UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSКI FAKULTET Sandra S. Arandjelovic ANALIZA MODALITET А CITOTOKSICNOG DELOV ANJA KOMPLEKSA NA BAZI PLA TINE(II), RUTENIJUMA(III), HROMA(III) 1 RODIJUMA(III) ISPITIV ANJEM NA TUMORSKIM CELIJAMA U KUL TURI -Doktorska disertacija- Beograd, 2006. Уt\ИВЕРЗИТЕ1'СК А f,\46 n ~01 Е Ј( А 'СВЕ t.P МдРК08\о\h оt:.ОГРАА DOKTORSKA DISERTACIJA BIOHEMIJSKIH NAUKA Mentoгj Clanovj komjsjje 1. 2. З . 4. Oatum odbгane: Ргоf. Ог Zjvoslav Tesjc Redovnj ргоfеsог Hemjjskj Fakultet Unjveгzjtet u Beogгadu Ог scj. med. Sjп jsa Radulovjc Naucnj savetnjk Ојгеktог jstгazjvackog sektoгa lnstjtut za Onkologjju ј Radjologjju Sгblje Ргоf. Ог Zjvoslav Tesjc Redovnj ргоfеsог Hemjjskj Fakultet Unjveгzjtet u Beogгadu Ог scj. med. Sjnjsa Radulovjc Naucnj savetnjk Ојгеktог jstгaz jvackog sektoгa lnstjtut za Onkologjju ј Rad jologjju Sгblje Ргоf. Ог Kataгjna Andelkovj6 Redovnj profesoг Hemjjskj Fakultet Unjveгzjtet u Beogгadu Ргоf. Ог Ousan Sladjc Redovnj profesoг Hemjjskj Fakultet Univeгzjtet u Beogгadu INSIПUТE OF ONCOlOGY AND RADIOlOGY Of SERBIA ' NfНIOHAl'. (flNCWII\ESEAACI!.]C(HTER ~ Najvecи zahvalпost za пastaпak ovog rada dиgиjem Prof Or Zivoslavи TeSi6и, kao i Or sci. med. Siпisi Radиlovi6и koji sи rиkovodili eksperimeпtalпim delom ovog rada i svojim zпапјет stavovima i iskиstvom doprjпefj пjegovoj иsреsпој realizacijj. Zahvaijиjem se Prof Dr Katariпj Aпdjelkovj6 ј Prof Dr Оиsапи Sladj6и па saradпji ј korisпim sиgestijama, сјте sи dopriпefj kvafjtetи ove teze. Eksperjmeпtafпj prikazj ovog rada sи игаdјепј и laboratorijj za farmakologijи lпstjtиta za oпkologijи ј radjofogijи Srbije (IORS). Јеdап deo eksperimeпtalпog rada, jzvedeп је па Nacjoпalпom oпkoloskom iпsfjfиtи и Мјfапи, и laboratoriji za farmakologijи, pod meпtorstvom Dr. Рао/е Perego, kojoj takodje dиgиjem vefjkи zahvalпost za savete ј velikodиsпи pomo6. Zahvaijиjem se svjт паиспјm, strиспјт ј tehjckjт saradпjcjma IORS-a i Hemijskog Fakиlteta и Beogradи, koji sи pomogli и паstајапји ovog rada. РоsеЬпи zahvalпost dиgиjem i svojoj porodjcj, Lепј, Pedj ј МјrоiјиЬи koji sи тј prui.ili podrskи, strpijeпje ј mofjvacijи za rad. 9'оолЈ~с~ ~i9'~ ANALIZA MODALITETA CITOTOKSICNOG DELOVANJA KOMPLEKSA Nд BAZI PLATINE(II), RUTENIJUMA(III), HROMA(III) 1 RODIJUMA(III) ISPIТIVANJEM Nд TUMORSKIM CELIJAMA U KULTURI ABSTRAKT Cjlj ove studjje Ьiо је jspjtjvanje potencjjala antjtumorskog dejstva kompleksa metala kao sto su rutenjjum(lll), hrom(lll) ј rodjjum(lll), sa Ьidentatnim f3-diketonato ligandima [(acac)-acetilacetonat ligand, (tfac)-trifluoroacetilacetonat ligand]. Takodje је poredjena aktivnosti ovih kompleksa sa aktivnoscu kompleksa platine cis- 1 trans- izomera dipiridindihloroplatine(ll)(cis-/trans-[Pt(Py)2CI2] , Py=piridjn) ј cjsplatjne. Antjproljferatjvna aktivnost kompleksa ispitivana је na panelu sest celijskjh ljnjja: А2780, Hela, Jurkat, К652, ukljucujucj cjsplatjna-sensjtjvne ј -rezistentne celije osteosarkoma (U2-0S and U2-0S/Pt). Uticaj unutarcelijskog glutationa (GSH) na citotoksicnu aktivnost ispitjvanjh kompleksa pracen је u kojnkubacjonoj studjjj sa butjoninsulfoksiminom (BSO). Protocna citometrija је upotreЬijena za ispjtjvanje apoptoze nakon Anexin V-FITC/PI bojenja kao i za ispjtivanje aktivnosti kaspaze-3. Apoptoza је dodatno pracena morfoloskom analizom celijske smrti na Hela celjjama nakon bojenja sa АО/ EtBr. Potencijal ispitivanjh agenasa da interaguju sa DNK analiziran је koriscenjem masene spektrometrije (ICP-MS), dok је inhjblcija sjnteze nukleinskih kiselina pracena na osnovu jnkorporacije radioaktivno oЬiezenih nukleotida 13C-tjmidin 1 3H-uridin u DNA 1 RNA. Antimetastatska aktivnost kompleksa pracena је na osnovu inhjblcjje aktjvnostj metaloproteinaza ММР-2 ј ММР-9, pomocu ELISA kjta. Rezultatj studjje cjtotoksicnostj ukazuju da је aktivnost Ru(tfac)3 jzrazena kao IC50 vrednost, na celjjama osteosarkoma, cisplatina-senzjtjvnom soju (U2-0S) IC50 = 39,25 ± 10,45 11М i cisplatina -rezistentnom soju (U2-0S/Pt) 37,75 ± 13,65 11М , priЬiizna aktivnostj na А2780 celijama. Citotoksicnost Ru(acac)3 se krece u opsegu jznad 1 ОО 11М, dok kompleksi hroma ј rodjjuma nemaju antjtumorsku aktivnost. Trans-[Pt(Py)2CI2] је pokazao antiproliferativnu aktivnost znacajno vecu u poredjenju sa cis- izomerom i skoгo priЬiiznu cjsplatini na ispitivanim celijskim linijama. Analiza celijskog ciklusa i apoptoze otkriva da Ru(tfac)3 jndukuje apoptozu na А2780 celijama do 40% i uzrokuje zastoj u S fazj celjjskog ciklusa kao ј opadanje broja celija u G1 ј G2. Ru(acac)3 takodje indukuje apoptozu do 10% na dvema celjjskim linijama А2780 (48 h dejstva) ј Hel a (72 h dejstva) mada је indukcija aktjvnosti kaspaze-3 (па Hela) slaba u poredjenju sa cisplatjnom. Trans-[Pt(Py)2CI2] poseduje kapacitet indukcije kaspaza-3-zavisne apoptoze, u stepenu slicnom cisplatinj i vecem od svog cis- izomera . lspitivanja jnterakcije ne-platinskih kompleksa sa DNK/RNK otkrjvaju da se jedino Cr(lll ) djrektno vezuje za DNK, dok derjvati Ru(lll) i Cr( l ll) , posebno Ru(tfac)3 poseduju snazan potencijal inhiblcije sjnteze DNK ј RNK. Ru(acac)3 pokazuje kapacjtet jnhjblcjje metaloprotejnaza ММР-2 i ММР-9. Na osnovu dobljenih rezultata , kompleksi rutenijuma(lll) poseduju antimetastatski potencjjal i osoblnu jndukcije apoptoze sto predstavlja znacajnu racionalnu osnovu za dalja jspjtivanja antitumorskog dejstva jedinjenja na bazi ruten ijuma(\11). Kljucne reci: trans-platina(ll) , rutenijum(lll), hrom(lll) , f3-djketonato, pjrjdjn, apoptoza, kaspaza-3, DNK-vezivanje, metaloproteinaze (ММР-2 , ММР-9) . MECHANISMS OF ANTITUMOR ACTION OF NOVEL METAL COMPLEXES OF Ru(lll), Cr(lll), Rh(ll l) дND Pt(ll) ON SEVERAL CELL LINES INCLUDING CISPLATIN-SENSITIVE /-RESISTANT VARIANT ABSTRACT The aim of this study was to investigate cellular response to several ruthenium(ll l), chromium(lll) and rhodium(lll) compounds carrying Ьidentate 13-diketonato ligands: [(acac)-acetylacetonato ligand, (tfac)-trifluoroacetylacetonato ligand]. ln addition activity of cis-1 trans- isomer pair of dipyridinedichloroplatinum(ll) , was analyzed in comparison to cisplatin. Cell sensitivity study was performed on а panel of several cell lines: А2780 , cisplatin-sensitive and -resistant osteosarcoma U2-0S and U2-0S/Pt, human cervix carcinoma (Hela) and mouse melanoma (816}, К562 and Jurkat, using growth inhibltion assay. Effect of intracellular GSH depletion on cell sensitivity to the agent's action was analyzed in co-incubation study with buthionine sulfoximine (BSO). Flow cytometry was used to assess apoptosis Ьу Annexin V-FITC/ Pl douЫe staining, and to analyze induction of caspase-3 activity using anti-active caspase-3 staining. ln addition, apoptosis was monitored Ьу fluorescence microscopy after АО/ ЕtВг staining. Agent DNA Ьinding/damaging affinity was determined Ьу inductively coupled mass spectrometry, while inhibltion of incorporation of radioactively labeled nucleotides 13C-thimidine 1 3H-uridine into DNA 1 RNA was analyzed using Liquid Scintillation Counter. Antimetastatic potential of ruthenium(lll) compounds was tested using ELISA kit for detection of metalloproteinases, ММР-2 and ММР-9. Results of the cytotoxicity study showed that the pattern of sensitivity to Ru(tfac}3 complex of the two CDDP -sensitive/-resistant osteosarcoma cell lines was similar to that of А2780 cells (72 h exposure}, with IC50 being 39,25 ± 10,45 џМ (in U2-0S) and 37,75 ± 13,65 џМ (in U2-0S/Pt). Cytotoxicity of Ru(acac}3 ranged over 100 џМ, while Cr(lll) and Rh(lll) complexes were completely devoid of antitumor action in vitro. Trans-[Pt(Py)2CI2] showed activity profile similar to cisplatin and four-fold better in comparison to its cis- izomer on all tested cell lines. However, trans- compound did not overcome cisplatin resistance in U2-0S/Pt cells. Ru(tfac)3 exhiblted strong potential for apoptosis induction as tested on А2780 cells, up to 40%, for 48 h of drug exposure and caused decrease of the percent of G1 and G2 cells. Ru(acac}3 induced apoptosis higher than 10% on two celllines А2780 (48 h action) and Hela (72 h action) whereas content of active caspase-3 was moderate in comparison to those induced Ьу CDDP. Trans-[Pt(Py)2CI2] possess higher capacity for caspase-3-dependent apoptosis induction in comparison to cis- isomer. DNA Ьinding study revealed that only Сг(асас}3 was сараЫе of Ьinding DNA, while Cr(lll) and Ru(lll) compounds, especially Ru(tfac)3 possess potential to inhiblt RNA and DNA synthesis at 100 џМ . Ru(acac)3 showed slight abllity to inhiblt ММР-2 and ММР-9 activity. Among the non-platinum compounds, only Ru(lll) complexes showed potential for antitumor action and differed in their mode of cytotoxic activity according to the different nature of their 13- diketonato ligands. Capabllity of Ru(tfac)3 to induce apoptosis, as well as antimetastatic potential of Ru(acac)3, provide а rational to investigate ruthenium based compounds as а sensitizer of tumor cells in comblnation therapy. These findings support the interest of Ru(lll) complexes among the novel tested metal-complexes as promising compounds endowed with potential antitumor action. Кеу words: trans-platinum(ll), ruthenium(lll), chromium(lll) , 13-diketonato, pyridine, apoptosis, caspase-3, DNA-Ьinding, metalloproteinases (ММР-2 and ММР-9) . SKRACENICE BBR3464- HMGB1- NER - MMR - sos- ЕСМ- MMPs- HER2- IL-2- NIН-ЗТЗ- L 1210- AIF- PARP- RPMI-1640- McCoy's- DMSO- РЕ- PBS- FCS- FBS- ВА- Cl- GSH- BSO- ICP-MS- trinuklearni trans-kompleks platine(ll) protein iz familijeHMG proteina, koji poseduju (eng. High Mobllity Group)-domen (eng. Nucleotide Excision Repair) proteini sistema nukleotidne reparacije DNK (eng. Mismatch Repair) proteini sistema za reparaciju pogresno sparenih baza DNK proteini SOS sistema (aktiviraju se u sluёaju velikih lezija па DNK) (eng. Extra Cellular Matrix) vancelijski matriks. (eng. Matrix Metalloproteinases) metaloproteinaze vancelijskog matriksa receptor za epidermalni faktor rasta 1 nterleukin-2 celijska linija misjeg karcinoma celijska linija misje leukemije limfocita (eng. Apoptosis inducing factor) faktor aktivacije apoptoze (eng. Poly ADP-ribose polymerase) enzim poliadenil-dinukleotidfosfat-riЬozo polimeraza (eng. Roswe/1 Park Memorial lnstitute) hranljivi medijum hranljivi medijum dimetilsulfoksid (eng. Phycoerythrin) Fikoeritrin (eng. Phosphate buffer saline) fosfatni pufer koji sadГZi NaCI, рН 7.2. (eng. Fetal calf serum) fetalni govedji serum (eng. Fetal bovine serum) fetalni govedji serum (eng. Bovine Albumine) govedji albumin (eng. Comblnation index) komblnacioni indeks glutation (Giutamil-cisteinil-g licin) butionin-sulfoksimin (eng. lnductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) induktivna kuplovana masena spektrometrija) AAS- atomska apsorpciona spektrometrija Triton-X-1 ОО polietilen-glikol-mono [4-(1, 1,3,3-tet rametilbutil)fenil]etar Pl - propidijum-jodid FITC- (eng. Fluorescein isothiocyanate) fluoresceinizotiocijanat АО - akridin-oranz EtBr- etidijum-bromid SADRZAJ 1. UVOD ....................................................................................... 1 ~- ЈГf:О~/~~~1 Dl:O ............................................. ........................ ~ 2. 1. ANТITUMORSКI POTENCIJAL TRANS-KOMPLEKSA PLA Т/NЕ(/1) ....... ................... 5 2. /. /. DNK-interakcija bioloski neaktivne transplatine u poreilenju sa cisplatinom ............. 5 2. /. 2. Prevazi/aienje dogme о bloloskoj inertnosti transp/atinskih komp/eksa ....... ... ........... 8 2. /. З. Trans-p/atina(/1) kompeksi sa p/anarnim amino ligandima .......................... ............ 10 2. /. 4. Mehanizam citotoks icnog dejstva trans-p/atinskih komp/eksa ................................... /5 2. Ј. 4. / . Trans-p/atina(/1) -DNK-lezije i р53 ......... ............ ........... ................................................. 15 2. / . 4. 2. Celijski meћanizmi =а reparaciju lrans-platina-DNK adukata ....................................... /6 2.1..1.2.1. Familija HMG-domen proteina (Нigll Alobllity G1·oup) ........................................... 17 2. / .4.2.2. Uloga sistema nukleotidna reparacija- NER(Nucleotide Excision Repair) 11 popravci cis-ltrans-Pt{IJ)- DNA adukata ............................................................ 18 2. / . ./.2.3. Uloga MMR sistema (MMR-Mismatcll repair) 11 popravci cis-ltrans-platina-DNA adukata ............................................................. 18 2. 2. ANТITUMORSКI POTENCIJAL KOMPLEKSA NA BAZI RUTENIJUMA(III), HROMA(/11) Ј ROD/JUMA(/11) ............................................ ............................................ 19 2. 2. Ј . Komp/eksi Rutenijuma: p1·imena и blomedicini ....... .......... ............ ......... ................... /9 2. 2. 2. Kompleksi rutenijuma- potencijal antitumO!'skog dqjstva .......... ........... ................... 20 2. 2. 2. 1. Komp/eksi Rutenijuma(ll) ...................................... ............ ........... ...... ............. 24 2. 2. 2. 2. Komp/eksi Rutenijuma(J/1) ......... .. .. ......................... .. ....................................... 26 2. 2. 2. З. Kompleksi Ru(/11) sa antimetas/atskim potencijalom: NA M/1 NAM!-A .......... 27 2. З. MEHANIZAM METASTAZIRANJA 1/NVAZIJE TUMORA .................................. ........ 29 2. З. 1. Migracija tumorskih celija ........................ ............ .... ......... .. ........... ......... .. ................ ЗO 2. з. 2. P,·oces invazije tumorskih ce/ija ............. .. ............ .. ...................................... .. ........... З/ 2. З. З. Metalopt·oteinaze matriksa (MMPs- matrix metalloproteinases) ............ .. .. .............. З/ 2. З. 4. Genetska t·egulacija procesa metastaziranja ...................... ....................................... З4 2. 4. КASPAZE - ULOGA И APOPTOZI ...................................................... ....................... 34 З. МА TERIJAL 1 METODE ............................ ........................... 37 З. 1. HEMIJSKA STRиKTиRA JSPJТIVANJH KOMPLEKSA .............................................. ЗВ З. 2. SASTA V HRANLJIVOG МЕDЈЈиМА RPMI 1640 ........................................................ 40 З. 2. /. Neorganske soli ...................................................... ................................................... 40 З. 2. 2. Aminokiseline ............................................................................................................. 40 З. 2. З. Vitamini ....................... ................. ........... ................................................................... 41 З. 2. 4. Ostale komponente ....................... .............................................................................. 41 З. З. SASTA V McCOY'S 5А MEDIJиMA (MOD/FIKOVANOG) ......................................... 42 З. З. 1. Neo1·ganske soli ......................................................................................................... 42 З. З. 2. Aminokiseline ................................ ................... .......................... ............................... . 42 З. З. З. Vitamini ................................................................................................................. .. .. . 4З З. З. 4. Ostale komponente ............... ....... ... ................. .................................................... ...... 4З З. 4. PRIPREMA HRANLJ/VOG MEDIJиMA ....................................................................... 44 З. 5. КиLТиRЕ CELIJA ........................................................................................................ 44 З. 5. Ј . Celije tumora epilela g1·lica materice (HeLa) ........................ ... ................................. 44 З. 5. 2. Ce/ije humanog karcinoma ovarijuma (А2780) ....... ......................... ... ...................... 45 З. 5. З. Ce/ije misjeg melanoma (В/6- V) ........................................................................ ....... 45 З. 5. 4. Maligne celije hronicne mijeloidne leukemije (К562) ............................................... 45 З. 5. 5. Celije leukemije humanih Т limfoЬ!asta (Jurkat) ....................................................... 45 З. 5. 6. Celije hшnanog osteosш·koma (U2-0S) .................................................................... 46 З. 5. 7. Cisplatina rezistentni soj celija humanog osteosarkoma (U2-0S 1 Pt) ...................... 46 З. б. РОSТиРАК ODRZA VANJA CEL/JA и KиLTиRI ...................................................... 46 З. 6. 1. Postupak pasai.iranja celija ............................................... ........................................ 47 З. 5. 2. Kinetika rasta ce/ija ................................................................................................... 47 З. 6. З. Hemocitometar ............................. .............................................................................. 47 З. 5. 4. P,·otokol za odretlivanje broja celija. ......................................................................... 47 З. 6. 5. Odretlivanje viabllnosti HeLa celija ................................................................... ....... 48 З. 7. /SPITIVANJE CITOTOKSICNOSТI TESТIRANIH KOMPLEKSA ............................... 49 З. 7. / . Postupak izvotlenja МТТ testa . .................................................................................. 49 З. 7. /. 1. Formi1·anje kalihracione krive za МТТ ............................................................................ 50 З. 7. / . 2. Ob1·ada podataka ............................................................................................................. 50 З. 7. 2. Test inћiЬicije rasta. ......................... ... ............ ............. .... ...................................... .... 52 З. 7. З. lspilivanje komblnovanog citotoksicnog dejstva kompleksa Ru(acac)з i cisplaiine ili oksaliplatine, па HeLa celijama ............................................................ 52 З. 7. З. 1. Postupak koinkubacije Ru(acac) 3 sa cisplatinom odnosno oksalip/alinom .................... 52 З. 7. З. 2. Statisticka obrada podataka ............................................................................................. 53 З. 8. AFINITET INTERAKC/JE NEPLAТINSКIH KOMPLEKSA SA GLиTATIONOM ....... 54 З. 8. /. Postupak odretlivanja glutationa metodom ро Тietz-u .............................................. 54 З. 8. /. / . Standardna Ю·iva .............................................................................................................. 55 З. 8. 2. Postupak ispitivanje uticaja butioninsu/foksimina (BSO) па citotoksiёno dejstvo agenasa ...................................................................................................................... 56 З. 9. ODREE>IVANJE INKORPORACIJE RADIOAKТIVNO OBELEZENIH NиKLEOTIDA и DNКIRNK ................................................................................................................... 56 З. 9. /. Priprema и=oraka ...................................................................................................... 56 З. 10. ANALIZA INTERAKCIJE /SPIТIVANIH AGENA SA SA DNK ................................... 57 З. 10. /. lzolacija celijske DNK metodom ро Maniatis-u ..................................................... 58 З. 10. 2. lspitivanje inlerakcije lestiranih kompleksa sa DNK in ''ilro ................................. 60 З. 10. 2. Ј. Procedura za i=olaciju plazmidne DNK ......................................................................... 60 З. 11. ODREEJIVANJE UNUTARCEL/JSKE AKUMULACIJE PLAТINE METODOM ATOMSKE APSORPCJONE SPEKTROFOTOMETRIJE (AAS) ........ ....................... 61 З. ЈЈ. Ј. Postupak j;Jaganja HeLa ceJija citotoksjcпjт рЈаtјпа(/1) аgепsјта ...................... 6Ј З. ЈЈ. 2. Prjprema kalibracjoпe krive za AAS ..................................................... .................. 62 З. ЈЈ. З. Postupak anaJjze jпtraceJijskog sadrzaja рЈаtјпе metodom AAS ............................ 62 З. Ј Ј. 4. Kvaпtjtativno odretlivanje protejпa и jspitivaпjт uzorcima ................................... 6З З. 12. KVALITA ТIVNA 1 KVANТITA ТIVNA ANALIZA MATR/KS METALOPROTEINAZA (ММР-2 1 ММР-9) ......................................................................................................... 64 З. Ј 2. Ј . Pl'iprema uzoraka ....................................................................... ............................. 64 З. Ј 2. 2. P1·ocedum za od1·edivanje humanih meraloprotejпaza ММР-2 ј ММР-9 и supen?alantu celija ................... .. ..... .. ............ .. ............. ......... .. ............ . ················· 64 З. Ј 2. З. Sad1·iaj kita za od,·etlivanje humanih metalop1·otejпaza ММР-2 ј ММР-9 ............ 65 З. 1З. ANALIZA CELIJSKOG CIKLUSA 1 APOPTOZE METODOM NA PROTOCNOM C/TOMETRU ............................................................................................................... 66 З. Ј З. Ј. Postupak jпkubacije А2780 celija sa jspitivanim komp!eksima meta!a t·utenijuma(!/1), hroma(ll/) i rodijuma(JJ!) ... .......... ............ ..................................... 66 З. Ј З. / . /. Postupak Ьојепја А2780 celija sa propidijum-jodidom (Р!) za anali:m apoptoze .......... 66 З. Ј З. /. 2. Postupak bojenja А2780 celija sa propidijшn-jodidom (Р!) :а anali:u ce/ijskog ciklusa ....................... ............................................................... ... .. ....... ....... .. .. 67 З. 1 З. 2. Posшpak inkubacije HeLa celija sa ispitivanim komp!eksima platine(/1) i rutenijuma(JJJ) ..... .................................. ............. ..................................................... 67 З. 1 З. /. /. Postupak bojenja HeLa celija sa propidijum-jodidom (Р Ј) za anali:u ce/ijskog ciklusa ....................... ...................................................................................... 68 З. ЈЗ. З. Statisticka obrada podataka ..................................................................................... 68 З. 14. ANALIZA APOPTOZE METODOM NA PROTOCNOM CITOMETRU PRIMENOM BOJENJA SA ANEKSIN V-FITC/PI ........................................................................... 69 З. Ј4. Ј. Sadriaj kita za odredivanje apoptoze Ьојепјет ceJija sa Anexin V-FIТC/Pl ......... 69 З. 14. 2. Postupak inkubacije celija sa ispitivanim kompleksima p/atine(ll) ј rutenijuma(/11) . ........................................... ................................................. ............ 70 З. Ј 4. З. Protokol za bojenje celija ................................................................................ .. ...... 70 З. 15. ODREEJIVANJE AKТIVNOSТI ENZIMA KASPAZA-З NA HELA CELIJAMA PRIMENOM PROTOCNE C/TOMETR/JE .................................................................. 71 З. Ј5. Ј. Sadri aj kjta za odretlivanje apoptoze detekcijom aktjvпe kaspaze-З ........ .............. 7Ј З. Ј5. 2. Postupak inkubacije ce/ija sa jspitivanim kompleksima platine(JJ) i rutenijuma(JJJ) ....... ............................... ..... ........... ....................... .............. .............. 72 З. Ј 5. З. Protokol za bojenje celija ................... ..... .............. .......... ............ .. .............. ............ 72 З. 16. MORFOLOSKA ANALIZA CELJJSKE SMRТI POMOCU FLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE ...... ............................. ...................................................................... 7З З. Ј 6. Ј . Postupak pripreme preparata celija, za analizu jluorescentnim mikroskopom ....... 7З З. 17. LABORATOR/JSК//NSTRUMENТ/1 HEMIКALIJE ....................... ........................... 75 З. Ј7. Ј. Laboratorijski aparati korisceni и ovom radu ......................................................... 75 З. Ј 7. 2. HemikaJije koriscene и ovom radu ..................................... ...................................... 76 4. REZUL Т А ТЈ ............................................................................ ............ 78 4. 1. C/TOTOKS/CNOST TESТIRANIH KOMPLEKSA ........................................................ 79 4. Ј. Ј. Aktivnost neplatinskih kompleksa .............................................................................. 79 4. Ј. 2. Aktivnost platinskih kompleksa .. ................................................................................ 8Ј 4. Ј. З. Odretlivanje glllfationa metodom ро Tietz-u .............................................................. 86 4. 1.4. Efekat smanjenja koncentracije jпtracelijskog glutationa (GSH) па citotoksicnost testiranih kompleksa .............................. .................................................................... 87 4. 1. 5. Koinkubacija Ru(acac)3 sa cisplatinom i oksaliplatinom .......................................... 91 4. 2. REZULTA Т/ ANAL/ZE APOPTOZE 1 CEL/JSKOG CIKLUSA KOR/SCENJEM PROTOCNOG CITOMETRA ......................... ................................................................ 94 4. 2. 1. Rezultati analize apoptoze i celijskog ciklusa kompleksa J"utenijuma(/11), hroma (111) i rodijuma(/11) . ................................ ................................................. ........................................ 94 4. 2. 2. Rezultati analize apoptoze ј celijskog ciklusa kompleksa pfatine(IJ) . ........................ 97 4. З. INTERAKCIJA KOMPLEKSA Ru(/11), Cr (1/1) i Rh(/11) SA DNK .................................. 99 4. З. /. Dj,·ektno vezivanje kompleksa metala za DNK ............................. ............................. 99 4. З. 2. Uticaj kompleksa rutenijuma(Ill), lu·oma (111) ј rodijuma(ll/) па jпhiblciju sinteze DNK iRNK . ........................................................................... ................................... 100 -1. З. 2. Ј . lnlliblcija sinteze DNK .......... ......................................................................................... 100 -1. З. 2. 2. lnlliblcija sinte=e RNK .................... ................................................................................ ЈОЈ 4. З. З. Unutarcelijska akumulacija kompleksa platine{ll} .................................................. 103 4. 4. METALOPROTEINAZA (ММР-21 ММР-9) IMUNOTEST ............................... ........... 103 4. 5. ISPITIVANJE APOTOZE PRIMENOM ANEKSJN V-FITC/PI KONJUGOVANOG ANTITELA ................................................................................... 104 4. б. ODREE>IVANJE AKТIVNOSТI КASPAZE-3 PRIMENOM PROTOCNE CJTOMETRIJE ............................................................................................................. 109 4. 7. REZULTATI MORFOLOSKE ANALIZE CELIJSKE SMRТI ............................ .. .. ...... 113 5. DISKUSIJA ......................................................................... 116 v 6. ZAKLJUCAK ...................................................................... 125 ~~JF'~~~J"\f~~ ................................................................... ................... Jr~j7 Dokt01·ska disel"/acija - U\·od 1. UVOD Neutralnj platjnskj koordjnacjonj kompleks cis-djammjndjhloroplatjna(ll), cis-DDP (CDDP), је prvo neorgansko jedjnjenje prjmenjeno u hemjoterapjjj tumora. Antjtumorska akjvnost ovog kompleksa otkrjvena је slucajno 1960, zahvaljujucj jstrazjvanjjma Barnet Rosenberg-a, profesora Ьiofizjke na drzavnom unjverzjtetu u Mjcjgenu, SAD (1 , 2). Od 1972. godjne cjsplatjna se prjmenjuje u klinjckoj praksi , ј jedan је od najefektjvnjjjh hemioterapijskih agenasa u lecenju tumora testjsa, jajnjka, pluca, glave, vrata ј besike. Otkrice antjtumorske aktjvnostj cjsplatine, podstaklo је sjntezu ј jspjtjvanja antjtumorskog potencijala hiljada analoga cjsplatjne, u potrazj za agensom koji Ьi imao јасе antitumorsko dejstvo ј manje jzгazene toksicne efekte. Poznato је da hemioterapija cjsplatjnom nije potpuno zadovoljavajuca, usled vise faktora, kao sto su: neselektivno dejstvo agensa, toksjcnost za zdrava tkiva, mutageno dejstvo agensa i рге svega rezjstencjje tumorskih celija na cjtotoksicno delovanje. Ojrektni strukturnj analozj, sintetisani jzmenom odlazecjh ljganada (hlorjda) ili statjcnjh ljganada (amjna) nisu imali Ьitno jzmenjen aspekat antjtumorske aktivnosti u poredenju sa cisplatjnom. Karboplatjna, cis-diammin-(1 , 1-cjklobutandikarboksilato )platina( ll), prjpada drugoj generaciji platinskih antitumorskih agenasa kojj nalaze prjmenu u kl jnjckoj praksj (3). Karboplatjna је ро hemijskoj strukturi analog cjsplatjne i spektar antjtumorskog dejstva se ne razlikuje Ьitno u poredenju sa cjsplatjnom. Karboplatina pokazuje unakrsnu rezjstenciju sa cisplatjnom, ali jma manje izrazenu toksicnost na bubrege ј nervnj sjstem. Oksaliplatjna, (SP-4-2)-[(1 R,2R)-cjkloheksan-1 ,2-djamjn-kN, kN1 [etandjoato(2-)- k01, k02] platjna(ll) , (EioxatjnR), gde su za atom platjne(ll) vezane Ьidentatne grupe 1 ,2-djamjnocjkloheksan (DACH) kao ј oksalatna grupa u cis- orjjentacjjj , prjpada trecoj generaciji analoga cjsplatine (4). Pokazano је da in vitro ј in vivo oksaljplatina ima sinergjstjcko dejstvo u komblnacjji sa 5-fluorouracjlom, ра se od 90-tjh godjna u komblnaciji sa 5-fluorouracilom primenjuje u hemioterapijj humanog karcjnoma kolona (5). Oksaljplatjn pokazuje in vitro ј in vivo aktivnost prema cisplatina-rezistentnjm celijama (6). Dokto,·ska dise,·tacija Uvod Medutjm ј u slucaju oksaljplatjne postoje ljmjtjrajucj faktorj za prjmenu u hemjoterapijj tumora, kojj se ogledaju pre svega u toksjcnostj na nervnj sjstem. Ogranjcenja koja su se javjla prj hemjoterapeutskoj prjmenj cisplatjne ј analoga, ali jsto tako i mogucnost da se strukturnjm izmenama kompleksa platjne utjce na profjl antitumorske aktivnosti, podstakli su dalja jstrazjvanja i prosirili potragu za efikasnjm antitumorskim agensom na siroko polje kompleksa metala. U poglavlju 2. 