UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Jelena Đ. Trifković ODREĐIVANJE KVANTITATIVNOG ODNOSA STRUKTURE I RETENCIJE ARILPIPERAZINA PRIMENOM TEČNE HROMATOGRAFIJE I MULTIVARIJANTNIH HEMOMETRIJSKIH METODA doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Jelena Đ. Trifković QUANTITATIVE STRUCTURE- RETENTION RELATIONSHIP STUDY OF ARYLPIPERAZINES BY LIQUID CHROMATOGRAPHY AND MULTIVARIATE CHEMOMETRIC METHODS Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentor: dr Dušanka Milojković-Opsenica vanredni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Članovi komisije: dr Živoslav Tešić redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Deana Andrić vanredni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Danica Agbaba redovni profesor Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Datum odbrane:      Ova doktorska disertacija je urađena na Katedri za analitičku hemiju Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu pod mentorstvom dr Dušanke Milojković-Opsenice, vanrednog profesora Hemijskog fakulteta u Beogradu. Autor koristi priliku da se zahvali dr Dušanki Milojković-Opsenici na pomoći i podršci u toku izrade i pisanja rada, na korisnim sugestijama i razumevanju. Zahvaljujem se dr Živoslavu Tešiću na ukazanom poverenju tokom niza godina zajedničkog rada, dr Deani Andrić, koja je sintetisala supstance ispitivane u okviru ove disertacije, na korisnim sugestijama pri završnoj izradi rada, kao i dr Danici Agbabi na stručnoj pomoći. I hvala mojim roditeljima i Leni, Jani i Ivanu. Ovaj rad posvećujem njima. Određivanje kvantitativnog odnosa strukture i retencije arilpiperazina primenom tečne hromatografije i multivarijantnih hemometrijskih metoda Cilj ove disertacije bilo je sistematsko proučavanje hromatografskog ponašanja serije novosintetisanih arilpiperazina u uslovima planarne hromatografije, procena retencionih podataka na osnovu multivarijantnih statističkih metoda i utvrđivanje veze između retencionih karakteristika i fizičko-hemijskih parametara ispitivanih molekula. Različiti reverzno-fazni hromatografski sistemi uspešno su primenjeni za razdvajanje ispitivanih arilpiperazina. Definisane su međumolekulske interakcije koje upravljaju retencionim ponašanjem ispitivanih supstanci. To su pre svega hidrofobne, elektrostatičke i interakcije koje uključuju građenje vodoničnih veza. Ponašanje arilpiperazina u primenjenim hromatografskim uslovima u saglasnosti je sa njihovim strukturnim svojstvima, kao i sa interakcijama za koje je utvrđeno da se uspostavljaju kada se ligand koji pokazuje afinitet prema dopaminskim D2 i serotoninskim 5-HT1A receptorima približi aktivnom centru receptora. Lipofilnost ispitivanih arilpiperazina određena je pomoću četiri hromatografska deskriptora, RM0, b, C0 i PC1. Na osnovu statističkih parametara linearne zavisnosti pomenutih deskriptora i izračunatih logP vrednosti, utvrđeno je da varijabla koja direktno opisuje raspodelu supstanci između stacionarne i mobilne faze, kao što je parameter RM0, pouzdanije određuje lipofilnost ispitivanih arilpiperazina od parametra koji je proporcionalan hidrofobnoj površini molekula (b) ili interpolisane veličine koja obuhvata sve hromatografske podatke jednog sistema (PC1). Analiza glavnih komponenata i klasterska analiza kao i višestruka linearna regresija, regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata i regresija glavnih komponenata primenjene su za identifikaciju molekulskih deskriptora koji na najbolji način opisuju ponašanje ispitivanih jedinjenja u hromatografskom sistemu, kao i za kvantifikaciju njihovog uticaja, a u cilju dobijanja matematičkih modela koji bi mogli da predvide hromatografsko ponašanje, odnosno lipofilnost novih srodnih molekula. Statistički parametri potvrđuju da su predloženi modeli statistički značajni i uporedivi. Molekulski deskriptori uključeni u konačne modele su slične prirode i njihov uticaj je približno jednak. Potvrđeno je da je hromatografsko ponašanje molekula određeno dvema komponentama, veličinom molekula i sposobnošću građenja vodoničnih veza. Usled većeg uticaja parametara rastvorljivosti na RM0 vrednosti, pretpostavljeno je da je u posmatranom hromatografskom sistemu particija dominantni mehanizam razdvajanja u odnosu na adsorpciju. Prediktivna svojstva dobijenih modela potvrđuju mogućnost njihovog korišćenja za predviđanje lipofilnosti novih, strukturno sličnih jedinjenja, kao i za razumevanje njihovog hromatografskog ponašanja. Ključne reči: Arilpiperazini, reverzno-fazna tankoslojna hromatografija, lipofilnost, analiza glavnih komponenata, klasterska analiza, višestruka linearna regresija, regresija glavnih komponenata, regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata. Naučna oblast: Hemija Uža naučna oblast: Analitička hemija UDK broj: 543 Quantitative structure-retention relationship study of arylpiperazines by liquid chromatography and multivariate chemometric methods The main goal of this PhD thesis was a systematic study of the retention of the newly synthesized arylpiperazines in planar chromatographic conditions, evaluation of the retention data by multivariate statistical methods and determination of the possible relationship between the retention characteristics and the physicochemical parameters of the investigated arylpiperazines. Different reversed-phase chromatographic systems are successfully applied for the separation of the investigated arylpiperazines. Hydrophobic, electrostatic and hydrogen bond interactions were defined as the most important molecular interactions govern the retention process. The results obtained are in accordance with the structural properties of the investigated compounds and moreover with the interactions established for their binding affinity at the dopamine D2 and serotonin 5-HT1A receptors. Four chromatographic descriptors, RM0, b, C0 i PC1 are used for assessing the lipophilicity of unknown solutes. These parameters were compared with calculated logP values, and statistical quality of these dependences shows that variables describing directly solute partitioning between stationary and mobile phase, such as RM0, are more suitable for lipophilicity estimation than parameters proportional to the molecular hydrophobic surface area (b), or interpolated quantity which combines all chromatographic data in one single feature (PC1). Principal component analysis and cluster analysis followed by multiple linear regression, partial least square regression and principal component regression, were performed to identify the molecular descriptors that best describe the chromatographic behavior of the investigated compounds, and to quantify their influences, in order to create a model that could be able to predict chromatographic behavior or lipophilicity of a newly synthesized molecules. The statistical parameters revealed that the models are statistically significant and their statistical results are comparable. The descriptors included in the final models of these three methods are of similar nature and significance. All models confirm the importance of the size of the molecule and hydrogen bonding interactions in assessment of their chromatographic behavior. According to larger influence of the solubility parameters on RM0 values, it was concluded that partition was the dominant separation mechanism in studied chromatographic systems. Predictive ability of the obtained models and equations based on the physically meaningful parameters allows an estimation of lipophilicity for similar compounds and understanding of their chromatographic behavior. Keywords: Arylpiperazines, reversed-phase thin-layer chromatography, lipophilicity, principal component analysis, cluster analysis, multiple linear regression, principal component regression, partial least square regression. Scientific field: Chemistry Field of Academic Expertise: Analytical Chemistry UDC Number: 543 Sadržaj   Str. Str. 1. Uvod 1 2. Opšti deo 4 2.1 Tečna hromatografija 2.1.1 Reverzno-fazna tankoslojna hromatografija 2.2 Procena lipofilnosti jedinjenja 2.3 Ispitivanje kvantitativnog odnosa strukture i retencije 2.3.1 Deskriptori molekulske strukture 2.3.2 Analiza glavnih komponenata 2.3.3 Komplementarne metode za opisnu analizu podataka 2.3.4 Kalibracija 2.3.4.1 Regresija metodom najmanjih kvadrata 2.3.4.2 Višestruki linearni regresioni model 2.3.4.3 Regresija glavnih komponenata 2.3.4.4 Regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata 2.4 Arilpiperazini: struktura i biološka aktivnost 5 7 9 14 15 18 21 24 31 33 37 39 41 3. Eksperimentalni deo 45 3.1 Reagensi 3.2 Tankoslojna hromatografija 3.3 Geometrijska optimizacija i izračunavanje vrednosti molekulskih deskriptora 3.4 Multivarijantna statistička analiza i modelovanje 46 46 47 48 4. Naši radovi 50 4.1 Retenciono ponašanje ispitivanih arilpiperazina u uslovima planarne hromatografije 4.2 Određivanje parametara lipofilnosti ispitivanih arilpiperazina 4.3 Multivarijantna analiza podataka 4.3.1 Uvodna multivarijantna analiza 4.3.2 Analiza glavnih komponenata 4.3.2.1 PCA primenjena na retencione podatke 4.3.2.2 PCA primenjena na molekulske deskriptore 4.3.3 Klasterska analiza 4.3.4 QSRR analiza 51 58 65 65 65 66 68 70 72 4.3.4.1 Višestruki linearni regresioni model 4.3.4.2 Regresija glavnih komponenata 4.3.4.3 Regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata 4.3.4.4 Uticaj pojedinih molekulskih deskriptora na hromatografsko ponašanje ispitivanih arilpiperazina 73 77 81 86 5. Zaključak 90 6. Literatura 93 7. Prilog 110                1 Uvod 1     2    1 Uvod  1. Uvod Veza između strukture supstanci i njihovog hromatografskog ponašanja je jedna od najvažnijih teorijskih oblasti izučavanja u hromatografiji poznata pod nazivom Kvantitativni odnosi strukture i retencije (Quantitative Structure-Retention Relationships, QSRR). Glavni ciljevi ovih istraživanja su predviđanje retencionog ponašanja novog jedinjenja na osnovu njegovih strukturnih karakteristika; pronalaženje relevantnih strukturnih parametara koji sadrže najviše korisnih informacija; karakterisanje stacionarnih faza; objašnjenje mehanizama odvajanja u hromatografskom sistemu; optimizacija hromatografskog sistema u određenim uslovima razdvajanja; procena lipofilnosti, odnosno relativne biološke aktivnosti jedinjenja. Hromatografija je danas jedna od osnovnih metoda za analizu različitih uzoraka, prečišćavanje složenih smeša i razdvajanje i izolovanje pojedinačnih komponenata. Tečna hromatografija predstavlja metodu kod koje se raspodela analita vrši između čvrste stacionarne faze (tankog sloja ili kolone) i tečne mobilne faze. Na konstantnoj temperaturi, ova raspodela je određena hemijskom strukturom analita i fizičko-hemijskim svojstvima mobilne i stacionarne faze. Utvrđivanje i optimizacija matematičke zavisnosti između veličina koje opisuju strukturu jedinjenja i retencije u posmatranim hromatografskim uslovima, primenom različitih statističkih tehnika za multivarijantnu analizu podataka, čini osnov QSRR studija. Hemometrijske metode koje se pri tome najčešće koriste su: analiza glavnih komponenata, klasterska analiza, višestruka linearna regresija, regresija glavnih komponenata i regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata. U okviru ovog rada planirano je proučavanje uticaja strukture serije novosintetisanih arilpiperazina na njihovu retenciju u uslovima reverzno-fazne tečne, odnosno tankoslojne hromatografije. Jedinjenja su nastala uvođenjem atoma halogena u benzimidazolsku i benzimidazol-2-tionsku dopaminergičku farmakoforu 1-aralkil-4-arilpiperazina ispitanih u našim prethodnim radovima1-4. Analizirani arilpiperazini pripadaju grupi dopaminskih  3    1 Uvod  liganada, koji su veoma značajni zbog svoje uloge u funkcionisanju velikog broja fizioloških procesa, kao što su koordinacija psihomotoričkih funkcija, organizacija procesa prepoznavanja i regulacija reproduktivnih ciklusa kod ljudi. Reverzno-faznom planarnom hromatografijom biće određena lipofilnost arilpiperazina, kao jedan od važnih faktora koji utiču na biološku aktivnost supstanci. Planirana je, takođe, analiza dobijenih retencionih podataka multivarijantnim statističkim metodama (kvalitativna analiza) i pronalaženje mogućeg odnosa između retencionih karakteristika i parametara molekulske strukture (kvantitativna analiza). Cilj navedenog istraživanja bio bi razumevanje mehanizama razdvajanja u primenjenim hromatografskim sistemima, pronalaženje strukturnih parametara koji sadrže najviše korisnih informacija, kao i dobijanje statistički značajnog modela koji bi poslužio za predviđanje retencije i lipofilnosti novih strukturno sličnih jedinjenja.   2 Opšti deo 4    2 Opšti deo  2.1 Tečna hromatografija U savremenoj analitičkoj hemiji, koja je zasnovana na primeni novih, naprednih metoda i izuzetno sofisticirane opreme, hromatografija zauzima značajno mesto. Hromatografske metode su, i danas, gotovo nezamenljive prilikom analize različitih uzoraka, prečišćavanja složenih smeša i razdvajanja i izolovanja pojedinačnih komponenata. Tečna hromatografija predstavlja tehniku kod koje mobilna faza (eluent) prolazi kroz stacionarnu fazu (tanak sloj ili kolonu) noseći sa sobom rastvor uzorka. Pri tome dolazi do procesa adsorpcije i desorpcije komponenata uzorka i njihove raspodele između tečne mobilne faze i površine čvrstog sorbenta kao stacionarne faze. Ceo postupak razdvajanja se može posmatrati kao sekvencijalni proces u kojem se migracija analita (odvajane supstance) ponavlja korak po korak kroz čitavu stacionarnu fazu sve dok uzorak ne napusti sistem ili rastvarač ne dostigne određeno mesto na ploči5. Različiti fizički i hemijski faktori određuju mehanizam sorpcije, koji uključuje adsorpciju, particiju, jonsku izmenu i ekskluziju. Planarna hromatografija predstavlja podvrstu tečne hromatografije u kojoj se kao stacionarna faza koristi tanak sloj sorbenta nanet na neku ravnu površinu (staklenu, metalnu ili plastičnu ploču). Zadržavanje, odnosno retencija, jedinjenja u ovom sistemu izražava se pomoću retardacionog faktora, odnosno RF vrednosti, koja predstavlja odnos puta koji je prešla analizirana supstanca i puta rastvarača: f xRF = (1) gde je x pređeni put supstance od polazne mrlje do težišta hromatografske zone, dok je f pređeni put rastvarača od polazne mrlje do fronta rastvarača. Nagli razvoj tankoslojne hromatografije sedamdesetih godina XX veka bio je rezultat optimizacije uslova izvođenja, tj. razvoja visokoefikasnih ploča i mogućnosti višestrukog eluiranja. Na taj način je klasična tankoslojna hromatografija postala visoko efikasna kvantitativna metoda koja zbog svoje jednostavnosti, brzine i niske cene danas 5     2 Opšti deo  predstavlja jednu od osnovnih metoda odvajanja i analize organskih i neorganskih jedinjenja u mnogim laboratorijama6. Visoko-efikasna tankoslojna hromatografija (High-Performance Thin-Layer Chromatography, HPTLC) je kompetitivna sa drugim hromatografskim tehnikama u pogledu tačnosti, preciznosti i reproduktivnosti. U odnosu na visoko-efikasnu tečnu hromatografiju (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) HPTLC karakterišu izvesne prednosti, kao što su: a) mala količina uzorka potrebna za analizu, b) veća preciznost i tačnost usled mogućnosti istovremene analize većeg broja uzoraka pod istim hromatografskim uslovima, c) mala osetljivost na nečistoće, d) prethodne analize ne mogu da utiču na ishod eksperimenta jer se za svaku analizu koriste nove stacionarne faze, e) mali utrošak mobilne faze po uzorku, f) veliki izbor adsorbenasa i rastvarača za razvijanje, h) mogućnost primene na nepolarnija jedinjenja7,8. Jedan od razloga široke primene planarne hromatografije je i mogućnost izbora i kombinacija velikog broja stacionarnih i mobilnih faza. Stacionarna faza, kao jedna od tri komponente hromatografskog sistema (stacionarna faza, mobilna faza i odvajana supstanca ili sorbend), igra značajnu ulogu u retencionom ponašanju različitih jedinjenja. Poznavanje svojstava stacionarnih faza omogućava njihov pravilan izbor prilikom rešavanja različitih problema vezanih za proces hromatografskog razdvajanja9. Postoji više različitih načina klasifikacije sorbenata koji se koriste u TLC. Najpraktičnija je podela prema hemijskoj prirodi sorbenta na sorbente sa uniformnim hemijskim karakteristikama (silika-gel, aluminijum oksid, celuloza, poliamid) i sorbente sa kombinovanim hemijskim karakteristikama (modifikovani silika-gel). Najčešće korišćeni sorbent sa uniformnim karakteristikama je silika-gel. Silika- gel je silicijum dioksid kod kojeg je svaki silicijumov atom okružen sa četiri atoma kiseonika gradeći tetraedar. Na površini silika-gela atomi kiseonika povezani su ili sa vodonikom (-Si-OH, silanolna grupa) ili sa drugim atomom silicijuma (-Si-O-Si-, siloksanska grupa). Silanolni aktivni centri se mogu u izvesnoj meri razlikovati, u zavisnosti od toga da li se javljaju kao izolovani ili vezani (tj. slobodni, vicinalni ili geminalni). Sve silanolne grupe ponašaju se kao proton-donori, dok siloksanske grupe imaju proton-akceptorska svojstva. U uslovima normalno-fazne (NP) hromatografije 6     2 Opšti deo  supstanca se raspodeljuje između izrazito polarne stacionarne faze i manje polarne mobilne faze. Sorbenti sa kombinovanim hemijskim karakteristikama dobijaju se reakcijom površinskih silanolnih grupa silika-gela sa različitim organskim i organo-silikonskim jedinjenjima. U zavisnosti od primenjenog organskog liganda dobijaju se hidrofobni (nepolarni) ili hidrofilni (polarni) sorbenti. Najznačajniji komercijalno dostupni hidrofobni sorbenti su metil- (RP-2), oktil- (RP-8) i oktadecil- (RP-18) modifikovani silika-gelovi, koji se, kombinovani sa polarnim mobilnim fazama, primenjuju kao sorbenti u reverzno-faznoj (RP) hromatografiji. Hidrofobnost pojedinih sorbenata zavisi ne samo od tipa liganda, već i od gustine prekrivenosti silika-gela alifatičnim ligandima10,11. Oktadecil-modifikovani silika-gel je najčešće korišćena stacionarna faza u RPTLC. Uz značajne prednosti, osnovni nedostatak ovog sorbenta je izražena heterogenost njegove površine, odnosno postojanje nemodifikovanih silanolnih grupa na površini koje učestvuju u građenju vodoničnih veza ili jonskim interakcijama sa molekulima odvajanih supstanci12. Među hidrofilno modifikovanim silika-gelovima najveću primenu u hromatografiji na tankom sloju imaju cijano-propil- (CN), amino-propil- (NH2) i diol- modifikovani silika-gelovi. Polarne funkcionalne grupe, kod svih ovih sorbenata, vezane su za matriks silika-gela pomoću kratkog nepolarnog dela. Preko polarnih grupa ovi sorbenti ostvaruju specifične interakcije sa sorbendima (normalno-fazna hromatografija), a prisustvo nepolarnih ugljovodoničnih delova na njihovoj površini, omogućava primenu i u reverzno-faznoj hromatografiji9,13. 2.1.1 Reverzno-fazna tankoslojna hromatografija Retencija u reverzno-faznoj tečnoj hromatografiji predstavlja veoma složen proces određen nizom specifičnih i nespecifičnih interakcija koje uključuju vodonično vezivanje, van der Waals-ove i elektrostatičke interakcije14. Do interakcija dolazi između odvajane supstance i rastvarača, između molekula sorbenda i u mobilnoj i u stacionarnoj fazi, između molekula rastvarača u mobilnoj i eventualno stacionarnoj fazi, 7     2 Opšti deo  a značajne su i intramolekulske interakcije alkil-nizova stacionarne faze i međumolekulske interakcije alkil-lanca sa molekulima odvajane supstance i rastvarača. Takođe, alkil modifikovani silika-gel sadrži 30-50 % nemodifikovanih silanolnih grupa sa kojima molekuli analita i rastvarača mogu da interaguju15. Jačina silanofilnih interakcija zavisi od broja efektivnih silanolnih grupa, strukture ispitivanih supstanci, kao i od elucione moći upotrebljene mobilne faze. Postoji više pristupa kojima se objašnjava kompleksan mehanizam razdvajanja u RPTLC sistemu, od kojih su solvofobna teorija i particioni model najšire prihvaćeni. Prema solvofobnoj teoriji Horváth-a i saradnika16,17, stacionarna faza ima pasivnu ulogu i zadržavanje je u najvećoj meri određeno favorizovanim promenama slobodne energije mobilne faze, odnosno mobilna faza potiskuje analit prema stacionarnoj fazi. Solvofobna teorija je kritikovana od strane mnogih autora, jer isključuje mogućnost ulaska molekula sorbenda u šupljine stacionarne faze i interakcije u njima, već kao moguće navodi samo interakcije u šupljinama mobilne faze i asocijaciju dva molekula analita18,19. Prema Carr-u i saradnicima20,21, stacionarna faza ima značajnu ulogu u retenciji, odnosno ukupna slobodna energija retencije nepolarnih jedinjenja je, pre svega, određena doprinosom slobodne energije koja potiče od stacionarne faze. Takođe, prema ovim autorima RP retencioni mehanizam predstavlja više particioni proces nego adsorpciju. Pomenute pristupe, kao i druge koji u ovom radu nisu navedeni, ne treba uzimati a priori jer se jasna razlika između particije i adsorpcije u RP hromatografiji nepolarnih jedinjenja ne može uočiti na osnovu termodinamičke analize22. Za uspešno hromatografsko razdvajanje primenom RPTLC važna komponenta je i mobilna faza. U tom smislu, optimizacija sastava mobilne faze ispitivana je od strane mnogih autora, a rezultati tih istraživanja sumirani u seriji radova23-25. U reverzno-faznoj hromatografiji voda je komponenta koja reguliše elucionu moć mobilne faze, dok su komponente koje se koriste za postizanje određene selektivnosti ograničene na one koje su mešljive sa vodom. Eluciona moć rastvarača u velikoj meri zavisi od upotrebljenog sorbenta i predstavlja meru njegovog kapaciteta da stupi u intermolekulske interakcije, dok selektivnost rastvarača predstavlja meru njegove sposobnosti da ostvaruje specifične intermolekulske interakcije, kao što su Keesom-ove (dipol-dipol) interakcije i vodonične veze. Parametar selektivnosti se karakteriše sa dva 8     2 Opšti deo  različita aspekta, polarnosti i parametra lokalizacije. Polarnost predstavlja meru solvatacione snage rastvarača i određuju ga parametri baznosti, kiselosti i dipolarnosti. Lokalizacioni parametar predstavlja meru sposobnosti rastvarača da ostvari interakcije sa sorbentom, tj. da interaguje na tačno definisan način26. Postoji nekoliko metoda za rangiranje rastvarača prema selektivnosti od kojih je najviše korišćen Snyder-ov trougao selektivnosti27. Klasifikacija rastvarača prema pomenutoj metodi je izvršena na osnovu njihove ukupne polarnosti. Rastvarači koji pripadaju istoj grupi pokazuju slično ponašanje. Solvatohromna skala selektivnosti rastvarača, zasnovana na studijama Kamleta i Taft-a28-30, o uticaju rastvarača na pomeranje apsorpcionog maksimuma solvatohromnog indikatora je, takođe, često korišćena metoda odabira rastvarača. Solvatohromni parametri su parametar π*, koji predstavlja meru dipolarnosti i polarizabilnosti rastvarača, kao i parametri α1 i β1, koji opisuju sposobnosti vodoničnog vezivanja kao proton-donori, odnosno proton- akceptori, redom. Rastvarači se na osnovu pomenutih parametara klasifikuju u određene grupe slične selektivnosti prema polarnim interakcijama. Najnovija, a istovremeno relativno široko prihvaćena, skala selektivnosti zasnovana je na Abraham-ovim parametrima31. Svojstva rastvarača data su veličinama E, S, A, B i V i odnose se redom na: polarizabilnost u višku (u odnosu na n-alkan iste molarne zapremine), dipolarnost, sposobnost građenja vodoničnih veza, pri čemu se supstanca može ponašati kao proton- donor, odnosno proton-akceptor. Date veličine korelišu se sa svojstvom rastvarača koje se odnosi na raspodelu istog između dve faze, za različite grupe supstanci, pri čemu se dobijaju odgovarajući regresioni koeficijenti32. 2.2 Procena lipofilnosti jedinjenja Lipofilnost predstavlja fizičko-hemijsku karakteristiku koja opisuje sposobnost supstance da se više rastvara u lipidima nego u vodi. Ovaj koncept je od velikog značaja u oblasti medicinskih nauka i životne sredine. Lipofilnost utiče na rastvorljivost jedinjenja33 i određuje pasivan transport kroz biološke membrane34. Pored drugih brojnih strukturnih zahteva utiče i na uspostavljanje interakcija u aktivnom mestu 9     2 Opšti deo  receptora35. Lipofilnost je, takođe, povezana sa biodostupnošću i biokoncentrovanjem hemikalija značajnih za životnu sredinu u zemljištu, biljkama i životinjama36. Lipofilnost nekog molekula je rezultat polarnih i nepolarnih interakcija do kojih dolazi u posmatranoj sredini. Nepolarne interakcije (Londonove disperzione sile) mogu da se izjednače sa hidrofobnošću i izraze preko sternih parametara kao što su zapremina molekula, polarizabilnost i molarna refraktivnost. Hidrofobne interakcije pozitivno utiču na lipofilnost. Polarne interakcije, koje obuhvataju jon-jon, jon-dipol, dipol-dipol interakcije i vodonično vezivanje, prikazuju se pomoću elektronskih konstanti, dipolnog momenta ili parametara vodoničnog vezivanja. Na lipofilnost molekula u značajnoj meri utiču i intramolekulske interakcije određene izvesnim strukturnim karakteristikama molekula, kao što su supstitucija na aromatičnom ili heterocikličnom delu molekula, prisustvo π sistema i intramolekulske vodonične veze37. Takođe, konformacione promene u molekulu, uslovljene prirodom sredine u kojoj se molekul nalazi (polarna ili nepolarna), u zavisnosti od prirode grupa „zarobljenih” unutar molekula ili izloženih rastvaraču, mogu da učine molekul hidrofilnijim ili lipofilnijim nego što bi se to očekivalo38,39. Jonizacija molekula, takođe, značajno menja vrstu međumolekulskih interakcija u koje stupa molekul40. Za izražavanje lipofilnosti jedinjenja obično se koristi particioni koeficijent između vode i organskog rastvarača nemešljivog sa vodom. Opsežno ispitivanje lipofilnosti sredinom dvadesetog veka, od strane Hansch-a i Fujita-e41 i Leo-a i saradnika42, rezultovalo je uvođenjem oktanol-voda sistema, kao referentnog sistema za određivanje ovog svojstva. n-Oktanol poseduje izvesne karakteristike zahvaljujući kojima je pogodan za simuliranje biološke membrane. Prisustvo dugačkog alkilnog (hidrofobnog) lanca sa funkcionalnom grupom sposobnom da se ponaša i kao donor i kao akceptor vodonične veze, kao i delimično zasićenje n-oktanola vodom, omogućavaju relativno lakše i pouzdanije eksperimentalno određivanje lipofilnosti42. Lipofilnost izražena kao oktanol-voda particioni koeficijent, u logaritamskom obliku, logPO/W, postala je jedna od najčešće ispitivanih fizičko-hemijskih karakteristika lekova, pesticida i drugih hemikalija36,43,44. Najčešće korišćena metoda za određivanje lipofilnosti u tečno-tečnom sistemu je metoda mućkanja („shake-flask”) u kojoj se vrši raspodela supstance između različitih 10     2 Opšti deo  zapremina 1-oktanola i vode, u levku za odvajanje. Međutim, značajni nedostaci ove metode su slaba reproduktivnost, dužina trajanja eksperimenta, potreba za većom količinom čistih supstanci, kao i nemogućnost primene na veoma hidrofilne, a naročito veoma lipofilne supstance (logPO/W > 5), zbog nepouzdanosti dobijenih rezultata uslovljene malom količinom oktanola u vodi45,46. Lipofilnost jedinjenja se može izraziti i pomoću koeficijenta raspodele supstance u čvrsto-tečnom sistemu, odnosno retencije u reverzno-faznoj visoko-efikasnoj tečnoj ili tankoslojnoj hromatografiji. Osnovne prednosti ovih metoda u odnosu na tradicionalnu proceduru su dužina trajanja eksperimenta, reproduktivnost, neosetljivost na prisustvo nečistoća i degradacionih proizvoda koje se tokom hromatografskog procesa izdvajaju, širi dinamički opseg, on- line detekcija, manje količine uzoraka potrebne za analizu, kao i lakša priprema uzorka47. Revije Hartman-a i Schmitt-a48 i Giaginis-a i Tsantili-Kakoulidou-a49 daju pregled radova koji opisuju hromatografske metode za određivanje lipofilnosti, stacionarne i mobilne faze koje su u tu svrhu korišćene, poteškoće koje se mogu javiti tokom particionog razdvajanja i načina za njihovo rešavanje, kao i pregled naprednih hromatografskih tehnika. Reverzno-fazna TLC metoda predstavlja najčešće korišćenu indirektnu metodu za određivanje lipofilnosti jedinjenja. Retenciona konstanta, RM, predložena od strane Bate-Smith-a i Westall-a50, je najčešće korišćeni retencioni parametar u tankoslojnoj hromatografiji za izražavanje lipofilnosti jedinjenja. Ova vrednost predstavlja logaritamsku funkciju retardacionog faktora: ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −= 11log F M R R (2) Između RM vrednosti i koncentracije organske komponente u mobilnoj fazi najčešće postoji linearna zavisnost51: bCRR MM += 0 (3) U zavisnosti od primenjene organske komponente u mobilnoj fazi, u slučajevima kada se posmatra širok opseg sastava mobilne faze, mogu se uočiti manje ili veće devijacije 11     2 Opšti deo  od linearne zavisnosti52,53. U tim slučajevima, kvadratna jednačina bolje opisuje retenciju supstance u zavisnosti od sastava mobilne faze54: 2 21 0 CbCbRR MM ++= (4) Odsečak RM0 predstavlja RM vrednost ekstrapolisanu na 0 Vol% organske komponente u mobilnoj fazi, odnosno na čistu vodu. Parametar RM0 predstavlja meru raspodele supstance između nepolarne stacionarne faze i polarne (vodene) mobilne faze, opisujući na taj način lipofilnost jedinjenja. Vrednost RM0 se zbog toga uglavnom koristi kao kvantitativni retencioni deskriptor u TLC umesto RM vrednosti koja u velikoj meri zavisi od primenjenih hromatografskih uslova55,56. Parametar b, odnosno nagib u jednačini 3, ukazuje na zavisnost rastvorljivosti supstance, a samim tim i retencije, od sastava mobilne faze. Nagib se uglavnom posmatra kao karakteristika specifične hidrofobne površine odvajane supstance. Dve teorije opisuju vezu između parametra b i specifične hidrofobne površine. Prva teorija povezuje nagib sa brojem molekula mobilne faze koji se nalaze u solvatacionoj sferi supstance, a koji su oslobođeni prilikom formiranja kompleksa stacionarna faza- sorbend57. U slučaju reverzno-fazne hromatografije ova zavisnost je određena nepolarnom (hidrofobnom) površinom molekula. Prema drugoj teoriji, površinski napon mobilne faze se menja sa njenim sastavom, uslovljavajući na taj način i promenu energije formiranja kompleksa stacionarna faza–odvajana supstanca, na mestu koje je upražnjeno oslobađanjem molekula mobilne faze58. Zavisnost između odsečka, RM0 i nagiba, b, za seriju strukturno sličnih jedinjenja, je uglavnom linearna i može se izraziti sledećom jednačinom: baaRM 10 0 += (5) Prisustvo jonogenih grupa koje modifikuju interakcije jedinjenja sa nepolarnom stacionarnom fazom ili polarnom mobilnom fazom, mogu da naruše pomenutu zavisnost. Parametar hidrofobnosti C0, koji predstavlja odnos odsečka (RM0) i nagiba (b), uveden je od strane Bieganowska-e i saradnika59: 12     2 Opšti deo  b RC M 0 0 −= (6) Parametar C0 se može shvatiti kao koncentracija organske komponente u mobilnoj fazi za koju je RM = 0, ili kao hidrofobnost po jedinici specifične hidrofobne površine. Sârbu i saradnici su izneli pretpostavku da visoka linearna zavisnost između odsečka (RM0) i nagiba (b) ne može biti objektivan kriterijum za pronalaženje homologe serije jedinjenja u okviru serije strukturno sličnih molekula, jer su korišćenjem metode rasplinute regresije (fuzzy regression) pokazali da su pomenuti parametri uvek visoko korelisani60. Uzimajući u obzir ove rezultate, kao i druge nedostatke regresionog modela, kao što su logaritamska skala i ekstrapolacija, predložili su korišćenje skorova dobijenih primenom metode analize glavnih komponenata (Principal Component Analysis, PCA) na retencionim podacima, kao parametara za opisivanje lipofilnosti61-63. U hromatografiji su dve glavne komponente (PC1 i PC2) uglavnom dovoljne za opisivanje najvećeg dela varijabiliteta među retencionim podacima. Jedna od komponenata uglavnom pokazuje visoku korelaciju sa lipofilnošću, veličinom molekula ili sternim faktorima, dok je druga komponenta više određena dipol-dipol interakcijama i elektronskim faktorima. Sva četiri navedena hromatografska deskriptora, RM0, b, C0 i PC1, se u istoj meri koriste za određivanje lipofilnosti supstanci i podjednako su zastupljeni u hromatografskoj literaturi64,65. Lipofilnost je bila prva fizičko-hemijska karakteristika za koju su razvijene metode za predviđanje. Danas postoji dosta softverskih paketa za izračunavanje lipofilnosti. Računske metode se zasnivaju ili na podstrukturama u molekulu (Substructure-Based Methods)66 ili na odgovarajućim svojstvima molekula (Property- Based Methods)67. Osnovni princip izračunavanja zasnovanog na podstrukturama je podela molekula na fragmente (tzv. fragmentaciona metoda) ili svođenje na nivo jednog atoma (tzv. atomska metoda) i naknadnog sabiranja dosprinosa pojedinih podstruktura konačnoj logP vrednosti. Metode koja se zasnivaju na svojstvima molekula podrazumevaju korišćenje deskriptora koji opisuju ceo molekul (trodimenzionalni i topološki deskriptori) za izračunavanje logP vrednosti. Na osnovu nekoliko 13     2 Opšti deo  fragmentacionih metoda, kao što su Fujita-Hansch-ova metoda68, Rekker-ova metoda69 i Hancsh-Leo-ova metoda70, kao i njihovih kombinacija, razvijeni su različiti softverski paketi. Neki od njih su: KLOGP, KOWWIN, CLOGP, ACD/LogP. Softverski paketi koji se zasnivaju na izračunavanjima na osnovu atoma su MOLCAD, TSAR, PrologP, ALOGP98 i XLOGP. Neki od programa za izračunavanje logP vrednosti kod kojih se uzimaju u obzir određene karakteristike molekula su: ABSOLV, ChemProp, VolSurflogP, MlogP, AlogPS, CSlogP. Uprkos velikoj raznolikosti razvijenih metoda, svaka ukazuje na značaj veličine molekula i sposobnosti građenja vodoničnih veza za tačno predviđanje lipofilnosti. 