation shows that [(S,S)-H2(Et)2- eddv]Cl2 ligand precursor reacts with K2[PdCl4] yielding a palladium(II) complex with partly hydrolyzed ester [PdCl{(S,S)-(Et)eddv}] (2). The reaction is diastereose- lective, and only one out of the four possible diastere- oisomers was formed, (R,R)-2 (1H and 13C NMR spectroscopy, X-ray structural analysis). Quantum chemi- cal calculations for 2 supported formation of (R,R)-N,N0 diastereoisomer for 2. Acknowledgments The authors are grateful to the Ministry of Science and Environmental Protection of the Republic of Serbia for financial support (Grant No. 172016). References 1. Kalud¯rovic´ GN, Ðinovic´ VM, Juranic´ ZD, Stanojkovic´ TP, Sabo TJ (2005) J Inorg Biochem 99:488 2. Kalud¯erovic´ GN, Schmidt H, Schwieger S, Wagner Ch, Paschke R, Dietrich A, Mueller T, Steinborn D (2008) Inorg Chim Acta 361:1395 3. Krajcˇinovic´ BB, Kalud¯erovic´ GN, Steinborn D, Schmidt H, Wagner Ch, Zˇizˇak Zˇ, Juranic´ ZD, Trifunovic´ SR, Sabo TJ (2008) J Inorg Biochem 102:892 4. Kalud¯erovic´ GN, Miljkovic´ D, Momcˇilovic´ M, Ðinovic´ VM, Mostarica-Stojkovic´ M, Sabo TJ, Trajkovic´ V (2005) Int J Cancer 116:479 5. Mijatovic´ S, Maksimovic´-Ivanic´ D, Radovica J, Miljkovic´ D, Kalud¯erovic´ GN, Sabo TJ, Trajkovic´ V (2005) Cell Mol Life Sci 62:1275 6. Ruiz J, Lorenzo J, Sanglas L, Cutillas N, Vicente C, Villa MD, Avile´s FX, Lo´pez G, Moreno V, Pe´rez J, Bautista D (2006) Inorg Chem 45:6347 7. Jamieson ER, Lippard SJ (1999) Chem Rev 99:2467 8. Kalud¯erovic´ GN, Schmidt H, Wagner Ch, Merzweiler K, Stein- born D (2007) Collect Czech Chem Commun 72:560 9. Kalud¯erovic´ GN, Heinemann FW, Knezˇevic´ NZˇ, Trifunovic´ SR, Sabo TJ (2004) J Chem Crystall 34:185 10. Brudzin˜ska I, Mikata Y, Obata M, Ohtsuki Ch, Yano Sh (2004) Bioorg Med Chem Lett 14:2533 Fig. 4 Theoretically determined structures (DFT calculations) of [PdCl2{(S,S)- (Et)eddv}] (2c) (energies are relative to the most stable isomer (R,R)-2c) Transition Met Chem (2011) 36:331–336 335 123 11. Khan BT, Bhatt J, Najmuddin K, Shamsuddin S, Annapoorna KJ (1991) J Inorg Biochem 44:55 12. Navarro-Ranninger C, Pe´rez JM, Zamora F, Gonza´lez VM, Masaguer JR, Alonso C (1993) J Inorg Biochem 52:37 13. Vujic´ JM, Cvijovic´ M, Kalud¯erovic´ GN, Milovanovic´ M, Zmej- kovski BB, Volarevic´ V, Arsenijevic´ N, Sabo TJ, Trifunovic´ SR (2010) Eur J Med Chem 45:3601 14. Sabo TJ, Kalud¯erovic´ GN, Grguric´-Sˇipka SR, Heinemann FW, Trifunovic´ SR (2004) Inorg Chem Commun 7:241 15. SADABS 2.06, Bruker AXS Inc. (2002) Madison WI, USA 16. SHELXTL NT 6.12, Bruker-AXS Inc. (2002) Madison, WI, USA 17. Frisch MJ, Trucks GW, Schlegel HB, Scuseria GE, Robb MA, Cheeseman JR, Montgomery JA, Vreven JrT, Kudin KN, Burant JC, Millam JM, Iyengar SS, Tomasi J, Barone V, Mennucci B, Cossi M, Scalmani G, Rega N, Petersson GA, Nakatsuji H, Hada M, Ehara M, Toyota K, Fukuda R, Hasegawa J, Ishida M, Nak- ajima T, Honda Y, Kitao O, Nakai H, Klene M, Li X, Knox JE, Hratchian HP, Cross JB, Bakken V, Adamo C, Jaramillo J, Gomperts R, Stratmann RE, Yazyev O, Austin AJ, Cammi R, Pomelli C, Ochterski JW, Ayala PY, Morokuma K, Voth GA, Salvador P, Dannenberg JJ, Zakrzewski VG, Dapprich S, Daniels AD, Strain MC, Farkas O, Malick DK, Rabuck AD, Raghava- chari K, Foresman JB, Ortiz JV, Cui Q, Baboul AG, Clifford S, Cioslowski J, Stefanov BB, Liu G, Liashenko A, Piskorz P, Komaromi I, Martin RL, Fox DJ, Keith T, Al-Laham MA, Peng CY, Nanayakkara A, Challacombe M, Gill PMW, Johnson B, Chen W, Wong MW, Gonzalez C (2004) GAUSSIAN 03 Revi- sion C.02 Gaussian JA Pople Inc Wallingford CT 18. Adamo C, Barone V (1997) Chem Phys Lett 274:242 19. Dunning TH Jr, Hay PJ (1976) Modern theoretical chemistry, vol 3, 3rd edn. Plenum, New York, p 1 20. Andrae D, Ha¨ußermann U, Dolg M, Stoll H, Preuß H (1990) Theor Chem Acc 77:123 21. De Iuliis MZ, Watson IDG, Yudin AK, Morris RH (2009) Can J Chem 87:54 22. Krajcˇinovic´ BB, Kalud¯erovic´ GN, Steinborn D, Schmidt H, Wagner C, Merzweiler K, Trifunovic´ SR, Sabo TJ (2009) J Serb Chem Soc 74:389 23. Baggio S, Amzel LM, Becka LN (1970) Acta Cryst B 26:1698 24. Wiesner JR, Lingafelter EC (1966) Inorg Chem 5:1770 25. Kaplun M, Sandstro¨m M, Bostro¨m D, Shchukarev A, Peresson P (2005) Inorganica Chim Acta 358:527 26. Robinson DJ, Kennard CHL (1970) J Chem Soc A 1008 27. Luo X-M, Chen X-H, Shanmuga Sundara Raj S, Fun H-K, Zhu L-G (1999) Acta Crystallogr C 55:1220 28. Singh AK, Sooriyakumar J, Husebye S, Tornroos KW (2000) J Organomet Chem 612:46 29. Billodeaux DR, Fronczek FR, Yoneda A, Newkome GR (1998) Acta Cryst C 54:1439 30. Steiner TH (1996) Cryst Rev 6:1 336 Transition Met Chem (2011) 36:331–336 123 b a c oj Sr 12, man 014, a r t i c l e i n f o Article history: Received 24 May 2011 Accepted 24 August 2011 a b s t r a c t complexes based on the palladium(II) ion have been synthesized and their different biological activities have been documented [9–11]. The impact of different palladium complexes on the growth and metabolism of various groups of microorganisms has been studied. Garoufis et al. [12] reviewed numerous scientific papers on anti-viral, antibacterial and antifungal activity of palladium(II) complexes with different types of ligands (sulfur and nitrogen do- nor ligands, Schiff base ligands and drugs as ligands). There are the in vitro antimicrobial activity of the ligands and the complexes. The structures of the isolated complexes are proposed on the basis of their infrared, 1H and 13C NMR spectra. The structures as well as the cis geometrical configurations of the isolated complexes are proposed on the basis of an X-ray structural study of the cis-S- cis-O bis(S-benzyl-thiosalicylate)–palladium(II) [Pd(S-bz-thiosal)2] complex. Our investigations are focused on the impact of the newly synthesized Pd(II) complexes on probiotics, since they are used as supplements and they play a significant role in the protection and maintenance of the balance of intestinal microflora during antibi- otic therapy. ⇑ Corresponding author. Polyhedron 31 (2012) 69–76 Contents lists available at e .eE-mail address: srecko@kg.ac.rs (S.R. Trifunovic´).1. Introduction Thiosalicylic acid and its derivatives have many various applica- tions: as reagents for metal determination [1,2], modificators for graphite paste electrodes [3], as photoinitiators for free radical polymerization [4] and in cosmetics in hair growth treatment [5]. They are useful in numerous disease treatments, in particular inflammatory, allergic and respiratory diseases [6] as well as Ras- tumor growth inhibitors [7]. Ketones derived from thiosalicylic acids have application as bile acid transport inhibitors [8]. The synthesis and evaluation of the biological activity of new metal-based compounds are fields of growing interest. Numerous other papers in the literature showing different intensities of palla- dium complex activity on various species of bacteria and fungi [13–20]. S-Alkyl (alkyl = benzyl, methyl, ethyl, propyl and butyl) derivatives of thiosalicylic acid have already been prepared and characterized using IR and elemental microanalysis [21–24], and the S-methyl derivate has also been characterized using NMR spec- troscopy [22,23]. Thiosalicylic acid has been used for the synthesis of palla- dium(II) complexes [25–28], but corresponding S-alkyl derivatives have not. Our investigations are focused on the synthesis of the corresponding Pd(II) complexes of S-alkyl derivatives as well asAvailable online 21 September 2011 Keywords: Palladium(II) complexes Crystal structure IR, 1H and 13C NMR spectroscopy Antimicrobial activity0277-5387/$ - see front matter  2011 Elsevier Ltd. A doi:10.1016/j.poly.2011.08.042S-Alkyl (R = benzyl, methyl, ethyl, propyl and butyl) derivatives of thiosalicylic acid and the correspond- ing palladium(II) complexes were prepared and their structures were proposed on the basis of infrared, 1H and 13C NMR spectroscopy. The cis geometrical configurations of the isolated complexes were pro- posed on the basis of an X-ray structural study of the bis(S-benzyl-thiosalicylate)–palladium(II), [Pd(S- bz-thiosal)2] complex. Antimicrobial activity of the tested compounds was evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum microbicidal concentration (MMC) in relation to 26 species of micro- organisms. The tested ligands, with a few exceptions, show low antimicrobial activity. The palladium(II) complexes, [Pd(S-R-thiosal)2], have statistically significant higher activity than the corresponding ligands. The complexes [Pd(S-et-thiosal)2] and [Pd(S-pro-thiosal)2] displayed the strongest activity amongst the all tested compounds. The palladium(II) complexes show selective and moderate antibacterial activity and significant antifungal activity. The most sensitive were Aspergillus fumigatus and Aspergillus flavus.  2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.Synthesis, characterization and antimicro with some alkyl derivates of thiosalicylic bis(S-benzyl-thiosalicylate)–palladium(II) Gordana P. Radic´ a, Verica V. Glo -dovic´ a, Ivana D. Rad Zoran R. Ratkovic´ a, Arto Valkonen c, Kari Rissanen c, aDepartment of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Domanovic´a bDepartment of Biology and Ecology, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Do cNanoscience Center, Department of Chemistry, University of Jyväskylä, P.O. Box 35, 40 Polyh journal homepage: wwwll rights reserved.ial activity of palladium(II) complexes cids: Crystal structure of the omplex, [Pd(S-bz-thiosal)2] evic´ b, Olgica D. Stefanovic´ b, Ljiljana R. Cˇomic´ b, ec´ko R. Trifunovic´ a,⇑ 34000 Kragujevac, Serbia ovic´a 12, 34000 Kragujevac, Serbia Finland SciVerse ScienceDirect dron l sevier .com/locate /poly S-Propyl-thiosalicylic acid (L4): M.p. 104 C, white powder. IR (KBr, cm1): 3414, 3056, 2979, 2641, 2555, 1678, 1588, 1562, hedr1462, 1405, 1310, 1271, 1257, 1150, 1062, 1053, 811, 740, 704, 691, 653, 554. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 1.1 (t, 3H, CH3), 1.74 (m, 2H, CH2), 2.92 (t, 2H, CH2), 7.15–8.15 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, d ppm): 13.8 (CH3), 21.6 (CH2), 34.1 (CH2), 123.8, 125.6, 126.2, 132.5, 133.1, 143.1 (Ar), 171.6 (COOH). S-Butyl-thiosalicylic acid (L5): M.p. 82–83 C, white powder. IR (KBr, cm1): 3420, 2955, 2869, 2641, 2556, 1674, 1586, 1560, 1462, 1408, 1320, 1270, 1250, 1153, 1060, 1048, 924, 810, 738, 704, 651, 553. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 0.96 (t, 3H, CH3), 1.46 (m, 2H, CH2), 1.78 (m, 2H, CH2), 2.94 (t, 2H, CH2),2. Experimental 2.1. Chemistry 2.1.1. Reagents and instruments All chemicals were obtained commercially and used without further purification. For the infrared spectra, a Perkin–Elmer Spec- trum One FT-IR spectrometer was employed. Elemental microanal- yses for C, H and S were performed by standard methods on a Vario III CHNS Elemental Analyzer, Elemental Analysensysteme GmbH. 2.1.2. General procedure for the synthesis of S-alkyl thiosalicylic acids (L1)–(L5) The thioacid ligands L1–L5 were prepared by alkylation of thio- salicylic acid by means of the corresponding alkyl halogenides in alkaline water–ethanol solution. Thiosalicylic acid (1 mmol) was added to a 100 cm3 round bot- tom flask containing 50 cm3 of 3a 0% solution of ethanol in water and stirred. A solution of NaOH (2 mmol in 5 cm3 of water) was added to the acid suspension, whereupon the solution became clear. The corresponding alkyl halogenide (2 mmol) was dissolved in 5 cm3 of ethanol and transferred to the stirred solution. The resulting mixture was kept overnight at 60 C. The reaction mix- ture was transferred into a beaker and ethanol was evaporated off on a water bath. Diluted hydrochloric acid (2 mol/dm3) was added to the resulting water solution and S-alkyl thiosalicylic acid was precipitated as a white powder. The liberated acid was filtered off and washed with plenty of distilled water. The product was dried under vacuum overnight. Yield: 85–95%. S-Benzyl-thiosalicylic acid (L1): M.p. 179–180 C, white powder. IR (KBr, cm1): 3414, 3061, 2920, 2648, 2559, 1674, 1584, 1562, 1463, 1412, 1317, 1272, 1255, 1154, 1062, 1046, 897, 743, 711, 652, 551. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 4.17 (s, 2H, CH2), 7.21–8.14 (m, 9H, Ar and bz). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, d ppm): 35.9 (CH2), 124.1, 125.9, 126.7, 127.3, 127.9, 128.3, 128.6, 129.3, 131.0, 132.4, 136.8, 141.3 (Ar and bz), 167.5 (COOH). S-Methyl-thiosalicylic acid (L2): M.p. 165–166 C, white powder. IR (KBr, cm1): 3446, 3068, 2916, 2652, 2560, 1674, 1586, 1561, 1466, 1412, 1308, 1291, 1270, 1255, 1151, 1062, 1048, 892, 743, 699, 652, 556. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 2.48 (s, 3H, CH3), 7.16–8.18 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, d ppm): 15.6 (CH3), 123.5, 124.4, 125.4, 132.5, 133.6, 144.4 (Ar), 171.6 (COOH). S-Ethyl-thiosalicylic acid (L3):M.p. 133–134 C, white powder. IR (KBr, cm1): 3435, 3066, 2972, 2652, 2562, 1682, 1588, 1563, 1466, 1414, 1315, 1275, 1252, 1152, 1063, 1049, 884, 740, 704, 690, 651, 550. 1H NMR (200 MHz, CDCl3, d ppm): 1.42 (t, 3H, CH3), 2.97 (q, 2H, CH2), 7.16–8.17 (m, 4H, Ar). 13C NMR (50 MHz, CDCl3, d ppm): 13.1 (CH3), 26.2 (CH2), 124.0, 125.9, 126.4, 132.6, 133.2, 142.9 (Ar), 171.4 (COOH). 70 G.P. Radic´ et al. / Poly7.15–8.16 (m, 4H, Ar). NMR (50 MHz, CDCl3, d ppm): 13.7 (CH3), 22.3 (CH2), 30.2 (CH2), 31.9 (CH2), 123.8, 125.7, 126.3, 132.5, 133.1, 143.1 (Ar), 171.4 (COOH).2.1.3. Preparation of the bis(S-benzyl-thiosalicylate)–palladium(II) complex, [Pd(S-bz-thiosal)2] (C1) K2[PdCl4] (0.100 g, 0.3065 mmol) was dissolved in 10 cm3 of water on a steam bath and (S-benzyl)-2-thiosalicylic acid (0.1497 g, 0.613 mmol) was added into the solution. The resulting mixture was stirred for 2 h and during this time an aqueous solu- tion of LiOH (0.0256 g, 0.613 mmol in 10 cm3 of water) was intro- duced. The complex [Pd(S-bz-thiosal)2] (C1) as a yellow precipitate was filtered, washed with water and air-dried. Yield: 0.11 g (58.70%). Anal. Calc. for C28H22O4S2Pd (Mr = 592.98): C, 56.71; H, 3.74; S, 10.82. Found: C, 56.43; H, 3.85; S, 10.75%. IR (KBr, cm1): 3420, 3057, 1634, 1616, 1562, 1327, 1146, 753, 708, 698. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, d ppm): 4.05 (s, 4H, CH2), 7.08–8.10 (m, 9H, Ar and bz). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, d ppm): 25.9 (CH2), 124.1, 125.6, 125.7, 126.2, 126.3, 126.8, 127.3, 127.8, 129.5, 133.2, 136.2, 139.7 (Ar and bz), 171.5 (COO). 2.1.4. Preparation of the bis(S-methyl-thiosalicylate)–palladium(II) complex, [Pd(S-met-thiosal)2] (C2) The complex [Pd(S-met-thiosal)2] (C2) was prepared as de- scribed in Section 2.1.3 using (S-methyl)-2-thiosalicylic acid (0.103 g, 0.613 mmol) instead of (S-benzyl)-2-thiosalicylic acid. Yield: 0.08 g (59.80%). Anal. Calc. for C16H14O4S2Pd (Mr = 440.672): C, 43.61; H, 3.20; S, 14.52. Found: C, 43.41; H, 3.39; S, 14.21%. IR (KBr, cm1): 3419, 1619, 1597, 1399, 1385, 1332, 1306, 1142, 960, 865, 741, 693, 654. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, d ppm): 2.35 (s, 6H, CH3), 7.19–8.08 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, d ppm): 14.6 (CH3), 123.6, 125.1, 125.2, 129.0, 132.7, 135.7, (Ar), 171.8 (COO). 2.1.5. Preparation of the bis(S-ethyl-2-thiosalicylate)–palladium(II) complex, [Pd(S-et-thiosal)2] (C3) The complex [Pd(S-et-thiosal)2] (C3) was prepared as described in Section 2.1.3 using (S-ethyl)-2-thiosalicylic acid (0.1117 g, 0.613 mmol) instead of (S-benzyl)-2-thiosalicylic acid. Yield: 0.0832 g (57.90%). Anal. Calc. for C18H18O4S2Pd (Mr = 468.856): C, 46.11; H, 3.87; S, 13.68. Found: C, 45.97; H, 3.93; S, 13.54%. IR (KBr, cm1): 1436, 1587, 1518, 1393, 752. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, d ppm): 1.27 (t, 6H, CH3), 2.83 (q, 4H, CH2), 7.11–8.08 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, d ppm): 14.4 (CH3), 13.8 (CH2), 124.8, 125.3, 126.1, 128.7, 133.2, 135.9 (Ar), 172.0 (COO). 2.1.6. Preparation of the bis(S-propyl-2-thiosalicylate)–palladium(II) complex, [Pd(S-pro-thiosal)2] (C4) The complex [Pd(S-pro-thiosal)2] (C4) was prepared as de- scribed in Section 2.1.3 using (S-propyl)-2-thiosalicylic acid (0.1203 g, 0.613 mmol) instead of (S-benzyl)-2-thiosalicylic acid. Yield: 0.0889 g (58.40%). Anal. Calc. for C20H22O4S2Pd (Mr = 496.908): C, 48.34; H, 4.46; S, 12.91. Found: C, 48.52; H, 4.11; S, 12.73%. IR (KBr, cm1): 1421, 1589, 1541, 1520, 1397, 752. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6, d ppm): 0.98 (t, 6H, CH3), 1.76 (m, 4H, CH2), 2.84 (t, 4H, CH2), 7.20–8.25 (m, 8H, Ar). 13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, d ppm): 13.2 (CH3), 22.0 (CH2), 27.6 (CH2), 125.1, 126.6, 126.7, 130.5, 134.2, 137.2 (Ar), 172.5 (COO). 2.1.7. Preparation of the bis(S-butyl-2-thiosalicylate)–palladium(II) complex, [Pd(S-bu-thiosal)2] (C5) The complex [Pd(S-bu-thiosal)2] (C5) was prepared as described in Section 2.1.3 using (S-butyl)-2-thiosalicylic acid, (0.1289 g, 0.613 mmol) instead of (S-benzyl)-2-thiosalicylic acid. Yield: 0.0941 g (58.43%). Anal. Calc. for C22H26O4S2Pd (Mr = 524.960): C, 50.33; H, 4.99; S, 12.22. Found: C, 50.52; H, 4.51; S, 12.56%. IR 1 1 on 31 (2012) 69–76(KBr, cm ): 3420, 1634, 1616, 1561, 1327, 1146, 753, 698. H NMR (200 MHz, DMSO-d6, d ppm): 0.95 (t, 6H, CH3), 1.33 (m, 4H, CH2), 1.62 (m, 4H, CH2), 2.79 (t, 4H, CH2), 7.24–8.19 (m, 8H, Ar). Crystal system monoclinic Space group P21/c transmission Refinement method full-matrix least-squares on F2 hedrData/restraints/parameters 4212/78/316 Goodness-of-fit (GOF) on F2 0.981 Final R indices [I > 2r(I)] R1 = 0.0624, wR2 = 0.1034 R indices (all data) R1 = 0.1215, wR2 = 0.1179Unit cell dimensions a (Å) 12.0280(5) b (Å) 21.0330(8) c (Å) 9.5049(4) a () 90 b () 92.578(2) c () 90 V (Å3) 2402.16(17) Z 4 Dcalc (g/cm3) 1.640 Absorption coefficient (mm1) 0.981 F(000) 1200 Crystal size (mm3) 0.16  0.04  0.02 Theta range for data collection 2.96–25.02 Index ranges 13 6 h 6 14, 23 6 k 6 25, 11 6 l 6 11 Reflections collected 13559 Independent reflections 4212 [Rint = 0.1276] Completeness to h = 25.02 99.3% Absorption correction multi-scan Maximum and minimum 0.9807 and 0.8589Table 1 Crystal data and structure refinement for the [Pd(S-bz-thiosal)2] complex (C1). Identification code CCDC 824331 Empirical formula C28H22O4S2Pd Formula weight 592.98 T (K) 123(2) k (Å) 0.71073 G.P. Radic´ et al. / Poly13C NMR (50 MHz, DMSO-d6, d ppm): 13.4 (CH3), 20.5 (CH2), 21.6 (CH2), 33.7 (CH2), 123.8, 124.4, 126.3, 130.2, 131.9, 135.9 (Ar), 171.9 (COO). 2.2. Crystal structure determination Cystals of the [Pd(S-bz-thiosal)2] complex (C1) suitable for X-ray determination were obtained by slow crystallization from a MSO- water system. The structural datawere collectedbyaBruker-Nonius Kappa CCD diffractometer equipped with an APEXII detector using graphitemonochromatisedMoKa radiation. The COLLECT [29] data collection softwarewasusedandobtaineddatawereprocessedwith DENZO-SMN [30]. The structures were solved by direct methods, using SIR-2004 [31], and refined on F2, using SHELXL-97 [32]. The reflections were corrected for Lorenz-polarization effects and multi-scan absorption correction was applied [33]. The hydrogen atomswere insertedat their calculatedpositionswith isotropic tem- perature factors [Uiso(H) factors of 1.2 times Ueq(C)] and refined as riding atoms. The figurewas drawnwithORTEP-3 [34]. Other exper- imental X-ray data are shown in Table 1. 2.3. In vitro antimicrobial assay 2.3.1. Test substances The tested compounds were dissolved in DMSO and then di- luted into nutrient liquid medium to achieve a concentration of 10%. An antibiotic, doxycycline (Galenika A.D., Belgrade), was dis- solved in nutrient liquid medium, a Mueller–Hinton broth (Torlak, Belgrade), while an antimycotic, fluconazole (Pfizer Inc., USA), was dissolved in Sabouraud dextrose broth (Torlak, Belgrade). Largest difference in peak and hole (e Å3) 0.587 and 0.6372.3.2. Test microorganisms The antimicrobial activity of the ligands L1–L5 and the corre- sponding palladium(II) complexes C1–C5 was tested against 26 microorganisms. The experiment involved 14 strains of pathogenic bacteria, including five standard strains (Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633) and nine clinical isolates (Escherichia coli, Enterococcus faecalis, P. aeruginosa, S. aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, Proteus mirabilis, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium). Also, four species of probiotic bacteria (Lactobacillus plantarum PMFKG-P31, Bacillus subtilis IP 5832 PMFKG-P32, Bifidobacterium animalis subsp. lactis PMFKG-P33, Lactobacillus rhamnosus PMFKG-P35), five species of mould (Aspergillus niger ATCC 16404, Aspergillus fumigatus PMFKG- F23, Aspergillus flavus PMFKG-F24, Aspergillus restrictus PMFKG-F25, A. niger PMFKG-F26) and three yeast species (Candida albicans (clinical isolate),Rhodotorula sp. PMFKG-F27, Saccharomyces boulardii PMFKG-P34) were tested. All clinical isolates were a generous gift fromthe InstituteofPublicHealth,Kragujevac. Theothermicroorgan- isms were provided from a collection held by the Microbiology Laboratory Faculty of Science, University of Kragujevac. 2.3.3. Suspension preparation Bacterial and yeast suspensions were prepared by the direct colony method. The colonies were taken directly from the plate and were suspended in 5 cm3 of sterile 0.85% saline. The turbidity of the initial suspension was adjusted by comparing it with 0.5 McFarland’s standard (0.5 cm3 1.17% w/v BaCl2  2H2O + 99.5 cm3 1% w/v H2SO4) [35]. When adjusted to the turbidity of the 0.5 McFarland’s standard, the bacteria suspension contains about 108 colony forming units (CFU)/cm3 and a suspension of yeast con- tains 106 CFU/cm3. Ten-fold dilutions of the initial suspension were additionally prepared into sterile 0.85% saline. The suspensions of fungal spores were prepared by gentle stripping of spore from slopes with growing aspergilli. The resulting suspensions were 1:1000 diluted in sterile 0.85% saline. 2.3.4. Microdilution method Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum microbicidal concentration (MMC) using the microdilution plate method with resazurin [36]. The 96-well plates were prepared by dispensing 100 lL of nutrient broth, Mueller–Hinton broth for bacteria and Sabouraud dextrose broth for fungi and yeasts, into each well. A 100 lL aliquot from the stock solution of the tested compound (with a concentration of 2000 lg/cm3) was added into the first row of the plate. Then, twofold, serial dilutions were performed by using a multichannel pipette. The obtained concentration range was from 1000 to 7.81 lg/cm3. A 10 lL aliquot of diluted bacterial yeast suspension and suspension of spores were added to each well to give a final concentration of 5  105 CFU/cm3 for bacteria and 5  103 CFU/cm3 for fungi and yeast. Finally, 10 lL resazurin solu- tion was added to each well inoculated with bacteria and yeast. Resazurin is an oxidation–reduction indicator used for the evalua- tion of microbial growth. It is a blue non-fluorescent dye that be- comes pink and fluorescent when reduced to resorufin by oxidoreductases within viable cells [37]. The inoculated plates were incubated at 37 C for 24 h for bacteria, 28 C for 48 h for the yeast and 28 C for 72 h for fungi. The MIC was defined as the lowest concentration of the tested substance that prevented the resazurin color change from blue to pink. For fungi, the MIC values of the tested substances were determined as the lowest con- centration that visibly inhibited mycelia growth. on 31 (2012) 69–76 71Doxycycline and fluconazole were used as a positive control. A solvent control test was performed to study the effect of 10% DMSO on the growth of microorganisms. It was observed that 10% DMSO wells where no indicator color change was recorded, on nutrient agar medium. At the end of the incubation period the lowest con- centration with no growth (no colony) was defined as the mini- mum microbicidal concentration. 2.3.5. Statistical analysis All statistical analyses were performed using SPSS package. Mean differences were established by the Student’s t-test. Data were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA). In all cases P values <0.05 were considered statistically significant. 