УНИВЕРЗИТЕТ У КРАГУЈЕВЦУ ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ мр Иван Т. ЛАЗАРЕВИЋ ПРОУЧАВАЊЕ БИНАРНИХ РАВНОТЕЖА У РАСТВОРИМА ГАДОЛИНИЈУМ(III) И АЛУМИНИЈУМ(III) ЈОНА У ПРИСУСТВУ ФЛУОРОХИНОЛОНА ОФЛОКСАЦИНА И МОКСИФЛОКСАЦИНА Докторска дисертација Крагујевац, 2012 ИДЕНТИФИКАЦИОНА СТРАНИЦА ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ I. Аутор Име и презиме: Иван Т. Лазаревић. Датум и место рођења: 11.06.1969. Крушевац. Садашње запослење: В.П. 6910 Крушевац (Центар за усавршавање кадрова АБХО Војске Србије). II. Докторска дисертација Наслов: „Проучавање бинарних равнотежа у растворима гадолинијум(III) и алуминијум(III) јона у присуству флуорохинолона офлоксацина и моксифлоксацина” Број страница: 243. Број слика: 108 у тексту и 18 у прилогу; Број табела: 60 у тексту и 28 у прилогу; Број шема: 4. Број библиографских података: 126. Установа и место где је рад израђен: Природно математички факултет, Крагујевац; Центар за усавршавање кадрова АБХО Војске Србије, Крушевац. Научна област (УДК): Неорганска хемија. УДК број 546. Ментор: др Предраг Ђурђевић, редовни професор. III. Оцена и одбрана Датум пријаве теме: 20.01.2010. године. Број одлуке и датум прихватања докторске дисертације: -Одлука ПМФ-а, Универзитета у Крагујевцу бр. 160/VII-1 од 24.02.2010. -Одлука Стручног већа за Природно математичке науке Универзитета у Крагујевцу број 616/10 од 14.04.2010.године. Комисија за оцену подобности теме и кандидата: -Одлука ПМФ-а, Универзитета у Крагујевцу бр.100/VII-1 од 03.02.2010. 1. Др Предраг Ђурђевић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, н.о. аналитичка и неорганска хемија; 2. Др Милена Јеликић Станков, редовни професор Фармацеутског факултета у Београду, н.о. анал. хемија; 3. Др Ратомир Јелић, доцент Медицинског факултета у Крагујевцу, н.о.неорганска хемија; Комисија за оцену и одбрану докторске дисертације: -Одлука ПМФ-а, Универзитета у Крагујевцу бр.350/V-2 од 09.05.2012. 1. Др Предраг Ђурђевић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, н.о. аналитичка и неорганска хемија; 2. Др Милена Јеликић Станков, редовни професор Фармацеутског факултета у Београду, н.о. хемија у фармацији; 3. Др Живадин Бугарчић, редовни професор ПМФ-а у Крагујевцу, н.о. неорганска хемија; Датум одбране дисертације: _____._____. 2012. године. Докторску дисертацију посвећујем породици, супрузи Сањи и деци Тијани и Немањи. Покојном оцу Томиславу у знак сећања ... Људи постоје док их се други сећају ... Ова дисертација је плод доприноса многих људи који су посредно или непосредно учествовали у њеном обликовању и изради. Рађена је у Институту за Хемијске науке Природно-математичког факултета у Крагујевцу и Центру за усавршавање кадрова АБХ службе Војске Србије, под руководством др Предрага Ђурђевића, редовног професора. Техничка дорада рукописа дисертације рађена је и током мог боравка у мировној мисији УН-а UNIFIL у Либану. Захваљујем се др Предрагу Ђурђевићу, редовном професору, који је предложио тему дисертације, руководио њеном израдом и указао ми помоћ током израде и писања. Др Милени Јеликић-Станков, редовном професору Фармацеутског факултета у Београду, др Живадину Бугарчићу, редовном професору Природно-математичког факултета у Крагујевцу и др Ратомиру Јелићу, ванредном професору Медицинског факултета у Крагујевцу, захваљујем на корисним саветима и сугестијама током израде и прегледа рукописа докторске дисертације. Захваљујем се др Љубинки Јоксовић, доценту, Андрији Ћирићу, дипл. хем. и Ивану Јаковљевићу, дипл. хем., на несебичној помоћи током израде дисертације у свим фазама, и многима који су (не)посредно испољили позитивни утицај на мене током израде дисертације. Посебну захвалност дугујем породици, супрузи Сањи и деци Тијани и Немањи на подршци и разумевању, који су ми све потешкоће преобразили у чар и лепоту, чаробним прахом своје посебности ... СПИСАК ОЗНАКА Концентрације: S - концентрација комплексних врста. X - слободна концентрација компоненте. T - укупна концентрација компоненте. Индекси: i - општи индекс за компоненте. j - општи индекс за комплексне врсте. m - специфични индекс за компоненту. p - индекс за број јона метала. q - индекс за број водоничних или хидроксидних јона. r - индекс за број лиганада. Суперскрипти: c - означава израчунату концентрацију. r - означава реалну количину. o - означава стару вредност у итерацији. n - означава нову вредност у итерацији. Параметри: β - кумулативна константа стабилности комплексних врста. k - матрица која дефинише компоненте и њихову разноврсност у комплексним врстама. Симболи: MRI - магнетна резонанаца. MRA - магнетна ангиографија. NMR - нуклеарно-магнетна резонанција. CT - компјутерска томографија. M - метални јон. L - лиганд. H - водонични јон. FQ - флуорохинолон(и). oflo - офлоксацин. moxi - моксифлоксацин. cipro - ципрофлоксацин. gati - гатифлоксацин. enox - еноксацин. enro - енроксацин lome - ломефлоксацин. nor - норфлоксацин. enro - енроксацин. levo - левофлоксацин. spar - спарфлокацин. UV - ултра-љубичаста област. ε - моларна апсортивност. Kd - константа дисоцијације слабе киселине (pKd =- logKd). EMS - електромоторна сила. E - потенцијал стаклене електроде. E0 - стандардни потенцијал стаклене електроде. Ej - дифузиони потенцијал. Q - Nernstov фактор (=59,16 mV, на 25оC). R - универзална гасна константа (8,314 Ј mol-1 K-1). F - Faradejeva константа (9,649 C mol-1). Vo - почетна запремина раствора. Vb - запремина додате базе. Ve - запремина базе потребна за неутрализацију киселине. CH или H - стехиометријска концентрација јона водоника. COH - стехиометријска концентрација хидроксидних јона. fH - коефицијент активитета водоничних јона. aH - активитет водоничних јона. KW - јонски производ воде. A - апсорбанција раствора. λ - таласна дужина (nm). C - концентрација компоненте која апсорбује. b - дебљина апсорпционог слоја (cm). εк - моларни апсорпциони коефицијент комплекса. CM - стехиометријска концентрација јона метала. CL - стехиометријска концентрација лиганда. [OH]v - концентрација [OH]--јона везаних у хидролитички комплекс. [OH]uk - укупна концентрација [OH]--јона у раствору. H0 - укупна концентрација [H]+-јона у раствору. M0 - укупна концентрација јона метала у раствору. L0 - укупна концентрација лиганда у раствору. [M] или m - равнотежна концентрација јона метала. [L] или a - равнотежна концентрација лиганда. [H] или h - равнотежна константа јона водоника. ZH - средњи протонски број. n - средњи лигандни број. M - јон метала. Mp(OH)q - хидролитички комплекс. HNL - протоновани лиганд. N - број протона у протонованом лиганду. KNH - појединачна константа протоновања. β nH - кумулативна константа протоновања. MpHqLr - мешовито-протоновани комплекс. βp,q,r - константа стабилности мешовито-протонованог комплекса. KN - појединачна константа стабилности комплекса. Cp,q - равнотежна константа комплекса. Mp(OH)qLr - мешовито-хидролитички комплекс. β*p,q,r - константа стабилности мешовито-хидролитичког комплекса. ZMe , ZHe и nе - експериментално добијене вредности средњег хидроксидног, протонског и лигандног броја. ZMc , ZHc и nc - израчунате вредности средњег хидроксидног, протонског и лигандног броја. mM - концентрација раствора у 10-3 mol/dm3. j - константа јонске средине. T - апсолутна температура. ZTT - завршна тачка титрације. ΔG - промена Gibbsove енергије. EJ - енергија јонизације. LMM - лиганди мале масе. LVM - лиганди велике масе. Ej - енергија јонизације. PMI - плазма мобилизациони индекс. aK - термодинамичка консанта дисоцијације. daK , - релативна константа дисоцијације. )(XaΘ - стандардна активност. maK , - концентрациона константа равнотеже. 1k 0 , ... - кумулативне константе дисоцијације. 2k nk iβ - кумулативне термодинамичке константе стабилности. 0 iHΔ H - промена стандардне енталпије i-те реакције. mβ - кумулативне константе протоновања. Q– - анјонски облик хинолона. HQ± - диполарни јон. H2Q+ - катјонски јон. k11, k12, k21, k22 - микроконстанте дисоцијације. К1, К2 - макроконстанте дисоцијације. Plog - логаритам партиционог коефицијента. π - хидрофобна константа. UV-VIS - ултраљубичаста и видљива спектроскопија. IR - инфрацрвена спектроскопија. NMR - нуклеарно магнетно резонантна спектроскопија. MS - масена спектрометрија. DMSO - диметилсулфоксид. MIK - минимална инхибиторна концентрација. iα - алфа вредности. Tc - укупна аналитичка концентрација слабе киселине. 0α - молска фракција. Mα - фракција слободног јона метала. AAS - атомска апсорпциона спектрометрија. GCMS - гасна хроматографија масена спектрометрија. LCMS - течна хроматографија масена спектрометрија. ICP - индуктивно куплована плазма. HySS - Hyperquad Simulation and Speciation. ECCLES - Evaluation of Constituent Concentrations in Large Equilibrium Systems. HYDRA - Hydrochemical Equilibrium Constant Database. MEDUSA - Make Equilibrium Diagrams Using Sophisticated Algorithms. JESS - Joint Expert Speciation System. GFR - гломеруларна филтрација. ICP-MS - индуковано куплована плазма-масена спектрометрија. GFAAS - графитна AAS. e0 - равнотежни потенцијал. F - Фарадејева константа. RE - референтна електрода. SE - стаклена електрода. М+ - молекулски јон. m* - метастабилни јон. CI - Chemical ionization. EI - Electron Impact. ESI - Electrospray ionization. FAB - Фast atom bombardment. LIMS - Laser ionization. MALDI - Matrix-assisted laser desorption ionization. PD - Plasma-desorption ionization. RIMS - Resonance ionization. SIMS - Secondary ionization. TIMS - Thermal ionization. CID - Collision induced dissociation. DOS - Disk operation system. OS - оперативни систем. LFER - Linear Free Energy Relationship. SIT - Specific Interaction Theory. Докторска дисертација Списак слика и шема СПИСАК СЛИКА И ШЕМА Број и назив слике Стр. Слика 1. Основне структуре језгара хинолона (a-4-оксо-1,4-дихидрохинолонско језгро; b-8-аза-4-хинолини; c-6,8-диаза-4-хинолини; d-2-аза-4-хинолини;) 17 Слика 2. Општа структура хинолона (лево) и флавона (десно) 19 Слика 3. Прстен C-Хинолин-4(1H)-он 19 Слика 4. Прстен C-потпуно ароматични дериват хинолина 20 Слика 5. Хемијска структура неких хинолона друге генерације 21 Слика 6. Хемијска структура неких хинолона треће генерације 21 Слика 7. Хемијска структура неких хинолона четврте генерације 21 Слика 8. UV/VIS спектар норфлоксацина на различитим pH вредностима 27 Слика 9. IR спектар ципрофлоксацина 28 Слика 10. IR спектар (А) офлоксацина и (Б) левофлоксацина 28 Слика 11. IR спектар (А) норфлоксацина и (Б) ципрофлоксацина 28 Слика 12. 1H NMR спектар норфлоксацина у D2O 31 Слика 13. 13C NMR спектар норфлоксацина у DMSO 31 Слика 14. 13C NMR спектар ципрофлоксацина 31 Слика 15. 13C NMR спектар норфлоксацина 32 Слика 16. Масени спектар ципрофлоксацина 33 Слика 17. Масени спектар ломефлоксацина 33 Слика 18. Структура офлоксацина (неутрални облик молекула у раствору) 34 Слика 19. Синтеза офлоксацина 34 Слика 20. Микроскопска јонизација офлоксацина (HQ0- неутрални облик; H2Q+- катјонски облик; HQ- -анјонски облик; HQ± - диполарни ("zwitter") облик;) 35 Слика 21. Растворљивост офлоксацина на различитим pH вредностима на собној температури 36 Слика 22. Шема фрагментације офлоксацина 37 Слика 23. IR спектар офлоксацина 38 Слика 24. UV VIS спектар офлоксацина у киселој и базној воденој средини 38 Слика 25. Абсорпциони максимум (λ max)/таласна дужина максимума за офлоксацин 39 Слика 26. Дифракција X-зрацима за офлоксацин 39 Слика 27. Метаболички продукти офлоксацина 40 Слика 28. Криве експерименталних неводених титрација за неке флуорохинолоне (Офлоксацин концентрације 2.8×10-2 mol/dm3, третиран са 0.1 mol/dm3 HClO4) 40 Слика 29. Хемијска структура моксифлоксацина 41 Слика 30. Прва фаза синтезе моксифлоксацина 41 Слика 31. Друга фаза синтезе моксифлоксацина 41 Слика 32. UV VIS спектар моксифлоксацина у метанолу 42 Слика 33. IR спектар моксифлоксацина снимљен KBr техником 43 Слика 34. 1H-NMR спектар моксифлоксацина снимљен техником Fourije-ове трансформације 44 Слика 35. 13C-NMR спектар моксифлоксацина снимљен техником Fourije-ове трансформације 44 Слика 36. Масени спектар моксифлоксацина 45 Слика 37. Активирање програма-почетна страница и отварање фајла базе у раду 58 Слика 38. Маска програма за подешавање и унос података посматраног система 59   I Докторска дисертација Списак слика и шема Слика 39. Маска за промену услова (концентрација) посматраног модела 59 Слика 40. Маска за додавање метала и лиганада у посматрани систем за симулацију 60 Слика 41. Маска за прорачун концентрација метала. лиганда и комплекса 60 Слика 42. Маска за приказ дистрибуционих дијаграма у посматраном систему 61 Слика 43. Раздвајање протеина плазме електрофорезом на pH=8.8 67 Слика 44. NIST Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes Database 73 Слика 45. График функције A=f (CLlCM) 95 Слика 46. График функције log(Ax /(Ao-Ax))=f (CL) 97 Слика 47. Масени спектрометар (основни делови) 98 Слика 48. Шематски приказ извора електроспреј јонзације (ESI) 103 Слика 49. Апаратура за извођење потенциометријских титрација 111 Слика 50. Perkin Elmer Lambda 35 UV-VIS спектрофотометар 112 Слика 51. Оптичка шема апсорпционог спектрофотометра 112 Слика 52. Активирање програма-почетна страница након покретања UV WinLab-а 113 Слика 53. Маска програма за подешавање параметра мерења 113 Слика 54. Маска програма за подешавање почетне и крајње таласне дужине 114 Слика 55. Маска програма за дефинисање броја узорака и назива 114 Слика 56. Маска програма која даје изглед UV VIS спектра (на слици је спектар моксифлоксацина) 115 Слика 57. LC MS Agilent 1100 116 Слика 58. Протоновање анјона офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 117 Слика 59. Апсорпциони спектри офлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на различитим вредностима pH 118 Слика 60. Протоновање анјона моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 119 Слика 61. Апсорпциони спектри моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на различитим вредностима pH 119 Слика 62. Хидролиза Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3LiCl средини на (298.0±0.5)К 120 Слика 63. Комплексирање Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. за концентрационе односе [Al3+]0:[oflo]0=1:1.1:3 и 1:5 као зависност pH од титрационог параметра а 121 Слика 64. Комплексирање Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. за концентрационе односе [Al3+]0:[oflo]0=1:1.1:3 и 1:5 као зависност средњег лигандног броја од негативног логаритма концентрације офлоксацинa 122 Слика 65. Комплексирање Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини. на температури од (298.0±0.5)К. за концентрационе односе [Gd3+]0 :[oflo]0=1:1. 1:2. 1:2.5. 1:3 и 1:5 као зависност pH од титрационог параметра а 123 Слика 66. Комплексирање Gd3+- офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини. на температури од (298.0±0.5)К. за концентрационе односе [Gd3+]0 :[oflo]0=1:1. 1:2. 1:2.5. 1:3 и 1:5 као зависност средњег лигандног броја n од негативног логаритма концентрације офлоксацина 123 Слика 67. Комплексирање Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини. на температури од (298.0±0.5)К. за концентрационе односе [Gd3+]0 :[moxi]0=1:1. 1:2. 1:3 и 1:5 као зависност pH од титрационог параметра а (moxi- моксифлоксацин) 125   II Докторска дисертација Списак слика и шема Слика 68. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi=1:1 ([Gd3+]=0.033 mmol/dm3, [moxi]=0.035 mmol/dm3 ) 126 Слика 69. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi=1:2 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3, [moxi]=0.0349 mmol/dm3 ) 126 Слика 70. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi=1:3 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3, [moxi]=0.0508 mmol/dm3 ) 127 Слика 71. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi=2:1 ([Gd3+]=0.0715 mmol/dm3, [moxi]=0.0349 mmol/dm3 ) 127 Слика 72. ESI MS спектар 0.1×10-3 mol/dm3 Gd3+ јона на pH 6.070 129 Слика 73. ESI MS спектар 0.5×10-3 mol/dm3 офлоксацина на pH 7 130 Слика 74. ESI MS спектар 1×10-4 mol/dm3 Gd3+ јона + 3×10-4 mol/dm3 oflo на pH 5.51 (70V) 130 Слика 75. Дистрибуциони дијаграм офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 143 Слика 76. Дистрибуциони дијаграм моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 144 Слика 77. Дистрибуциони дијаграм хидролитичких комплекса Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 145 Слика 78. Дистрибуциони дијаграми комплекса Gd3+-јона и офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl средини на (298.0±0.5)К при различитим концентрационим односима 147 Слика 79. Могућа структура комплекса [ ] +3)(HofloGd у раствору 148 Слика 80. Могућа структура комплекса [ ] +32)(HofloGd у раствору 148 Слика 81. Могућа структура комплекса [ ] +2Gdoflo у раствору 149 Слика 82. Могућа структура комплекса [ ]+ofloOHGd )( у раствору 149 Слика 83. Могућа структура комплекса [ ]+2)(ofloGd у раствору 150 Слика 84. Могућа структура комплекса [ ]−22 )()( ofloOHGd у раствору 150 Слика 85. Могућа структура комплекса [ ] +2)( ofloHofloGd у раствору 151 Слика 86. Могућа структура комплекса [ ] +33)(HofloGd у раствору 151 Слика 87. Могућа структура комплекса [ ] +22)( ofloHofloGd у раствору 152 Слика 88. Могућа структура комплекса [ ]2)(ofloGdOH у раствору 153 Слика 89. Дистрибуциони дијаграми комплекса Gd3+-јона и моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К за концентрациони однос M:L=1:5 153 Слика 90. Могућа структура [Gd(Hmoxi)3]3+ комплекса у раствору 155 Слика 91. Израчунати спектри Gd-moxi комплекса 155 Слика 92. Доминантни комплекси Al3+ јона у хуманој крвној плазми 160 Слика 93. Расподела комплекса Al(ОH)PO4 у присуству неких флуорохинолона 160 Слика 94. Расподела комплекса Al(ОH)Cit у присуству неких флуорохинолона 161 Слика 95. Расподела комплекса Al(ОH)3 у присуству неких флуорохинолона 161 Слика 96. Расподела комплекса AlPO4 у присуству неких флуорохинолона 161 Слика 97. Расподела комплекса Al3+ у офлоксацину 162   III Докторска дисертација Списак слика и шема   IV Слика 98. Расподела комплекса Al3+ у моксифлоксацину 162 Слика 99. Криве PMI вредности система Al3+-FQ 162 Слика 100. Доминантни комплекси Gd3+ јона у крвној плазми на pH 7.4 при различитим концентрацијама Gd3+-јона 165 Слика 101. Расподела комплекса GdAspCit без и у присуству неких флуорохинолона 167 Слика 102. Расподела комплекса GdH-2Cit без и у присуству неких флуорохинолона 167 Слика 103. Расподела комплекса GdCitLac без и у присуству неких флуорохинолона 167 Слика 104. Расподела комплекса GdH2HisCit без и у присуству неких флуорохинолона 168 Слика 105. Расподела комплекса GdHSA без и у присуству неких флуорохинолона 168 Слика 106. Расподела комплекса GdLeuCit без и у присуству неких флуорохинолона 168 Слика 107. Расподела комплекса GdCit без и у присуству неких флуорохинолона 168 Слика 108. Криве PMI вредности система Gd3+-FQ 169 СПИСАК СЛИКА ПРИЛОГА Број и назив слике Стр. Слика 29П ESI MS спектар 10.0×10-3 mol/dm3 Gd3+, pH 1.530 231 Слика 30П ESI MS спектар 1.0 mmol/dm3 Gd3+, pH 2.450 231 Слика 31П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+, pH 2.781 232 Слика 32П ESI MS спектар 0.1 mmol/dm3 Gd3+, pH 3.447 232 Слика 33П ESI MS спектар 0.1 mmol/dm3 Gd3+, pH 5.497 233 Слика 34П ESI MS спектар 2.5×10-5 mol/dm3 Gd3+, pH 6.043 233 Слика 35П ESI MS спектар 0.1 mmol/dm3 Gd3+, pH 6.414 234 Слика 36П ESI MS спектар 0.025 mmol/dm3 Gd3+, pH 6.654 234 Слика 37П ESI MS спектар 0.025 mmol/dm3 Gd3+, pH 6.995 235 Слика 38П ESI MS спектар 0.025 mmol/dm3 Gd3+, pH 7.551 235 Слика 39П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 1.0 mmol/dm3 oflo, pH 4.552 236 Слика 40П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 0.5 mmol/dm3 oflo, pH 4.662 236 Слика 41П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 1.0 mmol/dm3 oflo, pH 5.911 237 Слика 42П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 2.0 mmol/dm3 oflo, pH 6.440 237 Слика 43П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 1x10-4 mol/dm3 oflo, pH 5.11 (70V) 238 Слика 44П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 3x10-4 mol/dm3 oflo, pH 4.88 (70V) 238 Слика 45П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 3x10-4 mol/dm3 oflo, pH 4.73 (30V) 239 Слика 46П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 3x10-4 mol/dm3 oflo, pH 4.37 (30V) 239 Број и назив шеме Стр. Шема 1. Утицај структуре на дејство хинолона 22 Шема 2. Равнотеже у раствору флуорохинолона 23 Шема 3. Општа шема приказа специјације метала у раствору 51 Шема 4. Шема фрагментације офлоксацина 142 Докторска дисертација Списак табела   I СПИСАК ТАБЕЛА Број и назив табеле Стр. Табела 1. Најзначајнији представници хинолона различитих генерација 18 Табела 2. pK вредности неких хинолона 24 Табела 3. Солубилиозациони потенцијал воде за органске функционалне групе присутне у моно-и полифункционалним молекулима 25 Табела 4. Хидрофилно-липофилне π вредности органских фрагмената 26 Табела 5. Апсорпциони UV максимуми (λmax) и изобестичке тачке (λiso) водених раствора хинолона 27 Табела 6. Траке флуорованих хинолона у IR спектру 29 Табела 7. 1H NMR помераји флуорованих хинолона 30 Табела 8. 13C NMR помераји флуорованих хинолона у DCl 32 Табела 9. Табеларни приказ фрагментације неких молекула флуорохинолона 33 Табела 10. Растворљивост офлоксацина у различитим растварачима на 250°C 36 Табела 11. Експериметални подаци растворљивости (mg/ml) за офлоксацин и односи дозе и растворљивости за таблете офлоксацин различите јачине на 37±0.5°C 36 Табела 12. Максимуми у UV спектру моксифлоксацина у различитим растварачима 42 Табела 13. Растворљивост моксифлоксацина у различитим растварачима 43 Табела 14. Референтне вредности концентрације (mol/dm3) за јоне мале молекулске масе у плазми 69 Табела 15. Укупне концентрације лиганада и металних јона који се користе као компјутерска база података у хуманој крвној плазми (mol/dm3) 70 Табела 16. % дистрибуције металних јона Ca2+, Cu2+, Fe3+, Pb2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ међу лигандима мале молек. масе у хуманој плазми пронађеним компјутерском симулацијом 74 Табела 17. Поређење концентрација метала добијених компјутерском симулацијом са укупном концентрацијом процењеном на основу експерименталних разматрања 75 Табела 18. Концентрације слободних лиганада у плазми добијених симулацијом на вредности pH=7.4 75 Табела 19. Константе стабилности главних Gd3+-комплекса у хуманим интерстицијумским флуидима 81 Табела 20. Најважнија хемијска својства алуминијума 83 Табела 21. Хидролитички комплекси Al3+-јона 84 Табела 22. Константе стабилности Al3+-комплекса са неким органским лигандима на 298.0 К у 0.1 mol/dm3 LiCl средини. L- лиганд (анјон киселине) 86 Табела 23. Нормални нивои концентрација алуминијума у биолошким узорцима 87 Табела 24. Литературни преглед комплексирања Al3+ јона са ципрофлоксацином. еноксацином. ломефлоксацином и енроксацином 89 Табела 25. Литературни преглед комплексирања Al3+ јона са левофлоксацином. офлоксацином. норфлоксацином и спарфлоксацином 90 Табела 26. Преглед потенциометријских титрација протоновања офлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 117 Табела 27. Вредности концентрације офлоксацинa и pH вредности припремљених раствора за спектрофотометријска мерења у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 118 Табела 28. Преглед потенциометријских титрација протоновања анјона моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 119 Докторска дисертација Списак табела   II Табела 29. Преглед потенциометријских титрација хидролизе Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 120 Табела 30. Преглед потенциометријских титрација комплексирања Al3+- офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 121 Табела 31. Преглед потенциометријских титрација комплексирања Gd3+- офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини на (298.0±0.5)К 122 Табела 32. Преглед потенциометријских титрација комплексирања Gd3+- моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 124 Табела 33. Услови снимања ESI MS спектара на LC MS Agilent 1100 128 Табела 34. Услови проучавања хидролизе Gd3+ јона 128 Табела 35. Услови проучавања комплексирања Gd3+ јона и офлоксацина 129 Табела 36. Укупне концентрације лиганада и металних јона за компјутерски модел хумане крвне плазме у HySS 131 Табела 37. Комплекси Al3+ јона унети у базу у HySS 132 Табела 38. Комплекси Gd3+ јона унети у базу у HySS 133 Табела 39. Константе протоновања офлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на основу потенциометријских мерења 135 Табела 40. Константе протоновања моксифлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на основу потенциометријских и спектрофотометријских мерења 136 Табела 41. Константе стабилности хидролитичких комплекса Al3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 136 Табела 42. Константе стабилности хидролитичких комплекса Gd3+-јона у воденим растворима на (298.0±0.5)К у различитим јонским медијумима Ksp=[Gd3+]x[H+]-3 137 Табела 43. Константе стабилности комплекса Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 138 Табела 44. Константе стабилности Al3+-моксифлоксацин комплекса у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 138 Табела 45. Константе стабилности комплекса Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини на (298.0±0.5)К за различите концентрационе односе и када су укључене све титрације у обрачун 139 Табела 46. Константе стабилности Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl јонској средини на (298.0±0.5)К 140 Табела 47. Коначно прихваћен модел комплекса за константе стабилности Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 140 Табела 48. Збирни приказ комплекса и константи стабилности Al3+ и Gd3+ јона са офлоксацином и моксифлоксацином у 0.1 mol/dm3 LiCl и NaCl средини на (298.0±0.5)К 141 Табела 49. Табеларни приказ масених спектара хидролизе Gd3+ јона (c=0.025 mmol) на различитим pH вредностима 141 Табела 50. Табеларни приказ идентификованих врста у ESI-MS спектрима при комплексирању Gd3+ јона и офлоксацина (L-oflo-; LH0-Hoflo; LH2+-H2oflo+) 142 Табела 51. Поређење резултата модела хумане крвне плазме добијеним компјутерском симулацијом у HySS-у и ECCLES-у 156 Табела 52. Поређење резултата слободних концентрација лиганада добијеним компијутерском симулацијом на pH=7.4 у HySS-у и ECCLES-у 158 Табела 53. Поређење резултата укупне концентрације јона метала модела хумане крвне плазме добијеним компјутерском симулацијом у HySS-у и ECCLES-у 159 Докторска дисертација Списак табела   III Табела 54. Доминантни комплекси Al3+ у хуманој крвној плазми израчунати програмом HySS (без присуства трансферина) 160 Табела 55. Поређење дистрибуције алуминијума компјутерског модела хумане крвне плазме добијеним компјутерском симулацијом у HySS-у и ECCLES-у 163 Табела 56. Доминантни комплекси Gd3+ у серуму на pH 7.4 израчунати програмом HySS при минималној концентрацији Gd3+-јона 163 Табела 57. Доминантни комплекси Gd3+ у серуму на pH 7.4 израчунати програмом HySS при различитим концентрацијама Gd3+-јона 164 Табела 58. Дистрибуција комплекса Gd3+ јона (%) 166 Табела 59. Дистрибуција растворних комплекса Gd3+ јона (%) 166 Табела 60. Утицај неких флуорохинолона на доминантне комплексе Gd3+ јона у крвној плазми на pH 7.4 израчунати програмом HySS 167 СПИСАК ТАБЕЛА ПРИЛОГА Број и назив табеле Стр. Табела 1П Потенциометријска титрација 20.0 ml 1.00 mmol/dm3 офлоксацина са 0.093 mmol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 184 Табела 2П Потенциометријска титрација 20.0 ml 2.003 mmol/dm3 офлоксацина са 0.093 mmol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 184 Табела 3П Потенциометријска титрација 20.0 ml 2.000 mmol/dm3 офлоксацина + 3.225 mmol/dm3 HCl са 0.093 mmol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 185 Табела 4П Апсорпциони спектри офлоксацина у UV-VIS области. Coflo=2.50×10-5 mol/dm3 у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на 298 K 186 Табела 5П Потенциометријска титрација 20 ml 0.5 mmol/dm3 моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.1 mol/dm3 NaOH 187 Табела 6П Потенциометријска титрација 20 ml 1 mmol/dm3 моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.1 mol/dm3 NaOH 189 Табела 7П Потенциометријска титрација 20 ml 1.5 mmol/dm3 моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.1 mol/dm3 NaOH 191 Табела 8П Апсорпциони спектри моксифлоксацина у UV-VIS области. Cmoxi=5.35×10-5 mol/dm3 у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на 298 K 194 Табела 9П Потенциометријска титрација 20 ml 0.99 mmol/dm3 Gd3+ са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 195 Табела 10П Потенциометријска титрација 20 ml 2.53 mmol/dm3 Gd3+ са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 196 Табела 11П Потенциометријска титрација 20 ml 4.95 mmol/dm3 Gd3+ са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 197 Табела 12П Потенциометријска титрација 25.0 ml 0.498 mmol/dm3 Al3+-jona + 2.49 mmol/dm3 офлоксацина + 0.047 mmol/dm3 HCl са 0.091 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 197 Табела 13П Потенциометријска титрација 20.0 ml 0.995 mmol/dm3 Al3+-jona + 2.478 mmol/dm3 офлоксацина + 0.093 mmol/dm3 HCl са 0.0907 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 198 Табела 14П Потенциометријска титрација 20.0 ml 1.99 mmol/dm3 Al3+-jona + 2.453 mmol/dm3 офлоксацина + 0.186 mmol/dm3 HCl са 0.0907 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 199 Табела 15П Потенциометријска титрација 20 ml 1.0 mmol/dm3 Gd3+ и 1.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.0982 mol/dm3 NaOH 201 Докторска дисертација Списак табела   IV Табела 16П Потенциометријска титрација 20 ml 1.0 mmol/dm3 Gd3+ и 2.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.0982 mol/dm3 NaOH 203 Табела 17П Потенциометријска титрација 20 ml 1.0 mmol/dm3 Gd3+ и 2.5 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.0982 mol/dm3 NaOH 205 Табела 18П Потенциометријска титрација 20 ml 1.0 mmol/dm3 Gd3+ и 3.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.0982 mol/dm3 NaOH 208 Табела 19П Потенциометријска титрација 20 ml 0.6 mmol/dm3 Gd3+ и 3.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.0982 mol/dm3 NaOH 210 Табела 20П Потенциометријска титрација 20.0 ml 1.07 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 212 Табела 21П Потенциометријска титрација 20.0 ml 1.10 mmol/dm3 Gd3+ + 1.07 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1006 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 214 Табела 22П Потенциометријска титрација 20.0 ml 0.55 mmol/dm3 Gd3+ + 1.07 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1006 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 215 Табела 23П Потенциометријска титрација 20.0 ml 0.80 mmol/dm3 Gd3+ + 2.40 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1006 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 217 Табела 24П Потенциометријска титрација 20.0 ml 0.50 mmol/dm3 Gd3+ + 2.5 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1006 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl 220 Табела 25П UV-VIS спектри раствора Gd(III)-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-моксифлоксацин=1:1 ([Gd3+]=0.033 mmol/dm3 , [moxi]=0.035 mmol/dm3 ) 223 Табела 26П UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-моксифлоксацин=1:2 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3, [moxi]=0.0349 mmol/dm3 ) 225 Табела 27П UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-моксифлоксацин=1:3 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3, [moxi]=0.0508 mmol/dm3 ) 227 Табела 28П UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-моксифлоксацин=2:1 ([Gd3+]=0.0715 mmol/dm3, [moxi]=0.0349 mmol/dm3 ) 229 Докторска дисертација Садржај САДРЖАЈ СПИСАК СЛИКА И ШЕМА СПИСАК ТАБЕЛА ИЗВОД 1 SUMMARY 3 УВОД 5 1. ОПШТИ ДЕО 7 1.1. Формирање комплексних једињења у растворима 7 1.1.1. Протолитичке равнотеже у растворима 7 1.1.2. Равнотеже комплексирања 12 1.2. Опште особине флуорохинолона, флуорохинолони као лиганди 17 1.2.1. Опште о хинолонима 17 1.2.2. Структура и номенклатура хинолона 19 1.2.2.1. Утицај хемијске структуре на дејство хинолона 22 1.2.3. Киселинско-базне особине хинолона 22 1.2.4. Растворљивост 24 1.2.5. Спектроскопске особине хинолона 26 1.2.5.1. UV-VIS спектри 26 1.2.5.2. IR спектри 27 1.2.5.3. NMR спектри 29 1.2.5.4. Масени спектри 32 1.2.6. Офлоксацин као лиганд 34 1.2.7. Моксифлоксацин као лиганд 40 1.3. Компјутерска симулација специјације у раствору 47 1.3.1. Молска фракција (алфа вредности) 47 1.3.1.1. Молска фракција (алфа вредности) слабе киселине, HA 47 1.3.1.2. Молска фракција (алфа вредности) полифункционалних киселина и база 48 1.3.1.3. Фракциона дистрибуција комплексних једињења (алфа једначине) 49 1.3.2. Специјација јона метала 50 1.3.3. Методе за опис специјације у биолошким системима 54 I Докторска дисертација Садржај 1.3.4. Компјутерски програми за симулације специјација у растворима 55 1.3.4.1. HYSS 55 1.3.4.2. ECCLES 62 1.3.4.3. MINTEQA2 63 1.3.4.4. BEST/SPE 63 1.3.4.5. MEDUSA 64 1.3.4.6. MINEQL+ 64 1.3.4.7. JESS 65 1.4. Хумана плазма као средина у којој се формирају комплекси 67 1.4.1. Крвна плазма 67 1.4.2. База података крвне плазме-компјутерски модел крве плазме 69 1.5. Физиолошка специјација јона метала у плазми 71 1.5.1. Модели симулације равнотежа метал-јон у биофлуидима (May- ов компјутерски модел хумане крвне плазме) 71 1.5.2. Плазма мобилизациони индекс (PMI) 78 1.6. Особине Gd3+-јона у воденим растворима 79 1.7. Особине Al3+-јона у воденим растворима 83 1.8. Литературни преглед комплексирања Al3+ и Gd3+-јона са флуорохинолонима и литературни модели специјације Al3+ и Gd3+-јона у хуманој крвној плазми 89 1.8.1. Литературни преглед комплексирања Al3+ и Gd3+-јона са флуорохинолонима 89 1.8.2 Литературни модели специјације Al3+ и Gd3+-јона у хуманој крвној плазми 90 1.9. Методе за одређивање састава и константи стабилности комплекса 91 1. 9.1. Потенциометријске методе 91 1. 9.1.1. Потенциометријско одређивање завршне тачке титрације (ZTT) 92 1. 9.2. Спектрофотометријске методе 94 1.9.3. Масена спектрометрија 97 1.9.3.1. Електроспреј масена спектрометрија (ESI MS) 103 2. ЦИЉ, ЗАДАТАК И МЕТОДЕ 107 2.1. Циљ истраживања 107 2.2. Задатак рада 107 II Докторска дисертација Садржај 2.3. Примењене методе истраживања 107 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 109 3.1. Реагенси и методе анализе 109 3.2. Инструменти и процедура 110 3.2.1. Апаратура за извођење потенциометријских титрација 110 3.2.1.1. Процедура рада на pH–метру 111 3.2.2. UV-VIS спектрофотометар 112 3.2.2.1. Процедура рада на UV-VIS спектрофотометру 112 3.2.3. Масени спектрометар 115 3.2.3.1. Процедура рада на масеном спектрометру 115 3.3. Експериментални резултати 116 3.3.1. Протоновање офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 117 3.3.2. Протоновање моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 118 3.3.3. Хидролиза Al3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 120 3.3.4. Хидролиза Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 120 3.3.5. Комплексирање Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 121 3.3.6. Комплексирање Al3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 122 3.3.7. Комплексирање Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини 122 3.3.8. Комплексирање Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини 124 3.3.9. Масеноспектрометријско проучавање хидролизе Gd3+ јона и комплексирања Gd3+ и офлоксацина 128 3.3.10. Рачунарско моделирање хумане крвне плазме компјутерским програмом HySS 131 4. ОБРАДА РЕЗУЛТАТА МЕРЕЊА 135 4.1. Константе протоновања офлоксацин анјона 135 4.2. Константе протоновања моксифлоксацин анјона 135 4.3. Хидролитички комплекси Al3+-јона 136 4.4. Хидролитички комплекси Gd3+-јона 136 4.5. Комплекси Al3+-офлоксацин система 137 4.6. Комплекси Al3+-моксифлоксацин система 138 III Докторска дисертација Садржај IV 4.7. Комплекси Gd3+-офлоксацин система 138 4.8. Комплекси Gd3+-моксифлоксацин система 139 4.9. ESI MS спектри хидролизе Gd3+ јона и комплекси Gd3+ и офлоксацина 141 5. ДИСКУСИЈА РЕЗУЛТАТА 143 5.1. Протоновање офлоксацин анјона 143 5.2. Протоновање моксифлоксацин анјона 144 5.3. Хидролиза Gd3+-јона 145 5.4. Комплекси Gd3+-офлоксацин система 146 5.5. Комплекси Gd3+-моксифлоксацин система 153 5.6. Физиолошки модел хумане крвне плазме у компјутерском програму HySS 156 5.7. Биодистрибуција Al3+ јона у физиолошким условима 159 5.8. Биодистрибуција Gd3+ јона у физиолошким условима 163 6. ЗАКЉУЧАК 171 ЛИТЕРАТУРА 175 ПРИЛОГ 183 Потенциометријске титрације протоновања анјона офлоксацина 184 Апсорпциони спектри протоновања анјона офлоксацина 186 Потенциометријске титрације протоновања анјона моксифлоксацина 187 Апсорпциони спектри протоновања анјона моксифлоксацина 194 Потенциометријске титрације хидролизе Gd3+-јона 195 Потенциометријске титрације комплексирања система Al3+-офлоксацин 197 Потенциометријске титрације комплексирања система Gd3+-офлоксацин 201 Потенциометријске титрације комплексирања система Gd3+-моксифлоксацин 212 Апсорпциони спектри комплексирања система Gd3+-моксифлоксацин 223 Масени спектри хидролизе Gd3+ јона 231 Масени спектри комплексирања Gd3+ јона и офлоксацина 236 БИОГРАФИЈА 241 РАДОВИ ПРОИСТЕКЛИ ИЗ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ 243 Докторска дисертација Извод И З В О Д Предмет ове дисертације је карактеризација прототропних и равнотежа комплексирања јона Al3+ и Gd3+ и офлоксацина и Gd3+ и моксифлоксацина. Проучавања су вршена потенциометријским и спектрофотометријским методама у 0,1 mol/dm3 LiCl и NaCl средини, на (298.0±0.5)К. Проучавање хидролизе Gd3+ јона и комплексирања Gd3+ и офлоксацина, вршено је и ESI MS методом. Биодистрибуција Gd3+ и Al3+ јона у физиолошким условима, проучавана је компјутерском симулацијом, програмом HySS. Проучавањем ових система, наведеним експерименталним техникама и компјутерском симулацијом, добијени су следећи резултати: - Офлоксацин се може протоновати на две функционалне групе (на карбоксилној и терцијарној амино групи у пиперизинском супституенту) и има две константе протоновања logβq,r (q-протон, r-лиганд): Hoflo, logβ1,1=8.212±0.003; H2oflo+, logβ2,1=14.240±0.006; - Моксифлоксацин се може протоновати на две функционалне групе (на карбоксилној групи и на азоту са C7 супституента) и има две константе протоновања logβq,r (q- протон, r-лиганд): Hmoxi, logβ1,1=9.0±0,020; H2moxi+, logβ2,1=15.57±0.050. - Састав и константе стабилности хидролитичких комплекса који се формирају хидролизом Al3+-јона, узети су из литературних извора. - Потенциометријском методом и ESI MS методом, потврђено је постојање хиролитичких комплекса logβp,q (p-метал, q-H): GdOH2+ (-logβ1,-1=7,96±0,01); Gd(OH)3 (logKsp1,-3=17,90±0,1). - Реакције комплексирања Al3+-јона и офлоксацина указују на формирање протонованих, обичних, мешовито хидролитичких и полинуклеарно-мешовито хидролитичких комплекса са следећим константама стабилности logβp,q,r (p-метал, q-протон, r-лиганд): [Al(Hoflo)]3+ (logβ1,1,1=15.93±0.03); [Al(oflo)2]+ (logβ1,0,2=14.84±0.07); [Aloflo]2+ (logβ1,0,1=10.20±0.04); [Al(OH)oflo]+ (logβ1,-1,1=4.21± 0.05); [Al2(OH)2oflo]3+ (logβ2,-2,1=6.4±0.10). - Комплексирање у систему Gd3+-офлоксацин указује да се формирају протоновани, обични, мешовито хидролитички и полинуклеарно-мешовито хидролитички комплекси са следећим константама стабилности logβp,q,r (p-метал, q-протон, r- лиганд): [GdHoflo]3+ (logβ1,1,1=13.31±0.02); [Gdoflo]2+ (logβ1,0,1=6.00±0.02); [Gd(OH)oflo]+ (logβ1,-1,1=-1.01±0.03); [Gd(Hoflo)2]3+ (logβ1,2,2=26.04±0.02); [Gd(Hoflo)oflo]2+ (logβ1,1,2=18.14±0.02); [Gd(oflo)2]+ (logβ1,0,2=11.00±0.09); Gd(OH)(oflo)2 (logβ1,-1,2=3.34±0.04); Gd(OH)2(oflo)2 (logβ1,-2,2=-6.46±0.08); [Gd(Hoflo)3]3+ (logβ1,3,3=37.65±0.06); [Gd(Hoflo)2oflo]2+ (logβ1,2,3=30.71±0.06). - Комплексирање у систему Gd3+-моксифлоксацин указује на формирање комплекса са следећим константама стабилности logβp,q,r (p-метал, q-протон, r-лиганд): [GdHmoxi]3+ (logβ1,1,1=14.78±0.03); [Gd(Hmoxi)2]3+ (logβ1,2,2=29.75±0.02); [Gd(Hmoxi)3]3+ (logβ1,3,3=43.98±0.03); [Gd(Hmoxi)2moxi]2+ (logβ1,2,3=35.08±0.01); [Gd(Hmoxi)moxi2]+ (logβ1,1,3=27.56±0.03); Gd(moxi)3 (logβ1,0,3=19.20±0.05). - Компјутерским програмом HySS проучаван је модел хумане крвне плазме. Модел је укључио 8 јона метала (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+) и 43 лиганада (26 аминокиселина, 7 неорганских лиганада, 8 карбоксилних киселина и 2 протеина) са укупно 5941 комплекса. Константе стабилности комплекса узете су из JESS-ове, NIST-ове и IUPAC-ове базе константи стабилности, а у случају да се одговарајуће вредности нису могле наћи у базама, коришћени су литературни извори. За добијање поузданих резултата узете су вредности константи стабилности блиске физиолошким условима (Т=310К и I=0.15 mol/dm3 NaCl). Пошто те вредности нису 1 Докторска дисертација Извод 2 увек биле расположиве на основу термодинамичких података (ΔH и ΔS) и применом SIТ и LFER теорије извршена је корекција константи стабилности на физиолошке услове. - Al3+ јон је 81-89% везан у нормалном серуму за протеин трансферин. Преостали део од 11-19% стоји на располагању за формирање комплекса са осталим лигандима плазме. Проучавањем биодистрибуције Al3+-јона компјутерском симулацијом, установљено је да су у хуманој крвној плазми доминантни комплекси [Al(PO4)(OH)]- (проценат дистрибуције око 90%) и [AlCit(OH)]- (проценат дистрибуције од 6-13% у зависности од pH), док су комплекси Al(OH)3, Al(PO4), [Al(OH)4]- и [AlCit2(OH)2]5- испод 2%. Најдоминантнији комплекс [Al(PO4)(OH)]- приказује приближно идентичну концентрацију у присуству флуорохинолона ципрофлоксацина, флероксацина, ломефлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина и спарфлоксацина, док у исто време показује мању концентрацију у присуству моксифлоксацина него у присуству офлоксацина. Комплекс [AlCit(OH)]- има мању концентрацију у хуманој крвној плазми (ниже од 10%) у односу на фосфатни комплекс, па и у присуству неких флуорохинолона. Уопштено се може закључити да је у присуству офлоксацина већа концентрација доминантних комплекса него у присуству моксифлоксацина, што значи да моксифлоксацин испољава већи утицај на биодистрибуцију Al3+ јона него офлоксацин. Резултати доминантних комплекса Al3+ јона у хуманој крвној плазми (не узимајући у обзир везивање за трансферин), указују на релативно добро слагање резултата са литературним моделима, по врсти доминантних комплекса и проценту њихове расподеле. - Проучавањем биодистрибуције Gd3+-јона компјутерском симулацијом, установљено је да су доминантне нерастворне врсте. Међу њима, првенствено се формира GdPO4(s) због своје велике стабилности, док се комплекс Gd2(CO3)3(s) појављује даљим повећањем концентрације Gd3+-јона. Међу растворним врстама Gd3+-јона, доминантни комплекси су [GdHSA]16-, [GdOxa]+ и тернерни комплекси са цитратима као примарним лигандима. При ниским концентрацијама Gd3+-јона (10-9 mol/dm3) доминирају растворне врсте, док повећањем концентрације (10-8 mol/dm3 и вишим) долази до формирања доминантних нерастворних (таложних) комплекса. - Моксифлоксацин као биолиганд у хуманој крвној плазми значајније мобилише јоне Al3+ и Gd3+ од офлоксацина. Докторска дисертација Summary SUMMARY (Abstract) The subject of this dissertation is characterization of the prototropic and complexation equilibria in solutions of Al3+ and Gd3+ and ofloxacin and Gd3+ ion and moxifloxacin. Investigations were performed using potentiometric and spectrophotometric methods in 0,1 mol/dm3 LiCl and NaCl ionic medium, at (298.0±0.5)К. The hydrolysis of Gd3+ ions and complexation of Gd3+ and ofloxacin were studied using ESI MS method also. Bio-distribution of Gd3+ and Al3+ ions under physiological conditions, were investigated by computer simulations, using HySS software. Investigation of these systems using the above mentioned experimental techniques and computer simulation, gave the following results: - Ofloxacin can be protonated on two functional groups (on carboxylate and tertiary amino group at pipearizine substituent), with two protonation constants logβq,r (q-proton, r- ligand): Hoflo, logβ1,1=8.212±0.003; H2oflo+, logβ2,1=14.240±0.006 respectively; - Moxifloxacin can be protonated on two functional groups (on carboxylate gruop and on nitrogen at C7 substituent), with two protonation constants logβq,r (q-proton, r-ligand): Hmoxi, logβ1,1=9.30±0.020; H2moxi+, logβ2,1=15.57±0.050 respectively; - Composition and stability constants of hydrolytic complexes formed by hydrolysis of Al3+ ions have been taken from literature sources. - Potentiometric and ESI MS methods, confirmed the existence of hydrolytic complexes logβp,q (p-metal, q-H): GdOH2+ (-logβ1,-1=7.96±0.01); Gd(OH)3 (logKsp1,-3=17.90±0.1). - Reactions of Al3+ ions and ofloxacin complexation indicate formation of protonated, simple, mixed hydrolytic and polinucler-mixed hydrolytic complexes with the following stability constants logβp,q,r (p-metal, q-proton, q-ligands): [Al(Hoflo)]3+ (logβ1,1,1=15.93±0.03); [Al(oflo)2]+ (logβ1,0,2=14.84±0.07); [Aloflo]2+ (logβ1,0,1=10.20±0.04); [Al(OH)oflo]+ (logβ1,-1,1=4.21± 0.05); [Al2(OH)2oflo]3+ (logβ2,- 2,1=6.4±0.10). - Complexation in the system of Gd3+-ofloxacin indicates formation of protonated, simple, mixed hydrolytic and polinucler-mixed hydrolytic complexes with the following stability constants logβp,q,r (p-metal, q-proton, q-ligands): [GdHoflo]3+ (logβ1,1,1=13.31±0.02); [Gdoflo]2+ (logβ1,0,1=6.00±0.02); [Gd(OH)oflo]+ (logβ1,-1,1=-1.01±0.,03); [Gd(Hoflo)2]3+ (logβ1,2,2=26.04±0.02); [Gd(Hoflo)oflo]2+ (logβ1,1,2=18.14±0.02); [Gd(oflo)2]+ (logβ1,0,2=11.00±0.09); Gd(OH)(oflo)2 (logβ1,-1,2=3.34±0.04); Gd(OH)2(oflo)2 (logβ1,-2,2=- 6.46±0.08); [Gd(Hoflo)3]3+ (logβ1,3,3=37.65±0.06); [Gd(Hoflo)2oflo]2+ (logβ1,2,3=30.71±0.06). - Complexation in the system Gd3+-moxifloxacin indicates formation of the complexes with the following stability constants logβp,q,r (p-metal, q-proton, q-ligands): [GdHmoxi]3+ (logβ1,1,1=14.78±0.03); [Gd(Hmoxi)2]3+ (logβ1,2,2=29.75±0.02); [Gd(Hmoxi)3]3+ (logβ1,3,3=43.98±0.03); [Gd(Hmoxi)2moxi]2+ (logβ1,2,3=35.08±0.01); [Gd(Hmoxi)moxi2]+ (logβ1,1,3=27.56±0.03); Gd(moxi)3 (logβ1,0,3=19.20±0.05). - Using HySS software the model of human blood plasma was investigated. The model have included 8 metal ions (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+) and 43 ligands (26 amino acids, 7 inorganic ligands, 8 carboxyl acids and 2 proteins) with total number of 5941 complexes. Stability constants of complexes have been taken from JESS, NIST and IUPAC database of stability constants, but in the case of some data missing in databases, literature sources have been used. To obtain reliable results, values of the stability constants under physiological conditions have been used (Т=310К and I=0.15 mol/dm3 NaCl). In case that some values not being available, on the basis of thermodynamic data 3 Докторска дисертација Summary 4 (ΔH and ΔS) and using SIТ and LFER theory, correction of the stability constants on the physiological conditions was performed. - Al3+-ion is 81-89% bounded in normal plasma for protein transferin. The remaining part 11-19% is available for forming the complexes with other plasma ligands. By investigating bio-distribution of Al3+ ions, using computer simulation it was found that in the human blood plasma the most dominant complexes are [Al(PO4)(OH)]- (percentage of distribution around 90%) and [AlCit(OH)]- (percentage of distribution 6-13% depending of pH value), while complexes Al(OH)3, Al(PO4), [Al(OH)4]- and [AlCit2(OH)2]5- are below 2%. The most dominant complex [Al(PO4)(OH)]- presents similar concentration in presence of fluoroquinolones ciprofloxacin, fleroxacin, lomefloxacin, norfloxacin, ofloxacin and sparfloxacin, while at the same time it shows less concentration in presence of moxifloxacin than ofloxacin. Complex [AlCit(OH)]- has less concentration in human blood plasma (lower than 10%) then phosphate complex, even in the presence of some fluoroquinolones. Generally, it can be concluded that in the presence of ofloxacin percentage of the most dominant complexes Al3+-ion is higher than in the presence of moxifloxacin, indicating that moxifloxacin shows higher influence on Al3+ biodistribution than ofloxacin. Results of the most dominant complexes of aluminum in human blood plasma without presence of transferrin, indicate the relatively good agreement of results with literature models, by the composition of the most dominant complexes and percentage of their distribution. - Investigation of Gd3+-ions bio-distribution by computer simulation shows the presence of the solid species as dominant. Among them, the firstly formed is GdPO4(s) due to greater stability, while complex Gd2(CO3)3(s) appears afterwards. Among soluble species of the Gd3+ ions, dominant species are complexes [GdHSA]16-, [GdOxa]+ and ternary complexes with citrate as primary ligands. At the low Gd3+-ions concentrations (10-9 mol/dm3) soluble species are dominant, while increasing concentration (10-8 mol/dm3 and further increasing) causes the formation of nonsoluble dominant complexes (precipitates). - As a bioligand moxifloxacin in the human blood plasma shows more significant mobilization potential then ofloxacin for Al3+ and Gd3+ ions. Докторска дисертација Увод УВОД У мноштву разноврсних биолошких процеса, метални јони имају важну улогу. Сви метални јони који су присутни у организму човека (заједно са неметалима) могу се посматрати као главни елементи и елементи у траговима. Главни елементи су седам есенцијалних елемената: калцијум, магнезијум, натријум, калијум, фосфор, сумпор и хлор. Елементи у траговима се могу разматрати као: есенцијални (гвожђе, јод, бакар, цинк, манган, кобалт, молибден, селен, хром и флуор), вероватно есенцијални (никал, калај, ванадијум и силицијум), неесенцијални (алуминијум, бор, германијум, кадмијум, арсен, олово и жива) и егзогено унети (гадолинијум, ...). Минерални елементи су у људском организму заступљени у тачно одређеним количинама и односима, а њихово дејство у ћелијама, поред присутне количине, зависи и од међусобне равнотеже.1-4 Алуминијум(III) (у даљем тексту Al3+) је један од најраспрострањенијих елемената у земљиној кори са широким спектром примене. Међутим без обзира на то, до сада није потпуно позната његова физиолошка улога у људском и анималном организму. За људски организам јон Al3+ је токсичан, било да учествује у патогенези неких болести или да испољава директну дозно-зависну токсичност. Al3+-јон је веома токсичан за сва ткива у организму, а посебно за мождано. Токсичност Al3+-јона је обично умањена због сиромашне интестиналне апсорпције и ефикасне реналне екскреције. Повећана концентрација Al3+-јона у мозгу сматра се ризичним фактором настанка Alchajmer-ове болести која у мозгу оболелих узрокује абнормални облик протеина, плакова и фибрила (нарочито делова мозга задужених за памћење). Међутим, у неким случајевима као што је дијализа, количине Al3+-јона у храни, лековима и води могу представљати извор озбиљне опасности. Постојање знања о токсичности Al3+-јона је условило да се појача интересовање о његовом понашању у хуманом крвном серуму. Као мали тровалентни катјон, Al3+ се класификује као тврда Lewis-ова киселина која показује афинитет за везивање са тврдим базама (хидроксиди, флуориди, ...). У нормалном хуманом крвном серуму као основни лиганди за везивање са Al3+-јоном појављају се хидроксиди, фосфати, трансферин и цитрати. Због лабилности тако насталих комплекса и њиховог присуства у веома малим концентрацијама, њихове дистрибуције се не могу експериментално одредити, али коришћењем компјутерских модела ове дистрибуције се могу израчунати.5 Хелати гадолинијум(III)-јона (у даљем тексту Gd3+) су један од најчешћих контрастних агенаса магнетне резонанце (MRI), компјутерске томографије (CT) и магнетне резонантне ангиографије (MRA) због одличних магнетних својстава гадолинијума. Магнетна резонанца је моћна метода клиничке дијагностике која омогућава дијагностификовање болести на основу разлике у протонским NMR резонанцама нормалног и абнормалног ткива у присуству парамагнетичких тзв. контраст агенаса. Gd3+ је погодан за примену у NMR спектроскопији због великог броја неспарених електрона који креирају дугачка електрон-спин релаксациона времена. Док је сам Gd3+ веома токсичан, Gd3+ хелатни контрастни агенси садрже елеменат у високо стабилним комплексима са линеарним макроцикличним полиаминокарбоксилним киселинама као лигандима. Уопштено, ови комплекси показују добру толеранцију код људи и поседују кратко време елиминације. Клиничку примену као контрастни агенси у NMR спектроскопији налазе неколико комплекса Gd3+ јонског и неутралног карактера (Omniscan-GE Healtcare, Magnevist-Bayer Healhcare, OptiMARK-Mallinckrodt, ProHance- Bracco, MultiHance-Bracco, ...). Они су екстрацелуларни и имају способност брзог дифундовања у интерстицијалне просторе.6,7 Интересантну групу биолиганада чине флуоровани хинолони, који у својој структури садрже карбонилну и карбоксилну групу у вициналном положају. Стога су ове супстанце потенцијално добри хелатори јона метала. Флуоровани хинолони су 5 Докторска дисертација Увод 6 антибактеријска средства која се користе код уринарних и бубрежних инфекција, а новије генерације и код респираторних инфекција. Хинолони су синтетички антибиотици који садрже више стотина активних једињења од којих је више десетина регистровано као фармацеутски препарати. Велику пажњу међу њима, привлаче офлоксацин и моксифлоксацин, хинолонски антибиотици треће и четврте генерације који показују значајну активност према анаеробним бактеријама.8-11 Скорашња истраживања указују на важну улогу јона метала у механизму деловања ових антибиотика, првенствено у смислу смањења њихове активности у присуству јона метала због формирања делимично растворних комплекса или значајног утицаја у механизму њиховог деловања (нарочито магнезијума). Јони метала могу утицати на биорасположивост хинолона променом њихове растворљивости и липофилности, а настали комплекси могу поседовати нове биолошке карактеристике у смислу измене минималних инхибиторних концентрација и антибактеријског спектра дејства. Интеракција контрасних хелата и флуорохинолона је могућа код пацијената који су на антибактеријској терапији, при чему хинолонски хелати Gd3+-јона могу бити кандидати за контрасне агенсе. Циљ истраживања докторске дисертације је проучавање специјације Al3+ и Gd3+ јона под утицајем флуорохинолона офлоксацина и моксифлоксацина у хуманој крвној плазми. Добијени резултати могу бити значајни не само за боље познавање хемијских особина комплекса који се граде између лиганада типа флуорованих хинолона и наведених металних јона, већ и за боље познавање токсичних ефеката Al3+ и Gd3+ јона у терапеутској примени. Специјација и биодистрибуција Al3+ и Gd3+ јона у хуманој плазми, како указују литературни подаци изучавана је углавном у присуству лиганада који су нормално присутни у плазми при физиолошким условима. Литературни преглед података који се односе на област докторске дисертације указује на потребу за проучавањем специјације Al3+ и Gd3+ у биофлуидима, због веома малог броја литературно приступачних података. Флуоровани хинолони могу градити различита комплексана једињења са Al3+ и Gd3+ јонима, при чему до изражаја долазе два ефекта. При паралелној терапији, метаболизам ових јона може се променити у смислу њиховог транспорта у циркулацију или у другом случају флуоровани хинолони могу мобилисати наведене јоне из ткивних депоа при чему зависно од наелектрисања комплекса може доћи до њиховог транспорта у циркулацију или елиминације. Утицај терапеутски унетих лиганада на специјацију проучаван је у малом броју случајева углавном са лигандима тетрациклинског типа тако да се истраживања која су предмет ове докторске дисертације надовезују на резултате добијене приликом проучавања утицај тетрациклина на специјацију Al3+ и Gd3+ јона у хуманој крвној плазми. Специјациони модели развијени из оваквих проучавања, требали би пружити допринос у фармакокинетичким студијама хинолона у присуству Gd3+ контрастних агенаса и проучавању токсичних ефеката при паралелној примени хелата Gd3+-јона и флуорохинолона. У циљу провере предвиђених хипотеза, примењене су методе потенцијометријских мерења комплексирања у воденим растворима, UV-VIS спектрофотометријска мерења комплексирања, масеноспектрометријска мерења хидролизе и комплексирања и компијутерске симулације применом компјутерског програма HySS. Докторска дисертација Општи део   7 1. ОПШТИ ДЕО 1.1. Формирање комплексних једињења у растворима 1.1.1. Протолитичке равнотеже у растворима Протолитичке реакције су хемијске реакције које у растворима доводе до преноса протона између учесника у реакцији, при чему протон са једне хемијске јединке прелази на другу. Хемијске јединке које могу да размењују протоне зову се протолити. Све протолитичке реакције могу се поделити на реакције дисоцијације, неутрализације и хидролизе.11 Један пар честица је протон-донор и представља пар коњугована киселина- коњугована база. Други пар честица је такође коњуговани киселинско-базни пар и представља акцептор протона. У општем случају, реакције протолизе могу се представити у следећем облику: −+ ++ 1221 B BHBHB ' (1) B1H-B1- представља коњугован пар киселина-база који је донор протона а B2- B2H+ коњуговани пар база-катјонска киселина који је акцептор протона. Спонтано одигравање реакције (1) одређује промена Gibbs-ове енергије ове реакције у условима притиска и температуре различитим од стандардних. Да би се израчунала промена Gibbs-ове енергије реакције (1) потребно је дефинисати релативну јачину киселинско- базног пара, будући да од односа ових величина зависи померање горње равнотеже у леву или у десну страну. Апсолутна јачина киселине одређена је константом равнотеже реакције: BH +− + HB (2) In vaccuo )( )()( BHa BaHaK a −+ ×= (3) Величина представља термодинамичку константу дисоцијације киселине BH и мерило је апсолутне јачине ове киселине. Међутим, константа не може се експериментално одредити нити теоријски израчунати, јер апсолутне активности честица aK aK +H , −B и BH не могу да се одреде. У циљу поређења релативне јачине киселина можемо посматрати одвијање реакције дисоцијације у хомогеној средини која се карактерише релативном диалектричном пропустљивошћу већом од оне у вакууму и за коју се претпоставља да се уношењем честица +H , −B и BH не мења. Конвенционално се као таква средина узима вода, па се релативне јачине киселина и база израчунавају у односу на киселинско-базни пар OHOH 23 + .12-14 Реакцију дисоцијације киселине BH у води можемо представити једначином: −+ ++ BOHHBH 32 ' (4) Константа равнотеже ове реакције представљена је једначином: Докторска дисертација Општи део   8 )()( )()( 2 3 . OHaBHa BaOHaK da × ×= −+ (5) Ако десну страну једначине (5) помножимо и поделимо величином , добијамо једначину: )( +Ha )( 3, +×= OHKKK dada , (6) при чему је , константа равнотеже реакције дисоцијације хидронијум јона у води: )( 3 +OHKd OHHOH 23 +++ ' . (7) Из једначине (6) види се да је константа пропорционална константи , тј. да представља мерило јачине киселине под претпоставком да је константа на свим температурним вредностима. Стога се конвенционално узима да је: daK , aK )( 3 +OHKd 1)( 3 =+OHK d , (8) на стандардном притиску ( pØ=101,325 kPa) и свим температурама. Из једначина (6) и (8) следи да је: ada KK =, , (9) па је према томе релативна константа дисоцијације мера јачине киселинско базног пара у односу на киселинско базни пар daK , −BBH / OHOH 23 + . Величину је тешко експериментално одредити будући да апсолутне вредности активности појединих честица не могу да се мере. Стога се у једначини (6) користе релативне активности, тако да она постаје: daK , )( )()( 3 , BHa BaOHaK r rr da −+ ×= , (10) где је: )( )()( Xa XaXar Θ= . (11) Стандардна активност ) , дефинисана је једначином: (XaΘ )()()( XmXXa ΘΘΘ ×= γ . (12) Конвенционално се узима да је: Докторска дисертација Општи део   9 1)( 3 =+Θ OHa . (13) Како се стандардна активност воде не мења много приликом промене температуре и концентрације раствора, може се узети за довољно разблажене растворе да је стандардна активност воде једнака јединици. Однос )( )( BHa Ba Θ −Θ за разблажене растворе, по дефиницији тежи јединици, па је константа дисоцијације киселине: )( )()( 3 BHa BaOHaK a −+ ×= . (14) Узимајући у обзир дефиницију активности, )()()( XmXXa ×= γ , (15) једначина (14) се може написати на следећи начин: BH BOH BH BOH a m mm K −+−+ ×××= 33 γ γγ . (16) Како је BH неутрална честица, из Debye-Huckel-ове теорије следи да је BHγ приближно једнако јединици, а производ −+ × BOH γγ 3 једнак , тако да једначина (16) прелази у: 2 ±γ maa KK , 2 ×= ±γ , (17) где је концентрациона константа равнотеже, и дата је изразом: maK , )( )()( 3 , BHm BmOHmK ma −+ ×= . (18) Уколико је позната зависност средњег јонског коефицијента активности киселине од јонске јачине раствора, мерењем концентрационе константе дисоцијације киселине може се одредити термодинамичка константа дисоцијације .12,15 2 ±γ aK У случају полипротичне слабе киселине , дисоцијација се одиграва у више степена и може се представити поједностављеном шемом: BH n + − +→ HBHBH nn 1 1k + − +→ HBHBH nn 22 2k . . (19) . ++→ nHBBH n . nk Докторска дисертација Општи део   10 Величине , ... су кумулативне константе дисоцијације. Наелектрисања честица су изостављена ради једноставности.14 1k 2k nk Осим кумулативних, дефинишу се и сукцесивне константе дисоцијације према следећој шеми: + − +→ HBHBH nn 1 1K + −− +→ HBHBH nn 21 2K . . (20) ++→ HBHB . nK Кумулативне и сукцесивне константе дисоцијације повезане су релацијом: 11 Kk = 212 KKk ×= . . nn KKKk ×××= ...21 . (21) Парцијалне моларне фракције појединих честица у раствору дефинишу се релацијом: [ ] [ ] [ ] ).,...,0(, 0 ni C BH BH BH f BH in n i in in in n === − = − − − ∑ (22) У складу са законом о балансу маса добија се: [ ] [ ] [ iniin HBHkBH −− ×= ] . (23) Заменом једначине (23) у једначину (22) добија се: [ ] [ ] [ ]∑ = − − − ×+ ×= n i i i i ni in Hk HBHk f 1 1 . (24) Општа једначина дисоцијације полипротичне слабе киселине може се написати у облику: ∑ = −− − +×−→ n i ininn BHfHnnBH 0 )()( . (25) Једначина (25) је изведена под претпоставком да је концентрација различитих јонских форми сразмерна њиховим парцијалним молским уделима. Величина је Bjerrum-ова функција формирања која се дефинише једначином: − n Докторска дисертација Општи део   11 [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]∑ − = −−− −−− − − ×++×+×+ ×++×+×=×−= in i n n n n in HkHkHk HnkHkHk finn 0 2 2 1 1 2 2 1 1 ...1 ...2 )( . (26) Спонтано одигравање реакције дисоцијације, одређено је променом Gibbs-ове енергије реакције. Када су услови одигравања дисоцијације различити од стандардних, спонтаност тока дисоцијације одређује Gibbs-ова реакциона изотерма. За реакцију (19) Gibbs-ова реакциона изотерма износи: [ ] [ ] [ ] ⎟⎟ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎜⎜ ⎝ ⎛ × ××+Δ=Δ ∏ = − − Θ − 0 0ln BH HBH TRGG n n i nn in , (27) где је [ општа концентрација киселине ] ] ] 0BH n [ ] [∑ = −= n i inn BHBH 0 0 . (28) Концентрације различитих јонизованих облика слабе киселине могу се изразити преко парцијалних молских удела: [ ] [ 01 BHfBH ninn ×= −− . (29) Узимајући у обзир једначине (28) и (29), добија се израз за Gibbs-ову реакциону изотерму: [ ] ⎟⎟ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎜⎜ ⎝ ⎛ × ××−=Δ ∏ ∏ = − −− = − − − n i f in nn in i f i in in f Hk TRG 0 0ln . (30) Математичком трансформацијом ове једначине долази се до коначног израза за Gibbs-ову енергију: [ ] ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ ×+××−=Δ ∑ = −n i i i HkTRG 1 1ln . (31) Ако кумулативне константе изразимо преко сукцесивних, добија се следећи израз: [ ] [ ] [ ] [ ] ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ ×××++×++××−⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ ×××××=Δ n n n n KKK H KK H K HTR KKK HTRG ... ...1ln ... ln 2121 2 121 . (32) Докторска дисертација Општи део   12 Као што се види, на датој температури и притиску, промену Gibbs-ове енергије реакције дисоцијације одређује pH средине и сукцесивне константе дисоцијације слабе киселине. У случају једнобазне киселине једначина (32) прелази у једначину: [ ] [ ] ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ +××−⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛××=Δ 11 1lnln K HTR K HTRG . (33) У јако киселим срединама када је [ ] 1K H »1, тако да једначина (33) даје , што значи да је дисоцијација потпуно сузбијена.12 0=ΔG 1.1.2. Равнотеже комплексирања Метални комплекс (координационо једињење), настаје реакцијом металног јона са молекулима или јонима који на неком од својих атома садрже слободан електронски пар. Метални јон у комплексу назива се централним јоном, а молекули или јони који се вежу са металним јоном у комплекс називају се лигандима (од латинске речи ligare- везати). Везивањем металног јона и лиганда у комплекс, настаје поларна ковалентна веза у којој оба електрона даје лиганд, док их метални јон прима. Тако је лиганд донор електронског пара (Lewis-ова база), а централни метални јон акцептор електронског пара (Lewis-ова киселина). Оваква врсте везе се често назива и координативно ковалентном везом. Реакција између металног јона М и лиганда L може се приказати једначином: LMLM :: ' + (34) Пошто у растворима постоје само хидратисани метални јони, реакција грађења комплекса, представља заправо замену молекула растварача из солватисаног омотача металног јона другим молекулима или јонима (лигандима): OHOHMLLOHM nn 2122 )()( ++ −' (35) Преостале аква-групе могу се сукцесивно заменити другим лигандима све док не настане комплекс MLn. Уз предпоставку да лиганд гради само једну везу, тј. заузима само једно координационо место, број n представља максималан број лиганада везаних за метални јон и назива се координациони број (КБ) металног јона. Он зависи од особина металног јона и лиганда и најчешће износи 6 или 4, ређе 2 или 8, а врло ретко 3, 5, 7 или други. Комплекс MLn назива се мононуклеарним комплексом јер садржи само један метални јон, а комплекси у којима је више од једног металног јона, полинуклеарни комплекси (MmLn). Комплекси у којима је укључено више врста лиганада или металних јона називају се мешовити комплекси. Неки једноставни лиганди (амонијак, халогениди, цијанид, тиоцијанат ...) везују се на једно координационо место и зато се називају монодендатни, док лиганди који садрже две или више везујућих електрон-донорских атома могу деловати као два или више монодендатних лиганада па се називају би (три) (тетра) ... дентатним или уопштено полидентатним лигандима. Кад се њиховим везивањем формирају комплекси прстенасте структуре настају хелатни комплекси који се карактеришу великом Докторска дисертација Општи део   13 стабилношћу и тиме да се приликом везивања полидентатних лиганада за металне јоне, број везаних лиганада смањује, повећањем полидендатног карактера лиганда.13 Реакције комплексирања обухватају измену молекула воде координованих за централни метални јон M и лиганда L. У случају формирања комплекса који у молекулу садрже један метал говоримо о мононуклеарним комплексима, а уколико молекул комплекса садржи више атома метала, о полинуклеарним комплексима. Термодинамички опис поступног формирања комплекса може се сматрати комплетним уколико је познат следећи скуп података: MLLM →+ 01β 01HΔ 22 MLLM →+ 02β 02HΔ . (36) . nMLnLM →+ 0nβ 0nHΔ где су кумулативне термодинамичке константе стабилности, а је промена стандардне енталпије i-те реакције обрачунато по mol-у метала. 0 iβ 0iHΔ Спонтаност одигравања реакције комплексирања одређује промена Gibbs-ове енергије скупа реакција (36). Тај скуп реакција поједностављено се може написати у следећем облику: nMLMLMLLM +++→+ ...2 . (37) Ако се комплекси MLi формирају у концентрацијама које су сразмерне њиховим парцијалним молским уделима, онда реакцију комплексирања можемо написати у облику: nnMLfMLfMLfMfLM ++++→+ ...2210 , (38) где је парцијални молски удео појединих комплекса дат изразом: [ ] [ ] [ ]∑ = == n i i n n i i ML ML C ML f 0 . (39) Узимајући у обзир да је: [ ] [ ] [ ]iii LM ML ×=β , (40) добија се: [ ] [ ]∑ = + = n i i i i i i L Lf 1 1 β β . (41) При , 0=i 10 =β , а и представља молски удео некомплексираног метала. 0ff i = Докторска дисертација Општи део Према дефиницији парцијалног молског удела добија се: . (42) Да би коректно представили баланс масе у односу на лиганд, општу једначину ∑ = = n i if 1 1 комплексирања пишемо у облику: M nnn MLfMLfMLfMfLnfff ++++=++++ ......2 221021 (43) ли (44) где је -Bjerrum-ова функција формирања комплекса: (45) Ако се реакција комплексирања одвија у стандардним условима, онда је промена станда . (46) Ако се реакција комплексирања не одвија у стандардним условима, онда је промен и ∑ = − =+ n i ii MLfLnM 1 )( − n ∑ = − = n i iifn 1 рдне Gibbs-ове енергије представљена изразом: ∑ = Θ ×−=Δ n i iifTRG 1 ln β а Gibbs-ове енергије дата Gibbs-овом реакционом изотермом: [ ] [ ]∏ ∏ = =××+××−=Δ n i n n i f i f i ML ML TRTRG i i 1 0lnln β . (47) вођењем Froneaus-ове функције: , (48) леди да је Bjerrum-ова функција формирања комплекса12: У MTRG Φ××−= lnΔ с )(ln )(1 L G TR n − ∂ Δ∂××−= . (49) Средњи лигандни број може се израчунати у комплексометријској титрацији на ме Нека је реакција комплексирања представљена једначином: HmnMLLnH nm )( − n , јо тала и лиганда на следећи начин. M ×+→+ (50)   14 Докторска дисертација Општи део   15 водоничног јона у раствору TH , биће: Укупна концентрација [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]−+ −++++= OHHLHmLHHL mT ...2 2H (51) Ако су кумулативне константе протоновања , добија се: Hmβ [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ −+ −+××++××+××= OHHLHmLHLH mHmHHT βββ ...2 221 ] (52) H [ ] [ ] [ ] [ ][ ] [ ] [ ]HKHHmHHL WmHmHHT /...2 221 −+×++×++××= +βββH (53) [ ] [ ] [ ]++ −+×= HKHHPLH WT )( (54) з ове једначине добија се израз за равнотежну концентрацију лиганда: И [ ] [ ] [ ] )( / HP HKHHL WT ++ +−= . (55) купна концентрација лиганда у раствору је: , (56) дносно: (57) (58) . (59) давде је функција формирања: У m[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]∑ = +++++= i inT LHMLMLMLL 1 2 ...L о [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]LHLHMnL mHmHTT ××++××+×+= − ββ ...1L [ ] [ ] [ ] [ ] TmHmHHT MnHHHL ×+×++×+×+×= −βββ ...1( 221L [ ] TT MnHQL ×+×= −)(L О [ ] T T M HQLL )(×−n− = (60) водећи израз за [ ]LУ , добија се: T HHT M nCLn − − −= / (61) де је: г Докторска дисертација Општи део   16 [ ] [ ]++ +−= HKHHC WTH . (62) Из једначине (61) може се израчунати , ако је позната укупна концентрација метала , лиганда и водоничног јона , а измерена равнотежна концентрација водоничног јона, − n TTM TL H[ ]+H , [ ] pHH −+ = 10 . (63) Константе стабилности комплекса ML и могу се одредити на основу функционалне зависности , где су равнотежне концентрације метала, водоничног јона и лиганда. 2ML m,),,,( lhmfn iβ= − lh, Како је: 2 21 2 21 1 2 ll lln ×+×+ ×+×=− ββ ββ , (64) добија се: 0)2()1( 221 =−××+−××+ −−− nlnln ββ , (65) одакле се применом регресионе анализе израчунавају 1β и 2β . Ако се формира N-комплекс, онда је: ∑ = − =××− N m m m lmn 0 0)( β , (66) одакле се mβ израчунава применом мултидимензионе регресије. Докторска дисертација Општи део 1.2. Опште особине флуорохинолона, флуорохинолони као лиганди 1.2.1. Опште о хинолонима Историја хинолона почела је 1962. године када је идентификована налидиксинска киселина (као споредни производ у синтези хлороквина). Велики напредак је учињен увођењем атома флуора (F) у основно језгро. Почетком 1980-тих година синтетисан је норфлоксацин, хинолон са атомом флуора на положају C-6 и пиперзинским супституентом на положају C-7, који је имао значајно побољшану антибактеријску активност у односу на до тада синтетисане хинолоне.20 Иако читава група ових антибиотика носи назив 4-хинолони, структурно нису сви припадници ове групе деривати хинолона. Наиме, овој групи припадају и деривати нафтиридина, пиридопиримидина и цинолина, који садрже додатне атоме азота у једном или другом спојеном прстену. Заједничко за сва ова једињења је да имају 4- оксо-1,4-дихидрохинолонско језгро (Слика 1а). Краћи израз 4-хинолони је предложен као генеричко име за све антибактеријске агенске ове групе једињења. Оваква номенклатура даје тачан опис веза у пиридинском прстену. Тако су деривати нафтиридина означени као 8-аза-4-хинолини (Слика 1b), једињења са пиридопиримидинским прстеном 6,8-диаза-4-хинолини (Слика 1c), а једињења са цинолинским системом 2-аза-4-хинолини (Слика 1d). 