UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Milena R. Simić Anelacije heterocikličnih jedinjenja i njihova primena u sintezi prirodnih proizvoda Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Milena R. Simić Annulations of heterocyclic compounds and their application in synthesis of natural compounds Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. Mentori: Dr Vladimir Savić, redovni profesor Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu Dr Vele Tešević, vanredni profesor Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu Članovi komisije: Dr Vladimir Pavlović, redovni profesor Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu Dr Veselin Maslak, docent Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu Dr Miroslava Stanković, naučni saradnik JP „Nuklearni objekti Srbije” Datum odbrane doktorske disertacije:_______________________ Ova doktorska disertacija urañena je na Katedri za organsku hemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu i u Centru za hemiju IHTM-a u Beogradu. Temu rada predložili su mentori dr Vladimir Savić, redovni profesor i dr Vele Tešević, vanredni profesor. Zahvaljujem se mentorima na pomoći tokom izrade i pisanja ove doktorske disertacije, kao i članovima komisije dr Vladimiru Pavloviću, dr Veselinu Maslaku i dr Miroslavi Stanković na korisnim savetima i sugestijama. NMR i tečno-maseni spektri snimani su u Centru za hemiju IHTM-a, tako da se zahvaljujem dr Nini Todorović, Dejanu Vučetiću, Milki Jadranin, dr Ivanu Vučkoviću i svim ostalim kolegama na pomoći. Za izradu bioloških testova zahvaljujem se dr Miroslavi Stanković, dr Zorici Juranić i Ani Damjanović sa Instituta za onkologiju i radiologiju, kao i dr Jeleni Antić-Stanković sa Farmaceutskog fakulteta. Veliku pomoć u prikupljanju literature pružili su mi dr Goran Petrović i Stanimir Popović. Takoñe se zahvaljujem kolegama sa Katedre za organsku hemiju mr Gordani Tasić, Jeleni Ranñelović, Milošu Petkoviću i Predragu Jovanoviću, kao i Bojanu Markoviću sa Katedre za Farmaceutsku hemiju. Svojoj porodici se zahvaljujem za neizmernu podršku i razumevanje. Autor Anelacije heterocikličnih jedinjenja i njihova primena u sintezi prirodnih proizvoda Rezime: Cilj ove doktorske teze bio je razvoj nove sinteze protoberberinskih derivata, policikličnih jedinjenja koja sadrže izohinolinski skelet. Protoberberini predstavljaju široko rasprostranjenu, važnu grupu izohinolinskih alkaloida. Zahvaljujući njihovim izraženim farmakološkim osobinama interes za ovu grupu jedinjenja je u stalnom porastu. Novi sintetski put koji omogućuje pristup različitim klasama protoberberina baziran je na dobijanju zajedničkog intermedijera, 1,3-diena izohinolinske strukture. Diels-Alderovom reakcijom sa različitim dienofilima i oksidacijom nastalih cikloadukata omogućena je instalacija prstena C u različitim oksidacionim stanjima kao i dodatnih supstituenata potrebnih za funkcionalizaciju prstena D protoberberina. Na ovaj način dobijene su dve vrste skeleta prirodnih proizvoda, tetrahidroprotoberberinski i oksoprotoberberinski. Ova sintetska metodologija pokazala se primenljivom i na dihidro-β-karbolin i piridin. Alkaloidi koji su derivati β-karbolina su jedinjenja koja pokazuju veoma širok spektar bioloških aktivnosti, tako da postoji interes za razvoj metodologije za funkcionalizaciju ovog heterocikličnog jedinjenja. Polazeći od dihidro-β-karbolina, preko odgovarajućeg intermedijernog 1,3- diena, dobijene su dve klase jedinjenja, ketojobirinska i dihidrogambirtaninska. Piridin se takoñe pokazao pogodnim za ovu vrstu anelacija, pri čemu su dobijene benzohinolizinske strukture, slične nekim biološki aktivnim jedinjenjima. Ispitivano je in vitro citotoksično dejstvo nekih sintetisanih izohinolinskih i β- karbolinskih derivata na maligne ćelijske linije (FemX, HeLa, K562). Najznačajniju citotoksičnu aktivnost od ispitivanih jedinjenja pokazao je izohinolinski cikloadukt 2.17 prema K562 ćelijama (IC50=24,7 µM) Pored ovoga, ispitivana je funkcionalizacija 1,3-dienskog sistema paladijumom katalizovanim reakcijama, što je omogućilo dobijanje alilnih acetata sa izohinolinskom i β-karbolinskom strukturom. Razvijen je i sintetski put za dobijanje različitih benzazepinskih derivata izohinolina, β-karbolina i piridina, a neka od dobijenih jedinjenja su pokazala značajni protektivni efekat na DNK humanih limfocita, veći nego komercijalni radioprotektivni agens amifostin. Pored toga, ispitano je in vitro citotoksično dejstvo nekih sintetisanih benzazepinskih derivata na tri maligne ćelijske linije (FemX, HeLa, K562). Vrednosti IC50 sintetisanih benzazepina prema navedenim ćelijskim linijama kreću se od 17,49- 74,70 µM. Ključne reči: alkaloidi, protoberberini, izohinolin, β-karbolin, sinteza, Diels- Alderova reakcija, citotoksičnost, antioksidativne osobine Naučna oblast: Hemija Uža naučna oblast: Organska hemija UDK: 547. Annulations of heterocyclic compounds and their application in synthesis of natural compounds Resume: The aim of this thesis was the development of a synthetic route for protoberberine derivatives, polycyclic compounds containing the isoquinoline skeleton. The protoberberines are widespread, important group of isoquinoline alkaloids. Due to the potent pharmacological properties they have attracted an attention from medicinal chemist and drug researchers. Our proposed synthetic route enabling access to different classes of protoberberines is based on a common intermediate, an isoquinolinic 1,3-diene. The incorporation of ring C in various oxidative states, as well as the incorporation of additional substituents necessary for the functionalisation of ring D of protoberberines was achieved through Diels-Alder reactions with different dienophiles and the subsequent oxidation of the resulting cycloadducts. Two types of natural products' skeletons, tetrahydroprotoberberines and oxoprotoberberines were efficiently synthesised using this approach. This synthetic methodology proved to be applicable in the preparation of dihydro-β-carbolines and pyridines. Alkaloids derived of β-carboline are important compounds with a broad spectrum of biological activities. Starting with dihydro-β-carboline, through the corresponding intermediary 1,3- diene, ketoyobirines and dihydrogambirtanines were obtained. Pyridine had also shown amenable to these types of annulations, giving benzoquinolizine structures. In vitro cytotoxic activity of some synthetised isoquinolines and β-carbolines was investigated (FemX, HeLa, K562). Cycloadduct 2.17 shows the greatest cytotoxic activity of the compounds tested, with IC50 value of 24,7 µM towards K562 cells. In addition to this, the possibility of functionalization of 1,3-diene system in Pd- catalysed reaction was also explored, enabling access to different allylic acetates with isoquinoline and β-carboline structure. A synthetic route to benzazepine derivatives of isoquinoline, β-carboline and pyridine was also developed and some of the compounds obtained have shown a substantial protective effect on the DNA of human lymphocites, surpassing that of a commercial radioprotective agent amifostine. In vitro cytotoxic activity against cancer cell lines some synthetised benzazepine was tested (FemX, HeLa, K562). IC50 Values of benzazepine derivatives range of 17,49-74,70 µM. Keywords: alkaloids, protoberberines, isoquinoline, β-carboline, synthesis, Diels-Alder reaction, cytotoxicity, antioxidative activity Academic Expertise: Chemistry Field of Academic Expertise: Organic chemistry UDK: 547. Skraćenice Ac acetil AIBN azo-bis-izobutironitril Ar aril Bn benzil Brd prošireni dublet brs prošireni singlet BuLi butil-litijum COSY homonuklearna H,H-korelisana 2D NMR spektroskopija DCM dihlormetan DCE dihloretan DDQ 2,3-dihlor-5,6-dicijano-1,4-benzohinon DEAD dietilazo-dikarboksilat DIBAH diizobutilaluminijum-hidrid DMAD dimetil-acetilen-dikarboksilat DMD dimetildioksiran DMF dimetil-formamid DMSO dimetil-sulfoksid δ hemijsko pomeranje ∆ zagrevanje d dublet dd dublet dubleta ddd dvostruki dublet dubleta dt dublet tripleta e.e. enantiomerni višak eq ekvivalent EI elektronska jonizacija Et etil ESI elektrosprej jonizacija HEPES 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin-etansulfonska kiselina HRMS maseni spektar visokog razlaganja HMBC heteronuklearna korelacija preko više veza HSQC heteronuklearna korelacija preko jednostrukih kvantnih prelaza Hz herc IC50 koncentracija supstance koja dovodi do 50 % manjeg preživljavanja ćelija in vitro IR infracrvena spektroskopija J konstanta kuplovanja LDA litijum-diizopropilamid m multiplet Me metil MeCN acetonitril MIC minimalna inhibitorna koncentracija MMC mitomicin C Mts 2,4,6-trimetilfenilsulfonil MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid NOE nuklearni Overhauserov efekat NOESY dvodimenzionalna NOE spektroskopija NPM N-fenilmaleimid ν frekvenca Ph fenil PHA fitohemaglutinin PPA polifosforna kiselina Py piridin q kvartet RPMI vrsta hranljive podloge (Roswell Park Memorial Institute) s singlet s. t. sobna temperatura TBDPS terc-butil-difenilsilil TBTH tributilkalajhidrid t-Bu terc-butil TFA trifluorsirćetna kiselina THF tetrahidrofuran TLC tankoslojna hromatografija TMS trimetilsilil Ts 4-metilfenilsulfonil (tozil) T.t. tačka topljenja Sadržaj 1. OPŠTI DEO..................................................................................................................1 1.1. Uvod............................................................................................................................1 1.2. Izohinolinski alkaloidi-osnovne strukturne karakteristike......................................2 1.2.1. Protoberberini: strukturne karakteristike....................................................3 1.2.2. Homoprotoberberini-osnovne strukturne karakteristike.............................5 1.2.3. Rasprostranjenost u prirodi i biološke osobine protoberberina i homoprotoberberina...................................................................................7 1.2.4. Sintetski derivati protoberberina i homoprotoberberina...........................10 1.2.5. Biosinteza protoberberina.........................................................................13 1.3. β-Karbolinski alkaloidi............................................................................................16 1.3.1. Strukturne karakteristike............................................................................16 1.3.2. Rasprostranjenost u prirodi i biološke osobine β-karbolinskih derivata..16 1.3.3. Sintetski derivati β-karbolinskih alkaloida................................................18 1.3.4. Biosinteza β-karbolinskih alkaloida..........................................................19 1.4. Sinteze policikličnih derivata izohinolina i β-karbolina........................................22 1.4.1. Zatvaranje prstena C protoberberina i homoprotoberberina...................23 1.4.1.1. Intramolekulska nukleofilna supstitucija....................................23 1.4.1.2. Mannichov pristup......................................................................23 1.4.1.3. Homoftalid-izohinolinski pristup................................................26 1.4.1.4. Nukleofilna adicija drugih anjona na imino vezu.......................28 1.4.1.5.Cikloadicione reakcije.................................................................30 1.4.1.6. Pictet-Spenglerova reakcija........................................................33 1.4.1.7. Reakcija sa oksalil-hloridom......................................................34 1.4.1.8. Ekspanzija prstena C..................................................................35 1.4.1.9. Pd-Katalizovane ciklizacije.........................................................36 1.4.1.10. Elektrofilna aromatična supstitucija.........................................37 1.4.1.11. Dieckmannova kondenzacija.....................................................38 1.4.2. Zatvaranje prstena B.................................................................................39 1.4.2.1. Intramolekulska nukleofilna supstitucija....................................39 1.4.2.2. Elektrofilna aromatična supstitucija...........................................42 1.4.2.3. Slobodno-radikalske reakcije......................................................44 1.4.3. Istovremeno zatvaranje B i C–transanulacija...........................................45 1.4.4. Zatvaranje prstena D.................................................................................46 1.4.4.1. Olefinska metateza......................................................................46 1.4.4.2. Dieckmannova kondenzacija.......................................................47 1.4.5. Istovremeno zatvaranje prstenova C i D-bicikloanulacije.......................48 2. NAŠI RADOVI............................................................................................................49 2.1. Uvod..........................................................................................................................49 2.2. Pristup sintezi protoberberinskog skeleta...............................................................49 2.3. Sinteza protoberberinskog skeleta...........................................................................54 2.3.1. Sinteza izohinolinskog diena......................................................................54 2.3.2. Diels-Alderove reakcije izohinolinskih diena............................................57 2.3.3. Oksidacioni procesi izohinolinskih cikloadukata......................................66 2.3.4. Pokušaj sinteze nuevaminskog skeleta.......................................................88 2.4. Sinteza policikličnih tetrahidro-β-karbolinskih derivata.......................................91 2.4.1. Sinteza tetrahidro-β-karbolinskog diena...................................................92 2.4.2. Diels-Alderove reakcije tetrahidro-β-karbolinskog diena.........................94 2.4.3. Oksidacioni procesi tetrahidro-β-karbolinskog cikloadukta.....................96 2.5. Sinteza benzohinolizinskih derivata......................................................................100 2.5.1. Sinteza hinolizinskog diena......................................................................101 2.5.2. Diels-Alderova reakcija hinolizinskog diena...........................................104 2.5.3. Oksidacioni procesi hinolizinskog cikloadukta.......................................105 2.6. Biološka ispitivanja sintetisanih protoberberinskih derivata...............................109 2.6.1. Ispitivanje citotoksične aktivnosti nekih sintetisanih protoberberinskih derivata..............................................................................................................109 2.7. Funkcionalizacije različitih dienskih sistema pomoću Pd-katalizovanih reakcija..............................................................................................................112 2.7.1. Sinteza alilnih acetata iz karbocikličnih diena........................................112 2.7.2. Sinteza alilnih acetata iz heterocikličnih diena.......................................115 2.8. Alternativni pristup sintezi protoberberinskog skeleta.........................................120 2.8.1. Sinteza tetrahidro-β-karbolinskog enamida kao dienofila......................120 2.8.2. Sinteza izohinolinskog enamida kao dienofila.........................................123 2.9. Sinteza homoprotoberberina i tetrahidro-β-karbolinskih analoga......................125 2.9.1. Sinteze izohinolinskih i tetrahidro-β-karbolinskih benzo[c]azepinskih derivata..................................................................................................126 2.9.2. Sinteza piridinskog benzo[c]azepinskog derivata...................................131 2.9.3. Sinteze izohinolinskih i tetrahidro-β-karbolinskih benzo[d]azepinskih derivata..................................................................................................134 2.10. Biološka ispitivanja sintetisanih benzazepinskih derivata.................................141 2.10.1. Antioksidativno dejstvo..........................................................................141 2.10.1.1. Ispitivanje antioksidativnog dejstva sintetisanih benzazepina............................................................................................141 2.10.2. Ispitivanje citotoksične aktivnosti sintetisanih benzazepina..................146 2.11. Sinteze pirolidinskih derivata..............................................................................148 3. EKSPERIMENTALNI DEO....................................................................................154 3.1. Opšti podaci............................................................................................................154 3.2. Eksperimentalni postupci i spektralni podaci.......................................................155 3.3. Biološki testovi.......................................................................................................207 3.3.1. In vitro ispitivanje citotoksičnog dejstva sintetisanih jedinjenja.............207 3.3.1.1. Pripremanje rastvora testiranih jedinjenja...............................207 3.3.1.2. Ćelijske kulture.........................................................................207 3.3.1.3. Detekcija ćelijskog preživljavanja............................................208 3.3.2. In vitro ispitivanje antioksidativnog dejstva sintetisanih benzazepina....208 4. ZAKLJUČAK............................................................................................................210 5. CONCLUSION.........................................................................................................213 6. LITERATURA..........................................................................................................216 7. PRILOG....................................................................................................................230 8. BIOGRAFIJA...........................................................................................................237 1 1. OPŠTI DEO 1.1. Uvod Izohinolinski i β-karbolinski alkaloidi, derivati heterocikličnih jedinjenja A i B (slika 1.1), predstavljaju velike grupe prirodnih proizvoda. Ove klase jedinjenja pokazuju širok spektar bioloških aktivnosti i predmet su proučavanja različitih oblasti hemije, biologije i drugih nauka. Neka jedinjenja ovog tipa prisutna su u biljkama koje se od davnina koriste u tradicionalnoj medicini, kao što su pripadnice familije Berberidaceae.1 N N H N Izohinolin β−karbolin A B Slika 1.1 2 1.2. Izohinolinski alkaloidi-osnovne strukturne karakteristike U „izohinolinske“ se ubrajaju sve vrste alkaloida koje kao zajedničku jedinicu grañe imaju izohinolinsko (A) ili tetrahidroizohinolinsko (C) jezgro (slika 1.2). Neka jedinjenja iz ove brojne grupe su prosti derivati izohinolina, kao što je O-metilkoripalin, dok je kod nekih struktura vrlo kompleksna, kao što je slučaj kod emetina i glikozidnog derivata tetrahidroberberina.2 N MeO MeO O-Metilkoripalin N MeO MeO H N H MeO OMe (-) Emetin N N H A C N MeO HO H O-Glc OH OH O Benzil berbin N-oksid Slika 1.2: Primeri različitih izohinolinskih alkaloida 3 1.2.1. Protoberberini: strukturne karakteristike Protoberberini predstavljaju veliku podgrupu izohinolinskih alkaloida, inače veoma rasprostranjenih u biljnom svetu.1,3 Do danas je izolovano i okarakterisano oko 150 protoberberina. Na slici 1.3 prikazana je osnovna struktura ove grupe alkaloida, kao i numeracija njenog skeleta. N A B C D R R N H1 2 3 4 5 6 8 9 10 13b 11 12 13 13a Slika 1.3: Numeracija berberinskog skeleta Alkaloidi ove vrste mogu imati prsten C u različitim stepenima oksidacije. Na slici 1.4 su prikazane takve strukture i njima odgovarajuća poznata jedinjenja. Kvaternarni protoberberini, ili berberini imaju aromatizovan prsten C i kvaternarni azot. Tetrahidroberberini ili berbini imaju hidrogenizovan prsten C, dok je kod dihidroberberina ovaj prsten delimično hidrogenizovan. Ako je u strukturi prisutna laktamska grupa, reč je o oksoprotoberberinima (8-oksoprotoberberini). Uobičajeni supstituenti u prstenima A i D su metilendioksi-, metoksi- ili hidroksi-grupa. Protoberberini sa nesupstituisanim prstenom D su retki. Prvi prirodni optički aktivni protoberberin bez supstituenata u prstenu D je gusanlung D, izolovan 1995. godine iz kineske biljke Arcangelisia gusanlung.4 Tipovi supstitucije koji se najčešće sreću kod protoberberina su u položajima C-2, C-3 i C-9, C-10, a nešto reñe su supstitiusani C-2, C-3 i C-10, C-11. Dodatna funkcionalna grupa sa kiseonikom se može naći u položajima C-1, C-4, C-5, C-8, kao i na azotu (N-oksidi). Najveći broj prirodnih tetrahidroprotoberberina ima (S)-konfiguraciju na C-13a i nastali su biosintetski od (1S)-tetrahidrobenzilizohinolina. 4 N N N O Protoberberini Tetrahidroprotoberberini (berbini) 8-Oksoprotoberberini N OMe OMe O O Berberin N H OH (−) Spinozin N O MeO MeO OMe OMe Oksopseudopalmatin OH N H O O Gusanlung D O MeO MeO Slika 1.4: Tipovi protoberberinskih struktura Kod nekih prirodnih protoberberina C-10 je zamenjen azotom, što je specifično za Alangium alkaloide. Najpoznatiji 10-azaprotoberberini su alangimarin i alamaridin, izolovani iz indijskog žbuna Alangium lamarckii (slika 1.5). 5 5 Bromovani alkaloidi protoberberinske strukture retko se sreću u prirodnim izvorima. Iz morskih sunñera Theonella sp. izolovan je teoneberin, tetrabrom derivat tetrahidroberberinske strukture (slika 1.5).6 Zanimljivo je da je prvi nitroalkaloid izolovan iz prirodnog izvora upravo protoberberinskog tipa. Iz Corydalis saxicola Bunting izolovan je 2005. godine 1- nitroapokavidin (slika 1.5). 7 N O O MeO HO NO2 H Nitroapokavidin N N O MeO HO Alangimarin N MeO HO Br Br OH OMe Br HO OMe Br H Teoneberin Slika 1.5: Neuobičajeni protoberberini 1.2.2. Homoprotoberberini−osnovne strukturne karakteristike Homoprotoberberini su strukturno slični protoberberinima. Oni su takoñe tetraciklični alkaloidi sa izohinolinskim jezgrom, dok je prsten C sedmočlan i može se naći u različitim oksidacionim stanjima. U zavisnosti od toga da li prstenovi C i D čine tetrahidrobenzo[c]azepinsku ili tetrahidrobenzo[d]azepinsku strukturu, razlikuju se dve vrste skeleta, C-homoprotoberberinski (homoberbinski) i izo-C-homoprotoberberinski (izo-C-homoberbinski) (slika 1.6). 6 tetrahidrobenzo[c]azepin NN NN A B C D A B C D 1 2 3 4 5 6 14 8 9 10 1112 13 14a 1 2 3 4 5 6 14 8 9 10 1112 13 14a C-Homoprotoberberin izo-C-Homoprotoberberin tetrahidrobenzo[d]azepin Slika 1.6: Tipovi skeleta homoprotoberberina Prvi poznati prirodni izo-C-homoprotoberberin, hediamin (slika 1.7), izolovan je iz vrste Berberis actinacantha, dok su saulatin i dihidrosaulatin izolovani iz biljke Abuta bullata. 8 N O O O OMe OMe Hediamin N OMe OMe O O Saulatin N OMe OMe O HO Dihidrosaulatin MeO MeO MeO MeO Slika 1.7: Primeri prirodnih homoprotoberberina 7 1.2.3. Rasprostranjenost u prirodi i biološke osobine protoberberina i homoprotoberberina Familije poznate po sadržaju protoberberinskih alkaloida su Berberidaceae, Ranunculaceae, Papavericeae, Fumariceae, Lauraceae, Menispermaceae i Rutaceae. 2 Biološko dejstvo alkaloida ove vrste je veoma različito i dosta ispitivano. U narodnoj medicini mnogih zemalja može se naići na primenu biljaka bogatim protoberberinima. Etanolni ekstrakt lukovice Corydalis turtschaninovii se dugo upotrebljava u korejskoj narodnoj medicini za lečenje čireva na želucu i dvanaestopalačnom crevu, dismenoreje, aritmije, reumatizma, a posebno je zanimljiva njegova primena za poboljšanje memorije. Poznato je da smanjenje nivoa acetilholina u mozgu predstavlja ključnu fazu u nastanku demencije. Inhibitori acetilholin esteraze povećavaju raspoloživost acetilholina, tako da se primenjuju u terapiji Alzheimerove bolesti. Analizom ekstrakta Corydalis turtschaninovii ustanovljeno je da sadrži 16 alkaloida berberinskog tipa koji imaju jače ili slabije izraženo antiamnezivno dejstvo. Pseudoberberin, pseudokoptizin i berberin (slika 1.8) su pokazali najjače inhibitorno dejstvo na acetilholin esterazu. Do sličnih rezultata se došlo i ispitivanjem etanolnih ekstrakta drugih biljaka primenjivanih za lečenje Alzheimerove bolesti. 10 Pseudokoptizin N O O OMe OMe Berberin N O O O O N O O OMe OMe Pseudoberberin Slika 1.8: Protoberberini sa antiamnezivnim dejstvom Rhizoma coptidis je dugo primenjivana u kineskoj narodnoj medicini kao lek protiv malarije, dismenoreje, dijabetesa, gihta, opekotina, bolesti bubrega. Analizom njenog ekstrakta ustanovljeno je da su aktivni sastojci palmatin, jatrorzin, koptizin i berberin. Jedno od najvažnijih bioloških aktivnosti protoberberina je njihova 8 citotoksičnost. Protoberberini grade nekovalentne komplekse sa DNK, pri čemu jačina vezivanja opada datim redosledom prikazanim na slici 1.9. S druge strane, najveću selektivnost prema sekvenci pokazuje berberin.11 Berberin i palmatin iz Berberis lycium su takoñe zaslužni za širok spektar biološkog dejstva ekstrakta ove biljke, ali posebno zanimljivo je inhibitorno dejstvo na ekspresiju proto-onkogenog ciklina D1. Naime, čist berberin, kao i butanolni ekstrakt biljke indukuju acetilovanje α-tubulina, tako da je berberin moćan antineoplastik. 12 N OMe OMe N O O O O KoptizinJatrorzin N OMe OMe Palmatin N O O Berberin MeO MeO HO MeO OMe OMe Slika 1.9: Citotoksični protoberberini Smesa alkaloida iz već pomenute Corydalis saxicola (Yan-Huang-Lian- Injection) registrovana je u Kini i primenjuje se u različitima terapijama, ali posebno je važno antitumorno dejstvo njenih sastojaka. Skulerin, tetrahidropalmatin (slika 1.10) i palmatin (slika 1.9) pokazuju značajno citotoksično dejstvo prema P-388, KB16, A549 i HT-29 ćelijskim linijama. Berberin je citotoksičan prema većini tumora ćelijskih linija uključujući ćelije hepatoma, leukemije, Hep-2 (kancer larinksa), MCF-2 (kancer dojke), MKN i SNU-5 (kanceri želuca). 13 N OMe OH H N OMe OMe H Skulerin Tetrahidropalmatin MeO MeO MeO HO Slika 1.10: Citotoksični tetrahidroprotoberberini 9 Pojava rezistencije prema antikancerogenim lekovima predstavlja veliki problem u terapiji tumora. Mehanizmi nastanka rezistencije mogu biti različiti, a posebnu ulogu u nastanku rezistencije igra P-glikoprotein (P-gp). U normalnim uslovima, on omogućuje eliminaciju toksina iz ćelije, dok mutacije u ćelijama kancera utiču na njegovu povećanu ekspresiju i izbacivanje antikancerogenog leka iz ćelije (efflux). Primenom inhibitora P-glikoproteina može se izbeći rezistencija na lek, tako da su istraživanja u ovoj oblasti veoma intenzivna. Jedinjenja različitih struktura mogu biti P- gp inhibitori. Iz rizoma biljke Coptis japonica Makino izolovano je nekoliko protoberberinskih alkaloida i njihovim biološkim ispitivanjem ustanovljeno je da oksoberberin pokazuje značajnu citotoksičnost prema ćelijama tumora dok je kod 8- oksokoptizina citotoksičnost niska, ali pokazuje značajnu P-gp-inhibitornu aktivnost (slika 1.11) Inhibitorna aktivnost oksokoptizina je bliska verapamilu, koji se upotrebljava kao standard u ovim testovima.14 N O O O O N O OO O Oksokoptizin Oksoberberin OMe OMe Slika 1.11: Oksoprotoberberini sa P-gp-ihibitornom aktivnošću Ispitivane su i mnoge druge biološke aktivnosti protoberberina, kao što su antiviralno dejstvo na HIV-1 i hepatitis, antimalarijsko dejstvo, antifungalno, gastroprotektivno, antimikrobno i antioksidativno. Neki protoberberini su potencijalni agensi u tretmanu Parkinsonove bolesti, šizofrenije i bolesti zavisnosti. 15 Homoprotoberberini se u prirodi javljaju kao pratioci protoberberina (široko zastupljenim u biljkama familije Berberidaceae), ali u mnogo manjim količinama.16 U njihovoj strukturi postoji benzazepinski fragment (slika 1.6), koji je i sam od velikog farmakološkog značaja (bitan za bradikardijalnu aktivnost, po SAR studijama).17 Puntarenin izolovan iz biljaka Xanthorhiza simplicissima i Berberis empetrifolia pokazuje antimikrobno i antifungalno dejstvo (slika 1.12) Dosadašnja ispitivanja 10 fiziološkog dejstva homoprotoberberina pokazuju da neki od njih imaju antimalarijsko i antihipertenzivno dejstvo.18 N O O O O Puntarenin MeO MeO Slika 1.12: Biološki aktivni homoprotoberberin 1.2.4. Sintetski derivati protoberberina i homoprotoberberina Postoji veliki broj sintetskih izohinolinskih derivata koji su pokazali značajno fiziološko dejstvo. Neki od njih su u upotrebi kao registrovani lekovi, dok su neki još u fazi ispitivanja. Tetrabenazin, ili Xenazin®, relativno je prost izohinolinski derivat koji se primenjuje u terapiji Hantingtonove bolesti. Benzhinamid (Emeticon®, Quantril®, Promecon®) je antihistaminik i antiemetik, pa se primenjuje u uvodu u anesteziju, i to u vidu racemata. U skorije vreme je otkriveno da deluje i kao migrenolitik kao i P-gp inhibitor (slika 1.13) 19. N MeO MeO CONH2 OAc N MeO MeO OTetrabenazin H (Xenazine®) (Emeticon®) (±) Benzhinamid H Slika 1.13: Biološki aktivni sintetski izohinolinski derivati 11 Poznato je da protoberberini imaju antikancerogeno dejstvo, tako da su ispitivani i njihovi sintetski derivati. Odreñeni 3-acetoksi-oksoprotoberberini značajno inhibiraju rast hormon-zavisnih MCF-7 ćelija humanog kancera dojke. Na slici 1.14 prikazani su oksoprotoberberini koji pokazuju najjače inhibitorno dejstvo na navedene ćelije u 1 µM koncentraciji u poreñenju sa tamoksifenom kao standardom.20 O N Tamoxifen N AcO O OAc N AcO O OAc 54 50 52 ihibitorno dejstvo na MCF-7 (%) pri 1 µΜ Slika 1.14: Sintetski oksoprotoberberini sa antiproliferativnim dejstvom Sintetski protoberberin HWY-289 je pokazao značajno in vitro antifungalno dejstvo protiv Candida albicans i Candida krusei. Na slici 1.15 je prikazana njegova struktura, kao i vrednosti njegovog antimikoznog dejstva u odnosu na mikonazol kao standardni antimikotik.21 12 Cl Cl O N N Cl Cl Mikonazol N OMe OMe O O tBu HWY-289 Candida albicans 1,56 6,25 Candida krusei 3,13 6,25 MIC (mg/L) Slika 1.15: Sintetski protoberberin sa antimikoznim dejstvom 8-Cijanoprotoberberin i homoskulerin (slika 1.16) pokazuju značajnu in vitro aktivnost protiv Plasmodium falciparum, uzročnika malarije. Homoskulerin, pored jakog antimalarijskog dejstva pokazuje i visok stepen selektivnosti (selektivnu toksičnost prema FM3A ćelijama miša), što znatno olakšava njegovu potencijalnu primenu. 22 N MeO MeO OMe OH Homoskulerin N OMe OMe O O CN 0,3 µM Plasmodium falciparum 0,4µM IC50 Slika 1.16: Sintetski antimalarici 13 1.2.5. Biosinteza protoberberina Mada osnovne strukture izohinolinskih alkaloida čini izohinolin, ovi prirodni proizvodi se mogu značajno razlikovati. Jednostavni benzilizohinolini, kao i tetraciklični berberini, aporfini i morfini imaju zajednički prekursor u biosintezi.23 Na pojednostavljenoj shemi 1.1 prikazane su različite grupe alkaloida koje nastaju iz istog prekursora. N R R R N R R R R R O R R N H R N R R R R morfinanski alkaloidi protoberberiniaporfini Shema 1.1 Biosintetski put protoberberina polazi od L-tirozina, koji se metaboliše do tiramina, L-3,4-dihidroksifenillalanina (L-DOPA) i p-hidroksifenilpirogrožñane kiseline (HPPA). Tiramin i L-DOPA se mogu transformisati do dopamina, dok se iz p- hidroksifenilpirogrožñane kiseline stvara p-hidroksifenilacetaldehid (HPA). Ove dve jedinice reaguju dajući benzilizohinolinski alkaloid (S)-norkoklaurin. Posle selektivne O-metilacije praćene N-metilacijom nastaje (S)-N-metilkoklaurin. Hidroksilacijom benzil-grupe i naknadnim metilovanjem 4’-hidroksi-grupe nastaje (S)-retikulin, centralni intermedijer benzilizohinolinske grupe alkaloida. Prsten C protoberberina 14 zatvara se oksidacijom N-metil-grupe retikulina dajući (S)-skulerin, koji se, preko (S)- kanadina transformiše u berberin (shema 1.2). HO CO2H NH2 HO NH2 HO CO2H NH2 HO HO CO2H O HO NH2 HO HO NH HO HO OH O H NH MeO HO OH H N MeO HO OH H CH3 N MeO HO OH H CH3 OH N MeO HO OMe H CH3 OH N MeO HO OMe H OH N O O OMe H OMe N O O OMe OMe L-Tirozin L-DOPA Tiramin HPPA HPA Dopamin (S)-Norkoklaurin (S)-Koklaurin (S)-Retikulin (S)-Skulerin (S)-Kanadin Berberin BBE (S)-N-Metilkoklaurin Shema 1.2 15 U ovom biosintetskom putu posebno je zanimljiv korak u kome se vrši ciklizacija benzilizohinolinske strukture do protoberberinske. Ključnu ulogu u ovom koraku igra berberine bridge enzyme (BBE), koji vrši konverziju (S)-retikulina u (S)- skulerin. Predloženi mehanizam ove ciklizacije, predstavljen shemom 1.3, odvija se u dva koraka. Najpre dolazi do oduzimanja protona iz fenolne grupe od strane Glu 417, zatim dolazi do stvaranja C-C veze reakcijom sličnom Friedel-Craftsovom alkilovanju. Formalna odlazeća grupa, hidrid, biva prihvaćena od strane kofaktora flavina. Tautomerijom intermedijer 1.1 prelazi u (S)-skulerin, dok se regeneracija kofaktora vrši u prisustvu molekulskog kiseonika uz nastanak vodonik peroksida. N MeO HO OMe H O N MeO HO OMe H O (S)-Retikulin CH2 H N N N N N N O O R S Cys 166 His 104 O O Glu 417 H H O O Glu 417H N N N H N N N O O R S Cys 166 His 104 B O2 H2O2 N N N N N N O O R S Cys 166 His 104 N MeO HO OMe H OH (S)-Skulerin 1.1 Shema 1.3 16 1.3. β-Karbolinski alkaloidi 1.3.1. Strukturne karakteristike β-karbolinskih alkaloida U ovu klasu alkaloida se ubrajaju jedinjenja koji sadrže β-karbolinski, dihidro- β-karbolinski ili tetrahidro-β-karbolinski skelet. Većina jedinjenja ovog tipa su policiklični derivati β-karbolina. Norharman ili β-karbolin (slika 1.17), izolovan iz metanolnog ekstrakta morskog sunñera Tedania anhelans, može se smatrati najprostijim predstavnikom ove klase jedinjenja.24 Tetraciklični derivati najčešće imaju supstituisan prsten D. Kod pentacikličnih derivata prsteni D i E mogu biti različito oksidovani, dok je moguće i da prsten E bude heterocikličan. N H N N H N A B C D E Norharman (β−Karbolin) Slika 1.17: β-Karbolinski i johimbanski skelet 1.3.2. Rasprostranjenost u prirodi i biološke osobine β-karbolinskih derivata Biljne familije bogate ovim alkaloidima su Apocynaceae, Loganiceae i Rubiaceae. Različite vrste roda Rauwolfia su vekovima u upotrebi u afričkoj narodnoj medicini, dok se u Indiji koristi već 3000 godina. Primenjivane su kao antidot zmijskom otrovu (otuda i naziv „zmijski koren“ za Rauwolfia serpentina), protiv stomačnih tegoba, povišene temperature, migrene. Najvažniji sastojci biljke Rauwolfia serpentina su rezerpin i ajmalicin (antihipertenzivi), serpentin, ajmalin (antiaritmik).1 Psihoaktivne osobine biljke Peganum harmala se ispoljavaju zahvaljujući prisustvu harmina, harmalina i tetrahidroharmina, prostih β-karbolinskih alkaloida (slika 1.18). 25 17 Kora biljke Pausinystalia yohimbe takoñe je dugo u upotrebi u narodnoj medicini kao afrodizijak zbog vazodilatatorskog dejstva johimbina.1 Ketojobirin je degradacioni proizvod johimbina. Biljne vrste roda Alstonia se primenjuju u kineskoj narodnoj medicini protiv traheitisa (Alstonia constricta i Alstonia scholaris) a iz njih su izolovani alstonilin-oksid i striktozamin. Dihidrogambirtanin je izolovan iz ekstrakta sumatranske biljne vrste Uncaria gambier, poznate po antioksidativnom i citotoksičnom dejstvu,26 mada je ekstrakt našao primenu i u oblasti kozmetike i biotehnologije materijala.27 N H N OH H H Ajmalicin N H N H OH Dihidrokorinanteol N H N H MeOOC N H N Dihidrogambirtanin O Ketojobirin N H N 3-Oksomeranin HO Johimbin N H N H H OH H MeOOC MeOOC N H N MeO N H NH MeO Harmin Tetrahidroharmin Slika 1.18: Primeri različitih β-karbolinskih alkaloida 18 1.3.3. Sintetski derivati β-karbolinskih alkaloida Veliki broj sintetskih derivata β-karbolina pokazuje fiziološko dejstvo, tako da će biti pomenuti samo neki primeri od mnogih opisanih u literaturi. Marinski alkaloidi arborescidinskog tipa pokazali su antitumorno dejstvo, pa su jedinjenja slične strukture dosta ispitivana. Na slici 1.19 prikazana je struktura sintetskog derivata koji je in vitro pokazao značajno dejstvo protiv nekih tumornih ćelijskih linija u poreñenju sa etopozidom kao standardnim lekom u terapiji navedenih kancera.28 N H NH Br IC50 (µM) fibroblast pluca karcinom želuca karcinom bešike karcinom pluca Etopozid 18 9 19 13 4 0,4 2,5 3 Slika 1.19: Sintetski derivat β-karbolina sa citotoksičnim dejstvom Sedativno i antihipertenzivno dejstvo rezerpina je podstaklo mnoga ispitivanja psihofarmakoloških osobina derivata sa sličnim strukturnim osobinama. Halogenovani johimbanski derivat (slika 1.20) pokazuje značajno sedativno dejstvo. In vivo ispitivanja su pokazala da je minimalna efektivna doza (MED) ovog jedinjenja jednaka vrednosti za rezerpin, i iznosi 4-5 mg/kg tm.29 19 N H N H H Cl Slika 1.20: Sintetski derivat β-karbolina sa sedativnim dejstvom 1.3.4. Biosinteza β-karbolinskih alkaloida Biosintetski put ove klase alkaloida polazi od triptamina, koji reakcijom sa odgovarajućim aldehidom ili keto kiselinom daje imin 1.2. Prsten C se zatvara Mannichovom reakcijom u kojoj reaguje α-C atom indolovog prstena sa iminom, a nakon aromatizacije dobijenog intermedijera nastaje β-karbolin (shema 1.4). N H NH2 R O Triptamin N H N R N H NH RH N H NH RN H N R [O] 1.2 Shema 1.4 U slučaju reakcije sa piruvatom (shema 1.5) intermedijer 1.3 podleže oksidativnoj dekarboksilaciji dajući dihidro-β-karbolin 1.4, koji dalje može biti redukovan do tetrahidro-β-karbolinskih struktura ili potpuno aromatizovan. Metoksi- supstituent u prstenu A uvodi se hidroksilacijom i naknadnim metilovanjem.1 20 N H NH2 CO2H O NH NH CO2H N H N N H N CO2 N H NH Redukcija ElaegninHarman N H N MeO Harmalin N H N MeO Harmin N H NH MeO Tetrahidroharmin 1.3 1.4 [O] [O] Shema 1.5 Biosintetski put kompleksnijih struktura, poput ajmalicina i johimbina uključuje reakciju triptamina sa aldehidom sekologaninom glikozidne strukture, što je prikazano shemom 1.6. Stvaranje prstena C odvija se na isti način kao kod prostih karbolina. Nakon hidrolize glikozida 1.5, nastala aldehidna grupa reakcijom sa sekundarnim aminom daje iminijum derivat 1.6. Alilnom izomerizacijom intermedijera 1.6 nastaje konjugovan iminijum-jon, koji podleže intramolekulskom nukleofilnom napadu enola, pri čemu nastaje prsten E katenamina. Redukcijom katenamina nastaje ajmalicin. 21 N H N OH H H Ajmalicin MeOOC N H NH2 Triptamin O MeO2C OGlcH H N H NH O MeO2C OGlcH O H −Glc OH MeO2C H N H NH H O OH MeO2C H N H N H OH MeO2C H N H N Dehidrogajsošicin (enol) Sekologanin O MeO2C H N H N Katenamin NADPH 1.5 1.6 Shema 1.6 Karbociklična struktura koja odgovara ajmalicinu je johimbin, koji nastaje takoñe iz dehidrogajsošicina po mehanizmu prikazanim na shemi 1.7. O MeO2C H N H N Dehidrogajsošicin (keto) H MeO2C H N H N O H MeO2C H N H N OH H MeO2C H N H N OH H H Johimbin Shema 1.7 22 1.4. Sinteze policikličnih derivata izohinolina i β-karbolina Zahvaljujući širokoj rasprostranjenosti u prirodi, veoma različitim biološkim osobinama i mogućnosti primene u medicini, kao i strukturnoj kompleksnosti, interes za sintezu pomenutih grupa alkaloida porastao je poslednjih godina. N 1 2 3 4 5 6 8 8a 9 10 11 12 13 13a N H N A B C D E A B C D 13 1 19 56 21 16 9 10 11 12 14 17 18N 1 2 3 4 5 6 8 9 10 1112 13 14 A B C D 14a 3 Protoberberini Homoprotoberberini Johimbanoidi Slika 1.21 Strukture nekih derivata izohinolina i β-karbolina Sintetički pristupi se najčešće zasnivaju na ciklizacionim reakcijama u kojima nastaju prstenovi B, C i D protoberberina i homoprotoberberina, koji su izohinolinski derivati. Očigledna je analogija sa prstenovima C, D i E kod johimbanskog skeleta, koji je derivat karbolina (slika 1.21). 