3. Results and discussion 3.1. Synthesis and chemical characterization S-Alkyl (R = benzyl, methyl, ethyl, propyl and butyl) derivatives f thiosalicylic acid were prepared by the alkylation of thiosalicylic cid using the corresponding alkyl halogenides in alkaline water– thanol solution (Scheme 1). The corresponding [Pd(S-R-thiosal)2] omplexes were obtained by the direct reaction of K2[PdCl4] with e S-alkyl derivative of thiosalicylic acid (molar ratio 1:2) in water olution with satisfactory yields (more than 50%) (Scheme 2). A bidentate S–O coordination of the ligands L1–L5 to the Pd(II) n is expected. The lack of S–H stretching absorption bands in the omplexes C1–C5 in the range 2600–2550 cm1 [38] (2559 cm1 r L1, 2560 cm1 for L2, 2562 cm1 for L3, 2555 cm1 for L4 and 556 cm1 for L5) suggests the deprotonation of the S–H groups coordination in the complexes. The presence of two bands for C1 and C5 suggests small energy differences. These differences could be explained due to the presence of large benzyl and butyl groups and their steric impact to the phenyl part of the thiosalicylic acid. Chemical shifts arising from carbon and hydrogen atoms of this type of thioether and the corresponding palladium(II) complexes are found at the expected, and almost the same positions. Some differences in the chemical shifts of the carbon atoms of the car- boxylic groups of the S-benzyl, S-methyl, S-ethyl, S-propyl and S- C ONa S R H+ C O OH S R R= Benzyl, methyl, ethyl, propyl, butyl , ethyl, propyl and butyl esters of 2-thiosalicylic acid. C OC O CO O on o hedron 31 (2012) 69–76o a e c th s io c fo 2did not inhibit the growth of microorganisms. Also, in the experi- ment, the concentration of DMSO was additionally decreased be- cause of the twofold serial dilution assay (the working concentration was 5% and lower). Each test included growth con- trol and sterility control. All tests were performed in duplicate and the MICs were constant. Minimum bactericidal and fungicidal concentrations were determined by plating 10 lL of samples from K2PdCl4 + S R 2LiOH2 Scheme 2. The preparatiC O OH + R-X + 2NaOH Ethanol/H2O O SH Scheme 1. The preparation of the benzyl, methyl O OH 72 G.P. Radic´ et al. / Polyof the ligands and their coordination to the Pd(II) ion in the com- plexes. The carboxylate asymmetric stretching bands of ligands (1674 cm1 for L1 and L2, 1682 cm1 for L3, 1678 cm1 for L4and 1674 cm1 for L5) are located at lower energies than expected (1700–1750 cm1) [38,39]. This could be explained by the pres- ence of big R–S groups in the ortho position. The positions of these bands in corresponding C1–C5 complexes are in the expected re- gion (1600–1650 cm1) [18] (1633 and 1616 cm1 for C1, 1619 cm1 for C2, 1587 cm1 for C3, 1589 cm1 for C4 and 1633 and 1615 cm1 for C5), confirming their deprotonation and Pd S S RR R= Benzyl(C1), methyl(C2), ethyl(C3), propyl(C4), butyl(C5) f the [Pd(S-R-thiosal)2].Fig. 1. Molecular structure of the [Pd(S-benzyl)2] complex (C1) (heteroatoms are shown with an octant shaded mode). Bond angles () O(2)–Pd(1)–O(4) 88.4(2) O(2)–Pd(1)–S(1) 89.84(14) O(4)–Pd(1)–S(1) 172.52(15) O(2)–Pd(1)–S(2) 172.77(14) O(4)–Pd(1)–S(2) 89.70(14) S(1)–Pd(1)–S(2) 92.94(7) C(3)–S(1)–C(8) 105.9(3) C(3)–S(1)–Pd(1) 100.0(2) C(8)–S(1)–Pd(1) 104.4(2) C(17)–S(2)–C(22) 105.9(3) C(17)–S(2)–Pd(1) 99.1(2) C(22)–S(2)–Pd(1) 105.7(2) C(1)–O(2)–Pd(1) 128.5(4) C(15)–O(4)–Pd(1) 127.5(5) C(22)–C(23) 1.493(9) C(9)–C(8) 1.506(10) () Dihedral angles () 125 Pd(1)–S(2)–C(22)–C(23) 69.1(5) 155 Pd(1)–S(1)–C(8)–C(9) 52.0(5) 156 Pd(1)–S(1)–C(3)–C(2) 42.3(6) 127 Pd(1)–S(2)–C(17)–C(16) 40.5(6) 134 C(3)–C(2)–C(1)–O(2) 29.2(11) hedron 31 (2012) 69–76 73Short contacts H  A (Å) D  A (Å) C6–H6  O4a 3.318(9) C11–H11  O2b 3.414(9) C14–H14  O3c 3.293(9) C20–H20  O1b 3.305(9) C22–H22B  O3d 3.380(9) C24–H24  O3d 3.471(9) C25–H25  O1e 3.388(9) C27–H27  O1a 3.223(10) C4–H4  pd,g 2.71 3.653(10) C18–H18  pd,g 2.71 3.617(10)Table 2 Selected bond lengths (Å) and angles () for the [Pd(S-benzyl)2] complex (C1). Bond lengths (Å) Pd(1)–O(2) 2.024(4) Pd(1)–O(4) 2.034(4) Pd(1)–S(1) 2.246(2) Pd(1)–S(2) 2.254(2) S(1)–C(3) 1.778(7) S(1)–C(8) 1.829(7) S(2)–C(17) 1.787(7) S(2)–C(22) 1.830(7) O(2)–C(1) 1.278(8) O(4)–C(15) 1.279(8) O(1)–C(1) 1.229(8) O(3)–C(15) 1.235(8) C(16)–C(15) 1.516(10) C(2)–C(1) 1.518(9) G.P. Radic´ et al. / Polybutyl derivatives of thiosalicylic acid (167.5, 171.6, 171.4, 171.6, 171.4 ppm) and the corresponding palladium(II) complexes (171.5, 171.8, 172.0, 172.5, 171.9 ppm), respectively, can be ob- served. These differences could be explained by the coordination of the carboxylic group to the palladium(II) ion. It can be concluded from IR and NMR spectra of the ligands and the corresponding complexes that the ligands are bidentately coor- dinated to the palladium(II) ion, but nothing can be concluded about geometry of complexes. 3.2. Description of the crystal structure The [Pd(S-bz-thiosal)2] complex (C1) crystallizes in the P21/c space group of the monoclinic crystal system. The molecular struc- ture of the C1 complex is shown in Fig. 1 Selected geometric parameters are listed in Table 2. The crystal structure analysis shows the bidentate and a long cis-S–cis-O coordination (known for Pd-complexes) [40] of the S-benzyl-thiosalicylic acid ligand L1 to the Pd(II) ion (Fig. 1.) and the expected square-planar geom- etry. All the bonds are in the expected region. But a small deforma- tion of the geometry around Pd(II) [angles O(2)–Pd(1)–O(4) 88.37(19) and S(1)–Pd(1)–S(2) 92.94(7)] is expected and can be explained as a consequence of the presence of large S atoms in cis positions. The two six-membered rings involving the Pd atom are in skew- chair conformations in C1 (Fig. 1) and are practically equal, as ex- pected due to restrictions of the coordination geometry around Pd and the stiff thiosalicylic moieties. This is the reason for the orien- C22–H22A  pf,h 2.87 3.778(10) p  pd,h 3.308(10) Symmetry operators: a x, y + 1, z. b x + 1, y + 1, z. c x, y, z + 1. d x, y + 1/2, z + 1/2. e x, y1/2, z + 1/2. f x, y + 1/2, z  1/2. g Distance to closest C atom. h Distance from C to closest C atom.144 C(17)–C(16)–C(15)–O(4) 34.2(10) 168 127 174 159tation of benzyl groups, almost over the phenyl residues originat- ing from another S-benzyl-thiosalicylic ligand. The non-parallel positions of the phenyl and benzyl groups, and therefore non-sym- metric structure of the [Pd(S-bz-thiosal)2] complex, can also be 153 Fig. 2. A pair of C1 complexes formed by intermolecular interactions: C–H  O (green, accepted by O3), p  p (red, closest C25  C28) and C–H  p (blue, closest accepted by C24 or C21). (Colour online.) Table 3 In vitro antimicrobial activity of the tested ligands L1–L5 and the corresponding palladium(II) complexes C1–C5. Species L1 C1 L2 C2 L3 C3 L4 C4 5 C5 Doxycycline/ fluconazole MICa MMCb MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC IC MMC MIC MMC MIC MMC Bifidobacterium animalis subsp. lactis 500 500 500 1000 500 500 1000 1000 1000 1000 500 500 500 1000 250 500 000 1000 500 1000 31.25 62.5 Bacillus subtilis IP 5832 500 500 500 500 500 500 500 500 1000 >1000 250 500 500 500 250 250 000 >1000 250 500 1.953 15.63 Lactobacillus plantarum 500 1000 250 500 500 500 500 500 500 >1000 250 500 250 >1000 250 500 000 >1000 500 500 0.448 7.81 Lactobacillus rhamnosus >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 1000 1000 1000 500 500 1000 >1000 500 >1000 1000 >1000 1000 1000 7.81 31.25 Sarcina lutea 500 1000 250 500 1000 1000 500 500 500 >1000 250 250 500 >1000 250 250 000 >1000 250 500 <0.448 3.75 Enterococcus faecalis 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 1000 >1000 1000 1000 7.81 62.5 E. faecalis ATCC 29212 1000 1000 500 500 1000 1000 500 1000 500 1000 250 500 500 1000 250 500 000 1000 500 1000 7.81 62.5 Bacillus subtilis 500 500 250 500 125 500 500 500 1000 >1000 250 250 500 1000 250 250 000 >1000 250 500 0.112 1.953 Bacillus subtilis ATCC 6633 500 500 250 500 1000 1000 500 500 >1000 >1000 250 250 1000 >1000 250 250 000 >1000 250 500 1.953 31.25 Staphylococcus aureus 250 500 250 500 500 >1000 500 500 1000 >1000 250 250 250 1000 250 250 000 >1000 125 500 0.448 7.81 S. aureus ATCC 25923 500 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 500 500 500 1000 500 500 1000 >1000 500 500 0.224 3.75 Escherichia coli >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 1000 >1000 1000 1000 7.81 15.63 Escherichia coli ATCC 25922 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 1000 >1000 1000 1000 15.625 31.25 Pseudomonas aeruginosa 1000 >1000 1000 1000 500 >1000 500 1000 1000 >1000 500 500 500 >1000 500 1000 000 >1000 1000 1000 250 >250 P. aeruginosa ATCC 27853 500 >1000 500 1000 500 >1000 250 500 500 >1000 250 500 500 >1000 500 1000 00 >1000 500 1000 62.5 125 Proteus mirabilis 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 500 1000 250 >250 Salmonella enterica 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 1000 1000 15.625 31.25 Salmonella typhimurium 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 1000 1000 1000 500 500 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 1000 1000 15.625 125 Candida albicans >1000 >1000 500 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 000 1000 500 1000 62.5 1000 Rhodotorula sp. >1000 >1000 500 1000 500 1000 500 1000 500 1000 250 500 1000 1000 250 500 00 1000 500 1000 62.5 1000 Saccharomyces boulardii 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 1000 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 00 1000 500 1000 31.25 1000 Aspergillus niger >1000 >1000 500 1000 500 500 500 1000 500 1000 500 1000 500 1000 250 500 000 >1000 250 500 500 1000 Aspergillus niger ATCC 16404 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 1000 500 1000 500 500 000 1000 500 1000 62.5 62.5 Aspergillus restrictus 500 >1000 125 250 500 1000 500 1000 500 1000 125 250 500 1000 31.3 125 50 250 31.3 250 500 2000 Aspergillus fumigatus 62.5 62.5 62.5 62.5 62.5 250 <7.8 15.68 15.68 15.68 <7.8 <7.8 15.68 125 <7.8 <7.8 2.5 62.5 31.3 31.25 500 1000 Aspergillus flavus 31.25 250 <7.8 <7.8 1000 1000 15.7 15.68 125 125 62.5 500 125 500 62.5 62.5 25 1000 125 250 1000 1000 a MIC values (lg/cm3) – means inhibitory activity. b MMC values (lg/cm3) – means microbicidal activity. 74 G .P.R adic´ et al./Polyhedron 31 (2012) 69– 76L M 1 1 1 > 1 > 1 1 1 1 > > > 1 5 > > > 1 5 5 1 1 2 6 1 hedrexplained by a skew-chair conformation of the six-membered rings and, also, by the larger orientational freedom of the benzyl groups bonded to the S(1) and S(2) atoms. The spatial orientations of the benzyl groups are not similar, as can be seen from the values of the Pd(1)–S(1)–C(8)–C(9) and Pd(1)–S(2)–C(22)–C(23) dihedral angles (Table 2). Although the aromatic rings of the phenyl and benzyl groups seem to be over each other, the distance between them is too long for any reasonable intramolecular p  p interac- tions to occur. The deprotonated carboxyl groups are also twisted out of the adjacent aromatic plane, as can be seen from the C(3)– C(2)–C(1)–O(2) and C(17)–C(16)–C(15)–O(4) dihedral angles from Fig. 1. The spatial orientation of the benzyl groups in the crystal struc- ture is, of course, much more significantly defined by intermolecu- lar interactions during the crystallization process, in which the attractive and repulsive contacts compete with each other and a stable balance between them must be achieved. The lack of strong hydrogen bond donors gives space for much weaker C–H  O inter- actions to dominate as attractive ones in the crystallization process of C1. Eight such interactions are found from the structure (Table 2). Three potential C–H  p-type interactions were also found. Two complexes seem to form a pair involving two C–H  O, all three C–H  p and one additional p  p contact in the x, y + ½, z + ½ direction (Fig. 2). Based on S,O-coordination of all the ligands and the crystal struc- ture of the [Pd(S-bz-thiosal)2] complex, it can be assumed that the other complexes occur in the form of a cis-S-cis-O geometric isomer. 3.3. Microbiology The results of in vitro testing of antimicrobial activities for the five new palladium complexes are shown in Table 3. The solvent (10% DMSO) did not inhibit the growth of the tested microorganisms. The intensity of the antimicrobial action varied depending on the species of microorganism and on the type of tested compound. In general, the activity of the complexes was higher than the corre- sponding ligands (p < 0.05). MICs and MMCs values for ligands were in range 15.68 to >1000 lg/cm3, and for complexes <7.8 to 1000 lg/cm3. The best effect was observed for L3 and L4 for the li- gands, and C3 and C4 for the complexes (p < 0.05). Thepalladium(II) complexes showedsignificant antifungal activ- ity. The most sensitive was A. fumigatus, A. flavus and A. restrictus. The activity of the complexes was better than the positive control fluconazole (p < 0.05). The obtained concentrations of palladium(II) complexes which inhibit the growth of moulds were from <7.8 to 500 lg/cm3. Antimicrobial testing of newly synthesized complexes of palladium(II), done by Vasic´ et al., led to similar results [41]. The standard and clinical strain of A. niger did not show sensitivity similar to that mentioned, where the MIC went from 250 to 1000 lg/cm3. The tested compounds did not affect the growth of yeasts or their activities were very low. The MIC and MMC values for yeasts were from 500 to >1000 lg/cm3, except for the complexes C3 and C4 against Rhodotorula sp., where the MIC was 250 lg/cm3. All the tested compounds demonstrated weak and moderate antibacterial activity. The Gram-positive bacteria were more sensi- tive than the Gram-negative bacteria, especially for the activity of the complexes. The most sensitive was S. aureus with a MIC value of 125 lg/cm3 for the complex C5. The MICs for Gram-negative bacteria were 500 and 1000 lg/cm3. The tested complexes C2 and C3 exhibited somewhat stronger antibacterial activity towards P. aeruginosa ATCC 27853 (MIC = 250 lg/cm3). G.P. Radic´ et al. / PolyThe probiotics showed sensitivity similar to the sensitivity of the other bacteria. The MICs were from 250 to >1000 lg/cm3 and the MMCs were from 500 to >1000 lg/cm3.4. Conclusion The results of antimicrobial activity showed that the tested li- gands and the corresponding palladium(II) complexes showed dif- ferent degrees of antimicrobial activity in relation to the tested species. The tested ligands, with few exceptions, showed low anti- microbial activity. The palladium(II) complexes showed selective and moderate activity. A difference in the antimicrobial activity was observed between the ligands and the corresponding palla- dium(II) complexes, with higher activities being displayed for the palladium(II) complexes. Interesting results were obtained for Aspergillus species, which are common in the environment and which cause the infection known as aspergillosis. The tested com- plexes reacted better than the positive control. The molecular structure in the crystalline state was obtained for complex C1 and showed an unsymmetrical cis configuration around the Pd atom. The crystal structure was found to be stabilized by C– H  O, C–H  p-type and p  p interactions. Acknowledgements The authors are grateful for financial support from the Ministry of Education and Science of Republic of Serbia (Projects Nos. OI172016 and 41010) and the Academy of Finland (Project No. 122350). Appendix A. Supplementary data CCDC 824331 contains the supplementary crystallographic data for this paper. These data can be obtained free of charge via http:// www.ccdc.cam.ac.uk/conts/retrieving.html, or from the Cambridge Crystallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK; fax: (+44) 1223 336 033; or e-mail: deposit@ccdc.cam.ac.uk. References [1] A. Kumar Chhakkar, L. Rai Kakkar, Fresenius J. Anal. Chem. 347 (1993) 483. [2] G.R.E.C. Gregory, P.G. Jeffery, Analyst 92 (1967) 293. [3] M.J. Gismera, J.R. Procopio, M. Teresa-Sevilla, L. Hernandez, Electroanalysis 15 (2003) 126. [4] M. Aydin, N. Arsu, Y. Yagci, Macromol. Rapid Commun. 24 (2003) 718. [5] D. Shander, G. Ahluwalia, D. Grosso, US Patent 5411991. [6] H. Jacobelli, US Patent 20050267095. [7] J. Halaschek-Wiener, Y. Kloog, V. Wacheck, B. Jansen, J. Invest. Dermat. 120 (2003) 109. [8] I. Sadao, S. Fujio, M. Eiichi, K. Keita, Kokai Tokkyo Koho (2000) 127. [9] B.T. Khan, J. Bhatt, K. Najmoddin, S. Shamsuddin, K. Annapoorna, J. Inorg. Biochem. 44 (1991) 55. [10] C. Navarro-Eanninger, J.M. Peréz, F. Zamora, V.M. Gonzáles, J.M. Masaguer, C. Alonso, J. Inorg. Biochem. 52 (1993) 37. [11] I. Brudzinska, Y. Mikata, M. Obata, C. Ohtsuki, S. Yano, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 2533. [12] A. Garoufis, S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis, Coord. Chem. Rev. 253 (2009) 1384. [13] W. Guerra, E. de Andrade Azevedo, A.R. de Souza Monteiro, M. Bucciarellia- Rodriguez, E. Chartone-Souza, A.M. Amaral Nascimento, A.P. Soares Fontes, L. Le Moyec, E.C. Pereira-Maia, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 2348. [14] L.M.M. Vieira, M.V. de Almeida, M.C.S. Lourenço, F.A.F.M. Bezerra, A.P.S. Fontes, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 4107. [15] D. Kovala-Demertzi, M.A. Demertzis, J.R. Miller, C. Papadopoulou, C. Dodorou, G. Filousis, J. Inorg. Biochem. 86 (2001) 555. [16] R.R. Coombs, M.K. Ringer, J.M. Blacquiere, J.C. Smith, J.S. Neilsen, Y.-S. Uh, J.B. Gilbert, L.J. Leger, H. Zhang, A.M. Irving, S.L. Wheaton, C.M. Vogels, S.A. Westcott, Transition Met. Chem. 30 (2005) 411. [17] M. Ali, M. Aminul, R. Butcher, C. Karen, Transition Met. Chem. 31 (2006) 79. [18] I. Kizilcikli, Y.D. Kurt, B. Akkurt, A.Y. Genel, S. Birteksöz, G. Ötük, B. Ülküseven, Folia Microbiol 52 (2007) 15. [19] N.M. Aghatabay, M. Somer, M. Senel, B. Dulger, F. Gucin, Eur. J. Med. Chem. 42 (2007) 1069. [20] M.K. Biyala, K. Sharma, M. Swami, N. Fahmi, R. Vir Singh, Transition Met. Chem. 33 (2008) 377. [21] J.D. Smith, J. Org. Chem. 76 (6) (2011) 1513. [22] H.V. Huynh, Organometallics 29 (6) (2010) 1479. on 31 (2012) 69–76 75[23] J. Nakayama, T. Fujita, M. Hoshino, Chem. Lett. 11 (1982) 1777. [24] J.J. Donleavy, J. English Jr., J. Am. Chem. Soc. 62 (1940) 220. [25] I.M. Al-Daher, B.M. Al-Saadi, J. Iraq. Chem. Soc. 10 (1) (1985) 84. [26] Z. Koric´anac, B. Stankovic´, Arch. Pharm. 28 (1–2) (1978) 87. [27] C. Nair, H.L. Nigam, Indian J. Chem. 12 (7) (1974) 769. [28] I. Dema, V. Voicu, Acad. Rep. Populare Romine Studii cercetari chim. 23 (1960) 173. [29] COLLECT, Bruker AXS, Delft, The Netherlands, 2008. [30] Z. Otwinowski, W. Minor, in: C.W. Carter Jr., R.M. Sweet (Eds.), Methods Enzymol., vol. 276: Macromolecular crystallography, part A, Academic Press, New York, 1997, pp. 307–326. [31] M.C. Burla, M. Camalli, B. Carrozzini, G.L. Cascarano, C. Giacovazzo, G. Polidori, R. Spagna, J. Appl. Crystallogr. 38 (2005) 381. [32] G.M. Sheldrick, Acta Crystallogr., Sect. A 64 (2008) 112. [33] G.M. Sheldrick, SADABS, University of Göttingen, Germany, 1996. [34] L.J. Farrugia, J. Appl. Crystallogr. 30 (1997) 565. [35] J.M. Andrews, J. Antimicrob. Chemother. 56 (2005) 60. [36] S.D. Sarker, L. Nahar, Y. Kumarasamy, Methods 42 (2007) 321. [37] E. Banfi, G. Scialino, C. Monti-Bragadin, J. Antimicrob. Chemother. 52 (2003) 796. [38] R.M. Silverstein, C.G. Bassler, T.C. Morril, Spectrometric Identification of Organic Compounds, third ed., Wiley International Edition, 1974. p. 113. [39] K. Nakamoto, Infrared Spectra of Inorganic and Coordination Compounds, Wiley, New York, 1963. p. 206. [40] D.A. Langs, C.R. Hare, R.G. Little, Chem. Commun. (London) (1967) 1080. [41] G.P. Vasic´, V.V. Glo -dovic´, I.D. Radojevic´, O.D. Stefanovic´, L.R. Cˇomic´, V.M. Ðinovic´, S.R. Trifunovic´, Inorg. Chim. Acta 363 (2010) 3606. 76 G.P. Radic´ et al. / Polyhedron 31 (2012) 69–76 T/F E www.intechweb.org University Campus, STeP Ri Slavka Krautzeka 83/A 51000 Rijeka, Croatia +385 51 686 166info@intechweb.org CHAPTER: From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) andPlatinum(IV) Complexes AUTHORS: Srecko Trifunovic BOOK EDITOR: Varaprasad Bobbarala STATUS: ACCEPTED CHAPTER PROPOSAL REVIEW REPORT June 01, 2011 GENERAL Chapter title: It suits the manuscript's content ORIGINALITY How significant is the purpose of the study? Very significant. Will affect the field METHODS USED How do you evaluate the primary methods used in research? Clearly described and correct KEY RESULTS Did the key results address the specific questions asked? Absolutely LANGUAGE What is the quality of the language of the text? Good EDITOR'S COMMENT Accepted Sincerely yours, Aleksandar Lazinica, CEO Chapter Number 1 From Synthesis to 2 Antibacterial Activity of Some 3 New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 4 Ivana D. Radojević1, Verica V. Glođović2, 5 Gordana P. Radić2, Jelena M. Vujić3, 6 Olgica D. Stefanović1, Ljiljana R. Čomić1 and Srećko R. Trifunović2 7 1Department of Biology and Ecology, 8 Faculty of Science, University of Kragujevac, Kragujevac, 9 2Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, Kragujevac, 10 3Faculty of Agronomy, University of Kragujevac, Čačak, 11 Republic of Serbia 12 1. Introduction 13 Simultaneously with the rapid development of a wide range of antibacterial agents since the 14 1940s, bacteria have proved extremely adept at developing resistance to each new employed 15 agent. The rapidly increasing incidence of bacterial resistance to antimicrobial agents has 16 become a serious problem worldwide. Resistance mechanisms have been identified and 17 described for all known antibiotics currently available for clinical use (Fluit et al., 2000). 18 The synthesis and evaluation of the biological activity of the new metal-based compounds is 19 the field of growing interest. Numerous complexes based on palladium(II) and platina(IV)-20 ion have been synthesized and their different biological activities have been documented 21 (Agarwal, 2007; Mishra et al., 2007a; Mishra & Kaushik, 2007). The impact of different 22 palladium and platinum complexes on the growth and metabolism of various groups of 23 microorganisms has been studied. Garoufis et al. (2009) reviewed numerous scientific 24 papers on anti-viral, antibacterial and antifungal activity of palladium(II) complexes with 25 different types of ligands (sulfur and nitrogen donor ligands, Schiff base ligands and drugs 26 as ligands). There are other papers in the literature showing different intensity of 27 palladium(II) and platina(IV) complexes activity on various species of bacteria and fungi 28 (Kovala-Demertzi et al., 2001; Brudzinska et al., 2004; Coombs et al., 2005; Guerra et al., 2005; 29 Ali et al., 2006; Manav et al., 2006; Aghatabay et al., 2007; Kizilcikli et al., 2007; Mishra et al., 30 2007b; Biyala et al., 2008; Al-Hazmi et al., 2008; Vieira et al., 2009). 31 The aim of this paper is to describe synthesis of some new palladium(II) and platinum(IV) 32 complexes and in vitro research of their antibacterial activities. The second objective is to 33 evaluate the impact these compounds have on probiotic bacteria. Probiotics are used as 34 supplements and they play significant role in protecting and maintaining the balance of 35 intestinal microflora in antibiotic therapy. 36 Antibacterial Agents / Book 1 2 2. Experimental 1 2.1 Chemistry 2 The palladium(II) and platinum(IV) complexes were obtained by direct reaction of the 3 corresponding starting compounds (K2PdCl4 and K2PtCl6) and newly synthesized 4 tetradentate or bidentate ligands. The next compounds were synthesized: 5 - O,O′-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate (L1) 6 - dichlorido-(O,O′-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate)-palladium(II) 7 (C1) 8 - O,O′-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate (L2) 9 - dichlorido-(O,O′-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate)-palladium(II) 10 (C2) 11 - O,O′-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate (L3) 12 - dichlorido-(O,O′-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate)-palladium(II) 13 (C3) 14 - O,O′-ethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoate (L4) 15 - chorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-ethyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N′-2-(3-methyl)-16 butanoato)-palladium(II) (C4) 17 - tetrachlorido(O,O'-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)butanoate)-18 platinum(IV) (C4a) 19 - O,O′-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoate (L5) 20 - chorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-propyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N′-2-(3-methyl)-21 butanoato)-palladium(II) (C5) 22 - O,O′-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoate (L6) 23 - chorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-butyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N′-2-(3-methyl)-24 butanoato)-palladium(II) (C6) 25 - O,O′-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoate(L7) 26 - chorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-pentyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N′-2-(3-methyl)-27 butanoato)-palladium(II) (C7) 28 - O,O′-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate (L8) 29 - dichlorido(O,O′-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate)- 30 palladium(II) (C8) 31 - O,O′-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate (L9) 32 - dichlorido(O,O′-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate)- 33 palladium(II) (C9) 34 - O,O′-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate (L10) 35 - dichlorido(O,O′-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate)- 36 palladium(II) (C10) 37 - O,O′-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate(L11) -38 dichlorido(O,O′-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoate)- 39 palladium(II) (C11) 40 - S-benzyl-thiosalicylic acid (L12) 41 - bis-(S-benzyl-thiosalicylate)-palladium(II) (C12) 42 - S-methyl-thiosalicylic acid (L13) 43 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 3 - bis-(S-methyl-thiosalicylate)-palladium(II) (C13) 1 - S-ethyl-thiosalicylic acid (L14) 2 - bis-(S-ethyl-2-thiosalicylate)-palladium(II) complex (C14) 3 - S-propyl-thiosalicylic acid (L15) 4 - bis-(S-propyl-2-thiosalicylate)-palladium(II) (C15) 5 - S-buthyl-thiosalicylic acid (L16) 6 - bis-(S-butyl-2-thiosalicylate)-palladium(II) (C16) 7 - meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid (L17) 8 - dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)-palladium(II) 9 (L17a) 10 - s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)-11 platinum(IV) (L17b) 12 - O,O'-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate (L18) 13 - tetrachlorido(O,O'-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate)-14 platinum(IV)(C18) 15 - O,O'-diethyl-ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2'-benzyl)acetate (L19) 16 - tetrachorido(O,O'-diethyl-ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2'-benzyl)acetate)-17 platinum(IV) (C19) 18 - O,O'-dipropyl-ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2'-benzyl)acetate (L20) 19 - tetrachorido(O,O'-dipropyl-ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2'-benzyl)acetate)-20 platinum(IV) (C20) 21 - O,O'-dibutyl-ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2'-benzyl)acetate (L21) 22 - tetrachorido(O,O'-dibutyl-ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2'-benzyl)acetate)-23 platinum(IV) (C21) 24 2.1.1 The synthesis of the ligands - L1, L2, L3 and corresponding palladium(II) 25 complexes – C1, C2, C3 26 In 50 mL of dry alcohol (1-propanol, 1-butanol or 1-pentanol), saturated with gas HCl, 1.53 g 27 (7.5 mmol) of H2-S,S-eddp was added and the mixture was refluxed for 12 h. The mixture 28 was filtered and left in the refrigerator over night. The obtained white powder was filtered 29 and air-dried. 