UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Tamara D. Lazarevi-Pašti PRIMENA OKSIDACIJE ORGANO- TIOFOSFATNIH PESTICIDA U METODAMA ZA NJIHOVU DETEKCIJU NA BAZI INHIBICIJE ACETILHOLINESTERAZE doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Tamara D. Lazarevi-Pašti APPLICATION OF ORGANOTHIOPHOSPHATE PESTICIDES OXIDATION IN METHODS FOR THEIR DETECTION BASED ON ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITION Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. Mentori: dr Ljuba Mandi, redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Vesna Vasi, nauni savetnik Instituta za nuklearne nauke „Vina“ lanovi komisije: dr Ljuba Mandi, redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Vesna Vasi, nauni savetnik Instituta za nuklearne nauke „Vina“ dr Miroslav M. Vrvi, redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Datum odbrane doktorske teze: ________________________ Ova doktorska disetracija uraena je u Laboratoriji za fiziku hemiju Instituta za nuklearne nauke „Vina“. Mentoru, prof. dr Ljubi Mandi, zahvaljujem se na nesebinoj pomoi, podršci, posveenom vremenu za konsultacije i strunim savetima tokom izrade i pisanja ove teze. Mentoru, dr Vesni Vasi, zahvaljujem se na izboru teme, podršci i razumevanju, posveenom vremenu u izradi i pisanju ove teze, kao i na znanju koje sam stekla radei sa njom. Zahvalnost dugujem prof. dr Miroslavu M. Vrviu na dragocenim sugestijama tokom pisanja ove teze. Zahvaljujem se dr Tatjani Momi na svesrdnoj pomoi i uvoenju u problematiku, kao i na savetima tokom izrade eksperimentalnog dela teze. Zahvaljujem se svim kolegama iz Laboratorije za fiziku hemiju Instituta za nukelarne nauke „Vina“ na podršci i pomoi koju su mi pružali tokom izrade ove teze. Najtoplije se zahvaljujem svojoj porodici i dragim prijateljima na nesebinoj pomoi i iskrenoj podršci koju su mi pružali tokom izrade ove teze. Posebno se zahvaljujem svom suprugu Igoru na strunim savetima, podršci, strpljenju i razumevanju. PRIMENA OKSIDACIJE ORGANO-TIOFOSFATNIH PESTICIDA U METODAMA ZA NJIHOVU DETEKCIJU NA BAZI INHIBICIJE ACETILHOLINESTERAZE Ispitana je inhibicija slobodne acetilholinesteraze (AChE) odabranim organo- tiofosfatima (OP) (diazinon, malation, hlorpirifos, azinfos-metil, forat) i njihovim okso- analozima (diazokson, malaokson, hlorpirifos-okson, azinfos-metil-okson, forat-okson), pri emu su optimizovani uslovi za detekciju najniže koncentracije tih jedinjenja primenom AChE testa. Odreene su IC50 vrednosti za sva navedena jedinjenja. U cilju poveanja osetljivosti AChE testa, ispitivani organo-tiofosfati prevedeni su u okso-analoge u prisustvu enzima mijeloperoksidaze (MPO). To je potvreno pomou UPLC i GC/MS analize. Nastali oksidacioni proizvodi stabilni su najmanje 1h. Maksimalne koncentracije oksona dobijaju se kada se organo-tiofosfati inkubiraju sa 100 nM MPO u prisustvu H2O2 koncentracije 50 μM, pri pH 6, na temperaturi 25 °C u toku 10 minuta. Oksidacija OP u prisustvu MPO pod navedenim uslovima primenjena je u modifikaciji metode za detekciju OP na bazi inhibicije AChE. Odreena je granica detekcije modifikovane metode, kao i efikasnost oksidacije i njena primena na smešu OP. Gore navedeni organo-tiofosfati prevedeni su u odgovarajue oksone i pomou elektrohemijski generisanih halogena. Proizvodi koji nastaju identifikovani su kao oksoni pomou UPLC analize. Utvreno je da je najefikasnija oksidacija elektrogenerisanim bromom u toku 15 minuta. Odreena je i granica detekcije AChE testa za odreivanje OP kada su OP oksidovani elektrohemijski generisanim bromom. Uporeeni su efekti enzimske i elektrohemijske oksidacije OP na osetljivost AChE testa za detekciju OP. Rezultati su pokazali da su granice detekcije za jedan red veliine niže kada se oksidacija odvija u prisustvu elektrogenerisanih halogena u odnosu na enzimsku oksidaciju. Efekat neoksidovanih OP i OP oksidovanih u prisutvu MPO ispitan je i na imobilizovanoj AChE u protonom injekcionom sistemu. U ovom sluaju, granica detekcije metode još je niža, i to za još jedan red veliine u odnosu na slobodnu acetilholinesterazu. Kljune rei: organofosfati, pesticidi, biosenzori, oksidacija, acetilholin-esteraza, mijeloperoksidaza, detekcija; Nauna oblast: prirodno-matematike nauke Uža nauna oblast: biohemija APPLICATION OF ORGANOTHIOPHOSPHATE PESTICIDES OXIDATION IN METHODS FOR THEIR DETECTION BASED ON ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITION The inhibition of acetylcholinesterase in the presence of selected organothiophosphates (diazinon, malathion, chlorpyrifos, azinphos-methyl, phorate) and their oxo-analogues (diazoxon, malaoxon, chlorpyrifos-oxon, azinphos-methyl-oxon, phorate-oxon) was examined. Experimental conditions were optimized to detect the lowest posible concentrations of these compounds using AChE test. IC50 values were determined for all the mentioned compounds. Investigated organothiophosphates have been converted into their oxo-analogues in the presence of the enzyme myeloperoxidase. Oxidation products were detected using UPLC and GC/MS analysis. It was found that the products are stable within minimum 1h. In order to optimize oxidation procedure and achieve maximum concentrations of oxons, the optimal concentrations of H2O2 (50 μM) and MPO (100 nM) were determined. Also, the optimal incubation time of OPs and MPO (10 min), as well as the optimal pH (6) and temperature (25 °C) were estimated. Oxidation of OPs in the presence of MPO under optimal conditions was applied as a modification of the method for detecting OP using AChE test. The detection limits were determined for the modified method, as well as the efficiency of oxidation and its application for the analysi of sintetic mixture of OPs. Examined organothiophosphates have been converted into their oxo-forms using electrochemically generated halogens. Products have been identified as oxons using UPLC analysis. It was found that the the most efficient oxidation of OPs was carried out by after 15 minutes of oxidation with electrogenerated bromine. Detection limits were determined, too. Effects of enzymatic and electrochemical oxidation on the sensitivity of the AChE test for the detection of OP were compared. The results showed that the IC50 values were lower by 100 to 1000 times when the oxidation takes place in the presence of electrochemically generated halogens and that the limits of detection were for an order of magnitude lower, compared to the enzymatic oxidation procedure. The effects of OP and OP oxidized in the presence of MPO were tested on immobilized AChE. In this case, the method detection limit was for an order of magnitude lower. Key words: organophosphate, pesticide, biosensor, oxidation, acetylcholinesterase, myeloperoxidase, detection; Area of science: natural sciences and mathematics Sub-area of science: biochemistry Lista skraenica AChE – acetilholinesteraza ASChI - acetiltioholin-jodid BChE - butirilholinesteraza BSA – govei serum albumin (eng. bovine serum albumin) ChO – holin-oksidaza CPG - staklene kuglice sa kontrolisanom veliinom pora (eng. controlled-pore glass) CZE – kapilarna zonska elektroforeza (eng. capillary zone electrophoresis) DAD – detektor sa diodnim nizom DNK – deoksiribonukleinska kiselina DTNB - 5, 5' – ditio-bis-(2-nitrobenzoeva kiseina) DEF - S,S,S-tributilfosforotritionat DMF - dimetil-formamid ECD – detektor na bazi zahvata elektrona (eng. electron-capture detector) FIA – protona injekciona analiza (eng. flow injection analysis) FAD – flavin-adenin-dinukleotid FADH2 – redukovani flavin-adenin-dinukleotid GC – gasna hromatografija (eng. gas chromatography) GC/MS – gasni hromatograf spregnut sa masenim spektrometrom GOD - glukoza oksidaza HPLC – tena hromatografija pod visokim pritiskom (eng. high pressure liquid chromatography) HPLC/MS - tena hromatografija pod visokim pritiskom spregnuta sa masenim spektrometrom Km – Mihaelis-Mentenova konstanta kcat – katalitika konstanta LC – tena hromatografija (eng. liquid chromatography) MPO - mijeloperoksidaza NBS - N-bromsukcinimid NADPH - redukovani nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat OP - organofosfatni pesticidi OPH – organofosfat-hidrolaza 2-PAM - piridin-2-aldoksim PAPA - 4-aminofenil-acetat PBS – fiziološki rastvor puferisan fosfatom (eng. phosphate buffered saline) RNK – ribonukleinska kiselina iRNK – informaciona ribonukleinska kiselina SDS - natrijum-dodecil-sulfat SDS-PAGE – natrijumdodecilsulfat-poliakrilamid-gel-elektroforeza TMB-4 - 1,1'-trimetilen-bis-(4-formilpiridinium-bromid)-dioksim TMB - 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin TNB - 5-tio-2-nitrobenzoat TLC – tankoslojna hromatografija (eng. thin-layer chromatography) UV/VIS – ultraljubiasta i vidljiva oblast spektra elektromagnetnog zraenja UPLC – tena hromatografija pod ultra-visokim pritiskom (eng. Ultra Performance Liquid Chromatography) V0 – poetna brzina reakcije Vmax – maksimalna brzina reakcije ZKE - zasiena kalomelova elektroda Sadržaj  1. UVOD.................................................................................................................................1 2. OPŠTI DEO.......................................................................................................................3 2.1. Pesticidi................................................................................................................3 2.1.1. Grupe pesticida......................................................................................3 2.1.2. Organofosfatna jedinjenja.....................................................................4 2.2. Acetilholinesteraza...............................................................................................8 2.2.1. Mehanizam inhibicije acetilholinesteraze sa organofosfatima............13 2.3. Detekcija organofosfatnih pesticida...................................................................15 2.3.1. Konvencionalne metode......................................................................16 2.3.2. Biosenzori............................................................................................17 2.3.2.1. Biološki senzorni elementi...................................................18 2.3.2.2. Imobilizacija biokomponente...............................................19 2.3.2.3. Transduceri...........................................................................21 2.3.2.4. Generacije biosenzora..........................................................23 2.3.2.5. Prednosti i ogranienja biosenzora.......................................25 2.3.2.6. Primena biosenzora..............................................................26 2.3.2.7. Biosenzori za detekciju organofosfatnih pesticida............. 30 2.4. Oksidacija organofosfatnih pesticida................................................................33 2.4.1. Oksidacija organofosfatnih pesticida neorganskim supstancama......33 2.4.2. Oksidacija organofosfatnih pesticida pomou enzima.......................34 2.4.3. Elektrohemijska oksidacija organofosfatnih pesticida.......................35 2.5. Mijeloperoksidaza..............................................................................................36 2.5.1. Reakcioni mehanizam mijeloperoksidaze...........................................39 2.5.2. Trodimenzionalna struktura mijeloperoksidaze..................................41 3. MATERIJAL I METODE..............................................................................................44 3.1. Hemikalije..........................................................................................................44 3.2. Korišena oprema...............................................................................................47 3.2.1. Spektrofotometijska merenja..............................................................47 3.2.2. Tena hromatografija..........................................................................47 3.2.3. Gasna hromatografija..........................................................................47 3.2.4. Protoni injekcioni sistem (FIA).........................................................47 3.2.4.1. Imobilizacija AChE..............................................................49 3.2.5. Elektrohemijska merenja…………………………………………….50 3.2.6. Ostala laboratorijska oprema...............................................................50 3.3. Odreivanje aktivnosti AChE............................................................................51 3.4. Oksidacija OP u prisustvu MPO........................................................................51 3.5. Oksidacija OP elektrohemijski generisanim hlorom, bromom i jodom.............52 3.6. Identifikacija proizvoda oksidacije OP..............................................................52 3.6.1. UPLC...................................................................................................52 3.6.2. GC/MS................................................................................................53 3.7. Ispitivanje peroksidazne aktivnosti mijeloperoksidaze......................................54 3.8. Ispitivanje hlorinujue aktivnosti mijeloperoksidaze.........................................54 4. REZULTATI I DISKUSIJA..........................................................................................56 4.1. Inhibicija nativne AChE organofosfatima..........................................................56 4.1.1. Optimizacija uslova za detekciju najniže koncentracije OP primenom AChE testa.....................................................................................................56 4.1.2. Inhibicija AChE organo-tiofosfatima..................................................58 4.1.3. Inhibicija AChE okso-oblicima organofosfata...................................61 4.2. Prevoenje OP iz tio- u okso-oblik u prisustvu MPO........................................64 4.2.1. Oksidacija............................................................................................64 4.2.1.1. Identifikacija proizvoda oksidacije......................................65 4.2.1.1.1. UPLC.....................................................................65 4.2.1.1.1.1. Stabilnost oksidovanih oblika OP..........69 4.2.1.1.2. GC/MS..................................................................71 4.2.2. Optimizacija uslova za oksidaciju organo-tiofosfata..........................73 4.2.2.1. Odreivanje optimalne koncentracije H2O2 za oksidaciju OP u prisustvu MPO................................................................................74 4.2.2.2. Uticaj vremena inkubacije MPO sa OP na oksidaciju.........76 4.2.2.2.1. Odreivanje kinetikih konstanti za proces oksidacije OP u prisustvu MPO............................................78 4.2.2.3. Oksidacija OP u zavisnosti od koncentracije MPO.............80 4.2.2.4. Oksidacija OP u prisustvu MPO u zavisnosti od pH...........82 4.2.2.5. Zavisnost oksidacije OP u prisustvu MPO od temperature reakcione smeše.................................................................................83 4.2.2.5.1. Odreivanje aktivacione energije oksidacije.........86 4.2.3. Primena utvrenih optimalnih uslova oksidacije OP u prisustvu MPO u modifikaciji AChE testa za detekciju OP...................................................88 4.2.3.1. Odreivanje efikasnosti oksidacije OP pomou modifikovanog AChE testa...............................................................93 4.2.3.2. Uticaj smeše organofosfata na aktivnost AChE u nativnom obliku.................................................................................................94 4.3. Oksidacija OP elektrohemijski generisanim Cl2, Br2 i I2...................................96 4.3.1. Elektrohemijsko generisanje halogena na elektrodi od staklastog ugljenika........................................................................................................96 4.3.2. Oksidacija OP elektrogenerisanim X2 (X = Cl, Br, I)…………...…100 4.4. Poreenje efekta oksidacije OP razliitim metodama na njihovo odreivanje pomou AChE testa.................................................................................................109 4.5. Odredjivanje koncentracije OP u realnim uzorcima .......................................111 4.6. FIA sistem za detekciju OP..............................................................................112 4.6.1. Odreivanje radnih parametara FIA sistema……………………….113 4.6.2. Inhibicija imobilizovane AChE u prisustvu OP................................116 5. ZAKLJUAK................................................................................................................119 6. LITERATURA..............................................................................................................121 7. PRILOZI........................................................................................................................140 Biografija...........................................................................................................................143 11. UVOD Organofosfatni pesticidi, ija je upotreba u poljoprivredi i danas široko rasprostranjena, veoma su štetni po okolinu i oveka. Njihov toksini efekat potie od ireverzibilne inhibicije AChE, enzima koji uestvuje u transdukciji nervnih signala. Kao inhibitori AChE, organofosfatni pesticidi su toksini za oveka i zbog toga je razvijanje metoda za njihovu detekciju veoma važno. Organo-tiofosfati u organizmu podležu metabolikoj oksidaciji pod dejstvom citohroma P450, što vodi formiranju odgovarajuih oksona. Proizvodi oksidacije organo-tiofosfata su toksiniji od polaznih jedinjenja, jer su jai inhibitori AChE. Ova injenica može se iskoristiti za poboljšanje osetljivosti AChE testa za detekciju OP, koji se zasniva na inhibiciji enzima. Za oksidaciju organo-tiofosfata do sada su korišena razna jedinjenja. Najviše je ispitan efekat neorganskih oksidanata, od kojih su najbolje rezultate dali NBS, brom, azotna kiselina, hlor, ozon i vodonik-peroksid. Mnogi enzimi su takoe korišeni za oksidaciju OP, uglavnom peroksidaze, kao što su peroksidaza iz rena i hloroperoksidaza. Polazei od injenice da je oksidacija OP neophodan korak u metodama za njihovu detekciju, koje se baziraju na inhibiciji AChE, ciljevi ovog rada bili su: 1. -oksidacija organofosfatnih pesticida u prisustvu mijeloperoksidaze, odreivanje optimalnih uslova za oksidaciju (koncentracija H2O2, vreme inkubacije, koncentracija mijeloperoksidaze, pH, temperatura) i identifikacija proizvoda oksidacije pomou UPLC i GC/MS; 2. -elektrohemijsko generisanje hlora, broma i joda, odreivanje optimalnih uslova i oksidacija organofosfata pomou elektrogenerisanih halogena, identifikacija proizvoda oksidacije pomou UPLC, odreivanje najefikasnijeg halogena za oksidaciju organofosfata; 3. -poreenje efikasnosti oksidacije organofosfata u prisustvu enzima mijeloperoksidaze i elektrogenerisanih halogena, utvrivanje prednosti i mana obe metode; 24. -primena metode za odreivanje OP u realnim uzorcima; 5. -imobilizacija acetilholinesteraze i razvijanje FIA sistema za detekciju organo- tiofosfata uz oksidaciju kao modifikaciju metode. 32. OPŠTI DEO 2.1. Pesticidi 2.1.1. Grupe pesticida Termin sredstva za zaštitu bilja obuhvata sva hemijska jedinjenja koja se koriste za kontrolisanje rasta zglavkara, mikroorganizama i korova. Ta jedinjenja služe da se obezbedi ispravan rast biljaka i minimalno mogue zalaganje odgajivaa. Sveobuhvatniji termin pesticidi odnosi se na jedinjenja koja se upotrebljavaju za kontrolu štetoina svih vrsta, ukljuujui i one koji su direktna opasnost po zdravlje oveka i životinja. Meu štetoinama insektima znaajni su oni koji prenose humane bolesti, kao što su vrste komaraca koji su prenosioci malarije, vaši koje prenose tifus, buve koje prenose kugu i razliite vrste koje su nosioci meningitisa i žute groznice. U pesticide se ubrajaju: insekticidi, fungicidi, baktericidi, herbicidi i regulatori rasta biljaka [1]. Insekticidi su grupa pesticida koja je od velikog znaaja za poljoprivredu i ekonomiju. Uprkos tome što su mnogi proizvodi ve dostupni, ostalo je dosta prostora za nove i bolje. Razlog tome su vrste koje su razvile rezistenciju na postojee proizvode, naroito one koje se brzo dele i za kratko vreme proizvedu veliki broj generacija. Novorazvijeni pesticidi bi trebalo da imaju idealna svojstva, što podrazumeva prvenstveno širok spektar aktivnosti, a zatim i da budu bezbedni po sisare i ribe. Željena svojstva novih pesticida trebalo bi obezbediti po što manjoj ceni. Relativni znaaj fungicida i baktericida razlikuje se širom sveta. Promene u procesu kultivacije biljnih vrsta i uzgajanje novih vrsta dovele su do poveane uestalosti gljivinih obolenja, zbog ega je razvoj ove grupe pesticida veoma važan. 4Herbicidi važe za grupu pesticida koja se danas najviše koristi u poljoprivredi. Pored toga što znaajno utiu na poveanje prinosa, herbicidi štede trud oko uzgajanja biljaka. Ovaj faktor je posebno važan u razvijenim zemljama. Herbicidi imaju i karakteristike koje su važne sa gledišta ekologije i toksikologije. Kako se naješe primenjuju pre berbe, u momentu kada dospevaju do potrošaa budu razgraeni do ostataka koji nisu štetni. Mnogi herbicidi su selektivni inhibitori fotosinteze, koja je karakteristina za biljke, pa tako nisu toksini za sisare. Regulatori rasta biljaka imaju specifine efekte na fiziološke procese biljaka. Oni menjaju sastav biljke, na primer, tako što poveavaju sadržaj šeera ili proteina. Takoe mogu da inhibiraju rast jedinke skraivanjem internodusa, što dovodi do poveane fizike stabilnosti biljke. Ostale primene regulatora rasta biljaka ogledaju se u indukovanju cvetanja, poveanju otpornosti na sušu i mraz, pospešivanje sazrevanja i suzbijanje rasta drugih ometajuih biljaka u neposrednoj okolini jedinke. Regulatori rasta biljaka služe da poboljšaju prinos i kvalitet kultura. Razvoj novih proizvoda za zaštitu biljaka podrazumeva sintezu, biološki skrining, procenu zemljišta, toksikološka ispitivanja, metabolike studije, ispitivanje degradacije jedinjenja, proveru bezbednosti po životnu sredinu, zaštitu patenta i proizvodnju samog proizvoda. Svi pesticidi imaju neki uticaj na životnu sredinu oveka. Da bi se taj uticaj doveo na prihvatljiv nivo, svi komercijalno dostupni proizvodi u veini država moraju podlei striktnim zakonskim regulativama. Pre nego što se pusti na tržište, proizvod se mora detaljno ispitati i utvrditi koliku opasnost predstavlja po oveka i životinje. 2.1.2. Organofosfatna jedinjenja Fosfor i njegova jedinjenja danas imaju veliki znaaj u mnogim oblastima nauke i tehnike. Neorganska jedinjenja fosfora imaju veliku primenu u industriji, a u poljoprivredi se koriste kao fosfatna ubriva. Organska jedinjenja fosfora se primenjuju u proizvodnji 5plastinih masa, kao reaktanti u organskoj sintezi, kao dodaci mazivima i uljima, a koriste se u velikom obimu i u zaštiti bilja. Mnoga jedinjenja se danas koriste kao insekticidi, herbicidi ili fungicidi. Organska jedinjenja fosfora dobijaju na znaaju sa radovima nemakog istraživaa Šradera [2; 3]. Sistematski razvoj organske hemije fosfora poinje u dvadesetom veku. Sa radovima Šradera ova jedinjenja dobijaju praktian znaaj i poinje nov period industrijske proizvodnje insekticida iz grupe organskih jedinjenja fosfora [4]. Šrader i njegovi saradnici najpre su dali osnovnu strukturu za jedinjenja sa kontaktnim insekticidnim delovanjem, a ona je kasnije razvijena u strukturu ija je opšta formula: A R R1 (S) U ovoj formuli R i R1 su alkil-, alkoksi- ili amino- grupe, a „A“ grupa predstavlja kiselinski ostatak neorganske ili organske kiseline (Cl-, F-, SCN- i CH3COO -) ili neku drugu grupu (enolati, merkaptidi itd). Prošlo je dosta vremena dok se za sva jedinjenja koja su sintetizovana prema Šraderovoj opštoj formuli dokazalo ne samo biocidno delovanje, ve da se fosforilacijom objasni njihova hemijska i biohemijska aktivnost. Klark i saradnici su 1964. godine dali osnovnu strukturu za sva jedinjenja sa fosforilujuim svojstvima (Shema 2). X Y Z R R1 (S) 6U formuli X, Y i Z uglavnom predstavljaju atome H, C, N, O, S i halogena. Razvoj organske hemije fosfora potvrdio je svu njenu opravdanost, jer danas, pored insekticida, ova jedinjenja nalaze primenu kao herbicidi, fungicidi, regulatori rasta biljaka, rodenticidi i kao hemosterilanti. Veoma je interesantno da se neka od organskih jedinjenja fosfora koriste kao lekovi. Meu antibioticima poznat je fosfomicin, a za leenje razliitih vrsta tumora endoksan ili ciklofosfamid. Takoe se i neki jaki otrovi, kao što su paraokson i armin, koriste u leenju glaukoma [4]. Za samo pedeset godina sintetizovano je i ispitano više od sto hiljada organskih jedinjenja fosfora sa ciljem da se primene kao pesticidi. Meutim, danas primenu nalazi samo oko 150 jedinjenja. Veoma važna karakteristika ovih jedinjenja je da pokazuju izrazito razliita fizika svojstva, kao što su vrednosti napona pare i rastvorljivost u vodi. Razlikuju se i prema hemijskoj stabilnosti, a pokazuju i razliitu toksinost prema toplokrvnim životinjama. Široki spektar fizikohemijskih svojstava i bioloških aktivnosti omoguava ovim supstancama razliitu primenu u poljoprivredi i higijeni. Neke se koriste kao fumiganti, neke kao kontaktni otrovi, a druge kao sistematski insekticidi. Neka jedinjenja se koriste u zaštiti bilja u vreme setve, a druga mogu uspešno da se primenjuju samo u periodu žetve. Prva moraju da se odlikuju postojanošu kako bi se izbeglo sekundarno delovanje i smanjili troškovi, a druga grupa jedinjenja, koja se koriste u kasnijem periodu, treba da budu manje postojana. Na taj nain se reguliše koncentracija ostataka koja mora da bude zanemarljiva u periodu žetve. Prema Šraderu, da bi neko organsko jedinjenje fosfora bilo biološki aktivno treba da ima: • kiseonik ili sumpor koji su vezani dvostrukom vezom za petovalentni fosfor, • R i R1 alkil-grupe vezane za fosfor preko kiseonika (alkoksi –OR ili ariloksi –OAr grupe), preko azota (amido grupa –NR2) ili direktno (alkil –R i aril – Ar grupe), • kiselinski ostatak neorganske ili organske kiseline (F-, CNS-, RCOO- i dr.), kao i neke druge grupe, npr. merkapto grupa. 