UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Dragana Č. Dabić UTVRĐIVANJE VEZE IZMEĐU STRUKTURE I RETENCIJE OKSOTIAZOLIDINA PRIMENOM MULTIVARIJANTNE ANALIZE doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Dragana Č. Dabić QUANTITATIVE STRUCTURE- RETENTION RELATIONSHIP STUDY OF OXOTHIAZOLIDINES USING MULTIVARIATE ANALYSIS Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentor: dr Živoslav Tešić redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Članovi komisije: dr Maja Natić docent Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Dušanka Milojković-Opsenica vanredni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Danica Agbaba redovni profesor Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Marija Baranac-Stojanović docent Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Datum odbrane: Ova doktorska disertacija je urađena na Katedri za analitičku hemiju Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, pod mentorstvom dr Živoslava Tešića, redovnog profesora Hemijskog fakulteta u Beogradu. Najiskrenije se zahvaljujem prof. dr Živoslavu Tešiću na dragocenoj pomoći u toku izrade i pisanja rada, na korisnim savetima i stručnom usmeravanju. Dr Dušanki Milojković-Opsenici dugujem izuzetnu zahvalnost na dragocenim stručnim savetima i korisnim sugestijama tokom izrade doktorske disertacije. Posebnu zahvalnost dugujem i dr Maji Natić na stalnom interesovanju, savetima i nesebičnoj pomoći pri postavci i izradi ove disertacije. Zahvaljujem se dr Mariji Baranac-Stojanović, u okviru čije grupe su sintetisane supstance ispitivane u ovoj disertaciji, na savetima pri završnoj izradi rada, kao i dr Danici Agbabi na stručnoj pomoći. Najsrdačnije se zahvaljujem i svim svojim kolegama na rečima podrške i ohrabrenja. Utvrđivanje veze između strukture i retencije oksotiazolidina primenom multivarijantne analize Hromatografsko ponašanje 23 novosintetisana 2-alkiliden-4-oksotiazolidina ispitivano je u uslovima reverzno-fazne planarne hromatografije, uz upotrebu dve stacionarne faze (oktadecil-modifikovan (RP-18) i cijano-modifikovan (CN) silika-gel). Dvokomponentne smeše methanol/voda, acetonitril/voda i tetrahidrofuran/voda su korišćene kao mobilne faze. Linearna zavisnost RM vrednosti od zapreminskog udela organske komponente u mobilnoj fazi utvrđena je za sva ispitivana jedinjenja, sa visokom vrednošću korelacionog koeficijenta (r > 0,99). Ispitivani 4-oksotiazolidini predstavljaju kongenernu seriju jedinjenja, što potvrđuje značajan nivo korelacije dobijen pri poređenju RM0 vrednosti i drugih hromatografskih parametara (m, C0 i PC1). Svi hromatografski parametri lipofilnosti (RM0, m, C0 i PC1) poređeni su sa izračunatim log P vrednostima. Statistički parametri ovih zavisnosti pokazali su da RM0 vrednosti mnogo pouzdanije opisuju lipofilnosti od preostalih hromatografskih parametara (m, C0 i PC1). Analiza glavnih komponenata je primenjena na retencione podatke u cilju utvrđivanja sličnosti i razlika između upotrebljenih hromatografskih sistema. Višestruka linearna regresija (MLR) i parcijalna regresija najmanjih kvadrata (PLS) su omogućile ispitivanje odnosa između molekulskih deskriptora ispitivanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina i retencionih podataka određenih primenom dva hromatografska sistema (tetrahidrofuran/voda na RP-18 i CN stacionarnoj fazi). Potpuna geometrijska optimizacija izvršena je pomoću AM1 semi-empirijske molekulsko-orbitalne metode, nakon čega je set fizičko-hemijskih molekulskih deskriptora izračunat iz optimizovanih struktura. Poređenjem statističkih parametara odabran je model gde je na najbolji način opisana veza između seta izračunatih deskriptora i RM0 vrednosti. Dobra prediktivna moć MLR i PLS modela dobijenih za kalibracioni set podataka potvrđena je na podacima iz test seta. Molekulski deskriptori uključeni u odabrane MLR i PLS modele su slične prirode, a u sve dobijene modele uključen je parametar lipofilnosti (log P) što ukazuje na značaj lipifilnosti i njen uticaj na retenciju N-supstituisanih 2-alkiliden-4- oksotiazolidina. Ključne reči: Reverzno-fazna tankoslojna hromatografija, lipofilnost, analiza glavnih komponenata, višestruka regresiona analiza, parcijalna regresija najmanjih kvadrata, oksotiazolidini Naučna oblast: Hemija Uža naučna oblast: Analitička hemija UDK broj: 543 Quantitative structure-retention relationship study of oxothiazolidines using multivariate analysis The chromatographic behavior of 23 new 2-alkylidene-4-oxothiazolidine derivates was investigated by means of the reversed-phase thin-layer chromatography (RP TLC) on RP-18 and CN stationary phases. Binary mixtures of methanol/water, acetonitrile/water and tetrahydrofuran/water were used as mobile phases. Linear relationships between the volume fraction of the organic mobile phase modifier and the RM values were established for each solute with the high correlation coefficient values (r > 0.99). The investigated 4-oxothiazolidines are a congeneric set of compounds, and significant correlations were obtained between the chromatographically determined RM0 and other retention parameters (m, C0, and PC1). All lipophilicity parameters (RM0, m, C0, and PC1) obtained from the reversed-phase experiments were compared with the calculated log P values. Statistical parameters of these correlations showed that RM0 values were more suitable for lipophilicity estimation than other retention parameters (m, C0, and PC1). Principal Component Analysis was performed on retention data in an attempt to reflect the similarities and differences among different chromatographic systems. Multiple linear regression (MLR) and partial least squares regression (PLS) were performed to investigate relation between the structural descriptors of N-substituted 2-alkylidene-4-oxothiazolidines and chromatographic retention determined for the two chromatographic systems (tetrahydrofuran/water on RP-18 and CN stationary phases). Full geometry optimization based on Austin Model 1 (AM1) semiempirical molecular orbital method was carried out and a set of physicochemical molecular descriptors was calculated from the optimized structures. The best relationships in a set of calculated descriptors and RM0 values were chosen on the basis of comparison of the statistical parameters. The statistical parameters of MLR and PLS models built for training set show a significant predictive ability. The descriptors included in the chosen MLR and PLS models were of similar nature. Lipophilicity parameter (log P) selected out of a large set of possible molecular descriptors in all models, indicated the importance of lipophilicity and its influence on the retention behavior of the N-substituted 2-alkylidene-4-oxothiazolidines. Keywords: Reversed-phase thin-layer chromatography, lipophilicity, principal component analysis, multiple linear regression, partial least squares, oxothiazolidines Scientific field: Chemistry Field of Academic Expertise: Analytical Chemistry UDC Number: 543 Izvod Abstract 1. Uvod 1 2. Opšti deo 4 2.1 Tankoslojna hromatografija 5 2.1.1 Izbor stacionarne faze u normalno-faznoj i reverzno-faznoj tankoslojnoj hromatografiji 6 2.1.2 Mehanizmi odvajanja u tankoslojnoj hromatografiji 11 2.1.3 Izbor mobilne faze 13 2.2 Proučavanje kvantitativne veze između strukture i svojstava molekula 20 2.2.1 Kvantitativna veza između strukture i retencije, QSRR 20 2.2.2 Molekulski deskriptori kao svojstva strukture molekula 23 2.2.3 Parametar lipofilnosti 30 2.3 Hemometrijske metode u funkciji proučavanja odnosa strukture i retencije 37 2.3.1 Analiza glavnih komponenata, PCA 38 2.3.2 Višestruka regresiona analiza, MLR 40 2.3.3 Parcijalna regresija najmanjih kvadrata, PLS 43 2.4 N-supstituisani 2-alkiliden-4-oksotiazolidini 45 3. Eksperimentalni deo 48 3.1 Ispitivane supstance 49 3.2 Hromatografija na tankom sloju 49 3.3 Kompjuterska izračunavanja 52 3.3.1 Geometrijska optimizacija i izračunavanje molekulskih deskriptora 52 3.3.2 Hemometrijske metode 53 4. Rezultati i diskusija 54 4.1 Retenciono ponašanje ispitivanih jedinjenja u uslovima reverzno-fazne hromatografije 55 4.1.1 Uticaj prirode stacionarne i mobilne faze na retenciju ispitivanih jedinjenja 55 4.1.2 Definisanje razlika između ispitivanih hromatografskih sistema primenom PCA analize 60 4.2 Određivanje parametara lipofilnosti ispitivanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina 63 4.2.1 Određivanje parametara lipofilnosti primenom reverzno-fazne tankoslojne hromatografije 63 4.2.2 Određivanje lipofilnosti ispitivanih jedinjenja računskim putem 72 4.3 Ispitivanje veze između hromatografski određenih parametara lipofilnosti i izračunatih log P vrednosti 73 4.4 Modelovanje QSRR modela primenom hemometrijskih tehnika 80 4.4.1 Višestruka linearna regresiona analiza, MLR 4.4.2 Parcijalna regresija najmanjih kvadrata, PLS 81 88 5. Zaključak 96 6. Literatura 99 7. Prilog 115 Uvod 1 1. Uvod Uvod 2 Proučavanje odnosa između strukture i hromatografskog ponašanja (engl. Quantitaive structure-retention relationship, QSRR) biološki aktivnih ili potencijalno aktivnih jedinjenja je predmet velikog broja istraživanja. Najranija istraživanja u oblasti QSRR-a datiraju iz 50-ih godina XX veka. Rezultati do kojih se došlo sugerišu da na hromatografsko ponašanje jedinjenja utiče njihova struktura (priroda supstituenata), te fizičko-hemijske karakteristike stacionarne i mobilne faze1. Za QSRR istraživanja neophodno je postojanje dva tipa podataka (i) hromatografski retencioni podaci i (ii) odgovarajući molekulski deskriptori koji opisuju strukturna svojstva molekula. Najčešće primenjivane hromatografske tehnike u QSRR istraživanjima su savremene tehnike, visoko-efikasna tečna hromatografija (engl. High-performance liquid chromatography, HPLC) i gasna hromatografija (engl. Gas chromatography, GC). Tankoslojna hromatografija (engl. Thyn-layer chromatography, TLC) je korišćena u najranijim istraživanjima u ovoj oblasti, ali zbog niza prednosti (ekonomičnost, jednostavnost, brzina, širok izbor stacionarnih faza), često je i danas hromatografska metoda izbora za određivanje parametara retencije2. Pored toga, jedna od glavnih prednosti tankoslojne hromatografije je mogućnost hromatografisanja nekoliko uzoraka istovremeno uz upotrebu male količine mobilne faze i minimalnu pripremu uzorka. Reverzno-fazna tankoslojna hromatografija (engl. Reversed-phase thin-layer chromatography, RPTLC) se može smatrati opšte prihvaćenom metodom za određivanje lipofilnosti jedinjenja. Molekulski deskriptori, koji se mogu izračunati primenom mnogobrojnih kompjuterskih programa, pružaju značajne strukturne informacije i mogu se dovesti u vezu sa hromatografskim ponašanjem jedinjenja. Mnogobrojna istraživanja u ovoj oblasti pokazala su da veza između molekulskih deskriptora i retencije može biti iskorišćena za definisanje retencionog mehanizma, kao i za predviđanje parametara lipofilnosti2-5. U okviru ovog rada planirano je proučavanje hromatografskog ponašanja novosintetisanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina u uslovima reverzno- fazne planarne hromatografije. Proučavanje oksotiazolidina je od značaja, jer oni predstavljaju važna bioaktivna jedinjenja6. Naročito se izdvajaju 4-oksotiazolidini, jer oni poseduju antikonvulzivnu, sedativno-hipnotičku i anksiolitičnu aktivnost7,8. Iako Uvod 3 ova klasa jedinjenja nije pokazala značajnu antitumornu i antimikrobnu aktivnost, u literaturi postoje neki rezultati i u ovoj oblasti9-11. Kao stacionarne faze odabrani su alkil- i cijano-modifikovani silika-gelovi, dok će dvokomponentne smeše (acetonitril/voda, metanol/voda i tetrahidrofuran/voda) biti upotrebljene kao mobilne faze. Očekuje se da retencioni podaci pruže informacije o strukturi ispitivanih jedinjenja, ali i o prirodi interakcija u različitim hromatografskim sistemima. Analiza glavnih komponenata (engl. Principal component analysis, PCA) je hemometrijska metoda koja će u okviru ovog istraživanja biti primenjena na retencione podatke u cilju utvrđivanja razlika između upotrebljenih hromatografskih sistema. Takođe, jedan od važnih ciljeva ovog rada je proučavanje veze između hromatografki određenih parametara lipofilnosti (RM0, m, C0 i PC1) i izračunatih log P vrednosti. Pored ovih jednostavnih korelacija, primenom multivarijantnih hemometrijskih metoda planirano je ispitivanje veze između kompjuterski izračunatih molekulskih deskriptora i parametara lipofilnosti. Dve hemometrijske tehnike, višestruka linearna regresija (engl. Multiple linear regression, MLR) i parcijalna regresija najmanjih kvadrata (engl. Partial least squares regression, PLSR) će biti primenjene za dobijanje modela koji bi na najbolji način kvantitativno opisivali vezu između RM0 i molekulskih deskriptora i koji bi se mogli koristiti za predviđanje retencije i lipofilnosti novih strukturno sličnih jedinjenja. Kvalitet ovako dobijenih QSRR modela biće procenjen i upoređen pomoću odgovarajućih statističkih parametara. Opšti deo 4 2. Opšti deo Opšti deo 5 2.1 Tankoslojna hromatografija Razvoj hromatografije u prethodnih sto godina karakterisale su značajne prekretnice, pri čemu je svaka od njih označavala početak razvoja neke nove oblasti u hromatografiji. Sam početak razvoja hromatografskih tehnika vezuje se za eksperimentalni rad ruskog naučnika Tsvet-a s početka XX veka, kojim je započet razvoj kolonske hromatografije12. Najznačajniji napredak u istorijskom razvoju hromatografije desio se 1944. godine kada su Martyn i Synge otkrili da filter papir, pun malih pora, može predstavljati zamenu za prah celuloze kojim su punjene kolone13. Njihovim pronalaskom došlo je do razvoja nove oblasti, planarne hromatografije, u koju se pored hromatografije na papiru svrstava i hromatografija na tankom sloju. Za razvoj gasne hromatografije zaslužan je takođe Martyn, koji je u saradnji sa James-om dao osnove za dalji, brz napredak gasne hromatografije14, a saradnja Martyn-a i Synge-a rezultirala je i postavljanjem osnova za razvoj visoko-efikasne tečne hromatografije tokom 60-ih godina XX veka. Razvoj tankoslojne hromatografije je odličan primer kako su nova naučna dostignuća direktno proizilazila iz prethodnih istraživanja. Prva hromatografska ispitivanja na tankom sloju sproveli su Izmailov i Shraiber 1937. i 1938. godine15. U periodu između 1950. i 1954. godine Kirchner i saradnici su razvili tankoslojnu hromatografiju kakvu danas poznajemo, dok se sam termin tankoslojna hromatografija po prvi put pojavljuje kasnih 50-tih godina dvadesetog veka i vezuje se za nemačkog naučnika Stahl-a. Njegova istraživanja16,17 omogućila su da TLC postane opšteprihvaćena analitička tehnika. Istraživanja u oblasti tankoslojne hromatografije tokom sedamdesetih godina XX veka rezultovala su pojavom visoko-efikasnih ploča, pri čemu je klasična tankoslojna hromatografija postala visoko-efikasna tankoslojna hromatografija (engl. High-performance thin-layer chromatography, HPTLC). Tankoslojna hromatografija je tehnika koja omogućava jednostavno i brzo razdvajanje i određivanje velikog broja jedinjenja istovremeno, čime se smanjuju vreme i troškovi analize u poređenju sa HPLC analizom18,19. Potrošnja rastvarača koji se koriste kao komponente mobilne faze, kao i količina rastvarača koji završava u otpadu su minimalni u tankoslojnoj hromatografiji, što je naročito važno sa stanovišta zelene hemije20. Takođe, veliki izbor različitih sorbenata i mobilnih faza u značajnoj meri Opšti deo 6 olakšava optimizaciju hromatografskog odvajanja i doprinosi širokoj upotrebi tankoslojne hromatografije. Osim toga, čak i uzorci koji nisu sasvim čisti mogu biti analizirani na tankom sloju, jer se svaka TLC ploča upotrebljava samo jednom, što nije slučaj sa visoko-efikasnom tečnom hromatografijom, gde postoji mogućnost uništavanja kolone. 2.1.1 Izbor stacionarne faze u normalno-faznoj i reverzno-faznoj tankoslojnoj hromatografiji Izbor odgovarajuće stacionarne faze pri ispitivanju hromatografskog ponašanja jedinjenja je od izuzetne važnosti. Postoji veliki broj materijala koji su dostupni kao sorbenti u tankoslojnoj hromatografiji, pri čemu su neki od njih više u upotrebi od drugih. Neki sorbenti imaju vrlo usku oblast primene, kao npr. modifikovani silika-gel na čijoj su površini prisutni hiralni centri koji se kao takav koristi za odvajanje enantiomera. Sa druge strane, silika-gel i aluminijum oksid imaju široku primenu i mogu se koristiti za odvajanje različitih jedinjenja. Za izbor adekvatne stacionarne faze neophodno je poznavati strukturu i prirodu jedinjenja čije se hromatografsko ponašanje želi utvrditi. Karakteristike, kao što su polarnost, molekulska masa, oblik i veličina jedinjenja su veoma bitne pri izboru stacionarne i mobilne faze. Normalno-faznim hromatografskim sistemom smatra se svaki sistem u kojem je stacionarna faza polarnija od mobilne. U ovakvim uslovima supstance veće polarnosti pokazuju veće zadržavanje, jer su specifične interakcije sorbenta i odvajanih supstanci izraženije. Postoji veliki broj sorbenata koji se mogu koristiti kao stacionarne faze u normalno-faznim hromatografskim sistemima. Silika-gel je svakako jedan od najčešće korišćenih i najdostupnijih sorbenata, ali su i aluminijum-oksid, celuloza, pa čak i neki modifikovani silika-gelovi zastupljeni u velikom broju istraživanja u normalno-faznim hromatografskim sistemima. Kada je reč o reverzno-faznim hromatografskim sistemima može se napraviti analogija sa ekstrakcijom jedinejnja iz vodene faze pomoću nekog organskog rastvarača. Stacionarna faza u reverzno-faznoj hromatografiji je nepolarnija od mobilne faze, pa raspodela jedinjenja između dve faze zavisi od hidrofobnosti ispitivanih jedinjenja. To znači da se polarna (hidrofilna) jedinjenja slabije zadržavaju na Opšti deo 7 nepolarnim stacionarnim fazama u poređenju sa hidrofobnim jedinjenjima. Najčešće primenjivane stcionarne faze u reverzno-faznim uslovima su alkil-modifikovani silika-gelovi (npr. dimetil-, oktil-, oktadecil-modifikovan silika-gel), ali se u značajnoj meri koriste i drugi sorbenti, poput cijano-propil ili amino-propil modifikovanih silika-gelova. Silika-gel. Sa hemijske tačke gledišta, svaki silika-gel je silicijum-dioksid, gde je svaki atom silicijuma okružen sa četiri atoma kiseonika formirajući tetraedarsku strukturu. Na površini silika-gela dolazi do formiranja veza između kiseonika i vodonika (Si-O-H, silanolna grupa) ili kiseonika i drugog atoma silicijuma (Si-O-Si, siloksanska grupa)21. Silanolni aktivni centri mogu biti izolovani, vicinalni (susedni) i geminalni (Slika 1)22-24. Međumolekulske interakcije koje se ostvaruju između aktivnih centara silika-gela i molekula ispitivanih supstanci su rezultat formiranja vodoničnih veza, dipol-dipol i elektrostatičkih interakcija25. Slobodne silanolne grupe su mnogo kiselije od vodonično-vezanih i mogu dovesti do sorpcije rastvarača. Prisustvo veće koncentracije slobodnih silanolnih grupa na površini silika-gela dovodi do povećanja retencije i pojave „razvlačenja zona”. Kod ispitivanja hromatografskog ponašanja jedinjenja preporučuje se upotreba silika-gela čija je površina u najvećoj meri prekrivena geminalnim i vicinalnim silanolnim grupama. Slika 1. Tri tipa silanolnih grpa koje se javljaju na površini silika-gela: (a) slobodna silanolna grupa, (b) susedna (vicinalna) silanolna grupa i (c) geminalna silanolna grupa21 Opšti deo 8 Modifikovani silika-gelovi. Postojanje aktivnih centara na površini silika-gela omogućava njegovu hemijsku modifikaciju. Hemijsko vezivanje organskih liganada za silika-gel postiže se reakcijom između organo-silicijumovih jedinjenja i pristupačnih silanolnih grupa, što rezurtira stvaranjem siloksanskih grupa. Organski ligandi koji se obično koriste za hemijsku modifikaciju silika-gela mogu se podeliti na hidrofobne (nepolarne) i hidrofilne (polarne). Najčešće primenjivani hemijski modifikovani silika- gelovi su: dimetil (RP-2), oktil (RP-8), oktadecil (RP-18), fenil (Ph), 3-cijano-propil (CN), 3-amino-propil (NH2) i diol. Alkil-modifikovani silika-gelovi. Najznačajniji komercijalno dostupni hidrofobni ligandi su dimetil, oktil i oktadecil (Slika 2)26. Hidrofobnost sorbenata dobijenih hemijskom modifikacijom silika-gela ne zavisi samo od prirode liganda (što je alkil-lanac duži hidrofobnost datog sorbenta će biti veća), već zavisi i od pokrivenosti površine matriksa odgovarajućim alifatičnim ligandima (veća zastupljenost ugljovodoničnih lanaca obezbeđuje veću hidrofobnost datog sorbenta). Pri upotrebi hidrofobnih sorbenata uvek se koriste vodene mobilne faze. Ovakvi hromatografski sistemi, gde je mobilna faza polarnija od stacionarne nazivaju se reverzno-faznim hromatografskim sistemima. Slika 2. Dimetil (a), oktil (b), oktadecil (c) i fenil (d) grupe hemijski vezane na površinu silika-gela Opšti deo 9 Primena alikil-modifikovanih silika-gelova u hromatografskim istraživanjima danas je veoma rasprostranjena. Pregled literature ukazuje na mogućnost korišćenja ovih sorbenata pri identifikaciji boja i tragova boja27, odvajanju amino-kiselina28, ispitivanju prirodnih flavonoida i fenola29, odvajanju pesticida30, kao i pri ispitivanju metil-estara masnih kiselina31. Takođe, upotreba reverzno-faznih sorbenata je izuzetno rasprostranjena pri određivanju parametara lipofilnosti32-36. Cijano-modifikovan silika-gel. Cijano-modifikovana stacionarna faza (CN) dobija se hemijskom reakcijom cijano-propil supstituisanih silana sa silanolnom grupom matriksa (Slika 3)26. Zahvaljujući hemijskoj strukturi cijano-propil grupe, koja se sastoji iz nepolrnog dela (alkil-niz) i polarnog ostatka (cijano-grupa), ovaj sorbent se može koristiti i u normalno-faznim i u reverzno-faznim hromatografskim sistemima26. Izborom odgovarajućih rastvarača kao komponenata mobilne faze ostvaruju se uslovi normalno-fazne ili reverzno-fazne hromatografije. U normalno-faznim hromatografskim uslovima ispitivana jedinjenja interaguju sa cijano-grupama, ali i sa nemodifikovanim silanolnim grupama, koje su prisutne na površini matriksa. Zbog ugljovodoničnog dela cijano-propil liganda, ovaj sorbent se ponaša kao nepolarna stacionarna faza u uslovima reverzno-fazne hromatografije. Zbog strukture cijano-propil liganda mehanizmi hromatografskog odvajanja na ovom sorbentu su veoma komplikovani, naročito kada se radi o normalno-faznim hromatografskim uslovima. Postoje istraživanja koja pokazuju da upotrebom mobilne faze koja sadrži vodu u kombinacija sa nekim organskim rastvaračem dolazi do izražaja reverzno-fazna priroda CN stacionarne faze37,38. Međutim, pri ispitivanju hromatografskog ponašanja izrazito polarnih jedinjenja na CN stacionarnoj fazi, uz upotrebu mobilnih faza karakterističnih za reverzno-fazne uslove (smeša vode i organskog rastvarača) retencija ispitivanih jedinjenja se smanjuje sa povećanjem udela organske komponente u mobilnoj fazi39. Ovakvo hromatografsko odvajanje se zasniva na hidrofilnim interakcijama koje ispitivanja jedinjenja ostvaruju sa stacionarnom, odnosno mobilnom fazom, a sama tehnika se naziva hromatografija hidrofilnih interakcija (engl. Hydrophilic-interaction chromatography, HILIC). Opšti deo 10 Slika 3. Cijano-propil grupa hemijski vezana na površinu silika-gela Cijano-modifikovani silika-gel se pokazao kao veoma dobar sorbent kod određivanja parametara lipofilnosti40-44. Mogućnost korišćenja CN-stacionarne faze pri određivanju parametra lipofilnosti može se pripisati sličnošću sa fosfolipidnom ćelijskom membranom. Dipolarnost cijano-propil fragmenta (polarni deo je cijano- grupa, a nepolarni deo je ugljovodonični lanac) je sličan dipolarnoj strukturi biološke membrane, koja ima hidrofilnu "glavu" i hidrofobni ugljovodonični lanac45. Takođe, istraživanja su pokazala da je na CN-stacionarnoj fazi, u uslovima reverzno-fazne hromatografije, particija dominantan mehanizam razdvajanja46. Opšti deo 11 2.1.2 Mehanizmi odvajanja u tankoslojnoj hromatografiji Tankoslojna hromatografija se može definisati kao migracioni proces gde se komponente uzorka u različitom stepenu vežu na tanak sloj sorbenta, dok se rastvarač ili smeša rastvarača kreće dejstvom kapilarnih sila. Smatra se da mnogi faktori utiču na hromatografsko ponašanje u uslovima tankoslojne hromatografije. Retencija supstanci određena je interakcijama između ispitivanih supstanci i stacionarne faze, ispitivanih supstanci i mobilne faze, ali i interakcijama između mobilne i stacionarne faze. Hemijska priroda svake od komponenata hromatografskog sistema utiče na vrstu i jačinu ovih interakcija. Tipovi interakcija koji se mogu javiti su: elektrostatičke interakcije, vodonična vezivanja, jonska izmena, istiskivanje na osnovu veličine, kao i van der Waals-ove sile. Sorbenti se biraju tako da budu inertni u odnosu na rastvarač ili smešu rastvarača koja se primenjuje za hromatografsko odvajanje26. Postoje tri glavna mehanizma razdvajanja u tankoslojnoj hromatografiji:  adsorpcioni  particioni  jonska izmena. Adsorpcioni mehanizam. Adsorpcija je površinski fenomen, koji se zasniva na fizičkoj sorpciji molekula na aktivnim centrima prisutnim na površini stacionarna faze. Ako se radi o silika-gelu, ispitivana supstanca interaguje sa silanolnim grupama na površini silika-gela. Interakcije uključene u process adsorpcije su van der Waals-ove interakcije, elektrostitičke interakcije i vodonična vezivanja, a njihovo postojanje zavisi od prirode ispitivanih jedinjenja26. Kako se mobilna faza kroz sorbent kreće dejstvom kapilarnih sila, ispitivane supstance koje se slabo adsorbuju kretaće se sa frontom rastvarača, dok će one koji se snažno vezuju za sorbent ostati blizu polazne mrlje. Do razdvajanja ispitivanih supstanci može doći samo ukoliko imaju različit afinitet vezivanja za aktivne centre na površini stacionarne faze, odnosno ako je intezitet interakcija koje određuju retenciju različit. Intezitet ovih interakcija zavisi od više faktora, kao što su broj aktivnih centara na adsorpcionoj površini, prisustvo funkcionalnih grupa u molekulu ispitivane supstance koje interaguju sa aktivnim centrima, i eluciona moć primenjene mobilne faze. Opšti deo 12 Iako je adsorpcija mehanizam karakterističan pre svega za polarne stacionarne faze, postoje istraživanja47 koja razmatraju adsorpciju na alkil-modifikovanim stacionarnim fazama. Ovaj mehanizam u reverzno-faznim hromatografskim sistemima je ostvariv kada je gustina vezanih alkil-lanaca dovoljna da se ostvari interakcija između njih i pritom spreči prodiranje molekula u amorfono-kristalni ugljovodonični sloj na hromatografskoj površini. U tom slučaju krajevi vezanih alkil-lanaca grade površinu na kojoj se supsatnce adsorbuju, a retencija je vođena samo mehanizmom adsorpcije. Adsorpcija na hemijski modifikovanim stacionarnim fazama podrazumeva da su hidrofobne interakcije na dodiru između čvrste i tečne faze od najvećeg značaja, pri čemu hidrofobni delovi ispitivanih supstanci interaguju sa hidrofobnim grupama na površini stacionarne faze. Pored hidrofobnih interakcija, postoje i slabe dipol-dipol, dipol-indukovani dipol i indukovani dipol-indukovani dipol interakcije. Particioni mehanizam. U particionoj hromatografiji stacionarna faza je neisparljiva tečnost koja je adsorbovana ili hemijski vezana kao tanak sloj (ili film) na površini inertnog nosača48,49. U idealnom slučaju, stacionarna faza je nerastvorljiva u mobilnoj fazi. Ispitivane supstance se raspodeljuju između stacionarne i mobilne faze, pri čemu njihova pokretljivost zavisi od rastvorljivosti u mobilnoj, odnosno stacionarnoj fazi. Supstance koje imaju veći afinitet prema mobilnoj fazi manje će se zadržavati u odnosu na one čiji je afinitet veći ka stacionarnoj fazi. U revrzno-faznim hromatografskim sistemima particiona teorija podrazumeva da se supstanca raspodeljuje između vodene mobilne faze i organske stacionarne faze. Međutim, na sastav i konfiguracija alkil-modifikovanog silika-gela značajan uticaj ima sastav mobilne faze, jer solvatacija alkil-lanaca od strane organske komponente mobilne faze dovodi do neprecizne granice između mobilne i stacionarne faze50-52. U literaturi se može pronaći nekoliko teorija koje daju opis konfiguracije stacionarne faze i particionog mehanizma u reverzno-faznoj hromatografiji53. Jonska izmena. Jonska izmena je proces karakterističan za sorbente koji se sastoje od inertne matrice na kojoj su vezane funkcionalne grupe sposobne da otpuste jedne i vežu druge jone, iz uzorka ili mobilne faze. Izmena jona zavisi od afiniteta jonskih vrsta, koje se odvajaju, prema sorbentu. Mobilne faze koje se primenjuju u jonoizmenjivačkoj hromatografiji su rastvori elektrolita. Pokretljivost komponenti Opšti deo 13 uzorka je pH zavisna, jer svaka komponenta ima ukupno naelektrisanje koje se menja sa povećanjem ili smanjenjem kiselosti mobilne faze26. Prilično često, u realnim uslovima, raspodela ispitivanih jedinjenja između stacionarne i mobilne faze ne može se pripisati jednom od ovih mehanizama, već je rezultat dva ili više različitih tipova navedenih interakcija. Ova pojava je naročito izražena kod hemijski modifikovanih stacionarnih faza, gde se dvojna priroda retencionog mehanizma može objasniti činjenicom da s jedne strane molekuli ispitivane supstance teže da interaguju sa organskim ligandima na stacionarnoj fazi preko disperzionih sila (particija), a s druge strane postoji kompeticija s mobilnom fazom za aktivna mesta na površini matriksa (adsorpcija). 