16 N O COOH N N O COOH N N N O COOH N N O COOH a b c d Слика 1. Основне структуре језгара хинолона (a-4-оксо-1,4-дихидрохинолонско језгро; b-8-аза-4-хинолини; c-6,8-диаза-4-хинолини; d-2-аза-4-хинолини;) Хемијске модификације основне структуре одвијале су се у два главна правца. Први начин је базиран на модификацијама 6-флуоро, 7-пиперазинил хинолона и обухвата супституцију угљеника на положају 8 атомом азота и друге модификације бочног ланца, што је довело до настајања друге генерације флуорохинолона (нпр. 1- циклопропил и 1,8-цикло једињења). Даље супституције на 6-флуоро-7-пиперазинил молекулима, довеле су до даљег развоја флуорохинолона друге генерације са побољшаном активношћу и фармакокинетичким особинама. Даља 7-азабицикло модификација довела је до синтезе моксифлоксацина, флуорохинолона четврте генерације, са значајно побољшаном антибактеријском активношћу. Моксифлоксацин и гатифлоксацин имају и додатни 8-метокси бочни ланац.17 Код другог начина модификације задржано је нафтиридинско језгро. Овим начином модификације настали су еноксацин и тозуфлоксацин (флуорохинолони друге генерације). Даљим увођењем 7-азабицикло модификације, настали су флуорохинолони 17 Докторска дисертација Општи део треће генерације (тровафлоксацин), који су имали проширен антибактеријски спектар дејства. Хинолони припадају групи синтетичких антибиотика широког спектра дејства, који се примењују као фармацеутски препарати у свакодневној клиничкој пракси. Хинолони се према антибактеријском спектру дејства сврставају у различите генерације (Табела 1). Табела 1. Најзначајнији представници хинолона различитих генерација12,18 Генерација Представници Комерцијални препарат Индикације ПРВА генерација Циноксацин Флумекин Налидиксинска киселина Оксолонска киселина Пиромидинска киселина Пипемидинска киселина Cinoxacin® Flubactin® NegGam®, Wintomylon® - - Dolcol® Некомпликоване инфекције уринарног тракта ДРУГА генерација Ципрофлоксацин Еноксацин Флероксацин Ломефлоксацин Надифлоксацин Норфлоксацин Офлоксацин Пефлоксацин Руфлоксацин Ciprobay®,Cipro®, Ciproxin® Enroxil®, Penetrex® Megalone® Maxaquin® Lexinor®, Noroxin®, Quinabic®, Janacin® Floxin®, Oxaldin®, Tarivid® - Uroflox® Компликоване инфекције уринарног тракта, простатитис, полно-преносиве болести ТРЕЋА генерација Балофлоксацин Грепафлоксацин Левофлоксацин Пазуфлоксацин мезилат Спарфлоксацин Темафлоксацин Тозуфлоксацин - Raxar® Cravit®, Levaquin® - Zagam® Omniflox® - Пнеумонија у болничким условима ЧЕТВРТА генерација Клинафлоксацин Гемифлоксацин Моксифлоксацин Гатифлоксацин Ситафлоксацин Тровафлоксацин - Factive® Avelox® Tequin®, Zymar® - Trovan® Интра- абдоминалне инфекције У РАЗВОЈУ Ецинофлоксацин Прулифлоксацин - - - Прва генерација хинолона најчешће је коришћена за третман инфекција уринарног тракта. Друга генерација хинолона поседује повећану активност против Грам- негативних патогена (pneumokoka) а лимитиран потенцијал против Грам-позитивних патогена (stafilokoka). Користе се у индикованим инфекцијама уринарног тракта, гонореје, инфекција изазваних хламидијом, инфекција простате, инфекција коже и меког ткива, колере и салмонеле, легионарске болести... Трећа генерација хинолона поседује балансирани широки спектар активности и повећани потенцијал против пнеумокока. Делују против гираза и топоизомераза IV, а употребљавају се за индиковане инфекције респираторног тракта. Фармакокинетички профил (полуживот) омогућава једнодневно дозирање. Четврта генерација хинолона поседује повећану активност против Грам- позитивних патогена, а повољна фармакокинетика омогућава једнодневно дозирање и потпуно елиминисање хепато-билиарном екскрецијом. Употребљавају се за индиковане инфекције респираторног тракта.19 18 Докторска дисертација Општи део Генерација хинолона у развоју, поседује изразито повећану активност против Грам-позитивних бактерија, уздржану активност против ципрофлоксацин резистентних пнеумокока, високу активност против атипичних патогена узрочника инфекција респираторног тракта и уздржану активност наспрам Грам-негативних патогена. 30% се ренално елиминишу. Скоро сви клинички коришћени хинолони, садрже атом флуора у C-6 положају хинолона, нафтиридина или бензоксазинског прстена. Због присуства атома флуора у молекулу, ови антибактеријски агенси се описују као флуоровани хинолони или флуорохинолони. Појава треће генерације хинолона антибактеријских флорохинолона заснованих на налидиксинској киселини у раним осамдесетим, дала је нови импулс и правац синтетисању ефикаснијих представника са знатно ширим спектром дејства. Од тада, као резултат ових напора десетине представника у овој класи је синтетизовано и уведено у терапијске сврхе у ветеринарској и хуманој медицинској пракси за велики број клиничких индикација. Фармацеутска истраживања флуорохинолона су условила проширење њихове примене, од првобитне примене у третирању индикованих уринарних инфекција до примене у третману системских инфекција. 1.2.2. Структура и номенклатура хинолона Хинолони су аналози флавона и тиофлавона који се карактеришу кондензованим бензеновим (А) и хетероцикличним (C) прстеном. Код природних хинолона у положају 2 хетероцикличног прстена (C), налази се фенил група. Флавони у положају 1 имају везани кисеоник (X=O), тиофлавони везани сумпор (X=S), а хинолони имају везану амино групу (X=NR; R=H, ацетил и сулфонил). X B CA R' R O 1 2 344a 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6' X: O, S, NR R: -H, RCO-, C6H5SO2-, -Cl, -Br. O O 1 2 344a 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6' Слика 2. Општа структура хинолона (лево) и флавона (десно) Хинолони и флавони су широко распрострањени у биљкама а могу се различитим методама и лабораторијски синтетизовати. Међутим, тиофлавони се могу синтетизовати само у лабораторијским условима. N O Ar R R: H, R-, CH3O-, PhSO2- Слика 3. Прстен C-Хинолин-4(1H)-он 19 Докторска дисертација Општи део Хетероциклични C прстен хинолона (Слика 2), садржи неколико реактивних места (1, 3 и 4) и дозвољава различите степене незасићења у прстену (Слика 3 и Слика 4). N Y Ar Y=RO-, NH2- Слика 4. Прстен C-потпуно ароматични дериват хинолина Прстен А хинолона (Слика 2) (R=Cl, Br) може такође бити модификован нуклеофилном супституцијом у положајима 6- и 8-. Хемијска структура хинолона друге, треће и четврте генерације изводи се углавном из основног прстена хинолина и хинолона: N O HinolON N HinolIN Хинолони прве генерације садрже и нафтиридинско, цинолинско и пиридо- пиримидинско језгро. N N N N N N N Naftiridin Cinolin Pirido-pirimidin Ова језгра више се не користе код хинолона новијих генерација осим нафтиридинског језгра који се јавља код тозуфлоксацина (трећа генерација), гемифлоксацина и тровафлоксацина (четврта генерација). У свом молекулу сви 4-хинолони садрже карактеристичну групу: X N COOH 1 O 2 3 45 6 7 8 па се дакле могу сматрати дериватима 1-супституисане 1,4-дихидро-4-оксо-пиридин-3- карбонске киселине. Увођењем различитих супституената у основно хинолонско језгро добијају се различите хинолонске структуре па је за описивање положаја супституената хинолона новијих генерација ради усаглашавања извршено обележавање на основу следећег: 20 Докторска дисертација Општи део N O R R1 R3 R4 R5 R6 1 4 2 3 5 6 7 COOH 8 Увођењем супституената у положаје 1-,2-,6-,7- и 8- настају различите структуре хинолона: N O COOHF N HN Ciprofloksacin N O COOHF N HN CH3 Norfloksacin N O COOHF N NH3C O CH3 Ofloksacin N O COOHF N HN CH3 F CH3 Lomefloksacin N O COOHF N HN CH3 CH3 Grepafloksacin Слика 5. Хемијска структура неких хинолона друге генерације N O COOHF N HN O Gatifloksacin N O COOHF N HN F NH2 Sparfloksacin N O COOHF N N O Levofloksacin Слика 6. Хемијска структура неких хинолона треће генерације O N O COOHF NHN H H OH3C Moksifloksacin N F COOH NN F F H H H2N Trovafloksacin Слика 7. Хемијска структура неких хинолона четврте генерације 21 Докторска дисертација Општи део 1.2.2.1. Утицај хемијске структуре на дејство хинолона Корелација фармаколошког дејства хинолона са природом супституената у различитим положајима (1-,3-,4-,6-,7- и 8-) може се приказати уопштено на шеми 1. N O COOH -vezivawe za DNK-girazu. -prolazak kroz }elijski zid i porinske kanale }elijske membrane. R1 R4 R6 R5 1 2 3 45 6 7 8 -inhibitorna sposobnost DNK-giraze. -vezivawe za DNK-girazu. -aktivnost prema stafilokokama. -olak{ani prolaz kroz }elijski zid. -pove}ana aktivnost protiv Pseudomonas aeruginosa i nekih Gram-negativnih bakterija. -pove}ana aktivnost protiv anaerobnih vrsta. Ako su polo`aji 1 i 8 spojeni oksazinskim prstenom pove}ava se aktivnost protiv gram-pozitivnih i anaerobnih vrsta. R -antibakterijska aktivnost protiv: Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamidia, Legionella, Stafilokoka i anaerobnih vrsta. R-Me: pove}awe resorpcije i serumskog vremena polu`ivota. Шема 1. Утицај структуре на дејство хинолона21 Познавање структуре хинолона је од велике важности за разумевање поступака и процеса синтезе хинолона, као и начина њиховог дејства и биолошке активности. Структурно зависна активност флуорохинолона је предмет интензивног проучавања. Најважније структурне особине неопходне и значајне за антибактеријску активност нових хинолона, укључују карбоксилну групу у положају 3- хинолона-нуклеуса и алкил или арил групу у положају 1-. Поред тога, заједничко присуство два типа супституената, атом флуора у положају 6- и хетероцикличног азота у положају 7- је важно за биолошку активност. Хетероциклични азот се најчешће налази у пиперазинском или пиролидинском супституенту. Ако су ови супституенти заједно присутни, то одређује обим бактеријског спектра и ефикасност бактерицидне активности. Атом флуора у положају 6- обезбеђује значајно повећање антибактеријске активности за многе хинолоне, вероватно повећањем целуларне пенетрације и инхибиције активности ензима. Модификација положаја C-7 у молекулу хинолона је интезивно изучавана. Студије су показале да промене супституента у положају -7, имају велики утицај на потенцијал, спектар активности, растворљивост и фармакокинектику хинолона. Супституисани или несупституисани хетероцикли у положајима 5- и 6- као што су пиролидинил, пиролил, тиоморфонил, морфонил и пиперазинил у положају C-7, дају хинолоне са добром антибактеријском активношћу. 1.2.3. Киселинско-базне особине хинолона Тело човека је састављано од око 70–75% воде. Како је просечна молекулска маса лека 400 g/mol, доза од 400 mg даје концентрацију од 2×10-5 mol/dm3. Када разматрамо понашање оваквог раствора у организму, сусрећемо се са разблаженим раствором. За разблажене растворе Brönsted-Lowry-јева киселинско-базна теорија је најприкладнија за 22 Докторска дисертација Општи део објашњење и предвиђање киселинско-базних особина. Ово је важно пошто киселинско- базне особине лека директно утичу на апсорпцију, екскрецију и компатибилност са другим лековима. Према Brönsted-Lowry-јевој теорији киселина је било која супстанца која може да отпусти протон (H+), а база је било која супстанца која може да прими протон. Када киселина преда протон бази она прелази у своју коњуговану базу, слично када база прими протон она прелази у своју коњуговану киселину. Молекули могу садржавати више функционалних група, па тако могу на пример поседовати и киселе и базне особине. То су амфотерни молекули. Хинолони II, III и IV генерације су слабе органске хетероцикличне оксо киселине. Као протон акцептор појављује се секундарна амино група из пиперазинског, пиролидинског, пиперидинског прстена који може да прими протон и пређе у амонијум групу. Протон донор је карбоксилна група везана за хинолонско језгро. Ако анјонски облик хинолона означимо са Q–, диполни јон са HQ±, а катјонски са H2Q+, онда се равнотеже у воденом раствору хинолона могу представити следећим хемијским једначинама и одговарајућим изразима за константе равнотеже: N O N F R1 COO- COO- Q- HN+ R2 N O N F R1N R2 N O N F R1 COOH HN+ R2 N O N F R1 COOH N R2 K2K1 HQ0 HQ H2Q + k12 (dipolarni jon) (anjonski oblik) (katjonski oblik) (neutralni oblik) k21 k22 Шема 2. Равнотеже у раствору флуорохинолона где су k11, k12, k21, k22 микроконстанте, а К1 и К2 макроконстанте дисоцијације флуорованих хинолона. Код свих хинолона киселе особине амонијум групе мање су изражене него киселе особине карбоксилне групе. То је последица стабилизације – COO– групе +R ефектом хинолонског језгра као и успостављања водоничне везе између карбоксилног водоника и суседног карбонилног кисеоника у положају 4. 23 Докторска дисертација Општи део Табела 2. pK вредности неких хинолона Хинолон pKa1 pKa2 pK1 pKa спек. pk22 pk11 pk21 pk12 pI 4-оксо-хинолон 2.23 11.28 Ципрофлоксацин 6.11 8.50 6.19 7.04 8.72 6.19 7.3 Норфлоксацин 0.74 8.26 7.39 7.26 7.2 6.3 7.6 8.5 7.36 Офлоксацин 0.90 7.88 7.19 7.18 7.12 Нал. киселина 0.95 6.36 6.41 6.33 Еноксацин 0.71 6.71 7.47 7.53 Флумекин 6.50 6.50 6.51 Оксолинска кис. 6.61 6.61 6.72 Флероксацин 5.5 8.0 6.75 Пефлоксацин 6.32 7.47 6.7 6.1 7.1 7.7 6.89 Оламуфлоксацин 6.71 9.45 8.10 6.73 8.06 9.43 8.08 Грепафлоксацин 7.12 8.78 8.27 7.15 7.64 8.75 7.95 Амифлоксацин 5.42 7.57 5.8 5.7 7.2 7.3 6.50 Ломефлоксацин 5.49 8.78 6.0 5.7 8.3 8.6 7.14 Моксифлоксацин 6.25 9.29 7.46 6.29 8.08 9.25 7.77 1.2.4. Растворљивост Растворљивост молекула хинолона у телесним течностима утиче на њихову биорасположивост као и на њихову апсорпцију, дистрибуцију и елиминацију. Код растварања у води треба имати у виду формирање водоничне везе између присутних функционалних група и воде, као и могућност јонизације функционалних група. Свака функционална група способна да образује водоничну везу, доприноси повећању растворљивости молекула у води. Функционалне групе које повећавају растворљивост називају се хидрофилним, а оне које смањују растворљивост су хидрофобне. Хинолони се врло слабо растварају у води. Лако се растварају у киселинама и базама. Раствори у базама су стабилни до pH=12, при вишим pH вредностима долази до хидролизе и разлагања молекула хинолона. Већина хинолона раствара се у хлороформу и метиленхлориду. Растворљивост у етанолу, метанолу, ацетону и етру је мала. Растворљивост молекула лекова у води уопште, умногоме утиче на начин њихове употребе, апсорпције, дистрибуције и елиминације. Постоје два кључна концепта приликом разматрања растворљивости молекула у води (или мастима). Један је везивање водоника који утиче на формирање потенцијала функционалних група које су присутне у молекулима и јонизација функционалних група. Свака функционална група способна да буде донор или акцептор везе са водоником ће допринети укупној растворљивости једињења. Такве функционалне групе ће повећати хидрофилну природу молекула. Обрнуто, функционалне групе које не формирају водоничну везу неће повећати хидрофилност, већ ће утицати на хидрофобност молекула. Водонична веза представља специјални случај везе дипол- дипол. Генерално је правило да што више водоничних веза постоји, већа је растворљивост молекула у води. Свака функционална група молекула поседује одговарајући број потенцијалних места водоничне везе ( =3, =3, =2, =1...). Међутим, то не узима у обзир могућност интрамолекуларних водоничних веза које се могу формирати и које смањују растворљивост у води (повећавајући растворљивост у мастима). OHR  2NHR  ,RNHR  ,,,RNRR  Важну улогу у одређивању растворљивости у води имају јон-дипол везе. Овај тип везе настаје са органским солима. Соли настале од јаких киселина и база добро дисосују, а соли настале од слабих база и киселина слабо дисосују, па су самим тим и 24 Докторска дисертација Општи део слабо растворљиве. То најбоље и објашњава слабу растворљивост хинолона у води. Међутим, приликом сагледавања утицаја јонизованих молекула на растворљивост у води морају се у обзир узети и интрамолекулска јонска везивања. Лемке (Lemke) је развио емпиријски приступ предвиђања растворљивости једињења у води на основу солубилизационог потенцијала угљеника неколико органских функционалних група. Ако солубилизациони потенцијал функционалних група превазилази укупан број присутних атома угљеника, молекул се сматра растворним у води. У супротном, нерастворан је. Функционалне групе које интерагују било кроз интрамолекуларна водонична везивања или интеракције типа јон-јон ће смањити солубилизациони потенцијал сваке групе. Тешко је квантитативно одредити колико ће се таквих интеракција десити кроз растворљивост у води, али препознавање ових интеракција ће омогућити објашњење аномалија. У табели 3 је приказан солубилизациони потенцијал воде за неколико функционалних група заједничких за више лекова. Обзиром да већина молекула лекова садржи више од једне функционалне групе, Лемке (Lemke) је предвидео и солубилизациони потенцијал воде и за полифункционалне молекуле. Табела 3. Солубилиозациони потенцијал воде за органске функционалне групе присутне у моно-и полифункционалним молекулима22 Функционална група Монофункционалнимолекул Полифункционални молекул Алкохол 5-6 угљеника 3-4 угљеника Фенол 6-7 угљеника 3-4 угљеника Етар 4-5 угљеника 2 угљеника Алдехид 4-5 угљеника 2 угљеника Кетон 5-6 угљеника 2 угљеника Амин 6-7 угљеника 3 угљеника Карбоксилна киселина 5-6 угљеника 3 угљеника Естер 6 угљеника 3 угљеника Амид 6 угљеника 2-3 угљеника Уреа, карбонат, карбамат 2 угљеника Према овом методу, ради предвиђања растворљивости у води потребно је утврдити колико укупно функционалних група доприноси растворљивости у води и узети у обзир да свако наелектрисање на молекулу доприноси солубилизационом потенцијалу од 20-30 угљеника. На бази ових информација и прорачуна утврђује се проценат (не)растворљивости молекула у води. Осим емпиријског, постоји и аналитички приступ предвиђања растворљивости једињења у води који се заснива на израчунавању логаритма партиционог коефицијента ( ) молекула. Овај приступ је развијен на основу методе апроксимације који су развили Катес (Cates) и Лемке (Lemke), а заснива се на поставци да је у молекулу једињења присутна сума хидрофилних и хидрофобних особина сваке функционалне групе. Партициони коефицијент , представља однос концентрација лека (хинолона) у октанолу и води. Октанол је узет ради сличности амфифилне природе липида пошто има поларну групу (примарни алкохол) и дугачак -CH- ланац или „реп“, као што масне киселине чине део липидне мембране. Пошто је логаритамски завистан од слободне енергије, уопштено се изражава као , и представља збир хидрофобних и хидрофилних карактеристика органских молекулских група које чине структуру молекула. Због тога је мера солубилизационих карактеристика целокупног молекула. Због тога што свака органска функционална група унутар молекула доприноси укупној хидрофобној (и)или хидрофилној природи молекула, Plog P P Plog Plog 25 Докторска дисертација Општи део хидрофобна/хидрофилна вредност (хидрофобна константа π) може се придодати свакој функционалној групи. Ову релацију дефинише математички једначина: ∑ )(log fragmentiP S . (67) Приликом израчунавања из хидрофобних субституентних константи, збир се обично односи на или , ради разликовања од експериментално одређених вредности ( или ). Радовима Лемкеа (Lemke) и Катеса (Cates), формирана је табела π вредности (табела 4). Plog CcalcPlog measPlog Plog M log P Табела 4. Хидрофилно-липофилне π вредности органских фрагмената22 Фрагменти π вредност C (алифатични) +0.5 Фенил +2.0 Cl +0.5 O2NO +0.2 IMHB +0.65 S 0.0 O=C-O (карбоксил) -0.7 O=C-N (амид, имид) -0.7 O (хидроксил, фенол, етер) -1.0 N (амин) -1.0 O2N (алифатични) -0.85 O2N (ароматични) -0.28 Коришћењем вредности из табеле, могуће је извршити процену растворљивости многих органских једињења у води. Подаци добијени компјутерским прорачунима и прорачунима на основу података из табеле 4 поседују генерална слагања у погледу (не)растворљивости у води. Предвиђање растворљивости у води представља пут разумевања понашања молекула у раствору, посебно када се бавимо разликама између молекула и њиховом фармакокинетиком. Јонизационо стање молекула не утиче само на растворљивост у води, већ и на способност проласка кроз мембране и способност апсорпције. Везивање за серум протеине и количина слободног лека за везивање за рацепторе је умногоме зависна од јонизационог стања и хидрофилно/хидрофобне природе молекула.22 1.2.5. Спектроскопске особине хинолона 1.2.5.1. UV-VIS спектри Ултраљубичаста и видљива (UV-VIS) спектроскопија обухвата проучавање апсорпције електромагнетног зрачења у области од 200-800 nm. У поређењу са другим методама (IR, NMR и MS) UV/VIS спектроскопија нема велику примену за структурна одређивања, јер мали број органских једињења апсорбује у овој области таласних дужина. Веома је корисна метода за идентификацију делова молекула који апсорбују у овој области, такозваних хромофора. У ултраљубичастој области (од 200–400 nm) већина 4-хинолона, даје две траке. На нижим таласним дужинама налази се симетрична трака јаког интензитета, док се на вишим таласним дужинама налази асиметрична трака знатно мањег интензитета. Ова трака је сложена и има два блиска максимума. Положај максимума обе траке зависи од pH вредности раствора. Приликом повећања pH, 26 Докторска дисертација Општи део максимум траке на вишим енергијама помера се батохромно и при томе му интензитет расте. Максимуми нискоенергетске траке, при повећању pH, померају се хипсохромно, а интензитет им опада. На спектрима свих хинолона карактеристична је појава изобестичке тачке. Изобестичка тачка код хинолона друге генерације лежи у области таласних дужина од 290–310 nm. Високоенергетска трака потиче од апсорпције делокализованог S-електронског система хинолонског језгра, док нискоенергетска трака, потиче од апсорпције пиперазинског супституента и S-електрона карбонила и пиридинског прстена. Према томе оба система трака могу се приписати SpS и npS прелазима унутар хинолонског молекула. Слика 8. UV/VIS спектар норфлоксацина на различитим pH вредностима23 Табела 5. Апсорпциони UV максимуми (Omax) и изобестичке тачке (Oiso) водених раствора хинолона Хинолон Omax(nm) Oiso (nm) Налидиксинска киселина 258 332 328 - Флумекин 248 330 327 - Оксолинска киселина 260 337 286 - Офлоксацин 287 332 330 356 Норфлоксацин 272 323 317 345 Еноксацин 263 335 295 355 1.2.5.2. IR спектри У IR спектру флуорованих хинолона уочава се веома јака трака у области од 1730 – 1705 cm-1 која одговара истезајућим видрацијама карбонилне групе (QC=O у –COOH групи). Повећање таласног броја ове вибрације може се повезати са образовањем димерне структуре и/или учествовањем карбоксилне групе у сложеним коњугованим системима. Друга веома јака трака која се налази у области од 1644–1618 cm-1 одговара истезајућим вибрацијама карбонилне групе (QC=O) у положају 4. Средња или јака трака у IR спектру флуорованих хинолона на 810–800 cm-1 одговара савијајућим вибрацијама (GC-H) карактеристичним за алкене опште формуле R1R2=CHR3. На присуство атома водоника везаних за двоструку везу у ароматичном језгру указује група трака слабог интензитета (QC=H) у области од 3100–3000 cm-1. 27 Докторска дисертација Општи део Група средњих и јаких трака на 2805–2690 cm-1 одговара QC-H истезајућим вибрацијама метил групе у близини терцијарног алифатичног атома азота у пиперазинској групи. Трака QC-F ароматичног језгра јавља се у области од 1270–1100 cm-1. Ове траке су јаког или средњег интензитета, и обично се не могу уочити јер се преклапају са вибрацијама QC=C трака. Слика 9. IR спектар ципрофлоксацина24 Слика 10. IR спектар (А) офлоксацина и (Б) левофлоксацина25 Слика 11. IR спектар (А) норфлоксацина и (Б) ципрофлоксацина25 28 Докторска дисертација Општи део Табела 6. Траке флуорованих хинолона у IR спектру25 FQ nor cipro lome gati oflo levo Асигнација 3328 всл 3442 сл 3428 сл 3423 всл 3426 всл 3465 сл O-H истезање 3046 сл 3056 сл 3083 с 3041 сл 3039 сл 2967 с 2983 всл 2971 сл CH истезање у CH3 и CH2 групи 2942 сл 2938 с 2936 с 2943 сл 2930 сл 2838 сл 2888 с 2840 сл 2864 сл 2843 с 2788 с 2759 ј 2701 ј 2664 ј 2633 ј 2588 с 2458 ј N-H асиметрично истезање 1729 ј 1731 ј 1725 ј 1729 с 1715 ј 1711 ј C=O истезање 1621 1610 сл 1618 ј 1642 ј 1620 вј 1620 вј C=C и C=N истезање 1592 сл 1548 ј 1541 с 1549 ј 1547 ј 1521 с 1518 ј 1527 ј 1523 ј 1527 ј 1497 ј CH2 деформације 1478 вј 1468 с 1470 ј 1468 вј 1471 вј 1444 с 1444 с 1413 с 1447 вј 1401 с 1401 с CH2 савијање 1374 с 1389 с 1393 с 1375 с 1345 сл 1332 с 1352 с 1352 с 1300 сл 1328 сл 1296 с 1317 ј 1289 с 1292 с Мешовите вибрације 1282 с 1251 ј 1264 ј 1258 с 1276 ј 1242 с 1246 с CH савијање у равни 1203 сл 1194 ј 1171 сл 1213 сл 1199 с 1200 сл CH савијање + CH увијање и C-O истезање 1120 ј 1115 с 1145 всл 1141 ј 1158 сл 1098 сл 1067 сл 1094 с 1095 сл Бензенски прстен + пиридински прстен 1031 всл 1033 ј 1044 с 1061 сл 1053 ј 1051 ј 1018 ј 1014 сл 1006 с 997 с 977 сл 998 сл 975 с 977 с CH савијање 941 сл 929 с 939 с 955 с 955 с 887 сл 890 сл 888 сл 878 сл 876 сл 841 сл 864 с 850 всл 823 с 808 сл 811 сл 810 с 801 с 801 с C-N истезање + CH савијање 749 с 761 с 739 с 732 сл 742 сл 739 сл 727 с 707 сл 705 сл 697 с 650 сл 651 сл 665 сл 655 сл C-F истезање 612 ј 561 с 513 с 512 сл Деформације прстена 412 с 411 с Кривљење CH у прстену пиридина всл – веома слаба, сл – слаба, с – средња, ј – јака, вј – веома јака Ширење трака на 3500 и 1620 cm-1 указује на присуство водоничне везе. С обзиром да ширење није велико, може се сматрати да водонична веза карбонилни кисеоник-карбоксилни кисеоник, није јака. 1.2.5.3. NMR спектри 1H NMR спектри флуорохинолона показују карактеристичне линије мултиплетне структуре, које припадају бензеноидном систему, карбоксилном водонику и присутним супституентима. Хемијско померање у 1H NMR спектру на око 9 ppm потиче од протона –CH (C2) групе која се налази у пиридинском прстену, на око 8 ppm (два дублета) од хинолонског језгра, (C5) између 7 и 7.5 ppm су протони који припадају (C8) угљениковом атому, као и друга хемијска померања у зависности од присутних супституената. 29 Докторска дисертација Општи део Табела 7. 1H NMR помераји флуорованих хинолона FQ H-2 H-5 H-8 супституент N O COOHF N HN CH3 4 356 7 8 2 9 10 11 12 13 15 16 18 19 Nor 9.34 s 8.15 d 7.37 d етил група (CH3 1,65, CH2 4,85). пиперазинска група (CH2 (15.19) 3.86. CH2 (16.18) 3.58) N O COOHF N HN cipro 9.14 s 8.14 d 7.71d циклопропил група (CH2 1.26 – 1.52 m. CH 3.89 m). пиперазинска група (H-3’ 3.53 m. H-2’ 3.75 m) cipro 8.89 8.05 7.34 циклопропил група (CH2 1.27 – 1.47. CH 3.65). пиперазинска група (H-α 3.79. H-β 3.48) 3.65 nor 8.64 8.10 6.82 етил група (CH3 1.34. CH2 4.27). пиперазинска група (H- α 3.84. H- β 3.31) enro 8.65 s 7.91 d 7.56 d циклопропил група (CH2 1.18 – 1.33 m. CH 3.83 m). етил група (CH2 2.40 q. CH3 1.06 t). пиперазинска група (H- α 3.28 m. H- β 2.57 m) У 13C NMR спектру флуоро хинолона уочава се пет групa хемијских помераја, две испод 60 ppm и три изнад 100 ppm. Хемијски помераји испод 60 ppm одговарају супституентима који су везани за језгро хинолона, док помераји изнад 100 ppm одговарају угљениковим атомима који чине само језгро. Често није могуће тачно одредити који помераји одговарају којим угљениковим атомима, јер долази до преклапања сигнала. Тако у области око 170 ppm долази до преклапања сигнала који потичу од угљеника из карбоксилне групе са сигналом угљеника из прстена за који је везан карбонилни кисеоник. Такође и на око 110 ppm долази до преклапања сигнала који потичу од C3, C5 и C8 угљеникових атома. 30 Докторска дисертација Општи део Слика 12. 1H NMR спектар норфлоксацина у D2O26 Слика 13. 13C NMR спектар норфлоксацина у DMSO27 Слика 14. 13C NMR спектар ципрофлоксацина28 31 Докторска дисертација Општи део Слика 15. 13C NMR спектар норфлоксацина28 Табела 8. 13C NMR помераји флуорованих хинолона у DCl FQ C2 C3 C3a C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 Супституент N O COOHF N HN CH3 4 356 7 8 2 9 10 11 12 13 15 16 18 19 nor 150.1 109.0 177.8 171.7 113.4 154.0 147.5 108.2 139.7 121.5 етил група (CH3 16.58. CH2 53.09). пиперазинска група (CH2 46.15. 49.22) cipro 147.5 109.5 167.2 168 113.2 113 155.2 150.1 145.4 145.1 104.5 138.8 119 циклопропил група (1б. 6.7. 1а. 36.7). пиперазинска група (2`.6`. 44.6. 3`5`. 41.6) nor 147.7 106 168.8 175.3 111.3 110.8 155.7 150.7 145.2 145 105.7 137.2 119.1 119 етил група (1а 50.7. 1б 14.2). пиперазинска група (2`6`. 46.8. 3`5`. 43.6) 1.2.5.4. Масени спектри У циљу одређивања појединачних карактеристика молекула, масени спектрометар их преводи у јоне који се крећу под утицајем променљивог спољашњег електричног и магнетног поља. Три основне функције масеног спектрометра су: 1. Мала количина једињења се јонизује, обично до катјонског облика губљењем једног електрона, 2. Јони се одвајају и сортирају се према њиховој маси и наелектрисању, и 3. Одвојени јони се детектују и добија се масени спектар. Како су настали јони веома реактивни и кратког живота, њихово формирање мора се изводити у вакууму. Притисак при којем се стварају јони је од 10-5 -10-8 тора. Молекули се бомбардују електронима при чему избијају један електрон из молекула стварајући молекулски јон. Неки од ових јона се разбијају у мање катјонске и неутралне фрагменте. Када се на јонски зрак делује јаким магнетним пољем долази до његовог скретања, па на овај начин долази до одвајања наелектрисаних фрагмената. Масени спектри нам помажу код одређивања молекулског јона, као и фрагмената који су из њега настали. На основу масеног спектра може се закључити о ком хинолону се ради.29-55 32 Докторска дисертација Општи део Табела 9. Табеларни приказ фрагментације неких молекула флуорохинолона FQ 288.4 [M-CO2+2H]+ или [M-C2H5N]+ 245.5 [M-C2H5N-CO2+H]+ 314.4 cipro 331.3 N O COOHF N HN 332.5 [M+H]+ 268.5 [M-CO2-HF+H] + или [M-C2H5N-HF]+ 303.4 [M-HF+H]+ 234.4 [M-C2H5N-CO2+H]+ enox 320.3 NN O COOHF N HN CH3 321.5 [M+H]+ 206.3 [M-C2H5N-CO2-C2H5+3H] + или [M-C4H9N2-C2H5]+ 265.2 [M-C2H5N-CO2+H]+ 251.3 [M-C3H7N-CO2+H]+ lome 351.3 N O COOHF N HN CH3 F CH3 352.5 [M+H]+ 237.2 [M-C2H5N-CO2-C2H5+3H]+ 358.5 [M-CO2+H]+ 384.5 [M-HF+H]+ moxi 401.4 N O COOHF NHN H H OH3C 402.6 [M+H]+ 261.4 [M-C6H13N-CO2+H]+ 276.4 [M-CO2+H]+ 302.4 [M-HF+H]+ nor 319.3 N O COOHF N HN CH3 320.5 [M+H]+ 233.4 [M-C3H7N-CO2+H]+ 261.4 [M-C3H7N-CO2+H]+ oflo 361.4 N O COOHF N NH3C O CH3 362.5 [M+H]+ 318.5 [M-CO2+H]+ Слика 16. Масени спектар ципрофлоксацина Слика 17. Масени спектар ломефлоксацина 33 Докторска дисертација Општи део 1.2.6. Офлоксацин као лиганд Офлоксацин (9-флуоро-3-метил-10-(4-метил-1пиперазинил)-7-оксо-2,3-дихидро- 7H-пиридо-(1,2,3-де) 1,4-бензоксазин-6-карбоциклична киселина), Mr(C18H20FN3O4)= 361,4 g/mol (C-59.83%; H-5.58%; F-5.26%; N-11.63%; N-11.63%; O-17.71%) (Merc Index, 1997), је синтетички антибиотик широког спектра дејства који је типичан представник друге генерације антибиотика из групе флуорованих хинолона. N O N N F O COOH CH3H3C Слика 18. Структура офлоксацина (неутрални облик молекула у раствору) Слика 19. Синтеза офлоксацина57 34 Докторска дисертација Општи део Синтеза офлоксацина приказана је на слици 19 (страна 34). Први корак у синтези је алкална хидролиза стартног материјала калијум хидроксидом уз присуство диметилсулфоксида (DMSO) који обезбеђује селективну хидроксилизацију атома халогена суседног нитро групи. Други корак синтезе је алкализација 2-хидрокси-3,4- дифлуоронитробензена хлороацетоном у присуству ацетона у алкалном медијуму. Настали продукт подлеже редуктивној циклизацији са Raney никлом у присуству водоника. Настали међупроизводи потом подлежу процесу циклоацилације и кондензације загревањем на 145°C у полифосфорној киселини. Уклањањем карбоксилне етил групе и финалном кондензацијом са N-метилпиперизином добија се офлоксацин (Mitscher, 2005). Беле је боје, чистоће од 98-100%. Левофлоксацин је S-(-) облик офлоксацина, активнији од њега од 8-125 пута у зависности од типа бактерија. Користи се за третман уринарног тракта, простате, коже и инфекција уринарног и респираторног тракта, као и сексуално преносивих болести. Користи се као антибактеријско средство у третману инфекција узрокованих широким опсегом грам-позитивних и грам-негативних бактерија као и инфекција узрокованих Хламидијом. Слика 20. Микроскопска јонизација офлоксацина (HQ0- неутрални облик; H2Q+-катјонски облик; Q- -анјонски облик; HQ± - диполарни ("zwitter") облик;)57 Офлоксацин постоји у облику бледо-жућкастог или јарко-жућкастог кристалног пудера са горким укусом. Потребно га је складиштити на 4°C на тамном месту ради минимизације фотолитички индуковане деградације. Топи се на температури од 270- 273°C. Офлоксацин је слабо растворљив у води (на 293 Код 2 mmol/dm3) али се у базама и киселинама добро раствара при чему је стабилан до pH=12, а при вишим вредностима хидролизује и разлаже се. Растворан је у глацијалној сирћетној киселини, умерено растворан у метилен хлориду, дихлорметану, метанолу, етанолу или ацетону. 35 Докторска дисертација Општи део Растворљивост офлоксацина у различитим медијима на собној температури приказана је на слици 21. Може се уочити да је растворљивост офлоксацина pH зависна, и да је знатно већа у киселим него у базним растворима. Слика 21. Растворљивост офлоксацина на различитим pH вредностима на собној температури Табела 10. Растворљивост офлоксацина у различитим растварачима на 250°C Растварач Растворљивост Вода Добро растворан 0,1 mol/dm3 NaOH Нерастворан Метилен хлорид Незнатно растворан PBS (pH 5,6) Умерено растворан PBS (pH 7,4) Нерастворан Етанол Незнатно растворан Метанол Умерено растворан Хлороформ Незнатно растворан Етил ацетат Незнатно растворан DCM Незнатно растворан Етар Нерастворан Табела 11. Експериметални подаци растворљивости (mg/ml) за офлоксацин и односи дозе и растворљивости за таблете офлоксацин различите јачине на 37±0.5°C Односи дозе и растворљивости таблета (mg) pH pH по додавању офлоксацина Израчуната растворљивост (mg/ml) 200 300 400 1.2 1.94 37.09 5.3 8.09 10.81 Вода 7.15 2.66 75.19 112.81 150.38 4.5 5.2 14.62 13.69 20.53 27.38 5.05 6 16.49 30.82 46.22 61.63 6 6.32 5.04 39.68 59.52 79.37 6.8 6.8 4.57 43.76 65.64 87.53 7.2 7.15 2.85 70.18 105.26 140.35 7.5 7.3 2.8 71.43 107.14 142.86 8.2 7.87 3.64 54.95 82.42 109.9 9.2 8.85 4.32 46.3 69.44 92.6 Партициони коефицијенат офлоксацина за систем октанол/вода је -0.48. pH профил растворљивости показује да су константе дисоцијације и изоелектричне тачке , и pI=7.12. pK1 и pK2 су константе дисоцијације катјонског тј. 03.61 pK 21.82 pK 36 Докторска дисертација Општи део анјонског облика офлоксацина при чему се pK1 односи на дисоцијацију карбоксилне групе а pK2 на дисоцијацију пиперазинске амонијум групе из молекула офлоксацина. Изоелектрична тачка (pI=7.12) се налази у слабо алкалној области, што значи да се у плазми налази у нејонизованом облику или у облику диполарног ("zwitter") јона. Киселе особине амонијум групе су мање изражене него киселе особине карбоксилне групе што је последица стабилизације -COO- групе +R ефектом хинолонског језгра и успостављања водоничне везе између карбоксилног водоника и суседног карбонилног кисеоника у положају 4-. Офлоксацин је слаба органска хетероциклична оксо киселина која се у воденом раствору зависно од pH раствора може јавити у облику неутралног молекула, катјона, анјона, или диполарног ("zwitter") јона. Као и сви хинолони друге и треће генерације офлоксацин се понаша као амфипротична супстанца. Као протон акцептор појављује се секундарна амино група из пиперазинског прстена, која може да прими протон и пређе у амонијум групу. Протон донор је карбоксилна група из хинолонског језгра. Доминантна врста је диполарни јон и неутрални облик молекула. Однос диполарног јона у односу на неутрални облик на физиолошкој вредности pH је 146. Компаративно високе вредности константи се могу приписати ефекту киселинског слабљења везаног водоника у 6-карбоксилној групи суседног карбонилној групи. Вредности мање од се односе на катјонски облик (N4 из пиперазинил групе), веће од на анјонски облик, а вредности између њих на диполарни облик. Шема фрагментације офлоксацина приказана је на слици 22. 1pK 2pK Слика 22. Шема фрагментације офлоксацина58 37 Докторска дисертација Општи део Ифрацрвени спектар офлоксацина снимљен KBr техником у опсегу таласних дужина од 2000-650 cm-1 приказан је на слици 23. Најистакнутији пикови су на 1459, 1621, 1715 и 1086 cm-1. Уопштено хидроксилна група карбоксилне киселине била би у опсегу од 3300-2500 cm-1. Пик на 1715 cm-1 потиче од карбонилне групе карбоксилне киселине, на 1621 cm-1 потиче вероватно од истезања карбонила на положају 4 или истезања C=C везе на C-2 и C-3. Остали пикови на 1400 cm-1 потичу од вибрација N4 у пиперазинил групи, на 1530 cm-1 потиче од истезања C=О и на 1055 cm-1 потиче од истезања C-O-C етарске групе. Слика 23. IR спектар офлоксацина Слика 24. UV VIS спектар офлоксацина у киселој и базној воденој средини UV VIS спектар офлоксацина у воденом раствору (5×10-5 mol/dm3) показује два пика (јак пик на 287 nm и слаб пик на 332 nm). Јак пик потиче од хромофоре N-1 положаја карбоксилне групе, док слабији пик потиче од хромофоре азота пиперизинил групе. Спектар се мења када офлоксацин формира комплексе са катјонима металa, посебно са двовалентним катјонима, условљавајући црвени померај јаког апсорпционог пика на 285 nm и плавог помераја слабије израженог пика на 330 nm. На слици 24 је приказан UV спектар офлоксацина у киселој воденој (225, 226, 256 и 326 nm) и базној воденој (288 и 332 nm) средини. 38 Докторска дисертација Општи део Слика 25. Абсорпциони максимум (O max)/ таласна дужина максимума за офлоксацин Угао оптичке ротације офлоксацина je у опсегу од -0.10° до +0.10°. Због тога што офлоксацин има асиметрични атом угљеника, комерцијално се налази као рацемат. Офлоксацин карактерише добар фармокинетички профил. Офлоксацин показује снажну инхибиторну активност против многих бактерија као и организама резистентним на пеницилине, цефалоспорине и аминогликозиде. Брзо се и добро апсорбује у гастроинестиналном тракту. Концентрација од 3.5-5.3 Pg/ml се постиже у периоду од 1-2 часа по употреби у дози од 400 mg перорално, што условљава инхибицију више од 95% грам-негативних бактерија. Концентрација у урину и бешици, након 1-3 часа износи 100 μg/mL. Храна не утиче на апсорпцију офлоксацина. Време полуелиминације је између 5 и 7 часова и у потпуности се елиминише у непромењеној форми преко бубрега 80% у року од 24 часа. Полувреме елиминације је значајно повећано код пацијената са поремећеном реналном функцијом (око 20% за 24 часа). Ово указује да клиренс офлоксацина зависи од односа гломеруларне фитрације, што условљава да се мора водити рачуна код примене високих доза офлоксацина код пацијената са бубрежном дисфункцијом. Слика 26. Дифракција X-зрацима за офлоксацин Како се офлоксацин везује око 25% за албумин серума, то је и разлог његове релативно високе концентрације у плазми (од 3-4 Pg/mL) што омогућава његово лако продирање у већину ткива. У цереброспиналној течности постиже релативно високе концентрације, знатно изнад минималних инхибиторних концентрација (MIK) за многе патогене. Приликом истовремене примене са антацидима на бази алуминијума и магнезијума долази до смањења његове биорасположивости услед формирања различитих комплекса где се офлоксацин понаша као бидендатни лиганд, где донорске групе могу бити атоми кисеоника карбонилне и карбоксилне групе. 39 Докторска дисертација Општи део Уопштено, постоји проблем као последица комплексирања и хелатних интеракција флуорохинолона са извесним бројем терапеутских агенаса који укључују антациде, метоклопромиде, ... и металне катјоне. Ове интеракције условљавају смањивање апсорпције хинолона, а самим тиме и биорасположивост и антибактеријску активност. У том смислу постоји разлика између офлоксацина и осталих флуорохинолона. Ефекат поливалентних катјона приликом оралне апсорбције офлоксацина је мањи него са осталим флуорохинолонима. Офлоксацин се метаболизује у веома мањој количини у поређењу са осталим хинолонима. Између 65-80% примењеног офлоксацина оралним путем се екскретује непромењен преко бубрега за време од 48 часа од дозирања. Од 4-8% од дозе офлоксацина се екскретује преко фецеса, што индикује мали степен жучне екскреције. Неки метаболички продукти офлоксацина приказани су на слици 27. Слика 27. Метаболички продукти офлоксацина Одређивање офлоксацина могуће је вршити методама неводених титрација, спектрофотометријски, колориметријски, спектрофлуорориметријски, атомском апсорпционом спектроскопијом, течном хроматографијом (HPLC), хемилуминисценцијом, микробиолошким методама и капиларном електрофлорезом.11,58 Слика 28. Криве експерименталних неводених титрација за неке флуорохинолоне (Офлоксацин концентрације 2.8×10-2 mol/dm3, третиран са 0.1 mol/dm3 HClO4) 1.2.7. Моксифлоксацин као лиганд Моксифлоксацин је синтетички широко спектрални антибиотик из четврте генерације флуорованих хинолона. Молекулска формула му је C21H21FN3O4 HCl (хидрохлорид) и C21H24FN3O4 (база), а његова хемијска структура је следећа: 40 Докторска дисертација Општи део N O OH O F O N H3C HN H H 1 2 3 45 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 1'2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' а б Слика 29. Хемијска структура моксифлоксацина Моксифлоксацин хидрохлорид је 8-метоксифлуорохинолон четврте генерације. Хемијски назив му је 1–циклопропил–7-((С,С)-2’,8’-диазабицикло (4,3,0)–нон-8’-ил)–6– флуоро–8–метокси-1,4–дихидро–4–оксо–3-хинолин карбоксилна киселина. Састоји се од бицикличног ароматичног језгра са атомом флуора на положају C-6, метокси групом на положају C-8, N-1 циклопропил групе и азобицикличне групе на положају C-7. То је слабо жућкаста или жута супстанца, горког укуса са релативном молекулском масом од 437.90 g/mol (хидрохлорид) и 401.44 g/mol (база). Синтеза моксифлоксацин хидрохлорида одвија се у две фазе: У првој фази реагују трифлуорохинолонска киселина и S,S-пиролопиперидин. Реакција се одвија у присуству терцијарног амина N,N-диизопропилетиламина да би се неутралисала киселина која настаје у току реакције. Као систем растварача користи се смеша N- метил-2-пиролидинона и метанола. Смеша се рефлуктује три сата на температури од 70°C. После хлађења суспензија се филтрира, испира са метанолом и суши у вакууму. Као производ ове реакције добија се (Bay z 7906) који је интермедијер у синтези моксифлоксацина. Слика 30. Прва фаза синтезе моксифлоксацина Слика 31. Друга фаза синтезе моксифлоксацина У другој фази Bay z 7906 се преводи у моксифлоксацин хидрохлорид заменом атома флуора метокси групом у положају 8. Ово се постиже реакцијом Bay z 7906 и 41 Докторска дисертација Општи део калијум-терц-бутоксида у присуству тетрахидрофурана метанола. Смеша се рефлуктује 2.5 сата на 70°C. После хлађења раствор се пребацује у други суд који садржи разблажену хлороводоничну киселину. Раствор се хлади и меша све док се не заврши таложење. Талог се издваја и испира водом и етанолом. Уколико се моксифлоксацин хидрохлорид користи за израду инфузионих раствора онда постоји још један степен пречишћавања: талог добијен у другом степену се раствори у прочишћеној води и рефлуктује. У процесу синтезе моксифлоксацина јављају се супстанце које не могу никаквим поступцима пречишћавања да буду одстрањене из готовог производа. Нечистоће у готовом производу могу се поделити у неколико категорија: споредни производи и прекурсори синтезе, деградациони производи и хирални изомери. Потребно је напоменути да је само (S,S) изомер физиолошки активан, па се присуство других изомера може разматрати као онечишћење. Моксифлоксацин хидрохлорид је кристална супстанца светло жуте боје, горког укуса. Хигроскопан је и може да веже до једног мола воде, што зависи од температуре и релативне влажности. На повишеним температурама може да изгуби везану воду. Моксифлоксацин хидрохлорид нема јасно изражену тачку топљења, али на температурама изнад 250°C долази до његове разградње. Специфична ротација раствора моксифлоксацина концентрације 10 mg/mL у 50% ацетонитрилу је [α]°-131°. UV спектар моксифлоксацина је врло сличан спектру осталих флуорованих хинолона тј. има два максимума: први максимум је на 294 nm и потиче од апсорпције делокализованог π електронског система хинолонског језгра. Други максимум се налази на 330 nm и потиче од апсорпције пиперидинског супституента и S електрона карбонила и пиперидинског прстена. Специфичан коефицијент апсорпције Am је 1122, а моларни апсорпциони коефицијент e је 49126 (када је спектар снимљен у метанолу и за апсорпциони максимум на 294 nm). UV спектар моксифлоксацина у метанолу је приказан на слици 32. Слика 32. UV VIS спектар моксифлоксацина у метанолу Изглед и карактеристике спектра моксифлоксацина јако зависе од pH вредности растварача. У табели 12 су приказани положаји најизраженијих максимума у спектру за различите раствараче. Табела 12. Максимуми у UV спектру моксифлоксацина у различитим растварачима Растварач 0,1 mol/dm3 HCl Пуфер pH 7 0,1 mol/dm3 NaOH Максимум 1 295 nm 288 nm 291 nm Максимум 2 327 nm 338 nm 339 nm 42 Докторска дисертација Општи део Слика 33. IR спектар моксифлоксацина снимљен KBr техником IR спектар моксифлоксацина показује карактеристичне траке на следећим таласним бројевима (cm-1): од 3528–3470, од 3068–2830, од 2796–2083, од 1709–1623 и од 1515–1352. Најизраженије траке су у области од 1515–1352 cm-1 и оне потичу од истежућих вибрација C=C ароматичног језгра и савијајућих вибрација Н–H, C-H и C-Н- C прстена. Такође су изражене и истежуће вибрације C=О карбонилне групе у области од 1709–1623 cm-1. IR спектар моксифлоксацина снимљен KBr техником, приказан је на слици 33. Растворљивост моксифлоксацин HCl у води износи 24 mg/mL. Растворљивост се смањује у присуству хлоридних јона. Испитивања растворљивости на различитим pH вредностима на 25°C су показала да нема промене растворљивости у опсегу pH од 3–5 и она износи 27 mg/mL. На pH=1 (0,1 mol/dm3 HCl) растворљивост опада на 4.7 mg/mL због присуства хлоридних јона. Са повећањем pH вредности растворљивост незнатно расте, да би на pH=7 била 38 mg/mL. Табела 13. Растворљивост моксифлоксацина у различитим растварачима Растварач Растворљивост (mg/mL) на 25°C Вода 24 Вода + 0,1 mol/dm3 NaCl 5.1 Вода + 0,5 mol/dm3 NaCl 0.85 Вода + 1,0 mol/dm3 NaCl 0.40 Вода + 2,0 mol/dm3 NaCl 0.18 0,1 mol/dm3 HCl 4.7 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=3 27 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=4 27 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=5 27 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=6 29 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=7 38 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=8 45 0,15 mol/dm3 фосфатни пуфер pH=9 46 0,1 mol/dm3 NaOH 67 Метанол 26 N,N-диметилформамид 7.6 Етанол 2.5 Пропанол-2 0.24 Ацетонитрил 0.27 Ацетон 0.072 Етил ацетат 0.00085 n-Хептан < 0.0001 43 Докторска дисертација Општи део Пошто је моксифлоксацин у облику хидрохлорида, pH вредност воденог раствора моксифлоксацина концентрације 10 mg/ml износи 4.4. Моксифлоксацин има две pKa вредности. Прва pKa1 износи 6.38 и потиче од карбоксилне групе, а друга pKa2 износи 9.53 и потиче од азота у C7 супституенту. Ове константе одређене су потенциометријски коришћењем раствора у води концентрације 1 mg/mL. Партициони коефицијент моксифлоксацина је log Po/w=-1.87 за октанол/воду и log Po/w=- 0.61 за октанол/пуфер. Моксифлоксацин је чист S,S-енантиомер са два стереогена центра. Одговарајућа стереохемијска конфигурација је осигурана полазним материјалом S,S-пироло- пиперидином, па није потребна стерео-селективна синтеза нити сепарација рацемата. 1H-NMR спектар моксифлоксацина снимљен је техником Fourije-ове трансформације на радној фреквенцији од 300.135 MHz. Као растварач коришћен је диметилсулфоксид, а као интерни стандард тетраметилсилан. Спектрална ширина је била 20.07 ppm, а дигитална резолуција 0.368 Hz/Pt. Слика 34. 1H-NMR спектар моксифлоксацина снимљен техником Fourije-ове трансформације 13C-NMR спектар моксифлоксацина снимљен је техником Fourije-ове трансформације на радној фреквенцији од 75.48 MHz. Као растварач коришћен је диметилсулфоксид, а као интерни стандард тетраметилсилан. Спектрална ширина је била 301.1 ppm, а дигитална резолуција 0.694 Hz/Pt. Брзина аквизиције је била 1.442 s, а дужина пулса 7.4 ms, 90° угао пулса. Број слободно индукованих распада био је 3200. Слика 35. 13C-NMR спектар моксифлоксацина снимљен техником Fourije-ове трансформације 44 Докторска дисертација Општи део Пик молекулског јона моксифлоксацина (слика 36) се налази на 402.6 [M+H]+ а карактеристични фрагментни јони на 358.5 [M-CO2+H]+, 384.5 [M-HF+H]+ и 261.4 [M- C6H13N-CO2+H]+. Слика 36. Масени спектар моксифлоксацина Фармаколошке особине: Моксифлоксацин се добро апсорбује после оралне примене. Његова апсолутна биорасположивост (око 90%) је већа него код ципрофлоксацина и упоредива је са оним за новије флуорохинолоне. Максимална концентрација моксифлоксацина у плазми (око 4.5 Pg/mL) се достиже од 1-3 сата после оралне дозе у стационарном стању (при препорученом режиму дозирања од 400 mg једном дневно). На биорасположивост моксифлоксацина не утиче храна. Концентрације моксифлоксацина у плазми су пропорционалне дози до 800 mg. Дистрибуција: Моксифлоксацин је приближно 50% везан за серумске протеине. Запремина дистрибуције се креће од 1.7-2.7 dm3/kg. Моксифлоксацин је добро дистрибуиран у организму, при чему су концентрације у ткивима често веће од концентрација у плазми. Моксифлоксацин је детектован у саливи, назалном и бронхијалном секрету, мукози синуса, субкутаном ткиву и скелетним мишићима након оралне примене, дозе од 400 mg. Метаболизам: Моксифлоксацин се метаболише глукуронидном и сулфатном коњугацијом. Ензимски систем цитохрома P-450 не учествује у метаболизму моксифлоксацина и на њега моксифлоксацин не утиче. Сулфатни метаболит (М1) чини приближно 38% оралне дозе и елиминише се примарно фецесом. Приближно 14% оралне дозе се претвара у глукуронид (М2), који се екскретује примарно урином. Максималне концентације у плазми глукуронида су око 40% од оних за моксифлоксцин, док су те концентрације за сулфат мање од 10% од оних за моксифлоксацин. Елиминација: Приближно 45% оралне или интравенске дозе моксифлоксацина се излучује у непромењеном облику (око 20% урином и 25% фецесом). Готово цела (96%) орална доза се елиминише или у непромењеном облику или у облику познатих метаболита. Полу-живот елиминације моксифлоксацина је приближно 12 часова. Стационарно стање се постиже након највише 3 дана при препорученом режиму дозирања. Брзина елиминације моксифлоксацина из ткива је паралелна брзини елиминације из плазме. Дозирање: Уобичајено дозирање моксифлоксацина је 400 mg орално свака 24 часа. Трајање терапије зависи од типа инфекције. Доза треба да се узме најмање 4 сата пре или 8 сати након антацида који садрже алуминијум или магнезијум, металне катјоне као што су гвожђе, мултивитаминске препарате који садрже цинк, пуфероване 45 Докторска дисертација Општи део 46 таблете за жвакање диданозина и педијатријске прашкове за оралне растворе. Моксифлоксацин се може узимати са или без хране. Моксифлоксацин је регистрован у Републици Србији у облику таблета од 400 mg и у облику инфузије од 400 mg моксифлоксацина у 100 mL. Заштићени назив регистрованог комерцијалног фармацеутског препарата је Avelox. 12,20,59,60 Докторска дисертација Општи део 1.3. Компјутерска симулација специјације у раствору 1.3.1. Молска фракција (алфа вредности) 61 Састав раствора може се изразити графиком зависности релативних концентрација двеју компонената (нпр. метала и лиганда) у функцији pH вредности. Релативне концентрације ових компонената називају се алфа вредности, и означавају се са iα . Алфа вредности су корисне у приказивању промена у концентрацијама различитих врста који се дешавају у титрацији једноставне слабе киселине, али се могу такође израчунати и за полифункционалне киселине и базе. 1.3.1.1. Молска фракција (алфа вредности) слабе киселине, HA61 Ако са , означимо укупну аналитичку концентрацију слабе киселине, може се написати да је Tc −+= AHAT ccc . (68) Фракција укупне концентрације недисосоване киселине износи [ ] Tc HA=0α , (69) а фракција дисосоване [ ] Tc A−=1α . (70) Збир алфа вредности 110 =+αα . (71) Алфа вредност зависи једино од [ ]+OH3 и , и независна је од . Да би се добио израз за aK Tc 0α , израз за константу дисоцијације се може представити као [ ] [ ][ ]+− = OH HAKA a 3 . (72) Заменом и преуређивањем ових једначина, добије се вредност за молску фракцију [ ] [ ][ ] aT KOH OHcHA +== + + 3 3 0α . (73) Преуређивањем израза за константу дисоцијације и заменом у једначину за молску фракцију 0α , добија се вредност фракције дисосоване киселине, 47 Докторска дисертација Општи део [ ] [ ]+ − +== OHK K c A a a T 3 1α . (74) Из једначина за 0α и 1α , може се уочити идентичност имениоца. 1.3.1.2. Молска фракција (алфа вредности) полифункционалних киселина и база61 Ако са , означимо збир моларних концентрација полипротичне киселине у раствору, алфа вредност за слободну киселину се може приказати као Tc [ ] Tc MH 2 0 =α , (75) где је [ ] [ ] [ ]−− ++= 22 MHMMHcT . (76) Алфа вредности за и −HM −2M се могу приказати сличним једначинама, [ ] Tc HM −=1α (77) и [ ] Tc M −= 2 2α . (78) Имајући у виду да је збир алфа вредности једнака јединици, следи да је 1210 =++ ααα . (79) Алфа вредност система полипротичне киселине се може изразити и преко [ ]+OH3 , и . Оваквим изражавањем се добија: 1aK 2aK [ ] [ ] [ ] 213123 2 3 0 aaa KKOHKOH OH ×+×+ = ++ + α , (80) [ ] [ ] [ ] 213123 31 1 aaa a KKOHKOH OHK ×+×+ ×= ++ + α (81) и [ ] [ ] 213123 21 2 aaa aa KKOHKOH KK ×+×+ ×= ++ α . (82) 48 Докторска дисертација Општи део И у овом случају именилац је идентичан полином, као и то да је фракциона количина сваке врсте фиксна на свакој вредности pH, и независна од укупне концентрације. Уопштено за слабу киселину, , именилац у свим изразима за алфа вредности се може изразити у облику AHn [ ] [ ] [ ] anaanaanan KKKOHKKOHKOH ×××++××+×+ −+−++ ....... 2133211313 . (83) Бројилац за 0α је први члан у имениоцу, за 1α други и тако редом. Ако са означимо именилац, онда изразе за алфа вредности можемо написати као D [ ] DOH n /30 +=α , (84) и [ ] DOHKa /)1(311 −+×=α . (85) Алфа вредности за поли-функционалне базе се могу извести аналогијом, са једначинама које се могу написати у зависности константи дисоцијације базе и концентрације [ ]−OH . 1.3.1.3. Фракциона дистрибуција комплексних једињења (алфа једначине)61 Фракција врсте се може дефинисати као концентрациони однос врсте и укупне концентрације. За M-L системе, је укупна (аналитичка) концентрација централног металног јона и може се представити једначином MC [ ] [ ] [ ] [ nM MLMLMLMC ++++= ...2 ]. (86) Једначина (86) представља збир свих форми за које се претпоставља да су присутне тј. тзв. материјални или баланс масе. Фракција у форми „слободног“ аква јона је [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] 120 )...1(/ −+++++== nM MLMLMLMCMα . (87) У односу на [ , може се написати да је ]L [ ] [ ] [ ] 12122110 )......1( −××××++××+×+= nn LKKKLKKLKα . (88) Преко вредности 0α , могу се изразити и остале присутне алфа фракције [ ] [LKCML M ××== 101 / ]αα , [ ] [ 221022 / LKKCML M ×××== αα ] ] , ... , [ ] [ nnMnn LCML ××== βαα 0/ , (89) где је n-максимални број лиганада. 49 Докторска дисертација Општи део Важно значење ових једначина је у томе да у системима где су равнотежне константе познате, одређивање концентрација не-комплексираних лиганада или протона у равнотежи биће довољна информација да би се одредила дистрибуција метала међу свим могућим облицима. То је основа многих равнотежних дијаграма који се могу користити. Фракција слободног јона метала ( Mα ) зависи од константе стабилности комплекса (β ), односно кумулативних константи формирања n n M LLL ][][][1 1 2 21 ×+×+×+ = βββα Κ . (90) Лигандни број или степен формирања , представља средњи број везаних лиганада по металном јону. Веза између алфа фракција и лигандног броја може се приказати на следећи начин: − n n M L N C LCn ααα +++=−=− ...2 21 . (91) 1.3.2. Специјација јона метала Специјација описује концентрацију и садржај сваке хемијске врсте у више- компонентним системима, укључујући све присутне јоне и не-дисосоване молекуле. Хемијска специјација метала (било да је есенцијалан или токсичан) је значајна због хемијске форме у којој се метал уноси у организам, што најчешће одређује апсорпционе и транспортне особине метала у организму (а и тиме његову биолошку и физиолошку активност). Значајно је у неким случајевима и како је неки есенцијални или токсични метал апсорбован због праћења његове трансформације због могућих реакција измене лиганада са потенцијално присутним биомолекулама у биофлуидима или ткиву. Најконцизнија дефиниција хемијске специјације је: састав, концентрација и оксидационо стање сваке од хемијских форми метала које су присутне у узорку. Специјацијом се одређују биодистрибуције, екскреције и токсичности сваког елемента. У динамичким системима (нпр. крвна плазма), често је тешко, ако не и немогуће одредити специјацију било ког елемента. Зато се користе компјутери који омогућавају екстраполацију из једноставних система до више комплексних биолошких флуида. Познавање хемијске специјације може помоћи у објашњавању постојећих клиничких податка, како би се они користили у дизајнирању нових и ефикаснијих клиничких препарата. Специјација је важна због тога што често контролише особине хемијских система. Понашање многих биолошких, еколошких и индустријских процеса зависи од концентрације индивидуалних врста. Ове концентрације настају из термодинамичких равнотежа и кинетика компетитивних реакција. Специјација јона метала у раствору се може представити уопштено као на шеми 3 (страна51). Специјација јона метала је од интереса и за геохемијска и токсиколошка подручја изучавања. Приликом разматрања интеракција метала у траговима у живим организмима, могу се идентификовати три велика подручја интереса: специјација у екстерном окружењу, металне интеракције са биолошком мембраном која одваја организам из свог окружења, и подела метала унутар организма са пратећим биолошким ефектима.62,63 Термодинамички аспект специјације укључује одређивање стехиометрија (састава) и константи стабилности свих комплекса који се формирају са ендогено и егзогено везаним молекулима биолошких флуида или ткива. На тај начин се мора 50 Докторска дисертација Општи део дефинисати хемијска форма метала која постоји или се формира у посматраном систему (хемијском, еколошком или биолошком). У овом контексту се користи и дефинисан је појам хемијске специјације у литератури. Међутим, приликом хемијске специјације не сме се занемарити и кинетика формирања комплекса. Опсег везивања метала са лигандима мале молекулске масе (ЛМММ) је увек већи него везивања за велике протеине или остале биополимере. То значи да се засићење или осиромашење потенцијалних места везивања лиганада за метал дешава узастопно, тј., ЛМММ ће се везати за метал прво и такође ће изгубити или проследити метал ка следећем месту везивања где се исти процеси на местима везивања са молекулима велике молекулске масе дешавају истовремено, али пуно спорије. Мора се имати на уму да живи системи због своје сталне метаболичке везе са својим окружењем никада не постижу праву термодинамичку равнотежу. Опште је познато да метални јони имају велики број важних улога у биолошким системима. Метални јони који се разматрају као есенцијални су калцијум, магнезијум, манган, гвожђе, кобалт, бакар и цинк. Биолошки системи су свакодневно изложени дејству загађивача који садрже металне јоне олова (Pb2+), живе (Hg2+) и кадмијума (Cd2+). У хуманој крвној плазми као и у осталим биолошким флуидима, присутни метални јони се могу класификовати у четири посебне фракције: - они који су инкорпорирани у металопротеине (неизменљиви, нпр. бакар везан са церулоплазмином); - они који су релативно слабо везани са протеинима и који су у лабилној равнотежи са сличним јонима у растворима (нпр. бакар везан са серумским албуминима); - они који су комплексирани са бројним ЛМММ, укључујући анјоне амино киселине, карбоксилате, карбонате, фосфате, салицилате и аскорбате; - и слободни метални јони или везани за воду као аква јони. M-X (X=Cl-,F-,SO42-,HCO3-,CO32-) Неоргански комплекси (H2O)n-1M-OH Хидроксо комплекси C B M(H2O)n2+ Аква јон A Шема 3. Општа шема приказа специјације метала у раствору Прва фракција није од интереса у моделовању специјација осим ако метални јон није део равнотежа које се разматрају због ослобађања из протеина хемијском деградацијом. Аква јон је комплекс мале моларне масе, али због свог значаја се третира као посебна форма металног јона. Он мора бити присутан у свим воденим равнотежним D M-L (L=амино киселине, поликарбоксилне киселине) Органски комплекси (Мономерни лиганди) Е М :X :X :X X Полимерни орг. комплекси 51 Докторска дисертација Општи део системима и често се односи на слободни (не-комплексиирани) јон чак и кад је он комплексиран растварачем. Последње три фракције се могу посматрати као мултикомпонентни системи у којима су индивидуалне комплексне врсте у компетитивној равнотежи са слободним металним јонима. Иако биолошки системи никада не достижу праву равнотежу, они често постижу стабилно стање. Осим тога, да би постигли високу ефикасност измене енергије, већина биолошких система функционише близу реверзибилних равнотежа. Претпоставка постојања равнотеже је често оправдана. Фракције комплекса металних јона мале молекуларне масе, иако мале у поређењу са протеин-метал фракцијама, су од великог значаја и играју важну улогу у многим виталним физиолошким и биохемијском процесима. На пример, комплекси мале молекуларне масе, сматра се да су укључени: као интермедијери кад су метални јони део или су уклоњени из извесних металоензима или протеина носача, у трансферу неких металних јона кроз мембране, у одржавању есенцијалних метала у раствору и преуређивању потенцијала извесних редокс парова. Следи да је стицање детаљнијих знања о равнотежним дистрибуцијама металних јона између лиганада мале молекуларне масе јако пожељно. Укупна концентрација јона Mn2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+ и Pb2+ у крвној плазми је између 10-7 и 5×10-5 mol/dm3, и она је за слободне јоне испод границе детекције већине аналитичких метода. Поред тога, проблеми са експерименталном проценом равнотежних концентрација су изражени и присуством великог броја потенцијалних лиганада и чињеницом да узорци имају хемијске интеракције са системом. Симулација равнотежа метални јон-лиганд употребом компјутера представља тренутно најбољи метод процене равнотежних концентрација укључених комплекса у посматраном систему. Моделовање специјација у крвној плазми пионирски је отпочео Перин (Perrin) серијом радова. Перинови (Perrin) најранији модели били су ограничени на металне јоне Cu2+ и Zn2+ са изабраним аминокиселинама (16 у почетку а накнадно 22) као лигандима. У каснијем периоду, развио је системе у којима је укључио протеине (албумин и глобулин) и металне јоне Ca 2+ и Mg2+. У свим случајевима, главни део бакра (од 80-98%) је координиран са хистидином и цистином. Насупрот томе, цинк формира комплексе у широком опсегу аминокиселина. Резултати у вези протеин- металних комплекса нису били задовољавајући. На пример, концентрација бакар- албумин комплекса је била незнатна и дистрибуција калцијума између албумина и глобулина се значајно разликовала од експерименталних резултата постигнутих директним мерењима. У исто време Силен (Sillen), Морел (Morel), Мартел (Martell) и остали, проучавали су специјације на природним водама и урину. Први модели су били ограничени на један или два метална јона са ограниченим бројем лиганада. Развојем брзих компјутера са већим меморијама омогућено је да ови модели могу бити проширени и за мултикомпонентне системе. У моделу хумане крвне плазме који су развили Меј (May) и сарадници, 7 металних јона и 40 лиганада су разматрани истовремено. Овај модел укључује око 5000 комплекса са немогућношћу задовољавајућег укључивања лабилних протеин-метал равнотежа у модел.64 Суштински процес у развоју било ког модела специјације је дефинисање серије хемијских равнотежа које представљају разматрани систем. Приликом дефинисања равнотежа свих укључених хемијских врста, потребно је укључити и вредности равнотежних константи. Ово је уједно и једна од најтежих препрека у процесу моделовања специјација, јер прецизне константе равнотежа нису увек и расположиве. У ствари, у неким случајевима, све могуће равнотеже нису ни идентификоване. У општем случају процес развоја неког модела специјације се може представити као: ∏= i jik jjj xS ),(β , (92) 52 Докторска дисертација Општи део где је Sj-концентрација врста, βј-равнотежна константа, xi-концентрација слободне компоненте и k(i,j) стехиометријски коефицијенат компоненте. Серије равнотежа, заједно са укупном или слободном концентрацијом компонената чини компјутерски модел или базу података система. Од ових података, серије истовремених једначина баланса масе могу се подесити за укупну концентрацију компоненте као збир свих индивидуалних концентрација врста: ∑+= j jii jikSXT ),( . (93) Једначине баланса масе могу се решити итерацијама слободних концентрација компоненти. За ту сврху, постоје многи компјутерски програми који су у могућности да то ураде (нпр. компјутерски програм ECCLES).64 У динамичком мултикомпонентном систему као што је крвна плазма, укупна концентрација металног јона је знатно мања од укупне концентрације протеина, а концентрација слободних металних јона је веома мања од концентрације комплекса метал-протеин. То значи да концентрација јона метала остаје константна. Међутим, ако се егзогено унет метални јон користи у високим концентрацијама (нпр. гадолинијум или галијум) капацитет везивања са протеином може се повећати. У том случају, концентрација слободног металног јона неће остати константна. Такође, прихватање метала од протеина је често споро, и тако више него термодинамички очекивана концентрација слободног металног јона може постојати пре него се успостави равнотежа. Поред тог проблема, пуферовање концентрације слободног метала протеином, може се користити да би се упростили прорачуни симулација. За време прорачуна, концентрација слободног металног јона је фиксна у односу на укупну концентрацију, али се води рачуна да укупна концентрација не прелази познате нивое у крвној плазми. Због споре кинетике комплексирања протеина, постоје два екстремна услова симулација: - један, у којем је везивање за протеин занемарено и - други, у којем је везивање за протеин експлицитно укључено у прорачуне. Ова два симулациона услова служе да илуструју специјацију непосредно после ињектовања и након извесног времена када се успостави равнотежа са протеинима. Оно што се добија ново компјутерском симулацијом специјације метала у биолошким флуидима јесте: - процена равнотежних концентрација слободних метала, лиганада и сортираних металних комплекса, - релативна веза различитих амино киселина са металима, са варијацијама било концентрација метала, било лиганада, - релативна дистрибуција металних комплекса у функцији pH раствора, - ефакти токсичних металних јона у природном балансу концентрација метал- лиганд, - хемијске индиције избора одговарајућег детоксиканта у случају теже контаминације тешким металима, - избор терапеутских хелатних агенаса за различите људске и животињске болести и - потребне информације о обиму везивања метала за протеине у крви. Ове информације су значајне хемичарима у разумевању реакција и равнотежа у живим системима. То може обезбедити поуздане индиције за медицинску превенцију и третман бројних обољења и болести.64 53 Докторска дисертација Општи део 1.3.3. Методе за опис специјације у биолошким системима У биолошким флуидима, већина јона метала је везана за протеине. У ствари, мали део њих је везан за лиганде мале молекулске масе (аминокиселине, биофосфате, карбоксилате или хидроксикарбоксилате). Слободни аква јони метала у биолошким флуидима постоје у екстремно ниским концентрацијама, па не могу имати значајну улогу у физиолошким процесима. Насупрот њима, метали везани за лиганде мале молекулске масе имају кључну улогу у биолошким процесима, као што су инестинална апсорпција, апсорпција у ћелијама, пренос у ћелијама и ренална екскреција. Разумевање ових процеса захтева прецизнија знања о пропорцијама између лиганада мале молекулске масе и протеин везаних фракција јона метала, и њихових равнотежа које одређују ове пропорције. Специфичне експерименталне технике као што су гел филтрација, јонска хроматографија, ултрафилтрација, ултрацентрифугирање, AAS, GCMS, LCMS, ICP су у могућности да раздвоје и одреде метале који су везани за лиганде мале и велике молекулске масе. Раздвајање је веома важан аспект специјације елемената у траговима у биолошким узорцима. То подразумева купловање и примену директних техника раздвајања. Основни проблем при томе су мале (микрограмске) количине аналита. Идентификација је могућа једино ако је разматрана врста присутна у узорку и постоји аутентичан стандард за упоређивање. Са друге стране, развијени компјутерски програми који подржавају прорачуне равнотежа у вишекомонентним системима се могу применити не само за прорачуне специјација лабораторијских раствора, већ и за симулацију у природним смешама металних јона и лиганада у биолошким системима. Са аспекта састава елемената у траговима, биолошки флуиди, представљају уопштено хетерогене медије који садрже ћелије, протеине па чак и кристализоване честице. У студијама о саставу елемената у траговима биолошких флуида, често је неопходно да се поред одређивања укупног садржаја дефинише у којим хемијским формама се елементи у траговима појављују. Многи елементи у траговима су везани за макромолекуле (протеине, нуклеинске киселине, шећер ...) у биофлуидима. Поред ових фракција, јаком и инертном везом метални јони су везани за лиганде мале молекулске масе у биофлуидима (амино киселине, пептиди, биофосфати, аноргански јони...) који су знатно мобилнији. Не постоји општа техника за одређивање већине транзиционих јона метала у биолошким флуидима. Сваки јон метала, биолошки флуид и чак свака посебна фракција захтева примену специфичне инструменталне технике идентификације. Када је истраживана фракција квантитативно мала, примењене аналитичке технике не поседују одоговарајући степен осетљивости. У таквим случајевима компјутерска симулација представља једину расположиву технику за процену пропорције везивања метала за сваку компоненту. Ради мониторинга дистрибуције метала са лигандима мале молекулске масе, број експерименталних техника је знатно ограничен због лабилности везивања ових врста. Већина сепарационих техника интерферира са овим равнотежама дајући погрешне резултате. Убрзо по примени првих компијутерских програма који су подржавали прорачуне равнотежа у вишекомпонентним системима, већина од њих је примењена у координационој хемији, не само за прорачуне лабораторијских раствора већ и за симулације. Такви програми се у пракси данас све више користе у одређивању хемијских специјација у веома компликованим системима. Један од најшире коришћених програма за симулације је компјутерски програм ECCLES. Компјутерским програмима је неопходна богата и поуздана база података која садржи константе стабилности за све метал-лиганд интеракције које се могу десити у биолошким флуидима. Недостатак оваквих прорачуна и модела је недоступност свих потребних података. У таквим случајевима константе стабилности бинарних и тернарних метал- 54 Докторска дисертација Општи део лиганд система се превасходно морају одредити, са посебном пажњом на оне који су најважнији и који се најјаче везују између себе, па се стога мора извршити добра процена. У идеалном случају, резултати прорачуна се могу потврдити извесним методама раздвајања или структурним техникама. 