2.3 Ispitivanje kvantitativnog odnosa strukture i retencije Od 1977. godine u literaturi počinju da se pojavljuju radovi koji govore o nečemu što se danas označava kao ispitivanje kvantitativnog odnosa strukture i retencije (Quantitative Structure-Retention Relationships, QSRR)71,72. QSRR nastaje kao rezultat primene metodologije koja se koristi u ispitivanjima kvantitativnog odnosa strukture i biološke aktivnosti (Quantitative Structure-Activity Relationships, QSAR) na analizu hromatografskih podataka. Ovakve studije se u velikoj meri primenjuju na retencionim podacima dobijenim HPLC, GC i TLC metodama. Osnovni ciljevi, problemi i zablude koje prate ovakva istraživanja, kao i validacije modela i sugestije za dalji rad, kroz opsežan pregled publikacija, dati su u nekoliko revijalnih radova73-76. Dva tipa ulaznih podataka su potrebna za QSRR analize: set kvantitativno uporedivih retencionih podataka za dovoljno veliku grupu jedinjenja i set koji objedinjuje različite parametre koji odražavaju strukturne karakteristike tih jedunjenja77. Za relevantan QSRR model neophodan je pouzdan ulazni set podataka, odnosno pravilan odabir molekula i njihovih deskriptora, kao i odgovarajuća statistička analiza. Poželjno je da ispitivana jedinjenja pripadaju homologoj seriji, jer je u suprotnom teško dobiti linearnu zavisnost između retencionih parametara i deskriptora78. Ukoliko se QSRR analiza primenjuje na set strukturno različitih jedinjenja, najbolji rezultati se postižu ukoliko se početni set podeli na grupe koje sadrže strukturno slične fragmente79. 14     2 Opšti deo  Dobijanje QSRR modela sastoji se u utvrđivanju i optimizaciji matematičke zavisnosti između deskriptora i hromatografskih parametara primenom različitih statističkih tehnika za multivarijantnu analizu podataka. Najčešće hemometrijske metode koje se koriste u QSRR studijama su: analiza glavnih komponenata (Principal Component Analysis, PCA), klasterska analiza (Cluster analysis), višestruka linearna regresija (Multiple Linear Regression, MLR), regresija glavnih komponenata (Principal Component Regression, PCR), regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata (Partial Least Square, PLS), veštačke neuronske mreže (Artificial Neural Networks, ANN)80. Kao prvi korak u analizi multivarijantnih podataka preporučuje se primena kategorijski nedefinisanih metoda (unsupervised methods) u cilju sagledavanja strukture podataka (detekcije klastera ili spoljašnjih vrednosti) što može biti značajno za dalje razvijanje klasifikacionih ili kalibracionih modela. Ukoliko se dobije statistički značajan i razumljiv QSRR model, on može da se iskoristi za predviđanje retencije novih, srodnih jedinjenja81; za identifikaciju strukturnih deskriptora koji najviše utiču na retenciono ponašanje u posmatranim uslovima; za objašnjenje mehanizma razdvajanja u primenjenom hromatografskom sistemu82; za određivanje složenih fizičko-hemijskih svojstava jedinjenja (različitih od hromatografskih)83,84; kao i za predviđanje relativne biološke aktivnosti saglasno činjenici da je ista određena lipofilnošću jedinjenja i interakcijama sa aktivnim centrom receptora85. 2.3.1 Deskriptori molekulske strukture Molekulski deskriptori predstavljaju rezultat „prevođenja molekula u brojeveˮ čime je omogućena matematička obrada hemijskih informacija sadržanih u molekulu78. Za određenu hemijsku strukturu pomenuti parametri se dobijaju na osnovu hemijske građe, topologije, geometrije, talasne funkcije i površinske potencijalne energije molekula. U literaturi su opisane hiljade deskriptora, od jednostavnih koji daju broj veza ili atoma u molekulu, do složenih koji uzimaju u obzir trodimenzionalnu strukturu i konformacione promene86. 15     2 Opšti deo  Prema definiciji Todeschini-ja i Consonni-ja molekulski deskriptor je konačan rezultat logičkog i matematičkog postupka kojim se transformiše hemijska informacija, kodirana u simboličnom predstavljanju molekula, u koristan broj ili rezultat nekog standardizovanog eksperimenta87. Prema ovoj definiciji, molekulski deskriptori su podeljeni u dve kategorije: eksperimentalne vrednosti, odnosno empirijski deskriptori, kao što su logP, rastvorljivost u vodi (logS), kiselinske konstante i teorijski (neempirijski) molekulski deskriptori, koji proističu iz simboličke prezentacije molekula, kao što su molarna refraktivnost, polarizabilnost, kvantno-hemijski indeksi izračunati semi-empirijskim metodama, strukturni deskriptori dobijeni iz molekulske formule (topološki deskriptori), itd. Eksperimentalno određeni parametri su veoma korisni u ispitivanjima odnosa strukture i različitih svojstava jedinjenja jer na najbolji način odražavaju hemijsku strukturu molekula. Ovakvi deskriptori su, međutim, dostupni za mali broj jedinjenja, zbog čega je u pomenutim analizama neophodno koristiti izračunate deskriptore. Upoređujući dve vrste molekulskih deskriptora, dobijenih za seriju odabranih primarnih amina, primenom PCA i PLS metoda, Andersson i saradnici su potvrdili da izračunati deskriptori sadrže slične informacije o hemijskoj strukturi molekula kao i ekperimentalno određeni parametri88. Za izračunavanje teorijskih molekulskih deskriptora primenjuje se više razlitičitih komjuterskih programa zasnovanih na matematičkim modelima kojima se opisuje položaj i ponašanje atoma. Za proučavanje molekulskih sistema primenjuju se klasično- mehaničke i kvantno-mehaničke teorije. Klasično-mehanički pristup predstavlja metodu za lociranje optimalne geometrije molekula. Molekulsko-mehanička MM+ metoda je najčešće primenjivana i zasniva se na pretpostavci da potencijalna energija rasporeda atomskih jezgara u molekulu zavisi samo od međusobnog položaja jezgara, a ne i od položaja elektrona. Kvantno-mehaničke metode se zasnivaju na rešavanju Šredingerove jednačine semi-empirijskim i ab initio pristupom. Semi-empirijske metode koriste eksperimentalne podatke za pojednostavljenje Šredingerove jednačine, dok ab initio metode koriste samo matematičke aproksimacije89. Najčešće korišćena semi-empirijska metoda je Austin model 1 (AM1)90. Ova metoda se često koristi kod izračunavanja kvantno-mehaničkih deskriptora glomaznih molekula za koje ab initio proračuni jako 16     2 Opšti deo  dugo traju i prilično su skupi. Takođe, naelektrisanja, dipoli i dužine veza izračunati AM1 metodom pouzdaniji su od nekih ab initio metoda91. Metoda AM1 pouzdano reprodukuje elektronske osobine velikog broja supstituenata92. Za izračunavanja molekulskih deskriptora u okviru ove doktorske disertacije korišćeni su programi HyperChem i Molecular Modeling Pro. HyperChem je veoma pogodan za optimizaciju, manipulaciju i vizualizaciju molekula, kao i za molekusko mehanička, semi-empirijska i ab initio kvantno-mehanička izračunavanja koja se izvode simultano. Izračunavanja različitih energija minimizacije (geometrijska optimizacija) i molekulske dinamike daju uvid u molekulsku strukturu i fleksibilnost molekula. Molecular Modeling Pro program je specijalizovan za brza i efikasna određivanja odnosa struktura-svojstvo78 i u velikoj meri ga primenjuju hemičari koji se bave ispitivanjima odnosa između različitih svojstava molekula (QSAR, QSPR, QSRR). Molekulski deskriptori koji se najčešće koriste u QSRR analizi, klasifikovani na osnovu povezanosti sa određenom karakteristikom molekula, navedeni su u Tabeli 1. Tabela 1. Najčešće korišćeni deskriptori molekulske strukture Fizičko-hemijski empirijski i semi- empirijski parametri Hammett-ova konstanta, hidrofobne konstante, Taft- ove sterne konstante, rastvorljivost, solvatohromni parametri, particioni koeficijenti, temperatura ključanja Deskriptori povezani sa geometrijom molekula Dužina molekula, širina molekula, dubina molekula Particioni koeficijenti, parametri za opisivanje hidrofobnosti molekula Parametar lipofilnosti - logP, hidrofilno-lipofilni balans, hidrofilna površina, polarna površina Deskriptori povezani sa veličinom molekula (Konstitucioni deskriptori) Molekulska masa, refraktivnost, polarizabilnost, van der Walls-ova zapremina i površina Deskriptori povezani sa polarnošću molekula Dipolni momenat, ukupni dipol, energija molekulskih orbitala, akceptor i donor vodonične veze Deskriptori povezani sa molekulskom grafikom (Topološki parametri) Indeksi konektivnosti, Kappa indeksi, Valencioni indeksi Deskriptori povezani sa osobinama polimera i surfaktanata Površinski napon, rastvorljivost 17     2 Opšti deo  2.3.2 Analiza glavnih komponenata Analiza glavnih komponenata je multivarijantna metoda za određivanje linearnih latentnih varijabli (komponenata). Može se shvatiti kao metoda pomoću koje se formira novi koordinatni sistem sačinjen od međusobno normalnih latentnih varijabli usmerenih na pravac najvećeg varijabiliteta među podacima93. PCA uzima u obzir sve varijable i može se primeniti na bilo koju matricu podataka X, pri čemu se y-podaci ne uzimaju u obzir. Smanjenje dimenzija podataka koristi se u cilju: • Vizualizacije multivarijantnih podataka pomoću grafika rasutosti (scatter plot). • Prevođenja visoko-korelisanih x-varijabli u manji set nekorelisanih latentnih varijabli koje mogu da se koriste u daljoj hemometrijskoj analizi. • Razdvajanja značajnih informacija sadržanih u podacima (opisanih pomoću nekoliko latentnih varijabli) od onih koje su manje bitne. PCA primenjena za analizu retencionih podataka dobijenih RPTLC daje značajne informacije o ispitivanim jedinjenjima. Vrednosti skorova (linearna kombinacija retencionih podataka) koji odgovaraju prvoj glavnoj komponenti mogu se smatrati parametrima lipofilnosti, kako je naglašeno u ranijem tekstu. Grafik zavisnosti skorova prve od druge glavne komponente razdvaja jedinjenja po lipofilnosti ukazujući na postojanje odgovarajućih kongenernih serija, dok grafik koeficijenata latentnih varijabli daje uvid u mehanizam razdvajanja i ponašanje jedinjenja u primenjenim hromatografskim sistemima63,94-96. PCA razdvaja značajne informacije sadržane u retencionim podacima od informacija koje ne doprinose određivanju lipofilnosti jedinjenja, čime se eliminišu eksperimentalne greške uočene u regresionoj proceduri, kao i precenjene vrednosti dobijene postupkom ekstrapolacije. U QSRR studijama PCA se izvodi kao uvodna multivarijantna analiza podataka dobijenih hromatografskom analizom i izračunatih primenom različitih kompjuterskih programa. Primena PCA na retencione podatke ukazuje na sličnosti koje postoje između ispitivanih supstanci, a koje su određene njihovim strukturnim karakteristikama, kao i specifičnim interakcijama do kojih dolazi u različitim hromatografskim sistemima13,55,97. PCA može da ukaže i na različit uticaj organskih modifikatora i 18     2 Opšti deo  19    stacionarnih faza na retenciju, postojanje razlika između organskih rastvarača koji se koriste kao komponente mobilnih faza98,99, kao i između primenjenih stacionarnih faza100. Takođe, PCA primenjena na vrednosti molekulskih deskriptora grupiše jedinjenja na osnovu sličnosti u strukturi13,55,97,98. PCA je osetljiva na prisustvo rezultata koji su posledica grubih grešaka. Ovakve vrednosti u velikoj meri povećavaju varijansu, a pošto su glavne komponente u PCA usmerene na pravac najvećeg varijabiliteta, one bi značajno uticale na ishod analize. U tom smislu, ukoliko se posmatra homologa serija jedinjenja, PCA može da ukaže na prisustvo spoljašnjih vrednosti koje bi trebalo ukloniti pre konačnog modelovanja13,59,97,101. PCA se sastoji u pronalaženju pravca među varijablama koji na najbolji način odražava relativno rastojanje između objekata i opisuje maksimum varijanse skorova. Skorovi predstavljaju projekcije vrednosti podataka na latentnu varijablu, odnosno pravac. Ovaj pravac se naziva prva glavna komponenta (PC1) i definiše se pomoću vektora koeficijenata latentnih varijabli (loading vector): ( mppp ,,, 211 K=p ) (7) gde je m broj varijabli. Odgovarajući skorovi (označeni sa t) predstavljaju linearnu kombinaciju koeficijenata i varijabli. Za n objekata sortiranih u redove u matrici X, skor vektor t1 prve glavne komponente određen je sledećom zavisnošću: 11 pXt ⋅= (8) Druga glavna komponenta (PC2) predstavlja pravac normalan na PC1 kojim se opisuje maksimum preostalog varijabiliteta među podacima. Sve dalje glavne komponente su normalne na prethodne i njihov pravac pokriva varijanse među podacima projektovane na posmatrani pravac. Ukupan broj glavnih komponenata jednak je broju varijabli93. Na Slici 1 dat je šematski prikaz PCA; svi vektori koeficijenata latentnih varijabli predstavljeni su kao kolone u matrici koeficijenata, P, dok su svi vektori skorova predstavljeni kao kolone u matrici skorova, T ( PXT ⋅= ).  2 Opšti deo  pj2 1 a 1 pj1 p1 p Grafik koef.lat.var. (m varijabli) Koef. PC1lat.var. Matrica PCA koef.lat.var. m ti2 Varijable 1 j m 1 ti1 T = X . P Grafik skorova Objekti (n objekata) Matrica PCA skorova i t1 n Skorovi PC1 Varijanse Varijanse PCA varijabli skorova X Slika 1. Šematski prikaz PCA metode Broj glavnih komponenata se u najvećem broju slučajeva određuje pomoću grafika zavisnosti broja komponenata od varijanse PCA skorova (Slika 2). Saglasno definiciji, PC1 poseduje najveću varijansu dok svaka naredna glavna komponenta opisuje sve manji udeo varijabiliteta. Na pomenutom grafiku kriva naglo opada posle nekoliko prvih komponenata, jer je najveći deo varijanse objašnjen pomoću njih. Preostale glavne komponente sa niskim vrednostima varijansi pružaju informacije koje su od malog značaja za posmatranu analizu. Tačka u kojoj kriva odjednom postaje ravna predstavlja broj glavnih komponenata koje bi trebalo uzeti u obzir za dalju analizu. Pojedini programi za obradu podataka koriste svojstvene vrednosti na pomenutim graficima zavisnosti, koje su identične varijansama skorova. Kumulativna varijansa, νcumul, PCA skorova pokazuje koliki deo ukupne varijanse je obuhvaćen određenim brojem glavnih komponenata (Slika 2b). Po pravilu, broj glavnih komponenata koji se 20     2 Opšti deo  uzima za dalju obradu bi trebalo da objašnjava najmanje 80% ukupne varijanse podataka80. 100 40 80 30 60 20 40 10 20 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Broj glavnih komponenata Broj korišćenih PCA komponenata v v C U M U L Slika 2. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od a) varijanse PCA skorova (udeo u ukupnoj varijansi), b) kumulativne varijanse PCA skorova. Početni set podataka bi trebalo centrirati u odnosu na srednju vrednost ili autoskalirati na nulu srednje vrednosti i jedinicu varijanse pre početka PCA. Na taj način svaka varijabla dobija istu „težinuˮ za PCA. Međutim, u izvesnim slučajevima skaliranje podataka ima neželjene efekte. Naime, varijable za koje se zna da sadrže malu količinu informacija, posle centriranja, odnosno autoskaliranja postaće značajne koliko i varijable koje sadrže značajnije informacije. PCA ne može da napravi razliku između značajnih i informacija od malog značaja, već izražava što je moguće više varijabiliteta među podacima. U slučajevima kada je značaj pojedinih varijabli poznat, a među varijablama postoje one koje su manje značajne, podatke ne bi trebalo skalirati pre početka analize80. 2.3.3 Komplementarne metode za opisnu analizu podataka PCA je najčešće korišćena metoda za opisnu analizu (exploratory analysis) multivarijantnih podataka. Razvijene su, međutim, i nelinearne metode, 21     2 Opšti deo  komplementarne PCA metodi, kao što su klasterska analiza, faktorska analiza, Kohonen-ovo mapiranje i Sammon-ovo nelinearno mapiranje. Navedene metode daju bolji prikaz strukture podataka od PCA u slučajevima kada linearna projekcija varijabli ne daje dovoljno informacija zbog kompleksne strukture podataka80. Prednosti PCA se ogledaju u jasnoj definiciji metode i mogućnosti interpretacije rezultata preko grafika skorova i grafika koeficijenata latentnih varijabli. Takođe, nedostatak nelinearnih metoda u odnosu na PCA je postojanje parametara koji se mogu podešavati, kao što su metode za određivanje udaljenosti objekata i metode za povezivanje istih kod klasterske analize, redukcija podataka kod faktorske analize, itd. Klasterska analiza predstavlja nelinearnu metodu kojom se u setu multivarijantnih podataka pronalaze grupe sličnih objekata (u prostoru varijabli), ili varijable (u prostoru objekata), ili varijable i objekti istovremeno. Ova metoda pretpostavlja da su informacije o strukturi grupa sadržane u podacima, ali i da određeni objekat, odnosno varijabla, ne pripada samo jednoj grupi, već može biti deo dve ili više grupa80,93. U tom smislu, klasterska analiza često daje rezultate koje je teško objasniti, u smislu sličnosti objekata ili varijabli, zbog čega su u literaturi predloženi mnogi algoritmi koji se zasnivaju na različitim principima. Najznačajnije metode klasterske analize su sledeće: • Particiona metoda, u kojoj je svaki objekat, odnosno varijabla, pripisana samo jednoj grupi. • Hijerarhijska metoda, u kojoj su objekti, odnosno varijable i particije organizovane hijerarhijski. Odgovarajuća grafička prezentacija rezultata ima izgled dendrograma. Na dobijenom grafiku je moguće odrediti optimalan broj klastera i videti hijerarhijski odnos između različitih grupa objekata, odnosno varijabli. • Metoda rasplinutog klasterovanja (Fuzzy clustering methods), u kojoj je svaki objekat, odnosno varijabla, pripisana određenom klasteru na osnovu vrednosti koeficijenta pripadnosti toj grupi. Ovaj koeficijent je normiran i nalazi se u intervalu [0, 1], a može da se interpretira kao verovatnoća da je neki objekat, odnosno varijabla, pripisana određenom klasteru. 22     2 Opšti deo  • Metoda grupisanja po određenom modelu, u kojoj različiti klasteri prate određeni model, kao što je multivarijantna normalna distribucija sa određenom srednjom vrednošću i kovarijansom. Hijerarhijska metoda je najčešće korišćena metoda za klastersku analizu. U okviru nje postoje dve procedure za formiranje klastera: • Aglomerativna metoda, pri kojoj na prvom hijerarhijskom nivou svaki od objekata, odnosno varijabli, formira zasebne klastere. U sledećem nivou dva najbliža klastera se spajaju, pri čemu se postupak nastavlja sve dok svi objekti ne budu u jednom klasteru. • Metoda razdvajanja (separaciona metoda), pri kojoj su na prvom hijerarhijskom nivou svi objekti, odnosno varijable, u jednom klasteru. Na sledećem nivou, prvobitni klaster se razdvaja na dva manja klastera, od kojih se svaki u narednom nivou razdvaja na još dva i postupak ponavlja sve dok svaki od objekata, odnosno varijabli, ne formira zaseban klaster. Razdvajanje ili spajanje klastera u pomenutim hijerarhijskim metodama zasniva se na sličnostima i udaljenosti između klastera. Udaljenost između dva klastera određuje se različitim metodama od kojih su najzastupljenije: potpuno povezivanje (complete linkage), pojedinačno povezivanje (single linkage), prosečno povezivanje (average linkage), metoda centroida (centroid method) i Ward-ova metoda. Sve pomenute metode predstavljaju funkciju rastojanja između objekata, odnosno varijabli, kao što su Euclidean-ova razdaljina, Manhattan-ova razdaljina, Minkowski razdaljina ili Mahalanobis-ova razdaljina. Metoda potpunog povezivanja uzima u obzir maksimum svih međusobnih rastojanja između objekata koji pripadaju klasteru j i onih koji pripadaju klasteru l. Posledica ovakvog određivanja rastojanja između klastera je da, ukoliko su samo dva objekta iz dva klastera daleko, rastojanje između klastera će biti veliko. Suprotno ovoj metodi, kod pojedinačnog povezivanja se koristi minimalno rastojanje između dva objekta iz susednih klastera, zbog čega će ono biti malo ukoliko postoje dva objekta koja su dovoljno blizu, nezavisno od ostalih objekata iz posmatranih klastera. Metoda prosečnog povezivanja izračunava srednju vrednost rastojanja između svih parova objekata u dva klastera, odnosno izračunava sumu rastojanja svih 23     2 Opšti deo  međusobnih klastera i deli je sa brojem parova. Metoda centroida određuje rastojanje između centroida dva klastera. Pomenute metode, međutim, ne dovode do povećanja rastojanja unutar klastera zbog čega je vizualizacija rezultata otežana. Ovaj problem je prevaziđen korišćenjem korekcionog faktora koji se primenjuje u Ward-ovoj metodi80. U QSRR studijama klasterska analiza se izvodi kao dodatak PCA metodi u cilju grupisanja sličnih objekata (supstanci) ili varijabli (molekulskih deskriptora) na jednostavniji način i kao pomoć u razumevanju rezultata dobijenih PCA metodom13. 2.3.4 Kalibracija Jedan od osnovnih zadataka u nauci i tehnologiji je modelovanje određene osobine y sa jednom ili više varijabli x. Modeli opšteg oblika y = f(x) ili y = f(x1, x2,......,xm) mogu biti linearni ili nelinearni, mogu biti izraženi jednostavnim jednačinama zavisnosti ili manje uočljivim algoritamskim korelacijama. Ovaj rad je fokusiran na linearne modele opšteg oblika: exbxbxbxbay mmjj +++++++= LL2211 (9) gde je b0 odsečak, b1 – bm su regresioni koeficijenti, m je broj varijabli i e je odstupanje (rezidual). Regresija može biti izvedena korelisanjem zavisno promenljive sa vrednostima varijabli, kao što je to slučaj kod višestruke linearne regresije, ili pomoću malog seta intermedijalnih linearnih latentnih varijabli, odnosno komponenata, kod metoda kao što su regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata i regresija glavnih komponenata. Osnovni cilj pomenutih metoda je što tačnije određivanje vrednosti b0, b1 – bm, kao i greške predikcije. Svi modeli za predviđanje imaju smisla samo ako je odgovarajući kriterijum za određivanje performansi modela definisan i primenjen. Za analize zasnovane na regresiji, reziduali, tj. greške predviđanja, ei, su osnova za određivanje karakteristika modela: iii yye ˆ−= (10) 24     2 Opšti deo  sa yi vrednostima koje odgovaraju eksperimentalnim podacima i predviđenim, tj. modelovanim vrednostima, određenog objekta i. Parametri modela koji samo pokazuju koliko se dobro model uklapa u dobijene podatke nisu prihvatljivi; neophodno je realno određivanje performansi primenom modela na novim podacima. U zavisnosti od veličine seta podataka, odnosno broja raspoloživih objekata, postoji nekoliko načina modelovanja80: iyˆ 1. Ukoliko su na raspolaganju podaci za veliki broj objekata, najbolje je podatke podeliti na tri seta: set za obuku (training set), koji sadrži približno 50% objekata i služi za kreiranje modela, set za validaciju (validation set), sa oko 25% objekata, za optimizaciju modela u cilju povećanja njegove efikasnosti i set za predikciju (prediction, test set), za testiranje krajnjeg modela na novim objektima u cilju dobijanja realne slike o mogućnosti predikcije. Sva tri seta se obrađuju posebno. Primena opisane tehnike u hemiji je retka zbog toga što je često nemoguće obezbediti dovoljan broj objekata za ovakva modelovanja93. 2. U realnim uslovima, podatke je najčešće moguće podeliti na set za kalibraciju, koji se koristi za kreiranje i optimizaciju modela i set za predikciju. Kalibracioni set je podeljen na set za obuku i validacioni set pomoću unakrsne validacije (cross validation, CV). Pomenutom tehnikom najpre se određuje optimalna kompleksnost modela, kao optimalan broj PLS komponenata ili varijabli za MLR analizu, a potom se konstruiše model na čitavom kalibracionom setu i dobijena zavisnost primenjuje na test setu. 3. U slučaju manjeg broja objekata, CV metodom je moguće podeliti početne podatke na kalibracioni i test set. Kalibracioni set se koristi za dobijanje optimalnog modela koji se potom primenjuje na setu za predikciju. Svi objekti ulaze i u set za obuku, i u set za validaciju i u set za predikciju, ali se jedan određeni objekat nikada ne koristi istovremeno i za kreiranje i za testiranje modela. 4. Kada se obrađuje jako mali broj objekata, svi podaci mogu da se koriste kao kalibracioni set, dok se CV metoda koristi za određivanje kompleksnosti modela. Zbog nedostatka test seta, predikciona moć dobijene zavisnosti je u najvećem broju slučajeva previše optimistična. 25     2 Opšti deo  5. Model može da se kreira i iz svih podataka bez bilo kakve metode za optimizaciju i da se potom primeni na istim podacima. U ovom slučaju rezultujuća greška predikcije je uglavnom previše optimistična i ovaj postupak bi trebalo izbegavati. Podela objekata na set za obuku, validaciju i predikciju se, u najvećem broju slučajeva, izvodi jednostavnom metodom slučajnog uzorka. Međutim, postoje i sofisticiranije metode zasnovane na eksperimentalnom dizajnu i teoriji uzorkovanja. U hemometriji se često koristi Kennard-Stone-ov algoritam po kojem se kalibracioni set formira tako da bude reprezentativan za čitavu populaciju, da uniformno pokriva x- prostor i da obezbedi odgovarajuću težinu objektima udaljenim od centra102. Ovo se ostvaruje odabirom objekata na maksimalnoj razdaljini u x-prostoru (npr. Euclidean-ova razdaljina). Sa povećanjem broja nezavisno promenjivih u modelu, odnosno sa povećanjem kompleksnosti modela, greška predikcije za kalibracioni set se smanjuje. To bi značilo da se dovoljno kompleksan model može uklopiti u bilo koje podatke sa zanemarljivom devijacijom (rezidualima) između eksperimentalnih (pravih) i modelovanih (predviđenih) y-vrednosti. Ovakav model je, međutim, najverovatnije precenjen (overffitted) i često nije koristan za nove objekte. Generalno, greške predikcije za test set su minimalne u „srednjeˮ kompleksnim modelima. U hemometriji, kompleksnost modela se kontroliše brojem PLS i PCA komponenata, kao i broja varijabli, a optimalna kompleksnost modela se određuje pomoću unakrsne validacije103. CV omogućava određivanje greške predviđanja za svaki objekat u kalibracionom setu, na svakom nivou kompleksnosti modela. Slika 3 prikazuje tri moguća načina određivanja optimalne kompleksnosti regresionog modela80. 