23 1.4.1. Zatvaranje prstena C protoberberina i homoprotoberberina 1.4.1.1. Intramolekulska nukleofilna supstitucija Jedan od najpoznatijih načina za sintezu protoberberinskog skeleta je biomimetska sinteza, što podrazumeva stvaranje veze C-8−C-8a u ključnoj fazi. Reakcijom karbamata 1.7 sa metillitijumom u višku nastaje 8-metilenprotoberberin 1.9 u dobrom prinosu, preko intermedijernog berberinona 1.8 (shema 1.8).30 Regioselektivnost ove reakcije kontroliše izmena halogena (broma) i metala (litijum). Redukcijom enaminske funkcije pomoću NaBH4 dobija se B/C trans-8- metilprotoberberin 1.10 (Shema 1.8). N MeO MeO CO2Et Br MeLi THF, 0oC 90% N O MeO MeO OMe OMe OMe OMe AcOH NaBH4 N CH2 MeO MeO OMe OMe N MeO MeO OMe OMe H 81% 1.7 1.8 1.9 1.10 MeLi Shema 1.8 1.4.1.2. Mannichov pristup Primena Mannichove reakcije u sintezi protoberberina podrazumeva reakciju 1- benzil-tetrahidroizohinolina sa formaldehidom i naknadnu ciklizaciju. Iako je ovaj pristup jedan od najstarijih u sintezi protoberberina, postoje i novije sinteze bazirane na Mannichovoj reakciji. 24 Intramolekulska Mannichova reakcija izvedena sa 3’,4’-oksigenovanim 1- benziltetrahidroizohinolinima daje isključivo ili dominantno 10,11-disupstituisane protoberberine pre nego 9,10-disupstituisane proizvode. Kao što je prikazano na shemi 1.9, navedeni proizvod predominantno nastaje usled ipso-supstitucije trimetilsilil-grupe. Na taj način, (1S)-benzilizohinolin 1.11 dobijen od optički čistih prekursora reaguje sa formaldehidom pod Mannichovim uslovima dajući tetrahidroprotoberberin 1.12 u odličnom prinosu.31 NH MeO MeO OMe OMe SiMe3 HCHO, HCl EtOH, 85 oC 12 h N MeO MeO OMe OMe 89 %1.11 1.12 Shema 1.9 Sintetska metodologija koja uključuje Mannichovu kondenzaciju 1- feniletiltetrahidroizohinolina sa formaldehidom u prisustvu kiseline jedna je od najstarijih i u sintezi homoprotoberberina.32 Bischler-Napieralski ciklizacijom amida 1.13 sa fosforoksihloridom nastaje iminijum so 1.14 koja redukcijom pomoću natrijum- borhidrida daje odgovarajući feniletiltetrahidroizohinolin u obliku soli 1.15. Reakcijom 1.15 sa formaldehidom nastaje homoprotoberberinska struktura 1.16 (shema 1.10). 25 N MeO MeO HO OMe MeO MeO MeO N OMe MeO H MeO MeO N OMe MeO MeO MeO N OMe OMe POCl3 benzen ∆ HCHO, ∆ 1.13 1.14 1.15 1.16 MeOH 1. NaBH4 77 % 20 % 2. HCl H H Cl Shema 1.10 Homoprotoberberini se mogu dobiti na sličan način iz N-oksida feniletil- izohinolina u prisustvu fero-sulfata (shema 1.11).33 Neophodno je prisustvo fenolne grupe kod polaznog jedinjenja. Pod navedenim uslovima N-oksid 1.17 ciklizuje dajući smešu homoprotoberberina 1.18 i 1.19, kao i redukovani oblik polaznog jedinjenja 1.20. Proizvod 1.18, nastao kuplovanjem orto položaja fenolne grupe, dobija se u višku. MeO HO N OMe HO O Me FeSO4 MeOH MeO MeO N OMe MeO MeO N OMe OH OH 1.17 1.18 1.19 40 % 23 % MeO HO N OMe HO Me 22 % 1.20 Shema 1.11 26 Na shemi 1.12. je prikazana Mannichova reakcija koja se izvodi iz optički čistog feniletilizohinolina 1.23. Primenom hiralnog katalizatora 1.21 iz 1- feniletildihidroizohinolina 1.22 dobija se jedinjenje 1.23 sa visokim stepenim enantioselektivnosti.34 Njegovom reakcijom sa formaldehidom u kiseloj sredini dobija se enantiomerno čist homoprotoberberin 1.24. N MeO OMe OMe MeO MeO Et3N/HCO2H NH MeO OMe OMe MeO MeO H N MeO MeO H OMe OMe OMe HCHO, H+ N N H2 Ru Cl Tos 95% >99 % ee (-R,R)-kat (-R,R)-kat 1.21 1.22 1.23 1.24 >99 % ee 92 % MeCN Shema 1.12 1.4.1.3. Homoftalid-izohinolinski pristup Ovaj pristup uključuje funkcionalizaciju položaja C-1 dihidroizohinolina pomoću ftalidnog anjona i naknadnu ciklizaciju do oksoprotoberberina.35 Zatvaranje prstena C formiranjem veze N-7−C-8 jedna je od najprimenjivanijih metodologija u sintezi protoberberinskih skeleta. U tandemnoj reakciji nukleofilne adicije/intramolekulske reakcije fluorovanog ftalida 1.25 i dimetoksidihidroizohinolina 1.26 nastaje fluorovani oksoprotoberberin 1.27, što je prikazano shemom 1.13. Reakcija protiče regio- i stereoselektivno dajući proizvod trans-konfiguracije.36 27 N MeO MeO F O O LDA THF, -78 oC N MeO MeO F O H HO 68 % 1.25 1.26 1.27 Shema 1.13 Na shemi 1.14 prikazana je modifikacija prethodne reakcije kojom se dobija spiro jedinjenje kao proizvod. Isti dihidroizohinolin 1.26 reaguje sa anjonom 3- metoksiftalida 1.28 dajući 13-spiro derivat 1.30 kao jedini proizvod koji nastaje preko intermedijernog 8, 13-diona 1.29.37 N MeO MeO F O O N MeO MeO O MeO O N MeO MeO O OO O 1.28 1.29 1.30 1.26 H 51 % H Shema 1.14 Navedeni pristupi koji vode funkcionalizaciji položaja C-13 protoberberina mogu se primeniti i u sintezi homoprotoberberina. Bischler-Napieralski ciklizacijom amidnog laktona 1.31 u prisustvu polifosforne kiseline nastaje imin 1.32 koji se redukuje Adamsovim katalizatorom dajući dijastereoizomernu smešu homoftalid- izohinolina 1.33. Pod baznim uslovima amidni anjon amina 1.33 intramolekulski napada laktonsku karbonilnu grupu dajući dva proizvoda, laktamne alkohole 1.34 i 1.35. (shema 1.15).32 Oksidacijom ove dijastereoizomerne smeše pomoću Sarettovog reagensa dobija se keto-laktam 1.36. 28 N MeO MeO HO O O PPA CHCl3 N MeO MeO O O H2/PtO2 EtOH NH MeO MeO O O KOH MeOH MeO MeO N H HO MeO MeO N H HO MeO MeO NH O 1.31 1.32 1.33 1.34 1.35 1.36 O O CrO3/Py 47 % 55 % O Shema 1.15 1.4.1.4. Nukleofilna adicija drugih anjona na imino vezu Jedan od načina za grañenje veza N-7−C-8 je i adicija o-toluamida i drugih sličnih aromatičnih jedinjenja na dihidroizohinoline (shema 1.16). Polazeći od hiralnog o-toluamida 1.37 i dihidroizohinolina 1.26 izvršena je efikasna asimetrična sinteza 8- oksoprotoberberina 1.39.38. Toluamidi koji sadrže (S) ili (R)-feniletilamin kao hiralna pomoćna sredstva daju preko intermedijera 1.38 odgovarajuće protoberberine 1.39 odlične enantiomerne čistoće (>96 % ee). Nasuprot tome, ako se reakcija odvija u prisustvu ahiralnog toluamida 1.40 u prisustvu (−)-sparteina dobija se (−)-(13aS) sa znatno nižom enantioselektivnošću (77 % ee). 29 N MeO MeO N Cy Ph MeNH MeO MeO O N MeO MeO O Me NO Cy Ph Me Me NO Et Ph b 1.37 1.38 1.39 1.40 1.26 H toluen ∆ H H 48 % a a b n-BuLi/THF Uslovi Prinos (%) % ee 48 96 7745 Reakcija n-BuLi, (−) spartein toluen Shema 1.16. Jedna od metoda za formiranje prstena C je i reakcija 3,4-dihidroizohinolina sa aromatičnim 1,3-ditianima,39 prikazana shemom 1.17. Izohinolinski kompleks sa bortrifluoridom 1.41 reaguje sa litijumovom soli 2-ditianil-benzoata 1.42, dajući 1,3- tioketal protoberberina 1.43 u dobrom prinosu. Reduktivnom desulfurizacijom dobija se očekivani 8-oksostilopin i njegov dehidro-derivat 8-oksokoptizin. Redukcijom smeše ovih jedinjenja dobija se (±)-stilopin. 30 N BF3 O O CO2MeS S LDA THF, -76 oC 66 % N O O O O O O O S S N O O O O O N O O O O O Raney-Ni 76 % LiAlH4 THF 40 % N O O O O H Stilopin8-Oksostilopin 8-Oksokoptizin 1.41 1.42 1.43 Shema 1.17 1.4.1.5. Cikloadicione reakcije Shemom 1.18 prikazana je veoma elegantna metoda za dobijanje protoberberina u kojoj 3,4-dihidroizohinolinijum so 1.44 kao dienofil u [4+2] cikloadiciji reaguje sa intermedijernnim α-okso-o-hinodimetanom 1.46, koji se generiše dejstvom fluorida na o-sililmetilbenzoil-hlorid 1.45.40 Iz intermedijera 1.47 nastaje rezultujući 8- oksoprotoberberin 1.48, koji naknadnom redukcijom daje (±)-tetrahidropalmatin 1.49. 31 N COCl OMe OMe Si C O OMe OMe CsF N O MeO MeO OMe OMe MeO MeO N O MeO MeO OMe OMe ∆ ∆ N MeO MeO OMe OMe 94 % 58 % LiAlH4 1.44 1.46 1.48 1.49 1.45 1.47 Et2O MeCN Shema 1.18 Cikloadicijom pirolidindiona kao azadienskog analoga i benzina takoñe nastaje prsten C protoberberina.41 Pirolidindion 1.51 nastaje reakcijom 1-supstituisanog dihidroizohinolina 1.50 sa oksalil-hloridom. Reakcijom sa benzinom nastaje intermedijerni cikloadukt 1.52. Dekarbonilacijom nastaje hlorovani oksoprotoberberinski derivat 1.53 koji se dehalogenovanjem može transformisati do oksoprotoberberina 1.54 (shema 1.19). 32 N MeO MeO (COCl)2 N MeO MeO O O N O MeO MeO Cl Cl Cl 48 % N O MeO MeO H2/Pd-C NaOH, MeOH 100 % 1.54 1.52 1.511.50 N MeO MeO Cl O O 1.53 Py, THF 45 % DME ∆ Shema 1.19 Ova metodologija omogućuje i dobijanje ketojobirinske strukture, uprošćeno prikazano shemom 1.20. Pirolidindion 1.55 reakcijom sa benzinom daje hlorovani intermedijer 1.56, čijom hidrogenolizom nastaje ketojobirin 1.57. N H N O O N H N O Cl 1.55 63 % DME ∆ N H N O H2/Pd-C NaOH, MeOH 95% 1.56 1.57 Cl Shema 1.20 33 1.4.1.6. Pictet-Spenglerova reakcija Pictet-Spenglerova reakcija je primenjljiva u sintezi prostih i složenih derivata izohinolina. Veliki broj metoda za sintezu biološki aktivnih jedinjenja se bazira na ovoj reakciji, u kojoj su polazne komponente feniletilamin i aldehid. 42 Veoma zanimljiva sinteza oksoprotoberberina je ostvarena reakcijom 3,4- dimetoksifeniletilamina 1.58 sa ninhidrinom 1.59, što je prikazano shemom 1.21. 43 Pictet-Spenglerovom kondenzacijom ovih jedinjenja nastaje spiro-intermedijer 1.60. Nukleofilnom adicijom azota na karbonilnu grupu, dolazi do premeštanja i nastanka 8, 13-dioksigenovanog protoberberina 1.61. NH2 MeO MeO N MeO MeO OO N MeO MeO O HO HCl EtOH ∆ [O] 1.60 1.61 1.58 1.59 O O OH OH Shema 1.21 Pictet-Spenglerova reakcija predstavlja biomimetsku sintezu β-karbolina. Ovaj pristup se može primeniti u funkcionalizaciji β-karbolina, kao i u sintezi johimbanona. 43 Polazeći od triptamina 1.62 i ninhidrina nastaje spiro intermedijer 1.63. Finalna faza je zatvaranje prstena D johimbanona 1.64, što je analogno prstenu C protoberberina (shema 1.22). N H NH2 ninhidrin EtOH, H2O H2SO4 NH NH O O NH N O HO 77 % 1.63 1.64 ∆ 1.62 Shema 1.22 34 1.4.1.7. Reakcija sa oksalil-hloridom Stvaranje prstena C u sintezi homoprotoberberina može se ostvariti i otvaranjem prstena oksazolindiona. Poznato je da reakcijom (1,2-difeniletil)-fenilacetamida sa oksalil-hloridom u prisustvu FeCl3 nastaje oksalil-adukt koji lako hidrolizuje u kiseloj sredini. Ova reakcija je primenljiva za dobijanje različitih 3,4-dihidroizohinolina.44 Proučavanjem reakcionih uslova ustanovljeno je da, ako se reakcija izvodi na 60 oC i u prisustvu BF3.OEt2 kao Lewisove kiseline, amid 1.65 preko oksalil adukta 1.66 kvantitativno prelazi u izo-C-homoprotoberberinsku strukturu 1.67, što je prikazano shemom 1.23. 45 MeO MeO NH O OMe OMe (COCl)2, BF3.OEt2 DCM, 60 oC MeO MeO N O O O MeO MeO N O O MeO OMe MeO MeO 98 %1.65 1.66 1.67 Shema 1.23 Dobijeni homoprotoberberin 1.67 je moguće transformisati do oksoprotoberberina dekarbonilacijom pod baznim ili termičkim uslovima, što je prikazano shemom 1.24. Na taj način je od homoprotoberberinona 1.67 dobijen 8- oksopseudopalmatin. 35 N O O MeO OMe MeO MeO N O MeO MeO OMe OMe NaOH/MeOH,∆ 66 % 160 oC 70 % 1.67 8-Oksopseudopalmatin Shema 1.24 1.4.1.8. Ekspanzija prstena C Homoprotoberberinski skelet se može dobiti iz protoberberina pomoću dihlorkarbena. Oksoprotoberberin 1.68 reaguje sa dihlorkarbenom dajući ciklopropil- adukt 1.69. Redukcijom nastalog adukta pomoću LiAlH4 nastaje amin 1.70 koji podleže pregrañivanju uz povećanje prstena C. U prvom koraku nastaje iminijum so vinil- hloridnog homoprotoberberina 1.71 koja redukcijom daje hlorovani homoprotoberberin 1.72 (shema 1.25). 46 N O O O OMe OMe NaOH Et2BnN+I- CHCl3 N O O O OMe OMe Cl Cl N O O OMe OMe Cl Cl LiAlH4 THF N O O Cl N O O Cl OMe OMe OMe OMe 1.69 1.72 1.70 1.71 1.68 Shema 1.25 36 1.4.1.9. Pd-Katalizovane ciklizacije Poznata metodologija za grañenje veze C-13−C-13a zasniva se na ciklizaciji enamida, koja se može vršiti pod različitim uslovima.47 Elegantna sinteza 13- metilenprotoberberina 1.77 izvedena je Pd-katalizovanom Heckovom reakcijom iz 1- vinil-benzamida 1.76. 48 Ovaj prekursor je dobijen propargilovanjem benzamida 1.73 i in situ izomerizacijom dobijenog derivata. Alenamid 1.74 kiselo katalizovanom reakcijom prelazi u aciliminijum-jon 1.75 koji ciklizuje do vinil-izohinolinskog benzamida 1.76. Heckovom reakcijom dobija se metilen-protoberberin 1.77 (shema 1.26). HN O MeO MeO I N O MeO MeO I N O MeO MeO I N O MeO MeO I N O MeO MeO Br KOH TFA DCM Pd(OAc)2, K2CO3 Et4NBr 1.77 1.74 1. 2. in situ izomerizacija 1.73 1.75 1.76 DMF 70 % Shema 1.26 Dobijanje homoprotoberberina moguće je i primenom transmetalacionih procesa. Iminijum-so 1.78 se dobija in situ od 6,7-dimetoksi izohinolina i 2-jodobenzil bromida. U prisustvu alena, Pd(OAc)2 , indijuma i aditiva nastaje intermedijer 1.79 koji ciklizuje u enamin 1.80. Njegovom redukcijom se dobija homoprotoberberin 1.81 (shema 1.27). 49 Ova metodologija je primenljiva i za derivatizaciju β-karbolina, pri čemu nastaju benzazepinski derivati. 37 N MeO MeO Br I DMF 80 oC N MeO MeO I Pd(OAc)2, TFP In, CuI N MeO MeO In MeO MeO N EtOH MeO MeO N NaBH3CN 1.78 1.79 1.80 1.81 70 % Shema 1.27 1.4.1.10. Elektrofilna aromatična supstitucija Jednostavan pristup sintezi grañenjem C-12a−C-13 veze predstavlja i reakcija sekundarnih fenetilbenzilamina sa glioksalom. Fenetilbenzilamini se dobijaju iz fenetilamina i supstituisanih benzaldehida i redukcijom nastalog imina. Reakcijom glioksala i amina 1.82 nastaje intermedijer 1.83. Proizvod nastaje kombinacijom Mannichove i Pomeranz-Fritschove reakcije preko intermedijera 1.84 i 1.85. Redukcijom soli 1.86 nastaje tetrahidroprotoberberin 1.87. Alkilovanjem dobijenog jedinjenja dobija se kvaternarna so 1.88, koja pokazuje antihiperglikemične osobine (shema 1.28). 50 38 HN O O N O O O HO N O O O N O O O N O O N O O N O O Bn glioksal, AcOH, CuSO4, NaCl, H+ 60 % Zn/H+ ∆ 65 % BnX 82 % 1.82 1.83 1.84 1.85 1.86 1.87 1.88 50-85 oC Shema 1.28 1.4.1.11. Dieckmannova kondenzacija Jedna od metoda za dobijanje homoprotoberberina zasnovana je na zatvaranju prstena C Dieckmannovom kondenzacijom. Diestar 1.91 se dobija kondenzacijom aminoestra 1.89 sa bromidom 1.90. Dieckmannovom kondenzacijom nastaje intermedijer 1.92 koji prelazi u keto-homoprotoberberin 1.93. Redukcijom keto-grupe lako se dobija 14-hidroksi-homoprotoberberin 1.94 (shema 1.29). 32 39 N MeO MeO CO2Et Br N MeO MeO CO2Et CO2Et CO2Et MeO MeO N HO EtO2C MeCN, ∆ NaH benzen, ∆ MeO MeO N O H2/PtO2 EtOH MeO MeO N HO 1.91 1.89 1.92 1.93 1.94 1.90 Shema 1.29 1.4.2. Zatvaranje prstena B 1.4.2.1. Intramolekulska nukleofilna supstitucija Ovakva sinteza protoberberinskog skeleta zasniva se na C-2’- funkcionalizovanom 3-arilizohinolinskom derivatu kao ključnom intermedijeru i naknadnim formiranjem C-6−N-7 veze intramolekulskim alkilovanjem (shema 1.30). 51 3-Arilizohinolinski derivat 1.98 nastaje kuplovanjem benzonitrila 1.95 sa o-toluamidom 1.96. Intermedijer koji pri tom najverovatnije nastaje je enamino amid 1.97, koji ciklizuje uz eliminaciju dietilamina dajući zaštićeni 3-arilizohinolinski derivat 1.98. Njegovom deprotekcijom nastaje alkohol 1.99, koji ciklizuje preko intermedijernog tozilata dajući oksoprotoberberin 1.100 u dobrom prinosu. 40 O O CN OMOM Et2N O OMe OMe O O OMOM OMe OMe CONH2 NH2 Et2NH O O OMOM OMe OMe H N O O O OH OMe OMe H N O O O OMe OMe N O BuLi THF 10 % HCl THF TsCl, K2CO3 DMF 50 % 68 % 58 % 1.95 1.96 1.97 1.99 1.100 1.98 Shema 1.30 Sledeća metoda koja se primenjuje za formiranje prstena B zasnovana je na intramolekulskom alkilovanju 3-aril izohinolinskog intermedijera. Ciklizacijom 1,2– diariletilamida 1.101 preko 1.102 nastaje 3-aril izohinolinski intermedijer 1.103. Intramolekulskim alkilovanjem intermedijera 1.103 nastaje so 1.104, čijom se redukcijom pomoću NaBH4 dobijaju 8-metil supstituisani dijastereoizomerni alkaloidi koralidin i O-metilkoritenhirin u odnosu 4:1. U slučaju 8-fenilderivata nastaje samo cis- izomer, koji odgovara koralidinu (shema 1.31). 52 41 OTBDPS OMe OMe MeO MeO H N COMe Cl OMe OMe MeO MeO H N COMe Cl OMe OMe MeO MeO H N Me OMe OMe MeO MeO N Me OMe OMe MeO MeO N H OMe OMe MeO MeO N H MeCN 67 % PCl5 NaBH4 100 % Koralidin O-Metilkoritenhirin 4:1 1.102 1.103 1.104 1.101 Shema 1.31 3-Arilizohinolini se mogu uspešno primeniti za enantioselektivnu sintezu protoberberinskog alkaloida (S)-(−)-ksilopinina. Sulfinamid 1.107 dobijen je reakcijom nitrila 1.106 sa sulfiniminom 1.105. Reduktivnom ciklizacijom dobijeni 1,2-sulfinamid 1.107 daje C-2’-funkcionalizovan hiralni 3,4-dihidroizohinolin 1.108 (S)-konfiguracije. Redukcijom 1.108 pomoću NaBH4, prevoñenjem dobijenog alkohola u tozilat i ciklizacijom nastaje (S)-(−)-ksilopinin u prinosu 75 % (shema 1.32 ). 53 OTBDMSMeO MeO N S p-Tol O OMe OMe CN Me OTBDMSMeO MeO H N S p-Tol O CNMeO MeO N OHMeO MeO OMe OMe N MeO MeO OMe OMe LDA DIBAH HCl 1. NaBH4 2.TsCl/Py 3. NaH 1.106 1.105 1.1081.107 (S)- Ksilopinin THF -78 oC toluen 70 % 68 % 62 % H Shema 1.32 42 1.4.2.2. Elektrofilna aromatična supstitucija Hiralni 3-arilizohinolini opisani u prethodnim primerima, mogu se takoñe primeniti za dobijanje ne-racemskih protoberberina primenom Pomeranz-Fritsch- Bobbittove reakcije.54 Hiralni prekursor se dobija adicijom anjona koji nastaje iz o- toluamida 1.110 na sulfinimin 1.109 dajući 1,2-difeniletilamid 1.111 koji ciklizuje uz nastanak 3-arilizohinolona (S)-1.112. Redukcijom izohinolona 1.112 dobija se izohinolin 1.113, koji reaguje sa bromacetaldehid acetalom dajući nestabilan N- alkilovani intermedijer 1.114. Finalno zatvaranje prstena B postignuto je elektrofilnom supstitucijom i naknadnom redukcijom dajući (S)-(−)-O-metilbaratamin 1.115 u 25 % prinosu uz visoki stepen enantioselektivnosti (shema 1.33).54a MeO MeO N S tBu O Me O NEt2 MeO MeO NH SO tBu O NEt2 MeO MeO H N O H MeO MeO H N H MeO MeO N H OEt OEt MeO MeO N H t-BuLi -72 oC 1. HCl 2. n-BuLi BH3 THF NaHBrCH2CH(OEt)2 1.HCl 2. NaBH4 1.113 1.114 1.115 1.110 1.109 1.111 1.112 25 % e.e. 88 % Shema 1.33 43 Formiranje veze C-13a−C-13b u poslednjem koraku jedna je od uobičajenih metodologija u sintezi protoberberinskog skeleta. Pummerer-Mannichovom reakcijom amidosulfoksid 1.116 ciklizuje dajući izohinolinon 1.117. 55 Naknadnom eliminacijom tiofenil-grupe i ciklizacijom intermedijernog N-aciliminijum-jona 1.118 nastaje gusanlung D (shema 1.34). HN O O O S Ph O N O O O PhS N O O O N O O O TMSOTf, Et3N 64 % HCl 55 % Gusanlung D 1.116 1.1181.117 Shema 1.34 Jedna od metoda kojom se može dobiti berbanski i johimbanski skelet ima stereoselektivnu 6-egzo radikalsku ciklizaciju kao ključni korak.56 Sekundarni amin 1.119 se aciluje pomoću hloracetilhlorida do odgovarajućeg hloracetamida 1.120 koji se na kraju transformiše u odgovarajući ksantat 1.121. Ciklizacija ksantata u piperidon 1.122 se vrši pod radikalskim uslovima. Dobijeni piperidon 1.122 ciklizuje reduktivnom Bischler-Napieralski reakcijom do berbanskog derivata 1.123 (shema 1.35) Johimbanski skelet se dobija sličnom reakcionom sekvencom polazeći od triptamina. 44 NH MeO MeO N MeO MeO O H H N MeO MeO H H MeO(S)CS SC(S)OMe 1.123 N MeO MeO O S OMe S ClCH2COCl Et3N DCM, s.t. N MeO MeO O Cl MeOC(S)SK MeOH, s.t. DCE, laurilperoksid ∆ POCl3, benzen; NaBH4, EtOH 72 % 75 % 80 % 1.119 1.120 1.121 1.122 Shema 1.35 1.4.2.3. Slobodno-radikalske reakcije Polazeći od supstituisanih 3-arilizohinolina, C-4a−C-5 veza kod oksoprotoberberina 1.128 može se formirati i preko radikalskih reakcija. 57 Bromovani imin 1.124 reakcijom sa anhidridim homoftalne kiseline 1.125 daje jedinjenje 1.126, čijom se dekarboksilacijom dobija izohinolon 1.127. Slobodnoradikalskom ciklizacijom posredovanom TBTH nastaje 5-metil-oksoberberin 1.128 (shema 1.36). N Br OO O N O H Br HO2C N O H Br N O H DCM ∆ 90 % NaCl DMSO, DMF Bu3SnH AIBN toluen 1.124 1.128 1.125 1.126 1.127 Shema 1.36 45 1.4.3. Istovremeno zatvaranje B i C−transanulacija Transanularne ciklizacije su često primenjivane u sintezi prirodnih proizvoda.58 Primenjujući ovu strategiju u sintezi protoberberinske serije, N-7−C-13a veza oksoprotoberberina se formira u poslednjem koraku polazeći od sililovanog 10-članog stilbenskog laktama 1.130. Makrolaktam 1.130 se dobija iz benzamida 1.129 radikalskom ciklizacijom. Intermedijer 1.131 se dobija epoksidacijom stilbenskog laktama pomoću dimetildioksirana (DMD). Kiselo katalizovanim otvaranjem epoksida dobija se 8-oksoprotoberberin 1.132. S druge strane, iz laktama 1.130 je moguće dobiti i tetrahidrooksoberberin 1.134 preko silil-intermedijera 1.133 (shema 1.37). 59 HN MeO HO O Br Me3Si HN MeO HO O Me3Si HN MeO HO O Me3Si O Bu3SnH AIBN DMD HCl MeOH HI 50 oC Bu4NF 1.1301.129 1.131 1.1321.1331.134 THF 71 % aceton 47 % benzen, ∆ 75 % 100 % N O MeO HO N O MeO HO Me3Si N O MeO HO Shema 1.37 46 1.4.4. Zatvaranje prstena D Postoji više načina za zatvaranje prstena D, a najčešće se vrši formiranjem veze C-10−C-11. 60 1.4.4.1. Olefinska metateza Veoma pogodna metoda za grañenje veze ovog tipa je olefinska metateza, što je primenjeno u sintezi gusanlunga D (shema 1.38). Reakcijom ključnog intermedijera 1.135 sa alilmagnezijum-bromidom nastaje 1,4-adukt 1.136 koji se dalje aliluje dajući bis-alil derivat 1.137. Reakcijom olefinske metateze pomoću Grubbsovog katalizatora I generacije i naknadnom desulfurizacijim dobijenog proizvoda nastaje oksoprotoberberin 1.138. Redukcijom dvostruke veze jedinjenja 1.138 nastaje gusanlung D. 61 N O O O N O O O Ts N O O O Ts N O O O N O O O Ts MgBr THF 94 % Br THF NaH 90 % 1.Grubbs kat. 2. t-BuOK /t-BuOH ∆ 89 % HCO2NH4 -Pd/C ∆ 61 % 1.1361.135 1.1381.137 Gusanlung D MeOH Shema 1.38 47 1.4.4.2. Dieckmannova kondenzacija Formiranje C-10−C-11 veze u prstenu D berbanskog skeleta može se ostvariti i Dieckmannovom kondenzacijom. U nekoliko faza se preko intermedijera 1.139 dobija diestar 1.140. Dieckmannovom kondenzacijom dobijenog diestra formira se prsten D berbanskih derivata 1.141 i 1.142, koji se dobijaju u jednakim količinama.62 Oba ketoestra hidrolizom i dekarboksilacijom daju keto berban 1.143, što je prikazano shemom 1.39. N CN O O EtO2C H MeOH H2SO4 N O O MeO2C H t-BuOK benzen ∆ N O O H O H H CO2MeH N O O H O H H HMeO2C HCl (aq) N O O H O H H HH 96 % 1:1 90% 88 % 1.143 1.139 1.140 1.141 1.142 CO2Me Shema 1.39 48 1.4.5. Istovremeno zatvaranje C i D−bicikloanulacije Ovo je specifičan pristup primenljiv u sintezi berbanskih i johimbanskih derivata, kojim se kao finalni proizvod dobija dehidroberbanonski skelet 1.145, koji se lako može dalje transformisati do berbana 1.146. Poznato je da alil-kalajni reagens napada α-položaj izohinolina ili dihidroizohinolina 1.26 aktiviranog alkilhlorformijatom.63 Primenom polinezasićenih acil-hlorida takoñe se omogućuje aktiviranje izohinolina za nukleofilni napad, vrši se stabilizacija dobijenog enamina, a stvara se dienski partner za Diels-Alderovu reakciju. Subsekventnom Diels-Alderovom reakcijom izohinolinskog acil-derivata 1.144 istovremeno se formiraju prstenovi C i D, što je prikazano shemom 1.40. 64 Ova metodologija se može primeniti na izohinoline i dihidroizohinoline. N MeO MeO O N MeO MeO SnBu3 COCl DCM ∆ PhCl N MeO HO O N MeO HO H H 1. H2, PtO2 2. LiAlH4 + 1.146 1.144 1.145 79 % 86 % MeOH 1.26 H H Shema 1.40 Slična metodologija zasnovana je na reakciji 2,4-pentadienil-kalaja sa imino- vezom u prisustvu akrilol-hlorida primenljiva je na izohinolinski, dehidroizohinolinski i β-karbolinski sistem. 65 49 2. NAŠI RADOVI 2.1. Uvod U okviru ove doktorske teze ispitivane su različite ciklizacione transformacije u funkcionalizaciji, pre svega, izohinolinskog i dihidro-β-karbolinskog skeleta. Ovakvi procesi su omogućili postepeno uvoñenje kompleksnijih strukturnih karakteristika u osnovni heterociklični skelet i mogu biti korisni u sintezi prirodnih proizvoda, derivata ovih heterocikala. Sintetska strategija upotrebljena za funkcionalizaciju pomenutih heterocikličnih jedinjenja primenjena je i na piridinske derivate, omogućujući pristup policikličnim derivatima piridina. Racionalni strateški pristup omogućio je i sintezu zajedničkog intermedijera koji može biti upotrebljen za dobijanje različitih, ali strukturno srodnih vrsta prirodnih proizvoda izohinolinskog i β-karbolinskog tipa.66 2.2. Pristup sintezi protoberberinskog skeleta Već je pomenuto da protoberberinski skelet čini osnovu strukture mnogih prirodnih i sintetskih alkaloida koji pokazuju različito biološko dejstvo, kao i da se oni mogu naći u različito oksidovanimi supstituisanim oblicima (slika 2.1). N MeO OMe OMe MeO N O (−)-Ksilopinin H MeO MeO OMe OMe Oksopseudopalmatin Slika 2.1: Primeri prirodnih protoberberina 50 Retrosinteza a Cilj našeg istraživanja bio je nalaženje sintetskog puta za sintezu zajedničkog intermedijera iz koga se mogu efikasno dobiti strukturno različiti ali srodni derivati protoberberina (shema 2.1). Izborom adekvatnih metoda intermedijer I bi bio transformisan u oksoprotoberberinske (strukture II i III), tetrahidroberberinsku (struktura IV) i berberinsku strukturu (V), koje su prisutne u velikom broju prirodnih proizvoda.1-5 N O N N NN b c I NN O II III IV V a Shema 2.1 51 Retrosinteza b Pristup b je zasnovan na izboru izohinolinskog sistema kao dienofila koji bi u Diels-Alderovoj reakciji sa butadienskim fragmentom nagradio prsten D berbanskog skeleta, što je prikazano na shemi 2.2. N NN N N VI Shema 2.2 U slučaju da dvostruka veza u tetrahidropiridinskom prstenu strukture VI nije dovoljno reaktivna kao dienofil, alternativna mogućnost bi bila inkorporacija dvostruke C=C veze u laktamsku strukturu. Za dobijanje ovakvog jedinjenja bila bi pogodna olefinska metateza, zbog efikasnosti, blagih reakcionih uslova i visokih prinosa.67 Poznato je da prisustvo baznog azota, prisutnog kod amina, može negativno uticati na efikasnost ove reakcije. U slučaju jedinjenja sa slabo baznim osobinama, poput amida, sulfonamida, amonijum-soli, reakcija protiče bez problema. Prisustvo enaminskog azota takoñe ne ometa tok reakcije.67 Reakcijom adicije nekog alilnog nukleofila na iminsku vezu izohinolina dobili bismo prekursor za olefinsku metatezu. U literaturi su poznati primeri adicije različitih nukleofila na iminijum-soli.69 Kvaternizacijom iminskog azota različitim alkil- halogenidima stvara se pozitivno naelektrisanje na azotu, što znatno olakšava napad nukleofila na iminsku vezu. Iminski azot može biti kvaternizovan primenom reakcije acilovanja, što je primenjeno u sintezi 1-alilovanih derivata N-karbamoil izohinolina.70 Reakcija imino-veze sa akriloil-hloridom i alil-tributilkalajem opisana je u literaturi kod dihidrokarbolinskog sistema, mada nije primenjivana na izohinolinski. 71 52 Retrosinteza c Drugi pristup za dobijanje tetracikličnog derivata izohinolina (put c, shema 2.1) zasnovan je na reakciji dienske komponente izohinolinske strukture sa različitim dienofilima. NN Shema 2.1 (put c) Retrosintetski, ovakav heterociklični dien može se dobiti na nekoliko načina, što je prikazano na shemi 2.3. Retrosintetski put f je zasnovan na dobijanju diena iz eninskih derivata izohinolina. Strukture koje bi mogle dati dien paladijumom katalizovanim ciklizacijama su 1-propargil-N-alil izohinolin, kao i 1-alil-N-propargil izohinolin.72 Ova jedinjenja mogu da se dobiju reakcijom odgovarajućih kvaternarnih soli sa Grignardovim ili indijumovim reagensom. Mogući problem kod ovih reakcija je postojanje kisele alkinske veze, pa je neophodna zaštita, npr. sintezom TMS-propargil derivata.73 Putem g dien se dobija kuplovanjem dibrom-derivata izohinolina.74 Retrosintetski put e podrazumeva Heckovu ciklizaciju bis-alilovanog izohinolinskog sistema. Prekursori koji bi mogli reagovati na taj način su 1-alil-N-halogenpropenil izohinolin i 1-halogenpropenil-N-alilizohinolin. Adicijom alilnog nukleofila na kvaternarnu izohinolinijum-so dobili bismo prekursor za Heckovu ciklizaciju. Jednostavniji za pravljenje bio bi prekursor dobijen alilovanjem kvaternarne soli izohinolina sa halogenpropenil-halogenidom, jer bi na taj način izbegli pravljenje halogenpropenil-Grignardovog reagensa i mogućnost sporednih reakcija. 53 N N N N ili Xef N X X g N X Shema 2.3 U pristupu e postoji mogućnost pravljenja prekursora za Heck-ovu reakciju sa jodom i bromom. Očekivano je da jod-derivat bude reaktivniji. 75 S obzirom na nesimetričnu diensku komponentu, samo bi reakcije sa simetričnim dienofilima sa trostrukom vezom, kao što je DMAD, dale jedan proizvod, pri čemu bi se omogućila funkcionalizacija položaja C-10 i C-11 prstena D. 76 Nesimetrični dienofili sa trostrukom vezom, kao što je metil-propiolat, dali bi dva regioizomera, pri čemu se ne očekuje da jedan bude dominantan, a na taj način bi se dobili monosupstituisani cikloadukti.77 Nesimetrični dienofili sa dvostrukom vezom mogli bi dati kompleksnu smešu.78 U reakciji diena i simetričnog dienofila sa dvostrukom vezom (maleinanhidrid, maleinimidski derivati) očekuje se nastanak smeše egzo- i endo-proizvoda.79 54 2.3. Sinteza protoberberinskog skeleta 2.3.1. Sinteza izohinolinskog diena Na shemi 2.4 prikazan je redosled reakcija primenljiv u sintezi prekursora za skelet prirodnih proizvoda. Ključni intermedijer je izohinolinski 1,3 dien 2.4 sa egzocikličnim dvostrukim vezama. N N N I N I N N X R R 2.1 2.2 2.32.42.5 Shema 2.4 Kvaternarna izohinolinijum-so 2.1 dobijena je reakcijom izohinolina sa jod-alil- bromidom u acetonitrilu kao rastvaraču, pod refluksom,80 pri čemu je proizvod dobijen u dobrom prinosu (shema 2.5). N N I Br MeCN, ∆ Br I 85 % 2.1 Shema 2.5 55 Sledeći korak, alilovanje, izvršeno je adicijom Grignardovog reagensa na iminijum-so izohinolina 2.1 (shema 2.6). Sinteza alil-Grignardovog reagensa vrši se na standardan način, reakcijom alil-bromida sa magnezijumom.81 Dobijeni bis-alilovani izohinolin 2.2 nije prečišćavan zbog prisustva enaminske funkcionalne grupe i moguće hidrolize, već je kao sirov redukovan pomoću NaBH3CN. 49 Na ovaj način dobijen je prekursor 2.3 u dobrom prinosu. N I Br N I Br Mg Et2O MeOH N I 70% NaBH3CN 2.1 2.2 2.3 Shema 2.6 Heckova reakcija izvedena je pod standardnim uslovima, uz primenu 10 mol% Pd(OAc)2, 20 mol % PPh3, 1,5 eq K2CO3 u acetonitrilu (shema 2.7). Na ovaj način dobijen je dien 2.4. N Pd(OAc)2, PPh3 K2CO3 MeCN, ∆ N I 70%2.3 2.4 Shema 2.7 Struktura izohinolinskog diena 2.4 je potvrñena analizom NMR spektara. Specifični signali u 1H NMR-u za ovu strukturu su oni koji potiču od protona dve egzociklične dvostruke veze (slika 2.2). 56 N 2.4 1 2 3 6 7 11b 4 Slika 2.2: Numeracija skeleta izohinolinskog diena 2.4 Na δ 5,17-5,15 javlja se multiplet koga čine signali od po jednog protona iz svake =CH2 grupe. Na δ 4,87 je triplet koji odgovara jednom protonu iz =CH2 grupe vezane za C-2, dok se jedan proton iz =CH2 grupe vezane za C-3 javlja u vidu singleta na δ 4,84. H-11b daje signal u obliku širokog dubleta na δ 3,43 koji se kupluje sa protonima iz H2C-1 grupe. Na osnovu HSQC odreñeni su i signali ugljenika koji odgovaraju protonima egzocikličnih dvostrukih veza, na δ 109,7 i 109,4. Ostali signali su odreñeni analizom HSQC i COSY spektara. 57 2.3.2. Diels-Alderove reakcije izohinolinskih diena U cilju proučavanja reaktivnosti diena 2.4 i sinteze širokog spektra policikličnih izohinolinskih derivata, serija dienofila je upotrebljena u Diels-Alderovoj reakciji, pri čemu je omogućen nastanak prstena D berbanske strukture (tabela 2.1). Tabela 2.1: Diels-Alderova reakcija diena 2.4 sa različitim dienofilima N 2.4 Cl CN SO2Ph N N CO2EtEtO2C CO2MeMeO2C Dien Dienofil Prinos cikloadukta (%) 66 90 76 0 0 85 100* * sirova reakciona smeša je korišæena u daljim transformacijama CO2Me O O O N O O Ph Dien 2.4 je izložen reakciji sa reaktivnim dienofilom, dietilazo-dikarboksilatom na sobnoj temperaturi (shema 2.8).82 Proizvod 2.6 dobijen je u dobrom prinosu. N N N CO2EtEtO2C N N N CO2Et CO2Et DCM, s.t. 66% 2.62.4 Shema 2.8 58 Sledeća reakcija Diels-Alderovog tipa koja je proučavana bila je reakcija diena 2.4 sa dimetilacetilendikarboksilatom kao dienofilom. Reakcija je izvedena pod termičkim uslovima, u ključalom toluenu kao rastvaraču i uz mali višak DMAD, pri čemu je dobijen cikloadukt 2.7 u odličnom prinosu (shema 2.9).83 N COOMe COOMe N DMAD toluen ∆ 2.4 2.790 % Shema 2.9 Kako se izohinolinski dien 2.4 pokazao reaktivnim u Diels-Alderovoj reakciji, istom sekvencom reakcija sintetisani su i 3-metilizohinolinski dien 2.13, kao i 6,7- dimetoksiizohinolinski dien 2.10 (tabela 2.2). Poslednji dien bi imao značajnu ulogu u našoj strategiji u sintezi prirodnih proizvoda, s obzirom da većina prirodnih protoberberina ima upravo takve supstituente u izohinolinskom delu strukture. Objašnjenje za ovakav raspored supstituenata kod prirodnih proizvoda leži u biosintetskom putu, koji je bio razmatran u poglavlju 1. Tabela 2.2: Prinosi izohinolinskih derivata dobijenih reakcijama kvaternizacije, alilovanja i Heckove reakcije N I MeO MeO N I MeO MeO N MeO MeO Izohinolinijum so prinos (%) Proizvod alilovanja prinos (%) Proizvod Heckove reakcije prinos (%) Br 96 60 61 35N Br Br 90 N Br 70 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 H H N H H 59 Zanimljiv je slučaj dobijanja diena 2.13 iz 3-metilizohinolina. Nakon alilovanja kvaternarne soli i redukcije dobijenog enamina, dobijen je bis-alilovani proizvod u prinosu 70 %. Analizom NMR spektara predložena je struktura prikazana u tabeli 2.2. Za odreñivanje stereohemije proizvoda 2.12 i 2.13 ključna je bila analiza NOESY spektra. U NOESY spektru strukture 2.12 postoji korelacioni signal protona H-1, koji se javlja u obliku tripleta na δ 3,89 i H-3 (u vidu multipleta na δ 2,96-2,89, što ukazuje na njihovu blisku prostornu orijentaciju, dok ne postoji korelacioni signal metil-grupe i H- 1. Kod diena 2.13 postoji slični korelacioni signal u NOESY spektru, poreklom od signala H-11b na δ 3,46 i H-6, koji je u vidu multipleta na δ 2,62-2,57. Ključni korelacioni signali u NOESY navedenih jedinjenja prikazani su na slici 2.3. Slika 2.3: Korelacioni signali H-1/H-3 jedinjenja 2.12 i H-11b/H-6 jedinjenja 2.13 u NOESY spektrima Slični rezultati Diels-Alderovih reakcija sa DMAD dobijeni su i sa supstituisanim izohinolinskim dienima. Strukture i prinosi cikloadukata dobijenih na ovaj način predstavljeni su u tabeli 2.3. 60 Tabela 2.3. Prinosi Diels-Alderove reakcije izohinolinskih derivata sa DMAD Potvrda struktura cikloadukata izvedena je analizom spektralnih podataka. U IR spektrima ovih cikloadukata specifična je jaka traka koja pripada karbonilu estarskih grupa (1760 cm−1), što je dokaz da je došlo do cikloadicije. Molekulska težina i bruto formula ovih proizvoda je utvrñena pomoću LC/ESI/TOF masenih spektara snimanih u pozitivnom modu [M+H]+. U 1H NMR spektru se javljaju signali koji potiču od estarskih metil-grupa na δ 3,79 i njima odgovarajući signali u 13C NMR-u na δ 30,1 i 29,3. Karbonilni ugljenici se javljaju na δ 168,3 i 168,1. U interpretaciji ostalih signala od velikog značaja su bile 2D NMR tehnike. Pored Diels-Alderove reakcije sa DMAD, proučavana je i cikloadicija sa monosupstituisanim acetilenskim dienofilima. Na ovaj način moguće je dobiti monosupstituisane cikloadukte izohinolinske strukture. Reakcijom izohinolinskog diena 2.4 sa metil-propiolatom dobijena su dva proizvoda, 2.16 i 2.17 u dobrom prinosu (shema 2.10). Reakciono vreme bilo je duže u odnosu na reakciju diena sa DMAD, a bilo je neophodno dodati veću količinu dienofila. Ovo je, verovatno, posledica niske tačke ključanja metil-propiolata ili nastanka proizvoda polimerizacije, što je specifično za elektron-deficitarne alkene i alkine. Dien Cikloadukt sa DMAD N MeO MeO N COOMe COOMe MeO MeO N COOMe COOMe 80 95 Prinos (%) N 2.10 2.13 2.14 2.15 H H HH 61 N COOMe N toluen ∆ CO2Me N COOMe 2.4 2.172.1676 % 1:1 Shema 2.10 Regioizomeri 2.16 i 2.17 su razdvojeni posle prečišćavanja hromatografijom. Ukupan prinos je 75 %, a odnos dobijenih proizvoda 1:1. Velike sličnosti u NMR spektrima izolovanih proizvoda onemogućilo je identifikaciju regioizomera čak i pomoću 2D metoda. Pretpostavljeno je da će odreñivanje strukture biti znatno olakšano posle aromatizacije cikloadukata, pri čemu će 2D NMR metode, posebno NOESY nedvosmisleno ukazati na strukturu proizvoda. Pored DEAD i alkinskih dienofila, proučavani su i alkenski dienofili, za koje bi se očekivalo da u reakciji sa dienom daju smešu egzo-i endo-proizvoda. Zaista, u reakciji diena 2.4 sa N-fenilmaleinimidom dobijena je smeša cikloadukata u dobrom prinosu. Nakon prečišćavanja hromatografijom, izolovani su izomeri 2.18a i 2.18b u odnosu 2,5:1 u korist nepolarnije mrlje (po TLC-u). Zbog komplikovanih NMR spektara, nije bilo moguće sa sigurnošću utvrditi strukturu izomera, ali se pretpostavlja da izomer dobijen u višku predstavlja endo-cikloadukt (shema 2.11). Reakcijom 3- metilizohinolinskog diena 2.13 sa NPM dobijena su takoñe dva proizvoda, 2.19a i 2.19b (6:1) u ukupnom prinosu 73%. N Toluen ∆ N N O O Ph H H NPMR R R=H, 2.7 R=Me, 2.13 R=H, 2.18a/2.18b, 85 %, 2.5:1 R=Me, 2.19a/2.19, 73%, 6:1 Shema 2.11 62 Pored reakcije sa metil-propiolatom, jedan od pristupa za dobijanje monosupstituisanog protoberberinskog skeleta, bio je zasnovan na reakciji diena 2.4 sa hlorakrilonitrilom u ulozi dienofila. Diels-Alderovom reakcijom ovog tipa nastaju ciklični α-hlornitrili koji baznom hidrolizom daju ketone.79 Iz diena 2.4 na ovaj način bi bili dobijeni regioizomerni ketoni, koji bi procesom oksidacije mogli biti transformisani u protoberberine sa fenolnom grupom u položaju C-10 ili C-11. 20 Dien 2.4 je izložen reakciji sa hlorakrilonitrilom pod termičkim uslovima (shema 2.13). N Cl CN N CN N CN Cl Cl + toluen ∆ 2.20a 2.20b2.4 kvant. Shema 2.12 Zbog sličnih Rf vrednosti dobijenih proizvoda i nemogućnosti njihovog razdvajanja, sirova reakciona smeša je bez prethodne karakterizacije podvrgnuta uslovima bazne hidrolize. Uz pretpostavku da su dobijeni cikloadukti kojima odgovaraju strukture 2.20a i 2.20b, očekivano je da će njihovom hidrolizom nastati regioizomerni ketoni struktura 2.21a i 2.21b, koji će se efikasno razdvojiti hromatografijom. Reakcija je tekla 48 h na sobnoj temperaturi (shema 2.13). 63 N CN N CN Cl Cl N N O KOH/H2O DMSO Smeša O ? 2.20b 2.20a 2.21a 2.21b s.t. Shema 2.13 Nakon prečišćavanja reakcione smeše snimljeni su IR spektri da bi ustanovili da li se radi o polaznim jedinjenjima ili ketonima iste Rf vrednosti. Umesto očekivane trake ketona, u IR spektru dobijenih proizvoda uočene su oštre trake na 2206 cm−1, koje odgovaraju nitrilima. Maseni spektri su ukazivali na jedinjenja bez atoma hlora u strukturi, a definitivnom analizom NMR spektara dokazani je da je reč o proizvodima sa konjugovanom nitrilnom grupom. Pod baznim uslovima došlo je do eliminacije HCl i nastanka dvostruke veze, a sam proces je favorizovan stvaranjem konjugovanog sistema (shema 2.14).84 Na ovaj način je ponovo dobijena dienska struktura, koja je potencijalni kandidat za još jednu Diels-Alderovu reakciju sa dienofilom, što bi omogućilo dalju derivatizaciju dobijenog prstena D. 64 N CN N CN Cl Cl N CN N CN KOH/H2O DMSO Smeša 48 % 2.20a 2.22 2.20b 2.23 Shema 2.14 Diels-Alderove reakcije diena sa fenil-vinilsulfonom omogućuju dobijanje cikloadukata koji relativno lako podležu desulfurizaciji. U cilju dobijanja prirodnih proizvoda sa nesupstituisanim prstenom D, planirano je da se cikloadicijom izohinolinskog diena 2.10 i fenil-vinilsulfona dobije cikloadukt sa sulfonskom grupom. Posle aromatizacije dobijenog cikloadukta i desulfurizacije, bila bi dobijena struktura barataminskog tipa (shema 2.15). 