1.3.4. Компјутерски програми за симулације специјација у растворима Прорачун концентрација врста у хемијској равнотежи је значајан због врло широке и разноврсне примене. Постоје два главна приступа. За равнотеже у гасној фази је лако извршити смањење слободне енергије система прилагођавањем парцијалних притисака реагенаса, коришћењем стехиометрије базиране на експлицитним хемијским реакцијама, или не-стеохиометријски приступ у коме се хемијске реакције не користе директно. Ово произилази из чињенице да постоје обухватне базе података стандардних слободних енергија структуре смеша у гасној фази, и чињенице која се односи на идеалне гасне смеше, да постоји једноставан однос између хемијског потенцијала врста, њихове стандардне слободне енергије, структуре и њиховог парцијалног притиска (или mol фракције). За равнотежу раствора коју посматрамо као уопштену кисело-базну равнотежу, уобичајено је да се измере равнотежне константе појединачних реакција и да се прорачунају концентрације врста решавањем једначине баланса масе. Овај приступ је први пут примењен у компјутерским програмима HALTAFALL и COMICS. У суштини, програм HALTAFALL се може користити за равнотеже типа чврсто-раствор и гасовито-раствор. Скуп података стандардне слободне енергије може бити добијен из података константи равнотеже, а који се могу употребити у конвенционалном алгоритму смањења слободне енергије. Овакви методи су употребљени у биолошким системима и вишефазним равнотежама. Развој брзих компјутера са великим капацитетом меморија омогућио је симулације специјација сложених модела вишекомпонентних система. За ту сврху развијен је већи број комерцијалних програма који користе приступ помоћу равнотежних константи. Поређења неких од њих су објављена 1977. године, а потом 1984. године. Де Робертис (De Robertis) је давао добру библиографију све до 1986. године, а још један рад о поређењу програма је издат 1988. године. Остали програми које ови аутори нису разматрали или који су касније објављени обухватају компјутерске програме: EQUIL, RAMESES, CSMC, SYSTAB, ESTA, INSOL, CHEMEQL и HYPHEN. Неки од најзначајнијих и највише коришћених компјутерских програма за специјације су HYSS, ECCLES, MINTEQA2, BEST/SPE, MEDUSA и JESS који ће надаље бити и детаљније описани. 1.3.4.1. HYSS Hyperquad Simulation and Speciation (HySS)65 је компјутерски програм из групе компјутерских програма ©Protonic Software, направљен у више верзија (HySS1, HySS2, HySS2003, HySS2006, HySS2009) за Windows OS (95, 98, НТ, 2000, HP) на персоналним рачунарима. Програм има две основне функције: - симулацију потенциометријских титрационих кривих и - израчунавање концентрација врста у раствору константне запремине са системом за приказ специјационих дијаграма. У потенциометријској титрацији претпостављено је да је реакциони суд тако припремљен да је позната укупна количина сваког реагенса који се треба додати у реакциони суд, као и почетна запремина раствора. Концентрације реагенаса су одређене вредностима почетне и крајње концентрације. Ако су ове две вредности 55 Докторска дисертација Општи део идентичне, концентрација реагенса биће константна. Такође, опсег pH вредности је потребно дефинисати. У оба случаја, дефинисани хемијски модел се састоји од комплексних врста који се формирају у раствору или се у њему јављају као талог. Прорачуни се односе на равнотеже у растворима, и обухватају могућност формирања делимично растворљивих честица. Не постоје ограничења која би се односила на број презентованих реагенаса или на број једињења која би се формирала. Потреба за израдом овог програма је била практична примена програма понуђених од Windows OS како би обезбедили корисницима већи степен флексибилности него што је то претходно било могуће, а односи се на унос и излаз података, а ради поједностављења употребе програма. Полазна основа им је био претходни програм HYPHEN, који се користи за равнотеже у растворима, док је новом програму као опција додат рад са равнотежом чврсто-раствор. Структура софтвера HySS се заснива на томе, да је у суштини сваки прорачун концентрације слободних реагенаса [ ]A , [ ]B итд., одређен решавањем система једначина баланса масе: [ ] [ ] [ ]∑ ++= i j jj ba iiA CpBAaAT ii ...β ∑ ∑ (94) и [ ] [ ] [ ]∑ ++= i j jj ba iiB CqBAaBT ii ...β , (95) где су A, B итд. реагенси; a, b, …., p, q, итд. стехиометријски индекси, β представља (кумулативну) равнотежну константу, а количина С представља моларну концентрацију нерастворне врсте (количина чврсте компоненте подељена са запремином раствора) и користи се уколико има нерастворних врста. Приказ количине нерастворне супстанце као концентрација извршен је у програму HALTAFALL. Са сваким нерастворним, повезани су и производи растворљивости: [ ] [ ] ...jj qpj BAK = На почетку се претпостављало да се не формира чврста компонента и слободне концентрације су рачунате без величине С у једначини једнакости масе. Уколико би постојала могућност формирања талога, производ концентрације је поређен са одговарајућим Кј. Ако је производ већи не само да се укључује променљива С, већ се стандардној једначини додаје [ ] [ ]...lnlnln BqApK jjj += и слободне концентрације се поново рачунају. Када је присутан талог, група једначина једнакости масе и једначина растворљивости су решене употребом Њутн–Рапсонове (Newton-Raphson) методе и то итерационим решавањем линеарних једначина. Зато што је [ ] [ ] jjBA pAAKTT =∂∂=∂∂ )/ln(/ , итд., матрица коефицијената симетрична, можемо употребити бројчано стабилне Чолески (Choleski) факторизације раствора, било да се талог формира или не: када се чврста компоненета раствори, одговарајући ред и колона ће просто бити занемарени. Следећи проблеми се могу јавити приликом специјационих прорачуна, обзиром да је могуће да се одреди аналитичка константа ТA или слободна концентрација (А) сваког реагенса. На пример, ниво pH може бити пре одређен него ТH. У том случају одговарајућа једначина једнакости масе је одбачена и унапред дата вредност слободне концентрације је искоришћена да би се решио преостали сет једначина. Наведени нумерички процес је кроз употребу FORTRAN-а преведен у динамички линковану библиотеку (DLB-DLL). DLL библиотеке користи програм (HySS), написан у 16-то битном Visual Basic-у 4 (VB4). DLL врши само нумеричке процесе, док код VB4 регулише улаз и излаз података, и тиме омогућава употребу Windows OS (Windows 3.хх 56 Докторска дисертација Општи део или Windows 95) задржавајући предност брзине добијене FORTRAN-ом за интензивније компјутерске задатке. HySS омогућава извршење припрема за прорачун и извршење прорачуна и израду специјационих дијаграма на једном месту. Не постоје ограничења која би у форми правила регулисала број реагенаса, једињења или делимично растворљивих производа који могу бити у систему. Могу се извршити три врсте прорачуна: (1) симулација титрационе криве, (2) прорачун концентрације врста у домену промена и (3) специјација за појединачне врсту услова (појединачно дата тачка). [ ][ ] [ ][ ] [ ][ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ] ⎥⎥ ⎥⎥ ⎥⎥ ⎥⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢⎢ ⎢⎢ ⎢⎢ ⎣ ⎡ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ... ln ... lnln ...... ...... j jjj j BBB j AAA C K B B K A A K C T B B T A A T C T B B T A A T [ ] [ ][ ] [ ] ⎥⎥ ⎥⎥ ⎥⎥ ⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢⎢ ⎢⎢ ⎢ ⎣ ⎡ Δ Δ Δ j j C C B B A A = . (96) ⎥⎥ ⎥⎥ ⎦ ⎤ ⎢⎢ ⎢⎢ ⎣ ⎡ Δ Δ Δ j B A K T T ln .... Унос података се врши на екрану едитовањем двеју форми. Форма „модела“ (Model) омогућава да се унесу вредности равнотежне константе, производа растворљивости и/или стехиометријских коефицијената. Ова форма је уобичајена за сва три типа прорачуна. Употреба форме „услова“ (Conditions) варира у зависности од фактора. Уколико се изабере опција титрационе симулације, корисник уноси вредности почетне и крајње запремине и за концентрације реагенаса у бирети, али уколико је изабрана опција фиксне запремине само се ова вредност запремине уноси. Аналитичка вредност сваког реагенса се може подесити уношењем полазне количине реагенса у реакционом суду и у том случају прорачуни почетне и крајње концентрације ће бити приказани на екрану. Упоредо са наведеним, у специјационим прорачунима почетне и крајње вредности реагенса могу бити унете. На пример, дефинисање почетне и крајње pH вредности дефинисаће распон вредности у коме ће бити извршени специјациони прорачуни. За прорачуне појединачних тачака постоји посебан образац за унос било аналитичке концентрације реагенса, било вредности p (реагенса). Било који број појединачних тачака може бити унет. Сви ови подаци се чувају у фајлу и цео сет података може бити унет позивањем из фајла. Поред тога Hyperquad подаци, могу бити унети. Главни прорачуни су иницирани одабиром графикона који треба да се нацрта или из табеле концентрација. Постоји 8 врста графикона која се могу приказати, а који ће бити доступан зависи од изабраног сета услова. У вези са тим, за симулацију титрације у којој су дате вредности аналитичких концентрација свих реагенаса, Х-оса може приказивати вредности запремине титрационог средства, pH (уколико је јон водоника један од реагенаса) или вредност p(реагенс). Y-оса може приказивати концентрације врста, које се односе на аналитичку концентрацију једног од реагенаса или може приказати логаритам апсолутне концентрације. У другом наведеном случају, корисник може изабрати која концентрација врста ће се појавити на графу. Графикони су нацртани у Windows Metafile формату тако да могу бити копирани у clipbord или сачувани у x.WMF фајлу. Постављањем на прикладно место хемијске формуле за приказане врсте, исте се могу повезати са одговарајућом кривом. Табеле концентрације приказују вредности слободних концентрација реагенаса и концентрације врста у форми табела одвојених табулатором које могу бити копиране у clipbord или сачуване у x.TSV фајлу. У сваком случају подаци из табеле се могу унети у најчешће употребљиве корисничке програме ради других прорачуна (као што је израчунавање кумулативне концентрације) или за израду других графикона. Број 57 Докторска дисертација Општи део тачака у табели или на графикону се може изабрати (21, 51, 101, 201, 401 или 901), а избором најмање вредности врло брзо ће се завршити прорачунавање, а већи број тачака ће се користити код припреме графикона за штампу. Слика 37. Активирање програма-почетна страница и отварање фајла базе у раду 58 Докторска дисертација Општи део Слика 38. Маска програма за подешавање и унос података посматраног система Слика 39. Маска за промену услова (концентрација) посматраног модела 59 Докторска дисертација Општи део Слика 40. Маска за додавање метала и лиганада у посматрани систем за симулацију Слика 41. Маска за прорачун концентрација метала, лиганда и комплекса 60 Докторска дисертација Општи део Слика 42. Маска за приказ дистрибуционих дијаграма у посматраном систему Ново у програмском софтверу HySS је потпуна флексибилност са којима се услови могу поставити за рачунање специјација и једноставним интерфејсом према осталим апликацијама Windows OS, као што су Word процесор или табеларни прорачуни (Excel), за резултате израчунавања. Такође, опција титрационих симулација може се ефикасно користити и у дидактичке сврхе. Дијаграми које софтвер HySS производи подешени су са посебном пажњом да би се могли користити у рукописима који се припремају за публиковање. Стандардне величине дијаграма са ширинама 16,5 и 8,25 cm су прикладне за директну репродукцију у једној или две колоне странице формата А4 према препорукама Америчког хемијског друштва (American Chemical Society). Такође, одговарајуће написане хемијске формуле могу се написати према потреби и жељи у дијаграмима, једноставним опцијама и операцијама помоћу компјутерског миша. Дијаграми се могу памтити и као Windows Metafiles, као векторски графички фајлови омогућујући потребно подешавање величине. HySS садржи седам примера фајлова података који илуструју различите начине рада програма. За програм HySS појам врсте означава једињење које садржи више од једног реактанта. На пример, у систему са два реактанта, базом L и протоном H, могу бити различите врсте (LH, LH2, LH3…). Хидролитичке врсте се приказују формулом MLH-1, али због начина како су равнотежне константе дефинисане, израчунате концентрације оваквих врста су идентичне као концентрације врста типа ML(OH). Појам стехиометријски коефицијенти се односи на бројеве mol реактаната у једном mol и они се у хемијским формулама пишу као коефицијенти.65 61 Докторска дисертација Општи део 1.3.4.2. ECCLES ECCLES (Evaluation of Constituent Concentrations in Large Equilibrium Systems)64 је компјутерски програм намењен за процену концентрација компоненти у вишекомпонентним системима. Настао је у тренутку када су постојећи програми за специјације COMICS, SCOGS, MINIQUAD, LETAGRUP и HALTAFALL били неадекватни за изучавање модела који су поставили Меј (May) и сарадници. Служи за предвиђања и описивање in vivo понашања испитиваних система метал-лиганд. Најзначајнија предност овог програма је могућност прорачуна модела који садрже до 50 металних јона и око 100 лиганада истовремено, као и то што даје тачне концентрације сваког комплекса приликом смањења концентрација компонената као и релативне проценте (%) сваке компоненте. Крајњи резултат такође приказује индивидуално сваки метал или лиганд са одговарајућом концентрацијом и релативним процентом (%). Програм се заснива на трострукој процедури апроксимација која даје брзу конвергенцију, док у исто време одржава значајно мањим компјутерске захтеве него у случају употребе програма COMICS. Програм захтева константе стабилности комплекса, вредности концентрације металних јона и лиганада ради израчунавања дистрибуција компонената на датој вредности pH. Најкраћи опис програма ECCLES се заснива на једначини формирања типичног протонованог металног комплекса са константом kji HLMkHjLiM →++ + [ ] [ ] [ ] [ ]kji kjikji HLM KLMM=,,β у којој су ради једноставности избачена наелектрисања. Систем је описан серијом једначина баланса масе за сваку компоненту. Укупна једначина баланса масе за метални јон је ∑+= q qmm iCXT , (97) где је -аналитичка концентрација јона метала, -концентрација слободног- некомплексираног металног јона, -концентрација комплексне врсте , и - стехиометријски коефицијенат металног јона у комплексима врстама . Када се унесу захтевани подаци (почетна концентрација метала, лиганда, pH, и константe стабилности), ECCLES програм користи једначину са три модификације конвергенције преко Гаус-Њутноновог (Gauss-Newton) процеса минимизације да би израчунао крајње дистрибуције врста у раствору. mT mX qC q i q Опис алгоритма компјутерског програма ECCLES Потребно је пронаћи слободне концентрације компонената у вишекомпонентном систему метал-лиганд који је у равнотежи. Концентрација сваке комплексне врсте се одређује по једначини (92). Решење се постиже итеративним побољшањима процењених слободних концентрација док се не задовоље једначине баланса масе за сваку компоненту по једначини (93). Постоји читав низ применљивих техника оптимизације ради уопштавања проблема, али је примењена одговарајућа процедура која је погодна за велике системе који се проучавају. Првих неколико итерација се заснивају на једначини [ ]∑+= j o jj o m o m r mn m jmkSGX XTX ),(` (98) 62 Докторска дисертација Општи део где је апроксимација . ) )//()/( ),(`' om r m jikc i i r ij TTTTG ∏= //()/( ),( omrmjikcirii i j XCXXXG ∏= Показало се да једначина (98) може конвергирати у обезбеђујући да су све почетне > . Овај захтев је аутоматски задовољавајући у дефиницији у којој су почетне вредности за узете као једнаке укупним реалним концентрацијама, . Ових неколико првих итерација брзо производе вредности које су у близини раствора. Са бројем итерација као критеријумом, ово уређивање може се применити као искључиво. t mX 0 iX r iX ' jG 0 mX r mT Надаље ће израз ) увек конвертовати Xm0 у вредност Xmn која је мања него жељена реална концентрација. Кад би се израз који су користили Перин (Perrin) и Сејс (Sayce) у програму COMICS преписао као /( cm r m o m n m TTXX = [ ])/(0 cmrmrmmnm TTTXX = [ ] , именилац би био између вредности која би пребацила и која не би производила побољшање. По завршетку примене једначине c mT r mT ∑ j r m G T += jom n m X XX ` o j o m jmkS ),( , програм се преусмерава у средњу фазу у којој се итерациона формула Перина (Perrin) и Сајса (Sayce), користи у потпуности а захтева знатно мање прорачуна од претходне. По достизању овог нивоа, израз )cm/( r m o m n m TTXX = [ ])cmT/(rm T0 rmmnm TXX = се користи као резервни циклус за итерације. То побољшава стопу конвергенције у крајњим фазама.64 Значења симбола коришћених у опису алгоритма ECCLES компјутерског програма описана су у списку ознака докторске дисертације. 1.3.4.3. MINTEQA2 У неким радовима за симулацију дистрибуције Gd3+ специјације у хуманом инестиналном флуиду коришћен је MINTENQA2 програм који је развијен у америчкој агенцији за заштиту природне околине. MINTENQA2 је геохемијски модел који има могућност израчунавања равнотежа водених специјација, адсорпције, гасно фазних подела, стања засићења чврстих фаза и преципитације-растварања метала. MINTENQA2 може решити широк опсег проблема хемијских равнотежа. Модел садржи екстензивну термодинамичку базу података која садржи равнотеже метал-лиганд- протон, формирање хидроксида, растворљивост, адсорпцију, коначно чврсте, могуће чврсте, искључене врсте, јонску јачину као и температурне детаље. 1.3.4.4. BEST/SPE Програм BEST/SPE68 публикован је 1982. године, и основни алгоритам програма се заснива на једначини баланса масе за све врсте присутне у раствору. Концентрација сваке компоненте у једначинама баланса масе могу се написати за лиганде, метале, pH, и индивидуалне константе стабилности. Програм BEST/SPE захтева уобичајене титрационе податке (почетне концентрације метала и лиганада са pH вредностима у свакој титрационој тачки у експерименту). Програм након тога користи једначине баланса масе да би направио почетне претпоставке у првом сету константи формирања, након чега врши њихову итерацију Њутн-Рапсоновом (Newton-Raphson) методом за решавање истовремених једначина. Процес подешавања се прекида када се уочи непостојање побољшања и кад се постигне најбоље „фитовање“ (подешавање), титрационих кривих. Најбоље подешавање је постигнуто када су квадрати разлика између измерених и компјутерских вредности pH достигли минималну вредност. 63 Докторска дисертација Општи део Програм SPE је дизајниран као специјациони програм један иза другог са резултатима програма BEST, и као такав представља паралелу програму ECCLES, осим екстра графичке компоненте. Програм SPE захтева једино константе стабилности и почетне концентрације метала и лиганада ради цртања комплетних специјационих дијаграма. У неким радовима, компјутерски програми BEST/SPE и ECCLES су коришћени симултано у одређивању концентрација металних комплекса присутних у хуманој крвној плазми. 1.3.4.5. MEDUSA Софтвер сачињавају три главне компоненте: HYDRA (Hydrochemical Equilibrium Constant Database), MEDUSA (Make Equilibrium Diagrams Using Sophisticated Algorithms) и INPUT, SED и PREDOM софтверски пакети. HYDRA је софтвер који се користи за креирање фајлова података из равнотежних константи које су доступне у електронској бази података. Она представља Windows апликацију која креира улазне фајлове за SED и PREDOM софтверске пакете. Програм користи базу података која је развијена у Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden. MEDUSA је компјутерски програм намењен за израду равнотежних дијаграма. Она је Windows интерфејс за INPUT, SED и PREDOM софтверски пакет. INPUT, SED и PREDOM су MS-DOS софтверски пакети који креирају хемијске равнотежне дијаграме. Овај софтверски пакет нема у себи податке о равнотежним константама, већ корисник мора унети расположиве равнотежне константе у електронску базу. INPUT барата фајловима података (креирање, едитовање, ...), застарео је и потиснут је програмом MEDUSA. SED служи за креирање дијаграма фракција (дистрибуција врста дате хемијске компоненте), логаритамских дијаграма (концентрација у логаритамској скали за све врсте у хемијском систему) и дијаграма растворљивости (укупне растворене концентрације у функцији слободних концентрација). PREDOM креира предоминантне просторне дијаграме. Улазни и излазни фајлови су plain text files. Улазни фајлови за SED и PREDOM имају имена која се завршавају на "x.DAT" и морају се писати у складу са посебним input-file форматом. Дијаграми имају имена фајлова који се завршавају са "x.PLT" и садрже графике у посебном plot-file формату. Фајл CU.DAT је улазни фајл за програм SED и фајл CU-S- O.DAT је пример за програм PREDOM. TEST.PLT је тест фајл за цртање. Остали примери улазних и фајлова за цртање могу се пронаћи у суб-директоријуму "\EXAMPLES". 1.3.4.6. MINEQL+ MINEQL+ је једноставан софтвер за моделовање система хемијских равнотежа, за израчунавање у воденим системима у температурном опсегу од 0-50°C и малим и средњим јонским јачинама (<0,5 mol). MINEQL+ је програм који користи податке па не постоји потреба његовог програмирања. То поједностављено значи да је потребно креирати систем селектовањем хемијских компоненти из понуђеног менија, претражити термодинамичку базу података и покренути израчунавања. Међутим, програм такође обезбеђује алате који омогућавају контролу реакционих података, креирање термодинамичке базе података, извршавање синтетичких титрација ... Програм се заснива на два извора моћи. Прво, његова нумеричка машина је модификована верзија оригиналног MINEQL развијеног средином 1970-тих, који је постао стандард за пуно осталих модела хемијских равнотежа. Друго, MINEQL+ користи термодинамичку базу података која садржи целокупну USEPA MINTEQA2 базу података са подацима за хемијске компоненте које EPA не садржи, тако да су сви 64 Докторска дисертација Општи део прорачуни компатибилни са EPA спецификацијама. Софтвер ради под Windows OS (Vista/XP/98/2000/NT). 1.3.4.7. JESS JESS (Joint Expert Speciation System)66 је истраживачки софтвер који служи за моделовање хемијских специјација у комплексним воденим растворима. Програм захтева поседовање експертског знања хемије раствора и обухвата преко 250 програма, 2000 суб-рутина, око 234000 линија Фортран кода, а у термодинамичкој бази података око 72000 реакција и око 215000 константи. Примењује се под Windows OS XP. У већини JESS моделовања, специјација се прорачунава коришћењем познатих термодинамичких параметара за релевантне реакције у воденим срединама. Сви типови хемијских равнотежа могу се моделовати, укључујући протоновање, формирање комплекса, редокс, растворљивост и интеракције апсорпције. Подаци се узимају из JESS базе података, трансформишу у термодинамички сет једначина и решавају. Аутоматизација ове процедуре JESS програмом је кључна процедура доброг равнотежног моделовања. Бављење разлозима зашто су модели хемијских специјација од различитих истраживача противречни, једна је посебних прилаза програма JESS. Програм садржи неколико великих равнотежних модела са кинетичким прорачунима. Развој JESS термодинамичке базе података је у овом тренутку унапређен. Систем је превладао многе проблеме који су постојали са постојећим компилацијама равнотежних константи. Она је у потпуности интерактивна. Реакције се могу исказати у било којој форми. Било које вредности равнотежних константи, енталпије, ентропије и Гибсове (Gibbs) енергије могу бити придружене са реакцијом. Распон података интеракција у раствору садржи преко 100 металних јона са преко 3000 лиганада. Делови програма JESS олакшавају формирање суб-база података са разменом података између база. Основне карактеристике термодинамичке базе података су: − Подаци су генерално приближни начину на који су они приказани и појављују се у литератури и једино су од стране програма прилагођени ради постизања термодинамичке конзистентности. JESS база података је највећа база података која се може користити директно од стране програма за моделовање хемијских специјација. − Обзиром да се реакције третирају на уопштен начин, JESS се односи према многим типовима хемијских интеракција на начин какав остале базе података нису у могућности. Гибсова (Gibbs) енергија и топлота формирања врста од елемената у њиховим стандардним стањима се због тога користи као додатак реакцијама везивања типа метал-лиганд и лиганд-протон. − За разлику од осталих компилација равнотежних константи, формирање тернарних комплекса је представљено бинарним реакцијама. Подаци се због тога могу пронаћи директно претраживањем металног јона и укључених лиганда. JESS база података представља највећи појединачни извор тернарних равнотежних константи. − Хемијске супстанце су индексиране по имену, молекулској формули, и често по CAS регистарском броју. Уопштено, JESS софтвер поседује много варијанти хемијских имена од оних која се налазе у алтернативним изворима. − Свака вредност термодинамичког параметра је приказана са условима под којим су мерења вршена, (електролит, температура, јонска јачина, литературни извор, процена поузданости ...). Овакав начин JESS базу чини свеобухватном и критичком. У већини JESS моделовања, специјација се прорачунава коришћењем познатих термодинамичких параметара за релевантне реакције у воденим срединама. Сви типови хемијских равнотежа, укључујући протоновање, формирање комплекса, редокс реакције, растворљивост и адсорпција, могу се моделовати. Варијације у релативној количини компоненти, јонској јачини, температури као и pH раствора се у потпуности 65 Докторска дисертација Општи део 66 узимају у обзир. Профил свих присутних врста је постигнут, без обзира колико мало од сваке врсте може бити присутно. Израчунавања су због тога посебно корисна када систем није одговоран експерименталном истраживању, било због тога што је сувише компликован или је изван аналитичког опсега. Обзиром да су специјациони модели термодинамички засновани, не емпиријски, њихови резултати су увек значајни, у крајњем унутар ограничења доступних термодинамичких података. JESS програм пружа могућност приступа кинетичким моделима равнотежа. Обзиром да кинетички феномени зависе умногоме од преовлађујућих услова и да не постоје фундаментални подаци који су еквивалентни онима за хемијску равнотежу, кинетички модели су много више лимитирани него термодинамички у погледу њихових могућности предвиђања. Ови модели могу помоћи да се идентификују кључни фактори који су познати о систему.66 Докторска дисертација Општи део 1.4. Хумана плазма као средина у којој се формирају комплекси 1.4.1. Крвна плазма Крвна плазма је жућкаста течност која се добија након центрифугирања крвних елемената. Чини је вода, у којој су растворене соли и беланчевине. Ван ћелијска је течност која се добија када се из незгрушане крви издвоје крвне ћелије. Сама реч плазма је грчког порекла и значи стварање. Физичке особине плазме су: количина, боја, специфична тежина, вискозност, осмотски притисак и pH. Количина плазме у организму износи око 41 cm³/kg телесне масе, што чини више од половине целокупне запремине крви (2750-3300 mL плазме у телу одраслог човека). Смањује се при повећаном знојењу, а у току трудноће може се повећати чак и до 30%. Боја крвне плазме и серума је жућкаста и бистра. Делом, она потиче од билирубина који настаје разградњом хемоглобина, а делом од обојених супстанци каротина. При повећању билирубина у крви, боја крвне плазме је интезивно жута или жуто-мрка. Ненормално распадање еритроцита повлачи и промену боје плазме у ружичасту до црвене, због појаве хемоглобина у плазми. Крвна плазма не садржи црвене и беле крвне ћелије (еритроците и леукоците). Садржи око 90% воде, у којој су растворене анорганске соли, а највише кухињске соли (NaCl), и то око 9 g у литру плазме (0.9% односно 0.15 mol/dm3). У крвној плазми се налази велика количина различитих беланчевина од којих су најзначајнији: албумини, глобулини и фибриноген. Беланчевинама крвне плазме је задатак пренос појединих хормона, имунолошка обрана од микроорганизама као противтела (гама глобулин), те у згрушавању крви (фибриноген). Приближно половину укупних протеина плазме чини протеин албумин. Он је транспортни протеин за велики број различитих молекула. Слободна амино група на N-крају важна је у транспорту „метала у траговима“ (Zn2+, Cu2+). Важан је за одржавање осмотске равнотеже, јер велико смањења његовог нивоа у крви може довести до отицања ткива ради задржавања воде. Од укупне количине глобулина 3% су α1-глобулини (важни за транспорт липида), 7% α2-глобулини (важни за транспорт гвожђа и бакра), 9% β- глобулина (важни за транспорт гвожћа и липида) и 17% γ-глобулина (важни за имуно систем). Велики број „правих“ протеина плазме су транспортни протеини. Трансферин специфично веже Fe3+, церулоплазмин специфично веже Cu2+, хаптоглобин веже димере хемоглобина који настају разградњом тетрамера након прераног распада еритроцита у циркулацији. Протеине плазме је могуће раздвојити електрофорезом. Анода (+) Катода (-) Слика 43. Раздвајање протеина плазме електрофорезом на pH=8.8 67 Докторска дисертација Општи део У значајним количинама у плазми су присутни три изотопа (IgG-75%, IgA-20% IgM-5%). У крвној плазми се налази и шећер и то око 1 грам у литри (5.5 mmol/dm3). Шећер (претежно глукоза) има важну улогу у обезбеђивању ћелија тела глукозом коју ћелије користе као извор енергије за свој рад. У крвној плазми налази се и извесна количина масти. Глукоза, амино киселине, липиди и неоргански јони се у плазми налазе унети из хране, уреа и мокраћна киселина долазе као продукти метаболизма, протеини имају основну улогу у заштитној функцији тела, а хормони обављају функцију молекула који се крећу између органа преко крви. Специфична тежина плазме и серума је мања од специфичне тежине крви (1.015- 1.030), а то је због тога што у крви имамо и еритроците. Специфична тежина плазме зависи од концентрације беланчевина. Може се измерити пикнометром. Вискозност крвне плазме и серума је три пута мања од вискозности крви, и највише зависи од односа албумина и глобулина. Повећање количине глобулина повлачи и повећање вискозности плазме. Осмотски притисак плазме је скоро исти као и код крви. Зависи од броја честица растворених у њој: катјона и анјона разних електролита, молекула органских једињења и колоидних честица. pH плазме је од 7.2-7.6. Крвна плазма је слабо базна, а у односу на крв је слабо базне реакције јер се при издвајању плазме из ње губи одређена количина CO2. Што се тиче хемијског састава крвне плазме она садржи велики број органских и неорганских супстанци. Неорганске супстанце су вода и неорганске соли. Вода чини од 90-92% крвне плазме и њена количина је стална. Вода из плазме чини део ванћелијске воде и током живота, њен проценат у плазми се мења. Неорганске соли чине око 0.8% крвне плазме и налазе се у виду катјона, анјона и олигоелемената. Катјони су: натријум, калијум, калцијум и магнезијум. Најважнији анјони су: хлориди, хидрогенкарбонати, фосфати и сулфати. Олигоелементи су: гвожђе, бакар, манган, кобалт, јод и др. Органске супстанце су: беланчевине, липиди, угљенохидрати, витамини, ензими и хормони. Беланчевине су највећи чврсти састојак крвне плазме. Деле се у три групе: фибриноген, албумини и серум глобулини. Фибриноген је најзначајнија беланчевина у коагулацији крви. По хемијском саставу спада у глобулине. Ствара се искључиво у јетри. Количина у плазми је од 0.3-0.5g %. Албумини су заступљени у плазми од 3.5- 5.0g %. Стварају се у јетри и улога је у одржавању осмотског притиска крви. Глобулина има у крвној плазми од 2-3 g %. Липиди, чија количина варира у крвној плазми зависно од врсте хране и времена које је протекло од оброка до времена узимања крви за одређивање липида. Угљeни хидрати су у већини у облику глукозе. Њена концентрација у крвној плазми је од 80- 120 mg %, али се после оброка повећава до 200 mg % да би се за 2-3 сата вратила на нормалну. Витамини су у крвној плазми заступљени у врло малим концентрацијама (Витамин А 0.025 mg %, Витамин Б1 0.0005 mg %, Витамин Б2 0.0008 mg %, Никотинска киселина 0.03 mg %, Витамин Б5 0.012 mg %, Витамин Б9 0.0017 mg %, Витамин Ц 0.75 mg %). Ензими потичу од гуштераче, јетре, мишића и крвних ћелија. Најпознатији су: фосфатазе, пептидазе, амилазе и трансаминазе. У крвној плазми се налазе хормони свих жлезда са унутрашњим лучењем. Њихове количине су врло мале. Улога плазме је вишеструка. Најзначајнија је транспортна, улога у регулацији pH крви, ћелија ткива, улога у хемостази и хомеостази. Транспортна улога се састоји у преносу многобројних супстанци до и од појединих ткива и органа. Обрамбена улога се остварује преко гамаглобулина из којих се стварају антитела против микроорганизама. 68 Докторска дисертација Општи део Улога у регулацији pH крви осигурава се преко органских и неорганских састојака плазме. Улога у хемостази остварује се преко коагулације крви. Преко крвне плазме из органа за варење доносе се различити електролити и друге материје и предају се међућелијској течности а ове ћелијама. Табела 14. Референтне вредности концентрације (mol/dm3) за јоне мале молекулске масе у плазми Молекул/Јон mol/dm3 Хлор (Cl-) (96-106)×10-6 Натријум (Na+) (136-146)×10-6 Калијум (K+) (3.8-5.2)×10-6 Слободни калцијум (Ca2+) (2.3-2.7)×10-6 Магнезијум (Mg2+) (0.8-1.2)×10-6 Бикарбонат (HCO3-) (24-28)×10-6 Аноргански фосфати (PO43-) (0.6-1.6)×10-6 Глукоза (4.5-5.5)×10-6 Не протеински азот (15-30)×10-6 Уреа (3.5-7)×10-6 Креатинин (70-140)×10-6 Креатин (25-70)×10-6 Триглицериди (0.6-2.4)×10-6 Холестерол (4-6.5)×10-6 Лактат (1-1.8)×10-6 Пируват (0.05-0.2)×10-6 Органске киселине (4-6)×10-6 Слободне масне киселине (0.3-0.9)×10-6 Фосфолипиди (2-3)×10-6 Ацетоацетат (0.1-0.3)×10-6 Аланин (0.2-0.6)×10-6 Мокраћна киселина (0.1-0.4)×10-6 1.4.2. База података крвне плазме-компјутерски модел крве плазме Број могућих реакција хемијских равнотежа који се могу десити у хуманој крвној плазми је многобројан. Хумана крвна плазма као динамички систем (медијум) садржи известан број различитих металних јона и велики број лиганада мале моларне масе. Меј (May) и сарадници су конструисали компјутерски модел хумане крвне плазме у покушају да израчунају концентрацију свих могућих врста у равнотежи и да објасне неколико клиничких обсервација. Овај модел покушава да симулира равнотеже комплексирања које се дешавају у крвној плазми и састоји се од 40 лиганада, 9 металних јона и око 5000 комплекса.64 За потребна израчунавања са овом великом базом података пројектован је посебан компјутерски програм ECCLES. У већини радова, ова база се користи као база у коју се додају одговарајуће константе и врсте јона који представљају предмет изучавања и симулација. Константе се уносе из расположивих литературних података, а у случајевима где су исти системи проучавани од стране неколико аутора, резултати су критички сагледавани и селектовани. У ситуацијама кад су константе биле потенцијално важне а за њих нису постојали расположиви подаци, вредности су процењиване или употребом релација линеарне слободне енергије (LFER) или по хемијској аналогији. Формирање комплекса мешовитих лиганада дешава се нашироко у биолошким флуидима, што се 69 Докторска дисертација Општи део 70 показало као веома важно. Избор лиганада мале молекулске масе за модел који се проучавао, Меј (May) и сарадници (табела 15) су изабрали на основу критеријума њихове концентрације и расположивости и важности података константи формирања за комплексе метал-лиганд. Већина концентрација представљају средње вредности од неколико публикованих. Неке од концентрација лиганада (салицилат и триптофан) су умањене. Уреа, масне киселине, билирубин и фолна киселина су искључене из модела због тога што су оне готово потпуно везане за протеине. Метални јони Ca2+, Mg2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Pb2+, Mn2+, Zn2+ су одабрани је су најзаступљенији у хуманој крвној плазми и њихова биолошка улога је најпознатија и истражена. Проблеми који се односе на везивање протеина и метала онемогућују дефинисање недвосмисленог скупа концентрација сем у случају Ca2+. Стога, у симулацији дистрибуције осталих металних јона између комплекса мале молекуларне масе, одлучено је да се покрије опсег веродостојних слободних концентрација за сваки, док се процењене средње вредности приказују у заградама. Процењене средње вредности и концентрације за слободне металне јоне приказане су у табели 15. Табела 15. Укупне концентрације лиганада и металних јона који се користе као компјутерска база података ухуманој крвној плазми (mol/dm3)64 Компонента [mol/dm3] Компонента [mol/dm3] Протеини Неоргански лиганди Хумани серум албумин (HSA) 7.2×10-4 Карбонат (CO32-) 2.5×10-2 Трансферин (Tf) 2.5×10-5 Фосфат (PO42-) 1.6×10-3 Аминокиселине Тиоцијанат (SCN-) 1.4×10-5 Аланин (Ala) 3.7×10-4 Силикат (Sil) 1.4×10-4 Аминобутират (Ambu) 2.4×10-5 Сулфат (SO42-) 2.1×10-4 Аргинин (Arg) 9.5×10-5 Амонијак (NH3-) 2.4×10-5 Аспарагин (Asn) 5.5×10-5 OH- 1.2×10-6 Аспартат (Asp) 5.0×10-6 Карбоксилне киселине Цистеин (Cys) 2.3×10-5 Цитрат (Cit) 1.1×10-4 Цистин (Cis) 4.0×10-5 Лактат (Lac) 1.8×10-3 Цитрулин (Citrl) 2.7×10-5 Малат (Mal) 3.5×10-5 Глутамин (Gln) 4.8×10-5 Оксалат (Oxa) 1.2×10-5 Глутаминат (Glu) 5.2×10-4 Пируват (Pyr) 9.5×10-5 Глицин (Gly) 2.4×10-4 Салицилат (Sal) 5.0×10-6 Хистидин (His) 8.5×10-5 Суцинат (Succ) 4.2×10-5 Хистамин (Hsn) 1.0×10-8 Аскорбат (Asc) 4.3×10-5 Хидроксипролинат (Hypro) 7.0×10-6 Метални јони Изолеуцинат (Ile) 6.5×10-5 Ca2+ 1.43×10-3 Леуцин (Leu) 1.2×10-4 Mg2+ 6.48×10-4 Лизин (Lys) 1.8×10-4 Cu2+ 1.0×10-18 Метионин (Met) 2.9×10-5 Fe2+ 1.0×10-11 Орнитин (Orn) 5.8×10-5 Fe3+ 1.0×10-23 Фенилаланин (Phe) 6.4×10-5 Pb2+ 1.0×10-14 Пролин (Pro) 2.1×10-4 Mn2+ 1.79×10-12 Серин (Ser) 1.2×10-4 Zn2+ 1.0×10-9 Треонин (Thr) 1.5×10-4 Ni2+ 9.9×10-8 Триптофосфат (Trp) 1.0×10-5 V3+ 1.0×10-9 Тирозин (Tyr) 5.8×10-5 V5+ 6.0×10-8 Валин (Val) 2.3×10-4 VO2+ 1.0×10-9 Bi3+ 2.0×10-8 Докторска дисертација Општи део 1.5. Физиолошка специјација јона метала у плазми 1.5.1. Модели симулације равнотежа метал-јон у биофлуидима (May-ов компјутерски модел хумане крвне плазме) Калцијум (Ca2+) Концентрација Ca2+ јона у плазми је релативно висока (1.14×10-3 mol/dm3) и могуће је одредити директно специфичним јон селективним електродама. Бакар (Cu2+) Обзиром да је укупна концентрација бакра Cu2+ у крвној плазми 1.8×10-5 mol/dm3, највећим делом чврсто везана за церулоплазмин, укупна концентрација заменљивог бакра је 1×10-6 mol/dm3, при чему је већи проценат овог везан за хумани серум албумин. На темељу познавања константе дисоцијације бакар-албумин комплекса, мањи лимит за концентрацију слободног бакра је процењен на 10-19 mol/dm3. Конзервативан горњи лимит од 10-11 mol/dm3 је предложен чињеницом да је концентрација слободног Cu2+ јона мања од детекционог лимита јон-селективних електрода (10-9 mol/dm3) у експериментима Neumann-a и Sass-Kortsak-a. У каснијим радовима, уочено је да је да су односи бакра у албумину 0,4% када је метал ултрафилтрован. Треба нагласити да су истраживања Neumann-а и Sass-Kortsak-а извршена са укупним концентрацијама које су значајно у вишку од нормалне вредности у плазми, и због тога процене засноване на њиховим резултатима су на граници да буду јако пристрасне према горњим концентрационим лимитима. Гвожђе (Fe3+) Готово сви јони гвожђа Fe3+ су везани за трансферин. Коришћењем вредности константе везивања извештене од стране ААса (AAsa) и сарадника, могуће је извести закључак о концентрацији слободних Fe3+ јона у вредности од 10-24 mol/dm3. Горњи лимит слободне концентрације Fe3+ јона под физиолошким околностима је 10-18 mol/dm3 и условљен је производом растворљивости FeIII хидроксида. Олово (Pb2+) Укупна концентрација олова Pb2+ у плазми варира значајно, али извештена вредност је 5×10-7 mol/dm3. Комбиновањем са подацима Гуарда и Мураја (Guard and Murray), процењено је да је максимална слободна концентрације мања од 10-10 mol/dm3 у здравој хуманој крвној плазми. Обзиром да су многи протеини компетитивни са оловом, нормална вредност изгледа је значајно мања од тога. Интересантно је да симптоми плумбизма постају видљиви када укупна концентрација олова достигне вредност од 3×10-6 mol/dm3. Магнезијум (Mg2+) Употребом измењиве мембране Хетон (Heaton) је закључио да је јонизовани магнезијум Mg2+ просечно 79% од нефилтрираног магнезијума у серуму. Може се закључити да концентрација слободног Mg2+ лежи у опсегу 5.1-5.5×10-4 mol/dm3. Манган (Mn2+) Из студија о везивању мангана Mn2+ за албумин, концентрација слободног Mn2+ је процењена на максималну вредност 5×10-8 mol/dm3. Постоје различите тврдње везане за протеине за које је овај метал селективно везан. Остали радови критички се односе према укупној концентрацији у плазми на подручју контаминације. Из тих разлога резонски изгледа да се скенира концентрација слободног Mn2+ до крајњих лимита од 10-8 mol/dm3 силазно. 71 Докторска дисертација Општи део Цинк (Zn2+) Иако је вредност 4.6×10-5 mol/dm3 за укупну концентрацију цинка Zn2+, извештена неколико пута, по свему судећи је ова вредност погрешна, па је вредност од 1.6×10-5 mol/dm3 вероватнија. Обзиром да је од 10-20% укупног цинка везано за металопротеин α2-макроглобулин, концентрација измењивог цинка је процењена на 1×10-5 mol/dm3. Албумин везује велику фракцију измењивог цинка у лабилну равнотежу. Из вредности константе за комплекс цинк-албумин, изведена концентрација слободног цинка је око 10-9 mol/dm3. У складу са неизвесношћу ове вредност, и опсег од 10-11-10-8 mol/dm3 изгледа прихватљиво. У истраживаним моделима, Zn2+ је углавном везан за хумани серум албумин (од 80-90%), док је од 10-20% везан за α2- макроглобулин. Преостали део (<3%) се везује за лиганде мале молекулске масе. Избор комплекса за компјутерску симулацију је заснован делом на расположивости у литератури, из извештених или експерименталних радова индивидуалних система метал-лиганд. Обзиром да се мешовити тернарни комплекси формирају у системима који садрже металне јоне и два или више различитих лиганада, сви ови расположиви комплекси су укључени у разматрани систем. Интензивним проучавањем литературе за први посматрани модел, Меј (May) и сарадници су укључили у систем вредности константи формирања преко 250 мононуклеарних бинарних, лиганд протон и протонованих метал лиганд комплекса мерених под физиолошким условима, са око 400 сличних типова комплекса мерених под условима који су различити од крвне плазме, као и око 100 тернарних мешовитих комплекса. Имајући у виду да су вредности појединих константи које су публиковане биле различите, исте су критички процењиване, док су неке и изостављене. У ситуацијама где је било расположиво довољно података, узимане су средње вредности. Вршене су корекције Дебај-Хикеловом (Debye-Huckel) једначином за јонску јачину (-lgγB=zB2 AI1/2(1+åBI1/2), где је I-јонска јачина, z-број наелектрисаних јона, å-параметар величине јона и A,B-температурне константе) по аналогији са експерименталним дијаграмима јонске јачине Гергела (Gergely) и сарадника и Ван Хофофовом (Van’t Hoff) једначином (d lnK/dT=ΔrH0/RT2, где је K-константа равнотеже реакције, ΔrH0-стандардна енталпија, R-гасна константа и T-температура) за температурне корекције (у свим ситуацијама где су постојале константе које су мерене под не-физиолошким условима). Додатних 350 мононуклеарних бинарних или протонованих комплекса за које се сматрало да су потенцијално важни за крвну плазму нису имали вредности константе. Недостајуће константе су дефинисане проценом, применом разноврсних метода. Једна од таквих је примена принципа линеарне слободне енергије (LFER), и применом хемијских аналогија. Након почетних Мејових (May) радова, наредни модели за компјутерске симулације израђивани су коришћењем критичних база података као што је НИСТ-ова база критички селектованих константи стабилности металних комплекса (NIST Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes Database). НИСТ-ова база пружа вредности константи стабилности, енталпија и ентропија протона и равнотежа металних јона са лигандима у воденим растворима под дефинисаним условима јонске јачине и температуре. Подаци су критички разматрани ради прецизности и конзистентности. Приликом формирања посматраних модела најчешћи извори грешака у равнотежним константама су: - Употреба равнотежних константи уместо константи формирања, - Константе формирања не изражавају бесконачна разблажења и - Оскудан избор константи. У погледу малобројности расположивих константи формирања за тернарне комплексе и очекиване доминантне улоге ових у молекуларним фракцијама мале масе у крвној плазми, процене су извршене за око 4000 додатних тернарних константи, 72 Докторска дисертација Општи део разматраних као неопходних за укључивање у модел употребом релевантних бинарних константи, статистичких и стабилизационих фактора. Процене стабилизационих фактора су базиране где је било могуће на основу експериментално одређених фактора аналогних комплекса. Слика 44. NIST Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes Database67 Да би се кориговале константе формирања тернарних комплекса које су експериментално измерене у другим физиолошким условима, извршена је корелација на сваком стабилизационом фактору употребом једначине ⎥⎥⎦ ⎤ ⎢⎢⎣ ⎡ × ××Δ=Δ .)(exp)(exp )(mod)(mod .)(explog)(modlog 22 22 tt elel tel MBMA MBMA MABMAB ββ ββββ , (99) где је )(modlog elMABβΔ -измерен стабилизациони фактор примењив на модел (нпр. физиолошки) услова, .)(explog tMABβΔ -опажен фактор мерења под не-физиолошким условима [ ] 2log.)(explog.)(explog 2 1.) 22 −+− ttt MBMA ββ(explogΔ= MABβ , MABβ -константа формирања тернарног комплекса MAB, који формиран између метала М и два метала А и B, 2MB β и 2MA β су кумулативне константе бинарних комплекса МА2 и МB2, квалификатор (expt.)-односи се на експерименталне константе које су одређене под нефизиолошким условима и (model) се примењује на константе формирања измерене на коригованим условима модела. Измерен стабилизациони фактор се потом користи заједно са релевантним константама бинарних комплекса (при физиолошким условима), а статистички фактори да би постигли корекцију тернарних константи. Употребом средњих концентрација јона метала и укупних концентрација лиганада, извршена је компјутерска симулација међу скоро 5000 комплекса на три посебне вредности pH (7.2, 7.4 и 7.6) које су у опсегу средњих вредности у плазми. 73 Докторска дисертација Општи део Табела 16. % дистрибуције металних јона Ca2+, Cu2+, Fe3+, Pb2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ међу лигандима мале молек. масе у хуманој плазми пронађеним компјутерском симулацијом % укупног метала у фракцији Комплекс Наелектрисање pH=7.2 pH=7.4 pH=7.6 Ca2+ Протонован карбонат Цитрат Лактат Фосфат Карбонат +1 -1 +1 -1 0 9 4 3 2 1 9 4 3 3 2 9 4 3 4 3 Cu2+ Цистин хистидин Протонован цистин хистидин Бисхистидин Хистидин треонин Хистидин валин Протонован хистидин лизин Аланин хистидин Хистидин серин Хистидин фенилаланин Глицин хистидин Хистидин леуцин Глутамат хистидин Глутаминат хистидин Протонован хистидин орнитин Хистидин пролин Хистидин изолеуцин Хистидин триптофан -1 0 0 0 0 +1 0 0 0 0 0 -1 0 +1 0 0 0 16 20 12 9 5 5 4 4 3 3 2 2 2 2 2 1 1 21 17 11 8 5 5 4 4 3 3 2 2 2 2 1 1 1 28 14 10 7 5 4 4 4 3 3 2 2 2 1 1 1 1 Fe3+ Цитрат хидроксид Цитрат салицилат Цитрат глутамат Цитрат оксалат -1 -2 -2 -2 99 <1 <1 <1 99 <1 <1 <1 99 <1 <1 <1 Pb2+ Цистеин Цитрат цистеин Протонован цистин Протонован цистин фосфат Протонован карбонат Протонован бисцистинат 0 -3 +1 -2 +1 -1 76 6 8 2 5 1 80 7 5 3 2 2 82 7 3 3 1 3 Mg2+ Протонован карбонат Цитрат Карбонат Лактат Протонован фосфат +1 -1 0 +1 0 5 5 1 2 1 6 5 2 2 1 6 4 4 2 1 Mn2+ Протонован карбонат Цитрат Карбонат Оксалат Протонован фосфат +1 -1 0 0 0 24 10 1 2 1 24 10 2 2 1 24 9 4 2 1 Zn2+ Цитрат цистин Бис цистеин Цистеин хистидин Цустеин Хистидин Протонован бис цистеин Бис хистидин Цистеин глутамин -3 -2 -1 0 +1 -1 0 -1 50 9 9 4 4 1 2 <1 43 19 12 3 3 1 1 1 33 33 14 2 1 2 1 1 74 Докторска дисертација Општи део Табела 16 (страна 74) показује доминантне комплексе за сваки метални јон, изражене као проценат од укупне концентрације посматраног металног јона у фракцији мале молекуларне масе у плазми. Компјутерском симулацијом одређена је концентрација металних јона у крвној плазми. Концентрације које се користе у моделу комплексирања у крвној плазми су засноване на очекиваним количинама свих индивидуалних компоненати у крвној плазми. Табела 17. Поређење концентрација метала добијених компјутерском симулацијом са укупном концентрацијом процењеном на основу експерименталних разматрања Концентрација јона постигнута компјутерском симулацијом (mol/dm3) Експериментална концентрација (mol/dm3) Јон Конц. (mol/dm3) pH=7,2 pH=7,4 pH=7,6 a b % јона везаног за протеин Ca2+ 1.14×10-3 1.43×10-3 1.46×10-3 1.51×10-3 3×10-4 2.45×10-2 45 Cu2+ 10-18 6.01×10-12 1.57×10-11 4.14×10-11 10-12-10-9 1×10-6 >99 Fe3+ 10-23 4.24×10-13 6.68×10-13 1.06×10-12 / 2.2×10-5 100 Pb2+ 10-14 2.67×10-11 5.88×10-11 1.3×10-10 / 5×10-7 / Mg2+ 5.2×10-4 6.48×10-4 6.56×10-4 6.67×10-4 1.2×10-4 9×10-4 30 Mn2+ 10-12 1.79×10-12 1.83×10-12 1.89×10-12 / 10-8-10-6 / Zn2+ 10-9 6.91×10-8 1.84×10-7 5.5×10-7 10-7-10-6 1×10-5 >95 a-концентрација комплекса (искључена концентрација слободног јона метала). b-Укупна измењива концентрација метал-јон. Табела 18 приказује концентрације слободних лиганада добијених компјутерском симулацијом, на средњој pH вредности хумане крвне плазме. Табела 18. Концентрације слободних лиганада у плазми добијених симулацијом на вредности pH=7.4 Лиганд Конц. (mol/dm3) Компонента Конц. (mol/dm3) Аланин (Alanate) 2.87×10-6 Серин (Serinate) 4.2×10-6 Аминобутират (Aminobutyrate) 3.38×10-7 Треонин (Threoninate) 6.87×10-6 Аргинин (Arginine) 3.4×10-6 Триптофосфат (Tryptophanate) 1.97×10-7 Аспарагин (Asparaginate) 2.69×10-8 Тирозин (Tyrosinate) 3.49×10-9 Аспартат (Aspartate) 7.56×10-8 Валин (Valinate) 2.66×10-6 Цистеин (Cysteinate) 5.94×10-9 Хистамин (Histamine) 1.92×10-10 Цистин (Cystinate) 4.61×10-7 Карбонат (Carbonate) 3.54×10-5 Цитрулин (Citrullinate) 1.27×10-6 Фосфат (Phospate) 3.4×10-8 Глутамин (Glutamate) 4.74×10-7 Тиоцијанат (Thiocyanate) 1.4×10-5 Глутаминат (Glutaminate) 1.84×10-5 Силикат (Silicate) 2.67×10-10 Глицин (Glycinate) 2.47×10-6 Сулфат (Sulphate) 2.04×10-4 Хистидин (Histidinate) 2.35×10-6 Амонијак (Ammonia) 6.55×10-7 Хидроксипролинат (Hydroxyprolinate) 8.59×10-8 Цитрат (Citrate) 2.67×10-5 Изолеуцинат (Isoleucinate) 6.95×10-7 Лактат (Lactate) 1.76×10-3 Леуцин (Leucinate) 1.32×10-6 Малат (Malate) 3.11×10-5 Лизин (Lysinate) 4.88×10-9 Оксалат (Oxalate) 1.03×10-5 Метионин (Methionate) 8.56×10-7 Пируват (Pyruvate) 9.41×10-5 Орнитин (Ornithinate) 5.35×10-9 Салицилат (Salicylate) 1.2×10-11 Фенилаланин (Phenylalanate) 1.97×10-6 Суцинат (Succinate) 4.04×10-5 Пролин (Prolinate) 2.6×10-7 Аскорбат (Ascorbate) 5.36×10-8 Ефекти pH приказани у табели 16 (страна 74) на дистрибуцију неких металних јона су значајнији од очекиваног. Пораст и смањење у степену формирања комплекса може се закључити и са повећањем вредности pH. Тернарни комплекси се формирају у већем проценту са јонима Cu2+ и Fe3+. Важнији комплекси Cu2+ садрже хистидин, а цитратни комплекси су међу најдоминантнијим комплексима Fe3+ јона. 75 Докторска дисертација Општи део Бинарни комплекси су фаворизовани са јонима Ca2+, Mg2+ и Mn2+. Јони Pb2+ и Zn2+ формирају и бинарне и тернарне комплексе као доминантне комплексе. Јон Pb2+ се појављује у граничним концентрацијама комплекса са цистеином и цистином. Остале амино киселине и метионин које садрже сумпор нису компетитивне са оловом. Ово се вероватно може приписати релативно малим вредностима константи формирања Pb2+- метионитних комплекса и могућности компетитивних реакција са јонима Ca2+ и Mg2+. Тернарне цистеин-цитратне металне врсте су важне и за јоне Pb2+ и Zn2+, сугеришући да је један од аспекта токсичности узрокован вишком олова, може заменити цинк оловом из половине цистеина извесних ензима. Поређење укупних концентрација комплекса мале молекулске масе са процењеним вредностима из експерименталних вредности, указују на задовољавајући ниво слагања коренсподентних вредности. То управо и указује и пружа уверење да модел није погрешан. У погледу непоузданости процена концентрација металних јона, извршено је истраживање које је укључило варирање слободне концентрације сваког металног јона у опсезима приказаним у табели 17 (страна 75) користећи примарни модел на три вредности pH као референтним. Ове концентрације представљају вредности упечатљивих опажања за све вредности pH, где је проценат дистрибуције био независтан од концентрација слободних металних јона у изабраном опсегу валидности и прецизности од 1%. Објашњење овог феномена лежи у чињеници да је формирање комплекса мале молекулске масе у плазми минимално. У ствари, слободне концентрације лиганада мале молекулске масе су уобичајено неколико пута у опсегу веће него концентрације комплекса. Према томе, концентрације слободних лиганада нису значајно кориговане променама у концентрацијама комплекса, тј. оне су концентрационо пуферисане. Веома мале укупне концентрације транзиционих јона метала, слабо везивање Ca2+ и Mg2+ јона, и смањење концентрација слободних јона метала њиховим везивањем за протеине су доприносећи фактори. Као последица концентрације сваког комплекса је готово директна пропорционалност концентрацијама слободних јона метала који су одабрани. Пошто је ово истинито за све мононуклеарне врсте, укупна концентрација сваког метала у фракцијама мале молекуларне масе је такође директно пропорционална концентрацији слободних јона метала. Стога, проценат појављивања метала у датим врстама је константан, без обзира на тачну концентрацију јона метала која постоји у равнотежи са протеинима. Због тога, грешке у концентрацијама слободних јона метала неће изменити постојећу слику. Овакав приступ заправо успешно врши тзв. бајпас грешака и потешкоћа које су присутне у симулацијама које укључују равнотеже везивања метала и протеина. Валидност примарног модела је постигнута из симулације за сваки од три посебне вредности pH, употребом горњих концентрација слободних метала из опсега њихових концентрација. На свакој посебној вредности pH, компјутерска дистрибуција је била унутар 2% од одговарајућих вредности (табела 16-страна 74). Значај овако постављеног примарног модела, лежи у чињеници да обезбеђује постулате реакција металних јона које се могу десити у крвној плазми или чак унутар ћелија подржаних од овог медијума. На пример, неки од доминантних комплексних врста могу партиципирати у механизмима где су метални јони инкорпорирани у/или уклоњени из макромолекула. У складу са резултатима у табели 16 (страна 74), измена Fe3+ јона између молекула трансферина се дешава преко мешовитог комплекса који укључује једино цитратни лиганд, пре него дицитратни комплекс како је раније сугерисано. Ово је и потврђено касније кинетичким истраживањима измена Fe3+ јона између хелата и трансферина, где гвожђе дицитрат није најреактивнија врста. Слично се може закључити и да измена јона Cu2+ и Pb2+ између протеина у плазми укључује мешовите комплексе, где измена јона Mn2+ укључује бинарне комплексе. Следећа важна примена тиче се пасивног транспорта транзиционих јона метала кроз биолошке мембране. Мора се нагласити да је значајно више знања о пасивном, од 76 Докторска дисертација Општи део активног транспорта. Генерално, пасивни транспорт је ограничен на електрично неутралне врсте а величина флукса је зависна од разлике у концентрацијама са обе стране мембране. Насупрот томе, наелектрисане врсте не могу проћи кроз мембране у мерљивим опсезима, због наелектрисања и мале концентрације, па су аква јони транзиционих метала у плазми неизвесни у погледу дифузије кроз мембране. Једино неутрални комплекси транзиционих метала су изгледни у погледу липидне растворљивости, па су због тога пасивно транспортовани кроз мембране. Да би допринео разумевању и пасивног и активног процеса транспорта, компјутерски модел би могао бити принципијелно коришћен у одређивању релативних концентрација комплекса малих молекулских маса транзиционих метала, у два биолошка флуида раздвојених одговарајућом мембраном. Симулација би се такође могла користити ради индикације како промене pH вредности утичу на дистрибуцију, посебно са аспекта присуства или одсуства наелектрисања на киселим или базним центрима комплекса. Због тога би и истраживања услова који би повећали или умањили флукс могли бити од значаја. Примери биолошких флуида који би се могли симулирати за ове намене су интерстицијумски флуид, цереброспинални флуид, гастро сокови и урин. Ови модели само чекају постојање потребних експерименталних информација о присутним металима и лигандима, са проценама њихових укупних концентрација. Међу есенцијалним металима, гвожђе је јединствено у поседовању јединствене форме хомеостатичке контроле у људском организму. Премда су механизми хомеостазе гвожђа проучени, једино десетина од дијетално унетог гвожђа је апсорбована, и поврх тога, тело поседује минималну способност екскреције овог елемента. Из тога се може закључити тенденција организма да чува гвожђе. Насупрот томе, у половини порфирина у хемоглобину, гвожђе је уклоњено деградацијом протеина и ускладиштено за накнадну употребу. Сви доминантни комплекси гвожђа су у крвој плазми негативно наелектрисани. То омогућава спекулацију да је сметња транспорту кроз мембране резултирана негативним наелектрисањем и немогућности тела да екскретује гвожђе. Апсорпција гвожђа се дешава кроз инестинални тракт углавном у дуоденуму, и основни фактор који то омогућава је растворљивост. Било који фактор који претендује да повећа растворљивост гвожђа помоћу којег би се спречавало таложење хидроксида и повећање pH вредности на излазу из абдомена би унапредио апсорпцију гвожђа. Нормални пут абсорпције гвожђа може бити бајпасован комплексима мале молекулске масе. Знање о начину на који су различити комплекси настали у биофлуидима ће засигурно бити употребљено у терапији анемије и сидерозе. На сличан начин се може употребити и знање о другим транзиционим металима који су употребљени у примарном моделу компјутерске симулације. Доста тога остаје као задатак да се унапреде детаљи модела крвне плазме: − Прецизно одређивање свих до сада неизмерених константи формирања за важне комплексе (хидрогенкарбонатни комплекси, магнезијум и калцијум са аминокиселинама ...); − Експериментална мерења многих константи формирања мешовитих комплекса; и − Побољшање процена концентрација слободних металних јона у плазми, посебно магнезијума; Обзиром да је натријум хлорид главни контрибутор јонској јачини у крвној плазми (0.15 mol/dm3), постоји значајно подешавање за употребу овог електролита у одређивањима константи формирања. Такође, температура би требала бити идентична нормалној температури тела од 37°C (310K). Упркос чињеници да се све може предвидети, важно је препознати да би негативни докази произашли из модела могли бити од највеће вредности. Значајна стабилност компјутерске дистрибуције металних јона међу комплексима мале молекулске масе указује да ниједан недостатак металног јона или пак његов вишак неће значајно изменити укупну дистрибуцију. Надаље, није тешко предочити да резултати могу указати да се неки комплекс или чак целокупна 77 Докторска дисертација Општи део 78 фракција металног јона мале молекулска масе, може елиминисати као могући учесник у различитим физиолошким процесима који се истражују.64 1.5.2. Плазма мобилизациони индекс (PMI)68 Меј (May) и Вилијамс (Williams) су указали да се ефикасност хелатних агенаса у мобилизацији јона метала из лабилних комплекса метал-протеин може изразити плазма мобилизационим индексом или PMI индексом. Формулисан на овакав начин, PMI индекс показује добру меру релативне термодинамичке способности хелатних агенаса да се везују за металне јоне у крвној плазми, показујући да концентрација јона метала у фракцијама мале молекулске масе остаје мала у поређењу са онима који су везани за протеине плазме као што су албумин и трансферин. PMI вредности указују који јони метала у плазми су значајније мобилисани додатим лигандом (који делује као лек). PMI фактор је нарочито користан јер је независтан од прецизног степена везивања метал-протеин. Међутим, PMI фактор не узима у обзир било који кинетички допринос достизања равнотеже. PMI се дефинише као количник укупне концентрације комплекса мале молекулске масе у хелатору (леку) и укупне концентрације комплекса мале молекулске масе у нормалној крвној плазми. plazmikrvnojumasemolekulskemalekompleksaijakoncentracUkupna FQhelatoruumasemolekulskemalekompleksaijakoncentracUkupna PMI )(= у нашем случају FQ) од логаритамске вредности PMI вредности (-log PMI=f(-log FQ)). Графички се приказује као функционална зависност логаритамске вредности концентрације хелатора или лека ( Докторска дисертација Општи део   79 1.6. Особине Gd3+-јона у воденим растворима У Земљиној кори концентрација гадолинијума је око 5 ppm. Као и остали лантаноиди, налази се у облику минерала монацита (GdPO4) и бастнезита (GdCO3F). Гадолинијум је сребрнасто бели метал, мек је и лако се обрађује. Јавља се у две алотропске модификаcије: α и β-гадолинијум. Загревањем преко 1262°C алфа гадолинијум прелази у бета гадолинијум. На сувом ваздуху је релативно стабилан, а на влажном ваздуху губи сјај због настанка танког оксидног слоја. Са разблаженим минералним киселинама реагује врло бурно, али је готово инертан према јаким базама и води. Гадолинијум се састоји из смеше седам стабилних изотопа, а утврђено је постојање још деветнаест радиоактивних изотопа и три изомера. Користи се за прављење магнета, у електроници, у неутронској радиографији, а у легури са гвожђем за израду магнето-оптичких апарата за снимање. Електронска конфигурација гадолинијума је [Xe] 4f7 5d1 6s2. У својим једињењима гадолинијум се јавља у оксидаcионим стањима Gd2+ (електронске конфигурације f 8) и Gd3+ (електронске конфигурације f7). Орбитале Gd3+ јона 5d, 6s и 6p су празне и оне су одговорне за грађење комплекса и њихову стабилност. Гадолинијум гради стабилна једињења са халогенидима, типа GdX3 (X= F, Cl, Br, I), са кисеоником оксид Gd2O3, са сумпором сулфид Gd2S3 а са азотом нитрид GdN. Са хлоридима гради две врсте соли: GdCl3 и GdCl3×6H2O који се често користе за добијање комплекса. Гадолинијум (атомска маса 157.25; тачка топљења 1313°C; тачка кључања 3266°C) припада лантанидима или ретким металима земље који чине серију од 15 метала од лантанијума (атомски број 57) до лутецијума (атомски број 71). Електронска конфигурација гадолинијума и осталих лантанида сугерише њихову класификацију у трећој групи периодног система елемената. Јонски радијус опада прогресивно са повећањем атомског броја. Пошто се јонски радијус смањује у серији лантанида, могућност формирања комплекса се повећава што је основа њиховог издвајања у колони јонске измене. Гадолинијум се може добити редукцијом својих анхидрованих флуорида или хлорида са калцијумом на температури од 1000°C (2GdCl3+3Ca→3CaCl2+2Gd). Гадолинијум као и остали релативно ретки земљини метали је сребрно бео, поседује метални сјај, растегљивост и еластичност. Релативно је стабилан на сувом ваздуху али у влажном ваздуху губи боју формирањем оксидног филма. Реагује са водом споро и растворан је у разблаженој киселини. Гадолинијум се јавља у тровалентном оксидационом стању и због полупопуњеног 4f нивоа Gd3+ је стабилан и јединствен због свог парамагнетичног момента.235 Гадолинијум се налази у својим оксидима у гадолиниту и пронађен је у неколико осталих минерала, укључујући моназит и бастназит који имају комерцијалну важност. До сада је потврђено седамнаест изотопа гадолинијума, али природни гадолинијум је смеша седам изотопа и састоји се од 63×10-5 % темљине коре. Не постоје подаци у литератури који се односе на његову концентрацију у океанима, пијаћој води или исхрани. Два од гадолинијумова изотопа (155Gd и 157Gd) имају одличне карактеристике захвата неутрона али су у природи присутни у веома ниским концентрацијама. Метал поседује суперкондуктивна својства. Мање од 1% елемента побољшавају радне карактеристике и отпор гвожђа, хрома и сличних легура на високим температурама и оксидацији. Смеша етил сулфата поседује екстремно ниске карактеристике буке. Стога, могу се користити у побољшању карактеристика појачивача високих фреквенција. Због јако изражене тенденције парамагнетичних катјона лантанида да граде комплексе са синтетичким и природним лигандима, Gd-DTPA (Ks=1023) и Gd-DOTA (Ks=1028) хелати се користе као контрасни агенси у магнетној резонанци (MRI) и компјутерској томографији (CT). Gd-DTPA хелати се препоручују као безбедни нерадиоактивни индикатори гломеруларне филтрације (GFR) који могу бити Докторска дисертација Општи део   80 алтернативни метод за одређивање реналног клиренса у клиничким студијама прогресивних бубрежних болести и нефротоксичности. Унешен интраперитонално, GdCl3, показује антиимфламанторне ефекте а предложен је и као средство у лакој микроскопској хистохемији киселих и алкалних фосфатаза. Гадолинијум као и остали ретки земљини метали се разматра као неесенцијални за биљке и животиње. Уношење елемента исхраном у људски организам није познато а трансфер преко уношења поврћа је минималан, зато што биљке уопштено не апсорбују лантаниде из земље. Само мали део (<0.05%) ретких земљиних метала се апсорбује у гастроинестиналном тракту. Мало се зна о његовом метаболизму. Највероватније елиминација Gd се дешава преко фецалних и уринарних путева у зависности од анјона, дозе и начина уноса. Премда су спектроскопске и термодинамичке студије показале да се Gd везује за терминални угљеник трансферина на pH 7.4 и околни pCO2, формирање невезивних карбонато комплекса на физиолошкој pCO2 искључују субстанцијалну улогу трансферина у транспорту лантанида in vivo. Елемент се не појављује у свом јонском облику у крви, али је највероватније присутан као колоид било хидроксида било фосфата. Насупрот природним Gd једињењима, фармакокинетичке и фармаколошке особине хелата DTPA и DOTA који се користе у магнетној резонанци су интензивније проучаване. Са кинетичког аспекта, ова високо хидрофилна једињења се понашају идентично. Као што је и очекивано од хидрофилних супстанци обим дистрибуције је мали у људском организму, док је полуживот плазма елиминације од 20-90 минута код пацова и човека понаособ. Код мишева 89% примењених Gd-DTPA и Gd-DOTA доза се избацује уринарно у току од 1 сата. У корелацији са редукованим GFR код пацијената са хроничним реналним поремећајем серумски полуживот Gd- DTPA је продужен и ренални клиренс је смањен. Искоришћење Gd-DTPA после примене дозе од 0.1 mmol/L/kg је око 92±12%, где је екстраренална елиминација мања од 0.4% што указује да је гломеруларна филтрација доминантан начин елиминације хелата. Једини подаци који постоје о биодистрибуцији Gd3+ у плазми и урину са аспекта здравља су публиковани од стране Алајина и сарадника (Allain at all.), који су утврдили концентрацију елемента у овим биолошким флуидима мању од 0.3 μg/dm3. Подаци о дистрибуцији Gd у ткиву су ретки. Његово присуство у јетри и скелету је идентично нивоима присуства лантанида еуропијума и холмијума. Примена контрастних средстава Gd-DTPA и Gd-DOTA на пацовима резултира од 0.1-1% ретенције у јетри и слезени. Због слабе гастроинестиналне апсорпције, претпоставља се да је токсичност ретких земљиних метала оралним уношењем мала. Симптоми акутне парентералне токсичности Gd подразумевају стомачне болове, дијареју, летаргију, мускуларни грч и смрт због респираторног колапса. Слободни јони гадолинијума имају јонски радијус калцијума и могу ометати функције које зависе од калцијума као што су мускуларна контракција и неуротрансмисија. Скорашње студије су показале да серије лантанида укључујући и Gd опонашају дејство двовалентних катјона у неколико аспекта паратироидних функција интеракцијом са површином ћелије „Ca2+ механизмом“ in vitro. Под стандардним али нефизиолошким условима температуре и pH, оба комплекса Gd-DTPA и Gd-DOTA су веома стабилни. Ови комплекси се сматрају релативно нетоксични, а због својих парамагнетских својстава су подесни за магнетну резонанцу. Међутим није јасно да комплекс у зависности од својстава серума може дисоцирати метал из свог лиганда. Истраживања на мишевима којима су аплициране интраперитоналне фармаколошке дозе Gd-DTPA су показала повећање нивоа Gd у костима. Ова појава је објашњена дехелацијом Gd-DTPA in vivo. Међутим, није недвосмислено потврђено да ли је био која токсичност повезана са овим резонантним контрасним агенсима последица дисоцијације Gd јона и/или осмозе раствора који компоненте садржи. У скорије време Докторска дисертација Општи део   81 је сугерисано да акутна токсичност изражена кроз LD50 може бити у корелацији са in vitro стабилности хелата. Неколико аналитичких техника је доступно за мерење лантаноидних елемената, а већина од њих је развијена за њихово одређивање у геолошким узорцима и легурама. Најчешћа метода која се примењује за одређивање Gd у овим срединама је неутронска активациона анализа на недеструктиван начин. У литератури постоје скромни подаци о мерењу Gd у биолошким флуидима и ткиву. Неки истраживачи су користили атомску емисиону спектрометрију за одређивање Gd у ткиву. Остали су су користили радиоозначени Gd ради проучавања његове биодострибуције. За одређивање Gd у серуму и урину коришћена је техника ICP-MS. Део истраживача је користио и електротермалну атомску апсорпциону спектрометрију за одређивање Gd у биолошким флуидима и ткивима. Табела 19. Константе стабилности главних Gd3+-комплекса у хуманим интерстицијумским флуидима69 Комплекс log βp,q,r Комплекс log βp,q,r Комплекс log βp,q,r [Gd2(OH)2] 12.200 [Gd(Lys)(Citl)H3] 23.3324 [Gd(Tyr)(Suc)] 7.5023 [Gd3(OH)4] 15.829 [Gd(Tyr)(Lys)H] 16.5432 [Gd(Tyr)(Suc)H3] 25.4262 [Gd(His)(Trp)H] 16.937 [Gd(Cit)(Gln)H] 18.132 [Gd(Orn)(Suc)] 8.3513 [Gd(His)(Trp)H2] 24.312 [Gd(Cit)(Gln)H2] 26.213 [Gd(Orn)(Suc)H] 15.4976 [Gd(His)(Trp)H3] 33.950 [Gd(Cit)(Lac)] 10.237 [Gd(Orn)(Suc)H2] 20.2123 [Gd(His)(Thr)H3] 33.380 [Gd(Cit)(Lac)H] 13.965 [Gd(Orn)(Lys)] 7.6177 [Gd(Pro)(Thr)] 9.677 [Gd(Cit)(Lac)H2] 17.307 [Gd(Orn)(Lys)H2] 22.0226 [Gd(Pro)(Trp)] 10.647 [Gd(Cit)(Glu)] 12.662 [Gd(Orn)(Lys)H3] 24.3954 [Gd(Pro)(Trp)H] 17.977 [Gd(Cit)(Glu)H] 18.687 [Gd(Ser)] 5.227 [Gd(Pro)(Trp)H2] 25.602 [Gd(Cit)(Glu)H2] 23.117 [Gd(Ile)] 5.077 [Gd(Pro)(Thr)] 9.877 [Gd(Cit)(His)H2] 27.727 [Gd(Asp)2] 10.037 [Gd(Pro)(Thr)H2] 24.582 [Gd(Cit)(Leu)] 12.667 [Gd(Asp)] 5.767 [Gd(Gly)(Ala)H2] 23.052 [Gd(Cit)(Leu)H] 18.167 [Gd(Sal)] 2.827 [Gd(Val)(Glu)H2] 23.617 [Gd(Cit)(Asp)] 15.132 [Gd(Cit)] 5.995 [Gd(Cit)(Arg)H] 22.035 [Gd(Cit)(Asp)H] 20.827 [Gd(Lac)] 3.347 [Gd(Cit)(Arg)H2] 30.017 [Gd(Cit)(Asp)H2] 24.287 [Gd(Asn)2] 7.267 [Gd(Cit)(Ser)H2] 22.217 [Gd(Sal)] 2.827 [Gd(Citl)2] 7.667 [Gd(Cit)(Ile)H2] 22.557 [Gd(Gly)] 4.127 [Gd(Suc)] 3.107 [Gd(Asp)(Ile)H2] 27.577 [Gd(Ala)] 4.067 [Gd(Thi)] 2.897 [Gd(Asp)(Thr)H2] 25.927 [Gd(Pro)] 4.507 [Gd(Lys)] 3.365 [Gd(Asp)(Ser)H2] 26.287 [Gd(Val)] 3.457 [Gd(Tyr)] 4.247 [Gd(Cit)(Thr)H2] 22.347 [Gd(Thr)] 4.477 [Gd(Orn)] 3.269 [Gd(Glu)(Ala)H2] 23.127 [Gd(His)] 3.087 [Gd(Ox)] 7.137 [Gd(Cit)(Ala)H] 18.428 [Gd(Cys)] 4.827 [Gd(Ox)2] 10.127 [Gd(Cit)(Ala)H2] 26.720 [Gd(Arg)H] 15.852 [Gd(HSA)] 6.465 [Gd(Cit)(Ala)H3] 30.730 [Gd(Glu)] 4.727 [Gd(IgP)] 5.205 [Gd(Cit)(Gly)H] 18.529 [Gd(Glu)H] 11.857 [Gd(HPO4)] 5.037 [Gd(Cit)(Gly)H2] 30.935 [Gd(Gln)] 3.917 [Gd(HPO4)2] 8.847 [Gd(Cit)(Val)H] 18.446 [Gd(Trp)] 5.117 [Gd(OH)2] 6.593 [Gd(Cit)(Val)H2] 26.704 [Gd(Leu)] 4.627 GdPO4(s) -20.010 [Gd(Cit)(Val)H3] 30.660 [Gd(Lys)(Suc)] 7.3159 Gd(OH)3 21.700 [Gd(Lys)(Citl)] 7.9325 [Gd(Lys)(Suc)H3] 23.2568 Gd2(CO3)3(s) -32.200 [Gd(Lys)(Citl)H] 15.4237 [Gd(Lys)(Suc)H2] 20.3521 [Gd(Cit)(Gly)H2] 26.911 [Gd(Tyr)(Orn)] 8.5134 Као слободан јон, гадолинијум је високо токсичан, али се уопштено сматра безбедним приликом администрације у облику хелатног комплекса. Једињења се могу Докторска дисертација Општи део   82 класификовати у зависности да ли су макро-цикличне или линеарне геометрије и да ли су јонски или не. Циклично јонска једињења гадолинијума најлакше ослобађају јон гадолинијума и зато су најбезбеднија. Најпознатији комерцијални хелатни контрасни агенси гадолинијума за употребу су Omniscan, Multihance, Magnevist, ProHance, Vasovist, Eovist и OptiMARK. Гадолинијум контрасни агенси у MRI су се показали безбеднији од контрасних агенаса јода који су се користили у радиографији X-зрацима или компјутерској томографији. Иако су се агенси гадолинијума показали успешним за пацијенте са реналним погоршањем, код пацијената са озбиљним реналним поремећајима која захтевају дијализе, постоји ризик од ретких и озбиљних болести (нефрогена системска фиброза и нефрогена фиброзна дермопатија) који могу имати везу са употребом извесних контрасних агенаса гадолинијума. Иако узрочна веза није у потпуности доказана, према процедурама у SAD пацијенти на дијализи требају добити контрасне агенсе гадолинијума само ако је неопходно и дијализа се треба извршити што раније након скенирања ради моменталног уклањања контрасног агенса из тела.69,70 Докторска дисертација Општи део 1.7. Oсобине Al3+-јона у воденим растворима Алуминијум има атомску масу 27.0 (постоји само један природни изотоп), атомски број 13, густину 2.79 g/cm3, тачку топљења 660.4°C и тачку кључања 2467°C. То је кристално сиво бели растегљив метал. Редокс потенцијал му је -1.66V, +3 оксидационо стање, и мали атомски радијус од 57 pm који омогућава стабилност његових једињења. Метал је који јако хидролизује и уопштено је нерастворан у опсегу pH вредности од 6-8. При pH вредностима које су мање од 6 или веће од 8 као и у условима присуства неорганских и органских лиганада, растворљивост Al3+-јона је повећана. Чисти алуминијум је нестабилан према оксидацији и у случају контакта са ваздухом формира танак филм оксида по површини, креирајући заштитни слој који је отпоран на корозију. Алумининијум оксид, сиров материјал који се користи у индустрији производње алуминијума појављује се у два изомерна облика: α-Al2O3 и γ- Al2O3.247 У основном стању атом алуминијума има електронску конфигурацију 1s2 2s2 2p6 3s2 3p1. Конфигурација задње љуске (ns2 np1) може се шематски представити: 3s 3p У воденим растворима алуминијум се налази у стабилном тровалентном стању, хидратисан са шест молекула воде, док је оксидационо стање +1 веома безначајно и ретко. Стабилно тровалентно стање код алуминијума се може објаснити великом енергијом хидратације (4180 kJ/mol). Енергија хидратације зависи од наелектрисања и величине јона па је за мали јонски радијус од 0.045 nm и наелектрисање +3 та енергија велика. Са оксидационим бројем +3 алуминијум гради велики број једињења јонског и ковалентног карактера. Најчешћа координација алуминијума је четири и шест. Координацији четири одговара sp3 хибридизација са тетраедарском структуром, док координацији шест одговара sp3d2 хибридизација са октаедарском структуром. Са малим јонским радијусом и великим наелектрисањем Al3+-јон има велики јонски потенцијал и у воденим растворима лако хидролизује у одсуству других лиганада. Табела 20. Најважнија хемијска својства алуминијума11 Ковалентни радијус (nm) Јонски радијус (nm) Тачка топљења (K) Тачка кључања (K) 0.125 0.045 931.15 2573.15 Прва Еј (eV) Друга Еј (eV) Трећа Еј (eV) Редокс потенцијал (V) 5.98 19.0 28.44 Al 3+/Al -1.66 У зависности од pH раствора Al3+-јон хидролизује и даје различите мононуклеарне и полинуклеарне хидролитичке комплексе. При ниским вредностима pH, Al3+-јон постоји у облику аквакомплекса [Al(H2O)6]3+. Овај комплекс има октаедарску конфигурацију, и веома лако ступа у протон-трансфер реакције. Са повећањем pH раствора долази до хидролитичких реакција и стварања мононуклеарних комплекса [Al(OH)]2+, [Al(OH)2]+ и Al(OH)30. При вишим концентрацијама Al3+-јона долази до формирања полинуклеарних комплекса различитог састава. 