UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Rabia O. Eshkourfu SINTEZA, KARAKTERIZACIJA I BIOLOŠKA AKTIVNOST KOMPLEKSA Co(III) SA KONDENZACIONIM PROIZVODOM 2-ACETILPIRIDINA I DIHIDRAZIDA MALONSKE KISELINE doktorska disertacija Beograd, 2012 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Rabia O. Eshkourfu SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF Co(III) COMPLEX WITH CONDENSATION DERIVATIVE OF 2-ACETYLPYRIDINE AND MALONIC ACID DIHYDRAZIDE Doctoral Dissertation Belgrade, 2012 Mentor __________________________________ Redovni profesor dr Katarina AnĊelković, Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet Članovi komisije __________________________________ Redovni profesor dr Dušan Sladić, Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet __________________________________ Docent dr Maja Gruden-Pavlović, Univerzitet u Beogradu Hemijski fakultet __________________________________ Nauĉni saradnik dr Miroslava Vujĉić Univerzitet u Beogradu IHTM Datum odbrane ______________2012. Zahvalnica Doktorska disertacija je uraĊena na Katedri za Opštu i neorgansku hemiju Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Deo istraţivanja uraĊen je na Institutu za onkologiju i radiologiju u Beogradu. Iskreno se zahvaljujem dr Katarini AnĊelković koja je predloţila temu disertacije i rukovodila njenom izradom. Njena nesebiĉna pomoć i strpljenje bili su presudni da ova disertacija ugleda svetlost dana. Veliku zahvalnost dugujem dr Dušanu Sladiću, redovnom profesoru, dr Maji Gruden-Pavlović, docentu i dr Mirjani Vujĉić, nauĉnom saradniku IHTM-a na pomoći i korisnim sugestijama tokom izrade i pisanja disertacije. Posebno se zahvaljujem dr Dušanki Radanović, nauĉnom savetniku IHTM-a na savetima, velikom strpljenju i korisnim diskusijama. Ĉlanovima istraţivaĉke grupe dr Katarine AnĊelković, mr Maji Šumar Ristović, Milici Milenković, Boţidaru Ĉobeljiću i dr Tamari Todorović dugujem zahvalnost za nesebiĉnu pomoć tokom izrade, a naroĉito tokom pisanja disertacije na srpskom jeziku. Zahvaljujem se svojoj zemlji Libiji koja mi je omogućila da doktorsku disertaciju uradim u Republici Srbiji. Hvala mojoj porodici na podršci i razumevanju. SINTEZA, KARAKTERIZACIJA I BIOLOŠKA AKTIVNOST KOMPLEKSA Co(III) SA KONDENZACIONIM PROIZVODOM 2-ACETILPIRIDINA I DIHIDRAZIDA MALONSKE KISELINE REZIME U ovom radu opisana je sinteza, karakterizacija i biološka aktivnost kompleksa kobalta(III) sa kondenzacionim proizvodom 2-acetilpiridina i dihidrazida malonske kiseline. TakoĊe, opisana je sinteza i karakterizacija organske soli 2,2 -{1,1 -[2,2 - oksalilbis(hidrazin-2-il-1-iliden)]dietilidin}dipiridinijum diperhlorata dihidrata. Sintetisane supstance su okarakterisane u rastvoru NMR spektroskopijom, a u ĉvrstom stanju rendgenskom strukturnom analizom. U dobijenom kompleksu kobalta(III) kompleksni katjon [Co2L22] 2+ poseduje dinuklearnu strukturu dvostrukog heliksa u kojoj je svaki Co(III) centar koordinovan preko dve tridentatne N2O helatne jedinice iz oba H2L2 liganda, formirajući oko oba Co(III) oktaedarsko okruţenje. Citotoksiĉni potencijal kompleksa je uoĉen na ćelijama epitelnog kancera dojke (MDA-361) sa IC50 vrednošću 50,9 µM. Slaba citotoksiĉna aktivnost je uoĉena na EA.hy926 i B16 ćelijskim linijama sa IC50 vrednošću 258 µM odnosno 221 µM. Kompleks pokazuje slabu citotoksiĉnost na MRC-5 ćelije. H2L2 ligand pokazuje umerenu aktivnost na sve ćelijske linije osim na K562 i MDA-361 ćelije, a najbolja aktivnost je uoĉena na ćelijama mišijeg melanoma B16. K562 ćelije su rezistentne na kompleks i ligand, štaviše kompleks stimuliše njihov rast. Ćelije epitelnog kancera dojke MDA-361 su korišćene u eksperimentima u kojima je ispitan uticaj kompleksa [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH na progresiju ćelijskog ciklusa i indukciju ćelijske smrti. Posle 24 h inkubacije ćelija tretiranih kompleksom koncentracije IC50 i 2 x IC50 nije došlo do znaĉajne promene u zastupljenosti ćelija u G1, S i G2/M fazi. Uoĉen je jasan sub-G1 pik koji potiĉe od hipodiploidnih ćelija koje sadrţe fragmentisane molekule DNA što ukazuje na ćelije u kasnoj fazi apoptoze. Apoptotiĉki potencijal kompleksa [Co2L22] 2+ na MDA-361 ćelijama je ispitan i pomoću Annexin V-FITC / PI testa. Ispitivani kompleks dovodi do znaĉajanog povećanja procenta ćelija u ranoj fazi apoptoze (28,18 %) u odnosu na kontrolne ćelije (5,64 %). Interakcije kompleksa sa DNA iz telećeg timusa (CT-DNA) dovode do plavog pomeranja i hiperhromizma u UV-Vis spektrima. Vrednost konstante vezivanja Kb=4.2×105 M−1 ukazuje na vezivanje kompleksa u brazdi DNA. Ključne reči: Dinuklearni kompleks kobalta(III), Kristalna struktura, Apoptoza, Interakcije sa DNA Naučna oblast: Hemija Uža naučna oblast: Neorganska hemija UDK broj: 546.733 SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF Co(III) COMPLEX WITH CONDENSATION DERIVATIVE OF 2-ACETYLPYRIDINE AND MALONIC ACID DIHYDRAZIDE SUMMARY In this work the synthesis, characterization and biological activity of cobalt(III) with the condensation product of 2-acetylpyridine and malonic acid dihydrazide are presented. Furthermore the synthesis and characterization of organic salts 2,2 -{1,1 -[2,2 - oxalylbis(hydrazin-2-yl-1-ylidene)]diethylidyne}dipyridinium bis(perchlorate) dehydrate have been shown. Obtained substances were characterized in solution by NMR spectroscopy and in solid- state by the X-ray structure analysis. The complex cation [Co2L22] 2+ possesses a dinuclear double-stranded helicate structure in which each of Co(III) center is coordinated by two tridentate N2O chelating units from different ligands. Each Co(III) center thus are in a six-coordinated pseudooctahedral environment. Cytotoxic potential was observed for the complex on the epithelial breast cancer (MDA- 361) cell line, where the IC50 was 50.9 μM. The weak cytotoxic activity of the complex was observed with EA.hy926 and B16 cell line, reaching IC50 values at 258 μM and 221 μM, respectively. The complex revealed low cytotoxicity against MRC-5 cells. The corresponding H2L2 ligand also showed moderate cytotoxic activity against all cell lines, except K562 and MDA-361 cells, with the highest potency on the murine melanoma B16 cell line. K562 cells were resistant to both complex and ligand, the complex even stimulating cells to grow. Epithelial breast cancer (MDA-361) cell lines were used in the experiments where we examinated influence of the complex [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH on cell cycle progression and induction of cell death. After 24 h of incubation of cells treated with the concentration of IC50 and 2× IC50, the investigated complex gave no significant changes in the percentage of cells in the G1, S and G2/M phases. There is a clearly determined sub-G1 peak in the histograms of treated hypodiploid cells, containing fragmentized DNA molecule, indicating that such cells are in late apoptotic phase. Apoptosis of MDA-361 cells treated with investigated complex was evaluated by Annexin V–FITC / PI test. The investigated complex induced apoptosis, the early apoptotic cells comprising 28.18%, compared to 5.64% of control cells in the same phase. The interaction of the complex with calf thymus DNA (CT-DNA) was monitored by blue shift and hyperchromism in the UV–vis spectra. The observed intrinsic binding constant (Kb=4.2×105 M−1) together with structural analysis of the complex indicate the groove binding. Keywords: Dinuclear cobalt(III) complex, Crystal structure, Apoptosis, DNA binding Area of science: Chemistry Sub-area of science: Inorganic chemistry UDC number: 546.733 Sadržaj 1. UVOD ........................................................................................................................... 1 LITERATURA ............................................................................................................. 2 2. OPŠTI DEO .................................................................................................................. 3 LITERATURA ........................................................................................................... 33 3. EKSPERIMENTALNI DEO ...................................................................................... 41 3.1 Sinteza liganada i kompleksa ............................................................................ 41 3.1.1. Sinteza liganda N', N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]etandihidrazida (H2L1) .................................................................................................................. 41 3.1.2. Sinteza liganda N', N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]propandihidrazida (H2L2) .................................................................................................................. 42 3.1.3. Sinteza 2,2'-{1,1'-[2,2'-Oksalilbis(hidrazin-2-il-1-iliden)]dietilidin} dipiridinijum-diperhlorata dihidrata (1)............................................................... 43 3.1.4. Sinteza kompleksa [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH (2) ....................... 43 3.2. Merenja............................................................................................................. 44 3.3. NMR spektroskopija ........................................................................................ 44 3.4. Rendgenska strukturna analiza ......................................................................... 45 3.5. Biološka aktivnost ............................................................................................ 47 3.5.1. Test na raĉićima vrste Artemia Salina ....................................................... 47 3.5.2. Ispitivanje citotoksiĉne aktivnosti ............................................................. 47 3.5.2.1. In vitro metode odreĊivanja citotoksiĉne aktivnosti ........................... 48 3.5.3. Analiza distribucije faza ćelijskog ciklusa protoĉnom citometrijom ........ 49 3.5.4. Analiza ćelijske smrti ................................................................................ 49 3.5.5. Ispitivanje interakcija kompleksa 2 sa DNA sisara ................................... 50 3.5.6. Ispitivanje interakcija kompleksa [Co2L22] 2+ sa plazmidnom DNA ......... 50 3.5.7. Antimikrobna aktivnost ............................................................................. 51 LITERATURA ........................................................................................................... 52 4. REZULTATI I DISKUSIJA ....................................................................................... 53 4.1 Opis kristalne strukture soli (1) ......................................................................... 53 4.2 Opis kristalne strukture kompleksa (2) ............................................................. 60 4.3 NMR spektroskopija (2) .................................................................................... 62 4.4 Biološka aktivnost kompleksa (2) ..................................................................... 63 4.5 Citotoksiĉna aktivnost kompleksa (2) ............................................................... 