30 Complexes were obtained by mixing K2[PdCl4] (0.200 g, 0.613 mmol) and equimolar amount 31 of the dpr-S,S-eddp·2HCl·3H2O (L1) (0.2546 g, 0.613 mmol), dbu-S,S-eddp·2HCl·3H2O (L2) 32 (0.2718 g, 0.613 mmol) or dpe-S,S-eddp·2HCl·2H2O (L3) (0.2780 g, 0.613 mmol) esters. 33 During 2 h of stirring 10 cm3 of water solution of LiOH (0.0294 g, 1.226 mmol) was added in 34 small portions to the reaction mixture. Within this period, pale yellow precipitates of the 35 complexes C1-C3 were obtained, filtered off, washed with cold water, ethanol and ether and 36 air dried (Vasić et al., 2010) (Fig. 1.). 37 2.1.2 The synthesis of the ligands - L4, L5, L6, L7 and corresponding palladium(II) 38 complexes – C4, C5, C6, C7 39 In 50 mL of dry alcohol (ethanol, 1-propanol, 1-butanol or 1-pentanol), saturated with gas 40 HCl, 2.50 g (7.5 mmol) of (H2-(S,S)-eddv) was added and the mixture was refluxed for 12 h. 41 The mixture was filtered off and the filtrate was left for a few days in a refrigerator at 4°C. 42 The esters were recrystallized from hot alcohol used for each reaction. 43 Antibacterial Agents / Book 1 4 NH NH HO HO CH3 CH3 O O + ROH NH NH RO RO CH3 CH3 O O 2HClHCl R = n-Pr(L1), n-Bu(L2), n-Pe(L3) LiOH R = n-Pr(C1), n-Bu(C2), n-Pe(C3) N N RO RO CH3 CH3 O O Pd Cl Cl H H K2[PdCl4] 1 Fig. 1. The preparation of some alkyl esters of H2-S,S-eddp and corresponding palladium(II) 2 complexes 3 Complexes were obtained by mixing K2[PdCl4] (0.200 g, 0.613 mmol) and equimolar amount 4 of the L4 (0.241 g, 0.613 mmol), L5 (0.256 g, 0.613 mmol), L6 (0.273 g, 0.613 mmol) or L7 5 (0.290 g, 0.613 mmol) esters. During 2 h of stirring 10 cm3 of water solution of LiOH 6 (0.0294 g, 1.226 mmol) was added in small portions to the reaction mixture. Within this 7 period, pale yellow precipitates of the complexes C4-C7 were obtained, filtered off, washed 8 with cold water, ethanol and ether and air dried (Fig.2.). The crystal structure of C4 was 9 confirmed by X-ray analysis (Radić et al., 2010b; 2011a). 10 11 NH NH HO HO CH CH O O + ROH NH NH RO RO CH CH O O 2HClHCl R = Et(L4), n-Pr(L5), n-Bu(L6), n-Pe(L7) LiOH R = Et(C4), n-Pr(C5), n-Bu(C6), n-Pe(C7) N N RO CH O Pd O Cl H K2[PdCl4] H OCH 12 Fig. 2. The preparation of some alkyl esters of H2-S,S-eddv and corresponding palladium(II) 13 complexes 14 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 5 2.1.3 The synthesis of the ligands - L8, L9, L10, L11 and corresponding palladium(II) 1 complexes – C8, C9, C10 and C11 2 Thionyl choride (4 cm3, 55 mmol) was introduced into a flask containing 50 cm3 of 3 corresponding ice cooled alcohol (ethyl, n-propyl, n-butyl or n-pentyl; anhydrous 4 conditions) for 1 h. After addition of 2 g (5.54 mmol) [(S,S)-H4eddl]Cl2 the reaction mixture 5 was refluxed for 16 h, filtered off and the filtrate was left for a few days in a refrigerator at 6 4°C. The esters were recrystallized from the hot alcohol used for each reaction. 7 Complexes were obtained by mixing K2[PdCl4] (0.2 g, 0.61 mmol) and equimolar amount of 8 the L8·H2O (0.267 g, 0.61 mmol), L9·H2O (0.277 g, 0.61 mmol), L10·H2O (0.301 g, 0.61 mmol) 9 or L11·H2O (0.318 g, 0.61 mmol) esters. During 2 h of stirring 10 cm3 of water solution of 10 LiOH (0.0293 g, 1.22 mmol) was added in small portions to the reaction mixture. Within this 11 period, pale yellow precipitates of the complexes C8-C11 were obtained, filtered off, washed 12 with cold water, ethanol and ether and air dried (Vujić et al., 2010) (Fig.3.). The crystal 13 structure of C11 was confirmed by X-ray analysis (Vujić, et al., 2011). 14 15 NH NH HO HO O O + ROH NH NH RO RO O O 2HClSOCl2 R = Et(L8), n-Pr(L9), n-Bu(L10), n-Pe(L11) LiOH R = Et(C8), n-Pr(C9), n-Bu(C10), n-Pe(C11) N N RO RO O O Pd Cl Cl H H K2[PdCl4] reflux 16h 16 Fig. 3. The preparation of some alkyl esters of H2-S,S-eddl and corresponding palladium(II) 17 complexes 18 2.1.4 The synthesis of the ligands - L12, L13, L14, L15, L16 and corresponding 19 palladium(II) complexes – C12, C13, C14, C15, C16 20 The thioacid ligands (L12)-(L16) were prepared by alkylation of thiosalicylic acid by means 21 of corresponding alkyl halogenides in alkaline water-ethanol solution. 22 Thiosalicylic acid (1 mmol) was added to a 100 cm3 round bottom flask containing 50 cm3 of 23 30% solution of ethanol in water and stirred. A solution of NaOH (2 mmol in 5 cm3 of water) 24 was added to acid suspension. The solution became clear. The corresponding alkyl 25 halogenide (2 mmol) was dissolved in 5 cm3 of ethanol and transferred to the stirred 26 solution. The resulting mixture was kept overnight at 60°C. The reaction mixture was 27 Antibacterial Agents / Book 1 6 transferred into a beaker and ethanol was evaporated off on a water bath. Diluted 1 hydrochloric acid (2 mol/dm3) was added to the resulting water solution and S-alkyl 2 thiosalicylic acid was precipitated as a white powder. The liberated acid was filtered off and 3 washed with plenty of distilled water. The product was dried under vacuum overnight. 4 5 C O OH R-X Ethanol/H2O C O ONa SH S R H+ C O OH S R R= Benzy(L12), methyl(L13), ethyl(L14), propyl(L15), butyl(L16) 2NaOH, K2PdCl4 Pd OC S O S CO O RR LiOH R= Benzy(C12), methyl(C13), ethyl(C14), propyl(C15), butyl(C16) 6 Fig. 4. The preparation of alkyl eters of 2-thiosalicylic acid and corresponding palladium(II) 7 complexes 8 K2[PdCl4] (0.100 g, 0.3065 mmol) was dissolved in 10 cm3 of water on a steam bath and 9 (S-benzyl)-2-thiosalicylic acid (0.1497 g, 0.613 mmol), (S-methyl)-2-thiosalicylic acid (0.103 g, 10 0.613 mmol), (S-ethyl)-2-thiosalicylic acid (0.1117 g, 0.613 mmol), (S-propyl)-2-thiosalicylic 11 acid (0.1203 g, 0.613 mmol) or (S-butyl)-2-thiosalicylic acid, (0.1289 g, 0.613 mmol) was 12 added into the solution. The resulting mixture was stirred for 2h and during this time an 13 aqueous solution of LiOH (0.0256 g, 0.613 mmol in 10 cm3 of water) was introduced. The 14 complexes (C12- C16) as a yellow precipitate were filtered, washed with water and air-dried 15 (Radić et al., 2011) (Fig.4.). The crystal structure of C12 was confirmed by X-ray analysis 16 (Dimitrijević et al., 2011). 17 2.1.5 The synthesis of the ligand L17 and corresponding palladium(II) complex C17 18 and corresponding platinum(IV) complex C17a 19 Benzaldehyde (30 g) was refluxed with ammonium acetate (60 g) for 3 hours. The reaction 20 mixture was cooled and the product was filtered and washed with ethanol. Recrystallization 21 from 1-butanol gave N-benzoyl-N'-benzylidene-meso-1,2-diphenyl-ethylendiamine. 22 Hydrolysis of that compound with 70% sulphuric acid under reflux for 1h gave meso-1,2- 23 -diphenyl-ethylenediamine as the basic product of hydrolysis. 24 3-Chloro-propanoic acid (4.34 g, 0.04 mol) was dissolved in 5 cm3 of water on ice bath and 25 carefully neutralized with cold water solution of 5 cm3 NaOH (1.6 g, 0.04 mol). 1,2-26 Diphenyl--ethylenediamine (4.24 g, 0.02 mol) was added to this solution. The mixture was 27 being stirred for 4 hours at 90°C, and during this period 5 cm3 NaOH water solution (1.6 g, 28 0.04 mol) was introduced. After that, 5.6 cm3 6 mol/dm3 HCl was added and resulting 29 solution was evaporated to the volume of 7 cm3; 6 cm3 conc. HCl, 6 cm3 of ethanol and 6 cm3 30 of ether were added to the mixture. The white precipitate of H2 -1,2-dpheddp·2HCl·1.5H2O 31 (L17) was separated by filtration and refined with solution water : ethanol = 1 : 2. The crystal 32 structure of L17 was confirmed by X-ray analysis (Radić et al., 2010a). 33 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 7 O H + ONH4 O H2C N NH C O NaOH Et2O NH2 H2N ammonium acetatebenzaldehyde 70% H2SO4 refluxed refluxed 1-2 hour extraction C14H16N2 t.t.=120,5-121,5 C N-benzoyl-N`-benzylidene-meso-1,2-diphenylenediamine, 60%,C28H24ON2,mp=258-259 C + Cl H2 C H2 C C O OH2 HN N H O OHO HO (L17) meso-1,2-diphenyl-N,N`-di-3-propionic acid, dpheddp, 23,40% K2PdCl4 LiOH N N Pd Cl Cl H H O O OH OH K2PtCl6 LiOH NH NH Pt Cl Cl O O OH OH Cl Cl (C17a) (C17b) 1 Fig. 5. Reaction pathways in synthesis of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- 2 -propionic acid and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes. 3 Antibacterial Agents / Book 1 8 Potassium-hexachloridoplatinate(IV) (0.2 g, 0.411 mmol) was dissolved in 10 cm3 of water 1 on a steam bath and 1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid (0.1876 g, 2 0.411 mmol) was added. The reaction mixture was heated for 12 hours and during this 3 period 10 cm3 of LiOH water solution (0.0394 g, 1.65 mmol) was added in small portions and 4 the solution was filtered and evaporated to small volume. The orange precipitate of s-cis-5 [PtCl2(1,2-dpheddp)] C17b) was separated by filtration, washed with cold water and air-6 dried (Fig. 5). 7 2.1.6 The synthesis of the ligands L4, L18 and corresponding platinum(IV) complexes 8 C4a, C18 9 K2[PtCl6] (0.100 g, 0.205 mmol) and det-(S,S)-eddv (0.080 g, 0.205 mmol) were dissolved in 10 25 cm3 of water. The reaction mixture was heated on a steam bath for 3 h during which 11 water solution of LiOH·H2O (0.017 g, 0.41 mmol in 10 cm3 of water) was introduced. The 12 complex, [PtCl4(det-(S,S)-eddv)] (C4a), as a yellow precipitate was separated by filtration, 13 washed with water and air-dried (Fig. 6.). 14 In 50 cm3 of dry ethanol, saturated with gas HCl, 1.53 g (7.5 mmol) of H2-S,S-eddp was 15 added and the mixture was refluxed for 12 h. The mixture was filtered and left in the 16 refrigerator over night. The obtained white powder of O,O'-diethyl-(S,S)- 17 -ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate dihydrochloride, det-S,S-eddp·2HCl (L18) was 18 filtered and air dried. 19 K2[PtCl6] (0.100 g, 0.205 mmol) and det-(S,S)-eddp (0.068 g, 0.205 mmol) were dissolved in 20 25 cm3 of water. The reaction mixture was heated on a steam bath for 3 h during which 21 water solution of LiOH·H2O (0.017 g, 0.41 mmol in 10 cm3 of water) was introduced. The 22 complex, [PtCl4(det-(S,S)-eddp)] (C18), as a yellow precipitate was separated by filtration, 23 washed with water and air-dried (Stanković et al., 2011b) (Fig. 7.). The crystal structure of 24 C18 was confirmed by X-ray analysis (Stanković et al., 2011b). 25 26 NH H2C H2C NH CH CH CHC HO O CHC HO O NH H2C H2C NH CH CH CHC O H2C H3C O CHC O C H2 H3C O CH3CH2OH HCl K2PtCl6 LiOH NH H2C H2C NH CH CH CHC O H2C H3C O CHC O C H2 H3C O Pt Cl Cl Cl Cl H3C CH3 H3C CH3 H3C CH3 H3C CH3 CH3 H3C CH3 H3C (L4) (C4a) 27 Fig. 6. Synthesis of the ester det-(S,S)-eddv·2HCl and platinum(IV) complex 28 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 9 NH H2C H2C NH CH CH CH3C HO O CH3C HO O NH H2C H2C NH CH CH CH3C O H2C H3C O CH3C O C H2 H3C O CH3CH2OH HCl K2PtCl6 LiOH NH H2C H2C NH CH CH CH3C O H2C H3C O CH3C O C H2 H3C O Pt Cl Cl Cl Cl (L18) (C18) 1 Fig. 7. Synthesis of the ester det-(S,S)-eddp·2HCl and platinum(IV) complex 2 2.1.7 The synthesis of the ligands L19, L20, L21 and corresponding platinum(IV) 3 complexes C19, C20, C21 4 In 50 cm3 of dry alcohol (ethanol, 1-propanol, 1-butanol) saturated with gaseous HCl, 1.50 g 5 (3.65 mmol) of ethylenediamine-N,N'-di-S,S-(2,2ʹ-dibenzyl)acetate acid threehydrate 6 (H2-S,S-eddba·3H2O) was added and the mixture was refluxed for 12 h. The mixture was 7 filtered and left in the refrigerator over night. The obtained white powder was filtered and 8 air-dried. 9 K2[PtCl6] (0.100 g, 0.206 mmol) and 0.206 mmol of R2-S,S-eddba·2HCl (0.100 g of de-S,S- 10 -eddba·2HCl (L19), 0.106 g of dp-S,S-eddba·2HCl (L20), 0.112 g of db-S,S-eddba·2HCl 11 (L21)) were dissolved in 15 cm3 of water. The reaction mixture was heated at 40 °C for 12 h 12 and during this period 3.92 cm3 of aqueous 0.105 mol/dm3 LiOH·H2O (0.412 mmol) were 13 added in small portions The complexes (C19-C21) as a yellow-orange precipitates were 14 collected by filtration, washed with water, corresponding alcohol and ether and air-dried 15 (Fig. 8.). The crystal structure of L20 was confirmed by X-ray analysis (Dimitrijević et al., 16 2010). 17 O N O- O N H2-S,S-eddba H H -O O N+ OR O N+ H H RO+ 2 ROH HCl(g) H HCl - Cl- R = ethyl (L19), propyl (L20), butyl (L21) 18 a) 19 Antibacterial Agents / Book 1 10 O N+ OR O N+ H H RO H HCl - Cl- R = ethyl (L19), propyl (L20), butyl (L21) K2PtCl6 Pt Cl Cl Cl Cl N N O O O O R R + R = ethyl (C19), propyl (C20), butyl (C21) LiOH 1 b) 2 Fig. 8. The synthesis of: a) esters (R2-S,S-eddba·2HCl); b) complexes [PtCl4(R2-S,S-eddba)] 3 2.2 In vitro antimicrobial assay 4 2.2.1 Test substances 5 The tested compounds were dissolved in DMSO and then diluted into nutrient liquid medium 6 to achieve a concentration of 10%. Antibiotic, doxycycline (Galenika A.D., Belgrade), was 7 dissolved in nutrient liquid medium, a Mueller–Hinton broth (Torlak, Beograd). 8 2.2.2 Test microorganisms 9 Antimicrobial activity of twenty-one palladium(II) and platinum(IV) complexes and their 10 ligands was tested against 9 species of bacteria: 6 strains of pathogenic bacteria (including 4 11 standard strains: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterococcus faecalis ATCC 29212, 12 Staphylococcus aureus ATCC 25923; Sarcina lutea ATCC 9341 and 2 clinical isolates: Escherichia 13 coli and Salmonella enterica) and 3 species of probiotic bacteria (Bacillus subtilis IP 5832 14 PMFKG-P32, Bifidobacterium animalis subsp. lactis PMFKG-P33 and Lactobacillus rhamnosus 15 PMFKG-P35 ). All clinical isolates were a generous gift from the Institute of Public Health, 16 Kragujevac. The other microorganisms were provided from a collection held by the 17 Microbiology Laboratory Faculty of Science, University of Kragujevac. 18 2.2.3 Suspension preparation 19 Bacterial suspensions were prepared by the direct colony method. The colonies were taken 20 directly from the plate and were suspended in 5 mL of sterile 0.85% saline. The turbidity of initial 21 suspension was adjusted by comparing with 0.5 McFarland’s standard (0.5 ml 1.17% w/v 22 BaCl2×2H2O + 99.5 ml 1% w/v H2SO4) (Andrews, 2005). When adjusted to the turbidity of the 0.5 23 McFarland’s standard, bacteria suspension contains about 108 colony forming unites (CFU)/mL. 24 Ten-hold dilutions of initial suspension were additionally prepared into sterile 0.85% saline. 25 2.2.4 Microdilution method 26 Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory concentration 27 (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) by using microdilution plate method 28 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 11 with resazurin (Sarker et al., 2007). The 96-well plates were prepared by dispensing 100 μL 1 of nutrient broth into each well. A 100 μL from the stock solution of tested compound 2 (concentration 2000 μg/mL) was added into the first row of the plate. Then, twofold, serial 3 dilutions were performed by using a multichannel pipette. The obtained concentration 4 range was from 1000 μg/mL to 7.81 μg/mL. A 10 μL of diluted bacterial suspension was 5 added to each well to give a final concentration of 5 x 105 CFU/mL. Finally, 10 μL resazurin 6 solution was added to each well inoculated with bacteria. Resazurin is an oxidation–7 reduction indicator used for the evaluation of microbial growth. It is a blue non-fluorescent 8 dye that becomes pink and fluorescent when reduced to resorufin by oxidoreductases 9 within viable cells (Banfi et al., 2003). The inoculated plates were incubated at 37 °C for 24 h. 10 MIC was defined as the lowest concentration of the tested substance that prevented 11 resazurin color change from blue to pink. Doxycycline was used as a positive control. 12 Solvent control test was performed to study an effect of 10% DMSO on the growth of 13 microorganism. It was observed that 10% DMSO did not inhibit the growth of 14 microorganism. Also, in the experiment, the concentration of DMSO was additionally 15 decreased because of the twofold serial dilution assay (the working concentration was 5% 16 and lower). Each test included growth control and sterility control. All tests were performed 17 in duplicate and MICs were constant. Minimum bactericidal concentration was determined 18 by plating 10 μL of samples from wells, where no indicator color change was recorded, on 19 nutrient agar medium. At the end of the incubation period the lowest concentration with no 20 growth (no colony) was defined as minimum bactericidal concentration. 21 3. Results and discussion 22 The results of in vitro testing of antibacterial activities of the ligands and corresponding 23 palladium(II) and platinum(IV) complex are shown in Table 1-10. For comparison, MIC and 24 MBC values of doxycycline are listed in Table 11. The solvent (10% DMSO) did not inhibit 25 the growth of the tested microorganisms. 26 The intensity of antimicrobial action varied depending on the species of microorganism and 27 on the type and concentration of tested compounds. The difference between antimicrobial 28 activity of the ligands and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes is 29 noticed and, in general, the most active were palladium(II) complexes. 30 The results of antibacterial testing for the ligands (L1, L2, L3) and corresponding 31 palladium(II) complexes (C1, C2, C3) are shown in Table 1. The results for 3 strains of 32 pathogenic bacteria and 2 species of probiotic bacteria were reported in the paper Vasić et 33 al., (2010). Results for S. enterica, Staphyl. aureus ATCC 25923, S. lutea ATCC 9341 and L. 34 rhamnosus were first presented in this paper. These ligands and complexes, being compared 35 to positive control, showed low to moderate antibacterial activity. MIC and MBC values 36 were in range from <7.81 to >1000 μg/mL, depending on the species of bacteria. Gram-37 positive bacteria showed higher sensitivity. The most sensitive was S. lutea ATCC 9341, 38 where MIC was for C1 and C2 <7.81 μg/mL. The best activity at Gram-negative bacteria 39 was shown by C2 to P. aeruginosa ATCC 27853 and E. coli (MIC was 31.25 μg/mL). The 40 probiotics showed sensitivity similar to the sensitivity of the other bacteria to the tested 41 compounds. Exception is B. animalis subsp. lactis where L2, C2 and L3 inhibited its growth at 42 these concentrations: 7.81 μg/mL, 15,63 μg/mL and <7.81 μg/mL. 43 Antibacterial Agents / Book 1 12 The results of testing the ligands (L4, L5, L6, L7) and their palladium(II) complexes (C4, C5, 1 C6, C7) are shown in Table 2 and Table 3. The results of testing for L4 were reported in the 2 paper by Stanković et al., (2011a; 2011c). The tested ligands, with few exceptions, show very 3 low antimicrobial activity, while palladium(II) complexes show selective and moderate 4 activity. Interestingly, L6, L7 and C6, C7 exhibit strong antibacterial activity towards E. coli, 5 Staphyl. aureus ATCC 25923 and S. lutea ATCC 9341, MIC ranged <7.81 µg/mL to 31.25µg/mL. 6 Probiotic bacteria showed high resistance to the effects of tested substances. The most sensitive 7 was B. subtilis IP 5832 to C5 and C4 (MIC was 7.81µg/mL and 15.63 µg/mL). 8 The results of testing the ligands (L8, L9, L10, L11) and palladium(II) complexes (C8, C9, 9 C10, C11) are shown in Table 4 and Table 5. The ligands and complexes, being compared to 10 positive control, with few exceptions, showed low antibacterial activity. MIC and MBC 11 values were in range from <7.8 to >1000 μg/mL, depending on the species of bacteria. L9, 12 L10 and L11 showed excellent results to S. lutea ATCC 9341 (MIC and MBC <7.81 μg/mL) 13 and L10 and L11 to S. lutea ATCC 9341, Staphyl. aureus ATCC 25923 and L. rhamnosus (MIC 14 <7.81 μg/mL). In this case the ligands acted better than corresponding complexes and it is 15 an exception. The complexes have weak antimicrobial activity and some better influence 16 was seen on B. subtilis IP 5832 were MIC was in range from 39.06 to 312.5 μg/mL. 17 The results of testing the ligands (L12, L13, L14, L15, L16) and corresponding palladium (II) 18 complexes (C12, C13, C14, C15, C16) are shown in Table 6 and Table 7. The results for these 19 testing were accepted for publication in the paper by Radić et al., (2011b). All tested 20 compounds demonstrated selective and moderate antibacterial activity. Tested ligands, with 21 a few exceptions, show very low antimicrobial activity. The activity of corresponding 22 complexes was higher than with the ligands. MICs values for ligands were in range from 23 250 µg/mL to >1000 µg/mL, and for complexes from 62.5 µg/mL to 1000 µg/mL. The 24 Gram-positive bacteria were more sensitive than the Gram-negative bacteria especially by 25 the activity of the complexes. The best effect was observed in C16 to S. lutea ATCC 9341 26 were MIC and MBC 62.5 µg/mL. MICs for Gram-negative bacteria were at 500 μg/mL and 27 1000 μg/mL. The tested complexes (C13) and (C14) exhibited somewhat stronger 28 antibacterial activity towards P. aeruginosa ATCC 27853 (MIC = 250 μg/mL). The probiotics 29 showed sensitivity similar to the sensitivity of the other bacteria (Radić et al., 2011b). 30 31 Species L1 C1 L2 C2 L3 C3 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli 1 125 >500 62,5 125 31.3 >500 31,25 > 250 250 >500 125 > 500 Salmonella enterica >1000 >1000 125 125 nt nt 250 500 1000 >1000 250 500 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 1 >500 >500 125 250 >500 >500 31,25 125 250 >500 125 125 Enter. faecalis ATCC 29212 1 >500 >500 125 250 125 >500 62,5 250 >500 >500 62,5 250 Staphyl. aureus ATCC 25923 >1000 >1000 62.5 125 nt nt 62.5 125 250 1000 62.5 125 Sarcina lutea ATCC 9341 1000 1000 <7.8 <7.8 nt nt <7.8 15,6 31,25 125 31,25 31,25 Lactobacillus rhamnosus nt nt 62.5 500 nt nt 62.5 250 nt nt 62.5 125 Bifidobact. animalis subsp. lactis 1 125 >500 62,5 125 7.81 >500 15,6 125 <7.81 < 31.25 125 > 500 Bacillus subtilis IP 5832 1 125 >500 62,5 125 62.5 >500 15,6 125 62.5 >500 62,5 > 500 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 32 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL), nt, not tested 33 Table 1. Antibacterial activity of the ligands (L1,L2,L3) and corresponding complexes 34 (C1, C2, C3). 35 1 Vasić et al., (2010) From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 13 1 Species L4 2 C4 L5 C5 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli 500 1000 125 500 125 1000 125 500 Salmonella enterica 1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 1000 1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 1000 1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 Enter. faecalis ATCC 29212 500 500 500 1000 >1000 >1000 500 >1000 Staphyl. aureus ATCC 25923 500 500 250 500 250 500 125 500 Sarcina lutea ATCC 9341 31.25 125 250 250 1000 1000 250 250 Lactobacillus rhamnosus 1000 1000 500 1000 nt nt 500 1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis 250 500 125 1000 500 >1000 250 >1000 Bacillus subtilis IP 5832 125 500 15.63 >1000 62.5 >1000 7.81 1000 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 2 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL), nt, not tested 3 Table 2. Antibacterial activity of the ligands (L4, L5) and corresponding complexes (C4, C5). 4 5 Species L6 C6 L7 C7 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli 15.63 500 31.25 500 15.63 125 <7.81 125 Salmonella enterica 1000 1000 250 500 1000 1000 1000 1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 >1000 >1000 500 1000 500 >1000 500 1000 Enter. faecalis ATCC 29212 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 500 1000 Staphyl. aureus ATCC 25923 31.25 125 125 125 31.25 125 500 500 Sarcina lutea ATCC 9341 31.25 31.25 31.25 31.25 <7.81 <7.81 250 250 Lactobacillus rhamnosus 31.25 250 62.50 125 62.50 250 500 1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis 62.50 1000 62.50 1000 62.50 500 125 >1000 Bacillus subtilis IP 5832 250 >1000 500 1000 1000 >1000 500 >1000 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 6 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL) 7 Table 3. Antibacterial activity of the ligands (L6, L7) and corresponding complexes (C6, C7). 8 9 Species L8 C8 L9 C9 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli 625 >1000 625 >1000 312.5 >1000 >1000 >1000 Salmonella enterica >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Enter. faecalis ATCC 29212 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 625 >1000 Staphyl. aureus ATCC 25923 250 500 500 1000 31.25 125 250 500 Sarcina lutea ATCC 9341 250 250 500 500 <7.8 <7.8 250 250 Lactobacillus rhamnosus 1000 1000 500 1000 15.63 125 500 1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis 78 >1000 78 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Bacillus subtilis IP 5832 78.13 >1000 39.06 625 625 >1000 78 >1000 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 10 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL) 11 Table 4. Antibacterial activity of the ligands (L8, L9) and corresponding complexes (C8, C9). 12 2 Stanković et al., (2011a, 2011c) Antibacterial Agents / Book 1 14 1 Species L10 C10 L11 C11 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli >1000 >1000 >1000 >1000 625 >1000 312.5 >1000 Salmonella enterica >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 312.5 >1000 Enter. faecalis ATCC 29212 156.3 >1000 625 >1000 >1000 >1000 156.3 >1000 Staphyl. aureus ATCC 25923 <7.8 125 31.25 125 <7.8 125 500 500 Sarcina lutea ATCC 9341 <7.8 <7.8 31.25 31.25 <7.8 <7.8 250 250 Lactobacillus rhamnosus <7.8 <7.8 31.25 62.5 <7.8 <7.8 500 1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 625 >1000 Bacillus subtilis IP 5832 >1000 >1000 78 >1000 >1000 >1000 312.5 >1000 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 2 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL) 3 Table 5. Antibacterial activity of the ligands (L10, L11) and corresponding complexes (C10,C11). 