7Sa razvojem hemije organskih jedinjenja fosfora i sintezom novih jedinjenja složenih struktura, javila se potreba da se opšta formula Šradera modifikuje i tada je A grupa zamenjena grupacijom (P)-XYZ. Da bi se ovom formulom prikazalo jedinjenje sa dobrim pesticidnim svojstvima, potrebno je da veza P-X bude što slabija, a da grupa Z bude što više elektronegativna ili da postaje elektronegativna pod uticajem protona ili redukcionih supstanci, odnosno da je u stanju da induktivnim efektom privue elektrone veze P-X. Trei uslov je da se uvede Y atom sa sp2 hibridizacijom [4]. Nesumnjivo da ova modifikovana Šraderova formula može da posluži za objašnjenje ponašanja novih jedinjenja i da objasni potrebu sinteze jedinjenja u kojima su radikali razliita heterociklina jedinjenja. Ovim postupkom mogu da se objasne i potencijalna svojstva molekula u zavisnosti od protonacije u prisustvu rastvaraa ili u prelaznom stupnju. Tako se može objasniti zavisnost strukture i biološke aktivnosti nekog molekula, jer protonacija fosforilujue supstance igra važnu ulogu u fiziološkim procesima. Naješe korišeni organofosfatni pesticidi (OP) dati su u Tabeli 1. 8Tabela 1. Naješe korišeni OP Uobiajeni naziv Komercijalni naziv Naziv po IUPAC-u Acefat Acephate®, Orthene® O,S-dimetil-acetil-fosfoamidotioat Azinfos-metil Azinphos®, Guthion® O,O-dimetil-S-[(4-okso-1,2,3-benzotriazin- 3[4H]-il)metil]-fosfoditioat Hlorpirifos Chlorpyrifos®, Govern® O,O-dietil-O-(3,5,6-trihlor-2-piridinil)- fosfotioat Diazinon Diazinon® O,O-dietil-O-(2-izopropil-6-metil-4- pirimidinil)-fosfotioat Dimetoat Dimethoate®, Cygon® O,O-dimetil-S-metilkarbamoilmetil- fosfoditioat Disulfoton Di-Syston® O,O-dietil-S-[2-(etiltio)etil]-fosfoditioat Etoprop Mocap® O-etil-S,S-dipropil-fosfoditioat Fenamifos Nemacur® Etil-3-metil-4-(metiltio)fenil-(1-metiletil)- fosfoamidat Malation Fyfanon®, Malathion® Dietil-(dimetoksitiofosforiltio)sukcinat Metamidofos Monitor® O,S-dimetil-fosforamidotioat Metidation Supracide® S-2,3-dihidro-5-metoksi-2-okso-1,3,4- tiadiazol-3-ilmetil-O,O-dimetil-fosfoditioat Metil-paration Penncap-M® O,O-dimetil-O-(nitrofenil)-fosfotioat Naled Dibrom® 1,2-dibrom-2,2-dihloretil-dimetil-fosfat Oksidemeton- metil MSR® S-[2-(etilsulfinil)etil]-O,O-dimetil-fosfotioat Forat Phorate®, Thimet® O,O-dietil-S-[(etiltio)metil]-fosfoditioat 2.2. Acetilholinesteraza Acetilholinesteraza (AChE) je kljuni enzim nervnog sistema životinja. Glavna biološka uloga acetilholinesteraze je okonavanje prenosa impulsa u holinergikim sinapsama brzom hidrolizom neurotransmitera acetilholina [5] (Slika 1). 9Slika 1. Hidroliza acetilholina Komercijalno dostupne AChE se danas naješe izoluju iz elektrinih organa elektrinih riba, pa su te izoforme i najbolje ispitane. Razliite oligomerne forme ovog enzima iz elektrine jegulje (iz roda Electrophorus) i elektrine raže (iz roda Torpedo) su strukturno homologe sa AChE iz nerava i mišia kimenjaka. Bon i saradnici [6] su pokazali da aktivna mesta AChE iz etiri razliite vrste (elektrina jegulja, elektrina raža, pacov i kokoška) imaju ekvivalentnu katalitiku aktivnost po aktivnom mestu. Budui da je veoma ist preparat AChE iz elektrine jegulje komercijalno dostupan, oni su bili u stanju da utvrde da svaki monomer veže jedan molekul inhibitora. Susman i saradnici [7] su prvi okarakterisali trodimenzionalnu strukturu acetilholinesteraze. Oni su izuavali elektrini organ raže Torpedo californica pomou rendgenske analize sa rezolucijom od 2.8 angstrema. Pokazalo se da molekul AChE ima oblik elipse i dimenzije 45x60x65 angstrema. Enzim je dimer, što je prikazano na Slici 2. 10 Slika 2. Trodimenzionalna struktura AChE iz Torpedo californica Monomer enzima je / protein. Sastoji se od 12  ploica okruženih sa 14  heliksa. Prvi i poslednji par  ploica formiraju  ukosnicu (Slika 3). Slika 3. Sekundarna struktura AChE iz Torpedo californica Rane kinetike studije indikovale su da aktivno mesto acetilholinesteraze sadrži dva takozvana pod-mesta, esterazno i anjonsko pod-mesto, što odgovara katalitikom mestu i džepu za vezivanje holina. Esterazno mesto sadrži serin koji reaguje sa supstratom, kao i sa organofosfatima. Anjonsko pod-mesto vezuje naelektrisanu kvaternarnu grupu iz 11 acetilholina. Supstrat prodire duboko u usko udubljenje koje vodi do aktivnog mesta enzima. Doerti i saradnici [8] predstavili su teorijske i eksperimentalne podatke dobijene uz pomo modela koji podržava interakcije kvaternarnog azota i  elektrona aromatinih grupa. Prema tom modelu, doprinos aromatinog karaktera udubljenja veoma je znaajan za visok stepen vezivanja liganda. Rozenberi i saradnici predložili su „aromatino voeno“ vezivanje supstrata [9]. Esterifikaciono mesto formiraju Ser 200, His 440 i Glu 327. Enzimska reakcija hidrolize acetilholina u prisustvu acetilholinesteraze odvija se u dva stupnja: 1. reakcija izmeu acetil grupe supstrata i serinskog ostatka enzima (Slika 4a) 2. deacetilacija serinskog ostatka (Slika 4b) Prvi korak katalize podrazumeva napad serina (Ser 200) na acetilholin. Hidroksilna grupa serina nije jak nukleofil pri fiziološkim uslovima. Reakcija poinje tako što proton iz hidroksilne grupe serina biva preuzet od strane azota imidazolnog prstena histidina (His 440). Proton vezan za azot prelazi na glutamat (Glu 327). Aktivirani serin je jak nukleofil, koji može napasti C-atom karbonilne grupe supstrata, dovodei do stvaranja tetraedarskog prelaznog stanja. Anjon koji pri tome nastaje stabilizovan je vodoninim vezama sa ostacima Gly 118, Gly 119 i Ala 201. Proton sa His 440 obezbeuje formiranje holina, dok enzim ostaje acetilovan (Slika 4a). 12 Gly 118 Gly 119 Ala 201 R CH3 Ser 200 His 440 Glu 327 Gly 118 Gly 118 Gly 119 Gly 119 Ala 201 Ala 201 R CH3 CH3 Ser 200 Ser 200 His 440 His 440 Glu 327 Glu 327 Slika 4a. Mehanizam dejstva AChE – 1. faza, acetilovanje enzima Jedan molekul vode interkalira se izmeu acetil grupe i His 440. Proton iz molekula vode se prenosi na His 440, a hidroksilna grupa napada karbonilni C-atom acetilovanog intermedijera i formira se tetraedarsko prelazno stanje. Konano, proton se premešta sa histidina na serin, a etanska kiselina se oslobaa (Slika 4b). 13 Gly 118 Gly 118 Gly 119 Gly 118 Ala 201 Gly 119 R Gly 119 Ala 201 CH3 Ala 201 Ser 200 His 440 CH3 Glu 327 CH3 Ser 200 Ser 200 His 440 His 440 Glu 327 Glu 327 Slika 4b. Mehanizam dejstva AChE – 2. faza, deacetilovanje serinskog ostatka 2.2.1. Mehanizam inhibicije AChE sa organofosfatima Organofosfati su ireverzibilni inhibitori acetilholinesteraze, kovalentno se vezuju za aktivno mesto enzima. Hidroksilna grupa serina reaguje sa fosfatnim estrom (Slika 5), dolazi do eliminacije alkohola uz fosforilaciju Ser 200. Posle ovog koraka, enzim je ireverzibilno inhibiran i samo pomou piridin-2-aldoksima (2-PAM) i 1,1'-trimetilen-bis- (4-formilpiridinium-bromid)-dioksima (TMB-4) može da povrati svoju aktivnost [10]. 14 Inhibirani enzim treba reaktivirati u roku od nekoliko minuta, jer starenjem kompleksa pesticid-enzim reaktivacija postaje nemogua. COO- OH COO-COOH COOHCOO - COOH Slika 5. Mehanizam ireverzibilne inhibicije AChE organofosfatima Ukoliko je AChE blokirana inhibitorima, akumulacija acetilholina uzrokuje simptome koji daju sledeu kliniku sliku: 15 • muskarinske manifestacije – pojaana bronhijalna sekrecija, pojaana salivacija, znojenje, bronhokonstrikcije, abdominalni grevi, bradikardija • nikotinske manifestacije – fascikulacija glatkih mišia, a u težim sluajevima i dijafragme i respiratornih mišia, tahikardija • manifestacije centralnog nervnog sistema – glavobolja, vrtoglavica, uznemirenost, anksioznost, mentalna konfuzija, konvulzije, koma, depresija respiratornog centra. U ekstremnim sluajevima, ovi simptomi mogu odvesti u smrt [5]. 2.3. Detekcija organofosfatnih pesticida Budui da se organofosfatni pesticidi esto upotrebljavaju u poljoprivredi i kontoli razvoja insekata, njihova detekcija je veoma važna. etrdesetih i pedesetih godina dvadesetog veka analitike procedure za odreivanje organofosfata bile su vremenski veoma zahtevne i komplikovane zbog ogranienja dostupnih metoda. Bilo je teško identifikovati razliita jedinjenja, a kvantifikacija je bila mogua samo u sluajevima visokih koncentracija. Jedine metode izbora su bile hromatografija na papiru i razliite kolorimetrijske metode. Razvoj gasne hromatografije kao analitike metode i razvoj mikrokulometrijskog i detektora sa zahvatom elektrona (ECD, eng. electron-capture detector) postavio je nove ciljeve i olakšao analizu halogenovanih jedinjenja. Ipak, to nije bilo dobro rešenje za jedinjenja sa elektronegativnim funkcionalnim grupama. Kasnije su se pojavili detektori za gasne hromatografe specifini za pojedinane elemente. Kulometrijski detektor za halogenovana jedinjenja se koristio u to vreme, ali je njegov nedotatak bila nedovoljna osetljivost i robustnost za rutinske analize. Tokom vremena, razvijene su metode detekcije sa dovoljnom osetljivošu, ali je trajanje i jednostavnost izvoenja analize još uvek problem. 16 2.3.1. Konvencionalne metode Razdvajanje pesticida hromatografskim metodama pre odreivanja pojedinanih komponenti je danas rutina. Gasna hromatografija (GC, eng. gas chromatography) i tena hromatografija (LC, eng. liquid chromatography) se naješe koriste u te svrhe [11; 12; 13; 14]. Tankoslojna hromatograija (TLC, eng. thin-layer chromatography) je nekada bila veoma popularna, ali su je nove hromatografske tehnike potpuno potisnule [15]. Ipak, zahvaljujui razvoju novih sistema za detekciju, TLC se vraa u upotrebu. U poslednje vreme i kapilarna zonska elektroforeza (CZE, eng. capillary zone electrophoresis) poela je da se koristi, budui da se pokazala kao komplementarna sa GC i LC [16]. GC je dugo bila metoda izbora za razdvajanje pesticida prve generacije. Oni su bili jako hidrofobni, isparljivi i stabilni na visokim temperaturama. Problem se pojavio kada su u upotrebu ušli polarni i termolabilni pesticidi. Tada je LC dobila na znaaju u ovoj oblasti. Granica detekcije ove meteode je oko 1 nM [12; 13; 14]. Poseban doprinos dalo je korišenje novih vrsta detektora, kao što su detektor sa diodnim nizom (DAD, eng. diode array detector), fluorescentni i maseni detektor. Gasni hromatograf sa masenim spektrometrom (GC/MS) je instrument koji se u današnje vreme naješe upotrebljava za analizu OP [12]. Razlog je mogunost odreivanja mikrogramskih koliina pesticida, što se postiže zahvaljujui velikoj moi razdvajanja na GC koloni i povezanosti sa masenim spektrometrom, koji ima izuzetno visoku osetljivost (0,05 nM) [14; 17]. Ipak, osetljivost nije dovoljno visoka da se dostignu granice kvantifikacije koje Komisija evropskih zajednica propisuje za pojedinane pesticide, te je koncentrovanje uzorka uvek neophodno. Takoe, postoji jedan broj pesticida koji se i danas koriste, a nisu isparljivi i termostabilni, pa se ne mogu analizirati pomou GC/MS [18]. Iako se konvencionalne metode svakodnevno koriste u cilju detekcije pesticida i imaju niske granice detekcije, one su zametne, skupe i komplikovane. Zato je potrebno je konstruisati sistem koji e moi brzo, pouzdano i ekonomino da analizira sve organofosfatne pesticide, po potrebi i na mestu kontaminacije. 17 2.3.2. Biosenzori Termin senzor definiše se kao ureaj ili sistem koji odgovara na fizike i hemijske kvantitete tako što proizvodi izlazni signal koji je mera tog kvantiteta. To su obino elektroda ili optiko vlakno, koji detektuju ili odgovaraju na specifine interakcije sa hemikalijama u okruženju. Rad biosenzora se zasniva na sprezanju imobilizovanog biološkog senzorskog elementa (biološki aktivna komponenta, npr. antitelo, enzim ili elija) sa instrumentom (fizikohemijskim transducerom), koji transformiše specifino prepoznavanje u elektrini, optiki ili toplotni signal, pri emu se rezultati dobijaju odmah [19]. Merenje ciljnog analita se postiže selektivnom transdukcijom reakcije biomolekula i analita u merljivi signal. Najvažnije osobine svakog biosenzora su visoka specifinost i osetljivost prema ciljnom analitu, što se postiže kao rezultat optimizovanog molekulskog prepoznavanja biološki aktivne komponente i njenog prirodnog supstrata sa veim afinitetom nego pri prepoznavanju sa drugim komponentama u sistemu. Princip rada biosenzora prikazan je na Slici 6. Slika 6. Princip rada biosenzora 18 2.3.2.1. Biološki senzorni elementi Biosenzori se mogu klasifikovati prema tipu aktivne biološke komponente ili prema nainu signalne transdukcije, kao i prema kombinaciji ova dva aspekta. Tip biokomponente odreuje stepen selektivnosti i specifinosti biosenzora. Biokomponente su podeljene na tri grupe: biokatalitike, bioafinitetne komponente i hibridni receptori. Biokatalitiki elementi za prepoznavanje mogu biti sistemi koji sadrže enzime, cele elije (mikroorganizmi kao što su bakterije, kvasci, eukariotske elije), elijske organele ili iseci biljnog i životinjskog tkiva [20]. Prednost biosenzora koji koriste mikroorganizme, biljna ili životinjska tkiva ogleda se u injenici da je izbegnuta naporna procedura izolovanja i preišavanja, a da se enzim ipak koristi kao aktivna komponenta. Mikrobni senzori su manje osetljivi na inhibiciju od strane vrsta prisutnih u uzorku, tolerantniji na varijaciju pH i temperature i generalno traju duže. S druge strane, imaju spor odgovor i nisku selektivnost u poreenju sa senzorima na bazi izolovanih enzima [21]. Enzimski senzori su naješe korišeni i odlikuju se visokom selektivnošu. U principu, svi enzimski senzori rade na principu imobilizacije enzimskog sistema na transducer [22]. U grupu bioafinitetnih receptora ubrajaju se hemoreceptori, antitela i nukleinske kiseline. Ova grupa biosenzora zasniva se na afinitetu izmeu molekula, što obezbeuje selektivne interakcije sa datim ligandom i formiranje termodinamiki stabilnih kompleksa. Potencijalna široka upotreba imunosenzora rezultat je velikih mogunosti za njihovu primenu: svako jedinjenje može biti analizirano, uz uslov da postoji specifino antitelo za njega. Pored toga, imunosenzori su vrlo specifini i selektivni za odreeni antigen. Antigen-antitelo kompleksi mogu da se koriste za skoro sve tipove senzora. Fizikohemijske promene nastale usled vezivanja antigena i antitela ne generišu elektrohemijski signal koji je mogue detektovati. Iz tog razloga se enzimi, fluorescentna jedinjenja, elektrohemijski aktivne supstance, radionuklidi ili avidin-biotin kompleksi koriste za obeležavanje antigena ili antitela [23; 24]. Naješe korišeni transduceri u imunosenzorima su akustini ili optiki sistemi [22]. 19 Hibridni receptori, kao što su DNK i RNK probe, pokazali su obeavajue rezultate u analizi hrane, kao i u detekciji mikroorganizama. Princip selektivne detekcije se bazira na pronalaženju jedinstvene sekvence baze nukleinske kiseline u procesu hibridizacije. Sparivanje baza na odreeni nain (adenin i timin, citozin i guanin) obezbeuje da jedan jednolanani fragment može da prepozna sebi komplementaran deo i formira dvostruki lanac. DNK senzori se sastoje od dobro definisane jednolanane sekvence koja je imobilizovana na vrstu podlogu kao biološki receptor. DNK proba se dodaje u DNK ili RNK iz nepoznatog uzorka. Ako doe do hibridizacije probe i lanaca iz nepoznatog uzorka zbog sparivanja sekvenci koje su komplementarne, detekcija je mogua. Analitike metode koje se zasnivaju na interakcijama sa DNK su jedine koje mogu da detektuju genetike modifikacije. Komercijalno se koriste za detekciju patogena u hrani, kao što su Salmonella, Listeria, E.coli i S. Aureus [22; 25; 26]. 2.3.2.2. Imobilizacija biokomponente Da bi se biokomponente mogle upotrebljavati više puta, potrebno je da budu imobilizovane na neki nosa. Imobilizacija doprinosi stabilnosti komponente koja je imobilozovana u odnosu na slobodan, nativni oblik, a i uzorak je lakše odvojiti u takvom sistemu. Biokomponente mogu biti imobilizovane na nosa na razne naine: adsorpcijom, fizikim zarobljavanjem u trodimenzionalnu mrežu, kovalentnim vezivanjem, umrežavanjem (Shema 1) [27]. Matriks može funkcionisati iskljuivo kao nosa biokomponente, ali takoe može biti i mediator u mehanizmu signalne transdukcije. Svrha imobilizacije je da se zadrži maksimum aktivnosti biokomponente na površini transducera. Izbor metode za imobilizaciju zavisi od prirode biokomponente, tipa transducera, fizikohemijskih svojstava analita i radnih uslova biosenzora [22]. 20 Kovalentno vezivanje Umrežavanje Adsorpcija Zarobljavanje u trodimenzionalnu mrežu Shema 1. Naini imobilizacije enzima na nosa Adsorpcija biomolekula na nosae je najjednostavnija metoda za imobilizaciju biokomponente na transducer. Izvodi se tako što se rastvor biomolekula dovede u kontakt sa aktiviranim nosaem tokom definisanog vremenskog perioda. Potom se nevezani molekuli biokomponente uklone ispiranjem. Budui da je adsorpcija posledica Van der Valsovih veza, promena pH, jonske jaine ili temperature može dovesti do toga da se biomolekuli uklone sa nosaa. Zarobljavanjem u polimerizujue gelove obezbeuje se da biomolekuli ne mogu difundovati iz reakcione smeše, dok mali molekuli supstrata lako mogu da prodru do njih. Zarobljavanje u gelu je jednako blaga procedura kao adsorpcija, jer molekuli biokomponente nisu kovalentno vezani za nosa. Ovaj metod se dosta koristi, a kao gelovi se koriste kolagen, želatin, agar, polivinil-alkohol itd. U sluaju kovalentnog vezivanja, biokomponenta biva povezana sa nosaem kovalentnim vezama. U sluaju enzima, hemijski reaktivna mesta mogu biti amino i karboksilne grupe, imidazolne grupe histidina, itd. Obino se imobilizacija izvodi u tri koraka: 1. aktivacija nosaa; 2. nanošenje biomolekula na nosa; 3. uklanjanje adsorbovanih biomolekula; Nedostatak ove metode za imobilizaciju je gubitak aktivnosti biokomponente usled kovalentnog vezivanja za nosa. Kao nosai naješe se koriste celuloza, dekstran, i polivinil-hlorid. 21 Biopolimeri mogu biti meumolekulski povezani pomou bi- ili multifunkcionalnih reagenasa. Molekuli proteina mogu se umrežiti meusobno ili sa nekim drugim funkcionalnim proteinom (npr. goveim serum albuminom). Kao bifunkcionalni reagensi koriste se naješe glutaraldehid, derivati bisizocijanata i bisdiazobenzidin. Prednosti umrežavanja su jednostavnost procedure i jako hemijsko vezivanje biomolekula. Mana je mogunost gubljenja aktivnosti zbog potencijalnih promena u aktivnim mestima proteina. 2.3.2.3. Transduceri Biosenzori mogu biti klasifikovani prema tipu transducera na: elektrohemijske, optike, termalne i piezoelektrine. Biosenzori koji se baziraju na elektrohemijskim transducerima su ekonomini i imaju brz odgovor. Prednost je i to što postoji mogunost automatizacije, što znai i aplikaciju velikog broja uzoraka [28]. Elektrohemijski biosenzori mogu se podeliti na: konduktometrijske, impedometrijske, potenciometrijske i amperometrijske [22]. Konduktometrijski biosenzori se baziraju na principu promene provodljivosti sredine kada mikroorganizmi prevode nenaelektrisane supstrate, kao što su ugljeni hidrati, u intermedijere koji su naelektrisani, kao što je mlena kiselina. Koliina naelektrisanog metabolita je direktno proporcionalna stepenu rasta organizma. Konduktometrijski biosenzori su naješe nespecifini i daju loš signal, te se retko koriste [22]. Impedometrijski biosenzori se zasnivaju na principu da mikrobni metabolizam rezultira porastom provodljivosti i kapacitativnosti, što uzrokuje smanjenje impedanse [29; 30]. Impedansa se obino meri pomou strujnog mosta. Komercijalni analitiki ureaji koji se zasnivaju na ovoj tehnologiji postoje na tržištu [22]. Potenciometrijski transducer poseduje membranu ili površinu selektivnu na odreenu vrstu, koja generiše potencijal proporcionalan koncentraciji aktivne vrste, što se meri u odnosu na referentnu elektrodu [31]. Potenciometrijski ureaji mogu da mere promene u koncentraciji jona i pH. Radi se na poboljšanju granica detekcije i selektivnosti 22 ovih biosenzora, kao i na minijaturizaciji [32; 33; 34; 35]. Naješe se koriste u higijensko- sanitarnoj kontroli kvaliteta proizvoda [22; 36; 37; 38; 39]. Amperometrijski biosenzori mere struju koja se javlja pri hemijskoj reakciji elektroaktivne vrste na primenjenom potencijalu, što je povezano sa njenom koncentracijom u rastvoru. Amperometrijski biosenzor je brz, osetljiviji, precizniji i taniji od potenciometrijskog senzora, stoga što nije potrebno ekati da se uspostavi termodinamika ravnoteža i odgovor je linearna funkcija koncentracije analita. S druge strane, selektivnost amperometrijskih ureaja je odreena redoks potencijalom prisutnih elektroaktivnih vrsta. Kao posledica, struja merena instrumentom može ukljuiti doprinose nekoliko hemijskih (elektroaktivnih) vrsta [22]. Naješe se koriste za detekciju mikroorganizama u hrani [23; 25; 40; 41; 42]. Biosenzori sa optikim transducerima u poslednje vreme zaokupljaju sve više pažnje, što je uslovljeno napretkom u tehnologiji optikih vlakana i laserkoj tehnologiji. Ovi senzori su proširili granice primene spektrofotometrijskih metoda u analitikoj hemiji, posebno za sisteme male po dimenzijama. Optiki biosenzori su zasnovani na metodama merenja UV/VIS apsorpcije, bio/hemiluminescencije, fluorescencije/fosforescencije, refleksije, rasejanja i indeksa prelamanja, uzrokovanom interakcijom biokatalizatora sa ciljnim analitom. Optiki senzori, prvobitno razvijeni za kiseonik, CO i odreivanje pH korišenjem kiselo-baznih indikatora [43], prošireni su za konstrukciju fluorescentnih i luminescentnih optroda. Optrode su konstruisane sa imobilisanim selektivnim biokomponentama na jednoj strani optikog vlakna i komponentama za detekciju na drugom kraju. Promena intenziteta apsorbovane ili emitovane svetlosti od strane indikatorske boje je princip rada pH, pO2 i pCO2 proba na bazi optikih vlakana koja postižu transdukciju samo posredstvom indikatorske boje. Ova promena je direktno proporcionalna koliini analita prisutnoj u uzorku [22; 44; 45]. Biosenzori sa termalnim transducerima zasnivaju se na praenju promene energije u hemijskoj reakciji koja je katalizovana pomou enzima ili mikroorganizma tokom vremena. Deo nastale toplote uvek gubi, jer se ne mogu postii idealni adijabatski uslovi, zbog ega rezultati nisu potpuno pouzdani. Upotreba termalnih biosenzora u analizi hrane je ograniena za sada, zbog komplikovane instrumentacije. Ipak, nekoliko veoma važnih 23 jedinjenja u kontroli kvaliteta hrane odreuje se na ovaj nain: askorbinska kiselina, glukoza, laktat, galaktoza, etanol, penicilin G, cefalosporin i oksalna kiselina [46; 47; 48; 49]. Uprkos nedostatku osetljivosti, termalni biosenzori imaju prednost mogunosti minijaturizacije i konstruisanja ureaja za simultano odreivanje veeg broja jedinjenja [50; 51]. Piezoelektrini transduceri se obino koriste u imunosenzorima. Imunokompoenta se pri tome imobilizuje na površinu piezoelektrinog kristala [52]. Pri interakciji sa analitom dolazi do promene ukupne mase depozita na kristalu, zbog ega se menja njegova specifina frekvencija oscilovanja, što dalje može da se poveže sa koncentracijom analita u uzorku. Za širu primenu ovih tipova transducera još uvek postoje teškoe, jer zahtevaju kompleksnu instrumentaciju [22]. 2.3.2.4. Generacije biosenzora Ako se posmatra konstrukcija, biosenzori se mogu podeliti u tri generacije. Prvoj generaciji pripadaju biosenzori zasnovani na prostom vezivanju biokomponente za membranu. Ta membrana se zatim na odgovarajui nain povezuje sa transducerom, a proizvod reakcije biokomponente i ciljnog molekula difunduje do transducera i proizvodi signal. Primer za prvu generaciju biosenzora je senzor za merenje koncentracije glukoze (Slika 7). Enzim glukoza-oksidaza (GOD) je imobilizovana na poliakrilamidni gel na gas-propustljivoj membrani koja prekriva kiseoninu elektrodu. Slini biosenzori konstruisani su i za detekciju holesterola, monoamina, laktata, oksalata, etanola itd [53]. Druga generacija biosenzora podrazumeva specifine medijatore izmeu reakcije i transducera, u cilju poboljšanja odgovora. Primer je biosenzor za odreivanje koncentracije glukoze sa ferocenom kao medijatorom (Slika 8). Oksidacija glukoze odvija se zahvaljujui FAD komponenti glukoza-oksidaze, koja se konvertuje u FADH2. Potom se FADH2 reoksiduje do FAD pomocu medijatora ferocena. Medijator se reoksiduje direktno na 24 elektrodi. Struja koja nastaje tokom ovog procesa je ampreometrijska mera koncentracije glukoze [53]. Slika 7. Biosenzor za merenje koncentracije glukoze; GOD – glukoza-oksidaza; Slika 8. Princip rada biosenzora za odreivanje koncentracije glukoze sa ferocenom kao medijatorom (M) Na kraju, u treoj generaciji biosenzora, biokomponenta se imobilizuje direktno na transducer, što dovodi do toga da sama reakcija uzrokuje odgovor i nisu direktno ukljueni ni proizvod ni medijator. Problem ovde može nastati ako je biokomponenta protein, jer se oni uglavnom denaturišu na površini elektrode. Takoe, transfer elektrona može biti spor i 25 ireverzibilan. Dobro rešenje problema je modifikacija površine elektrode nekim materijalom koji nije elektroaktivan i nije medijator. Taj materijal bi trebalo vodoninim vezama da veže protein. Veina biosenzora sa elektrohemijskim transducerom koji su danas u upotrebi pripada ovoj generaciji [53]. 