UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Milka B. Jadranin IZOLOVANJE, KARAKTERIZACIJA I BIOLOŠKA AKTIVNOST JATROFANSKIH DITERPENA IZ EUPHORBIA DENDROIDES L. Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Milka B. Jadranin ISOLATION, CHARACTERIZATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF JATROPHANE DITERPENES FROM EUPHORBIA DENDROIDES L. Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 MENTOR: Dr Vele Tešević vanredni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: Dr Vlatka Vajs naučni savetnik Centra za hemiju IHTM Univerziteta u Beogradu i redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Dr Ivana Aljančić naučni savetnik Centra za hemiju IHTM Univerziteta u Beogradu Dr Bogdan Šolaja redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu i redovni član SANU Dr Milica Pešić viši naučni saradnik Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stanković“ Univerziteta u Beogradu Beograd, 2013. Ova doktorska disertacija je urađena u laboratorijama Odeljenja za instrumentalnu analizu Centra za hemiju IHTM i Hemijskog fakulteta u saradnji sa Institutom za biološka istraživanja „Siniša Stanković“. Prof. dr Veletu Teševiću, prof. dr Vlatki Vajs, dr Ivani Aljančić i prof. dr Slobodanu Milosavljeviću zahvaljujem se na ukazanom poverenju, nesebičnoj pomoći i sugestijama u svim fazama izrade ove disertacije. Imam čast i sreću da sa njima sarađujem i učim od njih. Prof. dr Bogdanu Šolaji se zahvaljujem na korisnim sugestijama u završnoj fazi pisanja disertacije. Dr Milici Pešić, koja je neposredno rukovodila eksperimentima za ispitivanje bioloških aktivnosti, zahvaljujem se na konstruktivnim primedbama koje su mi pomogle u razumevanju ove problematike. Kolegama iz CIA zahvaljujem se na razumevanju, podršci i pomoći tokom rada. Autor Milka Jadranin Doktorska disertacija i Izolovanje, karakterizacija i biološka aktivnost jatrofanskih diterpena iz Euphorbia dendroides L. IZVOD Rod Euphorbia, sa više od 2.000 vrsta jednogodišnjih, dvogodišnjih ili višegodišnjih cvetnica koje su članovi familije Euphorbiaceae, jedan je od najvećih i najraznovrsnijih rodova ne samo u svojoj familiji, već u celom biljnom carstvu. Biljke ovog roda koriste se u tradicionalnoj medicini još od antičkih vremena. Dosadašnja fitohemijska proučavanja pokazala su da vrste roda Euphorbia proizvode veoma raznovrsne sekundarne metabolite, uključujući različite terpene (seskviterpeni, diterpeni i triterpeni), steroide, cerebrozide, glicerole i fenolna jedinjenja (floracetofenoni, flavonoidi, tanini, kumarini). Mnoga od ovih jedinjenja pokazuju biološke aktivnosti, a najvažnije su reverzija višestruke rezistencije na lekove, antimitotsko, antiproliferativno, citotoksično, antivirusno, antimikrobno, antitumorsko, antiinflamatorno, tumor promotorsko i proinflamatorno dejstvo. Vrste iz roda Euphorbia su bogat izvor jatrofana, makrocikličnih diterpena osnovne trans-biciklo[10.3.0]pentadekanske strukture, za koje je karakteristično posto- janje veoma fleksibilnog dvanaestočlanog prstena. To su veoma funkcionalizovana, različito oksigenovana jedinjenja; u biljkama se obično nalaze u obliku poli- hidroksilovanih diterpena esterifikovanih različitim kiselinama (acetil, propanoil, n- butanoil, izobutanoil, izovaleril, angeloil, tigloil, benzoil, nikotinoil derivati, itd.), zbog čega su poznati i pod nazivom jatrofanski poliestri. U okviru ove disertacije ispitivani su jatrofanski diterpeni iz vrste Euphorbia dendroides L. poreklom iz Crne Gore koja do sada nije fitohemijski proučavana. Proučavanje je obuhvatalo dve celine: nadzemni deo i mlečni lateks. Iz nadzemnog dela E. dendroides izolovano je i okarakterisano šest novih jatrofana, koji su nazvani eufodendrofani A – F (1 – 5, 16), a iz mlečnog lateksa E. dendroides izolovano je i okarakterisano trinaest novih jatrofana, eufodendrofani G – S (6 – 15, 17 – 19), kao i tri jatrofana izolovana iz nadzemnih delova (1, 2, 16). Izolovani jatrofani imaju vrlo slične strukture. Jatrofani 1 – 15 se međusobno razlikuju samo po vrsti, broju i položaju supstituenata, dok se jatrofani 16 – 19 od njih Milka Jadranin Doktorska disertacija ii razlikuju po tome što sadrže endocikličnu (Δ5) umesto egzociklične (Δ6(17)) dvostruke veze. Jedinjenja 1 – 14 su penta- ili heksaesterifikovani jatrofanski polioli koji sadrže keto grupu u položaju C-14, jednu endocikličnu 11 E– i jednu egzocikličnu C-6(17) dvostruku vezu. Jedinjenje 15 je triesterifikovani jatrofanski poliol koji sadrži dve keto grupe (u položajima C-9 i C-14), jednu endocikličnu 11 E– i jednu egzocikličnu C- 6(17) dvostruku vezu. Jedinjenja 16 – 19 su heptaesterifikovani jatrofanski polioli koji sadrže keto grupu u položaju C-14 i dve endociklične dvostruke veze (Δ5 i Δ11). Jatrofani izolovani iz E. dendroides. 1–14 15 16–19 Izolovano jedinjenje R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 1 (Eufodendrofan A) H Pr Ac iBu Ac Nic H 2 (Eufodendrofan B) H iBu Ac iBu Ac Nic H 3 (Eufodendrofan C) H Pr Ac iBu Ac Nic Ac 4 (Eufodendrofan D) H iBu Ac Ac Bz Ac H 5 (Eufodendrofan E) H Pr Ac iBu Bz Ac H 6 (Eufodendrofan H) H Pr Ac iBu Bz Nic H 7 (Eufodendrofan I) H Pr Ac iBu Nic Nic H 8 (Eufodendrofan J) H Pr Ac iBu iBu Nic H 9 (Eufodendrofan K) H iBu Ac iBu Bz Nic H 10 (Eufodendrofan L) H iBu Ac iBu Nic Nic H 11 (Eufodendrofan M) H iBu Ac Ac Nic Ac H 12 (Eufodendrofan N) H Ac Ac iBu Ac Nic H 13 (Eufodendrofan O) OAc iBu Ac iBu Ac Nic H 14 (Eufodendrofan P) OAc iBu Nic iBu Ac Nic H 15 (Eufodendrofan G) ONic iVal Ac / / / / 16 (Eufodendrofan F) OAc Ac iBu Ac Nic Ac Ac 17 (Eufodendrofan Q) OAc Pr iBu Ac Nic Ac Ac 18 (Eufodendrofan R) OAc Ac iBu Nic Nic Ac Ac 19 (Eufodendrofan S) OAc Ac iBu Ac Bz Ac Ac Ac–acetil; Bz–benzoil; iBu–izobutanoil; iVal–izovaleril; Nic–nikotinoil; Pr–propanoil Milka Jadranin Doktorska disertacija iii Neka od izolovanih jedinjenja su podvrgnuta testovima za ispitivanje bioloških aktivnosti. Sposobnost jedinjenja 1 – 7, 9, 10 i 16 – 19 da in vitro inhibiraju rast senzitivih i rezistentnih ćelijskih linija humanog karcinoma pluća (NCI-H460 i NCI-H460/R), karcinoma debelog creva (DLD1 i DLD-TxR) i glioblastoma (U87 i U87-TxR) procenjivana je pomoću sulforodamin B (SRB) testa. Kao kontrolna supstanca upotrebljen je paklitaksel. Od ukupno trinaest analiziranih jatrofana, jedinjenja 2, 6, 9, 10, 17 – 19 efikasnije od ostalih inhibiraju rast kako NCI-H460 tako i NCI-H460/R ćelija (IC50 4,7  16,2 μM, odnosno IC50 8,3  26,8 μM). Jedino je otpornost NCI- H460/R ćelija na jedinjenje 16 značajna. Jedinjenja 10 i 18 najefikasnije od ispitivanih jatrofana inhibiraju rast U87 ćelija (IC50 10,0, odnosno 8,6 μM), a postižu zadovoljavajuće dejstvo i na U87-TxR ćelijama (IC50 57,1, odnosno 28,5 μM). Sposobnost jatrofanskih diterpena 1, 2, 6 – 10 i 15 – 19 da inhibiraju dejstvo P- glikoproteina (P-gp) ispitana je na MDR ćelijskim linijama humanog karcinoma pluća (NCI-H460/R), karcinoma debelog creva (DLD1-TxR) i glioblastoma (U87-TxR). U tu svrhu korišćen je standardni test kojim se akumulacija rodamina 123 prati protočnom citometrijom. Utvrđeno je se da su među ispitivanim jatrofanima jedinjenja 6 i 9 najjači inhibitori P-gp-a u MDR ćelijama humanog karcinoma pluća i humanog karcinoma debelog creva, efikasnija od R(+)-verapamila koji je korišćen kao pozitivna kontrolna supstanca. Jedanaest ispitivanih jedinjenja (1, 2, 6 – 10 i 16 – 19), kao i pozitivne kontrolne supstance (verapamil i tarikvidar), pokazali su umerenu aktivnost ka P-gp pumpi u MDR ćelijskoj liniji humanog glioblastoma (U87-TxR). Jedino je jedinjenje 15 bilo potpuno neaktivno. Proučen je i senzitivišući uticaj jedinjenja 1, 2, 6, 8, 18 i 19 na MDR ćelijsku liniju humanog karcinoma pluća u kombinaciji sa paklitakselom, kao i uticaj jedinjenja 1 i 2 u kombinaciji sa doksorubicinom. Svi jatrofani su uticali na povećanje senzitivnosti rezistentnih NCI-H460/R ćelija na paklitaksel, odnosno doksorubicin, što ukazuje na sposobnost ovih jatrofana da smanje rezistenciju MDR ćelijskih linija prema paklitakselu ili doksorubicinu. Na osnovu izvršenih ispitivanja, ne postoji očigledna razlika u aktivnosti između jatrofana sa 6(17) egzo dvostrukom vezom (1, 2, 6 – 10, 15) i jatrofana sa 5 endo Milka Jadranin Doktorska disertacija iv dvostrukom vezom (16 – 19), što ukazuje da položaj dvostruke veze vrlo malo utiče na aktivnost i da mnogo veći uticaj na aktivnost ima stepen oksigenacije. Ispitivanje bioloških aktivnosti dve grupe egzo jatrofana koji imaju identičnu strukturu osim supstituenta vezanog za C-8, a to su 1, 6 – 8 i 2, 9 i 10, pokazalo je da se aktivnost jedinjenja znatno povećava ako je za C-8 vezana benzoiloksi grupa umesto acetoksi, izobutanoiloksi ili nikotinoiloksi grupe. Tako od jatrofana sa 6(17) egzo dvostrukom vezom, jedinjenja 6 i 9 sa C-8 benzoiloksi grupom najjače inhibiraju dejstvo P-gp-a i to naročito u MDR ćelijama humanog karcinoma debelog creva. Od ispitivanih jatrofana sa 5 endo dvostrukom vezom (16 – 19) najefikasniji inhibitor P-gp-a je jedinjenje 19 kod kojeg je za C-9 vezana benzoiloksi grupa. Vrsta supstituenta vezanog za C-3, tj. propanoiloksi grupa umesto izobutanoiloksi grupe, ne utiče na aktivnost jedinjenja 1 i 2 ili 6 i 9. Međutim, zamena acetoksi grupe na C-3 propanoiloksi grupom u potpunosti sprečava inhibitorska svojstva jedinjenja 17 u odnosu na jedinjenje 16. Slaba aktivnost jedinjenja 15 potvrđuje značaj tipa supstitucije na C-7, C-8 i C- 9. Nepostojanje supstituenata u ovim položajima veoma smanjuje MDR modulatornu aktivnost jedinjenja 15 u odnosu na aktivnost ostalih ispitivanih jedinjenja. U ovom radu izolovana su strukturno vrlo slična jedinjenja – sva imaju isti skelet, a glavne razlike potiču od vrste i broja supstituenata vezanih za prsten srednje veličine, i ispitana je njihova biološka aktivnost. Zahvaljujući tome, može se zaključiti da aktivnost eufodendrofana sa egzo, odnosno endo dvostrukom vezom zavisi od toga da li je za položaj C-8, odnosno C-9 vezana benzoiloksi grupa. Ključne reči: Euphorbia dendroides, Euphorbiaceae, Izolovanje, Karakterizacija, Jatrofani, Eufodendrofani AS, P-glikoprotein (P-gp), Višestruka reverzija na lekove (MDR), Tubulin. Naučna oblast: Hemija Uža naučna oblast: Organska hemija UDK broj: 547 Milka Jadranin Doctoral Dissertation v Isolation, characterization and biological activity of jatrophane diterpenes from Euphorbia dendroides L. ABSTRACT Genus Euphorbia, with more than 2,000 species of annual, biennial or perennial flowering plants belonging to the family Euphorbiaceae, is one of the largest and most diverse genera not only in the spurge family but in the entire plant kingdom. Plants of this genus are used in traditional medicine since ancient times. Phytochemical studies up to now have shown that the species of the genus Euphorbia produce a variety of secondary metabolites, including various terpenes (sesquiterpenes, diterpenes and triterpenes), steroids, cerebrosides, glycerols and phenolic compounds (phloracetophenones, flavonoids, tannins, coumarins). These compounds perform many different activities, including modulability of multidrug resistance, microtubule- interacting activity, antiproliferative, cytotoxic, antiviral, antimicrobial, anticancer, anti- inflammatory, tumor promoting and proinflammatory effects. Genus Euphorbia is a rich source of jatrophanes, macrocyclic diterpenes with basic trans-bicyclo[10.3.0]pentadecane structure, which are characterized by the existence of a flexible twelve membered ring. These are very functionalized compounds with various oxygenation stages; in plants are usually found in the form of polyhydroxylated diterpenes esterified with various acids (acetyl, propanoil, n-butanoyl, isobutanoyl, isovaleryl, angeloyl, tigloyl, benzoyl, nicotinoyl derivatives, etc...), and are sometimes called jatrophane polyesters. In this dissertation, jatrophane diterpenes from Euphorbia dendroides L. originating from Montenegro were investigated. The study comprises investigation of the aerial parts and of the milky latex. From the aerial parts of E. dendroides six new jatrophanes, namely euphodendrophanes A  F (1  5, and 16), were isolated and characterized. From the milky latex of E. dendroides, in addition to 1, 2, and 16, the constituents of the aerial parts, thirteen new jatrophanes, euphodendrophanes G  S (6  15, and 17  19), were isolated and characterized. Milka Jadranin Doctoral Dissertation vi All isolated jatrophanes have very similar structures. Jatrophanes 1  15 are differing only in the type, number and position of substituents, while jatrophanes 16  19 differ from them in that they contain endocyclic (Δ5) instead of exocyclic (Δ6(17)) double bond. Compounds 1  14 are penta- or hexaesterified jatrophane-type polyols containing a keto carbonyl group at C-14, an endocyclic 11 E and an exocyclic C- 6(17) double bond. Compound 15 is triesterified jatrophane-type polyol containing two keto carbonyl groups (at C-9 and C-14), an endocyclic 11 E and an exocyclic C-6(17) double bond. Compounds 16  19 are heptaesterified jatrophane-type polyols containing a ketone carbonyl group at C-14 and two endocyclic double bonds (Δ5 and Δ11). Jatrophanes isolated from the E. dendroides. 1–14 15 16–19 Isolated compound R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 1 (Euphodendrophane A) H Pr Ac iBu Ac Nic H 2 (Euphodendrophane B) H iBu Ac iBu Ac Nic H 3 (Euphodendrophane C) H Pr Ac iBu Ac Nic Ac 4 (Euphodendrophane D) H iBu Ac Ac Bz Ac H 5 (Euphodendrophane E) H Pr Ac iBu Bz Ac H 6 (Euphodendrophane H) H Pr Ac iBu Bz Nic H 7 (Euphodendrophane I) H Pr Ac iBu Nic Nic H 8 (Euphodendrophane J) H Pr Ac iBu iBu Nic H 9 (Euphodendrophane K) H iBu Ac iBu Bz Nic H 10 (Euphodendrophane L) H iBu Ac iBu Nic Nic H 11 (Euphodendrophane M) H iBu Ac Ac Nic Ac H 12 (Euphodendrophane N) H Ac Ac iBu Ac Nic H 13 (Euphodendrophane O) OAc iBu Ac iBu Ac Nic H 14 (Euphodendrophane P) OAc iBu Nic iBu Ac Nic H 15 (Euphodendrophane G) ONic iVal Ac / / / / 16 (Euphodendrophane F) OAc Ac iBu Ac Nic Ac Ac 17 (Euphodendrophane Q) OAc Pr iBu Ac Nic Ac Ac 18 (Euphodendrophane R) OAc Ac iBu Nic Nic Ac Ac 19 (Euphodendrophane S) OAc Ac iBu Ac Bz Ac Ac Ac–acetyl; Bz–benzoyl; iBu–isobutanoyl; iVal–isovaleryl; Nic–nicotinoyl; Pr–propanoyl Milka Jadranin Doctoral Dissertation vii The biological activities of the representative set of isolated jatrophanes have been assessed. Compounds 1 – 7, 9, 10, and 16 – 19 were evaluated for their capacity to inhibit in vitro growth of six human cancer cell lines: non-small cell lung carcinoma (NCI- H460 and NCI-H460/R), colorectal carcinoma (DLD-1 and DLD-TxR), and glioblastoma (U-87 and U87-TxR) using a sulforhodamine B (SRB) assay. Paclitaxel was used as a positive control. Compounds 2, 6, 9, 10, and 17  19 more efficient than the others inhibited the growth of both NCI-H460 and NCI-H460/R cells (IC50 4.7  16.2 and 8.3  26.8 μM, respectively). Only the sensitivity to 16 was decreased considerably against the NCI-H460/R cell line. Compounds 10 and 18 the most efficient of the tested jatrophanes inhibited the growth of U-87 cells (IC50 10.0 and 8.6 μM, respectively) and quite effectively inhibited the growth of U87-TxR cells (IC50 57.1 and 28.5 μM, respectively). Jatrophane diterpenoids 1, 2, 6 – 10, and 15 – 19 were tested for their P-gp inhibiting activity on three different human MDR cancer cell lines: NCI-H460/R, DLD1-TxR and U87-TxR. Standard functional assay with Rhodamine (Rho) 123 as a fluorescent substrate for P-gp was assessed by flow-cytometry. Among the investigated jatrophanes, compounds 6 i 9 were found to be the most powerful inhibitors of P-gp in NCI-H460/R and DLD-TxR cells. Their efficacy was significantly higher than R(+)- verapamil’s taken as a positive control. Tested compounds (1, 2, 6 – 10, and 16 – 19), along with positive controls (verapamil and tariquidar), were moderately active against P-gp pump in glioblastoma U87-TxR cell line. Only compound 15 was ineffective. The interaction and reversal potential of compounds 1, 2, 6, 8, 18 and 19 in simultaneous treatment with paclitaxel, and effects of 1 and 2 in simultaneous combination with doxorubicin were examined. All jatrophanes induced the increase in paclitaxel or doxorubicin sensitivity in resistant NCI-H460/R cell line. These results point to the potential of tested jatrophanes to reverse paclitaxel and doxorubicin resistance in the MDR cancer cell line used. Preliminary structure–activity relationship showed no obvious difference in the activity of jatrophanes with 6(17) exo- (1, 2, 6 – 10, 15), and those with 5 endo double bond (16 – 19), what suggests that double bond position make little change in activity, rather the oxygenation pattern governs the activity. Milka Jadranin Doctoral Dissertation viii The biological evaluation of two groups of exo jatrophanes with identical structures except for the substitution on C-8, namely 1, 6 – 8 and 2, 9 and 10, have shown dramatic increase in the activity upon substitution of either acetyloxy, isobutanoiloxy or nicotinoiloxy with benzoyloxy group at C-8. Within the set of jatrophanes with 6(17) exo double bond ((1, 2, 6 – 10, 15)), the compounds 6 and 9 with benzoyloxy group at C-8 were the most effective inhibitors of P-gp activity. Among tested jatrophanes with 5 endo double bond (16 – 19) the most powerful inhibitor of P-gp was 19 with benzoyloxy group at C-9. Substitution of propanoyloxy by isobutanoyloxy group at C-3 do not influence on inhibitory activities of compounds 1 i 2 or 6 i 9. However substitution of acetyloxy by propanoyloxy group at C-3 completely abolished inhibitory effect of 17 compared with 16. Poor activity of compound 15 confirms the relevance of the substitution pattern at C-7, C-8 and C-9. The lack of substitution at these positions dramatically decreased the MDR-modulatory activity. Within the set of jatrophanes isolated and tested in this work were closely related compounds based on structurally homogeneous skeleton with main differences in the substitution pattern on medium sized ring. Thus it can be stressed that the activity is strongly affected by the benzoyloxy group at the positions C-8 and C-9 for jatrophanes with exo- and endo double bond, respectively. Keywords: Euphorbia dendroides, Euphorbiaceae, Isolation, Characterization, Jatrophanes, Euphodendrophanes AS, P-glycoprotein (P-gp), Multidrug resistance (MDR), Tubulin. Academic Expertise: Chemistry Field of Academic Expertise: Organic Chemistry UDK number: 547 SADRŽAJ UVOD ........................................................................................................................................... 1 1. OPŠTI DEO .............................................................................................................................. 2 1.1. Familija Euphorbiaceae .................................................................................................... 3 1.1.1. Opšte karakteristike familije Euphorbiaceae ............................................................ 5 1.2. Rod Euphorbia .................................................................................................................. 5 1.3. Jatrofani izolovani iz familije Euphorbiaceae ................................................................... 7 1.3.1. Biosinteza diterpena iz vrsta familije Euphorbiaceae ............................................. 37 1.4. Primena vrsta iz familije Euphorbiaceae u tradicionalnoj medicini ............................... 39 1.5. Toksičnost vrsta iz familije Euphorbiaceae .................................................................... 40 1.6. Primena vrsta iz familije Euphorbiaceae u savremenoj medicini ................................... 41 1.7. Biološke aktivnosti jatrofana .......................................................................................... 43 1.7.1. Reverzija višestruke rezistencije na lekove ............................................................ 44 1.7.2. Interakcije sa tubulinom (antimitotsko dejstvo)...................................................... 47 1.7.3. Antiproliferativno dejstvo ....................................................................................... 49 1.7.4. Citotoksično dejstvo ............................................................................................... 50 1.7.5. Antivirusno dejstvo ................................................................................................. 50 1.7.6. Antimikrobno dejstvo ............................................................................................. 51 1.7.7. Antitumorsko dejstvo .............................................................................................. 51 1.7.8. Proinflamatorno i tumor promotorsko dejstvo ........................................................ 51 1.8. Biljna vrsta Euphorbia dendroides ................................................................................. 52 2. NAŠI RADOVI ....................................................................................................................... 54 2.1. Jatrofani iz Euphorbia dendroides .................................................................................. 55 2.1.1. 5α,8α-Diacetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β- propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan A) ...................................... 57 2.1.2. 5α,8α-Diacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan B) ............................................................... 65 2.1.3. 5α,8α,15β-Triacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan C) ...................................................... 67 2.1.4. 5α,7β,9α-Triacetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-3β-izobutanoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan D) ............................................................... 70 2.1.5. 5α,9α-Diacetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-3β-propa- noiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan E) ................................................ 70 2.1.6. 5α-Acetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoil- oksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan H) ......................... 73 2.1.7. 5α-Acetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-8α,9α-dinikotinoiloksi-3β- propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan I) i 5α-acetoksi-15β-hidroksi-7β,8α-diizobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan J) ....................................................... 76 2.1.8. 5α-Acetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-9α-nikoti- noiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan K) ............................................... 79 2.1.9. 5α-Acetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-8α,9α-dinikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan L) ................................................................ 79 2.1.10. 5α,7β,9α-Triacetoksi-15β-hidroksi-3β-izobutanoiloksi-8α-nikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan M) .............................................................. 82 2.1.11. 3β,5α,8α-Triacetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan N) ............................................................... 82 2.1.12. 2α,5α,8α-Triacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-9α-nikotinoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan O) ...................................................... 87 2.1.13. 2α,8α-Diacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-5α,9α-dinikotinoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan P) ...................................................... 87 2.1.14. 5α-Acetoksi-15β-hidroksi-3β-izovaleriloksi-2α-nikotinoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion (Eufodendrofan G) ............................................................................ 91 2.1.15. 2α,3β,8α,15β,17-Pentaacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan F) ............................................................................. 99 2.1.16. 2α,8α,15β,17-Tetraacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propa- noiloksijatrofa-5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan Q) .................................................. 104 2.1.17. 2α,3β,15β,17-Tetraacetoksi-8α,9α-dinikotinoiloksi-7β-izobutanoiloksija- trofa-5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan R) .................................................................. 107 2.1.18. 2α,3β,8β,15β,17-Pentaacetoksi-9α-benzoiloksi-7β-izobutanoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan S) ........................................................................... 107 2.2. Hemotaksonomski značaj izolovanih jedinjenja ........................................................... 111 2.3. Biološke aktivnosti izolovanih jedinjenja ..................................................................... 112 2.3.1. Uticaj jatrofana na inhibiciju rasta ćelija karcinoma pluća, debelog creva i glioblastoma, kao i normalnih ćelija ............................................................................... 112 2.3.2. Antimitotska aktivnost .......................................................................................... 115 2.3.3. Inhibicija P-glikoproteina ..................................................................................... 115 2.3.4. Kombinovano dejstvo jatrofana sa klasičnim hemioterapeuticima ...................... 118 2.4. Uticaj strukture ispitivanih jedinjenja na njihovu aktivnost ......................................... 120 3. EKSPERIMENTALNI DEO ................................................................................................. 123 3.1. Hemijsko ispitivanje ..................................................................................................... 124 3.1.1. Eksperimentalne tehnike, instrumenti i rastvarači ................................................ 124 3.1.2. Biljni materijal i postupak izolovanja jedinjenja .................................................. 126 3.1.3. Spektralni podaci izolovanih jedinjenja ................................................................ 129 3.2. Ispitivanje biološke aktivnosti ...................................................................................... 133 3.2.1. Lekovi ................................................................................................................... 133 3.2.2. Hemikalije ............................................................................................................. 134 3.2.3. Ispitivana jedinjenja .............................................................................................. 134 3.2.4. Ćelije i ćelijske kulture ......................................................................................... 134 3.2.5. Određivanje hemosenzitivnosti pomoću sulforodamina B (SRB) ........................ 135 3.2.6. Određivanje inhibicije aktivnosti P-gp-a testom akumulacije rodamina 123 ....... 136 3.2.7. Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) ................................... 137 3.2.8. Merenje citotoksičnosti kolorimetrijskim MTT testom ........................................ 137 3.2.9. Određivanje antimitotske aktivnosti ..................................................................... 138 LITERATURA .......................................................................................................................... 139 BIOGRAFIJA............................................................................................................................ 150 UVOD Ovaj rad predstavlja početak fitohemijskog proučavanja biljnih vrsta iz roda Euphorbia (familija Euphorbiaceae) na Odeljenju za instrumentalnu analizu Centra za hemiju IHTM i Hemijskog fakulteta. Predmet rada je izolovanje i hemijska karakterizacija jatrofanskih diterpena iz biljne vrste Euphorbia dendroides L., kao i in vitro ispitivanje mogućnosti reverzije višestruke rezistencije na lekove nekih od izolovanih jedinjenja. U OPŠTEM DELU ovog rada dati su osnovni podaci o familiji Euphorbiaceae i rodu Euphorbia, sa kratkim opštim karakteristikama i mogućnostima primene. Zatim su predstavljeni rezultati dosadašnjih fitohemijskih ispitivanja jatrofana ove familije i navedene su njihove najvažnije biološke aktivnosti. Na kraju je opisana ispitivana biljna vrsta. U delu NAŠI RADOVI prikazan je detaljan postupak određivanja strukture izolovanih jedinjenja primenom savremenih spektrometrijskih i spektroskopskih metoda: masene spektrometrije visokog razlaganja (HRESIMS), 1D i 2D NMR spektroskopije ( 1 H, 13 C, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC), UV i IR spektroskopije, a zatim su analizirani rezultati bioloških testova i dat je komentar o uticaju strukture ispitivanih jedinjenja na njihovu biološku aktivnost. U EKSPERIMENTALNOM DELU date su informacije o korišćenim eksperimentalnim tehnikama, instrumentima i rastvaračima, kao i o biljnom materijalu, predstavljeni su postupci izolovanja svih jedinjenja i navedeni njihovi spektralni podaci, a dati su i podaci koji se tiču ispitivanja bioloških aktivnosti. 