1. Određivanje tzv. globalnog minimuma, koji predstavlja kompleksnost modela koji pokazuje minimalnu vrednost greške predviđanja za validacioni set. Ovakav model je obično precenjen. 2. Određivanje tzv. lokalnog minimuma za dobijanje jednostavnijih modela koji nisu precenjeni. 3. Prema “pravilu jedne standardne devijacije” pretpostavlja se da za model određene kompleksnosti postoji više vrednosti grešaka predikcije, što se postiže 26     2 Opšti deo  primenom unakrsne validacije. Srednja vrednost i standardna greška se izračunavaju za modele različite kompleksnosti i bira se najjednostavniji model čija je srednja vrednost greške predikcije jednu standardnu devijaciju iznad minimalne srednje greške predikcije. Slika 3b prikazuje ovaj postupak, pri čemu tačke na grafiku predstavljaju srednje vrednosti grešaka predikcije, dok je horizontalna linija povučena kroz tačku koja odgovara vrednosti globalnog minimuma plus jedna standardna devijacija. Najjednostavniji model se bira tako da srednja greška predikcije bude ispod pomenute linije. Greška Greška predikcije predikcije Globalni minimum Rezultat „pravila Lokalni minimum jedne standardne devijacijeˮ Sr. Vr. +S -S 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Kompleksnost modela Kompleksnost modela (broj PLS komponenata) (broj PLS komponenata) Slika 3. Načini određivanja optimalne kompleksnosti regresionog modela. Kvalitet modela određen je greškom predikcije, odnosno rezidualima, , dobijenim za nezavisni test set, ili unakrsnom validacijom. Postoji veći broj različitih parametara koji se koriste za opisivanje raspodele grešaka, a izvode se iz reziduala. Često korišćena veličina je tzv. standardna greška predikcije (standard error of prediction, SEP) koja se definiše na sledeći način: ii yy ˆ− ( ) ( )∑ ∑ = = −= −−−= z i ii z i ii yy z bias biasyy z SEP 1 1 2 ˆ1 ˆ 1 1 (11) 27     2 Opšti deo  gde je yi eksperimentalna vrednost, predviđena (modelovana) vrednost, z broj predikcija (koji u slučaju unakrsne validacije može biti veći od broja objekata), bias pristrasnost, odnosno greška predubeđenja. Greška predubeđenja predstavlja aritmetičku sredinu grešaka predikcije i ukoliko ne postoje sistematske greške, trebalo bi da bude bliska nuli. Primenom prethodne jednačine na kalibracioni set dobija se veličina koja se označava kao standardna greška kalibracije (standard error of calibration, SEC). iyˆ Srednje kvadratno odstupanje ili srednja kvadratna greška (mean squared error, MSE) predstavlja srednju vrednost kvadrata grešaka: ( )∑ = −= z i ii yyz MSE 1 2ˆ1 (12) MSEC se odnosi na rezultate iz kalibracionog seta, MSECV na rezultate dobijene unakrsnom validacijom i MSEP na rezultate iz test seta. MSE i SEP se nalaze u sledećem odnosu: 22 biasMSESEP −= (13) Pojmovi koji se koriste u multivarijantnoj analizi podataka su i koren srednjeg kvadratnog odstupanja (root mean squared error, RMSE) koji može biti određen za kalibraciju (RMSEC), unakrsnu validaciju (RMSECV) i predikciju (RMSEP). U slučaju zanemarljive vrednosti sistematske greške, RMSEP i SEP su gotovo identični, kao i MSEP i SEP2. ( )∑ = −= z i ii yyz RMSE 1 2ˆ1 (14) U unaksnoj validaciji često se koristi veličina označena kao suma kvadrata odstupanja od predviđenih vrednosti (predicted residual error sum of squares, PRESS), koja predstavlja sumu kvadrata grešaka: ( )∑ = ⋅=−= z i ii MSEzyyPRESS 1 2ˆ (15) 28     2 Opšti deo  Postupak odabira manjeg seta (m) od velikog broja varijabli (n) naziva se selekcija varijabli i koristi se prilikom konstruisanja višestrukog linearnog regresionog modela. Parametar koji se koristi kao kriterijum za odabir najboljeg MLR modela u procesu selekcije varijabli je tzv. korigovani (podešeni) koeficijent determinacije (adjusted coefficient of determination, R2adj) koji se može izraziti na jedan od sledeća dva načina: ( )22 1 1 11 R mn nRadj −−− −−= ( )( ) ( ) ( )∑ ∑ −= −= − −−−= = 2 1 2 2 ˆ 1 11 yyTSS yyRSS nTSS mnRSSR i n i ii adj (16) (17) gde je R2 koeficijent determinacije, tj. deo varijanse koji je objašnjen modelom, RSS (residual sum of squares) je suma kvadrata odstupanja, TSS (total sum of squares) je ukupna suma kvadrata odstupanja, tj. suma kvadrata razlika aritmetičke sredine eksperimentalnih vrednosti y i svake vrednosti y pojedinačno. Unakrsna validacija predstavlja korisnu alatku koja rešava problem dve kritične funkcije u hemometriji: • omogućava određivanje optimalne kompleksnosti modela, odnosno broja glavnih komponenata u PCA ili PCR modelu, ili broja latentnih varijabli u PLS modelima, i • omogućava određivanje performansi modela kada se primeni na nepoznatim podacima. Unakrsna validacija se zasniva na nizu analiza koje se označavaju kao sub- validacioni eksperimenti. Svaki eksperiment se izvodi tako što se za odabrani set podataka konstruiše model koji se potom primeni na preostale podatke. Na ovaj način, svaki sub-validacioni eksperiment uključuje testiranje modela na objektima koji nisu korišćeni za njegovo dobijanje. Unakrsna validacija uglavnom uključuje više od jednog 29     2 Opšti deo  sub-validacionog eksperimenta, od kojih svaki odabira različite podsetove uzoraka za građenje modela i njegovo testiranje. U statistici postoji nekoliko različitih metoda za unakrsnu validaciju koje se razlikuju prema načinu odabira podsetova za sub- validacioni eksperiment80. Svojstva pet različitih metoda za unakrsnu validaciju dostupnih u okviru statističkog paketa PLS_Toolbox za Matlab, koji je korišćen u ovoj disertaciji za statističku obradu rezultata, biće u ovom delu rada prodiskutovane. Pri narednim opisivanjima pojedinih metoda unakrsne validacije, n predstavlja ukupan broj objekata u setu podataka, dok je s broj podela podataka specifičan za određenu proceduru, koji mora biti manji od n/2. Pet pomenutih metoda su: metoda preklapanja (venetian blinds), metoda susednih blokova (contiguous blocks), metoda slučajnog podseta (random subset), metoda izostavljanja jednog objekta (leave-one-out) i uobičajena metoda (custom). • Metoda preklapanja predstavlja metodu kod koje se test set formira tako što se među podacima jedan objekat označi sa s- i svi objekti počevši od onog numerisanog kao prvi do s-tog objekta čine test set104,105. Ova metoda je jednostavna i laka za primenu ukoliko postoji relativno veliki broj objekata kod kojih nije utvrđena određena pravilnost u redosledu. • Kod metode susednih blokova svaki test set je određen odabirom susednih blokova koji sadrže n/s objekata iz seta podataka, počevši od prvog objekta u nizu105. Slično prethodnoj metodi, ovaj način unakrsne validacije je jednostavan i primenljiv na set većeg broja objekata između kojih ne postoji određena pravilnost. • Kod metode slučajnog podseta određuje se s različitih test setova slučajnim odabirom n/s objekata iz seta podataka, tako da jedan određeni objekat bude samo u jednom test setu105. Metoda slučajnog podseta obično daje dobre rezultate, naročito kada se selekcija podsetova ponavlja više puta. Ovom metodom se prevazilaze problemi koji se javljaju u unakrsnoj validaciji, kao što je mogućnost da objekti iz test seta i seta za modelovanje imaju različit fizički smisao ili da se isti objekat pojavljuje u oba seta. Povećanjem broja podela može se pravazići problem različitog 30     2 Opšti deo  fizičkog smisla objekata iz kalibracionog i test seta, dok se smanjenjem broja podela prevazilazi problem pojavljivanja objekata u oba seta. • Kod metode izostavljanja jednog objekta svaki pojedinačni objekat u setu podataka se koristi kao test set105. Ova metoda se uglavnom primenjuje kod manjeg broja objekata u setu (n < 20). • Kod uobičajene metode korisnik bira svaki test set. Na ovaj način određeni objekti se mogu naći u svakom test setu, mogu biti izostavljeni iz test setova ili mogu biti izostavljeni iz postupka unakrsne validacije. Uobičajena metoda zahteva dodatno vreme za određivanje kalibracionog i test seta za svaki sub-validacioni eksperiment, ali njena fleksibilnost može biti presudna u slučaju malog broja objekata ili kada su podaci generisani iz eksperimentalnog dizajna koji može prouzrokovati da test set i model set imaju različit fizički smisao. 2.3.4.1 Regresija metodom najmanjih kvadrata Linearni model kojim se povezuje jedna zavisna promenljiva sa jednom nezavisnom varijablom široko se primenjuje u hemiji. Predstavlja se sledećom relacijom: ebxay ++= (18) gde su a i b regresioni koeficijenti, a je odsečak, b je nagib, dok vektor e obuhvata reziduale (odstupanja) usled odstupanja podataka od idealnog linearnog odnosa106. Šematski prikaz ovog modela dat je na Slici 4. 31     2 Opšti deo  b 1 + = n x ŷ e y Slika 4. Šematski prikaz regresije metodom najmanjih kvadrata Osnovni zadatak prilikom konstruisanja linearnog modela je da se regresioni koeficijenti odaberu tako da greške modela budu svedene na minimum. Predviđene, tj. modelovane vrednosti , za uzorak i i greška predikcije posmatrane zavisnosti ei dati su sledećim relacijama: iyˆ iii ii yye bxay ˆ ˆ −= += (19) Najčešće korišćena metoda za određivanje prave koja se na najbolji način uklapa u eksperimentalne rezultate je metoda najmanjih kvadrata. Pri tome se traži onaj pravac (vrednost nagiba i odsečka) koji daje najmanju vrednost sume kvadrata reziduala, . Ovaj uslov je ispunjen kada je vrednost nagiba i odsečka data sledećim relacijama: ∑ 2ie ( )( ) ( ) xbya xx yyxx b i i i ii −= − −− = ∑ ∑ 2 (20) gde je x srednja vrednost svih vrednosti xi, a y srednja vrednost svih yi vrednosti. Greške nagiba i odsečka, kao i odgovarajući intervali pouzdanosti, proporcionalni su standardnoj grešci modela sy/x i dati su sledećim relacijama: 32     2 Opšti deo  ( ) 2 ˆ 2 / − − = ∑ n yy s i ii xy ( )∑ ∑ −= i i i i xya xxn x ss 2 2 / ( )∑ −= i i xy b xx s s 2 / ( ) ana staL 22,1 −±= ( ) bnb stbL 22,1 −±= (21) (22) (23) gde je t kritična vrednost Studentove t-raspodele za određeni nivo poverenja i broj stepeni slobode. Standardna greška modela predstavlja kvadratni koren sume kvadrata rezidualnih vrednosti podeljenih brojem stepeni slobode koji u slučaju linearne regresije iznosi n - 2, gde je n broj kalibracionih tačaka. 2.3.4.2 Višestruki linearni regresioni model Linearni model kojim se povezuje više nezavisno promenljivih sa jednom zavisno promenljivom je višestruki linearni regresioni model i prikazuje se sledećom relacijom: nnmmnnn exbxbxbay +++++= L2211 (24) gde je n broj objekata, a m broj varijabli106. Mnogo pogodniji način prikazivanja prethodne zavisnosti je pomoću matrica. Ukoliko se nezavisno promenljive prikažu pomoću matrice X, dimenzija n × (m+1), koja u prvoj koloni (koja određuje vrednost odsečka) sadrži n vrednosti jednakih 1, a preostale kolone vrednosti xij (i = 1,..., n; j = 1,..., m), tada osnovna zavisnost dobija sledeći oblik: eXby += (25) sa regresionim koeficijentima b = (a, b1,..., bm)T. Opisani model šematski je prikazan na Slici 5. Za srednje centrirane vrednosti x (za koje je 0,0 == yx , odnosno a = 0) prva kolona u matrici X može biti izostavljena. 33     2 Opšti deo  0 b0 1 b m 0 1 m 1 + = n X ŷ e y 1 1 1 . . 1 Slika 5. Šematski prikaz višestrukog linearnog regresionog modela Optimalne vrednosti regresionih koeficijenata se dobijaju za najmanju vrednost sume kvadrata reziduala, eTe, što je postignuto kada vrednosti regresionih koeficijenata iznose: ( ) yXXXb TT 1−= (26) a fitovane y vrednosti: Xby =ˆ (27) Regresioni koeficijenti (uključujući i odsečak) daju vektor b koji se može smatrati vektorom koeficijenata latentnih varijabli u x-prostoru, odnosno to je latentna varijabla koja daje maksimalnu vrednost Pearson-ovog korelacionog koeficijenta zavisnosti između vrednosti y i y . Neophodno je naglasiti da se za izračunavanje vrednosti regresionih koeficijenata koristi inverzna matrica XTX, koja je povezana sa korelacionom matricom x-varijabli, što dovodi do problema kada se posmatraju visoko korelisane x-varijable. U slučaju približno kolinearnih varijabli, inverzna matrica bi postala nestabilna ili bi je bilo nemoguće izračunati. To bi se isto desilo i kada bi broj nezavisno promenljivih bio veći od broja objekata (m > n), zbog čega ne bi bilo moguće predvideti y-vrednosti. Ovaj problem bi mogao biti rešen smanjenjem broja varijabli u ˆ 34     2 Opšti deo  regresionom modelu ili korišćenjem multivarijantnih metoda kao što su PCR ili PLS80,103. Korišćenje svih rapoloživih varijabli dovodi do boljeg uklapanja modela u podatke seta za kalibraciju jer reziduali postaju manji, a koeficijent determinacije veći. Međutim, osnovni cilj linearnog modelovanja nije povećanje uklapanja u podatke seta za kalibraciju, već povećanje prediktivnih svojstava test seta. Takođe, regresioni model sa velikim brojem varijabli je gotovo nemoguće interpretirati. Metoda MLR primenjena na set odabranih varijabli je, stoga, podjednako značajna i primenjivana kao i PCR i PLS metoda. Da bi se smanjio broj nezavisno promenljivih potrebno je pronaći kriterijum za odbacivanje onih varijabli koje u najmanjoj meri doprinose y-vrednostima, odnosno zadržati varijable koje nose najveći deo informacija sadržanih u polaznom setu. Pri tome bi trebalo ispuniti uslov da regresioni model bude realan i da u njega budu uključene sve varijable koje imaju uticaj na njega, ali da pri tome njihov broj bude što manji107,108. U okviru različitih statističkih programa dostupan je veliki broj metoda za selekciju varijabli. Najčešće korišćene metode, koje su istovremeno sastavni deo NCSS programa korišćenog u ovom radu su80: ƒ Selekcija unapred (Forward selection), tj. metoda kod koje je prvi model bez promenljivih, a prva varijabla koja se prihvata je ona koja daje model sa najvećom vrednošću parametra R2. Svaka naredna varijabla doprinosi povećanju pomenute veličine, pri čemu se proces prekida uključivanjem promenljive koja ne utiče značajno na vrednost R2. Varijabla koja se jednom nađe u modelu više ne može biti izostavljena iz njega. ƒ Selekcija unazad (Backward elimination) koja započinje modelom sa uključenim svim varijablama, nakon čega se iz modela postepeno eliminišu varijable sa najmanjim doprinosom vrednosti PRESS. ƒ Postepena regresija (Stepwise regression), tj. postupak koji kombinuje prethodne dve metode. Ona je u osnovi selekcija unapred, ali u svakom stupnju postoji mogućnost eliminacije promenljive iz modela. Potrebno je odabrati dva nivoa 35     2 Opšti deo  značajnosti na kojima se radi, jedan niži, kao kriterijum za uključivanje novih varijabli, i drugi, za njihovo isključivanje. Broj varijabli koji se zadržava u modelu zasniva se na ta dva nivoa značajnosti. ƒ Regresija svih promenljivih (All possible regression). To je metoda za selekciju varijabli kojom se proveravaju sve korelacije sa jednom, dve, ili više varijabli. Kriterijum za selekciju se beleži za svaku regresiju na osnovu čega je moguće dobiti najbolji deskriptor za jednoparametrijsku ili set deskriptora za višeparametrijsku jednačinu. ƒ Multivarijantna selekcija varijabli (Multivariate variable selection), tj. metoda kojom se u okviru datog seta varijabli traži manji set sa maksimalnom vrednošću parametra R2. Nakon odabira prve varijable, program iz preostalog seta bira drugu, pri čemu istovremeno proverava da li bi neka druga promenljiva mogla da zameni prvoizabranu. Ukoliko takva promenljiva postoji, ona ulazi u model, a lošija varijabla biva uklonjena. Potom se pokreće novo pretraživanje među preostalim promenljivim sve dok zamena varijabli dovodi do povećanja vrednosti R2. Pre građenja višestrukog linearnog regresionog modela neophodno je obraditi polazni set nezavisno promenljivih. Deskriptori koji nisu dostupni za sve ispitivane objekte se odbacuju. Uklanjaju se, takođe, i varijable koje imaju konstantne vrednosti za sve objekte, kao i one koje su međusobno visoko korelisane. Nakon pomenutih provera može se primeniti neki od postupaka za selekciju varijabli. Nezavisno promenljive koje su rezultat prethodnih operacija koriste se za pravljenje MLR modela. MLR je najčešće primenjivan način regresione analize u QSRR studijama85,109- 111. Upoređujući modele dobijene MLR i PLS metodama primenjenim na istom setu podataka, ustanovljeno je da su statistički parametri koji opisuju kvalitet dobijenih modela uporedivi, kao i da modele određuju deskriptori slične prirode, sa približno istim uticajem na zavisno promenljivu85,112-114. 36     2 Opšti deo  2.3.4.3 Regresija glavnih komponenata Selekcija varijabli je jedan od načina za redukciju broja regresionih varijabli, kao i isključivanje varijabli koje su međusobne kolinearne. Na ovaj način dobija se regresioni model koji je lako objašnjiv, ali u slučaju velikog broja x-varijabli konstruisanje ovakvog modela zahteva mnogo vremena i truda. PCR predstavlja multivarijantnu metodu koja, takođe, rešava problem kolinearnosti i redukcije broja nezavisno promenljivih, ali regresione varijable ne predstavljaju više originalne x-vrednosti već njihovu linearnu kombinaciju, odnosno skorove glavnih komponenata x-varijabli. Na taj način, PCR je kombinacija PCA i MLR metode80,103. Metode PCR šematski je prikazana na Slici 6. P X T 1 a 1 LR 1 PCA g = (TTT)-1TTy m a 1 m 1 n Varijable PCA skorovi y ŷ = Tg T = X P = XbPCR Slika 6. Šematski prikaz metode regresije glavnih komponenata PCA razlaže centriranu matricu X na skorove T i koeficijente latentnih varijabli P. Za određeni broj a glavnih komponenata, koji je uglavnom manji od broja varijabli u originalnoj X-matrici, pomenuto razlaganje se može predstaviti sledećom zavisnošću: ETPX T += (28) 37     2 Opšti deo  sa greškom izraženom kroz matricu E. Prema MLR modelu eXby += , i zamenom matrice X matricom skorova T dobija se sledeći regresioni model: ( ) TTT eTgebTPeXby +=+=+= (29) sa novim regresionim koeficijentom i greškom eT. Visoko korelisane x- varijable su na ovaj način svedene na nekoliko vektora skorova koji međusobno nisu korelisani. Kompleksnost PCR regresionog modela može biti optimizovana korišćenjem određenog broja glavnih komponenata. Regresioni koeficijenti, saglasno tekstu iz prethodnih poglavlja, dati su sledećim izrazom: bPg T= ( ) yTTTg TT 1−= (30) pa su konačni regresioni koeficijenti PgbPCR = (31) PCR je alternativa PLS metodi. U najvećem broju slučajeva njihove performanse su veoma slične55,115. PCR uglavnom rezultuje modelom sa većim brojem komponenata u odnosu na PLS jer se za izračunavanje PCA skorova ne koriste informacije sadržane u y-vrednostima. Ovo, međutim, ne mora uvek biti nedostatak jer se na taj način koristi veći deo varijanse sadržane u matrici X, što može učiniti model stabilnijim. Optimalan broj glavnih komponenata za PCR model bira se tako da one na najbolji način predviđaju y-varijablu, pri čemu procenat objašnjene varijanse u x- vrednostima nije od primarnog značaja. Drugim rečima, traži se optimalan podset određenog broja glavnih komponenata, a ne prvih nekoliko komponenata sa najvećom varijansom, jer je vrlo često neka dalja glavna komponenta pogodna za predviđanje y- varijable. Odabir dobrog seta PCA skorova vrši se na jedan od sledeća dva načina74: a) selekcija prvih nekoliko PCA komponenata koje obuhvataju određeni procenat ukupne varijanse podataka X (npr. 95%); b) selekcija PCA komponenata koje pokazuju maksimalnu korelaciju sa y. 38     2 Opšti deo  Prediktivna sposobnost finalnog modela proverava se primenom neke od metoda unakrsne validacije. 2.3.4.4 Regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata PLS je jedna od najčešće korišćenih metoda za multivarijantnu kalibraciju koja povezuje matricu X sa vektorom y ili matricom Y, tj. više zavisno promenljivih55,116-118. Po svojoj strukturi PLS i PCR modeli su praktično isti; vrednosti nezavisno promenljivih (x-podaci), se prvo prevedu u set od nekoliko intermedijernih linearnih latentnih varijabli (komponenata), koje se potom koriste za regresiju (MLR) sa zavisno promenljivom y. PCR koristi skorove glavnih komponenata (dobijenih isključivo iz matrice X) kao komponente, dok PLS koristi komponente koje su povezane sa y. Kriterijum koji se najčešće koristi u PLS za dobijanje intermedijarnih latentnih varijabli je maksimum kovarijanse između skorova i vrednosti y. Kovarijansa kombinuje veći deo varijanse u matrici X i velike vrednosti korelacionog koeficijenta sa posmatranom karakteristikom, zbog čega se PLS smatra kompromisom između PCR (maksimum varijanse u modelovanju X) i MLR (maksimum korelacije u modelovanju y) metoda. PLS i PCR su linearne metode, odnosno konačne latentne varijable koje predviđaju modelovanu karakteristiku, y, predstavljaju linearnu kombinaciju originalnih varijabli, kao i u MLR. Međutim, regresioni koeficijenti u konačnim MLR, PCR i PLS modelima su različiti, kao i njihova prediktivna svojstva. PLS se najčešće koristi za regresiju x-varijabli sa jednom y-varijablom na sledeći način80,93,103: 1. Prvo se izračunava PLS komponenta kao latentna varijabla koja pokazuje maksimum kovarijanse između skorova i modelovane karakteristike y. Ovde je potrebno naglasiti da je kriterijum „kovarijanseˮ zapravo kompromis između maksimalne vrednosti korelacionog koeficijenta (MLR) i maksimalne varijanse (PCA). 2. Informacije (varijansa) prve komponente se uklanjaju iz x-podataka. Pomenuti proces predstavlja projekciju x-prostora na ravan koja je 39     2 Opšti deo  normalna na pravac prve komponente. Rezultujuća matrica odstupanja (residual matrix, XRES) ima isti broj varijabli kao i originalna matrica, ali je unutrašnja dimenzionalnost umanjena za jedan. 3. Iz matriksa odstupanja odabira se sledeća PLS komponenta, ponovo sa maksimalnom kovarijansom između skorova i y. 4. Prethodno opisani postupak se ponavlja sve dok se uočavaju poboljšanja u modelovanju y. Broj PLS komponenata određuje kompleksnost modela. Takođe, optimalan broj komponenata određuje se pomoću unakrsne validacije. Optimalan broj PLS komponenata je uglavnom manji od optimalnog broja PCA komponenata kod PCR metode, zbog činjenice da su PLS komponente razvijene kao latentne varijable visoko korelisane sa y. Sa povećanjem broja komponenata povećava se i sličnost između PCR i PLS modela. Šematski prikaz PLS metode dat je na Slici 7. XCAL XKAL XTEST 1 b m 1 m 1 m 1 1 YKAL ŶKAL = XKAL. b n n Kalibracioni set ŶTEST = XTEST . b nT Test set PLS sa a komponenata Slika 7. Šematski prikaz regresije metodom delimičnih najmanjih kvadrata Predikcija većeg broja različitih y-varijabli (matrica Y) iz x-varijabli metodom delimičnih najmanjih kvadrata označava se kao PLS2. Višedimenzionalni x-prostor 40     2 Opšti deo  projektuje se na manji broj PLS komponenata (sumirajući x-varijable), dok se višedimenzionalni y-prostor projektuje na manji broj PLS-y-komponenata (sumirajući y- varijable). Komponente x- i y- su međusobno povezane matricom kovarijansi skorova80. 2.4 Arilpiperazini: struktura i biološka aktivnost Nakon otkrića fenotiazina i zadovoljavajućih rezultata u terapijama psihotičkih oboljenja, razvijena je serija lekova sličnih svojstava, antagonista dopaminskih D2 receptora, koji su bili označeni kao „klasični antipsihoticiˮ. Primena ovih lekova je, međutim, dovodila do ozbiljnih propratnih efekata, a bili su i neefikasni protiv negativnih simptoma šizofrenije, zbog čega je razvijena druga generacija antipsihotika označena kao „netipični antipsihoticiˮ ili „dopamin-serotonin sistem stabilizatoriˮ. Ovi derivati poseduju kombinovani antagonistički efekat prema D2 receptorima i serotoninskim 5-HT2 receptorima, ili deluju kao antagonisti D2 receptora i interaguju sa 5-HT1A receptorima. Drugi farmakološki pristup se bazira na dizajnu i razvoju novih lekova koji po svojoj strukturi predstavljaju i D2 antagoniste i 5-HT1A agoniste119. Dopaminski receptori su veoma značajni zbog svoje uloge u funkcionisanju velikog broja fizioloških procesa, kao što su koordinacija psihomotoričkih funkcija, organizacija procesa prepoznavanja i regulacija reproduktivnih ciklusa kod ljudi. Na molekulskom nivou, dopaminski receptori imaju značajnu ulogu u prenosu signala kroz ćelijsku membranu. Poremećaji na nivou dopaminergičkog sistema blisko su povezani sa nekim ozbiljnim neurološkim, psihičkim i endokrinološkim bolestima119. Na osnovu raspoloživih molekulskih modela dopaminskih receptora i objavljenih QSAR studija različitih dopaminergičkih liganada utvrđeno je da tri ključna farmakoforna strukturna zahteva određuju afinitet dopaminskih agonista: aromatično jezgro, most koji obezbeđuje povoljnu udaljenost između aromatičnog dela i baznog azota i bazni azot120. U cilju dobijanja D2 dopaminergičkih liganada koji ujedno pokazuju i afinitet prema serotoninskim receptorima, razvijena je serija arilpiperazinskih jedinjenja119. Pokazano je da se ligandi koji imaju visok afinitet prema D2/5-HT1A receptorima mogu dobiti povezivanjem arilpiperazina i 2-supstituisanog 41     2 Opšti deo  benzimidazola preko fleksibilnog lanca120. Utvrđeno je da afinitet dobijenih liganada za vezivanje za D2 receptore zavisi od strukture benzimidazolskog i arilpiperazinskog dela molekula, kao i od njihovog međusobnog rastojanja120. U tom smislu, sintetisana je serija 6-[2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-1H-benzimidazola, kao i 1-{2-[5-(1H- benzimidazol-2-tion)]etil}-4-arilpiperazina i ispitivan uticaj različitih supstituenata na stabilnost ligand-D2 kompleksa120,121. Interakcije dobijenih jedinjenja sa dopaminskim receptorom ostvaruju se preko jonskih interakcija između protonovanog N1 atoma piperazinskog prstena i Asp 86, kao i niza vodoničnih veza i elektronskih i sternih interakcija, koje u velikoj meri zavise od elektrostatičkog površinskog potencijala (raspodele elektronske gustine) u benzimidazolskom prstenu. Oslanjajući se na strukturu prethodno navedenih jedinjenja kao polaznu tačku, kao i na činjenice da na raspodelu elektronske gustine utiče priroda supstituenta u heterocikličnom prstenu, uveden je atom halogena u benzimidazolsku farmakoforu, sa očekivanjem da će se glavna preraspodela elektronske gustine ostvariti posredstvom velikog elektron-privlačnog dejstva halogena122-124. Sintetisana je serija novih 4-halo-6- [2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-1H-benzimidazola i 6-[2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-4-halo- 1,3-dihidro-2H-benzimidazol-2-tion sa arilpiperazinskim delom molekula izabranim shodno poznatim zahtevima o odnosu strukture i reaktivnosti (Slika 8). Za sva novosintetisana jedinjenja određen je afinitet vezivanja za dopaminske i serotoninske receptore u in vitro eksperimentima kompeticije sa radio-ligandima. Kao izvor dopaminskih i serotoninskih receptora korišćene su sinaptozomalne membrane izolovane iz goveđeg nukleusa kaudatusa i hipokampusa. Raspodela elektronske gustine u benzimidazolskom prstenu utiče na biološku aktivnost arilpiperazina. Efekat halogena na stabilnost kompleksa receptor-ligand može se objasniti transferom naelektrisanja ili vodoničnim vezivanjem halogena i receptora 125,126. Za seriju 4-halo-6-[2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-1H-benzimidazola utvrđeno je da halogenovanje povećava afinitet novih liganada prema oba tipa receptora u sledećem nizu: Br > Cl > H. Pokazano je da je najaktivniji ligand prema 5-HT1A receptoru 4- bromo-6-{2-[4-(2-hlorofenil)piperazin-1-il]etil}-1H-benzimidazol, čija je aktivnost povećana 1735 puta u odnosu na nehalogenovani analog. Sa druge strane, najaktiviniji ligand prema D2 receptoru bio je 4-bromo-6-{2-[4-(2-metoksifenil)piperazin-1-il]etil}- 42     2 Opšti deo  1H-benzimidazol, kod kojeg je halogenovanje povećalo afinitet prema pomenutom receptoru 40 puta. Ovakvo povećanje afiniteta za vezivanje ukazuje na postojanje privlačnih interakcija između atoma halogena i aminokiselinskih ostataka aktivnog mesta vezivanja oba ispitivana receptora122. Doking analize na modelima D2 receptora pokazale su da uvođenje halogena u benzimidazolski deo liganda dovodi do građenja vodoničnih veza i jonskih interakcija između atoma halogena i Ser 122. Slično tome, jonske interakcije su uočene i između halogenovanog liganda i Trp 358 kod 5-HT1A receptora. a b Slika 8. Geometrijski optimizovane strukture: a) 4-hloro-6-[2-(4-arilpiperazin-1- il)etil]-1H-benzimidazola, b) 6-[2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-4-halo-1,3-dihidro- 2H-benzimidazol-2-tion 43     44    2 Opšti deo  Za seriju 6-[2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-4-halo-1,3-dihidro-2H-benzimidazol-2- tion utvrđeno je, takođe, da raspodela elektronske gustine u benzimidazolskom prstenu prouzrokovana uvođenjem atoma halogena, kao i grupe koje se ponašaju kao akceptori vodonične veze (metoksi grupa) u orto položaju 1-arilpiperazinskog dela molekula, stabilizuju kompleks ligand-D2 receptor. Slično, fenil, 2-hlorofenil i 3-(fluorometil)fenil derivati pokazuju veći afinitet prema 5-HT1A receptorima123,124.  Veći afinitet halogenih derivata arilpiperazina prema D2 i 5-HT1A receptorima ukazuje na potrebu određivanja njihove lipofilnosti, odnosno razumevanja hromatografskog ponašanja, u cilju rasvetljavanja interakcija koji se odigravaju na ćelijskoj membrani, odnosno aktivnom mestu receptora. 