2.3.2.5. Prednosti i ogranienja biosenzora Biosenzori predstavljaju važnu analitiku alatku u današnje vreme. Biosenzor obezbeuje rezultate bolje od konvencionalnih analitikih sistema u smislu pouzdanosti, osetljivosti, reproduktivnosti, selektivnosti i specifinosti. Takoe, biosenzor daje rezultate u realnom vremenu, jednostavan je za rukovanje, prenosiv i ekonomian. Veoma je znaajna mogunost odreivanja ciljnog analita na licu mesta, kao i njegova detekcija u kompleksnoj smeši uz minimalnu pripremu uzorka. Mogunost uporedog odreivanja bioloških efekata (toksinost, efekat na endokrini sistem) ciljnog analita predstavlja informaciju od velikog zanaja. Postojea generacija biosenzora ima nekoliko ogranienja, koja se moraju prevazii: • osetljivost se mora poboljšati; • specifinost zavisi od antitela, enzima i mikrobne elije, pa treba pažljivo odabrati ono što e se koristiti shodno tome da li senzor služi za skrining ili identifikaciju specifinog analita; • vreme odgovora se mora skratiti; 26 2.3.2.6. Primena biosenzora Biosenzori se primenjuju u mnogim sektorima, ukljuujui kontolu bioprocesa i zaštitu životne sredine, kontrolu kvaliteta hrane, poljoprivredu, vojnu industriju, medicinu, farmaciju i slino. Najpoznatiji primer komercijalnog biosenzora je biosenzor za odreivanje nivoa glukoze u krvi. Princip rada ovog biosenzora zasniva se na korišenju enzima glukoza oksidaze imobilizovanog na elektrodu. Glukoza-oksidaza katalizuje oksidaciju glukoze, pri emu se dva elektrona prenose na FAD (koji je deo enzima), koji se redukuje do FADH2. U sledeem koraku elektroni prelaze na elektrodu. Struja koja se pri ovom procesu javlja je mera koncentracije glukoze. U ovom sluaju elektroda je transducer, a enzim je biološka senzorna komponenta [18]. Pored ovog primera, biosenzori se koriste u medicini za odreivanje raznih analita. Klasine procedure za odreivanje razliitih parametara traju po nekoliko dana, što je u sluajevima pacijenata sa intenzivne nege, ije se stanje menja iz minuta u minut, beskorisno. Takoe, dijabetiarima je potrebna brza analiza nivoa glukoze u krvi. Tako danas postoje biosensori za odreživanje glukoze koje pacijenti koriste kod kue [54]. Biotehnološka industrija se sve više rayvija i zahteva analitiko praenje procesa, koje se potencijalno može postii pomou biosenzora. To je posebno znaajno za dve oblasti: praenje aktivne komponente i proizvoda biotehnološkog procesa i analiza polutanata i mikrobiološkog zagaenja. Biosenzori su veoma selektivni zahvaljujui svojim enzimskim ili imunološkim komponentama i imaju sposobnost da iz kompleksne smeše molekula izdvoje ciljni analit [54]. Otkrie novih lekova je dugotrajno i naporno. Biosenzori predstavljaju mogunost da se taj proces znaajno ubrza. U farmaceutskoj industriji biosenzori se koriste da detektuju interakcije izmeu ciljnog molekula i potencijalnog leka bez korišenja markera ili praenja promene boje ili fluorescencije. Biosezori mogu brzo da izmere koliko dobro se potencijalni lek vezuje za ciljni analit. Prednost je i to što uzorci ne moraju biti preišeni. Primer koji ilustruje koliko biosenzori mogu ubrzati ispitivanje potencijalnih novih lekova 27 je antidepresiv Prozak, koji je na tržište dospeo tek posle 15 godina testiranja, dok je slian lek novije generacije doživeo isto posle samo dve godine ispitivanja pomou biosenzora [55]. Analiza hrane neophodna je da bi se zadovoljio širok spektar zahteva u industriji. Potreba za ovim postoji da bi se postigli kvalitet i bezbednost hrane, kao i da se osigura usklaenost sa propisima. Istraživai konstantno definišu razne indekse vezane za karakteristike hrane, koji mogu da ukažu na njen kvalitet i bezbednost [56]. Naješe se odreuju: alkohol u vinima, glukoza u šeerima i sirupima, biogeni amini kao indikatori za svežinu hrane, penicilin u mleku, kontaminanti kao što su pesticidi, toksini i mikrobi, vodonik-peroksid i sulfiti kao prezervativi u raznim prehrambenim proizvodima, kao što je zamrznuto povre itd. Tabela 2. daje primere razvijenih biosenzora za analizu hrane [57]. Tabela 2. Primeri razvijenih biosenzora za analizu hrane (Amp. – amperometrijski, Pot. – potenciometrijski transducer) Analit Uzorak Biokomponenta Transducer Granica detekcije Fruktoza Med, sok i kola D-fruktoza-dehidorgenaza Amp. 0,5-15 mM [58] Laktoza Hrana -galaktozidaza, laktozim, Saccharomyces cerevisiae Pot. [59] Etanol Alkoholna pia Alkohol-dehidrogenaza i NaDH-oksidaza Amp. 3·10-7–2·10-4 M [60] Polifenoli Maslinovo ulje Tirozinaza Amp 0,3-30 M [61] L-amino kiseline Sintetiki uzorci L-aminokiselina-oksidaza i peroksidaza iz rena Amp. [62] Sulfit Vino Sulfit-oksidaza Amp 0,002-0,3 mM [63] Bakterije Hrana Anti E. Coli i anti- salmonela antitela Amp. 50-200 elija/L [64] Pesticidi Mleko Holinesteraza Amp. 10-11-10-7 M [65] Pesticidi Povre Acetilholieteraza i butirilholinesteraza Amp. 5·10-5-50 mg/kg [66] 28 Postoji veliki potencijal za rutinsku i kontinualnu analizu prisustva neistoa i polutanata u vodi, zemljištu i vazduhu. Broj potencijalnih analita je ogroman, a osnovni parametri koji se prate su pH, provodljivost, razni neorganski joni i organske supstance kao što su fenoli, urea, pesticidi. Za ispitivanje sadržaja toksinih supstanci u vodi i zemljištu naješe se koriste celi organizmi. Veina biosenzora koji se upotrebljavaju u zaštiti životne sredine fokusirani su na bakterijske sisteme, dok su biosenzori sa eukariotskim elijama retki. Još rei su oni koji sadrže elije sisara, iako one mogu dati bolji i za oveka relevantniji odgovor u poreenju sa bakterijama [67]. Veliki problem predstavlja uestala upotreba pesticida u poljoprivredi, što je rezultiralo njihovim obilnim prisustvom u prirodnim vodama. Iako konvencionalne tehnike poput HPLC/MS i GC/MS daju zadovoljavajue analitike rezultate pri odreivanju pesticida, razvijaju se novi eseji i biosenzori za brže i jeftinije analize na licu mesta. Enzimski biosenzori, zasnovani na inhibiciji odreenog enzima, naješe se primenjuju za odreivanje ovih jedinjenja [67]. U Tabeli 3. nalaze se biosenzori koji se koriste u zaštiti životne sredine. 29 Tabela 3. Primeri biosenzora koji se koriste u zaštiti životne sredine Transducer Senzorni element Analit Karakteristike Matriks Elektrohemijski (amperometrijski) Antitela Atrazin LD: 1 g/L [68] - Optiki Antitela Simazin LD: 0,2 g/L [69] Prirodne, podzemne vode Optiki Antitela Pesticidi i estroni [70] Rena voda Elektrohemijski Antitela Surfaktanti LD: g/L opseg [71] - Elektrohemijski (amperometrijski) Antitela Estradiol LD: 1 ng/L [72] - Elektrohemijski (amperometrijski) Antitela Escherichia coli 10 elija/mL [73] Pijaa voda Optiki Antitela Salmonella enterditis, Lysteria monocitogenes 106 elija/mL [74] - Vojna industrija takoe ima veliki interes za prenosive senzore, zbog detekcije hemijskog oružja, kao što su npr. nervni gasovi [54]. Tehologija biosenzora se koristi i u mornarici. Senzor koji je od nedavno u upotrebi, napravljen od provodljivih polimera (sastojci donjeg veša), može dati podatke o tome da li vojnik krvari i da li je eventualna povreda nastala na veni ili arteriji. Takoe, postoje i minijaturni kompjuteri koje vojnik može progutati, a koji daju informacije o njegovom zdravstvenom stanju i nivou stresa. Tehnologija biosenzora upotrebljava se i za testiranje zloupotrebe narkotika u policiji, zatvorima, na graninim prelazima, ali i u sportu (doping kontrola). Takoe se sve više koristi i za detekciju eksploziva. Uprkos velikom broju biosenzora koji se trenutno razvijaju i bogatoj literaturi na ovu temu, malo sistema je još uvek praktino prihvatljivo za tržište (Tabela 4). 30 Tabela 4. Komercijalni biosenzori Instrument Biološki element Transducer Kompanija BIACORE Biomolekulska interakcija Optiki Biacore AB [75] IBIS Biomolekulska interakcija Optiki Windsor Scientific, Ltd. [76] SPR-CELLIA Cele elije, makromolekuli Optiki Nippon Laser and Electronics Lab REMEDIOS Cele elije Optiki (bioluminiscencija) Remedios Cellsence E. coli Elektrohemijski (amperometrijski) Euroclon, Ltd. [77] ToxSenTM Biomolekulska interakcija Elektrohemijski Abtech Scientific, Ltd. [76] PZ106 Immunobiosenzor system Antitela piezoelektrini Universal Sensors 2.3.2.7. Biosenzori za detekciju organofosfatnih pesticida Najviše istraživanja uraeno je na polju razvoja biosenzora za detekciju organofosfatnih pesticida. Znaajne su interakcije organofosfata sa specifinim biomolekulima, gde OP mogu biti supstrati (npr. za organofosfat-hidrolazu - OPH), inhibitori biomolekula (npr. acetilholinesteraze) ili antigeni [78]. Mehanizam inhibicije AChE pomou organofosfata je veoma specifian, što je dovelo do razvoja nekoliko analitikih metoda za identifikaciju i kvantifikaciju pesticida. Holinesteraza kao biokomponenta potie iz razliitih vrsta (AChE iz elektrine jegulje, goveih eritrocita, humanih eritrocita ili butirilholinesteraza - BChE - iz konjskog i humanog seruma) [66]. Ovi biosenzori mere enzimsku inhibiciju in vitro, a ona se može ekstrapolirati na in vivo inhibiciju. 31 Pokazano je da jedan enzim može biti meta veeg broja toksinih jedinjenja sa razliitom inhibitornom moi [79]. Tako biosenzori koji se zasnivaju na inhibiciji AChE mere sumu toksinih efekata svih pesticida u uzorku, ali ne mere njihovu ukupnu ni pojedinanu koncentraciju [80]. U kombinaciji sa raznim transducerima, kao što su potenciometrijski [81; 82; 83; 84; 85; 86; 87], amperometrijski [88; 89; 90; 91; 92; 93], optiki [94; 95; 96], piezoelektrini [97] i konduktometrijski [98], oni daju zadovoljavajue rezultate. U Tabeli 5. su navedeni neki od tih biosenzora. Tabela 5. Neki biosenzori za detekciju OP zasnovani na inhibiciji holinesteraza Detekcija Enzim Supstrat Vreme inkubacije Granica detekcije Referenca Amperometrijska Pt//Ag/AgCl AChE ASChCl 30 min 4 ng/ml [80] Amperometrijska Pt//Ag/AgCl AChE + BChE ASChI, BuSChI 10 min 0.1 ng/ml [66] Amperometrijska Pt//Ag/AgCl AChE PAPA 0 min 20 ng/ml [89] Amperometrijska H2O2 - senzor AChE + ChO ACh 30 min 3 ng/ml [99] Amperometrijska Pt//Ag/AgCl AChE + ChO ASCh 1 min 27 ng/ml [93] Potenciometrijska pH - elektroda AChE ACh 0 min 25 ng/ml [85] Konduktometrijska AChE, BChE AChCl, BuChCl 10 min 275 ng/ml [97] Spektrofotometrijska AChE ASChCl+DTNB 10 min 3 ng/ml [92] Hemiluminiscentna AChE + ChO ACh+luminol 30 min 0.75 ng/ml [94] ASChCl – acetiltioholin-hlorid; ASChI – acetiltioholin-jodid; BuSChI – butiriltioholin- jodid; AChCl – acetilholin-hlorid; BuChCl – butirilholin-hlorid; 32 Naješe korišeni optiki transduceri su spektrofotometrijski i fluorimetrijski. Ipak, spektrofotometrija esto nije dovoljno osetljiva da bi se detektovali pesticidi u koncentracijma u kojima se nalaze u realnim uzorcima (npr. voda za pie, povre, voe, zemljište). Zbog toga je potrebno primeniti osetljivije tehnike za merenje apsorbancije produkta reakcije izmeu AChE i supstrata. Sa druge strane, fluorimetrija je veoma osetljiva metoda, ali zahteva supstrate koji daju fluorescentne proizvode. Nedavno su optike metode poboljšane korišenjem lasera [18]. Uprkos tome, najvei broj biosenzora baziranih na inhibiciji AChE ima elektrohemijski transducer. Uglavnom su to amperometrijski i potenciometrijski transduceri. Meu amperometrijskim, transduceri koji se zasnivaju na praenju H2O2 pokazuju veu osetljivost nego oni sa detekcijom potrošnje kiseonika. Sa druge strane, potenciometrijski ureaji su najjednostavniji za konstruisanje i korišenje. Kao što se iz do sada navedenog vidi, biosenzori bazirani na inhibiciji AChE aktivno su istraživani u poslednjih dvadeset godina. Iako osetljivi i korisni kao jednokratni senzori za praenje zagaivaa u životnoj sredini, ovi biosenzori imaju neka ogranienja. Kao prvo, oni imaju dugotrajne i zamorne protokole koji zahtevaju dugu inkubaciju sa inhibitoima pre analize, kako bi se obezbedila dobra osetljivost. Takoe, potrebna je i inkubacija sa 2-PAM da bi se aktivnost AChE povratila posle inhibicije sa OP [89; 98; 99]. Drugo, AChE može biti, kao što je ve pomenuto, inhibirana raznim neurotoksinima, što podrazumeva veliki broj OP, ali i karbamate i mnoga druga jedinjenja. To je razlog zašto ovakvi biosenzori nisu selektivni i ne mogu biti upotrebljeni za kvantifikaciju pojedinanih pesticida. OPH je enzim koji hidrolizuje širok spektar organofosfatnih estara, pesticida kao što su paration, kumafos i acefat, kao i hemijskih agenasa somana, sarina, tabuna i drugih [100; 101; 102; 103]. Hidrolizom svakog molekula ovih jedinjenja oslobaaju se protoni, a na korelaciji broja protona i koncentracije molekula zasnivaju se potenciometrijska merenja. Na taj nain obezbeuju se jednostavnija, direktnija i brža merenja samo pesticida koji su po strukturi organofosfati (nasuprot AChE biosenzorima, koji ne razlikuju klase peticida). Pri tome, biosenzori koji se zasnivaju na OPH potencijalno bi mogli služiti za 33 kvantifikaciju pojedinanih OP kada bi se koristili kao detektor u konjukciji sa HPLC sistemom za hromatografsko razdvajanje [104; 105]. 2.4. Oksidacija organofosfatnih pesticida U realnim uzorcima organofosfatni pesticidi se nalaze u tio-obliku i u izuzetno niskim koncentracijama, naješe reda veliine ppb, a vrlo retko ppm. Budui da su okso- oblici organofosfata znatno jai inhibitori AChE od tio-oblika, oksidacijom OP se granica detekcije neke metode može spustiti i za tri reda veliine. Zato je oksidacija organo- tiofosfatnih pesticida neophodan korak u analizama [80]. 2.4.1. Oksidacija organofosfatnih pesticida neorganskim supstancama Pesticidi su do sada naješe oksidovani neorganskim jedinjenjima. Kumaran i saradnici [106] su prouavali poveanje efekta inhibicije AChE bromnom vodom dodavanjem u sintetiku morsku vodu sa pesticidima. Tri godine kasnije [107] predložili su metodu za skrining organofosfatnih pesticida u zemljištu. Pesticidi su najpre ekstrahovani organskim rastvaraima, koji su potom uparavani, a ostatak je rastvaran u acetonitrilu u koji je dodata bromna voda, kako bi se poveala osetljivost biosenzora. Odreena je inhibitorna mo i pogodna koncentracija bromne vode. Slino tome, Kim [108] i Li [109] su razvili pogodnu metodu za veoma brzu oksidaciju devet organofosfata pomou broma rastvorenog u acetonitrilu. Veliki procenat polaznih jedinjenja na taj nain preveden je u okso-oblike, ak 82-100%. Pare broma su takoe korišene za oksidaciju parationa [110]. N-bromsukcinimid (NBS) je privukao pažnju kao jedinjenje koje tio-oblike organofosfata brzo i specifino konvertuje u okso-oblike. Hercšprung i saradnici (1990) su predstavili metodu koja sa 100% efikasnosti prevodi pet odabranih organo-tiofosfata u 34 okso-oblike u vodenim uzorcima. Finalna koncentracija NBS podešena je tako da ne dovodi do inhibicije AChE. Pomou ove metode, koja ukljuuje i prekoncentraciju uzorka u jednom koraku, mogu se odrediti i pesticidi koncentracije 0,1 ppb [111]. Još dve istraživake grupe postigle su bolju osetljivost biosenzora za detekciju organofosfata korišenjem NBS. Za tri ispitivana pesticida, hlorpirifos, fenitrotion i paration, inhibicija AChE sa oksidovanim uzorkom bila je pet puta vea u odnosu na neoksidovani [11; 80]. Prvu oksidaciju realnih uzoraka izveo je Šulc sa svojim saradnicima 2002. godine. Oni su optimizovali uslove za detekciju pesticida u sokovima u prisustvu NBS kao sredstva za oksidaciju [112]. Brom i NBS su, do skoro, bili jedini oksidanti korišeni za poveanje osetljivosti metoda za detekciju organofosfata. Vremenom su se razvile mnoge metode za oksidaciju organo-tiofosfata, ali njihov cilj je uglavnom bio samo sinteza okso-oblika. Oksidacije su se naješe izvodile u organskim rastvaraima i pod drastinim eksperimentalnim uslovima [113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126]. Oksidacija pri takvim uslovima ne može biti upotrebljena u detekciji organofosfatnih pesticida, osim ako se ne uvedu neke modifikacije procedura. 2.4.2. Oksidacija organofosfatnih pesticida pomou enzima Poslednjih godina za oksidaciju organofosfatnih pesticida dosta su korišeni i enzimi. etiri hemoproteina, hloroperoksidaza, lignin-peroksidaza, peroksidaza iz rena i citohrom c, upotrebljeni su za oksidaciju 10 razliitih organofosfata (azinfos-metil, hlorpirifos, dihlorofention, dimetoat, paration, fosmet, terbufos, trihlorfon, fosfamidon i DEF - S,S,S-tributilfosforotritionat). Od etiri enzima, samo je hloroperoksidaza bila u stanju da oksiduje 7 od 10 pesticida. Trihlorfon, fosfamidon i DEF nisu reagovali sa hloroperoksidazom. Ovaj podatak nije iznenaujui, budui da su sva 3 navedena jedinjenja u okso-obliku i ve poseduju atom kiseonika u fosfatnoj grupi. Preostala 3 enzima nisu pod datim eksperimentalnim uslovima oksidovala nijedan od ispitivanih pesticida. U uzorcima 35 oksidovanim u prisustvu hloroperoksidaze nisu pronaeni proizvodi hidrolize, kao ni proizvodi halogenovanja [127]. Drugi autori pokazali su da peroksidaza iz rena može da oksiduje paration in vitro, ali u malom procentu, dok se vei deo hidrolizuje [128]. I citohrom P450 korišen je za oksidaciju hlorpirifosa i parationa u cilju njihove detekcije. Dobijeni rezultati bili su znatno bolji u odnosu na oksidaciju pomou NBS. To je posebno došlo do izražaja u sluaju realnih uzoraka, gde ak ni mnogo vee koliine NBS od inae primenjivanih nisu dale zadovoljavajue rezultate [129]. Svi ovi rezultati upuuju na to da se i neke druge peroksidaze mogu upotrebiti za oksidaciju organo-tiofosfata. 2.4.3. Elektrohemijska oksidacija organofosfatnih pesticida U literatiri se pod elektrohemijskom oksidacijom organo-tiofosfata naješe podrazumeva njihov tretman u cilju razgradnje i prevoenja u netoksine oblike, u idelanom sluaju njihova potpuna oksidacija do razliitih mineralnih formi [130; 131; 132; 133; 134; 135]. Procedure za elektrohemijsku oksidaciju pesticida se naješe zasnivaju na elektrohemijskom generisanju visoko reaktivnih radikalskih vrsta na anodama sa visokim nadnaponom za razlaganje vode (obino anode tipa Ti/TiO2 ili nerajui elik), pri emu nastaju OH•, O• i ClOH [136]. Ove kratkoživee vrste brzo oksiduju organo-tiofosfate (direktna oksidacija) ili prelaze u druge oksidanse koji se dele na primarne (Cl2, O2) i sekundarne (ClO2, O3, H2O2) koji imaju znatno duže polu-vreme života i mogu da difunduju od anode pri emu se proces oksidacije nastavlja (sekundarna oksidacija) [137; 138]. U literaturi takoe postoje podaci o elektrohemijskom tretmanu organo-tiofosfata elektro-Fentonovom reakcijom [139; 140; 141; 142]. Pri pomenutom postupku elektrohemijski se generiše Fe2+ jon koji u kiseloj sredini reaguje sa H2O2 dajui OH• radikal koji reaguje sa organo-tiofosfatima uklanjajui ih iz rastvora. Pored eletrohemijskog uklanjanja pesticida iz rastvora, elektrohemijski tretman se može iskorititi i za oksidaciju pesticida u cilju snižavanja njihove granice detekcije. Evtugin i saradnici [143] su predloži metod elektrohemijske „aktivacije“ uzorka. Autori su 36 demonstrirali da u sluaju elektrolitikog tremana sintetikog rastvora diazinona u 0,1 M NaCl dolazi do spuštanja granice detekcije za tri reda veliine. Korišene su elektrode od staklastog ugljenika, dok je elektroliza trajala 7 do 15 minuta pri gustinama struja od 1,5 do 2 mA cm-2. Prema autorima, u toku elektrolize generiše se Cl2 koji oksiduje diazinon, dok snižavanje granice detekcije navodi na zakljuak da u ovom sluaju dolazi do prevoenja diazinona iz tio- u okso- oblik, slino hemijskoj oksidaciji bromom [108; 109], iako autori nisu eksplicitno identifikovali proizvode nakon elektrohemijske aktivacije. Važno je napraviti paralelu izmeu elektrohemijskog tretmana rastvora pesticida u cilju njihove degradacije i elektrohemijskog tretmana u cilju snižavanja granice detekcije. Naime, u drugom sluaju jedini proizvod od interesa je okso- forma pesticida ija je dalja degradacija nepovoljna. Za razliku od elektrohemijskih tretmana koji za cilj imaju degradaciju pesticida, Evtugin i saradnici su za elektrohemijski tretman koristili elektrode od staklastog ugljenika, materijala koji pruža širok interval potencijala u kome nema reakcija na površini u odsustvu elektroaktivnih vrsta. Na taj nain omogueno je direktno formiranje Cl2 iz NaCl, a ne izuzetno reaktivnih OH•, O• i ClOH, što je spreilo intenzivnu oksidaciju diazinona, i prema prikazanim rezultatima, selektivno prevodjenje u okso- formu, što je ranije potvreno za sluaj hemijske oksidacije bromom [108; 109]. 2.5. Mijeloperoksidaza Mijeloperoksidaza (MPO, EC 1.11.1.7) je najzastupljeniji enzim u neutrofilima (od 1 % do 5 % suve mase elije) [144; 145], a ima ga i u monocitima. Neutrofilnu peroksidazu prvi je preistio Agner 1941. godine i zbog njene intenzivne zelene boje nazvao je verdoperoksidaza [144]. Dalja istraživanja tkivne distribucije enzima pokazala su da je prisutan samo u mijeloidnim elijama, pa je njegovo ime promenjeno u mijeloperoksidaza. MPO se sintetizuje i pakuje u azurofilne (primarne) granule neutrofila tokom promijelocitne faze razvia granulocita i prisutna je u zrelim granulocitima u mirovanju [146]. Monociti takoe sadrže MPO pozitivne citoplazmatine granule, iako ih je mnogo 37 manje nego u neutrofilima [147]. Ove peroksidazne granule se gube sazrevanjem monocita u makrofage, iako je prisustvo MPO u makrofagima uoeno u odreenim patološkim stanjima [148; 149]. Uloga MPO kao komponente antimikrobnog sistema neutrofila predložena je 1967. godine, kada je uoeno da ovaj enzim ima jako antimikrobno dejstvo u prisustvu H2O2 i jona halogena [150; 151; 152]. Neutrofili pripadaju grupi profesionalnih fagocita kod ljudi. Oni ingestuju bakterije u intraelijske odeljke nazvane fagozomi, u koje upuuju razliite citotoksine agense. Kada fagocituju, neutrofili podležu prasku potrošnje kiseonika, „respiratornom prasku“, izazvanom NADPH-oksidaznim kompleksom, koji se agregira na fagozomalnoj membrani (Slika 9) [153; 154]. Ovaj oksidazni sistem transportuje elektrone sa NADPH na citoplazmatsku stranu membrane, na kiseonik u ekstracelularnoj i intrafagozomalnoj tenosti, gde se prvo formira superoksid-anjon, a onda i druge reaktivne vrste kiseonika [155]. NADPH-oksidaza združena sa H+-kanalom dovodi do efluksa H+-jona [156; 157]. Superoksid-anjon je uglavnom redukujue sredstvo, ali može da se ponaša i kao oksidujue sredstvo. Kada njegova dva molekula interaguju, jedan se oksiduje, a drugi redukuje, u dismutaznoj reakciji u kojoj nastaju kiseonik i H2O2. Ovo se može desiti spontano, pogotovo na kiselim pH, ili može biti katalizovano superoksid-dismutazom (SOD). Vei deo kiseonika koji se potroši u respiratornom prasku pree u H2O2. Ovako nastali H2O2 je oksidant sa citotoksinim svojstvima. Ipak, najvei deo nastalog H2O2 iskoristi MPO u reakciji sa hloridom, pri emu nastaje hipohlorna kiselina (HOCl), ime se toksinost H2O2 prenosi na hipohlornu kiselinu (Slika 10) [156]. U zavisnosti od relativnih koncentracija donora, enzim ulazi ili u ciklus halogenovanja (hlorinujua aktivnost) ili peroksidacije (peroksidazna aktivnost) [158; 159]. Fiziološki supstrat mijeloperoksidaze su hloridi [150]. 38 Slika 9. Mogua mesta formiranja NADPH-oksidaznog kompleksa i njegova aktivnost u humanim neutrofilima Slika 10. MPO/H2O2/hlorid antimikrobni sistem. NADPH, redukovani nikotinamid-adenin- dinukleotid-fosfat; O2 .-, superoksid-anjon; HOCl, hipohlorna kiselina 39 2.5.1. Reakcioni mehanizam mijeloperoksidaze MPO u reakciji sa proizvodima koji nastaju tokom respiratornog praska fagocitoze, kao i mnogim drugim supstratima, formira tri kompleksa: jedinjenje I, II i III, razliitih spektralnih karakteristika. Feri ili nativna MPO (Fe (III)) reaguje sa H2O2 i formira jedinjenje I, koje sadrži dva oksidujua ekvivalenta više bego nativni enzim (Shema 2, reakcija 1). Jedinjenje I je oksogvože (IV) [Fe(IV)=O], meuproizvod koji sadrži porfirin -katjon radikal (Por•+) [158]. Jedinjenje I MPO je jak oksidant jedno- i dvoelektronskih oksidacionih reakcija. U zavisnosti od relativnih koncentracija donora enzim ulazi u ciklus halogenovanja (Shema 2, reakcije 1 i 2) ili peroksidacije (Shema 2, reakcije 1, 3 i 4). U ciklusu halogenovanja jedinjenje I u jednom dvoelektronksom koraku oksiduje halogene X- (hloride, bromide, jodide), kao i pseudohalogene tiocijanate (SCN-) u odgovarajue hipohalogene kiseline (HOX) i hipotiocijanatnu kiselinu (HOSCN) [160]. Fiziološki supstrat MPO su hloridi [150]. Standradni redukcioni potencijal para jedinjenje I/nativna MPO je prilino visok (1,16 V) na pH 7 [161]. Jedinjenje I je spektrofotometrijski okarakterisano apsorpcionim maksimumom na 412 nm [162]. U peroksidaznom ciklusu jedinjenje I se redukuje u dva uzastopna jednoelektronska koraka preko jedinjenja II, protonovane oksogvože(IV) vrste (Shema 2, reakcije 3 i 4). Jedinjenje II je spektrofotometrijski okarakterisano apsorpcionim maksimumom na 456 nm [163]. Mnogi neorganski i organski supstrati se ponašaju kao elektron-donori i za jedinjenje I i za jedinjenje II [164]. Jedinjenje I je izuzetno jak jednoelektronski oksidant zbog znatno veeg redukcionog potencijala jedinjenje I/jedinjenje II (1,35 V) od para jedinjenje II/nativna MPO (0,97 V) na pH 7 [165]. Ova razlika u oksidativnim kapacitetima jedinjenja I i II se odražava na brzinu reakcija ovih intermedijera sa razliitim supstratima. Loši peroksidazni supstrati koji brzo reaguju sa jedinjenjem I, a sporo redukuju jedinjenje II dobri su inhibitori proizvodnje HOX zato što zarobljavaju enzim u obliku jedinjenja II i na taj nain onemoguavaju ciklus halogenovanja [166]. Ipak, oni ne mogu kompetitivno da 40 inhibiraju peroksidaznu aktivnost, jer je ona zavisna od redukovanja jedinjenja II u nativni enzim (Shema 2, reakcija 4). Jedinjenje I kroz peroksidazni ciklus oksiduje brojne supstrate, kao što su fenoli, anilini i -diketoni u odgovarajue slobodne radikale (•AH) (Shema 2, reakcije 1, 3 i 4) [167; 168; 169]. MPO intermedijeri koji ne uestvuju ni u hlorinujuem ni u peroksidaznom ciklusu su Fe(II) oblik MPO i jedinjenje III, koje je fero-dioksi/feri-superoksid anjon komleks MPO (Shema 2). Slino višim oksidacionim stanjima, redukcioni potencijal Fe(III)/Fe(II) MPO je znatno viši (5 mV) od potencijala istog redoks-para drugih hem-peroksidaza [170]. Iz tog razloga MPO je veoma osetljiva na redukciju svog Fe(II) oblika radikalima intermedijera koji nastaju tokom peroksidaznog ciklusa (Shema 2, reakcija 11). U prisustvu kiseonika Fe(II) MPO se brzo konvertuje u jedinjenje III (Shema 2, reakcija 8). Postoji i mogunost da jedinjenje III bude formirano reakcijom feri MPO sa superoksid-anjonom (Shema 2, reakcija 9) ili jedinjenja II sa H2O2 (Shema 2, reakcija 6) [171]. Jedinjenje III treba posmatrati kao kompleks koji se može raspasti u feri MPO i superoksid-anjon (Shema 2, reakcija 10) ili fero MPO i kiseonik (Shema 2, reakcija 7). Jedinjenje III je spektrofotometrijski okarakterisano apsorpcionim maksimumom na 625 nm [172]. Shema 2. Opšta reakciona shema MPO 41 2.5.2. Trodimenzionalna struktura mijeloperoksidaze MPO je jedina sisarska peroksidaza ija je trodimenzionalna struktura poznata. Trodimenzionalna struktura mijeloperoksidaze prvi put je dobijena analizom kristalne strukture enzima psa [173]. Struktura humane MPO je kasnije definisana [174; 175]. Mijeloperoksidaza je katjonski dimer od 146 kDa sa jednim disulfidnim mostom izmeu simetrino povezanih polovina. Svaka polovina sastoji se od dva polipeptida od 14,5 i 58,5 kDa, a vei polipeptid je glikozilovan (Slika 11). Mali polipeptid sadrži 106, a veliki 467 ostataka aminokiselina. Posotoji pet dodatnih intralananih disulfidnih veza u velikom polopeptidu i jednu u malom. Sekundarna struktura sainjena je uglavnom od -heliksa [173; 174; 176]. Svaka polovina molekula poseduje centralno jezgro koje ine 6 heliksa kovalentno vezanih za hem (Slika 11). Pet heliksa potie od velikog polipeptida, a šesti od malog. Najvei deo velikog polipeptida se uvija u 5 odvojenih domena i jednu otvorenu petlju, koja okružuje jezgro (Slika 11). Mali polipeptid se obmotava oko površine molekula, pri emu samo njegov karboksi terminalni heliks prodire u unutrašnjost jezgra. Na pet mesta u velikom polipeptidu ostatak asparagina je N-glikozilovan (Asn157, Asn189, Asn225, Asn317 i Asn 563). Svaki monomer MPO sadrži po jedan atom gvoža, u obliku feri-protopofirina IX i jedan jon kalcijuma. 