1. OPŠTI DEO OPŠTI DEO 3 1.1. Familija Euphorbiaceae Familija mlečika u najširem smislu (Euphorbiaceae s.l.) jedna je od najvećih i najbrojnijih biljnih familija dikotiledonih skrivenosemenica koju čini pet podfamilija, 49 tribusa, 317 rodova i više od 8.000 vrsta.1 U Srbiji su spontano zastupljena samo dva roda, Euphorbia i Mercurialis. Na Balkanskom poluostrvu sreću se spontano ili supspontano i sledeći rodovi ove familije: Andrachne L., Chrozophora Neck. i Ricinus L.. 2 Familija Euphorbiaceae je veoma raznovrsna – njeni članovi su jednogodišnje ili višegodišnje zeljaste biljke, žbunovi i drveće sa listovima koji, po pravilu, imaju zalistke, kao i biljke kaktusolikog izgleda, sukulenti, često redukovanih listova, pri čemu osovina izdanka preuzima ulogu fotosinteze.2,3 Članovi ove familije su rasprostranjeni širom kopnenog dela zemljine kugle i rastu na skoro svim staništima, u veoma različitim klimatskim uslovima i na zemljištima različitog kvaliteta – neki od njih naseljavaju predele tropske klime i preživljavaju u toplim i suvim pustinjama, a neki drugi su stanovnici kišnih šuma. Nekoliko vrsta iz ove familije ima veliki ekonomski značaj i komercijalno se uzgaja, uključujući Ricinus communis L., čije seme je sirovina za izolovanje ricinusovog ulja, Manihot esculenta Crantz (manioka ili kasava), čiji se krtolasti koren koristi za dobijanje brašna, hleba i pića,4,5,6 Hevea brasiliensis Willd. Ex. A. Juss (kaučukovo drvo), čiji se lateks koristi kao sirovina za proizvodnju guma, Mallotus philippinensis Muell., koji se koristi za proizvodnju crvene boje, Vernicia fordii (Hemsl.) Airy Shaw (Syn. Aleurites fordii Hemsl.), iz čijeg semena se izoluje tungovo ulje. Neke vrste se gaje kao ukrasne biljke, npr. Euphorbia pulcherrima Willd., Euphorbia milii Des Moul i Euphorbia obesa, a mnoge vrste, kao što su Euphorbia esula L., Euphorbia maculata L. i Triadica sebifera, su korovi koji rastu na obradivom zemljištu i predstavljaju opasnost za zdravlje ljudi i stoke. Vrste familije Euphorbiaceae se koriste i za proizvodnju biodizela, između ostalih Euphorbia tirucalli,7,8 Euphorbia lathyris, 7 Jatropha curcas, 9,10,11,12 M. esculenta 13 i R. communis. 14,15 U mnogo manjoj meri se koriste za ogrev, kao sirovine u zanatstvu, i za pošumljavanje zemljišta.16 OPŠTI DEO 4 Pojedine vrste mlečika, poput E. esula, služe kao hrana za larve nekih Lepidoptera (leptiri i moljci), kao što su Hyles euphorbiae i Hyles tithymali. S obzirom na široku rasprostranjenost, veliku raznovrsnost i brojnost, vrste familije Euphorbiaceae su veoma pogodan materijal za naučno-istraživački rad. Slika 1. Odabrani članovi familije Euphorbiaceae: Ricinus. communis,17 Vernica fordii,18 Hevea brasiliensis, 19 Manihot esculenta, 20 Euphorbia obesa, 21 Euphorbia pulcherrima, 22 Euphorbia milii, 23 Euphorbia esula, 24 Euphorbia maculata, 25 Triadica sebifera. 26 OPŠTI DEO 5 1.1.1. Opšte karakteristike familije Euphorbiaceae Listovi Euphorbiaceae su većinom naizmenični, ređe naspramni sa sporednim listićima. Uglavnom su jednostavni, ali na spojevima sa stablom su uvek zrakasti, nikad perasti. Sporedni listići se javljaju u obliku dlačica, žlezda ili bodlji, a neke vrste (sukulente) ih ni ne poseduju. Građa cveta i cvasti je vrlo raznovrsna. Cvasti su većinom složene, ređe proste, sa malo cvetova ili su cvetovi sakupljeni u zajedničkom čašicolikom omotaču, čime se obrazuje specifična cvast – cijatijum. Retki su dvopolni cvetovi sa dvojnim cvetnim omotačem; cvetovi su uglavnom jednopolni, a biljke jednodome ili dvodome. Cvetni omotač ili uopšte nije razvijen ili ga čine i čašični i krunični listići ili samo čašični listići koji se oblikom i veličinom razlikuju kod muških i ženskih cvetova. Broj prašnika je različit, od jednog do mnogo, često koliko i listića cvetnog omotača. Filamenti su slobodni ili srasli. Cvetovi su tučkasti sa staminodijama ili bez njih. Plodnik ima tri oplodna listića; većinom je trook, ređe dvook (retko jednook ili višeok) sa najčešće jednim, retko dva anatropna viseća semena zametka u svakom okcu. Stubići su slobodni ili srasli, a većinom su na vrhu razdvojeni na dva režnja (retko na više). Plod je najčešće čahura koja se raspada na tri dela, a ponekad može biti bobičast ili koštuničast. Semena obično ima koliko i semenih zametaka.2 1.2. Rod Euphorbia Euphorbia je rod jednogodišnjih, dvogodišnjih ili višegodišnjih cvetnica koje su članovi familije Euphorbiaceae (podfamilija Euphorbioideae, tribus Euphorbieae, subtribus Euphorbiinae Griseb.). Sa više od 2.000 vrsta jedan je od najvećih i najraznovrsnijih rodova ne samo u svojoj familiji, već u celom biljnom carstvu.27 Vrste koje su članovi roda Euphorbia najčešće rastu u tropskim i suptropskim predelima, ali se sreću i u umerenoj zoni. Indikatori su suve klime. Pored vrsta sa vrlo širokim, postoji i znatan broj onih sa ograničenim arealom rasprostranjenosti, od kojih se neke nalaze samo na pojedinim ostrvima kao endemiti. 2 Morfološki su vrlo raznolike – mogu biti veliki pustinjski kaktusoliki sukulenti, drveće, žbunovi, ali i male zeljaste biljke.3 Vrste ovog roda odlikuju se i nekim OPŠTI DEO 6 zajedničkim morfološkim osobinama: obično su bledo zelene boje i imaju specifičnu građu cveta i cvasti. Cvetovi su jednopolni – jedan ženski i više muških cvetova sakupljeni su u zajednički omotač i grade specifičnu složenu cvast – cijatijum. Svaki cijatijum je izgrađen od jednog središnjeg ženskog cveta (trokarpelni tučak na dugačkoj dršci) koji je savijen naniže i opkoljen sa više prašnika, pri čemu svaki pojedinačni prašnik predstavlja muški cvet. Cela ova cvast obavijena je zajedničkim peharastim omotačem. Omotač na gornjoj ivici ima pet uspravnih ili unutrasavijenih zubaca (brakteje), koji služe kao krunični listići i između kojih se nalazi 4 – 5 poprečno jajastih ili ovalnih ili polumesečastih žlezda (nektarije). Listovi su uglavnom naizmenično, ređe naspramno, raspoređeni na stabljici; obično su prosti sa zaliscima i celi.2 U stablu i listovima se nalaze mlečne cevi u kojima se, u velikoj količini, nalazi mlečni sok – lateks koji je bogat terpenima. 3 Lateks je verovatno nastao kako bi se biljke odbranile od biljojeda. Prema tome, ima odbrambenu ulogu – otrovan je za biljojede, odbija insekte, a deluje i kao iscelitelj rana biljaka koje ga luče. Kod većine vrsta je beo ili bezbojan, ali može biti i žute boje (Euphorbia abdelkuri). Iz biljke ističe kada se ona mehanički ošteti. Kada lateks dođe u dodir sa vazduhom, posle nekoliko minuta očvršćava i više nije rastvoran u vodi. Hemijski sastav lateksa (diterpenski i/ili triterpenski estri) se razlikuje od vrste do vrste i od njega zavisi koliko je pojedina vrsta otrovna. Neke komponente lateksa deluju kao iritanti za kožu i sluzokožu, i mogu uzrokovati veoma bolna zapaljenja, pa u radu sa njima treba biti veoma obazriv. OPŠTI DEO 7 1.3. Jatrofani izolovani iz familije Euphorbiaceae Kako bi se prilagodile raznolikim životnim uslovima i opstale, vrste iz familije Euphorbiaceae proizvode veoma raznovrsne sekundarne metabolite. Iz korena, nadzemnih delova, drvenastih stabala, kore, mlečnih cevi, lateksa, listova, semena, kao i celih biljaka izolovani su različiti terpeni (seskviterpeni, diterpeni i triterpeni), steroidi, cerebrozidi, gliceroli i fenolna jedinjenja (floracetofenoni, flavonoidi, tanini, kumarini). 28 Glavni sekundarni metaboliti diterpenskog tipa zastupljeni u vrstama familije Euphorbiaceae su „niži“ diterpeni različitih skeletnih tipova, kao što su kazbani, jatrofani, abeo-jatrofani, latirani, mirsinani, ciklomirsinani, jatrofolani, krotofolani, ramnofolani, dafnani, tiglijani, ingenani, segetani, paralijani, pepluani, euforaktini, mada ove vrste proizvode i nespecifične „više“ diterpene poput bicikličnih labdana i klerodana, tricikličnih abijetana, izopimarana i pimarana, i tetracikličnih bajerana, atisana i kaurana. 28,29 „Niži“ diterpeni se, osim u vrstama iz familije Euphorbiaceae, mogu naći i u vrstama iz familije Thymeleaceae, dok se „viši“ diterpeni nalaze u mnogim biljnim familijama. 29 Triterpenski alkoholi izolovani iz lateksa vrsta ove familije se koriste kao hemotaksonomski markeri. 30,31 Euforbijasteroid je prvi diterpen izolovan iz vrste koja je član familije Euphorbiaceae (rod Euphorbia) i dobijen je 1937. iz ulja semena E. lathyris. 32 Njegova struktura, sa tricikličnim latiranskim skeletom, određena je 1970.33,34 Kasnije je iz ovog roda izolovan veliki broj diterpena čije su strukture veoma raznovrsne, što je posledica raznolikosti njihovih ugljeničnih skeleta, prirode supstituenata (estarske, olefinske, keto, laktonske i druge grupe), stepena supstituisanosti, ali i stereohemijske kompleksnosti. Vrste iz roda Euphorbia su izuzetno bogat izvor jatrofana, makrocikličnih diterpena osnovne trans-biciklo[10.3.0]pentadekanske strukture (Slika 2), za koje je karakteristično postojanje veoma fleksibilnog dvanaestočlanog prstena.35 To su veoma funkcionalizovana, različito oksigenovana jedinjenja; u biljkama se obično nalaze u obliku polihidroksilovanih diterpena supstituisanih različitim acil grupama (acetil, propanoil, n-butanoil, izobutanoil, izovaleril, angeloil, tigloil, benzoil, nikotinoil, itd.), zbog čega su poznati i pod nazivom jatrofanski poliestri. OPŠTI DEO 8 Slika 2. Osnovni strukturni skelet jatrofana. Obimno fitohemijsko istraživanje familije Euphorbiaceae rezultiralo je otkrićem velikog broja strukturno jedinstvenih makrocikličnih diterpena jatrofanskog tipa. Na osnovu dostupnih literaturnih podataka, do sada je izolovano 288 različitih jatrofana i to uglavnom iz vrsta roda Euphorbia (284), dok je iz vrsta koje su članovi drugih rodova familije Euphorbiaceae (rod Jatropha) izolovano samo četiri jatrofana. Ovi jatrofani su, prema nekim zajedničkim strukturnim karakteristikama, razvrstani u 16 grupa (Tabele 1  16). U tabelama koje slede koriste se sledeće skraćenice: Me, metil O O Ac, acetil Pr, propanoil O O O Bu, butanoil iBu, izobutanoil MeBu, 2-metilbutanoil O O O iVal, izovaleril Ang, angeloil Tig, tigloil O OOH O N O Hydrp, 3-hidroperoksi-2- metilen-butanoil Bz, benzoil Nic, nikotinoil O O O O O O Cinn, cinamoil PhOAc, fenoksiacetil BzOAc, benzoiloksiacetil A B 1 3 5 8 9 14 15 OPŠTI DEO 9 Tabela 1. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom. OR7 OR5 R2O R8O R4O R1 H R3O OR6 OR7 OR5 R2O R8O R4O R1 R3O OR6 1-14 15-19 Broj Naziv jedinjenja R1 OR2 OR3 OR4 OR5 OR6 OR7 R8 20-Me Biljna vrsta i ref 1 14-acetoksi-7-izobutanoiloksi-5,8-bis(2-metilbutanoil- oksi)jatrofa-6(17),11E-dien-3,9,15-triol H-α H-β MeBu-α iBu-α MeBu-α H-α Ac-α H β E. terracina 36 2 14-acetoksi-5,7-diizobutanoiloksi-8-(2-metilbutanoil- oksi)jatrofa-6(17),11E-dien-3,9,15-triol H-α H-β iBu-α iBu-β MeBu-α H-α Ac-α H β E. terracina 36 3 14-acetoksi-5,7-diizobutanoiloksi-8-(2-metilbutanoil- oksi)jatrofa-6(17),11E-dien-3,9,15-triol H-α H-β iBu-α iBu-β MeBu-β H-α Ac-β H β E. segetalis 37 4 2,5,14-triacetoksijatrofa-3-benzoiloksi-7-izobutanoil- oksi-9-nikotinoiloksi-6(17),11E-dien-8,15-diol OAc-α Bz-β Ac-α iBu-β H-α Nic-α Ac-β H β E. peplus 38 5 2,5,7,8,9,14-heksaacetoksijatrofa-3-benzoiloksi-6(17), 11E-dien-15-ol OAc-α Bz-β Ac-α Ac-β Ac-α Ac-α Ac-β H β E. peplus 38 6 2,5,9,14-tetraacetoksi-3-benzoiloksi-7-izobutanoiloksi- jatrofa-6(17),11E-dien-8,15-diol OAc-α Bz-β Ac-α iBu-β H-α Ac-α Ac-β H β E. peplus 38 7 2,5,7,14-tetraacetoksi-3-benzoiloksi-9-nikotinoiloksi- jatrofa-6(17),11E-dien-8,15-diol OAc-α Bz-β Ac-α Ac-β H-α Nic-α Ac-β H β E. peplus 38 8 2,5,7,9,14-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-8,15-diol OAc-α Bz-β Ac-α Ac-β H-α Ac-α Ac-β H β E. peplus 38,39 9 pepluanin A OAc-α Bz-β Ac-α Ac-β Ac-α Nic-α Ac-β H β E. peplus 40 OPŠTI DEO 10 Tabela 1. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom (nastavak). 10 pepluanin B OAc-α Bz-β Ac-α MeBu-β H-α Nic-α Ac-β H β E. peplus 40 11 pepluanin C OAc-α Bz-β iBu-α Bz-β Ac-α Ac-α Ac-β H β E. peplus 40 12 eufopeplin A OAc-α Bz-β Ac-α iBu-β Ac-α Nic-α Ac-β H β E. peplus 41 13 7,8,9,15-tetraacetoksi-3-benzoiloksi-2-izobutanoiloksi- jatrofa-6(17),11E-dien-5,14-diol OiBu-α Bz-β H-α Ac-β Ac-α Ac-α H-β Ac α E. sororia 42 14 3,5,8,9-tetraacetoksi-14-benzoiloksi-2,7-diizobutanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-15-ol OiBu-α Ac-β Ac-α iBu-β Ac-α Ac-α Bz-β H α E. sororia 42 15 2,3,8,9-tetraacetoksi-14-benzoiloksi-7-izobutanoiloksi- 5-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-15-ola OAc Ac Pr iBu Ac Ac Bz H / E. sororia 43 16 2,3,8,9-tetraacetoksi-14-benzoiloksi-5-izobutanoiloksi- 7-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-15-ola OAc Ac iBu Pr Ac Ac Bz H / E. sororia 43 17 2,3,8,9,14-pentaacetoksi-5-benzoiloksi-7-izobutanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-15-ola OAc Ac Bz iBu Ac Ac Ac H / E. sororia 43 18 2,3,8,9-tetraacetoksi-5,14-dibenzoiloksi-7-izobutanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-15-ola OAc Ac Bz iBu Ac Ac Bz H / E. sororia 43 19 2,3,8,9-tetraacetoksi-14-benzoiloksi-5,7-diizobutanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-15-ola OAc Ac iBu iBu Ac Ac Bz H / E. sororia 43 a Relativna konfiguracija jedinjenja nije određena. OPŠTI DEO 11 Tabela 2. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 9. OR4 R3 R1O HO R2 H AcO O 20-29 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 20-Me Biljna vrsta i referenca 20 5,7,8,14-tetraacetoksi-3-benzoiloksi-15- hidroksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc OAc Ac-α α E. semiperfoliata 44 21 5,7,14-triacetoksi-3-benzoiloksi-15-hidroksi-8- izobutanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc OiBu Ac-α α E. semiperfoliata 44 22 5,7-diacetoksi-3-benzoiloksi-8,14,15-tri- hidroksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc OH H-α α E. semiperfoliata 44 23 5,7,8-triacetoksi-3-benzoiloksi-14,15-dihi- droksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc OAc H-α α E. semiperfoliata 44 24 5,7,14-triacetoksi-3-benzoiloksi-8,15-dihi- droksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc OH Ac-α α E. semiperfoliata 44 25 5,7,14-triacetoksi-3-benzoiloksi-15-hi- droksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc H Ac-β α E. semiperfoliata 44 26 gujonianin E Bz H H Ac-α α E. guyoniana 45 27 5,7,14-triacetoksi-3-benzoiloksi-15-hi- droksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on Bz OAc H Ac-β α E. hyberna subsp. insularis 46 E. semiperfoliata 47 28 tukejanol A Ac OMeBu OAc Bz-β β E. tuckeyana 48 29 tukejanol B Ac iBu OAc Bz-β β E. tuckeyana 48 OPŠTI DEO 12 Tabela 3. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14. O R5 R2O R7O R4 R1 H OR3 OR6 O R5 R1 R2O R4 H OR3 OAc R6O O OAc HO HO OiVal R1 OMeBu OAc 30-94 95-100 101, 102 O OAc R1O AcO OR2 iBuO H OAc OAc O OR2 OAc AcO OBz HO OR1 OAcH 103-106 107-109 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 20-Me Biljna vrsta i ref 30 3,9,15-trihidroksi-5,7,8-triizobutanoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on H H-β iBu-α OiBu OiBu-β H H β E. segetalis 37 31 3,9,15-trihidroksi-7-izobutanoiloksi-5,8-bis(2-metilbu- tanoiloksi)jatrofa-6(17),11E-dien-14-on H H-β MeBu-α OiBu OMeBu-β H H β E. segetalis 37 32 3,9,15-trihidroksi-5,7-diizobutanoiloksi-8-(2-metilbu- tanoiloksi)jatrofa-6(17),11E-dien-14-on H H-β iBu-α OiBu OMeBu-β H H β E. segetalis 37 33 1,5,8,9-tetraacetoksi-2-benzoiloksiacetoksi-7-izobuta- noiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on OAc BzOAc-β Ac-α OiBu OAc-β Ac-α H β E. segetalis 37 34 5-acetoksi-3-benzoiloksi-9-cinamoiloksi-15-hidroksi- jatrofa-6(17),11E-dien-14-on H Bz-β Ac-α H H Cinn-α H β E. segetalis 37 OPŠTI DEO 13 Tabela 3. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14 (nastavak). 35 5-acetoksi-3,9-dicinamoiloksi-15-hidroksijatrofa- 6(17),11E-dien-14-on H Cinn-β Ac-α H H Cinn-α H β E. segetalis 37 36 3,9,15-trihidroksi-5,7,8-tris(2-metilbutanoiloksi)jatrofa- 6(17),11-dien-14-on H H MeBu-α OMeBu OMeBu-α H H β E. terracina 36 37 3,9,15-trihidroksi-5,7,8-triizobutanoiloksijatrofa- 6(17),11-dien-14-on H H iBu-α OiBu OiBu-α H H β E. terracina 36 38 3,9,15-trihidroksi-7-izobutanoiloksi-5,8-bis(2-metilbu- tanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on H H MeBu-α OiBu OMeBu-α H H β E. terracina 36 39 3,9,15-trihidroksi-5,7-diizobutanoiloksi-8-(2-metilbu- tanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on H H iBu-α OiBu OMeBu-α H H β E. terracina 36 40 pepluanin D H Ac-β Ac-α OAc H Ac-α Ac β E. peplus 40 41 pepluanin E OAc Bz-β Ac-α OiBu OH-α Nic-α H β E. peplus 40 42 2,3,5,8,9,15-heksaacetoksi-7-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on OAc Ac-β Ac-α OBz OAc-α Ac-α Ac β E. turczaninowii 49 43 3,5,8,9,15-pentaacetoksi-7-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on-e H Ac-β Ac-α OBz OAc-α Ac-α Ac β E. turczaninowii 49 44 3,5,7,8,9,15-heksaacetoksi-2-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on OBz Ac-β Ac-α OAc OAc-α Ac-α Ac β E. turczaninowii 49 45 3-acetoksi-5,9,15-trihidroksi-7-izobutanoiloksi-8-(2- metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11E-dien-14-on H Ac-β H-α OiBu OMeBu-α H H β E. terracina 36 46 5,7,8,9,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-6(17),11E- dien-14-on H Bz-β Ac-α OAc OAc-α Ac-α Ac β E. mongolica 50 E. bungei 51 47 7,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-2,5-bis(2-metilbutanoil- oksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu H-β MeBu-α OAc OAc-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 48 7,8,9-triacetoksi-3,7,8,9,15-pentahidroksi-2-izobutanoil- oksi-5-(2-metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OiBu H-β MeBu-α OAc OAc-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 49 7,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-2-nikotinoiloksi-5- (2-metilbutanoiloksi)jatropha-6(17),11-dien-14-on ONic H-β MeBu-α OAc OAc-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 OPŠTI DEO 14 Tabela 3. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14 (nastavak). 50 8,9-diacetoksi-3,15-dihidroksi-7-izobutanoiloksi-2,5- bis(2-metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu H-β MeBu-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 51 2,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-7-izobutanoiloksi- 5-(2-metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OAc H-β MeBu-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 52 7,9-diacetoksi-8-benzoiloksi-5,8,15-trihidroksi-2,3- bis(2-metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu MeBu-β H-α OAc OBz-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 53 8,9-diacetoksi-5,15-dihidroksi-7-izobutanoiloksi-2,3- -bis(2-metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu MeBu-β H-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. obtusifolia 52 54 2,3,8,9-tetraacetoksi-15-hidroksi-5,7-diizobutanoil- oksijatrofa-6(17),11-dien-14-on OAc Ac-β iBu-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. terracina 36 55 2,3,8,9-tetraacetoksi-5-benzoiloksi-15-hidroksi-7- izobutanoiloksijatrofa-6(17),11-dien-14-on OAc Ac-β Bz-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. terracina 36 56 2,5,8,9-tetraacetoksi-3-(benzoiloksiacetoksi)-15-hidro- ksi-7-izobutanoiloksijatrofa-6(17),11-dien-14-on OAc BzOAc-β Ac-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. terracina 36 57 eufodendroidin A OAc H-β iBu-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 58 eufodendroidin B OAc H-β MeBu-α OBz OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 59 eufodendroidin C OAc H-β Nic-α OBz OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 60 eufodendroidin D H H-β iBu-α OBz OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 61 eufodendroidin E H Ac-β iBu-α OBz OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 62 eufodendroidin F OH Ac-β iBu-α OBz OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 63 eufodendroidin G OAc Nic-β Ac-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 64 eufodendroidin H H Bz-β Ac-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53 OPŠTI DEO 15 Tabela 3. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14 (nastavak). 65 eufodendroidin I ONic Ac-β iBu-α OAc OAc-α Nic-α Ac β E. dendroides 53 66 2,5,8,9-tetraacetoksi-3-(fenoksiacetoksi)-15-hidroksi- 7-izobutanoiloksijatrofa-6(17),11-dien-14-on OAc PhOAc-β Ac-α OiBu OAc-α Ac-α H β E. dendroides 53,54 67 altotibetin A H Ac-β Bz-α OAc OAc-α Ac-α Ac β E. mongolica 50 E. altotibetic 55 68 altotibetin B H Ac-β Bz-α OBu OAc-α Ac-α Ac β E. altotibetic 55 69 altotibetin C OH Ac-β Bz-α OAc OAc-α Ac-α Ac β E. altotibetic 55 70 altotibetin D OH Ac-β Bz-α OBu OAc-α Ac-α Ac β E. altotibetic 55 71 eufotukejanol OBz Ac-β Ac-α OBz OAc-α Ac-α Ac β E. tuckeyana 48 72 eufoharakin A OH Bz-β Ac-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 73 eufoharakin B OH Bz-β Ac-α H OAc-α Nic-α H β E. characias 56 74 eufoharakin C OH Bz-β Ac-α H OAc-α Bz-α H β E. characias 56 75 eufoharakin D OH MeBu-β Ac-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 76 eufoharakin E H Bz-β Ac-α H OAc-α Nic-α H β E. characias 56 77 eufoharakin F H Bz-β Ac-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 78 eufoharakin G H iBu-β Ac-α H OAc-α Nic-α H β E. characias 56 79 eufoharakin H H iBu-β Ac-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 OPŠTI DEO 16 Tabela 3. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14 (nastavak). 80 eufoharakin I H Pr-β Ac-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 81 eufoharakin J H Ac-β Ac-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 82 eufoharakin K H iBu-β H-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 83 eufoharakin L OH Bz-β H-α H OAc-α Nic-α Ac β E. characias 56 84 esulatin K ONic Ac-β Ac-α OAc-β H Nic-α Ac α E. esula 57 85 esulatin L OAc Ac-β Ac-α OiBu-β H Nic-α Ac α E. esula 57 86 esulatin M H Ac-β Ac-α OiBu-β H Nic-α Ac α E. esula 57 87 esulatin D OAc Ac-β Ac-α OAc-β H Ac-α Ac α E. esula 58 88 esulatin F OAc Ac-β Ac-α OiBu-β OAc-α Ac-α Ac α E. esula 59 89 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-9-nikotinoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on OAc Ac-β Ac-α OAc-β H Nic-α Ac α E. peplus 38,39,40 E. esula 57 90 3,5,7,15-tetraacetoksi-9-nikotinoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on H Ac-β Ac-α OAc-β H Nic-α Ac α E. peplus 60 91 2,5,8-triacetoksi-3-benzoiloksi-15-hidroksi-7-izobuta- noiloksi-9-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on OAc Bz-β Ac-α OiBu-β OAc-α Nic-α H α E. peplus 61 92 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-9-nikotinoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-14-on OAc Ac-β Ac-α OAc-β H Nic-α Ac β E. peplus 61 93 gujonianin C ONic Ac-α Bz-β OAc-α OAc-β Ac-α Ac β E. guyoniana 62 94 gujonianin D H Bz-α Ac-β H H Ac-α Ac β E. guyoniana 62 OPŠTI DEO 17 Tabela 3. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14 (nastavak). 95 gujonianin A ONic Ac-α Bz-β OAc-α OAc-β H / β E. guyoniana 63 96 7,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-7-izovaleriloksi-5-(2- metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OiVal H-α MeBu-β OAc-α OAc-β H / β E. obtusifolia 64 97 8,9-diacetoksi-5,15-dihidroksi-7-izovaleriloksi-2,3-bis(2- metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu MeBu-α H-β OiVal-α OAc-β H / β E. obtusifolia 64 98 7,9-diacetoksi-8-benzoiloksi-5,15-dihidroksi-3-(2-metil- butanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu MeBu-α H-β OAc-α OBz-β H / β E. obtusifolia 64 99 7,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-5-(2-metilbutanoiloksi)- 2-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11-dien-14-on ONic H-α MeBu-β OAc-α OAc-β H / β E. obtusifolia 64 100 7,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-2,5-bis(2-metilbutanoil- oksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-on OMeBu H-α MeBu-β OAc-α OAc-β H / β E. obtusifolia 64 101 7,8,9-triacetoksi-3,15-dihidroksi-7-izovaleriloksi-5-(2- metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-ona OAc / / / / / / / E. obtusifolia 64 102 8,9-diacetoksi-3,15-dihidroksi-7-izovaleriloksi-2,5-bis(2- metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-dien-14-ona OMeBu / / / / / / / E. obtusifolia 64 103 5,7,8,9,15-pentaacetoksi-2-izobutanoiloksi-3-nikotinoil- oksijatrofa-6(17),11-dien-14-on Nic Ac / / / / / / E. sororia 42 104 5,8,9,15-tetraacetoksi-2,7-diizobutanoiloksi-3-nikotinoil- oksijatrofa-6(17),11-dien-14-on Nic iBu / / / / / / E. sororia 42 105 5,8,9,15-tetraacetoksi-2,7-diizobutanoiloksi-3-benzoil- oksijatrofa-6(17),11-dien-14-on Bz iBu / / / / / / E. sororia 42 106 5,7,8,9,15-pentaacetoksi-2-izobutanoiloksi-3-benzoil- oksijatrofa-6(17),11-dien-14-on Bz Ac / / / / / / E. sororia 42 107 3,5,9,15-tetraacetoksi-7,8-dibenzoiloksi-2-hidroksijatrofa- 6(17),11-dien-14-ona Ac Bz / / / / / / E. sieboldiana 65 108 3,5,8,9,15-pentaacetoksi-7-benzoiloksi-2-hidroksijatrofa- 6(17),11-dien-14-ona Ac Ac / / / / / / E. sieboldiana 65 109 sieboldanin A a Bz Ac / / / / / / E. sieboldiana 65 a Relativna konfiguracija jedinjenja nije određena. OPŠTI DEO 18 Tabela 4. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom, karbonilnom grupom u položaju 14 i hidroksilnom grupom u položaju 13. O OH OR4 R1O R6O OR3 H OR2 OR5 110-121 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 R5 R6 Biljna vrsta i referenca 110 amigdaloidin A Ac Ac Ang Ang Nic H E. amygdaloides 66 111 amigdaloidin B Ang H Ang Ac Nic H E. amygdaloides 66 112 amigdaloidin C Hydrp H Ang Ac Nic H E. amygdaloides 66 113 amigdaloidin D Ang H Ang Ac Ac H E. amygdaloides 66 114 amigdaloidin E Ang H Hydrp Ac Ac H E. amygdaloides 66 115 amigdaloidin F Ang H Hydrp Ac Ac Ac E. amygdaloides 66 116 amigdaloidin G Ang Ac H Hydrp Ac H E. amygdaloides 66 117 amigdaloidin H Hydrp Ac H Ang Ac H E. amygdaloides 66 118 amigdaloidin I Ac Hydrp H Ang Ac H E. amygdaloides 66 119 amigdaloidin J Hydrp Ac Ang H Ac H E. amygdaloides 66 120 amigdaloidin K Ac Hydrp Ang H Ac H E. amygdaloides 66 121 amigdaloidin L Ang Ac Hydrp H Ac H E. amygdaloides 66 OPŠTI DEO 19 Tabela 5. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položajima 9 (ili 8) i 14. O R6 R1 R3O R7O R5 R2 H OR4 O O AcO AcO H OAc O AcO O R3 R1O AcO R2 H OAc O O O AcO AcO OBz HO H OBz OH O R1O AcO H OH O 122-157 158 159-161 162 163-165 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 20-Me Biljna vrsta i referenca 122 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OiBu-α Ac α E. semiperfoliata 44 123 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-tigloiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OTig-α Ac α E. paralias 67 E. semiperfoliata 44 124 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OBz-α Ac α E. semiperfoliata 44 125 3,5,7,8,15-pentaacetoksi-2-nikotinoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me ONic Ac-β Ac-α OAc-β OAc-α Ac α E. semiperfoliata 44 126 2,3,5,8,15-pentaacetoksi-7-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OBz-β OBz-α Ac α E. semiperfoliata 44 127 2,3,5,8,15-pentaacetoksi-7-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OiBu-β OAc-α Ac α E. semiperfoliata 44 E. turczaninowii 49 128 3,5,7,8,15-pentaacetoksi-2-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me OBz Ac-β Ac-α OAc-β OAc-α Ac α E. semiperfoliata 44 129 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-hidroksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OH-α Ac α E. semiperfoliata 44 130 2,3,5,15-tetraacetoksi-7-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OiBu-β H Ac α E. semiperfoliata 44 OPŠTI DEO 20 Tabela 5. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položajima 9 (ili 8) i 14 (nastavak). 131 esulatin B Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β H Ac α E. semiperfoliata 44 E. esula 68 132 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OiBu-α Ac α E. paralias 69 133 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-angeloiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OAng-α Ac α E. paralias 69 134 3,5,7,15-tetraacetoksi-8-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Ac-β Ac-α OAc-β OiBu-α Ac α E. paralias 69 135 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-(2-metilbutanoiloksi)- jatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OMeBu-α Ac α E. paralias 69 136 2,3,5,7,15-pentaacetoksi-8-benzoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OBz-α Ac α E. paralias 69 137 2,3,5,7,8,15-heksaacetoksijatrofa-6(17),11E- dien-9,14-dion (SJ23B) Me OAc Ac-β Ac-α OAc-β OAc-α Ac α E. paralias 69 E. hyberna 46 138 3,5,7,8,15-pentaacetoksijatrofa-6(17),11E-dien- 9,14-dion Me H Ac-β Ac-α OAc-β OAc-α Ac α E. turczaninowii 49 139 3,5,8,15-tetraacetoksi-7-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11-dien-9,14-dion Me H Ac-β Ac-α OiBu-β OAc-α Ac β E. terracina 36 140 3,7,8,15-tetraacetoksi-5-benzoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Ac-β Bz-α OAc-β OAc-α Ac β E. bungei 51 141 3,8,15-triacetoksi-5,7-dibenzoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Ac-β Bz-α OBz-β OAc-α Ac β E. bungei 51 142 5,7,8-triacetoksi-3-benzoiloksi-15-hidroksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Bz-β Ac-α OAc-β OAc-α H β E. mongolica 50 143 5,8,15-triacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-6(17),11E- dien-9,14-dion H Me Bz-β Ac-α H OAc-α Ac β E. hyberna 70 144 3,5,8,15-tetraacetoksi-7-benzoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me H Ac-β Ac-α OBz-β OAc-α Ac β E. turczaninowii 49 145 eufopubescenol Me H Bz-α Ac-α H OAc-α Ac β E. pubescens 71 OPŠTI DEO 21 Tabela 5. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položajima 9 (ili 8) i 14 (nastavak). 146 pubescenol Me H Bz-β Ac-α H OAc-β Ac α E. pubescens 72 147 5,6-diacetoksi-3-benzoiloksi-15-hidroksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion Me H Bz-β Ac-α OAc-β H H β E. mongolica 73 148 5,7-diacetoksi-3-benzoiloksi-15-hidroksi-6-propanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Bz-β Ac-α OPr-β OAc-α H β E. mongolica 73 149 5,7-diacetoksi-3-benzoiloksi-6-butanoiloksi-15-hi- droksijatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Bz-β Ac-α OBu-β OAc-α H β E. mongolica 73 150 5,7-diacetoksi-3-benzoiloksi-6-izobutanoiloksi-15- hidroksijatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion Me H Bz-β Ac-α OiBu-β OAc-α H β E. mongolica 73 151 esulatin I Me OBz Ac-β Ac-α OAc-β H Ac α E. esula 57 152 esulatin J Me OBz Ac-β Ac-α OiBu-β H Ac α E. esula 57 153 enukokurin A Me H Pr-β Bz-α OiBu-β OH-α H β E. lateriflora 74 154 enukokurin B Me H Pr-β iBu-α OiBu-β OH-α H β E. lateriflora 75 155 enukokurin C Me H Pr-β Bz-α OPr-β OH-α H β E. lateriflora 75 156 esulon A Me OH Ac-β Bz-α OBz-β OH-α Ac β E. esula 76 157 esulon B Me OH Ac-β Bz-α OBz-β OAc-α Ac β E. esula 76 158 esulatin E / / / / / / / / E. esula 58 159 gujonianin B Bz-α H H / / / / β E. guyoniana 63 160 3,5,8,15-tetraacetoksi-7-propanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-dion Ac-α OPr-α OAc-β / / / / β E. sororia 43 OPŠTI DEO 22 Tabela 5. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) i endocikličnom Δ11 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položajima 9 (ili 8) i 14 (nastavak). 161 3,5,7,8,15-pentaacetoksijatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion Ac-α OAc-α OAc-β / / / / α E. turczaninowii 77 162 esulon C / / / / / / / / E. esula 76 163 3,15-diacetoksi-3-benzoiloksi-5-hidroksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-diona Bz-α / / / / / / / E. characias 78 164 3,15-diacetoksi-3-tigloiloksi-5-hidroksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-diona Tig-α / / / / / / / E. characias 78 165 3,15-diacetoksi-3-izobutanoiloksi-5-hidroksijatrofa- 6(17),11E-dien-9,14-diona iBu-α / / / / / / / E. characias 78 a Relativna konfiguracija 20-Me grupe nije određena. Tabela 6. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) dvostrukom vezom, karbonilnom grupom u položaju 14 i 11,12-epoksidnom grupom i jatrofani sa endocikličnom Δ12 dvostrukom vezom, karbonilnom grupom u položaju 14 i 5,6 epoksidnom grupom. O R3 AcO AcO OR2 R1 H OAc OR4 O O OH AcO R2O OBz HO H OBz O O R1O O R1O R2O H O O 166-171 172, 173 174-177 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 20-Me Biljna vrsta i referenca 166 kansuinin E H Ac OBz Nic / E. kansui 79 167 esulatin A OAc iBu OAc Ac / E. esula, 68 E. salicifolia 80 OPŠTI DEO 23 Tabela 6. Jatrofani sa egzocikličnom Δ6(17) dvostrukom vezom, karbonilnom grupom u položaju 14 i 11,12-epoksidnom grupom i jatrofani sa endocikličnom Δ12 dvostrukom vezom, karbonilnom grupom u položaju 14 i 5,6 epoksidnom grupom (nastavak). 168 2,3,5,9-tetraacetoksi-11,12-epoksi-7,8-diizobutanoiloksijatrof- 6(17)-en-14-on OAc iBu OiBu Ac / E. salicifolia 80 169 2,3,5,6,9-pentaacetoksi-11,12-epoksi-8-izobutanoiloksijatrof- 6(17)-en-14-on OAc Ac OiBu Ac / E. salicifolia 80 170 kansuinin F H Ac OBz Bz / E. kansui 81 171 kansuinin G H Ac H Nic / E. kansui 81 172 kansuinin C Ac-α H-β / / / E. kansui 82 173 kansuinin B H-α Ac-β / / / E. kansui 82,83 174 15-acetoksi-3-benzoiloksi-5,6-epoksijatrof-12-en-9,14-dion Bz-β OAc-β / / β E. mongolica, 73 E. characias 78 175 15-acetoksi-5,6-epoksi-3-propanoiloksijatrof-12-en-9,14-dion Pr-β OAc-β / / β E. characias 78 176 5,6-epoksi-15-hidroksi-3-tigloiloksijatrof-12-en-9,14-dion a Tig OH / / / E. characias 78 177 15-acetoksi-3-angeloiloksi-5,6-epoksijatrof-12-en-9,14-dion a Ang OAc / / / E. characias 78 a Relativna konfiguracija jedinjenja nije određena. OPŠTI DEO 24 Tabela 7. Jatrofani sa endocikličnim Δ5 i Δ11 dvostrukim vezama. R5O R2 R3 R1O R6O H OR4 AcO OAc BzO HO H OAc OAc BzO HO H OAc OH AcO 178-183 184 185 HO OR1 BzO AcO H OAc HO OH AcO OR1 BzO R3O H OR2 AcO OAc BzO H OAc 186, 187 188-192 193 Broj Naziv jedinjenja 2-Me R1 R2 R3 R4 R5 R6 Biljna vrsta i referenca 178 8,9,14,15-tetraacetoksi-3-benzoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-7-ol α Bz H OAc Ac Ac-β Ac E. serrulata 84 179 7,8,9,14,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa- 5E,11E-dien α Bz OAc OAc Ac Ac-β Ac E. platyphyllos 85 180 14-acetoksi-3-benzoiloksijatrofa-5E,11E-dien- 7,9,15-triol β Bz OH H H Ac-β H E. helioscopia 86 181 eufopubescen α Ac OAc OAc Ac Ac-α Ac E. pubescens 71 182 eufomeliferin A β Bz OAc OAc Ac Ac-β Ac E. mellifera 87 OPŠTI DEO 25 Tabela 7. Jatrofani sa endocikličnim Δ5 i Δ11 dvostrukim vezama (nastavak). 183 eufomeliferin B β Bz OAc OAc Ac Ac-β H E. mellifera 87 184 7,9,14-triacetoksi-3-benzoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-15-ol / / / / / / / E. helioscopia 88 185 7,9,14-triacetoksi-3-benzoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-15,17-diol / / / / / / / E. helioscopia 86 186 9,15-diacetoksi-3,7-dibenzoiloksi-1,13,14- trihidroksijatrofa-5E,11E-dien / Bz / / / / / Pedilanthus tithymaloides 89 187 9,15-diacetoksi-3-benzoiloksi-1,7,13,14- tetrahidroksijatrofa-5E,11E-dien / H / / / / / P. tithymaloides 89 188 eufornin α Ac Ac H / / / E. maddeni, 90 E. helioscopia 91 189 eufornin A α H Ac H / / / E. helioscopia 91 190 eufornin B α Ac H H / / / E. helioscopia 91 191 eufornin D α Ac Ac Ac / / / E. helioscopia 91 192 eufornin L β H H Ac / / / E. helioscopia 92 193 eufornin E / / / / / / / E. helioscopia 91 OPŠTI DEO 26 Tabela 8. Jatrofani sa endocikličnim Δ6 i Δ12 dvostrukim vezama. OAc OAc BzO AcO H AcO R1O OAc OH 194, 195 Broj Naziv jedinjenja R1 Biljna vrsta i referenca 194 7,8,9,14,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksi-1,5-dihidroksijatrofa-6,12-dien H P. tithymaloides 89 195 1,7,8,9,14,15-heksaacetoksi-3-benzoiloksi-5-hidroksijatrofa-6,12-dien Ac P. tithymaloides 89 Tabela 9. Jatrofani sa endocikličnom Δ5 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 7. OAcBzO HO H AcO O OBzO AcO H AcO O OAc OAc BzO AcO H AcO AcO O 196 197, 198 199 Broj Naziv jedinjenja 20-Me Biljna vrsta i referenca 196 eufornin C / E. helioscopia 91 OPŠTI DEO 27 Tabela 9. Jatrofani sa endocikličnom Δ5 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 7 (nastavak). 197 eufoskopin D β E. helioscopia 91 198 epieufoskopin D α E. helioscopia 91 199 1,8,9,14,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-5,12-dien-7-on / P. tithymaloides 89 Tabela 10. Jatrofani sa endocikličnom Δ5 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 9. OBzO AcO H AcO ONic OH O AcO HBzO OBz AcO O R2O HBzO OR1 R3O O AcO HBzO OAc AcO OH 200, 201 202 203-219 220 Broj Naziv jedinjenja 2-Me R1 R2 R3 R4 20-Me Biljna vrsta i referenca 200 eufoheliosnoid A α / / / / / E. helioscopia 91,93 201 eufoheliosnoid B β / / / / / E. helioscopia 91,93 202 14,15-diacetoksi-3,7-dibenzoiloksi-17-hidroksijatrofa- 5E,11E-dien-9-on / / / / / / E. helioscopia 86 203 eufoskopin A β H Ac-β Ac / β E. helioscopia 91 204 epieufoskopin A β H Ac-β Ac / α E. helioscopia 91 OPŠTI DEO 28 Tabela 10. Jatrofani sa endocikličnom Δ5 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 9 (nastavak). 205 eufoskopin B β Ac Ac-β Ac / β E. helioscopia 91 206 epieufoskopin B β Ac Ac-β Ac / α E. helioscopia 91 207 eufoskopin C β Bz Ac-β Ac / β E. helioscopia 91 208 eufoskopin G β H Ac-β H / β E. helioscopia 91 209 eufoskopin H β Ac Ac-β H / β E. helioscopia 91 210 eufoskopin I β H H-β Ac / β E. helioscopia 91 211 eufoskopin J β Ac H-β Ac / β E. helioscopia 91 212 eufoskopin K β Ac H-β H / β E. helioscopia 91 213 eufornin F α H Ac-α H / α E. helioscopia 91 214 eufornin G α Ac Ac-α H / α E. helioscopia 91 215 eufornin H α Ac Ac-α Ac / α E. helioscopia 91 216 eufornin I α H Ac-α Ac / α E. helioscopia 91 217 eufornin J α Ac Ac-β Ac / β E. helioscopia 91 218 eufornin K α H Ac-β Ac / β E. helioscopia 91 219 eufornin N α Ac Ac-α Ac / α E. helioscopia 94 220 eufoheliosnoid C / / / / / / E. helioscopia 91,93 OPŠTI DEO 29 Tabela 11. Jatrofani sa endocikličnom Δ5 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položajima 9 i 14. O AcO HBzO OR1 AcO R2 O O HBzO OH AcO OH O R5 O R1 H R2 AcO R3O R6 R4 221-225 226 227-229 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 R5 R6 20-Me Biljna vrsta i referenca 221 eufoskopin E H H / / / / β E. helioscopia 91 222 eufoskopin F Ac H / / / / β E. helioscopia 91 223 epieufoskopin F Ac H / / / / α E. helioscopia 91 224 eufoskopin M Ac OAc-β / / / / β E. helioscopia 91,92 225 15-acetoksi-3-benzoiloksi-7,11-dihidroksijatrofa-5,12- dien-9,14-dion Ac OAc-α / / / / α E. lunulata 95 226 eufoheliosnoid D / / / / / / / E. helioscopia 93,96 227 eufoskopin L Me H Bz OAc OAc-β H / E. helioscopia 91,92 228 eufoskopin N Me H Bz OH H H / E. helioscopia 91,92 229 15-acetoksi-3-propanoiloksijatrofa-5,12-dien-9,14-dion H Me Pr H H H / E. characias 78 OPŠTI DEO 30 Tabela 12. Jatrofani sa endocikličnom Δ5 dvostrukom vezom i karbonilnom grupom u položaju 14. OAc O H HO BzO OAc OAc O R1 H R2 R4O AcO OR3 OAc 230 231, 232 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 Biljna vrsta i referenca 230 eufomeliferin / / / / E. mellifera 87 231 pubescen D H Me Bz H E. pubescens 97 232 3,9,15-triacetoksi-7-butanoiloksijatrofa-5E,12E-dien-14-on Me H Bu Ac E. pubescens 98 OPŠTI DEO 31 Tabela 13. Jatrofani sa endocikličnim Δ4 i Δ11 dvostrukim vezama. OAc OAc AcO AcO BzO R3 R1 R2 OAc OAc O R1 R2 R4O BzO OAc R3O OAc OAc AcO BzO OAc AcO 233-235 236-242 243 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 20-Me Biljna vrsta i referenca 233 7,8,9,14,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-4E,11E-dien-6-ol OH Me Ac / / E. serrulata 84 234 8,9,14,15-tetraacetoksi-3,7-dibenzoiloksijatrofa-4E,11E-dien-6-ol OH Me Bz / / E. serrulata 84 235 7,8,9,14,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-4E,11E-dien-6-ol Me OH Ac / / E. platyphyllos 85 236 6,7,8,9,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksi-2-hidroksijatrofa-4E,11E- dien-14-on Me OH Ac Ac β E. serrulata 84 237 7,8,9,15-tetraacetoksi-3-benzoiloksi-6-hidroksijatrofa-4E,11E-dien- 14-on H Me H Ac β E. serrulata 84 E. platyphyllos 85 238 6,7,8,9,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-4E,11E-dien-14-on H Me Ac Ac β E. serrulata 84 239 2,7,8,9-tetraacetoksi-3-benzoiloksi-6,15-dihidroksijatrofa-4E,11E- dien-14-on Me OAc H H β E. serrulata 99 240 2,6,7,8,9,15-heksaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-4E,11E-dien-14-on Me OAc Ac Ac β E. serrulata 99 241 serulatin B Me H Ac Ac α E. serrulata 100 242 6,7,8,9,15-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-4Z,11E-dien-14-on Me H Ac Ac α E. serrulata 101 243 6,7,8,9,14-pentaacetoksi-3-benzoiloksijatrofa-1(15),4Z,11E-trien / / / / / E. serrulata 101 OPŠTI DEO 32 Tabela 14. Jatrofani sa oksaciklopentanskim prstenom. O OiBu AcO AcO OAc OAc OAc OAc H OH AcO O OR2 AcO R1 O OR4 OR3OAc H OH AcO O OR1 AcO O OR2 OAc OAc H OH AcO O OAcOR3 BzO R1 AcO OH R2 AcO 244 245-248 249, 250 251-253 O O O HO O O O R1 R2 O BzO AcO OH OAc OAcH O O OAc OAc NicO AcO AcO AcO H OAc 254 255-257 258 259 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 20-Me Biljna vrsta i referenca 244 esulatin H / / / / / E. esula 57 245 kansuinin A H Ac-β Bz-α Ac-α α E. kansui 82,102 246 kansuinin D H Ac-β Bz-α Nic-α α E. kansui 79 247 kansuinin H OH Ac-β Bz-α Ac-α α E. kansui 81 248 esulatin C a OAc iBu Bz Ac / E. esula 68 OPŠTI DEO 33 Tabela 14. Jatrofani sa oksaciklopentanskim prstenom (nastavak). 249 kansuinin D1 Bz-α Nic / / β E. kansui 103 250 3,5,7,8,9,15-heksaacetoksi-10,13-epoksi-13-hidroksijatrofa-6(17)- en-12-on Ac-β Ac / / α E. esula 104 251 serulatin A Me H Tig / / E. serulata 100 252 8,14,15-triacetoksi-3-benzoiloksi-6,9-epoksi-7-tigloiloksijatrofa- 4E,11E-dien-9-ol H Me Tig / / E. serulata 99 253 8,14,15-triacetoksi-3,7-dibenzoiloksi-6,9-epoksijatrofa-4E,11E- dien-9-ol H Me Bz / / E. platyphyllos 85 254 japodagron / / / / / Jatropha podagrica 105 255 jatrofon H-β Me-α / / / Jatropha gossypiifolia 106 , 107 256 hidroksijatrofon A OH-α Me-β / / / J. gossypiifolia 108 257 hidroksijatrofon B OH-β Me-α / / / J. gossypiifolia 108 258 7,9,14-triacetoksi-3-benzoiloksi-12,15-epoksijatrof-5E-en-11-ol / / / / / E. helioscopia 86 259 1,7,8,9,14,15-heksaacetoksi-5,13-epoksi-11,12-epoksi-3-nikotinoil- oksijatrof-6-en / / / / / P. tithymaloides 89 a Relativna konfiguracija na C-7, 8 i 9 nije određena. OPŠTI DEO 34 Tabela 15. 17-Bishomojatrofani. OR4 O OR5 OAc R1 R3O OR6 AcO R2O H O HO OAc O OAc OAc HOAcO BzO OAc AcO HO H O OAc O OAc OAc HOAcO BzO OAc AcO HO H O O 260-262 263 264 OH O OAc OAc HO BzO OAc AcO AcO H O O OR4 OR5 OAc R7O R1 OAc O R2O H O O R3O R6 O O AcO H BzO OH AcO O AcO OiBu OAc 265 266-282 283 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 20-Me Biljna vrsta i referenca 260 sororianolid C OAc-α Bz H-β Ac-α Ac Ac-β / α E. sororia 109 261 izoteracinolid A H Ac Bz-α H-β iBu Ac-α / β E. terracina 110 262 izoteracinolid B H Ac Bz-α H-β Pr Ac-α / β E. terracina 110 263 sororianolid A / / / / / / / / E. sororia 109 264 sororianolid B / / / / / / / / E. sororia 109 OPŠTI DEO 35 Tabela 15. 17-Bishomojatrofani (nastavak). 265 gujanianin F / / / / / / / / E. guyoniana 45 266 teracinolid A H Ac Ac Bz iBu H Ac / E. segetalis, 37 E. terracina 101 267 teracinolid B H Ac Ac Ac iBu H Ac / E. segetalis, 37 E. terracina, 101 E. dendroides 111 268 teracinolid C H Ac H Ac iBu H Ac / E. segetalis, 37 E. dendroides, 111 E. terracina 112 269 teracinolid D H Ac Ac Bz Ac H Ac / E. terracina 112 270 teracinolid E H Ac Ac Bz Pr H Ac / E. segetalis, 37 E. terracina 112 271 teracinolid F H Ac Ac iBu iBu H Ac / E. dendroides, 111 E. terracina 112 272 teracinolid G H Ac Ac Ac iBu H H / E. terracina 112 273 teracinolid H H Ac Ac iBu iBu H Ac / E. segetalis 37 274 teracinolid I OAc Ac Ac Ac iBu H H / E. segetalis 37 275 teracinolid J H Ac Ac iBu iBu H H / E. dendroides 111 276 teracinolid K H H Ac Ac iBu H Ac / E. dendroides 111 277 teracinolid L H H Ac iBu iBu H Ac / E. dendroides 111 278 13α-hidroksiteracinolid B H Ac Ac Ac iBu OH Ac / E. segetalis, 37 E. terracina, 110 E. dendroides 111 279 13α-hidroksiteracinolid F H Ac Ac iBu iBu OH Ac / E. dendroides 111 280 13α-hidroksiteracinolid G H Ac Ac Ac iBu OH H / E. terracina, 110 E. dendroides 111 281 13α-hidroksiteracinolid I OAc Ac Ac Ac iBu OH H / E. segetalis, 37 E. terracina 110 282 15-O-deacetil-13α-hidroksiteracinolid A H Ac Ac Bz iBu OH H / E. terracina 110 283 salicinolid / / / / / / / / E. salicifolia 113 OPŠTI DEO 36 Tabela 16. 1(15→14)Abeojatrofani, 9(10→18)abeojatrofan i 12,17-ciklojatrofan. R2O OR4 R1O OR6 OR5 OR3 H O R7 1 15 14 AcO AcO OAc OAc OAc ONic NicO 9 18 O OAc AcO AcO OAc iBuO H OAc OAc O H OH 284-286 287 288 Broj Naziv jedinjenja R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 Biljna vrsta i referenca 284 3,5,7,8,9,14-heksahidroksi-7-izobutanoiloksi-5,8-bis(2-metil- butanoiloksi)-1(15→14)abeojatrofa-6(17),11-dien-15-on H H MeBu iBu MeBu H OH-β E. terracina 36 285 abeodendroidin F OH Ac iBu Bz Ac Ac OH-β E. dendroides 111 286 epi-abeodendroidin F OH Ac iBu Bz Ac Ac OH-α E. dendroides 111 287 eufosalicin / / / / / / / E. salicifolia 80 288 salicifolin / / / / / / / E. salicifolia 113 OPŠTI DEO 37 1.3.1. Biosinteza diterpena iz vrsta familije Euphorbiaceae Do sada nije objavljena nijedna biohemijska studija, ali se pretpostavlja da biosinteza diterpena iz vrsta familije Euphorbiaceae počinje kondenzacijom geranilgeranil-difosfata. Pri tome, „niži“ diterpeni nastaju „glava-rep“ ciklizacijom geranilgeranil-difosfata, dok se skeleti nespecifičnih „viših“ diterpena formiraju iz geranilgeranil-difosfata klasičnom kaskadnom ciklizacijom koja je tipična za mnoge diterpene, triterpene i steroide. Smatra se da do funkcionalizacije diterpena dolazi posle ciklizacije. Najpre se kondenzacijom geranilgeranil-difosfata formiraju kazben ili cembrenski katjon (Slika 3). (Makrociklični diterpen kazben nastaje iz geranilgeranila u bezćelijskim kulturama Ricinus communis.114) Tako nastali kazben se smatra prekursorom policikličnih i polifunkcionalnih diterpena tiglijanskog, dafnanskog i ingenanskog tipa. Makrociklični diterpeni mogu nastati kao intermedijeri u tom biosintetskom procesu. 115 Pri tome, u biljnom organizmu makrociklični jatrofani nastaju ili iz cembrenskog karbokatjona ili iz kazbenskog prekursora daljom ciklizacijom i otvaranjem njegovog ciklopropanskog prstena. 116 Latirani mogu nastati ili iz kazbana daljom intramolekulskom ciklizacijom između C-4 i C-15116 ili iz jatrofana ciklizacijom između C-9 i C-11.117 Daljom ciklizacijom latirana i intramolekulskim formiranjem nove C–C veze mogu se dobiti tiglijani, ingenani i dafnani.116 OPŠTI DEO 38 Slika 3. Pretpostavljeni put biosinteze diterpena iz vrsta familije Euphorbiaceae. OPŠTI DEO 39 Prisustvo velikog broja sekundarnih metabolita koji ispoljavaju različite biološke aktivnosti u tesnoj je vezi sa raznovrsnom primenom vrsta iz familije Euphorbiaceae u tradicionalnoj i savremenoj medicini. Ipak, treba imati u vidu da su neki od sastojaka i toksični.118 1.4. Primena vrsta iz familije Euphorbiaceae u tradicionalnoj medicini Od pamtiveka se mnoge vrste koje su članovi familije Euphorbiaceae koriste kao popularno lekovito bilje. Poznati švedski botaničar Karl Line (Carl Nilsson Linnæus) je rodu Euphorbia i familiji Euphorbiaceae dao ova imena u čast starogrčkog lekara Euphorbus-a za koga se veruje da je koristio lateks vrste Euphorbia resinifera za lečenje stomačnih tegoba Juba II, romanizovanog kralja Severnoafričkog kraljevstva. 8,119 Prema indijskom Ajurveda medicinskom sistemu 120 u drugom veku pre Hrista neke vrste iz familije Euphorbiaceae korišćene su za lečenje bolesti jetre, uganuća, ujeda zmija i kao purgativ (Croton oblongifolius Roxb.), odnosno za lečenje ludila, konvulzija, astme, tumora i reume (Croton tiglium Willd.). U drevnom Ajurveda sistemu, za lečenje različitih bolesti primenjivane su i Euphorbia policarpa, Euphorbia hirta i Acalipha indica L. 121 U drevnoj kineskoj medicini korišćene su 33 vrste inače razvrstane u 17 rodova familije Euphorbiaceae. 122 Euphorbia pekinensis Rupr. se smatra jednom od 50 osnovnih lekovitih biljaka. U drevnom Jukatanskom biljnom sistemu primenjivane su različite vrste iz familije Euphorbiaceae, npr. Euphorbia ptercineura za lečenje astme i kašlja, Croton peraeruginosus za lečenje bubuljica, a Phillanthus micrandrus Müll. Arg. za lečenje rana, zapaljenja i infekcija.123 Čak i danas, mnogi preparati, svež lateks i čajevi koji se pripremaju od biljaka iz familije Euphorbiaceae koriste se u alternativnoj medicini. Na primer, E. tirucalli je poznata po svojoj lekovitosti protiv bradavica, izraslina, tumora, karcinoma, gonoreje, artritisa, astme, kašlja, bola u uhu, neuralgije, reumatizma, zubobolje i dr.7,124,125 Euphorbia thimifolia se koristi kao antivirusno sredstvo protiv Herpes simplex virusa tipa 2, 126 dok se E. maculata koristi za lečenje kolere, dijareje i dizenterije.127 Niz drugih biljnih vrsta iz ove familije koje su članovi roda Euphorbia takođe poseduje različita lekovita svojstva: E. peplus L., E. peploides, E. pilosa, E. palustris leče OPŠTI DEO 40 hidrofobiju; E. peplus, E. helioscopia, E. humistrata, E. hipericifolia, E. portulacoides L., E. iata Engelm, E. marginata Pursh, E. drummondii i E. heterodoxa primenjuju se za lečenje uobičajenih kućnih oboljenja.127 Međutim, u lekovitim preparatima koji se koriste u narodnoj medicini sadržaj aktivnih komponenti i efikasnost nisu tačno određeni i uvek isti. Otuda postoji potreba za detaljnim istraživanjima koja bi utvrdila njihovu bezbednost. 1.5. Toksičnost vrsta iz familije Euphorbiaceae Lekovitost nije jedina osobina kojom se odlikuju vrste iz familije Euphorbiaceae. Naime, većina članova familije je otrovna. Jedna od najotrovnijih supstanci biljnog porekla je ricin, protein izolovan iz R. communis, 128 mada su i druge vrste, kao što je npr. J. curcas L., jednako otrovne.129 Pokazalo se da su, od vrsta iz ove familije koje su članovi roda Euphorbia, za ljude otrovne: E. ledienii A. Berger, E. heterophilla L., E. cooperi N.E.Br. ex A. Berger, E. candelabrum Kotschy, E. virosa Willd., E. poissonii Pax, E. unispina N.E.Br. i E. venenifica Tremaux ex Kotschy; za domaće životinje otrovne su: E. caput-medusae L., E. silenifolia (Haworth) Sweet, E. ingens E. Mey. ex Boiss; za ribe su otrovne: E. scheffleri Pax, E. tirucalli L. i E. inaekuilatera Sond. Neke vrste izazivaju iritaciju, npr. E. tirucalli, E. poissonii, E. unispina i E. venenifica. 130 Pored toga, neki članovi familije izazivaju određena oboljenja ili utiču na podložnost organizama ka njima. Na primer, E. tirucalli, E. leuconeura, J. curcas i druge vrste su poznate kao kokarcinogenici i mogu izazvati/potpomagati prekomernu deobu ćelija što dovodi do pojave i rasta tumora. 8,131,132 Takođe, lateks vrsta E. tirucalli i Euphorbia royleana izaziva konjuktivitis u dodiru sa očima.125,133 Toksičnost ovih vrsta može biti uzrok toksičnosti hrane. Tako je, na primer, utvrđeno da neki uzorci meda gorkog ukusa izazivaju iritaciju zbog toga što sadrže ingenanske diterpene iz polena Euphorbia seguieriana kojim su se pčele hranile. Takođe, mleko može biti kontaminirano kokarcinogenim metabolitima biljaka – otrovno mleko koza hranjenih E. peplus izazvalo je slabu iritaciju u standardnom ogledu. Ekstrakt tog mleka je sadržavao tri toksična diterpena, ingenol-20-acetat-3- angelat, 20-deoksiingenol-3-angelat i 20-deoksiingenol-6a,7a-epoksid-3-angelat. OPŠTI DEO 41 Pretpostavlja se da bi to mogao biti uzrok razvoja kancera jednjaka u primorskom području Kaspijskog mora u Iranu.134 1.6. Primena vrsta iz familije Euphorbiaceae u savremenoj medicini Iako se vrste iz familije Euphorbiaceae koriste u tradicionalnoj medicini, njihovu primenu u savremenoj medicini do nedavno su ograničavala toksična dejstva, odnosno sposobnost nekih diterpena prisutnih u njihovom lateksu da izazivaju iritacije, ali i pojavu tumora. Farmakološka ispitivanja vrsta ove familije su stoga usmeravana uglavnom na iritaciono dejstvo policikličnih diterpena. Kada je 1968. godine Erih Heker (Erich Hecker) iz ulja semena Croton tiglium izolovao tumor promotorske forbol-12,13- diestre i odredio njihovu strukturu 135 pokrenuta su intenzivna istraživanja proinflamatornih i tumor promotorskih diterpena izolovanih iz vrsta familije Euphorbiaceae. Ova jedinjenja su imala presudnu ulogu u razumevanju oboljenja kao što su karcinomi i razni zapaljenski procesi. Najviše proučavano jedinjenje, 12-O- tetradekanoilforbol 13-acetat (TPA), dugi niz godina se koristi kao sredstvo za izazivanje zapaljenja i za proučavanje mehanizama koji dovode do pojave tumora u in vivo i in vitro sistemima. 136 U poslednjoj deceniji 20-og veka, forboidi su smatrani pre svega za tumor promotorske i proinflamatorne supstance koje aktiviraju protein kinazu C (PKC) i koje su odgovorne za toksične efekte i sposobnost lateksa, korenja, nadzemnih delova biljaka i semena vrsta iz familije Euphorbiaceae da izazivaju iritaciju kože,116 odnosno za veoma moćne karcinogene prirodnog porekla koje ne bi trebalo primenjivati u razvoju lekova. Od 2000-te godine, međutim, detaljnije su poznate funkcije PKC izoenzima u ćelijskoj signalizaciji i regulaciji različitih ćelijskih odgovora. Osim toga, proučene su biološke aktivnosti forboida koje su bitne za terapijske svrhe. Zahvaljujući tome, forboidi su postali vrlo atraktivne supstance za razvoj lekova 137 i za njihovu primenu u pretkliničkim i kliničkim studijama. Tako, ingenol 3-angelat je u drugoj fazi kliničkih ispitivanja kao lek za lokalni tretman nemelanomskih kancera kože kao što su OPŠTI DEO 42 bazocelularni karcinom, skvamocelularni karcinom i intraepidermalni karcinom, 138 a obećava i kao novi agens protiv leukemije.139 Od januara 2012. godine ovo jedinjenje (ingenol mebutat, PEP005, Picato ® , Leo Pharma), na osnovu odobrenja koje je dala Američka Savezna Uprava za hranu i lekove (engl. Food i Drug Administration, FDA), može da se koristi za lečenje aktinične keratoze, prekanceroznog stanja kože.29 To je prvi put posle mnogo vremena da je jedan biljni hemotip – prirodni proizvod bez strukturnih izmena – uveden u kliničku praksu, što samo dokazuje veliki značaj diterpena izolovanih iz vrsta familije Euphorbiaceae. Pri tome, ne treba smetnuti sa uma da je ingenol 3-angelat bio „stari“ molekul (prvi put je izolovan iz Euphorbia paralias 1980., 140 a iz E. peplus 2000. 61 ) kada su 2004. u Australiji 141 počela njegova preklinička ispitivanja. To ukazuje da ponovno ispitivanje poznatih jedinjenja može dovesti do prepoznavanja veoma vrednih supstanci i novih bioloških ciljeva. I strukturno slično jedinjenje, 20-O-acetilingenol 3-angelat (PEP008), takođe ima potencijal u terapiji niza različitih solidnih karcinoma (tumor dojke, tumor debelog creva i melanomi). 142 Pored ovih, još neka obećavajuća jedinjenja su trenutno predmet projekata razvoja lekova. Neki forbol i ingenol derivati, posebno prostratin, postali su veoma interesantni za terapiju HIV: oni reaktiviraju latentnost HIV-1 kroz PKC-zavisnu NF-κB aktivaciju i na taj način sprečavaju novu infekciju CD4 ćelija. Primena ovih agenasa u kombinaciji sa drugim antiretrovirusnim lekovima predlaže se kao potencijalna strategija u aktiviranju rezervoara virusa i eliminaciji skladišta latentne HIV infekcije. 143 Reziniferatoksin, diterpen dafnanskog tipa, ultrapotentni analog kapsaicina, prolazi kroz evaluaciju u drugoj i trećoj fazi kliničkih ispitivanja. Ovo jedinjenje aktivira tranzitorni receptorski potencijal vaniloida 1 u subpopulaciji primarnih aferentnih senzornih neurona uključenih u prenos bolnih impulsa (transmisija fiziološkog bola) i stoga deluju obećavajuće u sprovođenju dugotrajne analgezije.144 Osim toga, pepluanski diterpen pepluanon izolovan iz E. peplus ima sposobnost da deluje kao antiinflamatorni agens in vitro i in vivo, što može otvoriti nove perspektive u dizajniranju i razvoju novih nesteroidnih antiinflamatornih lekova. 145,146 Neki od ekstrakata su registrovani lekovi i kao takvi su dostupni na tržištu. Takav je npr. Euphorbium (aktivna supstanca je reziniferatoksin) dobijen iz lateksa vrste E. resinifera 147 koji se prodaje kao „Complexe Lehning Euphorbium N 88“ i upotrebljava kao nazalni sprej ili smeša protiv virusnih infekcija, rinitisa, sinuzitisa, OPŠTI DEO 43 hronične sekrecije iz nosa, suve i zapaljene nosne sluznice, kao i simptoma gripa. Ekstrakt Euphorbia pilulifera je naveden u Stedman-ovoj listi lekova i može se primeniti protiv astme, prehlade i drugih respiratornih infekcija, ali i kao sredstvo protiv grčeva.148 Disenteral® je ekstrakt vrste E. hirta i koristi se u lečenju dijareje,149 dok se preparat Radix (ekstrakt korena vrste Euphorbia kansui) koristi kao purgativ. Mallotus philippinensis se upotrebljava za proizvodnju lekovitih biljnih preparata – ova biljka produkuje rotlerin, snažan otvarač kalcijum-zavisnih kalijumovih kanala velike provodljivosti. 29 Mnoge druge vrste iz familije Euphorbiaceae su potencijalno važni veterinarski i poljoprivredni biocidi. 16 Imajući u vidu da su vrste iz familije Euphorbiaceae lako dostupne i vrlo rasprostranjene i da se glavni sastojci diterpenske frakcije ovih biljaka relativno lako izoluju, one se mogu smatrati važnim izvorom veoma vrednih biološki aktivnih supstanci. Nekim vrstama familije Euphorbiaceae, uprkos njihovoj lekovitosti, preti izumiranje. To je, npr., slučaj sa vrstama Euphorbia appariciana, Euphorbia crossadenia i Euphorbia gymnoclada. 150 1.7. Biološke aktivnosti jatrofana Uprkos tome što je prvi izolovani diterpen imao makrociklični skelet, makrociklični diterpeni su, na neki način, bili zanemareni. S obzirom da se u biljkama obično nalaze u malim količinama i u veoma složenim smešama, i pošto se ne karakterišu izrazitim toksikološkim dejstvima, dugo su bili interesantni samo hemičarima. Mnogo su interesantniji bili policiklični diterpeni tiglijanskog, ingenanskog i dafnanskog tipa, nazvani zajedničkim imenom „forboidi“, koji imaju proinflamatorno i tumor promotorsko dejstvo. Tako je bilo do 1970., kada su rezultati intenzivnog anti kancer skrining programa pokazali da makrociklični diterpeni jatrofanskog tipa imaju značajnu antileukemijsku aktivnost protiv limfocitne leukemije in vivo. 106 Posle toga utvrđeno je da nekoliko klasa makrocikličnih diterpena izolovanih iz vrsta familije Euphorbiaceae ispoljava antitumorsko dejstvo in vivo 90,151 i citotoksično dejstvo in vitro152 i da su, shodno tome, ova jedinjenja potencijalni hemioterapeutski agensi ili polazna jedinjenja u dizajnu novih hemioterapeutika. Od OPŠTI DEO 44 tada su makrociklični diterpeni, prvenstveno jatrofani, zbog svog biološkog značaja, kompleksnosti strukture i biološke aktivnosti postali predmet intenzivnog proučavanja. Najvažniji rezultat proučavanja je saznanje da su jatrofani inhibitori P-glikoproteina i potencijalni MDR modulatori. 