63 4.6 Ćelijski ciklus i apoptoza .................................................................................. 65 4.7. Ispitivanje interakcija kompleksa (2) sa CT-DNA ........................................... 67 4.8 Ispitivanje interakcija kompleksa (2) sa plazmidnom DNA ............................. 70 LITERATURA ........................................................................................................... 71 5. ZAKLJUĈAK ............................................................................................................. 73 BIOGRAFIJA ................................................................................................................. 75 1 1. UVOD Već duţi vremenski period u ţiţi našeg interesovanja su kompleksi d-metala sa ligandima koji predstavljaju kondenzacione proizvode 2-acerilpiridina i dihidrazida oksalne odnosno malonske kiseline [1]. Kompleksi d-metala sa ovakvim ligandima imaju interesantne strukturne karakteristike koje su uzrok razliĉitim aplikativnim svojstvima nagradjenih supstanci [2–5]. Treba znati da gore pomenuti ligandi predstavljaju N-heteroaromatiĉne dihidrazone, sa velikim brojem potencijalnih ligatorskih atoma, preko kojih se moţe izvršiti koordinacija uz formiranje razliĉitih geometrija oko centralnog metalnog jona pri variranju uslova hemijske reakcije. Takodje, ovi ligandi mogu se naći u neutralnom, monoanjonskom ili dianjonskom obliku, što dovodi do razliĉitog naelektrisanja kompleksnih jedinki. Ovakvi ligandi, s obzirom na svoju strukturu, mogu se vezati za više metalnih centara gradeći polinuklearne komplekse. Razlike u strukturi kompleksa sa ovim tipom liganada usmerile su izuĉavanje svojstava dobijenih supstanci, u prvom redu kao magnetnih ili bioloških materijala, sa ciljem uspostavljanja veze struktura→svojstva [5–7]. Kako su do sada prouĉavani iskljuĉivo kompleksi dvovalentnih metala sa kondenzacionim proizvodima 2-acetilpiridina i dihidrazida oksalne, odnosno malonske kiseline kao ligandima [1–7], cilj ovoga rada je bila sinteza, karakterizacija i potencijalna primena kompleksa Co(III) kao prvog u nizu metala oksidacionog broja tri. 2 LITERATURA 1. K. AnĊelković, D. Sladić, A. Bacchi, G. Pelizzi, N. Filipović, M, Rajković, Transition Met. Chem. 30(2) (2005) 243. 2. S. Sen, C.R. Choudhury, P. Talukder, S. Mitra, M. Westerhausen, A.N. Kneifel, C. Desplanches, N. Daro, J-P. Sutter, Polyhedron 25 (2006) 1271. 3. N. Filipović, A. Bacchi, M. Lazić, G. Pelizzi, S. Radulović, D. Sladić, T. Todorović, K.AnĊelković, Inorg.Chem.Comm.11 (2008) 47. 4. T. Todorović, U. Rychlewska, B. Warżajtis, D. Radanović, N. Filipović, I. Pajić, D. Radanović, K. AnĊelković, Polyhedron 28 (2009) 2397. 5. B. Ĉobeljić, B. Warţajtis, U. Rychlewska, D. Radanović, V. Spasojević, D. Sladić, R. Eshkourfu, K. Andjelković, J. Coord. Chem. 65(2012) 655. 6. M. Lazić, S. Radulović, T. Todorović, D. Sladić, Ţ. Tešić, K. AnĊelković, Mater. Sci. Forum 518 (2006) 513. 7. M. Vujĉić, M. Lazić, M. Milenković, D. Sladić, S. Radulović, N. Filipović, K. AnĊelković, J. Biochem. Mol. Toxicol. 25, (2011) 175. 3 2. OPŠTI DEO Hemija kompleksa sa bis-acil-/aroil-hidrazonima je veoma bogata. U zavisnosti od centralnog metalnog jona isti ligandi ovoga tipa pokazuju raznovrsnost u naĉinu koordinacije što dovodi do strukturne raznovrsnosti nagraĊenih jedinjenja (od malih do visoko polimerizovanih molekula) [1]. U Tabeli 1 prikazani su ligandi ovoga tipa kao i sa njima nagraĊeni kompleksi ĉija je strukturna karakterizacija potpuno uraĊena. 4 Tabela 1. Derivati bis-acil-/aroil-hidrazona i njihovi kompleksi. Strukturna formula Oznaka* Odgovarajući kompleks Ref. H5L1 Cu3(HL1)Cl2·H2O Cu3(HL1)(SO4)·8H2O [Cu6(HL1)2(DMSO)5(EtOH)(H2O)2](ClO4)2·2H2O 2,3 H4L2 Cu3L2Cl2·CHCl3·H2O Cu3L2(NO3)2·2H2O [Cu3L2(SO4)(H2O)3]2 2 H4L3 Cu2L3py4·2H2O [Cu2L3(morfolin)4(MeOH)] 4 H4L4 Cu2L4py3·4H2O 4 5 H2L5 [Zn4(H2L5)4](NO3)8 5 H2L6 [Pb2L6(AcO)2] 6 H4L7 Cu2(L7)py2·2H2O Cu2(L7)py3·4H2O (Sn(R1)2)2L7 R1 = Me, n-Bu 4 7 H2L8 [Zn4(H2L8)4](NO3)8 5 6 H2L9 [Cd2(H2L9)2Cl4(DMF)2] [Ni4(L9)4] 8 9 H4L10-n Cu2L10-2·2py·3MeOH Cu2L10-2·2py·MeOH Cu2L10-3·2py·3MeOH Cu2L10-4·2py·4MeOH [Cu2L10-4·4py]·py 10 H4L11-n [{Cu2L11-n}n] [{Cu2(H2L11-n)Cl2}n] [{Cu2(H2L11-n)}n](ClO4)2n [Cu2(H2L11-1)(H2O)2](ClO4)2·3H2O [{Cu2(H2L11-4)(EtOH)2}n](ClO4)2n·m(EtOH) [Cu2(H2L11-n)xH2O]·yH2O; n = 0 - 4 [Cu2(H2L11-n)Cl2xH2O]·yH2O; n = 0 - 4 11 12 7 [(Et2Sn)2(L11-1)] Na2[Ln(H2L11-1)2Cl]·nH2O Ln = Y, La, Ce, Nd, Eu, Dy, Er, Lu [(MoO2)(L11-1)(DMSO)2] 13 14 15 H4L12-n [(UO2)4(L12-n)2(H2O)4]; n = 1 - 4 [{Fe(H2L11-4)}2]Cl2·2H2O [Fe(H2L11-8)]·2,5H2O 16 17 H2L13 [Cd2(H2O)2(H2L13)2](ClO4)4·4H2O 18 H4L14 [Ni2(L14)(py)2] 19 8 H4L15 [Ni4(L15)2(CH3OH)4]·1,5CH3OH 20 H4L16 [Cu3(L16)(DMSO)5(H2O)](ClO4)2·H2O UO2(H2L16)(EtOH)2 (UO2)2(L16)(H2O)4 {UO2(H2O)2}2{UO2(CH3COO)2}(L16) 21 22 H6L17 [Cu3(H2L17)(H2O)3(CH3OH)(NO3)]NO3 23 H2L18 Ln2(H2L18)(pikrat)6·n(iPrOH)·mH2O Ln = Y, La, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho (n = 2, m = 4) Ln = Er, Tm, Yb (n = 0, m = 2) 24 H2L19 [Ni(L19)] 25 9 H4L20 [Cu36(L20)12(OH)8] 16+ 26 H3L21 [Cu2(H2L21)(OH)(NO3)(H2O)]NO3·2H2O [Cu2(H2L21)(OH)(H2O)2](ClO4)2·H2O 27 H2L22 [Mn16(L22)8(OH)8](NO3)8·15H2O [Mn16(L22)8(OH)8]( ClO4)8·15H2O 27 H4L23 [Cu2(L23)H2O]x [Cu2(H2L23)Cl2]x {[Cu2(H2L23)](NO3)2}x 28 10 H4L24 {[Cu2(L24)( H2O)0,5]·1,5H2O}x [Cu2(H2L24)Cl2]x {[Cu2(H2L24)](NO3)2}x 28 H2L25-1 R = CH3 [Co4(L25-1)4]·8MeOH·16H2O [Ni4(L25-1)4]·0,5Et2O·4H2O [Ni4(L25-1)4]·18H2O [Zn4(L25-1)4]·18H2O 29 H2L25-2 R = C7H15 [Fe4(L25-2)4]·4H2O [Co4(L25-2)4]·4H2O [Ni4(L25-2)4]·4H2O [Cu4(L25-2)4]·2H2O [Zn4(L25-2)4]·2H2O 29 H2L25-3 R = C6H5 [Ni4(H2L25-3)4](ClO4)8·12H2O [Zn8(H2L25-3)8](BF4)16·7C6H6·5CH3CN·5H2O [Co4(HL25-3)4](BF4)4·7CH3CN [Ni4(L25-3)2,5(HL25-3)1,5](NO3)1,5·MeOH·0,5Et2O·4H2O 29 11 H2L26 [Mn(L26)(H2O)2]·7H2O [Co(H2L26)(H2O)2]Cl2 [Sn(L26)Cl2] [Ni(H2L26)Cl2] [Zn(H2L26)(H2O)2]Cl2 [Zn(L26)]2·2CHCl3·2H2O [Cu4(L26)2Cl4] 30 31 32 33 34 H2L27 [SnEt2(H2L27)]2[SnEt2Cl3]Cl3 35 H2L28 [SnEt2(H2L28)]2[SnEt2Cl3]Cl3·2H2O 35 H4L29 [Fe(H4L29)Cl2] [Fe2L29Cl2(EtOH)2] [Ni(H4L29)(H2O)2](NO3)2 [Cd(H4L29)Cl2]·CHCl3·CH3OH [Mn(H2L29)(py)2] [Co(H2L29)(py)2] 36 37 38 39 40 12 [Ni2(H2L29)2]·CH2Cl2 [Ni2(H2L29)2(py)2]·CH2Cl2 [Sn( n Pr)2H2L29] [Mn(H2L29)(H2O)2]·DMF 41 42 H2L30 [Mn(H2L30)(CH3OH)Cl]Cl·H2O M(H2L30) M = Mn(II), Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II) {[Mn(L30)]}n [Ni(L30)]2 [Mn(H2L30)(Cl)(H2O)]Cl·2H2O [Cd(H2L30)Cl2]·H2O [SnPh2(L30)] [SnBuCl(L30)] 43 42 44 45 46 H2L31 [Pd(L31)] [M(H2L31)(H2O)Cl]Cl M = Co(II), Ni(II), Zn(II), Cu(II), Mn(II) [Y(L31)(H2O)(NO3)] [Er(L31)(H2O)(NO3)] {[Pr(L31)(HL31)](H2O)2((CH3)2SO)} [Sm(L31)(HL31)](H2O)2((CH3)2SO)} Ln(L31); Ln = Ce, Nd, Gd, Dy 47 48–50 51 52 13 [ReCl(L31)PPh3] 53, 54 H2L32 Co(L32) Co(H2L32)Cl2·4H2O [Ni(L32)]2 Ni(H2L32)Cl2·4H2O [Cu(L32)]2 [Zn(L32)]2 Zn(H2L32)Cl2·4H2O 55 H2L33 [(CH3)2Sn(HL33)]2[(CH3)2SnCl4] 56 H2L34 [Fe(HL34)Cl2] [Fe(L34)(H2O)2]ClO4·3H2O 57 58 H2L35 [Fe(L35)(H2O)]2O·3H2O [Ni(H2L35)2](ClO4)2·MeOH 59 60 14 H2L36-1 R1=OMe, R2=R3=H H2L36-2 R1=OC12H25, R2=R3=H H2L36-3 R1=OMe, R2=OC12H25, R3=H H2L36-4 R1=R2=R3= =OC12H25 [Ni(L36)] 61 H2L37-1 R=C7H15 H2L37-2 R=Ph [Pd2(L37)2] 62 15 H5L38 Sn(H5L38)(C2H5)2Cl2·3H2O Sn(H5L38)(C6H5CH2)2Cl2 Sn(H4L38)(C6H5)2Cl·2H2O [Sn(H3L38)(C6H5)2]·DMSO [Sn(H3L38)(C6H5)2]·DMSO 63 H3L39 Sn(H2L39)(C2H5)2Cl·3H2O Sn(H2L39)(n-C4H9)2Cl·H2O Sn2(HL39)(C6H5CH2)4Cl2·2H2O Sn2(H2L39)(C6H5)3Cl4 63 H2L40 [Sn(n-C4H9)2L40] [Pb(C6H5)2L40] [M(HL40)(AcO)2]·nH2O M = La(III), Gd(III); n = 2 M = Eu(III), n = 3; M = Tb(III), n = 5 [M(H2L40)(NO3)2]NO3· Y M = La(III), Y = EtOH; M = Gd(III), Eu(III), Tb(III); Y = 2H2O 64 65 16 H2L41 [M(H2L41)(NO3)2]NO3· Y M = La(III), Gd(III), Eu(III); Y = / M = Tb(III), Y = 1,5H2O 65 H3L42 [Cu3(L42)2] [Ni3(L42)2(H2O)6] 66 H3L43 [Cu2(L43)(μ-OMe)(MeOH)2]·MeOH 67 17 H3L44 [Ho2(H2L44)3(H2O)](NO3)2(OH)·3.5H2O [Lu2(H2L44)3](OH)3 68 H3L45 [Cu2(H2L45)(μ-C2H5O)(CH3OH)](ClO4)2 [Cu2(H2L45)(μ-Br)(CH3OH)](ClO4)2 [Cu2(H2L45)(μ-MeO)(ClO4)](ClO4)·EtOH [Cu2(H2L45)(μ-N3)](ClO4)2·1.5EtOH [Cu2(H2L45)(μ-C3H3N2)](ClO4)2·2H2O C3H3N2 = anjon imidazola [Zn2(HL45)(CH3COO)2]·CH3CH2OH 69 70 71 18 H5L46 [Ln2(H4L46)3] 3+ Ln = Y, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Gd, Dy, Er, Yb 72 H3L47 [Pd2(L47)(C4H2NO2)] C4H2NO2 = maleimid anjon [Pd2L47(CH3COO)] [Pd2L47(OH)] 73 74 19 H2L48 {M(L48)}n M = Co, Ni, Zn, Cd, Cu, Mn {M(H2L48)Cl2}n M = Co, Ni, Cd, Mn Ln(H2L48)2Cl3 Ln(III) = La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu,Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu 75 76 H2L49 [M2(L49)(phen)2]Cl2 [(M2(L49)2)n] M = Cu(II), Ni(II) 77 20 H2L50 [M2(L50)(phen)2]Cl2 [(M2(L50)2)n] M = Cu(II), Ni(II) 77 H6L51 {[Cu2(H4L51)(Hpz)2](ClO4)2}n; Hpz = pirazol {[Cu2(H4L51)(Him)2](ClO4)2}n; Him = imidazol 78 H6L52 {[Cu2(H4L52)(Hpz)2](ClO4)2}n 78 L53 [Cu2(L53)(terpy)2](CF3SO3)4 terpy = terpiridin 79 21 L54 [Cu2(L54)(terpy)2](CF3SO3)4 79 * Hn; n = broj kiselih atoma vodonika 22 Kompleksi jona metala sa strukturno sliĉnim polidentatnim ligandima dihidrazonskog tipa kao što su kondenzacioni derivati 2-acetilpiridina i dihidrazida oksalne ili malonske kiseline ispitivani su sa strukturnog aspekta [18, 80, 81], u cilju boljeg razumevanja njihovih magnetnih osobina [80] i biološke aktivnosti [18, 81, 82]. Strukturne razlike koje mogu nastati pri koordinovanju polidentatnog liganda N',N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]etandihidrazida (H2L1) ispitivane su u sluĉaju kompleksa bakra(II) i nikla(II) [80]. U reakciji Cu(OAc)2 H2O sa H2L1 u smeši 2-propanol/voda (5:1) dobijen je binuklearni kompleks {[Cu2(L1)(CH3COO)2] 8H2O}n (Slika 1) u kome ligand L1 u transoidnoj orijentaciji povezuje metalne centre preko oksamido mosta. U ovom kompleksu ligand L1 se ponaša kao bis-tridentatni ligand, to jest, L1 se koordinuje sa dva bakar(II) jona preko dva seta N2O donorskih atoma pri ĉemu nastaju dva petoĉlana i dva šestoĉlana helatna prstena. Binuklearne podjedinice su povezane preko µ1,1-acetato mostova što vodi ka formiranju 1-D polimera. Svaki Cu(II) jon je koordinovan sa piridinskim i hidrazonskim N-atomima i kiseonikovim atomom iz L1 i dva kiseonikova atoma iz acetatnog anjona. Uopšteno, u sluĉaju pentakoordinovanih jona metala distorzija strukture od idealne trigonalno-bipiramidalne (TBP) do kvadratno-piramidalne (SP) moţe se proceniti upotrebom Addison-ovog indeksa distorzije [83]: = ( )/60 , gde su i dva najveća ugla oko metalnog centra. Vrednosti za su 1,0 za idealnu TBP geometriju i 0,0 za idealnu SP geometriju. U kompleksu {[Cu2(L1)(CH3COO)2] 8H2O}n geometrija bakra(II) je kvadratno- piramidalna ( = 0,016) sa ĉetiri kratke veze u ravni Cu(1)–N(1) (1,992(3) Å), Cu(1)–N(3) (1,923(3) Å), Cu(1)–O(1) (2,017(2) Å) i Cu(1)–O(2) (1,950(2) Å) i jednom dugom vezom Cu(1)–O(2A) (2,401(2) Å) koja se gradi izmeĊu O(2A) iz drugog acetato liganda i Cu(II) jona. 23 Slika 1. Prikaz binuklearnih podjedinica povezanih preko acetato mostova u polimernom {[Cu2(L1)(CH3COO)2] 8H2O}n kompleksu . Simetrijski kodovi: A (–x + 1, –y + 1, –z), B (–x + 1, y, –z + 1/2) and C (x, –y + 1, z + 1/2). Tetrakoordinovani [Ni(L1)] H2O kompleks (Slika 2) je dobijen na sliĉan naĉin kao i {[Cu2(L1)(CH3COO)2] 8H2O}n kompleks polazeći od Ni(OAc)2 4H2O umesto Cu(OAc)2 H2O. U