42 Slika 11. MPO dimer. Veliki polipeptidi dve polovine su obojeni crveno i plavo, dok su mali polipeptidi svetlije nijanse istih boja. Ostale strukture: hem (zeleno), ugljeni hidrati (narandžasto), kalcijum (ljubiasto) i hloridi (žuto). U centru molekula je disulfidna veza (predstavljena crnom bojom). Hem je identifikovan kao derivat protoporfirina IX u kome su metil-grupe na pirolovim prstenovima A i C modifikovane (Slika 12a), tako da omoguavaju formiranje estarskih veza sa karboksilnim grupama Glu242 teškog i Asp94 lakog polipeptida. - ugljenik vinilne grupe na pirolovom prstenu A gradi kovalentnu vezu sa atomom sumpora Met243, pri emu nastaje sulfonijum-jon veza (Slika 12b) [173; 174]. Slika 12. a) Mreža vodoninih veza i položaji 5 molekula vode (W1-W5) u distalnoj šupljini MPO u kojoj je smešten hem. b) Neplanarni porfirinski presten u MPO i njegovo kovalentno vezivanje za protein preko dve estarske veze (Glu242 i Asp94) i jedna veza sulfonijum-jona (Met243). Dodatno, prikazani su proksimalni His336 i distalni katalitiki 43 ostaci His95, Arg239 i Gln91. Slika je konstruisana korišenjem koordinata iz Protein Data Bank [177]. Sulfonijum-jon veza ima dve uloge: služi kao supstituent koji privlai elektrone preko svog pozitivnog naelektrisanja i odgovoran je zajedno sa susednim ostatkom Glu242 za manju simetriju hem-grupe i distorziju planarne konformacije (Slika 12b) [174]. Postojanje ove veze je razlog specifinih spektroskopskih osobina MPO. Kod MPO Soretova traka na 430 nm znatno je pomerena ka crvenom delu spektra u odnosu na Soretove trake drugih proteina, a poseduje i dodatne trake na 496, 570, 620 i 690 nm, koje su odgovorne za karakteristinu zelenu boju ovog enzima [178; 179; 180]. Hem je lociran u pukotini sa prilazom rastvaraa preko otvorenog kanala. U distalnoj šupljini se nalazi pet molekula vode (W1-W5). Distalni His95 je vodonino vezan za molekul vode W1 koji se nalazi na pola puta izmeu N atoma His95 i gvoža hema (Slika 12 a i b). Njegova udaljenost i od azota histidina i atoma gvoža ukazuje da je vodonino vezan za histidin i slabo koordinovan sa gvožem iz hema. etiri preostala molekula vode formiraju vodonine veze sa His95, Arg239, Gln91, pirolovim C prstenom hema, kao i meusobno (Slika 12a) [174]. Molekul vode W2 je vodoninom vezom vezan za N atom Gln91, W3 za NH2 Arg239, W4 za propionat pirolovog C prstena hema, a W5 nema dodatno vodonino vezivanje (Slika 12a) [174]. 44 3. MATERIJAL I METODE 3.1. Hemikalije Mijeloperoksidaza iz humanih neutrofila (A430/A280=0.84) dobijena je od Planta Natural Products, Vienna, Austria, a koncentracija (1,85x10-5 M) je odreena spektrofotometrijski ( 430=91000 M -1 cm-1) [181]. Katalaza poreklom iz govee jetre, acetilholinesteraza iz elektrine jegulje (specifina aktivnost 288 IU/mg), acetiltioholin- jodid (ASChI), staklene kuglice sa kontrolisanom veliinom pora (CPG 240, 80-120 mesh– controlled-pore glass), amonijum-acetat, glacijalna siretna kiselina, acetonitril, o- dianizidin-dihidrohlorid, taurin, dimetil-formamid (DMF) i 5, 5' – ditio-bis-(2- nitrobenzoeva kiseina) (DTNB) dobijeni su od Sigma – Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kalijumhidrogen-fosfat (K2HPO4x3H2O), NaCl, KBr, KI, NaI, Na2S2O3, glutaraldehid, 3- aminopropil-trietoksi-silan, 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin (TMB) i 2-PAM dobijeni su od Merck KgaA, Germany. Rastvori vodonik-peroksida pripremani su svakodnevno, razblaživanjem osnovnog rastvora (30% m/V), a tana koncentracija je odreivana spektrofotometrijski ( 240=43,6 M -1 cm-1) [182]. Organofosfatni pesticidi diazinon, malation, hlorpirifos, azinfos-metil, forat, diazokson, malaokson, hlorpirifos-okson, azinfos-metil-okson i forat-okson dobijeni su od Pestinal, Sigma-Aldrich, Denmark (najmanje 93% istoe). Radni rastvori pesticida pravljeni su svakodnevno razblaživanjem osnovnog etanolnog rastvora koncentracije 1x10-1 M. Finalni rastvori sadržali su maksimalno 1% etanola, što je bilo neophodno zbog rastvorljivosti. Fizika svojstva ovih pesticida date su u Tabeli 6, a njihovne formule na Shemi 3. 45 Tabela 6. Fizika svojstva ispitivanih pesticida 46 diazinon       diazokson       malation malaokson hlorpirifos hlorpirifos-okson azinfos-metil azinfos-metil-okson forat forat-okson Shema 3. Strukturne formule ispitivanih organofosfata 47 3.2. Korišena oprema 3.2.1. Spektrofotometijska merenja Spektrofotometrijska merenja obavljena su na aparatu UV-VIS Perkin Elmer, Lambda 35, u staklenoj kiveti sa svetlosnim putem 1 cm. 3.2.2. Tena hromatografija Hromatografske analize su raene na sistemu UPLC Waters ACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatography system sa TUV detektorom, što je kontrolisano Empower softverom, na koloni ACQUITY UPLCTM BEH C18, 1.7 μm, 100 mm x 2.1 mm (Waters). 3.2.3. Gasna hromatografija Hromatografske analize su raene na sistemu GC/MS Agilent 7890A, GC sistem sa 700A QqQ MS, kolona DB-5 MS 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm. 3.2.4. Protoni injekcioni sistem (FIA) Ispitivanja na imobilizovanoj acetilholinestarzi uraena su na FIA (flow injection analysis) sistemu konstruisanom u Laboratoriji za fiziku hemiju INN Vinca. Sistem se 48 sastoji od od bioanalitike kolone (Slika 13) sa imobilizovanim enzimom, HPLC pumpe (Dionex AMP-1), injektora (Waters U6K) sa petljom od 200 μL, i UV VIS detektora (Spectra 200, Spectra Physics). Bioanalitika komponenta FIA sistema napravljena je tako što je kolona dimenzija 21x3 mm napunjena sa 10 - 13 mg imobilizovane AChE. Nosei pufer bio je 50 mM forfatni pH 8. Shematski prikaz biosenzora dat je na Shemi 4, a ureaj u celini je prikazan na Slici 14. Slika 13. Bioanalitika kolona sa imobilizovanom AChE Shema 4. Shematski prikaz biosenzora 49 Slika 14. FIA sistem za analize na imobilizovanoj AChE 3.2.4.1. Imobilizacija AChE 0,55 mg AChE imobilizovano je na 0,15 g aktiviranog CPG prema metodi opisanoj u literaturi [183; 184; 185]. Staklene kuglice su prokuvane u 5% azotnoj kiselini, a zatim isprane dejonizovanom vodom i osušene na 95 °C. Vodeni rastvor aminoalkilirajueg agensa pripreman je dodavanjem 10 mL 3-aminopropil-trietoksisilana u 90 mL vode, pri emu je pH podešavano na 3,5 pomou 5 M HCl. U ovaj rastvor dodavano je osušeno staklo i smeša je inkubirana na 75 °C tokom 150 minuta uz mešanje na svakih 15 minuta. Tretirano staklo je filtrirano, isprano dejonizovanom vodom i osušeno. Proces aktivacije ponovljen je 3 puta. Rastvor umreživaa glutaraldehida (2,5 %) pripremljen je dodavaljem 50 5 mL 25%-nog glutaraldehida u 45 mL 0,1 M fosfatnog pufera pH 7. Potom su alkilamino- grupe aktiviranog stakla (0,4 g) umrežene pomou 2 mL glutaraldehida u pari azota tokom 1 h i isprane dejonizovanom vodom. Enzim (0,55 mg) je rastvoren u 3 mL hladnog (4 °C) 50 mM fosfatnog pufera pH 6 i doveden u kontakt sa prethodno tretiranim staklom u struji azota tokom 2,5 h. Posle filtriranja, imobilizovani enzim je ispiran istim puferom i vodom. Imobilizovani enzim je skladišten u puferu na 4 °C do upotrebe. 3.2.5. Elektrohemijska merenja Elektrohemijska merenja obavljena su pomou Gamry PCI4/750 potenciostata (Gamry Instruments, USA), koji je kontrolisan preko Gamry Framework v4.35. i Pine Rotator (Pine Instruments, USA) sa disk elektrodom od staklastog ugljenika (površine poprenog preseka 0,19625 cm2). 3.2.6. Ostala laboratorijska oprema Za odmeravanje hemikalija korišene su analitika vaga Mettler i tehnika vaga Mettler, za mešanje uzoraka magnetna mešalica VELP scientifica, za odreivanje pH rastvora pH metar Metrohm 713 sa kombinovanom elektrodom, a za centrifugiranje centrifuga miniSpin plus, Eppendorf. 51 3.3. Odreivanje aktivnosti AChE Aktivnost AChE merena je pomou modifikovane Elmanove metode [186; 187; 188]. Finalna zapremina reakcione smeše bila je 700 μL. Reakcija je praena tokom 8 minuta na 37 °C. Kao supstrat korišen je 0,075 M ASChI u kombinaciji sa 1x10-4 M DTNB kao hromogenim agensom. Proizvod enzimske reakcije je tioholin, koji sa DTNB gradi 5-tio-2-nitrobenzoat (TNB) žute boje (Shema 5), koji se prati spektrofotometrijski na 412 nm. Intenzitet boje je mera aktivnosti enzima. Reakcija je praena u 50 mM fosfatnom puferu pH 8, a zaustavljana je dodavanjem 50 μL natrijum-dodecil-sulfata (SDS) koncentracije 1x10-1 M. Shema 5. Princip odreivanja aktivnosti AChE Elmanovom metodom 3.4. Oksidacija OP u prisustvu MPO Ispitivane koncentracije organofosfata inkubirane su u 50 mM fosfatnom puferu pH 6 sa razliitim koncentracijama MPO, u reakcionoj smeši finalne zapremine 0,5-1,0 mL. Reakcija je otpoinajna dodatkom H2O2 i zaustavljana dodavanjem katalaze koncentracije 100 μg/mL. Reakcione smeše su potom centrifugirane 10 minuta na 13000 rpm i supernatant je korišen za dalje analize. 52 3.5. Oksidacija OP elektrohemijski generisanim hlorom, bromom i jodom Indirektna elektrohemijska oksidacija ispitivanih organo-tiofostata izvršena je u troelektrodnom sistemu sa radnom rotirajuom elektrodom od staklastog ugljenika, platinskom kao pomonom i zasienom kalomelovom elektrodom (ZKE) kao referentnom elektrodom. Kao elektrolitiki rastvor korišen je 50 mM PBS pH 6,5 sa dodatkom Cl-, Br- ili I- i organo-tiofosfata željene koncentracije, ukupne zapremine 20 mL. Pre svakog eksperimenta radna elektroda je mehaniki oišena poliranjem sa dijamantskom pastom (veliina estica 1 – 5 m), a potom isprana etanolom i dejonizovanom vodom. Oksidacija je trajala 15 min u galvanostaskim uslovima pri gustini struje od 2 mA cm-2, ime je omogueno da u toku eksperimenta nastane bar 10 puta više halogena od prisutne koncentracije organo-tiofosfata [143]. U toku eksperimenta rastvor je homogenizovan rotiranjem radne elektrode brzinom od 900 rpm. Pored homogenizacije rastvora, rotacija elektrode izaziva konvekcioni tok elektrolita normalno na površinu elektrode konstantno dovodei novu koliinu reaktanata u blizinu elektrode, a takoe i smanjuje debljinu difuzionog sloja ubrzavajui transfer mase [189]. 3.6. Identifikacija proizvoda oksidacije OP 3.6.1. UPLC Analize svih OP raene su pod izokratskim uslovima sa mobilnim fazama koje su se sastojale od 20 mM amonijum-acetata u vodi (rastvor A) i 0,1 % siretne kiseline u acetonitrilu (rastvor B). U Tabeli 7. su dati zapreminski odnosi rastvora A i B koji su korišeni za analizu pojedinanih OP, kao i talasne dužine na kojima su 53 spektrofotometrijski praeni. Najpogodnije (karakteristine) talasne dužine izabrane su na osnovu spektara snimanih u oblasti izmeu 200 i 700 nm. Tabela 7. Zapreminski odnosi rastvora A i B u mobilnim fazama korišenim za UPLC analizu ispitivanih OP OP A:B (v/v) (nm) Diazinon i diazokson 25:75 245 Malation i malaokson 30:70 210 Hlorpirifos i hlorpirifos- okson 25:75 220 Azinfos-metil i azinfos- metil-okson 30:70 230 Forat i forat-okson 30:70 205 3.6.2. GC/MS Svi ispitivani OP analizirani su pod istim uslovima. Injekciona zapremina bila je 1 μL, a temperatura injektora 250 °C. Nosei gas helijum puštan je sa protokom od 1,3 mL/min na 80 °C u modu sa konstantnim pritiskom. Temperatura kolone je linearno programirana u opsegu od 80 – 300 °C tako da raste 10 °C/min. Maseni spektri dobijeni su u MRM (multiple reaction monitoring) modu. Energija kolizije bila je 15 eV, a kolizioni gas azot. 54 3.7. Ispitivanje peroksidazne aktivnosti mijeloperoksidaze MPO katalizuje tipine reakcije peroksidacije (jednaina 1). H2O2 + 2AH2  2 . AH + 2H2O (1) Peroksidazna aktivnost mijeloperoksidaze odreivana je po metodi Bradley et al. (1982), praenjem koncentracije nastalog oksidovanog oblika o-dianizidina u reakciji sa vodonik-peroksidom i enzimom [190]. Za odreivanje peroksidazne aktivnosti MPO korišen je supstrat o-dianizidin finalne koncentracije 0,53 mM u reakcionoj smeši. Svež rastvor o-dianizidina pravljen je pre poetka svakog eksperimenta. Aktivnost je odreivana u 50 mM fosfatnom puferu pH 6 u prisustvu 0,15 mM vodonik-peroksida. Koncentracija vodonik-peroksida odreivana je snimanjem apsorbancije na 240 nm ( 240=43,6 mM -1cm-1). Osnovni rastvor MPO koncentracije 1,29x10-5 M je razblaživan i dodavan u reakcione smeše do željenih finalnih koncentracija. Enzim i o-dianizidin su termostatirani 5 minuta na 25°C, nakon ega je reakcija zapoinjana dodavanjem vodonik-peroksida. Apsorbancija na 460 nm praena je tokom prvog minuta reakcije. Koncentracija oksidovanog oblika o-dianizidina odreena je korišenjem 460=11,3 mM -1cm-1 [190]. 3.8. Ispitivanje hlorinujue aktivnosti mijeloperoksidaze Hlorinujua aktivnost mijeloperoksidaze praena je po metodi Dypbukt et al. (1976) [191]. Koncentracija hipohlorne kiseline ije stvaranje u prisustvu vodonik-peroksida i hlorida katalizuje mijeloperoksidaza (jednaina 2) odreivana je merenjem konverzije taurina u taurin-hloramin, koji je detektovan korišenjem TMB u prisustvu jodida ( 645=30230 M -1cm-1). 55 H2O2 + X - + H+  HOX + H2O (2) Željene koncentracije mijeloperoksidaze inkubirane su 5 minuta u 20 mM fosfatnom puferu pH 6,5, koji je sadržao 100 mM natrijum-hlorid i 5 mM taurin. Reakcije su otpoinjane dodavanjem 10 – 30 μM vodonik-peroksida uz brzo mešanje i zaustavljane posle 30 minuta dodavanjem 100 μg/mL katalaze. Jedna zapremina (600μL) ove reakcione smeše je zatim brzo mešana sa 0,25 zapremina (150μL) reagensa za razvijanje boje. Nakon 5 minuta merena je apsorbancija na 645 nm i odreivana koncentracija nastale hipohlorne kiseline. Reagens za razvijanje boje sastojao se od 2 mM TMB u 400 mM acetatnom puferu pH 5,4, koji je sadržao 10 % DMF i 100 μM natrijum-jodid. Ovaj rastvor je pripreman rastvaranjem TMB u 100 % DMF koji je potom razblaživan acetatnim puferom do željene koncentracije TMB, a zatim je dodavan natrijum-jodid. 56 4. REZULTATI I DISKUSIJA 4.1. Inhibicija nativne AChE organofosfatima Toksini efekat organofosfatnih pesticida se pripisuje njihovoj ireverzibilnoj inhibiciji AChE [184; 185; 192; 193; 194]. Poznato je da tio-oblici organofosfata (organo- tiofosfati) u organizmu podležu metabolikim transformacijama pod uticajem citohroma P450, pri emu nastaju okso-oblici (oksoni) tih jedinjenja, u kojima je atom sumpora iz tio- grupe zamenjen atomom kiseonika [193; 195; 196]. Metabolika transformacija organo- tiofosfata u okso-oblike pod uticajem citohroma P450 prikazana je u prilogu (Slika P1). Okso-oblici su toksiniji od polaznih jedinjenja, jer jae inhibiraju AChE [192]. S obzirom na to da transformacija organofosfata iz tio- u okso-oblike predstavlja bitan korak u bioanalitikim metodama za detekciju niskih koncentracija ovih jedinjenja u životnoj sredini, koje se baziraju na inhibiciji AChE, bilo je potrebno odrediti koncentracionu zavisnost inhibicije ovog enzima kako tio-, tako i okso-oblicima odabranih organofosfatnih pesticida. Pored toga, bilo je potrebno definisati i druge uslove, kao što su koncentracija enzima i vreme inkubacije, kako bi se dobio optimalni spektrofotometrijski signal za detekciju niskih koncentracija inhibitora. 4.1.1. Optimizacija uslova za detekciju najniže koncentracije OP primenom AChE testa Aktivnost AChE odreivana je u opsegu koncentracija 0,5 - 2,5 U/mL na nain prethodno opisan u poglavlju 3.3, primenom modifikovane Elmanove metode [186]. Aktivnost enzima je izražena kao promena apsorbancije na 412 nm u minuti. Na Slici 15. prikazani su dobijeni rezultati. Sa grafika se vidi da je zavisnost aktivnosti AChE od njene 57 koncentracije u datom opsegu linearna. Obzirom na to da promena koncentracije nagraenog 5-tio-2-nitrobenzoata pri koncentraciji AChE od 2,5 U/mL daje za 8 minuta promenu apsorbancije za oko 0,5 jedinica, ta koncentracija enzima e se koristiti u esejima za odreivanje inhibicije. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 A k ti v n o s t A C h E ( ΔΔ ΔΔA / ΔΔ ΔΔ t) [AChE] (U/mL) Slika 15. Zavisnost aktivnosti AChE od njene koncentracije ispitana u 50 mM fosfatnom puferu pH 8,0 pomou modifikovane Elmanove metode Budui da je inhibicija AChE organofosfatima ireverzibilan proces zavisan od vremena inkubacije, odreeno je minimalno vreme inkubacije AChE sa inhibitorima koje e dati zadovoljavajuu promenu optikog signala. Aktivnost enzima koncentracije 2,5 U/mL je odreivana AChE testom, na prethodno opisan nain. Kao inhibitor uzet je malation u koncentracijama 1x10-4, 1x10-5 i 1x10-6 M. Malation je inkubiran sa enzimom na 37 °C tokom 20, 30 i 60 minuta pre otpoinjanja reakcije. Dobijeni rezultati prikazani su na Slici 16. Pri koncentracijama 1x10-4 M i 1x10-5 M vremenska zavisnost procenta inhibicije AChE je eksponencijalnog oblika i maksimalna vrednost inhibicije je dostignuta posle 20 minuta inkubacije. Pri koncentraciji od 1x10-6 M sa poveanjem vremena 58 inkubacije do 60 minuta aktivnost AChE se linearno smanjuje. Izborom vremena inkubacije od 20 minuta znaajno se smanjuje vreme potrebno za analizu. Optimalno vreme je izabrano na primeru malationa, ali se može upotrebiti i za ostale OP, jer su sline strukture i na isti nain inhibiraju AChE. 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t inkubacije OP i AChE (min) 1 2 3 Slika 16. Odreivanje optimalnog vremena kontakta AChE koncentracije 2,5 U/mL i malationa koncentracija 1) 1x10-4 M, 2) 1x10-5 M i 3) 1x10-6 M. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti tri merenja. 4.1.2. Inhibicija AChE organo-tiofosfatima Aktivnost AChE tio merena je pomou AChE testa (poglavlje 3.3.) [184; 186], u odsustvu (kontrola) i prisustvu diazinona, malationa, hlorpirifosa, azinfos-metila i forata. Nativni enzim izlagan je ispitivanim organo-tiofosfatima u koncentracionom opsegu od 1x10-8 do 1x10-3 M. Na osnovu rezultata dobijenih u poglavlju 4.1.1. vreme inkubacije 59 inhibitora i enzima iznosilo je 20 minuta, a potom je reakcija otpoinjana dodavanjem supstrata i praena 8 minuta. Na Slici 17. prikazane su inhibicione krive dobijene za ispitivane organo-tiofosfate. Sve krive su sigmoidnog oblika. 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 diazinon A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) malation hlorpirifos azinfos-metil forat Slika 17. Zavisnost aktivnosti AChE (2,5 U/mL) od koncentracije ispitivanih organo- tiofosfata. Vreme inkubacije AChE i organo-tiofosfata iznosilo je 20 minuta. Rezultati su prikazani kao procenat srednje vrednosti tri merenja aktivnosti u odnosu na kontrolu u odsustvu OP. Iz podataka sa Slike 17. odreene su IC50 vrednosti (koncentracija inhibitora koja indukuje 50% inhibicije enzimske aktivnosti) za sve inhibitore i prikazane u Tabeli 8. Iz navedenog se vidi da je azinfos-metil najslabiji inhibitor AChE sa IC50 1,47x10 -4 M, a vrlo 60 blisku vrednost IC50 ima i diazinon, 1,40x10 -4 M. Forat, malation i hlorpirifos imaju IC50 vrednosti za red veliine niže i one su 4,14x10-5, 2,50x10-5 i 1,15x10-5 M, respektivno. U grupi ispitanih organofosfata kao najjai inhibitor AChE pri datim uslovima pokazao se hlorpirifos. IC50 vrednosti su takoe odreene pomou Hill-ove metode linearne regresione analize (Slika 18) i prikazane u Tabeli 8, kao i Hill-ov koeficijent, nH. Poreenjem IC50 vrednosti dobijenih Hill-ovom analizom i fitovanjem eksperimentalnih podataka sigmoidnom krivom utvreno je da je njihova razlika u domenu eksperimentalne greške. Dobijeni Hill-ovi koeficijenti za ispitivana jedinjenja su u saglasnosti sa ranije objavljivanim vrednostima [197]. -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 diazinon lo g [ % a k ti v n o s ti /( 1 0 0 -% a k ti v n o s ti )] log [OP] malation azinfos-metil forat hlorpirifos Slika 18. Hill-ova analiza inhibicije aktivnosti AChE indukovane organo-tiofosfatima 61 Tabela 8. IC50 vrednosti dobijene Hill-ovom analizom i fitovanjem eksperimentlnih podataka sigmoidnom krivom i Hill-ov koeficijent nH za ispitivane organo-tiofosfate OP IC50 (M) odreeno iz sigmoidne krive Hill-ova analiza IC50 (M) nH Diazinon (1,40±0,21)x10-4 (1,58±0,55)x10-4 1,1±0,1 Malation (2,50±0,01)x10-5 (2,50±0,55)x10-5 1,3±0,1 Hlorpirifos (1,15±0,05)x10-5 (1,17±0,55)x10-5 1,6±0,1 Azinfos-metil (1,47±0,33)x10-4 (1,20±0,55)x10-4 1,2±0,1 Forat (4,14±0,52)x10-5 (4,30±0,55)x10-5 1,2±0,1 4.1.3. Inhibicija AChE okso-oblicima organofosfata Inhibicija AChE okso-oblicima organofosfata (diazokson, malaokson, hlorpirifos- okson, azinfos-metil-okson i forat-okson) ispitana je na nain koji je prethodno opisan u poglavlju 4.1.2. U ovom sluaju, organofosfati su bili u opsegu koncentracija od 1x10-9 do 1x10-5 M. Na Slici 19. prikazane su dobijene inhibicione krive ispitivanih okso-oblika organofosfata. Vidi se da su sve inhibicione krive sigmoidnog oblika, a da je inhibitorni efekat vei za oko dva do tri reda veliine u odnosu na odgovarajue tio-oblike. 62 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 hlorpirifos-okson diazokson A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) azinfos-metil-okson forat-okson malaokson Slika 19. Zavisnost aktivnosti AChE (2,5 U/mL) od koncentracije ispitivanih okso-oblika OP. Vreme inkubacije AChE i organo-tiofosfata iznosilo je 20 minuta. Rezultati su prikazani kao procenat srednje vrednosti tri merenja aktivnosti u odnosu na kontrolu u odsustvu OP. Iz rezultata prikazanih na Slici 19. odreene su vrednosti IC50 za ispitivane oksone i prikazani u Tabeli 9. U ovoj grupi najslabiji inhibitori AChE su forat-okson i hlorpirifos- okson sa IC50 2,00x10 -7 M, a zatim slede diazokson, azinfos-metil-okson i malaokson sa IC50 vrednostima 5,90x10 -8, 2,00x10-8 i 1,85x10-8 M, respektivno. Najjai inhibitor AChE u ovoj grupi jedinjenja je malaokson. IC50 vrednosti i Hill-ov koeficijent, nH, odreeni su pomou Hill-ove metode linearne regresione analize (Slika 20) i prikazane u Tabeli 9. Dobijeni Hill-ovi koeficijenti za ispitivana jedinjenja su u saglasnosti sa ranije objavljivanim vrednostima [197]. Poreenjem IC50 vrednosti dobijenih Hill-ovom analizom 63 i fitovanjem eksperimentalnih podataka sigmoidnom krivom utvreno je da je njihova razlika u domenu eksperimentalne greške. -8.5 -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -2 -1 0 1 2 diazokson malaokson azinfos-metil-okson forat-okson hlorpirifos-okson lo g [ % a k ti v n o s ti /( 1 0 0 -% a k ti v n o s ti )] log [OP] Slika 20. Hill-ova analiza inhibicije aktivnosti AChE indukovane okso-oblicima organofosfata Tabela 9. IC50 vrednosti dobijene Hill-ovom analizom i fitovanjem eksperimentlnih podataka sigmoidnom krivom i Hill-ov koeficijent nH za relevantne okso-oblike organofosfata OP IC50 (M) odreeno iz sigmoidne krive Hill-ova analiza IC50 (M) nH Diazokson (5,90±0,73)x10-8 (6,60±0,55)x10-8 1,5±0,1 Malaokson (1,85±0,51)x10-8 (1,50±0,55)x10-8 1,4±0,1 Hlorpirifos-okson (2,00±0,81)x10-7 (1,30±0,55)x10-7 1,1±0,1 Azinfos-metil-okson (2,00±0,74)x10-8 (2,30±0,55)x10-8 1,2±0,1 Forat-okson (2,00±0,35)x10-7 (1,70±0,55)x10-7 1,3±0,1 64 4.2. Prevoenje OP iz tio- u okso-oblik u prisustvu MPO Rezultati poreenja IC50 vrednosti za inhibiciju AChE organo-tiofosfatima i njihovim okso-analozima (Tabele 8 i 9) pokazuju da je u prisustvu okso-oblika stepen inhibicije AChE vei i za više od dva reda veliine. Iako prevoenje organo-tiofosfata u okso-analoge pojaava toksini efekat OP na organizme koji su im izloženi, injenica je da se ta pojava može iskoristiti za snižavanje nivoa detekcije pesticida. Mnoga jedinjenja korišena su da bi se tio-oblici organofosfata preveli u okso-oblike [80; 109; 124]. Ova transformacija može se postii i enzimskom reakcijom. U tu svrhu do sada uspešno su korišeni citohrom c, hloroperoksidaza, lignin-peroksidaza i peroksidaza iz rena [127]. Ovi rezultati upuuju na to da bi i druge peroksidaze mogle prevesti organofosfate iz tio- u okso-oblik. Stoga je u daljem radu ispitana je mogunost upotrebe mijeloperoksidaze za prevoenje OP iz tio- u okso-oblike. 