D/-)t r-rornncaHneq lnMnRn h. l6P'oVic 6poj ynraca J4 , ,' no.. llpnnor 1. l4sjaea o ayropcrBy 14rjaeruyjeru ga je 4orropcKa rqnceptatryja no4 HacnoBoM L, P iDA- V 12 C- atoma) (Ehringer, 1990). U zavisnosti od prisustva ili odsustva dvogubih veza MK mogu biti zasićene (eng.saturated fatty acids, SFA) i nezasićene. Prema broju dvogubih veza mogu biti mononezasićene MK (MUFA-eng. monounsaturated fatty acids) i polinezasićene MK (PUFA-eng. polyunsaturated fatty acids) (Tvrzicka, 2011). PUFA karakteriše pentadienska (-CH=CH- CH2-CH=CH-) struktura dvostrukih veza. Prema konfiguraciji dvogubih veza masne kiseline se javljaju u cis (preovladava u prirodi) i trans konfiguraciji. Masnokiselinski profili su specifični za vrste i za tkiva. U životinjskim tkivima najzastupljenije su MK sa 16 i 18 C-atoma (palmitinska, stearinska, oleinska i linolenska kiselina). Masne kiseline sisara dostižu dužinu lanca od 24 C-atoma, i 6 dvogubih veza. MK sa lancima kraćim od 14 i dužim od 22 C-atoma su prisutne u zanemarljivim koncentracijama (Nelson, 2005). U Tabeli 1 prikazane su MK koje se najčešće sreću u životinjskim mastima. Masne kiseline se u organizmu mogu naći u dva oblika: kao slobodne (free fatty acids-FFA ili NEFA) ili esterifikovane MK. U fiziološkim uslovima slobodne MK su u jonizovanom obliku. U plazmi slobodne masne kiseline su reverzibilno vezane za albumin, a u manjem iznosu za globuline i lipoproteine (oko 5% od ukupnih MK u krvi). Najveći deo MK u cirkulaciji je esterifikovan, vezan u obliku triglicerida, holesterol-estara i fosfolipida (Simopoulos 1999). Doktorska disertacija Tamara Popović 8 Tabela 1. MK koje se najčešće nalaze u životinjskim mastima Doktorska disertacija Tamara Popović 9 2.2.1. Biosinteza masnih kiselina i regulacija De novo sinteza MK odvija se u jetri, masnom tkivu, plućima, mozgu. Acetil-CoA je prekursor svih ugljenikovih atoma u MK. Nastaje razgradnjom aminokiselina (citosolni), oksidativnom dekarboksilacijom piruvata, β-oksidacijom MK u mitohondrijama. Sinteza MK započinje karboksilacijom acetil-CoA do malonil-CoA u prisustvu acetil-CoA- karboksilaze. Procesima redukcije i dehidratacije (četiri reakcije) dolazi do elongacije butiril-SACP uz potrošnju NADPH do 16 C-atoma, tj. palmitoil-CoA (Gunstone, 1994). Ukratko, acetil-CoA i ACP (acil-noseći protein) uz pomoć acetil-CoA ACP-transacilaze stvara acetil-ACP, koji u reakciji sa malonil-ACP-om daje acetoacetil-ACP. Acetioacetil- ACP se uz pomoć NADPH i enzima β-ketoacil-ACP-reduktaze redukuje do D-β- hidroksibutiril-ACP. Procesom dehidratacije, u prisustvu β-ketoacil-ACP-dehidrataze, nastaje α,β-trans-butenoil-ACP. Uz učešće molekula NADPH i enzima enoil-ACP- reduktaze nastaje butiril-SACP. U nastavku kroz 6 ponovljenih krugova elongacije nastaje palmitoil-ACP, odnosno palmitat (Slika 4). Enzim MK sintaza (eng. fatty acid syntase-FAS) je glavni multifunkcionalni enzim koji katalizuje sveukupan put palmitata (Smith 2003). FAS je aktivna u jetri i adipoznom tkivu. Uloga u de novo sintezi varira medju vrstama. Kod ljudi, jetra je glavno mesto de novo lipogeneze, dok se kod pacova sinteza masnih kiselina odvija i u jetri i u adipoznom tkivu (Pullen 1990). Regulacija enzimske aktivnosti odvija se kroz nekoliko mehanizama. Aktivacija FAS se reguliše hormonima (insulin, glukagon) (Sul, 2000). Insulin aktivira sintazu MK dok glukagon i kateholamini inhibiraju njenu aktivnost (cAMP-zavisnom fosforilacijom). Regulacija aktivnosti FAS se takoñe odvija i sa intracelularnom koncentracijom MK, njihovo povećanje smanjuje FAS aktivnost (Wiegman 2003). Regulacija genske ekspresije acetil-CoA- karboksilaze, kompomente FAS insulinom i sa MK je uglavnom posredovana transkripcionim faktorima, kao što su sterol- regulatorni element-vezujući proteini (SREBPs) (Kim 2002), a delimično i nuklearnim receptorima kao što su LXRs (Yamamoto 2007). Povećana ekspresija SREBP-1a značajno povećava ekspresiju gena, uključenih u sintezu holesterola i FAS, i izaziva odgovarajuću akumulaciju holesterola i triglicerida. Povećana ekspresija SREBP-1c uzrokuje samo selektivnu indukciju lipogenskih gena, bez efekata na gene za sintezu holesterola (Eberle Doktorska disertacija Tamara Popović 10 2004). SREBP-1 i FAS geni se eksprimiraju i koreliraju u tkivima koja sintetišu MK de novo. Slika 4. Regulacija biosinteze i razgradnje MK U sintezi masnih kiselina čiji je ugljovodonični niz duži od 16 C-atoma, kao i više nezasićenih MK učestvuju mikrozomalni enzimi elongaze i desaturaze. Elongacija MK se dešava kroz četiri koraka sukcesivne kondenzacije malonil-CoA i acil-CoA. Reakcije su praćene NADPH- redukcijom, dehidratacijom i ponovljenenom redukcijom (NADPH) koje Doktorska disertacija Tamara Popović 11 vode elongaciji lanca (Larsson, 1994). Sistemi desaturaza katalizuju stvaranje dvostrukih veza u molekulima MK. Kod sisara postoje 4 tipa desaturaza ∆9, ∆6, ∆5, ∆4. Supstrati su im aktivirane MK u formi acil-CoA (iz organizma ili unete hranom). Delovanjem desaturaza nastaju MK n-9, n-6 i n-3 serije, metaboliti palmitinske, linolne (LA) i α-linolenske kiseline (ALA). Desaturacija LA i ALA se odvija pod dejstvom ∆6-desaturaze, dok je desaturacija dihomo-γ-linolenske do arahidonske kiseline (AA) odreñena aktivnošću ∆5- desaturaze (Slika 5). Sisari nemaju ∆12 i ∆15-desaturaze koje katalizuju konverziju oleinske kiseline u LA i ALA. Zbog toga je de novo sinteza polinezasićenih n-6 i n-3 MK neizvodljiva. Budući da su bitne za organizam moraju se unositi hranom biljnog i životinjskog porekla. U organizmu čoveka one pomažu funkcionisanju ćelija i organa, a od njih se stvaraju jedinjenja slična hormonima (prostaglandini, leukotrieni) koji utiču na vaskularni tonus, zgrušavanje krvi, nivo lipida u krvi, imunološko stanje. Dejstvom ∆9- desaturaze u jetri (stearil-CoA desaturaze), uvodjenjem dvogube cis veze na ∆9 položaju (pri čemu iz stearil-nastaje oleil-CoA, dok iz palmitoil- nastaje palmitoleil-CoA) vrši se konverzija SFA u MUFA (Kim, 1989). Doktorska disertacija Tamara Popović 12 Slika 5. Biosinteza n-6 i n-3 familije polinezasićenih MK Doktorska disertacija Tamara Popović 13 2.2.2. Razgradnja masnih kiselina i regulacija Masne kiseline, pre nego što se oksiduju, moraju da se aktiviraju u ATP-zavisnoj reakciji acilovanja u kojoj nastaje acil-CoA. Proces aktivacije je katalizovan sa najmanje tri acil- CoA sintaze (tiokinaze), nastajanju acil-CoA prethodi stvaranje acil-adenilat anhidrida. Iako se aktivacija masnih kiselina dešava u citosolu, oksidacija se odvija u mitohondrijama, dakle neophodan je transport acil-CoA kroz unutrašnju membranu mitohondrija (Mead, 1958). Proces translokacije posredovan je specifičnim proteinskim nosačem (CPT-I) koji transportuje acil-karnitin u mitohondriju, a slobodan karnitin u citosol (Kerner and Hoppel, 2000). Acil-CoA transport se obavlja kroz četiri reakcije: acil-grupa citosolnog acil-CoA se prenosi na karnitin, tako uz osloboañanje CoA u citosol. Acil-karnitin se transportuje u mitohondrijalni matriks transportnim sistemom. Energija osloboñena hidrolizom acil- karnitina omogućava prenos acil-grupa na CoA, a osloboñeni karnitin se vraća u citosol. Ćelija na taj način održava citosolni i mitohondrijalni „pool“ CoA. Mitohondrijalni CoA učestvuje u oksidativnoj degradaciji piruvata i nekih AK, dok citosolni učestvuje u biosintezi masnih kiselina (Bridle 1985). Beta-oksidacija masnih kiselina se odvija kroz 4 reakcije: Iz acil-CoA, uz pomoć enzima acil-CoA dehidrogenaze, formira se trans-α,β dvostruka veza, odnosno nastaje trans-∆2- enoil-CoA. Hidratacijom dvostruke veze, u prisustvu enoil-CoA-hidrataze stvara se 3-L- hidroksiacil-CoA. Dehidrogenizacijom β-hidroksiacil-CoA, uz pomoć 3-L-hidroksiacil- CoA-dehidrogenaze nastaje β-ketoacil-CoA. Raskidanjem Cα-Cβ veze u reakciji tiolize (Claisen estarskim cepanjem), pomoću tiol-grupe drugog molekula CoA, u prisustvu β- ketoacil-CoA-tiolaze, formira se acetil-CoA i novi acil-CoA, koji sadrži 2C atoma manje nego početni (Macfarlane, 2008). Mitohondrija sadrži 3 acil-CoA-dehidrogenaze specifične za kratke, srednje i dugolančane MK-acil-CoA. Reakcija katalizovana ovim enzimom uključuje uklanjanje protona sa Cα i transfer vodonikovog jona sa Cβ na FAD. Rezultujući FADH2 se reoksiduje u mitohondrijalnom elektron-transportnom-lancu. Deficijencija ovog enzima može dovesti do iznenadne smrti novorodjenčadi (McGarry 1989). Svaki krug oksidacije masnih kiselina produkuje 1NADH, 1FADH2, 1acetil-CoA. Oksidacija acetil-CoA u CTK ciklusu generiše dodatno 1FADH2 i 3NADH koji se Doktorska disertacija Tamara Popović 14 reoksiduju kroz oksidativnu fosforilaciju uz stvaranje ATP-a. Kompletna oksidacija molekula MK je egzoterman proces, u kom nastaje puno molekula ATP. (npr. oksidacijom palmitinske kiseline dobija se 129 molekula ATP. Pod uslovima kad je povećano preuzimanje MK jetra često produkuje velike količine ketonskih tela, acetoacetata i beta-hidroksibutirata u procesu ketogeneze. Ketogeneza je povećana i kada nizak nivo insulina dovodi do aktivacije CPT-I povećanog transfera MK u mitohondrije. Konverzija acetil-CoA do ketonskih tela (pre nego kompletna oksidacija u CTK ciklusu) rezultuje smanjenom sintezom ATP/mol MK (Hegardt 1999). Ketogeneza (kao i biosinteza holesterola) je kontrolisana indirektno sa CPT-I i direktno aktivnošću mitohondrijalnog regulatornog enzima 3-hidroksi-3-metilglutaril-CoA (HMG- CoA) sintaze. Aktivnost se reguliše preko dva mehanizma: sukcinilacijom (kratkoročna regulacija) i transkripcijom (dugoročna regulacija). Kada se sukcinil-CoA „pool“ poveća, kao rezultat povećanog fluksa glikogenskih metabolita, sukcinil- grupa se vezuje za regulatornu subjedinicu HMG-CoA sintaze, čime se enzim inaktivira. Oba kontrolna mehanizma su pod uticajem nutritivnih i hormonskih faktora (McGarry 1989). 2.2.3. Masne kiseline i njihova biološka uloga 2.2.3.1. Zasićene masne kiseline Kratkolančane zasićene masne kiseline (SFA), kao što su sirćetna kiselina (2:0), propionska (3:0 i buterna kiselina (4:0), nastaju defragmentacijom vlakana u proksimalnom kolonu (debelom crevu). Buterna kiselina i delimično propionska kiselina koriste se u metabolizmu, proliferaciji i ćelijskoj replikaciji kolonocita (Gunstone 1994). Kaprilna (8:0) i kaprinska (10:0), koje se direktno resorbuju, su MK srednjih lanaca. Njihov intramitohondrijski transfer ne zahteva prisusutvo karnitina ili karnitin-palmitoil- transferaza. MK srednjih lanaca koriste se u enteralnoj ishrani za vreme kalorijske restrikcije, za vreme nekih strogo odreñenih režima ishrane (kod gojaznih pacijenata). Dugolančane SFA, laurinska (12:0), miristinska (14:0), palmitinska (16:0) i stearinska (18:0), imaju značajan aterogeni i trombogeni potencijal. Unos dugolančanih SFA povećava nivo serumskog holesterola, LDL-holesterola (eng. low density lipoproteins), što je povezano sa gojaznošću i vodi ka povećanom riziku od kardiovaskularnih oboljenja Doktorska disertacija Tamara Popović 15 (CHD). Stearinska kiselina ima protektivni efekat na proces ateroskleroze. Povećanje SFA u membranskim lipidnim premostima još uvek nije razjašnjeno (Nelson 2005). SFA vrlo dugačkih lanaca behenska (22:0), lignocerinska (24:0) javljaju se u značajnim koncentracijama kod naslednih metaboličkih poremećaja (Zellweger-ov sindrome, Refsum-ova bolest). Kod obolelih od ovih bolesti, pozitivni efekti postižu se suplementacijom n-3 PUFA. 2.2.3.2. Mononezasićene masne kiseline Mononezasićene masne kiseline (MUFA) su cis konfiguracije. Glavni predstavnici MUFA su oleinska kiselina (18:1 n-9), vascenska (18:1 n-7) i palmitoleinska kiselina (16:1 n-7). Oleinska kiselina ima antiaterogena i antitrombična svojstva, povećava odnos HDL/LDL holesterola. Inkorporacija oleinske kiseline u holesterol-estre, trigliceride i fosfolipide lipoproteinskih čestica ima uticaj na smanjenje lipoproteinske oksidacije. U sastavu membranskih lipida oleinska kiselina reguliše fluidnost ćelijske membrane, efikasnost transmembranskog transporta i utiče na transdukciju signala (Mead 1971). Mononezasićene masne kiseline trans konfiguracije su elaidinska (18:1 n-9t) i trans- vascenska (18:1 n-7t) kiselina. Trans-masne kiseline ispoljavaju aterogene efekte. Glavni izvori trans MK su margarini nastali iz hidrogenizovanih biljnih ulja korišćenjem neodgovarajućeg katalizatora. Hidrogenizovane masti koriste se u industriji brze hrane, ali primenom novih tehnoloških procesa značajno je smanjena produkcija trans-masnih kiselina (Larson 1994). 2.2.3.3. Polinezasićene masne kiseline Polinezasićene MK (PUFA) imaju više dvogubih veza. U organizmu učestvuju u: regulaciji rasta i razvoja, razvoja retine i moždanih funkcija, regulaciji imunog odgovora, utiču na pojavu karcinogeneze. Endogene PUFA uglavnom pripadaju n-9 familiji MK. Linolna kiselina (18:2, n-6) i α-linolenska kiselina (18:3, n-3) su esencijalne MK koje se moraju unositi hranom, dakle ne mogu se sintetisati de novo. Esencijalne MK imaju antiaterogene i antitrombične efekte. Utiču na koncentraciju lipoproteina, membransku Doktorska disertacija Tamara Popović 16 fluidnost, funkciju membranskih enzima i receptora, modulaciju produkcije eikozanoida, regulaciju krvnog pritiska i na metabolizam minerala (Tvrzicka, 2011). 2.2.3.4. n-3 masne kiseline Prekursor n-3 PUFA familije je α-linolenska kiselina (18:3, n-3; ALA). Glavni metabolički proizvodi su eikozapentaenska (EPA, 20:5, n-3) i dokozaheksaenska kiselina (DHA, 22:6, n-3) kao i dokozapentaenska kiselina (DPA, 22:5, n-3). Izvori ALA su semena i lišće biljaka kao što su lan, soja, ribizla i njihova ulja. Metaboliti EPA i DHA mogu se uzimati iz ribe (sardina, losos, tuna) i ribljih prerañevina i ulja. Kao ligandi peroksizomalnog proliferišućeg aktiviranog receptora (PPAR-α), n-3 PUFA imaju efekte na metabolizam lipida. Smatra se da PPAR-α smanjuju lipogenezu i VLDL sekreciju supresijom SREBP-1 (eng. sterol response element binding protein). n-3 PUFA povećavaju aktivnost lipoproteinske lipaze, smanjuju koncentraciju C-III i potenciraju reversni transport holesterola. Imunomodulatorski efekti n-3 PUFA su povezani sa sposobnošću da supresuju aktivaciju T-limfocita. Aktivacija T-limfocita zahteva acilovane proteine lokalizovane u membranskim premostima ćelija. Povećano izlaganje n-3 PUFA ostavlja premoste praznim (SANC, 2004). Pri unosu n-3 PUFA dolazi do smanjene proizvodnje inflamatornih i hemotaktičkih derivata, čime se smanjuje incidenca za razvoj hroničnih zapaljinskih procesa i oboljenja. Adhezioni molekuli uključujući ICAM-1, VCAM-1 i E-selektin, putem ushodne regulacije olakšavaju kretanje imunih ćelija u tkiva. Suplementacija sa ALA kod ljudi, u epidemiološkim studijama, dovela je do redukcije plazma koncentracije solubilnog E-selektina, CRP-a, IL-1, IL-6. Redukcija proinflamatronih citokina povezana je smanjenim rizikom od nastanka kardiovaskularnih bolesti. EPA i DHA mogu inhibirati IL-1β i TNF-α produkciju od strane monocita i nastajanje IL-6 i IL-8 iz endotelnih ćelija. Povećana produkcija ovih citokina može biti rizična u stanjima zapaljenja (Schmitz, 2008). 2.2.3.5. n-6 masne kiseline Prekursor n-6 familije PUFA je linolna kiselina (18:2, n-6; LA). Njeni metabolički produkti su γ-linolenska kiselina (GLA, 18:3, n-6), dihomo-γ-linolenska (DHGLA, 20:3 n- 6) i arahidonska kiselina (AA, 20:4, n-6), a u manjim koncentracijama to su dokozatetraenska (22:4, n-6) i dokozapentaenska (22:5, n-6) kiselina. Izvori n-6 PUFA su Doktorska disertacija Tamara Popović 17 suncokretovo ulje, ulje šafranike, ulje semenki groždja. U nižim koncentracijama nalaze se u ulju pšeničnih klica, kukuruznom ulju, susamovom ulju. PUFA n-6 su aktivatori PPAR- γ. Utiču na produkciju citokina, povećavaju sintezu holesterola, i smanjuju konverziju VLDL u LDL. Suplementacija n-6 vodi smanjenju ukupnih LDL i HDL holesterola i povećanju osetljivosti LDL čestica na lipoperoksidaciju (ovaj efekat je rezultat ushodne regulacije LDL receptora i aktivcije Cyp7A1). Kao ligandi PPAR-γ povećavaju insulinsku senzitivnost. Arahidonska kiselina je glavni prekursor eikozanoida koji su potentni signalni molekuli u i izvan ćelije (EFSA, 2010). Poremećaj nivoa PUFA i odnosa n-6/n-3 PUFA u organizmu utiče, izmedju ostalih faktora, na nastanak oboljenja kao što su: astma, neke autoimune bolesti, neurološka oboljenja, endokrinološki poremećaji, neka maligna oboljenja. Zbog toga je izbalansiran unos n-6 i n- 3 važan za optimalan rast razvoj i funkcionisanje organizma (Sigal, 1991). S obzirom na to da se n-6 i n-3 familije sintetišu iz pomenutih prekursora u prisustvu istog enzimskog sistema mikrozomalnih desaturaza i elongaza, reakcija koju katalizuje ∆6 desaturaza je odlučujući korak, afinitet ovog enzima za supstrat odreñuje tok sinteze. Najveći afinitet ∆6 desaturaza ima za ALA, manji za LA i najmanji za oleinsku kiselinu (Benatti, 2004). 2.2.4. Uticaj masnih kiselina na regulaciju genske ekspresije ALA, EPA, DHA redukuju citokin-posredovanu indukciju ekspresije inflamatornih gena u ćelijskoj kulturi. Regulacija ekspresije inflamatornih gena posredovana je sa nuklearnim faktorom kB (NF-kB) i peroksizom-proliferativnim aktiviranim receptorima (PPARs). NF- kB u svojoj neaktivnoj formi ima inhibitornu subjedinicu, koja se stimuliše fosforilacijom i disosuje od ostatka neaktivnog NF-kB heterotrimera. Preostala NF-kB jedinica prelazi u nukleus i reguliše transkripciju target gena (Fann YY, 2004). PPAR-α i γ- nañeni su u inflamatornim ćelijama. Regulisani su direktnim vezivanjem PUFA i eikozanoida (Devchand, 1996). Unos EPA i DHA (kroz riblje ulje) redukuje nivoe mRNA za inflamatorne medijatore TNF-alfa, IL-1B, i IL-6 u animalnim studijama. Tako je potvrñena veza izmeñu inflamacije, EPA i DHA i genske ekspresije. PPARs su regulisani direktnim vezivanjem Doktorska disertacija Tamara Popović 18 EPA i DHA što rezultuje u smanjenoj LTB4 produkciji. In vivo EPA i DHA imaju potentnije dejstvo na PPARs od ostalih MK (Fann YY, 2003). Slika 6. Uticaj n-3 i n-6 na gensku ekspresiju Doktorska disertacija Tamara Popović 19 2.2.5. Studije o suplementaciji n-3 masnim kiselinama i ribljim uljem Poslednjih desetak godina uloga n-3 masnih kiselina je dosta izučavana. Suplementacija n- 3 masnim kiselinama putem hrane, ulja, dijetetskih suplemenata u humanim, animalnim i in vitro studijama, doprinela je i izvoñenju zaključaka o efektima n-3 MK na organizam. U studiji Breslow i saradnika, od 14 prospektivnih kohort studija u kojima su postojale suplementirane i nesuplementirane grupe ispitanika u 12 je suplementacija sa n-3 MK pokazala benefit efekte na kardiovaskularni sistem (Breslow, 2006). Takoñe, u randomoziranim kontrolnim studijama (eng, randomized controled studies), RCT (DART) zaključeno je da umeren unos ribe (2-3 porcije nedeljno, što odgovara dozi od 500-800 mg/dnevno n-3 (EPA+DHA)) može redukovati mortalitet kod ljudi koji su u fazi oporavka od infarkta miokarda (Levitan 2010). Zaključak o pozitivnom dejstvu na kardiovaskularni sistem zasnovan je na nekoliko efekata koje n-3 MK uključuju: prevencija aritmija različitih etiologija (Breslow, 2006), snižavanje triglicerida izmerenih u plazmi (El-Badry, 2007), snižavanje arterijskog pritiska (Far, 2010), smanjenje agregacije trombocita i poboljšanje vaskularne reaktivnosti (Anderson, 2009) kao i smanjenje inflamacije (Walter, 2008). U animalnim studijama izučavano je antiaritmično dejstvo ribljeg ulja, redukcija ventrikularne fibrilacije kod pacova (Chapman, 2000). In vitro, (Brown, 1999) dodavanje EPA i DHA u kulturi neonatalnih pacovskih kardiomiocita inhibiralo je indukciju tahiaritmija sa ekstracelularnim kalcijumom, acil-karnitinom, tromboksanom. Ovi istraživači su ispitivali efekte ribljeg ulja i na elektrofiziološka dejstva tj. generisanje akcionog potencijala u delimično depolarizovanim kardiomiocitima. U studiji Bresow-a i sar. posebno je naglašena uloga odnosa n-6/n-3 za koji postoje podaci da je do četrdesetih godina prošlog veka bio oko 4, danas dostigao i 10 pa čak i 20 što je krajnje zabrinjavajuće. Takoñe u studiji se naglašava i uloga ALA kao prekursora n-3 i količine ALA koja bi se trebala uneti kako bi se dovoljne količine EPA i DHA sintetisale (Breslow, 2006) Studija Wakatsu i sar bavi se ulogom n-3 PUFA u aktivaciji PPARs receptora. Naime, riblje ulje snižava nivoe lipida u plazmi i jetri putem PPAR-nezavisnog mehanizma. U dijeti koja je podrazumevala riblje ulje snizio se plazma holesterol, kao i akululacija triglicerida u jetri. Zaključak ove studije da je inhibirana ekspresija SREBP-1c ribljim uljem predstavlja glavni mehanizam redukcije nivoa lipida kod miševa (Wakatsu, 2010) Doktorska disertacija Tamara Popović 20 U studiji Barone i sar. (2006), izučavan je model (pacovi), NESH-a, nealkoholnog steatohepatitisa, čestog oboljenja kod ljudi sa ciljem da se ispita uloga n-3 MK. S obzirom da je eksperiment potvrdio da n-3 MK tretman doprinosi smanjenju oštećenja jetre, predložene su konkretne eksperimentalne terapije ribljim uljem kad je ova dijagnoza u pitanju, imajući u vidu ulogu n-3 PUFA u ushodnoj regulaciji PPAR-α ekspresije u jetri. U studiji Anderson i Ma i sar, izučavani su odvojeni efekti ALA, EPA i DHA na kancerogena oboljenja, insulinsku rezistenciju, kardiovaskularne bolesti. Sudije (Denmark- Wahnefried, 2001, 2008, 2004) kod kojih je rañena suplementacija lanenim semenom (bogato sa ALA) kod muškaraca sa kancerom prostate pokazale su da je došlo do redukcije ćelijske proliferacije i povećanja apoptoze i smanjenja PSA (prostatičnog specifičnog antigena), ali se mora naglasiti da su studije pokazivale izvesne nedostatke i zahtevale još dopunjavanja kako u dizajnu tako i u količini merenih parametara. U studiji (Connolly, 1997) izvedenoj na miševima posle tretmana sa EPA+DHA u odreñenoj dozi dolazi do smanjenja rasta tumora prostate. Takodje veliki broj in vitro studija (du Toit, 1996) zaključuju o antikancerogenom delovanju ALA, dok tretman sa EPA i DHA dovodi do dozno-zavisne inhibicije humanih kancer ćelija (Rose, 1991). U nemalom broju studija pokazan je protektivni efekat EPA+DHA na rast tumora dojke i metastaze kod velikog broja modela glodara (pacova, miševa i sl) (Hubbard 1998, Rose, 1993). n-3 PUFA povećavaju insulinsku senzitivnost, smanjujući inflamatorne medijatore. U studiji (Far, 2010) u koju su bile uključene žene sa gojaznošću i insulinskom rezistencijom suplementirane su sa EPA+DHA u dozi od 6g/dan, 6 nedelja, praćeni su im različiti faktori inflamacije koji su se po tretmanu smanjili u odnosu na početak studije. Studije na životinjama kod nekoliko modela gojaznosti i dijabetesa, suplementacija je popravila insulinsku rezistenciju i povećala koncentraciju insulin-zavisnog adiponektina. EPA i DHA redukuju mRNA nivoe inflamatornih medijatora kao što su TNF-α, IL-1β i IL-6 u različitim animalnim studijama. EPA i DHA preveniraju aloksanom indukovani dijabetes i popravljaju antioksidativni status u različitim tkivima kod pacova (Barre, 2008). DHA tretman značajno utiče na lipidno okruženje kaveola u endotelnim ćelijama što rezultuje u selektivnom premeštanju kaveolina i eNOS, inhibira produkciju citokina i Doktorska disertacija Tamara Popović 21 signalizaciju što se može povezati sa DHA-indukovanim modifikacijama kaveola u aterosklerozi i drugim inflamatornim stanjima (Caramori, 2000). EPA je važna komponenta lipida nervnih ćelija služeći kao prekursor sinteze prostaglandin-3, troponin-3 i LT-5. Pozitivni efekti EPA pokazani su u nekim neurološkim bolestima kao što je šizofrenija (Peet, 2001), suicidna ponašanja (Perica, 2011). DHA ima ulogu u razvoju i strukturi moždanog tkiva i važna je za održavanje kognitivnog zdravlja kod ljudi. (Singh, 2005) n-3 MK doprinose neuronalnoj membranskoj fluidnosti i održavanju integriteta delimično kroz nastajanje dokozanoida. Ovo je važno u retini gde je količina n-3 masnih kiselina i najveća. DHA reguliše ćelijski transport i sinaptičke funkcije (Lukiw, 2008). Neuroprotektivna uloga n-3 ogleda se kroz uticaj na ekspresiju nekih gena u CNS-u preko transkripcionih faktora, a mogu da utiču na neke neurotransmitere. Choikwon i sar. 6- nedeljni tretman sa PUFA smanjuje obim infarkta mozga posle ishemije/reperfuzije u poredjenju sa kontrolnom grupom bez tretmana. 2.3. Lipoproteini Hidrofobni karakter lipida sprečava njihov direktan transport u plazmi, pa se oni transportuju izmedju tkiva i organa putem čestica koje se označavaju kao lipoproteini. Svaka lipoproteinska čestica se sastoji iz hidrofobnog jezgra (koje se sastoji od nepolarnih komponenti: estara holesterola i triglicerida) i hidrofilnog omotača (koji sadrži amfipatični fosfolipidni dvosloj, neesterifikovani holesterol sa polarnom hidroksilnom grupom i apolipoproteine). Različiti sadržaji lipida i apolippoproteina u česticama uslovljavaju različita fizičko-hemijska svojstva ovih čestica (veličina, gustina, flotaciona konstanta i elektroforetska pokretljivost). Ultracentrifugiranjem razdvaja se pet glavnih klasa lipoproteina: hilomikroni, liporoteini vrlo male gustine (VLDL), lipoproteini intermedijerne gustine (IDL), lipoproteini male gustine (LDL) i liporoteini velike gustine (HDL). Hilomikroni su lipoproteini male gustine, a vrlo velike čestice koje se nakon centrifugiranja izdvajaju iznad plazme u vidu mlečnog prstena. Sastoje se uglavnom iz egzogenih triglicerida i imaju ulogu transporta ovih molekula (Caramori, 2000). Doktorska disertacija Tamara Popović 22 Lipoproteini vrlo male gustine (VLDL) imaju ulogu u transportu endogeno sintetisanih triglicerida. Relativno su velike čestice. Sadrže i ostale lipidne komponente, a pre svega holesterol. Lipoproteini intermedijerne gustine (IDL) sadrže holesterol i trigliceride (Breslow, 1985). Lipoproteini male gustine (LDL) sadrže uglavnom holesterol u vidu estara holesterola, tako da je njihova glavna funkcija transport holesterola. Lipoproteini velike gustine (HDL) sadrže od lipidnih komponenti holesterol, fosfolipide i trigliceride. Njihova uloga je protektivna jer uklanjaju holesterol iz perifernih tkiva (Caramori, 2000). 