1. detaljnije је opisan istorijat sinteze trans-platinskjh kompleksa, kao i mehanjzam dejstva do sada poznatjh analoga transplatine sa potencjjalom antjtumorskog dejstva. Posebno је razmatrana aktjvnost trans-Pt(ll) derivata sa planarnjm aromatjcnjm ljgandjma. U protekle dve dekade, sjntetjsan је ј jspitan veljkj Ьгоја kompleksa prelaznih metala kao sto su: rutenijum (Ru), hrom (Cr), rodijum (Rh) itd. U poglavlju 2. 2. dat је prikaz potencijala anitutmorske aktjvnosti kompleksa ovjh metala, sa posebnim naglaskom na jedinjenjima rutenijuma sa antjmetastatskim dejstvom, kao sto su NAMI i NAMI-A (7). Uloga matriksnih metaloprotejnaza kao terapeutskih markera u kontrolj procesa invazije i metastaze tumorskih celjja, opisana је u poglavlju 2. З. Kako је glavnj cjlj delovanja antitumorskih agenasa zapravo uvodenje maligne celije u apoptozu, ucesce kaspaza u mehanizmu aktivacije apoptoze opisano је u poglavlju 2. 4. s obzirom na postojanje sirokog potencijala antitumorskog dejstva nestandardnjh kompleksa metala kao sto su trans- izomerj platjne ј derivatj prelaznjh metala, cjlj ovog rada Ьiо је poredenje aktivnosti cjsplatine sa aktivnoscu cis-/trans- geometrijskih izomera djpjrjdjndjhloroplatjne(ll), [Pt(Py)2CI2] 13-djketonato kompleksa prelaznih metala: rutenijuma(lll), hroma(ll l) i rodijuma(l l l). Sinteza ј struktura 13-diketonato kompleksa ispitjvanih u ovom radu, vec је opisana u ljteraturi (8). Na osnovu postojecjh ljteraturnih podataka koji ukazuju da neki Ьidentatni /3-diketonato kompleksi Ru(II)/Ru(lll) mogu posedovati vecu antiproliferativnu aktivnost od monohelata (9), preduzeli smo uporednu analizu Ьidentatnih 13-diketonato kompleksa, tako da se jzmenom strukture liganda: (tfac), (асас); ili centralnog metalnog jona: Ru(lll) , Cr(lll) , Rh(lll) i uporednom analizom citotoksjcne aktivnosti kompleksa moze stecj bolji uvid u mehanizam njihovog antitumorskog dejstva. 2 Doktorska disertacija Uvod Poseban naglasak Ьiо је na ispitivanju aktivnosti ovih jedinjenja na cisplatina-rezistentnim celijama humanog osteosarkoma U2-0S/Pt. Alternativni kompleksi metala sa drugacijim modalitetima vezivanja za celijsku DNK ili razlicitim mehanizmima indukcije apoptoze, u poredenju sa cisplatinom , pruzaju mogucnost prevazilazenja rezistencije tumorskih celija na cis-DDP i postavljanja novih racionalnih principa u dizajniranju efikasnog antitumorskog agensa. з Doktorska dise,·tacija-Teorijski deo 2. TEORIJSKI DEO 4 Doktorska disertacija-Teorijski deo 2. 1. ANTITUMORSKI POTENCIJAL TRANS-KOMPLEKSA PLATINE(II) 2. 1. 1. DNK-INTERAKCIJA 8/0LOSК/ NEAKТIVNE TRANSPLA ТINE U POREEJENJU SA C/SPLAТINOM Kako је DNK molekul glavna "meta" citotoksicnog dejstva platinskih kompleksa (1 О, 11 ), razlika u Ьio loskoj aktivnosti dva izomera, cisplatine i transplatine (SI. 2. 1.1.а .) је posledica razlicitih lezija koje formiraju na DNK, tj . razlicitih DNK-adukata (12). Cl N H 3 " Pt/ H 3 N / "-cl а) Ь) Sl. 2. 1. 1.а. Strukture kompleksa а) cisplatiпe; Ь) traпsp/atiпe. ОЬа izomera se vezuju za DNK u dva koraka, formirajuci najpre vezu sa N-7 polozajem guanina (13), а zatim sledi zatvaranje adukta formiranjem veze sa susednom bazom (sto је najcesce guanin ili adenin) na istom lancu ili naspramnom lancu DNK (SI. 2.1 . 1 . Ь . ). Sl. 2. 1 . 1.Ь. 1, 2-iпtra/aпcaпi adukt cisplatiпe sa susedпim guaпiп bazama 1, 2-d(GpG); јоп platiпe(/1) (zeleпa kuglica) formira vezu sa azotom (plava kuglica) и poloiaju N-7 па ostacima susedпih guaпiпa, па d(CpGpG) sekveпciji (1). 5 Doktorska disenacija-Teot·ijski deo Kinetika ove rekacije zavisi od prirode "staticnog" i "odlazeceg" liganda kompleksa platine, kao i od prisustva molekula koji ulaze u kompeticiju za intarakciju sa N-7 polozajem guanina (npr. unutarcelijski glutation) (14). Najbrojniji DNK-adukti koje formira cisplatina su 1 ,2-intralancani adukti izmedu susednih baza guanina 1, 2-d(GpG), koji cine 70% svih lezija na DNK indukovanih cisplatinom (SI. 2.1 . 1 . с . ) (15); 20% cine intralancani adukti d(ApG), а svega 5% cine interlancani adukti (SI. 2.1.1.с.). Jos uvek nije poznto koji tip adukata је najvise odgovoran za citotoksicno dejstvo cisplatine (16). trans-lzomer, medjutim, ne moze da formira 1,2- intralancane adukte zbog sternih smetnji usled geometrije kompleksa. Ucestalost trans-Pt-DNK-adukata је sledeca: 50% trans-[Pt(NHз)2{d(GMP)}-{d(CMP)}], 40% trans-[Pt(NH3)2{d(GMP)2}] 10% trans- (Pt(NH3)2{d(GMP)}-{d(AMP)}] (17). х " (r.t) H3N-Pt-/ NH3 (Ь) @ " (с) H3N-Pt-c / NH3 (d) (е) Slika 2.1.1.с. Cisplatina-DNK adukti: а) monodentantna veza sa guaninom (ligand Х moze Ьiti hlorid ili hidroksilna grupa); Ь) interlancana veza; с) cisplatina-guanin protein veza; d) 1,2-(GpG)- intra/ancana veza; е) 1,3-(GpG)-intra/ancana veza (N-predstav/ja bazu); f) 1,2-d(ApG)- intra/ancana veza. 6 Doktorska disertacija-Teorijski deo Tako su пајЬгојпiјi adukti koje form jгa trans-platjпa zapravo 1 , 3-iпtralaпcaпi ј iпterlaпcaпj aduktj jzmedu komplemeпtaгпjh baza guaпiп (Gua) ј citoziп (Cyt). Traпsplatjпa formjгa uglavпom moпodeпtatпe adukte, jпterag uj ucj uglavпom sa N-7 polozajem guапјпа, а nastalj aduktj se veoma sporo (zbog sterпjh smetпjj usled trans- jzomeгjje) prevode u bldeпtatпe , za vreme t112 > 11 h. Као posledjca formjraпja adukata javlja se koпformacjoпj poremecaj DNK heljksa, prj cemu cis- ј trans- jzomerj jпdukuju razljcjte promeпa koпformacjje tj . razlj(:jte ргоmепе entalpjje ј епtгорјје sjstema (18). Tako 1 ,2-јпtгаlапсапј cis-DDP-DNK adukt, jпdukuje zakrjvljeпje dvostrukog heljksa prema veljkoj brazdi, za 60° u odпosu па osu heljksa ј narusava stekjпg j пterakcjje baza kao ј komplemeпtarno vezjvaпje dva lапса DNK па mestu formjгaпja adukta (17). Nasuprot tome, aduktj koje fогmјга traпsplatiпa , 1,3- јпtгаlапсапi d(GpTpG) iпdukuju veoma slabo zakrivljeпje dvostrukog heliksa, za svega 20°-24° (SI. 2.1.1.d.} Те zпасајпе strukturпe razlike jzmedju adukata koje formiraju dva stereoizomera, imaju za posledjcu i razlicito prepozпavaпje ili popravku пastalih lezjja, ра tako ј razlicjtu blolosku aktjvпost cis- ј trans- platine. S/. 2.1. 1.d. Trodimenzionalna struktura DNK-Pt(l/)-1,3-intra/ancanog adukta. Uocava se Ыаgо zakrivljenje ONK he/iksa и odnosu па osu heliksa, uzrokovano vezivanjem trans- dinuklearnog kompleksa p/atine(/1) (p/atina(/1) -zelene kuglice; fosfor-DNK -iute kuglice). trans-Pt(/1) kompleks formira vezu izmeau ostataka guanina па sekvenci d(GpTpG) (1). 7 Doktorska disertacija-Teorijski deo 2. 1. 2. PREVAZILAZENJE DOGME О BIOLOSKOJ INERTNOSТI TRANS-PLAТINSIOH KOMPLEKSA Za razljku od cjsplatjne, trans- strukturnj jzomer, transplatjna, ne pokazuje Ьiolosku aktjvnost. Od otkrjca cjsplatjne, velikj broj studjja jmao је za сјј da ustanovj vezu jzmedju strukture kompleksa ј antjtumorskog potencjjala kompleksa platjne. Na osnovu prvjh studjja poredenja strukture ј aktjvnostj doslo se do sledecjh postavkj koje su smatrane Ьitn jm za racjonalno djzajnjгanje cjtotokjscnjh kompleksa platine (19): о kompleks mora Ьitj elektricnj neutralan, о trans- jzomeгj kompleksa platjne su Ьioloski neaktjvnj. Ove postavke jspostavjle su se kao netacne. Dugo se verovalo da trans- jzomerj kompleksa platjne generalno ne mogu jmatj Ьiolosku aktjvnost. 1980, godjne Farel i kolege (Farrel et а/.) (20, 21) su pokazali da trans- jzomeri kompleksa platjne sa planarnim aromaticпjm ligandom, mogu jmatj in vivo antjtumorsku aktjvnost ј vecu in vitro citotokiscnost u odnosu па postojece cis- jzomere. Zatjm su usledjlj rezultatj Kolucijjne grupe (Collucia et а/.), kojjm је potvrdena antjtumorska aktjvпost trans- jzomera platiпe sa statjcпjm jmjпoetarskjm ljgaпdom (22). U skorije vreme Navaro-Ranjnger ј saradпjcj (Navarro-Runnjnger et а/. ) pokazalj su da trans- platjпskj kompleksj sa asjmetrjcnim alifatjcnim amjno ligandjma mogu jmatj cjtotoksjcпu aktjvпost па cjsplat ina-rezjstentn jm tumorjma (23). Farel ј kolege su sjntetjsalj katjonskj poljпuklearnj trans-kompleks platjпe BBR3464, trans-[{PtCI(NH3)2}2(H2N-R-NH2)]2+, sa пaelektгjsanjem +4, kojj је takode pokazao aktjvnost па cjsplatjna-rezjstentпjm celjjama ј tumorjma sa р53 mutacjjom (24-26). То otkrjce dovelo је u pjtanje ј dotadasnje tvrdenje da је elektroпeutralnost kompleksa uslov aпtjtumorske aktjvnostj. Na osnovu struki ure kompleksa, odnosno prjrode statjcnog ljganda, transplatjnskj kompleksj kojj su do danas sjntetjsaпj ј pokazali aпtjtumorski potencijal mogu se klasifikovatj u nekoljko grupa (27, 28): 8 Doktorska disertacija-Teorijski deo 1) trans-ammino(amino) platina(IV) kompleksi (SI. 2.1.З.Ь.); 2) trans-platina(ll) kompleksi sa planarnim amino ligandima (SI. 2.1.2.); З) trans-platina(ll) kompleksi sa heterociklicnim amino ligandima (SI. 2.1 .2.); 4) trans-platina(ll) kompleksi sa iminoetarskim ligandima (SI. 2.1.2.); 5) trans-platina(ll) kompleksi sa asimetricnim alifaticnim ligandima (SI. 2.1. 2.); 6) Ьinuklea rni i trinuklearni trans-platina(ll) kompleksi (SI. 2.1.2.). с~ /NНз Pt w "'-с1 1 l: N 1 Ct-- Pt--Cl 1 о Ь) s~ \.=N""- Cl р( с( ""'-N~ Ls SI. 2.1.2. Struktura trans-izomera kompleksa platine sa p/anarnim amino ligandima: а 1) trans-ammindihloro(hinolin)platina(IJ); а2) trans-ditiazoldihloroplati na(!l) ,· Ь) tтans-dihloro(4-metilpil'idin)piperidin platina(IJ),· 9 Doktorska disertacija-Teorijski deo Н3С 'ен-н N с1 с/ 2 ' / Нз р~ с{ NНз d) е) SI. 2.1.2. Struktura trans-izomera kornpleksa platine(II): с) trans-kompleks sa iminoetaт·skim ligandom, izomer trans-EE (ЕЕ se odnosi па stereohemiju samog N-substituenta oko dvost1·uke C=N veze; d) tl·ans-ammindihloroizopropilamin platina(ll); е) trinuk/earni n·ans-kompleks BBR3464. 2. 1. 3. TRANS·PLA Т/NА(/1) KOMPEKSI SA PLANARNIM AM/NO L/GANDIMA 4+ Farel (Farrell et а/.) i kolege su pNi demoпstrirali da trans-plat iпski kompleksi opste formule trans- [PtCI2L2], gde је L plaпarпi amiпo ligaпd : y-pikoliп (4-metilpiridiп, 4- МеРу), ili pirid iп (Ру), (SI. 2.1 .З. а . ) poseduju zпаtпо vecu citotoksicпu aktivпost u poredeпju sa svojim cis- izomerima, u studiji па celijama leukemije L 1210 (20, 21). U nasim ispitivanjima па Hel a celijama, trans-[Pt(Py)2CI2] је pokazao cetiri puta vecu citotoksicnost (29), i veci potencijl indukcije apoptoze u poredeпju sa svojim cis- izomerom. 10 Doktorska diseгtacija-Teorijski deo Sl. 2. 1. 3.а. Struktura kompleksa trans-dipiridiпdihlorop/atina(/1) . Otkгjce Farela podstaklo је nova jstrazovanja trans-Pt kompleksa. Takode se javj/a potreba za agensjma kojj Ьј prevazjs/j ргоЫеm rezjstencjje tumora па hemjoterapjju cjsplatjnom. U mehanjzam rezjstencjje tumorskjh се/јја na cjsplatjnu ukljuёeno је vjse faktora: smanjena unutarceljjska akumulacjja cjtotoksjёnog agensa, povecanje koncentracjja unutarce/jjskog glutatjona ј/ј metalotjonejna, ројаёаnа popravka lezjja na DNK, odnosno povecana tolerancjja lezjja na DNK (30). U saradnjj farmaceutske fjrme Johnson Matthey Technology Centre, Bristol Myers Squibb (UK) ј jnstjtuta za jspjtjvanje lekova CRC Centre for Cancer Therapeutics (Sutton, UK), tokom 1990-jh godjna jzvrsena је sjnteza ve/jkog Ьгоја cis- ltrans- Pt kompleksa, ј spoveden "skгjnjng" (screening) njjhove antjtumorske aktjvnostj . Tako se doslo do dva trans- kompleksa platjne kojj su pokaza/j antjtumorskj potencjjal s/jёan cjsplatjnj/karboplatjnj , а jspo/jj/j manje sporednjh toksjёnjh efekata na zdravo tkjvo ј , sto је jos vaznjje, pokaza/j se aktjvnjm na cjsplatjna-rezjstentnjm (cis-R) ce/ jjama tumora. U in vitro eksperjmentjma trans-[amm jne (cjk/oheksj/amjndjhlorodjhjdrokso)plat jna(IV)] ЈМ335 (SI.2.1.3.b.) pokazao је cjtotoksjёnost uporedjvu sa cjsplatjnom ј jndukovao ce/jjsku smrt putem apoptoze (31 ). ЈМ335 kao ј njegov Pt(ll)djhloro homolog ЈМ334 (SI. 2 . 1 .3 .Ь.) pokazalj su aktjvnost na cjsplatjna-rezjstentnjm ce/jjskjm /jnjjama (СН cisR ј SKOV-3), dok odgovarajucj cis- jzomerj оЬа homologa njsu bllj aktjvnj na cis-R ce/jjama (32). 11 Doktorska disertacija-Teorijski deo ------------------------------------------------- ЈМ335 је jstovremeпo ј prvj trans- platjпskj kompleks kojj је pokazao zпасајпu aпtjtumorsku aktjvпost in vivo, mada maпju od cjsplatjпe sto је оЬјаsпјепо dezaktjvacjjom ovog јеdјпјепја u celjjj u reakcjjj sa glutatjoпom , ра tako kljпjcke studjje ovog kompleksa пjsu sprovedeпe (33). ЈМ334 ЈМ335 S/.2.1.3.b. Struktura trans-izomera kompleksa pfatine: ЈМЗЗ4, trans- ammin(cikloheksilamin)dihloro platina(/1); ЈМЗЗ5, trans-ammin(cikloheksilamin)dih/orodihidroksoplatina(JV). Sledecj uspesaп primer dizajпiraпja citotoksicog kompleksa platiпe , kojim је jedпostavпom strukturпom jzmeпom јеdiпјепја platiпe dobljeп kompleks sa vecom citotoksicпoscu, kao ј aktjvпoscu па cis-R , Ьila је siпteza cis-ammjпdihloro(2- metilpjridjп)platjne(ll), AMD 473 (ЈМ-473, ZD 0473) (SI. 2.1.3 .с.) (34). SJ. 2.1.З.с. Struktura kompleksa trans-ammindihloro(2-metilpiridin)platina(ll), ZD 0473. Zamena amjna u cjsplatjni plaпaгnjm aromaticjm prstenom 2-metjlpjгjdjna (ZD 0473), rezultovala је kompleksom sa aktjvnoscu па CDDP-rezistentnom mjsjem sarkomu 180, ZD 0473 је u kasnijoj fazi istrazivanja usao i u kliпjcke studije. 12 Doktorska disertacija-Teorijski deo ---------------------------------------------- дгomaticпi рlапагпi ligaпd usporava reakciju supstitucije јопа hlora sulfhidrilпim grupama glutatioпa ili pol ipeptida, оdпоsпо povecava verovatпocu iпterakcije kompleksa sa celijskom DNK. Ovaj moпofukcioпalпi kompleks platiпe пеmа sposobпost formiraпja interlaпcaпih DNK mostova. Aktivпost па CDDP rezisteпtпim celijama је posledica drugacijeg modaliteta DNK-vezivaпja u poredeпju sa cisp latinom ili smапјепе sposobпosti celija da popravi DNK-Iezije ovog moпofuпkcioпalпog ageпsa . Supstitucija amoпijaka (NНз) plaпarпim piridinom, Ьilo u cis-[PtCI2(NH3)2] (SI. 2.1.3.d.), Ыlо u trans- kompleksu , rezultuje povecaпjem citotoksicпosti (35). Studije па celijama leukemije L 121 О ukazale su da zameпa (NH3) grupe u traпsplatiпi , aromaticпim plaпarпim amiпom , (cime se doЬijaju kompleksi geпeralпe strukturпe formule trans- [PtC12(NH3)L]; L=plaпarni N-ligaпd : tiazol, hinoliп , beпzotiazol , izohiпoliп , piridiп , 4- metilpiridiп) (SI.2.1.3.d.) rezultuje takozvaпom aktivacijom trans-kompleksa, odпosno trans-izomerije (29, 36, 37). Postize se veca aktivnost trans-Pt-kompleksa u poredeпju sa postojecim cis- izomerom, па cisplatiпa-seпzitivпim i jos zпасајпiје rezisteпtпim celijama. Cl' / L Pt H3N / '-.....CI а) e)L=N~ ~s Ь) g)L =coNI ~ ~ h- Sl. 2. 1.З.d. Struktura kompleksa а) trans-ammindih/oro(L)platina(/1); L=a1) tiazol; а2У hinolin; Ь) trans-diamminhloro(4-metilpiridin)platina(ll). Strukturпa modifikacija trans-Pt-izomera mепја modalitet iпterakcije trans-Pt-kompleksa sa DNK u poredeпju sa traпsplatiпom . Aromaticпi plaпarni ligaпd zapravo formira drugacije sterпo okruzeпje oko ceпtralпog jona Pt(ll), sto utice па modalitet iпterakcije celokupпog trans- kompleksa sa DNK molekulom. 13 Doktorska disertacija-Teorijski deo Bierbach et а/. (38), је ukazao da plaпarnj piridiпskj ljgaпd (Ру) , podstjce odvijaпje heliksa prilikom vezjvaпja trans-Pt- kompleksa. вгаЬес ј saradпjcj (39), su pokazali da planarпi aromatjcпj аmјпо ligaпdi kao sto su hjnoljп ј tjazol, jmaju uticaja па formjraпje veceg broja iпterlaпcaпjh trans-Pt-DNK mostova (sa ucestaloscu 30%, za t112 > 11 h) u poredeпju sa traпsplatjпom. Pt-DNK mostovj se uglavпom formjraju izmedu guaпjпskjh baza, pretezпo па sekveпcama 5'-GC- 3'/S'GC-3" dvostrukog heljksa DNK. Uvodeпjem рlапагпоg hjпoliпa u trans-Pt kompleks se пе mепја kjпetika formiraпja moпoadukta trans-Pt-kompleksa sa DNK, пiti kjпetika preuredeпja moпodeпtatпog adukta u Ьideпtatпi (40). Adukti koje formira trans- [PtCI2(NHз)(hiпoliп)] jпdukuju koпformacioпu promeпu DNK heliksa пalik опој koju indukuje cjsplatjпa , ра su tako prepozпatj od straпe cjsplatiпa-specificпih aпtjtela . Pretpostavlja se, da zahvaljujucj prjrodj aromatjcпog prsteпa kao ј svojoj geometгjjskoj lokacijj u kompleksu (trans-polozaj) hiпoljп fогmјга stekjпg jпterakcjje sa bazama DNK, i tako пarusava koпformacjju heliksa, sto је u osпovi vece aktjvпosti trans- [PtCI2(NH3)(hjпoljп)] (SI. 2.1.3.d.) u odпosu na cis- isomer. Sljcпo је ј sa kompleksom trans-[PtCI2(NH3)(tiazol)] (SI. 2.1.3.d.), kojj indukuje koпformacjoпe ргоmепе па DNK, skoro ideпticпe опјmа koje formiraju 1 ,2-GG cjsplatjпa-DNK aduktj, ра su tako trans- [PtCI2(NH3)(tjazoi)]-DNK lezjje prepozпate u celijj od straпe HMGB1 protejпa , kao ј NER (nuc/eotide excision repair) sjstema za reparacjju lezjja, ukljuceпih takode u popravku cjsplatjпa-DNK lezjja (41 ). Medjutjm, jma prjmera kada strukturпe izmeпe traпsplatjпe пе rezultuju povecaпjem cjtotoksicпosti, kao sto је slucaj sa пovosiпtetjsпim kompleksom [Pt(NH3)2AmCI(, gde је Am volumjпozпi heterociklicпj plaпarni amiп , 4-meti l-pjгjdiп . Cis-izomer ovog katjoпskog kompleksa platiпe(ll) pokazuje zпасајпu aktivnost па пekoliko celijskjh linija (S 180, Р338, L 121 О) (42), dok trans-izomer пiје aktivaп. U ovom slucaju veca aktivnost cis-isomera objasпjava se brzom kjпetikom fогmјгапја DNK adukata, u poredeпju sa trans-izomerom, kao i odgovarajucom konformacioпom promeпom dvostrukog DNK heliksa. 14 Dokto1·ska disertacija-Teorijski deo ------------------------------------------- Najznacajnjja zajednjcka osoblna analoga transplatjne је sto se jednostavnom strukturnom jzmenom transplatjne postjze aktjvacjja tog bjoloskj jnertnog kompleksa, odnosno dobljaju se trans-Pt- kompleksj kojj jmaju aktjvnostj vece od postojecjh cis- jzomera na cjsplatjna-senzjtjvnjm ј , jos znacajnjje, -rezjstentnjm ljnjjama. Kako su nekj trans-Pt-kompeksj pokazalj potencjjal u prevazjlazenju rezjstencjje tumorskjh celjja na tretman cjsplatjnom, pretpostavlja se da se mehanjzam njjhovog cjtotoksjcnog delovanja razljkuje od mehanjzma dejstva cjsplatjne, ра tako pobuduju jntresovanje za dalje jstrazjvanje. 2. 1. 4. M EHANIZAM C/TOTOKSICNOG DEJSТVA TRANS·PLAТINSКIH KOMPLEKSA Cis- ј trans- kompleksj platjne foгmjгaju lezjje na celjjskoj DNK, alj se ne moze гесј da postojj djrektna korelacjja jzmedu sposobnostj platjnskjh kompleksa da jnhjblsu DNK repljkacjju ј njjhove antjtumorske aktjvnostj (43, 44). Celjjskj odgovor na ostecenja jzazvana cjtotoksjcnjm agensom, odjgгava se prenosenjem sjgnala u slozenoj mrezj kooгdjnovanjh sjgnalnjh puteva u celjjj u koje su ukljucenj protejnj mehanjzma za reparacjju DNK lezjja, kao ј р53 protejn (45). 2. 1. 4. 1. Trans-platina(/1)-DNK-/ezije i р53 Ostecenje na DNK nastalo cjtotoksjcnjm agensom је najcesce pocetni sjgnal za aktjvacjju protejna р53, kojj deluje kao transkrjpcjonj aktjvator ј pokrece kaskadu reakcjja u celjj j (46, 47). р53 Pokrece transkгjpcjju mnogobrojnjh gen , kao sto su: MDM-2, kodjra za protejn-jnhjЬitor р53; ВАХ, kodjгa za Вах apoptotskj protejn; GADD-45, kodjra za protjn ukljucen u DNK reparacjju ј zastoj celjjskog cjklusa u G2 fazj ; kao ј gen р21 protejna kojj jndukuje zastoj u G1/S ј G2 fazj celijskog cjklusa ј aktjvacjju NER tj . popravku nastaljh lezjja na DNK. р53 Takodje jnteraguje djгektno sa nekjm proteinjma u cel jj j, transkripcjonjm faktorima, ukljucenjm u reparaciju DNK lezjja, а takode је ukljucen u negatjvnu regulacjju Bcl-2, kojj funkcjonjse kao jnhjbltor apoptoze (48). 15 Doktorska disertacija-Teorijski deo Tako od funkcionalnog statusa р53 u celiji zavisi da li се u odogovoru na ostecenje citotoksicnim agensom celija prezjveti odnosno pokrenuti popravku DNK i zastoj celjjskog cjklusa jli се ucj u apoptozu. U slucaju nepopravljivih lezija na DNK р53 iпdukuje apoptozu. oosadasnjj literaturni podaci о znacaju р53 u cjtotoksjcnom dejstvu platjnskjh kompleksa su kontradjktorni (49). Neka jstrazjvanja ukazuju da р53 njje djrektno ukljucen u celjjskj odgovor na cjtotoksjcno dejstvo kompleksa platine, ј da cak CDDP- jndukovana apoptoza moze јсј putevjma nezavjsnjm od р53 (50, 51 ). lstrazivanja na celjjama tumora ovarjjuma А2780 pokazale su da status р53 nema uticaja па senzjtjvnost celije na cjtotoksjcno dejstvo trans-kompleksa ЈМ335 (31). Efjkasnost polinuklearnog trans-Pt kompleksa BBR3464 na tumorjma sa mutacijom na р53 ukazuje da DNK-aduktj ovog kompleksa mogu pokrenutj celjjsku smrt putevjma nezavjsnjm od funkcjonalnog statusa р53 (51 , 52). Moguce objasnjenje mehanjzma celjjske smrtj jeste da celjja ulazj u apoptozu usled vjsestrukjh neuspeljh pokusaja sjstema za reparacjju DNK da prepoznaju ј poprave neoblcne DNK-Iezjje nastale dejstvom ovog kompleksa. Neka jspjtjvanja na mutantu kvasca Schizosaccharomyces pombe Rad-mutant, ukazuju па ucesce MMR (mismatch repair) gena ј protejna za reparacjju DNK lezjja u regulacjj hemosenzjtjvnostj celjje na BBR 3464, dok protejnj NER jmaju maгgjnalnu ulogu (53, 54). Kako је gubltak funkcjje protejпa р53 пајсеsса mutacjja koja se srece u tumorskjm celijama ј kako је to jstovremeno glavпj uzrok smапјепе senzitjvпost jlj cak rezjstencjje nekjh tumorskjh celjja па hemiterapeutske ageпse, razvoj ageпsa kojj Ьi Ьiо efjkasaп пezavjsпo od р53 statusa је u centru daljjh jspitjvaпja. 2. 1. 4. 2. Ce/ijski mehanizmi za reparaciju trans-platina-DNK adukata DNK је pгjmarna meta citotoksicпog delovanja cjsplatjne, ра tako protejnj kojj jgгaju ulogu u prepoznavaпju DNK lezjja predstavljaju pocetпu karjku u laпcu celjjskjh reakcjja па CDDP. Postojj nekoljko protejna kojj Ьi moglj da budu odgovorпj za specjfjcпo prepozпavaпje CDDP-DNK jпtra-laпcanjh adukata, jnter-lancanjh adukata moпoadukata , а to su: 1) HMG-domeп protejпi (high mobllity group) 2) protejnj sistema za reparacjju lezjja па DNK kao sto su NER (nucleotide excision repair) ј MMR (mismatch repair) . 16 Doktorska disertacija-Teorijski deo -------------------------------------------------------- 2. 1. 4. 2. 1. Familija HMG-domen proteina (High Mobllity Group) HMG-domen protejnj, kojj prjpadaju famjljjj nehjstonskjh DNK vezujucjh protejna, jmaju malu molekulsku masu ј neoblcno vjsoko pozjtjvno naelektгjsanje , zbog cega pokazuju veljku elektroforetsku pokretljjvost na agaroznom gelu. HMG-domen је DNK vezujucj domen, а protejnj kojj ga sadrze jmaju osoblnu da se specificno vezuju za DNK- Iezjje (55). lma dokaza da se HMG protejnj vezuju specjfjcno za DNK-cjsplatjna-adukte tjpa: cis-GG, cis-AG alj ne ј za cis-GNG (gde је N ma koja baza) ј ne za DNK adukte koje foгmjra transplatjna (56, 57). Poznato је da HMG protejnj ucestvuju u prenosenju cjtotoksjcnog sjgnala od mesta formjranja cjsplatjna-DNK-adukta na druge sjgnalne protejne u celjji , alj tacan mehanjzam ovog procesa njje do kraja razjasnjen. Jedna teorjja је da vezjvanjm za cis-Pt-DNK adukt, HMG protejnj stjte DNK-Iezjju od prjstupa ostaljh protejna odgovoгnjh za prepoznavanje ј popravku lezjja na DNK, kao sto su protejnj NER jlj MMR (58). HMG protejnj jmaju funkcjju transkrjpcjonjh faktora. Moguce је da se usled vezjvanja HMG protejna za cjsplatjna-DNK-adukte sa vecom specjfjcnoscu u poredenju sa vezjvanjem za nj jhove cjljne promotorske Ш supresorske sekvence na DNK, ozblljno narusavaju unutarceljjske funkcjje . HMG protejnj njsu u stanju da prepoznaju lezjje nastale aduktjma koje fогmјга transplatina, njtj neoblcne jnterlancane DNK lezjje nastale vezjvanjem poljnuklearnog trans-kompleksa BBR3464 (59). Dok antjtela specjfjcna za trans-DDP adukte vezuju specjfjcno ј DNK-adukte koje foгmjra BBR3464 (43). Moguce је da trans-Pt kompleksj jndukuju konformacjonu promenu DNK V·eoma razljcjtu u poredenju sa cis-Pt kompleksjma, ра su tako celjjskj mehanjzmj kojj su ukljucenj u prepoznavanje ј uklanjanje nastaljh lezjja razljcjtj . Cis- ј trans-Pt kompleksj se Ьitno razljkuju u mehanjzmu cjtotoksjcnog dejstva sto stojj u osonjvj aktjvnostj nekjh trans-platjna kompleksa, kao sto је BBR3464, na cjsplatjna-rezjstentnjm celijama tumora. 17 Doktm·ska disertacija-Teorijski deo 2. 1. 4. 2. 2. Uloga sistema nukleotidna reparacija- NER(Nucleotide Excision Repair) u popravci cis-/ trans-Pt(II}-DNA adukata lma dokaza da NER sistem za reparaciju ima domiпaпtпu ulogu u prepozпavaпju i popravci cisplatiпa-DNK adukata (60). lпtralaпёaпi cis-GTG adukti se uklaпjaju sa vecom efikasпoscu od cis-AG adukata ili cis-GG adukata. Prelimiпarпe studije па celijama kvasca ukazuju da NER jma margjпa lпu ulogu u popravcj DNK-Iezjja пastaljh trans- platjпa kompleksjma kao sto su ЈМЗЗ5 jlj BBR3464 (54). 2. 1. 4. 2. З. Uloga MMR sistema (MMR-Mismatch repair} u popravci cis-/trans- platina-DNA adukata Sem proteiпa NER sistema, ј proteini MMR sjstema za popravku pogresпo spareпjh baza, jmaju ulogu u prepozпavaпju DNK-Iezjja пastalih vezjvaпjem cis- platjnskjh kompleksa (61 ). Ргјmесепо је da tumorske celjje sa fuпkcioпalпim MMR statusom odgovaraju pozjtjvпo па tretmaп alkjlujucjm ageпsjma (62). Prekomerпa ekspresjja proteiпa MMR sistema kao sto је hMSH2, postojj u celijama tumora ovarijuma ј testjsa, па koj ima hemjoterajja cisplatiпom daje роsеЬпо dobre rezultate. Pretpostavlja se da protejпj MMR sjstema, jmaju Ьitпu ulogu u daljem preпoseпju citotoksiёпog sjgnala od mesta formj raпja DNK-adukta па celjjske kompoпeпte u slozeпom laпcu reakcija, odgovorпom za uvodeпje celjje u apoptozu (63). Zastojem celjjskog cjk lusa u G1 ј G2 fazj паkоп dejstva cjsplatjпe javlja se u celjjama sa funkcjoпalпjm protejп jma MMR, dok se kod cel jja defjcjtarпjh u kompoпeпtama MMR sjstema javlja zastoj samo u G1 fazi celjjskog ciklusa. Ovo јаsпо јпdјсјга jпterakciju sa G2 taёkom koпtrole celijskog cjklusa, 'G2-checkpojпt', dok је zastoj u G1 fazj пajzgled пezavjsaп od fuпkcjje MMR protejпa (62). Tako se zastoj u G2 fazi celijskog ciklusa, kojj је karakeristiёna pojava nakoп tretmaпa tumorskjh celjja cjsplatjпom moze pripjsati delovaпju MMR-a. Medutjm, jma јпdјсјја da MMR пе mora Ьitj deteгmjпaпta celjjske seпzitivпostj па citotoksjёпo dejstvo trans-platjпskjh kompleksa. Poljпuklearпj trans-kompleks BBR3464 pokazuje cjtotoksjёпu aktjvпost ј па cisplatiпa-rezjsteпtпjm celjjama osteosarkoma U2- 0S/Pt, okarakterjsaпjm пedostatkom pojediпjh kompoпeпtj MMR sjstema (64). 18 Doktorska diserJacija-Teorijski deo 2.2. ANTIТUMORSKJ POTENCIJAL KOMPLEKSA NA BAZI RUTENIJUMA(III), HROMA(III) Ј RODIJUMA(III) Aktjvnost cjsplatjne u leёenju tumora, kao ј ogranjёenja koja su se javjla ргј hemjoterapeutskoj prjmen j cjsplatjne (toksjёnost za zdrava tk jva, rezjstencjja tumorskjh celjja na tretman cjsplatjnom) podstaklj su dalja jstrazjvanja kompleksa platjne ј prosjrjlj potragu za efikasnjm antjtumorskjm agensom na sjroko polje kompleksa metala. U protekle dve decenije, sjntetjsano је ј jspjtana Ьioloska aktjvnost nekoliko hiljada kompleksa platjne i velikog broja kompleksa drugjh metala kao sto su: zlato (Au), tjtan (Тј) , gvozda (Fe), paladjjum (Pd), rutenjjum (Ru), hrom (Сг), rodjjum (Rh), galijum(Ga) ј td (65, 66, 67). Veljkj broj kompleksa hroma(l l l) ј rodjjuma(ll l) је sjntetjsan ј jspitjvan na celijama tumora (68). Hrom је normalno prisutan u celijama kao mikroelement i igra ulogu u insulin-zavisnom unutarcelijskom transportu glukoze (69). U velikim koncentracjjama u cel iji hrom(lll) se vezuje sa DNK, koncentraciono zavisno, formirajuci DNK-interlanёane ј DNK jntralanёane mostove, ёime ometa repljkacjju (70). Rodijum takode jnteraguje sa DNK (71 ) , pri ёemu ispoljava mutageno svojstvo. Na celijama mikroba indukuje SOS reparaciju (72). Medu testiranim kompleksima razliёitih metala izdvajaju se kompleksi rutenijuma na osnovu svojih antitumorskih i antimetastatskih osoblna. 