4.2.1. Oksidacija Prevoenje OP iz tio- u okso-oblik postignuto je izlaganjem 1x10-5 M OP dejstvu 100 nM MPO u toku 10 minuta. Reakcija je otpoinjana dodavanjem 50 μM H2O2, a zaustavljana dodatkom katalaze. Da bi se tano utvrdilo da li je reakcija koja se odigrava u prisustvu mijeloperoksidaze zaista oksidacija, neophodno je bilo identifikovati novonastale proizvode. U tu svhu upotrebljena je tena hromatografija pod ultra-visokim pritiskom (eng. Ultra Performance Liquid Chromatography - UPLC), a kao dodatna metoda za identifikaciju nastalih proizvoda odabranih jedinjenja gasno-masena hromatografija (eng. Gas Chromatography / Mass Spectrometry – GC/MS). 65 4.2.1.1. Identifikacija proizvoda oksidacije 4.2.1.1.1. UPLC Proizvodi dobijeni biokatalitikom oksidacijom ispitivanih organo-tiofosfata identifikovani su najpre pomou UPLC-a. Napravljeni su standardni rastvori maksimalnih dostupnih koncentracija odgovarajuih tio- i okso-oblika ispitivanih organofosfata, rastvorenih u acetonitrilu i snimljeni hromatogrami pod uslovima opisanim u poglavlju 3.5.1. Razvijene su metode za odredjivanje koncentracije svakog od ispitanih organofosfata pomou UPLC-a. Kalibracioni grafici, dobijeni pri eksperimentalnim uslovima (u pogledu izbora mobilne faze i talasne dužine) odreenim za svako jedinjenje dati su u prilogu (Slika P2). Za identifikaciju proizvoda enzimske reakcije, organo-tiofosfati koncentracije 1x10- 5 M izlagani su dejstvu 100 nM MPO u toku 10 min. Nakon zaustavljana reakcije dodatkom katalaze, uzorci su razblaživani 10 puta u acetonitrilu, tako da je njihova finalna ukupna koncentracija (polazno jedinjenje + nastali proizvod) koja je analizirana bila 1x10-6 M. Snimljeni su hromatogrami oksidovanih uzoraka organotiofosfata pod istim uslovima kao za standardne rastvore, i prikazani na Slikama 21-25. Iz dobijenih hromatograma odredjena su retenciona vremena ispitanih jedinjenja i prikazana u Tabeli 10. Rezultati pokazuju, da se u svim sluajevima javljaju dva hromatografska pika. Identifikacija polaznih jedinjenja i nastalih okso-oblika je omoguena poreenjem retencionih vremena oksidovanih uzoraka organofosfata sa retencionim vremenima standarda iz Tabele 10. 66 0 1 2 3 4 5 -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040 A 2 4 5 t (min) diazinon diazokson A 0 1 2 3 4 5 -0.0050 -0.0025 0.0000 0.0025 0.0050 A 2 4 5 t (min) diazinon diazokson B Slika 21. Hromatogrami A) standarda koji je sadržao 1x10-5 M diazinon i 3,5x10-5 M diazokson i B) oksidovanog uzorka ukupne koncentracije 1x10-6 M, dobijeni pri istim uslovima. Analiza je uraena pomou UPLC-a pod izokratskim uslovima, sa mobilnom fazom koja se sastojala od rastvora CH3COOH u vodi koncentracije 0,1 % i acetonitrila u zapreminskom odnosu 25:75. 0 1 2 3 4 5 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 A 2 1 0 t (min) malation malaokson A 0 1 2 3 4 5 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 A 2 1 0 t (min) malation malaokson B Slika 22. Hromatogrami A) standarda koji je sadržao 1x10-5 M malation i 1x10-4 M malaokson i B) oksidovanog uzorka ukupne koncentracije 1x10-6 M, dobijeni pri istim uslovima. UPLC analiza je uraena pod izokratskim uslovima, sa mobilnom fazom koja se sastojala od rastvora CH3COOH u vodi koncentracije 0,1 % i acetonitrila u zapreminskom odnosu 30:70. 67 0 1 2 3 4 5 -0.010 -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 A 2 2 0 t (min) hlorpirifos hlorpirifos-okson A 0 1 2 3 4 5 -0.010 -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 A 2 2 0 t (min) hlorpirifos-okson hlorpirifos B Slika 23. Hromatogrami A) standarda koji je sadržao 1x10-5 M hlorpirifos i 3x10-7 M hlorpirifos-okson i B) oksidovanog uzorka ukupne koncentracije 1x10-6 M, dobijeni pri istim uslovima. UPLC analiza je uraena pod izokratskim uslovima, sa mobilnom fazom koja se sastojala od rastvora CH3COOH u vodi koncentracije 0,1 % i acetonitrila u zapreminskom odnosu 25:75. 0 1 2 3 4 5 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A 2 3 0 t (min) azinfos-metil okson azinfos-metil A 0 1 2 3 4 5 -0.010 -0.005 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 A 2 3 0 t (min) azinfos-metil-okson azinfos-metil B Slika 24. Hromatogrami A) standarda koji je sadržao 1x10-5 M azinfos-metil i 3,3x10-4 M azinfos-metil-okson i B) oksidovanog uzorka ukupne koncentracije 1x10-6 M, dobijeni pri istim uslovima. UPLC analiza je uraena pod izokratskim uslovima, sa mobilnom fazom koja se sastojala od rastvora CH3COOH u vodi koncentracije 0,1 % i acetonitrila u zapreminskom odnosu 30:70. 68 0 1 2 3 4 5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A 2 0 5 t (min) forat-okson forat A 0 1 2 3 4 5 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 A 2 0 5 t (min) forat-okson B Slika 25. Hromatogrami A) standarda koji je sadržao 1x10-5 M forat i 5x10-8 M forat-okson i B) oksidovanog uzorka ukupne koncentracije 1x10-6 M, dobijeni pri istim uslovima. UPLC analiza je uraena pod izokratskim uslovima, sa mobilnom fazom koja se sastojala od rastvora CH3COOH u vodi koncentracije 0,1 % i acetonitrila u zapreminskom odnosu 30:70. Tabela 10. Retenciona vremena tio- i okso-oblika organofosfata dobijena pomou UPLC-a OP RT (min) OP RT (min) Diazinon 2,70 Diazokson 1,54 Malation 2,30 Malaokson 1,65 Hlorpirifos 4,25 Hlorpirifos-okson 2,00 Azinfos-metil 2,10 Azinfos-metil-okson 1,70 Forat 2,55 Forat-okson 2,30 69 Prema hromatogramima prikazanim na Slikama 21-25 može se zakljuiti da u svim sluajevima izlaganja tio-oblika organofosfata mijeloperoksidazi u reakcionoj smeši, pored polaznog jedinjenja, postoji samo jedan glavni reakcioni proizvod. Prema retencionim vremenima standarda (datim u Tabeli 10.) ti proizvodi su identifikovani kao okso-oblici odgovarajuih organo-tiofosfata. 4.2.1.1.1.1. Stabilnost oksidovanih oblika OP Da bi se utvrdilo koliko dugo su proizvodi oksidacije stabilni, UPLC hromatogrami oksidovanih uzoraka su snimani tokom 60 minuta posle zaustavljanja reakcije oksidacije dodatkom katalaze. Kao primer, na Slici 26. prikazani su UPLC hromatogrami diazinona oksidovanog u prisustvu MPO. Iz kalibracionih pravih za diazinon i diazokson (Slika P2) odreene su koncentracije oba OP tokom 60 minuta i date u Tabeli 11. Naeno je da se izgled hromatograma i koncentracije OP nisu znaajno menjale sa vremenom, kao i da su za diazinon i diazokson one (0.73±0.08)x10-5 M i (0.27±0.02)x10-5 M, respektivno. Ovi rezultati takoe potvruju da nema drugih proizvoda oksidacije ni posle stajanja uzoraka na sobnoj temperaturi tokom 60 minuta, odnosno da ne dolazi do daljeg razlaganja okso- oblika. Slini rezultati dobijeni su kada je hloroperoksidaza korišena za oksidaciju nekih organofosfata, nisu primeeni proizvodi hidrolize i halogenovanja [127; 198]. Ove reakcije se takoe mogu uporediti sa transformacijama OP pod dejstvom citohroma P450 u in vivo i in vitro sistemima. Razlika je to što je dalje cepanje oksona karakteristino za oksidaciju organofosfata u prisustvu citohroma P450, što nije primeeno u sluajevima hloroperoksidaze i mijeloperoksidaze. Sa druge strane, i oksidacija organofosfata nekim neorganskim oksidantima, kao što je ozon, vodi do hidrolize okso-formi [199]. 70 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 diazokson diazinon 5 4 3 2 1 A 2 4 5 t (min) Slika 26. UPLC hromatogrami 1x10-5 M diazinona pre (1) i posle (2-5) 10 minuta inkubacije sa 100 nM MPO. Oksidovani uzorci (2-5) su praeni tokom 60 minuta, a vreme izmeu dva konsekutivna hromatograma bilo je 20 minuta. Analiza je uraena pod izokratskim uslovima, sa mobilnom fazom koja se sastojala od 25 % rastvora CH3COOH u vodi koncentracije 0,1 % i 75 % acetonitrila. Tabela 11. Koncentracije diazinona i diazoksona u reakcionoj smeši odreene primenom UPLC analize (kalibracioni grafici dati u prilogu, Slika P2) posle 10 minutne oksidacije sa 100 nM MPO i u narednih 60 minuta od zaustavljanja oksidacije. t (min) Cdiazinon (M) Cdiazokson (M) 0 (0,73±0,08)x10-5 (0,27±0,02)x10-5 20 (0,72±0,08)x10-5 (0,28±0,02)x10-5 40 (0,74±0,08)x10-5 (0,27±0,02)x10-5 60 (0,73±0,08)x10-5 (0,28±0,02)x10-5 71 4.2.1.1.2. GC/MS Kao potvrda za rezultate dobijene analizama na UPLC-u, oksidovani uzorci diazinona i malationa koncentracije 1x10-5 M su dodatno analizirani i na GC/MS-u. Dobijeni GC hromatogrami prikazani su na Slici 27. U oba sluaja jasno se vide dva hromatografska signala, jedan od polaznog jedinjenja, a drugi od nastalog proizvoda. Ovo je i dodatni dokaz da pri oksidaciji OP u prisustvu MPO nastaje jedan glavni reakcioni proizvod. Poreenjem masenih spektara jedinjenja koja se u tom signalu nalaze sa spektrima iz baze podataka potvreno je da su nastali proizvodi okso-oblici polaznih jedinjenja. Do istog zakljuka došlo se i poreenjem retencionih vremena sa standardima koji su analizirani pri istim uslovima (Tabela 12). 72 A B Slika 27. GC hromatogrami A) diazinona i B) malationa koncentracije 1x10-5 M oksidovanih u prisustvu 100 nM MPO tokom 10 minuta Tabela 12. Identifikacija proizvoda oksidacije organo-tiofosfata u prisustvu MPO pomou GC/MS-a Jedinjenje Mr m/z RA RT Diazinon 304 179, 137, 273 100 13.625 Diazokson 288 137, 273 35 13.299 Malation 330 125, 127, 173 100 15.462 Malaokson 314 127 47 14.664 73 4.2.2. Optimizacija uslova za oksidaciju organo-tiofosfata Na osnovu rezultata prikazanih u poglavlju 4.2.1. može se zakljuiti da se ispitivani organo-tiofosfati oksiduju u prisustvu MPO i H2O2 prema Shemi 6, gde se kao proizvod reakcije javlja okso-oblik: H2O2 MPO diazinon diazokson Shema 6. Prevoenje diazinona u diazokson Da bi se ispitivani organofosfati u što veem procentu preveli iz tio- u okso-oblik (Shema 8), bilo je potrebno optimizovati uslove pod kojima dolazi do oksidacije. Odreena je optimalna koncentracija H2O2 pri kojoj MPO najefikasnije katalizuje oksidaciju organo- tiofosfata, optimalno vreme inkubacije organo-tiofosfata sa MPO, minimalna koncentracija MPO koju je potrebno koristiti kako bi se postigao zadovoljavajui procenat prevoenja iz tio- u okso-oblik OP, kao i optimalni pH i temperatura za izvoenje reakcije. 74 4.2.2.1. Odreivanje optimalne koncentracije H2O2 za oksidaciju OP u prisustvu MPO U cilju odreivanja optimalnih uslova za konverziju ispitivanih organofosfata iz tio- u okso-oblik, ispitan je uticaj H2O2 koncentracija izmeu 1 i 200 μM na oksidaciju OP finalne koncentracije 1x10-5 M, pri razliitim koncentracijama MPO (10, 50 i 100 nM). Inkubaciono vreme izmeu ispitivanih OP i MPO bilo je 10 minuta. Oksidacija se odvijala u 50 mM fosfatnom puferu pH 6 na sobnoj temperaturi (25 °C). Budui da su okso-forme organofosfata potentniji inhibitori AChE od tio-oblika, dinamika formiranja oksona praena je AChE testom (poglavlje 3.3.) [187; 188; 192]. AChE je 20 minuta inkubirana sa ispitivanim organofosfatima posle njihove oksidacije u prisustvu MPO. Pri odreivanju preostale aktivnosti AChE svi uzorci su razblaživani 10 puta. Procenat inhibicije AChE indukovan oksidovanim uzorcima organo-tiofosfata razmatran je samo kao posledica poveanja koncentracije okso-forme, jer je u dodatnim eksperimentima utvreno da nema sinergizma izmeu uticaja tio- i odgovarajueg okso-oblika na aktivnost AChE. Na Slici 28. prikazana je zavisnost aktivnosti AChE posle izlaganja 1x10-5 M oksidovanim OP od koncentracije H2O2, za razliite koncentracije MPO. U svim ispitanim sluajevima aktivnost AChE najpre opada sa poveanjem koncentracije H2O2 i dostiže minimum, a zatim raste i dostiže vrednost koja odgovara inhibiciji koju indukuje poetna koncentracija polaznog jedinjenja. Sa grafika na Slici 28. se vidi da koncentracija H2O2 potrebna da se dostigne najvei procenat inhibicije AChE za datu koncentraciju MPO raste sa poveanjem koncentracije MPO. Sa druge strane, kada su OP oksidovani u prisustvu veih koncentracija H2O2, nije uoena promena u inhibiciji AChE. Ova pojava je posledica injenice da je aktivnost MPO inhibirana kada je H2O2 u višku [200; 201]. Paralelni eksperimenti bez MPO pokazali su da sam H2O2 ne dovodi do oksidacije organo-tiofosfata pod istim eksperimentalnim uslovima. Iz prikazanih rezultata takoe je mogue zakljuiti da je optimalna koncentracija H2O2 za oksidaciju ispitanih organo-tiofosfata u svim sluajevima bila oko 50 μM kada je koncentracija MPO 100 nM. 75 0 50 100 150 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [H 2 O 2 ] (μM) 100 nM MPO 50 nM MPO 10 nM MPO A 0 nM MPO 0 50 100 150 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [H 2 O 2 ] (μM) 100 nM MPO 50 nM MPO 10 nM MPO B 0 nM MPO 0 50 100 150 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [H 2 O 2 ] (μM) 100 nM MPO 50 nM MPO 10 nM MPO C 0 nM MPO 0 50 100 150 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [H 2 O 2 ] (μM) 10 nM MPO 50 nM MPO 100 nM MPO D 0 nM MPO 0 50 100 150 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [H 2 O 2 ] (μM) 100 nM MPO 50 nM MPO 10 nM MPO E 0 nM MPO Slika 28. Zavisnost aktivnosti AChE od koncentracije H2O2 primenjene pri oksidaciji A) diazinona, B) malationa, C) hlorpirifosa, D) azinfos-metila i E) forata finalne koncentracije 1x10-5 M u prisustvu MPO koncentracije 0, 10, 50 i 100 nM, tokom 10 minuta na pH 6 i sobnoj temperaturi 76 4.2.2.2. Uticaj vremena inkubacije MPO sa OP na oksidaciju U cilju utvrivanja uticaja vremena inkubacije ispitivanih OP (koncentracija 1x10-5, 1x10-6 i 1x10-7 M) i MPO (100 nM) na efikasnost oksidacije, vreme inkubacije je varirano od 1 do 30 minuta. Pri oksidaciji OP u prisustvu MPO koncentracija H2O2 je bila konstantna (50 μM). Reakcija oksidacije se odigravala u 50 mM fosfatnom puferu pH 6 na sobnoj temperaturi (25 °C). Efikasnost oksidacije (posmatrana kroz efekat oksidovanih OP na inhibiciju AChE) je praena pomou AChE testa, na prethodno opisan nain (poglavlje 3.3). Zavisnost aktivnosti AChE posle izlaganja oksidovanim organo-tiofosfatima od vremena inkubacije predstavljena je na Slici 29. Aktivnost AChE u prisustvu oksidovanih uzoraka ispitivanih OP smanjivala se sa produživanjem vremena inkubacije, što ukazuje na porast koncentracije okso-formi odgovarajuih jedinjenja. Posle oko 30 minuta, u svim ispitivanim sluajevima, došlo je do konstantnog nivoa aktivnosti AChE, iz ega se zakljuuje da je u toj taki nastala maksimalna koliina oksona pod datim uslovima. Sa druge strane, sa Slike 29. može se videti da je promena aktivnosti AChE u svim ispitivanim sluajevima neznatna u toku poslednjih 20 minuta, te je kao optimalno vreme inkubacije MPO i oksidovanih OP odabrano 10 minuta, kako bi se maksimalno skratila procedura uz zadržavanje nivoa osetljivosti. 77 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 1x10 -7 M diazinon A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) 1x10 -6 M diazinon 1x10 -5 M diazinon A 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 1x10 -5 M malation A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) 1x10-6M malation 1x10 -7 M malation B 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 1x10 -6 M hlorpirifos t (min) A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) 1x10 -5 M hlorpirifos 1x10 -7 M hlorpirifos C 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) 1x10-5 M azinfos-metil 1x10-6 M azinfos-metil 1x10-7 M azinfos-metil D 0 5 10 15 20 25 30 0 20 40 60 80 100 1x10 -7 M forat 1x10 -6 M forat 1x10 -5 M forat A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) E Slika 29. Zavisnost aktivnosti AChE posle izlaganja oksidovanom A) diazinonu, B) malationu, C) hlorpirifosu, D) azinfos- metilu i E) foratu (poetne koncentracije tio-formi bile su 1x10-5, 1x10-6 i 1x10-7 M) od vremena inkubacije 100 nM MPO sa OP, koje je varirano do 0 do 30 minuta, u prisustvu 50 μM H2O2, na pH 6 i sobnoj temperaturi (25 °C) 78 4.2.2.2.1. Odreivanje kinetikih konstanti za proces oksidacije OP u prisustvu MPO Iz podataka prikazanih u poglavlju 4.2.2.2. mogue je odrediti kinetike parametre reakcije oksidacije OP u prisustvu MPO primenom AChE testa za odreivanje koncentracije nastalih okso-oblika. Poetne brzine procesa oksidacije odreene su iz podataka prikazanih u prilogu (Slika P3). Koncentracije okso-oblika odreene su iz zavisnosti aktivnosti AChE od koncentracije oksona (Slika 19) i prikazane u Tabeli 13. Zahvaljujui podacima u Tabeli 13. konstruisani su Lineweaver-Burk-ovi dijagrami (Slika 30), pomou kojih su odreene kinetike konstante i zajedno sa poetnim brzinama prikazane u Tabeli 14. Tabela 13. Vremenska zavisnost koncentracije okso-oblika OP nastalih posle izlaganja organo-tiofosfata dejstvu 100 nM MPO tokom razliitih vremenskih intervala 79 0 2 4 6 8 10 0 200 400 600 800 1000 1200 diazinon 1 /V 0 ( μμ μμM -1 m in ) 1/C (μM-1) hlorpirifos azinfos-metil forat malation Slika 30. Lineweaver-Burk-ovi dijagrami za oksidaciju OP pomou 100 nM MPO na 25 °C Tabela 14. Poetne brzine i kinetike konstante za oksidaciju OP u prisustvu MPO Poetno jedinjenje C (μM) Diazinon Malation Hlorpirifos Azinfos- metil Forat V0 (μMmin -1) 0,1 8,39x10-4 4,77 x10-3 5,02 x10-3 1,11 x10-3 3,24 x10-3 0,5 3,63 x10-3 1,27 x10-2 9,63 x10-3 1,52 x10-3 7,85 x10-3 1 5,85 x10-3 1,29 x10-2 1,41 x10-2 1,63 x10-3 1,33 x10-2 5 1,25 x10-2 1,53 x10-2 2,73 x10-2 1,92 x10-3 3,52 x10-2 Km (μM) 2,081 0,256 0,283 0,067 1,367 Vmax (μMmin -1) 0,0183 0,0171 0,0188 0,0018 0,0399 kcat (min -1) 0,183 0,171 0,188 0,018 0,399 80 Iz rezultata priloženih u Tabeli 14. vidi se da je vrednost Km najniža za azinfos- metil i iznosi 0,067 μM, a zatim slede malation, hlorpirifos, forat i diazinon sa vrednostima 0,256, 0,283, 1,367 i 2,081 μM, respektivno. Budui da je Km mera afiniteta enzima ka supstratu, iz ovih vrednosti možemo proceniti afinitet MPO ka ispitivanim OP. MPO ima, dakle, najvei afinitet ka azinfos-metilu, a najniži ka diazinonu. 4.2.2.3. Oksidacija OP u zavisnosti od koncentracije MPO Uticaj koncentracije mijeloperoksidaze u rasponu od 10 do 100 nM na oksidaciju 1x10-5, 1x10-6 i 1x10-7 M ispitivanih organo-tiofosfata odreivan je posle 10 minuta inkubacije OP sa MPO. Koncentracija H2O2 bila je konstantna (50 μM), a oksidacija izvedena na pH 6 i sobnoj temperaturi (25 °C). Efikasnost oksidacije je praena pomou AChE testa, na prethodno opisan nain (poglavlje 3.3). Uticaj koncentracije MPO na oksidaciju ispitivanih OP prikazan je na Slici 31. U svim ispitanim sluajevima koncentracije MPO iznad 10 nM dovele su do poveanja inhibicije AChE. Iz prikazanih rezultata se vidi da je inhibicija AChE najvea posle inkubacije ovog enzima sa OP koji su oksidovani u prisustvu 100 nM MPO. 81 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 1x10 -6 M diazinon 1x10 -7 M diazinon 1x10 -5 M diazinon A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [MPO] (nM) A 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 1x10-7 M malation 1x10-6 M malation 1x10-5 M malation A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [MPO] (nM) B 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 1x10 -7 M hlorpirifos 1x10-6 M hlorpirifos 1x10 -5 M hlorpirifos A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [MPO] (nM) C 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 1x10-5 M azinfos-metil 1x10-6 M azinfos-metil A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [MPO] (nM) 1x10-7 M azinfos-metil D 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 1x10 -5 M forat 1x10-6 M forat 1x10-7 M forat A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [MPO] (nM) E Slika 31. Zavisnost aktivnosti AChE izložene tokom 10 minuta oksidovanom A) diazinonu, B) malationu, C) hlorpirifosu, D) azinfos-metilu i E) foratu (poetna koncentracija 1x10-5, 1x10-6 i 1x10-7 M) od koncentracije MPO (0 – 100 nM), u prisustvu 50 μM H2O2, na pH 6 i sobnoj temperaturi (25 °C) 82 4.2.2.4. Oksidacija OP u prisustvu MPO u zavisnosti od pH U cilju pronalaženja optimalne pH vrednosti za prevoenje ispitivanih organo- tiofosfata u odgovarajue okso-oblike, pH reakcione smeše je varirano u opsegu od 5,0 do 8,0. Ispitivani organo-tiofosfati koncentracije 1x10-7 M inkubirani su 10 minuta sa 100 nM MPO u prisustvu 50 μM H2O2 na sobnoj temperaturi. Uticaj pH vrednosti reakcione smeše na oksidaciju OP u prisustvu MPO praen je AChE testom (poglavlje 3.3). Dobijeni rezultati predstavljeni su na Slici 32. Sa prikazanog grafika vidi se da je optimalna pH vrednost za oksidaciju svih ispitivanih OP u prisustvu MPO 6,0. Ovi rezultati su u saglasnosti sa optimalnom pH vrednošu za aktivnost mijeloperoksidaze (Slika 33), kao i sa rezultatima odreivanja optimalne pH vrednosti za oksidaciju drugih jedinjenja u prisustvu MPO [202]. 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 0 20 40 60 80 100 diazinon hlorpirifos % i n h ib ic ij e A C h E pH malation azinfos-metil forat Slika 32. Zavisnost inhibicije AChE u prisustvu OP – okso-formi (nagraenih inkubacijom 1x10-7 M OP u toku 10 minuta sa 100 nM MPO) od pH reakcione smeše 83 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 A k ti v n o s t M P O ( ΔΔ ΔΔ A / ΔΔ ΔΔ t) pH 10 nM MPO 0.15 mM H 2 O 2 0.53 mM o-dianizidin Slika 33. Odreivanje optimalne pH vrednosti za aktivnost MPO koncentracije 10 nM 4.2.2.5. Zavisnost oksidacije OP u prisustvu MPO od temperature reakcione smeše Optimalna temperatura za oksidaciju organo-tiofosfata ispitivana je u opsegu od 25 (sobna temperatura) do 50 °C. Najpre je odreena optimalna temperatura za peroksidaznu aktivnost 10 nM MPO na pH 6 i rezultati su prikazani na Slici 34. Sa grafika se vidi da je mijeloperoksidaza najaktivnija na 37 °C, ali i da razlike u aktivnosti na ispitivanim temperaturama nisu velike. 84 20 25 30 35 40 45 50 55 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 A k ti v n o s t M P O ( ΔΔ ΔΔ A / ΔΔ ΔΔ t) t (° C) Slika 34. Odreivanje optimalne temperature za aktivnost MPO (10 nM) na pH 6 Organo-tiofosfati (diazinon, malation, hlorpirifos, azinfos-metil, forat) koncentracije 1x10-6 i 1x10-7 M inkubirani su 10 minuta sa 100 nM MPO u prisustvu 50 μM H2O2 u fosfatnom puferu pH 6, a oksidacija je dalje praena AChE testom. Dobijeni rezultati su predstavljeni na Slici 35. Dati grafici pokazuju da je u sluaju svih ispitivanih OP optimalna temperatura za oksidaciju 37 °C. Takoe, efikasnost oksidacije raste za oko 10 % kada se temperatura povea za 10 °C. Ipak, poveanje temperature iznad 37 °C dovodi do smanjenja efikasnosti oksidacije. Uprkosu utvrenom optimumu od 37 °C, dalja merenja su izvoena na sobnoj temperaturi, budui da se sa grafika na Slici 35. vidi da razlika u efikasnosti oksidacije nije znaajna. Ovi rezultati su u saglasnosti sa temperaturnim optimumom koji je odreen za aktivnost MPO (Slika 34), kao i sa temperaturnim optimumom za oksidaciju nekih drugih jedinjenja u prisustvu MPO [203]. 85 20 25 30 35 40 45 50 55 0 20 40 60 80 100 % i n h ib ic ij e A C h E t (° C) 1x10 -7 M diazinon 1x10 -6 M diazinon A 20 25 30 35 40 45 50 55 0 20 40 60 80 100 % i n h ib ic ij e A C h E t (° C) 1x10 -7 M malation 1x10 -6 M malation 20 25 30 35 40 45 50 55 0 20 40 60 80 100 % i n h ib ic ij e A C h E t (° C) 1x10 -7 M hlorpirifos 1x10 -6 M hlorpirifos C 20 25 30 35 40 45 50 55 0 20 40 60 80 100 % i n h ib ic ij e A C h E t (° C) 1x10 -7 M azinfos-metil 1x10 -6 M azinfos-metil D 20 25 30 35 40 45 50 55 0 20 40 60 80 100 % i n h ib ic ij e A C h E t (° C) 1x10 -7 M forat 1x10 -6 M forat E Slika 35. Uticaj temperature reakcione smeše na inhibiciju AChE u prisustvu oksidovanog A) diazinona, B) malationa, C) hlorpirifosa, D) azinfos-metila i E) forata (poetna koncentracija 1x10-6 i 1x10-7 M). Oksidacija se odvijala u prisustvu 100 nM MPO, 50 μM H2O2, tokom 10 minuta, na pH 6. 86 4.2.2.5.1. Odreivanje aktivacione energije oksidacije Budui da je reakcija oksidacije organo-tiofosfata posmatrana u uslovima pseudo- prvog reda, iz podataka prikazanih u poglavlju 4.2.2.5. bilo je mogue izraunati konstante brzina na razliitim temperaturama i prividnu energiju aktivacije za oksidaciju svakog pojedinanog pesticida. Koncentracije tio-oblika OP odreivanje su primenom AChE testa (poglavlje 3.3) i grafika na Slici 19 (kao razlika u koncentraciji pocetnog OP i nastalog okso-oblika). Konstante brzine reakcije odreene su fitovanjem eksperimentanih podataka jednainom: V0=kC0, gde je V0 poetna brzina reakcije na odreenoj temperaturi i za odreenu poetnu koncentraciju OP, k konstanta brzine reakcije na odreenoj temperaturi, a C0 poetna koncentracija OP. Rezultati su prikazani u Tabeli 15. Tabela 15. Konstante brzina na temperaturama 25, 30 i 37 °C i prividne energije aktivacije za oksidaciju ispitivanih OP u prisustvu 100 nM MPO OP k (min-1) Ea (KJ/mol) 25 °C 30 °C 37 °C Diazinon (5.07±0.72)x10-3 (5.35±1.52)x10-3 (6.15±0.42)x10-3 12.6±2.1 Malation (2.62±0.43)x10-2 (3.00±0.06)x10-2 (5.19±0.08)x10-2 45.0±9.9 Hlorpirifos (1.24±0.45)x10-2 (1.37±0.76)x10-2 (1.54±0.26)x10-2 13.8±0.5 Azinfos-metil (1.49±0.91)x10-3 (1.81±1.12)x10-3 (3.35±1.55)x10-3 53.0±9.9 Forat (1.34±0.39)x10-2 (1.39±0.14)x10-2 (1.94±0.44)x10-2 24.5±8.9 87 Iz rezultata prikazanih u Tabeli 15. vidi se da konstante brzine oksidacije rastu sa poveanjem temperature, što je i oekivano. Uticaj temperature na brzinu nekog elementarnog reakcionog koraka opisuje Arenijusova jednaina: k=Ae-Ea/RT gde je k konstanta brzine reakcije, A konstanta frekvencije sudara, Ea energija aktivacije, R gasna konstanta (8,314 Jmol-1K-1) i T temperature izražena u Kelvinovim stepenima. Iz logaritmovanog oblika ove jednaine i zavisnosti lnk od 1/T odreene su vrednosti Ea i date u Tabeli 15. Prividne energije aktivacije se kreu od 12.6 i 13.8 KJ/mol za diazinon i hlorpirifos, dok za forat, malation i azinfos-metil iznose 24.5, 45 i 53 KJ/mol, respektivno. Takoe, dobijene vrednosti su veoma sline energijama aktivacije oksidacija OP sa drugim agensima [204]. Opisno, energija aktivacije je veliina energetske barijere koju reaktanti moraju da savladaju u prelaznom stanju da bi nastao proizvod. Što je temperatura viša, to je vea brzina kretanja molekula, a samim tim i broj sudara u jedinici vremena i energija sudara. Sa povišavanjem temperature poveava se i broj sudara u kojima molekuli imaju dovoljno energije da savladaju energiju aktivacije. Samim tim se poveava i brzina hemijske (enzimske) reakcije. Dakle, što je energija aktivacije manja, to je reakcija brža. Za složene hemijske procese takoe je mogue primeniti Arenijusov izraz, ali je fiziki smisao parametara A i Ea drugaiji u odnosu na sluaj kada se posmatra elementarni reakcioni stupanj, a krajnja brzina hemijskog procesa zavisi od odnosa vrednosti predeksponencijalnog faktora A i vrednosti prividne Ea. Slino razliitim vrednostima prividne energije aktivacije, vrednost A za oksidaciju OP pomou MPO se nalazi u širokom intervalu vrednosti (-1 < ln A < 15). S obzirom da je za elementarni reakcioni korak vrednost A u vezi sa frekvencijom sudara reagujuih vrsta pretpostavljeno je da se vrednost predeksponencijalnog faktora u Arenijusovom izrazu može povezati sa afinitetom MPO prema odgovarajuem OP, opisanom pomou vrednosti Mihelis-Mentenove konstante Km (Slika 36). 