2.3.1. Metabolizam lipoproteina Metabolizam lipida se odvija u više faza egzogenim i endogenim putem kroz procese lipidne kaskade. Nakon varenja lipida u crevima i njihove apsorpcije u enterocite lipidi se transportuju u vidu lipoproteina iz creva u jetru, sto čini egzogenu fazu u metabolizmu lipida. Lipidi sintetisani u hepatocitima se iz jetre transportuju u periferno tkivo endogenim putem (Breslow, 1985). Ova dva puta se parcijalno preklapaju u stadijumu hidrolize čestica bogatih trigliceridima dejstvom enzima lipoproteinske i hepatične lipaze. Pored toga HDL transportuje holesterol iz perifernog tkiva ponovo u jetru što predstavlja reversni transport holesterola. U jetri se holesterol metaboliše u žučne kiseline i izlučuje iz organizma putem žuči i fecesa. Konačna ekstrahepatična koncentracija holesterola i stepen njegovog deponovanja u zidu krvnog suda, rezultat je ravnoteže ovih procesa (Brown, 1984). 2.3.2. Egzogena faza metabolizma lipoproteina Egzogena faza započinje u enterocitima stvaranjem hilomikrona iz lipidnih komponenti i apolipoproteina koji se sintetišu u endoplazmaticnom retikulumu enterocita. Holesterol unet hranom (kao estar holesterola) se absorbuje u intestinumu. Estri se hidrolizuju pomoću holesterol-esteraze i oslobañaju se holesterol i masne kiseline (Brown, 1984). Trigliceridi se hidrolizuju pomoću pankreasne i interstinalne lipaze i uglavnom apsorbuju kao slobodne MK i monogliceridi. Masne kiseline dugih lanaca nakon apsorpcije učestvuju u reesterifikaciji holesterola i resintezi TG u enterocitama, dok se MK kratkih lanaca Doktorska disertacija Tamara Popović 23 vezuju za albumin i tako transportuju u cirkulaciju. Resintetisani TG, holesterol i apolipoproteini se udružuju i grade velike lipoproteinske čestice poznatije kao hilomikroni. Hilomikroni se sastoje najvećim delom od TG, sekretuju se u limfu i ulaze u plazmu (Miller, 2011). U plazmi hilomikroni prihvataju apolipoprotein C I (Apo C I), apolipoprotein E (apo E) iz HDL-a u zamenu za estar holesterola i apolipoprotein A. Apo C utiče na liporoteinsku-lipazu enzim koji se nalazi u vaskularnom endotelu ekstrahepatičnog tkiva. Lipoproteinska lipaza hidrolizuje TG hilomikrona na glicerol i slobodne MK koje zatim preuzimaju ćelije. U ovom stadijumu hilomikroni se transformišu u ostatke hilomikrona (“remnant” čestice). Vezivanje ostataka hilomikrona za odgovarajuće receptore u hepatocitima i njihovom razgradnjom u istim, završava se egzogena faza metabolizma lipoproteina. Povećanje hilomikrona i ostataka hilomikrona bogatih sa TG posle obroka (postprandijalno) može preći kritičnu granicu sto dovodi do taloženja ovih čestica odnosno njihovih sastojaka u zidu arterija (Schwartz, 1993) (Slika7). 2.3.3. Endogena faza metabolizma lipoproteina Endogena faza metabolizma lipoproteina započinje stvaranjem VLDL čestica u hepatocitima. VLDL čestice nastaju u jetri iz endogeno sintetisanih TG, estara holesterola, apolipoproteina B-100 (apo B-100), koji se sintetišu u endoplazmatskom retikulumu, a sekretuju se putem Goldžijevog aparata u cirkulaciju. VLDL čestice se sastoje iz nekoliko subtipova, različitih veličina, koje su iako manji od hilomikrona jako bogati trigliceridima, i održavaju energetsko stanje organizma. VLDL kao i hilomikroni razmenjuju svoje komponente sa HDL-om. Na bilo kom stepenu VLDL-LDL kaskade lipoproteinske čestice bogate trigliceridima se mogu ukloniti iz plazme pomoću jetre. Ostaci velikih VLDL se direktno metabolišu dok ostaci malih VLDL ulaze u IDL-LDL put. U slučaju nekog poremećaja na LDL receptoru manje VLDL čestice se direktno uklanjaju i više transformišu u LDL. Ovo dovodi do povećanja koncentracija LDL-holesterola ( Breslow, 1985). Doktorska disertacija Tamara Popović 24 Slika 7. Metabolizam lipoproteina LDL transportuje holesterol iz jetre u periferna tkiva. Normalan LDL se preuzima pomoću LDL receptora i taj put je regulisan i ne dolazi do prekomerne akumulacije holesterola u ćeliji. U slučaju modifikacije LDL on ne može da se preuzima pomoću receptora hvatača (eng. scavenger-a) u makrofage i dolazi do njegove akumulacije (Kume, 1998). Doktorska disertacija Tamara Popović 25 2.4. Holesterol Holesterol je glavna komponenta plazmine membrane, strukturni je element intraćelijskih i ćelijskih membrana. Polarna -OH grupa mu daje amfifilan karakter dok steranski prsten omogućava veću rigidnost nego kod drugih membranskih lipida. Nalazi se i u lipoproteinima plazme gde je 70% holesterola esterifikovano pod uticajem enzima lecitin- holesterol-acil-transferaze (LHAT). Najčešće je esterifikovan sa linolnom kiselinom. Holesterol u cirkulaciji potiče iz ćelija gde je sintetisan (endogeni) ili je unet hranom (egzogeni). Sintetiše se u jetri i CNS-u. Oko 30% dnevne proizvodnje holesterola se kataboliše u jetri u žučne kiseline (Tietz,1996). Holesterol je prekursor steroidnih hormona kako polnih tako i hormona nadbubrežne žlezde, vitamina D i žučnih kiselina (Charlton – menys and Durrington, 2008). U ćelijskim membranama reguliše fluiditet, učestvuje u domenima kaveola i drugim svingolipidno-bogatim domenima (Jacobson, 2007). Holesterol se transportuje iz endoplazmatičnog retikuluma do plazmine membrane protein- posredovanim i vezikularnim putevima. Signalani putevi koji su uključeni su kompleksni i nisu kompletno razjašnjeni. Sterol-noseći-protein (sterol carrier protein 2-SCP-) je povezivan sa transportom lipida kao što su fosfatidilinozitol, sfingomijelin i fosfolipidi do plazmine membrane. On je uključen i u intracelularni put holesterola do plazmine membrane. (Schroeder, 2007). Apolipoprotein-posredovano celularno otpuštanje holesterola zahteva specifične interakcije apolipoproteina sa proteinima na ćelijskoj površini. CERP je holesterol oslobañajući regulatorni protein (poznat kao ABCA1-ATP vezujući transporter). Imajući u vidu ulogu transportera kao glavnog regulatora celularnog holesterola i fosfolipidne homeostaze predloženo je da ABCA1 doprinosi okretanju (flipping) lipida od unutrašnje ka spoljašnjoj membrani procesom uz učešće ATP-a (Oram, 2002). Doktorska disertacija Tamara Popović 26 2.5. Oksidativni stres Evolutivnim razvojem odbrambenih mehanizama, aerobni organizmi su postali sposobni da koriste kiseonik kao krajnji akceptor elektrona i da zaštite sebe od štetnih efekata reaktivnih metabolita kiseonika. Poremećaj balansa izmeñu nastajanja reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS, eng. reactive oxygen species) s jedne i aktivnosti antioksidativnog zaštitnog sistema (AOS, eng. antioxidant defence system) sa druge strane uzrokuje oksidativni stres (Halliwell1, 1999). Poremećaj balansa izmedju nastajanja ROS i AOS može uzrokovati razvoj različitih oštećenja ubrzavajući proces starenja, razvoj bolesti i smrt organizama (Sies, 1991). Povećanje u stvaranju ROS prisutno je u različitim patofiziološkim stanjima: kanceru, dijabetesu, aterosklerozi, neurodegenerativnim bolestima, reumatoidnom artritisu, stanjima ishemije/reperfuzije i drugim bolestima. Postoje dokazi da starenje uključuje progresivne promene u slobodno-radikalsko-posredovanim regulatornim procesima (Droge, 2002). ROS mogu dovesti do oštećenja ćelijskih lipida, proteina ili DNK i na taj način do inhibicije njihove normalne funkcije (Valko, 2007). Uspostavljanje delikatne i optimalne ravnoteže izmedju dobrih i loših efekata slobodnih radikala je veoma važno za normalno funkcionisanje živih organizama. Uloga reaktivnih vrsta kiseonika u ćelijskoj diferencijaciji, signalnim putevima, regulaciji metabolizma i intercelularnoj komunikaciji je nezaobilazna. Rasvetljavanje uloge azot monoksida (NO) kao endogenog transmitera i povezanost sa ROS, kao i nastanak novih vrsta (ONOO-) upotpunjuje moguće reaktivne vrste sa reaktivnim vrstama azota (RNS). Dakle, slobodno radikalske vrste mogu nastati (u mitohondrijama, mikrozomima, citosolu i endoplazmatičnom retikulumu) oksidativnim hidroksilovanjem u mikrozomima, autooksidacijom malih molekula oksidativnog praska u aktiviranim fagocitima za vreme inflamatornog odgovora (Jackson and O’Farrell 1993, Close 2005), u peroksizomima za vreme sinteze eikozanoida (dejstvom ciklooksigenaza, lipooksigenaza, i citohroma P450), kao produkti katalize, u toku procesa lipidne peroksidacije nezasićenih masnih kiselina, tokom oksidoredukcionih procesa u prisustvu metala kao i pod uticajem zračenja i ksenobiotika (Movat 1985, Jenkins 1988). Doktorska disertacija Tamara Popović 27 2.5.1. Fiziološki značaj ROS ROS se stvaraju pri prenosu elektrona na kiseonik u mitohondrijalnom transportnom lancu elektrona (Valko, 2004). U izmenjenim uslovima stvaraju se u neutrofilima za vreme respiratornog praska. U procesu β-oksidacije masnih kiselina i njihovom metaboličkom putu nivo vodonik-peroksida u peroksizomima se značajno povećava. Oksidacijom D- amino-kiselina, aktivacijom citohroma P450, degradacijom ksantina do mokraćne kiseline i autooksidacijom nekih kateholamina stvaraju se superoksid-anjon-radikal, kao i vodonik- peroksid (Li,1999). Slobodni kiseonični radikali pod fiziološkim uslovima imaju višestruke korisne uloge (Gutteridge and Halliwell, 1989). Učestvuju u biološkim procesima kao što su normalan ćelijski rast, pomažu ćelijsku adaptaciju i njen oporavak (Close 2005), programiranu ćelijsku smrt kao i starenje ćelije, učestvuju u fagocitozi (Movat 1985). U procesima signalizacije vezivanje brojnih peptidnih faktora rasta stimulišu ROS (u signalizaciji obavljaju oksidativnu ulogu): insulinski faktor rasta (IGF), vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) (Finkel 2003), citokini koji učestvuju u sistemskoj inflamaciji (Colavitti, 2002). Mnogi od ROS-posredovanih odgovora zapravo štite ćelije od oksidativnog stresa i učestvuju u ponovnom uspostavljanju „redoks homeostaze“. Kod viših organizama azot- monoksid i redoks- aktivne vrste uključeni su kao signalni molekuli za druge fiziološke funkcije kao što su regulacija vaskularnog tonusa, produkcija eritropoetina i signalna transdukcija od membranskih receptora. Sposobnost neutrofila za produkciju ROS i uloga u borbi protiv mikroorganizama je bitna za odbranu ćelija domaćina (Close 2005). Proizvodnja ROS u fagocitima i uloga NADPH oksidaze kao i mijeloperoksidaze (MPO), uz oslobadjanje neutrofilnih proteaza, u ubijanju bakterija navoñena je u literaturi mnogo puta (Reeves 2002). 2.5.2 Reaktivne kiseonične vrste Slobodni radikali mogu ometati funkciju više molekula. Oni su reaktivne hemijske vrste sa jednim ili više nesparenih elektrona, kao što su hidroksil-radikali, superoksid-anjoni, peroksil-radikali (Slika 8). Doktorska disertacija Tamara Popović 28 Superoksid- anjon-radikal (O2.-) Ovaj radikal nastaje u svim aerobnim ćelijama jednovalentnom redukcijom molekulskog kiseonika prema reakciji: O2 + e- → O2.- Superoksid-anjon-radikal se stvara u respiratornom lancu mitohondrija uključujući NADH- dehidrogenazu i ubihinon-Q-citohrom b-kompleks. Mitohondrijalno nastali superoksid- anjon spontano dismutuje do vodonik-peroksida i kiseonika ili je reakcija efikasno katalizovana sa mitohondrijalnom MnSOD. Mitohondrijalna produkcija superoksid-anjona može biti povećana fiziološkim koncentracijama azot-monoksida koji inhibira citohrom- oksidazu i sukcinat i NADH-koenzim-Q-reduktazu u membranama mitohondrija pacovskih srca (McIntyre, 1999). Superoksid-anjon-radikal nastaje pri autoksidaciji flavina, pterina, kateholamina (Cross, 1991). Može nastati i delovanjem različitih enzima oksidaza i dehidrogenaza. Superoksid- anjon može da nastane u ćeliji delovanjem spoljašnjih agenasa kao što je zračenje (Petkau, 1986) i delovanjem citostatika. Nastaje i oksidacijom hemoglobina (Hb) i mioglobina (Mb) u njihove oksidovane oblike methemoglobin (MetHb) i metmioglobin (MetMb) (Petkau, 1986). Višestruko je štetan za ćeliju: može da stvori nove radikalske kiseonične vrste (Singh,1978), može da reaguje kao oksidaciono i redukciono sredstvo (Weiss, 1986). Takoñe može da izazove depolimerizaciju polisaharida (Fridovich1978), inaktivaciju nekih virusa, da remeti sintezu DNK, oštećuje enzime i ćelijske membrane. Superoksid-anjon- radikal može da indukuje peroksidaciju lipida i transkripciju ribonukleinskih kiselina. Kada su fagocitne ćelije (npr. neutrofili) izložene nekom stimulusu dolazi do niza reakcija koje su označene kao oksidativni prasak (respiratory burst) (De Coursey i Ligeti, 2005). Nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat-oksidaza u neutrofilima generiše superoksid-anjon radikal, koji je neophodan za destrukciju bakterijskih ćelija. Ovaj enzimski kompleks se sastoji od dve, za membranu-vezane komponente, gp91phox i p22phox, koje čine citohrom b585, koji predstavlja enzimsko jezgro kompleksa. Posle aktivacije, citosolne komponente p47 phox, p67 phox p40 phox i g-vezani protein, Rac i RapIA. translociraju se do membrane pri čemu se formira aktivni enzimski kompleks. NAD(P)H-oksidaza, koja se nalazi van fagocitnih ćelija, produkuje superoksid-anjon-radikal, u količini koja iznosi 1 do10 % od Doktorska disertacija Tamara Popović 29 nivoa produkcije O2.- u neutrofilima i za ovako nastali radikal smatra se da ima funkciju u intraćelijskim signalnim procesima. Vodonik-peroksid Vodonik-peroksid je najstabilniji meñuproizvod redukcije molekulskog kiseonika (Cadenas, 1989). Nastaje dismutacijom superoksid-anjon-radikala pomoću enzima superoksid-dismutaze, reakcijom: 2O2.- + 2H+ SOD→ H2O2 + O2 U ćeliji vodonik-peroksid može da nastane u peroksizomima, mitohondrijama, mikrozomima i endoplazamtičnom retikulumu (Sies 1985). Vodonik-peroksid nastaje u ćeliji i delovanjem nekih oksidaza: urat-oksidaze, monoaminooksidaza (MAO), oksidaze D-aminokiselina, oksidaze L-hidroksikiselina, kao i u reakcijama autooksidacije askorbata, glutationa, tiola i kateholamina (Halliwell, 1993). Dovodi do oksidacije sulfhidrilnih grupa proteina i do inicijacije procesa lipidne peroksidacije (Cohen, 2009). Vodonik-peroksid u reakciji sa jonima metala (Fe2+) dovodi do stvaranja izuzetno reaktivnog hidroksil-radikala (.OH) (Cadenas, 1989) (Slika 8). Peroksizomi predstavljaju ćelijske organele koje produkuju vodonik-peroksid kao sporedni produkt oksidacije masnih kiselina i aminokiselina u fiziološkim stanjima. Toksičnost vodonik-peroksida sprečena je dejstvom katalaze koja ga razlaže do vode i kiseonika. Na ovaj način, peroksizomi održavaju delikatnu ravnotežu izmedu produkcije i neutralizacije ROS. Kako peroksizomi to čine još uvek nije dovoljno jasno. Kada su peroksizomi oštećeni, velike količine vodonik-peroksida izlaze u citoplazmu, dovodeći ćeliju u stanje oksidativnog stresa (Valko, 2004). Hidroksil-radikal (.OH) Hidroksil-radikal je najtoksičnija reaktivna vrsta kiseonika koja može da reaguje sa biološkim molekulima i da izazove njihovo oštećenje. Nastaje redukcijom molekulskog kiseonika pomoću tri elektrona. Doktorska disertacija Tamara Popović 30 Slika 8. ROS i putevi njihove meñukonverzije Hidroksil-radikal može da nastane iz vodonik-peroksida (Halliwell, 1990). Fenton je krajem 19. veka opisao reakciju u kojoj vodonik-peroksid može da reaguje sa jonima metala (Fe2+ ili Cu+), pri čemu nastaju hidroksil-radikali (Fenton, 1984). Ova reakcija je po njemu i dobila ime (Fentonova reakcija): Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + .OH + OH- Cu+ + H2O2 → Cu2+ + .OH + OH- Reakcijom izmeñu superoksid-anjon-radikala i vodonik-peroksida u prisustvu jona metala (Fe) nastaju hidroksil-radikali, a ova reakcija se zove Haber-Weissova reakcija: O2.- + H2O2 O2 + . OH + OH- Doktorska disertacija Tamara Popović 31 .OH može nastati iz vode pri aplikaciji većih doza zračenja (Cohen, 1986). Hidroksil- radikali su kratkoživeći, reaguju sa drugim biološkim molekulima (šećeri, amino kiseline, fosfolipidi, DNK baze, organske kiseline) i stvaraju sekundarne radikale (Halliwell, 1999). Za Fentonovu reakciju se zna da se odvija u in vitro uslovima, ali njen značaj u fiziološkim stanjima još uvek nije potpuno jasan, imajući u vidu činjenicu da su slobodni katalitički joni skoro nedostupni, jer ih vrlo efikasno uklanjaju metal-vezujući proteini (Kakhlon i Cabantchlk, 2002). Meñutim, postoje stanja “prepunjenosti gvožñem" u organizmu (npr. hemohromatoza) kada su dostupne veće količine ,,slobodnog gvoždja", što može imati štetne efekte na ćelijske strukture. Peroksil-radikal (ROO.) Sledeća reaktivna vrsta koja može nastati od kiseonika u biološkim sistemima je peroksil- radikal (ROO). Najednostavnija forma peroksil-radikala je hidroperoksil-radikal (HOO.), ili perhidroksil-radikal (De Grey, 2002). Hidroperoksil-radikal može inicirati proces peroksidacije masnih kiselina preko dva paralelna mehanizma. Jedan od mehanizama se odvija u in vivo uslovima i ksantin-oksidaza ima ulogu u ovom procesu. Ksantin-oksidaza (XO) i ksantin- dehidrogenaza (XD) su dve forme istog enzima označenog kao ksantin- oksidoreduktaza (XOR) (Borges, 2002; Vorbach, 2003). U katabolizmu purina, XOR katalizuje oksidativnu hidroksilaciju hipoksantina do ksantina, a zatim ksantina do mokraćne kiseline. Ksantin oksidoreduktaza, na taj način ima bitnu ulogu u enzimskoj odbrani ćelije od oksidativnog stresa (Vorbach, 2003). Singlet kiseonik( 1O2) Singlet kiseonik nema nesparenih elektrona, nije radikal, javlja se u aerobnim organizmima kao snažan oksidujući agens i prvo je „pobudjeno“ stanje molekulskog kiseonika. Singlet kiseonik nastaje reakcijama: O2.- + O2.-+ 2H+ → 1O2 + H2O2 O2.- + H2O2 + H+ → 1O2 + .OH + H2O Singlet kiseonik može da nastane pri osvetljavanju bioloških pigmenata i osvetljavanjem hloroplasta (Halliwell, 1999). Usled njegove reakcije sa različitim konstituentima ćelije Doktorska disertacija Tamara Popović 32 nastaju i štetni efekti (Halliwell, 1990). Singlet kiseonik reaguje direktno sa membranskim lipidima i učestvuje u formiranju lipidnih peroksil-radikala (Halliwell, 1990). 2.5.3. Oksidativna oštećenja makromolekula Oksidativni stres uzrokuje oksidativna oštećenja ćelija. Narušena ravnoteža ROS i AOS odražava se na lipide, proteine, nukleinske kiseline i ugljene hidrate (Aguilo 2005, Tauler 2006). Slobodni radikali mogu da izazovu oštećenja DNK, destrukciju nukleotidnih koenzima, mogu dovesti do poremećaja aktivnosti SH-zavisnih enzima, do oštećenja ćelijske membrane (Slater, 1989). Lipidna peroksidacija predstavlja niz lančanih slobodno- radikalskih reakcija koje dovode do razlaganja polinezasićenih masnih kiselina (PUFA) što za posledicu ima razaranje ćelijskih membrana i smrt ćelija (Close, 2005). Štetno delovanje ROS povezano je sa starenjem (Finkel, 2003) i nekim bolestima koje su posledica starenja (kancer, ateroskleroza i neurodegeneracija). (Slika 9) 2.5.3.1. Oksidativna oštećenja lipida U interakcijama ROS sa biološkim makromolekulima nastaju organski radikali. Jedan od najbolje proučenih procesa je lipidna peroksidacija (LP). U ovom procesu stvaraju se lipidni peroksil-radikali (ROO.) i lipidni hidroperoksidi (ROOH). Lipidni peroksidi, u reakcijama koje su katalizovane jonima metalima stvaraju alkoksi-radikale (RO.), holesterol-hidroperokside, endoperokside, epokside holesterola i masnih kiselina (Behrman, 1993, Halliwel1, 1995, Halliwell i Chirico 1993). LP može da dovede do degradacije lipidnih membrana, interakcije degradacionih produkata sa različitim molekulima u ćeliji i izvan nje, kao i do produkcije novih ROS u toku lančane reakcije (Dargel, 1991). Doktorska disertacija Tamara Popović 33 Slika 9. Oštećenja makromolekula slobodnim radikalima i posledice oštećenja Reakcija lipidne peroksidacije je lančana reakcija. Prvi korak u inicijaciji LP predstavlja oduzimanje atoma vodonika iz PUFA, koje ulaze u sastav bioloških membrana, tako da nastaje lipidni radikal (L.) (Halliwell i Gutteridge, 1989, Fridovich, 1989). Što je veći broj dvogubih veza u lancu viših masnih kiselina to je lakše odvajanje vodonikovog atoma a to je i razlog zbog koga su PUFA podložne peroksidaciji. U daljim procesima teku lančane slobodno-radikalske reakcije (propagacija) dolazi do stvaranja peroksil-radikala i organskih hidroperoksida (Dargel, 1991). Tok propagacije Doktorska disertacija Tamara Popović 34 zavisi od odnosa lipida i proteina u membrani. Sastav masnih kiselina, koncentracija kiseonika u membrani utiču na fazu propagacije. Za vreme propagacije lipidni hidroperoksidi (LOOH) u prisustvu gvožña disosuju do lipoksidnog (LO.) i peroksil- radikala (LOO.) koji reiniciraju peroksidaciju. L-H + OH. → H2O + L. L. + O2 → LOO. LOO. + LH → LOOH + L. LOO. + RH → LOOH + R. Krajnji proizvodi lipidne peroksidacije su: 4-hidroksi nonenal (HNE) i malondialdehid (MDA). MDA je glavni izvor lipofuscina čija se koncentracija u tkivima povećava tokom starenja. Malondialdehid može da reaguje sa slobodnim amino-grupama proteina i nukleinskih kiselina i da dovede do jos većih oštećenja ćelije (Scott, 1995). Proizvod n-6 PUFA (LA i AA), 4-OH-nonenal (HNE), je toksičan i inhibira rast ćelija, modifikuje lipoproteine, podstiče aterosklerozu (Leonarduzzi, 2005). On se metaboliše preko GSH- konjugata do merkapturne kiseline (Yang, 1998). Autooksidansi prekidaju lančane reakcije i stvaraju stabilne proizvode tj. uvode reakcije u terminalne faze. Terminaciju otpočinje vitamin E koji koji daje elektrone za prekidanje reakcije. Stepen lipidne peroksidacije je moguće odrediti odreñivanjem gubitka nezasićenih masnih kiselina, odreñivanjem količine primarnih produkata peroksidacije i količine sekundarnih proizvoda kao što su karbonili i ugljenohidratni proizvodi (Halliwell and Chirico, 1993). Lipidna peroksidacija dovodi do nastanka novih slobodnih MK (Evereklioglu, 2003). Unos PUFA masnih kiselina hranom omogućava njihovu ugradnju u membrane, što rezultira povećanom lipidnom peroksidacijom kao uz porast aktivnosti SOD i CAT (Pizato, 2005). Doktorska disertacija Tamara Popović 35 2.5.3.2. Oksidativno oštećenje proteina Mehanizmi uključeni u oksidaciju proteina reaktivnim kiseoničnim vrstama su proučavani u eksperimentima u kojima su aminokiseline, prosti peptidi i proteini izlagani jonizujućem zračenju u uslovima gde se formiraju hidroksil-radikali ili mešavina hidroksil- i superoksid-anjon-radikala (Stadtman, 2004). Bočni lanci aminokiselinskih ostataka proteina, posebno cisteina i metionina, su osetljivi na oksidaciju izazvanu ROS/RNS (Stadtman, 2004). Oksidativno oštećenje proteina podrazumeva izmenu sekundarne i tercijarne strukture proteina, oštećenja proteina produktima lididne peroksidacije. Usled oksidativnog oštećenja proteina dolazi do promena propustljivosti membrana, narušavanja ćelijske signalizacije, transporta jona. Kaskadno se iniciraju peroksidacioni procesi i menja inflamatorni odgovor (Slater, 1987, Lansing, 1991). 2.5.3.3. Oksidativno oštećenje nukleinskih kiselina Rezultat oštećenja nukleinskih kiselina sa ROS može biti: prekid jednog lanca, prekidi oba lanca DNK, DNK-DNK unakrsno povezivanje („cross-links“), modifikacija baza (otvaranje prstena, hidroksilacija prstena), oštećenja na ugljenohidratnom ili fosfatnom delu polinikleotidnog lanca (Valko, 2006). Oksidaciona oštećenja mogu dovesti do mutacija, narušiti DNK replikaciju, transkripciju, translaciju, prouzrokovati starenje i smrt ćelije (Ames, 1991). 2.5.3.4. Oksidativna oštećenja ugljenih hidrata Izolovani molekuli ugljenih hidrata (monosaharidi) kao što su glukoza ili fruktoza podložni su oksidaciji sa ROS. Veći fiziološki efekat prouzrokuju oštećenja na složenijim molekulima, koji imaju ugljeno-hidratnu komponentu (nukleinske kiseline-u čiji sastav ulaze pentoze, kao i preteini koji imaju razgranate oligosaharidne lance kovalentno vezane za asparagin ili treonin) (Halliwell i Gutteridge, 1989). Doktorska disertacija Tamara Popović 36 2.5.4. Metode za identifikaciju ROS S obzirom na to da je poluživot ROS kratak za njihovo identikovanje i odreñivanje potrebne su posebne tehnike, kao što je elektron spin rezonanca (ESR) (Jackson, 1985). U širokoj primeni su metode odreñivanja proizvoda nastalih u reakciji ROS sa biomolekulima. Modifikovane baze, kao što su timin-glikol i 8-hidroksi-guanozin mogu se nalaziti u urinu, a promene u njihovom sadržaju koriste se za praćenje i procenu oksidacionih oštećenja DNK in vivo (Maidt i Floyd, 1996). Za procenu stepena lipidne peroksidacije primenjuje se spektrofotometrijsko merenje koncentracije MDA, u reakciji sa tiobarbiturnom kiselinom (Close 2005). Imunološke tehnike koriste se za identifikaciju oksidovanog LDL-a u patogenezi ateroskleroze, ali i nekih drugih oboljenja (Vaughan, 1997). 2.6. Antioksidativni sistem odbrane organizma (AOS, eng. antioxidative defence system) Antioksidanti sprečavaju delovanje slobodnih kiseoničnih radikala na više nivoa: lokalnim smanjenjem slobodnih kiseoničnih radikala, sprečavanjem stvaranja ROS, vezivanjem slobodnih metalnih jona, uklanjanjem ROS, prekidanjem stvaranja novih radikala (Gutteridge and Halliwell, 1988). Antioksidativni zaštitni sistem obuhvata primarnu i sekundarnu antioksidativnu zaštitu. Primarna se sastoji od enzimskih (katalaza, superoksid- dismutaza, enzimi glutation ciklusa, citohrom-oksidaza, ksantin-oksidaza) i neenzimskih komponenata (vitamini A i E, vitamin C, albumin, transferin mokraćna kiselina, bilirubin). Sekundarnu antioksidativnu zaštitu čine: protein-specifične oksidoreduktaze (tiol- transferaze) (Brigelius 1985), protein-ADP-ribozil-transferaze (Berger, 1985) i ATP i Ca2+-nezavisne proteaze (Cadenas, 1989). Doktorska disertacija Tamara Popović 37 2.6.1 Antioksidativni enzimi Enzimske komponente primarne antioksidativne zaštite su SOD, CAT, enzimi glutation- ciklusa (GSH-Px, GST, GR i fosfolipid-hidroperoksid) (Evereklioglu 2003), citohrom- oksidaza, tioredoksin i familija peroksiredoksin-proteina. Njima je zajedničko svojstvo da blokiraju početak lančanih slobodnoradikalskih reakcija. Superoksid-dismutaza (SOD) SOD pripada grupi metaloenzima. Katalizuje dismutaciju superoksid-anjon-radikala u molekulski kiseonik i vodonik peroksid (McCord i Fridovich, 1969). 2O2.- + 2H+ SOD → H2O2 + O2 Ima 3 izoenzimske forme: citosolna (CuZnSOD) koja je dimer, mitohondrijalna (MnSOD), tetramer i ekstracelularna (EC SOD) tetramer i prokariotska SOD koja sadrži jon gvožña ( FeSOD) (Fridovich, 1989). Katalaza (CAT) Katalaza (CAT) katalizuje razgradnju vodonik-peroksida do vode i kiseonika (Margeritis 2003). 2H2O2 CAT → 2H2O + O2 Katalaza je tetramerni hemoprotein molekulske mase 240kDa. Sastoji od 4 subjedinice, sadrži protoporfirinsko jezgro sa jonom gvožña u aktivnom centru. Prisutna je u svim tkivima sisara (u peroksizomima). Peroksizomi su respiratorne organele koje katabolizuju većinu supstanci preko vodonik-peroksid generišućih enzima koji se onda razlaže pomoću katalaze. Katalaza se može naći i slobodna u citosolu u retikulocitima i u zrelim eritrocitima, dok su najviši nivoi katalazne aktivnosti nañeni u jetri i eritrocitima (Halliwell i Gutteridge, 1999). Glutation-peroksidaza (GSH-Px) Glutation-peroksidaza katalizuje glutation-zavisnu redukciju vodonik-peroksida u vodu i organskih hidroperoksida u odgovarajuće alkohole, prema sledećim jednačinama: H2O2 + 2GSH → GSSG + 2H2O Doktorska disertacija Tamara Popović 38 2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O GSH-Px, GPx nalazi se u citosolu (92%) i matriksu mitohondrija. Mogu biti selen- nezavisne (katalizuju redukciju organskih hidroperoksida i pretpostavlja se da pripadaju familiji glutation-S-transferazne aktivnosti) i selen-zavisne (tetramerni enzim, sa selenom u aktivnom centru u obliku selenocisteina) (Cotgreave, 1988). 