2. 2. 1. KOMPLEKSI RUTENIJUMA: PRIMENA U 8 /0MEDIC/N/ Kompleksi rutenijuma poseduju veliki potencijal za primenu u Ьiomedicini kao alternativni hemjoterapeutski agensj (72). Poznata је antimikrobna aktivnost pojedinjh kompleksa rutenjjuma na parazite tipa Plasmodium ili Trypanosoma cruzi. Kompleks [RuCI2(NH3)(hlorohjnon)]2+ је 2-5 puta aktjvnjji naspram parazita Plazmodium u poredenju sa samim ligandom hlorohinon (73). Tiosemjkarbazonskj derivati Ru(lll) poseduju antiblotsku aktivnost na Gram negativne bakterije t jpa Salmonela typhi i Enterobacterium faeca/is. Osoblna Ru(lll) jona da efikasno vezuje NO, moze Ьiti iskoriscena u terapijj fizioloskih stanja karakterisanih visokim njvoom azotmonoksida, NO (nрг. toksiёnjsok-sjndrom koji nastaje tokom teskih bakterijskih infekcija, kao posledica prekomerne sjnteze NO od strane makrofaga, tj . NO indukovanog kolapsa 19 Doktorska disertacija-Teorijski deo --------------------------------------------------- kard jovaskularпog sjstema) (74). Јеdјпјепје ruteпjjum-crveпo pozпato је kao efjkasaп ;munosupresivan ageпs , оdпоsпо jma osoblnu da smaпjeпjem пјvоа Са2+ suprimira antigeп-iпdukovaпu proliferaciju Т limfocjta. Cjtotoksicпo dejstvo ruteпijum-crveпo 05tvaruje tako sto se vezuje za Са2+ kaпale па povrsiпi mitohoпdrija i Ыokira efluks Са2+ , tako da zapravo ima antimitohondrijalnu aktivnost (73). 2. 2. 2. KOMPLEKSI RUTENIJUMA - POTENCIJAL ANТITUMORSKOG DEJSТVA Karakteristike kompleksa ruteпijuma koje ih сiпе toliko pogodпim za primeпu u blomediciпi ј terapjji tumora su pre svega: • sposobпost da se u krvi traпsportuje пetoksicпo , korisceпjem sistema za traпsport gvozda Fe(lll), • kiпetjka izmeпe ljgaпada , • sirok opseg redoks-poteпcijala. Pojediпi kompleksi ruteпijuma (Ru[CI2(DMS0)2(4-N021m)2], lm=imidazol, koriste se kao pomocпi ageпsi u radioterapjji tumora, odпosno povecavaju seпzjtjvпost tumorskjh celjja na terapjju zraceпjem , zahvaljujucj osoblпi da poseduju veljkj redoks-poteпcjjal ј da se vezuju za celijsku DNK (73). Kada dospeju u krv, deгjvatj ruteпijuma se vezuju za traпsferjп krvпe plazme, сјја је prevashodпa uloga u traпsportu gvozda(lll) do receptora za traпsferjп па роvгsјпј cjljпih celija (SI. 2 .2.2.а.) Osoblпa maligпjh celjja da imaju povecaпu ekspresiju receptora za traпsferiп u odпosu па celjje zdravjh tkiva (75, 76), otvara mogucпost da kompleksj ruteпjjuma budu specjfjcпo ј u vecoj merj dopremljeпi do celjja tumora korjsceпjem transportпog sjstema gvozda(lll), cjme Ьi mogla da se prevazide пespecifjcпost dejstva agensa, kao пegativпa odlika svjh do sada pozпatih hemjoterapeutskjh ageпasa koji se prjmeпjuju u leceпju tumora. Тrапsfегјп је 80 kD glikoprotejп , kojj сiпј јеdап poljpeptidпi lanac orgaпjzovaп u dva domeпa , od kojjh svaki ima vezivпo mesto za Fe(lll ) (77). Јопi gvozda se vezuju preko dva ostatka tiroziпa (Туг) i histjdjпa (His) i asparagjпske kiseliпe (Asp) u prisustvu karboпatпih јопа СО32- . 20 Doktorska diset'tacija-Teorijski deo ------------------------------------------ u uslovima nize рН vrednosti sredine dolazi do protonovanja ostatka histidina ili konformacione promene proteina usled izmene vodonicnih veza, sto pogoduje oslobadanju jona Fe(lll) iz kompleksa sa proteinom (78). za гazliku od cisplatine koje se dezaktivira u krvnoj plazmi, u interakciji sa proteinima plazme kompleksi rutenijuma se reverzibilno vezuju za transferin plazme, а oslobadaju se iz kompleksa sa proteinima u uslovima nize рН vrednosti sredine, u prisListvu АТР ili citrata. Takode, za razliku od jona Fe(lll) koji gube svoje ligande vezivanjem za apotransferin, u kompleksima Ru(l ll) N-heterociklicni ligandi ostaju vezani za metal, sto omogucuje transport celokupnog kompleksa do celija (79). Vezivanje antitumorskog agensa trans-[Ru(lm)2C14Г (lm=imidazol) (SI. 2.2 . 2 . Ь.) za apotransferin zahteva nekoliko sati, dok se vezivanje trans-[Ru( lnd)2CI4Г (lnd=indazol) odvija za nekoliko minuta. Apo-Tf \ Hem Feritin t =D=M=T=1 =ј. ~ ............... Clatherin 'н+ " Endozomalna membrana Sf. 2.2.2.а. Prikaz mehanizma usvajanja jona Fe(/11), odnosno jedinjenja Ru(/11), putem receptora za transferin. 21 Doktorska disertacija-Te01·ijski deo lako kompleksi ruteпijuma dele slicпost sa kompleksima platiпe(ll) u smislu kiпetike izmeпe ligaпada , oktaedarska struktura kompleksa Ru(ll) i Ru(lll) za razliku od рlапаrпе strukture platiпskih kompleksa, ukazuje da Ьi derivati ruteпijuma mogli da imaju drugaciji mehaпizam aпtitumorskog dejstva (79). U vodeпim rastvorima oktaedarski aпtitumorski kompleks trans-(Ru(lm)2CI4Г, cija је struktura prikazaпa па Slici 2 .2 .2 . Ь . 1. , podleze stupпjevitoj disocijaciji hloridпih јопа tj. hidrolizi. (80). Ргоmепа opsega apsorpcije kompleksa, ka plavo-zeleпom delu vidljivog spektra ( Л.= 585 пm) , ukazuje па reakciju hidrolizovaпe forme kompleksa ruteпijuma sa karboпatпim ili karboksilatпim joпima. Nakoп hidrolize u uпutarcelijskoj srediпi, kompleks ruteпijuma se aktivira za iпterakciju sa DNK. пNН '· ,) N Cl / / CI --Ru с1_- \ "--с1 ~N~ 'LNH 1 4 SJ. 2. 2.2.Ь. Strukturna formula kompleksa rutenijuma(/11) : 1) trans-[Ru(lm)гCI,J, 2) trans- [Ru(DMSO)(Im)2C/4] (NAMI); З, 4) kompleksa Ru(/1) sa Ьidentatnim i tridentatnim piridinskim ligandima (1). 22 Doktorska disertacija-Teorijski deo Ru(lll) kompleksj sa N-kooгdjпovaпjm ljgaпdima (amoпjjak, jmjdazol, pjrjdjп) poseduju sjrok redoks-poteпcjjal , u opsegu od 50-400 mV. Dovoljпo su malj da pгjdu kataljtjckom ceпtru eпzjma, ра tako mogu efjkasпo da ucestvuju u elektron-traпsfer reakcjjama u celij j, оdпоsпо preпosu elektrona od jedпog molekula na drugj (81). Pretpostavlja se da se in vivo desava redukcjja Ru(lll) do Ru(l l), kao reaktjvпjje forme ruteпjjuma sa vecjm afjпjtetom jпterakcjje sa celjjskom DNK, sto је takozvana aktjvacjja komplekesa (82). Dosadasпja jstrazjvanja ukazuju da kompleksj Ru(ll l) ј Ru(ll) mogu reagovatj sa molekulom DNK ј to uglavпom sa N-7 polozajem guапјпа, па GC bogatjm sekveпcama (83). Оо daпas је sjntetjsaп veljkj Ьгој kompleksa Ru(l l) i Ru( lll) sa ligandima tipa amiпa (84), dimetil-sulfoksjda (85, 86), N-heterocjkjcпjm аmјпо ligaпdima (87, 88), kojj pokazuju citotoksicпost na celjjama tumora, kao ј afjпjtet za jпterakcjju sa DNK u smjslu foгmjranja DNK-adukata, preloma па DNK laпcu (89, 90) i iпdukovaпja koпformacjoпjh promena DNK. Takode, Ru(II)/Ru(l ll)-kompleksj mogu da formjraju jnterlaпcane mostove jzmedu DNK ј ostataka hjstjdjna ilj jmidazola па protejпjma (91). U modulacjjj jnterakcije rutenjjuma sa DNK in vivo ucestvuje ј glutatjoп . Glutatjoп (y-glutamil-cistejпj l-gljcjп) , GSH, је pгjsutaп u celijj u koncentracijj 0,1-10 mM ј lako se oksjduje do djsulfida GSSG (92). GSH stjtj celjju od reaktjvn jh jпtermedjjera kjseoпjka, toksjcпjh teskjh metala, jlj produkata UV zracenja (93, 94). Роvесапје koncentracjje unutarceljjskog GSH doprinosj rezjstencjj j nekjh celjja tumora па citotoksicni efekat kompleksa па bazj Pt( ll), јег vezjvanjem platjne za GSH oпemogucuje jnterakciju Pt(ll) sa DNK. lsto tako, zavisпo od svoje konceпtracjje u celij j GSH moze da ројаса jlj umanjj stepeп interakcjje rutenjjuma sa DNK (95). U uslovima [GSH/Ru(ll l)] ~ 1 GSH redukuje Ru(lll) do reaktjvnjjeg Ru(ll) oЬiika, kojj lakse iпteraguje sa DNK; u uslovjma [GSH/Ru(lll)] ;:::: 1 GSH, vjsak GSH se vezuje opet za Ru(ll) jon ј inhjЬise jnterakciju sa DNK. GSH takode moze da zameпj ammjnrutenjjum(lll) u kompleksu sa traпsferiпom , ljgand NH3 u kompleksu trans-[Ru(NH3)6]3+ ј pjrjd jn (Ру) u kompleksu [Ru(NH3)5 Ру] з+ i formira [GSRu(NH3)5]+, sto ukazuje na aktivnu ulogu GSH u metaboljzmu agenasa na bazj rutenjjuma. 23 Doktorska disertacija-Teorijski deo 2. 2. 2. 1. Kompleksi Rutenijuma(/1) Cjtotoksjcпost kompleksa ruteпjjuma(\1 ) је u djrektпoj korelacijj sa jпterakcijom sa molekulom DNK (96, 97, 98). Relatjvпo пovu klasu Ru(\1) јеdјпјепја predstavljaju kompleksj Ru(\1) sa aromatjcпjm \jgaпdima tjpa агепа sa strukturпom formulom [Ru''( 116-агеп)(еп)Х] (Х= С\ , \; агеп= p-kumeп, bifeп j\; еп= etj\eпdjamjп) (S\.2.2.2.1.), koji su pokazalj aktjvпost uporedjvu sa aktjvпoscu cjsplatjпe ј\ј karboplatjпe (99). strukturпe karakterjstjke kompleksa koje se povezuju sa vjsokom cjtotoksjcпoscu su postojaпje jedпog staЬilпog Ьideпtatпog ljgaпda (etjleпdjamjп) , hjdгofobпog aromatjcпog \jgaпda (tetrahjdroaпtraceп), kojj dozvoljava boljj pгjstup aromatjcпom jezgru protejпa (enzjma) (1 ОО), kao ј jedпog "odlazeceg" \jgaпda (hlorjd) kojj moze Ьit j meta supstjtucjoпjh reakcjja. Ovaj tjp kompleksa Ru(\1) se odlikuje ј aktjvпoscu па cjsplatjпa­ rezjsteпtпjm \jпijama: A2780cis, sa faktorom rezjsteпcjje па cjsplatjпu/karboplatjпu Fr=1 О, ј mehaпjzmom rezjteпcije zavjsпjm od smaпjene ekspresjje MLH1 protejпa MMR sistema za reparacjju DNK. \spjtjvaпja DNK jпterakcjje ukazuju da Ru(ll) kompleksj sa агепа ljgaпdjma formjгaju moпofuпkcjoпalпe DNK adukte jпteragujucj sa guaпjпom , а takode se jпterkaljraju u DNK (S\.2.2.2.1.) (1 01 ). U uklaпjaпju takvjh lezjja na DNK, NER sjstem jma malu efikasпost. Kompeksj Ru(\1) sa aromatjcпjm \jgaпdjma tjpa агепа ј\ј 2-feпjlazopjrjdjпa (102) pokazuju aktjvnost па cjsplatjпa rezjsteпtпjm А2780А0 celjjama sa prekomernom ekspresjjom Р- 170 g\jkoprotejпa odgovorпog za sjпdrom multi-drug-resistance tj. rezjsteпcjju па mпoge cjtotoksjcпe ageпse . 24 Doktm·ska dlset·tac(ja-Teorijskl deo --------------------------------------- l~u-THA Ru-CYM Sl. 2.2.2.1. Kompleksi Ru(/1) sa aromaticпim ligaпdima tipa агепа sa strukturnom formulom [RJ1( r/-areп)(eп)CI] (агеп= THA(tetrahidroaпtraceп), CYM(cimeп); еп= eti/eпdiamiп) . Prikazaпa је iпterakcija kompleksa Ru-CYM sa ostacima guaпiпa па DNK !апси (104). То ukazuje da mehanjzmi rezjstencjje na cjtotoksjcno dejstvo platjnskjh agenasa njsu efektnj ј u slucaju Ru(ll) agenasa. lspjtjvanja mehanizma dejstva ukazuju na ucesce р53 ј p21/VVAF1 u zastoju celijskog cjklusa, kao ј u ucesce р53 ј Вах u apoptotskom odgovoru celjje na Ru( ll) agens (1 03). Kompleksj Ru(ll) sa aromatjcnjm ljgandima tjpa 3-aminopjridjna, p-aminobenzoeve kjseline, pokazuju jnhjblcjju tjpojzomeraze 11 i vjsoku cjtotoksjcnost na humanjm celjjama karcinoma kolona ј dojke (1 04). Novosintetisanj kompleksj Ru(ll) sa ketokonazol ligandima jndukuju kaspaza-3 zavisnu apoptozu na tumorskjm celijama, nezavisno od funkcionalnog statusa р53 (1 05). 25 Doktorska disertacija-Teorijski deo 2. 2. 2. 2. Kompleksi Rutenijuma(l/1) za razljku od Ru(ll) kompleksa kojj poseduju cjtotoksjcnost, kompleksj Ru(ll l) odljkuju se odsustvom znacajne cjtotoksjcnostj in vitro. Ru(lll) kompleksj su hemjjskj stabllnj u unutarceljjskoj sredjnj , tako da ljgandj ostaju dugo vezanj za centralnj metalnj jon cjme se moze objasnjtj njjhova relatjvna jnertnost u smjslu cjtotoksjcne aktjvnostj . U tumorskjm celjjama uglavnom postoje uslovj manje koncentracjje kjseonjka kao ј njze рН vrednostj, sto moze da pogoduje redukcjjj Ru(ll l) do Ru(ll) (1 06) ј tjme povecanju unutarceljjske гeaktjvnostj sa cjljnjm celjjskjm strukturama. lspjtjvanja DNK jnterakcjje Ru(ll l) u kompleksjma Hjm[trans-CI4Im2Ru(lll)] , Hjnd[trans-CI41nd2Ru(lll)] , Na[trans- CI41m(Me2SO)Ru(lll)] (lm=jmjdazol; lnd=jndazol) ukazuju da se Ru(ll l) koordjnuje jreveгzjЬilno za DNK molekul, formjrajucj jntralancane adukte kojj menjaju konformacjju DNK ј jnhjblsu sjntezu RNK (1 07). Dosadasn]a jstrzjvanja ukazuju da jako је jnterakcjja Ru(lll) sa DNK moguca, ne mora Ьitj u osnovj antjtumorske aktjvnostj kompleksa na bazj Ru(ll l) (108). Ргј tretmanu Hela ј Jurkat celjja kompleksom cis-[Ru(NHз)4CI2]CI , u koncentracjjj potrebnoj za postjzanje 50% jпhjblcjje rasta (ICso неLа = 3,5 џ.М ; ICso Jurkat =190 џ.М) (24 sata jnkubacjje) postjze se neznatno vecj stepen vezjvanja rutenjjuma za DNK Hela celija u odnosu na DNK Jurkat celjja (109). Dakle, DNK jnterakcjja kompleksa rutenijuma njje u korelacjjj sa cjtotoksjcnoscu u ovom slucaju. Razlika u cjtotoksjcnoj aktjvnostj cis- [Ru(NH3)4CI2]CI na dvema celjjskjm linijama se objasnjava smanjenim unutarcelijskim transportom u Jurkat celijama. Medutim kompleks trans-[Ru( lm)2CI4](ImH) koji pokazuje slicnu citotoksjcnost па dvema celjjskjm linjjama(ICso Hela = 2,0 џ.М; ICso Jurkat =1 ,З ~-tM ), jma ј dalje malj stepen Jurkat/DNK jnterakcjje kao ј kompleks sa manjom cjtotoksjcnoscu. Derjvatj rutenjjuma(lll) retko poseduju cjtotoksjcno dejstvo ј njjhov antjtumorskj efekat ne projzilazj jz cjtotoksjcnostj. Tacan mehanjzam antjtumorskog dejstva kompleksa na bazj Ru(lll) jos uvek njje razjasnjen, ali је pretpostavka da Ru(l ll) kompleks utjce na ekspresjju protejna u celjjj , u jnterakcjjj sa RNK jlj protejnima u celjjj jlj na celjjskoj membranj. Neka jstгZjvanja sa NAMI jlj poljnuklearnjm kompleksjma rutenjjuma potvrduju postojanje jnterlancanjh DNK-Ru(lll )-protein kompleksa u celijj (11 0). 26 Doktorska disertacija-Teorijski deo Takode је moguce da kompleksi Ru(lll) izazivaju zadeЫjanje (uguscenje) proteinskog sloja bazalne membrane oko celija tumora i time inhiЬisu proces invazije i metastaze (1 11 ). 2. 2. 2. З. Kompleksi Ru(/11) sa antimetastatskim potencija/om: NAMI 1 NAMI-A Kompleksi rutenijuma(ll l) sa dimetil-sulfoksidom (DMSO) kao sto su cis-1 trans- [Ru(Me2S0)4CI2] su medu prvim kompleksima Ru(lll ) ispitivanim па celijama tumora (112, 11 3). ОЬа kompleksa odlikuju se odsustvom znacajne citotoksicnosti in vitro, (IC50 >100 11М) . ОЬа kompleksa se vezuju za DNK indukujuci konformacione promene В---+ Z. Za razliku od cis- izomera koji nema antitumorsku aktivnost, trans- izomer narocito trans- [Ru(Me2SO)(Im)CI4)Na (NAMI) se odlikuje potencijalom inhiЬicije mikrometastaza (114, 115). NAMI NAMI-д SJ. 2.2.2.3. Strukturne formule komplekesa NAMI i NAMI-A. Molekulska tezina komp/eksa NAMI- A = 458,18 glmol. Molekulska formula, CвН15C/4N40Ru(III)S. NAMI-A је а kompleks rutenijuma izveden iz kompleksa NAMI, tako Sto је }оп Na• zamenjen imidazolnim jezgrom (lmH). 27 Doktorska disertacija-Teorijski deo Natrjj um-trans-jmjdazold jmetj 1-su lfoksjd-tetrahlororutenat( 111), Na[trans-Ruei4MezSO (jmjdazol)] (NAMI) ј jmjdazoljjum-trans-jm jdazoldjmetjl-sulfoksjd tetrahlororutenat(ll l) (lmH[trans-Ruei4(DMSO)Im]) (NAMI-A) (SI.2.2.2.3.) prjpadaju novoj generacjj j kompleksa okarakterjsanjh odsustvom cjtotoksjcnostj in vitro (116, 117), alj postojanjem in vivo apoptotskog ј antjmetastatskog dejstva (118, 119). Poredenjem sa cjsplatjnom, NAMI-A је 1053 puta manje cjtotoksjcan, jspjtjvanjem па nekoljko tumorskjh celjjskjh linjja: lgrov-1 , 2008, MeF-7, Т470 (120). lstovremeno, unutarceljjska akumulacjja ј in vivo DNK- vezjvanje za NAMI-A је 42 puta manje, jako pokazuje afjnjtet za Ge bogate regjone DNK, sljcno cjsplatjnj. Smanjena cjtotokjscnost kompleksa NAMI-A је rezu ltat smanjenog vezjvanja za DNK. NAMI formjra DNK-protejn jnterlancane mostove ј neznatan broj DNK jnterlancanjh mostova (< 1%); jndukuje konformacjone promene В ~ Z dvostrukog heliksa ј jnhjblse aktjvnost DNK- ј RNK- poljmeraza (114). Antjmetastatskj potencjjal NAMI njje posledjca cjtotoksjcnog efekta ovog kompleksa ј jspoljen је na modeljma tumora: mjsjeg Lewjs caгcjnoma pluca, меа karcjnoma sjsara ј 816 melanoma. Antjmetastaska aktjvnost NAMI dovodj se u vezu sa jnhjblcjjom matrjksne metaloprotejnaze-2 (ММР-2) ј in vivo utjcajem na koncentracjju ТIМР-2 (tkjvnj jnhjbltor ММР-2 koga lucj sam organjzam), Takode је mogude da NAMI , premoscjvanjem protejnskjh komponentj vanceljjskog matrjksa, tj. uguscjvanjem protejnskog sloja bazalne membrane oko tumora ј tumorskjh kгvnjh sudova, posredno otezava jnvazjju ј mjgracjju tumorskjh celjja (1 20, 121). NAMI-A је ргvј rutenjjumskj kompleks kojj је usao u 1 fazu kljnjckjh studjja u Amsterdamu (Holandjja). NAMI-A, kao ј sегјја analoga u kojjma је jmjdazol zamenjen pjrazolom, tjazolom јјј pjrazjnom, pokazuju odsustvo cjtotokjsjcnostj in vitro jspjtjvanjem na celjjama TS/A, B16-F10, MeF-7) , alj poseduje in vivo antjmetastatsku aktjvnost na modeljma tumora: mjsjeg Lewjs kaгcjnoma pluca, меа karcjnoma sjsara ј 816 melanoma. NAMI-A ј analozj redukuju formjranje metastaza, jndukuju smanjenje rasta prjmarnog tumora ј povecanje prezjvljavanja zjvotjnja (122). NAMI-A, prjmenjen jntrapeгjotonealno se izbacuje jz organjzma veoma brzo preko bubrega: u roku od 5 mjn. svega 10% Prvobltne koncentracjje agensa postojj u kгvj (114). 28 Doktorska disertacija-Teorijski deo u in vivo ispitivaпjima па modelima МСа carciпoma sisara, diпuklearпi kompleks Ru(lll), u kome su dva сепtгаlпа јопа Ru(lll) premosceпa blpiridiпom ili etileп-Ьipjrjdiпom , pokazuje aпtjmetastatske оsоЬiпе , slicпe kompleksu NAMI-A (123). тасап mehaпjzam aпtjmetastatskog dejstva NAMI-A пјје do kraja razjasпjeп. Pozпato је da NAMI-A iпhiЬise fuпkcjju ММР-2 , па пivou geпske ekspresjje ili posredstvom TIMP-2 (119). Takode, kao i NAMI, jma utjcaja па ugusceпje proteiпskog sloja koji jпkapsulira tumorsko tkjvo ј okruzuje krvпe sudove, tako da posredпo umaпjuje verovatпocu migracjje i iпvazjje tumorskih celija. Celije t retiraпe ovim kompleksom, pokazuju redukciju proliferacije, povecaпu ekspresiju receptora CD8+ i CD4+, kao i karakteristicaп zastoj celijskog ciklusa u G2/M fazi (124). Ookazi о aпtimetastatskom dejstvu kompleksa ruteпijuma predstavljaju osпovu daljih ispjtivaпja ј postavljaпja racioпalnih priпcipa u dizajпiraпju efikasпog antjmetastatskog ageпsa . 2. З. MEHANIZAM МЕТ AST AZIRANJA 1 INV AZIJE TUMORA lпvazjvпost ј metastatski poteпcjjal tumora su пajopasпiji aspektj bolesti kojj najvjse ugrozavaju zjvot pacijeпta (125-127). Kada tumor postaпe jпvazjvaп , rasipaпje tumorskjh celjja u orgaпjzmu odvija se putem ljmfпjh kaпala ilj krvпih sudova. Lokalпom invazijom tumorskog tkjva u zdravo tkjvo/organ tumor dovodi do kompresije zdravjh tkjva, njihovog osteceпja ilj ometaпja пormalпe fuпkcjje orgaпa , cjme ugrozava zjvot domacjпa . Najopasпiji momeпat u razvoju bolestj је upravo uspostavljanje metastaze, kada pacijeпt ne moze vise Ьitj lесеп prjmeпom lokalпih terapija. Tumorj slicпe veljcjпe ј hjstologjje mogu jmatj potpuпo razlicjt metastatskj poteпcjjal (msp), zahvaljujuci geпetskjm faktoгjma ј utjcajjma sredjпe. Faktorj kojj odredjuju msp celije su: о Mjkrosredjпa ј cjtokiпi lokalпog tkjva; о Faktori aпgjogeпeze; о Geпetska osпova tumorske celije, оdпоsпо molekularnj feпotjp celije. 29 Doktorska disertacija-Teorijski deo 2. 3. 1. MIGRACIJA TUMORSКIH CELIJA Mjgracjja tumorskjh celjja је neophodan jnjcjjalnj korak u metastazj tumora, najpre u tгenutku kada celjja tumora napusta pгjmarnj tumor ј dospeva u cjrkulac jju, kao ј na kraju jnvazjje kada se prjkacj na drugo mesto u organjzmu, gde се nastavjtj da se umnozava ј formjratj sekundaгnj tumor. Tumorska celjja odgovara na gomjlu sjgnala kojj aktjvjraju pokretlj jvost ј rast celjje, оdпоsпо sjgпala koje luce same tumorske celjje, zdrava tkjva ј vaпceljjskj matrjks (ECM-extra cellular matrix) (128, 129). Као odgovor па delovaпje hemoatraktaпata, na tumorskjm ce ljjama javljaju se pseudopodjje koje mogu jmatj vjsestruku funkcjju : kao seпzorп j elemeпtj za usmeravaпje mjgгacjje 6eljje, u sekrecjjj faktora za moЬi lпost, u jпdukcjjj procesa proteoljze matrjksa tokom kretaпja tumorske 6eljje kroz ЕСМ, kao ј u trasjraпju kretaпja tumorskih celjja (1 30). U procesu metastaze tumor se "oslaпja" па domacjna, u smjslu da su za mjgracjju tumorskjh celjja neophodnj nekj faktorj hemotaksije koje luce zdrava tkjva; alj proces metastaze se ne moze odvijati bez autokriп ih hemoatraktaпata iz samjh tumorskjh celija (AMF- autocrine motility factor) (1 З 1 ). Prvi takav faktor kojj је jzolovaп је autotaksjn (АХТ), membranska protejп-kjnaza (1 32, 133), lосјгапа na роvгsјпј 6eljje (1 34). Novjja jstrazjvaпja ukazuju па пјепu fosfod iesterazпu aktjvпost. U regulacjjj procesa proljferacije tumorskjh celjja , mjgracjje, ргјkасјпјапја 6eljje za podlogu, proteoljze ЕСМ, ukjucenj su ј mnogj faktorj rasta kojj se vezuju za tjroziп­ kjnaza-povezane receptore (1 35), kao sto su: EGF (epidermal growth factor) epjdermalnj faktor rasta ; PDGF (platelet derived growth factor) faktor rasta krvnjh plocjca; VEGF (vascular endothe/ial growth factor) vaskularnj endoteljjalnj faktor rasta ; HGF/SF, parakrjп i faktor pokretljjvostj kojj luce epjtelijalne ј eпdoteljjalпe 6eljje; HGS/SF, vezuje se za receptor produkat protoonkogeпa c-met ; TGF-13. faktor rasta tumorskjh 6el jja. 30 Doktorska disertacija-Teorijski deo ----------------------------------------- 2. З. 2. PROCES INVAZIJE TUMORSКIH CELIJA Dosadasпja jstrazjvaпja ukazuju da su angiogeneza tj . tumorom jпdukovaпa neovaskularjzacjja tumorskog tkjva ј invazija obavezпj гапј dogadjajj u razvoju tumora. /nvazija је mпogo efjkasпjjj proces od metastaze, sa mjljoпjma celjja rasutjh u cjrkulacijj dnevпo, alj samo пekoliko celjja uspeva da uspostavj поvе koloпjje па mапје jlj vjse udaljeпjjm mestjma od primarпog tumora. Proces jпvazjje , пјје statjcaп рюсеs kojj se odvjja zahvaljujucj prjtjsku sredjпe usled prekomerпe proliferacjje tumorskjh celjja, vec је aktivaп , dјпаmјсап proces koji zahteva protejnsku sjпtezu ј degradacjju (1 36). Tumorske celjje moraju da sjпtetjsu ј luce eпzjme kojj razgradjuju vaпceljjskj matrjks u cjlju jпvazjje u регјtопеаlпu sup lj j пu jlj krvotok. Ргјmагпј dogadjaj u jпvazjvпoj kaskadj celjja tumora је proteoljza kolageпa baza lпe membraпe , koju kataljzuju eпzjmj metaloprotejпaze matгjksa (ММР) . 2. З. З. M ETALOPROTEINAZE MATRIKSA (MMPS-" MATRIX METALLOPROTEINASES'J Matrjksпe metaloprotejпaze (MMP-"matгjx metalloprotejпase") su famjljja od oko 28 metaloeпzima (1 37), kojj kataljzuju razgradпju cjtavog пiza proteiпa vaпcelijskog matrjksa kao sto su: lаmјпјп , kolageп (IV), fjbriп , fibroпektiп , vjtroпektjп . Prvobltпa podela enzima familjje ММР Ьila је па osпovu specjficпosti za ројеdјпе kompoпeпte ЕСМ па: kolageпaze, zelatjпaze, stromeljzjпi , matreljzjпj . Daпas је prjhvaceпa podela ММР па osпovu strukture па osam klasa, od kojjh su pet sekretorпe metalprotejпaze а tгј su membraпskj vezaпe MMPs (MT-MMPs) (1 38). Sekretorпe metaloproteiпaze takodje ostaju locjraпe Ьljzu celjjske membraпe, jnterakcjjom sa receptornjm proteпjma celjje kao sto su јпtеgгјп (а, ~. х) ilj receptor CD44. ММР se luce u formj пeaktjvпog-proeпzjma , tj, da Ьi se aktjvjrale пеорhоdпо је katalitjcko серапје N-teгmjпalпog domeпa eпzima , u pгjsustvu пeophodпih kofaktora tj . jona bakra, Cu2• i ciпka , Zп Z+ (1 39). Postoje takozvaпi plazmiпogeп aktivatori, оdпоsпо serjn-proteaze koje prevode plazmjпogeп u ak1jvпu formu eпzima. 31 Doktorska disertacija-Teorijski deo osnovпa gradjvпa kompoпeпta bazalпe membraпe је kolageп tjpa (IV), па koga se oslanjaju lаmјпјп , heparaп-sulfat , proteogljkaпj ј jos пеkј sporedпj elemeпtj . Kolageп tjpa (IV) razgradjuju, dve zelatjпaze , razljёjte ро svojoj kataljtjёkoj aktjvпostj: zelatjпaza ММР- 2 (92 KD) ј ММР-9 (72 KD) (140). Zelatjпaza ММР-2 је lосјгапа па povrsj пj celjja melanoma ј povrsjпj kгvпjh sudova kojj prozjmaju tumor, prezeпtovaпa u vjdu kataljtjёkj aktjvпe forme, ёјmе se ubrzava degradacjja kolageпa . Eпzjmj ММР famjljje takodje jmaju ulogu u: oslobadjaпju faktora rasta TGF-13 паkоп katal jtjёkog серапја prekursorskjh form j; proteoljzj receptora za faktore rasta EGF familjje : HER2 ј HER4; proteolizj celjjskjh receptora za adhezjju; јпtеgгјп, E-kadheгjп ј CD44, sto rezultuje povecajem jпvazjvпog ропаsапја celjje. ММР eпzjmj jmaju ulogu u regulacjjj aпgjogeпeze ј jпdukcjjj apoptoze celjja (1 41 ). ММР-9 proteoljzom jпterleukjпa-2 jпhjblse IL-2 jпdukovaпu proljferacjju Т ljmfocjta. Degradacjja bazalпe membraпe пе zavjsj samo о kоlјёјпј prjsutпjh aktjvjгaпjh proteaza, vec se radj о ravпotezj sa ргјгоdпо postojecjm jпhjbltoгjma . Postoje епdоgепј faktoгj koje lucj zdravo tkjvo, takozvaпj ТIМР faktori (TIMP-tissue inhiЬitor of metalloproteinase family) , kojj jmaju fuпkcjju u jпhjblcjjj metaloprotejпaza (1 42, 143) Ravпoteza jzmedju faktora vaпceljjske sredjпe: MT-MMPs, MMPs ј TIMP odreduje da lj се docj do degradacjje matгjksa . ТIМР- faktori deluju kao sресјfјёпј alj ј kao пеsресјfјёпј jnhjbltorj. Fuпkcjja TIMP-1 ј ТIМР-2 пјје samo u jпhjblcjjj metaloprotejпaza (1 44). Опе mogu delovatj ј kao cjtokjпj kao ј u prepoznaju пekjh recepta па povrsjпj celjja, sto indjcjra da опј jmaju mпogo zпаёајпјјu ј sjгu ulogu. Takodje, jпhjbltor metaloprotjпaza је ј makroglobuljп-a krvпe plazme. Uосепа је pozjtjvпa korelacjja izmedju MMP-aktjvпostj tumorskjh celjja ј jпvazjvпjg potencjjala tumora, u studjjama па sjrokom spektru tumora kao sto su tumor ovarjjuma, pankreasa, pluca ј dojke. Tako је razvijen veljkj Ьгој ageпasa kojj ostvaruju svoje dejstvo jnhjblcjjom eпzjma fam jljje ММР jlj na пjvou genske ekspresjje, jlj jпhiblcjjom sjgnalnjh puteva kojj jndukuju ММР transkripcjj u, jl j jnhjblcjjom jnterakcjje ММР sa drug jm Protejnjma (1 41 ). 32 Doktorska disertacija-Teorijski deo Direktni inhibltori ММР- enzima se mogu podeliti u cetiri grupe: kolagen-peptidomimetici, kolagen ne-peptidomimetici, tetraciklini i kratki peptidi. Kratak prikaz sintetskih inhibitora MMP-enzima dat је u Tabeli 2. З. Veliki broj ovakvih agenasa је stigao do faze 111 klinickih studija. Tabela 2. З. Prikaz sintetskih inhibltora metaloproteinaza (141). /NH/8/TOR/ MATRIKSNIH METALOPROTEINAZA Kategorije ···-··-,· -·· .. Karakteristike ! Naziv agensa ...................................... -.......... ........... ............ .. ........ -.... -.......... _" ___ " ______ " ___ " ___ " _____ ," __ " .... _ ..... - .. Kolagen(IV) peptidomimetici Kolagen(IV) ne-peptidomimetici Tetraciklini Kratki peptidi Nekonvencionalni ј analozj supstrata za ММР Organska jedjnjenja Organska jedjnjenja konformacjono komplementama vezjvnom mestu enzima ММР Analozi tetracikl jna bez antiblotske aktivnosti inhiblsu aktivnost ј sjntezu ММР 1 i Batjmastat Marimastat ВАУ-12-9566 PrjnomastaVAG3340 BMS 275291 CGS 27023/MMI270 Metastat -·-·-·-----·---·--·-!·---·--.. -- _" _____ " ____ "_ Peptjdi vjsoko specjficni · za vezjvno mesto ММР ___ "" __ " .. _ ..... --... -...... - ...... _.f .... - .......... _ .. " .. , __ """,_ .............. _ ........ .. Ekstrakt jz hrskavjce ajkula lnhibltor angjogeneze .... ----·-·--·-·-- Komponente zelenog саја lnhibltori ММР-2 ј -9 lnhibltor ММР-2 33 Neovastat _1 ____ " ____ " __ " __ . _____ " ______ _ Acetjlsalicilna kiselina Doktorska di.sertacija-Teorijski deo 2. 3. 4. GENETSКA REGULACIJA PROCESA METASTAZIRANJA мetastatskj fenotjp zahteva dodatne genetske promene sem onjh koje su odgovorne sa nekontroljsanu proliferacjju. ldentjfjkovan је veljkj broj onkogena kojj samostalno jlj u komblnacjjj jndukuju takozvanj "anchorage-jndependent" rast celjja u kolonjjj (145). lma jndjkacjja da postoje onkogenj kojj samostalno reguljsu jnvazjvnj ј metastatskj potencjjal celije. Jedan od najbolje jzucenjh onkogena је H-ras kojj , transfektovan u celjje NIН-ЗТЗ, dovodj do pojava metastaza in vivo. Otkrjvenj su, takodje, nm23 ј К/SS-1 genj (146). nm23 kodjra za nukleotjd-djfosfa-kjnazu. Kada se govorj о regulacjjj metastatskog potencjjala celjje , jos uvek njje razjasnjeno da lj је ta osoblna nezavjsno determjnjsana ј kontrolisana u celjjama tumora jlj је to zavrsni korak u kaskadj celijske transformacije. 2. 4. КASPAZE - ULOGA U APOPTOZI Apoptoza, "programirana celijska smrt", је aktivni, geneticki kontrolisani proces uklanjanja suvisnih ili ostecenih celija. Ovaj tjp celijske smrti podrazumeva prjrodnu degeneraciju celjja , alj nadeno је da se javlja i pod fizjoloskim, kao ј uslovima kojj su patoloski za celiju. Apoptoza је okarakterisana seгjjom morfoloskjh ј Ьiohemijskjh karakteristika uocljivih па nivou celijske plazma membrane, jedarnog materijala i cel ijskih organela (146). Tokom apoptoze dolazi do fragmentacjje DNK, kondenzacjje hromatjna, skupljanja celjje, pupljenja membrane ј formjranja membranom ojvjcenjh ostataka celjjskog materjjala, takozvanjh apoptotskjh tela. Ove promene mogu se odjgratj u roku od 30-60 mjnuta ј rezultat su proteoljtjckog dejstva enzjma jz famjlje cjstejn-proteaza. Pored Bcl-familije pгotejna od сјје funkcjje/djsfunkcjje zavjsj ulazak celjje u apoptozu, kaspaze predstavljaju glavne jzvrsjoce mehanjzma apoptoze (147, 148). Kaspaze se sjntetjsu u vidu neaktjvnog proenzjma (zjmogena), а aktjvjraju se (auto)kataljtickim cepanjem Polipeptjdnog lanca, cjme nastaju dve subjedinice heterodimera. 34 Doktorska disertacija-Teorijski deo u celijama zdravih tkiva kaspaze su Ыokirane u neaktivnoj formi zahvaljujuci IAP- proteinima, takozvanim inhibltorima apoptoze (1 49). Kaspaze se ро svojoj funkciji mogu podeliti na: inicijatome, kao sto su kaspaza-8 i-9, (ucestvuju u aktivaciji ostalih kaspaza); efektome: kao sto је kaspaza-3 (ucestvuju u proteolitickoj degradaciji ciljnih enzima (148, 150). Slozeni mehanizam propagacije apotoze u kome ucestvuju kaspaze је prikazan na slici 2. 