54 65 N SO2Ph N SO2Ph N SO2Ph N MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO? 2.10 O-Metilbaratamin Shema 2.15 Reakcija diena 2.4 i vinil-sulfona je izvoñena u toluenu, uz refluks, meñutim, po TLC-u nije došlo ni do kakve promene u reakcionoj smeši. Vinil-sulfon je slabo reaktivan dienofil tako da smo reakciju pokušali da izvedemo pod energičnijim uslovima, u ksilenu pod refluksom.85 Ni u ovom slučaju nije primećen nastanak proizvoda (shema 2.16). N SO2Ph ksilen ∆2.7 N SO2Ph X Shema 2.16 66 2.3.3. Oksidacioni procesi izohinolinskih cikloadukata Kao što je pomenuto u uvodnom delu, ključni korak u našoj metodologiji za dobijanje skeleta protoberberina je aromatizacija prstena D, formiranog cikloadicijom. U literaturi su opisane primene različitih oksidacionih sredstava u aromatizaciji cikloheksadienskih derivata, tako da je ova transformacija proučavana pod različitim reakcionim uslovima. Aromatizacija nekih cikloheksadienskih jedinjenja pomoću MnO2 u velikom višku u dioksanu kao rastvaraču opisana je u literaturi. 86 Primenom ove reakcije oksidacije, pod navedenim uslovima očekivano je dobijanje tetrahidroprotoberberinske strukture 2.24 (shema 2.17). N COOMe COOMe N COOMe COOMe ? 2.7 2.24 O Shema 2.17 Cikloadukt 2.7 je izložen navedenim oksidacionim uslovima. Praćenje toka reakcije tankoslojnom hromatografijom bilo je otežano zbog difuznosti mrlja i njihovog slabog bojenja u KMnO4 reagensu, tako da je reakcija prekinuta posle 72 h, što sugerišu i literaturni podaci (shema 2.18). 86 N COOMe COOMe N COOMe COOMe dioksan MnO2 O 45 %2.7 2.25 Shema 2.18 67 IR spektar dobijenog jedinjenja pokazuje prisustvo dodatne C=O grupe, dok HRMS sugeriše molekulsku formulu C21H17NO5, koja ne odgovara strukturi 2.24. Analiza 1H NMR spektra izolovanog proizvoda pokazala je prisustvo manjeg broja signala nego što bi se očekivalo kod tetrahidroprotoberberinske strukture 2.24. U aromatičnom regionu pojavio se singlet na visokom hemijskom pomeranju (δ 8,9, H-9) koji se ne može dovesti u vezu sa tetrahidroberberinskom strukturom 2.24. Na δ 7,03 je singlet koji u NOESY spektru daje korelaciju sa aromatičnim protonom. U oblasti alifatičnih protona postoje samo dva tripleta, na δ 4,39 i 3,05, koji odgovaraju dvema susednim CH2 grupama u položajima C-5 i C-6. Sve pomenute informacije idu u prilog strukturi 2.25 koja je dodatno potvrñena analizom korelacija koje postoje u NOESY spektru (slika 2.4). Prisustvo dodatne karbonilne grupe je potvrñeno i pojavom signala na δ 161,3 u 13C NMR spektru, dok signal na δ 101,8 odgovara C-13 iz dvostruke veze. N COOMe COOMe O 1 4 12 13 5 9 Slika 2.4: Ključne korelacije u NOESY spektru (δ 7-8) jedinjenja 2.25 Deo NOESY spektra u kome se nalaze bitne korelacije za utvrñivanje strukture 2.25 prikazan je na slici 2.5. Na osnovu ovih podataka, utvrñeno je da je dobijen proizvod oksoprotoberberinske strukture 2.25. 68 Slika 2.5: Deo NOESY spektra (δ 7-8) jedinjenja 2.25 69 Dodatna potvrda oksoprotoberberinske strukture jedinjenja 2.25 dobijena je kristalografskom analizom (slika 2.6). Slika 2.6: Struktura jedinjenja 2.25 dobijena kristalografskom analizom U cilju optimizacije eksperimentalnih uslova proučavana je aromatizacija i sa drugim oksidacionim reagensima. 87 Pd/C se nije pokazao efikasnijim, prinos dobijenog proizvoda je bio 20%. DDQ, kao standardni reagens za aromatizaciju takoñe se nije pokazao adekvatnim, pošto je dobijena reakciona smeša bila veoma kompleksna. Prilikom praćenja reakcije TLC-om, Dragendorffov reagens se pokazao izuzetno korisnim. 88 Kao većina alkaloida, cikloadukti se njime boje u narandžastocrveno, dok oksoprotoberberini daju mrlje od plave do tamnosmeñe boje. U cilju pojednostavljenja eksperimentalnog postupka, ispitana je mogućnost dobijanja oksoprotoberberina 2.25 iz neobrañene reakcione smese posle završene Diels Alderove reakcije. Reakcionoj smeši nakon završene prethodne faze dodat je MnO2, i reakcija aromatizacije je nastavljena dok, po TLC-u nije došlo do njenog završetka (shema 2.19). Proizvod 2.25 izolovan je u prinosu 20 %, računajući reakciju cikloadicije i aromatizacije, što je nešto niže od prinosa dobijenog aromatizacijom 70 prečišćenog jedinjenja. Iz ovog razloga sve dalje reakcije aromatizacije izvoñene su sa prečišćenim cikloaduktima. N COOMe COOMe N COOMe COOMe MnO2 ON DMAD Toluen ∆ 20 % 2.4 2.7 2.25 Shema 2.19 U cilju dobijanja različito supstituisanih oksoprotoberberina, reakcija aromatizacije primenjena je i na izohinolinske cikloadukte sa DMAD, 2.14 i 2.15. Reakcije su protekle sa približno istom efikasnošću, i na taj način su dobijene strukture slične nekim fiziološki aktivnim protoberberinima (tabela 2.4).14, 20 Tabela 2.4: Prinosi reakcije aromatizacije izohinolinskih ciikloadukata N COOMe COOMe MeO MeO N COOMe COOMe N COOMe COOMe O MeO MeO Cikloadukt Oksoprotoberberin N COOMe COOMe O 40 50 Prinos (%) 2.26 2.27 2.14 2.15 71 U literaturi je navedeno da neki sintetski monokarboksilni derivati protoberberina pokazuju zanimljivo biološko dejstvo, tako da naša metodologija otvara mogućnost dobijanja i ispitivanja jedinjenja sa sličnom strukturom. 89 U cilju dobijanja monosupstituisanih oksoprotoberberina, reakcija aromatizacije primenjena je i na regioizomerne propiolatne cikloadukte (shema 2.20). N N dioksan MnO2 O N COOMe N COOMe dioksan MnO2 O 45% 43% COOMe COOMe 2.17 2.16 2.29 2.28 Shema 2.20 Već je pomenuto da potpunu karakterizaciju cikloadukata 2.16 i 2.17 nije bilo lako izvesti zbog preklapanja velikog broja signala. Aromatizacijom oba cikloadukta ponaosob strukture proizvoda su znatno pojednostavljene, tako da je karakterizacija dobijenih oksoprotoberberina izvršena u potpunosti. Nepolarniji cikloadukt je aromatizacijom dao proizvod koji se Dragendorffovim reagensom boji smeñeljubičasto na TLC-u, dok je aromatizacijom polarnijeg cikloadukta nastao proizvod koji se boji sivo. Analizom spektralnih podataka izolovanih proizvoda posredno smo odredili strukture polaznih cikloadukata. U IR spektrima oba proizvoda primećene su trake koje potiču od estarske i amidne grupe. HRMS spektri oba jedinjenja sugerišu bruto formulu C19H15NO3. 72 N CO2Me O 9 11 12 13 1 2 54 Slika 2.7: Korelacije H-13/H-1, H-13/H-12, H-4/H-5 u NOESY spektru jedinjenja 2.29 U 1H NMR spektru regiozomera dobijenog aromatizacijom nepolarnijeg cikloadukta uočen je dublet na visokom hemijskom pomeranju (δ 9,11) sa malom konstantom kuplovanja (J=1,6 Hz) koji odgovara H-9. U NOESY spektru ovog jedinjenja se ne vide korelacioni signali H-9 sa drugim protonima, ali se u HMBC javlja korelacioni signal H-9 sa karbonilnim ugljenicima amida, estra i C-11. Olefinski proton H-13 u oksoprotoberberinskim strukturama obično daje singlet na nešto nižem hemijskom pomeranju (δ 7,04). U COSY spektru se ne vidi njegovo kuplovanje ni sa jednim protonom, dok se u NOESY spektru pojavljuju korelacioni signali usled prostorne bliskosti sa H-12, (δ 7,62), i sa H-1 (δ 7,85). Dublet dubleta na δ 8,24, sa konstantama kuplovanja od 8,4 i 1,6 Hz pokazuje samo jedan NOE korelacioni signal (sa H-12), tako da signal odgovara H-11. Dublet na δ 7,62 pripada H-12, i pokazuje prostornu bliskost sa dva protona (H-11 i H-13) (slika 2.7).. Na ovaj način je utvrñena struktura regioizomera na slici 2.7, a samim tim je odreñen položaj supstituenta COOMe u polaznom cikloaduktu. Na slikama 2.8 i 2.9 su prikazani delovi NOESY i COSY spektri jedinjenja 2.29. 73 Slika 2.8: Deo NOESY spektra (δ 9,3-6,7) jedinjenja 2.29 74 Slika 2.9: Deo COSY spektra (δ 8,7-6,8) jedinjenja 2.29 75 Ključni signali u NOESY spektru za odreñivanje strukture jedinjenja 2.28 prikazani su na slici 2.10. 12 N O CO2Me 9 10 13 Slika 2.10: Ključne korelacije u COSY spektru (H-9/H-10) i HMBC spektru (C-13/H-12) jedinjenja 2.28 Analizom COSY spektra regioizomera dobijenog aromatizacijom polarnijeg cikloadukta uočen je signal na δ 9,11 u obliku dubleta koji se kupluje sa dvostrukim dubletom na δ 8,05. U HMBC spektru postoje korelacije izmeñu signala na δ 9,11 i C=O amida, i dvostrukog dubleta na δ 8,05 sa C=O estra. Ovi signali su pripisani H-9 (δ 9,11 ) i H-10 (δ 8,05). Singlet na 7,09 potiče od H-13 koji se ne kupluje sa drugim protonima. Na δ 8,30 se nalazi dublet sa malom konstantom kuplovanja (J=1,5 Hz) koji odgovara H-12. U HMBC spektru se vidi korelacija izmeñu C-13 i H-12, kao i H-12 sa C=O estra, tako da je utvrñena struktura jedinjenja 2.28. Na osnovu toga posredno je odreñena i struktura polaznog cikloadukta. Delovi COSY i HMBC spektara jedinjenja 2.28 su prikazani na slikama 2.11 i 2.12. 76 Slika 2.11 Deo COSY spektra (9-6,7 ppm) jedinjenja 2.28 77 Slika 2.12: Deo HMBC spektra (od 8,5-6,6 ppm) jedinjenja 2.28 78 Pošto je dokazano da se cikloadukti koji poseduju 1,4-cikloheksadiensku strukturu u prstenu D mogu efikasno aromatizovati, sledeći korak bio je primena oksidacionih uslova na cikoadukte sa jednom dvostrukom vezom. Bilo je interesantno ispitati da li je u ovom slučaju aromatizacija uopšte moguća, i da li se stepen oksidacije možda zaustavlja na tetrahidroprotoberberinskom proizvodu. Na cikloadukte 2.18a i 2.18b primenjeni su reakcioni uslovi za aromatizaciju. Reakcija je protekla uspešno, tako da se metoda za dobijanje oksoprotoberberinske strukture pokazala efikasnom i na ovakvim sistemima. Kao što je i očekivano, egzo-i endo-izomeri dali su identični proizvod aromatizacije, oksoprotoberberinsko jedinjenje, 2.30 (shema 2.21). N O N O O Ph N N O O Ph H H MnO2 dioksan 66%2.18a 2.30 Shema 2.21 Pod ovim reakcionim uslovima bilo je nemoguće reakciju zaustaviti na stepenu oksidacije tetrahidroprotoberberina, tako da smo zaključili da je stvaranje oksoprotoberberinske strukture dominantno i da možda mehanizam aromatizacije prevashodno vodi nastanku takve strukture. Cikloadukti 3-metilizohinolinske strukture sa NPM 2.19a i 2.19b takoñe aromatizacijom daju oksoberberinsko jedinjenje 2.31 (slika 2.13) u prinosu 45 %. Oksoprotoberberinska struktura ovog jedinjenja je potvrñena 2D NMR spektrima. 79 N O N O O Slika 2.13: Struktura proizvoda 2.31 U literaturi je opisano dobijanje tetrahidroprotoberberina redukcijom pomoću LiAlH4 oksoprotoberberina amidnog i enamidnog tipa. U cilju dobijanja takve strukture pokušali smo da iz oksoprotoberberinske strukture 2.25 dobijemo tetrahidroprotoberberinsku. Uz pretpostavku da će redukcijom estarskih grupa nastati dve primarne alkoholne grupe upotrebljen je višak redukcionog sredstva.39, 90 Kao proizvod ove reakcije dobijena je smeša proizvoda prikazanih shemom 2.22. N COOMe COOMe O LiAlH4 THF N O N O HO N O HO OHOH2.32 2.33 2.342.25 60 % 2 : 1 : 4 Shema 2.22 Praćenjem reakcije pomoću TLC-a uočen je nastanak tri proizvoda, čije je bojenje u plavo pomoću Draggendorfovog reagensa ukazivalo na prisustvo oksoprotoberberinske strukture. Analizom IR spektara sva tri proizvoda uočena je traka na 1626 cm−1 amidne grupe, traka estra nije primećena, a pojavila traka specifična za alkohole na 3315 cm−1. 1H 80 NMR spektar diola, (očekivano najpolarnijeg) bio je relativno jednostavan za interpretaciju. Indikativna je bila pojava dva singleta (sa 2H) na δ 4,67 i 4,62, koja potiču od benzilnih protona, i izostanak signala metil grupe iz estra. Zanimljivo je bilo odrediti regioizomere benzilalkoholnog tipa sa susednom metil grupom. I u ovom slučaju je najznačajniji doprinos u rešavanju strukture dao NOESY spektar. Kao i kod prethodnih interpretacija NMR spektara, indikativni signali su singlet na δ~8 (H-9) i singlet na δ~7 (H-13). U slučaju regioizomera 2.33 ključni pokazatelj strukture bili su korelacioni signal H-9 sa metil grupom vezanom za aromatičan prsten, kao i korelacioni signal CH2OH sa H-12 (slika 2.14). Slika 2.14: Korelacije H-13/H-12, H-9/CH3 i CH2OH/CH3 u NOESY spektru jedinjenja 2.33 Analizom NMR spektra drugog regioizomera, 2.32, kao ključni korelacioni signali uočeni su oni koji ukazuju na prostornu bliskost H-13 i H-12, H-9 i CH2OH, kao i CH3 i H- 12 (slika 2.15). Na taj način utvrñen je položaj supstituenata na C-10 i C-11. 81 N CH3 O 9 10 11 12 13 1 OH Slika 2.15: Korelacije H-13/H-12, H-9/CH2OH 3 i H-12/CH3 u NOESY spektru jedinjenja 2.32 U cilju dobijanja struktura tetrahidroberberinskog tipa ispitivani su blaži reakcioni uslovi za aromatizaciju, ograničavajući se na MnO2 kao reagens.91 Promenom rastvarača i dodavanjem manjeg viška MnO2 (5 eq w/w) sintetska procedura je modifikovana omogućujući pristup drugoj klasi jedinjenja. Reakcijom cikloadukta 2.7 u suvom dihlormetanu uz višak MnO2 od 5 eq (masenih) na 40 oC dobijen je proizvod na višoj Rf vrednosti od polaznog jedinjenja oksoprotoberberinske strukture, 2.24. I u ovom slučaju je od velike pomoći bila primena Dragendorffovog reagensa, pošto se mrlja novonastalog jedinjenja, kao i polazni cikloadukt, bojila crveno, za razliku od plavo obojenih oksoprotoberberina. Izolovanjem i identifikacijom proizvoda 2.24 ustanovljeno je postojanje tetrahidroprotoberberinske strukture (shema 2.23). N COOMe COOMe N COOMe COOMe MnO2 DCM, 40oC 63 %2.7 2.24 Shema 2.23 82 U IR spektru dobijenog jedinjenja specifične su samo trake poreklom od estarskih grupa. 1H NMR spektar je nešto složeniji od oksoprotoberberinske strukture, što je očekivano. U aromatičnom regionu se uočavaju dva singleta na δ 7,53 i 7,48, poreklom od protona u orto-položajima u odnosu na metil-estarske grupe. Na osnovu COSY spektra utvrñeni su signali parova protona koji se meñusobno kupluju: H2C-5 i H2C-6; H2C-13 i H- 13a. Analizom NOESY spektra okarakterisani su signali prostorno bliskih protona H2C-8 i H-9; H-1 i jedan proton iz H2C-13; H-13a i jedan proton iz H2C-13; H2C-13 i H-12 i samo jedan proton iz H2C-6 (slika 2.16) u jedinjenju 2.24. Na slikama 2.17 i 2.18 prikazani su delovi NOESY i COSY spektara jedinjenja 2.24. N COOMe COOMe 1 4 5 6 8 9 12 13 13a Slika 2.16: Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.24 83 Slika 2.17: Deo NOESY spektra (δ 4,5-2) jedinjenja 2.24 Slika 2.18: Deo COSY spektra (δ 4,5-2) jedinjenja 2.24 84 Optimizacijom uslova došlo se do zaključka da sa 5 eq (w/w) MnO2 za 30 minuta nastaje proizvod 2.24 u prinosu 63%. Neophodno je izbeći duže trajanje reakcije zbog mogućnosti dalje aromatizacije i nastanka oksoprotoberberinske strukture. U slučaju dodavanja veće količine MnO2, zagrevanjem u toku 24 h nastaje oksoprotoberberinski proizvod 2.25 u prinosu 70 %. Na taj način su nañeni optimalni uslovi za dobijanje dva različita proizvoda iz zajedničkog intermedijera, u znatno boljim prinosima (shema 2.24). N COOMe COOMe N COOMe COOMe MnO2 (5 eq) DCM, 40 oC 63 % MnO2 (30 eq) DCM, 40 oC 24 h30 min 70 % N COOMe COOMe O 2.24 2.7 2.25 Shema 2.24 Optimizovani reakcioni uslovi primenjeni su na cikloadukte supstituisanih izohinolina 2.14 i 2.15, pri čemu su dobijene tetrahidroprotoberberinske strukture 2.35 i 2.36 u dobrim prinosima (tabela 2.5). Strukture navedenih proizvoda su potvrñene analizom NMR spektara. U slučaju derivata 3-metilizohinolina 2.36, ključna je bila interpretacija NOESY spektra (slika 2.19). Signali koji pokazuju korelaciju sa H-13a su H- 6 i H-8β. Metil-grupa na C-6 pokazuje korelaciju sa H-8α. 85 N COOMe COOMe 6 8 9 12 13a H H Slika 2.19: Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.36 Tabela 2.5: Prinosi tetrahidroprotoberberinskih i oksoprotoberberinskih derivata N COOMe COOMe N COOMe COOMe MeO MeO N COOMe COOMe N COOMe COOMe N COOMe COOMe MeO MeO N COOMe COOMe N COOMe COOMe O N COOMe COOMe O MeO MeO Cikloadukt Tetrahidroprotoberberin , prinos (%) Oksoprotoberberin, prinos (%) 63 78 50 70 50 2.7 2.24 2.25 2.14 2.26 2.15 2.35 2.36 86 Bilo je zanimljivo ispitati da li cikloadukti dobijeni reakcijom sa N- fenilmaleinimidom mogu da daju različito aromatizovane struktrure. Cikloadukt 2.18a nije davao proizvod reakcije pod uslovima za blagu aromatizaciju ni nakon 24 h, tako da jedinjenje 2.37 nije izolovana. Dodavanjem veće količine MnO2, nakon 30 h dobijena je samo oksoprotoberberinska struktura 2.30 (shema 2.25). N N O O Ph H H 30 eq MnO25 eq MnO2 N N O O Ph N N O O Ph O 2.37 2.18a 2.30 DCM ∆ 45 % X Shema 2.25 Ovako razvijenim sintetskim pristupom potencijalno moguće je dobijanje prirodnog proizvoda ksilopinina, kao i njegovog okso derivata, oksoksilopinina (slika 2.20). 2d, 4b N OMe OMe MeO MeO N OMe OMe MeO MeO O Ksilopinin Oksoksilopinin Slika 2.20 Primena vinilen-karbonata kao dienofila omogućuje nastanak cikloadukta čijom se hidrolizom postiže uvoñenje alkoholne grupe u molekul. Pretpostavljeno je da bi izohinolinski dien reakcijom sa vinilen-karbonatom dao smešu egzo- i endo-cikloadukata 2.38. Primenom optimizovanih uslova za aromatizaciju na smešu cikloadukata bilo bi 87 moguće dobiti jedinjenje strukture 2.39. Hidrolizom karbonata 2.39 i metilovanjem dobijenih fenolnih grupa bilo bi moguće dobiti strukturu prirodnog proizvoda, ksilopinina (shema 2.26). Reakcijom diena 2.4 sa vinilen-karbonatom pod termičkim uslovima koji su do sada primenjivani za dobijanje cikloadukata nije došlo do nastanka proizvoda. Ovo je pripisano slaboj reaktivnosti vinilen-karbonata kao dienofila.92 Izvoñenjem reakcije u ksilenu, kao rastvaraču više tačke ključanja, nisu postignuti bolji rezultati ni posle produženog vremena reakcije. Sledeći pokušaj reakcije diena 2.4 i vinilen-karbonata izveden je zagrevanjem u zatvorenom sistemu, kao i u mikrotalasnom reaktoru, ali željeni proizvod reakcije nije dobijen. N OO O N O O O H H N O O O N OMe OMe MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO MeO ? ? ? 2.38 2.39 Ksilopinin Shema 2.26 88 2.3.4. Pokušaj sinteze nuevaminskog skeleta Izoindolo [1,2–a]izohinolinoni su malobrojna podgrupa izohinolinskih alkaloida, ali sa izraženim fiziološkim dejstvom.93 Na slici 2.21 je prikazan nuevamin, prvi alkaloid ovakve strukture izolovan iz prirodnog izvora. N OMe O OMe O O Nuevamin Slika 2.21: Primer jedinjenja izoindolo [1,2–a]izohinolinoskog tipa Primenom metodologije za sintezu protoberberina bilo bi moguće dobiti petočlani dien strukture 2.40, koji bi Diels-Alderovom reakcijom sa različitim dienofilima i naknadnom aromatizacijom mogao dati nuevaminski skelet 2.41 (shema 2.27). Zatvaranje petočlanih diena sa egzocikličnim dvostrukim vezama Heckovom reakcijom opisano je u literaturi.94 Osnovni problemi u ovom pristupu bili bi moguća aromatizacija diena 2.40 i dobijanje pirolne strukture, kao i nastanak šestočlanog proizvoda ciklizacije, umesto petočlanog. NN I N R R O 2.40 2.41 R R R R Shema 2.27 89 U cilju dobijanja prekursora za dobijanje petočlanog diena bilo je neophodno uvesti vinil-grupu u položaj C-1 izohinolina. Izvršena je adicija vinil-Grignardovog reagensa na jodoalil-izohinolinijum-so 2.1, i posle redukcije enamina dobijen je prekusor 2.42 (shema 2.28) N I MgBr Et2O N I NaBH3CN MeOH N I73 % R R R R R R R=H, 2.1 R=OMe, 2.8 R=H, 2.42 R=OMe, 2.43 Shema 2.28 Dobijeni prekursori 2.42 i 2.43 izloženi su reakcionim uslovima tipičnim za Heckovu reakciju i izolovani su samo proizvodi nastali zatvaranjem šestočlanog prstena (shema 2.29). N I R Pd(OAc)2, PPh3 K2CO3 MeCN, ∆ N R R R=H, 2.44, 37 % R=OMe, 2.45, 30% 2.46 R R=H, 2.42 R=OMe, 2.43 Shema 2.29 Analizom NMR spektara izolovanog proizvoda isključena je mogućnost nastanka petočlanog diena sa egzocikličnim dvostrukim vezama. Na slici 2.22 prikazane su ključne korelacije u NOESY spektru koje su doprinele odreñivanju strukture jedinjenja 2.44. 90 N 1 2 4 11b 6 7 Slika 2.22: Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.44 Ovakav pristup za dobijanje nuevaminskog skeleta je privremeno napušten, pa je ostavljena mogućnost za ispitivanje i optimizaciju uslova ciklizacije radi dobijanja petočlanog diena sa egzocikličnim dvostrukim vezama. U slučaju uspešne sinteze takvog intermedijera, sledeća faza bila bi proučavanje njegove reaktivnosti u Diels-Alderovim reakcijama, kao i mogućnost aromatizacije nastalih cikloadukata. 91 2.4. Sinteza policikličnih tetrahidro-β-karbolinskih derivata U cilju proširivanja metodologije za dobijanje protoberberinskog skeleta, pristup razvijen na izohinolinskim derivatima primenjen je i na dihidro-β-karbolin. Na taj način bilo bi moguće dobiti policiklične derivate β-karbolina koji su zastupljeni u nekim prirodnim proizvodima. Sličnost imino-grupa izohinolina i dihidro-β-karbolina sugerisala je mogućnost primene sekvence za dobijanje protoberberina na ovaj heterociklični sistem. Na taj način, polazeći od dihidro-β-karbolina, otvara se mogućnost dobijanja pentacikličnih tetrahidro-β- karbolinskih derivata sa različito aromatizovanim strukturama 2.49b, kakve se javljaju u nekim prirodnim proizvodima (shema 2.30).1, 26 Planirano je izvoñenje reakcija na dihidro- β-karbolinu sa nezaštićenom N-H vezom, pri čemu bi se uzela u obzir njena reaktivnost prema Grignardovom reagensu. N H N N H N X N H N N H N N H N Y 2.46 2.48 2.49 2.49a2.49b RR Y=O, CH2 N H N O N H N MeOOC Ketojobirin Dihidrogambirtanin H Shema 2.30 92 2.4.1. Sinteza tetrahidro-β-karbolinskog diena Polazno jedinjenje za ovu sintezu, dihidro-β−karbolin 2.46, dobijen je formilovanjem triptamina pomoću etil-formijata i ciklizacijom dobijenog formamida pomoću POCl3 (shema 2.31).95 N H NH2 HCO2Et N H NH O POCl3 N H N ∆ 2.461.62 Shema 2.31 Dihidro-β-karbolin 2.46 je kvaternizovan jod-propenil-bromidom na način koji je već opisan za dobijanje izohinolinskih kvaternarnih soli.83 Za razliku od izohinolinskih kvaternarnih soli kojima je bilo moguće odrediti tačku topljenja, karbolinijum-so 2.47 je veoma higroskopna, pa je neophodno izlaganje vazduhu svesti na minimum (shema 2.32). Br N H N MeCN ∆ I N H N Br 80% I 2.46 2.47 Shema 2.32 Reakcija alilovanja pomoću alilmagnezijum-bromida izvedena je na sličan način kao kod izohinolinskih derivata. U ovom slučaju je Grignardov reagens korišćen u višku zbog prisustva kisele indolove N-H veze.96 Za razliku od izohinolinskih derivata, ovde se 93 ne dobija enaminski intermedijer, što pojednostavljuje postupak za dobijanje bis-alilnog derivata 2.48 (shema 2.34). N H N I Br Mg Et2O N H N IBr 42% 2.47 2.48 Shema 2.33 Uz pretpostavku da će se ciklizacijom prekursora 2.48 dobiti dien sa egzocikličnim dvostrukim vezama kao kod izohinolinskih sistema, primenjeni su isti reakcioni uslovi. Reakcija ciklizacije izvedena je pod standardnim Heckovim uslovima i dobijen je tetrahidro-β-karbolinski dien 2.49 (shema 2.34). N H N I Pd(OAc)2, PPh3 K2CO3 MeCN, ∆ N H N 50 % 2.48 2.49 Shema 2.34 Struktura diena 2.49 potvrñena je analizom spektralnih podataka. Specifični signali u NMR spektru pripadaju protonima iz egzocikličnih dvostrukih veza. Signal na δ 5,18 je u obliku multipleta od dva protona, dok je drugi singlet na δ 4,88, takoñe od dva protona. Oba signala pokazuju korelaciju sa po jednim vodonikom iz susednih alilnih grupa, H2C-1 i H2C-4, na osnovu čega je zaključeno da svaki singlet potiče od dva protona sa različitih egzocikličnih veza. Signal H-12b je u vidu multipleta, i kupluje se u COSY spektru sa 94 protonima H2C-1. Na slici 2.23 su prikazane ključne korelacije u COSY spektru jedinjenja 2.49 koje su potvrdile pretpostavljenu strukturu. Slika 2.23:Ključne korelacije u COSY spektru jedinjenja 2.49 2.4.2. Diels-Alderove reakcije tetrahidro-β-karbolinskog diena Reaktivnost tetrahidro-β-karbolinskog diena u Diels-Alderovoj reakciji ispitana je u reakciji sa DMAD, pod termičkim uslovima, pri čemu je dobijen proizvod 2.50 u veoma dobrom prinosu (shema 2.35). N H N N H N CO2Me CO2Me DMAD toluen ∆ 2.49 2.5080 % Shema 2.35 Kako se reakcija sa DMAD pokazala uspešnom, sledeći korak bio je cikloadicija diena 2.49 sa N-fenilmaleinimidom. Očekivano je da će se u ovoj reakciji dobiti smeša egzo-i endo-cikloadukata. Reakcija diena 2.49 i NPM je izvedena uspešno pod termičkim uslovima, i dobijen je proizvod kao smeša izomera u visokom prinosu (shema 2.36). 95 N H N toluen ∆ N OO Ph 90 % N H N N O O Ph H H2.51a 2.51b 2.49 Shema 2.36 U skladu sa očekivanjima, proizvod reakcije 2.51 predstavljao je smešu egzo-i endo cikloadukata. Za razliku od izohinolinskih cikloadukata ovog tipa, koji su razdvojeni i okarakterisani posebno, tetrahidro-β-karbolinske cikloadukte sa NPM nije bilo moguće izolovati i okarakterisati pojedinačno zbog bliskih Rf vrednosti. Iz ovog razloga, prikupljeni su spektralni podaci smeše proizvoda 2.51. 96 2.4.3. Oksidacioni procesi tetrahidro-β-karbolinskih cikloadukata Sledeća faza u sintezi policikličnih derivata bila je ispitivanje mogućnosti aromatizacije prstena E tetrahidro-β-karbolinskih cikloadukata sa DMAD. Na taj način otvorila bi se mogućnost za dobijanje ketojobirinskih 2.53 i dihidrogambirtaninskih struktura 2.52 (sheme 2.37, 2.30).26 N H N N H N N H N O 2.50a 2.532.52 R R R [O] [O] Shema 2.37 Na cikloadukt 2.50 primenjeni su uslovi koji su već korišćeni za dobijanje oksoprotoberberina. Proizvod reakcije je izolovan u nižem prinosu u odnosu na aromatizaciju izohinolinskih cikloadukata (shema 2.38). N H N CO2Me CO2Me N H N CO2Me CO2Me O dioksan MnO2 (30eq) 25 % 2.50 2.54 70 oC Shema 2.38 97 U IR spektru dobijenog proizvoda 2.54 prisutne su trake poreklom od estra, kao i traka amida, što ukazuje na ketojobirinsku strukturu. Iz HRMS spektra proizilazi bruto formula C23H18N2O5. U aromatičnoj oblasti 1H NMR spektra uočljivi su singleti od po jednog protona na δ 8,77 i 7,56, koji odgovaraju protonima u orto-položaju u odnosu na estarske grupe. Singlet koji potiče od protona iz N-H veze nalazi se na δ 8,74. U spektru je prepoznatljiv singlet na δ 6,41 koji potiče od H-14. U alifatičnom regionu su uočljivi singleti estarskih CH3 grupa na δ 4,03 i 3,63 i dva tripleta na δ 4,51 i 3,15, koji ukazuju na fragment CH2-CH2 (H2C-6 i H2C-5). Korelacioni signali izmeñu prostorno bliskih protona u NOESY spektru potvrñuju strukturu 2.54 i predstavljeni su na slici 2.23. H-14 pokazuje korelaciju sa singletom orto-protona (H-16) u odnosu na metilestar, a proton sa dvostruke veze (H-14) korelaciju sa protonom vezanim za indolov azot (slika 2.24). Na ovaj način, primenom energičnijih uslova za aromatizaciju dobijeno je jedinjenje ketojobirinske strukture 2.54. Slika 2.24: Ključne korelacije u NOESY spektru (δ 9-6) jedinjenja 2.54 98 Slika 2.25: Deo NOESY spektra (δ 9-6) jedinjenja 2.54 Analogno dobijanju tetrahidroprotoberberina, sledeći korak bio je dobijanje dihidrogambirtaninske strukture. Na cikloadukt 2.50 primenjeni su blaži uslovi za aromatizaciju i dobijen je proizvod 2.55 (Shema 2.39). N H N CO2Me CO2Me N H N CO2Me CO2Me DCM MnO2 (10eq) 50 % 2.50 2.55 40 oC Shema 2.39 1H NMR Spektar jedinjenja 2.55 bio je nešto složeniji od spektra ketojobirinskog derivata 2.54. Na osnovu korelacije sa H-3 u COSY, odreñen je par dijastereotopnih 99 protona H2C-14. Samo jedan od njih pokazuje korelaciju u COSY sa H-3. Signali H2C-6 i H2C-5 se kupluju, što ukazuje na postojanje CH2-CH2 fragmenta. Par signala koji se ne kupluju sa drugim protonima su H-21, kao i aromatični protoni H-16 i H-19. Usled prostorne bliskosti korelacione signale u NOESY pokazuju H-19 i H2C-21. Dijastereotopni protoni H2C-14, pokazuju različite korelacione signale u NOESY. Jedan od njih pokazuje korelaciju sa N-H i H-16, dok drugi daje slab korelacioni signal sa H-16 (Slika 2.26). Slika 2.26 Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.55. 100 2.5. Sinteza benzohinolizinskih derivata Kako je dokazano da se aromatizacijom cikloadukata pomoću MnO2 mogu dobiti različite strukture u zavisnosti od stepena oksidacije sistema, u sledećem koraku je proučavana primenljivost razvijenog pristupa i na druga heterociklična jedinjenja. Primenom sekvence reakcija na nesupstituisani piridin, bilo bi moguće dobiti dienski sistem hinolizinske strukture. Diels-Alderovom reakcijom takvog diena sa različitim dienofilima i aromatizacijom nastalog cikloadukta bilo bi moguće dobiti benzohinolizinsku strukturu. Proučavanjem nekih supstituisanih derivata benzohinolizina ustanovljeno je da imaju različitu biološku aktivnost, pri čemu je najizraženije antiamnezivno dejstvo. Derivat na slici 2.27 pokazuje samo dva puta slabije antiamnezivno dejstvo od standardnog jedinjenja, takrina.97 N H H NHMe Cl Slika 2.27: Derivat benzohinolizina sa antiamnezivnim dejstvom Očekivano je da se prilikom adicije Grignardovog reagensa na kvaternarnu piridinijum-so dobiju dva proizvoda enaminske strukture, usled alilovanja položaja C-2 i C- 4 piridina. 98 Samo proizvod alilovanja položaja C-2 piridina bio bi pogodan prekursor za Heckovu ciklizaciju, kojom bi trebalo da se dobije dien hinolizinske strukture (shema 2.40). 101 N N Br Br N Br NN R R ? N Br [O] Shema 2.40 2.5.1. Sinteza hinolizinskog diena Reakcijom piridina sa brompropenil-bromidom, dobijena je kvaternarna so 2.56 u veoma dobrom prinosu. Ova piridinijum-so je prilično higroskopna, tako da se ne sme duže izlagati vazduhu (shema 2.41). N Br MeCN ∆ Br N Br Br 2.56 80 % Shema 2.41 Adicija Grignardovog reagensa na kvaternarnu so 2.56 izvršena je pod standardnim reakcionim uslovima, uz dobijanje dva proizvoda. Dobijena smeša sirovih enamina 2.57 i 2.58 je potom podvrgnuta redukciji pomoću NaBH3CN i dobijena je smeša dva proizvoda 102 2.59 i 2.60 u odnosu 1:1, koja je prečišćena hromatografijom radi izolovanja i karakterizacije. Nakon analize NMR spektara, ustanovljeno je da je nepolarniji proizvod, 2.59, rezultat adicije alil-Grignardovog reagensa na C-2 piridina, dok je polarniji proizvod, rezultat adicije na položaj C-4. Redukcijom C-4-alilovanog derivata piridina dobijena je piperidinska struktura 2.60, pošto su obe enaminske grupe redukovane (shema 2.42). Br Mg N Br Br N Br N Br NaBH3CN MeOH N Br N Br 2.56 2.57 2.58 2.59 2.60 Et2O 46 % 1:1 + Shema 2.42 Reakcija ciklizacije prekursora 2.59 izvedena je pod standardnim Heckovim uslovima i dobijen je dehidrohinolizinski dien 2.61. Pretpostavlja se da je razlog niskog prinosa reakcije dobijanje i sporednih proizvoda izomerizacije i polimerizacije, ali zbog kompleksnosti reakcione smeše nisu bili izolovani i okarakterisani (Shema 2.43). U literaturi do sada nije opisano uspešno dobijanje hinolizinskog diena iz sličnih supstrata usled dobijanja isključivo proizvoda izomerizacije.99 103 N Br Pd(OAc)2, PPh3 K2CO3 MeCN, ∆ N 26 % 2.612.59 Shema 2.43 Specifični signali jedinjenja 2.61 u 1H NMR-u potiču od protona dve =CH2 grupe egzocikličnih dvostrukih veza. Svaki od navedenih protona se javlja u vidu tripleta, na δ ~5,13, 5,09, 4,81 i 4,75. Analiza NOESY i COSY spektara je omogućila njihovo odreñivanje. U COSY spektru se javljaju korelacioni signali izmeñu H2C-1 i H-9a; H2C-6 i H2C-7. Identifikaciji signala znatno je doprinelo proučavanje 3D-modela strukture 2.61, na kome je očigledna prostorna bliskost protona signala H-9a i H-6α, H-4α i H-6α, H-4β i H- 6β H-9 i H-1α. Korelacije u NOESY i odgovarajuća 3D struktura jedinjenja 2.61 su na slici 2.28 i 2.29. Slika 2.28: Korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.61 104 Slika 2.29: Konformacija jedinjenja 2.61 minimizovana PM6 metodom. 2.5.2. Diels-Alderova reakcija hinolizinskog diena Sledeći korak bio je proučavanje reaktivnosti dobijenog hinolizinskog diena u Diels-Alderovoj reakciji. Reakcijom diena 2.61 sa DMAD pod termičkom uslovima dobijen je cikloadukt 2.62 u dobrom prinosu (shema 2.44). N DMAD toluen ∆ N CO2Me CO2Me 72% 2.622.61 Shema 2.44 U IR spektru dobijenog jedinjenja 2.62 javljuju se trake koje potiču od C=O estra. U 1H NMR spektru cikloadukta nema signala koji potiču od protona iz egzocikličnih 105 dvostrukih veza, specifičnih za polazni dien, dok je izostanak specifičnih signala =CH2 grupa na δ~109 u 13C NMR spektru dodatno potvrdio strukturu. Svi ostali spektralni podaci odgovaraju pretpostavljenoj strukturi 2.62. Na ovaj način dobijen je cikloadukt hinolizinskog tipa koji je potencijalni prekursor u sintezi benzohinolizinskih derivata. 2.5.3. Oksidacioni procesi hinolizinskog cikloadukta Bilo je interesantno da se ustanovi sklonost ovakvog sistema prema aromatizaciji. Očekivano bi bilo da se 1,3-dienski prsten dobijen cikloadicijom aromatizuje, ali postavljalo se pitanje reaktivnosti hinolizinskog dela strukture. U ovom molekulu, za razliku od izohinolinskih i karbolinskih cikloadukata, nije postojala mogućnost konjugacije sa već prisutnim aromatičnim jezgrom. Najpre je cikloadukt 2.62 izložen “blažim” uslovima za aromatizaciju (10 eq MnO2), i posle 3 h, dobijen je proizvod 2.63 (tok reakcije je praćen TLC-om) (shema 2.45). Za razliku od oksoprotoberberinskih i ketojobirinskih struktura, gde je Dragendorffov reagens bio od velike pomoći u identifikaciji proizvoda, ovde je bio samo indikator toka reakcije, jer su se mrlje koje odgovaraju polaznom jedinjenju i proizvodu bojile u crveno. N CO2Me CO2Me MnO2 DCM N CO2Me CO2Me 80% 2.62 2.63 Shema 2.45 U IR spektru proizvoda 2.63 jedina specifična traka potiče od C=O estra na 1716 cm−1, što se ne razlikuje od polaznog cikloadukta. Analizom 1H NMR spektra uočena su dva singleta u aromatičnom regionu, na δ 7,46 i 7,43, pored postojećih signala iz olefinske veze (δ 5,89 i 5,85). Pojava nova dva signala poreklom od aromatičnih protona ukazala je 106 na to da je prsten nastao cikloadicijom aromatizovan. Važne korelacije u NOESY spektru koje su nam potvrdile strukturu jedinjenja 2.63 prikazane su na slici 2.30. COSY i NOESY spektri jedinjenja 2.63 su na slikama 2.31 i 2.32. Slika 2.30: Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.63 Slika 2.31 NOESY Spektar (δ 8-2) jedinjenja 2.63 107 Slika 2.32 COSY Spektar (δ 8-2) jedinjenja 2.63 Na ovaj način razvijena je i metodologija za sintezu tetrahidrozohinolinskih derivata sa različitim supstituentima u aromatičnom jezgru, polazeći od nesupstituisanog piridina. Sledeći korak bio je aromatizacija hinolizinskog cikloadukta 2.62 pod energičnijim uslovima. Primenom većeg viška MnO2 dobijen je proizvod 2.64 zanimljive strukture (shema 2.46).100 N CO2Me CO2Me MnO2(30eq) DCM N CO2Me CO2Me O53%2.62 2.64 Shema 2.46 108 Detaljnom analizom IR, 1H NMR i 2D NMR spektara odreñena je struktura proizvoda 2.64. Za razliku od prethodne aromatizovane strukture 2.63, u U IR spektru se, pored trake C=O estra na 1716 cm−1 pojavila nova traka na 1669 cm−1, koja odgovara C=O enamida. 1H NMR je znatno jednostavniji za interpretaciju od prethodnih struktura, a ključnu ulogu u odreñivanju strukture imala je interpretacija NOESY spektra. Svi protoni su pokazivali korelaciju sa susednim protonima, izuzev singleta na δ 9,11 (H-7), koji je pokazivao korelaciju jedino sa metil-grupom iz estra na C-8. Na slici 2.33 prikazana je struktura jedinjenja 2.64 sa ključnim NOE korelacijama. Na ovaj način smo dobili zanimljivu planarnu akridizinsku strukturu.108 Slika 2.33: Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.64 109 2.6. Biološka ispitivanja sintetisanih protoberberinskih derivata 2.6.1. Ispitivanje citotoksičnog dejstva nekih sintetisanih protoberberinskih derivata Širok spektar biološke aktivnosti protoberberina usmerio je delimično naša istraživanja ka ispitivanju citotoksičnog dejstva nekih sintetisanih jedinjenja.11-13,20 Preliminarna ispitivanja zasnovana su na in vitro ispitivanju citotoksičnog dejstva pet derivata ove klase jedinjenja na tri maligne ćelijske linije: HeLa (ćelije humanog adenokarcinoma), FemX (ćelija humanog melanoma) i K562 (humanih ćelija mijelogene leukemije) u poreñenju sa cisplatinom. Odabrana su jedinjenja iz klase izohinolinskih cikloadukata i oksoprotoberberina. IC50 Koncentracija se definiše kao koncentracija supstance (leka) koja inhibira opstanak ćelije za 50% u poreñenju sa kontrolnim uzorkom (ćelije koje rastu samo u hranljivom medijumu). U tabeli 2.6 su prikazani preliminarni rezultati ispitivanja in vitro citotoksičnosti protoberberinskih derivata. Date su IC50 vrednosti (sa standardnim devijacijama, SD) za ispitivane derivate, kao i IC50 cisplatina za ispitivane ćelijske linije. Na osnovu preliminarnih rezultata ispitivanja citotoksične aktivnosti protoberberina ka različitim ćelijskim linijama možemo zaključiti da najnižu vrednost IC50 koncentracije prema FemX, HeLa i K562 ćelijama pokazuje monosupstituisani cikloadukt 2.17, koji pokazuje veću citotoksičnost prema navedenim malignim ćelijskim linijama od disupstituisanog cikloadukta 2.7. Ispitivani cikloadukti pokazuju veću citotoksičnu aktivnost od njima odgovarajućih oksoprotoberberina. Poredeći aktivnosti samih oksoprotoberberina, monosupstituisani (2.29) pokazuje veću aktivnost od disupstituisanog derivata (2.26). Zbog male rastvorljivosti oksoprotoberberina u ispitivanom medijumu ne mogu se sa sigurnošću porediti njihove aktivnosti meñusobno. Jedno od mogućih objašnjenja za veću aktivnost cikloadukata je prisustvo baznog azota, koji ne postoji u oksoprotoberberinskim strukturama. 110 Tabela 2.6: IC50 Vrednosti sintetisanih protoberberinskih derivata prema malignim ćelijskim linijama N COOMe COOMe N COOMe COOMe 2.7 2.25 O N COOMe2.17 N COOMe 2.29 O N COOMe COOMe 2.26 O MeO MeO Struktura jedinjenja FemX HeLa K562 88,48±9,01 82,89±12,35 53,29±2,42 178,21±1,97 134,49±6,99 101,15±11,19 65,53±0,52 38,10±8,83 24,70±0,24 188,38±8,87 120,75±11,83 85,57±28,98 IC50 (µM)±SD 1 2 3 4 5 (~200) (192,45) 188,08±13,39 92,82±6,26 85,94±1,12 (178,54) (164,82) Cisplatin6 6,51±0,36 4,85±0,36 4,90±0,36 111 Jedinjenja 2.25, 2.29 i 2.26 kristalisala su u medijumu, tako da su u zagradama date vrednosti IC50 nakon filtracije. Jedinjenje 2.26 nije filtrirano. U planu je ispitivanje antikancerogenog dejstva još nekih derivata protoberberinskog i β-karbolinskog tipa (slika 2.34). N COOMe N COOMe COOMe MeO MeO N COOMe COOMe N COOMe COOMe 2.382.28 2.70 2.71 2.17a N H N COOMe COOMe N H N COOMe COOMe N H N COOMe COOMe O 2.50 2.55 2.54 N COOMe COOMe O Slika 2.34: Sintetisani protoberberinski i β-karbolinski derivati sa potencijalno antikancerogenom aktivnošću 112 2.7. Funkcionalizacije različitih dienskih sistema pomoću Pd-katalizovanih reakcija U prethodnim poglavljima bilo je reči o našem pristupu u sintezi policikličnih skeleta prirodnih proizvoda. Ključni intermedijer u sintezi protoberberinskih struktura bio je izohinolinski dien, dok je tetrahidro-β-karbolinski dien omogućio sintezu ketojobirinskog i gambirtaninskog skeleta. Pored pomenutih Diels-Alderovih cikloadicija, izučavali smo i druge vidove funkcionalizacije ovih dienskih sistema. Uvoñenjem odgovarajuće funkcionalne grupe na dienski sistem derivata izohinolina ili β-karbolina omogućili bismo pristup mnogim derivatima različitih struktura sa potencijalno boljim biološkim osobinama. Takoñe, zahvaljujući principima sinteze usmerene ka diverzitetu ciljnih molekula (“diversity orientated synthesis“)66 očekivalo se da dienski sistemi heterocikličnog tipa mogu predstavljati dobru osnovu za dobijanje kompleksnih struktura. 2.7.1. Sinteza alilnih acetata iz karbocikličnih diena U našim laboratorijama već je razvijena metoda za dobijanje alilnih acetata iz alenskih prekursora.101 Ova metodologija je zasnovana na reaktivnosti alena u prisustvu acetata kao nukleofila, a vrši se preko pi-alil-paladijumske vrste.102 Kako su alil-acetati veoma važna jedinjenja u organskoj sintezi, proučavali smo i mogućnost reakcije nukleofilnog acetata sa pi-alil-paladijumskom vrstom formiranom iz diena (shema 2.47).103 Potencijalni problem u ovoj sintezi može predstavljati druga faza reakcije, koja je povratna, zbog čega može doći do sporednih reakcija pi-alil-paladijumske vrste. 