4 5 Species L12 C12 L13 C13 L14 C14 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 Salmonella enterica 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 500 >1000 500 1000 500 >1000 250 500 500 >1000 250 500 Enter. faecalis ATCC 29212 1000 1000 500 500 1000 1000 500 1000 500 1000 250 500 Staphyl. aureus ATCC 25923 500 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 500 500 Sarcina lutea ATCC 9341 250 500 250 250 1000 1000 250 250 500 500 250 500 Lactobacillus rhamnosus >1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 500 1000 1000 1000 500 500 Bifidobact. animalis subsp. lactis 500 500 500 1000 500 500 1000 1000 1000 1000 500 500 Bacillus subtilis IP 5832 500 500 500 500 500 500 500 500 1000 >1000 250 500 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 6 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL) 7 Table 6. 3 Antibacterial activity of the ligands (L12, L13, L14) and corresponding complexes 8 (C12, C13, C14). 9 10 Species L15 C15 L16 C16 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 1000 1000 Salmonella enterica 1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 500 >1000 500 1000 500 >1000 500 1000 Enter. faecalis ATCC 29212 500 1000 250 500 1000 1000 500 1000 Staphyl. aureus ATCC 25923 500 1000 500 500 >1000 >1000 500 500 Sarcina lutea ATCC 9341 250 250 500 500 1000 1000 62.5 62.5 Lactobacillus rhamnosus 1000 >1000 500 >1000 >1000 >1000 1000 1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis 500 1000 250 500 1000 1000 500 1000 Bacillus subtilis IP 5832 500 500 250 250 1000 >1000 250 500 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 11 MBC, minimum bactericidal concentration (μg/mL) 12 Table 7. 4 Antibacterial activity of the ligands (L15, L16) and corresponding complexes (C15,C16). 13 3 Radić et al., (2011b) 4 Radić et al., (2011b) From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 15 The results of in vitro testing of antibacterial activities of the ligand (L17) and corresponding 1 palladium(II) (C17a) and platinum(IV) (C17b) complexes are shown in Table 8. 2 3 Species L17 C17a C17b MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 Salmonella enterica >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 250 >1000 15.63 500 125 500 Enter. faecalis ATCC 29212 500 >1000 31.25 500 250 500 Staphyl. aureus ATCC 25923 500 >1000 31.25 500 250 500 Sarcina lutea ATCC 9341 500 >1000 62.5 500 125 500 Lactobacillus rhamnosus 125 >1000 62.5 >1000 31.25 >1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis >1000 >1000 31.25 125 250 500 Bacillus subtilis IP 5832 500 >1000 250 500 250 500 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 4 MBC, minimum microbiocidal concentration (μg/mL) 5 Table 8. 5Antibacterial activity of the ligand (L17) and corresponding palladium(II) (C17a) 6 and platinum(IV) (C17b) complexes. 7 The best activity manifested palladium(II) complex C17a with also the best seen result on 8 P. aeruginosa ATCC 27853 (MIC 15.63 μg/mL). The same one at Gram-positive bacteria had 9 MIC 31.25 – 62.5 μg/mL. Platinum (IV) complex C17b has weaker activity and the best 10 result manifested on L. rhamnosus where MIC was 31.25 μg/mL (Radojević et al., 2011). 11 12 Species L4 C4a L18 C18 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli 500 1000 1000 1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Salmonella enterica 1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 1000 1000 1000 >1000 1000 >1000 1000 >1000 Enter. faecalis ATCC 29212 500 500 1000 1000 500 1000 1000 1000 Staphyl. aureus ATCC 25923 500 500 500 1000 500 500 1000 1000 Sarcina lutea ATCC 9341 31.25 125 31.25 62.5 62.5 125 31.25 62.5 Lactobacillus rhamnosus 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis 250 500 500 1000 500 500 1000 >1000 Bacillus subtilis IP 5832 125 500 500 1000 500 500 500 1000 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 13 MBC, minimum microbiocidal concentration (μg/mL) 14 Table 9. 6Antibacterial of the ligands (L4, L18) and corresponding complexes (C4a, C18). 15 Antibacterial activity of the tested platinum(IV) (C4a, C18) complexes and corresponding 16 ligands (L4, L18) are shown in Table 9. Results for these testing was reported in the papers 17 Stanković et al., (2011a,c). The ligands and corresponding platinum(IV) complexes 18 demonstrated low antimicrobial activity. There was no difference in activities between the 19 5 Radojević et al., (2011) 6 Stanković et al., (2011a; 2011c) Antibacterial Agents / Book 1 16 ligands and corresponding complexes. The ligands and corresponding platinum(IV) 1 complexes showed significant antibacterial activity against S. lutea ATTC 9341. MICs values 2 were in range from 31.25 μg/mL to 62.5 μg/mL, and MBCs values were from 62.5 μg/mL to 3 125 μg/mL. The tested compounds did not affect the growth of Gram-negative bacteria or 4 their activities were very low (MIC ranged from 500 μg/mL to >1000 μg/mL, MBC from 5 1000 μg/mL to >1000 μg/mL). Also, probiotic bacteria showed high resistance to the effects 6 of tested substances. MICs were from 125 μg/mL to 1000 μg/mL, and MBCs were from 7 500 μg/mL to >1000 μg/mL (Stanković et al., 2011a,c). 8 The results of in vitro testing of antibacterial activities of the ligands (L19, L20, L21) and 9 corresponding platinum(IV) (C19, C20, C21) complex are shown in Table 10. 10 11 12 Species L19 C19 L20 C20 L21 C21 MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Escherichia coli >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 1000 1000 Salmonella enterica >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 1000 1000 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 Enter. faecalis ATCC 29212 1000 >1000 1000 1000 1000 >1000 250 500 1000 1000 125 500 Staphyl. aureus ATCC 25923 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 250 250 1000 >1000 125 250 Sarcina lutea ATCC 9341 1000 >1000 7.81 15.625 1000 >1000 15.625 31.25 1000 >1000 31.25 62.5 Lactobacillus rhamnosus >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Bifidobact. animalis subsp. lactis 125 250 1000 1000 <31.25 125 500 500 <31.25 250 125 500 Bacillus subtilis IP 5832 125 250 250 1000 250 250 250 250 250 250 125 250 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 13 MBC, minimum microbiocidal concentration (μg/mL) 14 Table 10. Antibacterial activity of the ligands (L19, L20, L21) and corresponding complexes 15 (C19, C20, C21). 16 The difference in action between ligands and corresponding complexes can be seen at 17 Gram-positive bacteria. Ligands have significant antimicrobial effect on probiotic bacteria 18 (L20, L21), and complexes on Gram-positive bacteria (C19, C20, C21). C21 has better 19 antimicrobial effect than two other complexes. The lowest antimicrobial action of 20 compounds was on Gram-negative bacteria, where tested concentrations of ligands 21 almost didn’t have the influence, while corresponding complexes had some better action, 22 but still weak and limited. L. rhamnosus also showed similar resistance to the action of 23 tested compounds (none of the tested concentrations had the influence on its growth), 24 while the other probiotic bacteria were more sensitive, especially to the action of ligands, 25 where MIC goes from <31.25 µg/mL to 250 µg/mL. At complexes MIC is in the range 26 from125 µg/mL to 1000 µg/mL. 27 The gram-positive bacteria were more sensitive than the gram-negative bacteria. The 28 platinum(IV) complexes showed high antibacterial activity against Gram-positive bacteria. 29 MIC values were in range from 7.81 μg/mL to 1000 μg/mL, and MBC values were from 30 15.63 μg/mL to 1000 μg/mL depending on the species of bacteria. The most sensitive was S. 31 lutea ATCC 9341 (MIC values are 7.81 μg/mL, 15.625 μg/mL and 31.25 μg/mL for different 32 complexes. 33 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 17 1 Species Doxycycline MIC MBC Escherichia coli 7.81 15.625 Salmonella enterica 15.625 31.25 Pseud. aeruginosa ATCC 27853 62.5 125 Enter. faecalis ATCC 29212 7.81 62.5 Staphyl. aureus ATCC 25923 0.224 3.75 Sarcina lutea ATCC 9341 < 0.448 7.81 Lactobacillus rhamnosus 7.81 31.25 Bifidobact. animalis subsp. lactis 31.25 62.5 Bacillus subtilis IP 5832 1.953 15.625 MIC, minimum inhibitory concentration (μg/mL), 2 MBC, minimum microbiocidal concentration (μg/mL) 3 Table 11. Antibacterial activity of the positive control - doxycycline 4 In general, the ligands demonstrated low and selective antimicrobial activity (with few 5 exceptions) and the complexes showed selective and moderate antibacterial activity. MIC 6 values were in range from <7.81μg/mL to >1000 μg/mL and MBC values from 7 15.625 μg/mL to >1000 μg/mL depending on the species of bacteria. The Gram-positive 8 bacteria were more sensitive than the Gram-negative bacteria. The most sensitive species is 9 S. lutea ATCC 9341. Tested probiotics, with a few exceptions, indicate high resistance toward 10 tested compounds. L. rhamnosus shows the highest resistance among them. The tested 11 complexes C1, C2, C3 and C17a exhibit strong activity towards E. coli, P. aeruginosa ATCC 12 27853 and E. faecalis ATCC 29212. The L6, L7 and C6, C7 exhibit strong antibacterial activity 13 towards E. coli. The tested compounds did not affect S. enterica or their activities were low. 14 Some activity showed palladium(II) complexes (C1, C2 , C3, C6 and C17a). At the ligands 15 the most effective antimicrobial activity show L6, L7, L9, L10 and L11 while the most active 16 complexes are C1, C2, C3, C6 and C17a. For eleven ligands (L1 - L11) and corresponding 17 palladium(II) complexes (C1 - C11) antifungal activity is investigated. Palladium(II) 18 complexes showed good antifungal activity opposite to ligands. This study are in keeping 19 with our research to a great extent (Radojević et al., 2010). 20 4. Conclusion 21 The intensity of antimicrobial action varied depending on the species of microorganism and 22 on the type of tested compounds. The tested ligands, with few exceptions, show low 23 antimicrobial activity. The difference between antimicrobial activity of the ligands and 24 corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes is noticed and, in general, the 25 most active were palladium(II) complexes. The Gram-positive bacteria were more sensitive 26 than the Gram-negative bacteria. The most sensitive species is Sarcina lutea ATCC 9341 and 27 the most resistant is Salmonella enterica where the tested compounds did not affect or their 28 activities were low. Tested probiotics, with a few exceptions, also indicate high resistance 29 toward tested compounds. 30 Antibacterial Agents / Book 1 18 5. Acknowledgement 1 The authors are grateful for financial support to the Ministry of Education and Science of 2 Republic of Serbia (projects No. OI172016 and III41010). 3 6. References 4 Agarwal, S.K. (2007). Synthesis & Characterization of Some Mixed Ligand Complexes of 5 Pd(II), Rh(III) and Pt(IV) with Carboxylic Hydrazones as Primary and 6 Dithiooxamide as Co-ligand. Asian Journal of Chemistry, Vol.19, No.4, pp. 2581-2585, 7 ISSN: 0970-7077 8 Aghatabay, N. M.; Somer, M.; Senel, M.; Dulger, B. & Gucin, F. (2007). Raman, FT-IR, NMR 9 spectroscopic data and antimicrobial activity of bis[μ2-(benzimidazol-2-yl)-2-10 ethanethiolato-N,S,S-chloro-palladium(II)] dimer, [(μ2-CH2CH2NHNCC6H4)PdCl]2 11 C2H5OH complex. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.42, No.8, (August 12 2007), pp. 1069-1075, ISSN: 0223-5234 13 Ali, A.M., Mirza, A.H., Butcher, R.J. & Crouse, K.A. (2006). The preparation, 14 characterization and biological activity of palladium(II) and platinum(II) 15 complexes of tridentate NNS ligands derived from S-methyl- and S-16 benzyldithiocarbazates and the X-ray crystal structure of the [Pd(mpasme)Cl] 17 complex. Transition Metal Chemistry, Vol.31, No.1, (February 2006), pp. 79-87, 18 Print ISSN: 0340-4285, Online ISSN: 1572-901X 19 Al-Hazmi, G.A., El-Metwally, N.M., El-Gammal, O.A. & El-Asmy, A.A. (2008). Synthesis, 20 spectral characterization and eukaryotic DNA degradation of thiosemicarbazones 21 and their platinum(IV) complexes. Spectrochimica Acta, Part A: Molecular 22 and Biomolecular Spectroscopy, Vol.69, No.1, (January 2008), pp. 56-61, ISSN: 1386-23 1425 24 Andrews, J.M. (2005). BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 4). 25 Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Vol.56, No.1, (July 2005), pp. 60-76, Print ISSN 26 0305-7453, Online ISSN 1460-2091 27 Banfi E., Scialino G. & Monti-Bragadin C. (2003). Development of a microdilution method to 28 evaluate Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility. Journal of Antimicrobial 29 Chemotherapy, Vol.52, No.5, (November 2003), pp. 796-800, Print ISSN 0305-7453, 30 Online ISSN 1460-2091 31 Biyala, M.K., Sharma, K., Swami, M., Fahmi, N. & Vir Singh, R. (2008). Spectral and biocidal 32 studies of palladium(II) and platinum(II) complexes with monobasic bidentate 33 Schiff bases. Transition Metal Chemistry, Vol.33, No.3, (April 2008), pp. 377 – 381, 34 Print ISSN: 0340-4285, Online ISSN: 1572-901X 35 Brudzinska, I., Mikata, Y., Obata, M., Ohtsuki, C. & Yano, S. (2004). Synthesis, structural 36 characterization, and antitumor activity of palladium(II) complexes containing a 37 sugar unit. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol.14, No.10, (17 May), pp. 38 2533–2536, ISSN: 0960-894X 39 Coombs, R.R., Ringer, M.K., Blacquiere, J.M., Smith, J.C., Neilsen, J.S., Uh, Y., Gilbert, J.B., 40 Leger, L.J., Zhang, H., Irving A.M., Wheaton, S.L., Vogels, C.M., Westcott, S.A., 41 Decken, A. & Baerlocher, F.J. (2005). Palladium(II) Schiff base complexes derived 42 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 19 from sulfanilamides and aminobenzothiazoles. Transition Metal Chemistry, 1 Vol.30, No.4, (May 2005), pp. 411-418, Print ISSN: 0340-4285, Online ISSN: 1572-2 901X 3 Dimitrijević, D.P., Vujić, J.M., Garcia-Granda, S., Menendez-Taboada, L. & Trifunović S.R. 4 (2010). Synthesis and crystal structure of O,O'-dipropyl-ethylenediamine-N,N'-di-5 (S,S)-(2,2'-dibenzyl)-acetate dihydrochloride. Proceedings of XVII Conference of the 6 Serbian Crystallographic Society, pp. 48, ISBN: 978-86- 6009-004-3, Ivanjica, Serbia, 7 June 3-5, 2010. 8 Dimitrijević, D.P., Radić G.P., Glođović, V.V., Radojević I.D., Stefanović O.D. , Čomić Lj., 9 Ratković Z.R., Valkonen A., Rissanen, K. & Trifunović, S. R. (2011). Crystal 10 structure of bis-(S-benzyl-thiosalicylate)-palladium(II) complex, [Pd(S-bz-eddp)2]. 11 Proceedings of XVIII Conference of the Serbian Crystallographic Society, pp. 44, ISBN: 12 978-86-7031-194-7, Fruška Gora, Serbia, June 2-4, 2011. 13 Kizilcikli, I., Kurt, Y.D., Akkurt, B., Genel, A.Y., Birteksöz, S., Ötük, G. & Ülküseven, B. 14 (2007). Antimicrobial Activity of a Series of Thiosemicarbazones and Their ZnII and 15 PdII Complexes. Folia Microbiologica, Vol.52, No.1, (January 2007), pp. 15-25, Print 16 ISSN: 0015-5632, Online ISSN: 1874-9356 17 Kovala-Demertzi, D., Demertzis, M.A., Miller, J.R., Papadopoulou, C., Dodorou, C. & 18 Filousis, G. (2001). Platinum(II) complexes with 2-acetyl pyridine 19 thiosemicarbazone: Synthesis, crystal structure, spectral properties, antimicrobial 20 and antitumour activity, Journal of Inorganic Biochemistry, Vol.86, No.2-3, 21 (September 2001), pp. 555-563, ISSN: 0162-0134 22 Garoufis, A., Hadjikakou, S.K. & Hadjiliadis, N. (2009). Palladium coordination compounds 23 as anti-viral, anti-fungal, anti-microbial and anti-tumor agents. Coordination 24 Chemistry Reviews, Vol.253, No.9-10, (May 2009), pp. 1384–1397, ISSN: 0010-8545 25 Guerra W., de Andrade Azevedo E., de Souza Monteiro A. R., Bucciarelli-Rodriguez M., 26 Chartone-Souza E., Nascimento A. M. A., Fontes A. P. S., Le Moyec L., Pereira-Maia 27 E. C. (2005). Synthesis, characterization, and antibacterial activity of three 28 palladium(II) complexes of tetracyclines. Journal of Inorganic Biochemistry, Vol.99, 29 No.12, (December 2005), pp. 2348–2354, ISSN: 0162-0134 30 Fluit, A.C., Jones, M.E., Schmitz, F.J., Acar, J., Gupta, R., Verhoef, J., & the SENTRY 31 Participants Group. (2000). Antimicrobial susceptibility and frequency of 32 occurrence of clinical blood isolates in Europe from the SENTRY Antimicrobial 33 Surveillance Program, 1997 and 1998. Clinical Infectious Diseases, Vol.30, No.3, 34 (March 2000), pp. 454-460, ISSN: 1058-4838 35 Manav, N., Mishra, A.K. & Kaushik, N. K. (2006). In vitro antitumour and antibacterial 36 studies of some Pt(IV) dithiocarbamate complexes. Spectrochimica Acta, Part A: 37 Molecular and Biomolecular Spectroscopy. Vol.65, No.1, (September 2006), pp. 32-35, 38 ISSN: 1386-1425 39 Mishra, A.K. & Kaushik, N.K. (2007). Synthesis, characterization, cytotoxicity, antibacterial 40 and antifungal evaluation of some new platinum (IV) and palladium (II) complexes 41 of thiodiamines. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.42, No.10, (October 42 2007), pp. 1239-1246, ISSN: 0223-5234 43 Antibacterial Agents / Book 1 20 Mishra A.K., Mishra, S.B., Manav, N. & Kaushik, N.K. (2007a). Platinum(IV) and 1 palladium(II) thiosemicarbazide and thiodiamine complexes: A spectral and 2 antibacterial study. Journal of Coordination Chemistry. Vol.60, No.18, (September 3 2007) pp. 1923-1932, Print ISSN: 0095-8972, Online ISSN: 1029-0389 4 Mishra, A.K., Mishra, S.B., Manav, N., Kumar, R., Sharad, R., Chandra, R., Saluja, D. & 5 Kaushik, N.K. (2007b). Platinum (IV) thiohydrazide, thiodiamine and 6 thiohydrazone complexes: A spectral, antibacterial and cytotoxic study. 7 Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Vol.66, No.4-5, 8 (April 2007), pp. 1042-1047, ISSN: 1386-1425 9 Radić, G.P., Glođović, V.V., Garsia-Granda, S., Menéndez-Taboada, L., Ratković, Z.& 10 Trifunović S.R. (2010a). Crystal structure of 1,2-diphenyl-ethylenediamine- N,N'-di-11 3- propanoic acid dihydrochloride. Proceedings of XVII Conference of the Serbian 12 Crystallographic Society, pp. 36, ISBN: 978-86- 6009-004-3, Ivanjica, Serbia, June 3-5, 13 2010. 14 Radić, G.P., Glođović, V.V., Heinemann, F.W. & Trifunović, S.R. (2010b). Synthesis and 15 crystal structure of palladium(II) complex with O,O'-diethyl- (S,S)-16 ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl) butanoate. Proceedings of XVII Conference of 17 the Serbian Crystallographic Society, pp. 60, ISBN: 978-86-6009-004-3, Ivanjica, Serbia, 18 June 3-5, 2010. 19 Radić, G.P., Glođović, V.V., Kaluđerović, G.N., Heinemann, F.W. & Trifunović, 20 S. R. (2011a). Palladium(II) complexes with R2edda derived ligands. Part V. 21 Reaction of O,O'-Diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)butanoate 22 with K2[PdCl4]. Transition Metal Chemistry, Vol.36, No.4 , (May 2011 ), pp. 331–23 336, ISSN: 0340-4285 24 Radić, G.P., Glođović, V.V., Radojević, I.D., Stefanović, O.D., Čomić, Lj.R., Ratković, Z.R., 25 Valkonen, A., Rissanen, K. & Trifunović, S.R. (2011b). Synthesis, characterization 26 and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl derivates 27 of thiosalicylic acids. Crystal structure of bis(S-benzyl-thiosalicylate)-28 palladium(II) complex, [Pd(S-bz-thiosal)2]. Polyhedron, Accepted, In Press, n.d. 29 ISSN: 0277-5387 30 Radojević, I., Čomić, Lj., Stefanović, O., Glodjović, V., Vasić, V., Vujić, J. & Trifunović, S. 31 (2010). Antimicrobial activity ligands and their corresponding palladium(II) 32 complexes against Aspergillus species. Proceedings of ICAR 2010, International 33 Conference on Antimicrobial Research, pp. 475-476, Available from: 34 http://www.formatex.org/icar2010/index.html, Valladolid, Spain, November 3-5, 35 2010. 36 Radojević, I., Stefanović, O., Radić, G., Glođović, V., Čomić, Lj. & Trifunović, S. (2011). In 37 vitro antimicrobial activity of novel platinum(iv) and palladium(ii) complexes with 38 1,2-diphenyl-ethylenediamine-n,n'-di-3-propanoic acid. Proceedings of Preclinical 39 testing of active substances and cancer research, with International Symposium on Anti-40 Cancer Agents, Cardiotoxicity and Neurotoxicity, pp. 10-11, ISBN: 978-86-7760-064-8, 41 Kragujevac, Serbia, March 16-18, 2011. 42 From Synthesis to Antibacterial Activity of Some New Palladium(II) and Platinum(IV) Complexes 21 Sarker, S.D., Nahar, L. & Kumarasamy, Y. (2007). Microtitre plate-based antibacterial assay 1 incorporating resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in 2 vitro antibacterial screening of phytochemicals. Methods, Vol.42, No.4, (August 3 2007), pp. 321-324,. ISSN: 1046-2023 4 Stanković, M., Radić, G., Glođović, V., Radojević, I., Stefanović, O., Čomić, Lj. & Trifunović, 5 S. (2011a). Antimicrobial activity of ethyl esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N′-di-2-6 propanoic and (S,S)- ethylenediamine-N,N′-di-2-(3-methyl)-butanoic acids and 7 corresponding platinum(IV) complexes. Proceedings of Preclinical testing of active 8 substances and cancer research, with International Symposium on Anti-Cancer Agents, 9 Cardiotoxicity and Neurotoxicity, pp. 9-10, ISBN: 978-86-7760-064-8, Kragujevac, 10 Serbia, March 16-18, 2011. 11 Stanković, M.Z., Radić, G.P., Glođović, V.V., Klisurić, O.R. & Trifunović, S.R. (2011b). 12 Synthesis and crystal structure of tetrachoride-(O,O'-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-13 N,N'-di-2-propanoato)-platinum(IV). Proceedings of XVIII Conference of the Serbian 14 Crystallographic Society, pp. 42, ISBN: 978-86-7031-194-7, Fruška Gora, Serbia, June 15 2-4, 2011. 16 Stanković, M.Z., Radić, G.P., Glođović, V.V., Radojević, I.D., Stefanović, O.D., Čomić, L.R., 17 Klisurić, O.R., Djinović, V.M. & Trifunović, S.R., (2011c). Stereospecific ligands and 18 their complexes IX: Synthesis, characterization and antimicrobial activity of ethyl 19 esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N’-di-2-propanoic and (S,S)-ethylenediamine-20 N,N’-di-2-(3-methyl)-butanoic acids and corresponding platinum(IV) complexes: 21 Crystal structure of tetrachloride-(O,O’-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N’-di-2-22 propanoato)-platinum(IV), [PtCl4(det-S,S-eddp)]. Polyhedron, In Press, doi: 23 10.1016/j.poly.2011.05.034, ISSN: 0277-5387 24 Vasić, G., Glodjović, V., Radojević, I., Stefanović, O., Čomić, Lj. & Trifunović, S. (2010). 25 Stereospecific ligands and their complexes. V. Synthesis, characterization and 26 antimicrobial activity of palladium (II) complexes with some alkyl esters of 27 ethylenediamine-N,N'-di-S,S-2-propionic acid. Inorganica Chimica Acta, Vol.363, 28 No.13, (October 2010), pp. 3606-3610, ISSN: 0020-1693 29 Vieira, L.M.M., de Almeida, M.V., Lourenço, M.C.S., Bezerra, F.A.F.M. & Fontes, A.P.S. 30 (2009). Synthesis and antitubercular activity of palladium and platinum complexes 31 with fluoroquinolones. European Journal of Medicinal Chemistry, Vol.44, No.10, 32 (October 2009), pp. 4107- 4111, ISSN: 0223-5234 33 Vujić, J.M., Cvijović, M., Kaluđerović, G.N., Milovanović, M., Zmejkovski B.B., Volarević 34 V., Arsenijević N., Sabo, T.J. & Trifunović, S.R. (2010). Palladium(II) complexes 35 with R2edda derived ligands. Part IV. O,O′-dialkyl esters of (S,S)-36 ethylenediamine-N,N′-di-2-(4-methyl)-pentanoic acid dihydrochloride and their 37 palladium(II) complexes: Synthesis, characterization and in vitro antitumoral 38 activity against chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells. European Journal of 39 Medicinal Chemistry, Vol.45, No.9, (September 2010), pp. 3601-3606, ISSN: 0223-40 5234 41 42 Antibacterial Agents / Book 1 22 Vujić, J.M., Garcia-Granda, S., Menendez-Taboada, L. & Trifunović, S.R. (2011). Crystal 1 structure of palladium(II) complex with O,O'- dipentil-etilenediamine- N,N'-di-2 (S,S)-2(4-methy)-pentanoate ligand. Proceedings of XVIII Conference of the Serbian 3 Crystallographic Society, pp. 40, ISBN: 978-86-7031-194-7, Fruška Gora, Serbia, June 4 2-4, 2011. 5 Synthesis, characterization and antimicrobial activity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with meso-1,2-diphenyl- -ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid. Crystal structure of H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O 1 2 3 4 5 6 Gordana P. Radića, Verica V. Glođovića, Zoran R. Ratkovića, Slađana B. Novakovićb, Santiago Garcia-Grandac, Laura Rocesc, Laura Menéndez-Taboadac, Ivana D. Radojevićd, Olgica D. Stefanovićd, Ljiljana R. Čomićd and Srećko R. Trifunovića 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 aDepartment of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Domanovića 12, 34000 Kragujevac, Republic of Serbia bVINČA Institute of Nuclear Sciences, Laboratory of Theoretical Physics and Condensed Matter Physics, PO Box 522, 11001 Belgrade, Republic of Serbia cPhysical and Analytical Chemistry Department, University of Oviedo, 33006 Oviedo, Spain dDepartment of Biology and Ecology, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Domanovića 12, 34000 Kragujevac, Republic of Serbia Abstract In the reaction of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine (1,2-dphen) with neutralized 3-chlor-propanoic acid, the new linear tetradentate edda-like ligand (edda = ethylenediamine-N,N'-diacetic ion) meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di- -3-propanoic acid dihydrochloride monohydrate (H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O) was prepared. The 1Corresponding author. Phone: +381 34300263; fax: +381 34335040 e-mail address: srecko@kg.ac.rs (S. R. Trifunović) corresponding platinum(IV) complex, s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine- -N,N'-di-3-propanoate)-platinum(IV) ([PtCl2(1,2-dpheddp)]) was synthesized by heating potassium-hexachloridoplatinate(IV) and H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O on steam bath for 12 hours with neutralization by means of lithium-hydroxide. The palladium(II) complex, cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)- -palladium(II) ([PdCl2(1,2-dpheddp)]) was obtained in the similar way using potassium- -tetrachloridopalladate(II), H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O and lithium-hydroxide. The compounds were characterized by elemental analysis and infrared spectroscopy. The spectroscopically predicted structure of the synthesized tetradentate ligand was confirmed by X-ray analysis of the H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O. 