4. (151 ). Supstrat za delovanje ovih enzima su signalni proteini koji odrzavaju strukturni integritet celije kao i proteini-negativni regulatori koji stite celiju od ulaska u apoptozu, kao sto su: protein ICAD' inhibltor DNK- nukleaze; protein Bcl-2, negativni regulator apoptoze; /amin-gradivni protein, koji u vidu polimera оЫаzе nuklearnu membranu, а takode ucestvuje u organizaciji hromatina; PARP (PolyADP-ribose polymerase), nukearni enzim koji katalizuje polimerizaciju ADP-riboze u oligonukleotidni lanac. Smatra se da PARP ima ulogu u popravci lezija DNK. Polimer ADP-riboze, vezivanjem DNK templata, uklanja histonske proteine i omogucuje pristup DNK- reparacionih enzima. Postoji nekoliko puteva aktivacije apoptoze: о Preko celijskih receptora iz familije TMF (tumor-necrosis faktor) kao sto је Fas/CD95, koji nakon vezivanja citotoksicnog liganda (F AS) prenose signal па kaspazu-8, cesto pro-kaspazu 10, Kaspaza-8 zatim aktivira efektorne kaspaze (-3, -6, -7) (152). о Oslobadanjem u citosol proteina mitohondrija kao sto su: citohrom с, faktor indukcije apoptoze (AIF-apoptosis inducing factor), endonukleaza-G. Citohrom с ucestvuje dalje u propagaciji signala na kaspazu-9. о Putevi pokretanja apotoze nezavisno od kaspaza, npr. aktivacijom AIF. Tumorske celije imaju pojacanu ekspresiju kaspaza ali , takode, i odgovarajucih inhibltora. Skorija istrazivanja ukazuju da se pojedini derivati polifeniluree vezuju za inhibltore kaspaza -3, -7 i -9, (XIAP) (153). Takozvani XIAP antagonisti, nemaju Ьitnih efekata na zdravo tkivo in vivo, а mogu podstaci apoptozu tumorskih celija direktno, premoscenjem brojnih elemenata kaskade. Kaspaze i njihovi inhibltori/aktivatori predstavljaju znacajne terapeutske markere u dizajniranju antitumorskih agenasa. 35 Dokto1·ska disш·tacija-Teorijski deo Slika2.4. Рпкаz mehaлizma apoptoze putem aktivaclje kaspaza {http: lllvн•ltl.calblocllem. apoptosis.com) 36 Doktorska disertacija - Materijal i metode 3. MATERIJAL 1 METODE 37 Doklorska disertacija - Male1·ijal i metode 3.1 . HEMIJSКA STRUКТURA ISPIТIVANIH KOMPLEKSA Hemjjska struktura kompleksa platjne(ll), rutenjjuma(lll) , hroma(lll) ј rodjjuma(lll), сјја је antjtumorska aktjvnost jspjtjvana u ovom radu, prjkazana је па slikama (SI. 3. 1.а . ј Ь .). Svi navedeni kompleksi su sintetisani na osnovu poznatih literaturnih podataka (8, 154). Cistoca kompleksa odredena је mikroanalizom ј NMR analjzom. Sl. 3. 1.а. СFз С~Нз о о) t"" L о CF, СНз о х~ 1\ ~CI13 CF3 11 Strukturne formule kompleksa Ru(/11), Cr(/11) i Rh(/11) koji sadrie Ьidentatne j3-diketonato ligande: /) Kompleks sa Ьidentatnim acetilacetonat /igandom (асас); X=Ru(/11), Cr(/11), Rh(/11); //) Kompleks sa Ьidentatnim trifluoroacetilacetonat ligandom (tfac); X=Ru(/11). 38 Sl. 3. 1 . Ь. Ј) П) ЈП) 11) Ch.__ р _...- Cl ЊNс::::"""" ~ NЊ 1) Doktorska disertacija - Matuijal i metode 111) Strukturne formule ispitivanih Pt(/1) komp/eksa: cis-diammindihlorop/atina(/1), cis-[Pt(NH3)2C/2], cisplatina, CDDP; cis-dipiridindih/oroplatina(/1), cis-[Pt(Py)2C/2], (Py=piridin); trans-dipiridindih/oroplatina(/1), trans-[Pt(Py)2CI2], (Py=piridin). 39 Doktorsko disutacija - Materijal i metode З. 2. SASTAV HRANLJIVOG MEDIJUMA RPM11640 RPMI-1640 medium је primarno firmulisan i namenjen za gajenje humanih celija u kulturi koje rastu u monosloju ili u suspenziji. RPMI 1640 podloga је proizvod jstrazjvaca Moore et а/. (155}, sa jnstjtuta "Roswell Park Memorjal lnstjtute", ро cemu јој је ј dat nazjv RPMI. Osnovni sadrzaj podloge је fosfatnj pufer (PBS-Phosphate Buffer Saljne), u kojj se dodaju amjno kiseljne ј vjtaminj. Hemjjskj sastav RPMI 1640 podloge је sledecj (g/1): З. 2. 1. NEORGANSKE SOLI Са(NОз)2 х 4Н20 0,1 KCI 4,0 MgS04 0,048 MgS04 х ?Н2О 0,10 NaCI 5,960 NаНСОз 2,0 Na2HP04 0,80 З. 2. 2. AMINOКISELINE L-glutamjn 0,3 L-Gijcjn 0,01 L-Histjdjn 0,015 L-Hidroksiproljn 0,02 L-lzoleucjn 0,05 L-Leucjn 0,05 L-Lizin-HCI 0,04 L-Metionin 0,015 L-Prolin 0,02 40 L-Fenilalanin L-Serin L-Treonin L-Triptofan L-Tirozin х 2Na х 2Н2О L-Valin З. 2. З. VITAMINI 0-Biotin Holin-hlorid Folna kiselina Mioinozitol Niacinamid p-Aminobenzoeva kis . 0-Pantotenska kis . Piridoksin х HCI Riboflavin Tiamin х Hcl Vitamin 812 З. 2. 4. 0 STALE KOMPONENTE 0-Giukoza Glutation HEPES Fenol crveno (Na-so) 41 Doklo1·ska disertacija Matuija/ i metode 0,015 0,03 0,02 0,005 0,029 0,02 0,0002 0,003 0,001 0,035 0,001 0,001 0,00025 0,001 0,002 0,001 0,000005 2 0,001 5,958 0,0053 Dokt01·ska dise,·tacija Mate1-ijal i metode з. З. SASTAV McCOY'S SA MEDIJUMA (MODIFIKOVANOG) McCoy-ev medjum је prvobltno formuljsan ј prjmenjen za gajenje humanjh ljmfocjta (155). Modjfjkovanj McCoy-ev 5А medjjum је bazjran па prvobltnoj formul j ј modjfikovan od strane jstrazjvaca Hsu ј Kellog (157), а kasnjje dodatno modjfikovan od strane lwakata ј Grace ( 157а). Osnovnj sadrzaj podloge је fosfatnj pufer, u kojj se dodaju neorganske soli, amjno-kjseline, vjtamjnj ј ostale komponente. Hemjjskj sastav McCoy-eve 5А podloge је sledecj (g/1 ): З. З. 1. N EORGANSKE SOLI CaCI2(anhjd.) 1.0 CaCI2 х ЊО 1,32 KCI 4,0 MgS04 х 7ЊО 2,0 NaCI 5,960 NаНСОз 2,20 NаЊРО4 х Н2О 0,58 NaH2P04 х 2ЊО 0,655 З. З. 2. AMINOКISELINE L-glutamjn 0,3 L-Gijcin 0,01 L-Hjstjdin 0,015 L-Hjdroksiproljn 0,02 L-lzoleucjn 0,05 L-Leucin 0,05 L-Ljzjn-HCI 0,04 L-Metjonjn 0,015 L-Proljn 0,02 L-Fenilalanjn 0,015 L-Serjn 0,03 42 L-Treonin L-triptofan L-Tirozin х 2Na х 2Н2О L-Valin З. З. З. ViTAMINI Vitamin С 0-Biotin Holin-hlorid Folna kiselina i-lnozitol Nikotinamid Nikotinska kis. p-Aminobenzoeva kis . 0-kalcijumpantotenat Piridoksin х HCI Piridoksal х HCI Riboflavin Tiamin х HCI Vitamin 812 З. З. 4. 0 STALE KOMPONENTE Bakto-pepton 0-Giukoza Glutation HEPES Fenol crveno( Na-so) 43 Doktm·ska dise,·tacija - Mate,·ijal i metode 0,02 0,005 0,029 0,02 0,0005 0,0002 0,005 0,0098 0,036 0,0005 0,0005 0,001 0,0002 0,0005 0,0005 0,0002 0,0002 0,002 0,6 3,0 0,0005 5,960 0,01 Dokt01·ska diser·racija - Mater·ijal i metode З. 4. PRIPREMA HRANLJIVOG MEDIJUMA Praskasta podloga; RPMI 1640; McCoys 5А (Sjgma Chem. Со, St. Loujs. SAD) је rastvorena u sterjlnoj destjlovanoj ЊО (102 g/ 1) , uz mesanje na 15-20 °С. U rastvor је dodato 2 g NаНСОз. Tokom prjpreme podloge рН vrednost medjjuma је podesavana na 0,1-0,2 jedjnjca jspod zeljene рН vrednostj, koja jznosj 6,7-7,0. Podesavanje р Н је vrseno rastvorjma 1 М HCI ј 1 М NaOH, а provera р Н је vrsena lakmus papjrom. Podloga је sterjljsana takozvanom "hladnom sterilizacijom", koriscenjem membranskog filtra poroznostj 0,22 mikrona. U podlogu је dodato 1 О% toplotom jnaktjvisanog fetalnog govedeg seruma (FCS- "fetal calf serum"). Pripremljena podloga је cuvana u frizideru , а pre upotrebe, tj . rada sa celijama zagrejana је do 37°С u vodenom kupatilu. З. 5. KUL TURE CELIJA U radu је upotrebaljen panel od 7 celijskjh ljnija tumora, od kojjh su celije Hela, 816, К562, Jurkat celijske linjje jz kolekcjje lnstjtuta za onkologiju ј radjologjju Srblje; А2780, U2-0S, U2-0S/Pt su poklon Nacionalnog instjtuta za onkologjju u Milanu (lst. Nazionale рег lo Studio е la Cura dei Tumorj, Milano, ltalia). 3. 5. 1. C EL/JE TUMORA EPITELA GRL/CA MATERICE (HELA) Celjje tumora epitela grlica mateгjce (Hela) (158) su poreklom humanog adenokarcjnoma. Poseduju morfologiju naljk fibroЫastima ј diploidni broj hromozoma (2n=46). Rastu u monosloju u hranlj jvoj podlozi RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamjna ј 10% FCS. Optimalna gustina sadenja celija u kulturi је 2-5 х 105 celija /cm2, а prilikom pasaziranja odrzavaju se na gustjnj 70- 80% od pocetne. Optimalan broj pasaza је 276 . 44 DokJorska disertacija -Materijal i metode З. 5. 2. CELIJE HUMANOG KARCINOMA OVARIJUMA (А2780) Celjje humanog karcjnoma ovarjjuma (А2780) (lst. Nazjonale per lo Studjo е la Cura dej Tumorj, Mjlano) rastu u monosloju u hranljjvoj podlozj RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamjna ј 1 О% FCS. Optjmalna gustjna sadenja celjja u kulturj је 3-6 х 105 celjja /cm2, а prjljkom pasazjranja odrzavaju se па gustjnj 70-80 % od pocetne ( 159). з. 5. з. CELIJE MISJEG MELANOMA (816-V) Celjje mjsjeg melanoma (816-V) poseduju morfologjje fibroЬiasta ј osoblnu produkcjje melanjna. Rastu u monosloju u hranljjvoj podlozi RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamina i 10% FCS. Optimalna gustjna sadenja celija u kulturj је 3-6 х 105 celija /cm2, а prjlikom pasazjranja odrzavaju se na gustjni 70-80 % od pocetne. Optimalan broj pasaza је 45 (160). З. 5, 4. MALIGNE CELIJE HRONICNE MIJELOIDNE LEUKEMIJE (К562) Maligne celjje hronjcne mjjelojdne leukemjje (К562) su multjpotentne hematopoetske celjje. Odljkuju se djplojdnom garnjturom hromozoma (2n=46). Rastu u suspenzjjj u hranljjvoj podlozj RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamjna ј 10% FCS. Optjmalna gustjna odrzavanja celjja u kulturj је 105-106 cel jja /ml (161 ). З. 5. 5. CELIJE LEUKEMIJE HUMANIH Т LIMFOBLASTA (JURКAT) Celjje leukemjje humanjh Т ljmfoЫasta (Jurkat) odljkuju se produkcjjom jnterleukjna-2 (IL-2) i pseudoploidnom garniturom hromozoma. Rastu u suspenziji u hranljivoj podlozi RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamina ј 10% FCS. Optjmalna gustjna odrzavanja celjja u kulturj је 3-9 х 105 celjja /ml (162). 45 Dokto1·s!w disertacija -Materija/ i metode З. 5. 6. CELIJE HUMANOG OSTEOSARKOMA (U2-0S) Celije humanog osteosarkoma (U2-0S) su epitelijalne morfologije. Gaje se u monosloju u modifikovanom McCoy-evom 5А medijumu, opskrЫjenom sa 1 О% FCS-a i dodatkom 75 ml, 200 mM L-glutamina (163). З. 5. 7. CtSPLA ТINA·REZISTENTNI SOJ CELIJA HUMANOG OSTEOSARKOMA (U2-0S / РТ) Cisplatina-rezistentni soj celija humanog osteosarkoma (U2-0S 1 Pt), је izveden iz U2-0S celijske linije а gaji se pod istim uslovima kao i U2-0S celijska linija. ОЬе linije poklon su Nacionalnog instituta za onkologiju u Milanu, ltalia. З. 6. POSTUPAK ODRZAVANJA CELIJA U KULTURI Kulture tumorskih celija su odrzavane u hranljivoj podlozi: RPMI 1640; МсСоу 5А (Sigma Chem. Со, St. Louis) рН 7,2, sa 10% inaktivisanog fetalnog govedeg seruma (FCS-fetal calf serum) (164). Kulture su gajene u inkubatoru (С02 inkubator 220, Flow laboratories, UK) na temp. 37°С, u uslovima visokog nivoa vlage, sa 5% СО2. Za gajenje adherentnih celija korisceni su polietilenski sudovi-falkoni , zapremine od 50-450 ml, odnosno povrsine dna 25-225 cm2 . Odrzavanje celija u monosloju postignuto је presejavanjem celija u svezu podlogu tj. "pasaziranjem". svakih 4-5 dana. Pasaziranje celija је obavljano u sterilnoj komori uz koriscenje sterilnih laboratorijskih sudova i nosenjem zastitne laboratorijeke opreme. Pasaziranje se vrsi kada celije potpuno prekriju dno suda, ili kada se istrose nutrijenti podloge, na sta ukazuje indikator promene рН podloge. 46 Doktorska diset·tacija - Materijal i metode З. б. 1. POSTUPAK PASAZIRANJA CELIJA Kada su nutrijenti podloge istroseni (na to ukazuje promena Ьоје podloge), medijum је odliven iz falkona sa Hela celijama, а dno suda (Р= 25cm2) (na kome su zalepljene celije) је isprano sa З ml, 0,25% rastvora tripsina, zagrejanog do 37°С, u vodenom kupatilu. Ce\ije u falkonu su zatim inkublrane u rastvoru tripsina (5m1Nralkona=50 ml}, na temp. 37°С, 1-5 min. Promena morfologije celija је pracena pod svetlosnim mikroskopom na uvelicanju 20/0,40. Kada su celije pocele da menjaju morfologiju (dobljaju okrugao oЬ\ik} , rastvor tripsina је prenesen iz falkona u epruvetu. Celije koje su ostale zalepljene za dno falkona su prikupljene sprjcem, resuspenzijom u podlozj 2-3 puta. Jedna zapremina suspenzije celija је vracena u falkon, dopunjena svezim medijumom do zapremine V=15 ml ј falkon је vracen u inkubator. Preostala suspenzija celija је koriscena za eksperimente in vitro. З. б. 2. КINEТIKA RASTA CELIJA Analiza ponasanja celija in vitro zasniva se na razumevanju procesa rasta i proliferacjje, sto podrazumeva ј pravilno odredivanje broja celija (164). Procena rasta kulture celija moze se vrsitj posmatranjem celija pod svetlosnim mikroskopom, ali kvaпtitativпi ekperimenti na celijama zahtevaju odredivanje tacпog broja celjja па kojima se vrsi eksperiment. З. б. З. H EMOCITOMETAR Копсепtгасјја celjja u suspeпziji moze Ьiti odredena koriscenjem hemocitometra-opticki ravna komora za posmatranje celija pod mikroskopom. Celije se broje uпutar obelezeпih zona na komori, а broj celija ро m/ suspenzjje tj . hranjivog medijuma, odreduje se па osпovu formule. З. б. 4. P ROTOKOL ZA ODREE>IVANJE BROJA CELIJA 1) Priprema komore za Ьrојапје: necistoce па komori se uklaпjaju ispiraпjem povrsiпe sa 70% alkoholom. Na komoru se postavlja pokrovпo staklo, koje takode mora Ьiti cisto. 47 Doktorska disertacija -Malиija/ i metode 2) Prjprema celjja za Ьгојапје vгsj se prethodпjm prjkupljaпjem 6el jja gajeпjh u kulturj . Ukoljko su celjje adhereпtпe пеорhоdпо је trjpsjпjzjгatj jh korjsceпjem 0,25% trjpsjпa(1-2 ml tripsjпa/falkoп 75 cm2). Nakoп 1-2 mјп. delovaпja tгјрsјпа celjje meпjaju morfologiju (zaokrugljuju se) i odlepljuju se sa podloge. Celije se prikupe korisceпjem pasterove pipete ili sprica i preпesu u epruvetu. Miп i malaп broj celija koji se moze odrediti brojaпjem pod mikroskopom је 105 celija/ml, а роvесапје koпceпtracije celjja za postupak Ьгојапја postize se talozeпjem celija ceпtrifugiraпjem (1 О 000 rpm, 1 О miп). Nakoп talozeпja celije se resuspeпduju u maloj zapremjпj hraпljivog medijuma (1-2 ml). 3. б. 5. 0 DREEJ IVANJE VIJABILNOSТ/ H EL A CELIJA VjjaЬilпost se defiпise kao Ьгој zjvjh celjja u ukupпo 1 ОО jzbrojaпjh celjja . VijaЬilпost Hela celija, odredena је metodom Ьојепја sa tripaп-plavim , ј zasпjva se па osoЬiпi zivih celija da izbacuju boju tripaп-plavo i ostaju ЬеzЬојпе, dok mrtve celije akumuljraju boju ј postaju plavo оЬојепе (165). U 50 J.ll suspeпzjje celjja u hraпljjvom medjjumu, dodato је 450 J.ll rastvora Ьоје trjpaп-plavo (R11): Rastvorj za Ьојепје celija: R1: 0,2% rastvor Ьоје trjpaп plavo u destilovaпoj Н2О R11 : R1 гаzЫаzеп 5 х u 4,5% rastvoru NaCI (0,04% rasvor Ьоје tгјрап plavo) ОЬојепа suspeпzjja celjja је dobro promesaпa па vorteksu ј 50 J..tl ove suspeпzjje је ргепеsепо automatskom pipetom па komoru za Ьгојапје (Neubauer). Prosecaп Ьгој zivih celjja ро polju komore, odredeп је brojaпjem celija pod mjkroskopom па uveljcaпju 20/0,40. Svako polje па komoгj za Ьгојапје zauzjma zapremiпu od 104 cm3. Kako 1cm3 odgovara zapremjпj od 1 ml, broj celija ро ml росеtпе suspeпzije celija u hraпljivom medjjumu је dоЬiјеп ро formuli: N =Ns х R х 104 Ns = prosecan broj celija ро polju komore R = faktor razЫazenja celija u rastvoru za Ьојепје 48 Doktorska dise,.tacija -Mate,.ijal i metode 3. 7. 1SPITIVANJE CITOTOKSICNOSTI TESTIRANIH KOMPLEKSA Cjtotoksjcпost jspjtjvaпjh kompleksa Ru(ll l}, Cr(lll) , Rh(lll) ј Pt(lll) aпaljzjraпa је па paпelu 7 6elijskih ljп ija tumora: Hela, В 16, К562, Jurkat, А2789 , U2-0S, U2-0S/Pt, korjsceпjem dva razlicjta testa јпhјЬiсјје rasta: metodom Ьгојапја celija (166) ј мтт testom (1 67, 168). мтт (3-(4,5-djmetiltjazol-2-jl}-2,5- djfeпil-tetrazolijum bromid) је zuta tetrazolijumska Ьоја koja u celijj podleze redukcjjj do tamпo-crveпe Ьоје . U МТТ testu, vjjaЬilпost celja se odreduje па osпovu metaboljcke aktivпostj celija. 3. 7. 1. P OSTUPAK IZVOE>ENJA MTTTESTA. Citotoksicпost jzazvaпa kompleksima platiпe( ll ) ј Ru(ll l), i spitivaпa је kolorimetrijski МТТ testom (167, 168), па paпelu 5 6elijskih liпija : Hela, К562, Jurkat, U2-0S, U2-0S/Pt. Aпalizjraпj su cis-ltrans- koпfiguracjoпj izomerj kompleksa platiпe(ll ) [Pt[(Py)2CI2], kao ј пeplatiпski kompleks Ru(acac)3 u poredenju sa cjsplatinom. U sredisnje bunarcjce mikrotjtar ploce sa 96 sudica sa ravпjm dпom, zasejano је 1000 celjja u 50 J.!l hranljivog medjjuma RPMI 1640. Na svaka tri bunarcica sa Hela celjjama, ostavljena su tri bunarcjca u koje је sipan samo hranljivi medijum (slepa proba). Celije su gajene u inkubatoru na 37°С , u atmosferi vazduha zasicenog parom, sa 5%СО2. Neposredno рге dodatka pojedinacnog kompleksa platine(ll) napravljen је osnovni rastvor ispitjvanog kompleksa u DMSO ili u fizjoloskom rastvoru, u koncentracjjj 1- 10 mM. Merenja su vrsena na analjtjckoj vagi sa tacпoscu merenja na 4-toj decjmalj. Polazecj od pгjpгemljenog osnovnog rastvora, formjrana је sегјја razЫazenja Pt(ll) kompleksa u hranljjvoj podlozj. 20-24 h пakon zasejavanja celija u bunarcice, u bunarcjce sa celijama, kao ј u bunarcjce samo sa podlogom (slepa ргоЬа), sipano је u tripljkatu 50 J.!l svakog razЫa.Zenja jspjtjvanog agensa, korjscenjem automatske pipete. RazЫazenja kompleksa platine(ll) u podlozi su formirana tako da finalne koncentracije kompleksa u sudicu ploca budu redom: 6,25; 12,5; 25; 50; 100 (J..I.M). 49 Dokto1·ska disertacija -Materijal i metode celije su gајепе sa ispitivaп im ageпsom u СО2 - iпkubatoru па 37°С, tokom 48h. Nakoп iпkubacije , 20 џl МТТ rastvora (5 mg МТТ/ml PBS)(PBS-fosfatп i pufer. рН 7,2} је dodato u svaki sudic, а 4 h kasпije је dodato 1 ОО џl rastvora (1 О% SDS u 0,01 М HCI). Nakoп 20 h ploce su рrепеsепе па citac mikrotitar ploca sa 96 sudica, radi mereпja apsorbaпce па 570 пm . З. 7. 1. 1. Formiranje kalibracione krive za МТТ Polazeci od suspeпzije Hela cel ija u hraпljivoj podlozi (1 06/ml) , formiraпa је serija razЬiazeпja ove suspeпzije, tako da broj celija/ml bude redom: 12.500, 25.000, 50.000, 100.000, 200.000, 400.000. u 6 Х 6 sredisпjih buпarcica mikrotitar ploce sa 96 sudica sa ravпim dпom , zasejaпo је 1 ОО џl pripremljeпih razЬiazeпja (suspeпzija Hela celija) . U preostale buпarcice mikrotitar ploca sipaпo је samo ро 1 ОО џl hraпljive podloge, kao slepa proba. Na ovaj nacin "zasejane" su dve ploce i рrепеsепе u iпkubator sa 5% СО2, па 37°С. U jedпu plocu је пakon 4 h sipaп reageпs МТТ (5mg/ml PBS), оdпоsпо u svaki pojediпacni sudic sa celijama kao i u sudice sa slepim probama, naпeto је 20 џl reageпsa . Ploca је vra6eпa u iпkubator, а паkоп 4h је u svaki sudic sipano 1 ОО џl 10% rastvora SDS u 0,01 М HCI. Sutradaп је ploca ргепеsепа па ELISA citac radi merenja apsorbaпce па 570 nm. U drugu plocu је , паkоп 20 h inkubacije na 37°С u iпkubator sa 5% СО2, sipaпo 20 џl reageпsa МТТ u svaki sudic. Ploca је vгасепа u iпkubator i паkоп 4 h је u svaki sudic ploce папеtо 100 џl rastvora koji sadrzi 10% SDS u 0 ,01М HCI. Sutradaп је ploca preneseпa па ELISA citac radi merenja apsorbaпcije па 570 пm . Na osnovu doЬijeпih apsorbaпcija formiraп је grafik zavisnosti apsorbaпcije МТТ reageпsa u fuпkcij i Ьгоја celija , za vreme inkubacije celija t=O h (Т о) i t=20 h (Ђо). 50 Doktorska dise1·tacija - Mate1·ijal i metode З. 7. 1. 2. Obrada podataka lzraёunavanja parametara koji karakterisu intenzitet citotoksiёnog , odnosno citostatskog dejstva ispitivanog agensa uradjena su prema Monks et а/. (169). Sa kalibracione krive za МТТ је odredeno u kom opsegu broja celija postoji linearna zavisnost apsorbance na 570 nm od broja zasejanih celija ро sudicu. Kasniji eksperimenti su radeni u tom opsegu Ьгоја celija. Nakon inkubacjje ј gajenja celija sa razljёitjm koncentracjjama jspjtjvanog agensa ј nakon tretmana bojom МТТ ј rastvaranjem formazana, odredena је apsorbancjja uzoraka. Ako је Ak srednja vrednost apsorbancjje uzoraka celija gajenjh u hranljjvoj podlozi , А srednja vrednost apsorbancjje uzoraka celjja gajenjh u prjsustvu razljcitjh koncentracjja ispitjvanog agensa, i ako se kao probe korjste apsorbancjje hranljjvog medjjuma bez celjja, sa odgovarajucim koncentracijama jspjtivanog agensa, tada је : Prezivljavanje celija (%)= A/Ak х100 Konstru jsan је djjagram prezjvljavanja celija (%)= f/(koncentracjja agensa) ј jz navedene krjve doЬijen је podatak о koncentraciji agensa koja jzaziva smanjenje prezjvljavanja celjja za 50%, ICso, 51 Doklot·ska disutacija - Malet·ijal i melode З. 7. 2. TEST INHIB/CIJE RASTA Preljmjпarпe studjje cjtotoksjcпog dejstva пeplatjпskjh kompleksa Ru(lll), Cr(lll) ј Rh(lll) radjeпe su па А2780 celjjama, korjsceпjem testa јпh јЬiсјје rasta (166). u tu svrhu celjje su sadjeпe u mjkrotjtar ploce sa 6 rupjca, 2 х 104 celjja/ml, u hraпljjvoj podlozj RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamjпa ј 10% toplotom jпaktjvjsaпog govedeg seruma (FCS). celjje su, 24 h kasпjje jzlozeпe dejstvu jspjtjvaпjh kompleksa u koпceпtracjjj З, 1 О , 30, 1 ОО (1-LM). Nakoп 24 sata koпtiпualпog dejstva ageпsa, hraпljj vi medijum је zаmепјеп medijumom bez ageпsa , ј jпkubacjja пastavljeпa jos 72 h u iпkubatoru па 37°С . Superпataпt је оdЬасеп а adhereпtпe celjje prj kupljeпe tripsiпjzacijom , sa 200 1-11 0,25% trjpsiпa . Suspeпzjji celija је dodato 5 ml pufera za Ьrојапје celija ј broj celija odredjeп па brojacu celija ("cell couпter") . З. 7. З. ISPIТIVANJE KOMBINOVANOG C/TOTOKS/CNOG DEJSТVA KOMPLEKSA Ru(ACAC)з 1 C/SPLA ТINE /LI OKSALIPLAТINE, NA HELA CEL/JAMA. U cilju jspjtivaпja uticaja пeplatinskog kompleksa Ru(acac)3 па efekat dejstva cjsplatjпe ј oksali p latjпe (kompleksa platiпe sa izrazeпim cjtotoksjcпjm dejstom) па Hel a celijama, jzvrseпa је studija komЬiпovaпog dejstva ageпasa, korjsceпjem МТТ testa (167, 170). З. 7. З. 1. Postupak koinkubacije Ru(acac)з sa cisplatinom odnosno oksaliplatinom Hel a 6elije (3000 celjja/ml) su zasadjeпe u sudjce 96-mjkrotjtar ploce u hraпljjvoj podlozj RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamjпa ј 10% FCS. Nakoп 24 h rasta 6eljja, dodat је RPMI 1640 medjjum sa sadrzajem jspjtjvaпjh supstaпcj u razljcitjm komЬiпacjjama: Ru(acac)з u koпceпtracjjj (0,5 х ICso; 1 х IC50; 1.5 х IC50) u komЬiпacjjj sa cjsplatjпom /jlj oksaliplatjпom u kопсепtгасјјј (0,5 х IC50; 1 х IC50; 1 ,5 х IC50). Vredпostj IC50 odredeпe su za 72 sata dejstva supstaпce korjsceпjem МП testa (poglavlje 3.7.1.). 52 DokJorska disertacija - Materija/ i metode Nakoп 72 h koпtiпualne koiпkubacije ispitivanih ageпasa , prezivljavaпje celija odredeno је kolorimetrijski koriscenjem МТТ metode. Opticka gustiпa merena је na .Л.=570 пm. Na osпovu dobljeпih vredпosti apsorpcije, formiraпa је kriva prezivljavaпja celija. Sa krive prezivljavaпja odredeп jeudeo mrtvih celija Fa ("cells affected"). Na osnovu te vredпosti (Fa) izracuпat је udeo celija koje su prezivele Fu ("cells unaffected")(Fu =1-Fa). Dobljeni podaci su statisticki obradeпi ро metodi Shou апd Talalay (171, 172) korisceпjem softvera (Calcy Sуп, Biosoft) (173), za izracuпavaпje i graficko prikazivanje komblпacionog indeksa Cl (епg. : ComЬination lndex). Svaka koпcentracija supstanci, tj. njihova komblnacija, primenjena је u tri poпavljanja. Rezultujuce Cl vrednosti su dobljeпe па osпovu 2- 3 nezavisna eksperimeпta. З. 7. З. 2. Statisticka obrada podataka Cl indeks ukazuje па modalitet medusobnog dejstva supstanci, pri komblпovanom dejstvu (172). Efekat komblпovaпog dejstva supstaпci moze Ьiti umапјеп u odпosu па efekat dejstva pojedпacпih supstaпci, kada se govori о aпtagoпizmu (CI<1); ројаёап u odпosu па efekat dejstva pojednacпih supstanci, kada se govori о siпergizmu (u medjusobnoj iпterakciji јеdап lek pojacava dejstvo drugog leka Cl>1 ); ili jedпak zblru efekata pojedinacпog dejstva, kada se govori о aditivпom dejstvu (CI=1 ). Softver Calcy Syn (173) koriscen је u ovom radu za obradu i graficko prikazivaпje komblnacioпih iпdeksa (CI) па osпovu sledece funkcije Uedпacine): CI=Fa/Fu+ (D/Dm) х т Fa-("fraction affected") udeo celija koje su podlegle dejstvu supstance (odredeno sa krive prezivljavanj celija, poglavlje З. 7.) Fu- ("fractioп unaffected") udeo celija koje su zive. D- ("dose")-doza supstance Dm-(" medijan effect dose") m=koeficijent koji ukazuje na oЫik krive prezivljavanje celija (m=1 hiperbola; m>1 sigmoidan oЫik; m<1 negativno sigmoidan oЫik) . 53 Dokrorska disertacija - Materijal i merode lndeks Cl moguce је doЬitj racunskjm putem па osnovu јеdпасјпе (172): CI=(D)1/(Dx)1+ (D)2/(Dx)2 + a(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2 (0)1, (0 )2- koпceпtracjje supstaпcj prjmenjeпjh u komЬinacjjj potrebnjh da se projzvede (efekat) prezjvljavanje Х. (Ох)1, (Ох)2- kопсепtгасјје supstaпcj primeпjenjh jпdjvjdualпo potrebпih da se proizvede (efekat) prezjvljavanje Х. Оео јеdпасјпе а(0)1(0)2/{Ох)1(0х)2 potrebaп је kada lekovj (supstaпce) jmaju potpuno drugacjje mehaпjzme delovaпja. Treba пaglasjtj da Cl moze da vaгjra sa promeпom opsega kопсепtгасјја lekova, tako da јеdпа komЬiпacjja koпceпtracjja lekova moze da daje aпtagonjstjcan efekat, druga komЬiпacjja adjtivan а treca komЬiпacjja sjпergjstjcan efekat (171 ). 3. 8. AFINITET INTERAKCIJE NE PLATINSKIH KOMPLEKSA SA GLUTATIONOM Afiпitet kompleksa metala па bazi Ru{ll l), Cr(lll) ј Rh(lll) da jnteraguju sa glutatjoпom (GSH), ispitjvan је korjsceпjem dveju in vitro metoda: Tjetz-e esej (174) ј kojпkubacjoпj esej sa Ьutјопјп sulfoksjmjпom (BSO) (174). GSH tripepdidni tiol , y-glutamjlcjsteinilgljcjп , пajzastupljeпjje sulfhjdrilno јеdјпјепје u celjjj, prjsutaп u konceпtracjjj 0,5-10 mM. Reakcjjom sa пukleofjljma , kao sto su kompleksj metala npr. Pt(ll), u odпosu 2:1, formjra kompleks GS-Pt-GS, koji moze Ьitj јzЬасеп iz celije preko роsеЬпе АТР zavjsпe pumpe. Tako GSH stiti celiju od citotoksjcпog dejstva cisplatiпe, cime је ukljucen u neke mehaпizme rezisteпcije па cisplatinu. 54 Doktorska dise1·tacija - Materijal i metode 2. 8. 1. P OSTUPAK ODREf>IVANJA GLUTATIONA METODOM РО Т/ETZ·U Ovim postupkom analizirana је kinetika interakcije kompleksa Ru(lll), Cr(lll) Rh(lll) za glutationom in vitro (174). Detektuje se zapravo preostala kolicina neodreagovanog glutationa na osnovu aktivnosti enzima glutation-reduktaze. Pripremljeni su rastvori ispitivanih kompleksa u fizioloskom rastvoru ekvimolarne koncentracije: 3.2 mM. U 300 1-11 rastvora GSH koncentracije 300 j..tQ/ml dodato је 1 ОО 1-11 odnosno 200 j..tl rastvora ispitivanih supstanci i dopunjeno sa 450 1-11 - 350 1-11 pufera А, do zapremine 850 1-11. Reakc.iona smesa је inkuЬirana preko noci. Sutradan је merena apsorbancija pojedinacnih rastvora na Л=412nm . Као slepa proba koriscena је smesa rastvaraca (DMSO: fizioloski rastvor : pufer А) u procentnom odnosu (2% :10%: 88%). Postojanje neizreagovanog GSH u rastvoru odredjeno је kvantitativno sa standardne krive, na osnovu smanjenja apsorbancije па Л.=412nm. Pufer А • Fosfatni pufer О , 1 М, р Н 7,2. • DTNB (3,95 mg 1 ml PBS) • Glutation-reduktaza, 1 mg/ml, (razЫazenje 1:1 О) • NADPH (8.33 mg/ml PBS) З. 8. 1. 1. Standardna kriva Radi formiranja standardne krive za GSH napravljena је serija standardnih rastvora GSH (u PBS О, 1 М) koncentracije 1 ОО, 150, 200, 250, 300 j..tQ/ml. U 300 1-11 rastvora GSH dodat је pufer А do zapremine 850 џl. Apsorbancija је merena na Л=412 nm. 55 Dokto1·ska disertacija - Marerija/ i metode 3. 8. 2. P OSTUPAK ISPIТIVANJA UТICAJA BUT/ONIN·SULFOKSIMINA (8$0) NA CITOTOKSICNO DEJSТVO AGENASA Butjoпjn sulfoksjmjn је sjntetska amjnokjseljna koja deluje kao jnhjbltor enzjma y-glutamjl-cjstejn-sjntetaze, odgovornog za pocetnj korak sjnteze GSH. lreverzjbllna jnhjЬicjja kljucnog enzjma u sjпtezj GSH, rezultuje smanjejem koпcentracjja GSH u celjjj , sto moze jmati utjcaja па cjtotoksicпj efekat ageпasa . Preljmjnarпe studjje utjcaja butjonjп-sulfoksjmjna (BSO) па cjtotoksjcпo dejstvo kompleksa Ru(l l l) ј Cr(lll) radjene su па А2780 celjjama (174). U tu svrhu celjje su sadjeпe u mjkrotjtar ploce sa 6 rupjca, 2 х1 04 celjja/ml. 24 h kasпjje celjje su tretjrane sa BSO u koпcentracjjj 1 119/ml ј jstovremeпo tretjraпe jspjtjvanjm ageпsom u koпceпtracjjj З , 10, 30, 100 (~-tM). Nakoп 24 sata koпtjпualпog dejstva BSO ј jspjtjvanog ageпsa jstovremeпo, podloga је zameпjena medjjumom bez ageпsa, ј jnkubacjja u termostatu nastavljeпa jos 72 h. Cjtotoksjcnj efekat odredjeп је testom јпhјЬiсјје rasta. З. 9. ODREDIVANJE INKORPORACIJE RADIOAKTIVNO OBELEZENIH NUKLEOTIDA U DNAIRNK Ovaj test se zasnjva па merenju jnhjblcjje ugradпje radjoaktjvпo obelezeпjh nukleotjda u пuklejпske kjseljne (DNK ј RNK) pod dejstvom ant jtumorskjh ageпasa (175). l пhjЬicjja јпkогрогасјје radjoaktjvпjh prekursora 13C-tjmjdjпa ј 3Н-uгјdјпа u makromolekule (DNK ј RNK) se uzjma kao mera in vitro osetlj jvostj tumora па datj lek. Nedostatak ovog testa је slaЬija jnkorporacjja prekursora u celjjama koje jmaju dugo vreme udvajaпja . Takodje је tesko j пterpretjгatj razl jke jzmedu celjjske smrtj uzrokovaпe lekom ј smrtj jzazvaпe smaпjeпjm traпsportom пukleotjda u celjji. 56 Doktorska disertacija - Materija/ i metode 3. 9. 