88 0 5 10 15 20 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 azinfos metil diazinon malationhlorpirifos forat K m / μμ μμ M ln A R 2 = 0.97 Slika 36. Korelacija vrednosti Km i lnA za sve ispitivane OP Svi ispitivani OP, izuzev hlorpirifosa, pokazuju da obrnutu korelaciju lnA i Km. U sluaju hlorpirifosa naena je mala prividna Ea, dok uprkos maloj vrednosti predeksponencijalnog faktora A pokazuje vrlo veliku brzinu oksidacije pomou MPO koja takoe ima veliki afinitet prema ovom OP. 4.2.3. Primena utvrenih optimalnih uslova oksidacije OP u prisustvu MPO u modifikaciji AChE testa za detekciju OP Po odreivanju optimalnih uslova za oksidaciju organofosfata u prisustvu MPO, ispitana je inhibicija AChE pomou oksidovanih organo-tiofosfata u opsegu koncentracija od 1x10-3 do 1x10-9 M. Rezultati su prikazani zajedno sa inhibicionim krivama pojedinanih tio- (krive 1) i okso-oblika (krive 2) organofosfata na Slici 37. Na inhibicionim krivama se vidi da su okso-oblici za dva do tri reda veliine jai inhibitori od 89 tio-oblika pod istim eksperimentalnim uslovima. Uzorci organo-tiofosfata oksidovanih u prisustvu MPO pod optimalnim uslovima (10 minuta inkubacije sa 100 nM MPO u prisustvu 50 μM H2O2 na sobnoj temperaturi u 50 mM fosfatnom puferu pH 6) takoe su pod istim eksperimentalnim uslovima (poglavlje 3.3) bili inkubirani sa AChE. % aktivnosti AChE u odnosu na kontrolu posle inkubacije sa oksidovanim uzorcima OP u zavisnosti od njihove koncentracije prikazana je krivama 3 na Slici 37. Jasno se vidi da se posle inkubacije organo-tiofosfata sa MPO inhibicione krive (krive 3) pomeraju ka nižim opsezima koncentracija u odnosu na poetna jedinjenja, tj. tio-oblike (krive 1), i to za jedan do tri reda veliine. Ova pojava može se pripisati formiranju odgovarajuih okso-oblika. U Tabeli 16. prikazane su IC50 vrednosti za oksidovane oblike ispitivanih organo- tiofosfata dobijene fitovanjem eksperimentalnih podataka sigmoidnom krivom. Poreenjem dobijenih IC50 vrednosti sa IC50 vrednostima za tio-oblike odgovarajuih OP iz Tabele 8. (poglavlje 4.1.1.), vidi se da je pomeranje najvee za malation, gde je IC50 oksidovanog uzorka oko 1000 puta manja u odnosu na tio-oblik. Kod diazinona IC50 oksidovanog oblika je oko 100 puta manja, kod hlorpirifosa oko 30 puta, kod azinfos-metila 10 puta, dok je kod forata IC50 svega 2,5 puta manja u odnosu na neoksidovani organo-tiofosfat. Iz toga se može zakljuiti da je prevoenje malationa u malaokson u prisustvu MPO najviše doprinelo sniženju nivoa detekcije pomou ove metode, dok prevoenje forata u forat-okson ima najmanji efekat. 90 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 3 2 1 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) A 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 3 2 1 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) B 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 1 3 2 C 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 3 2 1 [OP] (M) A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) D 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 3 2 1 E Slika 37. Koncentraciona zavisnost inhibicije aktivnosti AChE indukovane A) diazinonom, B) malationom, C) hlorpirifosom, D) azinfos- metilom i E) foratom pre (1) i posle (3) izlaganja 100 nM mijeloperoksidazi tokom 10 minuta, kao i okso-formama svih OP (2) 91 Tabela 16. IC50 vrednosti dobijene fitovanjem eksperimentlnih podataka sigmoidnom krivom za organofosfate oksidovane u prisustvu 100 nM MPO i 50 μM H2O2 tokom 10 minuta, na sobnoj temperaturi u 50 mM fosfatnom puferu pH 6 OP IC50 (M) Oksidovani diazinon (2,10±0,95)x10-6 Oksidovani malation (2,45±0,55)x10-8 Oksidovani hlorpirifos (6,38±0,85)x10-6 Oksidovani azinfos-metil (1,82±0,35)x10-5 Oksidovani forat (1,14±0,05)x10-5 Oksidacija OP u prisustvu MPO pri optimizovanim uslovima može se upotrebiti za odreivanje koncentracije organo-tiofosfata u uzorcima. Iz rezultata prikazanih na Slici 37. konstruisani su kalibracioni grafici za odreivanje poetnih koncentracija svih ispitivanih organo-tiofosfata i prikazani na Slici 38. Pomou njih je mogue odrediti poetnu koncentraciju organo-tiofosfata u uzorku na osnovu inhibicije aktivnosti AChE. To naelno važi samo za koncentracije OP < 10-6 M, tj. koncentracije tio-oblika pri kojima ne dolazi do inhibicije AChE, kako bismo bili sigurni da inhibicija AChE potie samo od oksona. Ovo nije ograniavajui faktor za metodu, jer u realnim uzorcima relevantan opseg koncentracija OP i jeste < 10-6 M. 92 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 diazinon % i n h ib ic ij e A C h E [OP] (M) malation hlorpirifos azinfos-metil forat Slika 38. Kalibracioni grafici za odreivanje poetne koncentracije organo-tiofosfata u uzorku kada je utvreno koliko je njime inhibirana AChE Podaci na Slici 38. omoguavaju odreivanje i granice detekcije metode (koncentracija OP pri kojoj je aktivnost AChE inhibirana za 10%). U Tabeli 17. prikazane su koncentracije svakog od ispitivanih OP pri kojima dolazi do 10% inhibicije aktivnosti AChE. 93 Tabela 17. Limit detekcije (LD) metode za svaki od odreivanih organo-tiofosfata posle oksidacije uzoraka u prisustvu MPO OP LD (M) Diazinon (1,17±0,05)x10-7 Malation (3,40±0,05)x10-9 Hlorpirifos (6,61±0,05)x10-7 Azinfos-metil (6,53±0,05)x10-8 Forat (1,85±0,05)x10-7 Iz prikazanog se vidi da je ovom metodom mogue detektovati najniže koncentracije malationa, reda veliine 1x10-9 M. 4.2.3.1. Odreivanje efikasnosti oksidacije OP pomou modifikovanog AChE testa Na osnovu dobijenih rezultata AChE testa i UPLC analize odreena je efikasnost oksidacije OP u prisustvu MPO. Ispitani su rastvori OP koncentracije 1x10-5 M, koji su oksidovani na nain opisan u poglavlju 3.4, a iji su UPLC hromatogrami prikazani na Slikama 21-25. Efikasnost oksidacije je odreena kao odnos koncentracije nastalog okso- oblika i poetnog tio-oblika. Koncentracije OP odreivane su paralelno pomou AChE testa na osnovu grafika datog na Slici 37. i UPLC analize. Rezultati su prikazani u Tabeli 18. U prisustvu MPO najefikasnija je oksidacija malationa, a zatim slede hlorpirifos, diazinon, forat i azinfos-metil. 94 Tabela 18. Efikasnost oksidacije (odnos koncentracije nastalog okso-oblika i poetne koncentracije tio-oblika) OP poetne koncentracije 1x10-6 M posle 10 minuta inkubacije sa 100 nM MPO odreena pomou UPLC analize i AChE testa. OP Ctio-oblik ( x10 -7 M) Cokso-oblik ( x10 -7 M) Efikasnost (%) AChE test UPLC AChE test UPLC AChE test UPLC Diazinon 9,57±0,09 8,31±0,08 0,42±0,06 1,68±0,09 4 16 Malation 6,80±0,07 5,50±0,09 3,20±0,08 4,50±0,09 32 45 Hlorpirifos 9,08±0,05 8,19±0,04 0,92±0,08 1,81±0,05 9 18 Azinfos- metil 9,88±0,09 9,30±0,09 0,11±0,06 0,70±0,07 1 7 Forat 9,00±0,05 9,10±0,06 1,00±0,07 0,90±0,05 10 9 4.2.3.2. Uticaj smeše organofosfata na aktivnost AChE u nativnom obliku Da bi se utvrdilo da li ispitivani organofosfati imaju sinergistiko dejstvo, ispitan je uticaj njihove smeše na aktivnost AChE. Odreena je aktivnost AChE koja je inkubirana sa sintetikim smešama koje su sadržale neoksidovane i oksidovane OP. Smeše su sadržale jednake koncentracije svih ispitivanih OP, i to po 2x10-6, 2x10-7 i 2x10-8 M. Ispitivane smeše su inkubirane 10 minuta sa 100 nM MPO. Dobijene vrednosti su prikazane u Tabeli 95 19. i uporeene sa ranije dobijenim rezultatima za pojedinane organo-tiofosfate istih koncentracija. Tabela 19. Uticaj pojedinanih organo-tiofosfata i sintetike smeše pre i posle oksidacije u prisustvu 100 nM MPO na aktivnost AChE (vrednosti u tabeli su date kao srednja vrednost tri merenja) OP Inhibicija AChE (% od kontrole) Cpoetna (M) neokisidovano oksidovano 2x10-6 2x10-7 2x10-8 2x10-6 2x10-7 2x10-8 Diazinon 0 0 0 20 5 0 Malation 15 0 0 100 91 40 Hlorpirifos 8 0 0 23 1 0 Azinfos- metil 7 0 0 32 19 2 Forat 10 0 0 30 7 0 Smeša* 11 0 0 66 29 10 *Jednake koncentracije svakog pojedinanog OP (po 2x10-6, 2x10-7 i 2x10-8 M) Ukoliko mešanje ispitivanih organofosfata nema nikakav efekat na inhibicioni potencijal svake pojedinane komponete iz smeše, procenat inhibicije AChE koji indukuje smeša trebalo bi da bude jednak zbiru inhibicija koje izazivaju pojedinane komponente u koncentracijama istim kao u datoj smeši. Ukoliko je inhibicija AChE posle inkubacije enzima sa smešom manja od zbira inhibicija pojedinanim OP, znai da se javlja 96 antagonistiki efekat, dok je u sluaju da je vea re o sinergizmu. U Tabeli 19. prikazane su srednje vrednosti tri merenja inhibicije aktivnosti AChE indukovane oksidovanim i neoksidovanim pojedninanim OP i njihovom smešom. Za poreenje matematikog zbira inhibicija izazvanih pojedinanim OP sa inhibicijama izazvanim sintetiom smešom primenjen je test za analizu varijanse (One-way ANOVA). Antagonistiki efekat se definiše kao statistiki znaajna razlika (P<0,05) izmeu inhibicija izazvanim smešom OP i inhibicije dobijene sabiranjem pojedinanih uticaja OP na enzim. Primenom testa za analizu varijanse je utvreno da je zbir procenata inhibicije aktivnosti AChE pojedinanim komponentama znaajno vei od procenta inhibicije koja potie od sintetike smeše ispitivanih OP u istim koncentracijama. Iz toga sledi zakljuak da ispitivana jedinjenja u smeši ispoljavaju anatagonistiki efekat. 4.3. Oksidacija OP elektrohemijski generisanim Cl2, Br2 i I2 Cilj ovog dela rada bilo je generisanje halogena iz 0,1 M rastvora Cl-, Br- ili I-, koji bi se zatim upotrebili za oksidaciju organo-tiofosfata, ime bi se postigli vea efikasnost oksidacije, vei stepen inhibicije AChE i snizio nivo detekcije OP. 4.3.1. Elektrohemijsko generisanje halogena na elektrodi od staklastog ugljenika Elektrohemijsko generisanje halogena mogue je ispitati tehnikom cikline voltametrije (Slika 39). Dobijeni rezultati ukazuju da je, u saglasnosti sa vrednostima standardnih redoks-potencijala za reakciju X2 + 2e  2X - (Tabela 20), jodid najpodložniji oksidaciji, dok je za generisanje znaajnije koliine Cl2 potrebna duboka anodna polarizacija. 97 Tabela 20. Standardni elektrodni potencijali za reakciju X2 + 2e  2X - [205] Reakcija Eo / V vs. SVE* Cl2 + 2e  2Cl - +1,358 Br2 + 2e  2Br - +1,066 I2 + 2e  2I - +0,563 * SVE – standardna vodonina elektroda -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 -10 -5 0 5 10 15 20 25 j (m A c m -2 ) E vs. ZKE (V) PBS + 0.1 M Cl - PBS + 0.1 M Br - PBS + 0.1 M I - PBS Slika 39. Ciklovoltamogrami rastvora 50 mM PBS + 0,1 M X- (X- = Cl-, Br-, I-), brzina polarizacije 50 mV s-1. Hronopotenciometrijski eksperimenti (Slika 40.) takoe ukazuju na navedeni trend. Prema Tabeli 20, elektrohemijski generisani halogeni predstavljaju mona oksidaciona sredstva koja mogu da oksiduju organo-tiofosfate u sluaju da su prisutni u rastvoru. 98 Meutim, sami eletrogenerisani halogeni se u vodenoj sredini disproporcionišu prema jednaini reakcije: X2 + H2O   H + + X- + HXO. Ravnoteža date reakcije je pomerena u smeru reaktanata i to najviše kod joda (Tabela 21). 0 200 400 600 800 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 PBS + 0.1 Cl - PBS + 0.1 M Br - E v s . Z K E ( V ) t (s) PBS + 0.1 M I - Slika 40. Hronopotenciogrami rastvora 50 mM PBS + 0,1 M X- (X- = Cl-, Br-, I-), j = 2 mA cm-2 Tabela 21. Standardne konstante ravnoteže za reakciju disproporcionisanja X2 + H2O  H + + X- + HXO [206] Reakcija Ko Cl2 + H2O  H + + Cl- + HClO 310-4 Br2 + H2O  H + + Br- + HBrO 610-9 I2 + H2O  H + + I- + HIO 310-13 99 Reaktivnost nastalog X2 u smislu pomenute reakcije disproporcionisanja je lako uoljiva sa ciklovoltamograma ispitivanih rastvora (Slika 39). Naime, povratni pik u smeru katodne polarizacije je najizraženiji kod rastvora koji sadrži I-, dok je kod rastvora hlorida skoro potpuno odsutan. Nastale kiseline tipa HXO su vrlo slabe, ali i same predstavljaju vrlo mona oksidaciona sredstva, pri emu je, posmatrajui vrednosti standardnih redoks- potencijala u kiseloj sredini (Tabela 22), najpotentnije oksidaciono sredstvo HClO, a najslabije HIO. Tabela 22. Standardni elektrodni potencijali za redoks-reakcije HXO vrsta u kiseloj sredini [206] Reakcija Eo / V vs. SVE 2HClO + 2H+ + 2e  Cl2 + 2H2O +1,63 HClO + H+ + 2e  Cl- + H2O +1,49 2HBrO + 2H+ + 2e  Br2 + 2H2O +1,59 HBrO + H+ + 2e  Br- + H2O +1,07 2HIO + 2H+ + 2e  I2 + 2H2O +1,45 HIO + H+ + 2e  I- + H2O +0,54 Za razliku od HClO, koja je stabilna u vodenoj sredini, HBrO i HIO su vrlo reaktivne i praktino ne mogu ni da se izoluju u istom obliku [206]. Dakle, kao konaan rezultat elektrohemijskog generisanja X2 u vodenoj sredini, pored samog X2 dobijaju se u izvesnoj koliini reaktivne vrste tipa HXO koje pored X2 takoe mogu da oksiduju prisutan organo-tiofosfat. Imajui u vidu navedene vrednosti standardnih redoks potencijala, stabilnosti X2 u smislu disproporcionisanja u X - i HXO i reaktivnosti HXO, pretpostavljeno je da najefikasnija oksidacija organo-tiofostata u odgovarajue okso-oblike može da se oekuje u sluaju oksidacije elektrogenerisanim Br2, što je kasnije i potvreno. 100 4.3.2. Oksidacija OP elektrogenerisanim X2 (X = Cl, Br, I) U preliminarnim eksperimentima oksidacija organo-tiofosfata u odgovarajuu okso- formu u toku elektrohemijskog tretmana rastvora organo-tiofosfata bila je praena pomou UPLC-a, pri emu je uoena efikasna transformacija tio-forme u okso-formu. Na primeru oksidacije 1x10-5 M rastvora diaziona elektrogenerisanim Br2 (Slika 41) može se uoiti da nakon 15 minutnog anodnog tretmana rastvora pri ranije navedenim uslovima (odeljak 3.8.) koncentracija diazinona pada ispod granice detekcije UPLC-a, dok paralelno sa smanjenjem hromatografskog signala diazinona raste signal diazoksona. Nakon 15 min anodnog tretmana u rastvoru je detektovan jedino diazokson (Tabela 23). Pored toga, važno je napomenuti da degradacija nastalog proizvoda nije uoena nakon 2 sata po izvršenom elektrodnom tretmanu. Efekat anodnog tretmana na proizvode oksidacije (okso-forme) ispitana je merenjem inhibicije AChE anodno tretiranim rastvorom okso-formi ispitivanih organo-tiofosfata. AChE testom (odeljak 3.3) nije utvrena razlika u stepenu inhibicije koju daje rastvor odgovorajueg okso-oblika ispitivanih organo-tiofosfata pre i nakon 15 min anodnog tretmana, što znai da ovakav tretman ne dovodi do promena u strukturi ispitivanih oksona. Na osnovu pomenutih preliminarnih rezultata zakljueno je da oksidacija organo-tiofosfata anodno generisanim X2 predstavlja relativno lak i jednostavan nain za oksidaciju ispitivanih organo-tiofosfata u okso-oblike, ime se znaajno snižava njihova granica detekcije. 101 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 15 min 10 min 5 min A 2 4 5 RT (min) 0 min tio-forma okso-forma Slika 41. UPLC hromatogrami 1x10-5 M rastvora diazionona u toku elektrohemijske oksidacije pomou elektrogenerisanog Br2 Tabela 23. Koncentracije diazinona i diazoksona u reakcionoj smeši posle inkubacije diazinona sa elektrohemijski generisanim bromom tokom 0, 5, 10 i 15 minuta odreene UPLC analizom pomou kalibracionih grafika datih u prilogu (Slika P2). tinkubacije (min) Cdiazinon (M) Cdiazokson (M) 0 1,00x10-5 0 5 (0,90±0,05)x10-5 (0,12±0,05)x10-5 10 (0,75±0,05)x10-5 (0,26±0,05)x10-5 15 (0,01±0,05)x10-5 (0,98±0,05)x10-5 102 Diazinon, malation, hlorpirifos, azinfos-metil i forat (koncentracija od 1x10-3 do 1x10-9 M) okisidovani su pomou elektrohemijski generisanih hlora, broma i joda na prethodno opisan nain (poglavlje 3.8.) u ukupnoj zapremini od 20 mL. Oksidacija je praena u toku vremena elektrolize uzimanjem jednakih alikvota zapremine 400 L na poetku eksperimenta i nakon 5, 10 i 15 min. Nakon tog vremena, višak elektrogenerisanog halogena uklonjen je dodatkom 10 L 0,1 M rastvora Na2S2O3. Koliina nastalih odgovarajuih okso-oblika praena je pomou AChE testa (poglavlje 3.3). Iz literature je poznato [143], a na osnovu preliminarnih eksperimenata potvreno da dodatak Na2S2O3 ne utie na rezultate AChE testa. Svi eksperimenti su raeni na sobnoj temperaturi i uvani na ledu do trenutka analize. Rezultati su prikazani na Slikama 42, 43 i 44. Slika 42. sadrži grafike na kojima su prikazane zavisnosti stepena oksidacije ispitivanih organofosfata koncentracije 1x10-6 M od vremena anodnog tretmana rastvora halogenida. Iz prikazanog se vidi da oksidacija pomou generisanog joda ne vodi potpunoj inhibiciji AChE ni nakon 15 minuta anodnog tretmana, kao i hlorom u sluaju diazinona. Primenom hlora u sluaju forata, bilo je dovoljno i 10 minuta da se dostigne isti stepen oksidacije kao u sluaju kada je primenjen jod, u skladu sa tim da su hlorne vrste nastale anodnim tretmanom jaa oksidaciona sredstva od jodnih analoga. Kod oksidacije elektrohemijski generisanim bromom za isti efekat bilo je dovoljno 5 minuta za prevoenje malationa, hlorpirifosa i azinfos-metila u odgovarajue okso-oblike i potpunu inhibiciju AChE, a za diazinon i forat bilo je potrebno 10 minuta. Ovi rezultati prikazani su i na Slici 43. 103 0 5 10 15 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) hlorA brom jod 0 5 10 15 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) hlor B brom jod 0 5 10 15 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) hlor C brom jod 0 5 10 15 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) hlor D brom jod 0 5 10 15 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) t (min) hlor E brom jod Slika 42. Zavisnost aktivnosti AChE preostale posle inhibicije sa oksidovanim A) diazinonom, B) malationom, C) hlorpirifosom, D) azinfos- metilom i E) foratom (koncentracije 1x10-6 M) od vremena anodnog tretmana rastvora halogenida 104 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 5min A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 10min 15min diazinon diazokson 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 5min A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 10 min 15min malation malaokson 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 5min A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 10min 15min hlorpirifos hlorpirifosokson 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 10min 15min azinfosmetil azinfos-metil-okson 5min A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 5min A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) 10min 15min forat forat-okson Slika 43. Inhibicione krive tio- i okso-oblika ispitivanih OP, kao i okso-oblika dobijenih tokom 5, 10 i 15 minuta anodnog tretmana tio- oblika 105 U cilju lakšeg poreenja dobijenih rezultata, na Slici 44. prikazane su inhibicione krive svih ispitivanih organofosfata, kako oksidovanih 15 minuta pomou elektrohemijski generisanih halogena, tako i komercijalnih tio- i okso-formi OP. Iz prikazanog se jasno vidi da je u svim sluajevima došlo do pomeranja inhibicionih krivih ka okso-oblicima, kao i da je najefikasnija oksidacija postignuta upotrebom generisanog broma, što je u skladu sa ranije iznesenim zakljucima (Slika 42). Najmanji stepen oksidacije OP dobijen je oksidacijom pomou joda, dok se generisani hlor uvek ponašao kao bolji oksidans od joda, a u sluaju hlorpirifosa i forata oksidovao OP jednako efikasno kao brom. Iz podataka prikazanih na Slici 44. odreene su vrednosti IC50 za okso-forme dobijene oksidacijom OP u prisustvu halogena i prikazane u Tabeli 24. Iz datih vrednosti jasno se može zakljuiti da je elektrogenerisani Br2 najpotentniji oksidans u ovoj grupi pod datim uslovima za sve ispitivane OP. Kada se ove vrednosti uporede sa IC50 vrednostima za tio-oblike odgovarajuih OP iz Tabele 8. (poglavlje 4.1.1.), vidi se da je promena najvea za azinfos-metil, gde je IC50 oko 10000 puta manje za uzorak oksidovan elektrogenerisanim bromom u toku 15 minuta. Za diazinon, malation i hlorpirifos IC50 se smanjilo oko 1000 puta, a u sluaju forata oko 400 puta u odnosu na neoksidovani uzorak. 106 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) diazokson diazinon hlor brom jod 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) malaokson malation hlor brom jod 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) hlorpirifos-okson hlorpirifos hlor brom jod 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) azinfos-metil okson azinfos-metil hlor brom jod 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 0 20 40 60 80 100 forat hlor brom jod A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [OP] (M) forat-okson Slika 44. Inhibicione krive tio- i okso-oblika ispitivanih OP, kao i okso-oblika dobijenih oksidacijom tio-oblika tokom 15 minuta pomou elektrohemijski generisanih hlora, broma i joda 107 Tabela 24. IC50 vrednosti za ispitivane OP oksidovane pomou eleketrohemijski generisanih hlora, broma i joda OP IC50 (M) Cl2 Br2 I2 Oksidovani diazinon (1,00±0,51)x10-6 (8,17±0,96)x10-8 (2,06±0,23)x10-6 Oksidovani malation (1,79±0,35)x10-8 (1,39±0,74)x10-8 (1,07±0,31)x10-6 Oksidovani hlorpirifos (7,50±0,78)x10-8 (6,14±0,55)x10-8 (6,21±0,28)x10-7 Oksidovani azinfos-metil (4,11±0,91)x10-8 (1,80±0,12)x10-8 (1,15±0,58)x10-7 Oksidovani forat (2,04±0,34)x10-7 (1,82±0,39)x10-7 (4,53±0,53)x10-7 Kao i u sluaju oksidacije OP u prisustvu MPO, pomou podataka prikazanih na Slici 44. mogue je konstruisati kalibracione grafike za odreivanje poetnih koncentracija ispitivanih OP u uzorcima. Grafici su prikazani na Slici 45. Iz ovih grafika takoe su odreene i granice detekcije metode (koncentracija OP koja inhibira aktivnost AChE za 10%) posle oksidacije uzoraka pomou elektorgenerisanog broma i prikazane u Tabeli 25. 108 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 diazinon % i n h ib ic ij e A C h E [OP] (M) malation hlorpirifos azinfos-metil forat Slika 45. Kalibracioni grafici za odreivanje poetne koncentracije OP u uzorku oksidovanom elektrogenerisanim bromom ako je poznato koliko je njime inhibirana AChE Tabela 25. Limit detekcije metode za svaki od odreivanih organo-tiofosfata posle oksidacije pomou elektrohemijski generisanog broma OP LD (M) Diazinon (1,74±0,05)x10-8 Malation (2,50±0,05)x10-9 Hlorpirifos (1,30±0,05)x10-8 Azinfos-metil (4,38±0,05)x10-9 Forat (3,28±0,05)x10-8 109 4.4. Poreenje efekta oksidacije OP razliitim metodama na njihovo odreivanje pomou AChE testa Kako bi se uporedile enzimska i oksidacija OP pomou elektrogenerisanih halogena, IC50 vrednosti dobijene pod optimalnim uslovima oksidacije u oba sluaja prikazane su u Tabeli 26. Tabela 26. IC50 vrednosti za ispitivane OP, oksidovane pod optimalnim uslovima u prisustvu MPO (enzimska oksidacija) i elektrogenerisanog Br2 (elektrohemijska oksidacija) OP IC50 (M) Enzimska oksidacija Elektrohemijska oksidacija Oksidovani diazinon (2,10±0,95)x10-6 (8,17±0,96)x10-8 Oksidovani malation (2,45±0,55)x10-8 (1,39±0,74)x10-8 Oksidovani hlorpirifos (6,38±0,85)x10-6 (6,14±0,55)x10-8 Oksidovani azinfos-metil (1,82±0,35)x10-5 (1,80±0,12)x10-8 Oksidovani forat (1,14±0,05)x10-5 (1,82±0,39)x10-7 Iz prikazanih rezultata može se zakljuiti da je oksidacija pomou elektrohemijski generisanog broma u svim ispitivanim sluajevima efikasnija od enzimske oksidacije pomou MPO. U zavisnosti od OP, stepen oksidacije se razlikuje. Kod malationa, koji je u oba sluaja dao najbolji rezultat, ta razlika je neznatna i red veliine je isti. Što se tie ostalih ispitivanih OP, IC50 vrednosti dobijene u sluaju oksidacije elektrohemijski generisanim bromom su za oko dva reda veliine manje od onim dobijenih oksidacijom pomou MPO u sluaju diazinona, hlorpirifosa i forata, a ak 1000 puta kada je re o azinfos-metilu. 110 Uporeene su i vrednosti limita detekcije metode posle oksidacija OP u prisustvu MPO i elektrogenerisanog broma (Tabela 27). Iz prikazanih rezultata jasno se vidi da je granica detekcije metode niža za ceo red veliine kada se uzorak oksiduje elektrohemijski. Ovo jedino ne važi u sluaju malationa, kada je limit detekcije nezavisan od naina oksidacije. Razlog tome je što se u oba sluaja oksidacijom stvara tolika koncentracija malaoksona koja potpuno inhibira AChE, pa se razlika ne može primetiti. Tabela 27. Granice detekcije (LD) za ispitivane OP oksidovane pod optimalnim uslovima u prisustvu MPO (enzimska oksidacija) i elektrogenerisanog Br2 (elektrohemijska oksidacija) OP LD (M) Enzimska oksidacija Elektrohemijska oksidacija Diazinon (1,17±0,05)x10-7 (1,74±0,05)x10-8 Malation (3,40±0,05)x10-9 (2,50±0,05)x10-9 Hlorpirifos (6,61±0,05)x10-7 (1,30±0,05)x10-8 Azinfos-metil (6,53±0,05)x10-8 (4,38±0,05)x10-9 Forat (1,85±0,05)x10-7 (3,28±0,05)x10-8 Rezultati pokazuju da je elektrohemijska oksidacija organo-tiofosfata znatno efikasnija. U oba sluaja, nastali okso-oblici stabilni su najmanje 1 h. Metoda enzimske oksidacije znatno krae traje, robustnija je, izvoenje je jednostavnije, a otpad koji ostaje posle procesa je neškodljiv po okolinu. Takoe, opisana oksidacija OP anodnim tretmanom zahteva relativno komplikovanu instrumentaciju i iskljuuje mogunost primene metode van posebno opremljenih laboratorija. U poreenju sa anodnim tretmanima koji za cilj imaju snižavanje granica detekcije OP opisanim u literaturi [143] opisana metoda indirektne elektrohemijske oksidacije OP ima za prednost visoku efikasnost (granice detekcije su skoro iste onima za iste okso-forme i praktino limitirane granicom detekcije 111 AChE testa), dok u odnosu na iste pruža mogunost efikasne oksidacije uzoraka relativno malih zapremina (reda 1 mL). 