ХЕМИЈСКИ ФАКУЛТЕТ УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ Сандра Б. Шеган КОРЕЛАЦИЈА СТРУКТУРЕ И РЕТЕНЦИЈЕ СТЕРОИДНИХ ТЕТРАОКСАНА ПРИМЕНОМ ТАНКОСЛОЈНЕ ХРОМАТОГРАФИЈЕ И МУЛТИВАРИЈАНТНИХ ХЕМОМЕТРИЈСКИХ МЕТОДА Докторска теза Београд, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Sandra B. Šegan QUANTITATIVE STRUCTURE-RETENTION RELATIONSHIP STUDY OF STEROIDAL TETRAOXANES BY THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY AND MULTIVARIATE CHEMOMETRIC METHODS Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Ментор др Душанка Милојковић-Опсеница Редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду Чланови комисије др Живослав Тешић Редовни професор Хемијског факултета Универзитета у Београду др Дејан Опсеница Научни саветник ИХТМ-а, Центра за хемију Датум одбране: Ова докторска дисертација рађена је на Катедри за Аналитичку хемију Хемијског факултета у Београду под менторством др Душанке Милојковић-Опсенице, редовног професора Хемијског факултета у Београду, којој се најискреније захваљујем. Такође се захваљујем др ЖивославуТешићу, редовном професору Хемијског факултета. Посебно се захваљујем др Дејану Опсеници, научном саветнику ИХТМ-а, Центра за хемију на уступљеним супстанцама као и свестраној помоћи током писања овог рада. Овај рад посвећујем мојим најмилијим, Дуњи, Маши, Лазару, Дејану и мојим родитељима. Докторска дисертација Сандра Шеган ИЗВОД У оквиру овог рада испитиван је утицај структуре различитих класа биолошки активних стероидних тетраоксана на њихово ретенционо понашање у условима реверзно-фазне танкослојне хроматографије. Као стационарне фазе коришћени су RP-18 силика-гел и CN- силика-гел. Ретенција испитиваних стероидних тетраоксана се заснива на њиховим неспецифичним хидрофобним интеракцијама са неполарном стационарном фазом. На основу добијених резултата одређена је липофилност бис-стероидних и мешовитих тетраоксана преко параметара RM0, b, C0 и PC1. На основу статистички значајних линеарних корелација између ових параметара и израчунатих logKоw вредности, утврђено је да се параметри RM0, b, C0 и PC1 могу успешно применити за процену липофилности бис-стероидних тетраоксана, док се за процену липофилности мешовитих тетраоксана могу користити параметри RM0, b и PC1. За изналажење дескриптора који на најбољи начин описују ретенционо понашање стероидних тетраоксана и квантификацију њиховог утицаја примењене су мултиваријантне хемометријске методе као што су анализа главних компонената, кластерска анализа, метода делимичних најмањих квадрата и вишеструка линеарна регресија. На основу добијених резултата предложени су најважнији структурни дескриптори који утичу на понашање и својства стероидних тетраоксана у примењеним хроматографским условима. За обе групе стероидних тетраоксана процењено је да највећи утицај на ретенцију имају структурни дескриптори који се односе на поларност молекула и њихове протон-донорске и акцепторске способности. На овај начин су утврђени статистички значајни модели који даље могу да се примене за предвиђање хроматографског понашања и липофилности нових сродних молекула. Модели који се односе на зависности биолошких активности бис-стероидних и мешовитих тетраоксана нису статистички значајни. На квалитативном нивоу указују на значај величине и облика молекула, поларности и протон-донорских својстава на антипролиферативну активност бис-стероидних тетраоксана. Насупрот томе, на антималаријску активност мешовитих тетраоксана највећи утицај имају дескриптори који уједно имају и највећи утицај на њихову ретенцију. Kључне речи: 1,2,4,5-стероидни тетраоксани, реверзно фазна танкослојна хроматографија, липофилност, анализа главних компонената, кластеерска анализа вишеструка линеарна регресија, регресија методом делимичних-најмањих квадрата Научна област:Хемија Ужа научна област: Аналитичка хемија УДК број: 543 Докторска дисертација Сандра Шеган ABSTRACT The main focus of this PhD thesis was an investigation of the structure of different classes of biologically active steroidal tetraoxanes on their retention behavior applaying the reversed-phase thin- layer chromatography. As the stationary phases were used unpolar RP-18 silica and CN-silica with moderate polarity. The hydophobic interactions of the investigated substances with non-polar sorbents were proposed as interaction determining retention under RP conditions. Four chromatographic descriptors, RM0, b, C0 and PC1 were used for assessing the lipophilicity of bis-steroidal and mixed tetraoxanes. On the basis of statisticaly significant linear correlations between these parameters and calculated logKоw values, it was found that all of them are suitable for lipophilicity estimation of bis-steroidal tetraoxanes, while for lipophilicity estimation of mixed tetraoxanes parameter C0 can be considered as the unfavorable. Chemometric methods such as principal component analysis, cluster analysis, partial least square and multiple linear regression, were performed to identify the molecular descriptors that best describe the chromatographic behavior of the investigated compounds, and to quantify their influences. For both classes of steroidal tetraoxanes the highest influence on retention have structural descriptors which describe the polarity of molecules and their hydrogen bond donating and accepting abbilities. In this way statistical significant models that can be used for prediction of chromatographic behavior and lipophilicity of a newly synthesized molecules are identified. Models based on biological activities and structural descriptors of both classes of steroidal tetraoxanes are statistically insignificant. On qualitative level, the most prominent factors affecting antiproliferative activity of the investigated bis-steroidal tetraoxanes are those relating to the size and shape of a molecule and those regarding to their polarity and the ability of hydrogen bodning. Contrary to that, the most prominent factors affecting antimalarial activity of mixed tetraoxanes are the same as the factors affecting their retention. Keywords: 1,2,4,5 steroidal tetraoxanes, reversed-phased thin-layer chromatography, lipophilicity, principal component analysis, cluster analysis, multiple linear regression, partial least square regression Scientific field: Chemistry Field of Academic Expertise: Analytical Chemistry UDC number: 543 Докторска дисертација Сандра Шеган i САДРЖАЈ САДРЖАЈ ..................................................................................................................................i 1. УВОД ....................................................................................................................................1 2. ОПШТИ ДЕО .......................................................................................................................3 2.1 Реверзно-фазна хроматографија ...................................................................................3 2.2 Липофилност једињења...............................................................................................10 2.3 Одређивање параметара липофилности ....................................................................12 2.3.1 Директне методе ...................................................................................................12 2.3.2 Индиректне методе ...............................................................................................13 2.3.2.1 Одређивање параметара липофилности применом високо-ефикасне течне хроматографије ..........................................................................................................14 2.3.2.2 Одређивање параметара липофилности применом танкослојне хроматографије ..........................................................................................................14 2.3.2.3 Одређивање параметара липофилности теоријским путем .......................17 2.4 Хроматографски системи за одређивање липофилности ........................................17 2.5 Квантитативна зависност структура - ретенција ......................................................19 2.5.1 Молекулски дескриптори.....................................................................................22 2.5.2 Молекулско представљање ..................................................................................23 2.5.3 Оптимизација структуре ......................................................................................24 2.5.4 Селекција дескриптора (варијабли) ....................................................................25 2.5.5 Статистичке методе у QSRR-у ............................................................................26 2.5.5.1 Кластерска анализа ........................................................................................26 2.5.5.2 Анализа главних компонената......................................................................27 2.5.6 Валидација модела ................................................................................................30 2.5.7 Статистички параметри........................................................................................32 2.5.8 Случајне корелације .............................................................................................33 3. НАШИ РАДОВИ................................................................................................................35 3.1 Стероидни тетраоксани ...............................................................................................35 3.2 Корелација структуре и ретенције бис-стероидних тетраоксана ............................37 3.2.1 Уводне мултиваријантне анализе........................................................................44 3.2.2 Анализа главних компонената (PCA) .................................................................44 3.2.3 Хијерархијска кластерска анализа ......................................................................48 3.2.4 Корелација структуре и ретенције ......................................................................49 3.2.5 Корелација структуре и биолошке активности..................................................54 3.3 Корелација структуре и ретенције мешовитих тетраоксана....................................58 3.3.1 Уводна мултиваријантна анализа........................................................................65 3.3.2 Корелација ретенције и солватохромних параметара .......................................68 3.3.3 Корелација структуре и ретенције методом делимичних најмањих квадрата ....71 3.3.4 Корелација структуре и ретенције методом вишеструке линеарне регресије (МLR)...73 3.3.5 Корелација структуре и биолошке активности..................................................78 4. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО............................................................................................81 Докторска дисертација Сандра Шеган ii 4.1 Танкослојна хроматографија ......................................................................................81 4.2 Геометријска оптимизација и израчунавање вредности молекулских дескриптора ..............................................................................................................................................82 4.3 Мултиваријантна статистичка анализа ......................................................................83 5. ЗАКЉУЧАК .......................................................................................................................84 6. ЛИТЕРАТУРА....................................................................................................................88 Докторска дисертација Сандра Шеган 1 1. УВОД Хроматографија је вероватно најмоћнија и најсвестранија аналитичка метода доступна модерном аналитичару. Њеном применом се на једноставан начин може раздвојити смеша на појединачне компоненте и одредити њихова квантитативна заступљеност. Узорци могу бити у гасовитом, течном или чврстом агрегатном стању и није преувеличавање ако се каже да не постоје два једињења, без обзира колико структурно слична била (чак и оптички изомери), која не могу бити раздвојена неком од хроматографских техника. Осим тога, анализе се могу изводити применом веома сложених и скупих инструмената, али и применом веома једноставне и јефтине танкослојне хроматографије. Реверзно-фазна течна хроматографија је најшире примењиван облик течне хроматографије који се интензивно користи у аналитичким и препаративним раздвајањима. С обзиром да се сматра да исте основне међумолекулске интеракције одређују понашање супстанце у хроматографском и биолошком окружењу, очекује се да постоји сличан утицај одређених структурних дескриптора на ретенцију и биолошку активност једињења. Један од физичко-хемијских параметара од посебног значаја за транспорт молекула кроз ћелијске мембране, односно биолошку активност, је липофилност једињења. Зато је од велике важности одређивање овог параметра, у чему хроматографске методе као брзе, једноставне и ефикасне налазе широку примену. Метода која повезује молекулску структуру изражену кроз дескрипторе са њиховим хроматографским понашањем (најчешће параметром липофилности) позната је под називом квантитативна зависност структуре и ретенције (quantitative structure–retention relationship, QSRR). Применом хемометријских метода обраде података могу се добити врло битне информације о карактеристикама једињења, чиме се могу дефинисати врсте интеракција испитиваних једињења са мобилном и стационарном фазом, као и да се предвиди ретенционо понашање нових или чак несинтетисаних молекула. Са развојем софтверске технологије доступно је на хиљаде различитих структурних дескриптора, Докторска дисертација Сандра Шеган 2 па је за QSRR моделовање важно одабрати оне који ће на најбољи начин објаснити утицај структуре на ретенцију испитиваних једињења. Предмет истраживања у оквиру ове докторске дисертације je проучавање утицаја структуре различитих класа биолошки активних стероидних тетраоксана на њихово ретенционо понашање у условима танкослојне хроматографије. У том циљу ће бити испитани различити, првенствено реверзно-фазни хроматографски системи, а на основу добијених резултата ће бити одређена липофилност поменутих супстанци. За изналажење дескриптора који на најбољи начин описују ретенционо понашање испитиваних једињења и квантификацију њиховог утицаја планира се примена мултиваријантних хемометријских метода као што су анализа главних компонената (principal component analysis – PCA), вишеструка линеарна регресија (multiple linear regression – MLR), регресија методом делимичних најмањих квадрата (partial least squares regression - PLS). На тај начин би били утврђени статистички валидни модели који даље могу да се примене за предвиђање хроматографског понашања и липофилности нових сродних молекула. Квалитативно и квантитативно одређивање најважнијих дескриптора одговорних за понашање стероидних тетраоксана као биолошки активних једињења у условима танкослојне хроматографије могло би да помогне у разумевању врста и јачина интеракција које ове и сличне супстанце остварују у биолошким системима. Докторска дисертација Сандра Шеган 3 2. ОПШТИ ДЕО 2.1 РЕВЕРЗНО-ФАЗНА ХРОМАТОГРАФИЈА Реверзно-фазна хроматографија је најчешће коришћена подврста течне хроматографије. Користи се у анализама хране, животне средине, клиничким и фармацеутским истраживањима, одређивањима физичко-хемијских својстава лекова, као и раздвајањима пептида, протеина и нуклеинских киселина. Велика популарност ове методе огледа се у могућности њеног коришћења у раздвајању једињења применом различитих механизама који се заснивају на хидрофобним, хидрофилним интеракцијама, као и на интеракцијама јонских парова и пропуштању, односно задржавању молекула на основу величине и/или облика њихових молекула. Такође, њеној популарности доприноси и постојање великог броја комерцијално доступних стационарних фаза. Основни елементи хроматографског система су одвајана супстанца (аналит), стационарна и мобилна фаза. Реверзно-фазне системе карактерише већа поларност мобилне у односу на стационарну фазу. У таквим системима постоји неколико подсистема који су међусобно зависни: аналит, угљоводонични ланац везан за матрикс силика-гела, молекули мобилне фазе адсорбовани на стационарној фази, слободне (немодификоване) силанолне групе силика-гела, као и све компоненте мобилне фазе [1]. Као стационарне фазе у реверзно-фазној хроматографији најчешће се користе комерцијално доступни алкил-модификовани силика-гелови који поседују метил- (RP- 2), октил- (RP-8) или октадецил- (RP-18) хидрофобне лиганде. Хидрофобност оваквих стационарних фаза не зависи само од типа лиганда (што је дужи алкил-низ лиганда стационарна фаза је хидрофобнија), већ и од степена покривености матрикса силика- гела одговарајућим лигандима (стационарна фаза је хидрофобнија што је већи број лиганада по јединици површине). На Слици 1 је дат схематски приказ површинских активних центара хемијски модификованих силика-гелова. Квалитет стационарних фаза огледа се у њиховим специфичним физичким и хемијским svojstvima. Потребно је да су издржљиве на висок притисак којем су изложене у колони, а физичке Докторска дисертација Сандра Шеган 4 карактеристике као што су величина пора, порозност и величина честица од којих зависе ретенција и селективност, треба да буду строго контролисане. Број слободних силанолних група на површини модификованих силика-гелова треба да буде што мањи, јер у зависности од њихове активности и pH-вредности, могу да утичу на секундарне хроматографске процесе, као што су водонично везивање, јонска измена и диполне интеракције. Ове тзв. секундарне интеракције су обично непожељне, јер доводе до ширења пикова (зона) и нерепродуктивног ретенционог времена [2]. Слика 1. Површинске функционалне групе неких хемијски модификованих силика- гелова Као мобилна фаза у реверзно-фазној хроматографији најчешће се користи смеша воде и неког органског растварача. Елуциона моћ растварача у великој мери зависи од употребљеног сорбента и представља меру његовог капацитета да ступи у све међумолекулске интеракције, док је селективност растварача мера његове способности да учествује у специфичним интермолекулским интеракцијама као што су оријентација и водоничне везе [3]. Овај параметар има два различита аспекта, а то су поларност и параметар локализације [1]. Поларност је мера солватационе снаге растварача и одређују га параметар базности (xe), параметар киселости (xd) и диполни параметар (xd), односно он изражава укупне интеракције мобилне фазе са узорком. Већа вредност овог параметра доводи до боље је растворљивости узорка у мобилној фази и ретенција је слабија [4]. Локализациони параметар (m) представља меру способности растварача да оствари интеракције са сорбентом, тј. да интерагује на тачно дефинисан начин. С друге стране, Докторска дисертација Сандра Шеган 5 нелокализујући растварачи такође могу да остваре интеракције са сорбентом, али су оне знатно слабије и случајне. За предвиђање ретенције на основу састава мобиле фазе, постизање максималног раздвајања и минимално трајање анализе, веома је важно да се зна утицај састава мобилне фазе на хроматографско понашање. Ово је обимно проучавано кроз Kamlet-Taft-ову методу солватохромног поређења [5]. Сматра се да се механизми раздвајања у реверзно-фазним системима заснивају на хидрофобним интеракцијама између испитиваних молекула и стационарне фазе. Ове интеракције су од великог значаја и имају важну улогу у одређивању структуре и динамике процеса који се дешавају у биолошким системима [6]. Могу се поделити на четири основне категорије: • Интеракције привлачења аналита и мобилне фазе – Лондонове силе (дисперзионе интеракције), дипол – дипол и интеракције грађења водоничних веза. Постојање ове врсте интеракција утиче на слабљење ретенције. • Одбојне интеракције одвајане супстанце и мобилне фазе које се остварују између хидрофилне мобилне фазе и неполарног аналита. • Лондонове силе између површине стационарне фазе и аналита. Ове интеракције су балансиране сличним интеракцијама површине стационарне фазе и мобилне фазе коју аналит измешта. У зависности од природе аналита, ове интеракције могу допринети јачању или слабљењу ретенције. • Електростатичке интеракције између аналита и површине стационарне фазе. Ове врсте интеракција су у одређеној мери компензоване поларним интеракцијама између аналита и мобилне фазе. На пример, при раздвајању серије једињења која представљају хомологи низ, у реверзно-фазним системима са повећањем дужине угљоводоничног низа јача ретенција аналита. Између аналита и угљоводоничног ланца везаног за стационарну фазу долазе до изражаја дисперзионе силе (London-Hall-ов ефекат) које утичу на селективност. Истовремено су оријентационе интеракције (Keesom-ов ефекат) занемарљиве зато што је поларност (диполни моменат) угљоводоничног дела молекула практично небитна. Такође, очекује се да су дипол-индуковани дипол интеракције (Debye-ев ефекат) исте за сва једињења из хомологог низа зато што су диполни моменти хомологе серије слични. С друге стране, магнитуда дисперзионих интеракција (London-Hall-ов ефекат) Докторска дисертација Сандра Шеган 6 се повећава са повећањем поларизабилности једињења, што заправо одражава њихову молекуларну величину. Интеракције аналита са мобилном фазом, које укључују оријентациони и индуктивни ефекат, су много јаче од истих интеракција са стационарном фазом, док су дипол-дипол и дипол-индуковани дипол интеракције сличне за сва једињења хомологог низа због сличних вредности њихових диполних момената. Пошто дисперзионе интеракције доминирају, а поларизабилност угљоводоника, на пример, октадецил ланаца везаних за стационарну фазу, је већа од поларизабилности малих молекула мобилне фазе, укупан ефекат свих van der Walls- ових интеракција (Keesom-ове, Debye-eве и London-Hall-ов ефекат) био би јачање ретенције молекула у хомологом низу са повећањем њихове молекулске масе. Дакле, ретенција у реверзно-фазним хроматографским системима зависи од два процеса [7]: 1. Привлачних интеракција: (а) дисперзионих између аналита и стационарне фазе и, у одређеном степену, са мобилном фазом; (б) диполарних у случају да аналит има изражен диполни моменат. Обе врсте интеракција могу да се подведу под појам тзв. ефекта стационарне фазе. 2. Хидрофобне интеракције или ефекат мобилне фазе или тзв. солвофобни ефекат. Иако се студира много година, овај ефекат још увек није довољно проучен. У реверзно-фазним системима са повећањем степена јонизације опада ретенција што се такође може протумачити интермолекулским интеракцијама. Претпоставља се да се дисперзионе интеракције јона аналита са обе фазе не разликују значајно од истих интеракција нејонизованих молекула аналита, док јон-дипол интеракције постају доминантне. Ове привлачне интеракције између јона аналита и поларних молекула мобилне фазе су значајније од интеракција јона аналита са неполарним угљоводоничним ланцима стационарне фазе. Јон-дипол интеракције су јаче од van der Waals-ових интеракција. Може се закључити да у реверзно-фазним системима pH- вредност мобилне фазе има велики утицај на ретенцију слабих киселина и база [8]. Објашњавање ретенционих механизама у реверзно-фазним системима у зависности од различитих променљивих као што су састав мобилне фазе, структура испитиваних једињења, природа стационарне фазе и температура, предмет је дугогодишњих истраживања [9]. Докторска дисертација Сандра Шеган 7 Прву теорију која је постављена у циљу објашњења ретенционог понашања супстанци у реверзно-фазној хроматографији познату као солвофобни модел објавили су Horvath и сарадници 1976. године [10]. Ови аутори су сматрали да ретенција и селективност одвајања зависе од површинског напона и дипол – дипол интеракција између поларних група испитиваних једињења и мобилне фазе. По овој теорији, у одређеном систему са мобилном и стационарном фазом, ретенциони фактор испитиваног једињења зависи од два параметра: - контактне површине између испитиваног једињења и мобилне фазе (што је већа контактна површина, већи је ретенциони фактор), и - површинског напона између мобилне фазе и испитиваног једињења. Ова теорија даје разумне претпоставке о утицају различитих мобилних фаза и испитиваних једињења на ретенцију, али у потпуности занемарује утицај стационарне фазе. Због овог недостатка, бројни научници су покушали да формулишу алтернативне моделе који би могли да објасне механизме ретенције у реверзно-фазним системима. Према партиционом моделу основни ретенциони механизам се остварује расподелом испитиваних молекула између две немешљиве течне фазе од којих је једна мобилна, а друга је стационарна фаза. Схематски приказ процеса партиције приказан је на Слици 2. Овај процес започиње стварањем шупљине величине молекула у органској фази, затим се наставља премештањем молекула из водене у органску фазу и завршава се затварањем заостале шупљине у воденој фази. Најчешће коришћени партициони систем је октанол-вода, а органска и водена фаза су међусобно засићене, међутим концентрација октанола у засићеној воденој фази је веома мала и не утиче на термодинамичке параметре добијене директним мерењем партиције. Обрнуто, велика концентрација воде у органској фази могла би да допринесе приметним разликама у термодинамичким параметрима испитиваних молекула. За разлику од система октанол- вода где су два растварача међусобно засићена, користе се и системи као што је хексадекан-вода који се може сматрати као систем два потпуно чиста растварача. Равнотежна константа за партицију између органске и водене фазе је важан физичко- хемијски параметар за карактеризацију хидрофобности [6]. Докторска дисертација Сандра Шеган 8 Слика 2. Схематски приказ процеса партиције Испитивани молекули се не адсорбују на стационарној фази, већ се само растварају у њој. Према томе, што је већа растворљивост узорка у стационарној фази, мања је његова растворљивост у мобилној фази, ретенција испитиваних супстанци је јача и обрнуто. Одвајање супстанци је условљено њиховим различитим подеоним коефицијентима између стационарне течности и течне мобилне фазе. По адсорпционој теорији ретенција се заснива на физичкој сорпцији молекула на површинским активним центрима чврсте стационарне фазе. Молекули се крећу из течне фазе ка адсорптивном слоју и премештају адсорбоване молекуле растварача. Схематски приказ овог процеса дат је на Слици 3. Слика 3. Схематски приказ процеса адсорпције Раздвајање хроматографисаних супстанци је могуће само уколико имају различите афинитете везивања за активне центре стационарне фазе. Према томе, ако је компонента смеше слабо адсорбована на површини чврсте стационарне фазе, она ће се брже од осталих, јаче адсорбованих супстанци, кретати кроз систем. Интензитет ових интеракција зависи од више фактора од којих су најважнији: број активних центара на адсорпционој површини, присуство поларних или поларизабилних функционалних група у молекулу одвајане супстанце које условљавају јаче интеракције са активним центрима, и елуциона моћ мобилне фазе (ретенција слаби са повећањем растворљивости узорка у мобилној фази) [6]. Докторска дисертација Сандра Шеган 9 Треба нагласити да стационарна фаза у реверзно-фазној хроматографији има врло комплексну структуру и веома је тешко одредити да ли се ретенција заснива на партицији или адсорпцији, па су вероватно у одређеној мери заступљена оба процеса. Carr и сарадници [11] су проучавали ретенционо понашање различитих једињења у условима RPLC и објаснили да стационарна фаза има важну улогу у ретенцији једињења. Наиме, они су закључили да је укупна слободна енергија ретенције неполарних једињења пре свега резултат доприноса слободне енергије која потиче од стационарне фазе, а мање од процеса који се дешавају у мобилној фази. По њима, првенствено стационарна фаза утиче на ретенцију и енталпија интеракција између аналита и стационарне фазе има главни утицај на ретенцију једињења, а ретенциони механизам се заснива углавном на партицији. У циљу разјашњења ретенционог механизма у реверзно-фазним системима анализирано је шест неполарних једињења (бензен, толуен, етилбензен, пропилбензен, изопропилбензен и терц-бутилбензен) на C18 и C2 колонама са мобилним фазама које поред воде садрже метанол, изопропанол, ацетонитрил и тетрахидрофуран. Претпоставља се да се ретенција на C2 колони заснива на адсорпцији, пошто на стационарној фази нема места за формирање шупљина за молекуле аналита. Закључено је да се ретенциони механизам на C18 колони разликује у зависности од органске компоненте мобилне фазе. Адсорпциони механизам доминира са мобилним фазама које садрже ацетонитрил и тетрахидрофуран, док је партициони механизам заступљен са изопропанол-вода мобилном фазом под условом да је молска фракција изопропанола већа од 0,2. Примена метанола у мобилној фази није дала јасну слику о ретенционом механизму [12]. У литератури је описано пет модела стационарних фаза који описују ретенцију у реверзно-фазним системима [6]. По партиционом моделу течног угљеника, алкил ланци везани за стационарну фазу ступају у хидрофобне интеракције са метанол-вода мобилном фазом и граде неку врсту кластера који формирају окружење слично течности погодно за партицију малих неполарних молекула [13]. По партиционом моделу течно-кристалног угљоводоника састав мобилне фазе утиче на геометријску конфигурацију алкил ланаца стационарне фазе на два начина. При већим концентрацијама органске компоненте у мобилној фази алкил ланци су Докторска дисертација Сандра Шеган 10 издужени и оријентисани нормално на површину дајући изглед четке и омогућујући улаз молекула мобилне фазе и аналита. Супротно томе, са повећањем садржаја воде у мобилној фази, стационарна фаза се понаша као квази слој течности у којој се налазе слој полегнутих и наслоњених алкил ланаца који отежавају пролаз растварачу, али не спречавају продирање испитиваних молекула [14]. По моделу адсорптивног угљоводоничног монослоја ретенција се заснива на механизму адсорпције када је густина неполарних везаних функционалних група довољно велика да ланци међусобно ступе у латералне интеракције и отежају продирање испитиваних молекула у аморфно-кристални угљоводонични слој стационарне фазе. У овом случају адсорпција се одвија на угљоводоничној површини сачињеној од алкил група сорбента [15]. Аморфно-кристални угљоводонични партициони модел, често називан и интерфазни модел, карактерише неуређена молекуларна организација површине стационарне фазе. Причвршћени крајеви ланаца чине регионе високог уређења, док је уређеност у области слободних крајева мања [16]. Велики недостатак ове теорије је тај што занемарује адсорпцију компонената мобилне фазе на површини стационарне фазе, што није у сагласности са бројним хроматографским и спектроскопским проучавањима која указују на значајну адсорпцију растварача. 