1. PRIPREMA UZORAKA А2780 celije (7 х 104 celija/ml) zasejaпe su u buпarcice mikrotitar ploce sa 96 rupica, u hraпljivoj podlozi RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamiпa i 1 О% FCS, 1 ОО fll/rupici. Nakoп 24 sata rasta celije su izlozeпe dejstvu jspitivaпih komleksa: Ru(acac)з , Сг(асас)з i Rh(acac)з, tako da kопаспе koпeпtracije u sudicima ploce budu 1 О i 30 (!lM). Neposredпo паkоп dodavaпja kompleksa u buпarcjce ploce dodato је 1 О fll rastvora 13C-timidiпa (50 ~tCi/ml) , оdпоsпо 1 о lll rastvora 3H-uridiпa (1 llCi/ml). lпhjbltorпo dejstvo kompleksa па ugradпju radioaktjvпjh пukleotida jspitivaпo је u dva vremeпska jпtervala : za 6 sata ј za 24 sata. lпkubacjja је vrseпa па temp. 37°С u iпkubatoru sa 5% СО2. Nakoп 6 h оdпоsпо 24 h jпkubacjje ploce su smesteпe u uredaj za prjkupljaпje celija (Harvester 96-Tomptec) , gde su celije preneseпe па papirпu podlogu ј јsргапе 5 х sa dest. НzО. Uzorci па papirпoj podlozj jnkublraпj su па 30°С, 2 h, а паkоп toga radioaktjvпost uzoraka је mereпa koriscenjem aparata Uquid Scintillation Counter (1205 Betaplate, Perkiп Elmer, SAD). 3. 10. ANALIZA INTERAKCIJE ISPITIVANIH AGENASA SA DNK Postojaпje jпterakcije пeplatiпskih kompleksa sa celijskim DNK molekulom tj. vezivaпje za DNK, analizjraпo је korisceпjem masene spektrometrije ICP-MS (ICP-MS, inductively coupled p/asma mass spectrometry) (176). U tu svrhu А2780 сеЈјје (1 ,5 х 106 celija /10 ml) zasejane su u hraпljivoj podlozi RPMI 1640, рН 7,2, sa dodatkom 2 mM glutamiпa i 10% FCS, u falkonima povrsine 75 cm2 . U ekspoпeпcijalnoj fazj rasta, kada su celije dostjgle broj od 3,5 miliona ро uzorku, izlozeпe su dejstvu ispjtjvanih kompleksa u ekvimolarnoj konceпtracjjj , 1 ОО f.!M. Dejstvo kompleksa ispjtivaпo је za dva vremenska jntervala: 2 sata i 24 sata. Dejstvo kompleksa prekiпuto је nakon 2 h odnosпo 24 h, ispiranjem celjja u hladnom (4°С) fosfatnom puferu, рН 7,2. Celije su prikupljene tripsiпizacijom , а suspenzjja celija (ukljucujuci plutajuce i adherentпe celije), istalozena је centrifugiranjem па 2000 rpm, 5 min. Talog celija је јsргап hladnim PBS-om, dva puta, resuspeпdovan u 1 ml PBS-a, i preneseп u ependorf kivetu. 57 Doktorska disertacija - Materija/ i metode 3. 10. 1. IZOLOVANJE CELIJSKE DNK METODOM РО MANIAТIS·U (177) 1) Celije u suspeпzjjj su jstalozeпe, ceпtrjfugjraпjem u mjпjfugj , ( 1 О mјп, 14.000,rpm); 2) Superпataпt је ukloпjeп а pelet resuspeпdovaп u 500 J.ll TNE pufera (27); З) Dodato је 50 J.ll 1 0% rastvora Trjtoп-X-1 ОО; 4) Dodato је 10 J.ll protejпaze К (10 mg/ml); 5) lпkubacjja је jzvrseпa preko посј па 37°С; 6) Dodat је rastvor RNA-ze (1 mg/ml) do fјпаlпе kопсепtгасјје 50 J.!Qiml; 7) Dodata је јеdпа zapremjпa (500 ~-tl) РС9 pufera ј promesaпo па vorteksu; 8) Uzorakje ceпtrjfugjraп па mjпjfugj 10 mјп , 14.000 гр. ; 9) Vodeпa faza је ргепеsепа u пovu epeпdorf kjvetu, а koracj 7, 8, 9, ропоvlјеп ј jos jedпom ; 10) Dodata је јеdпа zapremjпa hloroforma; 11) Uzorakje ceпtrjfugjraп па mjпjfugj 10 mјп ., 14.000 rpm.; 12) lzdvojeпa је vodeпa faza ј dodat 0,3 М пatrjjum acetatпj pufer рН 5. 1 З) Dodata је јеdпа zapremjпa hladпog (4°С) etaпola . Precjpjtat DNK se javlja u roku od 1 h, па -20°С; 14) Uzorak je ceпtrifugjraп 1 h па 17.000 rpm, па 4°С; 15) Pelet је јsргап etaпolom ј ceпtrifugiraпje ропоvlјепо 15 miп, па 17,000 па 4°С; 16) Supreпataпt је ukloпjeп а pelet osusen na vazduhu, 20 min; 17) Pelet је resuspendovan u 200 J..tl ТЕ pufera; 18) Za kvantitativnu detekciju DNK u uzorku, mегепа је apsorbaпcija na talasпoj duziпi Л.=260/280, tako sto је 2,5 J.ll DNK rastvora гаzЫаzепо sa 495 J..tl ЊО, а apsorbaпcija (ОО) uzorka merena па spektrofotometru, za гаzЫаzепја 200 х i 50 х; 19) Копсепtгасiја DNK izrazena је u jedinicama J.lQ/ml; 58 Doktot·ska diset·tacija - Materija/ i metode Puferi: TNE: • 1 О mM Tris-HCI (р Н 8) • 100 mM NaCI • 1 mM EDTA РС9: • 1 ОО ml fenol • 100 ml hloroform • 1 О mM Tris-HCI (р Н 9) ТЕ: • 10 mM Tris-HCI (рН 8) • 1 mM EDTA (рН 8) PBS: рН 7,8 59 Doktorska diserracija - Materijal i metode З. 10. 2. ISPIТIVANJE INTERAKCIJE TESТIRANIH KOMPLEKSA SA DNK IN VITRO Radj jspjtjvaпje afjп jteta kompleksa metala, za jпterakcjju sa DNK molekulom, sprovedeпo је jspj tjvaпje in vitro па fragmeпtu (Епg .: ladder) DNK duzj пe 123 Ьаzпа рага (Ьр) (178). Svakj ројеdјпаспј kompleks jпkublraп је sa 5 џl rastvora plazmjdпe DNK (1 џg/ml), prj cemu је jspjtjvaпj kompleksa рrјmепјеп u koпceпtracjjama: О , З J..LM ј З џМ. Копаспа zapremjпa reakcjoпe smese od 50 J..i.l postjgпuta је dodatkom pufera рН 7,4, koji sadrzi: Na2HP04 (1 mM) i NaCI (З mM). Reakcioпa smesa jпkuЬiraпa је preko посј па З7°С , паkоп cega је fragmeпt DNK jzolovaп ро proceduгj орјsапој u poglavlju З. 1 О. 2. 1. Nakoп odredjjvaпja koпcetracije DNK u uzorku, mereпjem absorbcije па Л.=260 1 280 пm , odredeпa је kofjcjпa vezaпog metala [Ru(lll ), Cr(lll) ili Rh(lll )] u svakom DNK uzorku, primeпom maseпe spektrometrjje ICP-MS (ICP-MS, inductively coupled plasma mass spectrometry) (176). З. 1 О. 2. 1. Procedura za izolaciju plazmidne DNK 1) Precjpjtacjja reakcjoпog rastvora u 200 џl pufera СНзСООNа ЗМ , р Н 5, uz dodatak etaпola (1 ОО%) ohladjeпog па 4°С u zapremjпskom odпos (2: 1 ). Talog se javlja паkоп з о miп. ' па ( -20) ос; 2) Ceпtrjfugiraпje па 17 000 rpm, 1 h, па 4°С; З) Precjpjtacja је ропоvlјепа u puferu CH3COONa 0,4 М, рН 5.2 , uz dodatak etaпola (100%) u zapremjпskom odпosu (2 : 5) ; 4) Ceпtrifugjraпje па 17 000 rpm, 20 miп., па 4°С; 5) Supernataпt је odf jveп а talog оргап etaпolom (80%), ceпtrjfug jгaпjem па 17000 rpm, 20 miп. , па 4°С ; 6) Superпataпt је оdЬасеп, а talog osuseп па vazduhu ј resuspeпdovaп u 1 О J..i.l pufera ТЕ, рН 8, koji sadrzi Tris-HCI10 mM ј EDTA 1 mM; 7) Копсепtгасј а DNK ро uzorku odredjena је mereпjem apsorpcije па А.=260/ 280 пm . 60 DokJ01·sko disertacija -Mateт·ija/ i melode 3. 11. ODREDIVANJE UNUTARCELIJSKE AKUMULACIJE PLATINE METODOM ATOMSKE APSORPCIONE SPEКТROFOTOMETRIJE (AAS) 3. 11. 1. P OSTUPAK IZLAGANJ A HELA CELIJA CITOTOKSICNIM PLATINA(/1) AGENSIMA U cjfju jspjtjvaпja uпutarcefjjske akumulacjja platjпe Hela celje su gајепе da rastu ј umпozavaju se 5-7 dапа u falkoпjma (Polyethyleпe plug сар, Sarstedt) роvгsјпе dпа 225 cm2 , u zapremjпj od 50 ml hraпljjvog medjjuma RPMI 1640, Hela celije (25-30 milioпa celija/falkoпu) u еksропепсјјаlпој fazi rasta izlozeпe su dejstvu platjпa( ll ) kompleksa, rastvoreпih u 40 ml RPMI 1640 medijuma u koпceпtraciji od 100 Ј..1М (179). lпkubacjja је prekjпuta odlivaпjem medijuma koji sadrzi platjпu ј jspjraпjem dпа falkoпa svezim medjjumom. Cefjje su podvrgпute procesu tripsiпizacije (opisaпom u poglavlju 3.6.1.) ј pгjkupljeпe sa dпа falkoпa , resuspeпzijom u medjjumu pomocu sprica. Suspeпzija celija је ргепеsепа u epruvetu i i sta lozeпa ceпtrifugiraпjem (Megafuge 1.0R, Heraeus iпstrumeпts) па 1500 х g, 10 miп . Talog је resuspeпdovaп u 10 ml hladпog fosfatпog pufera, рН 7,2, mesaпjem па vorteksu (Heidolph, REAX 2000 ), а celije opet istalozeпe ceпtrifugiraпjem па 1500 х g, 1 О miп . Postupak ispiraпja celija u fosfatпom puferu ропаvlјап је 2 х. Dobljeпi talog celija је resuspeпdovaп u 1 ml 0,2% vodeпog rastvora ( dest. Н20) Tritoп-X-1 ОО (179). Tako dobljeпi uzorci liziraпih celija zamrznuti su па -170°С (Uitra low temperature freezer; Herafreze, Heraeus instruments GтЬН). Uzorci su zatim podvrgпuti liofilizaciji, а kao takvi su cuvaпi u zamrzivacu па -20°С . 61 Doktorska disertacija - Mate1·ija/ i metode З. 11. 2. P RIPREMA KALIBRAC/ONE KRIVE ZA AAS Za odredivanje koncentracije platiпe u ispitivanim rastvorima neophodno је prethodпo koпstruisati kalibracioпi grafik zavisnosti intenziteta apsorpcije od koncentracije platine. Za izradu kalibracione krive korisceпa је serija staпdardпih rastvora platine poznate koпcentracije (J..tg/ml): 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 2.5; З; 3.5; 4; 5; 6; 7; 8. Standardni rastvori platine su pravljeni polazeci od sledecih rastvora: (1): Osпovni rastvor cisplatine (Chiпa) u fizioloskom rastvoru, 1 mg/ml. (2): Staпdardni rastvor ВА (govedji albumiп) 5 mg/ml u 0,2% vodenom rastvoru Triton-X-100 (Sigma Chem Со., St Louis) . Za pravljeпje osnovnog rastvora platine (40 flg/ml) , 0,615 ml rastvora (1) preneto је u normalni sud od 1 О ml i dopunjeno do crte, rastvorom. Serija standardnih rastvora platine formirana је razЫazivaпjem osnovпog rastvora platine (40 ~tg/ml) pomocu rastvora. Мегепја mase potrebnih supstanci vrsena su па analitiёkoj vagi, sa tacnoscu mereпja na 4 decimale (0,0001 g). З. 11. З. P OSTUPAK ANALIZE UNUTARCELIJSKOG SADRZAJA PLATINE METODOM AAS Neposredno pre spektrofotometrijske analize na MS-u, liofilizovaпi uzorci celija iz prethodnog koraka su resuspendovani u 500 J.!l dest. ЊО. Analiza uпutarcelijskog sadrzaja platine vrseпa је па besplameпom atomskom apsopcionom spektrofotometru (Perkin Elmer 5000) uz koriscenje grafitпe kivete HGA 500 i deuterijumskog korektora 0 2 . Pracena је emisija па 265,9 nm uz upotrebu proreza dimenzije 0,7 пm (180). 62 Doktorska disertacija - Materija/ i metode 3. 11. 4. KVANТITATIVNO ODREDIVANJE PROTEINA U /SPITIVANIM UZORCIMA Kvantjtatjvno odredjvanje protejna u uzorcjma ljzjranjh celjja , prethodno podvrgnutjm AAS analjzj, vrseno је kolorjmetrjjskj, metodom ро Lowry-ju. Prjncjp metode se zasnjva na merenju jntenzjteta Ьоје rastvora protejna u kome se vrsj bojena reakcjja jzmedju Foljnovog reagensa ј protejna s tjгozjnskjm ј cjsteinskjm ostacjma (181). Rastvori: А: jspitivani rastvor proteina В: sveze pripremljen alkalni rastvor bakra (50 ml 2% rastvora NazC03 u 0,1 mol/1 rastvora NaOH, pomesano је sa 1 ml 0,5% rastvora kalijum-natrijum-tartarata) С: Folinov reagens U 0,2 ml rastvora А dodato је 1 ml rastvora В. Smesa је promesana i ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 10 min. Zatim је brzo unesena u 0,8 ml rastvora С i promesana. Posle 30 mjn rastvor se obojio plavom bojom. lntenzitet Ьоје meren је na spektrofotometru (Beckman instruments G 2400, G.M.B.H. Munchen) na Л 750 nm. Koncentracija proteina u ispitivanom rastvoru је odredena sa kaljbracjone krive, konstrujsane гапјје pomocu rastvora ВА poznate koncentracjje. Za konstrujsanje kaljbracjone krjve prjpremljen је rastvor ВА standarda, koncentracjje od 20-400 mg/ml ј s njjm је vrsena reakcjja Foljna u takvjm uslovjma kao ј prj jspjtjvanju rastvora protejna. 63 Dokto1·ska disertacija -Materija/ i metode 3. 12. КVALIТATIVNA 1 КVANTITATIVNA ANALIZA MATRIKS METALOPROTEINAZA (ММР-21 ММР-9) Utjcaj neplatjnskjh kompleksa Ru(lll) , na sjntezu jli aktjvnost humanjh matrjks metaloprotejnaza ММР-9 ј ММР-2, а tjme ј antjmetastatskj potencjjal kompleksa, jspjtan је korjscenjem sendvjё-enzjm-jmunoesej tehnjke (182, 183). Za odredjvanje koncentracjje ј aktjvnostj matrjks metaloprotejnaza u jspjtjvanjm uzorcjma prjmenjen је kjt za jmunoesej (Quantjkjne R&D Systems, SAD). Test је izveden u poljstirenskoj mikrotjtar plocj sa 96 rupjca, ёјје је dno pekrjveno mjsjim monoklonskim antjteljma specifjёnim za humane enzime ММР-9 ј ММР-2. Koncentracjja ј aktjvnost metaloproteinaza merena је u supernatantu celija U2-0S tretiranih kompleksima Ru(ll l) , Cr (111) ј Rh(Ш). З. 12. 1. P RIPREMA UZORAKA U2-0S/Pt celjje (5 х 105 celjja/ml) zasejane su u bunarёjce mjkrotjtar рlоёе sa 6 sudjca, u 2 ml modifikovanog McCoy-evog 5А medijuma, opskrЬijenog sa 10% FCS-a ј 75 ml, 200 mM L-glutamina. Nakon 24 sata rasta celjje su jzlozene dejstvu ispitivanih komleksa: Ru(acac)з ј Ru(tfac)з tako da konaёne konentracjje u sudicjma рlоёе budu 10 i 30 (~-tM) . Nakon 24 sata dejstva agensa, supernatant celjja је prjkupljen ј podvrgnut kvantjtatjvnoj analizi humanjh metaloprotejnaza ММР-2 i ММР-9, korjs6enjem kjta (Quantikine R&D Systems, SAD). З. 12. 2. P ROCEDURA ZA ODREfJIVANJE HUMANIH METALOPROTEINAZA ММР-2 1 ММР-9 U SUPERNA TANTU CELIJA U svaku rupjcu mjkrotitar рlоёе sa 96 rupica sjpa se 100 ~-tl rastvaraca RD1- 334. Dodato је 100 ~-tl standarda jli uzorka ро rupicj ј mjkrotitar рlоёа prekrjvena adhezjvnom trakom. lnkublcjja је trajala 2 h na sobnoj temperaturi na sejkeru za mjkrotitar рlоёе(500 ± 50 rpm)(eng: horizontal orbtal microplate shaker). Aspjriran је svakj sudic mjkrotjtar ploce ј ispran ёetjrj puta nalivanjem pufera za jspjranje (400 ~-tl /sudicu), а zatim odljvanjem jednostavnjm nagljm prevrtanjem mjkrotitar ploce. 64 Doktorska disertacija Mate1·ijal i metode Pri kопаспоm ispiraпj u mikrotjtar ploca је jzvrпuta пaspram ciste papirпe vate. Dodato је 200 111 ММР-9 koпjugata u svakj sudjc ј prekrjveпo пovom adhezjvпom trakom. lпkubacj a је trajala 1 h па sоЬпој temperaturj па sejkeru. Ропоvlјеп је korak aspjracjje ј jspjraпja . Dodato је 200 111 pastvora supstrata u svakj sudjc ј j пkublraпo 30 mјп. па sоЬпој temperaturj zastjceпo od svetla. Dodato је 50 111 rastvora za zaustavljaпje reakcjje u svakj sudjc. Apsorpcja је mегепа па Л.=450 пm korjsceпjem ELISA-test cjtaca. lzmereпa apsorbancjja па Л.=450 пm korjgovaпa је za vredпostj apsorbance jzmerene na Л.=540 пm ј Л.=570 nm. З. 12. З. SADRZAJ К/ТА ZA ODREEJIVANJE HUMANIH METALOPROTEINAZA ММР-2 1 ММР-9 1)Peroksjdaza- konjugovana poljklonska antjtela specifjcna za humanu metaloprotejnazu ММР-9 ј ММР-2. 2) Staпdard za odredjvaпje humaпe ММР-9 ј ММР-2: liofiljzovaпi rekomblпaпtпj humaпi protein pro-MMP-9 i рго-ММР-2 u baznom puferu proteinskog sastava. З) Rastvarac RD1-334: bazni pufer sa protejпskjm sadrzajem. 4) Rastvarac za kaljbracjju RD5-10: bazпi pufer sa protejпskjm sadrzajem. 5) Pufer za ispiranje-konceпtrat. 6) Reagens za bojenje А 7) Reagens za bojenje В. 8) Rastvor za zaustavljaпje reakcjje: 2 М sumporпa kjseljna. 65 Doktorska disertacija Materijal i metode 3.13. ANALIZA CELIJSKOG CIKLUSA 1 APOPTOZE METODOM NA PROTOCNOM CITOMETRU Analiza celijskog ciklusa ј tipa celjjske smrtj indukovane kompleksima Ru(lll) , Cr(lll), Rh(lll) ј Pt(ll) na А2780 celijama ј Hela celjjama, vrsena је na protocnom citometru (Becton Dickinson, СА, SAD), nakon bojenja tretiranjh celija propjdjjum-jodjdom (PI-"Propjdjum lodid") (184). З. 1З. 1. P OSTUPAK INKUBACIJE А2780 CEL/JA SA /SPIТIVANIM KOMPLEKSIMA METALA RUTEN/JUM(/11}, HROMA(/11) 1 ROD/JUM(/11) Preljmjnarna kvant jtatjvna analjza apoptoze ј celjjskog cjklusa neplatjnskih kompleksa: Ru(l ll), Cr(lll), Rh(lll) jzvedena је na А2780 koriscenjem protocne cjtometгjje . А2780 celjje (6х1 05 celjja) zasejane su u 1 О ml RPMI 1640 medjjumu, рН 7,2,u falkone (75 cm2) ј gajene u inkubatoru sa 5% СО2. Nakon 24 h rasta, celjje su podvrgnute jspjtivanim agensima u ekvjmolarnoj koncentracjjj (1 ОО f..lM) kontjnualno u trajanju od 24 h odnosno 48 h. Nakon inkubacije sa kompleksima, celjje (adherentne kao ј plivajuce) su prjkupljene procesom trjpsinizacjje ј podvrgnute postupku bojenja ј pripreme za analjzu na protocnom citometru, korjscenjem kompjuterskog softvera Се// Quest (185). З. 1З. 1. 1. Postupak bojenja А2780 celija sa propidijum-jodidom (PI) za analizu apoptoze А2780 celije su isprane u fosfatnom puferu, рН 7,2 (PBS), dva puta nakon cega su resuspendovane u 1 ml PBS ј Ьгој celija odreden је bojenjem sa tripan- plavim. Za ispitivanje apoptoze 6 х1 05 celija је resuspendovano u 1 ml pufera za bojenje i jnkubrano preko no61, na 4°С. Pufer za bojenje: • RNaza А • Pl • Natrijumcjtrat • TRITON-X-1 ОО 1 mg/ml 10 f..lQ/ml 0,1% 0,1% 66 Doklorska disenacija - Materija/ i metode Kvaпtitativпa aпaliza apoptoze (sub-diploidпe populacije celija) vrseпa је па protocпom citometru (Весtоп Dick i пsoп, СА, SAD) korisceпjem argoпskog lasera, sa Л ekscitacije па 488пm . DNK histogram aпaliziraп је korisceпjem kompjuterskog softvera Се// Quest (185). З. 1 З. 1. 2. Postupak bojenja А2780 ce/ilja sa propidijum-jodidom (Р/) za analizu celijskog ciklusa Za potrebe aпalize celijskog ciklusa А2780 celije (1 х 1 06) su iпkuЬiraпe u mesaviпi Et-OH/ fizioloski rastvor (0,9%NaCI) 3:1 (v:v), preko посi , па 4°С. Nakoп procesa fiksacije, celije su istalozeпe ceпtrifugiraпjem (14000 rpm, 10 miп) , jspraпe hladпjm PBS-om, рН 7,2, ј resuspeпdovaпe u puferu za Ьојепје koj j sadГZj : RNazu А (1mg/ml) ј Pl (10 f..lQ/ml). Celjje su jпkuЬiraпe u puferu za Ьојепје 30 mјп. па sоЬпој temperaturi ј odmah podvrgпute aпalizj па protocпom cjtometru, korjsceпjem argoпskog lasera, sa л ekscjtacjje па 488 пm. Sadrzaj DNK aпaljzjraп је korjsceпjem kompjuterskog softvera Се// Quest (185). З. 1 З. 2. P OSTUPAK INKUBACIJE HELA CELIJA SA ISPIТIVANIM KOMPLEKSIMA PLA ТINE(/1) 1 RUTENIJUMA(/11) Hel a celjje (4 х105 celija) zasadene su u Зml RPMI 1640 medjjuma, рН 7,2, u mjkrotjtar ploce sa 6 buпarcjca ј rasle tokom 24 h, u jпkubatoru sa СО2. U еkропепсјјаlпој fazj rasta medjjum је odljveп ј па celjje папеsеп svez RPMI medjjum sa sadrzajem jspjtjvaпjh supstancj u kопсепtгасјјј koja odgovara IC50 , оdпоsпо 1,5 х IC50, (koпceпtracjjj koja jпhiЬira proliferacjju 50% оdпоsпо 75% celija). Celjje su jпkuЬiraпe sa isp itivaпjm kompleksima 24 h, 48 h ј 72 h па 37°С , u jпkubatoru sa 5%СО2. Ро zavrsetku iпkubacije, celjje su prikupljeпe procesom trjpsiпizacjje ј podvrgпute postupku za Ьојепје celjja. 67 Dokto1·slw diseгtacija - Mate1·ijal i metode З. 1З. 2. 1. Postupak bojenja HeLa celilja sa propidijum-jodidom za analizu ce/ijskog cik/usa Hela celjje su jspraпe u fosfatпom puferu (PBS), рН 7,2, паkоп cega su resuspeпdovaпe u 200 J.!l PBS. U suspeпzjju је dodato 2 ml hladпog etaпola, uz Ыаgо vorteksjraпje . Celjje su jпkuЬiraпe u etaпolu (ЕЮН) па ledu, mjпjmalпo 30 mјп. Nakoп fiksacjje u EtOH, 6eljje su talozeпe ceпtrjfug jraпjem па 2000 х g, 10 mјп . Superпataпt је odliveп а talog resuspeпdovaп u 800 џl PBS-a. Suspeпzjja је inkublrana u 1 ОО џl rastvora RNaze А koпcentracije 1 mg/ml, па 37°С, 30 min. Nakon tretmaпa RNazom, uzorcima је dodato 100 J.!l rastvora Pl (400 џg/ml) ј celije su odmah aпaliziraпe па protocnom cjtometru. Aпaljza DNK sadrzaja i celjjskog cjklusa је vrsena na protocnom cjtometru koriscenjem argonskog lasera sa л. ekscjtacjje na 488 пm . DNK hjstogram aпaljziraп је korjscenjem kompjuterskog softvera Cell Quest. З. 1З. З. STAТISTICKA OBRADA PODATAKA Kako u tecпostj , zbog prirode protocпog sistema citometra moze docj do grupisaпja celjja, dve prilepljeпe celije u G 1 fazj Ьi emjtovale jstj signal kao ј celjje u G2 fazi. Postojanje grupacjja celjja se uocava па grafiku DNK-pik= f(DNK- sadrzaj) (35) kao postojaпje pjka u oЫasti kojj odgovara trostrukom DNK-sadrzaju netretiraп jh celija u G1/Go fazj, koje sluze kao staпdard. Takav pik potice od tri slepljene celjje u G1 fazj ili celije u G1 fazj slepljeпe sa celjjom u G1 fazj. Da Ьi se prilikom izrade DNK hjstograma analizjrane populacije celija izbegle greske ovog tipa, vrsi se "gejtovaпje"-odablr celija koje se пalaze u dozvoljenom reg ioпu grafika u odnosu па staпdard . Prikazuje se DNK histogram samo odabranjh celija. 68 1 DokJorska disertacija - Materijal i metode З. 14. ANALIZA APOPTOZE METODOM NA PROTOCNOM CITOMETRU PRIMENOM BOJENJA SA ANEKSIN V-FITC/PI Ргоtејп aпeksjп-V se korjstj za kvaпtjtatjvпo mereпje apoptoze, па bazj svog afiпjteta za vezjvaпje fosfoljpjda celijske membraпe. U prjsustvu јопа Са2+ , aпeksjп-V se vezuje za пegatjvпo пaelektrjsaпe fosfolipjde па povrsjпj celjjske membraпe (Kd= 5 х 1 02) ргј cemu pokazuje vecj afiпjtet za fosfatjdjl-serjп. Celjja sa пastupaпjem apoptoze gubl jпtegrjtet ј sjmetrjju celjjske membraпe, u smjslu da dolazj do traпslokacjje fosfolipjda sa uпutrasпje па spoljasпju straпu celjjske membraпe cjme se fosfoljpjdj jzlazu jпterakcjjj sa elemeпtjma spoljasпje sredjпe. Prj protocпo-cjtometrjjskom odredivaпju apoptoze celjje, vrsj se Ьојепје celjja korjsceпjem kjta kojj sadrzj fluorescejп izotjocjjaпat (FITC-Fiuorescein isothiocyanate) koпjugovaпj protejп апеksјп V-FITC ј propjdjjum-jodid (PI) (ВО Bioscience, PharMingen, San Diego, SAD) (186, 187). Pl је staпdardпj protocпo-citometrjjski reageпs za odredivaпje vjjabllпost celjja. lпtaktпe celjje пе usvajaju Pl, а mrtve celjje јЈј опе sa osteceпom celijskom membranom propustaju Pl. Tako da u populaciji obojenih celija mozemo nacj tri grupe celjja . 3. 14. 1. SADRZAJ К/ТА ZA ODREfJ/VANJE APOPTOZE BOJENJEM CELIJSA SA ANEKSIN V-F/TC/PI 1) Fluoresceiп jzotiocjjaпatom-koпjugovaпj апеksјп V-FITC (FITC-"Fiuorescejп jsothiocyaпate"); 2) Propidijum-jodid (PI) 50 џg/ml U PBS-u; З) Pufer za vezjvaпje : • Hepes/NaOH, рН 7,4 10 mM, • NaCI 140 mM • CaCI2 2.5 mM 4) Fosfatпi pufer (PBS), рН 7,2. 69 Do~1orska disertacija - Materija/ i metode З. 14. 2. P OSTUPAK INKUBACIJE CELIJA SA ISPIТIVANIM KOMPLEKSIMA PLAТINE(/1) 1 RUTEN/JUMA(/11) Hela celjje (4х105 celija ) zasadeпe su u з ml RPMI 1640 medjjuma. рН 7,2, u mjkrotjtar ploce sa 6 rupjca ј rasle tokom 24 h u jпkubatoru sa СО2. U еksропепсјјаlпој fazj rasta med jjum је odljveп ј па celije папеsеп svez RPMI medjjum sa sadrzajem jspjtjvaпjh supstaпcj u koпceпtracjjj 1.5 х ICso. (koпceпtracjjj koja jпhjblra prol jferacjju 75% 6eljja). Celjje su jпkublraпe sa jsp jtjvaпjm ageпsjma 5 h u jпkubatoru sa со2 паkоп cega su prjkupljeпe trjpsjпjzacjjom ј podvrgпute postupku za Ьојепје. З. 14. З. P ROTOKOL ZA BOJENJE CELIJA 1) lspratj celjje hladпjm PBS-om (2 х) ; 2) Resuspeпdovatj celjje u puferu (1 х) za vezjvaпje pri konceпtracjjj od 1 х 106 6eljja/ml (0,5 ml pufera); З) Prenetj zapremjпu od 100 џl rastvora celjja (1 х 105 celjja) u kjvetu za protocпj citometar zapremine 5 ml; 4) Dodatj 5 џl aneksj п-V-FITC Ьоје ј 10 џl Pl; 5) Nezno vorteksjratj celjje ј jnkuЬiratj jh na sobnoj temperatutj (20-25°С), 15 mјп, u mraku; 6) Dodatj 400 џl pufera za vezivaпje (1 х) u svakj uzorak; 7) Analjzjratj na protocnom cjtometru sto pre (ako је moguce u roku od 1 h). Ргј aпaljzj па protocnom cjtometru korjstjtj З vrste kontrolnjh uzoraka celjja: 1) celjje koje пjsu podvrgпute bojenju; 2) celjje koje su podvrgnute bojenju aneksinom V-FITC; З) celjje koje su podvrgnute Ьојепјu sa Pl. Treba пapomenutj da se ј u populacjji netretjranjh celija javlja jzvestan procenat apoptoze jlj nekroze, sto zavjsj od tjpa celjj ske ljnije i uslova odrzavanja. 70 L Doklorslw disertacija Materija/ i metode 3. 15. ODREDIVANJE AKTIVNOSTI ENZIMA KASPAZA-3 NA HELA CELIJAMA PRIMENOM PROTOCNE CITOMETRIJE Kaspaza-3 је cistein-proteaza koja se aktivira u ranim fazama apoptoze, i predstavlja kljucni enzim na putu programirane celijske smrti . Sintetise se u vidu neaktivnog proenzima (32 kD) , а proteolizom koja је katalizovana od strane samog enzima ili od strane druge proteaze se prevodi u aktivnu formu. Aktivna forma enzima kaspaza-3 је heterodimer od 17 kD i 12 kD, i katalizuje proteoliticko cepanje proteina citoplazme kao sto su 04-GDI ili Bcl-2, kao i nukleusa PARP. Kaspaza-3 је kljucni enzim u kaskadi katalitickih proces, na putu apotoze, zbog cega se koristi kao marker ranih apoptotskih promena. Aktivacija kaspaze-3 ispitivana је koriscenjem kita koji sadrzi anti-kaspaza 3- fikoeritrinom (PE-Phycoerythrin) obelezena monoklonska antitela (ВО PharMingen, San Diego, SAO) (188, 189). 3. 15. 1. SADRZAJ К/ТА ZA ODREfJIVANJE APOPTOZE DETEKC/JOM AKTIVNE КASPAZE-3 1) Fikoeritrinom (PE-phycoerythrin) konjugovana poliklonska zecja antitela specificna za aktivnu kaspazu-3. 2) Pufer (р Н 7 ,2) za fiksaciju celija/permeabllizaciju, рге bojenja ( citofix). З) Saponin 4%. 4) Paraformaldehid. 5) Pufer ("perm/wash") (рН 7,2) za permeabllizaciju i ispiranje celija, primenjuje se za permeabllizaciju cel ija za proces bojenja. 6) Fetalni govedi serum (FBS-fetal bovine serum). 7) Natrijumazid. 8) Saponin. 71 Doktorska disertacija - Mate1·ijal i metode 3. 15. 2. P OSTUPAK INKUBACIJE CELIJA SA ISPIТIVANIM KOMPLEKSIMA PLA Т/NЕ(/1) 1 RUTENIJUMA(III) Hela celjje (4 х 105 celjja) zasadene su u Зml RPMI 1640 medjjuma, рН 7,2, u mjkrotjtar ploce sa 6 rupjca ј rasle su tokom 24 h, u jnkubatoru sa СО2 . U еksропепсјјаlпој fazj rasta medjjum је odl jveп ј па celije naпesen svez RPMI medjjum sa sadrzajem jspjtjvanjh supstancj u koпceпtracjjj 1.5 х IC5o, (koncentracjjj koja jnhjЬira proljferacjju 75% celjja). Za jzvodeпje ovog testa, Hela celjje sadene su u mjkrotjtar ploce sa 6 rupjca u RPMI podlozj, 4 х 105 celjja/3 ml RPMI. Nakoп 24 h rasta, medjjum је odliven ј па celjje паnеsеп svez medjjum sa sadrzajem jspjtjvaпjh supstaпcj u koпceпtracjjj 5 х IC50, ј 1 О х IC50, Celjje su jпkuЬiraпe sa jspjtjvanjm ageпsjma 5 h u jnkubatoru sa со2. паkоп cega su prjkupljeпe trjpsjnjzacjjom ј podvrgпute postupku za bojenje. 3. 15. 3. PROTOKOL ZA BOJENJE CELIJA 1) lspratj celjje hladпjm PBS-om (2х); 2) resuspeпdovatj celjje u cjtofjx puferu u konceпtracjjj 106 celjja/ 0,5 ml cjtofix; З) lnkuЬiratj celije па ledu, 20 mjn.; 4) lstalozjtj celjje (ceпtrjfugjraпjem 15.000 rpm/ 10 mjn); 5) Odljtj supernataпt tj. preostalj citofix rastvor; 6) lspratj celije "perm/wash" puferom, prj konceпtracjji od 0,5 ml pufera /106 celija, па sоЬпој temperaturj ; 7) Odredjtj ukupпu koliciпu uzorka ј odredjtj koljcjnu "perm/wash" pufera ј antjtela koje treba dodatj uzorku( tj. ukupпom broju uzoraka), tako da svakj uzorak od 1 06 celjja sadrzj 1 ОО J.ll PERM i 20 J.ll antjtela; 8) Celjje resuspendovatj u "perm/wash", dodatj aпtitela inkuЬirati 30 miп, па sobnoj temperaturj; 9) lspratj svakj uzorak u 1 ml "perm/wash"; 10) Resuspeпdovatj celjje u 0,5 ml "perm/wash"; 11 )Anal jzjratj па protocпom citometru. 72 Doktorska disertacija -Materijal i metode Analjza је vrsena na protocnom cjtometru korjscenjem argonskog lasera sa л. ekscjtacjje na 488 nm. Prjkupljenj podacj analjzjгanj su u logarjtamskom hjstogramu, korjscenjem kompjuterskog softvera Се// Quest (185). 3. 16. MORFOLOSКA ANALIZA CELIJSKE SMRTI POMOCU FLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE Morfoloske karakterjstjke celjjske smrtj Hela celjja, jndukovane platjna(ll) kompleksjma, analjzjrane su fluorescentnom mjkroskopjjom nakon bojenja tretjranjh celjja akrjdjn-oranzom (АО) ј etjdjjum-bromjdom (ЕtВг). АО је DNK- jnterkaljrajuca fluorescentna Ьоја koja fluorescjra zeleno ј korjscena је za vjzualjzacjju morfoloskuh promena na njvou jedra. Celija usvaja АО kada је membrana celjje intaktna, tako da se Ьоја akumuljra samo u celijama koje su zive jli podlezu apoptozi. EtBr је DNK-jnterkaljrajuca Ьоја koja fluorescira narandzasto. EtBr ne prolazj kroz jntaktnu celjjsku membranu ј akumuljraju је samo nekrotjcne celjje ј korjscen је za uocavanje nekrotjcnih celjjskih promena (190). 3. 16. 1. P OSTUPAK PR/PREME PREPARATA CEL/JA ZA ANAL/ZU FLUORESCENTN/M MIKROSKOPOM Hela celjje (104 celija) su rasle u RPMI 1640 medjjumu, рН 7,2, u petrj soljama djmenzjja 90 х 15 mm jedan dan. 105-106 6eljja u eksponeпcjjalпoj fazj rasta, jzlozeпo је dejstvu platjпa(ll) kompleksa rastvoreпih u medijumu, u koncentracijj koja jпhjЬira proljferaciju 75% celija (1 ,5 х IC). Celjje su iпkuЬirane sa j sp jtivaпjm kompleksima na 37°С , u inkubatoru sa 5% СО2, 24 h. Ро zavrsetku jnkubacjje aпaliziraпe su morfoloske promene celjja pod svetlosпim mjkroskopom. Celjje koje su se odlepjle sa dna suda, odljveпe su zajedпo sa medjjumom u epruvetu (V=15 ml). Celjje koje su ostale prjlepljeпe za dпо suda prjkupljene su trjpisjпizacj om. Suspeпzjje celija su sројепе u jednoj epruvetj ј centrjfugirane na 1500 х g, 10 miп. Talog је resuspendovaп u 10 ml svezeg medjjuma, па vorteksu ј ропоvlјепо је ceпtrjfugiraпje па 1500 х g 1 О mјп . 73 Doktorska disertacija -Mate1·ijal i metode Konacnj talog celjja је resuspendovan u 200 J..tl medjjuma, kojj sadrzj АО ј EtBr. Nakon 10 mjn, 10 J..tl obojene suspenzjje celija је naneseno na mjkroskopsko staklo, ј prekrjveno pokrovnjm staklom. Dobljenj preparatj celjja su odmah posmatranj pod fluorescentnjm mjkгoskopom (Carl Zejss, Jena, Hemacka), korjscenjem fjltra G274, а fotografisane djgjtalnjm aparatom (Oiympus, Camedja 4040). 74 Doktor·ska disertacija -Mateгija/ i metode 3. 17. LABORATORIJSKI INSTRUMENTII HEMIКALIJE 3. 17. 1. LABORA TOR/JSК/ APARA Т/ KORISCEN/ U OVOM RADU 1 Centrifuga (U-32, Воеса, Hemacka) 1 Mikrocentrifuga (Eppendorf, Hamburg, Hemacka) 1 Vorteks (REAX 2000, Heidolph lnstrumeets GmbH&Co. KG, Schwabach, Hemacka) 1 Frizider sa hladenjem na -1 70°С (Uitra low temperature freezer, Herafreze, Heraeus lnstrumnets GmbH, Hemacka) 1 Frizider (TCW 115, The Electrolux Group, Stocholm, Svedska) 1 Atomski apsopcioni spektrofotometar (Perkin Elmer, SAD) 1 Tecni scintilacioni brojac (1205 Betaplate, Perkin Elmer, SAD) 1 Maseni spekrometar (Perkin Elmer, SAD) 1 Protocnom citometar (Becton Dickinson, Mountain View, СА, SAD) 1 Spektrofotometar (Beckman instruments G 2400, G.M.B.H. MOnchen, Hemacka) 1 Sterilna komora (Kiimaoprema, Samobor, Hrvatska). 