ovom kompleksu ligand L1 se koordinuje sa niklom(II) u cisoidnom obliku preko N4 donorskih atoma pri ĉemu nastaje mononuklearni kompleks distorgovane kvadratno-planarne geometrije u kome L1 funkcioniše kao tetradentatni ligand (Slika 2). Fleksibilni ligand (L1) se reorijentiše iz transoidne u cisoidnu formu i obrnuto neometanom rotacijom oko C–C veze, kao što je to pokazano rendgenskom strukturnom analizom u sluĉaju {[Cu2(L1)(CH3COO)2] 8H2O}ni [Ni(L1)] H2O kompleksa. Odstupanje od planarnosti liganda L1 u [Ni(L1)] H2O kompleksu moţe se videti iz vrednosti pseudo-torzionog ugla [N(1)–N(3)–N(6)–N(4)] koordinovanih Lewis-ovih baza koji iznosi –23,3 . Odstupanje Ni(1) od proseĉne ravni N(1), N(3), N(4), N(6) iznosi 0,029 Å. Uglovi oko Ni(1) u šestoĉlanim helatnim prstenovima [N(1)–Ni(1)–N(3) = 91,79(8) i N(6)–Ni(1)–N(4) = 91,45(8) ] imaju normalne vrednosti. Ugao izmeĊu proseĉnih ravni piridinskih prstenova iznosi 119,8 . Torzioni 24 uglovi N(1)–C(5)–C(6)–N(2) i N(4)–C(12)–C(10)–N(5) koji iznose 20,9 i 12,4 , navedenim redosledom, su takoĊe mera uvijenosti piridinskih prstenova. Uzrok distorzije Ni(1) od idealne kvadratno-planarne geometrije je najverovatnije napon prouzrokovan sternim smetnjama izmeĊu vodonikovih atoma koji se nalaze na C(1) i C(16) atomima. Ova ĉinjenica vodi ka formiranju hiralnog molekula, meĊutim, imajući u vidu kristalizaciju [Ni(L1)] H2O kompleksa u centrosimetriĉnoj prostornoj grupi (P21/c) i izomeri grade racemat u ĉvrstom stanju. Slika 2. ORTEP dijagram [Ni(L1)] H2O kompleksa. Polifunkcionalni ligandi koji su dobijeni u kondenzacionim reakcijama u kojima se eliminišu mali molekuli, kao na primer voda, etanol i drugi mogu se lako hidrolizovati prilikom reakcije sa nekim jonima prelaznih metala u rastvaraĉima koji sadrţe malu koliĉinu vode. Tako na primer u reakciji H2L1 sa Cu(NO3)2 3H2O ili Cu(ClO4)2 6H2O u MeOH/H2O hidroliza na hidrazidnom fragmentu je dovela do formiranja binuklearnog kompleksa sa 2-acetilpiridin-hidrazonom proseĉne formule [(C7H9N3)2Cu2(C2O4)(H2O)2(NO3)2] u kome oksalato anjon funkcioniše kao most izmeĊu mononuklearnih podjedinica [25] (Slika 3). Sliĉno tome, hidroliza H2L1 liganda se takoĊe dogodila u reakciji sa Fe(ClO4)3 6H2O u vodi uz simultanu redukciju Fe(III) do Fe(II) pomoću oksalato anjona pri ĉemu je nastao mononuklearni kompleks Fe(II) sa 2-acetilpiridin-hidrazonom [84]. Tri liganda koordinovana sa gvoţĊem(II) formiraju 25 meridijalne geometrijske izomere (Slika 4) koji kristališu kao racemska smeša i izomera u centrosimetriĉnoj prostornoj grupi C2/c. Slika 3. (a) Prikaz dva dinuklearna fragmenta (Cu3 i Cu4) u kompleksu [(C7H9N3)2Cu2(C2O4)(H2O)2(NO3)2]. Neoznaĉene mononuklearne podjedinice generišu se operacijom simetrije 1–x, 1–y, –1–z; (b) Prikaz trećeg dinuklearnog fragmenta (Cu1, Cu2) u [(C7H9N3)2Cu2(C2O4)(H2O)2(NO3)2] kompleksu. 26 Slika 4. Prikaz [Fe(H2L1 )3] 2+ katjona u [Fe(H2Ll )3](ClO4)2 kompleksu. Strukturno sliĉan, ali nešto fleksibilniji ligand zasnovan na dihidrazidu malonske kiseline N',N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]propandihidrazid (H2L2) sa M(II) jonima (M(II) = Ni, Zn i Cd) gradi binuklearne komplekse koordinacionog broja šest {[Ni2(H2L2)2](ClO4)4, [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3 i [Zn2(H2L2)2](BF4)4[81]} ili sedam {[Cd2(H2O)2(H2L2)2](ClO4)4 4H2O [18]}, u kojima se dva liganda koordinuju sa dva metalna centra u bis-tridentatni naĉin (Slike 5–7). U kompleksima [Ni2(H2L2)2](ClO4)4, [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3, [Zn2(H2L2)2](BF4)4 i [Cd2(H2O)2(H2L2)2](ClO4)4 4H2O koordinacija svakog liganda je postignuta preko dva N2O donorska seta što vodi ka formiranju ĉetiri petoĉlana helatna prstena. Jedan od pokazatelja oktaedarskog napona je proseĉna Oh vrednost definisana kao proseĉno odstupanje 12 oktaedarskih uglova od idealne vrednosti (90 ). Za binuklearne kompleksne katjone[Ni2(H2L2)2] 4+ i [Ni2(HL2)(H2L2)] 3+ ustanovljene proseĉne Oh vrednosti su od 8,9 do 9,6 . Jezgro binuklearnih kompleksa [Ni2(H2L2)2](ClO4)4, [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3, i [Cd2(H2O)2(H2L2)2] (ClO4)4 4H2O predstavlja dvanaestoĉlani makrocikliĉni prsten (M(II)–O–C–CH2–C–O–)2 (M(II) = Ni, Zn i Cd). U oktaedarskim binuklearnim kompleksima Ni(II) dva NNO helatna sistema su meĊusobno okomito postavljeni, kao što se to moţe videti iz vrednosti diedarskih uglova koji iznose 83,6 i 82,5 u 27 [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 i 83,7 i 85,6 u [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3, dok u kompleksu [Cd2(H2O)2(H2L2)2](ClO4)4 4H2O, koordinacionog broja sedam, ovi uglovi imaju znatno niţe vrednosti (70 i 75 ). Slika 5. Prikaz bimetalnog kompleksnog katjona [Ni2(H2L2)2] 4+ . Termalni elipsoidi su prikazani sa 40% verovatnoće. Vodonikovi atomi vezani za ugljenikove atome nisu prikazani radi preglednosti. Vodonikovi atomi vezani za azotove atome su prikazani radi ilustracije neutralne forme liganda. 28 Slika 6. Prikaz bimetalnog kompleksnog katjona [Ni2(HL2)(H2L2)] 3+ . Termalni elipsoidi su prikazani sa 40% verovatnoće. Vodonikovi atomi vezani za ugljenikove atome nisu prikazani radi preglednosti. Vodonikovi atomi vezani za azotove atome su prikazani radi ilustracije neutralne i monodeprotonovane forme liganda. Slika 7. Prva sfera interakcija izmeĊu kompleksnog katjona [Cd2(H2O)2(H2L2)2] 4+ i okolnih anjona i nekoordinovanih molekula vode. 29 Frakcionom kristalizacijom taloga (iz DMSO/EtOH rastvora) koji je dobijen u reakciji H2L2 sa Ni(ClO4)2 6H2O u EtOH odvojena su dva razliĉita Ni(II) kompleksa kao zeleni {[Ni2(H2L2)2](ClO4)4} i braon {[Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3} kristali. Zeleni kristali imaju slojevitu strukturu (Slika 8), dok braon kristale karakteriše kanalna struktura (Slika 9). Slika 8. Slojevita struktura kristala kompleksa [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 posmatrana duţ c pravca. Prikazane su samo glavne komponente neureĊenih molekula. DMSO molekuli i perhloratni anjoni se nalaze u sendviĉu izmeĊu (100) katjonskih slojeva. 30 Slika 9. Prikaz kristalne strukture kompleksa [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3. Prazni kanali se nalaze u onom delu kristala gde je koncentrisana većina neureĊenih molekula rastvaraĉa (DMSO i etanol). Obe vrste kristala gube kristalnu formu kada se izloţe vazduhu, mada su se braon kristali pokazali stabilnijim. Kada se [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 kompleks rastvori u MeCN, DMF ili DMSO boja rastvora se praktiĉno trenutno menja od zelene do braon. Pored toga, iz rastvora dobijenog rastvaranjem zelenih kristala, dobijaju se oba kompleksa nikla(II) (zeleni i braon). Kompleks [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 kristališe prvi. Predloţeni mehanizam formiranja [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3 kompleksa polazeći od [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 dat je jednaĉinom (1). Kao što je napomenuto, nakon rastvaranja kompleksa [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 u DMSO, boja rastvora se relativno brzo menja od zelene do braon. Elektronski apsorpcioni spektar ovako dobijenog braon rastvora je sliĉan po obliku i poloţaju apsorpcionog maksimuma spektru kompleksa [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3 (Slika 10). Ovo podrţava pretpostavku da se kompleks [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 lako transformiše u stabilniji kompleks [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3. Tri spinski dozvoljena prelaza [ 3 A2g 3 T2g (F); 3 A2g 3 T1g (F) i 3 A2g 3 T1g (P)] se oĉekuju za oktaedarske Ni(II) komplekse. MeĊutim, kompleks [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3 pokazuje samo jednu asimetriĉnu traku u bliskoj infracrvenoj 31 oblasti na 854 nm. Apsorpcione trake koje se oĉekuju u vidljivoj i UV oblasti su maskirane CT prelazima ili prelazima u okviru liganada. U reakciji Zn(BF4)2 6H2O i liganda H2L2 dobijen je binuklearni Zn(II) kompleks koji formira nestabilne bele kristale. Na bazi preliminarnih rezultata rendgenske strukturne analize pokazano je da je struktura kompleksa [Zn2(H2L2)2](BF4)4 vrlo sliĉna strukturi kompleksa [Ni2(H2L2)2](ClO4)4. Slika 10. Elektronski apsorpcioni spektri [Ni2(H2L2)2](ClO4)4 (- - -) i [Ni2(HL2)(H2L2)](ClO4)3(―) u DMSO-u. 32 UraĊena je ispitivanje biološke aktivnosti H2L1 i H2L2 liganada i kompleksa dobivenih sa njima [82]. Pokazano je da je generalno aktivnost liganada umerena i da se povećava kompleksiranjem za metale [18]. UtvrĊena je veća aktivnost ispitivanih sistema (liganada i kompleksa) prema bakterijama nego prema gljivi Candida. albicans. TakoĊe je ispitivana citotoksiĉna aktivnost liganada i kompleksa. UtvrĊeno je da se aktivnost višestruko povećava kompleksiranjem [18]. Zbog velike neureĊenosti veći broj kompleksa sa ligandima H2L1 i H2L2 nije mogao da se analizira [81]. 33 LITERATURA 1. A.M. Stadler, J. Harrowfield, Inorg. Chim. Acta 362 (2009) 4298. 2. A. Bacchi, M. Carcelli, G. Pelizzi, C. Solinas, L. Sorace, Inorg. Chim. Acta 359 (2006) 2275. 3. H. Adams, D.E. Fenton, G. Minardi, E. Mura, A.M. Pistuddi, C. Solinas, Inorg. Chem. Commun. 3 (2000) 24. 4. G.M. Larin, A.N. Gusev, Yu.V. Trush, V.F. Shulgin, G.G. Aleksandrov, I.L. Eremenko, Dokl. Chem. 414 (2007) 115. 5. Z. He, C. He, Z.M. Wang, E.Q. Gao, Y. Liu, C.H. Yan, Dalton Trans. (2004) 502. 6. L. Han, L. Li, C.G. Yan, Synth. React. Inorg., Met.-Org., Nano-Met. Chem. 37 (2007) 597. 7. H.D. Yin, J. C. Cui, Y. L. Qiao, Polyhedron 27 (2008) 2157. 8. M.X. Li, L. Yan, J.P. Wang, J. Zhou, Acta Crystallogr., Sect E 62 (2006) m2517. 9. M. Li, P. Cai, C. Duan, F. Lu, J. Xie, Q. Meng, Inorg. Chem. 43 (2004) 5174. 10. (a) G.M. Larin, V.F. Shulgin, A.N. Gusev, A.N. Chernega, Russ. Chem. Bull. 53 (2004) 775; (b) V.F. Shulgin, A.N. Gusev, A.N. Chernega, G.M. Larin, Russ. Chem. Bull. 56 (2007) 236; (c) V.F. Shulgin, A.N. Gusev, V.Y. Zub, G.M. Larin, Russ. Chem. Bull. 54 (2005) 1804; (d) G.M. Larin, V.F. Shulgin, A.N. Gusev, A.N. Chernega, Dokl. Chem. 390 (2003) 152; 34 (e) V.F. Shulgin, A.N. Gusev, V.Y. Zub, G.M. Larin, Russ. Chem. Bull. 52 (2003) 1301; (f) V.F. Shulgin, A.N. Gusev, V.Y. Zub, G.M. Larin, Russ. Chem. Bull. 51 (2002) 2268; (g) G.M. Larin, V.F. Shulgin, E.D. Melnikova, V.Y. Zub, Y.V. Rakitin, Russ. Chem. Bull. 51 (2002) 632; (h) G.M. Larin, V.F. Shulgin, E.A. Sarnit, Y.V. Rakitin, Russ. Chem. Bull. 50 (2001) 812; (i) G.M. Larin, V.F. Shulgin, E.A. Sarnit, Mendeleev Commun. (1999) 129. 11. J.D. Ranford, J.J. Vittal, Y.M. Wang, Inorg. Chem. 37 (1998) 1226. 12. M.F. Iskander, L. El-Sayed, N.M.H. Salem, R. Werner, W. Haase, J. Coord. Chem. 58 (2005) 125. 13. M.P. Degaonkar, V.G. Puranik, S.S. Tavale, S. Gopinathan, G. Gopinathan, Bull. Chem. Soc. Jpn. 67 (1994) 1797. 14. Y. Liang, G. Huang, Y. Ma, G. Zhao, Polyhedron 12 (1993) 1043. 15. X. Wang, X.M. Zhang, H.X. Liu, Polyhedron 13 (1994) 2611. 16. C.T. Yang, J.D. Ranford, J.J. Vittal, Synth. React. Inorg., Met.-Org., Nano-Met. Chem. 35 (2005) 71. 17. W. Henderson, L.L. Koh, J.D. Ranford, W.T. Robinson, J.O. Svensson, J.J. Vittal, Y.M. Wang, Y. Xu, Dalton Trans. (1999) 3341. 