113 Pd(0) Pd ArX AcO- Ar Ar OAc Shema 2.47 Da bismo pokazali da je sinteza alilnih acetata iz diena metoda opšteg karaktera i radi jednostavnije identifikacije proizvoda, planirano je da se reakcija najpre primeni na simetričan dien dobijen iz alilovanog dietil-malonata. Reakcijom alil-dietilmalonata sa dibrom-propenom dobijen je bis-alilovani derivat 2.65, pogodan prekursor za Heckovu reakciju. Intramolekulskom ciklizacijom pod Heckovim uslovima iz jedinjenja 2.65 dobijen je simetričan dien 2.66 (shema 2.48). 104 CO2EtEtO2C Br Br NaH THF CO2EtEtO2C Br CO2EtEtO2C H 94% Pd(OAc)2, PPh3 Ag2CO3 MeCN ∆ 62% 2.662.65 Shema 2.48 Sledeća faza bila je ispitivanje reaktivnosti dobijenog diena i mogućnosti dobijanja alilnih acetata. Dien 2.66 sa p-metoksi-jodbenzenom u prisustvu Pd(OAc)2 (10 mol%), PPh3 (20 mol%) i AcONa (5 eq) u DMSO dao je alilni acetat 2.67 (shema 2.49). 101 114 CO2EtEtO2C CO2EtEtO2C OAcMeOI MeO + 51% DMSO Pd(OAc)2, PPh3 AcONa 2.66 2.67 Shema 2.49 Dobijeni proizvod 2.67 pokazuje jednu estarsku traku u IR spektru, pošto je došlo do preklapanja C=O traka acetata i malonata. U GC/MS spektru se vidi specifičan jon nastao gubitkom acetata, a konačnu potvrdu strukture dobili smo analizom NMR spektara. U 13C NMR spektru uočljiva su dva signala od estarskih karbonila, na δ 171,8, poreklom od dva identična malonata i na δ 171,0, od acetata. S obzirom na delimično simetričnu strukturu, broj signala je odgovarajuće manji. 1H NMR Spektar je relativno jednostavan, uočljivi su prošireni singleti na δ 4,71 od metilenske grupe vezane za acetat i na δ 3,40, od benzilnih protona. Široki singleti na δ 3,10 i 2.89 potiču od metilenskih protona H-2 i H-5. Dva oštra singleta na δ 3,79 i 2,08 potiču od metoksi grupe i metil grupe iz acetata (slika 2.35). CO2EtEtO2C OAcMeO 12 3 4 5 Slika 2.35 U tabeli 2.7 prikazani su još neki primeri dobijenih alilnih acetata iz diena 2.66 pomoću različitih aril-jodida.105, 106 Reakcije diena sa aril-jodidima koji poseduju elektron- privlačne grupe daju proizvode u boljem prinosu. 115 Tabela 2.7: Alilni acetati dobijeni iz diena 2.66 I Dien ArI Alil-acetat Prinos (%) CO2EtEtO2C I CO2EtEtO2C OAc CO2EtEtO2C OAc 40 22 2.66 2.68 2.69 2.7.2. Sinteza alilnih acetata iz heterocikličnih diena Kako se funkcionalizacija alifatičnog dienskog sistema pokazala uspešnom, bilo je zanimljivo primeniti navedene reakcione uslove na izohinolinski dien, i time sintetisati alilne acetate heterocikličnog tipa. Na ovaj način bio bi omogućen pristup novoj klasi jedinjenja izohinolinske strukture. Na izohinolinski dien 2.4 primenjeni su uslovi za sintezu alilnih acetata iz diena, pri čemu je s obzirom na nesimetričnu strukturu, neočekivano dobijen samo jedan regioizomer 2.70 u prinosu od 47 % (shema 2.50). 116 N Pd(OAc)2, PPh3 AcONa DMSO N OAc I + 47% 2.4 2.70 Shema 2.50 U IR spektru dobijenog proizvoda 2.70 uočljiva je jaka traka od C=O acetata, a u GC/MS uočen je jon na m/z 287,1 nastao gubitkom CH2OAc iz molekulskog jona. Struktura proizvoda 2.70 je potvrñena analizom NMR spektara. Pomoću HSQC spektra odreñen je H-11b u vidu dvostrukog dubleta na δ 3,46, kao jedini C-H signal. U COSY spektru su na osnovu kuplovanja sa H-11b odreñeni i H-1α (multiplet na δ 2,59-2,51) i H- 1β u vidu tripleta na δ 2,15. Fragment CH2-CH2 pripada položajima H2C-7 i H2C-6. Protoni iz položaja H2C-4 se javljaju u vidu jednog dubleta na 3,50, dok je drugi signal u vidu multipleta na δ 3,16-3,11, preklopljen sa signalima H-7α i H-6α). Signali alilne CH2 grupe vezanih za kiseonik iz acetata, javljaju se u vidu dubleta na δ 4,81 i 4,69, sa geminalnom konstantom kuplovanja J=12,5 Hz. Benzilni protoni su u vidu dubleta na δ 3,59 i 3,39, svaki sa geminalnom konstantom kuplovanja J=15,0 Hz. Za odreñivanje regiohemije, ključna je bila interpretacija NOESY spektra. Usled prostorne bliskosti H-1β i benzilnih protona, pojavljuje se njihov korelacioni signal u NOESY spektru. Korelaciju u NOESY pokazuje i H-4α sa CH2OAc (slika 2.36). Na osnovu ovih signala pretpostavljena je struktura jedinjenja 2.70, čiji je NOESY spektar je predstavljen na slici 2.37. 117 N H2C CH2OAc 1 4 6 11b Slika 2.36: Ključne korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.70 Pošto je bilo iznenañujuće dobijanje samo jednog regioizomera, snimljen je i NMR spektar sirove reakcione smeše ali interpretacija nije bila jednostavna zbog preklapanja signala. Uočeno je postojanje singleta poreklom od CH3-Ph (δ 2,31), metil grupe neizreagovalog p-tolil jodida, kao i CH3CO (δ 2,07), što sugeriše postojanje jednog izomera. Nastanak jednog regioizomera nije jednostavno objasniti; moguće je da regiohemiju kontroliše koordinacija dvostruke veze sa aromatičnim jezgrom. Slika 2.37: NOESY spektar jedinjenja 2.70 118 Reakcijom izohinolinskog diena 2.4 sa naftil-jodidom, dobijen je proizvod 2.71 (shema 2.51). N OAc N Pd(OAc)2, PPh3 AcONa DMSO 37% α-naftiljodid 2.712.4 Shema 2.51 Sličnost u strukturi izmeñu proizvoda 2.71 i nekih emetinskih derivata (slika 2.38) sugeriše mogućnost sinteze emetinoida primenom ove metodologije, što je predmet proučavanja u našoj laboratoriji. 107 N H N H MeO MeO Emetin N N H MeO MeO Emetamin N H N H MeO MeO Dehidroemetin H Slika 2.38: Primeri biološki aktivnih emetinoida 119 Rezultati dobijanja ostalih heterocikličnih alilnih acetata prikazani su u tabeli 2.8. Analogno odreñivanju strukture jedinjenja 2.70, odreñene su i strukture ostalih alilnih acetata sa izohinolinskim jezgrom. Reakcija dobijanja alilnih acetata primenljiva je i na tetrahidro-β-karbolinski dien 2.49, što omogućuje dodatnu funkcionalizaciju β-karbolinskih derivata. Tabela 2.8: Alilni acetati dobijeni iz heterocikličnih diena N N OAc I N H N N H N OAcI Dien ArI Alil-acetat Prinos % 30 34 I MeO N OAc OMe 32 2.4 2.72 2.73 2.742.49 120 2.8. Alternativni pristup sintezi protoberberinskog skeleta U cilju razvijanja alternativnog sintetskog puta za dobijanje protoberberinskog i ketojobirinskog skeleta (put a, shema 2.52), započeto je proučavanje pristupa u kome je dienofil izohinolinske ili β-karbolinske strukture (put b, shema 2.52). Na ovaj način bila bi omogućena funkcionalizacija položaja C-9, C-10, C-11 i C-12, što prethodno razvijenom metodologijom, mada moguće, znatno je otežano. N R R N R R R R R R a N N R R R R b 10 11 9 10 1112 Shema 2.52 2.8.1. Sinteza tetrahidro-β−karbolinskog enamida kao dienofila U našim ranijim radovima proučavana je sinteza tetracikličnog derivata β-karbolina reakcijom alilovanja kvaternarne β−karbolinijum-soli 2.75 i reakcijom olefinske metateze bis-alilovanog derivata 2.76. Prvobitna ideja bila je da se ovakav derivat dalje 121 funkcionalizuje.26, 108 Dobijeni ciklizacioni proizvod 2.77 mogao bi biti polazno jedinjenje za naknadne transformacije (shema 2.53). N H N N H N N H N 2.75 2.76 2.77 Shema 2.53 Kvaternizacija dihidro-β−karbolina 2.46 pomoću alil-bromida se odvija po već opisanom postupku, reakcijom u acetonitrilu, pri čemu se dobija kvaternarna so 2.75 (shema 2.54). N H N Br Br N H N MeCN ∆ 2.46 2.7580 % Shema 2.54 Posle kvaternizacije je izvršena reakcija In-katalizovanog alilovanja kvaternizovanog dihidro-β−karbolina 2.75, uz dobijanje bis-alilovanog proizvoda 2.76 (shema 2.55). U ovom slučaju se, za razliku od izohinolinskog sistema, ne dobija enaminska funkcionalna grupa, što pojednostavljuje sintezu. 122 N H N Br Br In THF N H N 2.75 2.76 40 % Shema 2.55 Reakcijom prekursora 2.76 sa Grubbsovim katalizatorom II generacije dobijen je proizvod olefinske metateze 2.77 u niskom prinosu, što je donekle u skladu sa literaturnim podacima (shema 2.56). Proučavanjem olefinske metateze izohinolinskih i karbolinskih derivata ustanovljeno je da baznost prisutnog azota nepovoljno utiče na prinos reakcije.109, 110 N H N N H NGrubbs II toluen ∆ 16%2.76 2.77 Shema 2.56 Zbog niskog prinosa prethodne reakcije (shema 2.56), funkcionalizacija jedinjenja 2.77 nije dalje proučavana. U cilju dobijanja prekursora za RCM bez baznog azota, pristupilo se sintezi akrilamidnog prekursora 2.79. Na ovaj način bilo bi takoñe omogućeno zatvaranje šestočlanog prstena uz nastanak dvostruke veze, a prisustvo baznog azota bi bilo izbegnuto. U literaturi je opisana reakcija alilovanja akriloil-karbolina pomoću alil-tributilkalaja na −78 oC.71, 111 Da bi se izbeglo korišćenje toksičnog reagensa i reakcija na niskoj temperaturi, metoda je modifikovana. Prvo je izvršena kvaternizacija dihidro-β-karbolina dodavanjem akriloil-hlorida na hladno, pri čemu nastaje intermedijerna kvaternarna so 2.78, a zatim je in situ generisan alil-indijumov reagens dodavanjem alil-bromida i 123 indijuma u prahu. β-Karbolinski akrilamid 2.79 dobijen je u niskom prinosu, ali je na ovaj način izbegnuta reakcija na vrlo niskoj temperaturi i primena toksičnog reagensa (shema 2.57).112 N H N N H N O Cl O THF NH N O Cl Br In THF 2.46 2.78 2.79 26 % Shema 2.57 Kao što je opisano u literaturi, olefinskom metatezom ovakvog prekursora primenom 6 mol% Grubbsovog katalizatora I generacije dobijen je proizvod 2.80 (shema 2.58). 113, 114 N H N O 2.79 N H N O 2.80 Grubbs I toluen s.t. 83 % Shema 2.58 2.8.2. Sinteza izohinolinskog enamida kao dienofila Kako je modifikovana reakcija za dobijanje alilovanih akrilamida dala željeni proizvod, planirano je i dobijanje izohinolinskog akrilamida, čije dobijanje nije opisano u litetraturi 71 (Shema 2.59). Reakcijom izohinolina i akriloil-hlorida nastaje intermedijerna kvaternarna so 2.81, na koju se adirao alil-indijumov reagens dajući alilovani akrilamid 2.82. Na ovaj način u izohinolinskom sistemu ne nastaje enaminska funkcionalna grupa, što 124 pojednostavljuje eksperimentalni postupak. Jedinjenje 2.82 nije u potpunosti okarakterisano, već je snimljen samo GC/MS koji je potvrdio očekivanu molekulsku masu. N THF N O Cl In, Br N O O Cl 25% 2.81 2.82 THF Shema 2.59 Očekivano je da ovako dobijen akrilamidni prekursor lako podleže reakciji olefinske metateze. Saglasno našim očekivanjima, ciklizacijom prekursora 2.82 na sobnoj temperaturi pomoću Grubbsovog katalizatora I generacije dobijen je očekivani proizvod 2.83 u dobrom prinosu (shema 2.60), tako da se pretpostavljena struktura 2.82 pokazala ispravnom.112 N O Grubbs I gen. 77% N ODCM, s.t. 2.82 2.83 Shema 2.60 Problem kod ovog pristupa za dobijanje protoberberinskog skeleta mogao bi biti slaba reaktivnost enamida 2.80 i 2.83 u reakcijama Diels-Alderovog tipa. U literaturi su opisane reakcije enamida u ulozi dienofila kada je prisutna dodatna elektron-akceptorska grupa na dvostrukoj vezi konjugovanoj sa karbonilnom grupom.115 Zbog nedostatka vremena, reakcije Diels-Alderovog tipa izohinolinskih i β-karbolinskih enamida nisu još proučavane. Jedan od planiranih ciljeva u našim laboratorijama jeste ispitivanje njihove 125 reaktivnosti i pronalaženje uslova za prevazilaženje slabe reaktivnosti ovih derivata. Time bi bila upotpunjena oba pristupa za dobijanje protoberberinskih i ketojobirinskih derivata polazeći od izohinolina i dihidro-β-karbolina. 2.9. Sinteza homoprotoberberina i njihovih tetrahidro-β-karbolinskih analoga Kao što je pomenuto u teorijskom delu, homoprotoberberini su pratioci protoberberina u biljnom materijalu. Slična struktura, veoma zanimljive biološke osobine njihovih prirodnih i sintetskih derivata podstakli su nas da sintetišemo ovakve strukture modifikacijom već primenjivanih metoda.16,18 Kako je već razvijen sintetski put za dobijanje protoberberinskih derivata, primenjen je sličan pristup za sintezu homoprotoberberina modifikovane strukture u odnosu na prirodne proizvode. U literaturi je poznato da tetrahidro-β-karbolinski i izohinolinski derivati mogu pokazivati antioksidativno i citoprotektivno dejstvo.116 S druge strane, stiren može delovati kao hvatač slobodnih radikala.117 Cilj našeg istraživanja u ovoj oblasti bio je dobijanje struktura, u kojima bi, pored izohinolinskog ili karbolinskog dela skeleta, postojao i benzazepinski deo, koji poseduje dvostruku vezu stirenskog tipa. Na taj način su u jednom molekulu iskombinovane dve jedinice koje bi mogle doprineti njihovoj antioksidativnoj aktivnosti. Sintetski put za dobijanje ovakve klase jedinjenja takoñe podrazumeva adiciju alil- indijumovog ili alil-Grignardovog reagensa na kvaternizovan izohinolin i dihidro-β- karbolin. Razlika u odnosu na prethodne reakcije je ta što se kvaternizacija vrši brombenzil- bromidom, tako da je ključni korak u sintezi zatvaranje sedmočlanog prstena C homoprotoberberina.118 Heck-ova intramolekulska reakcija pogodna je za ovu transformaciju, a na taj način moguće je dobiti egzocikličnu dvostruku vezu stirenskog tipa.119 126 2.9.1. Sinteze izohinolinskih i tetrahidro-β-karbolinskih benzo[c]azepina Neki pristupi za sintezu derivata homoprotoberberina koji se zasnivaju na kvaternizaciji izohinolina ili β-karbolina jodbenzil-bromidom, praćeno reakcijom sa nukleofilom i ciklizacijom opisani su u literaturi.49, 118 Naša prva reakcija ovog tipa izvedena je adicijom alil indijuma na kvaternizovan dihidro-β-karbolin, pri čemu se dobija prekursor za Heckovu reakciju. Sledeći korak je intramolekulska Heckova reakcija pri čemu se dobija pentaciklični derivat β-karbolina koji ima benzo[c]azepinsku strukturu. Kvaternizacija dihidro-β-karbolina je izvršena na uobičajen način, zagrevanjem sa brombenzil-bromidom u acetonitrilu, pri čemu je dobijen brombenzil-karbolinijum-bromid 2.84 u dobrom prinosu (shema 2.61). N H N Br Br N H N Br Br MeCN ∆ 2.46 2.84 80 % Shema 2.61 Alil-indijumov reagens je dobijen dodavanjem indijuma u prahu u rastvor alil- bromida i tetrahidrofurana u atmosferi azota, i naknadnim zagrevanjem. Adicijom dobijenog reagensa na kvaternarnu so 2.84 dobijen je prekursor za Heckovu reakciju 2.85 (shema 2.62). 127 N H N Br Br Br In THF N H N Br 55% 2.84 2.85 Shema 2.62 Heck-ova reakcija je izvoñena pod standardnim uslovima (shema 2.63). Ciklizacioni proizvod je dobijen u prinosu 36 %. Nešto slabiji prinos (30 %) dobija se primenom slabijih baza, K2CO3 i Na2CO3. N H N Br N H N Pd(OAc)2, PPh3 Cs2CO3 toluen ∆ 36%2.85 2.86 Shema 2.63 Analizom NMR spektara uočen je specifični singlet metilenske grupe na δ 5,24 koji se kupluje sa parom protona H2C-14. Na δ 4,34 javlja se signal H-13a u obliku dd koji se takoñe kupluje sa H2C-14. Korelacije izmeñu odgovarajućih protona u COSY spektru jedinjenja 2.86 prikazani su na slici 2.39. Slika 2.39: Korelacije u COSY spektru jedinjenja 2.86 128 Isti pristup je primenjen u sintezi homoprotoberberina iz izohinolina. Reakcijom alilovanja kvaternarne 3-metilizohinolinijum-soli 2.87 pomoću alil-indijuma i redukcijom dobijenog enaminskog proizvoda dobijen je prekursor za Heck-ovu reakciju 2.89 u prinosu 30 %. Reakcija alilovanja iste kvaternarne soli izohinolina pomoću alil-Grignardovog reagensa i redukcija enamina 2.88 protekla je u boljem prinosu, 62 % (shema 2.64). N Br MgBr Et2O N Br NaBH3CN MeOH N Br 62 % 2.87 2.88 2.89 Shema 2.64 U 1H NMR i GC/MS spektru prekursora za Heck-ovu reakciju 2.89 prisutni su tragovi drugog dijastereoizomera (15 %) ali dijastereoizomeri nisu mogli biti razdvojeni hromatografijom na koloni silika gela zbog iste Rf vrednosti. Izomer dobijen u višku prikazan je na slici. Ključni signali koji su pomogli odreñivanju date strukture su H-1 i H-3 koji pokazuju korelaciju u NOESY spektru (slika 2.40). N Br H H 1 3 4 Slika 2.40: Korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.89 Jedinjenje 2.89 izloženo je reakciji pod standardnim Heckovim uslovima i dobijena su dva proizvoda, 2.90 i 2.91. Primenom drugog katalitičkog sistema, Pd(PPh3)4, prinos 129 proizvoda se nije menjao (shema 2.65). Nepolarniji proizvod (po Rf vrednosti) je dobijen u višku 5:1. N Br N toluen ∆ 57%2.89 2.90 2.91 10mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq K2CO3 Shema 2.65 Analizom GC/MS spektara oba proizvoda uočeni su molekulski joni koji odgovaraju pretpostavljenoj strukturi. Detaljnom analizom 3D modela i NMR spektara uočeni su ključni signali koji su doprineli odreñivanju struktura. U NOESY spektru nepolarnijeg izomera 2.90, korelacioni signal H-6 i H-14a sugeriše prostornu bliskost ovih protona, dok metil grupa na C-6 ne pokazuje korelacioni signal sa H-14a. Proučavanjem konformacije potvrñena je prostorna bliskost ovih protona (slika 2.41). Kod polarnijeg izomera, 2.91, korelacioni signal u NOESY spektru postoji samo izmeñu H-6 i H2C-8. Iako na prvi pogled iznenañuje izostanak korelacionog signala izmeñu metil grupe na C-6 i H- 14a u ovom izomeru, proučavanje konformacije ukazuje na manju prostornu bliskost nego što bi se očekivalo. 130 N H 2.90 6 8 13 14 14a H Slika 2.41: Korelacije u NOESY spektru jedinjenja 2.90 i 2.91 i njihove konformacije minimizovane PM6 metodom. Ista sekvenca reakcija primenjena je i na 6,7-dimetoksi-izohinolin. Dobijanje homoprotoberberinske strukture sa ovim supstituentima je od značaja zbog veće sličnosti sa prirodnim, biološki aktivnim jedinjenjima.1-4 Alilovanjem kvaternarne soli 2.92 i redukcijom intermedijernog enamina dobijen je prekursor 2.93 (Shema 2.66). N Br MeO MeO Br 1. MgBr Et2O NaBH3CN MeOH 2. N Br MeO MeO 2.92 2.9340 % Shema 2.66 131 Reakcija ciklizacije 2.93 izvedena je pod Heckovim uslovima, pri čemu je dobijeno jedinjenje homoprotoberberinske strukture 2.94 (shema 2.67). N Br N MeO MeO MeO MeO 10 mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq K2CO3 toluen ∆ 52 % 2.942.93 Shema 2.67 Analizom NMR spektara potvrñena je pretpostavljena homoprotoberberinska struktura. 2.9.2. Sinteza piridinskog benzo[c]azepinskog derivata Da bi se dokazala primenljivost ove metodologije i na druge heterociklične sisteme, primenjena je sekvenca navedenih reakcija i na piridin, uz pretpostavku da će se dobiti zanimljiva benzazepinska struktura 2.95. Dobijanje ovakve strukture može biti od značaja zbog sličnosti sa biološki aktivnim jedinjenjima (shema 2.68).49, 99, 120 N N 2.95 Shema 2.68 Reakcija kvaternizacije primenjena je na nesupstituisan piridin. Kvaternarna piridinijum-so 2.96 dobijena je pod standardnim uslovima, reakcijom piridina sa brom- benzil bromidom (shema 2.69). 132 N Br Br N Br Br MeCN, ∆ 2.96 80 % Shema 2.69 Dobijena kvaternarna so 2.96 podvrgnuta je reakciji sa alil-Grignardovim reagensom, i dobijena su dva proizvoda, po TLC-u. Očekivano je da doñe do adicije alilmagnezijum-bromida na položaj C-2 i položaj C-4 piridina i stvaranja enaminskih struktura 2.97 i 2.98. Sirova smeša dobijenih enamina, od kojih je 2.98 dvostruki enamin, redukovana je na standardan način, pomoću NaBH3CN. Proizvod alilovanja na C-2, 2.99 je dehidropiridinske strukture, dok je redukcijom obe enaminske grupe proizvoda meñuproizvoda 2.98 nastala piperidinska struktura 2.100 (shema 2.70). 133 N Br Br Br Mg Et2O N N Br Br NaBH3CN MeOH N N Br Br 2.93 2.94 2.95 2.96 2.97 40 % 2:1 Shema 2.70 Odgovarajući prekursor za dobijanje benzazepinske strukture, 2.96, izložen je Heckovim uslovima i dobijen je ciklizacioni proizvod 2.92 u prinosu od 55% (shema 2.71). 10mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq K2CO3 toluen ∆ N Br N 55%2.96 2.92 Shema 2.71 134 U 1H NMR spektru jedinjenja 2.92 javljaju se specifični signali olefinskih protona H-1, u vidu multipleta na δ 5,76-5,73 i H-2 u vidu dvostrukog dubleta na δ 5,58. Signali protona koji pripadaju egzocikličnoj dvostrukoj vezi pojavljuju se u vidu singleta na δ 5,14 i dubleta na δ 5,10. Na osnovu HSQC odreñen je H-12a, koji daje multiplet na δ 3,43-3,40. Na osnovu njegovih korelacija u COSY spektru, odreñeni su H-1 i H-12. H-1, pored kuplovanja sa H-2, daje i korelacione signale sa H-3, dok se H-2 kupluje H-1 i H-3. Sa H-3 se kupluju samo protoni H-4, koji su u vidu dva dvostruka dubleta na δ 2,79 i 2,68. Signali koji se ne kupluju sa drugim protonima su dva H-6 protona (oba daju dublete, na δ 3,96 i 3,72). Ključne korelacije u COSY spektru su na slici 2.42. N 1 2 3 4 6 11 12 12a Slika 2.42: Ključne korelacije u COSY spektru jedinjenja 2.92 Na ovaj način, primenom sekvence reakcije kvaternizacije, alilovanja i Heckove ciklizacije omogućen je pristup različitim jedinjenjima koja poseduju benzo[c]azepinsku strukturu. 2.9.3. Sinteze izohinolinskih i tetrahidro-β-karbolinskih benzo[d]azepinskih derivata U klasi homoprotoberberina prisutne su dve vrste skeleta, C- i izo-C- homoprotoberberinski. Većina poznatih sintetskih metodologija omogućuje dobijanje C- homoprotoberberinskog skeleta, koji sadrži benzo[c]azepinski deo strukture. 16-18 Sledeća faza našeg istraživanja bila je primena razvijene metodologije u sintezi izo- C-homoprotoberberina sa egzocikličnom dvostrukom vezom stirenskog tipa. To bi 135 podrazumevalo uvoñenje benzil-grupe u položaj C-1 izohinolina i naknadnu ciklizaciju, pri čemu nastaje benzo[d]azepinska struktura. Razmatrana su dva pristupa za dobijanje ovih derivata. Prvi je podrazumevao adiciju benzil-Grignardovog reagensa na iminsku vezu izohinolina kvaternizovanog dibrom-propenom i naknadnu ciklizaciju reakcijom Friedel-Craftsovog tipa. Drugi pristup uključuje adiciju brombenzil-Grignardovog reagensa na alilizohinolinijum-so i Heckovu ciklizaciju dobijenog prekursora (Shema 2.72). N N Br N Br 1 2 2.100 2.104 2.105 Shema 2.72 Kvaternarne soli su sintetisane na standardni način. Benzil-Grignardov reagens 121 je adiran na so izohinolina sa dibrom-propenom (2.98), i dobijen je 1-benzilovani proizvod 2.99, koji je zatim redukovan po uobičajenom postupku za redukciju enamina, dajući 1- benzilni prekursor 2.100 (shema 2.73). N BrMg Br N Br N BrNaBH3CN Et2O MeOH 2.98 2.99 2.100Br Shema 2.73 136 Reakcija ciklizacije je ispitivana u prisustvu slabije i jače baze. U prisustvu slabije baze (K2CO3) nisu dobijeni proizvodi reakcije, dok je primenom jače baze, Cs2CO3, dobijen proizvod dealilovanja 2.101 u prinosu od 38 % (shema 2.74). 122 N Br10 mol% Pd(PPh3)4 1,5 eq K2CO3 10 mol% Pd(PPh3)4 1,5 eq Cs2CO3 toluen toluen NH 2.100 2.101 Polazno jedinjenje 2.100 Shema 2.74 Iz ovog razloga pristupilo se proučavanju sintetskog puta 2 (shema 2.72). Dobijanje prekursora 2.105 zasnovano je na adiciji brombenzil-Grignardovog reagensa na alil- izohinolinijum-so 2.104. Grignardov reagens je dobijen reakcijom brombenzilbromida sa 1,2 eq magnezijuma.121 Njegovom adicijom na kvaternarnu so, praćenom redukcijom sirovog enamina 2.104a dobijen je prekursor za Heck-ovu ciklizaciju 2.105 (shema 2.75). N BrMg Br N Br N Br Br NaBH3CN MeOH 50 % 2.104 2.104a 2.105 Et2O Shema 2.75 Reakcija ciklizacije jedinjenja 2.105 izvršena je primenom Heckovih uslova u prisustvu slabije baze i dobijen je proizvod izo-C-homoprotoberberinske strukture, 2.106. 137 Isti proizvod dobijen je i primenom drugog katalitičkog sistema, Pd(PPh3)4, pri čemu se prinos reakcije nije značajno menjao (shema 2.76). 10mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq K2CO3 N Br N toluen ∆ 40 %2.105 2.106 Shema 2.76 Analizom GC/MS i HRMS spektra potvrñeno je da je dobijen proizvod očekivane mase i bruto formule C19H19N, dok su analizom NMR spektara dobijene potpune informacije o strukturi jedinjenja 2.106. U 1H NMR-u su prisutni specifični signali protona iz metilenske grupe u obliku dubleta na δ 5,33 i singleta na δ 5,29. Signal H-14a, koji je u obliku dubleta na δ 4,36, kupluje sa dubletom H2C-14, što se potvrñeno u COSY spektru. Protoni H2C-8 se javljuju u vidu dubleta na δ 3,78 i 3,59 i kupluju se sa protonima egzociklične dvostruke veze. 1H NMR spektar jedinjenja 2.106 je na slici 2.43, dok su ključne korelacije u COSY spektru na slici 2.44. 138 Slika 2.43: 1H NMR Spektar jedinjenja 2.106 Slika 2.44: Korelacije H2C-8/=CH2 i H2C-14/H-14a u COSY spektru 2.106 Ova sekvenca reakcija je primenjena i na 3-metil-izohinolin, i dobijeno je jedinjenje 2.109 izo-C-homoprotoberberinske strukture (shema 2.77). 139 N BrMg Br N Br N Br Br NaBH3CN MeOH 35 % 10 mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq K2CO3 toluen ∆ N 30 % H H 2.107 2.107a 2.108 2.109 MeCN ∆ Shema 2.77 Interpretacijom 2D spektara ustanovljena je struktura proizvoda 2.109. Ključni signali za utvrñivanje orijentacije metil grupe na C-6 i H-14a nalaze se u NOESY spektru. Korelacioni signal izmeñu H-14a i H-6 ukazuje na blisku prostornu orijentaciju tih protona, što ide u prilog strukturi na slici 2.45. U NOESY spektru ne postoji signal koji bi ukazivao na prostornu bliskost metil-grupe i H-14a. Slika 2.45: Korelacije jedinjenja 2.109 u a) COSY i b) NOESY spektru U cilju dobijanja tetrahidro-β-karbolinskih benzo[d]azepina koji potencijalno imaju biološko dejstvo, ova sekvenca reakcija primenjena je i na dihidro-β-karbolinski sistem. Na 140 taj način dobili smo strukturu 2.111, koja je izomerna benzazepinskom derivatu karbolina 2.86. Alil-karbolinijum-so 2.75 dobijena je reakcijom dihidro-β-karbolina sa alil- bromidom u acetonitrilu (shema 2.56). Na alil-karbolinijum-so 2.75 adiran je brombenzil- Grignardov reagens (dodat u višku 3 eq) zbog kisele N-H veze i dobijen je prekursor 2.110 (shema 2.78). 2.75 2.110 BrMg Br N H N Br N H N Et2O 61 % Shema 2.78 Reakcija ciklizacije izvedena je pod standardnim Heckovim uslovima i dobijen je benzo[d]azepin 2.111 (shema 2.79). N H N N H N 10mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq K2CO3 toluen ∆ 57% 2.110 2.111Br Shema 2.79 Struktura derivata 2.111 odreñena je analogno jedinjenjima slične strukture. Na ovaj način pokazano je da se metoda za dobijanje benzo[d]azepina može uspešno primeniti i na β- karbolinski sistem. 141 2.10. Biološka ispitivanja sintetisanih benzazepinskih derivata 2.10.1. Antioksidativno dejstvo U organizmu slobodni radikali mogu da nastanu delovanjem raznih enzimskih i neenzimskih sistema smeštenih na ćelijskim membranama, u citoplazmi, plazma membrani i krvnim ćelijskim elementima. Produkcija slobodnih radikala u ljudskom organizmu je konstantna i predstavlja esencijalnu komponentu ćelijskog metabolizma i oni mogu biti od velike koristi za organizam ukoliko je njihova produkcija dobro kontrolisana i ograničena na odreñenim mestima gde su potrebni. Imunološki sistem stvara slobodne radikale koje koristi u napadu na ''spoljašnje napadače''. Narušavanjem ravnoteže izmeñu ćelijskih sistema koji proizvode slobodne radikale i onih koji održavaju antioksidantne odbrambene mehanizme nastaje oksidativni stres. Izlaganje ćelija oksidativnom stresu vrlo brzo dovodi do oštećenja na molekulu DNK. Prekidi na molekulu DNK kao i hidroksilacija baza, primarno su posledica stvaranja ·OH radikala iz vode u prisustvu prelaznih metala.123 Ovako generisani slobodni radikali koji su reaktivni i nestabilni u hemijskoj reakciji sa molekulima iz neposrednog okruženja često stvaraju hemijski stabilne DNK lezije. 2.10.1.1. Ispitivanje antioksidativnog dejstva sintetisanih benzazepina Pomenuto je da neki izohinolinski i β-karbolinski derivati pokazuju citoprotektivno dejstvo, dok stiren pokazuje osobine hvatača slobodnih radikala.116 Iz tog razloga dizajnirani su molekuli koji sadrže heterociklični deo, kao i stirensku grupu u strukturi. Ustanovljeno je da se citoprotektivno dejstvo nekih jedinjenja bazira na njihovoj sposobnosti da redukuju štetni uticaj nekih antitumornih agenasa na zdrave ćelije, bez umanjenja njegovog dejstva na tumorne ćelije. Cilj ovih ispitivanja bio je definisanje biološki aktivnog kompleksa ispitivanih benzazepinskih derivata koji ima optimalna antioksidativna svojstva, u cilju dobijanja jedinjenja ispitane biološke vrednosti i efekta. 142 Da bi ustanovio biološki efekat ispitivanih jedinjenja na humanim ćelijskim kulurama limfocita periferne krvi benzazepinski derivati su dodavani u odreñenoj koncentraciji i praćen je njihov efekat na humanim ćelijskim kulturama. Kao ’’pozitivna kontrola’’ korišćen je Amifostin, sintetski protektor poznatog protektivnog dejstva na humane ćelije,124 a ’’negativna kontrola’’bio je mitomicin C (MMC), mutageni agens čiji su biološki efekti poznati.125 Biološki efekat benzazepinskih derivata je u ćelijskim kulturama humanih limfocita meren promenom učestalosti mikronukleusa. Pošto mikronukleusi predstavljaju citogenetski odgovor ćelije na DNK oštećenja, smatra se da je indukcija mikronukleusa povezana sa dvolančanim oštećenjima DNK molekula i sa DNK reperom. Citohalazin B mikronukleusni test se koristi kao brza proba za klastogene agense (agense koji izazivaju prekide na hromozomima) i aneugene agense (hemijske supstance sposobne da izazovu poremećaj na nivou ćelijske deobe).126-128 Preliminarno su izvršena ispitivanja antioksidativnog dejstva nekih sintetisanih homoprotoberberina i njihovih tetrahidro-β-karbolinskih analoga. Odabrana su dva izohinolinska i dva tetrahidro-β-karbolinska derivata (slika 2.46). N H N N N N H N H 2.86 2.902.106 2.111 H Slika 2.46: Sintetski benzazepini čija je citoprotektivnost ispitivana 143 Dodavanjem 0,3 µM/ml jedinjenja 2.90 u ćelijske kulture, došlo je do smanjenja učestalosti mikronukleusa za 41 %, u odnosu na kontrolne ćelijske kulture (tabela 2.9). Dodavanjem 0,3 µM/ml jedinjenja 2.86 u ćelijske kulture, dolazi do smanjenja učestalosti mikronukleusa za 30,6 % u odnosu na kontrolne ćelijske kulture. Jedinjenje 2.111 kada se doda u koncentraciji od 0,3 µM/ml u ćelijske kulture, dovodi do smanjenja učestalosti mikronukleusa za oko 12 %, u odnosu na kontrolne ćelijske kulture. Dok ćelijske kulture koje su tretirane sa 0,3 µM/ml MS-144, pokazuju povećanje učestalosti mikronukleusa za 28,7 % u poreñenju sa kontrolnim vrednostima. Tretiranje ćelijskih kultura 0,1 µM/ml amifostina WR-272, dovodi do smanjenja učestalosti mikronukleusa za 26,4 % u poreñenju sa kontrolnim ćelijskim kulturama, dok tretiranje ćelijskih kultura 0,2 µM/ml mitomicinom C dovodi do povećanja učestalosti mikronukleusa za 16,2 % u poreñenju sa kontrolnim ćelijskim kulturama (tabela 2.9). Tabela 2.9: Učestalost MN, CBPI, distribucija MN po ćeliji i frekvencija MN merena u ćelijskim kulturama humanih limfocita tretiranih benzazepinskim derivatima. MN/Bnc PRI % Bnc sa MN MN/1000 Bnc DISTRIBUCIJA MN br Bnc Kontrola 2.86 2.106 2.111 2.90 Amifostin MMC 0,3 µΜ 0,3 µΜ 0,3 µΜ 0,2 µΜ 0,3 µΜ 0,1 µΜ 1,27 1,05 1,05 1,12 1,26 1,00 1,20 1,60 1,65 1,70 1,65 1,60 1,70 1,66 2,08 1,74 3,00 1,84 1,40 1,85 2,60 26,50 18,40 34,10 23,30 15,60 19,51 30,80 1058 1031 1086 1028 1016 1025 1037 0 1 2 3 1036 17 4 1 1013 1053 1009 1002 1006 1010 17 30 15 14 18 24 1 2 3 0 1 2 0 1 1 0 0 1 ∆ ΜΝ -30,6 +28,7 -12,1 -41,1 -26,3 +16,2 (%) MN/Bnc→ broj mikronukleusa po binuklearnoj ćeliji PRI→ proliferacioni indeks % Bnc sa MN → procenat binuklearnih ćelija sa mikronukleusima 144 MN/1000 Bnc→ broj mikronukleusa na 1000 pregledanih binuklearnih ćelija ∆ MN-promena učestalosti MN u odnosu na kontrolu (%) Br.Bnc→ ukupan broj pregledanih binuklearnih ćelija Distribucija MN→ distribucija mikronukleusa po ćeliji MMC→mitomicin C (klastogeni agens koji izaziva strukturne promene hromatinskog materijala i ima citotoksični efekat) Još uvek nije poznato koji mehanizam dovodi do redukcije broja mikronukleusa kod jedinjenja 2.90, kao i do povećanja učestalosti mikronukleusa pri istoj koncentraciji 2.106. Zajedničko za sve strukture je prisustvo benzazepinskog fragmenta, kao i egzociklična dvostruka veza stirenskog tipa. Najaktivnije jedinjenje, 2.90 ima C- homoprotoberberinski skelet, drugo po redu, 2.86 ima tetrahidro-β-karbolinsko jezro, ali takoñe poseduje benzo[c]azepinsku strukturu. Iz ovoga se može zaključiti da način vezivanja benzazepinskog prstena više utiče na aktivnost nego vrsta osnovnog heterocikličnog skeleta (slika 2.47). N N Slika 2.47: Zajednički strukturni fragmenat ispitivanih jedinjenja Nešto niže citoprotektivno dejstvo ima jedinjenje 2.111, tetrahidro-β-karbolinski derivat sa benzo[d]azepinskim skeletom. Jedina struktura koja pokazuje citotoksični efekat je izo-C-homoprotoberberinsko jedinjenje, 2.106. Jedno od mogućih objašnjenja za antioksidativnu aktivnost ovih jedinjenja je reaktivnost stirenskog dela molekula, koji može reagovati kao hvatač radikala (shema 2.80).117 145 N N R R Shema 2.80 S druge strane, kod dehidrokarbolinskih derivata indolov azot može hvatanjem slobodnih radikala dati indolil-katjon ili neutralni radikal (shema 2.81).129 N H N N N N N H Shema 2.81 Bilo bi zanimljivo testirati još neke slične derivate radi utvrñivanja dela strukture odgovornog za aktivnost. Sinteza derivata sa zaštićenim indolovim azotom bi bila bitna za utvrñivanje efekta nastajanja indolil-radikala. Derivati sa redukovanom dvostrukom vezom bi bili neophodni za potvrdu važnosti stirenske veze. 146 2.10.2. Ispitivanje citotoksične aktivnosti sintetisanih benzazepina Antiproliferativno dejstvo sintetisanih benzazepinskih derivata preliminarno je ispitivano in vitro na malignim ćelijskim linijama: HeLa (ćelije humanog adenokarcinoma cerviksa), FemX (ćelija humanog melanoma) i K562 (humanih ćelija mijelogene leukemije). IC50 koncentracija se definiše kao koncentracija supstance (leka) koja inhibira opstanak ćelije za 50% u poreñenju sa kontrolnim uzorkom (ćelije koje rastu samo u hranljivom medijumu). Rezulati dobijeni ispitivanjem citotoksičnosti benzazepinskih deriveta na navedenim ćelijskim linijama prikazani su u tabeli 2.9. Jedinjenja klase homoprotoberberina (2.87, 2.88 i 2.105) su pokazala veću in vitro citotoksičnu aktivnost prema navedenim ćelijskim linijama od protoberberina (tabela 2.5), dok je najveću citotoksičnu aktivnost pokazao benzazepinski derivat β-karbolina 2.111. U strukturama svih ispitivanih benzazepinskih derivata postoji bazni azot, i nesupstituisano aromatično jezgro. Zanimljivo je da su jedinjenja 2.90 i 2.111 koja pokazuju citotoksično dejstvo na različite tumorne ćelije, pokazala i citoprotektivno dejstvo na limfocite, dok je jedinjenje 2.106 citotoksično u oba slučaja (tabela 2.10). Iako su u pitanju testovi različite vrste, bilo bi interesantno ispitati detaljni mehanizam dejstva ovih jedinjenja. 147 Tabela 2.10: Koncentracije ispitivanih jedinjenja koje dovode do 50% manjeg preživljavanja u kulturi ćelija Cisplatin 6,51±0,36 4,85±0,36 4,90±0,36 Struktura jedinjenja FemX HeLa K562 IC50 (µM)±SD 1 2 3 4 N H N N N H 2.90 2.106 N H H 2.91 H 53,88±7,68 74,70±5,81 30,85±8,47 48,40±11,57 60,13±5,23 28,25±8,47 39,91±7,82 76,16±3,12 44,34±9,53 17,49±1,1833,59±10,10 31,52±5,68 2.111 148 2.11. Sinteze pirolidinskih derivata Pored navedenih anelacija, predmet našeg proučavanja bile su i reakcije koje bi vodile sintezi pirolidinskog prstena, kao i derivata kainske kiseline, prirodnog proizvoda marinskog porekla sa izraženim dejstvom na centralni nervni sistem.130 U literaturi su opisani različiti postupci za dobijanje kainske kiseline i njenih derivata (slika 2.48).131 N H CO2H CO2H N H CO2H CO2H N H CO2H CO2H Kainska kiselina Alo-kainska HO2C H Domoièna kiselina Slika 2.48: Kainska kiselina i kainoidi Reakcije paladijumom katalizovane ciklizacije 1,2,7 triena su opisane u literaturi i predstavljaju efikasnu metodologiju za dobijanje različito supstituisanih pirolidinskih prstenova.132 Na shemi 2.82 predstavljena je jedna od reakcija ovog tipa. N Mts N Ar Mts 10mol% [Pd (PPh3] K2CO3 Dioksan, ∆ ArI 85 % Shema 2.82 Na osnovu uspešno izvedenih sinteza ovog tipa, pretpostavljeno je da bi pristup koji je zasnovan na zatvaranju pirolidinskog prstena stvaranjem veza C-3−C-4 iz sličnih jedinjenja sa alenskom vezom mogao biti primenjen u sintezi kainoida (shema 2.83). 149 N H R R 5 2 34 N Tos Ar N O Pd Tos N O Tos 2.112 2.113 2.114 Ar N Pd Tos ba E E R R Shema 2.83 Sintetski put a zasnovan je na reakciji ciklizacije alenil-epoksidnog derivata.133 Na taj način bilo bi moguće dobiti derivat sa primarnom alkoholnom grupom na C-3, dok bi položaj C-4 bio funkcionalizovan izopropenil-supstituent sa aril-grupom. Pristup b podrazumeva ciklizaciju alenskog derivata u čijem molekulu postoji dvostruka veza za koju je vezana elektron-akceptorska grupa. Na ovaj način bi ciklizacijom bilo moguće dobiti petočlani prsten pirolidinskog tipa, sa elektron privlačnom grupom u položaju C-3, a u C-4 bi, kao i kod pristupa a, bio uveden izopropenil-supstituent sa aril-grupom. U cilju dobijanja prekursora koji bi poslužio kao model sistem za pristup a, najpre je sintetisan epoksi-alenski derivat. Reakcijom tozilamida sa etilhlor-formijatom sintetisan je karbamat 2.115, čijim je propargilovanjem dobijen amid 2.116. Uvoñenjem alenske grupe i hidrolizom karbamata 2.117 134 dobijen je alen 2.118 (shema 2.84). 150 NH2Tos NHTos CO2Et N Tos N CO2Et Tos CO2Et N H Tos ClCO2Et K2CO3 Aceton ∆ Br K2CO3 MeCN ∆ Cu2O, CH2O iPr2NH Dioksan ∆ NaOH, H2O THF, MeOH 2.115 2.116 2.117 2.118 70 % 100% 71 % 80 % Shema 2.84 Alkilovanjem alenilamida 2.118 pomoću epihlorhidrina u DMF dobijen je epoksi- alenski prekursor 2.119 (shema 2.85). N H Tos N O Tos O Cl NaH DMF 2.118 2.119 50 % Shema 2.85 Poznato je da elektrofilna π-alil-Pd vrsta nastala iz alena procesom transmetalacije prelazi u nukleofilni intermedijer. Ovakve reakcije, praćene umpolungom opisane su u literaturi i veoma su primenljive u organskoj sintezi.135 Reakcija epoksida sa nukleofilima često je primenjivana.136 Pretpostavljeno je da bi nukleofilna vrsta 2.121 nastala umpolungom π-alil-Pd nastalog iz alena mogla reagovati uz 151 raskidanje C-O veze, pri čemu bi se dobio alkohol 2.122, koji lako može biti dalje transformisan. Proces transmetalacije je moguće izvesti pomoću različitih reagenasa, npr. indijuma ili dietil-cinka (shema 2.86).137 N O Tos Ar N O Pd Tos Ar N O Tos MPd In N Ar OH Tos 2.1202.119 2.1222.121Et2Zn ? Shema 2.86 Prva reakcija ovog tipa izvedena je u prisustvu indijuma kao transmetalacionog agensa. Epoksi-alen 2.119, pod reakcionim uslovima prikazanim na shemi 2.87, nije dao proizvod ciklizacije. Izolovan je samo proizvod 2.123. Sličan rezultat dobijen je reakcijom epoksi-alena 2.119 sa p-tolil-jodidom, pri čemu je proizvod 2.124 izolovan u nešto nižem prinosu. N O Tos N Ar Tos O10mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 ArI, In DMF, 90 oC 2.119 2.123Ar=Ph 2.124Ar= p-Tol 30 % 23 % Shema 2.87 152 Reakcijom prekursora 2.119 u prisustvu dietil-cinka kao transmetalacionog agensa, dobijena je kompleksna smeša proizvoda, tako da se ne može sa sigurnošću tvrditi da li je došlo do nastanka ciklizacionog proizvoda (Shema 2.88). N O Tos 2.113 [Pd(PPh3)4] PhI, Et2Zn THF smeša proizvoda ∆ Shema 2.88 Zbog nedostatka vremena, reakcije ciklizacije epoksi-alena nisu dalje proučavane. Alternativni sintetski put (b, shema 2.86) podrazumevao je reakciju ciklizacije na model sistemu 2.125, koji ima alensku funkcionalnost, i elektronprivlačnu grupu vezanu za dvostruku vezu. Retrosintetski put b (shema 2.83) podrazumevao je ciklizaciju prekursora sa elektron privlačnom grupom vetzanom za dvostruku vezu. Reakcijom N-tozilalenamida 2.118 sa metil-propiolatom u prisustvu DMAP dobijeno je jedinjenje 2.125 (shema 2.89). NH Tos CO2Me N Tos CO2Me DMAP MeCN 2.118 2.125 70 % Shema 2.89 Očekivano je da će prekursor 2.125 pod uslovima reakcije prikazanim na shemi 2.90 dati ciklizacioni proizvod, meñutim, izolovana je kompleksna smeša proizvoda, čija karakterizacija nije bila moguća. 