83 Докторска дисертација Општи део Од нарочитог су значаја комплекси Al3+-јона са органским лигандима и у литератури постоје одређени подаци о комплексирању Al3+-јона са органским лигандима. Обзиром да је Al3+-јон метални јон који припада групи јаких Lewisovih киселина, уочљив је његов велики афинитет према органским лигандима који су јаке Lewisove базе. У том смислу најзначајније донорске групе су оне које су донори кисеоника са негативним наелектрисањем, HO- или RO-, али је свакако најзначајнији оксидни О2- јон. Табела 21. Хидролитички комплекси Al3+-јона11 Комплекс Средина (mol/dm3) mmol/dm 3 Т(К) -logβ [AlOH]2+ 0.1 NaClO4 10.0-50.0 298 5.30 0.5 NaClO4 5.0-50.0 298 4.82 0.1 NaNO3 0.1-1.0 298 5.33 0.5 NaNO3 1.0-10.0 298 5.65 [Al(OH)2]+ 0.1 NaClO4 2.5-50.0 298 9.90 [Al(OH)3]aq 0.1 NaClO4 2.5-50.0 298 15.60 [Al(OH)4]- 0 - 298 -23.00 [Al3(OH)4]5+ 0.6 NaCl 2.5-20.0 298 13.13 3.0 NaCl <0.30 298 -13.44 0.5 NaNO3 1.0-10.0 298 12.60 3.0 NaNO3 2.0-80.0 298 13.22 3.0 NaClO4 <0.15 298 -13.20 3.0 NaClO4 <0.30 298 -13.12 3.0 NaNO3 0.01-0.30 298 -13.30 [Al13(OH)32]7+ 1.0 NaClO4 - 298 -104.81 0.01 NaClO4 - 298 -100.4 1.0 KCl - 372.6 -64.3 1.0 KCl - 397.8 -52.9 1.0 KCl - 422.8 -43.9 Хидроксидни јон формира многе комплексе са Al3+-јоном, док се оксидни анјон који се теже ствара може наћи у полимерним хидролитичким врстама које премошћавају два или више Al3+-јона. Флуоридни јон је малог радијуса, негативан и изоелектричан са OH-. Међутим, и најјача веза флуора и Al3+ је ипак значајно слабија него његова веза са хидроксидним јоном. Ова разлика је последица поларности хидроксидног јона услед усмерености негативног наелектрисања према електрон акцептору (металном јону). Због тога метални јон поседује мању густину негативног наелектрисања при координацији са флуоридним анјоном него у случају координације са хидроксидним. У воденим растворима Al3+-јон показује изражен афинитет према одређеним органским лигандима. У том смислу најизраженији афинитет је према монодендатним лигандима као што су: алкоксидни (RO-), феноксидни (C6H5O-) и карбоксилатни (- COO). Ови лиганди се могу наћи и у бидендатним паровима у природним или синтетичким лигандима према којима афинитет не показује само Al3+-јон већ и остали тровалентни јони. Такви бидендатни парови су на пример катехолатни (-OC6H4O-) и хидокси-ацидни анјон (R-CHO--COO-). Јаке Lewisove базе у раствору испољавају висок афинитет и према водоничном јону, тако да при координацији Al3+-јона са таквим донорским групама у воденим растворима увек постоји и конкурентна реакција ових група са водоничним јоном. 84 Докторска дисертација Општи део Литературни подаци указују да се при комплексирану Al3+-јона са различитим органским лигандима формирају стабилни комплекси при чему је хидролиза без обзира на јаке хидролитичке тенденције јона сузбијена у значајној мери. У табели 22 (страна 86) приказане су одређене константе стабилности Al3+ комплекса са неким изабраним типовима органских лиганада. Њихова разноликост указује на значајну варијацију структуралних типова као и широк опсег константи стабилности. Константе стабилности за награђене комплексе имају високе вредности па се може закључити да Al3+-јон гради веома стабилне комплексе са лигандима који садрже више координирајућих група са кисеоником као донором електронског пара. У највећем броју случајева, равнотежна константа стабилности (као логаритамска вредност) за реакцију +−−+ + )3(3 nn AlLLAl ' (100) се приказује као [ ] [ ] [ ]−+ +− × = n n LAl AlLK 3 )3( (101) Међутим, није увек случај да се се константа равнотеже изражава на овакав начин. За лиганде који су јаке Lewisove базе понекад није могуће да се одреди или израчуна концентрација лиганада Ln-. Притом је једна или више константи протоновања било непозната било нетачно одређена, па је рачунање вредности log К или немогуће или је вредност нетачна. Ова потешкоћа се превазилази на начин приказан следећим једначинама: ++−−+ ++ HAlLHLAl nn )3()1(3 ' (102) [ ] [ ] [ ] [ ])1(3 )3( 1 −+ ++− × ×= n n H HLAl HAlLK (103) ++−−+ ++ HAlLLHAl nn 2 )3()2(23 ' (104) [ ] [[ ] [ ] ])2(23 2)3( 2 −+ ++− × ×= n n H LHAl HAlLK (105) На овакав начин равнотежне константе се могу у потпуности прецизно одредити потенциометријском методом, у pH опсегу од 2-12, независно од нетачних или непоузданих вредности константи протоновања лиганада изнад pH 12. Није познато да алуминијум припада елементима у траговима који су есенцијални за људско тело. Прецизно знање о биокинетици овог метала не постоји и може се постићи индиректним тест методама због недостатка природних изотопа. Хумани организам може абсорбовати алуминијум и његове компоненте орално, преко дисања, и парентерално преко медикамената који садрже алуминијум. Не постоје индикације о перкутаној абсорпцији. Прецизни механизам и локализација апсорпције за орално унет алуминијум није познат за сада. Претпоставка је да се алуминијум абсорбује у стомаку и дуоденуму као и у јејунуму (делу танког црева). Абсорбована количина зависи од растворљивости 85 Докторска дисертација Општи део једињења алуминијума и нивоа гастроинестиналне pH вредности. Поред тога, гвожђе и флуор утичу на повећање абсорпције. Такође, утицај на абсорпцију алуминијума могу остварити и хормони и витамин D. Дневно нутрационо уношење алуминијума је од 5- 10 mg, а мање од 1% ове количине се абсорбује. Истраживања су показала да се алуминијум директно абсорбује у плућима, а количина која ће се абсорбовати зависи од величине удахнутих честица. Табела 22. Константе стабилности Al3+-комплекса са неким органским лигандима на 298.0 К у 0.1 mol/dm3 LiCl средини. L- лиганд (анјон киселине)11,77 Lиганд (L) Комплекс log β Млечна киселина, HL AlL AlL2 AlL3 2.36 4.42 5.80 Јабучна киселина, H2L AlL 3.32 Lимунска киселина, H3L AlL AlHL AlL AlH-1L Al3(OH)(H-1L)3 Al3(OH)4(H-1L)3H7 7.98 2.94 3.31 6.23 14.43 -10.91 Винска киселина, H2L AlL2 AlH-1LH AlH-1L AlL2 AlH-1L2 AlH-4L3H4 AlH-4L3 AlH-5L3 7.65 1.18 5.15 3.72 12.67 -15.92 10.89 12.7 Салицилна киселина, H2L AlLH AlL2H AlL3H -0.2 -2.8 -6.5 Катехол, H2L AlLH2 AlL2H2 AlL3H2 AlHL2 AlHL3 -0.6 -9.10 -13.61 6.05 8.05 Серин Al(HL) AlL Al(OH)2L Al(OH)3L Al2(OH)2L2 11.21 5.71 -2.52 -7.48 4.62 Глутаминска киселина Al(HL) AlL Al(OH)2L Al(OH)3L 12.20 7.86 -2.30 -8.44 Неколико истраживачких група је дискутовало секундарну гастроинестиналну абсорпцију удахнутих честица алуминијума. Претпоставља се да се честице алуминијума транспортују преко епитела респираторног тракта у правцу ждрела а потом се гутају. Количина инхалационо унете алуминијумске прашине из природне 86 Докторска дисертација Општи део околине може се занемарити на садашњем степену сазнања. Ињекциони и инфузиони раствори могу се контаминирати алуминијумом, тако да се неки случајеви парентералног уноса алуминијума не могу искључити. Због тога се са медицинског гледишта пацијентима са реналном дисфункцијом као и онима који се прихрањују парентерално мора посветити посебна пажња у том смислу. Након релативно брзог уноса алуминијума у интерстицијумске зидове, његова транзиција према крви је значајно спорија. У плазми се алуминијум везује око 80% за протеине, посебно за трансферин. Количина која се тренутно сматра нормалном је око 5 µg/dm3. Алуминијум се може детектовати у свим органима, али једини органи у којима концентрација алуминијума расте са порастом година су плућа и хилусне лимфне жлезде. Са порастом уноса алуминијума његова највећа концентрација је у костима, слезени и срчаном мишићу. Код пацијената са реналном дисфункцијом уочено је повећање концентрације алуминијума у мозгу, због повећане пермеабилности баријере крв-мозак за алуминијум. Повећани ниво алуминијума у костима се сматра последицом хормонског дисбаланса и дефицијенције витамина D. Орално унет алуминијум који није абсорбован се екскретује као алуминијум фосфат у фецесу. Већина абсорбованог алуминијума се елиминише урином, у количинама мањим од 14 µg дневно. Значајније већи нивои се могу наћи при већим изложеностима алуминијуму. Подаци о биолошком полуживоту алуминијума су различити. Сумарно, анализирајући податке који су присутни у литератури може се закључити да се алуминијум елиминише у неколико корака па стога постоје и неколико полуживота алуминијума. Тренутно се дискутује о краткотрајном (неколико сати), средњем (неколико дана) и дугом (неколико месеци) полуживоту алуминијума. Нормални нивои концентрације алуминијума у биолошким материјалима се могу приказати табеларно (табела 23). Табела 23. Нормални нивои концентрација алуминијума у биолошким узорцима72 Материјал Тежина Концентрација Серум, плазма или целокупна крв ≤ 5 µg/dm3 ≤ 0.2 µmol/ dm3 Урин ≤ 14 µg/24 h ≤0.5 µmol/ dm3/24 h Кости 1.5-13.3 µg/g 0.05-0.49 µmol/g Мозак Сива маса Бела маса 0.80-3.56 µg/g 0.74-3.26 µg/g 0.03-0.13 µmol/g 0.03-0.12 µmol/g Са аспекта токсичности алуминијума, разматрају се патолошке промене на плућима, централном нервном систему и костима. Као последица дејства алуминијума код радника који су у дужем временском периоду били изложени дејству алуминијума уочене су фиброзе плућа (тзв. Шаверова (Shaver) болест) и алуминозе праћене пнеумотораксом код радника ангажованих у производњи пиротехничких средстава. Код пацијената на дијализи уочене су појаве енцелопатије или дијализне деменције. Повећана концентрација алуминијума уочена је у пределима мозга код пацијената који болују од Алјцхајмерове (Alchajmerove) болести. Такође је уочена и веза између алуминијума и остеомелације код пацијената на дијализи. Процена интерне изложености алуминијуму зависи од способности извршења тачних и прецизних мерења у биолошким материјалима. Многи аналитичари су суочени са проблемима детекције алуминијума у опсезима ppb који су повезани са проблемима скупљања, складиштења, третмана и финалних анализа узорака. За аналитичко одређивање алуминијума предложено је неколико аналитичких метода: флуоресценција X зрацима, неутрон активациона анализа, NMR, графитна AAS 87 Докторска дисертација Општи део 88 (GFAAS), атомска емисиона спектрометрија, пламена емисија, индуктивно куплована плазма емисиона спектрометрија. Највећи степен успеха у одређивању алуминијума у биолошким материјалима постигнут је применом методе GFAAS.11, 71-77 Докторска дисертација Општи део 1.8. Литературни преглед комплексирања Al3+ и Gd3+-јона са флуорохинолонима и литературни модели специјације Al3+ и Gd3+-јона у хуманој крвној плазми 1.8.1. Литературни преглед комплексирања Al3+ и Gd3+-јона са флуорохинолонима Реакције комплексирања металних јона (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Sr3+, Ba2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+) са флуорованим хинолонима (норфлоксацин, офлоксацин, флумекин, налидиксинска киселина, ципрофлоксацин, ...) су интезивно пручаване углавном применом метода потенциометрије и спектрофотометрије у различитим условима температуре, јонске средине, концентрација и pH. Међутим, постоји веома мало литературних података о комплексирању јона метала алуминијума и гадолинијума и флуорохинолона као биолиганда. До сада је проучавано комплексирање Al3+ јона и флуорохинолона норфлоксацина, офлоксацина, флероксацина и моксифлоксацина методом потенцијометрије и спектрофотометрије. Al3+ јон са норфлоксацином при 25°C у 0,15 mol/dm3 NaCl јонској средини, гради комплексе типа ML, ML2 и ML3 са константама стабилности logβ=7.03; logβ=12.47; и logβ=17.92.78 Al3+ јон са офлоксацином при 25°C у 0,1 mol/dm3 LiCl јонској средини гради комплексе типа ML, ML2 са константама стабилности logβ=10.2 и logβ=14.84.37 Међутим, приликом проучавања реакција комплексирања Al3+ јонa са офлоксацином при 25°C у 0.1 mol/dm3 LiCl јонској средини у присуству 10 mmol/dm3 SDS-a потврђен је комплекс типа ML са константом стабилности logβ=10.,28.38 Al3+ јон са флероксацином у при 25°C у 0.1 mol/dm3 LiCl јонској средини, гради комплексе типа M(HL)L2+, M(HL)3+, ML2+, M(OH)L+ и M(OH)2L са константама стабилности logβ=24.87(6); logβ=14.02(3); logβ=11.41(1); logβ=5.2(2); и logβ=-1.61(2).79 Al3+ јон са моксифлоксацином у при 25°C у 0.1 mol/dm3 LiCl јонској средини, гради комплексе типа M(HL)L2+, M(HL)3+, ML2+, M(OH)L+ и M(OH)2L са константама стабилности logβ=28.47(5); logβ=16.59(4); logβ=11.66(1); logβ=5.,28(2); и logβ=-2.92(2).79 Најзначајнији комплекси Al3+ јона и флуорохинолона ципрофлоксацина, еноксацина, ломефлоксацина и енроксацина приказани су у табели 24, а најзначајнији комплекси Al3+ јона и флуорохинолона левофлоксацина, офлоксацина, норфлоксацина и спарфлоксацина приказани су у табели 25 (страна 90).80 Табела 24. Литературни преглед комплексирања Al3+ јона са ципрофлоксацином, еноксацином, ломефлоксацином и енроксацином80 pqr cipro enox enro lome Al3+ (1, −2, 1) – −3.37±0.09 −3.96±0.08 −2.12±0.06 (1, −1, 1) 4.96±0.03 5.26±0.04 4.10±0.04 5.98±0.09 (1, 0, 1) 11.21±0.05 11.27±0.05 9.87±0.06 13.25±0.08 (1, 1, 1) 16.27±0.0 16.33±0.05 15.14±0.06 18.95±0.07 (1, 2, 1) 18.87±0.09 19.24±0.08 18.09±0.09 23.01±0.08 (1, −1, 2) - 8.99±0.09 7.03±0.05 9.01±0.16 (1, 0, 2) 15.92±0.08 27.31±0.09 14.70±0.06 17.19±0.37 (1, 1, 2) 23.73±0.05 45.04±0.09 21.67±0.05 25.78±0.14 (1, 2, 2) 29.67±0.06 51.43±0.09 27.36±0.06 23.36±0.11 (1, 0, 3) 19.56±0.16 20.32±0.16 22.89±0.24 – (1,1,3) 27.78±0.29 28.56±0.02 – 30.19±0.33 (1, 2, 3) 36.41±0.07 36.85±0.10 37.68±0.25 38.24±0.29 (1, 3, 3) 43.53±0.08 43.83±0.08 44.28±0.23 45.55±0.44 p-број јона метала, q-број H+ или OH- јона у комплексу, r-број лиганада 89 Докторска дисертација Општи део 90 Табела 25. Литературни преглед комплексирања Al3+ јона са левофлоксацином, офлоксацином, норфлоксацином и спарфлоксацином80 pqr levo oflo nor spar Al3+ (1, −2, 1) −0.12±0.06 −3.56±0.06 −4.09±0.07 (1, −1, 1) 7.71±0.06 5.21±0.03 4.71±0.02 6.13±0.05 (1, 0, 1) 13.88±0.05 12.21±0.03 10.23±0.06 13.82±0.05 (1, 1, 1) 18.90±0.05 17.56±0.04 15.36±0.03 17.68±0.07 (1, 2, 1) 21.38±0.10 18.67±0.05 17.80±0.08 20.53±0.09 (1, −1, 2) 7.85±0.20 7.05±0.13 7.77±0.22 8.41±0.25 (1, 0, 2) 16.54±0.09 15.32±0.08 16.28±0.12 17.25±0.17 (1, 1, 2) 24.21±0.09 22.70±0.07 23.50±0.10 24.88±0.14 (1, 2, 2) 31.17±0.08 28.84±0.07 29.46±0.08 29.47±0.19 (1, 0, 3) 18.14±0.28 19.14±0.33 19.17±0.16 – (1,1,3) 26.49±0.17 27.34±0.25 27.74±0.11 28.40±0.28 (1, 2, 3) 34.05±0.13 34.79±0.24 35.79±0.07 35.80±0.32 (1, 3, 3) 40.85±0.07 41.11±0.15 42.79±0.05 42.53±0.23 p-број јона метала, q-број H+ или OH- јона у комплексу, r-број лиганада Литературни подаци о комплексирању Gd3+ јона и флуорохинолона нису пронађени током израде ове дисертације. У литературним изворима је пронађено да су синтетизована три комплекса гадолинијума и флуорохинолона (Gd(L)3×6H2O, L=nor,oflo,cipro) који показују јак инхибиторни ефекат на леукемију тип HL-60 (мерено методом МТТ-Метил-Тиазол-Тетрозолиум) и тумор јетре тип BEL-7402 (мерено методом SRB-Сумпорродамин Б). Резултати истраживања показују да комплекс Gd(oflo)3×6H2O показује јак инхибиторни ефекат на тумор јетре тип BEL-7402, а комплекс Gd(cipro)3×6H2O показује јак инхибиторни ефекат на леукемију тип HL-60 и тумор јетре тип BEL-7402.81 1.8.2 Литературни модели специјације Al3+ и Gd3+-јона у хуманој крвној плазми Специјације јона метала (Ca2+, Mg2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Pb2+, Mn2+, Zn2+, Ga2+, In3+ …) у хуманој крвној плазми као медијуму су интензивно проучаване, али постоји веома мало литературних података о специјацијама Al3+ и Gd3+ јона у хуманој крвној плазми. Током израде докторске дисертације нису пронађени литературни подаци о специјацији јона Gd3+ јона у хуманој крвној плазми. У анализираним литературним изворима62-66, 68, 93-96, 98, 100, 101 углавном су проучавања специјација јона метала и хумане крвне плазме била заснована на May-овом компјутерском моделу хумане крвне плазме развијеном компјутерским програмом ECCLES или коришћењем базе података JESS. Равнотежни модел за специјацију Al3+ јона у серуму је 1992. године проучаван компјутерским програмом ECCLES од стране W.R.Harrisa5, а J.Wang је са сарадницима 2004. године компјутерским програмом MINTEQA2 проучавао специјацију Gd3+ јона у хуманом интерстицијумском флуиду69. Ови литературни модели су послужили за поређења са нашим резултатима добијеним компјутерском симулацијом програмом HySS. Докторска дисертација Општи део 1.9. Методе за одређивање састава и константи стабилности комплекса Реакције образовања комплекса доводе до измене колигативних особина раствора (апсорбанције, електродног потенцијала, интензитета расуте светлости ...). Мерењем било ког колигативног параметра који се у процесу настајања комплекса мења могуће је одредити састав, константе стабилности и термодинамичке величине формираног комплекса. Велики број параметара који се могу пратити као и расположивих система за праћење омогућују разноврстан избор метода за анализу насталих комплекса. На основу употребљене технике мерења и врсте прилаза обради експерименталних података све методе се могу поделити у две групе. Прву групу чине методе обраде експерименталних података које се заснивају на општем прилазу разматрања равнотежа у комплексирајућим срединама назвисно од примењене технике мерења. Обзиром да се ове методе могу применити за дефинисање карактеристичних величина комплекса независно од тога да ли се концентрација компоненти прати мерењем pH, апсорбанције, проводљивости, ... називају се још и опште методе и у њих се убрајају: − Бјерумова (Bjerrum) метода, − Леденова (Leden) метода, − Фронеусова (Froneaus) метода и − Жобова (Jobb) метода. Другу групу чине методе обраде експерименталних података које користе мерење специфичних величина уз коришћење одговарајућих техника али могу дати неопходне податке који се могу обрадити првом групом метода. У ову групу спадају: − електрохемијске методе (потенциометријске, поларографске), − спектрофотометријске методе, − поларографске методе, − методе засноване на јонској измени, − методе засноване на екстракцији, − методе засноване на мерењу растворљивости, − NMR методе, − EPR методе, − кинетичке методе и остале. Експериментално добијени подаци обрађују се одговарајућим математичким методама како би се одредиле константе протоновања лиганда и стабилности насталих комплекса. 1.9.1. Потенциометријске методе Основна карактеристика електрохемијских метода је потпуна независност од осталих метода. Ове методе се користе под условима константног коефицијента активности који се постиже употребом одговарајуће јонске средине раствора. Електрохемијске методе чине: − потенциометријске методе, − поларографске методе, − волтаметријске методе, − кондуктометриске методе и − кулометријске методе. Потенциометријске методе (најчешће коришћене) се могу поделити на директну потенциометрију и потенциометријску титрацију. При директној потенциометрији припрема се раствор са одговарајућом концентрацијом метала и лиганда за свако 91 Докторска дисертација Општи део мерење потенцијала. Дакле, задатак директне потенциометрије је да се мерењем EMS спрега: референтна електрода / испитивани раствор / индикаторска електрода одреди потенцијал индикаторске електроде и одговори на питање колика је концентрација јона у испитиваном раствору. Потенциометријска мерења се користе у испитивањима равнотежа у растворима, за одређивање константи протоновања лиганда, константи стабилности хидролитичких комплекса као и константи стабилности обичних и мешовитих комплекса. Заснивају се на пропорционалности потенцијала мерне (индикаторске) електроде и концентрације електроактивног јона у раствору. Ако се електроактивни јон означи са X, његова равнотежна концентрација са [X], потенцијал индикаторске електроде на којој се одиграва реверзибилна електродна реакција XX ' −⊕ + ze (106) биће дата Нернстовом (Nernst) једначином ( ⊕+= XazFRTee ln0 ) (107) где је: e0- равнотежни потенцијал а F-Фарадејева константа. У општем случају потенциометријски се може пратити концентрација већег броја јона под условом да за сваки од њих постоји одговарајућа реверзибилна електрода. Процеси протоновања, хидролизе и комплексирања су праћени повећањем или смањењем концентрације водоничног јона у раствору. Та чињеница омогућава посредно праћење промене концентрације металног јона, лиганда и награђене врсте у раствору на основу мерења pH раствора. 1.9.1.1. Потенциометријско одређивање завршне тачке титрације (ZTT) При проучавању реакција протоновања лиганда и комплексирања метала лигандом који може бити слаба киселина или база неопходно је одредити укупну концентрацију хидронијум јона у раствору. Та концентрација се одређује преко ZTT потенциометријске титрације испитиваног система са стандардним раствором јаке базе. ZTT се може одредити применом различитих метода као што су: − метода превојне тачке, − метода првог и другог извода титрационе криве и − Гранова (Gran) метода. Прве две методе су погодне у случајевима када крива титрације има симетричан (сигмоидан) облик, а трећа када крива титрације нема симетричан облик или је асиметрична. Због тога је Гранова метода често применљива метода одређивања ZTT у реакцијама комплексирања јона метала због низа предности које поседује: − није потребно познавати апсолутну вредност концентрације водоничног јона у раствору, тј. није потребна калибрација електродног система што је случај у класичним pH-метријским мерењима, − може се користити у присуству металног јона који хидролизује или гради комплекс и − није потребно вршити велики број мерења, нити је неопходно вршити мерења у близини тачке еквиваленције. 92 Докторска дисертација Општи део Гранова метода се може илустровати на примеру титрације јаке киселине јаком базом. Нека се одређена запремина V0 јаке киселине, концентрације Ck, титрује јаком базом концентрације Cb, у галванској ћелији типа: (-) RE ⏐ титровани раствор ⏐SE (+) где је RE-референтна електрода а SE-стаклена електрода. Константна јонска јачина се обезбеђује додавањем јаког електролита (NaCl, LiCl, NaClO4...) у титровани раствор тако да му је концентрација најмање 10 пута већа од полазне концентрације киселине. Концентрација водоничних јона, после додавања запремине Vb јаке базе, пре ZTT дефинисана је изразом: b bbk H VV CVVCC + −= 0 0 (108) У тачки еквиваленције (ZTT): ebk VCVC =0 (109) где је Ve-запремина базе потребна за неутрализацију киселине. Заменом Ck у израз (109) добија се: b beb H VV VVCC + −= 0 )( (110) Обзиром да је: HHH afCpH loglog −=−= (111) где су aH и fH активност и коефицијент активности водоничних јона, онда се добија: b bebHpH VV VVCf + −=− 0 )( 10 (112) односно: )(10)( 0 bebH pH b VVCfVV −=+ − (113) После тачке еквиваленције (ZTT), концентрација OH- јона се представља изразом: b kbb OH VV VCVC C + −= 0 0 (114) На основу претходних израза добија се израз за концентрацију OH- јона: b ebb OH VV VVC C + −= 0 )( (115) 93 Докторска дисертација Општи део Пошто се концентрација водоничног јона може израчунати из једначине : OH W H C K C = (116) где је KW-константа јонског производа воде, то се одговарајућим математичким трансформацијама добијају изрази који служе за одређивање тачке еквиваленције из другог дела титрационе криве, тј. после ZTT: WH bbpH b Kf VVC VV )( 10)( 00 −=+ (117) При цртању Грановог дијаграма на апцису се наноси запремина додате базе, а на ординату (V0+Vb)10-pH пре тачке еквиваленције, а после тачке еквиваленције на ординату се наноси (V0+Vb)10pH. При титрацијама раствора са високим концентрацијама H+ или OH- јона и у случајевима када се титрација изводи при променљивој јонској јачини, почетне тачке одступају од праве Грановог дијаграма. У таквим случајевима ZTT се одређује из завршног дела титрације где све тачке леже на правој линији. До одступања од праве линије Грановог дијаграма долази у случајевима када се титрује раствор који садржи метални јон који гради са присутним лигандом комплексе или сам хидролизује. У таквим случајевима у почетном делу титрације тачке леже на правој Грановог дијаграма, док почетком хидролизе или комплексирања тачке почињу одступати од праве. Из тог разлога се ZTT одређује из тачака које леже на праволинијском делу Грановог дијаграма. Гранова метода има одређених недостатака. Неопходно је одржавати коефицијент активности јона током титрације константним као и вредност дифузионог потенцијала. Ови услови се постижу ако се користи довољно висока концентрација јона у раствору и не сувише висока концентрација киселине која се титрује (од 0.01-0.05 mol/dm3). 1.9.2. Спектрофотометријске методе Спектрофотометријске методе се поред потенциометријских, највише користе за одређивање константи протоновања и константи стабилности награђених комплекса. Оне се заснивају на појави да при грађењу комплекса долази до промене у апсорпционим спектрима, што се у неким случајевима може и визуелно утврдити на основу промене боје, када је комплексно једињење обојено. Интензитет апсорбоване светлости која се пропушта кроз испитивани раствор зависи од концентрација датих компененти у раствору који апсорбују светлост. Ова зависност апсорпције од концентрације дата је Lambert-Berovim законом: bCA ε= (118) где је А-апсорбанција раствора, ε-моларни екстинциони коефицијент, b-дебљина апсорпционог слоја (cm) и C-концентрација компоненте која апсорбује. Мерењем апсорбанције раствора у функцији концентрације једне од компонената комплекса, или од односа концентрација компонената, могу се добити подаци из којих се може одредити састав и константа стабилности комплекса. Спектрофотометријске методе које се најчешће користе за изучавање комплекса су: − метода молских односа, − Jobova метода, 94 Докторска дисертација Општи део − Adamovič-ева метода, − Edmouns-Birnbaum-ова метода, − Bentt-French-ова метода, − Harvey-Manning-ова метода, − Henry-Frank-Ostwald-ова метода, − Nash-ова метода и − метода Jacimirskog. Најчешће коришћена метода за одређивање састава и константи стабилности релативно стабилних комплекса је метода молских односа која ће надаље бити детаљније објашњена. Експериментални поступак ове методе састоји се у мерењу апсорбанције серије раствора у којима се концентрација једне компоненте одржава константном (обично металног јона), а мења концентрација лиганда. Апсорбанција раствора мери се на одређеној таласној дужини и графички се представља у зависности од односа стехиометријских концентрација лиганда (CL) и металног јона (CM) (слика 45). Ако се образује само један стабилан комплекс (слика 45-крива 1) онда апсорбанца расте линеарно са молским односом и постаје константна када се целокупна количина металног јона веже у комплекс, па даљи додатак лиганда не изазива промену апсорбанције. Тачка прелома криве одређује однос метала и лиганда у комплексу. Када је настали комплекс нестабилан, односно слабо или јако дисосован онда се добија крива која нема јасан прелом па се прелом добија из пресека тангенти. У случају образовања већег броја комплексних једињења и када је разлика у константама стабилности јако велика, онда се добија крива са више прелома (слика 45 крива 2). На основу снимљених апсорпционих спектара, константе стабилности награђених комплекса могу се израчунати на два начина. Први начин: Предпоставимо да се образује комплекс типа MLn, са лигандом који или не подлеже дисоцијацији, или је потпуно дисосован. Константа стабилности комплекса је: [ ] [ ][ ]nnn LM ML=β (119) где су [MLn], [L] и [M] равнотежне концентрације комплекса, лиганда и јона метала. 1 2 M / CLC XA A0 A Слика 45. График функције A=f (CLlCM) Моларни екстинциони коефицијент комплекса εк, одређује се из графика функције A=f(CL/CM) за случај када је CL у вишку, по једначини: [ ]bML A n k 0=ε (120) 95 Докторска дисертација Општи део где је A0-апсорбанција која одговара прелому криве. Обзиром да је тада сав метални јон преведен у комплекс, онда је [MLn]=CM, а b-дебљина апсорпционог слоја. Када се израчуна средњи моларни апсорпциони коефицијент, онда се за било коју концентрацију лиганда у делу криве, пре хоризонталног дела, налази вредност апсорбанције и израчуна концентрација комплекса по једначини: [ ] b AML k n ε= (121) Равнотежне концентрације метала и лиганда су: [ ] [ nM MLCM −= ] (122) [ ] [ ]nL MLnCL −= (123) Заменом [MLn], [L] и [M] добија се израз за одређивање константе стабилности: [ ] [ ]( ) [ ]( )nnLnM n n MLnCMLC ML −−=β (124) Када је лиганд анјон слабе киселине која дисосује по једначини: −+ + LH' HL (125) онда се равнотежна концентрација лиганда израчунава узимајући у обзир константу дисоцијације киселине: [ ][ ] [ ]HL LHKd = (126) као и вредност pH раствора, односно концентрације H+-јона. Узимајући у обзир константу дисоцијације може се израчунати равнотежна концентрација лиганда из следећег израза: [ ] [ ][ ] [ ]( ) [ ]H MLnCK HA HLKL nLdd −== (127) Када је лиганд слабо дисосован онда је [L]<3. Потенцијал стаклене електроде дат је изразом jEhQEE +×+= log0 E 0E E , где је - концентрација слободног протона, -константа која укључује стандардни потенцијал стаклене електроде, -Nernstov фактор стаклене електроде и -дифузиони потенцијал. Параметри , и су одређени титрацијом јака киселина-јака база због провере погодности система. За време титрација тест раствора, је одређиван употрeбом података из ацидо региона где се не дешавају хидролиза и комплексирање (тако да је једнака аналитичкој концентрацији протона), наношењем на и екстраполацијом праве линије на вредности =0. Слободна концентрација протона h 0E jE Q E j − 0 Q h hQ log× h h Термостат Испиралице pH - метар Бирета Суд за титрацију Докторска дисертација Експериментални део 112 је израчунавана кроз једначину QEEEh j /)(log 0 −−= , која је примењена на целу титрациону криву. Све титрације су дупло реализоване. Слагање између две титрације било је боље од 1%. 3.2.2. UV-VIS спектрофотометар За спектрофотометријска мерења коришћен је Perkin Elmer Lambda 35 UV-VIS (USA) спектрофотометар са термостатираном кварцном Suprasil киветом. Слика 50. Perkin Elmer Lambda 35 UV-VIS спектрофотометар 3.2.2.1. Процедура рада на UV-VIS спектрофотометру Слика 51. Оптичка шема апсорпционог спектрофотометра Приликом снимања спектара коришћене су две кивете дебљине 1 cm. Једна кивета је пуњена испитиваним раствором, а друга (референтна) истим раствором као и испитивани али без јона метала. Оперативни параметри били су: брзина сканирања 2 nm/s, отвор разреза 0.3 nm, фотометричка сензитивност 0.2 abs. Спектрална мерења вршена су на растворима где је концентрација Gd и моксифлоксацин била константна (CGd =0.072, 0.033 и 0.017 mol/dm3; Cmoxi =0.051 и 0.035 mol/dm3), док је pH варирала од Докторска дисертација Експериментални део 113 3-9 (10 раствора). pH вредност тест раствора мерена је стакленом каломел електродом. pH вредност сваког тест раствора је контролисана дневно, за време од једне недеље. Стабилне вредности унутар 0.01 pH и 0.004 абсорпционих јединица су постизане после 1 сата и остајале су стабилне за време од неколико дана. Спектар тестираних раствора је сниман у интервалу таласних дужина од 250-450 nm. За овај рад коришћен је спектрофотометар који је повезан са IBM PC компатибилним рачунаром на коме се налази инсталиран програм UV WinLab чијим се активирањем добија маска програма приказана на слици 52. Слика 52. Активирање програма-почетна страница након покретања UV WinLab-а У овој масци се врши избор методе којом ће се радити. То се постиже кликом на жељени метод, којим се дефинишу параметри мерења. Када се изабере метод рада, отвара се маска приказана на слици 53. Слика 53. Маска програма за подешавање параметра мерења У овој масци се подешавају параметри снимања спектра. У пољу Ordinate mode Докторска дисертација Експериментални део 114 бира се величина која ће бити представљена на ординати. То може бити апсорбанција или екстинкција. У пољу Scan speed подешава се брзина снимања спектра (120 nm/min). У овој масци бира се и врста лампе којом ће се снимати спектар једноставним кликом на поља On и Off. Спектри су снимани у области таласних дужина од 250–450 nm. Извор светлости је деутеријумска (од 250-350 nm) и волфрам-халогена лампа (од 350– 450 nm). Такође у овом пољу се подешава и ширина разреза кроз који пролази емитована светлост, бирањем неке од понуђених вредности у пољу Slit (2 nm). На следећу маску се прелази тако што се кликне на поље Scan након чега се појављује прозор приказан на слици 54. Ова маска омогућава кориснику да зада рачунару у ком опсегу таласних дужина жели да сними спектар. То се постиже уношењем почетне вредности у поље Start wavelenght и крајње вредности у поље End wavelenght. У пољу Data interval уписује се вредност на ком растојању ће се очитавати апсорбанција. Број циклуса снимања се уноси у поље Number of cycles. Слика 54. Маска програма за подешавање почетне и крајње таласне дужине Слика 55. Маска програма за дефинисање броја узорака и назива Докторска дисертација Експериментални део 115 Последња маска (слика 55-страна 114) којим се дефинише број узорака којим се жели снимити спектар отвара се кликом на поље Sample. Давање назива спектра се постиже тако што се кликне у поље Result Filename, а број узорака који се испитује у поље Number of sаmples. Када је завршено са задавањем параметра кликне се на поље Start, како би отпочело снимање спектра. После неколико секунди рачунар од нас тражи да убацимо кивете са слепом пробом како би се извршила стандардизација апарата ("нула инструмента"). Слепа проба садржи све као и анализирани раствор осим испитиване супстанце. Након тога се редом убацују кивете са анализираним растворима и добијају се спектри (слика 56). Слика 56. Маска програма која даје изглед UV VIS спектра (на слици је спектар моксифлоксацина) 3.2.3. Масени спектрометар 3.2.3.1. Процедура рада на масеном спектрометру Процедура рада на масеном спектрометру подразумева укључивање масеног детектора, оптимизацију његовог рада и извршење анализе узорка. Укључивањем механичке вакуум пумпе потребно је постићи вакуум од најмање 3×10-4 thor. Укључивање вакумског система врши се преко опције Masslynx позивајући из основног прозора опцију Ms Tune. Из отвореног прозора активира се иконица Options а затим Pump. Постизање вакуума прати се на графичком приказу вакуум система а може се видети и по светлосној сигнализацији када зелена лампица засветли по достизању вакуума. У следећем кораку подешавају се температуре: Source temp, Desolvation temp у складу са методом која се користи за испитивани узорак. Уносе се вредности протока гасова и то за desolvation гас и cone гас. Исправност и спремност детектора прати се преко опције Diagnostic где сва поља морају бити зелена. Да би детектор могао да почне са активним радом непосредно пред почетак анализе потребно је отворити улаз у детектор помоћу металне полуге на конусу, отварањем стакленог прозора на фронту детектора и померањем пинцетом за 90º. Да би детектор радио у оптималном режиму за Докторска дисертација Експериментални део 116 одређивање испитиване супстанце неопходно је оптимизовати његов рад. Оптимизација детектора се врши на следећи начин: одвије се прикључак колоне на улаз Source, прикачи се капилара која води од перисталтичке пумпе, тј. ињекционог шприца у детектор. Напуни се стаклени шприц раствором стандарда у метанолу концентрације од 10-20 mg/l испитиване супстанце, постави у лежиште, осигура сигурносним држачем, врх игле се уведе у ињекторски улаз а на слободан део игле се прикачи уземљење. Кликом на опцију MS Tune, отвори се Analayse у поље Pump flow унесе се препоручена вредност од 10-50 µL/min. Преко иконе Syringe pump активира се рад перисталтичке пумпе. На MS tune страници унесе се вреност М+1 или М-1 масе анализираног једињења у кућицу Mass 1, Span 5, Gain 1. Из менија Option изаберемо опцију Autotune и са отвореног прозора позове се Setup, и у њој се упише циљана маса у простору Mass (Da). Притиском на Enter задаје се команда за почетак аутоматске оптимизације рада детектора и сачека се да се оптимизација заврши. Када је оптимизација завршена подешава се интензитет одговора детектора преко промене нагиба – Inlet source који мора бити у таквој позицији да је вертикала која се замишљено повлачи са врха капиларе буде удаљена од 5-7 mm од улаза у конус. То се постиже механичким окретањем великог завртња на кућишту Inlet source. На крају оптимизације сви добијени параметри се сачувају под одговарајућим називом. По завршетку комплетног подешавања инструмента склоне се ињекциони шприц из перисталтичке пумпе, откачи капилара са Inlet source, прикачи капилара са колоне и појединачно уноси узорак шприцем. За анализирање се припреми узорак у раствору и извуче шприцем. Да би се извршила анализа датог узорка у табелу узорака преко падајућег менија Samples позове се опција Add и дода нова линију за испитивани узорак. У ову линију уписује се File name–име под којим се чува анализа. File text-садржај текста који ће пратити резултате на добијеном спектру. MS file-назив методе снимања масених спектара. На опцији MS method налазе се сви неопходни параметри за рад у одређеном модусу (ESI +, ESI-, APCI+, APCI-), као и режим снимања TIC, SIR, који су дефинисани за сваку методу. Најважнији параметри су опсег снимања, брзина снимања, конусна волтажа, режим и начин снимања масених спектара. Када су попуњена сва поља у „новоформираној“ линији кликне се на икону RUN и стартује анализа. По завршетку снимања анализира се добијени спектар. Слика 57. LC MS Agilent 1100 3.3. Експериментални резултати У овој дисертацији, извршена су следећа мерења комплексирања у системима: Al3+-офлоксацин, Gd3+-офлоксацин и Gd3+-моксифлоксацин. На основу ових мерења, проучаван је утицај флуорохинолона (офлоксацина и моксифлоксацина) на биодистрибуцију Al3+ и Gd3+-јона и извршено је поређење модела добијеног у нашем Докторска дисертација Експериментални део 117 раду и модела описаних у литератури. У циљу проучавања реакције комплексирања у системима Al3+-офлоксацин, Gd3+-офлоксацин и Gd3+-моксифлоксацин, извршено је претходно изучавање реакција протоновања офлоксацин и моксифлоксацин анјона и хидролизе Al3+ и Gd3+-јона. 3.3.1. Протоновање офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Протоновање анјона офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, проучавано је потенциометријски, титрацијама раствора офлоксацина, при чему су концентрације офлоксацина износиле 1.0 и 2.0 mmol/dm3. Титрације испитиваних раствора вршене су стандардним раствором натријум-хидроксида концентрације 0.130 mol/dm3, а резултати су приказани у табели 26. Табела 26. Преглед потенциометријских титрација протоновања офлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К N0 L0 H0 pH област 1. 2.0 2.0 7.087-9.452 2. 1.0 1.0 6.962-8.429 3. 2.0 3.2 3.036-10.029 L0-почетна концентрација офлоксацина, H0-почетна концентрација киселине. Све концентрације су изражене у mmol/dm3. Добијени резултати представљени су на слици 58 као зависност pH раствора од титрационог параметра а (Прилог, табеле од 1П-3П). Слика 58. Протоновање анјона офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К Протоновање офлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, проучавано је и спектрофотометријски, у области таласних дужина од 300-400 nm. За спектрофотометријска мерења направљена је серија раствора офлоксацинa концентрације 2.5 mmol/dm3. Сваком од испитиваних раствора pH вредност је подешена у интервалу од 2.5-10.0 додавањем одговарајуће запремине стандардног раствора NaOH концентрације 0.130 mol/dm3. 3 4 5 6 7 8 9 10 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5a pH 1,0 mmol/L oflo 2,0 mmol/L oflo 2,0 mmol/L oflo+HCl Докторска дисертација Експериментални део 118 Табела 27. Вредности концентрације офлоксацинa и pH вредности припремљених раствора за спектрофотометријска мерења у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К N0 L0 pH 1. 0.025 2.691 2. 0.025 4.443 3. 0.025 5.972 4. 0.025 6.035 5. 0.025 6.270 6. 0.025 6.560 7. 0.025 8.229 8. 0.025 9.644 9. 0.025 0.1 mol/dm3 NaOH 10. 0.025 0.1 mol/dm3 HCl L0 -концентрација офлоксацинa у mmol/dm3 Вредности концентрације офлоксацинa и pH вредности припремљених раствора за мерење приказане су у табели 27, а добијени експериментални резултати приказани су на слици 59 као зависност измерене апсорбанције А од таласне дужине λ (Прилог, табела 4П). [oflo] = 2,5 mmol/dm3 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 300 320 340 360 380 400 nm A pH=2,691 pH=4,443 pH=5,972 pH=6,035 pH=6,270 pH=6,560 pH=8,229 pH=9,644 0,1 mol/L NaOH 0,1 mol/L HCl Слика 59. Апсорпциони спектри офлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на различитим вредностима pH 3.3.2. Протоновање моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Протоновање анјона моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, проучавано је потенциометријски, титрацијама раствора моксифлоксацинa, при чему су концентрације моксифлоксацинa износиле 0.5; 1.0 и 1.5 mmol/dm3. Титрације испитиваних раствора вршене су стандардним раствором натријум-хидроксида концентрације 0.100 mol/dm3, а резултати су приказани у табели 28 (страна 119). Докторска дисертација Експериментални део 119 Табела 28. Преглед потенциометријских титрација протоновања анјона моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К N0 L0 H0 pH област 1. 0.5 6.525 2.186-10.407 2. 1.0 5.321 2.273-9.663 3. 1.5 5.600 2.251-9.795 L0-почетна концентрација моксифлоксацинa, H0-почетна концентрација киселине. Све концентрације су изражене у mmol/dm3. Добијени резултати представљени су на слици 60 као зависност pH раствора од титрационог параметра а (Прилог, табеле од 5П-7П). 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 a pH 0,5 mmol/L moxi 1,0 mmol/l moxi 1,5 mmol/L moxi Слика 60. Протоновање анјона моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К pH 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 260 280 300 320 340 360 380 400 420 λ(nm) A 1.800 3.666 4.817 5.688 6.022 6.311 7.033 7.870 8.835 8.323 9.400 10.284 11.870 Слика 61. Апсорпциони спектри моксифлоксацинa у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на различитим вредностима pH Докторска дисертација Експериментални део 120 Протоновање моксифлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, проучавано је и спектрофотометријски. За спектрофотометријска мерења направљена је серија раствора моксифлоксацинa концентрације 0.05 mmol/dm3. Сваком од испитиваних раствора pH вредност је подешена у интервалу од 1.800-11.870 додавањем одговарајуће запремине стандардног раствора NaOH. Укупно је направљено 13 раствора моксифлоксацинa (Прилог, табела 8П). Добијени експериментални резултати приказани су на слици 61 (страна 119) као зависност измерене апсорбанције А од таласне дужине λ. 3.3.3. Хидролиза Al3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Састав и константе стабилности хидролитичких комплекса који се формирају хидролизом Al3+-јона узете су из литературних података.71,79 3.3.4. Хидролиза Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Хидролиза Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини, проучавана је потенциометријском титрацијом од 1.0-5.0 (0.99; 253; и 4.95) mmol/dm3 раствора Gd3+- јона на (298.0±0.5)К. Раствори су припремљени разблаживањем полазног раствора Gd3+-хлорида. Збирни преглед потенциометријских титрација хидролизе Gd3+-јона приказан је у табели 29 (Прилог, табеле од 9П-11П). Табела 29. Преглед потенциометријских титрација хидролизе Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К N0 М0 H0 pH област ZM(max) 1. 0.99 1.560 2.786-7.870 0.423 2. 2.53 4.240 2.370-7.350 0.181 3. 4.95 8.540 2.061-6.880 0.074 M0-почетна концентрација Gd3+-јона, H0-почетна концентрација киселине, ZM(max)-највећи хидроксидни број. Све концентрације су изражене у mmol/dm3. -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH Zm 1,0 mmol/L Gd(III) 2,5 mmol/L Gd(III) 5,0 mmol/L Gd(III) Слика 62. Хидролиза Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К Добијени резултати представљени су на слици 62 у облику зависности средњег Докторска дисертација Експериментални део 121 хидроксидног броја, ZM од pH раствора. Слика 62 (страна 120) показује да су у LiCl средини хидролитичке криве надређене за различите укупне концентрације гадолинијума, указујући при томе формирање мононуклеарних комплекса. Максимална вредност хидроксидног броја постигнута је пре формирања талога, зависно од укупне концентрације гадолинијума. Почетак таложења условио је нестабилност очитавања потенцијала, скоковити раст криве формирања, и визуално појаву замућења раствора. На свим концентрацијама Gd3+-јона, хидролиза је почињала на вредности pH око 5. 3.3.5. Комплексирање Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Комплексирање Al3+-офлоксацин у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, проучавано је потенциометријски, титрацијама серијe раствора у којима је однос концентрација Al3+-јона и офлоксацинa износио 1:1, 1:3 и 1:5. Титрације испитиваних раствора вршене су стандардним раствором натријум-хидроксида концентрације 0.130 mol/dm3, а резултати праћења реакција комплексирања су приказани у табели 30. Табела 30.Преглед потенциометријских титрација комплексирања Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±05)К N0 M0 H0 L0 pH област L0/M0 n max 1. 1.990 0.186 2.453 3.943-10.423 1:1 1.230 2. 0.995 0.093 2.478 5.096-9.805 1:3 2.460 3. 0.498 0.064 2.490 6.626-10.348 1:5 4.810 Добијени резултати представљени су на сликама 63 и 64 (страна 122) као зависност pH од титрационог параметра а, и као зависност средњег лигандног броја n од негативног логаритма концентрације офлоксацинa (Прилог, табелe од 12П-14П). 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 -0.2 0.3 0.8 1.3 1.8 2.3 2.8 a pH Al(III):oflo=1:1 Al(III):oflo=1:3 Al(III):oflo=1:5 Слика 63. Комплексирање Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, за концентрационе односе [Al3+]0:[oflo]0=1:1, 1:3 и 1:5 као зависност pH од титрационог параметра а Докторска дисертација Експериментални део 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 -log (oflo) n Al(III):oflo=1:1 Al(III):oflo=1:3 Al(III):oflo=1:5 Слика 64. Комплексирање Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, за концентрационе односе [Al3+]0:[ oflo ]0=1:1, 1:3 и 1:5 као зависност средњег лигандног броја од негативног логаритма концентрације офлоксацинa 3.3.6. Комплексирање Al3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Састав и константе стабилности комплекса који се формирају у растворима Al3+- моксифлоксацин система узете су из литературних података. 71,79 3.3.7. Комплексирање Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини Комплексирање Gd3+-офлоксацин система проучавано је потенциометријским мерењима у 0.1 mol/dm3 NaCl средини, на (298.0±0.5)К. Табела 31. Преглед потенциометријских титрација комплексирања Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини на (298.0±0.5)К N0 M0 H0 L0 pH област M0/L0 − n max 1. 1.0 5.18 1.0 2.279-10.618 1:1 0.999 2. 1.0 5.05 2.0 2.325-8.864 1:2 1.900 3. 1.0 3.89 2.5 2.359-9.269 1:2.5 2.302 4. 1.0 4.52 3.0 2.378-7.202 1:3 2.518 5. 0.6 1.32 3.0 2.783-9.417 1:5 2.941 M0-почетна концентрација Gd3+-јона, H0-почетна концентрација хлороводоничне киселине, L0-почетна концентрација офлоксацинa, max -највећа вредност средњег лигандног броја постигнутог у титрацији. − n Све концентрације су изражене у mmol/dm3. За ова проучавања направљена је серија раствора Gd3+-јона и офлоксацинa у којима је однос концентрација Gd3+:офлоксацин био 1:1; 1:2; 1:2,5; 1:3; и 1:5. Концентрације Gd3+-јона у испитиваним растворима приказане су у табели 31. У сваки 122 Докторска дисертација Експериментални део 123 испитивани раствор додавана је тачно одређена количина хлороводоничне киселине (HCl) да би се избегло омплексирање или хидролиза Gd3+-јона на почетку титрације. Испитивани аствори рипрема и у у 0.1 mo /dm3 NaCl средини. Титрације испитиваних раствора вршене су стандардним раствором натријум-хидроксида концентрације 0.0982 mol/dm3, а прегледи реакција к р п н с l комплексирања приказани су у табели 31 (страна 122) (Прилог, табеле од 15П–19П). Добијени експериментални резултати, приказани су, као зависност pH од титрационог параметра а (слика 65), и као зависност средњег лигандног броја n од негативног логаритма концентрације офлоксацинa (слика 66). Негативна вредност титрационог параметра а указује на титрацију вишка хлороводоничне киселине. 2 3 4 5 6 7 8 9 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 a pHGd(III) : oflo = 1:1 Gd(III) : oflo = 1:2 Gd(III) : oflo = 1:2,5 Gd(III) : oflo = 1:3 Gd(III) : oflo = 1:5 С темпера 1:1, 1:2, 1:2.5, 1:3 и 1:5 као зависност pH од титрационог параметра а лика 65. Комплексирање Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини, на тури од (298.0±0.5)К, за концентрационе односе [Gd3+]0 :[oflo]0= -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 2,5 4,5 6,5 8,5 10,5 12,5 -log(oflo) n Gd(III) : oflo = 1:1 Gd(III) : oflo = 1:2 Gd(III) : oflo = 1:2,5 Gd(III) : oflo = 1:3 Gd(III) : oflo = 1:5 С 1:2.5, 1:3 и 1:5 као зависно лика 66. Комплексирање Gd3+- офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини, на температури од (298.0±0.5)К, за концентрационе односе [Gd3+]0 :[oflo]0=1:1, 1:2, ст средњег лигандног броја n од негативног логаритма концентрације офлоксацина Докторска дисертација Експериментални део 124 На слици 66 (страна 123) се може уочити да се све криве формирања поклапају до вредности =0.5 при титрацијама у свим односима метал-лиганд. При односу − n M:L=1:1 крива има костантну вредност за = 1 што указује на формирање само − n комплекса типа MLHn где је n = 1, 0, -1. Надаље ове криве, осим криве 1:1 се поклапају до вредности = 1,5. Крива 1:2 указује на формирање само комплекса типа ML2Hn, где − n је n= 2, 1, 0, -1, -2. Остале криве формирања за > 2 представљају настајање − n мешовитих хидролитичких комплекса који настају услед хидролизе гадолинијума. 3.3.8. Комплексирање Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини Комплексирање у Gd3+-моксифлоксацин систему проучавано је потенциометријским мерењима у 0.1 mol/dm3 LiCl средини, на (298.0±0.5)К. Прво је извршена потенциометријска титрација чистог моксифлоксацина концентрације 1.07 mmol/dm3 натријум хидроксидом концентрације 0.1983 mol/dm3. За ова проучавања направљена је серија раствора Gd3+-јона и моксифлоксацина у којима је однос концентрација Gd3+:моксифлоксацин био 1:1; 1:2; 1:3 и 1:5. Концентрације Gd3+-јона у испитиваним растворима приказане су у табели 32. У сваки испитивани раствор додавана је тачно одређена количина хлороводоничне киселине (HCl) да би се избегло комплексирање или хидролиза на почетку. Испитивани раствори припремани су у 0.1 mol/dm3 LiCl средини. Титрације испитиваних раствора вршене су стандардним раствором натријум-хидроксида концентрације 0.1983 mol/dm3, а резултати праћења реакција комплексирања приказани су у табели 32 (Прилог, табеле од 20П-24П). Табела 32. Преглед потенциометријских титрација комплексирања Gd3+- моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К N0 M0 H0 L0 pH област M0/L0 1. - 4.93 1.07 2.426-9.262 - 2. 1.00 1.523 1.07 2.670-7.040 1:1 3. 0.55 1.035 1.07 2.984-9.060 1:2 4. 0.80 1.863 2.40 2.780-9.258 1:3 5. 0.50 1.958 2.50 2.799-8.500 1:5 M0-почетна концентрација Gd3+-јона, H0-почетна концентрација хлороводоничне киселине, L0-почетна концентрација моксифлоксацина. Све концентрације су изражене у mmol/dm3. Добијени експериментални резултати, приказани су као зависност pH од титрационог параметра а (слика 67, страна 125). Титрационе криве моксифлоксацина у присуству Gd3+-јона су померене удесно у односу на титрациону криву чистог моксифлоксацина, што указује на формирање комплекса у систему. Обзиром да се титрационе криве чистог моксифлоксацина и криве Gd3+-моксифлоксацин не поклапају на ниским вредностима pH, може се закључити да се реакције комплексирања дешавају на вредностима pH нижим од 3. Подударање титрационих кривих Gd3+- моксифлоксацин са различитим односима концентрација метал-лиганд, у pH опсегу око 3 указује на формирање 1:1 комплекса Gd3+-моксифлоксацин. Титрациона крива чистог моксифлоксацина показује два издвојена скока, указујући на протоновање лиганда са два протона. У присуству Gd3+-јона ово протоновање се дешава на нижим вредностима pH, и појава два пуферска подручја на титрационим кривама указује на формирање комплекса са односом метал-лиганд већим од 1:1. Стога се може очекивати формирање комплекса са односима метал-лиганд 1:1; 2:1; 3:1 као и мешовитих комплекса. Докторска дисертација Експериментални део 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 a pH 1,07 mmol/L moxi + 6,05 mmol/L HCl Gd(III):moxi=1:1 Gd(III):moxi=1:2 Gd(III):moxi=1:3 Gd(III):moxi=1:5 Слика 67. Комплексирање Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини, на температури од (298.0±0,5)К, за концентрационе односе [Gd3+]0 :[moxi]0=1:1, 1:2, 1:3 и 1:5 као зависност pH од титрационог параметра а (moxi-моксифлоксацин) Спектрофотометријска мерења раствора Gd3+-моксифлоксацин система вршена су у области таласних дужина од 250-450 nm, за концентрационе односе Gd3+- моксифлоксацин 1:1; 1:2; 1:3 и 2:1. pH вредност раствора подешавана је додатком стандарних раствора NaOH и HCl. Експериментално добијени апсорпциони спектри система Gd3+-моксифлоксацин за проучаване концентрационе односе приказани су на сликама од 68-71 (стране 126-127), као зависност измерене апсорбанције А од таласне дужине λ (Прилог, табеле од 25П-28П). Сви UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима показују интензивну високо енергетску траку од 290-300 nm, и ниско енергетску траку у области између 330-380 nm, са два уочљива максимума на око 340 и 370 nm. Високо енегетска трака је последица π→π* електронског прелаза у ароматичном прстену, док су максимуми на n→π* последица прелаза у карбонилној и карбоксилној групи. Два мања уочљива максимума у већем опсегу таласних дужина су последица равнотеже моксифлоксацина који формира интермолекуларну водоничну везу са молекулима воде као растварача, и са 4-кето и 3-карбоксилном групом киселине. Повећањем pH вредности од 3-8 приметно је да се максимум са већим интензитетом значајно помера улево ка нижим таласним дужинама (хипсохромно или плаво померање). Уочљиво је и битно смањење интензитета овог максимума. Два максимума у области од 330-380 nm, повећањем pH вредности показују мале промене облика, положаја и интензитета трака. Значајно се мање померају ка већим таласним дужинама (батохромно или црвено померање), са мањим порастом интензитета трака. Интензитет траке на 340 nm расте са повећањем вредности pH, а интензитет траке на 370 nm као и високо енергетске траке опада са повећањем вредности pH. У присуству јона Gd3+ у односу на спектар чистог моксифлоксацина, уочљиво је батохромно (црвено) померање свих апсорпционих трака ка већим таласним дужинама. 125 Докторска дисертација Експериментални део 1.6 [Gd(III)]:[moxi]=1:1A pH=3,671.4 pH=4,649 1.2 pH=5,058 pH=6,316 1.0 pH=5,618 pH=6,147 0.8 pH=6,65 pH=6,96 0.6 pH=6,96 pH=6,971 0.4 0.2 0.0 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 nm Слика 68. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi =1:1 ([Gd3+]=0.033 mmol/dm3, [moxi]=0.035 mmol/dm3 ) [Gd(III)]:[moxi]=1:21.6 A pH=3,684 pH=4,276 1.4 pH=5,12 Слика 69. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi =1:2 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3, [moxi]=0.0349 mmol/dm3 ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 pH=4,997 pH=5,667 pH=5,954 pH=6,375 pH=6,595 pH=6,868 pH=7,096 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 nm 126 Докторска дисертација Експериментални део 2.5A [Gd(III)]:[moxi]=1:3 pH=3,634 Слика 70. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi =1:3 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3, [moxi]=0.0508 mmol/dm3 ) Слика 71. UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацин система на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-moxi=2:1 ([Gd3+]=0.0715 mmol/dm3, [moxi]=0.0349 mmol/dm3 ) 0 0.5 1 1.5 2 pH=4,12 pH=4,742 pH=5,204 pH=5,601 pH=6,059 pH=6,541 pH=6,921 pH=7,024 pH=7,829 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 nm 1.8 A [Gd(III)]:[moxi]=2:1 1.6 pH=3,601 pH=4,055 1.4 pH=4,579 1.2 pH=5,205 pH=5,565 1.0 pH=6,273 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 250 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 nm pH=6,525 pH=6,958 pH=7,2 pH=7,469 127 Докторска дисертација Експериментални део 128 3.3.9. Масеноспектрометријско проучавање хидролизе Gd3+ јона и комплексирања Gd3+ и офлоксацина Проучавање хидролизе Gd3+ јона и комплексирања Gd3+ и офлоксацина вршено је ESI MS на LC-MS инструменту Agilent 1100 (слика 57, страна 116) при условима снимања спектара приказаним у табели 33. Табела 33. Услови снимања ESI MS спектара на LC MS Agilent 1100 Услови снимања Вредност Растварач 50%CH3OH/50% вода Проток 0.2 ml/min Запремина иницирања 20 µl MS ESI Поларитет + Напон фрагментора 20-200 V Капиларни напон 3500 V Температура гаса за сушење 200°C Проток гаса за сушење 12 l/min Притисак распршивача 35 psig Масени опсег 0-1000 m/z Мод Скенирање Хидролиза Gd3+ јона проучавана је при условима концентрација Gd3+ јона и pH вредностима приказаним у табели 34, при чему је претходно извршено снимање спектра мобилне фазе-растварача (50%CH3OH/50% вода), а након тога спектара раствора различитих концентрација Gd3+ јона на pH вредностима у опсегу од 1.530- 7.551. ESI MS спектар хидролизе Gd3+ јона приказан је на слици 72 (страна 129), и у Прилогу (слике 29П-38П). Табела 34. Услови проучавања хидролизе Gd3+ јона Р.бр. узорка Концентрација Gd3+ јона (mol/dm3) pH 1 10 ×10-3 1.530 2 1 × 10-3 2.450 3 0.5 × 10-3 2.781 4 0.1 ×10-3 3.447 5 0.1 ×10-3 5.497 6 0.025 ×10-3 6.043 7 0.1 ×10-3 6.070 8 0.1 ×10-3 6.414 9 0.025 × 10-3 6.654 10 0.025 × 10-3 6.995 11 0.025 × 10-3 7.551 Комплексирање Gd3+ и офлоксацина проучавано је при условима концентрација Gd3+ јона, офлоксацина и pH вредностима приказаних у табели 35 (страна 129), при чему је такође претходно извршено снимање спектара растварача (50%CH3OH/50% вода). Након снимања спектара растварача, извршено је снимање спектара чистог офлоксацина на pH 7 (слика 73, страна 130), а потом раствора различитих концентрација гадолинијума и офлоксацина на pH вредностима у опсегу од 4.552-7.150. Докторска дисертација Експериментални део 129 ESI MS спектар комплексирања Gd3+ јона и офлоксацина приказан је на слици 74 (страна 130), а неколико карактеристичних у Прилогу (слике 39П-46П). Табела 35. Услови проучавања комплексирања Gd3+ јона и офлоксацина Р.бр. узорка Концентрација Gd3+ јона (mol/dm3) Концентрација oflo (mol/dm3) pH 1 - 0.5 ×10-3 7.000 2 0.5 ×10-3 1.0 ×10-3 4.552 3 0.5 ×10-3 0.5 ×10-3 4.622 4 0.5 ×10-3 1.0 ×10-3 5.911 5 0.5 ×10-3 2.0 ×10-3 6.440 6 1.0 × 10-4 1.0 × 10-4 4.340 7 1.0 × 10-4 3.0 × 10-4 4.370 8 2.0 × 10-4 2.0 × 10-4 4.730 9 1.0 × 10-4 3.0 × 10-4 4.880 10 1.0 × 10-4 3.0 × 10-4 5.000 11 1.0 × 10-4 1.0 × 10-4 5.110 12 1.0 × 10-4 1.0 × 10-4 6.040 13 1.0 × 10-4 1.0 × 10-4 6.360 14 1.0 × 10-4 3.0 × 10-4 7.150 Слика 72. ESI MS спектар 0.1×10-3 mol/dm3 Gd3+ јона на pH 6.070 Идентификација пикова (опсег m/z: 102.4, 143.4, 148.4, 180.4, 185.4, 213.4, 231.3, 242.5, 243.5, 279.4, 280.4, 296.3, 301.3, 315.4, 338.4, 352.4, 380.5, 398.5, 449.4, 463.5, 514.5, 579.6, 679.7) који потичу од растварача извршена је на основу ESI MS спектра растварача (50%CH3OH/50% вода). Докторска дисертација Експериментални део 130 Слика 73. ESI MS спектар 0.5×10-3 mol/dm3 офлоксацина на pH 7 Слика 74. ESI MS спектар 1×10-4 mol/dm3 Gd3+ јона + 3×10-4 mol/dm3 oflo на pH 5 (70V) Докторска дисертација Експериментални део 131 3.3.10. Рачунарско моделирање хумане крвне плазме компјутерским програмом HySS Јони метала учествују у многим важним биохемијским процесима у организму, а са тачке гледишта координационе хемије могу се поделити у четири категорије: Јони везани за протеине плазме који нису у равнотежи са околним флуидом; Јони везани за протеине слабим везама који могу бити у равнотежи са околним флуидом; Јони везани у комплексе (са нискомолекуларним лигандима крвне плазме); Слободни јони метала;64 Табела 36. Укупне концентрације лиганада и металних јона за компјутерски модел хумане крвне плазме у HySS Компонента mol/dm3 Компонента mol/dm3 Протеини Неоргански лиганди Хумани серум албумин (HSA) 7.2×10-4 Карбонат (CO32-) 2.5×10-2 Трансферин (Tf) 2.5×10-5 Фосфат (PO42-) 1.6×10-3 Аминокиселине Тиоцијанат (SCN-) 1.4×10-5 Аланин (Ala) 3.7×10-4 Силикат (Sil) 1.4×10-4 Аминобутират (Ambu) 2.4×10-5 Сулфат (SO42-) 2.1×10-4 Аргинин (Arg) 9.5×10-5 Амонијак (NH3-) 2.4×10-5 Аспарагин (Asn) 5.5×10-5 OH- 1.2×10-6 Аспартат (Asp) 5.0×10-6 Карбоксилне киселине Цистеин (Cys) 2.3×10-5 Цитрат (Cit) 1.1×10-4 Цистин (Cis) 4.0×10-5 Лактат (Lac) 1.8×10-3 Цитрулин (Citrl) 2.7×10-5 Малат (Mal) 3.5×10-5 Глутамин (Gln) 4.8×10-5 Оксалат (Oxa) 1.2×10-5 Глутаминат (Glu) 5.2×10-4 Пируват (Pyr) 9.5×10-5 Глицин (Gly) 2.4×10-4 Салицилат (Sal) 5.0×10-6 Хистидин (His) 8.5×10-5 Сукцинат (Succ) 4.2×10-5 Хистамин (Hsn) 1.0×10-8 Аскорбат (Asc) 4.3×10-5 Хидроксипролинат (Hypro) 7.0×10-6 Метални јони Изолеуцинат (Ile) 6.5×10-5 Ca2+ 1.43×10-3 Леуцин (Leu) 1.2×10-4 Mg2+ 6.48×10-4 Лизин (Lys) 1.8×10-4 Cu2+ 1.0×10-18 Метионин (Met) 2.9×10-5 Fe2+ 1.0×10-11 Орнитин (Orn) 5.8×10-5 Fe3+ 1.0×10-23 Фенилаланин (Phe) 6.4×10-5 Pb2+ 1.0×10-14 Пролин (Pro) 2.1×10-4 Mn2+ 1.79×10-12 Серин (Ser) 1.2×10-4 Zn2+ 1.0×10-9 Треонин (Thr) 1.5×10-4 Al3+ 5.0 ×10-3 Триптофосфат (Trp) 1.0×10-5 Gd3+ 1.2×10-9 Тирозин (Tyr) 5.8×10-5 - - Валин (Val) 2.3×10-4 - - Познавање расподеле јона метала између нискомолекуларних комплекса хумане крвне плазме, треба да допринесе бољем познавању њихових функција. Обзиром да су концентрације слободних јона метала и њихових нискомолекуларних комплекса веома мале (pmol/dm3), мерење тих концентрација је изван границе детекције већине аналитичких метода. Стога се изучавање дистрибуције јона метала у хуманој крвној плазми мора извршити компјутерском симулацијом полазећи од познатог квалитативног састава хумане крвне плазме. Основна предпоставка у овом израчунавању јесте да се хумана крвна плазма налази у стационарном стању, односно стању блиском правој равнотежи. Докторска дисертација Експериментални део 132 За моделирање расподеле потребни су поуздани подаци о идентитету и стабилности комплекса у плазми, а који често нису доступни. Константе стабилности комплекса које нису измерене, процењују се најчешће применом LFER теорије, и ако је неопходно врши се корекција константи на услове јонске јачине и температуре крвне плазме применом SIT теорије. Најуспешнији поступак моделовања крвне плазме до сада извршили су Маy64 и сарадници применом компјутерског програма ECCLES. Након конструкције компјутерског модела хумане крвне плазме у ECCLES-у, појавио се велики број нових података о равнотежама, па се указала и потреба за допуном модела хумане крвне плазме. У овој дисертацији коришћен је компјутерски програм HySS и подаци публикованих константи стабилности комплекса металних јона и биологанада хумане крвне плазме мале молекулске масе. Развијен је компјутерски модел хумане крвне плазме који укључује 10 јона метала, 43 лиганда (26 аминокиселина, 7 неорганских лиганада, 8 карбоксилних киселина и 2 протеина) и 5941 комплекса. Константе стабилности комплекса узете су из JESS-ове66, NIST-ове67 и IUPAC-ове85-87 базе константи стабилности, а у случају да се одговарајуће вредности нису могле наћи у базама, коришћени су литературни извори. За добијање поузданих резултата узете су вредности константи стабилности које су блиске онима у физиолошким условима (Т=310К и I=0.15 mol/dm3 NaCl). Пошто те вредности нису увек биле расположиве на основу термодинамичких података (ΔH и ΔS) и применом SIТ теорије извршена је корекција константи стабилности на физиолошке услове. Јони метала који су укључени у компјутерски модел крвне плазме програмом HySS су: Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+ и Pb2+. Након развијања компјутерског модела хумане крвне плазме, исти је проширен комплексима јона Al3+ и Gd3+. Као лиганди укључени су најзаступљенији протеини, аминокиселине, неоргански лиганди и карбоксилне киселине у серуму. Укупне концентрације лиганада и слободне концентрације јона метала коришћених у компјутерском моделу хумане крвне плазме у HySS-у приказани су у табели 36 (страна 131). Табела 37. Комплекси Al3+ јона унети у базу у HySS Комплекс log β Комплекс log β AlH-1 -5.5 AlSucc 3.9 Al(CO3) 5.7 AlCit 7.98 Al(CO3)2 8.4 AlAsp 7.77 AlH(CO3) 10 AlGlu 7.69 Al(SO4) 2 AlHAsp 11.24 AlOxa 6.1 AlH2Asp 14.48 AlOxa2 11.09 AlHGlu 11.07 AlOxa3 15.12 Al H-1Cit2 6.68 Al2Oxa 7.47 AlHSucc 7.3 AlGly 7.61 AlSer 5.97 AlCitMal 10.64 AlThr 5.71 AlCitOxa 11.58 Al H2Asc2 3.55 AlMalOxa 8.86 AlHAsc 1.89 AlHOxa 6.6 AlCys 11.6 AlCitSal 17.83 AlLac 2.4 AlMalSal 15.11 AlH-1Lac -0.65 Al H-2Cit2 -0.42 AlCit2 12.44 Al3H-4Cit3 12 AlH-1Cit 4.4 AlMal 4.6 Al (PO4) 15.5 AlHMal 6.87 AlH-1(PO4) 11.2 Al Mal2 7.62 Докторска дисертација Експериментални део 133 Табела 38. Комплекси Gd3+ јона унети у базу у HySS Комплекс log β Комплекс log β Комплекс log β Gd H-1 -7.83 GdLac 3.347 GdMet 4.93 Gd H-2 -15.6 Gd Lac2 5.04 Gd Met2 9.31 Gd H-3 -22.16 GdSucc 3.42 GdPhe 4.98 Gd3H-4 -19 Gd Succ2 6.58 GdLys 7.42 Gd2H-2 -14.2 GdAla 5.19 Gd Lys2 14.03 Gd (SCN) 0.21 Gd Ala2 9.41 GdH-2Gln -11 Gd (NH3) 0.7 GdAsn 3.85 GdH-3Gln -21 Gd (SO4) 3 Gd Asn2 7.267 GdHCit 8.7 Gd (SO4)2 5 GdAsp 5.77 GdH-1Cit -1 GdOxa 7.137 Gd Asp2 10.037 GdH-2Cit -7.08 Gd Oxa2 10.127 Gd Ser2 8.79 GdCit 6.86 GdH-1Gly -4.96 Gd (CO3) 5.66 Gd Cit2 10.53 GdH-3Gly -20.6 Gd (CO3)2 9.96 GdHis 4.94 GdH-2Gly -10.08 GdThr 4.64 Gd His2 9.16 GdHGly 11.94 Gd Thr2 9.04 GdLeu 5.21 GlyGd 3.26 GdPro 5.58 Gd Leu2 9.52 Gd Gly2 9.17 GdHypro 3.92 GdCitrl 2.96 GdPyr 1.97 GdVal 5.1 GdSal 2.827 GdMal 4.45 Gd Val2 9.9 GdTrp 5.25 Gd Mal2 7.88 GdH-1Val -2.97 Gd Trp2 9.6 GdHHis 11.3 GdH2AspSer 26.29 GdH2CitLac 17.307 GdSer 5.227 GdH2ThrCit 22.35 GdGluCit 12.662 GdHHisTrp 16.937 GdH2AlaGlu 23.13 GdHGluCit 18.687 GdH2HisTrp 24.312 GdHAlaCit 18.423 GdH2GluCit 23.117 GdH3HisTrp 33.95 GdH2AlaCit 26.72 GdH2HisCit 27.727 GdH3HisThr 33.38 GdH3AlaCit 30.73 GdLeuCit 12.667 GdProThr 9.677 GdHGlyCit 18.53 GdHLeuCit 18.167 GdProTrp 10.65 GdH2GlyCit 26.91 GdAspCit 15.132 GdHProTrp 17.98 GdH3GlyCit 30.935 GdHAspCit 20.827 GdH2ProTrp 25.602 GdHValCit 18.446 GdH2AspCit 24.087 GdThrTrp 9.88 GdH2ValCit 26.704 GdLysSucc 7.32 GdH2ThrTrp 24.58 GdH3ValCit 30.66 GdH3LysSucc 23.26 GdH2AlaGly 23.05 GdCitrlLys 7.93 GdH2CitrlSucc 20.35 GdH2GluVal 23.62 GdHCitrlLys 15.42 GdOrnTyr 8.51 GdHArgCit 22.035 GdH3CitrlLys 25.33 GdTyrSucc 7.5 GdH2ArgCit 30.017 GdHLysTyr 16.54 GdH3TyrSucc 25.43 GdH2SerCit 22.22 GdHGlnCit 18.13 GdOrnSucc 8.35 GdH2IleCit 22.557 GdH2GlnCit 26.21 GdHOrnSucc 15.498 GdH2AspIle 27.577 GdCitLac 10.24 GdH2OrnSucc 20.21 GdH2AspThr 25.93 GdHCitLac 13.965 GdLysOrn 7.62 GdH2LysOrn 22.03 GdH3LysOrn 24.395 Gd H(PO4) 5.037 Gd H2(PO4)2 8.85 GdHsa 6.465 GdCitrl 7.67 GdOrn 3.27 GdTyr 4.247 Gd PO4 (s) -20.01 Gd H-3(s) 20.3 Gd2(CO3)2(s) -32.2 Након конструкције компјутерског модела хумане крвне плазме, у базу су додатно унети комплекси метала из базе и флуорохинолона за које су постојали расположиви подаци (офлоксацин, ципрофлоксаци, норфлоксацин, флероксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, спарфлоксацин, …). Пре уношења комплекса и константи стабилности метал-флуорохинолон, унети су подаци о Докторска дисертација Експериментални део 134 константама протоновања флуорохинолона. Укупне концентрација флуорохинолона коришћене у бази су биле максималне серумске концентрације истих које су биле познате и доступне из проучавања фармакокинетичких особина флуорохинолона у литератури. У базу су након тога унети комплекси Al3+ (табела 37, страна 132) и Gd3+ (табела 38, страна 133), са константама стабилности које одговарају физиолошким условима. Докторска дисертација Обрада резултата мерења 135 4. ОБРАДА РЕЗУЛТАТА МЕРЕЊА 4.1. Константе протоновања офлоксацин анјона Константе протоновања офлоксацин анјона одређиване су методом нелинеарне регресије, минимизирањем суме: )()( 2)()( n c iH i e iH UZZ β=−∑ (134) где је први члан једначине експериментална вредност средњег протонског броја, други члан израчуната вредност на основу прве апроксимације вредности константе протоновања. Минимизирање функције U, вршено је рачунарским програмом SUPERQUAD. У оквиру ове дисертације вршено је одређивање константи протоновања офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. Добијени експериментални резултати потенциометријских титрација приказани су у експерименталном делу на слици 58 (страна 117) у облику зависности pH раствора од титрационог параметра а. Константа протоновања офлоксацин анјона може се дефинисати следећом равнотежом: ofloHoflonH n=++ )2,1( =nnβ (135) У обрачуну су укључене све потенциометријске титрације представљене у табели 26 (страна 117) као и све тачке које су добијене. Обрачуном су обухваћене четири титрације, где је концентрација офлоксацина износила 0.5; 1.0; и 2.0 mmol/dm3, у pH опсегу од 2.020-10.029. За почетне вредности константи протоновања при обради експерименталних резултата, коришћене су вредности из различитих литературних подручја. При обрачуну је варирана концентрација протона. Израчуната вредност концентрације протона није се разликовала више од 0.2% од почетне концентрације па је ова промена концентрације протона прихваћена. Резултати добијени обрачуном рачунарским програмом SUPERQUAD, са најбољим вредностима статистичких параметара χ2 и s приказани су у табели 39. Табела 39. Константе протоновања офлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на основу потенциометријских мерења Комплекс log (βp,q,r±SD) (0, 1, 1) 8.212±0.003 (0, 2, 1) 14.240±0.006 χ2 12.78 s 1.10 4.2. Константе протоновања моксифлоксацин анјона Константе протоновања βn моксифлоксацин анјона, дефинисане равнотежом: +−−+ =+ )1(nnmoxiHmoxinH )2,1( =nnβ (136) одређене су стакленом електродом потенциометријским титрацијама у 0.10 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. У опсегу pH вредности од 2.186-10.407 укупно три потенциометријске титрације су извршене са концентрацијама у опсегу од 0.5-1.5 Докторска дисертација Обрада резултата мерења 136 mmol/dm3. Спектрофотометријска мерења су вршена у 15 раствора где је концентрација моксифлоксацина била 0.05 mmol/dm3, док су вредности pH вариране у опсегу од 4-9.4. Израчунате вредности константи протоновања приказане су у табели 40. Слагање између потенциометријски и спектрофотометријски добијених вредности је боље од 1%, и налазе се у опсегу претходно извештених вредности. Табела 40. Константе протоновања моксифлоксацин анјона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на основу потенциометријских и спектрофотометријских мерења Потенциометрија Спектрофотометрија Комплекс log (βp,q,r±SD) (0, 1, 1) 9.34±0.01 9.30±0.02 (0, 2, 1) 15.67±0.01 15.57±0.05 4.3. Хидролитички комплекси Al3+-јона Састав и стабилност комплекса, одређен је на бази препоставке да Al3+-јон ступа у интеракцију са молекулима воде и формира један или више хидролитичких комплекса опште формуле [Alp(OH)q](3p-q)+. Састав и константе стабилности хидролитичких комплекса који се формирају хидролизом Al3+-јона узете су из литературних података.71,79 Табела 41. Константе стабилности хидролитичких комплекса Al3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К 71,79 Комплекс log (βp,q,r±s) (1, -1, 0) 5.15 ± 0.01 (1, -2, 0) 9.53 ± 0.01 (1, -3, 0) 16.18 ± 0.10 (3, -4, 0) 13.44 ± 0.01 (13, -32, 0) 105.79 ± 0.14 χ2 12.36 s 1.11 4.4. Хидролитички комплекси Gd3+-јона Састав и константе стабилности комплекса, одређени су на основу претпоставке да Gd3+-јон ступа у интеракцију са молекулима воде и формира један или више хидролитичких комплекса опште формуле [Gdp(OH)q](3p-q)+ према реакцији: ++−+ +=+ qHOHGdOqHpGd qpqp )3(23 )( (137) где је количина +H јона еквивалентна количини хидроксидних јона везаних за Gd3+-јон. Укупна константа формирања се може дефинисати као: [ ] [ ] qpqpqp HGdC ++−+= 3,,β (138) где је равнотежна конентрација (qpC , qp, ) комплекса и [ ]+3Gd је слободна концентрација Gd3+-јона. Општа формула [Gdp(OH)q](3p-q)+ укључује непознату количину молекула воде као растварача и по могућности неке анјоне медијума. Хидратација индивидуалних јона и формирање комплекса Gd3+-јона са хлоридним Докторска дисертација Обрада резултата мерења 137 јонима је изостављена. Концентрација и хлоридних јона и молекула воде је много већа од концентрације Gd3+-јона. Због тога, није могуће одредити промене у концентрацији хлоридних јона и молекула воде. Да би се избегао ефект формирања комплекса концентрација анјона медијума се држала константном (0.1 mol/dm3) и много већом него концентрација Gd3+-јона. Обзиром да се промене главних коефицијената активности парова ( qp, ) и qp,β вредности не могу истовремено одредити, одржавање константног јонског медијума је коришћено ради одржавања константним главих коефицијената активности. Састав хидролитичких комплекса и њихове константе стабилности су одређене уз помоћ програма HYPERQUAD 2006. Израчунавања указују на формирање мононуклеарних комплекса Gd(OH)2+ у pH области од 5-7.5. Формирање нерастворних Gd-хидроксида је очекивана из титрационих кривих киселих раствора Gd3+ -хлорида са NaOH. По достизању pH области од ~7.5-9 даље додавање базе је заустављно. Израчунате вредности су са прегледом литературних података приказане у табели 42. Табела 42. Константе стабилности хидролитичких комплекса Gd3+-јона у воденим растворима на (298.0±0.5)К у различитим јонским медијумима Ksp=[Gd3+]x[H+]-3 Комплекси -log (βp,q,r±SD) Јонска средина Референца (1, -1, 0) 7.87 ± 0.03 NO3- 0.5 mol/dm3 88 8.20 ± 0.01 ClO4- 3.0 mol/dm3 89 7.3 ± 0.3 ClO4- 1.0 mol/dm3 90 7.83 ± 0.05 ClO4- 0.0 mol/dm3 91 7.96 ± 0.01 Cl- 0.1 mol/dm3 Ова дисертација (1, -2, 0) 13.04 ± 0.03 NO3 - 0.5 mol/dm3 88 14.6 ± 0.5 ClO4 - 1.0 mol/dm3 90 (1, -3, 0) Нерастворан log Ksp 19.32 ± 0.03 NO3 - 0.5 mol/dm3 88 17.0 ± 0.5 ClO4 - 1.0 mol/dm3 90 17.90 ± 0.1 Cl- 0.1 mol/dm3 Ова дисертација 4.5. Комплекси Al3+-офлоксацин система Равнотежа у системима Al3+ + офлоксацин се може представити у општој форми: rqp HAlrofloqHpAl ) 3 =++ ++ oflo( (139) У обрачун су укључене све потенциометријске титрације представљене у табели 30 (страна 121) као и све тачке које су добијене. Приликом израчунавања константи стабилности насталих комплекса испитивани су различити мононуклеарни и полинуклеарни комплекси и притом је испитано преко двадесет модела да би се нашли најприхватљивији: (1,0,1), (1,0,2), (1,1,1), (1,2,1), (1,1,2), (1,-1,1), (1,-2,1), (1,-3,1), (1,- 1,2), (1,-2,2), (1,-2,3) и полимери (2,1,1), (2,2,1), (2,1,2), (2,-1,1), (2,-2,1), (2,-2,2), (2,-3,1), (2,-3,2), (3,-1,1), (3,-2,1), (3,-1,2), (3,-2,2). За време израчунавања аналитички параметри почетних концентрација Al3+, офлоксацин протона су држани непромењени. Као полазни модел за обраду титрационих кривих послужили су хидролитички комплекси који су одраније одређени са најбољим статистичким параметрима у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. Докторска дисертација Обрада резултата мерења 138 Константе протоновања офлоксацин анјона, одређене у посебним титрацијама, нису оптимизоване током рачунања константи стабилности и коришћене су као константне вредности. Заједно са хидролитичким комплексима прво су у рачун као почетни модел увођени мононуклеарни комплекси типа (1,0,1), (1,-1,1) и полинуклеарни комплекс типа (2,-2,2). Свака титрациона крива је обрађивана посебно да би на крају све тачке титрационих кривих биле укључене у прорачун заједно, где су као полазни модел за обраду коришћени комплекси са најбољим статистичким параметрима. Заједно су обрађиване све титрације са истим концентрационим односом метал-лиганд. Израчунате вредности pH се нису разликовале од експериментално добијених за више од 0,003 (обично мање), што се може сматрати довољно прихватљивом грешком. Резултати добијени обрачуном рачунарским програмом SUPERQUAD, са најбољим вредностима статистичких параметара χ2 и s приказани су у табели 43. Резултати обрачуна приказани у табели 43 су указали да се граде четири мононуклеарна и један полинуклеарни комплекс. Табела 43. Константе стабилности комплекса Al3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К Комплекс log (βp,q,r±SD) (1, 1, 1) 15.93±0.03 (1, 0, 2) 14.84±0.07 (1, 0, 1) 10.20±0.04 (1, -1, 1) 4.21±0.05 (2, -2, 1) 6.4±0.10 χ2 21.40 s 3.40 4.6. Комплекси Al3+-моксифлоксацин система Састав и константе стабилности комплекса који се формирају у растворима Al3+- моксифлоксацин узете су из литературних података. 