18. N.R. Filipović, A. Bacchi, M. Lazić, G. Pelizzi, S. Radulović, D.M. Sladić, T.R. Todorović, K.K. AnĊelković, Inorg. Chem. Commun. 11 (2008) 47. 19. (a) B.B. Umarov, M.T. Toshev, V.G. Yusupov, G.G. Aleksandrov, N.A. Parpiev, K.B. Dustov, O.U. Sharopov, K.T. Sharipov, Koord. Khim. 14 (1988); (b) V.G. Yusupov, B.B. Umarov, N.A. Parpiev, Zh. Neorg. Khim. 32 (1987) 1956; 35 (c) V.G. Yusupov, B.B. Umarov, N.A. Parpiev, S.I. Yakimovich, Koord. Khim. 13 (1987) 1645; (d) V.G. Yusupov, B.B. Umarov, N.A. Parpiev, S.K. Kasymov, G.A. Shvekhgeimer, K.I. Kobrakov, N.G. Popandopulo, E.V. Arslanov, Zh. Obshch. Khim. 59 (1989) 1944. 20. L. Zhao, V. Niel, L.K. Thompson, Z. Xu, V.A. Milway, R.G. Harvey, D.O. Miller, C. Wilson, M. Leech, J.A.K. Howard, S.L. Heath, Dalton Trans. (2004) 1446. 21. X. Chen, S. Zhan, C. Hu, Q. Meng, Y. Liu, Dalton Trans. (1997) 245. 22. G. Paolucci, S. Stelluto, S. Sitran, Inorg. Chim. Acta 110 (1985) 19. 23. V.A. Milway, L. Zhao, T.S.M. Abedin, L.K. Thompson, Z. Xu, Polyhedron 22 (2003) 1271. 24. B. Ji, Q. Du, K. Ding, Y. Li, Z. Zhou, Polyhedron 15 (1996) 403. 25. T.L. Kelly, V.A. Milway, H. Grove, V. Niel, T.S.M. Abedin, L.K. Thompson, L. Zhao, R.G. Harvey, D.O. Miller, M. Leech, A.E. Goeta, J.A.K. Howard, Polyhedron 24 (2005) 807. 26. T.S.M. Abedin, L.K. Thompson, D.O. Miller, E. Krupicka, Chem. Commun. (2003) 708. 27. S.K. Dey, T.S.M. Abedin, L.N. Dawe, S.S. Tandon, J.L. Collins, L.K. Thompson, A.V. Postnikov, M.S. Alam, P. Müller, Inorg. Chem. 46 (2007) 7767. 28. A.W. Nashed, T.A. El Bokl, T.E. Khalil, W. Haase, M.F. Iskander, J. Coord. Chem. 58 (2005) 153. 29. X.Y. Cao, J. Harrowfield, J. Nitschke, J. Ramírez, A.M. Stadler, N. Kyritsakas- Gruber, A. Madalan, K. Rissanen, L. Russo, G. Vaughan, J.M. Lehn, Eur. J. Inorg. Chem. (2007) 2944. 30. C. Pelizzi, G. Pelizzi, G. Predieri, S. Resola, Dalton Trans. (1982) 1349. 31. C. Pelizzi, G. Pelizzi, F. Vitali, Transition Met. Chem. 11 (1986) 401. 32. D. Delledonne, G. Pelizzi, C. Pelizzi, Acta Crystallogr., Sect. C 43 (1987) 1502. 36 33. D. Wester, G.J. Palenik, Chem. Commun. (1975) 74. 34. A. Mangia, C. Pelizzi, G. Pelizzi, Acta Crystallogr, Sect. B 30 (1974) 2146. 35. P. Mazza, F. Zani, M. Orcesi, C. Pelizzi, G. Pelizzi, G. Predieri, J. Inorg. Biochem. 48 (1992) 251. 36. A. Bonardi, C. Carini, C. Merlo, C. Pelizzi, G. Pelizzi, P. Tarasconi, F. Vitali, F. Cavatorta, Dalton Trans. (1990) 2771. 37. A. Bonardi, C. Merlo, C. Pelizzi, G. Pelizzi, P. Tarasconi, F. Cavatorta, Dalton Trans. (1991) 1063. 38. C. Pelizzi, G. Pelizzi, S. Porretta, F. Vitali, Acta Crystallogr., Sect. C 42 (1986) 1131. 39. C. Pelizzi, G. Pelizzi, F. Vitali, Dalton Trans. (1987) 177. 40. M.R. Bermejo, M. Fondo, A.M. González, O.L. Hoyos, A. Sousa, C.A. McAuliffe, W. Hussain, R. Pritchard, V.M. Novotorsev, Dalton Trans. (1999) 2211. 41. C. Pelizzi, G. Pelizzi, Dalton Trans. (1980) 1970. 42. S. Naskar, D. Mishra, S.K. Chattopadhyay, M. Corbella, A.J. Blake, Dalton Trans. (2005) 2428. 43. C. Pelizzi, G. Pelizzi, G. Predieri, F. Vitali, Dalton Trans. (1985) 2387. 44. S. Naskar, D. Mishra, A.J. Blake, S.K. Chattopadhyay, Struct. Chem. 18 (2007) 217. 45. K.B. Gudasi, S.A. Patil, R.S. Vadavi, R.V. Shenoy, M. Nethaji, S.W.A. Bligh, Inorg. Chim. Acta 359 (2006) 3229. 46. C. Pelizzi, G. Pelizzi, G. Predieri, J. Organomet. Chem. 263 (1984) 9. 47. G.J. Palenik, T.J. Giordano, Dalton Trans. (1987) 1175. 48. C. Lorenzini, C. Pelizzi, G. Pelizzi, G. Predieri, Dalton Trans. (1983) 721. 49. K.A. Abboud, R.C. Palenik, G.J. Palenik, Acta Crystallogr., Sect. C 52 (1996) 2994. 37 50. T.J. Giordano, G.J. Palenik, R.C. Palenik, D.A. Sullivan, Inorg. Chem. 18 (1979) 2445. 51. J.E. Thomas, R.C. Palenik, G.J. Palenik, Inorg. Chim. Acta 37 (1979) L459. 52. F.B. Tamboura, P.M. Hab, M. Gaye, A.S. Sall, A.H. Barry, T. Jouini, Polyhedron 23 (2004) 1191. 53. F.B. Tamboura, M. Diop, M. Gaye, A.S. Sall, A.H. Barry, T. Jouini, Inorg. Chem. Commun. 6 (2003) 1004. 54. A.S. Al-Shihri, J.R. Dilworth, S.D. Howe, J. Silver, R.M. Thompson, Polyhedron 12 (1993) 2297. 55. C. Lorenzini, C. Pelizzi, G. Pelizzi, G. Predieri, Dalton Trans. (1983) 2155. 56. R.H.P. Franosco, P.C. Moreno, M.T. do P. Gambardella, G.F. De Sousa, M.B.P. Mangas, A. Abras, Acta Crystallogr., Sect. C 54 (1998) 1444. 57. I. Ivanović-Burmazović, A. Bacchi, G. Pelizzi, V.M. Leovac, K. Andjelković, Polyhedron 18 (1998) 119. 58. K. Andjelković, A. Bacchi, G. Pelizzi, D. Jeremić, I. Ivanović-Burmazović, J. Coord. Chem. 55 (2002) 1385. 59. A. Bacchi, I. Ivanović-Burmazović, G. Pelizzi, K. Andjelković, Inorg. Chim. Acta 313 (2001) 109. 60. G. Pelizzi, A. Bacchi, I. Ivanović-Burmazović, M. Gruden, K. Andjelković, Inorg. Chem. Commun. 4 (2001) 311. 61. A. Bacchi, M. Carcelli, O. Francescangeli, F. Neve, P. Pelagatti, C. Pelizzi, Inorg. Chem. Commun. 2 (1999) 255. 62. A. Bacchi, M. Carcelli, P. Pelagatti, C. Pelizzi, G. Pelizzi, C. Salati, P. Sgarabotto, Inorg. Chim. Acta 295 (1999) 171. 63. A. Bacchi, A. Bonardi, M. Carcelli, P. Mazza, P. Pelagatti, C. Pelizzi, G. Pelizzi, C. Solinas, F. Zani, J. Inorg. Biochem. 69 (1998) 101. 38 64. M. Carcelli, G. Corazzari, S. Ianelli, G. Pelizzi, C. Solinas, Inorg. Chim. Acta 353 (2003) 310. 65. M. Carcelli, S. Ianelli, P. Pelagatti, G. Pelizzi, D. Rogolino, C. Solinas, M. Tegoni, Inorg. Chim. Acta 358 (2005) 903. 66. E.B. Kaimakan, V.V. Lukov, L.D. Popov, Y.P. Tupolova, I.L. Trubnikov, V.A. Kogan, Russ. J. Coord. Chem. 32 (2006) 233. 67. (a) A.S. Antsyshkina, M.A. Porai-Koshits, G.G. Sadikov, V.V. Lukov, V.A. Kogan, S.I. Levchenkov, Zh. Neorg. Khim. 39 (1994) 905. (b) S.I. Levchenkov, V.V. Lukov, V.A. Kogan, Russ. J. Coord. Chem. 22 (1996) 144; (c) V.A. Kogan, L.D. Popov, V.V. Lukov, A.G. Starikov, Zh. Neorg. Khim. 39 (1994) 1676; (d) V.V. Lukov, S.I. Levchenkov, I.N. Shcherbakov, S.V. Posokhova, V.A. Kogan, Russ. J. Coord. Chem. 27 (2001) 135; (e) V.V. Lukov, S.I. Levchenkov, V.A. Kogan, Russ. J. Coord. Chem. 25 (1999) 46. 68. X.H. Bu, M. Du, L. Zhang, X.B. Song, R.H. Zhang, T. Clifford, Inorg. Chim. Acta 308 (2000) 143. 69. Y. Shiping, C. Peng, L. Daizheng, J. Zonghui, W. Genglin, W. Honggen, Y. Xinkan, Polyhedron 11 (1992) 879. 70. P. Cheng, D. Liao, S. Yan, J. Cui, Z. Jiang, G. Wang, X. Yao, H. Wang, Helv. Chim. Acta 80 (1997) 213. 71. L. Xiaozeng, W. Genglin, L. Daizheng, Y. Shiping, J. Zonghui, W. Honggen, Y. Xinkan, Polyhedron 14 (1995) 511. 72. P.M. Haba, F.B. Tamboura, O. Diouf, M. Gaye, A.S. Sall, C.A. Balde, C. Slebodnick, Bull. Chem. Soc. Ethiopia 20 (2006) 45. 39 73. B.F. Hoskins, C.J. McKenzie, I.A.S. MacDonald, R. Robson, Dalton Trans. (1996) 2227. 74. (a) M. Louey, C.J. McKenzie, R. Robson, Inorg. Chim. Acta 111 (1986) 107; (b) C.J. McKenzie, R. Robson, Chem. Commun. (1988) 112. 75. (a) Z. Gang, L. Feng, X. Jishan, M. Yongxiang, Polyhedron 7 (1988) 393; (b) V.A. Kogan, A.N. Morozov, V.V.Lukov, Zh. Neorg. Khim. 33 (1988) 133. 76. (a) M. Yongxiang, Z. Gang, Inorg. Chim. Acta 144 (1988) 265; (b) H. Xiao-jun, J. Pei-song, H. Guo-sheng, M. Yong-xiang, Transition Met. Chem. 16 (1991) 314; (c) Y. Ma, Z. Zeng, G. Huang, X. Han, Lanth. Actin. Res. 3 (1991) 259; (d) S.K. Sengupta, O.P. Pandey, A. Rai, A. Sinha, Spectrochim. Acta Part A 65A (2006) 139. 77. R. Gup, B. Kırkan, Spectrochim. Acta, Part A 64 (2006) 809. 78. D. Plaul, A. Buchholz, H. Goerls, W. Plass, Polyhedron 26 (2007) 4581. 79. (a) J. Ramírez, A.M. Stadler, G. Rogez, M. Drillon, J.M. Lehn, Inorg. Chem. 48 (2009) 2456; (b) J. Ramírez, L. Brelot, I. Osinska, A.M. Stadler, J. Mol. Struct. 931 (2009) 20. 80. S. Sen, C.R. Choudhury, P. Talukder, S. Mitra, M. Westerhausen, A.N. Kneifel, C. Desplanches, N. Daro, J.P. Sutter, Polyhedron 25 (2006) 1271. 81. T. Todorović, U. Rychlewska, B. Warżajtis, D. Radanović, N. Filipović, I. Pajić, D. Sladić, K. AnĊelković, Polyhedron 28 (2009) 2397. 82. M. Lazić, S. Radulović, T. Todorović, D. Sladić, Ţ. Tešić, K. AnĊelković, Mater. Sci. Forum 518 (2006) 513. 83. A.W. Addison, T.N. Rao, J. Reedijik, J. van Rijn, C.G. Verscoor, Dalton Trans. (1984) 1349. 40 84. K. AnĊelković, D. Sladić, A. Bacchi, G. Pelizzi, N. Filipović, M. Rajković, Transition Met. Chem. 30 (2005) 243. 41 3. EKSPERIMENTALNI DEO 3.1 Sinteza liganada i kompleksa 3.1.1. Sinteza liganda N', N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]etandihidrazida (H2L1) U suspenziju dihidrazida oksalne kiseline (0,19 g, 1,60 mmol) i 2-acetilpiridina (0,36 cm 3 , 3,20 mmol) u vodi (20 cm 3 ) dodato je par kapi konc. HCl i pH vrednost je podešena na oko 4,0–4,5. Reakciona smeša je mešana uz refluks 1 h, nakon ĉega je beli precipitat, H2L1, filtriran i ispran sa hladnom vodom. Prinos je bio 57 %. Podaci elementalne analize liganda H2L1 dati su u Tabeli 2. T. t. 244–246 °C; IR (KBr; ν/cm -1 ): 3343 (m) 1685 (vs), 1581 (vs), 1503 (s), 1483 (vs), 1463 (s), 1429 (s), 1368 (m), 1304 (m), 1181 (m), 1133 (m), 853 (w), 789 (m), 741 (w), 610 (w), 529 (m), 402 (m). 1 H NMR (500 MHz, DMSO): δ = 8.54 (d, 2H, J = 4,8 Hz, C-1, C-16), 7,37 (t, 2H, J = 2,6 Hz, C-2, C-15), 7,74 (C-3, C-4, C-14, C-13; kompleksni signal 4H), 2,34 (s, 6H, C- 7, C-11), 11,60 (s, 2H, N-1*, N-2*) ppm; 13 C NMR (500 MHz, DMSO): δ = 148,9 (C-1, C-16), 124,3 (C-2, C-15), 136,8 (C-3, C-14), 119,9 (C-4, C-13), 150,1 (C-5, C-12) 168,0 (C-6, C-10), 12,3 (C-7, C-11), 154,9 (C-8, C-9) ppm. Tabela 2. Elementalna analiza liganda H2L1. Element Izraĉunato za C16H16N6O2 (%), Mr = 324,38 NaĊeno (%) C 59,2 59,3 H 5,0 5,1 N 25,9 26,3 42 3.1.2. Sinteza liganda N', N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]propandihidrazida (H2L2) U suspenziju dihidrazida malonske kiseline (0,21 g, 1,60 mmol) i 2-acetilpiridina (0,36 cm 3 , 3,20 mmol) u vodi (20 cm 3 ) dodato je par kapi konc. HCl i pH vrednost je podešena na oko 4,0–4,5. Reakciona smeša je mešana uz refluks 1 h nakon ĉega je beli talog, H2L2, filtriran i ispran sa hladnom vodom. Prinos je bio 64 %. Podaci elementalne analize liganda H2L2 dati su u Tabeli 3. T. t. 220-221 °C; IR (KBr; ν/cm-1): 3440 (w), 3193 (m), 3094 (w), 1679 (vs), 1582 (m), 1463 (w), 1431 (m), 1391 (s), 1229 (m), 1155 (m), 995 (w), 781 (m), 729 (w). 1 H NMR (500 MHz, DMSO): δ = 8,57 (t, 2H, J = 6,6 Hz, C-1, C-17), 7,33 (m, 2H, C-2, C-16), 8,03 (t, 2H, J = 7,8 Hz, C- 3, C-15), 7,78 (td, 2H, J = 7,1 Hz, C-4, C-14), 2,32 (s, 6H, C-7, C-12), 2,39 (s, 2H, C- 9), 10,88 (s, 2H, N-1*, N-2*) ppm; 13 C NMR (500 MHz, DMSO): δ = 148,8 (C-1, C- 17), 124,1 (C-2, C-16), 136,5 (C-3, C-15), 120,1 (C-4, C-14), 148,2 (C-5, C-13), 170,7 (C-6, C-11), 12,2 (C-7, C-12) 155,3 (C-8, C-10) ppm. Tabela 3. Elementalna analiza liganda H2L2. Element Izraĉunato za C17H18N6O2 (%), Mr = 338,37 NaĊeno (%) C 60,3 59,8 H 5,4 5,3 N 24,8 24,9 43 3.1.3. Sinteza 2,2'-{1,1'-[2,2'-Oksalilbis(hidrazin-2-il-1-iliden)]dietilidin} dipiridinijum-diperhlorata dihidrata (1) Zn(ClO4)2·6H2O (0,32 g, 0,85 mmol) i H2L1 (0,27 g, 0,85 mmol) suspendovani su u MeOH (30 cm 3). Svetloţutoj suspenziji dodato je 4–5 kapi HClO4 i dobijeni ţuti rastvor je refluktovan 1 h na 65 °C. Nakon hlaĊenja do sobne temperature i fitriranja dobijen je ţuti mikrokristalni produkt. Prinos je bio 56 %. T. t. 238–240 °C. Molarna provodljivost (DMF, 1×10–3 mol/dm3) λM = 160 cm 2 /Ω·mol. Rastvorljivost: nerastvoran u vodi i etanolu, rastvoran u acetonitrilu i dimetil-sulfoksidu. 