3 Eksperimentalni deo   45   3 Eksperimentalni deo 3. Eksperimentalni deo 3.1 Reagensi Sinteza i karakterizacija ispitivanih arilpiperazina objavljena je u ranijim radovima122-124. Strukture proučavanih jedinjenja prikazane su u Tabeli 2. Metanol, dioksan i dimetilsulfoksid, koji su korišćeni kao organske komponente mobilne faze, bili su analitičkog stepena čistoće i nabavljeni od Merck-a (Darmstadt, Nemačka). 3.2 Tankoslojna hromatografija Za hromatografska ispitivanja primenjena je tehnika horizontalne tankoslojne hromatografije. Hromatografski sistemi sastojali su se od komercijalno dostupnog RP-18 F254S silika-gela (Merck, Nemačka) i mobilnih faza: (1) metanol:voda (sa 80 – 100 Vol% metanola), (2) dioksan:voda (sa 60 – 80 Vol% dioksana), (3) dimetilsulfoksid (DMSO):voda (sa 80 – 100 Vol% DMSO-a). U svim navedenim slučajevima, sadržaj organske komponente u mobilnoj fazi je povećavan u porcijama od 5 Vol%. Ispitivane supstance rastvarane su u smeši DMSO:aceton (1:1, v/v). Na ploče, dimenzija 10×10 cm, nanošeno je oko 1μl sveže pripremljenog rastvora arilpiperazina približne koncentracije 0,01 mol/dm3. Pre razvijanja, ploče sa nanetim uzorcima su sušene na vazduhu tokom 2 sata. Pređeni put rastvarača iznosio je oko 4,5 cm. Detekcija hromatografskih zona vršena je pod UV-lampom (254 nm). Sva ispitivanja su izvedena na sobnoj temperaturi (22 ± 2 ºC). 46 3 Eksperimentalni deo 3.3 Geometrijska optimizacija i izračunavanje vrednosti molekulskih deskriptora Geometrijska optimizacija i modelovanje molekula urađeni su pomoću programa Hyperchem (verzija 7,0, Hybercube, Inc.). Strukture ispitivanih arilpiperazina nacrtane su u Hyperchem Release 7 programu. Prva optimizacija izvedena je pomoću molekulsko- mehaničke MM+ metode, koja je zasnovana na MM2 algoritmu. U sledećem koraku, optimizacija je urađena korišćenjem Polak-Ribier Conjugate gradient (PRCG) algoritma. Strukture optimizovane na prethodno opisan način služile su kao početne za semi- empirijsku optimizaciju. Krajnja geometrijska optimizacija se zasniva na Austin Model 1 (AM1) semi-empirijskoj molekulsko-orbitanoj metodi90, a urađena je primenom algoritma Steepest Descent i Conjugate Directions algoritma. Set molekulskih deskriptora izračunat pomoću Hyperchem programa sastojao se od serije kvantno-hemijskih deskriptora kao što su: polarizabilitet (Pol), energija najviše popunjene molekulske orbitale (HOMO) i energija najniže slobodne elektronske orbitale (LUMO), dipolni momenat (DM), ukupni dipol (TD) i QSAR parametara, površine (SA) i refraktivnosti. Program Molecular Modeling Pro Plus (MMP Plus)127 korišćen je za izračunavanje seta dodatnih deskriptora za opisivanje veličine i račvanja molekula, kao što su dužina molekula (ML), širina molekula (MWe), dubina molekula (MD); topoloških parametara, Randić, Hall i Kier indeksa konektivnosti 0 – 4, Randić, Hall i Kier indeksa valentnosti 0 – 4; parametara koji opisuju osobine polimera i surfaktanata (Van Krevelen- ovi i Hoftyzer-ovi parametri rastvorljivosti), površinski napon (ST), molarna zapremina (MV), hidrofilno-lipofilni balans (HLB), površinski polaritet (SP), disperzija (D), polarnost (P), vodonično vezivanje (HB), udeo hidrofilne površine (HSA), akceptor vodonične veze (HBA), donor vodonične veze (HBD), lipofilnost (log P). Lipofilnost ispitivanih jedinjenja izračunata je primenom programa koji je dostupan na internet stranici Virtual Computational Chemistry Laboratory128,129. 47 3 Eksperimentalni deo 3.4 Multivarijantna statistička analiza i modelovanje Regresija metodom najmanjiih kvadrata i statistički test za proveru značajnosti korelacionog koeficijenta urađeni su primenom statističkog paketa Data Analysis u okviru Microsoft Office Excel-a (verzija 7.0). Metode PCA, hijerarhijska klasterska analiza (HCA), PCR i PLS izvedene su korišćenjem PLS_Toolbox statističkog paketa (Eigenvectors Inc. v. 5.7) u okviru MATLAB verzije 7.4.0.287 (R2007a) (MathWorks INC, Natick, MA, USA). Za PCA je korišćen Singular Value Decomposition (SVD) algoritam. Ovo je široko primenjivana tehnika za razlaganje originalne matrice podataka u nekoliko novih matrica koje otkrivaju mnoga korisna svojstva originalne matrice. Prema SVD metodi matrica X (dimenzija n × m) može da se razloži na tri nove matrice: . Za matricu X sa podacima koji su centrirani u odnosu na srednju vrednost, matrica T0 ima dimenzije n × m i sadrži PCA skorove normirane na dužinu 1. S je dijagonalna matrica veličine m × m koja sadrži tzv. jedinične vrednosti u svojoj dijagonali, a koje su jednake standardnoj devijaciji skorova. PT je transponovana matrica koeficijenata PCA latentnih varijabli dimenzija m × m. PCA skorovi, T, izračunavaju se iz odnosa: TPSTX ××= 0 STT ×= 0 80. Vrednosti Q i T2 za Hotelling- ovu raspodelu određeni su na 95% nivo značajnosti i korišćeni za utvrđivanje prisustva rezultata koji su posledica grubih grešaka. HCA je izvedena primenom aglomerativne metode uz korišćenje Ward-ovog modela za određivanje rastojanja između dva klastera i Euclidean-ove razdaljine za merenje udaljenosti između uzoraka80. Kod PLS regresije primenjen je SIMPLS algoritam. On izračunava PLS faktore kao linearnu kombinaciju originalnih varijabli tako da se kriterijum kovarijantnosti učini što značajnijim, poštujući pri tome određena ograničenja koja se odnose na ortogonalnost i normiranje. SIMPLS algoritam se razlikuje od ostalih PLS algoritama po načinu ortogonalizacije PLS komponenata. Naime, SIMPLS algoritam opisuje skorove kao 48 49 3 Eksperimentalni deo direktnu kombinaciju originalne X matrice a ne korišćenjem osiromašene X matrice (deflated X matrix) kao što je to slučaj kod drugih algoritama. Drugim rečima, analiza svojstvenih vrednosti se izvodi na originalnoj XY matrici projektovanoj na vektore koeficijenata latentnih varijabli iz prethodnih komponenata, a ne projektovanjem osiromašene matrice. Algoritam je predložen od strane Jong-a i označen kao „Straightforward Implementation of a Statistically Inspired Modification of the PLS algorithm”80,130. Validacija PLS modela izvedena je korišćenjem metode slučajnih uzoraka. MLR modelovanje je izvedeno korišćenjem demo verzije NCSS statističkog paketa (Hintze, J. (2001), NCSS and PASS Number Cruncher Statistical Systems, Kaysville, Utah). Za selekciju varijabli korišćena je metoda postepene regresije. 4 Naši radovi   50    4 Naši radovi  4.1 Retenciono ponašanje ispitivanih arilpiperazina u uslovima planarne hromatografije   U okviru ovog rada planirano je proučavanje hromatografskog ponašanja serije novosintetisanih arilpiperazina u uslovima planarne hromatografije, procena retencionih podataka na osnovu multivarijantnih statističkih metoda i utvrđivanje moguće veze između retencionih karakteristika i fizičko-hemijskih parametara ispitivanih molekula, u cilju dobijanja podataka značajnih za određivanje lipofilnosti jedinjenja, kao i razumevanje mehanizama razdvajanja u primenjenim hromatografskim sistemima. Ispitivanje hromatografskog ponašanja arilpiperazina složene strukture, uslovljene prisustvom hidrofilnih i hidrofobnih grupa (Tabela 2), trebalo bi da obezbedi korisne informacije o njihovim farmakološki značajnim fizičko-hemijskim parametrima. Ispitivani molekuli poseduju tri zajednička strukturna dela: benzimidazolski ili benzimidazol-2-tionski deo, arilpiperazinski deo i fleksibilni etilenski lanac koji čini vezu između prva dva dela. Svaki od navedenih delova učestvuje u nekoliko vrsta interakcija. Građenje vodonične veze na benzimidazolskom delu molekula može biti ostvareno preko aromatične –NH grupe koja se ponaša kao proton donorski centar čineći proton akceptorske osobine molekulskog okruženja još izraženijim, kao i preko –S atoma iz tio grupe benzimidazol-2-tionskog derivata, koji ima izražena proton akceptorska svojstva. Prisustvo jako polarizovanog π elektronskog sistema u arilpiperazinskom i benzimidazolskom delu molekula uslovljava dipolarne interakcije između ispitivanih molekula i stacionarne, odnosno mobilne faze. Etilenski most obezbeđuje odgovarajuću udaljenost arilpiperazinskog i heterocikličnog dela molekula, sprečavajući da sterne smetnje onemoguće prethodno navedene interakcije. 51     52    4 Naši radovi  Tabela 2. Strukture ispitivanih arilpiperazina Za proučavanje hromatografskog ponašanja ispitivanih molekula korišćena su tri organska rastvarača različite polarnosti, 1,4-dioksan (nepolaran rastvarač), dimetilsulfoksid (DMSO) (polaran neprotičan rastvarač) i metanol (polaran protični rastvarač). U Tabeli 3 prikazane su vrednosti dielektrične konstante, dipolnog momenta i Hansen-ovih parametara rastvorljivosti (δD – energija disperzionih veza, δP – energija dipolarnih međumolekulskih sila i δH – energija vodoničnih veza između molekula), za korišćene organske rastvarače. Jed. R Ar Jed. R Ar 1 Cl Phe 13 Cl Phe 2 Cl 2-MeOPhe 14 Cl 2-MeOPhe 3 Cl 2-ClPhe 15 Cl 2-ClPhe 4 Cl pirimidin-2-il 16 Cl 3-CF3Phe 5 Cl 2-NO2Phe 17 Cl pirimidin-2-il 6 Br Phe 18 Cl 2-NO2Phe 7 Br 2-MeOPhe 19 Br Phe 8 Br 2-ClPhe 20 Br 2-MeOPhe 9 Br 3-CF3Phe 21 Br 2-ClPhe 10 Br pirimidin-2-il 22 Br 3-CF3Phe 11 Br 2-NO2Phe 23 Br pirimidin-2-il 12 H 2-NO2Phe 24 Br 2-NO2Phe 25 H Phe 26 H 2,3-diMePhe 27 H naftil 28 H 2-MeOPhe 29 H 4-MeOPhe 30 H 4-ClPhe 31 H 4-FPhe 32 H 2-NO2Phe 33 H 3-NO2Phe N H N N N Ar R N H N H N N Ar R S  4 Naši radovi  Polarne rastvarače karakterišu više vrednosti δP i dielektrične konstante, pri čemu polarni protični rastvarači imaju izraženije vrednosti δH, dok polarni neprotični rastvarači imaju više vrednosti dipolnih momenata. Metanol sa molekulima ispitivane supstance gradi vodonične veze, dok DMSO, zahvaljujući visokoj vrednosti dipolnog momenta (razdvajanje delimično pozitivnog i delimično negativnog naelektrisanja unutar istog molekula), interaguje sa pozitivno naelektrisanim česticama preko negativnog dela dipola. Dioksan se klasifikuje kao nepolaran rastvarač zbog jako niske vrednosti dielektrične konstante, ali zahvaljujući kiseoniku koji može da se ponaša kao Lewis-ova baza on je sposoban da solvatizuje pojedine molekule. Tabela 3. Karakteristike primenjenih rastvarača Rastvarač Dielektrična konstanta Dipolni moment (D) δD δP δH 1,4-Dioksan 2,3 0,45 17,5 1,8 9,0 Dimetilsulfoksid 46,7 3,96 18,4 16,4 10,2 Metanol 33,0 1,70 14,7 12,3 22,3 δD – energija disperzionih veza; δP – energija dipolarnih međumolekulskih sila; δH – energija vodoničnih veza između molekula Rezultati hromatografskog određivanja dati su kao RF, odnosno RM -vrednosti, za svaki hromatografski sistem pojedinačno, u Prilogu (Tabele P1 – P3). U reverzno-faznim sistemima, u kojima je solvatacioni efekat veoma značajan, retencija je određena molekulskom strukturom jedinjenja. Uvođenje malih polarnih ili nepolarnih grupa u strukturu velikih molekula značajno utiče na njihovo hromatografsko ponašanje. Retencija, koja se ostvaruje nespecifičnim interakcijama ispitivane supstance i stacionarne faze (disperzione i indukcione sile, odnosno hidrofobne interakcije), kao i specifičnim interakcijama supstanci sa polarnom mobilnom fazom, jača je ukoliko su ispitivane supstance manje polarne. 53     4 Naši radovi  Ispitivana jedinjenja podeljena su u dve grupe u zavisnosti od prisustva tio-grupe u benzimidazolskom delu molekula. Značajno različito hromatografsko ponašanje derivata benzimidazol-2-tiona, usled prisustva dodatnog –S atoma u molekulu, uočeno je samo u sistemu RP-18/metanol:voda. Slabija retencija derivata benzimidazol-2-tiona u navedenom hromatografskom sistemu verovatno je posledica građenja vodonične veze sa hidroksilnom grupom metanola. Razlike u hromatografskom ponašanju ispitivanih jedinjenja unutar svake od grupa potiču od prisustva atoma halogena (Cl, Br) vezanog za benzimidazolsku i benzimidazol-2-tionsku dopaminergičku farmakoforu. Uvođenje voluminoznog supstituenta bogatog elektronima pojačava retenciju ovih jedinjenja u odnosu na analoge koji u istom položaju sadrže vodonik. Takođe, jedinjenja sa bromom u heterocikličnom delu molekula se najjače zadržavaju na stacionarnoj fazi u uslovima reverzno-fazne hromatografije. Treći faktor koji utiče na različito ponašanje analiziranih molekula je priroda supstituenta vezanog za arilpiperazinski deo molekula (Phe, 2-MeOPhe, 4- MeOPhe, 2-ClPhe, 4-ClPhe, 4-FPhe, 3-CF3Phe, pirimidin-2-il, 2-NO2Phe, 3-NO2Phe, 2,3- diMePhe, naftil). Jedinjenja sa hidrofobnom grupom (2,3-diMePhe, naftil,  3-CF3Phe) pokazuju najjaču retenciju, dok se uvođenjem metoksi grupe u molekul ili zamenom benzenovog prstena pirimidinskim povećava rastvorljivost u mobilnoj fazi usled čega slabe interakcije sa stacionarnom fazom. Svojstva organske komponente mobilne faze u značajnoj meri utiču na retenciju ispitivanih jedinjenja. Proton akceptorske osobine, izražene u sistemima DMSO:voda i dioksan:voda, ostvaruju se između –NH grupe benzimidazolskog i benzimidazol-2- tionskog prstena i parcijalno negativno naelektrisanog kiseonika iz DMSO-a, tj. slobodnog elektronskog para kiseonika iz dioksana. Proton donorska svojstva mobilne faze, izražene u sistemu metanol:voda, pokazuju značajan efekat samo u slučaju o- i p-metoksi derivata, zbog sposobnosti metoksi grupe da se ponaša kao jak proton akceptor. U svim ostalim slučajevima ovaj efekat je zanemarljiv jer u molekulu, pored azota u piperazinskom delu, koji je mnogo slabiji proton akceptor od metoksi grupe, ne postoji drugi dobar proton akceptorski centar. Stoga, retencija metoksi derivata je manja u odnosu na ostale analoge iz ispitivane serije. U slučaju derivata benzimidazol-2-tiona pomenute interakcije su manje 54     4 Naši radovi  moguće od interakcija koje vodonik iz hidroksilne grupe metanola ostvaruje sa sumporom iz tio-grupe, pa je pomenuta razlika u hromatografskom ponašanju analoga manje izražena. Sposobnost metanola da jako interaguje sa molekulima vode značajno utiče na ponašanje jedinjenja u hromatografskim sistemima koji kao organsku komponentu mobilne faze sadrže pomenuti rastvarač131. Vodeni rastvor metanola sadrži sam metanol, vodu, kao i metanol vezan za vodu, zbog čega se ovaj rastvarač može smatrati pre tercijarnim sistemom nego binarnom mobilnom fazom. Metanol-voda asocijacija umanjuje efekat organskog modifikatora uslovljavajući na taj način slabljenje retencije. Sa druge strane, DMSO i dioksan su u manjoj meri asosovani sa molekulima vode. Veće vrednosti retencionih parametara dobijene za sisteme RP-18/dioksan:voda mogu se objasniti fizičko-hemijskim karakteristikama ovog cikličnog etra. Zbog svoje hidrofobne strukture, dioksan snažno interaguje sa C-18 lancima stacionarne faze stvarajući monosloj na njenoj povšini sa polarnim delom molekula okrenutim ka analitima. Na ovaj način se u velikoj meri smanjuje hidrofobnost originalne stacionarne faze i kao posledica toga, retencija ispitivanih supstanci. Dobijeni rezultati u saglasnosti su sa strukturnim svojstvima ispitivanih supstanci kao i sa interakcijama za koje je potvrđeno da se uspostavljaju kada se ligand koji pokazuje afinitet prema dopaminskim D2 i serotoninskim 5-HT1A receptorima približi aktivnom centru receptora122. Osnovne interakcije između liganda i D2 receptora su sledeće: a) vodonično vezivanje između benzimidazolskog dela molekula i Ser 141 i Ser 122, koje se ostvaruje između –NH grupe liganda i halogena i amino kiselinskog ostatka; b) hidrofobnih interakcija između aromatičnog prstena arilpiperazinskog ili benzimidazolskog dela molekula i ostataka Phe 178, Tyr 216, Trp 182 i His 189; c) dodatne vodonične veze koje metoksi derivati (koji se ponašaju kao proton akceptori) mogu da grade sa Trp 182 (koji se ponaša kao proton donor); d) jonske interakcije između protonovanog N1 atoma piperazinskog prstena i Asp 86 (Slika 9). Slično, osnovne interakcije između liganda i 5-HT1A receptora su: a) jonske interakcije između protonovanog N1 atoma piperazinskog prstena i negativno naelektrisanog Asp 116, b) vodonično vezivanje između supstituenata prisutnih na 55     4 Naši radovi  benzimidazolskom delu molekula i Ser 199 i Trp 358, c) hidrofobnih interakcija između aromatičnog prstena arilpiperazinskog dela molekula i ostataka Phe 361 i Tyr 390 (Slika 10). Slika 9. Prikaz osnovnih interakcija između jedinjenja 7 i D2-receptora posmatrano iz različitih uglova (Slika 9a i 9b). 56     4 Naši radovi  Slika 10. Prikaz osnovnih interakcija između jedinjenja 7 i 5HT1A-receptora posmatrano iz različitih uglova (Slika 10a i 10b). 57     4 Naši radovi  4.2 Određivanje parametara lipofilnosti ispitivanih arilpiperazina Hromatografija je široko korišćena metoda za određivanje lipofilnosti, zbog odnosa koji postoji između odgovarajućeg retencionog parametra i particionog koeficijenta. Za uspešno hromatografsko merenje lipofilnosti mora biti utvrđena linearna zavisnost između retencionog parametra i koncentracije organske komponente mobilne faze. Dobijeni rezultati (Tabele P1-P3) pokazuju da retencija ispitivanih jedinjenja opada sa povećanjem koncentracije organske komponente u mobilnoj fazi u svim primenjenim hromatografskim sistemima. Istovremeno, utvrđena je linearna zavisnost između RM vrednosti, dobijenih na osnovu jednačine 2, i koncentracije organske komponente mobilne faze. Vrednosti RM0 dobijene su linearnom ekstrapolacijom RM vrednosti na čistu vodu. Vrednosti nagiba (b) i odsečka (hromatografski određen parametar lipofilnosti, RM0), kao i odgovarajući statistički parametri (Pearson-ov korelacioni koeficijent, r, standardna greška modela, s i nivo značajnosti, P), utvrđene za prethodno pomenutu linearnu zavisnost navedeni su u Tabelama P4-P6 u Prilogu, za svaki primenjeni hromatografski sistem posebno. Iz dobijenih rezultata se uočava da derivati benzimidazol-2-tiona pokazuju manju lipofilnost, odnosno niže RM0 vrednosti, samo u slučaju metanola kao organskog modifikatora verovatno usled veće rastvorljivosti pomenutih jedinjenja u mobilnoj fazi. Uvođenje polarne metoksi grupe u molekul ima negativan uticaj na lipofilnost. Takođe, jedinjenja sa većim hidrofobnim delom u arilpiperazinskom delu molekula (2,3-diMePhe, naftil,  3-CF3Phe) su lipofilnija. Prisustvo atoma halogena u benzimidazolskom i benzimidazol-2-tionskom delu molekula rezultuje većim RM0 vrednostima u poređenju sa njihovim nehalogenim analozima, usled povećanja elektronske gustine oko ovog dela molekula. Doking studije izvršene na ispitivanim arilpiperazinima pokazale su da 4-halo- derivati imaju veći afinitet prema D2 i 5HT1A receptorima od njihovih nehalogenih analoga. U slučaju D2 receptora između Cl, odnosno Br i Ser 122 dolazi do građenja vodoničnih veza i transfera naelektrisanja, dok se kod 5HT1A receptora transfer naelektrisanja vrši 58     4 Naši radovi  između atoma halogena i Trp 358122. Na ovaj način je još jednom potvđena mogućnost primene hromatografije za određivanje lipofilnosti ispitivanih arilpiperazina u cilju mapiranja procesa do kojih dolazi u biološkim sistemima. Uticaj prirode organske komponente u mobilnoj fazi na RM0 vrednosti analiziran je primenom neparametrijskog Kruskal-Wallis-ovog testa, kojim su upoređivane vrednosti medijana retencionih parametara analiziranih supstanci za tri primenjena hromatografska sistema. Kruskal-Wallis-ovim testom je potvrđeno da podaci ne pripadaju istoj populaciji, tj. da se medijane statistički značajno razlikuju (χ2 = 66,78, χ2kr = 5,99). U cilju utvrđivanja seta podataka koji dovodi do odstupanja primenjena je Fisher-ova metoda za određivanje najmanje značajne razlike i utvrđeno da se RM0 vrednosti sva tri seta statistički značajno razlikuju. Iako su Biagi i saradnici132,133 ustanovili da su RM0 vrednosti nezavisne od prirode organske komponente u mobilnoj fazi kada se u tu svrhu koriste aceton, acetonitril ili metanol, ovakav zaključak ne može biti prihvaćen generalno za svaki hromatografski proces13. Značajne razlike u RM0 vrednostima posledica su jakih specifičnih interakcija između supstance i eluenta, tj. građenja vodoničnih veza koji utiču na rastvorljivost analita u mobilnoj fazi134. Zbog utvrđenih statistički značajnih razlika između RM0 vrednosti analiziranih arilpiperazina, sledeći korak u analizi dobijenih rezultata sastojao se u odabiru hromatografskog sistema koji na najbolji način opisuje lipofilnost ispitivanih arilpiperazina. Hromatografsko ponašanje jedinjenja određeno je nizom međumolekulskih interakcija između analita, stacionarne i mobilne faze. Linearna zavisnost između retencionog faktora, RM0 vrednosti, i parametra lipofilnosti, logP, može se očekivati saglasno činjenici da je retencija jedinjenja u reverzno-faznoj tečnoj hromatografiji određena hidrofobnim interakcijama. Određivanje linearne zavisnosti između parametra lipofilnosti dobijenog hromatografskim ispitivanjima i izračunatih logP vrednosti je neizostavan korak u QSRR analizama. Statistički značajna korelacija između pomenutih veličina potvrđuje mogućnost primene RPTLC retencionog parametra za određivanje lipofilnosti. Za ispitivana jedinjenja izračunat je set logP vrednosti i dobijeni rezultati prikazani u Tabeli P7 u Prilogu. Ekstrapolisane RM0 vrednosti, za sva tri primenjena 59     4 Naši radovi  hromatografska sistema, upoređene su sa izračunatim logP vrednostima, a dobijeni statistički parametri ovih korelacija, prikazani u Tabeli 4. Zbog nižih r vrednosti dobijenih za analizirane zavisnosti proverena je značajnost koeficijenta korelacije, imajući u vidu veliki broj tačaka korišćenih za kalibraciju. Statističkim testovima za proveru značajnosti linearne korelacije (t- i F-test) utvrđeno je da između RM0 vrednosti, dobijenih za sistem sa dioksanom kao organskom komponentom mobilne faze, i predviđenih logP vrednosti ne postoji linearna zavisnost. Vrednosti parametara t i F, zajedno sa odgovarajućim kritičnim vrednostima, navedene su u Tabeli 4. Stoga se RM0 vrednosti, dobijene primenom dioksana, ne mogu koristiti kao mera lipofilnosti ispitivanih arilpiperazina. Utvrđena je statistički značajna linearna zavisnost između RM0 vrednosti, dobijenih za sisteme u kojima su korišćeni metanol i DMSO kao organski modifikatori, i izračunatih logP vrednosti (Tabela 4). Na ovaj način, umesto zahtevnom i sporom metodom mućkanja, lipofilnost arilpiperazina je uspešno određena na osnovu retencionih konstanti, dobijenih primenom relativno brze i jednostavne tankoslojne hromatografije. Prilikom tumačenja vrednosti t i F treba biti obazriv, jer se sa porastom broja merenja statistička značajnost može dokazati za relativno niske vrednosti Pearson-ovog koeficijenta iako za takve vrednosti bilo kakva kvantitativna zavisnost nema smisla. Zbog relativno velikog broja jedinjenja (n = 33) u Tabeli 4 su date i vrednosti koeficijenta determinacije. Iako rezultati t- i F-testa pokazuju da se RM0 vrednosti, dobijene primenom sistema metanol:voda, mogu upotrebiti kao parametar lipofilnosti ispitivanih jedinjenja, vrednosti koeficijenta determinacije i standardne greške, ukazuju da se pouzdaniji statistički parametri dobijaju za sistem sa DMSO-om. Na osnovu ovoga, kao i na osnovu najveće selektivnosti u razdvajanju ispitivanih arilpiperazina, kao najbolji sistem za određivanje lipofilnosti ispitivanih arilpiperazina odabran je onaj koji sadrži DMSO kao organski modifikator. Rezultati dobijeni primenom pomenutog hromatografskog sistema korišćeni su za dalja ispitivanja. 60     4 Naši radovi  Mogućnost primene vrednosti nagiba regresione jednačine 3 kao parametra lipofilnosti, proverena je na osnovu korelacije između vrednosti odsečka, RM0 i pomenutog parametra. Postojanje statistički značajne linearne zavisnosti potvrđeno je t- i F-testom: ( ) ( ) ( ) ( ) 04,276,916,431,955414,08687,0 208,10662,99601,0389,0 31;05,031,1;05,0 0 ====== ±−±−= krkr M ttFFsr Rb (32) Dobijena statistički značajna zavisnost ukazuje da vrednost nagiba može biti posmatrana kao alternativa RM0 vrednostima pri iskazivanju lipofilnosti ispitivanih jedinjenja. Vrednosti nagiba su dalje upoređivane sa izračunatim logP vrednostima. Odgovarajući statistički parametri (koeficijent korelacije, standardna greška, koeficijent determinacije, 95% nivo značajnosti, vrednosti t- i F-testa) prikazani su u Tabeli 5. Na osnovu t i F vrednosti, ali i niskih vrednosti koeficijenta determinacije može se zaključiti da se nagib ne bi mogao koristiti kao parametar lipofilnosti. Vrednosti parametra C0, dobijenog na osnovu jednačine 6, za svaki od primenjenih hromatografskih sistema, navedene su u Tabelama P4-P6 u Prilogu. Između ovog parametra i vrednosti RM0 nije utvrđena statistički značajna korelacija: ( ) ( ) ( ) ( ) 04,226,116,458,10660,12206,0 0063,00079,023,057,5 31;05,031,1;05,0 0 0 ====== ±−±= krkr M ttFFsr RC (33) Razlog za ovako lošu korelaciju može biti činjenica da je sam nagib loša procena lipofilnosti, kako je navedeno u prethodnom izlaganju. Vrednosti skorova prve glavne komponente, dobijenih primenom PCA metode na retencione podatke, ispitani su kao parametri za opisivanje lipofilnosti. Vrednosti PC1, za tri primenjena hromatografska sistema, date su u Tabelama P4-P6 u Prilogu. Statistički značajna zavisnost utvrđena je između vrednosti RM0 i PC1: ( ) ( ) ( ) ( ) 04,260,716,471,576462,08066,0 052,0393,011,040,51 31;05,031,1;05,0 0 ====== ±−±= krkr M ttFFsr RPC (34) 61     62    4 Naši radovi  Uzimajući u obzir visoku vrednost korelacionog koeficijenta i vrednosti t i F koje premašuju kritične vrednosti, parametar PC1 korelisan je sa izračunatim log P vrednostima, a dobijeni statistički parametri prikazani u Tabeli 6. Kao i u slučaju nagiba, dobijene su niske vrednosti koeficijenta determinacije, pa varijabla PC1 nije dalje razmatrana kao mogući parametar lipofilnosti. Primenom reverzno-fazne planarne hromatografije određena je lipofilnost ispitivanih arilpiperazina, jednog od važnih faktora koji utiču na biološku aktivnost supstanci. Određena su četiri hromatografska deskriptora, RM0, b, C0 i PC1, koji su u istoj meri zastupljeni u literaturi kao mera lipofilnosti. Utvrđeno je da varijabla koja direktno opisuje raspodelu supstanci između stacionarne i mobilne faze, kao što je parametar RM0, pouzdanije određuje lipofilnost ispitivanih arilpiperazina od parametra koji je proporcionalan hidrofobnoj površini molekula (b) ili interpolisane veličine koja obuhvata sve hromatografske podatke jednog sistema (PC1). Navedeni rezultati u saglasnosti su sa podacima dobijenim prilikom određivanja lipofilnosti nekih prirodnih i sintetisanih kumarina primenom RPTLC135, kao i određivanja particionog koeficijenta zemljište-voda (logKOW)64. U tom smislu, u QSRR analizama koje slede u daljem delu teksta, vrednosti RM0, dobijene za sistem RP-18/DMSO:voda, korišćene su kao parametar lipofilnosti koji je korelisan sa molekulskim deskriptorima.  