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Antimicrobial activity of the ligand and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes is investigated against 25 species of microorganisms. Testing is preformed by microdilution method and minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum microbicidal concentration (MMC) have been determined. The difference between antimicrobial activity of the ligand and corresponding platinum(IV) and palladium(II) complex is noticed and, in general, palladium(II) complex was the most active. Keywords: meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid; platinum(IV) complex; palladium(II) complex; infrared spectroscopy; crystal structure; antimicrobial activity 1. Introduction A geometrical isomerism in metal complexes of linear flexible tetradentate ligands having the donor atom array ONNO such as edda (edda = ethylenediamine- -N,N'-diacetato ion) or eddp (eddp = ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate ion) has been an interesting field studied by numerous authors [1-14]. Such ligands occupy four octahedral sites around the central ion and the other two sites may be occupied by other ligands. In that case three geometrical isomers are possible, as shown in Figure 1. 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 In most synthetic routes [1-14] edda takes a symmetric coordination position (s-cis) rather than unsymmetric one (uns-cis) [3]. It has been suggested that the observed chelate strain of chelate rings in uns-cis-edda complexes may be a contributing factor in determining the configuration of the edda ligand [6]. 1,3-pdda ligand (1,3-pdda = 1,3- -propylenediamine-N,N'-diacetate ion) and eddp (eddp = ethylenediemine-N,N'-di-3- -propanoate ion), with a longer diamine and carboxylate chelate rings than edda, prefer unsymmetric coordination [1,15,16], suggesting that the size of the chelate rings in linear tetradentate edda and similar ligands have a profound effect on the distribution of the geometrical isomers of the complexes. The synthesis and evaluation of the biological activity of the new metal-based compounds is the field of growing interest. Numerous complexes based on palladium(II) and platinum(IV)- -ion have been synthesized and their different biological activities have been documented [17–19]. The impact of different palladium and platinum complexes on the growth and metabolism of various groups of microorganisms has been studied. Garoufis et al. [20] reviewed numerous scientific papers on anti-viral, antibacterial and antifungal activity of palladium(II) complexes with different types of ligands (sulfur and nitrogen donor ligands, Schiff base ligands and drugs as ligands). There are other papers in the literature showing different intensity of palladium(II) and platinum(IV) complexes activity on various species of bacteria and fungi [21–34]. The aim of this paper is to synthesize new palladium(II) and platinum(IV) complexes and in vitro research their antibacterial and antifungal activities. 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 We wanted to extend the investigation of platinum complexes with derivatives ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate. The initial idea of this work was to prepare a new linear edda-like ligand, meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid (H2-1,2-dpheddp) and corresponding platinum(IV) and palladium(II) complexes. In all our attempts we prepared only s-cis geometrical isomer of Pt(IV) with low solubility in water and common organic solvents. 2. Experimental 2.1. Materials and measurements The reagents were obtained commercially and used without further purification. Infrared spectra were recorded on Perkin-Elmer FT-IR spectrophotometer, Spectrum One, using the KBr pellet technique. Elemental analyses were done on a Vario III CHNOS Elemental Analyzer, Elemental Analysensysteme GmbH. 2.2. Syntheses 2.2.1. Preparation of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine, 1,2-dphen The meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine was prepared according to the procedure described earlier [35]. Benzaldehyde (30.00 g) was refluxed with ammonium-acetate (60.00 g) for 3 hours. The reaction mixture was cooled and the product was filtered and washed with ethanol. Recrystallization from 1-butanol gave N-benzoyl-N'-benzylidene- -meso-1,2-diphenyl-ethylendiamine. Hydrolysis of that compound with 70% sulphuric acid under reflux for 1h gave meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine as the basic product of hydrolysis. 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 2.2.2. Preparation of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid dihydrohloride monohydrate, H2 -1,2-dpheddp·2HCl·H2O 3-Chloro-propanoic acid (4.34 g, 0.04 mol) was dissolved in 5.0 mL of water on ice bath and carefully neutralized with cold water solution of 5.0 mL NaOH (1.60 g, 0.04 mol). Meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine (4.24 g, 0.02 mol) was added to this solution. The mixture was being stirred for 4 hours at 90°C, and during this period 5.0 mL NaOH water soltion (1.60 g, 0.04 mol) was introduced. After that, 5.6 mL 6 mol/L HCl was added and resulting solution was evaporated to the volume of 7.0 mL; 6.0 mL conc. HCl, 6.0 mL of ethanol and 6.0 mL of ether were added to the mixture. The white precipitate of meso-1,2-diphenyl- -ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid dihydrochloride-monohydrate, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O was separated by filtration and refined with solution water : ethanol = 1 : 2. Yield: 4.00 g (44.69 %). Anal. Calcd. for H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O = C20H28Cl2N2O5 (Mr = 447.344): C, 53.69; H, 6.31; N, 6.26. Found: C, 53.88; H, 6.70; N, 6.08. 2.2.3. Preparation of s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoate)-platinum(IV), s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] Potassium-hexachloridoplatinate(IV) (0.2000 g, 0.411 mmol) was dissolved in 10.0 mL water on a steam bath and meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid dihydrohloride monohydrate (0.1839 g, 0.411 mmol) was added. The reaction mixture was heated for 12 hours and during this period 10.0 mL of LiOH water solution (0.0394 g, 1.65 mmol) was added in small portions and the solution was filtered and evaporated to small volume. The orange precipitate of s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] was separated by filtration, washed with cold water and air-dried. Yield: 0.095 g. (37.25%). Anal. Calc. for s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] = C20H26Cl2N2O4Pt (Mr = 620.396): C, 38.72; H, 3.57; N, 4.52. Found: C, 38.38; H, 3.81; N, 4.60. 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 2.2.4. Preparation of cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoate)-palladium(II), [PdCl2(1,2-dpheddp)] K2[PdCl4] (0.200 g, 0.613 mmol) was dissolved in 10.0 mL of water on a steam bath and meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid dihydrohloride monohydrate, H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O, (0.2742 g, 0.613 mmol) was added. The mixture was stirred for 2h and during this period water solution of LiOH (0.059 g, 2.452 mmol in 10.0 mL of water) was introduced. The complex cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)], as yellow precipitate, was filtered, washed with cold water and air-dried. Yield: 0.25 g (76.43%). Anal. Calc. for cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] = C20H24Cl2N2O4Pd (Mr = 533.732) (%): C, 45.00; H, 4.53; N, 5.25. Found: C, 45.64; H, 4.87; N, 5.31. 2.3. Crystal structure determination The single-crystals of H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O suitable for X-ray structure analysis were obtained by recrystallization of powdered substance from a small amount of water-ethanol mixture (1:2). The diffraction data were collected at room temperature on Oxford Diffraction Xcalibur Gemini S diffractometer equipped with CuKα radiation (λ = 1.54184 Å) (Table 1). The data were processed with CrysAlis software [36] and corrected for absorption by analytical numeric method [37]. Crystal structure was solved by direct methods, using Sir2002 [38] and refined using SHELXL [39]. The carboxyl O2–H group was found to be disordered over two sites whose occupancies were held at 50% during refinement. H atoms were placed at geometrically calculated positions with the D–H distances fixed to 0.93, 0.97, 0.90 and 0.82 Å from C(sp2), C(sp3), N and O atoms respectively. The corresponding isotropic displacement parameters of the hydrogen atoms were equal to 1.2 Ueq of the parent C and N and 1.5 Ueq of the parent O atoms. The details of the X-ray structural analysis are given in Table 1. Hydrogen bonds are listed in Table 2. The complete list of bond lengths and angles between non-hydrogen atoms as well as additional figures can be found in the supplementary material, Table S1. Geometrical calculations were made with PARST97 [40] and molecular graphics with ORTEP-3 [41]. 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 2.4. In vitro antimicrobial assay 2.4.1. Test substances The tested compounds were dissolved in DMSO and then diluted into nutrient liquid medium to achieve a concentration of 10%. An antibiotic, doxycycline (Galenika A.D., Belgrade), was dissolved in nutrient liquid medium, a Mueller-Hinton broth (Torlak, Beograd), while an antimycotic, fluconazole (Pfizer Inc.,USA) was dissolved in Sabouraud dextrose broth (Torlak, Belgrade). 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 2.4.2. Test microorganisms Antimicrobial activity of the ligand and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes was tested against 25 microorganisms. The experiment involved 15 strains of pathogenic bacteria, including 7 standard strains (Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923; Sarcina lutea ATCC 9341; Bacillus subtilis ATCC 6633; Bacillus pumilus NCTC 8241) and 8 clinical isolates (Escherichia coli; Enterococcus faecalis; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus; Sarcina lutea; Bacillus subtilis; Proteus mirabilis; Salmonella enterica). Also, four species of pathogenic fungi (Aspergillus fumigatus PMFKG-F23; Aspergillus flavus PMFKG-F24; Aspergillus restrictus PMFKG-F25; Aspergillus niger PMFKG-F26); two yeast species (Candida albicans (clinical isolate) and Rhodotorula sp. PMFKG-F27) and four species of probiotics (Lactobacillus plantarium PMFKG-P31, Bacillus subtilis IP 5832 PMFKG-P32, Bifidobacterium animalis subsp. lactis PMFKG-P33; Saccharomyces boulardii PMFKG-P34) were tested. All clinical isolates were a generous gift from the Institute of Public Health, Kragujevac. The other microorganisms were provided from a collection held by the Microbiology Laboratory Faculty of Science, University of Kragujevac. 2.4.3. Suspension preparation Bacterial suspensions and yeast suspension were prepared by the direct colony method. The colonies were taken directly from the plate and were suspended in 5 mL of sterile 0.85% saline. The turbidity of initial suspension was adjusted by comparing with 0.5 McFarland’s standard (0.5 mL 1.17% w/v BaCl2×2H2O + 99.5 mL 1% w/v H2SO4) [42]. When adjusted to the turbidity of the 0.5 McFarland’s standard, bacteria suspension contains about 108 colony forming unites (CFU)/mL and suspension of yeast contains 106 CFU/mL. Ten-fold dilutions of initial suspension were additionally prepared into sterile 0.85% saline. The suspensions of fungal spores were prepared by gentle stripping of spore from slopes with growing aspergilli. The resulting suspensions were 1:1000 diluted in sterile 0.85% saline. 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 2.4.4. Microdilution method Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum microbicidal concentration (MMC) by using microdilution plate method with resazurin [43]. The 96-well plates were prepared by dispensing 100 μL of nutrient broth, Mueller-Hinton broth for bacteria and Sabouraud dextrose broth for fungi and yeasts, into each well. A 100 μL from the stock solution of tested compound (concentration of 2000 μg/mL) was added into the first row of the plate. Then, twofold, serial dilutions were performed by using a multichannel pipette. The obtained concentration range was from 1000 to 7.81 μg/mL. A 10 μL of diluted bacterial, yeast suspension and suspension of spores was added to each well to give a final concentration of 5 x 105 CFU/mL for bacteria and 5 x 103 CFU/mL for fungi and yeast. Finally, 10 μL resazurin solution was added to each well inoculated with bacteria and yeast. Resazurin is an oxidation-reduction indicator used for the evaluation of microbial growth. It is a blue non-fluorescent dye that becomes pink and fluorescent when reduced to resorufin by oxidoreductases within viable cells. The inoculated plates were incubated at 37 °C for 24 h for bacteria, 28 °C for 48 h for the yeast and 28 °C for 72 h for fungi. MIC was defined as the lowest concentration of tested substance that prevented resazurin color change from blue to pink. For fungi, MIC values of the tested substance were determined as the lowest concentration that visibly inhibited mycelia growth. 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 Doxycycline and fluconazole were used as a positive control. Solvent control test was performed to study an effect of 10% DMSO on the growth of microorganism. It was observed that 10% DMSO did not inhibit the growth of microorganism. Also, in the experiment, the concentration of DMSO was additionally decreased because of the twofold serial dilution assay (the working concentration was 5% and lower). Each test included growth control and sterility control. All tests were performed in duplicate and MICs were constant. Minimum bactericidal and fungicidal concentration was determined by plating 10 μL of samples from wells, where no indicator color change was recorded, on nutrient agar medium. At the end of the incubation period the lowest concentration with no growth (no colony) was defined as minimum microbicidal concentration. 3. Results and discussion The meso-1,2-diphenyl-ethylenediamin-N,N'-di-3-propanoate ligand was obtained in reaction between meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine and 3-chloro-propanoic acid (Fig. 2.). Three geometrical isomers of 1,2-dpheddp-Pt(IV) complex with two identical monodentate ligands are theoretically possible, s-cis, uns-cis and trans (Fig. 1.). In reaction between K2[PtCl6] with H2-1,2-dpheddp ligand only one isomer of neutral octahedral 1,2-dpheddp-Pt(IV) complex, s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoate)-platinum(IV), s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)], with tetradentate coordination of the H2-1,2-dpheddp ligand was obtained (Fig. 3.). The complex is slightly soluble in water and, unfortunately, almost insoluble in organic solvents. In reaction between K2[PdCl4] with H2-1,2-dpheddp ligand only one isomer of neutral square-planar 1,2-dpheddp-Pd(II) complex, cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)- -palladium(II), cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)], with bidentate coordination of the H2-1,2-dpheddp ligand was obtained (Fig. 4.). 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 3.1. Infrared Spectra As it was demonstrated for metal aminocarboxylic acid complexes [44,45], the asymmetric stretching frequency of the carboxylate groups of the five-membered [44] rings lies at higher energy than the corresponding frequency of the six-membered chelate rings [45]. Later, this was supported by Neal and Rose [46] and Douglas et al [47,48] who found that edta-type hexadentate complexes with mixed and equivalent (two five- and six-membered) carboxylate arms, such as trans(O5)-[M(S,S-edds)]- (M = Co(III) or Cr(III); S,S-edds = S,S-ethylenediemine- -N,N'-disuccinic ion) [46-48] and trans(O5)-[M(eddadp)]- (eddadp = ethylenediamine-N,N'- -diacetato-N,N'-di-3-propionato ion) [47,48] exhibited two very strong and well-separated bands in the asymmetric stretching carboxylate frequency region. The bands were assigned to the carbonyl stretching vibrations of the five-membered rings at higher energy and six-membered rings at lower energy. The isolated platinum(IV) and palladium(II) complexes do not show any well resolved doublets in the asymmetric C=O stretching region (at 1618 cm-1 and 1610 cm-1 for platinum(IV) and at 1643 cm-1 and 1580 cm-1 for palladium(II) complex; Table 3), and mentioned doublets lie at lower energy than the corresponding bands of five-membered chelate rings [47,49]. The lack of absorption between 1700-1750 cm-1 indicates that the both carboxyl groups of the H2-1,2-dpheddp ligand are coordinated to the central platinum(IV) ion. The prepared ligand, meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid, has absorption bands in the same asymmetric C=O stretching region between 1700-1750 cm-1 (1754 cm-1 and 1732 cm-1, Table 3) suggesting some small differences in energies of COO- groups. 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 3.2. Description of the structure X-ray diffraction analysis of 1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoic acid confirmed expected meso orientation of the phenyl residues and dihydrochloride form of the molecule. The crystal structure of this compound is composed of two independent molecules with partly different conformations and molecules of crystal water, Fig. 5. Since the both acid molecules are centrosymmetrical, the asymmetric unit contains two halves, one from each of the independent molecules labelled as A and B. In molecule A the carboxyl O2–H group was found to be equally disordered over two sites. The two molecules have relatively similar bond distances and angles, however, having in mind a weak quality of X-ray diffraction data caused by small size of single-crystals, the presence of the solvent water molecule as well as the mentioned disorder in A, the direct comparison should be taken with care. The values of C2–C3–N1–C4 torsion angle in A and the equivalent C12–C13–N2–C14 torsion angle in B are equal to 180.0(6) and 172.3(6)° respectively, indicating somewhat different, but essentially planar forms of these parts of the aliphatic chains. The difference between the molecules becomes more significant if we compare the orientation of their carboxyl groups. In molecule A the carboxyl group is approximately coplanar to the rest of the aliphatic chain with the C1–C2–C3–N1 torsion angle of 175.3(7)°. In molecule B the directionality of this group is significantly changed and the corresponding C11–C12–C13–N2 torsion angle is equal to 55.3(10)° (Fig. S1). Such a conformation of molecule B allows the formation of intramolecular N–H…O hydrogen bond, which lacks in molecule A (Fig. S2). The difference in conformation of two molecules could be explained by the fact that their carboxyl groups form quite diverse hydrogen bonding. While the acceptor O1 from the molecule A engages only in one interaction (C13−H13b···O1), the corresponding O3 acceptor in molecule B, forms three interactions, where two represent the strongest hydrogen bonds of the crystal structure, N2−H2b···O3 and N1−H1a···O3 (Table 2). Furthermore, the O2–H group in molecule A is disordered over two positions as the crystal packing allows its simultaneous interaction with two different H acceptors (O5 and Cl2) and formation of two relatively strong hydrogen bonds (Table 2). In contrast to this, the equivalent O4–H group in molecule B does not form any significant interaction except the relatively weak N1–H…O4 hydrogen bond. 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 Apart from the carboxyl groups, the crystal structure contains additional hydrogen bonding sites such as Cl anions, molecule of crystal water and N–H groups which together build a rather complex 3D hydrogen bonding network. However as a dominant structural motif in this crystal packing one can identify the chain formed by direct interaction of molecules A and B via the strongest hydrogen bond, N1−H1a···O3. The neighbouring molecules A and B within this chain are additionally interconnected by several O–H…Cl and N–H…Cl hydrogen bonds, with a short H…Cl distances ranging from 2.20 to 2.33 Å (Fig. S3). 3.3. Microbiology The results of in vitro testing of antibacterial and antifungal activities of the ligand and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complex are shown in Table 4. For comparison, MIC and MMC values of doxycycline and fluconazole are also listed in Table 4. The tested ligand, palladium(II) and platinum(IV) complex showed different degrees of antimicrobial activity in relation to the tested species. The intensity of antimicrobial action varied depending on the species of microorganism and on the type of tested compounds. In general, the activity of complexes, especially of palladium(II) complex, was higher than the ligand. Also, platinum(IV) and palladium(II) complexes demonstrated more potent inhibitory effects on the growth of bacteria than fungi. 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 The palladium(II) complex showed significant antibacterial activity. MIC values were in range from 15.63 μg/mL to 500 μg/mL, and MMC values were from 125 μg/mL to 1000 μg/mL depending on the species of bacteria. The Gram-positive bacteria were more sensitive than the Gram-negative bacteria with MIC values at 31.25 μg/mL, 62.5 μg/mL. Interestingly, the tested complex exhibits strong antibacterial activity towards Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (MIC=15.63 μg/mL). The palladium(II) complex showed low antifungal activity, except for Aspergillus niger (MIC = 31.25 μg/mL). The ligand and corresponding platinum(IV) demonstrated low to moderate antimicrobial activity. MICs were from 125 μg/mL >1000 μg/mL while MMCs were from 500 μg/mL to >1000 μg/mL. The tested concentrations of the compounds did not affect the growth of clinical isolates of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Salmonella enterica, Candida albicans and Aspergillus flavus. 4. Conclusion In this paper we reported syntheses and crystal structure of tetradentate H2-1,2-dpheddp ligand. On the basis of the elemental analyses, infrared spectroscopy the s-cis geometry of the dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoate)-platinum(IV), s-cis-[PtCl2(1,2-dpheddp)] prepared by the direct reaction of K2[PtCl6] and H2-1,2-dpheddp in water solution, was proposed. The syntheses of cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)-palladium(II), cis-[PdCl2(1,2-dpheddp)] were also reported. Antimicrobial activity of ligand and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes was investigated against 25 species of microorganisms. The difference between antimicrobial activity of the ligand and corresponding platinum(IV) and palladium(II) complex was noticed and, in general, the most active was palladium(II) complex. Also, the complexes demonstrated more potent inhibitory effects on the growth of bacteria than fungi. 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 Acknowledgment This work was supported by Ministry of Education and Science of Republic of Serbia, Projects No 172016, No 173032 and 172035. Appendix A. Supplementary data CCDC 852978 contains the supplementary crystallographic data for crystal structure H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O. These data can be obtained free of charge via http://www.ccdc.cam.ac.uk/conts/retrieving.html, or from the Cambridge Crystallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK; fax: (+44) 1223-336-033; or e-mail: 340 341 deposit@ccdc.cam.ac.uk. 342 343 344 345 346 References [1] a) G.R. Brubaker, D.P. Schaefer, J.H. Worrell, Coord. Chem. Rev. 7 (1971) 161; b) D.J. Radanović, Coord. Chem. Rev. 54 (1984) 159; c) T.J. Sabo, S.R. Grgurić, S.R. Trifunović, Synth. React. Inorg. Met.-Org. Chem., (Review) 32 (2002) 1661. 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 [2] V.M. Đinović, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 67 (2002) 367. [3] J.I. Legg, D.W. Cooke, Inorg. Chem. 4 (1965) 1576. [4] N. Sakagami, T. Yasui, H. Kawaguchi, T. Ama, S. Kaizaki, Bull. Chem. Soc. Jpn. 67 (1994) 680. [5] J.I. Legg, D.W. Cooke, B.E. Douglas, Inorg. Chem. 6 (1967) 700. [6] V.M. Đinović, S.R. Grgurić, Xu Xing-You, T.J. Sabo, J. Coord. Chem. 53 (2001) 355. [7] S.R. Grgurić, S.R. Trifunović, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 63 (1998) 669. [8] Ž.Lj. Tešić, T.J. Sabo, S.R. Trifunović, D.M. Milojković, J. Chromatogr. A 874 (1999) 297. [9] N. Petranović, D. Minić, T.J. Sabo, D.J. Đoković, J. Therm. Anal. Co. 59 (2000) 807. [10] S.R. Grgurić, T.J. Sabo, Synth. React. Inorg. Met.-Org. Chem. 29 (1999) 1567. [11] G.N. Kaluđerović, T.J. Sabo, Polyhedron 21 (2002) 2277. [12] V.M. Đinović, G.A. Bogdanović, S. Novaković, T.J. Sabo, Synth. React. Inorg. Met.- Org. Chem. 32 (2002) 1085. [13] G.N. Kaluđerović, G.A. Bogdanović, T.J. Sabo, J. Coord. Chem. 55 (2002) 817. [14] P.J. Garnett, D.W. Watts, Inorg. Chim. Acta 8 (1974) 293. [15] M. Okabayashi, K. Igi, J. Hidaka, Bull. Chem. Soc. Jpn. 52 (1979) 753. [16] T.J. Sabo, S.R. Grgurić, D.D. Minić, S.R. Trifunović, J. Coord. Chem. 44 (1998) 47. [17] S.K. Agarwal, Asian J. Chem. 19(4) (2007) 2581. [18] A.K. Mishra, S.B. Mishra, N. Manav, N.K. Kaushik, J. of Coord. Chem. 60 (2007) (17-19). [19] A.K. Mishra, N.K. Kaushik, Eur. J. Med. Chem. 42(10) (2007) 1239. [20] A. Garoufis, S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis, Coord. Chem. Rev. 253 (2009) 1384. 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 [21] A.K. Mishra, S.B. Mishra, N. Manav, R. Kumar, R. Chandra, D. Saluja, N.K. Kaushik, Spectrochim. Acta A 66A(4-5) (2007) 1042. [22] G.A. l-Hazmi, N.M. El-Metwally, O.A. El-Gammal, A.A. El-Asmy, Spectrochim. Acta A 69A(1) (2008) 56. [23] N. Manav, A.K. Mishra, Kaushik, N.K. Spectrochim. Acta A 65A(1) (2006) 32. [24] B.T. Khan, J. Bhatt, K. Najmoddin, S. Shamsuddin, K. Annapoorna, J. Inorg. Biochem. 