3.1.4. Sinteza kompleksa [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH (2) Rastvoru N',N-bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]propandihidrazida, H2L2, (0,0338 g, 0,1 mmol) u etanolu (15 cm 3 ) dodati su 2,2'-dipiridilamina (0,0171 g, 0,1 mmol) i Co(NO3)2·6H2O (0,0291 g, 0,1 mmol), oba rastvorena u po 5 cm 3 etanola. Reakciona smeša je mešana 2 h. Dobijeni tamnobraoncrveni mikrokristalni proizvod proceĊen je i ispran hladnim etanolom. Prinos je bio 52 %. Podaci elementalne analize kompleksa [Co2L22] 2+ dati su u Tabeli 4. IR (KBr; ν/cm-1): 3416 (m), 1602 (w), 1501(s), 1457 (s), 1382 (vs), 1358 (vs), 1329 (s), 1257 (m), 1147 (m), 1074 (m), 1034 (w), 944 (w), 831 (w), 776 (m), 735 (m), 692 (w), 654 (m), 578 (w). 1 H NMR (500 MHz, DMSO): δ = 7,89 (d, 2H, J=5,0 Hz C-1, C-17), 7,49 (t, 2H, J=6,5 Hz, 6,0, C-2, C-16), 8,20 (t, 2H, J=8,0 Hz, 7,5, C-3, C-15), 8,13 (d, 2H, J=7,5 Hz, C-4, C-14), 3,10 (s, 6H, C-7, C-12), 3,41 (s, 4H, C-9) ppm; 13 C NMR (500 MHz, DMSO): δ = 152,2 (C-1, C-17), 128,8 (C-2, C-16), 141,9 (C-3, C-15), 126,5 (C-4, C-14), 159,8 (C-5, C-13), 162,5 (C-6, C- 11), 15,0 (C-7, C-12) 183,7 (C-8, C-10) 34,4 (C-9) ppm. UV-Vis (DMSO): λmax 370 nm (ε, 550M−1 cm−1) 1A1g→ 1 T2g (0,275), λmax 320 nm (ε, 950M −1 cm −1 ) 1 A1g→ 1 T1g (0,475). 44 Tabela 4. Elementalna analiza kompleksa [Co2L22] 2+ . Element Izraĉunato za C70H78Co4N28O25 (%), Mr = 1947,32 NaĊeno (%) C 43,18 42,80 H 4,04 3,99 N 20,14 19,79 3.2. Merenja Elementalna C, H, N analiza raĊena je standardnom mikrometodom na ELEMENTARVario ELIII C.H.N.S=O analizatoru Centra za instrumentalnu analizu Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Infracrveni spektri snimljeni su na Perkin-Elmer FTIR 1726 spektrometru KBr tehnikom. Korišćene su sledeće skraćenice za intenzitet traka u IR spektrima: veoma jaka (vs), jaka (s), srednje jaĉine (m), slaba (w). Molarna provodljivost DMF rastvora 1 odreĊena je na sobnoj temperaturi na Jenway-4009 konduktometru. Elektronski apsorpcioni spektri su snimani na UV Cintra 40 spektrometru. 3.3. NMR spektroskopija Za odreĊivanje naĉina koordinacije liganda H2L2 za kompleks 2, u DMSO-d6 rastvoru, korišćene su 1D 1H, 13C NMR i DEPT (‘’Distortionless Enhancement by Polarization Transfer’’) spektroskopija, 2D COSY (‘’Correlation Spectroscopy’’), kao i 2D 1 H–13C heteronuklearni korelacioni spektri. NMR spektri su dobijeni Bruker Avance 500 spektrometrom koji je opremljen sondom za široke linije. Svi spektri su snimani na 25 °C. 2D COSY spektri su snimani sa jednim skan/t1-inkrement, dok su 1H–13C 45 heteronuklearni spektri dobijeni sa 2 skan/t1-inkrement. Hemijska pomeranja su data u δ skali, u odnosu na tetrametilsilan (TMS) kao interni standard za 1H i 13C. Korišćene su sledeće skraćenice : singlet (s), dublet (d), triplet (t), triplet dubleta (td). 3.4. Rendgenska strukturna analiza Kristalografska merenja su vršena na Oxford Diffraction XcaliburS CCD difraktometru upotrebom grafit-monohromatskog MoK zraĉenja (0,71073 Å) na temperaturi 130(2) K. Za prikupljanje i redukciju podataka (refleksija) korišten je CrysAlis PRO program [1]. Svi relevantni podaci o kristalu, kao i podaci koji se odnose na prikupljanje podataka i utaĉnjavanje strukture dati su u Tabeli 5. Za rešavanje strukture korišten je SHELXS97 program, a za njeno utaĉnjavanje SHELXL97 [2]. Atomi teţi od vodonika su tretirani anizotropno, a vodonikovi atomi izotropno. Teţinski R-faktor wR i faktor primerenosti goodness of fit S su bazirani na F 2 vrednostima, dok je konvencionalni R-faktor baziran na F vrednostima, sa F vrednostima podešenim na nulu za negativne F 2 . H atomi koji se nalaze na C atomima su pozicionirani geometrijski to jest C—H rastojanja su fiksirana (C—H=0.95–0.98 Å), a njihovo utaĉnjavanje je vršeno tako što su Uiso(H) vrednosti definisane odnosom Uiso(H) = 1.2 Ueq(C). H atomi vezani za N atome su naĊeni u F mapama i utaĉnjavani slobodno. Vodonikovi atomi koji pripadaju molekulu vode su takoĊe naĊeni u F mapama. Upotrebom instrukcije DFIX njihova rastojanja su fiksirana na 0.84(2) Å (O6—H). Ispitivani kristal je pseudomeroedralno dupliran sa pravilom dupliranja (twin law) (1 0 0 0 -1 0 0 0 -1) u reciproĉnom prostoru. Utaĉnjavanje strukture je pokazalo da manjinska komponenta iznosi 6%. 46 Tabela 5. Relevantni kristalografski podaci i podaci o utaĉnjavanju strukture 1 i kompleksa 2. 1 2 Empirijska formula C16H18N6O2 2+·2ClO4·2 H2O C35H39Co2N14O12,5 Molarna masa / g cm -1 561,3 973,6 Temperatura / K 130 150 Talasna duţina 0,71073 0,71073 Kristalni sistem monokliniĉan trikliniĉan Prostorna grupa P21/c P1 Dimenzije jediniĉne ćelije a = 7,0166 (3) a = 15,0282(4) b = 15,6855 (5) b = 16,3112(4) c = 10,1152 (4) c = 17,4548(5) β = 90,240 (3)° β = 86,147(2)° Zapremina / Å3 1113,26 (7) 4001,19(18) Z 2 4 Dx / Mg m -3 1,674 1,616 η / mm-1 0,37 0,912 Θmax / Θmin 30,5°/2,9° – Br. prikupljenih refleksija 12596 25530 Br. nezavisnih refleksija 3402 14384 Faktor slaganja za F 2 0,105 0,1317 Finalno R [F 2 >2ζ(F2)] 0,043 0,0614 R (svi podaci) 0,037 0,1111 S 0,98 – 47 3.5. Biološka aktivnost 3.5.1. Test na račićima vrste Artemia Salina Kašiĉica liofilizovanih jajašaca morskih raĉića vrste Artemia salina je dodata u 1 dm 3 veštaĉke morske vode koja je sadrţavala nekoliko kapi suspenzije kvasca (3 mg suvog kvasca u 5 cm 3 destilovane vode). Kroz dobijenu suspenziju, koja je termostatirana na 28 °C i osvetljena, propuštan je vazduh u trajanju od 24 h. Testirane supstance su rastvorene u DMSO-u. U staklenu posudicu dodate su 1–2 kapi ekstrakta kvasca, 10–20 sveţe izleţenih larvi raĉića u 0,5 cm3 veštaĉke morske vode, kao i rastvori ispitivanih supstanci do odgovarajućih koncentracija. Za svaku koncentraciju su uraĊena dva odreĊivanja. Posudice su ostavljene na sobnoj temperaturi pod dejstvom svetlosti u trajanju od 24 h, nakon ĉega su izbrojani preţiveli raĉići. LC50 vrednost je definisana kao koncentracija supstance koja prouzrokuje smrt 50% raĉića. DMSO je bio neaktivan pod primenjenim uslovima. 3.5.2. Ispitivanje citotoksične aktivnosti U cilju ispitivanja citotoksiĉne aktivnosti liganada i kompleksa odabarno je pet tumorskih ćelijskih linija: epitelnog kancera dojke (MDA-361), karcinoma materice (HeLa), mišijeg melanoma (B16), humanih ćelija leukemije (K562) i humanih plućnih fibroblasta (MRC-5) koje su odrţavane u hranljivoj podlozi RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute, Sigma-Aldrich, Cat. No. R7755) u atmosferi povećane vlaţnosti u prisustvu 5% (v/v) CO2. Humane endotelne ćelije EA.hy926 su odrţavane u DMEM glukoznoj hranljivoj podlozi (Dulbecco-ova modifikacija Eagle-ovog medijuma, PAA, kataloški broj E15-883). Obe hranljive podloge pripremljene su u sterilnoj dejonizovanoj vodi, uz dodatak penicilina (100 jedinice/cm 3 ), streptomicina (100 48 µg/cm3) i 10%-tnog termiĉki inaktiviranog seruma fetusa goveĉeta (FCS, Sigma- Aldrich, kataloški broj F4135). 3.5.2.1. In vitro metode odreĎivanja citotoksične aktivnosti Ćelijske kulture su zasejane, osim za MRC-5 i K562, uz dodatak odgovarajuće hranljive podloge, na ploĉe od 96 bunarĉića tako da je gustina ćelija iznosila 2000 ćelija po bunarĉiću, dok je ta gustina za MRC-5 i K562 bila 5000 ćelija po bunarĉiću. Ćelije su ostavljene da miruju 24 h nakon ĉega su dodate ispitivane supstance do finalnih koncentracija 3, 9, 30, 90 i 300 µmol/dm3 za linije B16, MRC-5, i EA.hy926, odnosno 1, 3, 10, 30 i 100 µmol/dm3 za linije MDA-361, HeLa i K562. Rastvori ţeljenih koncentracija pripremljeni su neposredno pre dodatka agensa u bunarĉić, prvo rastvaranjem u DMSO-u koncentracije 10 mmol/dm 3, a potom razblaţivanjem sveţe pripremljenih polaznih rastvora ispitivanih supstanci odgovarajućim hranljivim medijumom. Za svaku koncentraciju je uraĊeno pet odreĊivanja za svaku ćelijsku liniju uz inkubiranje od 48 h. Osim za K562 ćelije, citotoksiĉna aktivnost svakog agensa ispitivana je testom sa sulforodaminom B (SRB, Sigma-Aldrich, kataloški broj S 1402- 5G) [3]. S obzirom na to da je K562 ćelijska linija koja se uzgaja u suspenziji, citotoksiĉni potencijal je odreĊen MTT (3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- -difeniltetrazolijum-bromid) metodom [4]. Procenat u odnosu na kontrolu je odreĊen korišćenjem jednaĉine (2): (2) gde je OGt – srednja optiĉka gustina tretiranih ćelija, OGs – srednja optiĉka gustina slepe probe, a OGk – srednja optiĉka gustina kontrolne probe. Rezultati citotoksiĉne aktivnosti izraţene su kao IC50 vrednosti (koncentracija ispitivanog agensa koja smanjuje broj ćelija za 50% u populaciji tretiranih ćelija u odnosu na netretirane kontrolne ćelije), koje su odreĊene korišćenjem GraphPad Prism programskog paketa [5]. 49 3.5.3. Analiza distribucije faza ćelijskog ciklusa protočnom citometrijom Ćelije humanog epitela kancera dojke (MDA-361) posejane su na ploĉe od šest bunarĉića (200000 ćelija po bunarĉiću) u duplikatu i ostavljene preko noći da odstoje nakon ĉega je dodata ispitivana supstanca. Za analizu ćelijskog ciklusa ispitivanog jedinjenja korišćene su dve koncentracije, prva jednaka vrednosti IC50, a druga 2 х IC50. Za analizu ćelijskog ciklusa, ćelije su prikupljene nakon 24 h tretmana supstancom, potom isprane jednom PBS puferom i fiksirane ledeno hladnim etanolom (70%). Ovako fiksirane ćelije su inkubirane na 4°C tokom 24 h, a potom je etanol uklonjen ispiranjem dva puta PBS-om. Ćelije su istaloţene centrifugiranjem, a potom tretirane sa 0,2 cm 3 ribonukleaze (1 mg/cm 3 ) 30 min na 37 °C. Onda su ćelije stavljene na led i dodat je propidijum-jodid (PI) (0,2 cm 3, 50 µg/cm3) 15 minuta pre analize [6]. 3.5.4. Analiza ćelijske smrti Apoptoza MDA-361 ćelija tretiranih prouĉavanim kompleksom [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH odreĊivana je Annexin V–FITC – fluorescein- -izotiocijanatnim kompletom za detekciju apoptoze (BD Biosciences, kataloški broj 65874x, Pharminogen San Diego, CA, USA). Suspenzija 1 х 106 ćelija/cm3 tretiranih ispitivanim kompleksom koncentracije 1 х IC50 tokom 24 h, isprana je dva puta hladnim PBS-om, a potom resuspendovana u 200 µL vezujućeg pufera (10 mmol/dm3 HEPES/NaOH (HEPES – (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina) pH 7,4; 140 mmol/dm 3 NaCl, 2,5 mmol/dm 3 CaCl2). 100 µL rastvora (1 х 10 5 ćelija) je potom prebaĉeno u kivetu od 5 mL i dodato je 5 µL Annexin V–FITC-a i 5 µL PI-a. Ćelije su blago vorteksovane i inkubirane na 25 °C tokom 15 min u mraku. Potom je dodato 400 µL vezujućeg pufera. Uzorak je analiziran protoĉnom citometrijom pomoću FACS Calibur Becton Dickinson protoĉnog citometra i Cell Quest kompjuterskog paketa [7]. 50 3.5.5. Ispitivanje interakcija kompleksa 2 sa DNA sisara CT-DNA (DNA iz telećeg timusa) je rastvorena u tris puferu (10 mmol/dm3 Tris–HCl pH 7,9) i ostavljena preko noći na 4 °C. Koncentracija DNA je podešena na 3 mg/mL pomoću pufera. Ovako pripremljena DNA je ĉuvana na 4 °C. Rastvor CT-DNA u vodi imao je odnos apsorbance na A260/A280 1,89–2,01 što ukazuje na to da je DNA uspešno preĉišćena od proteina. Koncentracija CT-DNA je odreĊena merenjem apsorbance rastvora DNA na talasnoj duţini 260 nm i izraĉunata na osnovu apsorpcionog koeficijenta ε260 = 6600 M -1 cm -1 [8]. Elektronska apsorpciona titracija kompleksa sa CT-DNA raĊena je pri konstantnoj koncentraciji kompleksa 2, variranjem koncentracije CT-DNA. U ependorf-kivete je stavljeno po 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15 µL osnovnog rastvora CT-DNA i dodato je po 10 µL rastvora kompleksa 2 i destilovane vode do zapremina od 1 mL. Reakciona smeša je inkubirana na 37 °C tokom 2 h uz povremeno vorteksovanje. Primarni spektri obraĊivani su u programu Microcal ORIGIN v8.0. 