153 N Tos CO2Me 10 mol% Pd(OAc)2 20 mol% PPh3 1,5 eq Cs2CO3 toluen ∆ ArI kompleksna smeša 2.125 Shema 2.90 Proučavanje reakcionih uslova nije dovelo do boljeg rezultata, jer ni u prisustvu slabije baze (K2CO3), drugog katalitičkog sistema [Pd(PPh3)4], kao i primenom različitih rastvarača (dioksan, THF) nije dobijen proizvod ciklizacije. 154 3. EKSPERIMENTALNI DEO 3.1. Opšti podaci 1H NMR Spektri snimljeni su Varian Gemini 2000 instrumentom na 200 MHz i Bruker Avance III na 500 MHz. 13C NMR merenja rañena na istim instrumentima na 50, odnosno 125 MHz. Hemijska pomeranja (δ) data su u ppm u odnosu na TMS kao interni standard. Maseni spektri su snimljeni Agilent MSD TOF spektrometrom u kombinaciji sa Agilent 1200 HPLC ureñajem, Agilent Technologies 5975C MS u kombinaciji sa Agilent Technologies 6890N GC, ili Thermo TSQ Quantum Access Max. Infracrveni spektri su snimljeni IR Termo Scientific NICOLET iS10 (4950) ureñajem. Prečišćavanje proizvoda reakcija izvršeno je fleš hromatografijom, pri čemu je korišćen silika-gel 60 (230-400 mesh). Reakcije su praćene hromatografijom na tankom sloju korišćenjem aluminijumskih ploča sa 0,25 mm silika-gela (Kieselgel 60 F254, Merck). Rastvarači korišćeni u reakcijama i za prečišćavanje proizvoda destilovani su pre upotrebe. 155 3.2. Eksperimentalni postupci i spektralni podaci Opšti postupak za dobijanje halogenpropenil-i brombenzil- kvaternarnih soli N-(2-Jodo-2-propenil)-izohinolinijum-bromid (2.1) U rastvor izohinolina (470 mg, 3,60 mmol) u suvom acetonitrilu (10 mL) doda se jodpropenil-bromid (934 mg, 3,78 mmol) i smesa zagreva na 85 oC u toku 4 h. Nakon toga, rastvarač se udalji uparavanjem pod sniženim pritiskom, pri čemu ostaje smolasti ostatak, koji se prečišćava na sledeći način: pipetom se dodaje suvi etar, i dobijena suspenzija se meša; etar se udalji dekantovanjem i dodaje se nova porcija sve dok dok smolasta supstanca ne postane praškasta. Tragovi etra se uklone isparavanjem pod sniženim pritiskom. Dobijena je kvaternarna so 2.1 u vidu svetlosmeñe amorfne supstance (1,23 g, 90 %). Kvaternarne soli dobijene na ovaj način uglavnom su korišćene u daljim reakcijama bez karakterizacije. Njihova struktura je indirektno potvrñena karakterizacijom jedinjenja dobijenih iz njih u narednoj fazi. Opšti postupak za adiciju alil-Grignardovog reagensa na kvaternarne iminiju-soli U dvogrli balon opremljen kondenzatorom odmeri se magnezijum u opiljcima (233 mg, 9,6 mmol) doda suvi etar (10 mL), i suspenzija meša u atmosferi azota. Kroz septum se dodaje rastvor alil-bromida (0,7 mL, 8 mmol) u suvom etru (20 mL). U slučaju burne reakcije neophodno je hladiti balon u ledenom kupatilu. Kvaternarna so (3 mmol) se doda u rastvor alilmagnezijum-bromida pod jakom strujom azota. Reakciona smesa se meša na sobnoj temperaturi 1 h i prati tankoslojnom hromatografijom. Posle završetka reakcije, obrada reakcione smeše vrši se izlivanjem u zasićen rastvor amonijum-hlorida u ledenoj vodi. Etarski sloj se odvoji pomoću levka za odvajanje, a vodeni ekstrahuje dihlormetanom (3 x 20 mL). Kombinovani organski slojevi se suše anhidrovanim natrijum-sulfatom, rastvarač destiluje pod sniženim pritiskom. U reakciji izohinolinskih kvaternarnih soli 156 dobijeni enamin se ne prečišćava hromatografijom, već se kao sirov koristi u reakciji redukcije. Proizvod nastao adicijom Grignardovog reagensa na karbolinijum-so prečišćava se fleš hromatografijom. Opšti postupak za redukciju enamina Sirovi enamin (1 mol eq) se rastvori u metanolu (7 mL) i ohladi na 0 oC pomoću ledenog kupatila. U rastvor se doda NaBH3CN (3 mol eq) i smesa zakiseli do pH~2 pomoću HCl konc. Smesa se spontano zagreje do sobne temperature i meša oko 3 h, posle čega se zaalkališe rastvorom NaOH (1 M vodeni rastvor) do pH~10. Smesa se ekstrahuje dihlormetanom, kombinovani organski slojevi se suše anhidrovanim natrijum-sulfatom, rastvarač ispari pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak se prečišćava fleš hromatografijom. 1-Alil-1,2,3,4-tetrahidro-2-(2-jodoalil)-izohinolin (2.3) Dobijen po opštem postupku za adiciju alil-Grignardovog reagensa na kvaternarne iminijum-soli (str. 155) i opštem postupku za redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 98:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.3 (70 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 2907, 2803, 1637, 1615, 1498, 1427, 1123, 903, 742 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,26-7,03 (m, 4H, ArH), 6,36 (dd, 1H, J1=1,5 Hz, J2=1,0 Hz, CI=CH2), 6,03-5,95 (m, 1H, =CH), 5,86 (d, 1H, J=1,0 Hz, CI=CH2), 5,04-4,99 (m, 2H, CHC=CH2), 3,71 (dd, 1H, J1=7,5 Hz, J2=5,5 Hz, H-1), 3,31 (d, 2H, J=4,5 Hz, CH2CI=CH2), 3,25-3,19 (m, 1H, H2C-3), 2,87-2,82 (m, 1H, H2C-4), 2,79-2,75 (m, 1H, H2C-3), 2,64 (dt, 1H, J1=16,5 Hz, J2=4,5 Hz, H2C-4), 2,59-2,53 (m, 1H, CH2CH=CH2), 2,47-2,42 (m, 1H, CH2CH=CH2); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 137,9; 136,7; 134,5; 128,9; 127,7; 126,3; 126,0; 115,9 (CHC=CH2); 111,6 (IC=); 65,4(CH2CI=CH2); 61,1 (C-1); 43,3 (C-3); 40,7 (CH2CH=CH2); 25,2 (C-4); m/z (EI) 338,0; 298,0; 170,1; 130,1; HRMS (ESI): izračunato za C15H18IN [M+H]+ 340,05567; izmereno 340,05547. 157 Opšti postupak za sintezu diena Smeša jodoalkena (0,7 mmol), Pd(OAc)2 (10 mol%), PPh3 (20 mol%), K2CO3 (1,5 eq) u acetonitrilu (10 mL) se zagreva na 90 oC u atmosferi azota u toku 12 h. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Rastvarač se ispari pod sniženim pritiskom, a ostatak rastvori u dihlormetanu, ispere vodom, suši anhidrovanim Na2SO4 i filtrira. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. 2,3,4,6,7,11b-Heksahidro-2,3-dimetilen-1H-pirido[2,1-a]izohinolin (2.4) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.4 (70 %) u vidu svetložute amorfne supstance, Tt=80-81 oC. IR νmax: 2926, 2735, 1617, 1492, 1450, 1136, 1137, 732 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,21-7,10 (m, 4H, ArH), 5,16-5,15 (m, 2H, CH2=C-2, CH2=C-3), 4,87 (t, 1H, J=2,0 Hz, CH2=C-2), 4,84 (brs, 1H, CH2=C-3), 3,49 (d, 1H, J=13,0 Hz, H2C-4), 3,44 (d, 1H, J=10,5 Hz, H-11b), 3,19-3,13 (m, 2H, H2C-4, H2C-7), 3,06-3,02 (m, 1H, H2C-6), 2,92 (dd, 1H, J1=14,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-1), 2,77 (dt, 1H, J1=16,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-7), 2,57 (dt, 1H, J1=4,0 Hz, J2=11,0 Hz, H2C-6), 2,40-2,34 (m, 1H, H2C-1); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 145,5; 144,1; 137,5; 134,4; 128,9; 126,2; 125,8; 125,3; 109,7 (CH2=); 109,4 (CH2=); 62,3 (C-11b); 62,1 (C-4); 50,7 (C-6) ; 40,0 (C-1); 29,6 (C-7). m/z (EI) 211,1; 196,1; 182,1; 130,0; 115,0; HRMS (ESI): izračunato za C15H17N [M+H]+ 212,14338; izmereno 212,14299. Dietil(5,6,8,9,10,11,12,13,13a-nonahidro-10,11-diazaizohino[2,1-b]izohinolin)10,11- dikarboksilat (2.6) U rastvor diena 2.4 (0,2 mmol) u suvom dihlormetanu (5,0 mL) doda se u atmosferi azota DEAD (1,0 eq, 0,2 mmol) na 0 oC i smesa meša 12 h na sobnoj temperaturi. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim 158 pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.6 (66 %) u vidu žutog ulja. IR νmax: 2980, 1704, 1377, 1223, 1099, 755 cm-1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,17-7,12 (m, 4H, ArH), 4,35-4,25 (m, 2H, H2C-12, H2C- 9), 4,20 (q, 4H, J=7,0 Hz, COOCH2CH3), 3,95-3,65 (m, 2H, H2C-12, H2C-9), 3,56 (dd, 1H, J1=10,0 Hz, J2=3,0 Hz, H-13a) , 3,23-3,13 (m, 2H, H2C-5, H2C-8), 3,09-3,06 (m, 1H, H2C- 6), 3,03-3,00 (m, 1H, H2C-8), 2,73 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-5), 2,61-2,57 (m, 1H, H2C-6), 2,56-2,51 (m, 1H, H2C-13), 2,18-2,13 (m, 1H, H2C-13), 1,25 (t, 6H, J=7,0 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 155,4 (C=Oestar); 137,3; 134,2; 128,9; 126,2; 126,1; 125,2; 62,4 (COOCH2CH3); 58,9 (C-13a) 55,7 (C-8); 50,9 (C-6); 45,7 (C-12); 44,0 (C-9); 34,2 (C- 13) 29,3 (C-5); 14,6 (CH3) 14,3 (CH3); m/z (ESI) 386,2; 340,2; 210,0; 196,1; 132,1; HRMS (ESI): izračunato za C21H27N3O4 [M+H]+ 386,20743, izmereno 386,20694. Opšti postupak za sintezu cikloadukata (Diels-Alderova reakcija) Smeša diena (0,2 mmol) i dienofila (1,2 eq, 0,24 mmol) u toluenu (5 mL) zagreva se u toku 2 h na temperaturi 110 oC u atmosferi azota. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. Dimetil-5,6,8,9,12,13,13a-heptahidro-izohino[2,1-b]izohinolin-10,11-dikarboksilat (2.7) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, 95:5 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.7 (90 %) u vidu bledožute amorfne supstance, Tt=121-124 oC IR νmax: 2950, 1716, 1433, 1267, 1196, 1068, 736 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,17-7,10 (m, 4H, ArH), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 3,78 (s, 3H, COOCH3), 3,58 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=3,0 Hz, H-13b), 3,22 (brd, 1H, J=16,0 Hz, H2C-8), 3,17-3,14 (m, 1H, H2C-5), 3,09 (dd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=4,0 Hz, H2C-6), 3,01-2,99 159 (m, 1H, H2C-8) 2,98-2,91 (m, 4H, H2C-9, H2C-12), 2,73 (brd, 1H, J=16,0 Hz, H2C-5), 2,59-2,55 (m, 1H, H2C-6), 2,53-2,49 (m, 1H, H2C-13), 2,19 (t, 1H, J=11,0 Hz, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C=Oestar); 168,1 (C=Oestar); 137,6; 134,2; 132,8; 131,8; 128,8; 126,1; 125,9; 125,2; 123,2; 122,9; 59,2 (C-11b); 58,0 (C-8); 52,2 (2C, COOCH3); 50,8 (C-6); 36,7 (C-13); 32,2 (C-12); 30,1 (C-9); 29,3 (C-5). m/z (ESI): 354,0; 322,0; 184,1; 132,0; 117,0; HRMS (ESI): izračunato za C21H23NO4 [M+H]+ 354,16998, izmereno 354,16918. 6,7-Dimetoksi-N-(2-jod-2-propenil)-izohinolinijum-bromid (2.8) Dobijen po opštem postupku za sintezu kvaternarnih soli (str. 155) u vidu bele amorfne supstance (96 %), Tt>270 oC 1-Alil-1,2,3,4-tetrahidro-2-(2-jodoalil)-6,7-dimetoksizohinolin (2.9) Dobijen po opštem postupku za adiciju alil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli (str. 155) i redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etilacetat) dobijen je proizvod 2.9 (60 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 2932, 1511, 1225, 1105, 900 cm−1 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,38 (s, 1H, ArH), 6,67 (s, 1H, ArH), 6,51-6,48 (m, 2H, =CH2), 5,83 (m, 1H, CHvinil), 5,21-5,16 (m, 2H,=CH2), 4,43 (s, 1H, H-1), 4,07-3,96 (m, 2H), 3,87 (s, 6H, OCH3), 3,90-3,80 (m, 1H), 3,57-3,49 (m, 2H), 3,12 (s, 2H, CH2), 2,66 (s, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 149,4; 148,0; 139,6; 131,9; 121,1; 120,7; 120,6; 111,1; 111,0; 61,7; 60.9; 43,5; 39,6; 21,9. m/z (EI) 399,1; 359,0; 321,1; 273,1; HRMS (ESI): izračunato za C17H22INO2 [M+H]+ 400,07680; izmereno 400,07774. 160 2,3,4,6,7,11b-Heksahidro-9,10-dimetoksi-2,3-dimetilen-1H-pirido[2,1-a]izohinolin (2.10) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, 65:35 v/v petroletar-etil-acetat) dobijen je proizvod 2.10 (61 %) u vidu svetložute amorfne supstance, Tt=65-67 o C. IR νmax: 1510, 1257, 1227, 1130, 1021 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,67 (s, 1H, H-11), 6,59 (s, 1H, H-8), 5,16-5,15 (m, 2H, H2C=C-2, H2C=C-3), 4,87 (t, 1H, J=2,0 Hz, H2C=C-2), 4,84 (s, 1H, H2C=C-3), 3,87 (s, 3H, OCH3), 3,85 (s, 3H, OCH3), 3,48 (d, 1H, J=13,0 Hz, H2C-4), 3,36 (d, 1H, J=10,5 Hz, H- 11b), 3,14 (d, 1H, J=10,5 Hz, H2C-4), 3,12-3,00 (m, 2H, H-7, H2C-6), 2,86 (dd, 1H, J1=13,5 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-1), 2,67 (dt, 1H, J1=15,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-7), 2,55 (td, 1H, J1=10,5 Hz, J2=4,0 Hz, H2C-6), 2,39-2,35 (m, 1H, H2C-1); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,5;147,2;145,4; 144,1; 129,4; 126,6; 111,4 (C-8); 109,7 (C-2’); 109,4 (C-3’); 108,5 (C-11); 62,0 (C-11b); 61,9 (C-4); 56,0 (OCH3); 55,8 (OCH3); 50,8 (C-6); 40,1 (C-1); 29,2 (C-7). m/z (EI) 270,1; 256,1; 240,1; 190,0; HRMS (ESI): izračunato za C17H21NO2 [M++H] 272,16451, izmereno 272,16501. N-(2-brom-2-propenil)-3-metil-izohinolinijum bromid (2.11) Dobijen po opštem postupku za sintezu kvaternarnih soli (str. 155) u vidu svetložute amorfne supstance (93 %). 1-Alil-1,2,3,4-tetrahidro-2-(2-bromoalil)-6-metil-izohinolin (2.12) Dobijen po opštem postupku za adiciju alil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli (str. 153) i redukciju enamina (str. 154). Fleš hromatografijom (silika-gel, 98:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.12 (70 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 1636, 1091, 1070, 892, 741 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,15-7,13 (m, 2H, ArH), 7,09-7,07 (m, 2H, ArH), 5,87 (q, 1H, J=1,5 Hz, CBr=CH2), 5,81-5,73 (m, 1H, =CH), 5,53 (q, 1H, J=1,5 Hz, CBr=CH2), 4,97-4,91 (m, 2H, CHC=CH2), 3.89 (t, 1H, J=6,5 Hz, H-1), 3,52 (t, 2H, J=1,5 Hz, CH2), 161 2,96-2, 89 (m, 1H, H-3), 2,67-2,65 (m, 2H, CH2), 2,53-2,47 (m, 1H, H2C-4), 2,43-2,37 (m, 1H, H2C-4), 1,21 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,3; 136,1; 135,8; 133,3; 127,6; 126,7; 126,2; 125,8; 117,2 (=CH2); 116,4 (=CH2); 63,7 (C-1); 62,4 (CH2 alil); 53,3 (C-3); 43,2 (C-4); 36,7 (CH2 alil); 22,4 (CH3); m/z (EI) 264,1; 200,1; 159,1; 144,1; HRMS (ESI): izračunato za C16H20BrN [M+H]+ 306,08519; izmereno 306,08593. 2,3,4,6,7,11b-Heksahidro-6-metil-2,3-dimetilen -1H-pirido[2,1-a] izohinolin (2.13) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.13 (70 %) u vidu tamnožutog ulja. IR νmax: 2962, 2891, 2769, 1639, 1494, 1081, 893, 731 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,21 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 7,18-7,12 (m, 2H, ArH), 7,06 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 5,17 (dt, 2H, J1=7,5 Hz, J2=2,0 Hz, =CH2), 4,87 (s, 2H, =CH2), 3,85 (d, 1H, J=12,5 Hz, H2C-4), 3,46 (d, 1H, J=11,5 Hz, H-11b), 3,01 (dd, 1H, J1=14,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-1), 2,88 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=11,5 Hz, H2C-7), 2,80 (dt, 1H, J1=12,0 Hz, J2=1,5 Hz, H2C-4), 2,68 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-7), 2,62-2,57 (m, 1H, H- 6), 2,39 (m, 1H), 1,28 (d, 3H, J=6,0 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 144,9 (C=CH2); 144,2 (C=CH2); 137,3; 134,8; 128,3; 126,1; 125,8; 125,0; 109,7 (=CH2); 109,5 (=CH2); 63,5 (C-11b); 56,6 (C-4); 54,2 (C-6); 40,8 (C-1); 38,6 (C-7); 20,3 (CH3); m/z (EI) 225,1; 210,0; 146,1; 118,1; 107,0; 91,1; HRMS (ESI): izračunato za C16H19N [M+H]+ 226,15903; izmereno 226,16004. Dimetil-5,6,8,9,12,13,13a-heptahidro-2,3-dimetoksi-izohino[2,1-b]izohinolin-10,11- dikarboksilat (2.14) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v etil-acetat-petroletar) dobijen je proizvod 2.14 (80 %) u vidu bele amorfne supstance, Tt=170 oC IR νmax: 1711, 1517, 1280, 1256, 1070, 781 cm−1 162 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,63 (s, 1H, H-4), 6,59 (s, 1H, H-5), 3,86 (s, 3H, COOCH3), 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,52 (m, J1=10,5 Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 3,22 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 3,11-3,06 (m, 2H, H2C-5, H2C-6), 3,00-2,95 (m, 5H, H2C-9, H2C-12, H2C-8), 2,63 (d, 1H, J1=16,0 Hz, H2C-5), 2,58-2,52 (m, 1H, H2C-6), 2,46 (brd, 1H, J=16,0 Hz, H2C-13), 2,21-2,15 (m, 1H, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C=Oestar); 168,2 (C=Oestar); 147,5; 147,4; 132,7; 132,0; 129,5; 126,5; 123,1; 122,9; 111,3; 108,3; 58,9 (C-13a); 58,0 (C-8); 56,0 (OCH3); 55,8 (OCH3); 52,2 (2C, COOCH3); 51,0 (C-6); 36,9 (C-13); 32,3 (C-12); 30,2 (C-9); 28,9 (C-5). m/z (EI) 268,1; 210,1; 136,1; HRMS (ESI): izračunato za C23H27NO6 [M+H]+ 414,19111, izmereno 414,19005. Dimetil-5,6,8,9,12,13,13a-heptahidro-6-metil-izohino[2,1-b]izohinolin-10,11- dikarboksilat (2.15) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.15 (60 %) u vidu bledožute amorfne supstance, Tt=157-160 oC. IR: 2948, 1718, 1439, 1273, 1067, 737 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,18-7,13 (m, 3H, ArH), 7,07 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 3,65 (brd, 1H, J=11,0 Hz, H-13b), 3,49 (brd, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,03-2,89 (m, 4H, H2C-9, H2C-12), 2,87-2,84 (m, 1H, H2C-5), 2,80- 2,77 (brd, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 2,69 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-5), 2,62-2,58 (m, 1H, H-6), 2,54 (brd, 1H, J=16,0 Hz, H2C-13), 2,23 (t, 1H, J=13,0 Hz, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C=Oestar); 168,1 (C=Oestar); 137,4; 134,4; 132,9; 131,8; 128,2; 126,0; 125,9; 125,1; 123,2; 123,0; 60,3 (C-13b); 53,9 (C-6); 53,8 (C-8); 52,2 (2C, COOCH3); 38,5 (C-5); 37,7 (C-13); 32,2 (C-12); 30,4 (C-9); 20,1 CH3). m/z (ESI): 368,1; 146,1; 129,1; 117; HRMS (ESI): izračunato za C22H25NO4 [M+H]+ 368,18563; izmereno 368,18474. 163 Diels-Alderova reakcija sa metil-propiolatom Smeša diena 2.4 (159 mg, 0,75 mmol) i metil-propiolata (127 mg, 1,5 mmol) u toluenu (5 mL) zagreva u toku 12 h na temperaturi 110 oC u atmosferi azota. Posle 6 h zagrevanja, doda se još 2,0 eq metil-propiolata. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Posle uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava flash hromatografijom na koloni silika-gela. Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v etar-petroletar) dobijeni su proizvodi 2.16 i 2.17 (76 %) u odnosu 1:1. Metil-5,6,8,9,12,13,13a-heptahidro-izohino[2,1-b]izohinolin-11-karboksilat (2.16) Izolovan u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=63-65 oC IR νmax: 2948, 1717, 1434, 1255, 726 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,19-7,10 (m, 4H, ArH), 6,99-6,98 (m, 1H, H-10), 3,76 (s, 3H, COOCH3), 3,59 (dd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 3,22-3,16 (m, 2H, H2C-8, H2C-5), 3,10 (ddd, 1H J1=11,0 Hz, J2=5,5 Hz, J3=1,5 Hz, H2C-6), 3,00 (brd, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 2,86-2,81 (m, 4H, H2C-12, H2C-9), 2,73 (brd, 1H, J=15,0 Hz, H2C-5), 2,59- 2,54 (m, 2H, H-13, H2C-6), 2,24-2,19 (m, 1H, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 167,3 (C=Oestar); 137,8; 135,8 (C-10); 134,3; 128,8; 127,7; 126,1; 126,0; 125,3; 124,9; 122,5; 59,4 (C-13a); 58,4 (C-8); 51,6 (COOCH3); 50,9 (C-6); 37,2 (C-13); 29,9 (C-9); 29,8 (C-12); 29,4 (C-5). m/z (ESI): 296,1; 264,1; 236,1; 220,1; 217,1; 144,1; HRMS (ESI): izračunato za C19H21NO2 [M+H]+ 296,16451, izmereno 296,16488. Metil-5,6,8,9,12,13,13a-heptahidro-izohino[2,1-b]izohinolin-10-karboksilat (2.17) Izolovan u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=110-116 oC IR νmax: 2950, 1717, 1653, 1435, 1253, 724 cm−1 NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,37-7,36 (m, 1H, ArH), 7,18-7,10 (m, 3H, ArH), 7,01-6,99 (m, 1H, H-11), 3,76 (s, 3H, COOCH3), 3,58 (dd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 3,23 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 3,21-3,15 (m, 1H, H2C-5), 3,09 (ddd, 1H, J1=11,0Hz, J2=5,6 Hz, J3=2,0 Hz, H2C-6), 3,02 (brd, 1H, J=16,5 Hz, H2C-8), 2,91-2,77 (m, 4H, H-9, H2C-12), 164 2,73 (brd, 1H, J=16,5 Hz, H2C-5), 2,57 (td, 1H, J1=11,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-6), 2,51 (brd, 1H, J=16,5 Hz, H2C-13), 2,18 (t, 1H, J=14,0 Hz, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 167,3 (C=Oestar); 137,9; 136,4; (C-11); 134,4; 128,8; 127,3; 126,0; 125,9; 125,2; 124,5; 122,9; 59,4 (C-13a); 58,7 (C-8); 51,6 (COOCH3); 50,9 (C-6); 36,9 (C-13); 31,9 (C-12); 29,4 (C-5); 27,9 (C-9); m/z (ESI): 296,1; 184,1; 132,1; 117,1; HRMS (ESI): izračunato za C19H21NO2 [M+H]+ 296,16451, izmereno 296,16451. (2.18a) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.18a (60 %) u vidu amorfne supstance, Tt=135-139 oC IR νmax: 2903, 1704, 1496, 1378, 1151, 738 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,44-7,41 (m, 2H, ArH), 7,37-7,34 (m, 1H, ArH), 7,25-7,22 (m, 2H, ArH), 7,15-7,01 (m, 4H, ArH), 3,54 (dd, 1H, J1=10,2 Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 3,28- 3,27 (m, 2H, H-10, H-11), 3,22 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-8), 3,12-3,07 (m, 2H, H2C-8, H2C- 5), 3,02 (ddd, J1=11,0 Hz, J2=5,5 Hz, J3=2,5 Hz, H2C-6), 2,69 (brd, 1H, J=16,5 Hz, H2C- 5), 2,60-2,57 (m, 1H, H2C-13), 2,54-2,38 (m, 6H, H2C-13, H2C-12, H2C-6, H2C-9), 2,25- 2,22 (m, 1H, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 179,0 (C=Oimid); 178,8 (C=Oimid); 137,4; 134,4; 132,1; 129,1; 128,8; 128,5; 127,9; 127,4; 126,6; 126,1; 125,9; 125,3; 59,0 (C-13a); 58,8 (C-8); 50,5 (C-6); 39,5 (C-11); 39,3 (C-10); 37,3 (C-13); 29,4 (C-5); 28,4 (C-12); 26,8 (C-9). m/z (ESI): 385,2; 383,2; 170,1; 132,1; 117,1; 105,1; HRMS (ESI): izračunato za C25H24N2O2 [M+H]+ 385,19105; izmereno 385,19108. (2.18b) Flash hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.18b (24 %) u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=160-163 oC IR νmax: 2916, 1703, 1495, 1371, 1172, 738 cm−1 165 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,47-7,37 (m, 4H’, ArH), 7,23-7,09 (m, 5H, ArH), 3,45- 3,43 (m, 1H, H-13a), 3,34-3,27 (m, 3H, H-8, H-10, H-11), 3,18-3,12 (m, 1H, H-5), 3,08- 3,05 (m, 1H, H-6). 3,03-2,99 (m, 1H, H-8), 2,72 (d, 1H, J=16,0 Hz, H-5), 2,62-2,58 (m, 1H, H-12), 2,57-2,53 (m, 2H, H-6, H-9), 2,44-2,41 (m, 2H, H-9, H-12), 2,32-2,31 (m, 1H, H- 13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 179,2 (C=Oimid); 179,1 (C=Oimid); 137,4; 134,2; 132,0; 129,2; 128,8; 128,7; 128,4; 128,1; 126,4; 126,2; 126,1; 125,4; 59,5 (C-13a); 58,6 (C-8); 50,9 (C-6); 40,1 (C-11); 39,4 (C-10); 38,1 (C-13); 30,3 (C-5); 29,4 (C-12); 28,9; 26,8 (C- 9). m/z (ESI): 385,2; 170,1; 132,1; 117,1; 105,1; 77,2; HRMS (ESI): izračunato za C25H24N2O2 [M+H]+ 385,19105; izmereno 385,19261. (2.19a) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.19a (63 %) u vidu bledožute amorfne supstance, Tt=172-173 oC. IR νmax: 1702, 1497, 1385, 1194, 735 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,43 (t, 2H, J=7,5 Hz, ArH), 7,37-7,34 (m, 1H, ArH), 7,26- 7,23 (m, 2H, ArH), 7,16-7,13 (m, 3H, ArH), 7,06 (d, 1H, J=6,0 Hz, ArH), 3,60 (brd, 1H, J=10,0 Hz, H-13a), 3,46 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-8), 3,29-3,24 (m, 2H, H-10, H-11), 2,90- 2,85 (m, 1H, H2C-8), 2,82-2,79 (m, 1H, H2C-5), 2,69-2,66 (m, 1H, H2C-5), 2,65-2,54 (m, 3H, H2C-6, H2C-12, H2C-13), 2,48-2,45 (m, 3H, H2C-9, H2C-12), 2,27 (t, 1H, J=13,5 Hz, H2C-13), 1,24 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 179,1 (C=Oimid); 178,8 (C=Oimid); 137,5; 134,5; 132,1; 129,1; 128,5; 128,2; 127,7; 127,2; 126,7; 125,9; 125,2; 60,1 (C-13a); 54,4 (C-8); 53,9 (C- 6); 39,3 (C-11); 39,1 (C-10); 38,4 (C-13); 38,3 (C-5); 28,0 (C-12); 26,9 (C-9); 20,2 (CH3). m/z (ESI): 399,2; 146,1; 129,1; 117; HRMS (ESI): izračunato za C26H26N2O2 [M+H]+ 399,20670, izmereno 399,20770. 166 (2.19b) Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.19b (10 %) u vidu narandžastog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=85-88 oC. IR νmax: 1704, 1496, 1379, 1020, 798, 739 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,47-7,38 (m, 4H, ArH), 7,23-7,05 (m, 5H, ArH), 3,59 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,51 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=3,0 Hz, H-13a), 3,35-3,26 (m, 2H, H-10, H-11), 2,87-2,80 (m, 2H, H2C-5, H2C-8), 2,68 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C- 5), 2,62-2,54 (m, 4H, H2C-6, H2C-9, H2C-12, H2C-13), 2,44-2,40 (m, 3H), 1,28 (d, 3H, J=6,0 Hz, H2C-9, H2C-12, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 179,2 (C=Oimid); 179,1 (C=Oimid); 137,3; 134,3; 132,0; 129,2; 129,0; 128,6; 128,3; 128,2; 128,1; 126,7; 126,4; 126,1; 126,0; 125,3; 60,5 (C-13a); 54,4 (C-8); 53,9 (C-6); 40,1 (C-11); 39,4 (C-10); 39,0 (C-13); 38,5 (C-5); 28,8 (C-12); 26,9 (C-9); 20,1 (CH3). m/z (ESI): 399,1; 397,2; 146,1; 129,1; 117,1; HRMS (ESI): izračunato za C26H26N2O2 [M+H]+ 399,20670, izmereno 399,20765. Sinteza cijano-derivata Smeša diena 2.4 (107 mg, 0,8 mmol) i hlorakrilonitrila (1,5 eq, 1,2 mmol) u toluenu (5 mL) zagreva se 14 h na temperaturi 110 oC u atmosferi azota. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Posle 12 h zagrevanja doda se jos 1 eq hlorakrilonitrila. Kada je reakcija završena, rastvarač se upari pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod se ne prečišćava hromatografijom već se kao takav koristi u sledećoj fazi. Smesi sirovih cikloadukata (151 mg, 0,5 mmol) rastvorenih u DMSO (1,0 mL) u atmosferi azota doda se topao rastvor kalijum-hidroksida (70 mg, 2,5 eq) u vodi (0,5 mL). Smesa se meša 48 h na sobnoj temperaturi. Reakcionoj smeši se doda etar (30 mL) i smesa ispere sa malo vode. Kombinovani etarski slojevi se suše anhidrovanim natrijum-sulfatom, sušilo udalji filtracijom, rastvarač ispari pod sniženim pritiskom, a sirovi ostatak prečišćava hromatografijom. Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v petroletar-etar) dobijeni su proizvodi 2.26 i 2.27 (48 %) u vidu žutog ulja. 167 5,6,8,11,12,13, 13a-Heptahidro-10-cijano-izohino[2,1-b]izohinolin (2.22) IR νmax: 2206, 1583, 1427, 908, 736 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,19-7,11 (m, 4H, ArH), 6,49 (s, 1H, H-9), 3,57 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 3,86 (d, 1H, J=17,5 Hz, H2C-8), 3,19-3,15 (m, 2H, H2C-5, H2C-8), 3,083 (ddd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=5,5 Hz, J3= 2,0 Hz, H2C-6), 2,75-2,67 (m, 2H, H2C-5, H2C-13), 2,58 (td, 1H, J1=11,5 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-6), 2,45-2,40 (m, 2H, H2C-11), 2,25-2,21 (m, 3H, H2C-12, H2C-13); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 141,1 (C-9); 137,2; 135,1; 134,3; 128,9; 126,3; 126,1; 125,3; 125,2; 119,8 (CN); 105,8 (C-10); 59,1 (C-13a); 58,8 (C-8); 50,7 (C-6); 35,3 (C-13); 29,4 (C-5); 24,8 (C-12); 23,8 (C-11); m/z (ESI) 263,0; 235,0; 117,2; 105,1; HRMS (ESI): izračunato za C18H18N2 [M+H]+ 263,15428, izmereno 263,15329. 5,6,8,9,10,13,13a-Heptahidro-11-cijano-izohino[2,1-b]izohinolin (2.23) IR νmax: 2205, 1588, 1423, 1129, 737 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,19-7,11 (m, 4H, ArH), 6,49 (s, 1H, H-12), 3,55 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 3,35 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,20-3,11 (m, 2H, H2C-5, H2C-8), 3,09-3,07 (m, 1H, H2C-6), 2,75-2,67 (m, 2H, H2C-5, H2C-13), 2,59 (dt, 1H, J1=11,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-6), 2,42 (t, 2H, J=9,5 Hz, H2C-9), 2,37-2,32 (m, 1H, H2C-13), 2,27 (t, 2H, J=9,5 Hz, H2C-10) 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,9 (C-12); 137,2; 136,0; 134,2; 128,9; 126,2; 126,0; 125,3; 125,2; 119,8 (CN); 105,5 (C-11); 58,8 (C-13a); 56,8 (C-8); 50,9 (C-6); 38,0 (C-13); 29,3 (C-5); 26,7 (C-10); 23,8 (C-9); m/z (ESI) 263,0; 117,2; 105,1; HRMS (ESI): izračunato za C18H18N2 [M+H]+ 263,15428, izmereno 263,15430. Opšti postupak za sintezu tetrahidroprotoberberina Smeša cikloadukta (0,1 mmol) i MnO2 (2,2 mmol, ~5 eq w/w) u suvom dihlormetanu (20 mL) meša se i zagreva na 40 oC u toku 30 min. Reakciona smeša se 168 razblaži dihlormetanom i filtrira kroz sloj celita. Celit se ispira dihlormetanom dok filtrat ne postane bezbojan. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. Dimetil-5,6,8,13,13a-pentahidro-izohino[2,1-b]izohinolin-10,11-dikarboksilat (2.24) Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.24 (63 %) u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=108-110 oC. IR νmax: 1720, 1433, 1292, 1129, 738 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,53 (s, 1H, H-12), 7,48 (s, 1H, H-9), 7,25-7,14 (m, 4H, ArH), 4,08 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,90 (s, 6H, COOCH3), 3,75 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,70 (dd, 1H, J1=11,5 Hz, J2=4,0 Hz, H-13a), 3.41 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=4,0 Hz, H2C-13), 3,23-3,16 (m, 2H, H2C-5, H2C-6), 2,95 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=11,0 Hz, H2C- 13), 2,80-2,76 (m, 1H, H2C-5), 2,69-2,64 (m, 1H, H2C-6); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,1 (C=O); 167,9 (C=O); 138,4; 138,0; 137,1; 134,4; 130,0; 129,4; 129,3; 128,9; 126,9; 126,4; 126,2; 125,4; 59,3 (C-13a); 58,0 (C-8); 52,6 (2xCH3); 50,9 (C-6); 36,5 (C-13); 29,4 (C-5). m/z (ESI) 352,1; 130,1; 117,1; 103,1; HRMS (ESI) izračunato za C21H21NO4 [M+H]+ 352,15433; izmereno 352,15493 Opšti postupak za sintezu oksoprotoberberina I metoda: Smeša cikloadukta (0,1 mmol) i MnO2 (10 mmol) u 1,4-dioksanu (20 mL) meša se na 70 oC (temperatura uljanog kupatila) tokom 72 h. Reakciona smeša se razblaži etil-acetatom i filtrira kroz sloj celita. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. II metoda: Smeša cikloadukta (0,1 mmol) i MnO2 (10 mmol,~23 eq w/w) u suvom dihlormetanu (20 mL) meša se i zagreva na 40 oC u toku 24 h. Reakciona smeša se razblaži dihlormetanom i filtrira kroz sloj celita. Celit se ispere i etrom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. 169 Dimetil-5,6,8-trihidro-8-okso-izohino[2,1-b]izohinolin-10, 11-dikarboksilat (2.25) Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.25 (70 %) u vidu žutih iglica Tt=178-180 oC. IR νmax: 1729, 1712, 1645, 1620, 1293, 1161, 772 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,90 (s, 1H, H-9), 7,84-7,82 (m, 1H, H-1), 7,79 (s, 1H, H- 12), 7,41 (m, 2H, H-2, H-3), 7,31 (m, 1H, H-4), 7,03 (s, 1H, H-13), 4,38 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-6), 3,97 (s, 3H, COOCH3), 3,95 (s, 3H, COOCH3), 3,05 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,4 (C=Oestar), 166,5 (C=Oestar), 161,3 (C=Oamid), 140,6; 138,7; 136,4; 135,7; 130,5; 130,2; 129,5; 128,1; 127,7; 127,4; 126,7; 125,4; 125,1; 101,8 (C-13); 52,9 (CH3); 52,6 (CH3); 39,9 (C-6); 28,3 (C-5). m/z (ESI) 364,1; 332,1; 317,1; 290,1; 230,1; HRMS (ESI): izračunato za C21H17NO5 [M+H]+ 364,11795, izmereno 364,11783. Dimetil-5,6,8-trihidro-2,3-dimetoksi-8-okso-izohino[2,1-b]izohinolin-10, 11- dikarboksilat (2.26) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.26 (50 %) u vidu žutih iglica, Tt=220 oC. IR νmax: 1709, 1563, 1514, 1241, 1046, 787 cm-1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,88 (s, 1H, H-9), 7,78 (s, 1H, H-12), 7,25(s, 1H, H-1), 6,88 (s, 1H, H-13), 6,76 (s, 1H, H-4), 4,36 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-6), 3,99 (s, 3H, OCH3), 3,96 (s, 3H, COOCH3), 3,95(s, 3H, OCH3), 3,94 (s, 3H, COOCH3), 2,97 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,5 (C=Oestar); 166,6 (C=Oestar); 161,4 (C=Oamid); 151,1 (C-2); 148,7 (C-3); 140,6; 138,9; 136,4; 130,6 (C-9); 129,3; 126,8; 126,4 (C-12); 124,6; 121,5; 110,5 (C-4); 108,1 (C-1); 100,4 (C-13); 56,3 (OCH3); 56,1 (OCH3); 52,9 (COOCH3); 52,6 (COOCH3); 39,9 (C-6); 27,8 (C-5). m/z (EI) 355,1; , 298,9; 281,1; 263,1; 207,0; HRMS (ESI): izračunato za C23H21NO7 [M+H]+ 424,13908, izmereno 424,13949 170 Dimetil-5,6,8-trihidro-6-metil-8-okso-izohino[2,1-b]izohinolin-10, 11-dikarboksilat (2.27) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, 85:15 v/v etar-dihlormetan) dobijen je proizvod 2.27 (36 %) u vidu svetložute amorfne supstance, Tt=95-96 oC IR νmax: 1715, 1620, 1433, 1285, 1225, 1228, 766 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,90 (s, 1H, H-9), 7,82 (d, 1H, J=7,5 Hz, H-12), 7,79 (s, 1H, H-1), 7,44-7,38 (m, 2H, H-2, H-3), 7,29 (d, 1H, J=7,0 Hz, H-4), 7,03 (s, 1H, H-13), 5,64-5,59 (m, 1H, H-6), 3,97 (s, 3H, COOCH3), 3.94 (s, 3H, COOCH3), 3,28 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=5,5 Hz, H2C-5), 2,88 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=1,0 Hz, H2C-5), 1,18 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,4 (C=Oestar); 166,6 (C=Oestar); 160,8 (C=Oamid); 139,6; 138,7; 136,3; 133;3; 130,5; 130,4; 129,3; 128,9; 127,6; 127,3; 126,7; 125,3 (C-1); 125,2 (C-12); 101,9 (C-13); 52,9 (COOCH3); 52,6 (COOCH3); 45,2 (C-6); 34,3 (C-5); 17,5 CH3). m/z (ESI): 378,1; 378,1; 346,1; 316,1; 302,0; 231,0; HRMS (ESI): izračunato za C22H19NO5 [M+H]+ 378,13360, izmereno 378,13485 Metil-5,6,8-trihidro-8-okso-izohino[2,1-b]izohinolin-11-karboksilat (2.28) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.28 (45 %) u vidu žute amorfne supstance, Tt=180-185 oC. IR νmax: 1720, 1640, 1621, 1151, 1090, 754 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,49 (d, 1H, J=8,4 Hz, H-9), 8,30 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-12), 8,05 (dd, 1H, J1=8,4 Hz, J2=1,5 Hz, H-10), 7,84 (dd, 1H, J1=5,1 Hz, J2=3,4 Hz, H-1), 7,40- 7,37 (m, 2H, H-2, H-3), 7,30-7,28 (m, 1H, H-4), 7,09 (s, 1H, H-13), 4,39 (t, 2H, J=6,1 Hz, H2C-6), 3,97 (s, 3H, CH3), 3,04 (t, 2H, J=6,1 Hz, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 166,5 (C=Oestar); 161,7 (C=Oamid); 138,3; 136,3; 135,4; 133,4; 129,9; 129,6; 128,4 (C-9); 128,3 (C-12); 128,0; 127,6; 126,4 (C-10); 125,1 (C-1); 102,7 (C-13); 52,5 (CH3); 39,8 (C-6); 28,5 (C-5). m/z (ESI) 306,1; 290,1; 276,0; 246,1; 232,0; 203,0; 171 HRMS (ESI): izračunato za C19H15NO3 [M+H]+ 306,11247, izmereno 306,11175. Metil-5,6,8-trihidro-8-okso-izohino[2,1-b]izohinolin-10-karboksilat (2.29) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.29 (42 %) u vidu žutih rombova, Tt=202-205 oC. IR νmax: 1703, 1651, 1614, 1600, 1288, 766 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9,11 (d, 1H, J=1,5 Hz, H-9), 8,24 (dd, 1H, J1=8,4 Hz, J2=1,6 Hz, H-11), 7,86-7,84 (m, 1H, H-1), 7,62 (d, 1H, J=8,2 Hz, H-12), 7,40-7,38 (m, 2H, H-2, H-3), 7,34-7,30 (m, 1H, H-4), 7,04 (s, 1H, H-13), 4,39 (t, 2H, J=6,1 Hz, H2C-6), 3,97 (s, 3H, COOCH3), 3,04 (t, 2H, J=6,1 Hz, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 166,6 (C=Oestar); 161,9 (C=Oamid); 139,9; 139,8; 135,7; 132,5; 130,5; 129,9; 129,8; 128,1; 127,6; 126,4; 125,3; 102,2 (C-13); 52,2 (CH3); 39,7 (C- 6); 28,4 (C-5); m/z (ESI): 306,0; 276,0; 247,1; 232,0; 176,1; 203,0; HRMS (ESI): izračunato za C19H15NO3 [M+H]+ 306,11247, izmereno 306,11202 (2.30) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.30 (70 %) u vidu žute amorfne supstance, Tt=214-217 oC. IR νmax: 1710, 1645, 1615, 1363, cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9,01 (s, 1H, H-9), 8,14 (s, 1H, H-12), 7,90-7,88 (m, 1H, H- 1), 7,55-7,41 (m, 7H, ArH), 7,35-7,33 (m, 1H, ArH), 7,18 (s, 1H, H-13), 4,43 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C--6), 3,08 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 166,5 (C=Oimid); 166,3 (C=Oimid); 161,6 (C=Oamid); 141,5; 141,3; 135,8; 134,1; 131,7; 130,6; 129,1; 128,3; 128,2; 128,1; 127,8; 127,5; 126,5; 125,6 (C-1); 125,3 (C-9); 122,3 (C-12), 102,8 (C-13); 40,0 (C-6); 28,2 (C-5). m/z (EI) 393,1; 378,1; 274,1; 246,1;231,0; HRMS (ESI): izračunato za C25H16N2O3 [M+H]+ 393,12337, izmereno 393,12420; 172 (2.31) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.31 (45 %) u vidu žutih iglica, Tt=216-218 oC. IR νmax: 1715, 1651, 1626, 1390, 1202, 756 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9,01 (s, 1H, H-9), 8,13 (s, 1H, H-12), 7,89-7,88 (m, 1H, H- 1), 7,55-7,43 (m, 7H, ArH), 7,32 (d, 1H, J=7,0 Hz, H-4), 7,19 (s, 1H, H-13), 6,68-5,63 (m, 1H, H-6), 3,31 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=6,0 Hz, H2C-5), 2,92 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=1,5 Hz, H2C-5), 1,22 (dd, 3H, J1=6,5 Hz, J2=2,0 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 166,5 (C=Oimid); 166,3 (C=Oimid); 161,1(C=Oamid); 141.5; 140,3; 134,1; 133,4; 131,7; 130,8; 129,4; 129,1; 128,6; 128,3; 128,2; 127,7; 127,4; 126,5; 125,4; 125,3 (C-1); 122,2 (C-12); 102,9 (C-13); 65,8 (C-6); 34,3 (C-5); 17,4 (CH3); HRMS (ESI): izračunato za C26H18N2O3 [M+H]+ 407,13902, izmereno 407,13858. m/z (ESI) 407,1; 378,1; 259,9; 230,1; 203,0; Redukcija estarskih grupa oksoprotoberberinskih derivata U dvogrli balon se odmeri LiAlH4 (150 mg, 1,36 mmol), prelije THF-om i suspenzija meša u atmosferi azota. U dobijenu suspenziju se u kapima dodaje rastvor oksoprotoberberina 2.25 (80 mg, 0,22 mmol). Kada je ukapavanje završeno, reakciona smesa se zagreva 12 h. Reakciona smeša se obrañuje dodavanjem 15 % rastvora NaOH i ekstrakcijom etrom. Kombinovani etarski ekstrakti suše se anhidrovanim natrijum- sulfatom, a posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, smesa sirovih proizvoda se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v etar-etil-acetat) dobijeni su proizvodi 2.32, 2.33 i 2.34 u ukupnom prinosu (60 %), u odnosu 2:1:4 5,6,8-Trihidro-10-hidroksimetil-11-metil-8-okso-izohino[2,1-b] izohinolin (2.32) Izolovan u vidu svetložutog ulja. IR νmax: 3385, 1628, 1527, 1040, 897, 770 cm−1 173 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,31 (s, 1H, H-9), 7,84-7,82 (m, 1H, H-1), 7,41 (s, 1H, H- 12), 7,38-7,36 (m, 2H, ArH), 7,30-7,28 (m, 1H), 7,06 (s, 1H, H-13), 4,77 (s, 2H, CH2OH), 4,37 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-6), 3,03 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-5), 2,49 (s, 3H, ArCH3), 2,19 (s, 1H, OH); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 162,5 (C=Oamid); 141,6; 139,1; 137,1; 135,9; 135,1; 129,9; 129,2; 127,8; 127,4; 127,2; 125,7; 124,8; 122,4 (C-1); 103,2 (C-13), 62,1 (CH2OH); 39,7 (C-6); 29,4 (C-5); 18,8 (CH3); m/z (ESI): 292,1; 262,1; 247,1; 244,1; 232,; HRMS (ESI): izračunato za C19H17NO2 [M+Na]+ 314,11515, izmereno 314,11520; 5,6,8-Trihidro-11-hidroksimetil-10-metil-8-okso-izohino[2,1-b] izohinolin (2.33) Izolovan u vidu bledožutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=133-136 oC IR νmax: 3319, 1629, 1587, 1492, 1020, 895, 789, 756 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,11 (s, 1H, H-9), 7,72 (d, 1H, J=8,2 Hz, H-1), 7,55 (s, 1H, H-12), 7,36-7,26 (m, 3H, ArH), 6,93 (s, 1H, H-13), 4,82 (s, 2H, CH2OH), 4,36 (t, 2H, J=6,2 Hz, H2C-6), 3,01(t, 2H, J=6,2 Hz, H2C-5), 2,43 (s, 3H, ArCH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,9 (C=Oamid);144,1; 136,7; 135,2; 134.7; 130.3; 129.1; 128,6 (C-9); 127,9; 127,42; 124,9; 123,8 (C-1); 103,0 (C-13); 63,0 (CH2OH); 39,6 (C-6); 28,6 (C-5); 18,7 (CH3); m/z (ESI): 292,1; 262,1; 247,1; HRMS (ESI): izračunato za C19H17NO2 [M+H]+ 292,13321, izmereno 292,13255; 5,6,8-Trihidro-10, 11-dihidroksimetil-8-okso-izohino[2,1-b] izohinolin (2.34) Izolovan u vidu svetložutog ulja. IR νmax: 3315, 1629, 1349, 897, 697 cm−1 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 8,26 (s, 1H), 8,02-7,99 (m, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,42-7,35 (m, 4H), 4,67 (s, 2H, CH2OH), 4,62 (s, 2H, CH2OH), 4,24 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-6), 3,01 (t, 2H, J=6,0 Hz, H2C-5), 1,71 (brs, 2H, OH) 174 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 161,1 (C=Oamid); 144,9; 138,5; 136,9; 135,5; 135,3; 130,0; 129,4; 128,3; 127,6; 125,3; 124,9; 123,8; 122,9; 102,4 (C-13); 60,3 (CH2OH); 60,1 (CH2OH); 40,9 (C-6); 27,9 (C-5); m/z (ESI): 308,0; 227,1; 198,9; 155.1; Dimetil-5,6,8,13,13a-pentahidro-2,3-dimetoksi-izohino[2,1-b]izohinolin-10,11- dikarboksilat (2.35) Dobijen po opštem postupku za sintezu tetrahidroprotoberberina (str. 167). Fleš hromatografijom (silika-gel, 95:5 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.35 (78 %) u vidu žutih iglica, Tt=173-175 oC. IR νmax: 1721, 1513, 1258, 1100, 728 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,55 (s, 1H, H-12), 7,47 (s, 1H, H-9), 6,71 (s, 1H, H-1), 6,23 (s, 1H, H-4), 4,08 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,90 (s, 3H, COCH3), 3,89 (s, 6H, COCH3, OCH3), 3,87 (s, 3H, OCH3), 3,74 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,63 (dd, 1H, J1=11Hz, J2=3,5Hz, H-13a), 3,37 (1H, dd, J1=16,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-13), 3,17-3,11 (m, 2H, H2C-5, H2C-6), 2,93 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=11 Hz, H2C-13), 2,71-2,61 (m, 2H, H2C- 6, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,1 (C=O); 168,0 (C=O); 147,7 (C-2); 147,5 (C-3); 138,3; 138,1; 129,9; 129,5; 129,4 (C-12); 128,9; 126,9 (C-9); 126,6; 111,4; 108,4; 59,0 (C- 13a); 58,0 (C-8); 56,0 (OCH3); 55,8 (OCH3); 52,5 (2C, COCH3); 51,1 (C-6); 36,7 (C-13); 28,9 (C-5). m/z (ESI) 412,1 [M+H]+; 380,1; 348,1; 322,1; 277,9; 250,1; HRMS (ESI): izračunato za C23H25NO6 [M+H]+ 412,17646; izmereno 412,17642. MS-290 Dimetil-5,6,8,13,13a-pentahidro-6-metil-izohino[2,1-b]izohinolin-10,11-dikarboksilat (2.36) Dobijen po opštem postupku za sintezu tetrahidroprotoberberina (str. 167). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.36 (45 %) u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=95-97 oC. 175 IR νmax: 1722, 1433, 1125, 1094, 737 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,53 (s, 1H, H-12), 7,50 (s, 1H, H-9), 7,25-7,17 (m, 3H, ArH), 7,11 (d, 1H, J=7,0 Hz, H-1), 4,41 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,90 (s, 6H, COOCH3 ), 3,76 (dd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=4,0 Hz, H-13a), 3,53 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,42 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-5), 2,98 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=11,0 Hz, H2C-5), 2,89 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=11,0 Hz, H2C-13), 2,75-2,68 (m, 2H, H2C-6, H2C-13), 1,35 (d, 3H, J=6,0 Hz, CH3). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,1 (C=O); 167,9 (C=O); 138,3; 138,2; 136,9; 134,6; 129,9; 129,3; 129,2; 128,3; 127,4; 126,3; 126,2; 125,3; 60,3 (C-13a); 53,9 (C-6); 53,7 (C- 8); 52,5 (COOCH3); 38,5 (C-13); 37,6 (C-5); 20,2 (CH3). m/z (EI) 281,1; 253,0; 207,1; HRMS (ESI) izračunato za C22H23NO4 [M+H]+ 366,16998; izmereno 366,16929 Opšta procedura za adiciju vinil-Grignardovog reagensa U suspenziju kvaternarne iminijum-soli (0,55 mmol) u suvom etru (10 mL) u atmosferi azota doda se rastvor vinilmagnezijum-bromida (0,85 mL, 0,83 mmol). Smesa se meša na sobnoj temperaturi i tok reakcije prati tankoslojnom hromatografijom. Posle 30 min reakcija se obradi izlivanjem u zasićen rastvor amonijum-hlorida u ledenoj vodi. Etarski sloj se odvoji pomoću levka za odvajanje, a vodeni ekstrahuje etrom (3 x 20 mL). Kombinovani organski slojevi se suše anhidrovanim natrijum-sulfatom, rastvarač ispari pod sniženim pritiskom. U reakciji izohinolinskih kvaternarnih soli dobijeni enamin se ne prečišćava hromatografijom, već se kao sirov koristi u reakciji redukcije. 1,2,3,4-Tetrahidro-2-(2-iodoalil)-1-vinilizohinolin (2.42) Dobijen po opštem postupku za adiciju vinil-Grignardovog reagensa (str. 175) i opštem postupku za redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 98:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.42 (73 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 1614, 1049, 900, 743 cm−1 176 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,14-7,09 (m, 4H, ArH), 6,40 (d, 1H, J=1,5 Hz, CI=CH2), 5,90 (s, 1H, CI=CH2), 5,85 (ddd, 1H, J1=17,5 Hz, J2=10,0 Hz, J2=8,5 Hz CH=CH2), 5,29 (dd, 1H, J1=10 Hz, J2=1,5 Hz, CH=CH2), 5,25 (dd, 1H, J1=17,5 Hz, J2=0,5 Hz, CH=CH2), 4,10 (d, 1H, J=8,5 Hz, H-1), 3,56 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2), 3,09-3,04 (m, 2H, CH2, H2C-3), 2,95-2,81 (m, 2H, H-4), 2,57-2,52 (m, 1H, H2C-3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 139,3 (CH=); 136,1; 134,7; 128,8; 128,3; 126,3; 125,6; 118,2 (CH=CH2); 111,4 (CI); 66,2 (C-1); 65,5 (CH2); 45,9 (C-3); 29,0 (C-4); m/z (EI): 325,0; 298,0; 257,9; 130,1; HRMS (ESI): izračunato za C14H16IN [M+H]+ 326,04002; izmereno 326,04149. 1,2,3,4-Tetrahidro-2-(2-iodoalil)-6,7-dimetoksi-1-vinil-izohinolin (2.43) Dobijen po opštem postupku za adiciju vinil-Grignardovog reagensa (str. 175) i redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.43 (40 %) u vidu bezbojnog ulja, koje očvršćava hlañenjem, Tt=63- 64 oC 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,60 (s, 1H, H-8), 6,58 (s, 1H, H-5), 6,4 (dd, 1H, J1=3,0 Hz, J2=1,5 Hz, CI=CH2), 5,89 (d, 1H, J=0,5 Hz, CI=CH2), 5,84 (ddd, 1H, J1=17,0 Hz, J2=9,0 Hz, J2=8,0 Hz, CH=CH2 ), 5,29 (dt, 1H, J1=11,5 Hz, J2=0,5 Hz, CH=CH2), 5,26-5,22 (m, 1H, CH=CH2), 4,02 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-1), 3,85 (s, 3H, OCH3), 3,81 (s, 3H, OCH3), 3,54 (dt, 1H, J1=15,0 Hz, J2=1,5 Hz, CH2CI=CH2), 3,08-3,03 (m, 2H, CH2CI=CH2, H-3), 2,86- 2,72 (m, 2H, H-4), 2,55-2,50 (m, 1H, H-3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,6; 147,1; 139,6; 127,8; 126,8; 126,2; 118,0; 111,5; 111,3 (ArH); 111,1 (ArH); 65,8 (C-1); 65,5 (CH2CI=CH2); 55,9 (OCH3); 55,8 (OCH3); 46,0 (C-3); 28,5 (C-4); HRMS (ESI): izračunato za C16H20INO2 [M+H]+ 386,06115; izmereno 386,06235. 4,6,7,11b-Tetrahidro-3-metilen-3H-pirido[2,1-a]izohinolin (2.44) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.44 (37 %) u vidu narandžastog ulja. 177 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,23-7,09 (m, 4H, ArH), 6,28 (dd, 1H, J1=10,0 Hz, J2=3,0 Hz, H-1), 6,01 (d, 1H, J=10,0 Hz, H-2), 4,90 (s, 1H, C=CH2), 4,88 (s, 1H, C=CH2), 4,46 (s, 1H, H-11b), 3,64 (dt, 1H, J1=14,5 Hz, J2=2,0 Hz, H-4), 3,52 (d, 1H, J=14,5 Hz, H-4), 3,04- 2,88 (m, 3H, H-6, H-7), 2,74-2,69 (m, 1H, H-6); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,6; 136,6; 134,4; 131,0 (C-1); 129,0; 127,7 (C-2); 126,3; 125,9; 111,5 (C=CH2); 59,4 (C-11b); 57,8 (C-4); 47,8 (C-6); 29,2 (C-7); m/z (EI): 169,1; 182,1; 167,1; HRMS (ESI): izračunato za C14H15N [M+H]+ 198,12773, izmereno 198,12737. 4,6,7,11b-Tetrahidro-9,10-dimetoksi-3-metilen-3H-pirido[2,1-a]izohinolin (2.45) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.45 (25 %) u vidu žutog ulja. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.69 (s, 1H, ArH), 6,59 (s, 1H, ArH), 6,27 (dd, 1H, J1=10,0 Hz, J2=3,0 Hz, H-2), 5,97 (d, 1H, J=10,0 Hz, H-1), 4,92 (s, 1H, =CH2), 4,88 (s, 1H, =CH2), 4,14 (brs, 1H, H-11b), 3,87 (s, 3H, OCH3), 3,84 (s, 3H, OCH3), 3,65 (dt, 1H, J1=14,5 Hz, J2=2,0 Hz, H2C-4), 3,52 (d, 1H, J=14,5 Hz, H2C-4), 3,01-2,97 (m, 1H, H2C-6), 2,88-2,83 (m, 2H, H2C-7), 2,72-2,68 (m, 1H, H2C-6); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,6; 147,4; 138,5 (C-1); 130,9; 128,4; 127,6 (C-2); 126,6; 111,6 (=CH2); 111,5 (C-7); 109,0 (C-10); 58,9 (C-11b); 57,7 (C-4); 56,0 (OCH3); 55,8 (OCH3); 47,6 (C-6); 28,8 (C-7); Dihidro-β-karbolin (2.46) 99 Triptamin (3,0 g, 19 mmol), rastvori se u metil-formijatu (ili etil-formijatu) (60 mL) i smesa refluktuje 12 h. Metil-formijat se ispari pod sniženim pritiskom, a sirovi N-formil- triptamin se upotrebljava u sledećoj fazi bez prečišćavanja. Fosfor-oksihlorid (15 mL) se ukapa u balon sa sirovim N-formil-triptaminom (3,5 g, 19 mmol) uz hlañenje pomoću ledenog kupatila. Smesa se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 h, a zatim izruči u čašu sa isitnjenim ledom (100 mL). Suspenzija se procedi na vakuumu radi otklanjanja smolastih nečistoća, a filtrat zatim zaalkališe uz hlañenje čvrstim NaOH 178 dok rastvor ne počne blago da se muti. Tada se zaalkališe koncentrovanim amonijum- hidroksidom do pH~10. Dihidro-β-karbolin se dobija ceñenjem pomoću vakuuma u vidu žute čvrste supstance, i suši se, najpre na vazduhu izmeñu listova filter papira, a zatim u eksikatoru do konstantne mase, uz izbegavanje dugom izlaganju svetlosti. Ovako dobijen sirovi dihidro-β-karbolin je zadovoljavajuće čistoće za dalje reakcije. 1H NMR (200 MHz, CDCl3), δ 8,39 (s, 1H, N-H), 8,29 (s, 1H, H-1), 7,60 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,40 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,32-7,12 (m, 2H, ArH), 3,95 (t, 2H, J=8,4 Hz, H2C-3), 2,91 (t, 2H, J=8,4 Hz, H2C-4); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 151,5 (C-1); 136,8; 125,4; 124,7; 120,5; 120,0; 116,3; 112,0; 48,5 (C-3); 19,0 (C-4); N-(2-Jod-2-propenil)-dihidro-β-karbolinijum-bromid (2.47) Dobijen po opštem postupku za sintezu kvaternarnih iminijum-soli (str. 155) u vidu ciglastocrvene amorfne supstance (80 %). Tačka topljenja nije odreñena zbog visoke higroskopnosti supstance. 1-Alil-2,3,4,9-tetrahidro-2-(2-jodoalil)-1H-pirido[3,4-b]indol (2.48) Dobijen po opštoj proceduri za adiciju alil-Grignardovog reagensa na iminijum soli (str. 155). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.48 (42 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 3230, 3070, 2916, 1615, 1451, 741 cm-1 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,76 (brs, 1H, N-H), 7,55-7,05 (m, 4H, ArH), 6,37 (d, 1H, J=1,2 Hz, CH2=CI), 6,01 (m, 1H, CH2=CH), 5,89 (d, 1H, J=1 Hz, CH2=CI), 5,16 (d, 2H, J=12,0 Hz, CH2=CH), 3,74 (t, 1H, J=6,6 Hz, H-1), 3,33 (s, 2H, CH2 alil), 3,25-3,00 (m, 1H), 2,86-2,45 (m, 4H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 136,2; 135,7; 134,8; 127,0; 126,6; 121,6; 119,4; 118,1; 117,5; 111,8; 110,7; 108,1; 64,8; 56.7; 44,7; 39,4; 18,7 ; m/z (EI) 378[M]+, 337 [M-alil]+; 209,1; 169,1; HRMS (ESI): izračunato za C17H19IN2 [M+H]+ 379,06657; izmereno 379,06643. 179 1,2,3,4,6,7,12,12b-Oktahidro-2,3-dimetilen-indolo[2,3-a]hinolizin (2.49) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.49 (50 %) u vidu bledožute amorfne supstance, Tt=153-156 oC IR νmax: 3418, 3049, 2949, 1643, 1314, 743 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,74 (brs, 1H, N-H), 7.48 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-8), 7.31 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-11), 7,12 (m, 2H, H-9, H-10), 5,19-5,18 (m, 2H, C2=CH2, C3=CH2), 4,88 (s, 2H, C2=CH2, C3=CH2), 3,56 (d, 1H, J=12,5 Hz, H2C-4), 3,45 (d, 1H, J=11,5 Hz, H- 12b), 3,15 (m, 2H, H2C-4, H2C-6), 3,03 (m, 1H, H2C-7), 2,79 (m, 2H; H2C-1, H2C-7), 2,66 (m, J1=11,0 Hz, J2=4,5 Hz, H2C-6), 2,47 (m, 1H, J1=12,5 Hz, J2=2,0 Hz, H2C-1); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 144,4; 143,9; 136,1; 134,1; 127,2; 121,6; 119,5; 118,2; 110,8 (C-11); 110,3 (C2=CH2); 110,1 (C3=CH2); 108,7 (C-7a); 61,4 (C-4); 59,2 (C-12b); 52,3 (C-6); 38,6 (C-1); 21,6 (C-7). m/z (EI) 259,2 [M]+; 235,1; 220,1; 206,1; 169,1; HRMS (ESI): izračunato za C17H18N2 [M+H]+ 251,15428; izmereno 251,15374 (2.50) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.50 (80 %) u vidu krembele amorfne supstance, Tt=161-163 oC. IR νmax: 2949, 1716, 1659, 1434, 1260, 1069, 738 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,74 (s, 1H, ArH), 7,50 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,32 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,16 (t, 1H, J=7,2 Hz, ArH), 7,11 (t, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 3,80 (s, 3H, COOCH3), 3,79 (s, 3H, COOCH3), 3,62 (m, 1H, H-3), 3,28 (brd, 1H, J=15,5 Hz, H2C-21), 3,20 (dd, 1H, J1=11,5 Hz, J2=4,5 Hz, H2C-5), 3,06-2,89 (m, 6H, H2C-6, H2C-16, H2C-19, H2C-21), 2,80-2,75 (m, 1H, H2C-6), 2,67 (dt, 1H, J1=11,0 Hz, J2=4,0 Hz, H2C-5), 2,32 (m, 2H, H2C-14); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C=Oestar); 168,1 (C=Oestar); 136,3; 134,1; 132,7; 131,9; 127,2; 123,7; 122,1; 121,6; 119,5; 118,3; 110,8; 108,7; 57,3 (C-21); 55,8 (C-3); 52,3 (2C, COOCH3); 51,9 (C-5); 34,9 (C-14); 32,3 (C-19); 30,3 (C-16); 21,5 (C-6). 180 m/z (ESI) 393,1; 171,1; 144,1; 117,1; HRMS (ESI): izračunato za C23H24N2O4 [M+H]+ 393,18088, izmereno 393,17969. Smeša cikloadukata (2.51a,b) Dobijena po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijena je smeša proizvoda 2.51a,b (91 %) u vidu žute amorfne supstance. IR νmax: 3348, 1702, 1384, 1195, 738 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,86 (s, 1H, N-H), 7,81 (s, 1H, N-H), 7,49-7,44 (m, 4H,), 7,39-7,33 (m, 4H), 7,28-7,25 (m, 2H), 7,22-7,19 (m, 4H), 7,14-7,09 (m, 4H), 3,55 (brd, 1H, J=10,0 Hz), 3,45 (brs, 1H), 3,38 (d, 1H, J=17,5 Hz), 3,37-3,30 (m, 1H), 3,30-3,26 (m, 4H), 3,19-3,13 (m, 3H) 3,08-3,05 (m, 1H), 2,99-2,95 (m, 2H), 2,76-2,71 (m, 2H), 2,65-2,61 (m, 2H), 2,55 (brd, 2H, J=17,5 Hz), 2,50-2,39 (m, 10 H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 179,3 (C=Oimid); 179,0 (C=Oimid); 178,9 (C=Oimid); 178,8 (C=Oimid); 136,2 (2C), 134,3; 133,9; 132,0; 129,2; 129,1; 129,0; 128,7; 128,6; 128,6; 128,1; 127,5; 127,1; 127,0; 126,7; 126,6; 126,3; 121,6; 121,5; 119,5; 118,2; 118,1; 110,8 (2C); 108,5; 60,4; 57,8; 57,7; 56,0; 55,5; 51,8; 51,7; 40,2; 39,4 (2C); 39,3; 36,2; 35,4; 28,9; 28,4; 27,0; 26,9; 21,5; 21,3; 21,0; 14,2; m/z (ESI) 424,2; 407,2; 171,1; 154,1; 144,1; 117,1; HRMS (ESI): izračunato za C27H25N3O2 [M+H]+ 424,20195, izmereno 424,20155. (2.54) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, etar) dobijen je proizvod 2.54 (45 %) u vidu žute amorfne supstance, Tt=220-225 oC IR νmax: 3283, 2922, 1699,1621, 1606, 1439, 1299, 1284, 1148, 1231, 737 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,77 (s, 1H, H-19), 8,74 (s, 1H, N-H ), 7,60 (d, 1H, J=7,5 Hz, H-9), 7,56 (s, 1H, H-16), 7,45 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-12), 7,32 (t, 1H, J=7,5 Hz, H-11), 7,18 (t, 1H, J=7,5 Hz, H-10), 6,41 (s, 1H, H-14), 4,51 (t, 2H, J=7,0 Hz, H2C-5), 4,03 (s, 3H, COOCH3), 3,63 (s, 3H, COOCH3), 3,15 (t, 2H, J=7,0 Hz, H2C-6); 181 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 169,5 (C=Oestar) ; 165,9 (C=Oestar); 161,2 (C=Oamid); 138,7; 138,4; 136,9; 134,9;130,7; 127,4; 126,1; 125,9; 125,5; 125,0; 124,9; 120,7; 119,6; 115,6; 111,8 (C-7); 97,7 (C-14); 53,2 (COOCH3); 52,2 (COOCH3); 41,0 (C-5); 19,7 (C-6). m/z (ESI) 403,1; 371,1; 355,1; 343,1; 283,1; HRMS (ESI): izračunato za C23H18N2O5 [M+H]+ 403,12885, izmereno 403,12910 (2.55) Dobijen po opštem postupku za sintezu tetrahidroprotoberberina (str. 167). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.55 (72 %) u vidu bledožute amorfne supstance, Tt=167-168 oC. IR νmax: 1720, 1434, 1271, 1125, 741 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,17 (s, 1H, N-H), 7,51 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-12), 7,45 (s, 2H, H-16, H-19), 7,35 (d, 1H, J=8,0 Hz, H-9), 7,17 (t, 1H, J=7,0 Hz, J2=1,0 Hz, H-10), 7,10 (dt, 1H, J1=7,0 Hz, J2=1,0 Hz, H-11), 4,09 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-21), 3,91 (s, 3H, COOCH3), 3,87 (s, 3H, COOCH3), 3,70 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-21), 3,55-3,53 (m, 1H, H- 3), 3,27-3,24 (m, 1H, H2C-5), 3,11 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=3,0 Hz, H2C-14), 3,06-2,99 (m, 1H, H2C-6), 2,94 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=11,5 Hz, H2C-14), 2,80 (dt, 1H, J1=15,5 Hz, J2=1,5 Hz, H2C-6), 2,71 (dt, 1H, J1=11,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C=O); 168,0 (C=O); 138,2; 137,3; 136,4; 133,6; 130,0; 129,4, 129,3; 127,1; 127,0; 121,7 (C-10); 119,5 (C-11); 118,2 (C-12); 110,9; 108,7; 57,3 (C-21); 55,8 (C-3); 52,7 (COCH3); 52,6 (COCH3); 52,2 (C-5); 34,6 (C-14); 21,4 (C- 6); m/z (ESI) 391,1; 374,1; 359,1; 144,1; 117,1; HRMS (ESI): izračunato za C23H22N2O4 [M+H]+ 391,16523; izmereno 391,16563. N-(2-Brom-2-propenil)-piridinijum-bromid (2.56) Dobijen po opštem postupku za sintezu kvaternarnih soli (str. 155) u vidu smeñe amorfne supstance (80 %). Tačka topljenja nije odreñena zbog visoke higroskopnosti supstance. 182 2-Alil-1-(2-bromoalil)-1,2,5,6-tetrahidropiridin (2.59) Dobijen po opštem postupku za adiciju alil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli (str. 155) i redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 95:5 v/v petroletar-etar) dobijeni su proizvodi 2.59 i 2.60 (1:1, 46 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 2888, 1636, 1112, 961, 844 cm−1 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 5,94-5,91 (m, 1H, =CH2), 5,84-5,76 (m, 2H, H-4, CH=CH2), 5,61 (dd, 1H, J1=4,4 Hz, J2=1,6 Hz, H-3), 5,57 (brs, 1H, =CH2), 5,10 (d, 1H, J=6,8 Hz, =CH2), 5,01 (brs, 1H, =CH2), 3,53 (d, 1H, J=15,6 Hz, CH2CBr), 3,19 (d, 1H, J=15,6 Hz, CH2CBr), 3,10-3,00 (m, 1H, H-2), 2,99-2,90 (m, 1H), 2,57-2,42 (m, 1H), 2,39- 2,19 (m, 2H), 2,11-2,01 (m, 2H, H2C-5); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 135,6; 131,9; 129,2; 125,4; 117,6; 116,4 (=CH2); 62,3 (CH2CBr); 58,4 (C-2); 46,3 (C-6); 37,9 (CH2CH=CH2); 24,0 (C-5). m/z (EI) 241,0; 200,0; 120,1; 80,1; HRMS (ESI): izračunato za C11H16BrN [M+H]+ 242,05389; izmereno 242,05474 4-Alil-1-(2-bromoalil) piperidin (2.60) IR νmax νmax: 2909, 2159, 1629, 1445, 980, 909, 892 cm−1 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 5,84-5,82 (m, 1H), 5,81-5,67 (m, 1H), 5.56 (s, 1H), 5,05- 4,99 (m, 1H), 4,95 (s, 1H), 3,16 (s, 2H), 2,93-2,86 (m, 2H), 2,03-1,92 (m, 4H), 1,69-1,65 (m, 3H), 1,33-1,24 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 137,0; 131,1; 118,2; 115,7; 66,8; 53,5; 40,9; 31,9; m/z (EI) 244,1; 202,0; 164,1; 138,1; 120,1; HRMS (ESI): izračunato za C11H18BrN [M+H]+ 244,06954; izmereno 244,06931. 2,3,4,6,7,9a-Heksahidro-2,3-dimetilen-1H-hinolizin (2.61) Dobijen po opštem postupku za sintezu diena (str. 157). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.61 (26 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 2937, 2908, 2732, 1332, 1130, 891, 802 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5,77-5,73 (m, 1H, H-9), 5,47 (dd, 1H, J1=10,0 Hz, J2=1,5 Hz, H-8), 5,12 (t, 1H, J=1,5 Hz, H2C=C-3), 5,08 (t, 1H, J=2,0 Hz, H2C=C-2), 4,81 (t, 1H, 183 J=2,0 Hz, H2C=C-3), 4,75 (t, 1H, J=2,5 Hz, H2C=C-2), 3,36 (d, 1H, J=12,5 Hz, H2C-4), 2,91 (dt, 1H, J1=12,0 Hz, J2=1,5 Hz, H2C-4), 2,88-2,85 (m, 1H, H2C-6), 2,67-2,64 (m, 1H, H-9a), 2,47-2,42 (m, 1H, H2C-7), 2,39 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-6), 2,35 (dd, 1H, J1=13,5 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-1), 2,20-2,14 (m, 1H, H2C-1), 2,05-2,00 (m, 1H, H2C-7); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ 145,6 (C-2); 144,4 (C-3); 128,9 (C-8); 125,3 (C-9); 109,5 (C3=CH2); 109,4 (C2=CH2); 61,7 (C-4); 60,5 (C-9a); 51,1 (C-6); 40,2 (C-1); 26,0 (C-7); m/z (EI) 160,1 [M-H]+; 146,1; 80,1; 67,1; HRMS (ESI): izračunato za C11H15N [M+H]+ 162,12773; izmereno 162,12773. Dimetil-4,6,7,10,11,11a-heksahidro-3H-pirido[1,2-b]izohinolin-8,9-dikarboksilat (2.62) Dobijen po opštem postupku za sintezu cikloadukata Diels-Alderovom reakcijom (str. 158). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.62 (72 %) u vidu krembele amorfne supstance, Tt=110-111 oC IR νmax: 1712, 1273, 1071, 791, 757 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 5,77 (m, 1H, H-2), 5,51 (d, 1H, J=10,0 Hz, H-1), 3,78 (s, 6H, COOCH3), 3,10 (d, 1H, J=20,0 Hz, H-11a), 2,95-2,82 (m, 7H, H2C-4, H2C-6, H2C-7, H2C-10), 2,43-2,40 (m, 2H, H2C-3, H2C-4), 2,05-2,03 (m, 2H, H2C-3, H2C-11), 1,94-1,90 (m, 1H, H2C-11); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C=O); 168,1 (C=O); 132,8 (C-7); 131,8 (C-8); 128,7 (C-1); 124,9 (C-2); 123,2 (C-6a); 122,9 (C-10a); 57,5 (C-11a); 56,9 (C-6); 52,2 (COOCH3); 50,6 (C-4); 36,1 (C-11); 32,2 (C-10); 30,3 (C-7); 25,9 (C-3); m/z (ESI) 304,0; 272,0; 243,1; 134,1; 115,2; HRMS (ESI) izračunato za C17H21NO4 [M+H]+ 304,15433; izmereno 304,15410 MS-292 Dimetil-4,6,11,11a-tetrahidro-3H-pirido[1,2-b]izohinolin-8,9-dikarboksilat (2.63) Dobijen po opštem postupku za sintezu tetrahidroprotoberberina (str. 167). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.63 (80 %) u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=75-78 oC. IR νmax: 1716, 1435, 1268, 1121, 776 cm−1 184 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,46 (s, 1H, H-10), 7,43 (s, 1H, H-7), 5,86-5,83 (m, 1H, H- 2), 5,89 (d, 1H, J=10,0 Hz, H-1), 3,98 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-6), 3,89 (s, 3H, COOCH3), 3,88 (s, 3H, COOCH3), 3,56 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-6), 3,04-3,01 (m, 1H, H2C-4), 2,99- 2,96 (m, 1H, H-11a), 2,85 (dd, 1H, J1=17,0 Hz, J2=4,0 Hz, H2C-11), 2,75 (dd, 1H, J1=17,0 Hz, J2=12,0 Hz, H2C-11), 2,52-2,47 (m, 2H, H2C-3, H2C-4), 2,10-2,06 (m, 1H, H2C-3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,1 (C=O); 167,9 (C=O); 138,5; 138,2; 129,9; 129,2; 129,2 (C-10); 128,3 (C-1); 127,0 (C-7); 125,5 (C-2); 57,6 (C-6); 57,0 (C-11a); 52,5 (2xCH3); 50,8 (C-4); 35,7 (C-11); 25,8 (C-3). m/z (ESI) 302,1; 271,1; 201,1; 155,1; 142,1; HRMS (ESI): izračunato za C17H19NO4 [M+H]+ 302,13868; izmereno 302,13883. Dimetil-6-okso-6H-pirido[1,2-b]izohinolin-8,9-dikarboksilat (2.64) Dobijen po opštem postupku za sintezu oksoprotoberberina (str. 168). Fleš hromatografijom (silika-gel, 6:4 v/v dihlormetan-etar) dobijen je proizvod 2.64 (53 %) u vidu narandžastih iglica, Tt=171-174 oC. IR νmax: 1715, 1668, 1634, 1616, 1119, 737 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9,11 (s, 1H, H-7), 8,88 (d, 1H, J=7,6 Hz, H-4), 7,83 (s, 1H, H-10), 7,35 (d, 1H, J=9,0 Hz, H-1), 7,14 (dd, 1H, J1=9,0 Hz, J2=6,5 Hz, H-2), 6,85 (s, 1H, H-11), 6,75 (t, 1H, J=6,5 Hz, H-3), 3,98 (s, 3H, COOCH3), 3,96 (s, 3H, COOCH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 168,8 (C=Oestar); 166,4 (C=Oestar); 158,7 (C=Oamid); 139,8 (10a); 137,9 (C-11a); 136,3 (C-9); 131,7 (C-8); 128,4 (C-2); 126,7 (C-4); 126,2 (C-10); 125,7 (C-1); 125,1 (C-8); 119,2 (C-6a); 113,1 (C-3); 100,3 (C-11); 52,9 (COOCH3); 52,6 (COOCH3). m/z (ESI) 312,1 [M+H]+, 280,1; 265,1; 253,1; 222,1; 194,1; 166,1; 140,1; HRMS (ESI): izračunato za C17H13NO5 [M+H]+ 312,08665; izmereno 312,08524. Opšti postupak za sintezu alilnih acetata iz diena Smeša diena (0,1 mmol), aril-jodida (0,15 mmol, 1,5 eq), Pd(OAc)2 (10 mol %), PPh3 (20 mol %) i AcONa (0,5 mmol, 5 eq) u DMSO (2,0 mL) zagreva se na 85-90 oC 185 (temperatura uljanog kupatila) u atmosferi azota u toku 12 h. Reakciona smeša se ohladi do sobne temperature, doda etar (20 mL), i smeša ispere vodom (3 x 5 mL). Organski sloj se suši pomoću anhidrovanog natrijum-sulfata, filtrira, filtrat ispari pod sniženim pritiskom. Sirovi ostatak se prečišćava fleš hromatografijom. Dietil-3-(4-metoksibenzil)-4-(acetoksimetil) ciklopent-3-en-1,1-dikarboksilat (2.67) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (SiO2, 4:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.67 (20,6 mg, 51 %) u vidu bledožutog ulja Rf=0,2 (SiO2, 4:1 v/v petroletar-etar); IR νmax: 1728, 1510, 1243, 1177, 1021 cm−1 ; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,01 (d, 2H, J=8,4 Hz, ArH), 6.81 (d, 2H, J=8,4 Hz, ArH), 4,71 (s, 2H, CH2OAc), 4,13 (q, 4H, J=7,0 Hz, CH3CH2OC), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,40 (s, 2H, CH2Ph), 3,10 (s, 2H, H2C-2), 2,89 (s, 2H, H2C-5), 2,08 (s, 3H, CH3CO), 1,20 (t, 6H, J=7,0 Hz, CH3CH2); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 171,8 (C=Oestar); 171,0 (C=Oestar); 158,1; 138,3; 130,3; 129,4; 128,4; 113,9; 61,5 (CH3CH2OC); 59,9 (CH2OAc); 57,2 (C-1); 55,2 (OCH3); 43,4 (CH2Ph); 42,2 (C-5); 33,3 (C-2); 20,8 (CH3CO); 13,9 (CH3CH2); m/z (EI) 344,2 (M+-OAc); 270,1; 225,1; 197,1; 165,1; 121,1; 91,1. HRMS (ESI): izračunato za [C22H28O6 +K]+ 443,14666, izmereno 443,14610 Dietil-3-(3,4-dimetilbenzil)-4-(acetoksimetil)ciklopent-3-en-1,1-dikarboksilat (2.68) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etil-acetat) dobijen je proizvod 2.68 (16,1 mg, 40 %) u vidu bledožutog ulja. Rf=0,3 (SiO2, 9:1 v/v petroletar-etil-acetat); IR νmax: 1729, 1226. 1182 cm−1; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,02 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 6,87 (s, 1H, ArH), 6,84 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 4,72 (s, 2H, CH2OAc), 4,15 (q, 4H, J=7,2 Hz, CH3CH2OC), 3,39 (s, 186 2H, CH2Ar), 3,10 (s, 2H, H2C-2), 2,91 (s, 2H, H2C-5), 2,21 (s, 6H, ArCH3), 2,08 (s, 3H, CH3CO), 1,20 (t, 6H, J=7,2 Hz, CH3CH2); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 171,8 (C=Oestar); 170,9 (C=Oestar); 138,3 (C-4); 136,5 (C-3); 135,6 (ArC); 134,3 (ArC); 129,8 (ArC); 129,7 (ArC); 128,4 (ArC); 125,7 (ArC); 61,5 (CH3CH2OC); 59,9 (CH2OAc); 57,2 (C-1); 43,4 (CH2Ph); 42,2 (C-5); 33,8 (C-2); 20,8 (CH3CO); 19,7 (ArCH3); 19,2 (ArCH3); 13,9 (CH3CH2).; m/z (EI) 342,2; 268,1; 223,1; 195,1; 165,1; 119,1; 91,1. HRMS (ESI): izračunato za [C23H30O6+K]+ 441,16740, izmereno 441,16741 Dietil-3-(acetoksimetil)-4-benzilciklopent-3-en-1,1-dikarboksilat (2.69) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etil-acetat) dobijen je proizvod 2.69 (8,2 mg, 22 %) u vidu bledožutog ulja. Rf=0,5 (SiO2, 4:1 v/v petroletar-etil-acetat); IR νmax: 1729, 1225, 1181, 1019, 700 cm−1; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,40-7,09 (m, 5H, ArH), 4,72 (s, 2H, CH2OAc), 4,17 (q, 4H, J=7,5 Hz, CH3CH2OC), 3,47 (s, 2H, CH2Ph), 3,11 (s, 2H, H2C-2), 2,91 (s, 2H, H2C-5), 2,08 (s, 3H, CH3CO), 1,20 (t, 6H, J=7,5 Hz, CH3CH2). 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 171,8 (C=Oestar); 171,0 (C=Oestar); 138,3 (C-4); 137,9 (C-3); 128,8 (ArC); 128,5 (ArC); 126,3 (ArC); 61,5 (CH3CH2OC); 59,9 (CH2OAc); 57,3 (C-1); 43,4 (CH2Ph); 42,2 (C-5); 34,3 (C-2); 20,8 (CH3CO); 13,9 (CH3CH2). m/z (EI) 314,2 (M+-OAc); 268,1; 240,1; 195,1; 167,1; 91,1. HRMS (ESI): izračunato za [C21H26O6+Na]+ 397,16216, izmereno 397,16197. 2-(4-Tolilmetil)-4,6,7,11b-tetrahidro-3-(acetoksimetil)-1H-pirido[2,1-a]izohinolin (2.70) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 2:3 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.70 (17 mg, 48 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax : 2914, 1733, 1371, 1200, 1020, 736 cm−1; 187 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,11-7,04 (m, 8H, ArH), 4,81 (d, 1H, J=12,0 Hz, CH2OAc), 4,69 (d, 1H, J=12,0 Hz, CH2OAc), 3,59 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,50 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-4), 3,46 (dd, 1H, J=10,5 i 3,5 Hz, H-11b), 3,39 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,16- 3,11 (m, 2H, H2C-4, H2C-7), 3,10-3,08 (m, 1H, H2C-6), 2,70 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-7), 2,59-2,51 (m, 2H, H2C-6, H2C-1), 2,31 (s, 3H, CH3Ar), 2,15 (t, 1H, J=14,0 Hz, H2C-1), 2,07 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171,1 (C=Oestar); 137,6; 135,9; 135,7; 135,2; 134,2; 129,2; 128,7; 128,4; 126,0; 125,8; 125,5; 125,3; 62,3 (CH2OAc); 58,9 (C-12); 57,4 (C-4); 50,8 (C- 6); 37,8 (CH2Ar); 36,8 (C-1); 29,2 (C-7); 20,9 (CH3); m/z (EI) 346,2 (M+-CH3); 287,1 (M+-CH2OAc); 256,1; 196,1; 132,1; HRMS (ESI) m/z izračunato za [C24H27NO2+H] + 362,21146, izmereno 362,21292 2-(1-Naftilmetil)-4,6,7,11b-tetrahidro-3-(acetoksimetil)-1H-pirido[2,1-a]izohinolin (2.71) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.71 (21 mg, 37 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 1731, 1635, 1371, 1019, 783 cm−1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8,05 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,86 (d, 1H, J=8,5 Hz, ArH), 7,73 (d, 1H, J=8,5 Hz, ArH), 7,54-7,47 (m, 2H, ArH), 7,41 (t, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,27 (d, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 7,09-7,03 (m, 3H, ArH), 6,94 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 4,79 (d, 1H, J=12,0 Hz, CH2OAc), 4,71 (d, 1H, J=12,5 Hz, CH2OAc), 4,07 (d, 1H, J=16,0 Hz, CH2Ar), 3,95 (d, 1H, J=16,5 Hz, CH2Ar), 3,65-3,59 (m, 2H, H2C-4, H-11b), 3.28 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-4), 3,21-3,18 (m, 2H, H2C-6, H2C-7), 2,77-2,74 (m, 1H), 2,64-2,60 (m, 2H, H2C-6, H2C-1), 2,23 (t, 1H, J=13,5 Hz, H2C-1), 2,04 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171,1 (C=Oestar); 136,9; 134,5; 134,3; 133,9; 133,7; 132,3; 128,8; 128,7; 127,0; 126,4; 126,2; 126,1;125,9; 125,6; 125,5; 125,3; 125,2; 123,3; 62,2 (CH2OAc); 58,9 (C-11b); 57,1 (C-4); 50,7 (C-6); 36,9 (C-1); 34,8 (CH2Ar); 28,9 (C-7); 20,9 (CH3); m/z (EI) 355,1; 281,1; 207,0; 73,1; 188 HRMS (ESI): izračunato za [C27H27NO2+H ]+ 398,21146, izmereno 398,21240 2-(3,4-Dimetilfenilmetil)-4,6,7,11b-tetrahidro-3-(acetoksimetil)-1H-pirido[2,1-a] izohinolin (2.72) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.72 (19 mg, 30 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 1735, 1371, 1222, 1020, 735 cm−1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,11-7,03 (m, 6H, ArH), 6,94 (s, 1H, ArH), 6,90 (d, 1H, J= 7,5 Hz, ArH), 4,82 (d, 1H, J=12,0 Hz, CH2OAc ), 4,70 (d, 1H, J=12,0 Hz, CH2OAc), 3,57 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,50 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-4), 3,45 (dd, 1H, J=10,5 i 3,5 Hz, H-11b), 3,36 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,19-3,08 (m, 3H, H2C-7, H2C-6, H2C-4), 2,70 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-7), 2,61-2,51 (m, 2H, H2C-1, H2C-6), 2,23 (s, 3H, ArCH3), 2,22 (s, 3H, ArCH3), 2,14 (m, 1H, H-1), 2,08 (s, 3H, CH3CO); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171,1 (C=Oestar); 137,6; 136,5; 136,3; 135,3; 134,3; 134,2; 129.9; 129,7; 128,7; 126,0; 125,9; 125,8; 125,4; 125,3; 62,2 (CH2OAc); 58,9 (C-11b); 57,3 (C-4); 50,8 (C-6); 37,7 (CH2Ar); 36,8 (C-1); 29,2 (C-7); 20,9 (CH3CO); 19,7 (ArCH3); 19,2 (ArCH3); m/z (EI) 374,2 (M+-1), 315,2 (M+-CH3COO), 256,1; 196,1; 169,1; 132,0; HRMS (ESI): izračunato za [C25H29NO2 +H]+ 376,22711, izmereno 376,22499 2-(4-Metoksifenilmetil)-4,6,7,11b-tetrahidro-3-(acetoksimetil)-1H-pirido[2,1- a]izohinolin (2.73) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 3:2 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.73 (18 mg, 32 %) u vidu žutog ulja. IR νmax: 1733, 1509, 1240, 1022, 736 cm−1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,11-7,03 (m, 6H, ArH), 6,83 (s, 1H, ArH), 6,81 (s, 1H, ArH), 4,82 (d, 1H, J=12,5 Hz, CH2OAc ), 4,70 (d, 1H, J=12,5 Hz, CH2OAc), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,57 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,50 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-4), 3,45 (dd, 1H, 189 J=11,0 i 3,5 Hz, H-11b), 3,38 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,19-3,11 (m, 2H, H2C-7, H2C- 4), 3,10-3,08 (m, 1H, H2C-6), 2,70 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-7), 2,58-2,51 (m, 2H, H2C-1, H2C-6), 2,16-2,11 (m, 1H, H2C-1), 2,08 (s, 3H, CH3CO); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171,1 (C=Oestar); 158,1; 137,6; 135,3; 134,2; 129,5; 128,8; 126,0; 125,8; 125,4; 125,3; 113,9; 62,2 (CH2OAc); 59,0 (C-11b); 57,3 (C-4); 55,2 (OCH3); 50,8 (C-6); 37,3 (CH2Ar); 36,7 (C-1); 29,2 (C-7); 21,3 (20,9 (CH3CO); m/z (EI) 270,1; 226,0; 210,1; 130,0, 59,9; HRMS (ESI): izračunato za [C24H27NO3+H]+ 378,20637, izmereno 378,20459. 2-(4-Tolilmetil)-3-acetoksimetil-1,4,6,7,12,12b-heksahidroindolo[2,3-a] hinolizin (2.74) Dobijen po opštem postupku za sintezu alilnih acetata iz diena (str. 184). Fleš hromatografijom (silika-gel, 2:3 v/v etar-petroletar) dobijen je proizvod 2.74 (16 mg, 34 %) u vidu žutog ulja. IR νmax: 2907, 1732, 1451, 1375, 1223, 1020, 740 cm−1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,65 (brs, 1H, N-H), 7,46 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,24 (m, 1H, ArH), 7,08 (m, 6H, ArH), 4,82 (d, 1H, J=12,5 Hz, CH2OAc), 4,69 (d, 1H, J=12,0 Hz, CH2OAc), 3,67 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,58 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-4), 3,49 (m, 1H, H-12b), 3,35 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,23-3,19 (m, 2H, H2C-6, H2C-4), 3,04-2,97 (m, 1H, H2C-7), 2,75 (dt, 1H, J=15,5 i 2,5 Hz, H2C-7), 2,64 (dt, 1H, J=11,5 i 4,0 Hz, H2C-6), 2,38-2,35 (m, 1H, H2C-1), 2,32 (s, 3H, ArCH3), 2,27-2,22 (m, 1H, H2C-1), 2,07 (s, 3H, CH3CO); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171,1 (C=Oestar); 136,2; 135,9; 135,7; 134,1; 133,9; 129,3; 128,5; 127,1; 126,3; 121,5; 119,4; 118,2; 110,7; 108,5; 62,2 (CH2OAc); 56,4 (C-4); 55,5 (C-12b); 51,8 (C-6); 37,6 (CH2Ar); 34,6 (C-1); 21,3 (CH3CO); 20,9 (ArCH3); HRMS (ESI): izračunato za [C26H28N2O2+H]+ 401,22235, izmereno 401,22364 190 Opšti postupak za dobijanje alil-kvaternarnih soli N-Alil-dihidro-β-karbolinijum-bromid (2.75) U rastvor dihidro-β-karbolina 2.46 (190 mg, 0,7 mmol) u suvom acetonitrilu (10 mL) doda se alil-bromid (0,6 mL, 7 mmol) i smesa zagreva na 85 o C u toku 5 h. Nakon toga, rastvarač se udalji destilovanjem pod sniženim pritiskom, pri čemu ostaje smolasti ostatak, koji se prečišćava na sledeći način: pipetom se dodaje suvi etar, i dobijena suspenzija se meša; etar se udalji dekantovanjem i dodaje se nova porcija sve dok dok smolasta supstanca ne postane praškasta. Tragovi etra se uklone uparavanjem pod sniženim pritiskom. Dobijena je kvaternarna alil-karbolinijum-so 2.75 u vidu žute amorfne supstance, Tt=173-178 oC (260 mg, 80 %). IR (KBr) νmax : 3032, 1645, 1543, 1442, 1422, 1339, 1318, 1197, 953 cm−1; 1H NMR (200 MHz, DMSO) δ 12,29 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 7,78 (d, 1H, J=8,4 Hz), 7,59 (d, 1H, J=8,4 Hz), 7,47 (t, 1H, J=8,4 Hz), 7,21 (t, 1H, J=8,4 Hz), 6,06 (m, 1H), 5,62- 5,47 (m, 2H), 4,63 (d, 2H, J=6,2 Hz), 4,01 (t, 2H, J=9 Hz), 3,29 (m, 2H); 13C NMR (50 MHz, DMSO) δ 155,8; 141,7; 130,7; 129,1; 125,7; 123,8; 123,5; 122,2; 121,8; 113,8; 61,0; 48,6; 19,3. Opšti postupak za adiciju alil-indijumovog reagensa na iminijum-soli U rastvor alil-bromida (0,1 mL, 1,1 mmol) i tetrahidrofurana (4,0 mL) u atmosferi azota doda se indijum u prahu (100 mg, 0,9 mmol). Alil-indijumov reagens se dobija zagrevanjem uz mešanje reakcione smese na 50 oC u toku 15 minuta. Rastvor alil- indijumovog reagensa se ohladi do sobne temperature i doda se čvrsta kvaternarna alil- karbolinijum-so 2.75 (140 mg, 0,7 mmol). Dobijena suspenzija se meša i zagreva na 65 oC 3h. Tok reakcije se prati tankoslojnom hromatografijom. Reakciona smesa se ohladi, a rastvarač se udalji uparavanjem pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori u etil-acetatu (30 mL), ispere vodom (10 mL), suši anhidrovanim natrijum-sulfatom. Sušilo se odvoji filtracijom a rastvarač se ispari pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod se prečišćava fleš 191 hromatografijom na koloni silika-gela, primenom eluenta 7:3 (v/v) petroletar/ etil-acetat. Dobijeno je 48,6 mg (40 %) proizvoda 2.76 u vidu žutog ulja. 1,2-Dialil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (2.76) 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,79 (br s, 1H, N-H), 7,48 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,28- 7,26 (m, 1H), 7,14-7,08 (m, 2H, ArH), 6,06-5,83 (m, 2H), 5,21-5,01 (m, 2H), 5,11 (s, 2H), 3,79 (t, 1H, J=6,6 Hz), 3,31-3,17 (m, 3H), 3,04-2,81 (m, 3H), 2,68-2,58 (m, 2H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 136,2; 136,0; 135,7; 134,8; 127,0; 121,4; 119,2, 118,0, 117,5; 117,3; 110,7; 107,9; 56,2; 56,1; 45,2; 38,5; 18,2. 1,4,6,7,12,12b-Heksahidroindolo[2,3-a]hinolizin (2.77) Bis-alilovani β-karbolin 2.76 (30 mg, 0,12 mmol) se rastvori u suvom toluenu (2,0 mL), a zatim se u reakcionu smesu u atmosferi azota doda Grubbsov katalizator II generacije (3 mg, 3 mol %) i smesa zagreva na 110 oC 12 h. Tok reakcije se prati tankoslojnom hromatografijom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika gela, primenom eluenta 7:3 (v/v) hloroform/etil-acetat. Dobijeno je 4,3 mg (16 %) proizvoda 2.77 u vidu žutog ulja. IR (KBr) νmax : 3211, 2929, 1634, 1557, 1505, 1455, 1332, 1289, 1096 cm−1 ; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,88 (brs, 1H, N-H), 7,51-7,47 (m, 1H, ArH), 7,36-7,33 (m, 1H), 7,19-7,06 (m, 2H), 5,81 (brs, 2H), 3,62-3,53 (m, 2H), 3,45 (s, 1H), 3,24-3,19 (m, 2H), 2,81-2,79 (m, 2H), 2,71-2,66 (m, 2H), 2,38-2,25 (m, 2H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 136,2; 127,2; 125,8; 124,1; 121,5; 119,4; 118,2; 110,8; 108,4; 55,5; 54,4; 52,2; 31,2; 21,3; m/z (EI): 224,1[M] +; 206,1; 194,1; 169,1; 154,1; 1-(1-Alil-3,4-dihidro-1H-pirido[3,4-b]indol-2(9H)-il) prop-2-en-1-on 71 (2.79) U rastvor dihidro-β-karbolina 2.46 (150 mg, 0,8 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (7 mL) ohlañen na 0 oC, ukapa se akriloil-hlorid (0,08 mL, 0,88 mmol) i smesa meša oko 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim se doda indijum (205 mg, 1,8 mmol) i alil-bromid (0,2 mL, 2,2 mmol), i reakciona smeša meša na sobnoj temperaturi 4 h. Rastvarač se upari pod 192 sniženim pritiskom, a ostatak prečisti fleš hromatografijom na koloni silika-gela primenom sistema 6:4 (v/v) petroletar/ etil-acetat. Dobijeno je 61 mg (26 %) jedinjenja 2.79 u vidu bezbojnih kristala, Tt=75 oC. IR νmax : 3260, 1635, 1589, 1445, 741 cm−1; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,95 (brs, 1H), 7,53-7,07 (m, 4H), 6,68 (dd, 1H, J=16,8 i 10,6 Hz), 6,30 (dd, 1H, J=16,8 i 1,8 Hz), 6,05 (m, 1H), 5,84-5,72 (m, 2H), 5,29-5,16 (m, 1H), 5,09-4,99 (m, 1H), 4,25-4,11 (m, 2H), 3,60-3,41 (m, 2H), 2,85-2,81 (m, 1H), 2,70- 2,64 (m, 1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 156,8; 134,5; 127,9; 121,8; 119,6; 118,7; 110,9; 95,7; 70,6; 49,2; 41,0; 38,8; 22,3; m/z (EI): 266,1 [M]+; 225,1; 171,1; 154,1; 115,0. 1,6,7,12b-Tetrahidroindolo[2,3-a]hinolizin-4(12H)-on 71 (2.80) Karbolin-akrilamid 2.79 (47 mg, 0,17 mmol) se rastvori u suvom toluenu (2,0 mL), a zatim se reakcionoj smesi u atmosferi azota doda Grubbs-ov katalizator I generacije (9 mg, 6 mol%) i smesa meša na sobnoj temperaturi 12 h. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela, primenom eluenta 1:1 (v/v) petroletar/ etil-acetat. Dobijeno je 35 mg (83 %) proizvoda 2.80 u vidu sivozelene amorfne supstance, Tt=225-228 oC. IR νmax : 3259, 1653, 1599, 1432, 808, 738, 698 cm−1; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 8,04 (brs, 1H), 7,53 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,34 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,26-7,10 (m, 2H, ArH), 6,72-6,63 (m, 1H), 6,11 (dd, 1H, J=10,0 i 2,8 Hz), 5,03 (dd, 1H, J=9,0 i 2,8 Hz ), 4,88 (dd, 1H, J1=13,6, i J2=5,0 Hz), 2,99-2,73 (m, 4H), 2,54-2,37 (m, 1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 164,9; 137,7; 136,4; 132,3; 126,6; 125,9; 122,4; 119,9; 118,5; 110,9; 109,7; 51,5; 38,7; 31,2; 20,83. HRMS (ESI): izračunato za C15H14N2O [M+H] + 239,11789; izmereno 239,11740. 193 1-(1-Alilizohinolin-2(1H)-il)prop-2-en-1-on (2.82) U rastvor izohinolina (50 mg, 0,4 mmol) u suvom tetrahidrofuranu (5,0 mL) ohlañen na 0 oC ukapa se akriloil-hlorid (0,04 mL, 0,43 mmol) i smesa meša oko 1 h na sobnoj temperaturi. Zatim se doda indijum (90 mg, 0,8 mmol) i alil-bromid (0,1 mL, 1,1 mmol) i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 12 h. Nakon toga rastvarač se ispari pod sniženim pritiskom, a ostatak prečisti fleš hromatografijom na koloni silika-gela primenom sistema 9:1 (v/v) petroletar/ etil-acetat. Dobijeno je 17,4 mg (20 %) proizvoda 2.82 u vidu bezbojnog ulja. Pretpostavljena struktura je potvrñena samo GC/MS metodom i jedinjenje je korišćeno u sledećoj fazi bez potpune karakterizacije. m/z (EI): 225,1 [M]+; 184,1; 130,1; 115,1; 103,1. 1H-Pirido[2,1-a]izohinolin-4(11bH)-on (2.83) Izohinolin-akrilamid (18 mg, 0,08 mmol) se rastvori u suvom dihlormetanu (2,0 mL), a zatim se reakcionoj smesi u atmosferi azota doda Grubbs-ov katalizator I generacije (3,0 mg, 4 mol %) i smesa meša na sobnoj temperaturi 2 h. Tok reakcije prati se tankoslojnom hromatografijom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela, primenom eluenta 7:3 (v/v) petroletar/ etil-acetat. Dobijeno je 12,1 mg (77 %) proizvoda 2.83 u vidu bezbojne amorfne supstance. IR νmax : 3100, 3079, 1650, 1618, 1454, 1405 cm−1 ; 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,43 (d, 1H, J=7,8 Hz, ArH), 7,26-7,11 (m, 2H, ArH), 7,01 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 6,84-6,75 (m, 1H), 6,14 (dd, 1H, J1=10,0 Hz, J2=2,8 Hz), 5,88 (d, 1H, J=8,0 Hz), 5,11 (dd, 1H, J1=13,4, J2=5,0 Hz), 3,10 (dt, 1H, J1=18,0, J2=6,0 Hz), 2,92- 2,73 (m, 1H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 162,1; 139,3; 131,6; 130,8; 128,2; 127,0; 125,0; 124,8; 124,3; 123,8; 108,5; 53,5; 29,7; m/z (EI): 197,1 [M]+; 168,1; 130,1; 115,1; 102,1; HRMS (ESI): izračunato za C13H11NO [M+H]+ 198,09134; izmereno 198,09094. 