44 (1991) 55. [25] C. Navarro-Eanninger, J.M. Perez, F. Zamora, V.M. Gonzales, J.M. Masaguer, C. Alonso, J. Inorg. Biochem. 52 (1993) 37. [26] I. Brudzinska, Y. Mikata, M. Obata, C. Ohtsuki, S. Yano, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 2533. [27] W. Guerra, E. de Andrade Azevedo, A.R. de Souza Monteiro, M. Bucciarelli- -Rodriguez, E. Chartone-Souza, A.M. Amaral Nascimento, A.P. Soares Fontes, L. Le Moyec, E.C. Pereira-Maia, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 2348. [28] L.M.M. Vieira, M.V. de Almeida, M.C.S. Lourenco, F.A.F.M. Bezerra, A.P.S. Fontes, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 4107. [29] D. Kovala-Demertzi, M.A. Demertzis, J.R. Miller, C. Papadopoulou, C. Dodorou, G. Filousis, J. Inorg. Biochem. 86 (2001) 555. [30] R.R. Coombs, M.K. Ringer, J.M. Blacquiere, J.C. Smith, J.S. Neilsen, Y.-S. Uh, J.B. Gilbert, L.J. Leger, H. Zhang, A.M. Irving, S.L. Wheaton, C.M. Vogels, S.A. Westcott, A. Decken, F.J. Baerlocher, Trans. Met. Chem. 30 (2005) 411. [31] M.A. Ali, A.H. Mirza, R.J. Butcher, K.A. Crouse, Trans. Met. Chem. 31 (2006) 79. [32] I. Kizilcikli, Y.D. Kurt, B. Akkurt, A.Y. Genel, S. Birteksoz, G. Otuk, B. Ulkuseven, Folia Microbiol. 52 (2007) 15. 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 [33] N.M. Aghatabay, M. Somer, M. Senel, B. Dulger, F. Gucin, Eur. J. Med. Chem. 42 (2007) 1069. [34] M.K. Biyala, K. Sharma, M. Swami, N. Fahmi, R. Vir Singh, Trans. Met. Chem. 33 (2008) 377. [35] Tripett S. J. Chem. Soc. (1957) 4407. [36] Oxford Diffraction, CrysAlis CCD and CrysAlis RED Versions 1.171.32.24. Oxford Diffraction Ltd., Abington, England, 2008. [37] R.C. Clark and J.S. Reid, Acta Cryst. A51 (1995) 887. [38] SIR2002 - M.C. Burla, M. Camalli, B. Carrozzini, G.L. Cascarano, C. Giacovazzo, G. Polidori and R. Spagna. J. Appl. Cryst. 36 (2003) 1103. [39] G.M. Sheldrick, Acta Cryst. A64 (2008) 112. [40] M. Nardelli. Comput. Chem. 7 (1983) 95. [41] L.J. Farrugia. J. Appl. Cryst. 30 (1997) 565. [42] J.M. Andrews, J. Antimicrob. Chemother. 56 (2005) 60. [43] S.D. Sarker, L. Nahar, Y. Kumarasamy, Methods 42 (2007) 321. [44] K. Nakamoto , Y. Morimoto, A.E. Martell, J. Am. Chem. Soc. 83 (1961) 4528. [45] M.B. Ćelap, S.R. Niketić, T.J. Janjić,V.N. Nikolić, Inorg. Chem. 6 (1967) 2063. [46] J.A. Neal, N.J. Rose, Inorg. Chem. 7 (1968) 2405; 12 (1973) 1226. [47] D.J. Radanović, B.E. Douglas, J. Coord. Chem. 4 (1975) 191. [48] K.D. Gailey, D.J. Radanović, M.I. Đuran, B.E. Douglas, J. Coord. Chem. 8 (1978) 161. [49] M.B. Ćelap, A.R. Niketić, T.J. Janjić, V.N. Nikolić, Inorg. Chem. 6 (1967) 2063. 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 [50] T.G. Appleton, J.R. Hall, M.A. Williams, Inorg. Chim. Acta 61 (1982) 51. [51] V.M. Ðinović, G.A. Bogdanović, S. Novaković, T.J. Sabo, J. Coord. Chem. 8 (2004) 535. [52] V.M. Đinović, L. Mančić, G. Bogdanović, P. Vulić, G. Del Rosario, T.J. Sabo, O.B. Milošević, J. Mater. Res. 20 (2005) 102. Figure 1. Possible geometrical isomers of [PtX2(eddp)] complex (X = monodentate ligand): s-cis (I), uns-cis (II) and trans (III). X X X s-cis uns-cis trans N N X X O O N N O X O N N O O (I) (II) (III) Figure 2. Reaction pathways in synthesis of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N′-di- -3-propanoic acid. 455 456 O H + ONH4 O CH2 N NH C O Et2O NH2 H2N ammonium-acetatebenzaldehyde 70% H2SO4 refluxed refluxed 1-2 h extraction C14H16N2 mp =120.5-121.5°C N-benzoyl-N'-benzylidene-meso-1,2-diphenylenediamine 60%, C28H24ON2, mp = 258-259°C + HN N H O OHO HO meso-1,2-diphenyl-N,N'-di-3-propanoic acid (H2-1,2-dpheddp) 23.40% Cl OH O 2 NaOH 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 Figure 3. Reaction pathway in synthesis of new platinum(IV) complex. HN N H O OHO HO K2PtCl6 LiOH NH NH Pt O O O O Cl Cl 469 470 471 472 Figure 4. Reaction pathway in synthesis of new palladium(II) complex. NH NH Pd Cl Cl OH OH O O HN N H O OHO HO K2PdCl4 LiOH 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 Figure 5. Crystal structure of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid with atom numbering scheme. As molecules are centrosymmetric, only atoms belonging to asymmetric unit are labeled. Selected bond lengths (Å), Molecule A (left): O1−C1 1.207(12); C1−C2 1.482(12); C2−C3 1.506(11); N1−C3 1.472(9); N1−C4 1.498(8); C4−C5 1.499(10); C5−C6 1.368(10). Molecule B (right): O3−C11 1.234(8); O4−C11 1.270(8); C11−C12 1.498(10); C12−C13 1.510(10); N2−C13 1.494(11); N2−C14 1.507(9); C15−C16 1.380(11). 489 490 491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 Table 1. Crystal data, data collection and structure refinement details for H2-1,2-dpheddp·2HCl·H2O. 512 513 Empirical formula C20H28Cl2N2O5 Formula weight 445.33 Temperature (K) 293(2) Wavelength (Å) 1.54184 Crystal system Triclinic Space group P1− a (Å) 8.6989(18) b (Å) 10.086(2) c (Å) 13.461(3) α (˚) 104.143(17) β (˚) 105.795(17) γ (˚) 100.754(18) V (Å3) 1060.7(4) Z 2 μ (mm-1) 3.047 F(000) 476 Crystal size 0.12 x 0.07 x 0.04 Reflections collected 16321 Unique reflections 4006 Rint 0.1762 R1, wR2 [I >2σ(I)] 0.1071, 0.2637 514 515 516 Table 2. Geometrical parameters (Å,°) of selected hydrogen bonds. D−H···A (Å) D−H H···A D···A D−H···A N2−H2b···O3i 0.90 2.16 2.750(8) 122 N1−H1a···O3i 0.90 2.00 2.786(8) 145 C2−H22a···O3i 0.97 2.52 3.176(10) 125 N1−H1a···O4ii 0.90 2.56 3.111(9) 120 C13−H13b···O1iii 0.97 2.46 3.076(11) 121 C13−H13a···O5i 0.97 2.45 3.415(16) 174 O2a−H2c···O5iv 0.82 2.06 2.72(3) 137 O2b−H2d···Cl2i 0.82 2.24 3.05(5) 168 N1−H1b···Cl2 i 0.90 2.20 3.089(7) 169 N2−H2a···Cl2 i 0.90 2.33 3.137(8) 148 C20 −H20···Cl1 i 0.93 2.73 3.651(10) 169 C2−H22a···Cl2 i 0.97 2.75 3.324(9) 118 aSymmetry codes: ( i) x,y,z; ( ii) -x+1,-y+2,-z+2; (iii) x,+y+1,+z; (iv) x,+y-1,+z. 517 518 519 520 521 522 523 524 Table 3. The most important IR bands (cm-1) of some compounds with linear O-N-N-O ligands. Compund υ as (COOH) υ as (COO-) Ref. trans-[Pt(H2edta)Cl2] 1775; 1764 1691; 1678 50 uns-cis-[Pt(H2edta)Cl2] 1758; 1742 1692; 1685 50 s-cis-[Pt(H2edta)Cl2] 1753; 1741 1725; 1716 50 trans-[Pt(eddp)Cl2]·H2O - 1637; 1630 13 trans-[Pt(1,3-pdda)Cl2]·H2O - 1696; 1660 51 trans-[Pt(pdda)Br2]·H2O - 1684; 1648 52 s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] - 1618; 1610 this work H2-1,2-dpheddp 1754; 1732 - this work cis-[Pd(1,2-dpheddp)Cl2] 1643; 1580 this work 525 526 527 528 529 530 531 532 533 534 535 536 537 538 539 540 541 542 543 544 545 546 Table 4. Antibacterial and antifungal activity of the tested ligand and corresponding palladium(II) and platinum(IV) complexes. 547 548 L1 palladium(II) complex platinum(IV) complex Doxycycline Fluconazol Species MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC/MMC MIC/MMC Escherichia coli ATCC 25922 >1000 >1000 500 1000 500 1000 7.81/15.625 / Pseud. aeruginosa ATCC 27853 250 >1000 15.63 500 125 500 62.5/125 / Staphylococcus aureus ATCC 25923 500 >1000 31.25 500 250 500 0.224/3.75 / Sarcina lutea ATCC 9341 500 >1000 62.5 500 125 500 < 0.448/7.81 / Bacillus subtilis ATCC 6633 500 >1000 62.5 500 250 500 1.953/31.25 / Enter. faecalis ATCC 29212 500 >1000 31.25 500 250 500 7.81/62.5 / Bacillus pumilus NCTC 8241 >1000 >1000 62.5 500 250 500 0.112/7.81 / Escherichia coli >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 7.81/15.625 / Pseud. aeruginosa 500 >1000 500 1000 500 1000 250/>250 / Staphylococcus aureus >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 0.448/7.81 / Sarcina lutea 500 >1000 62.5 500 250 500 < 0.448/3.75 / Bacillus subtilis 500 >1000 31.25 500 250 >1000 0.112/1.953 / Enter. faecalis >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 7.81/62.5 / Proteus mirabilis >1000 >1000 500 500 >1000 >1000 250/>250 / Salmonella enterica >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 15.625/31.25 / Bifidobacterium animalis subsp. lactis >1000 >1000 31.25 125 250 500 31.25/62.5 / Lactobacillus plantarum 500 >1000 125 500 250 500 0.448/7.81 / Bacillus subtilis IP 5832 500 >1000 250 500 250 500 1.953/15.625 / Saccharomyces boulardii >1000 >1000 >1000 >1000 1000 1000 / 31.25/1000 Candida albicans >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 / 62.5/1000 Rhodotorula sp. 1000 1000 500 1000 1000 1000 / 62.5/1000 Aspergillus niger 125 >1000 31.25 1000 125 >1000 / 500/1000 Aspergillus restrictus 250 250 500 500 1000 1000 / 500/2000 Aspergillus fumigatus 1000 1000 1000 1000 500 1000 / 500/1000 Aspergillus flavus >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 / 1000/1000 MIC, minimum inhibitory concentration (µg/mL) 549 550 551 552 MMC, minimum microbiocidal concentration (µg/mL) /, not tested. Elsevier Editorial System(tm) for Inorganica Chimica Acta Manuscript Draft Manuscript Number: ICA-D-11-00882R1 Title: Stereospecific ligands and their complexes. XI. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3- methyl)-butanoic acid Article Type: Regular Paper Keywords: palladium(II) complexes; (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid; in vitro antimicrobial activity. Corresponding Author: professor Srecko R Trifunovic, Ph.D Corresponding Author's Institution: Faculty of Science First Author: Srecko R Trifunovic, Ph.D Order of Authors: Srecko R Trifunovic, Ph.D; Gordana P Radic; Verica V Glodjovic; Ivana D Radojevic; Olgica D Stefanovic; Ljiljana R Comic; Vesna M Djinovic The complexes have been obtained by direct reaction of potassium-tetrachloridopalladate(II) with corresponding esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid. NH NH RO CH CH O O 2HCl LiOH R = Et(C1), n-Pr(C2), n-Bu(C3), n-Pe(C4) N N RO CH O Pd O Cl H K2PdCl4 + RO CH O H *Graphical Abstract (pictogram) The complexes have been obtained by direct reaction of potassium-tetrachloridopalladate(II) with corresponding esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid. *Graphical abstract (synopsis) Three new ligands and their palladium(II) complexes were synthesized. Characterized by microanalysis, MS, infrared, 1 H and 13 C NMR spectroscopy. Antimicrobial activity was tested in relation to 15 species of microorganisms. *Highlights 1 Stereospecific ligands and their complexes. XI. 1 Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) 2 complexes with some alkyl esters of 3 (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid  4 5 Gordana P. Radića, Verica V. GloĎovića, Ivana D. Radojevićb, Olgica D. Stefanovićb, 6 Ljiljana R. Čomićb, Vesna M. Ðinovićc and Srećko R. Trifunovića 7 8 a Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, 9 R. Domanovića 12, 34000 Kragujevac, Republic of Serbia 10 b Department of Biology and Ecology, Faculty of Science, University of Kragujevac, 11 R. Domanovića 12, 34000 Kragujevac, Republic of Serbia 12 c Faculty of Chemistry, University of Belgrade, Studentski trg 16, 11000 Belgrade, Republic of Serbia 13 14 Abstract 15 Three new ligand precursors and their palladium(II) complexes of general formula 16 [PdCl{(S,S)-(R)eddv}] (R = n-propyl, n-butyl and n-pentyl; S,S-eddv = (S,S)- 17 -ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoate) have been synthesized and 18 characterized by microanalysis, infrared, 1 H and 13 C NMR spectroscopy and mass 19 spectrometry. In vitro antimicrobial activity for these ligands and complexes is 20 investigated. Testing is performed by microdilution method and minimum inhibitory 21 concentration (MIC) and minimum microbicidal concentration (MMC) have been 22 determined. Testing is conducted against 15 microorganisms (five strains of pathogenic 23 bacteria, three species of probiotic bacteria, two yeast species and five pathogenic fungi). 24 Tested ligands, with a few exceptions, show very low antimicrobial activity. 25 Palladium(II) complexes show selective and moderate activity. The difference in 26 antimicrobial activity between ligands and corresponding palladium(II) complexes is 27 noticed and it is always higher with palladium(II) complexes. 28  Part X: J. Vujić, G.N. KaluĎerović, B.B. Zmejkovski, M. Milovanović, V. Volarević, N. Arsenijević and S.R. Trifunović (submitted)  Corresponding author: srecko@kg.ac.rs; *Manuscript Click here to view linked References 2 Keywords: palladium(II) complexes; (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid; in vitro 29 antimicrobial activity; 30 31 32 1. Introduction 33 34 In parallel with the rapid development of a wide range of antibacterial agents 35 since the 1940s, bacteria have proved extremely adept at developing resistance to each 36 new employed agent. The rapidly increasing incidence of bacterial resistance to 37 antimicrobial agents has become a serious problem worldwide. Resistance mechanisms 38 have been identified and described for all the known antibiotics currently available for 39 clinical use [1]. 40 In some previous papers synthesis and characterization of the palladium(II) 41 complexes with R2-S,S-eddp ligands (S,S-eddp = (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2- 42 -propanoate, R = n-Pr [2], n-Bu [2], n-Pe [2], i-Pr [3a], i-Bu [3b], c-Pe [4], Cy [4]) were 43 published. It was concluded from NMR spectra that the mixture of diastereoisomers of 44 the [PdCl2(R2-eddip)] complexes was obtained. The antitumoral investigations of some of 45 these ligands and complexes were performed [4]. 46 This study is focused on the synthesis, characterization and antimicrobial activity 47 of four novel R2edda-type ligand precursors: O,O-diethyl- (L1) [5], O,O-dipropyl- 48 (L2), O,O-dibutyl- (L3), O,O-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N-di-2-(3-methyl)- 49 -butanoate dihydrochloride (L4) and their corresponding palladium(II) complexes: 50 chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-ethyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N-2-(3-methyl) 51 butanoato-palladium(II) [5], (C1), chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-propyl-2-(3- 52 -methyl)-butanoate)-N-2-(3-methyl)butanoato-palladium(II) (C2), chlorido((S,S)- 53 -ethylenediamine-N-(O-butyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N-2-(3-methyl)butanoato- 54 -palladium(II) (C3), chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-pentyl-2-(3-methyl)- 55 -butanoate)-N-2-(3-methyl)butanoato-palladium(II) (C4). 56 The synthesis and evaluation of biological activity of the new metal-based 57 compounds has been the field of growing interest. Numerous complexes based on 58 palladium(II)-ion have been synthesized and their different biological activities have been 59 3 documented [6-8]. The impact of different palladium complexes on the growth and 60 metabolism of various groups of microorganisms has been studied. Garoufis et al. [9] 61 reviewed numerous scientific papers on antiviral, antibacterial and antifungal activity of 62 palladium(II) complexes with different types of ligands (sulfur and nitrogen donor 63 ligands, Schiff base ligands and drugs as ligands). Guerra et al. [10] synthesized three 64 palladium complexes with antibiotics of the tetracycline family and they tested their 65 effects on tetracycline sensitive and resistant bacterial strains. The palladium complex 66 with tetracycline was 16 times stronger than the tetracycline itself against resistant strain. 67 Vieira et al. [11] prepared new palladium(II) and platinum(II) complexes with 68 fluoroquinolones which showed activity to Mycobacterium tuberculosis. There are other 69 papers in the literature showing different intensity of palladium complexes activity on 70 various species of bacteria and fungi [12-17]. 71 The aim of this paper is to synthesize new palladium complexes and to research in 72 vitro their antibacterial and antifungal activities. The second aim is to investigate the 73 impact of newly synthesized palladium complexes on probiotics, since they are used as 74 supplements and they play significant role in protection and maintenance of balance in 75 intestinal microflora during the use of the antibiotic therapy. 76 77 2. Experimental 78 79 2.1. Chemistry 80 2.1.1. Reagents and instruments 81 (S,S)-Ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid, (H2-(S,S)-eddv) was 82 prepared using similar methods described in literature [18]. K2[PdCl4] was purchased 83 from Merck and used without further purification. Alcohols were dried by standard 84 methods. Infrared spectra were recorded by Perkin-Elmer Spectrum One FT-IR 85 spectrometer using the KBr pellet technique (4000-400 cm -1 ) and mass spectra were 86 recorded by Agilent 5973B. 1 H and 13 C NMR spectra were recorded by Varian Gemini-87 2000 (200 MHz) spectrometer in D2O (ligand precursors) and CDCl3 (palladium(II) 88 complexes) using tetramethylsilane as internal standard and in DMSO-d6 (ligands and 89 4 complexes). Elemental microanalyses for C, H and N were performed by standard 90 methods by Vario EL III C, H, N Elemental Analyzer. 91 92 2.1.2. Preparation of O,O'-dialkyl esters of the (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2- 93 -(3-methyl)-butanoic acid dihydrochloride, R2-S,S-eddv·2HCl 94 In 50 mL of dry alcohol (ethanol, 1-propanol, 1-butanol or 1-pentanol), saturated 95 with gas HCl, 2.50 g (7.5 mmol) of (H2-(S,S)-eddv) was added and the mixture was 96 refluxed for 12 h. The mixture was filtered off and the filtrate was left for a few days in 97 the refrigerator. The esters were recrystallized from hot alcohol used for each reaction. 98 O,O'-diethyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoate 99 dihydrochloride det-S,S-eddv·2HCl (L1) was previously synthesized [5]. 100 O,O'-dipropyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoate 101 dihydrochloride dpr-S,S-eddv·2HCl (L2) Yield: 1.72 g (55%). Anal. Calc. for 102 C18H38Cl2N2O4 (Mr = 417.404) (%): C, 51.79; H, 9.18; N, 6.71. Found (%): C, 51.92; 103 H, 9.06; N, 6.73. 1 H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 0.91 (t, 6H, C 9 H3), 1.21 (m, 12H, 104 C 5,6 H3), 1.74 (m, 4H, C 8 H2), 2.37 (m, 4H, C 1 H2), 3.52 (m, 2H, C 4 H), 4.11 (d, 2H, C 2 H), 105 4.27 (q, 4H, C 7 H2). 13 C NMR (50 MHz, D2O, δ ppm): 12.63 (C 8 H3), 19.47 (C 5 H3), 20.15 106 (C 6 H3), 24.22 (C 8 H2), 32.48 (C 4 H), 46.48 (C 1 H2), 69.35 (C 2 H), 72.21 (C 7 H2), 171.6 107 (C 3 OOPr). 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0.86 (t, 6H, C 9 H3), 1.18 (m, 12H, 108 C 5,6 H3), 1.58 (m, 4H, C 8 H2), 2.26 (m, 4H, C 1 H2), 3.46 (m, 2H, C 4 H), 4.07 (d, 2H, C 2 H), 109 4.37 (q, 4H, C 7 H2), 4.63 (2H, NH). 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 12.48 (C 8 H3), 110 18.96 (C 5 H3), 20.17 (C 6 H3), 24.89 (C 8 H2), 33.03 (C 4 H), 46.41 (C 1 H2), 68.97 (C 2 H), 72.06 111 (C 7 H2), 170.9 (C 3 OOPr). 112 113 O,O'-dibutyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoate 114 dihydrochloride dbu-S,S-eddv·2HCl (L3) Yield: 1.74 g (52%). Anal. Calc. for 115 C20H42Cl2N2O4 (Mr = 445.456) (%): C, 53.92; H, 9.50; N, 6.29. Found (%): C, 53.48; H, 116 9.54; N, 6.48. 1 H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 0.91 (t, 6H, C 10 H3), 1.13 (m, 12H, 117 C 5,6 H3), 1.37 (m, 4H, C 9 H2), 1,70 (m, 4H, C 8 H2), 2.41 (m, 4H, C 1 H2), 3.56 (m, 2H, C 4 H), 118 3.87 (d, 2H, C 2 H), 4.34 (q, 4H, C 7 H2). 13 C NMR (50 MHz, D2O, δ ppm): 15.80 (C 10 H3), 119 19.43 (C 5 H3), 19.76 (C 6 H3), 21.51 (C 9 H2), 32.60 (C 4 H), 36.38 (C 8 H2), 46.19 (C 1 H2), 120 5 64.50 (C 2 H), 70.49 (C 7 H2), 171.56 (C 3 OOR). 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 121 0.87 (t, 6H, C 10 H3), 1.17 (m, 12H, C 5,6 H3), 1.39 (m, 4H, C 9 H2), 1,66 (m, 4H, C 8 H2), 2.28 122 (m, 4H, C 1 H2), 3.48 (m, 2H, C 4 H), 3.79 (d, 2H, C 2 H), 4.26 (q, 4H, C 7 H2), 4.58 (2H, NH). 123 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 14.99 (C 10 H3), 19.37 (C 5 H3), 19.58 (C 6 H3), 21.43 124 (C 9 H2), 32.54 (C 4 H), 36.26 (C 8 H2), 46.03 (C 1 H2), 64.57 (C 2 H), 70.48 (C 7 H2), 125 171.51(C 3 OOR). 126 O,O'-dipentyl-(S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoate 127 dihydrochloride dpe-S,S-eddv·2HCl (L4) Yield: 1.82 g (51%). Anal. Calc. for 128 C22H46Cl2N2O4 (Mr = 473.508) (%): C, 55.80; H, 9.79; N, 5.92. Found (%): C,55.68; H, 129 9.76; N, 6.02. 1 H NMR (200 MHz, D2O, δ ppm): 0.90 (t, 6H, C 11 H3), 1.10 (m, 12H, 130 C 5,6 H3), 1.37 (m, 8H, C 9,10 H2), 1.72 (m, 4H, C 8 H2), 2.40 (m, 4H, C 1 H2), 3.62 (m, 2H, 131 C 4 H), 4.09 (d, 2H, C 2 H), 4.39 (q, 4H, C 7 H2). 13 C NMR (50 MHz, D2O, δ ppm): 16.13 132 (C 11 H3), 19.48 (C 5 H3), 20.69 (C 6 H3), 24.52 (C 10 H2), 30.31 (C 9 H2), 32.66 (C 8 H2), 33.92 133 (C 4 H), 46.29 (C 1 H2), 64.83 (C 2 H), 70.74 (C 7 H2), 171.84 (C 3 OOR). 1 H NMR (200 MHz, 134 DMSO-d6, δ ppm): 0.90 (t, 6H, C 11 H3), 1.12 (m, 12H, C 5,6 H3), 1.36 (m, 8H, C 9,10 H2), 135 1.68 (m, 4H, C 8 H2), 2.33 (m, 4H, C 1 H2), 3.64 (m, 2H, C 4 H), 4.02 (d, 2H, C 2 H), 4.21 (q, 136 4H, C 7 H2), 4.76 (2H, NH). 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 16.06 (C 11 H3), 19.43 137 (C 5 H3), 20.32 (C 6 H3), 24.45 (C 10 H2), 30.29 (C 9 H2), 32.69 (C 8 H2), 33.88 (C 4 H), 46.07 138 (C 1 H2), 64.12 (C 2 H), 70.76 (C 7 H2), 171.34 (C 3 OOR). 139 140 2.1.3. Synthesis of the palladium(II) complexes, C1-C4 141 The complexes were obtained by mixing K2[PdCl4] (0.200 g, 0.613 mmol) in 142 10 cm 3 of water and equimolar amount of the L1 (0.241 g, 0.613 mmol), L2 (0.256 g, 143 0.613 mmol), L3 (0.273 g, 0.613 mmol) or L4 (0.290 g, 0.613 mmol) esters. During 2 h 144 of stirring, 10 cm 3 of water solution of LiOH (0.0294 g, 1.226 mmol) was added in small 145 portions to the reaction mixture. Within this period, pale yellow precipitates of the 146 complexes C1-C4 were obtained, filtered off, washed with cold water, ethanol and ether 147 and air dried. 148 Chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-ethyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N-2-(3- 149 -methyl)butanoato-palladium(II) [PdCl{(S,S)-(Et)eddv}] (C1) was previously synthesized 150 [5]. 151 6 Chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-propyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N-2-(3- 152 -methyl)butanoato-palladium(II) [PdCl{(S,S)-(Pr)eddv}] (C2) Yield: 0.232 g (72%). 153 Anal. Calc. for (Mr = 443.272): C, 40.64; H, 6.59; N, 6.32. Found: C, 41.00; H, 6.57; N, 154 6.43. MS, m/z: 442.09. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0.94 (t, 3H, C 15 H3), 1.11 (d, 155 6H, C 6,7 H3), 1.21 (d, 6H, C 10,11 H3), 1.61 (m, 2H, C 14 H2), 1.94 (m, 4H, C 1,2 H2), 2.24 (m, 156 1H, C 5 H), 2.48 (m, 1H, C 9 H), 3.71 (d, 1H, C 3 H), 4.10 (d, 1H, C 8 H), 4.28 (t, 2H, C 13 H2). 157 13 C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 10.68 (C 15 H3), 19.25 (C 6 H3), 19.34 (C 7 H3), 21.15 158 (C 10 H3), 22.15 (C 11 H3), 30.58 (C 14 H2), 46.83 (C 5 H), 49.70 (C 9 H), 50.56 (C 1 H2), 56.61 159 (C 2 H2), 65.29 (C 8 H), 68.75 (C 3 H), 72.99 (C 13 H2), 171.73 (C 12 ), 178.74 (C 4 ). 1 H NMR 160 (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0.92 (t, 3H, C 15 H3), 1.03 (d, 6H, C 6,7 H3), 1.23 (d, 6H, 161 C 10,11 H3), 1.58 (m, 2H, C 14 H2), 1.89 (m, 4H, C 1,2 H2), 2.13 (m, 1H, C 5 H), 2.45 (m, 1H, 162 C 9 H), 3.59 (d, 1H, C 3 H), 4.02 (d, 1H, C 8 H), 4.29 (t, 2H, C 13 H2), 5.83 (2H, NH). 13 C 163 NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 11.12 (C 15 H3), 18.87 (C 6 H3), 19.36 (C 7 H3), 21.07 164 (C 10 H3), 22.17 (C 11 H3), 30.53 (C 14 H2), 46.74 (C 5 H), 49.72 (C 9 H), 50.55 (C 1 H2), 56.16 165 (C 2 H2), 65.39 (C 8 H), 68.74(C 3 H), 72.87 (C 13 H2), 171.56 (C 12 ), 178.28 (C 4 ). 166 167 Chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-butyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N-2-(3- 168 -methyl)butanoato-palladium(II) [PdCl{(S,S)-(Bu)eddv}] (C3) Yield: 0.198 g (71%). 169 Anal. Calc. for (Mr = 457.298): C, 42.02; H, 6.83; N, 6.13. Found: C, 42.23; H, 7.10; N, 170 5.99. MS, m/z: 458.10. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0.91 (t, 3H, C 16 H3), 0.99 (d, 171 6H, C 6,7 H3), 1.17 (d, 6H, C 10,11 H3), 1.35 (m, 2H, C 15 H2), 1.59 (m, 2H, C 14 H2), 2.19 (m, 172 4H, C 1,2 H2), 2.56 (m, 1H, C 5 H), 2.84 (m, 1H, C 9 H), 3.50 (d, 1H, C 3 H), 4.08 (d, 1H, C 8 H), 173 4.29 (t, 2H, C 13 H2). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 13.64 (C 16 H3), 17.99 (C 6 H3), 174 18.17 (C 7 H3), 19.24 (C 10 H3), 19.44 (C 11 H3), 21.58 (C 15 H2), 28.34 (C 5 H), 29.68 (C 9 H), 175 30.55 (C 14 H2), 38.68 (C 1 H2), 41.52 (C 2 H2), 59.40 (C 8 H), 61.40 (C 3 H), 67.21 (C 13 H2), 176 170.81 (C 12 ), 177.84 (C 4 ). 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 0.88 (t, 3H, C 16 H3), 177 0.93 (d, 6H, C 6,7 H3), 0.98 (d, 6H, C 10,11 H3), 1.23 (m, 2H, C 15 H2), 1.46 (m, 2H, C 14 H2), 178 2.06 (m, 4H, C 1,2 H2), 2.51 (m, 1H, C 5 H), 2.79 (m, 1H, C 9 H), 3.39 (d, 1H, C 3 H), 3.56 (d, 179 1H, C 8 H), 4.12 (t, 2H, C 13 H2), 5.85 (2H, NH). 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 180 13.53 (C 16 H3), 17.85 (C 6 H3), 18.79 (C 7 H3), 19.70 (C 10 H3), 19.87 (C 11 H3), 21.79 (C 15 H2), 181 7 21.99 (C 5 H), 27.83 (C 9 H), 30.44 (C 14 H2), 49.93 (C 1 H2), 53.96 (C 2 H2), 64.36 (C 8 H), 64.64 182 (C 3 H), 71.23 (C 13 H2), 171.37 (C 12 ), 179.20 (C 4 ). 183 Chlorido((S,S)-ethylenediamine-N-(O-pentyl-2-(3-methyl)-butanoate)-N-2-(3- 184 -methyl)butanoato-palladium(II) [PdCl{(S,S)-(Pe)eddv}] (C4) Yield: 0.217 g (75%). 185 Anal. Calc. for (Mr = 471.324): C, 43.32; H, 7.06; N, 5.94. Found: C, 43.43; H, 6.98; N, 186 5.89. MS, m/z: 470.12. 1 H NMR (200 MHz, CDCl3, δ ppm): 0.93 (t, 3H, C 17 H3), 0.99 (d, 187 6H, C 6,7 H3), 1.11 (d, 6H, C 10,11 H3), 1.32 (m, 2H, C 15 H2), 1.45 (m, 2H, C 16 H2), 1.60 (m, 188 2H, C 14 H2), 2.09 (m, 4H, C 1,2 H2), 2.46 (m, 1H, C 5 H), 2.79 (m, 1H, C 9 H), 3.51 (d, 1H, 189 C 3 H), 3.63 (d, 1H, C 8 H), 4.07 (t, 2H, C 13 H2). 13 C NMR (50 MHz, CDCl3, δ ppm): 17.92 190 (C 17 H3), 18.43 (C 6 H3), 19.98 (C 7 H3), 21.87 (C 10 H3), 22.09 (C 11 H3), 27.79 (C 16 H2), 27.94 191 (C 15 H2), 30.14 (C 14 H2), 36.72 (C 5 H), 37.28 (C 9 H), 41.55 (C 1 H2), 49.90 (C 2 H2), 54.07 192 (C 8 H), 64.50 (C 3 H), 71.20 (C 13 H2), 171.62 (C 12 ), 179.46 (C 4 ). 1 H NMR (200 MHz, 193 DMSO-d6, δ ppm): 0.91 (t, 3H, C 17 H3), 1.02 (d, 6H, C 6,7 H3), 1.13 (d, 6H, C 10,11 H3), 1.41 194 (m, 2H, C 15 H2), 1.58 (m, 2H, C 16 H2), 1.74 (m, 2H, C 14 H2), 2.18 (m, 4H, C 1,2 H2), 2.58 (m, 195 1H, C 5 H), 2.92 (m, 1H, C 9 H), 3.50 (d, 1H, C 3 H), 3.69 (d, 1H, C 8 H), 4.33 (t, 2H, C 13 H2), 196 6.05 (2H, NH). 