3.5.6. Ispitivanje interakcija kompleksa [Co2L22] 2+ sa plazmidnom DNA Ispitivanje interakcija kompleksa [Co2L22] 2+ sa plazmidnom DNA uraĊeno je na plazmidu pUC18. Plazmidna DNA je najpre inkubirana na 95 °C tokom 4 min, a zatim na 4 °C sledećih 20 min. Potom je reakciona smeša ukupne zapremine 20 µL koja se sastojala od 230 ng plazmida pUC18 i 40 mM natrijum-bikarbonatnog pufera, pH 8,4, inkubirana sa razliĉitim koncentracijama Co(II), H2L2 i [Co2L22] 2+ na 37 °C tokom 90 min i sa kompleksom [Co2L22] 2+ , koncentracije 10mM tokom 2 h. Reakciona smeša je povremeno vorteksovana. Reakcija je prekinuta kratkim vorteksovanjem na 10000 rpm i dodatkom 7 µL pufera za nanošenje uzorka (0,25% bromfenol-plavo, 0,25% ksilen- -cijanol FF i 30% glicerol u TAE puferu pH 8,24 (40 mM tris-acetat, 1 mM EDTA)). Za agaroznu gel elektroforezu je korišćena 1% agaroza (Amersham Pharmacia-Biotech, Inc) pripremljena u TAE puferu pH 8,24. Elektroforeza je raĊena pri konstantnom naponu (80 V) u trajanju od 1 h. Nakon završene elektroforeze gel je obojen rastvorom 51 etidijum-bromida (0,5 µg/mL). Posle 30 min bojenja gel je ispran vodom, ostavljen da stoji još 10 min u vodi, a zatim ponovo ispran vodom. Fragmenti DNA su vizuelizovani pod UV svetlom na 312 nm. 3.5.7. Antimikrobna aktivnost UraĊena je procena biološke aktivnost prema Gram-pozitivnim bakterijama Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae i Gram-negativnoj bakteriji Klebsiella pneumonie, korišćenjem agar difuzione metode. Bakterije su ostavljene preko noći u LB medijumu da narastu. Potom je suspenzija bakterijskih kultura u izotoniĉnom slanom rastvoru (0,5 mL) dodata u 10 mL otopljenog i prohlaĊenog hranljivog agra. Agar je preliven u sterilne Petri šolje i ostavljen da oĉvrsne. Mali bunarĉići (1 cm u preĉniku) su izbušeni u agaru. Rastvor [Co2L22] 2+ kompleksa u DMSO-u je razblaţivan dejonizovanom vodom do konaĉnih koncentracija (1000, 200, 40, 8 i 0,16 µg/mL) i dodavan u bunarĉiće. Zone inhibicije merene su u mm, nakon inkubacije na 37 °C u trajanju od 24 h. 52 LITERATURA 1. Oxford Diffraction (2009). CrysAlis PRO. Oxford Diffraction Ltd, Yarnton, England. 2. G.M. Sheldrick, Acta Crystallogr., Sect. A 64 (2008) 112. 3. P. Skehan, R. Storeng, D. Scudiero, A. Monks, J. McMahon, D. Vistica, J.T. Warren, H. Bokesch, S. Kenney, M.R. Boyd, J. Natl. Cancer Inst. 82 (1990) 1107. 4. R. Supino, in: S. O’Hare, C.K. Atterwill (Eds.), Methods in Molecular Biology, In Vitro Toxicity Testing Protocols, Humana Press, New Jersey, 1995, p. 137–149. 5. http://www.graphpad.com/help/prism5/prism5help.html?reg_classic_dr_variable. htm. 6. M.G. Ormerod, in: M.G. Ormerod (Eds.), Analysis of DNA-General Methods. Flow Cytometry, a Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1994, p. 119– 125. 7. I.M. Ghobrial, T.E. Witzig, A.A. Adjei, CA Cancer J. Clin. 55 (2005) 178. 8. M.E. Reichmann, S.A. Rice, C.A. Thomas, P. Doty, J. Am. Chem. Soc. 76 (1954) 3047. 53 4. REZULTATI I DISKUSIJA 4.1 Opis kristalne strukture soli (1) Prethodna istraţivanja su pokazala da se proizvodi direktne reakcije jona metala sa H2L1 ligandom (Šema 1) ĉesto ne mogu lako predvideti [1–5]. U ovom radu prikazani su rezultati rendgenske strukturne analize 2,2 -{1,1 -[2,2 -oksalilbis(hidrazin- 2-il-1-iliden)]dietilidin}dipiridinijum-diperhlorata dihidrata (C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O, Šema 2) koji je sluĉajno dobijen kao glavni proizvod direktne reakcije Zn(ClO4)2 6H2O sa ligandom N',N' 2 -bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]etandihidrazidom (H2L1). Pored toga, naši pokušaji da nagradimo komplekse M(III) jona sa H2L1 ligandom takoĊe nisu urodili plodom. Šema 1. N',N'2-bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]etandihidrazid (H2L1) U jediniĉnoj ćeliji katjon ispitivane soli C16H18N6O2 2+ (H4L1 2+) leţi na centru inverzije na 1/2, 0, 0. Struktura soli i brojĉana šema atoma prikazani su na Slici 11. Geometrijski parametri su sumirani u Tabeli 6. 54 Šema 2. Hemijska struktura C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O. Slika 11. ORTEP dijagram ispitivane soli. Termalni elipsoidi su prikazani sa 50% stepenom verovatnoće. Intramolekulske vodoniĉne veze (N—H···O i N—H···N) su prikazane sa isprekidanim linijama. Atomi oznaĉeni sufiksom "a" se nalaze u simetrijskoj poziciji 1–x, –y, –z. Tabela 6. Geometrijski parametri za C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O (Å, °). Cl1—O5 1,4198 (17) C1—C2 1,377 (2) Cl1—O4 1,4259 (14) C1—C6 1,477 (2) Cl1—O2 1,4309 (14) C2—C3 1,386 (3) Cl1—O3 1,4386 (17) C2—H2 0,95 O1—C8 1,214 (2) C3—C4 1,381 (3) 55 O6—H6A 0,815 (17) C3—H3 0,95 O6—H6B 0,839 (17) C4—C5 1,379 (3) N1—C5 1,340 (2) C4—H4 0,95 N1—C1 1,359 (2) C5—H5 0,95 N1—H1N 0,84 (2) C6—C7 1,493 (2) N2—C6 1,289 (2) C7—H7A 0,98 N2—N3 1,360 (2) C7—H7B 0,98 N3—C8 1,352 (2) C7—H7C 0,98 N3—H3N 0,84 (2) C8—C8i 1,532 (4) O5—Cl1—O4 109,55 (10) C4—C3—H3 119,9 O5—Cl1—O2 109,96 (11) C2—C3—H3 119,9 O4—Cl1—O2 111,30 (9) C5—C4—C3 118,46 (17) O5—Cl1—O3 108,40 (14) C5—C4—H4 120,8 O4—Cl1—O3 108,69 (10) C3—C4—H4 120,8 O2—Cl1—O3 108,87 (9) N1—C5—C4 120,35 (16) H6A—O6—H6B 114 (3) N1—C5—H5 119,8 C5—N1—C1 122,70 (15) C4—C5—H5 119,8 C5—N1—H1N 116,7 (15) N2—C6—C1 113,35 (15) C1—N1—H1N 120,6 (15) N2—C6—C7 128,13 (17) C6—N2—N3 118,61 (14) C1—C6—C7 118,52 (15) C8—N3—N2 118,15 (15) C6—C7—H7A 109,5 C8—N3—H3N 122,0 (14) C6—C7—H7B 109,5 56 N2—N3—H3N 118,4 (15) H7A—C7—H7B 109,5 N1—C1—C2 118,18 (16) C6—C7—H7C 109,5 N1—C1—C6 118,26 (15) H7A—C7—H7C 109,5 C2—C1—C6 123,53 (16) H7B—C7—H7C 109,5 C1—C2—C3 120,13 (17) O1—C8—N3 126,18 (17) C1—C2—H2 119,9 O1—C8—C8i 122,6 (2) C3—C2—H2 119,9 N3—C8—C8i 111,16 (18) C4—C3—C2 120,17 (17) C6—N2—N3—C8 169,62 (16) N3—N2—C6—C1 176,07 (14) C5—N1—C1—C2 −0,7 (2) N3—N2—C6—C7 −4,8 (3) C5—N1—C1—C6 −178,72 (16) N1—C1—C6—N2 3,3 (2) N1—C1—C2—C3 −0,3 (3) C2—C1—C6—N2 −174,65 (17) C6—C1—C2—C3 177,63 (16) N1—C1—C6—C7 −175,92 (16) C1—C2—C3—C4 0,9 (3) C2—C1—C6—C7 6,1 (3) C2—C3—C4—C5 −0,5 (3) N2—N3—C8—O1 −9,0 (3) C1—N1—C5—C4 1,1 (3) N2—N3—C8—C8i 172,93 (16) C3—C4—C5—N1 −0,5 (3) Simetrijski kod: (i) −x+1, −y, −z. Rastojanje C8—O1 iznosi 1,214(2) Å, što odgovara dvostrukoj vezi ugljenik– kiseonik. Duţine veza N3—C8 [1,352 (2) Å] i N2—C6 [1,289 (2) Å] ukazuju na prostu i dvostruku vezu izmeĊu ugljenika i azota, navedenim redosledom. Katjon C16H18N6O2 2+ (H4L1 2+ ) pokazuje odstupanje od planarnosti. Rastojanje izmeĊu proseĉne ravni definisane C1–C6,C8,N1–N3 atomima i one definisane odgovarajućim 57 atomima generisanim simetrijskom operacijom 1–x, –y, –z iznosi 0,223 Å. Struktura C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O je stabilizovana pomoću intramolekulskih i intermolekulskih vodoniĉnih veza ĉiji su geometrijski parametri dati u Tabeli 7. Transoidna konformacija katjona je stabilizovana pomoću N–H···O vodoniĉnih veza (Slika 11, Tabela 7). Torzioni ugao O1—C8—C8a—O1a [atomi oznaĉeni sufiksom "a" se nalaze u simetrijskoj poziciji 1–x, –y, –z] iznosi 180°. Syn orijentacije piridinijum- iminskih fragmenata su stabilizovane pomoću N—H···N intramolekulskih vodoniĉnih veza. Torzioni ugao N1—C1—C6—N2 iznosi 3,3(2)°. Intramolekulske vodoniĉne veze (N–H···O i N—H···N) vode ka formiranju S(5) motiva (Slika 11) [6]. U kristalnoj strukturi C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O katjoni, anjoni i molekuli vode uĉestvuju u formiranju intermolekulskih vodoniĉnih veza (Slika 12). Molekuli vode imaju ulogu dvostrukog donora [prema O1 i O3 na –x, y–1/2, –z+1/2] i jednostrukog akceptora. Piridinijum i hidrazonski azotovi atomi imaju ulogu dvostrukog donora sa jednom komponentom intra, a drugom inter. Od strane Jeffrey-ja i saradnika, [7] ovaj tip vodoniĉne veze je nazvan trocentriĉnom. Perhloratne grupe i molekuli vode posreduju u povezivanju katjonskih molekula (Slika 12). Svaki katjon je vodoniĉno povezan sa dva perhloratna anjona i dva molekula vode. Kiseonikovi atomi (O3 i O5) iz perhloratnih jona imaju ulogu H akceptora. Kiseonikov atom O5 prima H-atom od hidrazonskog N-atoma, a O3 od molekula vode. Drugi H-atom iz molekula vode je doniran karbonilnom kiseonikovom atomu (O1) iz katjonskog molekula. Ovaj sistem vodoniĉnih veza se širi u dve dimenzije paralelno sa (1 0 2). Heteroaromatiĉni prstenovi susednih katjona su ukljuĉeni u interakcije π···π tipa (Slika 13). Rastojanje izmeĊu teţišta heteroaromatiĉnih prstenova (C1—C5,N1) i (C1b—C5b,N1b) [atomi oznaĉeni sufiksom "b" se nalaze u simetrijskoj poziciji –x, –y, 1–z] je 3,600 (1) Å sa izmeštajem teţišta od 1,502 Å. Katjonski molekuli povezani preko π···π interakcija izmeĊu piridinijumskih jedinica se prostiru stepeniĉasto duţ [–1 0 1] pravca. 58 Tabela 7. Parametri vodoniĉnog vezivanja (Å, °). D—H···A D—H H···A D···A D—H···A N1—H1N···O6 0,84 (2) 1,86 (2) 2,690 (2) 168 (2) N1—H1N···N2 0,84 (2) 2,32 (2) 2,632 (2) 102 (2) N3—H3N···O5 0,84 (2) 2,36 (2) 3,011 (2) 134 (2) N3—H3N···O1i 0,84 (2) 2,36 (2) 2,686 (2) 104 (2) O6—H6A···O1 0,82 (2) 2,08 (2) 2,889 (2) 173 (2) O6—H6B···O3ii 0,84 (2) 1,98 (2) 2,809 (2) 171 (2) Simetrijski kodovi: (i) −x+1, −y, −z; (ii) −x, y−1/2, −z+1/2. 59 Slika 12. Dijagram pakovanja C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O prikazuje 2D skup paralelan sa (1 0 2) koji je generisan pomoću vodoniĉnog vezivanja. H-atomi nisu prikazani radi preglednosti, osim onih ukljuĉenih u vodoniĉne veze. Slika 13. Dijagram pakovanja C16H18N6O2 2+ 2ClO4 – 2H2O prikazuje 1D skup paralelan sa [–1 0 1] koji je generisan pomoću π···π interakcija izmeĊu piridinijumskih fragmenata. Posmatrano duţ b-pravca. 60 Za razliku od H2L1 liganda, sa H2L2 ligandom (Šema 3) nagraĊen je dinuklearni kompleks kobalta(III) kao prvi od kompleksa metala oksidacionog broja tri sa ovim ligandom. Kompleks je dobiven polazeći od Co(NO3)2 6H2O i liganda H2L2 (molski odnos 1:1) uz dodatak 2,2'-dipiridilamina iz etanolnog rastvora uz refluks. Šema 3. N',N'2-bis[(1E)-1-(2-piridil)etiliden]propandihidrazid (H2L2) Dva liganda L2 koordinovana su za svaki kobaltov jon, dok se dva nitratna jona nalaze u spoljnoj sferi kompleksa. Elementarna analiza je pokazala da se uz svaki kompleksni katjon nalaze i ½ molekula etanola i 2 molekula kristalne vode. Rezultati molarne provodljivosti su potvrdili da je kompleks elektrolit tipa 1:2. 2,2'-dipiridilamin je dodat reakcionoj smeši da bi promenio dielektriĉnu konstantu rastvora a kako bi kompleks kristalisao u monokristalnom obliku pogodnom za rendgensku strukturnu analizu. U toku reakcije Co(II) se oksidaovao u Co(III) vazdušnim kiseonikom, tako da je nagraĊen dijamagnetiĉan kompleks Co(III) što su i potvrdila merenja magnetnog momenta dobijenog kompleksa. 