40,53,56,73,84,85,87,92,111,153,154,155 1.7.1. Reverzija višestruke rezistencije na lekove Poslednjih decenija hemioterapija je jedan od najvažnijih načina lečenja karcinoma. Farmaceutska industrija proizvodi mnoštvo antitumorskih preparata, ali su najčešći tumori na većinu njih rezistentni, te i dalje postoji potreba za dobijanjem još efikasnijih lekova. Rezistencija na lekove može biti urođena ili stečena. Pojam „stečena rezistencija“ se odnosi na slučaj kada lek primenjen u dozi koja je ranije bila efikasna više ne deluje. Izgledalo je da je način da se ovaj problem prevaziđe kombinovana hemioterapija – primena više agenasa, koji svoje efekte ispoljavaju različitim mehanizmima. Međutim ćelije karcinoma su razvile višestruku rezistenciju. Tako je pojava višestruke rezistencije na lekove (engl. multidrug resistance, MDR), odnosno rezistencije ćelija na široki spektar strukturno i funkcionalno različitih lekova koji deluju različitim mehanizmima i imaju različite ciljne molekule,156 postala glavna prepreka uspešnoj hemioterapiji. MDR je složena pojava za koju su zaslužni brojni biohemijski mehanizmi, uključujući smanjenu apsorpciju leka ili pojačano izlučivanje leka; prekomernu produkciju ciljnih enzima ili produkciju modifikovanih ciljnih enzima; promene u mestu dejstva leka; izmenjen metabolizam lekova; ubrzanu popravku oštećenja DNK nastalih dejstvom leka; nemogućnost započinjanja apoptoze (programirana ćelijska smrt).156,157 Molekulske promene koje doprinose nastanku MDR uključuju ushodnu regulaciju ili aktivaciju transportnih proteina, detoksikacionih sistema i mehanizama za reparaciju ciljnih mesta (dejstva leka), kao i poremećaj (regulacije) mehanizama ćelijske smrti. Uprkos različitim mehanizmima koji dovode do MDR, najvažniji i najbolje proučen je onaj koji nastaje kao rezultat ili pojačanja ili prekomerne ekspresije mdr1 gena, koji kodira P-glikoprotein (P-gp). P-glikoprotein je ATP vezujući (engl. ATP- binding cassette, ABC) transportni membranski protein. Nalazi se u mnogim normalnim tkivima (bubrezi, pluća, jetra, tanko i debelo crevo, pankreas, placenta, endotelijalne OPŠTI DEO 45 ćelije kapilara testisa i krvno-moždane barijere), ali i u tumorskim ćelijama i to ne samo u eksperimentalnim modelima, već i u karcinomom zahvaćenim tkivima pacijenata.158 Deluje kao energetski zavisna ekskretorna pumpa koja, koristeći energiju dobijenu hidrolizom ATP-a, iz ćelije izbacuje hemijski raznovrsne hidrofobne, uglavnom neutralne ili katjonske molekule, 157 uključujući antikancerske agense (antraciklini, Vinka alkaloidi, taksani, epipodofilotoksini, imanitab, nilotinib, everolimus), pre nego što dospeju u citosol i na taj način smanjuje njihovu unutarćelijsku koncentraciju na nivo koji je niži od letalnog. Učestvovanje u procesima detoksikacije ćelija u normalnim tkivima jedna je od njegovih fizioloških uloga.159 Međutim, ovaj protein tumorske ćelije čini sposobnim da se odupru letalnim dozama pojedinih citotoksičnih lekova. Postoji nekoliko strategija za prevazilaženje MDR posredovane prekomernom ekspresijom P-glikoproteina. Najviše obećava ona koja se zasniva na razvoju netoksičnih jedinjenja (MDR modulatori, inhibitori ili hemosenzitivatori) koja su u stanju da, kada se primene kombinovano, inhibicijom ekskretorne aktivnosti proteina vrate citotoksičnost postojećih antikancerskih lekova prema MDR tumorskim ćelijama,160 odnosno da omoguće njihov unos u ćeliju u koncentraciji koja deluje. Tako je utvrđeno da su neka jedinjenja (verapamil, kvinidin, ciklosporin A, progesteron, VX- 710, PSC-833, itd.) u stanju da vrše reverziju MDR in vitro i in vivo. Međutim, iako su neka od tih jedinjenja prošla klinička ispitivanja (npr. verapamil i ciklosporin A), i dalje ne postoji klinički dostupan MDR modulator. Razvoj efikasnog modulatora ograničen je toksičnošću za normalne ćelije u dozama koje deluju na tumorske ćelije, neželjenim sporednim efektima, slabom efikasnošću i slabom rastvorljivošću.73 Tako, P-gp inhibitori prve generacije, npr. verapamil, kvinidin i ciklosporin A, koji se ne odlikuju supstratnom specifičnošću, moraju da se primene u velikim dozama da bi doveli do reverzije MDR, a neprihvatljivo su toksični. Inhibitori druge generacije, npr. valspodar, elakridar, birikodar i deksverapamil, su jači, specifičniji i manje toksični u odnosu na inhibitore prve generacije, ali interaguju i sa drugim transportnim proteinima. Treća generacija P-gp inhibitora, npr. tarikvidar, zosukvidar, lanikvidar i ONT-093, deluje veoma snažno na P-gp i pokazuje veliku specifičnost za ovaj protein. Dosadašnje farmakokinetičke studije nisu pokazale ni značajno metabolisanje ovih lekova preko sistema citohroma P450, kao ni klinički značajne interakcije sa konvencionalnim hemioterapeutskim agensima. 54 OPŠTI DEO 46 U poslednjih nekoliko decenija sprovedene su obimne studije sa ciljem da se nađe efikasan MDR modulator iz prirodnih izvora. Istraživanjem je, između ostalog, utvrđeno da jatrofanski diterpeni mnogo obećavaju kao MDR modulatori. Ovo je prvi put uočeno 2002. u eksperimentu na rezistentnim L5178 ćelijama limfoma miševa.84 Posle toga su rađena ispitivanja i na drugim test modelima. Neki jatrofanski diterpeni izolovani iz Euphorbia serrulata i E. peplus veoma snažno inhibiraju aktivnost P-glikoproteina u MDR ćelijskoj liniji humanog karcinoma debelog creva (COLO320). 84,154 Efikasnost euphodendroidina A – I, teracinolida B, C, F, H, J – L i 13α-OH teracinolida B i G, izolovanih iz Euphorbia dendroides, zatim pepluanina izolovanih iz E. peplus i eufoharakina iz Euphorbia characias da inhibiraju P-glikoproteinom posredovanu ekskreciju daunomicina ispitivana je praćenjem intracelularne akumulacije ovog leka 40,53,56,111 Na osnovu rezultata, eufodendroidin D i pepluanin A su najsnažniji P-gp inhibitori, s obzirom da su dva puta efikasniji od ciklosporina A („zlatni standard“ P-gp modulatora). Od ciklosporina A efikasniji P-gp inhibitori su i teracinolid H i eufoharakini C i I. Eufodendroini A, B i G, teracinolid J, 13α-OH teracinolid G, pepluanin E i eufoharakin E inhibiraju P-gp u istoj meri kao ciklosporin A. Ostala jedinjenja su manje efikasna, a teracinolidi C i L uopšte ne inhibiraju P-gp. To ukazuje da je, osim lipofilnosti, za ispoljavanje inhibicije P-glikoproteina veoma bitan stepen oksigenacije jatrofanskog skeleta, kao i položaj i vrsta supstituenata.53,111 Pubesceni A – D, izolovani iz Euphorbia pubescens, inhibiraju aktivnost P- glikoproteina u L5178 MDR ćelijskoj liniji limfoma miševa.71 Međutim, ova jedinjenja, kao i eufopubescenol, eufopubescen i pubescenol, izolovani iz iste biljne vrste, ne inhibiraju P-gp u MDA-MB-231 MDR ćelijskoj liniji karcinoma dojke.155 Epieufoskopin B iz E. helioscopia je dva puta efikasniji od ciklosporina A u inhibiciji P-glikoproteina da vrši ekskreciju mitoksantrona. Ostali ispitani jatrofani izolovani iz ove vrste su aktivni koliko i ciklosporin A (eufoskopini C, M i N) ili manje (eufornin). 92 Tukejanoli A i B i eufotukejanol, izolovani iz Euphorbia tuckeyana, u znatnoj meri produžavaju zadržavanje hemioterapeutika u L15178 ćelijama limfoma miševa OPŠTI DEO 47 zahvaljujući tome što inhibiraju P-gp. Oni su za red veličine aktivniji od verapamila koji je služio kao pozitivna kontrola, što ih čini jakim inhibitorima MDR.153 Jatrofani izolovani iz Euphorbia mongolica Porkh. uglavnom veoma snažno inhibiraju aktivnost P-glikoproteina u MDR L5178 ćelijama limfoma miševa.73,85 Eufomeliferin i eufomelifereni A i B, izolovani iz metanolnog ekstrakta Euphorbia mellifera, inhibiraju aktivnost P-glikoproteina u L5178Y MDR ćelijskoj liniji limfoma miševa na koncentraciono zavisan način, ali na aktvnost P-glikoproteina ćelijske linije humanog karcinoma debelog creva (COLO320) ili ne utiču ili je njihovo dejstvo veoma slabo. 87 1.7.2. Interakcije sa tubulinom (antimitotsko dejstvo) Tubulin je globularni heterodimerni protein koji se sastoji iz dve skoro identične podjedinice od po 55 kDa nazvane α- i β-tubulin. U fiziološkim uslovima heterodimeri polimerizuju u tzv. protofilamente, a oni se uređuju formirajući cilindrične filamente – mikrotubule. Mikrotubule imaju važnu ulogu u brojnim ćelijskim procesima, kao što su održavanje oblika ćelije, deoba ćelije, kretanje i međućelijski transport.161 To su veoma dinamične strukture koje se kontinuirano polimerizuju i depolimerizuju – heterodimeri se ugrađuju u mikrotubule, pa depolimerizuju, odnosno oslobađaju se u citoplazmu.162 Na taj način se uspostavlja dinamička ravnoteža, koju regulišu brojni proteini koji se vezuju za mikrotubule i stabilizuju ih. Tubulin je ciljni molekul mnogih antimitotskih agenasa. Neki antimitotski agensi interaguju sa mikrotubulama, sprečavaju njihovu depolimerizaciju i na taj način remete dinamičku ravnotežu i ometaju normalno odvijanje ćelijske deobe163 i drugih ćelijskih funkcija koje zavise od mikrotubula. Takav je, na primer, paklitaksel (taksol) koji se specifično vezuje za tubulin (i to za β-tubulin na polimerizovanim mikrotubulama), stabilizuje mikrotubule deobnog vretena i sprečava njihovu depolimerizaciju, što dovodi do zaustavljanja ćelijske deobe u G2/M fazi ćelijskog ciklusa. 164 Neki drugi antimitotski agensi, npr. indibulin, vinblastin, kolhicin i Vinka alkaloidi, imaju suprotno dejstvo – sprečavaju polimerizaciju tubulina i nastanak mikrotubula (Slika 4). OPŠTI DEO 48 Slika 4. Interakcije antimitotskih agenasa sa tubulinom. 165 Slika 5. Strukture nekih tubulinskih inhibitora. OPŠTI DEO 49 Paklitaksel je antitumorski agens koji se koristi u lečenju brojnih tumora,166 uključujući tumore prostate, jajnika, dojke, pluća, glave i vrata. Međutim, slaba rastvorljivost u vodi i neželjeni efekti koji se javljaju prilikom terapije paklitakselom (neurotoksičnost, preosetljivost, hematotoksičnost i kardiotoksičnost)167 ograničavaju njegovu primenu. Glavno ograničenje u korišćenju ovog agensa u lečenju tumora predstavlja razvoj rezistencije. Osim toga, izoluje se u malim prinosima, a njegova hemijska sinteza je komplikovana. To je podstaklo istraživanja u cilju otkrivanja bioloških analoga koji deluju istim mehanizmom kao i paklitaksel, ali nemaju navedene nedostatke. Mnogi strukturno različiti prirodni proizvodi su predloženi za nove antimitotske agense. Kao potencijalna zamena za paklitaksel ispitivani su, između ostalog, i pojedini makrociklični diterpeni jatrofanskog tipa izolovani iz Euphorbia semiperfoliata Viv.47 Tom prilikom je utvrđeno da ispitani jatrofani interaguju sa mikrotubulama na sličan način kao i paklitaksel (stimulišu polimerizaciju tubulina), inhibiraju rast ćelijskih linija nekih humanih kancera, ali ne zaustavljaju ćelijski ciklus u G2/M fazi. 1.7.3. Antiproliferativno dejstvo Pubesceni A – C izolovani iz E. pubescens in vitro umereno inhibiraju rast ćelijske linije NCI-H460 (humani karcinom pluća) na koncentraciono zavisan način, ali ne inhibiraju rast ćelijskih linija MCF-7 (humani adenokarcinom dojke) i SF-268 (humani karcinom CNS-a). 98 Jatrofani pubescenol i pubescen D izolovani iz iste vrste umereno inhibiraju rast sve tri pomenute ćelijske linije humanih karcinoma in vitro.72 I eufopubescenol i eufopubescen, takođe izolovani iz E. pubescens, inhibiraju rast MCF-7 i NCI-H460 ćelijskih linija, pri čemu se GI50 vrednosti nalaze u opsegu 40,9 – 75 μM, ali ne utiču inhibitorno na rast SF-268 ćelijske linije.71 Neki jatrofanski diterpeni izolovani iz E. esula, E. peplus i Euphorbia serrulata imaju umereno do snažno antiproliferativno dejstvo na ćelije humanog karcinoma debelog creva (COLO320). 154 Tukejanoli A i B i eufotukejanol, izolovani iz E. tuckeyana, in vitro deluju umereno antriproliferativno na ćelijsku liniju limfoma miševa (PAR) osetljivu na doksorubicin, kao i na odgovarajuću rezistentnu liniju.48 OPŠTI DEO 50 1.7.4. Citotoksično dejstvo Eufornin (IC50 3,1, odnosno 13,4 μM), izolovan iz E. helioscopia, deluje citotoksično na HeLa ćelije humanog karcinoma grlića materice i MDA-MB-231 ćelije humanog tumora dojke. 86 Gujonianini E i F i (2S*,3S*,4R*,5R*,7R*,13R*,14R*,15R*)-5,7,14-triacetoksi- 3-benzoiloksi-15-hidroksijatrofa-6(17),11E-dien-9-on, jatrofanski diterpeni izolovani iz Euphorbia guyoniana, ispoljavaju snažnu do umerenu citotoksičnost prema HEK293, humanim embrionalnim ćelijama bubrega 293, sa IC50 vrednostima od 35, 70, odnosno 100 μM.45 Jatrofani izolovani iz Euphorbia turczaninowii ne deluju citotoksično na B16 ćelijsku liniju melanoma miševa.49 Jatrofon je citotoksičan za ćelijsku kulturu Mycobacterium tuberculosis (Kohov bacil) u koncentraciji od 0,17 μg/mL.107 1.7.5. Antivirusno dejstvo Analizom niza jatrofana izolovanih iz Euphorbia hyberna ustanovljeno je da se jedan od njih, SJ23B, odlikuje snažnim antivirusnim dejstvom – podstiče internalizaciju HIV-1 receptora (CD4, CCR5 i CXCR4) i sprečava R5 i X4 virusne infekcije u ljudskim osnovnim primarnim T ćelijama u nanomolarnim koncentracijama. Osim toga, SJ23B je i snažan antagonist HIV-1 latencije. Iz svega ovoga sledi da jatrofanski diterpeni predstavljaju potencijalne anti-HIV agense, koji bi mogli da se koriste za ublažavanje reaktivacije HIV-a.168 OPŠTI DEO 51 1.7.6. Antimikrobno dejstvo Japodagron, jatrofanski diterpen izolovan iz korena Jatropha podagrica Hook, ispoljava antibakterijsko dejstvo protiv Bacillus subtilis (ATCC 6051), dajući zonu bez porasta od 12 mm na 20 μg/disku u standardnoj disk probi.105 Jatrofani izolovani iz lateksa Pedilanthus tithymaloides pokazuju antimalarijsko dejstvo prema Plasmodium falciparum K1 (IC50 vrednosti u opsegu 3,4 – 4,4 μg/mL) i umereno do slabo antituberkulozno dejstvo protiv Mycobacterium tuberculosis H37 Ra sa vrednostima minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) u opsegu 12,5 – 100 μg/mL.89 1.7.7. Antitumorsko dejstvo Jatrofon, eufoskopin A, eufoskopin B i eufornin pokazuju antitumorsko dejstvo. 59 Jatrofon je, npr., ispoljio značajno antileukemijsko dejstvo na P-388 limfocitnu leukemiju miševa kada je primenjen u koncentracijama od 27 i 12 mg/kg.107 1.7.8. Proinflamatorno i tumor promotorsko dejstvo Standardnim ogledom na miševima, koji se svodi na aplikovanje ispitivanih supstanci na kožu ušiju miševa, procenjivano je proinflamatorno dejstvo nekih jatrofana izolovanih iz E. peplus i E. esula. 60 Utvrđeno je da, od svih ispitivanih jedinjenja, samo (2S*,3S*,4R*,5R*,7S*,8S*,9S*,l3S*,15R*)-3,9,15-trihidroksi-7-izobutanoiloksi-5,8-bis- (2-metilbutanoiloksi)jatrofa-6(17),11-E-dien-14-on ima slabo proinflamatorno dejstvo koje se ispoljava pojavom crvenila na tretiranom mestu: ID 450 = ID 24 50 = 29 μg/uhu (crvenilo kože uha procenjivano je 4 i 24 sata po nanošenju acetonskog rastvora ispitivanih jedinjenja). Ovi rezultati ukazuju da jatrofani ne izazivaju iritaciju kože i ne doprinose u značajnoj meri proinflamatornom dejstvu vrsta iz familije Euphorbiaceae, i da su za snažno iritantno dejstvo ili toksično dejstvo ovih vrsta, pa i E. peplus, uglavnom odgovorni forboidi. To potkrepljuju i rezultati dobijeni sa serijom neiritantnih jatrofanskih estara izolovanih iz acetonskog i metanolnog ekstrakta E. characias, koji su OPŠTI DEO 52 u ogledima pokazali iritantno dejstvo, 78 kao i sa serijom jatrofana izolovanih iz E. turczaninowii. 49 1.8. Biljna vrsta Euphorbia dendroides E. dendroides L. je višegodišnji listopadni drvenoliki semisukulentni grm široke krošnje, kratkih i šibolikih grana koje se granaju rašljasto, visine do 3 m. Ima koru smeđe do crvenkastosmeđe boje koja, kao i grančice, sadrži obilje mlečnog soka. Korenov sistem je dobro razvijen i prodire duboko u pukotine krečnjačkih stena. Listovi su jednostavni, naizmenični, pri vrhu izdanaka gusto zbijeni, duguljasto-kopljasti, tupog ili šiljastog vrha, klinaste osnove, sa celom ivicom, sedeći. Na licu i naličju su svetlozeleni ili plavkastosivi, goli, a pre opadanja ljubičastocrvene boje. Biljka lista početkom jeseni, u proleće odbacuje lišće tako da je u vreme letnjih suša u bezlisnom stanju i ponovo lista s jesenjim kišama. Cveta od kasne jeseni pa sve do maja. Cvetovi su grupisani u tzv. cijatijume koji se sastoje iz središnjeg ženskog cveta opkoljenog sa 10 ili više izrazito jednostavnih muških cvetova sastavljenih iz po jednog jedinog prašnika u peharolikom omotaču na čijem obodu se nalazi 4 – 5 žlezda. Vrat tučka je razdeljen na tri dela. Plod je čahura sa 2 – 6 semena, pomalo spljošten i gladak. Seme je ovalno, tamno i glatko. Biljka se razmnožava iz semena ili vegetativno. Osetljiva je na mraz, pa raste na zaštićenim i sunčanim obroncima brdovitih priobalnih područja Mediterana na kamenitoj podlozi, obično u pukotinama stena169 (Slika 6). E. dendroides L. se od antičkih vremena upotrebljava u etnofarmakologiji, što je dokumentovano u starogrčkoj i rimskoj medicinskoj literaturi. Biljka, kao i druge mlečike, ima mlečne kanale iz kojih luči lateks koji je upotrebljavan za uklanjanje bradavica, kao riblji otrov i kao purgativ (sredstvo za čišćenje) po čemu je veoma slična E. characias L., jednoj od najefikasnijih mlečika prema podacima iz antičkog doba.170 Uprkos svom obilju, E. dendroides nije mnogo fitohemijski proučavana. Glavni cilj naučnog istraživanja ove vrste dugo je bio ograničen na njenu upotrebu kao bogatog izvora biomase za proizvodnju goriva. 171 S druge strane, vrste familije Euphorbiaceae iz roda Euphorbia predmet su mnogih savremenih istraživanja, najpre zbog toga što su veoma plodni proizvođači biološki aktivnih sekundarnih metabolita, prvenstveno jedinstvenih diterpena velikog biomedicinskog značaja.39,116,172 To je podstaklo OPŠTI DEO 53 naučnike da mnogo detaljnije proučavaju E. dendroides. Do sada je proučavana ova vrsta različitog geografskog porekla: isparljive supstance E. dendroides poreklom iz Grčke,173 epikutikularni voskovi E. dendroides,174 antioksidativna i citotoksična aktivnost E. dendroides iz Egipta, 175 ulje, 176 tokoferoli, masne kiseline i steroli, 177 kao i diterpeni 53,111 E. dendroides poreklom sa Sardinije, ali ova vrsta sa izabranog lokaliteta (Crna Gora) do sada nije fitohemijski proučavana. Slika 6. E. dendroides. 178,179,180,181,182,183,178 2. NAŠI RADOVI NAŠI RADOVI 55 Cilj ove doktorske disertacije bio je izolovanje diterpena jatrofanskog tipa iz biljnog materijala – Euphorbia dendroides, određivanje strukture izolovanih jedinjenja i ispitivanje njihovih bioloških aktivnosti. Jedinjenja su izolovana primenom standardnih tehnika: „dry-column flash“ hromatografije, hromatografije na koloni i preparativne tankoslojne hromatografije, kao i preparativne tečne hromatografije. Strukture i relativne konfiguracije izolovanih jedinjenja određene su primenom savremenih spektrometrijskih i spektroskopskih metoda: masene spektrometrije visokog razlaganja (HRESIMS), 1D i 2D NMR spektroskopije ( 1 H, 13 C, DEPT, COSY, NOESY, HSQC, HMBC), UV i IR spektroskopije i polarimetrije, kao i poređenjem dobijenih spektralnih podataka sa spektralnim podacima srodnih jedinjenja izolovanih iz E. dendroides 53 i iz drugih vrsta roda Euphorbia, kao što su: E. turczaninowii,49 E. obtusifolia, 52 E. terracina, 36 E. amygdaloides, 66 E. altotibetic, 55 E. segetalis, 37 E. peplus, 38 E. semiperfoliata 44 i E. paralias. 69 Odabrana jedinjenja su podvrgnuta testovima za ispitivanje bioloških aktivnosti. 2.1. Jatrofani iz Euphorbia dendroides Iz nadzemnog dela E. dendroides, posle liofilizacije vodeno–etanolnog ekstrakta, ekstrakcije dobijenog koncentrata n-heksanom i prečišćavanja heksanskog ekstrakta „dry-column flash“ hromatografijom (DCFC), preparativnom tankoslojnom hromatografijom (TLC) i preparativnom tečnom hromatografijom (LC), izolovano je i okarakterisano šest novih jatrofana, koji su nazvani eufodendrofani A – F (1 – 5, 16) (Tabela 17). Prečišćavanjem liofilizovanog mlečnog lateksa E. dendroides „dry-column flash“ hromatografijom, hromatografijom na koloni (CC) i preparativnom tečnom hromatografijom izolovano je trinaest novih jatrofana, eufodendrofani G – S (6 – 15, 17 – 19), kao i tri jatrofana izolovana iz nadzemnih delova (1, 2, 16) (Tabela 17). Izolovani jatrofani imaju vrlo slične strukture. Jatrofani 1 – 15 se međusobno razlikuju samo po vrsti, broju i položaju supstituenata, dok se jatrofani 16 – 19 od njih razlikuju po tome što sadrže endocikličnu (Δ5) umesto egzociklične (Δ6(17)) dvostruke NAŠI RADOVI 56 veze. Jedinjenja 1 – 14 su penta- ili heksaesterifikovani jatrofanski polioli koji sadrže keto grupu u položaju C-14, jednu endocikličnu 11 E– i jednu egzocikličnu C-6(17) dvostruku vezu. Jedinjenje 15 je triesterifikovani jatrofanski poliol koji sadrži dve keto grupe (u položajima C-9 i C-14), jednu endocikličnu 11 E– i jednu egzocikličnu C- 6(17) dvostruku vezu. Jedinjenja 16 – 19 su heptaesterifikovani jatrofanski polioli koji sadrže keto grupu u položaju C-14 i dve endociklične dvostruke veze (Δ5 i Δ11). Tabela 17. Jatrofani izolovani iz E. dendroides. 1–14 15 16–19 Izolovano jedinjenje R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 1 (Eufodendrofan A) H Pr Ac iBu Ac Nic H 2 (Eufodendrofan B) H iBu Ac iBu Ac Nic H 3 (Eufodendrofan C) H Pr Ac iBu Ac Nic Ac 4 (Eufodendrofan D) H iBu Ac Ac Bz Ac H 5 (Eufodendrofan E) H Pr Ac iBu Bz Ac H 6 (Eufodendrofan H) H Pr Ac iBu Bz Nic H 7 (Eufodendrofan I) H Pr Ac iBu Nic Nic H 8 (Eufodendrofan J) H Pr Ac iBu iBu Nic H 9 (Eufodendrofan K) H iBu Ac iBu Bz Nic H 10 (Eufodendrofan L) H iBu Ac iBu Nic Nic H 11 (Eufodendrofan M) H iBu Ac Ac Nic Ac H 12 (Eufodendrofan N) H Ac Ac iBu Ac Nic H 13 (Eufodendrofan O) OAc iBu Ac iBu Ac Nic H 14 (Eufodendrofan P) OAc iBu Nic iBu Ac Nic H 15 (Eufodendrofan G) ONic iVal Ac / / / / 16 (Eufodendrofan F) OAc Ac iBu Ac Nic Ac Ac 17 (Eufodendrofan Q) OAc Pr iBu Ac Nic Ac Ac 18 (Eufodendrofan R) OAc Ac iBu Nic Nic Ac Ac 19 (Eufodendrofan S) OAc Ac iBu Ac Bz Ac Ac Ac–acetil; Bz–benzoil; iBu–izobutanoil; iVal–izovaleril; Nic–nikotinoil; Pr–propanoil NAŠI RADOVI 57 2.1.1. 5α,8α-Diacetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-pro- panoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan A) Eufodendrofan A (1) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca. Na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 700,3335, utvrđeno je da je molekulska formula jedinjenja C37H49NO12. Analizom 13 C i 1 H NMR spektara (Slike 7 i 8, Tabela 18), ustanovljeno je da jedinjenje 1 sadrži šest oksigenovanih sp 3 ugljenika (pet sekundarnih i jedan tercijarni), od kojih su za pet vezane estarske grupe (dve acetoksi, jedna izobutanoiloksi, jedna nikotinoiloksi i jedna propanoiloksi), a za preostali je vezana hidroksilna grupa (δH 2,81 s, izmenljiv sa D2O). U NMR spektrima se takođe uočavaju signali keto grupe (δC 214,7), dve dvostruke veze (jedna egzociklična i jedna trans disupstituisana), jedne alifatične metilenske grupe, četiri metil grupe (dva dubleta i dva singleta u 1H NMR) i jednog kvaternernog sp3 ugljenka (δC 40,6). Ukupni izgled NMR spektara, u kombinaciji sa molekulskom formulom, ukazao je na biciklični diterpenski skelet. Primena 2D NMR tehnika (COSY, HMBC i NOESY) omogućila je potpuno određivanje strukture jedinjenja 1. 1H–1H COSY korelacije ukazale su da u molekulu postoje tri odvojena spinska sistema: А (H2-1/H-2, H-2/H3-16, H-2/H-3, H-3/H-4 i H- 4/H-5), B (H-7/H-8 i H-8 /H-9) i C (H-11/H-12, H-12/H-13 i H-13/H3-20) (Slika 9). Povezivanje fragmenata А, B i C omogućeno je analizom 2,3JC–H korelacija iz HMBC spektra (Slika 10). Postojanje daljinskog sprezanja H-5 i H-7 sa C-6 i C-17 (egzociklična dvostruka veza) ukazuje da su fragmenti А i B međusobno vezani C-6 atomom. Veza između fragmenata B i C ostvarena je preko atoma C-10, što je ustanovljeno postojanjem HMBC korelacije protona geminalnih metil–grupa H3-18 i H3-19 (vezane na C-10) sa C-9, C-10 i C-11. Na kraju, HMBC korelacija ugljenika keto–grupe (C-14) sa H-13, H3-20 i sa metilenskom grupom H2-1 dokazuje da su fragmenti А i C međusobno povezani. Ovakvo povezivanje fragmenata ukazalo je da biciklični diterpenski skelet jedinjenja 1 odgovara jatrofanskom tipu, tj. da je to biciklo[10.3.0]pentadekan sa 2,10,10,13-tetrametil-6-egzo-metilen supstitucijom i oksigenovanim ugljenikovim atomima C-3, C-5, C-7, C-8, C-9, C-14 (keton) i C-15, pri NAŠI RADOVI 58 Slika 7. 1 H NMR spektar jedinjenja 1. 20 1''''' 2''''' 3''''' 4''''' 13 9 5 11 3 8 12 4 OH 1α 1β 1' 2 7 17a 1'' 18 1'''' 16 19 3''' 2''' 2' 1''' 17b H O H O H H H HO H H H H O H O O H O H O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 N O O 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .6 4 4 .3 1 3 .5 0 3 .1 8 6 .9 6 5 .8 0 1 .4 9 2 .3 9 4 .3 4 3 .2 8 1 .2 3 2 .2 1 1 .0 8 0 .9 1 0 .9 6 0 .8 1 1 .0 1 2 .8 7 1 .1 1 1 .1 1 1 .1 9 2 .1 3 1 .1 2 1 .0 9 1 .0 5 1 .0 1 1 .0 0 NAŠI RADOVI 59 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 9 .1 1 3 .7 1 7 .9 1 8 .0 1 8 .6 2 0 .8 2 1 .0 2 4 .9 2 5 .2 2 7 .7 3 3 .7 3 7 .9 4 0 .6 4 0 .8 4 9 .9 5 3 .8 6 8 .1 6 9 .0 7 0 .8 7 7 .7 8 1 .4 8 7 .7 1 1 3 .6 1 2 3 .5 1 2 5 .3 1 2 7 .7 1 3 7 .1 1 3 7 .6 1 4 4 .9 1 5 1 .4 1 5 3 .7 1 6 4 .1 1 6 9 .1 1 7 0 .0 1 7 3 .0 1 7 4 .9 2 1 4 .7 Slika 8. 13 C NMR spektar jedinjenja 1. 14 6''''' 2''''' 6 11 4''''' 3''''' 5''''' 12 17 15 9 3 8 7 5 4 1 13 10 2 2''' ugljenici CH3 grupa ugljenici C=O grupa NAŠI RADOVI 60 čemu je za poslednji, sudeći po HMBC korelaciji OH/C-15, vezana slobodna hidroksilna grupa. Položaj estarskih grupa utvrđen je zahvaljujući postojanju korelacija između oksimetinskih protona i ugljenikovih atoma estarskih karbonilnih grupa (Slika 10). Naime, HMBC korelacije H-3 sa karbonilom propanoiloksi grupe (δC 173,1), H-7 sa karbonilom izobutanoiloksi grupe (δC 174,9) i H-9 sa karbonilom nikotinoiloksi grupe (δC 164,1) pokazuju da je propanoiloksi grupa vezana za C-3, izobutanoiloksi grupa za C-7, a nikotinoiloksi grupa za C-9. Pored toga, HMBC korelacije H-5 i H-8 sa karbonilima acetoksi grupa (δC 170,0, odnosno 169,1) dokazuju da su acetoksi grupe vezane za C-5 i C-8. Kao posledica paralelne orijentacije estarskih grupa vezanih za C-7 i C-9, do izražaja dolazi anizotropni uticaj aromatičnog prstena nikotinata vezanog u položaju C-9 koji uzrokuje da se protoni metil–grupa u izobutanoatu nalaze na niskim vrednostima hemijskih pomeranja (δH 0,86 i 0,65). 38 Relativna konfiguracija jedinjenja 1 određena je iz njegovih skalarnih i dipolarnih sprezanja (Slika 11), kao i poređenjem NMR spektara sa spektralnim podacima sličnih jedinjenja.38,101,112 Pod pretpostavkom da za H-4α konfiguraciju postoje biogenetske osnove, 74 NOE korelacije koje se javljaju između protona H-4/H-2 i H-4/H-3 u skladu su sa β-orijentacijom metil–grupe vezane za C-2 i propanoiloksi grupe vezane za C-3. S obzirom na vrednost konstante vicinalnog sprezanja između protona H-4 i H-5 (J4,5 = 0 Hz), ovi protoni se jedan u odnosu na drugi nalaze u ortogonalnom (trans) položaju, što znači da acetoksi grupa vezana za C-5 zauzima α- orijentaciju. NAŠI RADOVI 61 ppm 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Slika 9. Deo COSY spektra sa odabranim 1 H–1H COSY korelacijama jedinjenja 1. 11/12 12/13 2/3 13/H3-20 8/9 i 7/8 2/H3-16 1α/2 1β/2 3/4 4/5 NAŠI RADOVI 62 ppm 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Slika 10. Deo HMBC spektra sa odabranim HMBC korelacijama jedinjenja 1. H-5/C-17 H-5/C-6 H-7/C-17 H-7/C-6 H-8/; 3/; 5/; 9/; 7/ C=O, OC(O)R H-13/C-14 OH/C-14 H-1α/C-14 H-1β/C-14 H3-20/C-14 H3-19/C-10 H3-19/C-9 H3-19/C-11 H3-18/C-10 H3-18/C-9 H3-18/C-11 NAŠI RADOVI 63 Postojanje NOESY korelacije između H-4 i H-7 ukazuje na β-orijentaciju izobutanoiloksi grupe vezane za C-7. Nepostojanje dipolarnog sprezanja između H-7 i H-8 u skladu je sa α-orijentacijom acetoksi grupe na C-8. Pojava NOE između H-5 (δH 5,43) i H-11 (δH 5,92) ukazuje na njihovu prostornu bliskost, tj. da se nalaze na istoj (β) strani makrocikličnog prstena. NOE korelacije koje se javljaju između parova H-5/H-11 i H-5/H-13 definišu α-orijentaciju metil–grupe vezane za C-13. Velika vrednost konstante sprezanja između olefinskih protona H-11 i H-12 (J11,12 = 15,5 Hz) ukazuje na E-konfiguraciju endociklične dvostruke veze, pri čemu se H-12 nalazi na α-strani diterpenoidnog jezgra. S obzirom da se NOE javlja između H-12 i metil–grupe na C-10 (H3-18, δH 1,08), ova metil–grupa zauzma α-orijentaciju. Istovremeno, to znači da je preostala geminalna metil–grupa vezana za C-10 (H3-19, δH 1,33) β-orijentisana. NOE korelacije koje postoje između H3-19 i H-9, kao i između H-8 i H-9 ukazuju da je nikotinoiloksi grupa vezana za C-9 α-orijentisana. NOE korelacije koje se javljaju između OH-15 i H-5 definišu konfiguraciju na C-15 tako da hidroksilna grupa zauzima β-orijentaciju. Nepostojanje NOESY korelacije između H-4 i OH-15 potvrđuje trans vezivanje ciklopentanskog prstena koje je uobičajeno za jatrofanska jedinjenja.93,184 NAŠI RADOVI 64 Slika 11. Deo NOESY spektra jedinjenja 1 sa najvažnijim NOESY korelacijama. 5/11 8/9 5/13 4/7 3/4 5/OH 2/4 9/H3-19 12/H3-18 NAŠI RADOVI 65 2.1.2. 5α,8α-Diacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan B) Eufodendrofan B (2) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C38H51NO12, što je utvrđeno na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 714,3489. Masa ovog jedinjenja se razlikuje za 14 masenih jedinica (CH2 grupa) od mase jedinjenja 1. 