2.2 ЛИПОФИЛНОСТ ЈЕДИЊЕЊА Липофилност је важан физичко-хемијски параметер који је од суштинског значаја за биолошку активност неког једињења. По дефиницији (IUPAC Gold Book) липофилност представља афинитет молекула или дела молекула према липофилном окружењу. Иако се често сматрају синонимима, појам липофилности треба разликовати од појма хидрофобности. Наиме, хидрофобност се односи на асоцијацију неполарних група или молекула у воденом окружењу која расте са тенденцијом молекула воде да их искључе. Зато се хидрофобност сматра интегралним елементом липофилности и дубље сагледавање ова два параметра може да олакша разумевање карактеристичних интеракција. Липофилност једињења је резултат, са једне стране, хидрофобних интеракција које укључују формирање шупљине, хидрофобне и дисперзионе силе, а са друге стране поларних интеракција које обухватају Докторска дисертација Сандра Шеган 11 електростатичке интеракције и водоничне везе. У зависности од посматраног система, хидрофобне и поларне интеракције могу да имају различит или чак супротан допринос укупној вредности липофилности [17]. Значај липофилности једињења за одигравање биолошких процеса произилази из структуре ћелијске мембране. Наиме, ћелијска мембрана је селективно пропустљива баријера која се састоји из фосфолипидног двослоја са уграђеним протеинима. Липидни двослој састоји се из амфифилног фосфолипидног слоја који је сачињен из ланаца масних киселина оријентисаних једне ка другима, док су региони хидрофилних глава окренути ка супротном крају. На Слици 4 дат је схематски приказ хемијске структуре уобичајеног фосфолипида (фосфатидилхолина) и његов положај између два слоја. Слика 4. Структура ћелијске мембране На овај начин олакшан је пролаз липофилнијих једињења кроз ћелијску мембрану и грађење комплекса између једињења и места везивања на рецептору. Интеракције лек – рецептор укључују фундаментално исте интермолекулске силе које учествују у партицији између воде и немешљиве органске фазе, па се за процену липофилности једињења веома често користи реверзно–фазна течна хроматографија [18]. Докторска дисертација Сандра Шеган 12 2.3 ОДРЕЂИВАЊЕ ПАРАМЕТАРА ЛИПОФИЛНОСТИ 2.3.1 Директне методе Hansch и сарадници [19] су развили стандардни поступак „мућкања“ (shake- flask) за одређивање липофилности једињења изражену кроз логаритам партиционог коефицијента, logP. Партициони коефицијент, logP, изражава тенденцију молекула да се распореди између органске и водене фазе: logP = log(C0 / Cv) (1) где су C0 и Cv његове концентрације у органској и воденој фази. На овај начин се може одредити липофилност једињења од -2 до 4 logP вредности, при чему logP > 0 карактерише супстанце растворљиве у липидном слоју, док је logP < 0 карактеристика поларних једињења растворних у воденој фази. Недостатак ове методе је и тај што поступак релативно дуго траје, а при томе супстанца мора да буде чиста. За одређивање липофилности применом ове методе могу се користити различити системи растварача, а најчешће коришћени систем је изооктанол-вода [20]. Партициони коефицијент logP се односи на неутралне супстанце или јонизабилне супстанце у неутралном облику. У случају јонизабилних једињења користи се партициони коефицијент logD који представља партициони коефицијент у систему октанол – вода када једињење учествује у секундарној хемијској равнотежи у једној или у обе фазе (нпр. јонизација, агрегација, грађење јонских парова итд.). У случају јонизације у воденој фази, logP и logD су повезани једначином (2) за слабу монопротичну киселину која је делимично јонизована у воденој фази и једначином (3) за слабу монопротичну базу која је делимично протонована у воденој фази. logD = logPXH - log(1+10(pKa – pH)) (2) logD = logPX - log(1+10(pH – pKa)) (3) где XH и X одговарају неутралном облику слабе киселине и базе. Ако су logP и pKa једињења познати, logD се може израчунати на било којој pH вредности. За полипротична једињења једначина постаје много сложенија [17]. У директне методе за одређивање липофилности спада и метода потенциометријске титрације, а односи се на партицију неутралних супстанци или јонских парова у органској фази. Титрацијом јонизабилних једињења у двофазном Докторска дисертација Сандра Шеган 13 систему као што је октанол / вода са различитим запреминским уделима могу да се добију партициони коефицијенти свих јонских врста. Са увођењем високопрецизних потенциометријских титратора опремљених софистицираним програмима за прорачун, овај начин одређивања logP вредности налази све ширу примену [21]. 2.3.2 Индиректне методе Основни значај хроматографских метода у одређивању липофилности једињења заснива се на динамичкој партицији између две немешљиве фазе. Ретенција супстанце у реверзно–фазним хроматографским системима и партиција супстанце у систему н- октанол – вода су енергетски аналогни. Обично се као стационарна фаза користи C18 модификовани силика-гел, при чему се сама структура ове стационарне фазе може поредити са структуром фосфолипида у ћелијској мембрани. Угљоводонични ланци одговарају липофилном крају, а основа силика-гела хидрофилном делу фосфолипидне мембране. Осим тога, неполарне стационарне фазе су анизотропне и много боље описују партицију у фосфолипидном двослоју у односу на изотропни октанол. Као индиректна хроматографска метода често се користи метода калибрације која се заснива на одређивању logP вредности једињења на основу калибрационог сета једињења чије су logP вредности познате. Мерењем ретенционих параметара (logk или RM) калибрационог сета једињења и једињења чије се logP вредности одређују под истим хроматографским условима, могу да се одреде logP вредности испитиваних једињења: logP = p + qlogk (4) где је k ретенциони фактор (или ретенциони фактор који је резултат екстраполације logk вредности до мобилне фазе која садржи чисту воду, а за танкослојну хроматографију, RM или RM0). У пракси је веома важно да структуре једињења у калибрационом сету и једињења којима се одређује logP вредност буду сличне, иначе ће се добити непоуздане logP вредности [17]. Докторска дисертација Сандра Шеган 14 2.3.2.1 Одређивање параметара липофилности применом високо-ефикасне течне хроматографије Параметри липофилности добијени применом реверзно-фазне високо-ефикасне течне хроматографије могу да се изведу применом следеће формуле: logk = log w + Sφ (5) где је logk = log((tr – t0)/t0) (6) при чему је t0 ретенционо време једињења које се не задржава на колони (одговара фронту растварача), а kw одговара изократском фактору, односно мобилној фази која садржи чисту воду и обично представља екстраполисану вредност. Параметар S у једначини (5) зависи од природе органског растварача у мобилној фази и указује на механизам ретенције. Параметар φ је запреминска фракција органске компоненте мобилне фазе [22]. Валко (Valkó) и сарадници [23] су увели још један параметар који је везан за липофилност, а дефинише се једначином: φ0 = -logkw/S (7) Предност овог параметра је то што укључује липофилност и специфичну хидрофобну површину једињења, па је у неким случајевима овај параметар много поузданији за QSАR студије. Такође, овај параметар показује значајну корелацију са традиционално одређеним октанол/вода партиционим коефицијентима, за велики број структурно различитих једињења. 2.3.2.2 Одређивање параметара липофилности применом танкослојне хроматографије Четрдесетих година прошлог века ретенциони параметари добијени применом танкослојне хроматографије почели су да се повезују са подеоним коефицијентом добијеним у систему хлороформ–вода [24]. Одговарајући ретенциони коефицијент, RM, је повезан са експериментално одређеном RF вредношћу: RM = log(1/RF-1) (8) Примена реверзно-фазне танкослојне хроматографије (RP-TLC) у одређивању параметара липофилности једињења се заснива на претпостављеној линеарној зависности између RM вредности и концентрације органске компоненте мобилне фазе: Докторска дисертација Сандра Шеган 15 RM = RM0 + bC (9) где је RM0 (одсечак на Y-оси) параметар липофилности и представља RM вредност сведену на чисту воду, b је нагиб праве повезан са специфичном хидрофобном површином једињења и C је запреминска фракција органске компоненте у мобилној фази. Забележена одступања од линеарне зависности су приписана двојном партиционо–адсорпционом механизму [8]. У неким случајевима једначина (2) не описује на најбољи начин зависност ретенционог фактора RМ, већ се примењује полином другог степена [25]: RM=RM0 + bC + bC (10) Предност ове методе за одређивање липофилности у односу на директну методу мућкања је та што обухвата много шири опсег logP, потребне су мале количине супстанце која не мора да буде чиста, анализа је брза и репродуктивна. Поред RM0, за процену липофилности једињења користи се и параметар C0 aналогно приступу који је примењен за процену липофилности применом високо-ефикасне течне хроматографије [26]. Овај параметар може да се израчуна из односа одсечка и нагиба праве у једначини (9) [27]: C0 = -RM0/m (11) Значајан допринос примени RP-TLC у одређивању липофилности кроз многобројне радове дали су дали су Biagi и сарадници [28, 29, 30, 31]. Ови аутори су одређивали липофилност неких лекова применом стационарне фазе сачињене танког слоја силика-гела импрегнисаног силиконским уљем, а мобилне фазе су поред воде садржавале метанол, ацетон или ацетонитрил. Извели су следеће закључке: • Одсечак зависности RМ вредности од удела органског растварача у мобилној фази, може се узети као мера расподеле супстанце између силиконског уља и воденог раствора пуфера. • За веома поларне супстанце, које могу да се крећу и у одсуству органског растварача у мобилној фази, постоји веома добра корелација између експерименталних и екстраполисаних RM вредности. • Одсечак у једначини (9) не зависи од природе органског растварача. • У корелацији RM вредности и удела органског растварача, постоји линеарна зависност нагиба и одсечка. Због ове зависности и други аутори налазе да је употреба Докторска дисертација Сандра Шеган 16 нагиба TLC једначине валидна алтернативна мера липофилног карактера [32, 33]. Ова веза нагиба и одсечка налази се само у случају структурно веома сличних једињења. У оваквим случајевима екстраполисана RM вредност препоручује се као мера липофилности. Иако су Biagi и сарадници дошли до закључка да су RM0 вредности независне од природе органске компоненте у мобилној фази, ово се не може применити на било који хроматографски систем. Проучаван је утицај органске компоненте мобилне фазе и молекулске структуре неких дихидрокситиобензанилида на ретенцију у реверзно- фазној танкослојној хроматографији [34]. Закључено је да су екстраполиране RM0 вредности за системе са ацетоном и ацетонитрилом у мобилној фази веома сличне, док је метанол као органска компонента мобилне фазе допринео нешто нижим RM0 вредностима. Аутори наводе да је разлог таквом понашању то што испитивани молекули садрже више –ОH група, па ступају у јаке међумолекулске интеракције са молекулима метанола у мобилној фази. Последица тога је слабија ретенција, односно ниже RM0 вредности испитиваних једињења. С друге стране, метанол у мобилној фази је допринео већој селективности у раздвајању испитиваних једињења. Селективност у реверзно-фазним системима се заснива првенствено на дисперзионим интеракцијама између стационарне фазе и аналита, при чему се контрола раздвајања и ретенција постижу променом елуционе моћи растварача [35]. Касних деведесетих година 20-ог века предложен је хемометријски приступ за одређивање параметра липофилности на основу ретенционих података. Применом статистичке методе aнализе главних компонената (Principal Component Analysis – PCA) на ретенционе податке, најчешће RM вредности, могуће је добити нову скалу липофилности. Линеарном комбинацијом ретенционих података добијају се вредности главних компонената или скорова, а најчешће се прва главна компонента користи за корелацију са партиционим коефицијентом (logP) и другим дескрипторима. Осим тога, пажљивом анализом својствених вредности и својствених вектора (loadings) могу се добити корисне информације које се тичу објашњења хроматографског понашања и ретенционог механизма [36, 37]. Докторска дисертација Сандра Шеган 17 2.3.2.3 Одређивање параметара липофилности теоријским путем  Различити рачунарски програми могу да се користе за рачунање липофилности једињења. Липофилност као адитивно конститутвна карактеристика, теоријски се одређује применом два приступа. Један приступ заснива се на подели молекула на подструктуре, односно фрагменте (фрагменталне методе), при чему је укупна липофилност молекула резултат доприноса појединачних фрагмената. Други приступ узима у обзир читаву структуру молекула, односно, заснива се на доприносу сваког појединачног атома укупној липофилности једињења [38]. Rekker је предложио и методу за рачунање logP вредности изомера комбиновањем хроматографских података и теоријских прорачуна [39]: logPcal(1) = RF (srednje)/RF1 x logPRekker (12) logPcal(2) = RF (srednje)/RF2 x logPRekker (13) Иако рачунарски програми могу да буду веома корисни и могу да дају бројне информације за многа једињења, постоје и одређени недостаци примене ове методе. Теоријско одређивање logP вредности није применљиво на цвитер (zwitter) јоне, таутомере, наелектрисана једињења, као и на једињења са изразито јакoм способношћу водоничног везивања [40]. Експериментално одређене вредности липофилности се обично корелишу са израчунатим, али да би се добиле статистички значајне корелације структуре једињења морају бити сличне [41]. 2.4 ХРОМАТОГРАФСКИ СИСТЕМИ ЗА ОДРЕЂИВАЊЕ ЛИПОФИЛНОСТИ За одређивање липофилности једињења најчешће се користе RP-18 стационарне фазе. Статистички значајне корелације измерених и литературних logP вредности добијају се у комбинацији са метанол – вода мобилном фазом. Познато је да RP-18 стационарне фазе садрже слободне киселе силанолне групе које могу да остваре интеракције грађењем водоничних веза што има за последицу развлачење пикова (peak tailing), односно развлачење зона и нетачно одређене параметре липофилности. У Докторска дисертација Сандра Шеган 18 поређењу са системом n-октанол – вода, где долази до изражаја само партициони механизам, у хроматографском систему са RP-18 стационарном фазом, силанофилне интеракције аналит - стационарна фаза резултују двојним механизмом ретенције (адсорпција и партиција) [42]. Силанофилне интеракције могу да се редукују додатком тзв. маскирајућег агенса ( нпр. n-дециламин, триетиламин) мобилној фази. Lombardo и сарадници су за одређивање липофилности неутралних и базних једињења додавали n-дециламин мобилној фази [43]. У новије време се производе тзв. базно деактивиране стационарне фазе прилагођене раздвајању базних једињења са унапред деактивираним силанолним групама. Докторска дисертација Сандра Шеган 19 2.5 КВАНТИТАТИВНА ЗАВИСНОСТ СТРУКТУРА - РЕТЕНЦИЈА Карактеристике неког једињења зависе од његове структуре, али у великој мери и од његових интеракција са молекулима у окружењу. Процена ретенције у зависности од хемијске структуре аналита и физичко-хемијских карактеристика мобилне и стационарне фазе позната је под називом квантитативна зависност структура– ретенција (QSRR, quantitative structure-retention relationship). Схематски приказ ове зависности дат је на Слици 5. Слика 5. Схематски приказ квантитативне зависности структура-ретенција Да би се добиле статистички значајне корелације потребно је израчунати велики број структурних параметара. Хроматографија је јединствена метода која омогућава добијање великог броја квантитативно упоредивих, прецизних и репродуктивних података за велики број структурно различитих једињења (аналита) који се добијају Докторска дисертација Сандра Шеган 20 под истим експерименталним условима, па је структура једињења једина независна варијабла у систему [8]. Основи циљеви QSRR студија су следећи (Слика 5): 1. Предвиђање ретенције нових аналита 2. Одређивање најважнијих структурних дескриптора 3. Објашњење механизма раздвајања за дати хроматографски систем. За добијање одговарајућег математичког модела потребне су две врсте података: зависне варијабле (квантитативно упоредиви хроматографски подаци) за довољно велику групу испитиваних једињења и независне варијабле, односно дескриптори који осликавају структурне карактеристике испитиваних једињења. Основни QSRR приступ састоји се у регресији ретенције и теоријски добијене вредности логаритма партиционог коефицијента у систему октанол-вода (ClogP). Вредности ClogP се израчунавају из структурних формула аналита, обично применом неког комерцијално доступног компјутерског програма. Добија се регресиона једначина: tr = k1 + k2ClogP (14) где су k1 и k2 регресиони коефицијенти. Друга врста QSRR једначина се заснива на примени солватохромних параметара и тзв. линеарној зависности солватационе енергије (linear solvation energy relationship– LSER). Наиме, LSER анализа разлаже дату молекулску карактеристику на њене солватохроматске параметре. Ову методу су развили Taft, Carr, Abraham и сарадници [8], при чему се логаритам ретенционог параметра изражава једначином: logk = konstanta + M(δm2 – δs2)Vx/100 + S(πs*- πm*)αx + A(βS – βM)αX + B(αS - αM)βX (15) где се X односи на карактеристике аналита као што су моларна запремина ВX, поларизабилност/диполарност, πX*, киселост αx и базност βX. Сваки параметар аналита се множи са коефицијентом који представља разлику у комплементарним својствима мобилне фазе (субскрипт m) и стационарне фазе (субскрипт s). Солватохромни параметри су емпиријски по својој природи и применљиви су на ограничен број једињења. Докторска дисертација Сандра Шеган 21 Данас се примењује општи модел који су поставили Абрахам (Аbraham) и сарадници [44] и приказује се следећом једначином: SP = c + eE + sS + aA + bB +vV (16) У овој једначини, SP је мера партиције једињења (нпр. logk), c је константа или одсечак. Параметри Е, S, А, B и V представљају меру поларизабилности у вишку, диполарност, протонску киселост (способност донирања протона), протонску базност (способност примања протона) и молекулску запремину, а е, s, а, b и v су одговарајући коефицијенти. За добијање одговарајућег модела најчешће се користи метода вишеструке линеарне регресије, где се као зависна варијабла користи неки ретенциони параметар, а као независне варијабле теоријски израчунате варијабле Е, S, А, B и V. Добијени модели могу да помогну да се стекне увид у механизам хроматографске ретенције на молекулском (субмолекулском) нивоу. Интерпретација коефицијената у моделу заснива се на њиховој величини, хемијском значењу и предзнаку [45]: 1. Величина коефицијената одражава разлику интеракција са растварачем и према томе степен у којем ове интеракције утичу на карактеристике аналита (типична ретенција у хроматографским студијама) 2. Хемијски, коефицијенти су специфични и комплементарни параметру аналита који модификују (нпр. коефицијент протонске базности аналита одражава разлику у протонској киселости растварача). 3. Предзнак коефицијента се одређује линеарном регресионом анализом и указује на који начин интеракције аналита са стационарном и мобилном фазом утичу на ретенциони параметар који се моделује. Под појмом квантитативне зависности структуре и ретенције (QSRR) најчешће се подразумева трећа врста QSRR једначина која повезује ретенцију и израчунате структурне дескрипторе једињења и биће у даљем тексту детаљније разматрана. Докторска дисертација Сандра Шеган 22 2.5.1 Молекулски дескриптори По Тodeschini-ју и коауторима дефиниција молекулског дескриптора је следећа: „Молекулски дескриптор је финални резултат логичког и математичког поступка који трансформише хемијску информацију у одговарајућу бројну вредност или је резултат неког стандардног експеримента” [46]. Према томе, молекулски дескриптори могу да се поделе на две основне класе: експерименталне, као што су logP, моларна рефрактивност, диполни моменат, поларизабилност и уопште физичко-хемијске карактеристике и теоријске дескрипторе који се изводе из симболичког приказа молекула, а даље могу да се деле према различитим начинима молекулског представљања. Основна разлика између ове две групе дескриптора је то што теоријски дескриптори немају статистичку грешку везану за експерименталне услове. Поред тога, када се ради о серији сличних једињења, сматра се да је грешка приближно константна. Код најједноставнијих теоријских дескриптора који се односе на структурне карактеристике или на дескрипторе изведене применом егзактних математичких теорија искључују се све врсте грешака. Теоријски дескриптори изведени из физичких и хемијских теорија показују одређена преклапања са експерименталним мерењима. Пример оваквих дескриптора су неки квантно-хемијски дескриптори, површина и запремина молекула. Предности теоријски добијених дескриптора огледају се у уштеди времена, новца, као и у њиховој доступности. Са порастом потребе да се дубље истраже хемијски и биолошки системи непрекидно расте број дескриптора. Молекулски дескриптори су постали једне од најважнијих варијабли које се користе у молекуларном моделовању применом статистике, хемометрије и хемоинформатике. Уопштено, молекулски дескриптор би требало да задовољи одређене основне захтеве као што су [47]: 1.да тумачи структуру молекула 2. да показује добру корелацију са најмање једном карактеристиком 3. пожељно је да прави разлику између изомера 4. да је применљив на делове структуре молекула 5. генерализован на “више” дескрипторе 6. независан Докторска дисертација Сандра Шеган 23 7. једноставан 8. да се не заснива на својствима једињења 9. да није у корелацији са другим дескрипторима 10. да се лако конструише 11. примењив на структурно сличне молекуле 12. да показује тачан степен зависности са зависном промењивом 13. да се постепено мења са постепеним променама у структури. 2.5.2 Молекулско представљање Број структурних дескриптора који може да буде приписан неком једињењу је практично неограничен. Осим теоретских дескриптора, могу де се разликују и дескриптори у зависности од димензије: 0D, 1D, 2D, 3D и 4D дескриптори [47]. Дескриптори 0D се изводе из молекулске формуле и независни су од молекулске структуре. Ту спадају број и врста атома у молекулу, молекулска маса, сума van der Waals-ових запремина итд. Дескриптори 1D изводе се из једнодимензионалног приказа молекула и односе се на структурне фрагменте молекула као што су, на пример, број функционалних група или супституента који су од значаја за молекул. Према томе, није потребно потпуно познавање молекулске структуре. Дескриптори 0D и 1D (конституциони) се могу лако израчунати и објаснити, није потребна оптимизација молекулске структуре и не зависе од конформације молекула. Међутим, неки молекули, као што су изомери, могу да имају идентичне вредности ових дескриптора. Иако дају мало информација о молекулу, ови дескриптори могу да имају важну улогу у моделовању неких физичко-хемијских карактеристика или могу да буду укључени у много сложеније моделе. Дводимензионално приказивање молекула односи се на то како су атоми међусобно повезани. Представљање молекула у облику молекулског графа се обично назива тополошко представљање. Молекулски дескриптори изведени из алгоритама примењених за тополошко представљање називају се 2D дескриптори и укључују тзв. тополошке индексе. Докторска дисертација Сандра Шеган 24 Дескриптори изведени из просторне конфигурације називају се 3D или геометријски дескриптори. Молекул се дефинише на основу врсте атома и координата сваког атома (x, y, z). Неки од ових дескриптора односе се на стерне фактора и величину молекула. Стереоелектронско представљање молекула односи се на описивање молекула у зависности од дистрибуције електрона, а добијени дескриптори се називају 4D дескриптори [48]. 