4.2 Opis kristalne strukture kompleksa (2) Jedinjenje [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH kristališe u monokliniĉnom sistemu P 1 sa dva nezavisna i neznatno razliĉita jonska kompleksa [Co2L22] 2+ u strukturi, od kojih je jedan prikazan na Slici 14. 61 Slika 14. Pogled na jedan od dva nezavisna katjonska kompleksa [Co2L22] 2+pronaĊena u asimetriĉnoj jedinici. Kompleksni katjon [Co2L22] 2+ ima dinuklearnu strukturu dvostrukog heliksa u kojoj je svaki Co(III) centar koordinovan preko dve tridentatne N2O helatne jedinice iz oba H2L2 liganada. Co(III) centri se na taj naĉin nalaze u pseudooktaedarskom okruţenju. Svaki Co(III) jon okruţen je sa dve helatne jedinice koordinovane za Co(III) atom u mer konfiguraciji sa parovima karbonilnih atoma O i piridinskih atoma N u cis poloţajima, dok su N atomi hidrazida trans jedan u odnosu na drugi. Proseĉna C–N rastojanja (1,889 Å) su nešto kraća od proseĉnih Co–O (1,902 Å), ali su svi u opsegu objavljenih. Rastojanja izmeĊu C(O)–N i C(CH3)–N (proseĉno 1,310 i 1,295 Å), zajedno sa =N–N– rastojanjem (proseĉno 1,393 Å) ukazuju na to da su protoni u hidrazidu otpušteni i da se ligand koordinuje u dianjonskom bis-tridentatnom obliku. Helatni ligandi formiraju diedarske uglove izmeĊu ravni py–C(CH3)N=NC(O) i Co1 od 62 87,57 i 89,57° za dva nezavisna molekula. Diedarski uglovi za oba jonska kompleksa u strukturi sa Co2 su 89,23 i 86,15°. Rastojanja izmeĊu metalnih jona su 5,749 i 5,664 Å. Lanci bis(bidentatnog) liganda uvijaju se oko kobalt(III) jona i poseduju osu pseudorotacije drugog reda koja prolazi kroz jone metala. Zanimljivo je da, iako poseduje aromatiĉne liganade u kristalnoj strukturi, kompleks ne pokazuje nikakvu uoĉljivu meĊusobnu interakciju aromatiĉnih prstenova. Svaki od nezavisnih jonskih kompleksa [Co2L22] 2+ u asimetriĉnoj jedinici je inherentno hiralan i poseduje P konfiguraciju za desni i M konfiguraciju za levi heliks (Slika 15). Na osnovu ĉinjenice da kompleks [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH kristališe u ahiralnoj prostornoj grupi, u jediniĉnoj ćeliji smeštena su ĉetiri molekula (oba nezavisna jonska kompleksa zajedno sa svojim enantiomerima), ĉime se formira racemski stabilan proizvod. Slika 15. Nezavisni jonski kompleksi [Co2L22] 2+ u asimetriĉnoj jedinici sa desnim, P i levim, M heliksom. Atomi vodonika su izostavljeni zbog preglednosti. 4.3 NMR spektroskopija (2) Dodatna potvrda strukture dobijena je poreĊenjem1H-NMR spektra kobalt(III) kompleksa sa 1 H-NMR spektrom slobodnog H2L2 liganda. NH proton slobodnog H2L2, na 10,86 ppm, odsutan je u spektru kompleksa, sugerišući da je došlo do 63 deprotonovanja. Velika relativna pomeranja svih ostalih protona u kompleksu, u odnosu na ligand, ukazuju na jaku tridentatnu koordinaciju Co(III). TakoĊe, je poreĊen i 13 C-NMR spektar slobodnog H2L2 liganda sa spektrom kompleksa. Rezultati ukazuju na to da dolazi do N, N, O koordinacije. NMR spektri su u potpunom skladu sa kristalnom strukturom. 4.4 Biološka aktivnost kompleksa (2) Biološka aktivnost kompleksa 2 i odgovarajućeg liganda ispitivana je testom na raĉiće Artemia salina. Ovaj test je u dobroj korelaciji sa citotoksiĉnom aktivnošću [8]. Kompleks je pokazao umerenu aktivnost, sliĉnu onoj odgovarajućeg liganda (H2L2) i Co(NO3)2·6H2O (Tabela 8). Tabela 8. Biološka aktivnost kompleksa i odgovarajućeg liganda na Artemia salina. Supstanca LC50(mM) [Co2L22] 2+ 3,21 H2L2 3,97 Co(NO3)2·6H2O 6,32 4.5 Citotoksična aktivnost kompleksa (2) Citotoksiĉni potencijal novosintetisanog kompleksa [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH, odgovarajućeg liganda (H2L2) i soli ispitivan je na šest ćelijskih linija, ukljuĉujući ljudske ćelije raka dojke (MDA-361), ljudskog karcinoma grlića materice (HeLa), mišijeg melanoma (B16), ljudskih ćelija leukemije 64 (K562), ljudskih endotelnih ćelija (EA.hy926) i fibroblasta ljudskih pluća (MRC-5). Jedinjenja su pripremljena u opsegu koncentracija 1–100 μmol/L za MDA-361, HeLa, K562 i 3-300 μmol/L za B16 i EA.hy926 i MRC-5. Nakon 48 h aktivnosti jedinjenja su odreĊene pomoću sulforodamin B i MTT testova, a rezultati su izraţeni u vidu IC50 vrednosti. U ispitivanom opsegu koncentracija, citotoksiĉni potencijal za kompleks je primećen na epitelnim ćelijama raka dojke (MDA-361), gde je IC50 vrednost iznosila 50,9 μmol/L (Tabela 9). Slaba citotoksiĉna aktivnost kompleksa je primećena na EA.hy926 i B16 ćelijskim linijama, dostiţući IC50 vrednosti od 258 μmol/L i 221 μmol/L, redom. Kompleks je pokazao malu citotoksiĉnost protiv MRC-5 ćelija koje se smatraju normalnim, nekancerogenim ćelijama. Odgovarajući ligand H2L2 je takoĊe pokazao umerenu citotoksiĉnu aktivnost na sve ćelijske linije, osim na K562 i MDA-361 ćelije (Tabela 9). Ligand ima najveći potencijal na mišiji melanom B16. Odgovarajuća so pokazala je slabu aktivnost na ćelijama K562, EA.hy926 i B16, a najslabija aktivnost je primećena na MRC 5 ćelijskoj liniji (Tabela 9). Ćelije K562 su bile otporne kako na kompleks tako i na ligand (kompleks je ĉak stimulisao ćelije da rastu). Na slici 16 predstavljene su krive preţivljavanja ćelija tretiranih kompleksom [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH. Tabela 9. IC50 vrednosti (μmol/L) dobijene za razliĉite ćelijske linije Istraţivana jedinjenja Ćelijske linije EA.hy926 MDA-361 HeLa MRC-5 K562 B16 [Co2L22] 2+ 258 50,9 >100 >300 >100 221 H2L2 124 >100 72,6 107 >100 36,8 Co(NO3)2·6H2O 108 >100 >100 222 62,1 139 B16, EA.hy926 i MRC-5 ćelije su tretirane kompleksom u opsegu koncentracija 3–300 µM, dok su MDA-361, HeLa i K562 ćelije tretirane kompleksom u opsegu 65 koncentracija 1–100 µM. Sve ćelije su pokazale dozno-zavisnu inhibiciju rasta ćelija, osim K562 ćelija leukemije, gde je primećen stimulativan efekat na rast ćelija. Budući da je kompleks pokazao jak citotoksiĉni potencijal na epitelne ćelije raka dojke MDA-361, nastavili smo istraţivanje ka utvrĊivanju mehanizma posmatrane citotoksiĉnosti. Slika16. Krive preţivljavanja ćelija tretiranih sa[Co2L22] 2+ . 4.6 Ćelijski ciklus i apoptoza Rezultati citotoksiĉne aktivnosti daju samo podatak o smanjenju populacije ţivih ćelija, ali ne i o mehanizmu koji dovodi do smrti ćelija. Kako je dobijena IC50 vrednost niska za ćelijsku liniju MDA-361, bilo je neophodno da se ispita da li je posmatrani citotoksiĉni potencijal posledica menjanja ćelijskog ciklusa ili indukcije ćelijske smrti, apoptoze. U tu svrhu, testiran je uticaj kompleksa [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH na apoptozu najosetljivije ćelijske linije MDA-361. Ćelije su tretirane koncentracijom koja odgovara vrednostima IC50 i 2xIC50. Nakon 24 h ćelije su prikupljene i analizirane protoĉnom citometrijom. Na slici 17 se moţe videti da nije došlo do znaĉajne 66 preturbacije ćelijskog ciklusa. Nakon 24 h inkubacije ćelija tretiranih koncentracijom IC50 i 2xIC50 ispitivani kompleks nije dao nikakve znaĉajne promene u procentu ćelija u G1, S i G2 / M fazi. Slika 17. Efekat kompleksa [Co2L22] 2+na ćelijski ciklus ćelija raka dojke MDA-361. Prikazani su reprezentativni histogrami faza ćelijskog ciklusa na osnovu odreĊivanja koliĉine ćelijske DNA pre i posle tretmana sa [Co2L22] 2+ MeĊutim, postoji jasno uoĉljiv sub-G1 pik u histogramu tretiranih ćelija, kao što je prikazano na slici 17. On predstavlja hipodiploidne ćelije, koje sadrţe fragmentisani molekul DNA, ukazujući da su ćelije na kraju apoptotiĉke faze. Stoga je apoptotiĉki potencijal kompleksa [Co2L22] 2+na ćelije MDA-361 dodatno ispitan, korišćenjem Annexin V–FITC / PI testa. Princip ovog testa se zasniva na karakteristici specifiĉnoj za rane apoptotiĉke ćelije da molekul fosfatidilserina (PS) premeste sa unutrašnje na spoljašnju stranu ćelijske membrane. Annexin V je Ca2+-proteinska boja koja ima izraţen afinitet vezivanja za negativno naelektrisani fosfatidilserin (PS). TakoĊe, kod ćelija u kasnoj apoptozi i nekrozi povećana je permeabilnost ćelijske membrane, što omogućava da se u ovoj eksperimentalnoj proceduri koristi još jedna boja, propidijum- jodid, koja ulazi u jedro i vezuje se za molekul DNA. Na ovaj naĉin, posle analize protoĉnim citometrom, moguće je jasno razlikovati ćelije u ranoj apoptotiĉkoj fazi od nekrotiĉkih i kasnih apoptotiĉkih ćelija. Ćelije MDA-361 su tretirane koncentracijom kompleksa koja odgovara IC50 i nakon 24 h su obojene. Dobijeni histogrami prikazani su na slici 18. Ispitivani kompleks dovodi do znaĉajanog povećanja procenta ranih apoptotiĉkih ćelija, 28,18% u odnosu na 5,64% koliko su imale kontrolne ćelije u istoj 67 fazi. Sa druge strane, nije bilo znaĉajnijih promena u populaciji ćelija kod nekrotiĉne i kasne apoptotiĉke faze. Slika 18. Indukcija apoptoze tretiranih ćelija tumora. Reprezentativne taĉke pokazuju indukovanu apoptozu MDA-361 ćelija merenu protoĉnom citometrijom. 4.7. Ispitivanje interakcija kompleksa (2) sa CT-DNA Poznato je da se kompleksi prelaznih metala vezuju za DNA kovalentnim i/ili nekovalentnim interakcijama [9]. Nekovalentne interakcije ukljuĉuju umetanje izmeĊu baza DNA (interkaliranje) i vezivanje za malu brazdu, veliku brazdu, šećerno-fosfatnu kiĉmu i trostruki DNA ĉvor [10]. U literaturi je poznato da se kompleksi kobalta pri interakciji sa DNA mogu vezivati za brazdu [11], interkalirati [12] i stupati u elektrostatiĉke interakcije [13]. U ovom radu, spektroskopskim metodama je utvrĊivan naĉin interakcije [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH sa DNA iz telećeg timusa (CT-DNA). Spektri oktaedarskog Co(III) kompleksa pokazuju dve vidljive apsorpcione trake koje su obiĉno simetriĉne. Elektronski apsorpcioni spektri kompleksa, kako u odsustvu tako i u prisustvu CT-DNA, dati su na slici 19. Interakcija kompleksa sa CT-DNA je praćena pomoću hipohromizma i plavog pomeranja trake na 324 nm. Procenat hipohromizma za CT-DNA/[Co2L22] 2+ je odreĊen iz jednaĉine (εF – εB)/εF x 100, gde εF predstavlja molarni apsorpcioni koeficijent slobodnog kompleksa, a εB molarni 68 apsorpcioni koeficijent vezanog kompleksa (Slika 19A). Hipohromizam trake na 324 nm dostigao je 30,2% sa plavim pomeranjem od 10 nm. Apsorpcioni maksimum na 247 nm u spektru [Co2L22] 2+ pomeren je na 256 nm u spektu CT-DNA/[Co2L22] 2+ (Slika 19A). Crveni pomak apsorbance praćen je povećanjem molarnog apsorpcionog koeficijenta (hiperhromizam, dostiţe vrednost -32%), tako da se izobestiĉna taĉka javlja na 305 nm. Slika 19. OdreĊivanje konstante vezivanja apsorpcionom titracijom kompleksa [Co2L22] 2+ sa CT-DNA. Ove promene su tipiĉne u sluĉajevima vezivanja kompleksa nekovalentnim interakcijama za dvostruki heliks DNA [14]. Hipohromizam je rezultat kontrakcije heliksa DNA, kao i konformacionih promena na molekulu DNA, dok hiperhromizam potiĉe od manjih oštećenja strukture dvostrukog heliksa[15, 16]. Hiperhromni efekat, takoĊe, moţe biti posledica elektrostatiĉke interakcije na periferiji CT-DNA izmeĊu pozitivno naelektrisanog kompleksa [Co2L22] 2+ i negativno naelektrisane fosfatne kiĉme 69 [17]. Strukturno, interkalacija sa DNA ne bi mogla ni da bude jedan od vidova vezivanja, jer se lanac bis(bidentatnog) liganda obmotava oko jona kobalta, posedujući dvostruku pseudo-rotacionu osu koja prolazi kroz jon metala. Dakle, interkalacija dihidrazonskim tipom liganda izmeĊu niza susednih baznih