2.6.2. Neenzimski antioksidansi Neenzimske komponente AOS dele se na komponente rastvorljive u mastima i rastvorljive u vodi (Margeritis 2003). Liposolubilne su: vitamin E (alfa-tokoferol, vitamin A (retinol), provitamin A (beta-karoten), koenzim Q (ubihinon). Hidrosolubilni antioksidansi su: vitamin C (askorbinska kiselina), redukovani glutation (GSH), mokraćna kiselina, albumin, transferin, ceruloplazmin, feritin, bilirubin, cistein, histidin, laktoferin. Osim pomenutih ubrajaju se i melatonin, metalotioneini, piruvat, alfa- ketoglutarat, estrogeni, lipoinska kiselina, karnozin. Vitamin E je najznačajniji liposolubilni egzogeni prirodni membranski antioksidans kod ljudi. Uklanja ROS i prekida lanac reakcija peroksidacije membranskih lipida. U krvnoj plazmi štiti lipoproteine od oksidacije (Halliwell, 1991). Za njegovu aktivnost značajan je vitamin C koji ga regeneriše. 2.6.3. Vanćelijski antioksidansi U vanćelijske antioksidanse ubrajaju se: transferin, laktoferin, haptoglobin, ceruloplazmin, albumini, EC-SOD, EC GPx, glukoza, bilirubin, urati. Osnovna uloga nekih od njih je zadržavanje jona Fe i Cu u nereaktivnom obliku i onemogućavanje delovanja sa vodonik- peroksidom i superoksid-anjonom (Marklaud, 1982). EC-SOD katalitički uklanja superoksid- anjon. EC-GSHPx uklanja hidroperokside, glukoza uklanja hidroksil-radikal, bilirubin peroksil- radikale, a urati vezuju jone metala. Doktorska disertacija Tamara Popović 39 2.7. Laktat-dehidrogenaza (LDH) Merenje aktivnosti LDH koristi se u dijagnostici, ali je značajnije analiziranje izoenzimskih oblika LDH jer se raspodela pojedinih oblika u organima razlikuje. Laktat- dehidrogenaza katalizuje prelazak piruvata (krajnji proizvod glikolize) u laktat (uz učešće NADH) kad postoji odsustvo ili slabo prisustvo kiseonika. Izoenzimi LDH se označavaju na osnovu svoje elektroforetske pokretljivosti od 1 do 5, tako da LDH1 ima najveću a LDH5 najmanju elektroforetsku pokretljivost. Heterogenost LDH objašnjena je subjediničnom strukturom njenih izoenzima. Prema distribuciji izoenzima LDH u tkivima i organima oni se mogu podeliti u tri grupe: prvu grupu (čine tzv. "brzi izoenzimi" LDH1 i LDH2 koji su najviše zastupljeni u srcu, bubrezima i eritrocitima, drugu grupu čine tzv "spori izoenzimi", LDH4 i LDHs karakteristični za jetru i skeletne mišiće, i treću grupu srednji izoenzimi LDH3: karakteristični za pluća, tiroideu i nadbubreg. Usled oštećenja ćelijske membrane u procesu peroksidacije lipida i promene u njenoj permeabilnosti dolazi do ,,curenja" mnogih enzima citosola u ekstracelularni prostor. Na taj način se utvrñuje stepen oštećenja pojedinih organa. 2.8. Paraoksonaze (PON enzimska familija) Esteraze su klasifikovane u tri grupe (A, B i C esteraze) na bazi njihove reaktivnosti sa organofosfornim jedinjenjima kao što je paraokson i diizopropil-fluorofosfat. A-esteraze (uključujući arilesteraze) hidrolizuju organofosfate brzo, dok su B-esteraze (uključujući acetilholinesteraze i nespecifične karboksilesteraze) inhibirane organofosfatima. C-esteraze (npr. acetilesteraza) ne interaguju sa organofosfatima. Inter-individualna varijacija u aktivnosti esteraza je važan faktor koji utiče na farmakološke i toksikološke efekte prekursora aktivnih supstanci u kod ljudi i životinja (Atessahin, 2004). Studije pokazuju da paraoksonaze mogu značajno sniziti stvaranje proizvoda lipidne peroksidacije za vreme LDL oksidacije i da zbog toga omogućavaju HDL- vezanu zaštitu protiv procesa ateroskleroze (Mackness, 1993). Oksidovani LDL igra ulogu u dogañajima vezanim za inicijaciju ateroskleroze. HDL se pokazalo da sprečavaju oksidativne modifikacije LDL in vitro i in vivo (Klemola 2002). Paraoksonaze (PON1 i PON3 familije) Doktorska disertacija Tamara Popović 40 cirkulišu vezani za HDL čestice. Oni inhibiraju aterogenezu hidrolizom lipidnih hidroperoksida i sprečavajući LDL oksidaciju (Carro, 2005). 2.9. Starenje i slobodno-radikalska teorija Harmanova teorija starenja predstavlja slobodno-radikalsku teoriju starenja. Po njemu dužina života je inverzna funkcija metaboličke stope, a to je proporcionalno potrošnji kiseonika. Ukratko, po ovoj teoriji, ROS produkovane za vreme respiracije u toku života, mogu uzrokovati kumulativna oštećenja koja vode gubitku funkcija organizma i smrti. Kasnije, ta teorija je modifikovana tako da ne samo starenje per se već starenjem izazvane bolesti kao što su kancer, artritis, ateroskleroza, dijabetes, Alchajmerova bolest dovode do promena na ćelijama i organima. Dakle, po ovoj hipotezi degenerativne bolesti, udružene sa starenjem, uključuju slobodno-radikalske procese (Harman, 1950). Danas se fokus i naučna pažnja vezana za starenje sve više premešta iz mitohondrija u citoplazmu. Kalorijska restrikcija svakako dovodi do smanjenja mitohondrijalne funkcije. Blagi ROS odgovor, posredovan peroksidom, ključan je za aktivaciju adekvatnog odgovora u citoplazmi, posredovanu ćelijsku signalizaciju i produžetak dužine života. Slobodno radikalska teorija koja je zastupala da akumulacija oksidativnih oštećenja dovodi do starenja doživela je kritike (Blagosklonny, 2010). Prvo, povećana ekspresija glavnih AOS enzima, koji hvataju slobodne radikale, nije produžila život miševa (Perez, 2009). Drugo, delecija myt SOD (Sod2) produžila je život C.elegans (Van Raamsdonk, 2009 ). Treće, produženje života sa kalorijskom restrikcijom nije bilo povezano sa zaštitom protiv oštećenja somatskih DNK u D.melanogaster (Edman U, 2009). Četvrto, SOD2 haplotipska insuficijencija nije favorizovala starenje kod miševa sa disfunkcionalnim telomerama (Guachalla, 2009 ). Postoji nekoliko teorija koje su objašnjavale starenje. Složile su se da ili kalorijska restrikcija ili inaktivacija nutrijentno-zavisnih puteva (protein kinaza A) predstavljaju mehanizme koji deluju na produženje života kod različitih eukariota (eng. living on the edge). Doktorska disertacija Tamara Popović 41 2.9.1. Kalorijska restrikcija i starenje Kalorijska restrikcija bez malnutricije odlaže starenje i produžava život kod različitih vrsta. Kod primata ti efekti nisu dovoljno razjašnjeni. Longitudinalna dvadesetogodišnja studija, iz 2009-te na odraslim majmunima pokazala je da umerena kalorijska restrikcija snižava stopu smrtnosti povezanu sa starenjem. Procenat preživljavanja bio je veći u grupi sa kalorijskom restrikcijom u odnosu na kontrolnu grupu bez nje. Kalorijska restrikcija odlaže incidencu nekoliko patologija povezanih sa starošću kao što su dijabetes, kancer, kardiovaskularne bolesti, pa je to ojačalo teoriju o značaju primene iste na ljude. U 2009. godini brojne studije su ustanovile vezu izmeñu kalorijske restrikcije, dužine života, i signalnih puteva koji uključuju Sir2 (sirtuin) i p53 kod D.melanogaster (Bauer JH,2009 ) i E3 ubiquitin ligaze WWP-1 kod C.elegans (Carrano AC, 2009), kao i komponente ushodnog i nishodnog puta TOR (targeta rapamicina). 2.9.2. Farmakološke intervencije Serotonin/treonin protein kinaza (mTOR) reguliše ćelijski rast, ćelijsku proliferaciju, ćelijsko preživljavanje, transkripciju. Smanjenjem TOR aktivnosti usporava se starenje kod S.cerevisiae, C.elegans i D.melanogaster. Rapamicin je mTOR inhibitor, za koga je potvrñeno da produžava život. Kalorijska restrikcija i metioninska restrikcija dovode do produženja životnog veka smanjenjem mTOR aktivnosti dok se rapamicin koristi u prevenciji odbacivanja transplantiranog tkiva. U eksperimentu Harrison i sar, u kome je postojala administracija tOR-inhibitora u 600 dana stare miševe značajno je produžila njihov život. Dakle, mTOR inhibitori su zapravo gerosupresanti (Harrison DE, 2009 ). Wang i sar. su ispitivali farmakološke efekte clioquinol-a (5-hloro-7-jodohinolin-8-ol), metalnog helatora koji je ispoljio pozitivne efekte u nekoliko modela neurodegenerativnih bolesti inhibirajući aktivnost mitohondrijalnog enzima CLK-1 (clk-1/mclk-1 kodiraju mitohondrijalnu hidrolazu koja je neophodna za biosintezu ubihinona tj. koenzima Q) u ćelijama sisara. Kao inhibitor CLK-1 može usporiti procese starenja (Wang Y, 2009). Doktorska disertacija Tamara Popović 42 2.9.3. Autofagija Veza autofagije i procesa starenja je vrlo kompleksna. Autofagija se aktivira za vreme celularnog starenja. Prirodni polianjon spermidin može produžiti životni vek u kvascima, kod ptica, nematoda. Spermidin izaziva gubitak esencijalnih autofagnih gena u C.elegans (Isenberg T, 2009). Epel i sar. ispitivali su dužinu života kod S.pombe. Studija je pokazala da sty 1 MAP kinaza (za koju je poznato da je aktivira vodonik-peroksid) igra ulogu u promociji dužine života, za vreme kalorijske restrikcije, kada se indukuje ROS produkcija (Epel ES, 2009). Starenje, kao posledica metaboličkih aktivnosti utiče na sve žive organizme. Veruje se da je nemoguće izbeći oštećenja koja uzrokuje oksidacija, što doprinosi starenju. Oksidaciona oštećenja kao i ROS rastu sa starenjem. Štaviše, kalorijska restrikcija izaziva redukciju u metaboličkom turnoveru, slobodno-radikalskoj produkciji i produžava život različitim organizmima. Zapravo, živa bića se adaptiraju na ROS. Manipulacija sa redoks statusom ili targetima metaboličke aktivnosti može uticati na antioksidativnu mašineriju (Rasler, 2009). Doktorska disertacija Tamara Popović 43 III MATERIJAL I METODE 3.1. Hemikalije i reagensi Sve hemikalije su bile p.a. kvaliteta, komercijalno dostupne. Za pripremu rastvora korišćena je dvostruko dejonizovana voda. -Za odreñivanje biohemijskih parametara krvi pacova korišćeni su komercijalno dostupni kitovi, Elitech Diagnostic, Sees, France. - u postupku ekstrakcije lipida i razdvajanju lipidnih klasa na TLC-u korišćeni su organski rastvarači, Baker J.T. - Sve ostale korišćene hemikalije i reagensi bili su kompanije Sigma-Aldrich, Germany. 3.2. Analiza sastojaka ribljeg ulja Sastav ribljeg ulja u kapsuli (Natural Wealth, Nordvik, Srbija) analiziran je primenom GC/MS firme Agilent GC/MS (7890A) MS (59755C inert XL EI/CIMSD) sa DB23 kolonom (Agilent Tehnologies Inc, Santa Clara, CA, USA) sa konstantim pritiskom. Temperaturni program počeo je od 50 ºC (1min), a onda se temperatura povećavala za po 25 ºC/min do 175 ºC a potom za 4 ºC/min do 235 ºC za 5 minuta. Pritisak je bio 46.07 psi, a split protok 150 ml/min. Rezultati analize prikazani su u odeljku 4.1.1. 3.2.1. HPLC analiza tokoferola u ribljem ulju Priprema uzorka: u 2 g ribljeg ulja dodato je 100 ml 50% KOH u etanolu, i hidroliza je trajala 16 h. U 10 ml hidrolizata dodato je 5 ml vode i 5 ml n-heksana. Smeša je vorteksirana i gornji n-heksanski sloj je uzet za dalja ispitivanja. Proces ekstrakcije je ponovljen još dva puta. n-heksanski sloj je uparen na vakuumu i dodato mu je 1ml metanola. Pre analize uzorci su profiltrirani kroz 0.45 µm špric filtere sa regenerisanom celulozom. Uzorci su analizirani tečnom hromatografijom na uredjaju firme Agilent 1100 sa DAD detektorom, na Sun Fire C-8 koloni (4.6 x 150mm, 3.8 µm) (P.N. 186002732,Waters, Doktorska disertacija Tamara Popović 44 Ireland). Trihlorsirćetna kiselina (0.01%) je bila mobilna faza. 25 µL uzorka je injektovano u sistem, vitamini su detektovani u oblasti talasnih dužina 284-326 nm, a referentna talasna dužina je na 450 nm. Rezultati analize prikazani su u odeljku 4.1.2. 3.3. Eksperimentalne životinje i dijeta Eksperimenti su izvedeni sa 3 meseca (kontrolna grupa, telesna masa 283 ± 7.3g. i tretirana grupa, telesna masa 287 ± 8.1g.) i 22 meseca starim muškim pacovima Wistar soja (kontrolna grupa telesna masa 380±7.3g i tretirana grupa, telesna masa 387±8.1g.), gajenim individualno u kavezima u prostorijama pod kontrolisanim uslovima (12 h svetlost/mrak ciklusi, temperatura 22 ± 2ºC). U svakoj grupi bilo je po 10 pacova. Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa principima Evropske konvencije za zaštitu životinja vertebrata korišćenih za eksperimente (N.L 358/1-358/6.18 decembar 1986.). 3.3.1. Tretiranje pacova Wistar soja ribljim uljem Eksperimentalne životinje hranjene su standardnom laboratorijskom hranom (Veterinarski zavod Subotica). Riblje ulje koje je davano životinjama, dobijeno je u cilju eksperimenta. Svaka kapsula sadrži 300 mg EPA i 200 mg DHA. Tretman je trajao 6 nedelja. Svaka životinja u tretmanu dobijala je po 200 µL ribljeg ulja koje sadrži 45 mg EPA i 30 mg DHA, in house metodom u kojoj se jedan briketić natapa ribljim uljem i stavlja u hranilicu nakon prethodnog uklanjanja hrane. 3.3.2. Žrtvovanje životinja i priprema uzoraka Svi pacovi su žrtvovani 24 h nakon poslednjeg tretmana ribljim uljem, dekapitacijom. Punoj krvi koja je dobijena dodat je kao antikoagulans natrijum-citrat. Krv je centrifugovana na 1300 g, eritrociti su odvojeni od plazme, isprani tri puta fiziološkim rastvorom i korišćeni za odredjivanje enzimskih aktivnosti. Plazma je čuvana na -80 °C do analize. Posle žrtvovanja pacova delovi jetre isprani su na ledu hladnim fiziloškim rastvorom, i smrznuti na -80 ºC. Doktorska disertacija Tamara Popović 45 3.4. Biohemijske analize krvi pacova Holesterol, trigliceridi i mokraćna kiselina su odredjivani u plazmi. Primenom enzimskih metoda sa holeterol-oksidazom, glicerol-oksidazom i ksantin-oksidazom (Elitech Diagnostic, Sees, France) na biohemijskom analajzeru (CobasMira, Roche). HDL- holesterol je odreñivan posle taloženja drugih klasa lipoproteina sa fosfovolframovom kiselinom i magnezijum hloridom (Lopez-Virella et al 1977). LDL-holesterol je odredjivan primenom formule Friedwald i sar (Friedwald, 1972). 3.4.1. Odreñivanje koncentracije hemoglobina (Tentori i Salvati, 1981) Reakcijom hemoglobina sa kalijum-heksacijanoferatom(III) i cijanidom dobija se cijanomethemoglobin, čija je koncentracija odredjena spektrofotometrijski merenjem apsorbance na 540 nm, upotrebom molarnog apsorpcionog koeficijenta (a = 44000 mol- 1cm-1). Sva spektrofotometrijska merenja vršena su na aparatu Cecil CE 2021 UV/VIS. 3.5. Odreñivanje aktivnosti enzima antioksidativne odbrane 3.5.1. Odreñivanje aktivnosti katalaze (CAT) (Aebi, 1984) Aktivnost CAT odredjena je u eritrocitima na osnovu funkcije ovog enzima da katalizuje razgradnju vodonik-peroksida do vode i molekulskog kiseonika. Smanjenje koncentracije vodonik-peroksida praćeno je merenjem apsorbancije na 240 nm (A240), kinetičkom metodom analize. Jedinica aktivnosti CAT izražena je brojem µmola vodonik-peroksida koji se razlaže u jednom minutu po gramu hemoglobina u hemolizatu (µmol/min/g Hbx104). 3.5.2. Odreñivanje aktivnosti CuZn-superoksid-dismutaze (Beauchamp and Fridovich, 1971). SOD aktivnost je odredjena koristeći Calbiochem Superoxide Assay Kit. Apsorbancija nagrañenog proizvoda 5,6,6a,11b-tetrahidro-3,9,10-trihidroksibenzo(c)florin-a merena je na 525nm, A525 (Beauchamp and Fridovich, 1971). SOD aktivnost je izražena u U/g Hb. Doktorska disertacija Tamara Popović 46 3.6. Odreñivanje količine malondialdehida (MDA) (Cynamon et al., 1985) Koncentracija malondialdehida (MDA) odreñena je reakcijom sa tiobarbiturnom kiselinim (TBA) pri čemu nastaje obojeni proizvod. Intenzitet boje nastalog proizvoda odreñuje se spektrofotometrijski merenjem apsorbancije na 535 nm. Koncentracija MDA izračunata je na osnovu molarnog apsorpcionog koeficijenta bojenog proizvoda (a = 1.56x10-5mol-1cm- 1) i izražena u nmol/gHb. 3.7. Odreñivanje koncentracije nitrita u plazmi (Guevara et al., 1998) Koncentracija nitrita je odredjena ELISA testom, korišćenjem Grisovog reagensa. Apsorbancija je merena na 545 nm korišćenjem čitača (Plate reader, Mod A1, Nubenco Enterprises, INC). Rezultati su izraženi u µmolL-1. 3.8. Odreñivanje aktivnosti paraoksonaza u plazmi (Schiavon, 1996) Odreñivanje paraoksonazne aktivnosti u plazmi je zasnovano na spektrofotometrijskom merenju p-nitrofenola, kao rezultat enzimske hidrolize paraoksona. Merenje paraoksonazne aktivnosti je izvedeno u prisustvu i odsustvu natrijum-hlorida. PON1 aktivnost odreñena je sa natrijum-hloridom (osnovna aktivnost) i u prisustvu 1mol/L natrijum hlorida (NaCl- stimulisana aktivnost) u skladu sa metodom po Sciavon-u. Inicijalni stepen hidrolize paraoksona odreñivan je merenjem nagrañenog p-nitrofenola. Paraoksonazna aktivnost merena je na Cecil CE 2021 UV/VIS spektrofotometru na 405nm. 3.9. Odreñivanje ukupnih tiolnih grupa (Ellman, 1959) Broj ukupnih (proteinskih i neproteinskih) tiolnih grupa u plazmi odreñen je spektrofotometrijski sa 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoevom kiselinom, merenjem apsorbance na talasnoj dužini od 412 nm na spektrofotometru (CECIL CE 2021 UV/VIS), korišćenjem apsorpcionog koeficijenta, a=14150 mol-1cm-1. Dobijeni rezultati su izraženi u µM/L. Doktorska disertacija Tamara Popović 47 3.10. Odreñivanje zastupljenosti LDH izoenzimskih oblika u plazmi (Yoshida and Takakuma, 1997) LDH izoenzimi (LDH1-5) su analizirani nedenaturišućom, nativnom elektroforezom na 7% PAG-u (Yoshida and Takakuma, 1997). Trake su detektovane u prisustvu litijum-laktata kao supstrata, kofaktora NADH i tetrazolijumskog plavog. Intenziteti traka izoenzima LDH mereni su denzitometrijski korišćenjem Scion Image Beta 4.02 software (scion, Corp., 2007). Intenzitet svake trake izražen je kao procenat u odnosu na ukupnu površinu. 3.11. Analiza masnokiselinskog profila fosfolipida plazme gasno-tečnom hromatografijom Ukupni lipidi plazme ekstrahuju se smešom organskih rastvarača. Lipidne klase se razdvajaju tankoslojnom hromatografijom (TLC). Masne kiseline izolovane fosfolipidne frakcije se metiluju, a dobijeni metil-estri MK razdvajaju gasno-tečnom hromatografijom (GLC). 3.11.1. Ekstrakcija ukupnih lipida iz plazme Princip metode: Ukupni lipidi plazme ekstrahuju se smešom rastvarača hloroform-metanol 2:1 (v/v). Postupak: 0.5 ml plazme ekstrahovati 3 puta sa po 1,5 ml smeše rastvarača hloroform- metanol 2:1 (v/v), u koji je dodato 50 mg BHT (antioksidant). Izmeñu dodadavanja porcija hloroform-metanol 2:1 (v/v) smeša se snažno mućka oko 1 minut. Dobiveni lipidni ekstrakt propušta se kroz disk natrijum-sulfata, i upari do suva. Suvi prečišćen ekstrakt rastvara se u 0.2 ml smeše hloroform-metanola 2:1 (v/v) i koristi za hromatografsko razdvajanje lipidnih klasa. Doktorska disertacija Tamara Popović 48 3.11.2. Razdvajanje lipidnih klasa tankoslojnom hromatografijom (Ristić, 1991) Fosfolipidi plazme odvojeni su jednodimenzionom TLC na silika gelu GH debljine 0.5 mm. Ukupni lipidni ekstrakt plazme nanosi se na ploču koja je prethodno aktivirana na 110 °C u toku 1 h. Kao sistem za razvijanje koristi se smeša petroleter-dietiletar-sirćetna kiselina (87:12:1, v/v/v). Razdvojene frakcije lipida identifikuju se pod UV- lampom (sl.10). Slika 10. TLC hromatogram neutralnih lipida (PL = fosfolipidi, DG = diacilgliceroli, HOL = holesterol,TG = triacilgliceroli, HOL-E =estri holesterola, FFA-slobodne masne kiseline 3.11.3. Analiza masnih kiselina fosfolipida gasno-tečnom hromatografijom Masne kiseline fosfolipida analizirane su gasno-tečnom hromatografijom (GLC, eng. gas liquid chromatography) na aparatu Shimadzu GC 2014 sa jonizacionim detektorom. Korišćena je semikapilarna kolona DB-23. Debljina filma stacionarne faze je 0,25 mm. Protok nosećeg gasa (azota) je 5 ml/min, protok vazduha 320 ml/min, a vodonika 30 ml/min. Temperatura detektora podešena je na 250 °C, a injektora na 220 ˚C. Kolona se drži na 130 ˚C 15 minuta i temperatura podiže do 190˚C, brzinom 3 ˚C/minuti. Doktorska disertacija Tamara Popović 49 Priprema uzoraka za GLC Frakcija fosfolipida izdvojena na TLC se ekstrahuje sa odgovarajućeg sloja silika gela sa 1.5 ml n-heksana. Posle mućkanja dodaje se 0.2 ml 2M NaOH u metanolu. Epruvete se stave u termostat na 85°C i hidroliza odvija jedan sat. U hidrolizat se doda 0.2 ml 1M H2SO4 u metanolu i termostatira još dva sata na 85°C. Nakon hlañenja smeša se centrifugira na 3000 o/min i odvojeni heksanski sloj upari do suva u struji azota. Dobijene masne kiseline su esterifikovane po modifikovanoj metodi transesterifikacije Christopherson i Glass-a (Christopherson, 1969). Uzorci pripremljenih metil-estara rastvoreni su neposredno pre injektiranja u oko 10 µl n-heksana (zavisno od količine suvog ostatka), a od toga je injektirano 0.2 µl. Masne kiseline su identifikovane uporeñivanjem sa hromatogramom standarda masnih kiselina dobijenim pri istim uslovima. Sadržaji pojedinačnih masnih kiselina izraženi u procentima od ukupno detektovanih masnih kiselina na osnovu površine njihovih pikova. 3.12. Analiza masnih kiselina u fosfolipidima jetre i parametara oksidativnog stresa 3.12.1. Priprema tkiva jetre za analizu masnih kiselina fosfolipida jetre (Harth, 1978) Tkivo jetre (5g) je homogenizovano i dodato mu je 5 ml smeše hloroform:metanol (2:1) u koju je dodato 50 mg 2,6-bi-tercbutil-hidroksi-toluena (BHT) kao antioksidanta. Ekstrakt je ispran dodatkom 0.2 zapremine vode. Posle centrifugiranja gornja faza je uklonjena i ekstrakt uparen do suva u vakum-uparivaču na 50°C. U suvi ekstrakt dodaju se smeše: metanol/benzen (2:1), aceton/benzen (2:1), etanol/benzen (2:1) i posle dodatka svake od smeša vrši se uparavanje na vakuum-uparivaču. Dodavanjem hloroforma i njegovim uparavanjem suvi ekstrakt se koristi za hromatografsko (TLC) razdvajanje lipidnih klasa. 3.12.1.1. Analiza masnih kiselina fosfolipida jetre (Folch, 1957) Frakcija fosfolipida izoluje se TLC-om, sistemom za razvijanje heksan:dietiletar:sirćetna kiselina (87:2:1,v/v) koristeći Silikagel GF ploče (Merck, Darmstadt, Germany). Ekstrakcija i priprema metil-estara masnih kiselina i njihova GC analiza izvedena je kao što je opisano (Popović, 2009). Masne kiseline su identifikovane uporeñivanjem sa Doktorska disertacija Tamara Popović 50 hromatogramom standarda masnih kiselina (Sigma, Chemical Co, St.Louis, MO, USA) i /ili PUFA-2 standarda (Supelco Inc., Belleforte, PA, USA) i identifikovani su metil-estri pojedinačnih masnih kiselina (Folch, 1957). 3.12.2. Priprema tkiva jetre za analizu parametara oksidativnog stresa Posle delimičnog odmrzavanja jetra je homogenizovana na ledu u puferu: 50 mM Tris- HCl, pH 7.4, 1M NaCl, 20 mM EDTA i 1% Triton X-100. Odnos izmedju tkiva i pufera bio je 1:10 (w/v). Homogenizacija je izvedena na homogenizeru Ultra Turex (Janke Kinkel), (Krummer et al 2002). Homogenizovano tkivo je centrifugirano na 10000 g, 10 min, na +4ºC. Aktivnost CAT, SOD, PON1 i LPO, sadržaj ukupnih SH grupa i koncentracija nitrita je odredjivana u supernatantu. 3.12.2.1. Odreñivanje parametara oksidativnog stresa u jetri Ukupni sadržaj proteina u tkivnom homogenatu odreñivan je metodom po Lowry-iju. (Lowry, 1951). Aktivnost katalaze (CAT) odreñivana je po metodi Aebi i sar. (1984) i izražena u µM vodonik-peroksida/min/g proteina. Aktivnost ukupne superoksid-dismutaze (SOD) je odreñena po metodi Beauchamp and Fridovich (1971) primenom Calbiochem Superoxide Assay kit-a. SOD aktivnost je izražena u U/g proteina. Lipidna peroksidacija (LPO) u jetri odreñena je spektrofotometrijskim merenjem boje nastalog proizvoda izmeñu TBA i MDA na 535nm, a=1.56x10-5 mol-1cm-1 (Stock and Dormandy,1971) i izražena u nM MDA/g proteina. Koncentracija nitrita je odreñena ELISA testom korišćenjem Grisovog reagensa (Guevara, 1998). Koncentracija je izražena u µM/mg proteina. Sadržaj ukupnih tiolnih grupa u jetri odreñivan je metodom po Elmanu i njihova koncentracija izražena u µM/mg proteina (Ellman, 1959). PON1 aktivnost je odreñivana modifikovanom metodom zasnovanoj na hidrolizi paraoksona (Sciavon et al, 1996). Homogenat jetre je dodat u 0.1M Tris-HCl pufer, pH 8.0 koji sadrži 2.0 mM paraoxon (o,o-dietil-o-p-nitrofenil-fosfat, Sigma Chemical Co, London, UK) kao supstrat, 2.0 mM CaCl2 i 1mM NaCl. Stvaranje p-nitrofenola praćeno je Doktorska disertacija Tamara Popović 51 merenjem apsorbance na 480nm na 37ºC na CECIL CE 2021 UV/VIS spektrofotometru. PON1 aktivnost je izražena u internacionalnim jedinicama (U/L) kao količina (µmol) supstrata hidrolizovanog u minuti, na litar supernatanta (µM/min/L). Enzimske aktivnosti (CAT, SOD, PON1) odreñivane su na CECIL CE 2021 UV/VIS spektrofotometru (BMG Labtech Gmbh, offenburg, Germany) 3.13. Statistička obrada podataka Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± SD. Normalna distribucija varijabli testirana je korišćenjem Kolmogorov-Smirnov testa. S obzirom na to da su rezultati dobijeni za sve parametre pokazali normalnu distribuciju, ispitivanje statističke značajne razlike izmedju vrednosti dve grupe vršeno je pomoću Student-ovog t-testa, dok je za ispitivanje statističke značajne razlike izmeñu više grupa korišćen ANOVA test primenom Tukey-testa. Minimalni nivo statističke značajnosti bio je p<0.05. Doktorska disertacija Tamara Popović 52 IV REZULTATI 4.1. Analiza sastojaka ribljeg ulja GC/MS analiza sastojaka ribljeg ulja primenjenog kao dodatak ishrani pacova Wistar soja pokazala je prisustvo više od 50% n-3 masnih kiselina, a dva najizrazitija pika (slika 11) predstavljaju eikozapentaensku kiselinu (EPA) i dokozaheksaenska kiselina (DHA). Slika 11. GC/MS analiza sastojaka ribljeg ulja HPLC analiza ribljeg ulja (slika12) pokazala je prisustvo vitamina E (pretežno α- tokoferola) u smeši masnih kiselina koji ima uloga stabilizatora i antioksidanta. Doktorska disertacija Tamara Popović 53 Slika 12. Prikaz vitaminskog sadržaja ribljeg ulja HPLC hromatografijom 4.2. Biohemijski parametri pacova Wistar soja različite starosne dobi Potreba za poreñenjem biohemijskih parametara kontrolnih grupa životinja starih 3 i 22 meseca neophodna je kako bismo bolje razumeli metabolizam mladih i starih životinja, proces starenja i njegove posledice. Vrednosti holesterola, HDL-holesterola i triglicerida u plazmi pacova obe kontrolne grupe prikazane su na slikama 13, 14, 15. Dobijene srednje vrednosti koncentracija holesterola, HDL-holesterola i triglicerida u kontrolnoj grupi mladih pacova su statistički značajno više (p<0.01, p<0.001, p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. Doktorska disertacija Tamara Popović 54 m lad i- sta ri- 0.0 0.5 1.0 1.5 ** H o le st er o l (m m o l/L ) Slika 13. Koncentracija holesterola u plazmi kontrolnih grupa životinja različite starosne dobi. Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti: **p<0.01 m lad i sta ri 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 *** H DL - ho le st er o l (m m o l/L ) Slika 14. Koncentracija HDL-holesterola u plazmi kontrolnih grupa životinja različite starosne dobi. Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti:***p<0.001 Doktorska disertacija Tamara Popović 55 m lad i sta ri 0.0 0.2 0.4 0.6 *** Tr ig lic er id i (m m o l/L Slika15. Koncentracija triglicerida u plazmi kontrolnih grupa životinja različite starosne dobi. Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti: ***p<0.001. 4.2.1. Biohemijski parametri plazme kod mladih Wistar pacova tretiranih ribljim uljem Rezultati analize biohemijskih parametara (holesterol, trigliceridi, HDL-holesterol, LDL- holesterol, urea, kreatinin, mokraćna kiselina) u plazmi pacova (starih 3 meseca) kontrolne grupe i grupe tretiranih ribljim uljem, na početku eksperimenta i posle šest nedelja prikazani su u Tabeli 2. Vrednosti dobijene za gotovo sve parametre u plazmi mladih pacova se značajno razlikuju nakon šestonedeljnog tretmana ribljim uljem. Koncentracija triglicerida je značajno smanjena (p<0.05) posle tretmana. Koncentracija HDL-holesterola se značajno povećala (p<0.01) kako posle tretmana, tako i u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.001). Koncentracija LDL-holesterola je značajno snižena posle tretmana u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.001). Koncentracija mokraćne kiseline se značajno povećala posle tretmana (p<0.001), kao i u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.001). Doktorska disertacija Tamara Popović 56 Tabela 2. Rezultati analize biohemijskih parametara plazme mladih (3 meseca starih) pacova Wistar soja kontrolne grupe i grupe tretirane ribljim uljem u toku 6 nedelja Holesterol (mmol/L) Trigliceridi (mmol/L) HDL- holesterol (mmol/L) LDL- holesterol (mmol/L) Urea (mmol/L) Kreatinin (µmol/L) Mokraćna kiselina (mmol/L) Kontrolna grupa - početak eksperimenta 1.10±0.11 0.45±0.09 0.44±0.04 0.46±0.11 5.91±0.47 56.29±5.31 33.14±13.5 Kontrolna grupa - kraj eksperimenta 1.14±0.12 0.45±0.04 0.44±0.06 0.49±0.16 5.93±0.33 54.12±5.27 32.0±12.03 Tretirana grupa- početak tretmana 1.11±0.11 0.52±0.19 0.50±0.07 0.45±0.09 6.21±0.87 57.33±13.2 34.33±7.21 Tretirana grupa- kraj tretmana 1.15±0.11 0.43±0.03 * 0.60±0.06 ** ### 0.35±0.12 ### 5.61±0.46 56.55±7.47 50.67±2.74 *** ### Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti dobijenih: *p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 tretiranih početak-kraj; ###p<0.001 izmedju tretirane grupe i kontrolne grupe na kraju eksperimenta. Kardiovaskularni rizik kod mladih Wistar pacova (Tabela 3) je snižen (p<0.05) posle tretmana ribljim uljem, kao i u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.001). Rizik od nastanka ateroskleroze značajno je snižen u odnosu na kontrolnu grupu pacova (p<0.001). Non- HDL-holesterol je značajno snižen u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.05), kao i odnos nonHDL/HDL (p<0.001). Doktorska disertacija Tamara Popović 57 Tabela 3. Kardiovaskularni i rizik od ateroskleroze u tretiranoj (početak-kraj) i kontrolnoj grupi mladih pacova Wistar soja Kontrolna grupa Tretirana grupa početak kraj “non” HDL 0.67 ± 0.10 0.60 ± 0.09 0.54 ± 0.13 # CHOL/HDL kardiovaskularni rizik 2.54 ± 0.27 2.23 ± 0.32 1.92 ± 0.27 * ### LDL/HDL rizik nastanka ateroskleroze 1.06 ± 0.27 0.72 ± 0.16 0.59 ± 0.26 ### “non”HDL/HDL 1.54 ± 0.27 1.23 ± 0.32 0.95 ± 0.26 ### Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti dobijenih: *p<0.05, tretman (početak-kraj); # p<0.05, ###p<0.001, poredjenje u odnosu na kontrolnu grupu. 4.2.2. Biohemijski parametri plazme kod starih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem Koncentracija holesterola u plazmi (starih 22 meseca) značajno se smanjila (p<0.05) posle tretmana ribljim uljem i takoñe se smanjila u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.01) (Tabela 4). Koncentracija HDL-holesterola značajno se povećala posle tretmana (p<0.01), i u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.05). Koncentracija LDL-holesterola se statistički značajno smanjila (p<0.001) i u odnosu na početni nivo kod tretirane grupe i u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Koncentracija mokraćne kiseline se značajno povećala (p<0.001) u poreñenju sa početkom tretmana, kao i u odnosu na kontrolnu grupu životinja (Tabela 4). Doktorska disertacija Tamara Popović 58 Tabela 4. Rezultati odreñivanja biohemijskih parametara plazme u kontrolnoj grupi i grupi tretiranih pacova (22 meseca starih) na početku i posle 6 nedelja tretmana ribljim uljem Holesterol (mmol/L) Trigliceridi (mmol/L) HDL (mmol/L) LDL (mmol/L) Urea (mmol/L) Kreatinin (µmol/L) Mokraćna kiselina (mmol/L) Kontrolna grupa- početak tretmana 0.803±0.22 0.254±0.06 0.171±0.04 0.517±0.19 5.34±0.29 56.4±1.45 34.67±1.62 Tretirana grupa- početak tretmana 0.74±0.21 0.31±0.08 0.16±0.04 0.45±0.17 5.59±0.46 56.29±1.91 36.06±0.86 Tretirana grupa- kraj 0.54±0.14 * ## 0.25±0.06 0.23±0.07 ** # 0.17±0.13 *** ### 5.63±0.53 56.16±1.22 43.51±2.09 *** ### Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti dobijenih u istoj grupi na početku i na kraju tretmana ribljim uljem: *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, kao i izmedju tretirane i kontrolne grupe: #p<0.05, ##p<0.01, ### p<0.001. Na osnovu dobijenih rezultata izračunati su kardiovaskularni faktor rizika i faktor rizika od ateroskleroze i prikazani u Tabeli 5. Odnos ukupnog holesterola i HDL-holesterola značajno je snižen kod tretirane grupe (p<0.001) kao i u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.01). Odnos LDL-holesterola i HDL- holesterola značajno je snižen i u tretiranoj grupi i u odnosu na kontrolnu grupu, (p<0.001), što predstavlja značajno smanjenje rizika od ateroskleroze (Tabela 5). Non-HDL holesterol značajno je smanjen (p<0.001), kako u tretiranoj grupi tako i u odnosu na kontrolnu grupu (p<0.01), kao i odnos non-HDL i HDL-holesterola (p<0.001). Doktorska disertacija Tamara Popović 59 Tabela 5. Kardiovaskularni faktor rizika i rizik od ateroskleroze u tretiranoj (početak i kraj) i kontrolnoj grupi starih pacova Wistar soja “non”-HDL CHOL/HDL LDL/HDL “non”HDL/HDL Kontrolna grupa-početak 0.65±0.10 4.89±1.53 2.80±0.85 3.89±1.53 Tretirna grupa- početak 0.60±0.14 5.73±1.96 2.81±0.94 3.39±1.04 Tretirna grupa- kraj 0.31±0.13٭٭٭### 2.31±0.61٭٭٭## 0.82±0.38٭٭٭### 1.15±0.48٭٭### Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti dobijenih: na početku i kraju tretmana ribljim uljem**p<0.01, ***p<0.001, i u odnosu na kontrolnu grupu ##p<0.01, ###p<0.001. 4.3. Profili masnih kiselina fosfolipida plazme i jetre kod pacova Wistar soja različite starosne dobi Profili masnih kiselina u fosfolipidima plazme i fosfolipidima jetre razlikovali su se u kontrolnim grupama pacova Wistar soja različite životne dobi: mladih (3 meseca) i starih (22 meseca). 4.3.1. Sadržaj masnih kiselina u fosfolipidima plazme, u kontrolnim grupama pacova Wistar soja različite starosne dobi U kontrolnoj grupi mladih pacova u odnosu na stare pacove nañene su statistički značajno više vrednosti sledećih masnih kiselina: oleinske (18:1, n9, p<0.01), vascenske (18:1, n-7; p<0.05), MUFA (p<0.01). Sa druge strane, smanjio se sadržaj sledećih masnih kiselina: stearinske (18:0, p<0.01), linolne (18:2,n-6; p<0.05), arahidonske (20:4, n-6, p<0.05) kao i ukupnih PUFA (p<0.01) i n-6 (p<0.01) masnih kiselina (Tabela 6). Doktorska disertacija Tamara Popović 60 Tabela 6. Sadržaj masnih kiselina u fosfolipidima plazme u kontrolnim grupama pacova Wistar soja različite starosne dobi Zastupljenost MK (%) MK Mladi (3 meseca) Stari (22 meseca) 16:0 29.31 ± 0.62 28.34 ± 1.89 16:1 1.22 ± 0.78 0.73 ± 0.50 18:0 22.55 ± 0.38** 24.36 ± 1.46 18:1,n-9 12.25 ± 0.85** 8.23 ± 3.03 18:1,n-7 2.66 ± 0.24* 2.04 ± 0.60 18:2 12.58 ± 0.82* 14.07 ± 1.41 20:3 0.59 ± 0.06 0.69 ± 0.13 20:4 12.29 ± 0.31* 14.77 ± 2.43 20:5 0.28 ± 0.07 0.41 ± 0.22 22:4 0.27 ± 0.02 0.36 ± 0.19 22:5 0.82 ± 0.15 0.67 ± 0.17 22:6 4.88 ± 0.18 5.34 ± 1.39 SFA 51.88 ± 0.73 52.70 ± 1.18 MUFA 16.13 ± 1.43** 10.99 ± 3.94 PUFA 31.45 ± 0.94** 36.32 ± 3.65 n-3 5.97 ± 0.23 6.42 ± 1.46 n-6 25.75 ± 0.94** 29.89 ± 3.02 n-6/n-3 4.32 ± 0.25 4.65 ± 2.34 *p<0.05, **p<0.01 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti kontrolnih grupa životinja 4.3.2. Sadržaj masnih kiselina u fosfolipidima jetre u kontrolnim grupama pacova Wistar soja različite starosne dobi Sadržaj masnih kiselina u fosfolipidima jetre razlikovali su se kod pacova Wistar soja različite životne dobi: mladih (3 meseca) i starih (22 meseca) (Tabela 7). U kontrolnoj grupi mladih pacova u odnosu na stare pacove nañene su statistički značajno niže vrednosti u sadržaju sledećih masnih kiselina: Linolne (18:2, n-6, p<0.01), γ- linolenske (18:3, n-6, p<0.001), dihomo- γ-linolenske kiseline (20:3, n-6, p<0.05). Sadržaj ukupnih n-6 MK kao i odnos n-6/n-3 bili su takoñe sniženi (p<0.05, p<0.001). S druge Doktorska disertacija Tamara Popović 61 strane kod mladih pacova nañene su statistički značajno više vrednosti u sadržaju: palmitinske kiseline (16:0, p<0.001), palmitoleinske (16:1, p<0.05), eikozaheksaenske (22:6, n-3, p<0.001) kao i ukupnih n-3 masnih kiselina (p<0.001). Tabela 7. Profili masnih kiselina u fosfolipidima jetre u kontrolnim grupama pacova Wistar soja različite starosne dobi Zastupljenost MK (%) MK Mladi (3 meseca) Stari (22 meseca) 16:0 21.36 ± 1.55 *** 18.15 ± 1.17 16:1 0.71 ± 0.11 * 0.65 ± 0.32 18:0 23.49 ± 2.03 26.38 ±1.87 18:1,n-9 5.15 ± 0.44 5.37 ± 1.11 18:1,n-7 1.78 ± 0.15 2.02 ± 0.34 18:2 12.34 ± 0.74 ** 14.43 ± 1.37 18:3 0.033 ± 0.005 *** 0.05 ± 0.01 20:3 1.24 ± 0.34 * 1.67 ± 0.36 20:4 22.16 ± 1.36 23.02 ± 3.26 20:5 0.42 ± 0.07 0.50 ± 0.09 22:4 0.29 ± 0.04 0.21 ± 0.10 22:5 1.03 ± 0.08 0.97 ± 0.10 22:6 8.43 ± 0.71 *** 4.90 ± 1.04 SFA 44.85 ± 3.45 44.54 ± 1.03 MUFA 7.65 ± 0.46 8.05 ± 1.09 PUFA 45.97 ± 1.20 45.79 ± 3.30 n-3 9.92 ± 0.64 *** 6.44 ± 1.10 n-6 36.04 ± 1.51 * 39.35 ± 3.72 n-6/n-3 3.65 ± 0.36 *** 6.30 ± 1.46 *p<0.05, **p<0.01, p***<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti kontrolne grupe mladih i starih životinja 4.4. Masnokiselinski profili fosfolipida plazme i jetre, aktivnost desaturaza i elongaza kod mladih i starih pacova tretiranih ribljim uljem Profili MK u fosfolipidima plazme i jetre, kao i procenjene vrednosti aktivnosti desaturaza i elongaza razlikovale su se posle tretmana ribljim uljem i kod mladih i kod starih pacova u odnosu na kontrolne grupe životinja. Došlo je do promena u procentualnom sadržaju pojedinačnih masnih kiselina, promena u sadržaju ukupnih mononezasićenih (MUFA), polinezasićenih (PUFA), n-3, n-6 kiselina i njihovih meñusobnih odnosa. Doktorska disertacija Tamara Popović 62 4.4.1. Uticaj tretmana ribljim uljem na profile masnih kiselina fosfolipida plazme mladih pacova Zastupljenost masnih kiselina u fosfolipidima plazme kod pacova starih 3 meseca u kontrolnoj grupi i grupi tretiranoj sa ribljim uljem u toku šest nedelja prikazana je u Tabeli 8. Tabela 8. Profili MK fosfolipida plazme mladih pacova Wistar soja kontrolne grupe i grupe tretirane ribljim uljem u toku šest nedelja Zastupljenost MK u fosfolipidima (%) MK Tretirana grupa Kontrolna grupa 16:0 29.31 ± 0.51 29.33 ± 0.62 16:1 1.71 ± 0.1 1.22 ± 0.78 18:0 23.04 ± 0.44* 22.55 ± 0.38 18:1, n-9 13.72 ± 0.24*** 12.25 ± 0.85 18:1, n-7 2.51 ± 0.05 2.66 ± 0.24 18:2 11.93 ± 0.29* 12.58 ± 0.82 20:3 0.76 ± 0.39 0.59 ± 0.06 20:4 9.25 ± 0.09*** 12.29 ± 0.31 20:5 0.65 ± 0.03*** 0.28 ± 0.07 22:4 0.52 ± 0.38*** 0.27 ± 0.02 22:5 1.37 ± 0.03*** 0.82 ± 0.15 22:6 5.03 ± 0.18 4.88 ± 0.18 SFA 52.36 ± 0.38 51.88 ± 0.73 MUFA 17.93 ± 0.22* 16.13 ±1.43 PUFA 32.97 ± 11.19 31.45 ± 0.94 n-3 7.06 ± 0.18*** 5.97 ± 0.23 n-6 26.4 ± 11.20 25.75 ± 0.94 n-6/n-3 3.18 ± 0.12*** 4.32 ± 0.25 *p<0.05,**p<0.01,***p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe Doktorska disertacija Tamara Popović 63 U grupi pacova tretiranoj ribljim uljem značajne promene uočene su u sadržaju stearinske kiseline, čiji se procentni udeo povećao (p<0.05). Procenat oleinske kiseline se takoñe značajno povećao (p<0.001). Sadržaj linolne kiseline (18:2, n-6) se značajno smanjio (p<0.05) kao i arahidonske kiseline (20:4, n-6), (p<0.001). Suprotno tome, sadržaj eikozapentaenske kiseline (20:5, n-3) se značajno povećao (p<0.001), kao i dokozatetraenske kiseline (22:4, n-6), (p<0.001) i dokozapentaenske (22:5, n-3) (p<0.001). Sadržaj ukupnih mononezasićenih kiselina (MUFA) se značajno povećao (p<0.05), a ukupnih PUFA neznatno promenio. Meñutim, procentni udeo ukupnih n-3 masnih kiselina se povećao (p<0.001). Odnos n-6/n-3 se značajno statistički smanjio (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu. 4.4.1.1. Procenjene aktivnosti desaturaza i elongaza kod mladih pacova u kontrolnoj grupi i grupi tretiranoj ribljim uljem u trajanju šest nedelja Procenjene aktivnosti desaturaza (∆4, ∆5, ∆6, ∆9) i elongaza predstavljaju odnos (22:6/22:5, 20:4/20:3, 20:3/18:2, 18:1/18:0 i 18:0/16:0) procentualnih zastupljenosti MK u fosfolipidima plazme. Procenjene enzimske aktivnosti desaturaza i elongaza mladih pacova pokazale su statistički značajne promene posle suplementacije ribljim uljem (Tabela 9) . Procenjena enzimska aktivnost ∆4-desaturaze se značajno smanjila (p<0.001), kao i procenjena vrednost aktivnosti ∆5-desaturaze (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu. Procenjena aktivnost ∆9-desaturaze se značajno povećala (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu, dok se vrednosti elongaze nisu menjale. Doktorska disertacija Tamara Popović 64 Tabela 9. Procena aktivnosti desaturaza i elongaza mladih pacova kontrolne grupe i grupe tretirane ribljim uljem u toku šest nedelja Odnosi MK (enzimi) Tretirana grupa Kontrolna grupa 22:6/22:5 (∆4) 3.71 ± 0.07*** 6.19 ± 1.47 20:4/20:3 (∆5) 15.13 ± 0.96*** 20.83 ± 2.17 20:3/18:2 (∆6) 0.059 ± 0.003 0.04 ± 0.003 18:1/18:0 (∆9) 13.82 ± 0.23*** 12.36 ± 0.84 18:0/16:0 (elongaza) 0.78 ± 0.02 0.76 ± 0.02 ***p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe 4.4.2. Uticaj tretmana ribljim uljem na profile masnih kiselina fosfolipida jetre mladih pacova Ispitivali smo procentualnu zastupljenost masnih kiselina u fosfolipidima jetre, kod kontrolne i tretirane grupe kako bismo uočili razlike nastale tretmanom ribljim uljem. Takoñe, hteli smo da uočimo do kakvih je promena u profilu MK u fosfolipidima plazme i MK fosfolipida jetre došlo tretmanom ribljim uljem. Promene u ukupnim sadržajima SFA, MUFA, PUFA bile su od posebnog značaja. Rezultati analize zastupljenosti masnih kiselina u fosfolipidima jetre mladih pacova (3 meseca starosti) u kontrolnoj grupi i grupi tretiranoj ribljim uljem prikazani su u Tabeli 10. Sadržaj linolne kiseline (LA, n-6) se značajno procentualno povećao (p<0.001), kao i γ- linolenske kiseline (γ-LA, n-6), (p<0.01), a takoñe i dihomo-γ-linolenske kiseline (dihomo- γ-LA, n-6) (p<0.05) kod tretiranih pacova u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Sadržaj arahidonske kiseline (AA, n-6) se značajno procentualno smanjio (p<0.001). Procentualni udeo eikozapentaenske kiseline (EPA, n-3), se značajno povećao (p<0.001), kao i dokozatetraenske kiseline (DTA, n-6) (p<0.001), dokozapentaenske (DPA, n-3), (p<0.001) i dokozaheksaenske kiseline (DHA, n-3) (p<0.01) u odnosu na procentualni sadržaj ovih masnih kiselina u kontrolnoj grupi životinja. Doktorska disertacija Tamara Popović 65 Ukupni sadržaj mononezasićenih masnih kiselina (MUFA) se značajno povećao (p<0.05), kao i sadržaj n-3 masnih kiselina (p<0.001), dok se sadržaj ukupnih n-6 masnih kiselina smanjio (p<0.001), kao i odnos n-6/n-3 kiselina (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu životinja (Tabela 10). Tabela 10. Profili masnih kiselina fosfolipida jetre mladih pacova Wistar soja u kontrolnoj grupi i grupi tretiranoj ribljim uljem u toku šest nedelja Zastupljenost MK u fosfolipidima (%) MK Tretirana grupa Kontrolna grupa 16:0 22.23 ± 0.80 21.36 ± 1.55 16:1 0.82 ± 0.12 0.71 ± 0.11 18:0 22.45 ± 1.67 23.49 ± 2.03 18:1, n-9 5.37 ± 0.25 5.16 ± 0.44 18:1, n-7 1.99 ± 0.26 1.79 ± 0.16 18:2 15.89 ± 0.98### 12.34 ± 0.74 18:3 0.07 ± 0.03## 0.03 ± 0005 20:3 1.6 ± 0.08# 1.25 ± 0.35 20:4 15.57 ± 0.51### 22.17 ± 1.37 20:5 2.53 ± 0.25### 0.43 ± 0.07 22:4 0.09 ± 0.02### 0.29 ± 0.05 22:5 1.73 ± 0.19### 1.03 ± 0.08 22:6 9.5 ± 0.56## 8.43 ± 0.72 SFA 44.68 ± 1.30 44.85 ± 3.45 MUFA 8.18 ± 0.30# 7.66 ± 0.47 PUFA 46.90 ± 1.05 45.97 ± 1.20 n-3 13.84 ± 0.64### 9.92 ± 0.65 n-6 33.16 ± 0.97### 36.05 ± 1.51 n-6/n-3 2.40 ± 0.15### 3.65 ± 0.36 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe. 4.4.2.1. Procena aktivnosti desaturaza i elongaza u jetri pacova Wistar soja Aktivnosti desaturaza i elongaza procenjene na osnovu odnosa zastupljenosti MK u jetri pacova Wistar soja su se promenile posle tremana ribljim uljem u trajanju od 6 nedelja (Tabela 11). Doktorska disertacija Tamara Popović 66 Tabela 11. Procena aktivnosti desaturaza i elongaza u jetri mladih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem i u kontrolnoj grupi. Odnosi MK (enzimi) Tretirana grupa Kontrolna grupa 22:6/22:5 (∆4 ) 5.52±0.42### 8.24±1.20 20:4/20:3 (∆5) 9.77±0.74### 16.23±1.50 20:3/18:2 (∆6) 0.10±0.003 0.10±0.03 18:1/18:0 (∆9) 0.24±0.025 0.22±0.026 18:0/16:0 (elongaza) 1.01±0.10# 1.099±0.05 #p<0.05, ###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe Aktivnosti (∆4) kao i ∆-5-desaturaze (∆5) u tretiranoj grupi su se statistički značajno smanjile (p<0.001), kao i aktivnost elongaze (p<0.05), u odnosu na kontrolnu grupu životinja. 4.4.3. Uticaj tretmana ribljim uljem na profile masnih kiselina fosfolipida plazme starih pacova Profili masnih kiselina fosfolipida plazme u grupi starih pacova (22 meseca) tretiranih ribljim uljem značajno su se promenili u odnosu na kontrolnu grupu (Tabela 12). Utvrñeno je statistički značajno povećanje procentualnog udela sledećih masnih kiselina: stearinske (18:0; p<0.05), vakcenske (18:1, n-7; p<0.05), linolne (18:2, n-6; p<0.01), eikozatrienske (20:3, n-6; p<0.01), eikozapentaenske (20:5, n-3; p<0.05) i dokozapentaenske (22:5, n-3; p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu. Doktorska disertacija Tamara Popović 67 Tabela 12. Profili masnih kiselina fosfolipida plazme kod starih pacova Wistar soja u kontrolnoj grupi i grupi tretiranoj ribljim uljem u toku 6 nedelja. Zastupljenost MK u fosfolipidima (%) MK Kontrolna grupa Tretirana grupa 16:0 28.34±1.89 26.23±3.75 16:1 0.73±0.50 0.77±0.42 18:0 24.36±1.46 27.91±2.98# 18:1 n9 8.23±3.03 6.89±0.91 18:1 n7 2.04±0.60 2.90±0.50# 18:2 14.07±1.41 17.23±1.66## 20:3 0.69±0.13 1.31±0.46## 20:4 14.77±2.43 8.87±2.21### 20:5 0.41±0.22 0.72±0.21# 22:4 0.36±0.19 0.47±0.23 22:5 0.67±0.17 1.54±0.40### 22:6 5.34±1.39 5.03±1.19 SFA 52.70±1.18 54.13±3.97 MUFA 10.99±3.94 10.56±0.88 PUFA 36.32±3.65 35.18±4.12 n-3 6.42±1.46 7.28±1.61 n-6 n-6/n-3 29.89±3.02 4.65± 2.34 27.89±3.10 3.83 ± 1.92 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe životinja Pri tretmanu ribljim uljem samo se smanjila zastupljenost arahidonske kiseline (20:4, n-6; p<0.001) u odnosu na kontrolu. Doktorska disertacija Tamara Popović 68 4.4.3.1. Procena aktivnosti desaturaza i elongaza na osnovu masnokiselinskih profila fosfolipida starih pacova Procenjene aktivnosti desaturaza u grupi životinja tretiranih ribljim uljem promenile su se u odnosu na kontrolnu grupu, što je prikazano u Tabeli 13. Aktivnost ∆-4-desaturaze se značajno smanjila (p<0.01), kao i ∆-5-desaturaze (p<0.001), dok se procenjena vrednost aktivnosti ∆-6-desaturaze značajno povećala (p<0.05) u odnosu kontrolnu grupu životinja. Tabela 13. Procenjene vrednosti desaturaza i elongaza u plazmi u tretiranoj i kontrolnoj grupi starih Wistar pacova Kontrolna grupa Tretirana grupa 22:6/22:5 (∆ 4 ) 8.48 ± 3.37 3.32 ±0.56## 20:4/20:3 (∆ 5) 21.57 ± 4.01 7.48 ±3.56### 20:3/18:2 (∆ 6) 0.05 ± 0.01 0.07 ±0.02# 18:1/18:0 (∆ 9) 0.34 ± 0.14 0.25 ± 0.05 18:0/16:0 (elongaza) 0.86 ± 0.10 1.09 ±0.22 #p<0.5 ## p<0.01, ###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe životinja 4.4.4. Profili masnih kiselina fosfolipida jetre kod starih Wistar pacova Masnokiselinski profili fosfolipida jetre kod starih pacova (Tabela 14) promenili su se posle tretmana ribljim uljem u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Statistički značajno, u odnosu na kontrolnu grupu, povećao se procentni udeo palmitinske (p<0.001), i vakcenske kiseline (p<0.01) i linolne kiseline (LA, n-6) (p<0.01), eikozapentaenske (EPA, n-3; p<0.001) i dokozapentaenske kiseline (DPA, n-3, p<0.001). Doktorska disertacija Tamara Popović 69 Tabela 14. Profili masnih kiselina fosfolipida jetre pacova starih 22 meseca posle šestonedeljnog tretmana ribljim uljem i pacova kontrolne grupe Zastupljenost MK u fosfolipidima (%) MK Kontrolna grupa Tretirana grupa 16:0 18.15±1.18 25.50±2.39٭٭٭ 16:1 0.65±0.32 0.69±0.12 18:0 26.38±1.88 26.27±3.03 18:1 n9 5.38±1.12 4.75±0.49 18:1 n7 2.03±0.34 2.95±0.63 ٭٭ 18:2 14.43±1.37 17.35±1.68٭٭ 18:3 0.05±0.01 0.07±0.01 20;3 1.68±0.36 1.73±0.54 20:4 23.02±3.26 10.99±1.42٭٭٭ 20:5 0.50±0.09 2.64±0.67٭٭٭ 22:4 0.22±0.11 0.53±0.44 22:5 0.98±0.11 1.52±0.08٭٭٭ 22:6 4.90±1.04 5.00±0.24 SFA 44.54±1.033 51.77±2.72٭٭٭ MUFA 8.05±1.09 8.4±0.97 PUFA 22.76±1.06 28.85±1.82*** n-3 6.44±1.10 9.23±0.84*** n-6 39.35±3.73 30.61±2.64*** n-6/n-3 6.30±1.46 3.35±0.51*** *p<0.05, **p<0.01***p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe životinja Doktorska disertacija Tamara Popović 70 Suplementacija ribljim uljem je dovela do značajnog sniženja (p<0.001) procentualnog udela arahidonske kiseline (AA, n-6). Sadržaj ukupnih zasićenih masnih kiselina se povećao (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu. Sadržaj polinezasićenih (PUFA) se povećao (p<0.001), kao i sadržaj ukupnih n-3 masnih kiselina (p<0.001), dok se zastupljenost ukupnih n-6 smanjila (p<0.001). Odnos n-6/n-3 masnih kiselina se stoga značajno smanjio (p<0.001) (Tabela 14). 4.4.4.1. Procena aktivnosti elongaza i desaturaza u jetri starih pacova Wistar soja Procenjene aktivnosti ∆4 i ∆5 desaturaza i elongaza u jetri starih Wistar pacova tretiranih ribljim uljem značajno su se smanjile (p<0.01,p<0.001 i p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu životinja (Tabela 15). Tabela 15. Procenjene aktivnosti desaturaza i elongaza jetre kod starih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem i kod kontrolne grupe životinja Odnosi MK (enzim) Kontrolna grupa Tretirana grupa 22:6/22:5 (∆4 ) 5.07 ± 1.26 3.29 ± 0.25## 20:4/20:3 (∆5) 14.37 ± 4.05 6.72 ± 1.59### 20:3/18:2 (∆6) 0.12 ± 0.03 0.099 ± 0.02 18:1/18:0 (∆9) 0.20 ± 0.03 0.18 ± 0.04 18:0/16:0 (elongaza) 1.46 ± 0.18 1.04 ± 0.17### ##p<0.01, ###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe životinja Doktorska disertacija Tamara Popović 71 4.5. Parametri oksidativnog stresa u krvi i jetri pacova različite strarosne dobi Poreñenjem parametara oksidativnog stresa u krvi i jetri kod životinja različite starosne dobi, mladih (3 meseca) i starih (22 meseca) uočavaju se statistički značajne razlike u nekim ispitivanim parametrima. 4.5.1. Parametri oksidativnog stresa u eritrocitima i plazmi pacova različite strarosne dobi Poreñenjem vrednosti parametara oksidativnog stresa kod životinja različite starosne dobi uočava se razlika u koncentraciji nitrita i paraoksonaza. Koncentracija nitrita u plazmi statistički je značajno snižena kod životinja starih 3 meseca (p<0.01) u odnosu na životinje stare 22 meseca dok je aktivnost paraoksonaza u plazmi (PON1) statistički značajno povećana (p<0.0001) (Tabela 16). Tabela 16. Parametri oksidativnog stresa u eritrocitima i plazmi kontrolnih grupa pacova različite strarosne dobi Kontrolna grupa-mladi Kontrolna grupa-stari SOD (U/gHb) 290 ± 18.48 304.74 ± 25.52 CAT (U/gHb) 41.66 ± 4.10 43.55 ± 10.37 MDA (nmol/gHb) 66.04 ± 7.35 56.39 ± 3.51 Nitriti (µmol/L) 63.43 ± 2.75 ** 72.69 ± 13.58 SH grupe (µmol/L) 539.45 ± 0.05 599.96 ± 26.48 PON1 (U/L) 141.0 ± 3.91 *** 115.16 ± 9.04 **p<0.01, ***p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti kontrolnih grupa životinja Doktorska disertacija Tamara Popović 72 4.5.2. Parametri oksidativnog stresa u jetri kod pacova različite strarosne dobi Poreñenjem vrednosti parametara oksidativnog stresa u jetri kod životinja različite starosne dobi razlikuju se značajno u nekim parametrima. Lipidna peroksidacija (MDA) kod mladih pacova je statistički značajno snižena (p<0.001) kod kontrolne grupe mladih pacova u odnosu na grupu starih pacova dok je aktivnost superoksid-dismutaze statistički značajno povišena kao i koncentracija nitrita (p<0.05, p<0.01) (Tabela 17). Tabela 17. Parametri oksidativnog stresa u jetri kontrolnih grupa pacova Wistar soja različite strarosne dobi Kontrolna grupa-mladi Kontrolna grupa-stari SOD (U/mg proteina) 360.37 ±24.28367* 333.27 ±17.03 CAT (µmolH2O2/min/mg proteina) 154.98 ± 21.11 144.86 ± 3.33 MDA (nmol/ mg proteina) 73.73 ±7.77*** 94.06 ±7.54 nitriti (µmol/mg proteina) 6.37 ± 0.96** 4.65 ± 0.39 SHgrupe (µmol/mg proteina) 1053.79 ± 88.67 1062.78 ± 22.34 PON1(U//min/mg proteina) 24.48 ± 2.94 28.55 ± 5.02 Statistička značajnost razlike srednjih vrednosti kontrolnih grupa, *p<0.05**p<0.01, ***p<0.001 4.6. Parametri oksidativnog stresa kod pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem Uticaj suplementacije ribljim uljem na parametre oksidativnog stresa (enzimi antioksidativne zaštite, MDA, sadržaj SH, nitriti, PON) ispitivan je kod pacova Wistar soja starih 3 meseca i 22 meseca. Doktorska disertacija Tamara Popović 73 4.6.1. Parametri oksidativnog stresa u krvi mladih pacova tretiranih ribljim uljem Parametri oksidativnog stresa u krvi mladih pacova analizirani su u eritrocitima (SOD, CAT, MDA) i plazme (nitriti, PON) ispitivanih životinja. Vrednosti dobijene za parametre oksidativnog stresa, odnosno vrednosti aktivnosti enzima antioksidativnog sistema zaštite (AOS), (AOS eng. Antioxidative defence system) i koncentracije malondialdehida (MDA) i nitrita, statistički se značajno razlikuju u grupi mladih pacova tretiranih ribljim uljem u odnosu na kontrolnu grupu mladih životinja (Tabela 18). Aktivnosti superoksid-dismutaze (SOD) i aktivnost katalaze (CAT) u eritrocitima su se statistički značajno povećale (p<0.01, p<0.05). Koncentracija nitrita u plazmi se značajno smanjila (p<0.001), kao i (MDA) (p<0.01), parametra lipidne peroksidacije. Aktivnost paraoksonaznog enzima (PON1) se statistički značajno povećala (p<0.001). Suplementacija ribljim uljem kod mladih pacova Wistar soja u trajanju od šest nedelja dovodi do smanjenja lipidne peroksidacije i povećanja antioksidativne zaštite (povećanja aktivnosti AOS enzima). Tabela 18. Parametri oksidativnog stresa u eritrocitima i plazmi mladih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem Tretirana grupa Kontrolna grupa SOD (U/ gHb) 321.15 ± 25.32## 290.75 ± 18.5 CAT (µmolH2O2/gHb/min) 48.15 ± 5.73# 41.66 ± 4.10 MDA (nmol/gHb) 49.93 ± 11.7## 66.04 ± 7.35 Nitriti (µmol/L) 56.85 ± 3.65### 63.43 ± 2.75 SH grupe (µmol/L) 516.76 ± 72.87 539.45 ± 66.13 PON1 (U/L) 152.67 ± 4.80### 141.10 ± 3.91 #p<0.05 ##p<0.01###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane grupe i kontrolne grupe životinja Doktorska disertacija Tamara Popović 74 4.6.1.2. Relativna aktivnost LDH izoenzimskih oblika kod mladih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem Tretman mladih pacova Wistar soja ribljim uljem dovodi do promena u relativnoj aktivnosti laktat-dehidrogenaze (LDH1-5) kod mladih pacova (Slika 16). Procenti relativne aktivnosti izoenzimskih oblika LDH1-5 kod tretirane grupe pacova pokazuju statistički značajno sniženje LDH5 izoenzimskog oblika (p<0.01) kao i značajno povišenje relativne zastupljenosti LDH1 (p<0.05) u odnosu na kontrolnu grupu životinja. 