2.5.3 Оптимизација структуре Важан корак у проучавању квантитативне зависности структуре и ретенције је дефинисање молекулске структуре испитиваних једињења. Потребно је да се зна које су врсте атома у молекулу, начин на који су повезани и релативни положаји свих атома у простору. Геометријском оптимизацијом добијају се координате молекулске структуре које представљају минималну потенцијалну енергију од чега зависи стабилност једињења. За рачунање молекулских дескриптора потребна је коректна молекулска структура. Геометријска оптимизација се комбинује са проналажењем конформације молекула који доприноси минималној потенцијалној енергији. Проналажење конформације може да се изврши по систематском или принципу случајности у односу на мале ротационе углове дефинишући корак сваког циклуса. Ако је у молекулу присутно много једноструких веза и/или ако је изабрани ротациони угао мали, број добијених конформера може да буде веома велик. У следећем кораку изводи се потпуна геометријска оптимизација молекула при чему се за квантно– механичке прорачуне користе семиемпиријске методе. Квантно–механички прорачуни су атрактиван извор нових молекулских дескриптора који, у принципу, могу да изразе све електронске и геометријске карактеристике молекула и њихове интеракције [47] У пракси, оптимизација молекулске структуре почиње цртањем 3-D структуре једињења у неком од хемијских софтвера (као што су MDL ISIS Draw, ACD ChemSketch, ChemDraw) или се структуре изводе из базе података (ChemIDPlus, PubChem). Тродимензионалне структуре се затим генеришу, при чему први корак обухвата ефекат поља молекулске механике (MM+, MMFFs, AMBER итд), а у другом кораку се коначна минимизација спроводи применом семиемпиријских параметара (АМ1, PM3 итд) [49]. Докторска дисертација Сандра Шеган 25 2.5.4 Селекција дескриптора (варијабли) За добијање валидних модела применом линеарних регресионих метода неопходно је да се уради селекција варијабли. У пракси се обично полази од великог броја дескриптора, међутим при моделовању одређене биолошке активности неког једињења или његових ретенционих параметара, разумно је да се претпостави да је само мали број дескриптора значајан за формирање математичког модела. Као последица ове чињенице, као кључни полазни корак за добијање одговарајућег математичког модела је правилан одабир дескриптора. Ово даје могућност интерпретације значаја модела, занемарују се безначајни доприноси варијабли, повећавају се предвиђајуће карактеристике модела и смањује се време трајања анализе. Током година развијене су различите методе селекције варијабли, од једноставних до веома сложених. Метода постепене регресије (Stepwise Regression) је стандардна метода за селекцију варијабли [50]. Може да се подели на три методе: селекција унапред (Forward Selection), селекција или елиминација уназад (Backward Elimination) и постепена селекција (Stepwise method). Код селекције унапред, прва варијабла укључена у модел је она која има највећу вредност R2. Свака следећа додата варијабла додатно повећава коефицијент детерминације. Процес се прекида када се уведе варијабла чији допринос порасту поменутог коефицијента нема значаја или када све варијабле уђу у модел. Ова метода је релативно брза, али не гарантује добијање најбољег модела, осим у случају првог параметра. Може се користити у случају великог броја опажања и појмова када друге методе нису примењиве. • Код елиминације уназад почиње се са моделом у који су укључене све варијабле, а затим се елиминишу једна по једна и то прво она са најмањим доприносом вредности предвиђене суме квадрата грешака (predicted residual error sum of squares - PRESS). Процес се прекида када у моделу остану све значајне променљиве. Постепена селекција почиње као селекција унапред, али у сваком ступњу постоји могућност елиминације варијабле из модела. Одаберу се два нивоа значајности, један нижи, као Докторска дисертација Сандра Шеган 26 критеријум за укључивање нових варијабли и други за њихово искључивање [50, 51]. Такође, одабир дескриптора може да се уради и применом других метода као што су PLS, PCA и метода генетичких алгоритама. 2.5.5 Статистичке методе у QSRR-у Постоји неколико начина за повезивање ретенције испитиваних једињења са њиховом структуром. Најчешће примењиване статистичке методе дате су у Таблици 1. Могу се поделити на две основне класе: основне технике препознавања (Pattern recognition techniques) и корелационе анализе (Correlation analysis)). Основне методе препознавања заснивају се на груписању једињења на основу неке карактеристике, док корелационе методе утврђују квантитативну зависност структурних дескриптора и ретенције. Таблица 1. Подела статистичких метода за QSRR студије Методе препознавања Корелационе методе Кластерска анализа (Cluster analysis – CA) Вишеструка линеарна регресија (Multiple Linear Regression, MLR) Анализа главних компонената (Principal Component Analysis – PCA) Регресија главних компонената (Principal Components Regression, PCR) Нелинеарно мапирање (Non-linear Mapping) Регресија делимичних најмањих квадрата (Partial Least Squares Regression, PLS) Неуронске мреже (Neural networks) Неуронске мреже (Neural Networks) 2.5.5.1 Кластерска анализа Кластерска анализа je нелинеарнa методa која обухвата неколико различитих техника. При груписању објекти се групишу у кластере на основу сличности, тако да су објекти који припадају једном кластеру хомогени. Припадност кластеру се одређује мерењем удаљености између објеката, а најчешће се користи Wаrd-ова заснована на принципу минималне варијансе у оквиру кластера. Растојање између објеката 1 и 2 рачуна се применом Euclidian-ове раздаљине која се дефинише као: d12 = [(x11 – x12)2 + (x12 – x22)2]1/2 (17) Докторска дисертација Сандра Шеган 27 Једна од најчешће примењиваних метода груписања објеката је хијерархијска кластерска анализа. То је метода која се заснива на расподели групе објеката у појединачне класе, тако да се слични објекти налазе у истој класи. Разликују се агломеративне методе и сепарационе методе. Код агломеративних метода груписање почиње од више објеката и наставља се њиховим спајањем у један објекат. Сепарациона метода се заснива на подели читавог сета објеката на индивидуалне групе (кластере). Раздвајање или спајање кластера у поменутим методама заснива се на сличностима и удаљеностима између кластера [52] 2.5.5.2 Анализа главних компонената Ова метода је погодна за уочавање сличности и разлика међу посматраним једињењима, као и за уочавање спољашњих вредности. Анализа главних компонената може генерално бити представљена као метода која задржава интерну структуру података на начин који најбоље описује варијансу података. Математички PCA модел може да се представи као: D = Т × P (18) где је D матрица података, а Т и P су матрице скорова (score) и латентних варијабли (loading). Према PCA, подаци (посматрани објекти или аналити) су представљени у мултидимензионалном простору, где су варијабле које дефинишу осе пројектоване у неколико главних (основних) компонената које су линеарна комбинација оригиналних варијабли и описују максимум варијансе података. Прва главна компонента (PC1) се бира у смеру највеће варијансе. Друга главна компонента (PC2) је ортогонална на прву и представља варијабилитет који није објашњен са PC1 итд. Свака главна компонента се карактерише скоровима, који представљају нове координате пројектованих објеката, и латентним варијаблама (loadings) који представљају смер у односу на оригиналне варијабле. Зависност скорова прве две компоненте је дводимензионални приказ који даје распоред једињења, приказујући груписање једињења као и спољашне вредности. Одговарајуће зависности латентних варијабли (loadings) приказују зависности између варијабли и могу да се користе за одређивање варијабли (дескриптора) који доприносе позиционирању објеката у приказу односа скорова [53]. Докторска дисертација Сандра Шеган 28 Понекад је пре саме анализе неопходно да се уради једноставна трансформација, односно стандардизовање регресионих коефицијената (или аутоскалирање) полазних података, јер се независне варијабле изражавају у различитим јединицама. Стандардизовани регресиони коефицијенти се израчунавају на следећи начин: Bi = βi (si/sy) i = 1,…,k (19) где је Bi стандардизовани регресиони коефицијент, βi и si регресиони коефицијент и стандардна девијација независне варијабле и sy стандардна девијација зависне варијабле [54]. Међутим, у извесним случајевима скалирање података има нежељене ефекте. Наиме, варијабле за које се зна да садрже малу количину информација, после стандардизовања постаће значајне колико и варијабле које садрже значајније информације. PCA не може да направи разлику између значајних и информација од малог значаја, већ изражава што је могуће више варијабилитета међу подацима. У случајевима када је значај појединих варијабли познат, а међу варијаблама постоје оне које су мање значајне, податке не би требало скалирати пре почетка анализе [55]. 2.5.5.3 Вишеструка линеарна регресија (MLR) Вишеструка линеарна регресија је веома широко примењиван приступ проучавању квантитативне зависности структуре и ретенције. Једноставан линеарани регресиони модел подразумева да се као одговор зависне варијабле y на независну варијаблу x, добија праволинијска функција. Вишеструка линеарна регресија представља проширење методе једноставне линеарне регресије укључивањем више од једне независне варијабле x. Добија се мултилинеарни модел: Y = b0 + b1x1 + b2x2 +... +bnxn (20) где су x1, x2,...,xi молекулски дескриптори, а b0, b1, b2,...bn, регресиони коефицијенти [56]. Као и код једноставне линеарне регресије, у MLR моделу се одређују регресиони коефицијенти за сваку независну варијаблу, тако да сума квадрата грешака буде минимална. У великом броју случајева број дескриптора превазилази број једињења, па је пре MLR анализе неопходно редуковати број независних варијабли. То се постиже Докторска дисертација Сандра Шеган 29 искључивањем једне од две варијабле које су међусобно високо корелисане. Када је коефицијент корелације два дескриптора која су линеарно корелисана већи од 0,80 тада се узима дескриптор који је боље корелисан са зависном варијаблом, док се други дескриптор изузима из даље анализе [57]. Такође, из статистичке анализе се искључују дескриптори који имају константне вредности за сва испитивана једињења (укључујући и дескрипторе са вредношћу нула за 90% једињења), пошто не дају дискриминантне информације [58, 59]. Методе за селекцију дескриптора су бројне и доступне су у оквиру разних статистичких програма. 2.5.5.4 Метода делимичних најмањих квадрата (PLS) Метода делимичних најмањих квадрата представља технику линеарног моделовања код које се матрикс дескриптора X пројектује на мали број тзв. латентних варијабли. Последица тога је да PLS истовремено проналази варијабле које показују високу варијансу и високо су корелисане са зависном варијаблом Y. Број латентних варијабли у PLS моделу се одређује унакрсном валидацијом. Вредности значајних пројектованих варијабли (Variable Importance in Projection, VIP) указују на варијабле које су битне за добијање одговарајућег PLS модела [59]. Обично се варијабле са VIP вредностима које су веће од 1 сматрају значајним, док се оне са вредностима нижим од 1 могу искључити из модела, што не утиче на смањење предикционих карактеристика модела. VIP вредности дескриптора ј се рачуна на следећи начин: (21) где је p број варијабли, М је број задржаних латентних варијабли, wМј је пондер ј-те варијабле за m-ту латентну варијаблу, а SS(bm × tm) је проценат y варијабле који је објашњен m-том латентном варијаблом. Докторска дисертација Сандра Шеган 30 Метода делимичних најмањих квадрата се често користи као средство за класификацију применом дискриминантног приступа (PLS-DA). За ову анализу вектор класе се конструише за једну варијаблу сваке класе са вредношћу 1, ако узорак припада одређеној класи, и 0 ако не припада. Регресијом се добијају латентне варијабле које раздвајају класе једне од других. Ако је број варијабли много већи од броја једињења, PLS-DА модел може да буде прецењен и да се добију неодговарајуће класификације. Сходно томе, PLS-DА алгоритам може раздвојити две групе састављене од потпуно случајних података [60]. 2.5.6 Валидација модела Да би се добио статистички валидан и предвиђајући модел, потребно је да се задовоље одређени критеријуми. Најчешће се примењују два приступа. Један приступ подразумева укључивање физичко–хемијских дескриптора чији се значај у коначном моделу може објаснити. Други приступ подразумева одабир теоријских дескриптора из великог сета. Теоријски дескриптори не морају увек да буду повезани са зависном варијаблом, али квалитет добијених модела се објашњава на основу статистичких параметара и параметара који описују предиктивност модела [61]. Оваква врста валидације може да се врши помоћу посебно формираног сета једињења (тест-сет) која нису учествовала у добијању модела (екстерна валидација) или на основу истог калибрационог скупа који је служио за постављање модела (интерна валидација). Код екстерне валидације у добијену функцију замењују се дескриптори једињења из тест-сета и рачуна се њихова вредност за зависну промењиву. Ако су параметри спољашне валидације прихватљиви, то не мора да значи да је и модел поуздан. Екстерна валидација даје најреалнију слику уколико добијени модел има добру способност предвиђања, у супротном може се рећи да је модел прецењен [62, 63]. Постоји више облика интерне валидације: • Поступак у којем се поступно замењују молекули један за другим назива се изостави један (leave one out, LOO). Од укупног броја једињења из почетног скупа сукцесивно се изоставља по једно једињење, па се на основу преосталог скупа одређује математички модел методом MLR или PLS и на основу добијеног модела се рачуна Докторска дисертација Сандра Шеган 31 вредност зависне променљиве за изостављено једињење. Затим се претходно изостављено једињење враћа у почетни скуп једињења из којег се изоставља наредно једињење, па се претходни поступак понови. Уколико почетни скуп није превелик, тада се овај поступак понавља за свако једињење. У случају великог скупа једињења, користи се 50 до 70% елемената који се бирају на тај начин да репрезентују цео почетни скуп. Постоје и алтернативне методе где се у једном кораку искључује више молекула – изостави више (leave several out LSO, leave many out, LMO). • Код методе случајног подсета (random subset) одређује се s различитих тест- сетова случајним одабиром n/s објеката из сета података, тако да један одређени објекат буде само у једном тест-сету. Метода случајног подсета обично даје добре резултате, нарочито када се селекција подсетова понавља више пута. Овом методом се превазилазе проблеми који се јављају у унакрсној валидацији, као што је могућност да објекти из тест-сета и сета за моделовање имају различит физички смисао или да се исти објекат појављује у оба сета. Повећањем броја подела може се превазићи проблем различитог физичког смисла објеката из калибрационог и тест-сета, док се смањењем броја подела превазилази проблем појављивања објеката у оба сета. • Код методе преклапања (venetian blinds) тест-сет се формира тако што се међу подацима један објекат означи са s- и сви објекти почевши од оног нумерисаног као први до s-тог објекта чине тест-сет. Ова метода је једноставна и лака за примену уколико постоји релативно велики број објеката код којих није утврђена одређена правилност у редоследу. • Код уобичајене методе (custom) корисник бира сваки тест-сет. На овај начин одређени објекти се могу наћи у сваком тест-сету, могу бити изостављени из тест- сетова или могу бити изостављени из поступка унакрсне валидације. Уобичајена метода захтева додатно време за одређивање калибрационог и тест-сета за сваки суб- валидациони експеримент, али њена флексибилност може бити пресудна у случају малог броја објеката или када су подаци генерисани из експерименталног дизајна који може проузроковати да тест-сет и модел-сет имају различит физички смисао [55]. Уколико се у току QSRR студија добије више алтернативних модела који имају приближно исте статистичке параметре, онда се препоручује да се као коначан модел прихвати онај са најмањим бројем независних варијабли, молекулских дескриптора, јер је циљ да се добије једноставнији модел [59]. Докторска дисертација Сандра Шеган 32 2.5.7 Статистички параметри Статистичка значајност неког модела процењује се на основу неколико статистичких параметара [64]: • Квадрат коефицијента корелације, R2 и RCV2 односе се на калибрациону једначину и на једначину која је добијена применом унакрсне валидације и представљају меру квалитета модела. Разлика између R2 и RCV2 не би требало да буде већа од 0,3 [65]. (22) (23) • PRESS представља предвиђену суму квадрата грешака (predicted residual error sum of squares) (24) SSY (TSS) је укупна сума квадрата одступања (total sum of squares), односно суму квадрата разлика аритметичке средине експерименталних вредности y и сваке вредности y појединачно. (25) PRESS је важан параметар унакрсне валидације пошто даје добру апроксимацију стварне грешке предикције модела, при чему треба да буде задовољен услов PRESS << SSY, односно треба да буде задовољен услов PRESS/SSY < 0,4 [66]. • SD је стандардна девијација и пожељно је да ова вредност буде што нижа. (26) Докторска дисертација Сандра Шеган 33 • Корен средњег квадратног одступања (RMSE – root mean square error) односи се на калибрацију, унакрсну валидацију и предикцију (RMSEC, RMSECV и RMSEP). RMSEC и RMSEP не зависе од броја података у калибрационом сету или од броја дескриптора у моделу. Статистички значајан модел треба да има коефицијент детерминације R2 што ближи вредности 1,0, док вредности RMSEC, RMSECV и RMSEP треба да буду што је могуће сличније и ниже. (27) • F вредност (Фишеров количник) је количник објашњене и необјашњене варијансе за дати број степени слободе, даје информацију о статистичкој значајности модела, па се може рећи да је модел статистички значајнији што је F вредност већа. Овај статистички параметар се обично користи за процену укупног значаја изведене регресионе једначине. F = fR2/[(1-R2)m, (28) где је f број степени слободе, f = n – (m + 1), n = број једињења, а m је број дескриптора [67]. Интерпретацијом молекулских дескриптора у регресионом моделу могуће је указати на структурне карактеристике једињења која имају највећи значај на модел. Вредности стандардизованих регресионих коефицијената објашњавају релативни значај сваког дескриптора; што су ове вредности веће, већи је допринос одговарајућег дескриптора. Предзнак коефицијента означава позитиван или негативан допринос одговарајућег дескриптора зависној варијабли. 2.5.8 Случајне корелације Коначан QSRR/QSPR модел обично садржи мали број у односу на полазни израчунати скуп дескриптора. Да би коначан статистички модел био валидан, треба да се задовоље стандардни статистички критеријуми. Међутим, ови критеријуми се односе на индивидуалне варијабле у коначном моделу и не узима се у обзир број стварно посматраних дескриптора који би могао да буде укључен у једначину. Када је број посматраних независних варијабли велик, могу да се добију случајне корелације. Докторска дисертација Сандра Шеган 34 Пошто се овај фактор не одражава на стандардни статистички критеријум, важно је узети у обзир број посматраних варијабли ради њиховог могућег укључивања у једначину. Могућност добијања случајних корелација може да се избегне одређеним поступцима. Најважније је да се контролише колинеарност дескриптора, што се може постићи применом методе за одабир дескриптора селекцијом унапред (forward selection). Такође, довољан број података у почетном скупу је додатна гаранција за избегавање случајних корелација [56]. Докторска дисертација Сандра Шеган 35 3. НАШИ РАДОВИ 3.1 СТЕРОИДНИ ТЕТРАОКСАНИ Жучне киселине су амфифилна једињења која поседују стероидну структуру, са прстеновима А и B у cis положају, што доприноси закривљености молекула. Због овакве стуктуре, на α-површину молекула конвергирају хидроксилне групе и карбоксилна група на положају C-24, док се на β-површини налазе метил-групе градећи хидрофобни део молекула. Оваква структура, слична грађи сурфактаната, у великој мери одређује биолошку активност жучних киселина [68]. Ова чињеница и распрострањеност холне и деоксихолне киселине у природи послужила је као основа за њихово коришћење као полазних супстанци за синтезу стероидних тетраоксана као потенцијално биолошки активних једињења. Тетраоксани су супституисани деривати 1,2,4,5-тетраоксациклохексана (Слика 6). Супституенти R1, R2, R3 и R4 могу бити атоми водоника, различити алкил- и арил- низови или делови прстена. У литератури није описан тетраоксан код којег су сва четири супституента атоми водоника. O O O O R4 R1 R2 R3 Слика 6. Структура тетраоксана 1,2,4,5-Тетраоксациклохексански остатак (тетраоксан) постао је интересантна фармакофора, пошто је његова антималаријска активност веома слична 1,2,4- триоксанима, као што је природни артемисинин и његови синтетички деривати [69]. Испитивани бис-стероидни тетраоксани састоје се из два стероидна дела међусобно повезана тетраоксанским прстеном, при чему у односу на овај прстен могу Докторска дисертација Сандра Шеган 36 бити у cis- или trans положају [70]. Код мешовитих тетраоксана је један стероидни део молекула бис-стероидних тетраоксана замењен једноставним спироциклоалкилиден делом. На овај начин је у поређењу са бис-стероидним тетраоксанима смањена молекулска маса активног молекула, а истовремено је очуван његов амфифилни карактер [71]. У оквиру серије мешовитих тетраоксана синтетисани су деривати холне [69-71] и деоксихолне киселине [72], затим једињења са једноставном циклоалканском или исопропилиденском групом везаном за тетраоксански прстен [73]. На овај начин су разматрани утицаји различитих делова молекула на биолошку активност ових једињења. Стероидни део молекула утиче на повећану растворљивост ових једињења под физиолошким условима, а због његовог амфифилног карактера олакшан је пролаз кроз ћелијске мембране. Такође, деривати који представљају примарне и секундарне амиде под физиолошким условима нису јонизовани (што би било очекивано за карбоксилне киселине), па се не очекује разградња ћелијске мембране. Утврђено је да се фармакофора стероидних тетраоксана коју чине два акцептора водоничне везе (липидни) и једно хидрофобно место (алифатично), добро поклапа са структурама активних аналога, као и са структурама неких познатих триоксанских антималарика, укључујући артемизинин, артеетар, артесунатну киселину, као и са структурама неких других тетраоксана. За добру активност ове класе једињења важно је присуство бар једног акцептора водоничне везе на триоксанском или тетраоксанском делу структуре. Израчунавања интеракција неких од ових једињења са хемом упућују на то да је близина гвожђа из хема и триоксанског или тетраоксанског атома кисеоника важна за добру активност ових једињења. Изгледа да је пренос електрона са триоксанског или тетраоксанског атома кисеоника основа механизма дејства ових једињења [74]. Наша ранија проучавања стероидних тетраоксана односила су се на испитивање хроматографског понашања стероидних тетраоксана у различитим нормално- и реверзно–фазним системима и на објашњавање одговарајућих механизана раздвајања [75, 76]. У оквиру овог рада планирано је проучавање хроматографског понашања и разумевање механизама раздвајања првенствено у реверзно-фазним системима. С обзиром на то да процеси апсорпције и дистрибуције у биолошким системима зависе највећим делом од липофилности једињења и да постоји сличност у врстама Докторска дисертација Сандра Шеган 37 међумолекулских интеракција у реверзно-фазним и биолошким системима, планирано је утврђивање могуће везе између хроматографски добијеног параметра липофилности и различитих структурних дескриптора. На основу добијених резултата било би могуће предложити најважније структурне дескрипторе који утичу на понашање и својства стероидних тетраоксана у примењеним хроматографским условима. 3.2 КОРЕЛАЦИЈА СТРУКТУРЕ И РЕТЕНЦИЈЕ БИС-СТЕРОИДНИХ ТЕТРАОКСАНА Седам парова cis-trans изомера бис-стероидних тетраоксана (Таблица 2) испитивано је у неколико реверзно-фазних система. Коришћена је изразито неполарна C-18 стационарна фаза, као и цијано-модификовани силика-гел умерене поларности у комбинацији са мобилним фазама које су поред воде садржавале метанол као поларан и протичан растварач, ацетон или диоксан као поларне апротичне раствараче. Tаблица 2. Структуре испитиваних бис-стероидних тетраоксана O OAc AcO HO O AcO OAc H O COXXCO cis-C(2)C(2a) C(2)C(2a) C(24)C(24a) O AcO OAc H O O OAc AcO HO COX XCO C(2) C(2a) trans-C(2)C(2a) C(24) C(24a) Једињење H cis-C(2)C(2a) trans- C(2)C(2a) OCH3 1 2 NH2 3 4 NHPrn 5 6 OH 7 8 NHCH2CO2CH3 9 10 N(Prn)2 11 12 N 13 14 Докторска дисертација Сандра Шеган 38 Ретенција испитиваних бис-стероидних тетраоксана у реверзно–фазним хроматографским системима се заснива на хидрофобним интеракцијама стероидног дела молекула и неполарних група у положајима C(24) и C(24а) и специфичним интеракцијама између поларног тетраоксанског прстена, ацетокси група везаних за стероидне структуре и поларних група у положајима C(24) и C(24а) са молекулима мобилне фазе. Разлике у ретенцији испитиваних једињења зависе од природе супституената у положајима C(24) и C24а). Једињења са мање поларним супституентима у овим положајима су показала јачу ретенцију због јачих хидрофобних интеракција са стационарном фазом у односу на једињења са поларнијим супституентима. У свим случајевима ретенција испитиваних једињења слаби са порастом концентрације органске компоненте у мобилној фази. Истовремено, утврђено је да постоји линеарна зависност између RМ вредности добијених применом једначине RМ = log(1/RF-1) и концентрације органске компоненте у мобилној фази. Вредности одсечка, RМ0, добијене екстраполацијом RМ вредности на чисту воду, одговарају параметру липофилности једињења, док вредности нагиба, b, одговарају специфичној хидрофобној површини једињења. Таблице са RМ0 и b вредностима, као и одговарајућим статистичким параметрима за сваки хроматографски систем дате су у Прилогу (P1-P5). Такође су приказане вредности параметра C0, израчунате применом једначине (11), као и скорови прве главне компоненте, PC1, које су добијене методом анализом главних компонената. На RP-18 стационарној фази су добијене веће вредности параметра липофилности (RМ0) испитиваних бис-стероидних тетраоксана у односу на цијано- модификовану стационарну фазу. Овакво хроматографско понашање је вероватно последица јачих хидрофобних интеракција између аналита и октадецил-ланаца RP-18 силика гела у поређењу са цијано силика-гелом. Такође, очигледан је и утицај природе органске компоненте мобилне фазе на ретенцију, а самим тим и на RМ0 вредности испитиваних једињења. Наиме, метанол, који се најчешће користи при одређивању липофилности једињења због своје велике поларности и способности грађења асоцијација са молекулима воде, доприноси већим RМ0 вредностима у поређењу са ацетоном или диоксаном [77]. Разлике у својствима метанола као поларног и протичног растварача, са једне, и ацетона и диоксана као поларних и апротичних растварача са друге стране, одражавају се и на вредности нагиба које су ниже са Докторска дисертација Сандра Шеган 39 метанолом у односу на друга два растварача. Веће RМ0 вредности када се користи метанол у односу на ацетон или диоксан неки аутори објашњавају јаким специфичним интеракцијама аналита и мобилне фазе, односно грађењем водоничних веза које утичу на растворљивост аналита у мобилној фази [78]. Утврђено је да једињења 11 и 12 имају највећу вредност липофилности у свим системима, док примарни амиди (3 и 4) имају најнижу вредност липофилности. Разматрајући разлике у липофилности између cis- и trans- изомера може се уочити да cis- изомери имају ниже вредности липофилности у односу на trans- изомере. Добијене вредности нагиба су веће на цијано-модификованом слика-гелу у односу на RP-18 модификовани силика–гел, што је у сагласности са резултатима који се наводе у раду [79], где се каже да вредности нагиба расту са повећањем поларности стационарне фазе. Као што је истакнуто у Општем делу овог рада, за процену липофилности једињења применом танкослојне хроматографије, поред параметра RМ0, користи се параметар b који се односи на нагиб у једначини (9), а одговара специфичној хидрофобној површини једињења и параметар C0, добијен из једначине (11) који у себе укључује истовремено липофилност и специфичну хидрофобну површину једињења. Такође, веома често се користе и вредности скорова прве главне компоненте, PC1, добијене анализом главних