194 N-(2-Bromobenzil)-dihidro-β-karbolinijum-bromid (2.84) Dobijeno po opštem postupku za dobijanje kvaternarnih soli (str. 155) u vidu žute amorfne supstance (80 %). 1H NMR (200 MHz, DMSO) δ 9,02 (s, 1H, N-H), 7,78-7,67 (m, 3H, ArH), 7,56-7,38 (m, 4H, ArH), 7,25-7,17 (m, 1H, ArH), 5,30 (s, 1H, CH2 Ar), 4,85 (s, 1H, CH2 Ar), 4,05 (t, 2H, J=9,0 Hz), 3,33 (t, 2H, J=9,0 Hz). 13C NMR (50 MHz, DMSO), 156,9; 144,3; 135,1; 133,8; 132,9; 132,5; 131,2; 129,9; 126,8; 126,5; 125,9; 125,5; 123,4; 123,1; 114,6; 63,6; 20,8. 2-(2-Bromobenzil)-1-alil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (2.85) Dobijen po opštem postupku za adiciju alil-indijumovog reagensa na iminijum-soli (str. 190). Fleš hromatografijom (silika-gel, 75:25 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.85 (55%) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 3406 , 3055, 2916, 1463, 1437, 1043, 740 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,78 (brs, 1H, N-H), 7,62 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 7,53 (t, 2H, J=7,5 Hz, ArH), 7,32-7,29 (m, 2H, ArH), 7,17-7,09 (m, 3H, ArH), 5,98-5,89 (m, 1H, CH=CH2), 5,13-5,11 (m, 1H, =CH2), 5,09 (s, 1H, =CH2), 3,87 (q, 2H, J=3,4 Hz, CH2Ar), 3,79 (t, 1H, J=6,5 Hz, H-1), 3,24-3,19 (m, 1H, H2C-3), 2,98-2,90 (m, 2H, H2C-3, H2C-4), 2,71-2,64 (m, 2H, H2C-4, CH2CH=CH2), 2,57-2,52 (m, 1H, CH2CH=CH2); 13C NMR (125 MHz, CDCl3 δ 138,8; 136,2; 135,2; 135,1;132,7; 130,5; 128,3; 127,2; 127,1; 124,4; 121,5; 119,3; 118,2; 117,3 (=CH2); 110,8; 108,3 ; 57,5 (C-1); 57,1 (CH2Ar); 45,4 (C-3); 39,0 (CH2CH=CH2); 18,7 (C-4). HRMS izračunato za C21H21BrN2 [M+H]+ 381,09609, izmereno 381,09532; Opšti postupak za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom U rastvor prekursora (0,3 mmol) u toluenu (8,0 mL) doda se Pd(OAc)2 (7,3 mg, 10 mol %), PPh3 (17 mg, 20 mol %), i K2CO3 (67 mg, 1,5 eq). Reakciona smesa se zageva na 111 oC tokom 12 h. Kada je reakcija završena, toluen se ispari, ostatak rastvori u dihlormetanu (40 mL) i ispere vodom. Ekstrakt se suši pomoću anhidrovanog natrijum- 195 sulfata. Rastvarač se ispari pod sniženim pritiskom a ostatak prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. (2.86) Dobijen po opštem postupku za sintezu benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.86 (36 %) u vidu žute amorfne supstance, Tt=118-120 oC. IR νmax : 3206, 3058, 2850, 1622, 1454, 1345, 1323, 1162 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,86 (brs, 1H, N-H), 7,47 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,31 (m, 2H, ArH), 7,25-7,18 (m, 3H, ArH), 7,16-7,07 (m, 2H, ArH), 5,24 (s, 2H, =CH2), 4,34 (dd, 1H, J1=10,5Hz, J2=3,5 Hz, H-13a), 4,13 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 4,01 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 3,08-2,97 (m, 2H, H2C-6), 2,86-2,72 (m, 4H, H2C-5, H2C-14); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,8; 142,6; 136,5; 135,9; 129,4; 129,1; 127,6; 127,5; 121,6; 121,0; 119,4; 118,2; 114,8 (=CH2) ; 110,8; 108,5; 60,7 (C-13a); 59,6 (C-8); 47,4 (C- 6); 39,6 (C-14), 21,1 (C-5). m/z (EI) 300,1 [M+]; 171,1; 154,1; 130,1; 115,1; 91,1; HRMS izračunato za C21H20N2 [M+H]+ 301,16993, izmereno 301,17034; N-(2-Bromobenzil)-3-metil-izohinolinijum-bromid (2.87) Dobijen po opštem postupku za dobijanje kvaternarnih soli (str. 155) u vidu bele amorfne supstance (85 %), Tt=175-177 oC. 2-(2-Bromobenzil)-1-alil-1,2,3,4-tetrahidro-3-metil-izohinolin (2.89) Dobijen po opštoj proceduri za adiciju alil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli (str. 153) i redukciju enamina (str. 154). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.89 (30 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax 2964, 1455, 1355, 1023, 910, 742 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,69 (dt, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,51 (dd, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,26 (dt, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,17-7,08 (m, 5H, ArH), 5,72-5,64 (m, 1H, CH=CH2), 4,88-4,86 (m, 1H, =CH2), 4,85-4,80 (m, 1H, =CH2), 196 3,93 (d, 1H, J=16,0 Hz, CH2 Ar), 3,85 (d, 1H, J=6,0 Hz, H-1), 3,83 (d, 1H, J=16,0 Hz, CH2Ar), 2,95-2,89 (m, 1H, H-3), 2,78-2,68 (m, 2H, H2C-4), 2,51-2,45 (m, 1H, CH2CH=CH2), 2,38-2,32 (m, 1H, CH2CH=CH2), 1,15 (d, 3H, J=6,0 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 140,3; 138,4; 136,4; 135,8; 132,4; 130,9; 128,0; 127,8; 127,0; 126,9; 126,1;125,8; 123,5; 116,1 (=CH2); 63,8 (C-1); 58,9 (CH2Ar); 54,6 (C-3); 42,7 (CH2CH=CH2); 36,3 (C-4); 22,5 (CH3). m/z (EI) 313 [M-41,1]+; 168,9; 144,1; 115,1; 90,0; HRMS (ESI): izračunato za C20H22BrN, (M+H)+ 356,10084, izmereno 356,10094; 13-Metilen-6-metil-5,6,8,13,14,14a-heksahidroizohino[2,1-b][2]benzazepin (2.90) Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijeni su proizvodi 2.90 i 2.91 u odnosu 5:1 (57 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax 2961, 1601, 1449, 1259, 1083, 1023, 799 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ=7,44 (dd, 1H, J1=7,0 Hz, J2=2,0 Hz, ArH), 7,31 (d, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 7,22–7,14 (m, 4H, ArH), 7,08 (d, 2H, J=7,0 Hz, ArH), 5,41 (d, 1H, J=1,0 Hz, =CH2), 5,20 (s, 1H, =CH2), 4,33 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=5,5 Hz, H-14a), 3,83 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-8), 3,70 (d, 1H, J=16,0 Hz, H2C-8), 3,31 (dd, 1H, J1=13,3 Hz, J2=6,0 Hz, H2C-14), 3,28–3,18 (m, 1H, H-6), 2,79–2,71 (m, 1H, H2C-5), 2,68–2,55 (m, 2H, H2C-5, H2C-14), 1,22 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,3; 140.9; 139,6; 137,9; 135,5; 128,7; 127,6; 127,0; 126,4; 126,4; 126,2; 126,1; 113,2; 64,3 (C-14a); 53,5 (C-6); 47,7 (C-8); 41,6 (C-14); 33,1 (C-5); 20,2 (CH3); m/z (EI) 275,1 [M]+; 260,1; 146,1; 130,1; 115,1; HRMS (ESI): izračunato za C20H21N [M+H]+ 276,17468; izmereno 276,17567; 13-Metilen-6-metil-5,6,8,13,14,14a-heksahidroizohino[2,1-b][2]benzazepin (2.91) IR νmax 2908, 1485, 1435, 1369, 1158, 902, 760 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,30–7,10 (m, 7H, ArH), 7,05 (d, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 5,21 (s, 1H, =CH2), 5,13 (d, 1H, J=2,0 Hz, =CH2), 4,37 (dd, 1H, J1=10,7 Hz, J2=3,0 Hz, H-14a), 197 4,18 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 4,12 (d, 1H, J=15,5 Hz, H2C-8), 3,28–3,20 (m, 1H, H-6), 2,95–2,85 (m, 2H, H2C-5, H2C-14), 2,68 (dd, 1H, J1=13,5 Hz, J2=2,5 Hz, H2C-14), 2,61 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=8,0 Hz, H2C-5), 1,26 (d, 3H, J=6,0 Hz, CH3) 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 149,6; 143,8; 139,2; 136,5; 133,8; 129,7; 128,5; 127,7; 127,6; 127,3, 127,2; 126,5;126,2; 125,5; 115,0 ; 65,5 (C-14a); 57,4 (C-6); 47,1 (C-8); 41,9 (C-14); 37,6 (C-5); 19,2 (CH3); m/z (EI) 275.1 [M]+, 260,1; 146,1; 130,1; 115,1; 91,1; HRMS (ESI): izračunato za C20H21N, [M+H]+ 276,17468, izmereno 276,17536; N-(2-Bromobenzil)-6,7-dimetoksi-izohinolinijum-bromid (2.92) Dobijeno po opštem postupku za dobijanje kvaternarnih soli (str. 155) u vidu bele amorfne supstance (94 %), Tt=218-220 oC. 2-(2-Bromobenzil)-1-alil-1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dimetoksizohinolin (2.93) Dobijen po opštem postupku za adiciju alilmagnezijum-bromida (str. 155) i redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.93 (40 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax :1513, 1252, 1105, 908, 728 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,59 (dd, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 7,51 (dd, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 7,28 (dt, 1H, J1=7,5 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,09 (dt, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 6,59 (s, 1H, ArH), 6,56 (s, 1H, ArH), 5,93-5,85 (m, 1H, CH=CH2), 5,02-4,99 (m, 1H, =CH2), 4,98-4,97 (m, 1H, =CH2), 3,85 (s, 3H, OCH3), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,82 (s, 2H, CH2Ar), 3,68 (dd, 1H, J1=7,0 Hz, J2=5,5 Hz, H-1), 3,18 (dq, 1H, J1=13,0 Hz, J2=4,5 Hz, H2C-3), 2,92-2,86 (m, 1H, H2C-4), 2,80-2,76 (m, 1H, H2C-3), 2,62- 2,58 (m, 1H, CH2CH=CH2), 2,57-2,52 (m, 1H, H2C-4), 2,48-2,44 (m, 1H, CH2CH=CH2); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,3; 146,9; 138,8; 136,8; 132,5; 130,5; 129,9; 128,1; 127,1; 126,4; 124,3; 115,7 (=CH2); 111,4 (o-OCH3); 110,7 (o-OCH3); 61,3 (C-1); 57,3 (CH2Ar); 55,9 (OCH3); 55,7 (OCH3); 43,6 (C-3); 40,5 (CH2CH=CH2); 24,7 (C-4); m/z (EI) 402,1; 360.1; 280.1; 169.0; HRMS (ESI): izračunato za C21H24BrNO2 [M+H]+ 402,10632, izmereno 402,10627; 198 2,3-Dimetoksi-13-metilen-5,6,8,13,14,14a-heksahidroizohino[2,1-b][2]benzazepin (2.94) 49 Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.94 (70 %) u vidu bledožutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=133-135 oC. IR νmax :1517, 1463, 1257, 1225, 853, 766 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,26-7,17 (m, 4H, ArH), 6,63 (s, 1H, ArH), 6,57 (s, 1H, ArH), 5,26 (s, 1H, CH2=), 5,16 (d, 1H, J=2,0 Hz, CH2=), 4,27 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 4,24 (dd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=3,0 Hz, H-14a), 3,93 (d, 1H, J=15,0 Hz, H2C-8), 3,88 (s, 3H, OCH3), 3,83 (s, 3H, OCH3), 2,97-2,91 (m, 1H, H2C-5), 2,87-2,76 (m, 3H, H2C-5, H2C-6), 2,68 (dt, 1H, J1=15,0 Hz, J2=3,5 Hz, H2C-14), 2,61 (dd, 1H, J1=15,0 Hz, J2=3,5 Hz, H2C- 14); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 149,2; 147,6; 147,1; 143,5; 135,9; 131,4; 129,1; 127,5; 127,2; 126,1; 114,8; 111,4; 109,9; 64,4 (C-14a); 60,3 (C-8); 56,1 (OCH3); 55,8 (OCH3); 43,5 (C-14); 40,5 (C-6); 28,6 (C-5); m/z (EI) 321,2 [M]+; 192,1; 130,1; 115,1; HRMS (ESI): izračunato za C21H23NO2 [M+H]+ 322,18016, izmereno 322,18144; 11-Metilen-3,4,6,11,12,12a-heksahidropirido[1,2-b][2]benzazepin (2.95) Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 1:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.95 (55 %) u vidu žutog ulja koje očvršćava hlañenjem. IR νmax :1629, 1430, 1355, 1103, 759 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,24-7,13 (m, 4H), ArH, 5,76-5,73 (m, 1H, H-2), 5,59 (dd, 1H, J1=10,0 Hz, J2=2,5 Hz, H-1), 5,14 (s, 1H, =CH2), 5,09 (d, 1H, J=2,0 Hz, =CH2), 3,96 (d, 1H, J=14,5 Hz, H2C-6), 3,73 (d, 1H, J=14,5 Hz, H2C-6), 3,43-3,40 (m, 1H, H-12a), 2,79 (dd, 1H, J1=12,0 Hz, J2=6,0 Hz, H2C-4), 2,68 (dd, 1H, J1=12,0 Hz, J2=6,0 Hz, H2C-4), 2,49-2,42 (m, 2H, H2C-12), 2,19-2,16 (m, 2H, H2C-3); 199 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 149,3 (C-11); 143,4; 136,4; 130,6 (C-1); 129,1; 127,5; 127,4; 127,3; 125,2 (C-2); 114,4 (=CH2); 63,5 (C-12a); 64,9 (C-6); 48,1 (C-4); 40,9 (C-12); 26,0 (C-3). m/z (EI) 211,1 [M]+; 130,1; 115,1; 82,1; HRMS (ESI): izračunato za C15H17N, [M+H]+ 212,14338, izmereno 212,14333; N-(2-Bromobenzil)-piridinijum-bromid (2.96) Dobijen po opštem postupku za dobijanje kvaternarnih soli (str. 155) u vidu bele amorfne supstance (80 %), Tt=172-175 oC. 1-(2-Bromobenzil)-2-alil-1,2,5,6-tetrahidropiridin (2.99) Dobijen po opštem postupku za adiciju alil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli (str. 155) i redukciju enamina (str. 156). Fleš hromatografijom (silika-gel, 95:5 v/v petroletar-etar) dobijeni su proizvodi 2.99 u vidu bledožutog i 2.100 u vidu bezbojnog ulja (2:1, 36 %). IR νmax: 2159, 1437, 1022, 910, 746, 667 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,58 (dd, 1H, J1=7 Hz, J2=0,5 Hz, ArH), 7,51 (dd, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,27 (dt, 1H, J1=8,0 Hz, J2=0,5 Hz, ArH), 7,08 (dt, 1H, J1=7,5 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 5,90-5,81 (m, 2H, CH=CH2, H-4), 5,64 (dq, 1H, J1=10,0 Hz, J2=2,0 Hz, H-3), 5,06-5,01 (m, 2H, =CH2), 3,92 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,59 (d, 1H, J=15,0 Hz, CH2Ar), 3,11-3,08 (m, 1H, H-2), 2,85 (dt, 1H, J1=12,0 Hz, J2=5,0 Hz, H2C-6), 2,48- 2,42 (m, 1H, H2C-6), 2,41-2,38 (m, 1H, CH2CH=CH2), 2,35-2,78 (m, 1H, CH2CH=CH2), 2,07-2,06 (m, 2H, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,9; 135,8 (CH=CH2); 132,4; 130,3; 129,6 (C-3); 128,0; 127,2; 125,4; 124,2 (C-4); 116,3 (=CH2); 59,3 (C-2); 57,7 (CH2Ar); 46,7 (C-6); 37,9 (CH2CH=CH2); 24,5 (C-5); m/z (EI) 291,1; 250,0; 169,0; 90,1; HRMS (ESI): izračunato za C15H18BrN [M+H]+ 292,06954, izmereno 292,06984 200 1-(2-Bromobenzil)-4-alil-piperidin (2.100) Fleš hromatografijom (silika-gel, 95:5 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.100 (36 %) u vidu bezbojnog ulja. IR νmax :2917, 2159, 1463, 910, 747 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,51 (dd, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,48 (dd, 1H, J1=7,5 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 7,26 (dt, 1H, J1=7,5 Hz, J2=1,0 Hz, ArH), 7,07 (dt, 1H, J1=8,0 Hz, J2=2,0 Hz, ArH), 5,82-5,74 (m, 1H, CH=CH2), 5,01-4,97 (m, 2H, =CH2), 3,56 (s, 2H, CH2Ar), 2,88 (d, 2H, J=11,5 Hz, H2C-2, H2C-6), 2,06 (t, 2H, J=11,0 Hz, H2C-2, H2C-6), 2,00 (t, 2H, J=6,5 Hz, CH2CH=CH2), 1,65 (dd, 2H, J1=12,0 Hz, J2=1,5 Hz, H2C-3, H2C-5), 1,30-1,25 (m, 3H, H2C-3, H2C-5, H-4); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,2; 137,1 (CH=CH2); 132,5; 130,5; 128,1; 127,1; 124,5; 115,6 (=CH2); 62,1 (CH2Ar); 54,0 (C-2, C-6); 41,0 (C-4, CH2CH=CH2); 35,7 (C-4); 32,2 (C-3, C-5); m/z (EI) 293,1; 252,1; 169,0; HRMS (ESI): izračunato za C15H20BrN [M+H]+ 294,08519, izmereno 294,08621; 1-Benzil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin (2.103) Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika gel, 7:3 v/v petroletar-etilacetat) dobijen je proizvod 2.103 (45 %) u vidu bledožutog ulja. 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,37-7,08 (m, 9H, ArH), 4,22 (dd, 1H, J1=9,8 Hz, J2=3,4 Hz, H-1), 3,32-3,17 (m, 2H, CH2Ph), 2,95-2,75 (m, 4H, H2C-3, H2C-4), 1,96 (brs, 1H, N- H); m/z (EI) 220,1; 132,1; 117,1; 105,1; 91,1; 77,1; N-Alil-izohinolinijum-bromid (2.104) Dobijen po opštem postupku za dobijanje alil-kvaternarnih soli (str. 190) u vidu svetlosmeñe amorfne supstance (92 %) 201 Opšti postupak za adiciju brombenzil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli Brombenzil-bromid (1,1 g, 4,5 mmol) rastvoren u apsolutnom etru (2,0 mL) dodaje se na 0 oC na Mg-opiljke (121 mg, 5,0 mmol) prekrivene etrom (3,0 mL). Smesa se meša 1 h na sobnoj temperaturi. Dobijenom rastvoru Grignardovog reagensa se doda alil- izohinolinijum so 2.104 (834 mg, 3,3 mmol). Reakciona smesa se meša 1 h na sobnoj temperaturi. Po završetku reakcije, smesa se izlije u smesu leda i amonijum-sulfata. Odvoji se etarski sloj, a vodeni ekstrahuje sa etrom (2 x 20 mL). Kombinovani ekstrakti se suše anhidrovanim natrijum-sulfatom, rastvarač udalji pod sniženim pritiskom a ostatak prečišćava fleš hromatografijom na koloni silika-gela. 1-(2-Bromobenzil)-2-alil-1,2,3,4-tetrahidroizohinolin (2.105) Fleš hromatografijom (silika gel, 9:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.105 (50 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax : 3061, 2931, 1740, 733 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,53 (dd, 1H, J1=7,7 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 7,19-7,16 (m, 1H, ArH), 7,14-7,01 (m, 5H, ArH), 6,85 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 5,61-5,53 (m, 1H, CH=CH2), 4,99 (dt, 1H, J1=6,5 Hz, J2=1,5 Hz, =CH2), 4,97 (t, 1H, J=1,5 Hz, =CH2), 4,04 (dd, 1H, J1=8,5 Hz, J2=6,0 Hz, H-1), 3,40-3,33 (m, 1H, H2C-3), 3,26-3,22 (m, 1H, CH2CH=CH2), 3,16-3,10 (m, 1H, CH2Ar), 3,10-3,09 (m, 1H, CH2CH=CH2), 3,05-2,92 (m, 1H, CH2Ar), 2,99-2,93 (m, 2H, H2C-3, H2C-4), 2,59 (dd, 1H, J1=14,5 Hz, J2=5,0 Hz, H2C- 4); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 139,3; 137,6; 136,5; 134.5; 132,6; 132,4; 128,8; 128,3; 127,7; 126,7; 126,1; 125,4; 124,9; 116,7 (=CH2); 59,9 (C-1); 56,8 (CH2CH=CH2); 43,2 (C- 3); 42,3 (CH2Ar); 24,4 (C-4). m/z (EI) 342,1 [M]+; 172,2; 130,1; HRMS (ESI): izračunato za C19H20BrN [M+H]+ 342,08519, izmereno 342,08468; 202 9-Metilen-5,6,8,9,14,14a-heksahidroizohino[2,1-c][3]benzazepin (2.106) Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.106 (40 %) u vidu žutog ulja. IR νmax : 3063, 3019, 2850, 1485, 1451, 1428, 1383, 1323, 1138, 1101 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,30–7,09 (m, 8H, ArH), 5,32 (s, 1H, =CH2), 5,29 (s, 1H, =CH2), 4,36 (d, 1H, J=10,0 Hz, H-14a), 3,78 (d, 1H, J=13,0 Hz, H2C-8), 3,62 (d, 1H, J=10,0 Hz, H2C-14), 3,59 (d, 1H, J=13,0 Hz, H2C-8), 3,26-3,21 (m, 1H, H2C-6), 3,06-2,99 (m, 1H, H2C-6), 2,92-2,870 (m, 2H, H2C-5), 2,79 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=1,5 Hz, H2C-14); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 146,9; 142,7; 139,3; 138,2; 134,2; 129,5, 128,8; 127,8; 127,4; 127,4; 126,6; 126,2; 125,8; 116,6 (=CH2); 61,0 (C-14a); 60,4 (C-8); 45,4 (C-6); 40,7 (C-14); 28,8 (C-5). m/z (EI) 261,1 [M]+; 246,1; 130,1; 115,1; 91,1; HRMS (ESI): izračunato za C19H19N [M+H]+ 262,15903, izmereno 262,15839; N-Alil-3-metil-izohinolinijum bromid (2.107) Dobijen po opštem postupku za dobijanje alil-kvaternarnih soli (str. 190) u vidu krembele amorfne supstance (96 %) 1-(2-Bromobenzil)-2-alil-1,2,3,4-tetrahidro-3-metilizohinolin (2.108) Dobijen po opštem postupku za adiciju brombenzil-magnezijum-bromida na iminijum-soli (str. 201) i redukciju enamina (str. 154). Fleš hromatografijom (silika-gel, 9:1 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.108 (90 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax :1496, 1439, 1002, 916, 751, 737 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,49 (dd, 1H, J1=8,0 Hz, J2=1,5 Hz, ArH), 7,14-7,08 (m, 3H, ArH), 7,05-7,01 (m, 2H, ArH), 6,96 (dd, 1H, J1=7,5 Hz, J2=2,0 Hz, ArH), 6,78 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 5,54-5,46 (m, 1H, CH=CH2), 5,02 (dq, 1H, J1=17,0 Hz, J2=2,0 Hz, =CH2), 4,96-4,93 (m, 1H, =CH2), 4,10 (t, 1H, J=7,0 Hz, H-1), 3,15-3,14 (m, 2H, CH2CH=CH2), 3,00-2,92 (m, 2H, CH2Ar), 2,79-2,75 (m, 1H, H-3), 2,68-2,66 (m, 2H, H2C-4), 1,26 (d, 3H, J=6,0 Hz, CH3); 203 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,9; 138,4; 136,5; 135,8; 132,9; 132,3; 127,6; 127,2; 127,1; 126,5; 126,2; 125,7; 125,2; 116,8 (=CH2); 61,5 (C-1); 57,5 (CH2CH=CH2); 53,3 (C- 3); 46,6 (CH2Ar); 36,5 (C-4); 22,6 (CH3); m/z (EI) 186,1; 170,1; 144,1; 130,1; HRMS (ESI): izračunato za C20H22BrN [M+H]+ 356,10084, izmereno 356,10176; 6-Metil-13-metilen-5,6,8,13,14,14a-heksahidroizohino[2,1-b][2]benzazepin (2.109) Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.109 (30 %) u vidu bledožutog ulja koje očvršćava hlañenjem, Tt=72-75 oC. IR νmax : 2918, 1700, 1650, 1268, 758, 735 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,35 (m, 2H, ArH), 7,26-7,20 (m, 4H, ArH), 7,16 (t, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 7,07 (d, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 5,22 (d, 1H, J=1,5 Hz, =CH2), 5,07 (d, 1H, J=1,0 Hz, =CH2), 4,28 (dd, 1H, J1=10,5 Hz, J2=5,0 Hz, H-14a), 3,55 (s, 2H, H2C-8), 3,41 (dd, 1H, J1=14,5 Hz, J2=5,0 Hz, H2C-14), 3,12-3,08 (m, 1H, H-6), 3,03 (dd, 1H, J1=14,5 Hz, J2=10,5 Hz, H2C-14), 2,73-2,67 (m, 1H, H2C-5), 2,59 (dd, 1H, J1=16,5 Hz, J2=4,5 Hz, H2C-5), 1,19 (d, 3H, J=6,5 Hz, CH3); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 150,1; 141,7; 137,6; 136,5; 135,7; 128,8; 128,7; 127,6; 127,2; 126,8; 126,5; 126,3; 126,1; 112,0 (=CH2); 60,9 (C-14a); 53,6 (C-6); 46,6 (C-8); 39,9 (C-14); 33,2 (C-5), 19,9 (CH3); m/z (EI) 275,1 [M]+; 260,1; 146,1; 130,1; 115,1; 91,1; HRMS (ESI): izračunato za C20H21N [M+H]+ 276,17468, izmereno 276,17413; 1-(2-Brombenzil)-2-alil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol (2.110) Dobijen po opštem postupku za adiciju brombenzil-Grignardovog reagensa na iminijum-soli (str. 201). Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.110 (61 %) u vidu bledožutog ulja. IR νmax: 3407, 2930, 1463, 1327, 1023, 918, cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,59 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 7,50 (d, 1H, J=7,5 Hz, ArH), 7,25–7,06 (m, 7H, ArH, N-H), 5,72–5,61 (m, 1H, CH=CH2), 5,03 (d, 1H, J=8,0 Hz, =CH2), 204 5,00 (s, 1H, =CH2), 4,12 (t, 1H, J=7,5 Hz, H-1), 3,40–3,35 (m, 1H, H2C-3), 3,31-3,23 (m, 1H, CH2Ar), 3,22–3,11 (m, 4H, CH2CH=CH2, CH2Ar, H2C-3), 2,93–2,87 (m, 1H, H2C-4), 2,61 (dd, 1H, J1=16,0 Hz, J2=4,0 Hz, H2C-4); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 138,6; 136,5; 135,6; 134,3; 132,7; 132,5; 128,2; 127,1; 127,0; 124,9; 121,5; 119,2; 118,1; 117,0 (=CH2); 110,6; 108,1; 56,3 (CH2Ar); 55,6 (C-1); 44,3 (C-3); 41,3 (CH2CH=CH2); 17,7 (C-4). m/z (EI) 299,1; 211,1; 169,1; HRMS (ESI): izračunato za C21H21BrN2, [M+H]+ 381,09609, izmereno 381,09765; (2.111) Dobijen po opštem postupku za dobijanje benzazepinskih derivata Heckovom reakcijom (str. 194). Fleš hromatografijom (silika-gel, 3:2 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.111 (57 %) u vidu žute amorfne supstance, Tt=107-108 oC. IR νmax , 3402, 2902, 1449, 1319, 1162, 1091, 910 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,81 (s, 1H, N-H), 7,49 (d, 1H, J=8,0 Hz, ArH), 7,34 (t, 2H, J=8,0 Hz, ArH), 7,28–7,13 (m, 4H, ArH), 7,10 (t, 1H, J=7,0 Hz, ArH), 5,33 (s, 1H, =CH2), 5,29 (s, 1H, =CH2), 4,31 (d, 1H, J=10,0 Hz, H-14a), 3,69 (q, 2H, J=11,5 Hz, H2C-8), 3,41 (dd, 1H, J1=15,5 Hz, J2=10,0 Hz, H2C-14), 3,24–3,19 (m, 1H, H2C-6), 3,01–2,97 (m, 1H, H2C-6), 2,95-2,79 (m, 3H, H2C-14, H2C-5); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 147,3; 142,3; 136,6; 136,1, 134,9; 129,1; 127,8; 127,6; 127,2; 127,0; 121,6; 119,4; 118,2; 116,3 (=CH2); 110,7; 108,9; 59,4 (C-14a); 48,9 (C-6); 38,6 (C-14); 20,9 (C-5). m/z (EI) 299,1; 281,1; 254,1; 169,1; HRMS izračunato za C21H20N2 [M+H]+ 301,16993, izmereno 301,16953; N-((Oksiran-2-il)metil)-N-tozilbuta-2,3-dien-1-amin (2.119) NaH (60 % u mineralnom ulju, 85 mg, 2,11 mol) se suspenduje u DMF (20 mL) u atmosferi azota. U suspenziju ohlañenu na 0 oC, ukapa se alen 2.118 (393 mg, 1,76 mmol), rastvoren u DMF (2 mL) i smeša meša oko 30 min na sobnoj temperaturi. Tada se u nastali rastvor ukapa epihlor-hidrin (0,15 mL, 1,94 mmol) i smesa zagreva na 70 oC u toku 3 h. 205 Smesa se ohladi do sobne temperature, doda joj se etar, ispere vodom i organski sloj suši anhidrovanim natrijum-sulfatom. Sušilo se odvoji filtracijom a rastvarač se ispari pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografijom (silika-gel, 7:3 v/v petroletar-etar) dobijen je proizvod 2.119 (50 %) u vidu bledožutog ulja. 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,72 (d, 2H, J=8,4 Hz, ArH), 7,31 (d, 2H, J=8,4 Hz, ArH), 5,03-4,89 (m, 1H), 4,74-4,69 (m, 2H), 3,95-3,89 (m, 2H), 3,44 (dd, 1H, J1=15,2 Hz, J2=4,4 Hz), 3,143-3,06 (m, 1H), 2,78 (t, 1H, J=4,4 Hz), 2,55 (dd, 1H, J1=5,0 Hz, J2=2,8 Hz), 2,43 (s, 3H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 209,6; 143,5; 136,9; 129,8; 127,2; 85,8; 50,4; 49,1; 47,7; 45,7; 21,5; m/z (EI): 279,1 [M]+; 240,1; 184,0; 155,0; 91,1; N-((Oksiran-2-il)metil)-3-fenil-N-tozilbut-3-en-1-amin (2.123) Smesa epoksi-alena 2.119 (144 mg, 0,52 mmol), Pd (OAc)2 (11 mg, 10 mol%), PPh3 (27 mg, 20 mol%), PhI (0,06 mL, 0,52 mmol) i In (77 mg, 0,67 mmol) u DMF (5,5 mL) se u atmosferi azota zagreva 24 h na 90 oC. Reakciona smesa se ohladi do sobne temparature, razblaži sa 30 mL etra i ispere vodom. Organski sloj se suši anhidrovanim natrijum-sulfatom. Sušilo se odvoji filtracijom a rastvarač se ispari pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografijom (silika-gel, etar zasićen NH3) dobijen je proizvod 2.123 (30%) u vidu bledožutog ulja. IR: 2358, 1337, 1157, 574 cm−1 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,66 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,38-7,28 (m, 8H), 5,35 (d, 1H, J=1,0 Hz), 5,09 (d, 1H, J=1,0 Hz), 3,86-3,82 (m, 1H), 3,73-3,67 (m, 2H), 3,27-3,22 (m, 2H), 3,19 (d, 2H, J=6,0 Hz), 2,83-2,79 (m, 2H), 2,42 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) 144,7; 143,8; 139,8; 135,7; 129,9; 128,5; 127,8; 127,2; 125,9; 114,5; 70,2; 63,3; 51,6; 49,9; 35,1; 21,5; m/z (EI): 355,1; 258,1; 220,1; 155,0; 91,1; 206 N-((Oksiran-2-il)metil)-3-tolil-N-tozilbut-3-en-1-amin (2.124) Flash hromatografijom (silika-gel, etar zasićen NH3) dobijen je proizvod 2.124 (23 %) u vidu bledožutog ulja. 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,67 (d, 2H, J=8,5 Hz), 7,32-7,09 (m, 6H), 5,33 (d, 1H, J=1,0 Hz), 5,03 (d, 1H, J=1,0 Hz), 3,71 (brs, 2H), 3,29-3,17 (m, 4H), 2,82-2,74 (m, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,35 (s, 3H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 144,5; 143,8; 137,7; 136,8; 135,7; 129,9; 129,2; 127,9; 127,3; 125,8; 113,7; 70,2; 63,3; 51,6; 49,9; 35,0; 21,5; 21,0; m/z (EI): 328,1; 290,1; 258,1; 234,2; 198,1; 155,0; 91,1; (E, Z)-Metil 3-(N-(buta-2,3-dienil)-N-tozilamino)akrilat (2.125) U rastvor alena 2.118 (328 mg, 1,47 mmol) i metil-propiolata (0,17 mL, 1,91 mmol) u acetonitrilu (7,0 mL) ohlañenom na 0 oC doda se DMAP (234 mg, 1,91 mmol). Reakciona smeša se meša na hladnom još 2 h, a zatim zagreje do sobne temperature i meša još 12 h. U reakcionu smešu se doda dihlormetan (30 mL), ispere sa malo razblažene HCl i vodom, i suši anhidrovanim natrijum-sulfatom. Posle isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, sirovi proizvod se prečišćava hromatografijom. Fleš hromatografijom (silika-gel, 8:2 v/v petroletar-etil-acetat) dobijen je proizvod 2.125 (70 %) u vidu bledožutog ulja koje očvršćava hlañenjem. 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 8,08 (d, 2H, J=14,0 Hz), 7,73 (d, 2H, J=7,8 Hz), 7,33 (d, 2H, J=8,4 Hz), 5,18 (d, 1H, J=14,0 Hz), 4,19-4,82 (m, 1H), 4,76-470 (m, 2H), 4,12-4,07 (m, 2H), 3,73 (s, 3H), 2,44 (s, 3H); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 209,1; 167,5; 144,9; 141,3; 135,6;130,1; 127,3; 98,5; 84,3; 51,4; 44,8; 21,6; m/z (EI): 307,1 [M]+; 276,1; 248,1; 155,0; 108,1; 91,1; 207 3.3. Biološki testovi 3.3.1. In vitro ispitivanje citotoksičnog dejstva sintetisanih jedinjenja 3.3.1.1. Pripremanje rastvora testiranih jedinjenja Rastvori testiranih jedinjenja napravljeni su u DMSO u koncentraciji 10 mM, filtrirani kroz Milipor filtre (0,22 µm) i razblaženi u hranljivom medijumu do radnih koncentracija. Za sve testirane ćelijske linije, hranljivi medijum je bio RPMI 1640, bez fenol crvenog. Hranljivom medijumu dodati su (do konačne koncentracije) L-glutamin (3 mM), streptomicin (100 µg/mL) penicilin (100 IU/mL), fetalni teleći serum (10 %; FBS; inaktiviran na 56o C, 30 minuta) i HEPES (25 mM). pH vrednost je podešena na 7,2 (bikarbonatni rastvor). Za detekciju ćelijskog preživljavanja, korišćen je MTT (5 mg/mL) rastvoren u fosfatnom puferu (pH 7,2) i filtriran kroz Milipor filter (0,22 µm) pre upotrebe. 3.3.1.2. Ćelijske kulture Ćelijske linije HeLa (ćelije humanog adenokarcinoma cerviksa) i FemX (humani maligni melanom) su kultivisane u vidu monolejera u opisanom hranljivom medijumu, dok su ćelije K562 (ćelije humane mijeloidne leukemije) postavljene kao suspenzija u hranljivom medijumu. Sve ćelije su gajene na 37 oC u atmosferi sa 5% CO2. Ćelije HeLa i FemX su postavljene (2000 ćelija u bazenu) u mikrotitarske ploče sa 96 mesta (bazena) sa ravnim dnom, i 20 h kasnije su dodate ispitivane supstance u odgovarajućim koncentracijama. Finalne koncentracije testiranih jedinjenja bile su u opsegu od 12,5-200 µM. K562 Ćelijama (3000 ćelija u bazenu) 2 h nakon postavljanja dodata su ispitivana jedinjenja, tako da je finalna koncentracija bila u opsegu od 12,5-200 µM. Hranljivi medijum bez ćelija sa pet navedenih koncentracija testiranih jedinjenja korišćen je kao blank. 208 3.3.1.3. Detekcija ćelijskog preživljavanja 138 Preživljavanje ćelija odreñivano je MTT testom, 72 h nakon dodatka ispitivanih jedinjenja. Ukratko, 20 µL MTT rastvora dodaje se u svaki bazen mikrotitracione ploče, inkubira se 4 h na 37oC u atmosferi sa 5% CO2. Zatim se u svaki bazen dodaje 100 µL SDS (natrijum dodecil-sulfat) i nakon 24 h se očita apsorbanca na 570 nm. Nakon obrade podataka izračunate su IC50 vrednosti. 3.3.2. In vitro ispitivanje antioksidativnog dejstva sintetisanih benzazepina Venska krv korišćena u eksperimentu uzeta je od 5 zdravih odraslih muškaraca, odabranih po principu slučajnosti, prosečne starosti 42,3 godina, koji profesionalno nisu izloženi fizičkim ili hemijskim mutagenima. Od svake osobe uzeta su dva alikvota sa po 5 mL heparinizirane venske krvi. Postavljene su kulture u koje je dodato: 5 ml RPMI 1640 hranjivog medijuma (u kome je rastvoren L-glutamin, 20 % inaktivirani teleći serum i 0,1% fitohemaglutinin), 0,5 mL venske krvi i 0,3 µM benzazepinskih derivata. U kontrolnu kulturu nisu dodavani benzazepinski derivati. U jednu kulturu je dodato 0,1 µM Amifostin WR-2721 kao sintetički antioksidant sa poznatim efektom, a u drugu ćelijsku kulturu je dodato 0,2 µM mitomicina C, jedinjenja sa poznatim mutagenim efektom. Sve kulture su inkubirane u termostatu (37 oC). Tretman benzazepinskim derivatima je trajao 19 h (izračunato da je toliko vremena potrebno da se benzazepinski derivati uneti u organizam per os izmetabolišu i izluče iz organizma). Posle 19 sati, sve ćelijske kulture su isprane u čistom medijumu, prenesene u svež RPMI 1640 hranjivi medijum i nastavljena je inkubacija. Posle 48 h inkubacije, dodat je citohalazin B (u finalnoj koncentraciji 4 µg/ml), i inkubacija se nastavlja još 24 sata. Nakon 72 sata gajenja i rasta ćelijskih kultura vrši se preparacija. Preparacija je obavljena centrifugiranjem (na 1200 rpm) i ispiranjem ćelija u fiziološkom rastvoru, zatim u blago hipotoničnom rastvoru (0,56 % KCl + 0,9 % NaCl, u odnosu 1:1). 209 Ćelijska suspenzija je fiksirana u rastvoru sirćetne kiseline i metanola (1: 3). Na vazduhu osušeni preparati se boje rastvorom Gimza boje (2 %). Za analizu mikronukleusa je prebrojano 1000 binuklearnih ćelija po uzorku, po utvrñenim kriterijumima. 139 Efekat benzazepinskih derivata na ekspresiju mikronukleusa odreñuje se stepenom ćelijske proliferacije. Ćelijska proliferacija se izračunava preko cytokinesis- block proliferation index-a (CBPI). CBPI se izračunava na sledeći način: CBPI= [(MI + 2MII +3(MIII + MIV)] / N gde MI do MIV predstavlja broj ćelija sa jednim do četiri nukleusa, N je broj pregledanih ćelija. Rezultat je izražen kao učestalost MN na 1000 pregledanih binuklearnuih ćelija. 210 4. ZAKLJUČAK Osnovni cilj tokom izrade ove doktorske teze bio je razvoj sinteze protoberberina, prirodnih policikličnih proizvoda koji sadrže izohinolinski skelet. Mada se članovi ove grupe jedinjenja značajno razlikuju, pažljivom analizom došlo se do zaključka da je osnova strukturnih varijacija oksidaciono stanje prstena C. Uzimajući u obzir ovu činjenicu, smatrali smo da je moguće naći način da se razvije sintetski put koji bi omogućio pristup razlčitim klasama protoberberina preko jednog zajedničkog intermedijera. Retrosintetskom analizom došlo se do zaključka da je taj intermedijer 1,3-dien izohinolinskog tipa 2.4, koji bi sekvencom cikloadicija-oksidacija omogućio instalaciju prstena C u željenom oksidacionom stanju, kao i dodatnih supstituenata potrebnih za funkcionalizaciju prstena D. Pored ovoga, reaktivnost dienskog sistema omogućila bi i proširenje osnovne ideje primenom principa sinteze usmerene diverzitetom (diversity orientated syntesis). Izohinolinski dien 2.4 je dobijen sekvencom reakcija koja je podrazumevala kvaternizaciju izohinolina jodpropenil-bromidom, alilovanje iminijum-soli Grignardovim reagensom i redukciju nastalog enamina i Heckovu intramolekulsku reakciju u ukupnom prinosu 45 %. Na ovaj način sintetisani su i supstituisani izohinolinski dieni 2.10 i 2.13. Nakon uspešne sinteze diena proučavana je njegova reaktivnost u Diels-Alderovim reakcijama. Reakcijom diena 2.4 sa širokim spektrom dienofila dobijeni su različiti cikloadukti (66-95 %). U reakciji 2.4 sa simetričnim dienofilima alkenskog tipa (dietil-azodikarboksilat, N- fenil-maleimid) dobijeni su cikloadukti u prinosu 66 i 85 %. Proizvod reakcije sa NPM je smeša endo- i egzo-izomera (2.5:1). U reakciji izohinolinskog diena sa nesimetričnim dienofilom alkenskog tipa, hlor-akrilonitrilom, dobijena je kompleksna smeša regiozomera. Posle eliminacije HCl, dobijeni su regioizomerni konjugovani nitrili. Simetrični dienofil acetilenskog tipa, DMAD, kao proizvod reakcije sa dienom 2.4, očekivano je dao jedan proizvod 2.7 u odličnim prinosu (95 %), dok je reakcijom diena sa metil-propiolatom nastala smeša dva regioizomera u jednakim količinama (76 %). Optimizacijom uslova za oksidaciju cikloadukata, omogućen je pristup dvema klasama prirodnih proizvoda, tetrahidroprotoberberinima i oksoprotoberberinima. 211 Oksidacijom DMAD-cikloadukta 2.7, pod energičnijim oksidacionim uslovima dobijeno je jedinjenje oksoprotoberberinske strukture sa supstituisanim položajima C-10 i C-11 (70 %). Propiolatni cikloadukti su aromatizacijom dali regioizomerne oksoprotoberberine (43-45 %). Cikloadukti dobijeni reakcijom sa NPM, takoñe podležu aromatizaciji pod ovim uslovima, uz nastanak oksoprotoberberina (45-66 %). Primenom blažih uslova za aromatizaciju DMAD cikloadukata izohinolina dobijeni su derivati tetrahidroprotoberberinske strukture (50-78 %). Na ovaj način, polazeći od izohinolina, omogućen je pristup širokom spektru oksoprotoberberinskih i tetrahidroprotoberberinskih derivata, sa različito supstituisanim položajima C-10 i C-11, kao i monosupstituisanim derivatima. U cilju proširenja razvijene metodologije i dobijanja još nekih klasa jedinjenja, sekvenca reakcija primenjena je i na dihidro-β-karbolin i piridin. Na ovaj način, polazeći od dihidro-β-karbolina dobijen je 1,3-dien 2.49 (50 %). Ovaj intermedijer se takoñe pokazao reaktivnim u sekvenci cikloadicija-oksidacija, tako da je omogućen pristup dvema vrstama skeleta prirodnih proizvoda, dihidrogambirtaninskom (2.55, 72 %), i ketojobirinskom (2.54, 45 %). Primenom razvijene sinteze na piridin dobijen je dehidrohinolizinski dien 2.61 (26 %), koji je Diels-Alderovom reakcijom dao cikloadukt 2.62 (72 %). Primenom različitih oksidacionih uslova na cikloadukt 2.62 nastaju dve vrste skeleta, benzohinolizinski (2.63, 80 %) i benzohinolizinonski (2.64, 53 %). Preliminarna biološka ispitivanja izohinolinskih cikloadukata i oksoprotoberberinskih derivata zasnovana su na ispitivanju njihovog in vitro citotoksičnog dejstva. In vitro ispitivanja na malignim ćelijskim linijama (HeLa, FemX i K562) pokazala su da ovi derivati pokazuju izvesnu citotoksičnost. Od ispitivanih jedinjenja, najveću citotoksičnu aktivnost pokazuje cikloadukt 2.17, čija vrednost IC50 prema K562 ćelijama iznosi 24,7 µM. U cilju drugačije funkcionalizacije izohinolinskog diena, ispitivana je mogućnost funkcionalizacije intermedijernog diena paladijumom katalizovanim reakcijama. Primenom uslova za dobijanje alilnih acetata na simetrični karbociklični dien poznat u literaturi, dobijeni su različiti alilni acetati (22-51 %). Razvijeni reakcioni uslovi za dobijenje alilnih acetata primenjeni su i na heterociklične diene 2.4 i 2.49, pri čemu su 212 dobijeni prozvodi 2.70, 2.71-2.74 (30-47 %). Na taj način dobijeni su triciklični derivati tetrahidroizohinolina, odnosno tetraciklični derivati tetrahidro-β-karbolina. Jedna oblast istraživanja bila je i razvoj sinteze benzazepinskih derivata izohinolina i β-karbolina sa egzocikličnim dvostrukim vezama stirenskog tipa. Sekvencom reakcija kvaternizacije, alilovanja i Heckove intramolekulske reakcije uspešno su dobijena jedinjenja benzo[c]azepinskog tipa 2.86, 2.90, 2.91, 2.94 sa egzocikličnim dvostrukim vezama. Ova metodologija je primenjena i na piridin, čijom je funkcionalizacijom dobijen benzo[c]azepin 2.95 (55%). Slična metodologija je primenjena za dobijanje benzo[d]azepinskih derivata izohinolina i β-karbolina. Kvaternizacija je izvršena reakcijom izohinolina i dihidro-β-karbolina sa alil-bromidom dok je C-1 funkcionalizovan adicijom brombenzilmagnezijum-bromida na imino-vezu. Ciklizacija dobijenih prekursora izvedena je uspešno pri Heckovim uslovima, pri čemu su dobijena tri benzo[d]azepina, 2.106 (40 %), 2.109 (30 %) i 2.111 (57 %). Biološka ispitivanja sintetisanih benzazepina zasnovana su na proučavanju njihove citotoksične i antioksidativne aktivnosti. In vitro ispitivanja citotoksičnosti na HeLa, FemX i K562 ćelijskim linijama pokazala su da benzazepinski derivati pokazuju izvesnu citotoksičnu aktivnost. Najaktivnije ispitano jedinjenje je β-karbolinski benzo[d]azepinski derivat 2.111, čija IC50 prema K562 ćelijama iznosi 17,49 µM. In vitro ispitivanjem antioksidativnog dejstva benzazepina pokazano je da derivati 2.111 i 2.90 i 2.86 pokazuju izražen protektivni efekat na DNK humanih limfocita, pri čemu jedinjenja 2.90 i 2.86 imaju veći efekat od komercijalnog radioprotektivnog agensa amifostina. 