71,79 Табела 44. Константе стабилности Al3+-моксифлоксацин комплекса у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К246 Комплекс log (βp,q,r±SD) (1, 1, 1) 16.59±4 (1, 0, 1) 11.66±1 (1, -1, 1) 5.28±2 (1, -2, 1) -2.92±2 χ2 14.30 s 1.5632 4.7. Комплекси Gd3+-офлоксацин система Равнотежа система Gd3+-офлоксацин се може представити у општој форми: rqp ofloHGdoflorqHpGd )()( 3 ' −++ ++ (140) У обрачун су укључене све потенциометријске титрације представљене у табели 31 (страна 122) као и све тачке које су добијене. Резултати добијени обрачуном Докторска дисертација Обрада резултата мерења 139 рачунарским програмом HYPERQUAD 2006, са најбољим вредностима статистичких параметара χ2 и s приказани су у табели 45. Табела 45. Константе стабилности комплекса Gd3+-офлоксацин система у 0.1 mol/dm3 NaCl средини на (298.0±0.5)К за различите концентрационе односе и када су укључене све титрације у обрачун log (βp,q,r±SD) Комплекс (p,q,r) M:L=1:1 M:L=1:2 M:L=1:2,5 M:L=1:3 M:L=1:5 Сви односи (1, 1, 1) 13.21±0.004 13.03±0.02 13.00 ±0.02 13.33±0.01 13.26±0.04 13.31±0.02 (1, 0, 1) 6.08±0.01 6.00±0.02 (1, -1, 1) -1.42±0.01 -1.01±0.03 (1, 2, 2) 26.41±0.01 25.97±0.01 25.95±0.02 26.48±0.01 25.39±0.03 26.04±0.02 (1, 1, 2) 18.51±0.03 18.48±0.05 20.67±0.02 19.33±0.06 18.14±0.02 (1, 0, 2) 11.20±0.02 11.18±0.03 11.00±0.09 (1, -1, 2) 5.55±0.03 3.81±0.07 3.34±0.04 (1, -2, 2) -6.77±0.04 -6.81±0.06 -6.46±0.08 (1, 3, 3) 38.30±0.02 37.13±0.05 37.65±0.06 (1, 2, 3) 30.00±0.02 30.05±0.02 30.71±0.06 χ2 =10.15 χ2 =5.69 χ2 =3.08 χ2 =10.98 χ2 =4.00 χ2 =33.81 Статистика s =0.048 s =0.75 s =1.09 s =0.43 s =0.81 s =1.57 4.8. Комплекси Gd3+-моксифлоксацин система Константе стабилности система Gd3+-моксифлоксацин у 0.1 mol/dm3 LiCl јонској средини на (298.0±0.5)К на основу потенциометријских и спектрофотометријских мерења за различите концентрационе односе, приказани су у табели 32 (страна 124). Из прелиминарног сета комплекса (табела 46, страна 140), инициран је нови циклус прорачуна, у коме су изабрани подаци потенциометријских и спектрофотометријских мерења третирани заједно. При израчунавањима врсти и константи стабилности насталих комплекса рачунарским програмом HYPERQUAD 2006 а који дају најбоља слагања са експерименталним резултатима, вршено је минимизирање функције, U: ∑ = −= N n C ni O nini YYwNU 1 2)(/1( , (141) где представља статистичку тежину i-тог резидуала у n-тој тачки титрационе криве, и се односе на очитани и израчунати потенцијал (или апсорбанцију) посматраног модела, N је укупни број експерименталних тачака. Квалитет поклапања је процењиван на основу статистичких параметара. niw O niY C niY Вредност прорачунавана је формулом: niw 122 )) ))(( ( −∑ ∂−∂= kk C ni O ni ni k YYw σ . (142) Стандардна девијација параметара k, рачунала се формулом: 2/1)( kN UxGii i −=σ (143) Докторска дисертација Обрада резултата мерења 140 а стандардна девијација резидуала s, формулом: [ ])/( kNewes T −= (144) где је e-вектор у резидуалима потенцијала или апсорбанције. Прихватање израчунатог модела значило је да је вредност функције U минимална, стандардна девијација параметара (константи стабилности) мања од 30% вредности параметра, стандардна девијација резидуала мања од 3.0 и вредност Pearson- овог теста мања од 12.6. Табела 46. Константе стабилности Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl јонској средини на (298.0±0.5)К Потенциометрија Спектрофотометрија L/M = 0.5 - 2 L/M = 3 - 5 L/M = 0.5 - 2 L/M = 3 - 5 Комплекс (p,q,r) log (βp,q,r±SD) (1, 1, 1) 14.72±0.03 14.79±0.06 14.79±0.09 14.75±0.07 (1, 2, 2) 29.65±0.02 29.57±0.08 29.72±0.08 29.67±0.09 (1, 1, 2) 21.20±0.09 (1, 0, 2) 14.00±0.03 13.8±0.3 (1, 3, 3) 43.98±0.03 43.95±0.01 (1, 2, 3) 35.18±0.01 (1, 1, 3) 27.76±0.03 27.80±0.05 (1, 0, 3) 19.00±0.05 19.28±0.08 Статистика χ2 = 11.82 s = 1.23 χ2 = 15.98 s = 1.84 χ2 = 24.36 s = 4.4 χ2 = 13.65 s = 1.3 Спектрофотометријски подаци су прорачунавани програмом pHAb2006 (који такође припада фамилији рачунарских програма HYPERQUAD али поседује извесна побољшања) и програмом HYPERQUAD који такође поседује и могућност обрачуна спектрофотометријских података. Потенциометријски и спектрофотометријски подаци су се држали конзистентним проценом обе врсте података добијених коришћењем оба рачунарска програма и података добијених њиховом појединачном употребом. На основу прихватљивих критеријума, рачунарским програмом HYPERQUAD 2006 израчунати су крајње прихваћени комплекси (табела 47). Табела 47. Коначно прихваћен модел комплекса за константе стабилности Gd3+-моксифлоксацин система у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К Комплекс (p, q, r) log (βp,q,r±SD) (1, 1, 1) 14.78±0.03 (1, 2, 2) 29.75±0.02 (1, 3, 3) 43.98±0.03 (1, 2, 3) 35.08±0.01 (1, 1, 3) 27.56±0.03 (1, 0, 3) 19.20±0.05 Статистика χ2 = 12.02 s = 2.28 Комплекси Al3+ и Gd3+ јона са флуорохинолонима офлоксацином и моксифлоксацином са израчунатим константама стабилности приказани су збирно у табели 48 (страна 141). Докторска дисертација Обрада резултата мерења 141 Табела 48. Збирни приказ комплекса и константи стабилности Al3+ и Gd3+ јона са офлоксацином и моксифлоксацином у 0.1 mol/dm3 LiCl и NaCl средини на (298.0±0.5)К Јон метала Al3+ Gd3+ Лиганд oflo moxi oflo moxi Комплекс (p, q, r) log (βp,q,r±SD) (1, 1, 1) 15.93±0.03 16.59±4 13.31±0.02 14.78±0.03 (1, 0, 2) 14.84±0.07 11.00±0.009 (1, 0, 1) 10.20±0.04 11.66±1 6.00±0.02 (1, -1, 1) 4.21±0.05 5.28±2 -1.01±0.03 (2, -2, 1) 6.4±0.10 (1, -2, 1) -2.92±2 (1, 2, 2) 26.04±0.02 29.75±0.02 (1, 1, 2) 18.14±0.02 (1, -2, 2) -6.46±0.08 (1, 3, 3) 37.65±0.06 43.98±0.03 (1, 2, 3) 30.71±0.06 35.08±0.01 (1, 1, 3) 23.14±0.09 27.56±0.03 (1, 0, 3) 15.17±0.08 19.20±0.05 Статистика χ2 =21.40 s =3.40 χ2=14.30 s =1.5632 χ2 =33.81 s =1.57 χ2 = 12.02 s = 2.28 4.9. ESI MS спектри хидролизе Gd3+ јона и комплекси Gd3+ и офлоксацина Ради интерпретације ESI MS спектара хидролизе Gd3+ јона и комплексирања Gd3+ и офлоксацина, интензитет и положај пикова (сигнала) приказани су у табелама посебно за хидролизу Gd3+ јона (табела 49), посебно за комплексирања Gd3+ и офлоксацина (табела 50, страна 142). Прво су идентификовани сигнали и вредности m/z који потичу од растварача (опсег m/z: 102.4, 124.4, 143.4, 148.4, 180.4, 185.4, 213.4, 231.3, 236.3, 242.5, 243.5, 252.2, 273.4, 279.4, 280.4, 296.3, 299.3, 301.3, 315.4, 317.4, 338.4, 352.4, 361.4, 380.5, 381.5, 398.5, 449.4, 463.5, 514.5, 515.5, 579.6, 679.7, 680.8) како би се елиминисали ови пикови у даљој идентификацији. Табела 49. Табеларни приказ масених спектара хидролизе Gd3+ јона (c=0,025 mmol) на различитим pH вредностима m/z pH 6.043 pH 6.070 pH 6.414 pH 6.654 pH 6.995 pH 7.551 Идентификована врста 90.4 - - 90.4 90.4 90.4 [Gd(H2O)6]3+ 133.4 - - 133.4 133.4 - [Gd(OH)(H2O)5]2+ 191.4 191.4 191.4 191.4 191.4 - Gd(OH)2+ 214.4 214.4 214.4 214.4 214.4 214.4 [Gd(OH)2Na]2+ 225.5 - - 225.4 225.4 225.4 Gd(OH)2Cl 261.5 261.5 - 261.5 261.5 - Gd(OH)2Cl(H2O)2 283.5 283.5 283.5 283.5 283.5 283.5 [GdCl2(H2O)3]+ - - - - - 285.4 [Gd(OH)2Cl(H2O)2Na]+ Анализом ESI MS спектара хидролизе Gd3+ јона, прво су сагледани хидролитички комплекси потврђени потенцијометријском методом (табела 41, страна 136). Након тога у ESI MS спектрима идентификоване су могуће хидролитичке врсте Докторска дисертација Обрада резултата мерења 142 приказане у табели 49 (страна 141). ESI MS спектралном анализом потврђено је присуство хидролитичких комплекса који су идентификовани и потенциометријском методом (Gd(OH)2+ и Gd(OH)2+). Анализом ESI MS спектра офлоксацина и комплексирања офлоксацина и гадолинијума на различитим pH вредностима, утврђено је појављивање доминантних јонских врста на m/z 242.5, 362.4, 363.3 и 575.5. И у овом случају су прво идентификовани пикови који потичу од растварача. Најинтензивнији пик на m/z 362.4 одговара [Oflo+H]+ јонској врсти, мање интензиван на m/z 363.4 одговара [Oflo+2H]+ јонској врсти, што је у складу и са литературним подацима. N O F O COOH N NH CH3CH3 N O O CH3 N NH CH3 N O O N NH CH3 -CO2 -HF -2C2H4 -H2O -HF -CO m/z 242 m/z 296 m/z 362 m/z 463 m/z 575 ili Шема 4. Шема фрагментације офлоксацина Табела 50. Табеларни приказ идентификованих врста у ESI-MS спектрима при комплексирању Gd3+ јона и офлоксацина (L-oflo-; LH0-Hoflo; LH2+-H2oflo+) m/z експ. m/z теор. Идентификовани јони Врста од које вероватно потиче ESI-MS јон 701.7 702.7 [Gd3+ + 2L- - HF - C3H5N -2C3H4]+ GdL2+ 578.8 579.5 [Gd3+ + 2L- - C15H22F2N4]+ GdL2+ 475.6 475.6 [Gd3+ + L- + LH + 4H2O]2+ GdL2+ 414.2 414.4 [Gd3+ + L- + OH- + H2O - C8H13FN2]+ GdL+ 362.3 362.3 [LH2]+ Слободан лиганд 318.4 318.4 [LH2+-CO2]+ Молекулски јон Докторска дисертација Дискусија резултата 143 5. ДИСКУСИЈА РЕЗУЛТАТА У овој дисертацији су извршена испитивања комплексирања у системима: Al3+- офлоксацин, Gd3+-офлоксацин и Gd3+-моксифлоксацин. На основу ових мерења, проучаван је утицај флуорохинолона (офлоксацина и моксифлоксацина) на биодистрибуцију Al3+ и Gd3+-јона и извршено је поређење модела добијеног у нашем раду и модела описаних у литератури. У циљу проучавања реакције комплексирања у системима Al3+-офлоксацин, Gd3+-офлоксацин и Gd3+-моксифлоксацин, извршено је претходно изучавање реакција протоновања офлоксацин и моксифлоксацин анјона, као и хидролизе Al3+ и Gd3+-јона. 5.1. Протоновање офлоксацин анјона Константе протоновања офлоксацин анјона одређене су потенциометријским титрацијама у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К где су концентрације офлоксацина износиле 0.5, 1.0, 2.0 и 2.5 mmol/dm3. Резултати добијени обрачуном експерименталних података потенциометријских титрација приказани су у табели 39 (страна 135). Израчунате вредности константи протоновања у 0.1 mol/dm3 LiCl средини износе logβq,r (q-протон, r-лиганд): Hoflo, logβ1,1=8.212±0.003; H2oflo+, logβ2,1=14.240±0.006. Дистрибуциони дијаграм офлоксацина концентрације 1.0 mmol/dm3 у области pH вредности од 3-11 приказан је на слици 75. [of lo]=1,0 mmol/L 3 5 7 9 11 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to O flo OfloH2Oflo HOflo Слика 75. Дистрибуциони дијаграм офлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К На нижим pH вредностима офлоксацин је протонован на азоту и карбоксилатном анјону. На слици 75 се може видети да се он у раствору налази у катјонском облику који преовлађује на нижим pH вредностима, при pH око 7 највећа је концентрација диполарног јона а на pH већим од 9.5 преовлађује његов анјонски облик. Према томе у реакцијама комплексирања треба ове честице посматрати као лиганде. При повећању pH долази до депротоновања офлоксацина. Докторска дисертација Дискусија резултата 144 UV VIS спектар офлоксацина зависи од pH и састоји се од две апсорпционе траке, при чему је на нижим pH вредностима апсорбанција већа, док у области таласних дужина изнад 360 nm апсорбанција нагло опада. На слици 59 (страна 118) у експерименталном делу докторске дисертације приказани су спектри офлоксацина на различитим вредностима pH где је уочљива асиметрична нискоенергетска трака на око 330 nm, која потиче од апсорпције пиперизинског супституента и π-електрона карбонила и пиридинског прстена. Симетрична високоенергетска трака на око 270 nm, карактеристична за све хинолоне друге генерације која потиче од делокализованог π-електронског система хинолонског језгра није уочљива, јер је снимање спектара вршено у области спектра од 300-400 nm. Обе траке (карактеристична симетрична високоенергетска и асиметрична нискоенергетска) су резултат π→π и n→π прелаза унутар хинолонског језгра офлоксацина. 5.2. Протоновање моксифлоксацин анјона Константе протоновања анјона моксифлоксацинa одређене су потенциометријским титрацијама и спектрофотометријски у 0.1 mol/dm3 LiCl средини, на (298.0±0.5)К. Резултати добијени обрачуном експерименталних података потенциометријских титрација приказани су у табели 28 (страна 119). Израчунате вредности константи протоновања у 0.1 mol/dm3 LiCl средини износе logβq,r (q-протон, r-лиганд): Hmoxi, logβ1,1=9.30±0.020; H2moxi+, logβ2,1=15.57±0.050. Слагање између потенциометријски и спектрофотометријски добијених вредности је боље од 1%, и налази се у опсегу претходно публикованих вредности. Дистрибуциони дијаграм моксифлоксацина концентрације 1.0 mmol/dm3 у области pH вредности од 3-12 приказан је на слици 76. [moxi]=1,0 mmol/L 4 6 8 10 12 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to M ox i Moxi H2Moxi HMoxi Слика 76. Дистрибуциони дијаграм моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К Докторска дисертација Дискусија резултата 145 У воденим растворима моксифлоксацин се понаша као амфотермна аминокиселина са изоелектричном тачком pI=7.44. На основу дистрибуционог дијаграма, може се закључити да моксифлоксацин постоји у катјонском облику при pH нижим од 8 и у анјонском при pH вишим од 8. При pH око 7.5 највећа је концентрација диполарног јона. У реакцијама комплексирања ове честице треба посматрати као лиганде. На pH 7.4 доминантни облик моксифлоксацина је диполарни јон (Hmoxi±), док је катјонски облик (H2moxi+) мање заступљен, па му је концентрација практично занемарљива. На слици 61 (страна 119) у експерименталном делу докторске дисертације приказани су спектри моксифлоксацина на различитим вредностима pH где су уочљива два апсорпциона максимума, оштар, симетричан, високоенергетски и добро дефинисан на 290 nm, и широк, нижеенергетски, мањег интензитета на 320 nm. Приликом промене pH долази до мањег батохромног померања високоенергетске траке. Нискоенергентска трака мења свој облик и интензитет приликом промене pH. Са повећањем pH вредности до pH 7 интензитет ове траке расте и истовремено долази до појаве још једног слабо раздвојеног апсорпционог максимума на око 330 nm. Са даљим порастом pH вредности, интензитет траке опада и она поприма више симетричан изглед. Раствори моксифлоксацина су обојени слабо жутом бојом, па приликом пораста pH вредности интензитет ове боје јача, па се може закључити да боја потиче од ниско енергетске апсорпције. Обе траке (карактеристична симетрична високоенергетска и асиметрична нискоенергетска) су резултат π→π и n→π прелаза унутар хинолонског језгра моксифлоксацина. 5.3. Хидролиза Gd3+-јона Константе хидролитичких комплекса Gd3+-јона одређене су потенциометријским титрацијама у 0.1 mol/dm3 LiCl средини, при чему су концентрације раствора Gd3+-јона на (298.0±0.5)К износиле од 1.0-5.0 (0.99; 2.53; и 4.95) mmol/dm3. Hidroliza Gd3+ 6,5 7,0 7,5 8,0 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd GdH-1 GdH-2 GdH-3(s) Слика 77. Дистрибуциони дијаграм хидролитичких комплекса Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К Докторска дисертација Дискусија резултата 146 Хидролиза Gd3+-јона проучавана је и ESI MS при условима концентрација Gd3+ јона и pH вредностима приказаних у табели 34 (страна 128) експерименталног рада. Обе методе су потврдиле постојање идентичних хидролитичких комплекса чије су константе стабилности приказане у табели 42 (страна 137). Расподела хидролитичких врста приказана је на слици 77 (страна 145). Као што се са слике може видети Gd3+-јон хидролизује у опсегу pH вредности од 6-8. На pH вредности око 7 доминантан хидролитички комплекс је Gd(OH)2, док је на нешто нижој вредности доминантан комплекс GdOH. На pH вредностима већим од 7 почиње таложење при чему се хидролитички комплекс Gd(OH)3 јавља у облику талога. 5.4. Комплекси Gd3+-офлоксацин система Константе стабилности комплекса Gd3+-офлоксацин система одређене су потенциометријским титрацијама у 0.1 mol/dm3 NaCl средини, на (298.0±0.5)К, при чему је однос концентрација Gd3+:офлоксацин био 1:1; 1:2; 1:2,5; 1:3 и 1:5. Концентрација Gd3+-јона у испитиваним растворима приказане су у табели 31 (страна 122) експерименталног дела рада. Резултати добијени обрачуном експерименталних података потенциометријских титрација приказани су у табелама 45 (страна 139) и 48 (страна 141). Из табела је уочљиво формирање искључиво мононуклеарних врста. Gd:Of lo=1:1 3 5 7 9 11 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd Gd[Oflo]H Gd[Oflo] Gd[Oflo]H-1 Gd[Oflo]2H2 GdH-2 Gd:Of lo=1:2 3 5 7 9 11 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd Gd[Oflo]H Gd[Oflo]2H Gd[Oflo]2 Gd[Oflo]2H2 Gd[Oflo]2H-2 GdH-2 Gd:Of lo=1:2,5 3 5 7 9 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd Gd[Oflo]H Gd[Oflo]2 Gd[Oflo]2H2 Gd[Oflo]2H-2 Gd[Oflo]2H GdH-2 Gd:Of lo=1:3 3 5 7 9 11 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd Gd[Oflo]H Gd[Oflo]2H Gd[Oflo]2H2 Gd[Oflo]3H3 Gd[Oflo]2H-1 GdH-2 Докторска дисертација Дискусија резултата 147 Gd:Of lo=1:5 3 5 7 9 11 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd Gd[Oflo]H Gd[Oflo]2H Gd[Oflo]2H2 Gd[Oflo]3H3 Gd[Oflo]3H2 Gd[Oflo]2H-1 GdH-2 Слика 78. Дистрибуциони дијаграми комплекса Gd3+-јона и офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl средини на (298.0±0.5)К при различитим концентрационим односима На основу вредности константи стабилности комплекса Gd3+ јона и офлоксацина приказаним у табелама 45 (страна 139) и 48 (страна 141) израчунати су дистрибуциони дијаграми система Gd3+-офлоксацин за различите концентрационе односе Gd3+/oflo (слика 78). Анализом израчунатих комплекса, може се закључити да су комплекси [GdHoflo]3+ и [Gd(Hoflo)2]3+ идентификовани при свим концентрационим односима метал-лиганд. Комплекс [GdHoflo]3+ настаје у области области pH од 2-8 са максималном концентрацијом на pH око 5. Комплекс [Gd(Hoflo)2]3+ се јавља у области pH од 2-9 са максималном концентрацијом на pH око 7. При концентрационом односу 1:1 идентификовани су комплекси [Gdoflo]2+ у области pH од 5-9, са максималном концентрацијом на pH 7.5 и комплекс [Gd(OH)oflo]+ у области pH од 6-11, са максималном концентрацијом на pH 8.5. При концентрационим односима 1:2 и 1:2.5 идентификовани су и комплекси [Gd(Hoflo)oflo]2+, [Gd(oflo)2]+ и Gd(OH)2(oflo)2. Комплекс [Gd(Hoflo)oflo]2+ настаје у области pH од 4-10 са максималном концентрацијом на pH 7.5, комплекс [Gd(oflo)2]+ настаје у области pH од 6-11, са максималном концентрацијом на pH 8.0 и комплекс Gd(OH)2(oflo)2 настаје у области pH већој од 6, са максималном концентрацијом на pH око 11. При концентрационим односима 1:3 и 1:5 идентификовани су и комплекси Gd(OH)(oflo)2, [Gd(Hoflo)3]3+ и [Gd(Hoflo)2oflo]2+. Комплекс Gd(OH)(oflo)2 идентификован је у области pH од 6-12, са максималном концентрацијом на pH око 9, комплекс [Gd(Hoflo)3]3+ идентификован је у области pH од 3-9, са максималном концентрацијом на pH 6 и комплекс [Gd(Hoflo)2oflo]2+ идентификован је у области pH од 4-9, са максималном концентрацијом на pH 7.5. Комплекс (1,1,1) највероватније настаје реакцијом хидролитичких комплекса са катјонским обликом офлоксацина који егзистира на нижим pH вредностима, и може се представити реакцијом: [ ] [ ] OHHofloGdofloHOHGd 2323 )()( +→+ +++ (145) Докторска дисертација Дискусија резултата 148 Формирање овог комплекса је могуће и по другом механизму, по којем комплекс (1,1,1) настаје реакцијом јона Gd3+(aq) који настаје дисоцијацијом GdCl3+, са катјонским обликом офлоксацина по реакцији: [ ] ++++ +→+ HHofloGdofloHGd 323 )( (146) Могућа структура овог комплекса приказана је на слици 79: N C O Gd2+ O F O CH3 N N H3C O H Слика 79. Могућа структура комплекса [ ] +3)(HofloGd у раствору Са повећањем вредности pH, комплекс [ ] +3)(HofloGd везује “zwitter” јон офлоксацина дајући комплекс (1,2,2) највероватнијом реакцијом: [ ] [ +±+ →+ 323 )()( HofloGdHofloHofloGd ] (147) Формирање овог комплекса могуће је и по другом механизму по реакцији: [ ] ++++ +→+ HHofloGdofloHGd 2)(2 3223 (148) Могућа структура овог комплекса би била: N C O Gd+ O F O CH3 N N H3C N F O H3C N N CH3 O O CO O H H Слика 80. Могућа структура комплекса [ ] +32)(HofloGd у раствору Докторска дисертација Дискусија резултата 149 Комплекс (1,0,1) може настати реакцијом: [ ] ++++ +→+ HGdofloofloHGd 2223 (149) Могућа структура овог комплекса би била: N C O Gd2+ O F O CH3 N N H3C O Слика 81. Могућа структура комплекса [ ] +2Gdoflo у раствору Комплекс (1,-1,1) може настати реакцијом: [ ] +++ +→++ HofloOHGdOHHofloGd 2)(23 (150) Могућа структура овог комплекса би била: N C OO F O CH3 N N H3C O Gd+ OH Слика 82. Могућа структура комплекса [ ]+ofloOHGd )( у раствору Комплекс (1,0,2) може настати реакцијом: [ ] −+−+ +→+ OHofloGdofloOHGd 2)(2)( 22 (151) Могућа структура овог комплекса би била: Докторска дисертација Дискусија резултата 150 N C O Gd+ O F O CH3 N N H3C N F O H3C N N CH3 O O CO O Слика 83. Могућа структура комплекса [ ]+2)(ofloGd у раствору Комплекс (1,-2,2) може настати реакцијом: [ ] [ ]−−+ →+ 222 )()(2)( ofloOHGdofloOHGd (152) Могућа структура овог комплекса би била: N C O Gd O F O CH3 N N H3C N F O H3C N N CH3 O O CO O OHHO - Слика 84. Могућа структура комплекса [ ]−22 )()( ofloOHGd у раствору Комплекс (1,1,2) може настати реакцијом: [ ] [ ] OHofloHofloGdHofloOHGd 222 )(2)( +→+ ++ (153) Могућа структура овог комплекса би била: Докторска дисертација Дискусија резултата 151 N C O +Gd O F O CH3 N N H3C N F O H3C N N CH3 O CO O H Слика 85. Могућа структура комплекса [ ] +2)( ofloHofloGd у раствору Комплекс (1,3,3) може настати реакцијом: [ ++ →+ 333 )(3 HofloGdHofloGd ] (154) Могућа структура овог комплекса би била: N C O O F O CH3 N+ N CH3 N C O O F O CH3 N+ N H3C N C O O F O H3C N+ N CH3 Gd H H H O O O Слика 86. Могућа структура комплекса [ ] +33)(HofloGd у раствору Докторска дисертација Дискусија резултата 152 Комплекс (1,2,3) може настати реакцијом: [ ] [ ] OHofloHofloGdHofloOHGd 2222 )(3)( +→+ ++ (155) Могућа структура овог комплекса би била: N C O O F O CH3 N N CH3 O N C O O F O CH3 N N H3C O N C O O F O H3C N N CH3 O Gd H H Слика 87. Могућа структура комплекса [ ] +22)( ofloHofloGd у раствору Комплекс (1,-1,2) може настати реакцијом: [ ] [ ]22 )(2)( ofloGdOHofloOHGd →+ −+ (156) Могућа структура овог комплекса би била: Докторска дисертација Дискусија резултата 153 N C O Gd O F O CH3 N N H3C N F O H3C N N CH3 O CO O O OH Слика 88. Могућа структура комплекса [ ]2)(ofloGdOH у раствору 5.5. Комплекси Gd3+-моксифлоксацин система Константе стабилности комплекса система Gd3+-моксифлоксацин одређене су потенциометријским титрацијама у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, при чему је однос концентрација Gd3+:моксифлоксацин био 1:1; 1:2; 1:3 и 1:5. Концентрација Gd3+-јона у испитиваним растворима приказане су у табели 32 (страна 124). Резултати добијени обрачуном експерименталних података потенциометријских титрација, приказани су у табелама 46, 47 и 48 (странe 140 и 141). Из табела је уочљиво формирање искључиво мононуклеарних комплекса. На основу вредности константи стабилности комплекса Gd3+ јона и моксифлоксацина приказаним у табели 48 (страна 141) израчунат је дистрибуциони дијаграми Gd3+-моксифлоксацин за концентрациони однос Gd3+/moxi=1:5 (слика 89). Gd:Moxi=1:5; [Gd3+]=1,0 mmol/L 2 4 6 8 10 pH 0 20 40 60 80 100 % fo rm at io n re la tiv e to G d Gd GdMoxiH GdMoxi2H2 GdMoxi3H3 GdMoxi3H2 GdMoxi3H GdMoxi3 Слика 89. Дистрибуциони дијаграми комплекса Gd3+-јона и моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К за концентрациони однос 1:5 Докторска дисертација Дискусија резултата 154 На слици 89 (страна 153) се може уочити да је доминантан комплекс на нижим pH вредностима [Gd(Hmoxi)]3+, са максималном концентрацијом на pH=4. Овај комплекс се може формирати преко реакције Gd3+-аква јона и моксифлоксацина у катјонском облику имајући у виду доминантност катјонског облика у области pH од 2-5 по реакцији: [ ] [ ] OHHmoxiGdmoxiHOHGd 2323 )()( +→+ +++ (157) Овај комплекс може настати и и по другом мање вероватном механизму, реакцијом: [ ] ++++ +→+ HHmoxiGdmoxiHGd 323 )( (158) при чему треба имати у виду да карбоксилни протон учествује у везивању водоника интермолекуларно са 4-карбонилним кисеоником и интрамолекуларно са моксифлоксацином и молекулама растварача. Комплекс [Gd(Hmoxi)]3+ повећањем вредности pH везује “zwitter” јон моксифлоксацина дајући комплекс [Gd(Hmoxi)2]3+ највероватнијом реакцијом: [ ] [ +±+ →+ 323 )()( HmoxiGdHmoxiHmoxiGd ] (159) Овај комплекс са порастом pH ослобађа протоне дајући мешовити комплекс [Gd(Hmoxi)moxi]2+ са максимумом од 10% на pH 8. Са слике 89 (страна 152) се може уочити да повећањем pH вредности од киселе до слабо базне средине, формирање комплекса [GdHmoxi]3+, [Gd(Hmoxi)2]3+, [Gd(Hmoxi)3]3+ се врши консекутивним реакцијама: [ ] [ ] [ +±+±+++ →+→+→+ 3332323 )()()( HmoxiGdHmoxiHmoxiGdHmoxiHmoxiGdmoxiHGd ] (160) На pH вредностима већим од 7 протоновани лиганди моксифлоксацина у комплексу [Gd(Hmoxi)3]3+ ослобађају протоне дајући неутрални комплекс Gd(Hmoxi)3. Формирање комплекса Gd(Hmoxi)3 почиње на pH 8 и порастом pH, концентрација овог комплекса расте. У [Gd(Hmoxi)3]3+ комплексу моксифлоксацин делује као бидендатни О,О-лиганд са могућим формирањем шесточланим прстеном са 4-кето и 3-карбоксилним кисеоником. Gd3+-јон показује карактеристике координационих бројева 6, 8 и 9, а са већином лиганада поседује координациони број 8. Имајући у виду да није пронађено формирање комплекса L/M=4:1, може се претпоставити да су додатна два места у координационој сфери Gd3+-јона попуњена са молекулама воде. Слични резултат је пронађен и у радовима Турела (Turel) и сарадника који су проучавали флуоросцентне особине и структуру Eu3+-cipro комплекса. Они су пронашли да је два бидендатни О,О- cipro молекули и четири аква лиганди су координовани ѕа метал. Један cipro анјонски док су остали ”zwitter”-јонски.123 Сличне резултате за лантаноидне комплексе са cipro су пронашли Пин (Pin) и сарадници. Утврђено је да хинолони могу координисати јон метала у различитом стању протоновања (нпр. ”zwitter”-јонском, неутралном, и анјонском). Комплекс [Gd(Hmoxi)3]3+ је веома стабилан у области pH од 5-8 и вероватно се формира и у хуманој крвној плазми при физиолошким условима. Докторска дисертација Дискусија резултата 155 N O O O F O CH3 N N+ H H N O O O F O CH3 N N+ H H N O O O F OCH3 N N+ H H Gd H2O H2O Слика 90. Могућа структура [Gd(Hmoxi)3]3+ комплекса у раствору 0.0E+00 3.0E+04 6.0E+04 9.0E+04 1.2E+05 1.5E+05 1.8E+05 2.1E+05 2.4E+05 2.7E+05 3.0E+05 250 270 290 310 330 350 370 390λ (nm) ε [GdHmoxi] [Gd(Hmoxi)2] [Gd(Hmoxi)3] Слика 91. Израчунати спектри Gd-moxi комплекса Израчунати спектри у облику зависности моларне апсорптивности од таласне дужине за систем Gd-moxi приказани су на слици 91. Са слике се може уочити да се Докторска дисертација Дискусија резултата 156 спектри GdHmoxi3+, Gd(Hmoxi)23+ и Gd(Hmoxi)33+ разликују од спектра Hmoxi најизразитије у региону прелаза и у опсегу таласних дужина од 330-370 nm. Вероватни разлог за то је кидање интра- и интер-молекулских водоничних веза због координације 4-кето и 3-карбоксилног кисеоника и гадолинијума. *pn → 5.6. Физиолошки модел хумане крвне плазме у компјутерском програму HySS Физиолошки модел хумане крвне плазме конструисан је у компјутерском програму HySS.65 Модел је укључио 8 јона метала и 40 лиганада (26 аминокиселина, 6 неорганских лиганада, 8 карбоксилних киселина) (табела 15, страна 70) из May-овог модела64 конструисаног у компјутерском програму ECCLES, као и комплексе који су у међувремену идентификовани и публиковани. Наш модел је садржавао 5941 комплекса у односу на око 5000 комплекса колико је садржавао May-ов модел. Приликом израде физиолошког модела хумане крвне плазме у компјутерском програму HySS, укупне концентрације лиганада су преузете из May-овог модела, а почетне и крајње концентрације јона метала су критички анализиране из различитих литературних извора и укључиване у прорачун. Проценат дистрибуције јона метала међу лигадима мале молекулске масе добијен у May-овом моделу, упоређен је са нашим резултатима физиолошког модела хумане крвне плазме конструисаног у компјутерском програму HySS ради сагледавања постигнуте корелације. Резултати су приказани у табели 51. Табела 51. Поређење резултата модела хумане крвне плазме добијеним компјутерском симулацијом у HySS-у65 и ECCLES-у64 Компјутерски програм→ ECCLES (May-ov модел) HySS (Ова дисертација) Комплекс ↓ Наелектрисање ↓ % дистрибуције јона метала међу лигандима мале молекулске масе у хуманој крвној плазми Ca2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 HCO3 +1 9 9 9 9 9 9 Cit -1 4 4 4 4 4 4 Lac +1 3 3 3 1 1 1 PO4 -1 2 3 4 2 3 4 CO3 0 1 2 3 1 2 3 Mg2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 HCO3 +1 5 6 6 7 7 7 Cit -1 5 5 4 4 4 4 CO3 0 1 2 4 2 3 5 Lac +1 2 2 2 2 2 2 HPO4 0 1 1 1 1 1 1 Mn2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 HCO3 +1 24 24 24 23 23 23 Cit -1 10 10 9 10 10 10 CO3 0 1 2 4 1 2 4 Oxa 0 2 2 2 2 2 2 HPO4 0 1 1 1 1 1 1 Fe3+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 H-1Cit -1 99 99 99 99 99 99 Докторска дисертација Дискусија резултата 157 CitSal -2 <1 <1 <1 <1 <1 <1 CitGlu -2 <1 <1 <1 <1 <1 <1 CitOxa -2 <1 <1 <1 <1 <1 <1 Pb2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 Cys 0 76 80 82 75 78 80 CitCys -3 6 7 7 8 9 10 HCis +1 8 5 3 8 5 3 HCysPO4 -2 2 3 3 3 4 4 HCO3 +1 5 2 1 3 1 1 HCys2 -1 1 2 3 1 1 2 Cu2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 CisHis -1 16 21 28 17 24 31 HCisHis 0 20 17 14 17 15 13 His2 0 12 11 10 11 10 10 HisThr 0 9 8 7 6 6 5 HisVal 0 5 5 5 4 4 4 HHisLys +1 5 5 4 5 4 4 HisAla 0 4 4 4 4 4 4 HisSer 0 4 4 4 6 6 6 HisPhe 0 3 3 3 2 2 2 HisGly 0 3 3 3 3 3 3 HisLeu 0 2 2 2 3 3 3 HisGlu -1 2 2 2 1 1 1 HisGln 0 2 2 2 3 3 3 HHisOrn +1 2 2 1 2 2 2 HisPro 0 2 1 1 2 1 1 HisIle 0 1 1 1 1 1 1 HisTrp 0 1 1 1 1 1 1 Zn2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 CitCys -3 50 43 33 46 40 30 Cys2 -2 9 19 33 10 19 32 CysHis -1 9 12 14 8 11 12 Cys 0 4 3 2 3 2 2 His +1 4 3 1 6 4 2 HCys2 -1 1 1 2 2 3 3 His2 0 2 1 1 2 2 1 CysGln -1 <1 1 1 1 1 1 Fe2+ pH→ 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 HCO3 +1 27 23 19 CO3 0 14 19 24 His +1 10 13 16 Cit -1 8 7 6 Lac +1 2 1 1 Gln +1 2 2 2 H-1Cit -2 1 2 2 HPO4 0 Није разматрано у May-овом моделу хумане крвне плазме 1 1 1 Докторска дисертација Дискусија резултата 158 Из резултата приказаних у табели 51 (страна 156), уочљиво је да су у оба модела идентификовани исти доминантни комплекси са највећим присутним концентрацијама у хуманој крвној плазми. Израчунавањем процената дистрибуције доминантних комплекса по јонима метала, може се уочити да су слагања између модела велика, са појединачним разликама који не прелазе 5%. Стога се наш модел конструисан у HySS-у може сматрати добрим, а постигнута корелација између модела коректна, те да представља добру основу за даље прорачуне и евентуалну надоградњу. Резултати постигнути прорачуном за јон Fe2+ нису упоређивани са May-овим моделом јер овај јон није ни био укључен у његовом моделу. Приказани су само проценти дистрибуције доминантних комплекса Fe2+ јона у хуманој крвној плазми. На физиолошкој pH вредности хумане крвне плазме (pH 7.4) извршено је поређење резултата слободних концентрација лиганада добијених компјутерском симулацијом у May-овом моделу и нашег модела у HySS-у. Резултати поређења приказани су у табели 52. Табела 52. Поређење резултата слободних концентрација лиганада добијених компијутерском симулацијом на pH=7.4 у HySS-у и ECCLES-у Лиганд ECCLES (May-ov модел) HySS (Ова дисертација) free Ala 2.87×10-6 3.63×10-6 free Ambu 3.38×10-7 1.40×10-7 free Arg 3.40×10-6 2.04×10-10 free Asn 2.69×10-6 4.31×10-6 free Asp 7.56×10-8 5.65×10-8 free Citrl 1.27×10-6 3.13×10-7 free Cys 5.94×10-9 9.34×10-9 free Cis 4.61×10-7 5.99×10-7 free Gln 1.84×10-5 2.45×10-5 free Glu 4.74×10-7 6.80×10-7 free Gly 2.47×10-6 3.34×10-6 free His 2.35×10-6 3.23×10-6 free Hypro 8.59×10-8 1.18×10-7 free Ile 6.95×10-7 9.16×10-7 free Leu 1.32×10-6 1.71×10-6 free Lys 4.88×10-9 7.64×10-9 free Met 8.56×10-7 1.12×10-6 free Orn 5.35×10-9 9.69×10-9 free Phe 1.97×10-8 2.65×10-6 free Pro 2.60×10-7 3.45×10-7 free Ser 4.20×10-6 5.49×10-6 free Thr 6.87×10-6 9.12×10-6 free Trp 1.97×10-7 2.37×10-7 free Tyr 3.49×10-9 2.04×10-9 free Val 2.66×10-6 3.75×10-6 free Hsn 1.92×10-10 2.63×10-10 free CO3 3.54×10-5 7.27×10-5 free PO4 3.40×10-8 2.80×10-8 free Slc 2.67×10-10 2.50×10-12 free SO4 2.04×10-4 2.01×10-4 free (SCN) 1.40×10-5 1.40×10-5 free NH3 6.55×10-7 3.27×10-7 free Cit 2.67×10-5 2.67×10-5 Докторска дисертација Дискусија резултата 159 free Lac 1.76×10-3 1.79×10-3 free Mal 3.11×10-5 3.21×10-5 free Oxa 1.03×10-5 1.01×10-5 free Pyr 9.41×10-5 9.41×10-5 free Sal 1.20×10-11 1.25×10-11 free Succ 4.04×10-5 4.06×10-5 free Asc 5.36×10-8 4.82×10-9 Резултати поређења такође указују на добру репродуктивност нашег модела хумане крвне плазме конструисаног у HySS-у, са очекиваним разликама и нижим вредностима слободних концентрација лиганада у нашем моделу (јер је модел садржао већи број комплекса), што је условило очекивано и логично ниже вредности слободних концентрација присутних и укључених лиганада. При вредностима pH хумане крвне плазме 7.2, 7.4 и 7.6, извршено је поређење резултата укупне концентрације јона метала на основу компјутерске симулације May- овог и нашег модела. Резултати поређења приказани су у табели 53. Резултати поређења указују на добро слагање резултата и очекиване мање вредности у нашем моделу. Табела 53. Поређење резултата укупне концентрације јона метала модела хумане крвне плазме добијеним компјутерском симулацијом у HySS-у и ECCLES-у Програм→ ECCLES (May-ov модел) HySS (Ова дисертација) p(H) → 7.2 7.4 7.6 7.2 7.4 7.6 Јон метала ↓ Концентрација јона метала [mol/dm3] total Ca2+ 1.43×10-3 1.46×10-3 1.51×10-3 1.45×10-3 1.45×10-3 1.45×10-3 total Mg2+ 6.48×10-4 6.56×10-4 6.67×10-4 6.05×10-4 5.84×10-4 5.62×10-4 total Mn2+ 1.79×10-12 1.83×10-12 1.89×10-12 1.48×10-12 1.36×10-12 1.24×10-12 total Fe3+ 4.24×10-13 6.68×10-13 1.06×10-12 2.80×10-13 2.10×10-13 1.40×10-13 total Cu2+ 6.04×10-12 1.57×10-11 4.14×10-11 3.98×10-12 2.99×10-12 1.99×10-12 total Zn2+ 1.79×10-12 1.84×10-7 5.50×10-7 4.00×10-6 3.00×10-6 2.00×10-6 total Pb2+ 2.67×10-11 5.88×10-11 1.30×10-10 1.78×10-11 1.34×10-11 8.91×10-11 total Fe 2+ Јон није био укључен у модел 1.00×10-11 1.00×10-11 1.00×10-11 На основу анализе резултата поређења у табелама 51 (страна 156), 52 (страна 158) и 53 може се закључити да је физиолошки модел хумане крвне плазме конструисан у компјутерском програму HySS, добар, коректан, репродуктиван и у доброј је корелацији са May-овим моделом. Мале промене концентрација металних јона као и варирање броја комплекса и мање разлике у константама нису битније утицале на резултате прорачуна указујући на стабилност конструисаног компјутерског модела хумане крвне плазме. Очекиване разлике у резултатима су у границама прихватљивости, и оне су и унапред предвиђене због разлике у броју унетих комплекса у модел хумане крвне плазме, као и због појаве мањих разлика у кумулативним константама стабилности и минималним разликама вредностима почетних (initial) и крајњих (final) концентрација које су унете за јоне метала, приликом прорачуна у HySS-у. 5.7. Биодистрибуција Al3+ јона у физиолошким условима Уношењем комплекса алуминијума у компјутерски модел хумане крвне плазме (табела 37, страна 132) идентификовани су доминантни комплекси овог металног јона у Докторска дисертација Дискусија резултата 160 хуманој крвној плазми. Проценат расподеле доминантних (непротеинских) комплекса алуминијума (без присуства трансферина) у хуманој крвној плазми приказан је у табели 54. Табела 54. Доминантни комплекси Al3+ у хуманој крвној плазми израчунати програмом HySS (без присуства трансферина) Al3+ % дистрибуције Комплекс↓ pH→ 7.2 7.4 7.6 [Al(PO4)(OH)]- 84.36 88.50 89.98 [AlCit(OH)]- 13.73 9.06 6.10 Al(OH)3 0.79 1.26 2.06 AlPO4 0.72 0.48 0.31 [Al(OH)4]- 0.21 0.54 1.39 [AlCit2(OH)2]5- 0.09 0.09 0.10 Графички приказ расподеле доминантних комплекса алуминијума у хуманој крвној плазми приказан је на слици 92. У даљем тексту, доминантни комплекси алуминијума биће приказивани без наелектрисања ради једноставности. Из табеле 54 и слике 92 уочљиво је да су доминантни комплекси Al(PO4)(OH) (проценат расподеле 84.36-89.98%) и AlCit(OH) (проценат расподеле 6.10-13.73%), док су комплекси Al(OH)3, Al(PO4), Al(OH)4 и AlCit2(OH)2 испод 2% присутни у хуманој крвној плазми. Расподела доминантних комплекса алуминијума је анализирана и у присуству флуорохинолона (ципрофлоксацина, флероксацина, левофлоксацина, ломефлоксацина, коксифлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина и спарфлоксацина). Резултати расподела приказани су на сликама од 93-96 (страна 161). Al(PO4)(OH) AlCit(OH) Al(OH)3 Al(PO4) Al(OH)4 AlCit2(OH)2 7.2 7.4 pH 7.6 84.36% 13.73% 0.79% 0.72% 0.21% 0.09% 88.50% 9.06% 1.26% 0.48% 0.54% 0.09% 89.98% 6.10% 2.06% 0.31% 1.39% 0.10% 0% 5% 10% 15% % o f t ot al A l3+ Слика 92. Доминантни комплекси Al3+ јона у хуманој крвној плазми cipro flero levo lome moxi nor oflo spar Al(OH)PO4 0 20 40 60 80 100 % o f t ot al A l FQ Слика 93. Расподела комплекса Al(ОH)PO4 у присуству неких флуорохинолона Докторска дисертација Дискусија резултата 161 Комплекс Al(PO4)(OH) приказује приближно идентичну расподелу у присуству ципрофлоксацина, флероксацина, ломефлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина и спарфлоксацина. У присуству левофлоксацина расподела овог комплекса је мања. Овај комплекс показује мању расподелу у присуству моксифлоксацина него у присуству офлоксацина (слика 93, страна 160). Комплекс AlCit(OH) је знатно мање доминантан у хуманој крвној плазми (ниже од 10%) па и у присуству неких флуорохинолона. У том смислу, у присуству неких флуорохинолона, његова дистрибуција је слична као и дистрибуција комплекса Al(PO4)(OH). Анализом ових графика се може закључити да је проценат доминанатних комплекса алуминијума нешто већи у присуству офлоксацина него у присуству моксифлоксацина. cipro flero levo lome moxi nor oflo spar Al(OH)Cit 0 5 10 % to ta l A l FQ Слика 94. Расподела комплекса Al(ОH)Cit у присуству неких флуорохинолона cipro flero levo lome moxi nor oflo spar Al(OH)3 0 0,5 1 1,5 % to ta l A l FQ Слика 95. Расподела комплекса Al(ОH)3 у присуству неких флуорохинолона cipro flero levo lome moxi nor oflo spar AlPO4 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 % to ta l A l FQ Слика 96. Расподела комплекса AlPO4 у присуству неких флуорохинолона Докторска дисертација Дискусија резултата 7,2 120% 7,4 7,6 7,2 100% 7,4 7,6 7,2 50% 7,4 7,6 7,2 25% 7,4 7,6 Al(OH)PO4 Al(OH)Cit Aloflo Al(OH)3 Al(PO4) Al(OH)4 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% % o f t ot al A l % Total oflo (serum) Слика 97. Расподела комплекса Al3+ у офлоксацину 7,2 120% 7,4 7,6 7,2 100% 7,4 7,6 7,2 50% 7,4 7,6 7,2 25% 7,4 7,6 Al (OH)PO4 Al(OH)Cit AlHMox2 Al(OH)3 Al(PO4) Al(OH)Mox Al(OH)4 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% % o f t ot al A l % Total moxi (serum) Слика 98. Расподела комплекса Al3+ у моксифлоксацину 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 -7 -6,5 -6 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -logFQ -lo g PM I moxi oflo levo spar lome flero norflo cipro Слика 99. Криве PMI вредности система Al3+-FQ 162 Докторска дисертација Дискусија резултата 163 Овај закључак се може донети и анализом расподеле комплекса алуминијума у офлоксацину (слика 97, страна 162) и моксифлоксацину (слика 98, страна 162). Са слика је уочљива слаба веза између дозне зависности офлоксацина и моксифлоксацина у хуманом крвном серуму на расподелу комплекса алуминијума. Криве PMI вредности неких флуорохинолона приказане су на слици 99 (страна 162). PMI криве система Al3+-FQ указују да моксифлоксацин најзначајније мобилише Al3+-јоне у хуманој крвној плазми у односу на друге FQ (oflo, levo, spar, lome, flero, norflo, cipro). Oflo израженије мобилише Al3+-јоне у хуманој крвној плазми у односу на cipro и norflo а минорно у односу на levo, spar, lome и flero који су бољи мобилизатори Al3+-јоне у хуманој крвној плазми. Проучавањем доступних литературних података о равнотежним моделима за специјације алуминијума у хуманом крвном серуму, уочљиво је да је алуминијум од 81- 89% везан у нормалном хуманом крвном серуму за протеин трансферин5,92. Преостали део од 11-19% стоји на располагању за формирање комплекса са осталим лигандима. Резултати доминантних комплекса алуминијума у хуманој крвној плазми без присуства трансферина добијени прорачуном компјутерским програмом HySS, приказани у табели 55, указују на релативно добро слагање резултата са литературним моделима, по типу доминантних комплекса и проценту расподеле. Резултати добијени нашим прорачунима воде општем закључку који је у блиском слагању са публикованим резултатима, да у хуманом крвном серуму не- протеински алуминијум везује фосфате, хидроксиде и цитрате као доминантне лиганде. Табела 55. Поређење дистрибуције алуминијума компјутерског модела хумане крвне плазме добијеним компјутерском симулацијом у HySS-у и ECCLES-у Програм→ ECCLES5,64 HySS на pH 7.4 (Ова дисертација) Комплекс↓ % дистрибуције Al(PO4)(OH) 80 88.50 AlCit(OH) 10 9.06 Al(OH)3 4 1.26 AlPO4 3 0.48 Al(OH)4 2 0.54 AlCit2(OH)2 - 0.09 5.8. Биодистрибуција Gd3+ јона у физиолошким условима Уношењем комплекса гадолинијума у конструисани компјутерски модел хумане крвне плазме (табела 38, страна 133) идентификовани су доминантни комплекси јона гадолинијума у хуманој крвној плазми. Проценат расподеле доминантних комплекса гадолинијума при минималној концентрацији гадолинијума69 од 1.2×10-9 mol/dm3 у хуманој крвној плазми на физиолошкој вредности pH приказан је у табели 56. Табела 56. Доминантни комплекси Gd3+ у серуму на pH 7.4 израчунати програмом HySS при минималној концентрацији Gd3+-јона [Gd3+]=1,2×10-9 mol/dm3 Комплекс↓ % дистрибуције [GdAspCit]2- 29.39 [GdH-2Cit]2- 20.14 [GdCitLac]- 11.93 [GdH2HisCit]+ 10.47 [GdHSA]16- 7.88 Докторска дисертација Дискусија резултата 164 [GdLeuCit]- 3.04 GdCit 2.78 GdH2GlnCit 2.42 [GdOxa]+ 1.99 GdH2GlyCit 1.65 [GdGluCit]2- 1.20 GdH2AlaCit 1.16 GdH2ValCit 1.15 [GdH-1Cit]- 0.96 [Gd(CO3)2]- 0.69 [GdHAspCit]- 0.58 [GdHGlnCit]- 0.51 [Gd(CO3)]+ 0.48 [GdCit2]3- 0.35 [GdCitrl]2+ 0.21 GdHGlyCit 0.17 GdHValCit 0.16 GdHAlaCit 0.15 GdH2ArgCit 0.13 [GdH3HisThr]4+ 0.06 [GdLac]2+ 0.06 [GdHGluCit]- 0.05 [GdHLeuCit]- 0.04 [GdHArgCit]- 0.03 [GdOxa2]- 0.02 GdH-3 0.02 [GdSer]2+ 0.01 [GdMal]+ 0.01 [GdAla]2+ 0.01 Повећањем концентрације гадолинијума дошло је до промене расподеле доминантних комплексних врста у смислу смањења процента дистрибуције растворних комплекса и фаворизовања формирања нерастворних (таложних) врста. Табела 57. Доминантни комплекси Gd3+ у серуму на pH 7.4 израчунати програмом HySS при различитим концентрацијама Gd3+-јона [Gd3+] [mol/dm3]→ 10 -9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 3×10-3 5×10-3 7×10-3 10-2 Комплекс↓ % дистрибуције Gd2(CO3)3(s) 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 37.90 43.67 46.20 47.27 48.09 GdPO4(s) 0.00 75.67 97.57 99.76 99.98 100.00 31.00 12.64 7.59 5.42 3.80 [GdAspCit]2- 29.39 7.15 0.72 0.07 0.01 [GdH-2Cit]2- 20.14 4.90 0.49 0.05 0.01 [GdCitLac]- 11.93 2.90 0.29 0.03 0.00 [GdH2HisCit]+ 10.47 2.55 0.25 0.03 0.00 [GdHSA]16- 7.88 1.92 0.19 0.02 0.00 [GdLeuCit]- 3.04 0.74 0.07 0.01 0.00 GdCit 2.78 0.68 0.07 0.01 0.00 GdH2GlnCit 2.42 0.59 0.06 0.01 [GdOxa]+ 1.99 0.48 GdH2GlyCit 1.65 0.40 Докторска дисертација Дискусија резултата 165 [GdGluCit]2- 1.20 0.29 GdH2AlaCit 1.16 0.28 GdH2ValCit 1.15 0.28 [GdH-1Cit]- 0.96 0.23 [Gd(CO3)2]- 0.69 0.17 [GdHAspCit]- 0.58 0.14 [GdHGlnCit]- 0.51 0.12 Доминантни комплекси Gd3+ у серуму на вредности pH 7.4 израчунати програмом HySS при различитим концентрацијама Gd3+-јона приказани су у табели 57 (страна 164), а графички на слици 100. У даљем тексту, доминантни комплекси гадолинијума биће приказивани без наелектрисања ради једноставности. G d2 (C O 3) 3( s) G dP O 4( s) G dA sp C it G dH -2 C it G dC itL ac G dH 2H isC it G dH SA G dL eu C it G dC it G dH 2G ln C it G dO xa G dH 2G ly C it 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Species Total Gd 1.2E-09 1.0E-08 1.0E-07 1.0E-05 1.0E-05 1.0E-04 1.0E-03 1.0E-02 Слика 100. Доминантни комплекси Gd3+ јона у крвној плазми на pH 7.4 при различитим концентрацијама Gd3+-јона Као што се са слике 100 и табеле 57 (страна 164) може уочити, на минималној вредности концентрације гадолинијума, сви формирани комплекси гадолинијума су растворни, без појаве нерастворних врста. Повећањем укупне концентрације гaдолинијума формирају се нерастворне врсте. GdPO4(s) се појављује већ при концентрацији гадолинијума од 10-8 mol/dm3 и даљим повећањем концентрације (до 10-4 mol/dm3) постаје доминантна врста. При концентрацијама од 10-7-10-4 mol/dm3 проценат GdPO4(s) достиже вредности од 97.57- 100%. Истовремено, проценат растворних врста се смањује до минималних вредности. Даљим повећањем концентрације гадолинијума, (при вредностима већим од 10-3 mol/dm3) појављује се још један нерастворни комплекс Gd2(CO3)3(s), који постепено постаје доминантна врста. Комплекси GdPO4(s) и Gd2(CO3)3(s) остају као доминантне врсте у широком концентрационом опсегу укупних концентрација гадолинијума у хуманом крвном серуму, што је у сагласности са тежњом лантаноида да формирају нерастворне комплексе са фосфатима. Докторска дисертација Дискусија резултата 166 Анализирајући расподеле растворних комплекса гадолинијума, уочљиво је да су примарне растворне врсте гадолинијума у серуму, врсте које садрже HSA и Oxa, као и тернарне комплексе цитрата као примарних лиганда. Међу њима проценат комплекса GdCitLac је 11.93% због релативно велике концентрације лактата (1.8×10-3 mol/dm3). Повећање концентрација гадолинијума у опсегу у којем су идентификовани растворни комплекси указује да се проценат растворних врста не мења у значајнијем обиму. Литературни модели дистрибуције растворних и нерастворних комплекса гадолинијума (приказани без наелектрисања) при физиолошким условима pH, температуре и јонске јачине, израчунати компјутерским програмом MINTEQA2 приказани су у табелама 58 и 59.69 Табела 58. Дистрибуција комплекса Gd3+ јона (%)69 Укупна концентрација Gd3+ јона [mol/dm3] Комплекс↓ 1.203×10-9 1.4×10-9 2.61×10-9 1.0×10-6 6.0×10-4 1.0×10-3 2.05×10-2 GdPO4(s) 0 7.3 50.1 99.9 99.9 74.92 5.73 Gd2(CO3)3(s) 0 0 0 0 0.1 25.08 94.16 Растворни 100 92.7 49.9 0.1 0 0 0.1 Табела 59. Дистрибуција растворних комплекса Gd3+ јона (%)69 Укупна концентрација Gd3+ јона [mol/dm3] Комплекс↓ 1.203×10-9 1.0×10-7 5.988×10-4 2.074×10-2 2.2×10-2 Free Gd3+ 5.4 5.4 5.5 6.5 2.6 Gd3(OH)4 <1 <1 <1 1 78.9 GdCitAlaH2 1.6 1.6 1.6 1.6 <1 GdCitGlyH2 2.2 2.2 2.2 2.1 <1 GdCitValH2 1.4 1.4 1.4 1.3 <1 GdCitGlnH2 3.1 3.1 3.1 3 <1 GdCitLac 10 10 9.9 9.5 1.7 GdCitGlu 1.1 1.1 1.1 1 <1 GdCitHisH2 1.6 1.6 1.6 1.5 <1 GdCitLeu 7.9 7.9 7.8 7.4 1.2 GdCitAsp 7.7 7.7 7.6 5.3 <1 GdLac 1.1 1.1 1.1 1.3 <1 GdOxa 18.2 18.2 18.3 14.9 1.2 GdHSA 29.6 29.6 29.8 33.6 8.5 GdOH 2.5 2.5 2.5 3 1.2 Према литературним изворима69 при концентрацијама већим од 10-2 mol/dm3 појављује се и растворни комплекс Gd3(OH)4 који постепено постаје доминантна врста, на рачун смањења процента комплекса GdHSA и GdOxa. Обзиром да при нашим прорачунима у компјутерском програму HySS, нисмо повећавали концентрације гадолинијума преко вредности од 10-2 mol/dm3, појава овог комплекса није идентификована. Упоређивањем литературних модела (табеле 58 и 59) и нашег модела (табеле 56 и 57, стране 163 и 164) може се закључити да у опсегу варираних концентрација гадолинијума постоје слагања у понашању нашег модела у компјутерском програму HySS и литературних модела коришћењем компјутерског програма MINTEQA2.69 Утицај неких флуорохинолона на расподелу доминантних комплекса приказан је у табели 60 (страна 167) и сликама од 101-107 (стране 167 и 168). Докторска дисертација Дискусија резултата 167 Табела 60. Утицај неких флуорохинолона на доминантне комплексе Gd3+ јона у крвној плазми на pH 7.4 израчунати програмом HySS [Gd3+]=1,2×10-9 mol/dm3 FQ→ без FQ moxi oflo cipro Комплекс↓ % дистрибуције GdAspCit 29.39 29.35 29.39 29.33 GdH-2Cit 20.14 20.11 20.13 20.09 GdCitLac 11.93 11.92 11.93 11.91 GdH2HisCit 10.47 10.45 10.47 10.44 GdHSA 7.88 7.86 7.88 7.86 GdLeuCit 3.04 3.04 3.04 3.03 GdCit 2.78 2.78 2.78 2.77 bez moxi oflo cipro 29.29% 29.30% 29.31% 29.32% 29.33% 29.34% 29.35% 29.36% 29.37% 29.38% 29.39% 29.40% % o f s pe ci es FQ GdAspCit Слика 101. Расподела комплекса GdAspCit без и у присуству неких флуорохинолона 20.06% 20.07% 20.08% 20.09% 20.10% 20.11% 20.12% 20.13% 20.14% 20.15% % o f s pe ci es bez moxi oflo cipro FQ GdH-2Cit Слика 102. Расподела комплекса GdH-2Cit без и у присуству неких флуорохинолона 11.90% 11.90% 11.91% 11.91% 11.92% 11.92% 11.93% 11.93% 11.94% % o f s pe ci es bez moxi oflo cipro FQ GdCitLac Слика 103. Расподела комплекса GdCitLac без и у присуству неких флуорохинолона Докторска дисертација Дискусија резултата 168 10.43% 10.43% 10.44% 10.44% 10.45% 10.45% 10.46% 10.46% 10.47% 10.47% % o f s pe ci es bez moxi oflo cipro FQ GdH2HisCit Слика 104. Расподела комплекса GdH2HisCit без и у присуству неких флуорохинолона 7.84% 7.85% 7.85% 7.86% 7.86% 7.87% 7.87% 7.88% 7.88% 7.89% % o f s pe ci es bez moxi oflo cipro FQ GdHSA Слика 105. Расподела комплекса GdHSA без и у присуству неких флуорохинолона 3.03% 3.03% 3.03% 3.04% 3.04% 3.04% 3.04% % o f s pe ci es bez moxi oflo cipro FQ GdLeuCit Слика 106. Расподела комплекса GdLeuCit без и у присуству неких флуорохинолона 2.77% 2.77% 2.77% 2.77% 2.77% 2.78% 2.78% 2.78% 2.78% 2.78% 2.78% % o f s pe ci es bez moxi oflo cipro FQ GdCit Слика 107. Расподела комплекса GdCit без и у присуству неких флуорохинолона Докторска дисертација Дискусија резултата 169 0 1.5 3 4.5 -6 -5 -4 -3 -2 -1 -log FQ -lo g PM I oflo moxi cipro Слика 108. Криве PMI вредности система Gd3+-FQ Уопштено се може уочити да је утицај флуорохинолона на расподелу комплекса гадолинијума у хуманом крвном серуму веома мали, готово занемарљив, при чему је утицај моксифлоксацина минимално израженији у смислу утицаја на смањење процента расподеле доминантних растворних врста. Криве PMI вредности система Gd3+-FQ приказане су на слици 108. PMI криве такође потврђују да моксифлоксацин у хуманој крвној плазми израженије мобилише Gd3+-јон у односу на офлоксацин и ципрофлоксацин. Офлоксацин минорније мобилише Gd3+-јон од ципрофлоксацина. У посматраном систему (Gd3+-FQ) моксифлоксацин је израженији мобилизатор Gd3+-јона од офлоксацина, што је потврђено и у систему Al3+- FQ. Докторска дисертација Закључак 171 6. ЗАКЉУЧАК У оквиру ове докторске дисертације испитиване су прототропне и равнотеже комплексирања Al3+ јона и офлоксацина, Gd3+јона и офлоксацина и Gd3+ и моксифлоксацина, потенциометријским и спектрофотометријским методама у 0.1 mol/dm3 LiCl и NaCl средини, на (298.0±0.5)К. Проучавање хидролизе Gd3+ јона и комплексирања Gd3+ и офлоксацина вршено је и ESI MS методом, а биодистрибуција Gd3+ и Al3+ јона у физиолошким условима у хуманој крвној плазми проучавана је компјутерском симулацијом, програмом HySS. Циљ ових испитивања је био да се проучи утицај флуорохинолона офлоксацина и моксифлоксацина на биодистрибуцију Gd3+ и Al3+ јона у хуманој крвној плазми. На основу мерења комплексирања у системима Al3+-офлоксацин, Gd3+-офлоксацин и Gd3+- моксифлоксацин, проучаван је утицај флуорохинолона (офлоксацина и моксифлоксацина) на биодистрибуцију Al3+ и Gd3+ јона, након чега је извршено поређење модела добијеног у нашем раду и модела описаних у литератури. Свестраним разматрањем добијених експерименталних резултата, њиховом математичком обрадом и поређењем модела добијеног у нашем раду са литературним моделима, дошло се до следећих закључака: 1. Константе протоновања офлоксацина (oflo) одређене су потенциометријским титрацијама у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. Константе протоновања офлоксацина logβq,r (q-протон, r-лиганд) износе: Hoflo, logβ1,1=8.212±0.003; H2oflo+, logβ2,1=14.240±0.006; 2. Константе протоновања моксифлоксацина (moxi) одређене су потенциометријским титрацијама у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К, као и спектрофотометријским мерењима. Константе протоновања моксифлоксацина logβq,r (q-протон, r-лиганд) износе: Hmoxi, logβ1,1=9.30±0.020; H2moxi+, logβ2,1=15.57±0.050. 3. Састав и константе стабилности хидролитичких комплекса који се формирају хидролизом Al3+-јона, узете су из литературних података. 4. Хидролиза Gd3+-јона у 0.1 mol/dm3 LiCl средини, проучавана је потенциометријском титрацијама раствора Gd3+-јона на (298.0±0.5)К и ESI MS методом. Потенциометријском и методом ESI MS, потврђено је постојање хиролитичких комплекса logβp,q (p-метал, q-H): GdOH2+ (-logβ1,-1=7.96±0.01); Gd(OH)3 (logKsp1,-3=17.90±0.1). 5. Реакције комплексирања Al3+-јона и офлоксацина изучаване су потенциометријском методом у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К. Обрадом добијених експерименталних резултата нађено је да се формирају протоновани, обични, мешовито хидролитички и полинуклеарно-мешовито хидролитички комплекси са следећим константама стабилности logβp,q,r (p- метал, q-протон, q-лиганд): [Al(Hoflo)]3+ (logβ1,1,1=15.93±0.03); [Al(oflo)2]+ (logβ1,0,2=14.84±0.07); [Aloflo]2+ (logβ1,0,1=10.20±0.04); [Al(OH)oflo]+ (logβ1,- 1,1=4.21± 0.05); [Al2(OH)2oflo]3+ (logβ2,-2,1=6.4±0.10). 6. Комплексирање у систему Gd3+-офлоксацин проучавано је потенциометријским мерењима у 0.1 mol/dm3 NaCl средини, на (298.0±0.5)К. Обрадом добијених експерименталних резултата нађено је да се формирају протоновани, обични, мешовито хидролитички и полинуклеарно-мешовито хидролитички комплекси са следећим константама стабилности logβp,q,r (p-метал, q-протон, q-лиганд): [GdHoflo]3+ (logβ1,1,1=13.31±0.02); [Gdoflo]2+ (logβ1,0,1=6.00±0.02); [Gd(OH)oflo]+ (logβ1,-1,1=-1.01±0.03); [Gd(Hoflo)2]3+ (logβ1,2,2=26.04±0.02); [Gd(Hoflo)oflo]2+ (logβ1,1,2=18.14±0.02); [Gd(oflo)2]+ (logβ1,0,2=11.00±0.09); Gd(OH)(oflo)2 (logβ1,- 1,2=3.34±0.04); Gd(OH)2(oflo)2 (logβ1,-2,2=-6.46±0.08); [Gd(Hoflo)3]3+ Докторска дисертација Закључак 172 (logβ1,3,3=37.65±0.06); [Gd(Hoflo)2oflo]2+ (logβ1,2,3=30.71±0.06). Дистрибуциони дијаграми израчунатих комплекса показују да су у испитиваној области pH, комплекси [GdHoflo]3+ и [Gd(Hoflo)2]3+ идентификовани при свим концентрационим односима метал-лиганд при чему се комплекс [GdHoflo]3+ формира у области pH од 2-8 са максималном концентрацијом на pH око 5, а комплекс [Gd(Hoflo)2]3+ се формира у области pH од 2-9 са максималном концентрацијом на pH око 7. 7. Константе стабилности у систему Gd3+-моксифлоксацин одређене су у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на (298.0±0.5)К на основу потенциометријских и спектрофотометријских мерења. Нађени комплекси са константама стабилности logβp,q,r (p-метал, q-протон, q-лиганд) су: [GdHmoxi]3+ (logβ1,1,1=14.78±0.03); [Gd(Hmoxi)2]3+ (logβ1,2,2=29.75±0.02); [Gd(Hmoxi)3]3+ (logβ1,3,3=43.98±0.03); [Gd(Hmoxi)2moxi]2+ (logβ1,2,3=35.08±0.01); [Gd(Hmoxi)moxi2]+ (logβ1,1,3=27.56±0.03); Gd(moxi)3 (logβ1,0,3=19.20±0.05). Дистрибуциони дијаграми израчунатих комплекса показују да је у испитиваној области pH доминантан комплекс на нижим pH вредностима [GdHmoxi]3+, са максималном концентрацијом на pH 4. Комплекс [Gd(Hmoxi)2]3+ се формира у pH области од 2-7 са максималном концентрацијом на pH 4, комплекс [Gd(Hmoxi)3]3+ свој максимум има на pH 7, комплекси [Gd(Hmoxi)2moxi]2+ и [Gd(Hmoxi)moxi2]+ на pH 8, док формирање комплекса Gd(moxi)3 почиње при pH вредностима већим од 7. 8. Моделовања хумане крвне плазме вршена су употребом различитих компјутерских програма, при чему је највише коришћен програм ECCLES. Својевремено када је направљен модел хумане крвне плазме употребом компјутерског програма ECCLES (са 7 јона метала и 40 лиганада), садржавао је око 5000 комплекса, код којих су константе стабилности у већини биле процењене, а мали број комплекса је имао константе одређене при физиолошким условима. Овај компјутерски програм је превазиђен по својим перформансама јер ради у окружењу DOS OS, није интерактиван са Windows OS, тешко је доступан, а у време када је модел хумане крвне плазме у њему конструисан, многа мерења и нису узета у обзир. У међувремену, појавили су се нови компјутерски програми који су лако доступни за коришћење, раде под окружењем Windows OS и имају знатно веће и боље техничке могућности. Један од таквих је програм HySS. Компјутерским програмом HySS конструисан је модел хумане крвне плазме који је по слагању добијених резултата репродуктиван и у корелацији је са литературним моделом хумане крвне плазме, израђеним у компјутерском програму ECCLES. Модел је укључио 8 јона метала (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Pb2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+) и 43 лиганада (26 аминокиселина, 7 неорганских лиганада, 8 карбоксилних киселина и 2 протеина) из May-овог модела конструисаног у компјутерском програму ECCLES, као и комплексе који су у међувремену идентификовани и публиковани. Модел је садржао укупно 5941 комплекса у односу на око 5000 комплекса колико је садржавао May-ов модел. Константе стабилности комплекса узете су за око 90% унетих комплекса из JESS-ове базе константи стабилности. Преостале константе стабилности (око 10%) узете су из NIST-ове и IUPAC-ове базе константи стабилности, а у случају да се одговарајуће вредности нису могле наћи у базама, коришћени су литературни извори. За добијање поузданих резултата узете су вредности константи стабилности које су блиске онима у физиолошким условима (Т=310К и I=0.15 mol/dm3 NaCl). Пошто те вредности нису увек биле расположиве на основу термодинамичких података (ΔH и ΔS) и применом SIТ и LFER теорије извршена је корекција константи стабилности на физиолошке услове. Ради проучавања утицаја Al3+-јона, у модел хумане крвне плазме унети су комплекси Докторска дисертација Закључак 173 из табеле 37 (страна 132), а ради проучавања утицаја Gd3+-јона, у модел хумане крвне плазме унети су комплекси из табеле 38 (страна 133). Кључна потешкоћа је била у процени слободних концентрација метала због њиховог везивања за протеине хумане крвне плазме, а највећи недостатак је тај што нису узети у обзир проценти везивања метала за протеине, па су концентрације метала процењене. 9. Проучавањем биодистрибуције Al3+-јона компјутерском симулацијом, установљено је да су у хуманој крвној плазми доминантни комплекси [Al(PO4)(OH)]- (проценат дистрибуције око 90%) и [AlCit(OH)]- (проценат дистрибуције од 6-13% у зависности од pH), док су комплекси Al(OH)3, Al(PO4), [Al(OH)4]- и [AlCit2(OH)2]5- испод 2%. Најдоминантнији комплекс [Al(PO4)(OH)]- приказује приближно идентичну концентрацију у присуству флуорохинолона ципрофлоксацина, флероксацина, ломефлоксацина, норфлоксацина, офлоксацина и спарфлоксацина, док у исто време показује мању концентрацију у присуству моксифлоксацина него у присуству офлоксацина. Комплекс [AlCit(OH)]- има мању концентрацију у хуманој крвној плазми (ниже од 10%) у односу на фосфатни комплекс, па и у присуству неких флуорохинолона. Уопштено се може закључити да је у присуству офлоксацина већа концентрација доминантних комплекса него у присуству моксифлоксацина, што значи да моксифлоксацин испољава већи утицај на биодистрибуцију Al3+ јона него офлоксацин. Резултати доминантних комплекса Al3+ јона у хуманој крвној плазми (не узимајући у обзир везивање за трансферин), указују на релативно добро слагање резултата са литературним моделима, по врсти доминантних комплекса и проценту њихове расподеле. Резултати наших прорачуна воде општем закључку да у серуму не-протеински Al3+-јон везује фосфате, хидроксиде и цитрате као доминантне лиганде. 10. Проучавањем биодистрибуције Gd3+-јона компјутерском симулацијом у испитиваном опсегу концентрација, установљено је да су доминантне таложне врсте. Међу њима, првенствено се формира GdPO4(s) због своје велике стабилности, док се комплекс Gd2(CO3)3(s) појављује након тога. Међу растворним врстама Gd3+-јона, доминантни комплекси су комплекси [GdHSA]16-, [GdOxa]+ и тернарни комплекси са цитратима као примарним лигандима. На ниским концентрацијама гадолинијума (10-9 mol/dm3) доминирају растворне врсте, док повећањем концентрација (10-8 mol/dm3 и даљим повећањем) долази до формирања нерастворних (таложних) комплекса као доминантних. 11. Моксифлоксацин у хуманој крвној плазми значајније мобилише јоне Al3+ и Gd3+ као лиганд у односу на офлоксацин. 12. Значај нашег рада се огледа у чињеници, да се добијени резултати у овој докторској дисертацији могу користити за проучавање специјација у сложенијим условима и интеракцијама које обухватају не само лекове, него и токсичне супстанце. Иако савремене базе које се користе за моделирање хумане крвне плазме садрже преко 8000 комплекса, предложена база је интерактивна, графички је орјентисана, поуздана и релативно једноставна за употребу. Њена надоградња је сразмерно једноставна а исправка неког од података директна. Докторска дисертација Литература   175 Л И Т Е Р А Т У Р А 1. J.J.R.Frausto, R.J.P.Williams, The Biological Chemistry of the Elements. The Inorganic Chemistry of Life, Clarendon Press, Oxford, 1991. 2. S.J.Lippard, J.M.Berg, Principles of Bioinorganic Chemistry, University Science Books, Mill Valey, California, 1994. 3. P.M.Harrison, R.J.Hoare, Outline Studies in Biology. Metals in Biochemistry, Chapman and Hall, London, 1980. 4. Р.Јелић, Испитивање равнотежа комплексирања алуминијум(III) и гвожђе(III)-јона са неким алифатичним аминокиселинама, докторска дисертација, Универзитет у Крагујевцу, 1997. 5. W.R.Harris, Equilibrium model for speciation of aluminum in serum, Clin. chem. 38/9, 1809-1818, 1992. 6. P.Hermann, J.Kotek, V.Kubicek, I.Lukes, Gadolinium(III) complexes as MRI contrast agents: ligand design and properties of the complexes, Dalton Trans., 3027-3047, 2008. 7. M.Port, J.M.Idee, C.Medina, C.Robic, M.Sabatou, C.Corot, Efficiency, thermodynamic and kineic stability of marketed gadolinium chelates and their possible clinical consequences: a critical review, Biometals, 21, 469-490, 2008. 8. I.Turel, N.Bukovec, Complex formation between some metals and a quinolone family member (ciprofloxacin), Polyhedron, Vol.15, No2, 269-275, 1996. 9. X.G. Huang, H.S.Zhang, Y.X.Li, M.F.Li, Simultaneous spectrophotometric determination of norfloxacin, ofloxacin and lomefloxacin in rabbit blood serum by use of chemometrics, J.Chil.Chem.Soc, 54, No3, 204-207, 2009. 10. C.J.Eboka, A.B.Afolabi, In-vitro Adsorption of Fluoroquinolones on some pharmaceutical Adsorbens, Trop J.Pharm. Res, 5(1), 533-538, 2006. 11. И.Лазаревић, Утицај површински активних супстанци на прототропне и равнотеже комплексирања у раствору алуминијум(III)-јона и офлоксацина, магистарска теза, Универзитет у Крагујевцу, 2000. 12. А.Ђурђевић, Физичко-хемијска истраживања неких антибиотика и антивиротика у биофлуидима и дозираним облицима, докторска дисертација, Универзитет у Крагујевцу, 2009. 13. М.Обрадовић, Д.Веселиновић, П.Ђурђевић, Физичко хемијске методе испитивања равнотежа у комплексирајућим срединама, Филозофски факултет Ниш и Факултет за физичку хемију Београд, 1996. 14. J.G.Dick, Analytical Chemistry, McGraw-Hill, London, 1973. 15. D.Harvey, Modern analytical chemistry, Mc-Graw-Hill, Boston, 2000. 16. V.T.Andriole, The Quinolones, 3rd edition, Academic Press, London, 2000. 