13 C NMR (50 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 18.60 (C 17 H3), 19.08 (C 6 H3), 197 19.92 (C 7 H3), 21.94 (C 10 H3), 22.87 (C 11 H3), 28.81 (C 16 H2), 29.35 (C 15 H2), 32.34 (C 14 H2), 198 38.74 (C 5 H), 39.93 (C 9 H), 45.56 (C 1 H2), 51.18 (C 2 H2), 55.46 (C 8 H), 67.53 (C 3 H), 74.74 199 (C 13 H2), 171.38 (C 12 ), 178.92 (C 4 ). 200 201 202 2.2 In vitro antimicrobial assay 203 2.2.1. Test substances 204 The tested compounds were dissolved in DMSO and then diluted into nutrient 205 liquid medium to achieve a concentration of 10%. An antibiotic doxycycline (Galenika 206 A.D., Belgrade) was dissolved in nutrient liquid medium, a Mueller–Hinton broth 207 (Torlak, Beograd), while an antimycotic fluconazole (Pfizer Inc., USA) was dissolved in 208 Sabouraud dextrose broth (Torlak, Belgrade). 209 210 2.2.2. Test microorganisms 211 8 Antimicrobial activity of four ligands and corresponding palladium(II) complexes 212 was tested for 15 microorganisms including five strains of pathogenic bacteria (standard 213 and clinical strains): Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 29212, 214 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabilis (clinical isolate) and E. coli 215 (clinical isolate); three species of probiotics: Lactobacillus plantarum PMFKG-P31, 216 Bacillus subtilis IP 5832 PMFKG-P32 and Bifidobacterium animalis subsp. lactis 217 PMFKG-P33; two yeast species Candida albicans (clinical isolate) and Saccharomyces 218 boulardii PMFKG-P34 and five pathogenic fungi Aspergillus fumigatus PMFKG-F23, 219 Aspergillus flavus PMFKG-F24, Aspergillus restrictus PMFKG-25, Aspergillus niger 220 PMFKG-26 and standard strain Aspergillus niger ATCC 16404. All clinical isolates were 221 a generous gift from the Institute of Public Health, Kragujevac. The other 222 microorganisms were provided from the collection held by the Microbiology Laboratory 223 Faculty of Science, University of Kragujevac. 224 225 2.2.3. Suspension preparation 226 Bacterial suspensions and yeast suspension were prepared by the direct colony 227 method. The colonies were taken directly from the plate and were suspended in 5 mL of 228 sterile 0.85% saline. The turbidity of initial suspension was adjusted by comparing with 229 0.5 McFarland’s standard (0.5 mL 1.17% w/v BaCl2×2H2O + 99.5 mL 1% w/v H2SO4) 230 [19]. When adjusted to the turbidity of 0.5 McFarland’s standard, bacteria suspension 231 contains about 10 8 colony forming unites (CFU)/mL and suspension of yeast contains 232 10 6 CFU/mL. Ten-hold dilutions of initial suspension were additionally prepared into 233 sterile 0.85% saline. The suspensions of fungal spores were prepared by gentle stripping 234 of spore from slopes with growing aspergilli. The resulting suspensions were 1:1000 235 diluted in sterile 0.85% saline. 236 237 2.2.4. Microdilution method 238 Antimicrobial activity was tested by determining the minimum inhibitory 239 concentration (MIC) and minimum microbicidal concentration (MMC) by using 240 microdilution plate method with resazurin [20]. The 96-well plates were prepared by 241 dispensing 100 μL of nutrient broth, Mueller-Hinton broth for bacteria and Sabouraud 242 9 dextrose broth for fungi and yeasts, into each well. A 100 μL from the stock solution of 243 tested compound (concentration of 2000 μg/mL) was added into the first row of the plate. 244 Then, twofold serial dilutions were performed by using a multichannel pipette. The 245 obtained concentration range was from 1000 to 7.813 μg/mL. A 10 μL of diluted 246 bacterial, yeast suspension and suspension of spores was added to each well to give a 247 final concentration of 5 x 10 5 CFU/mL for bacteria and 5 x 10 3 CFU/mL for fungi and 248 yeast. Finally, 10 μL resazurin solution was added to each well inoculated with bacteria 249 and yeast. Resazurin is an oxidation-reduction indicator used for the evaluation of 250 microbial growth. It is a blue non-fluorescent dye that becomes pink and fluorescent 251 when reduced to resorufin by oxidoreductases within viable cells [21]. The inoculated 252 plates were incubated at 37°C for 24 h for bacteria, 28°C for 48 h for the yeast and 28°C 253 for 72 h for fungi. MIC was defined as the lowest concentration of the tested substance 254 that prevented resazurin color change from blue to pink. For fungi, MIC values of the 255 tested substance were determined as the lowest concentration that visibly inhibited 256 mycelia growth. 257 Doxycycline and fluconazole were used as a positive control. Solvent control test 258 was performed to study an effect of 10% DMSO on the growth of microorganism. It was 259 observed that 10% DMSO did not inhibit the growth of microorganism. Also, in the 260 experiment, the concentration of DMSO was additionally decreased because of the 261 twofold serial dilution assay (the working concentration was 5% and lower). Each test 262 included growth control and sterility control. All tests were performed in duplicate and 263 MICs were constant. 264 Minimum bactericidal and fungicidal concentration was determined by plating 265 10 μL of samples from wells, where no indicator color change was recorded, on nutrient 266 agar medium. At the end of the incubation period the lowest concentration with no 267 growth (no colony) was defined as minimum microbicidal concentration. 268 269 2.2.5. Statistical analysis 270 271 All statistical analyses were performed using SPSS package (SPSS for Windows, 272 ver. 17, 2008) (Chicago, IL, USA). Mean differences were established by Student’s t-test. 273 10 The data were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA). In all cases p 274 values <0.05 were considered statistically significant. 275 276 3. Results and discussion 277 278 3.1. Synthesis and characterization 279 280 Esters (L1-L4) and neutral palladium(II) complexes (C1-C4) were prepared by 281 using appropriate modifications of known methods (Scheme 1) [2,4,5,22-28]. These 282 esters are not soluble in chloroform, but rather in water, methanol, dimethyl sulfoxide and 283 hot alcohols used in individual esterification reactions. The complexes were synthesized 284 by combining aqueous solutions of K2[PdCl4] and the corresponding esters. Although we 285 expected bidentate coordination of synthesized diesters of S,S-eddv as with corresponding 286 esters of S,S-eddp [2], the results of elemental microanalysis, MS, IR, NMR ( 1 H and 13 C) 287 spectra suggest that partial diester hydrolysis and then tridentate coordination to the 288 palladium(II)-ion occurred which was confirmed by X-ray structure analysis for complex 289 [PdCl{(S,S)-(et)eddv}] [5]. This fact can be explained by moving chemical balance in 290 the direction of hydrolysis by precipitation of insoluble palladium(II) complexes. This did 291 not happen in the case of S,S-eddp-Pd(II) complexes since the complexes in question are 292 enough water soluble. Based on the structure of the ligands (Scheme 1) bidentate 293 coordination for the palladium(II) ion was expected. From the spectra, it can be 294 concluded that the synthesis of the complex occurred during the partial hydrolysis of the 295 ligand and it was tridentate coordinated to the central metal ion. The resulting complexes 296 are soluble in chloroform and dimethyl sulfoxide, but not in water. The results of 297 microanalysis and MS spectra confirmed the predicted content of the isolated ligands and 298 complexes. Also, the data from mass spectra of the C1-C4 match the proposed molecular 299 formulae of the complexes. 300 The most important bands in the infrared spectra of the isolated dialkyl esters and 301 corresponding palladium(II) complexes are given in Table 1. 302 Absorption bands for secondary amino groups were found for C1-C4 at 3178, 303 3181, 3180, 3180 cm -1 , respectively, indicating coordination via nitrogen atoms (for 304 11 ligand precursors only bands for secondary ammonium groups can be observed; L1-L4: 305 ν(R2NH2 + ) at 3415, 3437, 3428, 3439 cm -1 ). There is one absorption band at ~1730 cm -1 306 in the spectra of all ligands characteristic for ester group. There are two absorption bands 307 for ν(C=O) in spectra for all complexes, which indicates two different C=O groups, being 308 in correspondence to the hydrolysis of one of the alkyl groups, and coordination of the 309 residual oxygen atom. All other specific bands were found at similar positions for 310 corresponding ligand precursors and complexes. 311 The expected signals were found in 1 H NMR and 13 C NMR spectra. The signals 312 of CH2 protons of the ethylenediamine bridge showed coordination induced shifts in 313 spectra of complexes (up to 0.9 ppm) giving a clear indication of nitrogen coordination. 314 The signals for all methyl protons for all compounds were found within the range of 0.90- 315 -1.21 ppm. N,N-ligand coordination is confirmed by NH chemical shift (4.5 ppm for 316 ligands and 5.8 ppm for complexes) 317 In 13 C NMR spectra of complexes carbon atoms resonances were found as 318 expected. There are two signals around 170 ppm for all complexes, signal at a lower 319 chemical shift belongs to the ester carbon atom and signal at a higher chemical shift 320 belongs to the carbon atom of the carboxyl group that participates in coordination with its 321 oxygen atom. 322 323 3.2. Microbiology 324 325 The results of in vitro testing antibacterial and antifungal activities of the four new 326 palladium complexes and their ligands are shown in Table 2. For comparison, MIC and 327 MMC values of doxycycline and fluconazole are also listed in Table 2. The solvent (10% 328 DMSO) did not inhibit the growth of the tested microorganisms. 329 The intensity of antimicrobial action varied depending on the species of 330 microorganism and on the type and concentration of the substances. In general, the tested 331 ligands, with few exceptions, show very low antimicrobial activity, while palladium(II) 332 complexes show selective and moderate activity. The difference in antimicrobial activity 333 between ligands and corresponding palladium(II) complexes is noticed and is always 334 higher with palladium(II) complexes. Statistically significant difference in antimicrobial 335 12 action between the ligands and their appropriate complexes is at the level of MIC 336 expressed at all (p < 0.05). The tested substances do not show statistically significant 337 difference in activity against investigated groups of microorganisms. 338 The obtained results of the coordination compounds show enhanced activity 339 compared to the ligand, with indicates that the coordinated metal has an influence on the 340 antimicrobial effects. However, the higher activity of the complexes, as compared to the 341 free ligands, can be understood in terms of the chelation theory. This theory explains that 342 a decrease in the polarizability of the metal could enhance the lipophilicity of the 343 complexes [29]. 344 All tested compounds demonstrated selective to moderate antibacterial activity in 345 relation to the tested standard and clinical strains of bacteria. Being compared to positive 346 control, these substances showed low antibacterial activity. Interestingly, L3, L4 and C3, 347 C4 exhibit strong antibacterial activity towards Escherichia coli (clinical isolate), MIC 348 ranged <7.813 µg/mL to 31.25 µg/mL. 349 Also, probiotic bacteria showed high resistance to the effects of tested substances. 350 MICs were from 125 μg/mL to >1000 μg/mL, and MMCs were from 500 μg/mL to 351 >1000 μg/mL. The most sensitive was Lactobacillus plantarum to C3 and C4 (MIC was 352 <7.813 µg/mL). 353 Tested ligands and the corresponding palladium(II) complexes showed low 354 antifungal activity. MICs were from 125 μg/mL to >1000 μg/mL while MMCs were from 355 500 μg/mL to >1000 μg/mL. The tested compounds did not affect the growth of yeasts or 356 their activities were very low (MIC/MMC values were 1000 μg/mL and >1000 μg/mL). 357 358 Conclusion 359 360 Ligand precursors (L1-L4) and corresponding palladium(II) complexes (C1-C4) 361 were synthesized and characterized by IR, MS, 1 H and 13 C NMR spectroscopies and 362 elemental analysis. The results of antimicrobial activity showed that tested ligands and 363 the corresponding palladium(II) complexes demonstrated different degree of 364 antimicrobial activity in relation to the tested species. The difference in antimicrobial 365 activity between ligands and corresponding palladium(II) complexes is noticed and it is 366 13 always higher with palladium(II) complexes. Escherichia coli (clinical isolate) was 367 particularly sensitive to the L3, L4, C3 and C4, especially to the C4, so this complex 368 could be used as potential pharmaceutical agent. Our research showed that the change of 369 ligand structure and corresponding palladium(II) complexes had a significant impact on 370 their biological activity. We are going to track biological activity of the palladium(II) 371 complexes as a consequence of ligand structure change. 372 373 374 375 Acknowledgements 376 377 The authors are grateful to the Ministry of Education and Science of the Republic 378 of Serbia for financial support (Projects No. OI172016 and OI173032). 379 380 381 References 382 383 [1] A.C. Fluit, M.E. Jones, F.J. Schmitz, J. Acar, R. Gupta, J. Verhoef, Clin. Infect. Dis. 384 30 (2000) 454. 385 [2] G.P. Vasić, V.V. GloĎović, I.D. Radojević, O.D. Stefanović, Lj.R. Čomić, V.M. 386 Đinović, S.R. Trifunović, Inorg. Chim. Acta 363 (2010) 3606. 387 [3] a) B.B. Krajčinović, G.N. KaluĎerović, D. Steinborn, Ch. Wagner, K. 388 Merzweiler, S.R. Trifunović, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 74 (2009) 389. 389 b) B.B. Zmejkovski, G.N. KaluĎerović, S. Ǵomez-Ruiz, T.J. Sabo, J. Serb. 390 Chem. Soc. 74 (2009) 1249. 391 [4] B.B. Krajčinović, G.N. KaluĎerović, D. Steinborn, H. Schmidt, Ch. Wagner, 392 Ž. Žižak, Z.D. Juranić, S.R. Trifunović, T.J. Sabo, J. Inorg. Biochem. 102 (2008) 393 892. 394 [4] G.P. Radić, V.V. GloĎović, G.N. KaluĎerović, F.W. Heinemann and S.R. 395 Trifunović, Trans. Met. Chem. 36 (2011) 331–336. 396 14 [6] B.T. Khan, J. Bhatt, K. Najmoddin, S. Shamsuddin, K. Annapoorna, J. Inorg. 397 Biochem. 44 (1991) 55. 398 [7] C. Navarro-Eanninger, J.M. Peréz, F. Zamora, V.M. Gonzáles, J.M. Masaguer, C. 399 Alonso, J.Inorg. Biochem. 52 (1993) 37. 400 [8] I. Brudzinska, Y. Mikata, M. Obata, C. Ohtsuki, S. Yano, Bioorg. Med. Chem. Lett. 401 14 (2004) 2533. 402 [9] A. Garoufis, S.K. Hadjikakou, N. Hadjiliadis, Coord. Chem. Rev. 253 (2009) 1384. 403 [10] W. Guerraa, E. de Andrade Azevedoa, A.R. de Souza Monteirob, M. Bucciarellia- 404 -Rodriguezb, E. Chartone-Souzab, A.M. Amaral Nascimentob, A.P. Soares Fontesc, 405 L. Le Moyecd, E.C. Pereira-Maiaa, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 2348. 406 [11] L.M.M. Vieira, M.V. de Almeida, M.C.S. Lourenço, F.A.F.M. Bezerra, A.P.S. 407 Fontes, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 4107. 408 [12] D. Kovala-Demertzi, M.A. Demertzis, J.R. Miller, C. Papadopoulou, C. Dodorou, G. 409 Filousis, J. Inorg. Biochem. 86 (2001) 555 410 [13] R.R. Coombs, M.K. Ringer, J.M. Blacquiere, J.C. Smith, J.S. Neilsen, Y.-S. Uh, 411 J.B. Gilbert, L.J. Leger, H. Zhang, A.M. Irving, S.L. Wheaton, C.M. Vogels S.A. 412 Westcott, Trans. Met. Chem. 30 (2005) 411. 413 [14] M. Ali, M. Aminul, R. Butcher C. Karen, Trans. Met. Chem. 31 (2006) 79. 414 [15] I. Kizilcikli, Y.D. Kurt, B. Akkurt, A.Y. Genel, S. Birteksöz, G. Ötük, B. Ülküseven, 415 Folia Microbio. 52 (2007) 15. 416 [16] N.M. Aghatabay, M. Somer, M. Senel, B. Dulger, F. Gucin, Eur. J. Med. Chem. 42 417 (2007) 1069. 418 [17] M.K. Biyala, K. Sharma, M. Swami, N. Fahmi, R. Vir Singh, Trans. Met. Chem. 33 419 (2008) 377. 420 [18] L.N. Schoenberg, D.W. Cooke, C.F. Liu, Inorg. Chem. 7 (1968) 2386. 421 [19] J.M. Andrews, J. Antimicrob. Chemother. 56 (2005) 60. 422 [20] S.D. Sarker, L. Nahar, Y. Kumarasamy, Methods 42 (2007) 321. 423 [21] E. Banfi, G. Scialino, C. Monti-Bragadin, J. Antimicrob. Chemother. 52 (2003) 796. 424 [22] J.M. Vujić, M. Cvijović, G. N. KaluĎerović, M. Milovanović, B. B. Zmejkovski, V. 425 Volarević, N. Arsenijević, T.J. Sabo, S.R. Trifunović, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 426 3601. 427 15 [23] B.B. Zmejkovski, G.N. KaluĎerović, S. Ǵomez-Ruiz, Ž. Žižak, D. Steinborn, H. 428 Schmidt, R. Paschke, Z.D. Juranić, T.J. Sabo, Eur. J. Med. Chem. 44 (2009) 3452. 429 [24] G.N. KaluĎerović, H. Schmidt, S. Schwieger, Ch. Wagner, R. Paschke, A. 430 Dietrich, T. Mueller, D. Steinborn, Inorg. Chim. Acta 361 (2008) 1395. 431 [25] T.J. Sabo, G.N. KaluĎerović, S.R. Grgurić-Šipka, F.W. Heinemann, S.R. 432 Trifunović, Inorg. Chem. Commun. 7 (2004) 241. 433 [26] G.N. KaluĎerović, V.M. Đinović, Z.D. Juranić, T.P. Stanojković, T.J. Sabo, J. 434 Inorg. Biochem. 99 (2005) 488. 435 [27] G.N. KaluĎerović, D. Miljković, M. Momčilović, V.M. Đinović, M. Mostarica- 436 -Stojković, T.J. Sabo, V. Trajković, Int. J. Cancer 116 (2005) 479. 437 [28] S. Mijatović, D. Maksimović-Ivanić, J. Radović, D. Miljković, G.N. KaluĎerović, 438 T.J. Sabo, V. Trajković, Cell. Mol. Life Sci. 62 (2005) 1275. 439 [29] R.S. Srivastava, Inorg. Chim. Acta 56 (1981) 65. 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 Professor Umberto Belluco Department of Chemical Processes, Università degli Studi di Padova, Via Marzolo 9, I-35100 Padua, Italy March 14 th , 2012 Kragujevac, Republic of Serbia Dear professor Belluco, We have done our best to improve the paper “Stereospecific ligands and their complexes. XI. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of palladium(II) complexes with some alkyl esters of (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2- -(3-methyl) butanoic acid” by the authors Gordana P. Radić, Verica V. Glođović, Ivana D. Radojević, Olgica D. Stefanović, Ljiljana R. Čomić, Vesna M. Ðinović and Srećko R. Trifunović according to the suggestion of the reviewers. The following are our answers to the suggestions of the reviewers. Reviewer #1: In the abstract, there is no need for a new paragraph on line 20 (page 1). The whole abstract is in one paragraph. Please define eddp on page 2, line 35. Eddp was defined (line 41). In some previous papers synthesis and characterization of the palladium(II) complexes with R2-S,S- eddp ligands (S,S-eddp = (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2-propanoate, R = n-Pr [2], n-Bu [2], n-Pe [2], i-Pr [3a], i-Bu [3b], c-Pe [4], Cy [4]) were published. Antiviral on page 2 line 55, should not have a hyphen to be consistent with the other 'anti' studies. Garoufis et al. [9] reviewed numerous scientific papers on antiviral, antibacterial and antifungal activity of palladium(II) complexes with different types of ligands (sulfur and nitrogen donor ligands, Schiff base ligands and drugs as ligands). *Response to Reviewers Experiments, the yields have too many significant figures, for instance 54.97% should be just 55%. Also, Page 3, line 75, the first word should have the e of ethylenediamine capitalised. The yields of the all substances were given in the form of numbers without decimals. (S,S)-Ethylenediamine-N,N'-di-2-(3-methyl)-butanoic acid, (H2-(S,S)-eddv) was prepared using similar methods described in literature [18]. Page 8, line 237 Scheme is misspelled. Esters (L1-L4) and neutral palladium(II) complexes (C1-C4) were prepared by using appropriate modifications of known methods (Scheme 1) [2,4,5,22-28]. Ethylenediamine is misspelled on page 9, line 255. The signals of CH2 protons of the ethylenediamine bridge showed coordination induced shifts in spectra of complexes (up to 0.9 ppm) giving a clear indication of nitrogen coordination. Please add ppm when discussing chemical shifts on page 9. The expected signals were found in 1 H NMR and 13 C NMR spectra. The signals of CH2 protons of the ethylenediamine bridge showed coordination induced shifts in spectra of complexes (up to 0.9 ppm) giving a clear indication of nitrogen coordination. The signals for all methyl protons for all compounds were found within the range of 0.90-1.21 ppm. Please remove the last line on page 263 as this is not necessary. The last line was removed. The sentence on page 10, line 278 does not make any sense, please correct. The tested substances do not show statistically significant difference in activity against investigated groups of microorganisms. In the conclusions the reader is left to wonder what the impact of this work has on the scientific community and where this study will lead. Perhaps a line or two discussing future work would be helpful. Our research showed that the change of ligand structure and corresponding palladium(II) complexes had a significant impact on their biological activity. We are going to track biological activity of the palladium(II) complexes as a consequence of ligand structure change. Schemes 1 and 2 should be combined into one scheme. Schemes 1 and 2 were combined into Scheme 1. Reviewer #2: To avoid this hypothesis ESI mass spectra of the complexes should be collected. Mass spectra of the complexes were collected. The results of microanalysis and MS spectra confirmed the predicted content of the isolated ligands and complexes. Also, the data from mass spectra of the C1-C4 match the proposed molecular formulae of the complexes. On row 254 the authors say that the coordination through the N atoms of the ligand happened because there is a shift up to 0.9 ppm of the methylene protons; this comparison cannot be made because the spectra of the ligands are collected in D2O and those of the complexes in CDCl3, the same solvent should be used to make this comparison. I suggest to analyze the spectra also in deuterated DMSO for the reason reported above and for two other important reasons: 1) see NH signals (the chemical shift of NH is important to understand the coordination mode) 2) the antimicrobial studies are performed in this solvent (maybe the structure in this coordinating solvent is destroyed). N,N-ligand coordination is confirmed by NH chemical shift (4.5 ppm for ligands and 5.8 ppm for complexes). NMR spectra ( 1 H and 13 C) of all synthesized compounds were recorded in DMSO-d6 too. Many typographical errors are present in the papers and only few of them are reported below (one careful check must be needed). We accepted Your suggestions. Row 6: Vadic instead Radic Radić is correct. Row 81: missed one parenthesis after complexes. We accepted Your suggestions. Row 118: in which solvent is performed the reaction? The reactions are performed in water solution. Row 237: Scheme and not Sheme We accepted Your suggestions. Row 240: corresponding and not cooresponding We accepted Your suggestions. Rows 45, 46, 48, 125, 128, 137, 147 chlorido and not chorido. We accepted Your suggestions. Reviewer #3: Check the spelling and English grammar throughout the text. We accepted Your suggestions. The first paragraph of the introduction should state that the authors refer to previous work in order to make it clear that they are not starting to discuss the present work. We accepted Your suggestions. In parallel with the rapid development of a wide range of antibacterial agents since the 1940s, bacteria have proved extremely adept at developing resistance to each new employed agent. The rapidly increasing incidence of bacterial resistance to antimicrobial agents has become a serious problem worldwide. Resistance mechanisms have been identified and described for all the known antibiotics currently available for clinical use [1]. In some previous papers synthesis and characterization of the palladium(II) complexes with R2-S,S-eddp ligands (S,S-eddp = (S,S)-ethylenediamine-N,N'-di-2- -propanoate, R = n-Pr [2], n-Bu [2], n-Pe [2], i-Pr [3a], i-Bu [3b], c-Pe [4], Cy [4]) were published. It was concluded from NMR spectra that the mixture of diastereoisomers of the [PdCl2(R2-eddip)] complexes was obtained. The antitumoral investigations of some of these ligands and complexes were performed [4]. As stated in section 2.1.3, two equivalents of LiOH were used. Two equivalents of LiOH were used for neutralization of protonated amino groups. Can the authors explain why only one ester was hydrolyzed? Although we expected bidentate coordination of synthesized diesters of S,S-eddv as with corresponding esters of S,S-eddp [2], the results of elemental microanalysis, MS, IR, NMR ( 1 H and 13 C) spectra suggest that partial diester hydrolysis and then tridentate coordination to the palladium(II)-ion occurred which was confirmed by X-ray structure analysis for complex [PdCl{(S,S)-(et)eddv}] [5]. This fact can be explained by moving chemical balance in the direction of hydrolysis by precipitation of insoluble palladium(II) complexes. This did not happen in the case of S,S-eddp-Pd(II) complexes since the complexes in question are enough water soluble. Page 10, line 126 - the formula of the complex reported in reference 4 is wrong. It presents 2 chlorides. The formula of the complex reported in reference 4 is wrong. The correct formula is [PdCl{(S,S)-(Et)eddv}]. Page 15. The authors explain the higher activity of the complexes, compared to the ligands, based on the "chelation theory". Unfortunately, the reference is not accessible. Is there another reference they could give? We replaced reference [28] S.O. Podunavac-Kuzmanović, V.M. Leovac, N.U. Perišić-Janjić, J. Rogan, G. Balaš, J. Serb. Chem. Soc. 64 (1999) 381. with [28] R.S. Srivastava, Inorg. Chim. Acta 56 (1981) 65. With best wishes and regards, Yours sincerely, Prof. Srecko R. Trifunovic e-mail: srecko@kg.ac.rs address: Prof. Srecko Trifunovic Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, Radoja Domanovica 12, 34000 Kragujevac Repubic of Serbia Table 1 The most important IR absorption bands of ligands and [PdCl{(S,S)-(R)-eddv)}] complexes (cm -1 ) Compound ν(C=O) ν(C-O) ν(CH3) ν(R-NH2 + ) ν(R-NH) Ref. det-S,S-eddv . 2HCl (L1) 1733 1228 2977 3415 - 5 dpr-S,S-eddv . 2HCl (L2) 1734 1202 2973 3437 - dbu-S,S-eddv . 