1 H i 13 C NMR spektri jedinjenja 2 (Slika 12, Tabela 18) skoro su identični odgovarajućim spektrima jedinjenja 1. Jedina razlika je pojava signala tipičnih za izobutanoiloksi grupu (δH 2,64 (H-2′), 1,27 (H3-3′) i 1,22 (H3-4′) i δC 175,6 (C-1′), 34,28 (C-2′), 19,8 (C-3′) i 18,5 (C- 4′)) umesto signala propanoiloksi grupe vezane za C-3. U HMBC spektru jedinjenja 2 postoji korelacioni signal daljinskog sprezanja ugljenikovog atoma karbonilne grupe izobutanoata (C-1′) i protona H-3. Jedinjenja 1 i 2 imaju i istu relativnu konfiguraciju, što je dokazano poređenjem njihovih NOESY spektara. NAŠI RADOVI 66 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 3 .7 1 7 .9 1 8 .0 1 8 .5 1 8 .6 1 9 .8 2 0 .8 2 1 .1 2 4 .8 2 5 .3 3 3 .7 3 4 .3 3 8 .0 4 0 .6 4 0 .9 5 0 .0 5 3 .7 6 8 .0 6 9 .1 7 0 .8 7 7 .6 8 1 .4 8 7 .7 1 1 3 .8 1 2 3 .5 1 2 5 .4 1 2 7 .8 1 3 7 .1 1 3 7 .6 1 4 4 .8 1 5 1 .4 1 5 3 .8 1 6 4 .1 1 6 9 .1 1 7 0 .0 1 7 4 .9 1 7 5 .6 2 1 4 .6 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .7 4 3 .1 8 3 .4 4 3 .2 3 6 .6 7 3 .3 9 3 .0 9 1 .4 2 4 .3 7 3 .2 0 1 .1 5 1 .0 4 1 .0 1 0 .9 2 0 .9 5 1 .0 0 2 .9 6 1 .1 3 1 .0 1 1 .1 7 2 .1 8 1 .0 8 1 .1 3 1 .0 5 1 .0 4 1 .0 3 Slika 12. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 2. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 67 2.1.3. 5α,8α,15β-Triacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan C) Eufodendrofan C (3) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca. Na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 742,3438, molekulska formula ovog jedinjenja je C39H51NO13. NMR spektri jedinjenja 3 (Slika 13, Tabela 18) veoma su slični NMR spektrima jedinjenja 1. Jedina razlika je pojava signala dodatne acetoksi grupe (δH 2,12 i δC 20,6 i 169,0) uz izostanak signala protona hidroksilne grupe. Molekulska formula jedinjenja 3 u skladu je sa strukturnim elementima koji se uočavaju u 1H i 13C NMR spektrima – to je biciklični diterpenoid koji sadrži šest estarskih funkcionalnih grupa (tri acetoksi, jedna propanoiloksi, jedna izobutanoiloksi i jedna nikotinoiloksi grupa). Položaj estarskih grupa utvrđen je zahvaljujući HMBC korelacionim signalima estarskih karbonilnih ugljenikovih atoma i susednih oksimetinskih protona. Karbonili nikotinoiloksi, izobutanoiloksi i propanoiloksi grupa se sprežu sa H-9, H-7, odnosno H-3, dok se karbonili dve acetoksi grupe sprežu sa protonima H-5 i H-8, što potvrđuje da je položaj ovih estarskih grupa isti kao u jedinjenju 1. Daljinska sprezanja između karbonilnog ugljenikovog atoma preostale acetoksi grupe i protona iz prstena ne postoje, što ukazuje da je ova estarska grupa vezana za C-15, tj. na mestu spajanja dva prstena. Acetoksi grupa u položaju 15 uzrokuje paramagnetno pomeranje H-1α i H-5 (Δδ = 0,55, odnosno 0,40 ppm) i dijamagnetno pomeranje H-4 i H-13 (Δδ = -0,34, odnosno -0,64 ppm) u poređenju sa njihovim položajem u jedinjenju 1. NOESY eksperiment je pokazao da jedinjenja 3 i 1 imaju istu relativnu konfiguraciju. Na osnovu molekulske formule i NMR spektara, jedinjenje 3 je acetilovani analog jedinjenja 1. NAŠI RADOVI 68 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 9 .2 1 3 .4 1 7 .9 1 8 .8 1 9 .9 2 0 .6 2 1 .1 2 1 .1 2 4 .0 2 6 .9 2 8 .0 2 9 .7 3 3 .6 3 8 .3 4 0 .2 4 2 .8 4 5 .8 5 2 .8 6 7 .8 6 8 .4 7 1 .1 7 6 .2 7 9 .9 9 2 .9 1 1 1 .1 1 2 3 .6 1 2 5 .3 1 3 1 .5 1 3 7 .0 1 4 4 .7 1 5 1 .3 1 5 3 .8 1 6 4 .0 1 6 9 .0 1 6 9 .5 1 7 0 .5 1 7 3 .0 1 7 5 .5 2 1 2 .3 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .9 1 7 .1 2 3 .5 0 7 .1 6 4 .2 8 1 .4 5 3 .4 5 8 .0 9 1 .2 4 2 .2 1 0 .9 8 1 .0 5 1 .0 6 3 .2 8 1 .2 0 1 .1 1 1 .1 3 2 .0 5 1 .1 5 1 .2 4 1 .0 5 1 .1 1 1 .0 0 Slika 13. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 3. O OH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20O NAŠI RADOVI 69 Tabela 18. NMR podaci za jedinjenja 1–3 [500 MHz (1H), 125 MHz (13C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj 1 2 3 δH δC δH δC δH δC 1α 2,51 dd (14; 11) 49,9 2,53 dd (14; 11) 50,0 3,06 dd (14; 6,5) 45,8 1β 1,59 dd (14; 11) 1,60 dd (14; 11) 1,64 bt (14) 2 2,26 m 37,9 2,26 m 38,0 2,29 m 38,3 3 5,55 t (4,5) 77,7 5,55 t (4,5) 77,6 5,41 bs 76,2 4 3,13 brs 53,8 3,13 brs 53,7 2,79 d (3,0) 52,8 5 5,43 brs 68,0 5,41 brs 68,0 5,83 brs 67,8 6 144,9 144,8 144,7 7 5,08 brs 69,0 5,07 brs 69,1 5,08 brs 68,4 8 5,63 brs 70,8 5,68 brs 70,8 5,53 brs 71,1 9 5,22 brs 81,4 5,22 brs 81,4 5,21 d (2,0) 80,0 10 40,6 40,9 40,2 11 5,92 d (15,5) 137,6 5,92 d (15,5) 137,6 5,94 d (16) 137,0 12 5,71 m 127,7 5,71 m 127,8 5,76 m 131,5 13 4,25 40,8 4,25 40,6 3,61 m 42,8 14 214,7 214,6 212,3 15 87,7 87,9 92,9 16 0,93 d (6,5) 13,7 0,93 d (6,5) 13,7 0,92 d (6,5) 13,4 17a 5,06 brs 113,6 5,05 brs 113,8 5,06 brs 111,1 17b 5,14 brs 5,14 brs 5,09 brs 18 1,08 brs 25,2 1,07 brs 25,3 1,06 brs 26,9 19 1,33 brs 24,9 1,34 brs 24,8 1,25 brs 24,0 20 1,22 d (7,02) 18,6 1,23 d (7,02) 18,6 1,20 d (6,0) 19,9 OR2-3 1′ 2,41 dq (7,5; 4,5) 173,1 2,64 h (7,0) 175,6 2,40 dq (7,5; 4,5) 173,0 2′ 1,19 t (7,5) 27,7 1,27 (7,0) 34,3 1,19 d (7,5) 28,0 3′ 9,1 1,22 (7,0) 19,8 9,2 4′ 18,5 OR3-5 1′′ 2,07 s 170,0 2,08 s 169,1 2,03 s 169,5 2′′ 20,8 21,1 21,1 OR4-7 1′′′ 1,95 bm 174,9 1,98 bm 174,9 2,49 h (7,5) 175,5 2′′′ 0,86 brs 33,7 0,86 d (7,0) 33,7 0,93d (7,0) 33,7 3′′′ 0,65 brs 17,9 0,63 d (7,0) 17,9 0,73 brs 18,8 4′′′ 18,0 18,0 17,9 OR5-8 1′′′′ 1,98 s 169,1 1,98 s 170,0 2,10 s 170,5 2′′′′ 21,0 20,8 21,1 OR6-9 1′′′′′ 9,25 brs 164,1 9,26 brs 164,1 9,21 brs 164,0 2′′′′′ 8,80 brs 151,4 8,82 brs 151,5 8,81 brs 151,3 3′′′′′ 8,26 brd 125,3 8,26 brd 125,4 8,20 brd 125,3 4′′′′′ 7,45 brdd 137,1 7,47 brdd 137,1 7,45 brdd 137,0 5′′′′′ 123,5 123,5 123,6 6′′′′′ 153,7 153,8 153,9 OR7-15 1′′′′′′ 2,81 s 2,81 s 2,12 s 169,0 2′′′′′′ 20,6 NAŠI RADOVI 70 2.1.4. 5α,7β,9α-Triacetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-3β-izobutanoiloksijatrofa- 6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan D) Eufodendrofan D (4) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C37H48O12, što je utvrđeno na osnovu molekulskog jona [M + NH4] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 702,3483. Poređenje njegovih 1H i 13 C NMR spektara (Slika 14, Tabela 19) sa NMR spektrima jedinjenja 1 pokazalo je da su ova jedinjenja slična i da je jedina razlika broj, vrsta i položaj estarskih grupa. Na osnovu NMR spektara, jedinjenje 4 sadrži benzoiloksi, izobutanoiloksi i tri acetoksi grupe. Na prisustvo benzoiloksi grupe upućuju 1H i 13C signali na δH 7,42, 7,54 i 8,01 i δC 165,2, 130,0, 129,9 i 133,0. U HMBC spektru postoji korelacija H-8 sa karbonilnim ugljenikovim atomom benzoata, što predstavlja dokaz da je benzoiloksi grupa vezana za C-8. Položaj preostalih estarskih grupa (3-izobutanoiloksi i 5,7,9-triacetoksi) takođe je određen na osnovu daljinskih sprezanja između estarskih karbonilnih ugljenikovih atoma i susednih oksimetinskih protona. 2.1.5. 5α,9α-Diacetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-3β-propa- noiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan E) Eufodendofan E (5) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca. U HRESI masenom spektru ovog jedinjenja na m/z 716,3652 javlja se jon [M + NH4] + koji je u skladu sa molekulskom formulom C38H50O12. Podaci u 1 H i 13 C NMR spektrima jedinjenja 5, koji su dobijeni zahvaljujući 2D NMR eksperimentima (Slika 15, Tabela 19), veoma su slični odgovarajućim podacima jedinjenja 4. Razlikuju se jedino u signalima za propanoiloksi grupu na C-3, umesto izobutanoiloksi i za izobutanoiloksi grupu na C-7, umesto acetoksi. Položaj navedenih estarskih grupa je određen na osnovu HMBC korelacija karbonilnih ugljenika odgovarajućih estara (δC 173,2 i 174,9) i H-3, odnosno H-7. Ostali korelacioni signali u HMBC spektru potvrđuju predloženu strukturu. NAŠI RADOVI 71 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 3 .6 1 8 .2 1 8 .6 1 9 .7 2 0 .7 2 0 .8 2 1 .1 2 3 .8 2 6 .3 3 4 .4 3 8 .2 3 9 .9 4 0 .5 5 0 .0 5 3 .4 5 3 .6 6 8 .8 6 9 .7 7 1 .2 7 7 .5 8 0 .7 8 7 .5 1 1 1 .7 1 2 7 .1 1 2 8 .4 1 2 9 .9 1 3 3 .0 1 3 7 .7 1 4 5 .5 1 6 5 .2 1 6 9 .2 1 6 9 .8 1 7 5 .5 1 7 5 .5 2 1 4 .7 A 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 1 .1 4 3 .6 5 3 .2 5 3 .0 3 3 .3 8 4 .6 9 2 .8 6 2 .9 1 3 .0 9 2 .8 2 2 .6 2 1 .0 0 0 .9 7 0 .7 9 0 .8 7 1 .0 0 0 .8 2 2 .7 4 0 .9 0 1 .0 9 1 .0 1 2 .0 8 2 .0 2 1 .0 2 1 .9 5 Slika 14. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 4. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 72 B A 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 9 .8 1 1 6 .7 3 2 .7 8 1 .6 1 3 .1 6 2 .9 7 1 .1 6 3 .7 7 0 .9 4 7 .7 1 1 .0 0 3 .4 9 0 .9 0 1 .1 0 1 .0 3 1 .9 8 2 .0 0 1 .0 5 2 .0 1 Slika 15. 1 H NMR (A) i HSQC (B) spektar jedinjenja 5. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 73 2.1.6. 5α-Acetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoil- oksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan H) Eufodendrofan H (6) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C42H51NO12, što je utvrđeno na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 762,3487. Poređenjem 1H i 13C NMR spektralnih podataka ovog jedinjenja (Slika 16, Tabela 19) sa odgovarajućim podacima za eufodendrofan A, može se zaključiti da je jedina razlika između ova dva jedinjenja vezivanje benzoiloksi grupe za C-8 u jatrofanu 6, umesto acetoksi grupe koja je u jatrofanu 1 vezana u istom položaju. Prisustvo benzoiloksi grupe je očigledno na osnovu pojave 1 H i 13C NMR signala na δH 7,44, 7,55, 8,04 i δC 165,3, 130,0, 129,9, 128,4, 133,1, 128,4, 129,9, dok postojanje HMBC korelacije između H-8 i ugljenikovog atoma karbonilne grupe benzoata potvrđuje da je ova estarska grupa vezana u položaju C-8. Položaji ostalih estarskih grupa, 3-propanoiloksi, 5-acetoksi, 7-izobutanoiloksi i 9- nikotinoiloksi, takođe su određeni na osnovu daljinskih sprezanja između estarskih karbonilnih ugljenikovih atoma i susednih oksimetinskih protona. NAŠI RADOVI 74 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 9 .1 1 3 .7 1 7 .9 1 8 .4 1 8 .7 2 1 .0 2 4 .0 2 6 .4 2 7 .8 3 3 .8 3 8 .2 3 9 .9 4 0 .8 4 9 .7 5 4 .1 6 8 .7 6 9 .1 7 1 .5 7 7 .5 8 1 .8 8 7 .8 1 1 1 .1 1 2 3 .6 1 2 5 .4 1 2 7 .9 1 2 8 .4 1 2 9 .9 1 3 0 .0 1 3 3 .0 1 3 7 .0 1 3 7 .4 1 4 5 .8 1 5 1 .4 1 5 3 .8 1 6 4 .0 1 6 5 .3 1 6 9 .4 1 7 2 .8 1 7 4 .8 2 1 5 .2 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 3 .1 2 3 .4 8 3 .4 8 3 .2 9 3 .8 8 4 .4 6 3 .3 1 4 .6 2 0 .8 6 3 .6 2 1 .1 2 0 .9 6 1 .0 7 1 .0 3 3 .1 0 1 .1 0 1 .0 3 1 .1 5 1 .0 8 2 .2 3 3 .2 8 1 .1 2 2 .1 3 1 .0 6 1 .0 7 1 .0 0 Slika 16. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 6. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 75 Tabela 19. NMR podaci za jedinjenja 4–6 [500 MHz (1H), 125 MHz (13C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj 4 5 a 6 δH δC δH δC δH δC 1α 2,51 brs 50,0 2,40 m 49,7 2,59 m 49,7 1β 1,58 dd 1,60 t (12) 1,60 m 2 2,25 brs 38,2 2,29 bm 38,3 2,29 bm 38,1 3 5,57 brs 77,5 5,60 brs 77,3 5,58 brs 77,5 4 3,12 brs 53,6 3,07 brs 53,9 3,09 brt 54,0 5 5,47 brs 68,8 5,42 brs 68,7 5,49 brs 68,7 6 145,5 145,9 145,8 7 4,88 brs 69,7 4,82brs 69,0 4,98 brs 69,1 8 5,65 brs 71,2 5,70 brs 71,3 5,82 s 71,5 9 5,06 brs 80,7 5,06 brs 80,6 5,33 s 81,8 10 40,5 40,6 40,8 11 5,90 d (16,0) 137,8 5,86 d (16,0) 137,7 5,99 d (16,0) 137,4 12 5,83 m 127,1 5,92 m 127,0 5,97 dd (16,0; 9,5) 128,4 13 4,20 m 39,9 4,21 m 39,8 4,30 m 39,9 14 214,7 215,1 215,2 15 87,5 87,1 87,8 16 0,93 d (6,5) 13,6 0,93 d (6,5) 13,5 0,94 d (6,5) 13,7 17a 5,01 brs 111,8 4,96 brs 110,9 5,04 brs 111,1 17b 5,08 brs 5,03 brs 4,94 brs 18 0,98 brs 26,3 0,96 brs 26,6 1,05 brs 24,0 19 1,39 brs 23,8 1,42 brs 23,4 1,49 brs 26,4 20 1,22 d (7,0) 18,2 1,16 d (7,0) 18,3 1,25 d (6,5) 18,7 OR2-3 1′ 2,60 h (7,0) 175,5 2,40 q (7,5) 173,2 2,41 dq (7,5; 4,5) 172,8 2′ 1,26 d (7,0) 34,4 1,17 t (7,5) 27,8 1,17 t (7,5) 27,8 3′ 1,19 d (7,0) 18,6 9,3 9,1 4′/5′ 19,7 OR3-5 1′′ 2,09 s 169,2 2,09 s 169,2 169,4 2′′ 20,7 20,8 1,98 s 21,0 OR4-7 1′′′ 2,07 s 169,2 2,06 h (7,0) 174,9 1,94 brm 174,8 2′′′ 20,8 1,20 d (7,0) 34,1 0,90 d (7,0) 33,8 3′′′ 1,16 d (7,0) 19,2 0,69 d (7,0) 17,9 4′′′ 18,5 18,4 OR5-8 1′′′′ 165,2 165,2 165,3 2′′′′ 8,01 d (8,5) 130,0 8,02 d (8,5) 129,8 8,04 d (7,5) 130,0 3′′′′ 7,54 t (7,5) 129,9 7,56 t (7,5) 129,9 7,55 t (7,5) 129,9 4′′′′ 7,42 t (8,0) 128,3 7,43 t (8,0) 128,6 7,44 t (7,5) 128,4 5′′′′ 7,54 t (7,5) 133,0 7,56 t (7,5) 133,2 7,55 t (7,5) 133,1 6′′′′ 8,01 d (8,5) 128,4 8,02 d (8,5) 128,4 8,04 d (7,5) 128,4 7′′′′ 129,9 129,9 129,9 OR6-9 1′′′′′ 1,95 s 169,9 1,97 s 170,0 9,26 brs 2′′′′′ 21,2 21,0 8,82 brd (3,5) 151,4 3′′′′′ 8,26 brd (8,0) 125,4 4′′′′′ 137,0 5′′′′′ 123,6 6′′′′′ 153,8 7′′′′′ 164,0 OR7-15 1′′′′′′ 2,67 s 2,53 s 2,72 s a Podaci dobijeni na osnovu HMBC i HSQC spektara. NAŠI RADOVI 76 2.1.7. 5α-Acetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-8α,9α-dinikotinoiloksi-3β- propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan I) i 5α-acetoksi-15β-hidroksi-7β,8α-diizobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propanoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan J) Eufodendrofan I (7) i eufodendrofan J (8) izolovani su kao bezbojne amorfne čvrste supstance molekulskih formula C41H50N2O12, odnosno C39H53NO12, na osnovu molekulskih jona [M + H] + koji se u HRESI masenim spektrima ovih jedinjenja javljaju na m/z 763,3449, odnosno 728,3651. Jedinjenja 7 i 8 se, kao i jedinjenje 6, među sobom razlikuju samo po vrsti estarske grupe vezane za C-8 atom. Umesto 8-benzoiloksi grupe u jedinjenju 6, na osnovu NMR podataka (Slike 17 i 18, Tabela 20), u jedinjenju 7 u ovom položaju je vezana nikotinoiloksi, a u jedinjenju 8 izobutanoiloksi grupa. Da se ove estarske grupe nalaze u ovom položaju potvrđuju HMBC korelacije između odgovarajućih estarskih karbonilnih ugljenika (δC 164,0, odnosno 175,6) sa protonom H-8 (δH 5,88, odnosno 5,59). Položaji ostalih estarskih grupa (3-propanoiloksi, 5- acetoksi, 7-izobutanoiloksi, 9-nikotinoiloksi, za oba jedinjenja) takođe su određeni na osnovu daljinskih sprezanja između estarskih karbonilnih ugljenikovih atoma i susednih oksimetinskih protona. NAŠI RADOVI 77 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 9 .1 1 3 .7 1 7 .9 1 8 .4 2 1 .0 2 4 .1 2 6 .3 2 7 .8 3 3 .7 3 8 .1 3 9 .9 4 0 .8 4 9 .8 5 4 .0 6 8 .7 6 8 .9 7 2 .2 7 7 .4 8 1 .6 8 7 .8 1 1 1 .3 1 2 3 .4 1 2 6 .0 1 2 7 .9 1 3 7 .0 1 3 7 .3 1 4 5 .8 1 5 1 .2 1 5 1 .4 1 5 3 .5 1 5 3 .9 1 6 4 .0 1 6 4 .1 1 6 9 .2 1 7 2 .8 1 7 4 .8 2 1 5 .0 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .8 8 8 .3 9 3 .4 6 4 .1 2 1 3 .4 8 5 .6 2 4 .4 6 4 .2 4 2 .0 2 0 .9 0 1 .0 0 2 .8 2 1 .2 7 0 .9 0 0 .9 7 0 .9 6 1 .8 8 2 .0 6 1 .8 7 1 .7 9 1 .7 9 Slika 17. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 7. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 N NAŠI RADOVI 78 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 9 .1 1 3 .7 1 7 .9 1 8 .1 1 8 .6 1 8 .7 1 8 .9 2 0 .0 2 1 .0 2 4 .7 2 5 .4 2 7 .8 3 3 .7 3 4 .1 3 7 .4 4 0 .5 4 0 .7 4 9 .9 5 3 .9 6 8 .4 6 9 .1 7 0 .5 7 7 .6 8 1 .5 8 7 .7 1 1 2 .6 1 2 3 .5 1 2 5 .7 1 2 7 .6 1 3 7 .0 1 3 7 .6 1 4 5 .4 1 5 1 .4 1 5 3 .7 1 6 4 .0 1 6 9 .1 1 7 3 .0 1 7 4 .9 1 7 5 .6 2 1 4 .8 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .9 3 4 .8 5 3 .7 6 4 .7 0 2 2 .1 3 1 .0 8 5 .1 7 1 .7 4 1 .6 9 2 .2 2 1 .9 9 0 .9 3 0 .9 2 1 .0 0 4 .3 4 1 .0 7 1 .9 9 0 .9 2 1 .2 4 1 .1 5 0 .9 7 0 .8 3 0 .8 5 Slika 18. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 8. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 79 2.1.8. 5α-Acetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-9α-nikoti- noiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan K) Eufodendrofan K (9), izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C43H53NO12, na osnovu molekulskog jona [M + Na] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 798,3457, razlikuje se za 14 masenih jedinica (CH2) od molekulske mase jedinjenja 6. Ova razlika se objašnjava vezivanjem izobutanoiloksi grupe za C-3 atom (umesto propanoiloksi grupe vezane za isti C-atom u jedinjenju 6). 1 H i 13 C NMR podaci (Slika 19, Tabela 20) i HMBC korelacije koje se javljaju između estarskih karbonilnih ugljenikovih atoma i susednih oksimetinskih protona omogućili su određivanje položaja ostalih estarskih grupa. Tako je za C-5 vezana acetoksi, za C-8 benzoiloksi, za C-9 nikotinoiloksi grupa, a izobutanoiloksi grupa je, osim za C-3, vezana i za C-7 atom. 2.1.9. 5α-Acetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-8α,9α-dinikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan L) Eufodendrofan L (10) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C42H53N2O12, na osnovu molekulskog jona [M] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 777,3607. 1 H i 13 C NMR spektri (Slika 20, Tabela 21) ovog jedinjenja slični su odgovarajućim spektrima jedinjenja 2 i 9. Jedina razlika potiče od pojave signala 8-nikotinoiloksi umesto signala 8-acetoksi grupe u jedinjenju 2, odnosno 8-benzoiloksi grupe u jedinjenju 9. Položaji ostalih estarskih grupa (acetoksi u položaju C-5, izobutanoiloksi u položajima C-3 i C-7 i nikotinoiloksi u položajima C-8 i C-9) potvrđeni su HMBC korelacijama između estarskih karbonilnih ugljenikovih atoma i susednih oksimetinskih protona. NAŠI RADOVI 80 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 3 .7 1 7 .9 1 8 .4 1 8 .6 1 8 .7 1 9 .7 2 1 .1 2 4 .1 2 6 .3 3 3 .8 3 4 .4 3 8 .3 3 9 .9 4 0 .8 4 9 .8 5 4 .0 6 8 .8 6 9 .1 7 1 .5 7 7 .4 8 1 .8 8 7 .8 1 1 1 .3 1 2 3 .6 1 2 5 .8 1 2 8 .0 1 2 8 .4 1 2 8 .9 1 2 9 .9 1 3 3 .1 1 3 7 .0 1 3 7 .5 1 4 5 .8 1 5 1 .9 1 5 3 .8 1 6 3 .9 1 6 5 .9 1 6 9 .2 1 7 4 .9 1 7 5 .4 2 1 5 .2 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 3 .0 8 3 .4 4 3 .3 7 3 .2 7 3 .5 7 7 .1 9 3 .2 8 9 .1 6 0 .6 2 4 .4 9 0 .7 3 1 .3 6 2 .0 6 0 .9 6 1 .0 5 1 .0 3 3 .0 2 1 .0 2 2 .0 7 1 .0 8 2 .1 2 3 .1 3 1 .0 5 1 .9 5 1 .0 5 1 .0 4 1 .0 0 Slika 19. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 9. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 81 Tabela 20. NMR podaci za jedinjenja 7–9 [500 MHz (1H), 125 MHz (13C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj 7 8 9 δH δC δH δC δH δC 1α 2,58 m 49,8 2,52 m 49,9 2,58 m 49,8 1β 1,60 m 1,59 m 1,61 m 2 2,30 m 38,1 2,26 brm 37,4 2,30 brm 38,3 3 5,59 brs 77,4 5,57 brs 77,6 5,56 brs 77,4 4 3,09 brt 54,0 3,10 brs 53,9 3,10 brt 54,0 5 5,44 brs 68,7 5,43 brs 68,4 5,50 brs 68,8 6 145,8 145,4 145,8 7 5,02 brs 68,9 5,03 brs 69,1 4,99 brs 69,1 8 5,88 s 72,1 5,59 brs 70,5 5,83 s 71,5 9 5,34 s 81,6 5,20 s 81,5 5,34 s 81,8 10 40,8 40,7 40,8 11 6,01 d (16,0) 137,3 5,92 d (16,0) 137,6 5,99 m 137,3 12 5,97 m 127,9 5,78 m 127,6 5,97 m 128,0 13 4,29 m 39,9 4,25 m 40,5 4,31 m 39,9 14 215,0 214,8 215,2 15 87,8 87,7 87,8 16 0,94 d (7,0) 13,7 0,93 d (6,5) 13,7 0,94 d (6,5) 13,7 17a 5,06 brs 111,3 5,13 brs 112,6 5,04 brs 111,3 17b 4,96 brs 5,03 brs 4,94 brs 18 1,06 brs 24,1 1,05 brs 24,7 1,05 brs 24,1 19 1,49 brs 26,3 1,36 brs 25,5 1,48 brs 26,2 20 1,26 (7,0) 18,3 1,22 d (6,5) 18,1 1,25 d (7,0) 18,7 OR2-3 1′ 2,40 m 172,8 2,41 m 173,0 2,60 m 175,4 2′ 1,16 t (7,5) 27,8 1,19 t (7,5) 27,8 1,18 d (7,0) 34,3 3′ 9,1 9,1 1,26 d (7,0) 18,6 4′/5′ 19,7 OR3-5 1′′ 1,97 s 169,2 1,97 s 169,0 1,98 s 169,2 2′′ 21,0 21,0 21,0 OR4-7 1′′′ 1,94 brm 174,8 1,96 brm 174,8 1,94 brm 174,8 2′′′ 0,90 d (7,0) 33,7 0,85 d (7,0) 33,7 0,89 d (7,0) 33,8 3′′′ 0,68 d (7,0) 17,9 0,67 d (7,0) 17,9 0,69 d (7,0) 17,9 4′′′ 18,4 18,6 18,4 OR5-8 1′′′′ 9,25 brs 151,2 2,57 h (7,0) 175,6 165,9 2′′′′ 8,78 brs 125,9 1,16 d (7,0) 34,1 8,04 d (7,5) 129,9 3′′′′ 8,25 brd (8,0) 137,3 1,16 d (7,0) 18,9 7,55 t (7,5) 129,9 4′′′′ 7,39 brm 123,4 18,8 7,43 t (7,5) 128,4 5′′′′ 153,5 7,55 t (7,5) 133,0 6′′′′ 164,0 8,04 d (7,5) 128,8 7′′′′ 129,9 OR6-9 1′′′′′ 9,26 brs 9,26 brs 9,26 brs 2′′′′′ 8,82 brs 151,4 8,81 brs 151,5 8,82 brd (5,0) 151,9 3′′′′′ 8,29 brd (8,0) 126,0 8,25 d (7,5) 125,7 8,26 brd (8,0) 125,8 4′′′′′ 7,46 brm 137,0 7,45 brm 137,0 7,47 brm 137,5 5′′′′′ 123,6 123,6 123,6 6′′′′′ 153,9 153,8 153,8 7′′′′′ 164,0 164,0 163,9 OR7-15 1′′′′′′ 2,65 s 2,77 s 2,74 s NAŠI RADOVI 82 2.1.10. 5α,7β,9α-Triacetoksi-15β-hidroksi-3β-izobutanoiloksi-8α-nikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan M) Eufodendrofan M (11) je bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C36H47NO12, na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 686,3186. Spektralni podaci ovog jedinjenja (Slika 21, Tabela 21) ukazuju da je strukturno slično jedinjenju 4, od kojeg se razlikuje po tome što za C-8 ima vezanu nikotinoiloksi grupu umesto benzoiloksi. Prema tome, jedinjenje 11 je pentaesterifikovani diterpenski poliol jatrofanskog tipa kod kojeg je izobutanoiloksi grupa vezana za C-3, nikotinoiloksi za C-8, a acetoksi grupe se nalaze u položajima C- 5, C-7 i C-9. 2.1.11. 3β,5α,8α-Triacetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksija- trofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan N) Eufodendrofan N (12) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca. Na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 688,3184, utvrđeno je da je molekulska formula ovog jedinjenja C36H47NO12 i da je, prema tome, njegova molekulska masa za 28 masenih jedinica (C2H4) manja od molekulske mase jedinjenja 2. 1 H i 13 C NMR spektri jedinjenja 12 (Slika 22, Tabela 21) veoma su slični odgovarajućim spektrima jedinjenja 2, s tom razlikom da je izobutanoiloksi grupa vezana za C-3 u jedinjenju 2 zamenjena acetoksi grupom u jedinjenju 12. Na osnovu HMBC korelacija, ostale estarske grupe su raspoređene na sledeći način: 5-acetoksi, 7-izobutanoiloksi, 8-acetoksi i 9-nikotinoiloksi. NAŠI RADOVI 83 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 3 .7 1 4 .1 1 7 .9 1 8 .4 1 8 .6 1 8 .8 1 9 .7 2 1 .0 2 1 .1 2 4 .3 2 6 .1 2 9 .7 3 3 .7 3 4 .4 3 8 .3 4 0 .0 4 0 .8 4 9 .9 5 4 .0 6 8 .7 6 9 .0 7 2 .1 7 7 .4 8 1 .5 8 7 .8 1 1 1 .6 1 2 3 .3 1 2 3 .6 1 2 5 .2 1 2 6 .0 1 2 8 .0 1 2 9 .9 1 3 7 .0 1 3 7 .3 1 4 5 .7 1 5 1 .2 1 5 1 .4 1 5 3 .5 1 5 3 .9 1 6 4 .0 1 6 4 .1 1 6 9 .3 1 7 4 .8 1 7 5 .4 2 1 5 .0 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 3 .0 9 8 .0 8 3 .5 0 3 .9 8 9 .6 8 3 .6 5 4 .2 6 2 .9 3 1 .2 8 1 .9 9 0 .9 4 1 .0 0 1 .0 0 0 .9 9 2 .2 0 1 .1 3 1 .1 5 1 .1 6 3 .4 5 2 .7 2 2 .0 8 2 .2 8 2 .1 2 Slika 20. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 10. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 N NAŠI RADOVI 84 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 8 .1 1 8 .6 1 9 .7 2 0 .6 2 0 .8 2 1 .0 2 3 .8 2 6 .3 3 4 .3 3 8 .3 3 9 .8 4 0 .4 5 3 .7 6 8 .8 6 9 .1 6 9 .4 7 1 .9 8 0 .4 8 7 .3 1 1 1 .5 1 2 3 .4 1 2 6 .0 1 2 7 .1 1 2 8 .0 1 2 9 .3 1 3 7 .4 1 3 7 .7 1 4 5 .5 1 5 1 .1 1 5 3 .3 1 6 3 .9 1 6 9 .1 1 6 9 .3 1 6 9 .9 1 7 5 .5 2 1 4 .7 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 0 .9 9 3 .4 7 3 .3 7 2 .0 8 1 3 .1 7 3 .1 7 2 .9 1 5 .1 7 8 .9 4 0 .8 8 1 .8 5 1 .9 8 0 .9 9 1 .0 0 1 .0 7 1 .1 2 2 .3 5 1 .0 2 1 .0 8 1 .0 2 1 .7 3 1 .1 4 1 .0 2 1 .2 8 1 .2 2 Slika 21. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 11. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 N NAŠI RADOVI 85 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 8 .3 1 8 .6 2 0 .5 2 0 .7 2 0 .8 2 1 .0 2 1 .2 2 1 .3 2 4 .0 2 4 .9 2 5 .1 2 7 .1 2 7 .5 2 7 .7 2 7 .8 2 9 .7 3 3 .7 3 7 .8 3 8 .5 4 0 .6 4 0 .8 4 1 .0 4 4 .2 4 4 .4 5 3 .8 6 8 .0 6 9 .0 7 0 .8 7 2 .5 7 7 .9 8 1 .0 8 1 .2 8 1 .4 8 7 .5 8 7 .6 8 9 .5 9 0 .8 9 2 .7 1 1 3 .6 1 1 5 .9 1 2 3 .5 1 2 5 .4 1 2 7 .7 1 3 1 .2 1 3 5 .4 1 3 7 .0 1 3 7 .2 1 3 7 .6 1 4 4 .8 1 5 1 .3 1 5 3 .7 1 6 4 .1 1 6 9 .2 1 6 9 .8 1 7 0 .0 1 7 4 .9 2 0 3 .9 2 1 4 .8 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .7 3 7 .0 6 5 .7 9 1 0 .6 7 2 .8 1 4 .7 4 3 .7 9 3 .6 9 3 .3 4 1 .0 9 1 .0 0 3 .2 3 1 .1 3 5 .2 4 1 .1 9 1 .4 0 1 .2 8 1 .2 6 1 .1 7 Slika 22. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 12. O HOH O H O H H H HH H H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 NAŠI RADOVI 86 Tabela 21. NMR podaci za jedinjenja 10–12 [500 MHz (1H), 125 MHz (13C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj 10 11 12 δH δC δH δC δH δC 1α 2,59 m 49,9 2,51 m 50,0 2,48 m 49,8 1β 1,60 m 1,61 m 1,60 m 2 2,30 brm 38,3 2,26 brm 38,3 2,26 brm 37,8 3 5,57 brs 77,4 5,58 brs 77,6 5,51 brs 77,9 4 3,10 brt 54,0 3,09 brt 53,7 3,13 brs 53,8 5 5,46 brs 68,7 5,41 brs 69,4 5,44 brs 68,0 6 145,7 145,6 144,8 7 5,05 brs 69,0 5,01 brs 68,7 5,07 brs 69,0 8 5,90 s 72,1 5,70 brs 71,9 5,63 brs 70,8 9 5,34 s 81,5 5,07 brs 80,5 5,23 s 81,4 10 40,8 40,4 40,8 11 5,99 d (16,0) 137,3 5,87 d (16,0) 137,7 5,91 d (16,0) 137,6 12 5,94 m 127,9 5,84 m 128,0 5,75 m 127,7 13 4,30 m 40,0 4,21 m 39,8 4,25 m 40,6 14 214,9 214,7 214,8 15 87,8 87,3 87,6 16 0,95 d (6,5) 13,7 0,93 d (7,0) 13,5 0,94 d (7,0) 13,7 17a 5,07 brs 111,6 5,08 brs 111,6 5,13 brs 113,6 17b 4,98 brs 4,90 brs 5,07 brs 18 1,07 brs 24,3 0,99 brs 23,8 1,08 brs 24,8 19 1,49 brs 26,1 1,40 brs 26,3 1,34 brs 25,1 20 1,26 d (7,0) 18,8 1,22 d (7,0) 18,1 1,22 d (6,5) 18,6 OR2-3 1′ 2,58 h (7,5) 175,4 2,63 h (7,0) 175,4 2,07 s 169,8 2′ 1,18 d (7,5) 34,4 1,23 d (7,0) 34,3 21,7 3′ 1,25 d (7,5) 18,6 1,27 d (7,0) 18,6 4′/5′ 19,7 19,7 OR3-5 1′′ 1,97 s 169,2 2,09 s 169,1 2,00 s 169,2 2′′ 21,0 20,8 20,8 OR4-7 1′′′ 1,94 brm 174,8 1,96 s 169,3 1,96 brm 174,9 2′′′ 0,90 d (7,0) 33,7 20,6 0,87 brs 33,7 3′′′ 0,68 d (7,0) 17,9 0,65 brs 17,9 4′′′ 18,4 2,14 s 18,8 OR5-8 1′′′′ 9,22 brs 9,18 brs 2,14 s 170,0 2′′′′ 8,77 bd (4,5) 151,2 8,75 brd 151,1 21,0 3′′′′ 8,25 brd (8,0) 125,2 8,25 brd (8,0) 127,1 4′′′′ 7,39 dd (8,0; 5,0) 137,0 7,46 dd (8,0; 5,0) 137,2 5′′′′ 123,3 123,4 6′′′′ 153,5 153,3 7′′′′ 164,1 163,1 OR6-9 1′′′′′ 9,25brs 2,09 s 169,9 9,22 brs 2′′′′′ 8,83 brd (5,0) 151,5 21,0 8,78 brs 150,7 3′′′′′ 8,29 brd (7,5) 126,0 8,29d (8,0) 125,4 4′′′′′ 7,47 brm 137,1 7,50 brm 137,2 5′′′′′ 123,6 123,6 6′′′′′ 153,9 153,1 7′′′′′ 164,0 164,1 OR7-15 1′′′′′′ 2,68 s 2,67 s 3,12 s NAŠI RADOVI 87 2.1.12. 2α,5α,8α-Triacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-9α-nikotinoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan O) Eufodendrofan O (13) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C40H53NO14, na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 772,3557. Singlet u 1H NMR spektru koji potiče od tri protona (δ 1,51, H3-16) a tipičan je za tercijarnu metil grupu geminalnu sa estarskom grupom, kao i signal acetoksi grupe (δH 2,00 s, 3H; δC 171,1, 22,0) čiji karbonilni ugljenikov atom ne pokazuje korelaciju u HMBC spektru, ali i pojava 13 C NMR signala tercijarnog ugljenika (δC 87,4), ukazali su na 2-acetoksi supstituciju. Relativna konfiguracija na C-2, tj. 2α-orijentacija acetoksi grupe, određena je na osnovu pojave korelacionog signala H-1β/H3-16 u NOESY spektru. Spektralni podaci ostatka molekula (Slika 23, Tabela 22) slični su odgovarajućim podacima jedinjenja 2 i 12, na osnovu čega je zaključeno da je u ovom slučaju jatrofanski poliol esterifikovan acetil grupom u položajima C-2, C-5 i C-8, izobutanoil grupom u položajima C-3 i C-7, a nikotinoil grupom u položaju C-9. 2.1.13. 2α,8α-Diacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-5α,9α-dinikotinoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on (Eufodendrofan P) Eufodendrofan P (14) je bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C44H54N2O14, na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 835,3659. 1 H i 13 C NMR podaci jedinjenja 14 (Slika 24, Tabela 22) razlikuju se od odgovarajućih podataka jedinjenja 13 samo po pojavi signala nikotinoiloksi grupe vezane za C-5 umesto acetoksi. Da se nikotinoiloksi grupa nalazi u ovom položaju zaključeno je na osnovu korelacionog HMBC signala između odgovarajućeg estarskog karbonilnog ugljenika (δC 166,9) i H-5 (δH 5,58). Preostale HMBC korelacije za ostatak molekula u skladu su sa strukturom u kojoj je acetoksi grupa vezana za C-2 i C-3, izobutanoiloksi grupa za C-3 i C-7, a nikotinoiloksi za C-9. NAŠI RADOVI 88 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 7 .6 1 8 .2 1 8 .4 1 8 .6 1 9 .3 2 0 .6 2 0 .9 2 2 .0 2 4 .6 2 5 .3 3 3 .4 3 4 .0 4 0 .4 4 0 .5 5 0 .8 5 1 .2 6 8 .4 6 8 .5 7 0 .8 7 8 .6 8 1 .3 8 6 .7 8 7 .4 1 1 2 .2 1 2 3 .6 1 2 8 .1 1 3 7 .5 1 4 5 .4 1 5 1 .0 1 5 3 .4 1 6 3 .9 1 6 9 .3 1 7 0 .1 1 7 1 .1 1 7 4 .6 1 7 4 .9 2 1 4 .6 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .9 9 5 .0 6 3 .8 4 2 0 .4 9 3 .5 8 1 .7 7 6 .2 3 3 .9 4 3 .2 8 1 .1 7 1 0 .8 9 1 .0 9 1 .0 6 1 .1 2 3 .2 8 1 .1 9 1 .1 2 2 .2 3 1 .1 4 1 .1 3 1 .2 4 1 .1 0 1 .0 0 1 .0 0 Slika 23. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 13. O HOH O H O H H H HH O H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 O NAŠI RADOVI 89 B ppm 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 160 140 120 100 80 60 40 20 0 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .3 5 2 .7 0 2 .8 2 1 .2 9 4 .3 9 1 2 .8 4 3 .1 2 0 .9 9 3 .9 3 1 .4 2 3 .0 1 2 .7 4 2 .7 4 0 .9 6 0 .7 2 0 .7 7 0 .8 2 1 .0 4 1 .0 0 0 .7 8 0 .9 7 1 .0 3 1 .8 8 0 .9 7 1 .1 2 1 .2 0 2 .2 8 0 .8 2 0 .9 9 2 .2 4 1 .1 8 1 .0 0 Slika 24. 