17. J.M.Domagala, Structure-activity and structure-side-effect relationships for the quinolone antibacterials, J.Antimicrob.Chemoter., 33, 685-706, 1994. 18. J.Turindge, Pharmacokinetics and pharmacodynamics of fluoroquinolones, Drugs, Suppl.2, 58, 29-36, 1999. 19. F.V.Bambeke, J.M.Michot, J.V.Eldere, M.Tulkens, Clinical Microbiology and Infection, 11, 256-280, 2005. 20. А.Ћирић, Деривативно спектрофотометријско одређивање моксифлоксацина у крвном серуму, дипломски рад, Универзитет у Крагујевцу, ПМФ, 2006. 21. D.Cheng, W,R.Xu, C.X.Liu, World J Gastroenterol., 13(17), 2496-2503, 2007. 22. D.A.Williams, T.L.Lemke, Foye’s principles of Medicinal Chemistry, Fifth edition, Lippincott Williams&Wilkins, 2002. 23. K.T.Novak, B.Noszal, I.Hermecz, G.Keresturi, Be.Podany, G.Gyorgy, Protonation Equilibria of Quinolone Antibacterials, J. Pharm. Sci., 79 (11), 1990. Докторска дисертација Литература   176 24. I.A.Parshikov, J.D.Moody, J.P.Freeman, J.O.Lay Jr., A.J.Williams, T.M.Heinze, J.B.Sutherland, Formation of conjugates from ciprofloxacin and norfloxacin in cultures of Trichoderma viride, Mycoloq, 94 (1), 1, 2002. 25. M.H.Langlois, M.Montagut, J.P.Dubost, J.Grellet, M.C.Saux, Protonation equilibrium and lipophilicity of moxifloxacin, J. Pharm. Biomed. Anal. 37, 389, 2005. 26. I.A.Parshikov, J.D.Moody, J.P.Freeman, J.O.Lay Jr., A.J.Williams, T.M.Heinze, J.B.Sutherland, Formation of conjugates from ciprofloxacin and norfloxacin in cultures of Trichoderma viride, Mycoloq, 94, (1), 1, 2002. 27. I.A.Parshikov, J.P.Freeman, J.O.Lay Jr., R.D.Beger, A.J.Williams, J.B.Sutherland, Microbiological Transformation of Enrofloxacin by the Fungus Mucor ramannianus, Appl. Envir. Microbio., 66(6), 2664, 2000 28. M.P.Lopez-Gresa, R.Ortiz, L.Perello, J.Latorre, M.L.Gonzalez, S.G.Granda, M.P.Priede, E.Canton, Interactions of metal with two quinolone antimicrobial agents (Cinoxacin and ciprofloxacin) Spectroscopic and X-ray structural characterization. Antibacterial studies, J. Inorg. Biochem., 92, 65, 2002. 29. J.Polster, H.Lachmann, Spectrometric Titration: Analysis of Chemical Equilibria, ICH, Basel, 1989. 30. J.H.Borrell, M.T.Montero, Calculating Microspecies Concentration of Zwitterion Amphoteric Compounds: Ciprofloxacin as Example, J. Chem. Educ.; 74, 1311, 1997. 31. K.T.Novak, B.Noszal, I.Hermecz, G.Kereszturi, B.Podanyi, G.Szasz, Protonation Equilibria of Quinolone Antibacterials, J. Pharm. Sci.; 79, 1023, 1990. 32. H.R.Park, K.Y.Chung, H.Ch.Lee, J.K.Lee, K.M.Bark, Ionization and Divalent Cation Complexation of Quinolone Antibiotics in Aqueous Solution, Bull. Korean Chem. Soc., 21, 2000. 33. A.I.Drakopoulos, P.C.Ioannou, Spectrofluorimetric study of the acid-base equlibria and complexation bevavior of the fluoroquinoloe antibiotics ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin and pefloxacin in aqueous solution, Anal. Chim. Acta 354, 197, 1997. 34. J.Sun, S.Sakai, Y.Tauchi, Y.Deguchi, J.Chen, R.Zhang, K.Morimoto, Determination of lipophilicity of two quinolone antibacterials, ciprofloxacin and grepafloxacin, in the protonation equilibrium, Euro. J. Pharm. and Biopharm., 54, 51, 2002. 35. D.S.Lee, H.J.Han, K.Kim, W.B. Park, J.K.Ch, J.H.Kim, Dissociation and complexation of fluoroquinolone analogues, J. Pharm. Biomed. Anal., 12, 157, 1994. 36. G.Popović, Lj.Milovanović, V.Kapetanović, Study od acib-base equilibria of fleroxacin, J. Pharm. Biomed. Anal., 18, 859, 1998. 37. P.T.Đurđević, M.Jelikić-Stankov, Study of solution equilibrium between aluminium(III) ion and ofloxacin, J. Pharm. Biomed. Anal., 19, 501-510, 1999. 38. I.Lazarević, M.Jelikić-Stankov, P.Đurđević, The effect of sodium dodecylsulfate on prototropic equilibria in the aluminium(III)-ofloxacin system, Main Group Metal Chem., 21(10), 1998. 39. U.Neugebauera, A.Szeghalmib, M.Schmitta, W.Kieferb, J.Poppa, U.Holzgrabec, Vibrational spectroscopic characterization of fluoroquinolones, Spectrochim. Acta Part A 61, 1505, 2005. 40. K.T.Novak, B.Noszal, I.Hermecz, G.Keresturi, Be.Podany, Gyorgy, Protonation Equilibria of Quinolone Antibacterials, J. Pharm. Sci., 79(11), 1990. 41. P.Đurđević, R.Jelić, M.Jelikić-Stankov, D.S.Veselinović, D.Stankov, Complexation behaviour of cadmium(II) ion with nalidixic acid in chloride medium, J. Serb. Chem. Soc., 60(5), 403, 1995. 42. P.Đurđević, M.Jelikić-Stankov, J.Odović, Study of solution equilibria iron(III) ion and ciprofloxacin in pure nitrate ionic medium and micellar medium, Polyhedron 19, 1085, 2000. Докторска дисертација Литература   177 43. A.K.Chattah, Y.G.Linck, G.A.Monti; P.R.Levesein, S.A.Breda, R.H.Manzo, M.E.Olivera, NMR and IR characterization of the aluminium complexes of norfloxacin and ciprofloxacin fluoroquinolones, Magn. Reson. Chem., 45, 850, 2007. 44. N.J.Garrido, L.Perello, R.Ortiz, G.Alzuet, M.G.Alvarez, E.Canton, M.L.Gonzalez, S.G.Granda, M.P.Priede, Antibacterial studies, DNA oxidative cleavage, and crystal structure of Cu(II) and Co(II) complexes with two quinolone family members, ciprofloxacin and enoxacin, J. Inorg,. Biochem., 99, 677, 2005. 45. M.Imran, J.Iqbal, S.Iqbal, N.Ijaz, In vitro antibacterial studies of ciprofloxacin-imines and their complexes with Cu(II), Ni(II), Co(II) and Zn(II), Tubitak, 31, 67, 2007. 46. D.K.Saha, S.Padhye, C.E.Anson, A.K.Powell, Antimycobacterial activity of mixed-ligand copper quinolone complexes, Trans. Metal Chem., 28, 579, 2003. 47. P.Ball, V. T. Andriole (Ed), The quinolones, Academic Press, San Diego, CA, 1-31, 2000. 48. G.Sheehan, A.R.Roland, D. E. Low, Fluoroquinolone Antibiotics, Basel, 1-10, 2003. 49. J.R.Anacona, C.Toledo, Synthesis and antibacterial activity of metal complexes of ciprofloxacin, Trans. Metal Chem. 26, 228, 2001. 50. D.K.Saha, U.Sandbhor, K.Shirisha, S.Padhye, D.Deobagkar, C.E.Anson, A.K.Powell, A novel mixed-ligand antimycobacterial dimeric copper complex of ciprofloxacin and phenanthroline, Bioorg. Medic. Chem. Lett., 14, 3027, 2004. 51. J.Al-Mustafa, Magnesium, calcium and barium perchlorate complexes of ciprofloxacin and norfloxacin, Acta Chim. Slov. 49, 457, 2002. 52. P.Đurđević, R.Jelić, M.Jelikić-Stankov, D.S.Veselinović, D.Stankov, Complexation behaviour of cadmuim(II) ion with nalidixic acid in chloride medium, J. Serb. Chem. Soc., 60(5), 403, 1995. 53. S.A.Sadeek, Synthesis, thermogravimetric analysis, infrared, electronic and mass spectra of Mn(II), Co(II) and Fe(III) norfloxacin complexes, J. Molec. Struct., 753, 1, 2005. 54. B.Macias. M.V.Villa, I.Rubio, A.Castineiras, J.Borras, Complexes of Ni(II) and Cu(II) with ofloxacin. Crystal structure of a new Cu(II) ofloxacin complex, J. Inorg. Biochem., 84, 163, 2001. 55. L.Farkas, M.Gabor, F.Kallay, In Topics in flavonoid Chemestry and Biochemestry, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, 24, 1973. 56. М.Јеликић-Станков, П.Ђурђевић, Хемија антибиотика хинолонског типа, монографија, Фармацеутски факултет, Београд, 1999. 57. H.A.Okeri, I.M.Arhewoh, Analytical profile of the fluoroquinolone antibacterials. I Ofloxacin, African Journal of Biotechnology, Vol.7 (6), 670-680, 2008. 58. P.Calza, C.Medana, F.Carbone, V.Giancotti  and C.Baiocchi,  Characterization of intermediate compounds formed  upon photoinduced degradation of quinolones by  high- performance liquid chromatography,  Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1533–1552, 2008. 59. Bayer AG, Bussines Group Pharma, Marketing Authorization Application, data on file, November 2000. 60. М.Журкић, Проучавање равнотежа у раствору гадолинијум(III)-јона и моксифлоксацина, дипломски рад, Универзитет у Крагујевцу, ПМФ, 2009. 61. D.A.Skoog, D.M.West, F.J.Holler, S.R.Crouch, Analytical chemistry, Eight Edition, Thomson/Brooks/Cole, 2005. 62. T. Kiss, A. Odani, Demonstration of the importance of metal ion speciation in bioactive systems, Bull. Chem. Soc. Jpn. Vol. 80, No9, 1691–1702, 2007. 63. F.Quintus, Metal speciation in environmental and biological systems, Environmental Health Perspectives 103, Supplement 1, February 1995. Докторска дисертација Литература   178 64. P.May, P.W.Linder, D.R.Williams, Computer simulation of metal-ion equilibrium in biofluids: Models for the low-molecular-weight complex distribution of calcium (II), magnesium (II), manganese (II), iron (III), copper (II), zinc (II) and lead (II) ions in human blood plasma, J.Chem, Soc.. Dalton Trans., 588-595, 1977. 65. L.Alderihi, P.Gans, A.Ienco, D.Peters, A.Sabatini, A.Vacca, Hyperquad simulation and speciation (HySS): a utility program for the investigation of equilibria involving soluble and partially soluble species, Elsevier, Coordination Chemistry Reviews 184, 311-318, 1999. 66. P.M.May, D.Rowland, E.Königsberger, G.Hefter, JESS, a Joint Expert Speciation System – IV: A large database of aqueous solution physicochemical properties with an automatic means of achieving thermodynamic consistency, Talanta 81, 142–148, 2010. 67. R.M.Smith, A.E.Martell, R.J.Motekaitis, NIST Standard Reference Database 46, NIST Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes Database, Version 8.0 For Windows, U.S. Department of Commerce, Technology Administration, National Institute of Standards and Technology, Standard Reference Data Program, Gaithersburg, MD 20899, Texas A&M University, College Station, TX 77843-3255, May 2004. 68. P.Letkeman, Computer-modelling of metal speciation in human blood serum, Computer series, 182, Vol.73, No2, 165-170, February 1996, 69. J.Wang, H.Zhang, K.Yang, C.Niu, Computer simulation of Gd(III)speciation in human interstitial fluid, BioMetals, 17, 599-603, 2004. 70. H.G.Seiler, A.Sigel, H.Sigel, Handbook on metals in clinical and analytical chemistry, Marcel Dekker.Inc, Chapter 29, 365-369, 1994. 71. Љ.Јоксовић, Утицај растварача и јонске средине на хидролизу и комплексирање алуминијум(III)-јона са флуорованим хинолонима, докторска дисертација, Универзитет у Крагујевцу, ПМФ, 2008. 72. H.G.Seiler, A.Sigel, H.Sigel, Handbook on metals in clinical and analytical chemistry, Marcel Dekker.Inc, Chapter 16, 217-224, 1994. 73. И. Филиповић, С. Липановић, Опћа и анорганска кемија, Школска књига, Загреб, 295-313, 1982. 74. N.Milić, Ž.Bugarčić, P.Đurđević, Hydrolysis of the Aluminium(III) Ion in Sodium Perchlorate Medium, J. Serb. Chem. Soc. 55(12), 723-729, 1990. 75. N.Milić, Ž.Bugarčić, P.Đurđević, Hydrolysis of aluminum (III) ion in sodium nitrate medium, Can. J. Chem. Vol.69, 28-32, 1991. 76. N.Milić, Ž.Bugarčić, S.Nikezić, Hydrolysis of the aluminium(III) ion in sodium chloride medium, Gazzetta Chimica Italiana, 121, 45-48, 1991. 77. E.Martell, R.J.Motekaitis, R.M.Smith, Aluminium complexes of hydroaliphatic and hydroxyaromatic ligands in aqueous systems – some problems and solutions, Polyhedron, 9, 171-187, 1990. 78. S.C.Wallis, B.G.Charles, L.R.Gahan, L.J.Filippich, M.G.Bredhauer and P.A.Duckworth, Interaction of Norfloxacin with Divalent and Trivalent Prarmaceutical Cations. In Vitro Complexation and in Vivo Pharmacokinetic Studies in the dog, Journal of Pharmaceutical Science Vol.5, No8, August 1996. 79. P.Djurdjević, Lj.Joksović, R.Jelić, A.Djurdjević, and M.Jelikić Stankov, Solution Equilibria between Aluminum(III) Ion and some Fluoroquinolone Family Members. Spectroscopic and Potentiometric Study, Chem. Pharm. Bull. 55(12), 1689-1699, 2007. 80. B.Urbaniak, Z.J.Kokot, Analysis of the factors that significantly influence the stability of fluoroquinolone-metal complexes, Analytica Chimica Acta, 647, 54-59, 2009. 81. W.Guo-Ping, L.Qun-Fang, J.Zhejiang University (Science edition), 30(4), 417–442, 2003. 82. Ј.Мишовић, Т.Аст, Инструменталне методе хемијске анализе, Друго издање, ТМФ, 1975. Докторска дисертација Литература   179 83. H.M.Dion, L.K.Ackerman, H.H.Hill. Detection of inorganic ions from water by electrospray ionization-ion mobility spectrometry, Elsevier, Talanta, 57, 1161–1171, 2002. 84. R.Ekman,  J.Silberring,  A.Westman-Brinkmalm,  A.Kraj,  MASS SPECTROMETRY,  Instrumentation,  Interpretation, and  Applications,  Published by John Wiley&Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 2009. 85. D.Perrin, Stability constants of metal-ion complexes, part B, Organic Ligands, IUPAC chemical data series, N022, Australian National University, Canberra. 86. L.G.Sillen, A.E.Martell, Stability constants of metal-ion complexes, The chemical society, Burlington house, W.1, 1964. 87. L.Pettit, K.Powell, SC-Database, Academic Software and IUPAC, 2004. 88. P.Hermann, J.Kotek, V.Kubiček, I.Lukeš, Gadolinium(III) Complexes as MRI Contrast Agents: Ligand Design and Properties of the Complexes (review), Dalton Trans., 3027– 3047, 2008. 89. M.Port, J.-Marc Idee, C.Medina, C.Robic, M.Sabatou, C.Corot, Efficiency, thermodynamic and kinetic stability of marketed gadolinium chelates and their possible clinical consequences: a critical review, Biometals, 21, 469–490, 2008. 90. P.Đurđević, R.Jelić, D.Džajević, M.Cvijović, Solution Equilibria between Aluminium(III) ion and l-Histidine or l-Tyrosine, Metal Based Drugs, 8, 235–248, 2002. 91. H.M.Irving, M.G.Miles, L.D.Pettit, A study of some problems in determining the stoicheiometric proton dissociation constants of complexes by potentiometric titrations using a glass electrode, Anal. Chim. Acta, 38, 475–488, 1967. 92. L.O.Ohman, R.B.Martin, Citrate as the main small molecule binding Al3+ in Serum, Clin,Chem.40/4, 598-601, 1994. 93. G.E.Jackson, Aluminium, gallium and indium in biological fluids-a computer model of blood plasma, Polyhedron, Vol.9, No2/3, 163-170, 1990. 94. P.Zatta, P.Zambenedetti, R.Milacic, Aluminum toxicity: the relevant role of the metal speciation, Analusis magazine, 26, No6, 72-76, 1998. 95. W.R.Harris, C.Keen, Calculations of the distribution of zinc in a computer model of human serum, the journal of nutrition, 1677-1682, 1989. 96. G.E.Jackson, M.J.Byrne, Metal Ion speciation in blood Plasma: Gallium-67-citrate and MRI Contrast agents, The Journal of nuclear medicine, Vol.37, No2, February 1996. 97. G.E.Jackson, S.Wynchank, M.Woudenberg, Gadolinium (III) complex Equilibria: The implications for Gd(III) MRI Contrast Agents, Magnetic resonance in medicine 16, 57-66, 1990. 98. Y.Wang, X.LU, S.Y.wang, J.F.Han, K.Y.Yang, C.J.Niu, J.Z.NI, Study on effect of Gd(III) speciation on Ca(II) speciation in human blood plasma by computer simulation, Chinese Chemical Letters, Vol.12, No2, 161-162, 2001. 99. J.Shimada, K.Shiba, T.Oguma, H.Miwa, Y.Yoshimura, T. Nishikawa, Y.Okabayashi, T.Kitagawa, S.Yamamoto, Effect of Antacid on Adsorption of the quinolone lomefloxacin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1219-1224, 1992. 100. J.Wang, H.Zhang, K.Yang, C.Niu, J.Ni, Computer simulation of Zn(II) speciation and effect of Gd(III) on Zn(II)speciation in human blood plasma, Biological trace element Research, Vol.96, 125-131, 2003. 101. L.Konigsberger, E. Konigsberger, P.May, G.T.Hefter, Complexation of iron (III) and iron(II) by citrate. Implications for iron speciation in blood plasma, Journal of Inorganic Biochemestry, 78, 175-184, 2000. 102. G.Berthon, Handbook of Metal-Ligand interactions in biological fluids, Bioinorganic chemistry, Vol.2, Marcel Dekker, Inc, New York, Basel, Hong Kong, 1134, 1996. Докторска дисертација Литература   180 103. W.B.Herring, B.S.Leavell, L.M.Paixao, J.H.Yoe, Trace metals in human plasma and red blood cells, The American Journal of Clinical Nutrition, Vol.8, 848-854, 1960. 104. J.Dolovich, S.Levans, E.Nieboer, Occupational asthma from nickel sensitivity: I Human serum albumin in the antigenic determinant, British Journal of industrial medicine, 14, 51-55, 1984. 105. T.Kiss, E.Kiss, E.Garribba, H.Sukurai, Speciation of insulin-mimetic VO(IV)- containing drugs in blood serum, J.of Inorg.Biochem., 80, 65-73, 2000. 106. H.Sun, H.Li, A.B.Mason, R.C.Woodworth, P.J.Sedler, N-lobe versus C-lobe complexation of bismuth by human transferring, Biochem. J., 105-111, 1999. 107. H.Sun, H.Li, A.B.Mason, R.C.Woodworth, P.J.Sedler, Competitive binding of Bismuth to transferring and albumin in aqueous solution and in blood plasma, The J. of Biological Chemistry, Vol.276, No12, 8829-8835, 2001. 108. R.Pakdaman, F.B.Abdallah, J.M.E.H.Chahine, Transferrin, is a mixed chelate-protein ternary complex involved in the mechanism of iron uptake by serum-transferrin in vitro?, J.Mol.Biol., 293, 1273-1284, 1999. 109. J.M.E.H.Chahine, R.Pakdaman, Transferrin, a mechanism for iron release, Eur.J.Biochem, 230, 1102-1110, 1995. 110. W.R.Harris, Z.Wang, Y.Z.Hamada, Competition between transferring and the serum ligands citrate and phosphate for the binding of albumin, Inorg.Chem., 42, 3262-3273, 2003. 111. H.Sun, M.C.Cox, H.Li, P.J.Sadler, Rationalisation of metal binding to transferring:Prediction of metal-protein stability constants, Structure and Bonding, Vol.88, 71-102, 1997. 112. S.Thangadurai, S.K.Shukla, A.K.Srivastava, Y.Anjaneyulu, X-ray powder diffraction patterns for certain fluoroquinolone antibiotic drugs, Acta Pharm. 53, 295-303, 2003. 113. P.Caravan, C.Comuzzi, W.Crooks, T.J.McMurry, G.R.Choppin, S.R.Woulfe, Thermodynamic stability and kinetic inertness of MS-325, a new blood pool agent for magnetic resonance imaging, Inorg.Chem. 40, 2170-2176, 2001. 114. U.Neugebauer, A.Szeghalmi, M.Schmitt, W.Kiefer, J.Popp, U.Holzgrabe, Vibrational spectroscopic characterization of fluoroquinolones, Elsevier, 61, 1505-1517, 2005. 115. D.S.Lee, H.J.Han, K.Kim, W.B.Park, J.K.Cho, J.H.Kim, Dissociation and complexation of fluoroquinolone analogues, J.of Pharm.&Biomed.Anal, Vol.12, No2, 157-164, 1994. 116. V. Nischwitz, A.Berthele, B.Michalke, Speciation analysis of selected metals and determination of their total contents in paired serum and cerebrospinal fluid samples: An approach to investigate the permeability of the human blood-cerebrospinal fluid barrier, Anal.Chim.Acta, 627, 258-269, 2008. 117. V.A.Granadillo, J.E. Tahain, O.Salgado, L.E. Elejalde, B. R. Iturbe, G.B. Romero, R.A. Romero, The influence of the blood levels of lead, aluminum and vanadium upon the arterial hypertension, Elsevier, Clinica Chimica Acta, 233, 47-59, 1995. 118. A.S.Tracey, G.R.Willsky, E.S.Takeuchi, Vanadium, Chemistry, Biochemistry, Pharmacology, and practical application, Taylor&Francis Group, LLC, CRC Press, 153- 166, 2007. 119. H.R. Park, T.H. Kim, K.M. Bark, Physicochemical properties of quinolone antibiotics in various Environments, Invited review, Eur. J. Med. Chem., 37, 443–460, 2002. 120. S. Sakore, S. Choudhari, B. Chakraborty, Biowaiver monograph for immediate release solid oral dosage forms: Ofloxacin, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 2, Suppl 4, 156-161, 2010. Докторска дисертација Литература   181 121. T.Diwakar, K.Rajat, Preformulative studies for floating tablet of ofloxacin, International journal of pharmacy&life sciences, 1(7), 419-427, 2010. 122. Y.Cui, Y.Zhang, X.Tang, In vitro and in vivo evaluation of ofloxacin sustained release pellets, International Journal of Pharmaceutics 360, 47–52, 2008. 123. D. Čurman, P. Živec, I. Leban, I. Turel, A. Polishchuk, K. D.Klika, E. Karaseva, V. Karasev, Polyhedron, 27, 1489–1496, 2008. 124. M.Hughesa, R.Poole, Metal speciation and microbial growth-the hard (and soft) facts, Review article, Journal of general microbiology 137, 725-734, 1991. 125. H.B.Röllin, C.M.C.A.Nogueira, Identification of aluminium fractions in serum using the techniques of high performance liquid chromatography, ultrafiltration and zeemanatomic absorption spectrometry, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem 35(3), 215- 222, 1997. 126. P.M.May, G.L.Smith, D.R.Williams, Computer calculation of Zinc(II)-complex distribution in milk, The Journal of nutrition, 1990-1993, 1982. Докторска дисертација Прилог   183 П Р И Л О Г Докторска дисертација Прилог   184 Потенциометријске титрације протоновања анјона офлоксацина Табела 1П Потенциометријска титрација 20.0 ml 1.00 mmol/dm3 офлоксацина са 0.093 mmol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини ml. NaOH pH a 0.000 6.962 0.00 0.010 7.049 0.05 0.020 7.171 0.09 0.030 7.313 0.14 0.040 7.438 0.19 0.050 7.549 0.23 0.060 7.661 0.28 0.070 7.756 0.33 0.080 7.842 0.37 0.090 7.889 0.42 0.100 7.893 0.47 0.110 7.926 0.51 0.120 7.954 0.56 0.130 7.992 0.61 0.140 8.027 0.65 0.150 8.058 0.70 0.160 8.103 0.75 0.170 8.122 0.79 0.180 8.172 0.84 0.190 8.228 0.88 0.200 8.284 0.93 0.220 8.378 1.02 0.240 8.398 1.12 0.250 8.419 1.16 0.260 8.429 1.21 Табела 2П Потенциометријска титрација 20.0 ml 2.003 mmol/dm3 офлоксацина са 0.093 mmol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини ml. NaOH pH a 0.000 7.087 0.00 0.050 7.420 0.12 0.075 7.563 0.17 0.100 7.687 0.23 0.125 7.773 0.29 0.150 7.814 0.35 0.175 7.909 0.41 0.200 7.986 0.47 0.225 8.032 0.52 0.250 8.065 0.58 0.300 8.190 0.70 0.350 8.371 0.81 0.400 8.533 0.93 0.450 8.720 1.05 Докторска дисертација Прилог   185 0.500 8.898 1.16 0.550 9.131 1.28 0.600 9.310 1.40 0.650 9.409 1.51 0.700 9.420 1.63 0.750 9.430 1.75 0.800 9.438 1.86 0.850 9.445 1.98 0.900 9.452 2.10 Табела 3П Потенциометријска титрација 20.0 ml 2.000 mmol/dm3 офлоксацина + 3.225 mmol/dm3 HCl са 0.093 mmol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини ml. NaOH pH a 0.000 3.036 0.00 0.020 3.061 0.05 0.040 3.100 0.09 0.060 3.143 0.14 0.080 3.192 0.19 0.100 3.244 0.23 0.120 3.304 0.28 0.140 3.384 0.33 0.160 3.479 0.37 0.180 3.598 0.42 0.200 3.773 0.47 0.220 4.018 0.51 0.240 4.458 0.56 0.250 4.723 0.58 0.255 4.823 0.59 0.260 4.922 0.61 0.265 5.009 0.62 0.270 5.098 0.63 0.275 5.163 0.64 1.020 8.745 2.37 1.040 8.846 2.42 1.060 8.962 2.47 1.080 9.095 2.51 1.100 9.247 2.56 1.120 9.411 2.61 1.140 9.585 2.65 1.160 9.757 2.70 1.180 9.907 2.75 1.200 10.029 2.79 Докторска дисертација Прилог   186 Апсорпциони спектри протоновања анјона офлоксацина Табела 4П Апсорпциони спектри офлоксацина у UV-VIS области. Coflo=2.50×10-5 mol/dm3 у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на 298 K Апсорбанција pH 6.035 2.691 4.443 5.972 6.27 6.56 8.229 9.644 0.1 mol/dm3 NaOH 0.1 mol/dm3 HCl λ (nm) 300 0.55 0.762 0.717 0.547 0.515 0.52 0.436 0.515 0.521 0.744 303 0.476 0.707 0.664 0.477 0.44 0.448 0.361 0.434 0.441 0.69 306 0.405 0.604 0.573 0.401 0.366 0.361 0.287 0.357 0.361 0.588 309 0.339 0.503 0.467 0.332 0.304 0.303 0.239 0.294 0.297 0.486 312 0.285 0.401 0.374 0.277 0.259 0.261 0.212 0.25 0.251 0.386 315 0.246 0.337 0.313 0.26 0.254 0.242 0.201 0.225 0.225 0.321 318 0.23 0.297 0.274 0.25 0.25 0.236 0.202 0.218 0.218 0.283 321 0.225 0.28 0.257 0.249 0.249 0.239 0.211 0.222 0.222 0.273 324 0.229 0.276 0.256 0.245 0.242 0.245 0.22 0.23 0.231 0.271 327 0.236 0.278 0.259 0.244 0.24 0.255 0.232 0.24 0.242 0.27 330 0.243 0.281 0.261 0.242 0.235 0.264 0.242 0.251 0.253 0.267 333 0.25 0.282 0.262 0.237 0.231 0.271 0.252 0.262 0.263 0.266 336 0.253 0.276 0.257 0.232 0.226 0.256 0.26 0.27 0.272 0.258 339 0.248 0.266 0.248 0.232 0.225 0.246 0.258 0.275 0.275 0.247 342 0.241 0.253 0.236 0.23 0.221 0.223 0.248 0.265 0.264 0.234 345 0.225 0.238 0.225 0.219 0.22 0.202 0.233 0.25 0.254 0.232 348 0.206 0.22 0.207 0.204 0.211 0.174 0.215 0.233 0.235 0.215 351 0.189 0.198 0.183 0.185 0.189 0.136 0.196 0.218 0.216 0.191 354 0.166 0.167 0.154 0.156 0.163 0.1 0.169 0.184 0.191 0.164 357 0.13 0.137 0.126 0.126 0.13 0.067 0.132 0.151 0.154 0.129 360 0.098 0.11 0.099 0.091 0.093 0.045 0.095 0.111 0.111 0.102 363 0.069 0.091 0.079 0.064 0.066 0.03 0.062 0.08 0.079 0.085 366 0.048 0.076 0.064 0.044 0.044 0.02 0.038 0.057 0.056 0.068 369 0.036 0.064 0.053 0.033 0.029 0.012 0.023 0.038 0.038 0.056 372 0.023 0.054 0.043 0.022 0.018 0.007 0.015 0.027 0.025 0.047 375 0.016 0.045 0.035 0.015 0.012 0.003 0.005 0.016 0.015 0.038 378 0.01 0.039 0.027 0.015 0.007 0.001 0.001 0.011 0.01 0.03 381 0.006 0.031 0.022 0.006 0.004 0 0 0.006 0.005 0.024 384 0.004 0.026 0.017 0.003 0.002 0 0 0.002 0.001 0.02 387 0.002 0.022 0.014 0.002 0 0 0 0.001 0 0.015 390 0 0.02 0.01 0 0 0 0 0 0 0.012 393 0 0.014 0.007 0 0 0 0 0 0 0.009 396 0 0.011 0.006 0 0 0 0 0 0 0.007 399 0 0.01 0.004 0 0 0 0 0 0 0.006 402 0 0.008 0.001 0 0 0 0 0 0 0.004 405 0 0.007 0 0 0 0 0 0 0 0.002 Докторска дисертација Прилог   187 Потенциометријске титрације протоновања анјона моксифлоксацина Табела 5П Потенциометријска титрација 20 ml 0.5 mmol/dm3 моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.1 mol/dm3 NaOH ml. NaOH pH a 0.00 2.186 -14.050 0.10 2.221 -13.050 0.20 2.260 -12.050 0.30 2.297 -11.050 0.40 2.344 -10.050 0.50 2.394 -9.050 0.60 2.453 -8.050 0.70 2.520 -7.050 0.80 2.600 -6.050 0.85 2.645 -5.550 0.90 2.696 -5.050 0.95 2.754 -4.550 1.00 2.818 -4.050 1.05 2.897 -3.550 1.10 2.997 -3.050 1.15 3.122 -2.550 1.18 3.223 -2.250 1.20 3.298 -2.050 1.22 3.398 -1.850 1.23 3.458 -1.750 1.24 3.524 -1.650 1.25 3.611 -1.550 1.26 3.712 -1.450 1.27 3.817 -1.400 1.27 3.861 -1.350 1.28 3.930 -1.300 1.28 4.067 -1.250 1.29 4.194 -1.200 1.29 4.386 -1.150 1.29 4.513 -1.110 1.30 4.719 -1.070 1.30 4.811 -1.050 1.30 4.988 -1.030 1.30 5.047 -1.010 1.31 5.115 -0.990 1.31 5.218 -0.970 1.31 5.494 -0.930 1.31 5.563 -0.910 1.32 5.629 -0.890 1.32 5.698 -0.870 1.32 5.774 -0.830 Докторска дисертација Прилог   188 1.33 5.857 -0.790 1.33 5.940 -0.750 1.33 6.006 -0.710 1.34 6.111 -0.670 1.34 6.183 -0.630 1.35 6.261 -0.570 1.35 6.342 -0.530 1.36 6.408 -0.490 1.36 6.482 -0.450 1.37 6.596 -0.390 1.37 6.719 -0.350 1.38 6.846 -0.290 1.38 6.990 -0.250 1.39 7.196 -0.190 1.39 7.424 -0.150 1.39 7.512 -0.130 1.39 7.640 -0.110 1.40 7.733 -0.090 1.40 7.819 -0.070 1.40 7.929 -0.050 1.40 7.999 -0.030 1.40 8.163 -0.010 1.41 8.256 0.030 1.41 8.320 0.050 1.41 8.394 0.090 1.42 8.511 0.150 1.42 8.594 0.190 1.43 8.676 0.250 1.44 8.783 0.310 1.44 8.859 0.370 1.45 8.966 0.450 1.46 9.045 0.510 1.46 9.135 0.590 1.47 9.197 0.650 1.48 9.305 0.750 1.49 9.407 0.850 1.50 9.501 0.950 1.60 10.076 1.950 1.61 10.161 2.050 1.62 10.220 2.150 1.63 10.265 2.250 1.64 10.306 2.350 1.65 10.343 2.450 1.66 10.382 2.550 1.67 10.407 2.650 Докторска дисертација Прилог   189 Табела 6П Потенциометријска титрација 20 ml 1 mmol/dm3 моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.1 mol/dm3 NaOH ml.NaOH pH a 0.00 2.273 -6.321 0.10 2.314 -5.821 0.20 2.363 -5.321 0.30 2.415 -4.821 0.40 2.476 -4.321 0.50 2.547 -3.821 0.60 2.634 -3.321 0.70 2.740 -2.821 0.75 2.808 -2.571 0.80 2.884 -2.321 0.85 2.978 -2.071 0.90 3.098 -1.821 0.92 3.158 -1.721 0.94 3.225 -1.621 0.96 3.305 -1.521 0.98 3.401 -1.421 0.99 3.455 -1.371 1.00 3.521 -1.321 1.01 3.599 -1.271 1.02 3.639 -1.246 1.02 3.698 -1.221 1.03 3.747 -1.196 1.03 3.803 -1.171 1.04 3.883 -1.146 1.04 3.949 -1.121 1.05 4.058 -1.096 1.05 4.151 -1.071 1.06 4.271 -1.046 1.06 4.349 -1.031 1.06 4.447 -1.021 1.06 4.611 -1.011 1.06 4.657 -1.001 1.07 4.716 -0.991 1.07 4.787 -0.981 1.07 4.875 -0.971 1.07 4.927 -0.961 1.07 4.988 -0.951 1.08 5.046 -0.941 1.08 5.103 -0.931 1.08 5.152 -0.921 1.08 5.203 -0.911 1.08 5.252 -0.901 1.09 5.291 -0.891 Докторска дисертација Прилог   190 1.09 5.326 -0.881 1.09 5.367 -0.871 1.09 5.438 -0.851 1.10 5.492 -0.831 1.10 5.583 -0.801 1.11 5.661 -0.771 1.12 5.779 -0.721 1.13 5.842 -0.691 1.13 5.914 -0.661 1.14 5.991 -0.621 1.15 6.060 -0.581 1.16 6.168 -0.521 1.17 6.259 -0.471 1.18 6.349 -0.421 1.19 6.447 -0.371 1.20 6.550 -0.321 1.21 6.665 -0.271 1.22 6.793 -0.221 1.23 6.917 -0.181 1.23 7.022 -0.151 1.24 7.153 -0.121 1.24 7.255 -0.101 1.25 7.368 -0.081 1.25 7.500 -0.061 1.25 7.576 -0.051 1.26 7.618 -0.041 1.26 7.683 -0.031 1.26 7.747 -0.021 1.26 7.803 -0.011 1.26 7.870 -0.001 1.27 7.926 0.009 1.27 7.980 0.019 1.27 8.027 0.029 1.27 8.129 0.049 1.28 8.220 0.069 1.28 8.308 0.099 1.29 8.398 0.129 1.29 8.453 0.149 1.30 8.531 0.179 1.31 8.622 0.219 1.32 8.729 0.269 1.33 8.802 0.309 1.33 8.873 0.349 1.34 8.954 0.399 1.36 9.042 0.459 1.37 9.128 0.519 1.38 9.211 0.579 1.39 9.277 0.629 Докторска дисертација Прилог   191 1.40 9.342 0.679 1.41 9.403 0.729 1.42 9.469 0.779 1.43 9.535 0.829 1.44 9.598 0.879 1.45 9.664 0.929 Табела 7П Потенциометријска титрација 20 ml 1.5 mmol/dm3 моксифлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са 0.1 mol/dm3 NaOH ml.NaOH pH a 0.00 2.252 -4.733 0.05 2.272 -4.567 0.10 2.292 -4.400 0.15 2.312 -4.233 0.20 2.336 -4.067 0.25 2.360 -3.900 0.30 2.385 -3.733 0.35 2.412 -3.567 0.40 2.443 -3.400 0.45 2.473 -3.233 0.50 2.507 -3.067 0.55 2.544 -2.900 0.60 2.585 -2.733 0.65 2.628 -2.567 0.70 2.677 -2.400 0.75 2.733 -2.233 0.80 2.799 -2.067 0.85 2.874 -1.900 0.88 2.914 -1.817 0.90 2.965 -1.733 0.92 3.005 -1.667 0.94 3.054 -1.600 0.96 3.103 -1.533 0.98 3.166 -1.467 1.00 3.235 -1.400 1.02 3.316 -1.333 1.03 3.364 -1.300 1.04 3.416 -1.267 1.05 3.477 -1.233 1.06 3.548 -1.200 1.07 3.633 -1.167 1.08 3.685 -1.150 1.08 3.739 -1.133 1.09 3.805 -1.117 1.09 3.876 -1.100 1.10 3.964 -1.083 Докторска дисертација Прилог   192 1.10 4.065 -1.067 1.10 4.114 -1.060 1.10 4.162 -1.053 1.11 4.221 -1.047 1.11 4.282 -1.040 1.11 4.353 -1.033 1.11 4.429 -1.027 1.11 4.515 -1.020 1.12 4.611 -1.013 1.12 4.686 -1.007 1.12 4.757 -1.000 1.12 4.824 -0.993 1.12 4.883 -0.987 1.13 4.946 -0.980 1.13 4.997 -0.973 1.13 5.051 -0.967 1.13 5.132 -0.953 1.14 5.206 -0.940 1.14 5.274 -0.927 1.15 5.333 -0.913 1.15 5.385 -0.900 1.15 5.431 -0.887 1.16 5.480 -0.873 1.16 5.543 -0.853 1.17 5.600 -0.833 1.17 5.641 -0.820 1.18 5.691 -0.800 1.19 5.742 -0.780 1.19 5.800 -0.753 1.20 5.845 -0.733 1.21 5.901 -0.707 1.22 5.977 -0.667 1.23 6.041 -0.633 1.24 6.095 -0.600 1.25 6.156 -0.567 1.26 6.219 -0.533 1.27 6.280 -0.500 1.28 6.340 -0.467 1.29 6.400 -0.433 1.30 6.467 -0.400 1.31 6.537 -0.367 1.32 6.606 -0.333 1.33 6.677 -0.300 1.34 6.719 -0.283 1.34 6.760 -0.267 1.35 6.804 -0.250 1.35 6.849 -0.233 1.36 6.898 -0.217 Докторска дисертација Прилог   193 1.36 6.949 -0.200 1.37 7.001 -0.183 1.37 7.062 -0.167 1.38 7.130 -0.150 1.38 7.203 -0.133 1.39 7.292 -0.117 1.39 7.366 -0.103 1.39 7.410 -0.097 1.39 7.449 -0.090 1.40 7.495 -0.083 1.40 7.630 -0.077 1.40 7.649 -0.067 1.40 7.696 -0.060 1.40 7.747 -0.053 1.41 7.794 -0.047 1.41 7.848 -0.040 1.41 7.887 -0.033 1.41 7.989 -0.020 1.42 8.032 -0.013 1.42 8.071 -0.007 1.42 8.105 0.000 1.42 8.144 0.007 1.42 8.180 0.013 1.43 8.208 0.020 1.43 8.235 0.027 1.43 8.274 0.033 1.43 8.303 0.040 1.44 8.359 0.053 1.44 8.406 0.067 1.44 8.457 0.080 1.45 8.509 0.100 1.46 8.580 0.127 1.47 8.685 0.167 1.48 8.756 0.200 1.49 8.824 0.233 1.50 8.884 0.267 1.51 8.950 0.300 1.52 9.006 0.333 1.53 9.060 0.367 1.54 9.111 0.400 1.55 9.160 0.433 1.56 9.211 0.467 1.57 9.258 0.500 1.58 9.304 0.533 1.59 9.348 0.567 1.60 9.397 0.600 1.61 9.447 0.633 1.62 9.484 0.667 Докторска дисертација Прилог   194 1.63 9.533 0.700 1.64 9.577 0.733 1.65 9.620 0.767 1.66 9.659 0.800 1.67 9.699 0.833 1.68 9.750 0.867 1.69 9.795 0.900 Апсорпциони спектри протоновања анјона моксифлоксацина Табела 8П Апсорпциони спектри моксифлоксацина у UV-VIS области. Cmoxi=5.35×10-5 mol/dm3 у 0.1 mol/dm3 LiCl средини на 298 K Апсорбанција pH 1.800 3.666 4.817 5.688 7.033 7.870 8.835 10.284 11.870 6.022 6.311 8.323 9.400 λ(nm) 320 0.593 0.592 0.583 0.579 0.563 0.583 0.588 0.523 0.527 0.588 0.593 0.603 0.566 322 0.598 0.598 0.590 0.592 0.594 0.617 0.625 0.550 0.553 0.609 0.617 0.641 0.599 324 0.604 0.604 0.596 0.605 0.624 0.652 0.663 0.576 0.579 0.629 0.642 0.679 0.633 326 0.607 0.606 0.600 0.615 0.651 0.683 0.698 0.600 0.601 0.647 0.663 0.714 0.663 328 0.605 0.604 0.598 0.620 0.674 0.710 0.728 0.620 0.620 0.660 0.679 0.744 0.690 330 0.602 0.602 0.597 0.625 0.695 0.734 0.755 0.642 0.641 0.671 0.693 0.771 0.715 332 0.600 0.599 0.595 0.629 0.714 0.757 0.780 0.666 0.666 0.681 0.707 0.795 0.739 334 0.597 0.597 0.593 0.632 0.731 0.777 0.803 0.691 0.693 0.690 0.718 0.818 0.764 336 0.592 0.592 0.589 0.632 0.743 0.792 0.821 0.711 0.715 0.695 0.726 0.835 0.783 338 0.584 0.584 0.582 0.628 0.747 0.799 0.829 0.720 0.725 0.694 0.727 0.842 0.790 340 0.575 0.574 0.572 0.619 0.741 0.792 0.824 0.714 0.720 0.685 0.718 0.835 0.784 342 0.564 0.563 0.561 0.605 0.722 0.772 0.802 0.697 0.703 0.669 0.701 0.813 0.764 344 0.556 0.555 0.552 0.590 0.694 0.741 0.769 0.675 0.683 0.649 0.677 0.778 0.735 346 0.552 0.550 0.546 0.575 0.658 0.701 0.727 0.653 0.666 0.626 0.649 0.735 0.702 348 0.550 0.548 0.543 0.563 0.622 0.658 0.682 0.636 0.655 0.604 0.621 0.689 0.670 350 0.552 0.550 0.543 0.553 0.586 0.616 0.638 0.623 0.651 0.583 0.595 0.643 0.641 352 0.555 0.553 0.544 0.545 0.552 0.577 0.596 0.615 0.652 0.564 0.571 0.601 0.615 354 0.558 0.556 0.546 0.539 0.521 0.540 0.558 0.610 0.657 0.547 0.549 0.561 0.592 356 0.560 0.558 0.548 0.533 0.492 0.506 0.522 0.606 0.662 0.531 0.528 0.523 0.571 358 0.561 0.559 0.548 0.527 0.465 0.473 0.488 0.602 0.666 0.515 0.509 0.487 0.551 360 0.560 0.558 0.546 0.519 0.437 0.441 0.454 0.596 0.668 0.497 0.488 0.451 0.529 362 0.556 0.554 0.542 0.509 0.409 0.409 0.420 0.587 0.665 0.479 0.466 0.416 0.506 364 0.549 0.547 0.534 0.497 0.380 0.376 0.386 0.574 0.658 0.458 0.443 0.380 0.482 366 0.539 0.537 0.524 0.483 0.352 0.343 0.351 0.558 0.646 0.436 0.419 0.344 0.455 368 0.526 0.523 0.510 0.467 0.323 0.311 0.317 0.538 0.629 0.413 0.394 0.309 0.427 370 0.509 0.507 0.494 0.449 0.294 0.279 0.283 0.514 0.607 0.389 0.368 0.274 0.397 372 0.490 0.488 0.475 0.429 0.266 0.249 0.251 0.487 0.579 0.364 0.342 0.241 0.366 374 0.469 0.466 0.454 0.407 0.239 0.220 0.220 0.457 0.548 0.338 0.316 0.210 0.335 376 0.446 0.443 0.432 0.385 0.214 0.194 0.192 0.426 0.513 0.313 0.291 0.181 0.304 378 0.421 0.418 0.407 0.362 0.191 0.169 0.165 0.392 0.476 0.288 0.266 0.155 0.274 380 0.395 0.392 0.381 0.338 0.169 0.147 0.141 0.357 0.436 0.264 0.243 0.131 0.244 382 0.368 0.364 0.355 0.313 0.149 0.127 0.119 0.322 0.395 0.240 0.220 0.110 0.216 384 0.338 0.334 0.326 0.287 0.130 0.109 0.099 0.285 0.351 0.216 0.197 0.090 0.187 386 0.311 0.307 0.299 0.263 0.113 0.093 0.082 0.251 0.311 0.195 0.177 0.074 0.162 388 0.285 0.281 0.274 0.240 0.099 0.080 0.068 0.220 0.272 0.175 0.159 0.061 0.139 390 0.260 0.255 0.249 0.218 0.087 0.069 0.056 0.190 0.236 0.157 0.142 0.050 0.119 392 0.236 0.230 0.225 0.197 0.076 0.060 0.046 0.163 0.202 0.140 0.126 0.041 0.100 Докторска дисертација Прилог   195 394 0.213 0.207 0.203 0.177 0.066 0.052 0.037 0.138 0.172 0.125 0.112 0.033 0.084 396 0.192 0.186 0.182 0.159 0.057 0.045 0.030 0.116 0.144 0.111 0.099 0.027 0.070 398 0.172 0.165 0.162 0.141 0.050 0.040 0.024 0.097 0.120 0.098 0.088 0.022 0.057 400 0.153 0.147 0.143 0.125 0.043 0.035 0.020 0.080 0.098 0.086 0.077 0.018 0.047 402 0.136 0.129 0.126 0.109 0.037 0.031 0.016 0.065 0.080 0.076 0.068 0.015 0.038 404 0.121 0.114 0.111 0.096 0.032 0.028 0.013 0.053 0.064 0.066 0.059 0.012 0.031 406 0.107 0.100 0.097 0.083 0.028 0.025 0.010 0.043 0.051 0.058 0.051 0.010 0.025 408 0.094 0.087 0.084 0.072 0.024 0.023 0.008 0.034 0.041 0.050 0.045 0.008 0.020 410 0.083 0.075 0.073 0.062 0.021 0.021 0.007 0.027 0.032 0.044 0.039 0.007 0.016 412 0.072 0.065 0.063 0.053 0.018 0.019 0.006 0.022 0.025 0.038 0.033 0.006 0.013 414 0.063 0.056 0.054 0.045 0.015 0.018 0.005 0.018 0.020 0.032 0.028 0.005 0.010 416 0.054 0.047 0.046 0.038 0.013 0.017 0.004 0.014 0.015 0.028 0.024 0.005 0.008 418 0.047 0.040 0.039 0.032 0.011 0.016 0.003 0.011 0.012 0.024 0.021 0.004 0.007 420 0.040 0.034 0.033 0.026 0.010 0.015 0.003 0.009 0.009 0.020 0.017 0.003 0.005 422 0.035 0.029 0.027 0.021 0.008 0.014 0.002 0.007 0.007 0.017 0.015 0.003 0.005 424 0.030 0.024 0.023 0.018 0.007 0.014 0.002 0.006 0.006 0.014 0.012 0.003 0.004 426 0.025 0.020 0.019 0.014 0.006 0.013 0.002 0.005 0.004 0.012 0.010 0.003 0.003 428 0.021 0.016 0.015 0.011 0.005 0.013 0.002 0.004 0.004 0.010 0.009 0.002 0.003 430 0.018 0.013 0.012 0.009 0.004 0.013 0.001 0.004 0.003 0.008 0.007 0.002 0.002 432 0.015 0.011 0.010 0.007 0.004 0.012 0.001 0.003 0.002 0.007 0.006 0.002 0.002 434 0.013 0.009 0.008 0.005 0.003 0.012 0.001 0.003 0.002 0.006 0.005 0.002 0.002 436 0.011 0.007 0.006 0.004 0.003 0.012 0.001 0.003 0.002 0.005 0.004 0.002 0.002 438 0.009 0.005 0.005 0.003 0.003 0.012 0.001 0.002 0.001 0.005 0.004 0.002 0.002 440 0.008 0.004 0.004 0.002 0.002 0.011 0.001 0.002 0.001 0.004 0.003 0.002 0.002 Потенциометријске титрације хидролизе Gd3+-јона Табела 9П Потенциометријска титрација 20 ml 0.99 mmol/dm3 Gd3+ са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl ml. NaOH pH F H h Z 0.000 2.786 0.0327 1.510 1.510 0.000 0.005 2.802 0.0316 1.460 1.455 -0.005 0.010 2.817 0.0305 1.410 1.406 -0.004 0.015 2.835 0.0293 1.360 1.349 -0.011 0.020 2.850 0.0283 1.310 1.303 -0.007 0.025 2.875 0.0267 1.261 1.259 -0.002 0.030 2.891 0.0257 1.211 1.213 0.003 0.035 2.908 0.0248 1.161 1.167 0.006 0.040 2.927 0.0237 1.111 1.117 0.006 0.045 2.948 0.0226 1.061 1.064 0.003 0.050 2.969 0.0215 1.012 1.014 0.002 0.055 2.990 0.0205 0.962 0.966 0.004 0.060 3.013 0.0195 0.912 0.916 0.004 0.065 3.044 0.0181 0.863 0.853 -0.010 0.070 3.075 0.0169 0.813 0.794 -0.019 0.075 3.100 0.0159 0.764 0.750 -0.014 0.080 3.130 0.0149 0.714 0.700 -0.014 0.085 3.148 0.0143 0.664 0.671 0.007 0.090 3.193 0.0129 0.615 0.605 -0.010 0.095 3.229 0.0119 0.565 0.557 -0.008 0.100 3.270 0.0108 0.516 0.507 -0.009 0.105 3.315 0.0097 0.466 0.457 -0.009 Докторска дисертација Прилог   196 0.110 3.362 0.0087 0.417 0.410 -0.007 0.115 3.420 0.0076 0.368 0.359 -0.009 0.120 3.480 0.0067 0.318 0.313 -0.006 0.125 3.563 0.0055 0.269 0.258 -0.011 0.130 3.629 0.0047 0.220 0.222 0.002 0.135 3.727 0.0038 0.170 0.177 0.007 0.140 3.835 0.0029 0.121 0.138 0.017 0.145 3.972 0.0021 0.072 0.101 0.029 0.150 4.140 0.0015 0.023 0.068 0.046 0.155 4.390 0.0008 -0.027 0.038 0.066 0.160 4.917 0.0002 -0.076 0.011 0.088 0.165 5.805 0.0000 -0.125 0.001 0.128 0.170 6.650 0.0000 -0.174 0.000 0.176 Табела 10П Потенциометријска титрација 20 ml 2.53 mmol/dm3 Gd3+ са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl ml. NaOH pH F H h Z 0.000 2.370 0.0853 4.230 4.236 0.003 0.020 2.391 0.0814 4.028 4.036 0.003 0.040 2.414 0.0772 3.826 3.828 0.001 0.060 2.435 0.0737 3.624 3.648 0.009 0.080 2.460 0.0696 3.423 3.443 0.008 0.100 2.488 0.0653 3.222 3.228 0.002 0.120 2.515 0.0615 3.022 3.034 0.005 0.140 2.546 0.0573 2.822 2.825 0.001 0.160 2.577 0.0534 2.623 2.630 0.003 0.180 2.611 0.0494 2.423 2.432 0.003 0.200 2.649 0.0453 2.225 2.228 0.001 0.220 2.693 0.0410 2.026 2.014 -0.005 0.240 2.738 0.0370 1.828 1.816 -0.005 0.260 2.787 0.0331 1.631 1.622 -0.004 0.280 2.843 0.0291 1.434 1.426 -0.003 0.300 2.910 0.0250 1.237 1.222 -0.006 0.320 2.982 0.0212 1.041 1.035 -0.002 0.340 3.072 0.0172 0.845 0.841 -0.001 0.370 3.257 0.0113 0.551 0.550 -0.001 0.380 3.334 0.0094 0.454 0.460 0.003 0.390 3.425 0.0077 0.356 0.373 0.007 0.400 3.560 0.0056 0.259 0.274 0.006 0.405 3.631 0.0048 0.210 0.232 0.009 0.410 3.697 0.0041 0.162 0.200 0.015 0.415 3.779 0.0034 0.113 0.165 0.021 0.420 3.900 0.0026 0.064 0.125 0.024 0.425 4.014 0.0020 0.016 0.096 0.032 0.430 4.167 0.0014 -0.033 0.068 0.040 0.435 4.352 0.0009 -0.081 0.044 0.050 0.440 4.600 0.0005 -0.130 0.025 0.061 Докторска дисертација Прилог   197 Табела 11П Потенциометријска титрација 20 ml 4.95 mmol/dm3 Gd3+ са 0.1983 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl ml. NaOH pH F H h Z 0.000 2.047 0.1795 8.510 8.570 0.012 0.050 2.075 0.1687 7.994 8.035 0.008 0.100 2.104 0.1582 7.481 7.516 0.007 0.150 2.136 0.1473 6.970 6.982 0.002 0.200 2.169 0.1369 6.462 6.471 0.002 0.250 2.204 0.1266 5.957 5.970 0.003 0.300 2.243 0.1160 5.454 5.458 0.001 0.350 2.284 0.1058 4.953 4.966 0.003 0.400 2.332 0.0950 4.455 4.446 -0.002 0.450 2.384 0.0845 3.959 3.945 -0.003 0.500 2.440 0.0744 3.466 3.467 0.000 0.550 2.507 0.0639 2.975 2.972 -0.001 0.600 2.587 0.0533 2.486 2.472 -0.003 0.650 2.681 0.0430 2.000 1.991 -0.002 0.700 2.801 0.0327 1.516 1.510 -0.001 0.720 2.856 0.0289 1.324 1.330 0.001 0.740 2.927 0.0245 1.131 1.130 0.000 0.760 3.002 0.0207 0.939 0.951 0.002 0.780 3.094 0.0167 0.747 0.769 0.004 0.800 3.212 0.0128 0.556 0.586 0.006 0.820 3.366 0.0090 0.365 0.396 0.006 0.830 3.432 0.0077 0.269 0.004 -0.054 0.840 3.513 0.0064 0.174 0.207 0.007 0.850 3.590 0.0054 0.079 0.166 0.018 0.860 3.669 0.0045 -0.016 0.122 0.028 0.870 3.764 0.0036 -0.111 0.089 0.040 0.880 4.200 0.0013 -0.206 0.060 0.054 Потенциометријске титрације комплексирања система Al3+-офлоксацин Табела 12П Потенциометријска титрација 25.0 ml 0.498 mmol/dm3 Al3+-јона + 2.49 mmol/dm3 офлоксацина + 0.047 mmol/dm3 HCl са 0.091 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0.000 6.626 -0.02 4.81 0.23 0.010 6.653 0.00 4.78 0.27 0.020 6.717 0.01 4.72 0.30 0.030 6.776 0.03 4.66 0.33 0.040 6.837 0.04 4.60 0.36 0.050 6.886 0.05 4.55 0.41 0.060 6.943 0.07 4.50 0.45 0.070 6.992 0.08 4.45 0.49 0.080 7.045 0.10 4.40 0.54 0.090 7.090 0.11 4.36 0.59 0.100 7.137 0.13 4.32 0.64 Докторска дисертација Прилог   198 0.110 7.179 0.14 4.28 0.70 0.120 7.223 0.16 4.25 0.75 0.130 7.263 0.17 4.21 0.80 0.140 7.303 0.19 4.18 0.86 0.150 7.339 0.20 4.15 0.92 0.160 7.377 0.21 4.12 0.97 0.170 7.411 0.23 4.09 1.03 0.180 7.444 0.24 4.07 1.09 0.210 7.538 0.29 4.00 1.27 0.240 7.622 0.33 3.94 1.45 0.250 7.648 0.35 3.92 1.51 0.260 7.671 0.36 3.91 1.58 0.280 7.720 0.39 3.88 1.70 0.300 7.766 0.42 3.86 1.83 0.320 7.810 0.45 3.83 1.96 0.340 7.849 0.48 3.82 2.09 0.360 7.890 0.51 3.80 2.22 0.380 7.930 0.53 3.79 2.36 0.400 7.968 0.56 3.78 2.49 0.440 8.038 0.62 3.77 2.78 0.480 8.102 0.68 3.78 3.07 0.520 8.153 0.74 3.82 3.39 0.540 8.175 0.77 3.85 3.56 0.560 8.204 0.80 3.88 3.72 0.580 8.234 0.83 3.91 3.89 0.600 8.260 0.86 3.97 4.06 0.620 8.285 0.88 4.04 4.24 0.640 8.311 0.91 4.14 4.43 0.660 8.336 0.94 4.30 4.62 0.680 8.362 0.97 4.58 4.81 Табела 13П Потенциометријска титрација 20.0 ml 0.995 mmol/dm3 Al3+-jona + 2.478 mmol/dm3 офлоксацина + 0.093 mmol/dm3 HCl са 0.0907 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0.000 5.096 -0.04 7.07 1.00 0.010 5.215 -0.02 6.86 0.98 0.020 5.468 0.00 6.43 0.87 0.030 5.687 0.02 6.08 0.75 0.040 5.847 0.04 5.84 0.68 0.050 5.978 0.05 5.66 0.62 0.060 6.058 0.07 5.56 0.61 0.070 6.127 0.09 5.47 0.60 0.080 6.191 0.11 5.40 0.60 0.090 6.241 0.13 5.34 0.62 0.100 6.287 0.15 5.29 0.63 0.110 6.338 0.16 5.24 0.65 0.120 6.387 0.18 5.19 0.67 0.130 6.440 0.20 5.13 0.69 0.140 6.487 0.22 5.09 0.71 0.150 6.341 0.24 5.27 0.81 Докторска дисертација Прилог   199 0.160 6.590 0.26 4.99 0.76 0.170 6.636 0.27 4.95 0.79 0.180 6.687 0.29 4.90 0.82 0.190 6.734 0.31 4.86 0.85 0.200 6.780 0.33 4.82 0.89 0.210 6.827 0.35 4.78 0.92 0.220 6.871 0.37 4.75 0.96 0.230 6.913 0.38 4.72 0.99 0.240 6.955 0.40 4.68 1.03 0.250 6.993 0.42 4.66 1.07 0.260 7.029 0.44 4.63 1.11 0.270 7.067 0.46 4.61 1.15 0.280 7.102 0.47 4.59 1.19 0.290 7.140 0.49 4.56 1.23 0.300 7.173 0.51 4.54 1.27 0.310 7.204 0.53 4.53 1.31 0.320 7.236 0.55 4.51 1.35 0.330 7.267 0.57 4.50 1.40 0.340 7.299 0.58 4.48 1.44 0.350 7.329 0.60 4.47 1.48 0.360 7.357 0.62 4.46 1.53 0.370 7.386 0.64 4.46 1.57 0.380 7.414 0.66 4.45 1.61 0.390 7.438 0.68 4.45 1.66 0.400 7.463 0.69 4.45 1.70 0.410 7.488 0.71 4.45 1.75 0.420 7.511 0.73 4.46 1.79 0.430 7.536 0.75 4.46 1.84 0.440 7.560 0.77 4.47 1.88 0.450 7.585 0.79 4.48 1.93 0.460 7.608 0.80 4.50 1.97 0.470 7.629 0.82 4.52 2.02 0.480 7.654 0.84 4.54 2.07 0.490 7.676 0.86 4.57 2.11 0.500 7.697 0.88 4.61 2.16 0.510 7.720 0.90 4.66 2.21 0.520 7.741 0.91 4.72 2.26 0.530 7.762 0.93 4.80 2.31 0.540 7.783 0.95 4.92 2.36 0.550 7.804 0.97 5.10 2.41 0.560 7.826 0.99 5.47 2.46 Табела 14П Потенциометријска титрација 20.0 ml 1.99 mmol/dm3 Al3+-jona + 2.453 mmol/dm3 офл ни оксацина + 0.186 mmol/dm3 HCl са 0.0907 mol/dm3 NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl среди ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0.000 3 -0.08 9.32 0.59 .943 0.010 4.006 -0.06 9.20 0.60 0.020 4.135 -0.04 8.95 0.60 0.030 4.271 -0.02 8.68 0.60 0.040 4.430 0.00 8.38 0.60 Докторска дисертација Прилог   200 0.050 4.563 0.02 8.12 0.60 0.060 4.658 0.04 7.94 0.61 0.070 4.730 0.05 7.81 0.61 0.080 4.789 0.07 7.71 0.62 0.090 4.839 0.09 7.62 0.62 0.100 4.869 0.11 7.57 0.63 0.110 4.897 0.13 7.53 0.64 0.120 4.918 0.15 7.50 0.65 0.130 4.934 0.16 7.48 0.66 0.140 4.948 0.18 7.46 0.67 0.150 4.958 0.20 7.45 0.69 0.160 4.968 0.22 7.45 0.70 0.170 4.980 0.24 7.43 0.71 0.180 4.990 0.26 7.43 0.72 0.190 4.998 0.28 7.42 0.73 0.200 5.009 0.29 7.41 0.74 0.210 5.021 0.31 7.40 0.75 0.220 5.033 0.33 7.39 0.77 0.230 5.048 0.35 7.38 0.78 0.240 5.062 0.37 7.36 0.79 0.250 5.075 0.39 7.35 0.80 0.260 5.088 0.40 7.34 0.81 0.270 5.100 0.42 7.33 0.82 0.280 5.113 0.44 7.32 0.84 0.290 5.126 0.46 7.31 0.85 0.300 5.137 0.48 7.31 0.86 0.310 5.150 0.50 7.30 0.87 0.320 5.166 0.52 7.29 0.88 0.330 5.182 0.53 7.28 0.89 0.340 5.196 0.55 7.27 0.91 0.350 5.209 0.57 7.26 0.92 0.360 5.223 0.59 7.26 0.93 0.370 5.241 0.61 7.25 0.94 0.380 5.262 0.63 7.23 0.96 0.390 5.284 0.65 7.21 0.97 0.400 5.301 0.66 7.21 0.98 0.410 5.321 0.68 7.20 0.99 0.420 5.342 0.70 7.19 1.00 0.430 5.362 0.72 7.18 1.02 0.440 5.382 0.74 7.17 1.03 0.450 5.402 0.76 7.17 1.04 0.460 5.422 0.77 7.17 1.06 0.470 5.442 0.79 7.17 1.07 0.480 5.463 0.81 7.18 1.08 0.490 5.485 0.83 7.19 1.10 0.500 5.509 0.85 7.20 1.11 0.510 5.529 0.87 7.22 1.12 0.520 5.553 0.89 7.25 1.14 0.530 5.577 0.90 7.28 1.15 0.540 5.610 0.92 7.32 1.17 0.550 5.637 0.94 7.40 1.18 0.560 5.667 0.96 7.52 1.20 Докторска дисертација Прилог   201 0.570 5.695 0.98 7.75 1.21 0.580 5.725 1.00 8.59 1.23 Потенциометриј трац мп ирањ тема -офлоксацин Потенциометријска титрација 20 ml Gd3+ и 1.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са .0982 mol/dm3 NaOH ске ти ије ко лекс а сис Gd3+ Табела 15П 1.0 mmol/dm3 0 ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0 63 .000 2.279 -5.266 12.654 -0.0 0.100 2 -4 5 -0.055 .323 .77 12.568 0.200 2.372 -4.284 12.473 -0.047 0.300 2.426 -3.793 12.368 -0.038 0.400 2.488 -3.302 12.249 -0.028 0.500 2.559 -2.811 12.112 -0.017 0.550 2.599 -2.566 12.035 -0.010 0.600 2.642 -2.320 11.952 -0.003 0.650 2.690 -2.075 11.859 0.005 0.700 2.743 -1.829 11.757 0.014 0.750 2.803 -1.584 11.642 0.025 0.800 2.872 -1.338 11.511 0.039 0.850 2.952 -1.093 11.359 0.056 0.900 3.046 -0.847 11.181 0.078 0.920 3.089 -0.749 11.099 0.089 0.940 3.136 -0.651 11.012 0.102 0.960 3.188 -0.553 10.916 0.117 0.980 3.244 -0.454 10.813 0.135 1.000 3.306 -0.356 10.699 0.155 1.020 3.374 -0.258 10.575 0.180 1.040 3.450 -0.160 10.440 0.209 1.060 3.534 -0.062 10.292 0.243 1.080 3.626 0.037 10.131 0.284 1.100 3.728 0.135 9.958 0.332 1.110 3.783 0.184 9.866 0.359 1.120 3.840 0.233 9.772 0.387 1.130 3.900 0.282 9.674 0.417 1.140 3.963 0.331 9.573 0.449 1.150 4.029 0.380 9.469 0.483 1.160 4.099 0.429 9.362 0.518 1.170 4.172 0.478 9.250 0.555 1.180 4.250 0.528 9.135 0.593 1.190 4.333 0.577 9.014 0.632 1.200 4.423 0.626 8.886 0.673 1.205 4.471 0.650 8.820 0.693 1.210 4.522 0.675 8.751 0.714 1.215 4.575 0.699 8.679 0.735 1.220 4.632 0.724 8.604 0.756 Докторска дисертација Прилог   202 1.225 4.692 0.749 8.525 0.777 1.230 4.758 0.773 8.441 0.799 1.235 4.829 0.798 8.352 0.820 1.240 4.908 0.822 8.255 0.842 1.245 4.997 0.847 8.148 0.864 1.250 5.099 0.871 8.028 0.885 1.255 5.220 0.896 7.890 0.907 1.260 5.367 0.920 7.726 0.927 1.263 5.472 0.935 7.611 0.939 1.265 5.551 0.945 7.527 0.946 1.267 5.636 0.955 7.437 0.953 1.269 5.726 0.965 7.342 0.958 1.271 5.818 0.974 7.247 0.963 1.273 5.907 0.984 7.155 0.967 1.275 5.990 0.994 7.069 0.970 1.277 6.066 1.004 6.992 0.973 1.279 6.133 1.014 6.924 0.975 1.281 6.192 1.024 6.864 0.976 1.283 6.245 1.033 6.811 0.977 1.285 6.292 1.043 6.764 0.978 1.287 6.334 1.053 6.722 0.979 1.290 6.389 1.068 6.666 0.979 1.293 6.438 1.082 6.618 0.980 1.296 6.481 1.097 6.576 0.981 1.299 6.519 1.112 6.538 0.981 1.302 6.554 1.127 6.504 0.981 1.305 6.585 1.141 6.473 0.982 1.310 6.633 1.166 6.426 0.982 1.315 6.674 1.190 6.386 0.982 1.320 6.712 1.215 6.350 0.983 1.330 6.777 1.264 6.287 0.983 1.340 6.834 1.313 6.234 0.983 1.350 6.883 1.362 6.188 0.984 1.370 6.968 1.461 6.110 0.984 1.390 7.041 1.559 6.045 0.985 1.410 7.106 1.657 5.988 0.985 1.430 7.167 1.755 5.938 0.985 1.450 7.225 1.853 5.892 0.986 1.470 7.281 1.952 5.849 0.986 1.490 7.338 2.050 5.809 0.986 1.530 7.455 2.246 5.734 0.987 1.570 7.590 2.443 5.662 0.989 1.610 7.772 2.639 5.591 0.990 1.650 8.103 2.835 5.520 0.993 1.690 9.325 3.032 5.596 0.997 1.730 10.012 3.228 5.838 0.999 1.790 10.387 3.523 6.006 0.999 1.810 10.466 3.621 6.043 0.999 Докторска дисертација Прилог   203 1.820 10.501 3.670 6.059 0.999 1.830 10.533 3.719 6.074 0.999 1.840 10.563 3.768 6.089 0.999 1.850 10.592 3.817 6.102 0.999 1.860 10.618 3.866 6.115 0.999 Таб П Потенциометријска титрација 20 m 3 Gd3+ и 2.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са .0982 mol/dm3 NaOH ела 16 l 1.0 mmol/dm 0 ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0 21 .000 2.325 -2.365 12.260 -0.1 0.100 2 -2 0 -0.104 .374 .12 12.165 0.200 2.429 -1.874 12.060 -0.086 0.300 2.491 -1.629 11.940 -0.067 0.400 2.561 -1.383 11.804 -0.044 0.500 2.644 -1.138 11.644 -0.017 0.550 2.692 -1.015 11.552 -0.002 0.600 2.744 -0.892 11.451 0.016 0.650 2.803 -0.769 11.339 0.037 0.700 2.869 -0.647 11.212 0.062 0.750 2.944 -0.524 11.068 0.092 0.760 2.961 -0.499 11.037 0.099 0.770 2.978 -0.475 11.005 0.107 0.800 3.032 -0.401 10.902 0.131 0.820 3.071 -0.352 10.829 0.149 0.840 3.112 -0.303 10.750 0.170 0.850 3.134 -0.278 10.709 0.181 0.860 3.157 -0.254 10.667 0.193 0.870 3.180 -0.229 10.623 0.206 0.880 3.205 -0.205 10.578 0.219 0.890 3.230 -0.180 10.531 0.233 0.900 3.256 -0.156 10.483 0.248 0.910 3.282 -0.131 10.433 0.264 0.920 3.310 -0.107 10.382 0.281 0.930 3.339 -0.082 10.329 0.299 0.940 3.368 -0.058 10.275 0.317 0.950 3.399 -0.033 10.219 0.338 0.960 3.431 -0.008 10.162 0.359 0.970 3.463 0.016 10.102 0.381 0.980 3.497 0.041 10.042 0.405 0.990 3.531 0.065 9.980 0.430 1.000 3.567 0.090 9.916 0.456 1.020 3.641 0.139 9.784 0.513 1.040 3.719 0.188 9.647 0.574 1.060 3.801 0.237 9.505 0.641 1.080 3.886 0.286 9.357 0.711 1.100 3.976 0.335 9.205 0.786 Докторска дисертација Прилог   204 1.120 4.069 0.384 9.048 0.865 1.130 4.118 0.409 8.967 0.905 1.140 4.167 0.434 8.885 0.946 1.150 4.218 0.458 8.801 0.988 1.160 4.271 0.483 8.716 1.030 1.170 4.325 0.507 8.629 1.073 1.180 4.380 0.532 8.539 1.116 1.190 4.438 0.556 8.448 1.160 1.200 4.497 0.581 8.354 1.204 1.210 4.559 0.605 8.257 1.248 1.220 4.623 0.630 8.158 1.292 1.230 4.690 0.654 8.055 1.337 1.240 4.760 0.679 7.948 1.381 1.250 4.834 0.704 7.837 1.426 1.260 4.912 0.728 7.721 1.470 1.270 4.994 0.753 7.600 1.514 1.280 5.082 0.777 7.473 1.558 1.285 5.129 0.789 7.407 1.580 1.290 5.177 0.802 7.339 1.601 1.295 5.228 0.814 7.268 1.623 1.300 5.281 0.826 7.196 1.644 1.305 5.336 0.839 7.120 1.665 1.310 5.394 0.851 7.042 1.686 1.315 5.455 0.863 6.961 1.706 1.320 5.520 0.875 6.877 1.726 1.325 5.589 0.888 6.789 1.746 1.330 5.662 0.900 6.697 1.765 1.335 5.740 0.912 6.600 1.783 1.340 5.823 0.925 6.500 1.800 1.345 5.911 0.937 6.397 1.816 1.350 6.002 0.949 6.293 1.830 1.355 6.094 0.961 6.189 1.843 1.360 6.185 0.974 6.090 1.853 1.365 6.270 0.986 5.998 1.862 1.370 6.349 0.998 5.914 1.869 1.375 6.420 1.010 5.841 1.874 1.380 6.483 1.023 5.775 1.878 1.385 6.540 1.035 5.718 1.881 1.390 6.590 1.047 5.667 1.884 1.395 6.636 1.060 5.621 1.886 1.400 6.677 1.072 5.580 1.888 1.405 6.715 1.084 5.542 1.889 1.410 6.749 1.096 5.508 1.890 1.420 6.811 1.121 5.447 1.892 1.430 6.864 1.145 5.393 1.894 1.440 6.912 1.170 5.346 1.895 1.450 6.956 1.195 5.302 1.895 1.460 6.996 1.219 5.263 1.896 Докторска дисертација Прилог   205 1.470 7.032 1.244 5.226 1.896 1.480 7.067 1.268 5.191 1.896 1.490 7.099 1.293 5.159 1.896 1.500 7.130 1.317 5.127 1.896 1.510 7.160 1.342 5.098 1.896 1.520 7.188 1.366 5.069 1.896 1.530 7.215 1.391 5.041 1.896 1.540 7.242 1.416 5.014 1.895 1.550 7.268 1.440 4.988 1.895 1.560 7.294 1.465 4.962 1.894 1.570 7.319 1.489 4.937 1.894 1.580 7.343 1.514 4.912 1.894 1.600 7.392 1.563 4.863 1.893 1.625 7.452 1.624 4.803 1.891 1.650 7.513 1.686 4.744 1.890 1.675 7.574 1.747 4.686 1.888 1.700 7.638 1.808 4.628 1.887 1.720 7.691 1.857 4.581 1.885 1.740 7.746 1.907 4.534 1.884 1.760 7.805 1.956 4.488 1.884 1.780 7.867 2.005 4.441 1.883 1.800 7.933 2.054 4.395 1.883 1.820 8.004 2.103 4.350 1.883 1.840 8.081 2.152 4.306 1.884 1.860 8.166 2.201 4.263 1.885 1.870 8.212 2.226 4.242 1.886 1.880 8.261 2.250 4.222 1.887 1.890 8.312 2.275 4.203 1.888 1.900 8.367 2.299 4.184 1.889 1.910 8.425 2.324 4.167 1.890 1.920 8.488 2.348 4.150 1.892 1.930 8.555 2.373 4.134 1.893 1.940 8.626 2.398 4.120 1.895 1.950 8.702 2.422 4.107 1.897 1.960 8.781 2.447 4.096 1.898 1.970 8.864 2.471 4.087 1.900 Та П Потенциометријска титрација 20 m 3 Gd3+ и 2.5 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са .0982 mol/dm3 NaOH бела 17 l 1.0 mmol/dm 0 ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0 46 .000 2.359 -1.752 12.097 -0.1 0.100 2 -1 5 -0.125 .412 .55 11.995 0.150 2.440 -1.457 11.939 -0.113 0.200 2.471 -1.359 11.880 -0.101 0.250 2.504 -1.261 11.817 -0.088 0.300 2.538 -1.162 11.750 -0.074 Докторска дисертација Прилог   206 0.350 2.576 -1.064 11.677 -0.059 0.400 2.617 -0.966 11.598 -0.043 0.450 2.661 -0.868 11.512 -0.024 0.500 2.710 -0.770 11.418 -0.004 0.550 2.764 -0.671 11.314 0.019 0.600 2.824 -0.573 11.198 0.046 0.650 2.892 -0.475 11.068 0.078 0.700 2.970 -0.377 10.920 0.117 0.750 3.059 -0.279 10.751 0.166 0.800 3.163 -0.180 10.556 0.229 0.820 3.209 -0.141 10.470 0.259 0.840 3.258 -0.102 10.378 0.293 0.860 3.310 -0.063 10.282 0.329 0.880 3.365 -0.023 10.180 0.370 0.900 3.423 0.016 10.073 0.416 0.920 3.484 0.055 9.961 0.465 0.940 3.549 0.095 9.844 0.520 0.960 3.617 0.134 9.722 0.579 0.980 3.687 0.173 9.595 0.642 1.000 3.761 0.212 9.464 0.710 1.020 3.838 0.252 9.328 0.781 1.040 3.918 0.291 9.188 0.857 1.060 4.001 0.330 9.044 0.935 1.080 4.088 0.369 8.894 1.016 1.090 4.133 0.389 8.818 1.057 1.100 4.179 0.409 8.739 1.099 1.110 4.226 0.428 8.660 1.141 1.120 4.274 0.448 8.578 1.184 1.130 4.323 0.468 8.495 1.227 1.140 4.373 0.487 8.410 1.271 1.150 4.425 0.507 8.324 1.314 1.160 4.478 0.527 8.235 1.358 1.170 4.533 0.546 8.143 1.402 1.180 4.590 0.566 8.050 1.446 1.190 4.648 0.586 7.954 1.490 1.200 4.709 0.605 7.855 1.534 1.210 4.771 0.625 7.753 1.577 1.220 4.835 0.644 7.649 1.620 1.230 4.902 0.664 7.542 1.663 1.240 4.971 0.684 7.431 1.706 1.250 5.043 0.703 7.318 1.748 1.260 5.117 0.723 7.202 1.789 1.270 5.194 0.743 7.082 1.829 1.280 5.273 0.762 6.960 1.868 1.290 5.356 0.782 6.835 1.906 1.300 5.442 0.802 6.708 1.943 1.310 5.531 0.821 6.578 1.978 1.320 5.624 0.841 6.446 2.012 Докторска дисертација Прилог   207 1.330 5.720 0.860 6.312 2.044 1.340 5.821 0.880 6.176 2.074 1.350 5.924 0.900 6.041 2.102 1.360 6.031 0.919 5.907 2.127 1.370 6.139 0.939 5.776 2.149 1.380 6.245 0.959 5.653 2.169 1.390 6.348 0.978 5.539 2.187 1.400 6.443 0.998 5.436 2.201 1.410 6.531 1.018 5.346 2.214 1.420 6.610 1.037 5.268 2.224 1.430 6.680 1.057 5.199 2.233 1.440 6.744 1.077 5.139 2.240 1.450 6.801 1.096 5.086 2.247 1.460 6.853 1.116 5.038 2.252 1.470 6.901 1.135 4.995 2.257 1.480 6.944 1.155 4.956 2.261 1.490 6.985 1.175 4.920 2.265 1.500 7.023 1.194 4.886 2.268 1.520 7.092 1.234 4.825 2.273 1.540 7.154 1.273 4.770 2.276 1.560 7.211 1.312 4.719 2.279 1.580 7.265 1.351 4.671 2.281 1.600 7.316 1.391 4.626 2.282 1.620 7.364 1.430 4.582 2.282 1.640 7.411 1.469 4.540 2.283 1.660 7.457 1.509 4.498 2.283 1.680 7.503 1.548 4.458 2.282 1.700 7.548 1.587 4.418 2.282 1.720 7.593 1.626 4.379 2.281 1.740 7.639 1.666 4.340 2.281 1.760 7.685 1.705 4.302 2.280 1.780 7.731 1.744 4.265 2.279 1.800 7.779 1.784 4.228 2.279 1.820 7.827 1.823 4.191 2.278 1.840 7.878 1.862 4.155 2.278 1.860 7.930 1.901 4.120 2.278 1.880 7.984 1.941 4.086 2.279 1.900 8.040 1.980 4.053 2.280 1.920 8.100 2.019 4.021 2.281 1.940 8.164 2.059 3.989 2.283 1.960 8.232 2.098 3.959 2.285 1.980 8.306 2.137 3.930 2.288 2.000 8.387 2.176 3.902 2.291 2.020 8.478 2.216 3.875 2.295 2.040 8.580 2.255 3.850 2.299 2.060 8.696 2.294 3.826 2.302 2.080 8.827 2.333 3.803 2.305 2.100 8.970 2.373 3.781 2.306 Докторска дисертација Прилог   208 2.120 9.120 2.412 3.760 2.305 2.140 9.269 2.451 3.739 2.302 Та П Потенциометријска титрација 20 m 3 Gd3+ и 3.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са ol/dm3 NaOH бела 18 l 1.0 mmol/dm 0.0982 m ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0 73 .000 2.378 -1.395 11.979 -0.1 0.100 2 -1 2 -0.145 .433 .23 11.873 0.150 2.463 -1.150 11.815 -0.131 0.200 2.495 -1.068 11.753 -0.116 0.250 2.530 -0.986 11.687 -0.099 0.300 2.566 -0.904 11.615 -0.082 0.350 2.606 -0.823 11.539 -0.063 0.400 2.649 -0.741 11.455 -0.042 0.450 2.697 -0.659 11.364 -0.019 0.500 2.749 -0.577 11.264 0.007 0.550 2.806 -0.495 11.153 0.037 0.600 2.871 -0.413 11.028 0.073 0.650 2.944 -0.332 10.889 0.115 0.700 3.027 -0.250 10.730 0.167 0.750 3.123 -0.168 10.549 0.231 0.780 3.187 -0.119 10.429 0.278 0.810 3.257 -0.070 10.298 0.332 0.840 3.332 -0.021 10.158 0.393 0.860 3.386 0.012 10.058 0.439 0.880 3.442 0.045 9.954 0.489 0.900 3.501 0.078 9.845 0.543 0.920 3.563 0.110 9.732 0.602 0.940 3.628 0.143 9.615 0.664 0.960 3.695 0.176 9.493 0.731 0.980 3.765 0.209 9.367 0.801 1.000 3.838 0.241 9.237 0.874 1.020 3.913 0.274 9.103 0.951 1.040 3.992 0.307 8.963 1.030 1.060 4.073 0.339 8.819 1.112 1.080 4.159 0.372 8.669 1.195 1.100 4.248 0.405 8.513 1.280 1.110 4.294 0.421 8.433 1.323 1.120 4.341 0.438 8.350 1.366 1.130 4.390 0.454 8.266 1.410 1.140 4.440 0.470 8.179 1.453 1.150 4.491 0.487 8.091 1.496 1.160 4.543 0.503 8.000 1.539 1.170 4.597 0.519 7.908 1.583 1.180 4.652 0.536 7.813 1.625 1.190 4.708 0.552 7.716 1.668 Докторска дисертација Прилог   209 1.200 4.766 0.569 7.617 1.710 1.210 4.826 0.585 7.515 1.751 1.220 4.886 0.601 7.412 1.792 1.230 4.948 0.618 7.308 1.832 1.240 5.011 0.634 7.201 1.872 1.250 5.076 0.650 7.094 1.910 1.260 5.141 0.667 6.986 1.947 1.270 5.207 0.683 6.878 1.983 1.280 5.273 0.700 6.769 2.018 1.290 5.340 0.716 6.660 2.051 1.300 5.408 0.732 6.552 2.083 1.310 5.476 0.749 6.444 2.113 1.320 5.545 0.765 6.337 2.142 1.330 5.614 0.781 6.230 2.169 1.340 5.684 0.798 6.126 2.194 1.350 5.754 0.814 6.022 2.218 1.360 5.824 0.830 5.920 2.240 1.370 5.894 0.847 5.820 2.261 1.380 5.965 0.863 5.721 2.280 1.390 6.036 0.880 5.625 2.298 1.400 6.106 0.896 5.532 2.314 1.410 6.176 0.912 5.442 2.329 1.420 6.245 0.929 5.355 2.344 1.430 6.313 0.945 5.272 2.357 1.440 6.379 0.961 5.194 2.370 1.450 6.444 0.978 5.120 2.382 1.460 6.505 0.994 5.051 2.393 1.470 6.565 1.010 4.987 2.404 1.480 6.621 1.027 4.927 2.414 1.490 6.675 1.043 4.872 2.424 1.500 6.726 1.060 4.821 2.434 1.510 6.774 1.076 4.773 2.443 1.520 6.820 1.092 4.729 2.451 1.530 6.863 1.109 4.688 2.459 1.540 6.904 1.125 4.650 2.467 1.550 6.944 1.141 4.615 2.474 1.560 6.981 1.158 4.581 2.481 1.570 7.016 1.174 4.549 2.488 1.580 7.051 1.191 4.520 2.494 1.590 7.083 1.207 4.491 2.499 1.600 7.115 1.223 4.464 2.505 1.610 7.145 1.240 4.438 2.509 1.630 7.202 1.272 4.390 2.518 Докторска дисертација Прилог   210 Табела 19П Потенциометријска титрација 20 m 3 Gd3+ и 3.0 mmol/dm3 офлоксацина у 0.1 mol/dm3 NaCl са .0982 mol/dm3 NaOH l 0.6 mmol/dm 0 ml. NaOH pH a (-log oflo) n 0.000 2.783 -0.550 11.176 -0.222 0.050 2 -0 8 -0.179 .848 .46 11.048 0.100 2.924 -0.386 10.902 -0.128 0.120 2.957 -0.353 10.837 -0.104 0.140 2.993 -0.321 10.768 -0.077 0.160 3.031 -0.288 10.694 -0.049 0.180 3.072 -0.255 10.616 -0.017 0.200 3.115 -0.223 10.531 0.018 0.220 3.162 -0.190 10.441 0.058 0.240 3.213 -0.157 10.344 0.102 0.260 3.267 -0.124 10.239 0.151 0.280 3.326 -0.092 10.127 0.208 0.300 3.390 -0.059 10.006 0.271 0.320 3.458 -0.026 9.876 0.342 0.340 3.532 0.007 9.736 0.422 0.360 3.611 0.039 9.587 0.511 0.380 3.695 0.072 9.427 0.608 0.400 3.786 0.105 9.257 0.715 0.420 3.883 0.138 9.076 0.829 0.430 3.934 0.154 8.980 0.889 0.440 3.987 0.170 8.882 0.951 0.450 4.041 0.187 8.780 1.013 0.460 4.098 0.203 8.675 1.077 0.470 4.156 0.219 8.566 1.142 0.480 4.217 0.236 8.453 1.208 0.490 4.280 0.252 8.335 1.274 0.500 4.345 0.268 8.214 1.341 0.510 4.413 0.285 8.088 1.407 0.520 4.483 0.301 7.958 1.472 0.530 4.555 0.318 7.824 1.536 0.540 4.629 0.334 7.687 1.599 0.550 4.704 0.350 7.548 1.659 0.560 4.780 0.367 7.407 1.717 0.570 4.856 0.383 7.267 1.772 0.580 4.931 0.399 7.127 1.823 0.590 5.006 0.416 6.990 1.871 0.600 5.080 0.432 6.857 1.914 0.610 5.151 0.449 6.727 1.953 0.620 5.221 0.465 6.601 1.988 0.630 5.289 0.481 6.480 2.018 0.640 5.354 0.498 6.363 2.045 0.650 5.418 0.514 6.252 2.067 0.660 5.479 0.530 6.144 2.085 Докторска дисертација Прилог   211 0.670 5.539 0.547 6.041 2.100 0.680 5.596 0.563 5.942 2.111 0.690 5.652 0.579 5.848 2.119 0.700 5.707 0.596 5.757 2.124 0.710 5.759 0.612 5.669 2.126 0.720 5.811 0.629 5.585 2.125 0.730 5.861 0.645 5.504 2.123 0.740 5.910 0.661 5.425 2.118 0.750 5.959 0.678 5.349 2.112 0.760 6.006 0.694 5.276 2.105 0.770 6.053 0.710 5.205 2.096 0.780 6.099 0.727 5.136 2.086 0.790 6.144 0.743 5.069 2.076 0.800 6.189 0.759 5.004 2.065 0.810 6.233 0.776 4.941 2.054 0.820 6.278 0.792 4.879 2.042 0.830 6.321 0.809 4.819 2.031 0.840 6.365 0.825 4.760 2.020 0.850 6.409 0.841 4.702 2.010 0.860 6.452 0.858 4.646 1.999 0.870 6.495 0.874 4.591 1.990 0.880 6.538 0.890 4.537 1.982 0.890 6.580 0.907 4.484 1.974 0.900 6.623 0.923 4.433 1.968 0.910 6.665 0.940 4.383 1.963 0.920 6.706 0.956 4.335 1.959 0.930 6.748 0.972 4.287 1.956 0.940 6.788 0.989 4.242 1.955 0.950 6.829 1.005 4.197 1.955 0.960 6.868 1.021 4.154 1.956 0.970 6.907 1.038 4.112 1.958 0.980 6.946 1.054 4.072 1.962 0.990 6.984 1.070 4.033 1.966 1.000 7.020 1.087 3.995 1.971 1.010 7.057 1.103 3.959 1.978 1.020 7.092 1.120 3.924 1.985 1.030 7.127 1.136 3.891 1.993 1.040 7.160 1.152 3.859 2.001 1.050 7.193 1.169 3.827 2.011 1.060 7.226 1.185 3.798 2.020 1.070 7.257 1.201 3.769 2.031 1.080 7.288 1.218 3.741 2.041 1.100 7.348 1.250 3.688 2.064 1.120 7.405 1.283 3.639 2.087 1.140 7.461 1.316 3.594 2.112 1.160 7.514 1.349 3.551 2.138 1.180 7.565 1.381 3.512 2.165 1.200 7.615 1.414 3.474 2.192 Докторска дисертација Прилог   212 1.220 7.664 1.447 3.439 2.220 1.240 7.712 1.480 3.405 2.249 1.260 7.759 1.512 3.374 2.278 1.280 7.806 1.545 3.344 2.308 1.300 7.853 1.578 3.315 2.339 1.320 7.900 1.611 3.288 2.370 1.350 7.971 1.660 3.249 2.419 1.380 8.043 1.709 3.213 2.469 1.410 8.119 1.758 3.178 2.522 1.440 8.199 1.807 3.145 2.576 1.470 8.285 1.856 3.113 2.632 1.500 8.381 1.905 3.082 2.691 1.530 8.490 1.954 3.053 2.751 1.560 8.621 2.003 3.024 2.812 1.590 8.784 2.052 2.996 2.871 1.610 8.922 2.085 2.978 2.907 1.630 9.094 2.118 2.960 2.934 1.650 9.304 2.151 2.943 2.945 1.660 9.417 2.167 2.934 2.941 Потенциометријс раци п ања а G ксифлоксацин Потенциометријска 0 ml 1.07 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1983 mol/dm NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl средини ке тит је ком лексир систем d3+-мо Табела 20П титрација 20. 