4.5. Odredjivanje koncentracije OP u realnim uzorcima Budui da je oksidacija u prisustvu MPO dala optimalne rezultate za snižavanje granice detekcije OP pomou AChE testa, ova modifikovana metoda primenjena je i za odreivanje pesticida u realnim uzorcima. Kao uzorak upotrebljen je bistri sok od jabuke u koji su dodati diazinon i malation koncentracije 1x10-5 M, kao i smeša u kojoj se ova dva OP nalaze u jednakim koncentracijama (ukupno 1x10-5 M). U uzorcima je pre poetka analize pH doveden na pH 6. Uzorci su zatim oksidovani u prisustvu 100 nM MPO i 50 μM H2O2 tokom 10 minuta, na sobnoj temperaturi. Rezultati su prikazani u Tabeli 28, zajedno sa rezultatima inhibicije AChE u prirustvu OP istih koncentracija u vodi, kako neoksidovanih, tako i oksidovanih pod istim uslovima. Iz prikazanog se vidi da je slaganje za neoksidovane uzorke pesticida u soku i u vodi veoma dobro, dok oksidovani uzorci pokazuju velike razlike u procentu inhibicije AChE. Mogue je da neka jedinjenja prisutna u soku ometaju inhibiciju AChE pomou OP, te se ova metoda mora još modifikovati u smislu pripreme uzoraka, kako bi se mogla koristiti za ispitivanja u realnim sistemima. 112 Tabela 28. Aktivnost AChE posle izlaganja neoksidovanim i oksidovanim diazinonu i malationu koncentracije 1x10-5 M, koji se nalaze i soku ili vodi, pojedinano i u smeši. Oksidacija OP se odvijala u prisustvu 100 nM MPO i 50 μM H2O2 tokom 10 minuta, na sobnoj temperaturi. OP C (M) Aktivnost AChE (% od kontrole) neoksidovan oksidovan sok voda sok voda Diazinon 1x10-5 98±3 95±5 74±2 25±4 Malation 1x10-5 80±6 72±2 60±2 0±1 Smeša* 1x10-5 89±2 83±2 69±3 10±4 *jednake koncentracije diazinona i malationa (0,5x10-5 M) 4.6. FIA sistem za detekciju OP Efekat ispitivanih OP pre i posle oksidacije ispitan je i na imobilizovanom enzimu pomou FIA sistema. Testirane su razliite brzine protoka, od 0,1 do 1 mL/min. Inhibicija enzima odreivana je poreenjem enzimske aktivnosti pre i posle prolaska 200 μL rastvora pesticida željene koncentracije kroz bioanalitiku kolonu za odreeni period vremena. Procedura za odreivanje uticaja OP na imobilizovanu AChE je ukljuivala sledee korake: odreivanje poetne aktivnosti enzima u bioanalitikoj koloni, injektovanje uzorka koji sadrži pesticid i injektovanje supstrata radi odreivanja preostale enzimske aktivnosti (Shema 7). Nosei pufer je propuštan kroz sistem dok se bazna linija ne stabilizuje, a zatim je smeša od ASChI i DTNB injektovana i beležen je odgovor. Procedura je ponavljana najmanje tri puta (S1, S2, S3), a prosena vrednost signala (a1, a2, a3) je korišena u daljim raunima. Zatim je injektovan uzorak koji sadrži pesticid (SP). Odreivanje preostale aktivnosti enzima (ar) je postizano pomou još jedne injekcije supstrata (Sr). Preostala aktivnost enzima izražavana je kao procenat od intenziteta signala pre injekcije uzorka. Posle svakog ciklusa inhibicije, enzim je reaktiviran injektovanjem 4 mM 2-PAM. 113 Shema 7. Odreivanje uticaja OP na imobilizovanu AChE u FIA sistemu 4.6.1. Odreivanje radnih parametara FIA sistema Pre odreivanja uticaja oksidovanih OP na imobilizovanu AChE, bilo je neophodno uspostaviti radne parametre FIA sistema. Najpre je ispitano kako brzina protoka utie na visinu signala. Na Slici 46. su prikazani rezultati. Jasno se može videti da je signal vei što je brzina protoka pufera kroz sistem manja. Ovaj rezultat je oekivan, budui da sa manjim protokom supstrat duže vreme provede u kontaktu sa imobilizovanim enzimom. Najbolji signal dobijen je pri brzini protoka 0,1 mL/min. 114 0 25 50 75 100 0 100 200 300 400 500 600 700 0.1 mL/min 0.3 mL/min 0.5 mL/min In te n z it e t s ig n a la t (min) Slika 46. Visina FIA signala u zavisnosti od brzine protoka Sledei parametar koji je odreivan bila je stabilnost kontrole pri brzini protoka od 0,1 mL/min tokom vremena. Iz rezultata prikazanih na Slici 47. vidi se da se površina signala neznatno menja sa vremenom, što se može smatrati da je to u granicama eksperimentalne greške. 115 0 25 50 75 100 0 100 200 300 400 500 In te n z it e t s ig n a la t (min) Slika 47. Stabilnost kontrolne probe pri brzini protoka 0,1 mL/min Ispitano je i da li e enzim posle izlaganja 2-PAM-u potpuno povratiti svoju aktivnost. Po prethodno opisanoj proceduri dobijen je kontrolni signal. Zatim je imobilizovana AChE inhibirana u priustvu malaoksona koncentracije 1x10-6 M. Posle toga, enzim je izložen dejstvu 4 mM 2-PAM. Protok je tokom cele analize bio konstantan i iznosio 0,1 mL/min. Rezultati su prikazani na Slici 48. Može se uoiti da je regenerisani signal manji od kontrolnog, što znai da enzim nije povratio svoju punu aktivnost. Ovaj rezultat ukazuje na to da je upotreba imobilizovane AChE u ovom sistemu ograniena na odreen broj ciklusa. Onog trenutka kada enzim nije mogao biti reaktiviran do bar 90 % poetne aktivnosti, kolona je ponovo punjena. 116 0 25 50 75 100 125 150 0 100 200 300 400 regenerisano sa 2-PAM malaokson 1x10 -6 M kontrola In te n z it e t s ig n a la t (min) Slika 48. Regeneracija imobilizovane AChE sa 2-PAM u FIA sistemu 4.6.2. Inhibicija imobilizovane AChE u prisustvu OP Po utvrivanju radnih parametara sistema, bilo je mogue ispitati kako uzorci organo-tiofosfata oksidovani u prisustvu MPO deluju na imobilizovanu AChE. Odgovor imobilizovane AChE na neoksidovane i oksidovane OP praen je u prisustvu svakog ispitivanog OP koncentracije 1x10-7 M pojedinano i u smeši. Sva jedinjenja ispitana su pri brzinama protoka 0,1 i 0,5 mL/min. Signali dobijeni na taj nain prikazani su na Slici 49. Neoksidovani uzorci istih koncentracija OP nisu inhibirali enzim (Tabela 29). Posle svake inhibicije oksidovanim OP, AChE je reaktivirana pomou 2-PAM pri protoku od 0,1 mL/min (izabran je minimalan protok kako bi reaktivacija enzima bila pouzdana), kako bi povratila poetnu aktivnost (kontrolna vrednost). Kao što se sa Slike 49. može videti, u toku eksperimenta kontrolni signal se nije znaajno smanjivao. 117 0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 400 500 ko n tr o la k o n tr o la k o n tr o la k o n tr o la In te n z it e t s ig n a la t (min) k o n tr o la h lo rp ir if o s fo ra t a z in fo s -m e ti l s m e š a d ia z in o n A 0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 400 500 600 k o n tr o la k o n tr o la k o n tr o la k o n tr o la In te n z it e t s ig n a la t (min) k o n tr o la d ia z in o n h lo rp ir if o s fo ra t a z in fo s -m e ti l s m e š a B Slika 49. FIA signali pri protoku A) 0,5 mL/min i B) 0,1 mL/min pre (kontrola) i posle inhibicije AChE u prisustvu OP koncentracije 1x10-7 M 118 Kao granica detekcije uzeto je smanjenje signala za 10 % od vrednosti kontrolnog signala. Može se primetiti da snižavanje protoka FIA sistema sa 0,5 na 0,1 mL/min dovodi do poveanja kontrolnih signala za oko 10 %, dok se signali dobijeni merenjem zaostale aktivnosti posle ubrizgavanja OP smanjuju (Tabela 29). Na osnovu toga, može se zakljuiti da snižavanje protoka FIA sistema sa 0,5 na 0,1 mL/min vodi ka poveanju detekcionog limita ove metode. Oksidacija OP u sklopu njihovog odreivanja u protonim sistemima sa imobilizovanim enzimom je i ranije prouavana. Hloroperoksidaza u citratnom puferu korišena je kao okisidaciono sredstvo pri odreivanju OP pomou bioanalitikog eseja zasnovanog na inhibiciji AChE u FIA sistemu sa termalnim soivima kao detektorom [127; 198]. I brom je korišen kao in situ oksidans za vodene uzorke u FIA sistemu. Nije poznato kolika je efikasnost te oksidacije, kao ni da li ima nekih neželjenih proizvoda [106; 107; 108; 109]. Tabela 29. Uticaj brzine protoka na odgovor imobilizovane AChE u FIA sistemu za oksidovane OP koncentracije 1x10-7 M Intenzitet signala (% od kontrole) Protok (mL/min) 0,1 0,5 0,1 OP Neoksidovan Oksidovan Diazinon 100 78±5 70±7 Malation 100 65±5 59±2 Hlorpirifos 100 84±4 77±3 Azinfos-metil 96 80±3 80±5 Forat 100 67±3 57±4 Sintetika smeša* 100 80±5 72±2 *sadrži 0,2x10-7 M svakog OP 119 5. ZAKLJUAK Odreivanje OP pomou AChE testa je modifikovano. Enzim AChE inhibiran je sledeim organofosfatima: diazinon, diazokson, malation, malaokson, hlorpirifos, hlorpirifos-okson, azinfos-metil, azinfos-metil-okson, forat i forat-okson. Za ispitivane OP odreene su IC50 vrednosti. U cilju snižavanja granice detekcije metode primenjena je oksidacija OP. Diazinon, malation, hlorpirifos, azinfos-metil i forat su najpre oksidovani u prisustvu MPO, pri emu je utvreno da su optimalni uslovi za oksidaciju 50 μM H2O2, 100 nM MPO, 10 minuta inkubacije MPO i OP, pH 6 i sobna temperatura (25 °C). Proizvodi oksidacije su identifikovani kao odgovarajui oksoni pomou UPLC i GC/MS analize. Takoe je pokazano da su oksoni dobijeni na ovaj nain stabilni tokom 1h. Oksidacija OP u prisustvu MPO pod optimalnim uslovima primenjena je kao modifikacija AChE testa za detekciju OP. Na taj nain dobijene su IC50 vrednosti od 2,5 do 1000 puta manje nego za neoksidovane OP. Odreene su i granice detekcije za svaki ispitivani OP: 1,17x10-7 M za diazinon, 3,40x10-9 M za malation, 6,61x10-7 M za hlorpirifos, 6,53x10-8 M za azinfos- metil i 1,85x10-7 M za forat. Utvreno je da se u prisustvu MPO najefikasnije oksiduje malation, a zatim slede diazinon, hlorpirifos, forat i azinfos-metil. Kada se svi ispitivani organo-tiofosfati nau u smeši ispoljavaju antagonistiki efekat. Diazinon, malation, hlorpirifos, azinfos-metil i forat oksidovani su i pomou elektrohemijski generisanih hlora, broma i joda. Utvreno je da je oksidacija najefikasnija pri inkubaciji OP sa bromom tokom 15 minuta. Proizvodi oksidacije su identifikovani pomou UPLC analize. Indirektna elektrohemijska oksidacija je primenjena kao modifikacija u AChE testu, pri emu su dobijene IC50 vrednosti 400 do 10000 puta manje od onih za neoksidovane OP. Granice detekcije za svaki ispitivani organo-tiofosfat, dobijene pri ovoj modifikaciji testa, su 1,74x10-8 M za diazinon, 2,50x10-9 M za malation, 1,30x10-8 M za hlorpirifos, 4,38x10-9 M za azinfos-metil i 3,28x10-8 M za forat. Uporeen je efekat enzimske i elektrohemijske oksidacije kao modifikacije AChE testa i naeno da su IC50 vrednosti 100 do 1000 puta niže kada se OP oksiduju elektrohemijski. S tim u skladu, granice detekcije dobijene primenom elektrohemijske oksidacije OP su za red veliine niže 120 od onih koje se dobijaju pri enzimskoj oksidaciji. Oksidacija OP pomou elektrogenerisanih halogena je i ekonominija u odnosu na enzimsku. Ipak, oksidacija u prisustvu MPO krae traje, jednostavnija za izvoenje, a otpad koji ostaje u procesu je neškodljiv po okolinu. Ova metoda je i pogodnija za terensko izvoenje analiza. Uvoenjem imobilizovane AChE i FIA sistema u test snižava nivo detekcije za još jedan red veliine. 121 6. LITERATURA [1] K.H. Büchel, Chemistry of pesticides, John Wiley & Sons, Inc., 1983. [2] R.I. Krieger, Handbook of Pesticide Toxicology: Principles, Academic Press, 2001. [3] G. Matolcsy, M. Nádasy, V. Andriska, and S. Terényi, Pesticide chemistry, Elsevier, 1988. [4] D.J. Mini, Hemija pesticida, dobijanje i primena, Dušan Mini, Beograd, 1994. [5] A. Moretto, and M.K. Johnson, Toxicology of pesticides: experimental, clinical and regulatory perspectives, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1987. [6] S. Bon, M. Vigny, and J. Massoulié, Asymmetric and globular forms of acetylcholinesterase in mammals and birds. Proceedings of the National Academy of Sciences 76 (1979) 2546-2550. [7] J.L. Sussman, M. Harel, F. Frolow, C. Oefner, A. Goldman, L. Toker, and I. Silman, Atomic Structure of Acetylcholinesterase from Torpedo californica: A Prototypic Acetylcholine-Binding Protein. Science 253 (1991) 872-879. [8] D.A. Dougherty, and D.A. Stauffer, Acetylcholine Binding by a Synthetic Receptor: Implications for Biological Recognition. Science 250 (1990) 1558-1560. [9] T.L. Rosenberry, and E. Neumann, Interaction of ligands with acetylcholinesterase. Use of temperature-jump relaxation kinetics in the binding of specific fluorescent ligands. Biochemistry 16 (1977) 3870-3878. [10] K.C. Gulla, M.D. Gouda, M.S. Thakur, and N.G. Karanth, Reactivation of immobilized acetyl cholinesterase in an amperometric biosensor for organophosphorus pesticide. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 1597 (2002) 133-139. [11] D. Barceló, S. Lacorte, and J.L. Marty, Validation of an enzymatic biosensor with liquid chromatography for pesticide monitoring. Trends Anal. Chem. 14 (1995) 334- 340. [12] L.D. Betowski, and T.L. Jones, The analysis of organophosphorus pesticide samples by high-performance liquid chromatography/mass spectrometry and high- 122 performance liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry. Environmental Science & Technology 22 (1988) 1430-1434. [13] C.G. Cabanillas, and R. Bushway, Analysis of Phosmet and Azinphos-Methyl in Apples by High-Performance Liquid Chromatography. Journal of Liquid Chromatography 14 (1991) 3603 - 3613. [14] X. Guardino, J. Obiols, M.G. Rosell, A. Farran, and C. Serra, Determination of chlorpyrifos in air, leaves and soil from a greenhouse by gas-chromatography with nitrogen-phosphorus detection, high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 823 (1998) 91-96. [15] B. Fried, J. Sherma, and E. Corporation, Handbook of Thin-Layer Chromatography, Marcel Dekker, 2003. [16] X. Cheng, Q. Wang, S. Zhang, W. Zhang, P. He, and Y. Fang, Determination of four kinds of carbamate pesticides by capillary zone electrophoresis with amperometric detection at a polyamide-modified carbon paste electrode. Talanta 71 (2007) 1083- 1087. [17] K.S. Liapis, P. Aplada-Sarlis, and N.V. Kyriakidis, Rapid multi-residue method for the determination of azinphos methyl, bromopropylate, chlorpyrifos, dimethoate, parathion methyl and phosalone in apricots and peaches by using negative chemical ionization ion trap technology. Journal of Chromatography A 996 (2003) 181-187. [18] L. Pogacnik, Development and application of photothermal biosensor for detection of organophosphate and carbamate pesticides, Polytehnic School of Environmental Sciences, University of Nova Gorica, Nova Gorica, 2001. [19] M.P. Byfield, and R.A. Abuknesha, Biochemical aspects of biosensors. Biosensors and Bioelectronics 9 (1994) 373-399. [20] J. Davis, D. Huw Vaughan, and M.F. Cardosi, Elements of biosensor construction. Enzyme and Microbial Technology 17 (1995) 1030-1035. [21] R.S. Phadke, Biosensors and enzyme immobilized electrodes. Biosystems 27 (1992) 203-206. [22] L.D. Mello, and L.T. Kubota, Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink industries. Food Chemistry 77 (2002) 237-256. 123 [23] J. Fitzpatrick, L. Fanning, S. Hearty, P. Leonard, B.M. Manning, J.G. Quinn, and R. O'Kennedy, Applications and Recent Developments in the use of Antibodies for Analysis. Analytical Letters 33 (2000) 2563-2609. [24] M. Wilchek, and E.A. Bayer, The avidin-biotin complex in bioanalytical applications. Analytical Biochemistry 171 (1988) 1-32. [25] E. Boer, and R. Beumer, Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. International Journal of Food Microbiology 50 (1999) 119-130. [26] M. Wolcott, DNA-based rapid methods for the detection of foodborne pathogens. Journal of Food Protection 54 (1991) 387-401. [27] S. Frieder, and S. Florian, Chapter 2 Physicochemical, Biochemical and Technological Fundamentals of Biosensors, Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Elsevier, 1992, pp. 7-84. [28] J.H.T. Luong, A. Mulchandani, and G.G. Guilbault, Developments and applications of biosensors. Trends in Biotechnology 6 (1988) 310-316. [29] D. Gibson, P. Coombs, and D. Pimbley, Automated conductance method for the detection of Salmonella in foods: collaborative study. Journal of AOAC International 75 (1992) 293-297. [30] P. Feng, Commercial assay systems for detecting foodborne Salmonella: a review. Journal of Food Protection 55 (1992) 927-934. [31] S.S. Deshpande, and R.M. Rocco, Biosensors and their potential use in food quality control. Food Technology 48 (1994) 146-150. [32] P. Buhlmann, E. Pretsch, and E. Bakker, Carrier-based ion-selective electrodes and bulk optodes. 2. Ionophores for potentiometric and optical sensors. Chemical Reviews 98 (1998) 1593-1687. [33] I. Karube, and M. Suzuki, Microbiosensors for Food Analysis, Biosensor Design and Application, American Chemical Society, 1992, pp. 10-25. [34] R. Koncki, S. Glab, J. Dziwulska, I. Palchetti, and M. Mascini, Disposable strip potentiometric electrodes with solvent-polymeric ion-selective membranes fabricated using screen-printing technology. Analytica Chimica Acta 385 (1999) 451-459. [35] U. Krull, Biosensors for chemical analysis. Chemtech 20 (1990) 372-377. 124 [36] R.F. Taylor, I.G. Marenchic, and R.H. Spencer, Antibody- and receptor-based biosensors for detection and process control. Analytica Chimica Acta 249 (1991) 67-70. [37] K. Wan, J.M. Chovelon, N. Jaffrezic-Renault, and A.P. Soldatkin, Sensitive detection of pesticide using ENFET with enzymes immobilized by cross-linking and entrapment method. Sensors and Actuators B: Chemical 58 (1999) 399-408. [38] K. Wan, J.M. Chovelon, and N. Jaffrezic-Renault, Enzyme-octadecylamine Langmuir-Blodgett membranes for ENFET biosensors. Talanta 52 (2000) 663-670. [39] R.-I. Stefan, J.F.v. Staden, and H.Y. Aboul-Enein, Electrochemical Sensor Arrays. Critical Reviews in Analytical Chemistry 29 (1999) 133-153. [40] J.L. Brooks, B. Mirhabibollahi, and R.G. Kroll, Experimental enzyme-linked amperometric immunosensors for the detection of salmonellas in foods. Journal of Applied Microbiology 73 (1992) 189-196. [41] I. Hamid, D. Ivnitski, P. Atanasov, and E. Wilkins, Fast amperometric assay for E. coli O157:H7 using partially immersed immunoelectrodes. Electroanalysis 10 (1998) 758-763. [42] J. Rishpon, and D. Ivnitski, An amperometric enzyme-channeling immunosensor. Biosensors and Bioelectronics 12 (1997) 195-204. [43] W. Seitz, Chemical sensors based on immobilized indicators and fiber optics. CRC Critical Reviews in Analytical Chemistry 19 (1988) 135-173. [44] B.A.A. Dremel, B.P.H. Schaffar, and R.D. Schmid, Determination of glucose in wine and fruit juice based on a fibre-optic glucose biosensor and flow-injection analysis. Analytica Chimica Acta 225 (1989) 293-301. [45] M. Mehrvar, C. Bis, J.M. Scharer, M.M. Young, and J.H. Luong, Fiber-Optic Biosensors-Trends and Advances. Analytical Sciences 16 (2000) 677-692. [46] K. Mosbach, Thermal biosensors. Biosensors and Bioelectronics 6 (1995) 179-182. [47] P. Bataillard, Calorimetric sensing in bioanalytical chemistry: Principles, applications and trends. TrAC Trends in Analytical Chemistry 12 387-394. [48] K. Ramanathan, B.R. Jönsson, and B. Danielsson, Sol-gel based thermal biosensor for glucose. Analytica Chimica Acta 427 (2001) 1-10. 125 [49] K. Ramanathan, M. Rank, J. Svitel, A. Dzgoev, and B. Danielsson, The development and applications of thermal biosensors for bioprocess monitoring. Trends in Biotechnology 17 (1999) 499-505. [50] B. Xie, M. Mecklenburg, B. Danielsson, O. Ohman, P. Norlin, and F. Winquist, Development of an integrated thermal biosensor for the simultaneous determination of multiple analytes. Analyst 120 (1995) 155-160. [51] J.W. Grate, S.L. Rose-Pehrsson, D.L. Venezky, M. Klusty, and H. Wohltjen, Smart sensor system for trace organophosphorus and organosulfur vapor detection employing a temperature-controlled array of surface acoustic wave sensors, automated sample preconcentration, and pattern recognition. Analytical Chemistry 65 (1993) 1868-1881. [52] C. O’Sullivan, R. R. Vaughan, and G.G. Guilbault, Piezoelectric immunosensors- theory and applications. Analytical Letters 32 (1999) 2353-2377. [53] F. Scheller, F. Schubert, D. Pfeiffer, R. Hintsche, I. Dransfeld, R. Renneberg, U. Wollenberger, K. Riedel, M. Pavlova, M. Kuhn, H.-G. Muller, P.m. Tan, W. Hoffmann, and W. Moritz, Research and development of biosensors. A review. Analyst 114 (1989) 653-662. [54] B. Eggins, Biosensors, An Introduction, John Wiley & Sons Ltd, Baffins Lane, Chichester, 1996. [55] G. Boisdé, Chemical and Biochemical Sensing with Optical Fibers and Waveguides, Artech House, Massachusetts, 1996. [56] A. Scott, Biosensors for food analysis, Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 1998. [57] P.D. Patel, (Bio)sensors for measurement of analytes implicated in food safety: a review. TrAC Trends in Analytical Chemistry 21 (2002) 96-115. [58] P.A. Paredes, J. Parellada, V.M. Fernandez, I. Katakis, and E. Dominguez, Amperometric mediated carbon paste biosensor based on D-fructose dehydrogenase for the determination of fructose in food analysis. Biosens. Bioelectron. 12 (1997) 1233- 1243. [59] F. Amárita, C.R. Fernández, and F. Alkorta, Hybrid biosensors to estimate lactose in milk. Analytica Chimica Acta 349 (1997) 153-158. 126 [60] B. Leca, and J.-L. Marty, Reusable ethanol sensor based on a NAD+-dependent dehydrogenase without coenzyme addition. Analytica Chimica Acta 340 (1997) 143- 148. [61] V.C. Dall'Orto, C. Danilowicz, I. Rezzano, M.D. Carlo, and M. Mascini, Comparison between Three Amperometric Sensors for Phenol Determination in Olive Oil Samples. Analytical Letters 32 (1999) 1981-1990. [62] Y.C. Lee, and M.H. Huh, Development of a biosensor with immobilized L-amino acid oxidase for determination of L-amino acids. Journal of Food Biochemistry 23 (1999) 173-185. [63] M. Situmorang, D. Brynn Hibbert, J. Justin Gooding, and D. Barnett, A sulfite biosensor fabricated using electrodeposited polytyramine: application to wine analysis. Analyst 124 (1999) 1775-1779. [64] I. Abdel-Hamid, D. Ivnitski, P. Atanasov, and E. Wilkins, Highly sensitive flow- injection immunoassay system for rapid detection of bacteria. Analytica Chimica Acta 399 (1999) 99-108. [65] E. Medyantseva, M. Vertlib, G. Budnikov, and M. Tyshlek, Appl. Biochem. Microbiol. 34 (1998) 202-205. [66] G.S. Nunes, P. Skládal, H. Yamanaka, and D. Barceló, Determination of carbamate residues in crop samples by cholinesterase-based biosensors and chromatographic techniques. Analytica Chimica Acta 362 (1998) 59-68. [67] D. Barceló, M. López de Alda, M.P. Marco, and S. Rodríguez-Mozaz, Biosensors for environmental applications: Future development trends. Pure and Applied Chemistry 76 (2004) 723-754. [68] J. Parellada, A. Narváez, M.A. López, E. Domínguez, J.J. Fernández, V. Pavlov, and I. Katakis, Amperometric immunosensors and enzyme electrodes for environmental applications. Analytica Chimica Acta 362 (1998) 47-57. [69] C. Mouvet, R.D. Harris, C. Maciag, B.J. Luff, J.S. Wilkinson, J. Piehler, A. Brecht, G. Gauglitz, R. Abuknesha, and G. Ismail, Determination of simazine in water samples by waveguide surface plasmon resonance. Analytica Chimica Acta 338 (1997) 109-117. 127 [70] E. Mallat, C. Barzen, R. Abuknesha, G. Gauglitz, and D. Barceló, Fast determination of paraquat residues in water by an optical immunosensor and validation using capillary electrophoresis-ultraviolet detection. Analytica Chimica Acta 427 (2001) 165-171. [71] A. Rose, C. Nistor, J. Emnéus, D. Pfeiffer, and U. Wollenberger, GDH biosensor based off-line capillary immunoassay for alkylphenols and their ethoxylates. Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 1033-1043. [72] L.X. Tiefenauer, S. Kossek, C. Padeste, and P. Thiébaud, Towards amperometric immunosensor devices. Biosensors and Bioelectronics 12 (1997) 213-223. [73] C. Ercole, M.D. Gallo, M. Pantalone, S. Santucci, L. Mosiello, C. Laconi, and A. Lepidi, A biosensor for Escherichia coli based on a potentiometric alternating biosensing (PAB) transducer. Sensors and Actuators B: Chemical 83 (2002) 48-52. [74] V. Koubová, E. Brynda, L. Karasová, J. Skvor, J. Homola, J. Dostálek, P. Tobiska, and J. Rosický, Detection of foodborne pathogens using surface plasmon resonance biosensors. Sensors and Actuators B: Chemical 74 (2001) 100-105. [75] B. Hock, M. Seifert, and K. Kramer, Engineering receptors and antibodies for biosensors. Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 239-249. [76] T. Wink, J. de Beer, W.E. Hennink, A. Bult, and W.P. van Bennekom, Interaction between Plasmid DNA and Cationic Polymers Studied by Surface Plasmon Resonance Spectrometry. Analytical Chemistry 71 (1999) 801-805. [77] M. Farré, O. Pasini, M. Carmen Alonso, M. Castillo, and D. Barceló, Toxicity assessment of organic pollution in wastewaters using a bacterial biosensor. Analytica Chimica Acta 426 (2001) 155-165. [78] K.R. Rogers, and M. Mascini, Biosensors for field analytical monitoring. Field Analytical Chemistry & Technology 2 (1998) 317-331. [79] C. Tran-Minh, Biosensors, Chapman&Hall and Masson, 1993. [80] J.L. Marty, N. Mionetto, S. Lacorte, and D. Barceló, Validation of an enzymatic biosensor with various liquid chromatographic techniques for determining organophosphorus pesticides and carbaryl in freeze-dried waters. Analytica Chimica Acta 311 (1995) 265-271. 128 [81] D.M. Ivnitskii, and J. Rishpon, A potentiometric biosensor for pesticides based on the thiocholine hexacyanoferrate (III) reaction. Biosensors and Bioelectronics 9 (1994) 569-576. [82] C. Ristori, C. Del Carlo, M. Martini, A. Barbaro, and A. Ancarani, Potentiometric detection of pesticides in water samples. Analytica Chimica Acta 325 (1996) 151-160. [83] K. Stein, and G. Schwedt, Comparison of immobilization methods for the development of an acetylcholinesterase biosensor. Analytica Chimica Acta 272 (1993) 73-81. [84] R. Basanta, Measurement of cholinesterase activity inhibition for the detection of organophosphorus and carbamate pesticides in water. International Journal of Environmental Studies 48 (1995) 211 - 219. [85] K.R. Rogers, and L.R. Williams, Biosensors for environmental monitoring: a regulatory perspective. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 14 (1995) 289-294. [86] C. Dumschat, H. Müller, K. Stein, and G. Schwedt, Pesticide-sensitive ISFET based on enzyme inhibition. Analytica Chimica Acta 252 (1991) 7-9. [87] R.E. Gyurcsányi, Z. Vágföldi, K. Tóth, and G. Nagy, Fast Response Potentiometric Acetylcholine Biosensor. Electroanalysis 11 (1999) 712-718. [88] P. Skládal, G.S. Nunes, H. Yamanaka, and M.L. Ribeiro, Detection of carbamate pesticides in vegetable samples using cholinesterase-based biosensors. Electroanalysis 9 (1997) 1083-1087. [89] C. La Rosa, F. Pariente, L. Hernández, and E. Lorenzo, Amperometric flow- through biosensor for the determination of pesticides. Analytica Chimica Acta 308 (1995) 129-136. [90] C. Cremisini, S. Di Sario, J. Mela, R. Pilloton, and G. Palleschi, Evaluation of the use of free and immobilised acetylcholinesterase for paraoxon detection with an amperometric choline oxidase based biosensor. Analytica Chimica Acta 311 (1995) 273-280. [91] J.-L. Besombes, S. Cosnier, P. Labbé, and G. Reverdy, A biosensor as warning device for the detection of cyanide, chlorophenols, atrazine and carbamate pesticides. Analytica Chimica Acta 311 (1995) 255-263. 129 [92] A. Günther, and U. Bilitewski, Characterisation of inhibitors of acetylcholinesterase by an automated amperometric flow-injection system. Analytica Chimica Acta 300 (1995) 117-125. [93] D. Martorell, F. Céspedes, E. Martínez-Fàbregas, and S. Alegret, Amperometric determination of pesticides using a biosensor based on a polishable graphie-epoxy biocomposite. Analytica Chimica Acta 290 (1994) 343-348. [94] A. Roda, P. Rauch, E. Ferri, S. Girotti, S. Ghini, G. Carrea, and R. Bovara, Chemiluminescent flow sensor for the determination of Paraoxon and Aldicarb pesticides. Analytica Chimica Acta 294 (1994) 35-42. [95] P. Moris, I. Alexandre, M. Roger, and J. Remacle, Chemiluminescence assays of organophosphorus and carbamate pesticides. Analytica Chimica Acta 302 (1995) 53-59. [96] C. García de María, T. Manzano Muñoz, and A. Townshend, Reactivation of an immobilized enzyme reactor for the determination of acetylcholinesterase inhibitors Flow injection determination of paraoxon. Analytica Chimica Acta 295 (1994) 287-296. [97] J.M. Abad, F. Pariente, L. Hernández, H.D. Abruña, and E. Lorenzo, Determination of Organophosphorus and Carbamate Pesticides Using a Piezoelectric Biosensor. Analytical Chemistry 70 (1998) 2848-2855. [98] S.V. Dzydevich, A.A. Shuga, A.P. Soldatkin, A.M.N. Hendji, N. Jaffrezic- Renault, and C. Martelet, Conductometric biosensors based on cholinesterases for sensitive detection of pesticides. Electroanalysis 6 (1994) 752-758. [99] J.L. Marty, K. Sode, and I. Karube, Biosensor for detection of organophosphate and carbamate insecticides. Electroanalysis 4 (1992) 249-252. [100] K.I. Dave, C.E. Miller, and J.R. Wild, Characterization of organophosphorus hydrolases and the genetic manipulation of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Chemico-Biological Interactions 87 (1993) 55-68. [101] D.P. Dumas, S.R. Caldwell, J.R. Wild, and F.M. Raushel, Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Journal of Biological Chemistry 264 (1989) 19659-65. 130 [102] D.P. Dumas, H.D. Durst, W.G. Landis, F.M. Raushel, and J.R. Wild, Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Archives of Biochemistry and Biophysics 277 (1990) 155-159. [103] K. Lai, K.I. Dave, and J.R. Wild, Bimetallic binding motifs in organophosphorus hydrolase are important for catalysis and structural organization. Journal of Biological Chemistry 269 (1994) 16579-16584. [104] A. Mulchandani, P. Mulchandani, and W. Chen, Enzyme biosensor for determination of organophosphates. Field Anal. Chem. Tech. 2 (1998) 363-369. [105] A.L. Simonian, T.A. Good, S.S. Wang, and J.R. Wild, Nanoparticle-based optical biosensors for the direct detection of organophosphate chemical warfare agents and pesticides. Analytica Chimica Acta 534 (2005) 69-77. [106] S. Kumaran, and C. Tran-Minh, Determination of organophosphorous and carbamate insecticides by flow injection analysis. Anal. Biochem. 200 (1992) 187-194. [107] S. Kumaran, and M. Morita, Application of a cholinesterase biosensor to screen for organophosphorus pesticides extracted from soil. Talanta 42 (1995) 649-655. [108] Y.A. Kim, H.S. Lee, Y.C. Park, and Y.T. Lee, A convenient method for oxidation of organophosphorus pesticides in organic solvents. Environ. Res. 84 (2000) 303-309. [109] H.S. Lee, Y.A. Kim, Y.A. Cho, and Y.T. Lee, Oxidation of organophosphorus pesticides for the sensitive detection by a cholinesterase-based biosensor. Chemosphere 46 (2002) 571-576. [110] M.I. Arufe, J.L. Romero, J.J. Gamero, and M.J. Moreno, Oxidation of cholinesterase-inhibiting pesticides: A simple experiment to illustrate the role of bioactivation in the toxicity of chemicals. Biochemical Education 28 (2000) 174-177. [111] P. Herzsprung, L. Weil, K. Quentin, and I. Zombola, Determination of organophosphorous compounds and carbamates by their inhibition of cholinesterases, part 2: Estimation of detection limits for insecticide-determination by concentration , oxidation and inhibition values. Vom Wasser 74 (1990) 339-35. [112] H. Schulze, R. Schmid, and T. Bachmann, Rapid detection of neurotoxic insecticides in food using disposable acetylcholinesterase-biosensors and simple solvent extraction. Anal. Bioanal. Chem. 372 (2002) 268-272. 131 [113] J. Michalski, A. Okruszek, and W. Stec, Stereochemistry of oxidation of organophosphorus thiono-compounds and PIII compounds by nitric acid and dinitrogen tetroxide. Chem. Commun. D (1970) 1495 - 1497. [114] W.J. Stec, A. Okruszek, and J. Michalski, Organophosphorus compounds of sulfur and selenium. Stereochemistry of oxidation of thiono- and selenophosphoryl compounds with hydrogen peroxide. J. Org. Chem. 41 (1976) 233-238. [115] R. Luckenbach, and M. Kern, Stereospezifische Überfuhrüng chiraler acyclischer tertiärer Phosphinsulphide in die entsprechenden tertiären Phosphioxide mit Dymethilsulphoxid (DMSO). Chemische Berichte 108 (1975) 3533-3537. [116] A.W. Herriott, Peroxy acid oxidation of phosphinothioates, a reversal of stereochemistry. J. Am. Chem. Soc. 93 (1971) 3304-3305. [117] E.M. Bellet, and J.E. Casida, Products of peracid oxidation of organothiophosphorus compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry 22 (1974) 207-211. [118] Y. Segall, and J.E. Casida, Oxidative conversion of phosphorothiolates to phosphinyloxysulfonates probably via phosphorothiolate -oxides. Tetrahedron Letters 23 (1982) 139-142. [119] J. Helinski, Z. Skrzypczynski, J. Wasiak, and J. Michalski, Efficient oxygenation of thiophosphoryl and selenophosphoryl groups using trifluoroacetic anhydride. Tetrahedron Letters 31 (1990) 4081-4084. [120] K.S. Bruzik, and W.J. Stec, Reversible oxidation of phosphylthionates and phosphylselenonates with trifluoroacetic anhydride. The Journal of Organic Chemistry 55 (1990) 6131-6135. [121] F. Sánchez-Baeza, G. Durand, D. Barceló, and A. Messeguer, Dimethyldioxirane conversion of phosphine sulfides and phosphorothioates into their corresponding oxygen analogues. Tetrahedron Letters 31 (1990) 3359-3362. [122] J.A. Jackson, C.E. Berkman, and C.M. Thompson, Stereoselective and chemoselective oxidation of phosphorothionates using MMPP. Tetrahedron Letters 33 (1992) 6061-6064. 132 [123] L.A. Wozniak, and W.J. Stec, Oxidation in organophosphorus chemistry: Potassium peroxymonosulphate. Tetrahedron Letters 40 (1999) 2637-2640. [124] A. Skowronska, and E. Krawczyk, A general method for the conversion of thiophosphoryl and selenophosphoryl groups into phosphoryl groups by ozone oxidation. Synthesis 6 (1983) 509-510. [125] M. Terreni, M. Pregnolato, G. Resnati, and E. Benfenati, Selective sulfur oxygenation in phosphoroamidate, thionophosphate, and thiophosphate agrochemicals by perfluoro-cis-2,3-dialkyloxaziridine. Tetrahedron 51 (1995) 7981-7992. [126] A. Arnone, M. Pregnolato, G. Resnati, and M. Terreni, Conversion of Thio- and Selenophosphoryl into Phosphoryl Group by Perfluoro cis-2,3-Dialkyloxaziridines. The Journal of Organic Chemistry 62 (1997) 6401-6403. [127] J. Hernandez, N.R. Robledo, L. Velasco, R. Quintero, M.A. Pickard, and R. Vazquez-Duhalt, Chloroperoxidase-mediated oxidation of organophosphorus pesticides. Pestic. Biochem. Phys. 61 (1998) 87-94. [128] J.B. Knaak, M.A. Stahmann, and J.E. Casida, Insecticide metabolism in plants, peroxidase and ethylenediaminetetraacetic acid-ferrous iron-catalyzed oxidation and hydrolysis of parathion. J. Agric. Food Chem. 10 (1962) 154-158. [129] H. Schulze, R.D. Schmid, and T.T. Bachmann, Activation of phosphorothionate pesticides based on a cytochrome P450 BM-3 (CYP102 A1) mutant for expanded neurotoxin detection in food using acetylcholinesterase biosensors. Anal. Chem. 76 (2004) 1720-1725. [130] J. Muff, C. Andersen, R. Erichsen, and E. Søgaard, Electrochemical oxidation of pesticide polluted drainage water in its natural matrix. in: N. Kalogerakis, (Ed.), 2nd European Conference on Environmental Applications of Advanced Oxidation Processes, 2009. [131] C. Comninellis, Electrocatalysis in the electrochemical conversion/combustion of organic pollutants for waste water treatment. Electrochimica Acta 39 (1994) 1857-1862. [132] C. Comninellis, and A. Nerini, Anodic oxidation of phenol in the presence of NaCl for wastewater treatment. Journal of Applied Electrochemistry 25 (1995) 23-28. 133 [133] D. Arapoglou, A. Vlyssides, C. Israilides, A. Zorpas, and P. Karlis, Detoxification of methyl-parathion pesticide in aqueous solutions by electrochemical oxidation. Journal of Hazardous Materials 98 (2003) 191-199. [134] A. Vlyssides, E.M. Barampouti, S. Mai, D. Arapoglou, and A. Kotronarou, Degradation of Methylparathion in Aqueous Solution by Electrochemical Oxidation. Environmental Science & Technology 38 (2004) 6125-6131. [135] A.G. Vlyssides, P.K. Karlis, N. Rori, and A.A. Zorpas, Electrochemical treatment in relation to pH of domestic wastewater using Ti/Pt electrodes. Journal of Hazardous Materials 95 (2002) 215-226. [136] H.C. Yatmaz, and Y. Uzman, Degradation of Pesticide Monochrotophos from Aqueous Solutions by Electrochemical Methods. International Journal of Electrochemical Science 4 (2009) 614 - 626. [137] A. Vlyssides, D. Arapoglou, S. Mai, and E.M. Barampouti, Electrochemical detoxification of four phosphorothioate obsolete pesticides stocks. Chemosphere 58 (2005) 439-447. [138] H. Cheng, W. Xu, J. Liu, H. Wang, Y. He, and G. Chen, Pretreatment of wastewater from triazine manufacturing by coagulation, electrolysis, and internal microelectrolysis. Journal of Hazardous Materials 146 (2007) 385-392. [139] Y. Song-hu, and L. Xiao-hua, Comparison treatment of various chlorophenols by electro-Fenton method: relationship between chlorine content and degradation. Journal of Hazardous Materials 118 (2005) 85-92. [140] M.A. Oturan, and E. Brillas, Electrochemical Advanced Oxidation Processes (EAOPs) for Environmental Applications. Portugaliae Electrochimica Acta 25 (2007) 1-18. [141] S. Irmak, H.I. Yavuz, and O. Erbatur, Degradation of 4-chloro-2-methylphenol in aqueous solution by electro-Fenton and photoelectro-Fenton processes. Applied Catalysis B: Environmental 63 (2006) 243-248. [142] B. Boye, E. Brillas, and M.M. Dieng, Electrochemical degradation of the herbicide 4-chloro-2-methylphenoxyacetic acid in aqueous medium by peroxi- 134 coagulation and photoperoxi-coagulation. Journal of Electroanalytical Chemistry 540 (2003) 25-34. [143] G.A. Evtugyn, E.P. Rizaeva, E.E. Stoikova, V.Z. Latipova, and H.C. Budnikov, The application of cholinesterase potentiometric biosensor for preliminary screening of the toxicity of waste waters. Electroanalysis 9 (1997) 1124-1128. [144] K. Agner, Acta Chemica Scandinavica 2 (1941) 1-64. [145] J. Schultz, and K. Kaminker, Myeloperoxidase of the leucocyte of normal human blood. I. Content and localization. Archives of Biochemistry and Biophysics 96 (1962) 465-467. [146] D.F. Bainton, J. Ullyot, and M. Farquhar, The development of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in human bone marrow. The Journal of Experimental Medicine 134 (1971) 907-934. [147] B.A. Nichols, and D.F. Bainton, Laboratory Investigation 29 (1973) 27-40. [148] A. Daugherty, J.L. Dunn, D.L. Rateri, and J.W. Heinecke, Myeloperoxidase, a catalyst for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. The Journal of Clinical Investigation 94 (1994) 437-444. [149] R.M. Nagra, B. Becher, W.W. Tourtellotte, J.P. Antel, D. Gold, T. Paladino, R.A. Smith, J.R. Nelson, and W.F. Reynolds, Immunohistochemical and genetic evidence of myeloperoxidase involvement in multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 78 (1997) 97-107. [150] S.J. Klebanoff, A peroxidase-mediated antimicrobial system in leukocytes. Journal of Clinical Investigation 46 (1967) 1078. [151] S.J. Klebanoff, IODINATION OF BACTERIA: A BACTERICIDAL MECHANISM. The Journal of Experimental Medicine 126 (1967) 1063-1078. [152] S.J. Klebanoff, Myeloperoxidase-Halide-Hydrogen Peroxide Antibacterial System. J. Bacteriol. 95 (1968) 2131-2138. [153] A.J. Sbarra, and M.L. Karnovsky, The Biochemical Basis of Phagocytosis: I. METABOLIC CHANGES DURING THE INGESTION OF PARTICLES BY POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES Journal of Biological Chemistry 234 (1959) 1355-1362. 135 [154] G.Y.N. Iyer, M.F. Islam, and J.H. Quastel, Biochemical Aspects of Phagocytosis. Nature 192 (1961) 535-541. [155] S.J. Chanock, J. el Benna, R.M. Smith, and B.M. Babior, The respiratory burst oxidase. Journal of Biological Chemistry 269 (1994) 24519-24522. [156] L.M. Henderson, and J.B. Chappell, NADPH oxidase of neutrophils. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1273 (1996) 87-107. [157] L.M. Henderson, S. Thomas, G. Banting, and J.B. Chappell, The arachidonate- activatable, NADPH oxidase-associated H+ channel is contained within the multi- membrane-spanning N-terminal region of gp91-phox. Biochem. J. 325 (1997) 701-705. [158] D. Dolphin, A. Forman, D.C. Borg, J. Fajer, and R.H. Felton, Compounds I of Catalase and Horse Radish Peroxidase: Ï€-Cation Radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences 68 (1971) 614-618. [159] S.J. Klebanoff, Oxygen metabolites from phagocytes. in: J.I. Gallin, I.M. Goldstein, and R. Snyderman, (Eds.), Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Raven Press, Ltd, New York, 1992, pp. 541-588. [160] S.J. Klebanoff, Myeloperoxidase. P. Assoc. Am. Physician 111 (1999) 383-389. [161] M.L. Savenkova, D.M. Mueller, and J.W. Heinecke, Tyrosyl radical generated by myeloperoxidase is a physiological catalyst for the initiation of lipid peroxidation in low density lipoprotein. Journal of Biological Chemistry 269 (1994) 20394-400. [162] P.G. Furtmüller, U. Burner, and C. Obinger, Reaction of Myeloperoxidase Compound I with Chloride, Bromide, Iodide, and Thiocyanate. Biochemistry 37 (1998) 17923-17930. [163] S.V. Lymar, and J.K. Hurst, Role of Compartmentation in Promoting Toxicity of Leukocyte-Generated Strong Oxidants. Chemical Research in Toxicology 8 (1995) 833- 840. [164] P.G. Furtmüller, M. Zederbauer, W. Jantschko, J. Helm, M. Bogner, C. Jakopitsch, and C. Obinger, Active site structure and catalytic mechanisms of human peroxidases. Archives of Biochemistry and Biophysics 445 (2006) 199-213. [165] P.G. Furtmüller, J.r. Arnhold, W. Jantschko, H. Pichler, and C. Obinger, Redox properties of the couples compound I/compound II and compound II/native enzyme of 136 human myeloperoxidase. Biochemical and Biophysical Research Communications 301 (2003) 551-557. [166] A.J. Kettle, and C.C. Winterbourn, Mechanism of inhibition of myeloperoxidase by anti-inflammatory drugs. Biochemical Pharmacology 41 (1991) 1485-1492. [167] J. Uetrecht, and N. Zahid, N-chlorination of phenytoin by myeloperoxidase to a reactive metabolite. Chemical Research in Toxicology 1 (1988) 148-151. [168] D.C. Mays, L.J. Pawluk, G. Apseloff, W.B. Davis, Z.-W. She, A.L. Sagone, and N. Gerber, Metabolism of phenytoin and covalent binding of reactive intermediates in activated human neutrophils. Biochemical Pharmacology 50 (1995) 367-380. [169] S.M. Furst, and J.P. Uetrecht, Carbamazepine metabolism to a reactive intermediate by the myeloperoxidase system of activated neutrophils. Biochemical Pharmacology 45 (1993) 1267-1275. [170] G. Battistuzzi, M. Bellei, M. Zederbauer, P.G. Furtmüller, M. Sola, and C. Obinger, Redox Thermodynamics of the Fe(III)/Fe(II) Couple of Human Myeloperoxidase in Its High-Spin and Low-Spin Forms†Biochemistry 45 (2006) 12750-12755. [171] A.J. Kettle, and C.C. Winterbourn, Superoxide modulates the activity of myeloperoxidase and optimizes the production of hypochlorous acid. Biochem. J. 252 (1988) 529-536. [172] H. Hoogland, A. van Kuilenburg, C. van Riel, A.O. Muijsers, and R. Wever, Spectral properties of myeloperoxidase Compounds II and III. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 916 (1987) 76- 82. [173] J. Zeng, and R.E. Fenna, X-ray crystal structure of canine myeloperoxidase at 3 Å resolution. Journal of Molecular Biology 226 (1992) 185-207. [174] T.J. Fiedler, C.A. Davey, and R.E. Fenna, X-ray Crystal Structure and Characterization of Halide-binding Sites of Human Myeloperoxidase at 1.8 Ã… Resolution. Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 11964-11971. [175] R. Fenna, J. Zeng, and C. Davey, Structure of the Green Heme in Myeloperoxidase. Archives of Biochemistry and Biophysics 316 (1995) 653-656. 137 [176] R.E. Fenna, Myeloperoxidase, Handbook of Metalloproteins, John Wiley & Sons, Ltd, 2006. [177] E. Malle, P. Furtmüller, and W. Sattler, Myeloperoxidase: A target for new drug development? Br J Pharmacol 152 (2007) 838-854. [178] P.C. Andrews, and N.I. Krinsky, The reductive cleavage of myeloperoxidase in half, producing enzymically active hemi-myeloperoxidase. Journal of Biological Chemistry 256 (1981) 4211-4218. [179] R. Wever, W.M. Kast, J.H. Kasinoedin, and R. Boelens, The peroxidation of thiocyanate catalysed by myeloperoxidase and lactoperoxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 709 (1982) 212-219. [180] J. Arnhold, E. Monzani, P.G. Furtmüller, M. Zederbauer, L. Casella, and C. Obinger, Kinetics and Thermodynamics of Halide and Nitrite Oxidation by Mammalian Heme Peroxidases. European Journal of Inorganic Chemistry 2006 (2006) 3801-3811. [181] T. Odajima, and I. Yamazaki, Myeloperoxidase of the leukocyte of normal blood. I. Reaction of myeloperoxidase with hydrogen peroxide. Biochim. Biophys. Acta. 206 (1970) 71-77. [182] R.J. Beers, and I.W. Sizer, A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase J. Biol. Chem. 195 (1952) 133-140. [183] L. Pogacnik, and M. Franko, Optimisation of FIA system for detection of organophosphorus and carbamate pesticides based on cholinesterase inhibition. Talanta 54 (2001) 631-641. [184] D. Krstic, M. Colovic, M. Bavcon Kralj, M. Franko, K. Krinulovic, P. Trebse, and V. Vasic, Inhibition of AChE by malathion and some structurally similar compounds. J. Enz. Inh. Med. Chem. 23 (2008) 562-573. [185] D. Krstic, M. Colovic, M. Bavcon Kralj, M. Franko, K. Krinulovic, P. Trebse, and V. Vasic, The influence of malathion and its decomposition products on free and immobilized acetylcholinesterase. Russ. J. Phys. Chem. A 82 (2008) 663-668. 138 [186] G.L. Ellman, K.D. Courtney, V. Andres jr, and R.M. Featherstone, A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7 (1961) 88-90, IN1, 91-95. [187] T. Lazarevi Pašti, T. Momi, A. Onjia, L. Vujisi, and V. Vasi, Myeloperoxidase-mediated oxidation of organophosphorus pesticides as a pre-step in their determination by AChE based bioanalytical methods. Microchimica Acta 170 (2010) 289-297. [188] T. Lazarevic-Pasti, M. Colovic, J. Savic, T. Momic, and V. Vasic, Oxidation of diazinon and malathion by myeloperoxidase. Pesticide Biochemistry and Physiology 100 (2011) 140-144. [189] A. Bard, and L. Faulkner, Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, John Willey & Sons, INC., New York, 2000. [190] P.P. Bradley, D.A. Priebat, R.D. Christensen, and G. Rothstein, Measurement of Cutaneous Inflammation: Estimation of Neutrophil Content with an Enzyme Marker. J Investig Dermatol 78 (1982) 206-209. [191] J.M. Dypbukt, C. Bishop, W.M. Brooks, B. Thong, H. Eriksson, and A.J. Kettle, A sensitive and selective assay for chloramine production by myeloperoxidase. Free Radical Biology and Medicine 39 (2005) 1468-1477. [192] J. Casida, Pest toxicology: The primary mechanisms of pesticide action. Chem. Res. Toxicol. 22 (2009) 609-619. [193] A.P. Kulkarni, and E. Hodgson, Metabolism of insecticides by mixed function oxidase systems. Pharmacol. Therapeut. 8 (1980) 379-475. [194] L.G. Sultatos, Mammalian toxicology of organophosphorous pesticides. J. Toxicol. Environ. Health 43 (1994) 271-289. [195] H. Fallscheer, and J. Cook, Report on enzymatic methods for insecticides J. Assoc. Offic. Agric. Chem. 39 (1956) 691-697. [196] Q. Zhang, and S.O. Pehkonen, Oxidation of diazinon by aqueous chlorine: kinetics, mechanisms, and product studies. J. Agric. Food Chem. 47 (1999) 1760-1766. 139 [197] C.J.G.M. Smulders, T.J.H. Bueters, S. Vailati, R.G.D.M. van Kleef, and H.P.M. Vijverberg, Block of Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors by Organophosphate Insecticides. Toxicological Sciences 82 (2004) 545-554. [198] A. Boškin, C. Tran, and M. Franko, Oxidation of organophosphorus pesticides with chloroperoxidase enzyme in the presence of an ionic liquid as co-solvent. Environ. Chem. Lett. 7 (2009) 267-270. [199] N. Ohashi, Y. Tsuchiya, T. Sasano, and A. Hamada, Ozonation products of organophosphorous pesticides in water. Jpn. J. Toxicol. Environ. Health 40 (1994) 185- 192. [200] T. Momi, Z. Vuji, and V. Vasi, Kinetics of inhibition of peroxidase activity of myeloperoxidase by quercetin. International Journal of Chemical Kinetics 40 (2008) 384-394. [201] T. Momic, J. Savic, and V. Vasic, Oxidation of quercetin by myeloperoxidase. Ress. Lett. Phys. Chem. 2009 (2009). [202] R. Turkall, and M. Tsan, Oxidation of glutathione by the myeloperoxidase system. J. Reticuloendothel Soc. 31 (1982) 353-360. [203] A.B. Abdel-Naim, and A.M. Mohamadin, Myeloperoxidase-catalyzed oxidation of chloroacetonitrile to cyanide. Toxicology Letters 146 (2004) 249-257. [204] X. Fei, and G. Sun, Oxidative Degradation of Organophosphorous Pesticides by N-Halamine Fabrics. Industrial & Engineering Chemistry Research 48 (2009) 5604- 5609. [205] S. Mentus, Elektrohemija, Fakultet za fiziku hemiju, Beograd, 1999. [206] I. Filipovic, and S. Lipanovic, Opa i anorganska kemija, Školska knjiga Zagreb, Zagreb, 1973. 140 7. PRILOZI P450 diazinon diazokson malaokson P450 malation hlorpirifos hlorpirifos-okson P450 azinfos-metil azinfos-metil-okson P450 forat forat-okson P450 Slika P1. Metabolika transformacija organo-tiofosfata pod uticajem citohroma P450 141 0.0 2.0x10 -4 4.0x10 -4 6.0x10 -4 8.0x10 -4 1.0x10 -3 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 P o v rš in a h ro m a to g ra fs k o g s ig n a la [diazinon] (M) 0.0 2.0x10 -4 4.0x10 -4 6.0x10 -4 8.0x10 -4 1.0x10 -3 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 P o v rš in a h ro m a to g ra fs k o g s ig n a la [malation] (M) 0.0 2.0x10 -4 4.0x10 -4 6.0x10 -4 8.0x10 -4 1.0x10 -3 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 P o v rš in a h ro m a to g ra fs k o g s ig n a la [hlorpirifos] (M) 0.0 1.0x10 -4 2.0x10 -4 3.0x10 -4 4.0x10 -4 5.0x10 -4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 P o v rš in a h ro m a to g ra fs k o g s ig n a la [azinfos-metil] (M) 0.0 2.0x10 -4 4.0x10 -4 6.0x10 -4 8.0x10 -4 1.0x10 -3 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 P o v rš in a h ro m a to g ra fs k o g s ig n a la [forat] (M) Slika P2. Kalibracioni grafici za odreivanje koncentracija OP pomou UPLC analize 142 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [diazinon] (M) 1 min 5 min 10 min 30 min A 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [malation] (M) 1 min 5 min 10 min 30 min B 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [hlorpirifos] (M) 1 min 5 min10 min 30 min C 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [azinfos-metil] (M) 1 min 5 min 10 min 30 min D 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5 0 20 40 60 80 100 5 min 10 min 30 min A k ti v n o s t A C h E ( % o d k o n tr o le ) [forat] (M) 1 min E Slika P3. Koncentraciona zavisnost inhibicije AChE indukovana A) diazinonom B) malationom C) hlorpirifosom D) azinfos- metilom i E) foratom inkubiranim sa 100 nM MPO tokom 1, 5, 10 i 30 minuta 143 BIOGRAFIJA Tamara Lazarevi-Pašti je roena 14.06.1984. u Beogradu, gde je završila osnovnu školu i Treu beogradsku gimnaziju. Školske 2003/2004. godine upisala se na Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu, smer diplomirani biohemiar. Diplomirala je 10.07.2008. godine sa prosenom ocenom 8,82 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Poslediplomske studije na Hemijskom fakultetu Univerziteta u Beogradu, smer biohemija, upisala je školske 2008/2009. godine. Od novembra 2008. godine zaposlena je u Laboratoriji za fiziku hemiju Instituta za nuklearne nauke “Vina”, kao istraživa-saradnik.