parova sterno je onemogućena, ali moţe doći do delimiĉnog umetanja [18]. Treba istaći da se apsorbanca na 380 nm nije promenila nakon dodavanja DNA, što ukazuje na to da se supramolekulska struktura metal–ligand nije znaĉajno promenila. U cilju dobijanja podataka o afinitetu kompleksa za CT-DNA, uraĊena je spektroskopska titracija kompleksa uz povećanje koncentracije CT-DNA (Slika 19B). Praćena je apsorbanca na 256 nm za pojedinaĉne koncentracije DNA. Konstanta vezivanja, KB, odreĊena je pomoću jednaĉine (3) [19]: [DNA] x (εA – εF) -1 = [DNA] x (εB – εF) -1 + KB -1 x (εB – εF) -1 (3) gde εA predstavlja odnos apsorbanca/[Co2L22] 2+ , εF apsorpcioni koeficijent slobodnog kompleksa i εB apsorpcioni koeficijent vezanog kompleksa (CT-DNA/[Co2L22] 2+ ). Vrednost unutrašnje apsorpcione konstante vezivanja KB (Slika 19C) Co(III) kompleksa iznosila je 4,2 x 10 5 M -1. Vrednost se nalazi u opsegu karakteristiĉnom za interkalaciju [20], ali sterno odbijanje sa DNA, uzrokovano drugim ligandom vezanim za Co(III), diktira da vezivanje bude površinsko za malu brazdu DNA. Vrednost se razlikuje za red veliĉine od ranije istraţivanog Cd(II) kompleksa sa H2L2 za koji je pokazano da se vezuje za malu brazdu [21]. Visoka vrednost konstante vezivanja za malu brazdu moţe biti posledica helikoidne geometrije kompleksa (Slika 15). Treba napomenuti da geometrija kompleksa ima izvesnu sliĉnost sa kompleksima koji poseduju trostruku spiralu i koji se vezuju za veliku brazdu i/ili trostruki ĉvor DNA (engl. three-way junction–struktura koja se formira kada se tri dvostruka heliksa drţe zajedno u jednoj taĉki grananja) [10, 22]. Vezivanje za veliku brazdu ne moţe se iskljuĉiti u ovom sluĉaju, mada preĉnik [Co2L22] 2+iznosi 7 Å i manji je nego kod tipiĉnih jedinjenja koja se vezuju za veliku brazdu (širina ţleba velike brazde je 12 Å [23]). 70 4.8 Ispitivanje interakcija kompleksa (2) sa plazmidnom DNA Ispitivanje cepanja plazmidne DNA kompleksom obiĉno se prati agaroznom gel elektroforezom. Sposobnost raskidanja veza na dvostrukom lancu kompleksa Co(III) da posreduje u oštećenju DNA je ranije ispitana [18, 24]. Uticaj kompleksa [Co2L22] 2+ na plazmidnu DNA ispitivan je na plazmidu pUC18 (Slika 20). Ligand H2L2 nema nikakav uticaj na superuvijeni FI (nativna, neoštećena konformacija) i otvoreni cirkularni FII oblik (konformacija sa kovalentnim jednolanĉanim prekidima) (Slika 20A, uzorak 2) u poreĊenju sa kontrolnim plazmidom (Slika 20A, uzorak 1). U sluĉaju kompleksa [Co2L22] 2+ nije primećeno cepanje za koncentracije do 10 mM (Slika 20B, uzorci 2–4), dok veće koncentracije kompleksa uzrokuju veliko oštećenje DNA, koje se na gelu vidi kao gašenje traka (Slika 20B, uzorci 5–7). Rezultati pokazuju da kompleks Co(III) ne poseduje nukleaznu aktivnost. Oĉekivani efekat Co(II) jona je dobijen (DNA je potpuno degradirana, što se na gelu vidi kao razmaz formi FI i FII)(Slika 20A, uzorak 4). Slika 20. Agarozna elektroforeza. Prikazana je mobilnost super-helikoidne forme FI i otvorene cirkularne forme FII plazmida pUC18 (1,3 · 10-9 M). Rezultati ispitivanja interakcije [Co2L22] 2+ sa plazmidnom DNA su u saglasnosti sa prethodnim ispitivanjima efekta kompleksa na DNA, ukazujući na zakljuĉak da se oštećenja molekula DNA izazvana kompleksom Co(III) ostvaruju nekovalentnim interakcijama 71 LITERATURA 1. S. Sen, C.R. Choudhury, P. Talukder, S. Mitra, M. Westerhausen, A.N. Kneifel, C. Desplanches, N. Daro, J.P. Sutter, Polyhedron 25 (2006) 1271. 2. N. Filipović, A. Bacchi, M. Lazić, G. Pelizzi, S. Radulović, D. Sladić, T. Todorović, K. Andelković, Inorg. Chem. Commun. 11 (2008) 47. 3. T. Todorović, U. Rychlewska, B. Warżajtis, D. Radanović, N. Filipović, I. Pajić, D. Sladić, K. AnĊelković, Polyhedron 28 (2009) 2397. 4. T.L. Kelly, V.A. Milway, H. Grove, V. Niel, T.S.M. Abedin, L.K. Thompson, L. Zhao, R.G. Harvey, D.O. Miller, M. Leech, A.E. Goeta, J.A.K. Howard, Polyhedron 24 (2005) 807. 5. K. AnĊelković, D. Sladić, A. Bacchi, G. Pelizzi, N. Filipović, M. Rajković, Transition Met. Chem. 30 (2005) 243. 6. J. Bernstein, R.E. Davis, L. Shimoni, N.L. Chang, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34 (1995) 1555. 7. G. A. Jeffrey, H. Małuszyńska, J. Mitra, Int. J. Biol. Macromol. 7 (1985) 336. 8. B.N. Meyer, N.R. Ferrigni, J.E. Putnam, L.B. Jacobsen, D.E. Nichols, J.L. McLaughlin, Planta Med. 45 (1982) 31. 9. Q. L. Zhang, J. G. Liu, H. Chao, G. Q. Xue, L. N. Ji, J. Inorg. Biochem. 83 (2001) 49. 10. A. Oleksi, A.G. Blanco, R. Boer, J. Usón, J. Aymamí, A. Rodger, M.J. Hannon, M. Coll, Angew. Chem. Int. Ed. 45 (2006) 1227. 11. Z.H. Xu, F.J. Chen, P.X. Xi, X.H. Liu, Z.Z. Zeng, J. Photochem. Photobiol. A 196 (2008) 77. 72 12. R. Indumathy, M. Kanthimathi, T. Weyhermuller, B. Unni Nair, Polyhedron 27 (2008) 3443. 13. F. Arjmand, M. Muddassir, R.H. Khan, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 3549. 14. T. Hirohama, Y. Kuranuki, E. Ebina, T. Sugizaki, H. Arii, M. Chikira, P. T. Selvi, M. Palaniandavar, J. Inorg. Biochem. 99 (2005) 1205. 15. J.K. Barton, A.T. Danishefsky, J.M. Goldberg, J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 2172. 16. C.S. Chow, J.K. Barton, Methods Enzymol. 212 (1992) 219. 17. Y.N. Xiao, C.X. Zhan, J. Appl. Polymer Sci. 84 (2002) 887. 18. R.S. Kumar, S. Arunachalam, V.S. Periasamy, C.P. Preethy, A.Riyasdeen, M.A. Akbarsha, Polyhedron 27 (2008) 1111. 19. A. Wolfe, G.H. Shimer, T. Meehan, Biochemistry 26 (1987) 6392. 20. I. Haq, P. Lincoln, D.C. Suh, B. Norden, B.Z. Chowdhry, J.B. Chaires, J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 4788. 21. M. Vujĉić, M. Lazić, M. Milenković, D. Sladić, S. Radulović, N. Filipović, K. AnĊelković, J. Biochem Molecular Toxicology 25 (2011) 175. 22. I. Meistermann, V. Moreno, M.J. Prieto, E. Moldrheim, E. Sletten, S. Khalid, P.M. Rodger, J.C. Peberdy, C.J. Isaac, A. Rodger, M.J. Hannon, Proc Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 5069. 23. C.J. Larson, G.L. Verdine, u: S. M. Hecht (Ed.) Bioorganic Chemistry Nucleic Acids, Oxford University Press, New York, 1996, p. 324. 24. P. Nagababu, J.N.L. Latha, Y. Prashanthi, S. Satyanarayana, J. Chem. Pharm. Res. 1 (2009) 238. 73 5. ZAKLJUČAK U ovoj doktorskoj disertaciji prouĉeni su sinteza, struktura, karakterizacija i svojstva kompleksa kobalta(III) sa ligandom koji predstavlja kondenzacioni proizvod 2- -acetilpiridina i dihidrazida malonske kiseline. Sa kondenzacionim proizvodom 2-acetilpiridina i dihidrazida oksalne kiseline (H2L1) u prisustvu Zn(II), odnosno metala oksidacionog broja tri, nisu nagraĊeni kompleksi već je reakcija išla u smeru graĊenja organske soli 2,2 -{1,1 -[2,2 - oksalilbis(hidrazin-2-il-1-iliden)]dietilidin}dipiridinijum-diperhlorata dihidrata. Za razliku od H2L1 liganda sa H2L2 ligandom koji predstavlja kondenzacioni proizvod 2-acetilpiridina i dihidrazida malonske kiseline nagraĊen je dinuklearni kompleks kobalta(III) kao prvi od kompleksa metala oksidacionog broja tri. Kompleksni katjon [Co2L22] 2+ poseduje dinuklearnu strukturu dvostrukog heliksa u kojoj je svaki Co(III) centar koordinovan preko dve tridentatne N2O helatne jedinice iz oba H2L2 liganda, formirajući oko oba metalna jona oktaedarsko okruţenje. Citotoksiĉni potencijal novosintetisanog kompleksa [Co2L22](NO3)2·2H2O·0,5C2H5OH, odgovarajućeg liganda (H2L2) i polazne soli ispitan je na šest ćelijskih linija: MDA-361 (ljudske ćelije raka dojke), HeLa (ljudski karcinom grlića materice), B16 (mišiji melanom), K562 (ljudske ćelije leukemije), EA.hy926 (ljudske endotelne ćelije) i MRC-5 (fibroblasti ljudskih pluća). Citotoksiĉni potencijal kompleksa je uoĉen na ćelijama epitelnog kancera dojke (MDA-361) sa IC50 vrednošću 50,9 µM. Slaba citotoksiĉna aktivnost je uoĉena na EA.hy926 i B16 ćelijskim linijama sa IC50 vrednošću 258 µM i 221 µM. Kompleks pokazuje slabu citotoksiĉnost na MRC-5 ćelije. H2L2 ligand pokazuje umerenu aktivnost na sve ćelijske linije osim na K562 i MDA-361 ćelije, a najbolja aktivnost je uoĉena na ćelijama mišijeg melanoma B16. Odgovarajuća kobaltova so je pokazala slabu citotoksiĉnu aktivnost na K562 ćelijama, 74 EA.hy926 i B16 ćelijama, a najslabija aktivnost je uoĉena MRC-5 ćelijskoj liniji. K562 ćelije su rezistentne na kompleks i ligand, štaviše kompleks stimuliše njihov rast. S obzirom na to da je najbolji citotoksiĉni potencijal kompleksa [Co2L22] 2+ uoĉen na ćelijama epitelnog kancera dojke MDA-361, ove ćelije su korišćene u eksperimentima u kojima je ispitan uticaj kompleksa na modulaciju progresije ćelijskog ciklusa i indukciju ćelijske smrti. Posle 24 h inkubacije ćelija tretiranih kompleksom koncentracije IC50 i 2 x IC50 nije došlo do znaĉajne promene u zastupljenosti ćelija u G1, S i G2/M fazi. Uoĉen je jasan sub G1-pik koji potiĉe od hipodiploidnih ćelija koje sadrţe fragmentisane molekule DNA što ukazuje na kasne apoptotiĉke ćelije. Apoptotiĉki potencijal kompleksa [Co2L22] 2+ na MDA-361 ćelijama je ispitan i pomoću Annexin V-FITC / PI testa. MDA-361 ćelije su tretirane kompleksom koncentracije IC50 i inkubirane 24 h, nakon ĉega su bojene. Ispitivani kompleks dovodi do znaĉajanog povećanja procenta ranih apoptotiĉkih ćelija (28,18 %) u odnosu na kontrolne ćelije (5,64 %). Ne postoji znaĉajna promena u populaciji nekrotiĉkih i kasnih apoptotiĉkih ćelija nakon tretmana kompleksom. U cilju razumevanja mehanizma citotoksiĉnosti kompleksa [Co2L22] 2+ ispitivane su njegove interakcije sa sisarskom i plazmidnom DNA. Interakcije sa sisarskom DNA su praćene spektroskopski, a sa plazmidnom elektroforetski. Interakcije kompleksa [Co2L22] 2+ sa CT-DNA dovode do plavog pomeranja i hiperhromizma u UV–Vis spektrima. Konstata vezivanja kompleksa za CT-DNA odreĊena spektroskopskom titracijom rastvora kompleksa sa rastućom koncentracijom CT-DNA iznosi 4,2x105 M-1. Ova vrednost konstante vezivanja ukazuje na vezivanje kompleksa u brazdi DNA. Efekat kompleksa [Co2L22] 2+ i liganda (H2L2) na superuvijenu (FI) i otvorenu cirkularnu formu (FII) DNA ispitivan je na plazmidu pUC18. Ligand ne dovodi do promena u mobilnosti i izgledu formi plazmidne DNA u odnosu na kontrolu. U sluĉaju interakcije kompleksa do primenjene koncentracije od 10 mM se ne uoĉavaju prekidi na DNA, ali pri koncentracijama većim od ove, vezivanje kompleksa za DNA dovodi do gašenja fluoroscencije na elektroforetskom gelu, što ukazuje na visok stepen oštećenja. Dobijeni rezultati ukazuju na to da kompleks [Co2L22] 2+ nema nukleaznu aktivnost, tj. ne dovodi do prekida lanaca DNA. 75 BIOGRAFIJA Mr Rabia O. Eshkourfu roĊena je 4.11.1977. godine u Khomsu, Libija. Faculty of Ars & Science, Al-Mergeb University, Khoms, Libija završila je 2000. godine i stekla akademski naziv B.Sc. in Chemistry. Magistrirala je na College of Science Al- Mustansiriya University, Irak 4.2.2003. godine i stekla akademski naziv M.Sc. in Chemistry-Inorganic Chemistry. Magistarsku tezu Rabia Omar Mohammed Eshkourfu pod nazivom: „SYNTHESIS AND STUDY OF SOME METAL COMPLEXES OF THIOSEMICARBAZONE AND SEMICARBAZONE AND INVESTIGATION PHYSICAL AND SPECTRAL PROPERTIES” odbranila je kod profesora dr Najata J. Al-Obaidi-ja. Na doktorske studije Hemijskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu upisala se školske 2009. godine.