3 ml. NaOH pH CH h а 0.000 2.426 0.00493 0.00375 -4.61 0.005 2.434 0.00488 0.00368 -4.56 0.010 2.443 0.00483 0.00361 -4.51 0.030 2.468 0.00463 0.00340 -4.33 0.050 2.496 0.00442 0.00319 -4.14 0.100 2.571 0.00392 0.00269 -3.68 0.150 2.660 0.00342 0.00219 -3.22 0.175 2.713 0.00317 0.00194 -2.99 0.200 2.772 0.00292 0.00169 -2.75 0.225 2.840 0.00267 0.00145 -2.52 0.250 2.920 0.00242 0.00120 -2.29 0.275 3.012 0.00217 0.00097 -2.06 0.300 3.132 0.00193 0.00074 -1.83 0.310 3.191 0.00183 0.00064 -1.73 0.320 3.256 0.00173 0.00055 -1.64 0.330 3.334 0.00163 0.00046 -1.55 0.335 3.376 0.00158 0.00042 -1.50 0.340 3.424 0.00153 0.00038 -1.46 0.345 3.478 0.00148 0.00033 -1.41 0.350 3.538 0.00143 0.00029 -1.36 0.355 3.609 0.00139 0.00025 -1.32 0.360 3.625 0.00134 0.00024 -1.27 Докторска дисертација Прилог   213 0.365 3.709 0.00129 0.00020 -1.23 0.370 3.809 0.00124 0.00016 -1.18 0.372 3.855 0.00122 0.00014 -1.16 0.374 3.909 0.00120 0.00012 -1.14 0.376 3.968 0.00118 0.00011 -1.12 0.378 4.038 0.00116 0.00009 -1.10 0.380 4.120 0.00114 0.00008 -1.09 0.381 4.160 0.00113 0.00007 -1.08 0.382 4.205 0.00112 0.00006 -1.07 0.383 4.258 0.00111 0.00006 -1.06 0.384 4.317 0.00110 0.00005 -1.05 0.385 4.380 0.00109 0.00004 -1.04 0.386 4.448 0.00108 0.00004 -1.03 0.387 4.525 0.00107 0.00003 -1.02 0.388 4.605 0.00106 0.00002 -1.01 0.389 4.691 0.00105 0.00002 -1.00 0.390 4.775 0.00104 0.00002 -0.99 0.391 4.850 0.00103 0.00001 -0.98 0.392 4.923 0.00102 0.00001 -0.98 0.393 5.000 0.00101 0.00001 -0.97 0.394 5.067 0.00100 0.00001 -0.96 0.395 5.131 0.00099 0.00001 -0.95 0.396 5.185 0.00098 0.00001 -0.94 0.397 5.236 0.00097 0.00001 -0.93 0.398 5.285 0.00096 0.00001 -0.92 0.399 5.332 0.00095 0.00000 -0.91 0.400 5.381 0.00095 0.00000 -0.90 0.402 5.458 0.00093 0.00000 -0.88 0.404 5.527 0.00091 0.00000 -0.86 0.406 5.590 0.00089 0.00000 -0.85 0.408 5.648 0.00087 0.00000 -0.83 0.410 5.704 0.00085 0.00000 -0.81 0.412 5.754 0.00083 0.00000 -0.79 0.414 5.802 0.00081 0.00000 -0.77 0.416 5.850 0.00079 0.00000 -0.75 0.420 5.935 0.00075 0.00000 -0.72 0.424 6.015 0.00071 0.00000 -0.68 0.428 6.090 0.00067 0.00000 -0.64 0.432 6.157 0.00063 0.00000 -0.60 0.436 6.224 0.00059 0.00000 -0.57 0.440 6.290 0.00056 0.00000 -0.53 0.444 6.355 0.00052 0.00000 -0.49 0.448 6.417 0.00048 0.00000 -0.46 0.452 6.481 0.00044 0.00000 -0.42 0.456 6.548 0.00040 0.00000 -0.38 0.460 6.616 0.00036 0.00000 -0.34 0.464 6.688 0.00032 0.00000 -0.31 0.468 6.763 0.00028 0.00000 -0.27 0.472 6.842 0.00024 0.00000 -0.23 0.476 6.928 0.00021 0.00000 -0.20 0.480 7.025 0.00017 0.00000 -0.16 0.484 7.132 0.00013 0.00000 -0.12 Докторска дисертација Прилог   214 0.486 7.189 0.00011 0.00000 -0.10 0.488 7.254 0.00009 0.00000 -0.09 0.490 7.327 0.00007 0.00000 -0.07 0.492 7.407 0.00005 0.00000 -0.05 0.494 7.495 0.00003 0.00000 -0.03 0.495 7.539 0.00002 0.00000 -0.02 0.496 7.586 0.00001 0.00000 -0.01 0.497 7.642 0.00000 0.00000 0.00 0.498 7.700 -0.00001 0.00000 0.01 0.499 7.758 -0.00002 0.00000 0.02 0.500 7.822 -0.00003 0.00000 0.03 0.501 7.886 -0.00004 0.00000 0.03 0.502 7.952 -0.00005 0.00000 0.04 0.503 8.017 -0.00006 0.00000 0.05 0.504 8.077 -0.00007 0.00000 0.06 0.505 8.134 -0.00008 0.00000 0.07 0.506 8.193 -0.00008 0.00000 0.08 0.507 8.248 -0.00009 0.00000 0.09 0.508 8.300 -0.00010 0.00000 0.10 0.509 8.348 -0.00011 0.00000 0.11 0.510 8.391 -0.00012 0.00000 0.12 0.512 8.478 -0.00014 0.00000 0.14 0.514 8.551 -0.00016 0.00000 0.16 0.516 8.616 -0.00018 0.00000 0.17 0.518 8.675 -0.00020 0.00000 0.19 0.520 8.725 -0.00022 0.00000 0.21 0.522 8.773 -0.00024 0.00000 0.23 0.524 8.814 -0.00026 0.00000 0.25 0.528 8.875 -0.00030 0.00000 0.29 0.532 8.933 -0.00034 0.00000 0.32 0.536 8.995 -0.00037 0.00000 0.36 0.540 9.042 -0.00041 0.00000 0.40 0.544 9.098 -0.00045 0.00000 0.43 0.548 9.144 -0.00049 0.00000 0.47 0.552 9.174 -0.00053 0.00000 0.51 0.556 9.220 -0.00057 0.00000 0.54 0.560 9.262 -0.00061 0.00000 0.58 Та Потенциометријска титрација 2 mol/dm3 Gd3+ + 1.07 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1006 mo NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl бела 21П 0.0 ml 1.10 m 3 l/dm ml. NaOH pH CH h a 0.000 2.670 0.00152 0.00214 -1.42 0.020 2.716 0.00132 0.00192 -1.24 0.040 2.764 0.00112 0.00172 -1.05 0.060 2.819 0.00093 0.00152 -0.87 0.080 2.880 0.00073 0.00132 -0.68 0.100 2.947 0.00053 0.00113 -0.50 0.120 3.023 0.00033 0.00095 -0.31 0.140 3.110 0.00013 0.00078 -0.13 Докторска дисертација Прилог   215 0.160 3.211 -0.00006 0.00062 0.06 0.180 3.326 -0.00026 0.00047 0.24 0.200 3.460 -0.00046 0.00035 0.43 0.210 3.535 -0.00055 0.00029 0.52 0.220 3.614 -0.00065 0.00024 0.62 0.230 3.697 -0.00075 0.00020 0.71 0.240 3.790 -0.00085 0.00016 0.80 0.250 3.894 -0.00094 0.00013 0.89 0.255 3.950 -0.00099 0.00011 0.94 0.260 4.011 -0.00104 0.00010 0.99 0.265 4.077 -0.00109 0.00008 1.03 0.270 4.151 -0.00114 0.00007 1.08 0.275 4.230 -0.00119 0.00006 1.12 0.280 4.325 -0.00124 0.00005 1.17 0.285 4.442 -0.00128 0.00004 1.22 0.287 4.493 -0.00130 0.00003 1.24 0.290 4.575 -0.00133 0.00003 1.26 0.292 4.650 -0.00135 0.00002 1.28 0.294 4.723 -0.00137 0.00002 1.30 0.296 4.809 -0.00139 0.00002 1.32 0.298 4.910 -0.00141 0.00001 1.34 0.300 5.052 -0.00143 0.00001 1.36 0.302 5.236 -0.00145 0.00001 1.38 0.303 5.434 -0.00146 0.00000 1.38 0.304 5.634 -0.00147 0.00000 1.39 0.305 5.860 -0.00148 0.00000 1.40 0.306 6.102 -0.00149 0.00000 1.41 0.307 6.333 -0.00150 0.00000 1.42 0.308 6.432 -0.00151 0.00000 1.43 0.309 6.507 -0.00152 0.00000 1.44 0.310 6.576 -0.00153 0.00000 1.45 0.311 6.641 -0.00154 0.00000 1.46 0.312 6.696 -0.00155 0.00000 1.47 0.314 6.802 -0.00157 0.00000 1.49 0.316 6.895 -0.00159 0.00000 1.50 0.318 6.930 -0.00160 0.00000 1.52 0.320 6.980 -0.00162 0.00000 1.54 0.322 7.040 -0.00164 0.00000 1.56 Та Потенциометријска титрација 2 mol/dm3 Gd3+ + 1.07 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1006 m NaOH у 0.1 mol/dm3 LiCl бела 22П 0.0 ml 0.55 m 3 ol/dm ml. NaOH pH CH h a 0.000 2.984 0.00104 0.00104 -0.97 0.010 3.019 0.00094 0.00096 -0.87 0.020 3.062 0.00084 0.00087 -0.78 0.030 3.108 0.00074 0.00078 -0.69 0.040 3.158 0.00064 0.00070 -0.60 0.050 3.213 0.00054 0.00061 -0.50 0.060 3.274 0.00044 0.00053 -0.41 Докторска дисертација Прилог   216 0.070 3.344 0.00034 0.00045 -0.32 0.080 3.421 0.00024 0.00038 -0.23 0.085 3.461 0.00019 0.00035 -0.18 0.090 3.501 0.00014 0.00032 -0.13 0.095 3.549 0.00009 0.00028 -0.09 0.100 3.601 0.00004 0.00025 -0.04 0.105 3.649 -0.00001 0.00022 0.01 0.110 3.700 -0.00006 0.00020 0.05 0.115 3.749 -0.00010 0.00018 0.10 0.120 3.802 -0.00015 0.00016 0.14 0.125 3.857 -0.00020 0.00014 0.19 0.130 3.908 -0.00025 0.00012 0.24 0.135 3.965 -0.00030 0.00011 0.28 0.140 4.028 -0.00035 0.00009 0.33 0.145 4.092 -0.00040 0.00008 0.38 0.150 4.156 -0.00045 0.00007 0.42 0.155 4.226 -0.00050 0.00006 0.47 0.160 4.300 -0.00055 0.00005 0.52 0.165 4.392 -0.00060 0.00004 0.56 0.170 4.481 -0.00065 0.00003 0.61 0.172 4.519 -0.00066 0.00003 0.63 0.174 4.561 -0.00068 0.00003 0.65 0.176 4.609 -0.00070 0.00002 0.66 0.178 4.657 -0.00072 0.00002 0.68 0.180 4.705 -0.00074 0.00002 0.70 0.182 4.751 -0.00076 0.00002 0.72 0.184 4.808 -0.00078 0.00002 0.74 0.186 4.867 -0.00080 0.00001 0.76 0.188 4.926 -0.00082 0.00001 0.77 0.190 5.000 -0.00084 0.00001 0.79 0.192 5.074 -0.00086 0.00001 0.81 0.194 5.153 -0.00088 0.00001 0.83 0.196 5.250 -0.00090 0.00001 0.85 0.197 5.320 -0.00091 0.00000 0.86 0.198 5.420 -0.00092 0.00000 0.87 0.200 5.530 -0.00094 0.00000 0.89 0.202 5.658 -0.00096 0.00000 0.90 0.203 5.733 -0.00097 0.00000 0.91 0.204 5.826 -0.00098 0.00000 0.92 0.205 5.925 -0.00099 0.00000 0.93 0.206 6.048 -0.00100 0.00000 0.94 0.207 6.177 -0.00101 0.00000 0.95 0.208 6.315 -0.00102 0.00000 0.96 0.209 6.509 -0.00103 0.00000 0.97 0.210 6.623 -0.00104 0.00000 0.98 0.211 6.714 -0.00105 0.00000 0.99 0.212 6.800 -0.00106 0.00000 1.00 0.213 6.872 -0.00107 0.00000 1.01 0.214 6.925 -0.00108 0.00000 1.02 0.215 6.984 -0.00109 0.00000 1.02 0.216 7.040 -0.00109 0.00000 1.03 0.220 7.253 -0.00113 0.00000 1.07 Докторска дисертација Прилог   217 0.225 7.400 -0.00118 0.00000 1.12 0.230 7.501 -0.00123 0.00000 1.16 0.235 7.565 -0.00128 0.00000 1.21 0.240 7.617 -0.00133 0.00000 1.26 0.245 7.674 -0.00138 0.00000 1.30 0.250 7.718 -0.00143 0.00000 1.35 0.255 7.774 -0.00147 0.00000 1.40 0.260 7.834 -0.00152 0.00000 1.44 0.265 7.890 -0.00157 0.00000 1.49 0.270 7.942 -0.00162 0.00000 1.53 0.275 7.990 -0.00167 0.00000 1.58 0.280 8.030 -0.00172 0.00000 1.63 0.290 8.125 -0.00181 0.00000 1.72 0.300 8.190 -0.00191 0.00000 1.81 0.310 8.250 -0.00201 0.00000 1.91 0.320 8.325 -0.00210 0.00000 2.00 0.330 8.396 -0.00220 0.00000 2.09 0.340 8.471 -0.00230 0.00000 2.18 0.350 8.550 -0.00239 0.00000 2.28 0.360 8.633 -0.00249 0.00000 2.37 0.370 8.725 -0.00259 0.00000 2.46 0.380 8.827 -0.00268 0.00000 2.55 0.390 8.939 -0.00278 0.00000 2.65 0.400 9.060 -0.00287 0.00000 2.74 Та Потенциометријска титрација 20.0 m .80 mmol/dm Gd3+ + 2.40 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.1 aOH у 0.1 mol/dm3 LiCl ml. NaOH pH h a бела 23П l 0 3 006 mol/dm3 N CH 0.000 2.780 0.00186 0.00166 -0.78 0.050 2.854 0.00161 0.00140 -0.67 0.080 2.899 0.00145 0.00126 -0.61 0.110 2.950 0.00130 0.00112 -0.55 0.140 3.005 0.00115 0.00099 -0.48 0.170 3.061 0.00100 0.00087 -0.42 0.200 3.125 0.00085 0.00075 -0.36 0.230 3.186 0.00070 0.00065 -0.29 0.260 3.254 0.00055 0.00056 -0.23 0.285 3.313 0.00042 0.00049 -0.18 0.310 3.376 0.00030 0.00042 -0.13 0.335 3.441 0.00018 0.00036 -0.07 0.360 3.507 0.00005 0.00031 -0.02 0.380 3.564 -0.00005 0.00027 0.02 0.400 3.625 -0.00015 0.00024 0.06 0.410 3.655 -0.00020 0.00022 0.08 0.420 3.688 -0.00024 0.00021 0.10 0.430 3.719 -0.00029 0.00019 0.12 0.440 3.756 -0.00034 0.00018 0.15 0.450 3.787 -0.00039 0.00016 0.17 0.460 3.821 -0.00044 0.00015 0.19 Докторска дисертација Прилог   218 0.470 3.856 -0.00049 0.00014 0.21 0.480 3.892 -0.00054 0.00013 0.23 0.490 3.929 -0.00059 0.00012 0.25 0.500 3.967 -0.00064 0.00011 0.27 0.510 4.007 -0.00068 0.00010 0.29 0.520 4.045 -0.00073 0.00009 0.31 0.530 4.088 -0.00078 0.00008 0.33 0.540 4.131 -0.00083 0.00007 0.36 0.550 4.177 -0.00088 0.00007 0.38 0.560 4.225 -0.00093 0.00006 0.40 0.570 4.277 -0.00098 0.00005 0.42 0.580 4.331 -0.00102 0.00005 0.44 0.590 4.388 -0.00107 0.00004 0.46 0.600 4.451 -0.00112 0.00004 0.48 0.610 4.518 -0.00117 0.00003 0.50 0.620 4.589 -0.00122 0.00003 0.52 0.630 4.668 -0.00127 0.00002 0.54 0.635 4.710 -0.00129 0.00002 0.55 0.640 4.756 -0.00131 0.00002 0.56 0.645 4.801 -0.00134 0.00002 0.58 0.650 4.849 -0.00136 0.00001 0.59 0.655 4.903 -0.00139 0.00001 0.60 0.660 4.955 -0.00141 0.00001 0.61 0.665 5.013 -0.00143 0.00001 0.62 0.670 5.071 -0.00146 0.00001 0.63 0.675 5.133 -0.00148 0.00001 0.64 0.680 5.199 -0.00151 0.00001 0.65 0.685 5.268 -0.00153 0.00001 0.66 0.690 5.344 -0.00155 0.00000 0.67 0.692 5.373 -0.00156 0.00000 0.67 0.694 5.403 -0.00157 0.00000 0.68 0.696 5.437 -0.00158 0.00000 0.68 0.698 5.466 -0.00159 0.00000 0.69 0.700 5.502 -0.00160 0.00000 0.69 0.702 5.537 -0.00161 0.00000 0.69 0.704 5.571 -0.00162 0.00000 0.70 0.706 5.609 -0.00163 0.00000 0.70 0.708 5.646 -0.00164 0.00000 0.71 0.710 5.687 -0.00165 0.00000 0.71 0.712 5.727 -0.00166 0.00000 0.72 0.714 5.771 -0.00167 0.00000 0.72 0.716 5.813 -0.00168 0.00000 0.72 0.718 5.861 -0.00169 0.00000 0.73 0.720 5.913 -0.00170 0.00000 0.73 0.722 5.964 -0.00171 0.00000 0.74 0.724 6.019 -0.00172 0.00000 0.74 0.726 6.085 -0.00173 0.00000 0.74 0.728 6.148 -0.00174 0.00000 0.75 0.730 6.335 -0.00175 0.00000 0.75 0.731 6.361 -0.00175 0.00000 0.76 0.732 6.390 -0.00175 0.00000 0.76 0.733 6.428 -0.00176 0.00000 0.76 Докторска дисертација Прилог   219 0.734 6.469 -0.00176 0.00000 0.76 0.735 6.517 -0.00177 0.00000 0.76 0.736 6.557 -0.00177 0.00000 0.77 0.737 6.591 -0.00178 0.00000 0.77 0.738 6.635 -0.00178 0.00000 0.77 0.739 6.674 -0.00179 0.00000 0.77 0.740 6.722 -0.00179 0.00000 0.77 0.741 6.774 -0.00180 0.00000 0.78 0.742 6.812 -0.00180 0.00000 0.78 0.743 6.849 -0.00181 0.00000 0.78 0.744 6.890 -0.00181 0.00000 0.78 0.745 6.928 -0.00182 0.00000 0.78 0.746 6.969 -0.00182 0.00000 0.79 0.747 7.010 -0.00183 0.00000 0.79 0.748 7.040 -0.00183 0.00000 0.79 0.749 7.077 -0.00184 0.00000 0.79 0.750 7.110 -0.00184 0.00000 0.79 0.751 7.139 -0.00185 0.00000 0.80 0.752 7.169 -0.00185 0.00000 0.80 0.753 7.198 -0.00185 0.00000 0.80 0.754 7.226 -0.00186 0.00000 0.80 0.755 7.252 -0.00186 0.00000 0.81 0.756 7.276 -0.00187 0.00000 0.81 0.757 7.299 -0.00187 0.00000 0.81 0.758 7.320 -0.00188 0.00000 0.81 0.759 7.339 -0.00188 0.00000 0.81 0.76 7.357 -0.00189 0.00000 0.82 0.761 7.374 -0.00189 0.00000 0.82 0.762 7.392 -0.00190 0.00000 0.82 0.764 7.424 -0.00191 0.00000 0.82 0.766 7.456 -0.00192 0.00000 0.83 0.768 7.490 -0.00193 0.00000 0.83 0.77 7.522 -0.00194 0.00000 0.84 0.772 7.555 -0.00195 0.00000 0.84 0.774 7.586 -0.00195 0.00000 0.85 0.776 7.614 -0.00196 0.00000 0.85 0.778 7.644 -0.00197 0.00000 0.85 0.78 7.665 -0.00198 0.00000 0.86 0.782 7.688 -0.00199 0.00000 0.86 0.784 7.710 -0.00200 0.00000 0.87 0.786 7.728 -0.00201 0.00000 0.87 0.788 7.744 -0.00202 0.00000 0.87 0.79 7.761 -0.00203 0.00000 0.88 0.793 7.782 -0.00204 0.00000 0.89 0.796 7.802 -0.00206 0.00000 0.89 0.801 7.827 -0.00208 0.00000 0.90 0.806 7.850 -0.00211 0.00000 0.91 0.811 7.866 -0.00213 0.00000 0.92 0.821 7.900 -0.00218 0.00000 0.94 0.831 7.930 -0.00222 0.00000 0.96 0.851 7.984 -0.00232 0.00000 1.01 0.871 8.032 -0.00241 0.00000 1.05 Докторска дисертација Прилог   220 0.891 8.085 -0.00251 0.00000 1.09 0.911 8.136 -0.00260 0.00000 1.13 0.931 8.184 -0.00269 0.00000 1.17 0.951 8.234 -0.00279 0.00000 1.22 0.971 8.284 -0.00288 0.00000 1.26 0.991 8.337 -0.00297 0.00000 1.30 1.011 8.391 -0.00307 0.00000 1.34 1.031 8.445 -0.00316 0.00000 1.38 1.051 8.502 -0.00325 0.00000 1.43 1.071 8.562 -0.00335 0.00000 1.47 1.091 8.624 -0.00344 0.00000 1.51 1.111 8.672 -0.00353 0.00000 1.55 1.131 8.738 -0.00362 0.00000 1.59 1.151 8.808 -0.00371 0.00000 1.63 1.171 8.880 -0.00380 0.00000 1.68 1.181 8.915 -0.00385 0.00000 1.70 1.191 8.950 -0.00390 0.00000 1.72 1.201 8.987 -0.00394 0.00000 1.74 1.211 9.028 -0.00399 0.00000 1.76 1.221 9.071 -0.00403 0.00000 1.78 1.231 9.117 -0.00408 0.00000 1.80 1.241 9.161 -0.00412 0.00000 1.82 1.251 9.208 -0.00417 0.00000 1.84 1.261 9.258 -0.00421 0.00000 1.87 Та Потенциометријска титрација 20.0 m Gd3+ + 2.5 mmol/dm3 моксифлоксацина са 0.10 aOH у 0.1 mol/dm3 LiCl ml. NaOH pH h a бела 24П l 0.50 mmol/dm3 06 mol/dm3 N CH 0.000 2.799 0.00196 0.00159 -0.78 0.050 2.896 0.00170 0.00127 -0.68 0.080 2.949 0.00155 0.00112 -0.62 0.110 3.004 0.00140 0.00099 -0.56 0.140 3.063 0.00125 0.00086 -0.50 0.170 3.127 0.00109 0.00075 -0.44 0.200 3.197 0.00094 0.00064 -0.38 0.220 3.247 0.00084 0.00057 -0.34 0.240 3.297 0.00074 0.00050 -0.30 0.260 3.353 0.00064 0.00044 -0.26 0.280 3.409 0.00054 0.00039 -0.22 0.300 3.466 0.00044 0.00034 -0.18 0.320 3.525 0.00034 0.00030 -0.14 0.340 3.587 0.00024 0.00026 -0.10 0.360 3.650 0.00014 0.00022 -0.06 0.380 3.717 0.00005 0.00019 -0.02 0.400 3.788 -0.00005 0.00016 0.02 0.420 3.863 -0.00015 0.00014 0.06 0.430 3.903 -0.00020 0.00013 0.08 0.440 3.945 -0.00025 0.00011 0.10 0.450 3.987 -0.00030 0.00010 0.12 Докторска дисертација Прилог   221 0.460 4.032 -0.00035 0.00009 0.14 0.470 4.079 -0.00040 0.00008 0.16 0.480 4.129 -0.00045 0.00007 0.18 0.490 4.180 -0.00049 0.00007 0.20 0.500 4.235 -0.00054 0.00006 0.22 0.510 4.295 -0.00059 0.00005 0.24 0.520 4.358 -0.00064 0.00004 0.26 0.530 4.426 -0.00069 0.00004 0.28 0.540 4.501 -0.00074 0.00003 0.30 0.545 4.541 -0.00076 0.00003 0.31 0.550 4.582 -0.00079 0.00003 0.32 0.555 4.624 -0.00081 0.00002 0.33 0.560 4.672 -0.00084 0.00002 0.34 0.565 4.718 -0.00086 0.00002 0.35 0.570 4.766 -0.00088 0.00002 0.36 0.575 4.816 -0.00091 0.00002 0.37 0.580 4.865 -0.00093 0.00001 0.38 0.585 4.916 -0.00096 0.00001 0.39 0.590 4.975 -0.00098 0.00001 0.40 0.595 5.025 -0.00100 0.00001 0.41 0.600 5.077 -0.00103 0.00001 0.42 0.605 5.129 -0.00105 0.00001 0.43 0.610 5.181 -0.00108 0.00001 0.44 0.615 5.234 -0.00110 0.00001 0.45 0.620 5.286 -0.00113 0.00001 0.46 0.625 5.339 -0.00115 0.00000 0.47 0.630 5.390 -0.00117 0.00000 0.48 0.635 5.442 -0.00120 0.00000 0.49 0.640 5.495 -0.00122 0.00000 0.50 0.645 5.550 -0.00125 0.00000 0.51 0.650 5.604 -0.00127 0.00000 0.52 0.655 5.659 -0.00129 0.00000 0.53 0.660 5.716 -0.00132 0.00000 0.54 0.665 5.776 -0.00134 0.00000 0.55 0.670 5.845 -0.00137 0.00000 0.56 0.673 5.883 -0.00138 0.00000 0.57 0.676 5.922 -0.00140 0.00000 0.58 0.679 5.965 -0.00141 0.00000 0.58 0.682 6.010 -0.00142 0.00000 0.59 0.685 6.059 -0.00144 0.00000 0.60 0.688 6.110 -0.00145 0.00000 0.60 0.691 6.165 -0.00147 0.00000 0.61 0.694 6.227 -0.00148 0.00000 0.61 0.697 6.293 -0.00150 0.00000 0.62 0.700 6.362 -0.00151 0.00000 0.63 0.702 6.410 -0.00152 0.00000 0.63 0.704 6.462 -0.00153 0.00000 0.63 0.706 6.516 -0.00154 0.00000 0.64 0.708 6.571 -0.00155 0.00000 0.64 0.710 6.631 -0.00156 0.00000 0.65 0.712 6.693 -0.00157 0.00000 0.65 0.714 6.715 -0.00158 0.00000 0.65 Докторска дисертација Прилог   222 0.716 6.738 -0.00159 0.00000 0.66 0.717 6.753 -0.00159 0.00000 0.66 0.718 6.775 -0.00160 0.00000 0.66 0.719 6.799 -0.00160 0.00000 0.66 0.720 6.827 -0.00161 0.00000 0.67 0.721 6.854 -0.00161 0.00000 0.67 0.722 7.235 -0.00162 0.00000 0.67 0.723 7.248 -0.00162 0.00000 0.67 0.724 7.267 -0.00162 0.00000 0.67 0.725 7.292 -0.00163 0.00000 0.68 0.726 7.309 -0.00163 0.00000 0.68 0.728 7.349 -0.00164 0.00000 0.68 0.730 7.393 -0.00165 0.00000 0.69 0.732 7.434 -0.00166 0.00000 0.69 0.734 7.472 -0.00167 0.00000 0.69 0.736 7.509 -0.00168 0.00000 0.70 0.738 7.544 -0.00169 0.00000 0.70 0.740 7.575 -0.00170 0.00000 0.71 0.742 7.604 -0.00171 0.00000 0.71 0.744 7.630 -0.00172 0.00000 0.71 0.746 7.656 -0.00173 0.00000 0.72 0.749 7.694 -0.00174 0.00000 0.72 0.752 7.726 -0.00176 0.00000 0.73 0.755 7.759 -0.00177 0.00000 0.74 0.758 7.790 -0.00179 0.00000 0.74 0.761 7.819 -0.00180 0.00000 0.75 0.764 7.850 -0.00182 0.00000 0.75 0.767 7.875 -0.00183 0.00000 0.76 0.770 7.903 -0.00184 0.00000 0.77 0.775 7.938 -0.00187 0.00000 0.78 0.780 7.974 -0.00189 0.00000 0.79 0.785 8.007 -0.00192 0.00000 0.80 0.795 8.036 -0.00196 0.00000 0.82 0.795 8.061 -0.00196 0.00000 0.82 0.800 8.085 -0.00199 0.00000 0.83 0.810 8.128 -0.00203 0.00000 0.85 0.820 8.166 -0.00208 0.00000 0.87 0.830 8.199 -0.00213 0.00000 0.89 0.840 8.230 -0.00218 0.00000 0.91 0.850 8.260 -0.00222 0.00000 0.93 0.860 8.287 -0.00227 0.00000 0.95 0.880 8.346 -0.00236 0.00000 0.99 0.890 8.371 -0.00241 0.00000 1.01 0.900 8.400 -0.00246 0.00000 1.03 0.910 8.425 -0.00251 0.00000 1.05 0.920 8.455 -0.00255 0.00000 1.07 0.930 8.484 -0.00260 0.00000 1.09 0.940 8.500 -0.00265 0.00000 1.11 Докторска дисертација Прилог   223 Апсорпциони спектри комплексирања система Gd3+-моксифлоксацин Табела 25П UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони о сифлоксацин=1:1 ([Gd3+]=0.033 mmol/dm . [moxi]=0.035 mmol/dm3 ) днос Gd3+-мок 3 Апсорбанција pH 3.67 4.649 96 6.96 6.971 5.058 6.316 5.618 6.147 6.65 6. λ (nm) 250 0.3008 0.322 0.3674 0.329 3324 0.3299 0.3207 0.3092 0.3009 2 0.345 0. 252 0 0 0 0 0.2 45 0.3 6 0.3 87 0.3 0.3 99 0.3 7 0.3 87 0.32 0.3 0.3 .2899 0.3146 0.3609 0.327 0.3402 0.3293 .3275 .3187 .3078 0.2996 254 8 11 5 283 3 29 2 089 011 256 0.28 0.3084 0.3564 0.3293 0.3388 0.3302 0.3295 0.3207 0.3097 0.3021 258 0.2713 0.3004 0.3489 0.3248 0.3324 0.3249 0.3248 0.3167 0 0.3059 0.2984 260 0.2577 0 0.2878 0.3366 0.315 0.321 0.3143 0.3152 .3076 0.2975 0.2902 262 .2461 0.2771 0.3258 0.3064 0.3109 0.3053 0.3064 0.3 0.2908 0.2838 264 0.2437 0.2758 0.325 0.3077 0.311 0.3057 0.3072 0.3012 0.2925 0.2855 266 0.2552 0.2888 0.339 0.3236 0.326 0.3206 0.3226 0.3162 0 0.3076 0.3003 268 0.2818 0.3168 0.3702 0.3563 0.3578 0.3522 0.3543 .3472 0.3379 0.3306 270 0.3233 0.3608 0.4177 0.407 0.4068 0.4012 0.4033 0.3945 0.3838 0.3761 272 0.3799 0.4204 0.4832 0.4754 0.4739 0.4677 0.4703 0.4589 0.4465 0.4375 274 0.4517 0.4961 0.566 0.5623 0.5588 0.5516 0.5542 0.5402 0.5244 0.5148 276 0.5391 0.5872 0.6654 0.6649 0.6605 0.6518 0.6548 0.6365 0.6173 0.6061 278 0.6411 0.694 0.7819 0.7834 0.7787 0.7678 0.7712 0.747 0.7233 0.7111 280 0.7575 0.8139 0.9122 0.9131 0.9099 0.8955 0.8983 0.8672 0.8393 0.825 282 0.8887 0.9433 1.0505 1.0469 1.0469 1.028 1.0286 0.9911 0.9565 0.9406 284 1.0237 1.0694 1.1818 1.1651 1.1731 1.1465 1.1447 1.0998 1.0589 1.0415 286 1.1543 1.1775 1.2869 1.2474 1.2717 1.2329 1.2261 1.1737 1.1286 1.1089 288 1.2696 1.261 1.3594 1.2866 1.3304 1.2793 1.2648 1.2036 1.1556 1.1366 290 1.3747 1.3239 1.4081 1.2915 1.3622 1.295 1.2689 1.1999 1.1488 1.1281 292 1.46 1.3618 1.4286 1.2592 1.3622 1.2766 1.2386 1.1603 1.1052 1.0848 294 1.5149 1.3628 1.4047 1.1879 1.3202 1.2162 1.1675 1.0845 1.0272 1.007 296 1.5155 1 1.3111 1.3285 1.0771 1.2276 1.1147 1.0579 0.9764 0.9211 0.9009 298 .4518 1.2126 1.2097 0.9415 1.0973 0.9819 0.9239 0.8501 0.801 0.7811 300 1.31 1.0644 1.0521 0.797 0.941 0.8348 0.7807 0.7188 0.6796 0.6606 302 1.1195 0.8961 0.8843 0.6609 0.7835 0.6924 0.6475 0.599 0.5684 0.5507 304 0.9183 0 0.7336 0.729 0.5462 0.6429 0.5706 0.535 0.4983 0.4751 0.4594 306 .7404 0.5984 0.6019 0.457 0.5319 0.4754 0.4483 0.4207 0.4029 0.3888 308 0.6007 0.4961 0.5067 0.3927 0.4504 0.4061 0.3859 0.3645 0.3502 0.3374 310 0.5013 0.4251 0.4404 0.3493 0.3947 0.3598 0.3439 0.3263 0.3139 0.3024 312 0.4359 0.379 0.3972 0.3215 0.359 0.3302 0.3171 0.3018 0.2907 0.2799 314 0.3964 0.352 0.3715 0.3061 0.3385 0.3136 0.3022 0.2882 0.2777 0.2677 316 0.3754 0.3386 0.3586 0.2994 0.329 0.3062 0.2958 0.2824 0.2722 0.2624 318 0.3677 0.335 0.3553 0.3 0.3277 0.3065 0.2966 0.283 0.2731 0.2637 320 0.3674 0.3376 0.3581 0.3054 0.3322 0.3116 0.302 0.2886 0.2782 0.2688 322 0.3712 0.3431 0.3638 0.3135 0 0.3394 0.3193 0.3104 0.2966 0.2862 0.277 324 0.3747 0.3488 0.3706 .3226 0.347 0.3278 0.3191 0.3053 0.2949 0.2858 326 0.3759 0.3523 0.3757 0.3302 0.3533 0.3348 0.3267 0.3131 0.3028 0.2933 328 0.3736 0.3533 0.3776 0.3351 0.3566 0.3391 0.3322 0.3185 0.3081 0.2983 330 0.3728 0.3553 0.3812 0.3412 0.3618 0.345 0.3384 0.3247 0.3144 0.3048 332 0.3716 0.3576 0.3851 0.3476 0.3669 0.3506 0.3445 0.3307 0.3199 0.3106 334 0.37 0.3598 0.3885 0.354 0.3714 0.3562 0.3504 0.3372 0.3261 0.3165 336 0.3668 0.3597 0.3896 0.3584 0.3744 0.3599 0.3548 0.3414 0.3302 0.3207 338 0.3618 0.3567 0.3879 0.3592 0.3735 0.36 0.3556 0.3422 0.3314 0.322 Докторска дисертација Прилог   224 340 0 0 0 0 0 -0.001 -0.001 -0.001 -0.001 0 -0.001 -0 1 .3558 0.3508 0.3819 0.3548 0.3681 0.3554 0.3514 0.3381 0.3279 0.319 342 0.3492 0.3433 0.3733 0.3462 0.3596 0.347 0.3431 0.3305 0.3205 0.3108 344 0.344 0.3355 0.3643 0.336 0.3503 .3372 0.3328 0.3202 0.31 0.3007 346 0.3409 0.3301 0.3577 0.3269 0.3427 0.3288 0.3241 0.3112 0.301 0.2917 348 0.3399 0.327 0.3533 0.3206 0.3375 0.3231 0.3174 0.3039 0.2929 0.2841 350 0.341 0.3262 0.3514 0.3168 0.3354 0.3201 0.3134 0.2991 .2877 0.2787 352 0.3427 0.3271 0.3518 0.3153 0.3352 0.3192 0.3119 0.2968 0.2845 0.2757 354 0.3451 0.3292 0.3536 0.3159 0.3365 0.3201 0.3118 0.2962 0.2832 0.2742 356 0.347 0.3314 0.3556 0.3169 0.3383 0.3207 0.3123 0.2961 0.2824 0.2735 358 0.3481 0.3324 0.3569 0.3171 0.3393 0.321 0.3124 0.2958 0.2813 0.2723 360 0.3473 0.332 0.357 0.316 0.3384 0.3201 0.3109 0.2939 0.2792 0.2704 362 0.3453 0.3303 0.3551 0.3132 0.3365 0.3175 0.308 0.2909 0.2758 0.2667 364 0.3415 0.3269 0.3512 0.3084 0.3321 0.3124 0.3028 0.2859 0.2706 0.2615 366 0.3357 0.3211 0.3452 0.3013 0.3253 0.3052 0.2958 0.2789 0.2636 0.2546 368 0.3278 0.313 0.3365 0.2915 0.3159 0.2958 0.2862 0.2697 0.2547 0.246 370 0.3185 0.3034 0.3258 0.2798 0.3046 0.2839 0.2744 0.2589 0.2443 0.2355 372 0.3069 0.2917 0.3129 0.2657 0.2909 0.2701 0.2605 0.2457 0.232 0.2233 374 0.294 0.2784 0.2983 0.2503 0.2757 0.2545 0.2452 0.2316 0.2182 0.2099 376 0.2795 0.2633 0.2817 0.2332 0.2583 0.2374 0.228 0.2156 0.203 0.195 378 0.2641 0.2473 0.2641 0.2149 0.2402 0.2194 0.2104 0.1989 0.1876 0.1794 380 0.2481 0.2306 0.2456 0.1958 0.2216 0.201 0.1918 0.1813 0.1714 0.1637 382 0.2314 0.2137 0.2266 0.1768 0.2022 0.1815 0.1736 0.1641 0.1547 0.1476 384 0.2124 0.1939 0.2048 0.1555 0.1803 0.161 0.1527 0.1449 0.137 0.13 386 0.1956 0.1766 0.1858 0.1369 0.1613 0.1427 0.1345 0.1281 0.1211 0.1144 388 0.1792 0.16 0.1674 0.1193 0.1432 0.1252 0.1173 0.1119 0.1061 0.0997 390 0.1634 0.144 0.1499 0.103 0.126 0.1088 0.1012 0.0969 0.0921 0.086 392 0.1481 0.1287 0.1331 0.0877 0.1101 0.0936 0.0864 0.083 0.079 0.0732 394 0.1336 .1145 0.118 0.074 0.0954 0.0799 0.073 0.0706 0.0674 0.0619 396 0.1199 0.1013 0.1036 0.0617 0.0819 0.0675 0.061 0.0593 0.0569 0.0516 398 0.1071 0.089 0.0907 0.0507 0.0698 0.0564 0.0503 0.0492 0.0473 0.0424 400 0.0954 0.078 0.0791 0.0414 0.0593 0.0471 0.0413 0.0408 0.0393 0.0347 402 0.0846 0.068 0.0688 0.0332 0.05 0.0389 0.0336 0.0335 0.0323 0.0278 404 0.0748 0.0591 0.0595 0.0264 0.0421 0.0319 0.0269 0.0273 0.0266 0.0222 406 0.0656 0.0512 0.0514 0.0206 0.0351 0.0261 0.0213 0.0221 0.0214 0.0173 408 0.0574 0.0441 0.0442 0.0158 .0291 0.021 0.0165 0.0176 0.0173 0.0133 410 0.0504 0.0382 0.0382 0.012 0.0242 0.0168 0.0129 0.0141 0.0139 0.0099 412 0.0439 0.033 0.0333 0.0089 0.0202 0.0137 0.0099 0.0114 0.0113 0.0076 414 0.0383 0.0282 0.0287 0.0064 0.0165 0.0109 0.0076 0.0091 0.0091 0.0056 416 0.0329 0.0242 0.0248 0.0043 0.0137 0.0088 0.0056 0.0073 0.0072 0.0038 418 0.0285 0.021 0.0217 0.003 0.0114 0.0072 0.0043 0.006 0.0061 0.0027 420 0.0246 0.0182 0.019 0.0017 0.0095 0.0059 0.003 0.005 0.005 0.0016 422 0.0212 0.0157 0.0168 0.0007 0.0078 0.0046 0.0021 0.004 0.0039 0.0009 424 0.0183 0.0136 0.0149 0 0.0065 0.0037 0.0013 0.0032 0.0032 0.0001 426 0.0158 0.0121 0.0134 0 0.0055 0.0031 0.0009 0.0029 0.0028 0 428 0.0138 0.0106 0.0121 0 0.0046 0.0026 0.0004 0.0024 0.0024 0 430 0.012 0.0094 0.011 0.0039 0.0021 0.0001 0.0021 0.0021 0 432 0.0104 0.0083 0.01 0.0034 0.0017 0 0.0018 0.0017 0 434 0.0092 0.0075 0.0092 0.0029 0.0015 0 0.0017 0.0017 0 436 0.008 0.0068 0.0086 -0.001 0.0025 0.0012 0 0.0017 0.0015 438 0.0071 0.0062 .0081 -0.001 0.0022 0.0011 0 0.0016 0.0013 440 0.0065 0.0059 0.0077 -0.001 0.0021 0.001 0 0.0015 0.0013 .00 442 0.006 0.0054 0.007 -0.002 0.0017 0.0008 0 0.0015 0.0012 -0.001 444 0.0055 0.0052 0.0069 -0.002 0.0016 0.0007 0 0.0014 0.0012 -0.001 446 0.0052 0.0049 0.0064 -0.002 0.0015 0.0006 0 0.0012 0.0011 -0.001 448 0.0048 0.0046 0.0062 -0.002 0.0013 0.0005 0 0.0012 0.0011 -0.001 450 0.0045 0.0044 0.0058 -0.002 0.0011 0.0004 0 0.0011 0.0009 -0.001 Докторска дисертација Прилог   225 Та П UV пе с d3 н злич им p но концентрациони о сифлоксацин=1:2 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm3 oxi]=0.0349 mmol/dm3 ) бела 26 -VIS с ктри ра твора G +-моксифлоксаци а на ра ит H вред стима за днос Gd3+-мок . [m Апсорбанција pH 3.684 4.276 595 6.868 7.096 5.12 4.997 5.667 5.954 6.375 6. λ (nm) 250 0.3001 0.308 0.337 0.386 3373 0.3518 0.3511 0.3602 0.3683 3 0.3431 0. 252 0.2893 0.2974 0 0.2 39 0.2 4 0.3 55 0.3 0.3 81 0.3 8 0.3 04 0.351 0.3 0.3 1 0 0 0 .3289 0.3772 0.3386 0.334 0.3494 0.3496 0.3589 0.3669 254 8 92 2 729 3 33 5 603 678 256 0.2796 0.2884 0.3223 0.3704 0.3373 0.3333 0.3503 0.3516 0.3606 0.3671 258 0.2709 0.2797 0.314 0.3547 0.331 0.3275 0.3449 0.3466 0.3559 0.361 260 0.2572 0.2658 0.301 0.3345 0.3199 0.3171 0.3349 0.3368 0.3472 0.3509 262 0.2452 0.2535 0.2898 0.321 0.3103 0.3082 0.3267 0.3288 0.3406 0.3436 264 0.243 0.2509 0.2886 0.3123 0.3108 0.3092 0.3286 0.331 0.3443 0.3473 266 0.255 0.2633 0.302 0.315 0.3268 0.3253 0.3461 0.3489 0.3629 0.3667 268 0.2824 0.2915 0.3318 0.3396 0.3602 0.3586 0.3813 0.3849 0.3989 0.404 270 0.3256 0.336 0.3787 0.3842 0.4122 0.4099 0.4356 0.4403 0.453 0.4601 272 0.3848 0.3967 0.4428 0.447 0.4831 0.4803 0.5097 0.5157 0.5257 0.5357 274 0.4593 0.4733 0.5231 0.5264 0.5719 0.5679 0.6019 0.6096 0.6155 0.6296 276 0.549 0.5656 0.6195 0.6216 0.6775 0.6719 0.7107 0.7203 0.7208 0.7393 278 0.654 0.6743 0.7317 0.7332 0.7988 0.791 0.8348 0.8462 0.8388 0.8633 280 0.7759 0.7991 0.859 0.86 0.9334 0.9224 0.9703 0.9828 0.9658 0.9953 282 0.9109 0.9383 0.996 0.9979 1.074 1.0584 1.1086 1.1223 1.0941 1.1283 284 1.051 1.0814 1.1299 1.1326 1.2025 1.1801 1.2283 1.2424 1.204 1.2419 286 1.186 1.2188 1.2475 .2529 1.3034 1.2712 1.312 1.3237 1.2787 1.3188 288 1.307 1.3425 1.3396 1.3489 1.3648 1.3207 1.3479 1.3557 1.3059 1.3461 290 1.4153 1.4525 1.4105 1.4251 1.3923 1.3334 1.3416 1.342 1.2893 1.3247 292 1.5051 1.5396 1.4538 1.4775 1.3837 1.3088 1.2933 1.2858 1.2296 1.2544 294 1.5642 1.5968 1.462 1.4984 1.3381 1.2493 1.2079 1.1918 1.1334 1.1433 296 1.5673 1.5957 1.4192 1.469 1.2511 1.1533 1.092 1.069 1.0119 1.0077 298 1.5029 1.5246 1.3216 1.3814 1.1299 1.0301 0.9596 0.9317 0.8802 0.8672 300 1.3559 1.374 1.1711 1.2353 0.9829 0.8908 0.8221 0.7937 0.7513 0.7351 302 1.1587 1.173 0.9938 1.0549 0.8289 0.7508 0.6921 0.6671 0.6346 0.6195 304 0.9494 0.96 0.8176 0.8709 0.6862 0.6242 0.5796 0.5591 0.5358 0.5243 306 0.7632 0.7721 0.6668 0.7104 0.5679 0.5205 0.4894 0.4736 0.4581 0.4505 308 0.6169 0.6254 0.5508 0.5862 0.4786 0.4427 0.4222 0.4104 0.4006 0.3964 310 0.5129 .5215 0.4693 0.4974 0.4167 0.3889 0.3755 0.3669 0.361 0.3597 312 0.4453 0.4535 0.4166 0.439 0.3769 0.3542 0.3459 0.3394 0.3361 0.337 314 0.4041 0.4128 0.3853 0.4034 0.3538 0.3344 0.3292 0.324 0.3225 0.325 316 0.3828 0.3918 0.3697 0.3845 0.3433 0.3257 0.3223 0.3182 0.3175 0.3216 318 0.3745 0.3841 0.365 0.3771 0.3418 0.3251 0.3228 0.3194 0.319 0.3244 320 0.3748 0.3849 0.3672 0.3772 0.3463 0.33 0.329 0.326 0.3255 0.3325 322 0.3784 0.3891 0.3732 0.3812 0.3546 0.3386 0.3385 0.3362 0.3356 0.3439 324 0.3821 0.3932 0.3791 0.385 0.3632 0.3474 0.3488 0.3469 0.346 0.3561 326 0.3832 0.395 0.3827 0.3869 0.37 .3549 0.3577 0.3564 0.3555 0.3669 328 0.3814 0.3943 0.384 0.3863 0.3746 0.3598 0.3638 0.3635 0.3624 0.3748 330 0.3803 0.3934 0.3859 0.3866 0.3792 0.3653 0.3708 0.3705 0.3694 0.3834 332 0.3788 0.3922 0.3872 0.3862 .3837 0.3709 0.3768 0.3774 0.3763 0.3914 334 0.3771 0.3914 0.389 0.3865 0.3883 0.376 0.3838 0.3846 0.3832 0.399 336 0.3738 0.3875 0.3879 0.3841 0.3909 0.3785 0.388 0.3896 0.388 0.4044 338 0.3691 0.3836 0.3852 0.3803 0.3908 0.3795 0.3893 0.3912 0.3898 0.4067 340 0.3623 0.3769 0.3789 0.3732 0.3855 0.3742 0.3848 0.3873 0.3852 0.4022 342 0.356 0.3701 0.3711 0.3656 0.3772 0.3659 0.376 0.3782 0.376 0.393 344 0.3504 0.364 0.3633 0.3585 0.3668 0.3556 0.3641 0.3657 0.3635 0.3792 Докторска дисертација Прилог   226 346 0.3476 0.3607 0.3576 0.3539 0.358 0.346 0.353 0.354 0.3512 0.3655 348 0.3471 0.3594 0.354 0.3519 0.3514 0.3387 0.3438 0.3446 0.3408 0.353 350 0.3484 0.3602 0.3526 0.3525 0.3476 0.3342 0.3377 0.3378 0.333 0.3429 352 0.3505 0.3617 0.3527 0.3544 0.3454 0.3312 0.3334 0.3333 0.3269 0.3353 354 0.3529 0.3636 0.3541 0.3577 0.3448 0.3304 0.3318 0.3312 0.3233 0.3302 356 0.3553 0.3651 0.3553 0.3614 0.345 0.3302 0.3304 0.3295 0.3205 0.3256 358 0.3565 0.3656 0.356 0.3641 0.3441 0.3299 0.329 0.328 0.3181 0.3213 360 0.3558 0.3646 0.3548 0.3652 0.3422 0.3272 0.3262 0.3246 0.3142 0.3159 362 0.3541 0.3618 0.3524 0.3653 0.3389 0.3242 0.3225 0.3206 0.3092 0.31 364 0.3501 0.3572 0.3479 0.3636 0.333 0.3188 0.3166 0.3146 0.3027 0.3021 366 0.3441 0.35 0.3408 0.3594 0.3251 0.3111 0.3083 0.3057 0.2938 0.2926 368 0.3357 0.341 0.3319 0.353 0.315 0.3011 0.298 0.2949 0.2832 0.281 370 0.3263 0.33 0.3211 0.3448 0.3027 0.2892 0.2856 0.2823 0.271 0.2681 372 0.3145 0 0 -0.001 -0.001 -0 1 .3175 0.3088 0.3347 0.2888 0.2757 0.2718 0.2678 0.2572 0.2536 374 0.3011 0.303 0.2944 0.3225 0.273 0.2606 0.256 0.2517 0.242 0.2381 376 0.286 .2871 0.2781 0.3082 0.2555 0.2438 0.2386 0.234 0.2253 0.2215 378 0.2703 0.2706 0.2616 0.293 0.2374 0.2263 0.2209 0.2155 0.2084 0.2041 380 0.2534 0.2528 0.2437 0.2768 0.2189 0.2081 0.202 0.1966 0.1906 0.1863 382 0.2361 0.2349 0.2257 0.2596 0.1995 0.1894 0.1832 0.1777 0.1729 0.1686 384 0.2166 0.2148 0.2052 0.2391 0.1782 0.1689 0.1626 0.1565 0.1534 0.1497 386 0.1991 0.1968 0.1872 0.221 0.1597 0.151 0.1442 0.1379 0.1364 0.1329 388 0.1821 0.1795 0.1699 0.2032 0.142 0.1338 0.127 0.1206 0.1204 0.1172 390 0.1657 0.163 0.1532 0.1859 0.1252 0.1177 0.1107 0.1044 0.1052 0.1025 392 0.1499 0.147 0.1375 0.1689 0.1095 0.1026 0.0957 0.0893 0.0913 0.0888 394 0.1346 0.1318 0.1224 0.1525 0.0951 0.0885 0.0816 0.0755 0.0784 0.0762 396 0.1204 0.1177 0.1087 0.137 0.082 0.076 0.0692 0.0633 0.0671 0.0652 398 0.1072 0.1047 0.0961 0.1223 0.0703 0.0648 0.0582 0.0525 0.0569 0.0554 400 0.0952 0.0929 0.0847 0.109 0.06 0.0549 0.0485 0.0432 0.0481 0.0468 402 0.084 0.0819 0.0743 0.0965 0.0508 0.0464 0.0402 0.0352 0.0404 0.0394 404 0.0737 0.0719 0.065 0.085 0.0428 0.0388 0.033 0.0283 0.0339 0.033 406 0.0644 0.0628 0.0567 0.0746 0.036 0.0325 0.027 0.0226 0.0284 0.0277 408 0.056 0.0547 0.0493 0.0653 0.0301 0.0269 0.0217 0.0177 0.0237 0.0231 410 0.0487 0.0476 0.043 0.0573 0.0253 0.0225 0.0177 0.0142 0.0202 0.0197 412 0.0417 0.0409 0.0372 0.0497 0.0209 0.0186 0.014 0.0106 0.0169 0.0164 414 0.0358 0.035 0.0322 0.0433 0.0172 0.0152 0.0112 0.0081 0.0143 0.014 416 0.0303 0.0298 0.0278 0.0374 0.0143 0.0125 0.0087 0.0062 0.0121 0.0119 418 0.0257 0.0253 0.0242 0.0326 0.0117 0.0104 0.0068 0.0044 0.0105 0.0103 420 0.0216 0.0214 0.021 0.0283 0.0096 0.0084 0.0053 0.0031 0.0092 0.0089 422 0.0182 0.018 0.018 0.0246 0.0079 0.007 0.0042 0.0021 0.0081 0.008 424 0.0153 0.0151 0.0159 0.0216 0.0065 0.0059 0.0033 0.0015 0.0072 0.0072 426 0.0126 0.0126 0.0139 0.0188 0.0052 0.0047 0.0023 0.0007 0.0065 0.0065 428 0.0104 0.0104 0.0122 0.0165 0.0042 0.004 0.0018 0.0003 0.0059 0.006 430 0.0085 0.0086 0.0108 0.0145 0.0034 0.0033 0.0013 0 0.0055 0.0057 432 0.0069 0.007 0.0095 0.0129 0.0027 0.0027 0.0008 0 0.0051 0.0052 434 0.0056 0.0059 0.0086 0.0116 0.0022 0.0023 0.0007 0 0.0049 0.0052 436 0.0045 0.0048 0.0078 0.0103 0.0017 0.002 0.0004 0 0.0047 0.0049 438 0.0036 0.0039 0.0072 0.0094 0.0015 0.0017 0.0003 0 0.0045 0.0049 440 0.0029 0.0029 0.0065 0.0085 0.0009 0.0013 0 0.0042 0.0046 442 0.0022 0.0024 0.0059 0.0077 0.0006 0.0011 0 0.0041 0.0044 444 0.0018 0.002 0.0056 0.007 0.0006 0.001 0 .00 0.004 0.0044 446 0.0014 0.0017 0.0053 0.0064 0.0005 0.0009 0 -0.001 0.0038 0.0044 448 0.0011 0.0015 0.005 0.006 0.0004 0.0008 0 -0.001 0.0038 0.0042 450 0.0009 0.0012 0.0048 0.0056 0.0003 0.0007 0 -0.001 0.0037 0.0042 Докторска дисертација Прилог   227 Табела 27П UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони о сифлоксацин=1:3 ([Gd3+]=0.0165 mmol/dm . [moxi]=0.0508 mmol/dm3 ) днос Gd3+-мок 3 Апсорбанција pH 3.634 4.12 21 7.024 7.829 4.742 5.204 5.601 6.059 6.541 6.9 λ (nm) 250 0.458 0.4589 0.4629 0.478 067 0.5149 0.5184 0.5234 0.5447 4 0.4872 0.5 252 0.4388 0 0.4 93 0.4 6 0.4 86 0.461 0.4 63 0.5 6 0.5 2 0.5 0.5 0.5 32 1 0 .4397 0.4461 0.4657 0.4785 0.5013 0.5115 0.5161 0.5211 0.5418 254 2 30 3 7 01 13 184 235 4 256 0.425 0.4265 0.4358 0.4606 0.4774 0.5044 0.5169 0.522 0.5268 0.5419 258 0.4168 0.4183 0.4281 0.4547 0.4731 0.5016 0.5146 0.5191 0.5235 0.5313 260 0.3986 0.4002 0.4102 0.4386 0.4595 0.4886 0.5031 0.5067 0.5104 0.5127 262 0.377 0.378 0.3889 0.4187 0.4423 0.4721 0.4883 0.4917 0.4955 0.4963 264 0.3645 0.3662 0.3773 0.4086 0.4349 0.4657 0.4834 0.4872 0.4913 0.4946 266 0.3706 0.3719 0.3843 0.4171 0.4458 0.4779 0.4967 0.5026 0.5071 0.5153 268 0.399 0.4012 0.4149 0.4501 0.4803 0.5162 0.5357 0.5436 0.5485 0.5622 270 0.4512 0.4535 0.4695 0.5077 0.5397 0.5805 0.6017 0.6113 0.6178 0.635 272 0.5261 0.5293 0.5483 0.5907 0.6258 0.6737 0.6966 0.7085 0.7155 0.7356 274 0.6235 0.6274 0.6508 0.6985 0.7367 0.7935 0.8184 0.8333 0.8417 0.8629 276 0.7429 0.7474 0.7763 0.8293 0.8718 0.9385 0.9661 0.9844 0.9933 1.016 278 0.8863 0.8906 0.925 0.9842 1.0287 1.1077 1.1352 1.1566 1.167 1.1908 280 1.0515 1.0574 1.0969 1.1629 1.2079 1.2974 1.3267 1.3495 1.3625 1.3801 282 1.2395 1.2476 1.2912 1.3602 1.4014 1.5019 1.5272 1.5485 1.5644 1.5708 284 1.4463 1.4513 1.4984 1.5643 1.6 1.699 1.7182 1.744 1.7566 1.7524 286 1.6495 1.6587 1.7014 1.7523 1.7728 1.8665 1.873 1.8935 1.9135 1.9037 288 1.8472 1.8526 1.8843 1.9086 1.8995 1.9706 1.9638 1.9821 2.0009 2.0028 290 2.0143 2.0162 2.0368 2.0196 .9693 2.0159 1.9886 2 2.0156 2.0365 292 2.1675 2.1643 2.1612 2.0947 1.9967 2.0002 1.9432 1.9449 1.9549 1.9786 294 2.2848 2.2697 2.2515 2.1348 1.9944 1.9411 1.8502 1.8295 1.6 2 1.8428 1.8317 296 2.3517 2.334 2.2972 2.1233 1.9311 1.8272 1.7023 62 1.6664 1.61 298 2.3612 2.3345 2.2642 2.0432 1.82 1.6766 1.5282 1.4681 1.4671 1.351 300 2.2393 2.232 2.1309 1.9025 1.6564 1.4951 1.3361 1.2681 1.261 1.1073 0 302 2.0332 2.0119 1.9091 1.6789 1.4509 1.2929 1.1475 1.0796 1.0715 .9055 304 1.7407 1.7243 1.6222 1.4185 1.231 1.0961 0.9732 0.9134 0.9053 0.7506 306 1.4264 1.4099 1.3267 1.1655 1.0221 0.9169 0.8221 0.7733 0.7676 0.6373 308 1.1476 1.1325 1.0697 0.9491 0.846 0.7686 0.6992 0.6626 0.659 0.5582 310 0.9285 0.9184 0.871 0.7849 0.7111 0.6567 0.6076 0.5804 0.5786 0.5065 312 0.7749 0.7671 0.7326 0.6701 0.6171 0.5788 0.5431 0.5239 0.5235 0.4752 314 0.6756 0.67 0.6435 0.5961 0.5565 0.5288 0.5021 0.4891 0.4901 0.4599 316 0.6143 0.6102 0.5898 0.5518 0.5202 0.4997 0.4781 0.4693 0.4715 0.4563 318 0.5828 0.5793 0 0.5621 0.5305 0.5019 0.4866 0.4682 0.4631 0.466 0.4619 320 0.5708 .5681 0.5535 0.5238 0.498 0.4859 0.4686 0.4662 0.4698 0.4751 322 0.5718 0.5691 0.5561 0.5283 0.5031 0.4936 0.4776 0.4772 0.4821 0.4948 324 0.5775 0.5753 0.564 0.5373 0.5132 0.5067 0.4914 0.4933 0.4982 0.5185 326 0.5833 0.5818 0.5713 0.5466 0.5242 0.5208 0.5067 0.5108 0.5164 0.5428 328 0.5862 0.5819 0.5769 0.5525 0.5323 0.5339 0.5204 0.5275 0.5329 0.5664 330 0.5842 0.5816 0.5769 0.5563 0.5387 0.5428 0.5296 0.5381 0.5477 0.5844 332 0.5822 0.5811 0.5771 0.5596 0.5434 0.5504 0.5398 0.55 0.5579 0.6022 334 0.5799 0.5789 0.5765 0.562 0.5496 0.5571 0.5497 0.5622 0.5689 0.6187 336 0.5783 0.5782 0.5765 0.5657 0.5554 0.5667 0.5602 0.5741 0.5816 0.6354 338 0.5736 0.575 0.5745 0.5687 0.5581 0.5749 0.569 .5844 0.5929 0.6488 340 0.5668 0.5679 0.5706 0.5641 0.5577 0.5765 0.572 0.588 0.5974 0.656 342 344 0.5564 0.5475 0.54 0.5586 81 0.54 0.5606 97 0.5572 0.5466 0.5526 0.5421 0.5709 0.5598 0.55 0.5682 73 0.57 0.5849 33 0.5948 0.5825 0.6533 0.6395 Докторска дисертација Прилог   228 346 0.5375 0.5392 0.5395 0.534 0.5282 0.5435 0.5402 0.5548 0.5636 0.6166 348 0.5335 0.5346 0.5331 0.5243 0.5154 0.5279 0.5212 0.5352 0.5425 0.5881 350 0.5317 0.5308 0.5283 0.5175 0.5064 0.5139 0.5054 0.516 0.5223 0.5583 352 0.5329 0.5316 0.5278 0.5147 0.5007 0.5048 0.4942 0.5019 0.5077 0.5326 354 0.5352 0.5341 0.5297 0.5145 0.498 0.4995 0.4883 0.4921 0.4961 0.5081 356 0.5393 0.5384 0.5329 0.5172 0.4992 0.4978 0.4852 0.4854 0.4886 0.4896 358 0.5414 0.5411 0.5354 0.5199 0.4995 0.497 0.4836 0.4798 0.483 0.4707 360 0.5435 0.5437 0.5371 0.5205 0.5002 0.4956 0.4817 0.475 0.4774 0.4543 362 0.5434 0.5426 0.5367 0.5212 0.4994 0.494 0.4796 0.4715 0.4717 0.4382 364 0.5413 0.5401 0.5342 0.5202 0.4974 0.4903 0.476 0.4647 0.4653 0.421 366 0.5354 0.5351 0.5288 0.514 0.4918 0.4834 0.4689 0.4557 0.4549 0.4019 368 0.5273 0.5269 0.5196 0.506 0.4834 0.4738 0.4603 0.4433 0.4425 0.3821 370 0.5162 0.5146 0.5079 0.4944 0.471 0.4608 0.4466 0.4287 0.4267 0.3608 372 0.5019 0.5 0.4924 0.479 0.4556 0.4443 0.43 0.4105 0.4072 0.3373 374 0.4853 0.484 0.4747 0.4615 0.4384 0.4263 0.4122 0.3908 0.3873 0.3138 376 0.4661 0.4639 0.4547 0.441 0.4182 0.404 0.3905 0.3685 0.3645 0.2897 378 0.444 0.4418 0.4325 0.4181 0.3948 0.3801 0.3663 0.3432 0.3396 0.2644 380 0.4213 0 0 0 -0.004 -0.003 -0 2 -0.003 -0 2 .4186 0.4084 0.3938 0.3701 0.3542 .3407 0.3182 0.3139 0.2401 382 0.3963 0.394 0.3821 0.3672 0.3445 0.3272 0.3145 0.2917 0.2873 0.2162 384 0.37 0.3677 0.3554 0.3397 0.3179 0.2997 0.2867 0.2638 0.2602 0.1923 386 0.3407 0.3384 0.3249 0.3093 0.2875 0.2687 0.2564 0.2348 0.2311 0.1688 388 0.3147 0.3123 0.2983 0.2818 0.2607 0.2413 0.2295 0.2083 0.2052 0.1476 390 0.2884 0.2861 0.2715 0.2543 0.2342 0.2142 0.2027 0.1828 0.1798 0.1278 392 .2638 0.2613 0.2464 0.229 0.2093 0.1891 0.1779 0.1591 0.1564 0.1102 394 0.2399 0.2372 0.2219 0.2044 0.1857 0.1651 0.1547 0.1369 0.1344 0.0938 396 0.2169 0.2144 0.1991 0.1813 0.1635 0.1429 0.1328 0.1164 0.1143 0.0792 398 0.1948 0.1923 0.1771 0.1595 0.1427 0.122 0.1126 0.0975 0.0959 0.0661 400 0.1744 0.1717 0.157 0.1398 0.1239 0.1039 0.0948 0.0813 0.0799 0.0546 402 0.1555 0.1531 0.1386 0.1216 0.1072 0.0876 0.079 0.0666 0.0653 0.0443 404 0.1382 0.1358 0.1218 0.1054 0.0922 0.0729 0.0654 0.0538 0.0529 0.0357 406 0.1222 0.1197 0.1063 0.0908 0.0788 0.0603 0.0533 0.043 0.0423 0.0283 408 0.1076 0.1049 0.0923 0.0778 0.0669 0.0494 0.0428 0.0336 0.0334 0.0217 410 0.0942 0.0922 0.0801 0.0661 0.0569 0.0403 0.0344 0.026 0.0259 0.0167 412 0.0822 0.0802 0.0689 0.056 0.0482 0.0322 0.027 0.0195 0.0198 0.0122 414 0.0716 0.0695 0.0588 0.0472 0.0405 0.0254 0.0209 0.0143 0.0145 0.0082 416 0.0617 0.0598 0.0499 0.0395 0.034 0.0199 0.0158 0.01 0.0102 0.0053 418 0.0534 0.0517 0.0424 0.0329 0.0287 0.0154 0.0119 0.0065 0.0068 0.003 420 0.0453 0.0438 0.0352 0.0267 0.0235 0.0113 0.0085 0.0038 0.004 0.0006 422 0.0387 0.0372 0.0292 0.0219 0.0192 0.0081 0.006 0.0016 0.0021 0 424 0.0326 0.0314 0.0241 0.0177 0.0162 0.0058 0.004 0 0.0001 -0.001 426 0.0273 0.0262 0.0193 0.014 0.0131 0.0035 0.002 -0.001 -0.001 -0.003 428 0.0228 0.0222 0.0152 0.0107 0.0106 0.0014 0.0007 -0.002 -0.002 -0.003 430 0.019 0.0183 0.0119 0.0083 0.0086 0.0004 0 -0.003 -0.003 432 0.0155 0.0152 0.0093 0.0056 0.007 0 -0.001 -0.003 -0.004 434 0.0127 0.0126 0.0069 0.004 0.0054 -0.001 -0.001 -0.004 -0.004 -0.005 436 0.0105 0.0103 0.0047 0.0024 0.004 -0.002 -0.002 -0.004 -0.004 -0.005 438 0.0084 0.0086 0.003 0.001 0.0031 -0.003 .00 -0.005 -0.004 -0.005 440 0.0069 0.0074 0.0022 0.0002 0.0027 -0.002 -0.005 -0.004 -0.005 442 0.0057 0.0062 0.0009 0 0.0019 -0.003 -0.002 -0.005 -0.004 -0.005 444 0.0045 0.0051 0 -0.001 0.0009 -0.004 -0.003 -0.005 -0.005 -0.005 446 0.0034 0.0041 0 -0.002 0.0003 -0.004 -0.003 -0.005 -0.005 -0.005 448 0.003 0.0036 -0.001 -0.002 0.0003 -0.004 -0.003 -0.005 -0.005 -0.005 450 0.0026 0.003 -0.001 .00 0 -0.004 -0.003 -0.005 -0.005 -0.005 Докторска дисертација Прилог   229 Табе 28П UV-VIS спектри раствора Gd3+-моксифлоксацина на различитим pH вредностима за концентрациони однос Gd3+-моксифлоксацин=2:1 ([Gd3+]=0.0715 mmo 0.0349 mmol/dm3 ) Апсорбанција ла l/dm3. [moxi]= pH 9 3.601 4.055 4.579 5.205 5.565 6.273 6.525 6.958 7.2 7.46 λ (nm) 250 0.3011 0.31 51 0.3506 0.3547 93 0.3216 0.3417 0.3473 0.3508 0.3504 0.34 252 0.2903 0.3091 0.3128 0.335 348 0.3478 0.3429 0.3493 0.3535 0 0.2 11 0.3 0.306 0.3 2 0.3 12 0.3 0.35 0.3 7 0.3 0.3 43 9 0.3426 0. 254 0.2852 0.3043 0.3093 0.3348 0.3422 0.3495 0.3492 0.3448 .3513 0.3545 256 8 004 33 4 503 45 528 5 258 0.2719 0.2913 0.2966 0.3249 0.3333 0.344 0.344 0.3403 0.3483 0.349 260 0.2574 0.2772 0.2816 0.3102 0.3195 0.3311 0.3311 0.3288 0.3385 0.3392 262 0.2447 0.2655 0.2686 0.298 0.3079 0.3201 0.3201 0.3186 0.3301 0.3321 264 0.2422 0.2642 0.2664 0.2968 0.307 0.3199 0.32 0.3188 0.3316 0.3351 266 0.2544 0.2774 0.2799 0.3117 0.3224 0.336 0.3362 0.3347 0.3488 0.3532 268 0.2829 0.307 0.3105 0.3449 0.3558 0.3706 0.371 0.369 0.3844 0.3888 270 0.3278 0.3529 0.3586 0.3965 0.4081 0.4252 0.4257 0 0.4231 0.4399 0.4434 272 0.3886 0.4151 0.4237 0.4668 0.479 0.4989 .4998 0.4961 0.515 0.5162 274 0.4657 0.4929 0.5059 0.5552 0.5682 0.5917 0.5933 0.5882 0.6091 0.6076 276 0.559 0.5867 0.6054 0.6619 0.6757 0.7032 0.7055 0.6987 0.7208 0.7149 278 0.6688 0.6971 0.7227 0.7877 0.8019 0.834 0.8365 0.8273 0.8497 0.837 280 0.7945 0.823 0.8567 0.9287 0.9435 0.9793 0.9824 0.97 0.9896 0.9672 282 0.9348 0.9619 1.0023 1.079 1.0918 1.1305 1.1343 1.1174 1.1332 1.0984 284 1.0796 1.1044 1.1485 1.2213 1.2299 1.2671 1.2697 1.2487 1.2567 1.21 286 1.221 1.2408 1.2841 1.3393 1.34 1.3697 1.3713 1.3446 1 1.3412 1.2873 288 1.3479 1.3615 1.3993 1.4268 1.4165 1.4325 1.4339 .3977 1.3735 1.3127 290 1.4622 1.4684 1.4975 1.4909 1.4649 1.4645 1.4634 1.4156 1.3621 1.2918 1 292 1.5541 1.553 1.57 1.5223 1.4801 1.4571 1.4544 1.3947 1.3102 .2229 294 1.6155 1.6053 1.6014 1.5045 1.446 1.4007 1.3948 1.3286 1.22 1.1153 296 1.6183 1.5962 1.5646 1.4198 1.3472 1.2812 1.2732 1.2076 1.0942 0.9819 298 1.5475 1.5151 1.4547 1 1.2733 1.1933 1.1146 1.1053 1.0493 0.9506 0.8432 300 1.3942 1.3568 .2804 1.0877 1.0095 0.9288 0.9201 0.8773 0.8048 0 0.714 302 1.1893 1.1536 1.0732 0.8959 0.8272 0.755 0.7479 0.7178 .6723 0.6017 304 0.9707 0.9421 0.8703 0.7239 0.6691 0.6109 0.6057 0.5861 0.5607 0.5095 306 0.7782 0.7585 0.6997 0.5881 0.547 0.5036 0.4996 0.4863 0.4741 0.438 308 0.6284 0.6167 0.5717 0.4909 0.4606 0.4295 0.4265 0.4168 0.4106 0.3857 310 0.5232 0.5177 0.4841 0.4261 0.4038 0.3815 0.3793 0.3709 0.3673 0.3502 312 0.4542 0.4529 0.4278 0.3856 0.3686 0.3522 0.3505 0.3426 0.3396 0.3279 314 0.4127 0.4136 0.3949 0.3625 0.3488 0.3361 0.3346 0.3268 0.3238 0.3157 316 0.3912 0.3936 0.379 0.3525 0.3403 0.33 0.3287 0.3205 0.3171 0.3117 318 0.3838 0.3865 0.375 0.3519 0.3407 0.3317 0.3304 0.3217 0.3177 0.3144 320 0.3842 0.3871 0.378 0.3572 0.3463 0.3383 0.3371 0.328 0.3237 0.3215 322 0.3886 0.3916 0.3844 0.3654 0.3547 0.3477 0.3468 0.3372 0.3331 0.3323 324 0.3927 0.3952 0.39 0.3728 0.3628 0.357 0.3557 0.3463 0.3433 0.3437 326 0.3943 0.3969 0.3935 0.3784 0.3688 0.3643 0.3634 0.354 0.3521 0.3544 328 0.3923 0.3953 0.3938 0.3815 0.3726 0.3695 0.3686 0.3598 0.3586 0.3626 330 0.3916 0.3946 0.3953 0 0.386 0.3776 0.3764 0.3759 0.3659 0.3655 0.3704 332 0.3905 0.3936 .3969 0.3906 0.3834 0.3832 0.3827 0.3729 0.3724 0.3775 334 0.3888 0.3931 0.3983 0.3952 0.3887 0.3902 0.3896 0.3803 0.3794 0.3855 336 0.3857 0.3902 0.3975 0.3967 0.3914 0.3943 0.3941 0.3846 0.3847 0.3911 338 0.3811 0.3853 0.3936 0.3947 0.3902 0.3944 0.3939 0.3854 0.3864 0.3935 340 0.374 0.3782 0.3861 0.3882 0.3834 0.3881 0.3878 0.3797 0.3815 0.3896 342 344 0.3673 0.3614 0.3712 0.3651 0.3779 0.3709 0.3792 0.3698 0.36 0.374 44 0.36 0.3788 81 0.3784 0.368 0.3703 0.3595 0.36 0.3727 05 0.38 0.3671 Докторска дисертација Прилог   230 346 0.3591 0.3623 0.3672 0.3637 0.3579 0.3606 0.3599 0.3513 0.3504 0.3539 348 0.3584 0.3614 0.3652 0.3605 0.3541 0.3557 0.3547 0.3455 0.3426 0.3424 350 0.3599 0.3629 0.3661 0.3603 0.3534 0.3541 0.3535 0.3437 0.3377 0.3335 352 0.3616 0.3649 0.3677 0.3618 0.3548 0.3549 0.354 0.3438 0.3354 0 0 0 0 -0.002 -0 1 -0 1 -0 1 -0 1 -0.001 -0.001 -0.001 -0.001 -0.001 -0.001 -0.002 -0.001 -0.001 -0.001 -0.002 -0.001 -0.001 -0.001 -0.002 .3267 354 0.3642 0.3675 0.3701 0.3646 0.3577 0.3573 0.3563 0.3457 0.3354 0.3222 356 0.3658 0.3698 0.3722 0.3671 0.3602 0.3595 0.3588 0.3479 0.336 0.3184 358 0.3672 0.3712 0.3735 0.3692 0.3622 0.3609 0.3605 0.3493 0.3362 0.3153 360 0.3661 0.3703 0.3721 0.3685 0.362 0.36 0.3597 0.349 0.3352 0.3109 362 0.3639 0.3684 0.3694 0.3663 0.3601 0.3577 0.3573 0.3465 0.3322 0.3053 364 0.3593 0.3637 0.3643 0.3617 0.3554 0.3524 0.3519 0.3417 0.327 0.298 366 0.3524 0.3574 0.3568 0.3539 0.3482 0.3444 0.3438 0.3342 0.3197 0.2892 368 0.3436 0.3481 0.3467 0.3436 0.3378 0.3332 0.3327 0.3235 0.3094 0.2778 370 0.3328 0.3377 0.3348 0.3309 0.3254 .3197 0.3192 0.3104 0.2972 0.2653 372 0.3198 0.3246 0.3204 0.3158 0.3101 0.3034 0.3029 0.2948 0.2826 0.2511 374 0.3056 0.3104 0.3048 0.2986 0.2929 0.2851 0.2844 0.2773 0.2662 0.2358 376 0.2896 0.2947 0.2869 0.2801 0.2743 0.2651 0.2644 0.2582 0.2478 0.2193 378 0.2733 0.2776 0.269 0.2601 0.2544 0.2439 0.2432 0.2379 0.229 0.2024 380 0.2553 0.2595 0.249 0.2392 0.2333 0.2214 0.2208 0.2164 0.2088 0.1847 382 0.2376 0.2412 0.23 0.2182 0.2122 0.1996 0.1985 0.1953 0.1887 0.1674 384 0.2167 0.2205 0.2075 0.1944 0.1884 0.1749 0.1737 0.1714 0.1665 0.1479 386 0.1986 0.2021 0.188 0.1736 0.1676 0.1534 0.1522 0.1505 0.147 0.1313 388 0.181 0.1843 0.1696 0.154 0.1478 0.1333 0.132 0.1308 0.1284 0.1157 390 0.1641 0.1672 0.1517 0.1352 0.1291 0.1143 0.113 0.1124 0.1109 0.1009 392 0.1478 0.1507 0.135 0.1178 0.1117 0.0969 0.0955 0.0954 0.0947 0.0875 394 0.1325 0.1352 0.1194 0.1017 0.0957 0.0811 0.0798 0.08 0.08 0.0751 396 0.1181 0.1208 0.1049 0.0873 0.0814 0.0673 0.0658 0.0664 0.0669 0.0641 398 0.1049 0.1074 0.0919 0.0744 0.0687 0.0551 0.0536 0.0545 0.0554 0.0544 400 0.0926 0.0949 0.0801 0.0628 0.0574 0.0445 0.0431 0.0441 0.0452 0.0458 402 0.0815 0.0837 0.0694 0.0527 0.0477 0.0355 0.0341 0.0353 0.0367 0.0386 404 0.0712 0.0736 0.0599 0.0439 0.0393 0.0282 0.0266 .0279 .0294 0.0325 406 0.0621 0.0645 0.0515 0.0364 0.0322 0.0219 0.0204 0.0219 0.0234 0.0272 408 0.0536 0.0559 0.0438 0.0298 0.026 0.0167 0.0151 0.0166 0.0182 0.0227 410 0.0463 0.0487 0.0373 0.0243 0.0209 0.0126 0.0112 0.0126 0.0141 0.0191 412 0.0397 0.0423 0.0318 0.0198 0.0168 0.0093 0.0078 0.0093 0.0107 0.0163 414 0.0336 0.0363 0.0265 0.0158 0.0132 0.0067 0.0052 0.0068 0.008 0.0138 416 0.0284 0.0312 0.0223 0.0127 0.0103 0.0046 0.0032 0.0048 0.0061 0.0118 418 0.0236 0.0266 0.0184 0.0099 0.0078 0.0029 0.0017 0.0031 0.0043 0.0102 420 0.0198 0.0227 0.0152 0.0077 0.0062 0.0019 0.0005 0.002 0.0032 0.0092 422 0.016 0.0193 0.0124 0.0059 0.0044 0.0008 0 0.0011 0.0021 0.0081 424 0.0132 0.0164 0.0101 0.0044 0.0033 0.0001 -0.001 0.0003 0.0013 0.0075 426 0.0107 0.0139 0.0081 0.0032 0.0023 0 -0.001 0 0.001 0.007 428 0.0084 0.0117 0.0064 0.0022 0.0015 0 -0.001 0 0.0005 0.0065 430 0.0066 0.0099 0.0051 0.0013 0.0008 -0.001 -0.002 0 0.0001 0.0061 432 0.0053 0.0085 0.0041 0.0009 0.0006 -0.001 0 0.0001 0.0059 434 0.0039 0.0073 0.0031 0.0003 0.0001 -0.001 -0.002 0 0 0.0057 436 0.0029 0.0061 0.0023 0 0 .00 -0.002 .00 0 0.0055 438 0.0019 0.005 0.0016 0 0 .00 -0.002 .00 0 0.0054 440 0.001 0.0042 0.001 0 -0.001 -0.001 -0.002 0 0.0051 442 0.0004 0.0036 0.0006 -0.001 -0.001 -0.001 -0.002 0 0.0053 444 0 0.003 0.0002 -0.001 -0.001 -0.001 -0.002 0 0.0051 446 0 0.0024 0 -0.001 0 0.005 448 0 0.0022 0 -0.001 0 0.0051 450 0 0.0017 0 -0.001 0 0.0049 Докторска дисертација Прилог   231 М сени р л 3+ Слика 29П ESI MS спектар 10.0 × 10- m3 Gd3+ на pH 1.530 а спект и хидро изе Gd јона 3 mol/d Слика 30П ESI MS спектар 1.0 mmol/dm3 Gd3+, pH 2.450 Докторска дисертација Прилог   232 Слика 31П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+, pH 2.781 Слика 32П ESI MS спектар 0.1 mmol/dm3 Gd3+, pH 3.447 Докторска дисертација Прилог   233 Слика 33П ESI MS спектар 0.1 mmol/dm3 Gd3+, pH 5.497 Слика 34П E 3 SI MS спектар 2.5 × 10-5 mol/dm3 Gd3+, pH 6.04 Докторска дисертација Прилог   234 Слика 35П 3 3+ESI MS спектар 0.1 mmol/dm Gd , pH 6.414 Слика 36П E SI MS спектар 0.025 mmol/dm3 Gd3+, pH 6.654 Докторска дисертација Прилог   235 Слика 37П ESI MS спектар 0.025 mmol/dm3 Gd3+, pH 6.995 Слика 38П ESI MS спектар 0.025 mmol/dm3 Gd3+, pH 7.551 Докторска дисертација Прилог   236 Масени спектри комплексирања Gd3+ јона и офлоксацина Слика 39П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 1.0 mmol/dm3 oflo, pH 4.552 Слика 40П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 0.5 mmol/dm3 oflo, pH 4.662 Докторска дисертација Прилог   237 Слика 41П ESI MS спектар 0.5 mmol/ 0 mmol/dm3 oflo, pH 5.911 dm3 Gd3+ + 1. Слика 42П ESI MS спектар 0.5 mmol/dm3 Gd3+ + 2.0 mmol/dm3 oflo, pH 6.440 Докторска дисертација Прилог   238 Слика 43П -4 3 3+ -4 3 ESI MS спектар 1x10 mol/dm Gd + 1x10 mol/dm oflo, pH 5.11 (70V) Слика 44П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 3x10-4 mol/dm3 oflo, pH 4.88 (70V) Докторска дисертација Прилог   239 Слика 45П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 3x10-4 mol/dm3 oflo, pH 4.73 (30V) Слика 46П ESI MS спектар 1x10-4 mol/dm3 Gd3+ + 3x10-4 mol/dm3 oflo, pH 4.37 (30V) Докторска дисертација Биографија Б И О Г Р А Ф И Ј А мр Иван Т. ЛАЗАРЕВИЋ мр Иван Т. ЛАЗАРЕВИЋ рођен је 11.06.1969. године у Крушевцу. Основну школу завршио је у Крушевцу, Војну гимназију у Загребу (средња оцена 5.00), а Војну академију смер АБХО у Београду и Крушевцу (средња оцена 9.94). Запослио се у Школском Центру АБХО у Крушевцу 1992. године. Магистрирао је на ПМФ-у у Крагујевцу 2000. године (средња оцена 9.00), одбранивши магистарску тезу под насловом „Утицај површински активних супстанци на прототропне и равнотеже комплексирања у раствору алуминијум(III)-јона и офлоксацина“. Активно се бавио научним истраживањима у подручју неорганске токсикологије, неорганске хемије и хемије водених раствора. Уписао је 2007. године Докторске студије на ПМФ-у у Крагујевцу (студијски програм Неорганска хемија). Положио је све наставним планом предвиђене испите (на студијској групи Хемија, модул Неорганска хемија) са средњом оценом 9.00. Објавио већи број радова, чланака, скрипти, лекција и Правила и Упутстава из стручних области АБХО. На листи је експерата и предавача међународне Организације за забрану хемијског оружја (OPCW). Похађао више стручних курсева у земљи и иностранству. Тренутно на дужности заменика команданта Центра за усавршавање кадрова АБХО Војске Србије у Крушевцу. Говори енглески језик. Ожењен, отац двоје деце.   241 Докторска дисертација Публиковани радови   243 РАДОВИ ПРОИСТЕКЛИ ИЗ ДОКТОРСКЕ ДИСЕРТАЦИЈЕ Из докторске дисертације, публиковано је три научна рада и четири научна саопштења. Научни радови: 1. P. Đurđević, M. Jelikić-Stankov, I. Lazarević, The effect of surfactancts on equilibria in aluminum(III) ion+ofloxacin solutions and adsorption of ofloxacin on aluminum-oxide, Bull. Chem. Soc. Jpn., 74, 1261-1271, 2001. IF=1,376; M21. 2. P. Đurđević, R. Jelić, Lj. Joksović, I. Lazarević, M. Jelkić-Stankov, Study of solution equilibria between gadolinium(III) ion and moxifloxacin, Acta Chim. Slov. 57, 386–397, 2010. IF=1,066; M23. 3. M. Cvijović, V. Kilibarda, M. Jelikić-Stankov, I. Lazarević, I. Jakovljević, Lj. Joksović, P. Đurđević, ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions J. Braz. Chem. Soc., Vol. 00, No. 00, 1-11, 2012. IF=1,444; M22. Научна саопштења: 1. М. Јеликић-Станков, И. Лазаревић, П. Ђурђевић, Утицај површински активних материја на адсорпцију офлоксацина на γ-алуминијум оксиду, 43. Саветовање Српског хемијског друштва, Београд, FH1, 121-124, 24 и 25. јануар 2005. 2. A. Ćirić, I. Lazarević, R. Jelić, M. Jelikić-Stankov, P. Đurđević, Speciation on aluminium(III)-fluoroquionolone family members solutions, 15 Euroanalysis, Innsbruck, Austria, P015-B2, 6-10 September 2009. 3. И. Ж. Јаковљевић, И.Лазаревић, Љ. Јоксовић, А. Ћирић, Р. Јелић, П. Ђурђевић, Равнотеже комплексирања Gd(III)-јона са неким флуорохинолонима, 49. Саветовање Српског хемијског друштва, AH04-O, 29-32, Крагујевац, 13-14. мај 2011. 4. И. Т. Лазаревић, И. Јаковљевић, А. Ћирић, М.Јеликић-Станков, Р. Јелић П. Ђурђевић, Рачунарско моделирање хумане плазме, 49. Саветовање Српског хемијског друштва, Крагујевац, AH10-P, 46-49, 13-14. мај 2011. Публиковани радови из докторске дисертације, презентовани су на наредним странама. 386 Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin Scientific paper Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin Predrag Djurdjevi},1 Ratomir Jeli},2,* Ljubinka Joksovi},1 Ivan Lazarevi},3 and Milena Jeliki}-Stankov4 1 Faculty of Science, Department of Chemistry, University of Kragujevac, p.o.box 60, 34000 Kragujevac, Serbia 2 Medical Faculty, University of Kragujevac, S. Markovi}a 69, 34000 Kragujevac, Serbia, 3 CBRN Training Center of Serbian Army, MP 6910,37000 Kru{evac, Serbia 4 Faculty of Pharmacy, University of Belgrade, 11000 Belgrade, Serbia * Corresponding author: E-mail: rjelic@kg.ac.rs; Tel.: +381 34 306 800 ext. 226; Fax: +381 34 306 800 Received: 12-10-2009 Abstract The complex formation equilibria between gadolinium(III) ion and moxifloxacin (MOXI) were studied in aqueous so- lutions. The investigations were performed by glass electrode potentiometric (ionic medium: 0.1 mol dm–3 LiCl, 298 K) and UV spectrophotometric measurements. In the concentration range 0.5 ≤ [Gd3+] ≤ 1.0; 1.0 ≤ [MOXI] ≤ 2.0 mmol dm–3 ([MOXI]/[Gd] = 1 : 1 to 5 : 1) and pH between 2.5 and 9.0, gadolinium(III) and moxifloxacin form the complexes of the composition: Gd(HMOXI)3+, Gd(HMOXI)2 3+, Gd(HMOXI)3 3+, Gd(HMOXI)2MOXI 2+, Gd(HMOXI)(MOXI)2 +, Gd(MOXI)3. The stability constants of the complexes were calculated with the aid of Hyperquad2006 suite of programs, taking into account the hydrolysis of Gd3+ ion and protonation of moxifloxacin anion. The possible structure of the com- plexes, in solution, and their formation mechanism is suggested. The effect of moxifloxacin, and for comparison purpo- se, DTPA on gadolinium(III) plasma speciation was evaluated by computer simulation. Keywords: Gadolinium; moxifloxacin; complex formation; solution equilibrium, speciation 1. Introduction Quinolones are synthetic antibacterial agents widely used in clinical practice for urinary and respiratory infec- tion treatments.1 Moxifloxacin (MOXI) (1-cyclopropyl-7- [2,8-diazobicyclo(4.3.0)nonane]-6-fluoro-8-methoxy-1,4- dihydro-4-oxo-3-quinolone carboxylic acid) (Fig. 1) is a new 8-methoxyquinolone derivate of fluoroquinolones with enhanced activity against Gram-positive bacteria while preserving high activity against Gram-negative bac- teria.2 Fluoroquinolones suppress cell growth by inhibiting activity of bacterial DNA gyrase, an essential bacterial enzyme that maintains superhelical twists in DNA.3 Some evidence suggests that these drugs interact directly with DNA, blocking the activity of DNA-gyrase repair enzy- mes.4 Recent studies indicate an important role of metal ions in the mechanism of action of these drugs.5 In the first place, the activity of quinolones is reduced in the presence of certain metal ions by the formation of spa- ringly soluble metal complexes.6 On the other hand, it was proposed that metal ions (especially magnesium) are involved in the mechanism of action of theseFig. 1. Structure of moxifloxacin 387Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin drugs.7–10 Structural studies have also been performed on magnesium – norfloxacin11, magnesium – ciprofloxa- cin12–15 and magnesium – ofloxacin and levofloxacin complexes.16 Metal ions may change the bio-availability of quinolones by changing their solubility or their lipop- hilicity. The metal complexes of quinolones may have new biological properties in terms of altered minimal in- hibitory concentration, antibacterial spectrum, etc.17 Re- cently, three novel gadolinium complexes of fluoroqui- nolone, Gd(L)3 · 6H2O {L = Norfloxacin (NFLX), Oflo- xacin (OFLX) and Ciprofloxacin (CPLX), respectively}, have been synthesized and inhibitory effect of the li- gands and complexes on leukemia HL-60 cell line has been measured by using MTT (Methyl-Thiazol-Tetrozo- lium) assay method and liver cancer BEL-7402 cell line measured by SRB (Sulphurhodamin B) method.18 The results indicate that the complex Gd(OFLX)3 · 6H2O has strong inhibitory effect on BEL-7402 cell line and Gd(CPLX)3 · 6H2O has strong inhibitory effect on HL-60 and BEL-7402 cell lines. Gadolinium based chelates are widely used as mag- netic resonance, or CT scan imaging agents.19,20 These chelates may interact with quinolones upon concomitant intake (patients already on antibacterial therapy) or relea- se free gadolinium ion in plasma which may interact with plasma or other ligands (ie. drugs). On the other hand qui- nolone chelates of gadolinium may be candidates for ima- ging agents. Therefore, the aim of the present paper is to quanti- tatively examine the equilibria in moxifloxacin solution in the presence of gadolinium ion to gain better understan- ding of the identity, stability and speciation in gadolinium and fluoroquinolone family member, moxifloxacin, aque- ous solutions. The speciation model derived from such fundamental study should help in pharmacokinetic studies of quinolones in the presence Gd-containing agents and also in the study of toxic effects of Gd-ion upon concomi- tant intake of Gd-containing compounds and fluoroquino- lones. In this work we studied the complex formation bet- ween gadolinium(III) ion and moxifloxacin by using po- tentiometric and UV spectrophotometric measurements. 2. Experimental 2. 1. Reagents and Analysis All reagents were of analytical grade purity and were used without further purification. Doubly distilled water was used for preparation of all solutions. Calibra- ted class A volumetric glassware (relative error in volu- me measurements less than 1%) was used for analytical work. All mass measurements were made on an electro- nic balance Ohaus model DV215CD (precision: ± 0.01 mg). The stock solution of gadolinium(III) chloride was prepared by dissolving Gd2O3, (p.a., Merck) in HCl (“Suprapure”, Merck) and standardized by complexome- tric titrations using EDTA. The appropriate amount of HCl was added into a stock solution to avoid initial hydrolysis of Gd3+ ion. The excess HCl concentration in the gadolinium chloride stock solution was determined potentiometrically using Gran’s method, ie., by plotting (V0 + Vb) · 10 E/Q against Vb · V0 is initial volume of the ti- trated solution, Vb is a volume of added strong base (NaOH), E is a measured emf of the cell and Q is a slope of the glass electrode response. A straight line so obtai- ned, intersects Vb axis at point which is equal to Ve (equi- valence volume). The concentration of gadolinium stock solution was 0.0275 mol/dm3 and HCl, 0.0472 mol dm–3 with relative uncertainty better than 1%, as calculated by error propagation formulae. The constancy of the total proton concentration in GdCl3 solution with time was considered as a criterion for the absence of initial Gd3+ hydrolysis and was periodically checked by titration against standard NaOH before each series of measure- ments. Moxifloxacin hydrochloride, (declared purity > 99%), yellow powder, Mr = 437.9, was obtained from Ba- yerPharma AG (Germany). The standard solution of mo- xifloxacin (5.35 mmol dm–3) was prepared by direct weig- hing of the standard substance. The standard solution of HCl was added and its concentration was determined by Gran’s method as 6.35 mmol dm–3. A sodium hydroxide solution was prepared from concentrated volumetric solutions (p.a., Merck, FRG), of nominal concentration 1 mol dm–3 (maximum declared er- ror less than 2%) by dilution with freshly boiled doubly distilled water, followed by cooling under a constant flow of purified nitrogen. The alkali concentration was checked by titration against potassium hydrogen phthalate. The prepared titrant had a concentration 0.100 mol dm–3. A hydrochloric acid solution was made from HCl, (“Suprapure”, Merck) and standardized against tris- (hydroxymethyl)aminomethane. The final concentration was 0.104 mol dm–3. A lithium chloride solution was prepared from LiCl, (p.a., Merck), by dissolving the re-crystallized salt in twi- ce-deionized water. The concentration of this solution was determined by evaporation of a known volume of solution to dryness at 423 K and weighing the residue. Nitrogen gas, used for stirring solutions and provi- ding an inert atmosphere during the titrations, was puri- fied by passing it through 10% NaOH then 10% H2SO4, alkaline solution of pyrogallol, 0.1 mol dm–3 solution of KCl and finally distilled water. 2. 2. Apparatus and Procedure Potentiometric titrations were carried out in a doub- le-walled glass vessel, thermostatted at 298 K. Measure- ments were made on a Tacussel Isis 20000 pH meter (pre- cision ± 0.1 mV or ± 0.002 pH units) equipped with a Ra- 388 Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin diometer combined electrode. A Metrohm Dosimat model 665 automatic burette with anti-diffusion tip, was used for delivery of the titrant. The nominal volume of the burette was 5.00 mL. The burette was calibrated in three points. Thus the calculated error in volume was less than ± 10 µL and declared resolution was ± 5 µL. The ionic strength of all test solutions was adjusted to 0.1 mol dm–3 with lit- hium chloride. All measurements were performed under a nitrogen atmosphere. To reduce the concentration of the hydrogen ion, the alkali was added stepwise from an autoburette in small aliquots (0.005–0.01 cm3). The potential was moni- tored after each addition of titrant. The titration protocol was chosen in such a way that the hydrolysis and comple- xation reactions would proceed in the conditions as close to true equilibrium as possible.21 Usually stable potential readings were obtained in 3–5 min after addition of the ti- trant at the beginning of the titration (pH < 3) and in 5–10 min at pH values higher than 3. Potential of the glass electrode is given by the expression: E = E0 + Q log h + Ej where h is the concentration of free proton, E0 is a con- stant which include standard potential of the glass elec- trode, Q is the slope of the glass electrode response and Ej is liquid junction potential. The parameters, E0, Q and Ej were determined by strong acid – strong base titration to check the system suitability. During the titrations of the test solutions the E0 was determined using the data in the acidic region where no hydrolysis or complexation ta- kes place (so that h is equal to the analytical concentra- tion of proton), by plotting E – Q log h against h and ex- trapolating the straight line so obtained to h = 0. The free proton concentration was then calculated through the equation: log h = (E – E0 – Ej)/Q which was applied to the whole titration curve. All titrations were carried in dupli- cate. The agreement between duplicate titration was bet- ter than 1%. The water autoprotolysis constant was taken as pKw = 13.78 ± 0.02. Spectral measurements were made on double beam UV–Vis spectrophotometer model Lambda 35 (Perkin Elmer, U.S.A.). Operational parameters were: scan speed, 2 nm/s, slit width, 0.3 nm, photometric sensitivity, 0.2 abs. units. Matching pair of 1 cm quartz cuvettes was used for measuring the spectra. Spectral measurements were made on solutions in which the concentration of ga- dolinium and moxifloxacin were constant (CGd = 0.072, 0.033 and 0.017 mmol dm–3, CMOXI = 0.051 and 0.035 mmol dm–3) while pH was varied between 3.0 and 9.0 (10 solutions). The pH of the test solutions was measured with glass-calomel electrode couple, which was calibra- ted as a hydrogen concentration probe according to pro- cedure of Irving et al.22 The pH of each test solution was checked daily, during one week. The stable values, within 0.01 pH and 0.004 absorbance units, were attained after 1 h and remained stable during couple of days. Spectra of the test solutions were recorded in 250–450 nm wave- length interval. 2. 3. Data Treatment The species formed in the studied systems were cha- racterized by the general equilibrium: p Gd + q H + r MOXI = GdpHq(MOXI)r (1) and the corresponding constants are given by: formula (2) where MOXI is the deprotonated molecule of the ligand. Fully protonated moxifloxacin is denoted as H2MOXI +. In this study, the convention has been adopted whe- reby a complex containing a metal ion, M, proton, H and ligand L, takes the general formula MpHqLr, where p, q and r are the stoichiometric indices of the components in the complex. A negative values for q refers to proton removal or hydoxide ion addition during formation of the complex. Thermodynamically these two processes are equivalent and cannot be distinguished potentiometrically. The equili- brium constant for the formation of this complex from its components is then designated by the symbol βp,q,r. For convenience the species MpHqLr is denoted by the three stoichiometric coefficients (p,q,r) given in the order M, H, L. For simplicity, the charges of these species are omitted. Three kinds of equilibria should be considered in the present study: (a) protonation of moxifloxacin anion; (b) hydrolysis of Gd3+ ion; and (c) general three component equilibria, which include the case q = 0, i.e. the formation of pure binary complexes of Gd3+. The overall protonation constants of moxifloxacin anion and stability constants of hydrolytic complexes of Gd3+ ion were determined in se- parate experiments. Thus, in evaluation of three compo- nent equilibria (c), the binary models (a) and (b) were considered as known. The concentration stability con- stants of the complexes, βp,q,r were calculated with the aid of the suite of computer programs Hyperquad2006.23 In Hyperquad calculations the identity and stability of com- plexes which give the best fit to the experimental data, we- re determined by minimizing the objective function, U: Formula (3) where wni represents a statistical weight assigned to i th re- sidual at nth point of titration curve, and Yni o and Yni c refer to observed and calculated either potential or absorbance (o = observed, c = calculated) assuming the specific mo- del and trial constants, respectively. N is the total number of experimental points. Quality of the fit was judged by usual statistical parameters. The weight wni defined as re- ciprocal of the variance in the residual Yni o– Yni c is calcula- ted using an error propagation formula: Formula (4) 389Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin where the summation extends over all parameters, k, for which errors, σk, are specified and include titrant volume error (± 2 µL), error in emf readings (± 0.2 mV) and error in absorbance readings (± 0.002 abs units). The standard deviations of the parameters being refined are calculated using the formula: formula (5) where Gii is inverted Hessian used in the Gauss Newton procedure to minimize U. The standard deviations in resi- duals, s, was calculated as: formula (6) where e is a vector in residuals either potential or absor- bance. Acceptance of the model assumed minimum value of U, random distribution of residuals, standard deviation of parameters (stability constants) less than 30% of the parameter value, standard deviation in residuals less than 3.0 and Pearson’s test less than 12.6. The spectrophotometric data were evaluated with the aid of the program pHAb200624 (which also belongs to Hyperquad family but possesses some additional and improved features) and the program Hyperquad which is capable to treat spectral data. Potentiometric and spectro- metric data were made consistent by concomitantly eva- luating both kind of data with the aid of Hyperquad 2006 suite of programs using the best model obtained in separa- te treatment. 3. Results and Discussion In order to study speciation in three-component sys- tem Gd3+ – H+ (or OH–) – moxifloxacin, it is necessary first to characterize the binary equilibria, i.e. hydrolysis of gadolinium(III) ion and protonation of moxifloxacin an- ion, under exactly the same experimental conditions as for complexation study. 3. 1. Hydrolysis of Gadolinium(III) Iion The emf data of the hydrolysis of 1.0–5.0 mmol dm–3 Gd3+ ion in a 0.1 mol dm–3 LiCl medium are presen- ted in Fig. 2 as the dependence of the hydroxide number of Gd3+ on the free hydrogen ion concentration, –lpg h (pH). The hydroxide number ZGd denotes an average num- ber of hydroxide ions reacted per Gd3+ ion and was calcu- lated from the analytical concentration of hydrogen ions, H+, the measured free hydrogen ion concentration, h, and the total concentration of the Gd3+ ion, CGd, according to expression: formula (7) Fig. 2 shows that in LiCl medium the hydrolytic cur- ves are superimposed for the different total gadolinium concentrations thus indicating the formation of mononuc- lear complexes. The maximum value of the hydroxide num- ber reached before the precipitation occured, was between 0.08 and 0.42 depended on gadolinium concentration. The onset of precipitation was indicated by unstable potential readings, steep rise of formation curve and visually, as ap- pearance of slight opacity of solution. At each total concen- tration of the Gd3+ ions, hydrolysis started at about pH 5. The stability and composition of the complexes for- med were determined on the basis of the assumption that the Gd3+ ion interacts with water molecules and forms one or more hydrolytic complexes of the general formula Gdp(OH)q (3p–q)+ according to reaction: pGd3+ + qH2O = Gdp(OH)q (3p–q)+ + qH+ (8) where the amount of H+ produced is equivalent to the quantity of hydroxide ions bound to the Gd3+ ion. The overall formation constants, βp,q can be defined as: βp,q = Cp,q [Gd3+]–p [H+]+q (9) where Cp,q denotes the equilibrium concentration of the (p,q) complex and [Gd3+] is the free concentration of Gd3+ ion. The general formula Gdp(OH)q (3p–q)+ is also under- stood to include an unknown amount of H2O as solvent and possibly some anions of the medium. In reaction (8), the hydration of individual ions and complex formation of the Gd3+ ion with chloride ions are omitted. The concentration of both chloride ions and wa- ter molecules is much higher than the concentration of the Gd3+ ion; therefore, it is not possible to determine the changes in concentration of the chloride ions and water molecules. In order to avoid the complex formation effect, the concentration of the medium anion was kept constant (0.1 mol dm–3) and much higher than that of the Gd3+ ion. Also, since changes in the mean activity coefficients of Fig. 2. Hydrolysis of Gd3+ ion in a 0.1 mol dm–3 LiCl medium, at 298 K, where mM denotes mmol dm–3. Points are experimental da- ta, while the line has been calculated from the composition and sta- bility of the complexes. 390 Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin the (p,q) pairs and βp,q values can not be simultaneously determined, the constant ionic medium approach25 was used to keep mean activity coefficients constant. The composition of the hydrolytic complexes and their stability constants were determined with the aid of program Hyperquad2006.The calculation indicates the for- mation of only mononuclear complex Gd(OH)2+ in the pH range 5.0 to 7.5. The calculated value of the stability con- stant (–log β1,–1) for the complex Gd(OH)2+ is 7.96 ± 0.01. This result compares well with literature data (Table 1). is shown in Fig. 3. Distribution of gadolinium has been calculated by the program Hyss2006.30 The formation of the complex Gd(OH)2+ started at pH 5.7, and with increa- sing pH, the concentration of this complex increases. The highest concentration of this complex is at pH 7.0. Further increase in pH leads to onset of insoluble Gd(OH)3 whose concentration sharply increases upon increasing pH. We did not detect the formation of any polynuclear hydrolytic species, though scarce literature data indicate the forma- tion of (2,-2) and (3,-4) species. Fig. 3. The distribution of Gd3+ hydrolytic species in 0.1 mol dm–3 LiCl ionic medium at 298 K. CGd = 1.00 mmol dm –3 . Table 1. Review of mononuclear hydrolytic species of gadolinium(III) ion in aqueous solutions at 298 K and various ionic media. Species -log βp,q Ionic medium Reference (1,-1) 7.87 ± 0.03 Nitrate, 0.5 M 26 8.20 ± 0.01 Perchlorate, 3 M 27 7.3 ± 0.3 Perchlorate, 1 M 28 7.83 ± 0.05 Perchlorate, 0 29 7.96 ± 0.01 Chloride, 0.1 M this work (1,-2) 13.04 ± 0.03 Nitrate, 0.5 M 26 14.6 ± 0.5 Perchlorate, 1M 28 (1,-3), solid, log Ksp 19.32 ± 0.03 Nitrate, 0.5 M 26 17.0 ± 0.5 Perchlorate, 1M 28 17.9 ± 0.1 Chloride, 0.1 M this work Note. The equilibrium concentrations of Gd3+, [Gd3+], were calculated from CGd = [Gd3+] + β1,–1 [Gd3+] ·[H+]–1. Table 2. Calculated values of the solubility product of Gd(OH)3(s), KspGd(OH)3 C(Gd3+), mM –log hp p[Gd3+] p[OH] KspGd(OH)3 1.00 7.00 3.04 6.78 17.96 2.50 6.85 2.63 6.93 17.92 5.00 6.70 2.32 7.08 17.78 The formation of insoluble Gd-hydroxide was esti- mated from experimental titration curves of acidified so- lutions of gadolinium(III) chloride with sodium hydroxi- de. When pH ∼ 7.5–9 was reached further addition of al- kali was stopped since the excess of alkali was not con- nected with gadolinium hydrolysis. The titration curves were plotted as the dependence of pH on the titration pa- rameter (amount of strong base added per mole of Gd3+). The point of inflexion of pH-metric curve corresponds to the start of formation of hydroxide precipitate. For each total concentration of Gd3+ ion the beginning of precipita- tion was determined (–log hp). Assuming the formation of Gd(OH)3(s) only, the solubility product Ksp = [Gd3+] ·[H+]–3 was calculated from the known free concentration of Gd3+. The results are given in Table 2. Thus, calculated average value of solubility product of Gd(OH)3 is log Ksp = 17.9 ± 0.1. The distribution dia- gram of the hydrolytic complexes of gadolinium(III) ion 391Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin 3. 2. Protonation of Moxifloxacin Anion Protonation constants, βn, of the moxifloxacin an- ion, defined according to the equilibrium: nH+ + MOXI– = HnMOXI; βn (n = 1, 2) (10) were determined by glass electrode potentiometric titra- tions in 0.10 mol dm–3 LiCl medium at 298.15 K. Three ti- trations were carried out with 0.25, 0.50 and 1.10 mmol dm–3 total fluoroquinolone concentrations, in the pH ran- ge between 3.0 and 10.2. Spectrophotometric measure- ments were made on solutions in which the concentration of moxifloxacin was the same (0.05 mmol dm–3) while the pH values were varied between 4.0 and 9.4 (15 solutions were used). The calculated values of protonation con- stants are given in Table 3. Agreement between potentio- metrically and spectrophotometrically obtained values was better than 1%. The obtained values are in the range with previously reported data.31 pendence of pH on the titration parameter. The titration parameter, a, was calculated through the formula formula (11) where V0 and L are the initial volume and concentration of moxifloxacin in the titrated solution. Negative values of a represent the titration of excess of strong acid (HCl). Titra- tion curves of moxifloxacin in the presence of gadolinium ion (Fig. 4) are shifted to the right compared to moxifloxa- cin alone thus indicating strong complex formation in the system. Since the titration curves of moxifloxacin alone and Gd3+ + moxifloxacin do not coincide at low pH values it may be inferred that complexation reaction proceeds even at pH values lower than ca. 3. Coincidence of the titration curves of Gd3+ + moxifloxacin with different ligand to me- tal concentration ratios in the pH region around 3 indicates the formation of the 1 : 1 complexes. The titration curve of moxifloxacin alone shows two well separated jumps indi- cating the titration of two protons from the ligand. In the presence of gadolinium ion these protons are titrated at lo- wer pH values and appearance of two buffer regions on the titration curves points to formation of the complexes with ligand to metal ratio higher than 1 : 1. Thus the formation of complexes with the stoichiometry L/M = 1 : 1; 2 : 1 and 3 : 1 as well as mixed complexes may be expected. To find the model that gives the best fit to the expe- rimental data, various complexes and combinations the- reof were included in Hyperquad2006 calculations up to ligand to metal mole ratio 4:1. During the calculations, the analytical parameters (total metal, ligand and proton con- centration) were held constant. The pure hydrolytic com- plexes and protonated moxifloxacin species were not refi- ned during the calculations. Different strategies were em- ployed in the refinement operations: (i) fixing selected constants to simplify the optimization procedure, (ii) re- ducing the number of experimental points included in cal- culations, (iii) “piecewise” fitting of the experimental da- ta. Initially, each titration was treated separately. All the complexes found in this way were included as the starting model for subsequent calculations. The GdHMOXI and Gd(HMOXI)2 complexes were found at all titrations and concentration ratios. The scatter of the values of their stability constants is within the expe- rimental errors. The complexes Gd(HMOXI)(MOXI) and Gd(MOXI)2 were found at a MOXI:Gd concentration ra- tio of 2 : 1 and 1 : 1. At the higher concentration ratios (as L/M = 3 : 1 and 5 : 1) a significant improvement of the fit was achieved with the introduction of the complexes (1,3,3), (1,2,3), (1,1,3) and (1,0,3). Mixed hydrolytic com- plexes are not important even at higher pH values. The complexes with a stoichiometry L/M ≥ 4 were not found. The preliminary set of complexes obtained in sepa- rate calculations is given in Table 4. Statistical parameters which determine the quality of fit are also given. Table 3. Potentiometrically and spectrophotometrically determined protonation constants of moxifloxacin (MOXI) defined as: K1 = [HMOXI]/[H][MOXI], K2 = [H2 MOXI]/[HMOXI][H] Potentiometric Spectrophotometric log K1 9.34 ± 0.01 9.30 ± 0.02 log K2 6.33 ± 0.01 6.27 ± 0.05 3. 