1 LD H 2 LD H 3 LD H 4 LD H 5 LD H 1E LD H 2E LD H 3E LD H 4E LD H 5E LD H 0 10 20 30 40 50 * * LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 a) b) % LD H Slika 16. Relativna zastupljenost izoenzimskih oblika LDH u grupi mladih pacova tretiranih ribljim uljem. a) nativna elektroforeza LDH1-5 b) relativna aktivnost izoenzimskih oblika LDH kod kontrolne grupe (LDH1-5) i tretirane grupe (LDH1E-5E), * p<0.05, **p<0.01, statistička značajnost razlike srednjih vrednost tretirane i kontrolne grupe životinja Doktorska disertacija Tamara Popović 75 4.6.3. Parametri oksidativnog stresa u jetri mladih Wistar pacova tretiranih ribljim uljem Dodatak ribljeg ulja u hrani mladih pacova, u trajanju od šest nedelja, dovodi do značajnih promena u parametrima oksidativnog stresa (enzima antioksidativne zaštite, sadržaja MDA, nitrita, SH grupa i aktivnosti PON) u jetri tretiranih životinja u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Statistički se značajno smanjio stepen lipidne peroksidacije (p<0.001), aktivnost katalaze (p<0.05), koncentracija nitrita (p<0.01), dok se aktivnost paraoksonaze (PON1) statistički značajno povećala (p<0.01) (Tabela 19). Tabela 19. Parametri oksidativnog stresa u jetri mladih Wistar pacova tretirnih ribljim uljem Tretirana grupa Kontrolna grupa SOD (U/mg proteina) 353.87± 16.24 360.37 ± 24.28 CAT (µmolH2O2/min)/mg proteina) 138.62 ± 3.41# 154.98 ± 21.11 MDA (nmol/mg proteina) 47.8 ± 10.68### 73.73 ± 7.77 nitriti (µmol/mg proteina) 4.33 ± 1.61## 6.37 ± 0.96 SH grupe (µmol/mg proteina) 1070.28 ± 156.43 1053.79 ± 88.67 PON 1(U/min/ mg proteina) 42.37±4.73## 24.48±2.94 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane grupe životinja i kontrolne grupe Doktorska disertacija Tamara Popović 76 4.6.4. Parametri oksidativnog stresa u eritrocitima i plazmi starih Wistar pacova Suplementacija ribljim uljem starih Wistar pacova, u pomenutoj dozi u trajanju od šest nedelja, dovela je do promena u parametrima oksidativnog stresa u krvi tretiranih životinja u odnosu na kontrolnu grupu. Aktivnost superoksid-dismutaze (SOD) se značajno povećala (p<0.01) u odnosu na kontrolnu grupu, kao i aktivnost katalaze (CAT) (p<0.05). S druge strane stepen lipidne peroksidacije (MDA) se značajno smanjio (p<0.001), i koncentracja nitrita (p<0.001) u plazmi tretiranih životinja u odnosu na kontrolnu grupu. Koncentracija slobodnih SH grupa se povećala (p<0.05), kao i aktivnost paraoksonaze (PON1) u tretiranoj grupi (p<0.05) (Tabela 20). Tabela 20. Parametri oksidativnog stresa u eritrocitima i plazmi starih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem Tretirana grupa Kontrolna grupa SOD (U/gHb) 350.95±17.30** 304.74±25.52 CAT (U/gHb) 54.64 ± 5.12* 43.55 ± 10.37 MDA (nmol/gHb) 40.31 ± 3.11*** 56.39 ± 3.51 Nitriti (µmol/L) 30.77 ± 8.67*** 72.69 ± 13.58 SH grupe (µmol/L) 643.86 ± 37.65* 599.96 ±26.48 PON1(U/L) 126.33±6.74* 115.16 ± 9.04 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane i kontrolne grupe grupe životinja Doktorska disertacija Tamara Popović 77 4.6.4.1. Relativna aktivnost LDH izoenzimskih oblika kod starih pacova Wistar soja tretiranih ribljim uljem Tretman starih pacova Wistar soja ribljim uljem dovodi do promena u relativnoj aktivosti laktat-dehidrogenaze (LDH1-5) (Slika17). Procenti relativne aktivnosti izoenzimskih oblika LDH1-5 kod tretirane grupe pacova ribljim uljem pokazuju statistički značajno sniženje LDH5 (p<0.01) izoenzimskog oblika, kao i LDH3 (p<0.05), LDH4 (p<0.01) i LDH2 (p<0.01), a statistički značajno povišenje LDH2 (p<0.01) izoenzimskog oblika u odnosu na kontrolnu grupu. Slika 17. Relativna aktivnost izoenzimskih oblika LDH tretirane grupe ribljim uljem (LDHE1-E5) i kontrolne grupe (LDH1-5): a) nativna elektroforeza LDH1-5 b) relativna aktivnost izoenzimskih oblika LDH, *p<0.05, **p<0.01 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane grupe i kontrolne grupe životinja 1 LD H 2 LD H 3 LD H 4 LD H 5 LD H E1 LD H E2 LD H E3 LD H E4 LD H E5 LD H 0 10 20 30 40 ** * ** ** LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 a) b) % LD H Doktorska disertacija Tamara Popović 78 4.6.5. Parametri oksidativnog stresa u jetri starih pacova tretiranih ribljim uljem Parametri oksidativnog stresa u jetri promenili su se posle tretmana starih pacova ribljim uljem u odnosu na kotrolnu grupu životinja (Tabela 21). Aktivnost superoksid-dismutaze se povećala (p<0.05), kao i aktivnost katalaze (p<0.05) u tretiranoj grupi životinja u odnosu na kontrolnu grupu. Stepen lipidne peroksidacije (MDA) u jetri značajno se smanjio (p<0.001), kao i koncentracija nitrita (p<0.01) i aktivnost PON (p<0.01) u tretiranoj grupi (p<0.01), dok se količina SH grupa povećala, (p<0.05) u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova (Tabela 21). Tabela 21. Parametri oksidativnog stresa u jetri starih Wistar pacova tretiranih ribljim uljem Tretirana grupa Kontrolna grupa SOD (U/mg proteina) 394.88 ± 45.45* 333.27±17.03 CAT (µmolH2O2/min/mg proteina) 157.24 ± 11.37* 144.86 ± 3.33 MDA (nmol/ mg proteina) 77.37 ± 3.53*** 94.06 ± 7.54 nitriti (µmol/mg proteina) 3.89±0.31** 4.65 ± 0.39 SHgrupe (µmol/mg proteina) 1094.09 ± 16.54* 1062.79 ± 22.34 PON1(U//min/mg proteina) 19.20 ± 2.69** 28.55 ± 5.02 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 statistička značajnost razlike srednjih vrednosti tretirane grupe životinja i kontrolne grupe Doktorska disertacija Tamara Popović 79 4.7. Korelacije parametara oksidativnog stresa i sadržaja masnih kiselina u fosfolipidima plazme i jetre mladih i starih pacova Ispitivanjem povezanosti parametara oksidativnog stresa i sadržaja pojedinačnih masnih kiselina u fosfolipidima plazme i jetre uočene su pozitivne i negativne korelacije i kod mladih i starih pacova (Tabela 22 i Tabela 23). 4.7.1. Korelacije parametara oksidativnog stresa i sadržaja masnih kiselina u fosfolipidima plazme mladih i starih pacova Pri ispitivanju meñusobne povezanosti parametara oksidativnog stresa i sadržaja pojedinačnih masnih kiselina u fosfolipidima plazme kod kontrolnih i tretiranih grupa mladih i starih Wistar pacova, uočene su statistički značajne (p<0.05) pozitivne i negativne korelacije (Tabela 22). U kontrolnoj grupi mladih pacova nañena je pozitivna korelacija (r =0.805) izmeñu sadržaja palmitoleinske kiseline (16:1,n-7) i sadržaja tiolnih grupa, dok je posle tretmana ribljim uljem izmeñu ovih parametara utvrñena negativna korelacija (r=- 0.717) kao i sadržaja tiolnih grupa i lipidne peroksidacije (MDA) (r=-0.748). U kontrolnoj grupi starih pacova postoji veoma jaka pozitivna korelacija izmedju sadržaja MDA i dokozaheksaenske kiseline (22:6) (r=0.830), kao i izmedju aktivnosti superoksid- dismutaze i sadržaja oleinske kiseline u fosfolipidima (r=0.888). Negativna korelacija nañena je izmeñu aktivnosti superoksid-dismutaze i sadržaja dokozaheksaenske kiseline (r= -0.877) (Tabela 22). Posle tretmana ribljim uljem starih pacova Wistar soja, nañena je veoma dobra (r=0.841) pozitivna korelacija izmeñu sadržaja tiolnih grupa i aktivnosti superoksid-dismutaze, izmedju koncentracije nitrita i aktivnosti katalaze (r=0.884) , kao i negativna korelacija (r= -0.829) izmeñu aktivnosti superoksid-dismutaze i linolne kiseline. Doktorska disertacija Tamara Popović 80 Tabela 22. Korelacije parametara oksidativnog stresa i sadržaja MK u fosfolipidima plazme mladih i starih pacova Wistar soja u grupi tretiranoj ribljim uljem i kontrolnoj grupi pacova Korelacioni parametri Nivo značajnosti (p) Korelacioni koeficijent (r) Kontrola (K) /Tretman(T) Mladi /Stari SH/16:1 0.016 0.805 K Mladi pacovi SH/16:1 0.045 -0.717 T Mladi pacovi SH/MDA 0.033 -0.748 T Mladi pacovi MDA/22:6 0.041 0.830 K Stari pacovi SOD/18:1, n-9 0.044 0.888 K Stari pacovi SOD/22:6 0.051 -0.877 K Stari pacovi SH/SOD 0.036 0.841 T Stari pacovi Nitriti/CAT 0.004 0.884 T Stari pacovi SOD/18:2 0.041 -0.829 T Stari pacovi 4.7.2. Korelacije parametara oksidativnog stresa i sadržaja masnih kiselina u fosfolipidima jetre mladih i starih pacova U kontrolnoj grupi mladih pacova uočena je veoma jaka pozitivna korelacija (r=0.920) izmeñu aktivnosti katalaze u jetri i sadržaja dokozatetraenske kiseline (22:4,n-6) u fosfolipidima jetre (Tabela 23). Posle tretmana ribljim uljem nañena je pozitivna korelacija izmeñu količine tiolnih grupa i aktivnosti katalaze (r=0.813), izmeñu lipidne peroksidacije (MDA) i sadržaja palmitinske kiseline (r=0.749), izmeñu MDA i sadržaja linolne kiseline (r=0.717) u fosfolipidima jetre tretiranih životinja. Parametri koji koreliraju u jetri starih pacova i kontrolne i tretirane grupe se razlikuju od parametara mladih pacova. U kontrolnoj grupi starih pacova postoji negativna korelacija izmeñu sadržaja SH grupa i sadržaja eikozapentaenske kiseline (20:5) (r=-0.850) u fosfolipidima jetre, pozitivna korelacija izmeñu lipidne peroksidacije (MDA) i aktivnosti katalaze u jetri (r=0.884). Doktorska disertacija Tamara Popović 81 Posle tretmana ribljim uljem starih pacova Wistar soja uočena je pozitivna korelacija nitrita u jetri i sadržaja palmitinske kiseline (r=0.810) u fosfolipidima jetre, kao i negativna korelacija nitrita i sadržaja palmitoleinske kiseline (r= -0.905). Aktivnost katalaze u jetri negativno korelira sa sadržajem vakcenske kiseline (18:1, n-7) (r= -0.834) u fosfolipidima (Tabela 23). Tabela 23. Korelacije parametara oksidativnog stresa i sadržaja MK u fosfolipidima jetre mladih i starih pacova Wistar soja u grupi tretiranoj ribljim uljem i kontrolnoj grupi pacova Korelacioni parametri Nivo značajnosti (p) Korelacioni koeficijent (r) Kontrola (K)/tretman(T) Mladi /Stari CAT/22:4 0.001 0.920 K Mladi pacovi SH/CAT 0.014 0.813 T Mladi pacovi MDA/16:0 0.033 0.749 T Mladi pacovi MDA/18:2 0.045 0.717 T Mladi pacovi SH/20:5 0.032 -0.850 K Stari pacovi MDA/CAT 0.019 0.884 K Stari pacovi Nitriti/16:0 0.05 0.810 T Stari pacovi Nitriti/16:1 0.013 -0.905 T Stari pacovi CAT/18:1,n-7 0.039 -0.834 T Stari pacovi Doktorska disertacija Tamara Popović 82 V DISKUSIJA Sinteza n-3 masnih kiselina nije moguća u organozmu te ih je neophodno unositi hranom. Nazivaju se esencijalnim. Alfa-linolenska kiselina (ALA) nalazi se u biljkama, uljima, sojinom ulju, lanenom ulju, orasima, ulju repice. Eikozapentaenska i dokozaheksaenska kiselina mogu se naći u algama, ribi (losos, tuna, skuša). Poznato je da unos n-3 masnih kiselina putem hrane bogate ribom i proizvodima od ribe kao i korišćenjem dijetetskih suplemenata koje sadrže n-3 MK doprinosi tzv. „zdravim dijetama“. Antioksidativni efekti n-3 masnih kiselina povezani su sa procesima lipidne peroksidacije. Optimizacija uslova za ispoljavanje antioksidativnih efekata n-3 masnih kiselina iz ribe i dijetetskih saplemenata bila je od velikog značaja (EFSA, 2010). Kad je reč o dijetetskim suplementima neophodni uslovi zadovoljeni su dodatkom smeše tokoferola kao stabilizatora u sastav kapsula ribljeg ulja. Takoñe, tokoferoli se dodaju i mnogim proizvodima od ribe kao što su riblji fileti, paštete od ribe kao antioksidanti. Linolna masna kiselina (LA, n-6) ne može biti sintetisana de novo od strane ćelija sisara. Zbog toga se mora unositi i esencijalne je. Glavni izvori LA su cerealije, jaja, životinjska mast, hleb sa celim zrnima, suncokret. Esencijalne masne kiseline su važni sastojci membrana svih ćelija i utiču na membransku pokretljivost i propustljivost kao i ponašanje membranski vezanih enzima i receptora. Polinezasićene masne kiseline (PUFA) funkcionišu kao endogeni antiinflamatorni molekuli. Studija El-BAdry i sar. je objavila dokaze za te efekte n-3 PUFA u jetri transgenskih fat-1 miševa koji su u stanju da sintetišu n-3 masne kiseline iz n-6 PUFA uz pomoć endogene desaturaze. (El-BAdry, 2007) 5.1. Biohemijski parametri u plazmi pacova Wistar soja i uticaj suplementacije ribljim uljem Vrednosti biohemijskih parametara plazme kod mladih pacova pokazuju da je tretman sa ribljim uljem doveo do značajnog smanjenja koncentracija triglicerida i LDL holesterola, a do povećanja plazma koncentraciju HDL i mokraćne kiseline. Tretmanom su se smanjile plazma koncentracije non-HDL u odnosu na kontrolnu grupu kao i odnos CHOL/HDL koji predstavlja kardiovaskularni rizik. LDL/HDL odnos, parametar rizika od ateroskleroze tretmanom se takoñe značajno smanjio kao i odnos nonHDL/HDL (Tabela 2 i 3). Doktorska disertacija Tamara Popović 83 Kod starih pacova tretiranih ribljim uljem došlo je do značajnog sniženja plazma koncentracija holesterola i LDL-a, do povećanja plazma HDL koncentracije i mokraćne kiseline. Tretmanom su se značajno snizili i kardio (CHOL/HDL) i aterogeni rizici (LDL/HDL), kao i non-HDL i odnos non-HDL/HDL. (Tabela 4 i 5) Dakle, može se zaključiti da suplementacija ribljim uljem u ishrani mladih i starih pacova dovodi do hipotrigliceridnog i hipoholesterolemijskog efekta kao i do smanjenja faktora kardiovaskularnog rizika i rizika od ateroskleroze. Poredeći biohemijske parametre u plazmama kontrolnih grupa mladih i starih pacova, uočeno je značajno povećanje koncentracije holesterola (p<0.01), HDL-holesterola (p<0.001), triglicerida (p<0.001), u plazmi kontrolne grupe mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova (slike 13,14,15). Froyland i sar. ispitivali su efekte estara EPA i DHA na lipidni metabolizam kod pacova. Životinje su hranjene gavažno u dozi 1g/kg/dan, 3 meseca. Ova studija je pokazala da tretman estrima EPA (EPA-EE) i estrima DHA (DHA-EE) dovodi do snižavanja nivoa holesterola u plazmi dok tretman samo EPA- EE snižava koncentraciju triglicerida u plazmi. U mikrozomima jetre EPA-EE povećava HMG-CoA holesterol-acil-transferaznu aktivnost. Inhibicija aktivnosti HMG-CoA reduktaze u DHA-EE tretiranim pacovima može doprineti hipoholesterolemijskom delovanju (Froyland 1996). Leigh-Firbank i sar. su konstatovali da riblje ulje može redukovati koncentraciju triglicerida i smanjiti rizik od kardiovaskularnih oboljenja (Leigh, 2002). Berge i sar. su u svojoj studiji in vitro zaključili da značajnije EPA nego DHA snižava koncentraciju triglicerida u plazmi (Berge, 1990). Povećani unos ribljeg ulja (n-3 PUFA) redukuje incidencu od kardiovskularnih bolesti (Mitasikova, 2008). Studija je pokazala da n-3 PUFA značajno snižavaju arterijski krvni pritisak ne samo kod mužjaka i ženki spontano hipertenzivnih (SH) pacova (Mitasikova, 2008), već i kod pacova sa povišenim trigliceridima kod kojih snižavaju i plazma koncentraciju triglicerida (Tribulova 2007). Dobijeni rezultati studije u kojoj su mladi i stari pacovi tretirani ribljim uljem idu u prilog značajnog sniženja triglicerida kod starih pacova kao i da kontrolna grupa mladih pacova ima viši nivo plazma triglicerida u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova (Chapman, 2000). Rezultati pomenutih studija na animalnim modelima, kad su biohemijski parametri plazme u pitanju, su u skladu sa rezultatima koje smo dobili u našoj studiji . Doktorska disertacija Tamara Popović 84 U humanim studijama dobijeni su gotovo identični rezultati. U studiji McComir i sar, izveden je zaključak da 12 nedeljni tretman sa 3-6g ribljeg ulja dnevno utiče na smanjenje telesne težine i niz patologija povezanih sa metaboličkim sindromom kod ispitivane grupe pacijenata (McComir, 2009). Krajem devedesetih godina u nekoliko studija potvrñeno je hipotrigliceridno dejstvo ribljeg ulja (Harris, 1996). Riblje ulje ima osim hipotrigliceridnog i antiinflamtorno delovanje u reumatoidnom artritisu, ulcerativnom kolitisu i sl. dijagnozama povezanih sa inflamatornim odgovorom, kao što je CVD i dijabetes mellitus tip 2. 5.2. Uticaj suplementacije ribljim uljem na masnokiselinske profile fosfolipida plazme i jetre pacova različitih starosti kao i na aktivnost desaturaza i elongaza Tretman ribljim uljem uticao je na promenu profila masnih kiselina fosfolipida i u plazmi i u jetri ispitivanih životinja. 5.2.1. Uticaj suplementacije ribljim uljem na masnokiselinske profile fosfolipida plazme pacova različitih starosti Tretman ribljim uljem u našem eksperimentu doveo je do statistički značajnog povećanja (p<0.05) stearinske kiseline (18:0) i kod mladih i kod starih pacova, u odnosu na njihove kontrolne grupe. Prisutno je i povećanje oleinske kiseline (18:1,n-9) (p<0.001) kod tretirane grupe mladih životinja, povećanje vakcenske kiseline (18:1,n-7) (p<0.05) kod tretirane grupe starih životinja u odnosu na njihove kontrolne grupe. Kod mladih pacova tretman je doveo do sniženja (p<0.05) linolne kiseline (18:2), dok je kod starih tretman doveo do povišenja (p<0.01) linolne kiseline u odnosu na kontrolne grupe životinja. Suplementacija je dovela do statistički značajnog sniženja (p<0.001) arahidonske kiseline kod obe grupe tretiranih životinja. Sadržaj EPA procentualno je povišen (p<0.001) kod mladih pacova i starih pacova (p<0.05) u odnosu na kontrolne grupe životinja. Dokozapentaenska kiselina (DPA) povišena je značajno kod obe grupe tretiranih životinja (p<0.001), dok je kod mladih pacova povišena dokozatetraenska kiselina (p<0.001). Ukupne MUFA su se statistički značajno povećale (p<0.05), kao i n-3 (p<0.001), dok se Doktorska disertacija Tamara Popović 85 odnos n-6/n-3 statistički značajno smanjio (p<0.001), kod mladih pacova posle tretmana ribljim uljem, u odnosu na kontrolnu grupu. Polinezasićene MK n-3 i n-6 serije se brzo ugrañuju u ćelijske membrane i utiču na mnoge biološke funkcije, membransku fluidnost, aktivaciju inracelularnih puteva produkcijom eikozanoida, gensku ekspresiju i ćelijsku diferencijaciju (Alexender, 1998). Balans izmedju n-6 i n-3 MK u unosu je važan zbog njihove kompetitivne prirode. EPA ima ulogu prekursora za prostaglandin-3, tromboksana-3 i leukotriene-5 serije. Ona ima sposobnost da delimično blokira konverziju n-6 MK do štetnih eikozanoida tako redukujući kardiovaskularni rizik i inhibira nastanak tumora (Bagga, 2003, Arsić, 2009). DHA ima protektivnu ulogu u Alchajmerovoj bolesti i drugih tipova demencije (Arterburn,2006). Membranska fluidnost zavisi od masnokiselinskog profila fosfolipida, od dužine lanca masnih kiselina i stepena nezasićenosti. Veća prisutnost zasićenih masnih kiselina u ćelijskoj membrani menja membransku lipidnu fluidnost. (Popovic, 2010). Dijetarni masnokiselinski profil utiče na tkivni masnokiselinski profil kao i na membranski profil MK i membransku proteinsku funkciju (Hynes 2003). U studiji Calviello i sar. u kojoj su Wistar pacovi gavažno primali EPA ili DHA (360mg/kg/dan), tokom 1-4 nedelje, EPA tretman je povećao EPA i DPA procentualni sadržaj u fosfolipidima plazme. DHA tretman povećao je DHA sadržaj u fosfolipidima plazme. Oba tretmana smanjuju sadržaj arahidonske kiseline i n-6/n-3 PUFA odnosa u fosfolipidima plazme i u membranama, bez modifikacije indeksa desaturacije (Calviello, 1997). U studiji Harris i sar. rañenoj sa Wistar pacovima starih 8 nedelja, nisu postojale značajne promene u ukupnim zasićenim (SFA), mononezasićenim (MUFA) i polinezasićenim (PUFA) koncentracijama posle tretmana ribljim uljem (300mg/kg/dan, 4-6 nedelja) (Haris 1989). Ovi rezultati nisu u skladu sa rezultatima naše studije u kojoj je došlo do promena u MUFA, n-3 i odnosu n-6/n-3 posle saplementacije kod mladih Wistar pacova. U animalnim modelima pokazano je da PUFA redukuju renalnu inflamaciju i fibrozu, da smanjuju inflamaciju, snižavaju trigliceride, plazma glukozu kod izazvanog dijabetesa. (Lauretani, 2010). In vitro, EPA utiče na endotelne ćelije u kulturi da otpuštaju relaksirajuće faktore (EDRF, NO) (Ferrucci, 2006). Sadržaj masnih kiselina u fosfolipidima seruma/plazme su biohemijski markeri fiziološkog statusa različitih masnih kiselina i predstavljaju indikator nutritivnog unosa n-3 masnih Doktorska disertacija Tamara Popović 86 kiselina uključujući EPA i DHA. Nekoliko studija (Simon, 1995; Holub, 2004; Lemaitre, 2003) su pokazale obrnutu korelaciju izmedju ukupnih n-3 MK u fosfolipidima seruma/plazme i rizika od koronarnog srčnog oboljenja, ateroskleroze. N-6 masne kiseline (arahidonska kiselina, AA izmedju ostalih) koje su prisutne u različitom odnosu u različitim tkivima uključujući serumske/plazma fosfolipide konvertuju se u proinflamatorne eikozanoide i druge produkte povezane sa inflamatornim procesima i nekim hroničnim poremećajima. Odnos AA/EPA serum/plazma fosfolipida koreliraju pozitivno sa kliničkim simptomom depresije, dok se visok odnos AA/DHA povezuju sa neurološkim poremećajima. Odnos ukupnih masnih kiselina u serumu/plazmi fosfolipida i ukupnih n-3 MK takodje predstavljaju faktor rizika za koronarna srčana oboljenja. Odnosi AA/EPA, AA/DHA, AA/(EPA+DHA) mogu se posmatrati kao nezavisni u odnosu na ukupne MK. Odnos n-6/n-3 koji je <4.5 smatra se da pripada kategoriji „nižeg rizika“ za koronarna oboljenja, dok se za odnos AA/(EPA+DHA) <2.1 može reći da predstavlja „nizak rizik“ kad su fatalni ishodi infarkta miokarda u pitanju (Holub, 2009) Veliki broj različiih studija izveden je na humanoj populaciji korišćenjem ribljeg ulja ili suplemenata istog u različitim dijagnozama. Pacijentima (hronična bubrežna bolest, dijabetes mellitus 2, depresija, hipertenzija) je na početku studije potvrñen deficit n-3 masnih kiselina u profilima MK plazme. Suplementacijom je došlo do povećanja ukupnih n-3 MK i smanjenja n-6/n-3 odnosa kao i do promena u sadržaju pojedinačnih masnih kiselina u fosfolipidima plazme (Morris, 1993; Percy, 2005; Lauretani, 2010). 