1 H NMR (A) i HSQC (B) spektar jedinjenja 14. O HOH O H O H H H HH O H H O H O O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15 16 17 18 19 20 O N NAŠI RADOVI 90 Tabela 22. NMR podaci za jedinjenja 13–14 [500 MHz (1H), 125 MHz (13C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj 13 14 a δH δC δH δC 1α 3,29 d (16,0) 51,2 3,34 d (16,0) 53,3 1β 1,98 d (16,0) 2,15 d (16,5) 2 87,4 87,9 3 5,60 brs 78,6 5,98 brs 77,9 4 3,47 brt 50,8 3,55 brs 51,3 5 5,50 brs 68,4 5,58 brs 70,3 6 145,4 145,4 7 5,04 brs 68,5 5,00 brs 68,9 8 5,60 brs 70,8 5,57 brs 68,6 9 5,21 brs 81,3 5,18 s 81,2 10 40,5 40,6 11 5,94 d (16,0) 137,5 5,90 (16,5) 137,2 12 5,81 m 128,1 5,80 m 128,3 13 4,25 m 40,4 4,27 m 40,5 14 214,6 214,2 15 86,7 88,2 16 1,51 s 18,4 1,67 s 18,8 17a 5,10 brs 112,2 5,10 brs 113,8 17b 5,04 brs 4,94 brs 18 1,06 brs 25,3 1,02 brs 25,1 19 1,35brs 24,6 1,33 brs 24,9 20 1,20 d (7,0) 18,2 1,18 d (6,5) 19,1 R1-2: 1 2,00 s 171,1 2,03 s 169,9 2 22,0 21,1 OR2-3: 1′ 2,59 h (7,0) 174,6 2, 67 m 174,5 2′ 1,18 d (7,0) 33,4 1,26 d (6,5) 33,4 3′ 1,25d (7,0) 18,6 1,29 d (6,5) 18,6 4′/5′ 19,3 19,4 OR3-5: 1′′ 2,21 s 169,3 9,35 d (1,6) 2′′ 20,9 8,77 m 151,3 3′′ 8,54 dt, (8,0; 2,0) 128,3 4′′ 7,41 dd (8,0; 5,0) 137,0 5′′ 123,1 6′′ 152,9 7′′ 166,9 OR4-7: 1′′′ 1,96 brm 174,9 1,94 brm 174,7 2′′′ 0,88 d (6,0) 34,0 0,76 d (7,0) 34,1 3′′′ 0,61 brs 17,6 0,39 d (7,0) 17,5 4′′′ 18,6 18,5 OR5-8: 1′′′′ 2,07 s 170,1 2,05 s 169,3 2′′′′ 20,6 20,7 OR6-9: 1′′′′′ 9,22brs 9,18 d (1,6) 2′′′′′ 8,79 brs 151,0 8,77 m 151,4 3′′′′′ 8,29 d (8,0) 128,1 8,14 dt (8,0; 3,0) 127,9 4′′′′′ 7,46 brm 137,4 7,35 dd (8,0; 5,0) 137,7 5′′′′′ 123,6 123,5 6′′′′′ 153,4 153,7 7′′′′′ 163,9 164,4 OR7-15: 1′′′′′′ 2,09 s 2,96 s a Podaci dobijeni na osnovu HMBC i HSQC spektara. NAŠI RADOVI 91 2.1.14. 5α-Acetoksi-15β-hidroksi-3β-izovaleriloksi-2α-nikotinoiloksijatrofa-6(17), 11E-dien-9,14-dion (Eufodendrofan G) Eufodendrofan G (15) je bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C33H43NO9, na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 598,3024. Na osnovu 1 H i 13 C NMR spektara (Slike 25 i 26, Tabela 23), ovo jedinjenje sadrži tri estarske grupe: nikotinatnu (δH 9,23 brs, 8,81 brs, 8,28 brd i 7,42 brs; δC 150,9, 124,3, 137,5 123,8, 153,4 i 164,2), acetatnu (δH 2,00 s; δC 21,3 i 170,6) i izovaleratnu (δH 2,36 dd, 2,26 dd, 2,12 m, 1,02 d i 1,01 d; δC 171,2, 43,1, 31,2 i 22,5). Osim toga, 13C NMR i DEPT spektri pokazuju signale karakteristične za ugljenikove atome dve keto grupe, jedan O–supstituisan i jedan alkil–supstituisan kvaternerni ugljenikov atom, jedan nezasićen kvaternerni ugljenikov atom, jedan nezasićen metilenski ugljenikov atom (egzometilenska grupa), dva tercijarna nezasićena ugljenikova atoma, tri alkil metilenska ugljenika, dva O–supstituisana tercijarna ugljenikova atoma, dva alkil-supstituisana tercijarna ugljenikova atoma, jedan sekundarni i tri tercijarna ugljenikova atoma metil grupa. 1 H NMR i 1 H- 1 H COSY spektri (Slike 25 i 27) ukazali su da u molekulu postoje četiri nezavisna spinska sistema (А – D): А -CH2- (δH 3,12 d i 2,05 d); B -CHR-CH- CHR- (δH 5,82 d, 3,79 dd i 5,36 d); C -CH2-CH2- (δH 2,64 m, 2,15 m, 2,62 m i 2,35 m) i D trans-CH=CH-CH(CH3) (δH 5,61 d, 5,02 dd, 3,91 m i 1,07 d), gde R označava estarsku grupu. Na osnovu velikih vrednosti vicinalnih konstanti sprezanja signala na δH 5,61 (H-11, J = 16,0 Hz) i 5,02 (H-12, J = 16,0; 9,5 Hz) zaključeno je da endociklična dvostruka veza u položaju C-11 ima E-geometriju. Povezivanje fragmenata А, B, C i D omogućeno je analizom 2,3JC-H korelacija iz HMBC spektra (Slika 28). Sprezanja preko dve ili tri veze između kvaternernog ugljenika, δC 87,0 (C-2) i protona čiji se signali javljaju na δH 5,82 (H-3), 3,79 (H-4), 2,44 (OH-15) i 2,05 (H-1) ukazuju da fragmenti А i B, zajedno sa ugljenicima C-2 i C-15, zatvaraju petočlani prsten supstituisan metil grupom, hidroksilnom i dvema estarskim grupama. Postojanje daljinskih sprezanja između ugljenika keto grupe (δC 210,3, C-14) i protona čiji se signali javljaju na δH 3,12 (H-1), 3,79 (H-4), 1,07 (H3-20) i 2,44 (OH-15) dokazuje da je fragment D preko atoma C-14 povezan sa petočlanim prstenom. HMBC korelacije ugljenika preostale keto grupe NAŠI RADOVI 92 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 7 .4 5 4 .1 7 4 .3 3 1 1 .9 7 4 .0 7 1 0 .0 3 1 .7 8 2 .6 5 1 .5 1 2 .4 1 1 .0 6 1 .0 8 1 .0 3 3 .2 3 1 .1 5 1 .2 7 1 .1 3 1 .3 8 1 .0 7 1 .0 0 1 .0 0 Slika 25. 1 H NMR spektar jedinjenja 15. H O H H H H HO H O H H H H H O H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 O O O O O N 1' 2' 3' 4' 3 11 5 12; 17a; 17b 13 4 1α 7α; 8α 8β; 1''; 2''; 7β; 3''; 1β OH 1''' 16 19 18 20 4'' + 5'' NAŠI RADOVI 93 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 7 .1 1 9 .1 2 1 .2 2 2 .4 2 2 .5 2 4 .1 2 4 .3 2 5 .2 2 9 .3 3 5 .7 4 3 .1 4 4 .2 4 8 .7 4 9 .5 5 3 .3 6 9 .3 8 0 .1 8 7 .0 8 7 .8 1 1 7 .1 1 3 0 .9 1 3 7 .5 1 4 3 .7 1 5 0 .9 1 5 3 .4 1 6 4 .2 1 7 0 .7 1 7 1 .2 2 1 0 .1 2 1 0 .3 Slika 26. 13 C NMR spektar jedinjenja 15. 12 14 i 9 6' 2' 6 12 3' i 5' 11 i 4' 17 15 2 3 5 1 4 10 13 2'' 8 7 3'' ugljenici CH3 grupa ugljenici C=O grupa NAŠI RADOVI 94 ppm 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0 ppm 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Slika 27. Deo COSY spektra jedinjenja 15 sa odabranim 1 H–1H COSY korelacijama. 11/12 12/13 13/H3-20 4/5 3/4 1α/1β 7α/7β i 7β/8α 7α/8β i 8α/8β 7β/8β 7α/8α NAŠI RADOVI 95 ppm 0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5 ppm 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 Slika 28. Deo HMBC spektra jedinjenja 15 sa odabranim HMBC korelacijama. C-2/H-3 C-2/H-4 C-2/OH C-2/H-1β C-6/H-5 C-6/H-17a C-6/H-4 C-6/H-8α C-6/H-8β C-6/H-7β H-3/C=O, OiVal H-5/C=O, OAc C-9, C=O/H-11 C-9, C=O/H-8α C-9, C=O/H-19 C-9, C=O/H-18 C-14, C=O/H-4 C-14, C=O/H-1 C-14, C=O/OH C-14, C=O/H3-20 NAŠI RADOVI 96 (δC 210,1, C-9) sa protonima čiji se signali javljaju na δH 5,61 (H-11), 2,62 (H-8), 1,14 (H-18) i 1,24 (H-19) dokazuju da su fragmenti C i D povezani pomoću kvaternernih ugljenikovih atoma C-9 i C-10. Korelacije koje se u HMBC spektru uočavaju između signala ugljenika na δC 143,7 (C-6) i signala protona na δH 5,36 (H-5), 5,02 (H-17a), 3,79 (H-4), 2,15 (H-7β), 2,62 (H-8α) i 2,35 (H-8β) dokazuju da su fragmenti B i C međusobno povezani. Na ovaj način postaje očigledno da jedinjenje 15 ima jatrofansku strukturu esterifikovanu u položajima C-2, C-3 i C-5, sa hidroksilnom grupom u položaju C-15 i keto grupama u položajima C-9 i C-14. Korelacije estarskih karbonila (δC 171,2 i 170,6) sa oksimetinskim protonima (δH 5,82, odnosno 5,36) jasno pokazuju da je za C-3 vezan izovalerat, a za C-5 acetat. S obzirom da između ugljenikovog atoma karbonilne grupe nikotinata i oksimetinskih protona ne postoje daljinska sprezanja, može se zaključiti da je on vezan za kvaternerni ugljenik C-2 (δC 87,0). Relativna konfiguracija jedinjenja 15 određena je na osnovu korelacionih signala koji se vide u NOESY spektru (Slika 29). Izražene NOE interakcije protona H-4α (konfiguracija pretpostavljena na biogenetskoj osnovi) 74 sa protonima H-3 i H-1α ukazuju da je izovalerat vezan za C-3 atom β-orijentisan. Korelacioni signal H-1β/H3-16 ukazuje na 2β-orijentaciju H3-16 metil grupe, pa prema tome i na α-orijentaciju 2- nikotinata. Postojanje NOESY korelacije između H-5 i OH-15, kao i nepostojanje korelacije H-4α/H-5 dokazuje 5β-H orijentaciju (i istovremeno α orijentaciju 5-acetata), ali i da su prstenovi međusobno trans povezani. Osim toga, NOE interakcije H-5/H-11, H-5/H-13 i H-13/H3-19 upućuje da su ovi protoni β orijentisani. Velika vrednost vicinalne konstante sprezanja J4,5 (11 Hz), zajedno sa pojavom NOE signala H-5/H-17a i H-8/H-17b ukazuje da eufodendrofan G pripada „endo“ konformacionom tipu.66 Na osnovu svega navedenog, jedinjenje 15 je 5α-acetoksi-15β-hidroksi-3β-izovaleriloksi- 2α-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion. NAŠI RADOVI 97 Slika 29. Deo NOESY spektra jedinjenja 15 sa najvažnijim NOESY korelacijama. 5/11 5/17а 5/13 5/ОH 1β/H3-16 13/H3-19 1α/4α 3/4α 8α/17b 8β/17b NAŠI RADOVI 98 Tabela 23. NMR podaci za jedinjenje 15 [500 MHz ( 1 H), 125 MHz ( 13 C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj δH δC 1α 3,12 dd (16,5; 1) 53,3 1β 2,05 d (16,5) 2 87,0 3 5,82 d (4,0) 80,1 4 3,79 dd (11,0; 3,5) 48,7 5 5,36 d (11,0) 69,3 6 143,7 7α 2,64 m 29,7 7β 2,15 m 8α 2,62 m 35,7 8β 2,35 m 9 210,1 10 49,5 11 5,61 d (16,0) 137,5 12 5,02 dd (16,0; 9,5) 130,9 13 3,91 m 44,2 14 210,3 15 87,8 16 1,67 s 19,1 17a 5,02 s 117,0 17b 4,99 brs 18 1,14 brs 24,1 19 1,24 brs 24,4 20 1,07 d (6,5) 17,1 R1-2 1′ 9,23 brs 2′ 8,81 brs 150,9 3′ 8,28 brd (7,7) 124,3 4′ 7,42 brs 137,5 5′ 123,8 6′ 153,4 7′ 164,2 OR2-3 1′′ 2,36 dd (16,0; 7,0) 171,2 2′′ 2,26 dd (16,0; 7,0) 43,1 3′′ 2,12 m 31,2 4′′ 1,02 d (7,0) 22,4 5′′ 1,01 d (7,0) 22,6 OR3-5 1′′′ 2,00 s 170,6 2′′′ 21,3 OR7-15 1′′′′ 2,44 s NAŠI RADOVI 99 2.1.15. 2α,3β,8α,15β,17-Pentaacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan F) Eufodendrofan F (16) izolovan je kao amorfna čvrsta supstanca. Masenom spektrometrijom visokog razlaganja, na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se javlja na m/z 786,3346, utvrđeno je da je molekulska formula ovog jedinjenje C40H51NO15. Njegova struktura je određena primenom 1D i 2D NMR spektroskopije, kao i poređenjem tako dobijenih NMR spektara sa odgovarajućim spektrima jatrofana 1 – 15 i srodnih jedinjenja.38 Na osnovu NMR podataka (Slike 30 i 31, Tabela 24), jedinjenje 16 ima strukturu jatrofanskog poliola sa sedam estarskih grupa (pet acetata, jedan izobutanoat i jedan nikotinat) koje se mogu povezati sa sedam oksigenovanih sp 3 -ugljenikovih atoma, od kojih je jedan primarni, četiri su sekundarna, a dva su tercijarna. U NMR spektrima se javljaju i signali karakteristični za ugljenik keto-grupe (δC 211,5, C-14), dve endociklične dvostruke veze (Δ5 i Δ11), od kojih je jedna (Δ11) trans-disupstituisana kao u jedinjenjima 1 – 15, a druga trisupstituisana (Δ5: δH 5,14 brs, δC 111,7, 125,2), jednu alifatičnu metilensku grupu (H2-1), četiri metil grupe (jedna sekundarna: δH 1,17 d, H3- 20 i tri tercijarne: δH 1,07 s, 1,24 s i 1,50 s, H3-18, -19, odnosno -16) i jedan kvaternerni sp 3 -ugljenikov atom (δC 40,1, C-10). Ovo, u kombinaciji sa molekulskom formulom i COSY i HMBC korelacijama (Slike 32 i 33), upućuje na biciklični diterpenski skelet jatrofanskog tipa koji se od prethodno navedenih jedinjenja 1 – 15 razlikuje po tome što sadrži endocikličnu dvostruku vezu u položaju 5 (Δ5) umesto egzociklične u položaju 6(17) (Δ6(17)). Postojanje NOESY korelacije između H-4 (δH 3,17) i H2-17 (δH 5,05, 5,92) (Slika 34) u skladu je sa E-konfiguracijom ove dvostruke veze, koja je takođe utvrđena kod diterpena jatrofanskog tipa ranije izolovanih iz Euphorbia helioscopia.86 HMBC korelacije preko tri veze koje se javljaju između H-3 (δH 5,47), H-8 (δH 5,38) i H2-17 (δH 5,05, brs, 5,92, brs) i acetatnih karbonilnih ugljenika (δC 170,6, 168,9 i 170,3) ukazuju na 3,8,17-triacetoksi supstituisani sistem. HMBC korelacije između H-7 (δH 5,05) i karbonilnog ugljenika izobutanoata (δC 174,8), kao i korelacije između H-9 (δH 5,18) i karbonilnog ugljenikovog atoma nikotinata (δC 163,9), upućuju na strukturu u kojoj je za C-7 vezana izobutanoiloksi, a za C-9 nikotinoiloksi grupa. NAŠI RADOVI 100 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .6 7 2 .1 1 3 .0 0 3 .4 0 3 .6 0 6 .3 9 3 .1 6 1 .4 6 3 .2 0 1 0 .6 2 2 .9 8 0 .8 1 0 .6 1 1 .0 6 0 .9 8 4 .2 2 1 .0 7 1 .1 5 1 .1 1 2 .1 5 1 .0 6 0 .9 9 1 .0 6 1 .0 0 Slika 30. 1 H NMR spektar jedinjenja 16. H O H O H H H OH O H H H O O H O H O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 N O OO O O O 2''''' 6''''' 4''''' 5''''' 11 17b 12 3 8 9 5 7; 17a 1α 13 4 1β 19 18 20 16 3''' 4''' 2''; 2'''''' 2''''; 2''''''' 2''' 2' NAŠI RADOVI 101 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 7 .7 1 8 .0 1 8 .8 2 0 .0 2 0 .6 2 1 .1 2 1 .2 2 1 .3 2 2 .1 2 6 .9 3 3 .5 4 0 .1 4 3 .3 4 7 .5 4 9 .9 6 7 .8 7 7 .9 8 6 .4 9 2 .8 1 2 3 .3 1 2 5 .2 1 3 1 .9 1 3 7 .1 1 5 1 .3 1 5 3 .8 1 6 3 .9 1 6 8 .9 1 6 9 .5 1 7 0 .3 1 7 0 .6 1 7 4 .8 2 1 1 .5 Slika 31. 13 C NMR spektar jedinjenja 16. 14 ugljenici C=O grupa 6''''' 2''''' 12; 4''''' 11 5''''' 6; 5''''' 5 15 2 8 7; 17 3; 9 4 1 13 10 19 18 2''' ugljenici CH3 grupa NAŠI RADOVI 102 Slika 32. Deo COSY spektra jedinjenja 16 sa odabranim 1 H–1H COSY korelacijama. 11/12 12/13 13/H3-20 1α/1β 8/9 7/8 4/5 3/4 NAŠI RADOVI 103 Slika 33. HMBC spektar jedinjenja 16 i odabrane HMBC korelacije. NAŠI RADOVI 104 Signali karbonilnih ugljenika preostalih acetoksi grupa (δC 168,9 i 169,5) ne pokazuju korelacije u HMBC spektru. Ove grupe su vezane u položajima C-2 i C-15 (δC 86,4 i 92,8) kao 2α- i 15β-supstituenti, što je utvrđeno na osnovu sličnosti hemijskih pomeranja ugljenika C(1)H2, C-2, C(3)H i C(16)H3 (Tabela 24) sa hemijskim pomeranjima odgovarajućih ugljenikovih atoma u jedinjenju 2α,3β,5α,7β,15β- pentaacetoksi-9-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on izolovanom iz E. peplus. 38 Relativna konfiguracija preostalih stereocentara utvrđena je na osnovu konstanti sprezanja, NOESY korelacija (Slika 34) i poređenjem sa podacima37,38,53 za srodna jedinjenja poznata od ranije, kao i sa spektralnim podacima za jedinjenja 1 – 15. Na osnovu postojanja NOE korelacija između H-8 i H3-19β, kao i H-9 i H3-19β 37,53,86 ustanovljeno je da molekul poseduje uobičajeni cis–orijentisani 8α,9α-diaciloksi raspored. Da su acil grupe vezane za C-8 i C-9 cis–orijentisane potvrđuje i pojava NOE korelacije između protona H-8 i H-9. S druge strane, veoma mala vrednost konstante sprezanja J7,8 u skladu je sa trans–orijentacijom aciloksi grupa vezanih za C-7 i C-8, 38,53 odnosno β–orijentacijom aciloksi supstituenta vezanog za C-7. Da metil grupa u položaju 13 ima α–konfiguraciju utvrđeno je na osnovu sličnosti hemijskih pomeranja atoma H-13 (δH 3,58), C-13 (δC 43,3), H3-20 (δH 1,17) i C-20 (δC 20,0) sa hemijskim pomeranjima odgovarajućih atoma u jedinjenju 3 koje takođe sadrži OAc-15β grupu. 2.1.16. 2α,8α,15β,17-Tetraacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propa- noiloksijatrofa-5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan Q) Eufodendrofan Q (17) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C41H53O15N, na osnovu molekulskog jona [M + Na] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 822,3316, odnosno molekulske mase koja je za 14 atomskih masenih jedinica veća od molekulske mase jedinjenja 16. Pažljivom analizom 1 H i 13 C NMR spektralnih podataka (Slika 35, Tabela 24) utvrđeno je da je jedinjenje 17 3-propanoiloksi homolog jedinjenja 16, što potvrđuje i pojava H-1β/H3-16 i OPr-3/H3-16 korelacionih pikova u NOESY spektru. NAŠI RADOVI 105 Slika 34. Deo NOESY spektra jedinjenja 16 sa najvažnijim NOESY korelacijama. 8/9 4/17a 4/17b 8/H3-19 9/H3-19 NAŠI RADOVI 106 Tabela 24. NMR podaci za jedinjenja 16–19 [500 MHz (1H), 125 MHz (13C), CDCl3, TMS, δ (ppm), J (Hz)]. Položaj 16 17 18 19 δH δC δH δC δH δC δH δC 1α 3,78 d (16,5) 47,5 3,78 d (16,5) 47,5 3,80 d (16,5) 47,5 3,76 d (16,0) 47,7 1β 2,00 d (16,5) 1,99 d (16,5) 2,01 m 2,05 m 2 86,4 86,4 86,4 86,4 3 5,47 brs 77,9 5,47 brs 77,8 5,67 brs 77,9 5,50 brs 78,0 4 3,17 brs 49,9 3,17 brs 49,9 3,21 brs 49,8 3,41 brs 49,9 5 5,14 brs 111,7 5,14 brs 111,4 5,14 brs 111,7 5,14 brs 111,5 6 125,2 125,2 125,8 125,4 7 5,05 brs 68,0 5,05 brs 68,2 5,05 brs 67,8 4,96 brs 68,3 8 5,38 brs 71,2 5,38 brs 71,2 5,67 brs 71,2 5,36 brs 71,3 9 5,18 d (1,5) 80,0 5,18 d (1,5) 79,6 5,30 s 79,6 5,13 s 79,6 10 40,1 40,1 40,0 40,0 11 5,99 d (16,5) 131,9 5,99 d (16,5) 131,9 6,05 d (16,5) 132,0 5,99 d (16,5) 131,8 12 5,75 m 137,1 5,76 m 137,1 5,83 m 137,1 5,80 m 137,4 13 3,58 m 43,3 3,59 m 43,3 3,60 m 43,3 3,58 m 43,1 14 211,5 212,1 211,7 211,9 15 92,8 92,8 92,8 92,9 16 1,50 s 18,8 1,49 s 18,0 1,50 s 18,0 1,50 s 18,0 17a 5,05 brs 67,8 5,05 brs 67,8 5,05 brs 67,9 5,00 brs 67,7 17b 5,92 brs 5,92 brs 5,95 brs 5,91 brs 18 1,07 brs 26,9 1,07 brs 24,0 1,16 brs 24,4 1,04 brs 24,5 19 1,24 brs 24,1 1,24 brs 27,0 1,33 brs 27,0 1,26 brs 26,5 20 1,17 d (6,5) 20,0 1,17 d (6,5) 20,0 1,21d (6,5) 20,0 1,18 d (6,5) 20,1 OR1-2 1′ 168,9 169,5 170,6 169,0 2′ 2,04 s 20,6 2,04 s 22,2 2,04 s 21,3 2,13 s 22,0 OR2-3 1′′ 170,6 172,2 169,1 170,4 2′′ 2,20 s 21,1 2,41 dq (7,6; 1,7) 27,9 2,20 s 22,2 2,14 s 21,8 3′′ 1,20 t (7,6) 9,0 OR3-7 1′′′ 174,8 174,8 174,6 174,8 2′′′ 2,10 bm 33,5 2,10 bm 33,5 2,10 bm 33,6 1,94 brm 33,3 3′′′ 0,94 brd (7,0) 18,0 0,94 brd (6,8) 18,0 0,91 d (6,5) 17,7 0,88 d (7,0) 17,4 4′′′ 0,68 brd (7,0) 17,7 0,68 brs 18,9 0,68 d (6,5) 18,8 0,56 brs 18,7 OR4-8 1′′′′ 168,9 170,6 169,7 2′′′′ 2,13 s 21,2 2,11 20,6 9,19 brs 151,2 2,05s 20,6 3′′′′ 125,6 4′′′′ 8,28 brd (7,0) 137,2 5′′′′ 7,40 m 123,4 6′′′′ 8,80 brt (4,8) 153,9 7′′′′ 163,8 OR5-9 1′′′′′ 130,0 2′′′′′ 9,20 s 151,3 9,20 brs 151,3 9,22 brs 151,3 7,97 d (7,0) 129,9 3′′′′′ 125,2 124,9 125,1 7,43 t (7,0) 128,4 4′′′′′ 8,20 brd (8,0) 137,1 8,20 dt (8,0; 2,0) 137,2 8,20 br (7,0) 137,1 7,57 t (7,0) 133,1 5′′′′′ 7,38 dd (8,5) 123,3 7,38ddd (1,5; 5,0; 8,0) 123,3 7,40 m 123,4 7,43 t (7,0) 128,4 6′′′′′ 8,80 brd (5,0) 153,8 8,80 dd (5,0; 2,0) 153,8 8,80 brt (4,8) 153,8 7,97 d (7,0) 129,9 7′′′′′ 163,9 163,9 163,8 165,3 OR6-15 1′′′′′′ 170,3 170,3 168,9 168,9 2′′′′′′ 2,20 s 22,2 2,20 s 21,1 2,13 s 21,1 2,21 s 21,3 OR7-17 1′′′′′′′ 169,5 170,0 170,3 170,8 2′′′′′′′ 2,13 s 21,3 2,12 s 21,1 2,13 s 21,1 2,14 s 21,0 NAŠI RADOVI 107 2.1.17. 2α,3β,15β,17-Tetraacetoksi-8α,9α-dinikotinoiloksi-7β-izobutanoiloksija- trofa-5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan R) Eufodendrofan R (18) je izolovan kao bezbojna amorfna čvrsta supstanca. Masenom spektrometrijom visokog razlaganja, na osnovu molekulskog jona [M + H] + koji se javlja na m/z 849,3463, određena je molekulska formula C44H52N2O15. 1 H i 13 C NMR spektralni podaci (Slika 36, Tabela 24) ovog jedinjenja veoma su slični spektralnim podacima jedinjenja 16, i razlikuju se u signalima nikotinoiloksi grupe vezane za C-8, umesto acetoksi grupe vezane u istom položaju u jatrofanu 16. Prema tome, jedinjenje 18 je jatrofanski poliol esterifikovan acetatom u položajima C-2, C-3, C-15 i C-17, izobutanoatom u položaju C-7 i nikotinatom u položajima C-8 i C-9. 2.1.18. 2α,3β,8β,15β,17-Pentaacetoksi-9α-benzoiloksi-7β-izobutanoiloksijatrofa- 5E,11E-dien-14-on (Eufodendrofan S) Eufodendrofan S (19) je bezbojna amorfna čvrsta supstanca molekulske formule C41H52O15, na osnovu molekulskog jona [M + Na] + koji se u HRESI masenom spektru javlja na m/z 807,3196. Njegovi 1 H i 13 C NMR spektri (Slika 37, Tabela 24) su slični NMR spektrima jedinjenja 16. Jedina razlika potiče od prisustva 9-benzoata umesto 9- nikotinata. Na osnovu toga, jedinjenje 19 je heptaesterifikovani diterpenski poliol jatrofanskog tipa kod kojeg su acetati vezani u položajima C-2, C-3, C-8, C-15 i C-17, benzoat je vezan za C-9, a izobutanoat za C-7. NAŠI RADOVI 108 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 9 .0 1 8 .0 1 8 .1 1 8 .9 2 0 .0 2 0 .6 2 1 .1 2 1 .1 2 2 .2 2 4 .0 2 7 .0 2 7 .9 3 3 .5 4 0 .1 4 3 .3 4 7 .5 4 9 .9 6 7 .8 6 8 .2 7 1 .2 7 7 .8 7 9 .6 8 6 .4 9 2 .8 1 1 1 .4 1 2 3 .3 1 2 4 .9 1 2 5 .2 1 3 1 .8 1 3 7 .1 1 3 7 .2 1 5 1 .3 1 5 3 .8 1 6 3 .9 1 6 9 .5 1 7 0 .0 1 7 0 .3 1 7 0 .6 1 7 2 .2 1 7 4 .8 2 1 2 .1 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .8 0 1 .4 2 3 .2 0 3 .1 0 7 .1 0 5 .8 7 3 .4 3 1 .3 3 3 .2 0 6 .9 5 3 .0 8 2 .1 4 0 .8 6 1 .0 2 0 .9 8 3 .8 7 1 .0 8 1 .0 2 1 .0 8 2 .0 0 1 .0 4 1 .0 2 1 .0 6 1 .0 0 Slika 35. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 17. O OH O O H H H HH O H H H O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20O O O NAŠI RADOVI 109 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 7 .7 1 8 .0 1 8 .8 2 0 .0 2 1 .1 2 1 .3 2 2 .2 2 4 .4 2 7 .0 3 3 .6 4 0 .0 4 3 .3 4 7 .5 4 9 .8 6 7 .8 6 7 .9 7 1 .2 7 7 .9 7 9 .6 8 6 .4 9 2 .8 1 1 1 .7 1 2 3 .4 1 2 3 .4 1 2 5 .1 1 2 5 .6 1 2 5 .8 1 3 2 .0 1 3 7 .1 1 3 7 .3 1 5 1 .2 1 5 1 .3 1 5 3 .7 1 5 3 .9 1 6 3 .8 1 6 8 .9 1 6 9 .1 1 7 0 .3 1 7 0 .6 1 7 4 .6 2 1 1 .7 A 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 3 .2 9 4 .1 2 7 .2 6 4 .8 2 3 .7 0 1 2 .2 3 3 .1 8 0 .8 4 1 .1 0 1 .0 0 4 .1 2 1 .2 4 1 .2 6 3 .3 8 2 .2 1 1 .0 5 1 .1 7 2 .2 5 2 .1 9 Slika 36. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 18. O OH O O H H H HH O H H H O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20O O N O NAŠI RADOVI 110 B 220 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 1 7 .4 1 8 .0 1 8 .7 2 0 .1 2 0 .6 2 1 .0 2 1 .3 2 1 .8 2 2 .1 2 4 .6 2 6 .5 3 3 .3 3 4 .1 4 0 .0 4 3 .1 4 7 .7 4 9 .9 6 7 .7 6 8 .3 7 1 .3 7 8 .0 7 9 .6 8 6 .4 9 2 .9 1 1 1 .5 1 2 5 .4 1 2 8 .5 1 2 9 .8 1 3 0 .0 1 3 1 .7 1 3 3 .1 1 3 7 .4 1 6 5 .3 1 6 8 .9 1 6 9 .0 1 6 9 .7 1 7 0 .4 1 7 0 .8 1 7 4 .8 2 1 1 .8 A 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm 2 .7 9 4 .8 6 4 .1 3 4 .5 3 6 .6 3 3 .8 4 1 9 .2 8 1 0 .6 6 3 .6 8 1 .3 0 0 .9 6 1 .0 9 1 .0 0 3 .4 4 1 .1 7 1 .0 5 1 .1 5 1 .2 2 1 .0 2 1 .4 0 2 .7 0 1 .2 9 2 .1 0 Slika 37. 1 H (A) i 13 C NMR (B) spektar jedinjenja 19. O OH O O H H H HH O H H H O O O O O O N H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 19 20 O O O NAŠI RADOVI 111 2.2. Hemotaksonomski značaj izolovanih jedinjenja Za biljnu vrstu E. dendroides sakupljenu na dve lokacije (Sardinija i Crna Gora) karakteristično je prisustvo diterpena jatrofanskog tipa istog osnovnog ugljeničnog skeleta, sa egzocikličnom Δ6(17) dvostrukom vezom i sličnog rasporeda estarskih grupa. Eufodendrijani A-I i jatrofan Jedinjenje 7, 54 koji su uglavnom heksaestri sa više acetoksi, izobutanoiloksi i benzoiloksi grupa, svojstveni su za E. dendroides sa Sardinije, 53 dok je iz crnogorske populacije ove biljne vrste izolovano petnaest jatrofana (eufodendrofani A-E i G-P) koji su uglavnom pentaestri sa više acetoksi, izobutanoiloksi i nikotinoiloksi grupa. Osim ovih neznatnih razlika, hemotaksonomski marker biljne vrste E. dendroides sa dve lokacije može biti prostorna orijentacija metil grupe u položaju 20. Naime, ova metil grupa u jatrofanima iz E. dendroides ubrane na Sardiniji zauzima β- orijentaciju, dok u jatrofanima iz biljke sakupljene u Crnoj Gori zauzima suprotnu, tj. α- orijentaciju. Relativna stereohemija preostalog dela jatrofanskog molekula je identična kod obe populacije. Najveću razliku u hemijskom sastavu ove biljne vrste sa dva geografska lokaliteta predstavlja polarnija jatrofanska frakcija. Deset modifikovanih jatrofana – teracinolida i dva abeo-dendroidina su karakteristični za E. dendroides sa Sardinije.111 Nasuprot tome, polarnija frakcija E. dendroides iz Crne Gore sadrži četiri jatrofana sa endocikličnom 5,6-dvostrukom vezom (eufodendrofani F, Q, R i S). Precizno poređenje hemijskog sastava ukupnog ekstrakta E. dendroides sa različitih lokaliteta najbolje se ostvaruje HPLC-DAD-MS tehnikom. Dobijeni hromatogrami daju integralne profile ovih ekstrakata. NAŠI RADOVI 112 2.3. Biološke aktivnosti izolovanih jedinjenja 2.3.1. Uticaj jatrofana na inhibiciju rasta ćelija karcinoma pluća, debelog creva i glioblastoma, kao i normalnih ćelija Sposobnost jedinjenja 1 – 7, 9, 10 i 16 – 19 da in vitro inhibiraju rast senzitivih i rezistentnih ćelijskih linija humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NCI-H460 i NCI-H460/R), humanog karcinoma debelog creva (DLD1 i DLD-TxR) i glioblastoma (U87 i U87-TxR) procenjivana je pomoću sulforodamin B (SRB) testa. Kao kontrolna supstanca upotrebljen je paklitaksel. Od ukupno trinaest analiziranih jatrofana, jedinjenja 2, 6, 9, 10, 17 – 19 efikasnije od ostalih inhibiraju rast kako senzitivnih tako i rezistentnih ćelijskih linija humanog karcinoma pluća (Tabela 25). Efikasnost sredstava za lečenje karcinoma često je ograničena pojavom višestruke rezistencije na lekove (engl. multidrug resistance, MDR). Međutim, prisustvo MDR fenotipa u NCI-H460/R ćelijskoj liniji, sa povišenom ekspresijom P-glikoproteina (P-gp) koji sprečava unutarćelijsku akumulaciju paklitaksela i doksorubicina, nije znatno uticalo na inhibitorno dejstvo ispitivanih jedinjenja. Jedino je otpornost NCI- H460/R ćelija na jedinjenje 16 značajna. Jedinjenja 1, 2, 3, 9 i 17 efikasno inhibiraju rast senzitivnih ćelijskih linija humanog karcinoma debelog creva (IC50 < 50 μM), dok je jedinjenje 6 efikasno i na senzitivnim i na rezistentnim ćelijama ovog karcinoma (Tabela 25). Jedinjenja 10 i 18 najefikasnije od ispitivanih jatrofana inhibiraju rast senzitivnih ćelijskih linija glioblastoma, a postižu zadovoljavajuće dejstvo i na rezistentnim ćelijama glioblastoma. Rast rezistentnih ćelija glioblastoma takođe efikasno inhibiraju i jedinjenja 1, 2, 9 i 17 (Tabela 25). NAŠI RADOVI 113 Tabela 25. Uticaj eufodendofana na inhibiciju rasta senzitivnih i rezistentnih humanih tumorskih ćelijskih linija. Jedinjenje NCI-H460 NCI-H460/R DLD1 DLD1-TxR U87 U87-TxR IC30 (μM) a IC50 (μM) b IC30 (μM) a IC50 (μM) b IC30 (μM) a IC50 (μM) b IC30 (μM) a IC50 (μM) b IC30 (μM) a IC50 (μM) b IC30 (μM) a IC50 (μM) b 1 31,0 46,6 26,6 44,8 2,5 21,3 27,8 67,2 5,9 100,0 5,0 43,3 2 6,1 16,2 3,9 17,2 4,8 22,1 8,6 63,8 5,9 78,6 5,5 60,0 3 17,4 22,0 20,5 35,0 7,1 20,0 16,4 35,0 13,6 112,5 18,0 50,0 4 11,7 21,3 14,6 30,1 14,2 42,7 / / 10,4 52,6 / / 5 8,3 21,9 15,2 49,8 13,7 37,9 / / 14,1 73,1 / / 6 2,4 6,0 5,5 15,0 6,7 40,0 6,4 39,3 6,3 158,3 2,4 162,5 7 17,3 39,6 16,8 33,3 8,6 54,0 50,8 68,0 10,0 73,1 17,5 48,5 9 2,3 4,7 6,6 18,0 2,3 5,0 13,5 121,0 5,0 150,0 2,3 50,0 10 2,8 6,4 3,3 9,1 22,9 40,0 33,9 45,8 3,3 10,0 7,9 57,1 16 4,8 14,8 51,9 90,8 38,8 75,3 / / 27,3 65,5 / / 17 2,2 11,2 8,7 26,8 3,8 30,0 27,3 80,0 3,1 30,0 4,2 43,8 18 3,5 10,0 6,4 17,0 18,6 30,5 33,6 19,2 2,3 8,6 4,0 28,5 19 2,3 7,5 2,3 8,3 54 143 17,5 / 44 169 9,6 / paklitaksel b 3,6 9,4 440 2078 23 39 3410 6410 49 90 3610 9360 a Navedene vrednosti predstavljaju srednju vrednost koncentracija koje inhibiraju ćelijski rast za 30% (IC30)i dobijene su iz pet nezavisnih merenja metodom linearne regresije pomoću Excel softvera. b Navedene vrednosti predstavljaju srednju vrednost koncentracija koje inhibiraju ćelijski rast za 50% (IC50) i dobijene su iz pet nezavisnih merenja metodom linearne regresije pomoću Excel softvera. c Podaci za paklitaksel (pozitivna kontrola) dati su u nM. NAŠI RADOVI 114 Mehanizam dejstva dva najzastupljenija jatrofana 1 i 2 (izolovana u najvećoj količini) je dalje ispitan kod nesitnoćelijskog karcinoma pluća. U poređenju sa cisplatinom, koji nije supstrat za P-gp pumpu, ispitivani jatrofani su pokazali umerenu efikasnost u suzbijanju ćelijskog rasta (Slika 38). Slika 38. Uticaj jedinjenja 1 (a), 2 (b) i cisplatina (c) na rast senzitivnih i rezistentnih ćelija humanog karcinoma pluća. Stepen inhibicije rasta senzitivnih NCI-H460 ćelijskih linija delovanjem jedinjenja 1 i 2 ne razlikuje se bitno od stepena inhibicije rasta rezistentnih linija (NCI- H460/R), što ukazuje da se ova dva jedinjenja, poput cisplatina, iz ćelije ne izbacuju P- gp pumpom. Međutim, jedinjenje 2 znatno efikasnije deluje na obe ćelijske linije od jedinjenja 1 (IC50 (2) ≈ 20 μM; IC50 (1) ≈ 50 μM). Na osnovu toga bi se moglo zaključiti da prisustvo izobutanoiloksi grupe u položaju 3 favorizuje inhibitorno dejstvo jedinjenja 2 u odnosu na jedinjenje 1 kod kojeg je u položaju 3 vezana propanoiloksi grupa. S druge strane, prethodna istraživanja ističu važnost postojanja propanoiloksi grupe u položaju 3 jatrofana za njihovo inhibitorno dejstvo na ćelije karcinoma.54 Budući da je primena sredstava za lečenje karcinoma ograničena njihovom toksičnošću za normalne ćelije, upoređeno je dejstvo jatrofana 1 i 2 i cisplatina na mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane iz krvi zdravih osoba. Uticaj na rast PBMC posle 72 sata neprekidnog tretmana procenjen je MTT testom (kolorimetrijski test). Jedinjenja 1 i 2 u koncentracijama koje su pokazale inhibiciju rasta ćelija karcinoma nisu uticala na smanjenje broja PBMC, dok se pokazalo da je cisplatin u znatnoj meri citotoksičan za normalne ćelije (Slika 39). NAŠI RADOVI 115 Slika 39. Uticaj jedinjenja 1, 2 i cispla- Slika 40. Zavisnost stepena polimerizacije tubu- tina na rast PMBC. lina od koncentracije ispitivanog jedinjenja. 2.3.2. Antimitotska aktivnost Antimitotski potencijal jedinjenja 1 proveren je tubulinskim testom. 185 Različite koncentracije jedinjenja 1 (1, 10, 50 i 100 μM) inkubirane su sa rastvorom tubulina (1,1 – 10 μM) i posmatrano je ponašanje mikrotubula. Jedinjenje 1 dovodi do polimerizacije tubulina in vitro i to pri koncentraciji koja efikasno inhibira rast ćelija (IC50 29 μM). Paklitaksel polimerizuje tubulin pri znatno nižoj koncentraciji (IC50 0,7 μM). 2.3.3. Inhibicija P-glikoproteina Makrociklični diterpeni jatrofanskog tipa izolovani iz E. dendroides sa Sardinije deluju kao inhibitori P-gp pumpe. 