4 Naši radovi  63    Tabela 4. Statistički parametri linearne zavisnosti između eksperimentalno određene i izračunate vrednosti lipofilnosti za tri primenjena hromatografska sistema RM0 - f(log P) Organska komponenta Jednačina r s P t a Fb R2 RM0 - Alog Ps Metanol RM0 = 1,469 (±0,622) + 0,686 (±0,187) Alog Ps (35) 0,5496 0,6080 0,0009 3,66 13,42 0,3021 Dioksan RM 0 = 3,117 (±0,764) + 0,207 (±0,262) Alog Ps (36) 0,1404 0,7206 0,4359 0,79 0,62 0,0197 DMSO RM 0 = 1,124 (±0,499) + 0,480 (±0,091) Alog Ps (37) 0,6877 0,5284 ˂0,0001 5,27 27,82 0,4729 RM0 - AClog P Metanol RM0 = 1,764 (±0,573) + 0,581 (±0,173) AClog P (38) 0,5174 0,5602 0,0020 3,37 11,33 0,2677 Dioksan RM 0 = 1,958 (±0,621) + 0,592 (±0,213) AClog P (39) 0,4475 0,5855 0,0090 2,79 7,76 0,2003 DMSO RM 0 = 1,359 (±0,453) + 0,427 (±0,082) AClog P (40) 0,6810 0,4794 ˂0,0001 5,18 26,81 0,4638 RM0 - Alog P Metanol RM0 = 1,761 (±0,552) + 0,713 (±0,166) Alog P (41) 0,6096 0,5405 0,0002 4,28 18,33 0,3716 Dioksan RM 0 = 2,726 (±0,679) + 0,474 (±0,232) Alog P (42) 0,3440 0,6400 0,0450 2,03 4,16 0,1183 DMSO RM 0 = 1,380 (±0,411) + 0,503 (±0,0751) Alog P (43) 0,7691 0,4358 ˂0,0001 6,70 44,89 0,5915 RM0 - Mlog P Metanol RM0 = 0,661 (±0,309) + 0,730 (±0,093) Mlog P (44) 0,8150 0,3029 ˂0,0001 7,83 61,32 0,6642 Dioksan RM 0 = 2,405 (±0,542) + 0,224 (±0,186) Mlog P (45) 0,2120 0,5108 0,2363 1,21 1,46 0,0449 DMSO RM 0 = 0,962 (±0,314) + 0,387 (±0,057) Mlog P (46) 0,7725 0,3319 ˂0,0001 6,77 45,88 0,5968 RM0 - log PKOWWIN Metanol RM0 = 1,377 (±0,573) + 0,722 (±0,173) log PKOWWIN (47) 0,6006 0,5609 0,0002 4,18 17,49 0,3607 Dioksan RM 0 = 2,544 (±0,711) + 0,415 (±0,244) log PKOWWIN (48) 0,2926 0,6708 0,0984 1,70 2,90 0,0856 DMSO RM 0 = 0,783 (±0,384) + 0,548 (±0,070) log PKOWWIN (49) 0,8151 0,4063 ˂0,0001 7,83 61,37 0,6644 RM0 - Xlog P2 Metanol RM0 = -0,278 (±0,550) + 1,0516 (±0,166) Xlog P2 (50) 0,7519 0,5377 ˂0,0001 6,35 40,32 0,5654 Dioksan RM 0 = 3,205 (±0,865) - 0,015 (±0,296) Xlog P2 (51) -0,0090 0,8156 0,9603 -0,05 0,00 0,0001 DMSO RM 0 = 0,139 (±0,537) + 0,560 (±0,097) Xlog P2 (52) 0,7167 0,5687 ˂0,0001 5,72 32,74 0,5137 RM0 - Xlog P3 Metanol RM0 = 0,778 (±0,5108) + 0,881 (±0,154) Xlog P3 (53) 0,7170 0,4995 ˂0,0001 5,73 32,80 0,5141 Dioksan RM 0 = 3,297 (±0,757) + 0,126 (±0,259) Xlog P3 (54) 0,0870 0,7140 0,6302 0,49 0,24 0,0076 DMSO RM 0 = 0,818 (±0,435) + 0,527 (±0,079) Xlog P3 (55) 0,7669 0,4599 ˂0,0001 6,65 44,27 0,5881 a ; b( ) ,231;05,0 === ναkr ( )312ν1,1ν0,05;αkr04 Ft 4,16====  64  PC1 - f(log P) Jednačina r s R2 P ta Fb PC1 - Alog Ps PC1 = 3,712 (±0,114) + 0,142 (±0,053) Alog Ps (63) 0,4341 0,6557 0,1884 0,0116 2,68 7,20 PC1 - AClog P PC1 = 3,664 (±0,100) + 0,141 (±0,046) AClog P (64) 0,4793 0,5746 0,2297 0,0048 3,04 9,25 PC1 - Alog P PC1 = 4,092 (±0,097) + 0,178 (±0,045) Alog P (65) 0,5792 0,5558 0,3355 0,0004 3,96 15,65 PC1 - Mlog P PC1 = 3,050 (±0,068) + 0,157 (±0,031) Mlog P (66) 0,6687 0,3886 0,4472 ˂0,0001 5,01 25,07 PC1 - log PKOWWIN PC1 = 3,740 (±0,098) + 0,188 (±0,045) log PKOWWIN (67) 0,5965 0,5630 0,3558 0,0002 4,14 17,12 PC1 - Xlog P2 PC1 = 3,162 (±0,120) + 0,195 (±0,056) Xlog P2 (68) 0,5325 0,6903 0,2836 0,0014 3,50 12,27 PC1 - Xlog P3 PC1 = 3,660 (±0,102) + 0,185 (±0,047) Xlog P3 (69) 0,5749 0,5864 0,3305 0,0005 3,91 15,30 b - f(log P) Jednačina -r s R2 P ta Fb b - Alog Ps b = 1,318 (±0,680) - 41,188 (±11,556) Alog Ps (56) 0,5392 0,6129 0,2907 0,0012 3,56 12,71 b - AClog P b = 1,486 (±0,609) - 37,478 (±10,345) AClog P (57) 0,5454 0,5488 0,2975 0,0010 3,62 13,13 b - Alog P b = 1,417 (±0,579) - 46,021 (±9,843) Alog P (58) 0,6431 0,5221 0,4136 ˂0,0001 4,68 21,86 b - Mlog P b = 0,974 (±0,440) - 35,727 (±7,478) Mlog P (59) 0,6512 0,3967 0,4240 ˂0,0001 4,78 22,83 b - log PKOWWIN b = 0,947 (±0,590) - 48,054 (±10,020) log PKOWWIN (60) 0,6526 0,5315 0,4259 ˂0,0001 4,80 23,00 b - Xlog P2 b = 0,414 (±0,754) - 47,288 (±12,817) Xlog P2 (61) 0,5523 0,6798 0,3050 0,0009  3,69 13,61 b - Xlog P3 b = 1,087 (±0,643) - 44,278 (±10,923) Xlog P3 (62) 0,5886 0,5794 0,3464 0,0003  4,05 16,43 a ; b a ; b Tabela 5. Statistički parametri linearne zavisnosti između vrednosti nagiba i izračunatih logP vrednosti za sistem RP- 18/DMSO:voda Tabela 6. Statistički parametri linearne zavisnosti između vrednosti PC1 i izračunatih log P vrednosti za sistem RP- 18/DMSO:voda   4 Naši radovi  ( ) 04,231;05,0 === ναkrt ( ) 4,16312ν1,1ν0,05;αkrF ==== (t ) 04,231;05,0 === ναkr ( ) 4,16312ν1,1ν0,05;αkrF ====  4 Naši radovi  4.3 Multivarijantna analiza podataka 4.3.1 Uvodna multivarijantna analiza U cilju boljeg razumevanja rezultata dobijenih prilikom hromatografskog razdvajanja ispitivanih arilpiperazina izvršena je uvodna multivarijantna analiza kojom je ukazano na eventualno prisustvo rezultata koji su posledica grubih grešaka, kao i na postojanje moguće međusobne zavisnosti između objekata (ispitivanih jedinjenja) i varijabli (retencionih podataka i molekulskih deskriptora). U tom smislu primenjene su analiza glavnih komponenata i klasterska analiza. Set molekulskih deskriptora odabran je tako da reflektuje geometrijska, elektronska i fizičko-hemijska svojstva molekula. Deskriptori korišćeni u daljim analizama, kao i njihove vrednosti navedeni su u Tabeli P8 u Prilogu. Vrednosti molekulskih deskriptora su centrirane u odnosu na srednju vrednost i normirane na jediničnu vrednost standardne devijacije. Nakon izvršenog autoskaliranja svi objekti su simetrično raspoređeni oko koordinatnog početka, varijable su istih dimenzija i promenjen je međusobni odnos objekata. Dimenzije seta podataka iznosile su N × K (33 × 30), gde je N broj ispitivanih arilpiperazina, dok je K broj varijabli, odnosno molekulskih deskriptora. 4.3.2 Analiza glavnih komponenata Analiza glavnih komponenata izvršena je na podacima koji opisuju hromatografsko ponašanje ispitivanih arilpiperazina, kao i na molekulskim deskriptorima istih. Primena PCA na retencione podatke može ukazati na određene sličnosti između ispitivanih jedinjenja koje su uslovljene kako njihovim strukturnim karakteristikama tako i specifičnim interakcijama do kojih dolazi u različitim hromatografskim sistemima. Odgovarajući grafik koeficijenata latentnih varijabli može da ukaže na hromatografski sistem koji u najvećoj meri određuje utvrđeno grupisanje. Sa druge strane, PCA primenjena na set izračunatih 65     4 Naši radovi  molekulskih deskriptora dovodi do objedinjavanja jedinjenja samo na osnovu sličnih strukturnih karakteristika. 4.3.2.1 PCA primenjena na retencione podatke PCA primenjena na hromatografske podatke (RM vrednosti), dobijene za tri hromatografska sistema, rezultovala je trokomponentnim modelom kojim se objašnjava 95,14% ukupnog varijabiliteta među podacima. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od svojstvenih vrednosti dat je u Prilogu (Slika P1). Prva glavna komponenta obuhvata 77,98% varijabiliteta, dok druga glavna komponenta (PC2) pokriva 10,37%. Informacije sadržane u preostalim varijablama nisu bile značajne za analizu posmatranih podataka. Vrednosti skorova, odnosno njihova uzajamna projekcija, za prve dve glavne komponente, prikazana je na Slici 11a. Prisustvo rezultata koji su posledica grubih grešaka nije utvrđeno, odnosno među jedinjenjima nema onih koji odstupaju od posmatranog seta, jer se svi podaci nalaze unutar Hotelling T2 elipse. Uzajamna projekcija koeficijenata latentnih varijabli vektora prikazana je Slici 11b. U odnosu na PC2-osu jedinjenja su podeljena u dva klastera, saglasno prisustvu tio-grupe u molekulu, odnosno 6-[2-(4- arilpiperazin-1-il)etil]-1H-benzimidazoli su razdvojeni od 1-{2-[5-(1H-benzimidazol-2- tion)]etil}-4-arilpiperazina. Formiranje klastera na osnovu retencionih podataka ostvareno je isključivo duž PC2 ose. Naime, opseg u kojem figurišu varijable u PC1 je izuzetno uzak (0,245 – 0,275) i primenom ove metode nije utvrđen značajan uticaj sastava mobilne faze duž ovog pravca na razdvajanje jedinjenja. Najveći pozitivan uticaj na PC2 ima sistem metanol:voda, odnosno jedinjenja sa vrednostima PC2 skorova iznad nule (derivati 6-[2-(4- arilpiperazin-1-il)etil]-1H-benzimidazola) pokazuju jaču retenciju u hromatografskom sistemu koji sadrži metanol. Najveći negativan uticaj na razdvajanje duž PC2 pravca imaju sistemi DMSO:voda i dioksan:voda. Jedinjenja sa negativnim vrednostima PC2 skorova (derivati 1-{2-[5-(1H-benzimidazol-2-tion)]etil}-4-arilpiperazina) pokazuju jaču retenciju u hromatografskim sistemima u kojima su kao organska komponenta mobilne faze 66     4 Naši radovi  67    -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 -3 -2 -1 0 1 2 3 Scores on PC 1 (77.98%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 S co re s on P C 2 (1 0. 37 % ) 0.245 0.25 0.255 0.26 0.265 0.27 0.275 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 PC 1 (77.98%) P C 2 (1 0. 37 % ) DMSO 80% DMSO 85% DMSO 90% DMSO 95% DMSO 100% MeOH 80% MeOH 85% MeOH 90% MeOH 95% MeOH 100% Diox 60% Diox 65% Diox 70% Diox 75% Diox 80% primenjeni DMSO i dioksan. Prema PC1, jedinjenja se grupišu na osnovu prisustva atoma halogena u benzimidazolskoj i benzimidazol-2-tionskoj farmakofori, pri čemu se u slučaju benzimidazol-2-tion jedinjenja javljaju izvesna odstupanja. Naime, derivati 1-{2-[5-(1H- benzimidazol-2-tion)]etil}-4-arilpiperazina koji u arilpiperazinskom delu molekula sadrže grupe sa proton-akceptorskim svojstvima (2-MeOPhe, pirimidin-2-il, 2-NO2Phe) nalaze se u istom delu grafika nezavisno od prisustva atoma halogena u benzimidazolskom delu. Takođe, jedinjenja koja sadrže hidrofobne grupe (2,3-diMePhe, naftil,  3-CF3Phe) i u benzimidazolskom delu molekula sadrže vodonik, nalaze se u grupi sa halogenim derivatima. Jedinjenja koja se nalaze unutar jedne grupe imaju sličnu lipofilnost. Saglasno rezultatima PCA primenjene na retencione podatke, hromatografsko ponašanje ove klase jedinjenja određeno je isključivo prirodom supstituenata u arilpiperazinskom delu molekula.   a b Slika 11. PCA primenjena na retencione podatke, a) grafik skorova, b) grafik koeficijenata latentnih varijabli  4 Naši radovi  4.3.2.2 PCA primenjena na molekulske deskriptore PCA je izvedena na kompletnom setu podataka u cilju utvrđivanja spoljašnjih vrednosti, kao i međusobnih odnosa, odstupanja i grupisanja među objektima. Matrica podataka sastojala se od 33 objekta (ispitivanih arilpiperazina) i 31 varijable, od kojih su 3 zavisno promenljive (RM0_DMSO, RM0_MeOH, RM0_Diox) dok su preostalih 28 molekulski deskriptori. Dobijeni PCA model sastoji se od sedam glavnih komponenata kojima se objašnjava 92,71% ukupnog varijabiliteta među podacima. Prva glavna komponenta obuhvata 42,24% varijabiliteta, dok kumulativna varijansa objašnjena pomoću prve dve komponente iznosi 63,53%. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od svojstvenih vrednosti dat je u Prilogu (Slika P2). Uzajamne projekcije skorova i odgovarajućih koeficijenata latentnih varijabli, za prve dve glavne komponente, prikazane su na Slici 12. Prisustvo rezultata koji su posledica grubih grešaka nije utvrđeno. Na osnovu vrednosti PC2 jedinjenja sa atomom halogena u benzimidazolskom i benzimidazol-2-tionskom prstenu razdvojena su od jedinjenja sa vodonikom u istom položaju. Izuzetak predstavljaju supstance koje u arilpiperazinskom delu molekula sadrže grupe sa proton-akceptorskim svojstvima (2-NO2Phe, pirimidin-2-il), a koja se i pored atoma halogena u dopaminergičkoj farmakofori nalaze u grupi sa nehalogenim derivatima. Svojstva pomenutih jedinjenja određena su, dakle, prisustvom proton-akceptorskih grupa u mnogo većoj meri nego prisustvom halogenog atoma ili tio- grupe. Molekulski deskriptori koji određuju grupisanje halogenih derivata arilpiperazina opisuju geometriju i veličinu molekula, njihovu lipofilnost, molekulsku grafiku (logP, MW, masa, indeksi valentnosti 1-4, zapremina), kao i LUMO energiju. Grupisanje nehalogenih derivata i halogenih derivata koji u arilpiperazinskom delu sadrže proton-akceptorske grupe određeno je deskriptorima koji su povezani sa polarnošću molekula (HBA, HBD, ukupni dipol, HSA, HLB, PSA, HOMO energija). Najveći pozitivan i negativan uticaj na PC2 imaju deskriptori koji opisuju polarnost molekula, zbog čega se ova komponenta može smatrati diskriminišućim faktorom koji analizirana jedinjenja razdvaja saglasno njihovim 68     4 Naši radovi  polarnim karakteristikama. Najveći pozitivan uticaj na vrednosti PC1 imaju topološki deskriptori, parametar lipofilnosti, veličina molekula i njihova geometrija. Značaj deskriptora koji na negativan način utiču na PC1 je zanemarljiv. Ovim je potvrđena pretpostavka Sârbu-a i saradnika da su u hromatografiji dve glavne komponente uglavnom dovoljne za opisivanje najvećeg dela varijabiliteta među retencionim podacima, kao i da jedna od komponenata uglavnom pokazuje visoku korelaciju sa lipofilnošću, veličinom molekula ili sternim faktorima, dok je druga komponenta više određena dipol-dipol interakcijama i elektronskim faktorima61-63. Na grafiku koeficijenata latentnih varijabli se uočava visoka korelacija između molekulskih deskriptora MW, mase, indeksa valentnosti 1-4, zapremine, površine i log P, zbog čega bi se iste informacije o hromatografskom ponašanja arilpiperazina dobile korišćenjem bilo koje od ovih veličina. Pomenuti deskriptori su obrnuto proporcionalni parametrima HLB, HSA, PSA, HBA, HBD i ST. Visoka korelacija uočena je i između indeksa konektivnosti 0-4, polarizabiliteta i refraktivnosti. Slika 12b ukazuje, takođe, na razlike u hromatografskom ponašanju arilpiperazina kada se koriste različiti modifikatori u mobilnim fazama, čime je još jednom potvrđeno da su RM0 vrednosti zavisne od prirode organske komponente. Hromatografski određeni parametri lipofilnosti, dobijeni za sisteme DMSO:voda i metanol:voda, visoko su korelisani sa deskriptorima kao što su dipolni moment, masa, MW, log P, kao i izvesnim topološkim parametrima, dok su obrnuto proporcionalni deskriptorima koji su povezani sa polarnošću molekula (HBA, HBD, ukupni dipol, HSA, HLB, PSA, HOMO energija). Nasuprot tome, RM0 vrednosti dobijene za sistem dioksan:voda, su u obrnutim odnosima sa opisanim molekulskim deskriptorima. 69     4 Naši radovi  70    -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 -6 -4 -2 0 2 4 6 Scores on PC 1 (42.24%) S co re s on P C 2 (2 1. 29 % ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 PC 1 (42.24%) P C 2 (2 1. 29 % ) Total dipole LUMO Energy HOMO Energy SA Volume Refractivity Polarizability Mass MW Log P HLB Solubility parameter HBA HBD Dipole moment ST HSA PSA Connectivity 0 Connectivity 1 Connectivity 2 Connectivity 3 Valence 0 Valence 1 Valence 2 Valence 3 Connectivity index 4 Valence index 4 RM0_DMSO RM0_MeOH RM0_Diox Connectivity 0 Connectivity 1 Connectivity 2 Connectivity 3 Connectivity index 4 Valence 0 Polarizability Refractivity a b Slika 12. PCA primenjena na molekulske deskriptore, a) grafik skorova, b) grafik koeficijenata latentnih varijabli 4.3.3 Klasterska analiza Klasterska analiza je izvedena kao uvodna analiza kojom je set multivarijantnih podataka preveden u klastere koji su olakšali razumevanje rezultata dobijenih primenom PCA, ali i potvrdili pretpostavljeno grupisanje. HCA je primenjena na podatke koji opisuju retenciju ispitivanih arilpiperazina u uslovima planarne hromatografije, kao i na molekulske deskriptore. Na Slici 13 je prikazan dendrogram dobijen za retencione podatke za tri primenjena hromatografska sistema. Na razdaljini od 25 mogu se razlikovati dva klastera u kojima su jedinjenja razdvojena na osnovu polarnosti grupe u arilpiperazinskom delu molekula. U prvom klasteru se nalaze supstance (3, 8, 9, 15, 16, 21, 22, 26) koje sadrže hidrofobne grupe (2,3-diMePhe, 3-CF3Phe, 2-ClPhe), dok su u drugom klasteru jedinjenja koja sadrže grupe sa proton-akceptorskim karakteristikama.  4 Naši radovi  0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 5 10 15 20 25 30 Variance Weighted Distance Between Cluster Centers 1 6 2 7 27 4 10 5 11 12 13 19 14 20 18 24 17 23 25 28 32 30 29 31 33 3 8 9 15 21 26 16 22 Slika 13. Dendrogram dobijen za RM vrednosti Na razdaljini od 8 mogu se uočiti četiri klastera. U prvom klasteru se nalaze derivati 6-[2-(4-arilpiperazin-1-il)etil]-1H-benzimidazola, pri čemu se supstance 3, 6 i 9, koje pripadaju pomenutoj klasi ali sadrže hidrofobne grupe, nalaze u četvrtom klasteru, zajedno sa istim jedinjenjima iz grupe derivata 1-{2-[5-(1H-benzimidazol-2-tion)]etil}-4- arilpiperazina. U drugom klasteru se nalaze derivati benzimidazol-2-tiona koji u arilpiperazinskom delu molekula sadrže polarne grupe (pirimidin-2-il, 2-NO2Phe, 2- MeOPhe), dok treći klaster čine jedinjenja iz benzimidazol-2-tionske grupe koja u benzimidazolskom delu molekula ne poseduju atom halogena. Na dendrogramu dobijenom za molekulske deskriptore (Slika 14) uočavaju se dva klastera, na razdaljini od 17, pomoću kojih se ispitivana jedinjenja grupišu na osnovu 71     4 Naši radovi  prisustva tio-grupe u benzimidazolskom delu molekula. Unutar grupe 1-{2-[5-(1H- benzimidazol-2-tion)]etil}-4-arilpiperazina nije moguće objasniti formirane podgrupe, što upućuje na zaključak da se na osnovu molekulskih deskriptora pomenuta jedinjenja malo razlikuju. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 5 10 15 20 25 30 Variance Weighted Distance Between Cluster Centers 1 2 3 6 7 8 4 10 12 5 11 32 33 18 24 13 30 25 31 17 23 14 15 19 27 20 26 28 29 9 16 21 22 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 30 Variance Weighted Distance Between Cluster Centers 1 4 10 2 13 0 17 23 25 31 15 9 28 29 5 32 33 11 18 24 2 3 6 7 8 9 21 16 14 26 20 27 22 Slika 14. Dendrogram dobijen za molekulske deskriptore 4.3.4 QSRR analiza Hemometrijske metode višestruka linearna regresija, regresija metodom delimičnih- najmanjih kvadrata i regresija glavnih komponenata primenjene su za identifikaciju molekulskih deskriptora koji na najbolji način opisuju ponašanje ispitivanih jedinjenja u 72     4 Naši radovi  hromatografskom sistemu, kao i za kvantifikaciju njihovog uticaja, a u cilju dobijanja matematičkih modela na osnovu kojih bi moglo da se predvidi hromatografsko ponašanje, odnosno lipofilnost novih srodnih molekula. U QSRR analizama koje slede zavisno promenljive su bili parametri lipofilnosti, RM0, dobijeni za hromatografski sistem u kojem je korišćen DMSO kao organska komponenta mobilne faze, dok su kao nezavisno promenljive korišćeni molekulski deskriptori. Pre regresione analize podaci su podeljeni u dve grupe, na kalibracioni i test set. Molekuli koji su uključeni u određeni set odabrani su nasumice. Garkani-Nejad i Ahmadvand136,137 su, proučavajući uticaj veličine test seta na kvalitet modela, utvrdili da ukoliko test set sadrži 15 – 40% jedinjenja iz osnovnog seta, model konstruisan sa kalibracionim setom može uspešno da predvidi test set. Ukoliko test set sadrži manje od 15% jedinjenja iz osnovnog seta korelacioni koeficijent test seta je nepouzdan, dok ukoliko je pomenuti procenat visok, model dobijen za kalibracioni set nije kompletan i ne može tačno da predvidi posmatranu promenljivu. U ovom radu test set se sastojao od približno 39% jedinjenja odabranih iz osnovnog seta. U kalibracionom setu se nalazilo 20 jedinjenja (2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 22, 24, 25, 26, 28, 29, 30) koja su korišćena za konstruisanje modela, dok je test set koji je obuhvatao 13 jedinjenja (1, 8, 9, 13, 14, 17, 18, 21, 23, 27, 31, 32, 33) korišćenih za procenu dobijenog matematičkog modela. 4.3.4.1 Višestruki linearni regresioni model Višestruki linearni regresioni model se ne može primeniti za modelovanje kompleksnog seta podataka u kojem broj nezavisnih varijabli prevazilazi broj objekata. Stoga, korak koji prethodi pravljenju modela je redukcija broja nezavisno promenljivih varijabli. Molekulski deskriptori čije su vrednosti približno jednake za sva ispitivana jedinjenja, odnosno veličine kod kojih nije postojao varijabilitet među podacima, isključene su iz dalje analize jer nisu pružale informacije o razlikama između ispitivanih arilpiperazina (HOMO energija, zapremina, parametar rastvorljivosti i molarna refraktivnost). Deskriptori 73     4 Naši radovi  kod kojih postoji visoka međusobna korelacija pružaju iste informacije o jedinjenjima i jednu od njih bi trebalo zanemariti. Dva deskriptora su međusobno nezavisna ukoliko je vrednost korelacionog koeficijenta manja od 0,800039. Korelaciona matrica sa vrednostima Pearson-ovih koeficijenata (rij), koji predstavljaju linearne regresione koeficijente dobijene korelisanjem i-te nezavisne promenljive sa j-tom nezavisno promenljivom, za set molekulskih deskriptora izračunatih za seriju arilpiperazina, dati su u Tabeli P9 u Prilogu. Visoke vrednosti korelacionog koeficijenta su dobijene za deskriptore hidrofilna površina i hidrofilno-lipofilni balans, hidrofilna površina i akceptor vodonične veze, kao i za površinski napon i polarnu površinu. Od prethodno navedenih deskriptora zadržani su oni koji su pokazivali bolju korelaciju sa zavisno promenljivom, odnosno molekulski deskriptori hidrofilna površina i polarna površina su odbačeni. Deskriptori koji su preostali nakon izvršene selekcije prikazani su u Tabeli P10 u Prilogu i korišćeni su kao ulazni podaci za MLR metodu. Povećanje broja deskriptora u regresionoj jednačini rezultuje boljim prediktivnim karakteristikama modela. Sa druge strane, uvođenjem previše varijabli dobio bi se model koji je najverovatnije precenjen. U cilju odabira seta deskriptora koji će dati model sa najboljom prediktivnošću, izvršena je selekcija varijabli metodom postepene regresije. Rezultati primenjene metode dati su u Tabeli 7. Tabela 7. Selekcija varijabli metodom postepene regresije Broj ponavljanja Varijabla R 2 RMSE 1 Dodato HLB 0,5951 0,666 2 Dodato CI0 0,7438 0,545 3 Dodato CI2 0,8825 0,381 4 Dodato ST 0,9463 0,266 5 Dodato TD 0,9623 0,230 6 Dodato VI3 0,9762 0,190 7 Nepromenjeno 0,9762 0,190 74     4 Naši radovi  Molekulski deskriptori odabrani kao varijable koje značajno utiču na retencione parametre ispitivanih arilpiperazina su: ukupni dipol, polarizabilnost, hidrofilno-lipofilni balans, površinski napon, indeks konektivnosti 0 i 2 i indeks valentnosti 3. Modelovanjem RM0 vrednosti jedinjenja iz kalibracionog seta sa vrednostima prethodno navedenih molekulskih deskriptora, dobijena je MLR jednačina koju karakteriše visoka vrednost korigovanog koeficijenta determinacije (R2adj = 0,9652) i F-testa za korelaciju (F = 88,729), kao i niske vrednosti srednjeg kvadratnog odstupanja (MSE = 0,036), nivoa verovatnoće (P ˂ 0,001) i sume kvadrata odstupanja od predviđenih vrednosti (PRESS = 1,13). Vrednosti regresionih koeficijenata, njihove standardne devijacije i intervali pouzdanosti za 95% nivo značajnosti, dati su u Tabeli 8. Tabela 8. Statistički parametri MLR modela Nezavisna varijabla Regresioni koeficijent s L1 L2 t-test H0: bi=0 P H0: bi≠0 Odsečak 5,072 1,371 2,109 8,035 3,698 0,0027 Da CI0 -0,189 0,021 -0,234 -0,144 -9,138 ˂0,0001 Da CI2 0,816 0,081 0,642 0,991 10,096 ˂0,0001 Da HLB -0,269 0,055 -0,388 -0,149 -4,850 0,0003 Da ST -0,022 0,004 -0,029 -0,014 -6,134 ˂0,0001 Da TD -0,128 0,040 -0,215 -0,040 -3,159 0,0075 Da VI3 0,613 0,224 0,130 1,096 2,743 0,0168 Da U cilju utvrđivanja postojanja statistički značajne linearne zavisnosti između određene nezavisne varijable i zavisno promenljive, na vrednosti regresionih koeficijenata primenjen je t-test. Vrednost t se izračunava iz odnosa bs bt = , gde je b nagib u regresionom modelu, a sb standardna devijacija nagiba, dok je broj stepeni slobode n-k-1 (n – veličina uzorka, k – broj nezavisnih promenljivih). Prema nultoj hipotezi vrednost nagiba je jednaka nuli. Ukoliko je vrednost nagiba u regresionoj pravoj značajno različita od nule, između 75     4 Naši radovi  posmatrane nezavisno promenljive i RM0 vrednosti postoji statistički značajan odnos. Rezultati t-testa za regresione koeficijente dati su u Tabeli 8. Postojanje značajne zavisnosti utvrđeno je za sve molekulske deskriptore koji su uključeni u model. Predložena MLR jednačina primenjena je na jedinjenja iz test seta i RM0 vrednosti su upoređene sa eksperimentalno dobijenim. Visoke vrednosti R2adj (0,9652) i F (88,729), kao i niske vrednosti MSE (0,036) i P (˂ 0,001) ukazuju na dobru prediktivnu moć modela. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti dat je na Slici 15. Slika 15. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti dobijenih na osnovu MLR modela 76     4 Naši radovi  4.3.4.2 Regresija glavnih komponenata Kod PCR metode originalne varijable zamenjuju se sa nekoliko glavnih komponenata, dobijenih nakon PCA, redukujući na taj način početni set podataka. PCR metoda primenjena je na jedinjenja iz kalibracionog seta, pri čemu su svi molekulski deskriptori korelisani sa zavisno promenljivom i kvalitet dobijenog modela procenjen na osnovu sledećih parametara: R2Cal (koeficijent determinacije koji se odnosi na rezultate iz kalibracionog seta), R2CV (koeficijent determinacije koji je rezultat unakrsne validacije), RMSEC (koren srednjeg kvadratnog odstupanja koji se odnosi na rezultate iz kalibracionog seta), RMSECV (koren srednjeg kvadratnog odstupanja koji je rezultat unakrsne validacije)80,103. Unakrsna validacija je izvršena metodom slučajnih uzoraka, uz 5 podela i 20 ponavljanja i korišćena je za proveru prediktivnih svojstava PCR modela. Prvih osam glavnih komponenata, kojima je objašnjeno 97,25% ukupnog varijabiliteta u matrici podataka X, korišćeno je za modelovanje. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od odnosa RMSEC/RMSECV dat je na Slici P3 u Prilogu. Broj glavnih komponenata odabran je tako da odnos RMSEC/RMSECV bude što niži a da pri tome udeo objašnjenog varijabiliteta u modelu bude što viši. Tabela 9. Udeo pojedinačnih komponenata u PCR modelu Glavna komponenta X - Blok Y - Blok Udeo pojedinačne komponente Ukupan udeo Udeo pojedinačne komponente Ukupan udeo 1 46,01 46,01 17,66 17,66 2 19,49 65,49 48,75 66,40 3 13,62 79,12 6,99 73,39 4 7,91 87,03 0,22 73,61 5 4,42 91,45 12,51 86,12 6 2,64 94,09 9,93 96,05 7 1,92 96,01 0,36 96,41 8 1,24 97,25 1,44 97,85 77     4 Naši radovi  U Tabeli 9 prikazani su udeli pojedinačnih komponenata u predloženom PCR modelu. Najveći uticaj na model ima PC2 kojom se objašnjava 19,49% ukupne varijanse u matrici podataka X i sa y-vrednostima daje vrednost korelacionog koeficijenta u iznosu od 0,49. Značajno manji uticaj na model imaju PC1 i PC5 kod kojih vrednosti korelacionih koeficijenata iznose 0,18, odnosno 0,13, redom. Pri tome PC1 opisuje 46,01% ukupnog varijabiliteta među podacima. Glavne komponente koje su pokazivale malu sposobnost predviđanja RM0 vrednosti smatrane su manje značajnim. Statistički parametri PCR modela dobijenog za kalibracioni set su: R2Cal = 0,9784 i R2CV = 0,8810, RMSEC = 0,1457 i RMSECV = 0,3950. 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 Y Measured 1 RM0 Y C V P re di ct ed 1 R M 0 2 3 4 5 6 7 10 11 12 15 16 19 20 22 24 25 26 28 29 30 Slika 16. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti dobijenih na osnovu PCR modela 78     4 Naši radovi  79    5 10 15 20 25 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 Variable R eg V ec to r f or Y 1 R M 0 Total dipole LUMO Energy HOMO Energy SA Volume Refractivity Polarizability Mass MW Log P HLB Solubility parameter HBA HBD Dipole moment ST HSA PSA Connectivity 0 Connectivity 1 Connectivity 2 Connectivity 3 Valence 0 Valence 1 Valence 2 Valence 3 Connectivity i Valence in Grafik zavisnosti reziduala od Ymodela (RM0 vrednosti predviđene modelom) dat je na Slici P4 u Prilogu. Ovakva vrsta grafika može biti veoma korisna u smislu procene uklapanja predloženog modela u set podataka. Ukoliko su vrednosti reziduala raspoređene nasumično na grafiku, odnosno loše korelisane sa predviđenim RM0 vrednostima, smatra se da se model dobro uklapa u podatke. Slika P4 pokazuje slučajnu raspodelu reziduala sa niskom vrednošću korelacionog koeficijenta (r = -0,2985) između Ymodela i vrednosti reziduala, ukazujući na činjenicu da se predloženi PCR model dobro uklapa u podatke. Ovakav zaključak potvrđen je i grafikom zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti (Slika 16). Vrednosti koeficijenata molekulskih deskriptora u predloženom PCR modelu date su na Slici 17. Slika 17. Grafik vrednosti koeficijenata molekulskih deskriptora u PCR modelu  4 Naši radovi  Prediktivna sposobnost PCR modela proverena je na podacima iz test seta pri čemu su dobijeni sledeći statistički parametri: R2Cal = 0,9785, R2CV = 0,8385 i R2Pred = 0,9639; RMSEC = 0,1457, RMSECV = 0,4717 i RMSEP = 0,2628, gde je R2Pred i RMSEP koeficijent determinacije, odnosno koren srednjeg kvadratnog odstupanja koji se odnose na podatke iz test seta, redom. Na osnovu dobijenih statističkih parametara može se zaključiti da je predloženi PCR model dobar. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti za kalibracioni i test set prikazan je na Slici 18. 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 Y Measured 1 RM0 Y P re di ct ed 1 R M 0 2 3 4 5 6 7 10 11 12 15 16 19 20 22 24 25 26 28 29 30 1 8 9 13 14 17 18 21 23 27 31 32 33 Slika 18. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti za kalibracioni (x) i test set (▼), dobijenih na osnovu PCR modela 80     4 Naši radovi  4.3.4.3 Regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata Regresija metodom delimičnih-najmanjih kvadrata je jedna od najčešće primenjivanih metoda za regresionu analizu multivarijantnih podataka u hemometriji. RM0 vrednosti jedinjenja iz kalibracionog seta korelisane su sa svim molekulskim deskriptorima uz primenu unakrsne validacije metodom slučajnih uzoraka, uz 5 podela i 20 ponavljanja. Broj latentnih varijabli je odabran na osnovu minimalne vrednosti RMSECV. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od odnosa RMSEC/RMSECV dat je na Slici P5 u Prilogu. Minimalna vrednost RMSECV dobijena je za petokomponentni model. 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 Y Measured 1 RM0 Y C V P re di ct ed 1 R M 0 2 3 4 5 6 7 10 11 12 15 16 19 20 22 24 25 26 28 29 30 Slika 19. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti dobijenih na osnovu PLS modela 81     4 Naši radovi  Statistički parametri PLS modela za kalibracioni set su sledeći: R2Cal = 0,9832 i R2CV = 0,9095, RMSEC = 0,1287 i RMSECV = 0,3588. Grafik zavisnosti reziduala od Ymodela (Slika P6 u Prilogu), sa niskom vrednošću korelacionog koeficijenta (r = -0,2219) između Ymodela i vrednosti reziduala, kao i grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti (Slika 19), potvrđuje dobro uklapanje predloženog modela u set podataka. Kod PLS metode varijablu koja značajno utiče na vrednost zavisno promenljive karakteriše visoka vrednost regresionog koeficijenta. Varijabla, međutim, može biti značajna i za modelovanje matrice nezavisno promenljivih, što se iskazuje kroz visoku vrednost koeficijenta latentne varijable. Značaj određene varijable, u smislu njenog udela u objašnjenje zavisno promenljive i varijanse nezavisno promenljivih, izražava se kroz tzv. VIP vrednost (Variable Importance for the Projection – varijable značajne za projekciju). Ova vrednost se za varijablu j izračunava po formuli: ( ) ( )∑∑ = = ×= M m mmmjM m mm j tbSS tbSS pVIP 1 2 1 ω (70) pri čemu je p broj varijabli, M je broj latentnih varijabli kojima se objašnjava PLS model, ωij udeo j-te varijable u m-toj latentnoj varijabli, SS(bmtm) procenat podaka sadržanih u y- vrednostima objašnjen pomoću m latentnih varijabli. VIP vrednosti predstavljaju doprinos određene varijable modelu saglasno njihovom udelu u svakoj latentnoj komponenti, dok regresioni koeficijenti ukazuju na značaj određene varijable u modelu138,139. Na osnovu formule za izračunavanje VIP vrednosti srednja vrednost kvadrata VIP-skorova jednaka je 1, pa se pomenuta vrednost koristi kao kriterijum za selekciju varijabli139. Varijable sa vrednostima VIP-skorova većim od 1 smatraju se najznačajnijim za objašnjenje podataka zavisno promenljive. Grafik zavisnosti varijabli od vrednosti VIP-skorova dat je na Slici 20. Molekulski deskriptori koji imaju najveći uticaj na RM0 vrednosti su ST, HLB, HSA, PSA, CI2, SA, masa, MW, VI2-4. 