2.1.3 Izbor mobilne faze Selektivnost odvajanja u velikoj meri zavisi od izbora rastvarača ili smeše rastvarača koji čine mobilnu fazu. Izbor mobilne faze je kritična tačka pri optimizaciji hromatografskog odvajanja, jer često nepotpuno odvajanje, suviše jaka ili slaba retencija i razvučene zone mogu biti pripisani odabiru neadekvatne mobilne faze. Pri izboru mobilne faze uvek treba težiti jednostavnosti, te ako je moguće pronaći pogodan rastvarač kojim se postiže dobro odvajanje, uvek prednost treba dati monokomponentnim u odnosu na višekomponentne mobilne faze. Takođe, treba posebnu pažnju posvetiti čistoći izabranih rastvarača. Smešu rastvarača je nepohodno dobro homogenizovati i koristiti odmah po pripremanju, jer komponente smeše mogu međusobno interagovati. U normalno-faznim hromatografskim sistemima, pri odvajanju nepolranih ili slabo polarnih jedinjenja kao eluenti se mogu koristiti nepolarni rastvarači (npr. pri odvajanju na silika-gelu kao eluenti se koriste rastvarači slabije elucione moći, kao što su heksan, benzen, toluen, cikoleksan ili dihlormetan). Međutim, ukoliko se na polarnoj stacionarnoj fazi (npr. silika-gel) ispituje hromatografsko ponašanje polarnih jedinjenja, za njihovo pokretanje neophodno je upotrebiti polarnije rastvarače jače elucione moći. Ovo je očekivano, imajući u vidu da i ispitivana jedinjenja i molekuli mobilne faze interaguju sa aktivnim centrima na površini stacionarne faze. Opšti deo 14 Pri hromatografskom ispitivanju u reverzno-faznim hromatografskim sistemima obično se koriste polarni organski rastvarači (npr. metanol, etanol ili acetonitril) ili smeša organskih rastvarača sa vodom (npr. metanol/voda, aceton/voda, tetrahidrofuran/voda). Eluciona moć mobilne faze zavisi od udela organske komponente u njoj. Veći udeo organske komponente u mobilnoj fazi obezbeđuje veću elucionu moć mobilne faze i ovakve mobilne faze mogu se upotrebiti pri odvajanju nepolarnih jedinjenja u reverzno-faznim hromatografskim sistemima, gde je stacionarna faza izrazito nepolarna (npr. alkil-modifikovan silika-gel)26. Eluotropna serija. U cilju klasifikacije rastvarača prema njihovoj jačini, istraživači su predlagali parametre na osnovu kojih bi se mogla izvršiti klasifikacija. Prvobitno su rastvorljivost u vodi i dielektrična konstanta korišćeni kao parametri pri klasifikaciji54. Iako su podaci o rastvorljivosti veoma korisni, oni ipak ne daju kompletnu sliku o jačini rastvarača. Dielektrične konstante pružaju više informacija, ali su i kod ovog parametra uočene neke abnormalnosti. Ovi nedostaci su doveli do zaključka da je za pouzdanu klasifikaciju rastvarača neophodno uzeti u obzir i karakteristike rastvarača, ali i karakteristike stacionarne faze. Nekoliko modela je predloženo, a kao najuniverzalniji prihvaćen je model koji je predložio Snyder55,56. Parametar kojim se opisuje jačina rastvarača se obeležava sa ε0 i definiše se kao adsorpciona energija po jedinici standardnog rastvarača i dat je za određenu kombinaciju rastvarač/stacionarna faza. Vrednosti parametra mogu biti izračunate za širok opseg rastvarača koji se koriste u tankoslojnoj hromatografiji, a tako formiran niz naziva se eluotropni niz. U Tabeli 1 date su elutropne serije za aluminijum-oksid (eksperimentalno određen parametar ε0) i silika-gel (teorijske vrednosti parametra ε0 su izračunate za sve rastvarače, a za neke su date i eksperimentalno dobijene vrednosti)26,57,58. Ako se upotrebom nekog rastvarača postigne zadovoljavajuća retencija, odnosno pokretljivost, selektivnost može biti unapređena mešanjem dva ili tri rastvarača u takvom odnosu da ε0 smeše rastvarača bude jednaka ε0 rastvarača kojim je postignuta zadovoljavajuća retencija. Mogućnosti kombinacija dva ili više rastvarača su mnogobrojne, ali se često najbolji rezultati dobijaju modifikacijom početnog rastvarača male polarnosti dodatkom relativno male količine rastvarača mnogo veće polarnosti, pri čemu se njihov odnos odabira tako da se dostigne odgovarajuća ε0 vrednost. Opšti deo 15 Naravno, izbor mobilne faze u velikoj meri zavisi i od prirode ispitivanih jedinjenja. Za postizanje odgovarajuće pokretljivosti nepolarnih jedinjenja na silika-gelu (npr. ugljovodonici) primenjuju se mobilne faze male polarnosti i male elucione moći, dok će upotreba rastvarača veće elucione moći biti neophodna ukoliko se ispituje hromatografsko ponašanje jedinjenja koja sadrže veći broj polarnih grupa26. Dodatak male količine kiseline (npr. mravlje, sirćetne, propanske ili hlorovodonične kiseline) ili baze (npr. rastvora amonijaka, piridina ili amina) u mobilnu fazu može znatno poboljšati rezoluciju hromatografskog odvajanja. Opšti deo 16 Tabela 1. Eluotropne serije za aluminijum-oksid i silika-gel Rastvarač ε0 (Al2O3)eksp. ε0 (SiO2)eksp. ε0 (SiO2)izrač. n-Pentan 0,00 0,00 0,00 n-Heksan 0,01 0,01 Izooktan 0,01 0,01 Cikloheksan 0,04 0,03 Ciklopentan 0,05 0,04 Ugljentetrahlorid 0,18 0,11 0,14 Izopropil etar 0,28 0,22 Toluen 0,29 0,22 Hlorbenzen 0,30 0,23 Benzen 0,32 0,25 0,25 Hloroform 0,40 0,26 0,31 Dihlormetan 0,42 0,32 0,32 Metil-izobutil-keton 0,43 0,33 Tetrahidrofuran 0,45 0,35 Dietil etar 0,46 0,38 0,38 1,2-Dihloretan 0,49 0,38 Aceton 0,56 0,47 0,43 1,4-Dioksan 0,56 0,49 0,43 Etilacetat 0,58 0,38 0,45 Metilacetat 0,60 0,46 Amil-alkohol 0,61 0,47 Anilin 0,62 0,48 Acetonitril 0,65 0,50 0,50 Piridin 0,71 0,55 2-Butoksietanol 0,74 0,57 1-Propanol 0,82 0,63 2-Propanol 0,82 0,63 Etanol 0,88 0,68 Metanol 0,95 0,73 Etandiol 1,11 0,85 Sirćetna kiselina >1 >1 Voda >>1 >>1 Opšti deo 17 Kada je reč o reverzno-faznim hromatografskim sistemima, Snyder je 1979. godine sugerisao da je moguće vrednosti za jačinu rastvarača koje su dobijene za reverzno-faznu tečnu hromatografiju primeniti na uslove tankoslojne hromatografije (Tabela 2)59. Eluciona moć smeše rastvarača izračunava se na osnovu vrednosti za jačinu svakog pojedinačnog rastvarača (S) u smeši i njihovog udela u smeši (V) prema jednačini: Ssmeša = VASA + VBSB + ... (1) Tabela 2. Jačine rastvarača (S) definisane za reverzno-faznu tečnu hromatografiju Rastvarač Jačina rastvarača, S Voda 0,0 Metanol 3,0 Acetonitril 3,1 Aceton 3,4 1, 4-Dioksan 3,5 Etanol 3,6 2-Propanol 4,2 Tetrahidrofuran 4,4 Snyder-ov trougao selektivnosti. Snyder i Glajch su klasifikovali rastvarače u osam grupa na osnovu sličnih proton-akceptorskih (xe), proton-donorskih (xd) i doprinosa koje daju dipolne-interakcije (xn)60-62. Ova klasifikacija data je u Tabeli 326. Na osnovu ove klasifikacije Snyder je formirao trougao selektivnosti predstavljen na Slici 463, gde svaki ugao trougla predstavlja jedinični doprinos odgovarajućeg parametra. Opšti deo 18 Pri optimizaciji mobilne faze rastvarači se mogu odabrati tako da tri rastvarača iz različitih grupa, koje su blizu temenima originalnog trougla, formiraju trougao selektivnosti. Za odvajanja u normalno-faznim sistemima trougao selektivnosti mogu formirati npr. dietiletar, hloroform i dihlormetan, kojima se dodaje nepolaran n-heksan da bi se smanjila njihova eluciona moć. U slučaju reverzno-faznih sistema, acetonitril, metanol i tetrahidrofuran u smeši sa vodom formiraju trougao selektivnosti. Tabela 3. Klasifikacija rastvarača prema selektivnosti koju su predložili Snyder i Glajch Grupa Rastvarači I Alifatični etri II Alifatični alkoholi III Piridin, tetrahidrofuran, glikol etri, amidi (sa izuzetkom formamida) IV Formamid, sirćetna kiselina, glikoli V Dihlormetan, 1,2-dihloretan VI Alifatični ketoni i estri, 1,4-dioksan, acetonitril VII Aromatični ugljovodonici i etri, aromatični halogenidi, aromatična azo-jedinjenja VIII Hloroform, voda, nitrometan, m-krezol Opšti deo 19 Slika 4. Snyder-ov trougao selektivnosti63. Spisak rastvarača po grupama dat je u Tabeli 3 Iako se optimizacija mobilne faze često smatra nepotrebnim korakom i gubljenjem vremena, upravo adekvatan odabir mobilne faze može uticati na dobro odvajanje zona. Opšti deo 20 2.2 Pročavanje kvantitativne veze između strukture i svojstava molekula Opšte je poznato da fizička svojstva hemijskih jedinjenja kao što su boja, miris, tačka topljenja, električna provodljivost, itd. zavise od strukture samih molekula. Takođe, hemijska reaktivnost i biološka aktivnost su u tesnoj vezi sa molekulskom strukturom. Ako se struktura molekula posmatra kao nezavisna promenljiva, fizičko-hemijska svojstva i biološku aktivnost možemo smatrati zavisno promenljivim. Upravo iz tog razloga, veliki broj istraživanja u poslednjim decenijama ima za cilj definisanje veze između strukture i karakteristika molekula3,32-36. Proučavanje odnosa između strukture i aktivnosti (engl. Quantitative structure- activity relationship, QSAR), koje su 60ih godina XX veka započeli Hansh i Fujita omogućio je razvoj jedne potpuno nove naučne oblasti64. Pod okriljem QSAR ispitivanja, uz upotrebu istih principa, otpočelo je proučavanje veze između strukture i svojstava (engl. Quantitative structure-property relationship, QSPR), i došlo je do razvoja QSRR istraživanja kod kojih je akcenat stavljen na hromatografske parametre pri opisivanju odnosa između strukture i svojstava. 2.2.1 Kvantitativna veza između strukture i retencije, QSRR Kvantitativna veza koja opisuje odnos između retencije i strukture daje bitne informacije za hromatografska ispitivanja. Postavlja se pitanje šta se tačno podrazumeva pod terminom QSRR, imajući u vidu da je terminologija u literaturi zbunjujuća i nedosledna. Prvo, često se govori o „reaktivnosti“, a ne o retenciji; zatim, umesto kvantitativnog odnosa između strukture i retencije često se za opisivanje te veze koristi QSPR ili QSAR. Ipak, uopšteno gledano, može se reći da se pod QSRR ispitivanjima podrazumevaju sva istraživanja gde se retencioni podaci mogu predvideti na osnovu strukture molekula, ali i gde se fizičko-hemijski parametri predviđaju na osnovu retencionih podataka4. Začetak razvoja QSRR istraživanja vezuje se za 1950. godinu kada je Martin ukazao da promene supstituenta, svojstava mobilne ili stacionarne faze utiču na promenu retencije jedinjenja1. QSRR postaje moćan alat u hromatografskim Opšti deo 21 ispitivanjima sa pinorskim istraživanjima iz 1977. godine koje je predvodio Kaliszan65,66. U okviru QSRR istraživanja koriste se retencioni podaci iz gasne hromatografije, visoko-efikasne tečne hromatografije ili tankoslojne hromatografije. Odnos između retencionih podataka i fizičko-hemijskih parametara u vezi je sa aktivnošću leka, što doprinosi ključnom značaju QSRR istraživanja u dizajniranju novih, potencijalnih lekova. Svojstva molekula koje mogu biti predviđene na osnovu definisane veze sa retencijom su particioni koeficijent (log P)67-70, tačka ključanja71, napon pare72, toplota isparavanja73, Gibbs-ova slobodna energija74 ili hiralna selektivnost75. Dve vrste ulaznih podataka su neophodne za QSRR istražiavanja: hromatografski podaci za seriju jedinjenja, koji predstavljaju zavisno promenljive podatke i set različitih parametara koji opisuju strukturne karakteristike ispitivanih jedinjenja i koji predstavlja nezavisno promenljive podatke5. Primenom kompjuterskih tehnika ovi ulazni podaci se koriste za dobijanje QSRR jednačina. QSRR modeli mogu poslužiti za predviđanje retencionih podataka novih, još nesintetisanih jedinjenja, na osnovu njihovih strukturnih deskriptora. U mnogim slučajevima, preciznost i tačnost QSRR modela nije dovoljno dobra da bi se mogli koristiti za predviđanje retencije. Međutim, mogu se uspešno koristiti za objašnjavanje retencionog mehanizma, za optimizaciju odvajanja smeša složenog sastava, za identifikaciju najznačajnijih deskriptora, za određivanje kompleksnih fizičko-hemijskih osobina ili za procenu relativne biološke aktivnosti76. Šematski prikaz veze između ulaznih podataka za građenje QSRR modela i karakteristika molekula dat je na Slici 577. Da bi se dobili relavantni QSRR modeli neophodno je da ulazni set podataka bude pouzdan, a preporučljivo je i da ispitivana jedinjenja pripadaju homolognoj seriji, jer se u tom slučaju mogu očekivati dobre korelacije između retencije i deskriptora koji opisuju strukturu4. Opšti deo 22 Slika 5. Metodologija i ciljevi QSRR ispitivanja. Pored relevantnog ulaznog seta podataka, za formiranje statistički značajnih QSRR modela neophodno je odabrati pogodne statističke tehnike. Višestruka linearna regresija je svakako najčešće primenjivana statistička metoda, često u kombinaciji sa prethodnom selekcijom varijabli (npr. genetski algoritam) u slučaju da je broj dostupnih deskriptora velik78-81. Analiza glavnih komponenata i parcijalna regresija najmanjih kvadrata, su takođe moćne statističe tehnike koje se često koriste u QSRR istraživanjima34,80-82. Validacija modela je izuzetno važna u svakom QSAR ili QSRR modelovanju. Kvadrat korelacionog koeficijenta R2, korigovani R2 (engl. adjusted R2) i standardna greška (engl. standard error, SE) su statistički parametri koji se najčešće koriste za definisanje QSRR modela, mada se mora naglasiti da oni nisu uvek merodavni za Opšti deo 23 opisivanje prediktivnosti nekog modela. Da bi se optimalno odredio kvalitet nekog modela, različite tehnike validacije mogu biti primenjene. Koeficijent determinacije koji je dobijen unakrsnom validacijom (Rcv2) pruža pouzdane informacije o sposobnosti predviđanja QSRR modela80,83. 2.2.2 Molekulski deskriptori kao svojstva strukture molekula Molekulski deskriptori imaju ključnu ulogu u razvoju modela u oblasti hemije, farmaceutskih nauka, zaštite životne sredine, toksikologije, ekotoksikologije, medicine i kontrole kvaliteta. Dokaz o zainteresovanosti naučne zajednice za molekulske deskriptore se ogleda u velikom broju deskriptora koji se koriste u QSAR, QSRR i QSPR istraživanjima. Više od 5000 deskriptora84, koji su dobijeni primenom različitih teorija i pristupa, definisani su i izračunati pomoću namenskih softvera. QSAR, QSRR i QSPR modeli su konačan rezultat procesa koji otpočinje odabirom molekulskih deskriptora koji na odgovarajući način predstavljaju strukturu molekula, a završava se predviđanjem ponašanja molekula u prirodnom okruženju, biološkim ili fizičko-hemijskim sistemima. Ova istraživanja se zasnivaju na pretpostavci da struktura molekula (npr. njegova geometrijska, sterna i elektronska svojstva) mora sadržati svojstva odgovorna za njegova fizička, hemijska i biološka svojstva i da postoji mogućnost da se ova svojstva predstave jednim ili većim brojem računskih deskriptora. U poslednjih nekoliko decenija, mnoga naučna istraživanja usmerena su ka mogućnosti pronalaženja načina za „prevođenje“ informacija sadržanih u molekulskoj strukturi u brojčane vrednosti koje se mogu koristiti za definisanje veze između strukture i biološke aktivnosti ili strukture i drugih eksperimentalno određenih svojstava. Molekulski deskriptori predstavljaju konačan rezultat logičke i matematičke procedure, kojom se hemijska informacija sadržana u molekulskoj strukturi prevodi u numeričku vrednost84. Mnoge teorije i metodologije koje se bave proučavanjem veze između strukture i svojstava molekula dovele su do razvoja novog naučnog polja, što je rezultiralo razvojem nekoliko praktičnih aplikacija za izračunavanje molekulskih deskriptora. Molekulski deskriptori se mogu dobiti upotrebom principa iz nekoliko različitih teorija, kao što su kvantno-hemijska, teorija informacija ili teorija grafova. Deskriptori dobijeni na ovaj način koriste se za modelovanje različitih osobina jedinjenja, koja se Opšti deo 24 upotrebljavaju u naučnim istraživanjima u okviru toksikologije, analitičke hemije, fizičke hemije, medicinske hemije, farmakologije i ekologije85. U cilju dobijanja pouzdane procene molekulskih svojstava, identifikacije strukturnih karakteristika odgovornih za biološku aktivnost i odabira molekula za nove lekove, hemometrijske i hemoinformatičke metode se primenjuju za obradu molekulskih deskriptora. Konkretno, tokom poslednjih trideset godina, hemometrija je razvila metode klasifikacije i regresije koje su sposobne da obezbede, iako ne uvek, pouzdane modele za reprodukciju poznatih eksperimentalnih podataka i predviđanje nepoznatih vrednosti. Interesovanje za modele koji pouzdano predviđaju svojstva novosintetisanih jedinjenja raste tokom poslednjih godina i ovakvi modeli se sve više smatraju korisnim i pouzdanim za predviđanje podataka za nova jedinjenja. U poslednjih nekoliko godina upotreba informacionih tehnologija postala je značajan deo u procesu otkrivanja novih lekova85. U stvari, hemoinformatika obuhvata kreiranje, organizaciju, upravljanje, pretraživanje, analizu, distribuciju, vizuelizaciju i upotrebu hemijskih informacija86. Molekulski deskriptori, koji se dobijaju transformacijom hemijskih informacija u numeričke vrednosti, imaju fundamentalnu ulogu u svim ovim procesima i mogu se primeniti u informatičkim procedurama. Na Slici 6 ilustrovan je značaj i uloga molekulskih deskriptora u naučnim istraživanjima85. Opšti deo 25 Slika 6. Ilustracija povezanosti molekulskih deskriptora sa molekulskom strukturom, hemometrijskim tehnikama i primena u QSAR/QSRR modelovanju Eksperimentalni i teorijski deskriptori. Molekulski deskriptori mogu biti eksperimentalno određeni (fizičko-hemijska svojstva) ili teorijski izračunati, pomoću matematičkih formula ili kompjuterskih algoritama. Osnovna razlika između teorijski dobijenih i eksperimentalno određenih deskriptora je ta što teorijski deskriptori ne sadrže statističku grešku koja potiče od merenja. Međutim, pretpostavke potrebne da se olakša izračunavanje i numeričke aproksimacije koje se primenjuju prilikom izračunavanja molekulskih dekriptora predstavljaju greške koje prate teorijski dobijene deskriptore. Prednost fizičko-hemijskih deskriptora је činjenica da su u većini slučajeva oni u direktnoj vezi sa retencijom ili nekim drugim fizičko-hemijskim svojstvima. Međutim, ovi deskriptori često nisu dostupni ili su dostupne vrednosti koje podrazumevaju veliku grešku. Sa druge strane, teorijski deskriptori koji se dobijaju iz fizičkih i fizičko-hemijskih teorija podudaraju se sa eksperimentalno određenim parametrima. U odnosu na eksperimentalno određene deskriptore, najveća prednost teorijskih deskriptora se najčešće, mada ne uvek, ogleda u pogledu troškova, vremena i dostupnosti85. Dostupnost molekulskih deskriptora ne samo da je obezbedila mogućnost za istraživanje novih veza, već je i stimulisala veće promene u istraživanjima u ovoj Opšti deo 26 oblasti. Zapravo, korišćenje molekulskih deskriptora, teorijski izračunatih, omogućilo je po prvi put uspostavljanje veze između eksperimentalnih saznanja i teorijskih informacija koje proizilaze iz molekulske strukture. Sve do perioda između 1960. i 1970. godine molekulsko modelovanje se uglavnom sastojalo u istraživanju veza između eksperimentalno dobijenih vrednosti, dok se danas uglavnom radi na ispitivanju odnosa između eksperimentalno određenih svojstava i kompjuterski izračunatih molekulskih deskriptora koji opisuju neku informaciju sadržanu u strukturi jedinjenja. Prikaz molekulske strukture. Prikaz molekula je način na koji je molekul simbolički predstavljen, shodno odgovarajućoj proceduri i konvencionalnim pravilima. U zavisnosti od vrste algoritma primenjenog za izračunavanje deskriptora, razlikuju se 0D-, 1D-, 2D-, 3D- i 4D- molekulski deskriptori87. Najjednostavniji prikaz moeluka je hemijska formula (molekulska formula), koja sadrži samo informacije o vrsti i broju atoma u strukturi molekula. Ovakav prikaz molekula ne sadrži nikakve informacije o molekulskoj strukturi, pa se deskriptori dobijeni iz hemijskih formula mogu smatrati bezdimenzionalnim deskriptorima (0D molekulski deskriptori). Jednodimenzionalni prikaz molekula obuhvata informacije o broju fragmenata, funkcionalnih grupa i supstituenata od interesa za molekul. Dakle, za jednodimenzionalni prikaz molekula nije neophodno potpuno poznavanje molekulske strukture. Deskriptori izvedeni iz jednodimenzionalnog prikaza molekula, koji se koriste u analizi podstruktura, sličnosti i razlika između molekula, kao i za dizajn molekulskih biblioteka, nazivaju se jednodimenzionalni (1D molekulski deskriptori). 0D i 1D deskriptori uvek se mogu jednostavno izračunati, laki su za tumačenje, ne zahtevaju optimizaciju molekulske strukture i nezavisni su od bilo kakvih konformacionih problema. Glavni nedostatak ovih deskriptora je što mnogi molekuli imaju iste vrednosti ovih deskriptora, kao što je slučaj sa izomerima. Međutim, iako je količina informacija koju nose ovi deskriptori mala, oni ipak mogu imati važnu ulogu u modelovanju nekih fizičko-hemijskih svojstava ili mogu biti uključeni u složenije modele. Dvodimenzionalni prikaz molekula obuhvata informacije o načinu povezivanja atoma u molekulu, kao i informacije o prirodi hemijskih veza između atoma, nezavisno od drugih parametara kao što su ravnotožne udaljenosti između atoma, uglovi između Opšti deo 27 veza i uvijanje ugla veze. Ovakvo predstavljanje molekulske strukture zasnovano je na teoriji molekulskih grafova, a deskriptori dobijeni na ovaj način nazivaju se topološki ili dvodimenzionalni deskriptori (2D molekulski deskriptori). Trodimenzionalni prikaz molekula posmatra molekul kao rigidni geometrijski objekat u prostoru i predstavlja prikaz ne samo prirode atoma i veza između atoma, nego i opširnu prostornu konfiguraciju molekula. Ovakav prikaz molekula naziva se geometrijski prikaz i definiše molekul u svetlu atoma koji su zastupljeni u molekulu i prostornih (x, y, z) koordinata molekula. Molekulski deskriptori koji se dobijaju iz ovog prikaza nazivaju se 3D molekulski deskriptori ili geometrijski deskriptori. Neki od njih su predloženi kao mera veličine i sternih svojstava molekula. Stereoelektronski prikaz molekula obuhvata molekulske deskriptore koji se odnose na karakteristike molekula koje proizilaze iz elektronske raspodele i interakcije polja ispitivanog molekula i atoma ili atomskih grupa (npr. molekul vode, metil grupa) iz njegovog okruženja. Deskriptori na ovom nivou mogu se smatrati 4D molekulskim deskriptorima. Kako 3D i 4D deskriptori sadrže više informacija nego neki jednostavni deskriptori, poput deskriptora povezanih sa dimenzijama molekula ili topoloških deskriptora, postoji stanovište da je u svim procesima modelovanja bolje koristiti geometrijske 3D i 4D deskriptore. Ipak, ovakvo razmišljanje nije potpuno opravdano, jer previše informacija sadržano u okviru nezavisnih varijabli, koje se dovode u korelaciju sa zavisno promenljivom, često za posledicu ima dobijanje nereproduktivnih modela. Ovo navodi na zaključak da ne postoje „najbolji deskriptori“ koji se mogu primeniti na sve probleme. Generalno govoreći, molekulski deskriptori, pored uobičajene nepromenljivosti svojstava, treba da zadovoljavaju određene osnovne zahteve. Da bi se molekuski deskriptor upotrebljavao u QSAR/QSRR istraživanjima, potrebno je da tumači strukturu, pokazuje dobru korelaciju sa najmanje jednim svojstvom molekula, ukoliko je moguće da pravi razliku među izomerima, da je primenljiv na delove strukture, da ga je moguće generalizovati na više deskriptore, da je nezavisan i jednostavan, da nije zasnovan na fizičko-hemijskim svojstvima, da nije u korelaciji sa drugim deskriptorima, da se lako izračunava, da može da se primenjuje na strukturno slične molekule i da se postepeno menja sa postepenim promenama u strukturi88. Opšti deo 28 Kao što je već istaknuto, deskriptore je moguće klasifikovati na različite načine, pa se u zavisnosti od toga kakvu informaciju nose, molekulski deskriptori mogu podeliti na fizičko-hemijske, kvantno-hemijske, topološke i konstitucionalne deskriptore. Pored fizičko-hemijskih deskriptora (npr. log P, oktanol-voda particioni koeficijent), deskriptori povezani sa veličinom molekula (npr. molekulska zapremina, polarizabilnost, molarna refraktivnost) i deskriptori povezani sa polarnošću (npr. polarna površina, dipolni moment, energija HOMO i LUMO orbitala) se takođe često koriste u QSRR istraživanjima. O korišćenju log P u QSRR ispitivanjima svedoči veliki broj publikacija, čije je cilj utvrđivanje uspešnosti korišćenja reverzno-faznih hromatografskih sistema kao alternativnih načina za određivanje parametara lipofilnosti i predviđanje lipofilnosti67,68. Energetski parametri (npr. energije orbitala, maksimum i minimum elektrostatičkog potencijala, parcijalno naelektrisanje) su kvantno-hemijski deskriptori koji mogu poslužiti pri rasvetljavanju retencionog mehanizma69, dok su topološki i elektronski topološki deskriptori često uključeni u definisanje veze između strukture i retencije dobijene primenom gasne70,89 ili visoko-efikasne tečne hromatografije90. Glavni nedostaci kvantno-hemijskih deskriptora su prilično dugotrajan proces njihovog izračunavanja i činjenica