213 5. CONCLUSION The aim of this thesis was the development of a synthetic route to protoberberines, natural polycyclic products containing the isoquinoline skeleton. Although the members of this group differ considerably among themselves, a careful analysis led to the conclusion that the oxidative state of ring C lies at the heart of the group's structural variation. With this in mind, we intended to develop a synthetic route to access different classes of protoberberines via a common intermediate. Retrosynthetic analysis lead to the conclusion that this compound was an isoquinolinic 1,3-diene 2.4, which could, via a cycloaddition- oxidation sequence, enable the incorporation of ring C in a desired oxidative state, as well as the incorporation of additional substituents necessary for the functionalisation of ring D. In addition to this, the reactivity of the diene system would allow for the expansion of the original idea using the diversity oriented synthesis principle. Isoquinolinic diene 2.4 was obtained in a sequence of reactions involving: quaternisation of isoquinoline by iodo-propenyl-bromide, allylation of imminium salts by Grignard reagent and the reduction of the obtained enamine, intramolecular Heck reaction (total yield 45%). This synthetic methodology has also been proven applicable to substituted isoquinolines. After the diene's successful synthesis its reactivity in Diels-Alder reaction was studied. In the reaction of diene 2.4 with symmetric alkene dienophiles (diethyl azodicarboxylate, N-phenyl-maleimide) cycloadducts were obtained in 66 and 85 % yields. The NPM reaction product is a mixture of endo- and exo-isomers (2,5:1). A complex mixture of regioisomers was obtained in the reaction of the isoquinolinic diene with unsymmetric alkene dienophile, chloroacrylonitrile. After elimination of HCl, regioisomeric conjugated nitriles are obtained. As expect, a symmetric acetylene dienophyle (dimethyl acetylenedicarboxylate), in reaction with diene 2.4, yielded one product, 2.7 (95 %), while the reaction of methyl propiolate with the diene provided a mixture of regioisomers in equal amounts (76 %). Access to two classes of natural product scaffolds, tetrahydroprotoberberines and oxoprotoberberines was accomplished by varying the conditions for the oxidation of 214 cycloadducts. Oxidation of DMAD cycloadduct 2.7, under vigorous conditions, yielded an oxoprotoberberine compound with substituents in C-10 and C-11 positions (70 %). Regioisomeric oxoprotoberberines were obtained by aromatisation of propiolate cycloadducts (43-45 %). Cycloadducts obtained in reaction with NPM can also be aromatised under these conditions, yielding oxoprotoberberines (45-66 %). When milder aromatisation conditions were used, DMAD cycloadducts of isoquinoline yielded a tetrahydroprotoberberine like compound 2.24, 2.35 and 2.36 (50-78%). The synthetic route described above provides access to a broad spectrum of oxoprotoberberine and tetrahydroprotoberberine structures with different substituents in C- 10 and C-11 positions, as well as access to their monosubstituted counterparts. With the goal of expanding the developed methodology and obtaining additional classes of compounds, the above sequence of reactions was also applied to dihydro-β- carboline and pyridine. In this manner, dihydro-β-carboline was transformed to 1,3-diene 2.49 (50 %). This intermediate was also reactive in the cycloaddition-oxidation sequence, providing access to two types of natural products' skeletons, dihydrogambirtanine (2.55, 72 %) and ketoyobirine type (2.54, 45 %). Applying the developed synthetic route to pyridine gave dehydroquinolizine diene 2.61 (26 %), which yielded the cycloadduct 2.62 (72%) in a Diels-Alder reaction. Depending on the oxidation conditions used, cycloadduct 2.63 gives two types of molecular skeletons, benzoquinolizine (2.63, 80 %) and benzoquinolizinone (2.64, 53 %). Preliminary biological tests on isoquinoline cycloadducts and oxoprotoberberine derivatives were focused on their cytotoxicity. Tests conducted on HeLa, FemX and K562 cells have shown that these compounds show a certain of cytotoxicity. Cycloadduct 2.17 shows the greatest cytotoxic activity of the compounds tested, with IC50 value of 24,7 µM towards K562 cells. The possibility of functionalising the intermediate diene in Pd-catalysed processes was explored with the goal to obtain various classes of compounds. Heterocyclic allyl acetates (22-51% yield) were prapared, under conditions used to obtain these compounds from symmetric carbocyclic diene known in the literature. Reaction conditions developed for obtaining allyl acetates were also applied to heterocyclic 215 dienes 2.4 and 2.49, obtaining products 2.70-2.74 (30-47 %). Tricyclic derivatives of tetrahydroisoquinoline and tetracyclic derivatives of tetrahydro-β-carboline were obtained in this way. One of the goals of this research was to develop a synthetic route to benzazepine derivatives of isoquinoline and β-carboline with exocyclic styrene-like double bonds. The reaction sequence of quaternisation, allylation and intramolecular Heck reaction successfully yielded benzo[c]azepine compounds 2.86, 2.90, 2.91, 2.94 with exocyclic double bonds. This methodology was also applied on pyridine, whose functionalisation yielded benzo[c]azepine 2.95 (55 %). Similar methodology was used to obtain benzo[d]azepine derivatives of isoquinoline and β-carboline; in which these were quaternised by allyl bromide, while the C-1 atom was functionalised by adding bromobenzyl magnesium bromide to the imino bond. The obtained precursors successfully cyclised under Heck conditions, yielding three benzo[d]azepines, 2.106 (40%), 2.109 (30%) and 2.111 (57%). Biological activity testing of the synthetised benzazepines focused on studying their cytotoxic and antioxidative activities. Tests conducted on HeLa, FemX and K562 cell lines indicated that the benzazepines showed certain in vitro cytotoxic activity. β-Carboline benzo[d]azepine compound 2.111 was the most active one with the IC50 of 17,49 µmol towards K562 cells. Testing of the antioxidative action of benzazepines revealed that some compounds (2.111, 2.90 and 2.86) show a marked protective effect on the DNA of human lymphocites. Benzazepines 2.90 and 2.86 show better protective activity than commercial radioprotective agent amifostine. 216 6. LITERATURA 1. Dewick, P. M. Medicinal Natural Products: a biosynthetic approach, J. Wiley & Sons, Chichester, 2002. 2. a) Amaral, A.; Claudia, F.; Barnes, R. A.; Phytochemistry 1998, 47, 1445-1447. b) Sette, I. M. F.; da-Cunha, E. V. L.; Barbosa-Filho, J. M.; Pharm. Biol. (Lisse, Netherlands) 2000, 38, 318-320. c) Lee, S-Sh; Wu, W-N; Wilton, J. H.; J. Nat. Prod. 1999, 62, 1410-1414. d) Hung, T.M.; Nguyen, H.D.; Kim, J. C.; Planta Med. 2010, 76, 1762-1764. e) Campos, F. R.; Batista, R. L.; Batista, C.L.; Costa, E.V.; Biochem. Syst. Ecol. 2008, 36, 804-806. f) Mohd Azlan, N.; Mat Ropi, M.; Hanita, O.; Kartini, A.; Hiroshi, M.; Molecules 2011, 16, 3402-3409. g) Kulp, M.; Bragina, O.; Kogermanb, P.; Kaljuranda, M.; J. Chromatogr. A. 2011, 1218, 5298-5304. 3. a) Patiño Ladino, O. J.; Cuca Suárez, L.E.; Biochem. Syst. Ecol. 2010, 38, 853-856. b) Pang, S-Q.; Wang, G-Q.; Huang, B-K.; Zhang, Q-Y.; Qin, L-P.; Chem. Nat. Compd. 2007, 43, 100-102. c) Li, G-Y.; Li, B-G.; Yang, T.; Liu, G-Y.; Zhang, G-L.; Org. Lett. 2006, 8, 3613-3615. d) Bentley, K.W.; Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 444-463. e) Xie, W-D.; Jia, Z. J.; Chinese Chem. Lett. 2004, 15, 1057-1059. f) Zhanga, X.; Yea, W.; Zhaoa, S.;Cheb,C-T.; Phytochemistry 2004, 65, 929-932. g) Lopes, L.; Humpfer, E. Phytochemistry 1997, 45, 431-435. 4. a) Reimann, E.; Curr. Org. Chem. 2009, 13, 353-378. b) Queiroz, E. F.; Roblot, F.; Cave, A.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 438-440. c) Gonzalez, M.C.; Zafra-Polo, M.C.; Blazquez, M.A.; Serrano, A.; Cortes, D.; J. Nat. Prod. 1997, 60, 108-110. d) Zhang, J-S.; Le Men-Olivier, L.; Massiot, G.; Phytochemistry 1995, 39, 439-442. e) Singh, S.; Singh, T.D.; Singh,V.P.; Pandey, V.B.; Pharm. Biol. 2010, 48, 158-160. 217 5. Bhattacharjya, A.; Mukhopadhyay, R.; Sinha, R.R.; Esahak A., E.; Satyesh C. Tetrahedron 1988, 44, 3477-3488. 6. Kobayashi, J.; Kondo, K.; Shigemori, H.; Ishibashi, M.; Sasaki, T.; J. Org. Chem. 1992, 57, 6680-6682. 7. Li, H.J.; Zhang, W.D.; Zhang, W; Zhang, C; Liu, R.H.; Chinese Chem. Lett. 2005, 16, 367-368. 8. a) Rahimizadeh, M. J. Sci. Islam. Repub. Iran 1996, 7, 172-176. b) Hocquemillera, R.; Cave, R.; J. Nat. Prod. 1984, 47, 539-540. c) Sepulveda-Boza, S.; Friedrichs, E.; Puff, H.; Breitmaier, E.; Planta Med. 1983, 49, 32- 35. 10. a) Hung, T.M.; Na, M.;Dat, N.T.; J. Ethnoharmacol. 2008, 119, 74-80. b) Berkov, S.; Bastida, J.; Nikolova, M.; Phytochem. Anal. 2008, 19, 411-419. c) Shigeta, K.; Ootaki, K.; Tatemoto, H.; Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66, 2491- 2494. d) Frölich, L.; J. Neural Transm. 2002, 109, 1003-1014. 11. Chen, W-H.; Chan, C-L.; Cai, Z.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14 , 4955-4959. 12. Khan, M.; Giessrigl, B.; Vonach, C.; Mutat. Res. 2010, 683, 123-130. 13. Cheng, X.; Wang, D.; Jiang, L.; Chem. Biodivers. 2008, 5, 1335-1244. 14. a) Min, Y.D.; Yang, M. C.; Lee, K.H.; Arch. Pharm. Res. 2006, 29, 757-761. b) Min, Y.D.; Kwon, H.C.; Yang, M. C.; Arch. Pharm. Res. 2007, 30, 58-63. c) Pleban, K.; Ecker, G.; Mini Rev. Med. Chem. 2005, 5, 153-163. 15. a) Yan, M-H.; Cheng, P.; Jiang, Z-Y.; J. Nat. Prod. 2008, 71, 760-763. b) Singh, A.; Singh, S.; Singh, S.; J. Plant Protection Res. 2009, 49, 287-289. c) Hirano, H.; Osawa, E.; Yamaoka, Y.; Biol. Pharm. Bull. 2001, 24, 1277-1281. d) Costa, E.V.; Pinheiro, M.L.;Barison, A.; J. Nat. Prod. 2010, 73, 1180-1183. e) Nan, Y-H.; Lee, K-P.; Lee, D-U.; Bull. Korean Chem. Soc. 2009, 30, 3147-3149. f) Vennerstrom, J.L.; Lovelace, J.K.; Waits, V.B.; Antimicrob. Agens. Chemother. 1990, 34, 918-921. g) Mo, J.; Guo, Y.; Yang, Y-S.; Shen, J-S.; Jin, G-Z.; Curr. Med. Chem. 2007, 14, 2996- 3002. 218 h) Wangchuk, P.; Bremner, J.B.; Roonglawan, S.; Kamchonwongpaisan, R. S.; Phytother. Res. 2010, 24, 481-485. 16. a) Fajardo, V.; Tetrahedron Lett. 1983, 24, 155-158. b) Shamma, M.; Rahimizadeh, M.; J. Nat. Prod. 1986, 49, 398-405. c) Rahimizadeh, M.; J. Sci. Islam. Repub. Iran 1990, 1, 364-366. d) Lou, Z.; Gao, C.; Lin, F.T.; Zhang, J.; Lin, M.C.; Planta Med. 1992, 58, 114. 17. Reiffen, M.; Eberlien, W.; Müller, P.; J. Med. Chem. 1990, 33, 1496-1504. 18. a) Junji, M.; Nakashima, H.; Nemoto, H.; Kim, H-S.; Wataya, Y.; Heterocycles 1998, 49, 101-104. b) St. Georgiev, V.; Carlson, R. P.; Van Inwegen, R.; Khandwala, A.; J. Med. Chem. 1979, 22, 348-352. 19. a) Rishel, M.J.; Amarasinghe, K.K.D.; Dinn, S.R.; Johnson, B.F.; J. Org. Chem. 2009, 74, 4001-4004. b) Zheng, P.; Lieberman, B.P.; Choi, S.R.; Plöessl, K.; Kung, H.F.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 3435-3438. 20. a) Von Angerer, S.; Brandl, G.; Mannschrec, A.; Weimar, C.; Wiegrebe, W.; Anticancer Drug Des. 1992, 7, 351-363. b) Weimar, C.; Von Angerer, S.; Wiegrebe, W.; Arch. Pharm. (Weinheim) 1991, 324, 509- 518. 21. Park, K-S.; Kang, K-C.; Kim, K-Y.; Jeong, P-Y; Kim, J-H, J. Antimicrob. Chemother. 2001, 47, 513-519. 22. a) Vennerstrom, J.L.; Klayman, D.L; J. Med. Chem. 1988, 31, 1084-1087. b) Miyata, J.; Nakashima, H.; Nemoto, H.; Kim, H-S.; Wataya, Y.; Heterocycles 1998, 49, 101-104. 23. a) Kutchan, T.; Dittrich, H.; J. Biol. Chem. 1995, 270, 24475–24481. b) Bjorklund, J.; Frenzel, T.; Rueffer, M.; Kobayashi, M.; Mocek, U.; J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 1533-1545. c) Liscombe, D.; Ziegler, J.; Schmidt, J.; Ammer, C.; Facchini, P.; Plant J. 2009, 60, 729- 743. d) Fraaije, M.; Mattevi, A.; Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 719-721. 219 24. Parameswaran, P.S.; Naik, C. G.; Hegde, V. R.; J. Nat. Prod. 1997, 60, 802-803. 25. Herraiz, T.; D. González, D.; Ancín-Azpilicueta, C.; Arán, V.J.; Guillén, H.; Food Chem. Toxicol. 2010, 48, 839-845. 26. a) Shangb, J-H.; Caia, X-H.; Fenga, T.; Zhaob, Y-L.; Wangb, J-K.; J. Ethnoharmacol. 2010, 129, 174-181. b) Sheguin, E.; Koch, M.; J. Nat. Prod. 1982, 45, 738-744. c) Feng, T.; Cai, X-H.; Liu,Y-P.; Li, Y.; Wang, Y-Y.; J. Nat. Prod. 2010, 73, 22-26. d) Xu, Y-J.; Tang, C-P.; Ke, C-Q.;Yang Ye, Y.; Chem. Nat. Compd. 2009, 45, 834-836. e) Peube-Locou, N.; Plat, M.; Koch, M.; Phytochemistry 1973, 12, 199-200. 27. a) Hussin, M. H.; Kassim, M. J.; Mater. Chem. Phys. 2011, 125, 461-468. b) Tong, K. S.; Kassim, M. J.; Azraa, A.; Chem. Eng. J. 2011, 170, 145-153. c) U.S. Pat. Appl. Publ. 2001, Cont. of U.S. Ser. No. 125, 786. 20010012524 A1 20010809 AN 2009:1492597 28. Burro, B.E.A.; Meijler, M.M.; Korver, J.; Wanner, M.J.; Koomen, G-J. Tetrahedron 1998, 54, 6135-6146. 29. Creveling, C.R.; Daly, J.W.; Parfitt, R.T.; Witkop, B.; J. Med. Chem. 1968, 11, 596- 598. 30. Orito, K.; Miyazawa, M.; Kanbayashi, R.; Tatsuzawa, T.; Tokuda, M.; J. Org. Chem. 2000, 65, 7495-7500. 31. Cutter, P.S.; Miller, R.B.; Shore, N.E.; Tetrahedron 2002, 58, 1471-1478. 32. Shamma, M.; Hillman, M.J.; Tetrahedron 1971, 27, 1363-1374. 33. Kametani, T.; Ihara, M.; Takemura, M.; Satoh, Y.; Heterocycles 1980, 14, 817-825. 34. Szawkalo, J.; Czarnocki, Z.; Monatsh. Chem. 2005, 136, 1619-1627. 35. a) Marsden, R.; Mac Lean, D.; Can. J. Chem. 1984, 62, 1392-1399. b) Jahangir; Mac Lean, D.; Holland, H.; Can. J. Chem. 1986, 64, 1031-1035. 36.Warrener, R.; Liu, L.; Russel, R.A.; Tetrahedron 1998, 54, 7485-7496. 37. Warrener, R.; Liu, L.; Russel, R.A.; Tiekink, E. R. T.; Synlett 1998, 387-388. 38. Warrener, R.; Liu, L.; Russel, R.A.; Chem. Commun. 1997, 2173-2174. Liu, L.; Synthesis 2003, 1705-1706. 39. Chrzanowska, M.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 401-407. 220 40. Kessar, S. V.; Singh, P.; Vohra, R.; Kaur, N. P.; Venugopal, D.; J. Org. Chem. 1992, 57, 6716-6720. 41. a) Cobas, A.; Guitian, E.; Castedo, L.; J. Org. Chem. 1992, 57, 6765-6769. b) Cobas, A.; Guitian, E.; Castedo, L. Tetrahedron Lett. 1988, 29, 2491-2492. 42. a) Yang, M-L.; Kuo, P-C.; Hwang, T-L.; Chiou, W-F.; Qian, K.; Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, 1674-1682. b) Yang, M-L.; Kuo, P-C.; Damu, A.G.; Chang, R-J.; Chiou, W-F.; Tetrahedron 2006, 62, 10900-10906. 43. Tomasevich, L.; Kennedy, N.M.; Zitelli, S.M.; Hull, R. T.; Tetrahedron Lett. 2007, 48, 599-602. 44. Larsen, R.D.; Reamer, R.A.; Corley, E.G.; Davis, P.; Grabowski, E.J.J.; J. Org. Chem. 1991, 56, 6034-6038. 45. Suau, R.; Lopez-Romero, J.M.; Ruiz, A., Rico, R.; Tetrahedron 2000, 56, 993-998. 46. Manikumar, G.; Shamma, M.; J. Org. Chem. 1981, 46, 386-389. 47. a) Lenz, G.; J. Org. Chem 1974, 39, 2846-2851. b) Takano, S.; Suzuki, M.; Kijima, A.; Ogasawara, K.; Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2315- 2318. c) Bombrun, A.; Sageot, O.; Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1057-1060. d) Burns, B.; Grigg, R.; Santhakumar, V.; Sridharan, V.; Stevenson, P.; Worakun, T.; Tetrahedron 1992, 48, 7297-7320. 48. Navarro-Vasquez, A.; Rodriguez, D.; Martinez-Esperon, M.F.; Garcia, A.; Saa, C.; Tetrahedron Lett. 2007, 48, 2741-2743. 49. Cleghorn, L.A.T.; Grigg, R.; Kilner, C.; MacLachlan, W.S.; Sridharan, V.; Chem.Commun. 2005, 3071-3073. 50. Bian, X.; He, L.; Yang, G.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16 , 1380-1383. 51. a) Le, T.N.; Won-Jea Cho, W.J.; Bull. Korean Chem. Soc. 2007, 28, 763-766. b) Le, T.N.; Gang, S.G.; Won-Jea Cho, W.J.; J. Org. Chem. 2004, 69, 2768-2772. 52. Sotomayor, N.; Domınguez, E.; Lete, E.; J. Org. Chem. 1996, 61, 4062-4072. 53. Davis, F. A.; Mohanty, P. K.; J. Org. Chem. 2002, 67, 1290-1296. 54. a) Grajewska, A.; Rozwadowska, M.; Tetrahedron: Asymmetry 2007, 18, 2910-2914. 221 b) Chrzanowska, M.; Dreas, A.; Rozwadowska, M.; Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 2954-2958. 55. a) Padwa, A.; Gunn, D. E., Jr.; Osterhout, M. H.; Synthesis 1997, 1353-1377. b) Padwa, A.; Waterson, A. G.; Tetrahedron 2000, 56, 10159-10173. 56. a) Kaoudi, T.; Miranda, L.D.; Zard, S.T.; Org. Lett. 2001, 3, 3125-3127. b) Padwa, A.; Waterson, A. G.; Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8585-8588. 57. Banik, B.K.; Raju, V. S.; Manhas, M.S.; Bose, A. K.; Heterocycles 1998, 47, 639-642. 58. a) Molander, G.A.; Czako, B.; Rheam, M.; J. Org. Chem. 2007, 72, 1755-1764. b) White, J.D.; Hrnciar, P.; J. Org. Chem. 2000, 65, 9129-9142. c) Kaburagi, Y.; Tokuyama, H.; Fukuyama, T.; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10246-10247. 59. Rodrıguez, G.; Castedo, L.; Domınguez, D.; Saa, C.; Adam, W.; Saha-Moeller, C. R.; J. Org. Chem. 1999, 64, 877-883. 60. Hillard III, R.L.; Parnell, C.A.; K. Vollhardt, K. P. C.; Tetrahedron 1983, 39, 905-911. 61. Chang, J-K.; Chang, N-C.; Tetrahedron 2008, 64, 3483-3487. 62. Toth, I.: Bozsar, G.; Szabb, L.; Baitz-Gacs, E.; Liebigs Ann. Chem. 1987, 243-247. 63. Yamaguchi, R.; Moriyasu, M.; Yoshioka, M.; Kawanisi, M.; J. Org. Chem. 1985, 50, 287-288. 64. Yamaguchi, R.; Otsuji, A.; Utimoto, K.; J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2186-2187. 65. Yamaguchi, R.; Hamasaki, T.; Sasaki, T.; Ohta, T.; Utimoto, K.; J. Org. Chem. 1993, 58, 1136-1143. 66. a) Cuia, J.; Haoa, J.; Ulanovskayaa, O.A.; Dundasa, J.; Lianga, J; PNAS, 2011, 108, 6763-6768. b) Kumagai, N.; Muncipinto, G.; Schreiber, S.L.; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3635- 3638. c) Schreiber, S.L.; Nature 2009, 457, 153-154. 67. Fu, G; Nguyen, S; Grubbs, R; J. Am. Chem. Soc. 1993; 115, 9856-9851. 68. Borch, R.F.; Bernstein,M.D.; Durstlb, H.D.; J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 2897-2904. 69. a) Lavilla, R.; Gotsens, T.; Guerrero, M.; Masdeu, C.; M. Santano, C.; Tetrahedron 1997, 53, 13959-13968. 222 b) Barbier, D.; Marazano,C.; Riche,C.; Das, B.C.; Potier, P.; J. Org. Chem. 1998, 63, 1767- 1772. c) Baird, P. D.; Blagg, J.; Davies, S. G.; Sutton, K. H.; Tetrahedron 1988, 44, 171-186. d) Leonard, N. J.; Hauck, F. P.; J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 5279-5292. e) Bersch, H. W.; Hoff, D.; Schon, D.; Arch. Pharm. 1978, 311, 1029-1042. f) Beuchet, P.; Le Marrec, N.; Mosset, P.; Tetrahedron Lett. 1992, 33, 5959-5960. g) Chernyshov, I.Y.; Levin, V.V.; Dilman, A.D.; Belyakov, P.A.; Struchkova, M.I.; Russian Chem. B. 2010, 59, 2102-2107. h) Youte, J-J.; Barbier, D.; Al-Mourabit, A.; Gnecco, D.; Marazano, C.; J. Org. Chem. 2004, 69, 2737-2740. i) McIntosh, J.M.; Can. J. Chem. 1980, 58, 2604-2609. j) Valpuesta, M.; Ariza, M.; Díaz, A.; Suau, R.; Eur. J. Org. Chem. 2010, 4393-4401. k) Legros, J. Meyer, F.; Coliboeuf, M.; Crousse,B.; Bonnet-Delpon, D.; J. Org. Chem. 2003, 68, 6444-6446. l) Arai, T; Abe, H; Aoyagi, S; Kibayashi, C.; Tetrahedron Lett. 2004, 45, 5921-5924. m) Damodar, K.; Lingaiah, M.; Bhunia, N.; Das, B.; Synthesis 2011, 15, 2478-2482. 70. Lee, S.H.; Park, Y.S.; Nam, M.H.; Yoon, C.M. Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2170- 2172. 71. Deiters,A.; Pettersson, M.; Martin, S.F.; J. Org. Chem. 2006, 71, 6547-6561. 72. a) Trost, B.M.; Chen, S-F.; J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 6053-6054. b) Moreno-Manas, M.; Pleixats, R.; Roglans, A. Liebigs Ann. 1995, 10, 1807-1814. c) Trost, B.M.; Burgess, K.; J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1985, 1084-1086. d) Trost, B.M.; Tanoury, G.J. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 4753-4755. e) Trost, B.M.; Tour, J.M.; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5268-5270. f) Burns, B.; Grigg, R.; Sridharan, V.; Worakun, T.; Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4325- 4328. g) Wartenberg, F. H.; Hellendahl, B.; Blechert, S.; Synlett 1993, 7, 539-540. h) Trost, B.M.; Chen, S-F.; J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 6053-6054. 73. Verkruijsse, H. D.; Brandsma, L.; Synthetic Commun. 1990, 20, 3375-3378. 74. a) Moller, B; Undheim, K. Tetrahedron 1998, 54, 5789-5804. 223 b) Grigg, R.; Stevenson, P.; Worakun, T. J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1985, 14, 971- 972. c) Grigg, R.; Stevenson, P.; Worakun, T. Tetrahedron 1988, 44, 2049-2054. 75. Gibson, S.E.; Middleton, R.J.; Contemp. Org. Synth. 1996, 3, 447-471. 76. a) Takao, K.; Munakata, R.; Tadano, K.; Chem. Rev. 2005, 105, 4779-4807. b) Juhl, M.; Tanner, D.; Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2983-2992. c) De Picciotto, L.;Carrupt, P-A.;Vogel, P.; J. Org. Chem. 1982, 47, 3796-3799. d) Singh, V. K.; Prathap, S.; Kane, V. V.; Stressman, C. C.; Bates, R. B. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 3681-3684. e) Bailey,W.F.; Wachter-Jurcsak, N.M.; Pineau, M.R.;Timo V. Ovaska, T.V.; J. Org. Chem. 1996, 61, 8216-8228. 77. Konno, K.; Sagara, S; Hayashi, T.; Takayama, H., Heterocycles 1994, 39, 51-54. 78. a) Hub, D.;Gung, W-Y.; Ostrander, R.A.; Takusagawat, F.; J. Org. Chem. 1987, 52, 2509-2517. b) Marchand, A.P.; Wu, A.; J. Org. Chem. 1985, 50, 396-398. c) Fringueli, F.; Taticchi, A.; The Diels Alder Reaction; Selected Practical Methods, J. Wiley & Sons, Chichester, 2002. 79. Constantino, M.G.; Aragao, V.; da Silva, G.V.J. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 1393- 1395. 80. a) Kurosu, M.; Lin, M-H.; Kishi, Y.; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12248-12249. b) Katritzky, A.R.; Millet, G.H.; Noor,. R.H.M. Yates, F.S.; J. Org. Chem 1978, 43, 3957- 3960. c) Pardal, A.C.; Ramos, S.S.; Santos, P.F.; Reis, L.V.; Almeida, P. Molecules 2002, 7, 320- 330. d) Day, F.H.; Bradsher, C.K.; Chen, T-K.; J. Org. Chem. 1975, 40, 1195-1198. 81. Organic Syntheses, 2004, Coll. Vol. 10, 222 ; Vol. 76,.221. 82. a) Luna, A.P.; Ceschi, M.A.; Bonin, M.; Micouin, L.; Husson, H.P.; J. Org. Chem. 2002, 67, 3522-3524. b) Jubi, J.; Indu, U.; Suresh, E.; Radhakrishnan, K.V.; J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 5042- 5043. 224 83. Husinec, S.; Savic, V.; Simic, M.; Tesevic, V.; Vidovic, D.; Tetrahedron Lett. 2011, 52, 2733-2736. 84. Fleming, F.F.; Zhang, Z.; Tetrahedron 2005, 61, 747-789. 85. Carr, R.V.C.; Williams, R. V.; Paquette, L.A.; J. Org. Chem. 1983, 48, 4976-4986. 86. Kotha, S.; Khedkar, P.; J. Org. Chem. 2009, 74, 5667-5670. 87. a) Cossy, J.; Belotti, D.; Org. Lett. 2002, 4, 2557-2559. b) Mal, D.; Dey, S.; Tetrahedron 2006, 62, 9589-9602. 88. Wagner, H.; Bladt, S.; Plant Drug Analysis 1996. 89. a) Muller, G; Poittevin, A.; Fr. M. 1969, FR 7292 19691103. b) Liu, H.; Li, G.; Wang, J.; Liu, J.; PCT Int. Appl. 2011, WO2011006000A120110113. c) Liu, H.; Li, G.; Wang, J.; Liu, J.; PCT Int. Appl. 2010, WO2010075469A120100701. 90. a) Herman T. Teunissen, H.T.; Elsevier, C.J.; Chem. Commun. 1998, 1367-1368. b) Clarke, M.L: Dıaz-Valenzuela, M.B.; Slawin, A.M.Z. Organometallics 2007, 26, 16-19. c) Lu, W.; Lu, G.; Luo, Y.; Chen, A. J. Mol. Catal. A–Chemical. 2002, 188, 225-231. 91. a) Vanden Eynde, J.J.; Delfosse, F.; Mayence, A.; Van Haverbeke , Y.; Tetrahedron 1995, 51, 6511-6516. b) Broom, N.J.P, Sammes,P.G. J.C.S. Perkin I 465-470. 92. a) Taffin, C.; Kreutler,G.; Bourgeois, D.; Clot, E.; Perigauda, C.; New J. Chem. 2010, 34, 517-525. b) Baran, A.; Guenel, A.; Balci, M.; J. Org. Chem. 2008, 73, 4370–4375. 93. a) Zamudio-Medina, A-Z.; García-González, C.; Padilla, J.; González-Zamora E.; Tetrahedron Lett. 2010, 51, 4837-4839. b) Zubkov, F.I.; Ershova , J.D.; Orlova, A.A.; Zaytsev, V.P.; Nikitina, E.V.; Tetrahedron 2009, 65, 3789-3803 c) Ruijter, E.; Garcia-Hartjes, J.; Hoffmann, F.; van Wandelen, L.T.M.; de Kanter, F.J.J.; Synlett 2010, 2485-2489. d) Ambros, R.; Schneider, M.R.; von Angerer, S.; J. Med. Chem. 1990, 33, 153-160. e) Polossek,T.; Ambros, R.; von Angerer, S.; Brandl, G.; Mannschreck, A.; J. Med. Chem. 1992, 35, 3537-3547. 94. a) Bombrun, A.; Sageot, O.; Tetrahedron Let. 1997, 38, 1057-1060. 225 b) Grigg, R.; Stevenson, P.; Worakun, T.; J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1984, 1073-1075. 108. a) Knölker, H-J.; Cämmerer, S.; Tetrahedron Lett. 2000, 41, 5035-5038. b) Domınguez G, Perez-Castells, J.; Eur. J. Org. Chem. 2011, 7243-7253. 95. Whittaker, N.; J. Chem. Soc (C), 1969, 85-89. 96. Kawate, T.; Nakagawa, M.; Yamazaki, H.; Hirayama, M.; Hino, T. Chem. Pharm. Bull. 1993, 41, 287. 97. a) Donaldson, L. R.; Haigh, D.; Hulme, A.N.; Synlett 2009, 10, 1587-1590. b) Söllhuber, M.; Grande, M. T.; Trigo, G.G.; Vázquez, D.; Jiménez, A. Curr Microbiol. 1980, 4, 81-84. c) Szmuszkovicz, J.; Regan, C. M. PCT Int. Appl.(2000), WO 2000004905 A1 20000203. d) Zhao, S.; Totleben, M.J.; Freeman, J.P.; Bacon, C. L.; Fox, G. B.; Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 1637-1646. 98. a) Miyadera, T.; Tachikawa, R.; Tetrahedron 1969, 25, 5189-5198. b) Schultz, A.G.; Flood, L.; J. Org. Chem. 1986, 51, 838-841. c) Yamaguchi, R.; Moriyasu, M.; Yoshioka, M.; Kawanisi, M.; J. Org. Chem. 1985, 50, 287-288. d) Hori, M.; Ban, M.; Imai, E.; Iwata, N.; Suzuki, Y.; J. Med. Chem. 1985, 28, 1656-1661. 99. Santos, L.S.; Pilli, R.A.; Synthesis 2002, 1, 87-93. 100. Bradsher, C.K.; Sherer, J.P.; J. Org. Chem. 1967, 32, 733-737. 101. Husinec, S.; Jadranin, M.; Markovic, R.; Petkovic, M.; Savic, V.; Tetrahedron Lett. 2010, 51, 4066-4068. 102. Zimmer, R.; Dinesh,C.U.; Nandanan, E.; Khan, F.A.; Chem. Rev. 2000, 100, 3067- 3125. 103. a) Bäckvall, J.E.; Acc. Chem. Res. 1983, 16, 335-342. b) Bäckvall, J.E, Nystrom, J.E.; Nordberg, R.E.; J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 3676-3686. c) Bäckvall, J.E, Schink, J.E.; Renko, Z.D.; J. Org. Chem. 1990, 55, 826- d) Bäckvall, J.E.; Andersson, P.G.; J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 6374-6381. e) Liao, L.; Sigman, M.S.; J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 10209-10211. 104. Bhat, L.; Steinig, A.; Appelbe, R.; de Meijere, A.; Eur. J. Org. Chem. 2001, 1673- 1680. 226 105. Gorlushko D.A.; Filimonov, V.D.; Krasnokutskaya, E.A.; Semenischeva, N.I.; Gob, B.S. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 1080-1082. 106. Husinec, S.; Petkovic, M.; Savic, V.; Simic, M.; Synthesis 2012, 44, 399-408. 107. a) Palframan, M.J.; Parsons, A.F.; Johnson, P.; Tetrahedron Lett. 2011, 52, 1154- 1156. b) Reimann, E.; Renz, M.; Monatsh. Chem. 2007, 138, 211-218. c) Battersby, A.R.; Davidson, G.C.; Turner, J.C. J. Chem. Soc. 1965, 3899-3907. d) Lin, S.; Deiana, L.; Tseggai, A.; Córdova, A.; Eur. J. Org. Chem. 2012, 398-408. e) Zaarur, N.; Gabai, V.L.; Porco, J.A.; Calderwood, S.; Sherman, M.Y.; Cancer Res. 2006, 66, 1783-1791. 108. Van Tamelen, E.E.; Aldrich, P.E.; Katz, T.J.; J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 6426-6430. 109. Evans, P.; Grigg, R.; York, Mark; Tetrahedron Let. 2000, 41, 3967-3970. 110. a) Hanhinen, P.; Putkonen, T., Lounasma, M.; Heterocycles 1999, 5, 1827-1842. b) Beeken, P.; Bonfiglio, J.B.; Hasan, I.; Piwinski, J.J.; Weinstein, B.; J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 6677-6682. c) Fry, E.M.; Beisler, J. A.; J. Org. Chem. 1970, 30, 2809-2811. d) Potts, K. T.; Liljegren, D. R.; J. Org. Chem. 1963, 28, 3066-3070. e) Prusov, E.; Maier, M.E.; Tetrahedron 2007, 63, 10486-10496. 111. a) Loh, T-P.; Lye,P-L.; Wang, R-B.; Sim, K-Y. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 7779- 7783. b) Moral, J.A.; Moon, S-J.;Rodriguez-Torres, S.; Minehan, T.G. Org. Lett. 2009, 11, 3734- 3737. c) Kim, S.J.; Jang, D.O.; J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 12168-12169. d) Vilaivan, T.; Winotapan, C.; Shinada, T.; Ohfune, Y. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 9073- 9076. e) Law, M.C.; Cheung, T.W.; Wong, K.J.;Chan, T.H. J. Org. Chem. 2007, 72, 923-929. 112. Simić M.; Savić V.; Ranñelović J.; Arhiv za farmaciju, 2011, 61, 267-278. 113. Allin, S.M.; Khera, J.S.; Thomas, C.I.; Witherington, J.; Tetrahedron Lett. 2006, 47, 1961–1964. 114. Itoh, T.; Michiko, M.; Nagata, K.; Nakamura, S.; Heterocycles 2004, 63, 655-661. 227 115. a) Ohfusa, T.; Nishida, A.; Tetrahedron 2011, 67, 1893-1906. b) Fujita, R.; Yoshisuji, T.; Wakayanagi, S.; Wakamatsu, H.; Matsuzaki, H.; Chem. Pharm. Bull. 2006, 54, 204-208. 116. a) Táborská, E.; Bochořáková, H.; Soušek, J.; Sedmera, P.; Vavrečková, C.; Collect. Czech. Chem. Commun. 1996, 61, 1064-1072. b) Bi, W.; Cai, J.; Liu, S.; Baudy-Floc’h, M.; Bib, L.; Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 6909- 6919. c) Rackova, L.; Oblozinsky, M.; Kostalova, D.; Kettmann, V.; J. Inflamm. 2007, 4, 1-7. d) Pailee, P.; Prachyawarakorn, V.; Mahidol,C.; Ruchirawat, S.; Kittakoop, P.; Eur. J. Org. Chem. 2011, 3809-3814. e) Luo, A.; Fan, Y.; J. Med. Plant. Res. 2011, 5, 3702-3707. f) Anggraini, T.; Tai1, A.; Yoshino, T.; Itani, T.; Afr. J. Biochem. Res. 2011, 5, 33-38. 117. a) Li, K.; Alexakis, A.; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7600–7603. b) Šima, J.; Izakovič, M.; Žitnansky, M.; Int. J. Photoenergy 2006, 1-5. 118. a) Taylor, S.J.; Taylor, A.M.; Schreiber, S.L.; Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1681- 1685. b) Knight, J.; Parsons, P.J.; J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, 189-190. 119. Yang, L.; Wang, X.; Pan, Z.; Zhou, M.; Synlett 2011, 2, 207-210. 120. a) Metzger, A.; Schade, M.A.; Knochel, P.; Org. Lett. 2008, 10, 1107-1110. b) Borsini, E.; Broggini, G.; Colombo, F.; Khansaa, M.; Fasana, A.; Tetrahedron: Asymmetry 2011, 22, 264-269. 121. a) Agenet, N.; Mirebeau, J-H.; Petit, M.; Thouvenot, R.; Gandon, V.; Organometallics 2007, 26, 819-830. b) Teng, Z.; Keese, R.; Helv. Chim. Acta. 1999, 82, 515-521. 122. Ikunaka, M.; Maruoka, K.; Okuda,Y.; Ooi, T.; Org. Process Res. Dev. 2003, 7, 644- 648. 123. Barciszewski, J.; Barciszewska, M.Z.; Siboska, G.; Rattan, S. I..S.; Clark, B. Mol. Biol. Rep. 1999, 26, 231–238. 124. a) Acosta, J.C.; Richard, C.; Delgado, M.D.; Horita, M.; Rizzo, M.G.; Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 893-900. 228 b) Mihailovic, M.; Poznanovic, G.; Grdovic, N.; Vidakovic, M.; Dinic, S.; J. Radiol. Prot. 2010, 30, 567-583. c) Heidenreich, A.; Marx, F.J.; Peters, H.J.; Urologe [A] 1999, 38, 586-591. 125. Snodgrass, R.G.; Collier, A.C.; Coon, A.E.; Pritsos, C.A. J. Biol. Chem, 2010, 285, 19068-19075. 126. Jensen, D.; Ramel, C.; Gothe, R.; Mut. Res., 1974, 26, 553-555. 127. Lin, C.D.; Lin, S.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 2345-2349 128. a) Fenech, M.; Morley, A.A.; Denham, J.; Francis, W. Int. J. Radiat Biol, 1990, 57, 373-383. b) Fenech, M.; Morley, A.A.; Mut. Res. 1993, 285, 35-44. 129. Herraiz, T.; Galisteo, J.; J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 7156-7161. 130. a) Kim, B-S.; M.-Y. Kim, M-Y.; Leem, Y-H.; Neuroscience 2011, 194, 291-301. b) Golechha, M.; Chaundry, U.; Bhatia, J.; Saluja, D.; Arya, D.S.; Biol. Pharm. Bull. 2011, 34, 360-365. 131. a) Takano, S.; Sugihara, T.; Satoh, S.; Ogasawara, K.; J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 6467-6471. b) Hanessian, S.; Ninkovic, S.; J. Org. Chem. 1996, 61, 5418-5424. c) Conway, G.A.; Park, J.S.; Maggiora, L.; Mertes, M.P.; Galton, N.; J. Med. Chem. 1984, 27, 52-56. d) Ma, D.; Wu, W.; Deng, P.; Tetrahedron Lett. 2001, 42, 6929-6931. 132. a) Ohno, H.; Takeoka, Y.; Kadoh,Y.; Miyamura, K.; Tanaka, T.; J. Org. Chem. 2004, 69, 4541-4544. b) Ohno, H.; Miyamura, K.; Takeoka, Y.; Tanaka, T.; Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2647-2650. c) Zhu, G.; Zhang, Z.; Org. Lett. 2004, 6, 4041-4044. d) Makino, T. Itoh, K.; Tetrahedron Lett. 2003, 44, 6335-6338. e) Kang, S-K.; Lee,S-W.; Jung, J.; Lim, Y.; J. Org. Chem. 2002, 67, 4376-4379. 133. Xu, L.; Huang, X.; Tetrahedron Lett. 2008, 49, 500-503. 134. a) Xi, P-X.; Xu, Z-H.; Liu, X-H; Chen , F-J; Zeng, Z-Z; J. Fluoresc. 2009, 19, 63-72. 229 b) Gensler, W.J.; Forrest, J.F.; Surendra, K.D.; Lauher, J.W.; J. Org. Chem. 1971, 36, 4102-4105. c) Fugami, K.; Oshira, K.; Utimoto, K.; Bull. Chem. Soc. Jpn. 1989, 62, 2050-2054. d) Kuang, J.; Ma, S.; J. Org. Chem. 2009, 74, 1763-1765. e) Ohno, H.; Mizutani, T.; Kadoh, Y.; Aso, A.; Miyamura, K.; J. Org. Chem. 2007, 72, 4378-4389. f) Nakamura, H.; Sugiishi, T.; Tanaka, Y.; Tetrahedron Lett. 2008, 49, 7230–7233. 135. a) Marshall, J.A.; Chem. Rev. 2000, 100, 3163-3185. b) Zanoni, G.; Pontiroli, A.; Marchetti, A.; Vidari , G.; Eur. J. Org. Chem. 2007, 3599- 3611. 136. Yadav, J.S.; Anjaneyulu, S.; Ahmed, M.M.; Reddy, S.; Tetrahedron Lett. 2001, 42, 2557-2559. 137. a) Marshall, J.A.; Chem. Rev. 2000, 100, 3163-3185. b) Ohno, H.; Hamaguchi, H.; Tanaka, T.; Org. Lett. 2000, 2, 2161-2163. 138. a) Ohno, M.; Abe, T.; J. Immunol. Methods, 1991, 145, 199-203. b) Mismann, T.; J. Immunol. Methods, 1983, 65, 55-63. 139. Countryman, P.I.; Heddle, J.A. Mut. Res., 1976, 41, 321-332. 230 7. PRILOG Tabela 7.1: Kristalografski podaci i prečišćavanje strukture za jedinjenje 2.9. Identification code 001bgdv10 Empirical formula C21 H17 N1 O5 Formula weight 363.37 Temperature 150 K Wavelength 0.71073 Å Crystal system Monoclinic Space group P 1 21/n 1 Unit cell dimensions a = 6.89600(10) Å α= 90°. b = 8.64520(10) Å β= 95.1184(6)°. c = 28.7090(5) Å γ = 90°. Volume 1704.73(4) Å3 Z 4 Density (calculated) 1.416 Mg/m3 Absorption coefficient 0.102 mm-1 F(000) 760 Crystal size 0.310 x 0.220 x 0.190 mm3 Theta range for data collection 5.179 to 27.490°. Index ranges -8<=h<=8, -11<=k<=11, -37<=l<=37 Reflections collected 22503 Independent reflections 3857 [R(int) = 0.035] Completeness to theta = 26.940° 99.0 % Absorption correction Semi-empirical from equivalents Max. and min. transmission 0.98 and 0.86 Refinement method Full-matrix least-squares on F2 Data / restraints / parameters 3856 / 0 / 244 Goodness-of-fit on F2 0.9608 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0502, wR2 = 0.1273 R indices (all data) R1 = 0.0741, wR2 = 0.1404 Largest diff. peak and hole 0.38 and -0.38 e.Å-3 231 Tabela 7.2: Atomske koordinate ( x 104) i izotropni parametri pomeranja (Å2x 103) za 2.9. U(eq) je definisan kao trećina traga normalizovanog Uij tenzora. _________________________________________________________________________ x y z U(eq) _________________________________________________________________________ O(1) 6805(2) 5455(1) 7310(1) 34 C(2) 7373(2) 5285(2) 6915(1) 26 N(3) 9061(2) 4471(2) 6853(1) 25 C(4) 9755(2) 4239(2) 6417(1) 25 C(5) 8790(2) 4840(2) 6026(1) 27 C(6) 7000(2) 5644(2) 6052(1) 26 C(7) 6302(2) 5891(2) 6492(1) 25 C(8) 4566(2) 6692(2) 6527(1) 26 C(9) 3478(2) 7222(2) 6131(1) 25 C(10) 4135(2) 6938(2) 5687(1) 28 C(11) 5876(2) 6186(2) 5649(1) 29 C(12) 2929(2) 7370(2) 5244(1) 31 O(13) 3442(2) 8744(2) 5088(1) 38 C(14) 2257(3) 9296(3) 4680(1) 48 O(15) 1729(2) 6530(2) 5047(1) 49 C(16) 1638(2) 8096(2) 6161(1) 27 O(17) 1162(2) 8253(2) 6600(1) 37 C(18) -534(3) 9198(2) 6650(1) 37 O(19) 675(2) 8619(2) 5828(1) 40 C(20) 11568(2) 3320(2) 6403(1) 27 C(21) 12779(2) 3053(2) 6812(1) 30 C(22) 12216(2) 3746(2) 7259(1) 34 C(23) 10036(2) 3714(2) 7273(1) 31 C(24) 14474(3) 2184(2) 6790(1) 38 C(25) 14951(3) 1587(2) 6369(1) 42 C(26) 13757(3) 1845(2) 5964(1) 44 C(27) 12075(3) 2705(2) 5979(1) 36 ________________________________________________________________________ 232 Tabela 7.3: Dužine veza [Å] i uglovi veza [°] za 2.9 _________________________________ ___ O(1)-C(2) 1.2391(19) C(2)-N(3) 1.385(2) C(2)-C(7) 1.462(2) N(3)-C(4) 1.3965(19) N(3)-C(23) 1.4787(19) C(4)-C(5) 1.354(2) C(4)-C(20) 1.485(2) C(5)-C(6) 1.424(2) C(5)-H(51) 0.980 C(6)-C(7) 1.407(2) C(6)-C(11) 1.415(2) C(7)-C(8) 1.394(2) C(8)-C(9) 1.384(2) C(8)-H(81) 0.939 C(9)-C(10) 1.412(2) C(9)-C(16) 1.485(2) C(10)-C(11) 1.378(2) C(10)-C(12) 1.502(2) C(11)-H(111) 0.920 C(12)-O(13) 1.329(2) C(12)-O(15) 1.203(2) O(13)-C(14) 1.448(2) C(14)-H(141) 0.960 C(14)-H(142) 0.980 C(14)-H(143) 1.001 C(16)-O(17) 1.3388(19) C(16)-O(19) 1.2019(19) O(17)-C(18) 1.444(2) C(18)-H(181) 0.950 C(18)-H(182) 0.950 C(18)-H(183) 0.950 C(20)-C(21) 1.399(2) C(20)-C(27) 1.400(2) C(21)-C(22) 1.499(2) C(21)-C(24) 1.395(2) C(22)-C(23) 1.508(2) C(22)-H(221) 0.993 C(22)-H(222) 1.036 C(23)-H(231) 0.944 C(23)-H(232) 0.990 C(24)-C(25) 1.380(3) C(24)-H(241) 0.959 C(25)-C(26) 1.383(3) C(25)-H(251) 0.960 C(26)-C(27) 1.382(2) C(26)-H(261) 0.974 C(27)-H(271) 0.969 O(1)-C(2)-N(3) 121.04(13) O(1)-C(2)-C(7) 122.64(14) N(3)-C(2)-C(7) 116.31(13) C(2)-N(3)-C(4) 123.22(12) C(2)-N(3)-C(23) 116.52(12) C(4)-N(3)-C(23) 120.02(13) N(3)-C(4)-C(5) 120.32(14) N(3)-C(4)-C(20) 117.28(13) C(5)-C(4)-C(20) 122.40(14) C(4)-C(5)-C(6) 120.57(15) C(4)-C(5)-H(51) 122.7 C(6)-C(5)-H(51) 116.8 C(5)-C(6)-C(7) 119.22(14) C(5)-C(6)-C(11) 122.23(14) 233 C(7)-C(6)-C(11) 118.55(14) C(2)-C(7)-C(6) 120.25(14) C(2)-C(7)-C(8) 119.40(14) C(6)-C(7)-C(8) 120.34(13) C(7)-C(8)-C(9) 120.73(14) C(7)-C(8)-H(81) 121.5 C(9)-C(8)-H(81) 117.8 C(8)-C(9)-C(10) 119.36(14) C(8)-C(9)-C(16) 121.57(14) C(10)-C(9)-C(16) 119.07(13) C(9)-C(10)-C(11) 120.37(14) C(9)-C(10)-C(12) 121.46(14) C(11)-C(10)-C(12) 118.11(14) C(6)-C(11)-C(10) 120.61(14) C(6)-C(11)-H(111) 116.5 C(10)-C(11)-H(111) 122.9 C(10)-C(12)-O(13) 111.30(14) C(10)-C(12)-O(15) 123.62(16) O(13)-C(12)-O(15) 124.97(15) C(12)-O(13)-C(14) 114.81(15) O(13)-C(14)-H(141) 106.5 O(13)-C(14)-H(142) 114.8 H(141)-C(14)-H(142) 110.1 O(13)-C(14)-H(143) 111.2 H(141)-C(14)-H(143) 110.9 H(142)-C(14)-H(143) 103.5 C(9)-C(16)-O(17) 112.93(13) C(9)-C(16)-O(19) 124.01(14) O(17)-C(16)-O(19) 123.05(15) C(16)-O(17)-C(18) 114.85(13) O(17)-C(18)-H(181) 109.5 O(17)-C(18)-H(182) 109.4 H(181)-C(18)-H(182) 109.5 O(17)-C(18)-H(183) 109.6 H(181)-C(18)-H(183) 109.5 H(182)-C(18)-H(183) 109.5 C(4)-C(20)-C(21) 120.44(14) C(4)-C(20)-C(27) 120.18(14) C(21)-C(20)-C(27) 119.38(15) C(20)-C(21)-C(22) 118.18(14) C(20)-C(21)-C(24) 119.34(16) C(22)-C(21)-C(24) 122.47(15) C(21)-C(22)-C(23) 110.54(14) C(21)-C(22)-H(221) 110.6 C(23)-C(22)-H(221) 109.9 C(21)-C(22)-H(222) 112.7 C(23)-C(22)-H(222) 114.0 H(221)-C(22)-H(222) 98.6 C(22)-C(23)-N(3) 110.60(13) C(22)-C(23)-H(231) 110.8 N(3)-C(23)-H(231) 108.8 C(22)-C(23)-H(232) 107.9 N(3)-C(23)-H(232) 109.6 H(231)-C(23)-H(232) 109.1 C(21)-C(24)-C(25) 120.51(16) C(21)-C(24)-H(241) 119.9 C(25)-C(24)-H(241) 119.5 C(24)-C(25)-C(26) 120.37(17) C(24)-C(25)-H(251) 118.0 C(26)-C(25)-H(251) 121.7 C(25)-C(26)-C(27) 119.91(18) C(25)-C(26)-H(261) 124.7 C(27)-C(26)-H(261) 115.3 C(20)-C(27)-C(26) 120.49(16) C(20)-C(27)-H(271) 120.6 C(26)-C(27)-H(271) 118.7 _________________________________ 234 Tabela 7.4: Anizotropni parametri pomeranja (Å2x 103) za 2.9 Eksponent anizotropnog faktora pomeranja je dat u obliku: -2pi2[ h2 a*2U11 + ... + 2 h k a* b* U12 ] ______________________________________________________________________ U11 U22 U33 U23 U13 U12 ______________________________________________________________________ O(1) 40(1) 42(1) 19(1) 3(1) 3(1) 9(1) C(2) 32(1) 25(1) 21(1) 1(1) 2(1) 0(1) N(3) 29(1) 27(1) 19(1) 1(1) 0(1) 4(1) C(4) 28(1) 25(1) 22(1) -2(1) 0(1) 1(1) C(5) 30(1) 32(1) 20(1) -1(1) 2(1) 6(1) C(6) 31(1) 28(1) 19(1) 0(1) 0(1) 2(1) C(7) 30(1) 24(1) 19(1) 1(1) 0(1) 2(1) C(8) 33(1) 26(1) 19(1) 0(1) 3(1) 3(1) C(9) 29(1) 24(1) 22(1) 1(1) -1(1) 2(1) C(10) 34(1) 29(1) 19(1) 0(1) -1(1) 4(1) C(11) 35(1) 36(1) 18(1) 0(1) 2(1) 6(1) C(12) 34(1) 38(1) 21(1) 0(1) 1(1) 12(1) O(13) 37(1) 49(1) 28(1) 15(1) -3(1) 7(1) C(14) 40(1) 67(1) 34(1) 24(1) -4(1) 10(1) O(15) 59(1) 48(1) 36(1) -4(1) -18(1) 1(1) C(16) 31(1) 27(1) 23(1) 0(1) 0(1) 3(1) O(17) 38(1) 50(1) 23(1) -3(1) 2(1) 19(1) C(18) 35(1) 43(1) 35(1) -4(1) 4(1) 12(1) O(19) 38(1) 53(1) 27(1) 8(1) 1(1) 17(1) C(20) 26(1) 26(1) 30(1) 0(1) 0(1) 2(1) C(21) 29(1) 29(1) 30(1) 5(1) -1(1) 0(1) C(22) 34(1) 42(1) 26(1) 6(1) -5(1) 1(1) C(23) 35(1) 35(1) 22(1) 7(1) -1(1) 5(1) C(24) 32(1) 39(1) 41(1) 10(1) -3(1) 4(1) C(25) 33(1) 41(1) 52(1) 1(1) 1(1) 13(1) C(26) 39(1) 50(1) 42(1) -10(1) 3(1) 12(1) C(27) 32(1) 42(1) 33(1) -6(1) -1(1) 6(1) ______________________________________________________________________ 235 Tabela 7.5: Koordinate vodonika ( x 104) i izotropni parametri pomeranja (Å2x 103) za 2.9 ______________________________________________________________________ x y z U(eq) ______________________________________________________________________ H(51) 9268 4747 5716 26 H(81) 4125 6929 6819 27 H(111) 6380 6022 5367 29 H(141) 2775 10286 4604 61 H(142) 866 9387 4720 59 H(143) 2294 8559 4412 60 H(221) 12851 3182 7533 36 H(222) 12834 4825 7326 36 H(231) 9667 4225 7542 33 H(232) 9625 2618 7282 33 H(241) 15333 2021 7067 43 H(251) 16110 970 6370 48 H(261) 13967 1412 5659 47 H(271) 11207 2807 5696 38 H(181) -769 9251 6971 45 H(182) -315 10210 6537 45 H(183) -1632 8756 6476 45 ______________________________________________________________________ 236 Tabela 7.6: Vodonične veze za 2.9 [Å ,°]. ______________________________________________________________________ D-H...A d(D-H) d(H...A) d(D...A) <(DHA) ______________________________________________________________________ C(5)-H(51)...O(15)#1 0.98 2.50 3.291(2) 138 C(22)-H(221)...O(17)#2 0.99 2.52 3.392(2) 146 C(23)-H(232)...O(1)#2 0.99 2.46 3.355(2) 150 C(18)-H(181)...O(1)#3 0.95 2.47 3.367(2) 156 ______________________________________________________________________ Symmetry transformations used to generate equivalent atoms: #1 -x+1,-y+1,-z+1 #2 -x+3/2,y-1/2,-z+3/2 #3 -x+1/2,y+1/2,-z+3/2 237 8. BIOGRAFIJA Milena Simić (roñena Antanasijević) roñena je u Beogradu, 17.4.1972. godine, gde je završila osnovnu školu i gimnaziju. Diplomirala je 1998. godine na Hemijskom fakultetu u Beogradu (smer Organska hemija) sa prosečnom ocenom 8,80 na studijama i 10,0 na diplomskom radu. Magistarsku tezu odbranila je 2007. godine na Hemijskom fakultetu u Beogradu. Od 1998. godine zaposlena je na Farmaceutskom fakultetu na Katedri za organsku hemiju.