82     4 Naši radovi  83    5 10 15 20 25 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Variable V IP S co re s fo r Y 1 R M 0 Total dipole LUMO Energy HOMO Energy SA Volume Refractivity Polarizability Mass MW Log P HLB Solubility parameter HBA HBD Dipole moment ST HSA PSA Connectivity 0 Connectivity 1 Connectivity 2 Connectivity 3 Valence 0 Valence 1 Valence 2 Valence Connec 3 tivity in Valence ind Slika 20. Grafik zavisnosti varijabli od vrednosti VIP-skorova za PLS model Vrednosti korelacionih koeficijenata varijabli u predloženom PLS modelu date su na Slici 21. Najveći pozitivan uticaj na retencioni parametar imaju IC2, masa, MW i log P, dok najveći negativan uticaj imaju ST, HLB, PSA i VI0. Molekulski deskriptori koji opisuju geometriju i veličinu molekula, njihovu lipofilnost i molekulsku grafiku direktno su proporcionalni hromatografski određenom parametru lipofilnosti. Sa druge strane, prema dobijenom modelu jedinjenja sa većim vrednostima deskriptora koji su povezani sa polarnim karakteristikama molekula imaju niže RM0 vrednosti, odnosno manju lipofilnost.  4 Naši radovi  5 10 15 20 25 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 Variable R eg V ec to r f or Y 1 R M 0 Total dipole LUMO Energy HOMO Energy SA Volume Refractivity Polarizability Mass MW Log P HLB Solubility parameter HBA HBD Dipole moment ST HSA PSA Connectivity 0 Connectivity 1 Connectivity 2 Connectivity 3 Valence 0 Valence 1 Valence 2 Valence 3 Connectivity Valence Slika 21. Vrednosti korelacionih koeficijenata varijabli u PLS modelu Prediktivna sposobnost PLS modela proverena je na podacima iz test seta. Statistički parametri dobijenog modela, R2Cal = 0,9832, R2CV = 0,8710 i R2Pred = 0,9612; RMSEC = 0,1287, RMSECV = 0,4387 i RMSEP = 0,2796, potvrđuju da je predloženi PLS model dobar. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti, za kalibracioni i test set, dat je na Slici 22. 84     4 Naši radovi  3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 Y Measured 1 RM0 Y P re di ct ed 1 R M 0 2 3 4 5 6 7 10 11 12 15 16 19 20 22 24 25 26 28 29 30 1 8 9 13 14 17 18 21 23 27 31 32 33 Slika 22. Grafik zavisnosti eksperimentalno određenih od predviđenih RM0 vrednosti za kalibracioni (x) i test set (▼), dobijenih na osnovu PCR modela Tri predložene multivarijantne metode (MLR, PCR i PLS) karakterišu dobri statistički parametri. MLR je najosetljivija na vrstu i broj odabranih varijabli. U slučajevima kada postoje suvišne varijable ili varijable koje imaju konstantne vrednosti i ne razlikuju uzorke međusobno, daje modele lošijeg kvaliteta, zbog čega su dobijeni rezultati neočekivani. PLS i PCR su izuzetno značajne u hemometriji jer se pomoću njih može modelovati veliki broj međusobno visoko korelisanih varijabli. PLS prilikom formiranja latentnih varijabli koristi dva kriterijuma, pravac najveće varijanse unutar seta podataka i najbolju korelaciju sa vrednostima zavisno promenljive, zbog čega bi ova metoda trebalo da rezultuje modelom sa najvećom prediktivnom moći. Latentne varijable kod PCR objašnjavaju varijabilitet unutar seta nezavisno promenljivih varijabli zbog čega je ova metoda ograničena u odnosu na PLS. 85     4 Naši radovi  4.3.4.4 Uticaj pojedinih molekulskih deskriptora na hromatografsko ponašanje ispitivanih arilpiperazina Visoke vrednosti R2adj i R2pred, kao i niske vrednosti MSE i RMSEP, potvrđuju da su MLR, PCR i PLS modeli, dobijeni korelisanjem retencionih parametara sa molekulskim deskriptorima, validni. Korak koji sledi je pronalaženje fizičkog smisla u molekulskim deskriptorima koji su označeni kao važni za opisivanje i predviđanje hromatografskog ponašanja ispitivanih arilpiperazina. Kod MLR metode, varijable koje su pokazivale najveće vrednosti regresionog koeficijenta, i Student-ove t-vrednosti, kao i najniže vrednosti nivoa pouzdanosti P, odabrane su kao varijable koje imaju najveći uticaj na zavisno promenljivu. U slučaju PCR metode, deskriptori sa najvećim uticajem na PC2 komponentu, koja je pokazivala najveći korelacioni koeficijent sa y-vrednostima, posmatrani su kao deskriptori koji u najvećoj meri određuju RM0 vrednosti ispitivanih arilpiperazina. Kod PLS metode, doprinos varijabli y-vrednostima određen je korišćenjem vrednosti VIP skorova. U predloženim modelima značajan uticaj na RM0 vrednosti imaju molekulski deskriptori ST i HLB. Površinski napon je fizičko svojstvo određeno strukturom molekula. Najznačajnije karakteristike molekulske strukture koje utiču na površinski napon su površina molekula i proton-donorska, odnosno proton-akceptorska svojstva određenih atoma u molekulu140. Topološki deskriptori koji opisuju veličinu, oblik i račvanja u molekulu i nisu povezani sa geometrijom molekula, daju informaciju o površini molekula i direktno određuju površinski napon. Međutim, najveći pozitivan uticaj na pomenuto svojstvo imaju deskriptori koji opisuju sposobnost vodoničnog vezivanja. U modelu koji povezuje strukturu sa površinskim naponom nalaze se i izvesni elektronski deskriptori koji ukazuju na značaj polarnih interakcija pri određivanjima pomenutog fizičkog svojstva molekula140. U slučaju ispitivanih arilpiperazina elektrostatičke interakcije (jon-jon, jon- dipol, dipol-dipol interakcije), kao i vodonično vezivanje, određivaće vrednosti površinskog napona. Jedinjenja čiji atomi stupaju u ovu vrstu interakcija imaju više ST vrednosti, a u hromatografskom sistemu se slabije zadržavaju. Opisani odnos površinskog napona i 86     4 Naši radovi  retencionog parametra potvđen je i u svim predloženim modelima u kojima ova varijabla pokazuje negativan regresioni koeficijent. Za razliku od MLR modela u kojem ST pokazuje mali negativan uticaj na retenciju, u PCR i PLS modelu ST ima najveći koeficijent i u odnosu na sve druge varijable ima najveći negativan uticaj na RM0 vrednosti. Hidrofilno-lipofilni balans predstavlja odnos između hidrofilnih i hidrofobnih delova molekula i opisuje koji efekat dominira u molekulu. Prema Griffin-ovoj metodi za neutralne molekule, HLB je direktno proporcionalan molekulskoj masi hidrofilnog dela molekula i obrnuto proporcionalan masi celog molekula i ima vrednosti od 0 do 20. Vrednost HLB jednaka 0 odgovara potpuno hidrofobnom molekulu, dok vrednost 20 imaju jako hidrofilni molekuli141. QSRR i QSAR studije ukazuju na značajan uticaj ovog deskriptora na retencioni parametar142, odnosno biološku aktivnost143. Ispitivani arilpiperazini imaju HLB vrednosti u intervalu od 7 do 12, odnosno pokazuju i hidrofilna i lipofilna svojstva. U svim predloženim modelima pomenuti parametar karakteriše negativna vrednost regresionog koeficijenta, tj. sa povećanjem ovog balansa smanjuje se RM0 vrednost. Hidrofobnija jedinjenja koja pokazuju jače nespecifične disperzione interakcije između nepolarnih delova molekula i nepolarne stacionarne faze, više se zadržavaju pod primenjenim hromatografskim uslovima. U PLS i PCR modelima kao varijable koje značajno utiču na zavisno promenljivu pojavljuju se i parametri rastvorljivosti, PSA i HSA. Polarna površina se definiše kao deo površine molekula u kojem se nalaze izrazito elektronegativni atomi kao što su kiseonik, azot, sumpor, i vodonik vezan za prethodno navedene atome. Ovi polarni atomi učestvuju u vodoničnom vezivanju i drugim elektrostatičkim interakcijama. Jedinjenja sa većim brojem ovih atoma, koji nisu sterno zaklonjeni i dostupni su drugim polarnim atomima, rastvorljiviji su u polarnoj mobilnoj fazi hromatografskog sistema, zbog čega je regresioni koeficijent PSA u dobijenim modelima sa negativnim predznakom. PSA je deskriptor koji se pojavljuje u mnogim QSAR/QSRR modelima što je i očekivano sa obzirom na strukturne karakteristike ćelijske membrane i silika-gela117,144,145. Hidrofilna površina molekula predstavlja sumu svih hidrofilnih delova na površini molekula i mera je njegovih hidrofilnih svojstava146. Polarniji molekuli imaju veće vrednosti HLB parametra, 87     4 Naši radovi  rastvorljiviji su u mobilnoj fazi i pokazuju slabiju retenciju u uslovima reverzno-fazne hromatografije. Ovo potvrđuje negativan koeficijent pomenutog parametra u dobijenim modelima. U PLS modelu se kao varijabla koja značajno utiče na retencioni parametar pojavljuje i MW. Molekulska težina je najčešće korišćeni deskriptor za opisivanje veličine molekula jer za njegovo izračunavanje nisu neophodni optimizacija molekula i proračuni. Vrednosti ostalih parametara za opisivanje veličine i oblika molekula, kao što su zapremina, površina, refraktivnost, polarizabilnost, su različite u odnosu na MW, ali informacije koje pomenute varijable pružaju su praktično iste147. U slučaju ispitivanih arilpiperazina MW pozitivno utiče na RM0 vrednosti, odnosno sa povećanjem težine molekula raste njegova lipofilnost. Kod PCR modela MW značajno utiče na PC1 varijablu, koja posle PC2 ima najveći korelacioni koeficijent sa y-vrednostima. Lipofilnost i permeabilnost nekog jedinjenja u velikoj meri zavise od sposobnosti za vodonično vezivanje147,148. Fizičko-hemijski deskriptori koji određuju broj donora i akceptora vodoničnih veza u molekulu, imaju značajan uticaj na PC2. U dobijenom PCR modelu, međutim, HBA i HBD parametri imaju izrazito niske vrednosti regresionih koeficijenata (približno jednake nuli), zbog čega je njihov uticaj na model zanemarljiv. U PLS i MLR modele pomenuti deskriptori nisu uključeni. Ovi deskriptori, naime, ne opisuju jačinu vodoničnog vezivanja niti uzimaju u obzir postojanje intramolekulskog vodoničnog vezivanja. Ovakve informacije sadržane su u sofisticiranijim deskriptorima, kao što su PSA, HSA i ST, a koje imaju značajan uticaj na lipofilnost arilpiperazina149. U dobijenom MLR modelu kao deskriptor koji u značajnoj meri utiče na lipofilnost arilpiperazina javlja se i ukupni dipol. Ovaj parametar opisuje sposobnost molekula da učestvuje u dipol-dipol i dipol-indukovani dipol interakcijama sa komponentama mobilne i stacionarne faze. Zbog negativnog regresionionog koeficijent ovog parametra u modelu sa smanjenjem njegove vrednosti povećava RM0 vrednost, zbog čega su pomenute interakcija javljaju između jedinjenja i mobilne faze, više nego između jedinjenja i hidrofobne 88     89    4 Naši radovi  stacionarne faze. Značaj uticaj dipolnog momenta na retencioni parametar potvrđen je i u literaturi150,151. Kao varijable koje značajno utiču na sva tri predložena modela javljaju se i topološki deskriptori (indeksi konektivnosti i indeksi valentnosti). Ovi parametri opisuju veličinu i oblik molekula, račvanja u strukturi, nezasićenja, prisustvo heteroatoma i prstenova, broj atoma i način na koji su oni povezani u molekulu. Struktura nekog jedinjenja se predstavlja pomoću molekulskog grafika u kojem su atomi prikazani kao tačke (rogljevi), a veze kao ivice. Veza između atoma može biti opisana različitim topološkim matricama koje matematičkim rešavanjem daju jednu vrednost, označenu kao topološki indeks. Valencioni indeksi dodatno koriste broj valentnih elektrona u atomu152. Topološki deskriptori koji uključuju valentne i nevalentne molekulske indekse konektivnosti igraju značajnu ulogu u QSRR analizama. Veliki broj radova potvrđuje primenu topoloških deskriptora za predviđanje retencionih parametara različitih klasa organskih jedinjenja153. U modelima koji utvrđuju zavisnost parametra lipofilnosti arilpiperazina sa njihovom strukturom, topološki parametri imaju pozitivan regresioni koeficijent, odnosno povećanje veličine molekula povećava površinu za interakciju sa stacionarnom fazom što vodi ka jačanju retencije. Modeli koji opisuju zavisnost retencije serije arilpiperazina i molekulskih deskriptora, potvrđuju činjenicu da je lipofilnost molekula određena dvema komponentama, veličinom molekula i sposobnošću građenja vodoničnih veza147. Veličina molekula je opisana molekulskom težinom ili topološkim deskriptorima, dok su elektrostatičke interakcije (jon-jon, jon-dipol, dipol-dipol interakcije), kao i vodonično vezivanje prikazane pomoću deskriptora PSA, HSA, HLB i ST. Negativni regresioni koeficijenti parametara rastvorljivosti (PSA, HSA, HLB i ST) imaju veći uticaj na RM0 vrednosti od parametara koji opisuju veličinu molekula. Na osnovu ovakvih rezultata može se pretpostaviti da je u posmatranom hromatografskom sistemu particija dominantni mehanizam razdvajanja u odnosu na adsorpciju. Statistički parametri koji opisuju prediktivna svojstva dobijenih modela potvrđuju mogućnost njihovog korišćenja za predviđanje lipofilnosti novih, strukturno sličnih jedinjenja. 5 Zaključak   90   5 Zaključak 5. Zaključak U radu je proučeno hromatografsko ponašanje serije novosintetisanih arilpiperazina u uslovima reverzno-fazne planarne hromatografije. Dobijeni retencioni podaci su procenjeni na osnovu multivarijantnih statističkih metoda i utvrđena je veza između retencionih karakteristika i fizičko-hemijskih parametara ispitivanih molekula. Zahvaljujući amfifilnim svojstvima ispitivanih supstanci, različiti reverzno-fazni sistemi uspešno su primenjeni za njihovo razdvajanje. Utvrđeno je da su razlike u retenciji analiziranih jedinjenja posledica prisustva dodatnog atoma sumpora u molekulu derivata benzimidazol-2-tiona, prisustva atoma halogena (Cl, Br) vezanog za benzimidazolsku i benzimidazol-2-tionsku dopaminergičku farmakoforu i različite prirode supstituenta na benzenovom prstenu vezanom za piperazinski deo molekula. Ponašanje arilpiperazina u primenjenim hromatografskim uslovima u saglasnosti je sa njihovim strukturnim svojstvima, kao i sa interakcijama za koje je potvrđeno da se uspostavljaju kada se ligand koji pokazuje afinitet prema dopaminskim D2 i serotoninskim 5-HT1A receptorima približi aktivnom centru receptora. Lipofilnost ispitivanih arilpiperazina određena je pomoću četiri hromatografska deskriptora, RM0, b, C0 i PC1. Deskriptori su izračunati za sva tri primenjena hromatografska sistema. Takođe, utvrđena je linearna zavisnost između parametara lipofilnosti i izračunatih logP vrednosti u cilju potvrde mogućnosti primene RPTLC retencionog parametra za određivanje lipofilnosti. Na osnovu vrednosti statističkih parametara pomenutih korelacija, kao i najveće selektivnosti u razdvajanju ispitivanih arilpiperazina, kao najbolji sistem za procenu lipofilnosti ispitivanih arilpiperazina odabran je sistem koji sadrži DMSO kao organsku komponentu mobilne faze. Rezultati dobijeni primenom pomenutog hromatografskog sistema korišćeni su za dalje analize. Takođe je utvrđeno da varijabla koja direktno opisuje raspodelu supstanci između stacionarne i mobilne faze, kao što je parameter RM0, pouzdanije određuje lipofilnost ispitivanih 91 5 Zaključak arilpiperazina od parametra koji je proporcionalan hidrofobnoj površini molekula (b) ili interpolisane veličine koja obuhvata sve hromatografske podatke jednog sistema (PC1). U cilju boljeg razumevanja utvrđenog retencionog ponašanja ispitivanih arilpiperazina urađena je uvodna multivarijantna analiza. Analiza glavnih komponenata i klasterska analiza su primenjene radi utvrđivanja eventualnog prisustva rezultata koji su posledica grubih grešaka, kao i moguće međusobne zavisnosti između objekata (ispitivanih jedinjenja) i varijabli (retencionih podataka i molekulskih deskriptora). PCA potvrđuje da je ispitivana jedinjenja moguće klasifikovati saglasno njihovim strukturnim karakteristikama. Vrednosti prve dve glavne komponente pokazuju da se jedinjenja grupišu na osnovu prisustva tio-grupe u molekulu ili prisustva atoma halogena u benzimidazolskom, odnosno benzimidazol-2-tionskom delu molekula. Rezultati su potvrđeni klasterskom analizom. Hemometrijske metode MLR, PCR i PLS primenjene su za identifikaciju molekulskih deskriptora koji na najbolji način opisuju ponašanje ispitivanih jedinjenja u hromatografskom sistemu, kao i za kvantifikaciju njihovog uticaja, a u cilju dobijanja matematičkih modela koji bi mogli da predvide hromatografsko ponašanje, odnosno lipofilnost novih srodnih molekula. Statistički parametri potvrđuju da su predloženi modeli statistički značajni i uporedivi. Molekulski deskriptori koji su uključeni u konačne modele su slične prirode i njihov uticaj je približno jednak. Pomoću modela koji opisuju zavisnost retencije serije arilpiperazina i molekulskih deskriptora utvrđeno je da je hromatografsko ponašanje molekula određeno dvema komponentama, veličinom molekula i sposobnošću građenja vodoničnih veza. Veličinu molekula opisuju parametri molekulska težina ili topološki deskriptori, dok elektrostatičke interakcije (jon-jon, jon-dipol, dipol-dipol interakcije) i vodonično vezivanje određuju molekulski deskriptori PSA, HSA, HLB i ST. Dobijeni modeli su pokazali da negativni regresioni koeficijenti parametara rastvorljivosti (PSA, HSA, HLB i ST) imaju veći uticaj na RM0 vrednosti od parametara koji opisuju veličinu molekula. Na osnovu ovakvih rezultata pretpostavljeno je da je u posmatranom hromatografskom sistemu particija dominantni mehanizam razdvajanja u odnosu na adsorpciju. Na osnovu analize statističkih 92 93 5 Zaključak parametara koji opisuju prediktivna svojstva dobijenih modela potvrđena je mogućnost njihovog korišćenja za predviđanje lipofilnosti novih, strukturno sličnih jedinjenja. 6 Literatura   94   6 Literatura 6. Literatura 1. J. Trifković, Uticaj supstituenata na aromatičnim jezgrima 1-aralkil-4-arilpiperazina na njihovu retenciju u uslovima planarne hromatografije, Magistarski rad, Hemijski fakultet, Beograd, 2006. 2. J. Veličković, D. Andrić, G. Roglić, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Planar chromatography of some 1-arylpiperazines behaving as dopaminergic ligands, Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 17 (2004) 255–260. 3. J. Veličković, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Evaluation of the lipophilicity of some 1-arylpiperazines by planar chromatography, Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 18 (2005) 358–363. 4. F.Lj. Andrić, J. Trifkovć, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, An approximate linear solvation energy relationships model based on Snyder’s selectivity parameters. Chromatographic behavior of some 1-aralkyl-4-arylpiperazines, Chromatographia, 68 (2008) 453–458. 5. N. Grinberg, Modern thin-layer chromatography, Chromatography Science, Vol 52. Marcel Dekker, Inc. New York, USA, 1990. 6. J.M. Miller, Chromatography – Concepts and contrasts, John Wiley & Sons, Hoboken, Ney Jersey, 2005. 7. Sz. Nyiredy, Planar chromatography, a retrospective view for the third millenium, Research Institute for medicinal plants, Springer, 2001. 8. C.F. Poole, Thin-layer chromatography: challenges and opportunities, Journal of Chromatography A, 1000 (2003) 963–984. 9. D. Milojković-Opsenica, Sorbenti u hromatografiji na tankom sloju, Hemijski pregled, 41 (2000) 38-43. 10. J.J. Kirkland, Development of some stationary phases for reversed-phase high- performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1060 (2004) 9– 21. 94 6 Literatura 11. H.A. Claessens, M.A. Van Straten, Review on the chemical and thermal stability of stationary phases for reversed-phase liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1060 (2004) 23–41. 12. R.J.M. Vervoort, A.J.J. Debets, H.A. Claessens, C.A. Cramers, G.J. de Jong, Optimisation and characterisation of silica-based reversed-phase liquid chromatographic systems for the analysis of basic pharmaceuticals, Journal of Chromatography A, 897 (2000) 1–22. 13. S. Šegan, F. Andrić, A. Radoičić, D. Opsenica, B. Šolaja, M. Zlatović, D. Milojković-Opsenica, Correlation between structure, retention and activity of cholic acid derived cis–trans isomeric bis-steroidal tetraoxanes, Journal of Separation Science, 34 (2011) 2659–2667. 14. A. Vailaya, Fundamentals of Reversed Phase Chromatography: Thermodynamic and Exothermodynamic Treatment, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 28 (2005) 965–1054. 15. P. Nikitas, A. Pappa-Louisi, Retention models for isocratic and gradient elution in reversed-phase liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 1737–1755. 16. C. Horváth, W. Melander, I. Molnar, Solvophobic interactions in liquid chromatography with nonpolar stationary phase, Journal of Chromatography, 125 (1976) 129-156. 17. A. Vailaya, C. Horvath, Solvophobic theory and normalized free energies of nonpolar substances in reversed phase chromatography, Journal of Physical Chemistry B, 101 (1997) 5875-5888. 18. J.G. Dorsey, K.A. Dill, The molecular mechanism of retention in reversed-phase liquid chromatography, Chemical Reviews, 89 (1989) 331-346. 19. L.C. Tan, P.W. Carr, Revisionist look at solvophobic driving forces in reversed- phase liquid chromatography II. Partitioning vs. adsorption mechanism in monomeric alkyl bonded phase supports, Journal of Chromatography A, 775 (1997) 1–12. 95 6 Literatura 20. P.W. Carr, L.C. Tan, J.H.J. Park, Revisionist look at solvophobic driving forces in reversed-phase liquid chromatography III. Comparison of the behavior of nonpolar and polar solutes, Journal of Chromatography A, 724 (1996) 1-12. 21. J.H. Park, Y.K. Lee, Y.C. Weon, L.C. Tan, J. Li, L. Li, J.F. Evans, P.W. Carr, Revisionist look at solvophobic driving forces in reversed-phase liquid chromatography IV. Partitioning vs. adsorption mechanism on various types of polymeric bonded phases, Journal of Chromatography A, 767 (1997) 1-10. 22. A. Vailaya, C. Horvath, Retention in reversed-phase chromatography: partition or adsorption? Journal of Chromatography A, 829 (1998) 1–27. 23. C.F. Poole, N.C. Dias, Practitioner’s guide to method development in thin-layer chromatography, Journal of Chromatography A, 892 (2000) 123–142. 24. A.A. Amiri, B. Hemmateenejad, A. Safavi, H. Sharghi, A.R.S. Bena, M. Shamsipur, Structure–retention and mobile phase–retention relationships for reversed-phase high-performance liquid chromatography of several hydroxythioxanthone derivatives in binary acetonitrile–water mixtures, Analytica Chimica Acta, 605 (2007) 11–19. 25. J.R. Torres-Lapasio, M.J. Ruiz-Angel, M.C. Garcıa-Alvarez-Coque, Comparative study of solvation parameter models accounting the effects of mobile phase composition in reversed-phase liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1166 (2007) 85–96. 26. S. Gocan, Mobile phases in thin-layer chromatography. U: N. Grinberg, Modern thin-layer chromatography, Chromatography Science, Vol 52. Marcel Dekker, Inc. New York, USA, 1990, str. 139-174. 27. L.R. Snyder, Classification of the solvent properties of common liquids, Journal of Chromatography A, 92 (1974) 223–230. 28. M.J. Kamlet, R.W. Taft, The solvatochromic comparison method. I. The β-Scale of solvent hydrogen-bond acceptor (HBA) basicities, Journal of the American Chemical Society, 98 (1976) 377-383. 96 6 Literatura 29. R.W. Taft, M.J. Kamlet, The solvatochromic comparison method. 2. The α-Scale of solvent hydrogen-bond donor (HBD) acidities, Journal of the American Chemical Society, 98 (1976) 2886-2894. 30. M.J. Kamlet, J.L. Abboud, R.W. Taft, The solvatochromic comparison method. 6. The π* scale of solvent polarities, Journal of the American Chemical Society, 99 (1977) 6027-6038. 31. M.H. Abraham, C.F. Poole, S.K. Poole, Classification of stationary phases and other materials by gas chromatography, Journal of Chromatography A, 842 (1999) 79–114. 32. F.Lj. Andrić, Mapiranje interakcija ostvarenih u uslovima reverzno-fazne tečne hromatografije primenom dizajna smeše i Snyder-ovog koncepta polarnosti i selektivnosti rastvarača, Magistarski rad, Hemijski fakultet, Beograd, 2009. 33. A.P. Hill, R.J. Young, Getting physical in drug discovery: a contemporary perspective on solubility and hydrophobicity, Drug Discovery Today, 15 (2010) 648-655. 34. Y. Henchoz, B. Bard, D. Guillarme, P.A. Carrupt, J.L. Veuthey, S. Martel, Analytical tools for the physicochemical profiling of drug candidates to predict absorption/distribution, Analytical & Bioanalytical Chemistry, 394 (2009) 707–729. 35. M.J. Waring, Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19 (2009) 2844−2851. 36. S.K. Poole, C.F. Poole, Separation methods for estimating octanol–water partition coefficients, Journal of Chromatography B, 797 (2003) 3–19. 37. D. Vrakasa, A. Tsantili-Kakoulidou, D. Hadjipavlou-Litinab, Exploring the consistency of logP estimation for substituted coumarins, QSAR & Combinatorial Science, 22 (2003) 622-629. 38. P. Gaillard, P. Carrupt, B. Testa, The conformation-dependent lipophilicity of morphine glucuronides as calculated from their molecular lipophilicity potential, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 4 (1994) 737-742. 97 6 Literatura 39. A. Tsantili-Kakoulidou, A. Varvaresou, T. Siatra-Papastaikoudi, O.A. Raevsky, A comprehensive investigation of the partitioning and hydrogen bonding behavior of indole containing derivatives of 1,3,4-thiadiazole and 1,2,4-triazole by means of experimental and calculative approaches, Quantitative Structure-Activity Relationships, 18 (1999) 482-489. 40. D. Dellis, C. Giaginis, A. Tsantili-Kakoulidou, Physicochemical profile of nimesulide exploring the interplay of lipophilicity, solubility and ionization, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44 (2007) 57–62. 41. C. Hansch, T. Fujita, ρ-σ-π analysis. A method for the correlation of biological activity and chemical structure, Journal of the American Chemical Society, 86 (1964) 1616–1626. 42. A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chemical Reviews, 71 (1971) 525–616. 43. C. Giaginis, A. Tsantili-Kakoulidou, Alternative measures of lipophilicity: from octanol–water partitioning to IAM retention, Journal of Pharmaceutical Sciences, 97 (2008) 2984–3004. 44. Ł. Komsta, R. Skibiński, A. Berecka, A. Gumieniczek, B. Radkiewicz, M. Radon, Revisiting thin-layer chromatography as a lipophilicity determination tool - A comparative study on several techniques with a model solute set. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 53 (2010) 911–918. 45. L-G. Danielsson, Y-H. Zhang, Methods for determining n-octanol-water partition constants, Trends in Analytical Chemistry, 15 (1996) 188-196. 46. A. Finizio, M. Vighi, D. Sandroni, Determination of n-octanol/water partition coefficient (Kow) of pesticide critical review and comparison of methods, Chemosphere, 34 (1997) 131–161. 47. H. Van de Waterbeemd, M. Kansy, B. Wagner, H. Fischer, Lipophilicity measurement by high performance liquid chromatography (RPHPLC). U: V. Pilska, B. Testa, H. van de Waterbeemd, Lipophilicity in drug action and toxicology. Weinheim, Germany, VCH Publishers, 1996, str. 73–87. 98 6 Literatura 48. T. Hartmann, J. Schmitt, Lipophilicity – beyond octanol/water: a short comparison of modern technologies, Drug Discovery Today: Technologies, 1 (2004) 431-439. 49. C. Giaginis, A. Tsantili-Kakoulidou, Current state of the art in HPLC methodology for lipophilicity assessment of basic drugs. A review, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 31 (2008) 79–96. 50. E.C. Bate-Smith, R.G. Westall, Chromatographic behavior and chemical structure.1. Some naturally occurring phenolic substances, Biochimica et Biophysica Acta, 4 (1950) 427–440. 51. E. Soczewinski, G. Matysik, Two types of RM-composition relationships in liquid- liquid partition chromatography, Journal of Chromatography, 32 (1968) 458–471. 52. J.R. Torres-Lapasió, M. Rosés, E. Bosch, M.C. Garcia-Alvarez-Coque, Interpretive optimisation strategy applied to the isocratic separation of phenols by reversed- phase liquid chromatography with acetonitrile–water and methanol–water mobile phases, Journal of Chromatography A, 886 (2000) 31–46. 53. S.B. Gaica, D.M. Opsenica, B.A. Šolaja, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, The retention behavior of some cholic acid derivatives on different adsorbents, Journal of Planar Chromatography - Modern TLC, 15 (2002) 299-305. 54. P.J. Shoenmakers, H.A.H. Billiet, L. De Galan, Influence of organic modifiers on the rentention behaviour in reversed-phase liquid chromatography and its consequences for gradient elution, Journal of Chromatography A, 185 (1979) 179– 195. 55. J.Đ. Trifković, F.Lj. Andrić, P. Ristivojević, D. Andrić, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, Structure-retention relationship study of arylpiperazines by linear multivariate modeling, Journal of Separation Science, 33 (2010) 2619-2628. 56. D. Dabić, M. Natić, Z. Džambaski, M. Stojanović, R. Marković, D. Milojković- Opsenica, Ž. Tešić, Estimation of lipophilicity of N-substituted 2-alkylidene-4- oxothiazolidines by means of reversed-phase thin-layer chromatography, Journal of Liquid Chromatography & Related Technology, 34 (2011) 791-804. 57. F. Murakami, Retention behavior of benzene derivatives on bonded reversed-phase columns, Journal of Chromatography, 178 (1979) 393–399. 99 6 Literatura 58. C. Horváth, W. Melander, I. Molnar, Solvophobic interactions in liquid chromatography with nonpolar stationary phases, Journal of Chromatography, 125 (1976) 129–156. 59. M.L. Bieganowska, A. Doraczynska-Szopa, A. Petruczynik, The retention behavior of some sulfonamides on different TLC plates. 2. Comparison of the selectivity of the systems and quantitative determination of hydrophobicity parameters, Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 8 (1995) 122–128. 60. H.F. Pop, C. Sârbu, A new fuzzy regression algorithm, Analytical Chemistry, 68 (1996) 771-778. 