da njihovo tumačenje nije uvek jednostavno. Sa druge strane, topološki deskriptori se mogu kompjuterski prilično jednostavno izračunati, ali nisu neophodno u direktnoj korelaciji sa retencijom. U Tabeli 4 navedeni su molekulski deskriptori koji se najčešće koriste u QSRR istraživanjima, a podela je izvršena na osnovu njihove povezanosti sa određenim karakteristikama molekula. Opšti deo 29 Tabela 4. Neki strukturni deskriptori koji se koriste u QSRR istraživanjima Deskriptori povezani sa dimenzijom molekula (Konstitucioni deskriptori) Ukupan broj atoma u molekulu, broj atoma određenog tipa (C, H, O, N...) Ukupan broj veza, vrste veza, broj prstenova Van der Walss-ova zapremina i površina Molekulska masa Refraktivnost Polarizabilnost Zapremina i površina molekula dostupna rastvaraču Ukupna energija Deskriptori povezani sa geometrijom molekula Odnos dužine i širine molekula Moment inercije Topološki deskriptori (izvedeni na osnovu teorije grafova) Molekulski indeksi konektivnosti Kappa indeksi Valencioni indeksi Fizičko-hemijski parametri (empirijski i semiempirijski) Hammett-ove konstante Hansch-ove konstante Taft-ove sterne konstante Parametri rastvorljivost Solvatohromni parametri Podeoni koeficijent (log P) Temperatura ključanja pKa vrednosti Deskriptori povezani sa polarnošću molekula Dipolni moment Parcijalno i ukupno naelektrisanje Energije HOMO i LUMO orbitala Lokalni i ukupni dipol Opšti deo 30 2.2.3 Parametar lipofilnosti Berthelot i Jungfleisch su još davne 1872. godine definisali particioni koeficijent kao ravnotežnu raspodelu supstance između dva nemišljiva rastvarača, na konstatnoj temperaturi91. Postojanje veze između rastvorljivosti u lipidima i biološkog dejstva leka istraživali su pre više od jednog veka Meyer92 i Overton93. Nekoliko decenija kasnije, Pauling je otkrio vezu između lipofilnosti i anastetskog dejstva serije hemijskih jedinjenja94. Struktura i funkcija bilo kog biološkog sistema usko je povezana sa lipofilnim svojstvima njegovih molekula (komponenti). Hidrofobne interakcije snažno utiču na strukturu bioloških membrana, a takođe su transport i distribucija u okviru bioloških sistema u velikoj meri kontrolisani lipofilnošću komponenti sistema. Veoma hidrofobna unutrašnjost dvosloja membrane omogućava ili olakšava prolaz lipofilnih supstanci i sprečava slobodnu difuziju polarnih molekula, osim vode, u i iz ćelije. Takođe, lipofilnost igra dominantnu ulogu u ligand-receptor interakcijama (npr. u vezivanju hormona, neurotransmitera, modifikatora ćelijskih procesa i lekova za svoje receptore). Isto važi i za enzim-supstrat, enzim-inhibitor, antigen-antitelo i druge ligand- makromolekul interakcije. Lipofilnost se obično izražava preko particionog koeficijenta između vode i organskog rastvarača nemešljivog sa vodom (log P). Uobičajeno je odnos koncentracija u dve faze dat za slučaj kad je količina u organskoj fazi brojilac. Takođe, kada se govori o jonizujućim molekulima, log P se odnosi na neutralan oblik, dok je vrednost koja se određuje distribucioni koeficijent, log D. Distribucioni koeficijent se odnosi na odnos ukupne koncentracije jonizujuće i nejonizujuće vrste u obe faze. Mnoga prvobitna istraživanja u ovoj oblasti ukazivala su da vrednost particionog koeficijenta, log P, zavisi najviše od interakcija ispitivane supstance sa vodenom fazom, bilo da je reč o odbojnim silama (hidrofobni efekat) ili o vodoničnim vezama i polarnim interakcijama (hidrofilni efekat). Ovakva objašnjenja dala su ohrabrenje za upotrebu termina „hidrofobnost“ u medicinskoj hemiji i QSAR istraživanjima. Korišćenje termina „hidrofobnost“ u Hansch-ovim istraživanjima64, koji je 1964. godine po prvi put koristio oktanol/vodu kao sistem rastvarača za merenje hidrofobnosti, može biti opravdano činjenicom da su karakteristike korišćenog para Opšti deo 31 rastvarača takve da su polarni efekti slični u obe faze. Oktanol ima hidroksilnu grupu koja može da učestvuje u polarnim interakcijama sa molekulima uzorka, baš kao što je slučaj i sa vodom. Štaviše, postoji značajna količina vode unutar oktanolne faze. Dakle, log P vrednosti dobijene za oktanol/voda sistem naglašavaju razlike u interakciji ugljovodoničnih delova sa vodom i organskom fazom, ali prikrivaju interakcije polarnih grupa molekula. Međutim, tradicionalno objašnjavanje particije terminom „hidrofobnog vezivanja“ moralo je biti preispitano. Naime, termin „hidrofobno vezivanje“ opisuje tendenciju nepolarnih grupa da se grupišu u vodenim rastvorima, pri čemu se smanjuje stepen kontakta sa susednim molekulima vode95, dok se pod pojmom „lipofilnosti“ podrazumeva afinitet molekula, ili dela molekula, ka lipofilnom okruženju96. Određivanje lipofilnosti metodom mućkanja (engl. „shake-flask”). Sa razvojem UV spektroskopije, određivanje particionog koeficijenta na ovaj način postalo je rutina za jedinjenja koja imaju dovoljnu rastvorljivost u vodi i dovoljno jako apsorbuju u UV oblasti. Opšta upotreba log P vrednosti kao parametra lipofilnosti otpočela je tek 1964. godine sa Hasch-ovim proučavanjima, uz korišćenje oktanol/voda sistema za određivanje lipofilnosti, koji je sve do danas ostao standard u istraživanjima. Leo, Hansch i Elkins su 1971. godine objavili prvi sveobuhvatan pregled particionih koeficijenata, sa blizu 6000 vrednosti, uključujući i vlastitih 800, određenih za sistem oktanol/voda97. Iako je parametar lipofilnosti od 1964. godine tradicionalno određivan u sistemu oktanol/voda, u određene svrhe i za određen set jedinjenja, drugi parovi rastvarača su se pokazali adekvatnijim. Vrednosti particionih koeficijenata dobijenih za sistem oktanol/voda pokazale su se zadovoljavajućim za modelovanje lipofilnih interakcija sa biološkim membranama koje su pretežno izgrađene od proteina, dok za drugačije vrste bioloških membrana drugi sistemi rastvarača mogu biti pogodniji. Leahy i saradnici su 1989. godine svojim istraživanjima sugerisali da membrane (ili receptori) mogu imati različite karakteristike u pogledu mogućnosti ostvarivanja vodoničnih veza u odnosu na oktanol98. Dakle, oni su sugerisali da postoje membrane koje ne sadrže ni proton-donorske, ni proton-akceptorske grupe, dok sa druge strane neke membrane sadrže velike amfiprotične grupe, velike proton-donorske grupe ili pak velike Opšti deo 32 proton-akceptorske grupe. Stoga se Leahy zalagao za korišćenje propilen glikol dipelargonata (engl. propylene glycol dipelargonate, PGDP) kao lipidne faze za modelovanje fosfolipidne membrane i shodno tome odredio je particione koeficijente za mnoga jedinjenja za sistem PGDP/voda99. Particioni koeficijent, P, određen za sistem oktanol/voda dugo vremena je prioritetno korišćen za definisanje lipofilnosti jedinjenja. Za mnoga jedinjenja, određivanje particionih koeficijenata nije moguće primenom tradicionalnog načina mućkanjem, pa je ova metoda izgubila svoj primat100. Kao nedostatci ove metode navode se slaba reproduktivnost, dužina trajanja eksperimenta, potreba za relativno velikom količinom supstance i što je najvažnije nemogućnost određivanja particionog koeficijenta kod jedinjenja koja su veoma hidrofilna ili veoma lipofilna. Kod mnogih jedinjenja koja jonizuju, u slučaju slabo rastvornih jedinjenja ili jedinjenja koja slabo apsorbuju u UV oblasti postoje alternativne metode za merenje parametra lipofilnosti. Određivanje lipofilnosti primenom reverzno-fazne tankoslojne hromatografije. Hromatografske tehnike (HPLC i TLC) su veoma važne alternativne eksperimentalne metode za određivanje lipofilnosti jedinjenja. Martin i Syngle su 1941. godine pokazali da RF vrednost dobijena primenom reverzno-fazne tankoslojne hromatografije može da se dovede u vezu sa particionim koeficijentom P101. Retencija jedinjenja u hromatografiji je uglavnom regulisana procesima adsorpcije i particije. Da bi se odredili deskriptori lipofilnosti primenom hromatografskih tehnika, neophodno je ograničiti uticaj adsorpcije na retenciju jedinjenja. Adaptacija hromatografskih postupaka, gde je uobičajena hidrofilna, polarna, stacionarna faza zamenjenja hidrofobnom, nepolarnom, stacionarnom fazom, omogućila je eksperimentalno određivanje lipofilnih svojstava jedinjenja u uslovima reverzno-fazne hromatografije,. Upotreba hromatografskih tehnika u ispitivanjima lipofilnosti otpočela je sa radom Martin-a i Synge-a48, a nastavila se sa istraživanjima Conseden-a102, koji je utvrdio odnos između retardacionog faktora (RF vrednost), dobijenog u uslovima particione hromatografije, i particionog koeficijenta. Opšti deo 33 Da bi definisali linearnu zavisnost između hromatografskog ponašanja i hemijske strukture, Bate-Smith i Westall103 su uveli RM vrednost: ܴ୑ = log ଵିோూோూ (2) Imajući u vidu da se retardacioni faktor jedinjenja definiše kao odnos puta koji je prešla supstanca (a) i puta koji je prešao rastvarač (b) jednačina (2) može da se predstavi i na sledeći način: ܴ୑ = log ௕ି௔௔ (3) Dakle, RM predstavlja logaritamsku vrednost odnosa rastojanja između zone supstance i fronta rastvarača (što je mera interakcije supstance sa lipofilnom fazom) i puta koji je prešla ispitivana supsanca (što je mera migracije supstance sa hidrofilnom mobilnom fazom). Manje polarne supstance jače interaguju sa stacionarnom fazom, što se reflektuje sniženjem RF vrednosti, odnosno povećanjem RM vrednosti. Prema jednačini (2), RM vrednost će biti pozitivna ukoliko je RF vrednosti ispod 0,5 i obrnuto. Prema tome, RM vrednosti su u direktnoj korelaciji sa lipofilnošću jedinjenja, ukoliko su određene za hromatografski sistem u kojem dominira particioni mehanizam. Linearno povećanje RM vrednosti sa povećanjem dužine alkil-lanca kongenerne serije jedinjenja pokazalo je odličnu primenljivost RM umesto log P vrednosti, određenih standardnom metodom mućkanja. U velikom broju publikacija dobijene su dobre korelacije između RM i log P vrednosti104-106 Boyce i Milborrow su 1965. godine publikovali prvi QSAR rad gde su RM vrednosti, kao parametri lipofilnosti, korelisani sa biološkom aktivnošću107. Opšti deo 34 Biagi i saradnici su prvi sistematski koristili RP-TLC za određivanje lipofilnosti. Baš ova grupa naučnika zaslužna je za uvođenje RM0 vrednosti, tj. RM vrednosti ekstrapolisane na nulu koncentracije organske komponente, odnosno na čistu vodu. Odnos između RM vrednosti i zapreminskog udela organske komponente (φ) može biti predstavljen jednačinom: RM = RM0 + m∙φ (4) gde je m nagib prave, a RM0 vrednost odsečka. Pored RM0, m vrednosti se takođe mogu koristiti kao mera lipofilnosti jedinjenja108. Parametar m je povezan sa specifičnom hidrofobnom površinom i u nekim slučajevima može da se koristi kao parameter lipofilnosti. Za homologe serije jedinjenja utvrđeno je postojanje značajne linearne korelacije između m i RM0 vrednosti: RM0 = a + b∙m (5) gde su a i b linearni regresioni parametri. Biagi je, zajedno sa saradnicima, ukazao na međusobnu povezanost ovih parametara za nekoliko klasa farmakolški značajnih jedinjenja109-111. Takođe parametar C0 može biti upotrebljen za opisivanje lipofilnosti112,113. Ovaj parametar se definiše kao odnos RM0 i m vrednosti: C0 = RM0 / m (6) Parametar C0 se može shvatiti kao koncentacija organskog modifikatora u mobilnoj fazi za koju je raspodela supstance između dve faze jednaka (RF = 0,5; RM = 0). Takođe se može protumačiti kao hidrofobnost po jedinici specifične hidrofobne površine. Izbor stacionarne i mobilne faze pri određivanju lipofilnosti upotrebom hromatografskih tehnika u velikoj meri može uticati na dobijene vrednosti. Kada se za određivanje lipofilnosti koriste reverzno-fazni hromatografski sistemi, kao stacionarna faza se koristi neki nepolaran sorbent, koji ima ulogu lipidne faze. U ove svrhe se može Opšti deo 35 primeniti veliki broj različitih sorbenata, ali se radi reproduktivnosti i mogućnosti upoređivanja preporučuje upotreba komercijalno dostupnih sorbenata. Najčešće su u upotrebi alkil-modifikovani silika-gelovi (npr. RP-2, RP-8 i RP-18), ali se i druge vrste hemijski modifikovanih silika-gelova mogu upotrebiti u svrhu određivanja parametara lipofilnosti (npr. CN- i NH2-modifikovan silika-gel). Mobilna faza u reverzno-faznim hromatografskim sistemima se sastoji od smeše vode (ili pufera) i organskog rastvarača (tzv. modifikator) u različitim odnosima. Primena dvokomponentnih smeša je obavezna čak i kod onih stacionarnih faza gde je moguće korišćenje čiste vode. Supstance sa srednjom i visokom lipofilnošću, ukoliko se čista voda koristi kao mobilna faza, pokazuju samo zanemarljive razlike u retenciji, što utiče na tačnost merenja. Najčešće upotrebljavani organski modifikatori su metanol, aceton i acetonitril, dok su dioksan i tetrahidrofuran ređe u upotrebi. Braumann je preporučio upotrebu metanola kao organskog modifikatora, zbog izražene sličnosti njegovih fizičko- hemijskih svojstava sa vodom114. Sa teorijskog stanovišta RM0 vrednosti dobijene za različite sisteme rastvarača, bi trebalo da budu iste za sve upotrebljene rastvarače. Iako je Biagi109 upotrebljavajući silika-gel impregnisan silikonskim uljem potvrdio ovo teorijsko pravilo, Cserhiti115 je upotrebljavajući silika-gel impregnisan parafinom utvrdio postojanje značajnih razlika u RM0 vrednostima, u zavisnosti od upotrebljenog organskog modifikatora (metanol, aceton ili acetonitril). Pri hemijskoj modifikaciji silanolnih grupa na površini silika-gela, sterne smetnje sprečavaju da alifatični ligandi budu blizu jedan drugog, te na površini matriksa ostaje značajan deo slobodnih silanolnih grupa. Upravo iz tog razloga, retencija na stacionarnim fazama koje sadrže slobodne silanolne grupe, kao što je oktadecil silika-gel, zavisi od građenja vodoničnih veza i dipolnih interakcija, čije postojanje zavisi od elektronskih svojstava upotrebljenog modifikatora i mogućnosti građenja vodoničnih veza116,117. Značajne prednosti RP-TLC tehnike u odnosu na metodu mućkanja su, između ostalog, to što ispitivana jedinjenja ne moraju da budu čista, a neophodna je samo mala količina supstance. Takođe, mogu se ispitivati jedinjenja širokog opsega lipofilnosti i na kraju, kvantitativno određivanje koncentracije jedinjenja nije neophodno (određivanje koncentracije je čest problem kod klasične metode mućkanja). Opšti deo 36 Kompjutersko izračunavanje lipofilnosti. U poslednje vreme raste interes za mogućnost izračunavanja log P vrednosti primenom različitih kompjuterskih programa, koji predstavljaju zamenu za eksperimentalne metode. Danas postoji bar dvadeset softverskih paketa za izračunavanje lipofilnosti. Na osnovu metodologije koja se primenjuje pri izračunavanju, sve računarske procedure mogu se podeliti na fragmentacione metode (npr. Σf, Clog P, AB/log P), atomske metode (npr. CHEMICALC, SMILOGP, HINT) i metode zasnovana na molekulskim svojstvima (npr. ASClog P, Alog Ps). Fragmentacione metode uzimaju u obzir doprinos pojedinih fragmenata u molekulu i korekcioni faktor usled intramolekulskih interakcija118,119, dok atomske metode uzimaju u obzir doprinos pojedinačnih atoma u molekulu120. Kod metoda koje su zasnovane na molekulskim svojstvima izračunavanje se zasniva na empirijskim zavisnostima ili je zasnovano na 3D strukturi molekula. Imajući u vidu da je često potrebno parametar lipofilnosti odrediti za veliki broj jedinjenja, neophodno je da procedura za određivanje lipofilnosti bude dovoljno brza. U tom kontekstu primena kompjutera superiorna je u odnosu na eksperimentalna određivanja. Takođe, prednost kompjuterskih metoda je mogućnost izračunavanja log P vrednosti čak i za izrazito lipofilna jedinjenja. Rutinska primena računskih postupaka, međutim, zahteva kontinuiranu proveru poređenjem sa eksperimentalnim procedurama, jer kod molekula sa složenim fragmentima ili funkcionalnim grupama koje se ne nalaze u bazi podataka, računske metode pokazuju izvesne nepreciznosti. Opšti deo 37 2.3 Hemometrijske metode u funkciji proučavanja odnosa strukture i retencije Termin „hemometrija“ koristi se od 1971. godine da bi opisao sve veću upotrebu matematičkih modela, statističkih principa i drugih logičkih metoda u oblasti hemije, a naročito analitičke hemije121. Hemometrija je zajedničko ime za različite statističke metode koje se primenjuju u hemiji, a čiji cilj je obezbeđivanje maksimalne količine informacija analizom hemijskih podataka. Neka od značajnijih područja primene hemometrije uključuju: (1) kalibraciju, validaciju i poređenje različitih setova rezultata; (2) optimizaciju hemijskih merenja i eksperimentalnih procedura; (3) ekstrakciju maksimalne količine hemijskih informacija iz analitičkih podataka i (4) planiranje eksperimenata (eksperimentalni dizajn). Brz tehnološki razvoj, posebno u oblasti kompjuterizovanih instrumenata za analitičku hemiju, omogućio je značajan napredak u oblasti hemometrije u poslednjih tridesetak godina. Tokom većeg dela ovog perioda, fokus je bio na multivarijantnim metodama. Za najveći broj hemijskih pojava svojstvena je multivarijantnost, što zapravo znači da na jednu pojavu (zavisno promenljivu) utiče veći broj faktora (nezavisno promenljivih). Mnogi tradicionalni hemijski pristupi su univarijantni, ali se tom prilikom gubi velika količina informacija. Uzimajući u obzir distribuciju više varijabli istovremeno, može se dobiti više informacija nego kada bi se svaka promenljiva pojedinačno razmatrala. Ovo je jedna od prednosti multivarijantnih tehnika, jer kada se posmatra samo jedna varijabla, zanemaruju se korelacije između varijabli i u tom slučaju jedan deo ukupne slike nedostaje. Istraživanje koje je sproveo Bro daje opis dodatnih prednosti multivarijantnih metoda u poređenju sa univarijantnim122. Smanjenje šuma je moguće kada se veći broj varijabli analizira simultano primenom odgovarajućih multivarijantnih metoda (npr. nizak nivo šuma moguće je dobiti kada se analiza glavnih komponenata, PCA, iskoristi da bi se izdvojilo nekoliko značajnih faktora). Još jedna značajna prednost multivarijantnih tehnika je mogućnost korišćenja delimično selektivnih merenja, gde se upotrebom multivarijantnih metoda dobija rezultat oslobođen efekta ometajućeg signala. Opšti deo 38 Izračunavanja i softveri. U većini slučajeva izračunavanja u okviru hemometrijske analize su suviše komplikovana da bi se izvršavala ručno ili pomoću kalkulatora, pa je neophodno korišćenje nekog softvera. Jedna od poteškoća pri hemometrijskoj analizi je upravo odabir odgovarajućeg softvera, koji će najviše odgovarati podacima kojima se raspolaže. Excel i Matlab su softveri koji se najčešće koriste u ove svrhe. Prednost Excel-a je jednostavna upotreba i fleksibilan pregled podataka, dok se prednost Matlab-a ogleda u orjentisanosti ka radu sa matricama, posebno imajući u vidu da je većina podataka multivarijantna. Paralelno korišćenje Excel-a i Matlab-a predstavlja optimalnu kombinaciju123. 2.3.1 Analiza glavnih komponenata, PCA Analiza glavnih komponenata (engl. Principal component analysis, PCA) predstavlja verovatno najrasprostranjeniju i najpopularniju multivarijantnu hemometrijsku tehniku. U literaturi postoji veliki broj podataka o začecima razvoja ove metode, pri čemu je jedan od verovatno najpoznatijih ranih radova Pearson-ov rad objavljen 1901. godine124. Opšte je prihvaćeno da je revolucija u korišćenju PCA počela 30-ih i 40-ih godina XX veka sa radovima Hotellinga125. Jedna od važnijih primena PCA je u QSAR istraživanjima, gde je dostupan veliki broj fizičko-hemijskih parametara velikog broja jedinjenja. Jedan od problema sa multivarijantnim podacima je da njihov uobičajeni obim može otežati utvrđivanje odnosa među njima, tako da je cilj mnogih multivarijantnih metoda smanjivanje broja podataka. Takođe, često je korelacija među varijablama značajna, pa su zapravo neke od informacija suvišne. PCA je jedna od multivarijantnih metoda koja pruža mogućnost istraživanja postojanja pravilnosti u velikom setu podataka, pružajući informaciju o jedinjenjima koja se ponašaju na sličan način126. Opšti deo 39 Princip PCA metode može se prikazati kao matemtička transformacija matrice originalnih podataka, X, u sledećem obliku: X = T·P + E (7) gde matrica T sadrži onoliko redova koliko ima i matrica polaznih podataka, a matrica P sadrži onoliko kolona koliko ima i matrica polaznih podataka. To znači da je broj kolona u matrici T jednak broju redova u matrici P. E je matrica reziduala (odstupanja). PCA se može primeniti na matricu polaznih podataka bilo koje veličine, ali broj glavnih komponenti ne može biti veći od manje dimenzije originalnog seta podataka. Dakle, ako originalna matrica ima dimenzije I × J (I < J), ne može se izračunati više od I glavnih komponenti. Ako se broj glavnih komponenti označi sa A, tada su:  dimenzije T: I × A;  dimenzije P: A × J. Matrica T se sastoji od niza vektora u kolonama, dok se matrica P sastoji od niza vektora u redovima. Prvi vektori matrice T i P često se nazivaju i svojstveni vektori prve glavne komponente, a ilustracija ovog data je na Slici 7. Važno je naznačiti da cilj PCA analize uključuje nalaženje matematičke funkcije koja sadrži određena svojstva koja se mogu povezati sa hemijskim faktorima. Sledeći korak u analizi glavnih komponenata je određivanje broja značajnih faktora ili glavnih komponenata u matrici. Sa povećanjem broja glavnih komponenata povećava se i količina varijanse koja se opisuje datim modelom. Najveća količina varijanse sadržana je u prvih nekoliko glavnih komponenata. Po pravilu, broj glavnih komponenata koji se uzima za dalju obradu bi trebalo da objašnjava najmanje 80% ukupne varijanse podataka127. Opšti deo 40 Slika 7. Šematski prikaz funkcionisanja PCA metode 2.3.2 Višestruka regresiona analiza, MLR Kod proste linearne regresije, jedna zavisno promenljiva, Y, se dovodi u vezu sa jednom nezavisno promenljivom, X. Ova zavisnost se može predstaviti jednačinom: Y = a + b∙X + c (8) gde je a odsečak, b nagib prave, a c greška za koju važi pretpostavka da je nezavisna i sa srednjom vrednošću nula128. U većini slučajeva zavisno promenljiva, Y, je određena većim brojem nezavisnih varijabli, pa je za definisanje te zavisnosti neophodno upotrebiti neku multivarijantnu analizu. Višestruka linearna regresija, MLR, je jedna od najčešće korišćenih regresionih metoda, sa širokom upotrebom u QSRR, QSAR i QSPR istraživanjima79-81,129-131. MLR je pogodna regresiona metoda zbog svoje jednostavnosti i lakoće tumačenja modela koji daje linearnu vezu između svojstava jedinjenja, Y, i njegovih svojstvenih vektora, Opšti deo 41 označenih sa X, koji su obično molekulski deskriptori. Dakle, MLR omogućava predviđanje svojstava nepoznatih jedinjenja na osnovu postavljenog modela. Opšti izraz MLR modela može biti predstavljen sledećom jednnačinom: Y = a + b1∙X1 + b2∙X2 + bk∙Xk + c (9) gde je a konstanta modela, X1, ..., Xk su molekulski deskriptori sa odgovarajućim koeficijentima b1, ..., bk (za deskriptore od 1 do k)128. Vrednosti koeficijenata mogu pokazati stepen uticaja pojedinačnih molekulskih deskriptora na svojstvo jedinjenja. Takođe, predznak koeficijenta ukazuje na pozitivan ili negativan doprinos datog deskriptora na ispitivano svojstvo. Međutim, ova tumačenja nisu tačna kod međusobno visoko korelisanih deskriptora, jer im u tom slučaju mogu biti dodeljene pogrešne vrednosti koeficijenata. Prema tome, molekulski deskriptori u modelu treba da budu nezavisni jedni od drugih i broj deskriptora koji ulaze u model bi trebalo da bude bar pet puta manji od broja jedinjenja132. Osim toga, pretpostavka da su svojstva jedinjenja u linearnoj korelaciji sa molekulskim deskriptorima čini MLR metodu manje pogodnom za modelovanje gde je zavisna varijabla neka složena karakteristika (npr. toksičnost, gde više mehanizama može uzajamno da izazove toksičnu reakciju). Validacija QSAR i QSRR modela je vrlo važan korak, a njihov kvalitet se definiše statističkim parametrima. Najčešće se u ovu svrhu koriste kvadrat korelacionog koeficijenta R2, koji predstavlja meru odstupanja koja mogu biti objašnjena regresionom pravom, korigovani R2 i standardna greška SE. Međutim, nekada ovi statistički parametri nisu dovoljni da u potpunosti definišu prediktivnu moć određenog modela, te se različite tehnike validacije primenjuju da bi se utvrdio kvalitet modela. Obično se složenost modela proverava primenom unakrsne validacije (engl. Cross-validation, CV), koja u svojoj najjednostavnijoj varijanti podrazumeva metodu izostavljanja jednog objekta (engl. leave-one-out cross-validation, LOO-CV)133. Ceo proces se ponavlja sve dok svaki uzorak ne bude isključen. Statistički parametri koji definišu unakrsnu validaciju su koeficijent determinacije unakrsne validacije, Rcv2, koren srednjeg kvadratnog odstupanja određen za unakrsnu validaciju (engl. Root mean squared error cross-validation, RMSECV), kao i suma kvadrata odstupanja od predviđenih vrednosti (engl. Predicted residual error sum of squares, PRESS). Opšti deo 42 Vrednost Rcv2, definisana je jednačinom: ܴ௖௩ଶ = 1 − ௉ோாௌௌௌௌ௒ (10) gde je SSY suma kvadrata standardne devijacije srednje vrednosti zavisne promenljive (engl. The sum of the squared deviations of the dependent variable values from their mean). Da bi se dobile dobre korelacije između eksperimentalnih i predviđenih vrednosti potrebno je da SSY ima što nižu vrednost. U idealnom slučaju SSY = 0 i Rcv2= 1. Selekcija varijabli je takođe bitan korak u svakoj MLR analizi, jer je cilj dobiti najbolji model sa najboljom prediktivnošću. Da bi se broj varijabli smanjio potrebno je pronaći i odbaciti deskriptore koji sadrže najmanje informacije i koji u najmanjoj meri doprinose zavisno promenljivoj, Y. Prvi korak u selekciji deskriptora je odbacivanje svih deskriptora koji imaju konstantnu vrednost za sva ispitivana jedinjenja ili čije vrednosti nisu dostupne za sva jedinjenja. Nakon ove „ručne” selekcije deskriptora može se primeniti neki postupak za selekciju varijabli, da bi se broj deskriptora dodatno smanjio. Najčešće korišćene metode za selekciju varijabli su130:  Izbor unapred (engl. Forward selection) je metoda kod koje se prvo uključuje ona varijabla koja se u najvećoj meri koreliše sa zavisno promenljivom (najveća vrednost R2). Sa svakom sledećom uključenom varijablom vrednost R2 se dodatno povećava, a proces se prekida uključivanjem varijable čiji doprinos porastu parametra R2 nije značajan. Primenom ove metode, jednom uključena varijabla ne može više biti isključena iz modela.  Eliminacija unazad (engl. Backward elimination) u početni model uključuje sve varijable, a zatim se iz modela postepeno eliminišu varijable i to prvo ona sa najmanjim doprinosom vrednosti PRESS.  Postepena regresija ili regresija u koracima (engl. Stepwise regression) je zapravo selekcija unapred, ali u svakom koraku postoji mogućnost izostavljanja varijable koja je prethodno bila uključena u model. U okviru ove selekcije potrebno je odabrati dva nivoa značajnosti, jedan niži, kao kriterijum za uključivanje novih varijabli i drugi za njihovo isključivanje. Broj varijabli koji ostaje u modelu zasniva se na ta dva nivoa značajnosti. Opšti deo 43  Metoda međusobne regresije svih promenljivih (engl. All possible regressions) vrši selekciju varijabli na osnovu provere svih korelacija sa jednom, dve, tri varijable. Kriterijum za selekciju se beleži za svaku regresiju i na osnovu njega je moguće odabrati najbolji deskriptor za jednoparametrijsku ili više deskriptora za višeparametrijsku jednačinu.  