53 Stoga se može pretpostaviti da i jedinjenja izolovana iz iste biljne vrste, ali drugačijeg geografskog porekla imaju slične osobine. Kako bi proverili da li je ova pretpostavka tačna, sposobnost jatrofanskih diterpena 1, 2, 6 – 10, 15 – 19 da inhibiraju dejstvo P-gp-a ispitana je na MDR ćelijskim linijama humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NCI-H460/R), karcinoma debelog creva (DLD1-TxR) i glioblastoma (U87-TxR). U tu svrhu korišćen je standardni test kojim se akumulacija rodamina 123 (fluorescentni supstrat P-gp-a) prati protočnom citometrijom. Utvrđeno je da se izolovani jatrofani znatno razlikuju u stepenu inhibicije dejstva P-gp- a u NCI-H460/R i DLD1-TxR ćelijama, dok se njihova aktivnost prema P-gp-u u U87- TxR ćelijama ne razlikuje mnogo (Tabela 26). NAŠI RADOVI 116 Tabela 26. Uticaj jatrofana na dejstvo P-gp-a tri MDR ćelijske linije humanih karcinoma. Jedinjenje MFI a FAR b SI c NCI-H460 686 100,00 NCI-H460/R 23 3,35 1 143 6,23 20,85 2 119 5,17 17,35 6 519 22,57 75,66 7 72 3,13 10,50 8 374 16,26 54,52 9 509 22,13 74,20 10 384 16,70 55,98 15 28 1,22 4,08 16 150 6,52 21,87 17 45 1,96 6,56 18 191 8,30 27,84 19 362 15,74 52,77 R(+)-verapamil d 319 13,87 46,50 tarikvidar e 629 27,35 91,69 DLD1 314 100,00 DLD1-TxR 31 9,87 1 192 6,19 61,15 2 114 3,68 36,31 6 1058 34,13 336,94 7 169 5,45 53,82 8 435 14,03 138,54 9 1110 35,81 353,50 10 434 14,00 138,22 15 94 3,03 29,87 16 243 7,84 77,39 17 37 1,19 11,78 18 74 2,39 23,57 19 415 13,39 132,17 R(+)-verapamil 277 8,94 88,22 tarikvidar 507 16,35 161,46 U87 511 100,00 U87-TxR 31 6,07 1 125 4,03 24,46 2 119 3,84 23,29 6 241 6,90 41,88 7 194 6,26 37,96 8 129 4,16 25,24 9 217 7,00 42,47 10 186 6,00 36,40 15 28 1,87 11,35 16 110 3,55 21,53 17 105 3,38 20,55 18 169 5,45 33,07 19 124 4,00 24,26 R(+)-verapamil 93 3,00 19,00 tarikvidar 116 3,74 22,72 a Srednja vrednost izmerenog intenziteta fluorescencije (MFI) koristi se za izračunavanje b odnosa fluorescencije i aktivnosti (FAR) primenom jednačine: FAR = MFI tretiranih MDR ćelija / MFI netretiranih MDR ćelija. c Indeks senzitivnosti (SI) izračunat je iz srednje vrednosti izmerenog intenzitete fluorescencije (MFI) primenom jednačine: SI = MFI tretiranih MDR ćelija × 100 / MFI senzitivnih ćelija. d R(+)-Verapamil je primenjen u istoj koncentraciji (10 μM) kao i ispitivani jatrofani. e Tarikvidar je primenjen u koncentraciji 50 nM. NAŠI RADOVI 117 Sposobnost ispitivanih jedinjenja da inhibiraju aktivnost P-gp-a u MDR ćelijskim linijama karcinoma meri se kao povećana akumulacija Rho 123, a izražava se kao odnos fluorescencije i aktivnosti (FAR, Tabela 26). Na osnovu FAR vrednosti, jedinjenja za koja je 1 < FAR < 2 su nedelotvorna u inhibiciji P-gp-a, jedinjenja sa 2 < FAR < 10 umereno, jedinjenja sa 10 20 veoma snažno inhibiraju aktivnost P-gp-a. Osim toga, može se koristiti indeks senzitivnosti (SI) koji upoređuje akumulaciju Rho 123 u MDR ćelijskim linijama karcinoma posle njihovog tretiranja jatrofanima sa akumulacijom dobijenom kod netretiranih senzitivnih ćelijskih linija karcinoma (Tabela 26). U tom slučaju, SI vrednosti predstavljaju kapacitet ispitivanih jedinjenja da dostignu akumulaciju Rho 123 koja se postiže sa senzitivnim ćelijskim linijama karcinoma. Na skali SI vrednosti, kada je SI < 10 nema povećanja senzitivnosti; povećanje senzitivnosti je umereno za 10 < SI < 50, odnosno veliko za 50 < SI < 100, a kada je SI > 100 aktivnost P-gp-a se u potpunosti blokira (tada je akumulacija Rho 123 veća od akumulacije dobijene sa senzitivnom ćelijskom linijom kancera). Ispostavilo se da su među ispitivanim jatrofanima jedinjenja 6 i 9 najjači inhibitori P-gp-a u MDR ćelijskoj liniji humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NCI-H460/R, Tabela 26), efikasnija od R(+)-verapamila (kompetitivni inhibitor P-gp- a, druga generacija P-gp modulatora) koji je korišćen kao pozitivna kontrolna supstanca. Međutim, tarikvidar, nekompetitivni inhibitor P-gp-a,186 je efikasniji od jedinjenja 6 i 9. Jedinjenja 8, 10 i 19 su pokazala relativno visok anti-MDR potencijal, jedinjenja 1, 2, 16 i 18 su umereno efikasna, jedinjenje 7 je jedva efikasno, a jedinjenja 15 i 17 su potpuno neefikasna kod NCI-H460/R ćelija. Najveći porast nagomilavanja Rho 123 i potpuna blokada P-gp pumpe zapaženi su u MDR ćelijama humanog karcinoma debelog creva (DLD1-TxR) tretiranim jedinjenjima 6 i 9 (Tabela 26). Potpuna blokada P-gp pumpe nastupila je i tretiranjem ovih ćelija jedinjenjima 8, 10, 19 i tarikvidarom. Veliki kapacitet povećanja senzitivnosti koji se postiže primenom jedinjenja 16 uporediv je sa vrednošću verapamila. Umerena inhibicija P-gp-a, ali veliko povećanje senzitivnosti postiže se i tretmanom jedinjenjima 1 i 7, dok su jedinjenja 2, 15 i 18 izazvala umerenu inhibiciju P-gp-a i umereno povećanje senzitivnosti. Jedinjenje 17 ne deluje na MDR ćelije humanog karcinoma debelog creva. NAŠI RADOVI 118 Jedanaest ispitivanih jedinjenja (1, 2, 6 – 10, 16 – 19), kao i pozitivne kontrolne supstance (verapamil i tarikvidar), pokazali su umerenu aktivnost ka P-gp pumpi u MDR ćelijskoj liniji humanog glioblastoma (U87-TxR). Jedino je jedinjenje 15 bilo potpuno neaktivno. 2.3.4. Kombinovano dejstvo jatrofana sa klasičnim hemioterapeuticima S obzirom na to što se akumulacija Rho 123 povećala prilikom tretmana MDR ćelijske linije humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća, proučen je i senzitivišući potencijal jedinjenja 1, 2, 6, 8, 18 i 19 na pomenutu ćelijsku liniju u kombinaciji sa paklitakselom, kao i uticaj jedinjenja 1 i 2 u kombinaciji sa doksorubicinom. U tu svrhu rezistentne NCI-H460/R ćelije izlagane su 72 sata kombinovanom dejstvu 1, 2,5 i 5 μM jedinjenja 1, odnosno 2 ili 5 μM jedinjenja 6, 8, 18 i 19 i 0,005 – 5 μM paklitaksela, kao i dejstvu 5 μM jedinjenja 1, odnosno 2 i 0,05 – 5 μM doksorubicina (Tabela 27). Sposobnost izabranih jatrofana da smanje rezistenciju MDR ćelija na paklitaksel poređena je sa sposobnošću verapamila i tarikvidara, dok je sposobnost jedinjenja 1 i 2 da smanje rezistenciju MDR ćelija na doksorubicin poređena sa sposobnošću verapamila. Ovi efekti su procenjeni SRB testom. Svi jatrofani su uticali na povećanje senzitivnosti rezistentnih NCI-H460/R ćelija na paklitaksel, odnosno doksorubicin. Na primer, jedinjenje 1 smanjilo je IC50 vrednost paklitaksela 3, 19, odnosno 38 puta. Efekat jedinjenja 2 je još izraženiji – dovelo je do smanjenja IC50 vrednosti paklitaksela 11, 25, odnosno 60 puta. Utvrđeno je da ne postoje znatne razlike u aktivnosti jedinjenja 1 i 2 u koncentracijama 2,5 i 5 μM i verapamila. Oba jatrofana u koncentracijama 5 μM znatno smanjuju IC50 vrednost doksorubicina (Tabela 27). Rezultati dobijeni za kombinovano dejstvo jatrofana, verapamila ili tarikvidara i paklitaksela, odnosno doksorubicina na rezistentne NCI-H460/R ćelije podvrgnuti su kompjuterskoj analizi (engl. synergism/antagonism CalcuSyn software analysis). Sve kombinacije koje su korišćene za ispitivanje kombinovanog uticaja na rezistentne NCI- H460/R ćelije imale su sinergističko (CI < 1) ili snažno sinergističko dejstvo (CI < 0,5). Ovi rezultati ukazuju na sposobnost ovih jatrofana da smanje rezistenciju MDR ćelijskih linija prema paklitakselu ili doksorubicinu. Rezistentne NCI-H460/R ćelijske linije pokazuju slabu senzitivnost na paklitaksel, vinblastin, doksorubicin, epirubicin i NAŠI RADOVI 119 etopozid. 187 Poznato je da između jatrofanskih diterpena i antraciklina (doksorubicin i epirubicin) postoje sinergističke interakcije.153,154 Jedinjenja 1 i 2 čine NCI-H460/R ćelije senzitivnim na paklitaksel, pri čemu je senzitivnost koncentraciono zavisna (Tabela 27). Ovo je prvi put da je uočeno sinergističko dejstvo između jatrofana i paklitaksela. Tabela 27. Uticaj jedinjenja 1, 2, 6, 8, 18, 19, verapamila i tarikvidara na senzitivizaciju rezistent- nih NCI-H460/R ćelija na dejstvo klasičnih citostatika. Jedinjenje Koncentracija (μM) Koeficijent relativne reverzijea paklitaksel 0,005 – 5 1 3 1 + paklitaksel 2,5 19 5 38 1 11 2 + paklitaksel 2,5 25 5 60 6 + paklitaksel 5 20 8 + paklitaksel 5 10 18 + paklitaksel 5 5 19 + paklitaksel 5 5 1 20 verapamil + paklitaksel 2,5 22 5 46 tarikvidar + paklitaksel 5 25 doksorubicin 0,05 – 5 1 + doksorubicin 5 19 2 + doksorubicin 5 28 verapamil + doksorubicin 5 20 a Koeficijent relativne reverzije izračunat je kao količnik IC50 citostatika i IC50 citostatika u kombinaciji sa izabranim jatrofanima, verapamilom ili tarikvidarom. NAŠI RADOVI 120 2.4. Uticaj strukture ispitivanih jedinjenja na njihovu aktivnost Na osnovu dosadašnjih ispitivanja, ne postoji očigledna razlika u aktivnosti između jatrofana sa 6(17) egzo dvostrukom vezom (1, 2, 6 – 10, 15) i jatrofana sa 5 endo dvostrukom vezom (16 – 19). To se slaže sa rezultatima ranijih istraživanja koji ukazuju da način vezivanja vrlo malo utiče na aktivnost i da mnogo veći uticaj na aktivnost ima stepen oksigenacije. 111 Ispitivanje bioloških aktivnosti dve grupe egzo jatrofana koji imaju identičnu strukturu osim supstituenta vezanog za C-8, a to su 1, 6 – 8 i 2, 9 i 10 (Slika 41), pokazalo je da se aktivnost jedinjenja znatno povećava ako je za C-8 vezana benzoiloksi grupa umesto acetoksi, izobutanoiloksi ili nikotinoiloksi grupe. Tako od jatrofana sa 6(17) egzo dvostrukom vezom, jedinjenja 6 i 9 sa C-8 benzoiloksi grupom najjače inhibiraju dejstvo P-glikoproteina. Prisustvo benzoiloksi grupe na C-8, umesto acetoksi ili nikotinoiloksi grupe, utiče na povećanu akumulaciju Rho 123, naročito u MDR ćelijama humanog karcinoma debelog creva, što ukazuje na veću efikasnost jedinjenja 6 i 9 u poređenju sa jedinjenjima 1, 7 i 8, odnosno 2 i 10. R=Ac, 1 R=Ac, 2 R=Bz, 6 (eufodendrofan H) R=Bz, 9 (eufodendrofan K) R=Nic, 7 R=Nic, 10 R=iBu, 8 Ac–acetil; Bz–benzoil; iBu–izobutanoil; Nic–nikotinoil; Pr–propanoil Slika 41. Dve grupe strukturno sličnih jatrofana sa 6(17) egzo dvostrukom vezom. NAŠI RADOVI 121 Od ispitivanih jatrofana sa 5 endo dvostrukom vezom (16 – 19) najefikasniji inhibitor P-glikoproteina je jedinjenje 19 (Slika 42) kod kojeg je za C-9 atom vezana benzoiloksi grupa umesto nikotinoiloksi grupe (16). R=Nic, 16 R=Bz, 19 (eufodendrofan S) Ac–acetil; Bz–benzoil; iBu–izobutanoil; Nic–nikotinoil Slika 42. Strukturno slični jatrofani sa 5 endo dvostrukom vezom. Vrsta supstituenata vezanih za C-8 i C-9 jatrofanskog skeleta pokazala se bitnom i prilikom ispitivanja grupe strukturno sličnih jatrofanskih poliestara izolovanih iz E. dendroides sa Sardinije. 54 Uticaj strukture na aktivnost jedinjenja sa egzo jatrofanskim skeletom, izolovanih iz biljnog materijala sa Sardinije, istakao je značaj neesterifikovane (slobodne) hidroksilne grupe vezane za C-3, kao i vrste i tipa supstitucije u položajima C-2 i C-5. Naime, inhibicija dejstva P-glikoproteina znatno se smanjuje acilovanjem hidroksilne grupe vezane za C-3. 53 Isti je slučaj i sa modifikovanim jatrofanima.111 Vrsta supstituenta vezanog za C-3, tj. propanoiloksi grupa umesto izobutanoiloksi grupe, ne utiče na aktivnost jedinjenja 1 i 2 ili 6 i 9. Međutim, zamena acetoksi grupe na C-3 propanoiloksi grupom u potpunosti sprečava inhibitorska svojstva jedinjenja 17 u odnosu na jedinjenje 16. Slaba aktivnost jedinjenja 15 potvrđuje značaj tipa supstitucije na C-7, C-8 i C- 9. Nepostojanje supstituenata u ovim položajima veoma smanjuje MDR modulatornu aktivnost jedinjenja 15 u odnosu na aktivnost ostalih ispitivanih jedinjenja. Proučavanje uticaja strukture na aktivnost jatrofana 1, 2, 6 – 10, kao i eufodendroidina A – I,53 koji imaju identične ugljenične skelete dokazalo je da oba prstena (i mali i srednje veličine) učestvuju u vezivanju P-glikoproteina, mada je u slučaju eufodendroidina za vezivanje naročito važan mali prsten.53 NAŠI RADOVI 122 U ovom radu izolovana su strukturno vrlo slična jedinjenja – sva imaju isti skelet, a glavne razlike potiču od vrste i broja supstituenata vezanih za prsten srednje veličine, i ispitana je njihova biološka aktivnost. Zahvaljujući tome, može se zaključiti da aktivnost eufodendrofana sa egzo, odnosno endo dvostrukom vezom zavisi od toga da li je za položaj C-8, odnosno C-9 vezana benzoiloksi grupa. Od svih jedinjenja koja su izolovana iz E. dendroides iz Crne Gore najaktivnija su jedinjenja 6 i 9 koja u potpunosti sprečavaju dejstvo P-glikoproteina i aktivnija su od verapamila i tarikvidara. Međutim, ni efekti jedinjenja 8, 10 i 19 nisu beznačajni, s obzirom da i ona u potpunosti sprečavaju dejstvo P-glikoproteina u MDR ćelijama humanog karcinoma debelog creva, a i aktivnija su od verapamila. Ovih pet jedinjenja moglo bi se dalje koristiti u razvoju lekova i poboljšanju hemoterapije kod MDR karcinoma. 3. EKSPERIMENTALNI DEO EKSPERIMENTALNI DEO 124 3.1. Hemijsko ispitivanje 3.1.1. Eksperimentalne tehnike, instrumenti i rastvarači Za izolovanje i identifikaciju jedinjenja korišćene su sledeće tehnike i instrumenti: 1. „Dry–column flash“ hromatografija, DCFC188 na silika gelu kao stracionarnoj fazi (Silica gel less than 0.08 mm for column chromatography, Merck i ICN Silica 12–26 60 Å), za frakcionisanje liofilizovanog vodeno–etanolnog ekstrakta E. dendroides, kao i liofilizata lateksa ove biljne vrste. Frakcionisanje se vrši eluiranjem nanetog uzorka pogodnim rastvaračima ili njihovom smešom čija se polarnost postepeno povećava. 2. Hromatografija na koloni, CC na silika gelu kao stacionarnoj fazi (Silica gel 60, particle size 0.200 mm for column chromatography, 70–230 mesh, ASTM Merck), za prečišćavanje frakcija dobijenih „dry–column flash“ hromatografi- jom. Uzorak se nanosi na vrh kolone u obliku rastvora ili u čvrstom stanju, adsorbovan na silika gel, a eluiranje se vrši pogodnim rastvaračem ili smešom rastvarača čija se polarnost postepeno povećava. 3. Preparativna tankoslojna hromatografija, TLC na gotovim aluminijumskim pločama (AL TLC Silica gel 60 F254 Layer thickness 0.5 mm i 2 mm, dimenziја 20 × 20 cm, Merck), za prečišćavanje frakcija dobijenih „dry–column flash“ hromatografijom. 4. Analitička tankoslojna hromatografija, TLC na gotovim aluminijumskim pločama (Al TLC Silica gel 60 F254 Layer thickness 0.25 mm, Merck), za izbor najpogodnijeg eluenta i praćenje toka „dry–column flash“ hromatografije i hromatografije na koloni. Hromatogrami se posmatraju pod ultraljubičastom svetlošću talasne dužine λ = 254 nm, a zatim se izazivaju CAM reagensom (rastvor cerijumamonijum–molibdata u razblaženoj sumpornoj kiselini) i zagrevaju. 5. Preparativna tečna hromatografija, LC (Tečni hromatograf Agilent Technologies 1100 Series opremljen autosamplerom, DAD detektorom i Zorbax XDB C18 kolonom (250 × 9,4 mm i. d.; 5 μm); LC uslovi: temperatura kolone EKSPERIMENTALNI DEO 125 25 °C, mobilna faza (4,00 mL/min): A (0,2% mravlja kiselina u MilliQ vodi) i B (acetonitril) u gradijentnom modu, 55–90% B (0–25 min), 90% B (25–35 min), 90–55% B (35–36 min), 55% B (36–40 min), talasna dužina λ = 260 nm), za detekciju i finalno prečišćavanje komponenti dobijenih preparativnom tankoslojnom hromatografijom i hromatografijom na koloni. 6. Polarimetrija (Automatic Polarimeter AUTOPOL® IV, Rudolph Research Analytical, opremljen natrijumovom lampom (589 nm) i ćelijom za merenje dužine 10 cm), za određivanje specifične rotacije, [α] 20D . 7. Ultraljubičasta–vidljiva spektroskopija, UV/Vis (GBC Cintra 40 UV–Visible spektrometar), za određivanje apsorpcionih maksimuma i molarne apsorptivnosti izolovanih jedinjenja. 8. Infracrvena spektroskopija, IR (Infracrveni spektrometar Thermo Scientific Nicolet 6700 FT–IR), za snimanje IR spektara nanošenjem uzoraka u vidu kapilarnog filma na KBr pločicu. 9. Nuklearno-magnetna rezonantna spektroskopuja, NMR (NMR spektrometar Bruker 500 Avance III (500 MHz za 1 H i 125 MHz za 13 C)), za snimanje 1 H i 13 C 1D i 2D NMR spektara u deuterisanom hloroformu, CDCl3, kao rastvaraču i uz tetrametil-silan (TMS) kao interni standard. 10. Tečna hromatografija–masena spektroskopija, LC/MS (Tečni hromatograf Agilent Technologies 1200 Series opremljen autosamplerom, DAD detektorom i Zorbax Eclipse Plus C18 kolonom (150 × 4,6 mm i. d.; 1,8 μm) povezan sa Agilent Technologies 6210 Тime–of–Flight LC/MS sistemom; LC uslovi: temperatura kolone 40 °C, mobilna faza (1,00 mL/min): A (5 mM amonijum– formijat u MilliQ vodi) i B (acetonitril) u gradijentnom modu, 55–90% B (0–25 min), 90–55% B (25–26 min), 55% B (26–30 min), spektralni opseg λ = 190– 450 nm; MS uslovi: pozitivni mod, napon kapilare 4000 V, temperatura nebulizacionog gasa 350 °C, brzina gasa za sušenje 12 L/min, pritisak nebulajzera 45 psig, napon na fragmentoru 140 V, napon na skimeru 60 V, radiofrekventni napon oktapola 250 V, opseg m/z 100–2000), za snimanje ESI masenih spektara visoke rezolucije. EKSPERIMENTALNI DEO 126 Za pripremu ekstrakta, prečišćavanje i izolovanje jedinjenja hromatografskim tehnikama korišćeni su rastvarači analitičke čistoće, dodatno prečišćeni destilacijom i pre upotrebe sušeni kalcijum–hloridom ili natrijum–sulfatom. Za HPLC, LC/MS, UV/Vis i polarimetriju korišćeni su rastvarači HPLC čistoće. 3.1.2. Biljni materijal i postupak izolovanja jedinjenja Nadzemni delovi E. dendroides sakupljeni su u aprilu 2009. godine u okolini Petrovca, Crna Gora, i osušeni na promajnom mestu bez direktnog izlaganja sunčevoj svetlosti. Vaučer (No. 030409) je deponovan u herbarijumu Botaničke bašte „Jevremovac“ Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Lateks E. dendroides sakupljen je u aprilu 2011. godine na istom lokalitetu. Odvojeno su proučavani nadzemni delovi i lateks. Postupak izolovanja jedinjenja iz osušenog i samlevenog biljnog materijala (nadzemni delovi), odnosno lateksa predstavljen je šematski na Slici 43, odnosno 44. EKSPERIMENTALNI DEO 127 Slika 43. Postupak izolovanja jedinjenja iz nadzemnih delova E. dendroides. EKSPERIMENTALNI DEO 128 Slika 44. Postupak izolovanja jedinjenja iz lateksa E. dendroides. EKSPERIMENTALNI DEO 129 3.1.3. Spektralni podaci izolovanih jedinjenja Eufodendrofan A (5α,8α-diacetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α-ni- kotinoiloksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 1), C37H49O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +31,0 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 227 (3,48), 264 (3,28) nm; IR (film) νmax 3446, 2926, 1738, 1278, 1240 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 18; HRESIMS m/z 700,3335 M+H]+ (izračunato za C37H50O12N 700,3328). Eufodendrofan B (5α,8α-diacetoksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-15β-hidroksi- 9α-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 2), C38H51O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +41,6 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 217 (3,80), 264 (3,17) nm; IR (film) νmax 3446, 2972, 1737, 1278, 1240 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 18; HRESIMS m/z 714,3489 M+H]+ (izračunato za C38H52O12N 714,3484). Eufodendrofan C (5α,8α,15β-triacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikotinoil- oksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 3), C39H51O13N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +10,1 (c 0,06, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 213 (4,13), 264 (3,60) nm; IR (film) νmax 2975, 1736, 1373, 1253, 1190 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 18; HRESIMS m/z 742,3438 M+H]+ (izračunato za C39H52O13N 742,3433). Eufodendrofan D (5α,7β,9α-triacetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-3β-izo- butanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 4), C37H48O12: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +26,0 (c 0,08, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 228 (3,98), 273 (2,97) nm; IR (film) νmax 3478, 2929, 1740, 1273, 1235 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 19; HRESIMS m/z 702,3483 M+NH4] + (izračunato za C37H52O12N 702,3484). EKSPERIMENTALNI DEO 130 Eufodendrofan E (5α,9α-diacetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-7β-izobuta- noiloksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 5), C38H50O12: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +28,0 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 229 (4,03), 273 (3,00) nm; IR (film) νmax 3446, 2924, 1738, 1271, 1234 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 19; HRESIMS m/z 716,3652 M+NH4] + (izračunato za C38H54O12N 716,3640). Eufodendrofan F (2α,3β,8α,15β,17-pentaacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-ni- kotinoiloksijatrofa-5E,11E-dien-14-on, 16), C40H51O15N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -8,0 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 217 (4,00), 264 (3,41) nm; IR (film) νmax 3447, 2931, 1737, 1231 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 24; HRESIMS m/z 786,3346 M+H]+ (izračunato za C40H52O15N 786,3332). Eufodendrofan G (5α-acetoksi-15β-hidroksi-3β-izovaleriloksi-2α-nikotinoil- oksijatrofa-6(17),11E-dien-9,14-dion, 15), C33H43O9N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -21 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 217 (3,96), 262 (3,36) nm; IR (film) νmax 2928, 1735, 1719, 1370, 1235 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 23; HRESIMS m/z 598,3024 M+H]+ (izračunato za C33H44O9N 598,3011). Eufodendrofan H (5α-acetoksi-8α-benzoiloksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoil- oksi-9α-nikotinoiloksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 6), C42H51O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +77 (c 0,2, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 224 (4,22), 264 (3,46) nm; IR (film) νmax 2972, 1736, 1262, 1111, 1028 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 19; HRESIMS m/z 762,3487 M+H]+ (izračunato za C42H52O12N 762,3484). EKSPERIMENTALNI DEO 131 Eufodendrofan I (5α-acetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-8α,9α-dini- kotinoiloksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 7), C41H50O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +55 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 220 (4,29), 263 (3,77) nm; IR (film) νmax 2928, 1736, 1285, 1113, 1025 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 20; HRESIMS m/z 763,3449 M+H]+ (izračunato za C41H51O12N2 763,3436). Eufodendrofan J (5α-acetoksi-7β,8α-diizobutanoiloksi-15β-hidroksi-9α-ni- kotinoiloksi-3β-propanoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 8), C39H53O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +51 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 218 (4,10), 263 (3,49) nm; IR (film) νmax 2930, 1738, 1277, 1238, 1154, cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 20; HRESIMS m/z 728,3651 M+H]+ (izračunato za C39H54O12N 728,3640). Eufodendrofan K (5α-acetoksi-8α-benzoiloksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-15β- hidroksi-9α-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 9), C43H53O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +61 (c 0,2, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 224 (4,15), 264 (3,39) nm; IR (film) νmax 2970, 1734, 1263, 1113 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 20; HRESIMS m/z 798,3457 M+Na]+ (izračunato za C43H53O12NNa 798,3460). Eufodendrofan L (5α-acetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi-8α,9α- dinikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 10), C42H53O12N2: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +54 (c 0,2, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 220 (4,22), 263 (3,64) nm; IR (film) νmax 2973, 1736, 1283, 1266, 1112 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 21; HRESIMS m/z 777,3607 M]+, (izračunato za C42H53O12N2 777,3593). EKSPERIMENTALNI DEO 132 Eufodendrofan M (5α,7β,9α-triacetoksi-15β-hidroksi-3β-izobutanoiloksi-8α- nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 11), C36H47O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -9 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 217 (4,04), 263 (3,43) nm; IR (film) νmax 2973, 1737, 1373, 1279, 1234 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 21; HRESIMS m/z 686,3186 M+H]+ (izračunato za C36H48O12N 686,3171). Eufodendrofan N (3β,5α,8α-triacetoksi-15β-hidroksi-7β-izobutanoiloksi-9α- nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 12), C36H47O12N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +41 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 217 (4,02), 263 (3,43) nm; IR (film) νmax 2929, 1738, 1374, 1239, 1156 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 21; HRESIMS m/z 686,3184 M+H]+ (izračunato za C36H48O12N 686,3171). Eufodendrofan O (2α,5α,8α-triacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoil- oksi-9α-nikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 13), C40H53O14N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D +22 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 216 (4,06), 263 (3,46) nm; IR (film) νmax 2930, 1737, 1371, 1239, 1152 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 22; HRESIMS m/z 772,3557 M+H]+ (izračunato za C40H54O14N 772,3539). Eufodendrofan P (2α,8α-diacetoksi-15β-hidroksi-3β,7β-diizobutanoiloksi- 5α,9α-dinikotinoiloksijatrofa-6(17),11E-dien-14-on, 14), C44H54O14N2: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -15 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 218 (4,26), 263 (3,70) nm; IR (film) νmax 2927, 1738, 1286, 1240, 1113 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 22; HRESIMS m/z 835,3659 M+H]+ (izračunato za C44H55O14N2 835,3648). EKSPERIMENTALNI DEO 133 Eufodendrofan Q (2α,8α,15β,17-tetraacetoksi-7β-izobutanoiloksi-9α-nikoti- noiloksi-3β-propanoiloksijatrofa-5E,11E-dien-14-on, 17), C41H53O15N: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -17 (c 0,2, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 219 (3,99), 263 (3,40) nm; IR (film) νmax 2976, 1737, 1371, 1240, 1102 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 24; HRESIMS m/z 822,3316 M+Na]+ (izračunato za C41H53O15NNa 822,3307). Eufodendrofan R (2α,3β,15β,17-tetraacetoksi-7β-izobutanoiloksi-8α,9α-di- nikotinoiloksijatrofa-5E,11E-dien-14-on, 18), C44H52O15N2: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -2 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 219 (4,20), 263 (3,66) nm; IR (film) νmax 2934, 1737, 1373, 1246, 1107 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 24; HRESIMS m/z 849,3463 M+H]+ (izračunato za C44H53O15N2 849,3440). Eufodendrofan S (2α,3β,8β,15β,17-pentaacetoksi-9α-benzoiloksi-7β-izobuta- noiloksijatrofa-5E,11E-dien-14-on, 19), C41H52O15: Bezbojna amorfna čvrsta supstanca; [α] 20D -14 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 230 (4,01), 268 (3,00) nm; IR (film) νmax 2926, 1738, 1373, 1248, 1104 cm ־1 ; 1 H i 13 C NMR podaci, Tabela 24; HRESIMS m/z 807,3196 M+Na]+ (izračunato za C41H52O15Na 807,3198). 3.2. Ispitivanje biološke aktivnosti 3.2.1. Lekovi R(+)–Verapamil (Dex–Ver) je komercijalni proizvod (Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Germany). Čuvan je kao 1 mM rastvor na sobnoj temperaturi. Tarikvidar (Tariquidar, TQ) je poklon dr Svena Rotenberga iz Holandskog instituta za kancer u Amsterdamu (Dr. Sven Rottenberg, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam). Rastvoren je u dimetil–sulfoksidu i čuvan u obliku 10 mM alikvota na -20 °C. EKSPERIMENTALNI DEO 134 Paklitaksel (PTX) je komercijalni proizvod (Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Germany). Rastvoren je u apsolutnom etanolu i 1 mM alikvoti su čuvani na -20 °C. Doksorubicin (DOX) je komercijalni proizvod (EBEWE Arzneimittel GmbH, Vienna, Austria). Rastvoren je u dejonizovanoj vodi i 1 mM rastvor je čuvan na -20 °C. Cisplatin (CPt) je komercijalni proizvod (Pfizer (Perth) Pty. Ltd., Bentley, Australia). Čuvan je na sobnoj temperaturi kao 1 mM rastvor. Pre tretmana svi lekovi su razblaživani sterilnom vodom do postizanja željene koncentracije. 3.2.2. Hemikalije RPMI 1640 medijum, MEM (minimalni esencijalni medijum, engl. Minimum Essential Medium), rastvor penicilin–streptomicin, rastvor smeše antibiotik– antimikotik, L-glutamin i tripsin/EDTA su komercijalno dostupni proizvodi (PAA, Vienna, Austria). Fetalni goveđi serum (FBS), sulforodamin B (SRB), rodamin 123 (Rho 123) i dimetil–sulfoksid (DMSO) su proizvodi Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Germany. Medijum za odvajanje limfocita (Lymphocyte separation medium) proizvodi ICN Biomedicals, Costa Mesa, California, USA. 3-(4,5-Dimetil-2-tizolil)-2,5-difenil- 2H-tetrazolijum bromid (MTT sredstvo) je proizvod Sigma, St. Louis, Missouri, USA. 3.2.3. Ispitivana jedinjenja Jatrofanski diterpeni (1, 2, 6-10 i 15-19) su čuvani na -20 °C u obliku 20 mM rastvora u apsolutnom etanolu. Radni rastvori (1 mM) pripremani su u 25% etanolu. 3.2.4. Ćelije i ćelijske kulture Ćelijske linije humanog nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NCI-H460), karcinoma debelog creva (DLD1) i glioblastoma (U87) su komercijalni proizvodi (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Ove parentalne ćelijske linije se smatraju senzitivnim s obzirom na to što su dobijene od pacijenata koji nisu podvrgnuti lečenju, a kod kojih je dijagnostikovan primarni tumor. Odgovarajuće rezistentne EKSPERIMENTALNI DEO 135 ćelijske linije dobijene su selekcijom iz parentalnih ćelijskih linija koje su izlagane lekovima: ćelije NCI-H460/R potiču od NCI-H460 ćelija gajenih u medijumu sa 100 nM doksorubicina; 187 DLD1-TxR i U87-TxR ćelije su dobijene stalnim izlaganjem DLD1, odnosno U87 ćelija sve višim i višim koncentracijama paklitaksela.189 MDR ćelijske linije (NCI-H460/R i DLD1-TxR) i odgovarajući senzitivni parovi kultivisani su u RPMI 1640 medijumu koji je obogaćen dodavanjem 10% rastvora toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, 2 mM rastvora L–glutamina, 4,4 g/L glukoze i smeše antibiotika i antimikotika (rastvor koji sadrži 10.000 U/mL penicilina, 10 mg/mL streptomicina i 25 μg/mL amfotericina B) u inkubatoru (Sanyo Instruments, Japan) na temperaturi 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5% ugljen–dioksida. Ćelije U87 i U87-TxR su kultivisane u MEM medijumu uz dodatak 10% rastvora toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, L–glutamina i smeše antibiotika (5.000 U/mL penicilina i 5 mg/mL streptomicina). Ćelije su presejavane pomoću 0,25% rastvora tripsin/EDTA na svakih 72 sata i gajene u svežem medijumu tako da je njihova gustina bila 8.000 ćelija/cm2 za NCI-H460, DLD1 i DLD1-TxR, 16.000 ćelija/cm2 za U87 i NCI-H460/R i 32.000 ćelija/cm2 za U87-TxR. 3.2.5. Određivanje hemosenzitivnosti pomoću sulforodamina B (SRB) Ćelije gajene u flaskovima površine 25 cm2 tretirane su tripsinom i zasejavane u mikrotitar pločama sa 96 bunarića (za NCI-H460 i DLD1 po 2.000 ćelija/bunariću, a za U87 i NCI-H460/R po 4.000 ćelija/bunariću), gde su ostavljane preko noći. Tretman jatrofanima 1 i 2 (1 – 50 μM), kao i cisplatinom (2,5 – 10 μM) trajao je 72 sata. Efekti jedinjenja 1, 2, 6, 8, 18 i 19 uz istovremeni tretman klasičnim hemioterapeuticima (paklitaksel i doksorubicin) proučavani su na MDR ćelijskoj liniji  NCI-H460/R. Jedinjenja 1 i 2 i verapamil koncentracije 1, 2,5 i 5 μM, kao i jedinjenja 6, 8, 18 i 19 koncentracije 5 μM i tarikvidar koncentracije 50 nM kombinovana su sa paklitakselom (0,005 – 5 μM), a jedinjenja 1 i 2 i verapamil koncentracije 5 μM kombinovana su sa doksorubicinom (0,05 – 5 μM). Test hemosenzitivnosti urađen je posle 72 sata. Ćelijski proteini su bojeni sulforodaminom B (SRB) po delimično izmenjenoj proceduri koju je razvio Skehan sa saradnicima. 