компонената. Корелације RМ0 вредности са сваким од ових параметара приказане су у Таблици 3. На основу статистичких података може се закључити да параметар b показује изузетно високу линеарну корелацију са параметром RМ0, при чему су коефицијенти линеарне корелације, r, већи од 0,99, осим за систем са цијано-силика-гелом и ацетоном као органском фазом. Ово је типично за структурно слична једињења у партиционој хроматографији. Такође, утврђено је да постоји статистички значајна корелација између параметара C0 и RМ0. Статистички значајна корелација добијена је и између параметара PC1 и RМ0, при чему су коефицијенти линеарне корелације нешто нижи за цијано силика-гел у односу на RP-18 стационарну фазу. На основу овога може се закључити да се поред RМ0 вредности за процену липофилности бис-стероидних тетраоксана, могу успешно користити и параметри b, C0 и PC1. Докторска дисертација Сандра Шеган 40 Поред хроматографски одређених параметара липофилности, једињења су окарактерисана и израчунатим параметрима липофилности. За рачунање logP вредности постоје различити алгоритми, а у случају бис-стероидних тетраоксана коришћене су logP вредности чије се рачунање заснива на доприносу појединих атома (milogP) и фрагмената (logKоw) укупној липофилности молекула. Вредности milogP су израчунате применом програма доступног на интернет адреси http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties, док су logKоw израчунате применом програма EPIWEB 4.1. У Таблици П6 наведене су израчунате milogP и logKоw вредности бис-стероидних тетраоксана. С обзиром да се при израчунавањима не узима у обзир конформација молекула, cis-trans изомери имају идентичне вредности липофилности. Статистички параметри линеарне регресије између експериментално добијених параметара липофилности, RМ0 и израчунатих logP вредности приказане су у Таблици 4. На основу добијених резултата може се закључити да се RМ0 вредности много боље корелишу са logKоw вредностима добијеним фрагментационом методом у односу на корелације са milogP. Ово је у сагласности са литературним подацима по којима се фрагментациона метода сматра најбољом за одређивање n-октанол-вода партиционог коефицијента. У оба случаја коефицијенти корелације су нижи на цијано силика-гелу у односу на RP-18 силика-гел. С обзиром на више вредности коефицијената корелације RМ0 са logKоw вредностима, овај теоријски параметар липофилности је корелисан са параметрима b, C0 и PC1, а статистички параметри линеарне зависности су приказани у Таблици 5. У свим случајевима је добијена статистички значајна линеарна корелација, а најбоље корелације су добијене између PC1 и logKоw. Ови резултати потврђују претпоставку да се хроматографски добијени параметри липофилности могу користити за процену липофилности бис-стероидних тетраоксана. Докторска дисертација Сандра Шеган 41 R 2 0, 99 09 0, 95 41 0, 99 75 0, 99 64 0, 99 78 0, 82 88 0, 75 79 0, 76 80 0, 94 49 0, 98 16 0, 63 11 0, 78 01 0, 89 84 0, 94 90 0, 94 35 F 13 13 ,1 12 24 9, 72 9 48 24 ,5 98 34 09 ,1 71 55 63 ,4 78 58 ,0 81 37 ,5 77 39 ,7 21 20 5, 85 4 64 1, 44 5 20 ,5 28 42 ,5 80 10 6, 10 0 22 3, 52 4 20 0, 32 4 P 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 07 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 s 0, 00 10 0, 00 12 0, 00 14 0, 00 08 0, 00 08 14 ,7 39 14 ,7 84 16 ,6 45 11 ,0 41 0, 74 66 0, 63 21 0, 48 80 0, 33 18 0, 23 49 0, 24 74 r 0, 99 54 0, 97 68 0, 99 87 0, 99 82 0, 99 89 0, 91 04 0, 87 06 0, 87 63 0, 97 21 0, 99 08 0, 79 44 0, 88 32 0, 94 78 0, 97 42 0, 97 13 Је дн ач ин а b = -0 ,0 09 (± 0, 00 1) – 0 ,0 10 (± 0, 00 0) R M 0 b = -0 ,0 15 (± 0, 00 2) – 0 ,0 10 (± 0, 00 1) R M 0 b = -0 ,0 11 (± 0, 00 1) – 0 ,0 09 (± 0, 00 0) R M 0 b = -0 ,0 16 (± 0, 00 1) – 0 ,0 09 (± 0, 00 0) R M 0 b = -0 ,0 17 (± 0, 00 1) – 0 ,0 10 (± 0, 00 0) R M 0 C 0 = 67 ,8 40 (± 1, 87 3) + 3 , 0 97 (± 0, 40 6) R M 0 C 0 = 51 ,8 70 (± 3, 15 1) + 4 ,7 39 (± 0, 77 3) R M 0 C 0 = 85 ,3 98 (± 1, 62 6) + 0 ,9 86 (± 0, 15 6) R M 0 C 0 = 64 ,7 15 (± 1, 35 0) + 2 ,9 42 (± 0, 20 5) R M 0 C 0 = 58 ,0 26 (± 0, 76 0) + 3 ,0 83 (± 0, 12 1) R M 0 PC 1 = 3, 56 0( ±0 ,8 04 ) – 0 ,7 90 (± 0, 17 4) R M 0 PC 1 = 6, 73 29 (± 1, 04 0) – 1 ,6 65 (± 0, 25 5) R M 0 PC 1 = 3, 21 11 (± 0, 32 41 ) – 0 ,3 21 (± 0, 03 1) R M 0 PC 1 = 4, 19 2( ±0 ,2 87 ) – 0 ,6 52 (± 0, 04 4) R M 0 PC 1 = 3, 44 0( ±0 ,2 52 ) – 0 ,5 71 (± 0, 04 0) R M 0 Х ро м ат . с ис те м C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а Tа бл иц а 3. С та ти ст ич ки п ар ам ет ри ли не ар не з ав ис но ст и из м еђ у п ар ам ет ар а b, C 0 i PC 1 и R M 0 вр ед но ст и б ис -с те ро ид ни х те тр ао кс ан а b, C 0 , PC 1 – f(R M 0 ) b – R M 0 C 0 – R M 0 PC 1 – R M 0 Докторска дисертација Сандра Шеган 42 R 2 0, 20 46 0, 27 55 0, 35 14 0, 52 39 0, 48 07 0, 59 54 0, 61 76 0, 85 14 0, 83 42 0, 75 32 F 3, 08 6 4, 56 4 6, 50 1 13 ,2 06 11 ,1 08 17 ,6 59 19 ,3 85 68 ,7 45 60 ,3 98 36 ,6 25 P 0, 10 44 0, 05 39 0, 02 54 0, 00 34 0, 00 60 0, 00 12 0, 00 08 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 s 0, 93 38 0, 46 99 24 ,7 31 10 ,7 25 12 ,7 57 0, 66 60 0, 34 14 11 ,8 38 0, 63 28 0, 87 94 r 0, 45 23 0, 52 49 0, 59 28 0, 72 38 0, 69 33 0, 77 16 0, 78 59 0, 92 27 0, 91 34 0, 86 79 Је дн ач ин а R M 0 = 1 ,9 78 (± 1, 46 2) + 0 ,2 95 (± 0, 16 8) m ilo gP R M 0 = 2 ,4 95 (± 0, 73 5) + 0 ,1 81 (± 0, 08 4) m ilo gP R M 0 = 0 ,2 70 (± 3, 87 1) + 1 ,1 35 (± 0, 44 5) m ilo gP R M 0 = 0 ,4 16 (± 1, 67 9) + 0 ,7 02 (± 0, 19 3) m ilo gP R M 0 = -0 ,5 33 (± 1, 99 7) + 0 ,7 66 (± 0, 23 0) m ilo gP R M 0 = 1 ,0 40 (± 0, 84 4) + 0 ,3 10 (± 0, 07 3) lo gK ow R M 0 = 2 ,1 81 (± 0, 43 3) + 0 ,1 67 (± 0, 03 8) lo gK ow R M 0 = -2 ,1 68 (± 1, 50 0) + 1 ,0 89 (± 0, 13 1) lo gK ow R M 0 = 0 ,3 32 (± 0, 80 2) + 0 ,5 46 (± 0, 07 0) lo gK ow R M 0 = -0 ,5 71 (± 1, 11 5) + 0 ,5 90 (± 0, 09 7) lo gK ow Х ро м ат . с ис те м C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а Т аб ли ца 4 . С та ти ст ич ки п ар ам ет ри л ин еа рн е за ви сн ос ти и зм еђ у R M 0 в ре дн ос ти и и зр ач ун ат их в ре дн ос ти л ип оф ил но ст и би с- ст ер ои дн их те тр ао кс ан а R M 0 – f( lo gP ) R M 0 – m ilo gP R M 0 – lo gK ow Докторска дисертација Сандра Шеган 43 R 2 0, 58 89 0, 52 91 0, 84 66 0, 80 83 0, 73 71 0, 64 17 0, 62 96 0, 61 71 0, 80 93 0, 74 78 0, 70 44 0, 82 58 0, 77 12 0, 89 61 0, 81 47 F 17 ,1 95 13 ,4 84 66 ,2 30 50 ,6 13 33 ,6 38 8, 39 8 20 ,4 04 19 ,3 39 50 ,9 33 35 ,5 82 28 ,6 05 56 ,8 93 40 ,4 45 10 3, 55 1 52 ,7 62 P 0, 00 13 0, 00 32 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 01 34 0, 00 07 0, 00 08 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 02 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 0, 00 00 s 0, 00 67 0, 00 40 0, 01 12 0, 00 64 0, 00 91 27 ,3 20 18 ,2 87 21 ,3 83 20 ,5 41 27 ,6 68 0, 56 58 0, 43 44 0, 49 78 0, 33 54 0, 44 80 r 0, 76 74 0, 72 74 0, 92 01 0, 89 90 0, 85 85 0, 64 16 0, 79 35 0, 78 55 0, 89 96 0, 86 47 0, 83 93 0, 90 87 0, 87 81 0, 94 66 0, 90 26 Је дн ач ин а b = -0 ,0 20 (± 0, 00 8) – 0 ,0 03 (± 0, 00 1) lo gK ow b = -0 ,0 38 (± 0, 00 5) – 0 ,0 02 (± 0, 00 1) lo gK ow b = 0, 00 1 (± 0, 01 4) – 0 ,0 10 (± 0, 00 1) lo gK ow b = -0 ,0 20 (± 0, 00 8) – 0 ,0 05 (± 0, 00 1) lo gK ow b = -0 ,0 12 (± 0, 01 1) – 0 ,0 06 (± 0, 00 1) lo gK ow C 0 = 7 1, 99 1 (± 3, 46 3) + 0 ,8 78 (± 0, 30 3) lo gK ow C 0 = 6 0, 79 5 (± 2, 31 8) + 0 ,9 16 (± 0, 20 3) lo gK ow C 0 = 8 3, 60 3 (± 2, 71 1) + 1 ,0 43 (± 0, 23 7) lo gK ow C 0 = 6 5, 45 5 (± 2, 60 4) + 1 ,6 27 (± 0, 22 8) lo gK ow C 0 = 5 6, 15 0 (± 3, 50 73 ) + 1 ,8 32 (± 0, 30 7) lo gK ow PC 1 = 3, 75 0 (± 0, 71 7) – 0 ,3 35 (± 0, 06 3) lo gK ow PC 1 = 3, 75 0 (± 0, 71 7) – 0 ,3 35 (± 0, 06 3) lo gK ow PC 1 = 3, 92 3 (± 0, 63 1) – 0 ,3 51 (± 0, 05 5) lo gK ow PC 1 = 4, 22 9 (± 0, 42 5) – 0 ,3 79 (± 0, 03 7) lo gK ow PC 1 = 4, 03 2 (± 0, 56 8) – 0 ,3 62 (± 0, 04 9) lo gK ow Х ро м ат . с ис те м C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а Т аб ли ца 5 . С та ти ст ич ки п ар ам ет ри л ин еа рн е за ви сн ос ти и зм еђ у па ра м ет ар а b, C 0 и P C 1 и из ра чу на тi h вр ед но ст и ли по ф ил но ст и lo gK оw б ис -с те ро ид ни х те тр ао кс ан а b, C 0 , PC 1 – f(l og K o w ) b- lo gK ow C 0 – lo gK ow PC 1 – lo gK ow Докторска дисертација Сандра Шеган 44 3.2.1 Уводне мултиваријантне анализе У намери да се стекну основна знања о хроматографском понашању бис- стероидних тетраоксана корисно је да се ураде уводне мултиваријантне анализе. Најчешће се ове анализе спроводе посебно на целокупне ретенционе податке (RМ вредности) и молекулске дескрипторе. У Таблици П7 су наведени израчунати молекулски дескриптори који дају значајне структурне информације о испитиваним бис-стероидним тетраоксанима као што су топологија, геометрија и електронско окружење. Таблица П8 садржи корелациону матрицу структурних дескриптора бис- стероидних тетраоксана. 3.2.2 Анализа главних компонената (PCA) Примена PCA на ретенционе податке (RМ вредности за све хроматографске системе) може да укаже на сличности испитиваних једињења које су условљене специфичним структурним својствима, као и специфичним интеракцијама у различитим хроматографским системима. Такође, примена анализе главних компонената на израчунате молекулске дескрипторе може да допринесе груписању испитиваних једињења заснованих на њиховим структурним карактеристикама. Према томе, корисно је да се PCA примени посебно на ретенционе податке и молекулске дескрипторе. На овај начин се могу уочити једињења која се понашају као спољашње вредности и која је потребно уклонити пре завршног моделовања. PCA је прво примењена на аутоскалиране хроматографске податке (RМ вредности) што је резултовало моделом са две главне компоненте који објашњава 95,06% укупне варијансе. Прва главна компонента (PC1) описује 91,11% варијансе, а друга главна компонента (PC2) 8,39%. Вредности међусобног односа компонената PC1 и PC2, односно њихове узајамне пројекције, су приказане на Слици 7, док су зависности латентних варијабли приказане на Слици 8. Сва једињења се налазе унутар Hotelling Т2 елипсе што указује да међу посматраним једињењима нема оних која одступају од посматраног сета. Добијени резултати показују да су дуж PC1 раздвојене киселине (7, 8), примарни Докторска дисертација Сандра Шеган 45 амиди (3, 4) и секундарни амиди (5, 6, 9, 10) од естара (1, 2), терцијарних амида (11, 12) и пиперидинских деривата (13, 14). На основу овога може се закључити да се класификација бис-стероидних тетраоксана заснива на њиховој способности да приме протоне (једињења 1, 2, 11-14) и одају протоне (једињења 3-10). Ово би требало да буде у сагласности са саставом мобилне фазе, при чему се очекује да мобилне фазе са диоксаном или ацетоном утичу на ретенцију протон-донорних једињења, док би метанол требало да допринесе слабијој ретенцији протон-акцепторских једињења. Међутим, графикон зависности латентних варијабли не показује значајан утицај састава мобилне фазе дуж PC1 осе. Насупрот томе, хроматографски системи су много боље подељени дуж PC2 осе (Слика 8) која показује највећи позитивни утицај система са диоксаном на RP-18 (једињења са PC2 скоровима око нуле имају јачу ретенцију у хроматографским системима која садрже диоксан), а најмање негативне вредности системи са метанолом на RP-18 (једињења са PC2 вредностима мањим од нуле показују јачу ретенцију у хроматографским системима који садрже метанол). Слика 7. Вредности међусобног односа компонената PC1 и PC2 за ретенционе податке Докторска дисертација Сандра Шеган 46 Слика 8. Зависности латентних варијабли за ретенционе податке PCA примењена на дескрипторе је резултовала моделом са пет компонената који објашњава 94,71% укупне варијансе. Груписање једињења се разликује у односу на модел заснован на ретенционим подацима (Слика 9), а такође је установљено да не постоје спољне вредности. Идући дуж PC1 осе од негативних ка позитивним вредностима може се уочити да су примарни амиди (3, 4) и киселине (7, 8) груписани скоро на крају, веома близу једни другима и да су добро одвојени од осталих једињења. Следећу групу једињења чине секундарни амиди (5, 6, 9, 10) који се налазе у средини, груписани у мале кластере дуж PC2 осе, што је у сагласности са њиховом способношћу да се понашају и као донори и као акцептори протона. Терцијарни амиди (11-14) који немају способност одавања протона, смештени су на супротном крају PC1 осе. Једини изузетак је пар метил-естара (1, 2) који поседују само протон-акцепторска својства и смештени су у средини графика PC скорoва. Као што се види са Слике 10, већина дескриптора има позитиван утицај на PC2; негативан утицај на PC2 имају само HOMO, MD, LUMO и logP. Дескриптори %HS, HLB и HBAcc имају највећи негативан утицај на PC2. Докторска дисертација Сандра Шеган 47 Слика 9. Вредности међусобног односа компонената PC1 и PC2 за молекулске дескрипторе Анализа главних компонената је показала да нема груписања испитиваних бис- стероидних тетраоксана према типу изомера (cis- или trans-). Слика 10. Зависности латентних варијабли за молекулске дескрипторе Докторска дисертација Сандра Шеган 48 3.2.3 Хијерархијска кластерска анализа У циљу потврде груписања једињења која је добијена применом PCA, примењена је хијерархијска кластерска анализа (HCА). Ова метода се често користи у намери да се олакша груписање сличних објеката на графику PC скорова. Као и код PCA, коришћени су ретенциони подаци (RМ вредности) и израчунати молекулски дескриптори. Дендрограм заснован на ретенционим подацима за све хроматографске системе показује два добро одвојена кластера (Слика 11). Први кластер укључује једињења са протон-донорским својствима: примарне амиде (3, 4), секундарне амиде (5, 6, 9, 10) и киселине (7, 8). У другом кластеру су метил-естри (1, 2) и терцијарни амиди (11-14) који поседују само протон-акцепторске функционалне групе. Слика 11. Дендрограм за ретенционе податке Кластерска анализа примењена на дескрипторе резултовала је са два главна кластера, са малим разликама у односу на претходне резултате (Слика 12). Први кластер укључује примарне амиде (3, 4) и киселине (7, 8), док је други кластер сачињен од преосталих једињења, односно секундарних амида (5, 6, 9, 10), терцијарних амида (11-14) и метил-естара (1, 2). Докторска дисертација Сандра Шеган 49 Слика 12. Дендрограм за структурне дескрипторе 3.2.4 Корелација структуре и ретенције После PCA и HCА које су спроведене ради стицања увида у факторе који су одговорни за ретенцију испитиваних једињења, извршено је моделовање применом методе делимичних најмањих квадрата. Број латентних варијабли је изабран на основу минималне вредности RMSECV и минималне разлике између RMSEC и RMSECV. У Таблици 6 су наведени статистички модели који описују зависност параметара RМ0, b, C0 и PC1 од структурних дескриптора. Процена дескриптора који имају највећи утицај на ретенцију урађена је на основу VIP вредности. Варијабле са VIP вредностима већим од 1 се сматрају значајним за објашњавање зависне варијабле Y, док варијабле које имају мали или безначајан утицај на зависну варијаблу Y имају VIP вредности мање од 1. Статистичке особине коначних модела, као и дескриптори са вредностима VIP > 1 поређани по опадајућем редоследу коефицијената сумирани су у Таблици 6. Разматрајући моделе са ретенционим параметром RМ0 у функцији структурних дескриптора, може се уочити да су осим модела који описује ретенционо понашање на цијано силика-гелу и метанолом као органском компонентом у мобилној фази, остали модели статистички значајни. Очигледно је да су у ретенционе моделе укључени Докторска дисертација Сандра Шеган 50 приближно исти дескриптори који описују укупну поларност једињења и њихове протон-донорске и акцепторске карактеристике. Статистички најбољи модели су добијени са мобилним фазама које садрже ацетон: R2cal = 98.20%, R2CV = 88,20%, RMSEC = 0.069 и RMSECV = 0.179 за силика-гел и R2cal = 91,10%, R2CV = 83,30%, RMSEC = 0,429 и RMSECV = 0.588 зa RP-18. Исти дескриптори, P, SP, HB, HLB, %HS, HBAcc, HBD, MD, и logP утичу на RМ0 вредности бис-стероидних тетраоксана у системима са ацетоном у мобилној фази на цијано силика-гелу и RP-18 стационарној фази. Параметар поларности, P, и параметар SP су физичко-хемијски параметри који се односе на укупну поларност молекула и површинску поларност. Параметар HLB је хидрофилно-липофилни баланс и означава меру у којој су изражене хидрофилне и липофилне карактеристике једињења, док се параметар %HS односи на проценат хидрофилне површине молекула. Физичко –хемијски параметри HB, HBD и HBAcc се односе на способност водоничног везивања, протон-донорска и протон-акцепторска својства. Насупрот овим параметрима, неполарна својства једињења које утичу на ретенцију су изражене кроз параметар липофилности једињења, logP и параметер MD који се односи на дубину молекула. Посматрајући регресионе графиконе (Сликe П9-П13) може се уочити да дескриптори који описују поларност испитиваних једињења и њихове способности да граде водоничне везе, као што су: HLB, %HS, HBAcc, HBD, SP и HB, имају негативан допринос RМ0 вредностима бис-стероидних тетраоксана. Пошто се поларне интеракције у реверзно-фазној танкослојној хроматографији остварују углавном између испитиваних једињења и молекула мобилне фазе, логично је да веће вредности напред поменутих параметара доводе до слабије ретенције. Насупрот томе, дескриптори као што су logP и MD, који описују неполарне карактеристике испитиваних једињења и њихову способност да остварују дисперзионе интеракције са стационарном фазом, позитивно доприносе ретенционом параметру RМ0. Докторска дисертација Сандра Шеган 51 М ол ек ул ск и де ск ри пт ор и ук љ уч ен и у мо де л H LB (- ), % H S( -) , l og P (+ ), M D (+ ), H B A cc (- ), D (- ), SP (- ), H B D (- ), P( -) , H B (- ) P( -) , H LB (- ), % H S( -) , l og P (+ ), H B A cc (- ), M D (+ ), H B D (- ), SP (- ), H B (- ), D (- ) H LB (- ), % H S( -) , H B A cc (- ), lo g P( +) , H B D (- ), D (- ), SP (- ), M D (+ ), H B (- ) H LB (- ), % H S( -) , H B A cc (- ), lo g P( +) , H B D (- ), P( -) ,S P( -) , H B (- ),M D (+ ), D (- ) H B A cc (- ), lo g P( +) ,H LB (- ), % H S( -) , H B D (- ), P( -) H LB (+ ), % H S( +) , l og P (- ), M D (- ), D (+ ), SP (+ ), P( +) , H B D (+ ), H B (+ ) M D (- ), P( +) , l og P (- ), H LB (+ ), % H S( +) , H B A cc (+ ), SP (+ ), H B (+ ), H B D (+ ), M W (- ) H LB (+ ), % H S( +) , H B A cc (+ ), lo g P( -) , H B D (+ ), D (+ ), SP (+ ), M D (- ), H B (+ ) H LB (+ ), % H S( +) , l og P (- ), H B A cc (+ ), H B D (+ ), M D (- ), P( +) , S P( +) , H B (+ ) H B A cc (+ ), lo g P( -) , H LB (+ ), % H S( +) , H B D (+ ), P( +) RM SE CV 0, 72 9 0, 17 9 1, 32 5 0, 58 8 0, 94 8 0, 00 7 0, 00 2 0, 01 3 0, 00 6 0, 01 0 RM SE C 0, 53 1 0, 06 9 0, 96 0 0, 42 9 0, 73 6 0, 00 5 0, 00 1 0, 00 9 0, 00 4 0, 00 7 R 2 C V 0, 46 9 0, 88 2 0, 78 4 0, 83 3 0, 66 6 0, 47 0 0, 78 6 0, 76 3 0, 80 6 0, 64 9 R 2 c al 0, 70 0 0, 98 2 0, 88 6 0, 91 1 0, 79 8 0, 70 3 0, 97 0 0, 87 8 0, 90 1 0, 79 0 Бр ој ла те нт ни х ва ри ја бл и 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 Х ро м ат . с ис те м CN /М ет ан ол -в од а CN /А це то н- во да RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а CN /М ет ан ол -в од а CN /А це то н- во да RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а Т аб ли ца 6 . С та ти ст ич ки п ар ам ет ри P LS м од ел а би с- ст ер ои дн их т ет ра ок са на R M 0 , b, C 0 , PC 1 – f(д ес кр ип то ри ) R M 0 - д ес кр ип то ри b - д ес кр ип то ри Докторска дисертација Сандра Шеган 52 М ол ек ул ск и де ск ри пт ор и ук љ уч ен и у мо де л H LB (-) , % H S( -), H BD (-) , P (-) , l og P (+ ), M D (+ ), SP (-) , D (-) H BA cc (-) , H BD (-) , H LB (-) , % H S( -), lo g P( +) , P( -), H B( -), S P( -) H BA cc (-) , H BD (-) , H LB (-) , % H S( -), S P( -), H B( -), D (-) , l og P (+ ) H BA cc (-) , H LB (-) , % H S( -), lo g P( +) , H BD (-) , H B( -), S P( -), P (-) H BA cc (-) , P (-) , H BD (-) , l og P (+ ), H LB (-) , % H S( -), H B( +) H BA cc (+ ), H BD (+ ), H LB (+ ), % H S( +) , lo g P( -), M L( +) , S P( +) , H B( +) H BA cc (+ ), H LB (+ ), % H S( +) , H BD (+ ), lo g P( -), S P( +) , H B( +) , D (+ ) H BA cc (+ ), H LB (+ ), % H S( +) , H BD (+ ), lo g P( -), S P( +) , D (+ ), H B( +) H BA cc (+ ), H LB (+ ), % H S( +) , H BD (+ ), lo g P( -), S P( +) , H B( +) , D (+ ) H BA cc (+ ), H LB (+ ), % H S( +) , H BD (+ ), lo g P( -), P (+ ) RM SE CV 3, 10 8 1, 83 0 2, 15 7 1, 71 6 1, 72 3 0, 67 2 0, 39 8 0, 48 2 0, 36 1 0, 56 0 RM SE C 2, 13 2 1, 01 0 1, 43 6 1, 23 9 0, 91 3 0, 47 8 0, 30 2 0, 35 1 0, 28 5 0, 43 1 R 2 C V 0, 25 7 0, 60 8 0, 58 8 0, 84 6 0, 89 2 0, 54 6 0, 83 0 0, 75 7 0, 86 0 0, 66 5 R 2 c al 0, 58 2 0, 84 4 0, 79 8 0, 91 9 0, 96 8 0, 75 3 0, 90 1 0, 86 7 0, 91 2 0, 80 0 Бр ој ла те нт ни х ва ри ја бл и 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 Х ро м ат . с ис те м CN /М ет ан ол -в од а CN /А це то н- во да RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а CN /М ет ан ол -в од а CN /А це то н- во да RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а Т аб ли ца 6 . С та ти ст ич ки п ар ам ет ри P LS м од ел а би с- ст ер ои дн их т ет ра ок са на (н ас та ва к) R M 0 , b, C 0 , PC 1 – f( де ск ри пт ор и) C 0 - д ес кр ип то ри PC 1 - де ск ри пт ор и Докторска дисертација Сандра Шеган 53 Математички модели на CN силика-гелу и RP-18 стационарној фази разликују се у односима величине коефицијената. На цијано силика-гелу параметер поларности има највећи коефицијент, док је допринос овог параметра ретенцији на RP-18 стационарној фази знатно мањи. Ово је вероватно последица различите поларности ове две стационарне фазе. Наиме, због умерене поларности, цијано силика-гел у великој мери учествује и у поларним интеракцијама са молекулима бис-стероидних тетраоксана. Други по значају су параметри HLB, %HS, logP, HBAcc, MD и HBD. Насупрот томе, RP-18 стационарна фаза у много мањој мери учествује у поларним интеракцијама са испитиваним једињењима, па је допринос параметра поларности на ретенцију доста мање изражен, а највећи утицај на ретенцију су показали HLB, %HS, HBAcc и logP. Пошто се показало да параметри b, C0 и PCI који су изведени из хроматографских података показују статистички значајну корелацију са RМ0 вредностима, урађено је и PLS моделовање ових параметара са структурним дескрипторима. Графикони зависности варијабли од вредности VIP-скорoва и вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделима налазе се на Сликама П14 – П28. Математички модели који описују зависност параметра b, који се односи на специфичну хидрофобну површину једињења, укључују исте структурне дескрипторе као и модели са зависном варијаблом RМ0, али су регресиони коефицијенти супротног предзнака. Такође, PLS модел који се односи на хроматографски сyстем CN силика гел / метанол–вода није задовољавајућег статистичког квалитета. У математичким моделима који описују зависност C0 од структурних дескриптора се као најважнији параметар издваја способност примања протона HBAcc и то са негативним предзнаком коефицијента. У математчким моделима који описују зависност параметра PC1 од структурних дескриптора, осим у систему CN-силика-гел / метанол-вода који није статистички значајан, редослед првих пет регресионих коефицијената структурних дескриптора је идентичан. Први по значају дескриптор је HBAcc, затим следе, HLB, %HS, HBD и на крају logP. У овим моделима регресиони коефицијенти имају супротан предзнак у односу на моделе са RМ0 вредностима. С обзиром на то да су ове у моделе укључени исти дескриптори са истим редоследом регресионих коефицијената, може се Докторска дисертација Сандра Шеган 54 закључити да су PC1 вредности независне од хроматографског система и веома је корисно примењнивати их за процену липофилности једињења. 