3. Complex Formation of Gd3+ with Moxifloxacin Potentiometric Measurements The experimental data obtained by emf measurements in 0.1 mol dm–3 LiCl medium at 298 K are shown in Fig. 4. In order to derive the speciation model for each stu- died system the experimental data were plotted as the de- Fig. 4. Potentiometric titration of Gd3+ – moxifloxacin solutions with standard NaOH in 0.1 mol dm–3 LiCl ionic medium at 298 K. Full lines denote calculated curves. The concentration in mmol dm–3 is denoted as mM. 392 Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin The calculated errors (σ) in stability constants ref- lect the fitting error (due to model) and experimental er- rors in titrant volume and potential or absorbance rea- dings. Systematic errors on analytical concentrations could not be taken into account; they are rather assumed to be absent. Careful preparation of working solutions, and agreement between replicate titrations ensures the ab- sence of systematic errors thus, it may be assumed that the magnitude of relative errors on concentrations is far less than the errors arising from the choice of model, regres- sion and instrumental errors. It can thus be assumed that uncertainty on stability constants is well represented by calculated standard deviation. Spectrophotometric Measurements Spectral mea- surements were performed on Gd3+ – moxifloxacin solu- tions in which the concentration of both, gadolinium ion and moxifloxacin was kept constant while pH was varied by the addition of the standard HCl or NaOH, as appro- priate. All UV/Vis spectra show evidence of an intensive band centered at 290 nm and another lower energy broad band appears between 330 and 380. This band shows two well resolved maxima at 340 and 370 nm (Fig. 5). The high energy band is mainly due to the π → π* transition in the aromatic ring. The longest wavelength maximum is due to an n → π* (HOMO–LUMO) electro- nic transition32 and consists of two sub-peaks which are caused by an equilibrium of the moxifloxacin forming an intermolecular hydrogen bond with the solvent molecule water and moxifloxacin forming an intramolecular hydro- gen bond of the 4-keto and the 3-carboxylic acid group.33–35 Upon increasing the pH from ca. 3 to 8 higher ener- gy band shows significant changes in position and maxi- mum intensity (hypsochromic shift). The lower energy band exhibits however, only small changes in a shape, position and intensity (bathochromic shift). Intensity of the band at 340 nm increases upon increasing the pH. In- tensity of the band at 370 nm and higher energy band de- creases with increasing the pH. In the presence of gadoli- nium ion, in comparison with the spectrum of moxifloxa- cin alone, all bands are shifted toward higher wave- lengths. The spectral data were first evaluated with the aid of the pHAb2006 program. In calculations, the molar ab- sorptivities of moxifloxacin anion, H(MOXI) and H2(MOXI) were known from spectral measurements of moxifloxacin anion protonation and were fixed, while the- se of gadolinium(III) – aqua ion and pure hydrolytic com- plexes were set to zero. The calculations were carried out in the following way: the complexes found by potentio- metry were included in pHAb calculations and their stabi- lity constants were allowed to float. When the best fit of Fig. 5. The UV–Vis spectra of Gd3+ – moxifloxacin solutions at different pH values and ligand (L) to metal (M) concentration ratios: (a) L/M = 3, (b) L/M = 0.5 Table 4. Stability constants of gadolinium – moxifloxacin complexes formed in a 0.1 mol dm–3 LiCl ionic medium, at 298 K. L/M denotes ligand to metal mole ratio. log βp.q.r ± σ Species Potentiometric Spectrophotometric (p,q,r) L/M = 0.5–2 L/M = 3–5 L/M = 0.5–2 L/M = 3–5 (1, 1, 1) 14.72 ± 0.03 14.79 ± 0.06 14.79 ± 0.09 14.75 ± 0.07 (1, 2, 2) 29.65 ± 0.02 29.57 ± 0.08 29.72 ± 0.08 29.67 ± 0.09 (1, 1, 2) 21.20 ± 0.09 (1, 0, 2) 14.00 ± 0.03 13.8 ± 0.3 (1, 3, 3) 43.98 ± 0.03 43.95 ± 0.01 (1, 2, 3) 35.18 ± 0.01 (1, 1, 3) 27.76 ± 0.03 27.80 ± 0.05 (1, 0, 3) 19.00 ± 0.05 19.28 ± 0.08 Statistics χ2 = 11.82 χ2 = 15.98 χ2 = 24.36 χ2 = 13.65 s = 1.2 s = 1.8 s = 4.4 s = 1.3 a) b) 393 these species predominate in the 2.0–5.0 pH region. Gd3+ + H2MOXI + → Gd(HMOXI)3+ + H+ (12) This reaction, from the electrostatic point of view, is not favorable, but one should bear in mind that the carboxyl proton participates in hydrogen bonding both intermolecular with 4-carbonyl oxygen and intramole- cular with another moxifloxacin and solvent molecules. This facilitates its release by the action of Gd3+ ion. The complex Gd(HMOXI)3+ upon increasing the pH, binds another zwitterionic molecule of moxifloxacin and gives the complex Gd(HMOXI)2 3+ via the reaction path: Gd(HMOXI)3+ + HMOXI± → Gd(HMOXI)23+ (13) This complex with increasing pH releases protons and gives mixed complex Gd(HMOXI)MOXI2+ with a maximum of 10 % concentration at pH 8. As can be seen from Fig. 7, in going from acidic to weakly alkaline me- dium gradual formation of complexes GdHMOXI3+, Gd(HMOXI)2 3+ and Gd(HMOXI)3 3+ takes place probably by consecutive reactions: Gd3+ + H2MOXI + → Gd(HMOXI)3+ + HMOXI± + HMOXI± Gd(HMOXI)2 3+ + HMOXI± Gd(HMOXI)3 3+ (14) At pH values higer than 7, protonated moxifloxacin ligands in the complex Gd(HMOXI)3 3+ release protons and give neutral complex Gd(MOXI)3. The formation of the complex Gd(MOXI)3 starts at about pH = 8 and with in- creasing pH, the concentration of this complex increases. In Gd(HMOXI)3 3+ complex moxifloxacin acts as a bidentate O,O- ligand with a probable formation of six- membered ring by 4-keto and 3-carboxyl oxygens (Fig. 8). Gadolinium(III) ion exhibits characteristic coordina- tion numbers 6, 8 and 9.36 With the most ligands Gd3+ ta- kes coordination number 8.37 Since we did not find any evidence for the formation of L/M = 4 : 1 complex it may be assumed that additional two coordination sites in the gadolinium coordination sphere are filled with water mo- lecules. The similar result was found by Turel et al.38, in studying the fluorescence properties and structure of Eu3+ – ciprofloxacin complex. They found that two bidentate O,O-bonded ciprofloxacine molecules and four aqua li- gands are coordinated to the metal. One ciprofloxacin is anionic while the other is zwitterionic. Similar results for lanthanide complexes with ciprofloxacin was found by Pin et al.39 In this work we also found that quinolones may coordinate to metal ion in various states of protona- tion (ie, zwitterionic, neutral and anionic form). The com- plex Gd(HMOXI)3 3+ is very stable in the 5.0–8.0 pH and is probably formed in plasma, under physiological condi- tions. Fig. 6. The calculated spectra of Gd–moxifloxacin species the spectra was achieved the stability constants were va- ried one at a time simultaneously with variation of molar absorptivities. The accepted results of calculation are gi- ven in Table 4. Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin Along with the stability constants, in spectral calcu- lations, the molar absorptivities of the complexes were calculated. The calculated spectra for Gd–moxifloxacin system are presented in Fig. 6. As seen from Fig. 6 the cal- culated spectra of GdHMOXI3+, Gd(HMOXI)2 3+ and Gd(HMOXI)3 3+, complexes differs from that of pure HMOXI most significantly in the region of n → p * transi- tion in the 330–370 nm wavelength interval. It is probably caused by breaking the intra- and intermolecular hydro- gen bonds due to coordination of both 4-keto and 3-car- boxyl oxygens to gadolinium. From preliminary set of complexes (Table 4) a new calculation cycle was initiated, this time both selected po- tentiometric and spectrophotometric data were treated concomitantly. On the basis of acceptance criteria the fi- nal accepted set of complexes was derived and this set is shown in Table 5. The distribution diagram of species in the Gd3+ – moxifloxacin system, for the concentration ratio [MOXI] /[Gd] = 5 : 1 is shown in Fig 7. As can be seen from Fig. 7, the dominating complex at lower pH values is Gd(HMOXI)3+, with the maximum concentration at pH = 4. This complex may be formed via the reaction of Gd3+ aqua ion and moxifloxacin cation bearing in mind that Table 5. Final set of complexes obtained by potentiometric and spectrophotometric measurements in Gd3+ – moxifloxacin solu- tions at 0.1 mol/dm3 LiCl ionic medium and 298 K. Species log β ± σ Gd(HMOXI)3+ 14.78 ± 0.03 Gd(HMOXI)2 3+ 29.75 ± 0.02 Gd(HMOXI)3 3+ 43.98 ± 0.03 Gd(HMOXI)2MOXI 2+ 35.08 ± 0.01 Gd(HMOXI)(MOXI)2 + 27.56 ± 0.03 Gd(MOXI)3 0 19.20 ± 0.05 Statistics χ2 = 12.02 s = 2.28 _______→ _______→ _______→ 394 Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin Fig. 7. Distribution diagram of Gd – moxifloxacin species at li- gand-to-metal concentration ratio = 5 : 1 and total gadolinium con- centration 1.0 mmol dm–3 Fig. 8. Possible structure of Gd(HMOXI)3 3+ complex in solution. 3. 4. Computer Simulation of the Effect of Moxifloxacin on Gadolinium(III) Distribution in Plasma The low-molecular weight complex distribution of Gd(III) ion in human blood plasma was first studied by Jackson et al.40 by computer simulation. Webb et al.41 stu- died Gd3+ and Cm3+ distribution in the gastrointestinal tract and Yue Wang et al.42 studied Gd3+ speciation in hu- man blood plasma taking into account the precipitates and some important mixed complexes. Jinping Wang43 studied Gd3+ speciation in human interstitial fluid. The results of these studies reveal that at lower gadolinium concentra- tion the metal is mainly bound to citrate. At milimolar le- vel of Gd3+ concentration and without taking into account the insoluble complexes, transferrin, citrate and glutamate appear as main binders. Introduction of insoluble species into the speciation scheme indicates the predominance of phosphate. DTPA has an effect on Gd3+ distribution at concentrations approximately higher than 10–5 mol dm–3. We used the simplified model of human blood plasma ta- king into account only the most important ligands (trans- ferrin, albumin, citrate, phosphate, oxalate, carbonate glu- tamate and hydroxide) to study the effect of moxifloxacin and DTPA on Gd3+ ion distribution between low molecu- lar weight complexes. As competitive the following metal ions were considered: Ca2+ and Mg2+. The speciation was calculated for different total concentrations of Gd3+ ion at pH = 7.4 using the program Hyss2006. From Fig. 7 it is seen that tris complex of moxifloxacin and gadolinium is predominant at physiological range of pH so that this complex only was taken into account in speciation calcu- lations. The data for stability constants of various complexes were taken from literature.44 Where more than single data were available the corresponding constants were avera- 395Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin ged. The plasma concentrations of ligands were taken from reference 45. The results of calculations indicate that when inso- luble phosphate (log *Ksp0 = –25.62) was introduced into simulation it is predominant species of all up to the 10–2 mol dm–3 Gd3+. The relative fraction of Gd(OH)3(s) (log *Ksp = 17.9) increases with increasing total Gd(III) con- centration. However, Jackson et al.40 found that kinetics of the formation of insoluble gadolinium(III) phosphate is very slow so that in considering fast complexation with DTPA and moxifloxacin the formation of phosphate may Fig. 9. Calculated distribution of gadolinium species in human plasma at pH = 7.4. CIT = citrate, TRANSF = transferrin, OX = oxalate, ALB = albumin 396 Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin not be taken into account. Soluble species consist of low molecular weight ligand complexes (carboxylate, amino acid), protein complexes (albumin, transferrin, IgG) free Gd3+ and so on. We calculated the distribution only for main binders neglecting amino acid other than glutamic, and ternary complexes. The results are given in Fig. 9 as the distribution of various complexes. Normal Gd3+ pla- sma level is lower than 0.3 µg/L46 but upon administering Gd(DTPA) for the purpose of MRI, glomerular filtration rate measurements or CT scanning, its concentration may increase up to toxic levels (∼ 6 mmol dm–3) followed by its retention in bones.46 The increase in toxicity was ascri- bed to facilitated dissociation of the complex in the pla- sma environment.19,20 Gd3+ toxicity is due to its interferen- ce with Ca2+ – dependent functions. DTPA significantly affects the concentration of free Gd3+ and the effect is more pronounced with increasing to- tal gadolinium concentration. Moxifloxacin is effective chelator at lower gadolinium total concentration but at mili- molar range of total gadolinium concentration distribution of low molecular weight complexes is almost unchanged. 4. Conclusion Gadolinium(III) ion and moxifloxacin form in vitro in aqueous solution, array of complexes of which the tris complex Gd(HMOXI)3 predominates at physiological pH values. In accord with literature data for similar comple- xes, the moxifloxacin is bound to metal ion by carboxyla- te and 4-carbonyl oxygen. This complex is stable enough to exhaust the normal gadolinium concentration in plasma upon oral intake of one 400 mg dose of moxifloxacin, at low Gd3+ concentration (10–9–10–7 mol dm–3) so that the presence of moxifloxacin may change Gd3+ distribution in plasma. However, at higher Gd3+ concentrations moxiflo- xacin is not competitive chelator with regard to MRI agents (such as DTPA). 5. Acknowledgement Financial support from the Ministry of Science and Technological Development of Serbia, under the project 142013, is gratefully acknowledged. 5. References 1. P. Ball, The Quinolones. History and overview. In: V. T. An- driole (Editor). The Quinolones, Academic Press, San Diego, 2000, 2–24. 2. M. Donati, M. R. Fermepin, A. Olmo, L. D’Apote and R. Cevenini, J. Antimicrob. Chemother., 1999, 43, 825–827. 3. G. Klopman, S. Wang, M.R. Jacobs, J. J. Ellner, Antimicrob. Agents Chemother., 1993, 37(9), 1807–1815. 4. K. Drlica, D. C. Hooper, Mechanism of Quinolone Action, In: D. C. Hopper, J. S. Wolfson, (Editors). Quinolone Anti- microbial Agents, (3rd Edition), American Society for Micro- biology, Washington DC, 2003, 19–41. 5. I. Turel, Coord. Chem.. Rev., 2002, 232, 27–47. 6. S. Lober, S. Ziege, M. Rau, G. Schreiber, A. Mignot, P. Koeppe, H. Lode, Antimicrob. Agents Chemother., 1999, 43(5), 1067–1071. 7. G. Palu, S. Valisena, G. Ciarrocchi, B. Gatto, M. Palumbo, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89, 9671–9675. 8. I. Turel, A. [onc, M. Zupan~i~, K. Sep~i}, T. Turk, Metal Ba- sed Drugs, 2000, 7(2), 101–104. 9. S. Lecomte, M. H. Baron, M. T. Chenon, C. Coupry, N. J. Moreau, Antimicrob. Agents Chemother., 1994, 38(12), 2810–2816. 10. C. Sissi, M. Andreolli, V. Cecchetti, A. Fravolini, B. Gatto, M. Palumbo, Bioorg. Med. Chem., 1998, 6(9), 1555–1561. 11. Z. F. Chen, R. G. Xiong, J. L. Zuo, Z. Guo, X. Z. You, H. K. Fun, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 2000, 4013–4014. 12. M. @upan~i~, R. C. Koro{ec, P. Bukovec, J. Thermal Anal. Calorim., 2001, 63, 787–795. 13. J. Al-Mustafa, Acta Chim. Slov., 2002, 49, 457–466. 14. I. Turel, P. @ivec, A. Pevec, S. Tempelaar, G. Psomas, Eur. J. Inorg. Chem., 2008, 23, 3718–3727. 15. S. K. Upadhyay, P. Kumar, V. Arora, J. Struct. Chem., 2006, 47(6), 1078–1083. 16. P. Dreven{ek, J. Ko{mrlj, G. Giester, T. Skauge, E. Sletten, K. Sep~i}, I. Turel, J. Inorg. Biochem., 2006, 100, 1755– 1763. 17. L. J. Ming, Med. Res. Rev., 2003, 23(6), 697–762. 18. W. Guo-ping, L. Qun-fang, J. Zhejiang University (Science edition), 2003, 30(4), 417–442. (Google search) 19. P. Hermann, J. Kotek, V. Kubi~ek, I. Luke{, Dalton Trans., 2008, 3027–3047. 20. M. Port, J.-Marc Idee, C. Medina, C. Robic, M. Sabatou, C. Corot, Biometals, 2008, 21, 469–490. 21. P. Djurdjevi}, R. Jeli}, D. D`ajevi}, M. Cvijovi}, Metal Ba- sed Drugs, 2002, 8, 235–248. 22. H. M. Irving, M. G. Miles, L. D. Pettit, Anal. Chim. Acta, 1967, 38, 475–488. 23. P. Gans, A. Sabatini and A. Vacca, Talanta, 1996, 43, 1739– 1753. 24. P. Gans, A. Sabatini and A. Vacca, Ann. Chim., 1999, 89, 45– 49. 25. L.-O. Ohman, S. Sjöberg, Coord. Chem. Rev., 1996, 149, 33–57. 26. L. G. Rodenas, S. J. Liberman, Talanta, 1991, 38(3), 313– 318. 27. T. Amaya, H. Kakihana, M. Maeda, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1973, 46, 2889–2890. 28. J. Kragten, L. G. Decnop-Weever, Talanta, 1980, 27(12), 1047–1050. 29. G. D. Klungness, R. H. Byrne, Polyhedron, 2000, 19, 99– 107. 30. L. Alderighi, P. Gans, A. Lenco, D. Peters, A. Sabatini, A. Vacca, Coord. Chem. Rev., 1999, 184, 311–318. 397Acta Chim. Slov. 2010, 57, 386–397 Djurdjevi} et al.: Study of Solution Equilibria Between Gadolinium(III) Ion and Moxifloxacin 31. P. Djurdjevi}, Lj. Joksovi}, R. Jeli}, A. Djurdjevi}, and M. Jeliki} Stankov, Chem. Pharm. Bull., 2007, 55(12), 1689–1699. 32. C. H. Song, H. W. Ryu, J. K. Park, T. S. Ko, Bull. Kor. Chem. Soc., 1999, 20, 727–730. 33. D. Gimenez, D. Grasso, L. Sarabia, M. C. Ortiz, Talanta, 2004, 64, 442–451. 34. U. Neugebauer, A. Szeghalmi, M. Schmitt, W. Kiefer, J. Popp, U. Holzgrabe, Spectrochim. Acta A, 2005, 61, 1505– 1517. 35. H. R. Park, T. H. Kim, K. M. Bark, Eur. J. Med. Chem., 2002, 37, 443–460. 36. L. C. Thompson, Complexes, in K. A. Gschneidner Jr, L. Eyring (Eds.), Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths, North Holland Pub. Co., 1979, 209–297. 37. G. Choppin and E. N. Rizkalla, Solution chemistry of actini- des and lanthanides, in K. A. Gschneidner Jr, L. Eyring, G. R. Choppin and G. H. Lander (Eds), Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths, Elsevier Science B.V., 1994, 559–590. 38. D. ^urman, P. @ivec, I. Leban, I. Turel, A. Polishchuk, K. D. Klika, E. Karaseva, V. Karasev, Polyhedron, 2008, 27, 1489–1496. 39. L. Jia-Bin, Y. Pin, G. Fei, H. Gao-Yi, Y. Kai-Bei, Chinese J. Chem., 2001, 19(6), 598–605. 40. G. E. Jackson, S. Wynchank, M. Woudenberg, Magnetic Res. Med., 1990, 16, 57–66. 41. L. M. Webb, D. M. Taylor, D. R. Williams, J. Alloy and Compounds, 1998, 12, 271–273. 42. Y. Wang, X. Lu, S. Y. Wang, J. F. Han, K. Y. Yang, C. J. Niu, J. Z. Ni, Chin. Chem. Lett., 2001, 12(2), 161–162. 43. J. Wang, H. Zhang, K. Yang, C. Niu, Biometals, 2004, 17, 599–603. 44. SC-Database. IUPAC stability constants database. Academic Software. UK. 2005. 45. C. Burtis, E. Ashwood, D. Bruns, B. Sawyer (editors), Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, 6th edition, Saunders – Elsevier, St. Louis, USA. 2008, 836–873. 46. H. Seiler, A. Sigel, H. Sigel, Handbook on Metals in Clinical and Analytical Chemistry, Marcel Dekker, N.Y., 1994, 365–369. Povzetek Raziskovali smo ravnote`ja nastanka kompleksov med gadolinijevimi(3+) ioni in moxifloxacinom (MOXI) v vodnih raztopinah. Uporabili smo potenciometri~ne meritve s stekleno elektrodo (ionski medij: 0,1 mol dm–3 LiCl, 298 K) in UV spektrofotometri~ne meritve. V koncentracijskem obmo~ju 0,5 ≤ [Gd3+] ≤ 1,0; 1,0 ≤ [MOXI] ≤ 2,0 mol dm–3 ([MOXI]/[Gd3+] = 1 : 1 do 1 : 5) in pH med 2,5 in 9,0, tvorijo gadolinijevi(3+) ioni s moxifloxacinom komplekse s se- stavo: Gd(HMOXI)3+, Gd(HMOXI)2 3+, Gd(HMOXI)3 3+, Gd(HMOXI)2MOXI 2+, Gd(HMOXI)(MOXI)2 +, Gd(MOXI)3. Konstante stabilnosti so bile izra~unane s programom Hyperquad2006 z upo{tevanjem hidrolize gadolinijevih(3+) io- nov in protonacije aniona moxifloxacina. Napovedali smo mo`ne strukture kompleksov v raztopini in predpostavili me- hanizem njihovega nastanka. Z ra~unalni{ko simulacijo smo ovrednotili vpliv moxifloxacina in ga primerjali z vplivom DTPA na porazdelitev gadolinijevih(3+) zvrsti v krvni plazmi. Article J. Braz. Chem. Soc., Vol. 00, No. 00, 1-11, 2012. Printed in Brazil - ©2012 Sociedade Brasileira de Química 0103 - 5053 $6.00+0.00 A *e-mail: preki@kg.ac.rs ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions Mirjana Cvijović,a Vesna Kilibarda,b Milena Jelikić-Stankov,c Ivan Lazarević,d Ivan Jakovljević,e Ljubinka Joksoviće and Predrag Đurđević*,e aThe Copper Mill, Sevojno, 31000 Užice, Serbia bMilitary Medical Academy, 11000 Belgrade, Serbia cChair of Analytical Chemistry, Faculty of Pharmacy, 11000 Belgrade, Serbia dCBRN Training Center of the Serbian Armed Forces, 37000 Kruševac, Serbia eChemistry Department, Faculty of Science, P.O. Box 60, 34000 Kragujevac, Serbia Soluções de AlCl3 foram analisadas em concentrações de 0,03 a 5,0 mmol dm-3 e pH de 3,5 a 6,0 por espectrometria de massas com ionização por electrospray e analizador quadrupolar (ESI-Q-MS). Esses dados espectrais foram comparados com os obtidos por ressonância magnética nuclear (NMR) de 27Al e potenciometria. Espécies resultantes da hidrólise do cátion alumínio em solução apresentaram-se principalmente como complexos carregados positivamente (+1) com moléculas de água coordenadas (n = 1-3) ao metal. As análises revelaram que complexos poliméricos de carga +2 e +3 (em concentrações mais elevadas de Al e pH > 4) contêm íons cloretos coordenados. O aspecto geral dos espectros de massas é dependente de parâmetros instrumentais tais como taxa de fluxo de solvente, temperatura na fonte de ionização e voltagens do cone e capilar. Assim, o ajuste fino do instrumento com relação a estes parâmetros foi realizado. Uma tensão de cone de amostra não superior a 50 V levou à melhor correspondência entre dados de potenciometria, ressonância magnética nuclear de 27Al e espectrometria de massas. Solutions of AlCl3 were analyzed at concentrations from 0.03 to 5.0 mmol dm-3 and pH from 3.5 to 6.0 using an electrospray ionization quadrupole mass spectrometer (ESI-Q-MS). Mass spectral data were compared with those obtained by 27Al nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and potentiometry. Hydrolytic aluminum species were present in solution mainly as +1 positively charged complexes with n coordinated water molecules (n = 1-3). Analysis revealed that polymeric complexes of +2 and +3 charges (at higher Al concentrations and pH > 4) contained coordinated chloride ions. The general appearance of the mass spectra is dependent on instrumental parameters such as solvent flow rate, ionization source temperature and cone and capillary voltages. Thus, fine tuning of the instrument with respect to these parameters was performed. Sample cone voltages not exceeding 50 V led to the best agreement between potentiometric, 27Al NMR and mass spectral data. Keywords: aluminum, hydrolysis, mass spectrometry Introduction Aluminum ions are extremely prone to hydrolysis due to their high affinity toward negatively charged oxygen. Several excellent reviews devoted to various aspects of aluminum hydrolysis, summarizing data accumulated over several decades, were published.1-6 The extent of hydrolysis and the identity and stability of the hydrolytic species formed in solution depend upon many factors, such as the nature and concentration of the supporting ionic medium, pH, nature and concentration of the base used to force hydrolysis, aging time and presence of other substances that may interact with aluminum(III) and/or with water molecules.7-26 So, to fit the observed experimental data, various models for aluminum hydrolysis, including low molecular weight (lmw), oligomers (omw) and higher molecular weight polymers (hmw), have been proposed.1,4,27-35 Various transformations of Al species in solution such as hydrolysis, polymerization, flocculation, precipitation and ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions J. Braz. Chem. Soc.2 crystallization can be described by two general models, namely “core + link” and “cage-like” Keggin, Al13. These models were reviewed by Bi et al.36 The “core + link” model is best suited for the explanation of transient state processes under moderate rate of base injection during the titration of Al solutions. According to this model, hydroxyl-Al changes from monomeric to polymeric through the continuous speciation change from small polymer (linear shape) → intermediate-size polymer (2D-planar shape) → large polymer, following an hexameric ring model. The structure of the polymers is the same as that of Al(OH)3, in which the basic units are either single or double hexameric rings. The most stable polymer is two-dimensional C-Al139+, which self-assembles to three-dimensional Keggin or K-Al137+ during the aging of the solution.37-46 The amorphous Al-hydroxide is formed through a surface coordination process or a gradual growth process from [Al(OH)3]n(aq) (n = 2-12) to sediment [Al(OH)3]n (n → ∞) in the pH region from 4 to 7. In a “cage-like” model, the hydrolyzed Al solutions contain only monomeric, dimeric, Keggin Al-13 polymeric and some larger polymerized Al species. Prolonged aging of weakly acidic aluminum solutions at elevated temperatures yields polynuclear species including [Al30O8(OH)56(H2O)26]18+, referred to as Al30-mer.10 Polymeric species are metastable and during the aging step undergo structural re-organization. These species can be transformed from one to another directly. The K-Al13 transforms slowly to Al(OH)3 through the aggregation, in the process of aging, of partially hydrolyzed Al species.47 Bi et al.36 summarized both models into the following scheme: at an average hydroxyl to aluminum ratio (defined as Z = [OH]/[Al]), Z ca. 0.2), only hexa-aqua Al3+, Al(OH)2+, Al(OH)2+ and Al(OH)30(aq) exist in solution together with small polymers of general formula Alm(OH)Zm(3m-Zm)+. The polymers exist as transient species up to Z ca. 2.5. Beyond this value, the main Al species are large Al13–Al54 polymers and sol/gel Al(OH)3. The polymer charges range between +7 to +18. At higher values of Z, precipitation occurs by aggregation of polymeric species, so that the main constituents of the solution are [Al(OH)3]n(aq) and AlxOz(OH)y(3x-y-2z)+. At the same time, the gel begins to dissolve (pH > 6) and the soluble Al(OH)4- complex forms.36,45 Recently, much useful information concerning the identity of hydrolyzed aluminum species has been obtained by mass spectrometric measurements.48-54 “Soft” ionization techniques such as electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) were extensively used. ESI-MS spectra do not exactly represent the speciation picture of the solution “before the measurement” due to perturbations occurring after the sample injection in the ion source and before the ion detection. Therefore, the experimental conditions should be adjusted in such way that nebulization and desolvation do not disturb labile hydrolytic process in the solution. Also, the change in the pH of the droplet environment (due to its decrease in volume) does not cause charge reduction in the hydrolytic complexes pinched out from the droplet. The most comprehensive ESI-MS study of aluminum hydrolysis was performed by Sarpola et al.51-54 They reported several different anionic and cationic Al-complexes ranging from monomeric to polymeric species (Al30) in chloride, sulfate and mixed chloride and sulfate media. The effect of the anion on speciation was also studied. By using the ESI-TOF-MS (electrospray ionization-time of flight-mass spectrometry) technique, they found three different pH ranges in which the speciation of Al differed from each other: at pH ca. 3 the dominant forms were dimeric [Al2O(OH)2Cl(H2O)0-3]+ and trimeric [Al3O(OH)4Cl2(H2O)0-3]+, while at pH ca. 5 larger polymers with the Al13 core were dominant. The charge of these complexes ranged from -2 to +3, and the disagreement with the +7 charge of Keggin polymers was explained by the presence of terminal chloro atoms. At neutral pH, the formation of colloids and precipitates was indicated by the loss of all signals from the spectra. The largest aluminum cation found by Sarpola et al.51 was the Al30 cluster as [Al30O35(OH)17]3+. In more recent work,54 the results obtained by ESI-TOF-MS were re-investigated by using tandem mass spectrometry with triple-quadrupole instrument. No anionic spectra were observed. Signals of the monomeric complexes [Al(OH)2]+ and [Al(OH)2(H2O)n]+ (n = 1, 2, 3) dominated the full scan spectra. At higher collisional energy, two hydroxo groups formed a bridging oxo ligand, with the loss of one water molecule. Chloro ligands were not present as bridging ions since at even low collisional energies they were eliminated as HCl. It was observed that even small dimeric and trimeric complexes were able to capture aqua ligands and the fragment ion spectra broadened toward higher m/z values. ESI-MS was also applied to aluminum hydrolysis studies in very diluted aluminum chloride solutions by Zhao et al.50 They divided all hydrolytic species into four groups. The first group, formed at pH ca. 4, consisted of monomeric and dimeric species. At pH ca. 4.8, trimeric to pentameric species formed and upon raising the pH to ca. 5.0, these species polymerized to higher oligomers from Al6 to Al10. The fourth group contained the polymerization products from Al11 to Al21, and finally flocks appeared at pH ca. 6.4. Urabe et al.48,49 studied the speciation of aluminum hydrolytic complexes in chloride solutions by applying ESI-Q-MS (electrospray ionization-quadrupole- Cvijović et al. 3Vol. 00, No. 00, 2012 mass spectrometry), ESI-Q-MS/MS (electrospray ionization-quadrupole-tandem mass spectrometry) and ESI-TOF-MS measurements. Hydrolysis was not forced by the addition of base, i.e., it was carried out in the aluminum concentration range of 0.02 to 100 mmol dm-3 without pH adjustment. Aluminum species existed in solution mainly as positively charged monomeric aluminum hydroxides with several water molecules. In addition to monomers, some polymers were identified (Al2, Al3, Al4 and Al5) with +1 charge. In positive mode, no complexation with chloride was observed. According to Urabe et al.48, in partially neutralized AlCl3 solution (CAl = 1 mmol dm-3, Z = 1.5), triply charged tridecamer and doubly charged tridecamer, Al132+, were observed at m/z 279-309 and m/z = 409 + 9n (n = 0-7) respectively. Tridecameric species differed by the number of water molecules in the cluster. Available literature data indicate that the main problem encountered in ESI-MS studies of aluminum hydrolysis is the correspondence between equilibrium state in solution and species present in the MS source (gas phase reaction). Generally, classical methods (potentiometry, multinuclear magnetic resonance (MR) spectroscopy and spectrophotometry) identified much less species than ESI-MS, indicating that most species observed by MS are rather characteristic of the MS gas phase than of the solution. Thus, optimal tuning of the mass spectrometry instrument should be performed in order to obtain maximum agreement between spectral and potentiometric data. It has been established in previous work49 that ESI-Q-MS preserves the dissolution state of aluminum ion better than ESI-TOF-MS. In the present work, the hydrolysis of aluminum chloride under various conditions using the ESI-Q-MS technique was studied to establish a correspondence between real speciation in hydrolyzed aluminum solutions and signals obtained in ESI-MS. From such set of known species, it would be in principle possible to establish the realistic model of hydrolysis, i.e., to give the preference to some of the above described models. Experimental Reagents The standard aluminum chloride solution was prepared by dissolving Al sheets (99.98% purity, Merck, Darmstadt, FRG) in HCl (Suprapure, Merck). The content of aluminum was checked by gravimetry and ICP-OES (inductively coupled plasma – optical emission spectrometry). The aluminum concentration was 0.1000 ± 0.0005 mol dm-3. The content of strong acid (HCl) in the aluminum solution was determined potentiometrically using the Gran method, and the concentration of HCl was 0.153 ± 0.002 mol dm-3. Methanol (P.A., Merck) was distilled twice before use. Formic acid and NaOH were reagent grade purity (Merck). Tetramethylammonium hydroxide (TMA) and ammonium hydroxide were Sigma-Aldrich products (Austria). Instruments ESI-MS spectra were recorded on a Waters (Milford, USA) LC/MS instrument equipped with a Micromass model ZQ 2000 API single quadrupole mass detector, operating under the control of the MassLynx 4.0 software. The instrument was used as a simple ESI-MS equipment, i.e., the column was by-passed. Samples were introduced by flow injection analysis with either water or water/methanol 50:50 (v/v %) as solvent flow phase with a flow rate of 0.2 mL min-1. The sample was introduced into the ESI probe by manual injection with the use of a Hamilton Microliter syringe. Samples were also introduced by continuous flow at 10 µL min-1. Spectra were taken in positive mode. For pH measurements, a Mettler Toledo DL 50 instrument equipped with a radiometer combined electrode was used. Optimal MS conditions were established by a series of preliminary experiments and the best operational parameters were: capillary voltage 3.5 kV, cone voltage 50 V, extractor voltage 3 V, source temperature 125 °C, desolvation temperature 200 °C and dynamic range m/z 40-1000. The solvent used was aqueous formate buffer. The cone (nitrogen) and desolvation gas flows were set at 50 and 450 L h-1 respectively. 27Al NMR spectra were recorded at 130.28 MHz on a Bruker DRX spectrometer with AlCl3 in 6.0 mol dm-3 HCl as external standard. Digital resolution was 1.27 Hz per point. Potentiometric titrations were performed with a Radiometer DTS 800 titrator (Copenhagen, Denmark) equipped with a Radiometer combined electrode. Results Hydrolyzed aluminum samples were prepared in the following way: a volume of the AlCl3 stock solution was diluted with water to the desired concentration and the pH of the solutions was adjusted to the 3.2-6.0 range by addition of either NaOH/HCl or formic acid/NH4OH. Solutions were aged either for 4 h or for 7, 15 or 30 days. During the aging period, the pH value was periodically checked, and the values stable to 0.01 pH units for 15 min were recorded. ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions J. Braz. Chem. Soc.4 The nature of the resulting mass spectrum was dependent on various parameters such as applied voltages, solvents, pH and concentration of the solutions. First, the effect of voltages at the electrospray needle, RF lens and sample cone was investigated on AlCl3 plus quercetin solutions (CAl = 5 × 10-6 mol dm-3, Cquercetin = 1 × 10-5 mol dm-3), according to Deng and Berkel.55 The potentials were varied in the range of 2.0 to 4.5 kV at the needle, 0 to 200 V at the cone and 0 to 20 V at the lenses. These conditions were adjusted to produce the [Al(quercetin-H)2]+ complex as the dominant ion.55 It was found that the intensity of the [Al(quercetin-H)2]+ pseudo-molecular ion signal at m/z 629 decreases with increasing cone voltages and is almost independent of the RF lens voltages. So, the voltage at the needle was kept at 3.5 kV. The sample cone voltage was further investigated on 5.0 × 10-4 mol dm-3 aluminum chloride solutions at pH 4.20. This voltage was varied between 10 and 200 V (10, 20, 45, 50, 70, 100, 150 and 200 V). Along with voltages, the desolvation temperature (200-300 oC) and gas flow (300-450 L h-1) were varied. The optimum area and clean baseline were obtained at cone voltages of 45-50 V, even for low intensity signals. The optimum desolvation temperature was set at 200 oC since higher temperatures produced a high number of low intensity signals. When the cone voltage was raised to 150 V, the signals of m/z higher than 300 became more intense and the observable spectral area extended toward higher m/z values. At the same time, the background noise increased and low intensity signals became indistinguishable from the background. A sample cone voltage of 200 V increased the noise and the amount of overlapping signals in the cationic spectra. The final optimal conditions are listed in Table 1. Some of the obtained ESI-MS spectra at different cone voltages are shown in Figure 1. The composition of the solvent also influences the appearance of the spectra. The spectra were recorded using water or water/methanol as solvents (pH 4.20). The most distinctive feature of the spectra was seen at m/z 61 and was assigned to the dihydroxo complex, [Al(OH)2]+. In the spectrum recorded using a water/ammonium formate to methanol rate of 90:10 (v/v %), this signal disappears, indicating that the lowering of the solvent dielectric constant and surface tension is unfavorable for polyol formation. In order to study the speciation of Al3+ hydrolytic complexes, the ESI-MS spectra were recorded at different pH values (3.20 to 6.20) and at a constant aluminum concentration of 2.7 × 10-5 mol dm-3 under the optimal operational conditions. Clear solutions were observed up to pH 5.00; at this pH value, the solutions were stable for a prolonged period of time up to two days (i.e., no turbidity or precipitation was observed). At higher pH values, the solutions stayed clear for 2-3 h after the addition of base, and then a gradual turbidity developed. Most of the ESI-MS signals in solutions of pH between 5.50 to 6.20 disappeared. A representative spectrum at pH 3.59 is shown in Figure 2 and the identified species are given in Table 2. The majority of the species identified in ESI-MS spectra were singly charged. Since the Al3+ aqua ion is present in all solutions, the formation of mononuclear Al–OH species may proceed in the gas phase, through charge reduction during the dehydration process: [Al(H2O)6]3+ → [Al(OH)n(H2O)6-n](3 - n)+ + nH3O+ ESI-MS spectra of hydrolyzed aluminum solutions were also indicative of the presence of various polynuclear hydrolytic complexes containing Al2-Al7 cores. The singly charged complexes predominate. Each complex ion was identified by its m/z value, though different complexes containing (OH)22- and O(OH)2- groups may correspond to identical m/z values. When chloride ions were coordinated to Al, then the chlorine isotopic distribution was employed for identification of the Al-complexes. The [AlCl3 + H+] and [AlCl2]+ signals were seen at m/z 133 and 97, respectively. These species are not characteristic of the solutions and have probably been formed during the nebulization process. Intensive signals in the m/z 60-100 region were assigned to binary mononuclear hydroxo complexes, i.e., [Al(OH)]2+ and [Al(OH)2]+. These complexes are characteristic of low concentration, hydrolyzed Al solutions and form rapidly and reversibly.1-8 The [Al(OH)2]+ species may contain up to two water molecules in the coordination sphere. Table 1. Optimal instrumental conditions for ESI-MS measurements Parameters Sample flow rate 10 µL min-1 Capillary voltage 3.5 kV Sample cone voltage 50 V Extractor voltage 3 V R.f. lens 5 V Source temperature 125 oC Desolvation temperature 200 oC Mass range m/z 40-1000 Resolution 2000 Cone gas flow rate 50 L h-1 Desolvation gas flow rate 450 L h-1 Cvijović et al. 5Vol. 00, No. 00, 2012 Some polymeric species appear as hydrated or chloro species whose charge was always found to be +1. This leads to the conclusion that these species may contain, in their structures, bridging oxo or hydroxo groups. Other polymeric species containing the Al3, Al4, Al5 and Al7 cores were much less abundant at micromolar aluminum concentrations. The Al3 and Al4 polymers contain chloride, which reduces their charge and perhaps promotes polymerization. Chloro complexes may form metastable ion pairs from positively charged Al-OH species and chloride anions during the ESI nebulization. These complexes may be stable enough to be detected by quadrupole mass analyzer, i.e., the complexes do not dissociate during the time needed to reach the detector (ca. 100 µs). Water molecules are coordinated to central aluminum in many hydrolytic polymers; up to five water molecules were found. These complexes are only partially hydrolyzed, and further deprotonation of coordinated water molecules may appear at higher pH values as a competitive process to prevent further polymerization. However, a different hydrolytic scheme is seen in aged aluminum solutions (Figure 3). The spectrum shows only a few signals which were assigned to [Al(OH)2]+, [Al6(OH)13]5+ and [Al4(OH)9]3+. The most intense peak was given by the aqua aluminum ion; this is understandable because of the relatively low pH of the solution. Other intense signals belong to tetrameric and hexameric species, indicating that, even at mildly acidic pH, the polymerization proceeds to a significant degree. Upon Figure 1. ESI-MS spectra of a 5.0 × 10-4 mol dm-3 AlCl3 solution, pH 4.20, at various cone voltages. ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions J. Braz. Chem. Soc.6 Table 2. Identified species in 2.7 × 10-5 mol dm-3 solutions of AlCl3 at different pH values Observed m/z Identified species pH Importance 57 [Al(H2O)8]3+ 3.59-4.81 61 [Al(OH)2]+ 3.19-4.81 70 [Al2(OH)3Cl]2+ 3.19-4.81 chloro species 79 [Al(OH)Cl]+ and/or [Al(OH)2(H2O)]+ 3.19-4.81 chloro species 97 [Al(OH)2(H2O)2]+ 3.19-4.81 103 [Al2O2(OH)]+ 3.59 121 [Al2O(OH)3]+ 3.19-4.81 123 [Al2(OH)3(H2O)]+ 3.19-4.81 133 [Al(OH)2(H2O)4]+ 3.19-4.81 157 [Al2O(OH)3(H2O)2]+ 3.19-4.81 175 [Al2H9O7]+ and/or [Al2O(OH)2Cl(H2O)2]+ 3.19-3.59 chloro species 217 [Al3O(OH)6(H2O)]+ 3.59-4.81 oligomer 235 [Al3H10O9]+ 3.59 253 [Al3O(OH)5Cl(H2O)2]+ 3.19-4.81 chloro species 277 [Al4O(OH)9]+ 3.59-4.81 polynuclear Figure 2. ESI-MS spectra of a 2.7 × 10-5 mol dm-3 AlCl3 solution, pH 3.59, cone voltage 50 V, taken in water as the mobile phase. Figure 3. ESI-MS spectrum of a 0.1 mmol dm-3 AlCl3 solution at pH 3.30, aged for one month. further pH increase, the intensity of the aqua aluminum ion signal decreases sharply, and new signals appear that can be assigned to species with Al7 to Al12 cores. At pH between 5.0 and 6.0 most signals disappear from the spectra and only lighter polymer cores (Al2 and Al3) were detected in solution before precipitation took place. Cvijović et al. 7Vol. 00, No. 00, 2012 The effect of various aluminum concentrations on the MS spectra was investigated at pH 4.20, and aluminum concentrations were varied between 0.1 × 10-3 and 1.0 × 10-3 mol dm-3 with one day of aging time. The representative spectra are shown in Figures 4a and 4b. The identified species are shown in Table 3. For aluminum concentrations in the milimolar range, higher polymers containing Al8-Al13 cores were observed. The single-charge complexes were observed for Al1 to Al4, as well as for Al7 cores. The +2 and +3 charges were found for Al8-Al13 cores. We have also examined the spectra of solutions in which the total concentration of aluminum ion was 5.0 mmol dm-3 at pH 4.05 with relatively high concentration of chloride ion (total chloride = 150 mmol dm-3). A representative spectrum is given in Figure 5. The whole process is clearly composed of two stages. In the first stage the lighter charged particles reach the detector. In the second stage heavier, larger polymers form in the droplets by clustering of oligomers with sodium and chloride ions and possibly water molecules. The transfer of these clusters into the gas phase is unefficient so low intensity signals are produced. It is seen that the majority of complexes contain chloride either as a coordinated ion or as a counter ion. No atempt to identify these polymers was made. Single-charged species prevail at higher pH values Figure 4. (a) ESI-MS spectrum of a 1.0 × 10-4 mol dm-3 AlCl3 solution, pH 4.35, sample cone voltage of 50 V. (b) ESI-MS spectrum of 1.0 x 10-3 mol dm-3 AlCl3 solution, pH 4.23, 50 V. Table 3. Identified species in AlCl3 solutions with aluminum concentrations from 0.1 × 10-3 to 1.0 × 10-3 mol dm-3 at pH 4.20 Observed m/z Species Concentration of solution (mol dm-3) 61 [Al(OH)2]+ 1 × 10-4 - 1 × 10-3 70 [Al2(OH)3Cl]2+ 1 × 10-4; 1 × 10-3 79 [Al(OH)Cl]+ and/or [Al(OH)2(H2O)]+ 1 × 10-4 - 1 × 10-3 97 [Al(OH)2(H2O)2]+ 1 × 10-4 - 1 × 10-3 133 [Al(OH)2(H2O)4]+ 1 × 10-4 - 1 × 10-3 175 [Al2H9O7]+ and/or [Al2(OH)2Cl(H2O)]+ 1 × 10-4 - 1 × 10-3 193 [Al7O9(OH)(H2O)2]2+ and/or [Al2O(OH)2Cl(H2O)3]+ and/or [Al2(OH)4Cl(H2O)2]+ 1 × 10-4; 1 × 10-4 - 1 × 10-3 199 [Al3O(OH)6]+ 1 × 10-4 213 [Al13O18]3+ 1 × 10-4 - 1 × 10-3 247 [Al5O7]+ 5 × 10-4 253 [Al3O(OH)5Cl(H2O)2]+ 5 × 10-4 375 [Al5O4(OH)2Cl4]2+ 5 × 10-4; 494 [Al7O5(OH)8Cl2(H2O)]+ 5 × 10-4; 1 × 10-3 ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions J. Braz. Chem. Soc.8 (> 4.8). The most intense signals in the whole pH range investigated could be attributed to Al2-Al6 cores. Discussion From the general inspection of Tables 2 and 3, it may be seen that the species found in our work are consistent with earlier literature reports,48-54 although some of the signals in the recorded mass spectra could not be assigned. The main problems encountered in the interpretation of the ESI-MS spectra are perturbations that occur in the droplets. Three kinds of perturbations may occur in the ESI-MS ion source: in solution, at the liquid-gas interface and in the gas phase. These perturbations may be linked to the formation of hydrolytic polymers in the droplets, different transfer efficiencies from the droplets to the gas phase for different complexes (according to their charge to radius ratio and surface activity), and subsequent partial thermal decomposition of the polymers.53 Perturbations in solution occur in the droplets during their evaporation. Evaporation of droplets changes the concentration of dissolved species and consequently causes equilibrium shifts due to pH, concentration, temperature and ionic strength changes. Perturbations at the liquid-gas interface depend upon the radius of the droplets and the surface activity of the ions. These parameters influence the efficiency with which different species are transferred from the droplets to the gas phase and therefore change their concentration. Perturbations in the gas phase are fragmentations or other thermally induced reactions taking place after the transfer of the ions to the gas phase and before their detection. The formation of polymeric hydrolytic complexes can occur as a result of perturbations in the droplets when Al3+ solutions are electrosprayed. Whether the formation of polymeric hydrolytic species is the result of true equilibrium in solution or perturbations in ESI-MS source, it can be judged by comparison of the results obtained by different methods and by tuning the instrumental parameters of ESI-MS. In ESI-MS the aluminum chloride signal is found at m/z 133. It disappears in solutions in which the pH is higher than 4.50 and this result is consistent with 27Al NMR spectra. These spectra were taken at different pHs in the range of 3.30 to 6.50. The aqua aluminum ion signal is assigned to 0 ppm. The small peak at 0.34 ppm seen in the pH range of 3-5 was attributed to the mono-hydrolyzed species, Al(OH)(H2O)52+ formed in the first step of the hydrolysis,56 while the broad, small intensity peaks at 4.5 ppm that appear at pH > 4.0 were attributed to lmw species, Al2(OH)2(H2O)84+ and Al3(OH)4(H2O)95+.56 In theory,57,58 it is possible to find signals from monomers up to 9 ppm. However, in this work, signals with S/N ratio higher than 3 were not found in this region. Higher hydrolytic polymers produced very broad peaks, seen as an increase in the area between 10 and 40 ppm upon increasing pH. Since these peaks are overlapped and immersed into the background, their analysis by NMR spectroscopy is difficult. Tridecameric or polymeric species containing thirteen aluminum ions, AlO4Al12(OH)24(H2O)127+, were identified at 62.5 ppm.59,60 This polymer begins to form at pH ca. 4 and the signal is at the maximum intensity at pH ca. 5.5. Upon further increase in pH, the signal suddenly disappears at pH ca. 6.0 and no NMR evidence is found for the formation of lighter polymers. After a short period of aging, turbidity and flocculation take place in the system. However, ESI-MS indicates the formation of Al3–Al8 polymers in this pH range, which may suggest that the Keggin polymer first transforms to lighter polymers before precipitation. The tridecamer contains a tetrahedral aluminum surrounded by twelve octahedral aluminums all bound to each other through oxygen. The tetrahedral aluminum gives a distinct sharp peak at 62.5 ppm59,60 relative to the monomeric Al(H2O)63+. The other twelve aluminums in the tridecamer as well as other large Figure 5. ESI-MS spectra of an aluminum chloride solution (CAl = 5.0 mmol dm-3, C Cl- = 150 mmol dm-3, pH 4.05). Cvijović et al. 9Vol. 00, No. 00, 2012 amorphous polymeric aluminum species produce a very broad peak around 40 ppm that is not easily integrated because it is not clearly defined. However, the integration between ca. 40 to 80 ppm shows that the area increased up to 10% upon rising the pH from 5.0 to 6.0. Potentiometric titrations were carried out with two different protocols of base addition: in one titration set, each new portion of the base was added (at the rate of 0.05 mL s-1) five minutes after the potential stabilization, while in the other case the addition of the base was initiated 20 min after the potential stabilization, at the same rate. Further sets of titrations were made in such a way that, at some definite value of pH, the addition of the base was stopped until the potential readings taken over a prolonged period of time showed relative standard deviation less than 3%. Titration curves showed pronounced hysteresis in the region in which the titration parameter (a) ranged between 1.0 and 1.5 (Figure 6). Up to a close to 0.2, the solutions remained clear even for a prolonged period of time. Titration curves obtained under different kinetic conditions coincided up to a values close to 0.2 (Figure 6). With higher values of a, relatively fast addition of the base did not produce visible changes in the solutions and the potentials remained steady. However, leaving such solutions for one or more hours without the addition of the base, unsteady potentials (relative standard deviation in potential readings > 5%) with slight opacity were produced. Further increase of the titration parameter led to the formation of microcolloids and, at a close to 1, a permanent precipitate was formed. Thus, the broad region of the titration curves involving the plateau and the steep rise of pH (Figure 6) corresponds to a meta-stable state with the main step attributable to the formation of soluble Al(OH)3(aq). These species subsequently form a supersaturated solution, and when the number of nucleation centers reaches a critical value, it begins to condense by forming polymeric rings, and precipitates. Attempts to fit these titration curves with sets of complexes taken from databases (Table 4), gave an excellent fit up to Z (hydroxyl to aluminum ratio) close to 1.0. At higher values of Z, the calculated curve goes closer to the experimental curve obtained with slow base addition. Differences between ESI and potentiometric speciation are observed for species which are detected by ESI with different number of acidic protons, that is, with different charges. The data available in the literature64,65 showed the key role of the radius (r) of the droplets in determining the relative intensity of the ESI-MS ions. The radius can affect directly the effectiveness by which the ions are transferred to gas phase. Solution perturbations can be increased by larger droplets. Since the passage of the ions to the gas phase is delayed, this gives the reactions in the droplets more time to occur. At the same time, larger r values increase the gas phase concentration of surface active complexes and decrease that of surface inactive complexes. Comparing ESI-MS, NMR and potentiometric data, it can be concluded that the best agreement was obtained with low molecular mass hydrolytic species. This probably results from the fact that, in polymerized aluminum solutions, the density and viscosity of the solution increase with consequent increase of the surface tension of the droplet. Thus, higher energies are needed to pinch out the higher molecular weight species from the droplet. Conclusion The ESI-MS technique was successfully applied in the study of aluminum hydrolysis in chloride-containing Figure 6. Titration curves of AlCl3 solutions with two different titration protocols. The solid line denotes the titration curve calculated with the data given in Table 4. Table 4. Literature data on aluminum hydrolytic complexes61-63 Species log β AlH -1 -5.5 AlH -2 -11.3 AlH -3(aq) -16.3 AlH -4 -6.96 AlH -5 -43.1 Al2H-2 -7.7 Al3H-4 -13.9 Al3H-11 -63.0 Al6H-15 -60.7 Al8H-22 -93.0 Al13H-22 -106.1 AlH -3(s) -10.3 ESI-MS Study of Speciation in Hydrolyzed Aluminum Chloride Solutions J. Braz. Chem. Soc.10 aqueous medium. Low molecular weight hydrolytic species with +1 and +2 charge prevail in solution in the pH range 3-6 and at mild ESI conditions. Higher polymers, Al5 to Al13, are transient species seen at pH values higher than 4.5 and shortly after preparing the solution. Aging of solutions with pH values up to 6 did not produce polymers higher than Al13. Most polymeric species contain chlorides bound directly to aluminum ions. Acknowledgement The financial aid from the Ministry of Education and Science of Serbia under the project grant 172016 is gratefully acknowledged. References 1. Baes, C. F.; Mesmer, R. E.; The Hydrolysis of Cations; John Wiley & Sons: New York, 1976. 2. Nazarenko, V. A.; Antonovich, V. P.; Nevskaya, E. M.; Gidroliz Ionov Metallov v Razbavlennykh Rastvorakh; Atomizdat: Moscow, 1979. 3. Hayden, P. L.; Rubin, A. J. In Aqueous Environmental Chemistry of Metals; Rubin, A. J., ed.; Ann Arbor Science Publishers: An Arbor, MI, 1974. 4. Orvig, C. In Coordination Chemistry of Aluminum; Robinson, G. H., ed.; VCH Publishers: New York, 1993, p. 85. 5. Nordstrom, D. K.; May, H. M. In The Environmental Chemistry of Aluminum; Sposito, G., ed.; CRC Press, Inc. Lewis Publishers: Boca Raton, FL, 1996, p. 39. 6. Öhman, L.-O.; Sjöberg, S.; Coord. Chem. Rev. 1996, 149, 33. 7. Wesolowski, D. J.; Palmer, D. A.; Geochim. Cosmochim. Acta 1994, 58, 2947. 8. Palmer, D. A.; Wesolowski, D. J.; Geochim. Cosmochim. Acta 1993, 57, 2929. 9. Akitt, J. W.; Elders, J. M.; Bull. Soc. Chim. Fr. 1986, 10. 10. Bertsch, P. M.; Parker, D. R. In The Environmental Chemistry of Aluminum; Sposito, G., ed.; CRC Press, Inc. Lewis Publishers: Boca Raton, Fl, 1996, p. 117. 11. Brosset, C.; Biedermann, G.; Sillén, L. G.; Acta Chem. Scand. 1954, 8, 1917. 12. Brown, P. L.; Sylva, R. N.; Batley, G. E.; Ellis, J.; J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1985, 1967. 13. Martell, A. E.; Hancock, R. D.; Smith, R. M.; Motekaitis, R. J.; Coord. Chem. Rev. 1996, 149, 311. 14. Browne, B. A.; Driscoll, C. T.; Science 1992, 256, 1667. 15. Frippiate, J. J.; Van Cauwelaert, F.; Bosmans, H.; J. Phys. Chem. 1965, 69, 2458. 16. Akitt, J. W.; Elders, J. M.; J. Chem. Soc., Dalton. Trans. 1988, 1347. 17. Matijević, E.; Stryker, L. J.; J. Colloid Interface Sci. 1966, 22, 68. 18. Shen, Y.-H.; Dempsey, B. A.; Environ. Int. 1998, 24, 899. 19. Parks, G. A.; Am. Mineral. 1972, 57, 1163. 20. Aveston, J.; J. Chem. Soc. 1965, 4438. 21. Matijević, E.; Težak, B.; J. Phys. Chem. 1953, 57, 951. 22. Matijević, E.; Mathai, K. G.; Ottewill, R. H.; Kerker, M.; J. Phys. Chem. 1961, 65, 826. 23. Bottero, J. Y.; Tchoubar, D.; Cases, J. M.; Flessinger, F.; J. Phys. Chem. 1982, 86, 3667. 24. Seichter, W.; Mögel, H.-J.; Brand, P.; Salah, D.; Eur. J. Inorg. Chem. 1998, 1998, 795. 25. Milic, N. B.; Bugarcic, Z. D.; Djurdjevic, P. T.; Can. J. Chem. 1991, 69, 28. 26. Bottero, J. Y.; Cases, J. M.; Fiessinger, F.; Poirier, J. E.; J. Phys. Chem. 1980, 84, 2933. 27. Hayden, P. L.; Rubin, A. J. In Aqueous-Environmental Chemistry of Metals; Rubin, A. J., ed.; Ann Arbor Science Publishers: Ann Arbor, MI, 1976, p. 317. 28. Sillén, L. G.; Q. Rev. Chem. Soc. 1959, 13, 146. 29. Turner, R. C.; Ross, G. J.; Can. J. Chem. 1970, 48, 723. 30. Turner, R. C.; Can. J. Chem., 1976, 54, 1910. 31. Parker, W. O.; Millini, R.; Kiricsi, I.; Inorg. Chem. 1997, 36, 571. 32. Stumm, W.; Morgan, J. J.; Aquatic Chemistry, 2nd ed.; John Wiley & Sons: New York, 1981. 33. Akitt, J. W.; Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1989, 21, 1. 34. Akitt, J. W.; Greenwood, N. N.; Khandelwal, B. L.; Lester, G. D.; J. Chem. Soc., Dalton. Trans. 1972, 604. 35. Akitt, J. W.; Farthing, A.; J. Chem. Soc., Dalton. Trans. 1981, 1606. 36. Bi, S.; Wang, C.; Cao, Q.; Zhang, C.; Coord. Chem. Rev. 2004, 248, 441. 37. Keggin, J. F.; Nature 1933, 131, 908. 38. Keggin, J. F.; Proc. R. Soc. London, Ser. A 1934, 144, 75. 39. Baker, L. C. W.; Figgis, J. S.; J. Am. Chem. Soc. 1970, 92, 3794. 40. Allouche, L.; Gérardin, C.; Loiseau, T.; Férey, G.; Taulelle, F.; Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 511. 41. Johansson, G.; Acta Chem. Scand. 1960, 14, 771. 42. Casey, W. H.; Rustad, J. R.; Ann. Rev. Earth Planet. Sci. 2007, 35, 21. 43. Fu, G.; Nazar, L. F.; Bain, A. D.; Chem. Mater. 1991, 3, 602. 44. Wang, M.; Muhammed, M.; Nanostruct. Mater. 1999, 11, 1219. 45. Shi, B.; Li, G.; Wang, D.; Tang, H.; Sep. Purif. Technol. 2007, 54, 88. 46. Bradley, S. M.; Kydd, R. A.; Fyfe, C. A.; Inorg. Chem. 1992, 31, 1181. 47. Casey, W. H.; Phillips, B. L.; Karlsson, M.; Nordin, S.; Nordin, J. P.; Sullivan, D. J.; Neugebauer-Gawford, S.; Geochim. Cosmochim. Acta 2000, 64, 2951. 48. Urabe, T.; Tsugoshi, T.; Tanaka, M.; J. Mol. Liq. 2008, 143, 70. Cvijović et al. 11Vol. 00, No. 00, 2012 49. Urabe, T.; Tanaka, M.; Kumakura, S.; Tsugoshi, T.; J. Mass Spectrom. 2007, 42, 591. 50. Zhao, H.; Liu, H.; Qu, J.; J. Colloid Interface Sci. 2009, 330, 105. 51. Sarpola, A.; Hietapelto, V.; Jalonen, J.; Jokela, J.; Laitinen, R. S.; J. Mass Spectrom. 2004, 39, 423. 52. Sarpola, A.; Hellman, H.; Hietapelto, V.; Jalonen, J.; Jokela, J.; Rämö, J.; Saukkoriipi, J.; Polyhedron 2007, 26, 2851. 53. Sarpola, A.; The Hydrolysis of Aluminum, a Mass Spectrometric Study, Ph.D. Thesis, University of Oulu, Finland, Acta Univ. Oul. 2007, C 279, 1. 54. Sarpola, A.; Hietapelto, V.; Jalonen, J.; Jokela, J.; Laitinen, R. S.; Rämö, J.; J. Mass Spectrom. 2004, 39, 1209. 55. Deng, H.; Van Berkel, G. J.; J. Mass Spectrom. 1998, 33, 1080. 56. Perry, C. C.; Shafran, K. L.; J. Inorg. Biochem. 2001, 87, 115. 57. Tossell, J. A.; J. Magn. Reson. 1998, 135, 203. 58. Kubicki, J. D.; Sykes, D.; Apitz, S. E.; J. Phys. Chem. A. 1999, 103, 903. 59. Kloprogge, J. T.; Seykens, D.; Geus J. W.; Jansen, J. B. H.; J. Non-Cryst. Solids 1992, 142, 87. 60. Casey, W. H.; Chem. Rev. 2006, 106, 1. 61. Pettit, L.; Powell, J. K.; Stability Constant Database and Mini- SCDatabase, version 5.8.; IUPAC and Academic Software: Otley, UK, 2008. 62. Smith, R. M.; Martell, A. E.; Motekaitis, R. J.; NIST Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes Database, version 8.0. for Windows; U. S. National Institute of Standards and Technology: Gaithersburg, MD, 2004. 63. May, P. M.; Rowland, D.; Murray, K.; JESS-Joint Expert Speciation System, version 6.4; Murdoch University: Perth, Australia, 2005. 64. Di Marco, V. B.; Ravene, L.; Dean, A.; Traldi, P.; Rapid Comm. Mass Spectrom. 2010, 24, 868. 65. Di Marco, V. B.; Bombi, G. G.; Zambon, S.; J. Mass Spectrom. 2009, 44, 120. Submitted: October 24, 2011 Published online: May 15, 2012 43. savetovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd, 24. i 25. januar 2005. FH1 121 Uticaj površinski aktivnih materija na adsorpciju ofloksacina na -aluminijum oksidu Milena J. Stankov, Ivan Lazarevi*, Predrag urevi** Farmaceutski fakultet, 11000 Beograd, *ABHO Školski centar, 37000 Kruševac **Prirodno-matematiki fakultet, 34000 Kragujevac Ofloksacin (9-fluoro-3-metil-10-(4-metil-1-piperazinil)-7-okso-2,3-dihidro-7H-pirido(1,2,3-de)1,4-ben- zoksazin-6-karboksilna kiselina (šema 1) je fluorisani 4-hinolonski antibiotik koji se koristi u leenju respiratornih i urinarnih infekcija. Iz njegove formule se vidi da pripada grupi heterociklinih amino kiselina pa u rastvoru može postojati u obliku katjona, dipolarnog jona, neutralnog molekula i anjona. Neutralni oblik (šema 1) postoji, za razliku od prirodnih amino kiselina, u rastvoru i relativno širokoj pH oblasti imajui u vidu da se konstante protonovanja karboksilata i piperazinskog tercijarnog azota ne razlikuju mnogo. N O N N O COOHF CH3H3C Šema 1. Formula ofloksacina Klinika ispitivanja pokazuju da paralelno uzimanje ofloksacina i antacida na bazi aluminijuma dovodi do smanjenja koncentracije ofloksacina u krvi što je takoe praeno smanjenjem PIK-a (površina ispod krive „koncentracija – vreme“). To dovodi do smanjenja bio-raspoloživosti ofloksacina i to za oko 30%. Mogue objašnjenje ovog efekta je kompleksiranje ofloksacina i jona aluminijuma i/ili adsorpcija ofloksacina na površini antacida – aluminijum hidroksida ili aluminijum fosfata. Obe interakcije mogu dovesti do poveanja koncentracije rastvornog aluminijuma, a samim tim i do njegovih toksinih efekata. Ofloksacin može pomeriti ravnotežu: Al(OH)3 + 3 H+ Al3+ + 3 H2O na desno, vezivanjem tragova aluminijum jona nastalih disocijacijom slabo rastvornog jedinjenja (hidroksida ili fosfata). Na taj nain osloboeni joni aluminijuma mogu stupiti u interakcije sa drugim supstancama prisutnim u gastrointestinalnom traktu ili u serumu pa ako se tom prilikom nagrade elektrino neutralni kompleksi oni lako mogu proi kroz lipidnu barijeru elijskih membrana i dovesti do ispoljavanja toksinih efekata aluminijuma. Površinski aktivne materije (PAM) dovode do solubilizacije ofloksacina i helata aluminijuma i ofloksacina, vezuju vodu prisutnu u koordinacionoj sferi kompleksa i spreavaju hidrolizu aluminijuma. Na taj nain oni dovode do poveane bioraspoloživosti aluminijuma1. Primarni cilj ovog rada je da omogui modeliranje interakcija izmeu ofloksacina i aluminijumskih antacida u kiseloj sredini želudca kao i u baznoj sredini dvanaestopalanog creva. Eksperimentalni deo Pre upotrebe -aluminijum oksid (p.a. Merck) žaren je na 1373 K nekoliko asova a potom hlaen do sobne temperature i eksikatoru koji je sadržavao CaO. Rastvor ofloskacina (p.a. Hoechst, Frankfurt am Main, Nemaka) pripremljen je rastvaranjem odvage ofloksacina u bidestilisanoj vodi (100,0 g/mL). Natrijum dodecilsulfat (SDS) (p.a. Sigma, USA) preišen je pranjem sa etrom i alkoholom i osušen u eksikatoru koji je napunjen fosfor-pentoksidom. Cetiltrimetilamonijum-bromid (CTAB) (p.a. Sigma, USA) ispran je etanolom i rekristalisan iz bidestilisane vode. Svi ostali reagensi bili su istoe p.a proizvodi Merck, Darmstadt, Nemaka. Pripremljena je serija epruveta sa šlifovanim staklenim zatvaraem tako što je oprana u vreloj koncentrovanoj azotnoj kiselini. Potom je odmereno 0,1 g ili 0,2 g( sa tanošu ± 0,0001 g) Al2O3 u svaku epruvetu. Razliite zapremine osnovnog rastvora ofloksacina (0,1 – 2,5 mL) prenete su u svaku epruvetu pomou Eppendorf mikro pipete. Zatim su epruvete podeljene u tri serije. U prvoj seriji u jednu grupu epruveta dodata je bidestilisana voda, u drugu 0,100 mol/L HCl, a u treu 0,001 mol/L rastvor NaOH do ukupne zapremine rastvora 5,00 mL. Druga serija pripremljena je slino kao i prva s tim da je u svaku epruvetu dodat rastvor SDS-a tako da mu je ukupna koncentracija u epruvetama bila 10,0 ili 12,0 mmol/L. U treoj seriji u epruvete je dodan rastvor CTAB- a tako da mu je ukupna koncentracija bila 1,0 ili 5,0 mmol/L. Epruvete su zatvorene i uvršene u termostatiranu mukalicu (298 K). Mukanje je vršeno 5 asova. Koncentracija ofloksacina odreena je spektrofotometrijski na 280 nm. Kalibraciona kriva dobijena je u koncentracionom opsegu ofloksacina od 122 1 – 50 g/mL. Nakon merenja koncentracije ofloksacina rastvor iz epruveta je otfiltriran, a vrsta supstanca preneta na gu i isprana hladnom bidestilovanom vodom. Nakon sušenja preko noi u eksikatoru napunjenom sumpornom kiselinom snimljeni su infracrveni spektri svih taloga u nujolu u oblasti 4000 – 250 cm-1. Takoe je snimljen DSC termogram nekih taloga. Eksperimentalni rezultati Na slikama 1 i 2 prikazane su dobijene adsorpcione izoterme ofloksacina kao zavisnost obima adsorpcije ofloksacina od analitike koncentracije ofloksacina u rastvoru. Vidi se da su sve izoterme Freundlichovog tipa: 1/ xn kc m  gde je n broj molova adsorbovanog ofloksacina, m masa aluminijum oksida, k i x su konstante, a c je analitika koncentracija ofloksacina. Kao što se iz slike 1 vidi u neutralnoj sredini (pH od 6,70 do 7,10) obim adsorpcije ofloksacina (n/m u gornjoj jednaini) znatno je vei bez prisustva PAM dok dodatak bilo SDS-a ili CTAB-a znaajno smanjuje adsorpciju pri obe izuavane koncentracije PAM. Taj efekat može se objasniti na sledei nain: adsorbens, aluminijum oksid ima tendenciju da adsorbuje pozitivne jone iz rastvora odnosno, da naelektriše svoju površinu pozitivno. To se postiže adsorpcijom bilo vodoninog bilo aluminijumovog jona ili oba. Pošto je koncentracija oba jon u neutralnim rastvorima ofloksacina vrlo mala, a ofloksacin je u obliku dipolarnog jona on se svojim pozitivnim krajem adsorbuje na adsorbensu. Meutim, u prisustvu PAM dipolarni ofloksacin se solubilizuje i teži da ostane u rastvoru (SDS), dok se pozitivni CTAB kompetitivno adsorbuje i istiskuje ofloksacin. 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0 10 20 30 40 50 60 C(oflo) (g/mL) Ex te nt o f a ds or pt io n (m mo l/g ) oflo oflo+SDS oflo+CTAB neutral medium Slika 1. Adsorpcija ofloksacina na aluminijum oksidu pri pH = 6.8 U kiseloj sredini adsorpcija je znatno poveana u prisustvu SDS-a (slika 2). U ovom sluaju postoji jaka interakcija izmeu pozitivno naelektrisane površine adsorbensa i negativne sulfo grupe PAM-a. Meutim, takva adsorpcija zahteva reorijentaciju molekula SDS-a sa ekspozicijom hidrofobnog ugljovodoninog niza ka vodi, što je energetski jako nepovoljno. Da bi se smanjila ova energetska barijera u krajeve ugljovodoninog niza ugrauje se ofloksacin katjon i okree svoj pozitivni kraj (protonovani piperazinski azot) ka vodi. Na taj nain u sistemu postoje dve vrste adsorbovanog ofloksacina: jedna koja je neposredno vezana za površinu adsorbensa (kompetitivno sa vodoninim jonom) i druga koja je vezana u hidrofobnom ugljovodoninom nizu, budui da je molekul ofloksacina u celini hidrofoban. Pozitivni CTAB kompetitivno spreava adsorpciju ofloksacina ali ga hidrofobno ne vezuje. U alkalnoj sredini površina aluminijum oksida naelektrisana je negativno usled adsorpcije hidroksidnog jona iz rastvora. Ofloksacin postoji u rastvoru kao negativno naelektrisani anjon. Dakle, bez prisustva PAM njegova adsorpcija bie smanjena u odnosu na neutralnu sredinu, zbog kompeticije sa hidroksidnim jonima. U prisustvu CTAB-a može se oekivati da e pozitivni CTAB poveati adsorpciju ofloksacin anjona u odnosu na 123 adsorpciju iz alkalne sredine bez PAM-a, jer se svojom pozitivnom cetiltrimetilamonijum grupom okree ka površini adsorbensa istovremeno interkalirajui anjone ofloksacina. U prisustvu SDS-a adsorpcija je smanjena zbog odbijanja negativnog kraja SDS-a i anjona ofloksacina. Infracrveni spektri (slika 3.) ukazuju da se apsorpcija karbonilne grupe koja se u slobodnom ofloksacinu nalazi izmeu 1670 cm-1 i 1690 cm-1 (zavisno od toga da li je u katjonskom ili neutralnom obliku) pomera prilikom adsorpcije na 1630 cm-1 što ukazuje na jaku interakciju sa adsorbensom, verovatno hemisorpciju. Najvee promene u ic spektrima vide se u oblasti 3200 – 2100 cm-1 gde u adsorbatu išezava uska traka na 2150 cm-1, a traka na oko 3000 cm-1 znatno se širi. DSC termogram pokazuje dehidrataciju u obliku širokog pika malog intenziteta do oko 1100C, a zatim se vide dva pika u oblasti do 2200C koji odgovaraju razlaganju ofloksacina, verovatno dekarboksilaciji na oko 1700C i otkidanju piperazina na oko 2100C. Nema bitne razlike u DSC termogramu istog ofloksacina i adsorbata. Model kojim se može objasniti adsorpcija u baznoj sredini, u prisustvu CTAB-a predstavljen je na slici 4. CTAB je adsorbovan zbog elektrostatikih interakcija sa negativnom površinom aluminijum oksida2. Hidrofobni anjon ofloksacina interkalira se u micele CTAB-a i na taj nain omoguava njihovu stabilizaciju jer okree ka vodi svoje negativno naelektrisane karboksilatne grupe. 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 0 10 20 30 40 50 60 C(oflo) (g/mL) Ex te nd o f a ds or pt io n (m mo l/g ) oflo oflo+SDS oflo+CTAB 0.1 M HCl Slika 2. Adsorpcija ofloksacina na aluminijum oksidu u kiseloj sredini 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 450,0 0,8 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24,4 cm-1 %T 3435,03 1637,85 826,87 667,85 639,77 619,94 591,02 573,19 535,94 505,95 495,34 479,24 467,53 Slika 3. IC spektri adsorbovanog ofloksacina na aluminujum oksidu 124 solution 1 mM NaOH x Al2O3 y H2O Slika 4. Šematski prikazana adsorpcija ofloksacina u prisustvu CTAB-a Zakljuak Površinski aktivne materije znatno utiu na adsorpciju ofloksacina na aluminijum oksidu. Poveanje obima adsorpcije primetno je u kiseloj sredini u prisustvu SDS-a, dok u baznoj sredini SDS negativno utie na adsorpciju, odnosno smanjuje je dok je CTAB poveava. Uticaj PAM na adsorpciju može se objasniti hidrofobnim interakcijama PAM-a i ofloksacina iji je molekul kao celina hidrofoban. The effect of surface active substances on ofloxacin adsorption on -alumina surface Surface active substances SDS and CTAB, significantly influence the adsorption of ofloxacin on the surface of aluminum oxide. The effect is pH dependent. Adsorption is of Freundlich type and is higher in neutral media with no presence of surfactants, while in acidic medium it is significantly enhanced in the presence of SDS. CTAB increases the adsorption in alkaline medium while SDS exerts opposite effect. The observed phenomena may be explained by lipophilic interactions between surfactants and ofloxacin. IR spectra and thermograms of adsorbate indicate strong interaction between alumina surface and neutral ofloxacin. Literatura: 1. G. Hoeffken, H. Lode, R. Wiley, T. Glatzel, D. Sievers, T. Olschewski, Rev. Infect. Dis. 10(Suppl. 1), 138 (1988); S. Lober, S. Ziege, M. Rau, G. Schreiber, A. Mignot, P. Koeppe, H. Lode, Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 43 (1999) 1067 2. P. urevi, M. Jeliki-Stankov, I. Lazarevic, Bull. Chem. Soc. Jpn, 74 (2001) 1261 P015-B2 Speciation in Aluminium(III) – Fluoroquinolone Family Members Solutions A. Ciric1, I. Lazarevic2, R. Jelic3, M. Jelikic-Stankov4, P. Djurdjevic1, 1Faculty of Science, Chemistry Department, P.O. Box 60, 34000 Kragujevac, Serbia 2Serbian Armed Forces – CBRN, 37000 Krusevac, Serbia 3 Faculty of Medicine, University of Kragujevac, S. Markovica 69, 34000 Kragujevac, Serbia 4Faculty of Pharmacy, Institute of Analytical Chemistry, Vojvode Stepe 450, 11000 Belgrade, Serbia Aluminium can be regarded as detrimental and in particular neurotoxic element. The iatrogenic aluminum originates mainly from aluminum-containing phosphate binders and aluminum-containing antacids administered to uremic patients or those with gastric or duodenal ulcer. Fluorinated quinolones are chemically weak substituted heterocyclic amino acids which primarily find use in the treatment of urinary and respiratory infections. Clinical investigations have shown that concomitant intake of fluoroquinoles and aluminum-containing compounds (eg. antacids) results in reduced maximal plasma concentration accompanied by the decrease in AUC. In our previous works we have investigated complex formation equilibria of aluminum with fluoruquinolones norfloxacin, ofloxacin, fleroxacin and moxifloxacin. Composition and stability of complex species were determined. The objective of this work was to assess the influence of fluoroquinolones, on bioavalibility of aluminum through computer-aided speciation calculation. The calculations were performed with the program Hyss2006 and the model for human plasma was taken from the literature. The main binding species for aluminium in blood are transferrin, albumin, citrate, phosphate and hydroxide. Very low concentration of fluoroquinolones in plasma do not affect the plasma levels of Al-citrate and Al-phosphate. At concentration levels of fluorquinolones higher than 0.02 mmol/L, the levels of citrate and phosphate complexes begins to decrease and in some time the concentration of Al-fluoroquinolone complexes increases. These complexes are charged and could be excreted by kidneys. Thus in case of toxic levels of aluminum in plasma the fluoroquinolone would be able to partly bind aluminum through chelation.