190 SRB je negativno naelektrisana supstanca koja sadrži dve sulfonske grupe kojima se elektrostatički vezuje za bazne ostatke aminokiseline EKSPERIMENTALNI DEO 136 bojeći ukupne proteine ćelija ružičasto. Ukratko, na kraju perioda predviđenog za tretman ćelija, u mikrotitar pločama sa 96 bunarića ćelije su fiksirane dejstvom 50% trihlorsirćetne kiseline (50 μL/bunariću) 60 minuta na 4 °C, a zatim su četiri puta ispirane česmenskom vodom i bojene 0,4% (w/v) rastvorom SRB u 1% sirćetnoj kiselini (50 μL/bunariću) 30 minuta na sobnoj temperaturi. Posle toga, kako bi se uklonio višak boje, ćelije su tri puta ispirane sa po 250 μL 1% sirćetne kiseline i osušene na 45 °C u termostatu. Kompleks proteina vezanog za boju ekstrahovan je sa po 200 μL 10 mM Tris baze (pH 10,5) po bunariću, a njegova optička gustina je merena na λ = 540 nm i korigovana za vrednost optičke gustine SRB boje rastvorene u puferisanoj 10 mM Tris bazi (pH 10,5) očitanu na λ = 670 nm (LKB 5060–006 Micro Plate Reader, Vienna, Austria). Inhibicija rasta ćelija (I) određena je primenom sledeće jednačine: I (%) = 1 – × 100 gde je A – apsorbancija. Koncentracija testirane supstance koja smanjuje ćelijski rast za 50% u odnosu na ćelijski rast u kontroli, IC50 izračunata je metodom linearne regresije pomoću Excel softvera. 3.2.6. Određivanje inhibicije aktivnosti P-gp-a testom akumulacije rodamina 123 Uticaj jatrofana 1, 2, 6 – 10 i 15 – 19 na funkciju P-gp-a analiziran je metodom protočne citometrije zahvaljujući sposobnosti njegovog supstrata Rho 123 da fluorescira, pri čemu je intenzitet fluorescencije srazmeran akumulaciji Rho 123. Verapamil (kompetitivni P-gp inhibitor) i tarikvidar (nekompetitivni P-gp inhibitor) su poslužili kao pozitivne kontrolne supstance. Ćelije NCI-H460 i NCI-H460/R su kultivisane u flaskovima površine 75 cm2 do postizanja 80% konfluentnosti, kada su tretirane tripsinom i prebacivane u kivete za centrifugiranje zapremine 10 mL rastvaranjem u medijumu koji je sadržavao 5 μM Rho 123. Tada im je dodavan verapamil (5 i 20 μM), tarikvidar (50 nM), odnosno jatrofani 1, 2, 6 – 10 i 15 – 19 (10 μM), pa su ostavljane da stoje 30 minuta na 37 °C u vlažnoj atmosferi sa 5% ugljen– dioksida. Na kraju perioda predviđenog za akumulaciju, ćelije su odvajane centrifugiranjem, dva puta ispirane fosfatnim puferom i ostavljene da stoje u 0,5 mL hladnog rastvora fosfatnog pufera na ledu na tamnom mestu do analize pomoću EKSPERIMENTALNI DEO 137 FACScalibur protočnog citometra (Becton Dickinson, Oxford, U.K.). Fluorescencija Rho 123 merena je na kanalu 2 (FL2-H) na talasnoj dužini λ = 530 nm. Za svaki uzorak prikupljeno je bar 10.000 pojedinačnih događaja. Razlike u obliku krive su kvantifikovane primenom Komogorov–Smirnov neparametarske statistike. CellQuest Pro na Macintosh računaru je upotrebljen za izračunavanje P vrednosti. 3.2.7. Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) Heparinom tretirana krv zdravih dobrovoljnih davalaca krvi centrifugirana je 10 minuta brzinom 115 G. Na taj način su razdvojena dva sloja: gornji žućkasti sloj (plazma) i donji crveni sloj. Plazma i 1 mL najgornjeg dela donjeg sloja su odvojeni, promešani i naneti na 4 mL medijuma za odvajanje limfocita. Kivete ispunjene medijumom za odvajanje i uzorcima centrifugirane su 20 minuta brzinom 800 G. Tada su se jasno razlikovala dva sloja: gornji žućkasti sloj koji je sadržavao pločice i donji bezbojni sloj medijuma za razdvajanje. Ova dva sloja razdvajao je sloj u kome su se nalazile mononuklearne ćelije periferne krvi. Te ćelije su pažljivo odvojene da bi se izbeglo mešanje sa krvnim pločicama i dva puta isprane rastvorom fosfatnog pufera centrifugiranjem 10 minuta brzinom 700 G. Na kraju su PBMC ćelije sastvorene u RPMI 1640 medijumu koji je sadržavao 5% fetalnog goveđeg seruma i antibiotike. Ćelije su obojene tripan plavom bojom (engl. trypan blue) kako bi se razlikovale mrtve od živih ćelija, i izbrojane pomoću hemocitometra. Bojenjem ćelija tripan plavom bojom stiče se uvid u njihovu brojnost i kvalitet. Naime, boja ne prodire u unutrašnjost živih ćelija koje imaju intaktnu ćelijsku membranu, te one ostaju neobojene (pod mikroskopom se vide kao svetle beličaste ćelije). S druge strane, mrtve ćelije vezuju boju. Na taj način žive (vijabilne) ćelije se razlikuju od mrtvih. Ćelije su brojane mikroskopski na hemocitometru. 3.2.8. Merenje citotoksičnosti kolorimetrijskim MTT testom Stepen preživljavanja ćelija određena je kolorimetrijski, MTT testom koji se zasniva na redukciji 3-(4,5-dimetil-2-tizolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolijum bromida u formazan boju dejstvom aktivnih mitohondrija živih ćelija. Ukratko, ćelije su nanete u bunariće mikrotitar ploče sa 96 bunarića tako da je njihova gustina bila 500.000 ćelija/bunariću u 100 μL RPMI 1640 medijuma koji je sadržavao 5% fetalnog goveđeg seruma i antibiotike. Posle 24 sata ćelije su tretirane različitim koncentracijama EKSPERIMENTALNI DEO 138 jedinjenja 1, 2 i cisplatina i ostavljene da tako stoje narednih 72 sata. Tada je u svaki bunarić dodato po 50 μL rastvora MTT sredstva (2,5 mg MTT/mL medijuma za gajenje kultura) i ploča je ostavljena 60 minuta na 37 °C. Da bi se rastvorila formazan boja, čija je količina proporcionalna broju živih ćelija, dodat je DMSO. Apsorbancija rastvorene boje merena je na 540 nm pomoću automatskog čitača (LKB 5060-006 Micro Plate Reader, Vienna, Austria). 3.2.9. Određivanje antimitotske aktivnosti Uticaj jedinjenja 1 na polimerizaciju tubulina praćen je turbidimetrijski po delimično izmenjenom standardnom postupku.185 Paklitaksel je korišćen kao pozitivna kontrolna supstanca. Mikrotubularni protein goveđeg mozga (tubulin) izolovan je po proceduri koju su opisali Shelanski i saradnici. 191 Svež rastvor tubulina koncentracije 2,2 mg/mL i MES (2–(N–morfolino)etansulfonska kiselina) pufer koji je sadržavao GTP čuvani su na ledu pre početka ogleda. Osnovni rastvori paklitaksela i jedinjenja 1 (10 mM) pripremljeni su u dimetil–sulfoksidu, a zatim su razblaženi rastvorom dimetil– sulfoksida u vodi (1:1, v/v) do koncentracije 1 mM. Od ovih rastvora, razblaživanjem vodom, pripremani su radni rastvori željenih koncentracija (1 – 1000 μM). Po 40 μL rastvora jedinjenja 1, odnosno paklitaksela (pozitivna kontrola) različitih koncentracija dodavano je rastvoru tubulina (460 μL) i ostavljano da stoji 45 minuta na 37 °C. Slepa proba je napravljena mešanjem MES pufera (40 μL) i rastvora tubulina (460 μL). Po isteku 45 minuta, rastvori su prebacivani u UV kivete, pa je 15 minuta neprekidno merena njihova apsorbancija na GBC Cintra 40 UV–Visible spektrometru povezanom sa termostatičkim cirkulatorom Petrotest 25–0359 ohlađenim na 4 °C. (Tubulin na 37 °C gradi mikrotubule i ima maksimum apsorpcije na 350 nm. Hlađenjem do 4 °C dolazi do depolimerizacije i apsorpcija opada. Inkubiranjem tubulina sa različitim koncentracijama ispitivanih jedinjenja dolazi do različitog stepena polimerizacije što se ogleda u smanjenoj promeni apsorbancije na 350 nm.) Stepen polimerizacije tubulina određen je iz razlike vrednosti apsorbancije na početku ogleda (t = 0 min, 37 °C) i posle 15 minuta (t = 15 min, 4 °C) u odnosu na odgovarajuću razliku slepe probe. Iz grafika zavisnosti stepena polimerizacije tubulina od koncentracije ispitivanog jedinjenja određena je IC50 vrednost, tj. koncentracija pri kojoj je 50% tubulina polimerizovano. Uticaj paklitaksela i jedinjenja 1 na polimerizaciju tubulina izražen je njihovom koncentracijom koja dovodi do 50% polimerizacije tubulina (IC50). 139 LITERATURA 1. Webster G.L., 1994. Ann. Mo. Bot. Gard. 81, 3. 2. Janković M.M. i Nikolić V., 1972. U: Josifović M. (urednik), Flora SR Srbije, III tom, SANU, Beograd, str. 537. 3. Kojić M., 1991. Botanika, V izdanje, IP „Nauka“ Beograd, str. 322. 4. Sanchez T., Salcedo E., Ceballos H., Dufou, D., Mafla G., Morante N., Calle F., Perez J.C., Debouck D., Jaramillo G., Moreno I.X., 2009. Starch-Starke 61, 12. 5. Srinivas T. 2007. Starch-Starke 59, 477. 6. Aloys N., Ming Z.H., 2006. Food Rev. Int. 22, 1. 7. Duke J.A., 1983. Handbook of Energy Crops. Purdue University centre for new crops and plant products. www.hort.purdue.educ. Accessed on 1 March 2013. 8. Van Damme P.L.J., 2001. In: Schlissel A. and Pasternak D. (Eds.) Combating desertification with plants. Kluwer Academic Pub. p. 169. 9. Achten W.M.J., Verchot L., Franken Y.J., Mathijs E., Singh V.P., Aerts R., Muys B., 2008. Biomass Bioenerg. 32, 1063. 10. de Oliveira J.S., Leite P.M., de Souza L.B., Mello V.M., Silva E.C., Rubim J.C., Meneghetti S.M.P., Suarez P.A.Z., 2009. Biomass Bioenerg. 33, 449. 11. Kaushik N., Kumar K., Kumar S., 2007. J. Biobased Mater. Biol. 1, 301. 12. Kumar N., Sharma P.B., 2005. J. Sci. Ind. Res. India 64, 883. 13. Adeniyi O.D., Kovo A.S., Abdulkareem A.S., Chukwudozie C., 2007. J. Disper. Sci. Technol. 28, 501. 14. Benavides A., Benjumea P., Pashova V., 2007. Dyna-Colombia 74, 141. 15. Meneghetti S.A.P., Meneghetti M.R., Serra T.A., Barbosa D.C., Wolf C.R., 2007. Energ. Fuel 21, 3746. 16. Mwine J.T., Van Damme P., 2011. J. Med. Plants Res. 5, 652. 140 17. http://rainyside.com/images/annuals/Ricinus_communisGibsonii092604.jpg 18. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/07/Vernicia_fordii4.jpg/ 220px-Vernicia_fordii4.jpg 19. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2c/Rubber_tree_plantati on.JPG/360px-Rubber_tree_plantation.JPG 20. https://fbcdn-sphotos-e-a.akamaihd.net/hphotos-ak-ash4/p480x480/398607_216455 131811500_1148798776_n.jpg 21. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/67/Euphorbia_obesa_2. jpg/467px-Euphorbia_obesa_2.jpg 22. http://aminus3.s3.amazonaws.com/image/g0010/u00009738/i00447129/a6036a5bff e728af765aa9a4a96d21ee_large.jpg 23. http://s3.amazonaws.com/sagebudphotos/EUMI9/Euphorbia_milii_Red_Plant_Tor reLaMata_600.jpg 24. http://www.floracyberia.net/spermatophyta/angiospermae/dicotyledoneae/euphorbia ceae/euphorbia_esula_tommasiniana.jpg 25. http://luirig.altervista.org/cpm/albums/15d/010165-euphorbia-maculata.jpg 26. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8a/Tallow2232.JPG 27. WCSP (World Checklist of Selected Plant Families. Facilitated by the Royal Botanic Gardens, Kew. Published on the Internet; http://apps.kew.org/wcsp/ Retrieved 2013-05-26) 28. Shi Q.-W., Su X.-H, Kiyota H., 2008. Chem. Rev. 108, 4295. 29. Vasas A., Rédei D., Csupor D., Molnár J., Hohmann J., 2012. Eur. J. Org. Chem. 2012(27), 5115. 30. Ponsinet G., Ourisson G., 1968. Phytochemistry 7, 89. 31. Nielsen P.E., Nishimura H., Liang Y., Calvin M., 1979. Phytochemistry 18, 103. 32. Dublyanskaya N.F., 1937. Pharmazie Pharmakol. 11-12, 50. 33. Adolf W., Hecker E., 1970. Tetrahedron Lett. 11, 2241. 34. Hecker E., Adolf W., Kubinyi H., 1970. Tetrahedron Lett. 11,3071. 141 35. Lentsch C., Rinner U., 2009. Organic Letters 11, 5326. 36. Marco A., Sanz-Cervera F.J., Yuste A., Jakupovic J., Jeske F., 1998. Phytochemistry 47, 1621. 37. Jakupovic J., Jeske F., Morgenstern T., Tsichritzis F., Marco J.A., Berendsohn W., 1998. Phytochemistry 47, 1583. 38. Jakupovic J., Morgenstern T., Bittner M., Silva M., 1998. Phytochemistry 47, 1601. 39. Hecker E., 1971. In: Wagner H., Horhammer L. (Eds). Pharmacognosy and Phytochemistry. Springer, Berlin, p 147. 40. Corea G., Fattorusso E., Lanzotti V., Motti R., Simon P., Dumontet C., Di Pietro A., 2004. J. Med. Chem. 47, 988. 41. Song Z.-Q., Mu S.-Z., Di Y.-T., Hao X.-J., 2010. Zhongguo Tianran Yaowu 8, 81. 42. Huang Y., Aisa H.A., 2010. Phytochem. Lett. 3, 176. 43. Aisa A., Lu D., 2013. Faming Zhuanli Shenqing CN 103086882 A 20130508 44. Appendino G., Jakupovic S., Tron G.C., Jakupovic J., Milon V., Ballero M., 1998. J. Nat. Prod. 61, 749. 45. Hegazy M.-E.F., Mohamed A.E.-H.H., Aoki N., Ikeuchi T., Ohta E., Ohta S., 2010. Phytochemistry 71, 249. 46. Appendino G., Spagliardi P., Ballero M., Seu G., 2002. Fitoterapia 73, 576. 47. Miglietta A., Gabriel L., Appendino G., Bocca C., 2003. Cancer Chemother. Pharmacol. 51, 67. 48. Duarte N., Lage H., Ferreira M.-J.U., 2008. Planta Med. 74,61. 49. Liu L.G., Tan R.X., 2001. J. Nat. Prod. 64, 1064. 50. Hohmann J., Rédei D., Forgo P., Molnár J., Dombi G., Zorig T., 2003. J. Nat. Prod. 66, 976. 51. Shokoohinia Y., Chianese G., Zolfaghari B., Sajjadi S.-E., Appendino G., Taglialatela-Scafati O., 2011. Fitoterapia 82, 317. 52. Marco J.A., Sanz-Cervera F.J., Checa J., Palomares B.E., Fraga M., 1999. Phytochemistry 52, 479. 142 53. Corea G., Fattorusso E., Lanzotti V., Taglialatela-Scafati O., Appendino G., Ballero M., Simon P.-N., Dumontet C., Di Pietro A., 2003. J. Med. Chem. 46, 3395. 54. Corea G., Di Pietro A., Dumontet C., Fattorusso E., Lanzotti V., 2009. Phytochem. Rev. 8, 431. 55. Pan L., Zhang X.F., Deng Y., Wang H., Wu D.G., Luo X.D., 2003. Helv. Chim. Acta 86, 2525. 56. Corea G., Fattorusso E., Lanzotti V., Motti R., Simon P.-N., Dumontet C., Di Pietro A., 2004. Planta Med. 70, 657. 57. Vasas A., Sulyok E., Rédei D., Forgo P., Szabó P., Zupkó I., Berényi Á., Molnár J., Hohmann J., 2011. J. Nat. Prod., 74, 1453. 58. Günther G., Hohmann J., Vasas A., Máthé I., Dombi G., Jerkovich G., 1998. Phytochemistry 47, 1309. 59. Günther G., Martinek T., Dombi G., Hohmann J., Vasas A., 1999. Magn. Reson. Chem. 37, 365. 60. Hohmann J., Vasas A., Günther G., Dombi G., Blazsó G., Falkay G., Máthé I., Jerkovich G., 1999. Phytochemistry 51, 673. 61. Hohmann J., Evanics F., Berta L., Bartók T., 2000. Planta Med. 66, 291. 62. El-Bassuony A.A., 2007. Asian J. Chem. 19, 4553. 63. Ahmed A.A., Gheraf N., El-Bassuony A.A., Rhouati S., Gad M.H., Ohta S., Hirata T., 2006. Nat. Prod. Commun. 1, 273. 64. Betancur-Galvis L., Checa J., Marco J.A., Estornel E., 2003. Planta Med. 69, 177. 65. Kamano Y., Kuroda N., Kizu H., Komiyama K., 1997. Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 39, 505. 66. Corea G., Fattorusso C., Fattorusso E., Lanzotti V., 2005. Tetrahedron 61, 4485. 67. Abdelgaleil S.A.M., Kassem S.M.I., Doe M., Baba M., Nakatani M., 2001. Phytochemistry 58, 1135. 68. Hohmann J., Vasas A., Günther G., Máthé I., Evanics F., Dombi G., Jerkovich G., 1997. J. Nat. Prod. 60, 331. 143 69. Jakupovic J., Morgenstern T., Marco J.A., Berendsohn W., 1998. Phytochemistry 47, 1611. 70. Ferreira A.M.V.D., Carvalho L.H.M., Carvalho M.J.M., Sequeira M.M., Silva A.M.S., 2002. Phytochemistry 61, 373. 71. Valente C., Pedro M., Ascenso J.R., Abreu P.M., Nascimento M.S.J., Ferreira M.J.U., 2004. Planta Med. 70, 244. 72. Valente C., Pedro M., Duarte A., Nascimento M.S.J., Abreu P.M., Ferreira M.J.U., 2004a. J. Nat. Prod. 67, 902. 73. Rédei D., Forgo P., Molnár J., Szabó P., Zorig T., Hohmann J., 2012. Tetrahedron 68, 8403. 74. Fakunle C.O., Connolly J.D., Rycroft D.S., 1989. J. Nat. Prod. 52, 279. 75. Fakunle C.O., Connolly J.D., Rycroft D.S., 1992. Fitoterapia 63, 329. 76. Manners G. D., Wong R. Y., 1985. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: Organic and Bio- Organic Chemistry 10, 2075. 77. Liu L.G., Tan R.X., Gong Y.M., 2006. Chinese Chem. Lett. 17, 201. 78. Seip E.H., Hecker E., 1984. Phytochemistry 23, 1689. 79. Wang L.Y., Wang L.N., Yao X.S., Miyata S., Kitanaka S., 2003. Chem. Pharm. Bull. 51, 935. 80. Hohmann J., Evanics F., Dombi G., Molnár J., Szabó P., 2001. Tetrahedron 57, 211. 81. Pan Q., Ip F.C. F., Ip N.Y., Zhu H.X., Min Z.D., 2004. J. Nat. Prod. 67, 1548. 82. Wang L.Y., Wang N.L., Yao X.S., Miyata S., Kitanaka S., 2002. J. Nat. Prod. 65, 1246. 83. Uemura D., Katayama C., Uno E., Sasaki K., Hirate Y., 1975. Tetrahedron Lett. 21, 1703. 84. Hohmann J., Molnár J., Rédei D., Evanics F., Forgo P., Kálmán A., Argay G., Szabó P., 2002. J. Med. Chem. 45, 2425. 85. Hohmann J., Forgo P., Csupor D., Schlosser G., 2003. Helv. Chim. Acta 86, 3386. 144 86. Lu Z.-Q., Guan S.-H., Li X.-N., Chen G.-T., Zhang J.-Q., Huang H.-L., Liu X., Guo D.-A., 2008. J. Nat. Prod. 71, 873. 87. Valente I., Reis M., Duarte N., Serly J., Molnár J., Ferreira M.-J. U., 2012. J. Nat. Prod. 75, 1915. 88. Barla A., Birman H., Kültür S., Öksüz S., 2006. Turk. J. Chem. 30, 325. 89. Mongkolvisut W., Sutthivaiyakit S., 2007. J. Nat. Prod. 70, 1434. 90. Sahai R., Rastogi R.P., Jakupovic J., Bohlmann F., 1981. Phytochemistry 20, 1665. 91. Yamamura S., Shizuri Y., Kosemura S., Ohtsuka J., Tayama T., Ohba S., Ito M., Saito Y., Terada Y., 1989. Phytochemistry 28, 3421. 92. Barile E., Borriello M., Di Pietro A., Doreau A., Fattorusso C., Fattorusso E., Lanzotti V., 2008. Org. Biomol. Chem. 6, 1756. 93. Zhang W., Guo Y.-W., 2005. Planta Med. 71, 283. 94. Geng D., Shi Y., Min Z.D., Liang J.Y., 2010. Chinese Chem. Lett. 21, 73. 95. Wang Y., Li X.-f., Xie P., Wang T.-j., 2012. Zhongcaoyao 43, 1981. 96. Zhang W., Guo Y.-W., 2006. Chem. Pharm. Bull. 54, 1037. 97. Valente C., Ferreira M.J.U., Abreu P.M., Gyémánt N., Ugocsai K., Hohmann J., Molnár, J., 2004. Planta Med. 70, 81. 98. Valente C., Ferreira M.J.U., Abreu P.M., Pedro M., Cerqueira F., Nascimento M.S.J., 2003. Planta Med. 69, 361. 99. Rédei D., Hohmann, J., Evanics F., Forgo P., Szabó P., Máthé I., 2003. Helv. Chim. Acta 86, 280. 100. Hohmann J., Rédei D., Evanics F., Kálmán A., Argay G., Bartók T., 2000. Tetrahedron 56, 3619. 101. Marco J.A., Sanz-Cervera J.F., Yuste A., Jakupovic J., Lex J., 1996. J. Org. Chem. 61, 1707. 102. Uemura D., Hirata Y., 1975. Tetrahedron Lett. 21, 1697. 103. Chen Y., Yuan D., Xu X., Fu H., 2008. Zhongguo Zhongyao Zazhi 33, 1836. 145 104. Liu L.G., Meng J.C., Wu S.X., Li X.Y., Zhao X.C., Tan R.X., 2002. Planta med. 68, 244. 105. Aiyelaagbe O.O., Adesogan K., Ekundayo O., Gloer J.B., 2007. Phytochemistry 68, 2420. 106. Kupchan S.M., Sigel C.W., Matz M.J., Renauld J.A.S., Haltiwanger R.C., Bryan R.F., 1970. J. Amer. Chem. Soc. 92, 4476. 107. Kupchan S.M., Siegel C.W., Matz M.J., Gilmore C.J., Bryan R.F., 1976. J. Am. Chem. Soc. 98, 2295. 108. Taylor M.D., Smith A.B.III, Furst G.T., Gunesekara S.P., Bevelle C.A., Cordell G.A., Farnsworth N.R., Kupchan S.M., Uchida H., Branfman A.R., Dailey R.G.Jr, Sneden A.T., 1983. J. Am. Chem. Soc. 105, 3177. 109. Huang Y., Aisa H.A., 2010. Helv. Chim. Acta 93, 1156. 110. Marco J.A., Sanz-Cervera J.F., Yuste A., Jakupovic J., 1999. J. Nat. Prod. 62, 110. 111. Corea G., Fattorusso E., Lanzotti V., Taglialatela-Scafati O., Appendino G., Ballero M., Simon P.-N., Dumontet C., Di Pietro A., 2003. Bioorg. Med. Chem. 11, 5221. 112. Marco J.A., Sanz-Cervera J.F., Yuste A., Jakupovic J., 1997. Phytochemistry 45, 137. 113. Hohmann J., Evanics F., Dombi, G., Szabó P., 2001. Tetrahedron Lett. 42, 6581. 114. Robinson D.R., West C.A,. 1970. Biochemistry 9, 70. 115. Adolf W., Hecker E., 1977. Isr. J. Chem. 16, 75. 116. Evans F.J., Taylor S.E., 1983. Progr. Chem. Org. Nat. Prod. 44, 1. 117. Onwukaeme N.D., Rowan M.G., 1992. Phytochemistry, 31, 3479. 118. Seigler D.S., 1994. Ann. Mol. Bot. Gard. 81, 380. 119. Lovell C.R., 1998. Clin. Dermatol. 16, 33. 120. Kapoor L.D., 1989. Handbook of Ayurdev madical plants, In: L.D. Kapoor, (Ed.). Med. plants. CRC Press. 146 121. Hooper M., 2002. Major hebs of Ayurveda. Elsevier Health Sciences, Elsevier, The Netherlands, p. 340. 122. Lai X.Z., Yang Y.B., Shan X.L., 2004. Econ. Bot. 58, S307–S320. 123. Ankli A., Sticher O., Heinrich M., 1999. Econ. Bot. 53, 144. 124. Cataluna R.S.M.K., 1999. Second World Congress on Medicinal and Aromatic Plants for Human Welfare Wocmap, 2: 501, 289. 125. Van Damme P., 1989. Afr. Focus 5, 176. 126. Gupta B., Rasmi S., Goyal R., 2007. Pharmacogn. Rev. 1, 299. 127. www.botanical.com 128. Palatnick W., Tenenbein M., 2000. Clin. Toxicol. 38, 67. 129. Mampane K.J., Joubert P.H., Hay I.T., 1987. Phytother. Res. 1, 50. 130. Abdel-Fattah M.R., 1987. Bot. J. Linn. Soc. 94, 293. 131. Hirota M., Suttajit M., 1988. Cancer Res. 48, 5800. 132. Vogg G., Mattes E., Rothenburger J., Hertkorn N., Achatz S., Sandermann H., 1999. Phytochemistry 51, 289. 133. Shlamovitz G.Z., Gupta M., Diaz J.A., 2009. A J. Emerg. Med. 36, 239. 134. Jassbi A. R., 2006. Phytochemistry 67, 1977. 135. Hecker E., 1968. Cancer Res. 28, 2338. 136. Hecker E., 1977. Pure Appl. Chem., 49, 1423. 137. Kedei N., Lundberg D.J., Tóth A., Welburn P., Garfield S.H., Blumberg P.M., 2004. Cancer Res. 64, 3243. 138. Ramsay J.R., Suhrbier A., Aylward J.H., Ogbourne S., Cozzi S.J., Poulsen M.G., Baumann K.C., Welburn P., Redlich G.L., Parsons P.G., 2011. Brit. J. Dermatol. 164, 633. 139. Lee W.Y., Hampson P., Coulthard L., Ali F., Salmon M., Lord J.M., Scheel- Toellner D., 2010. J. Biol. Chem. 285, 23889. 147 140. Sayed M.D., Riszk A., Hammouda F.M., El-Missiry M.M., Williamson E.M., Evans F.J., 1980. Experientia, 36, 1206. 141. Ogbourne S.M., Suhrbier A., Jones B., Cozzi S.J., Boyle G.M., Morris M., McAlpine D., Johns J., Scott T.M., Sutherland K,P., Gardner J.M., Le T.T.T., Lenarczyk A., Aylward J.H., Parsons P. G., 2004 Cancer Res. 64, 2833. 142. Mason S.A., Cozzi S.J., Pierce C.J., Pavey S.J., Parsons P.G., Boyle G.M., 2010. Invest. New Drugs 28, 575–586. 143. Sánchez-Duffhues G., Vo M.Q., Pérez M., Calzado M.A., Moreno S., Appendino G., Muñoz E., 2011. Curr. Drug Targets 12, 348–356. 144. Kissin I., Szallasi A., 2011. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2159. 145. Barile E., Corea G., Lanzotti V., 2008. Nat. Prod. Commun. 3, 1003. 146. Corea G., Fattorusso E., Lanzotti V., Di Meglio P., Maffia P., Grassia G., Ialenti A., Ianaro A., 2005. J. Med. Chem. 48, 7055. 147. Appendino G., Szallasi A., 1997. Life Sci. 60, 681. 148. www.drugs.com 149. Elujoba A.A., Odeleye O.M., Ogunyemi C.M., 2005. Afr. J. Trad. Complem. 2, 46. 150. Names.cria.org.br 151. Torrance S.J., Wiedhopf R.M., Cole J.R., Arora S.K., Bates R.B., Beaver W.A., Cutler R.S., 1976. J. Org. Chem. 41, 1855. 152. Abo K., Evans F.J., 1981. Phytochemistry 20, 2535. 153. Duarte N., Járdánházy A., Molnár J., Hilgeroth A.; Ferreira M., 2008. J. Bioorg. Med. Chem. 16, 9323. 154. Engi H., Vasas A., Rédei D., Molnár J., Hohmann J., 2007. Anticancer Res. 27, 3451. 155. Ferreira M.J.U., Gyémant N., Madureira A.M., Tanaka M., Koos K., Didziapetris, R., Molnár, 2005. J. Anticancer Res. 25, 4173. 156. Teodori E., Dei S., Martelli C., Scapecchi, C., Gualtieri F., 2006. Curr. Drug Targets 7, 893. 148 157. Szakács G., Paterson J., Ludwig J., Genthe C., Gottesman M., 2006. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 219. 158. Nobili S., Landini I., Mazzei T., Mini E., 2012. Med. Res. Rev. 32, 1220. 159. Srinivas E., Murthy J., Rao A., Sastry G., 2006. Curr. Drug Metab. 7, 205. 160. Borowski E., Bontemps-Gracz M.M., Piwkowskam A., 2005. Acta Biochim. Pol. 52, 609. 161. Galletti E., Magnani M., Renzulli M.L., Botta M., 2007. Chem. Med. Chem. 2, 920. 162. Orr G.A., Verdier-Pinard P., McDaid H., Horwitz S.B., 2003. Oncogene 22, 7280. 163. Kavallaris M., Kuo D.Y.-S., Burkhart C.A., Regl D.L., Norris M., Haber M., Horwitz S.B., 1997. J. Clin. Invest. 100, 1282. 164. Derry W.B., Wilson L., Jordan M.A., 1995. Biochemistry 34, 2203. 165. Lu Y., Chen J., Xiao M., Li W., Miller D.D., 2012. Pharm. Res. 29, 2943. 166. Cortes J.E., Pazdur R., 1995. Docetaxel. J. Clin. Oncol. 13, 2643. 167. Rowinsky E.K., Donehower R.C., 1995. N. Engl. J. Med. 332, 1004. 168. Bedoya L.M., Marquez N., Martinez N., Gutierrez-Eisman S., Alvarez A., Calzado M.A., Rojas J.M., Appendino G., Muñoz E., Alcamì J., 2009. Biochem. Pharmacol. 77, 965. 169. Šilić Č., 1983. U: Korene Z. i Mitić V. (urednici), Atlas drveća i grmlja. „Svjetlost“ OOUR Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Sarajevo i Zavod za udžbenike i nastavna sredstva, Beograd, str. 84. 170. Pliny the Elder, Naturalis Historia, XXVI, 45. Mayhoff, K.F.T. (Ed.) 1906 Lipsiae, Teubner. 171. Sharma D.K., Tiwari M., Behera B.K., 1994. Biores. Technol. 49, 1. 172. Singla A.K., Pathak K., 1990. Fitoterapia 61, 483. 173. Fokialakis N., Mellion E., Magiatis P., Harvala C., Mitaku S., 2003. Flavour Frag. J. 18, 39. 149 174. Guelz P.G., Hemmers H., Bodden J., Marner F.J., 1987. Zeitschrift fuer Naturforschung C: Journal of Biosciences 42, 191. 175. Ibrahim A.Y., Mahmoud K., El-Hallouty S.M., 2011. Journal of Applied Sciences Research 7, 1246. 176. Conti L., Marchetti M., Botteghi C., 1988. Phytochemistry 27, 791. 177. Bruni R., Muzzoli M., Loi M.C., Fantin G., Poli F., Sacchetti G., 2004. Fitoterapia 75, 50. 178. http://www.montenegreen.com/modro-zeleno/spasu-nema-spasa/ 179. http://www.trigoso.it/Le%20nostra%20flora/Euforbia-04.jpg 180. http://www.dipbot.unict.it/sistematica_es/Immagini/1865_051.jpg 181. http://www.janjina.croatia1.com/images/Sl-18.jpg 182. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/73/Euforbia_dendroides02.jpg 183. http://www.naturamediterraneo.com/Public/data7/spin/100_7559.JPG_200922315 1147_100_7559.JPG 184. Shizuri Y., Kosemura S., Ohtsuka J., Terada Y., Yamamura S., 1983. Tetrahedron Lett. 24, 2577. 185. Gaskin F., Cantor C.R., Shelanski M.L., 1974. J. Mol. Biol. 89, 737. 186. Fox E., Bates S.E., 2007. Expert Rev. Anticancer Ther. 7, 447. 187. Pešić M., Marković J.Z., Janković D., Kanazir S., Marković I.D., Rakić L., Ruždijić S., 2006. J. Chemother. 18, 66. 188. Shusterman A.J., Mc Dougal P.G., Glasfeld A., 1997. J. Chem. Edu. 74, 1222. 189. Podolski-Renić A., Anđelković T., Banković J., Tanić N., Ruždijić S., Pešić M., 2011. Biomed. Pharmacother. 65, 345. 190. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R., 1990. J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107. 191. Shelanski M.L., Gaskin F., Cantor C.R., 1973. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 765. 150 BIOGRAFIJA Milka (Branislav) Jadranin je rođena 21. januara 1971. godine u Obrenovcu. Osnovnu školu je završila u selu Stubline kod Obrenovca, a srednju u Obrenovcu. Školske 1989/90. upisala se na Hemijski fakultet u Beogradu, a diplomirala je 7. oktobra 2004. sa srednjom ocenom 8,75 tokom studija i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Poslediplomske studije na Hemijskom fakultetu u Beogradu, na Odeljenju za instrumentalnu analizu pri Katedri za organsku hemiju kod mentora prof. dr Slobodana Milosavljevića, upisala je školske 2004/05. godine i završila ih sa prosečnom ocenom 10,00. Magistarsku tezu pod naslovom „Sekundarni metaboliti biljnog roda Amphoricarpos“ odbranila je 24. decembra 2007. godine. Od 1. decembra 2004. zaposlena je u Centru za hemiju IHTM kao istraživač pripravnik, a u zvanje istraživač saradnik izabrana je 23. aprila 2008. godine. U okviru svog naučno-istraživačkog rada bavi se hemijom sekundarnih metabolita biljaka, proučavanjem hemijskog sastava odbrambenih supstanci životinja, spektroskopskim i hromatografskim tehnikama analize strukture organskih jedinjenja, kao i biološkim dejstvima hemijskih jedinjenja i biljnih ekstrakata. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписанa: Милка Јадранин Изјављујем да је докторска дисертација под насловом: „Изоловање, карактеризација и биолошка активност јатрофанских дитерпена из Еuphorbia dendroides L.“ • резултат сопственог истраживачког рада, • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршила ауторска права и користила интелектуалну својину других лица. Потпис докторанта У Београду, 08.11.2013. Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора: Милка Јадранин Број индекса: / Студијски програм: / Наслов рада: „Изоловање, карактеризација и биолошка активност јатрофанских дитерпена из Еuphorbia dendroides L.“ Ментор: проф. др Веле Тешевић Потписана: Милка Јадранин Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предала за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанта У Београду, 08.11.2013. Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: „Изоловање, карактеризација и биолошка активност јатрофанских дитерпена из Еuphorbia dendroides L.“ која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предала сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучила. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанта У Београду, 08.11.2013. 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.