Multivarijantna selekcija varijabli (engl. Multivariate variable selection) u okviru većeg seta podataka traži manji set koji obezbeđuje maksimalnu vrednost R2. Nakon odabira prve varijable, program iz preostalog seta bira drugu varijablu koja zajedno sa prethodnom daje najveću vrednost R2. Pored toga, program proverava da li bi neka druga promenljiva mogla da zameni prvoizabranu promenljivu. Ukoliko postoji takva promenljiva, ona ulazi u sistem, a lošija varijabla biva uklonjena. Postupak traje sve dok zamena varijabli više ne utiče na povećanje vrednosti R 2. 2.3.3 Parcijalna regresija najmanjih kvadrata, PLS PLS regresija je tehnika koja objedinjuje i kombinuje karakteristike PCA i MLR. Ovo je izuzetno korisna tehnika kada treba predvideti set zavisnih varijabli iz velikog seta nezaviso promenjlivih. Zanimljivo je istaći da je ova thenika razvijena u okviru društvenih nauka134-136, ali je značajniju primenu pronašla upravo u hemometriji137. Ako matrica Y ima dimenzije I × K (I je broj objekata, npr. jedinjenja, a K broj zavisnih varijabli), a matrica X dimenzije I × J, gde je J broj zavisno promenljivih, zadatak PLS regresije će biti definisanje veze između matrice zavisno promenljivih, Y, i matrice nezavisno promenljivi, X. Kada je broj varijabli u matrici X veći od broja objekata, nemoguće je primeniti višestruku linearnu regresiju, pa se u ovakvim okolnostima primenjuju neke druge metode, a jedna od njih je i PLS. Pristup PLS metode omogućava prevazilaženje problema sa kolinearnim varijablama, zamenjujući ih sa nekoliko latentnih, međusobno normalnih varijabli (PLS komponente)138. Ove PLS komponente su linearne kombinacije originalnih varijabli X, a kriterijum za njihovo dobijanje je visoka korelacija sa zavisno promenljivom i maksimum kovarijanse između X (npr. matriks molekulskih deskriptora) i Y (npr. retencioni prametri). Latentne Opšti deo 44 varijable dobijene na ovaj način mogu se iskoristiti za predviđanje Y vrednosti, što može poslužiti za predviđanje osobina molekula. Prilikom PLS regresije matrice X i Y se transformišu prema sledećim jednačinama: X = T·P + E (11) Y = U·Q + F (12) gde su T i U matrice skorova (PLS komponenti), P i Q su matrice koeficijenata latentnih varijabli, a E i F matrice reziduala (odstupanja). Važno je razmatrati broj latentnih varijabli koji se koristi u PLS modelovanju, a optimalan broj latentnih varijabli se može odrediti primenom metode unakrsne validacije (LOO-CV), gde se deo podataka (objekata) koristi kao set za kalibraciju (engl. training set), a drugi deo se izdvaja kao set za testiranje (engl. test set) i koristi se za validaciju modela. Uvek je poželjno da samo nekoliko latentnih varijabli (PLS komponenata) opisuje najveći deo varijacija. Kvalitet PLS modela definiše se na osnovu kvadrata višestrukog korelacionog koeficijenta za kalibraciju (R2Y), kvadrata višestrukog korelacionog koeficijenta za unakrsnu validaciju (Q2Y), korena srednjeg kvadratnog odstupanja za kalibraciju (engl. Root mean square errors of calibration, RMSEC) i korena srednjeg kvadratnog odstupanja za unakrsnu validaciju (RMSECV)127,139. Opšti deo 45 2.4 N-supstituisani 2-alkiliden-4-oksotiazolidini Istraživanja su pokazala da 4-oksotiazolidinsko jezgro (Slika 8) predstavlja važan deo strukture biološki aktivnih jedinjenja140,141. Ova klasa jedinjenja ima širok spektar farmakološkog dejstva i raznovrsnu primenu. Ustanovljeno je da jedinjenja koja u strukturi sadrže 4-oksotiazolidinski prsten imaju antibakterijsko9,142, antivirusno143, antiinflamatorno144, antifugalno145, analgetsko146 i antikancersko dejstvo147. Slika 8. Struktura 4-oksotiazolidinskog prstena U poslednje vreme, veliku pažnju hemičara privlače 4-oksotiazolidini koji u položaju C2 sadrže egzocikličnu dvostruku vezu. Neki od 2-alkiliden-4-oksotiazolidina se kao netoksične, aktivne supstance koriste u lečenju različitih oboljenja. Predstavnici ove klase jedinjenja su ralitolin koji se koristi kao antiepileptik148, piprozolin koji se uporebljava kod oboljenja jetre i etozolin (diuretik) koji se koristi pri lečenju hipertenzije. Strukture ovih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina, koji su registrovani kao lekovi, date su na Slici 9. Slika 9. Strukture 2-alkiliden-4-oksotiazolidina koji su registrovani kao lekovi Opšti deo 46 Tiazolidinski derivati čije je hromatografsko ponašanje ispitivano u ovom radu sintetisani su regioselektivnom bazno katalizovanom reakcijom α-merkapto estara 1 i α-supstituisanih nitrila 2 (Slika 10)149,150. Reakcije su izvedene u apsolutnom etanolu u prisustvu katalitičke količine kalijum-karbonata, na temperaturi ključanja rastvarača. Slika 10. Šematski prikaz sinteze 2-alkiliden-4-oksotiazolidinskih derivata Pod blagim reakcionim uslovima, upotrebom jednog ekvivalenta kalijum-karbonata, ostvareno je regioselektivno N-alkilovanje 2-alkiliden-4-oksotiazolidina 3 (Slika 11)151. Slika 11. N-alkilovanje 2-alkiliden-4-oksotiazolidinskih derivata Opšti deo 47 Funkcionalizacija položaja C-5, N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina 4a, bez supstituenta u tom položaju, ostvarena je reakcijom sa terc- butoksibis(dimetilamino)metanom (Bredereck-ov reagens) (Slika 12). Reakcije sinteze 5-(dimetilamino)metiliden derivata 2-alkiliden-4-oksotiazolidina 5 su izvedene u toluenu na temperaturi ključanja rastvarača. Slika 12. Sinteza 5-(dimetilamino)metiliden derivata 2-alkiliden-4-oksotiazolidina Sva sintetisana jedinjenja okarakterisana su na osnovu spektralnih podataka (IR, 1H i 13C NMR, MS) i elementalne analize. Eksperimentalni deo 48 3. Eksperimentalni deo Eksperimentalni deo 49 3.1 Ispitivane supstance Strukture 23 novosintetisana N-supstituisana 2-alkiliden-4-oksotiazolidina151, koji su izolovani kao Z-izomeri, prikazane su na Slici 13. 3.2 Hromatografija na tankom sloju Za proučavanje hromatografskog ponašanja ispitivanih jedinjenja (Slika 13) primenjena je tehnika uzlazne tankoslojne hromatografije. TLC ispitivanja su izvedena na komercijalno dostupnim pločama dimenzija 10  10 cm. Korišćene su dve vrste stacionarnih faza: C18 (E. Merck, Germany; Art. 5559) i HPTLC CN (E. Merck, Germany; 16464). Upotrebljene mobilne faze bile su dvokomponentne smeše (metanol (MeOH)/voda, acetonitril (ACN)/voda i tetrahidrofuran (THF)/voda). Korišćeni su različiti zapreminski odnosi organskih komponenata (Tabela 5). Svi rastvarači upotrebljeni kao komponente mobilne faze bili su analitičkog stepena čistoće. Ispitivane supstance su rastvorene u metanolu. Na ploče je nanošeno oko 2 µl sveže pripremljenih rastvora približne koncentracije 1 mg/cm3. Ploče su razvijane u vertikalnoj kadi, nakon što je atmosfera u kadi zasićena parama rastvarača tokom 15 minuta. Sva ispitivanja su izvršena na sobnoj temperaturi (22 ± 2 ºC). Hromatografske zone su detektovane pod UV lampom, na talasnoj dužini λ = 254 nm. Na osnovu tri uzastopna merenja izračunate su prosečne RF vrednosti za svaku ispitivanu supstancu. Eksperimentalni deo 50 Slika 13. Strukture ispitivanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina Eksperimentalni deo 51 Tabela 5. Primenjeni hromatografski sistemi Stacionarna faza Mobilna faza Zapreminski udeo organske komponente RP-18 Metanol/voda 0,95; 0,90; 0,85; 0,80; 0,75; 0,70 Acetonitril/voda 0,90; 0,80; 0,70; 0,60; 0,50 Tetrahidrofuran/voda 0,85; 0,80; 0,70; 0,60; 0,50 CN Metanol/voda 1,00; 0,90; 0,80; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60 Acetonitril/voda 0,70; 0,60; 0,50; 0,45; 0,40 Tetrahidrofuran/voda 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40 Eksperimentalni deo 52 3.3 Kompjuterska izračunavanja 3.3.1 Geometrijska optimizacija i izračunavanje molekulskih deskriptora Dva kompjuterska programa, Hyperchem (verzija 7.0, Hypercube) i Molecular Modeling Pro Plus (MMP Plus) upotrebljena su za izračunavanje molekulskih deskriptora, a Hyperchem je iskorišćen i za geometrijsku optimizaciju152,153. Strukture ispitivanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina nacrtane su u Hyperchem Release 7 programu. Prvi korak u optimizaciji molekulske strukture izveden je pomoću molekulsko-mehaničke MM+ metode, koja je zasnovana na MM2 algoritmu. U sledećem koraku molekulske strukture su optimizovane korišćenjem Polak-Ribiere Conjugate Gradient (PRCG) algoritma. Strukture optimizovane na ovaj način korišćene su kao polazne za semi-empirijsku optimizaciju. Potpuna geometrijska optimizacija svih struktura postignuta je primenom semi-empirijske molekulsko-orbitalne metode (Austin Model 1, AM1)154, a urađena je primenom algoritma Steepest Descent, i na kraju Conjugate Directions algoritma. Isti kompjuterski program, Hyperchem, upotrebljen je za izračunavanje molekulskih deskriptora. Izračunati su deskriptori koji se odnose na elektronska svojstva, optimizovane geometrije, ukupnu energiju, toplotu građenja i QSAR svojstva: ukupna energija (engl. total energy, TE), energija vezivanja (engl. binding energy, BE), toplota građenja (engl. heat of formation, HOF), dipolni moment (engl. dipol moment, DM), energija najviše popunjene orbitale (engl. highest occupied molecular orbital energy, HOMO), energija najniže nepopunjene orbitale (engl. lowest unoccupied molecular orbital energy, LUMO), površina (engl. surface area (approx), SA), energija hidratacije (engl. hydration energy, HE), refraktivnost (engl. refractivity, R) i polarizabilnost (engl. polarizability, P). Pomoću programa Molecular Modeling Pro Plus (MMP Plus) izračunati su deskriptori koji opisuju fizičko-hemijska svojstva i konstitucioni deskriptori: molekulska dužina (engl. molecular length, L), molekulska širina (engl. molecular weight, W), molekulska dubina (engl. molecular depth, D), Randić, Hall i Kier indeksi konektivnosti Eksperimentalni deo 53 0-4 (engl. connectivity indices 0-4, CI 0-4), Randić, Hall i Kier indeksi valentnosti 0-4 (engl. valence indices 0-4, VI 0-4), hidrofilno-lipofilni balans (engl. hydrophilic-lipophilic balance, HLB), parameter rastvorljivosti (engl. solubility parameter, SP), Hansen-ova disperzija (engl. Hansen dispersion, HD), Hansen-ova polarnost (engl. Hansen polarity, HP), Hansen-ovo vodonično vezivanje (engl. Hansen hydrogen bonding, HHB), akceptor vodonične veze (engl. hydrogen bond acceptor, HBA), donor vodonične veze (engl. hydrogen bond donor, HBD), rastvorljivost u vodi (engl. water solubility, SW), površinski napon (engl. surface tension, ST), hidrofilna površina (engl. hydrophilic surface area, HSA) i polarna površina (engl. polar surface area, PSA). Parametri lipofilnosti su kompjuterski izračunati pomoću programa dostupnih na internetu (Alog Ps, AClog P, ABlog P, Milog P, Alog P, Mlog P, log PKOWWIN, Xlog P2, Xlog P3)155, dok su Clog P vrednosti izračunate pomoću ChemDraw Ultra 9.0 softvera156. 3.3.2 Hemometrijske metode Linearna regresija urađena je primenom statističkog paketa Data Analysis u okviru Microsoft Office Excel-a (verzija 7.0). NCSS 2004 softverski paket157 je iskorišćen za analizu glavnih komponenata (PCA) i višestruku linearnu regresiju (MLR). Parcijalna regresija najmanjih kvadrata (PLS) izvedena je primenom PLS Toolbox statističkog paketa (Eigenvector Research, Inc. v. 5.2.2.) u okviru MATLAB verzije 7.4.0.287 (R2007a) (MathWorks INC., Natick, MA). Rezultati i diskusija 54 4. Rezultati i diskusija Rezultati i diskusija 55 4.1 Retenciono ponašanje ispitivanih jedinjenja u uslovima reverzno-fazne hromatografije Hromatografsko ponašanje novosintetisanih N-supstituisanih 2-alkiliden- 4-oksotiazolidina (Slika 13) ispitivano je u uslovima reverzno-fazne hromatografije. U cilju ispitivanja uticaja stacionarne i mobilne faze na retenciju jedinjenja, korišćene su dve stacionarne faze (RP-18 i CN-modifikovan silika-gel) i tri dvokomponentna sistema rastvarača (metanol/voda, acetonitril/voda i tetrahidrofuran/voda). Oktadecil-modifikovan silika-gel, RP-18, odabran je kao stacionarna faza koja se najčešće koristi pri hromatografskom ispitivanju lipofilnosti, a CN-modifikovan silika gel je upotrebljen, jer se takođe pokazao kao veoma dobar sorbent kod određivanja lipofilnosti40-44. Mobilna faza u reverzno-faznoj tankoslojnoj hromatografiji obično je dvo- ili više-komponentna smeša rastvarača od kojih je jedan uvek voda, a drugi je organski rastvarač-modifikator. Pri optimizaciji mobilne faze rastvarači se mogu odabrati tako da tri rastvarača, iz različitih grupa Snayder-ovog trougla55,56, formiraju trougao selektivnosti. Za odvajanja u reverzno-faznim sistemima trougao selektivnosti mogu formirati acetonitril, metanol i tetrahidrofuran u smeši sa vodom, te su stoga baš oni odabrani kao organski modifikatori. 4.1.1 Uticaj prirode stacionarne i mobilne faze na retenciju ispitivanih jedinjenja Karakteristike stacionarnih faza i prisustvo odgovarajućih funkcionalnih grupa na njihovim površinama utiču na različitu retenciju jedinjenja, kada se primeni RP-18, odnosno CN-modifikovan silika-gel. Retencioni podaci (RF i RM vrednosti) za sve hromatografske sisteme dati su u Prilogu (Tabele P1-P6). Na Slici 14 upoređene su RM vrednosti ispitivanih jedinjenja za hromatografske sisteme gde su upotrebljene dve različite stacionarne faze, dok su mobilne faze i udeli organskog modifikatora bili isti (φ = 0,7 za sisteme MeOH/voda i ACN/voda; φ = 0,5 za sistem THF/voda). Rezultati i diskusija 56 Slika 14. RM vrednosti ispitivanih jedinjenja za RP-18 i CN stacionarnu fazu Iz prikazanih rezultata (Slika 14) evidentno je da, bez obzira na upotrebljeni organski modifikator u mobilnoj fazi, ispitivana jedinjenja snažnije interaguju sa RP-18 stacionarnom fazom u poređenju sa CN-modifikovanim silika-gelom. Posledica jake retencije ispitivanih jedinjenja pri upotrebi RP-18 stacionarne faze može se objasniti izraženijim nespecifičnim interakcijama ispitivanih supstanci i ove stacionarne faze (disperzione i indukcione sile, odnosno hidrofobne interakcije) u odnosu na CN stacionarnu fazu, koja je manje hidrofobna od RP-18. Pored nespecifičnih interakcija jedinjenja sa stacionarnom fazom, na retenciju utiču i specifične interakcije ispitivanih jedinjenja sa mobilnom fazom. Promena retencionih parametara se može očekivati kada se promeni organska komponenta mobilne faze, zbog toga što različiti organski modifikatori imaju različite proton-donorske i proton-akceptorske sposobnosti, te različite afinitete ka dipol-interakcijama. Rezultati i diskusija 57 Takođe, stacionarna faza dobijena hemijskom modifikacijom silika-gela (npr. RP-18, CN) pored hemijski modifikovanih silanolnih grupa i slobodnih silanolnih grupa sadrži i sorbovane molekule organskog modifikatora. Stoga je primenjeni organski modifikator odgovaran i za pojavljivanje razlika u svojstvima stacionarne faze usled promene organske komponente u mobilnoj fazi. U okviru ovog rada upotrebljena su tri organska modifikatora (MeOH, ACN i THF) koja pripadaju različitim grupama Snyder-ovog trougla i odlikuju se različitim sposobnostima da doniraju ili prime proton prilikom vodoničnog vezivanja, kao i različitim mogućnostima u pogledu ostvarivanja dipol-interakcija. Vrednosti proton-akceptorskih (xe), proton donorskih (xd) i doprinosa koje daju dipol-interakcije (xn) za upotrebljene organske rastvarače date su u Tabeli 6. Tabela 6. Karakteristike primenjenih organskih modifikatora Organski modifikatori xd xe xn Metanol 0,48 0,22 0,30 Acetonitril 0,31 0,27 0,42 Tetrahidrofuran 0,38 0,20 0,42 Razlike u svojstvima upotrebljenih organskih komponenata ogledaju se i u njihovoj različitoj elucionoj moći. Eluciona moć upotrebljenih modifikatora, definisana za RP-18 stacionarnu fazu, raste u slećem nizu: MeOH (S = 3,0) < ACN (S = 3,1) < THF (S = 4,0). Uticaj promene organskog modifikatora na retenciju jedinjenja ispitan je poređenjem RM vrednosti dobijenih za hromatografske sisteme uz upotrebu različitih organskih modifikatora za isti zapreminski udeo organske komponente u mobilnoj fazi (φ = 0,6 za sve organske komponente za CN stacionarnu fazu i φ = 0,7 za sve organske komponente za RP-18 stacionarnu fazu). Rezultati ovog poređenja, za obe primenjene stacionarne faze, dati su na Slici 15. Rezultati i diskusija 58 Slika 15. Uticaj promene organskog modifikatora na retenciju jedinjenja na a) RP-18 i b) CN stacionarnoj fazi Rezultati i diskusija 59 Iz prikazanih rezultata (Slika 15) vidi se da pri istom zapreminskom udelu različitih organskih modifikatora u mobilnoj fazi ispitivane supstance imaju različite RM vrednosti. To se može pripisati različitim interakcijama do kojih dolazi tokom hromatografskog procesa između rastvarača i ispitivane supstance, kao i uticaju primenjenih rastvarača na svojstva stacionarnih faza. Rezultati poređenja RM vrednosti dobijenih za RP-18 stacionarnu fazu ukazuju da je retencija kod svih jedinjenja najjača u slučaju kad je metanol primenjen kao organski modifikator, a za najveći broj jedinjenja retencija je najslabija pri upotrebi tetrahidrofurana kao organske komponente. Poredeći karakteristike upotrebljenih organskih rastvarača, date u Tabeli 6 (xd, xe i xn vrednosti), uočljivo je da najznačajnije razlike postoje u proton-donorskim sposobnostima, gde je sklonost metanola da interaguje kao proton-donor izuzetno jaka. Iako je metanol jači proton-donor od tetrahidrofurana, retencija pri upotrebi tetrahidrofurana je značajno slabija. Ovo se može objasniti činjenicom da je sorpcija metanola na RP-18 stacionarnoj fazi znatno manja od sorpcije tetrahidrofurana, koji zbog svoje hidrofobne strukture snažno interaguje sa ugljovodoničnim lancima RP-18 stacionarne faze. Snažna sorpcija tetrahidrofurana, pri čemu se na površini stacionarne faze formira monosloj organskog modifikatora tako da je polarni deo molekula tetrahidrofurana okrenut ka ispitivanim supstancama, sprečava interakcije ispitivanih jedinjenja sa stacionarnom fazom i samim tim dovodi do slabije retencije158. Retencioni parametri, RM vrednosti, određeni pri upotrebi CN-modifikovanog silika-gela ukazuju da je za najveći broj ispitivanih jedinjenja retencija značajno jača uz upotrebu metanola kao organskog modifikatora. Sposobnost metanola da zbog posedovanja hidroksilne grupe jako interaguje sa molekulima vode značajno utiče na ponašanje jedinjenja u hromatografskim sistemima koji kao organsku komponentu mobilne faze sadrže metanol159. Metanol-voda asocijat umanjuje efekat organskog modifikatora, smanjuje elucionu moć mobilne faze, što za posledicu ima jaču retenciju ispitivanih jedinjenja. Sa druge strane, acetonitril i tetrahidrofuran su u značajno manjoj meri asosovani sa molekulima vode, pa je uticaj organske komponente u mobilnoj fazi izraženiji. Rezultati i diskusija 60 Rezultati predstavljeni na Slici 15 ukazuju da kod CN-modifikovanog silika-gela RM vrednosti dobijene uz upotrebu tetrahidrofurana kao organske komponente nisu najniže, što ukazuje na slabiju interakciju tetrahidrofurana sa CN stacionarnom fazom, pa je i sorpcija tetrahidrofurana smanjena. 4.1.2 Definisanje razlika između ispitivanih hromatografskih sistema primenom PCA analize Različite vrednosti retencionih parametra prikazanih u Tabelama P1-P6 ukazale su na značajan uticaj organskog modifikatora, odnosno stacionarne faze na retenciju ispitivanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina. Da bi ove razlike bile još uočljivije analiza glavnih komponenata je primenjena na retencione parametre, sa ciljem definisanja razlika i sličnosti između primenjenih hromatografskih sistema. PCA je primenjena na sve RF vrednosti (Tabele P1-P3) određene za šest primenjenih hromatografskih sistema34. Dimenzije početne matrice bile su 33 (broj hromatografskih sistema) × 23 (broj jedinjenja), a za obradu podataka korišćena je matrica kovarijanse, bez prethodnog autoskaliranja. Svojstvene vrednosti matrice kovarijanse, zajedno sa pojedinačnim i zbirnim udelima date su u Tabeli 7. Na osnovu dobijenih vrednosti može se uočiti da tri glavne komponente opisuju 97,70% ukupne varijanse (varijabilnosti informacija). Prva komponenta prikazuje 86,98% ukupne varijanse, druga prikazuje 9,08%, dok treća prikazuje svega 1,64% ukupne varijanse. Tabela 7. Svojstvene vrednosti i odnos varijansi objašnjeni pomoću prve tri glavne komponente korišćenjem matrice kovarijansi Komponenta Svojstvena vrednost Pojedinačni udeo (%) Zbirni udeo (%) Scree Plot PC1 1,052441 86,98 86,98 ||||||||||||||||||| PC2 0,073904 9,08 96,07 || PC3 0,019430 1,64 97,70 | Rezultati i diskusija 61 Na Slici 16 prikazana je vrednost skorova, odnosno njihova uzajamna projekcija, za prve dve glavne komponente. Ovaj grafički prikaz omogućava uočavanje raspodele hromatografskih sistema u PC1-PC2 dvodimenzionalnom prostoru, ukazujući na sličnosti i razlike između ispitivanih hromatografskih sistema. Posmatrajući podatke u odnosu na PC2 osu moguće je uvideti postojanje dve odvojene grupe podataka. Prva grupa obuhvata podatke koji se odnose na sisteme MeOH/voda (podaci 1-6) i ACN/voda (podaci 7-11) na RP-18 stacionarnoj fazi. Druga grupa obuhvata podatke dobijene za CN stacionarnu fazu, za sve primenjene mobilne faze (MeOH/voda, 17-23; ACN/voda, 24-28; THF/voda, 29-33). Ovi rezultati ukazuju na postojanje sličnosti u hromatografskim podacima u okviru stacionarnih faza, odnosno na postojanje razlika u retencionim parametrima dobijenim za dve stacionarne faze. Ovakvo grupisanje podataka moglo bi da ukaže i na postojanje različitih retencionih mehanizama kod ispitivanih stacionarnih faza. Međutim, druga grupa, pored svih podataka koji se odnose na CN stacionarnu fazu uključuje i grupu podataka koja se odnosi na sistem THF/voda na RP-18 stacionarnoj fazi (podaci 12-16). Ovakvo ponašanje ispitivanih jedinjenja za dati hromatografski sistem može se pripisati svojstvima tetrahidrofurana i njegovoj jakoj sorpciji kad je reč o oktadecil-modifikovanom silika-gelu160. Rezultati i diskusija 62 Slika 16. Grafik zavisnosti vrednosti PC1 komponente od vrednosti PC2 komponente pokazuje raspored hromatografskih sistema u PC1-PC2 dvodimenzionalnom prostoru Rezultati i diskusija 63 4.2 Određivanje parametara lipofilnosti ispitivanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina Pored standardne metode mućkanja97 za određivanje lipofilnosti se koriste i druge metode. Osnovni nedostaci ove metode, kao što su niska reproduktivnost, dužina trajanja eksperimenta, nemogućnost primene na izrazito hidrofilne i lipofilne supstance, mogu se prevazići upotrebom hromatografskih tehnika za određivanje lipofilnosti ili kompjuterskih algoritama koji omugoćavaju izračunavanje log P vrednosti. 4.2.1 Određivanje parametara lipofilnosti primenom reverzno-fazne tankoslojne hromatografije Da bi ispitali uticaj sastava mobilne faze na retenciju jedinjenja na RP-18 i CN stacionarnoj fazi, variran je zapreminski udeo metanola, acetonitrila i tetrahidrofurana. Dobijeni rezultati (Tabele P1-P6) pokazuju da retencija ispitivanih jedinjenja opada sa povećanjem udela organske komponente u mobilnoj fazi za sve primenjene hromatografske sisteme. Primenom jednačine (4) ispitana je zavisnost RM vrednosti (Tabele P1-P6) od udela organske komponente, φ. Parametar lipofilnosti (RM0), određen je ekstrapolacijom RM vrednosti na nula zapreminskog udela organske komponente. Ovako određene RM0 vrednosti, baš kao i vrednosti nagiba (m), te statistički parametri (koeficijent korelacije, r, i standardna devijacija, s) predstavljeni su u Tabeli 8 (za RP-18 stacionarnu fazu) i Tabeli 9 (za CN stacionarnu fazu). Dobijeni rezultati su pokazali zadovoljavajući korelacioni koeficijent (r > 0,99) za sve primenjene hromatografske sisteme, što ukazuje na statistički značajnu linearnu zavisnost. RM0 vrednosti dobijene ekstrapolacijom ne bi trebalo da zavise od prirode organske komponente, pošto one predstavljaju retenciju u čistoj vodi109. Međutim, kod RP-18 i CN stacionarne faze na površini postoje nemodifikovane silanolne grupe koje interaguju sa molekulima organskih modifikatora iz mobilne faze (vodonične veze, dipol-dipol interakcije). Mogućnost uspostavljanja ovih interakcija, kao i njihov stepen zavisiće od svojstava (elektronska svojstva, mogućnost građenja vodoničnih veza) upotrebljenog organskog modifikatora116,117. Rezultati i diskusija 64 Takođe, pored nespecifičnih interakcija ispitivanih supstanci sa funkcionalnim grupama na površini upotrebljenih stacionarnih faza, na retenciju u značajnoj meri utiču jake specifične interakcije između ispitivanih jedinjenja i komponenata mobilne faze (npr. mogućnost građenja vodoničnih veza povećava rastvorljivost jedinjenja u mobilnoj fazi i uslovljava slabiju retenciju). Različit stepen interakcija ispitivanih jedinjenja sa stacionarnom, odnosno mobilnom fazom pri upotrebi različitih organskih rastvarača uticaće na razlike u RM vrednostima, pa samim tim i na RM0 vrednosti. Iz Tabele 8 evidentno je da je RM0 vrednost za najveći broj jedinjenja najveća kada je metanol korišćen kao komponenta mobilne faza. Ovakvi rezultati su u saglasnosti sa činjenicom da od upotrebljenih organskih modifikatora metanol ima najmanju elucionu moć na oktadecil-modifikovanom silika-gelu, kao i najmanju moć sorpcije. Rezultati predstavljeni u Tabeli 9 jasno pokazuju da su parametri lipofilnosti svih hromatografisanih supstanci dobijeni na CN stacionarnoj fazi uz korišćenje tetrahidrofurana kao organskog modifikatora veći u odnosu na RM0 vrednosti dobijene pri korišćenju metanola, odnosno acetonitrila kao organskog modifikatora. Rezultati i diskusija 65 Tabela 8. Parametri lipofilnosti dobijeni za RP-18 stacionarnu fazu Jedinjenja MeOH/voda ACN/voda THF/voda RM0 m r s RM0 m r s RM0 m r s 1 3,398 -3,989 -0,993 0,067 2,141 -2,915 -0,994 0,075 2,728 -4,313 -0,990 0,119 2 3,126 -3,844 -0,993 0,066 2,265 -3,370 -0,990 0,114 2,788 -4,455 -0,991 0,114 3 3,340 -4,051 -0,991 0,077 1,967 -2,877 -0,995 0,066 2,868 -4,493 -0,991 0,118 4 2,156 -3,006 -0,996 0,037 2,012 -3,235 -0,992 0,087 2,445 -3,940 -0,993 0,094 5 3,664 -4,114 -0,996 0,052 2,124 -2,695 -0,998 0,040 2,826 -4,268 -0,995 0,080 6 2,984 -3,619 -0,995 0,051 2,059 -2,913 -0,993 0,080 2,560 -4,071 -0,991 0,109 7 1,950 -2,983 -0,993 0,037 1,122 -2,460 -0,991 0,069 1,198 -2,430 -0,994 0,050 8 3,520 -4,000 -0,994 0,046 3,031 -3,892 -0,996 0,070 3,386 -5,015 -0,990 0,116 9 3,164 -3,675 -0,991 0,070 1,992 -2,747 -0,994 0,072 2,077 -3,543 -0,995 0,071 10 4,601 -4,650 -0,997 0,041 2,343 -2,532 -0,998 0,037 2,151 -3,515 -0,991 0,077 11 3,377 -3,429 -0,997 0,027 1,933 -2,186 -0,996 0,040 2,560 -4,208 -0,994 0,087 12 2,754 -3,100 -0,997 0,029 2,053 -2,690 -0,995 0,051 2,303 -3,734 -0,998 0,044 13 1,637 -2,211 -0,996 0,020 1,470 -2,317 -0,992 0,068 2,274 -3,680 -0,990 0,086 14 1,387 -2,086 -0,996 0,020 1,353 -2,366 -0,997 0,043 1,960 -3,389 -0,992 0,070 15 2,153 -2,857 -0,998 0,021 1,924 -2,940 -0,998 0,049 2,295 -3,715 -0,991 0,100 16 1,525 -2,091 -0,990 0,031 1,795 -2,860 -0,998 0,034 2,167 -3,801 -0,994 0,082 17 1,370 -2,057 -0,997 0,016 1,741 -3,120 -0,999 0,022 2,035 -3,685 -0,998 0,051 18 1,576 -2,280 -0,991 0,033 1,819 -3,214 -0,999 0,026 2,003 -3,703 -0,995 0,069 19 0,472 -1,370 -0,994 0,027 1,272 -2,753 -0,992 0,075 1,171 -2,416 -0,994 0,054 20 2,096 -2,470 -0,993 0,052 1,580 -2,350 -0,995 0,042 1,834 -3,261 -0,992 0,083 21 2,408 -2,840 -0,996 0,047 1,580 -2,350 -0,995 0,042 1,854 -3,286 -0,992 0,080 22 2,356 -2,500 -0,997 0,035 1,546 -2,017 -0,991 0,049 1,793 -3,174 -0,991 0,066 23 2,060 -2,300 -0,997 0,034 1,365 -1,925 -0,992 0,043 1,601 -3,174 -0,992 0,071 Rezultati i diskusija 66 Tabela 9. Parametri lipofilnosti dobijeni za CN stacionarnu fazu Jedinjenja MeOH/voda ACN/voda THF/voda RM0 m r s RM0 m r s RM0 m r s 1 2,823 -3,634 -0,992 0,048 2,528 -4,441 -0,993 0,076 3,580 -6,940 -0,998 0,035 2 3,072 -4,080 -0,997 0,028 2,391 -4,278 -0,994 0,066 3,768 -7,340 -0,998 0,044 3 2,857 -3,900 -0,996 0,032 2,390 -4,309 -0,995 0,057 3,676 -7,140 -0,998 0,040 4 1,896 -2,606 -0,993 0,033 2,056 -3,788 -0,994 0,057 3,078 -6,040 -0,998 0,035 5 2,810 -3,760 -0,993 0,041 2,438 -4,248 -0,991 0,081 3,466 -6,660 -0,999 0,023 6 2,322 -3,240 -0,997 0,023 2,292 -4,159 -0,993 0,067 3,222 -6,320 -0,998 0,037 7 1,000 -1,860 -0,998 0,012 1,199 -3,010 -0,995 0,041 2,208 -5,140 -0,994 0,050 8 3,541 -4,514 -0,991 0,064 2,879 -4,817 -0,993 0,077 3,966 -7,520 -0,997 0,054 9 1,772 -2,840 -0,996 0,022 2,049 -3,824 -0,990 0,075 3,042 -6,240 -0,999 0,031 10 2,560 -3,503 -0,992 0,046 2,378 -4,231 -0,990 0,083 3,270 -6,640 -0,995 0,059 11 1,886 -2,560 -0,996 0,020 2,355 -4,293 -0,990 0,085 3,400 -6,920 -0,997 0,049 12 1,158 -2,000 -0,998 0,013 1,767 -3,960 -0,997 0,042 3,508 -7,040 -0,996 0,058 13 1,293 -2,220 -0,991 0,028 1,418 -3,031 -0,996 0,036 2,172 -4,620 -0,997 0,034 14 0,620 -1,420 -0,999 0,006 1,303 -3,036 -0,997 0,034 1,772 -3,980 -0,999 0,019 15 1,494 -2,440 -0,991 0,030 1,785 -3,602 -0,995 0,049 2,528 -5,240 -0,995 0,046 16 1,576 -2,360 -0,991 0,030 1,500 -3,098 -0,997 0,034 2,420 -5,040 -0,997 0,035 17 1,289 -2,046 -0,996 0,020 1,381 -2,986 -0,995 0,043 2,664 -5,760 -0,993 0,064 18 1,324 -2,160 -0,995 0,023 1,647 -3,560 -0,995 0,051 2,524 -5,420 -0,996 0,044 19 0,463 -1,067 -0,997 0,015 0,745 -2,117 -0,990 0,048 1,478 -3,540 -0,993 0,039 20 1,895 -2,860 -0,997 0,021 1,535 -3,420 -0,991 0,073 2,658 -5,820 -0,997 0,040 21 0,820 -1,786 -0,998 0,014 0,840 -2,711 -0,994 0,046 2,702 -5,840 -0,991 0,070 22 0,810 -1,321 -0,997 0,014 1,322 -2,951 -0,992 0,058 2,566 -5,660 -0,995 0,051 23 1,656 -2,640 -0,991 0,032 1,226 -2,943 -0,991 0,063 2,324 -5,320 -0,994 0,053 Rezultati i diskusija 67 Da bi se utvrdio uticaj prirode organskog modifikatora na parametar lipofilnosti, RM0 vrednosti dobijene za metanol/voda, acetonitril/voda i tetrahidrofuran/voda hromatografske sisteme su poređene, a korelacioni koeficijenti dati su u Tabeli 10 za RP-18 stacionarnu fazi i Tabeli 11 za CN stacionarnu fazu. Tabela 10. Korelaciona matrica RM0 vrednosti dobijenih za RP-18 stacionarnu fazu RM0 (MeOH/voda) RM0 (ACN/voda) RM0 (THF/voda) RM0 (MeOH/voda) 1 RM0 (ACN/voda) 0,729 1 RM0 (THF/voda) 0,651 0,863 1 Tabela 11. Korelaciona matrica RM0 vrednosti dobijenih za CN stacionarnu fazu RM0 (MeOH/voda) RM0 (ACN/voda) RM0 (THF/voda) RM0 (MeOH/voda) 1 RM0 (ACN/voda) 0,911 1 RM0 (THF/voda) 0,847 0,883 1 Rezultati ovog poređenja (Tabele 10 i 11) ukazuju da su razlike između upotrebljenih organskih modifikatora izraženije na RP-18 stacionarnoj fazi (niži koeficijenti korelacije), u poređenju sa CN stacionarnom fazom. Niske vrednosti korelacionih koeficijenata (Tabela 10), dobijene za poređenje RM0 vrednosti za sistem MeOH/voda na RP-18 stacionarnoj fazi sa RM0 vrednostima za ACN/voda (r = 0,729) i THF/voda (r = 0,651), ukazuju da se metanol po svojstvima značajno razlikuje od acetonitrila i tetrahidrofurana. Rezultati dobijeni u sistemima rastvarača koji su sadržavali acetonitril i tetrahidrofuran (aprotični) kao organsku komponentu mobilne faze, pokazali su se mnogo sličnijim (r = 0,863), nego rezultati postignuti sa metanolom kao modifikatorom (protični). To se može pripisati različitim interakcijama do kojih dolazi tokom hromatografskog procesa između rastvarača i ispitivanih jedinjenja, kao i između organske komponente mobilne faze i stacionarne faze. Rezultati i diskusija 68 Viši korelacioni koeficijenti dobijeni pri poređenju RM0 vrednosti za CN stacionarnu fazu (Tabela 11) ukazuju da je u ovim hromatografskim sistemima uticaj prirode organske komponente na retenciju manji. Razlike između priroda stacionarnih faza moguće je utvrditi poredeći parametre lipofilnosti za dve stacionarne faze (RP-18 i CN) za isti sistem rastvarača u mobilnoj fazi. Rezultati poređenja RM0 vrednosti dobijenih na dve stacionarne faze uz primenu istih mobilnih faza dati su u Tabeli 12. Tabela 12. Poređenje RM0 vrednosti dobijenih na primenjenim stacionarnim fazama (RP-18 i CN) Organski modifikator Jednačina r ta Fb MeOH RM0CN = 0.930 + 0,872∙RM0RP-18 (13) 0,768 5,495 30,254 ACN RM0CN = 0,712 + 0,630∙RM0RP-18 (14) 0,878 8,406 70,901 THF RM0CN = 0,268 + 0,677∙RM0RP-18 (15) 0,842 7,152 51,266 a tkrit. (α = 0,05; ν = 21) = 2,080; b Fkrit. (α = 0,05; ν1 = 1, ν2 = 21) = 4,325 Koeficijenti korelacije dati u Tabeli 12 ukazuju da su razlike između stacionarnih faza najizraženije kad je metanol korišćen kao organski modifikator. Statističkim testovima za proveru značajnosti linearne korelacije (t- i F-test) utvrđeno je da između RM0 vrednosti dobijenih na dve stacionarne faze uz primenu istih mobilnih faza postoji statistički značajna linearna zavisnost. Koeficijent korelacije (r) je veličina koja pokazuje koliko se dobro uklapaju podaci u jednačinu, tj. koliko je dobra korelacija (idealna linearna korelacija ima r = ±1), a F-vrednost ukazuje na verovatnoću da je dobijena jednačina statistički značajna. Pored RM0 vrednosti i drugi hromatografski parametri mogu se koristiti za definisanje lipofilnosti jedinjenja. Parametar m u nekim slučajevima može da igra važnu ulogu u opisivanju lipofilnosti108. Pored m vrednosti, za definisanje lipofilnosti može se koristiti i parametar C0112,113. Sârbu i saradnici su predložili da se skorovi dobijeni primenom analize glavnih komponenata na retencione podatke mogu koristiti za opisivanje lipofilnosti44,161,162. Kada se PCA primeni na hromatografske podatke (dimenzije početne matrice su broj jedinjenja × broj varijacija organske komponente za svaki sitem) obično prve dve glavne komponente opisuju najveću varijabilnost. Prva Rezultati i diskusija 69 glavna komponenta (PC1) najčešće pokazuje visoku korelaciju sa lipofilnošću. Vrednosti parametara C0 i PC1 za sve primenjene hromatografske sisteme date su u Prilogu u Tabelama P7 i P8. Da bi se ustanovilo da li je moguće koristiti m vrednosti kao parametre lipofilnosti, proverena je korelacija između RM0 i m vrednosti za sve upotrebljene hromatografske sisteme. Jednačine prave koje opisuju ovu zavisnost, kao i statistički parametri dati su u Tabeli 13. Vrednosti nagiba m, kao što se iz Tabela 8 i 9 može videti, prate RM0 vrednosti ispitivanih jedinjenja. Naime, sa povećanjem RM0 vrednosti, veći je i nagib i obrnuto. Statistički parametri dobijeni pri poređenju RM0 i m vrednosti pokazuju da se m vrednosti mogu koristiti za opisivanje lipofilnosti ispitivanih jedinjenja za sve primenjene hromatografske sisteme, a najlošija korelacija dobijena je za sistem ACN/voda na RP-18 stacionarnoj fazi. Brojni radovi su potvrdili da vrednost nagiba m zavisi od prirode organskog modifikatora, a takođe, i od molekulske strukture ispitivanih jedinjenja (npr. veličina supstance, broj i struktura polarnih funkcionalnih grupa), pa pošto RM0 vrednosti zavise od istih fizičko-hemijskih parametara, dobijena visoka korelacija je očekivana. Visoke vrednosti koeficijenta potvrda su da se ispitivani N-supstituisani 2-alkiliden-4-oksotiazolidini ponašaju kao serija srodnih jedinjenja u primenjenim hromatografskim uslovima. Tabela 13. Statistički parametri linearne zavisnosti između RM0 i m vrednosti Stacionarna faza Mobilna faza Jednačina r SE Fa RP-18 MeOH/voda m = -0,882 - 0,863∙RM0 (16) 0,966 0,226 295,829 ACN/voda m = -1,317 - 0,763∙RM0 (17) 0,692 0,342 19,287 THF/voda m = -1,166 - 1,149∙RM0 (18) 0,985 0,108 699,172 CN MeOH/voda m = -0,711 - 1,086∙RM0 (19) 0,991 0,125 1183,002 ACN/voda m = -1,518 - 1,156∙ RM0 (20) 0,980 0,141 504,356 THF/voda m = -1,166 - 1,149∙RM0 (21) 0,986 0,177 758,598 aFkrit. (α = 0,05; ν1 = 1, ν2 = 21) = 4,325 Rezultati i diskusija 70 Poređenjem RM0 vrednosti sa C0 i PC1 vrednostima provereno je da li ovi parametri mogu da se koriste za opisivanje lipofilnosti. Jendačine koje opisuju ove zavisnosti zajedno sa odgovarajućim statističkim parametrima date su u Tabelama 14 i 15. Tabela 14. Poređenje RM0 i C0 vrednosti za sve upotrebljene hromatografske sisteme Stacionarna faza Mobilna faza Jednačina r SE Fa RP-18 MeOH/voda C0 = 0,505 + 0,117∙RM0 (22) 0,807 0,084 39,206 ACN/voda C0 = 0,404 + 0,149∙RM0 (23) 0,545 0,099 8,864 THF/voda C0 = 0,388 + 0,091∙RM0 (24) 0,941 0,018 162,930 CN MeOH/voda C0 = 0,444 + 0,117∙RM0 (25) 0,903 0,046 92,460 ACN/voda C0 = 0,262 + 0,125∙RM0 (26) 0,960 0,022 248,714 THF/voda C0 = 0,356 + 0,043∙RM0 (27) 0,907 0,014 97,609 aFkrit. (α = 0,05; ν1 = 1, ν2 = 21) = 4,325 Retencioni parametri dati u Tabeli 14 pokazuju da C0 vrednosti određene pri upotrebi CN stacionarne faze mogu da se koriste umesto RM0 vrednosti za opisivanje lipofilnosti (koeficijenti korelacije su od 0,903 do 0,960). Kada se porede RM0 i C0 vrednosti dobijene za RP-18 stacionarnu fazu, baš kao i pri poređenju m i RM0 vrednosti, najlošija korelacija je dobijena za sistem ACN/voda. Ova podudarnost je logična imajući na umu da je parametar C0 izveden iz parametara m i RM0. Rezultati i diskusija 71 Tabela 15. Poređenje RM0 i PC1 vrednosti za sve upotrebljene hromatografske sisteme Stacionarna faza Mobilna faza Jednačina r SE Fa RP-18 MeOH/voda PC1 = -2,245 + 0,905∙RM0 (28) 0,870 0,505 65,201 ACN/voda PC1 = -2,390 + 1,294∙RM0 (29) 0,543 0,860 8,764 THF/voda PC1 = -3,975 + 1,797∙RM0 (30) 0,954 0,308 211,023 CN MeOH/voda PC1 = -1,863 + 1,047∙RM0 (31) 0,887 0,473 77,143 ACN/voda PC1 = -2,980 + 1,655∙RM0 (32) 0,967 0,260 303,683 THF/voda PC1 = -3,954 + 1,378∙RM0 (33) 0,909 0,426 100,025 aFkrit. (α = 0,05; ν1 = 1, ν2 = 21) = 4,325 Statistički parametri koji opisuju zavisnost između PC1 i RM0 vrednosti određenih na CN stacionarnoj fazi (Tabela 15) ukazuju da se PC1 vrednosti mogu koristiti za definisanje lipofilnosti ispitivanih jedinjenja. Sa druge strane, nizak korelacioni koeficijent (r = 0,543) dobijen za poređenje PC1 i RM0 vrednosti određenih pri upotrebi acetonitrila kao organskog modifikatora na RP-18 stacionarnoj fazi pokazuje da ni PC1 parametar, baš kao ni m i C0, ne može da se koristi umesto RM0 za opisivanje lipofilnosti. Rezultati i diskusija 72 4.2.2 Određivanje lipofilnosti ispitivanih jedinjenja računskim putem Različiti kompjuterski programi omogućavaju brzo i jednostavno izračunavanje log P vrednosti. U okviru ovog istraživanja pored hromatografski određenih parametara lipofilnosti (RM0, m, C0 i PC1), lipofilnost jedinjenja okarektirasana je i izračunatim log P vrednostima. U prilogu, u Tabeli P9 date su log P vrednosti izračunate primenom kompjuterskih algoritama. Iako se ove vrednosti međusobno razlikuju, u idealnom slučaju, bez obzira na algoritam primenjen prilikom izračunavanja, korelacija između izračunatih log P vrednosti treba da bude potpuna (r = 1). Međutim, to nije uvek tako163. To dokazuju i podaci iz Tabele P10 u Prilogu, gde su prikazani koeficijenti korelacije dobijeni pri poređenju izračunatih log P vrednosti. Činjenica da postoje razlike između izračunatih log P vrednosti, kao i da korelacija između njih nije savršena, ukazuje da različite procedure za izračunavanje lipofilnosti rezultuju različitim log P vrednostima, jer se zasnivaju na različitim metodama. Rezultati i diskusija 73 4.3 Ispitivanje veze između hromatografki određenih parametara lipofilnosti i izračunatih log P vrednosti Brojna istraživanja su pokazala statistički značajnu vezu između retencionih parametara (RM0, m, C0 i PC1) serije srodnih supstanci dobijenih primenom reverzno-fazne hromatografije i kompjuterski izračunatih log P vrednosti34,35,164. Da bi se ustanovilo koji hromatografski sistem može da se upotrebi za dobijanje parametara koji mogu da se koriste u opisivanju lipofilnosti, RM0 vrednosti za sve upotrebljene hromatografske sisteme su poređene sa izračunatim log P vrednostima. Ova zavisnost može da se izrazi jednačinom: RM0 = a + b·log P (34) Rezultati poređenja RM0 vrednosti dobijenih primenom RP-18 stacionarne faze i izračunatih log P vrednosti dati su u Tabeli 16. U Tabeli 17 date su jednačine prave i statistički parametri koji opisuju zavisnost između RM0 vrednosti dobijenih primenom CN stacionarne faze i izračunatih log P vrednosti. Poređenjem eksperimentalno određenih RM0 vrednosti, dobijenih na RP-18 stacionarnoj fazi, i parametara lipofilnosti izračunatih pomoću različitih programa (Tabela 16), vidi se da je kod metanola kao modifikatora dobijen najviši stepen korelacije (korelacioni koeficijenti koji opisuju ove zavisnosti imaju najveće vrednosti za poređenje RM0 vrednosti određenih primenom metanola kao organskog modifikatora sa Alog Ps vrednostima). Takođe, rezultati u Tabeli 16 ukazuju da se log P vrednosti izračunate upotrebom različitih algoritama u različitom stepenu korelišu sa eksperimentalno dobijenim RM0 vrednostima. Iako na osnovu ovih rezultata nije moguće ukazati na algoritam koji je najbolji za sve slučajeve i uvek primenljiv može se za svaki hromatografski sistem odabrati log P vrednost koja se najbolje koreliše sa RM0 vrednostima dobijenim za dati sistem. Vrednosti statističkih parametara date u Tabeli 17 pokazuju da je najbolje slaganje ostvareno između RM0 vrednosti i izračunatih log P vrednosti kada se tetrahidrofuran koristi kao organska komponenta mobilne faze na CN stacionarnoj fazi Rezultati i diskusija 74 (srednja vrednost retencionog koeficijenta je r = 0,900), dok je najlošije slaganje dobijeno za sistem MeOH/voda (r = 0,728). Cilj ispitivanja veze između eksperimentalno određenih i izračunatih parametara lipofilnosti je pronalaženje jednačine koja bi se mogla koristi za predviđanje hromatografskog ponašanja novih jedinjenja, strukturno sličnih ispitivanim N-supstituisanim 2-alkiliden-4-oksotiazolidinima. Poređenje statističkih parametara datih u Tabeli 16 (r, SE i F vrednosti) ukazuje da najveći stepen podudarnosti postoji između RM0 vrednosti dobijenih za sistem MeOH/voda i izračunatih Alog Ps vrednosti (r = 0,901; F = 90,733), kao i RM0 vrednosti dobijenih za sistem THF/voda i izračunatih Clog P vrednosti (r = 0,898; F = 87,808). Alog Ps vrednosti se najbolje korelišu sa RM0 vrednostima koje su određene za CN stacionarnu fazu pri upotrebi tetrahidrofurana kao organskog modifikatora (r = 0,946; F = 178,901). Vrednosti statističkih parametara za ove korelacije pružaju priliku da se jednačine koje opisuju ove zavisnosti koriste kao modeli za predviđanje retencije novih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina. Kako su vrednosti statističkih parametara date za jednačine (35) i (64) slične, odlučeno je da sistem THF/voda na obe stacionarne faze bude sistem izbora pri daljim, detaljnijim proučavanjima odnosa između strtukture i retencije kongenernih 4-oksotiazolidina. Rezultati i diskusija 75 Tabela 16. Korelacije između RM0 vrednosti dobijenih primenom tri organska modifikatora na RP-18 stacionarnoj fazi i izračunatih log P vrednosti RM0 = f(log P) Modifikator Jednačina r SE Fa RM0 = f(Alog Ps) MeOH RM0 = 0,621 + 0,869∙Alog Ps (35) 0,901 0,426 90,733 ACN RM0 = 1,085 + 0,354∙Alog Ps (36) 0,842 0,232 51,040 THF RM0 = 1,339 + 0,406∙Alog Ps (37) 0,762 0,352 29,046 RM0 = f(AClog P) MeOH RM0 = 0,566 + 0,902∙AClog P (38) 0,848 0,522 53,549 ACN RM0 = 0,998 + 0,400∙AClog P (39) 0,861 0,218 60,137 THF RM0 = 1,201 + 0,476∙AClog P (40) 0,810 0,318 40,208 RM0 = f(ABlog P) MeOH RM0 = 1,129 + 0,643∙ABlog P (41) 0,782 0,641 32,988 ACN RM0 = 1,291 + 0,264∙ABlog P (42) 0,736 0,291 24,829 THF RM0 = 1,510 + 0,334∙ABlog P (43) 0,735 0,368 24,704 RM0 = f(Milog P) MeOH RM0 = 0,956 + 0,854∙Milog P (44) 0,884 0,460 74,983 ACN RM0 = 1,266 + 0,326∙ Milog P (45) 0,838 0,235 49,378 THF RM0 = 1,530 + 0,382∙Milog P (46) 0,716 0,379 22,080 RM0 = f(Alog P) MeOH RM0 = 0,881 + 0,747∙Alog P (47) 0,803 0,587 38,071 ACN RM0 = 1,119 + 0,340∙Alog P (48) 0,772 0,273 31,020 THF RM0 = 1,281 + 0,435∙Alog P (49) 0,846 0,290 52,732 RM0 = f(Mlog P) MeOH RM0 = 1,075 + 0,876∙Mlog P (50) 0,865 0,493 62,555 ACN RM0 = 1,329 + 0,323∙Mlog P (51) 0,730 0,293 24,017 THF RM0 = 1,593 + 0,386∙Mlog P (52) 0,690 0,393 19,103 RM0 = f(log PKOWWIN) MeOH RM0 = 1,701 + 0,571∙log PKOWWIN (53) 0,784 0,611 33,487 ACN RM0 = 1,519 + 0,240∙log PKOWWIN (54) 0,756 0,281 28,084 THF RM0 = 1,749 + 0,339∙log PKOWWIN (55) 0,843 0,293 51,404 RM0 = f(Xlog P2) MeOH RM0 = 1,122 + 0,694∙Xlog P2 (56) 0,873 0,479 67,452 ACN RM0 = 1,356 + 0,251∙Xlog P2 (57) 0,723 0,296 23,046 THF RM0 = 1,638 + 0,293∙Xlog P2 (58) 0,667 0,405 16,858 RM0 = f(Xlog P3) MeOH RM0 = 0,908 + 0,785∙Xlog P3 (59) 0,853 0,514 55,893 ACN RM0 = 1,234 + 0,306∙Xlog P3 (60) 0,761 0,279 28,884 THF RM0 = 1,470 + 0,370∙Xlog P3 (61) 0,728 0,372 23,680 RM0 = f(Clog P) MeOH RM0 = 1,085 + 0,672∙Clog P (62) 0,734 0,668 24,532 ACN RM0 = 1,141 + 0,340∙Clog P (63) 0,851 0,226 54,959 THF RM0 = 1,268 + 0,454∙Clog P (64) 0,898 0,239 87,808 aFkrit. (α = 0,05; ν1 = 1, ν2 = 21) = 4,325 Rezultati i diskusija 76 Tabela 17. Korelacije između RM0 vrednosti dobijenih primenom tri organska modifikatora na CN stacionarnoj fazi i izračunatih log P vrednosti RM0 = f(log P) Modifikator Jednačina r SE F RM0 = f(Alog Ps) MeOH RM0 = 0,370 + 0,655∙Alog Ps (65) 0,771 0,552 30,727 ACN RM0 = 0,752 + 0,487∙Alog Ps (66) 0,831 0,333 46,846 THF RM0 = 1,522 + 0,626∙Alog Ps (67) 0,946 0,219 178,901 RM0 = f(AClog P) MeOH RM0 = 0,264 + 0,714∙AClog P (68) 0,761 0,562 28,958 ACN RM0 = 0,626 + 0,554∙AClog P (69) 0,855 0,310 57,091 THF RM0 = 1,415 + 0,685∙AClog P (70) 0,938 0,235 152,689 RM0 = f(ABlog P) MeOH RM0 = 0,714 + 0,507∙ABlog P (71) 0,699 0,610 20,091 ACN RM0 = 1,021 + 0,371∙ABlog P (72) 0,742 0,401 25,665 THF RM0 = 1,810 + 0,503∙ABlog P (73) 0,891 0,306 81,323 RM0 = f(Milog P) MeOH RM0 = 0,722 + 0,592∙ Milog P (74) 0,695 0,623 19,674 ACN RM0 = 0,966 + 0,467∙Milog P (75) 0,795 0,363 36,170 THF RM0 = 1,801 + 0,598∙Milog P (76) 0,902 0,292 91,655 RM0 = f(Alog P) MeOH RM0 = 0,387 + 0,651∙Alog P (77) 0,793 0,528 35,596 ACN RM0 = 0,731 + 0,500∙Alog P (78) 0,882 0,282 73,854 THF RM0 = 1,605 + 0,591∙Alog P (79) 0,924 0,258 122,955 RM0 = f(Mlog P) MeOH RM0 = 0,798 + 0,611∙Mlog P (80) 0,685 0,631 18,579 ACN RM0 = 1,052 + 0,467∙Mlog P (81) 0,758 0,390 28,323 THF RM0 = 1,854 + 0,632∙Mlog P (82) 0,910 0,280 100,778 RM0 = f(log PKOWWIN) MeOH RM0 = 1,120 + 0,483∙log PKOWWIN (83) 0,753 0,570 27,494 ACN RM0 = 1,295 + 0,370∙log PKOWWIN (84) 0,837 0,327 49,094 THF RM0 = 2,292 + 0,422∙ log PKOWWIN (85) 0,845 0,361 52,286 RM0 = f(Xlog P2) MeOH RM0 = 0,878 + 0,460∙Xlog P2 (86) 0,657 0,653 15,986 ACN RM0 = 1,093 + 0,361∙Xlog P2 (87) 0,748 0,397 26,639 THF RM0 = 1,920 + 0,484∙Xlog P2 (88) 0,888 0,311 77,951 RM0 = f(Xlog P3) MeOH RM0 = 0,661 + 0,289∙Xlog P3 (89) 0,688 0,629 18,852 ACN RM0 = 0,930 + 0,435∙Xlog P3 (90) 0,776 0,377 31,770 THF RM0 = 1,714 + 0,577∙Xlog P3 (91) 0,912 0,277 103,379 RM0 = f(Clog P) MeOH RM0 = 0,468 + 0,631∙Clog P (92) 0,782 0,540 33,114 ACN RM0 = 0,801 + 0,481∙Clog P (93) 0,864 0,301 61,911 THF RM0 = 1,775 + 0,526∙Clog P (94) 0,837 0,369 49,325 aFkrit. (α = 0,05; ν1 = 1, ν2 = 21) = 4,325 Rezultati i diskusija 77 Kao što je već istaknuto, pored RM0 vrednosti i drugi retencioni parametri (m, C0 i PC1) mogu da se koriste za opisivanje lipofilnosti. Korelacija RM0 vrednosti i izračunatih log P vrednosti daje uvid koji hromatografski sistemi su najpodesniji za određivanje parametara lipofilnosti, pa su za poređenje sa izračunatim log P vrednostima korišćeni samo retncioni parametri dobijeni za sistem THF/voda na RP-18 i CN stacionarnoj fazi. U Tabeli 18 predstavljeni su korelacioni koeficijenti za poređenje retencionih parametara (m, C0 i PC1) dobijenih primenom THF/voda mobilne faze na RP-18 stacionaranoj fazi sa izračunatim log P vrednostima. Tabela 18. Korelacije između izračunatih log P vrednosti i retencionih parametara (m, C0 i PC1) dobijenih za sistem THF/voda na RP-18 stacionarnoj fazi m C0 PC1 Alog Ps -0,737 0,753 0,798 AClog P -0,786 0,782 0,816 ABlog P -0,716 0,698 0,713 Milog P -0,696 0,709 0,738 Alog P -0,824 0,788 0,819 Mlog P -0,683 0,660 0,688 log PKOWWIN -0,828 0,794 0,821 Xlog P2 -0,652 0,653 0,684 Xlog P3 -0,715 0,699 0,723 Clog P -0,867 0,870 0,885 Vrednosti korelacionih koeficijenata date u Tabeli 18 govore da se m parametar, određen za sistem THF/voda na RP-18 stacionarnoj fazi, najbolje koreliše sa Clog P vrednostima (r = -0,867), baš kao što se pokazalo i sa RM0 vrednostima (Tabela 16). Takođe, C0 i PC1 parametri se najbolje korelišu sa Clog P vrednostima (r = 0,870 za C0; r = 0,885 za PC1). Međutim, iako je poređenje RM0 vrednosti sa drugim retencionim parametrima (m, C0 i PC1) ukazalo da se oni mogu koristiti umesto RM0 vrednosti Rezultati i diskusija 78 (Tabele 13-15), koeficijenti korelacije dati u Tabelama 16 i 18 pokazuju da su ipak RM0 vrednosti parametri koji najbolje definišu lipofilnost ispitivanih jedinjenja. Koeficijenti korelacije koji opisuju odnos između retencionih parametara (m, C0 i PC1) dobijenih primenom THF/voda mobilne faze na CN stacionaranoj fazi i izračunatih log P vrednosti dati su u Tabeli 19. Poređenje korelacionih koeficijenata sa rezultatima u Tabeli 17 navodi na zaključak da se i parametar m u značajnoj meri koreliše sa izračunatim log P vrednostima i da je najveći koeficijent korelacije dobijen pri poređenju sa Alog Ps vrednostima, baš kao što je slučaj i sa RM0 vrednostima dobijenim za primenjeni sistem. Koeficijenti korelacije dobijeni pri definisanju veze između C0, odnosno PC1 i izračunatih parametara lipofilnosti su značajno niži. Tabela 19. Korelacije između računskih log P vrednosti i retencionih parametara (m, C0 i PC1) za sistem THF/voda na CN stacionarnoj fazi m C0 PC1 Alog Ps -0,942 0,825 0,825 AClog P -0,915 0,861 0,876 ABlog P -0,892 0,770 0,776 Milog P -0,904 0,782 0,788 Alog P -0,885 0,882 0,901 Mlog P -0,929 0,755 0,749 log PKOWWIN -0,812 0,816 0,820 Xlog P2 -0,904 0,734 0,737 Xlog P3 -0,916 0,782 0,787 Clog P -0,771 0,888 0,899 Poređenje svih retencionih parametara sa izračunatim log P vrednostima dalo je uvid u mogućnost njihovog korišćenja za definisanje parametra lipofilnosti. Vrednosti korelacionih koeficijenata izračunatih pri ispitivanju odnosa između retencionih parametara dobijenih primenom sistema THF/voda na RP-18 stacionarnoj fazi i izračunatih parametara lipofilnosti govore da parametar RM0 najpouzdanije određuje lipofilnost ispitivanih 4-oksotiazolidina. Iako je utvrđena linearna veza izmešu RM0 Rezultati i diskusija 79 vrednosti i drugih retencionih parametara (m, C0 i PC1), njihove lošije korelacije sa izračunatim log P vrednostima pokazale su da ne mogu da se koriste umesto RM0 vrednosti za definisanje lipofilnosti. Sa druge strane za sistem THF/voda na CN stacionarnoj fazi utvrđeno je da parametar m može biti upotrebljen umesto parametra RM0 da bi se definisala lipofilnost ispitivanih jedinjenja. Međutim, kako literaturni podaci favorizuju upotrebu RM0 vrednosti, a imajući i u vidu ipak nešto niže vrednosti koeficijenata korelacije kod poređenja m i log P vrednosti, RM0 vrednosti su korišćene u daljim QSRR istraživanjima. Kako je utvrđeno da je uticaj stacionarne faze na retenciju ispitivanih jedinjenja značajan, u daljim QSRR analizama RM0 vrednosti dobijene za dva sistema, THF/voda na RP-18 i na CN stacionarnoj fazi, su korelisane sa molekulskim deskriptorima. Rezultati i diskusija 80 4.4 Modelovanje QSRR modela primenom hemometrijskih tehnika Proučavanje odnosa između strukture i retetencije ima za cilj pronalaženje matematičkih modela koji se koriste da povežu molekulske deskriptore sa hromatografskim ponašanjem odabrane serije jedinjenja. Hemometrijska obrada hromatografskih podataka može otkriti bitne informacije o ispitivanim jedinjenjima (retenciju, fizičko-hemijska svojstva, relativnu biološku aktivnost), ali i o prirodi stacionarne faze na kojoj je vršeno hromatografsko ispitivanje (mehanizam hromatografskog odvajanja u datom hromatografskom sistemu, kvantitativno poređenje retencionih svojstava dobijenih na različitim stacionarnim fazama, otkrivanje koji su strukturni deskriptori pogodni za predviđanje retencije)165. Da bi se opisala veza između retencije i strukture novosintetisanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina osim jednostavne linearne regresije (poglavlje 4.2) uporebljene su višestruka linearna regresija i parcijalna regresija najmanjih kvadrata. Cilj primene ove dve regresione analize bio je dobijanje modela koji bi na najbolji način kvantitativno opisivali vezu između RM0 i molekulskih deskriptora i koji bi se mogli koristiti za predviđanje retencije i lipofilnosti novih strukturno sličnih jedinjenja. Pre regresione analize podaci su podeljeni u dve grupe, na kalibracioni i test set, a odabir jedinjenja u određeni set izvršen je nasumično. Istraživanja su pokazala da veličina test seta utiče na kvalitet modela i da je optimalna količina podataka koju treba da sadrži test set 15-40% podataka iz osnovnog seta166,167. U ovom radu test set je obuhvatao približno 26% jedinjenja nasumično odabranih iz osnovnog seta. Kalibracioni set se sastojao od 17 jedinjenja (2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22) koja su korišćena za konstruisanje modela, dok je test set obuhvatao preostalih 6 jedinjenja (1, 4, 6, 14, 18, 23) i korišćen je za proveru prediktivne moći dobijenih matematičkih modela. Rezultati i diskusija 81 4.4.1 Višestruka linearna regresiona analiza, MLR Višestruka linearna regresija je jedna od najčešće primenjivanih hemometrijskih tehnika u QSRR istraživanjima78. Prednost MLR metode je jednostavna interpretacija rezultata, jer daje direktnu korelaciju zavisno promenljive od varijabli (koeficijenti uz molekulske deskriptore govore o uticaju tih deskriptora na zavisno promenljivu). Sa druge strane, ograničen broj nezavisnih varijabli (broj nezavisnih varijabli mora biti manji od broja objekata) ističe se kao glavni nedostatak MLR analize. Takođe, bitan nedostatak ove regresione analize je nemogućnost korišćenja deskriptora koji se međusobno visoko korelišu. Da bi se smanjio početni broj deskriptora i olakšalo uspostavljanje korelacije između hromatografske retencije i molekulskih deskriptora izvršena je njihova selekcija. Prvi korak u selekciji deskriptora bio je eliminisanje deskriptora čije su vrednosti približno jednake za sva jedinjenja, jer takvi deskriptori nisu pružali informaciju