5.2.2. Uticaj suplementacije ribljim uljem na masnokiselinske profile fosfolipida jetre pacova različitih starosti Tretman ribljim uljem uticao je na masnokiselinski profil fosfolipida jetre kod mladih i starih pacova. Tretmanom je došlo do statistički značajnog povećanja procentnog sadržaja linolne kiseline (18:2) (p<0.001), α-linolenske kiseline (18:3) (p<0.01) i dihomo-γ- linolenske kiseline (20:3) (p<0.05) kod mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu dok se sadržaj arahidonske kiseline kao i dokozatretraenske kisleine (22:4) fosfolipida jetre tretiranih mladih životinja statistički značajno snizio (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Kod tretiranih životinja procenatna zastupljenost EPA (20:5), DPA (22:5) (p<0.001), i DHA (22:6) (p<0.01) se povećala u fosfolipidima jetre mladih životinja. Doktorska disertacija Tamara Popović 87 MUFA su se statistički značajno povećale (p<0.05), kao i ukupne n-3 (p<0.001), dok se sadržaj n-6 smanjio (p<0.01) kao i odnos n-6/n-3 (p<0.001) ) u fosfolipidima jetre mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu. Kod grupe starih pacova tretiranih ribljim uljem došlo je do povećanja sadržaja palmitinske kiseline (16:0) (p<0.001), vakcenske (18:1,n-7) (p<0.05), linolne kiseline (18:2) (p<0.01), EPA (p<0.001), DPA (p<0.001) i sniženja AA(p<0.001). Ukupne SFA i PUFA i ukupne n-3 (p<0.001) su se povećale (p<0.001), n-6 su se snizile kao i odnos n- 6/n-3 (p<0.001) , u poredjenju sa kontrolnom grupom. Dakle, tretman ribljim uljem značajno je kod životinja obe strar osne dobi snizio ukupne n- 6, snizio odnos n-6/n-3, a od pojedinačnih MK snizio AA, povećao EPA, DPA, i linolnu kiselinu u fosfolipidima jetre. Jetra je jedan od organa na koje može uticati poremećaj u n-6/ n-3 odnosu. Kod miševa n-3 PUFA ublažava inflamaciju jetre i redukuje sadržaj masti u steatoznim jetrama. Pretretman sa n-3 PUFA značajno smanjuje obim mikrocirkulatornog defekta koji prati ishemia/reperfuzija oštećenja i štiti od hepatocelularnih oštećenja u makrostetoznoj jetri miša. Slična zaštita prijavljena je kod normalnih jetri miševa koji su bili na pretretmanu farmakološkim supstancama koje menjaju nivo eikozanoida (Iwata, 1999). Nesporno je da PUFA imaju veliki uticaj na funkciju jetre. One smanjuju ekspresiju hepatičnih gena za glikolitičke i lipogenske regulatorne enzime (Giudetti, 2003). Souza Melo i sar. Ispitivali su efekat tretmana n-3 masnim kiselinama posle parcijalne hepatoktomije (70%) kod pacova. Posle tretmana, povećava se koncentracija GSH u plazmi i jetri. U tretiranoj grupi životinja dolazi i do značajnog smanjenja lipidne peroksidacije. S obzirom da je hepatoktomija per se već izvor slobodno radikalskih preocesa, tretman sa n-3 masnim kiselinama doprineo je antioksidativnom efektu i delovao povoljno na regenereciju jetre (Souza Melo, 2010). Unos n-3 PUFA rezultuje u normalizaciji n-3/n-6 odnosa, redukovanoj intrahepatičnom sadržaju masti i makrosteatozi. Kod NESHA, masnokiselinski profili fosfolipida u jetri su sadržali viši n-6 i niži n-3 PUFA sa značajno povećanim n-6/n-3 odnosom u poreñenju sa normalnim jetrama. Suplementacijom n-3 u toj studiji, kod nealakoholisane masne jetre, snižavaju se transaminaze i trigliceridi u poreñenju sa kontrolnom grupom dok je sadržaj AA i n-6/n-3 odnos bio niži u poreñenju sa kontrolnom grupom (Araya, 2004). Doktorska disertacija Tamara Popović 88 Neadekvatni unos ALA, neodgovarajući balans sa LA ili poremećaji desaturacija i elongacija su poznati faktori koji utiču na metabolizam n-3 PUFAs. U prisustvu jednog ili više ovakvih faktora , produkcija ALA derivata je smanjena. n-3 PUFA utiču na lipidnu homeostazu jetre preko transkripcionih faktora i enzima koji imaju glavnu ulogu u metabolizmu MK i akumulaciji masti u jetri. n-3 PUFA nishodno regulišu transkripcioni faktor sterol regulatorni element vezujući protein-1 (SREB-1), i smanjuju DNA vezivanje nuklearnog faktora-Y (NF-Y). SREBP-1 ushodno reguliše lipogenične gene, sintazu masnih kiselina (FAS) i sterol-CoA-desaturazu-1 (SCD-1) i zbog toga potenciraju akumulaciju triglicerida u jetri ( Sekiya, 2003). Dostupnost NF-Y je esencijalna za transkripciju FAS. Mutacija NF-Y inhibira SREBP-1 posredovani supresivni efekat n-3 PUFA na FAS. S druge strane, n-3 dugolančane PUFA ushodno regulišu peroksizomalni- proliferišući-aktivirajući-receptor-alfa (PPAR-alfa) koji stimuliše oksidaciju masnih kiselina jetre i povećava transkripciju za mitohondrijalnu karnitin- palmitoil- transferazu-1 (CPT-1) i peroksizomalnu acil-CoA oksidazu (ACO) (Teran-Garcia, 2007). PPAR-alfa povećava sekreciju apolipoproteina B-100, glavnog strukturnog proteina VLDL-a i ushodno reguliše ekspresiju MK vezujućeg proteina jetre (LFABP) koji je esencijalan za sekreciju apo B-100 (Badry, 2007). Poredeći masnokiselinske profile u fosfolipidima jetre u grupi pacova (starih 8 nedelja) sa fosfolipidima jetre mladih pacova u našem eksperimentu, ukupne n-3 MK procentualno su manje zastupljene, kao i n-6/n-3 odnos koji je viši u masnokiselinskim profilima fosfolipida jetre kod mladih (3 meseca) pacova u našem eksperimentu (Ristić-Medić, 2003). Pacovi tretirani ribljim uljem u studiji Amusquivar i sar. imaju procentualno viši sadržaj n- 3 MK, EPA, DHA u fosfolipidima jetre u odnosu na sadržaj istih masnih kiselina u fosfolipidima plazme. U istoj studiji sadržaj oleinske kiseline viši je u fosfolipidima plazme tretiranih životinja nego u fosfolipidima jetre dok je sadržaj arahidonske kiseline nešto viši u fosfolipidima jetre nego u fosfolipidima plazme (Amusquivar, 2000). Doktorska disertacija Tamara Popović 89 5.2.3. Profili MK fosfolipida jetre kontrolnih grupa pacova Wistar soja različite starosne dobi Sadržaj stearinske kiseline (18:0) u fosfolipidima plazme statistički je značajno niži (p<0.01) u kontrolnoj grupi mladih pacova, dok je procenat oleinske kiseline (18:1,n-9) i vakcenske (18:1,n-7) značajno viši (p<0.01) u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. Sadržaj linolne kiseline (18:2) kao i sadržaj arahidonske (20:4) je značajno niži (p<0.05) kod mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. Ukupne MUFA su značajno više (p<0.01), PUFA značajno niže (p<0.01), kao i ukupne n-6 (p<0.01) u fosfolipidima plazme u kontrolnoj grupi mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. Sadržaj palmitinske kiseline (16:0) procentualno je povišen (p<0.001) kao i palmitoleinske kiseline (16:1) (p<0.05) u fosfolipidima jetre u kontrolnoj grupi mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. Linolna kiselina (18:2) je procentualno snižena kao i α- linoleinska kiselina (p<0.001) i dihomo-γ-linolenska kiselina (p<0.05) u fosfolipidima jetre u kontrolnoj grupi mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. Dokozaheksaenska kiselina (p<0.001) je procentualno povećana (p<0.001), kao i ukupne n-3 (p<0.001) i odnos n-6/n-3 (p<0.001) u fosfolipidima jetre u kontrolnoj grupi mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova 5.2.4. Elongaze i desaturaze Elongaze i desaturaze katalizuju reakcije sinteze MUFA i PUFA. Procenjene aktivnosti desaturaza i elongaza u plazmi mladih i starih pacova pokazale su statistički značajne promene posle suplementacije ribljim uljem. ∆4, ∆5 i ∆9 desaturaze su statistički značajno snižene (p<0.001) u plazmi tretiranih mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu. Kod starih pacova takoñe je došlo posle tretmana ribljim uljem do statistički značajnog sniženja u jetri ∆4 desaturaze (p<0.01) i ∆5 desaturaze (p<0.001) i povišenja ∆6 desaturaze (p<0.05) u odnosu na kontrolnu grupu pacova. Dakle, tretman ribljim uljem doveo je do statistički značajnog sniženja ∆4, ∆5 desaturaza u plazmi kod mladih i starih pacova u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Doktorska disertacija Tamara Popović 90 Procenjene aktivnosti desaturaza i elongaza u jetri mladih i starih pacova pokazale su statistički značajne promene posle suplementacije ribljim uljem. ∆4 i ∆5 procenjena desaturazna aktivnost smanjila se (p<0.001) u jetri mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu. Kod starih pacova procenjene desaturazna aktivnost se takoñe smanjila, ∆4 (p<0.01) i ∆5 (p<0.001). Procenjena aktivnost elongaze se statistički značajno smanjila (p<0.05) kod tretiranih mladih pacova, kao i kod tretiranih starih pacova (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Dakle tretman ribljim uljem doveo je do statistički značajnog sniženja procenjenih aktivnosti ∆4, ∆5 desaturaza i sniženja procenjene aktivnosti elongaze u jetri kod mladih i starih pacova u odnosu na kontrolnu grupu životinja. LA i ALA se metabolišu do odgovarajućih metabolita desaturazno-elongaznim reakcijama sa istim setom ∆5 i ∆6-desaturaza i elongaza. U zavisnosti od inicijalnog supstrata LA ili ALA nastaju različite klase eikozanoida. Kao posledica ishrane, odnos n-6:n-3 PUFA kreće se 15-16:1 u zemljama zapadne Evrope, umesto zdravog odnosa 1-4:1. Ovo se može popraviti unosom EPA i DHA. ∆5- desaturaze imaju ograničenu aktivnost da konvertuju dihomo-γ-linolensku kiselinu u arahidonsku kiselinu. Zbog toga sinteza antiinflamatornih eikozanoida nastalih iz dihomo-γ-linolenske kiseline može prevazići efekte proinflamatornih eikozanoida nastalih iz arahidnonske kisleine (AA) (Marra, 1988). Eikozanoidi nastali iz arahidonske kiseline su biološki aktivni u malim količinama. U većim koncentracijama oni doprinose formiranju tromba i razvoju inflamatornih poremećaja. Unos suplementacijom, EPA i DHA povezan je sa smanjenom produkcijom tromboksana A2 (TXA2), potentnog trombocitnog agregatora i vazokonstriktora, i leukotriena B4 (LTB4) (Sinclair,1990). Visok unos n-6 PUFA pomera fiziološki odgovor u proinflmatorni i protrombički sa povećanjem u viskozitetu krvi, vazospazmu i vazokonstrikciji. Suprotno, n-3 PUFA imaju antiinflamtorne, antitrombičke, vazodilatatorne i hipolipemičke osobine. Tako, n-3 PUFAs imaju negativni regulatorni uticaj na hepatičku lipogenezu (Simopoulos, 2003). Veliki broj faktora je uključen u regulaciju ∆5 i ∆6 desaturazne aktivnosti. Niska ∆6- desaturazne aktivnost nañena je kod dijabetičnih i hipertenzivnih pacova. Drugi Doktorska disertacija Tamara Popović 91 eksperimenti na pacovima pokazali su da hormoni kao glukagon, epinefrin, glukokortikoidi i tiroksin inhibiraju ∆5 i ∆6 desaturazne aktivnost dok insulin stimuliše ∆6- desaturaznu aktivnost (Lopez Jimenez, 1993). Hronično konzumiranje alkohola kao i gojaznost povezane su sa redukovanim aktivnostima desaturaza, a studije na životinjama i ljudima su pokazale da je aktivnost desaturaza i polno zavisna što je povezano sa hormonskim statusom. (Medeiros 1995). Mnoge studije su ispitivale regulaciju elongaza sisara na nivou enzimske aktivnosti. Ispitivanja su bila usmerena na nutritivnu i tkivno-specifičnu regulaciju ekspresije elongaza u novije vreme. U jetri pacova Elovl-5 je predominantna elongaza (Wang, 2005). Aktivnosti pacovskih hepatičnih ∆5 i ∆6 desaturaza su regulisane i dijetarnim unosom. Elovl-5 je odgovorna za elongaciju masnih kiselina i sposobna je da vrši elongaciju zasićenih masnih kiselina (16:0, 18:0, 20:0, 22:0 i 24:0) pre nego mononezasićenih (18:1, n-9) i polinezasićenih (20:4, n-6) masnih kiselina (Wang, 2005). Pacovska heptična Elovl-5 ekspresija je regulisana na pretranslacionom nivou sa dijetarnim n-3 PUFA i PPARα agonistima. Za razliku od ∆5 i ∆6 i ∆9 desaturaza, elongaze ne pokazuju uniformni odgovor na tretman ribljim uljem (Igarashi, 2008). 5.3. Parametri oksidativnog stresa U oksidativnom metabolizmu u fiziološkim uslovima formiranje slobodnih radikala odvija se kontinuirano, ali u neznatnom obimu. U uslovima poremećene homeostaze u ćeliji nastaje višak slobodnih radikala, što dovodi do oštećenja ćelija i tkiva. Antioksidativni sistem objedinjuje niz reakcija usmerenih na različite aspekte i faze u lancu oksidativnog oštećenja ćelija i tkiva (Lykkesfeldt i Svendsen, 1997). Superoksid-anjon-radikal je jak oksidans, ali njegova prooksidativna aktivnost se odnosi na njegovu konjugovanu kiselinu, peroksil-radikal (HOO.), koja inicijalno pokreće proces oštećenja lipida, oduzimanjem protona, čime započinje proces peroksidacije lipida. Autooksidacijom superoksid-anjon-radikala nastaje vodonik-peroksid. Ravnotežna koncentracija vodonik-peroksida u ćeliji se održava uz pomoć katalaze i glutation- peroksidaze (GSH-Px). Katalaza, zbog svoje izuzetno visoke Vmax, vrlo brzo razgrañuje vodonik-peroksid. Osim ovim putem, vodonik-pereksid može biti homolitički razgrañen i u prisustvu jona prelaznih metala kao što su Fe2+ i Cu+. Tada nastaje najpotentniji Doktorska disertacija Tamara Popović 92 kiseonični radikal, hidroksil-radikal. On, veoma neselektivno inicijalno reaguje sa biomakromolekulima, sa DNK, ili nekim drugim molekulima. Najosetljiviji deo ćelije na oksidativno oštećenje su membrane ćelija i ćelijskih organela, zbog visokog sadržaja polinezasićenih masnih kiselina (PUFA). Sastav membranskih lipida i promenjeni fluiditet utiču i na aktivnost nekih membranskih enzima. U zavisnosti na kojim se subćelijskim membranama odigrava peroksidacija lipida, zavisi i ozbiljnost i obimnost narušenih ćelijskih funkcija. Mitohondrijalne PUFA su pretežno target za peroksidacije koje nastaju delovanjem gvožña. Kao što je već napomenuto, peroksidacija lipida je višefazni proces koji se odvija kroz fazu inicijacije, propagacije i terminalnu fazu. Malondialdehid je krajnji proizvod peroksidacije lipida polinezasićenih masnih kiselina, koji se preko Shiff-ovih baza unakrsno vezuje za proteine i fosfolipide membrane (Valko 2007, Mukul 2005, Pryor 2006, Rossner, 2007. 5.3.1. Parametri oksidativnog stresa u krvi i jetri mladih i starih pacova Wistar soja posle tretmana ribljim uljem Posle suplementacije ribljim uljem u trajanju od šest nedelja Wistar pacova došlo je do statistički značajnog povećanja aktivnosti SOD (p<0.01), CAT (p<0.05) i PON1 (p<0.001), kao i statistički značajnog sniženja lipidne peroksidacije (MDA) (p<0.01) i koncentracije nitrita (p<0.001) ) u krvi mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu životinja (Tabela 16). Tretman ribljim uljem doveo je do statistički značajnog sniženja aktivnosti katalaze (p<0.05), lipidne peroksidacije (p<0.001) i koncentracije nitrita (p<0.01), kao i do povećanja aktivnosti PON1 (p<0.01) u jetri mladih pacova u odnosu na kontrolnu grupu životinja (Tabela 19). Kod starih pacova suplementacija ribljim uljem u trajanju od 6 nedelja dovela je do statistički značajnog povećanja aktivnosti SOD (p<0.01), CAT (0.05) i PON1 (p<0.05) i povećanja količine SH grupa (p<0.05), kao i do statistički značajnog sniženja lipidne peroksidacije (p<0.001) i koncentracije nitrita (p<0.001) u krvi pacova u odnosu na kontrolnu grupu životinja (Tabela 20). Doktorska disertacija Tamara Popović 93 Aktivnosti SOD i CAT su se statistički značajno povećale (p<0.05), kao i količina SH grupa (p<0.05) i aktivnost PON1 (p<0.01), dok se lipidna peroksidacija značajno snizila (p<0.001), kao i koncentracija nitrita (p<0.01), u jetri starih pacova tretiranih ribljim uljem u odnosu na kontrolnu grupu pacova (Tabela 21). Dakle, tretman ribljim uljem kod mladih pacova u jetri i krvi doveo je do značajnog sniženja lipidne peroksidacije, sniženja koncentracije nitrita, povećanja aktivnosti PON1 u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Kod starih pacova tretman ribljim uljem doveo je do statistički značajnog sniženja lipidne peroksidacije, koncentracije nitrita, povećanja količine SH grupa, aktivnosti SOD, CAT i PON1 u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Tretman ribljim uljem kod pacova obe starosne dobi i u jetri i u krvi doveo je do sniženja lipidne peroksidacije, koncentracije nitrita i povećanja PON1, dok je uticaj suplementacije na povećanu aktivnost enzima antioksidativne odbrane (SOD i CAT) bio više izražen kod starih pacova. Poredeći pacove različite starosne dobi u plazmi mladih pacova nañena je snižena koncentracija nitrita (p<0.01), kao i povećana aktivnost PON1 (p<0.001) u odnosu na grupu starih pacova. U jetri, aktivnost SOD je statistički značajno povećana (p<0.05), kao i koncentracija nitrita (p<0.01), dok je lipidna peroksidacija smanjena (p<0.001), kod mladih pacova u odnosu stare pacove. 5.3.2. Rezultati drugih studija i povezanost sa dobijenim rezultatima 5.3.2.1. Starenje i antioksidativna zaštita Povećana ekspresija gena za aktivnosti enzima antioksidativne zaštite i primena neenzimskih antioksidanata može produžiti dužinu života (Melov, 2002). Studije i kliničke i na animalnim modelima pokazale su sniženje sadržaja neenzimskih antioksidanata za vreme starenja. Štaviše, uloga lipofilnih antioksidanata je podržana sa rezultatima da dugoživeće vrste imaju više nivoe vitamina A, E (neenzimskih lipofilnih antioksidanata) i niži nivo endogene SOD (Mecocci, 2000). Dužina života korelira sa nižom produkcijom slobodnih radikala i višim stepenom popravke DNK. Aktivnost AOS igra važnu ulogu u odreñivanju dužine života vrste. (Ceballos-Picot, 1992). Doktorska disertacija Tamara Popović 94 U toku starenja volumen eritrocita se smanjuje vremenom naročito u drugoj polovini života (Pandey 2010). Ove promene su povezane sa nižim koncentracijama holesterola u plazmi, i gubitkom membranskih konstituenata starenjem (Pandey, 2010). Antioksidantni kapacitet plazme je marker starenja (ukupni antioksidatvni potencijal-ORAC, FRAP) (Benzie, 1996). Dugoživeći sisari imaju nizak nivo nezasićenosti u celularnim membranama: ovo vodi smanjenoj lipidnoj peroksidaciji u tim vrstama (Sanz, 2006). Lipidna peroksidacija indukuje promene u integritetu memebrana, fluidnosti i permeabilnosti i modifikovanje LDL-a do proaterogenih i proinflamatornih formi i generisanje potencijalno toksičnih proizvoda (Greenberg, 2007). Proizvodi lipidne peroksidacije su mutageni i karcinogeni, i uključeni su u mehanizme koji vode poremećajima kao što je CHD, kancer, neurološke bolesti i starenje (Lee J, 2004). Povećanje u MDA korelira sa smanjenjem antioksidativnog kapaciteta plazme za vreme starenja, što potvrñuje da se sa godinama smanjuje antioksidativna moć a to je i razlog povećanog oksidativnog stresa u starenju (Rizvi, 2006). Kod eukariota zastupljene su sledeće superoksid-dismutaze: CuZn-SOD koja je prisutna u citosolu, Mn-SOD u mitohondrijama i EC-SOD, ekstracelularna. EC-SOD su značajne jer regulišu i modifikuju dejstvo NO. radikala koji nastaje u makrofagima, endotelnim ćelijama, hepatocitima ili drugim ćelijama (Van Remmen, 2003). SOD je jedan od glavnih enzima koji štite ćeliju od ROS. U jetri konkretno njena aktivnost je vrlo visoka. Ljudi imaju najviši nivo SOD u odnosu na metaboličku potrošnju od svih vrsta (Pandey, 2010). Gianni i sar. su otkrili da u starenju ne postoji razlika u aktivnosti CuZn-SOD, već u promenama aktivnosti Mn-SOD sa starenjem. Naime aktivnost mitohondrijalne Mn-SOD se povećava sa starenjam (Gianni, 2004). Barnett i sar. su pokazali da se aktivnost CAT ne menja sa starenjem, (Barnett,1995). Glutation sistem ima negativnu korelaciju sa starenjem (Pandey, 2010). Naši rezultati su pokazali da se aktivnost i CAT i SOD u eritrocitima ne menjaju statistički značajno sa starenjem, dok je aktivnost SOD povećana u jetri mladih pacova u odnosu na stare. U jetri je statistički značajno snižena lipidna peroksidacija kod mladih pacova. Ovi rezultati su delimično u skladu sa rezultatima drugih autora (Rizvi, 2006), odnosno našem eksperimentu, tkivni (jetra) antioksidativni status u većoj meri korelira sa starenjem. Doktorska disertacija Tamara Popović 95 5.3.2.2. Tretman ribljim uljem i antioksidativna zaštita Rezultati studija Palozza i sar. (1996) i Sekine i sar. (2007) pokazali su da dijetarni unos n- 3 PUFA povećava eritrocitnu membransku osetljivost na peroksidaciju i produkciju lipidnih peroksida u jetri i bubregu. S druge strane, ispitivanja Hsu-a (2001) pokazala su da dijetarna suplementacija sa n-3 PUFA nema efekta na lipidnu membransku peroksidaciju ili da ima pozitivan efekat na održavanje nivoa glutationa i antioksidativne enzimske aktivnosti u krv. Ostaje pitanje da li je povećana osetljivost membrana na peroksidaciju (ili povećana količina produkata peroksidacije) rezultat povećanog dejstva ROS iz fagocita ili disfunkcije antioksidativnog sistema u krvi ili oba ova faktora (Hsu, 2001). Eritrociti nemaju mitohondrije, izloženi su dejstvu ROS, s obzirom na autooksidaciju hemoglobina pod visokim pritiskom kiseonika u arterijskoj krvi. Povećana intraeritrocitna ROS koncentracija dovodi do eritrocitne membranske lipidne peroksidacije, i može oštetiti druge intracelularne proteine (Cimen, 2007). Održavanje prooksidativno-antioksidativnog balansa u eritrocitima je takoñe važno za druga tkiva s obzirom da su eritrociti mobilni detoksifikujući elementi u cirkulaciji (Brown, 1989) ili kada ROS difunduju iz njih što može biti razlog tkivnih mikrooštećenja (Johnson, 2005). Osnovni supstrat za oksidativno oštećenja membrana su PUFA u fosfolipidima i glikolipidima, nezasićene MK i holesterol koji se nalaze u jezgru lipoproteina, kao i holesterol i lipoproteini bioloških membrana (Trostchansky, 2006). Tokom LP nastaju primarni visoko reaktivni intermedijeri, čijom razgradnjom se dobijajaju aldehidi, koji reaguju sa amino-grupama proteina menjajući tako njihova strukturna i funkcionalna svojstva (Traverso, 2004). LP smanjuje fluidnost bioloških membrana, povećava jonsku propustljivost i dovodi do inaktivacije membranskih enzima. Intenzivna LP dovodi do opadanja membranskog potencijala, povećanja permeabilnosti za vodonične jone i druge jone, kao i mogućih oštećenja ćelija što je praćeno izlaskom njenog sadržaja. Tkiva poremećene funkcije brže ulaze u lipidnu peroksidaciju. Povećana peroksidabilnost nastaje inaktivacijom, odnosno manjkom antioksidativnih mehanizama, otpuštanjem metalnih jona (Fe, Cu) iz depoa i metaloproteina, koji su hidrolizovani enzimima otpuštenim iz oštećenih lizozoma (Gutteridge 1993). Doktorska disertacija Tamara Popović 96 Naši rezultati su nedvosmisleno pokazali da je nakon tretmana ribljim uljem došlo do statistički značajnog smanjenja LP i kod mladih i kod starih pacova u eritrocitima (p<0.01) i jetri (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Suplementacija n-3 masnih kiselina doprinela je očuvanju ćelijskih membrana eritrocita i hepatocita kod pacova različite starosne dobi, njihove strukture, fluidnosti i funkcionalnosti. Demoz i sar. (1992) su našli da EPA ima hipotrigliceridni efekat, da ispoljava pojačan antioksidativni odgovor i dovodi do smanjenja lipidne peroksidacije u jetri tretiranih miševa. Takoñe je pokazano da tretman sa omega-3 smanjuje lipidnu peroksidaciju u corpus striatumu kod pacova (Sarsilmaz 2003). Dijetarna suplementacija ribljim uljem može svakako pojačati odgovor na slobodno radikalska oštećenja i redukovati lipidnu peroksidaciju. Ovo ide u prilog činjenici da riblje ulje može biti izbor kod velikog broja dijagnoza gde je oksidativna/antioksidativna odbrana narušena. Zanimljivo je pitanje kako se oksidativni potencijal MDA i nekih drugih aldehida generiše. Pretpostavlja se da vezivanje aldehida i proteina može dovesti do produkcije ranih i relativno nestabilnih proizvoda koji su sposobni da interaguju sa jonima metala u autooksidativnom smislu, indukujući stvaranje oksidativnih vrsta i trigerujući oksidaciju. Krajnji (end-stage) proizvodi uzrokuju funkcionalna oštećenja molekula što se povezuje sa molekulskim osnovama procesa starenja. Izučavanja njihove strukture dala bi osnov za evaluaciju aldehidnih modifikacija proteina za vreme starenja i starenjem povezanih procesa razvoja bolesti (Traverso 2004). GSH/GSSG odnos se često koristi kao indikator celularnog redoks stanja (Wu, 2004). GSH-redoks status u eritrocitima je važan parametar oksidatinog stresa. U našim eksperimentima odreñivali smo količinu ukupnih tiolnih (SH) grupa posle suplementacije ribljim uljem. Količina tiolnih grupa se povećala posle suplementacije ribljim uljem kako u krvi (p<0.05) tako i u jetri (p<0.05) starih pacova. Ovo povećanje nije uočeno posle suplementacije kod mladih pacova. Dakle, suplementacija ribljim uljem uticala je na redoks status u pravcu smanjene oksidacije, tj. u pravcu povećanja sadržaja slobodnih tiolnih grupa kod starih pacova. Azot-monoksid (NO) je visoko difuzabilan molekul, brzo prolazi kroz ćelijske membrane i ima ulogu biološkog signala u mnogim fiziološkim procesima, kao što su vazodilatacija, inhibicija agregacije trombocita, neurotransmisija, imuni odgovor. Smatra se da NO deluje Doktorska disertacija Tamara Popović 97 kao antioksidans jer štiti ćeliju od agenasa koji indukuju oksidativni stres. Azot-monoksid može u patofiziološkim procesima reagovati sa kiseonikom i superoksid-anjon-radikalom, pri čemu nastaju reaktivne kiseonično-azotne vrste koje su moćni oksidujući agensi sa citotoksičnim delovanjem. Na mestima povećane produkcije NO i O2.- stvara se peroksinitrit (ONOO-). Pri protonovanju peroksinitrita nastaje peroksinitritna kiselina (ONOOH) koja vrlo lako disosuje na OH. i NO2- koji su odgovorni za toksične efekte ONOO-. Posledice delovanja peroksinitrita su reakcije oksidacije i nitrovanja biomolekula. Joni prelaznih metala katalizuju heterolitičko cepanje ONOOH pri čemu nastaje OH- i NO2+ (nitronijum katjon), koji izaziva nitrovanje aromatičnih molekula, a supstrat je često tirozinski ostatak. U našem eksperimentu odreñivana je koncentracija nitrita u plazmi i u jetri, koja je indikator količine cirkulišućeg NO. Suplementacija n-3 PUFA dovodi do smanjenja koncentracija cirkulišućih nitrita i u plazmi i u jetri, kod pacova obe ispitivane starosne dobi. Smanjenje koncentracija cirkulišućeg NO, kao i superoksid-anjon-radikala (povećana aktivnost SOD) u plazmi i jetri starih pacova kao i u plazmi mladih pacova, smanjuje verovatnoću nastanka peroksinitrita, kao i pomenutih redoks vrsta koje nastaju po njegovom protonovanju. Poredeći kontrolne grupe životinja značajno niže koncentracije nitrita (p<0.01) prisutne su kod kontrolne grupe starih pacova, dok je aktivnost SOD povišena (p<0.05) kod kontrolne grupe u jetri mladih životinja. Mnogobrojne studije (Esterbauer 1993, Aviram 1996, Heinecke 2003) bavile su se ulogom oksidativnog stresa u patogenezi ateroskleroze, medju kojima su oksidativna modifikacija LDL, hiperfunkcija trombocita, imunosupresija. Faktori oksidativnog stresa, kao što su povišen nivo holesterola, poremećaj odnosa apolipoproteina, hipertenzija, dijabetes, bubrežna insuficijencija, čine LDL čestice podložnijim za oksidaciju. Nativni LDL podleže oksidativnoj modifikaciji uz pomoć aktiviranih oksigenaza, da bi zatim bio preuzet od strane makrofaga i neutrofilnih ćelija kod kojih oksidativni stres podstiče proces lipidne peroksidacije. To dovodi do poremećaja u metabolizmu holesterola u ćelijama zida arterija, agregaciju oksidovanih lipidnih čestica i pojavu aterosklerotičnih lezija. Proces je kontrolisan sa enzimima antioksidativne zaštite, koji imaju ulogu sprečavanja širenja oksidativnog stresa. HDL molekuli učestvuju u zaštiti od oksidativne modifikacije LDL molekula, koji indukuju ćelije zida arterijskih krvnih sudova na proizvodnju Doktorska disertacija Tamara Popović 98 proinflamatornih molekula. Epidemiološke studije kao i kliničke studije sugerišu da n-3 PUFA kao i unos alfa-linoleinske kiseline kao prekursora n-3 imaju značajnu ulogu u prevenciji CHD i ateroskleroze (Harper and Jacobson 2001). PUFA unos, takoñe, redukuje sintezu triglicerida u jetri (Nestel 1990, Brown 1999), inhibicijom masnokiselinske sinteze de novo i stimulacijom oksidacije masnih kiselina (Nestel, 1998). Efekti PUFA na sintezu triglicerida povezani su sa smanjenjem gojaznosti i adipoznog tkiva (Bremer, 2001). Dakle, PUFA ispoljavaju pozitivne efekte na lipidni metabolizam (Vecera, 2003). U skladu sa ovim rezultatima, naši rezultati su pokazali da se kod mladih pacova snižavaju koncentracije plazma triglicerida, dok se kod starih pacova tretmanom ribljim uljem značajno snižavaju vrednosti ukupnog holesterola. LDL- holesterol se snižava kod tretiranih životinja obe starosne dobi. Rezultati PON1 aktivnosti, po suplementaciji, su pokazali pozitivnu korelaciju PON1 sa HDL-om, negativnu sa LDL-om čime se sprečava oksidacija LDL-holesterola, faktora rizika nastanka ateroskleroze. Kod mladih pacova korelacija PON1 aktivnosti po suplementaciji postojala je i u jetri (p<0.01) i u plazmi (p<0.001), a kod starih u plazmi (p<0.05). U kontrolnim grupama pozitivna korelacija PON1 i sa HDL-om prisutna je u plazmi. Aktivnost PON1 veća je kod kontrolne grupe mladih pacova (p<0.001) u odnosu na kontrolnu grupu starih pacova. U studiji Downer i sar, (2005) koja se bavi matematičkim modelovanjem , konstatovano je da je parametar ukupne LDH aktivnosti više uziman u obzir a ne izoenzimska zastupljenost. Pri odreñenim brzim promenama u energetskom metabolizmu postoji značajan fiziološki efekat procentualne izoenzimske zastupljenosti odreñenog tkiva tako da je fiziološki značaj odreñivanja izoenzimskih oblika i praćenje njihove zastupljenosti pri ovakvim promenama značajan (Quistorff, 2011). Procentualna zastupljenost izoenzimskih oblika LDH u plazmi mladih i starih pacova tretiranih ribljim uljem pokazuje značajnu promenu. Procentualna zastupljenost LDH1 oblika je značajno povišena (p<0.05), dok je LDH5 izoenzimski oblik značajno snižen (p<0.05) kod mladih pacova tretiranih ribljim uljem u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Procentualna zastupljenost LDH2, značajno se povećava (p<001), posle tretmana ribljim uljem kod starih pacova, dok se procentualna zastupljenost LDH3 (p<0.05), LDH4 (p<0.01) i LDH5 (p<0.001) smanjuje u odnosu na kontrolnu grupu životinja. Doktorska disertacija Tamara Popović 99 Usled oštećenja ćelijske membrane u procesu peroksidacije lipida i promene u njenoj permeabilnosti dolazi do ,,curenja" mnogih enzima citosola u ekstracelularni prostor. Na osnovu aktivnosti enzima može se utvrditi stepen oštećenja pojedinih organa. Jedan od