1 lnkubator (СО2 inkubator 220, Flow Laboratories, UK) 1 ёitac mikrotitar ploce sa 96 sudica (Behring EL 311 , Becton Dickinson, СА, SAD) 1 Prikupljac radioaktivno obelezenih celija (Harvester 96-Tomptec, Becton Dickinson, СА, SAD) 1 Svetlosni mikroskop (Carl Zeiss , Jena, Hemacka) 1 Analiticka vaga (Mettler Н43) 1 Vodeno kupatilo (Sutjeska, Beograd) • lnkubator na 37°С (Sutjeska, Beograd) • Digitalni fotoaparat (Oiympus, Camedia 4040). • Mikrotitar ploce sa 96 i 6 sudica (NUNC, Apogent Company, Roskilde, Danska) 1 Petri solje (90 х 15 mm, Flow laboratories, Velika Britanija) 1 Automatske pipete (Acura 821 , Socorex, svajcarska) 1 Nastavci za automatske pipete (Eppendorf, Hamburg, Hemacka) 1 Spricevi (NIPRO Europe N.V., Belgija) • lgle (NIPRO Europe N.V., Belgija) • Falkoni (Corning lncorporated, SAD.) • Membranski filtar (Millex-HA, Millipore. 0,22 J.Lm, SERSTEDT, Hemacka) • Komorica za brojanje celija (Neubauer,Parmer lnstrument Company, Kanada) 1 Pokrovno staklo (Gold Seal, SAD) 75 Doktorska disertacija Materijal i metode 3. 17. 2. H EMIKALIJE KORISCENE U OVOM RADU Kompleksj metala Ru(lll) , Cr(lll}, Rh{lll) ј Pt(ll ) su sjntetjsanj па osnovu poznatjh literaturnjh podataka (8, 154). Cistoca kompleksa odredjena је mjkroanal jzom ј spektrofotometrijskom analizom. • Praskasta podloga RPMI 1640 (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAO) • Oimetil-sulfoksid, OMSO (Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAO) • Natrijumdodecilsulfat, SOS (Sigma Chem. Со., St. Louis , SAO) • 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenii-2H-tetrazolijumbromid (МТТ) (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAO) • Fetalni govedi serum (FCS-Fetal calf serum) (Veterinarski fakultet, Novi Sad; lnvitrogen ltalia, San Guliano Milanese, ltalija) • Cisplatina (Hemijski Fakultet, Univerzitet u Beogradu) • Etanol (Medicom, Sabac) • Fizioloski rastvor (Hemofarm, Vrsac) • Oest. Н20 (Zavod za transfuziju krvi, Beograd) • NaHC03 ("Zorka Pharma", Sabac) • Na2 СОз (Е. Merck, Darmstadt, Hemacka) • NaH2 РО4 (Aikaloid, Skoplje) • Na2 НРО4 (Aikaloid, Skoplje) • NaOH ("Zorka Pharma", Sabac) • HCI (konc.) (Е . Merck, Oermstadt, Hemacka) • Kalijum-natrijum-tartarat (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Oeisenhofen, Hemacka) • L,O-butionin sulfoksimin, L,O-BSO (ВО PharMingen, San Oiego, СА, SAO) • Folinov-reagens (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAO) • Tripan plavo (Е. Merck, Oarmstadt, Hemacka) • Akridin-oranz (АО) (Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAO) • Etidijum-bromid (EtBr) (Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAO) • Propidijum-jodid (PI) (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAO) • Oktilfenoksipoli-etoksietanol, TRITON-X-1 ОО (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAO) • Fosfatni pufer sa NaCI, рН 7,2 (PBS-Phosphate buffer saline) (Torlak, Beograd) • Tripsin (Torlak, Beograd) • Govedji albumin (kristal) (ВА -Bovine Albumin) (Miles Laboratories, L ТО, SAO) 76 ..Doktorska disertacija - Mate1·ija/ i metode • DNK fragment (125 Ьр , Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAD) • RNaza А (BD PharMingen, San Diego, CA,SAD ) • Aneksin V-FITC (BD PharMingen, San Diego, СА, SAD) • Кit za odredivanje aktivne humane kaspaze-3 (BD PharMingen, San Diego, СА, SAD) • Kit za odredivanje ММР-2 i ММР-9 (Quantikine R&D Systems, SAD) • 13C-Timidin (Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAD) • 3H-Uridin (Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAD) • Glutation, GSH (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAD) • Glutation-reduktaza (Sigma Chem. Со., St. Louis, SAD) • NADPH (Sigma Chem. Со. , St. Louis, SAD) 77 Doktorska diserfacija Re=иltati 4. REZULTATI 78 Doktorska disertacija Re:ultati 4. 1. C\TOTOKStёNOST TESTIRANIH KOMPLEKSA 4. 1. 1. A KTIVNOST NEPLAT/NSКIH KOMPLEKSA U cjlju poredenja antjproljferatjvne aktjvnostj neplatjnskjh kompleksa rutenjjuma(lll) , hroma(lll ) ј rod jjuma(lll) sa aktjvпoscu cjsplatjпe , jzvedeпa је aпaljza cjtotoksjcпostj па paпelu tri celjjske lјпјје: celjjama karcjпoma humaпog ovarjjuma (А2780) , celjjama osteosarkom - cjsplatiпa-seпzjtjvпom (U2-0S) ј cjsplatjпa­ rezjstentпom soju (U2-0S/Pt), prjmeпom testa јпhјЬiсјје rasta. Rezultatj su prjkazanj kao IC5o vredпost (kопсепtгасјја ageпsa koja jzazjva j пhjЬicjju prezivljavaпja celjja za 50 %) ј datj su u Tabeli 4.1.1. ОоЬiјепј rezultatj па А2780 celijama ukazuju da јеdјпо kompleks Ru(tfac)з poseduje cjtotoksicпost u opsegu kопсепtгасј а do 1 ОО J..tM kako ргј dejstvu za 24 sata (IC50 = 40,63 ± 15,48 J..tM) tako ј prj dejstvu za 72 sata (ICso = 25,2 ± 11 ,5 ~-tM) (Tabela 4.1.1). Aktjvпost Ru(tfac)3 па cjsp1atina-seпzjtjvпjm celijama osteosarkoma U2-0S (ICso = 39,25 ± 10,45 J..tM) priЬiizna је aktivnosti na cisplatina-rezistentnim celijama U2-0S/Pt (IC5o = 37,75 ± 13,65 J..tM) i, takodje, uporediva sa aktjvпoscu па А2780 celjjama. Kompleksj Cr(ll l) ј Rh(lll) njsu pokazalj cjtotoksicnost tokom prelimjпamog ispjtjvaпja па А2780 celjjama (Tabela 4.1 .1). Aпtjproljferativna aktjvnost Ru(acac)з aпalizirana је dodatпo korisceпjem МТТ testa па paпelu 6 celjjskih liпija (Hela, 816, U2-0S, U2-0S/Pt, Jurkat, К562) u sirem opsegu konceпtracije iduci do 300 J..tM. ICso vredпosti su odredene sa grafika prezivljavanja celija (SI. 4. 1 .а ,Ь , с) i prikazani su u Tabeli 4.1.2. Sve dоЬiјепе IC50 vredпosti krecu se u opsegu jzпad 1 ОО J..tM. Aпtiproljferativпa aktjvnost па celijama osteosarkoma U2-0S (IC5o = 173,16 ± 5,50 J..t.M) ispoljeпa је паkоп 48 sati dejstva ageпsa, sto ukazuje па povecaпu osetljivost ovih celija па ispitivaпi kompleks, u poredenju sa drugim celijskim liпijama . Prj tome aktjvпost kompleksa је veca na cjsplatjпa-seпzjtivпoj celijskoj ljпijj, u poredeпju sa cjsplatjпa­ rezisteпtпom. Poredeпje aktjvпosti dva RLII(III) kompleksa па 816, Jurkat ј К562 ukazuje da NAMI-A jma vecu citotoksicпu aktjvпost u poredeпju sa Ru(acac)з. 79 Dokto1·ska disertacija Re=иltati Tabela 4.1.1 Rezultati testa inhiblcije rasta 6elija, odreaeni па trima 6elijskim linijama А2780, cisplatina -senzitivnim (U2-0S}, i -rezistentnim (U2-0S/Pt) 6e/ijama, nakon kratkotrajnog (24 sata) kao i dugotrajnog (72 sata) dejstva agensa. ICso (J.tM) 8 Kompleks Vreme (h) А2780 U2-0S U2-0S/Pt Ru(tfac)з 24 40 ± 15 39 ± 10 37 ± 19 Ru(acac)з 24 > 100 > 100 > 100 Сr(асас)з 24 > 100 Rh(acac)з 24 > 100 в Rezultati citotoksicnosti testiranih kompleksa su prikazani kao IC50 vrednost (koncentracija leka koja izaziva inhiblciju prezivljavanja celija za 50 %). Prikazane ICso vrednosti (± sd) pojedinaёnih kompleksa odredene su sa grafika prezivljavanja celija i predstavljaju srednju vrednost tri do ёetiri nezavisna eksperimenta. 80 Doktot·ska disertacija Re:ultali 4. 1. 2. AKТIVNOST PLA ТINSКIH KOMPLEKSA Radj poredeпja aпtjproliferatjvпe aktjvпosti platiпskih kompleksa: cisplatiпe , cis- [Pt(Py)2CI2] , trans-[Pt(Py)2CI2] , sa aktivпoscu kompleksa Ru(lll) : NAMI-A, Ru(acac)з, izvedeп је МТТ test па paпelu sest celijskih liпija (Hela, 816, U2-0S, U2-0S/Pt, Jurkat, К562) . ICso vredпosti odredeпe su sa grafika prezivljavaпja celija (SI. 4. 1 . а ., Ь .,с . ) i prikazaпi u Tabeli 4.1.2. Rezultati eksperimeпta sugerisu da visoku aпtiprolifertivпu aktivпost pokazuju uglavпom platiпski( ll)kompleksi, pri cemu cisplatiпa ima пajvecu aktjvпost . trans-Dipiridiпdihloroplatiпa(ll) , [Pt(Py)2CI2] , ima vecu citotoksicпost u poredeпju sa cis- jzomerom, па svim ispitivaпim celijskim liпijama . Aktivпost cjsplatiпe па celijama osteosarkoma, cjsplatjпa-seпzjtivпom soju U2-0S (IC50 = 5,22 ± 0,5 11М) ј cisplatiпa-rezjsteпtпom soju U2-0S/Pt (ICso = 12,25 ± 2,48 J..LM) (Tabela 4.1.2) razlikuje se za faktor Fr = 2,3. Trans- ј cis- lzomeri kompleksa [Pt(Py)2CI2], pokazuju maпju aktivпost па celijama osteosarkoma u poredeпju sa aktivпoscu па Hela celijama (IC50 vredпost odredeпe za 48 sati dejstva kompleksa) i, isto tako maпju aktivпost па cisplatiпa-rezisteпtпom soju (U2-0S/Pt), pri cemu је trans- izomer skoro duplo aktivпjji (ICso = 28,99 ± 0,69 11М)] u poredeпju sa cis- jzomerom (IC50 = 52,50 ± 5,73 11М). Ni јеdап od ispjtjvaпjh kompleksa Ru(lll ) jli Pt(ll) пе prevazjlazj rezjsteпcjju па cjsplatjnu. 81 оо N Tab e la 4 . 1 . 2 . Rezultati МТТ testa odreaeni па neko/iko celijskih linija: HeLa, cisplatina-senzitivnim ce\ijama osteosarkoma (U2-0S) i -rezistentnim celijama (U2-0S/Pt), К562, Jurkat, 816. Rezultati citotoksitnosti testiranih kompleksa su prikazani kao IC50 vrednost (koncentracija leka koja izaziva inhiblciju prezivljavanja celija za 50 %. Prikazane IC50 vrednosti pojedinatnih kompleksa odredene su sa grafika prezivljavanja celija i predstavljaju srednju vrednost tri do cetiri nezavisna eksperimenta. ICso (f..LМ) Kompleks НеLаь И2-ОSВ U2-0S!Pf Ru(acac)з 114 ± 1 173,16 ± 5,50 >300• NAMI-A Cis-[Pt(Py)2CI2] 832,30 ± 0,07 49,13 ± 3,29 52,50 ± 5,73 Trans-[Pt(Py)2CI2] 89,5 ± 0,1 23,89 ± 2,34 28,99 ± 0,69 CDDPC 4,73 ± 0,53 5,22 ± 0,59 12,25 ± 2,48 Oksaliplatina 5,53 ± 0,61 N.D: Nije odredeno, * > 300 Nije Ьilo antiproliferativne aktivnosti do koncentracije 300 ~1М . а ь с Prikazane IC50 vrednosti odredene su za 48 sati dejstva agensa. Prikazane IC50 vrednosti odredene su za 72 sata dejstva agensa. Cis-[Pt(NH3) 2C/2], cisplatina, CDDP. Jurkaf 115,19 ± 0,61 70,68 ± 3,24 11,32 ± 0,89 7,84 ± 1,15 4,43 ± 0,69 К56~ в1вь 142,9 ± 32,5 148 ± 1 99 ± 34 85,88 ± N.D. 22,38 ± 1,31 12,5 ± 2,6 9,13 ± 1,82 7,74 ± 1,56 6,21 ± 0,24 5,68 ± 0,33 Doklorska diserracija-Rezultati 140 120 Hela • CDDP -~ • Ru(acac)з о -ns 100 • Oksaliplatin ::-ф Cis-[Pt(Py)2CI2] ·() 80 Q) +, ..... 6 Trans-[Pt(Py)2CI2] r:: ns • > 60 т ns ::' 1 > ;;::; 40 r. т + Q) --... а. 1 20 • о •Q ·! а ---ј о 50 100 150 200 250 300 350 Koncentracija agensa (J..LM) Sl. 4. 1.а. Dijagram prezivljavanja HeLa celija, odrecfen МТТ testom nakon 72 sata dejstva ispitivanih kompleksa. Dijagram prezivljavanja (inhiblcije rasta) ce/ija, prikazuje procenat prezivljavanja celija и funkciji koncentracije ispitivanog agensa. Sa dijagrama prezivljavanja celija odrecfene su !С50 vrednosti (koncentracija agensa koja izaziva inhiblciju rasta celija za 50 %). 83 --------------------------------------------- --- LEGENDA ~ 120 l ~ ~ 100 -~ ф -{) -~ с ro > -~ 40 > ;N ф ..... а.. о 50 120 100 i= ro 8 '~ во х• f •(.) ! -~ 60 + с ro t > -~ 40 {:,. ; ;; ... ;N 20 ф ..... а.. . ~ о о 100 100 -+- Ru(acac)з -11- NAMI-A ...... соор Cis-[Pt(Py)2CI2] --.8г- Trans-[Pt(Py)2CI2] 816 150 200 250 Koncentracija agensa (џМ) К562 f + + 200 300 Koncentracija agensa (џМ) Jurkat t 1 100 150 200 250 Koncentracija agensa (џМ) 300 400 f 300 Doktorska disertacija-Rezultati ---, 350 500 350 S/. 4. 1 .Ь. Oijagrami prezivljavanja 816, К562 i Jurkat ce/ija, odreaeni МТТ testom nakon 72 sata dejstva ispitivanih kompleksa. 84 Doktorska disertacija-Rezultati • CDDP LEGENDA +- Ru(acac)3 Cis-[Pt(Py)2CI2] ~rans-[Pt(P )2CI2] 120 ·---··-·-·-······-··· ·······-······- ··-··- U2-0S - 100 ~ ~ ns • :: 80 • ф •() ф • 'С' 60 /:;), ns /::,. > • ns • 6 :.::-> 40 ;r:;j • ф ... • 0.. 20 • /::,. • о • о 50 100 150 200 250 300 350 Koncentracija agensa ( џ.М) 120 _ 100 t U2-0S/Pt ~ ~ ns 80 :::" ф ·- • •() ф ..... 60 ь. ·- с: ns • /::,. > ns • :.::- • > 40 ' r:;j ф • ... 0.. ~ 20 - • о о 50 100 150 200 250 300 350 Koncentracija agensa ( џ.М) Sl. 4. 1 . с. Oijagrami prezivijavanja celija osteosarkoma, cisplatina-senzitivnog (U2-0S) i cisplatina- rezistentnog soja (U2-0S/Pt), odreaeni primenom МТТ testa, za 48 sati dejstva ispitivanih komp/eksa. 85 Doktorska diseгtacija - Re:u/tati 4. 1. 3. 0 DREfJIVANJE GLUTAT/ONA METODOM РО TtETZ· U Kinetika interakcije kompleksa Ru( ll l), Cr(lll) i Rh(lll) sa glutationom in vitro odredena је metodom ро Tietz-u, kojom је zapravo pracena preostala kolicina neizreagovanog glutationa u rastvoru, merenjem apsorbancije na Л.=415 nm. Reakciju in vitro katalizuje enzim glutation-reduktaza. Koncentracija glutationa ocitana је sa standardne krive, formirane na osnovu serije standardnih rastvora GSH koncentracije: 50, 100, 150,200, 250, 300 (JJ.g/ml) (Siika 4.1.3). Е 0,7 с: ~ 0,6 -.::t ~ 0,5 <13 с <13 (..) с ~ 0,3 .._ о ~ 0,2 <( 0,1 50 100 150 200 250 з оо Koncentracija GSH (~tg/ml) Slika 4.1.3 Standardna kriva za odreaivanje glutationa (GSH). Prilikom interakcije kompleksa metala sa glutationom u rastvoru pocetne koncentracije (GSH) 300 (llg/ml), dolazi do formiranja kompleksa GSH-metal, sto rezultuje opadanjem apsorpcije па Л.=415 nm. Dobljeni rezultati ukazuju da ispitivani kompleksi metala Ru(lll) , Cr(ll l) i Rh(lll) interaguju sa GSH, narocito pri vecoj koncentraciji (3,2 mM)(Tabela 4.1.3). 86 Doktorska disertacija Re=иltati Tabela 4.1.3 lnterakcija kompleksa Ru(/11}, Cr(/11) i Rh(/11) sa glutationom in vitro, odredeno metodom ро Тietz-u. Koncentracija GSH (neizreagovanog) (pglml) 1 1---·--·----:--~~----,-------------------- ----------r-··---------------------------; Kompleksi 1 ,6 mM а 3,2 mM а Ru(tfac)з -~ Ru(acac)з 260 280 о 210 Сr(асас)з 120 60 --------·--·- ----·- -·-·-·----·--------·- -------···- ·- ··- ·--·--·- -------Rh(acac)з 240 60 - .. ------·----Nдмt:д· .. ·-·-----·-·-- ·-~- ··· --------25о --- ... -· -·-·--- - ------11-о i-----------------·--- ·1---------·------------ -----------·---- - CDDP 160 40 а Koncentracije 1,6 mM i 3,2 mM odnose se na ispitivane komplekse metala, dodate u rastvor GSH, poёetne koncetracije 300 ~o~g/ml. Ni jedan od kompleksa nije pokazao veci afinitet za interakciju sa GSH u poredenju sa cisplatinom. Takodje, reakcija GSH sa metalima Ru(lll) i Rh(lll) ne prati koncentracionu tj. linearnu zavisnost. S obzirom da rezultati nisu reproduktivni ne mogu se uzeti u dalje razmatranje. 4.1.4. E FEKAT SMANJENJA KONCENTRACIJE UNUTARCELIJSKOG GLUTATIONA (GSH) NA CITOTOKSJёNOST TESTIRANIH KOMPLEKSA Ovim testom pracen је efekat smanjenja koncentracije unutarcelijskog glutationa (GSH) na aktivnost ispitivanih kompleksa па celijama А2780, 816, К562. Butionin-sulfoksimin (BSO) је primenjen kao inhibltor sinteze glutationa, pri koncentraciji 1J!g/ml, pri kojoj sam nije imao inhiЬitorno dejstvo na rast celija. Analiza na А2780 celijama ukazala је da Ru(tfac)з ima nesto bolju citotoksicnost u koinkubaciji sa BSO (IC50 = 38,73 ± 0,32 J..LM) u poredenju sa aktivnoscu bez BSO (IC50 = 40 ± 15 llM) (Tabela 4. 1.4.а.). lnhiЬicija sinteze unutarcelijskog GSH nije imala uticaja па aktivnost kompleksa Cr(lll) i Rh(lll ). 87 1 Ј Dokto1·ska disertacija - Re:ultati lspjtjvanja na В16 ј К562 ce/jjama ukazala su da smanjenje unutarcelijske koncentracjje GSH jma utjcaja na aktjvnost kompleksa Ru(acac)3 ј NAMI-A, odnosno ICso vrednost Ru(/11) kompleksa opada (SI. 4.1.4.). Тај rezultat ukazuje da Ru(/11) kompleksj pokazuju afinjtet za jnterakcjju sa unutarce/jjskjm GSH. Kako је status unutarce/jjskog glutatjona raz/jcjt u razfjcjtjm celijskjm finjjama efekat dejstva BSO na aktjvnost Ru(/11) kompleksa razljcjt је na К562 ј В16 ce/jjama (Tabela 4. 1.4.а . ј Sl. 4.1.4.). Tako u kojnkubacjonoj studjjj na К562 ce/jjama, BSO jma vecj utjcaj na aktjvnost Ru(acac)3, (IC50 = 89 ± 9 !Ј.М), jako је seпzjtjvпost dveju ce/jjskjh fiпjja na Ru(acac)3 prjbfjzпa (В16 ICso = 148 ± 1 !Ј.М) ; К562 ICso = 142 ± 32 ~Ј.М). Kompleks NAMI-A pokazuje vecu cjtotoksjcпost u odпosu sa Ru(acac)з па obema celijskjm /јпјјаmа (SI. 4.1.4.). Smапјепе kопсепtгасјје GSH jma jzrazeпjjj utjcaj па aktjvnost NAMI-A па В16 celjjama (ICso = 57 ~Ј.М). Рогеаепје dejstva platjnskjh kompleksa u kojпkubacjjj sa BSO, ukazuje da smапјепје kопсепtгасјје uпutarcefjjskog glutatjoпa utjce па povecanje aktjvпostj cis-[Pt(Py)2CI2] na obema cefjjskjm /jnjjama. CDDP kao ј trans-[Pt(Py)2C/2] pokazuju najvecu cjtotoksjcnu aktjvпost u poredeпju sa svjm testjгaпjm kompleksjma, а/ ј ргоmепа koпcentracjja uпutarceljjskog GSH па В16 ј К562 celjjama jma slab utjcaj na modulacjju aktjvпostj ovjh platjпskjh kompleksa. Tabela 4.1.4.а. Aktivnost kompleksa Ru(/10, Cr(/11) i Rh(/11) па celijama karcinoma ovarijuma (А2780) и koinkubacionoj studiji sa BSO (1f.Jg/ml) . /Cso (џМ) а 1 Kompleksi А2780 1 ~-- ·-. - - .. --·----·-.. ·-·-.. ---·-·---.. -·-.. ·r·-- - А2780 (BSO) Б ј -·-·---·--·-.. --'1 ! Ru(tfac)з 40 ± 15 ~----·------ -----·--·-·-.. ,. 38,73 ± 0,42 1 -i 1 Ru(acac)з > 100 . ~~~---------~------- > 100 1 1 Сг(асас)з > 200 i >200 1 Rh(acac)3 > 200 1 >200 а Citotoksicnost kompleksa је odredena testom inhiblcije rasta nakon 24 sati dejstva kompleksa. Vrednost IC50 predstavlja koncentraciju leka koja izaziva inhiblciju prezivljavanja celija za 50 %. ь Celije tretirane ispitivanim kompleksima u koinkubaciji sa BSO (1Jlg/ml). 88 Dokto1·ska disertacija-Rezultati ---------------------------------------------------- 180 .--.. о "' 150 () ::=;.. ro 120 ·~ ф •() ф "С 90 ro > .~ > 60 ;N ф '-а.. 30 о 180 'С> 150 "' () :~ 120 ф •() ф Е 90 ro > ro ·~ ;~ 60 ~ а.. 30 о 1 1 1 CDDP - - г 1 .Ј CDDP D ICso LEGENDA Е1 ICso u prisustvu BSO 816 ,.....__r--- fi гr- i- ~ 1 -"'" r---1 Cis-[Pt(Py)2CI2] Trans-[Pt(Py)2Cl2] Ru(acac )з NAMI-A -- К562 r- г-1- г L. ~ г- t-г-1- ... " 1-=u r-=1 Ј Cis -[Pt(Py)2Ciz] Trans-[Pt(Py)2CI2] Ru(acac)3 NAMI-A S/. 4.1.4. Dijagrami prikazujи citotoksicno dejstvo testiranih kompleksa (IC50 vrednosti) па celijama 816 i К562 odreaene primenom МТТ testa, и иslovima smanjene koncentracije intracelijskog glutationa (GSH) pri koinkиbacinom dejstvи sa bиtionin-sиlfoksiminom (BSO 4, 5 )J.glml), и poreaenjи sa citotoksicnoscи па istim celijama koje nisи tretirane sa BSO (celijama koje imajи norma/an statиs GSH). 89 Doktorska disш·tacija - Re:ultati Tabela 4. 1.4.Ь. Uticaj sтапјепја uпutarcelijske koпceпtarcije glutatioпa, па citotoksicпost testiraпih kompleksa, па ce/ijama К562 i Jurkat. Prikazaпe su IC50 vredпosti (::t sd). 1 ICso (џМ) Kompleksi f--- г~56218SОа 816 l 816/8SOa -' К562 Ru(acac)з 142 ± 32 1 89± 9 148,14± 1 1 145,6 ± N.D. +- - Ј NAMI-A ј 99 ± 34 1 87 ± 10 85,88 ± N.D. 1 57,85 ± N.D. е--···-~~~~[;;(·~-;)2С ~~- ---ј--·--·· 22 ~ ·;·-··--··~·-···-·-·- ;-~-;·----··-·-·· ·--·-··-- ~;-~-;------ ~----·-···- -~-~--~-·--·-·-·- . 1 f- trans-[PI(Py),CI~--9 ± 1 г--1~.0. -- 7 ± 1 - ~~±0,46 - CDDP 1 6,21± 0,24 1 6,61± 0,51 5,68 ± 0,33 6,48 ± ND 8 Celije su tretirane sa butionin-sulfoksiminom BSO (4.5 Ј..!М) 24 sata pre dodavanja testiranog kompleksa, а koinkubacija је nastavljena u prisustvu ispitivanog kompleksa jos 72 sata. N.D: Vrednost nije odreaena . 90 Doktorska disertacija - Re:ultali 4. 1. 5. K OINKUBACIJA Rи(АСАС)з SA C/SPLAT/NOM Ј OKSAL/PLATINOM Citotoksicnost Ru(acac)з ispitivana је u koinkubacionoj studijj sa pojedinacnjm kompleksima platjne(l l) , cjsplatinom ј oksaljplatinom, na Hela celjjama. Rezultujuce vrednostj komЬinacjonjh jndeksa (CI), prikazane su u Tabeli 4.1.5. Efekat komЬinovanog dejstva Ru(lll) se razlikuje u slucaju cjsplatjne ј oksaljplatine (SI. 4.1.5.а). Prj komЬinovanom dejstvu sa nizjm koncentracijama cisplatjne (0,5 х ICso; ICso) uocava se sinergizam (CI< 1), dok pri vjsjm koncentracjjama cisplatine, efekat varira sa promenom koncentracija Ru(acac)3 od sinergizma (CI< 1) do aditivnog efekta (CI:: 1) (SI. 4. 1 . 5.Ь). Oksaliplatina daje antagonistican efekat (CI>1) pri svim primenjenim koncentracijama (SI. 4. 1 . 5 . Ь . ). ТаЬе/а 4. 1. 5. Rezultati komblnovanog dejstva cisplatine (CDDP) i Ru(acac)3, odnosno oksaliplatine (ОХ) i Ru(acac)3 па HeLa 6e/ijama, primenjenih и komblnaciji tri razlicite koncentracije: 0,5 х IC50; IC50; 1,5 х IC50, Prikazane vrednosti komblnacionih indeksa С! (CI-comblnation index ) dobijeni su primenom МП testa, za 72 sata dejstva agenasa i predstavijaju srednju vrednost 2 do З nezavisna merenja (:t sd.). 1- Ru(acac)з 0,5 х ICso CDDP1 0,5 х ICso 0,84± 0,03 i i ! CDDP2 ICso : 1 CDDPЗ 1,5 х ICso Cl ( komblnacioni indeks) --- --~~~.--------------~ 0,89± 0,08 0,72± 0,09 1- ·- - -·----+- ·--·-- ~ ·---·- " -·--·------·--------- ICso 1 0,84± О , 11 1 0,84± 0,07 1 ,07± 0,41 t-·---·-.. ---··-··---1·-·-·- . . .. ·-·-.. · .. --r-·- - ·----·- .. ·-. . .. ----·---г----.. -·-·-----·-.. ----·-· -- 1,5 х ICso ! 0,82± 0,02 1 ,01 ± 0,04 1 0,73± 0,09 ОХ1 0,5 х IC5o ОХ2 ICso охз 1,5 х ICso Ru(acac) 3 komblnacion i indeks) 1 0,5 х ICso 1 1 ,06± N.D.3 1 ,06± 0,06 ! 0,9± 0,2 1 --·----~--·--·--·--- --·-·-- -------- --- ·- . 1 ICso 1 1,18± N.D. 1 0,94± 0,1 9 1 1,04± 0,25 Ј --· .... -~-··-· --·---·-··--·-!·--·-·--- .... -· . -·-·- ··-··- ·- -..... ~---·-··---.. ·--· .... ···· · -- - .. - .. -· ---г·····-··-·-----·-.. ----·--.. -·-...... __ .. ___ 1 1,5x1Cso 1 1,04± N.D. 1 1,18± 0,19 Ј 1,12± 0,06 1 8 ± N.D ("not determined") nije odreбno . 91 Doktorska disш·tacija-Re:ultati ------------------------------------------------------- Koncentracija 11М Koncentracija ~LM CDDP Ru/CDЗ ~ Ru/CD2 Ru!CD I --- Ru(acac)з Oksaliplatina (ОХ) Ru!OXЗ __.__ Rн/ОХ2 Rн/OX I --- Rн(асас)3 SJ. 4.1.5. Krive prezivljavanja HeLa ce/ija (Fa-fraction affected, tj. udeo mrtvih celija) pri simultanom dejstvu Ru(acac)3 sa cisplatinom ili oksaliplatinom. KomЬinovano dejstvo kompleksa ispitivano је za 72 sata dejstva agenasa, primenom komЬinacije doza odre(Jenih па osnovu poznatih vrednosti IC50. Graniёne doze cine 1 ОО% (2 х IC50) standardnog agensa odnosno 100% testiranog agensa, tako da se dobija niz komЬinacija doza: Graniёna doza 100:0 %(testirani agens Ru(acac):/standardni agens, СО ili ОХ) 75:25% (testiraпi agenslstandardni agens, СО1 Ш ОХ1) 50:50 % (testirani agenslstandardni agens, CD2 ili ОХ2) 25:75 %(testiraпi agenslstandardni agens, СОЗ Ш ОХЗ) Granicna doza 0:100% (testirani agens Ru(acac):/standardni agens (СО ili ОХ) 92 2 1 Doktorska disertacija-Rezultati Ru/CDЗ Ru/CD2 Ru/CDI ················-·······················-·····-·······················t···-··················· ················-········· .......•.. с 1 = 1 • о 1 2 2 з 1 О . О. о. о. Fa 2 53 {5 р \з / r 1 -з~ • 1 ............................................................................. ~---4·-········----·----··--· ···· -u о __ О. о. О. \. Fa 1. Ru/OXЗ ··• ·· Ru/OX2 Ru/OXI .......... С! = 1.0 S/. 4.1.5. Graficki prikaz Cl-komblпacioпog iпdeksa, za simultaпo dejstvo Ru(acac)з sa cisplatiпom Ш oksalip/atiпom, па Не/а celijama. КотЬlпоvапо dejstvo kompleksa ispitivaпo је za 72 sata dejstva ageпasa, primeпom komblпacije koпceпtracija (doza) odreaeпih па osпovu pozпatih vredпosti ICso: graпicпa doza 1 ОО% odgovara koпceпtraciji 2 х /С50. 75:25 (%) testiraпi ageпs lstaпdardпi ageпs (CD1 Ш ОХ1) 50:50 (%) testiraпi ageпs/staпdardпi ageпs (CD2 ili ОХ2) 25:75 (%) testiraпi ageпs/staпdardпi ageпs (СОЗ ili ОХЗ) 93 Doktoгska disertacija -Re=иltati 4. 2. REZUL TATI ANALIZE APOPTOZE 1 CELIJSKOG CIKLUSA KORISCENJEM PROTOCNOG CIТOMETRA U cjlju jspjtjvanja korelacjje jzmedju cjtotokjsjcnostj testjranjh kompleksa rutenjjuma(lll), hroma (111), rodjjuma(lll) ј platjne(ll) , ј mehanjzma njjhovog antjproljferatjvnog dejstva, analjzjralj smo potencjjal ovjh komlpeksa da uzrokuju apoptozu ј promene celjjskog cjklusa koriscenjem protocnog citometra, nakon bojenja tretjгanjh celjja sa Pl. 4.2.1. REZULTAТI ANALIZE APOPTOZE 1 CEL/JSKOG CIKLUSA KOMPLEKSA RUTENIJUMA(/11), HROMA (///) 1 ROD/JUMA(/11) . Preljmjnarna analiza potencijala neplatinskih kompleksa: Ru(tfac)3, Ru(acac)3 , Cr(acac)3, Rh(acac)3, da jndukuju apoptozu (sub-G1 frakcjja) ј promene celjjskog ciklusa izvedena na celijama karcinoma humanog ovarijuma А2780, ukazala је na postojanje veljkjh razlika medju testjгanim kompleksima. Ru(tfac)з је pokazao najveci potencijal za indukciju apoptoze (sub-G1 frakcija) 46,71 %, odredeno nakon 48 satj kontjnualnog dejstva u koncentracjjj 100 )lM (ТаЬ. 4.2.1.). Ru(tfac)3 је takodje jndukovao promene celjjskog cjklusa, zastoj u S fazj , odnosno opadanje broja celija u G1 i G2 fazj (SI. 4.2 . 1 . а .). Medju ostaljm testjranjm kompleksjma Ru(acac)3, је indukovao znacajan procenat apoptoze 14,70 %, na А2780 celijama (48 satj dejstva), kao ј na Hela celjjama 11 ,21 % (72 satj dejstva) u koncentracjjj 1,5 х IC5o (SI. 4.2.1.Ь. ) prj cemu procenat celjja u apoptozj raste u koncentracionoj ј vremenskoj zavjsnostj _ Analjza celjjskog cjklusa, na dvema celjjskim ljnjjama (А2780, Hela), ukazala је da Ru(acac)з utjce na neznatno smanjenje Ьгоја celjja u G1, G2 fazj , kao ј zastoj u S fazj celijskog ciklusa, kojj su na А2780 celjjama reverziЬilni odnosno promene su uocljive nakon 24 sata dejstva agensa ј skoro nestaju nakon 48 satj. Kompleksi Сг(асас)3 ј Rh(acac)3 njsu pokazali uticaj na progresjju celijskog ciklusa kao ni potencijal za indukcjju apotoze, jspitivanjem na А2780 celjjama. 94 70 ...-._ 60 ~ ..._" .N 50 з 0.. 8.. 40 ('О ::s з 30 -8 "§' 20 ~ 10 LEGENDA: ~Ru(tfac}3 -8- Ru(acac)3 Cr(acac)3 ~Rh(acac)з Kontrola Doktorska disertacija-Rezultati ----------------- 24 h о ~--------------~------------~---------------Ј G1 s Faze celijskog ciklusa 70 -г------------------------- .N 50 з 0.. 8.. 40 ('О ::s ('О з 30 ~ ' (.) "§' 20 ~ 10 G2-M 48 h о +---------------r-------------~~------------~ G1 s G2-M Faze eelijskog ciklusa Sf. 4.2.1.а. Uticaj kompleksa Rи(/11), Cr(/11) i Rh(/11), primenjenih и ekvimolarnoj koncentraciji (100 ЈЈМ), па progresijи celijskog ciklиsa А2780 6elija, nakon 24 sati, odnosno 48 sati delovanja. Dijagrami prikazиjи raspored (%) tretiranih celija ро fazama celijskog ciklиsa (G1, S, G2; sиb-G1 apoptotska frakcija nije prikazana) и porecJenjи sa kontrolom (netretiranim ce/ijama). 95 Doktorska disertacija-Rezultati 120 48 h - 100 ~ Q - .N о - 80 а. о .___ а. (\) 60 ------. _________ LEGENDA: ::3 :~ ф о() 40 -~ С() 20 • G2 о • • о ICso 1.5x1Cso s Koncentracija agensa • G1 120 • Sub- G1 - 72 h ~ ~ 100 .N о -0.. 80 о 0.. (\) ::Ј 60 • (\) • :=-- • ф •(.) 40 ·о ..... Q) 20 о о ICso 1.5xiC50 Koncentracija agensa S/. 4.2. 1.Ь. Uticaj kompleksa Ru(acac}3 па progresiju celijskog ciklusa HeLa celija, primenjenog и koncentraciji koja odgovara !С50 i 1. 5 х /С50, nakon 48 sati, odnosno 72 sata dejstva. Dijagrami prikazuju raspored tretiranih celija ро fazama celijskog ciklusa (sub-G1, G1, S, G2; sub-G1 apoptotska frakcija) . 96 Doktorslш disertacija Re=ultati Tabela 4. 2. Ј. Apoptoza А2780 сеЦја, indukovana гazliCitim kompleksima metala. Sub-G1 DNK sadriaj (%) а 1 Kompleks 24 h 48 h 1 Ru(tfac)з 3,36 46,71 ј ~R~u~(-ac_a~c_)з ________________ 9~·~93 ___________________ 1~4,~7~0- -------] 1 Сг(асас)з 8,88 4,75 . - . ----1 Гк~~;,;i'----·-----·- - --~:~~--·-.. --·-.. _ .. ___________ .. _______ ~·~ :-------·----1 " Proccnat celija u apoptozi odr·eden је 11akon 24 sata odnosno 48 sati delovanja agensa, primenom protocne citometrije i izrazen је kao procenat eelija u sub-Gl fa zi ciklusa. 4. 2. 2. REZULTAТI ANALIZE APOPTOZE 1 CEL/JSKOG CIKLUSA KOMPLEKSA PLAТ/NE{/1). Delovanje kompleksa platine ispitivano је па Hela celijama i poredeno sa delovanjem cisplatine. Analiza apoptoze (sub-G1 frakcije) ukazuje da cis- [Pt(Py)2CI2] indukuje veci procenat apoptoze, 17,06% u poredenju sa trans- [Pt(Py)2CI2] , 5,98 %, tokom 24 sata dejstva u koncentraciji koja odgovara 1,5 х ICso. Cis-[Pt(Py)2CI2] је indukovao znacajan ali reverzibllan zastoj celijskog ciklusa u S fazi, odnosno zastoj se javlja pri manjoj koncentraciji (IC50), а nestaje pri vecoj koncentraciji 1,5 IC50 (SI. 4.2.2.). Proporcionalno smanjenju broja celija u S fazi celijskog ciklusa, pri koncentraciji 1,5 IC5o, javlja se akumulacija celija u sub-G1 (apoptotskoj) frakciji. 97 Doktorska disertacija-Rezultati 70 LEGENDA: -- 60 ~ ~ sub-G1 "N 50 $3 Q. G1 о 40 Q. со s :Ј ~ 30 Qj G2 () ·о 20 ... IXI 10 о о ICso 1.5 х IC50 Koncentracija CDDP 70 -- 60 ~ ~ ·;::; $3 50 Q. о 40 Q. со :Ј ~ 30 Qj () 20 ·о .. i1l 11) 10 о о ICso 1.5 х IC50 Koncentracija Cis-[Pt(Py)2CI2) S/. 4.2.2. Uticaj kompleksa 70 Pt(/1) па progresiju celijskog ~ 60 ciklusa HeLa ce/ija, ·;::; 50 primenjenog и koncentraciji о ... Q. о koja odgovara IC50 i 1,5 х !Cso, Q. 40 1'0 :::1 nakon 48 sati, odnosno 72 sata 1'0 30 :=' ф dejstva. Dijagrami prikazuju u ·-- 20 е raspored celija fazama р о m 10 celijskog ciklusa (sub-G1, G1, о S, G2; sub-G1 apoptotska о ICso 1.5 х IC50 frakcija). Koncentracija Trans-[Pt(Py)2C12] 98 Dokt01·ska diser/acija - Re=ullati Trans-[Pt(Py)2CI2] jndukuje neznatan zastoj u S fazj celijskog ciklusa, kao ј neznatno smanjenje broja celjja u G1 fazj, pri ICso. Те promene su takodje reverzjbllne јег nestaju ргј vecoj koncentracjji (1 .5 х IC50) agensa (SI. 4.2.2.). Medju testiranim kompleksima platine(l l), cisplatjna је pokazala najjaci koncentraciono zavisan utjcaj па jndukcjju apoptoze; procenat celjja u sub-G1 (apototskoj) frakcjji Ьiо је 12,49 о/о pri koncentracijj IC50 ј raste do 24,69 о/о prj koncentracjj j 1,5 ICso. Promene celijskog ciklusa karakteгjsane su reverzibllnjm zastojem u S fazj celjjskog ciklusa i znacajnim opadanjem broja celjja u G1 ј G2 fazama (SI. 4.2.2. ). 4. З. INTERAKCIJA KOMPLEKSA Ru(lll), Cr(lll ) i Rh(lll) SA DNA Afinjtet jnterakcjje testiranih kompleksa metala sa nuklejnskjm kiselinama, pre svega molekulom DNK, jspitjvan је prjmenom razlicitjh metoda: analjzom direktnog vezivanja metala za ONK primenom masene spektrometrije ICP-MS (eng.: inductively coupled mass spectrometry) ispitivanjem inhibltornog dejstva kompleksa na sjntezu unutarceljjske DNK ili RNК. 4. 