o razlikama između ispitivani 2-alkiliden-4-oksotiazolidina. Deskriptori zadržani nakon ovog koraka selekcije predstavljeni su u Tabeli P11 u Prilogu. Dalje, ispitivanjem korelacije između RM0 vrednosti (dobijenih za sistem THF/voda na RP-18 i CN stacionarnoj fazi) i molekulskih deskriptora utvrđeno je da se od svih izračunatih deskriptora vrednosti log P najbolje korelišu sa RM0 (Clog P se najbolje koreliše sa RM0 (THF/voda: RP-18), dok se Alog Ps vrednosti najbolje korelišu sa RM0 (THF/voda: CN)). Ovaj podatak je iskorišćen u sledećem koraku selekcije deskriptora. Naime, proveravanjem korelacije između deskriptora došlo se do podataka kod kojih deskriptora postoji visoka međusobna korelacija i svi deskriptori koji su pokazali visoku korelaciju (r > 0,800) sa Clog P i Alog Ps vrednostima su eliminisani. Iz seta deskriptora predstavljenog u Tabeli P11 u Prilogu eliminisani su sledeći deskriptori: SW, TE, BE, P i F. Korelaciona matrica molekulskih deskriptora zadržanih nakon selekcije, koji su korišćeni pri MLR analizi, data je u Tabeli P12 u Prilogu. Pre MLR analize, vrednosti molekulskih deskriptora su centrirane u odnosnu na srednju vrednost i izvršeno je skaliranje na jediničnu vrednost standardne devijacije. Da bi se odabrao set molekulskih deskriptora koji će dati model sa najboljom prediktivnošću, selekcija varijabli izvršena je metodom postepene regresije. Statistički parametri korišćeni za proveru kvaliteta MLR modela bili su kvadrat korelacionog Rezultati i diskusija 82 koeficijenta, R2, standardna greška, SE, nivo značajnosti, P, i Fischer-ova vrednost značajnosti, F, pri čemu je nivo prihvatljivosti za pojedinačne nezavisne promenljive podešen na 95%-tni nivo pouzdanosti. Ocena prediktivne moć dobijenih MLR modela bila je okarakterisana parametrima Rcv2 i PRESS. Regresione jednačine dobijene za zavisnost RM0 vrednosti, određenih za sistem THF/voda na RP-18 i CN stacionarnoj fazi, od molekulskih deskriptora date su u Tabeli 20, a statistički parametri koji opisuju date jednačine prikazani su u Tabeli 21. Tabela 20. Regresione jednačine koje definišu odnos između RM0 vrednosti i molekulskih deskriptora Hromatografski sistem Model Jednačina THF/voda RP-18 s.f. 1 RM0 = 1,166 + 0,488∙Clog P (95) 2 RM0 = 2,847 + 0,455∙Clog P - 0,647∙SP (96) 3 RM0 = 3,439 + 0,461∙ClogP - 0,079∙SP - 0,375∙HBA (97) THF/voda CN s.f. 4 RM0 = 1,534 + 0,609∙Alog Ps (98) 5 RM0 = 1,455 + 0,560∙Alog Ps + 0,550∙HBD (99) 6 RM0 = -0,480 + 0,574∙Alog Ps + 0,563∙HBD - 0,218∙HOMO (100) Povećanje broja deskriptora u regresionoj jednačini rezultuje boljim prediktivnim karakteristikama modela, što pokazuju i statistički parametri dati u Tabeli 21. Međutim, uvođenjem prevelikog broja varijabli dobio bi se precenjeni model. Imajući u vidu da je opšte prihvaćeno da broj jedinjenja treba da bude najmanje pet puta veći od broja nezavisnih promenljivih132, regresione jednačine sa tri promenljive (Tabela 20) mogu se koristiti za definisanje kvantitativne veze između retencije i strukture ispitivanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina. Rezultati i diskusija 83 Tabela 21. Statistički parametri MLR modela Model Deskriptori Pa R2 F Pb Rcv2 PRESS PRESS/SSY Nc R P- 18 st ac io na rn a fa za 1 Clog P 0,0000 0,834 75,447 0,0000 0,801 0,875 0,199 17 2 Clog P SP 0,0000 0,849 39,361 0,0000 0,2576 0,822 0,796 0,178 17 3 Clog P SP HBA 0,0000 0,861 26,922 0,0000 0,1841 0,3039 0,839 0,731 0,161 17 C N st ac io na rn a fa za 4 Alog Ps 0,0000 0,892 124,051 0,0000 0,879 0,782 0,121 17 5 Alog Ps HBD 0,0000 0,927 88,818 0,0000 0,0217 0,921 0,530 0,079 17 6 Alog Ps HBD HOMO 0,0000 0,939 66,453 0,0000 0,0158 0,1409 0,935 0,445 0,065 17 a Nivo značajnosti jednačine (modela). b Nivo značajnosti pojedinačnih deskriptora. c Broj jedinjenja u kalibracionom setu. Regresione jednačine dobijene pri ispitivanju kvantitativne veze između retencije na RP-18 stacionarnoj fazi i deskriptora molekulske strukture ukazuju da je Clog P deskriptor koji u najvećoj meri određuje retenciju ispitivanih jedinjenja, jer je primenom metode postepene regresije baš Clog P uključen u jedno-parametarsku jednačinu (Tabela 20, Model 1). Pored Clog P deskriptora, na retenciono ponašanje ispitivanih jedinjenja na RP-18 stacionarnoj fazi utiču i deskriptor koji opisuje sposobnost jedinjenja da bude akceptor vodonične veze (HBA) i parametar rastvorljivosti (SP). MLR modeli dobijeni pri poređenju retencije na CN stacionarnoj fazi sa molekulskim deskriptorima potvrđuju značajan uticaj parametra lipofilnosti na hromatografsko ponašanje ispitivanih jedinjenja. Prvi parametar uključen primenom metode postepene regresije bio je Alog Ps. Činjenica da za oba proučavana hromatografska sistema log P parametar u najvećoj meri određuje retenciju ukazuje na značaj hidrofobnih interakcija između ispitivanih jedinjenja i stacionarne faze. Iz regresionih jednačina, kojima su predstavljeni Modeli 4 i 5 (Tabela 20) može se videti da su deskriptori od značaja za definisanje retencije na CN stacionarnoj fazi i energija Rezultati i diskusija 84 najviše popunjene molekulske orbitale (HOMO) i deskriptor koji opisuje sposobnost jedinjenja da bude donor vodoničnih veza (HBD). Regresione jednačine date u Tabeli 20 ukazuju da je samo parametar lipofilnosti, log P, zajednički deskriptor za sve MLR modele. Imajući u vidu da su retencioni parametri korišćeni pri MLR analizi dobijeni primenom iste mobilne faze (THF/voda), može se zaključiti da su razlike u upotrebljenim stacionarnim fazama odgovorne za selekciju različitih deskriptora. Vrednosti koeficijenata uz molekulske deskriptore govore o uticaju tih deskriptora na retenciju ispitivanih jedinjenja, pa tako pozitivna vrednost koeficijenta govori da sa povećanjem vrednosti datog molekulskog deskriptora dolazi do povećanja RM0 vrednosti. Parametri lipofilnosti, Alog Ps i Clog P imaju pozitivne koeficijente (Modeli 1-6), što znači da jedinjenja sa višim log P vrednostima snažnije interaguju sa nepolarnim stacionarnim fazama, što za posledicu ima jaču retenciju, odnosno RM0 vrednosti. Ovakav uticaj parametra lipofilnosti na retenciju je očekivan, jer sa porastom lipofilnosti raste i mogućnost uspostavljanja hidrofobnih interakcija između jedinjenja i stacionarne faze. Pozitivan uticaj na retenciju na CN stacionarnoj fazi ima i HBD deskriptor, što znači da će jedinjenja sa većom sposobnošću da budu donori vodoničnih veza snažnije interagovati sa CN stacionarnom fazom, koja ima dovoljnu elektronsku gustinu da učestvuje u građenju vodoničnih veza84. Na isti način mogao bi se objasniti i negativan uticaj HOMO energije na retenciju na CN stacionarnoj fazi. Jedinjenja sa nižom vrednošću HOMO energije, koja je povezana sa jonizacionim potencijalom, su snažnije vezana za CN stacionarnu fazu u odnosu na jedinjenja sa višim vrednostima HOMO energije. Negativne vrednosti koeficijenata koje stoje uz parametre SP i HBA ukazuju da jedinjenja koja se slabije rastvaraju u vodi (niže SP vrednosti) i kod kojih nisu izražene sposobnosti da se ponašaju kao akceptori vodoničnih veza (niže HBA vrednosti) snažnije interaguju sa nepolarnom RP-18 stacionarnom fazom, što za posledicu ima jaču retenciju. Rezultati i diskusija 85 Upoređujući statističke parametre dobijene za Modele 1-3 (Tabela 21) može se zaključiti da se sa uvođenjem novih deskriptora (HBA i SP) poboljšavaju statistički parametri koji opisuju date modele. Uvođenjem deskriptora koji opisuje sposobnost ispitivanih molekula da budu akceptori vodoničnih veza (HBA) i parametra rastvorljivosti (SP) vrednost koeficijenta determinacije raste od R2 = 0,834 (Model 1, Tabela 21) do R2 = 0, 861 (Model 3, Tabela 21). Na sličan način, povećanje broja deskriptora u regresionim jednačinama koje opisuju zavisnost retencije na CN stacionarnoj fazi od strukture ispitivanih jedinjenja dovodi do poboljšanja statističkih parametara koji opisuju Modele 4-6 (Tabela 21). Sa uključivanjem HOMO i HBD deskriptora u jednoparametarsku regresionu jednačinu vrednost koeficijenta determinacije R2 raste. Na prediktivnu moć modela ukazuju kvadrat korelacionog koeficijenta unakrsne validacije, Rcv2, vrednost parametra PRESS i količnik PRESS/SSY. Da bi QSRR model bio pouzdan količnik PRESS/SSY bi trebalo da bude manji od 0,4168. Takođe, vrednost količnika PRESS/SSY koja je manja od 0,1 ukazuje da je postavljena jednačina prihvatljiva. Poređenjem statističkih parametara datih za Modele 3 i 6, koji uključuju tri molekulska deskriptora može se zaključiti da su oba predložena modela statistički značajna. Oba modela imaju količnik PRESS/SSY manji od 0,4, a Model 6 ima količnik PRESS/SSY manji od 0,1 te se može smatrati veoma dobrim modelom. Takođe, vrednost kvadrata korelacionog koeficijenta unakrsne validacije za Model 6 (Rcv2 = 0,935) pokazuju veoma dobru stabilnost prema varijaciji podataka u postupku unakrsne validacije. Iako statistički parametri mogu poslužiti za opisivanje kvaliteta dobijenih MLR modela, provera prediktivne moći MLR modela izvršena je primenom regresionih jednačina na jedinjenja iz test seta. Regresione jednačine koje opisuju Modele 3 i 6 su iskorišćene za izračunavanje RM0 vrednosti za jedinjenja iz test seta, a onda je njihova prediktivna moć ispitina upoređivanjem sa ekspirimentalno dobijenim. Statistički parametri dobijeni za ispitivanje zavisnosti između predviđenih i eksperimentalno određenih RM0 vrednosti prikazani su u Tabeli 22. Poređenjem statističkih parametara može se zaključiti da je preiktivna moć Modela 6 dobijenog za retenciju na CN stacionarnoj fazi mnogo bolja u poređenju sa Modelom 3 koji opisuje Rezultati i diskusija 86 zavisnost retencije na RP-18 stacionarnoj fazi od molekulskih deskriptora. Visoka vrednost koeficijenta determinacije (R2 = 0,935) i F-vrednosti (F = 57,082), te niske vrednosti parametara PRESS (0,145) i količnika PRESS/SSY ukazuju na dobru prediktivnu moć Modela 6. Grafik zavisnosti RM0 vrednosti predviđenih na osnovu Modela 3 (RP-18 stacionarna faza) od eksperimentalno određenih RM0 vrednosti dat je na Slici 17. Na Slici 18 predstavljena je grafička zavisnost RM0 vrednosti dobijenih na osnovu Modela 6 (CN stacionarna faza) od RM0 vrednosti eksperimentalno određenih za dati hromatografski sitem. Tabela 22. Statistički parametri koji opisuju prediktivnu moć modela Test set Regresiona jednačina R2 F Rcv2 PRESS PRESS/SSY Na Model 3 RM0pred. = -1,195 + 0,922∙ RM0eksp. (101) 0,765 12,994 0,692 0,217 0,308 6 Model 6 RM0pred. = -1,195 + 0,922∙ RM0eksp. (102) 0,935 57,082 0,930 0,145 0,070 6 a Broj jedinjenja u test setu. Rezultati i diskusija 87 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 RM 0pred. = -1,195 + 0,922*RM 0eksp. R M 0 p re dv ið en o RM 0 eksperimentalno Slika 17. Zavisnost RM0 vrednosti dobijenih na osnovu MLR modela za RP-18 stacionarnu fazu (Model 3) od eksperimentalno određenih RM0 vrednosti 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 RM 0pred. = 2,476 + 0,738*R M 0eksp. R M 0 p re dv ið en o RM 0 eksperimentalno Slika 18. Zavisnost RM0 vrednosti dobijenih na osnovu MLR modela za CN stacionarnu fazu (Model 6) od eksperimentalno određenih RM0 vrednosti Rezultati i diskusija 88 4.4.2 Parcijalna regresija najmanjih kvadrata, PLS Da bi se utvrdila kvantitativna veza između retencije i strukture ispitivanih jedinjenja sve češće se koristi PLS analiza, koja je u velikoj meri i potisnula MLR. Prednosti PLS regresije u poređenju sa MLR metodom su sposobnost analize podataka koji su kolinearni, pa nije neophodna selekcija varijabli, kao i mogućnost upotrebe neograničenog broja deskriptora (broj deskriptora može biti veći od broja objekata). PLS analiza je primenjena na retencione podatke u okviru kalibracionog seta. RM0 vrednosti određene za dva hromatografska sistema (THF/voda na RP-18 i CN stacionarnoj fazi) korelisane su sa molekulskim deskriptorima datim u Tabeli P11 u Prilogu. Primenom unakrsne validacije metodom izostavljanja jednog objekta, LOO-CV, izvršena je kalibracija modela. Broj latentnih varijabli je odabran na osnovu minimalne vrednosti RMSECV. Za oba PLS modela (dobijena za dva ispitivana hromatografska sistema) minimalna vrednost RMSECV dobijena je za trikomponentni model (tri latentne varijable). Statistički parametri za dobijene PLS modele dati su u Tabeli 23. Tabela 23. Statistički parametri koji opisuju PLS modele dobijene za RP-18 i CN stacionarnu fazu R2Y Q2Y RMSEC RMSECV N PLS Model 1 (RP-18) 0,939 0,774 0,138 0,265 17 PLS Model 2 (CN) 0,975 0,930 0,103 0,173 17 Rezultati predstavljeni u Tabeli 23 su uporedivi sa statističkim parametrima koji opisuju MLR modele dobijene za dva hromatografska sistema (Tabela 21). Upoređujući statističke parametre dobijene za dva PLS modela može se zaključiti da je statistički značjniji model (više vrednossti R2Y i Q2Y, te niže vrednosti RMSEC i RMESCV), baš kao i pri MLR analizi, dobijen pri upotrebi retencionih parametara određenih na CN stacionarnoj fazi. Grafici zavisnosti RM0 vrednosti dobijenih na osnovu PLS modela od eksperimentano određenih RM0 vrednosti (Slike 19 i 20), potvrđuju dobro uklapanje predloženih modela u set podataka. Rezultati i diskusija 89 Slika 19. Grafik zavisnosti RM0 vrednosti predviđenih na osnovu PLS Modela 1 (RP-18) od eksperimentalno određenih Slika 20. Grafik zavisnosti RM0 vrednosti predviđenih na osnovu PLS Modela 2 (CN) od eksperimentalno određenih Rezultati i diskusija 90 Pri PLS modelovanju nezavisne varijable koje značajno utiču na vrednost zavisno promenljive karakteriše visoka vrednost regresionog koeficijenta, dok niska vrednost regresionog koeficijenta ukazuje na mali doprinos predikciji odgovora. Međutim, varijabla može biti značajna i za modelovanje matrice nezavisnih varijabli, što se manifestuje visokom vrednošću koeficijenata latentne varijable. Značaj neke nezavisne varijable u pogledu njenog uticaja na zavisnu varijablu ili varijansu nezavisno promenljivih, izražava se kroz vrednost koja definiše koliko je varijabla značajna za projekciju (engl. Variable Importance for the Projection, VIP). VIP vrednost se izračunava pomoću jednačine: a A a aak A a k SS SSk VIP 1 1       (103) gde je k broj varijabli, wak je značaj k-te varijable za glavnu komponentu a, A je ukupan broj glavnih komponenti, a SSa je suma kvadrata objašnjena pomoću glavne komponente a169. Varijable sa VIP vrednostima većim od 1 smatraju se najrelevantnijim za objašnjenje zavisno promenljive i varijanse nezavisno promenljivih170. Upravo se ova činjenica koristi pri selekciji varijabli, odnosno definisanju nezavisnih varijabli koje imaju najznačajniji doprinos predikciji zavisne varijable. Grafik zavisnosti VIP vrednosti, dobijenih za PLS Model 1 (RP-18), od varijabli dat je na Slici 21, dok je zavisnost VIP skorova, dobijenih za PLS Model 2 (CN), od nezavisnih varijabli predstavljena na Slici 22. Molekulski deskriptori koji imaju najveći uticaj na RM0 vrednosti određene na RP-18 stacionarnoj fazi su: Clog P, TE, BE, HOMO, R, P, HHB i SW. Slika 22 pokazuje da su deskriptori koji u najvećoj meri utiču na RM0 vrednosti određene na CN stacionarnoj fazi (VIP > 1): Alog Ps, TE, BE, R, P, HP, HHB, SW i HSA. Poredeći VIP vrednosti za deskriptore (Slike 21 i 22) može se zaključiti da se najveći broj deskriptora sa VIP vrednostima većim od 1 podudara za oba dobijena PLS modela i da su od svih deskriptora parametri lipofilnosti, Clog P i Alog Ps, najznačajniji (najviše VIP vrednosti) za oba PLS modela. Rezultati i diskusija 91 Slika 21. Grafik zavisnosti VIP vrednosti za PLS Model 1 (RP-18) od varijabli Slika 22. Grafik zavisnosti VIP vrednosti za PLS Model 2 (CN) od varijabli Rezultati i diskusija 92 Dok VIP vrednosti govore o doprinosu nazavisnih varijabli na predikciju zavisne varijable, vrednosti korelacionih koeficijenata varijabli ukazuju da li nezavisno promenljiva ima pozitivan ili negativan uticaj na zavisno promenljivu. Vrednosti korelacionih koeficijenata varijabli u predloženim PLS modelima date su na Slikama 23 i 24. Predznaci korelacionih koeficijenata deskriptora (Slike 23 i 24) pokazuju da deskriptori imaju isti efekat na retenciju na obe stacionarne faze. Najveći pozitivan uticaj na retencione parametre dobijene primenom oba ispitivana hromatografska sistema (THF/voda na RP-18 i CN stacionarnoj fazi) imaju parametri lipofilnosti (Clog P i Alog Ps), dok deskriptori povezani sa polarnim svojstvima jedinjenja imaju najviši negativan korelacioni koeficijent, tj. imaju najizraženiji negativan uticaj na RM0 vrednosti. Molekuli sa većom tendecijom da formiraju vodonične veze (visok korelacioni koeficijent za HHB deskriptor) i većom energijom dipolnih interakcija među molekulima (visok korelacioni koeficijent za HP deskriptor) se slabije vežu na obe stacionarne faze, što rezultuje slabijom retencijom na nepolarnim stacionarnim fazama171. Sličan efekat na retenciju ispitivanih jedinjenja imaju i drugi deskriptori koji opisuju elektronska svojstva molekula (TE, BE, SW i HOMO energija). Sa druge strane, polarizabilnost (P) i refraktivnost (R) su molekulski deskriptori, koji zavise od zapremine molekula i mogućnosti preraspodele elektronske gustine, koji imaju pozitivan efekat na retenciju u oba ispitivana hromatografska sistema, što potvrđuju pozitivni koeficijenti na Slikama 23 i 24. Rezultati i diskusija 93 Slika 23. Vrednosti korelacionih koeficijenata varijabli u PLS Modelu 1 (RP-18) Slika 24. Vrednosti korelacionih koeficijenata varijabli u PLS Modelu 2 (CN) Rezultati i diskusija 94 Prediktivne sposobnosti dobijenih PLS modela proverene su na podacima iz test seta. Statistički parametri koji opisuju prediktivnu moć PLS modela su RPred2 i RMSEP. Baš kao i u slučaju MLR analize, prediktivna moć PLS modela dobijenog za CN stacionarnu fazu je veća od modela dobijenog za RP-18 stacionarnu fazu (RPred2 = 0,870 i RMSEP = 0,153 za PLS Model 1 (RP-18); RPred2 = 0,881 i RMSEP = 0,237 za PLS Model 1 (CN)). Grafici zavisnosti RM0 vrednosti, za kalibracioni i test set, od eksperimentalno određenih RM0 vrednosti dati su na Slikama 25 i 26. Statistički parametri koji opisuju dobijene MLR i PLS modele pokazuju značajnu prediktivnu sposobnost. Poređenjem statističkih parametara koji opisuju MLR i PLS modele može se zaključiti da MLR i PLS modeli, dobijeni za hromatografski sitem THF/voda na CN stacionarnoj fazi, pokazuju bolju moć predviđanja u odnosu na modele dobijena za RP-18 stacionarnu fazu. Model sa najboljim statističkim parametrima, koji bi mogao da se koristi za predviđanje retencije je MLR Model 6, jednačina (100), gde je RPred2 = 0,94. Rezultati i diskusija 95 Slika 25. Grafik zavisnosti predviđenih RM0 vrednosti za kalibracioni (●) i test set (▼) dobijenih na osnovu PLS Modela 1 od eksperimentalno određenih Slika 26. Grafik zavisnosti predviđenih RM0 vrednosti za kalibracioni (●) i test set (▼) dobijenih na osnovu PLS Modela 2 od eksperimentalno određenih Zaključak 96 5. Zaključak Zaključak 97 U okviru ovog istraživanje ispitano je retenciono ponašanje 23 N-supstituisana 2-alkiliden-4-oksotiazolidina u uslovima reverzno-fazne planarne hromatografije. Kao stacionarne faze korišćeni su oktadecil-modifikovan (RP-18) i cijano-modifikovan (CN) silika-gel. Dvokomoponentne smeše vode i organskih rastvarača (metanol, acetonitril i tetrahidrofuran) upotrebljene su kao mobilne faze. Poređenjem retencionih parametara dobijenih primenom različitih hromatografskih sistema utvrđeno je da na retenciju ispitivanih jedinjenja u uslovima reverzno-fazne hromatografije utiču kako priroda stacionarne, tako i svojstva mobilne faze. Hromatografsko ponašanje ispitivanih jedinjenja u skladu je sa očekivanim u reverzno-faznim uslovima. Sa povećanjem sadržaja organske komponente u mobilnoj fazi slabi retencija, tj. RF vrednosti ispitivanih jedinjenja su više što je veća koncentracija organskog modifikatora u binarnoj mobilnoj fazi. Analiza glavnih komponenata primenjena na retencione podatke ukazala je na razlike između upotrebljenih hromatografskih sistema. Retencioni podaci, dobijeni primenom različitih hromatografskih sistema, upotrebljeni su za određivanje parametara lipofilnosti (RM0, m, C0 i PC1). Pored hromatografski određenih parametara lipofilnosti (RM0, m, C0 i PC1), lipofilnost jedinjenja okarektirasana je i izračunatim log P vrednostima. Korelacija RM0 i log P vrednosti dala je uvid koji hromatografski sistemi su najpodesniji za određivanje parametara lipofilnosti, pa je na osnovu statističkih parametara koji opisuju date korelacije sistem tetrahidrofuran/voda na obe stacionarne faze (RP-18 i CN) odabran za detaljnije proučavanje odnosa strukture i retencije serije 2-alkiliden-4-oksotiazolidina. Iako je utvrđena linearna veza između RM0 vrednosti i drugih retencionih parametara (m, C0 i PC1), ispitivanje korelacije između ovih retencionih parametara i log P vrednosti pokazalo je da se oni u manjoj meri korelišu sa izračunatim log P vrednostima, te da ne mogu da se koriste umesto RM0 vrednosti za definisanje lipofilnosti. Da bi se opisala veza između retencije i strukture novosintetisanih N-supstituisanih 2-alkiliden-4-oksotiazolidina osim jednostavne linearne regresije, uporebljene su višestruka linearna regresija (MLR) i parcijalna regresija najmanjih kvadrata (PLS). Pomoću MLR i PLS analize identifikovani su deskriptori koji u Zaključak 98 najvećoj meri određuju hromatografsko ponašanje 2-alkiliden-4-oksotiazolidina u ispitivanim hromatografksim sistemima, a sve u cilju dobijanja matematičkih modela koji bi se mogli koristiti za predviđanje retencije i lipofilnosti novih strukturno sličnih jedinjenja. Kao najznačajniji deskriptor u svim MLR i PLS modelima izdvojio se parametar lipofilnosti (Clog P i Alog Ps), koji je pozitivno korelisan sa retencijom ispitivanih jedinjenja. MLR analiza je pokazala da pored parametra lipofilnosti na retenciju na RP-18 stacionarnoj fazi utiču i parametar rastvorljivosti (SP) i parametar koji ukazuje na sposobnost ispitivanih jedinjenja da budu akceptori vodoničnih veza (HBA). Za razliku od parametra lipofilnosti, molekulski deskriptori povezani sa polarnošću molekula (SP i HBA) imaju negativan uticaj na retenciju ispitivanih jedinjenja, tj. sa povećanjem vrednosti ovih deskriptora dolazi do smanjenja retencije ispitivanih jedinjenja na RP-18 stacionarnoj fazi. Sa druge strane, MLR model dobijen pri poređenju retencionih parametara određenih na CN stacionarnoj fazi i molekulskih deskriptora, pored Alog Ps izdvaja kao deskriptore od značaja za definisanje retencije HBD (sposobnost jedinjenja da bude donor vodoničnih veza) i HOMO (energija najviše popunjene molekulske orbitale). Pozitivan uticaj HBD deskriptora na retenciju na CN stacionarnoj fazi pokazuje da elektronska gustina na CN-grupama pruža mogućnost građenja vodoničnih veza, pa se jedinjenja sa većom sposobnošću doniranja vodoničnih veza snažnije vezuju za CN stacionarnu fazu. Molekulski deskriptori koji su pri PLS regresiji izdvojeni kao bitni za retenciju na obe stacionarne faze su slične prirode i imaju približno jednak uticaj na retenciju. Pored parametara lipofilnosti, deskriptori izdvojeni kao značajni za definisanje retencije na obe stacionarn faze su: TE, BE, R, P, HHB i SW. Prediktivna moć svih MLR i PLS modela, predloženih za predviđanje retencije strukturno sličnih 4-oksotiazolidina, proverena je pomoću test seta. Statistički parametri koji opisuju zavisnost predviđenih od eksperimentalno određenih parametara retencije potvrdili su mogućnost korišćenja ovih modela za procenu lipofilnosti sličnih jedinjenja. Literatura 99 6. Literatura Literatura 100 1. A. J. P. Martin. Some theoretical aspects of partition chromatography, Biochem. Soc. Symp. 3 (1950) 4-20. 2. Q. S. Wang, L. Zhang, Review of research on quantitative structure-retention relationships in thin-layer chromatography, J. Liq. Chrom. Relat. Tech. 22 (1999) 1-14. 3. R. Kaliszan, Structure and Retention in Chromatography. A Chemometric Approach, Harwood Academic Publishers, Amsterdam (1997). 4. K. Heberger, Quantitative structure-(chromatographic) retention relationships, J. Chromatogr. A 1158 (2007) 273-305. 5. R. Kaliszan, M. A. van Straten, M. Markuszewski, C. A. Cramers, H. A. Claessens, Review of research on quantitative structure-retention relationships in thin-layer chromatography, J. Chromatogr. A 855 (1999) 455-486. 6. S. P. Singh, S. S. Parmar, K. Raman, V. I. Stenberg, Chemistry and biological activity of thiazolidinones, Chem. Rev. 81 (1981) 175-203. 7. D. J. Faulkner, Marine natural products, Nat. Prod. Rep. 15 (1998) 113-158. 8. N. Sokolenko, G. Abbenante, M. J. Scanlon, A. Jones, L. R. Gahan, G. R. Hanson, D. P. Fairlie, Cyclooligomerization of Thiazole-Containing Tetrapeptides. Symmetrical Macrocycles with up to 76 Amino Acids, J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 2603-2604. 9. Ş. G. Küçükgüzel, E. E. Oruç, S. Rollas, F. Şahin, A. Özbek, Synthesis, characterization and biological activity of novel 4-thiazolidino 1,3,4-oxadiazoles and some related compounds, Eur. J. Med. Chem. 37 (2002) 197-206. 10. V. Gududuru, E. Hurh, J. T. Dalton, D. D. Miller, Discovery of 2-arylthiazolidine- 4-carboxylic acid amides as a new class of cytotoxic agents for prostate cancer, J. Med. Chem. 48 (2005) 2584-2588. 11. R. Ottanà, S. Carotti, R. Maccari, I. Landini, G. Chiricosta, B. Caciagli, M. G. Vigorita, E. Mini, E. In vitro antiproliferative activity against human colon cancer cell lines of representative 4-thiazolidinones. Part I, Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (2005) 3930-3933. 12. M. Tswett, Physical-chemical studies of chlorophyll. Adsorption, Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft, 24 (1906) 316-326. 13. A. J. Martin, Nobel Lectures- Chemistry, 1942–1962 , Elsevier, Amsterdam (1964). Literatura 101 14. A. T. James, A. J. Martin, Gas-liquid partition chromatography: the separation and microestimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid, Biochem. J. 50 (1952) 679-90. 15. C. F. Poole, Planar chromatography at the turn of the century, J. Chromatogr. A 856 (1999) 399-427. 16. E. Stahl, Dünnschicht-Chromatographie; Methode, Einflussfaktoren und einige Anwendungsbeispiele, Pharmazie 11 (1956) 633-637. 17. E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, II. Standardisierung, Sichtbarmachung, Dokumentation und Anwendung, Chemiker Ztg. 82 (1958) 323-329. 18. C. F. Poole, Thin-layer chromatography: challenges and opportunities, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 963-984. 19. C. F. Poole, S. K. Poole, Multidimensionality in planar chromatography, J. Chromatogr. A 703 (1995) 573-612. 20. C. J. Welch, N. Wu, M. Biba, R. Hartman, T. Brkovic, X. Gong, R. Helmy, W. Schafer, J. Cuff, Z. Pirzada, L. Zhou, Greening analytical chromatography, Trends Anal. Chem. 29 (2010) 667-680. 21. Fredric M . Rabel, Handbook of Thin-Layer Chromatography, Sorbents and Precoated Layers in Thin-Layer Chromatography, Taylor & Francis Group, New York, USA (2005). 22. J. Köhler, D. B. Chase, R. D. Farlee, A. J. Vega, J. J. Kirkland, Comprehensive characterization of some silica-based stationary phase for high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A 352 (1986) 275-305. 