takvih enzima je i laktat dehidrogenaza (LDH). Nalazi se u citoplazmi a prilikom oštećenja lako prelazi u ekstracelularni prostor tako da se njena aktivnost povećava u krvnoj plazmi. LDH katalizuje reakciju pretvaranja piruvata u laktata uz pomoć NADH/NAD+. Pri niskim koncentracijama kiseonika piruvat se u mišićima prevodi u laktat, koji preuzima jetra. Smanjenje LDH5 izoenzimskog oblika ide u prilog činjenici da riblje ulje dovodi do smanjenja oštećenja ćelijskih membrana hepatocita i kod starih i kod mladih pacova. Sniženje LDH5 predstavlja adaptaciju hepatocita na nove uslove prolongirane suplementacije ribljim uljem. Sumarno, kao što je pomenuto ROS predominantno uzrokuju ćelijska oštećenja, imaju i ulogu signalnih molekula i učestvuju u intracelularnoj regulaciji. ROS interferiraju sa ekspresijom gena i signalnim transdukcionim putevima. Oni utiču na redoks status i mogu izazvati pozitivne odgovore (ćelijska proliferacija), ali i negativne (ćelijska smrt). Igraju ulogu sekundarnih mesindžera, kao što je regulacija Ca2+ citosolne koncentracije, regulacija proteinske fosforilacije, aktivacija odreñenih transkripcionih faktora kao što su NF-kB i AP-1 familija faktora. ROS inhibiraju fosfolipidne fosfataze, interaguju sa sulfhidrilnim grupama na cisteinskim ostatcima. Ove strukturne promene menjaju proteinsku konformaciju koja vodi ushodnoj regulaciji nekoliko signalnih kaskada, kao što su scr7abl kinaza, MAPK i PI3 kinaza zavisni signalni putevi. Ove signalne kaskade vode aktivaciji nekoliko redoks-regulišućih transkripcionih faktora (AP-1, NF-kB, p53, HIF-1, NFAT). Doktorska disertacija Tamara Popović 100 VI ZAKLJUČAK Efekat tretmana ribljim uljem na masnokiselinske profile fosfolipida i parametre oksidativnog stresa u krvi i jetri ispitan je na pacovima Wistar soja različite starosne dobi (mladim pacovima od tri meseca i starim pacovima od 22 meseca). U grupi mladih pacova sadržaj holesterola, HDL-holesterola i triglicerida u plazmi bio je značajno viši u odnosu na grupu starih pacova. Dobijene vrednosti mogu biti posledica bržeg metaboličkog “turnover-a” kod grupe mladih u odnosu na grupu starih pacova. Ostali biohemijski parametri nisu se razlikovali izmeñu ove dve kontrolne grupe. Tretman pacova ribljim uljem, koje je sadržalo eikozapentaensku (EPA, 20:5 n-3) i dokozoheksaensku kiselinu (DHA, 22:6 n-3) u iznosu od 32,85 % i 20,70 %, respektivno, trajao je od šest nedelja. Efekat suplementacije ribljim uljem kod pacova različite starosne dobi na biohemijske parametre krvi Kod obe starosne grupe životinja tretman ribljim uljem doveo je do povećanja sadržaja HDL-holesterola i mokraćne kiseline, a do smanjenja sadržaja LDL-holesterola u plazmi, kako u odnosu na početak tretmana, tako i u odnosu na kontrolnu grupu. Kod mladih pacova tretman je doveo je do smanjenja koncentracije triglicerida u odnosu na početak tretmana, a kod starih pacova je doveo do sniženja holesterola i u odnosu na početak tretmana i u odnosu na kontrolnu grupu. Može se zaključiti da tretman ribljim uljem smanjuje rizik od ateroskleroze i ima kardioprotektivni efekat. Kod mladih pacova ispoljava hipotrigliceridni efekat, a kod starih hipoholesterolemijski. Povećanje koncentracije mokraćne kiseline, kao endogenog antioksidanta, kod pacova obe starosne dobi ide u prilog antioksidativnog delovanja ribljeg ulja. Efekti suplementacije ribljim uljem na masnokiselinske profile fosfolipida plazme kod pacova različite starosne dobi U netretiranim grupama pacova različite starosne dobi utvrñene su razlike u masnokiselinskim profilima fosfolipida plazme. Starenjem se povećava sadržaj stearinske, linolne kiseline, arahidonske i ukupnih n-6 masnih kiselina, a opada nivo MUFA i oleinske kiseline. Doktorska disertacija Tamara Popović 101 Tretman ribljim uljem kod pacova obe starosne dobi, u odnosu na kontrolne grupe, dovodi da se u fosfolipidima plazme povećava sadržaj stearinske kiseline, eikozapentaenske kiseline i dokozapentaenske kiseline, a smanjuju sadržaj arahidonske kiseline i procenjene vrednosti aktivnosti ∆4 i ∆5 desaturaza. Dakle, kod obe starosne grupe povećanje zastupljenosti EPA i DHA u fosfolipidima su direktno posledica suplementacije ribljim uljem. U fosfolipidima plazme mladih pacova (u odnosu na kontrolnu grupu) pri tretmanu ribljim uljem smanjuje se procentna zastupljenost linolne kiseline, a povećava zastupljenost oleinske kiseline, MUFA i ukupnih n-3 masnih kiselina, što za posledicu ima snižavanje odnosa n-6/n-3 masnih kiselina. Dodatno povećanje sadržaja oleinske kiseline kod mladih tretiranih pacova (u odnosu na kontrolnu grupu) može se smatrati pozitivnim efektom imajući u vidu njena kardioprotektivna svojstva, pozitivne efekte na stanje krvnih sudova i endotela. Kod starih Wistar pacova u fosfolipidima plazme pri tretmanu ribljim uljem povećava se sadržaj linolne kiseline i dihomo-γ-linolenske kiseline. Promena u sadržaju dihomo-γ-linolenske kiseline, koja je prekursor PGA1 prostaglandin-familije, može uticati na sprečavanje agregacije trombocita, snižavanje krvnog pritiska, smanjenje zapaljenskih procesa i utiče na balans izmeñu zastupljenosti PGA1 i PGA2 familije eikozanoida. Efekti suplementacije ribljim uljem kod pacova različite starosne dobi na masnokiselinske profile fosfolipida jetre Značajne promene u masnokiselinskim profilima fosfolipida jetre nañene su kod netretiranih starih u odnosu na mlade pacove Wistar soja. Procentna zastupljenost linolne, α-linolenske, dihomo-γ-linolenske i ukupnih n-6 masnih kiselina bila je povećana, dok je zastupljenost palmitinske kiseline, dokozaheksaenske kiseline i ukupnih n-3 masnih kiselina bila smanjena. Dakle, starenjem se smanjuje ukupni sadržaj n-3 masnih kiselina, a time i značajno povećava odnos n-6/n-3, što je za organizam nepovoljno. Tretman ribljim uljem kod pacova obe starosne dobi, u odnosu na kontrolne grupe, doveo je do povećanja sadržaja linolne, eikozapentaenske, dokozapentaenske i ukupnih n-3 masnih kiselina u fosfolipidima jetre. Sa druge strane, sadržaj arahidonske i ukupnih n-6 masnih kiselina je smanjen, kao i odnos n-6/n-3. Suplementacija je dovela i do smanjenja Doktorska disertacija Tamara Popović 102 procenjenih vrednosti aktivnosti ∆4 i ∆5 desaturaza i elongaza. Sve navedeno dokazuje da tretman ribljim uljem dovodi do poboljšanja masnokiselinskih profila fosfolipida jetre. Razlike u odgovoru na tretman starih i mladih pacova ribljim uljem odnose se na zastupljenost pojedinačnih masnih kiselina u fosfolipidima jetre, ali i na zastupljenost ukupnih masnih kiselina. Tako je kod mladih pacova došlo do povećanja zastupljenosti α- linolenske i dihomo-γ-linolenske kiseline, a kod starih palmitinske i vakcenske kiseline, u odnosu na odgovarajuće kontrolne grupe. Sadržaj ukupnih MUFA u fosfolipidima jetre se povećao pri tretmanu mladih pacova, dok kod starih dolazi do povećanja zastupljenosti SFA i PUFA. Ovakve razlike samo dopunjavaju u manjoj ili većoj meri već pomenuto protektivno delovanje ribljeg ulja. Efekat suplementacije ribljim uljem na parametre oksidativnog stresa u krvi pacova različite starosne dobi Analiza parametara oksidativnog stresa u krvi kontrolnih grupa različite starosne dobi pokazala je da se srednje vrednosti aktivnosti SOD, CAT i sadržaja MDA u eritrocitima ne menjaju sa starenjem. Razlika izmeñu starosnih kontrolnih grupa nañena je za sadržaj nitrita u plazmi, koji je kod mladih pacova bio niži u odnosu na grupu starih pacova, i paraoksonaze čija je aktivnost bila povećana. Veće razlike u parametrima oksidativnog stresa kod kontrolnih grupa pacova različite starosne dobi dobijene su pri njihovom odreñivanju u tkivu jetre. U ćelijama jetre starih pacova niža je aktivnost SOD (kao i koncentracija nitrita), i veći je nivo lipidne peroksidacije u odnosu na grupu mladih pacova. Tretman ribljim uljem kod pacova obe starosne dobi doveo je do značajnog povećanja aktivnosti SOD, CAT i paraoksonaza u krvi, u odnosu na odgovarajuće kontrolne grupe, kao i do smanjene lipidne peroksidacije i koncentracije plazma cirkulišućih nitrita. Samo kod starih pacova došlo je i do povećanja količine slobodnih tiol-grupa, u odnosu na kontrolnu grupu, čime je antioksidativni kapacitet plazme u tretmanu značajno povećan. Studije sa animalnim modelima omogućavaju ispitivanja efekata suplementacije u organima. Efekat tretmana ribljim uljem na parametre oksidativnog stresa u jetri pacova obe starosne dobi bio je sličan postignutom u krvi za stepen lipidne peroksidacije i sadržaj Doktorska disertacija Tamara Popović 103 nitrita, koji su značajno sniženi u odnosu na odgovarajuće kontrolne grupe. Bolji tkivni antioksidativni odgovor u tretmanu nañen je kod starih pacova, jer je došlo do značajnog povećanja aktivnosti CAT, SOD i količine tiol-grupa, dok se aktivnost paraoksonaza statistički značajno smanjila u odnosu na kontrolnu grupu. Može se zaključiti da riblje ulje ima protektivni antioksidativni efekat, odnosno da se tretmanom ribljim uljem mogu izbeći oksidativna oštećenja koja doprinose starenju. Doktorska disertacija Tamara Popović 104 VII LITERATURA Aguiló A, Tauler P, Fuentespina E, Tur JA, Córdova A, Pons A. Antioxidant response to oxidative stress induced by exhaustive exercise. Physiol Behav. 2005; 31; 84(1):1-7. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984; 105:121-6. Alexender J. W. Immunonutrition: the role of omega 3 fatty acids. Nutrition. 1998; 14, 627–633. Alexeyev MF. Is there more to aging than mitochondrial DNA and reactive oxygen species? FEBS J. 2009; 276(20):5768-87. Ames B.N., Schigenaga, M.K. and Park, E.M. DNA damage by endogenous oxidants as a cause of aging and cancer. In “oxidative damage and repair: chemical, biological and medical aspects”, ed. (K.J.A.Davies), Pergamon Press, New York, 1991; 181-187. Amusquivar E, Rupérez FJ, Barbas C, Herrera E. Low arachidonic acid rather than alpha- tocopherol is responsible for the delayed postnatal development in offspring of rats fed fish oil instead of olive oil during pregnancy and lactation. J Nutr. 2000; 130(11):2855-65. Anderson BM and Ma D WL. Are all n-3 polyunsaturated fatty acids created equal. Lipids in Health and Disease 2009; 8:33 Araya J, Rodrigo R, Videla LA, Thielemann L, Orellana M, Pettinelli P, Poniachik J.Increase in long-chain polyunsaturated fatty acid n - 6/n - 3 ratio in relation to hepatic steatosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Clin Sci (Lond). 2004; 106 (6):635-43. Archer S. Measurement of nitric-oxide in biological models. FASEB J. 1993; 7:349-360. Arsić A., Prekajski N, Vučić V, Tepšić J, Popović T, Vrvić M, Glibetić M. Milk in human nutrition: comparison of fatty acid profiles. Acta Veterinaria. 2009; 59: 569–578. Arterburn, L. M., Hall E. B, Oken, H. Distribution, interconversion, and dose response of n–3 fatty acids in humans. Am J Clin Nutr. 2006; 83: 1467S–1476S. Atessahin A, Karahan I, Pirincci I. Effects of phenobarbital on serum and liver paraoxonase and arylesterase actvities in rats. Turk J Vet Anim Sci. 2004; 28: 363-367. Aviram M. Interaction of oxidized low density lipoprotein with macrophages in atherosclerosis, and the antiatherogenicity of antioxidants. Eur Clin Chem Clin Biochem. 1996; 34(8):599-608. Review. Doktorska disertacija Tamara Popović 105 Barbosa DS, Cecchini R, El Kadri MZ, Rodríguez MA, Burini RC, Dichi I. Decreased oxidative stress in patients with ulcerative colitis supplemented with fish oil omega-3 fatty acids. Nutrition. 2003; 19(10):837-42. Badry A M E, Fraf R, Clavien P A. Omega3-omega 6: What is right for the liver? J Hepatol. 2007; 47:718-725. Baroni G S (14) A Model of Insulin Resistance and Nonalcoholic Steatohepatitis in Rats Role of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor and n-3 Polyunsaturated Fatty Acid Treatment on Liver Injury. The American Journal of Pathology, 2006; 169: 3 Bauer JH, Morris SN, Chang C, Flatt T, Wood JG, Helfand SL. dSir2 and Dmp53 interact to mediate aspects of CRdependent life span extension in D. melanogaster. Aging. 2009; 1: 3848. Bagga D.,Wang, L, Farias-Eisner R, Glaspy J, A Reddy S. T.: Differential effects of prostaglandin derived from omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids on COX-2 expression and IL-6 secretion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States 2003; 100: 1751–1756. Barnett YA, King CM. An investigation of antioxidant status, DNA repair capacity and mutation as a function of age in humans. Mutat Res. 1995; 338(1-6):115-28. Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem. 1971;44(1):276-87. Beckman J S, Beckman T W, Chen J, Marshall P A, Freeman BA. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990; 87(4):1620-4. Benatti P, Peluso G, Nicolai R, Calvani M. Polyunsaturated fatty acids: biochemical, nutritional and epigenetic properties. J Am Coll Nutr. 2004; 23(4):281-302. Review. Benzie IF, Strain J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Anal Biochem. 1996;15,239(1):70-6. Berge R. K, Madsen L, Vaagenes H, Tronstad K J, Gottlicher M, and. Rustan A. C, BJ 1990; 343: 191–197. Bergendi, L, Benes L, Durackov ,Ferencik, M. Chemistry,physiology and pathology of free radicals. Life Sci. 1999; 65: l965-1974. Doktorska disertacija Tamara Popović 106 Berger NA. Polly (ADP-ribose) in the cellular responses to DNA damage. Radiat.Res. 1985; 101:4-15. Blagosklonny M.V et al. (36). Impact papers on aging in 2009. Aging. 2010; 2(3):111- 121. Review. Bloom M, Evans E, Mouritsen OG. Physical properties of the fluid lipid- bilayer component of cell membranes: a perspective. Q Rev Biophys. 1991; 24(3):293-397. Review. Bonkowski MS, Dominici FP, Arum O, Rocha JS, Al Regaiey KA, Westbrook R, Spong A, Panici J, Masternak MM, Kopchick JJ, Bartke A. Disruption of growth hormone receptor prevents calorie restriction from improving insulin action and longevity. PLoS One 2009; 4: e4567. Borges F, Fernandes E, Roleira, F. Progress towards the discovery of xanthine oxidase inhibitors. Cun. Med. Chem. 2002; 9:195-217. Bremer J. The biochemistry of hypo- and hyperlipidemic fatty acid derivatives: metabolism and metabolic effects. Prog Lipid Res. 2001;40(4):231-68. Breslow J l. Human apolipoprotein molecular biology and genetic variation. Ann. Rev. Biochem. 1985; 54: 699-727. Breslow J L n-3 Fatty acids and cardiovascular disease Am J Clin Nutr 2006; 8:1477S– 82S Brigelius R. Mixed disulfides: bilogical functions and increase in oxidative stress, In : „Oxidative stress“ ed. (H. Sies). Academic Press, New York 1985; 243-271. Brindle N P, Zammit VA, Pogson C. I. Regulation of carnitine palmitoyltransferase activity by malonyl-CoA in mitochondria from sheep liver, a tissue with a low capacity for fatty acid synthesis. Biochem J. 1985; 232: 177–182. Brown AM, Castle J, Hebbachi AM, Gibbons GF. Administration of n-3 fatty acids in the diets of rats or directly to hepatocyte cultures results in different effects on hepatocellular ApoB metabolism and secretion. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999;19(1):106-14. Brown JM, Grosso MA, Terada LS, Beehler CJ, Toth KM, Whitman GJ, Harken AH, Repine JE. Erythrocytes decrease myocardial hydrogen peroxide levels and reperfusion injury. Am J Physiol. 1989; 256(2 Pt 2):H584-8. Doktorska disertacija Tamara Popović 107 Brown DA, London E: Structure and function of sphingolipid and cholesterol-rich membrane rafts. J Biol Chem 2000, 275(23):17221-17224. Brown, M S and Goldstein J L, How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis. Sci.Am. 1984; 251(5):58-66. Butterfield A, MirandaL, Lange,B, Sultana R, involvements of lipid peroxidation product HNEin the pathogenesis and progression of Alzheimer disease, Biochimica and biophysia acta, 2010; 1801(8): 924-9. Review. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity. Annu. Rev. Biochem. 1989; 58: 79-110. Calviello G, Palozza P, Franceschelli P, and. Bartoli G. M, Lipids.1997; 32: 1075–1083. Carr A, McCall M R, Frei B. Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species-reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscl Thromb Vasc Biol. 2000; 20: l716-1723. Carrano AC, Liu Z, Dillin A, Hunter T. A conserved ubiquitination pathway determines longevity in response to diet restriction. Nature 2009; 460: 396-399. Caramori PR, Zago AJ. Endothelial dysfunction and coronary artery disease. Erq Bras Cardiol 2000; 75: 173-182. Caro AA, Cederbaum AI. Role of cytochrome P450 in phospholipase A2- and arachidonic acid-mediated cytotoxicity. Free Radic Biol Med. 2006; 1,40(3):364-75. Carpetier Y, Portois L, Sener A, and Malaisse W Y. Correlation between liver and plasma fatty acids profile of phospholipids and triglycerides in rats. Int J Mol Med. 2008; 22: 255– 262. Ceballos-Picot I, Trivier J M, Nicole A, Sinet P M, Thevenin M. Age-correlated modifications of copper-zinc superoxide dismutase and glutathione-related enzyme activities in human erythrocytes. Clin Chem. 1992; 38(1):66-70. Chapman C, Maternal and early dietary FA intake: Changes in lipid metabolism and liver enzymes in adults rats. J.Nutr. 2000; 130:146-151. Charlton –menys and Durrington. Human cholesterol metabolism and therapeutic molecules. Exp Physiol. 2008; 93(1): 27-42. Doktorska disertacija Tamara Popović 108 Chiueh, C C. Neuroprotective properties of nitric oxide. Ann.N.Y. Acad. Sci. 1999; 890: 301-311. Christopherson SW, Glass RL. Preparation of milk fat methyl esters by alcoholysis in a essentially nonalcoholic solution. Journal of dairy science 1969; 52:1289-1290. Cimen, M Y. Free radical metabolism in human erythrocytes. Clin Chim Acta.2007, 390: 1-11. Close G L, Ashton T, McArdle A, Maclaren D P. The emerging role of free radicals in delayed onset muscle soreness and contraction-induced muscle injury. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2005;142 (3):257-66. Cohen, G. Monoamine oxidase, hydrogen peroxide and Parkinson’s disease, In „Advances in Neorology“, eds. (M. D. Yahr and K. J. Bergman), Raven Press, New York, 1986; 119- 125. Cohen D E, Supinski A M, Bonkowski M S, Donmez G, Guarente LP. Neuronal SIRT1 regulates endocrine and behavioral responses to calorie restriction. Genes Dev. 2009; 23: 28122817. Colavitti R, Pani G, Bedogni B, Anzevino R, Borrello S, Waltenberger J, Galeotti T J. Reactive oxygen species as downstream mediators of angiogenic signaling by vascular endothelial growth factor receptor-2/KDR. Biol Chem. 2002. 1, 277(5):3101-8. Cotgreave I A, Moldeus P. and Orrenius S. Host biochemical defense mechanisms against prooxidants. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1988; 28, 189-212. Cross A R and Jones OTG. Enzymatic mechanisms of superoxide production. Biochim. Biophys. Acta Bio- Energetics, 1991; 1057: 281-298. Cynamon HA, Isenberg JN, Nguyen CH.A rapid method for erythrocyte membrane phospholipid determination.Clin Chim Acta. 1984; 144(1):65-70. Dargel R, Lipid peroxidation- a common pathogenic mechanism. Exp. Toxicol. Pathol. 1991; 44: 169-181. Davidson MH: Mechanisms for the hypotriglyceridemic effect of marine omega-3 fatty acids. Am J Cardiol. 2006; 98: 27i-33i. Doktorska disertacija Tamara Popović 109 De Coursey TE, and Ligeti E. Regulation and termination of NADPH oxidase activity. Cell. Mol. Life. 2005; 62:2173-2193. De Grey A D N J. HO2. -The forgotten radical. DNA Cell Biol.2002; 2l: 25l-257. Dement E J, Richieri G V, and Kleinfeld A M. Biochem. J. 2002; 63:809– 815. Demoz A, Willumsen N, Berge RK. Eicosapentaenoic acid at hypotriglyceridemic dose enhances the hepatic antioxidant defense in mice. Lipids. 1992; 27(12):968-71. Devchand PR, Keller H, Peters JM, Vazquez M, Gonzalez FJ, Wahli W. The PPARalpha- leukotriene B4 pathway to inflammation control. Nature 1996; 384(6604):39-43. Dowhan, W, Bogdanov M.Functional roles of lipids in membranes. In: Biochemistry of lipids, lipoproteins, and membranes (4th edition Elsevier Science,Vance D.E and Vance J.E, 2002; 1-35. Downer J, Sevinsky JR, Ahn NG, Resing KA, Betterton MD. Incorporating expression data in metabolic modeling: a case study of lactate dehydrogenase. J Theor Biol. 2006; 7,240(3):464-74. Droge W.Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function, Physiol.Rev. 2002; 82: 47-95. Edman U, Garcia AM, Busuttil RA, Sorensen D, Lundell M, Kapahi P, Vijg J. Lifespan extension by dietary restriction is not linked to protection against somatic DNA damage in Drosophila melanogaster. Aging Cell 2009; 8: 331-338. Ehringer W, Belcher D, Wassall SR, Stillwell W. A comparison of the effects of linolenic (18:3 omega-3) and docosahexaenoic (22:6 omega-3) acids on phospholipid bilayers. Chem Phys Lipids 1990; 54(2):79-88. El-Badry AM, Graf R, Clavien PA. Omega 3 – Omega 6: What is right for the liver? Journal of Hepatology 2007; 47: 718–725. Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. 1959; 82(1):70-7. EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergens (NDA). Scientific Opinion on Dietary Reference Values for fats, including saturated fatty acids, polyunsaturated fatty acids, monounsaturated fatty acids, trans fatty acids, and cholesterol. EFSA Journal 2010; 8:1461. Doktorska disertacija Tamara Popović 110 Epel ES, Merkin SS, Cawthon R, Blackburn EH, Adler NE, M.J. P, Seeman TE. The rate of leukocyte telomere shortening predicts mortality from cardiovascular disease in elderly men. Aging. 2009; 1: 81-88. Erdogan H, Fadillioglu E, Ozgocmen S, Sogut S, Ozyurt B, Akyol O, Ardicoglu O.Effect of fish oil supplementation on plasma oxidant/antioxidant status in rats. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2004; 71(3):149-52. Esterbauer H, Wäg G, Puhl H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. Br Med Bull. 1993; 49(3): 566-76. Review. Evereklioglu C, Er H, Doganay S, Cekmen M, Turkoz Y, Otlu B, Ozerol E. Nitric oxide and lipid peroxidation are increased and associated with decreased antioxidant enzyme activities in patients with age-related macular degeneration. Doc Ophthalmol. 2003; 106 (2):129-36. Fan YY, McMurray DN, Ly LH, Chapkin RS. Dietary (n-3) polyunsaturated fatty acids remodel mouse T-cell lipid rafts. J Nutr. 2003; 133(6):1913-1920. Fan YY, Ly LH, Barhoumi R, McMurray DN, Chapkin RS: Dietary docosahexaenoic acid suppresses T cell protein kinase C theta lipid raft recruitment and IL-2 production. J Immunol 2004; 173(10):6151-6160. Farzaneh-Far R, Lin J, Epel E S,. Harris W S,. Blackburn E H, P, and. Whooley M A. Association of Marine Omega-3 Fatty Acid Levels With Telomeric Aging in Patients With Coronary Heart Disease JAMA. 2010; 20, 303(3): 250. Fenton H J H. Oxidation of tartaric acid in the presence of iron. J. Chem. Soc. 1984; 65, 899-910. Finkel T. Oxidant signals and oxidative stress. Current opinion in cell biology. 2003; 15: 247-54. Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 1957; 226(1):497-509. Doktorska disertacija Tamara Popović 111 Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem. 1972; 18(6): 499-502. Fridovich I. The biology of oxigen radicals. Science 1978; 201: 875-880. Fridovich I. Superoxide dismutase: an adaptation to a paramagnetic gas. J Biol Chem. 1989; 264: 7761-4. Froyland L, Vaagenes H, Asiedu D K, Garras A, Lie O, and Berge R K, Lipids.1996; 31:169–178. Gianni P, Jan K J, Douglas M J, Stuart P M, Tarnopolsky M A.Oxidative stress and the mitochondrial theory of aging in human skeletal muscle. Exp Gerontol. 2004;39 (9):1391- 400. Giudetti A M, Beynen A C, Lemmens A G, Gnoni G V, Geelen M J. Hepatic fatty acid metabolism in rats fed diets with different contents of C18:0, C18:1 cis and C18:1 trans isomers. Br J Nutr. 2003; 90(5):887-93. Giudetti AM, Sabetta S, di Summa R, Leo M, Damiano F, Siculella L, Gnoni GV.Differential effects of coconut oil- and fish oil-enriched diets on tricarboxylate carrier in rat liver mitochondria. J Lipid Res. 2003; 44(11):2135-41. Ghafourifar P, Cadenas E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol. Sci. 2005; 26(4): 190-195. Goldstein IM, Ostwald P, Roth S. Nitric oxide: a review of its role in retinal function and disease. Vision Res. 1996; 36(18):2979-94. Grandison R C, Piper M D, Partridge L. Aminoacid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature 2009; 462: 1061-1064. Greenberg M E, Li X M, Gugiu B G, Gu X, Qin J, Salomon R G, Hazen S L.The lipid whisker model of the structure of oxidized cell membranes. J Biol Chem. 2008; 283(4):2385-96. Doktorska disertacija Tamara Popović 112 Guachalla L M, Ju Z, Koziel R, von Figura G, Song Z, Fusser M, Epe B, JansenDırr P, Rudolph K L. Sod2 haploinsufficiency does not accelerate aging of telomere dysfunctional mice. Aging 2009; 1: 303315. Guevara I, Iwanejko J, Dembińska-Kieć A, Pankiewicz J, Wanat A, Anna P, Gołabek I, Bartuś S, Malczewska-Malec M, Szczudlik A. Determination of nitrite/nitrate in human biological material by the simple Griess reaction. Clin Chim Acta. 1998; 22,274(2):177-88. Gunstone F D. Fatty Acid Structure. In: The Lipid Handbook.London: Chapman and Hall. 1994; 1-19. Gunstone F D. High resolution 13C NMR. A technique for the study of lipid structure and composition. Prog Lipid Res. 1994; 33(1-2):19-28. Gutteridge J M, Quinlan G J.Antioxidant protection against organic and inorganic oxygen radicals by normal human plasma: the important primary role for iron-binding and iron- oxidizing proteins. Biochim Biophys Acta. 1993;1156(2):144-50. Halliwell B, Gutteridge J M C. Free Radicals in Biology and Medicine, third ed.Oxford University Press, New York. 1999. Halliwell B. and Gutteridge, J M C. Free radicals in biology and medicine, New York, Oxford University Press, 1989; 1-543. Halliwell B. How the characterize a biological antioxidant. Free Rad. Res. Comms. 1990; 9: 1-32, Halliwell B, Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement,and significance. Am J Ctin Nutr. 1993; 57, (5):715 S -7245 Harman D. "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry." J Gerontol. 1956; 11(3): 298-300. Harper CR and Jacobson T A: The fats of life. The role of omega-3 fatty acids in the prevention of CHD. Arch Intern Med. 2001; 161: 2185-2191. Harrison D E, Strong R, Sharp Z D, Nelson J F, Astle C M, Flurkey K, Nadon N L, Wilkinson J E, Frenkel K, Carter C S, Pahor M, Javors M A, Fernandezr E, Miller R A. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogenous mice. Nature. 2009;460:392-396. Doktorska disertacija Tamara Popović 113 Harth S, Dreyfus H, Urban PF, Mandel P. Direct thin-layer chromatography of gangliosides of total lipid extracts. Anal Biochem. 