3.2.5 Корелација структуре и биолошке активности Као што је познато, на биолошку активност једињења утичу електронски, хидрофобни или стерни параметри, а липофилност једињења се сматра једним од најважнијих параметара. Антипролиферативна активност бис-стероидних тетраоксана према Fеm-X и HeLа ћелијским линијама [80] је била предмет истраживања у овом раду. Минималне инхибиторне концентрације испитиваних бис-стероидних тетраоксана изражена као logC вредности дате су у Таблици П29. Најзначајнију вредност антипролиферативне активности према ћелијским линијама Fеm-X и HеLа показује једињење 3 (активност овог једињења према ћелијској линији HеLа је слична активности cis-платине). Применом упоредног t-теста пронађено је да тип изомеризације (cis- или trans-) не утиче на биолошку активност испитиваних једињења на ћелијске линије Fеm-X (tизрачунато = 0,099, tкритично = 2,571, P = 0,05, и n = 6) и HеLа (tизрачунато = 2,485, tкритично = 3,182, P = 0,05, и n = 4). Метода делимичних најмањих квадрата (PLS) је коришћена за проучавање зависности антипролиферативне активности према ћелијама хуманог карцинома грлића материце (HеLа) и ћелијама меланома (Fеm-X) испитиваних једињења као зависних варијабли и структурних дескриптора као независних варијабли. За PLS модел који се односи на ћелијску линију Fеm-X статистички параметри су R2 =0,636, R2CV = 0,478, RMSEC = 0,335, RMSECV = 0,410, a за PLS модел који се односи на ћелијску линију HеLа R2 = 0,660, R2CV = 0,512, RMSEC =0,348 RMSECV = 0,425. Добијени математички модели нису статистички значајни за предвиђање биолошке активности, али могу да укажу на квалитативном нивоу на дескрипторе који имају важан утицај на биолошку активност бис-стероидних тетраоксана. На основу VIP вредности (Слике 13 i 14), одређени су дескриптори који имају највећи утицај на биолошку активност испитиваних једињења према обе ћелијске линије: MV, HB, Rеf, Pol, површина молекула, SА (grid), HOMO, LUMO, као и дескриптори из групе индекса конективности. Осим ових дескриптора, према Fеm-X ћелијској линији велики утицај Докторска дисертација Сандра Шеган 55 имају и дескриптори SP, МWе и HBD. Дескриптори МV и МWе су из групе која описује величину молекула и односе се на запремину молекула и молекулску масу. Од физичко-хемијских дескриптора издвојио се дескриптор који се односи на површину молекула, SА (grid), дескриптор површинске поларности, SP, дескриптор који се односи на способност водоничног везивања, HB и дескриптор који се односи на протон-донорска својства, HBD испитиваних бис-стероидних тетраоксана. Из групе групе квантно-хемијских дескриптора издвојили су се дескриптори Rеf и Pol који се односе на рефрактивност и поларизабилност молекула као и енергија HOMO и LUMO орбитала. Регресиони вектори за добијене моделе указују да дескриптори HB, HBD и SP имају негативан предзнак, док остали дескриптори имају позитиван предзнак (Слике 15 и 16). Сличан закључак су извели Цвијетић и сарадници [81] који су у случају 33 1,2,4,5-тетраоксанска деривата утврдили да су хидрофобност молекула и њихове протон-донорска својства главни параметри који утичу на активност испитиваних једињења према ћелијама хуманог карцинома грлића материце (HеLа) и ћелијама меланома (Fеm-X). Пошто хидрофобнија једињења обично испољавају већу активност јер лакше пролазе кроз фосфолипидни двослој ћелијске мембране, негативни коефицијент израчунате logP вредности у регресионом моделу указује да проучавана једињења имају алтернативни механизам проласка кроз ћелијску мембрану. Обично се сматра да су исте карактеристике одговорне за понашање једињења у биолошком и реверзно-фазном окружењу. Међутим, у случају добијених QSRR и QSАR модела, различите карактеристике једињења утичу на ретенцију у примењеним хроматографским системима и специфичну антипролиферативну активност. Може се уочити да су регресиони вектори ретенције и антипролиферативне активности једињења супротни једни другима. Најочигледнија разлика је између регресионих коефицијената индекса конективности који су у првом случају близу вредности 0, док су у другом случају ове вредности високе и имају велик утицај на антипролиферативну активност за обе ћелијске линије. У случају ретенције под реверзно-фазним хроматографским условима, доминантни дескриптори који утичу на партицију између поларне мобилне фазе и неполарне стационарне фазе су: HLB, %HS, P, HB, HBAcc, HBD и logP. Докторска дисертација Сандра Шеган 56 Слика 13. Вредности VIP скорова у PLS моделу за Fem-X ћелијску линију Слика 14. Вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделу за Fem-X ћелијску линију Докторска дисертација Сандра Шеган 57 Слика 15. Вредности VIP скорова у PLS моделу за HeLa ћелијску линију Слика 16. Вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделу за HeLa ћелијску линију Докторска дисертација Сандра Шеган 58 3.3 КОРЕЛАЦИЈА СТРУКТУРЕ И РЕТЕНЦИЈЕ МЕШОВИТИХ ТЕТРАОКСАНА Други део истраживања обухватио је серију од четрдесет мешовитих тетраоксана чије су структуре приказане у Таблици 7. Од деривата холне киселине проучавана су једињења са циклоалканским и изопропилиденским остатком, док су од деривата деоксихолне киселине проучавана само једињења са циклоалканским остатком. Хроматографско понашање мешовитих тетраоксана проучавано је на RP-18 и CN-силика-гелу, а мобилне фазе су поред воде садржавале метанол, ацетон или диоксан. У реверзно-фазним хроматографским системима циклоалкански и изопропилиденски остатак ступају у хидрофобне интеракције са стационарном фазом, поларни тетраоксански прстен делује као протон-акцептор, док стероидни остатак учествује у хидрофобним и поларним интеракцијама (протон- донорским и акцепторским). У већини случајева киселине показују јачу ретенцију у односу на примарне амиде. Разлог оваквог понашања може да буде грађење интрамолекулских водоничних веза у молекулима киселина, што смањује могућност грађења водоничних веза са молекулима мобилне фазе, па се ретенција појачава. Такође, ретенција естара је јача од ретенције одговарајућих киселина. Установљена је добра селективност у раздвајању мешовитих тетраоксана који се разликују за једну –CH2 групу, као и између епимера, али није пронађена правилност у томе који епимер има јачу ретенцију. У свим случајевима ретенција испитиваних једињења слаби са порастом концентрације органске компоненте у мобилној фази. RМ0 вредности мешовитих 1,2,4,5–тетраоксана добијене екстраполацијом до чисте воде за сва четири хроматографска система дате су у Таблицама П30-П33. Веће RМ0 вредности су добијене за метанол (просечна вредност 5,866) у поређењу са диоксаном (просечна вредност 5,687) или ацетоном (просечна вредност за RP-18 4,948, а за CN- силика-гел 4,689). Разлике у вредностима одсечака и нагиба одражавају хемијску природу органског модификатора. Између одсечка, RМ0, и нагиба, b, добијена је линеарна зависност са задовољавајућим статистичким параметрима што се види из Докторска дисертација Сандра Шеган 59 Таблице 8, па се може закључити да испитивана једињења припадају конгенерној серији. Таблица 7. Структуре испитиваних мешовитих тетраоксана n R1 R2 R3 R4 R5 1 1 H H H H OH 2 1 H H H H OCH3 3 1 H H H H NH2 4 1 H H H H NHPrn 5 1 H H H H NHCH2CO2CH3 6 1 CH3 H H H OCH3 7 1 CH3 H H H NH2 8 1 CH3 H H H NHMe 9 1 CH3 H H H NHPrn 10 1 CH3 H H CH3 OCH3 11 0 H H H H OCH3 12 3 H H H H OCH3 13 1 i-Pr H CH3 H OCH3 14 1 H (R)-CH3 H H OH 15 1 H (R)-CH3 H H OCH3 16 1 H (R)-CH3 H H NH2 17 1 H (R)-CH3 H H NHMe 18 1 H (R)-CH3 H H NHPrn 19 1 H (S)-CH3 H H OH 20 1 H (S)-CH3 H H OCH3 21 1 H (S)-CH3 H H NH2 22 1 H (S)-CH3 H H NHMe 23 1 H (S)-CH3 H H NHPrn H OAc AcO O R5 O O O O R1R2 R4 R3 ( )n Докторска дисертација Сандра Шеган 60 Наставак Таблице 7. R1 24 OH 25 OCH3 26 NH2 27 NHMe 28 NHPrn 29 N(Me)2 30 NHCH2COOCH3 31 NHPh 32 NHNH2 R1 33 OH 34 OCH3 35 NH2 36 NHPrn 37 NHNH2 38 NH(Prn)2 39 NHPh 40 N С обзиром да добијене RМ0 вредности показују линеарну зависност од концентрације органске компоненте у мобилној фази, могу се користити за одређивање липофилности. Мешовити тетраоксани деривати деоксихолне киселине имају највеће вредности липофилности, док мешовити тетраоксани деривати холне киселине који садрже ацетонску субјединицу имају најнижу липофилност. Слично као код бис-стероидних тетраоксана разматрана је могућност примене изведених хроматографских дескриптора (b, RМ0 и C0) за процену липофилности мешовитих тетраоксана. Једначине које описују ове линеарне корелације за сваки од примењених хроматографских система са одговарајућим статистичким параметрима приказане су у Таблици 8. Као што је раније наведено параметер b, који одговара специфичној хидрофобној површини, показује статистички значајну линеарну корелацију са параметром RМ0. Насупрот томе, параметар C0 не показује статистички значајну корелацију са параметром RМ0, осим у случају хроматографског система CN- силика-гел / ацетон–вода. Испитивања линеарне зависности између PC1 и RМ0 дала су статистички валидне резултате, али нешто лошијег квалитета у односу на линеарне корелације између параметара b и RМ0. Докторска дисертација Сандра Шеган 61 Ради провере применљивости хроматографски добијених параметара липофилности, исти су корелисани са израчунатим параметрима липофилности. У Таблици 9 су дате једначине линераних корелација параметра RМ0 и израчунатих параметара липофилности milogP и logKоw, са одговарајућим статистичким параметрима. С обзиром да су линеарне корелације RМ0 са израчунатим logKоw вредностима резултовале бољим статистичким карактеристикама у односу на корелације RМ0–milogP, испитиване су линеарне зависности овог параметра са хроматографским дескрипторима b, C0 и PC1. Добијене линеарне корелације са одговарајућим статистичким параметрима су приказане у Таблици 10. Може се видети да су статистички најзначајниије линеарне корелације добијене за зависност b-logKоw. Нешто лошије линеарне корелације су добијене за зависност PC1–logKоw, при чему у оба случаја за хроматографски систем CN-силика-гел добијени статистички параметри указују да не постоји статистички значајна корелација. Најлошије линеарне корелације су добијене за зависност C0–logKоw, па се параметри C0 могу сматрати најнепогоднијим за процену липофилности мешовитих тетраоксана. Докторска дисертација Сандра Шеган 62 R 2 0, 97 9 0, 82 1 0, 75 8 0, 98 4 0, 49 1 0, 17 6 0, 32 1 0, 77 5 0, 56 8 0, 51 9 0, 67 4 0, 83 8 F 1, 75 7, 45 5 17 9, 51 2 12 3, 48 8 2, 39 7, 48 9 38 ,6 95 9, 33 7 19 ,3 97 13 5, 17 1 52 ,3 79 43 ,0 30 81 ,5 77 20 2, 86 8 P 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 4 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 s 0, 00 2 0, 00 5 0, 00 6 0, 00 1 4, 68 1 8, 45 1 5, 13 9 1, 28 1 1, 45 3 1, 32 6 1, 22 9 0, 71 6 r 0, 98 9 0, 90 8 0, 87 4 0, 99 2 0, 71 0 0, 44 4 0, 58 1 0, 88 3 0, 76 1 0, 72 9 0, 82 6 0, 91 8 Је дн ач ин а b = -0 ,0 09 (± 0, 00 1) – 0 ,0 08 (± 0, 00 0) R M 0 b = -0 ,0 11 (± 0, 00 3) – 0 ,0 09 (± 0, 00 1) R M 0 b = -0 ,0 14 (± 0, 00 5) – 0 ,0 10 (± 0, 00 1) R M 0 b = -0 ,0 11 (± 0, 00 1) – 0 ,0 11 (± 0, 00 0) R M 0 C 0 = 8 0, 12 3 (± 2, 64 8) + 2 ,6 96 (± 0, 43 3R M 0 C 0 = 6 9, 38 0 (± 5, 86 2) + 3 ,5 25 (± 1, 15 3) R M 0 C 0 = 6 0, 86 6 (± 4, 30 0) + 3 ,4 57 (± 0, 78 5) R M 0 C 0 = 5 9, 59 8 (± 1, 18 2) + 2 ,8 88 (± 0, 24 8) R M 0 C 0 = 6 9, 38 0 (± 5, 86 2) + 3 ,5 25 (± 1, 15 3) R M 0 PC 1 = -5 ,7 11 (± 0, 82 1) + 0 ,9 73 (± 0, 13 4) R M 0 PC 1 = -5 ,8 72 (± 0, 91 9) + 1 ,1 87 (± 0, 18 1) R M 0 PC 1 = -9 ,1 20 (± 1, 02 8) + 1 ,6 95 (± 0, 18 8) R M 0 Х ро м ат . с ис те м R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да Tа бл иц а 8. С та ти ст ич ки п ар ам ет ри л ин еа рн е за ви сн ос ти и зм еђ у па ра м ет ар а b, C 0 i P C 1 и R M 0 в ре дн ос ти м еш ов ит их т ет ра ок са на b, C 0 , PC 1 – f(R M 0 ) b – R M 0 C 0 – R M 0 PC 1 – R M 0 Докторска дисертација Сандра Шеган 63 R 2 0, 47 4 0, 46 1 0, 57 6 0, 16 0 0, 60 4 0, 61 3 0, 75 2 0, 27 8 F 36 ,1 34 34 ,3 11 53 ,9 73 8, 42 5 60 ,4 98 62 ,7 39 11 9, 45 9 16 ,0 35 P 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 6 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 s 1, 25 4 0, 86 2 0, 68 3 0, 75 7 1, 08 8 0, 73 0 0, 52 2 0, 70 1 r 0, 69 8 0, 68 9 0, 76 6 0, 42 6 0, 78 4 0, 78 9 0, 87 1 0, 54 5 Је дн ач ин а R M 0 = -2 ,8 99 (± 1, 47 1) + 1 ,2 29 (± 0, 20 4) m ilo gP R M 0 = -0 ,9 20 (± 1, 01 1) + 0 ,8 23 (± 0, 14 0) m ilo gP R M 0 = -0 ,4 50 (± 0, 80 0) + 0 ,8 18 (± 0, 11 1) m ilo gP R M 0 = 2 ,1 36 (± 0, 88 8) + 0 ,3 58 (± 0, 12 3) m ilo gP R M 0 = -4 ,4 21 (± 1, 33 3) + 1 ,1 15 (± 0, 14 3) lo g K ow R M 0 = -2 ,0 79 (± 0, 89 4) + 0 ,7 61 (± 0, 09 6) lo g K ow R M 0 = -1 ,5 50 (± 0, 63 9) + 0 ,7 51 (± 0, 06 8) lo g K ow R M 0 = 1 ,2 75 (± 0, 86 0) + 0 ,3 70 (± 0, 09 2) lo g K ow Х ро м ат . с ис те м R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да R P/ М ет ан ол -в од а R P/ А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а C N /А це то н- во да Т аб ли ца 9 . С та ти ст ич ки п ар ам ет ри л ин еа рн е за ви сн ос ти и зм еђ у па ра м ет ар а R M 0 и из ра чу на ти х вр ед но ст и ли по ф ил но ст и м еш ов ит их т ет ра ок са на R M 0 – f( lo gP ) R M 0 – m ilo gP R M 0 – lo gK ow Докторска дисертација Сандра Шеган 64 R 2 0, 54 8 0, 50 8 0, 69 4 0, 28 3 0, 50 3 0, 06 9 0, 14 1 0, 18 9 0, 52 7 0, 50 7 0, 54 8 0, 20 4 F 48 ,3 18 41 ,1 91 89 ,4 21 16 ,4 28 40 ,4 49 3, 90 6 7, 41 1 10 ,0 63 44 ,5 23 41 ,0 44 48 ,2 05 11 ,0 25 P 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 05 5 0, 01 0 0, 00 3 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 2 s 0, 01 0 0, 00 8 0, 00 7 0, 00 8 4, 62 8 8, 98 2 5, 77 7 2, 43 2 1, 52 0 1, 34 2 1, 44 7 1, 58 6 r 0, 74 8 0, 72 1 0, 83 8 0, 54 9 0, 71 8 0, 30 5 0, 40 4 0, 45 8 0, 73 5 0, 72 1 0, 74 8 0, 47 4 Је дн ач ин а b = 0, 02 6 (± 0, 01 2) – 0 ,0 09 (± 0, 00 1) lo gK ow b = 0, 00 8 (± 0, 01 0) – 0 ,0 07 (± 0, 00 1) lo gK ow b = 0, 00 8 (± 0, 00 8) – 0 ,0 08 (± 0, 00 1) lo gK ow b = -0 ,0 25 (± 0, 00 9) – 0 ,0 04 (± 0, 00 1) lo gK ow C 0 = 60 ,1 65 (± 5, 67 2) + 3 ,8 77 (± 0, 60 9) lo gK ow C 0 = 6 5, 24 6 (± 11 ,0 09 ) + 2 ,3 38 (± 1, 18 3) lo gK ow C 0 = 6 0, 35 0 (± 7, 08 0) + 2 ,0 71 (± 0, 76 1) lo gK ow C 0 = 6 3, 76 8 (± 2, 98 0) + 1 ,0 16 (± 0, 32 0) lo gK ow PC 1 = -1 2, 33 0 (± 1, 86 3) + 1 ,3 36 (± 0, 20 0) lo gK ow PC 1 = -1 0, 45 0 (± 1, 64 5) + 1 ,1 32 (± 0, 17 7) lo gK ow PC 1 = -1 2, 21 1 (± 1, 77 3) + 0 1, 32 3 (± 0, 19 0) lo gK ow PC 1 = -6 ,4 02 (± 1, 94 4) + 0 ,6 94 (± 0, 20 9) lo gK ow Х ро м ат . с ис те м R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да Tа бл иц а 10 . С та ти ст ич ки п ар ам ет ри л ин еа рн е за ви сн ос ти и зм еђ у па ра м ет ар а b, C 0 , и PC 1 и из ра чу на ти х па ра м ет ар а ли по ф ил но ст и lo gK оw м еш ов ит их т ет ра ок са на b, C 0 , PC 1 – f(l og K ow ) b- lo gK ow C 0 – lo gK ow PC 1 – lo gK ow Докторска дисертација Сандра Шеган 65 3.3.1 Уводна мултиваријантна анализа Као метода уводне мултиваријантне анализе примењена је анализа главних компонената. Ова метода примењена на хроматографске податке (RМ) користећи матрикс коваријансе са аутоскалирањем, је резултовала моделом са седам главних компонената који објашњава 96,20% укупне варијансе. Вредност прве главне компоненте (PC1) износи 66,81% укупне веаријансе, друге (PC2) 12,65%, треће (PC3) 6,93%. Према Hotelling Т2 елипси у испитиваном сету једињења не постоје спољне вредности (Слика 17). Једињења су класификована у три групе на основу њихове липофилности. Деривати холне киселине који садрже отворени изопропилиденски ланац су смештени у крајњем левом делу графикона скорова, деривати деоксихолне киселине су у крајњем десном делу, а деривати холне киселине са циклохексанским прстеном су смештени између ове две групе. У свакој групи, идући дуж PC1 осе ка позитивнијим вредностима, смењују се деривати са амидо-групом на позицији C(24) са киселинама и естрима. Слика 17. Вредности међусобног односа компонената PC1 и PC2 за ретенционе податке Докторска дисертација Сандра Шеган 66 Слика 18. Вредности латентних варијабли PC1 и PC2 за ретенционе податке На основу карактеристика органске компоненте мобилне фазе било би очекивано да ће мобилна фаза која садржи диоксан или ацетон највише утицати на ретенцију протон-донорних једињења, док би метанол условљавао слабију ретенцију једињења која се понашају као протон-акцептори. Графикон зависности латентних варијабли (Слика 18), међутим, показује да је опсег PC1 вердности у којем су смештене варијабле изузетно узак, што указује да на класификацију испитиваних једињења не утиче састав мобилне фазе. Анализа главних компонената примењена на молекулске дескрипторе резултавала је раздвајањем једињења на основу њихових структурних карактеристика (Слика 19). Добијен је модел са четири главне компоненте које објашњавају 83,68% укупне варијансе, а на основу Hotelling Т2 елипсе једињења 5 и 34 су спољне вредности. Једињење 5 је дериват холне киселине са циклопентанским прстеном везаним за тетраоксански прстен, док је једињење 34 дериват деоксихолне киселине са метокси-групом у положају C(24). На графикону скорова (Слика 20) прве две главне компоненте може се уочити да су се на основу природе супституената у положају C(24) мешовити тетраоксани поделили на два кластера. Киселине, заједно са примарним и секундарним амидима сачињавају једну групу једињења са позитивним вредностима PC2, док терцијарни амиди и естри имају негативне вредности PC2 и формирају другу Докторска дисертација Сандра Шеган 67 групу једињења. Највећи позитиван утицај на PC2 имају HLB, %HS, HBA и други дескриптори који су директно повезани са поларним карактеристикама мешовитих тетраоксана. Негативан утицај на PC2 скорове имају параметар липофилности, енергија LUMO орбитала, енергија хидратације (HЕ) и дескриптор који се односи на дужину молекула (ML). Према томе, може се закључити да скорови PC2 представљају фактор раздвајања једињења на основу њихове поларности. Слика 19. Вредности међусобног односа PC1 и PC2 за молекулске дескрипторе Слика 20. Вредности латентних варијабли PC1 и PC2 за молекулске дескрипторе Докторска дисертација Сандра Шеган 68 3.3.2 Корелација ретенције и солватохромних параметара Разлике у ретенцији испитиваних једињења у одређеном хроматографском систему су резултат разлике у физичко-хемијским својствима испитиваних једињења, тако да се, знајући њихова својства може објаснити и њихово хроматографско понашање користећи LSER. Ова метода се заснива на моделу интеракција испитиване супстанце и мобилне фазе, у којем се процес солватације испитиване супстанце може објаснити дисперзионим интеракцијама, параметром диполарност-поларизабилност и протон- донорским и акцепторским интеракцијама. Метода вишеструке линеарне регресије је коришћена да се одреде параметри мобилне фазе који утичу на ретенцију мешовитих 1,2,4,5-тетраоксана применом реверзно-фазне танкослојне хроматографије. Нумеричке вредности LSER параметара за сва једињења наведене су у Таблици П34, а у Таблици П35 је дата корелациона матрица вредности солватохромних параметара. Ове вредности су коришћене као назависне варијабле, а вредности RМ0 као зависне варијабле у MLR моделима. Као критеријум квалитета добијених MLR модела коришћени су следећи статистички параметри: квадрат коефицијента корелације, R2, стандардна грешка, SЕ, ниво значајности, P, и Фишеров ниво значајности, F. Ниво прихватљивости независних варијабли био је на нивоу поузданости од 95%. Предиктивна моћ модела је проверена израчунавањем R2CV вредности. У Таблици 11 су наведени математички модели који укључују све солватохромне параметре, као и модели који се добијају након елиминисања статистички безначајних параметара. Докторска дисертација Сандра Шеган 69 С та ти ст ич ки п ар ам ет ри R 2 = 0 ,8 73 , R 2 a dj = 0 ,8 54 , M SE = 0 ,1 60 , F = 46 ,6 56 , P = 0 ,0 00 0, N = 4 0, S SY = 4 2, 86 6, PR ES S = 7, 91 9, R 2 C V = 0 ,8 15 R 2 = 0 ,8 71 , R 2 a dj = 0 ,8 57 , M SE = 0 ,3 97 , F = 59 ,3 53 , P = 0 ,0 00 , N = 4 0 R 2 = 0 ,8 12 , R 2 a dj = 0 ,7 84 , M SE = 0 ,6 24 , F = 29 ,3 93 , P = 0 ,0 00 0, N = 4 0, S SY = 2 ,8 97 , PR ES S = 31 ,1 54 7, R 2C V = 0 ,7 24 2 R 2 = 0 ,7 89 , R 2 a dj = 0 ,7 71 , M SE = 0 ,8 14 , F = 44 ,8 29 , P = 0 ,0 03 , N = 4 0 R 2 = 0, 66 1, R 2 a dj = 0 ,6 11 1, M SE = 0 ,5 35 , F = 13 ,2 60 , P = 0 ,0 00 , N = 4 0, S SY = 5 3, 67 0, PR ES S = 24 ,8 32 , R 2 C V = 0 ,5 37 R 2 = 0 ,6 34 , R 2 a dj = 0 ,6 04 , M SE = 0 ,7 38 , F = 20 ,8 25 , P = 0 ,0 00 N = 4 0 R 2 = 0 ,6 53 , R 2 a dj = 0 ,6 02 , M SE = 0 ,2 83 , F = 12 ,7 83 , P = 0 ,0 00 , N = 4 0, S SY = 0 ,7 11 , PR ES S = 14 ,5 02 5, R 2C V = 0 ,4 77 2 R 2 = 0 ,6 34 4, R 2 a dj = 0 ,6 04 , M SE = 0 ,7 38 , F = 20 ,8 25 , P = 0 ,0 00 , N = 4 0 Је дн ач ин а R M 0 = 4 ,7 76 (± 1 ,2 88 ) - 0 ,9 47 (± 0 ,4 07 )a + 0 ,5 46 (± 0 ,7 79 )b + 2, 74 5 (± 0 ,6 35 )e – 4 ,1 66 (± 0, 72 9) s + 1 ,9 01 (± 0, 29 2) v R M 0 = 4 ,9 77 (± 1 ,2 29 ) - 0 ,9 26 (± 0 ,4 02 )a + 2 ,5 07 (± 0 ,6 35 )e – 3, 77 9( ±0 ,3 00 )s + 1 ,9 02 (± 0, 28 9) v R M 0 = 1 1, 94 1 (± 2, 54 1) – 2 ,9 64 (± 0, 80 3) a – 3, 62 7 (± 1, 53 7) b + 2, 55 6( ±1 ,2 54 )e – 2 ,4 12 (± 1, 43 8) s + 1 ,5 17 (± 0, 57 6) v R M 0 = 1 2, 93 04 (± 2, 56 43 ) – 2 ,4 42 4( ±0 ,6 94 1) a – 5, 87 4( ±0 ,6 53 )b + 1, 68 6( ±0 ,5 53 5) v R M 0 = 0 ,2 84 (± 2, 35 3) – 1 ,1 97 (± 0, 74 3) a – 0, 18 9 (± 1, 42 3) b + 3, 48 8( ±1 ,1 61 )e – 3 ,2 54 (± 1, 33 2) s + 2 ,1 14 (± 0, 53 3) v R M 0 = 0 ,8 36 (± 2, 19 6) + 3 ,0 03 (± 0, 82 2) e – 3, 58 2( ±0 ,5 49 )s + 2, 61 3( ±0 ,4 39 )v R M 0 = 4 ,0 74 (± 1, 71 2) – 1 ,0 81 (± 0, 54 1) a + 1, 05 4 (± 1, 03 6) b + 3, 01 4 (± 0, 84 5) e – 3, 53 9 (± 0, 96 91 )s + 1 ,0 37 (± 0, 38 8) v R M 0 = 0 ,8 36 (± 2, 19 6) + 3 ,0 03 (± 0, 82 2) e – 3, 58 2( ±0 ,5 49 )s + 2, 61 3( ±0 ,4 39 )v Т аб ли ца 1 1. M LR м од ел и R M 0 вр ед но ст и и со лв ат ох ро м ни х па ра м ет ар а м еш ов ит их т ет ра ок са на Х ро м ат ог ра ф ск и си ст ем R P1 8/ М ет ан ол -в од а R P1 8/ А це то н- во да R P1 8/ Д ио кс ан -в од а C N /А це то н- во да Докторска дисертација Сандра Шеган 70 Дескриптори А, B, S, Е и V се односе на испитивана једињења, док се коефицијенти а, b, s, е и v односе на хроматографаски систем. Позитивне вредности коефицијената указују да су доминантније интеракције једињења са стационарном фазом, па је ретенција једињења јача. Негативна вредност коефицијента указује да су доминантније интеракције једињења са мобилном фазом. MLR модел који се односи на хроматографски систем RP18/метанол–вода указује на то да су протон-донорске и протон-акцепторске способности најдоминантнија врста интеракција између мешовитих тетраоксана и мобилне фазе, док су са стационарном фазом најизраженије кохезионе и дисперзионе интеракције. Модели вишеструке регресионе анализе за обе стационарне фазе и ацетон као ораганску компоненту мобилне фазе указују на важност диполарности/поларизабилности (S) испитиваних супстанци у интеракцијама са мобилном фазом и на значај вишка моларне рефрактивности (Е) и запремине (V) у интеракцијама са стационарним фазама. У MLR моделу за хроматографки систем RP18/диоксан–вода, коефицијенти који се односе на способност мешовитих тетраоксана да дају протоне (А), као и њихова својства диполарности/поларизабилности (S), су негативни што сугерише да је овај тип интеракција мешовитих тетраоксана јачи са мобилном него са стационарном фазом. Што су веће вредности ових коефицијената, ниже су RМ0 вредности. С друге стране, коефицијенти који се односе на вишак моларне рефракције (Е) и представљају меру интеракција испитиваних једињења са стационарном фазом које се остварују преко n- или π-електрона, као и коефицијенти који се односе на запремину молекула (V) која утиче на кохезионе и дисперзионе интеракције, имају позитиван предзнак. Повећање јачине ових интеракција доводи до повећања RМ0 вредности. Докторска дисертација Сандра Шеган 71 3.3.3 Корелација структуре и ретенције методом делимичних најмањих квадрата Моделовање ретенције и структурних дескриптора урађено је применом методе делимичних најмањих квадрата (PLS). Као зависне варијабле коришћене су RМ0, b и PC1 вредности добијене у четири реверзно-фазна хроматографска система, док су као независне варијабле коришћени структурни дескриптори. Квалитет модела се заснива на вредностима Пирсоновог коефицијента корелације који се односи на калибрацију (R2cal), кросвалидацију (R2cv) и предикцију (R2pred), као и вредностима гешака калибрације (RMSEC), кросвалидације (RMSECV) и предикције (RMSEP). Димензије улазних података су N × K (40 × 32), где је N број једињења, а K је број варијабли, односно дескриптора. Овај сет од 40 једињења је подељен методом случајног избора на два подсета: калибрациони сет који сачињава 26 једињења (6, 10, 12, 3, 15, 16, 19, 39, 33, 32, 37, 27, 7, 14, 25, 5, 35, 31, 28, 30, 18, 29, 40, 9, 17, 22) и тест сет од преосталих 14 једињења (1, 2, 4, 8, 11, 13, 20, 23, 24, 26, 34, 38, 21, 36). У Таблици П36 су приказани структурни дескриптори мешовитих тетраоксана, а у Таблици П37 корелациона матрица мешовитих тетраоксана. Модели добијени квантификацијом зависности између фактора који утичу на ретенцију, односно липофилности приказани су у Таблици 12. Графикони зависности варијабли од вредности VIP-скорива и вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделима налазе се на Сликама П38 – П49. Процена дескриптора који имају највећи утицај на ретенцију урађена је на основу VIP вредности. Дескриптори који су укључени у QSRR моделе су у Таблици 12 поређани по опадајућем редоследу регресионих коефицијената са предзнаком који означава допринос зависној варијабли. Статистички значајни PLS модели су добијени само за зависност RM0 од структурних дескриптора. Модел са диоксаном као органским модификатором показује најбоље статистичке перформансе. Докторска дисертација Сандра Шеган 72 М ол ек ул ск и де ск ри пт ор и ук љ уч ен и у м од ел Lo gP (+ ),H LB (-) ,% HS (-) ,H BA (-) , P (-) , H BD (-) , H B( -), VI 3(+ ), Lo gP (+ ),H LB (-) ,% HS (-) ,H BA (-) ,P( -),H B( -),V I 3 (+ ), S A( Ap )(- ) Lo gP (+ ),H LB (-) ,% HS (-) ,P( -),H BA (-) ,V I3( +) ,H B( -),S A( Ap )(- ), C I3 Lo gP (+ ), H LB (-) ,% HS (-) ,D M (-) ,P( -), HB A( -),H B( -), D( +) Lo gP (-), HL B( -), % HS (-), P( +), H BA (+) , H BD (+) , V I3( -), H B( +), H E( -), SA (ap )(+ ) Lo gP (-), P( +), H LB (+) , % HS (+) , D (-), LU M O( +), CI 3(- ), V I3( -), H BA (+) Lo gP (-), H LB (+) , % HS (+) , P( +), H BA (+) ,V I3( -),C I3( -), S A( Ap )(+ ), V I1( -),H B( +), V I2( -) HL B( +), % HS (+) , D M (+) , L og P(- ), D (-), P( +), H E( +), SA (A P)( +) Lo gP (+) , V I3( +), H LB (-), % HS (-), SA (ap ), H B( -), D (+) , H BA (-), V I2( +), CI 3(+ ), V I1( +), P( -) HL B( -), % HS (-), Lo gP (+) , SA (A p)( -), H BA (-), V I3( +), H B( -), M W d(- ), C I3( +), CI 2(- ), H E( -) HL B( -), % HS (-), Lo gP (+) , H BA (-), P( -),V I3( +), SA (A p)( -), M W d(- ), H B( -), C I3( +) HL B( -), % HS (-), D M (-), M L( +), M W d(- ),P (-), Lo gP (+) , H BA (-) RM SE P 1,0 62 0,9 75 0,4 54 0,5 00 0,0 10 0,0 08 0,0 10 0,0 07 1,6 00 0,9 75 1,4 21 1,3 03 RM SE CV 1,1 45 0,7 28 0,3 94 0,6 65 0,0 10 0,0 12 0,0 06 0,0 09 1,4 80 0,7 28 1,8 27 2,0 08 RM SE C 0,7 83 0,5 08 0,2 65 0,4 77 0,0 07 0,0 08 0,0 04 0,0 07 1,0 71 0,5 08 1,0 97 1,2 78 R2 pred 0,6 94 0,5 66 0,8 32 0,7 93 0,6 88 0,7 50 0,4 88 0,4 03 0,8 07 0,5 66 0,8 31 0,5 94 R2 CV 0,5 08 0,5 82 0,8 42 0,3 97 0,5 03 0,0 80 0,6 86 0,1 21 0,4 78 0,5 82 0,2 81 0,0 29 R2 cal 0,7 46 0,7 75 0,9 27 0,6 66 0,6 79 0,4 78 0,8 18 0,4 67 0,7 09 0,7 75 0,6 78 0,4 24 Бр .ла т. ва р. 4 2 3 3 2 2 2 2 3 3 3 2 Х ро м ат . с ис те м RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а CN /А це то н- во да RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а CN /А це то н- во да RP 18 /М ет ан ол -в од а RP 18 /А це то н- во да RP 18 /Д ио кс ан -в од а CN /А це то н- во да Т аб ли ца 1 2. P LS м од ел и м еш ов ит их т ет ра ок са на R M 0 , b, P C 1 – f(д ес к. ) R M 0 – f( де ск .) b – f( де ск .) PC 1 – f( де ск .) Докторска дисертација Сандра Шеган 73 Дескриптори који су укључени у финалне моделе су слични по својој природи и значају. Сви модели потврђују значај параметра липофилности, logP. Овај параметар описује неполарна својства једињења и његову способност да учествује у хидрофобним (дисперзионим) интеракцијама са стационарном фазом, па према томе позитивно утичу на ретенцију. Дескриптори као што су HLB, %HS, HBD, HB и HBA, описују поларност испитиваних једињења, односно њихову способност да учествују у хидрофилним интеракцијама. Ови параметри имају негативан утицај на RМ0-вредности. Тополошки дескриптори пружају информације о степену рачвања и величини молекула, позитиван предзнак VI3 значи да рачвање трећег степена доприноси већим RМ0-вредностима. Математички модел добијен за хроматографски систем CN-силика-гел/ацетон- вода као битан дескриптор укључује и диполни моменат (DM). Диполни моменат се може описати као мера способности једињења да учествује у дипол-дипол и дипол- индуковани дипол интеракцијама са компонентама мобилне и стационарне фазе и има негативан утицај на ретенцију. Поредећи моделе ретенције са солватохромним параметрима (LSER) и молекулским дескрипторима уочава се да су модели са молекулским дескрипторима дали статистички боље резултате у предикцији ретенције. 