23. J. Nawrochi, Silica surface controversy, strong adsorbtion sites, their blockage and removal, Part I and Part II, Chromatographia 31 (1991) 177-92. 24. H. Enghelhardt, H. Low, W. Götzinger, Chromatographic characterization of silica- based reversed phases (review), J. Chromatogr. A 544 (1991) 371-79. 25. Sz. Nyiredy, Planar chromatography, A respective view for the third millennium, Springer, Budapest, Hungary (2001). 26. P. E. Wall, Thin-layer Chromatography, A Modern Practical Approach, VWR International Ltd, Poole, Dorset, UK (2005). 27. G. B. Proctor, R. W. Horobin, A widely applicable analytical system for biological stains: reverse-phase thin layer chromatography, Stain Tech. 60 (1985) 1-6. Literatura 102 28. J. Sherma, D. W. Armstrong, B. P. Sleckman, Chromatography of Amino Acids on Reversed Phase Thin Layer Plates, J. Liq. Chrom. Relat. Tech. 6 (1983) 95-108. 29. M. Vanhaelen, R. Vanhaelen-Fastre, Pregnenolone separation from cholesterol using Sephadex LH-20 mini-columns, J. Chromatogr. A 187 (1980) 255-260. 30. M. Miszczyk, A. Pyka, Comparison of normal and reversed-phase TLC for separation of selected pesticides, J. Planar Chromatogr. 19 (2006) 15-20. 31. A. Pyka, A. Niestroj, J. Śliwiok, Investigation of the Separation of Higher Fatty Acid Methyl Esters by Reversed-Phase HPTLC, J. Planar Chromatogr. 16 (2003) 227-229. 32. E. H. Rabtti, M. Natić, D. Milojković-Opsenica, J. Trifković, I. Vucković, V. Vajs, Ž. Tešić, RP TLC-Based Lipophilicity Assessment of Some Natural and Synthetic Coumarins, J. Brazil. Chem. Soc. 23 (2012) 522-530. 33. A. Atrrog, M. Natić, T. Tosti, D. Milojković-Opsenica, I. Dordević, V. Tesević, M. Jadranin, S. Milosavljević, M. Lazić, S. Radulović, Z. Tesić, Lipophilicity of some guaianolides isolated from two endemic subspecies of Amphoricarpos neumayeri (Asteraceae) from Montenegro, Biomed. Chromatogr. 23 (2009) 250-256. 34. D. Dabić, M. Natić, Z. Džambaski, M. Stojanović, R. Marković, D. Milojković- Opsenica, Ž. Tešić, Estimation of lipophilicity of N-substituted 2-alkylidene-4- oxothiazolidines by means of reversed-phase thin-layer chromatography, J. Liq. Chrom. Relat. Tech. 34 (2011) 791-804. 35. J. Veličković, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Evaluation of the lipophilicity of some 1-arylpiperazines by planar chromatography, J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 323-327. 36. M. Natić, R. Marković, K. Anđelković, D. Milojković-Opsenica, Ž. Tešić, Reversed-phase thin-layer chromatography of stereodefined 2-alkylidene-4- oxothiazolidines and 1,2-dithioles, J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 323-327. 37. J. G. Dorsey, W. T. Cooper, Retention mechanisms of bonded-phase liquid chromatography, Anal. Chem. 66 (1994) 857A-867A. 38. M. D. Foster, R. E. Synovec, Reversed phase liquid chromatography of organic hydrocarbons with water as the mobile phase, Anal. Chem. 68 (1996) 2838-2844. Literatura 103 39. A. Radoičić, H. Majstorović, T. Sabo, Ž. Tešić, D. Milojković-Opsenica, Hydrophilic-interaction planar chromatography of some water-soluble Co(III) complexes on different adsorbents, J. Planar Chromatogr. 22 (2009) 249-253. 40. A. Hawrył, E. Kuśmierz, P. Pisarczyk, M. Wujec, M. Waksmundzka-Hajnos, Determination of the lipophilicity of some new thiosemicarbaside derivatives by reversed-phase thin-layer chromatography, Acta Chromatogr. 24 (2012) 271-290. 41. R. D. Briciu, A. Kot-Wąsik, A. Wąsik, J. Namieśnik, C. Sârbu, The lipophilicity of artificial and natural sweeteners estimated by reversed-phase thin-layer chromatography and computed by various methods, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 3702-3706. 42. D. Casoni, J. Petre, V. David, C. Sarbu, Prediction of pesticides chromatographic lipophilicity from the computational molecular descriptors, J. Sep. Sci. 34 (2011) 247-254. 43. C. Sarbu, D. Casoni, A. Kot-Wąsik, A. Wąsik, J. Namieśnik, Modeling of chromatographic lipophilicity of food synthetic dyes estimated on different columns, J. Sep. Sci. 33 (2010) 2219-2229. 44. D. Casoni, A. Kot-Wąsik, J. Namieśnik, C. Sârbu, Lipophilicity data for some preservatives estimated by reversed-phase liquid chromatography and different computation methods, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 2456-2465. 45. J. H. Park, M. H. Yoon, Y. K. Ryu, B. E. Kim, J. W. Ryu, M. D. Jang, Characterization of some normal-phase liquid chromatographic stationary phases based on linear solvation energy relationships, J. Chromatogr. A 796 (1998) 249-258. 46. M. M. Acanski, Chromatographic Enantioresolution of Six Purine Derivatives Endowed with Anti-Human Breast Cancer Activity, Chromatographia 62 (2005) 475-482. 47. K. A. Dill, The mechanism of solute retention in reversed-phase liquid chromatography, J. Phys. Chem. 91 (1987) 1980-1988. 48. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, A new form of chromatogram employing two liquid phases, J. Biochem. 35 (1941) 1358-1368. Literatura 104 49. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid, J. Biochem. 50 (1952) 679-690. 50. D. E. Martire, R. E. Boehm, A unified theory of retention and selectivity in liquid chromatography. 2. reversed-phased liquid chromatography with chemically bonded phases, J. Phys. Chem. 87 (1983) 1045-1062. 51. P. W. Carr, J. Li, A. J. Dallas, D. I. Eikens, L. C. Tan, Revisionist look at solvophobic driving forces in reversed-phase liquid chromatography, J. Chromatogr. A 656 (1993) 113-133. 52. G. E. Berendsen, K. A. Pikaart, L.de Galan, Preparation of various bonded phases for HPLC using monochlorosilanes, J. Liq. Chromatogr. 3 (1980) 1437. 53. A. Vailaya, Cs. Horváth, Retention in reversed-phase chromatography: partition or adsorption, J. Chromatogr. A 829 (1998) 1-27. 54. J. C. Touchstone, Practice of thin layer chromatography, 3rd ed, J. Wiley, Chichester, UK (1992). 55. L. R. Snyder, Linear elution adsorption chromatography IX. Strong eluents and alumina. The basis of eluent strength, J. Chromatogr. A 16 (1964) 55-88. 56. L. R. Snyder, Linear elution adsorption chromatography: XIII. Further studies on a narrow pore silica, J. Chromatogr. A 25 (1966) 274-293. 57. J. M. Miller, Chromatography-Concepts and Contrasts, John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey, USA (2005). 58. F. Geiss, Fundamentals of thin layer chromatography (planar chromatography), Hüthig, New York, USA (1987). 59. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, Introduction to modern liquid chromatography, 2nd ed, Wiley-Interscience, New York, USA (1979). 60. L. R. Snyder, J. L. Glajch, Solvent strength of multicomponent mobile phases in liquid-solid chromatography: Binary-solvent mixtures and solvent localization, J. Chromatogr. A 214 (1981) 1-19. 61. L. R. Snyder, J. L. Glajch, Solvent strength of multicomponent mobile phases in liquid-solid chromatography: Mixtures of three or more solvents, J. Chromatogr. A 214 (1981) 21-34. Literatura 105 62. L. R. Snyder, J. L. Glajch, Solven strength of multicomponent mobile phases in liquid-solid chromatograph: Further study of different mobile phases and silica as adsorbent, J. Chromatogr. A 248 (1982) 165-182. 63. L. R. Snyder, Classification of the solvent properties of common liquids, J. Chromatogr. A 92 (1974) 223-230. 64. C. Hansch, T. Fujita, p-σ-π Analysis. A Method for the Correlation of Biological Activity and Chemical Structure, J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 1616-1626. 65. R. Kaliszan, H. Foks, The relationship between the RM values and the connectivity indices for pyrazine carbothioamide derivatives, Chromatographia 10 (1977) 346-349. 66. R. Kaliszan, Correlation between the retention indices and the connectivity indices of alcohols and methyl esters with complex cyclic structure, Chromatographia 10 (1977) 529-531. 67. H. Van de Waterbeemd, M. Kansy, B. Wagner, H. Fischer, Lipophilicity in drug action and toxicology; Lipophilicity measurement by high performance liquid chromatography (RP-HPLC), Wiley-VCH, Weinheim (1996). 68. F. Lombardo, M. Y. Shalaeva, K.A. Tupper, F. Gao, ElogDoct:  A Tool for Lipophilicity Determination in Drug Discovery. 2. Basic and Neutral Compounds, J. Med. Chem. 44 (2001) 2490-2497. 69. X. Liu, H. Tanaka, A. Yamauchi, B. Testa, H. Chuman, Determination of lipophilicity by reversed-phase high-performance liquid chromatography: Influence of 1-octanol in the mobile phase, J. Chromatogr. A 1091 (2005) 51-59. 70. C. Giaginis, A. Tsantili-Kakoulidou, Current state of the art in HPLC methodology for lipophilicity assessment of basic drugs, J. Liq. Chrom. Relat. Tech. 31 (2008) 79-96. 71. K. Heberger, T. Kowalska, Thermodynamic significance of boiling point correlations for alkylbenzenes in gas chromatography: Extension of Trouton’s rule, J. Chromatogr. A 845 (1999) 13-20. 72. D. A. Hinckley, T. F. Bidleman, W. T. Foreman, J. R. Tuschall, Determination of vapor pressures for nonpolar and semipolar organic compounds from gas chromatographic retention data, J. Chem. Eng. Data 35 (1990) 232-237. Literatura 106 73. K. Heberger, T. Kowalska, Thermodynamic properties of alkylbenzenes from retention-boiling point correlations in gas chromatography, Chromatographia 44 (1997) 179-186. 74. K. Heberger, T. Kowalska, M. Gorgenyi, Determination of the Gibbs free energy of one methylene unit from Kováts retention index-boiling point correlations on DB-210 stationary phase, Acta Chromatogr. 9 (1999) 25-37. 75. M. Szaleniec, A. Dudzik, M. Pawul, B. Kozik B, Quantitative structure enantioselective retention relationship for high-performance liquid chromatography chiral separation of 1-phenylethanol derivatives, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6224-6235. 76. R. Kaliszan, Quantitative structure-retention relationships, Anal. Chem. 64 (1992) 619A-631A. 77. R. Kaliszan, Chromatography and capillary electrophoresis in modelling the basic processes of drug action, trends in analytical chemistry, TRAC Trend. Anal. Chem. 18 (1999) 400-410. 78. R. Put, Y. van der Heyden, Review on modelling aspects in reversed-phase liquid chromatographic quantitative structure-retention relationships, Anal. Chim. Acta 602 (2007) 164-172. 79. M. Natić, R. Marković, D. Milojković-Opsenica, Ž. Tešić, Structure-retention relationship study of diastereomeric (Z)- and (E)-2-alkylidene-4-oxothiazolidines, J. Sep. Sci. 30 (2007) 2241-2248. 80. J. Trifković, F. Andrić, P. Ristivojević, D. Andrić, Ž. Lj. Tešić, D. M. Milojković- Opsenica, Structure-retention relationship study of arylpiperazines by linear multivariate modeling, J. Sep. Sci. 33 (2010) 2619-2628. 81. D. Dabić, M. Natić, Z. Džambaski, R. Marković, D. Milojković-Opsenica, Ž. Tešić, Quantitative structure-retention relationship of new N-substituted 2-alkylidene-4- oxothiazolidines, J. Sep. Sci. 34 (2011) 2397-2404. 82. J. Li, J. Sun, Z. He, Quantitative structure-retention relationship studies with immobilized artificial membrane chromatography; II: Partial least squares regression, J. Chromatogr. A 1140 (2007) 174-179. Literatura 107 83. C. Giaginis, A. Tsantili-Kakoulidou, Quantitative Structure-Retention Relationships as Useful Tool to Characterize Chromatographic Systems and Their Potential to Simulate Biological Processes, Chromatographia 76 (2013) 211-226. 84. R. Todeschini, V. Consonni, Handbook of Molecular Descriptors. Methods and Principles in Medicinal chemistry, Wiley-VCH, Weinheim (2000). 85. V. Consonni, R. Todeschini, Recent Advances in QSAR Studies: Methods and Applications, Molecular descriptors, Springer, New York, USA (2009). 86. J. Gasteiger, Handbook of chemoinformatics, From data to knowledge in 4 volumes. Wiley-VCH, Weinheim (2003). 87. P. C. Jurs, J. S. Dixon, L. M. Egolf, Chemometrics methods in molecular design, Representations of molecules, VCH Publishers, New York, USA (1995). 88. M. Randić, Generalized molecular descriptors, J. Math. Chem. 7 (1991) 155-168. 89. R. Ghavami, S. Faham, QSRR models for Kováts’ retention indices of a variety of volatile organic compounds on polar and apolar GC stationary phases using molecular connectivity indexes, Chromatographia 72 (2010) 893-903. 90. J. C. Drosos, M. Viola-Rhenals, R. Vivas-Reyes, Quantitative structure–retention relationships of polycyclic aromatic hydrocarbons gas-chromatographic retention indices, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 4411-4421. 91. M. Berthelot, E. Jungfleisch, On the laws that operate for the partition of a substance between two solvents, Ann. Chim. Phys. 26 (1872) 396-407. 92. H. Meyer, Zur theorie der alkoholnarkose, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42 (1899) 109-118. 93. E. Overton, Studien iiber die Narkose, Fisher, Jena (1901). 94. L. Pauling, A Molecular Theory of General Anesthesia, Science 134 (1961) 15-21. 95. V. Pliška, B. Testa, H. van de Waaterbeemd, Lipophilicity in Drug Action and Toxicology, VCH-Weinheim (1996). 96. H. van de Waterbeemd, R. E. Carter, G. Grassy, H. Kubinyi, Y. C. Martin, M. S. Tute, P. Willet, Glossary of terms used in computational drug design, Pure Chem. 69 (1997) 1137-1152. 97. A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chern. Rev. 7l (1971) 525-616. Literatura 108 98. D. E. Leahy, P. J. Taylor, A. R. Wait, Model solvent systems for QSAR. Part I. Propylene glycol dipelargonate (PGDP). A new standard solvent for use in partition coefficient determination, Quаnt. Struct.-Act. Relat. 8 (1989) 17-31. 99. D. E. Leahy, J. J. Morris, P. J. Taylor, A. R. Wait, Model solvent systems for QSAR. Part II. Fragment values ('f-values') for the 'critical quartet', J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 (1992) 723-731. 100. A. Brandstrom, A rapid method for the determination of distribution coefficient of bases for biological purposes, Acta. Chem. Scand. 17 (1963) 1218-1224. 101. H. Kubinyi, QSAR: Hansch Analysis and Related Approaches, VCH-Weinheim (1993). 102. R. Consden, A. H. Gordon, A. J. Martin, Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper, Biochem. J. 38 (1944) 224-232. 103. E. C. Bate-Smith, R. G. Westall, Chromatographic behavior and chemical structure in some naturally occurring phenolic substances, Biochem. Biophys. Acta 4 (1950) 427-440. 104. J. Dorsey, M. Khaledi, Hydrophobicity estimations by reversed-phase liquid chromatography. Implications for biological partitioning processes, J. Chromatogr. A 656 (1993) 485–99. 105. A. Nasal, D. Siluk, R. Kaliszan, Chromatographic retention parameters in medicinal chemistry and molecular pharmacology, Curr. Med. Chem. 10 (2003) 381-426. 106. S. K. Poole, C. F. Poole, Separation methods for estimating octanol–water partition coefficients. J. Chromatogr. B 797 (2003) 3–19. 107. C. B. C. Boyce, B. V. Milborrow, A simple assessment of partition data for correlating structure and biological activity using thin-layer chromatography, Nature 208 (1965) 537-538. 108. T. Cserháti, Determination of the lipophilicity of some aniline derivatives by reversed-phase thin-layer chromatography. The effect of the organic phase in the eluent, Chromatographia 18 (1984) 318-322. 109. G. L. Biagi, A. M. Barbaro, A. Sapone, M. Recanatini, Determination of lipophilicity by means of reversed-phase thin-layer chromatography: I. Basic aspects Literatura 109 and relationship between slope and intercept of TLC equations, J. Chromatogr. A 662 (1994) 341-361. 110. G. L. Biagi, A. M. Barbaro, A. Sapone, M. Recanatini, Determination of lipophilicity by means of reversed-phase thin-layer chromatography: II. Influence of the organic modifier on the slope of the thin-layer chromatographic equation, J. Chromatogr. A 669 (1994) 246-253. 111. G. L. Biagi, A. M. Barbaro, M. Recanatini, Determination of lipophilicity by means of reversed-phase thin-layer chromatography III. Study of the TLC equations for a series of ionizable quinolone derivatives, J. Chromatogr. A 678 (1994) 127-137. 112. K. Dross, C. Sonntag, R. Mannhold, Determination of the hydrophobicity parameter RMw by reversed-phase thin-layer chromatography. J. Chromatogr. A 973 (1994) 113-124. 113. M. L. Bieganowska, A. Doraczynska, A. Petruczynik, The retention behavior of some sulfonamides on different TLC plates. 2. Comparison of the selectivity of the systems and quantitative determination of hydrophobicity parameters. J. Planar Chromatogr. 8 (1995) 122-128. 114. T. Braumann, Determination of hydrophobic parameters by reversed-phase liquid chromatography: theory, experimental techniques, and application in studies on quantitative structure-activity relationships, J. Chromatogr. A 373 (1986) 191-225. 115. T. Cserhati, Determination of the lipophilicity of some aniline derivatives by reversed-phase thin-layer chromatography. The effect of the organic phase in the eluent, Chromatographia 18 (1984) 318-322. 116. M. Verzele, E. van Damme, C. Dewaele, M. Ghijs, On the polarity of stationary phases in straight-phase LC, Chromatographia 24 (1987) 302- 308. 117. H. Lamparczyk, M. Atomura, K. Jinno, Qualitative description of dispersive and inductive electrostatic interactions in reversed-phase liquid chromatography, Chromatographia 23 (1987) 752-759. 118. A. Leo, Calculating log Poct from Structures, Chem. Revs. 93 (1993) 1281-1306. 119. R. F. Rekker, R. Mannhold, G. Bijloo, G. De Vries, K. Dross, The lipophilic behaviour of organic compounds. 3. The search for interconnections between Literatura 110 reversed-phase chromatographic data and log Poct values, Quant. Struct. Act. Relat. 17 (1998) 549-557. 120. G. E. Kellogg, G. S. Joshi, D. J. Abraham, New Tools for Modeling and Understanding Hydrophobicity and Hydrophobic Interactions, Med. Chem. Res. 1 (1992) 444-453. 121. S. Wold, Chemometrics; what do we mean with it and what do we want from it, Chemometr. Intell. Lab. 30 (1995) 109–115. 122. R. Bro, Multivariate calibration. What is in chemometrics for the analytical chemist? Anal. Chim. Acta, 500 (2003) 185-194. 123. P. J. Gemperline, Practical guide to chemometrics, Introduction to Chemometrics, Taylor & Francis Group, New York, USA (2006). 124. K. Pearson, On lines and planes of closest fit to systems of points in space, Philos. Mag. 2 (1901) 559-572. 125. H. Hotelling, Analysis of a Complex of Statistical Variables Into Principal Components, J. Educ. Psychol. 24 (1933) 417-441. 126. R. G. Brereton, Chemometrics. Data analysis for the laboratory and chemical plant, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, England (2003). 127. K. Varmuza, P. Filzmoser, Introduction to multivariate statistical analysis in chemometrics. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Florida, USA (2009). 128. J.N. Miller, J.C. Miller, Statistics and chemometrics for analytical chemistry, 6thed, Pearson Education Limited, Harlow, England (2010). 129. E. Pourbasheer, S. Riahi, M. R. Ganjali, P. Norouzi, Quantitative structure-activity relationship (QSAR) study of interleukin-1 receptor associated kinase 4 (IRAK-4) inhibitor activity by the genetic algorithm and multiple linear regression (GA-MLR) method, J. Enzym. Inhib. Med. Ch. 25 (2010) 844-853. 130. M. Fernandez, J. Caballero, QSAR models for predicting the activity of non- peptide luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) antagonists derived from erythromycin A using quantum chemical properties, J. Mol. Model. 13 (2007) 465- 476. Literatura 111 131. G. B. Luilo, S. E. Cabaniss, Quantitative Structure-Property Relationship for Predicting Chlorine Demand by Organic Molecules, Environ. Sci. Technol. 44 (2010) 2503-2508. 132. J. G. Topliss, R. P. Edwards, Chance Factors in Studies of Quantitative Structure- Activity Relationships, J. Med. Chem. 22 (1979) 1238-1244. 133. A. R. Katritzky, V. S. Lobanov, M. Karelson, QSPR: The Correlation and Quantitative Prediction of Chem ical and Physical Properties from Structure, Chem. Soc. Rev. 24 (1995) 279-287. 134. H. O. A. Wold, Research Papers in Statistics, Nonlinear estimation by iterative least squares procedures, Wiley, New York (1966). 135. H. O. A. Wold, Quantitative Sociology, Path Models with Latent Variables: The NIPALS, Academic Press, New York, (1975). 136. H. O. A. Wold, Systems under indirect observation, Part II, Soft modelling: the basic design and some extensions, North-Holland, Amsterdam (1982). 137. P. Geladi, B. Kowalski, Partial least- squares regression: A tutorial, Anal. Chim. Acta 185 (1986) 1-17. 138. K. Bodzioch, A. Durand, R. Kaliszan, T. Bączek, Y. Vander Heyden, Advanced QSRR modeling of peptides behavior in RPLC, Talanta 81 (2010) 1711-1718. 139. M. Otto, Chemometrics, Statistics and Computer Application in Analytical Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim (1999). 140. A. K. Jain, A. Vaidya, V. Ravichandran, S. K. Kashaw, R. K. Agrawal, Recent developments and biological activities of thiazolidinone derivatives: a review, Bioorg. Med. Chem. 20 (2012) 3378-3395. 141. Y. S. Prabhakar, V. R. Solomon, M. K. Gupta, S. B. Katti, QSAR studies on thiazolidines: biologically privileged scaffold, Top. Heterocycl. Chem. 4 (2006) 161-249. 142. V. V. Vintonyak, K. Warburg, H. Kruse, S. Grimme, K. Hübel, D. Rauh, H. Waldmann, Identification of Thiazolidinones Spiro-Fused to Indolin-2-ones as Potent and Selective Inhibitors of the Mycobacterium tuberculosis Protein Tyrosine Phosphatase, Angew. Chem. Int. Ed. 49 (2010) 5902-5905. 143. R. K. Rawal, S. B. Katti, N. Kaushik-Basu, P. Arora, Z. Pan, Non-nucleoside inhibitors of the hepatitis C virus NS5B RNA-dependant RNA polymerase: 2-Aryl- Literatura 112 3-heteroaryl-1,3-thiazolidin-4-one derivatives, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 6110-6114. 144. S. Allen, B. Newhouse, A. S. Anderson, B. Fauber, A. Allen, D. Chantry, C. Eberhardt, J. Odingo, L. E. Burgess, Discovery and SAR of trisubstituted thiazolidinones as CCR4 antagonists, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 1619- 1624. 145. S. A. Ahmed, S. Odde, P. R. Daga, J. J. Bowling, M. K. Mesbah, D. T. Youssef, S. I. Khalifa, R. J. Doerksen, M. T. Hamann, Latrunculin with a Highly Oxidized Thiazolidinone Ring:  Structure Assignment and Actin Docking, Org. Lett. 9 (2007) 4773-4776. 146. L. J. S. Knutsen, C. J. Hobbs, C. G. Earnshaw, A. Fiumana, J. Gilbert, S. L. Mellor, F. Radford, N. J. Smith, P. J. Birch, J. R. Burley, S. D. C. Ward, I. F. James, Synthesis and SAR of novel 2-arylthiazolidinones as selective analgesic N-type calcium channel blockers, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17 (2007) 662-667. 147. H. Zhou, S. Wu, S. Zhai, A. Liu, Y. Sun, R. Li, Y. Zhang, S. Ekins, P. W. Swaan, B. Fang, B. Zhang, B Yan, Design, synthesis, cytoselective toxicity, structure- activity relationships, and pharmacophore of thiazolidinone derivatives targeting drug-resistant lung cancer cells, J. Med. Chem. 51 (2008) 1242-51. 148. D. M. Rock, M. J. McLean, R. L. Macdonald, W. A. Catterall, C. P. Taylor, Ralitoline (CI-946) and CI-953 block sustained repetitive sodium action potentials in cultured mouse spinal cord neurons and displace batrachotoxinin A 20-alpha- benzoate binding in vitro, Epilepsy Res. 8 (1991) 197-203. 149. R. Marković, M. Baranac, V. Jovanović, Z. Džambaski, Regioselective synthesis of a stereodefined heterocyclic push-pull alkene, J. Chem. Educ. 81 (2004) 1026- 1029. 150. R. Marković, M. Baranac, Z. Džambaski, M. Stojanović, P. J. Steel, High regioselectivity in the heterocyclization of beta-oxonitriles to 4-oxothiazolidines: X- ray structure proof, Tetrahedron 59 (2003) 7803-7810. 151. Z. Džambaski, R. Marković, E. Kleinpeter, M. Baranac-Stojanović, Tetrahedron (2013), članak je u pripremi. 152. http://www.hyper.com/ 153. http://www.norgwyn.com/mmpplus.html Literatura 113 154. M. J. S. Dewar, E. G. Zoebisch, E. F. Healy, J. J. P. Stewart, Development and use of quantum mechanical molecular models. 76. AM1: a new general purpose quantum mechanical molecular model, J. Am. Chem. Soc. 107 (1985) 3902-3909. 155. http://www.vcclab.org/ 156. http://www.cambridgesoft.com 157. J. Hintze, NCSS and PASS. Number Cruncher Statistical Systems, Kaysville, Utah (2001), www.ncss.com. 158. R. M. McCormick, B. L. Karger, Distribution phenomena of mobile-phase components and determination of dead volume in reversed-phase liquid chromatography, Anal. Chem. 52 (1980) 2249-2257. 159. B. Natalini, R. Sardella, E. Camaioni, S. Natalini, R. Pellicciari, Dominant factors affecting the chromatographic behaviour of bile acids, Chromatographia 64 (2006) 343-349. 160. V. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Ed, John Wiley & Sons, Germany (2004). 161. C. Sârbu, K. Kuhajda, S. Kevrešan, Evaluation of the lipophilicity of bile acids and their derivatives by thin-layer chromatography and principal component analysis, J. Chromatogr. A 917 (2001) 361-366. 162. C. Onisor, M. Poša, S. Kevrešan, K. Kuhajda, C. Sârbu, Estimation of chromatographic lipophilicity of bile acids and their derivatives by reversed-phase thin layer chromatography, J. Sep. Sci. 33 (2010) 3110-3118. 163. T. Djaković-Sekulić, A. Smolinski, N. Perišić-Janjić, M. Janicka, Chemometric characterization of (chromatographic) lipophilicity parameters of newly synthesized s-triazine derivatives, J. Chemometrics 22 (2008) 195-202. 164. M. M. Natić, R. M. Baošić, D. M. Milojković-Opsenica, Ž. Lj. Tešić, Estimation of the Hydrophobicity of Tris-β-diketonato Complexes from Reversed-Phase Thin- Layer Chromatographic Data, J. Planar Chromatogr. 18 (2005) 344-348. 165. R. Kaliszan, Handbook of analytical separation, Elsevier, The Netherlands (2000). 166. Z. Garkani-Nejad, Quantitative structure-retention relationship study of some phenol derivatives in gas chromatography, J. Chromatogr. Sci. 48 (2010) 317-323. Literatura 114 167. Z. Garkani-Nejad, M. Ahmadvand, Comparative QSRR modeling of nitrobenzene derivatives based on original molecular descriptors and multivariate image analysis descriptors, Chromatographia 73 (2011) 733-742. 168. S. Wold, Validation of QSAR's, Quant. Struct.-Act. Relat. 10 (1991) 191-193. 169. S. Gaudet, K. A. Janes, J. G. Albeck, E. A. Pace, D. A. Lauffenburger, P. K. Sorger, A Compendium of Signals and Responses Triggered by Prodeath and Prosurvival Cytokines, Mol. Cell. Proteomics 4 (2005) 1569-1590. 170. S. Wold, PLS for multivariate linear modeling. In QSAR: Chemometric methods in molecular design: methods and principles in medicinal chemistry. Wiley, Weinheim, Germany (1995). 171. C. Hansen, Solubility Parameters: A user's handbook, Second Edition, Boca Raton, Fla: CRC (2007). Prilog 115 7. Prilog Prilog 116 Prilog Tabela P1. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP-18 / MeOH:voda Tabela P2. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP-18 / ACN:voda Tabela P3. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP-18 / THF:voda Tabela P4. Retencioni podaci za hromatografski sistem CN / MeOH:voda Tabela P5. Retencioni podaci za hromatografski sistem CN / ACN:voda Tabela P6. Retencioni podaci za hromatografski sistem CN / THF:voda Tabela P7. Parametri lipofilnosti, C0 i PC1, za RP-18 stacionarnu fazu Tabela P8. Parametri lipofilnosti, C0 i PC1, za CN stacionarnu fazu Tabela P9. Izračunate log P vrednosti Tabela P10. Korelaciona matrica log P vrednosti Tabela P11. Molekulski deskriptori korišćeni za multivarijantnu analizu Tabela P12. Korelaciona matrica molekulskih deskriptora korišćena u MLR analizi Prilog 117 Tabela P1. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP-18 / MeOH:voda Jedinjenje 95%a 90% 85% 80% 75% 70% RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,70 -0,37 0,60 -0,18 0,54 -0,07 0,42 0,14 0,30 0,37 0,16 0,72 2 0,75 -0,48 0,69 -0,35 0,62 -0,21 0,51 -0,02 0,40 0,18 0,24 0,50 3 0,74 -0,45 0,67 -0,31 0,61 -0,19 0,49 0,02 0,37 0,23 0,20 0,60 4 0,82 -0,66 0,79 -0,58 0,74 -0,45 0,65 -0,27 0,56 -0,10 0,44 0,10 5 0,63 -0,23 0,51 -0,02 0,44 0,10 0,30 0,37 0,23 0,52 0,12 0,87 6 0,74 -0,45 0,65 -0,27 0,59 -0,16 0,47 0,05 0,37 0,23 0,23 0,52 7 0,89 -0,91 0,84 -0,72 0,81 -0,63 0,74 -0,45 0,64 -0,25 0,72 -0,41 8 0,65 -0,27 0,56 -0,10 0,46 0,07 0,34 0,29 0,21 0,58 0,22 0,55 9 0,64 -0,25 0,59 -0,16 0,51 -0,02 0,43 0,12 0,30 0,37 0,18 0,66 10 0,37 0,23 0,30 0,37 0,20 0,60 0,12 0,87 0,07 1,12 0,04 1,38 11 0,42 0,14 0,35 0,27 0,24 0,50 0,19 0,63 0,14 0,79 0,14 0,79 12 0,60 -0,18 0,54 -0,07 0,43 0,12 0,33 0,31 0,26 0,45 0,22 0,55 13 0,74 -0,45 0,69 -0,35 0,64 -0,25 0,59 -0,16 0,50 0,00 0,50 0,00 14 0,80 -0,60 0,76 -0,50 0,70 -0,37 0,67 -0,31 0,59 -0,16 0,59 -0,16 15 0,79 -0,58 0,72 -0,41 0,65 -0,27 0,59 -0,16 0,48 0,03 0,51 -0,02 16 0,73 -0,43 0,70 -0,37 0,65 -0,27 0,59 -0,16 0,54 -0,07 0,44 0,10 17 0,79 -0,58 0,75 -0,48 0,70 -0,37 0,66 -0,29 0,61 -0,19 0,53 -0,05 18 0,79 -0,58 0,74 -0,45 0,71 -0,39 0,65 -0,27 0,59 -0,16 0,49 0,02 19 0,87 -0,83 0,86 -0,79 0,86 -0,79 0,81 -0,63 0,79 -0,58 0,76 -0,50 20 0,51 -0,02 0,60 -0,18 0,62 -0,21 0,40 0,18 0,41 0,16 0,29 0,39 21 0,52 -0,03 0,62 -0,21 0,63 -0,23 0,40 0,18 0,41 0,16 0,27 0,43 22 0,49 0,02 0,46 0,07 0,49 0,02 0,29 0,39 0,28 0,41 0,19 0,63 23 0,56 -0,10 0,52 -0,03 0,55 -0,09 0,35 0,27 0,36 0,25 0,26 0,45 a Procenat organskog modifikatora u mobilnoj fazi. Prilog 118 Tabela P2. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP-18 / ACN:voda Jedinjenje 90%a 80% 70% 60% 50% RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,75 -0,48 0,60 -0,18 0,38 0,21 0,29 0,39 0,21 0,58 2 0,84 -0,72 0,70 -0,37 0,51 -0,02 0,36 0,25 0,27 0,43 3 0,82 -0,66 0,70 -0,37 0,54 -0,07 0,38 0,21 0,25 0,48 4 0,89 -0,91 0,80 -0,60 0,59 -0,16 0,46 0,07 0,35 0,27 5 0,66 -0,29 0,56 -0,10 0,35 0,27 0,23 0,52 0,15 0,75 6 0,78 -0,55 0,69 -0,35 0,48 0,04 0,37 0,23 0,22 0,55 7 0,91 -1,00 0,89 -0,91 0,82 -0,66 0,69 -0,35 0,58 -0,14 8 0,79 -0,58 0,53 -0,05 0,33 0,31 0,18 0,66 0,07 1,12 9 0,75 -0,48 0,64 -0,25 0,48 0,04 0,33 0,31 0,22 0,55 10 0,45 0,09 0,34 0,29 0,22 0,55 0,14 0,79 0,07 1,12 11 0,52 -0,04 0,43 0,12 0,29 0,39 0,19 0,63 0,12 0,86 12 0,68 -0,33 0,58 -0,14 0,40 0,18 0,29 0,39 0,15 0,75 13 0,80 -0,60 0,74 -0,45 0,58 -0,14 0,50 0,00 0,34 0,29 14 0,86 -0,79 0,79 -0,58 0,68 -0,33 0,56 -0,10 0,40 0,18 15 0,86 -0,79 0,73 -0,43 0,58 -0,14 0,40 0,18 0,28 0,41 16 0,80 -0,60 0,76 -0,50 0,62 -0,21 0,43 0,12 0,32 0,33 17 0,87 -0,83 0,85 -0,75 0,74 -0,45 0,56 -0,10 0,41 0,16 18 0,85 -0,75 0,85 -0,75 0,73 -0,43 0,55 -0,09 0,40 0,18 19 0,95 -1,28 0,89 -0,91 0,81 -0,63 0,66 -0,29 0,55 -0,09 20 0,76 -0,50 0,67 -0,31 0,57 -0,12 0,40 0,18 0,27 0,43 21 0,76 -0,50 0,67 -0,31 0,57 -0,12 0,40 0,18 0,27 0,43 22 0,63 -0,23 0,55 -0,09 0,46 0,07 0,30 0,37 0,22 0,55 23 0,68 -0,33 0,61 -0,19 0,52 -0,04 0,38 0,21 0,27 0,43 a Procenat organskog modifikatora u mobilnoj fazi. Prilog 119 Tabela P3. Retencioni podaci za hromatografski sistem RP-18 / THF:voda Jedinjenje 85%a 80% 70% 60% 50% RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,92 -1,06 0,80 -0,60 0,61 -0,19 0,47 0,05 0,24 0,50 2 0,93 -1,12 0,82 -0,66 0,63 -0,23 0,47 0,05 0,25 0,48 3 0,93 -1,12 0,80 -0,60 0,61 -0,19 0,47 0,05 0,27 0,43 4 0,93 -1,12 0,79 -0,58 0,62 -0,21 0,49 0,02 0,28 0,41 5 0,87 -0,83 0,76 -0,50 0,59 -0,16 0,41 0,16 0,20 0,60 6 0,91 -1,00 0,80 -0,60 0,61 -0,19 0,47 0,05 0,29 0,39 7 0,97 -1,51 0,86 -0,79 0,74 -0,45 0,65 -0,27 0,49 0,02 8 0,90 -0,95 0,79 -0,58 0,48 0,03 0,38 0,21 0,11 0,91 9 0,93 -1,12 0,84 -0,72 0,65 -0,27 0,55 -0,09 0,36 0,25 10 0,90 -0,95 0,79 -0,58 0,63 -0,23 0,51 -0,02 0,28 0,41 11 0,95 -1,28 0,81 -0,63 0,69 -0,35 0,52 -0,03 0,25 0,48 12 0,91 -1,00 0,81 -0,63 0,67 -0,31 0,48 0,03 0,24 0,50 13 0,90 -0,95 0,79 -0,58 0,64 -0,25 0,49 0,02 0,27 0,43 14 0,93 -1,12 0,81 -0,63 0,67 -0,31 0,56 -0,10 0,36 0,25 15 0,91 -1,00 0,79 -0,58 0,63 -0,23 0,47 0,05 0,25 0,48 16 0,93 -1,12 0,89 -0,91 0,72 -0,41 0,54 -0,07 0,32 0,33 17 0,93 -1,12 0,90 -0,95 0,76 -0,50 0,58 -0,14 0,37 0,23 18 0,94 -1,19 0,91 -1,00 0,76 -0,50 0,61 -0,19 0,39 0,19 19 0,90 -0,95 0,84 -0,72 0,75 -0,48 0,64 -0,25 0,55 -0,09 20 0,90 -0,95 0,84 -0,72 0,73 -0,43 0,60 -0,18 0,44 0,10 21 0,90 -0,95 0,85 -0,75 0,72 -0,41 0,58 -0,14 0,45 0,09 22 0,90 -0,95 0,83 -0,69 0,71 -0,39 0,57 -0,12 0,45 0,09 23 0,89 -0,91 0,81 -0,63 0,70 -0,37 0,59 -0,16 0,45 0,09 a Procenat organskog modifikatora u mobilnoj fazi. Prilog 120 Tabela P4. Retencioni podaci za hromatografski sistem CN / MeOH:voda Jedinjenje 100% a 90 80 75 70 65 60 RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,76 -0,50 0,71 -0,39 0,57 -0,12 0,47 0,05 0,34 0,29 0,24 0,50 0,10 0,95 2 0,79 -0,58 0,73 -0,43 0,61 -0,19 0,51 -0,02 0,36 0,25 0,28 0,41 0,10 0,95 3 0,80 -0,60 0,74 -0,45 0,63 -0,23 0,56 -0,10 0,41 0,16 0,31 0,35 0,12 0,87 4 0,76 -0,50 0,72 -0,41 0,61 -0,19 0,55 -0,09 0,46 0,07 0,37 0,23 0,21 0,58 5 0,79 -0,58 0,72 -0,41 0,61 -0,19 0,54 -0,07 0,38 0,21 0,30 0,37 0,13 0,83 6 0,80 -0,60 0,74 -0,45 0,64 -0,25 0,58 -0,14 0,47 0,05 0,37 0,23 0,16 0,72 7 0,82 -0,66 0,79 -0,58 0,75 -0,48 0,72 -0,41 0,66 -0,29 0,62 -0,21 0,46 0,07 8 0,78 -0,55 0,75 -0,48 0,53 -0,05 0,47 0,05 0,29 0,39 0,18 0,66 0,08 1,06 9 0,80 -0,60 0,76 -0,50 0,75 -0,48 0,70 -0,37 0,63 -0,23 0,55 -0,09 0,45 0,09 10 0,83 -0,69 0,78 -0,55 0,63 -0,23 0,57 -0,12 0,45 0,09 0,32 0,33 0,12 0,87 11 0,80 -0,60 0,72 -0,41 0,58 -0,14 0,53 -0,05 0,44 0,10 0,24 0,50 0,11 0,91 12 0,86 -0,79 0,81 -0,63 0,74 -0,45 0,69 -0,35 0,63 -0,23 0,51 -0,02 0,28 0,41 13 0,84 -0,72 0,81 -0,63 0,75 -0,48 0,71 -0,39 0,66 -0,29 0,57 -0,12 0,40 0,18 14 0,83 -0,69 0,82 -0,66 0,77 -0,52 0,74 -0,45 0,70 -0,37 0,62 -0,21 0,47 0,05 15 0,85 -0,75 0,81 -0,63 0,73 -0,43 0,70 -0,37 0,65 -0,27 0,54 -0,07 0,37 0,23 16 0,77 -0,52 0,73 -0,43 0,67 -0,31 0,63 -0,23 0,55 -0,09 0,46 0,07 0,36 0,25 17 0,81 -0,63 0,78 -0,55 0,68 -0,33 0,65 -0,27 0,59 -0,16 0,51 -0,02 0,37 0,23 18 0,82 -0,66 0,80 -0,60 0,72 -0,41 0,67 -0,31 0,62 -0,21 0,53 -0,05 0,37 0,23 19 0,80 -0,60 0,76 -0,50 0,71 -0,39 0,73 -0,43 0,70 -0,37 0,64 -0,25 0,59 -0,16 20 0,81 -0,63 0,79 -0,58 0,70 -0,37 0,65 -0,27 0,57 -0,12 0,47 0,05 0,30 0,37 21 0,88 -0,87 0,86 -0,79 0,80 -0,60 0,77 -0,52 0,74 -0,45 0,68 -0,33 0,55 -0,09 22 0,76 -0,50 0,71 -0,39 0,64 -0,25 0,61 -0,19 0,56 -0,10 0,45 0,09 0,28 0,41 23 0,80 -0,60 0,77 -0,52 0,73 -0,43 0,69 -0,35 0,61 -0,19 0,55 -0,09 0,44 0,10 a Procenat organskog modifikatora u mobilnoj fazi. Prilog 121 Tabela P5. Retencioni podaci za hromatografski sistem CN / ACN:voda Jedinjenje 70% a 60% 50% 45% 40% RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,78 -0,55 0,60 -0,18 0,36 0,25 0,19 0,63 0,16 0,72 2 0,79 -0,58 0,63 -0,23 0,36 0,25 0,22 0,55 0,19 0,63 3 0,80 -0,60 0,64 -0,25 0,37 0,23 0,23 0,52 0,19 0,63 4 0,79 -0,58 0,64 -0,25 0,42 0,14 0,27 0,43 0,24 0,50 5 0,76 -0,50 0,60 -0,18 0,34 0,29 0,19 0,63 0,17 0,69 6 0,79 -0,58 0,65 -0,27 0,39 0,19 0,24 0,50 0,20 0,60 7 0,89 -0,91 0,81 -0,63 0,65 -0,27 0,57 -0,12 0,53 -0,05 8 0,74 -0,45 0,56 -0,10 0,25 0,48 0,14 0,79 0,11 0,91 9 0,80 -0,60 0,66 -0,29 0,45 0,09 0,27 0,43 0,25 0,48 10 0,78 -0,55 0,63 -0,23 0,36 0,25 0,21 0,58 0,19 0,63 11 0,80 -0,60 0,67 -0,31 0,39 0,19 0,23 0,52 0,20 0,60 12 0,91 -1,00 0,80 -0,60 0,65 -0,27 0,48 0,03 0,40 0,18 13 0,83 -0,69 0,73 -0,43 0,56 -0,10 0,44 0,10 0,40 0,18 14 0,87 -0,83 0,77 -0,52 0,62 -0,21 0,51 -0,02 0,47 0,05 15 0,84 -0,72 0,72 -0,41 0,52 -0,03 0,37 0,23 0,33 0,31 16 0,82 -0,66 0,71 -0,39 0,52 -0,03 0,42 0,14 0,37 0,23 17 0,83 -0,69 0,74 -0,45 0,57 -0,12 0,45 0,09 0,41 0,16 18 0,88 -0,87 0,75 -0,48 0,56 -0,10 0,45 0,09 0,41 0,16 19 0,83 -0,69 0,8 -0,60 0,67 -0,31 0,62 -0,21 0,54 -0,07 20 0,86 -0,79 0,78 -0,55 0,62 -0,21 0,52 -0,03 0,44 0,10 21 0,92 -1,06 0,87 -0,83 0,74 -0,45 0,69 -0,35 0,66 -0,29 22 0,84 -0,72 0,72 -0,41 0,63 -0,23 0,51 -0,02 0,44 0,10 23 0,86 -0,79 0,78 -0,55 0,67 -0,31 0,54 -0,07 0,51 -0,02 a Procenat organskog modifikatora u mobilnoj fazi. Prilog 122 Tabela P6. Retencioni podaci za hromatografski sistem CN / THF:voda Jedinjenje 60% a 55% 50% 45% 40% RF RM RF RM RF RM RF RM RF RM 1 0,79 -0,10 0,63 -0,20 0,46 -0,34 0,24 -0,62 0,14 -0,85 2 0,82 -0,09 0,64 -0,19 0,45 -0,35 0,23 -0,64 0,14 -0,85 3 0,80 -0,10 0,65 -0,19 0,45 -0,35 0,23 -0,64 0,14 -0,85 4 0,78 -0,11 0,64 -0,19 0,47 -0,33 0,28 -0,55 0,19 -0,72 5 0,77 -0,11 0,62 -0,21 0,43 -0,37 0,24 -0,62 0,14 -0,85 6 0,79 -0,10 0,64 -0,19 0,47 -0,33 0,27 -0,57 0,18 -0,74 7 0,89 -0,05 0,80 -0,10 0,69 -0,16 0,53 -0,28 0,44 -0,36 8 0,78 -0,11 0,60 -0,22 0,39 -0,41 0,18 -0,74 0,11 -0,96 9 0,84 -0,08 0,70 -0,15 0,55 -0,26 0,35 -0,46 0,23 -0,64 10 0,85 -0,07 0,70 -0,15 0,52 -0,28 0,31 -0,51 0,22 -0,66 11 0,86 -0,07 0,71 -0,15 0,52 -0,28 0,32 -0,49 0,21 -0,68 12 0,85 -0,07 0,69 -0,16 0,50 -0,30 0,28 -0,55 0,19 -0,72 13 0,81 -0,09 0,69 -0,16 0,57 -0,24 0,43 -0,37 0,34 -0,47 14 0,81 -0,09 0,72 -0,14 0,62 -0,21 0,50 -0,30 0,41 -0,39 15 0,82 -0,09 0,68 -0,17 0,53 -0,28 0,39 -0,41 0,29 -0,54 16 0,81 -0,09 0,68 -0,17 0,56 -0,25 0,39 -0,41 0,30 -0,52 17 0,87 -0,06 0,76 -0,12 0,60 -0,22 0,42 -0,38 0,34 -0,47 18 0,85 -0,07 0,74 -0,13 0,60 -0,22 0,42 -0,38 0,33 -0,48 19 0,82 -0,09 0,75 -0,12 0,65 -0,19 0,54 -0,27 0,49 -0,31 20 0,88 -0,06 0,77 -0,11 0,63 -0,20 0,46 -0,34 0,34 -0,47 21 0,87 -0,06 0,77 -0,11 0,61 -0,21 0,41 -0,39 0,34 -0,47 22 0,88 -0,06 0,77 -0,11 0,64 -0,19 0,46 -0,34 0,36 -0,44 23 0,89 -0,05 0,79 -0,10 0,67 -0,17 0,51 -0,29 0,42 -0,38 a Procenat organskog modifikatora u mobilnoj fazi. Prilog 123 Tabela P7. Parametri lipofilnosti, C0 i PC1, za RP-18 stacionarnu fazu Jedinjenje MeOH/voda ACN/voda THF/voda C0 PC1 C0 PC1 C0 PC1 1 0,852 0,590 0,735 0,627 0,632 0,903 2 0,813 0,121 0,672 0,035 0,626 0,806 3 0,825 0,280 0,684 -0,014 0,638 0,863 4 0,717 -0,837 0,622 -0,558 0,621 0,602 5 0,891 1,004 0,788 0,984 0,662 1,408 6 0,825 0,251 0,707 0,203 0,629 0,697 7 0,654 -1,672 0,725 0,355 0,493 -1,774 8 0,880 0,859 0,925 1,991 0,675 2,127 9 0,861 0,560 0,884 1,564 0,586 -0,130 10 0,989 1,811 0,763 0,861 0,612 0,706 11 0,985 1,449 0,634 -0,466 0,608 0,431 12 0,888 0,828 0,572 -0,974 0,617 0,277 13 0,740 -0,596 0,654 -0,250 0,618 0,199 14 0,665 -1,100 0,456 -1,905 0,578 -0,704 15 0,754 -0,581 0,779 1,172 0,618 0,603 16 0,729 -0,551 0,628 -0,421 0,570 -0,327 17 0,666 -0,987 0,558 -1,146 0,552 -0,758 18 0,691 -0,841 0,566 -1,064 0,541 -0,977 19 0,345 -2,243 0,462 -1,913 0,484 -1,914 20 0,849 0,166 0,673 0,000 0,562 -0,758 21 0,848 0,218 0,673 0,000 0,564 -0,733 22 0,942 0,829 0,766 0,657 0,565 -0,703 23 0,896 0,443 0,709 0,264 0,504 -0,843 Prilog 124 Tabela P8. Parametri lipofilnosti, C0 i PC1, za CN stacionarnu fazu Jedinjenje MeOH/voda ACN/voda THF/voda C0 PC1 C0 PC1 C0 PC1 1 0,777 1,464 0,569 1,176 0,516 1,173 2 0,753 1,255 0,559 1,014 0,513 1,190 3 0,733 0,987 0,555 0,959 0,515 1,190 4 0,728 0,650 0,543 0,688 0,510 0,856 5 0,747 1,089 0,574 1,204 0,520 1,277 6 0,717 0,655 0,551 0,876 0,510 0,912 7 0,538 -1,056 0,398 -1,191 0,430 -1,596 8 0,784 1,721 0,598 1,649 0,527 1,682 9 0,624 -0,809 0,536 0,586 0,488 0,174 10 0,731 0,865 0,562 1,042 0,492 0,396 11 0,737 1,181 0,549 0,870 0,491 0,373 12 0,579 -0,396 0,446 -0,739 0,498 0,650 13 0,582 -0,837 0,468 -0,370 0,470 -0,437 14 0,437 -1,200 0,429 -0,834 0,445 -1,048 15 0,612 -0,673 0,496 -0,002 0,482 -0,047 16 0,668 -0,140 0,484 -0,167 0,480 -0,144 17 0,630 -0,387 0,462 -0,440 0,463 -0,636 18 0,613 -0,547 0,463 -0,461 0,466 -0,557 19 0,434 -1,388 0,352 -1,310 0,418 -1,557 20 0,663 -0,155 0,449 -0,800 0,457 -0,857 21 0,459 -1,639 0,310 -1,953 0,463 -0,644 22 0,613 0,089 0,448 -0,722 0,453 -0,945 23 0,627 -0,729 0,417 -1,074 0,437 -1,405 Prilog 125 Tabela P9. Izračunate log P vrednosti Jedinjenje Alog Psa AClog Pa ABlog Pa Milog Pa Alog Pa Mlog Pa log PKOWWINa Xlog P2a Xlog P3a Clog Pb 1 3,19 3,18 2,87 2,83 3,69 2,71 2,98 3,27 3,23 3,46 2 3,00 2,86 3,31 2,49 3,07 2,31 2,41 2,69 2,72 2,83 3 2,68 2,99 4,00 2,59 3,40 2,50 2,81 2,99 3,12 3,15 4 2,07 2,20 1,29 1,47 2,16 1,16 0,36 1,44 1,60 1,55 5 3,25 2,89 3,19 2,68 3,24 2,35 3,06 2,88 2,79 3,51 6 2,24 2,19 2,40 1,92 2,49 1,70 2,17 2,08 2,10 2,65 7 0,90 0,76 1,73 0,42 1,29 0,75 0,15 0,61 0,76 0,86 8 3,80 3,74 3,86 3,02 4,02 2,76 3,43 3,43 3,45 4,13 9 2,39 2,41 1,31 2,06 1,87 1,60 -0,10 2,17 2,01 1,31 10 3,56 3,09 3,21 3,27 2,94 2,74 2,60 3,60 3,20 3,06 11 3,36 3,38 2,89 3,42 3,40 3,05 3,52 4,00 3,63 2,83 12 3,35 3,20 4,02 3,18 3,11 2,83 2,35 3,72 3,52 3,11 13 1,14 1,38 1,12 0,89 1,28 0,54 0,88 0,66 1,01 1,93 14 0,72 0,82 0,73 0,52 0,91 0,23 0,47 0,37 0,61 1,41 15 1,49 1,38 1,71 0,71 1,24 0,58 0,92 0,52 0,83 2,02 16 1,47 1,81 1,20 1,43 2,11 1,42 1,28 1,57 1,73 2,24 17 1,76 1,49 1,64 1,09 1,49 1,02 0,70 0,98 1,22 1,60 18 1,49 1,63 2,33 1,20 1,82 1,29 1,11 1,28 1,62 1,92 19 0,14 0,83 -0,38 0,07 0,58 -0,47 -1,34 -0,27 0,11 0,32 20 2,17 1,70 1,66 1,48 1,19 1,48 0,24 1,70 1,63 1,10 21 2,12 1,83 2,35 1,59 1,52 1,71 0,64 2,01 2,03 1,34 22 1,86 2,02 1,22 1,83 1,81 1,86 0,81 2,29 2,14 1,06 23 1,35 1,03 0,75 0,92 0,61 0,80 0,00 1,09 1,01 0,43 a log P vrednosti su izračunate primenom programa155; b Clog P vrednosti su izračunate primenom programa156. Prilog 126 Tabela P10. Korelaciona matrica log P vrednosti Alog Ps AClog P ABlog P Milog P Alog P Mlog P log PKOWWIN Xlog P2 Xlog P3 Clog P Alog Ps 1 AClog P 0,962 1 ABlog P 0,869 0,842 1 Milog P 0,969 0,973 0,842 1 Alog P 0,901 0,956 0,874 0,914 1 Mlog P 0,956 0,942 0,880 0,976 0,910 1 log PKOWWIN 0,853 0,866 0,881 0,866 0,928 0,873 1 Xlog P2 0,956 0,953 0,843 0,992 0,897 0,989 0,851 1 Xlog P3 0,956 0,971 0,880 0,988 0,935 0,989 0,885 0,992 1 Clog P 0,827 0,862 0,865 0,815 0,928 0,796 0,948 0,776 0,829 1 Prilog 127 Tabela P11. Molekulski deskriptori korišćeni za multivarijantnu analizu Jedinjenje Clog P Alog Ps TE BE HOF DM HOMO LUMO SA HE R P 1 3,46 3,19 -81896,21 -4135,26 20,81 2,59 -8,75 -0,65 423,50 -3,93 97,61 34,66 2 2,83 3,00 -86970,56 -4279,07 42,10 4,30 -8,89 -0,36 447,52 -6,55 101,05 36,01 3 3,15 2,68 -94157,67 -4842,70 28,66 4,22 -8,82 -0,37 518,76 -5,78 109,97 39,68 4 1,55 2,07 -59978,43 -2870,17 53,49 2,31 -8,90 -0,41 362,98 -6,83 68,80 24,93 5 3,51 3,25 -85334,21 -3566,32 -59,61 1,48 -9,03 -0,56 485,71 -2,97 86,80 31,93 6 2,65 2,24 -77501,30 -3595,31 -63,24 2,04 -8,86 -0,39 424,26 -2,73 79,27 29,31 7 0,86 0,90 -68025,34 -3101,89 -14,47 3,33 -8,67 -0,24 356,94 -7,71 71,57 26,35 8 4,13 3,80 -110365,61 -5304,12 -32,76 3,05 -8,97 -0,75 465,22 -5,37 117,66 42,72 9 1,31 2,39 -75172,48 -3724,06 85,78 1,27 -8,66 -0,81 479,37 -6,61 87,45 31,60 10 3,06 3,56 -100527,62 -4419,56 -26,67 2,17 -8,64 -0,81 570,34 -2,37 105,45 38,60 11 2,83 3,36 -97072,81 -4971,70 70,55 2,89 -8,35 -0,27 490,15 -3,77 116,26 41,33 12 3,11 3,35 -109315,20 -5660,06 97,48 5,51 -8,16 -0,36 600,42 -4,41 128,62 46,35 13 1,93 1,14 -62125,09 -2675,40 -101,99 0,90 -8,95 -0,46 428,06 -1,53 55,01 21,48 14 1,41 0,72 -58533,78 -2395,83 -97,51 1,03 -8,97 -0,50 396,94 -1,84 50,51 19,65 15 2,02 1,49 -87041,23 -3602,76 -189,15 2,13 -9,06 -0,59 532,39 -2,89 70,56 27,71 16 2,24 1,47 -62924,82 -2931,91 -9,59 2,21 -8,81 -0,68 383,39 -2,56 68,86 25,00 17 1,60 1,76 -68017,87 -3094,42 -6,99 2,73 -8,92 -0,15 398,05 -5,13 72,30 26,35 18 1,92 1,49 -75206,15 -3659,21 -21,60 2,77 -8,76 -0,28 477,44 -4,35 81,22 30,02 19 0,32 0,14 -41006,77 -1666,55 23,36 2,26 -9,03 -0,53 322,36 -5,81 40,05 15,27 20 1,10 2,17 -83108,64 -3845,03 128,57 4,35 -8,62 -0,59 532,24 -4,89 90,95 33,02 21 1,34 2,12 -90295,09 -4407,99 115,80 3,87 -8,75 -0,48 614,49 -4,10 99,87 36,69 22 1,06 1,86 -78130,18 -3797,11 11,39 2,32 -7,79 -0,48 504,87 -2,21 87,51 31,66 23 0,43 1,35 -73623,02 -3144,91 39,59 2,19 -8,59 -0,59 523,49 -1,77 69,16 26,31 Prilog 128 Tabela P11. Nastavak Jedinjenje HLB SP HD HP HHB HBA HBD WS ST HSA PSA 1 6,59 25,24 23,56 6,32 6,51 0,46 0,42 -2,95 47,67 4,06 43,70 2 10,00 25,70 23,79 6,26 7,42 0,70 0,69 -2,73 50,92 10,59 55,73 3 8,88 24,53 22,88 5,48 6,94 0,78 0,67 -3,77 48,40 10,84 55,73 4 11,56 26,23 23,08 9,76 7,76 0,33 0,23 -0,44 40,51 8,36 47,26 5 7,65 24,84 22,37 6,44 8,67 0,54 0,19 -2,56 36,31 8,31 52,93 6 8,92 24,02 21,69 6,12 8,31 0,54 0,23 -1,47 39,14 8,26 52,93 7 12,12 26,79 23,09 8,97 10,20 0,98 0,72 -0,46 65,72 9,33 69,72 8 7,67 24,16 22,37 5,15 7,53 0,80 0,42 -3,76 44,16 10,08 73,16 9 7,76 25,50 22,52 8,51 8,41 0,46 0,27 -0,57 36,21 7,68 52,19 10 5,91 24,58 22,05 6,11 8,99 0,68 0,23 -2,69 38,21 7,77 57,86 11 5,84 24,91 23,03 6,02 7,32 0,60 0,46 -3,09 31,59 8,25 48,63 12 6,56 24,35 22,52 5,33 7,56 0,91 0,71 -3,90 43,25 9,97 60,66 13 8,07 22,78 19,46 7,48 9,19 0,57 0,04 0,86 30,72 6,30 52,93 14 9,52 23,69 19,99 8,26 9,66 0,57 0,04 1,06 34,94 6,57 52,93 15 8,71 22,71 19,51 6,18 9,83 0,90 0,04 0,26 33,66 8,90 82,39 16 8,03 25,23 22,61 8,33 7,48 0,49 0,23 -0,42 44,49 6,10 43,70 17 11,18 25,80 22,94 8,21 8,50 0,72 0,51 -0,19 61,40 8,67 55,73 18 9,22 24,27 21,92 6,91 7,80 0,80 0,48 -1,23 57,01 8,63 55,73 19 13,42 27,53 21,40 14,49 9,46 0,35 0,05 2,09 35,69 6,63 47,26 20 8,36 25,26 22,43 7,43 8,93 0,77 0,31 -0,33 52,51 8,36 60,66 21 7,09 24,09 21,66 6,47 8,33 0,84 0,28 -1,37 46,71 8,66 60,66 22 5,81 24,79 22,16 7,52 8,19 0,53 0,04 -0,55 37,04 6,19 48,63 23 6,75 23,61 20,11 7,50 9,83 0,59 0,02 0,93 30,74 6,60 57,86 Prilog 129 Tabela P12. Korelacina matrica deskriptora korišćenih u MLR analizi Clog P Alog Ps HOF DM HOMO LUMO SA HE Clog P 1 Alog Ps 0,827 1 HOF -0,701 0,274 1 DM -0,682 0,366 0,593 1 HOMO -0,160 0,223 0,471 0,332 1 LUMO 0,194 -0,219 0,057 0,338 0,104 1 SA -0,107 0,508 0,268 0,418 0,432 -0,202 1 HE -0,147 -0,076 -0,449 -0,456 0,132 -0,254 0,280 1 HLB 0,240 -0,595 -0,136 -0,030 -0,551 0,405 -0,730 -0,581 SP 0,062 -0,117 0,461 0,191 0,008 0,172 -0,545 -0,716 HD 0,677 0,532 0,575 0,506 0,228 0,198 -0,115 -0,643 HP 0,680 -0,722 0,069 -0,318 -0,211 0,024 -0,670 -0,271 HHB -0,414 -0,641 -0,388 -0,389 -0,197 -0,054 -0,110 0,195 HBA -0,258 0,149 -0,045 0,601 0,102 0,293 0,502 -0,156 HBD 0,354 0,437 0,386 0,744 0,135 0,479 0,080 -0,641 ST -0,708 -0,913 -0,255 -0,537 -0,233 -0,010 -0,451 0,184 HSA -0,642 -0,012 0,235 0,534 -0,051 0,459 -0,156 -0,588 PSA 0,152 0,340 0,128 0,612 -0,093 0,366 0,298 -0,528 Prilog 130 Tabela P12. Nastavak HLB SP HD HP HHB HBA HBD ST HSA PSA Clog P Alog Ps HOF DM HOMO LUMO SA HE HLB 1 SP 0,582 1 HD 0,061 0,670 1 HP 0,696 0,645 -0,103 1 HHB 0,314 -0,091 -0,665 0,415 1 HBA -0,079 -0,290 -0,017 -0,515 0,139 1 HBD 0,117 0,324 0,727 -0,355 -0,494 0,540 1 ST 0,472 0,075 -0,608 0,743 0,724 -0,327 -0,669 1 HSA 0,405 0,435 0,571 -0,038 -0,165 0,510 0,724 -0,198 1 PSA 0,202 0,017 0,278 -0,361 -0,115 0,649 0,636 -0,475 0,381 1 Biografija Dragana Dabić je rođena 13. jula 1983. godine u Novoj Gradiški, Republika Hrvatska. Osnovnu školu završila je u Barandi, a srednju školu u Beogradu. Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu upisala je školske 2002/03. godine, a diplomirala 2007. godine sa prosečnom ocenom 8,9. Doktorske studije pri Katedri za analitičku hemiju Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu upisala je 2007. godine. Od 24.01.2008. bila je stipendista Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije. Kao istraživač-pripravnik, na Inovacionom centru Hemijskog fakulteta, zaposlena je od 01.01.2011. godine. U zvanje istraživača-saradnika, u kojem se i sada nalazi, izabrana je 01.05.2011. godine. U toku svog istraživačkog rada Dragana Dabić je bila angažovana kao stipendista Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije na projektu broj 142062 od 2008. do 2010. godine. Od 2011. godine je angažovana na projektu finansiranom od strane Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (projekat broj 172017) i FP7 RegPot projektu broj 256716. Tokom doktorskih studija honorarno je bila angažovana u izvođenju vežbi u okviru nastave iz Analitičke hemije 1, Odabranih oblasti analitičke hemije, kao i Hromatografskih metoda za studente osnovnih i master studija na različitim studijskim programima. Dragana Dabić je koautor sedam naučnih radova koji su publikovani u međunarodnim časopisima. Koautor je četrnaest naučnih saopštenja na međunarodnim naučnim skupovima i na skupovima nacionalnog značaja. Naučni radovi 1. Aleksandra V. Pavlović, Dragana Č. Dabić, Nebojša M. Momirović, Biljana P. Dojčinović, Dušanka M. Milojković-Opsenica, Živoslav Lj. Tešić, Maja M. Natić, Chemical Composition of Two Different Extracts of Berries Harvested in Serbia, J. Agric. Food Chem. 61 (17), 2013, 4188-4194. 2. Sonja M. Davidović, Mile S. Veljović, Milica M. Pantelić, Rada M. Baošić, Maja M. Natić, Dragana Č. Dabić, Sonja P. Pecić, Predrag V. Vukosavljević, Physicochemical, antioxidant and sensory properties of peach wine made from Redhaven cultivar, J. Agric. Food Chem. 61 (6), 2013, 1357-1363. 3. Tomislav Tosti, Maja Natić, Dragana Dabić, Dragana Milić, Dušanka Milojković Opsenica, Živoslav Tešić, Structure-retention relationship study of polyoxygenated steroids, J. Sep. Sci. 35 (20), 2012, 2693-2698. 4. Maja Natić, Dragana Dabić, Dušanka Milojković-Opsenica, Biljana Dojčinović, Goran Roglić, Dragan Manojlović, Živoslav Tešić, Development and validation of a simple thin-layer chromatographic method for the analysis of p-chlorophenol in treated wastewater, J. Serb. Chem. Soc. 77 (11), 2012, 1649-1659. 5. Dragana Dabić, Maja Natić, Zdravko Džambaski, Rade Marković, Dušanka Milojković-Opsenica, Živoslav Tešić, Quantitative structure-retention relationship of new N-substituted 2-alkylidene-4-oxothiazolidines, J. Sep. Sci. 34 (18), 2011, 2397-2404. 6. Dragana Dabić; Maja Natić; Zdravko Džambaski; Milovan Stojanović; Rade Marković; Dušanka Milojković-Opsenica; Živoslav Tešić, Estimation of lipophilicity of N-substituted 2-alkylidene-4-oxothiazolidines by means of reversed-phase thin-layer chromatography, J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 34 (18), 2011, 791-804. 7. Sanja Ilić, Maja Natić, Dragana Dabić, Dušanka Milojković-Opsenica, Živoslav Tešić, 2D TLC Separation of Phenols by Use of RP-18 Silica Plates with Aqueous and Non-Aqueous Mobile Phases, J. Planar Chromatogr. 24 (2), 2011, 93-98. Saopštenja 1. D. Dabić, U. Gašić, M. Natić, T. Ćirković Veličković, Ž. Tešić, The determination of phenolic profiles of Serbian polyfloral honeys, Belgrade Food Intenational Conference: Food, health and well being, Belgrade, Serbia, November 26-28, 2012, Book of abstract, p 89. 2. D. Dabić, A. Pavlović, Chemical composition of different berries harvested in Serbia, First International Conference of Young Chemists of Serbia, Belgrade, Serbia, October 19-20, 2012, Book of abstract, p 18. 3. Silvio Kečkeš, Uroš M. Gašić, Dragana Č. Dabić, Dušanka M. Milojković- Opsenica, Maja M. Natić, and Živoslav Lj. Tešić, Rapid liquid chromatography- hybrid OrbiTrap mass spectrometry studies of polyphenols in Serbian honey, The XXXVth Symposium “Chromatographic Methods of Investigating the Organic Compounds”, Szczyrk, Poland, May 30th - June 1st, 2012, Book of abstracts, p 21. 4. Maja Natić, Dragana Dabić, Aleksandra Lazić, Živoslav Tešić, Determintion of free and total ellagic acid in three different raspberry cultivars grown in Serbia, 5th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis, Prague, Czech republic, November 1-4, 2011, Book of abstract, p 259. 5. D. Dabić, M. Natić, A. Pavlović, Ž. Tešić, Total phenolic content and antioxidant properties of different berries harvested in Serbia, 2nd FCUB ERA Workshop-Food Chemistry and Biotechnology, Belgrade, Serbia, October 18-19, 2011, Book of abstract, p 44. 6. D. Dabić, A. Lazić, U. Gašić, A. Radoičić, M. Natić, Ž. Tešić, Determination of free and total Ellagic acid content in berries grown in Serbia, 16th European Conference on Analytical Chemistry, Belgrade, Serbia, September 11-15, 2011, Book of abstract, CH 06. 7. D. Dabić, M. Vojić, N. Stevanović, M. Aleksić, R. Baošić, Potentiometric determination of dissociation constants of some Schiff base ligands in binary water-organic solvent mixtures, 16th European Conference on Analytical Chemistry, Belgrade, Serbia, September 11-15, 2011, Book of abstract, EC 09. 8. Kečkeš, S., Gašić, U., Dabić, D., Natić, M., Milojković-Opsenica, D., Tešić, Ž., Identification and quantification of antioxidant components of Serbian honeys from various floral sources, 2nd CEFSER (Center of Excellence in food Safety and Emerging Risks) WORKSHOP, Novi Sad, Serbia, September 8-10, 2011, Book of abstracts, p 64. 9. Maja Natić, Jelena Veljkovic, Dragana Dabić, Dušanka Milojković-Opsenica, Biljana Dojčinović, Goran Roglić, Dragan Manojlović, Živoslav Tešić, TLC densitometric investigation of the degradation of 4-chlorophenol using advanced oxidation processes (AOPs), The XXXIIIrd Symposium “Chromatographic Methods of Investigating the Organic Compounds”, Szczyrk, Poland, May 25-27, 2010, Book of abstracts, p 13. 10. Al Hadi M. A. Rabbti, Dragana Č. Dabić, Ivan Vučković, Maja M. Natić, Živoslav Lj. Tešić, Quantitative retention-activity relationships of some natural and synthetic coumarins, 48th Meeting of the Serbian Chemical Society, Novi Sad, Serbia, April 17-18, 2010, Book of abstracts, p 16. 11. Dragana Č. Dabić, Jovana Tatar, Marija Baranac, Rade Marković, Maja M. Natić, Dušanka Milojković-Opsenica and Živoslav Tešić, Salthing-Out Thin Layer Chromatography od Some Pyridinium Salts, The XXXIInd Symposium “Chromatographic Methods of Investigating the Organic Compounds”, Szczyrk, Poland, June 3-5, 2009, Book of abstracts, p 32. 12. Dragana Č. Dabić, Maja M. Natić, Zdravko D. Džambaski, Milovan Stojanović, Rade R. Marković, Dušanka M. Milojković-Opsenica, Živoslav Lj. Tešić, The lipophilicity of some new derivates of 2-alkylidene-4- oxothiazolidines, 47th Meeting of the Serbian Chemical Society, Belgrade, Serbia, March 21, 2009, Book of abstracts, p 13. 13. Dragana Č. Dabić, Maja M. Natić, Dušanka M. Milojković-Opsenica and Živoslav Lj. Tešić, Reversed-phase thin-layer chromatography of some phthalate esters, 6th Aegean Analytical Chemistry Days (ACCD), Denizli, Turkey, October 9-12, 2008, Book of abstracts, p 93. 14. Maja M. Natić, Tomislav B. Tosti, Dragana R. Milić, Dragana Č. Dabić, Dušanka M. Milojković-Opsenica and Živoslav Lj. Tešić, Relationships between structure, retention and antiproliferative activity of some estrogen derivatives, 6th Aegean Analytical Chemistry Days (ACCD), Denizli, Turkey , October 9-12, 2008, Book of abstracts, p 287.