3. 1. D tREK TNO VEZIVANJE KOMPLEKSA METALA ZA DNK Afinjtet 13-djketonato kompleksa Ru(lll ), Cr(lll ) ј Rh(ll l) da interaguju sa ONK ispitivan је : а) analizom djrektnog vezjvanja kompleksa (odnosno metala) za celijsku DNK na А2780 celijama; Ь) analizom in vitro jnterakcije kompleksa metala sa fragmentom DNK (eng.: DNA-Iadder) duzine 12З bazna рага (Ьр) . U оЬа slucaja kvantjtativna anal iza izvrsena је koriscenjem ICP-masene spektrometrije (ICP-MS). U nasim eksperimentalnim uslovima medju svjm testiranim kompleksima jedino Cr(acac)3, pokazuje afinitet za interakciju sa DNK molekulom. Koncentracjja Cr(lll ) vezana za ONK fragment (О , З 1-LQ), iznosi 26,7 (pg/ Ј-1.9 DNK) (ТаЬ. 4.7,) i veca је pri visoj koncentracij i DNK (З 1-LQ), kada iznosi 57,9 (pg/ Ј-1.9 DNK). Takode је detektovana znacajna koncentracjja Cr(ll l) jona vezana za celijsku DNK, 45,1 З (pg/DNK 1-LQ), nakon samo 1. sata jnkubacjje. 99 Dokror·ska diser·tacija - Re:u/tari Tabela 4. З. 1. Rezultati analize vezivanja metala Ru(llf), Cr(llf) i Rh(llf) za ONK, ispitivanjem па celijskoj DNK (А2780) i in vitro analiza vezivanja metala za DNK-fragment duzine 123 Ьр, primenom ICP-masene spektrometrije (ICP-MS). Vezivaпje za fragment DNK -12ЗЬр (pg/IJg DNK) а 0,3 !ЈМ З!ЈМ Ru(tfac)з о о Ru(acac)3 о о Cr(acac)3 26,7 57,9 Rh(acac)з о о Cisplatin 6613 N.D. 8 Rezultati su prikazani u vidu pg metala/j.Jg DNK. ь N.D. = nije odredjeno. Vezivaпje za celjisku DNK (pg/IJg DNK) 8 1 h 24 h о о о о 45,13 N .D . ь о о N.D. ь N .D.ь 4. З. 2. UТ/САЈ KOMPLEKSA RUTEN/JUMA(/11}, HROMA (11/) 1 ROD/JUMA(II/) NA /NH/8/C/JU SINTEZE DNK 1 RNК. Sposobпost (3-diketoпato kompleksa па bazi Ru(lll), Cr(ll l) i Rh(lll) da iпterferiraju sa procesima siпteze пukleiпskih kiseliпa u celiji , aпaliziraпa је mereпjem iпkorporacije radioaktivпo obelezeпih пukleotida, 1 3C-timidiпa i 3H- uridina, u makromolekule (DNK i RNK), па А2780 celijama. 4. З. 2. 1. lnhiblcija sinteze DNK Uticaj Ru(tfac)3 па iпhjЬicjju siпteze DNK molekula, pokazuje koпceпtracjoпu ј vremeпsku zavjsпost. Najvece jпhiЬitorno dejstvo (prikazaпo kao proceпat iпkorporacije radioaktivпo obelezeпog пukleotida C 3C-timidiпa) izпosi 17,5 % pri пајvесој koпceпtraciji ageпsa (1 ОО f..LM) i duzem vremeпu dejstva (24 sata) (SI.4.3.2.1.). Kompleks Ru(acac)3, ima slaЬij i utjcaj па iпhjЬiciju DNK s iпteze, koji је kопсепtгасiопо zavistaп ј priЬiizaп za оЬа vremeпa dejstva; pri 100 ~-tM izпosj oko 65 %. Uticaj Cr(acac)3 па iпhiЬiciju sinteze DNK је slabo izrazeп . 100 Doktorska disertacija -Re=иftati 4. З. 2. 2. lnhiЬicija sinteze RNK Dobljenj podacj ukazuju da Ru(tfac)3 , jma najvecj potencjjal jnhjblcjje RNK sjnteze, kojj је jzгazenjjj prj vecoj koncentracjjj (100 J.lM) tako da sjnteza RNK (jzrazena kao procenat jnkorporacjje radjoaktjvno obelezenjh nukleotida 3H- urjdjna) jznosj 21 ,17% (od mogucjh 100%) nakon 6 satj dejstva, odnosno 5% nakon 24 satj dejstva kompleksa (SI.4.3.2.2.). Efekat Ru(tfac)3 ргј njzjm koncentracjjama (1 О ~-tM. 30 ~-tM) jeste reverzjbllan, јег se uocava nakon 6 satj dejstva, ј nestaje nakon 24 sata. Ru(acac)3 ј Сг(асас)3 takodje pokazuju jnhjbltorno dejstvo па proces sjnteze RNK (jnkorporacuje 3H-urjdjna), mada u manjem stepenu ј jznosj 50,2 % za Ru(acac)3 ј 57,1 % za Cr(acac}3 , ргј koncentracjjj 100 Ј..!М (6 h). Efekat ova dva kompleksa uocen nakon 6 satj dejstva је skoro potpuno reverzjbllan ј u slucaju svjh pгjmenjenjh koncentracjja agensa nestaje nakon 24 sata. 101 __________________ ________ D_o_ktOJ'Ska disertacija-Rezultati ,...1 20---- -t- DNK 6 h ro 100" в со о 80 о ~ 60 .S с LEGENDA: О 10 Ј.!М О 30 Ј.!М 8 100 Ј.!М 1201 100 80 60 1 DNK 24 h ~ f-L-~ 1-I-- ~ :0 40 .Е '1 () 20 ~ 40 20 о ~ш Ј Ј Ru(tfac)3 Ru(acac)з Сг(асас)з Ru(tfac)3 Ru(acac)з Сг(асас)3 Sl. 4.3.2.1. lпhibltorno dejstvo komp/eksa Rи(асас)з, Cr(acac)3 i Rи(tfac)3 па proces siпteze ONK (inkorporacije 14C-timidiпa) паkоп 6 sati, оdпоsпо 24 sata dejstva и konceпtraciji 10, 30, 100 (ј..ЈМ). 1001т---- ~ 90 RNK 6 h -;. ~ 80 -~ (ј 70 ~ о 60 е о 50 ~ -~ 40 с: 'О 30 -с 1 20 f 10 o~L_L_L_~~L_~~~-L-~~~ Ru(tfac)3 Ru(acac)з Сг(асас)з 120 100 80 60 40 1 20 о RNK 24 h ..--r--- г-=- 1 ~ \-L 1-- о 1 о ' 1~ ь Ru(tfac)3 Ru(acac)з Сг(асас)з SJ. 4.3.2.2. lпhibltorno dejstvo kompleksa Rи(асас)з, Сr(асас)з i Rи(tfac)3 па proces siпteze RNK (inkorporacije 3H-иridiпa) паkоп 6 sati, оdпоsпо 24 sata dejstva и koпceпtraciji 10, 30, 100 (J.lM). 102 ; Doktorska disertacija - Re:ultati 4. З. З. U NUTARCELIJSKA AKUMULACfJA KOMPLEKSA PLATfNE{/1) Unutarcelijska akumulacija platine i1spitivana је na Hela celijama, nakon 2 sata inkubacije celija sa platina( ll) kompleksima. Rezultati ove analize (prikazani u Tabeli 4.3.3.) ukazuju da је unutarcelijski sadrzaj platine razlicit za razlicite komplekse platine(ll) i opada u nizu: trans-[Pt(Py)2CI2]> cis-[Pt(Py)2CI2]> cisplatina. Tabela. 4. З. З. Unutarcelijska akumulacija p/atine(/1) и HeLa telijama, odredena primenom atomske apsorbcione spektrofotometrije (AAS). Kompleks CDDP cis-[Pt(Py)2CI2] Sadriaj platine (11) (1-19 Pt(ll ) 1 mgproteina) а 0,760 1,076 1,533 8 Rezultati su prikazani u vidu Ј.Ј9 metala/ mg proteina. 4. 4. METALOPROTEINAZE (ММР-21 ММР-9) IMUNOTEST Uticaj kompleksa Ru(l ll) na aktivnost ili koncentraciju metaloproteinaza ММР-2 i ММР-9, ispitivan је u supernatantu celija osteosarkoma U2-0S, nakon tretmana celija ispitivanim kompleksom (24 sata), i postjnkubacjje u podlozj bez agensa 72 sata. Kvantjtatjvna analjza ММР-2 ј ММР-9 jzvrsena је pгjmenom ELISA-jmunotest kjta (Quantikine System, R&D, SAD). Dobljeni rezultatj prjkazanj su u Tabeli 4. 4. Za ova ispitivanja odabrane su U2-0S celjje, јег se one odljkuju visokim sadrzajem enzima ММР-2 i ММР-9 u celijskom supernatantu. Na osnovu preljminarnih analiza Ru(acac)3, pri koncentracjjj 30 ~-tM. jspoljava ocigledan inhibltorni utjcaj na ММР-2 ј ММР-9. 103 Doktot·ska diset·tacija - Re=ultati Tabela 4. 4. Sadriaj enzjma ММР-2 ј ММР-9 (nglml), odreaen и sиpernatantи U2-0S" ce/ija, nakom jzfaganja (24 sata) testjranom komp/eksи Rи(/11) и koncentracijj od 1Q џМ ј 30 џМ. Kompleksi ММР koncentracija 1 (nglml), 24 sata dejs tva 10 Ј.!М 30 џМ ..._ ~··. ••м" .. "_" ___ ,_,, --··-··-----·----·------.. ·--··· --·-·-.. ·---------- Ru(acac)з 4,88 3,82 ·- ... '" '''""' ,"_м• ... _"_,,._,_,_" t--··-·-··-··-·- ·--·---·-·····- ··-·- ·-··- ··---·- ··--·- ··------·-.. - .. _____ .. .... . .... иооо_,_., __ ,_".,_ 1 Ru(tfac)з 5,74 5,2 ·-·--·--·---- ..• -·--·--·-··- ··-·-----··-·--·-·-·-.. --·····--·· Kontrola 4,18 а Celije osteosarkoma U2-0S se odlikuju visokom produkcijom enzima ММР-2 and ММР-9, ciji је sadГZaj u supernatantu celija iznad granice detekcije (0, 156 ng/ml) za Quantikine System-ELISA test. 4. 5.1SPITIVANJE APOTOZE PRIMENOM ANEKSIN V-FITC/PI KONJUGOVANOG ANTITELA Poteпcijal kompleksa platiпe( ll ) da iпdukuju apoptozu па Hela celijama ispitivan је dodatпo u poredenju sa kompleksom Ru(acac)3, korisceпjem protocпog citometra, паkоп obelezavaпja celija flruoresceпtпo koпjugovaпim proteinom aпeksiпV-FITC (FITC-fluorescein isothiocyanate; fluoresceiпizotiocijaпat) Propidijum-jodidom (PI) . Kompleks Ru(acac)з је podvrgnut ovoj aпalizi s obzirom па to da је u prethodnim testovima pokazao poteпcijal za iпdukciju apoptoze (videti poglavlje 4.2.1.), iako poseduje slab citotoksicni efekat. DoЬijeni rezultati prikazani su u vidu dot-plot grafikoпa i histograma, na Slici 4.5. Na "dot-plot" grafikoпima (SI. 4. 5.Ь.) u populaciji celija obojeпih komЬiпacijom Ьоја aпeksiп-V-FITC/PI mogu se пасi tri grupe celija, Tabela 4.5. 104 Doktorska disertacija - Re:ultali Tabela 4. 5. Sematski prikaz moguceg bojenja celija komЬinacijom Ьоја aneksin-V-FITCIPI Bojenje celija 1 Aneksin ~-~-=~~!С - Р/ ~----- --- 1 + + Faza celijske smrti Zdrave celije ·1 _ј Pocetna faza apoptoze ' Zavrsna faza apoptoze; sekundarna nekroza; prava nekroza. + lntracelijska inkorporacija,tj . vezjvanje Ьоје . - Odsustvoi jntracelijske inkorporacjje,tj. vezivanja Ьоје. Poredenje potencijala za indukcjju apoptoze kompleksa Pt(ll) medusobno, ukazuje da cis-1 trans- [Pt(Py)2CI2] imaju .slican efekat indukcije apoptoze, tokom 24 sata dejstva agensa ј iznose za cis- izomer: 26,35 ± З, 12 %; za trans-izomer: 24,58 ± 0,98 % (SI. 4.5 .а ; 4 . 5 . Ь . ) . Kompleks Ru(acac)з, indukovao је znacajan procenat apoptoze 29,09 ± 1,32 % (SI. 4.5. а . ј 4 . 5 . Ь.) (A+PI- populacija celija) , tek nakon 48 satj kontjnualnog dejstva. Mada procenat cel jja obojenjh propjdijum- jodidom (A-PI+), koji iznosj 31.78 % (SI. 4 . 5Ь.) ukazuje na pojavu sekundarnih nekrotjcnih promena tokom celijske smrti. 105 " ~ ' "' ;ј g о. о о. т ј ~ =' ., \) о ~ DoktOI"Ska disertacija-Rezultati 40 О Oh 35 - 024h 30 r--1- 048h + 25 r--1- г+ 20 15 - 10 - г+ г--+- 5 - ,....-- r- r-- - о . Ru(acac)з CDDP Trans-[Pt(Py)2CI2] Sl. 4. 5.а. Dijagram prikazиje иporedni potencijal ispitivanih kompleksa Pt(/1) i Ru(acac)3 za indukciju apoptoze HeLa 6e/ija, nakon dejstva и koncentraciji 1. 5 х /С50, tokom О, 24 i 48 sati. Procenat 6e/ija и apoptozi odreaen је primenom protocne citometrije, nakon bojenja tretiranih 6elija komblnacijom Ьоја aneksin-V-FITCIPI. 106 Doktorska disertacija-Rezultati Sl. 4. 5.Ь. Dijagrami prikazиjи proceпat apotoze iпdиkovaпe dejstvom cisplatiпe, cis-ltraпs­ izomerima p/atiпe(/1) i Rи(асас)3 па HeLa 6elijama, паkоп 24 i 48 sati dejstva и koпceпtraciji 1,5 /С50; aпaliziraпo primeпom рrоtоёпе citometrije. 'Dot-plot' dijagram, prikazиje zastиpijeпost celija и zavisпosti od оЬојепја sa aпeksiп-V-FITC (А) i Р/ i razlikиjemo tri grиpe ce/ija: levi gornji kvadraпt (А-Р/+}, пekrotiёпe celije; desпi doпji kvadraпt (A+PI-), celije и rапој apoptozi; desпi gornji kvadraпt (A+PI+}, 6elije koje иlaze и пekrozи (sekипdarna пekroza). Aпeksiп-FITC histogram prikazиje рrосепtиа!пи zastиpijeпost celija obojeпih pozitivпo samo па Aпeksiп-V-FITC (rапа apoptoza). DNK-PI histogrami, prikazиjи zastиpijeпst 6elija obojeпih pozitivпo samo па Р/ (пekroza). 107 Doktorska disertacija-Rezultati ----------------------------------------------------------- Ru(acac)з 24h .. Pl ~ Aneksin-FITC о о С> о <'> N N ~ о с:> ~ ~ N С> С> -С> "'"' """ Q.- ~- ~- 6.37 (%) "о " 8w 7.48 (%) Оо ~ uco М1 С> ..,.. М1 о .".. о ~ с:> о Aneksin-FITC 10 4 Ru(acac)з 48h .... Aneksin-FITC ~ Pl с:> С> о С> <'> N N ~ с:> С> ~ ~ "' с:> с:> -о '""' ""'' о.- ~- ~-"о "' оо - 8w Uco ~ о .".. о ~ о 1 0'~ 104 дмk!':in-F1Tr: Cis-[Pt(Py)2CizJ 24h .... Aneksin-FITC Pl ~ С> С> С> о N N а о ~ ~ о с:> '" "' 11\ N ;:- ~- "' "' ос:> Ос:> u oo 26.35% \.)()) с:> с:> v v о о 10 104 104 Aneksin-FITC Trans-(Pt(Py)zCiz] 24h .... Aneksin-F1TC Pl ~ о о о о N N м ~ о о oD ~ N о о "'"' \1\ N -о ;:- ~-о._ "о " оо - 8оо 24.58 % Uoo ~ о С> v .... о ~ С> с:> 104 104 104 AnP.k!':in-F1Tr: 108 Doktorska disertacija -Re=иftali 4. 6. ODREDIVANJE AКТIVNOSTI КASPAZE-3 PRIMENOM PROTOCNE CITOMETRIJE Potencjjal kompleksa Pt(ll) ј Ru(acac)3 da jndukuju aktjvnost enzjma kaspaze-3, kao markera rane apoptoze, jspjtjvan је na Hela celjjama nakon 5 satj dejstva agensa prj koncentracjjama koje odgovaraju 5 х ICso ј 1 О х ICso {ICso koncentracjja leka koja jzazjva inhiblciju prezjvljavanja ispitivane kulture celija za 50 %, odredena МТТ testom). Rezultati analjza na protocnom citometru, dobljeni nakon bojenja tretiranih celija anti-kaspaza-3 monoklonskim antitelima obelezenim bojom fikoeritrin (РЕ- PhycoErythrine), prikazani su u vidu histograma na Slici 4.6 .Ь . Cjsplatina је pokazala dozno zavisnu indukcjju kaspaze-3 koja iznosi 5 % pri 5 х IC5o odnosno 16,24 % pri 10 х ICso (SI.4.6.a.). Zanimljivo је da trans-[Pt(Py)zCI2] pokazuje duplo veci kapacitet za indukciju kaspaze-3 prj vecoj koncentracijj 1 о х IC50 (9,54 %) u poredenju sa cis- izomerom (3, 79 %), iako је potencijal ovih jzomera za indukciju apoptoze na Hela celjjskoj ljnjji priЬijzan (odredeno Aneksin V- FITC/PI bojenjem, videti poglavlje 4.5.) . Ru(acac)з pokazuje slabu sposobnost jndukcjje kaspaze-3, u poredenju sa cisplatjnom, koja iznosj 0,9 % pri 5 х IC50 ј raste do 4,16% pri koncentraciji 1 О х ICso. Najmanju sposobnost indukcije kaspaze-3 pokazao је cis- platinski kompleks cis-[Pt(Py)2CI2] (3,79 % pri 10 х ICso). 109 Doktot·ska disertacija-Re:ultali ----------------------------------------------------- 18 -е- CDDP 16 -+-- Ru(acac)з 14 Cis-[Pt(Py)2CI2] -~ -А- Traпs-[Pt ( Py)2CI2] ~ - 12 w а. 1 (") 10 nJ N nJ 8 а. rл nJ ~ 6 nJ с > ... ~ 4 <( 2 о о 5 х IC50 10 х IC50 Koncentracija agensa SJ. 4.б.а. Oijagram prikazиje иporedпi kapacitet kompleksa Rи(асас)з, CDDP i cis-/traпs­ [Pt(Py)2Cbl, da iпdиkији aktivпost eпzima kaspaza-3, па HeLa ce/ijama паkоп dejstva и koпceпtraciji od 5 х /С50 ili 1 О х IC50, tokom 5 sati. Sl. 4. б.Ь. Rezиltati aпalize aktivпog eпzima kaspaza-3, па HeLa ce/ijama, prikazaпi и vidи histograma. Histogrami prikazиjи рrосепtиа/по па/аzепје aktivпe kaspaze-3 и popиlaciji aпaliziraпih celija, пakon dejstva Rи(асас)3 ili СООР ili cis-ltraпs­ [Pt(Py)2C/2], и koпceпtraciji od 5 х IC5o ili 1 О х IC50, tokom 5 sati. Aпaliza је izvrseпa primeпom protocne citometrije, паkоп Ьојепја ce/ija fikoeritriп (PE-PhycoEritrine) obelezeпim aпtitelima specificпim za aktivnи kaspazи-3. 110 Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) ____________________________ D_o_k_to_rs_k_a_d_isertacija-Rezu/tati о о о о N N Cis-[Pt(Py)2CI2] 5 х ICso Trans-[Pt(Py)2CI2] 5 х ICso о о .о .о .... .... о 1.95 (%) о ~~~~ ~~~~ 1.95 (%) ё ё :s ::s оо М2 Оо <.>со <..>оо М2 о о v v о о 104 Aktivna kaspaza З-РЕ Aktivna kaspaza З-РЕ .::;; <::> о о N N Cis-[Pt(Py)2CI2] 10 х IC50 Trans-[Pt(Py)2CI2] 10 х ICso о -=· .,:) •Ј:> о 3.79 (%) <::> 9.54 (%) и~ N ~-t: <= :s М2 ::> М2 о о (ј ~ :..;. :5t о о ..,. v -=· 101 102 103 104 103 104 Aktivna kaspaza З-РЕ Akt ivna kaspaza З-РЕ S/ika 4. 6.Ь. 112 Dok1o1·ska dise1·tacija Re:u/tati 4. 7. REZULTATI MORFOLOSKE ANALIZE CELIJSKE SMRTI Morfoloska analiza cel ijske smrtj jndukovane kompleksjma platjne kao Ru(acac)з na Hela celjjama, nakon bojenja tretjranjh celija komblnacjjom Ьоја akгjdjn-oranz (AO)/etjdjjum-bromjd (EtВr) , otkrjla је brojne morfoloske promene koje ukazuju na apoptozu. Cisplatina, nakon 24 sata dejstva pri koncentraciji 1,5 х IC50 , jndukuje tipjcne apoptotske morfoloske promene karakterjsane smanjenjem celijske zapremjne, srpastjm ј ekscentricno postavljenim jedrom, kao i pupljenjem celijske membrane. Veliki broj celija fluorescira narandzasto kao rezu ltat inkorporacije etidijum-bromida usled narusene strukture celijske membrane (karakteristicno za kasniju fazu celijske smrti). Cis-/trans-[Pt(Py)2CI2] izomeri indukuju apoptotske morfoloske promene takodje, nakon 24 sati dejstva pri 1,5 х ICso. ali izrazene u manjem stepenu u poredenju sa cisplatinom (SI. 4.7.а.). Ru(acac)3 indukuje smanjenje broja celija u odnosu na kontrolu i neznatnu promenu morfologije celija vec pri 24 sata dejstva u koncentraciji 1,5 х ICso. Pri duzem vremenu dejstva (48 sati) , uocava se pojava srpastog jedra (SI. 4. 7.Ь). Pri 72 sata dejstva veliki broj celjja је odlepljen od podloge ј uocavaju se promene karakterjstjcne za nekrozu. Jedro celjja fluorescira narandzasto kao posledica jnkorporacije EtBr (takozvana sekundarna nekroza). 113 Doktorska disertacija-Rezultati S/. 4. 7. а. Flиorescentne fotomikrografije HeLa celija nakon tretmana ispitivanim agensima p/atine(/1): А) cis-[Pf(Py)2C/2] indиkиje apoptotske promene и vidи smanjenja celijske zapremine, pojave kondenzovanog jedra. Celije sи и fazi kasne apoptoze kada је integritet celijske membrane narиsen i celije inkorporirajи EtBr, usled cega jedro flиorescira narand' asto. В) trans-[Pt(Py)2C/2} indиkиje promene nalik apoptozi, и vidи ekscentricno postavljenog jedra. Meaиtim иocljive sи i nekroticne promene tipa иvecanja jedra ј celijske zapremjne, kao ј obojenja jedra sa EtBr. С) Kontrola, netretirane HeLa celije. Ј 14 Doktorska disertacija-Rezultati SJ. 4. 7.Ь. Flиorescentne fotomjkrografije HeLa celija nakon tretmana sa Rи(асас)3 prj koncentracijama koje odgovarajи 1,5 х /С50 и trajanjи od 24 h, 48 h Ш 72 h. А) Kontrola, netretjtane celije; В) Morfo/oske promene nakon 24 h delovanja Rи(асас)з: иосаvа se smanjenje zapremjne ce/ija, kao ј smanjenje иkиpnog broja ce/ija и odnosи па kontrolи.; С) Nakon 48 h de/ovanja Rи(асас)з, јаv/јаји se jasne apoptotske promene и vjdи smanjenja zapremjпe celija, zaokrиg/jenja celija ј ekscentrjcno postavljenog jedra. Celije flиorescjrajи zeleno јег иsvајаји samo АО. О) Nakon 72 h delovanja Rи(асас)з, jedro inkorporira EtBr, (иsled cega flиorescira narandzasto), kao posledica narиsavanja strиktиre celijske membrane и kasnoj fazi apoptoze Ш takozvanoj sekиndarnoj nekrozj. 115 Doktorska disertacija Diskusija 5. DISKUSIJA 116 Doktorska disertacija -Diskusija Cilj ovog rada Ьiо је ispitivaпje aпtiproliferativпe aktivпosti kompleksa siпtetisaпih па bazj ruteпijuma{lll) , hroma(lll ) ј rodijuma(lll) , sa Ьideпtatпim ~­ diketoпato ligaпdima: trifluoroacetilacetoпat (tfac) i acetilacetoпat (асас) . Takodje је poredjeпa aktivпost ovih пеkопvепсјопапih kompleksa metala sa aпtjtumorskom aktivпoscu kompleksa па bazi platjпe , pre svega cjsplatiпe , koja пalazj veliku primeпu u kliпjckoj praksj (2) , aktjvпoscu cisЛrans geometrijskjh izomera djpjrjdjпdihloroplatjпe(ll) [ Pt(Py)2CI2] . Sjпteza ј hemjjska struktura ~-diketoпato kompleksa jspjtivaпjh u ovom radu, vec su opisaпi u ljteraturi (8, 9, 153). Na osпovu postojecih literaturпih podataka koji ukazuju da пeki Ьideпtatпi ~-diketoпato kompleksi Ru(II)/Ru(lll) mogu posedovatj vecu aпtiproliferatjvпu aktivпost od moпohelata (9) , preduzel j smo uporedпu aпal izu Ьideпtatпih ~-diketoпato kompleksa metala, tako da se i zmeпom strukture liganda: (tfac), (асас) ; jlj ceпtralпog metalпog јопа : Ru(lll), Cr(ll l), Rh(lll), ј uporedпom aпalizom antjtumorske aktjvпosti kompleksa, moze steci boljj uvjd u mehaпjzam пjihovog cjtotoksjcпog dejstva . Na osпovu studije citotoksjcпostj ~-djketonato kompleksa metala па panelu trj celjjske ljпije : celijama karciпoma humaпog ovarijuma (А2780) i celijama osteosarkoma cjsplatj пa-senzitivпom (U2-0S) i cjsplatiпa-rezjsteпtпom soju (U2- 0S/Pt), јеdјпо kompleks Ru(tfac)3 poseduje citotoksjcпost u opsegu kопсепtгасјја do 1 ОО џМ {Tabela 4.1.1.). Aktjvпost Ru(tfac)3 па cjsplatiпa-seпzjtjvпim eelijama osteosarkoma (U2-0S) IC50 = 39 ± 1 О џМ је priЬijzпa aktivпosti па cisplatiпa­ rezjstentnjm celijama (U2-0S/Pt) IC5o = 37 ± 19 џМ i takodje, uporediva sa aktivпoscu па А2780 celijama (IC5o vredпost је koпceпtracjja leka koja jzazjva iпhiЬiciju prezivljavaпja celija za 50 %). Aпtiproliferativпa aktivпost Ru(acac)3 aпaliziraпa је па sedam celjjskih liпija (А2780, Hela, 816, U2-0S, U2-0S/Pt, Jurkat, К562) ј sve dоЬiјепе IC5o vredпosti krecu se u opsegu izпad 100 џМ ( Hela IC5o = 114 ± 1 џМ) , (816 IC5o = 148 ±1 џМ). Kompleksj Cr(lll) i Rh(lll) пjsu pokazali citotoksicпu aktivпost u in vitro uslovima. Odsustvo zпасајпе citotoksicпe aktivпosti kompleksa rutenjjuma u ovom slucaju Ru(acac)3 Ьilo је ocekivaпo, s obzirom па postojece literaturne podatke (1 03, 191 ). 117 Doktorska disenacija -Diskusija Stuktura ljgaпda -tfac-, doprjпosj vecoj cjtotoksicпoj aktjvпostj kompleksa Ru(tfac)з. Cjtotoksjcпost Ru(tfac)з moze se objasпjtj mogucom uпutarcelijskom redukcjjom Ru(ll l) do Ru(ll) kojj poseduje veci afiпjtet za iпterakciju sa пukleofilima u celjji (192). Kompleksj Ru{ll) оЬlспо poseduju citotoksicпu aktivпost (1 02, 193). lspjtjvaпje uticaja smапјепја kопсепtгасјје uпutarcelijskog glutationa (GSH), па aktivпost kompleksa metala па celijama А2780, 816, К562, primeпom Ьutјопјп sulfoksimiп (8SO) kao jпhjbltora sjпteze glutatjona, ukazala је da Ru(tfac)3 jma пesto vecu cjtotoksjcпost па А2780 u koiпkubacijj sa 8SO (IC50 = 38,73 ± 0,42 f...LM) u рогеаепјu sa aktjvnoscu bez 8SO (IC5o = 40 ± 15 f...LM) (Tabela 4. 1.4.а) lspjtjvaпja па 816 ј К562 celjjama ukazala su da smапјепје unutarceljjske kопсепtгасјје GSH jпdukuje роvесапје aktjvnostj kompleksa Ru(acac)з ј NAMI-A (IC50 vredпost Ru(lll) kompleksa opada). Kako је status uпutarceljjskog glutatjoпa razljcjt u razljcitjm celjjskjm ljnjjama (92), efekat dejstva 8SO па aktjvпost Ru(lll) kompleksa razlj(:jt је na К562 ј 816 celijama (SI. 4.1.4.) Tako па К562 celijama, 8SO jma vecj utjcaj па aktjvпost Ru(acac)з, (IС5щвsо) = 89 ± 9 џМ), jako је senzjtivnost dveju celijskih linija na Ru(acac)з priЫizпa (816 IC5o 148 ± 1 f...LM; К562 IC50 = 143 ± 32 J.LM). lпhiЬicjja sjпteze uпutarceljjskog GSH пјје jmala utjcaja па aktjvпost kompleksa Cr(lll) ј Rh(lll). Ovakav rezultat ukazuje da Ru(lll ) kompleksj pokazuju afiпjtet za jпterakcjju sa uпutarceljjskjm GSH, odпosno GSH jma ucesca u mehanjzmu celjjske odbraпe od aпtjproljferatjvпog dejstva jspjtjvaпjh ~-djketoпato kompleksa Ru(lll). Rezultatj studija citotoksjcпostj Ru(acac)3 u komЬiпacjji (kojпkjbacjji) sa ројеdјпаспјm kompleksjma platjпe(ll) , cisplatjпom ј oksaljplatjпom , па Hela celijama, odпosno rezultujuce vredпostj komblпacjoпjh jпdeksa (CI) (Tabela 4.1. 5.) razljkuju se u slucaju cisplatjne ј oksaljplatjпe . Takodje Cl varjra u zavisпostj od primeпjeпih koпceпtracija (оdпоsпо komЬiпacije kопсепtгасјја) kompleksa. Pri komЬiпovaпom dejstvu sa пizjm koпcentracjjama cjsplatiпe (IC50; 0,5 х IC5o) javlja se sjпergjzam (CI< 1 ), dok pri visi m koпceпtracjjama cjsplatjпe, efekat tezi adjtjvпom (CI::1) (SI. 4. 1.5 . Ь.) . 118 Doktorska disutacija -Diskusija Oksaliplatina, pri svim primenjenim koncentracijima daje antagonistjcan efekat (CI >1 ); (SI. 4 .1 . 5.Ь.). Kako CDDP ј oksaliplatjna formiraju razljcite lezjje na DNK (194), i kako su ј celijskj reparacioni mehanizmj ukljucen j u popravku t jh lezjja razljkuju (195), moguce је objasnjti zasto је efekat koinkubacije ovi kompleksa sa Ru(lll) razlicjt. S obzirom na to da preovladava sinergizam kao rezultat koinkubacionog dejstva kompleksa Ru(Ш) ј CDDP, to ukazuje da Ьi mehanjzmi antiproliferativnog dejstva Ru (acac)з moglj Ьiti razliciti u poredjenju sa mehanizmima delovanja cjsplatine. Afjnitet 13-diketonato kompleksa na bazj Ru(lll), Cr(lll) ј Rh(lll ) da jnteraguju sa DNK ј eventualno postojanja/nepostojanja moguce DNK interakcjje koja Ьi mogla Ьiti odgovorna za prisustvo/odsustvo citotokisicne aktivnosti ispitivanih kompleksa, ispitivani su: а) analizom direktnog vezivanja kompleksa (odnosno metala) za celijsku DNK na А2780 celijama, ili anal izom in vitro interakcije kompleksa metala sa DNK fragmentom 123 Ьр, koriscenjem ICP-masene spektrometrije (ICP-MS). Moguca posredna interferencija sa procesima sinteze DNK ili RNK u celiji ispitivana је merenjem inkorporacije radioaktivno obelezenih nukleotida 13C- timidina i 3H-uridina u makromolekule DNK i RNK, na А2780 celijama. U nasim eksperimentalnim uslovima, medju svim testiranim kompleksjma, jedjno Cr(acac)3 pokazuje afinjtet za djrektnu interakcjju sa molekulom DNK, sto ukazuje da vezivanje za DNK nije u korelacijj sa cjtotoksicnom aktjvnoscu 13-diketonato kompleksa ispitjvanjh u ovom radu. lspjtivanje potencijala za inhЬiciju sinteze DNK (prikazan kao procenat jnhiЬicjje inkorporacije radioaktivno obelezenog nukleotida 13C-timidina), ukazuje da Ru(tfac)3 ima najvece inhiЬitorno dejstvo koje prati koncentracionu i vremensku zavisnost (SI. 4.3.2.1.). Kompleksi Ru(acac)3 ј Сг(асас)3 takodje jmaju uticaja, ali slaЬijeg, na jnhjЬicjju DNK sjnteze. lnhjЬitorno dejstvo kompleksa Cr(lll) na sjntezu DNK, moze se objasniti formiranjem lezija na DNK na osnovu prethodnih rezultata, koji potvrdjuju interakciju Cr(lll) jona i DNК. Kompleksi Ru(lll) oёigledno imaju uticaja na proliferaciju celija , ali nema dokaza da Ьi direktna DNK interakcija mogla Ьiti odgovorna ( 1 08). 11 9 Dok1orska disef"lacija -Diskusija Efekat delovaпj a Ru(tfac)з па jпh jblcjju sj пteze RNK (jпkorporacjja 3H-urjdjna) је jzrazeпjjj prj vecoj kопсепtгасјјј (1 ОО 11М), а prj пjzjm koncentracjjama је reverzjbllaп , јег se uocava паkоп 6 satj dejstva ј пestaje паkоп 24 sata. Ru(acac)3 ј Сг(асас)з takodje pokazuju slablje jnhjbltorno dejstvo па proces sjпteze RNК. Reveгzjbllпo jпhjbltorno dejstvo ukazuje па mogucu jпterakcjj u sa molekulima RNK, tj. formjraпje ostecenja па RNK, koje jndukuje zastoj sjпteze RNK tj. aktjvjra celjjske sjsteme za reparacjju (1 ). U cjlju jspjtjvaпja korelacjje jzmedju cjtotoksjcпostj testjranjh kompleksa ruteпjjuma(lll ) , hroma(lll) , rodjjuma(lll) ј platjпe(ll) ј mehaпjzma пjjhovog aпtjproljferatjvпog dejstva, aпaljzjralj smo poteпcjjal ovjh komlpeksa da uzrokuju apoptozu ј promeпe celijskog cjklusa korisceпjem protocпog cjtometra, паkоп Ьојепја tretjraпih celjja sa Pl, kao ј prjmenom aпeksjп-V-FITC/PI dvostrukog Ьојепја . Aпaljza potencijala пeplatiпskjh kompleksa: Ru (tfac)з , Ru(acac)з. Cr(acac)3, Rh(acac)з , da iпdukuju apoptozu (sub-G1 frakcjja) ј promeпe celjjskog ciklusa izvedena na celijama karcinoma humanog ovarijuma А2780, ukazala је da Ru(tfac)3 pokazuje najveci potencijal za iпdukciju apoptoze (sub-G1 frakcija 46,71 %) паkоп 48 sati delovaпja u koпceпtraciji 1 ОО 11М. Ru(tfac)3 је , takodje, indukovao promene celjjskog cjklusa, zastoj u S fazj , оdпоsпо ораdапје broja celjja u G1 ј G2 fazj . Medu ostalim testjraпjm kompleksjma, Ru(acac)3 је iпdukovao znacajaп procenat apoptoze 14,70% (па А2780 celjjama), kao ј zastoj u S fazj celjjskog cjklusa, kojj је па А2780 celjjama reverzjbllaп , оdпоsпо promeпe su uocljjve паkоп 24 sata dejstva ageпsa ј skoro пestaju nakoп 48 satj . Rezultatj aпaljze celjjskog cjklusa ukazuju jos jedпom па mogucnost jпterakcjje kompleksa Ru(lll) sa procesjma sjпteze DNK ili ucesca celjjskjh sjstema za reparacjju (MMR, NER) u popravcj eveпtualпjh DNK osteceпja (62, 96), sto је u saglasпostj sa rezultatima jпhjblcije DNK-siпteze. U slucaju Ru(tfac)з, moguce је da neuspeli pokusaji popravke osteceпja па DNK rezultuju trajп jm tj. duzjm zastojem u S fazj , а shodno tome zпасајпоm povecaпju Ьгоја cel jja u sub-G1 , apoptotskoj frakcjjj; celije koje пе uspevaju da produ kroz S fazu, podlezu apoptozj (46). 120 Doklorska disertacija -Diskusija Zastoj celijskog ciklusa u S fazi iпdukovaп kompleksom Ru(acac)3 је reverzibllпe prirode, sto ukazuje da su osteceпja u celiji izazvaпa ovim kompleksom razlicita u odпosu па osteceпja izazvaпa sa Ru(tfac)3. Ru(acac)3 , iпdukovao је zпасајап proceпat apoptoze па Hela celijama, 29,09 ± 1,32 %, (SI. 4. 5 .а . i 4.5 . Ь . ) , potvrdeпo primeпom aпeksiп V-FITC/PI Ьојепја, nakoп 48 sati dejstva. Mada proceпat celija obojeпih propidijum-jodidom (A-PI+), kojj ukazuje па pojavu sekuпdarnih nekrotjcnjh promeпa tokom celjjske smrtj, jzпosj 31 .78% (SI. 4. 5 . Ь.) Rezultat morfoloske aпalize celjjske smrtj takodje otkrjva prjsustvo sekuпdarnu пekrotjcпjh promeпa u kasпoj fazj celjjske smrti (nakon 72 sata dejstva Ru(acac)3 pri koncentracjjj 1,5 х IC50), takozvaпa sekuпdarпa nekroza (190). Kompleksj Сг(асас)3 ј Rh(acac)3 nemaju aпtiprofjferatjvпu aktivпost, njsu pokazafj utjcaj па progresjju celjjskog cjklusa kao пi potencjjal za iпdukcjju apoptoze, jspjtjvanjem па А2780 celijama. Struktura ljgaпda -асас- ocjgfedпo пе dopriпosi aktivпostj kompleksa па bazj Cr(l ll) , Rh(lll) . Postoje brojni literaturni podaci koji ukazuju da kompleksi na bazi Ru(lll), mogu imatj poteпcijal aпtjtumorskog dejstva cak ј u slucaju kada ne poseduju cjtotoksicпost (196, 197). Као glavпi predstavпjk takve grupe kompleksa metala је Ru(lll) Na[trans-RuCI4Me2SQ(jmjdazol)] (NAMI) kao ј kompleks novjje generacije imidazolijum trans-imjdazoldimetilsulfoksid-tetrahlororuteпat(lll) (lm H[trans- RuCЏDMSO)Im]) (NAMI-A), koji su potpuno liseпi citotoksicпe aktjvпosti in vitro alj poseduju in vivo aпtimetastatsko dejstvo ј sпаzап potencijal indukcjje apoptoze (116, 117, 122). P-diketoпato kompleks Ru(acac)з ispitivaп u ovom radu moze se svrstati u istu grupu Ru(lll) јеdiпјепја, па osпovu sposobпostj iпdukcije apoptoze i vrlo slabe citotoksjcпosti. Tako smo smatrali potrebпim da se mehaпjzam dejstva ovog kompleksa dalje istrazj bez obzira па пе postojaпje zпасајпе djrektпe cjtotoksjcnosti . U tom smjslu ispitaп је aпtimetastatskj poteпcjjal kompleksa Ru(lll): Ru(acac)3, Ru(tfac)з па U2-0S celjjama, па osпovu kvaпtitatjvпe aпalize metaloproteiпaza (ММР) ММР-2 i ММР-9, prjmeпom ELISA-jmuпotest kita (Quantikine System, R&D, SAD). 