2HCl (L3) 1737 1215 2967 3428 - dpe-S,S-eddv . 2HCl (L4) 1736 1230 2964 3439 [PdCl{(S,S)-(Et)-eddv)}](C1) 1735, 1640 1267 2970 - 3178 5 [PdCl{(S,S)-(Pr)-eddv)}] (C2) 1731, 1652 1267 2970 - 3181 [PdCl{(S,S)-(Bu)-eddv)}] (C3) 1716, 1640 1267 2966 - 3180 [PdCl{(S,S)-(Pe)-eddv)}] (C4) 1716, 1642 1267 2969 - 3180 Table(s) Table 2. Antibacterial and antifungal activity of tested ligands and corresponding palladium(II) complexes Species L1 C1 L2 C2 L3 C3 L4 C4 Doxycycline / Fluconazole MIC* MMC** MICMIC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC MIC MMC E. coli ATCC 25922 1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 500 1000 7.81 15.63 Ps. aeruginosa ATCC 27853 1000 1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 500 >1000 500 1000 62.5 125 Enter. faecalis ATCC 29212 500 500 500 1000 >1000 >1000 500 >1000 1000 >1000 500 1000 1000 >1000 500 1000 7.81 62.5 Escherichia coli 500 1000 125 500 125 1000 125 500 15.63 500 31.25 500 15.63 125 <7.813 125 7.81 15.63 Proteus mirabilis 1000 1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 500 1000 250 > 250 Bifidobac.an. subsp. lactis 250 500 125 1000 500 >1000 250 >1000 62.5 1000 62.5 1000 62.5 500 125 >1000 31.3 62.5 Lactobacillus plantarum 250 >1000 250 >1000 500 >1000 250 >1000 62.5 250 <7.813 125 62.5 250 <7.813 62.5 0.45 7.81 Bacillus subtilis IP 5832 125 500 15.63 >1000 62.5 >1000 7.813 1000 250 >1000 500 1000 1000 >1000 500 <1000 1.95 15.63 Saccharomyces boulardii 1000 1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 31.3 1000 Candida albicans >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 >1000 >1000 1000 >1000 62.5 1000 Aspergillus niger >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 500 >1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 1000 1000 500 1000 A. niger ATCC 16404 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 500 1000 62.5 62.5 Aspergillus flavus 1000 >1000 500 500 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 250 500 >1000 >1000 1000 1000 1000 1000 Aspergillus fumigatus 1000 >1000 250 500 >1000 >1000 500 1000 >1000 >1000 500 500 >1000 >1000 125 500 500 1000 Aspergillus restrictus 1000 >1000 500 500 >1000 >1000 1000 1000 >1000 >1000 500 500 500 1000 250 500 500 2000 * MIC values (µg/mL) – means inhibitory activity ** MMC values (µg/mL) – means microbicidal activity Table(s) NH NH HO HO CH CH O O ROH NH NH RO RO CH CH O O 2HCl HCl R = Et(L1), n-Pr(L2), n-Bu(L3), n-Pe(L4) LiOH R = Et(C1), n-Pr(C2), n-Bu(C3), n-Pe(C4) N N RO CH O Pd O Cl H K2PdCl4 CH O H Scheme 1. The preparation of the ethyl, propyl, buthyl and pentyl esters of H2-S,S-eddv and corresponding palladium(II) complexes Figure(s) NH2 NH2 O O O O 1 2 34 5 6 7 8 9 10 11 Pd O Cl N N O O H H O 2Cl 1 2 3 4 Fig. 1. Numbering of compounds used for NMR data 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 Figure(s) Synthesis, characterization, cytotoxicity of novel platinum(IV) and palladium(II) complexes with 1,2-diphenyl-ethylenediamine- -N,N'-di-3-propanoic acid Gordana P. Radića, Verica V. Glođovića, Zoran Ratkovića, Marija Milovanovićb, Vladislav Volarevićb, Nebojša Arsenijevićb, Laura Menéndez-Taboadac, Santiago Garcia-Grandac, Srećko R. Trifunovića1 a Department of Chemistry, Faculty of Science, University of Kragujevac, R. Domanovića 12, 34000 Kragujevac, Republic of Serbia b Centre for Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Kragujevac, Svetozara Markovića 69, 34000 Kragujevac,Republic of Serbia c Physical and Analytical Chemistry Department, University of Oviedo, 33006 Oviedo, Spain Abstract In the reaction of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine (1,2-dphen) with neutralized 3-chlor-propanoic acid, the new linear tetradentate edda-like ligand (edda = ethylenediamine- -N,N'-diacetic ion) meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid dihydrochloride- dihydrate (H2-1,2-dpheddp·2HCl·1.5H2O) was prepared. The corresponding platinum(IV) complex, s- cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl–ethylenediamine-N,N'–di-3-propanoate)-platinum(IV), [Pt(1,2- dpheddp)Cl2]·H2O, was synthesized by heating potassium-hexachloridoplatinate(IV) and H2-1,2- dpheddp·2HCl·1.5H2O on steam bath for 12 hours with neutralization by means of lithium-hydroxide. The compounds were characterized by elemental analysis, infrared, 1H and 13C NMR spectroscopy. 1 Corresponding author. Tel. : +381 34300263; fax: +381 34335040 E-mail address: srecko@kg.ac.rs. (S.R. Trifunović) Keywords: meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid; platinum(IV) complex; infrared spectroscopy; NMR spectroscopy. 1. Introduction A geometrical isomerism in metal complexes of linear flexible tetradentate ligands having the donor atom array ONNO such as edda (edda = ethylenediamine- -N,N'-diacetato ion) or eddp (eddp = ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate ion) has been an interesting field studied by a numerous of authors [1-14]. Such ligands occupy four of the octahedral sites around the central ion and the other two sites may be occupied by other ligands, in which three geometrical isomers are possible, as shown in Fig. 1. In most synthetic routes [1-14] edda takes a symmetric coordination position (s-cis) rather than unsymmetric one (uns-cis) [3]. It has been suggested that the observed chelate strain of chelate rings in uns-cis-edda complexes may be a contributing factor in determining the configuration of the edda ligand [6]. 1,3-Pdda ligand (1,3-pdda = 1,3- -propylenediamine-N,N'-diacetate ion) and eddp (eddp = ethylenediemine-N,N'-di-3- -propanoate ion), with a longer diamine and carboxylate chelate rings than edda, prefer unsymmetric coordination [1,15,16], suggesting that the size of the chelate rings in linear tetradentate edda and similar ligands have a profound effect on the distribution of the geometrical isomers of the complexes. Since the seventies, when cisplatin with antitumor activity was discovered by Rosenberg and co-workers [17,18], thousands of platinum complexes have been synthesized in order to obtain new Pt(IV) compound with improved properties in comparison to the parent drug cisplatin [19-21]. Platinum(IV) compounds are more inert than platinum(II) species and this property may allow oral usage. Jolley et. al. reported the synthesis and cytotoxicity of several platinum(II) and platinum(IV) complexes containing ethylenediamine derivates, including the complex with the ethylenediamine-N,N'-diacetato ligand. The later complex can be considered as a variant of JM-216, having the carboxylato groups tethered to the amine ligands. The authors found the complexes of the type [Pt(edda)Cl2] were less active than JM-216 [22] (JM-216 is pharmaceutical abbreviation for the trans,cis-cis-diacetato-dichlorido-ammino- cyclohexylammino-platinum(IV) complex, trans,cis-cis-[Pt(CH3COO)2Cl2(NH3)(c-C6H11NH2)] ) Natile and co-workers [23] investigated how the substitution edda with eddp (eddp = ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate ion) influenced to their biological activity and concluded that eddp-Pt(IV) had smaller activity than corresponding edda-Pt(IV) complex. They supposed this fact as due to the different complex geometry, s-cis in the case of edda and trans in the case of eddp. We wanted to extend the investigation of platinum complexes with derivatives ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate. The initial idea of this work was to prepare a new linear edda-like ligand, meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid (H2-1,2-dpheddp) and corresponding Pt(IV) complexes in s-cis and/оr trans geometries. In all our attempts we prepared only s-cis geometrical isomer, with a low solubility in water and common organic solvents. Here we report synthesis the meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid and corresponding s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di- propionato)-platinum(IV) complex using the same method as Liu [24]. The ligand has been characterized by elemental analysis, infrared, 1H and 13C NMR spectroscopy. The geometric configuration of the isolated complex is assigned on the basis of their infrared, 1H and 13C NMR spectroscopy. 2. Experimental 2.1. Materials and measurements The reagents were obtained commercially and used without further purification. Infrared spectra were recorded on Perkin-Elmer FT-IR spectrophotometer, Spectrum One, using the KBr pellet technique. 1H and 13C NMR spectra were recorded on a Varian Gemini-200 NMR spectrometer using TMS as an internal reference, using D2O solutions for meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid and s-cis-dichlorido-(meso-1,2- -diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)platinum(IV) complex, s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2], and CDCl3 solution for meso-1,2-diphenyl- -ethylenediamine (1,2-dphen) at 22˚C, using 10 mM solutions. Elemental analyses were done on a Vario III CHNOS Elemental Analyzer, Elemental Analysensysteme GmbH. 2.2. Syntheses 2.2.1. Preparation of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine, 1,2-dphen The meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine was prepared according to the procedure described earlier [25]. Benzaldehyde (30 g) was refluxed with ammonium acetate (60 g) for 3 hours. The reaction mixture was cooled and the product was filtered and washed with ethanol. Recrystallization from 1-butanol gave N-benzoyl-N'-benzylidene-meso-1,2-diphenyl- ethylendiamine. Hydrolysis of that compound with 70% sulphuric acid under reflux for 1h gave meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine as the basic product of hydrolysis. 2.2.2. Preparation of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid dihydrohloride-monohydrate, H2 -1,2-dpheddp·2HCl·1H2O 3-Chloro-propanoic acid (4.34 g, 0.04 mol) was dissolved in 5 cm3 of water on ice bath and carefully neutralized with cold water solution of 5 cm3 NaOH (1.6 g, 0.04 mol). 1,2- Diphenyl-ethylenediamine (4.24 g, 0.02 mol) was added to this solution. The mixture was being stirred for 4 hours at 90°C, and during this period 5 cm3 NaOH water soltion (1.6 g, 0.04 mol) was introduced. After that, 5.6 cm3 6 mol/dm3 HCl was added and resulting solution was evaporated to the volume of 7 cm3; 6 cm3 conc. HCl, 6 cm3 of ethanol and 6 cm3 of ether were added to the mixture. The white precipitate of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- propanoic acid dihydrochloride-monohydrate, H2-1,2-dpheddp·2HCl·1H2O was separated by filtration and refined with solution water : ethanol = 1:2. Yield: 4.00 g (43.83 %). Anal. Calcd. for H2-1,2-dpheddp·2HCl·1H2O = C20H28Cl2N2O5 (Mr = 456.352): C, 52.63; H, 6.40; N, 6.14. Found: C, 52.88; H, 6.70; N, 6.08. 2.2.3. Preparation of s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoate)-platinum(IV), s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] Potassium-hexachloridoplatinate(IV) (0.2 g, 0.411 mmol) was dissolved in 10 cm3 water on a steam bath and 1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid (0.1876 g, 0.411 mmol) was added. The reaction mixture was heated for 12 hours and during this period 10 cm3 of LiOH water solution (0.0394 g, 1.65 mmol) was added in small portions and the solution was filtered and evaporated to small volume. The orange precipitate of s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] was separated by filtration, washed with cold water and air-dried. Yield: 0.095 g. (37,2 %). Anal. Calc. for s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] = C20H26Cl2N2O4Pt (Mr = 620,40): C, 38.72; H, 3.57; N, 4.52. Found: C, 38.38; H, 3.81; N, 4.61. 2.3. In vitro cytotoxicity studies 2.3.1. Preparation of drug solutions Platinum complexes were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) at a concentration of 20 mM and filtered through a 0.22 mm Millipore filter. These stock solutions were diluted in culture medium immediately before use. MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide was dissolved (5 mg/ml) in a phosphate buffer saline having a pH of 7.2, and filtered through the 0.22 mm Millipore filter before use. All reagents were purchased from Sigma Chemicals 2.3.2. Cell lines The mouse breast tumor cell line 4T1 and mouse malignant melanoma cell line B16F1 were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). The cells were maintained in in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 IU/ml penicillin G and 100 mg/ml streptomycin. 2.3.3. Assessment of Cytotoxicity Cytotoxic effects of Pt and Pd complexes and cisplatin on 4T1 and B16F1 cell lines were determined using MTT colorimetric technique [26]. The cells were diluted with medium to 5 x 104 cells/ml and aliquots (5x103cells/100µl) were placed in individual wells in 96-multiplates. About 24h later, after the cell adherence, each well received 100µl of either Pt, Pd, cisplatin which had been serially diluted 2-fold in medium to concentrations ranging from 500 µM to 3.9 µM. Cells were incubated at 37°C in a 5% CO2 incubator for 72h. After incubation supernatant was removed, fresh medium and MTT (3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium- bromide) solution (5 mg/ml in phosphate buffered saline) were added to each well and the plates were incubated for additional 4 h. Upon incubation the cell-free supernatants were suctioned off, and DMSO (150 μl) and glycin buffer were added to dissolve the crystals. The plates were shaken for 10 min. The optical density of each well was determined at 595 nm using microplate multimode detector Zenyth 3100. The percentage of cytotoxicity was calculated using the formula: % cytotoxicity = 100-((TS−BG0)−E/(TS−BG0) × 100), where ,,BG0” is for background of medium alone, ,,TS” is for total viability/spontaneous death of untreated target cells, and ,,E” is for experimental well. 3. Results and discussion The meso-1,2-diphenyl-ethylenediamin-N,N'-di-3-propanoate ligand was obtained in reaction between 1,2-diphenyl-ethylenediamine and 3-chloro-propanoic acid (Fig. 2.). Three geometrical isomers of 1,2-dpheddp-Pt(IV) complex with two identical monodentate ligands are theoretically possible, s-cis, uns-cis and trans (Fig. 1.). In reaction between K2[PtCl6] with H2- 1,2-dpheddp ligand only one isomer of neutral octahedral 1,2-dpheddp-Pt(IV) complex, s-cis- dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)platinum(IV), s-cis- [Pt(1,2-dpheddp)Cl2], with tetradentate coordination of the 1,2-dpheddp ligand was obtained. The complex is slightly soluble in water and, unfortunately, almost insoluble in organic solvents. 3.1. Infrared Spectra As it was demonstrated for metal aminocarboxylic acid complexes [27,28], the asymmetric stretching frequency of the carboxylate groups of the five-membered [27] rings lies at higher energy than the corresponding frequency of the six-membered chelate rings [28]. Later, this was supported by Neal and Rose [28] and Douglas et al [30,31] who found that edta-type hexadentate complexes with mixed and equivalent (two five- and six-membered) carboxylate arms, such as trans(O5)-[M(S,S-edds)]- (M = Co(III) or Cr(III); S,S-edds = S,S-ethylenediemine- -N,N'-disuccinic ion) [29-31] and trans(O5)-[M(eddda)]- (eddadp = ethylenediamine-N,N'- diacetato-N,N'-di-3-propionato ion) [30,31] exhibited two very strong and well-separated bands in the asymmetric stretching carboxylate frequency region. The bands were assigned to the carbonyl stretching vibrations of the five-membered rings at higher energy and six-membered rings at lower energy. The isolated Pt(IV) and Pd(II) complexes do not show any well resolved doublets in the asymmetric CO stretching region (at 1618 cm-1 and 1610 cm-1 for Pt(IV) and at 1643 cm-1 and 1580 cm-1 for Pd(II) complex; Table 1, and mentioned doublets lie at lower energy than the corresponding bands of five-membered chelate rings [30,32]. The lack of absorption between 1700-1750 cm-1 indicates that the both carboxyl groups of the 1,2-dpheddp ligand are coordinated to the central platinum(IV) ion. The prepared ligand, meso-1,2-diphenyl- ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid, has absorption bands in the same asymmetric CO stretching region between 1700-1750 cm-1 (1754 cm-1 and 1732 cm-1, Table 1) suggesting some small differences in energies of COO- groups. 3.2. 1H and 13C NMR Spectra The resonance frequency assignments are summarized in Table 4. The NMR spectra of the synthesized meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine (1,2-dphen) are recorded in CDCl3 and for its N-derivative, meso-1,2-diphenyl- -ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoic acid (H2-1,2-dpheddp) in D2O. In spite of low solubility in water and other common organic solvents of the s-cis-dichlorido-(meso-1,2-diphenyl- -ethylenediamine-N,N'-di-3-propanoate)platinum(IV) complex, s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2], we successfully recorded its 1H and 13C NMR spectra in D2O. The 1H and 13C NMR spectra in heavy water solution of the prepared [Pt(1,2-dpheddp)Cl2] complex reveals s-cis geometry (Fig. 1.). The 1H and 13C NMR spectral peaks of both prepared compounds (a and b), given in Fig. x, are compatible to their molecular structures (Table 2). The resonances of hydrogen and carbon atoms arising from the ethylenediamine chain and phenyl groups in 1,2-dphen and H2-1,2- dpheddp were found at similar positions but the signals are slightly shifted to the higher positions in H2-1,2-dpheddp compound as a due to the presence of residue of propanoic acid (Table 2). The lack of the NH hydrogen peak in 1H NMR spectrum of H2-1,2-dpheddp could be explained with fast exchange of hydrogen atoms with deuterium atoms from D2O. The signals positions of the hydrogen and carbon in NMR spectra of synthesized [Pt(1,2-dpheddp)Cl2] complex are also expected and confirm the coordination of the 1,2- -dpheddp ligand to the Pt(IV) central ion. But the two signals from ethylenediamine carbon atoms and, also, the two signals from carbon arising from COO- groups (Table 2) suggest small differences in energies of these atoms. Those differences in energies of mentioned carbon atoms could be explained by the coordination of the 1,2-dpheddp ligand to the Pt(IV) central ion which leads the voluminous phenyl groups in the neighborhood in the contrary to their positions in a free H2-1,2-dpheddp ligand (Fig. x, compound b). The model analysis suggests the almost parallel orientation of the phenyl groups. Therefore, the diamine ring conformation becomes rigid forcing the carbon atoms to be different in energies. 3.3. In vitro cytotoxic activity In order to investigate in vitro cytotoxic potential of platinum and palladium complexes various concentrations of complexes were added to target cells and the cell number was determined after 72h by MTT assay. The complexes showed a dose dependent cytotoxic effect toward both cell lines. (figures). Palladium(II) complex showed higher cytotoxic effect in compare to platinum(IV) complex on both cell lines. Both complexes were less active than cisplatin, exception were the concentrations above 62.5 μM of platinum complex on B16F1 cell line. Taking in consideration standard deviations, IC50 values for the B16F1 cell line were approximately the same (Pt-223.38±25.12, Pd-157.51±14.09, cisplatin-186.63±28.11). Palladium(II) complex showed significantly higher cytotoxic effect on 4T1 cells (IC50-31.94±13.38) in compare to platinum(IV) complex (IC50-144.69±55.3) and cisplatin (IC50-17.34±2.25). 4. Conclusion On the basis of the elemental analyses, infrared, 1H and 13C NMR spectroscopy the s-cis geometry of the dichlorido-(meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N'-di-3- -propanoate)platinum(IV), trans-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] prepared by the direct reaction of K2[PtCl6] and H2-1,2-dpheddp in water solution, was proposed. In this paper we also report syntheses and characterization of tetradentate 1,2-dpheddp ligand. Palladium(II) complex showed higher cytotoxic effect in compare to platinum(IV) complex on both cell lines. Both complexes were less active than cisplatin. Acknowledgment This work was supported by Ministry of Science and Environment of Republic Serbia, Project No 172016. We are grateful to Ms Snežana Trifunović for the elemental analyses. References [1] a) G.R. Brubaker, D.P. Schaefer, J.H. Worrell, Coord. Chem. Rev. 7 (1971) 161. b) D.J. Radanović, Coord. Chem. Rev. 54 (1984) 159. c) T.J. Sabo, S.R. Grgurić, S.R. Trifunović, Synth. React. Inorg. Met.-Org. Chem., (Review) 32 (2002) 1661. [2] V.M. Djinović, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 67 (2002) 367. [3] J.I. Legg, D.W. Cooke, Inorg. Chem. 4 (1965) 1576. [4] N. Sakagami, T. Yasui, H. Kawaguchi, T. Ama, S. Kaizaki, Bull. Chem. Soc. Jpn. 67 (1994) 680. [5] J.I. Legg, D.W. Cooke, B.E. Douglas, Inorg.Chem. 6 (1967) 700. [6] V.M. Djinović, S.R. Grgurić, Xu Xing-You, T.J. Sabo, J. Coord. Chem. 53 (2001) 355. [7] S.R. Grgurić, S.R. Trifunović, T.J. Sabo, J. Serb. Chem. Soc. 63 (1998) 669. [8] Ž.Lj. Tešić, T.J. Sabo, S.R. Trifunović, D. M. Milojković, J. Chromatography A874 (1999) 297. [9] N. Petranović, D. Minić, T.J. Sabo, D.J. Djoković, J. Therm. Anal. Co. 59 (2000) 807. [10] S.R. Grgurić, T.J. Sabo, Synth. React. Inorg. Met.-Org. Chem. 29 (1999) 1567. [11.] G.N. Kaludjerović, T.J. Sabo, Polyhedron 21 (2002) 2277. [12] V.M. Djinović, G.A. Bogdanović, S. Novaković, T.J. Sabo, Synth. React. Inorg. Met.- Org. Chem. 32 (2002) 1085. [13] G.N. Kaludjerović, G.A. Bogdanović, T. J. Sabo, J. Coord. Chem. 55 (2002) 817. [14] P.J. Garnett,D.W. Watts, Inorg. Chim. Acta 8 (1974) 293. [15] M. Okabayashi , K. Igi, J. Hidaka, Bull. Chem. Soc. Jpn. 52 (1979) 753. [16] T.J. Sabo, S.R. Grgurić, D.D. Minić, S.R. Trifunović, J. Coord. Chem. 44 (1998) 47. [17] B. Rosenberg, L. Van Camp, J.E. Trosko, V.H. Mansour, Nature (London) 222 (1969) 385. [18] B. Rosenberg, L. Van Camp, Cancer Res. 304 (1970) 1799. [19] E. Wong, C.M. Giandomenico, Chem. Rev. 99 (1999) 2451. [20] L.R. Kelland, in: B. Lippert (Ed), Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug, VHCA/Wiley-VCH, Weinheim pp. (1999) 497. [21] G. Natile, M. Coluccia, Coord. Chem. Rev. 383 (2001) 216. [22] J.N. Jolley, A.I. Yanovsky, L.R. Kelland, K. B. Nolan, J. Inorg. Biochem. 83 (2001) 91. [23] T.J. Sabo, G.N. Kaludjerović, D. Poleti, Lj. Karanović, A. Boccarelli, F. Cannito, G. Natile, J. Inorg. Biochem. 98 (2004) 1378. [24] C. Liu, Inorg. Chem. 3 (1964) 680. [25] S. Tripett J. Chem. Soc. (1957) 4407. [26] T. Mosmann Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65(1-2) (1983) 55 [26] K. Nakamoto , Y. Morimoto, A. E. Martell, J. Am. Chem. Soc. 83 (1961) 4528. [27] M.B. Ćelap, S.R. Niketić, T.J. Janjić,V.N. Nikolić, Inorg. Chem. 6 (1967) 2063. [28] J.A. Neal, N.J. Rose, Inorg. Chem. 7 (1968) 2405; 12 (1973) 1226. [29] D.J. Radanović, B.E. Douglas, J. Coord. Chem. 4 (1975) 191. [30] K.D. Gailey, D.J. Radanović, M.I. Djuran, B.E. Douglas, J. Coord. Chem. 8 (1978) 161. [31] M.B. Ćelap, A.R. Niketić, T.J. Janjić, V.N. Nikolić, Inorg. Chem. 6 (1967) 2063. [32] T.G. Appleton, J.R. Hall, M.A. Williams, Inorg. Chim. Acta 61 (1982) 51. [33] V.M. Djinović, G.A. Bogdanović, S. Novaković, T.J. Sabo, J. Coord. Chem. 8 (2004) 535. [34] V.M. Djinović, L. Mančić, G. Bogdanović, P. Vulić, G. Del Rosario, T.J. Sabo, O.B. Milošević, Journal of Materials Research 20 (2005) 102. Table 1 The most important IR bands (cm-1) of some Pt(IV) complexes with linear O-N- -N-O ligands Compund υ as (COOH) υ as (COO-) Ref. trans-[Pt(H2edta)Cl2] 1775; 1764 1691; 1678 32 uns-cis-[Pt(H2edta)Cl2] 1758; 1742 1692; 1685 32 s-cis-[Pt(H2edta)Cl2] 1753; 1741 1725; 1716 32 trans-[Pt(eddp)Cl2]·H2O - 1637; 1630 13 trans-[Pt(1,3-pdda)Cl2]·H2O - 1696; 1660 33 trans-[Pt(pdda)Br2]·H2O - 1684; 1648 34 s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] - 1618; 1610 this work H2-1,2-dpheddp 1754; 1732 - this work Table 2 Characteristic 1H and 13C NMR shifts of 1,2-dphen, H2-1,2-dpheddp and s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] Group 1,2-dphen H2-1,2-dpheddp s-cis-[Pt(1,2-dpheddp)Cl2] NH 1.43 (s) - - CH 4.02 (s) 4.78 (s) 4.82 (s) Ph 7.33 (m) 7.70 (m) 7.3 (m) N-CH2-CH2 - 2.93 (m) 3.05 (m) 1H CH2CH2COOH - 2.46 (m) 2.70 (m) CH 62.8 66.33 18.5; 42.4 Ph 132.97 134.98;133.71;131.98;131.28 128.3;128.3;126.4;137.2 CH2-COOH - 178.74 172.66; 172.07 N-CH2-CH2 - 45.43 18.3; 42.2 13C CH2CH2COOH - 32.70 37.1 s-singlet, m-multiplet Fig. 1. Possible geometrical isomers of [Pt(eddp)X2] complex (X = monodentate ligand): s-cis (I), uns-cis (II) and trans (III) X X X s-cis uns-cis trans N N X X O O N N O X O N N O O Fig. 2. Reaction pathways in synthesis of meso-1,2-diphenyl-ethylenediamine-N,N`-di-3- -propionic acid O H + ONH4 O CH2 N NH C O NaOH Et2O NH2 H2N ammonium acetatebenzaldehyde 70% H2SO4 refluxed refluxed 1-2 hour extraction C14H16N2 t.t.=120,5-121,5 C N-benzoyl-N`-benzylidene-meso-1,2- diphenylenediamine, 60%,C28H24ON2,mp=258-259 C + Cl H2 C H2 C C O OH2 HN N H O OHO HO meso-1,2-diphenyl-N,N`-di-3-propionic acid, dpheddp, 23,40% Fig. 3. Cytotoxicity of investigated complexes on mouse breast tumor cell line 4T1 after 72 hours of growth in the presence of tested complexes. Results are means of three experiments. 0 20 40 60 80 100 120 0 3.9 7.8 15.625 31.25 62.5 125 250 cy to to xi ci ty [ % ] c [µM] 4T1 Pt Pd cisplatin Fig. 4. Cytotoxicity of investigated complexes on mouse malignant melanoma cell line B16F1 after 72 hours of growth in the presence of tested complexes. Results are means of three experiments. 0 20 40 60 80 100 120 0 3.9 7.8 15.625 31.25 62.5 125 250 500 cy to to xi ci ty % c [μM] B16F1 Pt Pd cisplatin Fig. 5. IC50 (µM) for the 72 h of action of investigated compounds on 4T1 cells, determined by MTT assay 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 Pt Pd cisplatin IC 50 [μ M ] 4T1 Fig. 6. IC50 (µM) for the 72 h of action of investigated compounds on B16F1 cells, determined by MTT assay 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 Pt Pd cisplatin IC 50 [μ M ] B16F1