61. C. Sârbu, K. Kuhajda, S. Kevrešan, Evaluation of the lipophilicity of bile acids and their derivatives by thin-layer chromatography and principal component analysis. Journal of Chromatography A, 917 (2001) 361–366. 62. C. Onisor, M. Poša, S. Kevrešan, K. Kuhajda, C. Sârbu, Estimation of chromatographic lipophilicity of bile acids and their derivatives by reversed-phase thin layer chromatography, Journal of Separation Science, 33 (2010) 3110–3118. 63. D. Casoni, A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Sârbu, Lipophilicity data for some preservatives estimated by reversed-phase liquid chromatography and different computation methods, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 2456–2465. 64. F.Lj. Andrić, J.Đ. Trifković, A.D. Radoičić, S.B. Šegan, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, Determination of the soil-water partition coefficients (log KOC) of some mono- and poly-substituted phenols by reversed-phase thin-layer chromatography, Chemosphere, 81 (2010) 299-305. 65. J. Odović, K. Karljiković-Rajić, J. Trbojević-Stanković, B. Stojimirović, S. Vladimirov, The lipophilicity examination of some ACE inhibitors and hydrochlorothiazide on cellulose in RP thin-layer chromatography, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 11 (2012) 763-770. 66. R. Mannhold, C. Ostermann, Prediction of log P with substructure - based methods. U: Molecular drug properties measurement and prediction, Editor: R. Mannhold. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2008, str. 357- 379. 100 6 Literatura 67. I.V. Tetko, G.I. Poda, Prediction of log P with property - based methods. U: Molecular drug properties measurement and prediction, Editor: R. Mannhold. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2008, str. 381-406. 68. T. Fujita, J. Iwasa, C. Hansch, A New Substituent Constant, π, Derived from partition coefficients, Journal of American Chemical Society, 86 (1964) 5175-5180. 69. R.F. Rekker, The hydrophobic fragmental constant, Pharmacochemistry Library, Vol. 1, Elsevier, New York, 1977. 70. C. Hansch, A.J. Leo, Substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology, John Wiley, New York, 1979. 71. R. Kaliszan, H. Foks, The relationship between the RM values and the connectivity indices for pyrazine carbothioamide derivatives, Chromatographia, 10 (1977) 346- 349. 72. R. Kaliszan, Correlation between the retention indices and the connectivity indices of alcohols and methyl esters with complex cyclic structure, Chromatographia, 10 (1977) 529-531. 73. Q.S. Wang, L. Zhang, Review of research on quantitative structure-retention relationships in thin-layer chromatography, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 22 (1999)1–14. 74. K. Heberger, Quantitative structure–(chromatographic) retention relationships, Journal of Chromatography A, 1158 (2007) 273–305. 75. L. Zhang, Q-S. Wang, Quantitative structure-retention relationships: TLC analysis, U: Encyclopedia of chromatography (3rd Edition). CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida, USA, 2010, str. 1980-1982. 76. R. Put, Y. Vander Heyden, Review on modelling aspects in reversed-phase liquid chromatographic quantitative structure–retention relationships, Analytica Chimica Acta, 602 (2007) 164–172. 77. R. Kaliszan, Chromatography and capillary electrophoresis in modelling the basic processes of drug action, Trends in Analytical Chemistry, 18 (1999) 400-410. 101 6 Literatura 78. Y. Polyakova, K.H. Row, Quantitative structure-retention relationships applied ro reversed-phase high-performance liquid chromatography, Medicinal Chemistry Research, 14 (2005) 488-522. 79. Y. Polyakova, L.M. Jin, K.H. Row, QSPR models for chromatographic retention of some azoles with physicochemical properties, Bulletin of Korean Chemical Society, 27 (2006) 211-218. 80. K. Varmuza, P. Filzmoser, Introduction to multivariate statistical analysis in chemometrics. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida, USA, 2009. 81. L-T. Qin, S-S. Liu, F. Chen, Q-F. Xiao, Q-S. Wu, Chemometric model for predicting retention indices of constituents of essential oils, Chemosphere, 90 (2013) 300–305. 82. T. Cserhati, Relationship between the physicochemical parameters of 3,5- dinitrobenzoic acid esters and their retention behaviour on ß-cyclodextrin polymer support, Analytica Chimica Acta, 292 (1994) 17-22. 83. A.A. Qasimullah, S. Muzaffar, A. Andrabi, P.M. Qureshi, Solvent polarity as a function of RF in thin-layer chromatography of selected nitro functions, Journal of Chromatographic Science, 34 (1996) 376-378. 84. A. Pyka, Topological indexes and RM values for prediction of the pKa values of isomeric methylphenols, chlorophenols, and nitrophenols. Part X, Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 9 (1996) 52-55. 85. M. Koba, T. Baczek, M.P. Marszałł, Importance of retention data from affinity and reverse-phase high-performance liquid chromatography on antitumor activity prediction of imidazoacridinones using QSAR strategy, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 64– 65 (2012) 87– 93. 86. R. Todeschini, V. Consonni, Molecular descriptors for chemoinformatics, Wiley- VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim, 2009. 87. R. Todeschini, V. Consonni, Handbook of molecular descriptors, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim, 2000. 102 6 Literatura 88. P.M. Andersson, M. Sjostrom, S. Wold, T. Lundstedt, Comparison between physicochemical and calculated molecular descriptors, Journal of Chemometrics, 14 (2000) 629–642. 89. M.M. Natić, Hemometrijski pristup proučavanju retencionog ponašanja diastereomernih 2-alkiliden-4-okskotiazolidina, Doktorska disertacija, Hemijski fakultet, Beograd, 2008. 90. M.J.S. Dewar, E.G. Zoebisch, E.F. Healy, J.J.P. Stewart, AM1: A new general purpose quantum mechanical molecular model, Journal of American Chemical Society, 107 (1985) 3902-3909. 91. K.M. Gough, K. Belohorcova, K.L.E. Kaiser, Quantitative structure-activity relationships (QSARs) of Photobacterium phosphoreum toxicity of nitrobenzene derivatives, The Science of the Total Environment, 142 (1994) 179-190. 92. T. Sotomatsu, Y. Murata, T. Fujita, Correlation analysis of substituent effects on the acidity of benzoic acids by the AM1 method, Journal of Computational Chemistry, 10 (1989) 94–98. 93. H. Van de Waterbeemd, Chemometric methods in molecular design, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, Federal Republic of Germany, 1995. 94. C. Sarbu, S. Todor, Determination of lipophilicity of some non-steroidal antiinflammatory agents and their relationships by using principal component analysis based on thin-layer chromatographic retention data, Journal of Chromatography A, 822 (1998) 263–269. 95. C. Sarbu, D. Casoni, M. Darabantu, C. Maiereanu, Quantitative structure— retention and retention—activity relationships of some 1,3-oxazolidine systems by RP-HPTLC and PCA, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35 (2004) 213–219. 96. R.D. Briciu, A. Kot-Wasik, A. Wasik, J. Namiesnik, C. Sârbu, The lipophilicity of artificial and natural sweeteners estimated by reversed-phase thin-layer chromatography and computed by various methods, Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 3702–3706. 103 6 Literatura 97. D. Dabić, M. Natić, Z. Džambaski, R. Marković, D. Milojković-Opsenica, Ž. Tešić, Quantitative structure–retention relationship of new N-substituted 2- alkylidene-4-oxothiazolidines, Journal of Separation Science, 34 (2011) 2397-2404. 98. T. Đaković-Sekulić, A. Smoliński, N. Trišović, G. Ušćumlić, Multivariate evaluation of the correlation between retention data and molecular descriptors of antiepileptic hydantoin analogs, Journal of Chemometrics, 26 (2012) 95–107. 99. F. Tache, R.D. Nascu-Briciu, C. Sârbu, F. Micale, A. Medvedovici, Estimation of the lipophilic character of flavonoids from the retention behavior in reversed phase liquid chromatography on different stationary phases: A comparative study, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 57 (2012) 82– 93. 100. K. Heberger, Evaluation of polarity indicators and stationary phases by principal component analysis in gas–liquid chromatography, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 47 (1999) 41–49. 101. H. Kemp, M. Kempe, QSRR analysis of β-lactam antibiotics on a penicillin G targeted MIP stationary phase, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398 (2010) 3087–3096. 102. R.W. Kennard, L.A. Stone, Computer aided design of experiments, Technometrics, 11 (1969) 137-148. 103. R. G. Brereton, Chemometrics. Data analysis for the laboratory and chemical plant, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, England, 2003. 104. R.N. Feudale, H. Tan, S.D. Brown, Piecewise orthogonal signal correction, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 63 (2002) 129– 138. 105. V. Sikirzhytski, K. Virkler, I.K. Lednev, Discriminant analysis of raman spectra for body fluid identification for forensic purposes, Sensors, 10 (2010) 2869-2884. 106. J.N. Miller, J.C. Miller, Statistics and chemometrics for analytical chemistry, Sixth edition, Pearson Education Limited, Harlow, England, 2010. 107. E. Anderssen, K. Dyrstad, F. Westad, H. Martens, Reducing over-optimism in variable selection by cross-model validation, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 84 (2006) 69–74. 104 6 Literatura 108. M. Forina, S. Lanteri, M.C. Cerrato Oliveros, C. Pizarro Millan, Selection of useful predictors in multivariate calibration, Analytical and Bioanaytical Chemistry, 380 (2004) 397–418. 109. N. Perišić-Janjić, R. Kaliszan, N. Milošević, G. Ušćumlić, N. Banjac, Chromatographic retention parameters in correlation analysis with in silico biological descriptors of a novel series of N-phenyl-3-methyl succinimide derivatives, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 72 (2013) 65– 73. 110. J. Yana, D-S. Caoa, F-Q. Guo, L-X. Zhang, M. He, J-H. Huang, Q-S. Xu, Y-Z. Liang, Comparison of quantitative structure–retention relationship models on four stationary phases with different polarity for a diverse set of flavor compounds, Journal of Chromatography A, 1223 (2012) 118– 125. 111. C.I. De Matteis, D.A. Simpson, M.R. Euerby, P.N. Shawb, D.A. Barrett, Chromatographic retention behaviour of monosubstituted benzene derivatives on porous graphitic carbon and octadecyl-bonded silica studied using molecular modelling and quantitative structure–retention relationships, Journal of Chromatography A, 1229 (2012) 95– 106. 112. A.G. Fragkakia, A. Tsantili-Kakoulidou, Y.S. Angelis, M. Koupparis, C. Georgakopoulos, Gas chromatographic quantitative structure–retention relationships of trimethylsilylated anabolic androgenic steroids by multiple linear regression and partial least squares, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 8404–8420. 113. V.K. Gupta, H. Khani, B. Ahmadi-Roudi, S. Mirakhorli, E. Fereyduni, S. Agarwal, Prediction of capillary gas chromatographic retention times of fatty acid methyl esters in human blood using MLR, PLS and back-propagation artificial neural networks, Talanta, 83 (2011) 1014–1022. 114. K. Bodziocha, A. Durand, R. Kaliszan, T. Baczek, Y. Vander Heyden, Advanced QSRR modeling of peptides behavior in RPLC, Talanta, 81 (2010) 1711–1718. 115. L-T. Qin, S-S. Liu, H-L. Liu, J. Tong, Comparative multiple quantitative structure–retention relationships modeling of gas chromatographic retention time of essential oils using multiple linear regression, principal component regression, and 105 6 Literatura partial least squares techniques, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 5302– 5312. 116. E.H.M.A. Rabtti, M.M. Natić, D.M. Milojković-Opsenica, J.Đ. Trifković, I.M. Vučković, V.E. Vajs, Ž.Lj. Tešić, RP TLC-based lipophilicity assessment of some natural and synthetic coumarins, Journal of Brazilian Chemical Society, 23 (2012) 522-530. 117. S. Šegan, J. Trifković, T. Verbić, D. Opsenica, M. Zlatović, J. Burnett, B. Šolaja, D. Milojković-Opsenica, Correlation between structure, retention, property, and activity of biologically relevant 1,7-bis(aminoalkyl)diazachrysene derivatives, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 72 (2013) 231-239. 118. G. Ermondi, G. Caron, Molecular interaction fields based descriptors to interpret and compare chromatographic indexes, Journal of Chromatography A, 1252 (2012) 84– 89. 119. A. Zhang, J.L. Neumeyer. R.J. Baldessarini, Recent progress in development of dopamine receptor subtype-selective agents: potential therapeutics for neurological and psychiatric disorders, Chemical Reviews, 107 (2007) 274-302. 120. V. Šoškić, J. Joksimović, Bioisosteric approach in the design of the new dopaminergic/serotonergic ligands, Current Medicinal Chemistry, 5 (1998) 493- 512. 121. V. Šukalovic, M. Zlatović, D. Andrić, G. Roglić, S. Kostić-Rajačić, V. Šoškic, Modeling of the D2 dopamine receptor arylpiperazine binding site for 1-{2-[5-(1H- benzimidazoIe-2-thione)]ethyl}-4-arylpiperazines, Archiv der Pharmacie, 337 (2004) 502-512. 122. D. Andrić, G. Roglić, V. Šukalović, V. Šoškić, S. Kostić-Rajačić, Synthesis, binding properties and receptor docking of 4-halo-6-[2-(4-arylpiperazin-1-yl)ethyl]- 1H-benzimidazoles, mixed ligands of D2 and 5-HT1A receptors, European Journal of Medicinal Chemistry, 43 (2008) 1696-1705. 123. D. Andrić, G. Tovilović, G. Roglić, V. Šoškić, M. Tomić, S. Kostić-Rajačić, 6-[2- (4-Arylpiperazin-1-y]-4-halo-1,3-dihydro-2H-benzimidazole-2-thiones: synthesis 106 6 Literatura and pharmacological evaluation, Journal of Serbian Chemical Society, 72 (2007) 747-755. 124. D. Andrić, G. Tovilović, G. Roglić, Đ. Vasković, V. Šoškić, M. Tomić, S. Kostić- Rajačić, Synthesis and pharmacological evaluation of several N-(2- nitrophenyl)piperazine derivatives, Journal of Serbian Chemical Society, 72 (2007) 429-435. 125. P. Metrangolo, H. Neukirch, T. Pilati, G. Resnati, Halogen bonding based recognition processes: a world parallel to hydrogen bonding, Accounts of Chemical Research, 38 (2005) 386-395. 126. P. Politzer, P. Lane, M.C. Concha, Y. Ma, J.S. Murray, An overview of halogen bonding, Journal of Molecular Modeling, 13 (2007) 305-311. 127. http://www.norgwyn.com/mmpplus.html 128. http://www.vcclab.org 129. I.V. Tetko, J. Gasteiger, R. Todeschini, A. Mauri, D. Livingstone, P. Ertl, V.A. Palyulin, E.V. Radchenko, N.S. Zefirov, A.S. Makarenko, V.Yu. Tanchuk, V.V. Prokopenko, Virtual computational chemistry laboratory – design and description, Journal of Computer-Aided Molecular Design, 19 (2005) 453–463. 130. S. de Jong, SIMPLS: An alternative approach to partial least square regression, Chemometrics and Intelligent Laboratory System, 18 (1993) 251-265. 131. B. Natalini, R. Sardella, E. Camaioni, S. Natalini, R. Pellicciari, Dominant factors affecting the chromatographic behaviour of bile acids, Chromatographia, 64 (2006) 343–349. 132. G.L. Biagi, A.M. Barbaro, A. Sapone, M. Recanatini, Determination of lipophilicity by means of reversed-phase thin-layer chromatography. II. Influence of the organic modifier on the slope of the thin-layer chromatographic equation, Journal of Chromatography A, 669 (1994) 246–253. 133. G.L. Biagi, A.M. Barbaro, A.Sapone, Determination of lipophilicity by means of reversed-phase thin-layer chromatography. I. Basic aspects and relationship between slope and intercept of TLC equations, Journal of Chromatography A, 662 (1994) 341–361. 107 6 Literatura 134. A. Niewiadomy, A. Zabinska, J. Matysiak, J.K. Rozyło, Influence of modifier and molecular structure of some dihydroxythiobenzanilides on retention in reversed- phase high performance thin-layer chromatography, Journal of Chromatography A, 791 (1997) 237-243. 135. E.H.M.A. Rabtti, M.M. Natić, D.M. Milojković-Opsenica, J.Đ. Trifković, T. Tosti, I.M. Vučković, V. Vajs, Ž.LJ. Tešić, Quantitative structure-toxicity relationship study of some natural and synthetic coumarins using retention parameters, Journal of Serbian Chemical Society, 77 (2012) 1443-1456. 136. Z. Garkani-Nejad, Quantitative structure-retention relationship study of some phenol derivatives in gas chromatography, Journal of Chromatographic Science, 48 (2010) 317–323. 137. Z. Garkani-Nejad, M. Ahmadvand, Comparative QSRR modeling of nitrobenzene derivatives based on original molecular descriptors and multivariate image analysis descriptors, Chromatographia, 73 (2011)733–742. 138. S. Wold, M. Sjostrom, L. Eriksson, PLS-regression: a basic tool of chemometrics, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 58 (2001) 109–130. 139. I-G. Chong, C-H. Jun, Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 78 (2005) 103 – 112. 140. D.T. Stanton, P.C. Jurs, Computer-assisted study of the relationship between molecular structure and surface tension of organic compounds, Journal of Chemical Information and Modeling, 32 (1992) 109-115. 141. R.C. Pasquali, M.P. Taurozzi, C. Bregni, Some considerations about the hydrophilic–lipophilic balance system, International Journal of Pharmaceutics, 356 (2008) 44–51. 142. R.M. Baošić, A.D. Radojević, Ž.LJ. Tešić, Prediction of the retention of β- diketonato complexes in TLC systems on silica gel by quantitative structure– retention relationships, Journal of Serbian Chemical Society, 75 (2010) 513–521. 143. J.V. Turner, B.D. Glass, S. Agatonović-Kustrin, Prediction of drug bioavailability based on molecular structure, Analytica Chimica Acta, 485 (2003) 89–102. 108 109 6 Literatura 144. J. Kelder, P.D.J. Grootenhuis, D.M. Bayada, L.P.C. Delbressine, J-P. Ploemen, Polar molecular surface as a dominating determinant for oral absorption and brain penetration of drugs, Pharmaceutical research, 16 (1999) 1514-1519. 145. D.E. Clark, Rapid calculation of polar molecular surface area and its application to the prediction of transport phenomena. 2. Prediction of blood-brain barrier penetration, Journal of Pharmaceutical Science, 88 (1999) 815-821. 146. Q. Cao, V. Garib, Q. Yu, D.W. Connell, M. Campitelli, Quantitative structure– property relationships (QSPR) for steroidal compounds of environmental importance, Chemosphere, 76 (2009) 453–459. 147. G. Camenischa, J. Alsenz, H. van de Waterbeemd, G. Folkers, Estimation of permeability by passive diffusion through Caco-2 cell monolayers using the drugs’ lipophilicity and molecular weight, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 6 (1998) 313–319. 148. O.A. Raevsky, K-J. Schaper, Quantitative estimation of hydrogen bond contribution to permeability and absorption processes of some chemicals and drugs, European Journal of Medicinal Chemistry, 33 (1998) 799-807. 149. P. Zakeri-Milani, H. Tajerzadeh, Z. Islambolchilar, S. Barzegar, H. Valizadeh, The relation between molecular properties of drugs and their transport across the intestinal membrane, DARU, 14 (2006) 164-171. 150. T. Körtvélyesi, M. Görgényi, K. Héberger, Correlation between retention indices and quantum-chemical descriptors of ketones and aldehydes on stationary phases of different polarity, Analytica Chimica Acta, 428 (2001) 73–82. 151. T. Baczek, R. Kaliszan, Predictive approaches to gradient retention based on analyte structural descriptors from calculation chemistry, Journal of Chromatography A, 987 (2003) 29–37. 152. R. Ghavami, S. Faham, QSRR models for Kovats’ retention indices of a variety of volatile organic compounds on polar and apolar GC stationary phases using molecular connectivity indexes, Chromatographia, 72 (2010) 893–903. 153. A. Pyka, Topological indexes and QSRR methodology in pharmaceutical and chemical analysis, Journal of AOAC International, 95 (2012) 673-690. 7 Prilog   110    111    7 Prilog  Prilog Određivanje kvantitativnog odnosa strukture i retencije arilpiperazina primenom tečne hromatografije i multivarijantnih hemometrijskih metoda Doktorska disertacija Sadržaj Tabela P1. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP–18 / methanol : voda. Tabela P2. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP–18 / dioksan : voda. Tabela P3. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP–18 / DMSO : voda. Tabela P4. Hromatografski deskriptori (RM0, b, C0, and PC1) izvedeni iz retencionih podataka dobijenih za sistem RP18 / Diox:voda. Tabela P5. Hromatografski deskriptori (RM0, b, C0, and PC1) izvedeni iz retencionih podataka dobijenih za sistem RP18 / MeOH:voda. Tabela P6. Hromatografski deskriptori (RM0, b, C0, and PC1) izvedeni iz retencionih podataka dobijenih za sistem RP18 / DMSO:voda. Tabela P7. Izračunate log P vrednosti. Tabela P8. Molekulski deskriptori korišćeni za multivarijantnu analizu. Tabela P9. Korelaciona matrica vrednosti molekulskih deskriptora. Tabela P10. Korelaciona matrica vrednosti molekulskih deskriptora uključenih u MLR model.  112    7 Prilog  Slika P1. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od svojstvenih vrednosti za PCA analizu na retencionim podacima. Slika P2. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od svojstvenih vrednosti za PCA analizu na vrednostima molekulskih deskriptora. Slika P3. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od odnosa RMSEC/RMSECV u PCR modelu. Slika P4. Grafik zavisnosti reziduala od Ymodela za PCR model. Slika P5. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od odnosa RMSEC/RMSECV u PLS modelu. Slika P6. Grafik zavisnosti reziduala od Ymodela za PLS model.  113    7 Prilog  Tabela P1. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP–18 / metanol : voda Jedinjenje 80% a 85% 90% 95% 100% RF R RM RF M RF RM RF RM RF RM 1 0,25 0,477 0,37 0,231 0,44 0,105 0,52 -0,035 0,61 -0,194 2 0,28 0,410 0,40 0,176 0,46 0,070 0,54 -0,070 0,64 -0,250 3 0,15 0,753 0,26 0,454 0,38 0,213 0,46 0,070 0,53 -0,052 4 0,21 0,575 0,29 0,389 0,39 0,194 0,48 0,035 0,56 -0,105 5 0,18 0,659 0,29 0,389 0,40 0,176 0,51 -0,017 0,63 -0,231 6 0,20 0,602 0,29 0,389 0,39 0,194 0,50 0,000 0,60 -0,176 7 0,26 0,454 0,38 0,213 0,44 0,105 0,52 -0,035 0,61 -0,194 8 0,13 0,826 0,24 0,501 0,37 0,231 0,44 0,105 0,52 -0,035 9 0,11 0,908 0,21 0,575 0,36 0,250 0,41 0,158 0,50 0,000 10 0,20 0,602 0,28 0,410 0,37 0,231 0,44 0,105 0,53 -0,052 11 0,20 0,602 0,31 0,347 0,41 0,158 0,52 -0,035 0,65 -0,269 12 0,27 0,432 0,35 0,269 0,45 0,087 0,53 -0,052 0,67 -0,308 13 0,36 0,213 0,46 0,070 0,53 -0,087 0,60 -0,231 0,70 -0,454 14 0,38 0,250 0,46 0,070 0,55 -0,052 0,63 -0,176 0,74 -0,368 15 0,24 0,501 0,37 0,231 0,46 0,070 0,58 -0,140 0,66 -0,288 16 0,20 0,602 0,32 0,327 0,40 0,176 0,51 -0,017 0,63 -0,231 17 0,38 0,213 0,45 0,087 0,54 -0,070 0,62 -0,213 0,70 -0,368 18 0,32 0,327 0,41 0,158 0,50 0,000 0,63 -0,231 0,75 -0,477 19 0,34 0,231 0,43 0,087 0,52 -0,035 0,60 -0,176 0,69 -0,432 20 0,37 0,288 0,45 0,122 0,52 -0,035 0,60 -0,176 0,73 -0,347 21 0,17 0,689 0,35 0,269 0,43 0,122 0,55 -0,087 0,64 -0,250 22 0,15 0,753 0,32 0,327 0,40 0,176 0,52 -0,035 0,61 -0,194 23 0,36 0,250 0,44 0,105 0,49 0,017 0,61 -0,194 0,69 -0,347 24 0,34 0,288 0,42 0,140 0,52 -0,035 0,59 -0,158 0,72 -0,410 25 0,42 0,140 0,53 -0,052 0,64 -0,250 0,70 -0,368 0,78 -0,550 26 0,21 0,575 0,30 0,368 0,45 0,087 0,52 -0,035 0,61 -0,194 27 0,25 0,477 0,34 0,288 0,47 0,052 0,55 -0,087 0,63 -0,231 28 0,41 0,158 0,51 -0,017 0,61 -0,194 0,67 -0,308 0,76 -0,501 29 0,43 0,122 0,54 -0,070 0,64 -0,250 0,69 -0,347 0,76 -0,501 30 0,34 0,288 0,46 0,070 0,56 -0,105 0,63 -0,231 0,74 -0,454 31 0,44 0,105 0,55 -0,087 0,65 -0,269 0,70 -0,368 0,79 -0,575 32 0,41 0,158 0,49 0.017 0,56 -0,105 0,68 -0,327 0,78 -0,550 33 0,43 0,122 0,53 -0.052 0,64 -0,250 0,69 -0,347 0,76 -0,501 aUdeo organske komponente u mobilnoj fazi  114    7 Prilog  Tabela P2. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP–18 / dioksan : voda Jedinjenje 60% a 65% 70% 75% 80% RF R R RM F M RF RM RF RM RF RM 1 0,34 0,288 0,46 0,070 0,54 -0,070 0,61 -0,194 0,70 -0,368 2 0,39 0,194 0,48 0,035 0,55 -0,087 0,65 -0,269 0,76 -0,501 3 0,24 0,501 0,38 0,213 0,49 0,017 0,59 -0,158 0,67 -0,308 4 0,46 0,070 0,55 -0,087 0,61 -0,194 0,70 -0,368 0,85 -0,753 5 0,37 0,231 0,47 0,052 0,57 -0,122 0,66 -0,288 0,77 -0,525 6 0,33 0,308 0,44 0,105 0,54 -0,070 0,60 -0,176 0,69 -0,347 7 0,37 0,231 0,46 0,070 0,55 -0,087 0,63 -0,231 0,75 -0,477 8 0,25 0,477 0,37 0,231 0,48 0,035 0,58 -0,140 0,67 -0,308 9 0,22 0,550 0,34 0,288 0,46 0,070 0,55 -0,087 0,65 -0,269 10 0,45 0,087 0,54 -0,070 0,60 -0,176 0,70 -0,368 0,85 -0,753 11 0,37 0,231 0,48 0,035 0,58 -0,140 0,68 -0,327 0,80 -0,602 12 0,47 0,052 0,56 -0,105 0,62 -0,213 0,71 -0,389 0,84 -0,720 13 0,34 0,288 0,43 0,122 0,58 -0,140 0,64 -0,250 0,75 -0,477 14 0,40 0,176 0,49 0,017 0,55 -0,087 0,69 -0,347 0,82 -0,659 15 0,24 0,501 0,39 0,194 0,49 0,017 0,64 -0,250 0,75 -0,477 16 0,21 0,575 0,35 0,269 0,45 0,087 0,63 -0,231 0,75 -0,477 17 0,47 0,052 0,56 -0,105 0,63 -0,231 0,73 -0,432 0,88 -0,865 18 0,34 0,288 0,44 0,105 0,57 -0,122 0,68 -0,327 0,81 -0,630 19 0,31 0,347 0,42 0,140 0,57 -0,122 0,64 -0,250 0,75 -0,477 20 0,40 0,176 0,48 0,035 0,54 -0,070 0,67 -0,308 0,78 -0,550 21 0,24 0,501 0,37 0,231 0,49 0,017 0,62 -0,213 0,74 -0,454 22 0,20 0,602 0,33 0,308 0,43 0,122 0,62 -0,213 0,71 -0,389 23 0,47 0,052 0,55 -0,087 0,62 -0,213 0,72 -0,410 0,87 -0,826 24 0,30 0,368 0,44 0,105 0,57 -0,122 0,65 -0,269 0,76 -0,501 25 0,44 0,105 0,52 -0,035 0,62 -0,213 0,71 -0,389 0,88 -0,865 26 0,23 0,525 0,35 0,269 0,51 -0,017 0,63 -0,231 0,72 -0,410 27 0,27 0,432 0,40 0,176 0,56 -0,105 0,66 -0,288 0,77 -0,525 28 0,43 0,122 0,51 -0,017 0,60 -0,176 0,70 -0,368 0,86 -0,788 29 0,47 0,052 0,56 -0,105 0,63 -0,231 0,74 -0,454 0,92 -1,061 30 0,42 0,140 0,50 0,000 0,57 -0,122 0,73 -0,432 0,87 -0,826 31 0,48 0,035 0,55 -0,087 0,63 -0,231 0,75 -0,477 0,95 -1,279 32 0,45 0,087 0,55 -0,087 0,64 -0,250 0,73 -0,432 0,91 -1,005 33 0,49 0,017 0,57 -0,122 0,66 -0,288 0,77 -0,525 0,96 -1,380 aUdeo organske komponente u mobilnoj fazi  115    7 Prilog  Tabela P3. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP–18 / DMSO : voda Jedinjenje 80% a 85% 90% 95% 100% RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,24 0,501 0,56 -0,105 0,68 -0,327 0,77 -0,525 0,88 -0,865 2 0,11 0,908 0,31 0,347 0,42 0,140 0,53 -0,052 0,71 -0,389 3 0,02 1,690 0,04 1,380 0,08 1,061 0,13 0,826 0,21 0,575 4 0,18 0,659 0,32 0,327 0,46 0,070 0,60 -0,176 0,72 -0,410 5 0,37 0,052 0,65 -0,269 0,77 -0,525 0,81 -0,630 0,92 -1,061 6 0,18 0,659 0,49 0,017 0,62 -0,213 0,73 -0,432 0,85 -0,753 7 0,05 1,279 0,15 0,753 0,22 0,550 0,30 0,368 0,48 0,035 8 0,01 1,996 0,04 1,380 0,07 1,123 0,11 0,908 0,19 0,630 9 0,01 1,996 0,03 1,510 0,07 1,123 0,16 0,720 0,25 0,477 10 0,16 0,720 0,30 0,368 0,45 0,087 0,59 -0,158 0,71 -0,389 11 0,21 0,575 0,36 0,250 0,51 -0,017 0,56 -0,105 0,79 -0,575 12 0,29 0,389 0,40 0,176 0,53 -0,052 0,60 -0,176 0,80 -0,602 13 0,17 0,689 0,30 0,368 0,46 0,070 0,55 -0,087 0,78 -0,550 14 0,12 0,865 0,31 0,347 0,41 0,158 0,56 -0,105 0,72 -0,410 15 0,27 0,432 0,59 -0,158 0,77 -0,525 0,89 -0,908 0,92 -1,061 16 0,04 1,380 0,12 0,865 0,25 0,477 0,45 0,087 0,60 -0,176 17 0,20 0,602 0,34 0,288 0,53 -0,052 0,67 -0,308 0,76 -0,501 18 0,23 0,525 0,38 0,213 0,50 0,000 0,60 -0,176 0,80 -0,602 19 0,16 0,720 0,30 0,368 0,45 0,087 0,55 -0,087 0,77 -0,525 20 0,11 0,908 0,30 0,368 0,40 0,176 0,55 -0,087 0,71 -0,389 21 0,05 1,279 0,16 0,720 0,31 0,347 0,52 -0,035 0,59 -0,158 22 0,03 1,510 0,11 0,908 0,24 0,501 0,43 0,122 0,57 -0,122 23 0,19 0,630 0,33 0,308 0,50 0,000 0,66 -0,288 0,75 -0,477 24 0,23 0,525 0,38 0,213 0,52 -0,035 0,60 -0,176 0,80 -0,602 25 0,30 0,368 0,40 0,176 0,55 -0,087 0,65 -0,269 0,82 -0,659 26 0,11 0,908 0,20 0,602 0,29 0,389 0,42 0,140 0,60 -0,176 27 0,01 1,996 0,01 1,996 0,02 1,690 0,03 1,510 0,06 1,195 28 0,32 0,327 0,43 0,122 0,57 -0,122 0,68 -0,327 0,85 -0,753 29 0,37 0,231 0,46 0,070 0,59 -0,158 0,71 -0,389 0,88 -0,865 30 0,14 0,788 0,23 0,525 0,33 0,308 0,45 0,087 0,60 -0,176 31 0,27 0,432 0,40 0,176 0,54 -0,070 0,68 -0,327 0,80 -0,602 32 0,51 -0,630 0,87 -0,826 0,92 -1,061 0,96 -1,380 0,98 -1,690 33 0,36 0,250 0,50 0,000 0,65 -0,269 0,77 -0,525 0,86 -0,788 aUdeo organske komponente u mobilnoj fazi  116    7 Prilog  Tabela P4. Hromatografski deskriptori (RM0, b, C0, and PC1) izvedeni iz retencionih podataka dobijenih za sistem RP18 / Diox:voda, R – Pearson-ov korelacioni koeficijent, S – standardna greška modela, P – nivo značajnosti, n - broj merenja. Jedinjenje Hromatografski deskriptori i odgovarajući statistički parametri RM0 b r s P n C0 PC1 1 2,15 ± 0,13 0,032 ± 0,002 -0,9952 0,028 0,0001 5 68,3 ± 5,6 -1,24 2 2,25 ± 0,16 -0,033 ± 0,002 -0,9933 0,036 0,0007 5 66,3 ± 6,5 -0,16 3 2,84 ± 0,21 -0,040 ± 0,003 -0,9915 0,048 0,0009 5 71,3 ± 7,6 -2,91 4 2,43 ± 0,42 -0,039 ± 0,006 -0,9662 0,094 0,0074 5 63,1 ± 14,6 1,95 5 2,46 ± 0,10 -0,037 ± 0,001 -0,9979 0,022 0,0001 5 66,5 ± 3,7 -0,03 6 2,19 ± 0,13 -0,032 ± 0,002 -0,9951 0,029 0,0004 5 68,9 ± 5,7 -1,55 7 2,31 ± 0,14 -0,034 ± 0,002 -0,9948 0,032 0,0005 5 67,1 ± 5,7 -0,59 8 2,78 ± 0,13 -0,039 ± 0,002 -0,9968 0,029 0,0002 5 71,5 ± 4,7 -3,08 9 2,93 ± 0,16 -0,040 ± 0,002 -0,9950 0,037 0,0004 5 72,7 ± 5,9 -3,91 10 2,52 ± 0,42 -0,040 ± 0,006 -0,9673 0,095 0,0071 5 63,5 ± 14,3 1,76 11 2,68 ± 0,15 -0,041 ± 0,002 -0,9961 0,033 0,0003 5 66,0 ± 4,9 0,44 12 2,29 ± 0,33 -0,037 ± 0,005 -0,9761 0,074 0,0044 5 62,5 ± 12,1 2,16 13 2,57 ± 0,16 -0,038 ± 0,002 -0,9946 0,036 0,0005 5 67,6 ± 5,9 -0,61 14 2,67 ± 0,34 -0,041 ± 0,005 -0,9793 0,077 0,0036 5 65,6 ± 11,5 0,61 15 3,36 ± 0,14 -0,048 ± 0,002 -0,9975 0,031 0,0002 5 69,9 ± 4,1 -2,00 16 3,69 ± 0,15 -0,052 ± 0,002 -0,9975 0,034 0,0002 5 70,9 ± 4,1 -2,77 17 2,71 ± 0,48 -0,043 ± 0,007 -0,9645 0,108 0,0080 5 62,7 ± 14,9 2,61 18 3,04 ± 0,16 -0,045 ± 0,002 -0,9960 0,037 0,0003 5 67,0 ± 5,0 0,03 19 2,78 ± 0,15 -0,041 ± 0,002 -0,9959 0,034 0,0003 5 68,2 ± 5,1 -0,89 20 2,37 ± 0,25 -0,036 ± 0,004 -0,9856 0,056 0,0021 5 66,0 ± 9,6 0,09 21 3,31 ± 0,07 -0,047 ± 0,001 -0,9994 0,015 <0,0001 5 70,3 ± 2,0 -2,34 22 3,59 ± 0,19 -0,050 ± 0,003 -0,9957 0,042 0,0003 5 71,7 ± 5,4 -3,38 23 2,61 ± 0,47 -0,042 ± 0,007 -0,9636 0,105 0,0083 5 62,9 ± 15,1 2,34 24 2,87 ± 0,15 -0,042 ± 0,002 -0,9960 0,035 0,0003 5 68,0 ± 5,1 -0,68 25 2,93 ± 0,52 -0,046 ± 0,008 -0,9634 0,117 0,0084 5 63,9 ± 15,3 1,99 26 3,34 ± 0,17 -0,047 ± 0,002 -0,9961 0,038 0,0003 5 70,6 ± 5,1 -2,39 27 3,27 ± 0,13 -0,048 ± 0,002 -0,9978 0,029 0,0001 5 68,7 ± 3,7 -1,00 28 2,80 ± 0,45 -0,043 ± 0,006 -0,9696 0,100 0,0064 5 64,4 ± 13,9 1,54 29 3,25 ± 0,76 -0,052 ± 0,011 -0,9394 0,172 0,0177 5 63,0 ± 20,0 2,91 30 3,06 ± 0,49 -0,047 ± 0,007 -0,9686 0,111 0,0067 5 64,8 ± 14,1 1,51 31 3,82 ± 1,10 -0,060 ± 0,016 -0,9125 0,247 0,0307 5 63,2 ± 24,5 3,14 32 3,20 ± 0,66 -0,051 ± 0,009 -0,9524 0,148 0,0124 5 63,3 ± 17,5 2,69 33 4,02 ± 1,15 -0,064 ± 0,016 -0,9146 0,258 0,0296 5 62,8 ± 24,1 3,75  117    7 Prilog  Tabela P5. Hromatografski deskriptori (RM0, b, C0, and PC1) izvedeni iz retencionih podataka dobijenih za sistem RP18 / MeOH:voda, R – Pearson-ov korelacioni koeficijent, S – standardna greška modela, P – nivo značajnosti, n - broj merenja. Jedinjenje Hromatografski deskriptori i odgovarajući statistički parametri RM0 b r s P n C0 PC1 1 3,01 ± 0,21 -0,032 ± 0,002 -0,9924 0,037 0,0008 5 93,6 ± 9,3 -1,02 2 2,89 ± 0,20 -0,031 ± 0,002 -0,9928 0,035 0,0007 5 92,1 ± 9,0 -0,36 3 3,88 ± 0,40 -0,040 ± 0,004 -0,9817 0,071 0,0030 5 97,2 ± 14,9 -3,05 4 3,30 ± 0,12 -0,034 ± 0,001 -0,9978 0,021 0,0001 5 96,3 ± 5,1 -2,32 5 4,13 ± 0,14 -0,044 ± 0,002 -0,9981 0,025 <0,0001 5 94,5 ± 4,7 -1,86 6 3,70 ± 0,07 -0,0389 ± 0,0007 -0,9995 0,012 <0,0001 5 95,2 ± 2,5 -2,04 7 2,89 ± 0,21 -0,031 ± 0,002 -0,9916 0,037 0,0009 5 93,5 ± 9,8 -0,92 8 4,14 ± 0,47 -0,042 ±0,005 -0,9782 0,082 0,0039 5 97,7 ± 16,3 -3,45 9 4,40 ± 0,56 -0,045 ± 0,006 -0,9724 0,098 0,0055 5 98,5 ± 18,5 -4,01 10 3,16 ± 0,13 -0,032 ± 0,001 -0,9972 0,022 0,0002 5 98,0 ± 5,8 -2,90 11 3,98 ± 0,12 -0,042 ± 0,001 -0,9986 0,020 <0,0001 5 93,8 ± 4,0 -1,46 12 3,33 ± 0,18 -0,036 ± 0,002 -0,9953 0,032 0,0004 5 92,4 ± 7,3 -0,59 13 2,84 ± 0,15 -0,033 ± 0,002 -0,9959 0,027 0,0003 5 87,0 ± 6,5 1,29 14 2,61 ± 0,13 -0,030 ± 0,001 -0,9963 0,023 0,0003 5 88,1 ± 6,3 1,86 15 3,58 ± 0,21 -0,039 ± 0,002 -0,9949 0,036 0,0004 5 91,9 ± 7,6 -0,36 16 3,79 ± 0,18 -0,040 ± 0,002 -0,9963 0,032 0,0003 5 94,3 ± 6,5 -1,63 17 2,56 ± 0,05 -0,0292 ± 0,0006 -0,9994 0,009 <0,0001 5 87,6 ± 2,5 1,49 18 3,55 ± 0,21 -0,040 ± 0,002 -0,9950 0,037 0,0004 5 88,9 ± 7,3 1,16 19 2,80 ± 0,26 -0,032 ± 0,003 -0,9881 0,045 0,0016 5 88,0 ± 11,3 0,95 20 2,80 ± 0,05 -0,0314 ± 0,0005 -0,9996 0,008 <0,0001 5 89,1 ± 2,0 1,40 21 4,17 ± 0,49 -0,045 ± 0,005 -0,9782 0,087 0,0039 5 93,3 ± 15,9 -1,19 22 4,27 ± 0,51 -0,045 ± 0,005 -0,9774 0,089 0,0041 5 94,5 ± 16,3 -1,90 23 2,65 ± 0,19 -0,030 ± 0,002 -0,9927 0,033 0,0008 5 88,9 ± 8,9 0,99 24 3,02 ± 0,20 -0,34 ± 0,002 -0,9935 0,035 0,0006 5 89,0 ± 8,4 1,01 25 2,84 ± 0,14 -0,034 ± 0,002 -0,9969 0,025 0,0002 5 83,6 ± 5,6 3,43 26 3,66 ± 0,28 -0,39 ± 0,003 -0,9903 0,050 0,0011 5 94,1 ± 10,5 -1,48 27 3,32 ± 0,20 -0,036 ± 0,002 -0,9946 0,034 0,0005 5 92,8 ± 7,8 -0,73 28 2,72 ± 0,12 -0,32 ± 0,001 -0,9975 0,021 0,0001 5 84,6 ± 5,0 2,87 29 2,53 ± 0,18 -0,030 ± 0,002 -0,9938 0,031 0,0006 5 83,1 ± 7,9 3,36 30 3,13 ± 0,16 -0,036 ± 0,002 -0,9963 0,028 0,0003 5 87,6 ± 6,3 1,73 31 2,72 ± 0,17 -0,033 ± 0,002 -0,9952 0,029 0,0004 5 82,7 ± 6,9 3,72 32 3,01 ± 2,45 -0,035 ± 0,003 -0,9909 0,004 0,0010 5 85,4 ± 9,7 2,68 33 2,57 ± 0,17 -0,031 ± 0,002 -0,9944 0,030 0,0005 5 83,3 ± 7,5 3,32  118    7 Prilog  Tabela P6. Hromatografski deskriptori (RM0, b, C0, and PC1) izvedeni iz retencionih podataka dobijenih za sistem RP18 / DMSO:voda, R – Pearson-ov korelacioni koeficijent, S – standardna greška modela, P – nivo značajnosti, n - broj merenja. Jedinjenje Hromatografski deskriptori i odgovarajući statistički parametri RM0 b r s P n C0 PC1 1 5,41 ± 0,74 -0,063 ± 0,008 -0,9757 0,129 0,0045 5 7,3 ± 1,4 0,43 2 5,58 ± 0,66 -0,060 ± 0,007 -0,9781 0,116 0,0039 5 8,4 ± 1,4 -0,36 3 6,12 ± 0,20 -0,056 ± 0,002 -0,9977 0,034 0,0001 5 31,3 ± 1,6 2,65 4 4,85 ± 0,19 -0,053 ± 0,002 -0,9975 0,034 0,0001 5 29,9 ± 1,4 1,36 5 4,17 ± 0,47 -0,052 ± 0,005 -0,9853 0,081 0,0021 5 8,9 ± 1,3 -1,03 6 5,75 ± 0,79 -0,065 ± 0,009 -0,9741 0,139 0,0050 5 7,3 ± 1,4 0,27 7 5,77 ± 0,61 -0,057 ± 0,007 -0,9798 0,107 0,0034 5 9,4 ± 1,5 -0,19 8 6,97 ± 0,77 -0,064 ± 0,009 -0,9742 0,135 0,0049 5 9,0 ± 1,6 1,95 9 8,05 ± 0,43 -0,077 ± 0,005 -0,9941 0,076 0,0005 5 18,6 ± 1,5 3,20 10 5,06 ± 0,25 -0,055 ± 0,003 -0,9961 0,044 0,0003 5 20,1 ± 1,4 0,14 11 4,81 ± 0,54 -0,053 ± 0,006 -0,9813 0,095 0,0030 5 8,9 ± 1,4 -1,10 12 4,15 ± 0,46 -0,047 ± 0,005 -0,9825 0,081 0,0028 5 9,0 ± 1,4 -1,98 13 5,38 ± 0,43 -0,059 ± 0,005 -0,9904 0,075 0,0011 5 12,6 ± 1,4 0,22 14 5,58 ± 0,52 -0,060 ± 0,006 -0,9863 0,092 0,0019 5 10,6 ± 1,4 -0,70 15 6,28 ± 0,78 -0,075 ± 0,009 -0,9805 0,137 0,0032 5 8,0 ± 1,4 3,41 16 7,53 ± 0,45 -0,078 ± 0,005 -0,9938 0,079 0,0006 5 16,6 ± 1,5 4,43 17 5,05 ± 0,31 -0,056 ± 0,003 -0,9945 0,054 0,0004 5 16,4 ± 1,4 1,27 18 4,75 ± 0,41 -0,053 ± 0,005 -0,9891 0,072 0,0014 5 11,6 ± 1,4 -0,57 19 5,41 ± 0,39 -0,059 ± 0,004 -0,9921 0,068 0,0008 5 13,9 ± 1,4 0,48 20 5,68 ± 0,57 -0,061 ± 0,006 -0,9845 0,099 0,0023 5 10,0 ± 1,4 -1,32 21 6,96 ± 0,78 -0,073 ± 0,009 -0,9792 0,137 0,0036 5 8,9 ± 1,5 2,22 22 7,87 ± 0,67 -0,081 ± 0,007 -0,9878 0,117 0,0016 5 11,8 ± 1,5 4,01 23 5,09 ± 0,27 -0,056 ± 0,003 -0,9958 0,047 0,0003 5 19,0 ± 1,4 0,95 24 4,74 ± 0,42 -0,053 ± 0,005 -0,9889 0,073 0,0014 5 11,4 ± 1,4 -1,44 25 4,40 ± 0,36 -0,050 ± 0,004 -0,9908 0,062 0,0011 5 12,3 ± 1,4 -2,55 26 5,11 ± 0,18 -0,053 ± 0,002 -0,9979 0,031 0,0001 5 28,6 ± 1,5 2,19 27 5,43 ± 0,55 -0,042 ± 0,006 -0,9699 0,096 0,0064 5 9,9 ± 1,8 -0,57 28 4,55 ± 0,42 -0,052 ± 0,005 -0,9881 0,074 0,0015 5 10,7 ± 1,4 -3,05 29 4,55 ± 0,60 -0,053 ± 0,007 -0,9772 0,105 0,0041 5 7,6 ± 1,4 -3,91 30 4,57 ± 0,09 -0,047 ± 0,001 -0,9993 0,016 ˂0,0001 5 49,0 ± 1,5 -1,87 31 4,55 ± 0,05 -0,0514 ± 0,0006 -0,9981 0,009 ˂0,0001 5 86,6 ± 1,4 -2,79 32 3,70 ± 0,29 -0,054 ± 0,003 -0,9948 0,050 0,0004 5 13,0 ± 1,3 -2,58 33 4,42 ± 0,03 -0,0520 ± 0,0003 -0,9999 0,005 ˂0,0001 5 163,4 ± 1,4 -3,17  119    7 Prilog  Tabela P7. Izračunate log P vrednosti Jedinjenje Alog Ps AClog P Alog P Mlog P log PKOWWIN Xlog P2 Xlog P3 1 3,97 3,45 4,03 3,19 3,62 3,66 4,01 2 3,94 3,35 4,02 2,90 3,70 3,57 3,98 3 4,50 4,06 4,70 3,68 4,26 4,28 4,63 4 2,45 2,26 2,78 2,39 2,42 2,09 2,62 5 3,81 3,46 3,93 3,24 3,44 3,55 3,83 6 4,21 3,54 4,12 3,30 3,86 3,84 4,07 7 3,98 3,43 4,10 3,01 3,94 3,75 4,04 8 4,66 4,15 4,78 3,79 4,51 4,46 4,70 9 4,45 4,30 5,06 4,12 4,83 4,76 4,95 10 2,11 2,34 2,86 2,51 2,67 2,27 2,68 11 3,84 3,54 4,01 3,35 3,68 3,73 3,90 12 3,03 2,84 3,26 2,74 2,79 2,93 3,21 13 3,99 3,94 4,28 3,05 3,83 3,05 3,68 14 3,99 3,84 4,26 2,76 3,91 2,97 3,65 15 4,55 4,55 4,95 3,55 4,48 3,67 4,31 16 4,45 4,70 5,22 3,87 4,80 3,98 4,57 17 2,34 2,75 3,02 2,25 2,64 1,49 2,30 18 3,46 3,95 4,18 3,10 3,65 2,94 3,51 19 4,11 4,03 4,36 3,17 4,08 3,23 3,74 20 4,05 3,92 4,35 2,87 4,16 3,14 3,72 21 4,58 4,64 5,03 3,65 4,72 3,85 4,37 22 4,63 4,79 5,31 3,98 5,04 4,15 4,63 23 2,39 2,83 3,11 2,37 2,88 1,66 2,36 24 3,72 4,03 4,26 3,21 3,90 3,12 3,57 25 3,32 3,33 3,62 2,56 3,19 2,43 3,05 26 3,67 3,96 4,59 3,01 4,28 3,09 3,78 27 4,35 4,51 4,53 3,29 4,36 3,70 4,30 28 3,36 3,22 3,60 2,27 3,27 2,35 3,02 29 3,42 3,22 3,60 2,27 3,27 2,35 3,02 30 3,95 3,94 4,28 3,05 3,83 3,05 3,68 31 3,49 3,39 3,82 2,94 3,39 2,59 3,15 32 2,80 3,33 3,51 2,61 3,01 2,32 2,88 33 2,94 3,33 3,51 2,61 3,01 2,32 2,88  120    7 Prilog  Tabela P8. Molekulski deskriptori korišćeni za multivarijantnu analizu, Jed. TD LUMO Energy HOMO Energy SA Volume Refracti vity Polariza bility Mass MW Log P HLB SP DM 1 3,382 -0,315 -8,850 476,605 987,766 100,688 38,306 340,855 340,855 4,235 8,761 25,801 4,170 2 5,481 -0,307 -8,800 479,257 1027,703 107,151 40,778 370,882 370,882 4,048 8,240 25,623 6,310 3 4,784 -0,081 -8,719 491,920 1022,872 105,493 40,234 375,301 375,300 4,948 7,838 26,503 5,800 4 4,443 -0,234 -8,820 480,721 982,950 98,813 37,597 341,843 341,843 3,287 11,392 26,641 4,510 5 6,442 -1,358 -8,198 465,571 1015,397 108,013 40,147 385,853 401,896 3,838 11,574 24,963 3,290 6 5,048 -0,301 -8,427 481,507 998,839 103,506 39,004 385,306 385,307 4,385 8,582 25,734 5,070 7 3,405 -0,169 -8,775 525,674 1085,575 109,969 41,476 415,333 415,333 4,198 8,086 25,566 4,090 8 3,139 -0,289 -8,816 523,087 1045,888 108,311 40,932 419,751 419,751 5,098 7,679 26,417 4,780 9 6,986 -0,490 -8,563 512,295 1060,356 109,480 40,566 453,305 453,305 5,268 7,529 24,880 6,020 10 3,451 -0,279 -8,733 441,484 966,931 101,631 38,295 386,294 386,294 3,437 11,150 26,546 4,530 11 6,250 -0,557 -8,712 501,145 1056,485 109,826 40,845 430,304 430,304 4,217 10,506 26,144 7,040 12 3,898 -0,460 -8,723 448,995 989,604 102,204 38,219 351,408 351,408 3,354 11,321 25,553 4,630 13 4,784 -0,818 -8,350 468,842 1012,219 109,666 41,969 372,915 372,921 5,715 9,851 25,241 2,240 14 5,769 -0,589 -8,430 521,440 1104,447 116,129 44,441 402,942 402,947 5,527 9,277 25,124 4,100 15 5,429 -0,706 -8,509 500,488 1063,218 114,471 43,897 407,361 407,366 6,428 8,930 25,909 3,420 16 5,764 -0,390 -8,677 499,197 1035,527 106,662 39,868 408,854 408,854 5,118 7,874 24,921 5,740 17 3,213 -0,736 -8,530 447,282 1002,549 107,791 41,260 373,903 373,909 4,766 12,339 25,992 1,870 18 8,212 -0,840 -8,499 521,215 1091,589 115,986 43,810 417,913 417,919 5,546 11,611 25,657 5,460 19 4,913 -0,708 -8,473 495,350 1045,594 112,484 42,667 417,366 417,373 5,865 9,628 25,196 3,680 20 2,693 -0,053 -8,163 513,631 1109,977 114,202 43,536 429,359 429,360 4,843 8,151 25,423 1,850 21 5,069 -0,690 -8,460 514,350 1080,431 117,289 44,595 451,811 453,305 5,268 7,534 24,880 6,730 22 6,576 -0,732 -8,499 579,652 1147,482 118,458 44,229 485,365 485,371 6,748 8,536 24,451 4,400 23 6,201 -0,768 -8,523 463,772 1027,227 110,609 41,958 418,354 418,360 4,916 12,064 25,925 3,530 24 8,630 -1,483 -7,931 487,432 1082,357 118,804 44,508 462,364 462,370 5,696 11,364 25,599 6,740 25 4,934 -0,415 -8,329 476,051 1005,198 104,861 40,041 338,470 338,477 5,002 10,922 24,543 2,060 26 4,556 -0,526 -8,412 500,921 1073,749 114,944 43,711 366,524 366,530 6,300 9,133 23,876 2,080 27 6,459 -0,350 -8,276 490,807 1120,750 121,311 47,311 388,530 388,536 5,976 9,656 25,264 3,170 28 4,217 -0,430 -8,331 503,284 1069,746 111,324 42,513 368,497 368,503 4,814 10,219 24,478 2,730 29 6,145 -0,366 -8,289 526,326 1086,591 111,324 42,513 368,497 368,503 4,921 9,816 24,478 2,980 30 7,181 -1,065 -7,957 472,119 1026,380 109,666 41,969 372,915 372,921 5,715 10,310 25,241 3,450 31 5,584 -0,565 -8,425 443,974 977,394 105,078 39,950 356,461 356,467 5,145 10,665 24,913 2,960 32 7,266 -0,652 -8,453 480,316 1044,414 111,182 41,882 383,468 383,474 4,833 12,663 25,016 4,720 33 4,743 -1,007 -8,541 484,969 1028,742 111,182 41,882 383,468 383,474 4,745 12,256 25,016 3,580  121    7 Prilog  Tabela P8. Nastavak Jed. ST HSA PSA CI0 CI1 CI2 CI3 VI0 VI1 VI2 VI3 CI4 CI4 1 61,544 9,548 35,160 37,355 11,793 10,426 8,981 35,335 8,810 6,697 5,035 7,593 3,653 2 64,201 9,957 44,390 40,933 12,742 11,144 9,762 38,666 9,339 7,033 5,339 8,308 3,888 3 62,903 9,147 35,160 37,225 12,204 10,953 9,448 35,390 9,293 7,219 5,425 7,990 3,960 4 61,991 11,846 48,050 36,355 11,793 10,426 8,981 34,205 8,670 6,549 4,887 7,593 3,526 5 77,639 15,840 96,670 44,096 13,490 11,937 9,853 40,290 9,440 7,041 5,207 7,909 3,627 6 63,930 9,557 35,160 37,355 11,793 10,426 8,981 36,164 9,225 7,143 5,351 7,593 3,972 7 66,506 9,965 44,390 40,933 12,742 11,144 9,762 39,495 9,754 7,480 5,655 8,308 4,207 8 65,272 9,146 35,160 37,225 12,204 10,953 9,448 36,219 9,708 7,666 5,741 7,990 4,279 9 54,562 9,536 35,160 39,725 13,398 13,017 10,271 36,721 9,952 7,856 5,768 8,430 4,212 10 64,752 11,828 48,050 36,355 11,793 10,426 8,981 35,034 9,085 6,996 5,203 7,593 3,845 11 107,181 12,427 87,300 38,803 13,114 11,884 10,001 36,281 9,639 7,477 5,589 8,546 4,154 12 104,161 12,426 87,300 38,933 12,704 11,344 9,610 35,398 8,742 6,501 4,933 8,040 3,477 13 72,922 11,230 38,060 38,225 12,187 11,071 9,248 36,532 9,401 7,307 5,348 7,899 3,955 14 74,924 11,657 47,290 41,803 13,135 11,790 10,030 39,863 9,930 7,643 5,652 8,614 4,190 15 73,648 10,838 38,060 38,096 12,597 11,599 9,715 36,587 9,883 7,829 5,739 8,295 4,262 16 48,708 9,946 35,160 39,725 13,398 13,017 10,271 35,892 9,538 7,409 5,452 8,430 3,893 17 73,865 13,521 50,950 37,225 12,187 11,071 9,248 35,402 9,260 7,159 5,200 7,899 3,828 18 119,530 14,132 90,200 39,673 13,508 12,530 10,268 36,650 9,815 7,640 5,586 8,851 4,138 19 75,396 11,205 38,060 38,225 12,187 11,071 9,248 37,361 9,815 7,753 5,675 7,899 4,272 20 80,116 10,538 47,290 43,803 13,135 11,790 10,030 42,178 10,087 7,832 5,851 8,614 4,374 21 54,444 9,548 35,160 39,725 13,398 13,017 10,271 36,721 9,952 7,856 5,768 8,430 4,212 22 63,592 11,203 38,060 40,596 13,792 13,663 10,538 37,918 10,543 8,466 6,092 8,736 4,513 23 76,382 13,492 50,950 37,225 12,187 11,071 9,248 36,231 9,675 7,606 5,527 7,899 4,145 24 123,207 14,078 90,200 39,673 13,508 12,530 10,268 37,478 10,229 8,086 5,913 8,851 4,455 25 71,592 11,695 38,060 38,355 11,776 10,532 8,850 36,478 8,918 6,780 4,994 7,440 3,610 26 66,792 11,270 38,060 44,096 12,597 11,565 9,909 42,323 9,751 7,664 5,789 8,080 4,032 27 63,225 11,693 38,060 42,924 13,759 12,437 10,769 40,632 10,329 7,943 5,980 9,365 4,438 28 73,878 12,110 47,290 41,933 12,725 11,251 9,631 39,808 9,447 7,116 5,299 8,155 3,845 29 73,878 11,692 47,290 41,933 12,708 11,323 9,669 39,808 9,441 7,142 5,310 7,903 3,764 30 72,746 11,694 38,060 38,225 12,170 11,154 9,260 36,532 9,395 7,356 5,316 7,592 3,749 31 71,380 11,662 38,060 38,225 12,170 11,154 9,260 35,778 9,018 6,921 5,065 7,592 3,623 32 120,976 14,568 90,200 39,803 13,097 11,990 9,870 36,595 9,332 7,113 5,232 8,393 3,793 33 121,055 14,146 90,200 39,803 13,081 12,065 9,898 36,595 9,326 7,142 5,224 8,135 3,740  122    7 Prilog  Tabela P9. Korelaciona matrica vrednosti molekulskih deskriptora TD LUMO Energy SA Refrac tivity Polariz ability Mass MW Log P HLB HBA HBD DM ST TD 1,000 LUMO Energy -0,794 1,000 SA 0,128 0,095 1,000 Refractivity 0,406 -0,450 0,662 1,000 Polarizability 0,339 -0,370 0,645 0,980 1,000 Mass 0,356 -0,336 0,600 0,712 0,601 1,000 MW 0,375 -0,383 0,579 0,707 0,589 0,996 1,000 Log P 0,405 -0,340 0,586 0,801 0,833 0,478 0,457 1,000 HLB 0,231 -0,496 -0,548 -0,255 -0,293 -0,284 -0,253 -0,368 1,000 HBA 0,381 -0,681 -0,059 0,264 0,147 0,250 0,323 -0,112 0,539 1,000 HBD 0,336 -0,640 0,154 0,546 0,554 0,138 0,193 0,446 0,293 0,651 1,000 DM 0,406 -0,097 -0,113 -0,156 -0,259 0,314 0,301 -0,238 -0,048 -0,060 -0,603 1,000 ST 0,357 -0,501 -0,172 0,301 0,227 0,280 0,283 -0,051 0,532 0,500 0,167 0,273 1,000 HSA 0,427 -0,754 -0,281 0,129 0,042 0,043 0,105 -0,155 0,834 0,895 0,616 -0,075 0,585 PSA 0,319 -0,537 -0,315 0,024 -0,104 0,146 0,194 -0,395 0,643 0,805 0,199 0,321 0,800 CI0 -0,018 -0,157 0,363 0,531 0,507 0,151 0,190 0,185 -0,169 0,516 0,555 -0,437 0,058 CI1 0,412 -0,426 0,506 0,640 0,515 0,681 0,711 0,283 -0,150 0,638 0,324 0,197 0,322 CI2 0,487 -0,422 0,589 0,659 0,540 0,742 0,755 0,507 -0,224 0,451 0,270 0,202 0,173 CI3 0,356 -0,298 0,595 0,703 0,597 0,705 0,714 0,402 -0,318 0,432 0,192 0,223 0,254 VI0 -0,122 -0,066 0,401 0,597 0,614 0,159 0,184 0,278 -0,252 0,326 0,554 -0,544 0,011 VI1 0,336 -0,349 0,722 0,931 0,878 0,889 0,885 0,727 -0,410 0,216 0,387 0,001 0,173 VI2 0,352 -0,335 0,693 0,895 0,851 0,884 0,871 0,799 -0,421 0,088 0,320 0,031 0,131 VI3 0,238 -0,220 0,692 0,883 0,840 0,858 0,842 0,731 -0,505 0,041 0,229 0,054 0,140 CI4 0,249 -0,184 0,569 0,703 0,613 0,787 0,777 0,355 -0,349 0,282 0,032 0,342 0,383 VI4 0,170 -0,141 0,640 0,794 0,753 0,891 0,867 0,627 -0,477 -0,040 0,111 0,150 0,188    123    7 Prilog  Tabela P9. Nastavak HSA PSA CI0 CI1 CI2 CI3 VI0 VI1 VI2 VI3 CI4 VI4 TD LUMO Energy SA Refractivity Polarizability Mass MW Log P HLB HBA HBD DM ST HSA 1,000 PSA 0,804 1,000 CI0 0,268 0,202 1,000 CI1 0,336 0,453 0,623 1,000 CI2 0,191 0,221 0,422 0,918 1,000 CI3 0,136 0,292 0,593 0,959 0,924 1,000 VI0 0,127 0,021 0,941 0,436 0,246 0,445 1,000 VI1 0,000 -0,028 0,437 0,688 0,733 0,752 0,497 1,000 VI2 -0,081 -0,128 0,276 0,573 0,692 0,667 0,360 0,976 1,000 VI3 -0,156 -0,115 0,350 0,575 0,646 0,696 0,447 0,968 0,976 1,000 CI4 0,019 0,278 0,419 0,854 0,801 0,919 0,342 0,777 0,706 0,757 1,000 VI4 -0,208 -0,117 0,167 0,465 0,529 0,573 0,299 0,918 0,936 0,958 0,732 1,000      124    7 Prilog    Tabela P10. Korelaciona matrica vrednosti molekulskih deskriptora uključenih u MLR model TD LUMO Energy SA Polariz ability Mass HLB HBA HBD DM Log P ST CI0 CI2 VI3 CI4 TD 1,000 LUMO Energy -0,607 1,000 SA 0,174 0,130 1,000 Polarizability 0,386 -0,305 0,516 1,000 Mass 0,362 -0,268 0,622 0,510 1,000 HLB 0,240 -0,505 -0,546 -0,117 -0,320 1,000 HBA 0,445 -0,688 -0,055 0,186 0,189 0,631 1,000 HBD 0,334 -0,616 -0,053 0,475 -0,026 0,502 0,645 1,000 DM 0,386 -0,027 0,200 -0,118 0,454 -0,254 -0,041 -0,621 1,000 Log P 0,352 -0,308 0,508 0,592 0,718 -0,427 -0,018 0,192 0,119 1,000 ST 0,386 -0,503 -0,106 0,161 0,085 0,665 0,650 0,325 0,126 -0,244 1,000 CI0 0,161 -0,093 0,395 0,546 0,161 -0,153 0,429 0,449 -0,232 0,163 0,062 1,000 CI2 0,556 -0,366 0,555 0,577 0,724 -0,175 0,417 0,150 0,353 0,640 0,161 0,467 1,000 VI3 0,274 -0,099 0,693 0,778 0,828 -0,488 -0,030 0,081 0,196 0,806 -0,067 0,400 0,630 1,000 CI4 0,428 -0,124 0,546 0,739 0,635 -0,178 0,283 0,094 0,324 0,463 0,273 0,533 0,780 0,742 1,000 RM0 -0,063 0,287 0,576 0,202 0,595 -0,803 -0,447 -0,421 0,324 0,691 -0,623 -0,007 0,473 0,614 0,349    125    7 Prilog  2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 12 Principal Component Number E ig en va lu es 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 Principal Component Number E ig en va lu es Slika P1. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od svojstvenih vrednosti za PCA primenjenu na retencione podatke Slika P2. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od svojstvenih vrednosti za PCA primenjenu na molekulske deskriptore   7 Prilog  126    2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Principal Component Number R M S E C V R M 0, R M S E C R M 0 Slika P3. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od odnosa RMSEC/RMSECV u PCR modelu 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 -3 -2 -1 0 1 2 3 Leverage Y S td nt R es id ua l 1 R M 0 2 3 4 5 6 7 10 11 12 15 16 19 20 22 24 25 26 28 29 30 Slika P4. Grafik zavisnosti reziduala od Ymodela za PCR model  127  7 Prilog  2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Latent Variable Number R M S E C V R M 0, R M S E C R M 0 Slika P5. Grafik zavisnosti broja glavnih komponenata od odnosa RMSEC/RMSECV u PLS modelu   0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 -3 -2 -1 0 1 2 3 Leverage Y S td nt R es id ua l 1 R M 0 2 3 4 5 6 7 10 11 12 15 16 19 20 22 24 25 26 28 29 30 Slika P6. Grafik zavisnosti reziduala od Ymodela za PLS model Jelena Đ. Trifković Biografija Jelena Đ. Trifković (rođena Veličković) rođena je 03. decembra 1976. godine u Beogradu, Republika Srbija, gde je završila osnovnu i srednju školu. Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu upisala je školske 1995/96. godine, a diplomirala 2001. godine sa prosečnom ocenom 8,27. Poslediplomske studije pri Katedri za analitičku hemiju Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu upisala je 2003. godine. Magistarsku tezu pod naslovom „Uticaj supstituenata na aromatičnim jezgrima 1-aralkil-4-aril piperazina na njihovu retenciju u uslovima planarne hromatografije" odbranila je 18. decembra 2006. godine. Od avgusta 2003. godine bila je zaposlena kao asistent-pripravnik na Katedri za analitičku hemiju Hemijskog fakulteta u Beogradu. U zvanje asistenta za užu naučnu oblast Analitička hemija na Katedri za analitičku hemiju izabrana je 11.05.2007. godine. U tom zvanju se i sada nalazi. U toku svog nastavnog rada bila je angažovana u izvođenju nastave iz nekoliko kurseva iz oblasti analitičke hemije i hemometrije na sva tri nivoa studija. Koautor je praktikuma koji se koristi u nastavi, „Praktikum iz kvalitativne hemijske analize neorganskih jedinjenja”, Dušanka Milojković-Opsenica, Jelena Trifković, Hemijski fakultet, Beograd, 2010, ISBN 978-86-7220-036-2. Stipendista je Balkanske Ekološke Asocijacije (B.EN.A) i kompanije Carlsberg (2006/2007. godine). Pohađala je obuku "X-ray, IR and Raman Spectroscopy Application" - ISS on Instrumental Analysis 2006 (Sofija, Bugarska, septembar 2006. godine). Naučni radovi 1. S. Šegan, J. Trifković, T. Verbić, D. Opsenica, M. Zlatović, J. Burnett, B. Šolaja, D. Milojković-Opsenica, Correlation between structure, retention, property, and activity of biologically relevant 1,7-bis(aminoalkyl)diazachrysene derivatives, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 72 (2013) 231- 239. 2. Kristina B. Lazarević, Filip Andrić, Jelena Trifković, Živoslav Tešić, Dušanka Milojković-Opsenica, Characterisation of Serbian unifloral honeys according to their physicochemical parameters, Food Chemistry, 132 (2012) 2060-2064. 3. E.H.M.A. Rabtti, M.M. Natić, D.M. Milojković-Opsenica, J.Đ. Trifković, I.M. Vučković, V.E. Vajs, Ž.Lj. Tešić, RP TLC-Based Lipophilicity Assessment of Some Natural and Synthetic Coumarins, Journal of Brazilian Chemical Society, 23 (2012) 522-530. 4. E.H.M.A. Rabtti, M.M. Natić, D.M. Milojković-Opsenica, J.Đ. Trifković, T. Tosti, I.M. Vučković, V. Vajs, Ž.LJ. Tešić, Quantitative Structure-Toxicity Relationship Study of Some Natural and Synthetic Coumarins Using Retention Parameters, Journal of Serbian Chemical Society, 77 (2012) 1443-1456. 5. J. Trifković, F. Andrić, P. Ristivojević, D. Andrić, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, Structure-retention relationship study of arylpiperazines by linear multivariate modeling, Journal of Separation Science, 33 (2010) 2619- 2628. 6. F.Lj. Andrić, J.Đ. Trifković, A.D. Radoičić, S.B. Šegan, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, Determination of the soil-water partition coefficients (log KOC) of some mono- and poly-substituted phenols by reversed-phase thin-layer chromatography, Chemosphere, 81 (2010) 299-305. 7. F.Lj. Andrić, J. Trifkovć, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, An Approximate Linear Solvation Energy relationships Model Based on Snyder’s Selectivity Parameters. Chromatographic Behavior of Some 1-Aralkyl-4- Arylpiperazines, Chromatographia, 68 (2008) 453–458. 8. J. Veličković, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Evaluation of the Lipophilicity of Some 1-Arylpiperazines by Planar Chromatography, Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 18 (2005) 358–363. 9. J. Veličković, D. Andrić, G. Roglić, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Planar Chromatography of Some 1-Arylpiperazines Behaving as Dopaminergic Ligands, Journal of Planar Chromatography – Modern TLC, 17 (2004) 255–260. Saopštenja 1. F. Lj. Andrić, J.Đ. Trifković, I. Radović, D.M. Milojković-Opsenica, Ž.Lj. Tešić, Characterization and classification of Serbian monofloral honeys according to their mineral profiles by the means of multivariate data analysis. XIII Chemometrics in Analytical Chemistry, CAC-2012, June 2012, Budapest, Hungary, Book of Abstracts P192. ISBN 978-963-9970-24-3 2. M.S. Jovetić, J.Đ. Trifković, F.Lj. Andrić, S. Škrivanj, Ž.Lj. Tešić, D.M. Milojković-Opsenica, Mineral content of honey as a tool in tracing regional differences of Serbian polyfloral honey using pattern recognition methods, XIII. Chemometrics in Analytical Chemistry Conference, CAC-2012, June 2012, Budapest, Hungary, Book of Abstracts P217. ISBN 978-963-9970-24-3 3. Mirjana Stanković, Jelena Trifković, Filip Andrić, Nebojša Nedić, Živoslav Tešić, Dušanka Milojković-Opsenica, Determination of polyphenolic compounds in bee pollen from Serbia by UPLC-LTQ-orbitrap MS-MS, 50th Meeting of the Serbian Chemical Society, Belgrade, Serbia, June 2012, Book of Abstracts P16. ISBN 978-86-7132-048-1 4. Filip Andrić, Jelena Trifković, Aleksandra Radoičić, Jelena Kečkeš, Živoslav Tešić, Dušanka Milojković-Opsenica, Characterisation of Serbian monofloral honey according to their amino-acid composition. 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis, Prague, Czech Republic, November 2011, Book of Abstracts P157. ISBN 978-80-7080-795-8. 5. Dušanka Milojković-Opsenica, Sandra Šegan, Jelena Trifković, Mario Zlatović, Dejan Opsenica, Igor Opsenica, Bogdan Šolaja, Quantitative structure-retention relationship study of some 1,7-bis(aminoalkyl) diazachrysene derivatives, 17th European Symposium on Organic Chemistry, ESOC 2011”, Hersonissos, Crete, Greece, 10-15 July 2011, Book of abstracts (lectrinic version, USB), P2.105, p108. 6. K. B. Lazarević, J. Đ. Trifković, F. Lj. Andrić, Ž. Lj. Tešić, D. M. Milojković- Opsenica, Characterization of Serbian monofloral honey according to their physico-chemical parameters. Conferentia Chemometrica, September 2011, Sümeg, Hungary, Book of Abstracts P25. ISBN 978-963-9970-15-1 7. K. B. Lazarević, J. Đ. Trifković, F. Lj. Andrić, Ž. Lj. Tešić, D. M. Milojković- Opsenica, Physico-chemical parameters in tracing regional differences of Serbian polyfloral honey, Conferentia Chemometrica, September 2011, Sümeg, Hungary, Book of Abstracts P40. ISBN 978-963-9970-15-1 8. P. Ristivojević, J. Trifković, N. Terzić, B. Šolaja, D. Milojković-Opsenica, A Quantitative Structure-Retention Relationship Study of Adamantane Derivatives of 4-amino-7-chloroquinoline, EUROANALYSIS 2011-European Conference on Analytical Chemistry, ”Challenges in Modern Analytical Chemistry”, September 2011, Belgrade, Serbia, CH30. 9. F. Andrić, P. Ristivojević, J. Trifković, Ž. Tešić, D. M. Milojković-Opsenica, Determination of the soil-water, octanol-water, and air-water partition coefficients for the twelve benzodiazepines by the means of the reversed-phase thin-layer chromatography, The XXXIV Symposium, Chromatographic Methods of Investigating The Organic Compounds, Katowice - Szczyrk, June 8th-10th, 2011. 10. Marija Nikolić, Jelena Trifković, Filip Lj. Andrić, Aleksandra Radoičić, Dragan Vučović, Živoslav Lj. Tešić, Dušanka M. Milojković-Opsenica, Planarna hromatografija hidrofilnih interakcija nekih anestetika, 48. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Novi Sad, 17-18. april 2010., AH-01, p.13. ISBN 978-86-7132-042-9 11. Filip Andrić, Jelena Vlajković, Jelena Trifković, Živoslav Tešić, Dušanka M. Milojković-Opsenica, Determination of nine water-soluble food dyes by the means of reversed-phase planar chromatography, 2nd Workshop Specific methods for food safety and quality - Pre event to physical chemistry 2010, Belgrade, 21 September 2010, Book of Abstracts, p. 12. J. Đ. Trifković, P. M. Ristivojević, F. Lj. Andrić, D. Andrić, Ž. Lj. Tešić, D. M. Milojković-Opsenica, Relationship Between Structure and Thin-layer Chromatographic Lipophilicity Parameter of Some Arylpiperazines, EUROANALYSIS 2009-European Conference on Analytical Chemistry, ”The Impact of Analytical Chemistry on Quality of Life”, September 2009, Innsbruck, Austria, Book of Abstracts P121-B1. 13. Aleksandra D. Radoičić, Jelena Đ. Trifković, Filip Lj. Andrić, Živoslav Lj. Tešić, Dušanka M. Milojković-Opsenica, Planarna hromatografija hidrofilnih interakcija nekih amino-kiselina, 47. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd, 21. mart 2009., AH-11, p.21. ISBN 978-86-7132-031-2 14. Filip Lj. Andrić, Luka Novković, Jelena Trifković, Dušanka M. Milojković- Opsenica, LSER model hromatografskog ponašanja nekih 1-aralkil-4- arilpiperazina, 46. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd, 21. februar 2008., AH 07, p.19. ISBN 978-86-7132-035-1 15. J. Trifković, F. Andrić, M. Natić, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Determination of hydrophobic parameters for some arylpiperazines by RP-TLC and PCA, The XXXIst Symposium, Chromatographic Methods of Investigating The Organic Compounds, Katowice - Szczyrk, June 4th-6th, 2007, Book of Abstracts, p.40. ISBN 978-83-925714-0-7 16. Filip Lj. Andrić, Jelena Đ. Trifković, Dušanka M. Milojković-Opsenica, Živoslav Lj. Tešić, Optimizacija razdvajanja derivata nekih 1-arilpiperazina na tankom sloju silika-gela, 44. Savetovanje Srpskog hemijskog društva, Beograd, 06-07. februar 2006., AH-P04, p.21. ISBN 86-7132-027-8 17. Jelena Đ. Veličković, Deana Andrić, Goran Roglić, Živoslav Lj. Tešić, and Dušanka M. Milojković-Opsenica, Planar Chromatography of Some 1- Arylpiperazines Behaving as Dopaminergic Ligands, Planar Chromatography 2004, Visegrad, Hungary, May 2004., Proceedings of the International Symposium on Planar Separations p. 637-644. 18. Jelena Đ. Veličković, Živoslav Lj. Tešić, and Dušanka M. Milojković- Opsenica, Evaluation of the Lipophilicity of Some 1-Arylpiperazines by Planar Chromatography, Planar Chromatography 2005, Siofok, Hungary, May 2005., Proceedings of the International Symposium on Planar Separations p. 649-655.