121 DokJorska diserJacija - Diskusija ОоЬlјепј rezultatj ukazalj su da Ru(acac)3 jspoljava ocjgledan utjcaj па jпhjblcjju sjпteze 1 aktjvnostj ММР-2 ј ММР-9 prj konceпtracjjj 30 j..tM, prj cemu sadrzaj ММР-9 ј ММР-2 u supernataпtu celjja opada па 3,82 ng/ml, dok је vredпost u пetretjraпjm U2-0S cel jjama (koпtrola) 4,18 пg/ml. Kako је cjtotoksjcпost Ru(acac)з па U2-0S celjjama mala, 1Cso(U2-0S) > 100 j..tM, smanjeпje kопсепtгасјја ММР-9 ј ММР-2, se пе moze objasnjtj cjtotoksjcпjm efektom ovog kompleksa, ргј dejstvu Ru(acac)3 u konceпtracjjj 30 j..tM zпаtпо mапјој od IC50. Mehaпjzam celjjske smrtj , tj. apoptoze jпdukovaпe dejstvom Ru(acac)3 па Hela celjjama, jspjtaп је ргасепјеm aktjvпostj kaspaze-3, enzjma kojj јgга kljucпu ј јпјсјјаlпu ulogu u kaskadj procesa u celjji , па putu programjrane celjjske smrtj . Aпaljza је vrseпa prjmeпom kjta (ВО 8joscjence) паkоп pet satj dejstva Ru(acac)3 u kопсепtгасјјј koja odgovara vredпostjma: 5 х IC50 ј 1 О х IC50, Na osпovu dobljeпjh rezutata, Ru(acac)3 pokazuje slabu sposobnost jпdukcjje kaspaze-3, u vrednostj od 4.16% prj koncentracjjj 1 О х IC50, Poredeпjem sa cjsplatjпom, koja је pokazala dozпo zavjsпu jndukcjju kaspaze-3 (5 % prj 5 х IC50 ; оdпоsпо 16.24 % pri 10 х IC50 ) kao i trans-[Pt(Py)2CI2] kompleksom platjпe( ll ) jspjtjvaпjm u ovom radu, koji pokrecu apoptozu indukcijom kaspaze-3 moze se zaklj uёiti da Ru(acac)3 пеmа jstj mehaпjzam dejstva, kao jspjtjvanj kompleksj platjпe(ll) . Moguce је da Ru(acac)з pokrece apoptozu posredпo, putem jпterakcjje sa protejпjma jl i molekulima RNK u celjj j (91 ). Nase studjje potvrduju poteпcjjal jspjtivaп jh kompleksa Ru(lll) za iпterakciju sa procesima sjпteze RNK ј DNK, kao ј iпhiЬitorno dejstvo Ru(acac)з па procese sjпteze/aktivпosti metaloptotejnaza ММР-2 ј ММР-9. Aпalizjraпj kompleksj Ru(lll) , razlicjti ро strukturi Ьideпtatпjh ~­ djketoпato ligaпada, ocjgledпo se medjusobпo razlikuju ро mehaпjzmu aпtiproliferatjvпog dejstva. Stuktura ljgaпda -tfac-, dopriпosi vecoj cjtotoksjcпoj aktivпostj kompleksa Ru(tfac)3. CDDP kao i trans-[Py(Py)2CI2] poseduju пajvecu cjotoksjcпu aktjvпost u poredeпju sa svim testjraп jm kompleksjma metala па primeпjeпjm cel jjskjm liпjjama . Smапјепје koпceпtracjje uпutarcelijskog GSH, пјје jmalo zпacajan uticaj па modulacjju aktivпostj platjnskih kompleksa, ispjtjvanjem па 816 i К562 6eljjama. 122 Doktoгska disertacija Diskusija Kada se poredj aktjvпost samo platjпskj h kompleksa jsp jtjvaпjh u ovom radu, cis- jzomer -[Pt(Py)2CI2] jma пајmапјu sposobпost jпdukcj e kaspaze-З. Ovaj rezultat u saglasпostj sa odпosom cjtotoksjёпe aktjvпostj cis- ј trans- jzomera па Hela celjjama tj. odпosom odgovarajucjh IC50 vredпostj , koje jzпose ICso(cls)= 32,30 ± 0,07 ~tM ; ICsщTRANs)= 9,50 ± О, 1 О ~М. Trans-[Pt(Py)2CI2] pokazuje trj puta vecu cjtotoksjёпost u poredeпju sa cis- jsomerom, ј slјёпо tome, pokazuje dva puta vecj kapacjtet za jпdukcjju kaspaze-З prj kопсепtгасјј ј 10 х IC50 (9,54 %) u poredeпju sa cis- jzomerom {З,79 %). Zaпjm(jjvo је da је poteпcjjal ovjh jzomera za jпdukcjju apoptoze па Hela celjjskoj ljпjji prjЬi jzan. Апеksјп V-FITC/PI bojenje па Hela celjjama, ukazuje da cis-1 trans- [Pt(Py)2CI2] jmaju slјёап efekat j пdukcjje apoptoze, tokom 24 sata dejstva ageпsa , kojj izпose za cis- jzomer: 26. З5 ± 3,12 %; za trans-jzomer: 24,58 ± 0,98 %. (SI. 4. 5 . а . ј 4 . 5 . Ь . ) Cjsplatjna је pokazala пајасј koпceпtracjono zavjstan utjcaj па jпdukcjju apoptoze, kako па osпovu sadrzaja (%) cel jja u sub-G1 prjljkom aпaljze celjjskog cjklusa (24,69 % prj koncentracjj j 1,5 IC50) , tako ј па osпovu Апеksјп V-FITC aпaljze (З1 , З2 % za 48 satj dejstva). lspitivanje potencijala trans-[Pt(Py)2CI2] da prevazide rezisteпciju па cisplatinu, vrseпo је па cisplatiпa-rezjsteпtnom soju (U2-0S/Pt) ргј ёemu је trans- jzomer pokazao dvostruko vecu cjtotoksjёпu aktivпost [IC50 28,99 ± 0,69 (џМ)] u poredeпju sa cis- izomerom [ICso = 52,50 ± 5,73 (~М)] . DоЬiјепј rezutatj se пе razlikuju mnogo u poredeпju sa aktivпoscu tj . odnosom aktjvпostj , [ICsщcls) : IC5щтRдNS) = (1 ,5:1) do (З: 1 )] ovih izomera па drugim celjjskim liпjjama korjsceпjm u ovom radu: Hela, 816, U2-0S, U2-0S/Pt, Jurkat, К562. Takodje, оЬа izomera su ispoljila vecu aktivпost па U2-0S (ICso(TRдNS) 2З.89 ± 2. З4 ~М ; ICso(CIS) = 49,1 З ± З, 29~М) u poredeпju sa cisplatiпa-rezjsteпtпim sojem. Poredeпje strukture i aktivnosti kompleksa platiпe ispitivaпih u ovom radu otkriva da cis-ltrans- jzomerija ima vrlo Ьitап uticaj па aktivnost platjпskjh kompleksa, оdпоsпо samo promeпom koпfiguracije , u ovom s luёaju uvodjeпjem trans- koпfjguracjje , moze se posticj takozavпa aktjvacija kompleksa platjпe (40, 198) 199), sto је u saglasnosti sa dosadasnjim (jteraturnjm podacjma. 123 Doktorska disertacija Zakljucak 6. ZAKLJUCAK 124 Doktorska disertacija - Zakljucak • Aпaliziraпi kompleksi Ru(lll): Ru(tfac)3, Ru(acac)3, razliciti ро strukturi Ьideпtatпih 13-diketoпato ligaпada, ocigledпo se medjusobпo razlikuju ро mehaпizmu aпtiproliferativпog dejstva; stuktura ligaпda -tfac- dopriпosi zпасајпо vecoj citotoksicnoj aktivпosti kompleksa Ru(tfac)3. • lspitivaпje mehaпizma dejstva kompleksa Ru(lll) ukazuje da: )> kompleksi Ru(lll), pre svega Ru(tfac)3 uticu па iпhiЬiciju siпteze RNK ј DNK, iako паsе studije пisu potvrdile direktпo vezivaпje Ru(lll) za DNК. )> Ru(acac)з poseduje jпhiЬitorпo dejstvo па procese siпteze/aktivпosti metaloptoteiпaza ММР-2 ММР-9, tj. poseduje poteпcijal aпtimetastatskog dejstva. )> Ru(acac)3 i Ru(tfac)3 pokrecu apoptozu u stepeпu slicпom cisplatiпi , mada Ru(acac)з ima slaЬiji poteпcijal iпdukcije kaspaze-3, poredeпjem sa cjsplatiпom kao i trans-[Pt(Py)2CI2]. )> Ru(acac)з ne poseduje direktan citotoksican efekat in vitro, ali u koiпkubacioпom dejstvu sa cisplatiпom pokazuje siпergizam sto daje racioпalпu osnovu za dalje ispitivaпje aпtitumorskog poteпcijala kompleksa ruteпijuma u komЬiпaciji sa citotoksicпim ageпsima . • Kompleksi Сг(асас)з ј Rh(acac)з пemaju aпtiproljferativпu aktivпost, пisu pokazali uticaj па progresiju celijskog ciklusa kao пi poteпcijal za iпdukciju apoptoze, sto ukazuje da struktura ligaпda -асас- ocigledпo пе dopriпosi aktivпosti kompleksa па bazi Cr(lll) i Rh(lll) . • Medu svim testiraпim kompleksima jediпo Сг(асас)3, koji пе poseduje citotoksicпost, pokazuje afiпjtet za direktпo vezivaпje za DNK molekul, sto ukazuje da DNK-iпterakcija пе mora Ьiti u korelaciji sa aпtiproliferativпom aktivпoscu kompleksa metala. 125 Doktorska disertacija -Zakljш!ak • Kompleksi platine(ll), cisplatina kao i trans-[Py(Py)2CI2] poseduju najvecu citoksicnu aktivnost od svih testiranih jedinjenja na primenjenim celijskim linijama. • Poredenje strukture i aktivnosti kompleksa platine ispitivanih u ovom radu otkriva da cis-ltrans- izomerija ima vrlo Ьitan uticaj na aktivnost platinskih kompleksa, odnosno samo promenom konfiguracije, u ovom slucaju uvodjenjem trans- konfiguracije, moze se postici takozvana aktivacija kompleksa platine, sto је u saglasnost.i sa dosadasnjim literaturnim podacima. 126 Dokt01·ska diset·tacija - Refet·ence REFERENCE 1. Ј. Reedijk, Ргос. Natl. Acad. Sci. SAO , 100 (200З) З611. 2. R. Rosenberg, Cisplatin, Current Status and Future Oevelopment, Ed. А. W. Prestakyo, S. Т. Crooke. S. К. Carter. Academic Press, New York, 1987, str. 11 . З . G. Giaccone, Orugs, 59 (2000) 9. 4. Е. Raymond, S. G. Chaney, А. Taamma, Е. Cvitkovic, Annals of Oncology, ~ (1998) 105З. 5. О. Machover, Е. Oiaz-RuЬio , А. de Gramont, А. Schilf, Ј . Ј . Gastiaburu, S. Brienza, l (1996) 95. 6. Е. Raymond, S. Faivre, Ј . М . Woynarowski, S. G. Chaney, Seminars in Oncology, 25 (1998) 4. 7. К. Keppler, W. Rupp, Ј . Cancer Res. Clin. Oncol., 111 (1986) 166 8. L. Wolf, Е. Butter, Н . Ј . Weinelt, Annorg. Allg. Chem., ЗО6 (1960) 87, 9. F. Bregant, S. Расог, S. Ghosh, S.К. Chattopadhyay, G. Sava, Anticancer Res., Ы (199З)1011. 1 О . А. Eastman, Pharmacol. Ther. З4 (1987), 155. 11 . Е.В. Oouple, Pharmacol. Ther., 25 (1984), 297, 12. Ј.М . Malinge, М. Leng, Cisplatin, Chemistry and Biochemistry of а Leading Anti- cancer Orug, Ed: В. Lippert, Ed. Wiley-VCH: Zurich, Switzerland, 1999, str.159. 1 З. А. Eastman, М .А. Barry, Biochemistry, 26 (1987), ЗЗОЗ. 14. V. ВгаЬес, М. Leng, Ргос. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90 (199З) 5З45. 15. К.М. Comess, L. Chassot, С .Е. Costello, S.J. Lippard, Biochemistry, 29 (1990) 811 . 16. М .Ј .Р . Walters, В .Ј .М . Braakhuis, А.Ј . Jacobs-Bergmans, А. Kegel, R.A. Baan, W.J.F. van der Vijgh, А.М.Ј . Fichtinger-Schepman, Annals of Oncol, 10 (1999), 97, 17. Е. R. Jamieson, S. Ј. Lippard, Chem. Rev. , 99 (1999), 2467, 18. С. Hofr, V. Brabec, Ј. Biol. Chem., 276 (2001) 9655. 19. R. Rosenberg, Chemistry and Biochemistry of а Leading Anti-cancer Orug, Ed: В. Lippert, Wiley-VCH:Cirih, 1999, рр. 4-27, 20. N. Farrell, Т.Т.В. На, Ј . Р . Souchard, F.L.Wimmer, S. Cros, N.P. Johnson, Ј . Med. Chem., З2 (1989), 2240, 21. N. Farrell, L. R. Kelland, Ј . О . Roberts, М . Van Beusichem, Cancer Res. , 52 (1992), 5065. 22. М . Leng, О. Locker, М. Ј . Giraud-Panis, А. Schwart, F. Р. lntini , G. Natile, С. Pisano, А. Boccarelli, О. Giordano, М. Coluccia, Mol. Pharmacol., 58 (2000), 1525. 127 Doktot·ska disef"tacija - Reje1·ence 23. E.l Montero, S.O.Oiaz, A.M.Gonzales-Vadillo, Ј .М. Perez, C.Aionso, Navarro- Raninger, Ј . Med. Chem., 42 (1999), 4264. 24. L.S. Hollis, W.l . Sunquist, J.N. Burstyn, W.J. Heiger-Bernays, S .F. Bellon, К.Ј . Ahmed, A.R. Amundsen , E.W. Stern, S.J. Lippard, Cancer Res., Q1 (1991) 1866. 25. А.Р. Silverman, W. Bu, S.M. Cohen, S.J. Lippard, Ј . Biol. Chem., 277 (2002) 49743. 26. N. Farrell, У. Qu, U. Bierbach, М . Valsecchi, Е. Menta, Chemistry and Biochemistry of а Leading Anticancer Orug, В. Lippert, Ed. Wiley-VCH: Zurich, 1999, str. 479. 27. У. Najajreh, Ј .М. Perez, С. Navarro-Rannineger, О. GiЬson, Ј. Med. Chem., 45 (2002) , 5189. 28. L.R. Kelland , Ј. lnorg. Biochem., 77 (1999)121 . 29. S. Arandjelovic S, L. . Tesic, Z. Juranic, S. Radulovi6, М. Vrvi6, В . Potkonjak, Z. llic, Ј. Exp&Ciin. Сапе. Res .• 1 (2002) 51-526. 30. R. Р. Perez, Eur. Ј . Cancer, 43 (1998) 1535. 31 . L.R. Kelland , S.Y. Sharp, C.F. O'Neill, F.l. Raynaud, Р.Ј . Beale, I.R. Judson, Ј . lnorg. Biochem. 77 (1999) 111 . 32. L.R. Kelland , C.F.J. Barnard, К.Ј. Mellish, М. Jones, Р.М. Goddard, М . Vallenti, Cancer Res., 54 (1994) 5618. 33. L.R. Kelland, C.F.J. Barnard, I.G. Evaпs, В.А. Murrer, B.R.C. Theobald, S.B. Wyer, Р.М. Goddard, М. Jones, М. Vallenti, К.Ј . Mellish, А. М . Bryant, Р.М. Rogers, K.R. Наггар, Ј . Med. Chem., 38 (1995) 3016. 34. Ј . Holford, Р.Ј . Beale, F.E. Boxall, S.Y. Sharp, L.R. Kellaпd , Eur. Ј . Cancer, 36 (2000) 1984. 35. N. Farrell, Cancer lnvest. 11 (1993) 578. 36. У. Zou, В. van Houten, N. Farrell, Biochemistry, 32 (1993) 9632. 37. S. Mani6, Z. Tesic, Z. Jurani6, S. Radulovi6, Ј . BUON., § (2001) 279. 38. U. Bierbach, У. Qu, T .W. НаmЫеу, Ј . Peroutka, H.L. Nguyeп, М . Ooedee, N. Farrell, lnorg. Chem., 38 (1999) 3535. 39. V. Brabec, К. Neplechova, Ј . Kasparkova, N. Farell, JBIC, ~ (2000) 364. 40. А. Zakovska, О. Novakova, Z. Balcarova, U. Bierbach, N. Farrell, V. Brabec, Eur. Ј . Biochem., 254 (1998) 547, 41 . Ј . Kasparkova, О. Novakova, N. Farrell, V. Brabec, Biochemistry, 42 (2003) 792. 42. Е. Khazanov, У. Berenholz, О. Gibson, У. Najajreh, Ј Med. Chem., 45 (2002) 5196. 128 Doktorska disertacija -Reference 43. V. ВгаЬес, Ј. Kasparkova, О. Vrana, О. Novakova, Ј. W. Сах, У. Qu, N. Farrell, Biochemistry, 38 (1999) 6781 . 44. V. Murray, Ј. Whittaker, М . D. Temple, W .D. McFadyen, Biochem. Biophys. Acta, 261 (1997) 1354. 45. G. Pratese, Р. Perego, F. Zunino, Biochem. Pharmacol. 61 (2001 )381. 46. S.A. Amundson, T.G. Myers, А.Ј . Fornace, Oncogene, 17 (1998) 3287, 47. S. Manic, L. Gatti, N. Carenini, G. Fumagalli , F. Zunino, Р. Perego, Current Cancer Drug Target, ~ (2003) 21 . 48. Ј.А . Houghton, Curr. Opin. Onco1. 11 (1999) 475. 49. V. М. Gonzalez, М.А. Fuertes, С. Alonso, Ј . М . Perez, Mol. Pharmacol., 59 (2001) 657, 50. A.W.M. Boersma, К. Nooter, Н. Burger, С.Ј . Kortlan, G. Stoter, Cytometry, 27 (1997) 275. 51. К.Е. Pestell, S.M. Hobbs, Ј.С. Titley, L.R. Kelland, М. 1. Walton, Mol. Pharmacol. 57 (2000) 503. 52. C.F. O'Neill, M.G. Ormerod, D. Robertson, Ј.С. Titley, У. Cumber-Walseer, v L.R. Kelland, Br. Ј. Cancer, 74 (1996)1037, 53. Р. Perego, S. Ј . Gretchen, L. Gatti, S. В. Howell, F. Zunino, Pharmacological Rewievs, 52 (2000) 477,. 54. Р. Perego, F. Zunino, N. Carenini, F. Giuliani, S. Spinelli, S.B. Howell, Mol. Pharmacol. 54 (1998) 21 З . 55. Ј. D. Watson, N. Н. Hoplins, Ј. W. Robertson. Ј. А. Steiz, А. M.Weiner, Molecular Biology of the Gene, Ed: Menlo Park, California , 1992, 147~ 56. U.M. Ohndorf, М.А. Rould, Q. Не, С.О. РаЬо, S.J. Lippard, Nature, 399 (1999)707, 57. Ј. Zlatanova, Ј. Yeneva, S.H. Leuba, FASEB Ј., 11 (1998) 791. 58. У. Sedletska, М. Ј. Giruad-Panis, Ј . М. Malinge, Curr. Med. Chem.-Anti Cancer Agents, § (2005) 251 . 59. Ј . Kasparkova, N. Farrell , V. Brabec, Ј . Biol. Chem., 275 (2000) 15789. 60. Е. Reed, Cancer Treatment Rev., 24 (1998) 331 . 61. Ј. Zehnulova, Ј . Kasparkova, N. Farrell, V. Ј. ВгаЬес, Ј. Biol . Chem., 276 (2001) 22191. 62. М. Crul, М. Ј. Н. Schellens, Н. Ј . Beijnen, Canc.Treat. Rev., 23 (1997) 341 . 63. М. Yamada, Е. O'Regan, R. Brown, P.Karran , Nucleic Acid Res., 25 (1997) 491 . 64. Q. Li , K.Gardner, L. Zhang, B.Tsang, F. Bostic-Bruton, Е. Reed, Ј . Biol. Chem., 273 (1998) 23419. 129 DokJo,.ska disenacija - Reftl"ence 65. Ј. Reedijk, Current Opinion in Chemical Biology, ~ (1999) 236-240, 66. Т. Kopf-Maier, Eur. Ј . Clin Pharmacol., 47 (1994) 1. 67. G. Sava, Т. Giraldi, G. Mestroni, G. Zassinovich, Chem. Biol.lnteract. , 45 (1983) 1. 68. Н . Hirohumi, А. R. Rohana, М. Naoui, H.A.Tajmir-Riahi, Ј . Biol. Chem., 275 (2000) 10150, 69. Н . Wang, А. Kruszewski, D. L. Brautigan, Biochemistry, 44 (2005) 8167 70. Н .У. Shrivastava, Т. Ravikumar, N. Shanmugasundaram, М. Babu,. N. В. Unni,. Free Radic. Biol. Med., 38 (2005) 58. 71 . N. Katsaros, А. Anagnostopolou, Crit. Rev. Oncol . Hematol., 42 (2002) 297, 72. L.D. Dale, D.J. Edwards, Lett. Арр. Microb., ~ (1989) 53. 73. S. S. Allardyce, Р. Ј . Dyson, Platinum Metals Reviews, 45 (2001) 62. 74. S. Р. Fricker, Met. lons. Biol. Syst. 36 (1999) 665. 75. Н . Depenbrock, S . Schmelcher, R. Peter, В . К. Keppler, Weirich, Т. G. Block, Ј. Rastetter, Ј. Hanausker, Eur. Ј. Cancer, 33 (1997) 2404. 76. А. Bergamo, L. messori, F. Piccioli, М. Cocchietti, G. Sava, lnvestigational New Drug, 21 (2003) 401 . 77. W. R. Harгis, Struct. Bond. 92 (1998) 121 . 78. F. Kratz, М. Т. Schutte, Cancer Ј., 11 (1998) 60. 79. К. Keppler, Metal Complexes in Cancer Chemotherapy, В. К . Keppler Ed: VCH, Wienheim, Geramny, 1993, str. 187-220. 80. М. Ј. Clarke, Coord. Chem. Rev., 232 (2002) 69. 81 . О. М. Dhubhghaill, W Hagen, В. К. Keppler, К. G. Lipponer, Ј. Sadler, Ј . Chem. Soc. Dalton. Trans., 25 (1994) 3305. 82. М. Bastos, К. А. Gordon, Т. А. Ocain, Bioorg. Med. Chem. Lett., §. (1998) 147, 83. S.R. Grguric-Sipka, R.A. Vilaplana, Ј . М. Perez, М.А. Fuertes, Alonso, С. У . Alvarez, Т.Н. Sabo, F. Gonzalez-Vilxhez, Ј . lnorg. Biochem. 97 (2003) 215. 84. Е. Alessio; W . Attia; М. Calligaris; S. Cauci, L. Dolzani, G. Mastroni, С. Monti- Bragadin, G. Nardin, F. Quadrifoglio, G. Sava, М . Tamaro, S. Zorzet, Proceedings of the Fifth lnternational Symposium on Platinum and Other Metal Coordination Compounds in Cancer Chemotherapy, М . Nicolini, Ed: Martinus Nijhoff: Boston, 1988, str. 617-633. 85. L.D. Dale, Ј.Н. Tocher, Т.М. Dyson, 0.1. Edwards, D.A. Tocher, Anti-Cancer Drug Design, z (1992) З. 86. М. Coluccia, G. Sava, F. Loseto, А . Nassi, А . Boccareli, О. Giordano, Е. Alessio, G. Mestroni , Eur. Ј . Cancer, 13 (1993) 1873. 130 Doktorslш disenacija -Reference 87. В.К. Keppler, W . Rupp, Ј . Cancer. Res. Clin. Oncol. 111 (1986) 166. 88. О. Novakova, Ј . Kasparkova , О. Vrana, Р .М. van Vilet, Ј. Reedijk, V. ВгаЬес, Biochemistry, 34 (1995) 12369. 89. Ј . Malina, О. Novakova, В.К. Keppler, Е . Alessio, V. Brabec, Ј . Biol. lnorg. Chem., § (2001) 435. 90. В. Van Houten, S. lllenye, У. Qu, N. Farrell , Biochemistry, 32 (1993) 11794. 91. Р.К . Chan, К.А. Skov, B.R. James, N. Farrell, Chem. Biol. lnteract. , 59 (1986) 247, 92. М. Hartmann, К. G. Lipponer, В. К. Keppler, lnorg. Chim. Acta., 267 (1998) 137, 93. L. Rabenstein, К. К. Millis, К. Н . Weaver, Ј . Org. Chem., 58 (1993) 4144. 94. Т. М . Buttke, Р. А. Sandstrom, lmmunol. Today, ~ (1994) 7, 95. К. Lemma, Ј. Berglund, N. Farrell, L. 1. Elding, Ј . Biol. lnorg. Chem., .§. (2000) 300, 96. D. Frasca, М . Ј. Clarke, Ј . Am. Chem. Soc., 121 (1999) 8523. 97. D. Pluim, R. С. van Waardenburg, Ј . Н . Beijnen, Ј . Н . Schellens, Cancer Chemother. Pharrnacol . 54 (2004) 71. 98. А.С. Hotze, М. Васас, А.Н . Velders, В.А. Jansen, Н. Kooijman, A.L. Spek, J.G. Haasnoot, Ј . Reedijk, Ј . Med. Chem., 46 (2003) 1743. 99. H.L. Chan, H.Q. Liu, В.С . Tzeng, Y.S. You, S.M. Peng, М . Yang, С.М. Che, lnorg. Chem., 41 (2002) 3161 . 100. R.E. Aird , Ј . Cummings, А. А. Ritchie, М. Muir, R. Е. Morris, Н . Chen, Р. Ј. Sadler, D. 1. Jodrell, Br. Ј. Cancer, 86 (2002) 1652. 101. D. Cummins, Н. В. Gray, Ј. Am. Chem. Soc., 99 (1977) 5158. 102. О. Novakova, Ј . Kasparkova, V. Bursova, С. Hofr, М . Vojtiskova, Н . Chen, Р. Ј. Sadler, V. Brabec, Chem. Biol., 12 (2005) 121 . 103. А.С. Hotze, М. Васас, А. Н . Velders, ВА Jansen, Н . Kooijman, A.L. Spek, J.G. Haasnoot, Ј. Reedijk, Ј. Med. Chem., 46 (2003)1743. 104. R.L. Hayward, Q.C. Schornagel, R. Tente, J.S. Macpherson, R.E. Aird, S. Guichard, А. Hablemariam, Р. Sadler, D. 1. Jodrell , Cancer. Chemother. Pharrnacol., 55 (2005) 577. 105. У. N. V. Gopal, А. К . Konuru, А. К. Konodapi, Arch. Biochem. Biophys. 401 (2002) 53. 106. М . Strasberg-Reiber, А. Anzellotti, R. А. Sanchez-Delado, М . Reibe, lnt. Ј. Cancer, 112 (2004) 376. 107. К. А. Marx, С. Seery, Р . Malloy, Mol. Cell Biochem., 90 (1989) 37, 108. Ј. Malina, О. Novakova, В. К. Keppler, Е. Alessio, V. Brabec, Ј . Biol. lnorg. Chem., § (2001) 435. 131 Dokrorska diserracija Refш·ence 109. V. Brabec, Prog. Nucleic. Acid. Res. Мо!. Biol., 71 (2002) 1. 110. R. Frasca, L. Е. Gehrig, М . Ј . Clarke, J. lnorg. Biochem., 83 (2001 ) 139. 111 . А. Barca, В. Pani, М . Tamaro, Е. Russo, Mutant. Res., 423 (1999) 171 . 112. S. Zorzet, А. Bergamo, М . Cocchietto, А. Sorc, В. Gava, Е. Alessio, Е. lengo, G. Sava, Ј . Pharmacol. Ехр. Ther., 295 (2000) 927, 11 З . Е . Alessio, G. Mastroni, G. А. Nardi, М. Waihib, М. Calligaria, G. Sava, S. Zorzet, lnorg. Chem., 27 (1988) 4099. 114. Е. Alessio; W. Attia; М. Calligaris; S. Cauci, L. Dolzani, G. Mastroni, С . Monti- Bragadin, G. Nardin, F. Quadrifoglio, G. Sava, Dev. Oncol ., 54 (1988) 617, 115. G. Sava, Е. Alessio, Е. Bergamo, G. Mastroni, Тор. Biol. lnorg. Chem., 1 (1999) 143. 116. G. Sava, S. Pacor, М. Coluccia, М . Mariggio, М. Cocchietto, Е. Alessio, G. Mastroni, Drug. lnvest. , § (1994) 150, 117. G. Sava, R. Gagliardi , А. Bergamo, Е. Alessio, G. Mestroni, Anticancer Res., _lli (1999) 969. 118. G. Sava, S. Pacor, G. Mestroni, Е. Alessio, Clin. Ехр. Metastasis., 10 (1992) 273. 119. Е. Alessio, G. Mestroni, А. Bergamo, G. Sava, Curr. Тор. Med. Chem., 1._(2004) 1525. 120. А. Bergamo, В. Gava, Е. Alessio, G. Mestroni, В. Serli, М . Cocchietto, S. Zorzet , G. Sava, lnt. Ј . Oncol., ђ (2002) 1331. 121 . Е . Morgunova, А. Tuuttila, U. Bergmann, М . lsupov, У. Lindqvist, G. Schneider, К. Tryggvason, Sience, 284 (1999) 1667, 122. М . Whittaker, С . D. Floyd, Р. D. Brown, Ј. Н. Gearing, Chem. Rev., 99 (1999) 2735. 123. М . Rademaker-Lakhai, D. van den Bongard, D. Plum. Ј . Н . Beijnen, Ј . Н . М . Schellens, Clin. Сапе. Res. , 10 (2004) 3717, 124. Е. Alessio, Е. lengo, S. Zorzet, А. Bergamo, М. Coluccia, А. Boccareli, G. Sava G, Ј. lnorgan. Biochem. 79 (2000) 173. 125. А. Bergamo, R. Gagliardi, V. Scarcia, А. Furlani, Е . Alessio, G. Mastroni, G. Sava, Ј . Pharmacol. Ехр. Ther. , 289 (1999) 559 126. Е. С . Kohn, L. А. Liotta, Cancer Res. , 51 (1995) 1865. 127. L. А. Liotta, W. G. Stetler-Stevenson, Cancer Res., ~ (1991) 5054. 128. М . Ј . Duffy, Biotherapy, 1 (1992) 45. 129. S. Aznavorian , М. L. Stracke, Н . С. Krutzsch, Ј . Cell. Biol., 110 (1990)1427, 130. L. А. Liotta, R. Mandler, G. Murano, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 83 (1986) 3302. 131. S. Rong, S. Segal, М . Anver, Proc. Natl. Acad. Sci., ~ (1994) 4731 . 132 Dokrorska diserracija -Refeгence 132. Lapis, S. Paku, L. А. Liotta, Clin. Ехр. Metast., § (1988) 73. 133. S. А. Aaronson, Clin . Ехр. Metast., 254 (1991 ) 1146. 134. L. А. Liotta, Murata, Clin. Ехр. Metast., 12 (1994) З. 135. М. L. Stracke, Н.С. Е .Ј. Krutzsch, Ј. Biol. Chem., 267 (1991) 2524. 136. Т. Clair, Н .У. Lee, L.A. Liotta , M.L. Stracke, Ј . Biol. Chem., 272 (1997) 996. 137. М. Coussens, Z. Werb, Ј . Chem. Biol. , ~ (1996) 895. 138. N. Nagase, Ј . F. Woessner, Ј . Biol. Chem., 274 (1999) 21491 . 139. М. Preston,Oncogene, .f. (2002). 140. А. F. Chambers, L. М. Matrisian, Ј . Natl. Cancer lnst., 89 (1997) 1260, 141 . L. А. Liotta, К. Tryggvason, S. Garblsa, Nature, 248 (1980) 67, 142. М. EgeЫad, Z. Werb, Nature Rev. Cancer, .f. (2002) 161. 143. W. G. Stetler-Stevenson, Н . С . Krutzsch, L. А. Liotta, Ј . Biol. Chem., 264 (1989) 17374. 144. D. Е. Gomez, D. F. Alonso, Н. Yoshiji, U. Р. Thorgeirsson, Eur. Ј . Cell. Biol., 74 (1997) 111 . 145. Ј . Ј . Reynolds, Oral. Dis. , .f. (1996) 70, 146. P.S. Steeg, G. Bevilacqua, L. Kopper, Ј. Natl. Cancer. lnst., 80 (1988) 200, 147. Weigelt, Ј . L. Peterse, L. Ј . van't Veer, Nature Rev. Cancer, § (2005) 591 . 148. Т. Patel, G. Ј . Gores, S. Н . Kaufmann , FASEB Ј., 10 (1996) 587, 149. У. Zhang1, N. Fujita1 Т. Tsuruo, Oncogene, 18 (1999) 1131 . 150. S. Salvesen, С. S. Duckett, Nature Rev. Moll . Cell Bioll. ~ (2002) 401 . 151 . N. А. Thornberry, У. Lazebnik, Science, 281 (1998) 1312. 152. R. Е. Bachelder, М. А. Wendt, N. Fujita , Т. Tsuruo, А. М . Mercurio, Ј . Biol. Chem., 276 (2001) 34702. 153. D. Schimmer, Cancer Cell , § (2004) 25. 154. N. Juranic, lnorganica Acta, 87 (1984) 37, 155. G. Е. Мооге, R. Е. Gerner, Н. A.Franklin , А.М.А. , 199 (1967) 519. 156. Т. А. МсСоу, М . Maxwell, Р. F. Kruse, Proc. Soc. Exper. Biol . Med., 1QO (1959) 115. 157. Т. С. Hsu, D. S. Kellogg, Ј. Nat. Cancer lnst., 25 (1960) 221 . 157 а . lwakata, Ј . Т. Grace, Ј . N.Y.J.Med., 64 (1964) 2279. 158а. 158. А. Manniello, В. Parodi, О. Aresu, Р. Romano, Animal celllines catalogue, (1990) 159. Semin. Oncol. (1984). 160. N.Y .Ann, Acad. Sci. (1963). 161 . ln. Ј . Cancer. (1979). 133 Dokrorska diser·tacija - Rejer·ence 162. Р. Perego, С . Caserini, L. Gatti, N. Carenini, S. Romanelli, R. Supino, О. Colangelo, 1. Viano, R. Leone, S. Spinelli, G. Pezzoni, С. Manzotti, N. Farrell, F. Zunino, 55 (1999) 528. 163. Freshney IR, Liss AR, in: Culture of Animal cells, а manual of basic technique, NY(1983) 199. 164. Sigma, Chem. Со. Biochemicals and reagents for life science research, (1997)1752. 165. Р. Perego, G.L. Beretta, L. Gatti, u Handbook of Proteomic Methods, Ed: Р.М . Conn, Humana Press: New Jersey, (2003). 166. R. Supino, u Methods in Molecular Biology, Ed: S. О'Наге, С.К. Atterwill , Humana Press: New Jersey, 1995, str. 137-149. 167. N. Ј . Marshall, С. Ј. Goodwin, Growth Regulation ~ (1995) 69. 168. Monks et а/. Ј . Natl. Cancer lnst., 83 (1991 )757. 169. Ј . Edelman, Н . Quam, В. Mullins, Cancer Chemother. Pharmacol. 48 (2001) 141 . 170. А Bergman, V.W.Т. Haperen, G. Verman, Clin. Cancer. Res., ~ (1996) 521 . 171. С. Chou, Р. Talalay, Trends in Phaпnacological Sciences, 1 (1983) 450, 172. lnternet adresa: www. Biosoft Software for Science.htm 173. Р. Pratesi, Р. Perego, D. Polizzi , S.C. Righetti, R. Supino, С. Caserini, С. Manzotti, F. С . Giuliani, G. Pezzoni, S. Tognella, S. Spinelli, N. Farrell, F. Zunino, Br. Ј. Cancer, 80 (1999) 1912. 174. Ciusani, Е, Perego, Р. Carenini, N. Corna, Е. Facchinetti, F. Boiardi, А Salmaggi , А Zunino, F. Biochem. Pharmacol. 63 (2002) 881 . 175. А Bonetti, Р. Apostoli, М. Zannineli, F. Pavanel, М. Colombatti, G.L. Cetto, Т. Franceshi, L. Spperetto, R. Leone, Clin. Cancer. Res .• ~ (1996) 1829. 176. Т. Maniatis, Е. F. Fritsh, Ј . Sambrook, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: New York, 1982. 177. D. Fink, S. Nebel, S. Aebl, Cancer Res. , 56 (1996) 4881. 178. L. Burger, К. Nooter, lnt. Ј . Cancer, 73 (1997) 592. 179. 1. Oyama, D. Eagle, ~ (1956) 305. 180. О. Н . Lowry, N. Ј . Rosenbergh, Ј . Biol. Chem., 193 (1951) 265. 181 . М . Matrisian, BioAssays, 14 (1992) 455. 182. W. Guerin, Р.С. Holland, Dev. Dyn., 202 (1995) 91 . 183. Е. Spinozzi, Е. Agea, Scand. Ј. lmmunol., 41 (1995) 504. 184. M.G. Ormerod, Flow cytometry, а practical approach, Ed: M.G. Ormerod, Oxford University Press: New York, 1994, str. 119-125. 134 Doklo1·ska disenacija - Reference 185. Р. Raynal, Н .В . Pollard, Biochem. Biophys. Acta, 1197 (1994) 63. 186. 1. Vermes, С. Haanen, Н . Steffens-Nakken, С. Reutelingsperger, Ј . lmmunol. Meth. 184 (1995) 39. 187. N. Fujita, Т. Tsuruo, Biochem. Biophys. Res. Comm., 246 (1998) 484. 188. Т. Patel, G.J. Gores, S.H. Kaufmann, FASEB Ј ., 10 (1996) 5877, 189. N.K. Banada, W.C. Satterfield, А. Dunlap, K.S. Steimer, R. Kurrle, Т.Н . Finkel, Apoptosis , 1._(1996) 49. 190. Sava, S. Pacor, A.Bergamo, М . Cocchietto, G. Mestroni, Е. Alessio, Chem. Biol. lnteract., 95 (1995) 109. 191. М. Strasberg, А. Anzellotti, R.A. Sanchez-Delgado, М . Rieber, lnt. Ј. Cancer, 112 (2004) 376. 192. М . Mura, М . Camalli, L. Messori, F. Piccioli, Р. Zanello, М . Corsini, lnorg. Chem., 43 (2004) 3863. 193. К.А. Магх, R. Kruger, М.Ј . Clarke, Mol. Cell. Biochem., 86 (1989)155. 194. J.R. Rubln, М. Sabat, М . Sundaralingam, Nucleic Acid. Res. , 11 (1983) 6571 195. А. Bergamo, S . Zorzet, В. Gava, А. Sorc, Е. Alessio, Е. lengo, G. Sava, Anticancer Drugs, 11 (2000) 665. 196. А. Bergamo, S. Zorzet, М . Cocchietto, М.Е. Carotenuto, М. Magnarin, G. Sava, Anticancer Res., 21 (2001) 1893. 197. S. Arandjelovic, Z. Tesic, S. Radulovjc, Med. Chem. Reviews-Online, f. (2005) 415. 198. S. Radulovic, z. Tesic, S. Manic, Curr. Med. Chem., ~ (2002)1611. 135 t CURRICULUM VITA SANDRA S. дRANDJELOVIC lnstjtut za Onkologjju i Rad jologjju Sгblje (IORS) Pasterova 14, 11 000 Belgгade Tel: 381 11 2067289 Fax: 381 11 685 300 e-ma jl: manjcs@пcгc. ac.yu Sапdга S. Aгaпdjelovjc, гоdјепа је u Fгaпcuskoj u gгadu Touгs, 20. 04. 1971. Osпovпu ј sгedпju skolu zavгsila је u Beogгadu . Ojplomjгala је па odseku Biohemija, Hemjsjkj Fakultet u Beogгadu , 1996 godjпe. 1996 godjпe upjsala је pos/ediplomske studije па odseku za Biohemiju, Hemjjskj Fakultet, Uпjveгzjtet u Beogгadu , kao stjpeпdjsta Mjпjstaгstva za пauku ј tehпologjju Sгblje . 1997 godjпe pocela је гаd па lпstjtutu za Oпkologjju ј Radjologjju Sгblje (IORS) u lаЬогаtогјјј za ekspeгjmeпtalпu faгmakologjju . 2000 оdЬгапјlа је Magistarsku tezu pod пazjvom "Mehaпjzam cjtotoksjcпog dejstva пekjh kompleksa p latjпe( ll ) па Hela celjjama". Doktoгske stud jje upjsala је па Hemjjskom fakultetu u Beogгadu, pod mentoгstvom Ргоf. Ог z jvoslava Tesjca ј Ог scj . med. Sjпjse Radulovjca. 2001 god. , doblla је st jpeпdjju UICC (lntemacional Union Against Cancer) za stгucпo usavrsavaпje na Nacioпalпom oпkoloskom jпstjtutu u Milaпu (lпstjtuto Nazjoпale Tumorj) pod meпtorstvom Ог. Paola Perego - laboratoгjja za ekspeгjmeпtalпu farmakologjju . Сlап је Evrioske огgапјzасјје za borbu protjv raka (EACR), asocjjacjje stjpeпdjsta UICC (AUF) ј Oгustva Ьiohemjcara Srblje. Zaposleпa је па IORS-u, u laboгatoгiji za ekspeгjmeпtalпu farmakologjju, u zvaпju jstrazjvac-saradпjk . Прилог З. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку "Светозар Марковић" да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом : Aпaliza modaliteta citotoksicпog delovaпja kompleksa па bazi platiпe (11), ruteпijuma (111), hroma (111) i rodijuma (111) ispitivaпjem па tumorskim celijama u kulturi која је моје ауторска дело . Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање . Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла . 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијалне '.~уторство- некомерцијалне- без прераде 4. Ауторство- некомерцијалне- делити под истим условима 5. Ауторство- без прераде 6. Ауторство- делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци , кратак опис лиценци дат је на полеђини листа) . Потпис ,,:hw\1! /eLoV1·c kcr"f У Београду , _9.12.201 З ________ _ Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-а Sandra S. Arandelovic Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Aпaliza modaliteta citotoksicпog delovaпja kompleksa па bazi platiпe (11), ruteпijuma (111), hroma (111) i rodijuma (111) ispitivaпjem па tumorskim celijama u kulturi • резултат сопственог истраживачког рада, • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа , • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица . Потпис У Београду , __ 9.12.201 3. _____ _