3.3.4 Корелација структуре и ретенције методом вишеструке линеарне регресије (МLR) За добијање модела ретенције примењена је и метода вишеструке линеарне регресије. Први корак који је претходио прављењу модела је одабир дескриптора. Искључени су дескриптори са скоро идентичним вредностима, као и један од два висококорелисана дескриптора са циљем да се спречи преклапање информација. Као што је наведено у Општем делу овог рада, два дескриптора су међусобно независна ако је линеарни коефицијент корелације мањи од 0,800. Новоформирани сет дескриптора сачињавају МWе, МL, МWd, МD, logP, HLB, SP, D, P, HB, HBA, HBD, VI3, DM, SA(Ap), SA (grid), HE, Ref, Pol. За одабир варијабли је примењена метода постепеног одабира варијабли (stepwise regression). Поред RМ0 вредности, као зависне варијабле су Докторска дисертација Сандра Шеган 74 коришћени и параметри b који одговарају специфичној хидрофобној површини, а показали су добру линеарну корелацију са RМ0. За сваки од хроматографских система урађена је селекција варијабли. Ови подаци су наведени у Таблици 13. Регресиони коефицијенти модела, њихове стандардне девијације, t-тест и прихватљивост регресионих коефицијената на основу нулте хипотезе (H0) су приказани у Таблици 14. Постојање статистички значајне линеарне зависности између независне и зависне варијабле утврђено је на основу t- теста примењеног на регресионе коефицијенте. Вредност t се израчунава из односа t = b/sb, где је b нагиб у регресионом моделу, а sb стандардна девијација нагиба, док је број степени слободе h -k-1 (h – величина узорка, k – број независних променљивих). Према нултој хипотези вредност нагиба је једнака нули. Уколико је вредност нагиба у регресионој правој значајно различита од нуле, између посматране независне променљиве и RМ0 вредности постоји статистички значајан однос [55]. У MLR модел који се односи на хроматографски систем RP18/метанол–вода укључени су дескриптори који описују липофилност једињења, logP, способност отпуштања протона, HBD и површину молекула SА(Аp). Постојање значајне зависности утврђено је за све структурне дескрипторе укључене у модел. Највећу вредност има коефицијент HBD, а његов негативан предзнак указује да се испитивана једињења понашају као протон-донори према мобилној фази. Јаче протон-донорске интеракције са молекулима мобилне фазе доприносе нижим RМ0 вредностима. С друге стране, позитиван предзнак коефицијената logP и SА(Аp), указују да повећање липофилности молекула и његове површине доводи до јачих хидрофобних интеракција са стационарном фазом, при чему RМ0 вредности расту. У МLR модел који се односи на хроматографски систем RP18/ацетон–вода и диоксан - вода укључени је само дескриптор logP. Такође, позитивне вредности овог коефицијента у оба модела указују да повећање липофилности једињења доводи до повећања RМ0 вредности. Међутим, у оба MLR модела на основу нулте хипотезе одбацује се вредност одсечка. У MLR моделу који се односи на хроматографски систем CN-силика гел/ацетон–вода укључени су дескриптори HLB, HЕ и SА(Аp). Највећу вредност коефицијента има HLB, док је допринос преостала два дескриптора знатно мањи. Негативни коефицијенти дескриптора HLB и HЕ указују да повећање вредности ових Докторска дисертација Сандра Шеган 75 параметара доводи до мањих RМ0 вредности. Супротно томе, веће вредности површине молекула SА(Аp) доводе до већих RМ0 вредности. Исти дескриптори су укључени и у МLR моделе који се односе на зависности параметра b од структурних дескриптора, али са супротним предзнаком коефицијената. Статистички параметри MLR модела наведени су у Таблици 15. С обзиром да је најбољи MLR модел добијен за хроматографски систем RP-18/метанол–вода, једначина предложена овим моделом примењена је на једињења из тест сета и RМ0 вредности су упоређене са експерименталним. На основу вредности R2аdј (0,813), МSЕ (0,469), F (37,287) и PRESS/SSY (0,254) може се рећи да овај модел има добру предвиђајућу моћ. График зависности експериментално одређених од предвиђених RМ0 вредности дат је на Слици 21. Слика 21. График зависности експериментално одређених од предвиђених RМ0 вредности Докторска дисертација Сандра Шеган 76 Таблица 13. Селекција варијабли методом постепене регресије Хромат. систем Број понављања Варијабла R2 MSE RP-18/ 0 Непромењено 0,000 1,585 Метанол- 1 Додато log P 0,669 0,930 вода 2 Додато HBD 0,757 0,814 3 Додато SA(Ap) 0,836 0,685 4 Непромењено 0,836 0,685 RP-18/ 0 Непромењено 0,000 1,082 Ацетон- 1 Додато logP 0,574 0,721 вода 2 Непромењено 0,574 0,721 RP-18/ 0 Непромењено 0,000 1,000 Диоксан- 1 Додато logP 0,791 0,467 вода 2 Непромењено 0,791 0,467 CN/ 0 Непромењено 0,000 0,824 Ацетон- 1 Додато HLB 0,242 0,732 вода 2 Додато HE 0,388 0,672 3 Додато SA(Grid) 0,555 0,586 4 Додато HBD 0,651 0,531 RM0- f(деск.) 5 Непромењено 0,651 0,531 RP-18/ 0 Непромењено 0,000 0,014 Метанол- 1 Додато logP 0,587 0,009 вода 2 Додато HBD 0,669 0,008 3 Додато SA(Ap) 0,754 0,007 4 Непромењено 0,754 0,007 RP-18/ 0 Непромењено 0,000 0,012 Ацетон- 1 Додато logP 0,369 0,009 вода 2 Непромењено 0,369 0,009 RP-18/ 0 Непромењено 0,000 0,010 Диоксан- 1 Додато logP 0,770 0,005 вода 2 Непромењено 0,770 0,005 CN/ 0 Непромењено 0,000 0,009 Ацетон- 1 Додато HLB 0,231 0,008 вода 2 Додато HE 0,378 0,008 3 Додато SA(grid) 0,571 0,007 b – f(деск.) 4 Непромењено 0,571 0,007 Докторска дисертација Сандра Шеган 77 Таблица 14. Регресиони коефицијенти и њихова прихватљивост на основу нулте хипотезе (H0) Хр. систем. Независна варијабла Регресиони коефицијент Стандардна грешка коефицијента t-test H0:bi=0 P H0: bi≠0 RM0- f(деск.) RP-18/ Одсечак 7,749 2,789 2,778 0,011 Да Метанол-вода HBD -3,819 0,817 -4,674 0,000 Да Log P 0,618 0,114 5,405 0,000 Да SA (Ap) -0,008 0,003 -3,242 0,004 Да RP-18/ Одсечак -0,465 0,927 -0,502 0,621 Не Ацетон-вода Log P 0,575 0,101 5,684 0,000 Да RP-18/ Одсечак -0,424 0,601 -0,705 0,488 Не Диоксан-вода log_P 0,624 0,066 9,523 0,000 Да CN/ Одсечак 1,017 2,777 0,366 0,718 Не Ацетон-вода HE -0,194 0,049 -3,918 0,001 Да HLB -1,194 0,235 -5,077 0,000 Да SA(Grid) 0,009 0,003 2,872 0,009 Да b – f(деск.) RP-18/ Одсечак -0,084 0,030 -2,844 0,009 Да Метанол-вода HBD 0,033 0,009 3,821 0,001 Да log_P -0,005 0,001 -3,991 0,001 Да SA (Ap) 0,001 0,000 2,765 0,011 Да RP-18/ Одсечак -0,011 0,012 -0,893 0,381 Не Ацетон-вода Log P -0,005 0,001 -3,747 0,001 Да RP-18/ Одсечак -0,010 0,006 -1,662 0,110 Не Диоксан-вода Log P -0,006 0,001 -8,951 0,000 Да CN/ Одсечак -0,015 0,031 -0,477 0,638 Не Ацетон-вода HLB 0,002 0,001 4,154 0,000 Да HE 0,014 0,003 5,219 0,000 Да SA(grid) 0,000 0,000 -3,149 0,005 Да Tаблица 15. Статистички параметри MLR модела Хр.систем R2 R2adj MSE R2CV F PRESS SSY PRESS/SSY RM0- f(деск.) RP-18/ Метанол-вода 0,836 0,813 0,469 0,745 37,287 15,982 62,823 0,254 RP-18/ Ацетон-вода 0,574 0,556 0,520 0,508 32,304 14,416 29,280 0,492 RP-18/ Диоксан-вода 0791 0,782 0,218 0,752 90,691 6,212 25,030 0,248 CN/ Ацетон-вода 0,555 0,494 0,343 0,283 9,129 10,694 16,963 0,630 b–f(деск.) RP-18/ Метанол-вода 0,754 0,721 0,000 0,601 22,529 0,002 0,005 0,400 RP-18/ Ацетон-вода 0,369 0,343 0,000 0,163 14,040 0,003 0,003 1,000 RP-18/ Диоксан-вода 0,769 0,760 0,000 0,722 80,128 6,8E-04 0,002 0,283 CN/ Ацетон-вода 0,571 0,513 0,000 0,398 9,764 1,3E-03 0,002 0,590 Докторска дисертација Сандра Шеган 78 3.3.5 Корелација структуре и биолошке активности Неки од проучаваних мешовитих тетраоксана испољавају значајну in vitro и in vivo антималаријску активност [70-73]. Вредности минималне инхибиторне концентрације, logC, према D6 и W2 ћелијским линијама проучаваних мешовитих тетраоксана су дате у Таблици П50. Мешовити тетраоксани, деривати холне киселине су показали већу биолошку активност у односу на деривате деоксихолне киселине, што указује на то да ацетокси- група у положају C(7) значајно доприноси њиховој антималаријској активности. Генерално, активност мешовитих тетраоксана према W2 ћелијској линији је много већа него према D6 ћелијској линији. Такође, 4″-метилциклохексил деривати имају већу активност од несупституисаних циклохексил деривата, чланови (4″R)-серије имају већу биолошку активност од одговарајућих (4″S)-епимера што указује на утицај малих структурних промена на биолошку активност ових једињења. In vitro антималаријска активност према две Plasmodium falciparum ћелијске линије, W2 (хлорокин отпорна и осетљива према мефлокину) и D6 (хлорокин осетљива) је анализирана у функцији израчунатих структурних дескриптора применом методе делимичних најмањих квадрата (PLS). Добијени QSАR модели нису статистички значајни за прецизно предвиђање биолошке активности, али могу на квалитативном нивоу да укажу на структурне дескрипторе који имају утицај на биолошку активност ових једињења. Графикони зависности варијабли од вредности VIP-скорова и вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделима налазе се на Сликама 22-25. Према добијеним моделима најважнији дескриптори према обе ћелијске линије су: HLB, %HS, HB, logP, HBА, CI2, HОМО, МWd и SА(Аp). Поред ових дескриптора у модел за ћелијску линију W2 укључен је и дескриптор МW. Са графикона VIP скорова за обе ћелијске линије, може се уочити да се дескриптори HLB, %HS и HB издвајају са два пута већим вредностима у поређењу са осталим. LogP и HОМО утичу на биолошке активности у позитивном смислу. То значи да веће вредности липофилности утичу на већу активност према W2 и D6 ћелијским линијама. Такође, повећање HОМО енергије утиче на већу реактивност молекула, Докторска дисертација Сандра Шеган 79 односно много је лакше молекулима да предају електроне из доступног HОМО нивоа (близу нултог) и да се, према томе, понашају као добри нуклеофили. Супротно, HLB, %HS, HB, HBA, CI2, МWd, SА(Аp) и МW утичу на биолошку активност у негативном смислу, што указује да повећање ових вредности утиче на нижу активност према W2 и D6 ћелијским линијама. . Слика 22. График зависности варијабли од вредности VIP-скорова у PLS моделу за W2 ћелијску линију Слика 23. Вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделу за W2 ћелијску линију Израчунавања интеракција неких од ових једињења са хемом сагласна су са претходно изнетим закључком да је близина хема и триоксанског или тетраоксанског атома кисеоника важна за добру активност ових једињења. С обзиром на закључак да је пренос електрона са триоксанског или тетраоксанског атома кисеоника основа Докторска дисертација Сандра Шеган 80 механизма [73], чини се да је допринос HОМО дескриптора од додатног значаја за антималаријску активност 1,2,4,5- мешовитих тетраоксана. Резултати добијени моделовањем антималаријске активности мешовитих тетраоксана и резултати добијени моделовањем антипролиферативне активности, могу да укажу да се ове две активности одвијају различитим механизмима дејства Слика 24. График зависности варијабли од вредности VIP-скорова у PLS моделу за D6 ћелијску линију Слика 25. Вредности корелационих коефицијената варијабли у PLS моделу за D6 ћелијску линију Докторска дисертација Сандра Шеган 81 4. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 4.1 ТАНКОСЛОЈНА ХРОМАТОГРАФИЈА За хроматографско проучавање бис-стероидних и мешовитих тетраоксана примењена је метода хоризонталне танкослојне хроматографије. Коришћена је хоризонтална HPTLC када за танкослојну хроматографију (Camag, Muttenz, Switzerland). Испитиване супстанце растваране су у дихлорметану. На плоче, димензија 10 × 10 cm наношено је око 1 µl свеже припремљеног раствора приближне концентрације 2 mg/ml. Бис-стероидни тетраоксани испитивани су у следећим хроматографским системима: (i) RP-18 силика-гел (Арт.. 13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза метанол – вода, 86 – 100 Vоl% метанола у порцијама од 2 Vol%, (ii) RP-18 силика-гел (Арт.13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза ацетон – вода, 70 – 90 Vol% ацетоне у порцијама од 5 Vol%, (iii) RP-18 силика-гел (Арт. 13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза диоксан – вода, 65 – 90 Vol% диоксана у порцијама од 5 Vol%, (iv) CN-силика-гел F254s (Арт.13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза метанол – вода, 70 – 90 Vol% метанола у порцијама од 5 Vol%, (v) CN-силика-гел F254s (Арт. 13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза ацетон – вода, 60 – 90 Vol% ацетона у порцијама од 5 Vol%. Мешовити тетраоксани су испитивани у следећим хроматографским системима: (i) RP-18 силика-гел (Арт. 13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза метанол – вода, 92 – 100 Vol% метанола у порцијама од 2 Vol%, (ii) RP-18 силика-гел (Арт.13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза ацетон – вода, 60 – 100 Vol% ацетоне у порцијама од 10 Vol%, Докторска дисертација Сандра Шеган 82 (iii) RP-18 силика-гел (Арт. 13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза диоксан – вода, 70 – 90 Vol% диоксана у порцијама од 5 Vol%, (iv) CN-силика-гел F254s (Арт. 13124, Merck, Darmstadt, Germany) и мобилна фаза метанол – вода, 50 – 90 Vol% ацетона у порцијама од 10 Vol%. Сви растварачи били су аналитичког степена чистоће. Пређени пут растварача је био око 4,5 cm. Детекција хроматографских зона вршена је прскањем плоча 50%- тном сумпорном киселином и загревањем док зоне не постану видљиве. Сва испитивања су изведена на собној температури (22 ± 2°C). 4.2 ГЕОМЕТРИЈСКА ОПТИМИЗАЦИЈА И ИЗРАЧУНАВАЊЕ ВРЕДНОСТИ МОЛЕКУЛСКИХ ДЕСКРИПТОРА Структуре испитиваних једињења нацртане су у Hyperchem Release 7 програму. Геометријска оптимизација и моделовање молекула урађени су помоћу програма Hyperchem (верзија 7.0, Hypercub, Inc.). Прва оптимизација изведена је помоћу молекулско-механичке ММ+ методе, која је заснована на ММ2 алгоритму. У следећем кораку, оптимизација је ураћена коришћењем Polak-Ribiere Conjugate gradient (PRCG) алгоритма. Структуре оптимизоване на претходно описан начин служиле су као почетне за семи-емпиријску оптимизацију. Крајња геометријска оптимизација се заснива на Austin Model 1 (AM1 Hamiltonian), семи-емпиријској молекулско-орбиталној методи, а урађена је применом алгоритма Steepest Descent i Conjugate Directions алгоритма. Квантно-хемијски дескриптори као што су поларизабилност (Pol), енергија HОМО и LUМО орбитала, диполни моменат (DМ), и QSAR параметри као што су површина молекула (SA grid и SА aprox), и рефрактивност (Rеf) су израчунати применом Hyperchem Release 7 програма. Molecular Modeling Program Pro Plus (http://norgwyn.com/mmpplus.html) је коришћен за рачунање дескриптора везаних за величину и рачвање молекула, као што су дужина молекула (МL), ширина молекула (МWd), дубина молекула (МD); тополошких параметара, Randić, Hall i Kier индекса конективности 0–4, Randić, Hall i Kier индекса валентности 0–4; параметара који Докторска дисертација Сандра Шеган 83 описују својства полимера и сурфактаната (Van Krevelen-ови и Hoftyzer-ови параметри растворљивости), моларна запремина (МV), хидрофилно-липофилни баланс (HLB), површинска поларност (SP), дисперзија (D), поларност (P), водонично везивање (HB), удео хидрофилне површине (%HS), акцептор водоничне везе (HBAc), донор водоничне везе (HBD), липофилност (logP). 4.3 МУЛТИВАРИЈАНТНА СТАТИСТИЧКА АНАЛИЗА Методе PCA, HCA и PLS су изведене коришћењем демо верзије PLS Тооlbox статистичког пакета (Eigenvectors, v. 5.7) за МАТLAB верзију 7.4.0.287 (R2007а) (МаthWоrks, Natick, МА, USА). Пре моделовања подаци су аутоскалирани да би се спречило да варијабле са већим вредностима превладавају у коначном моделу. Хроматографски подаци нису аутоскалирани, пошто су истог реда величине. Анализа главних компонената изведена је помоћу Singular Value Decomposition алгоритма (SVD). Вредности Q и Т2 за Hotelling-ову расподелу одређени су на нивоу поузданости од 95% и коришћени су за утврђивање присуства тзв. спољних резултата. На овај начин, коришћењем ограниченог броја главних компонената, редукује се простор ретенционих података, даља анализа се поједностављује и једињења се групишу на основу некекарактеристике. Кластерска анализа (HCA) је изведена применом агломеративне методе уз коришћење Wаrd-овог модела за одређивање растојања између два кластера и Eucleidean-ове раздаљине за мерење удаљености између узорака. PLS метода је коришћена применом SIMPLS алгоритма. Он израчунава PLS факторе као линеарну комбинацију оригиналних варијабли, тако да се критеријум коваријантности учини што значајнијим, поштујући при томе ограничења која се односе на ортогоналност и нормирање. MLR моделовање је изведено коришћењем демо верзије NCSS статистичког пакета (Hintze, J. (2001), NCSS and PASS Number Cruncher Statistical Systems, Kaysville, Utah, USA). Докторска дисертација Сандра Шеган 84 5. ЗАКЉУЧАК Различити реверзно-фазни системи су коришћени за одређивање квантитативног односа структуре и ретенције бис-стероидних и мешовитих тетраоксана. На основу добијених резултата могу се извести следећи закључци: • Механизам ретенције стероидних тетраоксана се заснива на протон- акцепторским интеракцијама поларног тетраоксанског прстена хидрофобним и поларним интеракцијама (протон- донорским и акцепторским) стероидног остатка. Код мешовитих тетраоксана изражене су и хидрофобне интеракције циклоалканског и изопропилиденског остатка са стационарном фазом. • На разлике у ретенцији у оквиру серије бис-стероидних и мешовитих тетраоксана, највећи утицај има природа супституената у положајима C(24) и C(24a). Једињења са мање поларним групама у овим положајима показују јачу ретенцију и више RM0 јер су израженије њихове хидрофобне интеракције са стационарном фазом. Насупрот томе, већа поларност молекула у реверзно- фазним системима доприноси њиховим јачим специфичним интеракцијама са молекулима поларне мобилне фазе, што се одражава на слабију ретенцију и ниже RM0 вредности. При истом саставу мобилне фазе интензитет сорпције једињења је јачи на RP-18 силика-гелу у односу на цијано модификовани силика-гел. Ово је последица хидрофобније површине RP-18 силика-гела у односу на CN-силика-гел. • Cis-изомери бис-стероидних тетраоксана имају ниже вредности параметра липофилности, RM0, у односу на одговарајуће trans-изомере. • Утврђена је статистички значајна корелација између параметара RM0 bis- стероидних тетраоксана у свим хроматографским системима са одговарајућим параметрима b, C0 и PC1. На основу овога може се закључити да се поред RM0 вредности за процену липофилности bis-стероидних тетраоксана, могу успешно користити и параметри b, C0 и PC1. • Статистички значајне линеарне корелације су добијене између параметара RM0, b, C0 и PC1 са израчунатим logKоw вредностима добијеним фрагментационом Докторска дисертација Сандра Шеган 85 методом. Ови резултати потврђују претпоставку да се хроматографски добијени параметри липофилности могу користити за процену липофилности бис- стероидних тетраоксана. • Уводне мултиваријантне анализе, PCA и HCA примењене на ретенционе податке (RM-вредности) и структурне дескрипторе, су показале да су бис- стероидни тетраоксани класификовани на основу својих структурних карактеристика. • Метода делимичних најмањих квадрата, PLS, је коришћена за утврђивање структурних дескриптора који на најбољи начин описују понашање бис- стероидних тетраоксана у примењеним хроматографским системима. Статистички најбољи резултати на обе стационарне фазе су добијени са ацетоном као органском компонентом мобилне фазе. Утврђено је да су најважнији дескриптори који утичу на ретенцију бис-стероидних тетраоксана HLB, %HS, HBAcc, logP и HBD, односно, дескриптори који се односе на поларност једињења и њихове протон-донорске и акцепторске карактеристике. • PLS модели који се односе на моделовање антипролиферативне активности бис- стероидних тетраоксана према Fem-X и HeLa ћелијским линијама као зависних варијабли и структурних дескриптора као независних варијабли нису статистички значајни, али на квалитативном нивоу указују да су најважнији дескриптори који утичу на биолошку активност бис-стероидних тетраоксана MWe, MV, SP, HB, HBD, Ref, Pol, WI, HOMO, LUMO и дескриптори који се односе на индексе конективности. • На основу добијених QSRR и QSАR модела, може се закључити да различите карактеристике бис-стероидних тетраоксана утичу на њихову ретенцију у примењеним хроматографским системима и специфичну антипролиферативну активност. • Поредећи просечне вредности параметара RM0 мешовитих тетраоксана, са просечним RM0 вредностима бис-стероидних тетраоксана у истим хроматографским системима, може се закључити да бис-стероидни тетраоксани на RP-18 силика-гелу имају веће просечне вредности параметара RM0, док на цијано модификованом силика-гелу и ацетоном као органском компонентом мобилне фазе, већу вредност параметара RM0 имају мешовити тетраоксани. Ово Докторска дисертација Сандра Шеган 86 се може протумачити јачим хидрофобним интеракцијама бис-стероидних тетраоксана са неполарном површином RP-18 силика-гела. Насупрот томе, на цијано модификованом силика-гелу јаче хидрофобне интеракције са стационарном фазом показују мешовити тетраоксани. • Деривати деоксихолне киселине имају највеће вредности липофилности, док мешовити тетраоксани деривати холне киселине који садрже ацетонску субјединицу имају најниже вредности липофилности. • Утврђена је статистички значајна корелација између параметара RM0 мешовитих тетраоксана у свим хроматографским системима са одговарајућим параметрима b и PC1, док параметар C,0 осим у случају хроматографског система CN-силика- гел / ацетон–вода, не показује статистички значајну корелацију са параметром RМ0. • Израчунати параметри липофилности, logKоw, показују статистички значајне корелације са параметрима RM0, b и PC1. • Применом анализе главних компонената на ретенционе податке мешовити тетраоксани су класификовани на основу њихове липофилности. Анализа главних компонената примењена на молекулске дескрипторе мешовитих тетраоксана резултовала је груписањем једињења на основу њихових структурних карактеристика. • Моделовањем ретенције и солватохромних параметара применом методе вишеструке линеарне регресије квантификовани су утицаји солватохромних парамтара који утичу на ретенцију у примењеним хроматографским системима. У хроматографском систему RP-18/метанол-вода, протон-донорске и протон- акцепторске способности су најдоминантнија врста интеракција између мешовитих тетраоксана и мобилне фазе, док су са стационарном фазом најизраженије кохезионе и дисперзионе интеракције. У хроматографском систему RP-18/диоксан–вода на ретенцију мешовитих тетраоксана утичу протон донорске способности и својства диполарности/поларизабилности према мобилној фази и кохезионе и дисперзионе интеракције са стационарном фазом. MLR модели са ацетоном као органском компонентом мобилне фазе у комбинацији са обе стационарне фазе указују на важност Докторска дисертација Сандра Шеган 87 диполарности/поларизабилности мешовитих тетраоксана у интеракцијама са мобилном фазом и на значај вишка моларне рефрактивности и запремине у интеракцијама са стационарном фазом. • Моделовањем ретенције и структурних дескриптора применом PLS методе, статистички значајни PLS модели су добијени само за зависност RM0 од структурних дескриптора. У свим PLS моделима изражен је значај неполарних особина мешовитих тетраоксана и њихове способности да учествују у хидрофилним интеракцијама. Модел са диоксаном као органским модификатором показује најбоље статистичке перформансе. • Моделовањем ретенције и структурних дескриптора применом MLR методе, статистички значајан модел са добром предикционом особином, добијен је само за систем RP-18/метанол–вода. Овај MLR модел укључује дескрипторе logP, HBD и SА(Аp). • Добијени QSАR модели нису статистички значајни за прецизно предвиђање биолошке активности, али на квалитативном нивоу указују да на антималаријску активност мешовитих тетраоксана имају утицај исти структурни дескриптори који утичу и на ретенцију мешовитих тетраоксана. Докторска дисертација Сандра Шеган 88 6. ЛИТЕРАТУРА 1 V. R. Meyer, Practical High Performance Thin-Layer Chromatography, Wiley, Chichester, 1994 2 Sz. Nyiredi, Planar Chromatography, A Retrospective View for the Third Millennium, Research Institute for Medicinal Plants, Budakalasz, Hungary, 2001 3 C. F. Poole and S. K. Poole, Chromatography today, Elsevier, Amsterdam, 1991 4 M. Palamareva, I. Kozekov, Journal of Chromatography A, 758 (1997) 135-144 5 A. A. Amiri, B. Hemmateenejad, A. Safavi, H. Sharghi, A. R. S. Beni, M. Shamsipur, Analytica Chimica Acta 605 (2007) 11–19 6 A. Vailaya, Cs. Horvath, Journal of Chromatography A, 829 (1998) 1–27 7 M. Turowski, T. Morimoto, K. Kimata , H. Monde, T. Ikegami, K. Hosoya, N. Tanaka, Journal of Chromatography A, 911 (2001) 177–190 8 R. Kaliszan, Chemical Review 107 (2007) 3212-3246 9 R. P. J. Ranatunga and P. W. Carr, Analitical Chemistry 72 (2000) 5679-5692 10 C. Horváth, W. R. Melander and I. Molnar, Journal of Chromatography, 125 (1976) 129- 156 11 P. Carr, L. C. Tan, J. H. Park, Journal of Chromatography A, 724 (1996) 1-12 12 P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, P. Agrafiotou, Journal of Chromatography A, 1034 (2004) 41–54 13 C. H. Lochmuller, D. R. Wilder, Journal of Chromatographic Science, 17 (1979) 574-579 Докторска дисертација Сандра Шеган 89 14 D. E. Martire, R. E. Boehm, Journal of Physical Chemistry 87 (1983) 1045-1062 15 K. A. Dill, Journal of Physical Chemistry, 91 (1987) 1980-1988 16 J. G. Dorsey, K. A. Dill, Chemical Review, 89 (1989) 331-346 17 S. K. Poole, C. F. Poole, , Journal of Chromatography B, 797 (2003) 3-19 18 E. Rutkowska, K. Pająk and K. Jźwiak, Acta Poloniae Pharmaceutica in Drug Research, 70 (2013) 3-18 19 C. Hansch, T. Fujita, Journal of American Chemical Society, 86 (1964) 1616-1626 20 Z. Shi, J. He, T. Yao, and W. Chang, Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 27(3) (2004) 465-479 21 S. D. Kramer, J. -C. Gautier and P. Saudemon, Pharmaceutical Research, 15(8) (1998) 1310-1313 22 C. Giaginis and A. Tsantili-Kakoulidou, Journal of Liquid Chromatography & Related Technology, 31 (2008) 79–96 23 C. M. Y. Du, K. Valko, C. Bevan, D. Reynolds, and M. H. Abraham, Analytical Chemistry, 70 (1998) 4228-4234 24 A.J. P. Martin, R.L.M. Synge, Biochemical Journal, 35 (1941) 1358-1368 25 G. Cimpan, F. Irimie, S. Gocan, H. A. Claessens, Journal of Chromatography B, 714 (1998) 247–261 26 M. L., Bieganovska, A. Doraczynska and A. Petruczynska, Journal of Planar Chromatography-Modern TLC, 8(2) (1995) 122-128 27 C. Du, K Valkó, C. Bevan and D. Reynolds, Analytical Chemistry, 70(20) (1998) 4228- 4234 Докторска дисертација Сандра Шеган 90 28 G. L. Biagi, A. M. Barbaro, M. C. Guerra, P. A. Borea, and M. Recanatini, Journal of Chromatography, 504 (1990) 163-178 29 G. L. Biagi, A. M. Barbaro, A. Sapone and M. Recanatini, Journal of Chromatography A, 662 (1994) 341-361 30 G. L. Biagi, A. M. Barbaro, A. Sapone and M. Recanatini, Journal of Chromatography A, 669(1-2) (1994) 246-253 31 G. L. Biagi, A. M. Barbaro, and M. Recanatini, Journal of Chromatography A 678 (1994) 127-137 32 M. Kuchar, E. Kraus and M. Jelinkova, Journal of Chromatography, 557 (1991) 399-411 33 T. Cserhati, Journal of Liquid Chromatography, 16 (1993) 1805-1817 34 A. Niewiadomya, A. Zabinska, J. Matysiak, J. K. Rózyło, Journal of Chromatography A, 791 (1997) 237–243 35 A. Nasal, D. Siluk R. Kaliszan, Current Medicinal Chemistry, 10 (2003) 381-426; [34] A. Detroyer, V. Schoonjans, F. Questier, Y. Vander Heyden, A. P. Borosy, Q. Guo, D. L. Massart, Journal of Chromatography A, 897 (2000) 23-36 36 C. Sarbu Dorina Casoni, M. Darabantu, Carmen Maiereanu, , Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 35 (2004) 213–219 37 D. Casoni, A. Kotwasik, J. Namiesnik, C. Sarbu, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 2456–2465 38 H. Zhu, A. Sedykh, S. K. Chakravarti, G. Klopman, Current Computer-Aided Drug Design, 1 (2005) 3-9 39 M. Stefaniak, A. Niestrij, J. Klupsch, J. Sliviok, A. Pyka, Chromatographia, 62 (2005) 87- 89 Докторска дисертација Сандра Шеган 91 40 D. Lu, P. Chambers, P. Wipf, X-Q Xie, D. Englert, S. Weber, Journal of Chromatography A, 1258 (2012) 161– 167 41 S. K. Poole, C. F. Poole, Journal of Chromatography B, 797 (2003) 3-19 42 C. Stella, A. Galland, X. Liu, B. Testa, S. Rudaz, J. -L. Veuthey, P. -A. Carrupt, Journal of Separation Science, 28 (2005) 2350-2362 43 F. Lombardo, M. Y. Shalaeva, K. A. Tupper, and F. GaoJournal of Medicinal Chemistry, 44 (2001) 2490-2497 44 M. Vitha, P. W. Carr, Journal of chromatography A, 1126 (2006) 143-194 45 P. C. Sadek, P. W. Carr, R. M. Doherty, M. J. Kamlet, R. W. Taft, M. H. Abraham, Analitical Chemistry, 57 (1985) 2971-2978 46 R. Todeschini and V. Consonni, Handbook of Molecular Descriptors Wiley-VCH, 2000 47 T. Puzyn, J. Leszczynski, M. T. D. Cronin, Recent Advances in QSAR Studies Methods and Applications, Springer Science+Business Media B. V. 2010 48 K. Bodziocha, A. Duranda, R. Kaliszan, T. Baczek, Y. Vander HeydenTalanta 81 (2010) 1711–1718 49 A. R. Katritzky, M. Kuanar, S. Slavov, and C. D. Hall, Chemical Review, 110 (2010) 5714–5789 50 I. -G. Chong, C. -H. Jun, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 78 (2005) 103–112 51 M. M. Natić, Hemometrijski pristup proučavanju retencionog ponašanja diastereomernih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina, Doktorska disertacija, Hemijski fakultet, Beograd, 2008 52 M. Otto, Chemometrics, Statistical and Computer Application in Analytical Chemistry, Wiley-VCH, 1999 Докторска дисертација Сандра Шеган 92 53 R. G. Brereton, Chemometrics, Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant, Jhon Wiley & Sons Ltd. , Chichester, England 2003 54 M. Goodarzi, R. Jensen, Y. V. Heydena, Journal of Chromatography B, 910 (2012) 84–94 55 J. Đ. Trifković, Određivanje kvantitativnog odnosa strukture i retencije arilpiperazina primenom tečne hromatografije i multivarijantnih hemometrijskih metoda, Doktorska disertacija, Hemijski fakultet, Beograd 2013 56 Y. Polakova, A. R. Katritzky, M. Kuanar, S. Slavov, and C. D. Hall, Chemical Review, 110 (2010) 5714–5789 57 J. C. Drosos, M. Viola-Rhenals, R. Vivas-Reyesa, Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 4411–4421 58 A. G. Fragkakia, A. Tsantili-Kakoulidou, Y. S. Angelis, M. Koupparis, C. Georgakopoulos, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 8404–8420 59 T. Le, V. C. Epa, F. R. Burden, and D. A. Winkler, Chemical Review, 112 (2012) 2889– 2919 60 J. A. Westerhuis, H. C. J. Hoefsloot, S. Smit, D. J. Vis, A. K. Smilde, E. J. J. van Velzen, J. P. M. van Duijnhoven, F. A. van Dorsten Metabolomics, 4 (2008) 81–89 61 M. Goodarzi, R. Jensen, Y. Vander Heydena, Journal of Chromatography B, 910 (2012) 84– 94 62 K. Baumann, Trends in Analytical Chemistry, 22 (2003) 395-406 63 K. Baumann, Journal of Computet-Aided Molecular Design, 18 (2004) 549-562 64 R. Kiralj and M. M. C. Ferreira, Journal of Brazilian Chemical Society, 20(4), (2009) 770- 787 65 S. D. Bolboaca, C. L. Jantschi, Environment Chemical Letter, 6 (2008) 175–181 Докторска дисертација Сандра Шеган 93 66 J. Li, J. Sun, Z. He, Journal of Chromatography A, 1140 (2007) 174–179 67 R. P. Verma and C. Hansch, Chemical Review, 109 (2009) 213–235 68 X.