1978; 86: 543-551. Heinecke J W. Oxidative stress: new approaches to diagnosis and prognosis in atherosclerosis. Am J Cardiol. 2003; 6, 91(3A):12A-16A. Hegardt F G. Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl- CoA synthase: a control enzyme in ketogenesis. Biochemical Journal. 1999; 338 (Pt 3): 569–582. Holub DJ, Holub BJ.Omega-3 fatty acids from fish oils and cardiovascular disease. Mol Cell Biochem. 2004 Aug;263(1-2):217-25. Review. Hsu H C, Lee Y T, Chen M F. Effects of fish oil and vitamin E on the antioxidant defense system in diet-induced hypercholesterolemic rabbits. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2001; 66(2):99-108. Hynes G R, Heshka J, Chadee K, and Jones P J, J. Lipid Res. 2003; 44: 893–901. Igarashi M, Ma L K, Chang J, Bell M, and Rapoport S I, J.Lipid. Res. 2008; 49: 1735– 1745. Isenberg T, Knauer H, Schauer A, Buttner S, Ruckenstuhl C, CarmonaGutierrez D, Ring J, Schroeder S, Magnes C, Antonacci L, Fussi H, Deszcz L, Hartl R, Schraml E, Criollo A, Megalou E, Weiskopf D, Laun P, Heeren G, Breitenbach M, GrubeckLoebenstein B, Herker E, Fahrenkrog B, Frohlich KU, Sinner F, Tavernarakis N, Minois N, Kroemer G, Madeo F. Induction of autophagy by spermidine promotes longevity. Nat Cell Biol. 2009; 11: 1305-1314. Iwata K, Shimazu M, Wakabayashi G, Ohshima A, Yoshida M, Kitajima M. Intraportal perfusion of prostaglandin E1 attenuates hepatic postischaemic microcirculatory impairments in rats. J Gastroenterol Hepatol 1999; 14:634–641. Jackson M J, Edwards R H, Symons M C. Electron spin resonance studies of intact mammalian skeletal muscle. Biochim Biophys Acta. 1985; 20,847(2):185-90. Jackson M J, O'Farrell S. Free radicals and muscle damage. Br Med Bull. 1993;49(3):630-41. Doktorska disertacija Tamara Popović 114 Jang YC, Remmen V H. The mitochondrial theory of aging: insight from transgenic and knockout mouse models. Exp Gerontol. 2009; 44(4): 256-60. Jen C, Buison A, Pellizzon M, Ordiz F, Santa Ana L, and Brown J. Exp. Biol. Med. 2003;228: 843–849. Jenkins R R. Free radical chemistry. Relationship to exercise. Sports Med. 1988; 5(3):156-70. Johnson R M, Goyette G J, Ravindranath Y, Ho Y S. Hemoglobin autoxidation and regulation of endogenous H2O2 levels in erythrocytes. Free Radic Biol Med. 2005; 1,39 (11):1407-17. Kakhlon O. and Cabantchik, Z L. The labile iron pool: Characteization,measurement, and participation in cellular processes. Free Radic. Biol. Med. 2002; 33,1037-1046. Kawai Y, Fujii H, Okada M. Tsuchie Y, Uchida K, and.Osawa T, J. Lipid. Res. 2006; 47: 1387–95. Kent C. Eukaryotic phospholipids biosynthesis. Annual Review Biochemistry.1995; 64, 315-343, Kerner J, Hoppel C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. 2000; 1486. 1–17. Klemola P, Freese R, Jauhiainen M, Pahlman R, Alftan G, Mutanen M. Dietery determinants of serum paraoxonase activity in healthy humans. Atherosclerosis. 2002; 160: 425-432. Kim H J, Miyazaki M, Man W C, Ntambi J M. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) as regulators of lipid metabolism: polyunsaturated fatty acids oppose cholesterol-mediated induction of SREBP-1 maturation. Annals of New York Academy of Sciences 2002; 967: 34–42. Kim K H, López-Casillas F, Bai D H, Luo X, Pape M E. Role of reversible phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase in long-chain fatty acid synthesis. FASEB J. 1989;3(11):2250-6. Review Doktorska disertacija Tamara Popović 115 Koshland D E. The molecule of the year. Science. 1992; 258:186l. Krummer S, Thiermann H, Worek, F, Eyer, P. Equipotent cholinesterase reactivation in vitro by the nerve agent antidotes HI 6 dichloride and HI 6 dimethanesulfonate. Arch Toxicol. 2002;76: 589–595. Kume N, Murase T, Moriwaki H, Aoyama T, Sawamura T, Masaki T, Kita T. Inducible expression of lectin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells. Circ Res. 1998; 83(3): 322-7. Lansing M W, Mansour E, Ahmed A, Cortes A, Garcia L, Lauredo I T, Wanner A, Abraham W M. Lipid mediators contribute to oxygen-radical-induced airway responses in sheep. Am Rev Respir Dis. 1991; 144(6):1291-6. Larsson K, Quinn P J. Occurrence and Characteristics of Oils and Fats. In: The Lipid Handbook. London: Chapman and Hall. 1994; 47-223. Lauretani F, Maggio M, Pizzarelli F, Michelassi S, Ruggiero C, Ceda G P, Bandinelli S, Ferrucci L. Omega-3 and renal function in older adults. Curr Pharm Des. 2009; 15(36):4149-56. Lee J, Koo N, Min D B. ROS, aging and antioxidative nutraceuticals. Comprehens Rev Food Sci Food Safety. 2004; 3:21-33. Lee S, Gura K M, Puder M. Omega-3 fatty acids and liver disease. Hepatology 2007;45:841–845. Leigh-Firbank EC, Minihane A M, Leake, D S Wright, J W, Murphy M C Griffin B A, and Wiliams C M. BJN. 2002; 87: 435–445. Lemaitre R N, King I B, Mozaffarian D, Kuller L H, Tracy R P, Siscovick D S. n-3 polyunsaturated fatty acids, fatal ischemic heart disease, and nonfatal myocardial infarction in older adults: the Cardiovascular Health Study. Am J Clin Nutr. 2003; 77(2): 319-25. Leonarduzzi G, Chiarpotto E, Biasi F, Poli G. 4-Hydroxynonenal and cholesterol oxidation products in atherosclerosis. Mol Nutr Food Res. 2005; 49(11):1044-9. Doktorska disertacija Tamara Popović 116 Levitan E B, Wolk A, and Murray A. Mittleman Fatty fish, marine omega-3 fatty acids, and incidence of heart failure. Eur J Clin Nutr. 201 ; 64(6): 587–594 Li Li Ji. Antioxidants and oxidative stress in exercise. P.S.E.B.M. 1999; 222: 283-292. Lykkesfeldt J, Svendsen O. Oxidants and antioxidants in disease: oxidative stress in farm animals. Vet J. 2007; 173 (3): 502-511. Review. Lo C J, Terasaki M, Garcia R, Helton S. Fish oil-supplemented feeding does not attenuate warm liver ischemia and reperfusion injury in the rat. J Surg Res. 1997; 7 1:54–60. Lopez Jimenez J A, Bordoni A, Hrelia S, Rossi C A, Turchetto E, Zamora Navarro S, et al. Evidence for a detectable delta-6-desaturase activity in rat heart microsomes: aging influence on enzyme activity. Biochem Biophys Res Commun. 1993; 192:1037–1041. Lowry N. J, Rosebrough, A. L. Farr, and R. J. Randall. Folin-phenol protein quantification method of O. H.. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275. Lukiw W J. and. Bazan N G. Docosahexaenoic Acid and the Aging Brain J. Nutr. 2008; 138: 2510–2514. Ma D W. Lipid mediators in membrane rafts are important determinants of human health and disease. Appl Physiol Nutr Metab. 2007; 32(3): 341-350. Macfarlane D P, Forbes S, Walker B R. Glucocorticoids and fatty acid metabolism in humans: fuelling fat redistribution in the metabolic syndrome. J Endocrinol. 2008; 197(2):189-204. Maidt M L. and Floyd R A. Measurement of products of free radical attack on nucleic acids. In: “Free Radicals: A practical approach “, eds. (N.A. Punchard and F.J. Kelly), I.R.L. press and Oxford University. 1996 ; 201-209. Mackness M, Arrol S, Abbot C, Durrington P N: Protection of low density lipoprotein against oxidative modification by high density lipoprotein associated paraoxonase. Atherosclerosis. 1993; 104: 129-135. Doktorska disertacija Tamara Popović 117 Marra C A, de Alaniz M J, Brenner R R. Effect of various steroids on the biosynthesis of arachidonic acid in isolated hepatocytes and HTC cells. Lipids. 1988; 23:1053–1058. Margaritis I, Palazzetti S, Rousseau A S, Richard M J, Favier A. Antioxidant supplementation and tapering exercise improve exercise-induced antioxidant response. J Am Coll Nutr. 2003; 22(2): 147-56. Marklund S L, Holme E, Hellner L. Superoxide dismutase in extracellular fluids. Clin Chim Acta. 1982; 126(1): 41-51. McGarry J D, Woeltje K F, Kuwajima M, Foster D W. Regulation of ketogenesis and the renaissance of carnitine palmitoyltransferase. Diabetes/Metabolism Reviews 1989; 5: 271– 284. McIntyre M, Bohr D F, Dominiczak A F. Endothelial function in hypertension: the role of superoxide anion. Hypertension. 1999;34(4 Pt 1): 539-45. Mead J F. The metabolism of the essential fatty acids. Am J Clin Nutr 1958; 6:656-61. Mead J F. The metabolism of polyunsaturated fatty acids. In: Holman RT, editor. Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids. Oxford: Pergamon Press. 1971; 161-89. Mecocci P, Polidori M C, Troiano L, Cherubini A, Cecchetti R, Pini G, Straatman M, Monti D, Stahl W, Sies H, Franceschi C, Senin U. Plasma antioxidants and longevity: a study on healthy centenarians. Free Radic Biol Med. 2000; 28(8):1243-8. Melo José Ulisses de Souza, TCBC-CEI; Jefferson Menezes Viana SantosII; samu de Sandes KimuraII; ManoelMessias Campos JúniorIII; Radamés Bezerra MeloIV; Paulo Roberto Leitão de Vasconcelos.V Effects of fatty acids on liver regeneration in rats. Rev. Col. Bras Cir. 2010; 37: 5. Melov S. Animal models of oxidative stress, aging, and therapeutic antioxidant nterventions. Int J Biochem Cell Biol. 2002; 34(11):1395-400. Review. Miller W L, Bose H S. Early steps in steroidogenesis: intracellular cholesterol trafficking. J Lipid Res.2011; 52(12): 2111-35. Review. Doktorska disertacija Tamara Popović 118 Mitasikova M, Smidova S, Mascsaliova A, Knezi V, Dlugosova K, Okruhlicova B, Weismann P, Tribulova N. Aged Male and Female Spontaneosly hypertensive rats benefit from n-3 polyunsaturated fatty acids supplementation. Physiol.Res. 2008; 57(2),S39-48. Movat H Z. The inflammatory reaction, Amsterdam, Oxford: Elsevier Scientific Publication. 1985. Morris D, Kisly A, Stoyka C G, Provenzano R. Spontaneous bilateral renal artery occlusion associated with chronic atrial fibrillation. Clin Nephrol.1993; 39(5):257-9. Mukul D, Ansari K M., Dhawan A, ShuklaY, Khanna, S K: Correlation of DNA damage in epidemic dropsy patients to carcinogenic potential of argemone oil and isolated sanguinarine alkoloid in mice. Int J Cancer. 2005; 117(5):709-17 Muller F L, Lustgarten M S, Jang Y, Richardson A, Van Remmen H. Trends in oxidative aging theories. Free Radic Biol Med. 2007; 43(4):477-503. Medeiros L C, Liu Y W, Park S, Chang P H, Smith AM. Insulin, but not estrogen, correlated with indexes of desaturase function in obese women. Horm Metab Res. 1995; 27:235–238. Nelson D L, Cox M M. Lipid Biosynthesis. In: Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman and Company. 2005;787-815. Nelson D L, Cox M M. Biological Membranes and Transport.In: Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman and Company. 2005; 369-420. Nestel P J. Effects of n-3 fatty acids on lipid metabolism: Annu Rev Nutr. 1990; 10; 149- 167. Nestel P J. Fish oils, lipids and coronary artery disease. In: Atherosclerosis XI. B Jacotot, D Mathe, J C Fruchart, Elsevier science Singapure. 1998; 195-200. Oram J F. HDL- apolipoproteins and ABCA1: partners in the removal of excess cellular cholesterol. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003; 1;23(5):720-7.Review. Doktorska disertacija Tamara Popović 119 Palozza P, Sgarlata E, Luberto C, Piccioni E, Anti M, Marra G, Armelao F, Franceschelli P, Bartoli GM. n-3 fatty acids induce oxidative modifications in human erythrocytes depending on dose and duration of dietary supplementation. Am J Clin Nutr. 1996; 64(3):297-304. Pan D A, and Storlien L H, J. Nutr. 1993; 123: 512–519. Pandey K B, Rizvi S I, Markers of oxidative stress in erythrocytes and plasma during aging in humans. Oxid Med Cell Longev. 2010; 3(1): 2-12. Peet M, Brind J, Ramchand CN, Shah S, Vankar GK. Two double-blind placebo- controlled pilot studies of eicosapentaenoic acid in the treatment of schizophrenia. Schizophr Res. 2001;49:243-251. Pérez V I, Van Remmen H, Bokov A, Epstein C J, Vijg J, Richardson A. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 2009; 8: 73-75. Percy C, Pat B, Poronnik P, Gobe G. Role of oxidative stress in age-associated chronic kidney pathologies. Adv Chronic Kidney Dis. 2005; 12(1):78-83. Review. Perica MM, Delas I. Essential fatty acids and psychiatric disorders. Nutr Clin Pract. 2011;26:409-425. Petkau A. Scientific basis for the clinical use of superoxide dismutases. Cancer Treatment. 1986; 13: 17-44. Petrowsky H, McCormack L, Trujillo M, Selzner M, Jochum W, Clavien P A. A prospective, randomized, controlled trial comparing intermittent portal triad clamping versus ischemic preconditioning with continuous clamping for major liver resection. Ann Surg. 2006; 244:921–928. Pizato N, Bonatto S, Yamazaki R K, Aikawa J, Nogata C, Mund R C, Nunes E A, Piconcelli M, Naliwaiko K, Curi R, Calder P C, Fernandes L C. Ratio of n6 to n-3 fatty Doktorska disertacija Tamara Popović 120 acids in the diet affects tumor growth and cachexia in Walker 256 tumor-bearing rats. Nutr Cancer. 2005; 53(2):194-201. Prinz W A. Non –vesicular sterol transport in cells. Prog Lipid Res. 2007; 46(6): 297-314. Pristerá A, Okuse K. Building excitable membranes: lipid rafts and multiple controls on trafficking of electrogenic molecules. Neuroscientist. 2012 ;18(1):70-81. Popović T, Ranić M, Predrag Bulajić,P, Milićević M Arsić A Vučić V, and Glibetić M. Effects of n-3 Fatty Acids Supplementation on Plasma Phospholipids Fatty Acid Composition in Patients with Obstructive Jaundice- a Pilot Study. 2009; 49 (3): 370-375. Popović T, Borozan S, Arsić , Debeljak-Martačić J,Vučić V, de Luka S, Milovanović I, Trbović A, and Glibetić M. Effects of n–3 Supplementation on Plasma and Liver Phospholipid Fatty Acids Profile in Aged Wistar Rats. Croat. Chem. Acta. 2011; 84 (1): 73–79. Pryor W A, Houk K N, Foote C S, Fukuto J M, Ignarro L, Squadrito G L, Davies K J. Free radical biology and medicine: it's a gas, man! Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2006; 291(3): R491-511. Review. Pullen D L, Liesman J S, Emery R S. A species comparison of liver slice synthesis and secretion of triacylglycerol from nonesterified fatty acids in media. Journal of Animal Science. 1990; 68: 1395–1399. Quistorff B, Grunnet N, The isoenzyme pattern of LDH does not play a physiological role except perhaps during fast transitions in energy metabolism. Aging. 2011; 3( 5): 457-460. Rasler M and Lehrach H. Building a new bridge between metabolism, free radicals and longevity. Aging; 2009; 1(10): 836-838. Reeves E P, Lu H, Jacobs H L, Messina C G, Bolsover S, Gabella G, Potma E O, Warley A, Roes J, Segal A W. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 2002; 21, 416(6878):291-7. Ridnour L A, Thomas, D D, Mancardi D, Espey M G, Miranda K M, Paolocci N.; The chemistry of nitrosative stress induced by nitric oxide and reactive nitrogen oxide species. Putting perspective on stressful biological situations. Biol. Chem. 2004; 385: 1-10. Doktorska disertacija Tamara Popović 121 Ristić-Medić D, Ristić G, Tepsić V, and Ristić G N. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 2003; 49: 367–374. Ristić V, Uticaj diazepama i alkohola na lipide krvne plazme i jetre kod pacova. Doktorska disertacija. Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Institut za medicinska istraživanja, 1991; 3-35. Rizvi S I, Jha R, Maurya P K. Erythrocyte plasma membrane redox system in human aging. Rejuvenation Res. 2006; 9(4):470-4. Rojas C, Cadenas S, Pérez-Campo R, López-Torres M, Pamplona R, Prat J, Barja G. Relationship between lipid peroxidation, fatty acid composition, and ascorbic acid in the liver during carbohydrate and caloric restriction in mice. Arch Biochem Biophys. 1993; 306(1):59-64. Rossner P J, Terry M B, Gammon M D, Agrawal M, Zhang F F, Ferris J S, Teitelbaum S L, Eng S M, Gaudet M M, Neugut A I, Santella R M. Plasma protein carbonyl levels and breast cancer risk. J Cell Mol Med. 2007;11 (5):1138-48. Ruiz-Gutierrez V, Perez-Espinosa A, Maria Vazquez C and Santa-Maria C. Effects of dietary fats (fish, olive and high-oleic-acid sunflower oils) on lipid composition and antioxidant enzymes in rat liver. British Journal of Nutrition.1999; 82: 233-241. SACN (Scientific Advisory Committee on Nutrition) Committee on Toxicity. Advice on fish consumption: benefits and risks. London: The Stationary Office; 2004. Sanz A, Pamplona R, Barja G. Is the mitochondrial free radical theory of aging intact?Antioxid Redox Signal. 2006; 8(3-4):582-99. Review. Sarsilmaz M, Songur A, Ozyurt H, Kuş I, Ozen OA, Ozyurt B, Söğüt S, Akyol O. Potential role of dietary omega-3 essential fatty acids on some oxidant/antioxidant parameters in rats' corpus striatum. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2003; 69(4):253-9. Scion Corp, 2007: Available at http://www.scioncorp.com (accessed June 20, 2007). Doktorska disertacija Tamara Popović 122 Schiavon R, De Fanti, E, Giavarina D, Biasioli S, Cavalcanti G, Guidi G. Serum paraoxonase activity is decreased in uremic patients. Clinica Chimica Acta. 1996; 247:71– 80. Schmocker C, Weylandt K H, Kahlke L, Wang J, Lobeck H, Tiegs G. Omega-3 fatty acids alleviate chemically induced acute hepatitis by suppression of cytokines. Hepatology 2007; 45:864–869. Schmitz G, Ecker J. The opposing effects of n-3 and n-6 fatty acids. Prog Lipid Res. 2008; 47(2):147-155. Schroeder F, Atshaves B P, McIntosh A L, Gallegos A M, Storey S M, Parr R D, Jefferson J R, Ball J M, Kier A B. Sterol carrier protein-2: new roles in regulating lipid rafts and signaling. Biochim Biophys Acta. 2007;1771(6):700-18. Review. Scott G. Antioxidants the modern elixir? Chem Britain. 1995; 31: 879-882. Schwartz C J, Valente A J, Sprague E A. A modern view of atherogenesis. Am J Cardiol. 1993 ;71(6): 9B-14B. Review. Sekine S, Kubo K, Tadokoro T, Saito M. Effect of Docosahexaenoic Acid Ingestion on Temporal Change in Urinary Excretion of Mercapturic Acid in ODS Rats. J Clin Biochem Nutr. 2007; 41(3):184-90. Selman C, McLaren J S, Meyer C, Duncan J S, Redman P, Collins A R, Duthie G G, Speakman J R. Life-long vitamin C supplementation in combination with cold exposure does not affect oxidative damage or lifespan in mice, but decreases expression of antioxidant protection genes. Mech Aging Dev. 2006; 127(12): 897-904. Sekiya M, Yahagi N, Matsuzaka T, Najima Y, Nakakuki M, Nagai R. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 2003; 38:1529–1539. Sies H. Oxidative stress, Oxidants and Antioxidants, New York, Academic Press. 1991. Sies H. Oxidative stress: Introductory remarks. In „Oxidative Stress“, ed. (H. Sies), Academic Press, New York. 1-8, 1985. Singh A. Introduction: Interconversing of singlet oxygen and related species. Photochem. Pathobiol. 1978; 28: 429-433. Doktorska disertacija Tamara Popović 123 Singh M. Essential fatty acids, DHA and human brain. Indian J Pediatr. 2005;72:239-242. Simon J A, Hodgkins M L, Browner W S, Neuhaus J M, Bernert J T, Hulley S B. Serum fatty acids and the risk of coronary heart disease. Am J Epidemiol. 1995;1,142(5): 469-76. Simopoulos A P. Essential fatty acids in health and chronic diseases. Forum Nutr 2003; 56:67–70. Simopoulos A P. Evolutionary aspects of omega-3 fatty acidsin the food supply. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1999; 60:421-9. Sinclair S, Levy G. Eicosanoids and the liver. Ital J Gastroenterol. 1990; 22:205–213. Sigal E. The molecular biology of mammalian arachidonic acid metabolism. Am J Physiol. 1991 ; 260(2 Pt 1): L13-28. Review. Slater T F. Free radicals and tissue injury: fact and fiction. Br J Cancer Suppl. 1987; 8:5- 10. Sözmen E Y, Kerry Z, Uysal F, Yetik G, Yasa M, Ustünes L, Onat T. Antioxidant enzyme activities and total nitrite/nitrate levels in the collar model. Effect of nicardipine. Clin Chem Lab Med. 2000; 38(1):21-5. Stadtman E R. Role of oxidant species in aging. Curr. Med.Chem. 2004; 11:1105-1112. Stahl A. Pflugers. Arch. 2004; 447: 722–727. Stock T L, Dormandy T L. The autoxidation of human red cell lipids induced by hydrogen peroxide. Brit J Haematol. 1971; 20: 95–111. Tauler P, Sureda A, Cases N, Aguiló A, Rodríguez-Marroyo J A, Villa G, Tur J A, Pons A. Increased lymphocyte antioxidant defences in response to exhaustive exercise do not prevent oxidative damage. J Nutr Biochem. 2006; 17(10): 665-71. Tentori L, Salvati A M. Hemoglobinometry in human blood. Methods Enzymol. 1981; 76:707-15. Tepsić V, Pavlović M, Ristić-Medić D, Ristić V, Lekić N, Tepsić J, Debeljak Martačić J, Miličević M, Glibetić M. Acta Vet- Beograd. 2008; 58: 33–41. Doktorska disertacija Tamara Popović 124 Teran-Garcia M, Adamson AW, Yu G, Rufo C, Suchankova G, Dreesen TD, et al. Polyunsaturated fatty acid suppression of fatty acid synthase (FASN): evidence for dietary modulation of NF-Y binding to the Fasn promoter by SREBP-1c. Biochem J 2007; 402:591–600. Tietz, , Textbook of Clinical Chemistry, Third Edition, Amazon, 1996. Traverso N, Menini, S Pesce Maineri E, Patriarca S., Odetti, Cottalsso D., Marinari U M, Adelaide M Pronzato. Malondialdehyde, a lipoperoxidation-derived P aldehyde, can bring about secondary oxidative damage to proteins. Journal of Gerontology. 2004; 59A(9): 890- 895. Traverso N, Stefano M, Maineri, E P, Patriarca S, Odetti P, Cottalasso D, Umberto M, Marinari, I Pronzato A. Malodiadehide, a lipid peroxidation-derived aldehide can bring about secondary oxidative damage to proteins. Journal of gerontology: biological sciences. 2004;59A(9): 890-895. Tribulova N, Okruhlicova Ľ, Imanaga I, Hirosawa N, Ogava K, Weismann P. Factors involved in the susceptibility of spontaneously hypertensive rats to low K+-induced arrhytmias. Gen Physiol Biophys. 2003; 22: 369-382. Trostchansky A, Batthyány C, Botti H, Radi R, Denicola A, Rubbo H. Formation of lipid- protein adducts in low-density lipoprotein by fluxes of peroxynitrite and its inhibition by nitric oxide. Arch Biochem Biophys. 2001; 395(2): 225-32. Tvrzicka E, Kremmyda L S, Stankova B, Zak A. Fatty acids as biocompounds: their role in human metabolism, health and disease--a review. Part 1: classification, dietary sources and biological functions. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2011; 155 (2):117-30. Urena M A, Ruiz-Delgado F C, Gonzalez E M, Segurola C L, Romero C J, Garcia I G, Gonzalez-Pinto J, Gonez-Sanz R. Assessing risk of the use of livers with macro and microsteatosis in a liver transplant program. Transplant Proc. 1998; 30(7): 3288–3291. Doktorska disertacija Tamara Popović 125 Valko M, Izakovic M, Mazur M, Rhodes C J, Telser J. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. Mol Cell Biochem. 2004; 266:37-56. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin M T , Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease, The Int J Biochem Cell Biol. 2007; 39(1): 44-84. Review. Valko M, Rhodes C J, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact. 2006; 160(1):1-40. Van Raamsdonk J M, Hekimi S. Deletion of the mitochondrial superoxide dismutase sod2 extends lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet 2009; 5(2): e1000361. Van Remmen H, Ikeno Y, Hamilton M, Pahlavani M, Wolf N, Thorpe S R, Alderson N L, Baynes J W, Epstein C J, Huang T T, Nelson J, Strong R, Richardson A. Life-long reduction in MnSOD activity results in increased DNA damage and higher incidence of cancer but does not accelerate aging. Physiol Genomics. 2003;16 (1):29-37. Vaughan J H.The Epstein-Barr virus and systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 1997; 15,100(12): 2939-40. Vecera R, Skottová N, Vána P, Kazdová L, Chmela Z, Svagera Z, Walterá D, Ulrichová J, Simánek V.Physiol Res. Antioxidant status, lipoprotein profile and liver lipids in rats fed on high-cholesterol diet containing currant oil rich in n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. 2003; 52(2):177-87. Vorbach C, Harrisofl R, & Capecchi M R. Xanthine oxidoreductase is central to the evolution and function of the innate immune system. Trends Immunol. 2003; 24:512-517. Doktorska disertacija Tamara Popović 126 Wakutsu M, Tsunoda N, Shiba S, Muraki E, Kasono K Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)-independent functions of fish oil on glucose and lipid metabolism in diet-induced obese mice. In Health and Disease 2010, 9:101. Walczewska A, Dziedzic B, Stepien T, Swiatek E, Nowak D. Effects of dietary fats on oxidative-antioxidative status of blood in rats. JCBN. 2010; 47: 18-16. Wang Y, Branicky R, Stepanyan Z, Carroll M, Guimond M P, Hihi A, Hayes S, McBride K, Hekimi S. The antineurodegeneration drug clioquinol inhibits the aging associated protein CLK1. J Biol Chem. 2009; 284: 314-323. Wang Y, Botolin D, Christian B, Busik J, Xu J, and. Jump D B, J. Lipid. Res. 2005; 46:706–715. Weiss S J. Oxigen, ischemia and inflammation. Acta Physiol. Scand. 1986; 548: 9-37. Wiegman C H, Bandsma R H, Ouwens M, van der Sluijs F H, Havinga R, Boer T, Reijngoud D J, Romijn J A, Kuipers F. Hepatic VLDL production in ob/ob mice is not stimulated by massive de novo lipogenesis but is less sensitive to the suppressive effects of insulin. Diabetes. 2003; 52, 1081–1089. Wu G, Fang Y Z, Yang S, Lupton J R, Turner N D. Glutathione metabolism and its implications for health. J Nutr. 2004; 134(3):489-92. Yamamoto T, Shimano H, Inoue N, Nakagawa Y, Matsuzaka T, Takahashi A, Yahagi N, Sone H, Suzuki H, Toyoshima H, Yamada N. Protein Kinase A suppresses SREBP-1c expression via phosphorylation of LXR in the liver. J Biol Chem. 2007; 282: 11687– 11695. Doktorska disertacija Tamara Popović 127 Yancey P G, Kawashiri M A, Moore R, Glick J M, Williams D L, Connelly M A, Rader D J, Rothblat G H. In vivo modulation of HDL phospholipid has opposing effects on SR-BI- and ABCA1-mediated cholesterol efflux. J Lipid Res. 2004; 45(2):337-46. Yang K, Fang J L, Hemminki K. Abundant lipophilic DNA adducts in human tissues. Mutat Res. 1998; 422(2):285-95. Yoshida M, Takakuwa Y. Method for the simultaneous assay of initial velocities of lactate dehydrogenase isoenzymes following gel electrophoresis. J Biochem Biophys Methods. 1997; 34(3):167-75. Zuin A, Casteliiano D. Living on the edge:stress and activation of stress responces promote lifespan extension,(25). Aging. 2010; 2(4), 231-235. Doktorska disertacija Tamara Popović 128 BIOGRAFIJA Tamara B. Popović roñena je 19.03.1972. godine u Beogradu. Osnovnu i srednju školu završila je u Beogradu. Na Hemijskom fakultetu, odseku biohemija, diplomirala je 1999. godine. Specijalistički rad odbranila je 2002 godine, a magistarsku tezu 2005 godine na Hemijskom fakultetu. Tamara B. Popović je od januara 2000.godine zaposlena na Institutu za Medicinska istraživanja Univerziteta u Beogradu, kao istraživač-saradnik. Koautor je 15 radova u meñunarodnim časopisima i većeg broja radova saopštenih na meñunarodnim i domaćim naučnim skupovima.