-X. Zhu and M. Nichifor, Accounts of Chemical Research, 35(7) (2002) 539-546 69 D. M. Opsenica, Steroidni tetraoksani: sinteza i biološka aktivnost, Doktorska disertacija, Hemijski fakultet, Beograd, 2002. 70 D. Opsenica, G. Pocsfalvi, Z. Juranić, B. Tinant, J. -P. Declercq, D. E. Kyle, W. K. Milhous, B. A. Šolaja, Journal of Medicinal Chemistry, 43 (2000) 3274-3282 71 B. A. Šolaja, N. Terzić, G. Pocsfalvi, L. Gerena, B. Tinant, D. Opsenica, and W. K. Milhous, Journal of Medicinal Chemistry, 45 (2002) 3331-3336 72 N. Terzić, D. Opsenica, D. Milić, B. Tinant, K. S. Smith, W. K. Milhous, and B. A. Šolaja, , Journal of Medicinal Chemistry, 50 (2007) 5118-5127 73 D. M. Opsenica, N. Terzić, P. L. Smith, Y. Yang, L. Anova, K. S. Smith, B. A. Šolaja, Bioorganic & Medicinal Chemistry 16 (2008) 7039–7045 74 A. K. Bhattacharjee, K. A. Carvalho, D. Opsenica and B. A. Šolaja, Journal of Serbian Chemical Society, 70(3) (2005) 329–345 75 S. B. Gaica, D. M. Opsenica, B. A. Šolaja, Ž. Lj. Tešić and D. M. Milojković-Opsenica, Journal of Planar Chromatography, 17 (2004) 342-349 76 S. B. Gaica, D. M. Opsenica, B. A. Šolaja, and D. M. Milojković-Opsenica, Journal of Planar Chromatography, 22 (2009) 175-181 77 B. Natalini, R. Sardella, E. Camaioni, S. Natalini, R. Pellicciari, Chromatographia 64 (2006) 343–349 78 A.Niewiadomy, A. Źabiñska, J. Matysiak, J. Róźylo, Journal of Chromatography A 791 (1997) 237–243 Докторска дисертација Сандра Шеган 94 79 L. G. Biagi, A. M. Barbaro, A. Sapone, and M. Recanatini, Journal of Chromatography A 662 (1994) 341-361 80 D. Opsenica, G. Angelovski, G. Pocsfalvi, Z. Juranić ,Ž. Žižak, D. Kyle, W.K. Milhouse and B. A. Šolaja, Bioorganic & Medicinal Chemistry 11 (2003) 2761‒2768 81 I. N. Cvijetić, Ž. P. Žižak, T. P. Stanojković, Z. D. Juranić, N. Terzić, I. M. Opsenica, D. M. Opsenica, I. O. Juranić, B. J. Drakulić, European Journal of Medicinal Chemistry 45 (2010) 4570–4577  Докторска дисертација Сандра Шеган ПРИЛОГ Таблица П1. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података бис-стероидних тетраоксана добијених за систем CN силика-гел/Метанол-вода Јед. RM0 -b -r SD P N C0 PC1 1 4,939 0,057 0,997 0,041 2,058E-4 5 85,892 2,277 2 5,834 0,067 0,992 0,066 9,106E-4 5 87,082 3,673 3 3,248 0,042 0,990 0,054 0,001 5 76,967 -3,078 4 3,811 0,047 0,995 0,042 3,950E-4 5 80,397 -1,386 5 4,341 0,054 0,997 0,038 1,972E-4 5 79,648 -2,058 6 4,612 0,056 0,992 0,066 9,106E-4 5 82,364 -0,281 7 3,485 0,044 0,996 0,036 2,956E-4 5 78,853 -2,180 8 4,124 0,051 0,998 0,032 1,414E-4 5 81,187 -1,022 9 3,861 0,049 0,987 0,071 0,002 5 78,800 -2,428 10 4,155 0,051 0,982 0,088 0,003 5 81,478 -0,833 11 6,004 0,071 0,985 0,115 0,002 5 84,320 1,488 12 6,257 0,073 0,989 0,099 0,001 5 85,599 2,660 13 3,248 0,042 0,990 0,054 0,001 5 76,967 0,981 14 5,200 0,060 0,986 0,094 0,002 5 85,675 2,187 Таблица П2. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података бис-стероидних тетраоксана добијених за систем CN силика-гел/Ацетон-вода Јед. RM0 -b -r SD P N C0 PC1 1 4,408 0,059 0,958 0,162 0,011 5 74,330 2,296 2 4,582 0,061 0,954 0,174 0,012 5 75,116 3,030 3 2,996 0,046 0,926 0,169 0,024 5 65,704 -2,595 4 3,462 0,051 0,949 0,155 0,014 5 67,757 -2,221 5 4,209 0,059 0,951 0,175 0,013 5 71,096 -0,731 6 4,329 0,060 0,954 0,174 0,012 5 71,672 -0,277 7 3,559 0,052 0,947 0,161 0,014 5 68,568 -1,718 8 3,817 0,055 0,954 0,157 0,012 5 69,532 -1,395 9 3,707 0,054 0,964 0,137 0,008 5 68,397 -2,395 10 3,756 0,054 0,950 0,162 0,013 5 69,299 -2,028 11 4,494 0,060 0,982 0,105 0,003 5 74,777 2,542 12 5,035 0,070 0,986 0,107 0,002 5 72,339 2,866 13 4,063 0,056 0,978 0,108 0,004 5 72,680 1,112 14 4,193 0,057 0,974 0,122 0,005 5 73,169 1,514  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П3. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података бис-стероидних тетраоксана добијених за систем RP-18/Метанол-вода Јед. RM0 -b -r SD P N C0 PC1 1 11,852 0,121 0,994 0,068 <0,0001 8 97,709 1,795 2 12,544 0,127 0,993 0,080 <0,0001 8 98,774 2,995 3 6,922 0,076 0,997 0,031 <0,0001 8 91,434 -2,973 4 7,636 0,081 0,980 0,088 <0,0001 8 93,691 -1,683 5 8,842 0,094 0,998 0,030 <0,0001 8 94,365 -1,300 6 10,188 0,106 0,996 0,047 <0,0001 8 96,386 0,321 7 6,623 0,074 0,991 0,051 <0,0001 8 89,496 -4,063 8 7,541 0,082 0,998 0,051 <0,0001 8 92,301 -2,527 9 7,035 0,077 0,994 0,043 <0,0001 8 91,014 -3,260 10 8,639 0,092 0,997 0,038 <0,0001 8 94,205 -1,401 11 14,450 0,148 0,983 0,130 <0,0001 7 97,831 3,054 12 16,092 0,162 0,986 0,128 <0,0001 7 99,090 4,497 13 10,245 0,104 0,994 0,058 <0,0001 8 98,137 1,685 14 11,323 0,114 0,993 0,069 <0,0001 8 99,147 2,862 Таблица П4. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података бис-стероидних тетраоксана добијених за систем RP-18/Ацетон-вода Јед. RM0 -b -r SD P N C0 PC1 1 7,908 0,090 0,997 0,069 <0,0001 6 88,771 2,354 2 7,829 0,089 0,996 0,078 <0,0001 6 88,163 2,493 3 4,425 0,0576 0,997 0,045 <0,0001 6 76,817 -3,090 4 4,859 0,062 0,997 0,050 <0,0001 6 78,499 -2,609 5 5,972 0,072 0,998 0,042 <0,0001 6 82,482 -0,943 6 6,375 0,076 0,999 0,022 <0,0001 6 83,775 -0,337 7 5,608 0,070 0,998 0,046 <0,0001 6 80,351 -2,053 8 6,041 0,074 0,997 0,064 <0,0001 6 81,752 -1,414 9 4,417 0,057 0,997 0,042 <0,0001 6 78,039 -2,502 10 5,146 0,064 0,998 0,041 <0,0001 6 79,789 -2,101 11 8,276 0,093 0,994 0,095 5,95E-4 5 88,992 3,284 12 9,196 0,1028 0,999 0,026 <0,0001 5 89,459 3,781 13 6,953 0,080 0,999 0,032 <0,0001 6 86,908 1,559 14 6,970 0,080 0,999 0,021 <0,0001 6 86,905 1,577  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П5. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података бис - стероидних тетраоксана добијених за систем RP-18 / Диоксан - вода Jед. RM0 -b -r SD P N C0 PC1 1 8,125 0,098 0,999 0,037 <0,0001 5 82,913 3,350 2 8,014 0,096 0,999 0,033 <0,0001 5 83,130 3,469 3 3,548 0,052 0,996 0,049 <0,0001 6 67,714 -3,181 4 3,970 0,057 0,995 0,058 <0,0001 6 69,534 -2,915 5 4,876 0,066 0,994 0,075 <0,0001 6 73,651 -1,644 6 5,081 0,068 0,998 0,049 <0,0001 6 74,748 -1,237 7 6,047 0,079 0,999 0,038 <0,0001 6 76,252 -0,963 8 6,602 0,085 0,999 0,044 <0,0001 6 77,491 -0,358 9 4,093 0,058 0,992 0,077 <0,0001 6 70,806 -2,371 10 4,227 0,059 0,997 0,044 <0,0001 6 72,142 -1,896 11 8,050 0,098 0,999 0,027 <0,0001 5 82,225 2,693 12 7,997 0,097 0,998 0,048 <0,0001 6 82,700 3,208 13 6,793 0,085 0,998 0,048 <0,0001 6 79,549 0,941 14 6,915 0,087 0,998 0,055 <0,0001 6 79,574 0,904 Таблица П6. Израчунате logP вредности бис-стероидних тетраоксана Једињење milogP logKоw 1 9,36 12,74 2 9,36 12,74 3 8,29 8,60 4 8,29 8,60 5 8,96 9,21 6 8,96 9,21 7 8,64 9,63 8 8,64 9,63 9 5,16 9,52 10 5,16 9,52 11 9,94 15,62 12 9,94 15,62 13 9,57 12,84 14 9,57 12,84  Докторска дисертација Сандра Шеган V I1 28 ,4 27 28 ,4 27 27 ,7 80 27 ,7 80 30 ,8 24 30 ,8 24 27 ,6 50 27 ,6 50 30 ,7 50 30 ,7 50 33 ,7 43 33 ,7 43 32 ,9 15 32 ,9 15 V I2 26 ,2 68 26 ,2 68 26 ,0 48 26 ,0 48 27 ,8 15 27 ,8 15 25 ,9 03 25 ,9 03 27 ,8 21 27 ,8 21 29 ,8 77 29 ,8 77 29 ,9 98 29 ,9 98 V I3 22 ,9 89 22 ,9 89 22 ,6 19 22 ,6 19 23 ,7 24 23 ,7 24 22 ,5 54 22 ,5 54 23 ,8 95 23 ,8 95 25 ,2 33 25 ,2 33 25 ,9 71 25 ,9 71 K I2 22 ,3 92 22 ,3 92 21 ,2 34 21 ,2 34 24 ,7 69 24 ,7 69 21 ,2 34 21 ,2 34 26 ,4 49 26 ,4 49 27 ,6 78 27 ,6 78 25 ,0 00 25 ,0 00 W I 13 05 50 13 03 41 12 89 02 12 04 99 16 91 88 16 68 39 11 56 17 11 53 52 16 90 01 17 19 01 21 34 84 21 72 94 18 23 68 18 83 42 Po l 10 7, 12 0 10 7, 12 0 10 4, 88 0 10 4, 88 0 11 5, 89 0 11 5, 89 0 10 3, 45 0 10 3, 45 0 11 7, 34 0 11 7, 34 0 12 6, 90 0 12 6, 90 0 12 1, 68 0 12 1, 68 0 R ef 26 7, 31 0 26 7, 31 0 26 1, 42 0 26 1, 42 0 28 9, 76 0 28 9, 76 0 25 7, 78 0 25 7, 78 0 29 2, 92 0 29 2, 92 0 31 8, 10 0 31 8, 10 0 30 5, 29 0 30 5, 29 0 V ol 26 62 26 62 25 65 25 65 28 99 28 99 25 45 25 45 29 55 29 55 31 30 31 30 29 74 29 74 SG 13 33 13 33 12 70 12 70 14 61 14 61 12 69 12 69 15 00 15 00 15 37 15 37 14 75 14 75 H O M O -1 0, 40 6 -1 0, 39 6 -1 0, 42 2 -1 0, 39 9 -9 ,9 15 -9 ,9 36 -1 0, 41 9 -1 0, 41 5 -1 0, 31 5 -1 0, 35 1 -9 ,4 99 -9 ,5 08 -9 ,4 64 -9 ,5 53 LU M O 1, 02 1 0, 99 7 0, 99 9 1, 00 7 1, 01 0 1, 00 2 0, 97 3 0, 95 7 0, 97 2 0, 82 3 0, 99 3 1, 08 4 0, 97 9 1, 14 5 Т аб ли ца П 7. М ол ек ул ск и де ск ри пт ор и би с- ст ер ои дн их т ет ра ок са на Је ди њ ењ е 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14  Докторска дисертација Сандра Шеган H B 8, 05 3 8, 05 3 8, 77 5 8, 77 5 7, 49 9 7, 49 9 8, 82 0 8, 82 0 8, 46 5 8, 46 5 7, 35 5 7, 35 5 7, 62 4 7, 62 4 % H S 27 ,4 11 27 ,4 12 31 ,1 73 31 ,1 67 29 ,6 11 29 ,6 12 30 ,6 92 30 ,6 87 34 ,2 42 34 ,2 37 28 ,3 52 28 ,3 48 30 ,3 49 30 ,3 08 H B A cc 2, 20 0 2, 20 0 3, 06 0 3, 06 0 2, 66 0 2, 66 0 2, 81 0 2, 81 0 3, 24 0 3, 24 0 2, 24 0 2, 24 0 2, 24 0 2, 24 0 H B D 0, 00 0 0, 00 0 0, 98 0 0, 98 0 0, 51 0 0, 51 0 0, 79 0 0, 79 0 0, 52 0 0, 52 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 0, 00 0 D M 2, 39 0 1, 55 0 9, 63 0 0, 31 7 5, 71 0 1, 83 0 2, 13 0 2, 87 0 4, 24 0 10 ,7 00 5, 50 0 10 ,4 00 4, 15 0 6, 13 0 C I0 14 1, 50 1 14 1, 50 1 13 8, 08 6 13 8, 08 6 15 4, 32 9 15 4, 32 9 13 6, 08 6 13 6, 08 6 15 3, 48 4 15 3, 48 4 17 0, 89 8 17 0, 89 8 16 0, 31 2 16 0, 31 2 C I1 34 ,8 62 34 ,8 62 33 ,7 86 33 ,7 86 36 ,8 62 36 ,8 62 33 ,7 86 33 ,7 86 38 ,6 50 38 ,6 50 39 ,7 60 39 ,7 60 38 ,9 31 38 ,9 31 C I2 35 ,0 05 35 ,0 05 34 ,7 66 34 ,7 66 36 ,4 73 36 ,4 73 34 ,7 66 34 ,7 66 38 ,3 70 38 ,3 70 38 ,6 08 38 ,6 08 38 ,7 29 38 ,7 29 C I3 29 ,4 66 29 ,4 66 28 ,2 41 28 ,2 41 30 ,1 73 30 ,1 73 28 ,2 41 28 ,2 41 31 ,7 70 31 ,7 70 32 ,2 45 32 ,2 45 32 ,9 06 32 ,9 06 V I0 13 4, 49 7 13 4, 49 7 13 0, 83 6 13 0, 83 6 14 7, 50 9 14 7, 50 9 12 8, 57 5 12 8, 57 5 14 4, 72 8 14 4, 72 8 16 4, 23 2 16 4, 23 2 15 3, 64 6 15 3, 64 6 Т аб ли ца П 7. М ол ек ул ск и де ск ри пт ор и би с- ст ер ои дн их т ет ра ок са на (н ас та ва к) Је ди њ ењ е 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14  Докторска дисертација Сандра Шеган M W e 10 41 ,3 27 10 41 ,3 27 10 11 ,3 04 10 11 ,3 04 10 95 ,4 66 10 95 ,4 66 10 13 ,2 73 10 13 ,2 73 11 55 ,4 32 11 55 ,4 32 11 79 ,6 28 11 79 ,6 28 11 47 ,5 42 11 47 ,5 42 M V 58 7, 33 7 58 9, 29 7 57 2, 21 9 57 1, 84 1 63 2, 43 9 63 2, 40 7 56 8, 32 0 56 8, 39 4 64 6, 90 6 64 7, 26 4 69 3, 15 9 69 3, 56 8 65 9, 92 7 66 0, 14 9 SA 75 ,6 20 75 ,6 14 73 ,2 97 73 ,2 51 81 ,5 02 81 ,4 97 72 ,7 31 72 ,7 37 83 ,4 57 83 ,5 00 89 ,7 67 89 ,8 19 83 ,9 61 83 ,9 80 M L 32 ,6 96 29 ,7 73 32 ,5 43 27 ,7 83 36 ,4 17 34 ,3 43 30 ,1 39 27 ,4 37 37 ,9 47 32 ,8 12 36 ,2 85 32 ,4 39 32 ,7 18 31 ,9 88 M W 12 ,5 37 13 ,7 34 12 ,7 93 12 ,8 42 12 ,5 66 14 ,0 41 13 ,0 57 12 ,9 22 13 ,5 14 18 ,7 25 13 ,4 13 18 ,6 16 13 ,4 67 16 ,5 38 lo gP 13 ,9 24 13 ,9 24 11 ,1 72 11 ,1 72 13 ,6 00 13 ,6 00 13 ,1 72 13 ,1 72 9, 98 1 9, 98 1 15 ,7 08 15 ,7 08 13 ,8 62 13 ,8 62 M D 11 ,9 37 12 ,4 51 10 ,9 44 12 ,0 98 11 ,8 92 12 ,7 88 11 ,5 45 11 ,9 30 12 ,1 14 11 ,2 05 11 ,8 47 16 ,3 29 11 ,7 23 12 ,8 91 H LB 4, 84 5 4, 84 5 5, 71 0 5, 70 8 5, 35 1 5, 35 1 5, 59 9 5, 59 8 6, 41 6 6, 41 5 5, 06 1 5, 06 0 5, 52 0 5, 51 1 SP 20 ,4 99 20 ,4 99 21 ,0 71 21 ,0 71 20 ,2 32 20 ,2 32 21 ,5 14 21 ,5 14 20 ,9 47 20 ,9 47 19 ,8 84 19 ,8 84 20 ,5 08 20 ,5 08 D 18 ,7 71 18 ,7 71 19 ,0 08 19 ,0 08 18 ,6 95 18 ,6 95 19 ,5 40 19 ,5 40 19 ,0 51 19 ,0 51 18 ,3 63 18 ,3 63 18 ,9 14 18 ,9 14 Т аб ли ца П 7. М ол ек ул ск и де ск ри пт ор и би с- ст ер ои дн их т ет ра ок са на (н ас та ва к) Је ди њ ењ е 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14  Докторска дисертација Сандра Шеган D 1, 00 0 -0 ,0 54 0, 83 4 0, 52 2 0, 54 9 0, 64 1 -0 ,2 81 -0 ,7 39 -0 ,5 97 -0 ,4 73 -0 ,5 30 -0 ,7 55 -0 ,6 71 -0 ,6 05 -0 ,5 36 -0 ,6 52 -0 ,7 28 -0 ,6 94 -0 ,6 95 -0 ,6 94 -0 ,6 49 -0 ,6 32 -0 ,3 76 SP 1, 00 0 0, 96 6 0, 07 2 0, 94 6 0, 56 4 0, 66 0 0, 74 0 -0 ,2 34 -0 ,8 09 -0 ,6 71 -0 ,5 49 -0 ,6 21 -0 ,8 27 -0 ,7 62 -0 ,7 05 -0 ,6 47 -0 ,6 99 -0 ,7 88 -0 ,7 67 -0 ,7 69 -0 ,7 64 -0 ,7 25 -0 ,7 48 -0 ,4 21 H LB 1, 00 0 0, 56 4 0, 52 2 0, 42 6 0, 53 1 1, 00 0 0, 86 1 0, 55 4 0, 26 9 -0 ,1 23 0, 09 8 0, 22 4 0, 08 0 -0 ,1 68 -0 ,0 94 -0 ,0 78 -0 ,0 84 0, 09 4 -0 ,0 72 -0 ,0 45 -0 ,0 53 0, 00 2 0, 07 9 -0 ,3 04 -0 ,5 41 M D 1, 00 0 -0 ,3 77 -0 ,5 37 -0 ,5 13 -0 ,0 87 -0 ,5 13 -0 ,3 77 -0 ,4 34 -0 ,4 34 0, 22 4 0, 52 2 0, 41 0 0, 34 1 0, 35 5 0, 53 4 0, 48 6 0, 45 1 0, 40 1 0, 43 8 0, 51 3 0, 48 4 0, 48 5 0, 46 1 0, 40 6 0, 48 9 0, 56 6 lo gP 1, 00 0 0, 52 7 -0 ,8 65 -0 ,6 54 -0 ,5 38 -0 ,3 84 -0 ,7 20 -0 ,8 65 -0 ,9 02 -0 ,6 64 -0 ,0 79 0, 47 2 0, 26 1 0, 15 9 0, 25 6 0, 51 1 0, 46 3 0, 45 3 0, 43 9 0, 23 9 0, 42 0 0, 40 2 0, 41 0 0, 34 1 0, 25 0 0, 65 3 0, 56 3 M W 1, 00 0 0, 02 4 0, 55 3 0, 20 5 -0 ,2 76 -0 ,2 63 0, 11 4 -0 ,2 75 0, 20 5 -0 ,0 41 -0 ,3 24 0, 68 0 0, 53 5 0, 60 4 0, 61 4 0, 58 1 0, 51 6 0, 53 2 0, 51 4 0, 49 0 0, 59 9 0, 57 4 0, 55 9 0, 55 6 0, 56 9 0, 56 8 0, 34 6 -0 ,0 12 M L 1, 00 0 0, 03 3 0, 01 1 -0 ,0 07 0, 14 0 -0 ,5 42 -0 ,5 17 -0 ,0 01 -0 ,5 24 0, 14 0 0, 00 5 -0 ,2 95 0, 32 4 0, 60 9 0, 64 3 0, 59 0 0, 56 0 0, 59 2 0, 56 9 0, 50 0 0, 42 6 0, 70 7 0, 62 6 0, 62 0 0, 61 4 0, 68 2 0, 72 7 0, 38 9 -0 ,0 05 SA 1, 00 0 0, 65 3 0, 57 8 0, 37 6 0, 49 3 -0 ,0 28 -0 ,7 67 -0 ,7 07 0, 10 2 -0 ,7 85 -0 ,0 28 -0 ,3 41 -0 ,6 37 0, 50 5 0, 98 9 0, 97 8 0, 93 5 0, 91 6 0, 98 0 0, 97 0 0, 92 8 0, 86 4 0, 98 0 0, 99 1 0, 99 2 0, 99 0 0, 99 5 0, 97 4 0, 82 5 0, 16 9 M V 1, 00 0 0, 99 7 0, 63 4 0, 57 9 0, 37 8 0, 48 3 -0 ,0 21 -0 ,7 55 -0 ,6 86 0, 12 7 -0 ,7 90 -0 ,0 21 -0 ,3 59 -0 ,6 49 0, 49 8 0, 99 1 0, 98 5 0, 95 0 0, 93 8 0, 98 3 0, 98 3 0, 95 1 0, 89 8 0, 96 9 0, 99 2 0, 99 8 0, 99 7 0, 99 5 0, 97 1 0, 85 0 0, 19 2 M W e 1, 00 0 0, 98 0 0, 97 7 0, 65 3 0, 61 6 0, 22 6 0, 40 3 0, 13 2 -0 ,6 50 -0 ,5 84 0, 12 2 -0 ,6 90 0, 13 2 -0 ,2 45 -0 ,6 16 0, 51 4 0, 94 5 0, 99 8 0, 98 2 0, 96 1 0, 92 8 0, 94 5 0, 91 4 0, 87 1 0, 97 8 0, 95 4 0, 96 9 0, 96 7 0, 98 2 0, 97 9 0, 75 8 0, 07 7 Т аб ли ца П 8, К ор ел ац ио на м ат ри ца м ол ек ул ск их де ск ри пт ор а би с- ст ер ои дн их те тр ао кс ан а M W e M V SA M L M W lo gP M D H LB SP D P H B % H S H B A cc H B D D M C I0 C I1 C I2 C I3 V I0 V I1 V I2 V I3 K I2 W I Po l R ef V ol SG H O M O LU M O  Докторска дисертација Сандра Шеган V I0 1, 00 0 0, 98 8 0, 95 8 0, 90 1 0, 92 3 0, 99 2 0, 99 0 0, 99 0 0, 97 2 0, 92 9 0, 91 4 0, 30 4 C I3 1, 00 0 0, 89 1 0, 93 9 0, 94 3 0, 94 6 0, 88 9 0, 90 6 0, 93 8 0, 93 9 0, 93 0 0, 92 1 0, 79 6 0. 17 5 C I2 1, 00 0 0, 97 7 0, 89 1 0, 93 5 0, 93 0 0, 90 9 0, 92 5 0, 92 1 0, 94 6 0, 94 5 0, 94 4 0, 93 7 0, 76 7 0. 08 9 C I1 1, 00 0 0, 98 4 0, 97 2 0, 94 1 0, 96 2 0, 93 7 0, 90 0 0, 96 8 0, 96 2 0, 97 9 0, 97 7 0, 98 5 0, 97 7 0, 79 4 0. 12 0 C I0 1, 00 0 0, 95 5 0, 90 9 0, 90 2 0, 99 9 0, 98 8 0, 95 6 0, 89 7 0, 94 1 0, 99 6 0, 99 5 0, 99 5 0, 98 2 0, 94 4 0, 89 6 0. 26 9 D M 1, 00 0 0, 47 4 0, 50 0 0, 51 3 0, 44 1 0, 45 6 0, 45 0 0, 42 9 0, 37 8 0, 52 1 0, 53 9 0, 48 7 0, 48 3 0, 48 7 0, 47 2 0, 29 6 -0 .0 89 H B D 1, 00 0 -0 ,0 99 -0 ,6 58 -0 ,6 39 -0 ,5 69 -0 ,7 13 -0 ,6 71 -0 ,6 78 -0 ,6 72 -0 ,7 12 -0 ,5 68 -0 ,6 29 -0 ,6 52 -0 ,6 57 -0 ,6 35 -0 ,6 02 -0 ,6 45 -0 .3 78 H B A cc 1, 00 0 0, 84 9 0, 12 4 -0 ,4 28 -0 ,2 88 -0 ,2 05 -0 ,3 68 -0 ,4 66 -0 ,4 53 -0 ,4 72 -0 ,5 19 -0 ,2 02 -0 ,3 80 -0 ,3 85 -0 ,3 96 -0 ,3 24 -0 ,2 47 -0 ,6 15 -0 .5 95 % H S 1, 00 0 0, 86 1 0, 55 4 0, 26 9 -0 ,1 23 0, 09 9 0, 22 4 0, 08 0 -0 ,1 68 -0 ,0 94 -0 ,0 78 -0 ,0 84 0, 09 4 -0 ,0 72 -0 ,0 45 -0 ,0 53 0, 00 2 0, 07 9 -0 ,3 04 -0 .5 41 H B 1, 00 0 0, 53 1 0, 71 9 0, 77 3 -0 ,1 79 -0 ,8 39 -0 ,7 21 -0 ,6 21 -0 ,6 99 -0 ,8 60 -0 ,8 31 -0 ,7 98 -0 ,7 60 -0 ,7 01 -0 ,8 12 -0 ,8 08 -0 ,8 13 -0 ,7 97 -0 ,7 63 -0 ,8 59 -0 .4 59 Та бл иц а П 8, К ор ел ац ио на м ат ри ца м ол ек ул ск их д ес кр ип то ра б ис -с те ро ид ни х те тр ао кс ан а (н ас та ва к) P 1, 00 0 0, 14 1 0, 42 6 0, 34 5 0, 31 9 0, 34 2 0, 13 2 0, 13 4 0, 22 9 0, 15 2 0, 12 8 0, 16 2 0, 22 9 0, 23 6 0, 05 0 0, 16 7 0, 16 0 0, 16 1 0, 09 3 0, 04 3 0, 18 9 0. 12 1  Докторска дисертација Сандра Шеган LU M O 1, 00 0 H O M O 1, 00 0 0, 48 6 SG 1, 00 0 0, 74 7 0, 07 6 V ol 1, 00 0 0, 98 9 0, 81 9 0, 15 6 R ef 1, 00 0 0, 98 8 0, 95 7 0, 88 8 0, 24 4 Po l 1, 00 0 1, 00 0 0, 99 0 0, 96 0 0, 88 1 0, 23 5 W I 1, 00 0 0, 99 5 0, 99 4 0, 98 4 0, 95 0 0, 87 4 0, 25 4 K I2 1, 00 0 0, 95 0 0, 95 2 0, 94 7 0, 98 1 0, 98 4 0, 70 3 0, 03 0 V I3 1, 00 0 0, 77 6 0, 89 0 0, 91 8 0, 92 3 0, 86 9 0, 82 3 0, 92 8 0, 37 1 V I2 1, 00 0 0, 98 5 0, 85 1 0, 95 1 0, 96 7 0, 97 1 0, 92 8 0, 88 3 0, 94 6 0, 34 2 Т аб ли ца П 8. К ор ел ац ио на м ат ри ца м ол ек ул ск их де ск ри пт ор а би с- ст ер ои дн их те тр ао кс ан а (н ас та ва к) V I1 1, 00 0 0, 98 9 0, 95 2 0, 91 0 0, 98 3 0, 99 3 0, 99 4 0, 96 9 0, 93 1 0, 92 8 0, 29 9  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П9. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П10. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу RМ0-f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П11. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П12. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу RМ 0- f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П13. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П14. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П15. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П16. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П17. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П18.а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П19. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П20. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0- f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П21. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П22. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П23. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П24. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Метанол – вода  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П25. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1- f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П26. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П27. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу C0 PC1 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П28. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли бис-стероидних тетраоксана у PLS моделу PC1 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П29. Минималне инхибиторне концентрације испитиваних бис-стероидних тетраоксана изражена као logC вредности Једињење Fem-X HeLa 1 1,462 1,462 2 1,290 1,312 3 0,491 0,568 4 0,792 0,778 5 1,362 1,519 6 1,973 2,220 7 0,623 0,716 8 0,881 0,964 9 2,033 2,000 10 0,669 0,565 11 1,681 2,021 12 1,929 2,000 13 1,903 1,954 14 2,009 2,079  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П30. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података мешовитих тетраоксана добијених за систем RP-18 / Метанол - вода Једињење RM0 SE b SE r SD P C0 PC1 1 4,510 1,229 -0,049 0,013 0,912 0,081 0,031 91,483 -2,349 2 6,192 0,515 -0,064 0,005 0,990 0,034 0,001 97,209 0,115 3 4,529 0,658 -0,048 0,007 0,971 0,043 0,006 93,772 -1,352 4 5,228 0,583 -0,055 0,006 0,982 0,038 0,003 95,398 -0,760 5 4,541 0,683 -0,048 0,007 0,968 0,045 0,007 95,408 -1,441 6 6,835 0,280 -0,069 0,003 0,997 0,019 0,000 98,776 1,125 7 5,592 0,479 -0,059 0,005 0,989 0,032 0,001 95,590 -0,706 8 4,057 1,398 -0,042 0,015 0,859 0,092 0,062 95,913 -0,432 9 5,458 0,241 -0,061 0,003 0,998 0,016 0,000 89,186 -0,530 10 7,383 0,700 -0,074 0,007 0,986 0,046 0,002 99,507 1,682 11 7,507 0,259 -0,073 0,003 0,997 0,017 0,000 102,270 -2,194 12 8,183 0,505 -0,083 0,005 0,994 0,033 0,001 99,184 1,715 13 8,384 0,658 -0,083 0,007 0,990 0,043 0,001 101,013 2,952 14 6,503 1,340 -0,067 0,014 0,941 0,088 0,017 97,199 4,190 15 8,172 0,653 -0,083 0,007 0,990 0,043 0,001 98,577 1,207 16 5,136 0,563 -0,054 0,006 0,983 0,037 0,003 94,941 -1,004 17 5,586 0,691 -0,058 0,007 0,978 0,046 0,004 95,644 -0,652 18 5,845 0,672 -0,052 0,007 0,987 0,035 0,002 112,180 -0,324 19 5,198 0,594 -0,054 0,006 0,981 0,039 0,003 96,445 -0,295 20 7,171 0,390 -0,073 0,004 0,995 0,026 0,000 98,497 1,020 21 5,229 0,448 -0,055 0,005 0,989 0,030 0,001 95,412 -0,725 22 5,095 0,606 -0,053 0,006 0,979 0,040 0,004 96,314 -0,324 23 4,057 1,398 -0,042 0,015 0,859 0,092 0,062 95,913 -0,011 24 5,874 0,241 -0,061 0,003 0,998 0,016 0,000 95,985 -3,792 25 7,383 0,700 -0,074 0,007 0,986 0,046 0,002 99,507 -1,287 26 3,366 0,278 -0,039 0,003 0,992 0,018 0,001 87,194 -3,364 27 3,713 0,447 -0,042 0,005 0,982 0,030 0,003 88,618 -3,035 28 4,150 0,566 -0,046 0,006 0,976 0,037 0,004 90,603 -2,555 29 3,971 0,545 -0,043 0,006 0,975 0,036 0,005 92,125 -1,838 30 3,716 0,659 -0,042 0,007 0,963 0,043 0,009 87,851 -3,381 31 4,267 0,717 -0,046 0,008 0,963 0,047 0,008 91,970 -2,040 32 3,060 0,464 -0,044 0,008 0,978 0,050 0,004 68,919 -0,554 33 6,142 0,207 -0,063 0,002 0,998 0,014 0,000 97,952 0,562 34 9,139 0,682 -0,089 0,007 0,991 0,045 0,001 102,223 4,190 35 6,414 0,552 -0,064 0,006 0,988 0,036 0,002 100,379 1,929 36 7,235 0,806 -0,072 0,008 0,980 0,053 0,003 101,046 2,520 37 3,877 0,513 -0,043 0,007 0,980 0,047 0,004 90,803 0,006 38 9,582 0,799 -0,094 0,008 0,989 0,053 0,002 101,830 4,133 39 7,624 0,303 -0,075 0,003 0,997 0,020 0,000 101,782 3,201 40 8,736 0,570 -0,085 0,006 0,993 0,038 0,001 102,892 4,390  Докторска дисертација Сандра Шеган Tаблица П31. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података мешовитих тетраоксана добијених за систем RP-18 / Ацетон - вода Једињење RM0 SE b SE r SD P C 0 PC1 1 5,198 1,052 -0,061 0,013 0,938 0,410 0,018 85,641 -0,248 2 5,598 0,743 -0,064 0,009 0,971 0,289 0,006 87,067 0,485 3 3,478 0,575 -0,043 0,007 0,961 0,224 0,009 81,447 -2,003 4 4,532 0,557 -0,054 0,007 0,977 0,217 0,004 84,082 -1,144 5 5,522 1,069 -0,066 0,013 0,946 0,416 0,015 83,294 -1,763 6 5,648 0,492 -0,064 0,006 0,987 0,192 0,002 88,519 1,356 7 4,044 0,468 -0,046 0,006 0,978 0,182 0,004 87,539 -0,956 8 5,663 0,726 -0,066 0,009 0,974 0,283 0,005 85,550 -0,378 9 4,044 0,372 -0,048 0,005 0,987 0,145 0,002 84,081 -1,070 10 6,447 0,490 -0,072 0,006 0,990 0,191 0,001 89,915 2,529 11 4,898 0,349 -0,057 0,004 0,992 0,136 0,001 86,690 0,203 12 6,519 0,495 -0,073 0,006 0,990 0,193 0,001 89,420 2,241 13 7,036 0,736 -0,077 0,009 0,980 0,287 0,003 91,258 3,600 14 5,065 0,587 -0,060 0,007 0,979 0,228 0,004 83,990 -1,231 15 6,275 0,656 -0,070 0,008 0,981 0,255 0,003 89,134 1,987 16 4,344 0,739 -0,052 0,009 0,957 0,288 0,011 83,533 -1,366 17 4,730 0,444 -0,048 0,006 0,981 0,173 0,003 97,727 -0,829 18 4,665 0,460 -0,055 0,006 0,985 0,179 0,002 84,360 -0,986 19 4,069 0,460 -0,055 0,006 0,985 0,179 0,002 73,584 -0,986 20 6,365 0,646 -0,071 0,008 0,982 0,252 0,003 89,150 1,997 21 5,962 0,591 -0,055 0,007 0,964 0,230 0,008 107,608 -1,344 22 4,852 0,717 -0,057 0,009 0,966 0,279 0,007 84,679 -0,856 23 5,558 0,807 -0,065 0,010 0,967 0,314 0,007 85,646 -0,323 24 3,493 0,361 -0,044 0,004 0,985 0,140 0,002 80,117 -2,572 25 4,865 0,783 -0,057 0,010 0,960 0,305 0,009 84,761 -0,874 26 2,093 0,296 -0,027 0,004 0,975 0,115 0,005 76,398 -2,690 27 3,593 0,486 -0,035 0,006 0,960 0,189 0,010 101,779 -2,990 28 3,444 0,674 -0,043 0,008 0,949 0,262 0,014 79,731 -2,670 29 3,394 0,451 -0,040 0,006 0,973 0,176 0,005 84,420 -1,516 30 2,805 0,524 -0,035 0,006 0,953 0,204 0,012 79,456 -2,326 31 5,748 0,952 -0,069 0,012 0,959 0,371 0,010 83,917 -1,474 32 3,128 0,899 -0,060 0,011 0,970 0,350 0,006 51,874 -0,098 33 4,934 0,087 -0,054 0,001 0,999 0,034 0,000 91,203 2,557 34 5,612 0,332 -0,059 0,004 0,993 0,129 0,001 94,481 0,815 35 5,667 1,085 -0,064 0,013 0,940 0,422 0,018 89,104 1,803 36 6,223 0,662 -0,070 0,008 0,980 0,258 0,003 89,412 2,095 37 4,665 0,630 -0,041 0,008 0,983 0,245 0,003 112,684 2,038 38 6,369 0,296 -0,069 0,004 0,996 0,115 0,000 91,905 3,751 39 6,475 0,473 -0,073 0,006 0,991 0,184 0,001 88,826 1,828 40 4,889 0,564 -0,055 0,007 0,983 0,220 0,003 88,893 3,410  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П32. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података мешовитих тетраоксана добијених за систем RP-18 / Диоксан - вода Једињење RM0 SE b SE SD r P C 0 PC1 1 5,448 0,246 -0,069 0,003 0,048 0,997 0,000 79,410 -0,625 2 6,519 0,460 -0,078 0,006 0,091 0,992 0,001 83,255 1,717 3 5,090 0,390 -0,065 0,005 0,077 0,992 0,001 78,308 -2,478 4 5,092 0,357 -0,065 0,004 0,070 0,993 0,001 77,975 -1,332 5 4,625 0,228 -0,061 0,003 0,045 0,997 0,000 76,198 -2,061 6 6,058 0,181 -0,072 0,002 0,036 0,999 0,000 84,028 2,125 7 4,917 0,357 -0,064 0,004 0,070 0,993 0,001 77,061 -1,760 8 5,172 0,332 -0,067 0,004 0,065 0,994 0,001 77,768 -0,446 9 6,015 0,588 -0,075 0,007 0,116 0,986 0,002 79,883 -1,451 10 7,194 0,222 -0,085 0,003 0,044 0,998 0,000 84,936 3,004 11 6,654 0,434 -0,080 0,005 0,085 0,993 0,001 82,973 1,580 12 6,461 0,351 -0,077 0,004 0,069 0,995 0,000 84,352 2,418 13 7,554 0,589 -0,088 0,007 0,116 0,990 0,001 85,939 3,808 14 5,382 1,000 -0,068 0,013 0,197 0,953 0,012 79,143 -0,788 15 6,857 0,457 -0,082 0,006 0,090 0,993 0,001 83,718 2,098 16 4,457 0,240 -0,058 0,003 0,047 0,996 0,000 76,586 -1,752 17 4,871 0,086 -0,063 0,001 0,017 1,000 0,000 77,068 -1,715 18 5,387 0,578 -0,067 0,006 0,124 0,983 0,000 80,282 -1,457 19 5,854 0,581 -0,072 0,007 0,114 0,985 0,002 81,535 0,635 20 6,673 0,361 -0,079 0,005 0,071 0,995 0,000 84,259 2,393 21 3,909 0,676 -0,051 0,008 0,133 0,961 0,009 76,792 -1,372 22 4,970 0,411 -0,064 0,005 0,081 0,991 0,001 77,661 -1,457 23 5,416 0,390 -0,068 0,005 0,077 0,993 0,001 79,406 -0,625 24 4,631 0,172 -0,061 0,002 0,034 0,998 0,000 76,544 -1,905 25 5,117 0,253 -0,064 0,003 0,050 0,996 0,000 80,589 0,165 26 3,703 0,213 -0,051 0,003 0,042 0,996 0,000 72,035 -3,424 27 3,593 0,055 -0,050 0,001 0,011 1,000 0,000 72,584 -3,007 28 4,362 0,209 -0,058 0,003 0,041 0,997 0,000 75,084 -2,467 29 4,043 0,174 -0,054 0,002 0,034 0,998 0,000 75,566 -2,007 30 3,543 0,238 -0,049 0,003 0,047 0,995 0,001 72,598 -2,952 31 4,966 0,125 -0,064 0,002 0,025 0,999 0,000 77,357 -1,580 32 3,227 0,554 -0,043 0,007 0,109 0,990 0,001 75,925 0,240 33 5,983 0,286 -0,072 0,004 0,056 0,996 0,000 82,746 1,362 34 6,643 0,523 -0,065 0,018 0,278 0,962 0,009 101,723 4,358 35 5,360 0,436 -0,067 0,005 0,086 0,990 0,001 79,522 -0,513 36 5,699 0,410 -0,070 0,005 0,081 0,992 0,001 81,643 0,702 37 5,386 0,641 -0,068 0,008 0,126 0,988 0,002 78,743 1,115 38 6,116 0,980 -0,107 0,007 0,390 0,929 0,023 57,267 3,902 39 6,220 0,958 -0,074 0,012 0,189 0,963 0,009 84,393 2,417 40 6,019 0,820 -0,070 0,010 0,161 0,970 0,006 85,738 3,135  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П33. Хроматографски дескриптори (RM0, b, C0 и PC1) изведени из ретенционих података мешовитих тетраоксана добијених за систем CN силика-гел / Ацетон – вода Једињење RM0 SE b SE SD r P C 0 PC1 1 4,027 0,229 0,055 0,003 0,995 0,102 0,000 73,487 -0,359 2 5,145 0,368 0,072 0,005 0,992 0,163 0,001 71,762 1,548 3 3,521 0,311 -0,051 0,004 0,989 0,138 0,001 69,305 -2,430 4 3,893 0,283 -0,055 0,004 0,992 0,126 0,001 71,040 -1,347 5 4,760 0,506 -0,066 0,007 0,983 0,224 0,003 71,789 -0,929 6 5,442 0,300 -0,071 0,004 0,995 0,133 0,000 76,223 1,875 7 3,950 0,346 -0,056 0,005 0,989 0,153 0,001 70,039 -1,907 8 3,973 0,329 -0,057 0,005 0,990 0,146 0,001 70,200 -1,820 9 4,545 0,350 -0,063 0,005 0,991 0,155 0,001 71,919 -0,829 10 5,560 0,299 -0,073 0,004 0,995 0,133 0,000 76,158 2,272 11 5,552 0,326 -0,073 0,005 0,994 0,144 0,001 75,952 2,016 12 5,689 0,212 -0,074 0,003 0,998 0,094 0,000 76,567 2,629 13 5,839 0,272 -0,076 0,004 0,996 0,121 0,000 77,339 3,341 14 4,180 0,260 -0,061 0,004 0,995 0,115 0,001 69,091 -1,854 15 5,525 0,205 -0,072 0,003 0,998 0,091 0,000 76,315 1,937 16 5,141 0,915 -0,072 0,013 0,955 0,405 0,011 71,898 -1,137 17 3,578 0,314 -0,052 0,004 0,989 0,139 0,001 69,333 -2,353 18 4,196 0,378 -0,059 0,005 0,988 0,168 0,002 70,997 -1,569 19 5,102 0,650 -0,068 0,009 0,974 0,288 0,005 75,034 0,809 20 5,260 0,613 -0,070 0,009 0,979 0,271 0,004 74,714 0,945 21 3,450 0,420 -0,050 0,006 0,980 0,186 0,003 69,142 -2,748 22 3,450 0,420 -0,050 0,006 0,980 0,186 0,003 69,142 -2,748 23 4,635 0,584 -0,064 0,008 0,976 0,259 0,004 72,758 -0,839 24 3,777 0,314 -0,053 0,004 0,990 0,139 0,001 71,672 -1,251 25 5,074 0,596 -0,067 0,008 0,978 0,264 0,004 75,386 0,843 26 3,339 0,142 -0,049 0,002 0,998 0,063 0,000 68,426 -2,435 27 3,549 0,256 -0,050 0,004 0,993 0,114 0,001 70,565 -1,677 28 4,775 0,464 -0,065 0,007 0,985 0,206 0,002 73,116 0,104 29 3,682 0,217 -0,051 0,003 0,995 0,096 0,001 71,768 -1,146 30 3,510 0,481 -0,048 0,007 0,972 0,213 0,006 72,510 -0,935 31 5,374 0,353 -0,071 0,005 0,993 0,156 0,001 75,797 1,585 32 5,778 0,171 -0,075 0,002 0,999 0,076 0,000 77,136 2,780 33 5,325 0,532 -0,071 0,007 0,984 0,235 0,003 75,215 1,388 34 5,444 0,220 -0,070 0,003 0,997 0,097 0,000 77,766 2,882 35 4,346 0,506 -0,060 0,007 0,980 0,224 0,004 72,796 -1,112 36 5,161 0,653 -0,069 0,009 0,975 0,289 0,005 74,372 0,205 37 5,575 0,544 -0,075 0,008 0,985 0,241 0,002 74,637 1,129 38 5,342 0,433 -0,071 0,006 0,989 0,192 0,001 75,670 1,297 39 5,732 0,389 -0,077 0,005 0,993 0,172 0,001 74,254 1,340 40 5,375 0,536 -0,072 0,008 0,984 0,238 0,002 74,447 0,504  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П34. Израчунати солватохромни параметри за мешовите тетраоксане Једињење A B S E V 1 0,570 2,360 3,350 1,860 4,706 2 0,000 2,350 3,310 1,760 4,847 3 0,490 2,580 3,820 2,110 4,747 4 0,260 2,600 3,790 2,000 5,169 5 0,260 2,930 4,190 2,060 5,244 6 0,000 2,390 3,300 1,770 4,987 7 0,490 2,610 3,810 2,120 4,888 8 0,260 2,620 3,770 2,010 5,029 9 0,260 2,630 3,780 2,010 5,310 10 0,000 2,420 3,290 1,770 5,128 11 0,000 2,360 3,310 1,760 4,706 12 0,000 2,370 3,320 1,750 5,128 13 0,000 2,460 3,280 1,780 5,410 14 0,570 2,390 3,340 1,870 4,847 15 0,000 2,390 3,300 1,770 4,987 16 0,490 2,610 3,810 2,120 4,888 17 0,260 2,620 3,770 2,010 5,029 18 0,260 2,630 3,780 2,010 5,310 19 0,570 2,390 3,340 1,870 4,847 20 0,000 2,390 3,300 1,770 4,987 21 0,490 2,610 3,810 2,120 4,888 22 0,260 2,620 3,770 2,010 5,026 23 0,260 2,630 3,780 2,010 5,310 24 0,570 2,370 3,250 1,660 4,392 25 0,000 2,380 3,210 1,550 4,532 26 0,490 2,590 3,720 1,910 4,433 27 0,260 2,610 3,690 1,800 4,574 28 0,260 2,610 3,690 1,790 4,855 29 0,000 2,660 3,700 1,810 4,714 30 0,260 2,940 4,090 1,860 4,930 31 0,410 2,680 4,060 2,370 5,040 32 0,470 3,030 3,900 2,060 4,532 33 0,570 2,000 2,960 1,790 4,349 34 0,000 2,000 2,920 1,690 4,490 35 0,490 2,220 3,440 2,040 4,391 36 0,260 2,240 3,410 1,930 4,813 37 0,470 2,660 3,610 2,190 4,490 38 0,000 2,300 3,430 1,940 5,236 39 0,410 2,310 3,770 2,510 4,998 40 0,000 2,270 3,510 2,160 4,986  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П35. Корелациона матрица солватохромних параметара мешовитих тетраоксана A B S E V A 1,000 B 0,188 1,000 S 0,299 0,866 1,000 E 0,438 0,333 0,668 1,000 V -0,387 0,268 0,332 0,228 1,000 Таблица П36, Молекулски дескриптори мешовитих тетраоксана Једињење Mwe MV SA ML MWd MD Log P HLB SP D P 1 620,780 348,091 44,470 13,711 12,788 18,058 9,230 5,432 21,360 19,380 2,373 2 634,807 358,568 45,912 11,646 19,784 15,489 9,606 4,816 20,540 18,763 2,284 3 619,796 349,754 44,726 12,965 19,209 12,666 8,230 5,523 21,033 18,954 2,953 4 661,877 380,079 48,854 23,063 14,388 12,430 9,444 5,240 20,329 18,701 2,452 5 691,860 387,380 49,839 14,390 23,830 12,636 7,635 6,134 20,925 18,995 2,606 6 648,834 368,597 47,267 23,494 12,423 15,391 10,125 4,446 20,358 18,625 2,214 7 633,822 361,320 46,290 20,777 14,126 13,088 8,749 5,132 20,828 18,804 2,858 8 647,849 370,349 47,525 21,819 14,182 12,869 8,905 5,615 20,384 18,702 2,530 9 675,903 390,276 50,225 22,020 15,408 11,781 9,963 4,880 20,161 18,572 2,381 10 662,861 378,575 48,614 23,548 12,383 10,285 10,644 4,097 20,186 18,495 2,149 11 620,781 348,829 44,591 24,094 12,326 9,490 9,047 5,006 20,669 18,838 2,360 12 662,861 378,559 48,619 23,831 12,368 11,668 10,814 4,472 20,305 18,626 2,147 13 690,915 398,486 51,313 23,724 12,208 10,798 11,702 3,804 19,927 18,320 2,027 14 634,807 358,109 45,827 23,431 12,313 9,955 9,749 5,228 21,142 19,213 2,296 15 648,834 368,566 47,266 24,667 12,300 9,961 10,125 4,637 20,358 18,625 2,214 16 633,823 359,938 46,100 21,942 14,119 10,247 8,749 5,317 20,828 18,804 2,858 17 647,850 370,370 47,530 21,890 14,160 11,120 8,860 5,800 20,380 18,700 2,530 18 675,904 390,246 50,226 22,565 15,593 12,175 9,963 5,058 20,161 18,572 2,381 19 634,807 358,109 45,827 23,431 12,313 9,955 9,749 5,228 21,142 19,213 2,296 20 648,834 368,566 47,266 24,667 12,300 9,961 10,125 4,637 20,358 18,625 2,214 21 633,823 359,938 46,100 21,942 14,119 10,247 8,749 5,317 20,828 18,804 2,858 22 647,850 370,370 47,530 21,890 14,160 11,120 8,860 5,800 20,380 18,700 2,530 23 675,904 390,246 50,226 22,565 15,593 12,175 9,963 5,058 20,161 18,572 2,381 24 580,716 325,078 42,019 21,928 12,378 10,231 8,187 5,406 21,294 19,152 2,536 25 594,743 335,534 43,457 22,854 12,406 10,186 8,563 4,757 20,429 18,510 2,431 26 579,731 326,772 42,273 21,653 12,308 8,996 7,187 5,503 20,956 18,702 3,151 27 593,758 337,175 43,701 23,023 12,382 10,222 7,343 6,027 20,461 18,594 2,779 28 621,812 357,098 46,400 24,945 12,495 10,152 8,401 5,207 20,212 18,459 2,600  Докторска дисертација Сандра Шеган 29 607,785 347,614 45,136 23,020 12,489 10,169 7,379 4,253 20,367 18,409 3,086 30 651,795 364,397 47,385 24,750 12,378 11,067 6,592 6,148 20,845 18,772 2,764 31 655,829 369,829 46,895 25,675 12,353 9,071 9,582 5,379 21,147 19,498 2,576 32 594,746 334,100 43,342 22,767 12,382 10,220 5,637 5,899 21,243 18,866 3,153 33 562,744 320,967 40,800 22,114 11,424 10,191 10,411 4,423 21,059 19,316 2,306 34 576,771 331,421 42,239 23,401 11,499 10,291 10,787 3,788 20,191 18,659 2,221 35 561,760 322,807 41,075 20,981 11,279 9,090 9,411 4,527 20,717 18,859 2,986 36 603,840 353,105 45,199 22,107 13,500 10,503 10,625 4,311 19,985 18,599 2,432 37 576,774 330,135 42,145 20,985 11,269 10,006 7,861 4,959 21,013 19,023 2,992 38 645,921 383,414 49,330 23,092 13,682 9,766 11,399 4,136 19,711 18,311 2,599 39 637,857 365,878 45,700 23,112 13,339 10,482 11,806 4,498 20,946 19,642 2,409 40 629,878 366,818 46,421 20,217 13,452 8,665 10,476 4,485 20,261 18,795 2,771 ... Таблица П36, наставак Једињење HB %HS HBA HBD CI0 CI1 CI2 CI3 VI0 VI1 VI2 1 8,661 29,964 1,500 0,400 83,493 20,807 20,944 17,221 79,140 17,107 15,590 2 8,039 27,286 1,200 0,000 86,200 21,345 21,063 17,833 82,101 17,496 15,772 3 8,627 30,361 1,620 0,490 84,493 20,807 20,944 17,221 80,270 17,172 15,662 4 7,585 29,131 1,420 0,250 92,614 22,345 21,797 18,186 88,607 18,694 16,546 5 8,382 33,015 1,720 0,260 92,192 23,239 22,746 18,985 87,216 18,657 16,549 6 7,915 25,680 1,200 0,000 89,070 21,766 21,512 18,461 84,971 17,916 16,259 7 8,488 28,662 1,620 0,490 87,363 21,228 21,393 17,849 83,140 17,593 16,149 8 7,704 30,760 1,430 0,250 90,070 21,766 21,512 18,461 86,063 18,054 16,356 9 7,474 27,564 1,420 0,250 95,485 22,804 22,012 19,173 91,477 19,175 16,871 10 7,797 24,160 1,200 0,000 91,941 22,187 21,969 19,026 87,841 18,337 16,755 11 8,171 28,114 1,200 0,000 83,493 20,845 20,710 17,583 79,394 16,996 15,418 12 7,793 25,790 1,200 0,000 91,614 22,345 21,770 18,333 87,515 18,496 16,479 13 7,573 22,887 1,200 0,000 97,518 23,071 23,102 19,171 93,419 19,221 17,850 14 8,519 29,079 1,500 0,400 86,363 21,201 21,566 17,641 82,010 17,501 16,211 15 7,915 26,507 1,200 0,000 89,070 21,739 21,685 18,254 84,971 17,889 16,394 16 8,488 29,465 1,620 0,490 87,363 21,201 21,566 17,641 83,140 17,566 16,284 17 7,700 31,580 1,360 0,250 90,070 21,740 21,680 18,250 86,060 18,030 16,490 18 7,474 28,341 1,420 0,250 95,485 22,739 22,419 18,607 91,477 19,088 17,168 19 8,519 29,079 1,500 0,400 86,363 21,201 21,566 17,641 82,010 17,501 16,211 20 7,915 26,507 1,200 0,000 89,070 21,739 21,685 18,254 84,971 17,889 16,394 21 8,488 29,465 1,620 0,490 87,363 21,201 21,566 17,641 83,140 17,566 16,284 22 7,700 31,580 1,360 0,250 90,070 21,740 21,680 18,250 86,060 18,030 16,490 23 7,474 28,341 1,420 0,250 95,485 22,739 22,419 18,607 91,477 19,088 17,168 24 8,954 29,851 1,500 0,400 77,958 19,100 20,047 15,599 73,604 15,400 14,518 25 8,294 27,029 1,200 0,000 80,665 19,638 20,167 16,212 76,565 15,789 14,700  Докторска дисертација Сандра Шеган 26 8,913 30,273 1,630 0,490 78,958 19,100 20,047 15,599 74,734 15,465 14,591 27 8,074 32,553 1,430 0,250 81,665 19,638 20,167 16,212 77,657 15,926 14,797 28 7,811 28,985 1,430 0,250 87,079 20,638 20,901 16,565 83,071 16,987 15,474 29 8,148 24,838 1,230 0,000 84,535 20,011 20,875 16,615 80,604 16,294 15,412 30 8,631 33,080 1,720 0,260 86,656 21,532 21,849 17,364 81,681 16,950 15,477 31 7,772 29,736 1,350 0,460 86,778 22,156 22,498 17,975 82,044 17,587 16,038 32 9,239 31,994 1,870 0,760 80,665 19,638 20,167 16,212 76,234 15,715 14,692 33 8,066 25,577 1,170 0,400 78,338 19,003 18,982 16,268 74,953 16,130 14,870 34 7,387 22,818 0,870 0,000 81,045 19,541 19,102 16,880 77,914 16,518 15,052 35 8,039 26,030 1,290 0,490 79,338 19,003 18,982 16,268 76,083 16,195 14,942 36 6,898 25,091 1,090 0,250 87,460 20,541 19,836 17,234 84,420 17,717 15,826 37 8,411 27,907 1,530 0,760 81,045 19,541 19,102 16,880 77,583 16,445 15,044 38 6,819 24,329 1,330 0,000 95,744 21,990 20,903 18,269 92,781 19,176 16,857 39 6,863 25,904 1,500 0,290 87,158 22,059 21,433 18,644 83,393 18,317 16,390 40 7,040 25,849 1,330 0,000 90,451 21,575 20,964 18,600 87,489 18,762 16,918 ...Таблица П36, наставак Једињење VI3 KI2 DM HOMO LUMO SA(Ap) SA(grid) HE Ref Pol 1 13,238 12,793 0,871 -10,444 1,003 748,290 862,740 -9,540 157,96 63,240 2 13,456 13,372 4,607 -10,477 1,128 797,410 897,120 -4,660 162,73 65,070 3 13,270 12,793 6,935 -10,515 1,081 727,830 859,120 -8,510 159,78 63,950 4 13,823 14,555 5,739 -9,968 1,085 851,980 956,260 -3,850 173,95 69,460 5 13,908 15,392 5,327 -10,397 0,851 873,570 977,980 -7,000 175,53 70,180 6 13,982 13,613 4,441 -10,473 1,120 813,570 910,290 -3,770 167,15 66,910 7 13,796 13,036 6,314 -10,500 0,992 753,400 882,200 -7,830 164,20 65,790 8 14,056 13,613 5,475 -9,895 1,019 810,950 910,960 -4,650 169,09 67,620 9 14,405 14,791 5,839 -9,876 1,037 887,210 993,980 -3,010 182,99 73,130 10 14,445 13,853 4,569 -10,455 1,118 827,350 921,030 -3,010 171,56 68,740 11 13,206 12,793 4,952 -10,483 1,114 790,840 984,970 -4,900 158,13 63,240 12 13,956 14,555 4,095 -10,490 1,111 826,870 924,280 -3,710 171,93 68,740 13 14,792 14,676 4,214 -10,469 1,107 900,600 969,970 -1,850 180,84 72,410 14 13,658 13,036 4,735 -10,493 1,004 787,300 881,600 -9,460 162,51 65,070 15 13,876 13,613 4,667 -10,474 1,132 834,940 919,490 -4,210 167,28 66,910 16 13,691 13,036 6,398 -10,500 0,991 774,360 890,170 -8,290 164,33 65,790 17 13,950 13,610 6,233 -9,870 0,980 832,350 918,220 -4,950 169,23 67,620 18 14,244 14,791 6,196 -9,836 0,989 897,430 982,330 -3,510 178,50 71,290 19 13,658 13,036 4,735 -10,493 1,004 787,300 881,600 -9,460 162,51 65,070 20 13,876 13,613 4,667 -10,474 1,132 834,940 919,490 -4,210 167,28 66,910 21 13,691 13,036 6,398 -10,500 0,991 774,360 890,170 -8,290 164,33 65,790 22 13,950 13,610 6,233 -9,870 0,980 832,350 918,220 -4,950 169,23 67,620 23 14,244 14,791 6,196 -9,836 0,989 897,430 982,330 -3,510 178,50 71,290  Докторска дисертација Сандра Шеган 24 11,720 11,736 4,705 -10,576 0,994 757,560 814,720 -11,090 146,22 58,510 25 11,938 12,310 4,341 -10,565 1,097 806,760 848,820 -5,740 150,99 60,340 26 11,752 11,736 3,383 -10,538 1,021 744,800 817,690 -9,160 148,04 59,220 27 12,012 12,310 5,484 -9,945 1,140 815,460 853,590 -6,530 152,94 61,060 28 12,305 13,485 5,360 -9,926 1,144 877,470 916,560 -5,200 162,21 64,730 29 12,219 12,552 4,387 -9,572 1,138 849,230 869,540 -3,490 157,84 62,890 30 12,391 14,320 6,421 -10,364 0,891 889,750 935,390 -7,470 163,80 65,450 31 12,791 14,198 3,988 -8,765 0,339 845,560 937,810 -8,160 172,72 68,880 32 11,894 12,310 5,082 -10,289 0,989 779,250 845,210 -16,510 152,53 60,570 33 12,927 11,172 5,319 -10,515 1,028 682,660 810,190 -9,590 147,22 58,840 34 13,145 11,736 5,155 -10,498 1,154 731,710 843,630 -4,270 151,99 60,680 35 12,960 11,172 7,686 -10,480 1,111 651,620 804,810 -8,160 149,04 59,560 36 13,512 12,893 7,024 -9,871 1,103 779,050 898,540 -3,570 163,21 65,060 37 13,101 11,736 6,317 -9,912 1,028 677,500 826,710 -14,960 153,52 60,910 38 14,267 14,320 6,635 -9,540 1,121 855,580 960,910 -0,640 177,38 70,570 39 13,998 13,613 7,161 -8,735 0,359 755,570 919,210 -6,720 173,71 69,220 40 14,636 13,036 5,887 -9,604 1,283 735,690 903,710 -1,680 170,97 67,960  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П37. Корелациона матрица молекулских дескриптора мешовитих тетраоксана Po l 1, 00 0 R ef 1, 00 0 0, 99 9 H E 1, 00 0 0, 62 0 0, 62 4 SA (g rid ) 1, 00 0 0, 62 9 0, 89 6 0, 89 7 SA (A p) 1, 00 0 0, 80 7 0, 55 0 0, 70 7 0, 71 0 LU M O 1, 00 0 -0 ,0 61 -0 ,1 45 0, 29 5 -0 ,2 07 -0 ,2 03 H O M O 1, 00 0 -0 ,5 72 0, 23 0 0, 32 3 0, 21 1 0, 42 3 0, 39 9 D M 1, 00 0 0, 14 7 -0 ,0 56 0, 11 1 0, 07 7 0, 08 9 0, 11 5 0, 11 5 K I2 1, 00 0 0, 07 6 0, 29 4 -0 ,2 17 0, 84 4 0, 91 9 0, 54 8 0, 93 2 0, 93 5 V I3 1, 00 0 0, 62 9 0, 14 7 0, 14 2 0, 04 7 0, 27 9 0, 64 4 0, 57 2 0, 81 3 0, 81 7 V I2 1, 00 0 0, 91 6 0, 82 5 0, 14 7 0, 26 0 -0 ,0 58 0, 58 1 0, 79 8 0, 62 6 0, 94 4 0, 94 8  Докторска дисертација Сандра Шеган V I1 1, 00 0 0, 96 8 0, 91 9 0, 85 8 0, 11 0 0, 31 9 -0 ,0 72 0, 56 8 0, 84 3 0, 65 6 0, 96 5 0, 96 5 V I0 1, 00 0 0, 96 5 0, 95 3 0, 84 2 0, 87 9 0, 12 8 0, 30 3 0, 03 9 0, 70 1 0, 85 8 0, 71 5 0, 96 0 0, 96 0 C I3 1, 00 0 0, 89 3 0, 94 9 0, 93 8 0, 91 8 0, 83 8 0, 14 2 0, 26 7 -0 ,1 45 0, 53 9 0, 82 5 0, 59 3 0, 93 3 0, 93 7 C I2 1, 00 0 0, 79 8 0, 76 6 0, 75 7 0, 81 9 0, 58 8 0, 90 1 0, 12 3 0, 18 8 -0 ,2 90 0, 77 7 0, 80 5 0, 41 7 0, 84 8 0, 86 0 C I1 1, 00 0 0, 91 9 0, 94 7 0, 90 9 0, 93 5 0, 92 3 0, 79 4 0, 96 0 0, 11 1 0, 28 3 -0 ,2 27 0, 71 7 0, 90 2 0, 56 2 0, 96 8 0, 97 3 C I0 1, 00 0 0, 93 5 0, 81 7 0, 90 1 0, 99 6 0, 96 0 0, 95 5 0, 82 4 0, 91 1 0, 12 8 0, 28 4 0, 00 4 0, 73 9 0, 87 7 0, 68 6 0, 97 0 0, 97 1 H B D 1, 00 0 -0 ,4 23 -0 ,3 67 -0 ,2 67 -0 ,4 14 -0 ,4 42 -0 ,3 89 -0 ,3 73 -0 ,3 51 -0 ,3 64 -0 ,0 06 0, 00 6 -0 ,3 71 -0 ,4 56 -0 ,4 48 -0 ,8 61 -0 ,3 55 -0 ,3 60 H B A 1, 00 0 0, 72 3 -0 ,0 74 0, 02 4 0, 18 5 -0 ,1 20 -0 ,1 24 -0 ,1 16 -0 ,0 92 -0 ,2 18 0, 08 2 -0 ,0 34 0, 00 2 -0 ,3 41 -0 ,0 05 -0 ,0 57 -0 ,6 14 -0 ,0 22 -0 ,0 23 % H S 1, 00 0 0, 76 3 0, 54 3 -0 ,1 62 -0 ,0 18 0, 16 5 -0 ,1 85 -0 ,2 20 -0 ,2 20 -0 ,2 22 -0 ,3 45 0, 07 5 0, 29 6 -0 ,0 24 -0 ,2 83 0, 11 4 -0 ,0 21 -0 ,4 94 -0 ,1 18 -0 ,1 14 H B 1, 00 0 0, 55 3 0, 58 2 0, 55 0 -0 ,5 84 -0 ,4 60 -0 ,1 81 -0 ,5 56 -0 ,6 40 -0 ,6 53 -0 ,5 66 -0 ,6 02 -0 ,4 09 -0 ,1 18 -0 ,5 98 0, 02 3 -0 ,2 80 -0 ,5 08 -0 ,7 68 -0 ,6 00 -0 ,5 87 P 1, 00 0 0, 43 8 0, 44 1 0, 61 7 0, 61 9 -0 ,4 29 -0 ,4 76 -0 ,3 63 -0 ,5 21 -0 ,4 31 -0 ,4 83 -0 ,4 67 -0 ,5 14 -0 ,4 09 -0 ,0 09 0, 11 7 -0 ,0 51 -0 ,3 49 -0 ,4 41 -0 ,5 06 -0 ,4 12 -0 ,4 27  Докторска дисертација Сандра Шеган D 1, 00 0 0, 05 2 0, 27 9 0, 28 2 0, 32 5 0, 53 6 -0 ,4 21 -0 ,1 67 -0 ,1 26 -0 ,1 56 -0 ,4 42 -0 ,2 34 -0 ,2 54 -0 ,1 59 -0 ,2 60 -0 ,0 71 0, 17 2 -0 ,6 73 -0 ,4 91 -0 ,3 02 -0 ,6 15 -0 ,2 42 -0 ,2 42 SP 1, 00 0 0, 83 1 0, 36 6 0, 75 9 0, 52 2 0, 59 1 0, 71 4 -0 ,6 37 -0 ,4 04 -0 ,2 19 -0 ,4 52 -0 ,6 81 -0 ,5 52 -0 ,5 18 -0 ,4 78 -0 ,4 34 -0 ,1 16 -0 ,1 85 -0 ,4 52 -0 ,5 16 -0 ,5 17 -0 ,8 74 -0 ,5 22 -0 ,5 17 H LB 1, 00 0 0, 52 2 0, 28 2 0, 44 1 0, 55 3 1, 00 0 0, 76 4 0, 54 3 -0 ,1 62 -0 ,0 18 0, 16 4 -0 ,1 85 -0 ,2 21 -0 ,2 20 -0 ,2 22 -0 ,3 46 0, 07 5 0, 29 5 -0 ,0 25 -0 ,2 83 0, 11 4 -0 ,0 22 -0 ,4 94 -0 ,1 18 -0 ,1 14 Lo g P 1, 00 0 -0 ,7 49 -0 ,4 84 -0 ,0 25 -0 ,7 34 -0 ,7 53 -0 ,7 49 -0 ,6 46 -0 ,5 12 0, 48 4 0, 43 3 0, 20 9 0, 56 4 0, 52 8 0, 61 8 0, 59 1 0, 70 6 0, 28 8 -0 ,0 68 0, 19 1 -0 ,0 13 0, 05 8 0, 35 0 0, 60 4 0, 49 4 0, 49 8 M D 1, 00 0 0, 02 1 0, 15 4 0, 06 4 0, 06 5 -0 ,2 50 0, 09 1 0, 15 4 0, 07 6 -0 ,0 62 0, 20 1 0, 29 0 0, 25 2 0, 26 0 0, 17 7 0, 23 0 0, 17 4 0, 22 2 0, 27 9 0, 00 6 -0 ,1 85 0, 04 0 0, 12 5 0, 15 4 0, 06 7 0, 18 9 0, 20 2 M W d 1, 00 0 0, 44 0 -0 ,1 12 0, 33 5 -0 ,0 05 -0 ,0 05 0, 04 2 -0 ,0 06 0, 33 5 0, 29 8 -0 ,0 17 0, 35 6 0, 45 1 0, 40 0 0, 37 6 0, 32 9 0, 38 1 0, 30 9 0, 28 1 0, 46 8 0, 05 4 -0 ,0 09 -0 ,0 89 0, 26 0 0, 37 5 0, 13 7 0, 37 9 0, 38 3 M L 1, 00 0 -0 ,7 16 -0 ,6 14 0, 16 3 -0 ,2 31 -0 ,2 91 -0 ,2 23 -0 ,1 72 -0 ,2 38 -0 ,2 31 -0 ,2 37 -0 ,1 68 0, 10 3 0, 01 9 0, 06 6 0, 00 8 0, 11 1 0, 01 4 0, 07 1 -0 ,0 50 0, 06 2 0, 00 2 0, 22 4 -0 ,0 91 0, 28 5 0, 16 3 0, 16 6 0, 09 5 0, 09 0 SA 1, 00 0 0, 10 4 0, 39 9 0, 24 4 0, 35 4 -0 ,0 30 -0 ,5 50 -0 ,3 97 -0 ,4 21 -0 ,4 50 -0 ,0 30 0, 01 3 -0 ,4 15 0, 97 4 0, 95 8 0, 90 3 0, 87 5 0, 95 1 0, 90 4 0, 90 8 0, 72 4 0, 96 6 0, 12 0 0, 24 0 -0 ,0 65 0, 83 8 0, 90 5 0, 63 1 0, 95 5 0, 95 9 M V 1, 00 0 0, 99 1 0, 08 8 0, 40 0 0, 24 2 0, 43 4 -0 ,0 72 -0 ,5 28 -0 ,3 18 -0 ,4 51 -0 ,5 06 -0 ,0 71 -0 ,0 14 -0 ,4 10 0, 98 0 0, 98 2 0, 90 3 0, 92 2 0, 96 1 0, 94 4 0, 94 2 0, 78 6 0, 96 2 0, 12 1 0, 28 9 -0 ,1 23 0, 78 0 0, 90 9 0, 63 6 0, 98 1 0, 98 4 M w e 1, 00 0 0, 97 5 0, 97 2 0, 03 9 0, 44 9 0, 30 1 0, 32 1 0, 06 0 -0 ,3 79 -0 ,2 26 -0 ,4 50 -0 ,3 41 0, 06 0 0, 07 9 -0 ,3 63 0, 91 8 0, 98 4 0, 96 2 0, 89 7 0, 88 1 0, 87 6 0, 88 7 0, 71 3 0, 96 9 0, 11 6 0, 20 1 -0 ,1 89 0, 79 4 0, 89 4 0, 53 2 0, 93 3 0, 94 2 M w e M V SA M L M W d M D Lo g P H LB SP D P H B % H S H B A H B D C I0 C I1 C I2 C I3 V I0 V I1 V I2 V I3 K I2 D M H O M O LU M O SA (A p) SA (g rid ) H E R ef Po l  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П38. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П39. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ 0- f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П40. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П41. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу RМ0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П42. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П43. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П44. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П45. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу b - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П46. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Метанол - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П47. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Ацетон - вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П48. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан - вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем RP-18 / Диоксан – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Слика П49. а) График зависности варијабли од вредности VIP-скорова мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода. b) Вредности корелационих коефицијената варијабли мешовитих тетраоксана у PLS моделу C0 - f (деск.) за хроматографски систем CN силика-гел / Ацетон – вода.  Докторска дисертација Сандра Шеган Таблица П50. Минималне инхибиторне концентрације мешовитих тетраоксана израженe као logC вредности Jедињење W2(IC50) W2logC D6(IC50) D6logC 1 19,220 1,284 30,570 1,485 2 16,960 1,229 21,470 1,332 3 4,740 0,676 11,830 1,073 4 6,800 0,833 14,760 1,169 5 10,770 1,032 22,010 1,343 6 15,640 1,194 27,030 1,432 7 11,120 1,046 17,310 1,238 8 10,020 1,001 15,780 1,198 9 9,290 0,968 13,150 1,119 10 357,080 2,553 31,180 1,494 11 27,670 1,442 39,140 1,593 12 20,000 1,301 48,440 1,685 13 73,240 1,865 154,360 2,189 14 0,960 -0,018 1,490 0,173 15 5,050 0,703 9,990 1,000 16 0,580 -0,237 1,170 0,068 17 19,080 1,281 32,720 1,515 18 3,820 0,582 3,220 0,508 19 17,350 1,239 31,090 1,493 20 13,160 1,119 24,640 1,392 21 14,100 1,149 20,030 1,302 22 11,870 1,075 16,650 1,221 23 83,010 1,919 84,940 1,929 24 27,540 1,440 27,010 1,432 25 2,690 0,430 6,860 0,836 26 - - - - 27 22,350 1,349 46,870 1,671 28 7,400 0,869 18,140 1,259 29 17,290 1,238 35,540 1,551 30 - - - - 31 8,710 0,940 14,680 1,167 32 16,360 1,214 28,100 1,449 33 93,860 1,973 106,730 2,028 34 111,690 2,048 201,430 2,304 35 19,080 1,281 32,720 1,515 36 37,920 1,579 69,110 1,840 37 346,750 2,540 346,750 2,540 38 150,140 2,177 178,860 2,253 39 81,620 1,912 133,240 2,125 40 55,490 1,744 105,560 2,024  Докторска дисертација Сандра Шеган БИОГРАФИЈА СА БИБЛИОГРАФИЈОМ Сандра Б. Шеган (рођена Гаица) рођена је 25.1.1975. године у Задру, Република Хрватска. Основну школу је завршила у Задру, а средњу у Книну. Биолошки факултет у Београду уписала је 1993. године као редован студент на студијској групи професор биологије и хемије. Дипломирала је 28.6.2000. године са просечном оценом 8,59 и оценом 10 на дипломском испиту. Од јануара 2002. Године била је стипендиста Министарства за науку, техногију и развој Републике Србије, а од 1.10.2003. године запослена је као истраживач приправник у Центру за хемију ИХТМ-а. Магистарски рад под називом ”Испитивање хроматографског понашања стероидних тетраоксана на танким слојевима различитих сорбената” одбранила је 28.3.2005. године при Катедри за аналитичку хемију, Хемијског факултета Универзитета у Београду. По одбрани магистарске тезе, 22.7.2005. године изабрана је у звање истраживач-сарадник. Магистар Сандра Шеган је до сада учествовала у реализацији четири научно- истраживачка пројекта финансирана од стране Министарства за науку и технолошки развој Републике Србије. Члан је Српског хемијског друштва. Kоаутор je осам научних радова од тога четири у врхунским међународним часописима из категорије М21 и четири у међународним часописима категорије М23 као и осам саопштења на научним скуповима. Тренутно је ангажована на пројекту Министарства просвете и науке Републике Србије под називом Синтеза аминохонолина њихових деривата као антималарика и инхибитора ботулинум неуротоксина А (172008).  Докторска дисертација Сандра Шеган Списак научних радова и саопштења: М 21 – Радови објављени у врхунским часописима међународног значаја 1. Filip Andrić, Jelena Trifković, Aleksandra Radoičić, Sandra Šegan, Živoslav Tešić, Dušanka Milojković-Opsenica, Determination of the soil-water partition coefficients (log KOC) of some mono- and poly-substituted phenols by reversed-phase thin-layer chromatography. Chemosphere 81(3) (2010) 299-305. 2. Sandra Šegan, Filip Andrić, Aleksandra Radoičić, Dejan Opsenica, Bogdan Šolaja, Mario Zlatović, Dušanka Milojković-Opsenica, Correlation between structure, retention and activity of cholic acid derived cis–trans isomeric bis-steroidal tetraoxanes, J. Sep. Sci. 34 (2011) 2659–2667. 3. Dejan Šegan, Rastko Vukićević, Sandra Šegan, Nešo Šojic, Olivier Buriez, Dragan Manojlović, Kinetic Investigations of the Electrochemical bromination of peracetylated D- glucal in Organic Solvents, Electrochimica Acta 56(27) (2011) 9968-9972. 4. Sandra Šegan, Jelena Trifković, Tatjana Verbić, Dejan Opsenica, Mario Zlatović, James Burnett, Bogdan Šolaja, Dušanka Milojković-Opsenica, Correlation between structure, retention, property, and activity of biologically relevant 1,7-bis(aminoalkyl)diazachrysene derivatives, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 72 (2013) 231– 239. М 23 - Радови објављени у часописима међународног значаја 1. Sandra B. Gaica, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja, Živoslav Lj. Tešić and Dušanka M. Milojković–Opsenica, The Retention Behaviour of Some Cholic Acid Derivatives on Different Adsorbents, J. Planar Chromatogr. 15 (2002) 299-305. 2. Sandra B. Gaica, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja, Živoslav Lj. Tešić and Dušanka M. Milojković–Opsenica, The Effect of Strucure of Mixed Tetraoxanes on their Retention Behaviour on Different Adsorbents, J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 342-349. 3. Igor M. Opsenica, Kirsten K. Smith, Lucia Gerena, Sandra Gaica, Bogdan A. Šolaja, Ribofuranose as a carrier of tetraoxane and 4-aminoquinoline antimalarial pharmacophores, J. Serb. Chem. Soc. 73 (2008) 1021-1025.  Докторска дисертација Сандра Шеган 4. Sandra B. Šegan, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja, Dušanka M. Milojković- Opsenica, Planar chromatography of cholic acid-derived cis-trans isomeric bis-steroidal tetraoxanes, J. Planar Chromatogr., 22, (2009) 175-181. М 34 - Саопштења на научним скуповима међународног значаја: 1. штампано у целини: 1. Sandra B. Gaica, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja, Živoslav Lj. Tešić and Dušanka M. Milojković–Opsenica, The Retention Behaviour of Some Cholic Acid Derivatives on Different Adsorbents, Planar Chromatography 2002, Hevitz, Hungary, May 2002., Proceedings of the International Symposium on Planar Separations p. 225-232. 2. Sandra B. Gaica, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja, Živoslav Lj. Tešić and Dušanka M. Milojković–Opsenica, The Effect of Strucure of Mixed Tetraoxanes on Their Retention Behaviour, Planar Chromatography 2004, Visegrad, Hungary, May 2004., Proceedings of the International Symposium on Planar Separations p. 307-315. 2. штампано у изводу 1. Sandra. B. Gaica, Dejan M. Opsenica , Bogdan A. Šolaja , Živoslav Lj. Tešić and Dušanka M. Milojković-Opsenica, Evaluation of the Lipophilicity of bis-Steroidal Tetraoxanes by Reversed-phase Thin-layer Chromatography, 3rd International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Bucharest, Romania, September 22-25, 2002, Book of Abstracts Volume I, PO184, p. 338. 2. Sandra B. Gaica, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja, Živoslav Lj. Tešić B.,. and Dušanka M. Milojković-Opsenica, Thin-Layer Chromatography of Mixed Tetraoxanes, 4rd International Conference of the Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Belgrade, Serbia & Montenegro, July 18-21. 2004., Book of Abstracts Volume I, p.131. 3. Sandra B. Šegan, Nataša Terzić-Jovanović, Dejan M. Opsenica, Jelena Trifković, Bogdan A. Šolaja, and Dušanka M. Milojković-Opsenica, A Quantitative Structure-Retention Relationship Study of 1,2,4,5-Mixed Tetraoxanes, 8th International Conference of the  Докторска дисертација Сандра Шеган Chemical Societies of the South-Eastern European Countries, Belgrade, Serbia, June 27-29. 2013., Book of Abstracts, p.52. М 64 – Радови саопштени на скупу националног значаја штампани у целини 1. Sandra B. Gaica, Dejan M. Opsenica, Nataša Terzić, Bogdan A. Šolaja i Dušanka M. Milojković-Opsenica, Planarna hromatografija nekih mešovitih tetraoksana derivata deoksiholne kiseline, 43. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd, 24-25. januar 2005. p. 86-89 i Izvodi radova, p.16. 2. Sandra B. Gaica, Igor M. Opsenica, Dejan M. Opsenica, Bogdan A. Šolaja i Dušanka M. Milojković-Opsenica, Retenciono ponašanje mešovitih tetraoksana derivate holne i 4- oksocikloheksankarboksilne kiseline u uslovima planarne hromatografije 44. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd, Srbija, 6-7. februar 2006. Izvodi radova, p.21, AH- PO5,